(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノウイルスを作製する方法であって、
ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格を、１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールと、配列およびライゲーション非依存的クローニング（ＳＬＩＣ）によって組み合わせてアデノウイルスコアモジュールデスティネーションベクターを構築するステップであって、ここで、該１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュールとＬ３−Ｌ４モジュールとの両方、またはＥ２−Ｌ４モジュールを含むコアモジュールを形成し、該コアモジュールは、長さが少なくとも１２ｋｂである、ステップと、
該アデノウイルスコアモジュールデスティネーションベクターに、該コアモジュールに隣接する組換え部位核酸配列を挿入し、それによって組換えコンピテントなコアモジュールデスティネーションベクターを形成するステップと、
該組換えコンピテントなコアモジュールデスティネーションベクターを、１つまたは複数の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールと、部位特異的組換えによって組み合わせてアデノウイルスゲノムを構築するステップであって、ここで、該１つまたは複数の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、Ｅ１モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格が、ｐ１５Ａ複製開始点を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格が、哺乳動物Ｉ−ＳｃｅＩ発現カセットを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記コアモジュールは、長さが少なくとも１４ｋｂである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記コアモジュールが、Ｅ２−Ｌ２モジュールおよびＬ３−Ｌ４モジュールを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記コアモジュールがＥ２−Ｌ４モジュールを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格および前記１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、長さが２０〜２５塩基対の一本鎖核酸オーバーハングを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格および前記１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、一本鎖核酸オーバーハングをそれぞれの末端に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、
環状であるか、環状プラスミド中に含まれるアデノウイルス遺伝子モジュールを、エンドヌクレアーゼと接触させ、線状アデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ；および
該線状アデノウイルス遺伝子モジュールを、エキソヌクレアーゼと接触させ、該１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ
によって形成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格が、
環状ベクター骨格を、エンドヌクレアーゼと接触させ、線状ベクター骨格を形成するステップ；および
該線状ベクター骨格を、エキソヌクレアーゼと接触させ、該ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格を形成するステップ
によって形成される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え部位核酸配列が、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＲ、またはａｔｔＬ部位である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え部位核酸配列が、ＳＬＩＣによって前記アデノウイルスコアモジュールデスティネーションベクターに挿入される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えコンピテントなコアモジュールデスティネーションベクターを、前記１つまたは複数の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールと、部位特異的組換えによって組み合わせるステップが、該組換えコンピテントなコアモジュールデスティネーションベクターおよび該１つまたは複数の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを、インテグラーゼと接触させるステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞に前記アデノウイルスゲノムをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アデノウイルスゲノムが、細胞内で発現される際に組換えアデノウイルスを形成することができる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アデノウイルスゲノムが、補完的細胞系中で発現されるか、またはヘルパーウイルスを伴う細胞中で発現される際に組換えアデノウイルスを形成することができる部分的なアデノウイルスゲノム構築物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の組換えコンピテントまたはハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールの少なくとも１つが、該遺伝子モジュールの由来する野生型アデノウイルスに対して、１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
組換えアデノウイルスを作製する方法であって、
ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格を、１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールと、配列およびライゲーション非依存的クローニング（ＳＬＩＣ）によって組み合わせてアデノウイルスコアモジュールデスティネーションベクターを構築するステップであって、ここで、該ベクター骨格は、哺乳動物Ｉ−ＳｃｅＩ発現カセット、ｐ１５Ａ複製開始点、またはそれら両方を含み、該１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュールとＬ３−Ｌ４モジュールとの両方、またはＥ２−Ｌ４モジュールを含むコアモジュールを形成する、ステップと、
該アデノウイルスコアモジュールデスティネーションベクターに、該コアモジュールに隣接する組換え部位核酸配列を挿入し、それによって組換えコンピテントなコアモジュールデスティネーションベクターを形成するステップと、
該組換えコンピテントなコアモジュールデスティネーションベクターを、１つまたは複数の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールと、部位特異的組換えによって組み合わせてアデノウイルスゲノムを構築するステップであって、ここで、該１つまたは複数の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、Ｅ１モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記コアモジュールは、長さが少なくとも１２ｋｂである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなベクター骨格および前記１つまたは複数のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、長さが２０〜２５塩基対の一本鎖核酸オーバーハングを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１０年８月１６日に出願された米国仮出願第６１／３７４，１９８号の利益を主張する。米国仮出願第６１／３７４，１９８号は、その全体が、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の背景
異なるヒト組織に感染する５２種のヒトアデノウイルス、および魚類から霊長類までにわたる他の種に感染する数百のアデノウイルスが存在する。これらのウイルスは、感染後１時間以内にそれらのゲノムのペイロードを核に送達する非常に効率的なナノマシンである。ＤＮＡウイルスと同様に、これらは宿主ＤＮＡ内には組み込まれず、確立されたＧＭＰプロトコールを使用して高力価に産生させることができ、また、異所性遺伝子を発現させることに関して、研究およびヒト遺伝子治療への適用において安全性が実証されている。しかし、現在まで、これらの潜在的な適用は、ほぼ１つの変種、Ａｄ５またはＡｄ２／５キメラのみが用いられていること、および急速かつ系統的に複数の遺伝子改変を工学的に作り出し、組み合わせることができないことによって妨げられてきた。したがって、アデノウイルスベクターのレパートリーをＡｄ２／５のそれを越えて広げる必要性および構成要素の部分から新規のアデノウイルスゲノムを急速に新規に構築することを容易にする科学技術的なプラットフォームを開発し、複数の改変および異種性エレメントの系統的な組み入れを可能にする必要性が高い。そのような系は、３６遺伝子（スプライスバリアントを含めず）の送達および発現の両方において非常に効率的な天然のウイルスの構築様式（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を利用する。この系により、異なる腫瘍試料において調節解除された経路活性の複合的かつ定量的な測定を組み入れる有力な診断薬および治療薬がもたらされ得る。
【０００３】
いくつかの適用におけるアデノウイルスベクターの潜在性は、３６ｋｂのウイルスゲノムを急速かつ系統的に操作する能力により妨げられている。さらに、基礎研究、動物モデル、遺伝子治療および腫瘍細胞崩壊療法において使用されるアデノウイルスベクターはアデノウイルス（Ａｄ）血清型２型および５型に限られている。Ａｄ２およびＡｄ５は、最初に発見されたものであり、そのようなものとして、それらのゲノム、特にそのＥ１領域において操作するために用いるベクター／ツールが受け継がれている。Ａｄ２／５線維タンパク質は、受容体ＣＡＲに結合することによって上皮細胞に感染する。残念ながら、ＣＡＲは全ての細胞型において発現されるのではなく、また、多くの転移で下方制御される。さらに、ヒト集団のおよそ８０％がＡｄ２／５に対する既存の中和抗体を有し、それが、オフターゲットの肝臓取り込みおよび炎症と共に、全身への適用を制限している。したがって、遺伝子送達およびがん療法のためのＡｄ２／５ベクターの使用は、必ずしも最適な選択ではなく、それどころか、大部分は歴史上の偶然である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らの最終の目標は、腫瘍選択的溶解性複製を行うだけでなく、何回も繰り返される処置において全身的に投与することができ、肝毒性を回避し、複雑な腫瘍脈管構造を効率的に標的化し、横断し、細胞に異なる受容体を介して感染し、プロドラッグ活性化酵素／毒素の発現を腫瘍内に局在化させることにより腫瘍バイスタンダー効果を生じ、有益な宿主抗腫瘍免疫応答を呼び起こす強力なウイルスがん療法を工学的に作製することである。これらは、ヒトアデノウイルスがマウスにおいて複製することができないことによりさらに複雑になる主要な難題である。これは、異種移植片モデルを超える多くの利点を有する、がんの、免疫コンピテントな遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）においてヒト腫瘍細胞崩壊ウイルスを評価することの妨げになる。
【０００５】
ヒトアデノウイルスは５２種あり、異なる宿主組織環境に感染し、複製するために高度に特殊化された適応を示す。これらのウイルスの多くは、種々の組織に感染し、ＣＡＲ以外の細胞受容体に結合する線維タンパク質ならびに「Ｅ３」免疫調節遺伝子の別個のコホートを有する。それらのゲノムを改変するために必要なツールがないので、それらの独特の性質についての広範囲にわたる試験や活用はなされていない。同様に、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ−１）を含めた、他の種に感染するアデノウイルスもある。
【０００６】
本明細書では、当技術分野におけるこれらの問題および他の問題に対する解決法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、組換えアデノウイルスを作製するための方法（本明細書では「Ａｄｓｅｍｂｌｙ」とも称される）が提供される。当該方法は、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュール（または下記のその変異体）から選択される２種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。
【０００８】
別の態様では、複数のアデノウイルス遺伝子モジュールを含むライブラリーが提供される。
【０００９】
別の態様では、本明細書において提供される方法を実施するためのキットが提供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
組換えアデノウイルスを作製する方法であって、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、およびＥ４モジュールからなる群から選択される３種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む方法。
（項目２）
前記核酸が前記Ｅ１モジュールを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸が前記Ｅ４モジュールをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記核酸が、前記Ｅ２−Ｌ２モジュール、前記Ｌ３−Ｌ４モジュール、または該Ｅ２−Ｌ２モジュールと該Ｌ３−Ｌ４モジュールの両方をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記核酸を構築する前に、前記３種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの２種を組み合わせることによってマクロモジュールを形成する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記マクロモジュールがＥ２−Ｌ４マクロモジュールである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記Ｅ２−Ｌ４マクロモジュール、および前記Ｅ１モジュール、前記Ｅ３モジュール、または前記Ｅ４モジュールから選択される１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｅ１モジュール、前記Ｅ２−Ｌ２モジュール、前記Ｌ３−Ｌ４モジュール、前記Ｅ３モジュール、および前記Ｅ４モジュールから選択される少なくとも４種のアデノウイルス遺伝子モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記Ｅ１モジュール、前記Ｅ２−Ｌ２モジュール、前記Ｌ３−Ｌ４モジュール、前記Ｅ３モジュール、および前記Ｅ４モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記核酸が少なくとも１２ｋｂである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記核酸が、欠失しているアデノウイルス核酸配列、変異したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物をコードする、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物をコードする、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したアデノウイルスの線維遺伝子産物をコードする、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したウイルスコートタンパク質をコードする、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記異所性のアデノウイルス核酸配列が、プロドラッグ変換酵素をコードする、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記非アデノウイルス遺伝子産物がレポータータンパク質である、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記非アデノウイルス遺伝子産物が標的化タンパク質である、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
前記標的化タンパク質が腫瘍標的化タンパク質または脈管構造標的化タンパク質である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記核酸を転写させ、それにより組換えアデノウイルスを形成するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記組換えアデノウイルスが複製コンピテントである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記組換えアデノウイルスが複製インコンピテントである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記構築するステップが、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターと、１種または複数種のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールとをハイブリダイズさせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターが、
（ｉ）デスティネーションベクターを切断し、それにより線状デスティネーションベクターを形成するステップ、および
（ｉｉ）該線状デスティネーションベクターをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、該ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを形成するステップ、
により形成される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
１種または複数種の前記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、
（ｉ）１種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを含むエントリーベクターをエンドヌクレアーゼと接触させ、それにより、放出された１種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ、および
（ｉｉ）該放出された１種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、前記１種または複数種の該ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ、
により形成される、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
構築するステップが、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび前記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を含有する１種または複数種の組換えコンピテントなエントリーベクターを、インテグラーゼと接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を含有する前記組換えコンピテントなエントリーベクターが、１種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールおよび組換えコンピテントなドナーベクターをインテグラーゼと接触させ、それにより、該アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を含有する該組換えコンピテントなエントリーベクターを形成するステップにより形成される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
構築するステップが、
