(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるBDNF又はNT-3の発現に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
【請求項２】
神経栄養因子がBDNFである請求項１記載の判定又は評価方法。
【請求項３】
神経栄養因子がNT-3である請求項１記載の判定又は評価方法。
【請求項４】
BDNF又はNT-3の発現に対する作用が促進作用である請求項１乃至３のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項５】
BDNF又はNT-3の発現に対する作用を、細胞におけるCREBに対する作用を指標として測定する請求項１乃至４のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項６】
CREBに対する作用がCREBのリン酸化促進作用である請求項５記載の判定又は評価方法。
【請求項７】
CREBのリン酸化促進作用をc−Fosの発現亢進を指標として測定する請求項６記載の判定又は評価方法。
【請求項８】
BDNF又はNT-3の発現に対する作用を、細胞におけるMAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用を指標として測定する請求項１乃至４のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項９】
MAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質が、MEK／ERK経路におけるタンパク質である請求項８記載の判定又は評価方法。    
【請求項１０】
MEK／ERK経路におけるタンパク質が、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2又はRskである請求項９記載の判定又は評価方法。
【請求項１１】
MAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質が、PI3K／Akt経路におけるタンパク質である請求項８記載の判定又は評価方法。
【請求項１２】
PI3K／Akt経路におけるタンパク質が、PI3K、Akt又はP38MAPKである請求項１１記載の判定又は評価方法。
【請求項１３】
MAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用がタンパク質のリン酸化促進作用である請求項８乃至１２のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項１４】
細胞が培養細胞である請求項１乃至１３のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項１５】
細胞がSH-SY5Y細胞である請求項１４記載の判定又は評価方法。
【請求項１６】
炎症組織が皮膚組織である請求項１乃至１５のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項１７】
炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項１乃至１５のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか一項記載の判定又は評価を行うことによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質規格を担保する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な判定又は評価方法等に関するものであり、具体的には被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の、培養細胞におけるBDNF発現に対する作用又はBDNF産生に関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対する作用を指標として、該被検物質を判定又は評価する方法に関する。なお、このような文脈における「処理」とは、その物質の存在下に細胞を培養することを意味するものである（以下同じ）。
【背景技術】
【０００２】
脳由来神経栄養因子（brain-derived neurotrophic factor：BDNF）は、神経成長因子（nerve growth factor：NGF）やニューロトロフィン-3（neurotrophin-3：NT-3）と共にニューロトロフィンファミリー（神経栄養因子ファミリー）に属し、種々の細胞、例えば神経細胞（ニューロン）、神経膠細胞（マイクログリア、星状細胞、乏突起膠細胞等）等で産生される分泌性タンパク質である。BDNFは海馬を中心として中枢神経系に偏在し、神経細胞の生存・維持、神経突起の形態調節、シナプスの機能調節、神経可逆性の制御等、神経系において種々の生理活性を示すことが知られている。【０００３】
生体内におけるBDNFの発現は、BDNFに対する高親和性受容体であるTrkB（tropomyosin receptor kinase B）の活性化を通じて開始されるMAPキナーゼ（mitogen-activated protein kinase：MAPK：分裂促進因子活性化タンパク質）／CREB（cAMP-response-element-binding protein：サイクリックAMP応答配列結合タンパク質）経路と呼ばれる細胞内シグナル伝達系を介して、最終的にはCREBの活性化（リン酸化）によって制御されることが知られている。すなわちBDNFが細胞表面上にあるTrkBに結合してTrkBが活性化されると、Ras活性化を介したMEK（MAPK
kinase：MAPキナーゼキナーゼ）／ERK（extracellular-signal-regulated kinase）経路によるCREB活性化、並びにPI3K（phosphoinositide 3-kinase）／Akt経路によるCREB活性化（本願では、両経路を合わせてMAPキナーゼ／CREB経路という。）が導かれるとされている。【０００４】
