(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛に関係する化合物を識別する方法であって、
ａ）Ｉｆｉ２０５核酸を含む、細胞系又は無細胞系の試験システムを備える工程、
ｂ）該試験システムを試験化合物と接触させる工程、及び
ｃ）試験化合物の該試験システムに対する作用を決定する工程、
を含んでなり、対照と比較して、試験化合物の該試験システムに対する有意な作用が検出された場合に、試験化合物を疼痛に関係する化合物として識別し、そして、該作用は、Ｉｆｉ２０５核酸の発現の変化である、上記識別方法。
【請求項２】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５遺伝子及び／又はＩｆｉ２０５タンパク質のシグナル伝達経路に自然に参加する細胞化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５タンパク質の上流又は下流のシグナル伝達を変化させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５遺伝子の上流又は下流のシグナル伝達を変化させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
化合物がＩｆｉ２０５遺伝子の発現を変化させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５遺伝子及び／又はＩｆｉ２０５タンパク質のシグナル伝達経路に自然に参加する細胞化合物に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５タンパク質に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５遺伝子の上流又は下流のシグナル伝達を抑制する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
化合物がＩｆｉ２０５遺伝子の発現を抑制する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
疼痛に関係する化合物が、Ｉｆｉ２０５タンパク質の上流又は下流のシグナル伝達を抑制する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
化合物がＩｆｉ２０５タンパク質に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ハイスループット方法である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
疼痛が神経障害性疼痛である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
疼痛に関係する化合物を識別することに関する方法及び使用並びに痛覚過敏を診断する方法
【０００２】
この発明は、疼痛に関係する化合物を識別する方法、疼痛に関係する化合物を識別するためのＩｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質の使用、及びそれを含む痛覚過敏（algesia）を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肉体的疼痛は、侵害性刺激又は肉体的傷害の不快な認識と表現されうる通例の感覚的体験である。個体は様々な日常の傷及び痛みによって、そして時にはより重篤な損傷又は病気を介して疼痛を体験する。科学的及び臨床的目的の場合、疼痛は、“不快な感覚性・情動性体験であり、それには実際の、又は可能性のある組織損傷を伴うものと、あるいはそのような損傷があるように表現されるものがある（an unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential tissue damage, or described in terms of such damage）”と国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）によって定義されている。
【０００４】
あらゆる種類の疼痛は、米国において医師とのカウンセリングのための最も一般的な理由であり、毎年、すべての米国人の半数が医療的ケアを得ようとしている。疼痛は、人のクオリティ・オブ・ライフ及び全般的機能を顕著に妨げる多くの医学的状態における主要な症状である。診断は様々な形で、期間、強度、種類（鈍痛、灼熱痛、拍動痛又は刺痛）、原因、又は体の部位によって特徴付けられる疼痛に基づく。通常、疼痛は処置しなくても停止するか、あるいは休息するか又は鎮痛剤を服用するなどの簡単な手段に反応し、その場合はこうした疼痛は、“急性（acute）”疼痛と呼ばれる。しかし、疼痛は、難治性になり、慢性疼痛と呼ばれる状態に進展することもありえ、そうした場合には、疼痛はもはや１つの症状であるとは考えられず、それ自体病気であると考えられる。近年、疼痛の研究は、薬理学、神経生物学、看護、歯科医療、理学療法、及び心理学などの多くの様々な分野によって注目されている。
【０００５】
疼痛は、疼痛性刺激を取り消すための反射反応を引き起こす身体の防御システムの一部であり、そして疼痛は、その挙動を将来の特定の有害な状況の回避を増大させるように適応させるのに役立つ。
【０００６】
疼痛の医学的管理によって、急性疼痛と慢性疼痛の区別が生じる。急性疼痛は、‘通常の（normal）’疼痛であり、つま先を傷つけたとき、骨折したとき、歯痛を有するとき、あるいは広範囲な外科的手術の後に歩いたときに感じる。慢性疼痛は、‘疼痛疾患（pain
illness）’であり、疼痛は、毎日、毎月感じられ、そして治癒する可能性がないように見える。
【０００７】
一般に、医師は、通例、数ある原因の中でも、軟部組織損傷、感染、及び／又は炎症によって引き起こされる急性疼痛を処置する際にはより安心感がある。疼痛では通例、医薬（通常、鎮痛剤）と共に、あるいは原因を除去し、痛覚過敏を制御するための適切な手法とを同時処置する。急性疼痛を適切に処置しないと、時として慢性疼痛をもたらすことになる。
【０００８】
疼痛を処置するための一連の医薬が知られている。しかしながら、副作用及び耐性が公知の鎮痛剤に伴う共通の問題である。従って、米国成人のサーベイでは、疼痛が、人々が補足的な、そして代替的な医薬を用いる最も普通の原因であることが判明したことは驚くべきことではない。
【０００９】
このことによって、疼痛治療のための新規なアプローチ及び標的が依然として必要であることが証明されている。
【００１０】
驚くべきことに、Ｉｆｉ２０５が疼痛に関与していることが現在判明した。疼痛に関与している遺伝子の特定化のためのスクリーニングアッセイにおいて、疼痛感受性が異なる３種類の異なる近交系マウス系統が検討された。様々な遺伝子の発現はマウス系統の疼痛感受性と相関する。疼痛感受性と発現の間の最も良好な相関関係を示す遺伝子の中に、Ｉｆｉ２０５があった（実施例参照）。それ故、Ｉｆｉ２０５は疼痛に関係する化合物を識別するための、そして痛覚・痛覚過敏（algesia）を診断するための興味深い標的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、この発明は、第一及び第二の局面において、疼痛に関係する化合物を識別する方法であって、
ａ）Ｉｆｉ２０５核酸あるいはＩｆｉ２０５タンパク質、又はその機能的に活性な変異体を含む試験システム（test system）を備える工程、
ｂ）前記試験システムを試験化合物と接触させる工程、及び
ｃ）試験化合物の前記試験システムに対する作用を決定する工程、
を含んでなり、対照と比較して、試験化合物の前記試験システムに対する有意な作用が検出された場合に、試験化合物を疼痛に関係する化合物として識別することを特徴とする、前記識別方法を提供する。
【００１２】
この発明の第一局面は、Ｉｆｉ２０５核酸を含んでなる試験システムに関連し、そして第二局面はＩｆｉ２０５タンパク質又はその機能的に活性な変異体を含んでなる試験システムに関連する。
【００１３】
本発明の試験システムは、疼痛に関係するメカニズムを解明するために使用することができる。具体的には、この試験システムは疼痛に関係する、Ｉｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質と相互作用する、特にそれを活性化するか、あるいは不活性化する薬剤を創出し、識別し、及び／又は特性化するために使用することができる。識別された薬剤は、疼痛、特に神経障害性疼痛の処置において使用することができる興味深い治療薬である。あるいはまた、Ｉｆｉ２０５は痛覚過敏の診断に使用しうる。
【００１４】
この発明による試験システムが適応することができる種々の試験設計が当技術分野において知られている。例示的な試験に関する更なる詳細が本発明の方法において示されている。この試験システムは試験化合物の作用をこの試験システムによって決定するために使用することができる。当業者であれば、例えば、広く行なわれている方法に必要で、具体的な試験方法意図にふさわしい更なる薬剤を加えることによって、試験システムを設計することができるであろう。
【００１５】
Ｉｆｉ２０５核酸あるいはＩｆｉ２０５タンパク質又はその機能的に活性な変異体に加えて、本発明の試験システムは１つ又は複数の更なるコンポーネント（components）を含んでなることができる。試験設計及び検出方法に左右されるが、この試験システムは、例えば、公知のＩｆｉ２０５リガンド、Ｉｆｉ２０５シグナル伝達コンポーネント、検出手段などを含むことができる。当業者であれば、この試験システムを試験デザインに適合させることができ、すなわち、適切なバッファー、コファクター、基質、１つ又は複数の種々の抗体、マーカー、酵素あるいは他のあらゆる必要な薬剤を選択するであろう。この試験システムは広く行なわれている条件下にて、適宜、細胞系、又は無細胞系でありうる。
【００１６】
この発明の方法の第一工程では、Ｉｆｉ２０５核酸、例えば、Ｉｆｉ２０５遺伝子、又はＩｆｉ２０５ ｃＤＮＡ、又はＩｆｉ２０５ ｍＲＮＡ、又はＩｆｉ２０５プロモーター、又はＩｆｉ２０５タンパク質を含んでなる試験システムが提供される。
【００１７】
Ｉｆｉ２０５は、インターフェロン（ＩＦＮｓ）によって誘導される多数の遺伝子産生物の中の１つであり、細胞増殖、免疫調節、並びに腫瘍及びウイルス感染に対する宿主抵抗性の重要なレギュレーターである、タンパク質のインターフェロン誘導性ｐ２００（ＩＦＩ２００）ファミリーに属する。このタンパク質ファミリーのメンバーは、互いに相同性が高く、そしてＨＩＮファミリーに属する、Ｉｆｉ２０２ａ、Ｉｆｉ２０２ｂ、Ｉｆｉ２０３、Ｉｆｉ２０４、及びＩｆｉ２０５を含むいくつかのマウスタンパク質、並びにいくつかのヒトホモログ、Ｉｆｉ−１６、骨髄性細胞核分化抗原（ＭＮＤＡ）、アブセントインメラノーマ（absent in melanoma）（ＡＩＭ）２及びＩＦＩＸから成っている。マウスとヒトタンパク質の間の最も高い相同性は、Ｉｆｉ２０５とＭＮＤＡの場合に存在し、それは４４％の同一性を有する。Ｉｆｉ−２００タンパク質は、ファミリーメンバーの中で保存性が高く、ａドメインとｂドメインの２種類の形で存在する、保存されたＣ末端の２００アミノ酸相同領域の少なくとも１つのコピーを有する。この２００アミノ酸ドメインはいくつかの高度に保存された特徴を含む：ＭＦＨＡＴＶＡＴ（配列番号３）領域［これは、タンパク質−タンパク質相互作用、Ｒｂ−結合部位、推定されるＡＴＭ−リン酸化部位、及び推定されるサイクリン依存性キナーゼ２リン酸化部位にとって重要であると考えられる］。これまで、Ｉｆｉ２０２を除いて、Ｉｆｉ−２００タンパク質はすべて、アポトーシス及び炎症シグナル伝達経路の調節におけるタンパク質−タンパク質相互作用に関連する保存されたモチーフである、アポトーシス及びインターフェロン応答に関与するドメイン、（ＤＡＰＩＮ）／ＰＹＲＩＮドメインを有している。このｐ２００タンパク質は、Ｒｂ及びｐ５３などの複数の転写因子の活性と相互作用し、そしてそれらの活性をモジュレートする能力に基づく細胞周期調節及び分化にかかわっており、そしてそれらの遺伝子配座における突然変異を癌の発症率に結びつける有意な所見がある。
【００１８】
Ｉｆｉ２０５遺伝子は、増殖抑制作用を骨髄細胞増殖に及ぼすことによって、骨髄単球性細胞分化において重要な役割を演じている核タンパク質をコードしている。Ｉｆｉ２０５は、骨髄分化の間に造血幹細胞において誘導される。Ｉｆｉ２０５は、その活性がそのタンパク質結合ドメインによって媒介される強力な細胞増殖調節剤であるということが示唆されている。これはＩＬ−３依存性造血始原細胞増殖及び血清誘導性ＮＩＨ−３Ｔ３細胞増殖を阻害する。増殖阻害はアポトーシスプロセスを介して影響されない。これは、Ｉｆｉ−２００ファミリーの他のメンバーに存在し、場合によってはありうるタンパク質−タンパク質相互作用部位の存在を表すＰＡＡＤ／ＤＡＰＩＮ／ＰＹＲＩＮドメインを含む。このドメインは詳細に述べられている死ドメインと同じ６個のαヘリックスを含む折り畳み構造を有していると予想されている。死ドメインは、細胞死に関与しているＴＮＦＲ−１及びＦＡＳ／ＡＰＯ１レセプターに存在している。Ｉｆｉ２０５は、おそらく骨髄細胞系列中で転写制御因子として機能する。これによって、ｐ５３及びＲｂ依存性並びに非依存性経路を介して増殖が阻害される。
【００１９】
Ｉｆｉ２０５の呼称に入る２つの変異体がこれまで知られている。そのアミノ酸配列が下記に提示されている、変異体の１つに対する呼称は、“インターフェロン誘導性タンパク質２０５−Ａ（interferon inducible protein 205-A）”、“インターフェロン活性化タンパク質２０５−Ａ（interferon-activable protein 205-A）”、“ＩＦＩ２０５−Ａ”、“ｐ２０５”、“Ｄ３タンパク質（D3 protein）”、又は“Ｄ３ｃＤＮＡ”である。該当する遺伝子は“ｉｆｉ２０５”又は“ｉｆｉ２０５ａ”と呼ばれている。これは染色体１，９５．３ ｃＭ，サイトバンド Ｈ３（Chromosome 1, 95.3 cM, cytoband H3）上に位置している。このタンパク質は、分子量が約４５ｋＤａである４０４個のアミノ酸から構成されている［ＮＣＢＩ（（米国）国立バイオテクノロジー情報センター（National Centre for Biotechnology Information）から利用可能であるUniProtKB/Swiss-Prot Q8CGE8（IFI5A_MOUSE）及びNP_766236.2；（米国）医療図書館（National Library of Medicine）38A, Bethesda, MD20894, USA；www.ncbi.nih.gov参照），核酸配列NM_172648.3に該当する］。これはアミノ酸１〜８８にＤＡＰＩＮ領域、１つのモチーフＴＳＴＡＱＡ［Ｒ］、アミノ酸１９２〜３９２にＨＩＮ２００ドメイン、及び結合モチーフＭＦＨＡＴＶＡＴ（配列番号３）を含む。
【００２０】
【化１】
0005939994.tif 000002
【００２１】
第二の変異体は、“インターフェロン活性化タンパク質２０５−Ｂ（interferon-activable protein 205-B）”、“インターフェロン誘導性タンパク質ｐ２０５−Ｂ（interferon-inducible protein p205-B）”、“Ｉｆｉ−２０５−Ｂ”、“ＭＮＤＡ”、“Ｄ３タンパク質（D3 protein）”、“ｐ２０５”、及び“骨髄性細胞核分化抗原（myeloid cell nuclear differentiation antigen）”の呼称のもとで知られている。このタンパク質は、分子量がおよそ４７ｋＤａである４２５個のアミノ酸から構成されている（ＮＣＢＩから利用可能であるUniProtKB/Swiss-Prot Q08619（IFI5B_MOUSE）及びアクセション番号 Ｍ７４１２３．１参照）。この配列は、アミノ酸１〜８８にＤＡＰＩＮ領域、アミノ酸１２９〜１７７に７個のアミノ酸ＴＳＴＡＱＡ［ＧＲ］の４回の繰り返し、アミノ酸２１３〜４１３にＨＩＮ２００ドメイン、及び結合モチーフＭＦＨＡＴＶＡＴを含む。