（ｉ）ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターとハイブリダイゼーションコンピテントな第１のアデノウイルス遺伝子モジュールとをハイブリダイズさせ、それにより、第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップ；および
（ｉｉ）該第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターおよび組換えコンピテントな第２のアデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターをインテグラーゼと接触させ、それにより、第２のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップ
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールが前記Ｅ２−Ｌ２モジュール、前記Ｌ３−Ｌ４モジュール、またはＥ２−Ｌ４マクロモジュールであり、第２のアデノウイルス遺伝子モジュールが前記Ｅ１モジュール、前記Ｅ３モジュール、または前記Ｅ４モジュールである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
複数の異なるＥ１モジュール、複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、複数の異なるＥ３モジュール、複数の異なるＥ４モジュール、または複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールを含むライブラリー。
（項目３２）
前記複数の異なるＥ１モジュール、前記複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、前記複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、前記複数の異なるＥ３モジュール、前記複数の異なるＥ４モジュール、または前記複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールが、複数のアデノウイルスの種由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む、項目３１に記載のライブラリー。
（項目３３）
前記複数の異なるＥ１モジュール、前記複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、前記複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、前記複数の異なるＥ３モジュール、前記複数の異なるＥ４モジュール、または前記複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールが、２種以上のヒトアデノウイルス血清型由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む、項目３２に記載のライブラリー。
（項目３４）
前記複数の異なるＥ１モジュール、前記複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、前記複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、前記複数の異なるＥ３モジュール、前記複数の異なるＥ４モジュール、または前記複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールが、欠失しているアデノウイルス核酸配列、置換されたアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、項目３１に記載のライブラリー。
（項目３５）
前記複数の異なるＥ１モジュール、前記複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、前記複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、前記複数の異なるＥ３モジュール、前記複数の異なるＥ４モジュール、または前記複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールが組換えコンピテントである、項目３１に記載のライブラリー。
（項目３６）
前記複数の異なるＥ１モジュール、前記複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、前記複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、前記複数の異なるＥ３モジュール、前記複数の異なるＥ４モジュール、または前記複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールがハイブリダイゼーションコンピテントである、項目３１に記載のライブラリー。
（項目３７）
項目１から２０までのいずれか一項に記載の方法に従って調製したアデノウイルスゲノムライブラリー。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、既存のアデノウイルスベクター法とＡｄｓｅｍｂｌｙの比較チャートである。現在の系に伴ういくつかの制限がＡｄｓｅｍｂｌｙにより克服される。
【図２】図２は、アデノウイルスを治療薬としてさらに開発するために克服する必要がある難題を示す。簡単な図は、当分野において克服する必要がある主要な問題のいくつかを示している。
【図３】図３は、４つの異なるアデノウイルス属を列挙している系統樹である。公知のアデノウイルスが全て列挙されているわけではない。これは、アデノウイルス科における種の多様性を実証している。
【図４】図４は、５２種の公知のヒトアデノウイルスに対する受容体および向性を示す。受容体および向性は、血清型間およびサブグループ間で変動し、したがって、特定のウイルスを再標的化するために利用することができる。
【図５】図５は、アデノウイルス属にわたる「コア」ゲノム領域の保存を示す。本図の上部は、ヒトＡｄ５ゲノム（配列番号１３７）の簡易化したマップであり、コア領域が破線の枠内に強調表示されている。このコア領域は、本図の下部の遺伝子の周りの白枠によって示されるように、全アデノウイルス属全体を通して保存されている。全ての属がこのコア領域を共有し、コアオープンリーディングフレームのほとんど全てがＩＶａ２（左端）からｐＶＩＩＩ（右端）にわたって存在する。ゲノムの変動性は上記ゲノムの末端にある。出願人らは、モジュールの内容は種間でいくらか変動するが、上記コアに対するそれらの位置は変動しないので、本発明者らのモジュールの名称をＥ１モジュール（本明細書ではＥ１様モジュールとも称される）（コアの左側の全てのもの、棒で示される）、コアモジュール（棒で示される）、およびＥ３モジュール（本明細書ではＥ３様モジュールとも称される）（コアの右側の全てのもの、棒で示される）に分割した。いくつかの場合では、上記線維タンパク質は上記コアのすぐ隣であるが、他の場合（ヒトＡｄ）では、線維タンパク質は上記コアの外側にある。
【図６】図６は、アデノウイルス種にわたって転写単位が保存されていることを示す、種々のアデノウイルス属の転写マップである。１つまたは２つの属に見いだされる遺伝子としてコア遺伝子が示されている。この図は、属間でのゲノムの末端における変動性の概説を提供する。本明細書において列挙されている「Davison、Benko、Harrach」は、Benkoe  Mら、（２００５年）Family  Adenoviridae.  Fauquet  CM、Mayo  MA、Maniloff  J、Desselberger  U、Ball  LA（編）：Virus  Taxonomy.  VIIIth  Report  of  the  International  Committee  on  Taxonomy  of  Viruses.  Elsevier、New  York、２１３〜２２８頁を指す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、配列番号３２に記載のヒトＡｄ５ポリメラーゼタンパク質のアミノ酸９６６〜１１０３（下部、コンセンサスのすぐ上）と非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのポリメラーゼタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ポリメラーゼ配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号１〜３２に対応する。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、配列番号３２に記載のヒトＡｄ５ポリメラーゼタンパク質のアミノ酸９６６〜１１０３（下部、コンセンサスのすぐ上）と非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのポリメラーゼタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ポリメラーゼ配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号１〜３２に対応する。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、配列番号３２に記載のヒトＡｄ５ポリメラーゼタンパク質のアミノ酸９６６〜１１０３（下部、コンセンサスのすぐ上）と非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのポリメラーゼタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ポリメラーゼ配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号１〜３２に対応する。
【図７Ｄ】図７Ｄ〜７Ｇは、配列番号７３に記載のヒトＡｄ５ヘキソンタンパク質のアミノ酸５０１〜７４７（下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのヘキソンタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ヘキソン配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。黄色で強調表示されている残基は種間にわたって１００％保存されている。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号３３〜７３に対応する。
【図７Ｅ】図７Ｄ〜７Ｇは、配列番号７３に記載のヒトＡｄ５ヘキソンタンパク質のアミノ酸５０１〜７４７（下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのヘキソンタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ヘキソン配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。黄色で強調表示されている残基は種間にわたって１００％保存されている。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号３３〜７３に対応する。
【図７Ｆ】図７Ｄ〜７Ｇは、配列番号７３に記載のヒトＡｄ５ヘキソンタンパク質のアミノ酸５０１〜７４７（下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのヘキソンタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ヘキソン配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。黄色で強調表示されている残基は種間にわたって１００％保存されている。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号３３〜７３に対応する。
【図７Ｇ】図７Ｄ〜７Ｇは、配列番号７３に記載のヒトＡｄ５ヘキソンタンパク質のアミノ酸５０１〜７４７（下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのヘキソンタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列のいずれも、個々にＡｄ５ヘキソン配列と比較すると、この領域内は少なくとも４５％同一である。黄色で強調表示されている残基は種間にわたって１００％保存されている。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号３３〜７３に対応する。
【図７Ｈ】図７Ｈ〜７Ｉは、配列番号１０３に記載のヒトＡｄ５  ＤＮＡ結合性タンパク質のアミノ酸４０８〜４７５（ＤＢＰ、下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのＤＢＰの対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列はいずれも、個々にＡｄ５  ＤＢＰ配列と比較すると、この領域内は少なくとも３５％同一である。黄色で強調表示されている残基は種間にわたって１００％保存されている。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号７４〜１０３に対応する。
【図７Ｉ】図７Ｈ〜７Ｉは、配列番号１０３に記載のヒトＡｄ５  ＤＮＡ結合性タンパク質のアミノ酸４０８〜４７５（ＤＢＰ、下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのＤＢＰの対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列はいずれも、個々にＡｄ５  ＤＢＰ配列と比較すると、この領域内は少なくとも３５％同一である。黄色で強調表示されている残基は種間にわたって１００％保存されている。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号７４〜１０３に対応する。
【図７Ｊ】図７Ｊは、配列番号１３５に記載のヒトＡｄ５  ｐＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸６〜４３（下部、コンセンサスのすぐ上）と、非ヒトアデノウイルス由来のいくつかのｐＶＩＩＩタンパク質の対応する領域とのアラインメントである。非ヒトＡｄ配列はいずれも、個々にＡｄ５  ｐＶＩＩＩ配列と比較すると、この領域内は少なくとも３５％同一である。左側の表示はＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示し、上から下に、それぞれ配列番号１０４〜１３５に対応する。
【図８】図８は、アデノウイルスゲノムの操作についての最初の概念の概要である。
【図９】図９は、４種のＤＮＡ断片を使用したマルチサイトゲートウェイの例の簡単な図である。マルチサイトゲートウェイは、本発明者らが提唱した、ゲノムを再構築するための系であった。左側が提唱した系である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ゲートウェイａｔｔ組換え部位の名称および構成の詳細図である。ゲートウェイクローニングにより生じた４種の異なるａｔｔ組換え部位が存在する。４種は全て、実際の組換えが起こる場所である中心の２１ｂｐのａｔｔＢ領域を含有する。特異的な酵素混合物（ＢＰ）を用いるとａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位が組み換えられる。得られたその反応物にはａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位が創製される。この反応は別の酵素混合物（ＬＲ）を用いると可逆的であり、ａｔｔＬおよびａｔｔＲが組み換えられてａｔｔＰおよびａｔｔＢが形成される。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、６種の異なるａｔｔ部位間の配列の差異を示す。各部位はその適合物（ｉｔｓ  ｍａｔｃｈ）と特異的に組み換えられる。ａｔｔＢ１部位はａｔｔＰ１部位とのみ組み換えられ、ａｔｔＢ２はａｔｔＰ２とのみ組み換えられる、などである。
【図１１】図１１は、Ａ）ヒトＡｄ５ゲノム（配列番号１３７）の、再構築用モジュールへの分割の例である。Ｂ）マルチサイトゲートウェイ技術を用いて、提唱されたモジュールを再構築した後のａｔｔＢ部位の挿入箇所を示す。
【図１２−１】図１２は、上記ヒトＡｄ５ゲノム（配列番号１３７）内の潜在的なａｔｔＢ挿入部位の例である。挿入部位は、標的領域内の種々のアデノウイルスの配列をアラインメントすること、および非保存配列の周りの場所を選択することによって決定することができる。矢印は、Ａｄ５について選択された部位を示す。Ａ）Ｅ１モジュールとＥ２モジュールの間のａｔｔＢ４の挿入を示す。Ｂ）Ｅ２モジュールとＬ３モジュールの間のａｔｔＢ６の挿入部位を示す。Ｃ）Ｌ３モジュールとＥ３モジュールの間のａｔｔＢ５の挿入を示す。Ｄ）Ｅ３モジュールとＥ４モジュールの間のａｔｔＢ３の挿入部位を示す。この特定の挿入のために、線維ポリＡ／終止とＥ４ポリＡの間にＡｄ５配列を重複させることにより組換え部位を緩衝することに決定した。したがって、上記ａｔｔＢ挿入と共に、これら２つのエレメントの間に位置する２７ｂｐの重複が存在する。
【図１２−２】図１２は、上記ヒトＡｄ５ゲノム（配列番号１３７）内の潜在的なａｔｔＢ挿入部位の例である。挿入部位は、標的領域内の種々のアデノウイルスの配列をアラインメントすること、および非保存配列の周りの場所を選択することによって決定することができる。矢印は、Ａｄ５について選択された部位を示す。Ａ）Ｅ１モジュールとＥ２モジュールの間のａｔｔＢ４の挿入を示す。Ｂ）Ｅ２モジュールとＬ３モジュールの間のａｔｔＢ６の挿入部位を示す。Ｃ）Ｌ３モジュールとＥ３モジュールの間のａｔｔＢ５の挿入を示す。Ｄ）Ｅ３モジュールとＥ４モジュールの間のａｔｔＢ３の挿入部位を示す。この特定の挿入のために、線維ポリＡ／終止とＥ４ポリＡの間にＡｄ５配列を重複させることにより組換え部位を緩衝することに決定した。したがって、上記ａｔｔＢ挿入と共に、これら２つのエレメントの間に位置する２７ｂｐの重複が存在する。
【図１３】図１３は、ＰＣＲによって５種のＡｄ５モジュールを得るための試みの難題および結果を示す。一番下の表には、ＰＣＲによって得られた各断片の配列決定の結果および公開されているＡｄ５配列との差異が列挙されている。全ての誤差の再現性は１００％であったので、本発明者らが使用した鋳型は公開されているＡｄ５配列とは異なり、そのＰＣＲの忠実度が高いことが示唆される。
【図１４】図１４は、ＰＣＲにより、精製されたウイルスから直接得られたＤＮＡからＡｄ５アデノウイルス遺伝子モジュールを得ることができることを示す。Ａｄ５ゲノムＤＮＡを、精製されたウイルスから直接単離し、上記Ａｄ５モジュールのＰＣＲのための鋳型として使用した。５回のＰＣＲは全て上首尾であった。左側のパネル：Ｅ２モジュールおよびＬ３モジュールの、４連でのＰＣＲを示す。右側のパネル：Ｅ１モジュール、Ｅ３モジュール、およびＥ４モジュールの、２連でのＰＣＲを示す。赤色の矢印は、所望のＰＣＲ産物を示す。所望の産物が明確であるので、右側では矢印は省略する。
【図１５】図１５は、ゲートウェイＢＰ反応における上記Ａｄ５アデノウイルス遺伝子モジュールの効率を示す。標準反応において上記Ｅ１モジュール、Ｅ２モジュール、およびＬ３モジュールは効率的でなかったが、上記Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールは効率的であった。
【図１６】図１６は、配列およびライゲーション非依存的クローニング（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ）（ＳＬＩＣ）についての図である。左側は、単一断片ＳＬＩＣについて示し、右側は、多重（ｍｕｌｔｉ）（９種）断片ＳＬＩＣの例である。
【図１７】図１７は、ゲートウェイクローニング酵素を使用せずにゲートウェイエントリーベクターを創製するためのＳＬＩＣの使用を示す。
【図１８】図１８は、Ａｄ５のＥ１領域が細菌に対して中程度に毒性であることを示す。Ａｄ５のＥ１領域または対照（ｌａｃＺ）を、ＳＬＩＣを用いてゲートウェイＤＯＮＲベクターに挿入した。ｌａｃＺ対照におけるコロニーは全て「正常な」サイズであり、ｌａｃＺ挿入について陽性であった。Ｅ１プレートでは「正常な」サイズのコロニーは２つしか現れず、そのどちらもＥ１について陰性であった。しかし、それよりも小さなコロニーがいくつか存在しており（矢印）、その全てがＥ１について陽性であった。したがって、上記Ａｄ５のＥ１領域により、細菌の成長が遅くなる。これは、何故ゲートウェイ組換え反応を用いてＥ１を挿入することに問題があったかを説明している。
【図１９】図１９は、５種のモジュールエントリーベクターからＡｄ５ゲノムを再構築するための最初のマルチサイトゲートウェイ戦略を示す。まず、上記５種のエントリーベクターのうち３種をスタッファーベクターとともに組み合わせた。次いで、そのスタッファーを除去して対抗選択カセットを挿入する。次いで、最後の２種のエントリーベクターを組み合わせて完全なゲノムを創製する。この特定の戦略では、上記Ｅ１モジュール、ならびに上記Ｅ２モジュールおよびＬ３モジュールのサイズが大きいことに関連づけられる毒性が示された。
【図２０】図２０は、ヒトＡｄ５  Ａｄｓｅｍｂｌｙの二重ＤＥＳＴベクターの創製を示す。上記Ｅ２モジュールおよびＬ３モジュールを、それらのそれぞれのエントリーベクターからＰＣＲによって得、ＳＬＩＣを用いてベクターの骨格と組み合わせる。その後、上記ベクターを、上記モジュールの末端に工学的に作製した独特の制限部位で消化した後、ＳＬＩＣによってゲートウェイ対抗選択カセットを上記モジュールの隣に挿入する。
