(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌の処置に使用するための薬学的組成物であって、以下：
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含む天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）を含有し、
ここで、該癌が、子宮頸部癌、肝細胞癌、陰茎の扁平上皮細胞癌、および、リンパ腫からなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項２】
前記患者へのリンパ管周辺投与のためのものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
シクロホスファミドを含む投薬レジメにおいて使用するためのものである、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む投薬レジメにおいて使用するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記天然のサイトカイン混合物が、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記癌が、肝細胞癌である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記癌が、リンパ腫である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、癌患者についてのワクチン療法に関する。より詳細には、本発明は、内因性および外因性の腫瘍ペプチドまたはタンパク質の両方に関して、免疫抑制を有している癌患者を免疫するワクチン免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
ヒトの癌は、宿主の免疫システムによって反応すると腫瘍退行を導く抗原を有することが如々に明らかになっている。これらの抗原は、血清学的アプローチおよび細胞免疫アプローチの両方によって定義されている。この定義によって、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方のエピトープの定義が導かれている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これらの結果に基づいて、これが、腫瘍の退行を導くための癌の免疫療法の目的となってきた。しかし、歴史的には、成功した結果はあまりなく、そして一般的には頻度および大きさにおいては数が少ない。
【０００３】
癌患者を免疫する試みにおける基本的な問題点は、腫瘍を保有している状態が、腫瘍および宿主の乱れた免疫システムの両方に由来する免疫抑制機構に関係していることである（非特許文献４）。それにより、免疫は難しく、そして現在もなお堅実な主薬には到達していない。免疫抑制または免疫の低下（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、免疫システムの応答能力の減少に関係している。このような抑制は、薬物誘導型であり得るかまたは疾患誘導型であり得る。このような状態は、処置による薬物誘導型であり得るか、ＡＩＤＳにおけるようなウイルス誘導型であり得るか、または癌のような疾患状態によって誘導され得る。この状態では免疫システムは事実上オフにされる。
【０００４】
種々の腫瘍免疫方法論が開発されている。しかし、これらの方法論の全てが複雑であり、そして感染性疾患について使用される従来の免疫方法論から明らかにそれている（非特許文献５）。１つのこのような腫瘍免疫方法論には、キーホールリンペットヘモシアニンと結合させられ、かつＤｅｔｏｘ（登録商標）ミコバクテリウムアジュバントおよび低用量のシクロホスファミドとともに投与される、シアリルＴＮポリサッカライドムチン抗原であるＴｈｅｒａｔｏｐｅ（登録商標）が関係している（非特許文献６）。しかし、転移性乳癌および卵巣癌の患者でのこのワクチンの使用によって、患者の低い割合においては重大な臨床応答が生じる。重大な応答とは、５０％よりも大きな腫瘍の縮小を意味する。
【０００５】
パピローマウイルスペプチド１６を発現する遺伝子についての発現ベクターが、免疫のためまたは子宮頸癌の患者について使用されており、そして患者の低い割合において重大な臨床応答を生じたので、アデノウイルス構築物を使用する遺伝子治療もまた、試みられている（非特許文献７）。
【０００６】
樹状細胞媒介型の治療もまた試みられている。ここでは、樹状細胞は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のオリゴペプチドフラグメントでパルスされた。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は転移性前立腺癌の患者に使用されており、患者の低い割合において重大な臨床応答を有する（非特許文献８）。
【０００７】
さらに、自己由来の腫瘍が、悪性黒色腫の癌患者を免疫するために、低用量のシクロホスファミドおよびＢＣＧとともに使用されている。しかし、臨床応答はほとんど報告されていない（非特許文献９）。試みられた別の方法論には、ＭＡＧＥ抗原を種々のワクチンアジュバントとともに使用することが含まれた。重ねて、これによっては、たとえあるとしても、悪性黒色腫の患者での応答は、ほとんど生じない（私信  Ｔｈｉｅｒｙ  Ｂｏｏｎ）。
【０００８】
Ｄｏｙｌｅらのいくつかの特許（第５，５０３，８４１号；第５，８００，８１０号；第６，０６０，０６８号；第５，６４３，５６５号；第５，１００，６６４号）は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を使用して患者の免疫応答を強化する方法を開示する。この方法は、免疫原であることが既知の抗原を使用する、感染性疾患および主に機能へ応じた用途を開示する。限定された適応性が実証された。上記で開示されるように、癌の処置は、種々のアプローチを必要とすることが既知である。今日までには、ＩＬ−２での処置は２つの癌（腎細胞癌および悪性黒色腫）において一般性の低い効果を有する（２０％未満の応答率）。扁平上皮細胞の頭部および頸部の癌、ならびに子宮頸癌、ならびに前立腺癌においては、これは一般的には効果がないと考えられる。よって、ＩＬ−２での処置は、これらの用途については照明されていない。従って、Ｄｏｙｌｅらの特許の方法を、癌の処置において小ペプチドの使用に適応することは当業者の範囲内ではない。
【０００９】
健常な患者における複雑な構造かつ大きな分子量の既知の「伝統的な」抗原での予防  対  免疫抑制された患者（一般的には良好ではない）での腫瘍抗原またはペプチド（一般的には良好ではない）での処置（一般的には良好ではない）を対比させることが重要である。前者は容易であり、そして本発明者らの現在のウイルスワクチンは、それらの効率を立証する。後者は、３０年間の猛烈な研究にもかかわらず、日常的な基準ではほぼ不可能である。
【００１０】
本発明が、樹状細胞によってプロセシングされそして提示される内因性ペプチド、または樹状細胞が調製されそしてＴ細胞に対してそれらを効率よく提示することができる環境（リンパ節）に対して内因的に投与された内因性ペプチドでの免疫に関する（しかし、これに限定はされない）ことが、重要である。この目的は、多くの免疫学者らによって克服することが不可能と考えられている。ペプチドは、有効な免疫原としてはあまりに小さく、それらの半減期は短く、これらは多くの場合、患者がそれに対して免疫原的に寛容であり、そして応答の獲得が自己免疫の誘導と同等である、非変異型（ｎｏｎｍｕｔａｔｅｄ）自己抗原である。
【００１１】
上記の方法論のいくつかにおいては、腫瘍関連抗原に対する細胞性免疫および／または腫瘍性免疫が誘導されている（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。このことは特に、腫瘍の退行にそのように関係している。それにもかかわらず、このような処置の成功率は無視できる程度でありそして一貫しない（＜３０％）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓａｈｉｎ  Ｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：７０９−７１５、１９９７
【非特許文献２】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：６８４−６９３、１９９７
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  ＲＦら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７０：８５−１００、１９９９
【非特許文献４】Ｋａｖａｎａｕｇｈ  ＤＹら、Ｈｅｍａｔｏｌ−Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ  １０（４）：９２７−９５１、１９９６
【非特許文献５】Ｗａｂｅｒ  Ｊ．Ｔｕｍｏｒ，Ｍｅｄｓｃａｐｅ  Ａｎｔｈｏｌｏｇｙ  ３：２、２０００
【非特許文献６】Ｍａｃｌｅａｎ  ＧＤら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９（４）：３０９−３１６、１９９６
【非特許文献７】Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｋｚ  ＬＫら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４７：１５２４−１５２７、１９９６
【非特許文献８】Ｓａｎｄａ  ＭＧら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５２：２、１９９９；Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＰら、Ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ、３８：４３−７８、１９９９
【非特許文献９】Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ＭＪら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３（６）：７７３−７８１、１９９６
【非特許文献１０】Ｗｅｂｅｒ  Ｊ．Ｔｕｍｏｒ，Ｍｅｄｓｃａｐｅ  Ａｎｔｈｏｌｏｇｙ  ３：２、２０００
【非特許文献１１】Ｍａｃｌｅａｎ  ＧＤら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９（４）：３０９−３１６、１９９６
【非特許文献１２】Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｋｚ  ＬＫら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４７：１５２４−１５２７、１９９６；Ｓａｎｄａ  ＭＧら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５２：２、１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、癌患者を免疫する一環したそして有効な方法を開発することが有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明に従うと、ナイーブＴ細胞の産生を誘導し、Ｔ細胞の免疫を回復することによって免疫低下を克服するための方法が提供される。すなわち、本発明は、免疫回復を提供する。本発明はさらに、ナイーブＴ細胞の産生を誘導する工程、および適切な部位でナイーブＴ細胞に内因性抗原または外因性抗原へ曝露する工程を包含する、ワクチン免疫療法の方法を提供する。さらに本発明は、局所リンパ節での未成熟な樹状細胞の分化および成熟の促進、ならびに得られる成熟樹状細胞によりプロセシングされたペプチドの提示を可能にし、それによってＴ細胞の免疫を得るためにＴ細胞に対して腫瘍ペプチドを曝露することによる、局所リンパ節での免疫の障害を除去するための方法を提供する。さらに本発明は、アジュバントとして有効量の天然のサイトカイン混合物を、癌または他の持続性病巣の内因性抗原または外因的に投与される抗原に与えることによる、癌および他の持続性病巣の処置方法を提供する。
