(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’への方向に、
（ａ）第１のタンデム反復核酸と、
（ｂ）第１のＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｃ）標的核酸と、
（ｄ）第２のＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｅ）第２のタンデム反復核酸と
を含む、切り出し可能な核酸構築物。
【請求項２】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項４】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項５】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対を含む、請求項１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項６】
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項７】
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項８】
前記第１のタンデム反復核酸の５’側に連結した第１のゲノム組込み部位と、前記第２のタンデム反復核酸の３’側に連結した第２の組込み部位とをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項９】
前記標的核酸が、Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターエレメントを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項１１】
Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターをさらに含む、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記ベクターが、Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
酵母細胞である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
一倍体の酵母細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
二倍体の酵母細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記切り出し可能な核酸構築物が、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから少なくとも１つの標的核酸を切り出す方法であって、該切り出し可能な核酸構築物を、該宿主細胞において、Ｆ−ＣｐｈＩと接触させるステップを含む方法。
【請求項２０】
前記切り出すステップにより、プロモーターエレメントが、対象の遺伝子に作動可能に連結される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
５’から３’への方向に、
（ａ）第１のゲノム組込み配列と、
（ｂ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第１のタンデム反復核酸と、
（ｃ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｄ）標的核酸と、
（ｅ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｆ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第２のタンデム反復核酸と、
（ｇ）第２のゲノム組込み配列と
を含み、
該第１および第２のゲノム組込み配列の各々が、酵母ゲノム遺伝子座との相同組換えを開始するのに十分な長さおよび同一性のものである、切り出し可能な核酸構築物。
【請求項２８】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項２７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項２９】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項２７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３０】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項２７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３１】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３２】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３３】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３４】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３５】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３６】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３７】
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項２７から３６のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３８】
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項３７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項３９】
前記第１および第２のゲノム組込み配列の各々が、個別に約５０〜５００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項４０】
前記第１および第２のゲノム組込み配列の各々が、個別に約５００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
【請求項４１】
請求項２７から４０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む酵母細胞。
【請求項４２】
一倍体の酵母細胞である、請求項４１に記載の酵母細胞。
【請求項４３】
二倍体の酵母細胞である、請求項４１に記載の酵母細胞。
【請求項４４】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項４１に記載の酵母細胞。
【請求項４５】
（ａ）５’から３’への方向に、
（ｉ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第１のタンデム反復核酸と、
（ｉｉ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｉｉｉ）標的核酸と、
（ｉｖ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｖ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第２のタンデム反復核酸と
を含む切り出し可能な核酸構築物と、
（ｂ）該第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターと
を含む酵母細胞。
【請求項４６】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項４５に記載の酵母細胞。
【請求項４７】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項４５または４６に記載の酵母細胞。
【請求項４８】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項４５または４６に記載の酵母細胞。
【請求項４９】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする、請求項４５または４６に記載の酵母細胞。
【請求項５０】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｆ−ＣｐｈＩをコードする、請求項４５または４６に記載の酵母細胞。
【請求項５１】
前記ベクターが、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５２】
前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、請求項５１に記載の酵母細胞。
【請求項５３】
前記プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである、請求項５１に記載の酵母細胞。
【請求項５４】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５５】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５６】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項４５から５６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５８】
前記切り出し可能な核酸構築物が、前記酵母細胞のゲノムに組み込まれる、請求項４５から５７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５９】
（ａ）請求項２７に記載の切り出し可能な核酸構築物と、
（ｂ）前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターと
を含むキット。
【請求項６０】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項５９または６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項５９または６０に記載のキット。
【請求項６３】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする、請求項５９または６０に記載のキット。
【請求項６４】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｆ−ＣｐｈＩをコードする、請求項５９または６０に記載のキット。
【請求項６５】
前記ベクターが、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、請求項５９から６４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである、請求項６５に記載のキット。
【請求項６８】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項５９から６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６９】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項５９から６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項５９から６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７１】
少なくとも１つの標的核酸を、切り出し可能な核酸構築物を含む酵母細胞のゲノムから切り出す方法であって、該切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、
（ａ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第１のタンデム反復核酸と、
（ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｃ）標的核酸と、
（ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｅ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第２のタンデム反復核酸と
を含み、
ホーミングエンドヌクレアーゼが、該第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、該切り出し可能な核酸構築物を、該酵母細胞において、該ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法。
【請求項７２】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項７１から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記酵母細胞が、一倍体の酵母細胞である、請求項７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記酵母細胞が、二倍体の酵母細胞である、請求項７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記少なくとも１つの標的核酸を前記酵母細胞のゲノムから前記切り出すステップにより、対象の遺伝子の発現の活性化を結果としてもたらす、請求項７１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの標的核酸を前記酵母細胞のゲノムから前記切り出すステップにより、対象の遺伝子の発現の抑制を結果としてもたらす、請求項７１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも２つの標的核酸を、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法であって、各切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のタンデム反復核酸と、
（ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｃ）標的核酸と、
（ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｅ）第２のタンデム反復核酸と
を個別に含み、
少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の該第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、該少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を、該宿主細胞において、１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法。
【請求項９０】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する、請求項８９から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
少なくとも１つの切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
少なくとも１つの切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
各切り出し可能な核酸構築物の前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項８９から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項８９から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記酵母細胞が、一倍体の酵母細胞である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記酵母細胞が、二倍体の酵母細胞である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年８月３０日に出願された米国仮出願第６１／３７８，３５０号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本明細書で提供される核酸、組成物、および方法は一般に、分子生物学および遺伝子操作の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
標的核酸を宿主細胞ゲノムまたはエピソームから切り出す遺伝子操作法は、代謝工学、工業的微生物学、合成生物学、および分子遺伝学の基礎研究を含めた、多様な分野において必要とされている。しかし、標的核酸を除去するためのかつての方法は、適用が制限および限定されている。部位特異的なリコンビナーゼによる除去法は、例えば、宿主細胞内でゲノムの潜在的な不安定性をもたらす、有害な特異的リコンビナーゼ結合部位を残す。他の方法は、生成させうる切り出しイベントの頻度が低頻度であり、このため、切り出しイベントを受けるまれな宿主細胞の増殖−選択のための方法を必須とする。ゲノムの潜在的な不安定性をもたらすことなしに、標的核酸の、宿主細胞ゲノムまたはエピソームからの、高頻度でかつ高忠実度の切り出しを可能としうる核酸、組成物、および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
３．要旨
本明細書では、１または複数の遺伝子座を、宿主細胞のゲノムから切り出すことを可能とする核酸、組成物、および方法が提供される。第１の態様では、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復核酸と、ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｃ）標的核酸と、ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｅ）第２のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞ゲノムに組み込む。一部の実施形態では、第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が任意選択である。
【０００５】
第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、切り出し可能な核酸構築物を切断することを可能とする。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位に結合したホーミングエンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位で、またはこれに近接したところで、切り出し可能な核酸構築物を切断しうる。一部の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１４〜４０ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１４〜４０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に２０〜４０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に２５〜４０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に３０〜４０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に３５〜４０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に２４ヌクレオチド塩基対からなる。
【０００６】
一部の実施形態では、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。特定の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。
【０００７】
一部の実施形態では、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。
【０００８】
特定の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。具体的な実施形態では、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である。具体的な実施形態では、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である。
【０００９】
標的核酸の切断後、第１および第２のタンデム反復により促進される染色体内組換えを介して、宿主細胞ゲノムの修復が生じうる。一部の実施形態では、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、少なくとも１８ヌクレオチド塩基対を個別に含む。一部の実施形態では、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜５００ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、宿主細胞が酵母細胞であり、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる。
【００１０】
一部の実施形態では、標的核酸が、選択マーカーをコードする。一部の実施形態では、選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、上記の切り出し可能な核酸構築物が、第１のタンデム反復の５’側に連結した第１のゲノム組込み部位と、第２のタンデム反復の３’側に連結した第２のゲノム組込み部位とをさらに含む。第１および第２のゲノム組込み部位は、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込みを有利に促進しうる。
【００１２】
別の態様では、上記の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第１のタンデム反復の５’側に連結した第１の組込み部位と、第２のタンデム反復の３’側に連結した第２の組込み部位とをさらに含む。
【００１３】
一部の実施形態では、宿主細胞が原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ）である。一部の実施形態では、宿主細胞が真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）である。特定の実施形態では、宿主細胞が、単細胞の真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）である。特定の実施形態では、宿主細胞が、酵母細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である。他の実施形態では、宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の酵母細胞である。
【００１４】
一部の実施形態では、宿主細胞が、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターであって、ホーミングエンドヌクレアーゼが、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なベクターをさらに含む。特定の実施形態では、ベクターが、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである。
【００１６】
別の態様では、宿主細胞ゲノムに組み込まれる上記の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復核酸と、ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｃ）標的核酸と、ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｅ）第２のタンデム反復核酸とを含む。一部の実施形態では、宿主細胞が、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターをさらに含む。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＳｃｅＩである。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ＣｐｈＩである。
【００１７】
別の態様では、上記の切り出し可能な核酸構築物と、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含むキットが本明細書中に提供される。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＳｃｅＩである。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ＣｐｈＩである。
【００１８】
別の態様では、少なくとも１つの標的核酸を、宿主細胞のゲノムから切り出す方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞が、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復核酸と、ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｃ）標的核酸と、ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｅ）第２のタンデム反復核酸である核酸構築物を含む。特定の実施形態では、方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、宿主細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現させるステップを含む。方法の一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する。一部の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である。一部の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である。
【００１９】
別の態様では、少なくとも２つの標的核酸を、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法であって、各切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復核酸と、ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｃ）標的核酸と、ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、ｅ）第２のタンデム反復核酸とを個別に含む方法が本明細書中に提供される。一部の実施形態では、方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞において、ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞において、１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。
【００２０】
有利なことには、標的核酸の切り出しを受けるゲノム核酸は、第１および第２のタンデム反復を介する組換えにより形成される。一部の実施形態では、新たに形成されたゲノム核酸が、第１および第２のタンデム反復の組換え産物として生じる第３のタンデム反復を含む。有利な実施形態では、宿主細胞内に残存する切断可能なエンドヌクレアーゼ構築物のうちのごく一部が第３のタンデム反復であり、これは、わずか１８ヌクレオチド塩基対の長さでありうる。
【００２１】