【図２１】図２１は、ヒトＡｄ５についてのＡｄｓｅｍｂｌｙプロセスを示す。上記コアモジュールの二重ＤＥＳＴベクターを、ゲートウェイＬＲ反応において残りの３種のエントリーベクターそれぞれのうちの１つと組み合わせて、完全なウイルスゲノムを再構築する。
【図２２】図２２は、上記Ａｄｓｅｍｂｌｙ法を用いて試みたいくつかの対抗選択マーカーの効率を示す。ＰｈｅＳ＋ｃｃｄＢが使用され、そして、これはコロニーのブラインドスクリーニング、または、まずコロニーのＰＣＲを行って挿入物を同定した後の標準の制限消化スクリーニングのいずれによっても効率的である。
【図２３】図２３は、Ａｄｓｅｍｂｌｙベクターの骨格が、上記方法の複数の実施形態のための２つの独特の特徴を有することを示す。上記ベクターの骨格は、プラスミドのコピー数を減らし、したがって、Ａｄ５のＥ１モジュールに媒介される毒性を低下させるｐ１５Ａ複製開始点が使用される。さらに、上記ベクターは、トランスフェクションするとウイルスゲノムが上記ベクターの骨格から自己除去されることを可能にする哺乳動物のＩ−ＳｃｅＩ発現カセットを含有する。
【図２４】図２４は、上記Ａｄｓｅｍｂｌｙ反応の効率を示す。Ａ）Ａｄ５についてのＡｄｓｅｍｂｙ反応を、上記コアの二重ＤＥＳＴベクター２０ｆｍｏｌおよびＥ１モジュールエントリーベクター、Ｅ３モジュールエントリーベクター、およびＥ４モジュールエントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌを使用して実施した。上記反応を室温で一晩行い、翌日に、ＮＥＢ１０−β細胞に形質転換した。クローン１６個が成長し、それをＥｃｏＲＶ消化によってスクリーニングするために調製した。クローン１６個のうち２個が正確な制限消化パターンを示した（星印、クローン４および８）。「Ｌ」はＤＮＡラダーである。「（−）」は、陰性対照の、自己消化した上記コアの二重ＤＥＳＴベクターである。「（＋）」は、陽性対照の、消化した完全なＡｄ５ゲノムである。Ｂ）Ｅ１エントリーベクターの量が増加することにより、Ａｄｓｅｍｂｌｙの効率が改善される。Ａｄ５に対するＡｄｓｅｍｂｌｙ反応を、上記コアの二重ＤＥＳＴベクター２０ｆｍｏｌ、Ｅ１モジュールエントリーベクター５０ｆｍｏｌおよびＥ３モジュールエントリーベクター、およびＥ４モジュールエントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌを使用して実施した。上記反応を室温で一晩行い、翌日に、ＮＥＢ１０−β細胞に導入し、形質転換した。クローン１０個が成長し、それをＥｃｏＲＶ消化によってスクリーニングするために調製した。クローン１０個のうち７個が正確な制限消化パターン（赤色の星印）を示した。「Ｌ」はＤＮＡラダーである。「（−）」は、陰性対照の、消化されたＡｄ５のＥ２−Ｅ４ベクターである。「（＋）」は、陽性対照の、消化された完全なＡｄ５ゲノムである。
【図２５】図２５は、ヒトＡｄ５についてのＡｄＳｌｉｃＲの方法を示す。Ａｄｓｅｍｂｌｙのために創製したＥ２−Ｌ３コアモジュールで開始し、上記ベクターをＳｗａＩ消化によって線形化する。次いで、上記Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールを、ＳＬＩＣを用いて上記ベクターに挿入する。その後ＰａｃＩを用いてそのベクターを線形化した後、上記Ｅ１モジュールをＳＬＩＣによって挿入し、完全なゲノムを創製する。
【図２６】図２６は、ヒトＡｄ５のＡｄＳｌｉｃＲ法における効率を示す。コロニーＰＣＲを、第１選択のスクリーニングとして用い、その後にＰＣＲ陽性クローンを制限消化する。
【図２７】図２７は、Ａｄｓｅｍｂｌｙされた（Ａｄｓｅｍｂｌｅｄ）ウイルスの、組織培養での成長を示す。Ａ）Ａｄｓｅｍｂｌｙにより構築された複製性アデノウイルスによって生成したプラークである。Ａｄｓｅｍｂｌｙされたゲノムを２９３細胞にトランスフェクトし、７日目までに明らかなプラークが現れた。Ｂ）ＡｄｓｅｍｂｌｙされたＡｄ５の継代および成長の継続。ＡｄｓｅｍｂｌｙされたＡｄ５のトランスフェクションからの全てのウイルスを収集し、新鮮な２９３細胞に再播種した。プレート全体にわたる明白な細胞変性効果が３日目までに明らかであった。
【図２８】図２８は、２９３細胞において成長させるとＡｄｓｅｍｂｌｙされたＡｄ５の力価がほんのわずかに低下することを示す。２９３細胞に、ａｔｔＢ挿入を有さないか、または４種のａｔｔＢそれぞれの挿入を個々に有するかのいずれかの、野生型Ａｄ５、ＡｄｓｅｍｂｌｙされたＡｄ５、またはＡｄＳＬＩＣ  Ａｄ５のうちのいずれかをＭＯＩ＝１０で感染させた。４８時間後に全てのウイルスを収集し、ＥＬＩＳＡによって力価を決定した。任意の欠損を示すウイルスのみが、Ａｄｓｅｍｂｌｙされたウイルスおよび、上記ａｔｔＢ３の挿入のみを含有するＡｄＳＬＩＣウイルスである。どちらも、野生型レベルと比較して、２分の１の適度な減少を示す。これらのデータにより、ＡｄＳＬＩＣを用いて創製されたウイルスが２９３細胞において複製欠損を有さないことも実証されている。全てのウイルスについてのインプットレベルについて力価を決定し、それは、ほぼ１×１０７ＩＵ／ｍＬであった（示されていない）。
【図２９Ａ】図２９Ａは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙのエントリーベクターライブラリー内のベクターを示す。上記モジュールが由来するＡｄ血清型が最初に列挙されており、次に上記ベクターへの任意の変化が列挙されている。変化させなかった場合、そのエントリーを「野生型」と称する。図２９Ｂは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣのためのマクロモジュールベクターを示す。上記マクロモジュールが由来するＡｄ血清型が最初に列挙されており、次にマクロモジュールを含むモジュール、次に上記ベクターへの任意の変化が列挙されている。変化がない場合、それを「野生型」と称する。図２９Ｃは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄＳＬＩＣを用いて構築されたアデノウイルスゲノムを示す。ゲノムが基づくＡｄ血清型が最初に列挙されており、次にウイルスへの任意の変化が列挙されている。変化がない場合、それを「野生型」と称する。
【図２９Ｂ】図２９Ａは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙのエントリーベクターライブラリー内のベクターを示す。上記モジュールが由来するＡｄ血清型が最初に列挙されており、次に上記ベクターへの任意の変化が列挙されている。変化させなかった場合、そのエントリーを「野生型」と称する。図２９Ｂは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣのためのマクロモジュールベクターを示す。上記マクロモジュールが由来するＡｄ血清型が最初に列挙されており、次にマクロモジュールを含むモジュール、次に上記ベクターへの任意の変化が列挙されている。変化がない場合、それを「野生型」と称する。図２９Ｃは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄＳＬＩＣを用いて構築されたアデノウイルスゲノムを示す。ゲノムが基づくＡｄ血清型が最初に列挙されており、次にウイルスへの任意の変化が列挙されている。変化がない場合、それを「野生型」と称する。
【図２９Ｃ】図２９Ａは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙのエントリーベクターライブラリー内のベクターを示す。上記モジュールが由来するＡｄ血清型が最初に列挙されており、次に上記ベクターへの任意の変化が列挙されている。変化させなかった場合、そのエントリーを「野生型」と称する。図２９Ｂは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣのためのマクロモジュールベクターを示す。上記マクロモジュールが由来するＡｄ血清型が最初に列挙されており、次にマクロモジュールを含むモジュール、次に上記ベクターへの任意の変化が列挙されている。変化がない場合、それを「野生型」と称する。図２９Ｃは、本明細書に記載のＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄＳＬＩＣを用いて構築されたアデノウイルスゲノムを示す。ゲノムが基づくＡｄ血清型が最初に列挙されており、次にウイルスへの任意の変化が列挙されている。変化がない場合、それを「野生型」と称する。
【図３０】図３０は、ＳＬＩＣを用いたプラスミドへのゲノム全体の挿入を示す。Ａ）その手順の概略であり、それにより、ＰＣＲによって、挿入されるウイルスゲノムの末端に対して相同性のある短部（約２０ｂｐ）を含有するプラスミドベクターが得られる。次いで、上記ゲノムおよびベクターの両方をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳＬＩＣにおいて標準として使用する。Ｂ）プラスミド骨格へのＡｄ５ゲノム全体の挿入の例である。スクリーニングした６つのクローン全てが上記ゲノム全体を含有した。上記ゲノムは順方向または逆方向で挿入され得るが、この場合、４つ（クローン１、４、５、および６）が1つの配向であり、２つ（クローン２および３）が別の配向であった。
【図３１】図３１は、アデノウイルスゲノムを改変する方法を例示している。
【図３２】図３２は、アデノウイルスゲノムを改変する方法を例示している。
【図３３】図３３は、アデノウイルスゲノムを改変する方法を例示している。
【図３４】図３４の上のパネルは、ＡｄＳＬＩＣｒ系を用いた非ヒトアデノウイルスであるマウスアデノウイルス１型（配列番号１０４）のゲノムの構築の例を示す。Ｅ１モジュールプラスミド、Ｅ３線維モジュールプラスミド、およびＥ４モジュールプラスミドを、制限酵素を用いてそれらを切除することができ、線形化された（ＳｗａＩまたはＰｍｅＩのいずれかを用いて）コアベクターへの、配列およびライゲーション非依存的クローニング（ＳＬＩＣ）のために必要な正確なオーバーハングが残るように設計する。これにより、ＳＬＩＣために必要な線状断片を得るためのＰＣＲの必要がなくなり、したがって、誤差が導入される潜在性が消える。これはまた、最終のゲノム構築物に外来配列が挿入されないようにも設計される。典型的な方法は、上記Ｅ３線維モジュールおよびＥ４モジュールを切り取り、ＰｍｅＩにより線形化された上記コアベクターを組み合わせることを伴う。これにより、ＳｗａＩで切断し、切り取られたＥ１モジュールと組み合わせて完全なゲノムを創製することができるＥ２−Ｅ４マクロモジュールを創製する。下のパネルは、上記の戦略を用いて野生型マウスアデノウイルス１型を構築し、マウス３Ｔ６細胞をトランスフェクトした後にプラークを形成している感染性ウイルスが得られたことを示す。
【図３５】図３５は、成長を妨げる挿入部位を同定するための、単一のａｔｔＢ組換え部位の挿入を含有するウイルスの成長分析を示す。Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて創製されたウイルスは、野生型ウイルスと比較してわずかな成長欠陥を有したので（図２８）、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて創製されたウイルスに存在するａｔｔＢの挿入の各々のうちの１つのみを含有するように、ＡｄＳＬＩＣを用いて、ウイルスを創製した。２９３細胞（上のグラフ）に、ＭＯＩ＝１０で感染させた。Ｕ２ＯＳ細胞（下のグラフ）に、ＭＯＩ＝５０で感染させた。全てのウイルスを４８時間後に収集し、力価を決定した。モジュール［Ｌ３］と［Ｅ３］の間へのａｔｔＢ５の挿入によって、野生型ウイルスと比較してＵ２ＯＳ細胞における成長は妨げられなかったが、他の３つの接合部におけるａｔｔＢ挿入では野生型と比較して成長が阻害された。
【図３６】図３６は、上記Ｅ１モジュールとＥ２−Ｌ２モジュールの間の最初のａｔｔＢ４の挿入部位により成長欠陥が生じたので（図３５）、選択できる代替の配置を設計したことを示す。塩基対の位置は、配列番号１３７に記載の位置を指す。
【図３７】図３７は、上記Ｅ３モジュールとＥ４モジュールの間の最初のａｔｔＢ３の挿入部位により成長欠陥が生じたので（図３５）、代替の配置を設計したことを示す。塩基対の位置は、配列番号１３７に記載の位置を指す。
【図３８】図３８は、Ｕ２ＯＳ細胞に、ウイルスをＭＯＩ＝５０で感染させ、４８時間後に全てのウイルスを採取し、力価を決定したことを示す。Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて創製された３種のウイルスを野生型ウイルスと比較する。代替のａｔｔＢ部位の挿入（黒色のひし形および三角形）を含有するウイルスは、元のａｔｔＢ部位の配置（黒色のＸ）と比較して成長が改善された。これらのウイルスは全て、上記Ｌ２モジュールとＬ３モジュールの間に位置するａｔｔＢ部位を欠き、成長に影響を及ぼさない上記Ｌ３モジュールとＥ３モジュールの間のａｔｔＢの挿入を含有する。
【図３９】図３９は、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、導入遺伝子が上記Ｅ１モジュールから発現されるウイルスを創製できることを示す。この場合、Ａｄ５のＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子を、上記Ｅ１モジュール内のＧＦＰ発現カセットで置き換えた。ウイルスを、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて構築し、生存可能なＧＦＰ発現ウイルスを得た。
【図４０】図４０は、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、導入遺伝子がＥ３モジュールから天然のウイルス転写構築様式を用いて発現されるウイルスを創製することができることを示す。上記Ｅ３モジュールを改変して１１．６Ｋのタンパク質（Ａｄ５ヌクレオチド、２９４９１〜２９７７２）を欠失させ、その代わりにｍＣｈｅｒｒｙを入れた。次いで、Ｅ３転写物を自然にスプライシングさせてｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子およびｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現させる。Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて上記ウイルスを創製し、Ｕ２ＯＳ細胞の形質導入が示される。これは、１）上記Ｅ３モジュールからの導入遺伝子の発現、および２）外来遺伝子を発現させるための、天然のウイルス転写構築様式の使用の例である。
【図４１】図４１は、上記Ｅ４モジュールから複数の導入遺伝子を発現させるための、ネイティブなウイルス転写構築様式の使用を示す。上記ネイティブなＥ４プロモーターをＣＭＶプロモーターで置き換え、３種のネイティブなＥ４遺伝子を導入遺伝子で置き換えた。次いで、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、ウイルスを創製した。塩基対の位置は、配列番号１３７に記載の位置を指す。
【図４２】図４２は、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、複数の導入遺伝子が上記Ｅ４モジュールからネイティブなウイルス転写構築様式を用いて発現されるウイルスを創製することができることを示す。図４１で創製されたウイルスを２４時間にわたってＵ２ＯＳ細胞に形質導入し、全ＲＮＡを収集し、ランダムプライミングを用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを実施して、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子へのスプライシングについて試験した。黒色の矢印は、ＧＦＰを発現する、スプライシングされていない転写物を示す。白色の矢印は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する、スプライシングされた転写物を示す。これにより、単一のモジュールから複数の外来遺伝子を発現させることができることが実証されている。レーン１および２は陰性対照であり、それぞれ、形質導入されていない細胞または野生型Ａｄ５を感染させた細胞である。
【図４３】図４３は、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いた、単一のゲノムの構築における複数のモジュールにわたる複数の種類の変化の組み入れを示す。図は、Ａｄ５ゲノムの５種のモジュールを示し、垂直方向の矢印は、完全なゲノムを構築する前に各モジュールに対して行った変更を示している。上記Ｅ１モジュールをルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合タンパク質のための導入遺伝子発現カセットに変換した。上記Ｌ３モジュール内のヘキソンタンパク質について、Ｇｌｕ４５１を点変異によってＧｌｎに変化させた。上記Ｅ３モジュール内のネイティブなＡｄ５線維の一部を、他のヒトアデノウイルス血清型由来のいくつかの線維部分のうちの１つで置き換えた。Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、それぞれが代替の線維タンパク質を有する６種のウイルスを創製した。Ａｄ５に関して列挙されている塩基対の位置は、配列番号１３７に記載の位置を指す。受託番号ＤＱ０８６４６６、ＡＪ８５４４８６、ＢＫ００１４５３、ＮＣ＿００１４６０、およびＡＹ＿７３７７９７は、それぞれ配列番号１３９〜１４３に対応する。
【図４４】図４４は、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて創製された線維キメラウイルスのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）における形質導入能が、普通のＡｄ５線維と比較して改善されていることを示す。ヒトＥＳＣに、２４時間または４８時間にわたって種々のＭＯＩで形質導入し、ＧＦＰの発現を顕微鏡法によって測定した。一番上のパネルは、ウイルスなしの陰性対照である。２番目のパネルはＣＭＶプロモーターの下でＧＦＰを発現する「Ａｄ５  ＣＭＶ−ＧＦＰ」である。左側に、試験したウイルスの線維キメラが示されている（すなわち、Ａｄ５／３は、Ａｄ３線維ノブを有するＡｄ５である）。画像は全て５倍の倍率で取得する。
【図４５】図４５は、アデノウイルス血清型間でコアモジュールを交換することにより、生存可能なウイルスが産生されることを示す。Ａｄ１１由来のコアモジュールを創製した。Ａｄ５のＥ１モジュールおよびＥ３モジュールを、それぞれＡｄ１１のｐＩＸおよびＵエキソン（Ｕｅｘｏｎ）線維を保有するように改変した。ＡｄＳＬＩＣを用いてウイルス全体を構築し、ウイルスを２９３細胞において再構成させた。「最終のウイルス」一覧に示されている塩基対の位置は、配列番号１３７（Ａｄ５）および配列番号１４１（Ａｄ１１）に記載のもの由来である。
【図４６】図４６は、ウイルス感染に関する機能を試験するためにウイルス遺伝子に変異を生じさせるためのＡｄＳＬＩＣの使用を示す。上記Ｅ１モジュールにおいて、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の２６０位におけるＨｉｓをＡｌａに変異させた。他のモジュールは全て野生型であった。このウイルスは、ＡｄＳＬＩＣを用いて構築した。ヒト小気道（ｓｍａｌｌ  ａｉｒｗａｙ）上皮細胞に、複製欠損Ａｄ５（レーン１）、野生型Ａｄ５（レーン２）、またはＡｄ５  Ｈ２６０Ａ（レーン３）のいずれかをＭＯＩ＝１０で感染させた。感染の３６時間後に総タンパク質を収集し、ウエスタンブロットにより、ｐ５３（一番上のパネル）、ｍｄｍ２、Ａｄ５後期タンパク質、およびアクチンについて分析した。野生型Ａｄ５とは異なり、Ａｄ５−Ｈ２６０Ａウイルスはｐ５３を分解することができず、また後期タンパク質産生の欠損を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマー、ならびにその相補物を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含有する核酸、合成核酸、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、参照核酸と同様の結合特性を有する核酸、および参照ヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００１２】
別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列だけでなく、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Batzerら、Nucleic  Acid  Res.  １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ohtsukaら、J.  Biol.  Chem.  ２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Rossoliniら、Mol.  Cell.  Probes  ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００１３】