MEK／ERK経路については、Trk受容体の活性化から、Grb2／Sos、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、Rsk等の各種タンパク質の活性化が順次に伝達されて、最終的にCREBが活性化（リン酸化）されてBDNF等を発現するとされている。また、PI3K／Akt経路については、Trk受容体の活性化によってPI3K、Akt、P38MAPK等のタンパク質の活性化が順次伝達されて、同様にCREBのリン酸化が導かれるとされている。【０００５】
本発明者らは、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が、培養細胞においてBDNF等の神経栄養因子の発現に対する作用を有することを見出した。そして、その際に該抽出物は、BDNF等発現に関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に作用すること、またこれらの作用が、Trk受容体、PI3K、P38MAPK、MEK1/2等に対する各阻害剤によって抑制されることを明らかにした。本発明判定又は評価方法はこのような研究成果に基づくものである。【０００６】
本発明判定又は評価方法の被検対象物であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物については、鎮痛作用、鎮静作用、抗ストレス作用、抗アレルギー作用（特許文献１参照）、免疫促進作用、抗癌作用、肝硬変抑制作用（特許文献２参照）、特発性血小板減少性紫斑病に対する治療効果（特許文献３参照）、帯状疱疹後神経痛、脳浮腫、痴呆、脊髄小脳変性症等への治療効果（特許文献４参照）、レイノー症候群、糖尿病性神経障害、スモン後遺症等への治療効果（特許文献５参照）、カリクレイン産生阻害作用、末梢循環障害改善作用（特許文献６参照）、骨萎縮改善作用（特許文献７参照）、敗血症やエンドトキシンショックの治療に有効な一酸化窒素産生抑制作用（特許文献８参照）、骨粗鬆症に対する治療効果（特許文献９参照）、Nef作用抑制作用やケモカイン産生抑制作用に基づくエイズ治療効果（特許文献１０、１１参照）、脳梗塞等の虚血性疾患に対する治療効果（特許文献１２参照）、線維筋痛症に対する治療効果（特許文献１３参照）、感染症に対する治療効果（特許文献１４参照）、抗がん剤による末梢神経障害の予防又は軽減作用（特許文献１５参照）などが知られている。しかし、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物によるBDNF発現促進及びその調節作用について明らかにしたのは初めてであり、BDNFの発現促進及びそれに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質の活性化促進等を指標として、該抽出物を判定又は評価する方法は今まで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５３−１０１５１５号公報
【特許文献２】特開昭５５−８７７２４号公報
【特許文献３】特開平１−２６５０２８号公報
【特許文献４】特開平１−３１９４２２号公報
【特許文献５】特開平２−２８１１９号公報
【特許文献６】特開平７−９７３３６号公報
【特許文献７】特開平８−２９１０７７号公報
【特許文献８】特開平１０−１９４９７８号公報
【特許文献９】特開平１１−８０００５号公報
【特許文献１０】特開平１１−１３９９７７号公報
【特許文献１１】特開２０００−３３６０３４号公報
【特許文献１２】特開２０００−１６９４２号公報
【特許文献１３】国際公開ＷＯ２００４／０３９３８３号公報
【特許文献１４】特開２００４−３００１４６号公報
【特許文献１５】国際公開ＷＯ２００９／０２８６０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、培養細胞におけるBDNF等の神経栄養因子の発現それに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対する作用を指標としたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の薬理作用について鋭意研究を行った結果、該抽出物が培養細胞におけるBDNF等の神経栄養因子の発現に対して作用を及ぼすこと、並びに、BDNF等発現に関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対して作用を及ぼすことを見出し、これらを指標としたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法として本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、培養細胞におけるBDNF等の神経栄養因子の発現及びそれに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対する作用を有することが明らかになった。このBDNF等の発現及びそれに関与するタンパク質に対する作用は簡便な方法を用いて測定することができる。ワクシニアウイルス接種炎症皮膚抽出物は非常に膨大な数の成分からなる多成分系の物質であることから、その作用を単一あるいは複数の含有成分の含量等で判定又は評価し、薬効等を担保することは極めて困難である。その点、本発明の判定又は評価方法によれば、簡便にワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の作用を判定又は評価でき、引いては該抽出物の薬効を担保することに利用できるなど、極めて有用性の高いものである。なお、本願における「判定又は評価」には、試験、検査等により対象物を調べて見定める概念のすべてが包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、SH-SY5Y細胞を被検物質（実施例１の方法で製造されたワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚抽出物。本願の薬理試験で用いられている「被検物質」は同じ。）又はレチノイン酸で処理した際のBDNFの発現（mRNAレベル）を経時的に調べた結果を示す電気泳動図である。