本明細書で提供される組成物および方法は、有利なことに、ゲノムの潜在的な不安定性をもたらすことなしに、１または複数の標的核酸を、宿主細胞ゲノムまたはエピソームから正確かつ効率的に切り出すことを可能にする。遺伝子操作では、選択されたゲノム位置またはエピソーム位置において標的核酸を取り出すことが必要でありうる多くの場合が存在する。例えば、上記の組成物および方法は、同じ宿主細胞またはその後代におけるそれらの再使用を可能とするために、選択マーカーを取り出すのに有利に用いることができる。「マーカー再利用」は、限定された一組の選択マーカーを有する宿主生物において複数の遺伝子操作イベントを必要とする状況において有用でありうる。提供される組成物および方法はまた、宿主細胞を製造環境または自然環境に放出する前に、不要な核酸（例えば、抗生物質耐性マーカー）を宿主細胞から取り出すのにも用いることができる。
【００２２】
さらに、記載される組成物および方法は、宿主細胞およびその後代における特定の遺伝子の発現をオンまたはオフに変えるのに用いることができる。遺伝子をオフに変えるために、記載される組成物および方法を用いて、例えば、遺伝子のシス作用性制御エレメントのうちの１もしくは複数、そのコード配列のうちの一部もしくは全部、またはその転写アクチベーターのうちの１もしくは複数を表す核酸を切り出すことができる。遺伝子の発現をオンに変えるためには、干渉する核酸のストレッチ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｓｔｒｅｔｃｈ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を切り出して、特定の遺伝子の発現に必要とされるエレメント間において、必要な近接する相互作用を生み出すことができる。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
５’から３’への方向に、
（ａ）第１のタンデム反復核酸と、
（ｂ）第１のＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｃ）標的核酸と、
（ｄ）第２のＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｅ）第２のタンデム反復核酸と
を含む、切り出し可能な核酸構築物。
（項目２）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる、項目１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、項目１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目４）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、項目１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目５）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対を含む、項目１に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目６）
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、項目１から５のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目７）
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、項目６に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目８）
前記第１のタンデム反復核酸の５’側に連結した第１のゲノム組込み部位と、前記第２のタンデム反復核酸の３’側に連結した第２の組込み部位とをさらに含む、項目１から７のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目９）
前記標的核酸が、Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターエレメントを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目１０）
項目１から７のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞。
（項目１１）
Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターをさらに含む、項目１０に記載の宿主細胞。
（項目１２）
前記ベクターが、Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、項目１１に記載の宿主細胞。
（項目１３）
前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、項目１２に記載の宿主細胞。
（項目１４）
酵母細胞である、項目１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１５）
一倍体の酵母細胞である、項目１４に記載の宿主細胞。
（項目１６）
二倍体の酵母細胞である、項目１４に記載の宿主細胞。
（項目１７）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目１４に記載の宿主細胞。
（項目１８）
前記切り出し可能な核酸構築物が、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、項目１から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１９）
項目１に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから少なくとも１つの標的核酸を切り出す方法であって、該切り出し可能な核酸構築物を、該宿主細胞において、Ｆ−ＣｐｈＩと接触させるステップを含む方法。
（項目２０）
前記切り出すステップにより、プロモーターエレメントが、対象の遺伝子に作動可能に連結される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記宿主細胞が酵母細胞である、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
５’から３’への方向に、
（ａ）第１のゲノム組込み配列と、
（ｂ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第１のタンデム反復核酸と、
（ｃ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｄ）標的核酸と、
（ｅ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｆ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第２のタンデム反復核酸と、
（ｇ）第２のゲノム組込み配列と
を含み、
該第１および第２のゲノム組込み配列の各々が、酵母ゲノム遺伝子座との相同組換えを開始するのに十分な長さおよび同一性のものである、切り出し可能な核酸構築物。
（項目２８）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、項目２７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目２９）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、項目２７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３０）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、項目２７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３１）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３２）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３３）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３４）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３５）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、項目２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３６）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、項目２７から３０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３７）
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、項目２７から３６のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３８）
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、項目３７に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目３９）
前記第１および第２のゲノム組込み配列の各々が、個別に約５０〜５００ヌクレオチド塩基対からなる、項目２７から３８のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目４０）
前記第１および第２のゲノム組込み配列の各々が、個別に約５００ヌクレオチド塩基対からなる、項目２７から３８のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。
（項目４１）
項目２７から４０のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む酵母細胞。
（項目４２）
一倍体の酵母細胞である、項目４１に記載の酵母細胞。
（項目４３）
二倍体の酵母細胞である、項目４１に記載の酵母細胞。
（項目４４）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目４１に記載の酵母細胞。
（項目４５）
（ａ）５’から３’への方向に、
（ｉ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第１のタンデム反復核酸と、
（ｉｉ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｉｉｉ）標的核酸と、
（ｉｖ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｖ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第２のタンデム反復核酸と
を含む切り出し可能な核酸構築物と、
（ｂ）該第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターと
を含む酵母細胞。
（項目４６）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、項目４５に記載の酵母細胞。
（項目４７）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、項目４５または４６に記載の酵母細胞。
（項目４８）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、項目４５または４６に記載の酵母細胞。
（項目４９）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする、項目４５または４６に記載の酵母細胞。
（項目５０）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｆ−ＣｐｈＩをコードする、項目４５または４６に記載の酵母細胞。
（項目５１）
前記ベクターが、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、項目４５から５０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
（項目５２）
前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、項目５１に記載の酵母細胞。
（項目５３）
前記プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである、項目５１に記載の酵母細胞。
（項目５４）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、項目４５から５３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
（項目５５）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、項目４５から５３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
（項目５６）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、項目４５から５３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
（項目５７）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目４５から５６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
（項目５８）
前記切り出し可能な核酸構築物が、前記酵母細胞のゲノムに組み込まれる、項目４５から５７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
（項目５９）
（ａ）項目２７に記載の切り出し可能な核酸構築物と、
（ｂ）前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターと
を含むキット。
（項目６０）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、項目５９に記載のキット。
（項目６１）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、項目５９または６０に記載のキット。
（項目６２）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、項目５９または６０に記載のキット。
（項目６３）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする、項目５９または６０に記載のキット。
（項目６４）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、Ｆ−ＣｐｈＩをコードする、項目５９または６０に記載のキット。
（項目６５）
前記ベクターが、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、項目５９から６４のいずれか一項に記載のキット。
（項目６６）
前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、項目６５に記載のキット。
（項目６７）
前記プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである、項目６５に記載のキット。
（項目６８）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、項目５９から６７のいずれか一項に記載のキット。
（項目６９）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、項目５９から６７のいずれか一項に記載のキット。
（項目７０）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、項目５９から６７のいずれか一項に記載のキット。
（項目７１）
少なくとも１つの標的核酸を、切り出し可能な核酸構築物を含む酵母細胞のゲノムから切り出す方法であって、該切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、
（ａ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第１のタンデム反復核酸と、
（ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｃ）標的核酸と、
（ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｅ）１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる第２のタンデム反復核酸と
を含み、
ホーミングエンドヌクレアーゼが、該第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、該切り出し可能な核酸構築物を、該酵母細胞において、該ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法。
（項目７２）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する、項目７１から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、項目７１から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記酵母細胞が、一倍体の酵母細胞である、項目７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記酵母細胞が、二倍体の酵母細胞である、項目７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記少なくとも１つの標的核酸を前記酵母細胞のゲノムから前記切り出すステップにより、対象の遺伝子の発現の活性化を結果としてもたらす、項目７１から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記少なくとも１つの標的核酸を前記酵母細胞のゲノムから前記切り出すステップにより、対象の遺伝子の発現の抑制を結果としてもたらす、項目４５に記載の方法。
（項目８９）
少なくとも２つの標的核酸を、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法であって、各切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のタンデム反復核酸と、
（ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｃ）標的核酸と、
（ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、
（ｅ）第２のタンデム反復核酸と
を個別に含み、
少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の該第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、該少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を、該宿主細胞において、１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法。
（項目９０）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる、項目８９に記載の方法。
（項目９４）
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する、項目８９から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
少なくとも１つの切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
少なくとも１つの切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
各切り出し可能な核酸構築物の前記第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つが、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位である、項目８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
各切り出し可能な核酸構築物の前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、項目８９から１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記宿主細胞が酵母細胞である、項目８９から１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記酵母細胞が、一倍体の酵母細胞である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記酵母細胞が、二倍体の酵母細胞である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目１０５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、切り出し可能な核酸構築物の実施形態を示す図である。図１Ａ：５’から３’への方向に、第１のタンデム反復核酸（「ＤＲ１」）と、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（「ＥＳ１」）と、標的核酸（「標的核酸」）と、第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（「ＥＳ２」）と、第２のタンデム反復核酸（「ＤＲ２」）とを含む切り出し可能な核酸構築物を示す図である。図１Ｂ：図１Ａに示される切り出し可能な核酸構築物であって、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の５’側に連結した第１の組込み部位（ＩＳ１）および第２のタンデム反復核酸の３’側に連結した第２の組込み部位（ＩＳ２）をさらに含む切り出し可能な核酸構築物を示す図である。
【図２】図２は、切り出し可能な核酸構築物による形質転換によって、標的核酸が、組込み部位を介する相同組換えにより宿主細胞ゲノムの特定の遺伝子座にノックアウトおよび／またはノックインされることを示す図である。標的核酸には、２コピーのホーミングエンドヌクレアーゼ制限部位（それぞれ、ＥＳ１およびＥＳ２）が隣接しており、それらには、次に、切断後における修復を誘導する２つのタンデム反復（それぞれ、ＤＲ１およびＤＲ２）が隣接している。
【図３】図３は、標的核酸の切り出しを示す図である。一部の実施形態では、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（それぞれ、ＥＳ１およびＥＳ２）の各々を、１または複数の対応するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）で切断する（図３Ａ）ことにより、３つの核酸断片：（１）ゲノム核酸またはエピソーム核酸の左側アーム、（２）標的核酸を含む核酸断片、および（３）ゲノム核酸またはエピソーム核酸の右側アームが生じる（図３Ｂ）。切断後、宿主細胞における５’から３’への方向の内因性エキソヌクレアーゼにより、各核酸断片の１つの鎖が迅速に分解され、標的核酸を含む核酸断片が破壊され、ゲノム核酸またはエピソーム核酸の左側アーム（４）および右側アーム（５）に３’側テールが残される（図３Ｃ）。
【図４】図４は、標的核酸の切り出しを示す図である（続き）。左側アームおよび右側アームの一本鎖を分解することにより、互いと相補的なタンデム反復である、各アームに見出されるタンデム反復を露出する（図４Ａ）。タンデム反復における相補性領域は、ヘテロ二重鎖を形成し（図４Ｂ、６）、宿主細胞タンパク質により促進される組換えを受ける。右側アーム（７）および左側アーム（８）の一本鎖の３’側最末端は相補性でなく、このため、第１および第２のタンデム反復の相補性部分により形成されるヘテロ二重鎖の一部とはならない。これらの非相補性の３’側最末端は、フラップヌクレアーゼにより切断することができる。最後に、修復ＤＮＡ合成（ｒｅｐａｉｒ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）およびＤＮＡリガーゼによりヘテロ二重鎖を充てんし、ニックを封止して、標的核酸の切り出しが正確なインタクトなゲノム核酸またはエピソーム核酸が創製される（図４Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
５．１  定義
本明細書で用いられる「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、その天然の生物学的機能が、遺伝子変換イベントを触媒して、特定の遺伝子のエンドヌクレアーゼをコードする対立遺伝子を、その遺伝子のエンドヌクレアーゼを含まない対立遺伝子へと拡張することである、複数のエンドヌクレアーゼのうちのいずれか１つを指す。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１巻（２９号）：３７５７〜７４頁（２００１年）；  Ｊａｃｑｕｉｅｒ、Ｃｅｌｌ  、４１巻：３８３〜９４頁（１９８５年）を参照されたい。１）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、２）ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、３）Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、４）ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、および５）シアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼを含めた、少なくとも５つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーが公知である。例えば、Ｓｔｏｄｄａｒｄ、Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、３８巻（１号）：４９〜９５頁（２００６年）を参照されたい。これらのファミリーに由来する特定のホーミングエンドヌクレアーゼの例には、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩが挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、同じであるかまたは類似のホーミングエンドヌクレアーゼ制限部位を認識し、そしてこの部位でまたはこれに近接したところで切断する、このようなエンドヌクレアーゼの天然または人工のバリアントが、この定義内に包含されることを認める。
【００２５】
本明細書で用いられる「ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位」という用語は、特定のホーミングエンドヌクレアーゼにより認識される核酸を指す。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位への結合の後、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位で、またはこれに近接したところで、二本鎖切断を生じうる。
【００２６】
本明細書で用いられる「近接する」という用語は、特定の核酸から約１〜約１００、１〜約７５、１〜約５０、１〜約２５、１〜約２０、１〜約１５、１〜約１０、または１〜約５ヌクレオチドの距離を指す。
【００２７】
本明細書においてホーミングエンドヌクレアーゼとの関連で用いられる「切断する」および「切断」という用語は、特定の核酸において二本鎖切断を生じる作用を指す。当業者により理解される通り、二本鎖切断（ｂｒｅａｋ）は、平滑末端を残す場合もあり、粘着末端（すなわち、５’突出または３’突出）を残す場合もある。
【００２８】