【００２２】
【化２】
0005939994.tif 000003
【００２３】
Ｉｆｉ２０５の第二変異体を用いて行なった構造−機能研究によって、高度に保存されたタンパク質結合モチーフ（ＭＦＨＡＴＶＡＴ；配列番号３）を有しているＨＩＮ２００ドメインは、Ｉｆｉ２０５活性を媒介する際に重要な役割を演じていることが明らかにされた。いくつかの下記の不可欠な機能ドメインが特定化された：Ｎ末端に位置しているＤＡＰＩＮ／ＰＹＲＩＮドメイン、コイルド−コイル領域（これは増殖抑制活性に必要である）、２つのＲｂ結合部位、増殖抑制活性に必要であるドメイン内のＣ末端Ｒｂ結合ＬＸＣＸＥモチーフ、７個の残基ＴＳＴＡＱＡ［ＧＲ］の繰り返し領域の４回の繰り返しの配列、及び増殖抑制活性の関与している推定されるＡＴＭリン酸化部位。この部位におけるＡＴＭ依存性リン酸化は、タンパク質の安定性を高める働きをし、そしてＩＦＩ２０５によって誘導される細胞周期の停止を促進させることができる。この高度に保存されたタンパク質結合モチーフ（ＭＦＨＡＴＶＡＴ；配列番号３）は、Ｒｂ及び５３ＢＰなどの他のキーとなる転写制御エレメントとのＩｆｉ２０５の相互作用を促進する際、Ｉｆｉ２０５活性に不可欠でありうる。
【００２４】
その上、Ｉｆｉ２０５は、Ｒｂとｐ５３の複合体に見出すことができ、そしてｐ５３の転写活性を高めることができ、さらにＲｂによって制御されている標的遺伝子の発現に影響を与えうる。更にＩｆｉ２０５は、Ｒｂ及びｐ５３を欠いている細胞内で細胞増殖を抑制することができ、すなわちＲｂ及びｐ５３における突然変異を有する癌細胞の増殖を抑制する新規なメカニズムに相当しうる。
【００２５】
おそらく、細胞増殖及び増殖を制御するキーとなる転写因子に結合し、前記キーとなる転写因子の活性をモジュレートすることにより、Ｉｆｉ２０５がその増殖抑制作用を媒介するタンパク質−タンパク質相互作用は不可欠な手段であるように思われる。Ｉｆｉ２０５は、造血始原細胞が骨髄系列の拘束を受けるときに強力に発現される。おそらく、Ｉｆｉ２０５は骨髄単球性細胞分化の間に誘導され、そして細胞増殖停止を引き起こし、すなわち、始原細胞を分化させる。これはｐ５３及びＲｂ依存性及び非依存性経路を介して増殖を抑制する。
【００２６】
用語「Ｉｆｉ２０５」は、ハツカネズミ以外の種に起源する上記に説明した変異体及びホモログなどの自然的に発生する変異体を包含する。
【００２７】
非自然的に発生する変異体は、有限個のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換、特に、最大で、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換によって得ることができる。
【００２８】
この発明のＩｆｉ２０５の変異体は、変異体がその生物学的機能、例えば、疼痛への関与（例えば、疼痛表現型“機械的痛覚過敏（mechanic hyperalgesia）”の発現）、又は補体古典経路を維持しているという点から、機能的に活性な変異体であるということは留意すべきことである。好ましくは、生物学的機能の維持は、自然的に発生するＩｆｉ２０５の活性の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％又は９０％、更により好ましくは９５％を有しているものと定義される。生物学的活性は当業者に知られているように決定することができる。例えば、疼痛表現型“機械的痛覚過敏（mechanic hyperalgesia）”の発現は、実施例中、及びPersson et al., 2009, Molecular Pain 5:7中に詳述されているように決定することができる。
【００２９】
変異体は、更なるコンポーネントを含むために修飾することができる。従って、この変異体は、本明細書で詳述したように自然的に発生するＩｆｉ２０５タンパク質又はその変異体から成るドメイン及び少なくとも１つの更なるコンポーネントを有する分子でありうる。１つの好ましい実施形態では、変異体は、（ｉ）Ｉｆｉ２０５タンパク質又は機能的に活性な変異体、及び（ｉｉ）更なるタンパク質コンポーネントを含んでなる融合タンパク質でありうる。例えば、このタンパク質は、精製目的のために使用されるタグ（例えば、６Ｈｉｓ（又はＨｅｘａＨｉｓ）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）などのマーカーと結合することができる。例えば、高度に精製されたＩｆｉ２０５タンパク質又は変異体が必要である場合には、２つ又は多数のマーカー（例えば、上記のマーカー又はタグの組み合わせ）を使用することができる。この場合には、タンパク質は、２回又はそれより多い分離クロマトグラフィー工程で精製され、各場合において第一と次いで第二のタグの親和性を利用する。こうしたダブル又はタンデムタグ（tandem tags）の例には、ＧＳＴ−Ｈｉｓタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをポリヒスチジンタグに融合させた）、６×Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ（６個のヒスチジン残基をＳｔｒｅｐタグに融合させた）、６×Ｈｉｓ−タグ１００−タグ（６個のヒスチジン残基を哺乳類ＭＡＰキナーゼ２の１２個のアミノ酸タンパク質に融合させた）、８×Ｈｉｓ−ＨＡ−タグ（８個のヒスチジン残基をヘムアグルチニンエピトープタグに融合させた）、Ｈｉｓ−ＭＢＰ（Ｈｉｓタグをマルトース結合タンパク質に融合させた）、ＦＬＡＧ−ＨＡタグ（ＦＬＡＧタグをヘムアグルチニンエピトープタグに融合させた）、及びＦＬＡＧ−Ｓｔｒｅｐタグがある。マーカーはタグタンパク質を検出するために使用することができ、そこでは特異抗体が使用されうる。適切な抗体には、抗ＨＡ抗体（例えば、１２ＣＡ５又は３Ｆ１０）、抗６−Ｈｉｓ抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体及び抗ＧＳＴ抗体が挙げられる。更に、このＩｆｉ２０５タンパク質は、蛍光マーカー又は放射性マーカーなどの異なったカテゴリーのマーカーに連結することができ、これによってＩｆｉ２０５の検出が可能になる。更なる実施形態では、Ｉｆｉ２０５は、融合タンパク質の一部分であることができ、その場合、酵素活性を有するタンパク質コンポーネントなどの第二部分は検出のために使用することができる。
【００３０】
この発明の別の実施形態では、Ｉｆｉ２０５変異体は、その断片が依然として機能的に活性であるＩｆｉ２０５断片でありうる。これには、短い内部領域及び／又はＣ及び／又はＮ末端領域の欠失（例えば、最大で、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の欠失）Ｉｆｉ２０５タンパク質が含まれうる。これに加えて、Ｉｆｉ２０５断片はＩｆｉ２０５タンパク質の場合に上記に詳述したように更に修飾することができる。
【００３１】
これに代わって、あるいはこれに加えて、上記に述べたようなＩｆｉ２０５タンパク質又はその変異体は、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むことができる。しかしながら、アミノ酸が化学的に関連のあるアミノ酸と置換される半保存的及び特に保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸のうちで、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のうちで、酸性残基を有するアミノ酸のうちで、アミド誘導体のうちで、塩基性残基を有するアミノ酸のうちで、又は芳香族残基を有するアミノ酸のうちでなされる。典型的な半保存的及び保存的置換は以下である：
【００３２】
アミノ酸      保存的置換               半保存的置換
Ａ            Ｇ；Ｓ；Ｔ               Ｎ；Ｖ；Ｃ
Ｃ            Ａ；Ｖ；Ｌ               Ｍ；Ｉ；Ｆ；Ｇ
Ｄ            Ｅ；Ｎ；Ｑ               Ａ；Ｓ；Ｔ；Ｋ；Ｒ；Ｈ
Ｅ            Ｄ；Ｑ；Ｎ               Ａ；Ｓ；Ｔ；Ｋ；Ｒ；Ｈ
Ｆ            Ｗ；Ｙ；Ｌ；Ｍ；Ｈ       Ｉ；Ｖ；Ａ
Ｇ            Ａ                       Ｓ；Ｎ；Ｔ；Ｄ；Ｅ；Ｎ；Ｑ
Ｈ            Ｙ；Ｆ；Ｋ；Ｒ           Ｌ；Ｍ；Ａ
Ｉ            Ｖ；Ｌ；Ｍ；Ａ           Ｆ；Ｙ；Ｗ；Ｇ
Ｋ            Ｒ；Ｈ                   Ｄ；Ｅ；Ｎ；Ｑ；Ｓ；Ｔ；Ａ
Ｌ            Ｍ；Ｉ；Ｖ；Ａ           Ｆ；Ｙ；Ｗ；Ｈ；Ｃ
Ｍ            Ｌ；Ｉ；Ｖ；Ａ           Ｆ；Ｙ；Ｗ；Ｃ；
Ｎ            Ｑ                       Ｄ；Ｅ；Ｓ；Ｔ；Ａ；Ｇ；Ｋ；Ｒ
Ｐ            Ｖ；Ｉ                   Ｌ；Ａ；Ｍ；Ｗ；Ｙ；Ｓ；Ｔ；Ｃ；Ｆ
Ｑ            Ｎ                       Ｄ；Ｅ；Ａ；Ｓ；Ｔ；Ｌ；Ｍ；Ｋ；Ｒ
Ｒ            Ｋ；Ｈ                   Ｎ；Ｑ；Ｓ；Ｔ；Ｄ；Ｅ；Ａ
Ｓ            Ａ；Ｔ；Ｇ；Ｎ           Ｄ；Ｅ；Ｒ；Ｋ
Ｔ            Ａ；Ｓ；Ｇ；Ｎ；Ｖ       Ｄ；Ｅ；Ｒ；Ｋ；Ｉ
Ｖ            Ａ；Ｌ；Ｉ               Ｍ；Ｔ；Ｃ；Ｎ
Ｗ            Ｆ；Ｙ；Ｈ               Ｌ；Ｍ；Ｉ；Ｖ；Ｃ
Ｙ            Ｆ；Ｗ；Ｈ               Ｌ；Ｍ；Ｉ；Ｖ；Ｃ
【００３３】
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＹからＣへの変更は、新規なシステインが遊離のチオールのままである場合には、半保存的である。更に、当業者であれば、立体的要求がなされる位置ではグリシンは置換されるべきではないこと、そしてＰは、αヘリックス又はβシート構造を有するタンパク質の部分に導入されるべきではないことを理解するであろう。
【００３４】
置換を有するＩｆｉ２０５タンパク質又は断片又は変異体は、Ｉｆｉ２０５タンパク質又は断片又は変異体の場合の上記の詳述と同様に修飾することができる。本発明の下記の説明では、Ｉｆｉ２０５タンパク質に関して示されているすべての詳細な内容はまた、別途記載のない限り、機能的に活性であるその変異体にも関連している。
【００３５】
Ｉｆｉ２０５タンパク質の上記の修飾は、組み合わせることが可能であることが注目される。この発明の変異体は、例えば、それに融合させたマーカーを有しているＩｆｉ２０５の断片、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換を含むＩｆｉ２０５タンパク質断片でありうる。
【００３６】
しかしながら、最も好ましくは、Ｉｆｉ２０５タンパク質は、上記に詳述したような自然的に発生するＩｆｉ２０５タンパク質であり、更により好ましくは、自然的に発生するヒトＩｆｉ２０５タンパク質である。
【００３７】
用語「Ｉｆｉ２０５核酸」は、上記のＩｆｉ２０５タンパク質、並びに自然的に発生する、及び非自然的に発生するその変異体（本明細書中に定義されている）を目的としてコーディングされている核酸を包含する。好ましくは、この用語は、Ｉｆｉ２０５遺伝子のコーディング領域又は非コーディング領域に関連し、その場合、こうしたセクションはその遺伝子に特異的であるために適切なサイズである。そうした領域の例にはイントロン、エクソン又はＩｆｉ２０５プロモーターなどの制御エレメントがある。
【００３８】
最も好ましいＩｆｉ２０５核酸は、上記に詳述したように自然的に発生するＩｆｉ２０５タンパク質、更により好ましくは、配列番号１のＩｆｉ２０５の自然的に発生するヒトホモログをコーディングしている。この核酸は、細胞内で遺伝情報又は形態構造を持っている、モノマーであるヌクレオチドの鎖から構成される任意のマクロ分子でありうる。最も一般的な（そしてそれ故、好ましい）核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。最も好ましくは、用語「Ｉｆｉ２０５核酸」は、Ｉｆｉ２０５遺伝子、プロモーター、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに関連する。
【００３９】
人工核酸には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。こうしたものはそれぞれ、分子の骨格の変化によって自然的に発生するＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。
【００４０】
この発明の方法の第二工程では、Ｉｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質又はその機能的に活性な変異体を含んでなる試験システムを、試験システムに対して作用を及ぼし、そしてそれを検出するのに適切な時間及び条件下にて、薬剤又は試験化合物と接触させる。
【００４１】
適切な条件は、例えば、必要なタンパク質の変性を回避し、又は、存在する場合には生存可能な細胞を維持するための適切な温度及び溶液を含む。適切な条件は選択される具体的な試験システムに依存するであろうし、そして当業者であれば、かれらの一般的知識に基づいて適切な条件を選択することができるであろう。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間の範囲で変化する可能性があり、好ましくは、約５分〜約２４時間の範囲で変化する。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイ形式、マーカー、溶液の量、濃度などに左右されるであろう。このアッセイは、１０℃〜４０℃のような温度範囲を超えて行なってもよいが、通例、周囲温度で行なわれる。
【００４２】
この発明の試験システムを用いて試験される薬剤は、任意の化学的性質の任意の試験物質（test substance）であってもよいし、又は試験化合物（test compound）であってもよい。薬物として、それとも疾患の薬剤として既に知られていてもよい。あるいは、別の実施形態では治療作用を有していることがまだ知られていない公知の化学化合物であってもよく、そしてこの化合物は新規であってもよいし、それともこれまで知られていない化学化合物であってもよい。この薬剤はまた、試験物質（複数を含む）又は試験化合物（複数を含む）の混合物であってもよい。
【００４３】
この発明のスクリーニング方法の一実施形態では、試験物質が化学化合物ライブラリーの形で提供される。化学化合物ライブラリーは、複数の化学化合物を含み、そして、化学合成分子又は天然物を含めて多くのあらゆる供給源から集められ、あるいはコンビナトリアルケミストリー手法によって生成されている。これらはハイスループットスクリーニングに特に適しており、そして特定の構造の化学化合物、あるいは植物などの特定の有機体の化合物から構成されうる。この発明の文脈では、化学化合物ライブラリーは、好ましくは、タンパク質及びポリペプチド又は有機小分子を含むライブラリーである。好ましくは、有機小分子は、サイズが５００ダルトン未満であり、特に可溶性であり、非オリゴマーである有機化合物である。