特定の核酸配列は、「スプライスバリアント」も暗黙のうちに包含する。同様に、核酸にコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントにコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライスバリアント」は、その名称が示すように、遺伝子の代替スプライシングの産物である。転写後に、最初の核酸転写物は、異なる（代替の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされ得る。スプライスバリアントが産生される機構は変動するが、エキソンの代替スプライシングを含む。その同じ核酸から、読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写によって生じる代替のポリペプチドもこの定義に包含される。この定義には、上記スプライス産物の組換え型を含めたスプライシング反応の任意の産物が含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの例がLeicherら、J.  Biol.  Chem.  ２７３巻（５２号）：３５０９５〜３５１０１頁（１９９８年）において考察されている。
【００１４】
所望の治療的な遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、当技術分野においてよく理解されている標準のライゲーション技法および制限技法を用いることができる（Maniatisら、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York（１９８２年）を参照されたい）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断すること、調整すること、および再ライゲーションすることができる。
【００１５】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが、翻訳が容易になるように位置している場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、また、分泌リーダーの場合では、近接しており、読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施に従って使用する。
【００１６】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記の初期状態のパラメータで用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照されたい）によって測定したところ、同じである２つ以上の配列またはサブシーケンス、または同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（すなわち、比較ウィンドウまたは示された領域にわたり最大の対応について比較しアラインメントした場合、特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）を有する２つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。そのような配列はそこで「実質的に同一」といわれる。この定義は、試験配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）も指す、またはそれに適用することができる。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も包含する。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することが好ましい、または５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することがより好ましい。
【００１７】
配列比較のために、一般には、１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期状態のプログラムパラメータを使用することができる、あるいは、代替のパラメータを指定することができることが好ましい。次いで上記配列比較アルゴリズムにより、上記プログラムパラメータに基づいて、上記参照配列と比較した上記試験配列についてのパーセント配列同一性が算出される。
【００１８】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、配列を、同じ数の連続した位置の参照配列と、その２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、２０から６００まで、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のうちの任意の１つのセグメントを参照することを含む。比較するために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較するための最適な配列のアラインメントは、例えば、Smith  &  Waterman、Adv.  Appl.  Math.  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Needleman  &  Wunsch、J.  Mol.  Biol.  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson  &  Lipman、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、１９９５年、追補）を参照されたい）によって行うことができる。
【００１９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschulら、Nuc.  Acids  Res.  ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびAltschulら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を使用する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で公知の通り、National  Center  for  Biotechnology  Informationを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした際にいくらかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかの、クエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Altschulら、上記）。これらの最初の近傍ワードヒット（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）は、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種としての機能を果たす。累積アラインメントスコアが増加し得る限りは上記ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（残基の一致する対についてのリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して上記累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、上記累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘまで低下するとき；上記累積スコアが、１つまたは複数のネガティブスコアリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントが蓄積したことによってゼロ以下になるとき；または、いずれかの配列の末端に到達するときに停止する。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、上記アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、初期状態としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、初期状態としてワード長３、および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff  &  Henikoff、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【００２０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。
【００２１】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに上記天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００２２】
アミノ酸は、本明細書ではそれらの一般に公知の３文字記号によってまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号のいずれかによって称することができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードによって称することができる。
【００２３】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントとは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または上記核酸が基本的に同一の配列に対するアミノ酸配列をコードしない場合の核酸を指す。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記コドンを、記載されているその対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。本明細書におけるポリペプチドをコードする核酸配列の全ても同様に、上記核酸の可能性のあるサイレント変異の全てを説明する。核酸の各コドン（普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を改変して機能的に同一の分子をもたらすことができることは、当業者には理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれに、発現産物に関しては、潜在的に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては、そうではない。
【００２４】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における単一のアミノ酸または低百分率のアミノ酸を変化させる、付加するまたは欠失させる核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変更によりアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸で置換される「保存的に修飾されたバリアント」であることが当業者には理解される。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存置換の表は当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、それを排除するものではない。
【００２５】
以下の８群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton、Proteins（１９８４年）を参照されたい）。
【００２６】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、その細胞、ウイルス、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入またはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって改変されていること、またはその細胞が、そのように改変された細胞に由来する細胞であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞においては見いだされない遺伝子を発現する、または別の方法で異常に発現される、低発現である、もしくは全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
【００２７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブが、一般には核酸の複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅ）中のその標的サブシーケンスとハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な手引きは、Tijssen、Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology--Hybridization  with  Nucleic  Probes、「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  assays」（１９９３年）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度、ｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択する。上記Ｔｍは、上記標的と相補的な上記プローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、上記プローブの５０％が平衡状態で占有される）でその標的配列とハイブリダイズする温度（定義済みのイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現することもできる。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であることが好ましい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであってよい：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベートすること、または、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃で洗浄すること。
【００２８】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、それでも実質的に同一である。これは、例えば、上記遺伝暗号により許容される最大のコドンの縮重を用いて核酸のコピーを創製する場合に生じる。そのような場合では、上記核酸は、一般には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄が挙げられる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。同様のストリンジェンシーの条件をもたらすために代替のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用することができることは、当業者には容易に理解される。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するための追加の手引きは多数の参照、例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら編、John  Wiley  &  Sonsにおいて提供される。
【００２９】
ＰＣＲに関して、低ストリンジェンシーの増幅のためには約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃から４８℃の間で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅のためには、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、上記プライマーの長さおよび特異性に応じて約５０℃から約６５℃までの範囲であり得る。高ストリンジェンシーの増幅および低ストリンジェンシーの増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間続くアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間にわたる伸長相を含む。低ストリンジェンシーの増幅反応および高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび手引きは、例えば、Innisら（１９９０年）PCR  Protocols、A  Guide  to  Methods  and  Applications、Academic  Press,  Inc.  N.Y.）において提供される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、癌腫および肉腫を含めた、哺乳動物に見いだされる全種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、頭頸部がん、肝がん、腎がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がんおよび髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ（insulanoma）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前癌皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮体がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺および膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺がんが挙げられる。
【００３１】
「白血病」という用語は、広範には造血臓器の進行性の悪性疾患を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の増殖および発生の変形を特徴とする。白血病は、一般に、（１）疾患の持続時間および特性−急性または慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄系（ｍｙｅｌｏｉｄ）（骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））、リンパ系（リンパ性）、または単球性；および（３）血液中の異常な細胞の数が増加するか増加しないか−白血病性または無白血病性（亜白血病性）に基づいて臨床的に分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗白血病活性を予測するものとして広範に認められている。Ｐ３８８アッセイにおいて試験陽性の化合物は、一般に、処置されている白血病の種類にかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏでいくらかのレベルの抗白血病活性を示すと考えられている。したがって、本発明は、白血病を処置する方法、および好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好酸球性白血病、グロス白血病（Ｇｒｏｓｓ’  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、有毛細胞白血病、血球母細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球性白血病（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Ｎａｅｇｅｌｉ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ’ｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）を処置する方法を包含する。
【００３２】
「肉腫」という用語は、概して、胚の結合組織のような物質でできている腫瘍を指し、一般に、線維状物質または均一な物質に埋め込まれた密に固まった（ｐａｃｋｅｄ）細胞で構成される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎生期肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫（Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ  ｓａｒｃｏｍａ）、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫（ｆａｓｃｉａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、線維芽細胞肉腫（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、Ｂ細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫（Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫（Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、傍骨性肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、網状赤血球肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、ラウス肉腫、漿液嚢腫性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられる。