【００１５】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）  局所リンパ節での免疫の障害を取り除くための方法であって、該方法は、以下：
局所リンパ節中の未成熟の樹状細胞の分化および成熟を促進する工程；ならびに
得られた成熟樹状細胞によるＴ細胞への抗原の提示を可能にして、該抗原に対するＴ細胞の免疫を獲得する工程、
による、方法。
（項目２）  前記促進する工程がさらに、処置される病巣に対して、局所リンパ節中に流れ出るリンパ管へと、リンパ管周辺で天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）を投与する工程として定義される、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記病巣がガンまたは他の持続性病巣である、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記提示される病巣が感染性である、項目３に記載の方法。
（項目５）  前記抗原が内因性抗原である、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記抗原が外因性抗原である、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記投与する工程がさらに、前記ＮＣＭを、リンパ管周辺、リンパ管内、結節内、脾臓内、皮下、筋肉内、または皮内で注射する工程として定義される、項目２に記載の方法。
（項目８）  ガンまたは持続的病巣に対する免疫の誘導方法であって、該方法は、以下：
外因性抗原および天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）からなるアジュバントの有効量を投与する工程、
による、方法。
（項目９）  前記投与する工程がさらに、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、δＩＦＮ、およびＴＮＦαを含むＮＣＭを投与する工程として定義される、項目７に記載の方法。
（項目１０）  前記投与する工程がさらに、前記ＮＣＭを、リンパ管周辺、リンパ管内、結節内、脾臓内、皮下、筋肉内、または皮内で注射する工程として定義される、項目８に記載の方法。
（項目１１）  ナイーブＴ細胞の産生を誘導する工程による、弱い〜中程度のＴ細胞の減少を克服するため、およびＴ細胞免疫応答を回復させるための、方法。
（項目１２）  前記誘導する工程がさらに、天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）を投与する工程として定義される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  前記投与する工程がさらに、前記ＮＣＭを、リンパ管周辺、リンパ管内、結節内、脾臓内、皮下、筋肉内、または皮内で注射する工程として定義される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）  前記投与する工程がさらに、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、δＩＦＮ、およびＴＮＦαを含むＮＣＭを注射する工程として定義される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）  前記投与する工程が、前記ＮＣＭ中、１回の注射について約１５０〜６００単位のＩＬ−２を投与することを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  前記ブロックおよび誘導する工程がさらに、シクロホスファミドおよび非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）を同時送達する工程として定義される、項目１１に記載の方法。
（項目１７）  ガンまたは持続性病巣に由来する内因性抗原または外因的に投与される抗原に対するアジュバントとして有効量の天然のサイトカイン混合物を投与することにより、免疫抑制された患者のガンまたは他の持続性病巣を処置する、方法。
（項目１８）  前記投与する工程がさらに、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、およびδＩＦＮを含むＮＣＭを注射する工程として定義される、項目１４に記載の方法。
（項目１９）  前記投与する工程がさらに、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、およびδＩＦＮを含むＮＣＭを注射する工程として定義される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）  処置される内因性病巣による、直接的または間接的なＴ細胞の内因性抑制をブロックする工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目２１）  前記ブロックおよび誘導する工程がさらに、シクロホスファミドおよび非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）を同時送達する工程として定義される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）  前記ＮＳＡＩＤが、インドメタシン、イブプロフェン、ビオックス、セレブレックス、および他の関連化合物を含む群より選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  ワクチン免疫療法の方法であって、該方法は、以下：
ナイーブＴ細胞の産生を誘導する工程、および
内因性または外因性の抗原に対して該ナイーブＴ細胞を曝露する工程、
を包含する、方法。
（項目２４）  前記曝露する工程が、病巣を有している患者の局所的節中に残存している内因的に処理されたペプチド調製物への前記ナイーブＴ細胞を曝露する工程としてさらに定義される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  前記病巣がガンまたは感染性である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）  前記曝露する工程がさらに、外因的に産生される抗原を投与する工程として定義される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）  前記抗原が他の場合には非免疫原性ペプチドである、項目２３に記載の方法。
（項目２８）  前記曝露する工程がさらに、処置される病巣から遠位のリンパ節において、成熟ペプチドを提示する樹状細胞で前記ナイーブＴ細胞を免疫する工程として定義される、項目２３に記載の方法。
（項目２９）  有効量の天然のサイトカイン混合物の投与による、リンパ球減少症の処置方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の他の利点は、添付の図面と組み合わせて考慮すると、以下の詳細な説明を参照してさらに理解されることが容易に認識される。
【図１】図１は、ＰＨＡへの持続的な曝露対律動的な曝露を利用する、種々の媒体中のＮＣＭの比較を示すグラフである。
【図２】図２は、ＰＨＡへの持続的な曝露に対する、細胞濃度の影響を示すグラフである。
【図３】図３は、２倍の濃度（２μｇ／ｍｌ）でＰＨＡを用いた、図１と同様の棒グラフである。
【図４】図４は、脾臓細胞に関する、チミジンの取り込み対ＩＬ２  １ｍｌあたりの単位のグラフである。
【図５】図５は、胸腺細胞に関する図２と同様のグラフである。
【図６】図６は、ＩＬ１、ＩＬ２、またはＩＬの組み合わせ、ＮＣＭ、または生理食塩水で処理した退縮した胸腺を有するマウスについての、対照対インビボでの処置の比を示すグラフである。
【図７】図７は、組換えＩＬ１、組換えＩＬ２、組換えＩＬ１および組換えＩＬ２、ならびにＮＣＭでの処置の比較をもまた示すグラフである。
【図８】図８は、脾臓細胞および胸腺細胞のマーカーに対する、インビボでのＮＣＭ処置の影響を示すグラフである。
【図９】図９は、脾臓細胞および胸腺細胞のマーカーに対する、インビボでのＮＣＭ処置の影響を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、対照培地またはＮＣＭを用いたインビボでの処置後の、種々の組み換えインターロイキンまたはＮＣＭを含有しているインビトロの培地に対する、脾臓細胞および脾臓細胞の応答を示すグラフである。
【図１１】図１１は、培地、種々のインターロイキン、またはＮＣＭに対するインビトロでの、あるいは、対照培地またはＮＣＭでのインビボでの、脾臓細胞および胸腺細胞の応答を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、インビボでの対照またはＮＣＭを用いて処理した後の、ＣｏｎＡおよびＰＨＡに対するインビトロでの脾臓細胞および胸腺細胞の応答を示す。
【図１３】図１３は、インビボで対照またはＮＣＭを用いて処理した後の、ＣｏｎＡおよびＰＨＡに対するインビトロでの脾臓細胞および胸腺細胞の応答を示す。
【図１４】図１４は、対照、および扁平上皮細胞の頭部および頸部の癌（Ｈ＆ＮＳＣＣ）を有する癌の対照、またはＩＲＸ−２（ＮＣＭ）で処置した集団での節の大きさを示す棒グラフである。
【図１５Ａ】図１５は、２つの棒グラフを示し、一方は、対照、ならびに頭部および頸部の扁平上皮細胞癌の対照、ならびにＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処置した患者における、Ｔ細胞の面積を示し、そして他方はその密度を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、２つの棒グラフを示し、一方は、対照、ならびに頭部および頸部の扁平上皮細胞癌の対照、ならびにＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処置した患者における、Ｔ細胞の面積を示し、そして他方はその密度を示す。
【図１６Ａ】図１６は、３個の処置群における、Ｂ細胞の面積および小胞を示す２つの棒グラフを示す。
【図１６Ｂ】図１６は、３個の処置群における、Ｂ細胞の面積および小胞を示す２つの棒グラフを示す。
【図１７Ａ】図１７は、３個の処置群における、他の細胞および洞組織球増殖症の比較を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、３個の処置群における、他の細胞および洞組織球増殖症の比較を示す。
【図１８】図１８は、節Ｂ＆ＴおよびＣａｎｃｅｒ  Ｂ＆Ｔフィットプロットを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