【００４４】
この発明の方法の第三工程では、試験化合物の試験システムに対する作用を検出する。下記において、一連の種々の検出システムがより詳細に述べられるであろう。しかしながら、こうしたものは例示的なものであり、そして他の試験システム及び方法もまた適切でありうることが理解されるべきである。
【００４５】
試験化合物が試験システムに対して特異的であり、かつ有意な作用を有する場合には、この試験化合物は疼痛に関係する化合物として識別される。この場合には、試験化合物の作用は対照、特に陰性対照と比較される。
【００４６】
対照は、それらが想定外の影響（例えば、バックグラウンドシグナル）を除去し、又は最小にすることができるので試験方法の一部分である。対照実験は可変部分の特定の系に対する作用を検討するために使用される。対照実験では、１セットの試料は修飾され（又は修飾されていると思われる）、そして他のセットの試料は、無変化（陰性対照）を示すと予想されるか、又は明確な変化（陽性対照）を示すと予想される。対照は試験物質と共に１つの試験の実施において決定することができる。これは試験化合物の作用を決定する前又は後に決定することができるか、あるいは公知の値である場合もありうる。
【００４７】
試験システムに対する作用を有する試験化合物は、試験システムシグナルを変化させ、増加させ、あるいは減少させる結果となりうる。この発明の文脈では、試験化合物と接触させた試験システムが対照（例えば、試験化合物と接触させない試験システム）のそれと比較して有意により低いか、より高いシグナルを生じる場合には、この試験化合物は対照と比較して作用を有するものとする。当技術分野の当業者であれば、２つの値が互いに有意に異なっているか否かを評価する統計的手順［例えば、スチューデントのｔ検定（Student's t-test）又はカイ二乗検定（chi-square tests）］を知っている。更に、当業者はどのように適切な対照を選択するかを知っている。
【００４８】
好ましい実施形態では、この試験システムのシグナルは、対照、陽性対照又は陰性対照のどちらかの少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、そして最も好ましくは、少なくとも９０％分、試験化合物によって変動する。
【００４９】
本発明の方法の場合、任意の適切な検出方法を使用することができる。適切な方法は、この試験システム及び試験される薬剤の特性に応じて選択することができる。
【００５０】
この方法は、ヘテロジニアス(Heterogeneous）アッセイであっても、それともホモジニアス（homogeneous）アッセイであってもよい。本明細書中で使用される際は、ヘテロジニアスアッセイは、１回若しくは複数回の洗浄工程を含み、一方、ホモジニアスアッセイでは、こうした洗浄工程は必要ない。試薬及び化合物は単に混合し測定するだけである。
【００５１】
この試験方法は、連続的アッセイであってもよいし、又は非連続的アッセイであってもよい。連続的アッセイは、更なるワーキングが必要でない反応速度を与える。連続的アッセイには多くの異なる種類がある。分光光度計によるアッセイ（spectrophotometer assays）では、反応過程は吸光度の変化を測定することによって追跡する。蛍光は分子が異なる波長の光を吸収した後、１つの波長の光を放出するときに存在する。蛍光測定アッセイは、生成物からの基質の蛍光の差異を使用して酵素反応を測定する。こうしたアッセイは、一般的に、分光光度計によるアッセイと比較してはるかに高感度であるが、しかしながら、不純物によって引き起こされる干渉、及び光に曝露されるとき多くの蛍光化合物の不安定性を被る可能性がありうる。熱量法は、化学反応によって放出され、又は吸収された熱の測定である。こうしたアッセイは、熱のある程度の変化が必要である反応が多く、そして微量熱量計を用いると酵素又は基質があまり多く必要でないので極めて一般的である。こうしたアッセイは、他のいずれかの方法ではアッセイが不可能である反応を測定するのに使用することができる。化学発光は化学反応による光の放出である。いくつかの酵素反応では光が出現し、そしてこれを測定し生成物形成を検出することができる。こうした種類のアッセイは、出現する光が数日から数週間にわたって写真フィルムによって捕捉することができるので極度に感受性を示しうるが、しかしながら、反応によって放出される光のすべてが検出されるわけではないので定量化することが困難でありうる。静的光散乱は、溶液中のマクロ分子の重量平均モル質量及び濃度の生成物を測定する。測定時間にわたって１つ又は複数の種の一定の総濃度を考慮すると、散乱シグナルは、溶液の重量平均モル質量の直接測定であり、これは、複合体形態又は解離によって変化するであろう。それ故、この測定によって複合体並びに反応速度の化学量論比が定量化される。タンパク質動態の光散乱アッセイは、酵素を必要としない極めて一般的な手法である。
【００５２】
非連続的アッセイは、試料が間隔をおいて酵素反応から取り出され、そして生成物産生又は基質消費の量がこうした試料中で測定されるときに使用される。放射アッセイは放射能の基質への取り込み、又は基質からのその放出を測定する。こうしたアッセイにおいて最も頻繁に使用される放射性同位体は、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ及び125Ｉである。放射性同位体は基質の単一原子を特異的に標識することを可能にしうるので、こうしたアッセイは極めて感受性があり、かつ特異的である。これらは生化学において頻繁に使用され、そして粗抽出物における特異的反応を測定する唯一の方法であることがしばしばある。クロマトグラフィーアッセイはクロマトグラフィーによって反応混合物をそのコンポーネントに分離することによって生成物の生成を測定する。これは通例、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってなされるが、薄層クロマトグラフィーのより簡単な手法を使用することもできる。このアプローチには多くの材料が必要でありうるが、その感受性は、基質／生成物を放射性又は蛍光タグを用いて標識することによって増大させることができる。
【００５３】
この発明によれば、試験化合物の作用をＩｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質との相互作用によって行なうことができる。従って、試験化合物のＩｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質への相互作用／結合は、（ｉ）Ｉｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質と、（ｉｉ）試験化合物の複合体を検出することによって決定することが可能である。２つ又はそれより多いコンポーネントの複合体を検出する適切な方法は、下記に詳述されている。
【００５４】
あるいは、試験化合物の作用［例えば、結合］、及びＩｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質に対する影響は間接的に検出することができる。この場合には、Ｉｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質の下流の作用を検出することができる。例えば、Ｉｆｉ２０５に関連する転写及び翻訳に対する作用を決定することができる。一実施形態では、Ｉｆｉ２０５ ｍＲＮＡ又はＩｆｉ２０５タンパク質の量が検出される。
【００５５】
特定のタンパク質又は他の核酸の存在又は量を測定するように設計されている多くの知られている検出方法は、タグ、マーカー又は標識の使用に左右される。この試験システム又は試験化合物のコンポーネントは、種々の方法で標識して十分な検出又は精製を可能にすることができる。１つの好ましい実施形態では、検出可能なマーカーは、この試験システムに対する作用を検出するために使用される。この場合には、（ｉ）核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質、（ｉｉ）試験化合物及び／又は（ｉｉｉ）この試験システムの更なるコンポーネントを、少なくとも１つの検出可能なマーカーを用いて標識することができる。
【００５６】
通常の標識方法は、コンポーネントの１つ又は複数の官能基を標識するために使用することができる。タンパク質の場合には、こうしたことは、例えば、各ポリペプチド鎖のＮ末端及びリシン残基の側鎖に存在する第１級アミノ基；ジスルフィド結合を還元剤で処理するか、又はリシン残基をスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの試薬で修飾することによって利用可能にしたシステイン残基上に存在するスルフヒドリル基；又は、通例、抗体のＦｃ領域中に存在する炭水化物基［該炭水化物基は、酸化されて、カップリングのための活性なアルデヒドを創成することができる］でありうる。このコンポーネント又は化合物は、ビオチン（アビジン−ビオチン化学のため）、酵素、アミン、スルフヒドリル又は他の官能基標識のための活性化蛍光色素［例えば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素又はアレクサフルオロ（Alexafluos）を加える］などの一連の種々の薬剤を用いて標識することができる。3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ又は14Ｃなどの放射性標識、並びにペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを含む一般的な酵素標識もまた用いることができる。
【００５７】
この発明の一実施形態では、マーカーは、放射標識、特に、3Ｈ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、又は14Ｃである。
【００５８】
別の実施形態では、マーカーは、１つ又は複数の蛍光マーカーである。適切な蛍光マーカーは、この発明の方法の文脈中に述べられている。
【００５９】
こうした方法においては、その化学タグ、マーカー又は標識を介して検出可能である標的特異的プローブの使用が特に有用である。抗体は最も一般的な種類のプローブである；特定の抗原に対するそれらの結合親和性はそうした標的が複合体試料（complex sample）中に“見出され（found）”、そして検出されることを可能にする。しかしながら、抗体はそれ自身タンパク質であり、それらが可視化のために標識されていないか、あるいは二次的に標識されている別の分子でプローブされていない場合には、それらはアッセイ系中で特異的に検出可能ではない。
【００６０】
マーカー（又はタグ又は標識）は、別の物質又は物質の複合体の存在を指摘することができるあらゆる種類の物質である。このマーカーは、検出される物質に連結するか、あるいは検出される物質中に取り込まれている物質でありうる。検出可能なマーカーは、例えば、タンパク質、酵素反応の産生物、第二メッセンジャー（second messenger）、ＤＮＡ、分子の相互作用などを検出するために分子生物学及び生物工学で使用される。適切なマーカー又は標識の例には、蛍光団、発色団、放射標識、金属コロイド、酵素、又は化学発光若しくは生物発光分子が含まれる。蛍光団の例には、フルオレセイン、ローダミン、及びスルホインドシアニン色素Ｃｙ５が含まれる。放射標識の例には、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、99mＴｃ又は125Ｉが含まれる。酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、及びウレアーゼが含まれる。更なる例及び好ましい実施形態は本明細書中に詳述されている。
【００６１】
異なるタイプの化学標識又はタグは二次抗体又は一次抗体及び他の分子にコンジュゲートし、様々な方法によるそれらの可視化（すなわち、検出及び測定）を容易にすることができる。放射性同位体は過去には広範囲に使用されていたが、こうしたものは高価であり、シェルフライフが短く、シグナルの改善がなく：ノイズ比率、そして特別な取り扱い及び処理が必要である。酵素及び蛍光団が、アッセイのための検出可能なタグとして、放射性同位体に大幅に取って代わってきている。試薬及び機器のいくつかの進歩によって、こうしたより新しい技術を、より汎用性があり、かつ有力にさせている。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素タグは、ブロッティング、免疫学的アッセイ、及び免疫組織化学方法の場合に最も一般的に使用される。蛍光タグは細胞イメージング、核酸増幅及びシークエンシング及びマイクロアレイ（microarrays）の場合に主に使用されている；しかしながら、蛍光技術はあらゆるタイプのアッセイにおける応用のために急速に発展している。
【００６２】
タンパク質を検出するには、特定の抗体の使用がしばしば必要となる。従って、Ｉｆｉ２０５タンパク質又はその変異体の検出は、特定のＩｆｉ２０５抗体を含みうる。Ｉｆｉ２０５に対する抗体は、商業上の供給者から入手可能でありうるか、又は当業者に周知の標準的な手順（例えば、ハイブリドーマ手法を用いて）によって作成することができる。あるいは、抗体は、調製された抗原の形態を用い、免疫化動物のために十分に確立された手法を使用して調達することができる。種々の試薬が利用可能であり、抗体生成及び精製に役立ち、そして種々の会社が抗体作成サービスを専門にしている。果たすべき適用次第であるが、異なったレベルの純度及び特異性の種類が一次抗体の供給に必要である。ごくわずかの限定要素（parameters）をあげると、抗体はモノクローナルであってもよいし、それともポリクローナルであってもよく、抗血清、又はアフィニティー精製溶液として供給され、そして天然タンパク質検出、あるいは変性タンパク質検出の妥当性が検証される。
【００６３】
標的抗原、本件ではＩｆｉ２０５又はその断片を認識する抗体は、“一次抗体（primary antibody）”と呼ばれる。この抗体を、タグを用いて標識する場合には、この抗原の直接検出が可能である。しかしながら、通例、直接検出の場合にはこの一次抗体は標識されない。その代わり、検出可能なタグで標識された“二次抗体（secondary antibody）”を、標的抗原に結合している一次抗体プローブする（probe for the primary antibody）第二工程中で加える。すなわち、この抗原は間接的に検出される。間接的検出の別の形態では、ビオチンのようなアフィニティータグで標識されている一次又は二次抗体を用いることが必要である。次いで検出可能な酵素又は蛍光団タグで標識したストレプトアビジンのような二次（又は三次）プローブを、ビオチンタグプローブするのに使用し、検出可能なシグナルを生じさせることができる。こうしたプロービングのいくつかの変異体及び検出ストラティジーが存在する。しかしながら、１つ１つは特異的プローブ（例えば、一次抗体）に左右され、その存在は直接又は間接的に、ある種の測定可能なタグ（たとえば、その活性が、その基質と反応して着色生成物をもたらすことができる酵素）に連結する。
【００６４】