【００３３】
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる黒色腫としては、例えば、末端部黒子黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫（Ｃｌｏｕｄｍａｎ’ｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫（subungal  melanoma）、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
【００３４】
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある、上皮細胞でできている悪性の新しい成長物を指す。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる例示的な癌腫としては、例えば、細葉癌腫（ａｃｉｎａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細葉状癌腫（ａｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、細気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、体癌腫（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌腫（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、鎧状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｎ  ｃｕｉｒａｓｓｅ）、皮膚癌腫、円柱状癌腫（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｕｒｕｍ）、胎生期癌腫、脳様癌腫、類表皮癌腫（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮腺様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ  ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性癌腫（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｘ  ｕｌｃｅｒｅ）、線維性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、ゼラチン状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌腫（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫（ｈａｉｒ−ｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血液様癌腫（ｈｅｍａｔｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳児胎生期癌腫（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペシェール癌腫（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌腫（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ上皮癌（ｌｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫、モール癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫、粘液分泌性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘液性類表皮癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌腫、粘液腫性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽腔癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌腫（ｏｓｔｅｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌腫、門脈周囲性癌腫（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前浸潤癌、有棘細胞癌（ｐｒｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粥状癌腫（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫（ｒｅｓｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａｔｏｄｅｓ）、シュナイダー癌（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫（ｓｏｌａｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌腫（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌腫（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、および絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
【００３５】
「治療有効用量または量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ  ｏｒ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書では、それが投与されるものに効果を生じる用量を意味する。その正確な用量および処方は処置の目的に依存し、当業者は公知の技法を使用して確かめることができる（例えば、Lieberman、Pharmaceutical  Dosage  Forms（１〜３巻、１９９２年）；Lloyd、The  Art,  Science  and  Technology  of  Pharmaceutical  Compounding（１９９９年）；Remington：The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版、Gennaro編（２００３年）、およびPickar、Dosage  Calculations（１９９９年）を参照されたい）。
【００３６】
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書に記載の化合物に見いだされる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味するする。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を十分な量の所望の塩基と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、またはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を、十分な量の所望の酸と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、硫酸、一水素硫酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する酸付加塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸（ｐ−ｔｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸、酒石酸、およびメタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギン酸塩（arginate）などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（galactunoric）のような有機酸の塩も包含される（例えば、Bergeら、Journal  of  Pharmaceutical  Science  ６６巻：１〜１９頁（１９７７年）を参照されたい）。ある特定の本発明の化合物は、その化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性および酸性の官能基を含有する。当業者に公知の他の薬学的に許容されるキャリアは、本発明に適している。
【００３７】
詳細な実施形態
Ｉ．Ａｄｓｅｍｂｌｙ法
一態様では、組換えアデノウイルスを作製するための方法（本明細書では「Ａｄｓｅｍｂｌｙ」とも称される）が提供される。当該方法は、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュール（または下記のその変異体）から選択される２種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュールまたはアデノウイルスマクロモジュールから選択される３種、４種または５種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。上記核酸は、アデノウイルスゲノム構築物であってよい。アデノウイルスゲノム構築物は、発現されると（例えば、哺乳動物の細胞に導入されると）、組換えアデノウイルスを形成することができる核酸である。上記核酸は、追加的なウイルス（例えば、ヘルパーウイルス）と一緒に、発現されると（例えば、哺乳動物の細胞に導入されると）組換えアデノウイルスを形成することができる部分的なアデノウイルスゲノム構築物であってもよい。そのように形成されたアデノウイルスは、複製し、パッケージングして後代ウイルスを生じさせることができる。したがって、本明細書において提供される方法は、単独で、補完的細胞系中で、またはヘルパーウイルスと一緒に、のいずれかで哺乳動物の細胞にトランスフェクションすると、複製され、パッケージングされて後代ウイルスを生じさせる２つ以上のゲノムのモジュールまたは異種性エレメントから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアデノウイルスゲノムを構築するステップを含むことができる。ゲノムのモジュールは、進化的に保存された配列、転写単位または機能単位に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、およびＥ４モジュールから選択される３種以上のアデノウイルス遺伝子のモジュールから核酸を構築するステップを含む。生じた核酸（本明細書では「構築された核酸」とも称される）は、構築した後に発現させ（例えば、複製、転写、翻訳、およびパッケージング）、それにより、組換えアデノウイルスを形成することができる。上記核酸の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｉｎ  ｓｉｔｕで、細胞内で（例えば、上記核酸を細胞にトランスフェクトすることによって）、またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。ある特定の実施形態では、その発現を細胞内で実施し、それにより、ウイルスの産生を導く。
【００３８】
「アデノウイルス遺伝子モジュール」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュールまたはそのマクロモジュールを指す。したがって、アデノウイルス遺伝子モジュールは核酸（例えば、ＤＮＡ）である。「個々のアデノウイルス遺伝子モジュール」とは、本明細書で使用される場合、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、またはＥ４モジュールを指す。いくつかの実施形態では、個々のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を、上記核酸を構築する前に、より小さなサブモジュールから構築することができる。アデノウイルスマクロモジュールは、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュールのうちの２種、３種または４種の組み合わせである。したがって、上記マクロモジュールは、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュールのうちの２種、３種または４種を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）の線状の鎖である。「アデノウイルスマクロモジュール」という用語は、本明細書で使用される場合、
Ｅ１−Ｌ２マクロモジュール（すなわち、Ｅ１モジュールおよびＥ２−Ｌ２モジュールを組み合わせて含む核酸）；
Ｅ１−Ｌ４マクロモジュール（すなわち、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュールおよびＬ３−Ｌ４モジュールを組み合わせて含む核酸）；
Ｅ１−Ｅ３マクロモジュール（すなわち、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュールおよびＥ３モジュールを組み合わせて含む核酸）；
Ｅ２−Ｌ４マクロモジュール（すなわち、Ｅ２−Ｌ２モジュールおよびＬ３−Ｌ４モジュールを含む核酸、本明細書では「コアマクロモジュール」とも称される）；
Ｅ２−Ｅ３マクロモジュール（すなわち、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュールおよびＥ３モジュールを組み合わせて含む核酸）；
Ｅ２−Ｅ４マクロモジュール（すなわち、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールを組み合わせて含む核酸）；
Ｌ３−Ｅ３マクロモジュール（すなわち、Ｌ３−Ｌ４モジュール、およびＥ３モジュールを組み合わせて含む核酸）
Ｌ３−Ｅ４マクロモジュール（すなわち、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールを組み合わせて含む核酸）；および
Ｅ３−Ｅ４マクロモジュール（すなわち、Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールを組み合わせて含む核酸）
を指す。
いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスマクロモジュールは、Ｅ２−Ｌ４マクロモジュール（すなわち、コアマクロモジュール）またはＥ３−Ｅ４マクロモジュールである。あるアデノウイルスマクロモジュールを、上記核酸を構築するための２種以上の選択されたアデノウイルスのモジュールの１つとして使用する場合、他の選択されたアデノウイルスのモジュール（複数可）は、そのアデノウイルスマクロモジュール内に含有される個々のアデノウイルス遺伝子モジュールではない。言い換えれば、個々のアデノウイルス遺伝子モジュールは各々、別々であろうと、マクロモジュール内であろうと、構築される核酸内に１回のみ存在する。例えば、上記核酸を構築するための２種以上の選択されたアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種がコアマクロモジュールである場合、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールもＬ３−Ｌ４モジュールも、構築される核酸に含まれるための別のモジュールとして選択されない。同様に、３種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールを選択する場合、そのアデノウイルスマクロモジュールは、Ｅ１−Ｅ３マクロモジュールでもＥ２−Ｅ４マクロモジュールでもない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、上記方法は、（ｉ）Ｅ１モジュール、（ｉｉ）コアマクロモジュール、および（ｉｉｉ）Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュールまたはＥ３−Ｅ４マクロモジュールから選択される３種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。当該方法は、Ｅ１モジュール、コアマクロモジュール、Ｅ３モジュール、およびＥ４モジュールから選択される４種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む場合もある。
【００４０】
いくつかの実施形態では、上記核酸を構築する前に、１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを組み合わせてマクロモジュールを形成することができる。マクロモジュールを形成する場合、その方法は、マクロモジュールおよびそのマクロモジュールに含まれない１種または複数種の個々のアデノウイルス遺伝子モジュール（すなわち、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、および／またはＥ４モジュール）から上記核酸を構築するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記マクロモジュールはコアマクロモジュールである。したがって、いくつかの実施形態では、上記方法は、上記コアマクロモジュールおよび上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ３モジュール、または上記Ｅ４モジュールから選択される１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを使用して上記核酸を構築するステップを含む。
【００４１】
アデノウイルスは、核内で複製する、エンベロープを有さない正二十面体のウイルスである。本明細書において提供されるアデノウイルス遺伝子モジュールは、例えば、Davisonら、Journal  of  General  Virology（２００３年）、８４巻、２８６９５〜２９３８頁に記載のアデノウイルスゲノムのある特定の位置を指す。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールはヒトアデノウイルスに由来する。図５は、本明細書において提供されるアデノウイルス遺伝子モジュール、ならびに、それらのキロベース（ｋｂ）単位のおおよそのサイズを示すヒトＡｄ５の簡単なマップである。各モジュールは、複数の遺伝子産物および代替の遺伝子スプライシング配置をコードし得る。
【００４２】
「Ｅ１モジュール」とは、本明細書で使用される場合、アデノウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有する核酸である。上記Ｅ１モジュールは、構築された上記核酸のタンパク質コード領域に作動可能に連結し得るプロモーターをさらに含んでよい。上記Ｅ１モジュールは、一般には、アデノウイルスのＥ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域に由来する。上記ＩＴＲ領域に加えて、上記Ｅ１モジュールは、アデノウイルスゲノムのＥ１末端から上記ウイルスのポリメラーゼコード領域までに見いだされるウイルス遺伝子のいずれかも含んでよい（以下で考察する）。例えば、上記Ｅ１モジュールは、主要な転写活性化因子であるＥ１Ａ（例えば、ｐＲＢファミリーの不活性化因子をコードする）、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（例えば、アポトーシス遮断因子をコードする）、Ｅ１Ｂ５５Ｋ（例えば、ｐ５３結合性エクスポーター、ｍｒｅ結合性エクスポーターおよびウイルスｍＲＮＡエクスポーター）および／またはｐＩＸ（例えば、少数の（ｍｉｎｏｒ）構造タンパク質およびウイルスカプシド上でヘキソンと相互作用するタンパク質をコードする）のコード領域をさらに含んでよい。上記Ｅ１モジュールの長さはおよそ４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂまたは１ｋｂであり得る。いくつかの実施形態では、上記Ｅ１モジュールは天然に見いだされるアデノウイルスのＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域とほぼ同じサイズの長さである（例えば、図５参照）。
【００４３】