【図２】図2は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際の各種神経栄養因子の発現（mRNAレベル）を調べた結果を示す電気泳動図である。
【図３】図３は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際のBDNFの発現（mRNAレベル）を調べた結果を示すグラフである。
【図４】図４は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際の細胞内のBDNFの発現（タンパク質レベル）を調べた結果を示すグラフである。
【図５】図５は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際のc-Fosの発現（mRNAレベル）を調べた結果を示す電気泳動図である。
【図６】図６は、SH-SY5Y細胞を被検物質又はヒトリコンビナントBDNFで処理した際のCREB経路における細胞内シグナル伝達分子の発現（タンパク質レベル）を調べた結果を示す電気泳動図である。
【図７】図７は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際の、CREB経路の細胞内シグナル伝達分子に対する阻害剤によるBDNFの発現（mRNAレベル）に対する影響を調べた結果を示す電気泳動図である。
【図８】図８は、SH-SY5Y細胞を被検物質又はフォルスコリンで処理した際の細胞内サイクリックAMP（cAMP）含量を調べた結果を示すグラフである。
【図９】図９は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際の、抗TrkB抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤等によるBDNF等の発現（mRNAレベル）に対する影響を調べた結果を示す電気泳動図である。
【図１０】図１０は、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理した際の細胞表面のTrkA/B量を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、培養細胞をワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物によって処理し、BDNF等の発現又はそれに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質の活性化等を測定することによって、被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を判定又は評価する方法に関する。
【００１３】
本発明に使用可能な細胞としては、最も簡便には市販の培養細胞がある。その最も好ましい例のひとつとして、BDNF等及びその高親和性受容体TrkBを発現するヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞が挙げられる。しかし、本発明においては、SH-SY5Y細胞に限らず、PC12細胞（ラット副腎髄質由来褐色細胞腫）やシュワン細胞（新生児ラット坐骨神経）といった別の細胞も適宜使用することができる。
【００１４】
本発明判定又は評価方法の被検物質は、ワクシニアウイルスを動物に接種した炎症組織において産生される生理活性物質（ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物）であり、該物質を病態組織から抽出する方法並びにそれらの薬理活性等が上述のようにすでに種々報告されている（上記特許文献１乃至１５等参照）。
【００１５】
また、本発明被検物質として使用可能な市販されている製剤として、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤がある。この製剤は、日本の医療用医薬品集〔2010年版、財団法人日本医薬情報センター編集・発行〕の2978乃至2980頁に記載されているように、ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚組織から抽出分離した非タンパク性の活性物質を含有するものである。腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、じんま疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症状の冷感・異常知覚・痛み、帯状疱疹後神経痛等に対する適応が認められており、皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として承認を受けて販売されている。
【００１６】
以下、本発明被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を製造する方法等について説明する。
【００１７】
本発明被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。
【００１８】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。
（a）ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液（濾液または上清）を得る。
（b）前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
（c）得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（d）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。