本明細書で用いられる「タンデム反復」という用語は、２つ以上の核酸群の一部である核酸であって、そこでは、各メンバーが、他のメンバー（複数可）に関して、十分なヌクレオチドの相同性を共有して、互いの間の組換えを媒介する核酸を指す。タンデム反復は、上記タンデムの他のメンバーに関して、同じ方向（「定方向タンデム反復」）または反対方向（「逆方向タンデム反復」）のいずれかに配置される。
【００２９】
本明細書で用いられる「標的のＤＮＡセグメント」という用語は、本明細書で提供される組成物および方法を用いて宿主細胞ゲノムから切り出される任意の標的のＤＮＡセグメントを指す。有用な例には、タンパク質コード配列、選択マーカー、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写アクチベーター、転写リプレッサー、転写アクチベーター結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エキソン、ポリＡテール、複数のクローニング部位、核内局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または他の任意の天然に存在するかもしくは合成のＤＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、標的のＤＮＡセグメントが、天然由来のものでありうる。代替的に、標的のＤＮＡセグメントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて作製された、完全に合成由来のものでもありうる。さらに、標的のＤＮＡセグメントは、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組合せを含む場合もあり、単離された天然に存在するＤＮＡ分子と合成ＤＮＡ分子との任意の組合せを含む場合もある。例えば、標的のＤＮＡセグメントは、タンパク質コード配列に作動可能に連結した異種プロモーター、ポリＡテールに連結したタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結したタンパク質コード配列などを含みうる。
【００３０】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、細胞における複製が可能であり、挿入配列の複製をもたらすように、それに挿入配列を作動的に連結することが可能な染色体外の核酸分子に関して用いられる。有用な例には、例えば、プラスミド構築物、ファージ構築物、コスミドベクターなどの環状ＤＮＡ分子のほか、直鎖状核酸構築物（例えば、ラムダファージ構築物、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）など）が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターには、プロモーターおよび／またはターミネーターなどの発現シグナル、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子などの選択マーカー、ならびにその中へ挿入配列をクローニングしうる１または複数の制限部位が含まれうる。ベクターは、他の固有の特徴（それらが適応しうるＤＮＡ挿入配列のサイズなど）も有しうる。
【００３１】
本明細書で用いられる「ゲノムの」という用語は、宿主細胞内に含有される染色体ＤＮＡおよびエピソームＤＮＡの両方を指す。
【００３２】
５．２  切り出し可能な核酸構築物
一態様では、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）、ｂ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）、およびｃ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）のほか、ＤＲ１とＤとの間またはＤとＤＲ２との間のいずれかに位置する第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）、および必要に応じて、それぞれ、ＤとＤＲ２との間またはＤＲ１とＤとの間のいずれかに位置する第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ２）を含む切り出し可能な核酸構築物が本明細書中に提供される（図１Ａ）。したがって、一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、ｃ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、ｄ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、ｂ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、ｃ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、ｄ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、ｂ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、ｃ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、ｄ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ２）と、ｅ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）とを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、上記の切り出し可能な核酸構築物が、第１のタンデム反復の５’側に連結した第１のゲノム組込み配列（ＩＳ１）と、第２のタンデム反復の３’側に連結した第２のゲノム組込み配列（ＩＳ２）とをさらに含む。したがって、一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１の組込み配列（ＩＳ１）と、ｂ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、ｃ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、ｄ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、ｅ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）と、ｆ）第２の組込み配列（ＩＳ２）とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１の組込み配列（ＩＳ１）と、ｂ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、ｃ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、ｄ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、ｅ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）と、ｆ）第２の組込み配列（ＩＳ２）とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、５’から３’への方向に、ａ）第１の組込み配列（ＩＳ１）と、ｂ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、ｃ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、ｄ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、ｅ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ２）と、ｆ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）と、ｇ）第２の組込み配列（ＩＳ２）とを含む。
【００３４】
有利なことには、第１および第２の組込み配列は、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進しうる。切り出し可能な核酸構築物は、宿主細胞ゲノムに組み込まれると、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の、宿主細胞ゲノムからの、高頻度でかつ高忠実度の切り出しを可能とする。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、直鎖状ＤＮＡ分子である。
【００３５】
切り出し可能な核酸構築物は遺伝子操作での適用における選択マーカーの切り出しを促進するのに用いることもでき、生物を製造環境または天然の環境へと放出する前に抗生物質耐性マーカーを除去するのに用いることができる。切り出し可能な核酸構築物はまた、宿主細胞およびその子孫細胞における遺伝子の発現を恒久的にオンに変えるのに用いることもでき、恒久的にオフに変えるのに用いることもできる。遺伝子の発現を防止するために、そのシス作用性制御配列、そのコード配列、または転写アクチベーターをコードする遺伝子を切り出すことができる。遺伝子の発現を誘発するために、遺伝子または転写リプレッサーのためのＤＮＡ結合部位を切り出してそれに制御される遺伝子（複数可）の発現を可能とすることもでき、干渉するＤＮＡのストレッチ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｓｔｒｅｔｃｈ  ｏｆ  ＤＮＡ）を切り出して、特定の遺伝子の発現に必要とされるエレメント間の必須の近接する相互作用を生じさせることもできる。
【００３６】
切り出し可能な核酸構築物は、当業者に明らかな任意の技法により生成させることができる。特定の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物を、当技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分子クローニング技法を用いて生成させる。例えば、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；  「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）を参照されたい。
【００３７】
切り出し可能な核酸構築物の各エレメントについては、以下で詳細に論じる。
【００３８】
５．２．１．ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位
切り出し可能な核酸構築物は、少なくとも第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、必要に応じて、第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ２）とを含む。切り出し可能な核酸構築物が、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位だけを含む一部の実施形態では、ＥＳ１を、第１のタンデム反復（ＤＲ１）の３’側であり、かつ、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の５’側に、または標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の３’側であり、かつ、第２のタンデム反復（ＤＲ２）の５’側に配置することができる。切り出し可能な核酸構築物が、第１および第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位を含む一部の実施形態では、ＥＳ１を、第１のタンデム反復（ＤＲ１）の３’側であり、かつ、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の５’側に配置し、ＥＳ２を、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の３’側であり、かつ、第２のタンデム反復（ＤＲ２）の５’側に配置する。特定の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄ内に配置する。
【００３９】
ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、対応するホーミングエンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位で、またはこれに近接したところで、切り出し可能な核酸構築物を切断することを可能とする。
【００４０】
ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、１４〜４０ヌクレオチド塩基対の長さの範囲にわたる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、１４〜４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、１８〜４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、２０〜４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、２５〜４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、３０〜４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、３５〜４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、２４ヌクレオチドからなる。
【００４１】
一部の実施形態では、ＥＳ１を、ＤＲ１の３’側であり、かつ、Ｄの５’側に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、ＤＲ１の３’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、ＤＲ１の３’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、ＤＲ１の３’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄの５’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄの５’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１をＤの５’端の上流に配置する。
【００４２】
一部の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄの３’側であり、かつ、ＤＲ２の５’側に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄの３’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄの３’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、Ｄの３’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、ＤＲ２の５’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１を、ＤＲ２の５’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２をＤＲ２の５’端の上流に配置する。
【００４３】
一部の実施形態では、ＥＳ１と組み合わせて存在させる場合のＥＳ２を、Ｄの３’側であり、かつ、ＤＲ２の５’側に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２を、Ｄの３’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２を、Ｄの３’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２を、Ｄの３’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２を、ＤＲ２の５’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２を、ＤＲ２の５’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ２をＤＲ２の５’端の上流に配置する。
【００４４】
ＥＳ１およびＥＳ２の両方を存在させる一部の実施形態では、ＥＳ１とＥＳ２とを互いに関して反対方向に配置する。ＥＳ１およびＥＳ２の両方を存在させる一部の実施形態では、ＥＳ１とＥＳ２とを互いに関して同じ方向に配置する。
【００４５】
一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２が、当業者に公知である任意のホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。多種類のホーミングエンドヌクレアーゼが、４ｂｐの一本鎖３’突出を有するねじれ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）二本鎖切断（ＤＳＢ）を触媒する（しかし、ＩＩ群のイントロンに由来するホーミングエンドヌクレアーゼはこれを触媒しない）。一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２のうちの少なくとも１つが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。特定の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２の各々が、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。例えば、Ｓｔｏｄｄａｒｄ、Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、３８巻（１号）：４９〜９５頁（２００６年）を参照されたい。これらのファミリーは、それらの保存されたヌクレアーゼ活性部位のコアモチーフおよび触媒機構、生物学的分布およびゲノム分布、ならびに非ホーミングヌクレアーゼ系との広範にわたる関係において大きく異なる。これらのファミリーに由来する有用な特定のホーミングエンドヌクレアーゼの例には、Ｉ−ＣｒｅＩ（Ｒｏｃｈａｉｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻：９７５〜９８４頁（１９８５年）を参照されたい）、Ｉ−ＭｓｏＩ（Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９巻：９６０〜９６９頁（２００１年）を参照されたい）、Ｉ−ＳｃｅＩ（Ｆｏｕｒｙら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４４０巻：３２５〜３３１頁（１９９８年）を参照されたい）、Ｉ−ＳｃｅＩＶ（Ｍｏｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：４０６９〜４０７６頁（１９９２年）を参照されたい）、Ｈ−ＤｒｅＩ（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ、１０巻：８９５〜９０５頁（２００２年）を参照されたい）、Ｉ−ＨｍｕＩ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ−Ｂｌａｉｒら、Ｃｅｌｌ、６３巻：４１７〜４２４頁（１９９０年）；  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ−Ｂｌａｉｒら、Ｃｅｌｌ、８４巻：２１１〜２２１頁（１９９６年）を参照されたい）、Ｉ−ＰｐｏＩ（Ｍｕｓｃａｒｅｌｌａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１０巻：３３８６〜３３９６頁（１９９０年）を参照されたい）、Ｉ−ＤｉｒＩ（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、７６巻：７２５〜７３４頁（１９９４年）；  Ｊｏｈａｎｓｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：４４０５頁（１９９３年）を参照されたい）、Ｉ−ＮｊａＩ（Ｅｌｄｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９巻：２８１〜２８８頁（１９９９年）；  Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１巻：４５７〜４６３頁（１９９４年）を参照されたい）、Ｉ−ＮａｎＩ（Ｅｌｄｅ，  Ｓ．ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９巻：２８１〜２８８頁（１９９９年）；  Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１巻：４５７〜４６３頁（１９９４年）を参照されたい）、Ｉ−ＮｉｔＩ（Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１巻：４５７〜４６３頁（１９９４年）；  Ｅｌｄｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９巻：２８１〜２８８頁（１９９９年）を参照されたい）、Ｉ−ＴｅｖＩ（Ｃｈｕら、Ｃｅｌｌ．、４５巻：１５７〜１６６頁（１９８６年）を参照されたい）、Ｉ−ＴｅｖＩＩ（Ｔｏｍａｓｃｈｅｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５巻：３６３２〜３６３３頁（１９８７年）を参照されたい）、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ（Ｅｄｄｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、５巻：１０３２〜１０４１頁（１９９１年）を参照されたい）、Ｆ−ＴｅｖＩ（Ｆｕｊｉｓａｗａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻：７４７３〜７４８１頁（１９８５年）を参照されたい）、Ｆ−ＴｅｖＩＩ（Ｋａｄｙｒｏｖら、Ｄｏｋｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３９巻：１４５〜１４７頁（１９９４年）；  Ｋａｌｉｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８巻：４２７７頁（１９９０年）を参照されたい）、Ｆ−ＣｐｈＩ（Ｚｅｎｇら、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．、１９巻：２１８〜２２２頁（２００９年）を参照されたい）、ＰＩ−ＭｇａＩ（Ｓａｖｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９巻：４３１０〜４３１８頁（２００１年）を参照されたい）、Ｉ−ＣｓｍＩ（Ｃｏｌｌｅａｕｘら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２３巻：２８８〜２９６頁（１９９０年）を参照されたい）、Ｉ−ＣｅｕＩ（Ｔｕｒｍｅｌら、Ｊ  ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１８巻：２９３〜３１１頁（１９９１年）を参照されたい）、およびＰＩ−ＳｃｅＩ（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６５巻：６７２６〜６７３３頁（１９９０年）を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
一部の実施形態では、ＥＳ１またはＥＳ２のうちの少なくとも１つが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。  特定の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２の各々が、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。
【００４７】
本明細書で提供される組成物および方法の具体的な実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２を、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が宿主細胞の野生型（操作されていない）核ＤＮＡに存在しないことに基づき選択する。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ（ｐｐｓ１）、ＰＩ−ＭｇａＩ（ｐｐｓ１）、およびＦ−ＣｐｈＩの認識部位が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型（操作されていない）核ＤＮＡに存在しない（例えば、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、２００９年、１９巻、２１８〜２２頁；  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９８８年、８５巻、６０２２〜６頁；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００２年、２７７巻、１６２５７〜６４頁；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００２年、２７７巻、４０３５２〜６１頁；およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００１年、２９巻、４３１０〜８頁を参照されたい）一方で、ＶＤＥ、別名ＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位は、ある株には存在するが、他の株には存在しない（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００１年、２９巻、４２１５〜２３頁を参照されたい）。したがって、本明細書で提供される組成物および方法の一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２が、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位であり、宿主細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２が、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ（ｐｐｓ１）の認識部位であり、宿主細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２が、ＰＩ−ＭｇａＩ（ｐｐｓ１）の認識部位であり、宿主細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２が、Ｆ−ＣｐｈＩの認識部位であり、宿主細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。
【００４８】
一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２の選択が、以下の基準：（１）ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、宿主細胞の野生型（操作されていない）ゲノムの全体（すなわち、ミトコンドリアＤＮＡを含めた）に存在しないこと、（２）対応するホーミングエンドヌクレアーゼの発現が存在しない場合は、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が切断されないこと、および（３）例えば、ゲノムに組み込んだ標的核酸の切り出しを誘導する、対応するホーミングエンドヌクレアーゼの核における発現が、宿主細胞に有害ではないことのうちの１または複数を満たすことに基づく。一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２が、宿主細胞の野生型（操作されていない）核ＤＮＡに存在しないことに加えて、上記で列挙した基準のうちの１つ、２つ、または３つ全てを満たす。