通例、検出可能な標識のない一次抗体及びある種の二次（間接的）検出法が、アッセイ方法の中で必要である。それにもかかわらず、ほとんどすべての抗体は、必要に応じて、ビオチン、ＨＲＰ酵素又はいくつかの蛍光団の１つで標識することができる。大抵の一次抗体はマウス、ウサギ又は他のいくつかの種の１つで作成される。ほとんどすべてのこうしたものはＩｇＧクラスの抗体である。それ故、製造業者が、大部分の利用及び検出システムのためにすぐに使用できる標識二次抗体を作成し、供給することは比較的簡単であり、かつ経済的である。然れども、純度レベル、ＩｇＧ及び種特異性、並びに検出標識の点で異なる、数百のオプションが利用可能である。二次抗体の選択は、一次抗体が調達される動物種（宿主種）に左右される。例えば、一次抗体がマウスモノクローナル抗体である場合には、二次抗体はマウス以外の宿主から得られた抗マウス抗体である必要がある。
【００６５】
プローブとしてのビオチン結合タンパク質である場合には、ビオチンと、アビジン若しくはストレプトアビジンタンパク質の間の高度に特異的なアフィニティー相互作用が、多くの種類の検出及びアフィニティー精製方法のベースである。ビオチンは極めて小分子（２４４ダルトン）であるので、抗体又は他のプローブとの共有結合はそれらの機能をめったに妨げない。それにもかかわらず、プローブ上での標識としてのその存在は、アビジン又はストレプトアビジンを用いる、効率的で、かつ特異的である二次検出を可能にする。双方の種類のビオチン結合タンパク質が、多くの種類のアッセイ系での検出を可能にする酵素又は蛍光タグで標識された精製形態中で利用可能である。
【００６６】
酵素標識は、ブロッティング及び免疫アッセイで検出のための二次抗体（又はストレプトアビジン）タグとして最も一般的に使用されている。酵素はそれらの活性を介して検出可能なシグナルを提供する；特定の基質との化学反応が、着色した光を放出する、又は蛍光生成物を生ぜしめる。β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼのようなレポーター酵素はプローブを作成するために成功裡に使用されてきたが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、タンパク質検出のための標識として最も広範に使用されている２つの酵素である。数多くの発色性、蛍光性、及び化学発光性の基質が、どちらでも任意の酵素を用いて使用するために利用可能である。
【００６７】
通常、仔牛の腸から単離されるアルカリホスファターゼは、大きい（１４０ｋＤａ）タンパク質であり、基質分子からのホスファート基の加水分解を触媒し、その結果、着色した、又は蛍光を発する生成物を生じさせ、あるいはこの反応の副産物として光を放出する。ＡＰは、塩基性ｐＨ（ｐＨ ８〜１０）で最適な酵素活性を有し、そしてシアン化物、アルセネート（arsenate）、無機ホスファート及びＥＤＴＡなどの２価カチオンキレート剤によって阻害されうる。ウェスタンブロットの場合の標識として、ＡＰは他の酵素を上回る明確な利点を提供する。その反応速度は直線性を維持するので、検出感度を、単に反応をより長い間にわたって進行させることによって改善することができる。
【００６８】
西洋ワサビペルオキシダーゼは４０ｋＤａのタンパク質であり、過酸化水素による基質の酸化を触媒し、その結果、着色した、又は蛍光を発する生成物を生じさせ、あるいはこの反応の副産物として光を放出する。ＨＲＰは、ｐＨが中性付近で最適に機能し、そしてシアン化物、スルフィド及びアジドによって阻害されうる。抗体−ＨＲＰコンジュゲートは、酵素及び抗体の双方の特異的活性に対して抗体−ＡＰコンジュゲートよりも優れている。これに加えて、その高いターンオーバー率、優れた安定性、低コスト及び広範囲の基質の利用性によって、ＨＲＰは大抵の利用の場合に選択する酵素となっている。ＨＲＰ酵素の小さなサイズ故に、ポリ−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いることによって更なる感度の増加を実現することができ、そしてかなりの研究者にＡＢＣタイプ増幅系を用いる必要性を除去することを可能にしている。
【００６９】
検出のための蛍光標識は、歴史的には、蛍光顕微鏡を用いて、流動細胞計測法（ＦＣ）、蛍光活性化−細胞選別法（ＦＡＣＳ）及び免疫組織化学（ＩＨＣ）などの少数の細胞生物学利用において用いられてきた。最近まで、プローブを標識する２つの最も一般的な蛍光団は、フルオレセイン（フルオレセイン・イソチオシアネート，ＦＩＴＣ）及びローダミン（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン，ＴＲＩＴＣ）であった。他の標識には、種々の形態の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質（アロフィコシアニン、フイコシアニン、フィコエリトリン及びフィコエリトロシアニン）などの蛍光タンパク質が含まれる。蛍光タンパク質は、検出のための高蛍光シグナルを生み出す能力を有するが、コンジュゲーション目的のために最適化することが困難でありえ、そして結合アッセイにおいて、立体障害又はバックグラウンドのシグナルの問題を発生させる場合がありうる。
【００７０】
ブロッティング及び免疫アッセイにおいて蛍光団コンジュゲートプローブの使用は、実施するために基質を展開する工程がないので、酵素標識の使用と比較して必要な工程はより少ない。蛍光検出は、プロトコールはより短いが、特別な装置を必要とし、その感度は酵素化学発光系で得ることができるほど高くない。酵素検出ほどの感度ではないけれども、蛍光検出法では化学廃棄物が減少し、そして多重適合性（multiplex compatibility）（同じ実験において１つより多い蛍光団を用いる）という付加的な利点を有する。
【００７１】
これに代わって、あるいはこれに加えて、２つの物質［例えば、試験化合物又は公知のＩｆｉ２０５リガンド及びＩｆｉ２０５タンパク質］の近接性（proximity）を検出するために、２つのマーカーを使用することができる。これらのマーカーは、例えば、１つの放射性又は蛍光性マーカーと、１つのシンチレータでもよく（例えば、シンチレーション近接アッセイの場合）、あるいは２つの蛍光マーカーを使用することもできる（例えば、ＦＲＥＴの場合）。一実施例では、Ｉｆｉ２０５タンパク質及び試験物質は第一及び第二マーカーで標識することができる。試験物質がタンパク質に結合し、それ故、標識が非常に近接している場合には、エネルギーは第一から第二の標識に移動することができ、従って、Ｉｆｉ２０５タンパク質と試験物質の相互作用を検出することができる。この試験は、公知のＩｆｉ２０５リガンドが標識の１つを担持している競合結合試験として設計することができる。
【００７２】
適切なマーカーの組み合わせの例には以下が含まれる：
−イットリウム珪酸塩又はポリビニルトルエンなどのシンチレータと組み合わせた放射標識、3Ｈ、33Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、125Ｉ［例えば、微粒子で仕切られる］又は
−ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミン ｘ イソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユーロピウム、テルビウム）などのアクセプター蛍光マーカーと組み合わせた、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエロー ＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル １−ピレンブチレート（succinimdyl 1-pyrenbutyrate）、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体などのドナー蛍光マーカー。
【００７３】
抗体による検出に代わる手段として、本発明の方法は、競合結合実験として設計することができ、そこで公知のＩｆｉ２０５リガンドの結合が試験化合物によってＩｆｉ２０５から退去することが検討される。公知のリガンドがタンパク質から順調に退去することは、試験物質がタンパク質に結合することを示すインジケーターである。このアプローチでは、公知のＩｆｉ２０５リガンドを標識し、これによって多数の試験化合物（例えば、ライブラリーの）を好都合に試験することを可能にする［この結果、試験化合物のそれぞれが標識される必要はないことになる］ことが有利である。
【００７４】
リガンドは、生体分子と結合して、そして生体分子と複合体を形成することができる物質であり、本明細書中では、該生体分子は、例えば、Ｉｆｉ２０５タンパク質又は核酸である。これは生体分子上の部位に、イオン結合、水素結合及びファンデルワールス力などの分子間力によって結合する分子である。このドッキング（結合：association）は通例、可逆的（解離：dissociation）である。リガンドとその標的分子の間の現実の不可逆的な共有結合は、生物系では稀である。生体分子へのリガンド結合は、その活性、例えば、シグナル伝達下流（downstream signal transduction）を活性化する能力を変更することができる。リガンドは、インヒビター及びアクティベーターを含む。
【００７５】
インヒビターは酵素に結合し、そしてそれらの活性を減少させる分子である。酵素の活性をブロッキングすることは代謝インバランスを修正することができるので、酵素インヒビターである薬物が多い。酵素に結合するすべての分子がインヒビターであるわけではない；酵素アクティベーターは酵素に結合し、そして酵素活性を増加させる。
【００７６】
インヒビターの結合は、結合パートナーが生体分子と相互作用するのを妨げ、及び／又は生体分子が活性であるか、又は活性化されるのを妨げる。インヒビターの結合は、可逆的であるか、それとも不可逆的である。不可逆的なインヒビターは通例、生体分子と反応し、そしてそれを化学的に変化させる。こうしたインヒビターは、例えば、活性に必要であるキーとなるアミノ酸残基を修飾することができる。対照的に、可逆的インヒビターは非共有結合によって結合し、そして異なるタイプのインヒビターはこうしたインヒビターが生体分子に結合するか否かに応じて生じる。
【００７７】
選択的リガンドは、酵素のような非常に制限されたタイプの標的（生体分子）に結合する傾向を有し、一方非選択的リガンドはいくつかのタイプの標的に結合する。これは薬理学において重要な役割を演じており、そこで非選択的である薬物は、それらは所望の作用を生じるものに加えて他のいくつかの生体分子に結合するので、より多くの副作用を有する傾向がある。
【００７８】
競合結合試験の場合には、公知のリガンドを少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識し、そしてｂ）のインキュベーション工程に加える。工程ｂ）の後、結合した標識リガンドを非結合リガンドから分離する。この分離は、ろ過、遠心分離、固定化、相分離及び液体の除去などの一般的な分離工程によってなされうる。標識によって提供されたシグナルの量は、結合したリガンドの量を示しており、それ故、また、リガンドと試験化合物は生体分子への結合を得るために争うので、生体分子に結合した試験化合物の量をも示している。
【００７９】
一実施形態では、試験化合物の作用を検出のためのアッセイは、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、又はＦＰ（蛍光偏光）アッセイである。
【００８０】
ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）は、生化学スクリーニングのために使用される均一系において広範囲のプロセスの迅速であり、かつ感受性を有する測定を生物学的に可能にする技術の一種である。ＳＰＡにかかわるビーズのタイプは、寸法、及びビーズ自身の内部は微視的であり、それが刺激されたときに光を放出するシンチラントが存在する。刺激は、放射標識分子がビーズと相互作用するときに生じる。この相互作用は、ビーズが光を放出するのを誘発することになり、それはシンチレーションカウンターを用いて検出することができる。
【００８１】
より詳細には、放射標識分子がビーズに結合するか、あるいはビーズに近接している時、発光が促進される。しかしながら、このビーズが放射標識分子によって結合しない（unbounded）ままになっている場合には、ビーズは光を放出するように刺激されないであろう。これは、ＳＰＡビーズから過度に離れているときには、結合しなかった（unbounded）放射能から放出されるエネルギーがあまりにも無軌道（dissolute）であるという事実に起因しており、それ故、このビーズはシグナルを生み出すために刺激されない。
【００８２】
トリチウムはＳＰＡに大変よく適合するので高く推奨される。これは、水中で(through
water)非常に短い１．５μｍの路程であることによる。従って、β粒子がシンチラントビーズを含む１．５μｍの特定の範囲内であるとき、シンチラントビーズを刺激して、光を放出するのに十分なエネルギーが存在する。１．５μｍより大きい距離がある場合には、このβ粒子は十分なエネルギーがないので、ビーズを刺激するのに必要な距離を移動することができない。また、この方法を酵素アッセイ、及び放射免疫アッセイのような広範囲の利用に適用させることを可能にするビーズコーティングの詰め合わせも利用可能である。
【００８３】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）では、２つの発色団間の放射のないエネルギー移動が述べられている。励起状態でのドナーの発色団は、非放射長距離の双極子−双極子カップリングメカニズムによってエネルギーを近接している（通例、＜１０ｎｍ）アクセプター蛍光団に移動させることができる。双方の分子が蛍光性であるので、このエネルギー移動はしばしば“蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）”と呼ばれているが、実際にはエネルギーは蛍光によって移動されるわけではない。ＦＲＥＴは、タンパク質−薬剤相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、及びタンパク質−コンホメーション変化を検出し、そして定量化する有用なツールである。タンパク質が薬剤に、１つのタンパク質が別のタンパク質に、あるいはタンパク質がＤＮＡに結合することをモニタリングする場合には、一方の分子をドナーで標識し、他方をアクセプターで標識し、そしてこうした蛍光団標識分子を混和する。これらが非結合状態で存在するときには、ドナー放出がドナー励起して検出される。分子が結合すると、このドナー及びアクセプターは近接状態になり、そしてドナーからアクセプターへの分子間ＦＲＥＴのため、アクセプター放出が主に観察される。ＦＲＥＴの場合の適切な隣接体（neighbors）は、当技術分野で知られており、そして当業者であれば、双方の抗体の場合の標識の適切な組み合わせを選択することができるであろう。ドナー及び対応するアクセプターに関して本明細書中で使用されている際には、“対応する（corresponding）”とは、ドナーの励起スペクトルとオーバーラップする放出スペクトルを有するアクセプター蛍光モイエティを意味する。しかしながら、双方のシグナルは、互いに分離可能であるべきである。従って、アクセプターの放出スペクトルの極大波長は、ドナーの励起スペクトルの極大波長と比較して、好ましくは、少なくとも３０ｎｍ大きく、より好ましくは、少なくとも５０ｎｍ大きく、例えば、少なくとも８０ｎｍ大きく、少なくとも１００ｎｍ大きく、又は少なくとも１５０ｎｍ大きい。
【００８４】