【００１９】
上記各工程を更に詳しく述べると次のとおりである。
（a）について
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの発痘皮膚組織が好ましい。
【００２０】
これら炎症組織を採取して破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。
【００２１】
（b）について
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、タンパク質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶タンパク質を除去する。
【００２２】
（c）について
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
【００２３】
（d）について
吸着剤より有効成分を溶出（脱離）させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。
【００２４】
このようにして得られた抽出物（溶出液）は、製剤用原体や医薬品製剤として好ましい形態に適宜調製することができる。例えば、溶液のpHを中性付近に調整して製剤用原体とすることもでき、また濃縮・希釈によって所望の濃度に合せることもできる。さらに注射用製剤として塩化ナトリウムを加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することもできる。また、これら溶液を濃縮乾固又は凍結乾燥することによって、錠剤等の原料として利用できる固形物の形態に調製してもよい。
【００２５】
患者への投与方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げられ、投与量はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定することができる。市販製剤で認められている投与量は、前記日本の医療用医薬品集（2978頁）によれば、基本的には内服では1日16NU、注射剤では1日3.6乃至7.2NUを投与するよう示されているが、疾患の種類、重傷度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能である（NU：ノイロトロピン単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED50値をもって規定する。1NUはED50値が100 mg／kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。）。
【００２６】
以下に、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の製造方法の具体例、並びに該抽出物によるBDNFの発現亢進に関する薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90〜100℃で30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90〜100℃で15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5に調整し、2％の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。【００２８】
実施例２
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性（pH4.5乃至5.5）に調整した後、100℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性（pH8.5乃至10.0）とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5とし、約1.5％の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH9.4乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。【００２９】
実施例３
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5.0に調整した後、流通蒸気下100℃で加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9.1とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でpH4.1に調整し、活性炭2％を加えて2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭5.5％を加えて2時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行い、減圧下に乾固した。【００３０】
次に、上記実施例１で得られた本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を被検物質として、その存在下にヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を培養した際の薬理試験の結果の一例を示す。なお、SH-SY5Y細胞については、Hamano等の方法（Molecular Brain Research、137巻、70−76頁、2005年）に従い、10％ウシ胎仔血清（FCS）、1mLピルビン酸、0.37％ブドウ糖及び25mIU/mLペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（Gibco DMEM；Invitrogen社）中、37℃、5％CO2の加湿インキュベータで前培養したものを用いた。また、被検物質で処理した後の各培養細胞について、48時間以内の形態学的変化や、トリパンブルー色素排除試験による細胞生存率の低下は見られないことを確認した。また、試験終了後、全データについてStudent のt-検定（SAS