【００４９】
５．２．２．タンデム反復
切り出し可能な核酸構築物は、第１および第２のタンデム反復を含む。第１のタンデム反復（ＤＲ１）は、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の５’側に配置し、第２のタンデム反復（ＤＲ２）は、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）の３’側に配置する。
【００５０】
第１および第２のタンデム反復は、ホーミングエンドヌクレアーゼによる切断後に、切り出し可能な核酸構築物の残留物の組換えを媒介しうる。互いに関して同じ向きに配置されたタンデム反復（定方向タンデム反復）は、一本鎖アニーリング経路を介して、宿主細胞内の染色体内組換えを有利に媒介し得る。例えば、Ｉｖａｎｏｖら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４２巻：６９３〜７０４頁（１９９６年）を参照されたい。
【００５１】
ＤＲ１およびＤＲ２は、ホーミングエンドヌクレアーゼによる切断後に、切り出し可能な核酸構築物の残留物の組換えを媒介しうる、任意のタンデム反復でありうる。このような組換えに影響を及ぼしうるタンデム反復の特性には、長さ、ＧＣ含量、宿主細胞ゲノムの天然の配列との相同性、およびタンデム反復の間の配列同一性の程度が挙げられるがこれらに限定されない。配列同一性の程度は、デフォルトパラメータによるＢＬＡＳＴ  ２．２．２またはＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８など、本明細書で記載されるコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを含めた、任意のコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを用いて決定することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、ＤＲ１を、ＥＳ１の５’端に配置する。一部の実施形態では、ＤＲ１を、ＥＳ１の５’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＤＲ１を、ＥＳ１の５’端の上流に配置する。
【００５３】
一部の実施形態では、ＤＲ２を、ＥＳ１の３’端に配置するか、またはＥＳ１およびＥＳ２の両方を存在させる場合は、ＥＳ２の３’端に配置する。一部の実施形態では、ＤＲ２を、ＥＳ１の３’端にすぐ隣接して配置するか、またはＥＳ１およびＥＳ２の両方を存在させる場合は、ＥＳ２の３’端に配置する。一部の実施形態では、ＤＲ２を、ＥＳ１の３’端の下流に配置するか、またはＥＳ１およびＥＳ２の両方を存在させる場合は、ＥＳ２の３’端に配置する。
【００５４】
一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に少なくとも１８ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８〜５００ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に、１８〜５００、１８〜４９５、１８〜４９０、１８〜４８５、１８〜４８０、１８〜４７５、１８〜４７０、１８〜４６５、１８〜４６０、１８〜４５５、１８〜４５０、１８〜４４５、１８〜４４０、１８〜４３５、１８〜４３０、１８〜４２５、１８〜４２０、１８〜４１５、１８〜４１０、１８〜４０５、１８〜４００、１８〜３９５、１８〜３９０、１８〜３８５、１８〜３８０、１８〜３７５、１８〜３７０、１８〜３６５、１８〜３６０、１８〜３５５、１８〜３５０、１８〜３４５、１８〜３４０、１８〜３３５、１８〜３３０、１８〜３２５、１８〜３２０、１８〜３１５、１８〜３１０、１８〜３０５、１８〜３００、１８〜２９５、１８〜２９０、１８〜２８５、１８〜２８０、１８〜２７５、１８〜２７０、１８〜２６５、１８〜２６０、１８〜２５５、１８〜２５０、１８〜２４５、１８〜２４０、１８〜２３５、１８〜２３０、１８〜２２５、１８〜２２０、１８〜２１５、１８〜２１０、１８〜２０５、１８〜２００、１８〜１９５、１８〜１９０、１８〜１８５、１８〜１８０、１８〜１７５、１８〜１７０、１８〜１６５、１８〜１６０、１８〜１５５、１８〜１５０、１８〜１４５、１８〜１４０、１８〜１３５、１８〜１３０、１８〜１２５、１８〜１２０、１８〜１１５、１８〜１１０、１８〜１０５、１８〜１００、１８〜９５、１８〜９０、１８〜８５、１８〜８０、１８〜７５、１８〜７０、１８〜６５、１８〜６０、１８〜５５、１８〜５０、１８〜４５、１８〜４０、１８〜３５、１８〜３０、１８〜２５、または１８〜２０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００ヌクレオチド塩基対からなる。
【００５５】
一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８〜２００ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８〜１５０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８〜１００ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８〜８０ヌクレオチド塩基対からなる。
【００５６】
一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも２５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも３０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも３５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも４０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも４５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも６０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも６５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも７５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも８５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２が、１００％のヌクレオチド配列同一性を共有する。
【００５７】
好ましい実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２を、互いに関して同じ方向に配置する（すなわち、ＤＲ１およびＤＲ２を、定方向タンデム反復とする）。
【００５８】
５．２．３．標的のＤＮＡセグメント
切り出し可能な核酸構築物は、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）を含む。一部の実施形態では、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）を、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）の３’側に配置する。一部の実施形態では、第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ２）を存在させる場合、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）を、ＥＳ２の５’側に配置する。一部の実施形態では、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）を、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）の３’側であり、かつ、第２のタンデム反復（ＤＲ２）の５’側に配置する。一部の実施形態では、標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）を、第１のタンデム反復（ＤＲ１）の３’側であり、かつ、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）の５’側に配置する。
【００５９】
一部の実施形態では、Ｄの５’端を、ＥＳ１の３’端に配置する。一部の実施形態では、Ｄの５’端を、ＥＳ１の３’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、Ｄの５’端を、ＥＳ１の３’端の下流に配置する。
【００６０】
一部の実施形態では、Ｄの５’端を、ＤＲ１の３’端に配置する。一部の実施形態では、Ｄの５’端を、ＤＲ１の３’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、Ｄの５’端を、ＤＲ１の３’端の下流に配置する。
【００６１】
一部の実施形態では、ＥＳ１をＥＳ２と組み合わせて存在させる場合、Ｄの３’端を、ＥＳ２の５’端に配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１をＥＳ２と組み合わせて存在させる場合、Ｄの３’端を、ＥＳ２の５’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＥＳ１をＥＳ２と組み合わせて存在させる場合、Ｄの３’端を、ＥＳ２の５’端の上流に配置する。
【００６２】
一部の実施形態では、Ｄの３’端を、ＤＲ２の５’端に配置する。一部の実施形態では、Ｄの３’端を、ＤＲ２の５’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、Ｄの３’端を、ＤＲ２の５’端の上流に配置する。
【００６３】
標的のＤＮＡセグメントは、当業者によって有用であるとみなされる任意の標的のＤＮＡセグメントでありうる。例えば、標的のＤＮＡセグメントは、宿主ゲノムに「ノックイン」され、その後切り出しにより「ノックアウト」されうる、対象の遺伝子を含みうる。一部の実施形態では、標的核酸が、切り出し可能な核酸構築物の宿主ゲノムへの組込みについて選択するのに用いることができ、その後切り出しにより宿主ゲノムから取り出される、選択マーカーを含みうる。
【００６４】
標的のＤＮＡセグメントの有用な例には、タンパク質コード配列、選択マーカー、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写アクチベーター、転写リプレッサー、転写アクチベーター結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エキソン、ポリＡテール、複数のクローニング部位、核内局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または他の任意の天然に存在するまたは合成のＤＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、標的のＤＮＡセグメントが、天然起源のものでありうる。代替的に、標的のＤＮＡセグメントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて作製された、完全に合成起源のものでもありうる。さらに、標的のＤＮＡセグメントは、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組合せを含む場合もあり、単離された天然に存在するＤＮＡ分子と合成ＤＮＡ分子との任意の組合せを含む場合もある。例えば、標的のＤＮＡセグメントは、タンパク質コード配列に作動可能に連結した異種プロモーター、ポリＡテールに連結したタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結したタンパク質コード配列などを含みうる。標的のＤＮＡセグメントは、当技術分野において公知の標準的な手順により、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から得ることもでき、化学合成により得ることもでき、ｃＤＮＡクローニングにより得ることもでき、または、所望の細胞から精製された、ゲノムＤＮＡもしくはその断片のクローニングにより得ることもでき、あるいはＰＣＲ増幅およびクローニングにより得ることもできる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（２００１年）；  Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｄ．Ｍ．（編）、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、２版、ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．（１９９５年）を参照されたい。
【００６５】
一部の実施形態では、Ｄが、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターエレメントを含む。例えば、切り出し可能な核酸構築物が、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼであるＦ−ＣｐｈＩの第１および第２の認識部位を含む場合、標的のＤＮＡセグメントは、Ｆ−ＣｐｈＩをコードする核酸配列であって、プロモーターエレメントに作動可能に連結した核酸配列を包含しうる。具体的な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含めた、標的のＤＮＡセグメントの切り出しが、例えば、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込み後に、選択的に切り出され得るように、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする核酸の発現を制御するプロモーターエレメントが、誘導性プロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトース誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１遺伝子、ＧＡＬ７遺伝子、およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）である。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｇｒＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択される。具体的な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＳｃｅＩである。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ＣｐｈＩである。
【００６６】
一部の実施形態では、Ｄが、１または複数の選択マーカーをコードする。一部の実施形態では、選択マーカーが、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーは、組換え核酸配列を生じるのに用いられるプラスミドベクターに一般的である。例えば、ｐＢＲに由来するプラスミドおよびｐＵＣに由来するプラスミドは、選択マーカーとして、細菌性薬物耐性マーカーであるＡＭＰｒ遺伝子またはＢＬＡ遺伝子を含有する（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，  Ｊ．  Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５巻：３７３７頁（１９７８年）を参照されたい）。ＢＬＡ遺伝子は、β−ラクタマーゼとして機能し、スペクトルの狭いセファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン、ならびにテモシリンを除く全ての抗グラム陰性菌性ペニシリン類などのβ−ラクタム抗生物質に対する細菌耐性に関与する酵素であるＴｅｍ−１をコードする。
【００６７】
他の有用な選択マーカーには、ＮＡＴ１遺伝子、ＰＡＴ遺伝子、ＡＵＲ１−Ｃ遺伝子、ＰＤＲ４遺伝子、ＳＭＲ１遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、マウスｄｈｆｒ遺伝子、ＨＰＨ遺伝子、ＤＳＤＡ遺伝子、ＫＡＮＲ遺伝子、およびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉのＮＡＴ１遺伝子は、ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、ノーセオトリシンに対する耐性を付与する。Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのＴｕ９４に由来するＰＡＴ遺伝子は、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、ビアロホスに対する耐性を付与する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＵＲ１−Ｃ遺伝子は、Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓが生成する、出芽酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して毒性の抗真菌抗生物質であるＡｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａ（ＡｂＡ）に対する耐性を付与する。ＰＤＲ４遺伝子は、セルレニンに対する耐性を付与する。ＳＭＲ１遺伝子は、スルホメツロンメチルに対する耐性を付与する。Ｔｎ９トランスポゾンに由来するＣＡＴコード配列は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。マウスｄｈｆｒ遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与する。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードし、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子は、Ｄ−セリンデアミナーゼをコードし、酵母が唯一の窒素供給源としてのＤ−セリンを含むプレートで増殖することを可能とする。Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、Ｇ４１８に対する耐性を付与する。Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓに由来するＳＨ  ＢＬＥ遺伝子は、ゼオシン結合タンパク質をコードし、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。
【００６８】
他の実施形態では、選択マーカーが、酵母宿主株の形質転換細胞の選択を可能とする酵母遺伝子を含む。一部の実施形態では、選択マーカーが、宿主株における栄養素要求性、例えば、栄養性の（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ）栄養素要求性をレスキューする。このような実施形態では、宿主株が、例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＭＥＴ１５、およびＴＲＰ１などの栄養素要求性の表現型をもたらす、宿主のアミノ酸生合成経路のうちの１もしくは複数の遺伝子における機能破壊、または例えば、ＡＤＥ２およびＵＲＡ３などの栄養素要求性の表現型をもたらす、宿主のヌクレオチド生合成経路のうちの１もしくは複数の遺伝子における機能破壊を含む。具体的な実施形態では、遺伝子改変された酵母宿主株が、ＵＲＡ３遺伝子における機能破壊を含む。栄養素要求性の表現型をもたらす宿主酵母における機能破壊は、点変異の場合もあり、部分的または完全な遺伝子欠失の場合もあり、ヌクレオチドの付加または置換の場合もある。アミノ酸またはヌクレオチドの生合成経路内の機能破壊は、宿主株を、原栄養性の野生型株とは対照的に、１または複数の栄養素の補充なしには培地での最適の増殖が不可能な、栄養素要求性の変異体とする。それで、宿主株において機能破壊された生合成遺伝子は、さらにまた、例えば、破壊された生合成遺伝子の機能的コピーを含む１または複数のプラスミドを導入すると後にレスキューされうる、栄養素要求性遺伝子マーカーとして働くことができる。
【００６９】
ＵＲＡ３酵母遺伝子、ＴＲＰ１酵母遺伝子、およびＬＹＳ２酵母遺伝子の選択マーカーとしての使用は、陽性選択および陰性選択の両方が可能であるために、顕著な利点を有する。陽性選択が、ＵＲＡ３の変異、ＴＲＰ１の変異、およびＬＹＳ２の変異に対して栄養素要求性を補完することにより実施されるのに対し、陰性選択は、原栄養性株の増殖は阻止するが、ＵＲＡ３の変異体、ＴＲＰ１の変異体、およびＬＹＳ２の変異体のそれぞれの増殖を可能とする、特異的阻害剤である５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸、およびα−アミノアジピン酸（ａ−ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）（αＡＡ）のそれぞれに基づく。ＵＲＡ３遺伝子は、ウラシルの生合成に必要とされる酵素であるオロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼをコードする。ＦＯＡは、デカルボキシラーゼの作用により、毒性化合物である５−フルオロウラシルへと転換されるようであるために、ＵＲＡ３＋細胞は全て死滅させるがｕｒａ３−細胞は死滅させない、ＦＯＡを含有する培地において、ｕｒａ３−細胞（またはｕｒａ５−細胞）を選択することができる。ＦＯＡ培地における陰性選択は、高度に識別的であり、通常は１０−２未満のＦＯＡ耐性コロニーがＵｒａ＋である。ＦＯＡによる選択手順は、一倍体株において、変異によりｕｒａ３マーカーを生成させるのに用いることができ、より重要なことには、ＵＲＡ３含有プラスミドを有さない細胞を選択するのに用いることができる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファンの生合成における第３ステップを触媒するホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼをコードする。５−フルオロアントラニル酸を用いる対抗選択は、アントラニル酸をトリプトファンへと変換するのに必要とされる酵素を欠き、このため、５−フルオロアントラニル酸に対して耐性である株による代謝拮抗を包含する。ＬＹＳ２遺伝子は、リシンの生合成に必要とされる酵素であるアミノアジピン酸レダクターゼをコードする。通常の窒素供給源は欠くが、リシンおよびαＡＡは含有する培地において、ｌｙｓ２−変異体およびｌｙｓ５−変異体は増殖するが、正常な株は増殖しない。明らかに、ｌｙｓ２変異およびｌｙｓ５変異は、高レベルのαＡＡにより形成される、リシン生合成の毒性の中間体を蓄積させるが、これらの変異体は、なおもαＡＡを窒素供給源として用いうる。ＦＯＡによる選択手順と同様に、ＬＹＳ２含有プラスミドをｌｙｓ２宿主から都合よく駆逐することもできる。
【００７０】
他の実施形態では、選択マーカーが、栄養素要求性の変異をレスキューするマーカー以外のマーカーである。例えば、酵母宿主細胞株は、変異が公知の選択法により同定されうる限りにおいて、栄養素要求性の変異以外の変異、例えば、宿主に致死性でなく、また、株の意図される使用、例えば、工業的発酵に対して有害作用をもたらさすこともない変異を含みうる。
【００７１】
５．２．４．ゲノム組込み配列
一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第１および第２のゲノム組込み配列を含む。ゲノム組込み配列は、本明細書で記載される切り出し可能な核酸構築物が、例えば、宿主細胞を介する相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれることを可能とする。切り出し可能な核酸構築物を相同組換えによりゲノムへと組み込むために、切り出し可能な核酸構築物は、一方の末端において、上流のゲノム組込み配列（ＩＳ１）を含む核酸配列を含み、他方の末端において、下流のゲノム組込み配列（ＩＳ２）を含む核酸配列を含み、各ゲノム組込み配列が、その染色体を有する宿主細胞による相同組換えを開始するのに十分な長さおよび配列同一性を有することが好ましい。一部の実施形態では、第１のゲノム組込み配列（ＩＳ１）を、第１のタンデム反復（ＤＲ１）の５’側に配置し、第２のゲノム組込み配列（ＩＳ２）を、第２のタンデム反復（ＤＲ２）の３’側に配置する。
【００７２】
特定の実施形態では、ＩＳ１を、ＤＲ１の５’側に配置する。一部の実施形態では、ＩＳ１を、ＤＲ１の５’側にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＩＳ１を、ＤＲ１の５’側の上流に配置する。
【００７３】
特定の実施形態では、ＩＳ２を、ＤＲ２の３’側に配置する。一部の実施形態では、ＩＳ２を、ＤＲ２の３’側にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ＩＳ２を、ＤＲ２の３’側の下流に配置する。
【００７４】
第１および第２のゲノム組込み配列は、切り出し可能な核酸構築物を、相同組換えを介して宿主細胞ゲノム、例えば、酵母ゲノムの特定の遺伝子座へと組み込むことを可能とする。切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞ゲノムへと標的化して組み込むことにより、有用な利点をもたらすことができる。例えば、切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞ゲノムにおける対象の遺伝子に組み込み、これにより、対象の遺伝子を「ノックアウト」し、これを非機能性とすることができる（図２）。代替的に、切り出し可能な核酸構築物の標的化した組込みは、対象の遺伝子を特定のゲノム遺伝子座へと「ノックイン」するのに有用な場合もあり、制御エレメントを対象の遺伝子近傍に「ノックイン」して、例えば、対象の遺伝子の発現を活性化させるか、または上方制御するのに有用な場合もある。
【００７５】
特定のゲノム遺伝子座における切り出し可能な核酸構築物の組込みに影響を及ぼしうる特性には、ゲノム組込み配列の長さ、切り出し可能な核酸構築物の全長、およびゲノム組込み遺伝子座のヌクレオチド配列または位置が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ゲノム組込み配列の１つの鎖と宿主細胞ゲノムの特定の遺伝子座の１つの鎖との間の有効なヘテロ二重鎖の形成は、ゲノム組込み配列の長さに依存しうる。ゲノム組込み配列の長さについての有効な範囲は、５０〜５，０００ヌクレオチドである。ゲノム組込み配列とゲノム遺伝子座との間の相同性についての有効な長さに関する議論には、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１巻：５５８６〜９１頁（１９９１年）を参照されたい。
【００７６】
ＩＳ１およびＩＳ２は、切り出し可能な核酸構築物のゲノム組込みを可能とする、十分な長さと宿主細胞のゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性とを有する任意のヌクレオチド配列を含みうる。一部の実施形態では、「十分な配列同一性」が、少なくとも２０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも２５０塩基対、少なくとも５００塩基対、または５００塩基対超の長さにわたり、宿主細胞のゲノム遺伝子座に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を指す。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノム遺伝子座の長さが、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００または５，０００ヌクレオチドである。配列同一性の程度は、デフォルトパラメータによるＢＬＡＳＴ  ２．２．２またはＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８など、本明細書で記載されるコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを含めた、任意のコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを用いて決定することができる。