一般的には、本発明は、ワクチン免疫療法を利用して患者を処置するための方法を提供する。ここでは、患者は免疫抑制される。免疫抑制によって、患者が低下した細胞性免疫を有し、従って新しい抗原に応答する能力が損なわれていることが意味される。さらに詳細には、血液中のＴリンパ球の数が減少し、そして／またはこれらの細胞の機能が、例えばＰＨＡ増殖アッセイによって示されるように、損なわれる。
【００１８】
Ｔリンパ球減少症（血中Ｔ細胞レベルが低い）は、細胞性免疫不全に特徴的な診断である；既存の胸腺細胞の機能の損傷は他の特徴である。Ｔリンパ球減少症を処置するための一般的に受け入れられている（臨床的に証明されている）方法は存在しない。骨髄移植（±胸腺移植）は重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ−先天性、放射線照射または化学療法によって誘導される）の症例において使用されている。組み換えＩＬ２は、大きな毒性によりいくらか影響があるものの、ＡＩＤＳにおいて試されている。
【００１９】
新たなＴ細胞を作製して、Ｔリンパ球減少症を治そうとする２つの方法が存在する。１つの方法（ｒＩＬ−２療法の場合）は、すでに抹消中にあるＴ細胞（すなわち、記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ）（血液、リンパ節、および脾臓））を増大させる。他の方法は、胸腺中での骨髄由来の新しいＴ細胞（得られる前駆体）の処理に関する。これは、子供においては通常に生じるが、成体では生じない。これらの新しい細胞は、最近は「胸腺移住者（ｔｈｙｍｉｃ  ｅｍｉｇｒｅｓ）」と呼ばれ、そして「ナイーブ」Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ４５ＲＡ）の表面マーカーを有する。ＮＣＭ療法（およびサイモシンα１）は、これらの新しいＴ細胞の産生、ならびに以前から存在している記憶Ｔ細胞の増大を生じる。
【００２０】
さらに詳細には、本発明は、内因的または外因的のいずれかで投与される抗原に対する免疫応答を提供するための免疫に関係している、新しい発見を利用する。このような抗原は、過去に免疫原性であると考えられたことがあるが、本発明で使用した他の抗原は、以前には非免疫原性であると考えられ得た。このような抗原の例は、ＭＡＧＥ−１タンパク質由来のＥＡＤＰＴＧＨＳＹ（黒色腫）、ＭＡＧＥ−３由来のＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（肺癌腫）、ＭＡＧＥ−３由来のＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（肺癌腫）などである（Ｂｅｌｌｏｎｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、第２０巻、Ｎｏ．１０、４５７−４６２頁、１９９９を参照のこと）。
【００２１】
本発明は、このような免疫が不可能であると以前は考えられた被検体において免疫を得るために、いくつかの一般的な新しく導かされた方法工程を利用する。さらに詳細には、本発明は、ナイーブＴ細胞の産生の誘導による、免疫低下を克服するための方法を提供する。用語「ナイーブ」Ｔ細胞は、新しく産生された（成体においてもなお）Ｔ細胞を意味することになる。ここでは、これらのＴ細胞は抗原に対してはまだ曝露されていない。このようなＴ細胞はこの段階では、それらに曝露される抗原（例えば、腫瘍ペプチド）を有している成熟樹状細胞による提示の際に特異的になることがまだ可能である、非特異性である。このように、本発明によって、新しいＴ細胞を補充するかまたは作成する。これは一般的には、天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）の投与によって達成される。ＮＣＭは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、δＩＦＮ、ＴＮＦα、ならびにＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含む。これらの構成要素の量および割合は以下に詳細に記載される。好ましくは、約１５０〜６００単位のＩＬ２がＮＣＭ中に含まれる。
【００２２】
好ましくは、ＮＣＭは、病巣（例えば、処置される腫瘍または他の持続的な病巣）に対して局所的なリンパ節中に流れ出るリンパ系周辺に注射される。病巣（例えば、癌）に対して局所であるリンパ節に流れ出るリンパ系へのリンパ管周囲での投与が重要である。腫瘍周辺での注射は、ほとんど応答と関連せず、進行とすら関連するので、禁忌とされている。１０日の注射計画が最適であり、そして２０日の注射プロトコールは、臨床的には有効ではあるが、ＴＨ１応答を低下させる傾向があり、そして癌へのリンパの浸潤によって測定される場合には、所望されるＴＨ２応答を減少させるようにシフトする。両側からの注射が有効である。根治的頚部郭清術が行われる場合は、反対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒｉａｌ）での注射が有効である。
【００２３】
Ｔ細胞の内因性の抑制（例えば、種々の癌の病巣によって引き起こされる）をブロックすることが好ましい。ブロックは、低用量のシクロホスファミドおよび非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）の同時送達によって達成される。選択されるＮＳＡＩＤはインドメタシンである。インドメタシンは最も有効なＮＳＡＩＤであるが、これはおそらく最も毒性が強くもある。Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（セレブレックス）（登録商標）およびＶｉｏｘｘ（ビオックス）（登録商標）、Ｃｏｘ  ＩＩ  ＮＳＡＩＤＳはあまり有効ではない。Ｖｉｏｘｘ（登録商標）はより毒性が強く、それによって多くの患者において胃炎を生じ得る。イブプロフェンは有効であるが、組織学的応答はＴＨ１媒介性応答よりもむしろＴＨ２の特徴であり、これはあまり望ましくない。ＮＳＡＩＤＳの副作用は、プロトンインヒビターおよびプロスタグランジンＥアナログで集中的に処置される。亜鉛および総合ビタミン剤は、Ｔ細胞免疫の回復を助けるための有用な物質である。出願人らは、反対抑制（ｃｏｎｔｒａｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ）を伴う処置およびＮＣＭを伴わない亜鉛が効果がないことを見出した。
【００２４】
まとめると、最少のレジメは、シクロホスファミドおよびＮＳＡＩＤを使用する反対抑制と組み合わせてＮＣＭを用いるリンパ管周囲での処置である。別のレジメは、亜鉛およびビタミンをさらに含み、可能であればセレニウムの添加を含む、以前に記載されているレジメである。好ましい亜鉛の用量は５０から７５ｍｇである。標準的な総合ビタミン剤が投与され得る。亜鉛は、利用可能なグルコン酸塩であり得る。
【００２５】
臨床応答を最大にするため、および生存率を最も増大させるためには、リンパ球の浸潤の程度および型が重要である。９０：１０の比のリンパ球：顆粒球またはマクロファージの浸潤が最適である。Ｔ細胞および／またはＢ細胞の浸潤は、好ましくは拡散性であり、かつ激しく、そして周辺にはない。２０％未満の軽度の浸潤は、強い臨床応答には関係しない。腫瘍の縮小および組織学的サンプルの断片化が、良好な応答の反映に好ましい。
【００２６】
良好な応答に欠かせないリンパ節の変化には、少なくとも５つの局面が含まれる。リンパ節の拡大、および誘導された腫瘍の大きさの縮小の単なる反転ではなく、正常と比較して全体的な大きさの増大が好ましい。増大したＴ細胞およびＢ細胞の面積は免疫を示す。洞組織球増殖症（ＳＨ）は、摂取されそしてプロセシングされた腫瘍抗原を有するが、成熟することができず、そして細胞毒性Ｔ細胞およびＢ細胞を導くＴＨ１およびＴＨ２効果細胞（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）を刺激することができるナイーブＴ細胞に対してこれらの腫瘍ペプチドを提示する、未成熟の樹状細胞の蓄積であると考えられている。ＳＨの逆転が好ましい。
【００２７】
このように、本発明は、局所リンパ節中での未成熟な樹状細胞の分化および成熟を促進し、従って、得られた成熟樹状細胞が、Ｔ細胞へ小ペプチド（一般的には、９アミノ酸の長さ）を提示して、Ｔ細胞の免疫を獲得することを可能にすることによる、局所リンパ節での免疫の障害の除去を提供する。さらに、成熟樹状細胞の誘導が必要である。最後に、内因性腫瘍ペプチドを提示する樹状細胞に応答することができるナイーブＴ細胞の誘導の存在下で、Ｔリンパ球減少症患者に抹消血Ｔリンパ球を動員することが所望される（Ｓｐｒｅｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９３巻、２００１年７月１３日、２４５−２４８頁を参照のこと）。
【００２８】
上記を考慮して、本発明の鍵となる機構上の特徴は、樹状細胞のインビボでの成熟であり、これによって有効なペプチド抗原の提示を生じる。以下に示される実施例に基づくと、ＣＤ４５  ＲＡポジティブである確約されていないナイーブＴ細胞の増大が認められている。抗原を用いると、これによってＴ細胞およびＢ細胞クローン性の増大が導かれ、患者において免疫が生じる。これにより生じる血行性の拡散による腫瘍への浸潤によって、確固たる腫瘍の崩壊が導かれる。結果は、以下のデータに見られるように、免疫学的記憶に起因する生存性の増大である（Ｓｐｒｅｎｔら（前出）を参照のこと）。
【００２９】
外因的に提供される合成のまたは抽出された腫瘍ペプチド（Ｂｅｌｌｏｎｅら（前出）を参照のこと）が、予め感作させられたかもしくは同時に感作された局所リンパ節または遠位リンパ節に送達され得、そして腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（Ｂ細胞を伴うかまたは伴わない）を生じることが、理論上推測される。３つの実験が以下に示される。上記を考慮して、ＮＣＭおよび他の薬剤の作用が、任意の腫瘍抗原（合成および内因性のペプチドおよびタンパク質）について有用であると結論付けられ得る。これらのペプチドの多くは通常は免疫原性ではなく、そして成熟した活性化された樹状細胞によって提示された場合にのみ、これらはナイーブＴ細胞の免疫に有効である。このように、免疫Ｔ細胞の出現は、事実上、樹状細胞が生じるかまたは適切に働くようにされることを意味する。また、事実上は、樹状細胞の活性化および成熟は、癌、免疫不全、ならびにＴ細胞の周知の欠損（例えば、数の減少およびアネルギーを伴う機能、ならびに推定されるアポトーシス）の重要な要因と考えられている。
【００３０】
本発明に従って送達されるプロトコールおよび医薬品についてさらに詳細に言及すると、本発明は、患者（例えば、癌患者、ならびに他の病巣または抗原を産生する疾患状態の患者）を免疫するために、天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）を利用する。さらに詳細には、本発明は、ＮＣＭおよび腫瘍関連抗原をその中に含有している組成物（ＮＣＭは、免疫応答を生じるためのアジュバントとして作用する）の有効量の投与によって、癌に対する癌患者の免疫応答を強化する方法を利用する。腫瘍関連抗原は、癌患者の所属節に内在する内因的に処理された腫瘍ペプチド調製物、またはこれらの節もしくはその付近に外部から投与された腫瘍抗原調製物との組み合わせのいずれかであり得る。腫瘍ペプチドならびに抗原は、たとえ腫瘍関連タンパク質抗原が完全であるので、それらが免疫原性である可能性がより高い場合に、免疫原性であるとは予想されないとしても、本明細書中に含まれる。