System version 8.2、SAS Institute Japan社）により統計解析し、0.05（5%）及び0.01（1%）を有意水準として有意差検定を行った。【００３１】
薬理試験１：BDNFの経時的発現
SH-SY5Y細胞（5×105細胞）を被検物質（30mNU/mL）又はポジティブコントロールとしてレチノイン酸（1μM）で処理し、無血清DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地で0、1、3、6、12、18、24時間培養した。培養上清を除去した後、トータルRNAをトリゾル試薬（Invitrogen社）により単離し、回収率と純度を260nm及び280nmの紫外部吸収より測定した（GeneQuant Pro、GE Healthcare社）。RNA等量をスーパースクリプトIIIファーストストランドDNA合成キット（Invitrogen社）によってランダムプライマーを用いて一本鎖DNAに逆転写し、続いてTaq DNAポリメラーゼ（Invitrogen社）による半定量的PCR（Polymerase chain reaction）を行った。なお、BDNF及びシクロフィリンA（内部標準遺伝子）用のPCRプライマー（Invitrogen社）はYamamoto等の方法（Neurochemical Research、21巻、8号、929−938頁、1996年）に従って設計した。PCR産物を3%アガロースゲル（NuSieve 3:1 アガロース、タカラバイオ社）電気泳動により分離し、BDNF及びシクロフィリンAのバンドをエチジウムブロマイド（0.1μg/mL）染色して可視的に検出した。PCRにおける鋳型と産物の量の直線性は別途確認した。上記試験結果の一例を図１に示す。【００３２】
薬理試験２：神経栄養因子の用量依存的発現
SH-SY5Y細胞（約5×105細胞）を被検物質（0、2、10、50、250mNU/mL）で処理し、無血清DMEM培地で24時間培養した。次に、上記薬理試験１と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、NGF、BDNF、NT-3、TrkA、TrkB及びGAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のバンドを可視的に検出した。なお、NGF、BDNF及びNT-3用の各PCRプライマー（Invitrogen社）はYamamoto等の方法（Neurochemical Research、21巻、8号、929−938頁、1996年）に従って設計し、TrkA（Tropomyosin-related kinase A）、TrkB（Tropomyosin-related kinase B）及びGAPDH用の各PCRプライマー（Sigma Genosys社）は以下の配列として独自に設計した〔TrkA(178bp)：5'-tggacaaccctttcgagttc-3'
5'-cgtccacatttgttgagcac-3'、TrkB(188bp)：5'-ccgagattggagcctaacag-3' 5'-tgcaggttgctgtttttcag-3'、GAPDH：5'-atcactgccacccagaagac-3'   5'-tttctagacggcaggtcagg-3'〕。【００３３】
また、抽出したトータルRNAについて、濃度が既知である目的物の鋳型cDNAを用いてリアルタイムPCRシステム（Prism 7900HT、Applied Biosystems社）により、BDNFのmRNAを定量した。なお、BDNF及びGAPDH用のPCRプライマーは以下のヌクレオチド配列である〔BDNF：5'-gctgcaaacatgtccatgag-3'
5'-atgggattgcacttggtctc-3'、GAPDH：5'-atcactgccacccagaagac-3' 5'-tttctagacggcaggtcagg-3'〕。結果は、GAPDHに対するBDNFの転写コピー数の比率を8回測定した平均値を得、コントロール（生理食塩水処理）を1.0とした場合の値として表示した。上記試験の半定量的PCRの結果の一例を図２に、定量的PCRの結果の一例を図３に示す。【００３４】
薬理試験３：細胞内BDNFの発現
SH-SY5Y細胞（1×106細胞）を被検物質（0、2、10、50mNU/mL）存在下で24時間培養した。次に、SH-SY5Y細胞（1×106細胞）をプレートよりこそげ取り、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤混合物（Sigma社）を含有する溶解バッファー（20mM HEPES：4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic
acid；pH7.2、1%Nonidet P-40、10%glycerol、50mM NaF、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride、1mM NaVO4）で処理した。細胞残屑を除去した後、ELISA（enzyme-lnked immuno-solvent assay、酵素免疫測定法）を行うまで細胞溶解物を-80℃で保存した。なお、細胞溶解物のタンパク含量はBCAタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社）で測定した。【００３５】
次に、保存しておいた細胞溶解物中のBDNFを市販のELISAキット（Emax ELISA kits、Promega社）を用い、我々の標準プロトコールに準じて定量した。すなわち、BDNF捕獲用の対応抗体を96-well ポリスチレンプレート（lumulon 4HBX、Thermo Fisher Scientific社）の表面に結合させ、次に、取り込んだBDNFを二次抗体と結合させ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish
peroxidase ：HRP）で標識した種特異的抗体により検出した。結合していない標識抗体を除去した後、マイクロプレートリーダー（Benchmark microplate reader、BioRad社）で450nmにおける発色性基質を測定して、結合している酵素の活性を算定した。これらキットを使用して、3.9〜500pg/mLの範囲で細胞内BDNFを定量した。なお、他の神経栄養因子タンパク質との交差反応は2％未満である。結果はn=3の平均値及び標準誤差で示した。上記試験結果の一例を図４に示す。【００３６】
薬理試験４：c-Fosの発現
SH-SY5Y細胞（5×105細胞）を被検物質（0、2、10、50mNU/mL）で24時間培養した。次に、上記薬理試験１と同様に、単離したRNAについて半定量的RT-PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、c-Fosのバンドを可視的に検出した。なお、c-Fos用のPCRプライマー（Sigma
Genosys社）は以下の配列として独自に設計した〔c-Fos (178bp)：5'-gcttcccttgatctgactgg-3'   5'-atgatgctgggaacaggaag-3'〕。上記試験結果の一例を図５に示す。【００３７】
薬理試験５：CREB経路に対する効果
細胞内シグナル伝達分子を、CREB（MAB5432；Millipore社）、リン酸化CREB（P-CREB：Clone 10E9；Millipore社）、P42/44 MAPキナーゼ（ERK1/2；Cell Signaling Technology社）、リン酸化P42/44 MAPキナーゼ（P-MAPK： Tyr202/Tyr204；Cell Signaling Technology社）及びc-Fos（Gene Tex社）に対して産生される各特異抗体を用いてイムノブロット法により検出した。すなわち、まずSH-SY5Y細胞（1×106細胞）を無血清DMEM培地で6時間培養し、ヒトリコンビナントBDNF（50pg/mL；Peprotech社）又は被検物質（0、2、10、50mNU/mL）で10分又は30分間処理した。次いで、該細胞をセルスクレイパー（BD Biosciences社）でこそげ取り、すぐに氷冷したPBSで洗浄した後、Mutoh等の方法（Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America、92巻、5087−5091頁、1995年）に従って細胞溶解した。細胞溶解物について4〜20％ゲル（ePAGEL；Atto Chmicals社）のSDS-PAGE電気泳動を行い、PVDF（Polyvinylidene floride）メンブレンにブロッティングした。該メンブレンを3％無脂肪乳及び0.1％Tween20（TBS-T）を含有するトリス緩衝生理食塩水（TBS；20mM Tris-HCl、pH 7.5、0.15M NaCl）で1時間ブロッキングした後、一次抗体及びHRP標識二次抗体との反応をTBS-T中室温で1時間行った。CREB、リン酸化CREB、P42/44 MAPキナーゼ、リン酸化P42/44 MAPキナーゼ及びc-Fosの免疫反応性バンドを電気化学的発光による検出システム（ECL；GE Healthcare社）により可視的に検出した。上記試験結果の一例を図６に示す。【００３８】
薬理試験６：BDNF発現における細胞内シグナル伝達阻害剤による影響
SH-SY5Y細胞（5×105細胞）を被検物質（10mNU/mL）存在下、無血清DMEM培地中で24時間培養した。培養終了30分前に、培地に溶解したPD98059（MEK阻害剤、10μM）、LY294002（PI-3K阻害剤、15μM）又はSB203580（p38 MAPK阻害剤、0.5μM）を培養物に添加した。次に、上記薬理試験１と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的RT-PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、BDNF及びシクロフィリンAのバンドを可視的に検出した。上記試験結果の一例を図７に示す。【００３９】
薬理試験７：細胞内cAMP含量
SH-SY5Y細胞を24well培養プレートに3.75×105細胞／wellで播種し、無血清DMEM培地において、被検物質（2、10、50 mNU/mL）又はポジティブコントロールとしてのフォルスコリン（10μM；Sigma社）で30分間処理した。培養上清を除去した後、すぐに300μL/wellの0.1M塩酸で4℃にて細胞溶解した。細胞溶解物の細胞内cAMP含有量をEIA（enzyme
immunoassay）キット（Cayman Chemicals社）により、メーカーの使用説明書に従って直接測定した。なお、タンパク質濃度はBSA標準液（Thermo Fisher Scientific社）を用いたBCAプロトコール（Thermo Fisher Scientific社）により測定した。結果は4回測定の平均値及び標準偏差で示す。上記試験結果の一例を図８に示す。【００４０】
薬理試験８：TrkB阻害の影響
SH-SY5Y細胞（5×105細胞）を被検物質（10mNU/mL）で無血清DMEM培地中24時間培養した。培養終了30分前に、K252a（チロシンキナーゼ阻害剤、500nM）又はヒトTrkB特異抗体のウサギIgG（αTrkB、20μg/mL）を培養物に添加した。次に、上記薬理試験１と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的RT-PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、BDNF及びシクロフィリンAのバンドを可視的に検出した。上記試験結果の一例を図９に示す。【００４１】
薬理試験９：TrkBの内在化