「Ｅ２−Ｌ２」モジュールとは、本明細書で使用される場合、ウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域およびヘキソンタンパク質コード領域のうちの少なくとも１つを含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールは、ウイルスＤＮＡ−結合タンパク質コード領域も含む。上記Ｅ２−Ｌ２モジュールは、一般には、上記アデノウイルスのＥ２Ｂ領域、Ｌ１領域および／またはＬ２領域に由来する。上記Ｅ２−Ｌ２モジュールは、Ｅ２Ｂ  ＩＶａ２（例えば、後期転写アクチベーターおよびウイルスカプシドへのウイルスＤＮＡのパッケージングを補助するタンパク質）、Ｅ２Ｂ  Ｐｏｌ（例えば、ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする）、Ｅ２Ｂ  ｐＴＰ（例えば、ウイルスゲノムの末端に結合し、ウイルスの複製およびパッケージングに必要な末端タンパク質をコードする）、Ｌ１  ５２Ｋ（例えば、カプシドへのウイルスＤＮＡのパッケージングに必要なタンパク質をコードする）、Ｌ１ＩＩＩａ（例えば、上記カプシドの安定化を補助する少数の構造タンパク質をコードする）、Ｌ２ＩＩＩ（ペントン）（例えば、上記線維が突出するカプシドの頂点を形成する主要な構造タンパク質をコードする）、Ｌ２ｐＶＩＩ（例えば、ヒストンＨ３との相同性を有し、上記カプシド内のウイルスＤＮＡと会合するコア構造タンパク質をコードする）、Ｌ２Ｖ（例えば、上記ＤＮＡとウイルスカプシドの間の会合を形成するコア構造タンパク質をコードする）、およびＬ２ｐＸ（例えば、上記ウイルスゲノムに結合し、それを凝縮するコア構造タンパク質をコードする）のコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールは、天然に見いだされるアデノウイルスのＥ２Ｂ領域、Ｌ１領域およびＬ２領域とほぼ同じサイズの長さである（例えば、図５参照）。
【００４４】
「Ｌ３−Ｌ４」モジュールとは、本明細書で使用される場合、ウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域およびヘキソンタンパク質コード領域の少なくとも１つを含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記Ｌ３−Ｌ４モジュールは、ウイルスＤＮＡ−結合タンパク質コード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールがウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域を含有する場合、上記Ｌ３−Ｌ４はウイルスＤＮＡコード領域を含有せず、その逆もまた同じである。同様に、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールがヘキソンタンパク質コード領域を含有する場合、上記Ｌ３−Ｌ４は、ヘキソンタンパク質コード領域を含有しなくてよく、その逆もまた同じである。同様に、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールがウイルスＤＮＡ−結合タンパク質コード領域を含有する場合、上記Ｌ３−Ｌ４は、ウイルスＤＮＡ−結合タンパク質コード領域を含有しなくてよく、その逆もまた同じである。言い換えれば、上記ウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域、上記ヘキソンタンパク質コード領域、および上記ウイルスＤＮＡ−結合タンパク質コード領域は、一般には、構築されるその核酸内に１回のみ現れる。上記Ｌ３−Ｌ４モジュールは、Ｌ３ｐＶＩ（例えば、その頂点において上記カプシドと上記ウイルスゲノムＤＮＡの間の会合を形成する少数の構造タンパク質をコードする）、Ｌ３ＩＩ（ヘキソン）（例えば、上記カプシドの三角形の面を形成する主要な構造タンパク質をコードする）、Ｌ３  ２３Ｋ（例えば、ウイルスタンパク質を完全なカプシド集合体に加工するウイルスプロテアーゼをコードする）、Ｅ２Ａ  ＤＢＰ（例えば、ウイルスＤＮＡに結合し、複製を容易にするＤＮＡ結合タンパク質をコードする）、Ｌ４  １００Ｋ（例えば、細胞タンパク質合成を阻害し、ウイルスの後期タンパク質の翻訳を促進するタンパク質をコードする）、Ｌ４  ３３Ｋ（例えば、後期ウイルス遺伝子のスプライシングを促進するタンパク質をコードする）、１種または複数種の線維タンパク質、およびＬ４  ２２Ｋ（例えば、後期ウイルス遺伝子発現を促進し、ウイルスＤＮＡのパッケージングを補助するタンパク質をコードする）のコード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記Ｌ３−Ｌ４モジュールは天然に見いだされるアデノウイルスのＬ３領域、Ｅ２Ａ領域およびＬ４領域または天然に見いだされるアデノウイルスのＬ３領域、Ｅ２Ａ領域、Ｌ４領域およびＬ５領域とほぼ同じサイズの長さである（例えば、図５参照）。
【００４５】
「コアマクロモジュール」（本明細書では「Ｅ２−Ｌ４マクロモジュール」とも称される）とは、本明細書で使用される場合、ウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域およびヘキソンタンパク質コード領域の少なくとも１つを含有する核酸を指す。いくつかの実施形態では、上記コアマクロモジュールは、ウイルスＤＮＡ−結合タンパク質コード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記コアマクロモジュールは上記ウイルスの構造タンパク質の大部分ならびにＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なウイルスの構造タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、上記コアマクロモジュールは、ウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域、ヘキソンタンパク質コード領域およびウイルスＤＮＡポリメラーゼコード領域を含む。他の実施形態では、上記コアは、Ｌ３ｐＶＩ（例えば、その頂点において上記カプシドと上記ウイルスゲノムＤＮＡの間の会合を形成する少数の構造タンパク質をコードする）、Ｌ３ＩＩ（ヘキソン）（例えば、上記カプシドの三角形の面を形成する主要な構造タンパク質をコードする）、Ｌ３  ２３Ｋ（例えば、ウイルスタンパク質を完全なカプシド集合体に加工するウイルスプロテアーゼをコードする）、Ｅ２Ａ  ＤＢＰ（例えば、ウイルスＤＮＡに結合し、複製を容易にするＤＮＡ結合タンパク質をコードする）、Ｌ４  １００Ｋ（例えば、細胞タンパク質合成を阻害し、ウイルスの後期タンパク質の翻訳を促進するタンパク質をコードする）、Ｌ４  ３３Ｋ（例えば、後期ウイルス遺伝子のスプライシングを促進するタンパク質をコードする）、およびＬ４  ２２Ｋ（例えば、後期ウイルス遺伝子発現を促進し、ウイルスＤＮＡのパッケージングを補助するタンパク質をコードする）、Ｅ２Ｂ  ＩＶａ２（例えば、後期転写活性化因子およびウイルスＤＮＡの上記ウイルスカプシドへのパッケージングを補助するタンパク質をコードする）、Ｅ２Ｂ  Ｐｏｌ（例えば、ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする）、Ｅ２Ｂ  ｐＴＰ（例えば、ウイルスゲノムの末端に結合し、ウイルスの複製およびパッケージングに必要な末端タンパク質をコードする）、Ｌ１  ５２Ｋ（例えば、カプシドへのウイルスＤＮＡのパッケージングに必要なタンパク質をコードする）、Ｌ１ＩＩＩａ（例えば、上記カプシドの安定化を補助する少数の構造タンパク質をコードする）、Ｌ２ＩＩＩ（ペントン）（例えば、上記線維が突出する上記カプシドの頂点を形成する主要な構造タンパク質をコードする）、Ｌ２ｐＶＩＩ（例えば、ヒストンＨ３との相同性を有し、上記カプシド内のウイルスＤＮＡと会合するコア構造タンパク質をコードする）、Ｌ２Ｖ（例えば、ＤＮＡとウイルスカプシドの間の会合を形成するコア構造タンパク質をコードする）、１種または複数種の線維タンパク質、およびＬ２ｐＸ（例えば、上記ウイルスゲノムに結合し、それを凝縮するコア構造タンパク質をコードする）のコード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記Ｌ３−Ｌ４モジュールは、天然に見いだされるアデノウイルスのＥ２Ｂ領域、Ｌ１領域、Ｌ２領域、Ｌ３領域、Ｅ２Ａ領域およびＬ４領域または天然に見いだされるアデノウイルスのＥ２Ｂ領域、Ｌ１領域、Ｌ２領域、Ｌ３領域、Ｅ２Ａ領域、Ｌ４領域およびＬ５領域とほぼ同じサイズの長さである（例えば、図５参照）。
【００４６】
上記ウイルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号３２に記載のヒトＡｄ５  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸９９６〜１１０３の少なくとも５０個の連続したアミノ酸（例えば、全て）または別の種に由来するそのホモログと少なくとも４５％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の同一性を共有する配列を含有する（図７Ａ〜Ｃ）。上記ヘキソン遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号７３に記載のヒトＡｄ５ヘキソンのアミノ酸５０１〜７４７の少なくとも５０個の連続したアミノ酸（例えば、全て）または別の種に由来するそのホモログと少なくとも４５％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の同一性を共有する配列を含有する（図７Ｄ〜Ｇ）。上記ウイルスＤＮＡ−結合タンパク質遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号１０３に記載のヒトＡｄ５  ＤＮＡ−結合タンパク質のアミノ酸４０８〜４７５の少なくとも５０個の連続したアミノ酸（例えば、全て）または別の種に由来するそのホモログと少なくとも３５％（例えば、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の同一性を共有する配列を含有する（図７Ｈ〜Ｉ）。
【００４７】
「Ｅ４モジュール」とは、本明細書で使用される場合、アデノウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記Ｅ４は、１種または複数種の線維タンパク質のコード領域をさらに含む。上記Ｅ４モジュールは、Ｅ４ｏｒｆ６／７（例えば、ウイルス転写のＥ２Ｆトランス活性化を媒介するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ６（例えば、ウイルスのＤＮＡ合成を促進し、ウイルスの後期ｍＲＮＡを安定化し輸出し、スプライシングを促進するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ４（例えば、ウイルス転写およびスプライシングを制御し、ＰＰ２Ａを調節するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ３（例えば、ｐ５３−媒介性転写を遮断し、ＭＲＮ  ＤＮＡ−修復複合体を妨害し、コンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を防止するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ２、およびＥ４ｏｒｆ１（例えば、ＰＩ３キナーゼを通じたシグナル伝達を促進し、それにより、タンパク質合成および細胞生存を導くタンパク質をコードする）のコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記Ｅ４モジュールは、天然に見いだされるアデノウイルスのＥ４領域または天然に見いだされるアデノウイルスのＥ４領域およびＬ５領域とほぼ同じサイズの長さである（例えば、図５参照）。
【００４８】
「Ｅ３モジュール」とは、本明細書で使用される場合、１種または複数種の線維タンパク質のコード領域および／またはアデノウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記Ｅ３モジュールは、ｐＶＩＩＩのタンパク質コード領域の末端からそのゲノムの右側の末端に位置するＩＴＲまでの任意の公知のアデノウイルスの配列を含む（図５に示されている通り）。上記ｐＶＩＩＩコード領域は、配列番号１３５に記載のヒトＡｄ５ｐＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸６〜４３の少なくとも５０個の連続したアミノ酸（例えば、全て）と少なくとも３５％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の同一性を共有する配列を含有するタンパク質をコードする任意の遺伝子である（図７Ｊ）。上記Ｅ３モジュールは、Ｌ４ｐＶＩＩＩ（例えば、少数の構造タンパク質をコードする）Ｅ３  １２．５Ｋ、Ｅ３ＣＲ１α（例えば、アポトーシスをブロックするタンパク質をコードする）、Ｅ３ｇｐ１９Ｋ（例えば、ＭＨＣ−Ｉ抗原提示を阻害する免疫調節タンパク質をコードする）、Ｅ３ＡＤＰ（例えば、ウイルスを放出するために細胞を効率的に溶解する機能を果たすタンパク質をコードする）、Ｅ３ＲＩＤα（例えば、アポトーシス促進性のＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする）、Ｅ３ＲＩＤβ−（例えば、上記アポトーシス促進性のＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする）、Ｅ３  １４．７Ｋ（例えば、アポトーシスをブロックするタンパク質をコードする）、およびＬ５ＩＶ（線維）（例えば、ペントンベースから伸長し、受容体の結合性に関与する主要な構造タンパク質をコードする）のコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記Ｅ３モジュールは天然に見いだされるアデノウイルスのＥ３領域または天然に見いだされるアデノウイルスのＥ３領域およびＬ５領域とほぼ同じサイズの長さである（例えば、図５参照）。
【００４９】
「Ｅ３−Ｅ４マクロモジュール」とは、本明細書で使用される場合、アデノウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸である。Ｅ−３−Ｅ４マクロモジュールは、ｐＶＩＩＩのタンパク質コード領域の末端からゲノムの右側の末端に位置するＩＴＲまでの任意の公知のアデノウイルスの配列をさらに含んでよい（図５に示されている通り）。上記Ｅ３−Ｅ４マクロモジュールは、Ｅ４ｏｒｆ６／７（例えば、ウイルス転写のＥ２Ｆトランス活性化を媒介するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ６（例えば、ウイルスＤＮＡの合成を促進し、ウイルスの後期ｍＲＮＡを安定化し輸出し、スプライシングを促進するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ４（例えば、ウイルス転写およびスプライシングを制御し、ＰＰ２Ａを調節するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ３（例えば、ｐ５３媒介性転写を遮断し、ＭＲＮ  ＤＮＡ−修復複合体を妨害し、コンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を防止するタンパク質をコードする）、Ｅ４ｏｒｆ２、Ｅ４ｏｒｆ１（例えば、ＰＩ３キナーゼを通じたシグナル伝達を促進し、それにより、タンパク質合成および細胞生存を導くタンパク質をコードする）、Ｌ４ｐＶＩＩＩ（例えば、少数の構造タンパク質をコードする）Ｅ３  １２．５Ｋ、Ｅ３ＣＲ１α（例えば、アポトーシスを遮断するタンパク質をコードする）、Ｅ３ｇｐ１９Ｋ（例えば、ＭＨＣ−Ｉ抗原提示を阻害する免疫調節タンパク質をコードする）、Ｅ３ＡＤＰ（例えば、ウイルスを放出するために細胞を効率的に溶解する機能を果たすタンパク質をコードする）、Ｅ３ＲＩＤα（例えば、上記アポトーシス促進性のＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする）、Ｅ３ＲＩＤβ−（例えば、上記アポトーシス促進性のＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする）、Ｅ３  １４．７Ｋ（例えば、アポトーシスを遮断するタンパク質をコードする）、およびＬ５ＩＶ（線維）（例えば、上記ペントンベースから伸長し、受容体の結合に関与する主要な構造タンパク質をコードする）のコード領域をさらに含んでよい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種は、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが由来する天然の（例えば、野生型）アデノウイルスに見いだされるモジュールの配列と比較して、１つまたは複数の変異（例えば、核酸の置換、付加または欠失）を含む。例えば、本明細書において提供される核酸は、十分な数のアデノウイルス遺伝子モジュールを、特定の細胞の状態下で上記核酸を細胞にトランスフェクションすることにより、複製コンピテントなアデノウイルスが形成されるようにコードし得る。上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種における変異により、生じるアデノウイルスを、一部の細胞（例えば、癌細胞などの疾患細胞）においては複製されるが、他の細胞（例えば、健康な細胞などの非疾患細胞）においては複製されないようにすることができる。上記変異は、１種または複数種のタンパク質コード領域の付加（例えば、非ウイルスタンパク質コード領域などの１種または複数種の外因性タンパク質コード領域または異種タンパク質コード領域の付加）も含んでよい。１種または複数種のタンパク質の付加により、追加的なウイルスの機能性、ウイルスの機能性の損失（例えば、複製）をもたらすこと、ウイルスを検出する方法（例えば、蛍光マーカー）をもたらすこと、ウイルスを精製する方法（例えば、Ｈｉｓタグを付けたカプシドタンパク質）をもたらすこと、または、後でさらに使用するために単離および／または精製される対象のタンパク質を産生することができるウイルスもたらすことができる。したがって、上記変異により、ウイルスの機能を付加すること、またはウイルスの機能を減じることができる。したがって、本明細書において産生される組換えアデノウイルスは、外因性の（例えば、異種性の）核酸またはネイティブな核酸配列の変更を導入することによって改変されたアデノウイルスを含む。上記変更は、上記のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種における変異によるもの、またはネイティブなアデノウイルスゲノムに存在するアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種の排除によるものであってよい。
【００５１】
したがって、いくつかの実施形態では、上記核酸は、変異したアデノウイルス核酸配列を含む。アデノウイルス核酸配列は、天然のアデノウイルスまたはネイティブなアデノウイルス（例えば、野生型）に見いだされる配列である。上記変異したアデノウイルス核酸配列は、上記のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種における変異、または上記ネイティブなアデノウイルスゲノムに存在するアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種の排除により生じ得る。ある特定の実施形態では、上記核酸は、欠失したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または外因性（例えば、異種性）核酸配列（例えば、非アデノウイルス遺伝子産物をコードする）を含む。上記変異したアデノウイルス核酸配列は、機能性の変更を付与する変異したＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物、変異したＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子産物、変異したアデノウイルス線維遺伝子産物、変異したウイルスコートタンパク質、プロドラッグ変換酵素、レポータータンパク質、変異したヘキソンタンパク質、ｐＩＸと融合したタンパク質、特定の細胞に対して毒性のタンパク質、上記核酸を得る型以外のアデノウイルス由来の完全な線維遺伝子もしくは部分的な線維遺伝子、および／または標的化タンパク質（例えば、腫瘍標的化タンパク質または脈管構造標的化タンパク質）を含んでよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、上記核酸は上記Ｅ１モジュールを含む。上記核酸は、上記Ｅ１モジュールおよび上記Ｅ４モジュールの両方も含んでよい。ある特定の実施形態では、上記核酸は上記Ｅ１モジュールおよび上記Ｅ２−Ｌ２モジュールを含む。上記核酸は、上記Ｅ１モジュールおよび上記Ｌ３−Ｌ４モジュールも含んでよい。上記核酸は、上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールおよび上記Ｌ３−Ｌ４モジュールも含んでよい。
【００５３】
いくつかの実施形態では、上記方法は、Ｅ１モジュール、コアモジュール、Ｅ３モジュール、および／またはその派生体（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）もしくは構成成分から選択される少なくとも３種のアデノウイルス遺伝子モジュールから上記核酸を構築するステップを含む。関連する実施形態では、ヒトＡｄ５の例では、上記方法は、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、およびＥ４モジュールから上記核酸を構築するステップを含む。ある特定の実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２１ｋｂ、２２ｋｂ、２３ｋｂ、２４ｋｂ、２５ｋｂ、２６ｋｂ、２７ｋｂ、２８ｋｂ、２９ｋｂ、３０ｋｂ、３１ｋｂ、３２ｋｂ、３３ｋｂ、３４ｋｂ、３５ｋｂ、３６ｋｂ、３７ｋｂ、３８ｋｂ、３９ｋｂ、４０ｋｂ、４１ｋｂ、４２ｋｂ、４３ｋｂ、４４ｋｂ、４５ｋｂ、４６ｋｂ、４７ｋｂ、４８ｋｂ、４９ｋｂ、または５０ｋｂである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２１ｋｂ、２２ｋｂである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも１２ｋｂである。