【００３１】
好ましい実施態様においては、本発明の構成には、ＮＣＭおよび腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原（低用量のシクロホスファミド、シクロオキシゲナーゼインヒビター、および本発明の組成物の作用をさらに増大させることが示されている他の同様の化合物とともに以下で定義される）の投与が含まれる。
【００３２】
上記を明確にし、そしてさらに定義するために、以下の定義が提供される。「アジュバント」によって、特定の抗原に対する免疫応答を強化する能力を有する組成物が意味される。有効であるためには、アジュバントは抗原部位にまたはその付近に送達されなければならない。このような能力は、免疫媒介型の防御の有意な強化によって証明される。免疫の増大は、典型的には、抗原に対して惹起された抗体の力価の有意な増大（通常は１０倍を超える）によって証明される。細胞性免疫の強化は、ポジティブ皮膚反応テスト、細胞毒性Ｔ細胞アッセイ、δＩＦＮまたはＩＬ−２についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、あるいは腫瘍中へのＴ細胞の浸潤（以下に記載される）によって測定され得る。
【００３３】
「腫瘍関連抗原」によって、類似タンパク質またはペプチド（これらは、樹状細胞のエキソビボでのパルスによって作用することが以前に示されている）、あるいは他の同等の抗原が意味される。これには、ＰＳＭＡペプチド、ＭＡＧＥペプチド（Ｓａｈｉｎ  Ｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：７０９−７１５、１９９７；Ｗａｎｇ  ＲＦら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７０：８５−１００、１９９９）、パピローマウイルスペプチド（Ｅ６およびＥ７）、ＭＡＧＥフラグメント、ＮＹ  ＥＳＯ−１、または他の同様の抗原が挙げられ得るがこれらに限定されない。以前にはこれらの抗原は、それらの大きさ（すなわち、これらは小さすぎる）またはそれらが免疫原性特性（すなわち、自己抗原）を有さないと以前には考えられていことのいずれかに基づいて、患者の処置には有効ではないと考えられていた。
【００３４】
ＮＣＭ（非組み換えサイトカイン混合物）は、米国特許第５，６３２，９８３号および同第５，６９８，１９４号に示されているように定義される。簡潔には、ＮＣＭは４−アミノキノロン抗生物質の継続的存在の下で、そして有糸分裂促進物質（これは好ましい実施態様においてはＰＨＡである）の継続的存在または律動的存在の下で、調製される。
【００３５】
本発明に従うと、高齢の免疫抑制されたマウスにおいてＴ細胞の発達および機能を促進することにおいて有効であると以前に示されている、部分的に特徴付けられたＮＣＭが提供される。このＮＣＭの頭部および頸部のガンを有する免疫抑制された患者への投与の際に、ＮＣＭで処置されたガン患者の血中へのＴリンパ球の動員によって、ＣＤ２およびＣＤ４５  ＲＡの両方を有している未成熟のナイーブＴ細胞の増大を生じることが、本出願においてはじめて実証された。これは、成体のヒトがナイーブＴ細胞を作製することができることの最初の実証である。先行する参考文献：Ｍａｃｋａｌｌら（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５）、第３３２巻、１４３−１４９頁）；およびＭａｃｋａｌｌによる総説（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０００、第１８巻、１０−１８頁）は、子供ではなく成体で新しいＴ細胞を作製することは不可能であると議論しており、そしてガンの化学療法および／または放射線治療後にＴ細胞を再び補充する試みの問題点を議論している。一般的には、新しいＴ細胞は成体のヒトでは作製されないという定説が存在する。しかし、強い化学療法のための骨髄移植後には、新しいＴ細胞が成体において作製され得るという証拠が存在している。今日までには、これを達成することができる分子療法は存在していないが、リンパ球数の増大は、ＨＩＶ感染した患者において、組み換えインターロイキン−２での延長されたそして強い治療を用いて達成されている。これらは、胸腺由来Ｔ細胞であることが明かに実証されてはおらず、そしておそらく既存の末梢Ｔ細胞の増大である。
【００３６】
以前に、Ｃｏｒｔｅｓｉｎａらは、頭部および頸部のガンを有する患者において天然のＩＬ−２をリンパ管周辺で使用し、そしていくつかの腫瘍退行を誘導し（Ｃｏｒｔｅｓｉｎａ  Ｇら、Ｃａｎｃｅｒ  ６２：２４８２−２４８５、１９８８）、白血球によるいくらかの腫瘍の浸潤を伴った（Ｖａｌｅｎｔｅ  Ｇら、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３（６）：７０２−７０８、１９９０）。処置することができない再発が生じ、そして応答は非特異的で記憶を伴わず、従って非免疫原性であった（Ｃｏｒｔｅｓｉｎａ  Ｇら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６９：５７２−５７７、１９９４）。組み換えＩＬ−２を用いた最初の観察を確認するための反復的な試みは、実質的には成功しなかった（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４、１９９７）。
【００３７】
本発明の方法は、免疫療法用化合物の十分な局在化を提供するための、局所的なリンパ管周辺での注射、または当業者に公知の他の注射でＮＣＭを使用することを含む。好ましい実施形態においては、注射は頸部に行われるが、処置される疾患によって必要とされる場合には、他の位置に適用され得る。この処置によって、改善され、再発のない生存をもまた示す患者の高い割合において臨床的な退行を誘導した（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１２０：３９５−４０３、１９９４；Ｍｅｎｅｓｓｅｓ  Ａら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２２：４４７−４５４、１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １２６：３４５−３５１、２０００；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：５６４−５６６２、１９９３）。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：５６５４−５６６２、１９９３）は、頭部および頸部のガンにおいて、組み換えインターロイキン２の腫瘍注射によって、Ｔリンパ球の浸潤が生じたが、有意な臨床応答は伴わなかったことを観察した。１５０人までの患者でのリンパ管周辺での注射と組み合わせたＭｕｌｔｉｋｉｎｅ（Ｃｅｌｓｃｉ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）の腫瘍周辺での注射は、有意な腫瘍応答（すなわち、１１人の患者のみにおいて５０％以上の腫瘍の縮小）を生じた。これによると、それらの応答率は、本研究で観察される高い程度の応答（４０％）と比較して、１０％未満である。さらに、彼らは、本出願人らがわずか２０％と観察した、応答しない人を５０％と記録した。
【００３８】
本出願人らは、腫瘍周辺注射および腫瘍内注射が、最初にＮＣＭプロトコールに対してポジティブな応答を有した患者においてもなお疾患の進行を伴うことがあり、従ってその利点が取り消され得ることを観察した。従って、腫瘍周辺での注射は禁忌であり、そして本発明の部分から排除される。これによって本出願人らは、腫瘍が免疫の部位ではないという解釈を導き、そして本出願は、限局性リンパ節が免疫の部位である証拠を示す。次いで、限局性リンパ節の未公開の分析によってなお、限局性リンパ節が、仮定される腫瘍抗原についての免疫の部位であることを示すデータを明らかにした（図１４〜１８）。多数の種々の腫瘍抗原の同定によって、このような抗原の存在を仮定すると、それらが免疫プロトコールにおいて有効には使用されていないという難問がここ１０年間にわたって存在していた。時々生じるポジティブな例が報告されているが、主には、データはネガティブである。抗原提示の問題は、ここ１０年間に興味が集まっており、そして樹状細胞が、腫瘍由来の小ペプチドの提示における重要な役者として明らかにされている。ＤｅＬａｕｇｈおよびＬｏｔｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，第１２巻、５８３−５８８頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２０００）、第１８巻、７６７−８１１頁；また、Ａｌｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻、８６−８９頁（１９９８）を参照のこと。
【００３９】
簡潔には、腫瘍抗原が適切に抗原性であるためには、これらは壊死性腫瘍細胞ではなくアポトーシスから生じなければならない（Ａｌｂｅｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ、３９、２：８６−８７、１９９７）。これらは、大きな組織球の形態を有する未成熟の樹状細胞によって捕捉される必要がある。これらの未成熟の樹状細胞は抗原をプロセシング（エンドサイトーシス、食作用、および消化）し、そしてＴ細胞への提示のためのＭＨＣ溝中に消化された抗原のペプチドフラグメント（一般的には９個のアミノ酸）を提示する成熟樹状細胞に進化する。応答するためには、Ｔ細胞はＭＨＣ溝中でそれらに対して提示された抗原、および種々の同時刺激シグナルを有さなければならない。参考文献：ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＤｅＬａｕｇｈ。
【００４０】
研究者ら（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９９）は、培養物中で作製され、次いで腫瘍抗原でパルスされた樹状細胞を利用し、そして前立腺特異的膜抗原ペプチドに対して患者を免疫することにおいて小さい程度の成功を達成した。残念なことに、樹状細胞をパルスするこのアプローチは扱いにくく、そしてどちらかといえば不十分である。本発明では、本出願人らは、リンパ節洞（こではガンにおいて蓄積する）に存在する細胞が樹状細胞の系統の細胞であること、そしてＮＣＭプロトコールを用いるインビボでの処置の後、これらの細胞が消滅し、次いで最終的には抗原がＴ細胞について免疫原性になることを示した。次いで、これらは腫瘍に応答することが可能である。従って、本発明の重要な局面は、限局性リンパ節中に、有効な抗原のプロセシングおよび提示を可能にする微環境を作製することができる。それが誘導する免疫は、Ｔ細胞が病巣に移動することを可能にし、そして腫瘍崩壊は、事実上は、樹状細胞による適切な抗原プロセシングの証明である。さらに、ＮＣＭで処置した患者は全て、遠位での転移（これは、臨床的には１５％まで、そして病理学的には５０％までと予想される）を生じなかった。このことは、単なる局所免疫ではなく全身免疫が、処置によって誘導されたことを示す。これは先行技術の組成物を上回る劇的な進歩である。なぜなら、先行技術の組成物は、最良でも、転移性疾患に対しては有効性が一貫しなかったからである。本発明の組成物が全身免疫を作製する能力は、より有効でありそして十分な患者の処置を可能にする。さらに、全身性応答が大きいことは、処置の有効性を制限することなく、そして毒性を有することなく、より少ない用量を個体に投与することを可能にする。