ＦＲＥＴ技術における種々のアクセプター蛍光モイエティと共に使用することができる代表的なドナー蛍光モイエティには、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエロー ＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル １−ピレンブチレート（succinimdyl 1-pyrenbutyrate）、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体が含まれる。代表的なアクセプター蛍光モイエティは、使用されるドナー蛍光モイエティに左右されるが、ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミン ｘ イソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユーロピウム、又はテルビウム）が含まれる。ドナー及びアクセプター蛍光モイエティは、例えば、Molecular Probes (Junction City, OR) 又は Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO）から得ることができる。
【００８５】
また、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）は、この発明の試験システムのために使用することができる。ＴＲ−ＦＲＥＴは、ＴＲＦ（時間分解蛍光）とＦＲＥＴの原理を統合したものである。この組み合わせによって、ＴＲＦの低いバックグラウンドの利点とＦＲＥＴのホモジニアスアッセイ方式が合体される。ＦＲＥＴについては既に上記に述べられているところであるが、ＴＲＦは長い半減期を有する、ランタニド類（lanthanides）又は他の任意のドナーのユニークな特性を利用している。ＴＲ−ＦＲＥＴの場合の好適なドナーには、とりわけ、ランタニドキレート（クリプタート）及び他のいくつかの金属リガンド複合体が挙げられ、これらは、マイクロからミリ秒時間範囲内の蛍光半減期を持つことができ、従って、また、これらによってエネルギー移動がマイクロからミリ秒測定値で生じさせることが可能となる。蛍光ランタニドキレートは、７０年代後半にエネルギードナーとして使用されている。一般的に使用されるランタニド類には、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）及びジスプロシウム（Ｄｙ）が挙げられる。それらの特有の光物理学的及びスペクトル特性のために、ランタニド複合体は、生物学における蛍光適用に対して大変興味深い。具体的には、それらはより伝統的な蛍光団と比較した場合、大きなストロークシフト及び極めて長い発光半減期（マイクロ秒からミリ秒まで）を有する。
【００８６】
通例、有機発色団がアクセプターとして使用される。こうしたものにはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）が含まれる。ＴＲ−ＦＲＥＴ並びにアクセプターに関する適切な詳細は、ＷＯ ９８／１５８３０に記載されている。
【００８７】
蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイは、溶液中の蛍光性基質を励起するために偏光を使用するアッセイである。こうした蛍光性基質は、溶液中において遊離型であり、そして回転（tumble）し、その結果放出光が脱偏光する。基質がより大きな分子、すなわち、アシル基に結合すると、その回転速度は大幅に減少し、放出光は高度に偏光されたままとなる。
【００８８】
また、質量分析法を使用することができる。用語“質量分析法（mass spectrometry）”とは、試料から表面上に気相イオンを発生させ、そして質量分析計を用いて気相イオンを検出するイオン化源の使用を意味する。用語“レーザー脱離質量分析法（laser desorption mass spectrometry）”とは、試料から表面上に気相イオンを発生させ、そして質量分析計を用いて気相イオンを検出するイオン化源としてのレーザーの使用を意味する。アシル化したアシルアクセプターなどの生体分子のための質量分析の好ましい方法は、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわち、ＭＡＬＤＩである。ＭＡＬＤＩでは通例、分析物を、乾燥すると分析物と共結晶化するマトリクス材料と混和する。マトリクス材料は、普通なら不安定な生体分子又は分析物を崩壊させるエネルギー源からエネルギーを吸収する。別の好ましい方法は、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわち、ＳＥＬＤＩである。ＳＥＬＤＩでは、分析物が塗布されている表面が分析物捕捉及び／又は脱離において積極的な役割を演じる。本発明の文脈では、試料は、クロマトグラフィー又は他の化学処理を受けた場合もありうる生物学的試料及び適切なマトリクス基質を含んでなる。
【００８９】
質量分析で、“見かけの分子質量（apparent molecular mass）”とは、検出されたイオンの分子質量（ダルトン単位）電荷値、ｍ／ｚを意味する。見かけの分子質量がどのように誘導されるかは、使用する質量分析計のタイプに依存する。飛行時間型質量分析計の場合には、この見かけの分子質量は、イオン化から検出までの時間の関数である。用語“シグナル（signal）”とは、検討中の生体分子によって発生されるあらゆる応答を意味する。例えば、用語、シグナルとは、質量分析計の検出器にヒットする生体分子によって発生される応答を意味する。シグナル強度は生体分子の量又は濃度と相関関係をもつ。このシグナルは２つの値によって定義される：記載されているように発生した見かけの分子質量値と強度値。この質量値は生体分子の元素の特性値であり、一方強度値は、対応する見かけの分子質量値をもつ生体分子の相当する量又は濃度に合致する。従って、“シグナル（signal）”は常に生体分子の特性を意味する。
【００９０】
上記に詳述した如く、第一の局面は、疼痛に関係する化合物を識別する方法であって、その方法が、
ａ）Ｉｆｉ２０５核酸を含む試験システムを備える工程、
ｂ）前記試験システムを試験化合物と接触させる工程、及び
ｃ）試験化合物の前記試験システムに対する作用を決定する工程、
を含んでなり、対照と比較して、試験化合物の前記試験システムに対する有意な作用を検出する場合に、試験化合物を疼痛に関係する化合物として識別することを特徴とする、前記識別方法である。
【００９１】
試験化合物の核酸に対する作用は種々の発現又はシグナル伝達レベルで決定することができる。
【００９２】
試験化合物は、Ｉｆｉ２０５遺伝子又はＩｆｉ２０５遺伝子それ自体の制御配列に結合するように設計することができる。それによって、試験化合物は遺伝子の発現に影響をもたらすことができる。
【００９３】
従って、試験化合物の制御配列への結合は、（ｉ）制御配列又は遺伝子と、（ｉｉ）試験化合物の複合体を検出することによって決定することができる。２つ又はそれより多いコンポーネントの複合体を検出する適切な方法は、本明細書中に詳述されている。
【００９４】
制御配列は、転写因子のような制御タンパク質が選択的に結合するＤＮＡセグメントである。こうした制御タンパク質は、ゲノム中で適切に位置している、制御領域［通例、遺伝子の‘上流（upstream）’の短い間隔部分が制御される］と呼ばれるＤＮＡの短いストレッチ（stretches）に結合する。そうすることによって、こうした制御タンパク質はＲＮＡポリメラーゼと呼ばれる別のタンパク質複合体を動員することができる。このようにして、これらは遺伝子発現を制御している。この制御配列には、通例、他の制御領域（エンハンサー、サイレンサー、境界因子／インシュレーター）と協力して働き、所与の遺伝子の転写レベルを指示しているプロモーター領域が含まれる。
【００９５】
また、試験化合物の作用、例えば、結合、及び遺伝子転写に対する影響は、間接的に検出できる。この場合、Ｉｆｉ２０５遺伝子の下流の作用を検出することができる。例えば、Ｉｆｉ２０５に関連する転写及び翻訳に対する作用を決定することができる。一実施形態では、Ｉｆｉ２０５ ｍＲＮＡ、又はＩｆｉ２０５タンパク質の量が検出される。あるいは、ｐ５３及びＲｂ依存性経路のメンバーを決定することができる。
【００９６】
ｍＲＮＡを検出する適切な方法は、本明細書中に述べられており、例えば、ノーザンブロット解析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）、in situ（インサイチュ）ハイブリダイゼーション、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれる。
【００９７】
ノーザンブロッティング手順の場合には、ＲＮＡ試料を、まず、変性条件下にてアガロースゲル中で電気泳動によってサイズ分離することができる。次いでこのＲＮＡをメンブレン（membrane）に移し、架橋させ、そして標識プローブでハイブリダイズさせる。ランダムプライミングされたＤＮＡプローブ、ニック翻訳を行なったＤＮＡプローブ、又はＰＣＲによって生成したＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドを含めて、非同位体放射標識プローブ又は高比活性放射標識プローブを使用することができる。これに加えて、部分的にのみ相同性を有する配列（例えば、異なる種由来のｃＤＮＡ、又はエキソンを含み得るゲノムＤＮＡ断片）をプローブとして使用することができる。
【００９８】
ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）は、特定のｍＲＮＡを検出及び定量のための極めて高感度な方法である。ＮＰＡの原理は、アンチセンスプローブ（放射性標識又は非同位体）をＲＮＡ試料に溶液ハイブリダイゼーションすることである。ハイブリダイゼーション後、一本鎖プローブ、ハイブリッド形成しないプローブ及びＲＮＡをヌクレアーゼによって分解する。残存する保護された断片を、例えば、アクリルアミドゲルによって分離させる。溶液ハイブリダイゼーションは通例、メンブレンベースハイブリダイゼーションと比較してより効率的であり、これはブロットハイブリダイゼーションの２０〜３０μｇ（最大）と比較して、試料ＲＮＡは１００μｇまで調整することができる。ＮＰＡはまた、切断はプローブとオーバーラップしている領域（プローブは通例、約１００〜４００塩基長である）中で検出されるだけなので、ノーザン解析と比較してＲＮＡ試料分解に対する感度は低い。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡテンプレートが、レトロウイルス逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にコピーされる。次いでこのｃＤＮＡを、ＰＣＲによって指数的に増幅させる。相対定量（relative quantitative）ＲＴ−ＰＣＲは、目的遺伝子と同時に内部標準（internal control）を増幅させる必要がある。内部標準は試料を正規化するために用いられる。一旦正規化すると、特定のｍＲＮＡの相対存在量の直接比較を試料全体にわたって行うことができる。競合的ＲＴ−ＰＣＲが絶対定量のために使用される。この手法には、サイズ又は配列の少しの違いによって内在性標的と区別することができる競合的ＲＮＡをデザインし、合成し、そして正確に定量化することが必要である。公知の量のコンペティターＲＮＡを試験試料に加え、そしてＲＴ−ＰＣＲを行なう。内在性標的に起源するシグナルをコンペティターに起源するシグナルと比較して、試料中に存在する標的の量を決定する。
【０１００】
上記の方法は、核酸標識を含みうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドの標識を可能にする一連の手法は当業者に知られている。こうしたものには、例えば、ＤＮＡプローブのニックトランスレーション標識、ＤＮＡプローブのランダムプライミングＤＮＡ標識、ＤＮＡプローブのＰＣＲ標識及びオリゴヌクレオチド３’／５’末端標識、ＲＮＡプローブの転写標識、オリゴヌクレオチド３’／５’末端標識及びオリゴヌクレオチドテイリングが挙げられる。
【０１０１】
ニックトランスレーション法は、ランダムに分配するニックをＤＮＡに導入するＤＮアーゼＩの能力に基づいている。ＤＮＡポリメラーゼＩは、損なわれていない鎖（intact strand）に相補的なＤＮＡをプライマーとしてニックの３’−ＯＨ末端を用いて５’→３’の方向に合成する。同時にＤＮＡポリメラーゼＩの５’→３’エキソヌクレオリティック（exonucleolytiｃ）な活性によって、合成方向にヌクレオチドを除去する。このポリメラーゼ活性によって、除去したヌクレオチオドは、同位体によって標識されるか、又はハプテンによって標識されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸で順次置き換えられる。すなわち、低温（１５℃）では、この反応において標識されていないＤＮＡは、新たに合成された標識ＤＮＡによって置き換えられる。一般的な標識としては、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識、又はフルオレセイン又はテトラメチルローダミンなどの蛍光色素が挙げられる。
【０１０２】
“ランダムプライミングによる（random primed：ランダムプライムド）”ＤＮＡ標識の方法は、標識するＤＮＡに対するすべての可能性のあるヘキサヌクレオチドの混合物のハイブリダイゼーションに基づいている。すべての配列の組み合わせは、ヘキサヌクレオチドプライマー混合物において表現され、プライマーがテンプレートＤＮＡに統計的に結合することになる。すなわち、テンプレートＤＮＡの全長に沿った同程度の標識が保証されている。相補的な鎖はクレノー酵素（Klenow enzyme）（標識グレード）を用いてランダムヘキサヌクレオチドプライマーの３’ＯＨ末端から合成される。反応中に存在する修飾デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、［32Ｐ］標識、［35Ｓ］標識、［3Ｈ］標識、［125Ｉ］標識、ジゴキシゲニン標識、又はビオチン標識した）は、新たに合成された相補的ＤＮＡ鎖に組み込まれる。
【０１０３】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、微量のＤＮＡを増幅することを可能にする。唯一の前提条件は標的配列のある種の配列情報が、適切なプライマーを合成する場合に知られていることである。標識をＰＣＲと組み合わせることは、ＰＣＲ生成物の分析、また少量の各標的配列から標識プローブを製造する場合に強力なツールとなる。例えば、ジゴキシゲニン、ステロイドハプテンは、ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを標識するために、そしてその後の着色による検出又は発光検出に使用することができる。ジゴキシゲニンは通例、アルカリに不安定なエステル結合を介してｄＵＴＰにカップリングする。標識ｄＵＴＰはＤＮＡポリメラーゼを用いて酵素的核酸合成により容易に組む込むことができる。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドは、単一のジゴキシゲニン標識ジデオキシウリジン三リン酸（ＤＩＧ−ｄｄＵＴＰ）のような標識の組み込み、又はより長いヌクレオチドテイルの付加のいずれかによって、オリゴヌクレオチドの３’末端においてターミナルトランスフェラーゼで酵素的に標識することができる。ターミナルトランスフェラーゼは、デオキシヌクレオシド三リン酸とジデオキシヌクレオシド三リン酸を、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ断片とオリゴヌクレオチドの３’ＯＨ末端にテンプレート非依存的に付加することを触媒する。ターミナルトランスフェラーゼによって、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識及び蛍光色素標識されたデオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチド、並びに放射性標識されたデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドが組み込まれる。これに代わって、あるいはこれに加えて、オリゴヌクレオチドは、例えば、古典的な固相ホスフォラミダイト（phosphoramidite）合成方法に従って最終工程でホスフォラミダイトと反応させることによって、５’末端において標識されうる。このプロセスにより５’末端アミノ官能基が創成される。アンモニアで処理すると、オリゴヌクレオチドが支持体から遊離し、そして保護基が切断される。次の工程では、ジゴキシゲニンモイエティが５’位置に導入される。