【００５４】
本明細書において提供される方法によって形成される上記核酸は、任意の発現可能な核酸であってよい。上記核酸を発現させてアデノウイルスを産生することができる。上記アデノウイルスは、感染性かつ／または自己複製可能（例えば、複製コンピテント）であり得る。いくつかの実施形態では、上記核酸はプラスミドである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、構築するステップは、上記アデノウイルス遺伝子モジュール（またはマクロモジュール）を一緒に組み合わせて上記核酸を形成することを含み、ここで、上記アデノウイルスのモジュールまたはマクロモジュールの配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が、細胞に導入した際の複製可能なアデノウイルスを形成する助けとなる（例えば、上記細胞における上記ウイルスの発現または形成）。したがって、いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、マクロモジュール）は、配向特異様式で構築する。例えば、いわゆる「ゲートウェイ」技術および／またはその配列およびライゲーション非依存的クローニング技術（「ＳＬＩＣ」）を含めた任意の適用可能なクローニング技法を用いることができる。上記ゲートウェイ技術または同様の技術では、部位特異的組換えを用いて、核酸（例えば、ＤＮＡ）断片を、１片の核酸から別の核酸に交換する。その最終結果は、デスティネーションベクターまたはプラスミドへの核酸配列の挿入である。これらの技術および方法は、本明細書では、集合的に「部位特異的組換え法」または「ＳＳＲ法」と称される。ＳＳＲ法のそのような一適用では、ＤＮＡ断片をエントリーベクターからデスティネーションベクターに移動させ、その結果、上記デスティネーションベクターの増殖が可能になる（図９）。エントリーベクターおよびデスティネーションベクターは、一般には、組換え部位を含有する。いくつかの実施形態では、エントリーベクターは組換えコンピテントである。他の実施形態では、エントリーベクターはハイブリダイゼーションコンピテントである。ハイブリダイゼーションコンピテントなエントリーベクターは、１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含有し得、それが酵素的な制限によってエントリーベクターから放出され得、それにより、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが放出される。本明細書では、アデノウイルス遺伝子モジュールをデスティネーションベクターに挿入して上記核酸（例えば、核酸プラスミド）を形成するように、ゲートウェイ技術を適合させたＳＳＲ法が提供される。上記ゲートウェイ技術を用いる一般的な方法は、例えば、Soneら、J  Biotechnol.（２００８年）９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁；Hartleyら、Genome  Res.（２０００年）、１０巻、１７８８〜１７９５頁；およびSasakiら、J.  Biotechnol.（２００４年）、１０７巻、２３３〜２４３頁に記載されている。
【００５６】
例えば、ＳＳＲ法を使用する場合、その構築は、組換えコンピテントな（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）デスティネーションベクター（例えば、組換え部位核酸配列を含むデスティネーションベクター）および上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を、インテグラーゼ（例えば、ラムダファージインテグラーゼ、ラムダファージ切り出し酵素（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）、または細菌宿主組み込み因子（ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ））と接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成することを含む。上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種は組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、組換え部位核酸配列を含むアデノウイルス遺伝子モジュール）である。いくつかの実施形態では、１種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、アデノウイルス遺伝子モジュールに組換え部位核酸配列を付加し、それにより、１種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することによって形成される。他の実施形態では、１種または複数種の上記組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、組換えコンピテントなエントリーベクターの一部である。いくつかの実施形態では上記アデノウイルス遺伝子モジュールを含有する、上記組換えコンピテントなエントリーベクターは、１種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールおよび組換えコンピテントなドナーベクターを、インテグラーゼと接触させ、それにより、上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を含有する、組換えコンピテントなエントリーベクターを形成することによって形成される。したがって、いくつかの実施形態では、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を含有する、１種または複数種の組換えコンピテントなエントリーベクターをインテグラーゼ活性と接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成する。
【００５７】
図２０〜２１には、ヒトＡｄ５のために開発された、本明細書において提供される方法の実施形態が図示されている。上記構築するステップは、それぞれがアデノウイルス遺伝子モジュールを含有するデスティネーションベクターおよび１種または複数種のエントリーベクターを、ラムダファージインテグラーゼ、ラムダファージ切り出し酵素、または細菌宿主組み込み因子のいずれかの１つまたは複数と組み合わせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記エントリーベクターは、アデノウイルス遺伝子モジュールに組換え部位を付加し、その後、ドナーベクターおよび、ラムダファージインテグラーゼ、ラムダファージ切り出し酵素、または細菌宿主組み込み因子のいずれかの１つまたは複数と組み合わせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターを形成することにより形成される。
【００５８】
デスティネーションベクターは、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが接合している核酸、例えば、プラスミドである。その接合は、上記デスティネーションベクター内に含まれることになる（例えば、挿入される）上記アデノウイルス遺伝子モジュールを含有する１種または複数種のエントリーベクターを交換することによるものであってよい。上記デスティネーションベクターには、上記組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を、上記インテグラーゼ（例えば、インテグラーゼ、切り出し酵素、および／または宿主組み込み因子）と接触させる（例えば、組み合わせる）前に１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを存在させていてよい。
【００５９】
組換え部位核酸配列は、本明細書では「ａｔｔ」部位とも称され、２つの核酸の間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的組換えを容易にする核酸配列である。いくつかの実施形態では、上記組換え部位核酸配列の長さはおよそ２１ｂｐである。例えば、組換え部位核酸配列は、ゲートウェイリコンビナトリアルシグナル、例えば、図１０に示されているものおよび／またはSoneら、J  Biotechnol.（２００８年）９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁；Hartleyら、Genome  Res.（２０００年）、１０巻、１７８８〜１７９５頁；およびSasakiら、J.  Biotechnol.（２００４年）、１０７巻、２３３〜２４３頁に記載のものなどであってよい（例えば、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＢｒ部位、ａｔｔＰｒ部位など）。
【００６０】
いくつかの実施形態では、１種または複数種の上記組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、ドナーベクターの一部を形成する（または、ドナーベクター内に存在する）。上記ドナーベクターは、ゲートウェイ技術または同種のクローニング技術と適合するプラスミドであってよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＤＥＳＴベクターは、異なる対抗選択カセットを含有する。対抗選択カセットは、ある特定の条件下で細菌細胞の成長を妨げる任意のＤＮＡ断片である。図２２には、本明細書において提供される方法において使用されている種々の対抗選択カセットの効率が記載されている。
【００６２】
図１９には、マルチサイトゲートウェイ戦略を用いてＡｄ５アデノウイルス遺伝子モジュールを再構築するための元となる計画が詳述されている。この特定の戦略は４種のエントリーベクターを組み合わせることを伴い、エントリーベクターのうちの３種がアデノウイルス遺伝子モジュールであり、４種目が無関係のスタッファーモジュールである。これらの４種のモジュールを組み合わせたら、上記スタッファーモジュールをゲートウェイ反応によって除去して新しいデスティネーションベクターを創製する。最後に、その残りの２種のアデノウイルス遺伝子モジュールを、ゲートウェイ反応によって挿入して完全な上記ウイルスゲノムにする。この元となる計画は、上記Ａｄ５のＥ１モジュール由来の毒性の問題に加え、ゲートウェイ反応においてよりより大きなアデノウイルス遺伝子モジュールを使用した場合に非効率的であった。組み合わせ方法（例えば、ＳＬＩＣ法およびＳＳＲ法）により、上記モジュールからゲノムがより容易に構築された（例えば、実施するステップがより少なく、各ステップの効率がよりよい）。
【００６３】
上記ＳＬＩＣ技術では、２つの核酸（例えば、ＤＮＡ断片）におけるエキソヌクレアーゼにより生成された一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）オーバーハングに依拠することによって一本鎖相同配列をアニーリングすることを用いる（図１６）。したがって、上記ＳＬＩＣ技術では、その挿入される核酸（例えば、ＤＮＡ）およびデスティネーションベクターにおけるエキソヌクレアーゼにより生成された一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）オーバーハングに依拠することによる相同組換えおよび一本鎖アニーリング（例えば、ハイブリダイゼーション）を用いる。本発明では、アデノウイルス遺伝子モジュールをデスティネーションベクターに挿入して上記核酸（例えば、核酸プラスミド）を形成するための、ＳＬＩＣ技術を適応させる方法が提供される。このプロセスは、本明細書では、ＡｄＳｌｉｃまたはＡｄＳｌｉｃＲとも称することができる。ＳＬＩＣ技術を用いた一般的な方法は、例えば、Liら、Nature  Methods（２００７年）、４巻、２５１〜２５６頁に記載されている。図２５には、ヒトＡｄ５のために確立されたＡｄＳｌｉｃＲの例が図示されている。図２６には、上記ＡｄＳｌｉｃＲ法における反応の効率が詳述されている。
【００６４】
例えば、上記ＳＬＩＣ技術（または同様のクローニング技術）を用いる場合、その構築するステップは、一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）オーバーハングを有する（例えば、各末端に）ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクター（例えば、デスティネーションベクター（例えば、線状ベクター））を、上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種にハイブリダイズ（例えば、アニーリング）させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む。上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターは、本明細書では、ＳＬＩＣコンピテントなベクターとも称することができる。上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種は、ハイブリダイゼーションを容易にする（例えば、ストリンジェントな条件下で）ために上記デスティネーションベクターの一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）オーバーハングに対して十分に相補的な少なくとも１つの一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）オーバーハング（例えば、各末端に）を有するハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、線状のアデノウイルス遺伝子モジュール））であってよい。いくつかの実施形態では、上記デスティネーションベクターオーバーハングおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールオーバーハングは、それぞれ長さ約２０〜２５ｂｐである。上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターは、任意の適切な方法体系を用いて形成することができる。
【００６５】
例えば、いくつかの実施形態では、上記デスティネーションベクターが環状（例えば、プラスミド）である場合、上記デスティネーションベクターを切断し（例えば、エンドヌクレアーゼを用いて）、それにより、線状デスティネーションベクターを形成する。次いで、上記線状デスティネーションベクターをエキソヌクレアーゼ（すなわち、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ）と接触させ、それにより、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを形成する。同様に、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記アデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ（例えば、処理し）、それにより、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することによって形成できる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを、上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種にハイブリダイズさせることは、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュール（複数可）をＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが環状である、または環状プラスミド内に含有される場合、上記アデノウイルス遺伝子モジュールを、エキソヌクレアーゼ処理する前にエンドヌクレアーゼ処理することによって線形化する。したがって、いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種を、１種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを含むエントリーベクターをエンドヌクレアーゼと接触させ、それにより、放出された上記１種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することによって形成する。放出された１種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、１種または複数種のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することができる。本明細書で言及されるエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールは、エントリーベクターの一部であるアデノウイルス遺伝子モジュールである。本明細書で言及される放出されたエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールは、例えば、制限酵素によってエントリーベクターから放出されたアデノウイルス遺伝子モジュールである。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールは、環状ではなく（例えば、ＰＣＲまたは遺伝子合成によって得られる）、エキソヌクレアーゼ処理する前の線形化を必要としない。いくつかの実施形態では、ＳＬＩＣコンピテントなベクターを上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの１種または複数種にアニーリングさせるステップは、上記ＳＬＩＣコンピテントなベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュール（複数可）をＤＮＡポリメラーゼと組み合わせるステップを含んでよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、上記ＳＬＩＣコンピテントなベクターは、ＳＬＩＣコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールとアニーリングさせる前に１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含有する。したがって、いくつかの実施形態では、複数のＳＬＩＣ反応を逐次的に実施して、複数のアデノウイルス遺伝子モジュールを挿入する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールを生成するための鋳型として使用する、プラスミド内のアデノウイルスゲノムを得るために、ＳＬＩＣを用いて、プラスミド骨格にアデノウイルスゲノム全体を挿入することができる。いくつかの実施形態では、上記ＳＬＩＣコンピテントなアデノウイルスゲノムは、精製されたウイルスストックから得られる。図３０には、そのようなプロセスの実施形態が図示されており、ヒトＡｄ５についての例が提供される。
【００６８】
上記アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、少なくとも１種のアデノウイルス遺伝子モジュールを有する核酸である。適切なクローニング技術を用いて、所望の数のアデノウイルス遺伝子モジュールを上記デスティネーションベクターに付加して上記アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成する。例えば、一度形成したら、上記アデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、上記アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、上記適切なクローニング技術（例えば、ゲートウェイクローニング技術および／またはＳＬＩＣクローニング技術）を用いてさらに改変して、さらなるアデノウイルス遺伝子モジュールを付加し、それにより、上記核酸を形成させ、上記核酸を発現させて（例えば、細胞において）、アデノウイルス（例えば、複製可能なアデノウイルス）を形成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、第１のアデノウイルス遺伝子モジュールを、上記適切なクローニング技法を用いてさらに改変して、その第２のアデノウイルスのモジュール、第３のアデノウイルスのモジュールおよび／または第４のアデノウイルスのモジュールを形成し、第２のアデノウイルス遺伝子モジュール、第３のアデノウイルス遺伝子モジュールおよび／または第４のアデノウイルス遺伝子モジュールをそれぞれ上記ベクターに付加し、それにより、上記核酸を形成させ、上記核酸を発現させてアデノウイルス（例えば、複製可能なアデノウイルス）を形成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上記核酸は、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターである。