【００７７】
特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、原核生物ゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記原核生物ゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、真核生物ゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記真核生物ゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、酵母ゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記酵母ゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。切り出し可能な核酸構築物の組込みに適するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム遺伝子座には、ＮＤＴ８０遺伝子座、ＨＯ遺伝子座、ＧＡＬ８０遺伝子座、ＨＴＸ３遺伝子座、ＧＡＬ２遺伝子座、およびＧＡＬ１−ＧＡＬ１０−ＧＡＬ７遺伝子座が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約５０〜５，０００ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約５０〜５，０００ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約１００〜２，５００ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約１００〜１，０００ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約２５０〜７５０ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００または５，０００ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、ＩＳ１およびＩＳ２の各々が、個別に約５００ヌクレオチドからなる。
【００７９】
第１および第２のゲノム組込み配列を含む切り出し可能な核酸構築物は、当業者に明らかな任意の技法を用いて作製することができる。特定の実施形態では、当技術分野において公知のオーバーラップ伸長ＰＣＲ技法および分子クローニング技法を用いて、第１および第２の組込み配列を含む切り出し可能な核酸構築物を作製する。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１３６６３３号、米国特許第５，０２３，１７１号（過剰伸長ＰＣＲによるスプライシング）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい。
【００８０】
５．３  宿主細胞
別の態様では、上記の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞が、宿主細胞ゲノムに組み込まれる切り出し可能な核酸構築物を含む。
【００８１】
適切な宿主細胞には、標的のＤＮＡセグメントの染色体の遺伝子座またはエピソームの遺伝子座からの切り出しが所望である任意の細胞が含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞が、原核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、細菌細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、真核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性がん腫細胞、またはマウス胚性幹細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、昆虫細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、Ｓ２細胞、シュナイダー細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞、またはＳｆ９細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、単細胞の真核生物細胞である。
【００８２】
一部の実施形態では、宿主細胞が、酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である。有用な酵母宿主細胞には、微生物寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託され、とりわけ、
【００８３】
【化１】
0005883449.tif 000002
に属する酵母細胞が含まれる。
【００８４】
一部の実施形態では、酵母宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ細胞、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ細胞、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在ではＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして公知である）細胞である。特定の実施形態では、酵母宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。一部の実施形態では、酵母宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ細胞またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（かつては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれた）細胞である。一部の実施形態では、酵母宿主細胞が、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓなど、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する細胞である。別の具体的な実施形態では、酵母宿主細胞が、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞である。
【００８５】
具体的な実施形態では、酵母宿主細胞が、パン酵母細胞、ＣＢＳ  ７９５９細胞、ＣＢＳ  ７９６０細胞、ＣＢＳ  ７９６１細胞、ＣＢＳ  ７９６２細胞、ＣＢＳ  ７９６３細胞、ＣＢＳ  ７９６４細胞、ＩＺ−１９０４細胞、ＴＡ細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、ＳＡ−１細胞、Ｍ−２６細胞、Ｙ−９０４細胞、ＰＥ−２細胞、ＰＥ−５細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＲ−１細胞、ＢＲ−２細胞、ＭＥ−２細胞、ＶＲ−２細胞、ＭＡ−３細胞、ＭＡ−４細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＣＢ−１細胞、ＮＲ−１細胞、ＢＴ−１細胞、およびＡＬ−１細胞からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、ＰＥ−２細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、およびＳＡ−１細胞からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞が、ＰＥ−２細胞である。別の具体的な実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞が、ＣＡＴ−１細胞である。別の具体的な実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞が、ＢＧ−１細胞である。
【００８６】
特定の実施形態では、当技術分野において公知である、外因性核酸を細胞に導入するための従来の任意の技法を用いて、上記のとおりの切り出し可能な核酸構築物を宿主細胞に導入することができる。このような方法には、細胞による溶液からの分子の直接的な取込み、または、例えば、リポソームもしくはイムノリポソームを用いるリポフェクションを介する取込みの促進、粒子を介するトランスフェクション、などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号；  Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０年、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、最新版、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい。当技術分野では、酵母細胞を形質転換するための具体的な方法が周知である。Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７５巻：１２９２〜３頁（１９７８年）；  Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：３３７６〜３３８５頁（１９８５年）を参照されたい。例示的な技法には、スフェロプラスティング、電気穿孔、ＰＥＧ  １０００を介する形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムを介する形質転換が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
５．４  ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクター
別の態様では、標的のＤＮＡセグメントを、切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから切り出すのに有用なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする発現ベクターが本明細書中に提供される。
【００８８】
特定の実施形態では、発現ベクターが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。特定の実施形態では、発現ベクターが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｇｒＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。具体的な実施形態では、発現ベクターが、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする。特定の実施形態では、発現ベクターが、Ｆ−ＣｐｈＩをコードする。
【００８９】
ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターが、宿主細胞内のホーミングエンドヌクレアーゼの発現を可能とする任意の発現ベクターである。適切な発現ベクターには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳動物細胞において遺伝子を発現させるのに使用するための公知の発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＳＣＭ５２５、ｐＤＩＣ７３、ｐＳＣＭ３５１、およびｐＳＣＭ３５３が挙げられるがこれらに限定されない。酵母発現ベクターの例には、ｐＰＥＸ７およびｐＰＥＸ４０８が挙げられるがこれらに限定されない。他の適切な発現ベクターの例には、ＣＥＮ．ＡＲＳ配列と酵母用選択マーカーとを含む、酵母−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｐＲＳシリーズのシャトルベクター、および２μプラスミドが挙げられる。
【００９０】
特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターが、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする選択マーカーをさらに含む。特定の実施形態では、選択マーカーが、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００９１】
特定の実施形態では、発現ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した転写終結配列およびプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターが、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターが、誘導性プロモーターである。
【００９２】
酵母細胞に用いるのに適する例示的なプロモーターの例には、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、および誘導性プロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば、ＧＡＬ１遺伝子、ＧＡＬ７遺伝子、およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）の誘導性ガラクトースプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９３】
一部の実施形態では、核内局在化配列（ＮＬＳ）を含むさらなるヌクレオチド配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’側に連結する。ＮＬＳは、大型（＞２５ｋＤ）のホーミングエンドヌクレアーゼの核内局在化を促進しうる。一部の実施形態では、核内局在化配列が、ＳＶ４０の核内局在化配列である。一部の実施形態では、核内局在化配列が、酵母の核内局在化配列である。
【００９４】
ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターは、当業者に明らかな任意の技法を介して作製することができる。特定の実施形態では、当技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分子クローニング法を用いてベクターを作製する。例えば、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい。
【００９５】
５．５  標的のＤＮＡセグメントを切り出す方法
別の態様では、１または複数の標的のＤＮＡセグメントを、上記の１または複数の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから切り出す方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位で、またはそれに近接したところで切断するように、方法が、切り出し可能な核酸構築物、例えば、染色体内に組み込んだ核酸構築物を、宿主細胞において、ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する。
【００９６】
切り出し可能な核酸構築物は、当業者により適切であるとみなされる任意の技法により、ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させることができる。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いて、ホーミングエンドヌクレアーゼを、宿主細胞内で発現させる。上記の発現ベクターを含めた、任意のホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いることができる。ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターは、選択マーカー、例えば、標的のＤＮＡセグメントを切り出した後、発現ベクターを含有しない宿主細胞の選択を可能とする対抗選択マーカーを含み得る。用いられる発現ベクターはまた、選択マーカーを有さないベクターであるか、または選択されないベクターである、一過性ベクターでもありうる。具体的な実施形態では、一過性ベクターを含む宿主細胞の後代は、時間の経過と共にベクターを喪失する。他の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物を、ホーミングエンドヌクレアーゼの精製形態と接触させることができる。
【００９７】
一部の実施形態では、ＥＳ１およびＥＳ２の各々の切断により、３つの核酸断片（図３Ａおよび図３Ｂ）：（１）ゲノム核酸の左側アーム、（２）標的のＤＮＡセグメントを含む核酸断片、および（３）ゲノム核酸の右側アームが有利に生み出される。切断後、宿主細胞において見出される内因性の５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼは、各核酸断片の１つの鎖を迅速に分解し、標的のＤＮＡセグメントを含む核酸断片を破壊し、ＤＲ１およびＤＲ２を相補性領域として含む（図４Ａ）ゲノム核酸の左側（４）アームおよび右側（５）アーム上に長い３’側テールを残す（図３Ｃ）。相補性領域は、ヘテロ二重鎖を形成し（図４Ｂ：６）、宿主細胞のタンパク質により促進される組換えを受ける。一部の実施形態では、相補性領域が、一本鎖アニーリング経路を介して有利に組換えを受ける。右側（７）アームおよび左側（８）アーム上のテールの３’側最末端は相補性でなく、このため、相補性部分により形成されるヘテロ二重鎖から突出する。これらの非相補性の３’側最末端は、フラップヌクレアーゼにより有利に切断される。最後に、修復ＤＮＡ合成およびＤＮＡリガーゼによりヘテロ二重鎖を充てんし、ニックを封止して、標的のＤＮＡセグメントの切り出しが正確な、インタクトなゲノム核酸が創製される（図４Ｃ）。ＤＲ１およびＤＲ２が、互いと１００％のヌクレオチド配列同一性を共有する実施形態では、ＤＲ１とＤＲ１とが有利に組み換えられて、ＤＲ１およびＤＲ２と１００％のヌクレオチド配列同一性を共有する第３のタンデム反復を含むゲノム核酸を創製する。
【００９８】
別の態様では、少なくとも２つの標的核酸を、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物をゲノムに組み込んだ宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法が本明細書中に提供される。一部の実施形態では、上記方法は、１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つのところで、またはこれに近接したところで切断するように、少なくとも２つの切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞において、１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。
【００９９】
一部の実施形態では、宿主細胞が、２つ以上の切り出し可能な核酸構築物を含み、ここで、各切り出し可能な核酸構築物が、固有のＥＳ部位、すなわち、宿主細胞内の他の切り出し可能な核酸構築物の間で共有されないＥＳ部位を含む。これらの実施形態では、標的のＤＮＡセグメント複数の同時的な切り出しを果たす１または複数のホーミングエンドヌクレアーゼが宿主細胞において供給される。一部の実施形態では、標的のＤＮＡセグメント複数の同時的な切り出しを果たす複数のホーミングエンドヌクレアーゼが宿主細胞において供給される。
【０１００】
他の実施形態では、各切り出し可能な核酸構築物のＥＳ領域の各々を、そのＥＳを切断することが可能な単一のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させる結果、各切り出し可能な核酸構築物の標的のＤＮＡセグメントの同時的な切り出しがもたらされるように、ゲノムに組み込んだ切り出し可能な核酸構築物の各々が、少なくとも１つの同一のＥＳ領域を共有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法により、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１０を超える標的核酸の、宿主細胞のゲノムからの同時的な切り出しが可能となる。一部の実施形態では、複数の同時的な切り出しが、組み込んだ切り出し可能な核酸構築物の各々の内で共有されるＥＳ部位に対する特異性を有する単一のホーミングエンドヌクレアーゼによりなされる。他の実施形態では、複数の同時的な切り出しが、組み込んだ切り出し可能な核酸構築物内の少なくとも１つのＥＳ部位に対して各々が特異性を有する、複数のホーミングエンドヌクレアーゼによりなされる。
【０１０１】
提示される方法の利点は、特定の切り出し可能な核酸構築物のＤＲ１およびＤＲ２が、切断されると、切り出し可能な核酸構築物の組換えを媒介しうる任意のタンデム反復を含みうるということである。したがって、各々が固有のタンデム反復を有する複数の切り出し可能な核酸構築物を、異なる切り出し可能な核酸構築物の間におけるタンデム反復の組換えに起因するゲノムの不安定性を憂慮することなしに、同じ細胞内で用いることができる。さらに、上記方法は、選択マーカーを取り出すのに有利に使用して、同じ宿主細胞またはその後代におけるそれらの再使用を可能とすることができる。
【０１０２】
他の実施形態では、切り出しイベントを、宿主細胞における対象の内因性遺伝子の発現を促進するか、抑制するか、または変化させるのに用いることができる。例えば、一部の実施形態では、第１のゲノム組込み配列が、対象の内因性遺伝子のコード配列の５’側に配置されたヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含み、第２のゲノム組込み配列が、対象の内因性遺伝子のコード配列内に配置されたヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含み、標的のＤＮＡセグメントが、例えば、宿主細胞を培養する培養培地に、それぞれ、インデューサーまたはリプレッサーを添加することにより、誘導することもでき、抑制することもできる、プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む。標的遺伝子座に組込み配列を組み込むと、標的遺伝子の天然プロモーターが、標的のＤＮＡセグメントに由来する誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターで置き換えられ、培養培地中の誘導剤または抑制剤の存在に依存して、対象の遺伝子の遺伝子産物の産生がもたらされる。同様に、切り出し可能な核酸構築物が有する標的のＤＮＡセグメントは、それぞれ、インデューサーまたはリプレッサーを添加することにより、誘導することもでき、抑制することもできる、リプレッサーをコードするヌクレオチド配列を含みうる。制御可能なプロモーターまたはリプレッサーが、宿主細胞ゲノムから切り出されるように、本明細書で記載される切り出しイベントを誘導することにより、対象の遺伝子の発現に対するこのような外因性の制御を所望に応じて取り出すことができる。
【０１０３】
他の実施形態では、例えば、対象の内因性遺伝子のコード配列とその天然のプロモーターエレメントとの間の作動可能な連結を中絶させることにより、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込みを使用して、対象の内因性遺伝子の発現を破壊することができる。内因性遺伝子の発現の回復が所望される場合は、本明細書で記載される方法に従う切り出しイベントを誘導して、天然のプロモーターエレメントを、対象の内因性遺伝子のコード配列と作動的に再連結する、すなわち、天然のプロモーターエレメントを、対象の内因性遺伝子についてのコード配列の作動可能な近傍内に戻すことができる。
【０１０４】
５．６  キット
別の態様では、標的のＤＮＡセグメントを宿主細胞のゲノムから切り出すためのキットが本明細書中に提供される。一部の実施形態では、キットが、（ａ）５’から３’への方向に、（ｉ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、（ｉｉ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、（ｉｉｉ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、（ｉｖ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）とを含む切り出し可能な核酸構築物と、（ｂ）第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、キットが、（ａ）５’から３’への方向に、（ｉ）第１のタンデム反復（ＤＲ１）と、（ｉｉ）標的のＤＮＡセグメント（Ｄ）と、（ｉｉｉ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、（ｉｖ）第２のタンデム反復（ＤＲ２）とを含む切り出し可能な核酸構築物と、（ｂ）第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、キットが、（ａ）５’から３’への方向に、（ｉ）第１のタンデム反復核酸（ＤＲ１）と、（ｉｉ）第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ１）と、（ｉｉｉ）標的核酸と、（ｉｖ）第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ２）と、（ｖ）第２のタンデム反復核酸（ＤＲ２）とを含む切り出し可能な核酸構築物と、（ｂ）第１または第２のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも１つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に少なくとも１８ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、個別に１８〜５００ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、第１および第２のタンデム反復核酸の各々が、個別に、１８〜５００、１８〜４９５、１８〜４９０、１８〜４８５、１８〜４８０、１８〜４７５、１８〜４７０、１８〜４６５、１８〜４６０、１８〜４５５、１８〜４５０、１８〜４４５、１８〜４４０、１８〜４３５、１８〜４３０、１８〜４２５、１８〜４２０、１８〜４１５、１８〜４１０、１８〜４０５、１８〜４００、１８〜３９５、１８〜３９０、１８〜３８５、１８〜３８０、１８〜３７５、１８〜３７０、１８〜３６５、１８〜３６０、１８〜３５５、１８〜３５０、１８〜３４５、１８〜３４０、１８〜３３５、１８〜３３０、１８〜３２５、１８〜３２０、１８〜３１５、１８〜３１０、１８〜３０５、１８〜３００、１８〜２９５、１８〜２９０、１８〜２８５、１８〜２８０、１８〜２７５、１８〜２７０、１８〜２６５、１８〜２６０、１８〜２５５、１８〜２５０、１８〜２４５、１８〜２４０、１８〜２３５、１８〜２３０、１８〜２２５、１８〜２２０、１８〜２１５、１８〜２１０、１８〜２０５、１８〜２００、１８〜１９５、１８〜１９０、１８〜１８５、１８〜１８０、１８〜１７５、１８〜１７０、１８〜１６５、１８〜１６０、１８〜１５５、１８〜１５０、１８〜１４５、１８〜１４０、１８〜１３５、１８〜１３０、１８〜１２５、１８〜１２０、１８〜１１５、１８〜１１０、１８〜１０５、１８〜１００、１８〜９５、１８〜９０、１８〜８５、１８〜８０、１８〜７５、１８〜７０、１８〜６５、１８〜６０、１８〜５５、１８〜５０、１８〜４５、１８〜４０、１８〜３５、１８〜３０、１８〜２５、または１８〜２０ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ＤＲ１およびＤＲ２の各々が、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００ヌクレオチド塩基対からなる。
【０１０６】