【００４１】
文献（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４、１９９７；Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ：Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２１：７９−１０１、１９９９）は、ガンの２つの主要なタイプであるＳＣＣと腺癌の両方について、限局性リンパ節が、洞組織球増殖症、リンパ減少、および多くの場合はアネルギー性腫瘍関連リンパ球（ＩＬ−２を使用してエキソビボでの増大および回復を伴って腫瘍細胞に対して反応することができる）の存在を含む腫瘍に関係する異常を反映する。次いで、転移を伴って、リンパ減少および機能低下が生じる。さらに、このような患者の無関係な頸部リンパ節は、平均の大きさの減少、ならびに頭部および頸部のガンに関係している洞組織球増殖症の増大を示した（図１４〜１７を参照のこと）。
【００４２】
特に組成物に関して、本発明の組成物は、天然のサイトカイン混合物、および内因性または外因性のいずれかの腫瘍関連抗原を含む。さらに、低用量のシクロホスファミド、シクロオキシゲナーゼインヒビター、亜鉛、および他の同様の化合物が、本発明の組成物の作用をさらに増大させることが示されている。
【００４３】
ガン、ＨＩＶ感染、老化、腎臓移植、および他のこのような不全に関係している細胞性免疫不全の患者の処置のための免疫が、本発明の組成物を用いて達成され得る。
【００４４】
処置のための投与およびプロトコールは以下のとおりである。
【００４５】
遺伝子産物／合成抗原の送達：
本発明の化合物（ＮＣＭを含む）および外因性抗原は、個々の患者の臨床的症状、投与部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重を考慮して、最適な免疫を達成するように投与されそして服用される。従って、本明細書中の目的のための薬学的「有効量」は、当該分野で公知であるようなこのような考慮によって決定される。この量は、免疫（改善された腫瘍の縮小、断片化、および浸潤、生存率、またはさらに迅速な回復を含むがこれらに限定されない）、あるいは症状の改善または排除を達成するために有効でなければならない。
【００４６】
本発明の方法においては、本発明の化合物は、種々の方法で投与され得る。これらが、化合物としてまたは薬学的に受容可能な塩として投与され得、そして単独で、あるは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、およびビヒクルと組み合わせて有効成分として投与され得ることに留意するべきである。化合物は、皮内または皮下、リンパ管周辺またはリンパ管内、結節内または脾臓内（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃａｌｌｙ）または筋肉内、腹腔内、および胸郭内（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｓｉｃａｌｌｙ）で投与され得る。化合物の移植もまた有用であり得る。処置される患者は、温血動物（特に、ヒトを含む哺乳動物）である。薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびに移植のキャリアは、一般的には、本発明の有効成分とは反応しない、不活性な非毒性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化材料をいう。
【００４７】
用量は、単回用量であり得るか、または数日間にわたる複数回の用量であり得る。
【００４８】
本発明の化合物の投与の際には、これは一般的には、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁物、乳濁物）で処方される。注射に適切な薬学的処方物には、滅菌の水溶液または分散物、および滅菌の注射可能な溶液または分散物への再構成のための滅菌の粉末が含まれる。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有している溶媒または分散媒体であり得る。
【００４９】
適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子の大きさの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持される。非水溶性のビヒクル（例えば、菜種油、ゴマ油、オリーブオイル、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油）およびエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル）もまた、化合物の混合のための溶媒システムとして使用され得る。さらに、種々の添加物（組成物の安定性、滅菌性、および等張性を強化する）（抗菌性保存料、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤を含む）が添加され得る。微生物の作用の防御は、種々の抗生物質および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）によって確実にされ得る。多くの場合は、等張化剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を含むことが所望される。注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によってもたらされ得る。しかし、本発明に従うと、使用されるすべてのビヒクル、希釈剤、または添加物は、化合物と適合性である必要がある。
【００５０】
ペプチドは、重合され得るか、または当該分野で周知のようにヒト血清アルブミンのようなキャリアに結合され得る。
【００５１】
滅菌の注射可能な溶液は、所望される場合には、種々の他の成分とともに必要量の適切な溶媒中に、本発明の実施に利用される化合物を取り込むことによって調製され得る。
【００５２】
本発明の薬理学的処方物は、任意の適合性のキャリア（例えば、種々のビヒクル、添加物、および希釈剤）を含有している注射可能な処方物で患者に投与され得る；または本発明で利用される化合物は、徐放皮下移植物の形態で、または、モノクローナル抗体、ベクターによる送達、イオン導入法、ポリマーマトリックス、リポソーム、およびミクロスフェアのような標的化送達システムで患者に非経口的に投与され得る。本発明において有用な送達システムの例には、以下が含まれる：第５，２２５，１８２号；第５，１６９，３８３号；第５，１６７，６１６号；第４，９５９，２１７号；第４，９２５，６７８号；第４，４８７，６０３号；第４，４８６，１９４号；第４，４４７，２３３号；第４，４４７，２２４号；第４，４３９，１９６号；および第４，４７５，１９６号。多くの他のこのような移植、送達システム、およびモジュールが、当業者に周知である。
【００５３】
上記は、腫瘍抗原（自己由来または定義されたタンパク質もしくはペプチドのいずれか）に対してガン患者を免疫するためのアジュバントとしてＮＣＭを使用するためのプロトコールを提供する。
【００５４】
【表１】
0005963688.tif 000002
【００５５】
商業的な抗原の投与経路は、好ましくは頸部である。なぜなら、これは利用しやすく、そして頸部は体のリンパ節の３０％より多くを含み、そして全身免疫が得られることが予想され得るからである。
【００５６】
低用量のシクロホスファミド：低用量のＣＹは、ガンのマウスおよびガン患者において、細胞性免疫を増大させるため、およびリンパ球による抑制を減少させるために使用されている（Ｂｅｒｄ  Ｄ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２８８：４４９−４５８、１９８９；Ｂｅｒｄ  Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：３３１７−３３２１、１９８７）。そしてこれは、ガン患者の有効な免疫療法に使用されている（Ｗｅｂｅｒ  Ｊ．，Ｍｅｄｓｃａｐｅ  Ａｎｔｈｏｌｏｇｙ  ３：２、２０００；Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＰ、Ｔｊｏａ  ＢＡ、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＳＪ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．３８：４３−７８、１９９９；Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１２０：３９５−４０３、１９９４）。
【００５７】
亜鉛：亜鉛不足は、細胞性免疫の改善に関係しており、そして亜鉛での処置はマウスにおいては免疫回復的である（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７：６９６−７０１、１９９５；Ｓａｈａ  Ａ．，ら、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７：７２９−７３４、１９９５）。
【００５８】
シクロオキシゲナーゼインヒビター（ＣＯＸｉ）様インドメタシン：ガンはプロスタグランジンを産生し、そして宿主マクロファージのプロスタグランジン産生を誘導する（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｉｎｔ’ｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４、１９９７）。プロスタグランジンはＴ細胞について免疫抑制性であることが公知であるので、ＰＧ合成のシクロオキシゲナーゼインヒビターでの阻害が適切である。
【００５９】
組み換えタンパク質の精製
Ｍａｒｓｈａｋら「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ．」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６。
【００６０】
抗原の用量および頻度
１〜１０００μｇ（好ましくは、１０〜５００）；形態−可溶性（必要な場合には、部分的に重合されるかまたはキャリアに結合させられる）
スケジュール：１日目、１２日目、２１日目
（Ｐｒｅ−Ｒｘ）：１２日目、２１日目、３１日目
注射部位：局所注射（すなわち、頸部での注射）
予想される応答：腫瘍の縮小
腫瘍の病理学的変化（縮小、断片化、リンパの浸潤）
抗原に対する体液性免疫（ＲＡＩまたはＥＬＩＳＡ）
抗原に対する細胞性免疫（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの、インビトロでのリンパ球増殖、皮内皮膚反応テスト）
ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥフラグメント、Ｅ６、Ｅ７ペプチドのようなオリゴペプチドは、樹状細胞に対してパルスされてもなお免疫原として貧弱であることを記憶しておくこと。従って、有効な免疫は、生じるとは予想されない。有効な免疫を用いてもなお、腫瘍退行が、特に前立腺と頸部とのような距離で、この方法によって驚くべきことに認められる。転移性疾患の退行は、常に、免疫療法での驚くべき事象である。臨床応答の程度および頻度は、有効性の要因であり、従ってこのアプローチの新規性である。
【００６１】
診断用皮膚反応テストは、我々をさらに有効な免疫へと導くための別の方法である。患者は、ＩＲＸ−２（ＮＣＭ）を用いて良好な応答を誘導するように予め処置され得る（ＮＣＭ、ＰＨＡ皮膚テスト、およびリンパ球数の増大、ならびにリンパ節の異常の反転）。