細胞表面のTrkB分子の密度を一部改良されたSerresとCarneyの方法（Brain Research、1101巻、36-42頁、2006年）により測定した。すなわち、まず、SH-SY5Y細胞を1×105/ｍLで播種して培養し、1％FCS含有DMEM培地において被検物質（2, 10, 50 mU/mL）で処理した。受容体の内在化を防ぐために0.1mM塩化カルシウムと1mM塩化マグネシウムを添加した氷冷PBSで細胞を3回洗浄した。次に、細胞表面上の分子を、PBSに溶解した250μg/mL EZ-Link
sulfo-LC-LC-NHS-biotin（Thermo Fisher Scientific社）により4℃で30分間ビオチン化した。未反応のビオチン化試薬を抑制するために10ｍMグリシン含有氷冷PBSで2回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤混合物（Sigma社）を含有する最低量の細胞溶解バッファー（1% Nonidet P-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS in PBS）で細胞溶解した。タンパク濃度を細胞溶解バッファーで50μg/mLに調整して試料とした。【００４２】
5μgの試料（100μL）をストレプトアビジンが固定されたプレート上、2時間室温でインキュベートした。0.2％Tween20含有PBSで3回洗浄した後、ウサギ抗Trk抗体（100μL；Clone C-14、
Santa Cruz Biotechinology社）を1：1,000に希釈して添加し、1時間置いた。洗浄後、HRPで標識した抗ウサギIgG（1：1,000、 100μL；AP132P、Chemicon
International社）を添加して1時間置き、次いで、TMB
One Substrate（100μL；Promega社）との酵素反応を行った。0.1N塩酸（50μL）を添加して反応を停止し、結合した特異的抗体を450nmでの吸光度を測定することにより定量した（Benchmark
micloplate reader）。結果はn=3の平均値及び標準誤差で示し、コントロールに対するパーセンテージで表示した。上記試験結果の一例を図１０に示す。【００４３】
薬理試験結果
（１）被検物質によるSH-SY5Y細胞におけるBDNF発現促進
薬理試験１の結果（図１）より、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理することにより、BDNFの発現がmRNAレベルで経時的に亢進されることが確認された。また、培養24時間後の被検物質によるBDNF誘導の強さは、ポジティブコントロールであるレチノイン酸と同程度であった。【００４４】
薬理試験２の結果（図２及び図３）より、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理することにより、BDNF及びBDNF以外の神経栄養因子（NGF、NT-3）の発現がmRNAレベルで亢進されることが認められた。しかし、神経栄養因子の高親和性受容体であるTrkAやTrkBの発現は亢進されなかった。また、これらの試験では、被検物質によるBDNFの発現促進効果には至適濃度（10mNU/mL）があると考えられた。【００４５】
さらに、薬理試験３の結果（図４）より、被検物質10mNU/mL以上の濃度による処理で、細胞内のBDNF量（タンパク質レベル）が有意に上昇することが確認された。一方、細胞外に分泌された遊離BDNF量を測定する目的で、培養上清中のBDNF量を測定したが検出されなかった（検出限界3.9pg/mL）。これは以前にBalkowiecらが報告している通り（The Journal of Neuroscience、20巻、7417−7423頁、2000年）、遊離BDNFがTrkBによって即時に細胞内に取り込まれるためであると考えられた。【００４６】
（２）被検物質によるBDNF等発現促進のメカニズム
BDNF等の発現はTrk受容体の下流に位置するRas-MAPキナーゼカスケードやCREBのリン酸化等、細胞内シグナル伝達カスケードにより制御されていることが知られている（Current Opinion in Neurobiology、11巻、272−280頁、2001年）。BDNFの発現と同様に、プロトオンコジーン遺伝子であるc-Fosの発現もCREBの活性化により上昇するが、薬理試験４の結果（図５）より、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理することによって、c-Fosの発現が亢進されることが確認された。【００４７】
また、薬理試験５の結果（図６）より、被検物質でSH-SY5Y細胞を処理して10分以内に、CREBの133番目のセリン残基のリン酸化やその上流モジュレーターであるp42/44MAPキナーゼ（ERK1/2）のリン酸化が亢進されることが認められた。なお、PC12細胞やシュワン細胞を用いた試験系においても、被検物質がERK1/2のリン酸化を亢進することが認められている。
細胞外から与えたBDNFでも同様にこれらCREBや42/44MAPキナーゼのリン酸化を亢進したが、図１に示した通り、被検物質によるBDNFの発現促進作用は比較的時間がかかるため、細胞外に放出促進されたBDNFがこの被検物質の作用を間接的に起こしているのではないと考えられた。また、この結果に符合して、PI3K、MEK1/2、p38MAPKはいずれもTrkB受容体から開始されるCREB活性化経路のモジュレーター（介在するタンパク質）であるが、薬理試験６の結果（図７）より、これらモジュレーターに対する阻害剤によって、被検物質によるBDNFの発現促進が抑制されることが認められた。つまり、PI3K阻害剤（LY294002）によってAktのリン酸化が、MEK1/2阻害剤（PD98059）によってERK1/2のリン酸化が、ｐ38MAPK阻害剤（SB203580）によってCREBのリン酸化が各々阻害される。このことから、被検物質はPI3K／MAPキナーゼ経路やRas-MAPキナーゼカスケードといった上流のシグナル伝達カスケードを標的とすると考えられた。【００４８】