一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第１のタンデム反復核酸の５’側に連結した第１のゲノム組込み配列、および第２のタンデム反復核酸の３’側に連結した第２のゲノム組込み配列をさらに含む。一部の実施形態では、キットが、切り出し可能な核酸構築物の組込みおよびその後における標的核酸の切り出しが所望される宿主細胞に特異的な第１および第２のゲノム組込み配列を提供する。例えば、一部の実施形態では、キットにより、選択される酵母のゲノム遺伝子座との相同組換えを開始するのに十分な長さおよび相同性を共有する、第１および第２の酵母特異的なゲノム組込み配列を含む、酵母で用いるための核酸構築物が提供される。一部の実施形態では、キットにより、各々が特定の酵母のゲノム遺伝子座を標的とする第１および第２のゲノム組込み配列の固有の対を含む、複数の核酸構築物が提供される。
【０１０７】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットが、（ａ）５’から３’への方向に、（ｉ）少なくとも１８ヌクレオチド塩基対を有する第１のタンデム反復核酸と、（ｉｉ）第１のＩ−ＳｃｅＩ部位と、（ｉｉｉ）標的核酸と、（ｉｖ）第２のＩ−ＳｃｅＩ部位と、（ｖ）少なくとも１８ヌクレオチド塩基対を有する第２のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物と、（ｂ）Ｉ−ＳｃｅＩをコードする核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の５’側に連結した第１の組込み部位、および第２のタンデム反復核酸の３’側に連結した第２の組込み部位をさらに含む。
【０１０８】
別の具体的な実施形態では、本明細書で提供されるキットが、（ａ）５’から３’への方向に、（ｉ）第１のタンデム反復核酸と、（ｉｉ）第１のＦ−ＣｐｈＩ部位と、（ｉｉｉ）標的核酸と、（ｉｖ）第２のＦ−ＣｐｈＩ部位と、（ｖ）第２のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物と、（ｂ）Ｆ−ＣｐｈＩをコードする核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第１のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の５’側に連結した第１の組込み部位、および第２のタンデム反復核酸の３’側に連結した第２の組込み部位をさらに含む。
【０１０９】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットが、上記の切り出し可能な核酸構築物および／またはベクターによる形質転換に適する１または複数の宿主細胞をさらに含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、キットが、標的のＤＮＡセグメントを、本明細書で開示される宿主細胞のゲノムから切り出す方法について記載する、使用のための指示をさらに含む。一部の実施形態では、キットが、標的のＤＮＡセグメントを含む切り出し可能な核酸構築物であって、上記標的のＤＮＡセグメントが、例えば、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エキソン、ポリＡテール、複数のクローニング部位、核内局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、選択マーカー、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、または分解シグナルから選択される切り出し可能な核酸構築物を含む。
【実施例】
【０１１１】
６．１  実施例１：ｘＭａｒｋｅｒ構築物の構築
本明細書中に記載される組成物および方法を実行して、「ｘＭａｒｋｅｒ」として本明細書中に記載される、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに用いるための一連の切り出し可能な選択マーカーを調製して特徴付けた。第１世代のマーカーでは、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを用い、図１に示されるＤＮＡ構築物のパラメータであって、（１）エンドヌクレアーゼ部位に隣接する定方向反復の異なる長さ、および（２）エンドヌクレアーゼ部位が１つである場合と２つである場合との対比を包含するパラメータについて調べた。第２世代のマーカーでは、第１世代のマーカーについての試験結果を、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼについてより広範に適用した。第３世代ｘＭａｒｋｅｒは、以下の表１に列挙される他のエンドヌクレアーゼへの有用性および拡張性を裏付けた。
【０１１２】
【表１】
0005883449.tif 000003
以下に記載する実験において用いられる試薬について、制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＦｅｒｍｅｎｔａｓから得た。Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ製の高忠実度熱安定性ポリメラーゼであるＰｈｕｓｉｏｎは、プラスミドをクローニングするのに用いられるＤＮＡの構築のため、または染色体組み込みのための酵母の形質転換に用いた。低忠実度熱安定性ポリメラーゼキットは、酵母コロニーに由来するゲノムＤＮＡのＰＣＲに用いた（Ｑｉａｇｅｎ  Ｔａｑ  ＰＣＲキット）。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得た。他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ、Ｆｉｓｈｅｒ、およびＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た（例えば、トリスおよびＥＤＴＡなどの標準的な分子生物学用バッファ成分、ならびに酢酸リチウムおよび酵母窒素ベースなどの標準的な酵母用試薬）。ＤＮＡのクローニングに用いられるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＤＮＡミニプレップは、Ｑｉａｇｅｎ製のミニプレップキットにより実施した。分子生物学技法、酵母分子遺伝学技法、および酵母細胞培養技法は、標準的なプロトコールに従い実施した。
【０１１３】
６．１．１．第１世代ｘＭａｒｋｅｒの構築
ｘＭａｒｋｅｒの初期シリーズでは、ＵＲＡ３を選択マーカーとして用い、そのシリーズの各メンバーは、Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位の数（１つまたは２つ）および定方向反復の長さ（２０、４０、６０、または８０ｂｐ）で異なった。ＵＲＡ３は、その存在を、ウラシルを欠く培地における増殖により選択することができ、その非存在を、５−フルオロオロチン酸を含有する培地における増殖により選択しうる対抗選択マーカーである。定方向反復配列は、２０ｂｐの各セグメントが約５０％のＧＣ含量を有し、３０℃を上回る温度では、２０、４０、６０、および８０ｂｐのストレッチが、予測される二次構造を殆ど有さない、１１２ｂｐのＤＮＡのストレッチからなるようにデザインされた。Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位は全て、同じ１８ｂｐの配列：５’−ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３’（配列番号３）を共有した。表２では、試験した第１世代ｘＭａｒｋｅｒの全てを、切断部位の数およびそれらの互いに対する方向、定方向反復（ＤＲ）の長さおよび配列、ならびにＩ−ＳｃｅＩ切断部位（複数可）の配列と共に列挙する。２つのＩ−ＳｃｅＩ部位を有するｘＭａｒｋｅｒでは、エレメントの配列は、ＤＲ→／Ｉ−ＳｃｅＩ部位→／ＵＲＡ３／Ｉ−ＳｃｅＩ部位→／ＤＲ→であった。１つのＩ−ＳｃｅＩ部位を有するｘＭａｒｋｅｒでは、エレメントの配列は、ＤＲ→／Ｉ−ＳｃｅＩ部位→／ＵＲＡ３／ＤＲ→であった。
【０１１４】
【表２】
0005883449.tif 000004
ｘＭａｒｋｅｒにおける反復部位のために、構築では、左半分と右半分とを個別に構築してから、その左半分と右半分とを接合することが必要であった。第１世代ｘＭａｒｋｅｒは、３つのステップで創製した。
【０１１５】
第１に、リン酸化オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、左側（５’）側と右側（３’）側とで選択マーカーに隣接する配列を個別に構築した。アニーリングにより創製した、左側および右側の二本鎖隣接配列は、相補性であり、パリンドロームではない、３’側の一本鎖の５塩基突出（トップ側においてＴＡＧＡＣ、およびボトム側においてＧＴＣＴＡ）を有するようにデザインした。表３に、各ｘＭａｒｋｅｒに用いられるオリゴ鎖（ｏｌｉｇｏ）を列挙する。各アニーリング反応では、ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の等モルのオリゴヌクレオチド混合物を、ヒートブロックにおいて５分間にわたり９５℃まで加熱し、次いで、ヒートブロックの電源を切り、１〜２時間にわたり室温までゆっくりと冷却した。
【０１１６】
【表３】
0005883449.tif 000005
第２に、３ウェイライゲーションのために、アニーリング混合物に由来する、対応する、左側の隣接ＤＮＡおよび右側の隣接ＤＮＡを、ＲＹＳＥ  １２エントリーベクターと混合した。粘着末端ライゲーションにより、左側反復配列の右側端を右側反復配列の左側端に接合し、反対側の末端では、平滑末端ライゲーションにより、左側反復配列および右側反復配列をプラスミドに接合した。Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位の間のスペーサーは、ＸｂａＩ部位により隔てられた多様なＳｃｈＩ制限部位を含有した。これらのプラスミドは、いまだマーカーを有さず、切断および修復を誘導する隣接配列だけを有するため、これらをｘＭａｒｋｅｒエントリーベクターと呼んだ。
【０１１７】
第３に、ＵＲＡ３選択マーカーを、ｘＭａｒｋｅｒエントリーベクターへとライゲーションした。ＵＲＡ３マーカーは、ＰＣＲにより、プラスミド（ＲａＢｉｔ  １２−０−Ｍ−５５５）から増幅して、平滑末端マーカーをもたらした。定方向反復二重Ｉ−ＳｃｅＩ部位ｘＭａｒｋｅｒには、オリゴヌクレオチドＫＢ４３９およびＫＢ４４０を用いた、ＵＲＡ３についてのＰＣＲで、単一Ｉ−ＳｃｅＩ部位ｘＭａｒｋｅｒには、オリゴヌクレオチドはＫＢ４３９およびＫＢ４４１であった。ｘＭａｒｋｅｒエントリーベクターをＳｃｈＩで消化して、平滑末端の直鎖状プラスミドをもたらした。次いで、標準的なリガーゼ条件を用いて、２つの断片を一緒にライゲーションした。これにより、図１に示されるｘＭａｒｋｅｒ構造を生成させた。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおける挿入物のＤＮＡ配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。
【０１１８】
６．１．２．第２世代ｘＭａｒｋｅｒの構築
第２世代のｘＭａｒｋｅｒは全て、ＤＮＡの修復を支援する６０ｂｐの定方向反復、および定方向反復における２つのＩ−ＳｃｅＩ切断部位により創製した。各ｘＭａｒｋｅｒは、固有の６０ｂｐの配列を有し、これは、以下の表４に示す通り、セミランダム配列となるように選択した。
【０１１９】
【表４】
0005883449.tif 000006
６０ｂｐの配列は、２つの基準：（１）第１、第２、および第３の２０ｂｐのウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）が６０℃±２℃の融解温度を有すること、および（２）６０ｂｐの配列中に現れるどの１３ｂｐ以上の配列ウインドウも酵母ゲノムにおける任意の天然の配列と同一ではないことを満たすように選択した。このセットは、４つの異なる選択マーカー：ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼまたはｈｐｈ、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼまたはｎａｔ、およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼまたはｋａｎを包含した。細菌に由来するこれらの３つの薬物耐性遺伝子は全て、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するＴＥＦ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターに対応する隣接配列により制御されるので、これらに接尾辞「Ａ」を付してこのＴＥＦ１−に由来する調節性制御を示し、次いで、これらのカセットをｈｐｈＡ、ｎａｔＡ、およびｋａｎＡと呼んだ。
【０１２０】
ｘＭａｒｋｅｒにおける反復部位のために、構築では、左半分と右半分とを個別に構築してから、その左半分と右半分とを接合することが必要であった。第２世代ｘＭａｒｋｅｒは、第１世代とは異なる戦略を用いる、２つのステップで創製した。以下の表５に列挙されるテールの長いオリゴヌクレオチドでマーカーのＰＣＲ増幅をプライミングすることにより、マーカーの左側および右側に６０ｂｐの配列および２０ｂｐのＩ−ＳｃｅＩ切断部位を導入した。
【０１２１】
【表５】
0005883449.tif 000007
オリゴヌクレオチドは、固有の６０ｂｐの配列およびＩ−ＳｃｅＩ部位を含有する８０ｂｐの３’端および５’テールに２０〜２２ｂｐのプライミング領域を含有した。マーカーの左側と右側とでは、２つのわずかに異なるＩ−ＳｃｅＩ部位を用いた：左側では、バージョン１（ｖ１）を５’−ＧＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３’（配列番号２１）とし、右側では、バージョン２（ｖ２）を５’−ＡＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＴＴＴＡＴ−３’（配列番号２２）とした。第２世代ｘＭａｒｋｅｒは全て、ＤＲ（６０ｂｐ）→／Ｉ−ＳｃｅＩ部位（ｖ１）→／マーカー／Ｉ−ＳｃｅＩ部位（ｖ２）→／ＤＲ（６０ｂｐ）→により概括されるエレメント構造を有した。
【０１２２】
ｘＭａｒｋｅｒ構築物の概要は、以下の通りである。第１に、マーカーの左側部分およびマーカーの右側部分を、ＰＣＲにより個別に増幅した。プライマーは、マーカーの中央のセグメントが、左側および右側の両方のＰＣＲ産物に包含されるように、かつ、この重複セグメントが、一本鎖の相補性突出を残す固有の制限部位を包含するようにデザインした。第２に、その２つのＰＣＲ産物を、選択した制限酵素で個別に消化し、ゲル精製し、線状化させたＲＹＳＥ  １２エントリーベクターを有する３つの小片からなるライゲーション混合物に添加した。第１世代のライゲーションと同様に、左側部分と右側部分とをアニーリングさせ、粘着末端を用いてライゲーションする一方で、マーカー構築物の最も外部の末端には、レシピエントプラスミドとの平滑末端ライゲーションを施した。第１世代の方法との差異は、ライゲーション後において、その産物が既にマーカー遺伝子を含有し、構築が完了しているということである。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおける挿入物のＤＮＡ配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。前出の１２  ＲａＢｉｔ類を用いたのと全く同様に、これらのプラスミドを、化合物である（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ＤＮＡ構築物をＲＹＳＥベースでスティッチングするのに用いうる、新規のｘＭａｒｋｅｒ用の１２  ＲａＢｉｔ類であった。
【０１２３】
以下では、ｘＭａｒｋｅｒの詳細について記載する。当初各マーカーに用いた、マーカーの内部の固有の制限部位は、以下：ｈｐｈＡ、ＮｄｅＩ（ＲｓｒＩＩまたはＢａｎＩ）、ｋａｎＡ、ＰｖｕＩ（ＮｃｉＩまたはＢｓｔＸＩ）、ｎａｔＡ、ＳｔｙＩ、およびＵＲＡ３、ＮｃｏＩ（ＢｓｉＨＫＡＩまたはＡｌｗＮＩ）の通りである。当初の酵素が陽性のクローンをもたらさなかった場合は、後で選択した酵素を用いたが、それらの利益は、２つの左側部分または２つの右側部分を有する、ライゲーションされたプラスミドを得る可能性がないように、一本鎖の突出をパリンドロームとしないということである。マーカーの左側部分の増幅は、表示された制限部位の右側のトップ鎖にアニーリングさせた約２０ｂｐのリバースプライマーと、５’側のオリゴヌクレオチドが、以下の通りの構造：６０ｂｐの配列→／Ｉ−ＳｃｅＩ部位（ｖ１）→／約２０ｂｐのフォワードプライマーを有するように、５’テールを包含するマーカーの左端にアニーリングさせたプライマーとにより実施した。マーカーの右側部分の増幅は、表示された制限部位の左側のボトム鎖にアニーリングさせた約２０ｂｐのフォワードプライマーと、３’側オリゴヌクレオチドが、このような構造：６０ｂｐの配列（逆相補）→／Ｉ−ＳｃｅＩ部位（ｖ２：逆相補）→／約２０ｂｐのリバースプライマーを有するように、５’テールを包含するマーカーの右端にアニーリングさせたプライマーとにより実施した。表４は、各ｘＭａｒｋｅｒの左側部分および右側部分を増幅するのに用いられるプライマーのリストを含む。マーカーをＰＣＲ増幅するのに用いられる鋳型は、ＲａＢｉｔプラスミド：ｈｐｈＡ用の１２−０−Ｍ−２１、ｋａｎＡ用の１２−０−Ｍ−２６１、ｎａｔＡ用の１２−０−Ｍ−２６２、およびＵＲＡ３用の１２−０−Ｍ−５５５とした。前出の１２  ＲａＢｉｔ類を用いたのと全く同様に、完成したｘＭａｒｋｅｒ用の第２世代のプラスミド自体を、化合物であるＤＮＡ構築物をＲＹＳＥベースでスティッチングするのに用いうる１２  ＲａＢｉｔ類とした。
【０１２４】
６．１．３．Ｉ−ＳｃｅＩ発現プラスミドの構築
Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１用プロモーターの制御下に置き、多様なマーカーを有するＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドのセットへとクローニングした。ＣＥＮ．ＡＲＳ配列ならびにＬＥＵ２（ｐＲＳ４１５、別名ｐＡＭ６３）マーカーおよびＵＲＡ３（ｐＲＳ４１６、別名ｐＡＭ６３）マーカーを有する酵母−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターについては既に記載されている（例えば、Ｇｅｎｅ、１９９２年、１１０巻、１１９〜２２頁、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９年、１２２巻、１９〜２７頁を参照されたい）。ｐＲＳ４１６の誘導体は、栄養素要求性マーカーを、薬物耐性マーカーであるｋａｎＡ（ｐＡＭ１１１０）、ｎａｔＡ（ｐＡＭ１１１１）、およびｈｐｈＡ（ｐＡＭ１１１２）で置き換えることにより作製した。ベクターの各々は、ポリリンカー／複数のクローニング部位内の固有の平滑末端制限部位である、ＥｃｏＲＶ（薬物耐性マーカー）またはＳｍａＩ（ＵＲＡ３およびＬＥＵ２）において消化し、次いで、ホスファターゼで処理した。線状化させたベクターを、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で処理して５’末端をリン酸化させた、３分節をスティッチングしたＰＣＲ産物にライゲーションした。ＰＣＲ産物は、ＲＹＳＥ４およびＲＹＳＥ１１と称するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、重複末端を有するＤＮＡの３つの小片：（１）Ｓａｐ１によりＲａＢｉｔ  ２３−０−Ｐ−３９から遊離した挿入物により供給される、ＲＹＳＥリンカー２および３を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１に由来するプロモーターと、（２）鋳型として用いられる特別に合成した遺伝子とプライマーである００１７７−ＪＤ−７５ＡＮおよび００１７７−ＪＤ−７５ＡＯとに由来するＰＣＲ産物により供給される、ＲＹＳＥリンカー３および４を有するＩ−ＳｃｅＩコード配列、ならびに（３）Ｓａｐ１によりＲａＢｉｔ  ４５−０−Ｔ−６４から遊離した挿入物により供給される、ＲＹＳＥリンカー４および５を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨに由来するターミネーターを一緒にスティッチングすることにより作製した。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおけるＰＧＡＬ１−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＴＴＤＨ３挿入物のＤＮＡ配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。発現プラスミドは、ｐＡＭ１５９２（ＵＲＡ３）、ｐＡＭ１５９３（ｋａｎＡ）、ｐＡＭ１５９４（ｎａｔＡ）、およびｐＡＭ１５９５（ｈｐｈＡ）と称した。ＰＧＡＬ１プロモーターは、細胞をガラクトース中で増殖させると高度に発現するが、野生型細胞（ＧＡＬ８０＋  ＧＡＬ４細胞）では、細胞をブドウ糖中で増殖させると発現しない。しかし、ＧＡＬ８０リプレッサーを欠く（ｇａｌ８０Δ）変異体では、ガラクトースの非存在下であってもＰＧＡＬ１が発現し、ブドウ糖によるＰＧＡＬ１の抑制は、ＧＡＬ４ＯＣ（オペレーターについて構成的）と称するプロモーターの変異を有するＧＡＬ４変異体を添加することによりさらに低減される。
【０１２５】
上記の通り、エンドヌクレアーゼの発現を、ある宿主株の遺伝子バックグラウンド（ＧＡＬ８０＋）では誘導性に発現し、他のものの遺伝子バックグラウンド（ｇａｌ８０Δ＋／−ＧＡＬ４ＯＣ）では構成的に発現する強力なプロモーターの制御下に置いた。他の多くの誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターも、良好に作用すると予測される。プロモーターが構成的であっても、エンドヌクレアーゼの発現は、所望の期間の後にプラスミドを喪失することにより、容易に消失させることができ、細胞のうちの約半分は、非選択培地中で１０世代後に、これらのプラスミドを喪失する（例えば、Ｇｅｎｅ、１９９２年、１１０巻、１１９〜２２頁、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９年、１２２巻、１９〜２７頁を参照されたい）。
【０１２６】
６．１．４．第３世代ｘＭａｒｋｅｒの構築：さらなる  エンドヌクレアーゼ
他のエンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＳｃｅＩ以外）のｘＭａｒｋｅｒの初期シリーズでは、ＵＲＡ３を選択マーカーとして用いた。ｘＭａｒｋｅｒのシリーズの各メンバーは、異なるエンドヌクレアーゼ認識／切断部位［ＶＤＥ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ（ｐｐｓ１）、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ（ｐｐｓ１）］を含有した。切断部位の記載については、上記の表１を参照されたい。全てのｘＵＲＡ３マーカーは、切断部位に隣接する、定方向反復方向にある同じ５０ｂｐの配列の２つのコピーを含有し、切り出し後においてｓｃａｒとなるように定められたこの固有の５０ｂｐの配列をｘＭ０と称した。以下の表６で、ｓｃａｒ配列について記載する。
【０１２７】
【表６】
0005883449.tif 000008
ｓｃａｒ配列は、以下の基準：（１）ＧＣ含量が約５０％であること、（２）２０ｂｐ（合計５０ｂｐ内）の第１および第２の配列の融解温度が６０℃±２℃であること、（３）３０℃を上回る温度では予測される二次構造が最小であること、および（４）５０ｂｐの配列中に現れるどの１３ｂｐ以上の配列ウインドウも酵母ゲノムにおける任意の天然の配列と同一ではないことを満たすように選択した。ｘＭａｒｋｅｒにおけるエレメントの一般的な配列および方向は、図１に示す通り：ＤＲ（５０ｂｐ）→、切断部位→、ＵＲＡ３、切断部位→、ＤＲ（５０ｂｐ）→、であった。
【０１２８】
ｘＭａｒｋｅｒにおける反復部位のために、ＤＮＡ分子の創製では、その左半分とその右半分とを個別に構築してから、その左半分とその右半分とを接合することが必要であった。本節に記載されるマーカーの構築には、上記の６．２節における「第２世代」の戦略を用いた。
【０１２９】
第１に、マーカーの左側部分およびマーカーの右側部分を、ＰＣＲにより個別に増幅した。各ｘＭａｒｋｅｒをＰＣＲ増幅するために、４つのオリゴヌクレオチドをデザインした。ＰＣＲのための２つの「外部」オリゴヌクレオチドを、マーカーの末端にアニーリングさせ、２つの「内部」オリゴヌクレオチドを、マーカー遺伝子の内部にアニーリングさせた。外部オリゴヌクレオチドは、３’端において、鋳型と相補的な２０〜２２ｂｐの配列を含有し、５’末端において、鋳型にアニーリングせず、切断配列およびｓｃａｒ配列を導入することに働く７４〜９０ｂｐの配列を含有した。外部オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に組み入れる前に、ＰＮＫでリン酸化させて、後のステップにおけるライゲーションを促進させた。内部オリゴヌクレオチドは、マーカーの中央のセグメントが、左側および右側の両方のＰＣＲ産物に包含されるように、かつ、この重複セグメントが、一本鎖の相補性突出を生成させるのに用いられうる固有の制限部位を包含するようにデザインした。可能な場合は、パリンドロームではない突出を生成させる制限酵素を選択して、２つの左側部分（または２つの右側部分）が一緒にライゲーションされる可能性を低減することが有利であった。
【０１３０】
第２に、２つのＰＣＲ産物を選択した制限酵素で個別に消化し、ゲル精製した。第３に、各々が粘着末端および平滑末端を有する左側セグメントおよび右側セグメントを、３つの小片からなるライゲーションのための線状化させたＲＹＳＥ  １２エントリーベクタープラスミドに添加した。左側部分と右側部分とをアニーリングさせ、粘着末端を用いてライゲーションする一方で、マーカー構築物の最も外部の末端には、レシピエントプラスミドとの平滑末端ライゲーションを施した。ライゲーションしたプラスミドの個別のクローンを回収し、ＤＮＡ配列決定により所望のプラスミドを同定した。前出の１２  ＲａＢｉｔ類を用いたのと全く同様に、これらのプラスミドを、化合物であるＤＮＡ構築物をＲＹＳＥベースでスティッチングするのに用いうる、新規のｘＭａｒｋｅｒ用の１２  ＲａＢｉｔ類とした。
【０１３１】
ｘＵＲＡ３マーカーの第１のセットについて調べた後、さらなる作業のために、Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼを選択した。Ｆ−ＣｐｈＩと共に用いるために、異なる選択マーカーを有するさらなるｘＭａｒｋｅｒを作製した。このセットは、６つの異なる選択マーカー：ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼまたはｈｐｈ、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼまたはｎａｔ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼまたはｋａｎ、ゼオシン耐性遺伝子またはｂｌｅ、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはｐａｔを包含した。細菌に由来するこれらの薬物耐性遺伝子は全て、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するＴＥＦ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターに対応する隣接配列により制御されるので、これらに接尾辞「Ａ」を付してこのＴＥＦ１−に由来する調節性制御を示し、次いで、これらのカセットをｈｐｈＡ、ｎａｔＡ、ｋａｎＡ、ｚｅｏＡ、およびｐａｔＡと呼んだ。表７に、各マーカーについての制限部位および内部（ｉｎｎｅｒ）オリゴヌクレオチドを列挙し、表８に、各マーカーについての外部オリゴヌクレオチドを列挙する。
【０１３２】
【表７】
0005883449.tif 000009
【０１３３】
【表８】
0005883449.tif 000010
６．１．５．エンドヌクレアーゼ発現プラスミドの構築
以下の表９では、エンドヌクレアーゼ遺伝子であるＩ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ（ｐｐｓ１）、ＰＩ−ＭｇａＩ（ｐｐｓ１）、およびＶＤＥを含有するプラスミドについて記載する。エンドヌクレアーゼ遺伝子は、化学合成する（Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩＩ（ｐｐｓ１）、ＰＩ−ＭｇａＩ（ｐｐｓ１））か、またはＰＣＲによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅した（ＶＤＥ）。