【００６２】
これによって、アジュバント方法論を作製する
免疫回復とアジュバンシー（ａｄｊｕｖａｎｃｙ）の組み合わせ
ペプチドおよびタンパク質を免疫原性にする
一定の距離で腫瘍退行を達成するための免疫応答の程度を得る。
【００６３】
これは、ペプチドおよび／または炭水化物を含有している腫瘍抗原およびハプテンの全ての形態に拡大することができる。
【００６４】
これは、ＨＩＶ＋患者のＡＩＤＳウイルスワクチン；他の扱いが困難な状況；腎臓移植、老化などのような適用の領域に拡大することができる。
【００６５】
患者は、プロトコールの考慮の前に１つ以上の腫瘍ペプチドについて皮膚反応テストされる。１００μｇの１つ以上の腫瘍ペプチドが、ＮＣＭシリーズの１日目および１０日目について以下に議論されるように、ＮＣＭプロトコールを使用してＮＣＭとともに頸部のリンパ管周辺に投与される。組み合わせが、２１日目に繰り返される。腫瘍応答および組織学に加えて、ペプチドに対する免疫反応が、皮膚テストの反復によって、または当該分野で公知の他の手段によってモニターされる。
【実施例】
【００６６】
実施例１
細胞培養に関する全ての工程を、滅菌条件下で行う。本明細書中には記載しない細胞免疫学の一般的な方法は、ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８１）のような細胞免疫学的技術についての一般的な参考文献に記載されているように、そして当該分野で公知であるように行う。
【００６７】
天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ）の調製
複数のＨＩＶ陰性肝炎ウイルス陰性ドナー由来のヒト血液の軟膜白血球を回収する。別の実施形態においては、動物が獣医学的用途のための細胞供給源であり得る。ドナー由来の細胞をプールし、そしてｆｉｃｏｌｌ  ｈｙｐａｑｕｅ勾配（Ｐｈａｅｍａｃｉａ）上に重層して、好中球および赤血球を含まないリンパ球を得る。当該分野で公知であるように同じ出発リンパ球の集団を生じる別の方法を使用し得る。
【００６８】
リンパ球を洗浄し、そして細胞のサブセットの選択のための表面活性化細胞培養フラスコ（ＭＩＣＲＯＣＥＬＬＥＣＴＯＲ．ＴＭ．Ｔ−２５  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｌａｓｋｓ）（その中には、刺激薬（すなわち、ＰＨＡのような有糸分裂促進物質）が固定されている）に対して、Ｘ  ｖｉｖｏ−１０媒体（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に分配する。１つの実験のセットでは、Ｘ  ｖｉｖｏ−１５およびＸ  ｖｉｖｏ−２０媒体を示すように使用した。刺激薬の固定プロセスは、フラスコ中でのパンニング手順（すなわち、細胞の分離）のための種々の物質の固定について製造業者によって記載されているとおりである。あるいは、リンパ球を、刺激薬（例えば、ＰＨＡ）に対して２〜４時間曝露し、次いで３回洗浄する。
【００６９】
細胞を、Ｘ  ｖｉｖｏ−１０培地中で２４〜４８時間、８０μｇ／ｍｌのシプロフフロキサシン（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂ）とともに、ＣＯ２／空気インキュベーター中で３７℃でインキュベートする。あるいは、ＲＰＭＩ  １６４０培地を使用することができる（Ｗｅｂｂら、１９７３）。一般的には、ＨＳＡを、０．１から０．５％で（重量／容量）で使用する。インキュベーション後、上清を流し出し、そして回収する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まない培地を作製のために使用する場合には、インターロイキンをさらに安定化させるためにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し得る。上清を４℃から−７０℃で保存する。
【００７０】
上清の特徴づけ
プールした上清を、ＩＬ−２については生体アッセイによって、そして残存しているインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ＣＳＦ、ＴＮＦ、およびＩＦＮについてはＥＬＩＳＡによって、サイトカイン含有量の測定によって特徴付ける。滅菌性を、チオグリコレート培地中での培養によって試験し、そして内毒素を、当該分野で公知であるようにｌｉｍｕｌｕｓ溶解物アッセイによって測定する。
【００７１】
サイトカイン含有量についての上清の標準化：
それぞれの上清を、比較ができるように、投与される濃度または量のいずれかによって標準化する。
【００７２】
上清からの混入物の除去：
使用される場合には、ＤＮＡおよびウイルスの排除には、限外濾過、カラムクロマトグラフィー、ウイルス保持フィルター、エタノール分配、ポリエチレングリコール／ベントナイト沈殿、ガンマ線照射、および／または溶媒／界面活性剤処理（静脈内でのガンマグロブリンおよびモノクローナル抗体について使用されているような）のような技術を使用する（例えば、ＩＧＩＶ  Ｎｅｗｓ  Ｕｐｄａｔｅパンフレット）。
【００７３】
モデル
他に記載されていない限りは、高齢のマウスでのヒドロコルチゾンによって誘導した胸腺の縮小のモデルを使用した（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷら、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７：８２１−８２８、１９９５）。
【００７４】
実験動物
胸腺の退縮が始まっている繁殖引退した年齢の（８〜９ヶ月）を雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，Ｆｌａ．）を、インビボ試験で使用した。マウスの体重を合わせ、そして５個のグループにランダムにプールした。動物を、飲料水は制約なく与えて、標準的な研究用食餌を与えた。対象群を除く全てのマウスを、化学的胸腺摘出および脾臓の重量の減少を導くために、ヒドロコルチゾン（０．１ｍｌの０．９％の塩化ナトリウム中で５ｍｇ／マウス）で腹腔内（ｉ．ｐ．）で２日間連続して処置した。
【００７５】
ヒドロコルチゾンで処置した成体マウスは、２日で急な胸腺の退縮（対照の３０％未満）および脾臓の大きさの減少（対照の８０％未満）を示し、１０日までに徐々に回復した。
【００７６】
実験計画
それぞれの処置群は５匹の動物を有し、そしてそれぞれの実験を２〜５回繰返した。処置を、３日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）で開始し、そして全部で５日間の間１日に１回続けた。処置群に、本文に示すような以下のインビボ処置の１つを注射した：
・１．発熱物質を含まない生理食塩水（対照）；
・２．組換えインターロイキン−１（ｒＩＬ−１；４ｎｇ）；
・３．組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２；５０単位）；
・４．ｒＩＬ−１＋ｒＩＬ−２（それぞれ、４ｎｇ＋５０単位）
・５．天然のサイトカイン混合物（ＮＣＭ；５０単位のＩＬ−２等量）。
【００７７】
８日目に、マウスの体重を秤量し、頸部脱臼によって屠殺し、そしてそれらの脾臓および胸腺を回収しそして秤量した。器官を細かく刻み、残っている赤血球を塩化アンモウムを使用して溶解させ（ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ、１９８１）、そして細胞を計数した。
【００７８】
次いで、種々の物質に対する細胞の増殖応答を決定した。細胞のサンプルを、５％のウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および２−メルカプトエタノール（２×１０−５Ｍ）を有しているＲＰＭＩ  １６４０倍地中での３７℃、５％のＣＯ２での細胞培養のために、調製した。細胞を、１．５×１０６／ｍｌの濃度で４連で０．２ｍｌのマイクロウェル中にプレートし、そして本文に示すように以下の１つとともに７２時間インキュベートした：
・１．対照希釈物（完全なＲＰＭＩ  １６４０培地）
・２．ｒＩＬ−１（１ｎｇ／ｍｌ）
・３．ｒＩＬ−２（２単位／ｍｌ）
・４．ＮＣＭ（ＩＬ−２等量の２単位／ｍｌ）
・５．コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ；１．５μｇ／ｍｌ）
・６．フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；０．５μｇ／ｍｌ）。
【００７９】
培養をＤＮＡ合成を測定するために停止させ、従って、滴定したチミジン（３Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；比活性６．７Ｃｉ／ｍＭ）の１８時間のパルスを用いた細胞増殖物を、複合型自動サンプル回収装置を用いて回収し、そして液体シンチレーションカウンティングのために処理した。マーカーの研究をまた、Ｈａｄｄｅｎら（１９９２）によって記載されているように行った。結果を、それぞれの動物についての３個のサンプルによるｃｐｍの数学的平均として表す。種々の動物を用いて得られたデータの提示を簡単にするために、種々の動物での結果をプールし、そしてまとめて計算し、そしていくつかの場合には、対照に対する比率として表し、そして他のものは平均の標準誤差（ＳＥＭ）について平均＋括弧として表す。
【００８０】
（統計学的分析）
ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を、適切である場合にはデータを分析するために使用した。
【００８１】
結果：
目的は、血清の非存在下で高レベルのインターロイキン−２を産生するようにリンパ球を刺激する方法であって、そしていかなる方法においても、上清中には有意な量のＰＨＡは生じない方法を見つけることである。これを行うために、ＰＨＡを、「パンニング」細胞分離について製造業者の説明書に記載されているように、細胞のサブセットの選択のための表面活性化細胞培養フラスコ（ＡＩＳ  ＭＩＣＲＯＣＥＬＬＥＣＴＯＲ．ＴＭ．Ｔ−２５プレート）上に固定したか、または細胞中へパルスし、続いて洗浄した（パルス技術）。
【００８２】
これらの実験に使用した培地は、Ｘ  ｖｉｖｏ−１０（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）であり、そしてこれは、インターロイキン−２−リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞プロトコルについて、米国食品医薬品局によりヒトへの投与について是認されている。最少必須培地（ＭＥＭ）またはＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）と同様に、ヒトのリンパ球の増殖をサポートし得る血清を含まない培地もまた、使用することができた。
【００８３】
最初の実験は、ＰＨＡ（ＨＡ−１６、Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）を製造業者によって記載されている技術によって固定することができたこと、および７．５〜１５×１０６／ｍｌの細胞数、２４時間〜４８時間の曝露時間、および２５または５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ濃度の最適条件下で、血清を含まない上清中で高収量のインターロイキン−２を得ることができたことを示した。この収量は、ＰＨＡ（ＮＩ）への簡単な曝露、それに続く洗浄、および続く血清を含まない培地中でのシプロフロキサシン（ＮＩＭ）との培養を使用するパルス技術よりも優れていた（表１）。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