一方、薬理試検７の結果（図８）より、CREB活性化における上記経路とは異なる経路のモジュレーターであるcAMPの細胞内レベルは被検物質により上昇されず、特に濃度50mNU/mLの被検物質では有意に抑制されることが認められた。この結果より、被検物質はcAMP依存性プロテインキナーゼ経路ではなくMAPキナーゼ経路を活性化することによりCREBに関係する転写を促進して、BDNFやc-Fosの発現を促進すると考えられた。【００４９】
（３）被検物質の作用に対するTrkBの関与
MAPキナーゼ／CREB経路における神経作用はTrkBの活性化を通じて協調的に調節されることが知られているが、上記薬理試験より、被検物質の作用におけるTrkBの関与が明らかにされた。具体的には、薬理試験８の結果（図９）より、チロシンキナーゼ阻害剤K252a又はTrkB特異抗体の存在下で、被検物質により促進されたBDNFの発現はほほ完全に抑制されることが確認された。このことより、被検物質は直接TrkBを標的にして内因性のチロシンキナーゼを活性化し、MAPキナーゼ／CREB経路の活性化によりBDNFの発現を促進していると考えられた。【００５０】
また、薬理試験９の結果（図１０）より、被検物質で48時間処理すると細胞表面のTrkBの発現が有意に減少することが認められ、TrkBの細胞内取込みが起こっていると考えられた。【００５１】
以上のことから、本発明として、次のようなものを導くことができる。もっとも、これらは例示であって、本発明はこれらに限られるものではない。
(1)細胞における神経栄養因子の発現に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
(2)作用が発現促進作用である(1)記載の判定又は評価方法
(3)神経栄養因子がBDNFである(1)又は(2)記載の判定又は評価方法。
(4)神経栄養因子がNGF又はNT-3である(1)又は(2)記載の判定又は評価方法。
(5)細胞におけるCREBに対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
(6)作用がCREBのリン酸化促進作用である(5)記載の判定又は評価方法。
(7)CREBのリン酸化促進作用をc−Fosの産生を測定して指標とする(6)記載の判定又は評価方法。
(8)細胞におけるMAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
(9)作用がタンパク質のリン酸化促進作用である(8)記載の判定又は評価方法。
(10)MAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質が、MEK／ERK経路におけるタンパク質である(9)記載の判定又は評価方法。
(11)MEK／ERK経路におけるタンパク質が、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2又はRskである(10)記載の判定又は評価方法。
(12)MAPキナーゼ／CREB経路に介在するタンパク質が、PI3K／Akt経路におけるタンパク質である(11)記載の判定又は評価方法。
(13)PI3K／Akt経路におけるタンパク質が、PI3K、Akt又はP38MAPKである(12)記載の判定又は評価方法。
(14)細胞が培養細胞である(1)乃至(13)にいずれかに記載の判定又は評価方法。
(15)細胞がSH-SY5Y細胞である(14)記載の判定又は評価方法。
(16)炎症組織が皮膚組織である(1)乃至(15)のいずれかに記載の判定又は評価方法。
(17)炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である(1)乃至(15)のいずれかに記載の判定又は評価方法。
(18)(1)乃至(17)のいずれかに記載の判定又は評価方法によって品質規格が担保されたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
(19)(1)乃至(17)のいずれかに記載の判定又は評価を行うことによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質規格を担保する方法。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を被検物質とした上記薬理試験の結果から明らかなように、該抽出物で培養細胞を処理することにより、TrkBの活性化を通じてMAPキナーゼ／CREB経路が活性化され、BDNFやc-Fos等の発現が亢進することが認められた。【００５３】
従って、BDNF等の発現、あるいはそれに関与するタンパク質の活性化を測定することにより、ワクシニアウイルス接種炎症皮膚抽出物の作用を判定又は評価し、あるいは該抽出物の薬効を担保すること等に利用できる。【００５４】
すなわち、市販のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤は、慢性疼痛関連疾患の治療用として、優れた効果と高い安全性から長年に亘って広く使用されている薬剤である。ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液は、有効成分が明確になっていないため、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用いる大変手間のかかる方法で品質の担保を行っている。これに対して、本発明の判定又は評価方法は、培養細胞を用いたin vitro試験で実施することができるものであり、特殊な病態モデル動物を用いる判定法に比べて、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質を担保するための簡便迅速な判定又は評価する方法として、有用性の高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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