【０１０５】
上記の標識方法において使用することができる種々の標識が知られている。それらの検出を含めてそうしたものの一部を以下に例示的に記載する：
【０１０６】
ビオチン標識化合物は、例えば、抗ビオチン抗体によって、又はストレプトアビジンコンジュゲートによって検出することができる。抗ビオチン抗体［例えば、モノクローナル抗ビオチン抗体又はＦａｂ−断片（アルカリホスファターゼ（ＡＰ）でコンジュゲートされている）］を、ナイロンメンブレンでの発光を伴う酵素免疫アッセイによってビオチン標識核酸を検出する際に使用することができる。この検出方法は、細胞及び組織内（例えば、in situハイブリダイゼーション）、イムノブロッティング、免疫組織化学又はＥＬＩＳＡにおいて、メンブレン上のビオチン標識核酸の検出の場合（例えば、サザンブロット、ドットブロット）に使用することができる。ストレプトアビジンコンジュゲートは、いくつかの免疫学的検出系の場合に使用できるビオチン標識物質（例えば、ビオチン化抗体）を検出する場合に使用される。この場合には、例えば、ストレプトミセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii）に起源するストレプトアビジンは、アルカリホスファターゼ又はβ−ペルオキシダーゼとカップリングすることができる。この検出方法は、イムノブロッティング、免疫組織化学又はＥＬＩＳＡを用いて使用することができる。
【０１０７】
プローブ−標的ハイブリッドは、酵素結合免疫アッセイを用いて検出することができる。この免疫化学検出工程は通例、放射性検出手順と比較してより高感度である。このアッセイでは、メンブレンをブロッキングし、抗体とフィルターとの非特異的相互作用を妨げることができる。ジゴキシゲニンに特異的なアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体は、標識ハイブリッド上の分子中のジゴキシゲニン（digoxigenein）を認識する。アルカリホスファターゼ基質を添加すると、このハイブリッドの可視化が可能になる。
【０１０８】
化学発光検出の場合には、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート・二ナトリウム、又は４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート・二ナトリウムなどのアルカリホスファターゼの適切な基質は、ジオキセタンフェニルホスフェートの群に属する。アルカリホスファターゼによって脱リン酸すると中間体が形成され、その分解によって、例えば、Ｘ線フィルムに記録することができる光放出がもたらされる。
【０１０９】
ＤＩＧ標識プローブ比色検出は通例、レドックス系を形成する無色基質と共に行なわれる。例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート及び４−ニトロ−ブルー−テトラゾリウム−クロリドなどがある。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェートは、アルカリホスファターゼによって酸化され、ホスフェート基の放出によってインジゴになる。並列して、４−ニトロ−ブルー−テトラゾリウム−クロリドは、還元されてジホルマザンになる。この反応生成物は、メンブレンの種類によるが、水不溶性の暗青色から帯褐色沈殿を形成する。
【０１１０】
種々のレポーター分子は、検出抗体とカップリングして、特定のプローブターゲットハイブリダイゼーション［これには、酵素結合抗体（enzyme-coupled antibodies）、蛍光色素標識抗体（蛍光色素によって放出される、波長の可視化を可能にする蛍光顕微鏡及び特定のフィルターによって検出）、及び金コロイドに結合する抗体（冷却した切片（cryostatic sections）を電子顕微鏡によって検出）などが含まれるが、それらには限定されない］を可視化することができる。
【０１１１】
複数・同時ハイブリダイゼーション（Multiple simultaneous hybridizations）は、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン標識プローブ、及び蛍光色素標識プローブの組み合わせを用いて、１つの調製物中で異なる染色体領域又は異なるＲＮＡ配列を局在化させることによって行うことができる。こうしたマルチプローブ（multiprobe）試験は、抗体にカップリングした異なる蛍光色素の可用性によって可能になる。こうしたものには、フルオレセイン又はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチシアネート；黄色）、ローダミン又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート；赤）、及びＡＭＣＡ（アミノ−メチルクマリン酢酸；青）が挙げられる。
【０１１２】
制御配列に対する作用は、制御配列をレポーター遺伝子に結合させ、そしてその結果生じたＤＮＡコンストラクトを細胞又は有機体（organism）に導入することよって検出することができる。培養液中の細菌又は真核細胞の場合には、これは通例、プラスミドと呼ばれる環状ＤＮＡ分子の形態である。レポーターの発現は、目的遺伝子を成功裡に取り込むためのマーカーとして使用しているので、研究中の細胞又は有機体中、天然では発現しないレポーター遺伝子を使用することが重要である。可視的に識別可能な特性を誘導する一般的に使用されるレポーター遺伝子には通例、蛍光及び発光タンパク質が必要である；例としては、クラゲ（jelly fish）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）［これはそれを発現する細胞を青い光のもとで緑色に光らせる］、ルシフェラーゼ酵素［これは、光を創成するルシフェリンとの反応を触媒する］、及びｄｓＲｅｄ遺伝子由来の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。別の細菌中の一般的なレポーターには、ｌａｃＺ遺伝子［これは、タンパク質β−ガラクトシダーゼをコードしている］がある。この酵素は、基質アナログＸ−ｇａｌを含む培地（ＩＰＴＧなどの誘導性分子も天然のプロモーターのもとで必要である）で増殖させたとき、遺伝子を発現する細菌を、青色を呈するようにする。細菌中の選択可能なマーカーレポーターの例には、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性が付与されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子がある。試験化合物の影響は、対照と比較して上記のシグナルの量を決定することによって検出することができる。
【０１１３】
上記に詳述した如く、第二の局面は、疼痛に関係する化合物を識別する方法であって、その方法が、
ａ）Ｉｆｉ２０５タンパク質、又はその機能的に活性な変異体を含む試験システムを備える工程、
ｂ）前記試験システムを試験化合物と接触させる工程、及び
ｃ）試験化合物の前記試験システムに対する作用を決定する工程、
を含んでなり、対照と比較して、試験化合物の前記試験システムに対する有意な作用が検出された場合に、試験化合物を疼痛に関係する化合物として識別することを特徴とする前記識別方法を提供する。
【０１１４】
従って、試験化合物のＩｆｉ２０５タンパク質、又はその変異体への結合は、（ｉ）Ｉｆｉ２０５タンパク質、又はその変異体と、（ｉｉ）試験化合物の複合体を検出することによって決定することができる。２つ又はそれより多いコンポーネントの複合体を検出する適切な方法は、上記及び下記に詳述されている。
【０１１５】
タンパク質を検出する適切な方法は、本明細書中に述べられており、そして例えば、標識タンパク質の検出（検出可能なマーカー、タグ又は酵素コンポーネントを含んでなる融合タンパク質など）、タンパク質免疫染色、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動、イムノブロッティング、ウェスタンブロッティング、吸光度測定、酵素アッセイなどが含まれる。この方法では、検出前のタンパク質精製が必要でありえ、これにはタンパク質単離（例えば、クロマトグラフィー法、タンパク質抽出、タンパク質可溶化、ゲル電気泳動、及び等電点焦点法（electrofocusing）が包含されうる。
【０１１６】
タンパク質免疫染色は、試料中の特定のタンパク質を検出するための抗体ベースの方法である。用語「免疫染色」は本来、組織切片の免疫組織化学染色を意味するのに使用されてきた。しかしながら、現在では免疫染色は、抗体ベースの染色方法を使用する組織学、細胞生物学、及び分子生物学、固定により保存される組織切片又は細胞の免疫組織化学又は免疫細胞化学において使用される広範囲の技法を包含している。
【０１１７】
ＩＨＣ染色の初期のケースでは蛍光色素が用いられていたが、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどの酵素を用いる他の非蛍光方法が現在ではよりしばしば用いられている。こうした酵素は、光学顕微鏡によって容易に検出可能である着色生成物が付与される反応を触媒することができる。また、放射性元素も標識として使用することができ、そして免疫反応が放射能写真術によって可視化することができる。組織調製物又は固定は、細胞形態及び組織構造の保存に不可欠である。不適切な、又は長期の固定は抗体結合能力を著しく損なう場合がある。多くの抗原はホルマリンによって固定され、パラフィン埋包組織切片の形で成功裡に実際に使用することができる。固定の方法及び時間の最適化、ブロッキング剤での前処理、高塩濃度での抗体インキュベーション、及び抗体後の洗浄バッファー及び洗浄時間を最適化することは高クオリティの免疫染色を得るのに重要でありうる。
【０１１８】
ウェスタンブロッティングは、あらゆる精製工程の前又は後に、細胞又は組織から作製された抽出物から特定のタンパク質（天然又は変性させた）を検出することを可能にする。一般的に、タンパク質は、ドライブロッティング、セミドライブロッティング、又はウェットブロッティング法を介して、合成メンブレン（通例、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ）に移される前に、ゲル電気泳動を用いて大きさによって分離する。次いでメンブレンを、免疫組織化学と同様な方法を用いる抗体を使用してプロービングすることができるが、しかしながら固定の必要はない。検出は通例、化学発光反応を触媒するペルオキシダーゼ結合抗体を用いて行なわれる。ウェスタンブロッティングは、半定量的に又は定量的に抽出物間のタンパク質レベルを比較するために使用することができる通常の分子生物学的方法である。ブロッティングの前のサイズ分離は、タンパク質分子量を公知の分子量マーカーと比較して測定することを可能にする。ウェスタンブロッティングは、組織ホモジネート又は抽出物の所与の試料中の特定のタンパク質を検出するのに用いられる分析手法である。これはポリペプチドの長さ（変性条件）によって、あるいはタンパク質の３次元構造（天然／非変性条件）によって、タンパク質を分離するゲル電気泳動を用いる。
【０１１９】
酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡは、多穴プレート方式（通例、１プレートにつき９６穴）中の血漿、血清又は細胞／組織抽出物に由来するタンパク質濃度を定量的に又は半定量的に決定する診断方法である。大雑把に言えば、溶液中のタンパク質はＥＬＩＳＡプレートに吸着される。目的タンパク質に特異的な抗体は、プレートをプローブするために使用される。バックグラウンドは、ブロッキング方法及び洗浄方法（ＩＨＣに関して）を最適化することによって最小にし、そして特異性は陽性及び陰性対照の存在によって確保されている。検出方法は通例、比色又は化学発光をベースとしている。
【０１２０】
電子顕微鏡、すなわちＥＭは、組織又は細胞の詳細な微小構造を検討するために使用することができる。免疫ＥＭは、超薄組織切片中の特定のタンパク質を検出することを可能にする。重金属粒子（例えば、金）で標識された抗体は、透過型電子顕徽鏡法を用いて直接可視化しうる。これはタンパク質の細胞内局在を検出する際には強力であるけれども、免疫ＥＭは、技術的に困難性があり、高価であり、そして組織固定及び処理方法の厳密な最適化が必要である。
【０１２１】
あるいは、Ｉｆｉ２０５タンパク質に対する試験化合物の作用（例えば、結合）、及び影響は間接的に検出できる。この場合、Ｉｆｉ２０５タンパク質の下流の作用が検出できる。例えば、表現型に対する作用（例えば、痛覚表現型の出現）が決定されうる。
【０１２２】
この発明の好ましい実施形態では、疼痛に関係する化合物は、Ｉｆｉ２０５遺伝子及び／又はＩｆｉ２０５タンパク質のシグナル伝達経路（signal transduction pathway）に自然的に（naturally）参加する細胞の化合物（cellular compound）である。
【０１２３】
上記に詳述した如く、Ｉｆｉ２０５は、インターフェロン（ＩＦＮ）によって誘導される多数の遺伝子産生物の１つであるタンパク質のインターフェロン誘導性ｐ２００（ＩＦＩ２００）のファミリーに属し、細胞増殖、免疫調節及び腫瘍及びウイルスに対する宿主抵抗性の重要なレギュレーターである。
【０１２４】
しかしながら、疼痛におけるＩｆｉ２０５のシグナル伝達経路についての詳細はほとんど知られていない。それ故、シグナル伝達経路のコンポーネントを特定化することが望ましい。この場合、場合により、Ｉｆｉ２０５のシグナル伝達に関与していることが疑わしいこともある、細胞コンポーネントを検出することができうる。こうしたことは疼痛に関係する薬剤の更なる標的となりうる。
【０１２５】
この発明の好ましい実施形態では、疼痛に関係する化合物は、Ｉｆｉ２０５タンパク質の上流又は下流のシグナル伝達を変化させる。これに加えて、あるいはこれに代わって、疼痛に関係する化合物は、Ｉｆｉ２０５遺伝子の上流又は下流のシグナル伝達を変化させ、特に、その場合、該化合物はＩｆｉ２０５遺伝子の発現を変化させる。
【０１２６】
上記に既に詳述した如く、Ｉｆｉ２０５タンパク質又はＩｆｉ２０５遺伝子のレベルに対する作用が決定されうるのみならず、上流又は下流のシグナル伝達又は発現レベルに対する作用が決定されうる。例としては、Ｉｆｉ２０５遺伝子レベル（Ｉｆｉ２０５タンパク質の上流）、ｍＲＮＡレベル（Ｉｆｉ２０５タンパク質の上流及びＩｆｉ２０５遺伝子の下流）、タンパク質レベル（Ｉｆｉ２０５遺伝子の下流）、及び表現型レベル（phenotype level）（Ｉｆｉ２０５遺伝子及びＩｆｉ２０５タンパク質の下流）が含まれる。