ＩＬ−２含有量を、Ｇｉｌｌｉｓら（１９７８）によって記載された方法によってＣＴＬＬ  ＩＬ−２依存性細胞株を使用して上清中で測定した。ＩＬ−２を、６４０単位（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ）を含有している既知の標準に対して国際単位で定量した。
【００８６】
細胞を含まずにインキュベートしたフラスコ由来の細胞を含まない上清を、残存しているＰＨＡが増殖性応答を生じるための十分な量で存在するかどうかを決定するために、ヒトリンパ球に対して試験した。０．０１μｇ／ｍｌより多い残存しているＰＨＡは、このような応答を生じる。細胞の非存在下では、少量のＰＨＡは、４０〜４８時間で上清中で観察された。しかし、ＰＨＡ（２５μｇ／ｍｌ）を２４時間だけ使用した場合は、これらのレベルはごくわずかであった。従って、２４時間のインキュベーションが最適と考えた。本発明においてＸ  ｖｉｖｏ−１０、Ｘ  ｖｉｖｏ−１５、およびＸ  ｖｉｖｏ−２０（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、ならびにＭＥＭの比較を行い、そして図１〜３に示した。Ｘ  ｖｉｖｏ−１０およびＸ  ｖｉｖｏ−１５は、インターロイキン−２−リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞プロトコルについて、米国食品医薬品局によりヒトへの投与について是認されている。ＮＣＭの生成を、１μｇ／ｍｌのＰＨＡに対する持続的な曝露対律動的な曝露を利用して、種々の培地中で比較した（図１）。細胞濃度の影響を、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（図２）および２μｇ／ｍｌのＰＨＡ（図３）への持続的な曝露を用いて調査した。これらの因子の最適な組み合わせが、ＰＨＡを２μｇ／ｍｌで用いて２．５もしくは５．０×１０６／ｍｌの細胞濃度で、またはＰＨＡを１μｇ／ｍｌで用いて５×１０６細胞／ｍｌで、Ｘ−ｖｉｖｏ−１０中での固定化による持続的な曝露であることを見出した。細胞あたりの収量は、２．５×１０６細胞／ｍｌで最大効率であるので、２μｇ／ｍｌでＰＨＡを用いるその濃度が、最適として選択される。
【００８７】
ＰＨＡへの曝露後のヒト白血球からのサイトカインの産生を増強するためのシプロフロキサシンおよび２つの他の４−アミノキノロン抗生物質（ノルフロキサシンおよびオフロキサシン）についてのパラメーターを決定するために、予備実験を、フラスコではなくむしろチューブ内で行った。表ＩＩＩは、これらの４−アミノキノロン抗生物質のそれぞれの８０μｌ／ｍｌがＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＧ−ＣＳＦの産生を増強したことを示す。ＩＬ−８の産生は最大であった。ＩＬ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−７は、全ての上清中でこれらの環境下では検出できなかった。これらの結果は、これらの血清を含まない条件下では、８０μｇ／ｍｌで試験した全ての４−アミノキノロンが、血清を含まない条件下でＰＨＡによって誘導されるサイトカインの産生を増強したことを示す。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
モノクローナル抗体ＯＫＴ−３（Ｏｒｔｈｏ）（これは、Ｔリンパ球が増殖しそしてインターロイキンを産生するように誘導する）を、これらの条件下で刺激薬として使用することができたこともまた決定した。表ＩＩＩは、実施例１に示すように、ＯＫＴ−３が、フラスコ中でインキュベートした細胞を用いて、ＰＨＡおよびシプロフロキサシンによって誘導されるものと同様にサイトカインを誘導したことを示す。ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−７は、刺激薬のいずれのセットを用いても検出されなかった。ＯＫＴ−３は、ＰＨＡおよびシプロフロキサシン（ＣＩＰＲＯ）と組み合わせた場合に、いくつかのＩＬについての小さい付加的効果を生じた。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
インビトロでｒＩＬ−２を上回ってＮＣＭが優れていることを示すために、マウスの脾臓細胞および胸腺細胞を、生物アッセイによって決定したＩＬ２および滴定したチミジンの取り込みによって測定したＤＮＡ合成に匹敵するレベルで、ＭＥＭおよびｒＩＬ−２を用いて培養した。ＮＣＭは、ＩＬ２含有量に基づくｒＩＬ−２よりも大きい脾臓細胞（図４）および胸腺細胞（図５）の増殖を誘導した。
【００９２】
図６および７に示すような一連の実験において、退縮した胸腺を有するマウスを、ｒＩＬ−１、ｒＩＬ−２、これらの因子の組み合わせ、ＮＣＭ、または生理食塩水（コントロール）を用いてインビボで処置した。脾臓および胸腺を取り出し、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２）、ＮＣＭ、および有糸分裂促進物質ＣｏｎＡに対する細胞増殖性応答について細胞を試験した。結果を、生理食塩水で処理したコントロールに対する比として表す。ｒＩＬ−１、ｒＩＬ−２、およびそれらの組み合わせ（ｒＩＬ−１およびｒＩＬ−２）を用いたインビボでの処置は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＮＣＭ、またはＣｏｎＡでのインビトロでの刺激に対しては、脾臓細胞（図６）または胸腺細胞（図７）の増殖性応答を増大させることについて有意な影響を有さなかった。インビボでのＮＣＭ処置は、４個の全ての刺激に対して脾臓細胞および胸腺細胞の両方を有意に増大させた。これらの結果は、刺激に対するこれらの細胞の感度の増大、および／または応答性細胞の数の増大と一致する。
【００９３】
図８および９は、脾臓細胞および胸腺細胞のマーカーに対するインビボでのＮＣＭ処置の影響を示す。未成熟のＴ細胞を−−によって示し、そしてこれは特に胸腺中にＴリンパ球前駆体を提示し得る。ＮＣＭは、脾臓および胸腺中の集団を比例的に増大させた。未成熟のＴ細胞を＋＋によって示し、そしてこの集団は、ＮＣＭ処置によって胸腺中で比例的に減少される。成熟Ｔ細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋によって示す。ＮＣＭは、胸腺中の成熟Ｔ細胞の割合および脾臓でのそれらの数を増大させた。これらの結果は、Ｔ細胞前駆体を増大させ、そして胸腺での成熟Ｔ細胞へのそれらの発達を促進するＮＣＭの作用と一致する。
【００９４】
図１０および図１１は、ヒドロコルチゾンモデルでのコントロール媒体またはＮＣＭでのインビボでの処置後の、培地（ＲＰＭＩ）、ｒＩＬ−１（ＩＬ１）、ｒＩＬ−２（ＩＬ２）、またはＮＣＭに対するインビトロでの脾臓細胞および胸腺細胞の応答を示す。マウスを、本明細書中で上記に記載するように処置した。これらのデータは、ＮＣＭがバックグラウンドの脾臓細胞応答、ＩＬ−１およびＩＬ−２に対する脾臓細胞応答を増大させたが、ＮＣＭは、バックグラウンドの胸腺細胞応答、ならびにＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＮＣＭに対する胸腺細胞応答は増大させなかったことを示す。
【００９５】
図１２および１３は、コントロール媒体またはＮＣＭでのインビボでの処置後の、ＣｏｎＡおよびＰＨＡに対するインビトロでの脾臓細胞および胸腺細胞の応答を示す。マウスを、本明細書中で上記に記載したように処置した。
【００９６】
インビトロでの研究は、増殖シグナルに対する脾臓細胞及び胸腺細胞の感作において等量でｒＩＬ−２よりもＮＣＭが優れていることを示す。胸腺細胞に対する影響は、分化の十分な促進を反映する。ＮＣＭ組成物は、ｒＩＬ−１、ｒＩＬ−２、さらにこれらの組み合わせとも異なり、インビボでのＴリンパ球の作用（ＩＬ応答）および発達（有糸分裂促進物質の応答および細胞マーカー）を強力に促進する。これは、免疫システムの刺激を必要とする任意の治療的測定に、またはなお、免疫システムの損傷または不全の部分的な作用の回復にも、治療的に関係している。例えば、化学治療剤は損傷細胞であり得、これには免疫応答に関係しているＴリンパ球が含まれる。Ｔリンパ球の機能および発達を刺激することによる本発明は、損傷した際には、免疫システムのこの特徴を部分的または完全のいずれかに回復させることができる。
【００９７】
（実施例２）
ＮＣＭおよび低用量のシクロホスファミド、インドメタシン、および亜鉛を有している、頸部の局所的なリンパ管周辺での注射が、扁平上皮細胞頭頸部の癌（Ｈ＆ＮＳＣＣ）を有する患者の高い割合において臨床的な退行を誘導したことを示す（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１２０：３９５−４０３、１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２２：４４７−４５４、１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １２６：３４５−３５１、２０００）。これには、再発を伴わない生存の改善の証拠を伴う。全体的には、主要ではない応答（２５％〜５０％）、腫瘍の退縮、および病理学的標本中での腫瘍の縮小を含み、９０％より多くが応答し、そして大部分は５０％を超える腫瘍の縮小を有した。
【００９８】
これらの応答は、免疫抑制によって媒介されることが推測される。なぜなら、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方について、腫瘍への浸潤を観察したからである。この治療は、有意な毒性を伴わなかった。
【００９９】
いくつかの未公開の観察によってこの推測の証明を提供し、そして本発明を導く。
１）ＮＣＭの組み合わせでのリンパ球減少性の癌患者の処置によって、顕著なリンパ球の固定を生じた；分析した際には、これらの患者は、ＣＤ４５ＲＡポジティブＴ細胞（すなわち、ナイーブＴ細胞）の増大を示した（表ＩＶ）。
２）Ｈ＆ＮＳＣＣの患者でのＮＣＭの腫瘍内または腫瘍周辺での注射は、可逆性の免疫療法によって誘導された腫瘍の退行、または腫瘍の進行のいずれかを生じた。従って、腫瘍は、免疫部位以外である。
３）所属リンパ節の分析は、所属リンパ節が仮定される腫瘍抗原に対しての免疫部位であることを示す未公開データを明らかにした（図１４〜１８を参照のこと）。
４）ＮＣＭで処置したこれらの患者は全て、臨床的には１５％、そして病理学的には５０％までにおいて予想される転移は生じなかった。このことは、単なる局所免疫が誘導されることではなく全身免疫が誘導されることを示す。
５）患者を、処置の前に０．１ｍｌのＮＣＭに対する皮膚反応テストを用いて予めテストした。ポジティブ皮膚反応テスト（２４時間で＞０．３ｍｍ）を用いると、これらの９０％より多くが、強い臨床応答および病理学的応答を有した。ネガティブ皮膚反応テストを行った患者は、弱い応答を有したかまたは応答を有さなかった。従って、皮膚反応テストは、良好に応答する患者を選択するようである。
【０１００】