【０１３４】
【表９−１】
0005883449.tif 000011
【０１３５】
【表９−２】
0005883449.tif 000012
エンドヌクレアーゼのうちの３つ（Ｆ−ＣｐｈＩおよびＩ−ＳｃｅＩを除く全て）は、核膜孔を介して細胞内の合成部位（細胞質）から作用部位（核）へと自由に移動するには大型過ぎる（＞２５ｋＤ；３５３〜４５６アミノ酸）ので、ＳＶ４０の核内局在化配列（ＮＬＳ）をそのタンパク質のアミノ末端に付加するために、コード配列の５’末端にＤＮＡ配列を付加した。このＮＬＳは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける有糸分裂（通常の増殖性）増殖の間におけるＶＤＥの活性に不可欠であると記載されている。これは、この天然の酵母酵素が、天然では減数分裂の間に限り核に入るためである。例えば、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００３年、２３巻、１７２６〜３６頁を参照されたい。ＳＶ４０のＮＬＳについてのコード配列を含有するテールを有するオリゴヌクレオチドを用いてＮＬＳをＶＤＥに付加し、遺伝子全体の化学合成の一部としてＮＬＳをＰＩ−ＭｔｕＩＩおよびＰＩ−ＭｇａＩに付加した。ＰＣＲベースの「スティッチング」または「オーバーラップ伸長」を用いて、ＮＬＳを有するかまたは有さずに、エンドヌクレアーゼコード配列を、プロモーターおよびターミネーターと融合させた。ＡＣＳ２に由来するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプロモーターおよびＡＤＥ６に由来するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのターミネーターにより、ＲＹＳＥリンカーを用いることなしに、構築物の第１のセットを作製した。この第１のセットでは、プロモーター−遺伝子−ターミネーターのＰＣＲスティッチング産物を、個別の小片のＰＣＲ反応をプライミングするのに用いられるオリゴヌクレオチド上のテールによりその固有の制限部位を導入した、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いで、その構築物を、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ホスファターゼで処理したレシピエントプラスミドへとライゲーションした。第２のセットでは、ＧＡＬ１に由来するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプロモーターおよびＴＤＨ３に由来するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのターミネーターを用い、このセットでは、プロモーター（２３−０−Ｐ−３９）およびターミネーター（４５−０−Ｔ−６４）用にＲＹＳＥリンカーおよびＲＹＳＥ  ＲａＢｉｔプラスミドを用いた。プラスミドのこの第２のセットでは、平滑末端でスティッチングした産物を、平滑末端による二本鎖切断を生じる制限酵素で線状化させた、酵母マーカーを有するＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドへと効率的にライゲーションしうるように、プロモーター−遺伝子−ターミネーターの構築物を、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いてあらかじめリン酸化させたＲＹＳＥプライマーであるＲＹＳＥ４およびＲＹＳＥ１１とスティッチングした。最後に、ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおける「プロモーター−遺伝子−ターミネーター」挿入物のＤＮＡ配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。プラスミド構築の詳細については、以下に記載する。
【０１３６】
レシピエントプラスミドは全て、ＣＥＮ．ＡＲＳ配列を有する酵母−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターの「ｐＲＳ」シリーズに基づいており、酵母選択マーカー、例えば、ＵＲＡ３でマーキングされたバージョン（ｐＲＳ４１６、別名ｐＡＭ６４）については、既に記載されている（例えば、Ｇｅｎｅ、１９９２年、１１０巻、１１９〜２２頁、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９年、１２２巻、１９〜２７頁を参照されたい）。ｐＲＳ４１６の誘導体は、栄養素要求性マーカーを、薬物耐性マーカーであるｋａｎＡ（ｐＡＭ１１１０）、ｎａｔＡ（ｐＡＭ１１１１）、およびｈｐｈＡ（ｐＡＭ１１１２）で置き換えることにより作製した。プラスミドの第２のセットでは、ｐＡＭ１１１２を、ポリリンカー／複数のクローニング部位内の固有の平滑末端制限部位（ＥｃｏＲＶ）において消化し、次いで、ホスファターゼで処理した。線状化させたベクターを、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で処理して５’末端をリン酸化させた、３分節をスティッチングしたＰＣＲ産物にライゲーションした。プラスミドの第１のセットでは、３分節をスティッチングしたＰＣＲ産物およびｐＡＭ１１１２レシピエントプラスミドの両方を、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化し、次いで、ライゲーションのために混合した。
【０１３７】
エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるための「プロモーター−遺伝子−ターミネーター」ＰＣＲ産物を、重複末端を有するＤＮＡの３つの小片を一緒にスティッチングすることにより作製した。３つの小片を創製するのに用いられるオリゴヌクレオチドおよび鋳型、ならびに３つの小片を一緒にスティッチングするのに用いられるオリゴヌクレオチドを、表１０に示す。
【０１３８】
【表１０−１】
0005883449.tif 000013
【０１３９】
【表１０−２】
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６．１．６．Ｉ−ＳｃｅＩ発現プラスミドの構築
Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１用プロモーターの制御下に置き、多様なマーカーを有するＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドのセットへとクローニングした。ＣＥＮ．ＡＲＳ配列ならびにＬＥＵ２（ｐＲＳ４１５、別名ｐＡＭ６３）マーカーおよびＵＲＡ３（ｐＲＳ４１６、別名ｐＡＭ６３）マーカーを有する酵母−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターについては既に記載されている（例えば、Ｇｅｎｅ、１９９２年、１１０巻、１１９〜２２頁、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９年、１２２巻、１９〜２７頁を参照されたい）。ｐＲＳ４１６の誘導体は、栄養素要求性マーカーを、薬物耐性マーカーであるｋａｎＡ（ｐＡＭ１１１０）、ｎａｔＡ（ｐＡＭ１１１１）、およびｈｐｈＡ（ｐＡＭ１１１２）で置き換えることにより作製した。ベクターの各々は、ポリリンカー／複数のクローニング部位内の固有の平滑末端制限部位である、ＥｃｏＲＶ（薬物耐性マーカー）またはＳｍａＩ（ＵＲＡ３およびＬＥＵ２）において消化し、次いで、ホスファターゼで処理した。線状化させたベクターを、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で処理して５’末端をリン酸化させた、３つの分節をスティッチングしたＰＣＲ産物にライゲーションした。ＰＣＲ産物は、ＲＹＳＥ４およびＲＹＳＥ１１と称するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、重複末端を有するＤＮＡの３つの小片：（１）Ｓａｐ１によりＲａＢｉｔ  ２３−０−Ｐ−３９から遊離した挿入物により供給される、ＲＹＳＥリンカー２および３を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１に由来するプロモーターと、（２）鋳型として用いられる特別に合成した遺伝子と、プライマーである００１７７−ＪＤ−７５ＡＮおよび００１７７−ＪＤ−７５ＡＯとに由来するＰＣＲ産物により供給される、ＲＹＳＥリンカー３および４を有するＩ−ＳｃｅＩコード配列、ならびに（３）Ｓａｐ１によりＲａＢｉｔ  ４５−０−Ｔ−６４から遊離した挿入物により供給される、ＲＹＳＥリンカー４および５を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨに由来するターミネーターを一緒にスティッチングすることにより作製した。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおけるＰＧＡＬ１−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＴＴＤＨ３挿入物のＤＮＡ配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。発現プラスミドは、ｐＡＭ１５９２（ＵＲＡ３）、ｐＡＭ１５９３（ｋａｎＡ）、ｐＡＭ１５９４（ｎａｔＡ）、およびｐＡＭ１５９５（ｈｐｈＡ）と称した。ＰＧＡＬ１プロモーターは、細胞をガラクトース中で増殖させると高度に発現するが、野生型細胞（ＧＡＬ８０＋  ＧＡＬ４細胞）では、細胞をブドウ糖中で増殖させると発現しない。しかし、ＧＡＬ８０リプレッサーを欠く（ｇａｌ８０Δ）変異体では、ガラクトースの非存在下であってもＰＧＡＬ１が発現し、ブドウ糖によるＰＧＡＬ１の抑制は、ＧＡＬ４ＯＣ（オペレーターについて構成的な変異体）と称するプロモーターの変異を有するＧＡＬ４変異体を添加することによりさらに低減される。
【０１４０】
エンドヌクレアーゼの発現を、ある宿主株の遺伝子バックグラウンド（ＧＡＬ８０＋）では誘導性に発現し、他のものの遺伝子バックグラウンド（ｇａｌ８０Δ＋／−ＧＡＬ４ＯＣ）では構成的に発現する強力なプロモーターの制御下に置いた。他の多くの誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターも、良好に作用すると予測される。プロモーターが構成的であっても、エンドヌクレアーゼの発現は、所望の期間後にプラスミドを喪失することにより、容易に消失させることができ、細胞のうちの約半分は、非選択培地中で１０世代後に、これらのプラスミドを喪失する（例えば、Ｇｅｎｅ、１９９２年、１１０巻、１１９〜２２頁、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９年、１２２巻、１９〜２７頁を参照されたい）。
【０１４１】
６．１．７．Ｆ−ＣｐｈＩ発現プラスミドの構築
ｈｐｈＡマーカーを有するＦ−ＣｐｈＩ発現プラスミド（ｐＡＭ１７９９）を作製し、これについて調べた後、それらの各々が、レシピエントプラスミドおよびｐＡＭ１７９９における固有の部位を切断する制限酵素であるＸｈｏＩおよびＸｂａＩを用いて、ＰＧＡＬ１−Ｆ−ＣｐｈＩ−ＴＴＤＨ３カセットを、異なるマーカーを有する他のＣＥＮ．ＡＲＳプラスミド（ｐＡＭ１１１０、ｐＡＭ１１１１、ｐＡＭ６４）へとサブクローニングした。プラスミドは全て、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断し、プラスミドベクターは、ホスファターゼで処理し、ＰＧＡＬ１−Ｆ−ＣｐｈＩ−ＴＴＤＨ３カセットは、他のバックボーンとライゲーションした。ライゲーション後において、正確なプラスミド単離物を、制限消化により同定した。
【０１４２】
ゼオシン耐性プラスミド（ｐＡＭ１８００）を、他のものとは異なる方法により創製した。ＰＧＡＬ１−Ｆ−ＣｐｈＩ−ＴＴＤＨ３のための「プロモーター−遺伝子−ターミネーター」ＰＣＲ産物を一緒にスティッチングし、次いで、ゼオシン耐性マーカーを有するレシピエントプラスミドへとライゲーションするよりは寧ろ、ｈｐｈＡマーカーを有するＦ−ＣｐｈＩ発現プラスミド（ｐＡＭ１７９９）により構築を開始し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける酵母の相同組換えを利用してハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の代わりにゼオシン耐性遺伝子で置換することによりマーカーを交換した。第１に、ハイグロマイシンＢ耐性コード配列における固有の部位を切断する制限酵素であるＮｄｅＩによりｐＡＭ１７９９を線状化させた。第２に、ｈｐｈマーカーの発現を制御するｐＡＭ１７９９における配列と相同である、ＰＴＥＦプロモーターおよびＴＴＥＦターミネーターに由来する配列を導入する、長いテールを有するオリゴヌクレオチド（ＪＵ１８３およびＪＵ１８４）を用いて、ｐＡＭ１５００（または任意のＴｏｐｏプラスミド）からゼオシン耐性遺伝子をＰＣＲ増幅した。第３に、２つのＤＮＡ小片をゲル精製し、「ギャップ修復」による組換えのために、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をゼオシン耐性遺伝子で正確に置き換えた酵母へと形質転換した。正確なプラスミドは、ＤＮＡ配列決定により検証した。
【０１４３】
ＰＧＡＬ１プロモーターは、細胞をガラクトース中で増殖させると高度に発現するが、野生型細胞（ＧＡＬ８０ＧＡＬ４遺伝子型を有する）をブドウ糖中で増殖させると発現しない。しかし、ＧＡＬ８０リプレッサーを欠く（ｇａｌ８０Δ）変異体では、ガラクトースの非存在下であってもＰＧＡＬ１が発現し、ブドウ糖によるＰＧＡＬ１の抑制は、ＧＡＬ４ＯＣ（オペレーターについて構成的な変異体）と称するプロモーターの変異を有するＧＡＬ４変異体を添加することによりさらに低減される。ＰＡＣＳ２プロモーターは、全て炭素供給源中で中程度に発現する。
【０１４４】
６．２  実施例２：選択マーカーの染色体ＤＮＡからの切り出し
この実施例では、実施例１に記載したｘＭａｒｋｅｒ構築物が、選択マーカーの宿主細胞染色体ＤＮＡからの切り出しの媒介において有用であることを裏付ける。以下に記載する通り、構築物を細胞へと形質転換し、細胞をｘＭａｒｋｅｒに対して選択的な培地に播種し、コロニーＰＣＲにより正確な組込みを確認するが、このような株は、標準的なマーカーより作製された他の任意の株と全く同様に機能し、ｘＭａｒｋｅｒは、安定的に維持される。第３に、ｘＭａｒｋｅｒの切り出しが所望される場合は、以下の節に記載する通り、株をその独自のマーカーおよびホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子についての発現構築物を含有する単一コピーの（ＣＥＮ．ＡＲＳ）プラスミドで形質転換する。複数世代にわたりプラスミドの存在について選択し、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を誘導する条件下で増殖させた後に、株をｘＭａｒｋｅｒの喪失について調べる。最後に、株を、ホーミングエンドヌクレアーゼ発現プラスミドの喪失を可能とする条件下で増殖させ、単離物をプラスミドの喪失について調べる。この工程の終了時には、株は、ｘＭａｒｋｅｒを再使用できる状態にある。
【０１４５】
この戦略では、ｘＭａｒｋｅｒが、所望のＤＮＡ構築物を適正に組み込んだ細胞を選択および検証するのに十分な期間にわたり安定であることが有利である。高度な安定性は、第２の形質転換によりエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入するまではエンドヌクレアーゼ遺伝子を欠く細胞を用いることにより確認される。しかし、代替の手法では、誘導性プロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼ遺伝子を安定的に組み込んだ宿主株を用いる。この代替のスキームによれば、株を、調節されたプロモーターからエンドヌクレアーゼの発現を誘導する条件下で培養するまで、ｘＭａｒｋｅｒは安定である。所望の特徴を有するプロモーターが利用可能である場合、この手法により、エンドヌクレアーゼプラスミドの形質転換に必要な時間および労力が節約される。
【０１４６】
６．２．１．Ｉ−ＳｃｅＩを用いるｘＭａｒｋｅｒについての初期試験：
標的ＤＮＡを正確に切り出すためのこの手法について調べるために、選択マーカーの染色体ＤＮＡからの切り出しの効率および忠実度を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて測定した。第１に、ｘＭａｒｋｅｒを、ノックアウト構築物を生成させるのに選択された遺伝子（総称的に述べると、ＧＯＩ＝対象の遺伝子）の上流および下流の領域に対応する＞５００ｂｐの配列の２つのストレッチ間に配置した。第２に、酵母細胞を、このＤＮＡ構築物で形質転換して、対象の遺伝子を欠失させ、二重交差イベントをもたらす相同組換えを介して、そのコード配列をｘＭａｒｋｅｒで置き換えた。第３に、変異体をＩ−ＳｃｅＩ発現プラスミドで形質転換し、プラスミドを保有する単離物にエンドヌクレアーゼを発現し、ＤＮＡの切断および修復を受ける時間を与えた。第４に、マーカー選択的な条件下では増殖することが不可能なコロニーを同定およびカウントした。第５に、対象の遺伝子を欠失させた（ｇｏｉΔ）遺伝子座の染色体ＤＮＡ配列を決定して、マーカーが予測通りきれいに切り出されて修復されたかどうかを評価した。この一連のステップの詳細については、第１世代のマーカーについて以下で提示される。
【０１４７】
第１に、３つのエレメントを有するオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、ＧＯＩ  ＵＳ／ｘＭａｒｋｅｒ／ＧＯＩ  ＤＳ（ＧＯＩ＝対象の遺伝子、ＵＳ＝上流、ＤＳ＝下流）の構造を有するノックアウト構築物を一緒にスティッチングした。まず、ｎｄｔ８０Δ構築物との関連で、Ｉ−ＳｃｅＩ  ｘＭａｒｋｅｒについて調べたが、ＮＤＴ８０とは、有糸分裂して増殖する細胞におけるその欠失が識別可能な（ｄｉｓｃｅｒｎａｂｌｅ）表現型を有さないために選択される、減数分裂特異的な遺伝子である。各ＰＣＲ反応では、ＳａｐＩによる消化によりそれらのプラスミドバックボーンから遊離する３つのＲａＢｉｔ類：（１）ＮＤＴ８０の上流の（０１−０−Ｕ−３０）、（２）ｘＭａｒｋｅｒ用のＲａＢｉｔ、および（３）ＮＤＴ８０のＤＳの（２９−０−Ｄ−２３）を鋳型として用いた。ＰＣＲのためのプライマーは、ＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９とした。ＰＣＲの後、反応混合物をアガロースゲルに負荷し、所望の全長産物をゲルから精製した。
【０１４８】
第２に、酵母細胞をゲル精製したＰＣＲ産物で形質転換し、選択プレートに播種した。第１世代ｘＭａｒｋｅｒ用の選択プレートは、ＣＳＭ−ウラシルであり、薬物耐性マーカー用の選択プレートはＹＰＤ＋薬物（ハイグロマイシンＢ、ノーセオトリシン、またはＧ４１８）とした。全てのｘＭａｒｋｅｒ試験は、ＣＥＮ．ＰＫ２株のバックグラウンドまたはＳ２８８ｃ株のバックグラウンドに由来する株において実施した。第１世代ｘＭａｒｋｅｒについての初期試験は、ＰＣＲ産物を、その関連する遺伝子型がＧＡＬ８０＋ＧＡＬ４  ｇａｌ１Δである株（Ｙ１６２５）へと形質転換することを包含し、この遺伝子型は、ＰＧＡＬ１からの野生型の誘導性発現であって、ガラクトースが「無傷性誘導物質」であるように、この糖の摂取を不可能とする誘導性発現を付与した。所望の形質転換細胞は、表２に列挙されるｘＵＲＡ３マーカーの複数のバージョンを有する変異体の遺伝子型であるｎｄｔ８０Δ：：ｘＵＲＡ３を有した。組換えにより創製される新規のＤＮＡ接合部を越えて増幅させるプライマー対を用いるＰＣＲを介して、煮沸により溶解させた細胞からゲノムＤＮＡを増幅することにより、ＣＳＭ−Ｕプレートに現れたコロニーを、所望の染色体の遺伝子座の存在について調べた（「コロニーＰＣＲ」）。プライマーＲＹＳＥ３およびＡＥＴ００６５−１８６−６３−Ｆ−ｐＮＤＴ８０による新規の５’側接合部の増幅により１０２４ｂｐの産物をもたらし、プライマーＲＹＳＥ４およびＡＥＴ００７２−１８６−６３−Ｒ−ｔＮＤＴ８０を用いる新規の３’側接合部の増幅により１０２４ｂｐの産物をもたらした。さらなる解析のために、各ｘＭａｒｋｅｒのバリアントについて２つの単離物を選択した。
【０１４９】
第３に、遺伝子型ｎｄｔ８０Δ：：ｘＭａｒｋｅｒを有する単離物を、Ｉ−ＳｃｅＩ発現プラスミドで形質転換した。第１世代のｎｄｔ８０Δ：：ｘＵＲＡ３株について、ｎａｔＡでマーキングされたプラスミド（ｐＡＭ１５９４）を標準的な形質転換条件を用いて形質転換し、これらの細胞に、液体ＹＰＤ中の３〜６時間にわたる増殖の間に新規のマーカー遺伝子を発現する時間を与え、次いで、ＹＰＤ＋ノーセオトリシンプレートに播種した。各形質転換物のうちの半分を通常のＹＰＤ（２％のデキストロース）に播種し、半分をＹＰＤＧ（１％デキストロース＋１％ガラクトース）に播種した。宿主株の遺伝子型がＧＡＬ８０＋ＧＡＬ４  ｇａｌ１Δであるためで、デキストロースではＩ−ＳｃｅＩ遺伝子のＧＡＬ１プロモーターが誘導されず、デキストロースとガラクトースとの混合物でも、デキストロースが高濃度であるためＧＡＬ１プロモーターはオフ状態を維持すると予測されるが、次いで、デキストロースが消費されプレート中のガラクトースが影響して、オンに変える。
【０１５０】
第４に、マーカーを切り出した単離物を同定した。ｘＵＲＡ３マーカーは、ＵＲＡ３を欠く細胞の増殖だけを可能とする、５−ＦＯＡプレートにおける対抗選択の利点を有する。これに対し、他のｘＭａｒｋｅｒを切り出した単離物は、スクリーニング、例えば、全ての単離物を増殖させる非選択プレートから、所望の単離物を増殖させない選択プレートへのレプリカプレーティングを行うことにより同定されるはずである。第１世代ｘＭａｒｋｅｒでは、対抗選択を利用するためにＵＲＡ３を用いた。予測通り、上記のプラスミドを保有する形質転換体を、ＹＰＤプレートから５−ＦＯＡプレートへと画線播種したところ、ＹＰＤではＩ−ＳｃｅＩが発現しないために、コロニーが増殖しなかった。プラスミドを保有する形質転換体を、ＹＰＤＧプレートから５−ＦＯＡプレートへと画線播種したところ、多くのコロニーが増殖した。ＹＰＤＧプレートは、ガラクトースを含み、Ｉ−ＳｃｅＩの発現を誘導する。５−ＦＯＡプレートは、無傷のＵＲＡ３を保有する細胞に対して選択する。Ｉ−ＳｃｅＩによる形質転換体を再画線播種することにより、対照のｕｒａ３Δ株と比べて増殖する５−ＦＯＡコロニーの数に基づくと、細胞のうちの≧３０％が、二重のＩ−ＳｃｅＩ部位の間からＵＲＡ３を喪失したと推定され、単一のＩ−ＳｃｅＩ部位を有するｘＵＲＡ３ではその頻度がより低いようであった。これにより、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させることなしに、ＵＲＡ３  ｘＭａｒｋｅｒが切り出されることはまれであり（細胞の＜１０−６個）、Ｉ−ＳｃｅＩの発現を誘導した後では、ＵＲＡ３の切り出しが高頻度となることが示唆された。その後、切り出しの頻度についてより直接的に調べた。
【０１５１】
第５に、ｘＭａｒｋｅｒを組み込んだ染色体の遺伝子座を配列決定して、Ｉ−ＳｃｅＩによる切断およびその後のＤＮＡ二本鎖切断修復の後においても残存するｓｃａｒについて評価した。マーカー機能を喪失したことが裏付けられたコロニーを、ｘＭａｒｋｅｒとＧＯＩターゲティング配列との間の接合部の上流および下流でアニーリングさせるプライマー対によるコロニーＰＣＲに用い、次いで、そのＰＣＲ産物を配列決定した。ｎｄｔ８０Δ：：ｘＭａｒｋｅｒの場合は、プライマーを、ｘＭａｒｋｅｒ配列とＮＤＴ８０配列との間の接合部の２０８ｂｐ上流（ＪＵ−１９７−１６８−１２５−ＮＤＴ８０ＵＳ−Ｆ）および２３４ｂｐ下流（ＪＵ−１９８〜１６８−１２５−ＮＤＴ８０ＤＳ−Ｒ）でアニーリングさせた。予測されるＰＣＲ産物のサイズは、ＵＲＡ３がきれいに切り出される場合は４６２〜５２２ｂｐであり、ＵＲＡ３が完全に無傷の場合は２０７２ｂｐであった。コロニーＰＣＲに用いた２７の５ＦＯＡ耐性コロニーの全てが、切り出しについて予測される約５００ｂｐの産物をもたらした。これらの２７のＰＣＲ産物を配列決定したところ、全ての場合において、図１に示される、予測される完全なｓｃａｒが示された（表１１を参照されたい）。表１１に示される通り、２７の試験したコロニー全てにより、ｘＭａｒｋｅｒが組み込まれた後、Ｉ−ＳｃｅＩが発現し、ｘＭａｒｋｅｒが切出されることが示された。
【０１５２】
【表１１】
0005883449.tif 000015
第１世代ｘＭａｒｋｅｒおよび第２世代ｘＭａｒｋｅｒ（表２および４）についてはまた、ＧＡＬ１プロモーターが構成的である（ｇａｌ８０Δ  ＧＡＬ４ＯＣ）、異なるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株においても調べた。上記の通り、ｎｄｔ８０Δ：：ｘＭａｒｋｅｒ構築物を一緒にスティッチングし、酵母へと形質転換した。ｘＵＲＡ３による形質転換混合物をＣＳＭ−Ｕプレートへと直接に播種し、薬物耐性マーカーを有する形質転換混合物を、まず、振とう型インキュベーター内の液体ＹＰＤ中で３〜６時間にわたり増殖させてから、ＹＰＤ＋薬物プレートへと播種した。コロニーＰＣＲによりｎｄｔ８０Δ：：ｘＭａｒｋｅｒが組み込まれていることが検証されている各ｘＭａｒｋｅｒバリアントの２つの形質転換体を、Ｉ−ＳｃｅＩ発現プラスミドのうちの１つで個別に形質転換し、上記の選択プレートに播種した。
【０１５３】
ＰＧＡＬ１−Ｉ−ＳｃｅＩの発現は構成的であるので、プラスミド形質転換選択プレートにおけるコロニーは、ｘＭａｒｋｅｒを維持するかまたは切り出した混合細胞集団を含有することが予測された。各プレートにからの複数のコロニーを、プラスミドもしくはマーカーまたはこれらの両方を喪失した細胞の増殖を可能とするＹＰＤ非選択プレートに再画線播種した。これらの再画線播種に由来するコロニーを、ＹＰＤプレートに採取し（ｐａｔｃｈｅｄ）、一晩にわたり増殖させ、次いで、ＹＰＤ＋薬物プレート、ＣＳＭ−ウラシルプレート、および５−ＦＯＡプレートへとレプリカプレーティングした。多くのパッチが、５−ＦＯＡおよびＣＳＭ−ウラシルの両方で増殖したことから、パッチ内の混合集団が明らかとされ、解析のための均一集団を得るには、コロニーを単離する前に、非選択的条件下でさらなる増殖が必要であることが示唆された。この実験では一般に、混合パッチのためにマーカー切り出しの頻度が過小評価されているが、一般にパッチのうちの少なくとも１８％、そしてよりしばしば３５〜５０％のパッチでは、少なくとも一部の細胞のマーカーが切り出されていた（表１２）。大半のパッチ（５３〜８８％）は、レプリカプレーティングの前にＩ−ＳｃｅＩ発現プラスミドを完全に喪失していた。パッチの採取およびレプリカプレーティングと並行して、２つの個別のｎｄｔ８０Δ：：ｓ１ｘ−ｈｐｈＡ株に由来するＹＰＤ再画線播種プレートにおける９０のコロニーを、コロニーＰＣＲによるマーカーの切り出しについて調べたところ、コロニーのうちの４８％（４３／９０）が、ｈｐｈＡマーカーの正確な切り出しについて予測されるサイズのバンドをもたらした。
【０１５４】
【表１２】
0005883449.tif 000016
上記の実験と同様の実験を用いる探索のために、さらなるｘＭａｒｋｅｒを構築した。加えて、同じ株の異なる遺伝子座に組み込んだ複数のｘＭａｒｋｅｒの同時的な切り出しについての試験も成功し、ゲノムの不安定性の徴候を示さなかった（例えば、染色体の転座）（以下の実施例６．２．４．を参照されたい）。
【０１５５】
６．２．２．他のエンドヌクレアーゼを用いるｘＭａｒｋｅｒについての試験：