【０１２７】
この発明の好ましい実施形態では、疼痛に関係する化合物は、Ｉｆｉ２０５遺伝子及び／又はＩｆｉ２０５タンパク質のシグナル伝達経路に自然に参加する細胞化合物（cellular compound）に結合し、特に、この場合、疼痛に関係する該化合物は、Ｉｆｉ２０５遺伝子又はＩｆｉ２０５タンパク質、とりわけＩｆｉ２０５タンパク質に結合する。
【０１２８】
化合物が、Ｉｆｉ２０５遺伝子及び／又はＩｆｉ２０５タンパク質のシグナル伝達経路に自然に参加する細胞化合物に結合すると、おそらくシグナル伝達に対して作用を与えることは明らかである。多くの場合、人工の化合物が、シグナル伝達経路に自然に参加する細胞化合物に結合すると、経路を抑制することをもたらす。しかしながら、人工の化合物は、その経路を活性化するように設計されうる。双方の場合に、結合すると、経路に対して作用を及ぼし、その結果、疼痛感受性が変更される可能性が高い。
【０１２９】
この発明の好ましい実施形態では、疼痛に関係する化合物は、Ｉｆｉ２０５遺伝子の上流又は下流のシグナル伝達を抑制し、この場合、この化合物は、特にＩｆｉ２０５遺伝子の発現を抑制する。この発明の好ましい実施形態では、疼痛に関係する化合物がＩｆｉ２０５タンパク質の上流又は下流のシグナル伝達を抑制し、特にこの場合、この化合物はＩｆｉ２０５タンパク質に結合する。実施例の結果に基づくと、こうした化合物は、疼痛を抑制又は減少させることができることが予想される。それ故、こうしたものは好ましい。
【０１３０】
この発明の別の好ましい実施形態では、この試験システムは、動物細胞、特に哺乳類細胞、とりわけヒト細胞などの細胞内にある。
【０１３１】
細胞ベース系は、細胞及び細胞機構［例えば、インスリンの下流のシグナル伝達コンポーネント、あるいはＩｆｉ２０５タンパク質、又はＩｆｉ２０５遺伝子の下流又は上流のシグナル伝達コンポーネント］を増殖させることによって容易にこの試験システムを増幅することを可能にするので、有利であり、こうしたことは、変化した細胞のグルコース取り込みを示すシグナルを検出するために使用されうるのと同様である。
【０１３２】
この発明の関連において適切な細胞の例としては、Ｌ６細胞、３Ｔ３脂肪細胞、ＨＥＫ２９３、７４５−Ａ、Ａ−４３１、心房筋細胞（atrial myocytes）、ＢｘＰＣ３、Ｃ５Ｎ、Ｃａｃｏ−２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＣ５３１、ＣＦＰＡＣ、ＣＨＯ、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ＥＡＨＹ、ＥＡＨＹ ９２６、Ｆ９８、ＧＨ３、ＧＰ＆ｅｎｖＡＭ１２、Ｈ−２９５ Ｒ、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、ＨＡＣＡＴ、ＨＡＣＡＴ Ａ１３１、ＨＥＫ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｈｓ ７６６Ｔ、ＨＴ２９、ＨＵＶ−ＥＣ Ｒ２４、ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ、ＩＥＣ １７、ＩＥＣ １８、ジャーカット（Jurkat）、Ｋ ５６２、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、Ｌ ９２９、ＬＩＮ １７５、ＭＡｔ−ＬＹＬＵ、ＭＣＦ−７、ＭＮＥＬ、ＭＲＣ−５、ＭＴ４、Ｎ６４、ＮＣＴＣ ２５４４、ＮＤＣＫ ＩＩ、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＮＴ２／Ｄ１、Ｐ１９、初代神経細胞、初代樹状細胞、初代ヒト筋芽細胞、初代角質細胞、ＳＦ９、ＳＫ−ＵＴ−１、ＳＴ、ＳＷ ４８０、ＳＷＵ−２ ＯＳ、Ｕ−３７３、Ｕ−９３７、及びＹ−１が挙げられるが、それらに限定されない。他の適切な細胞は当技術分野の当業者に知られている。
【０１３３】
動物又はヒトから直接培養される細胞は、初代細胞と呼ばれている。腫瘍に由来するある種の細胞株を除いて、大部分の初代細胞培養物は寿命が限られている。一定数の集団倍加後、細胞は、一般に生存能力を保持したまま、老化のプロセスを受け、分裂が停止する。
【０１３４】
樹立又は不死化細胞株は、ランダム突然変異又は意図的な修飾、例えば、テロメラーゼ遺伝子の人工的発現を通して、無期限に増殖する能力を獲得している。特定の細胞型を表す多数の十分に樹立された細胞株が存在し、適切な細胞株を選択することは、当業者の知識の範囲内にある。
【０１３５】
従って、本発明の好ましい形態では、細胞は細胞株である。細胞株は、単一の共通の祖先細胞から誘導され、従って遺伝的に同一である、培養において増殖された細胞の集団である。好ましい細胞株としては、ＨＥＫ ２９３細胞（初代ヒト胎児腎臓）、３Ｔ３細胞（マウス胚性線維芽細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル細胞株）、ＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮子宮頸癌）、ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞白血病）、ＢＨＫ ２１細胞（ハムスター正常腎臓、線維芽細胞）、及びＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌）がある。
【０１３６】
細胞又は細胞株は、遺伝的に修飾し、作用の検出のために必要なＩｆｉ２０５又はコンポーネントを含むことができる。特に好ましい細胞株は、公知のプロモーター系の制御のもとでＩｆｉ２０５をコーディングしている遺伝子を包含する。このプロモーター系は制御可能であり、例えば、化学物質によって誘導可能であり、あるいは構成的に活性である。こうしたプロモーター系は当業者に周知である。
【０１３７】
また、細胞溶解物（粗製の、分画した又は精製した）を使用することができる。こうしたものを製造する例示的な方法は当業者に知られており、そして断片化、遠心分離及び再懸濁を含むことができる。
【０１３８】
この発明の好ましい実施形態では、方法はハイスループットスクリーニング方法である。
【０１３９】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、特に薬物発見において使用され、生物学及び化学の分野に関連する科学実験のための方法である。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、例えば、ロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体ハンドリング装置、及び高感度検出器を用いて、研究者が何千、又はそれどころか何百万個の生化学的、遺伝的又は薬理学的試験を迅速に行なうことを可能にする。このプロセスによって、特定の生体分子経路をモジュレートする活性化合物、抗生物質又は遺伝子を迅速に同定することができる。
【０１４０】
通例、ＨＴＳは、候補化合物のライブラリーに対するアッセイのスクリーニングを行なうのに自動化を用いる。典型的なＨＴＳスクリーニングライブラリー又は“デックス（decks）”は、１００，０００乃至２，０００，０００を超える化合物を含むことができる。
【０１４１】
ほとんどの場合、ＨＴＳの重要な試験容器は、マルチウェルプレート又はマイクロプレートである。ＨＴＳのための現代のマイクロプレートは通例、９６、３８４、１５３６、又は３４５６ウェルを有している。こうしたものは、すべて９６の倍数単位であり、８×１２ ９ｍｍ間隔ウェルを有しているオリジナルの９６ウェルマイクロプレートを反映している。大部分のウェルは、実験的に有用な物質、しばしば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び他の何らかの化学化合物の水溶液を含み、後者はプレート全体のそれぞれのウェルごとに異なる。他のウェルは、空である場合もあり、所望の実験対照として使用することが意図されている。
【０１４２】
アッセイを準備するには、研究者はプレートの各ウェルに彼らが実験を行ないたい何らかの生物学的実体を充填させる。この場合には、Ｉｆｉ２０５核酸又はＩｆｉ２０５タンパク質を含む実験系をその中に充填させることになる。一定のインキュベーション時間が経過して、生物学的物質を、ウェル中の化合物に吸収させ、それに結合させ、さもなければそれと反応させ（又は反応させずに）た後、すべてのプレートのウェル全部を、手動、又は機器によって測定する。特殊化された自動式の分析機器によって、ウェル上でいくつかの実験（例えば、それらに偏光を照らし、そして反射率を測定する（これによってタンパク質結合が示されうる））が行なわれうる。この場合、該機器はそれぞれの数を１つのウェルから得られた値にマッピングして、グリッド数値として各実験の結果をアウトプットすることができる。高容量分析機器は、何千という実験データポイントを非常に迅速に作成して、このように数分間隔で数十のプレートを測定することができる。
【０１４３】
この発明の好ましい実施形態では、疼痛は神経障害性疼痛である。神経痛又は神経障害性疼痛は、非侵害受容性疼痛、又は換言すれば、体のあらゆる部分の疼痛受容体細胞の活性化に関連しない疼痛と定義することができる。神経痛は、神経構造又は神経機能における変化によって生じる疼痛であると考えられている。侵害受容性疼痛と異なって、神経痛は連続的な侵害受容性インプットなしで存在する。神経痛は、以下の２つのカテゴリーに分類される：中枢性神経痛及び末梢性神経痛。この特有の疼痛は、以下の４つの起こりうるメカニズムに関連があると考えられている：イオンゲート機能不全；神経が機械的に過敏になり、異所性シグナルを生み出す：大径線維と小径線維の間のクロスシグナル；及び中枢プロセッサーにおける損傷による機能不全。
【０１４４】
神経痛は診断するのがしばしば困難であり、大部分の処置はほとんど、又は全く有効性を示さない。診断には通例、欠けている感覚又は運動機能を特定化することによって損傷した神経の位置を突きとめることが必要である。これには、ＥＭＧ試験又は神経幹伝導試験などの試験が必要でありうる。神経痛は、通常の疼痛薬物療法に十分に反応しないので、他の種類の疼痛と比較して処置するのがより困難である。このためこの疼痛を診断し、これを処置する新しい方法を開発する必要性があり、それ故、Ｉｆｉ２０５核酸及びＩｆｉ２０５タンパク質が関心のある標的を提供していることが判明している。
【０１４５】
第三の局面では、この発明は疼痛に関係する化合物を識別するためのＩｆｉ２０５核酸の使用を提供し、第四の局面では、この発明は疼痛に関係する化合物を識別するためのＩｆｉ２０５タンパク質の使用を提供する。
【０１４６】
用語“Ｉｆｉ２０５核酸（Ifi205 nucleic acid）”、“Ｉｆｉ２０５タンパク質（Ifi205 protein）”及び“疼痛に関係する化合物を識別する（identifying a compound involved in pain）”に関しては、この発明の方法の関連で提供されている定義として言及されている。上記に述べられている方法が識別のために使用することができることは注目される。
【０１４７】
この発明の第三又は第四の局面の好ましい実施形態では、化合物及び／又は疼痛は、この発明の方法の好ましい実施形態の関連で上記に定義されている通りである。
【０１４８】
この発明に従って識別された疼痛に関係する化合物は、薬剤として使用することができる。薬剤を製造する場合には、特定化された標的又はその製薬学的に許容される塩は、所望の特性を提供するように組み合わせた製薬学的に許容される担体又は補助剤などの成分の混合物から成る一般的な医薬投与剤形の形態でなければならない。
【０１４９】
この製剤は、少なくとも１つの適切な製薬学的に許容される担体又は補助剤を含んでなる。こうした物質の例には、脱塩水、等張生理食塩水、リンゲル液、緩衝剤、有機又は無機酸及び塩基並びにその塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、プロピレングリコールなどのグリコール類、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類、グルコース、スクロース及びラクトースなどの糖類、とうもろこしデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン類、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミドなどの可溶化剤及び懸濁剤、落花生油、綿実油、トウモロコシ油、大豆油、ひまし油などの油類、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルなどの合成脂肪酸エステル、ゼラチン、デキストラン、セルロース及びその誘導体、アルブミンなどの高分子アジュバント、有機溶媒、シトレート（citrates）及び尿素などの錯化剤、安定化剤、例えば、プロテアーゼ又はヌクレアーゼインヒビター、好ましくは、アプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はペプスタチンＡ、ベンジルアルコールなどの保存剤、亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、ワックス及びＥＤＴＡなどの安定化剤がある。着色剤、放出剤（releasing agents）、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、この組成物中に存在することができる。生理学的バッファー溶液は、およそ６．０〜８．０のｐＨ、殊におよそ６．８〜７．８のｐＨ、特におよそ７．４のｐＨ、及び／又はおよそ２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくはおよそ２９０〜３１０ミリオスモル／リットルの浸透圧モル濃度を有することが好ましい。薬剤のｐＨは、一般に、例えば、好ましくは、リン酸塩バッファー、トリスバッファー （トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ヘペスバッファー（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）、又はＭＯＰＳバッファー （３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）などの適切な有機又は無機バッファーを用いて調整される。それぞれのバッファーの選択は、一般的に、所望のバッファーのモル濃度に左右される。リン酸塩バッファーは、例えば、注射及び点滴溶液に適切である。薬剤を製剤化する方法並びに適切な製薬学的に許容される担体または補助剤は、当技術分野の当業者に周知である。製薬学的に許容される担体及び補助剤は、広く使用されている投与剤形及び識別された化合物に応じて、数ある中で選択される。
【０１５０】
医薬組成物は、経口、経鼻、直腸、非経口、膣内、局所的又は膣内投与用に製造することができる。非経口投与には、皮下、皮内、筋肉内、静脈内又は腹腔内投与が含まれる。
【０１５１】