主要な増大を、これらのＴリンパ球減少症の患者において７５２→１０２０のＴリンパ球数（ＣＤ２）において観察した  （正常＝１６００に対してＴ細胞数７５２）。「ナイーブ」ＣＤ４５ＲＡポジティブＴ細胞（５３２→７８２）で対応する増大が存在したことが重要である。上記のように、これらの増大は、一般的には、ＮＣＭのような薬理学的治療を用いて、特に成体においては生じるとは考えられない。これらの細胞は、おそらく新生胸腺の移住者であり、そして腫瘍抗原のような新しい抗原に応答する主要な新規の能力が考えられ得る。既存のＣＤ４５ＲＡポジティブ細胞は、腫瘍抗原には応答せず、そして腫瘍によって誘導される免疫抑制（アネルギー）に起因して、そのように行うことが十分にはできない場合がある。
【０１０１】
文献（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４、１９９７；Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２１：７９−１０１、１９９９）は、癌の主用な２つのタイプであるＳＣＣおよびアデノ腺癌の両方について、所属リンパ節が、以下を含む腫瘍に関係している異常を反映することを示す：洞組織球増殖症、リンパ球の減少、および多くの場合は、腫瘍細胞（ＩＬ−２を有する）に反応し得る腫瘍関連リンパ球の存在。転移を有する場合は、リンパ球の減少および機能低下が生じる。無関係の頸部のリンパ節１０  Ｈ＆ＮＳＣＣおよび１０個のコントロールの未公開の分析は、平均の大きさの減少およびＨ＆ＮＳＣＣに関係している洞組織球の増大を示した（図１４〜１７）。
【０１０２】
【表５】
0005963688.tif 000006
【０１０３】
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【０１０４】
１サイクルのＮＣＭ（ＩＲＸ−２）プロトコルでの処置（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１２０：３９５−４０３、１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２２：４４７−４５４、１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊら、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １２６：３４５−３５１、２０００）の後、無関係な頸部のリンパ節は、図１４〜１７に示す変化を示した。ＮＣＭで処置しなかったＨ＆ＮＳＣＣ患者の所属リンパ節に対して比較すると、これらの節は大きさ、Ｔ細胞の面積および密度において有意な増大を示し、そして胚中心の数、ならびに洞組織球増殖症および密集の低減を示した。処置した患者のリンパ節は全て刺激され、そしてコントロールの節よりも大きく、増大したＴ細胞面積および密度を有した。従って、これらの節は正常にまで回復しただけではなく、Ｈ＆ＮＳＣＣでの生存性との既知のポジティブな相関関係である、Ｔ細胞の支配の証拠をまた示した（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４、１９９７）。
【０１０５】
重要なことは、Ｂ細胞およびＴ細胞の面積に関係しているリンパ節の変化が、Ｔ細胞およびＢ細胞の浸潤を反映するそれらの腫瘍中での変化に関係する場合には、高い程度の相関関係が、Ｔ細胞（ｐ．＜０．０１）およびＢ細胞（ｓ．＜０．０１）について、そして存在する全てのリンパについて（ｐ．＜０．００１）得られた（図１８）。次いで、これらの変化は、病理学的および臨床的な基準による腫瘍の縮小に関係する。これらの知見は、腫瘍の反応が、リンパ節の変化に直接およびポジティブに相関していること、および腫瘍の反応が、従属型可変性としてリンパ節の変化を反映することを示す。これらの知見は、一般的に免疫システムがどのように作用するかについての知見（Ｒｏｉｔｔ  Ｉ，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ  Ｊ，Ｍａｌｅ  Ｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ，１９８９）、およびそれに続くサイトカイン遺伝子での腫瘍トランスフェクションについての知見（Ｍａａｓｓ  Ｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、９２：５５４０−５５４２）とまとめて、ＮＣＭプロトコルが、リンパ節のレベルでいまだ同定されていない腫瘍抗原に対するこれらの患者を免疫することを示す。自己の腫瘍抗原での免疫を反映するリンパ節の変化についての証拠を示した研究者は、以前にはいなかった。これらのデータによって、出願人は、これが、離れた場所の転移の退行を生じる作用において、従来の不十分であるかまたはあまり有効ではない腫瘍抗原での免疫を誘導する試みについての、良好な出発点を構成することを確信する。
【０１０６】
（実施例３）
頭頸部のリンパ腫を有する２人の患者を処置した。
【０１０７】
含んだ患者は、このプロトコルへの参加に同意した頭頸部の癌を有する患者であった。以後の計画は以下のとおりであった。
【０１０８】
処置前に、患者を前腕に皮下で０．１ｍｌのＮＣＭを用いて皮膚反応テストを行った。この場所に印をつけ、そして２４時間後にテストを読み取った。テストでは、誘導および紅斑が３ｍｍに等しいかまたはそれよりも大きい場合に、ポジティブと考えた。
【０１０９】
ＮＣＭの各サイクルは、以下のように２１日間であった：
１日目：低用量のシクロホスファミド（３００ｍｇ／ｍ２  ｉ．ｖ．）
１〜２１日目：インドメタシン  ２５ｍｇ  ｐ．ｏ．  １日３回
硫酸亜鉛  ５０ｍｇ  ｐ．ｏ．  １日１回
３〜１２日目：頸部のリンパ管周辺で１ｍｌの皮下としてＮＣＭの２００単位を５回。
【０１１０】
（症例＃１）
患者は、左の下顎部の領域に３ヶ月の腫瘍の存在の以前の病歴を有し、他の症状は有さない、２３歳の男性であった。緊急治療室では、この患者は、深いレベルで部分的に固定された非常に固い約６．５ｃｍの直径の左の顎下三角のリンパ節の腺症が見つかった。残りの身体検査は正常であった。切開による生検によっては、ホジキンリンパ腫を示した。病巣は、ステージＥＣＩＩＡであった。ＮＣＭの１サイクルの処置を行い、これによって、直径が１ｃｍ減少した大きさの腺腫として、小さい応答を生じた。ＮＣＭ処置後に得られた生検の報告は、病巣の６０％が正常なリンパ浸潤を示したこと、そして残りの新生物（４０％）は壊死を示したことを示した。生存可能な腫瘍は見られなかった。
【０１１１】
この後、患者には、３６００ｒａｄの放射線治療を頸部に行った。患者は現在は疾患を有していない。
【０１１２】
（症例＃２）
患者は、有痛の頸部中央部の腫瘍塊の２ヶ月の病歴、ならびに１０ｋｇの体重の減少を示した、８２歳の男性である。身体検査では、患者は、右側の口蓋扁桃に腫瘍を示し、これは、扁桃の中心に核を有して約４×３ｃｍにまで大きくなった。頸部では、右側の下顎骨のリンパ節で約２×２ｃｍを測定し、そしてリンパ節の塊は約５×５ｃｍのレベルＩＩおよびレベルＩＩＩであった。残りの検査では正常であった。扁桃および頸部のリンパ節の１つの切開による生検では、中程度の段階の定義された混合型非ホジキンリンパ腫を示した。
【０１１３】
患者に、ＮＣＭを２サイクル行い、その終わりに、扁桃および頸部の腺腫の直径の１ｃｍの縮小を観察した。ＮＣＭ処置後の病理学的報告は、生存している腫瘍が２０％、断片化されそして壊死性が３０％、そして正常なリンパ浸潤が５０％であることを示した。
【０１１４】
患者に、６サイクルの化学療法（ＣＨＯＰ）を行い、そしてその後、４６００ｒａｄの総線量で外部放射線治療（ＲＴ）を行った。この患者は、ＲＴの８ヶ月後に再発し、後頭に副腎過形成を有した。患者は、頸部の疾患の兆候の３ヵ月後に死亡した。
【０１１５】
（実施例４）
未処置の初期段階（臨床段階ＩＢ１、ＩＢ２、およびＩＩＡ）の子宮頸癌の１０人の患者を、ＩＲＸ−２として局所的注射、リンパ管周辺での注射（１０回の毎日の注射）、それに続く２１日目での放射線子宮摘出術で処置した。ＩＲＸ２の開始１日前に、患者に、３００ｍｇ／ｍ２でシクロホスファミドの単回のＩＶ用量を与えた。経口で、インドメタシンまたはイブプロフェンならびに硫酸亜鉛を、１日目から２１日目まで投与した。臨床および病理学的応答、毒性および疾患を有さない生存性を評価した。
【０１１６】
全ての患者のＮＣＭ処置を完了し、そして応答および毒性について評価した。臨床応答が５０％の患者に見られた（３人で部分的な応答（ＰＲ）、２人で小さい応答（ＭＲ）（＞２５％＜５０％の縮小））。７人の患者に外科手術を行った。腫瘍の断片化を伴う病理学的な腫瘍の縮小が、５つの症例で見られた。むしろ、リンパ球、血漿細胞、好中球、マクロファージ、および好酸球を含む、腫瘍に浸潤する細胞型の異質のパターンが存在した。処置を、注射の間の穏やかな痛みおよび少量の出血、ならびにインドメタシンに対する胃の不耐を除いて、十分に寛容化した。追跡調査の２４ヶ月目には、９人の患者が疾患を有していない。
【０１１７】
この以前には公開されていない研究は、腫瘍周辺のＮＣＭが、初期段階の未処置の子宮頸癌において、免疫媒介性の腫瘍応答を誘導することを示す。
【０１１８】
（実施例５）
原発性肝細胞癌からの肝臓転移を有する２人の患者を、脾臓内ＮＣＭ（１回または３回の注射）で処置した。プロトコルは、それ以外は、Ｈ＆ＮＳＣＣ、子宮頸癌、またはリンパ腫の症例について先に記載したとおりであった。進行した肝細胞癌を有する１人の患者は、断層撮影法によって確認した部分的な応答を有し、病歴は入手することができなかった。他の患者は、外科手術によって確認した部分的な応答を有した。組織学的試験は、腫瘍の縮小、断片化、およびリンパ浸潤を示した。
【０１１９】
（実施例６）
陰茎の扁平上皮癌（ヒトパピローマウイルスに関係する）の４人の患者を、上記のようなＮＣＭプロトコルで処置した；４人全てが、部分的な応答を臨床的に示し、そして外科手術による検体は、腫瘍の縮小および断片化、ならびにＨ＆ＮＳＣＣ癌患者の特徴であるリンパ浸潤を示した。
【０１２０】
（実施例７）
マウスを、アジュバントとしてミョウバンを用いて（１：１容量）３つの位置（１日目、１４日目、２１日目）でオボアルブミン１００μｇと組み合わせたＰＭＳＡペプチドで免疫した（５匹）か、またはＮＣＭ（２０単位のＩＬ２等量）（５匹）動物を、２８日目にオボアルブミン（１００μｇ）（２匹）またはペプチド（１００μｇ）（３匹）を用いて皮膚反応テストした。オボアルブミンおよびＮＣＭで、ペプチドを含まずに処置した２匹の動物は、ポジティブ皮膚反応テストでオボアルブミンに応答した。オボアルブミンおよびミョウバンで処置した２匹の動物は応答しなかった。オボアルブミンとペプチド、およびＮＣＭで処置した３匹の動物のうちの２匹が応答した。オボアルブミンとペプチド、およびミョウバンで処置した動物は全て、応答しなかった。従って、ＮＣＭが、抗原としての腫瘍ペプチドおよびオボアルブミンの両方について、ミョウバンより優れたアジュバントであった。
【０１２１】
本出願を通じて、種々の刊行物（米国特許を含む）が、著者および年号および特許番号によって引用されている。刊行物についての全ての引用文献を以下に列挙する。これらの刊行物および特許の開示は、それらの全体において、本発明が属する分野の状態をより完全に記載するために、本出願中に参考として援用される。
【０１２２】
本発明は、例示の様式で記載されており、そして使用されている技術用語が限定よりもむしろ記述の言葉の性質において意図されることが理解される。
【０１２３】
明らかに、本発明の多くの改変およびバリエーションが、上記の教示を参照して可能である。従って、本発明が、詳細に記載されている以外で実施され得ることが、本発明の範囲内であることが理解される。
【０１２４】
（参考文献）
【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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