表６に示すｘＵＲＡ３マーカーのセットを用いて、４つのさらなるエンドヌクレアーゼについて調べた。各ｘＭａｒｋｅｒは、２つのエンドヌクレアーゼ切断部位（これらは、５０塩基対の定方向反復配列が相互に隣接する）が隣接するＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含有した。各ｘＭａｒｋｅｒには、３つのエレメントを有するオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、ＧＯＩ  ＵＳ／ｘＭａｒｋｅｒ／ＧＯＩ  ＤＳ（ＧＯＩ＝対象の遺伝子、ＵＳ＝上流、ＤＳ＝下流）の構造を有するノックアウト構築物を一緒にスティッチングした。まず、新規のエンドヌクレアーゼＵＲＡ３  ｘＭａｒｋｅｒを、対象の遺伝子（ＧＯＩ）としてのＨＸＴ３について調べた。各ＰＣＲ反応では、ＳａｐＩでの消化によりそれらのプラスミドバックボーンから遊離する３つのＲａＢｉｔ類：（１）ＨＸＴ３の上流の（０１−０−Ｕ−４０７）、（２）ｘＭａｒｋｅｒ用のＲａＢｉｔ（ｘ０．ＵＲＡ．ＶＤＥ、ｘ０．ＵＲＡ．Ｆ−ＣｐｈＩ、１２−０−ｘ０．ＵＲＡ．ＰＩ−ＭｔｕＩＩ、１２−０−ｘ０．ＵＲＡ．ＰＩ−ＭｇａＩ）、および（３）ＨＸＴ３のＤＳの（２９−０−Ｄ−４０８）を鋳型として用いた。ＰＣＲによるスティッチングに用いられるプライマーは、ＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９であった。ＰＣＲの後、反応混合物をアガロースゲルに負荷し、所望の全長産物をゲルから精製した。酵母細胞をゲル精製したＰＣＲ産物で形質転換し、ＵＲＡ３（ＣＳＭ−ウラシル）用の選択プレートに播種した。所望の形質転換体は、表６に列挙されるｘＵＲＡ３マーカーの複数のバージョンを有する変異体の遺伝子型であるｈｘｔ３Δ：：ｘＵＲＡ３を有した。組換えにより創製される新規のＤＮＡ接合部を越えて増幅させるプライマー対を用いるＰＣＲを介して、煮沸により溶解させた細胞からゲノムＤＮＡを増幅することにより、ＣＳＭ−ウラシルプレートに現れたコロニーを、所望の染色体の遺伝子座の存在について調べた（「コロニーＰＣＲ」）。プライマーは、ＫＢ５０２、ＫＢ５０３、およびＣＰＫ９０４であり、後者の２つにより、ｈｘｔ３Δ：：ｘＵＲＡ３の７３８ｂｐの断片を生成させ、前者の２つにより、無傷のＨＸＴ３の５３８ｂｐの断片を生成させた。さらなる解析のために、各ｘＭａｒｋｅｒのバリアントについて２つの単離物を選択した。
【０１５６】
ｘＵＲＡ３マーカーは、ＵＲＡ３を欠く細胞の増殖だけを可能とする、５−ＦＯＡプレートにおける対抗選択の利点を有する。これに対し、他のｘＭａｒｋｅｒを切り出した単離物は、スクリーニング、例えば、全て単離物を増殖させる非選択プレートから所望の単離物を増殖させない選択プレートへのレプリカプレーティングにより同定しなければならない。第１世代ｘＭａｒｋｅｒでは、まれな切り出しイベントの定量化を可能とする対抗選択を利用するために、ＵＲＡ３を用いた。予測通り、ｘＵＲＡ３マーカーを含有するが、エンドヌクレアーゼ発現プラスミドを欠く株を、５−ＦＯＡプレートへと播種または画線播種したところ、コロニーが増殖しなかった。これにより、エンドヌクレアーゼにより触媒される切断の非存在下では、ｘＭａｒｋｅｒの自発的な切り出しが極めてまれであることが示された。これにより、エンドヌクレアーゼを発現させることなしに、ＵＲＡ３  ｘＭａｒｋｅｒが切り出されることはまれである（細胞＜１０−６個）ことが示唆された。
【０１５７】
確認されたｈｘｔ３Δ：：ｘＵＲＡ３の遺伝子型を有する単離物は、マーカー遺伝子ｈｐｈＡ（ｐＡＭ１７９９、ｐＡＭ１８６５、ｐＡＭ１８６６）でマーキングされたエンドヌクレアーゼのための同種の発現プラスミドで形質転換した。形質転換混合物に由来する細胞に、液体ＹＰＤ中の３〜６時間にわたる増殖の間に新規のマーカー遺伝子（ｈｐｈＡ）を発現する時間を与え、次いで、ＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢプレートに播種した。宿主株の遺伝子型は、ｇａｌ８０Δ  ＧＡＬ４ｏｃであったので、エンドヌクレアーゼの遺伝子発現を駆動するＧＡＬ１プロモーターが構成的に発現し、インデューサーは必要としなかった。３日間にわたる増殖の後、形質転換体のコロニーをＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢプレートに再画線播種し、さらに３日間にわたり増殖させた。再画線播種（１つのエンドヌクレアーゼ当たり４つのコロニー）に由来するコロニーを３ｍｌのＹＰＤに再懸濁させ、プラスミドの喪失を可能とする非選択的条件下で一晩にわたり増殖させた。細胞密度を決定し、培養物を希釈し、細胞を３つの異なる固体培地：ＹＰＤ培地、ＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢ培地、および５−ＦＯＡ培地によるプレート１枚当たりの推定密度１５０、１５，０００、または１５０，０００個で播種した。ＹＰＤでは、全ての細胞がコロニーを形成することが予測され、ハイグロマイシンＢでは、エンドヌクレアーゼの発現プラスミドを維持する細胞だけがコロニーを形成することが予測され、５−ＦＯＡでは、ｘＵＲＡ３マーカーを切り出した細胞だけがコロニーを形成することが予測された。
【０１５８】
表１３に示される結果は、Ｆ−ＣｐｈＩが、高効率でｘＭａｒｋｅｒの切り出しを媒介し、ＰＩ−ＭｔｕＩＩが、低効率でｘＭａｒｋｅｒの切り出しを媒介し、ＰＩ−ＭｇａＩが、検出不可能なレベルでｘＭａｒｋｅｒの切り出しを媒介したことを示す。ＣＥＮ．ＡＲＳエンドヌクレアーゼ発現プラスミドの喪失が高頻度のイベントであったことから、新規のｘＭａｒｋｅｒでの別ラウンドの形質転換を行う前に、エンドヌクレアーゼを喪失した細胞を分離するのが容易であることが示唆される。
【０１５９】
【表１３】
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Ｆ−ＣｐｈＩを介するマーカーの切り出しが「完全な」ｓｃａｒを残したかどうかを決定するため、５−ＦＯＡ耐性（機能的にはｕｒａ３−）コロニーを、ｘＵＲＡ３マーカー（オリゴヌクレオチドＫＢ５０３およびＫＢ６０４）の組込み部位に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるコロニーＰＣＲに供し、５３３ｂｐのＰＣＲ産物を、オリゴヌクレオチドプライマーＫＢ５０３によるＤＮＡ配列決定のために送った。１６の試験したコロニーのうちの全てのコロニーが、ｘＭａｒｋｅｒから残存する唯一のＤＮＡ配列を単一の５０ｂｐの配列のコピーとする「完全な」ｓｃａｒを有した。
【０１６０】
６．２．３．Ｆ−ＣｐｈによるｘＭａｒｋｅｒ切り出しの頻度および忠実度についてのさらなる試験
さらなるＦ−ＣｐｈＩによる切断部位および多様な選択マーカー（ｎａｔＡ、ｋａｎＡ、ｈｐｈＡ、ｚｅｏＡ）を有するｘＭａｒｋｅｒを創製し、これらについて調べた。一倍体および二倍体のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるこれらのマーカーの切り出し頻度および切り出しの忠実度について、単独および組合せの両方で調べた。切り出しの頻度は、試験したコロニーの１００％であることが頻繁であり、常に＞８０％であった。切り出しの忠実度は、１００％近くであった。多くの個別の培養物における切り出しイベントのほとんど全てが、予測されるｓｃａｒをもたらし、切り出しが残したのは、ｘＭａｒｋｅｒに定方向反復として導入された５０ｂｐの固有の配列の１つのコピーだけであり、マーカー自体は存在しなかった（表１４）。
【０１６１】
【表１４−１】
0005883449.tif 000018
【０１６２】
【表１４−２】
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ＮＤＴ８０遺伝子座においてｘＭａｒｋｅｒを有する株（ＮＤＴ８０遺伝子を欠失している）は、以下の通りに作製した。細胞を形質転換するのに用いられる、スティッチングされたＰＣＲ産物は、ｘＭａｒｋｅｒ（１２  ＲａＢｉｔとしての）を、ＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９と称するオリゴヌクレオチドを有する、０１−０−Ｕ−９７  ＲａＢｉｔおよび２９−０−Ｕ−２３  ＲａＢｉｔとスティッチングすることにより作製した。形質転換後、正確な単離物の同一性を、一方を形質転換したＤＮＡ（ＣＰＫ６５０）の外部とし、他方をマーカーの内部とし（例えば、ＵＲＡ３にはＫＢ５６１およびＫＢ５６２、ｎａｔＡ、ｋａｎＡ、およびｈｙｇＡにはＫＢ５６３およびＫＢ５６４）て、約１．１ｋｂのＰＣＲ産物をもたらす、オリゴヌクレオチドプライマーの対を用いるコロニーＰＣＲにより検証した。天然のＮＤＴ８０の配列の取り出しは、無傷のＮＤＴ８０遺伝子座を有する親株から４４２ｂｐのＰＣＲ産物をもたらすオリゴヌクレオチドＡＥＴ８３およびＡＥＴ８４によるコロニーＰＣＲに由来するＰＣＲ産物が存在しないことにより検証した。Ｆ−ＣｐｈＩ発現プラスミド（ｐＡＭ１８００）による形質転換後、個別のコロニーを、５０ｂｐのｓｃａｒ配列の１つのコピーだけを残す完全な切り出しに応じる４９２ｂｐのバンド（このバンドは、ゲル上で泳動させて、視覚化し、他の任意のＤＮＡから分離し、次いで、ゲルから抽出し、ＰＣＲ反応をプライミングするのに用いられる同じオリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ配列決定のために送った）をもたらす、ＪＵ１９７およびＪＵ１９８を用いたコロニーＰＣＲにより、意図される切り出しについて調べた。
【０１６３】
ＧＡＬ８０遺伝子座においてｘＭａｒｋｅｒを有する株（ＧＡＬ８０遺伝子を欠失している）は、以下の通りに作製した。細胞を形質転換するのに用いられる、スティッチングされたＰＣＲ産物は、ｘＭａｒｋｅｒ（１２  ＲａＢｉｔとしての）を、ＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９と称するオリゴヌクレオチドと共に、０１−０−Ｕ−２７０  ＲａＢｉｔおよび２９−０−Ｕ−９５  ＲａＢｉｔとスティッチングすることにより作製した。形質転換後、正確な単離物の同一性を、コロニーＰＣＲにより検証した。オリゴヌクレオチドであるＪＵ４３６およびＲＹＳＥ３は、形質転換したＤＮＡがＧＡＬ８０遺伝子の上流の配列内に組み込まれる５’側接合部周囲の近傍を増幅して、５７２ｂｐのＰＣＲ産物をもたらし（代替的に、ＪＵ２１０およびＲＹＳＥ３を用いて、１８２ｂｐのＰＣＲ産物をもたらし）、ＪＵ２２１およびＲＹＳＥ４は、マーカーの、ＧＡＬ８０の下流の配列ｂｐとの３’側接合部の増幅により３８６ｂｐの産物をもたらした（代替的に、ＪＵ４３９およびＲＹＳＥ４を用いて、５３１ｂｐのＰＣＲ産物をもたらした）。陰性対照は、無傷のＧＡＬ８０遺伝子座に応じて２９０ｂｐの産物をもたらし、所望の遺伝子座に応じては何らの産物ももたらさない、プライマーＪＵ２１２およびＪＵ２１０を用いるコロニーＰＣＲであった。Ｆ−ＣｐｈＩ発現プラスミド（ｐＡＭ１８００またはｐＡＭ１７９９）による形質転換後、個別のコロニーを、５０ｂｐのｓｃａｒ配列の１つのコピーだけを残す完全な切り出しに応じる２７７ｂｐのバンド（このバンドは、ゲル上で泳動させて、視覚化し、他の任意のＤＮＡから分離し、次いで、抽出し、ＰＣＲ反応をプライミングするのに用いられる同じオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した）をもたらす、ＪＵ２１０およびＪＵ２１１を用いるコロニーＰＣＲにより、意図される切り出しについて調べた。
【０１６４】
Ｆ−ＣｐｈＩの発現プラスミドによる形質転換後、選択プレートに現れたコロニーのうちの８つを無作為に選択して、切り出しを診断するコロニーＰＣＲに供した。以下のｘＭａｒｋｅｒ：ｘ０ＵＲＡ３、ｘ１ｎａｔ、ｘ３ｋａｎ、ｘ４ｎａｔ、およびｘ６ｚｅｏについて、８つのコロニー全てが、予測されるＰＣＲ産物をもたらし、ＤＮＡ配列決定により、完全なｓｃａｒが検証された。ｘ２ｈｐｈマーカーは、異常な結果をもたらした。ｓｃａｒの配列決定およびｘＭａｒｋｅｒ（１２  ＲａＢｉｔプラスミド）の再配列決定により、定方向反復は意図された通りでなく、代わりに、わずか１９ｂｐが、隣接配列のスクランブリングを伴ってマーカーに定方向反復して隣接することが明らかとなった。二本鎖切断の修復に供された小領域に限れば、切り出しの頻度および忠実度は良好であったが、第１の試験では、８つのコロニー中６つが、マーカーをきれいに切り出し、多様な長さのｓｃａｒを残し、第２の試験では、８つのコロニー中８つが、マーカーを切り出し、１９ｂｐのｓｃａｒを残した。これにより、定方向反復の長さには１７〜１８ｂｐで十分であり、５０ｂｐでは、Ｆ−ＣｐｈＩによる切断後における染色体の修復を誘導するのに十分過ぎることが示唆される。
【０１６５】
複数の状況において、ｘＭａｒｋｅｒの切り出しが高頻度でかつ高精度であることが観察された。最も単純な状況は、各株に単一のｘＭａｒｋｅｒというものであった。より複雑な状況は、無傷のＧＡＬ８０対立遺伝子１つとｘＭａｒｋｅｒにより欠失させた対立遺伝子１つとを有するヘテロ接合性の二倍体株におけるｘＭａｒｋｅｒの切り出しであり、この場合は、無傷のＧＡＬ８０遺伝子座が、破壊された対立遺伝子におけるｘＭａｒｋｅｒの切り出し後においても無傷を維持した。これは、Ｆ−ＣｐｈＩの作用後、ｘＭａｒｋｅｒの近傍において切断された染色体末端であれば、染色体の無傷の第２のコピーを、修復の鋳型として用い、これにより、無傷のＧＡＬ８０遺伝子座を、そこから欠失させた染色体へと回復させる遺伝子変換イベントをもたらしうることが生じた可能性があるために、重要である。この遺伝子変換イベントは認められなかったが、代わりに、細胞は、染色体内一本鎖アニーリング機構により、切断された染色体を優先的に修復したことが明らかである。
【０１６６】
６．２．４．複数のｘＭａｒｋｅｒの同時的な切り出し
この実施例は、各ｘＭａｒｋｅｒを用いて固有の遺伝子座への組込みをマーキングする、宿主細胞の染色体ＤＮＡからの複数の選択マーカーの同時的な切り出しを媒介するｘＭａｒｋｅｒ構築物の有用性を実証するものである。
【０１６７】
ＧＡＬ８０遺伝子座およびＧＡＬ４遺伝子座の両方においてｘＭａｒｋｅｒを有する株は、以下の通りに作製した。ハイグロマイシン感受性細胞を、ｘＭａｒｋｅｒターゲティング構築物であるＧＡＬ８０−ＵＳ＿ｘＭ４．Ｈｐｈ．ＦＣｐｈＩ＿ＧＡＬ８０−ＤＳで形質転換した。形質転換物は、３ｍＬの液体ＹＰＤ培地中で５時間にわたり増殖させ、次いで、ハイグロマイシンを添加したＹＰＤへと播種した。形質転換体は、コロニーＰＣＲにより検証した。オリゴヌクレオチドＨＪ５３およびＨＪ８４８は、形質転換したＤＮＡがＧＡＬ８０の上流の配列内に組み込まれた５’側接合部周囲の近傍を増幅して、７６１ｂｐのＰＣＲ産物をもたらし（代替的に、ＨＪ５３およびＨＪ２５３を用いて、１ｋｂのＰＣＲ産物をもたらし）、Ｈ７２７およびＨＪ２５８は、ＧＡＬ８０の下流の配列ｂｐを含めマーカーの３’側接合部の増幅により１０３３ｂｐの産物をもたらした（代替的に、ＨＪ７２７およびＨＪ５４を用いて、６２７ｂｐのＰＣＲ産物をもたらした）。次いで、選択された単離物を、ｘＭａｒｋｅｒターゲティング構築物であるＧＡＬ４−ＵＳ＿ｘＭ０．Ｋａｎ．ＦＣｐｈＩ＿ＧＡＬ４−ＤＳで形質転換した。形質転換物は、３ｍＬの液体ＹＰＤ培地中で５時間にわたり増殖させ、次いで、Ｇ４１８を添加したＹＰＤへと播種した。形質転換体は、コロニーＰＣＲにより検証した。オリゴヌクレオチドＨＪ２７０およびＨＪ２５３は、形質転換したＤＮＡがＧＡＬ４遺伝子の上流の配列内に組み込まれる５’側接合部周囲の近傍を増幅して、１．１ｋｂのＰＣＲ産物をもたらし（代替的に、ＨＪ２７０およびＨＪ５４を用いて、７７４ｂｐのＰＣＲ産物をもたらし）、Ｈ２３９およびＨＪ７０６は、ＧＡＬ４遺伝子の下流の配列ｂｐを含めマーカーの３’側接合部の増幅により７９３ｂｐの産物をもたらした（代替的に、ＨＪ２３９およびＨＪ２４１を用いて、１０３８ｂｐのＰＣＲ産物をもたらした）。
【０１６８】
遺伝子型ｇａｌ８０Δ：：ｘＨｐｈ  ｇａｌ４Δ：：ｘＫａｎを有する単離物を、ｎａｔＡでマーキングしたＦ−ＣｐｈＩ発現プラスミド（ｐＡＭ１８６４）で形質転換した。形質転換物は、３ｍＬの液体ＹＰＤ培地中で５時間にわたり増殖させ、次いで、ノーセオトリシンを添加したＹＰＤへと播種した。３０℃で３日間にわたるインキュベーション後、４つの形質転換体を新鮮なＹＰＤに画線播種して、ｐＡＭ１８６４を喪失させた。ｘＭａｒｋｅｒの切り出しおよびｐＡＭ１８６４の喪失について調べるため、５０のコロニー（各画線から約１２〜１３のコロニー）をＹＰＤプレートに採取し、次いで、２４時間後に、ＹＰＤ、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、またはノーセオトリシンを添加したＹＰＤでレプリカプレーティングした。レプリカプレーティングの４８時間後に、プレートを精査した。
【０１６９】
同時的な複数の組込みの頻度は１００％であった、すなわち、５０／５０のコロニーが、ハイグロマイシンおよびＧ４１８の両方に対する耐性を喪失したことから、全ての試験したコロニーが両方のｘＭａｒｋｅｒを喪失したことが示される。また、約２０％（１０／５０）のコロニーがノーセオトリシンに対する耐性を喪失したことから、コロニーのうちの２０％がＦ−ＣｐｈＩプラスミドを喪失したことも示される。２つのｘＭａｒｋｅｒ構築物をゲノムに組み込んだ、２つのさらなる株についても同様の頻度が観察された。Ｆ−ＣｐｈＩを発現させた第２のｇａｌ８０Δ：：ｘＨｐｈ  ｇａｌ４Δ：：ｘＫａｎ株でも、５０／５０のコロニーが、ハイグロマイシンおよびＧ４１８の両方に対する耐性を喪失し、また、１０／５０のコロニーも、ノーセオトリシンに対する耐性を喪失した。Ｆ−ＣｐｈＩを発現させた第３のｇａｌ８０Δ：：ｘＨｐｈ  ｇａｌ４Δ：：ｘＫａｎ株でも、４８／４８のコロニーが、ハイグロマイシンおよびＧ４１８の両方に対する耐性を喪失し、また、５／５０のコロニーも、ノーセオトリシンに対する耐性を喪失した。また、３つの薬物全てに対する耐性を喪失したコロニーも、コロニーＰＣＲで検証した。予測通り、これらの全てが、Ｆ−ＣｐｈＩにより両方のｘＭａｒｋｅｒを切り出した。
【０１７０】
この実施例により、単一の一倍体株からの２つのマーカーの完全な切り出しが高頻度であることが裏付けられる。さらに、この実施例は染色体の転座またはゲノムの不安定性についての証拠がなかったことも裏付ける。これらの結果により、ｘＭａｒｋｅｒ構築物が、宿主細胞ゲノムからの標的ＤＮＡの高度に効率的で同時的な複数の切り出しを促進することが示される。
【０１７１】
６．２．５．多様な長さのＤＲを含むｘＭａｒｋｅｒ構築物のゲノム安定性
この実施例は、エンドヌクレアーゼ発現の非存在下において酵母ゲノムに組み込んだ場合の、多様な長さの定方向反復（ＤＲ）を含むｘＭａｒｋｅｒ構築物の安定性を裏付ける。
【０１７２】
誘導前に、かつ、非誘導性条件下において著明な切り出しが生じないように、条件付け遺伝子欠失系を厳密に制御することが有利である。ゲノム操作の関連において、高比率の自発的な相同組換えイベントは、ゲノムの不安定性、選択マーカーの望ましくない喪失、および結果として、所望の遺伝子型について選択する能力の喪失をもたらしうる。
【０１７３】
天然で、内因性で、自発的な相同組換えイベントは、介在ＤＮＡを欠失させる定方向反復配列（一般に＞３００ｂｐ）間におけるまれな組換えによる交差を触媒しうる。公表された報告は、その配列に隣接するＤＲ間における自発的な組換えによる交差（「ループアウト」）を介して、配列を酵母宿主細胞ゲノムから切り出しうることを示している。長さ３００ｂｐ〜１．１ｋｂのＤＲの間でこのようなループアウトが生じる比率は、１，０００個中１個の細胞（１×１０−３）〜１０，０００個中１個の細胞（１×１０−４）（Ａｌａｎｉら（１９８７年）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１６巻（４号）：５４１〜５頁（長さ１１００ｂｐの定方向反復では、１０−４）；  Ｗａｃｈら（１９９４年）、Ｙｅａｓｔ、１０巻（１３号）：１７９３〜８０８頁（長さ４３０ｂｐの定方向反復では、１０−３〜１０−４）；  Ｅｒｄｅｎｉｚら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、７巻（１２号）：１１７４〜８３頁）（長さ約３００〜３０００ｂｐの定方向反復では、１０−３〜１０−４）の間にあることが報告されている。多様な長さの定方向反復を有するｘＭａｒｋｅｒ構築物を組み込んだゲノムの安定性を決定するために、エンドヌクレアーゼ発現の非存在下で、多様な長さのＤＲ間における自発的な組換えによる交差の比率を評価した。
【０１７４】
ＮＤＴ８０遺伝子座において長さ５０、６０、８０、および１９８ｂｐの定方向反復を有するｘＭａｒｋｅｒを組み込んだ株（ＮＤＴ８０遺伝子を欠失している）は、以下の通りに作製した。組込みベクターは、以下のＵＲＡ３  ｘＭａｒｋｅｒのバリアントを、プライマーとしてＲＹＳＥ０オリゴヌクレオチドおよびＲＹＳＥ１９オリゴヌクレオチドを用いて、０１−０−Ｕ−３０  ＲａＢｉｔおよび２９−０−Ｄ−２３  ＲａＢｉｔとスティッチングすることにより作製した。
【０１７５】
【表１５】
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ｕｒａ３−株への形質転換後、細胞をｕｒａ３プレートに播種し、コロニーＰＣＲにより正確な組込みについてコロニーを検証した。オリゴヌクレオチドＡＥＴ００６５−１８６−６３−Ｆ−ｐＮＤＴ８０およびＲＹＳＥ３は、形質転換したＤＮＡがＮＤＴ８０の上流の配列内に組み込まれる、５’側接合部周囲の近傍を増幅して、１０２４ｂｐのＰＣＲ産物をもたらし、ＡＥＴ００７２−１８６−６３−Ｒ−ｔＮＤＴ８０およびＲＹＳＥ４は、ＮＤＴ８０の下流の配列を含むマーカーの３’側接合部の増幅により１０２４ｂｐの産物をもたらした。これらの結果により、ｘＭａｒｋｅｒの組込みおよびＮＤＴ８０の破壊が示される。各ｘＭａｒｋｅｒバリアントについて確認された２つの単離物を、さらなる解析のために選択した。
【０１７６】
コロニーを、ウラシルを欠くＣＳＭに再画線播種し、次いで、ＤＲ間における自発的なＵＲＡ３マーカーの切り出しを可能とするために、細胞を、液体ＹＰＤ中で２日間にわたり増殖させ、１２〜２４時間ごとに希釈した（結果として、約２５回の倍加がもたらされる）。この培養培地では、ＵＲＡ３＋コロニーおよびｕｒａ３−コロニーのいずれもが良好に増殖するので、遺伝子切り出しについての選択はなされない。加えて、天然のＵＲＡ３、すなわち、任意の定方向反復が隣接しないＵＲＡ３を含む細胞も、ＵＲＡ３コード配列のループアウトを伴わずにＵＲＡ３遺伝子活性を低減するかまたは不活化させる（５−ＦＯＡ上における宿主細胞の生存をもたらす）点変異（複数可）をもたらしうる、自発的な変異の比率を評価するための対照として増殖させた。
【０１７７】
最後に、培養物を５−ＦＯＡを含有する固体培地に播種し、さらに２．５日間にわたり増殖させてから、コロニーをカウントした。コロニーＰＣＲにより、各遺伝子型につき１６個の個別のｕｒａ３−（５−ＦＯＡ耐性）コロニーを、ＵＲＡ３遺伝子の自発的なループアウトについて、または代替的に、無傷のＵＲＡ３遺伝子の存在について確認した。ｘＭａｒｋｅｒとＮＤＴ８０配列の間の接合部の２０８ｂｐ上流（ＪＵ−１９７−１６８−１２５−ＮＤＴ８０ＵＳ−Ｆ）および２３４ｂｐ下流（ＪＵ−１９８〜１６８−１２５−ＮＤＴ８０ＤＳ−Ｒ）でアニーリングするプライマーを用いた。予測されるＰＣＲ産物のサイズは、ＵＲＡ３がきれいに切り出される場合は４６２〜５２２ｂｐとなり、ＵＲＡ３遺伝子が完全に無傷の場合は２０７２ｂｐとなる。
【０１７８】
表１６に示される通り、定方向反復が隣接しないＵＲＡ３を含む細胞における５−ＦＯＡ耐性の平均頻度は、約１．７×１０−６細胞であり、これは、ＵＲＡ３の不活化をもたらす自発的な変異の内因性比率を示す。長さ５０〜８０ｂｐの定方向反復が隣接するＵＲＡ３を含む細胞における５−ＦＯＡ耐性の平均頻度は、約４．５×１０−６〜１．１４×１０−５細胞であり、長さ１９８ｂｐの定方向反復が隣接するＵＲＡ３を含む細胞における５−ＦＯＡ耐性の平均頻度は、約４．７×１０−５細胞であった。
【０１７９】
コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）の結果により、ＵＲＡ３マーカーのループアウトとは対照的に、ある量の５−ＦＯＡ耐性のｘＭａｒｋｅｒコロニーは、ＵＲＡ３の不活化をもたらす自発的な変異の結果として現れることが確認された。特に、ＤＲの長さが５０ｂｐおよび８０ｂｐである、組み込まれたｘＭａｒｋｅｒ構築物を含むコロニーの場合、ｃＰＣＲによりスクリーニングした１２中４つ（４／１２）の５ＦＯＡ耐性コロニーが、無傷のＵＲＡ３遺伝子を有したことから、これらのコロニーにおける５−ＦＯＡ耐性が、ＵＲＡ３のループアウトではなく、ＵＲＡ３における自発的な変異を不活化させることから現れたことが示される。したがって、ｘＭａｒｋｅｒ株における、ＤＲを介する自発的なループアウトの頻度は、５−ＦＯＡ耐性の観察される頻度よりなお低いことが予測される。５−ＦＯＡ耐性を代用物として用いるこの限界について理解してもなお、これらの結果により、長さ約５０〜２００ｂｐのＤＲと関連する自発的なループアウトの頻度は、３００ｂｐ〜１．１ｋｂのＤＲについて報告されている自発的なループアウトの比率より１〜３桁低い（上記で論じたとおり、１０−４〜１０−３に対して１０−６〜１０−５）ことが示される。
【０１８０】
これらの結果は、長さ約２００ｂｐのＤＲにより、自発的なループアウトイベントの数が、長さが少なくとも３００ｂｐのＤＲと比較して１〜２  ｌｏｇ低減されることを裏付ける。特に、長さを１９８とするＤＲの自発的なループアウトイベントの頻度は、定方向反復のない場合の頻度である約４．７×１０−５細胞と比較して、１．７×１０−６細胞であった。
【０１８１】
ＤＲの長さがより短い場合の結果は、なおより劇的である。上に記載した通り、結果は、長さを５０〜８０ｂｐの範囲とするＤＲにより、自発的なループアウトイベントの数が、長さを少なくとも３００ｂｐとするＤＲと比較して２〜３  ｌｏｇ低減される（１０−４〜１０−３に対して１０−６〜１０−５）ことを裏付ける。
【０１８２】
さらに、これらの結果により、ＤＲの長さが２００を下回って短くなるにつれて、自発的なＵＲＡ３ループアウトの比率は、ＵＲＡ３の自発的な変異の比率に近づくことが示される。ＤＲの長さを５０、６０、および８０とする結果として、ループアウトに起因するＵＲＡ３の喪失は、自発的な不活化変異と比較して、約２．７〜７倍の増大に過ぎなかった。
【０１８３】
これらの結果は、ＤＲの長さを約２００ｂｐ以下とすることにより、ＤＲの長さを３００ｂｐ以上とする場合と比較して、ゲノムの安定性の点で実質的な利点がもたらされることを示唆する。標的ＤＮＡの切り出しは、厳密に調節され、ホーミングエンドヌクレアーゼによる誘導前の著明な切り出しはない。したがって、本明細書に記載されるｘＭａｒｋｅｒによる方法および組成物は、ゲノムの安定性の増大および株操作の間における所望の遺伝子型のより効率的な選択を結果としてもたらしうる非誘導性条件下において、標的ＤＮＡ、例えば、選択マーカーの貯留を改善する。
【０１８４】
【表１６】
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これらの結果は、本明細書で記載される組成物および方法が、選択マーカーの特化したバリアントを創製して切り出すために、高頻度、高効率、高忠実度、および高安定性を有して作用することを裏付ける。Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼおよびＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼは、この手法のために良好に作用するが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞では、Ｆ−ＣｐｈＩが例外的な切り出し頻度および切り出し忠実度を示すことは予測外である。切り出しイベント自体は、二倍体細胞においてもなおゲノムの不安定性をもたらさず、複数のｘＭａｒｋｅｒを有する細胞においてもなおゲノムの不安定性をもたらさない。この手法の主要な利点には、多くのｘＭａｒｋｅｒを一度に同時的に切り出す能力、および各ｓｃａｒが固有となるよう、同じ株におけるｘＭａｒｋｅｒの反復使用およびリサイクリングもなおデザインしうるように、多種多様な固有のｓｃａｒ配列を選択する能力が挙げられる。これは、ゲノム全体にわたり散在して、リコンビナーゼの再導入の際に再度の切断を待つ、部位特異的なリコンビナーゼの結合および切断部位の複数のコピーであって、染色体セグメントの転座および潜在的に切り出しをもたらす複数のコピーを必然的に残す、Ｆｌｐ／ＦＲＴ系またはＣｒｅ／ｌｏｘ系を凌駕する利点である。別の利点は、切り出し頻度が５０％より高いことがしばしばであり、このため、切り出しに成功した産物の単離物の増殖だけを可能とするのに利用可能な選択法が存在しない場合であっても、所望の産物株を同定するスクリーニング法を用いて、任意の所望の標的ＤＮＡを切り出すのにこの手法を用いうるということである。
【０１８５】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に表示されたと仮定した場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。理解を明確にするための例示および例として、先行する発明についてある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らせば、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、それに対してある変化および改変を行いうることは、当業者に容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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