薬剤はカプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤及び顆粒剤などの経口投与のための固体投与剤形、製薬学的に許容されるエマルション、ミクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルなどの経口投与のための液体投与剤形、注入可能な製剤、たとえば、滅菌した注入可能な水性又は油性の懸濁液、好ましくは、坐剤である、直腸又は膣内投与のための組成物、並びに軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤又はパッチなどの局所又は経皮投与のための投与剤形を含む、様々な投与形態として製剤化することができる。
【０１５２】
任意の具体的な患者のための具体的な治療的に有効な投与量レベルは、識別された化合物の活性、投与剤形、患者の年齢、体重及び性別、処置期間及び医療分野において周知である同様のファクターを含めて種々のファクターに左右されるであろう。
【０１５３】
ヒト又は他の哺乳類に１回又は分割投与で投与されるこの発明の化合物の１日当たりの総投与量は、例えば、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量でありえ、あるいは、より好ましくは、約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ（体重）でありうる。単回投与の組成物はこうした量又はその約数を含み、１日投与量を作製することができる。一般に、この発明による処置レジメンは、こうした処置を必要とする患者に、１日あたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇのこの発明の化合物の化合物（複数を含む）を単回又は複数回投与量で投与することを含んでなる。
【０１５４】
第五の局面では、この発明は痛覚過敏を診断する方法であって、
ａ）患者の試料中のＩｆｉ２０５遺伝子の発現レベルを決定することと、及び
ｂ）Ｉｆｉ２０５遺伝子の発現レベルが対照と比較して患者の試料中で増加する場合に、患者を痛覚過敏（algesic）と認定する工程を含んでなる、前記方法を提供する。
【０１５５】
実施例中で示すように、Ｉｆｉ２０５遺伝子の発現レベルは、痛覚過敏と相関性がある。従って、この発現レベルは、Ｉｆｉ２０５関連痛覚過敏に使用するか、あるいはＩｆｉ２０５関連痛覚過敏を診断することができる。遺伝子の発現レベルは、遺伝子レベル、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルによって検出することができる。
【０１５６】
対照は、例えば、以下でありうる：
Ａ）１つ又は複数の非痛覚過敏個体（non-algesic individual）の単離した試料（これは、分析する試料と比較してほぼ同じ量の全ｍＲＮＡ又は全タンパク質を有しうる）及び／又は
Ｂ）対照は、代表的な個体群セットで発現されたＩｆｉ２０５ ｍＲＮＡ又はＩｆｉ２０５ ｃＤＮＡ又はＩｆｉ２０５タンパク質の平均量に少なくともほぼ該当する量のＩｆｉ２０５ ｍＲＮＡ又はＩｆｉ２０５ ｃＤＮＡ又はＩｆｉ２０５タンパク質を有しているか、
あるいは、非痛覚過敏個体の１つ又は複数又は代表的なセットで発現されたＩｆｉ２０５ ｍＲＮＡ又はＩｆｉ２０５ ｃＤＮＡ又はＩｆｉ２０５タンパク質の平均量に少なくともほぼ該当する量のＩｆｉ２０５ ｍＲＮＡ又はＩｆｉ２０５ ｃＤＮＡ又はＩｆｉ２０５タンパク質を有しているタンパク質／ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの標準レファレンス試料でありうる（ここで、この試料はまた、Ｉｆｉ２０５に該当しない、更なるタンパク質、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ種を含むことができる）。
【０１５７】
発現レベルの増加は、Ｉｆｉ２０５遺伝子のコピー数の増加のためでありうる。遺伝子のコピー数の増加のためである、一連の疾患が知られている。例えば、乳癌の１つの原因は、ＨＥＲ−２増幅でありうる。遺伝子増幅は、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び銀、発色、又は蛍光in situハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ／ＣＩＳＨ／ＦＩＳＨ）によって決定することができる。
【０１５８】
プローブのin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞又は組織内で行なわれる。細胞構造はこの手順の間維持されるので、ＩＳＨは、組織試料内でｍＲＮＡの位置に関する情報が必要となる。この手順は例えば、中性緩衝ホルマリン中に試料を固定化し、そしてパラフィン中に組織を埋包することによって開始される。次いでこの試料を薄い切片にスライスし、顕微鏡スライドの上に載せる。（あるいは、組織を凍結切断し、パラホルムアルデヒド中に後固定した）。パラフィンを取り除き、そして切片を再水和するための一連の洗浄後、プロテイナーゼＫによる消化を行い、プローブアクセス可能性を増加させ、次いで標識プローブを試料切片にハイブリダイズする。放射標識プローブを、スライド上で乾燥した液体フィルムを用いて可視化し、一方、非同位元素標識プローブは、比色又は蛍光試薬を用いて検出することが好都合である。
【０１５９】
また、遺伝子増幅は、バーチャル・カリオタイピング（virtual karyotyping）又は比較ゲノムハイブリダイゼーションによって検出することができる。破壊したＤＮＡから高解像度カリオタイプ（high-resolution karyotypes）をイン・シリコで生成するためのプラットホームが出現する（例えば、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（arrayCGH）及びＳＮＰアレイによる）。概念的には、このアレイは、ゲノム内の関心領域に相補的である何百から何百万のプローブで構成されている。試験試料に起源する破壊されたＤＮＡは、断片化され、標識され、そしてアレイにハイブリダイズされる。各プローブのこのハイブリダイゼーションシグナル強度は、アレイ上の各プローブの場合の試験／正常の発現量の比（対数比：log2 ratio）を作成するために、特殊なソフトウェアが使用される。アレイ上の各プローブのアドレス及びゲノム中の各プローブのアドレスがわかると、ソフトウェアは染色体の順番にプローブを並べ、そしてイン・シリコでゲノムを再構築する。
【０１６０】
更に、多数のＰＣＲをベースとする方法もまた上記に述べられている。
【０１６１】
これに代わって、あるいはこれに加えて、Ｉｆｉ２０５の発現レベルを、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルによって検出することができる。この場合に、ｍＲＮＡ又はＩｆｉ２０５タンパク質の量が検出される。ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するための適切な方法は上記に詳述されている。
【０１６２】
本発明は、本明細書中に述べられている特定の方法、プロトコール、及び試薬に限定されることはないが、その理由は、それらは変動しうるからである。更に本明細書中で使用されている用語は具体的な実施形態を述べるためだけを目的としており、この発明の範囲を限定する意図ではない。本明細書中、及び添付の請求項中で使用される際には、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、別途この文脈で明示しない限り、複数のものを含んでいる。同様に、語“含んでなる（comprise）”、“含む（contain）”及び“包含する（encompass）”は、排他的ではなく、非排他包含的に解釈されなければならない。
【０１６３】
別途定義されていない限り、本明細書中で使用されているすべての技術的及び科学的用語及びあらゆる頭字語は、本発明の分野の当業者による通常の理解と同じ意味を有する。本明細書中に述べられているものと同様又は同等であるあらゆる方法及び物質はこの発明の実施の際に使用することができるが、好ましい方法、及び物質は本明細書中に述べられている。
【０１６４】
本発明は、以下の図面及び実施例によって更に説明されているが、別途明確に指示されていない限り、実施例は単に説明の目的のために含まれているものであり、本発明の範囲を限定するものではないということが理解されるところである。
【０１６５】
図面：
図１は、あらゆる個々のマウスの場合に、Ｌ５ ＤＲＧの神経障害性疼痛表現型スコア（機械的過敏，Ｘ軸）、及び対応するＩｆｉ２０５の遺伝子制御［対数比（log ratio）（チャング対擬似対照（Sham control）（Chung vs. Sham control）Ｙ軸］を示す。マウスのデータは、使用した系統（strain）に応じて記号コードされている。ピアソン相関解析が行なわれ、そしてそして疼痛表現型及び遺伝子制御（対数比）の２つのパラメーターの有意な正相関が明らかとなった。これによって個々のマウスの場合、行動学的検査において示される機械的痛覚過敏が顕著であればあるほど、チャング手術処理を施した神経障害性マウス（Chung-operated neuropathic mice）においてＩｆｉ２０５のより高いＬ５ ＤＲＧ発現があったことを意味している。
【０１６６】
この有意な相関は、Ｉｆｉ２０５遺伝子発現の神経障害性疼痛表現型惹起に対する因果関係を示している。（Ｒ（ピアソン）＝０．７５７；ｐ値＝７．５４×１０-6；ＦＤＲ＝０．００６）。
【０１６７】
図２はＬ５ ＤＲＧのＩｆｉ２０５の場合の例示的な強度データを示す（3d p.o.）。
【０１６８】
実施例：
痛覚過敏に関与するタンパク質としてのＩｆｉ２０５の特定
疼痛治療の新しい標的を特定するために、その制御が慢性神経障害性疼痛を引き起こすもととなる、遺伝子を特定する相関解析を行なった（Persson et al., 2009, Molecular Pain 5:7も参照）。要約すれば、近交系マウス系ＡＫＲ／Ｊ（ＡＫＲ）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｃ５７／Ｂ６）及びＣＢＡ／Ｊ（ＣＢＡ）の後根神経節（ＤＲＧｓ）のＲＮＡ試料を検討した。近交系マウス系は、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA）から得た。チャング手術処理を施した（神経障害性疼痛のチャングモデル（Kim and Chung, 1992, Pain 50: 355-363）及び対応する擬似手術処理を施した対照動物に対してＬ５の位置における脊髄神経に軸索切断術を行なった。試料をアフィメトリクスマイクロアレイ（Affymetrix microarrays（MOE430 2.0）を用いてプロファイルした。各グループの中で少なくとも５頭の動物を試験した。ＤＲＧｓを除去する前に、疼痛表現型“機械的痛覚過敏（mechanic hyperalgesia）”の出現をすべてのマウスで決定した（Persson et al., 上掲，特に“行動学的検査（Behavioral testing）”の部分）。３つのマウス系はそれらの表現型の点で異なっていた。ＣＢＡマウス、Ｃ５７／Ｂ６マウス及びＡＫＲマウスでは、表現型が、それぞれ低レベル、中レベル及び高レベルで現れた。
【０１６９】
遺伝子発現実験を行なうために、この方法によって十分な量（＞３００ｎｇ）及びクオリティでＲＮＡが提供される、マウスＤＲＧｓの全ＲＮＡを単離する方法（Persson et al.,前掲，特に“ＴａｑＭａｎ及びマイクロアレイ解析のためのＲＮＡ抽出（RNA extraction for TaqMan and microarray analysis）”の部分）が開発された。３つの系統のマウス（チャング手術処理を施すか又は擬似手術処理を施した対照動物）のＬ５ ＤＲＧｓからのＲＮＡを抽出した後、ＲＮＡプローブをアフィメトリクスマイクロアレイ（MOE430 2.0）によってハイブリダイズした。
【０１７０】
アフィメトリクス遺伝子発現データを統計的に解析し、相関解析の前にフィルタリングした。次のフィルタークライテリア（criteria）が使用された：
−すべてのチャング手術処理を施した動物の少なくとも６０％における絶対発現比（Abs. fold-change）≧１．５又は
−すべてのチャング手術処理を施した動物の少なくとも２０％における絶対発現比≧２．０（それぞれ、すべての擬似手術処理を施した対照動物の平均値に対して）及び
−少なくとも５頭における遺伝子発現強度＞５０（バックグラウンドレベル）
【０１７１】
３つの系統の個々のマウスの表現型データ及びそれらの遺伝子発現データ（対数比（チャング手術処理対擬似手術処理）として表現されている）又はチャング手術処理を施した動物の発現強度が相関解析のために使用された。
【０１７２】
上記のフィルタークライテリアを満たしているそれぞれの遺伝子の場合に、ピアソン相関係数遺伝子発現データ及び表現型データ（機械的過敏）を算出した（（Persson et al., 上掲，特に“相関解析（Correlational analysis）”の部分）。単独の遺伝子の相関係数の有意性を決定するために、“真の帰無仮説の割合（false discovery rate”（ＦＤＲ）を導入した（Storey, J.D. (2002) J. R. Statist. Soc. 64, part 3, 479-498）。ＦＤＲ＞０．０５を有する遺伝子のピアソン相関係数は、有意であると見なした。対数比（log ratio）データ（チャング手術処理対擬似手術処理）及び発現強度を用いて、それぞれ７４の配列と１１４の遺伝子を特定した。こうした配列／遺伝子の場合のデータは、遺伝子発現と表現型データの有意な相関を示し（ＦＤＲ＜０．０５）、そして疼痛及び痛覚過敏に関連することは知られていなかった。
【０１７３】
発現と疼痛表現型の最もよい相関を有する遺伝子の１つであるＩｆｉ２０５遺伝子の場合、対数比データと機械的過敏の相関解析は、０．７５７のピアソン相関係数（７．５４×１０-6のｐ値）及び０．００６のＦＤＲをもたらした。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】あらゆる個々のマウスの場合に、Ｌ５ ＤＲＧの神経障害性疼痛表現型スコア（機械的過敏，Ｘ軸）、及び対応するＩｆｉ２０５の遺伝子制御［対数比（log ratio）（チャング対擬似対照（Sham control）（Chung vs. Sham control）Ｙ軸］を示す。マウスのデータは、使用した系統（strain）に応じて記号コードされている。ピアソン相関解析が行なわれ、そしてそして疼痛表現型及び遺伝子制御（対数比）の２つのパラメーターの有意な正相関が明らかとなった。これによって個々のマウスの場合、行動学的検査において示される機械的痛覚過敏が顕著であればあるほど、チャング手術処理を施した神経障害性マウス（Chung-operated neuropathic mice）においてＩｆｉ２０５のより高いＬ５ ＤＲＧ発現があったことを意味している。この有意な相関は、Ｉｆｉ２０５遺伝子発現の神経障害性疼痛表現型惹起に対する因果関係を示している。（Ｒ（ピアソン）＝０．７５７；ｐ値＝７．５４×１０-6；ＦＤＲ＝０．００６）。
【図２−１】Ｌ５ ＤＲＧのＩｆｉ２０５の場合の例示的な強度データを示す（3d p.o.）。
【図２−２】Ｌ５ ＤＲＧのＩｆｉ２０５の場合の例示的な強度データを示す（3d p.o.）。
【図２−３】Ｌ５ ＤＲＧのＩｆｉ２０５の場合の例示的な強度データを示す（3d p.o.）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【配列表】
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