【００６９】
実際に、異なるクローニング技術を用いて、上記核酸またはアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを構築することができる。いくつかの実施形態では、上記構築は、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを、第１のアデノウイルス遺伝子モジュールにハイブリダイズ（例えば、アニーリング）させ、それにより、第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成することを含む。上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールは、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールであってよい。上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターおよび第２のアデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターを、インテグラーゼ（例えば、インテグラーゼ、切り出し酵素、または組込み宿主因子）と接触させ（例えば、組み合わせ）、それにより、第２のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成することができる。上記第２のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、組換えコンピテントな第２のアデノウイルス遺伝子モジュールベクター（例えば、デスティネーションベクター）であってよく、上記第２のアデノウイルス遺伝子モジュールは、組換えコンピテントな第２のアデノウイルス遺伝子モジュールであってよい。いくつかの実施形態では、上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記Ｅ２−Ｌ２モジュール、上記Ｌ３−Ｌ４モジュール、または上記Ｅ２−Ｌ４マクロモジュールである。上記第２のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ３モジュール、または上記Ｅ４モジュールであってよい。上記アデノウイルス遺伝子モジュールを構築するための、組み合わせてクローニングする方法の例は図２０〜２１において提供され、そこではＳＬＩＣとゲートウェイが組み合わされている。
【００７０】
他の実施形態では、上記構築は、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび第１のアデノウイルス遺伝子モジュールを、インテグラーゼ（例えば、インテグラーゼ、切り出し酵素、または組込み宿主因子）と（例えば、その存在下で）接触させ（例えば、組み合わせ）、それにより、第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む。上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールは、組換えコンピテントな第１のアデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、エントリーベクター）である。上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを第２のアデノウイルス遺伝子モジュールにハイブリダイズさせ、それにより、第２のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成する。上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールベクター（例えば、デスティネーションベクター）である。上記第２のアデノウイルス遺伝子モジュールは、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、エントリーベクター）である。いくつかの実施形態では、上記第２のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記Ｅ２−Ｌ２モジュール、上記Ｌ３−Ｌ４モジュール、または上記Ｅ２−Ｌ４マクロモジュールである。上記第１のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ３モジュール、または上記Ｅ４モジュールであってよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では（例えば、ヒトＡｄ５の例）、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールおよび上記Ｌ３−Ｌ４モジュールは、それぞれおよそ１４ｋｂおよび１０ｋｂである。本明細書において提供される発見の１つは、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールおよびＬ３−Ｌ４モジュールのサイズが、いくつかの実施形態では、標準のクローニング技術またはゲートウェイ（例えば、マルチサイトゲートウェイ）クローニング技術を用いて効率的に上記核酸へと構築するためには大きすぎることである。図１５に例が提供されている。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＬＩＣクローニング技術（または同様のクローニング技術）を用いて、これらのモジュールをデスティネーションベクター（例えば、エントリーベクター）に挿入する。例えば、ゲートウェイクローニング技術を用いて、他のアデノウイルス遺伝子モジュールを付加することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上記Ｅ２−Ｌ２モジュールおよび上記Ｌ３−Ｌ４モジュールを上記核酸に構築する場合、ＳＬＩＣとゲートウェイ（例えば、マルチサイトゲートウェイ）クローニング戦略の組み合わせを用いて上記核酸を構築することが好ましい。ＳＬＩＣとゲートウェイ（例えば、マルチサイトゲートウェイ）クローニング戦略の組み合わせの特定の実施形態は図２０〜２１に記載されている。
【００７２】
本明細書において提供される方法の特定の実施形態は、高速かつ効率的なアデノウイルスゲノム構築物の構築を提供する。いくつかの場合では、上記アデノウイルスゲノム構築物は、１０時間かかからずに、９時間かかからずに、８時間かかからずに、７時間かかからずに、６時間かかからずに、５時間かかからずに、４時間かかからずに、３時間かかからずに、２時間かかからずに、または１時間かかからずに構築される。さらに、本明細書において提供される方法により、ベクターにアデノウイルス断片を挿入すること、個々のベクターに容易かつ独立した変異誘発を行なうこと、および／または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多部位特異的に構築することが可能になる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールの１種または全種を、下記の組換えアデノウイルス遺伝子モジュールのライブラリーから選択することができる。したがって、上記Ａｄｓｅｍｂｌｙプロセスのある特定の実施形態により、アデノウイルス遺伝子モジュールの最適な組み合わせに基づいてカスタマイズされたアデノウイルスの機能性を高速に最適化することを可能にすることによって、そこでは、多種多様な組換えアデノウイルスを急速かつ効率的に構築することが可能になる。それにより、当該方法により、種々のアデノウイルス血清型由来の部分を混合し、調和させる（ｍａｔｃｈｉｎｇ）ことによって新規のアデノウイルス血清型のキメラを創製することができるようになる。これにより、各血清型の独特の性質を与える組み合わせだけでなく、上記血清型の種々の向性の利用、および、優勢な血清型に対する既存の免疫を潜在的に回避するためのそれらの使用が可能になる。
【００７４】
本明細書において提供される方法の特定の実施形態は、限られた制限酵素部位クローニング技術に依存することを回避する。当該方法では、アデノウイルス血清型５のみに依存することを回避することも可能にし得る。実際に、ヒトＡｄ５の例では、上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ２−Ｌ２モジュール、上記Ｌ３−Ｌ４モジュール、上記Ｅ３モジュール、および上記Ｅ４モジュールの５種類全てを使用する場合、変異体の選択肢は、従来公知の方法よりも実質的に増加する。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法により、上記ゲノム内の化合物の変化を同時に創製することが可能になる。
【００７５】
当該方法では、多くの場合、数ヶ月かかり得る、特殊化した細菌株または哺乳動物の細胞培養物（例えば、ＭＡＧＩＣ）における非効率的な相同組換えのみに依拠する従来公知のゲノム構築を回避することも可能にし得る。さらに、本明細書において提供される方法の特定の実施形態は、一般に利用可能な試薬を用い、特殊化した細菌（例えば、ｃｃｄＢ抵抗性細菌）を使用しない簡単なプロトコールを提供する。
【００７６】
本明細書において提供される方法およびライブラリーの有用性としては、例えば、以下があげられる：
（１）遺伝子機能を解析するためのアデノウイルス遺伝子の変異誘発。
（２）アデノウイルス遺伝子機能が損失することにより、通常の細胞において複製することができなくなるが、それらの機能が補完される腫瘍細胞において選択的な溶解性複製を行う、アデノウイルスの変異体。
（３）複製欠損ベクターまたは複製コンピテントなウイルスいずれかとしての標的化遺伝子の発現。
（４）当該方法により、遺伝子を発現させるための新規の複製欠損アデノウイルスを提供することができる。この目的のために、本明細書の方法を用いて構築されたアデノウイルスを最適化することができる。ヒトＡｄ５の場合では、Ｅ１モジュールのライブラリーは、例えば、いくつかのＥ１Ａ欠失モジュールまたはＥ１Ｂ欠失モジュールを含んでよく、かつ／または、それぞれが、異なる哺乳動物プロモーターを含有し、それにより、その使用者が、対象の遺伝子を発現させるための最良のプロモーターを選択することが可能になる。
【００７７】
（５）上記アデノウイルスゲノムの既存の転写構築様式を利用した多重遺伝子発現。
【００７８】
いくつかの実施形態では、上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ２−Ｌ２モジュール、上記Ｌ３−Ｌ４モジュール、上記Ｅ３モジュール、および上記Ｅ４モジュールのそれぞれを使用する場合、上記Ｅ４モジュールにのみその変異が存在しない。
【００７９】
上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ２−Ｌ２モジュール、上記Ｌ３−Ｌ４モジュール、上記Ｅ３モジュール、上記Ｅ４モジュールおよびそのマクロモジュールは、任意の適切なアデノウイルスから任意の適切な方法（例えば、ＰＣＲ技法または遺伝子合成）を用いて誘導することができる。例えば、精製したウイルスから得たウイルスゲノムＤＮＡからのＰＣＲを使用することができる（図１４）。図１３には、上記ヒトＡｄ５アデノウイルス遺伝子モジュールについて得られたＰＣＲ効率が詳述されている。いくつかの実施形態では、上記Ｅ１モジュール、上記Ｅ２−Ｌ２モジュール、上記Ｌ３−Ｌ４モジュール、上記Ｅ３モジュール、および上記Ｅ４モジュールの組み合わせが完全な、または実質的に完全なアデノウイルスゲノムを構築する、またはそのマクロモジュールが完全な、または実質的に完全なアデノウイルスゲノムを構築する。本明細書において提供される教義を用いて、当業者は、上記モジュール間の切断部位（ｂｒｅａｋ）の正確な位置を決定することができる。例えば、バイオインフォマティクスの手法を用いて、組換え部位核酸配列（例えば、ゲートウェイ組換えシグナルまたはゲートウェイ組換え部位）の最適な挿入部位を決定することができる。いくつかのアデノウイルス血清型をアラインメントすることができ、アデノウイルス遺伝子モジュール間のゲノム領域を保存について分析することができる。いくつかの実施形態では、血清型間のヌクレオチドの保存は回避されるが縮重領域は許容される挿入部位である。例えば、ヒトＡｄ５における組換え部位核酸配列の挿入部位の特定の適切な位置は、図１２、図３５、図３６、図３７および図３８において矢印で示されている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュール間の配列は短い場合があり、そのため、配列を重複させることが必要である。図１２に例が提供されており、そこでは、上記Ａｄ５線維ポリＡと上記Ｅ４ポリＡの間の配列が短いので、Ａｄ５配列の２７ｂｐの重複をａｔｔＢ部位の挿入と一緒に挿入した。
【００８１】
いくつかの実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、１つまたは複数の組換え部位核酸配列を含む。図３５〜３９に、組換えアデノウイルス内の、組換え部位核酸配列の核酸配列の位置がその組換えアデノウイルスの成長速度にどのように影響するかについての、決して限定するものではない例が開示されている。したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の組換え部位核酸配列（例えば、ａｔｔ部位）を含む組換えアデノウイルスの成長が、１つまたは複数の組換え部位核酸配列を欠く組換えアデノウイルスよりも遅くなり得る。他の実施形態では、１つまたは複数の組換え部位核酸配列（例えば、ａｔｔ部位）を含む組換えアデノウイルスは、少なくとも、１つまたは複数の組換え部位核酸配列を欠く組換えアデノウイルスと同じ速さで成長し得る。他の実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、上記Ｅ３モジュールと上記Ｅ４モジュールの間の組換え部位核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｅ３モジュールと上記Ｅ４モジュールの間の組換え部位核酸配列は、ａｔｔＢ３組換え部位核酸配列である。いくつかの実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、配列番号１３７に記載のヌクレオチド３２９０４またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後に組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、上記Ｅ１モジュールと上記Ｅ２−Ｌ２モジュールの間の組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、配列番号１３７に記載のヌクレオチド４０３５またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後に組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、配列番号１３７に記載のヌクレオチド３６０８またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後に組換え部位核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、上記Ｌ３−Ｌ４モジュールと上記Ｅ３モジュールの間の組換え部位核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｌ３−Ｌ４モジュールと上記Ｅ３モジュールの間の組換え部位核酸配列は、ａｔｔＢ５組換え部位核酸配列である。他の実施形態では、上記核酸（例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクター）は、上記Ｅ１モジュールと上記Ｅ２モジュールの間の第１の組換え部位核酸配列、上記Ｌ３−Ｌ４モジュールと上記Ｅ３モジュールの間の第２の組換え部位核酸配列および上記Ｅ３モジュールと上記Ｅ４モジュールの間の第３の組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記第１の組換え部位核酸配列は、配列番号１３７に記載のヌクレオチド４０３５またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後の核酸に含まれ、上記第３の組換え部位核酸配列は、配列番号１３７に記載のヌクレオチド３２９０４またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後の核酸に含まれる。
【００８２】
上記Ａｄ５ゲノム（配列番号１３７）への４種の挿入を示す、実行した挿入戦略の１つの例が以下に列挙されている。その数字は、上記組換え部位核酸配列を挿入するための挿入部位が位置する、公開された上記Ａｄ５ゲノム配列内のヌクレオチドの位置を示す。下記の実施例では、上記ａｔｔＢ配列（すなわち、上記組換え部位核酸配列）に下線が引かれており、最終の挿入のためのＡｄ５配列内の重複が太字になっている。同様の内容の適切かつ／または同等の挿入部位または相同なウイルス配列は当業者にはすぐに理解される。
【化１】
0005981916.tif 000002
【００８３】
図２１の構築戦略を１７回用いて、感染性のヒトＡｄ５ウイルスを得る。図２４には、本明細書において提供される方法の効率が詳述されている。４つの別々の場合において、野生型のＡｄｓｅｍｂｌｙされたアデノウイルスを細胞にトランスフェクトし、ウイルスを産生させた。さらに、このプロトコールにより、１３種の変異体アデノウイルスが生成し、その全てが感染性ウイルスを産生する。図２７では、そのトランスフェクションで再構築された野生型Ａｄ５の、単一のプラークとして、および同様に２９３細胞を通過させた画像が提供される。図２０〜２１および図２５の戦略で産生したウイルスを、図２８に示されている通り、２９３細胞における複製の有効性について試験した。
【００８４】
別の態様では、本明細書に開示されている方法により作製したアデノウイルスが提供される。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスは複製コンピテントである。別の実施形態では、上記アデノウイルスは複製コンピテントではない。
【００８５】
ＩＩ．アデノウイルス遺伝子モジュールおよびマクロモジュールライブラリー
別の態様では、複数のアデノウイルス遺伝子モジュール（例えば、マクロモジュール）を含むライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるＥ１モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるＥ３モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるＥ４モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるコアマクロモジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記の方法に従って上記アデノウイルスゲノムライブラリーを調製する。
【００８６】
他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるＥ１モジュール、複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、複数の異なるＥ３モジュール、複数の異なるＥ４モジュール、および／または複数の異なるコアマクロモジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるマクロモジュールを含み、そのマクロモジュールは複数の異なるＥ１−Ｌ２マクロモジュール、複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュール（すなわち、コアマクロモジュール）および／または複数の異なるＥ３−Ｅ４マクロモジュールを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび／またはマクロモジュールは、それらが、異なる種類のアデノウイルス（例えば、異なる種または異なる血清型）に由来するという点で異なる。例えば、いくつかの実施形態では、上記複数の異なるＥ１モジュール、上記複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、上記複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、上記複数の異なるＥ３モジュール、上記複数の異なるＥ４モジュール、および／または上記複数の異なるマクロモジュール（例えば、コアマクロモジュール）は、複数のアデノウイルスの型（例えば、２種以上のヒトアデノウイルス血清型）由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび／またはマクロモジュールは、それらが、異なる変異体モジュールまたはマクロモジュール（例えば、欠失しているアデノウイルス核酸配列、置換されたアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列）をコードするという点で異なる。例えば、上記ライブラリーは、欠失したアデノウイルス核酸配列、変異したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む複数の異なるＥ１モジュール、複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、複数の異なるＥ３モジュール、複数の異なるＥ４モジュール、または複数の異なるマクロモジュール（例えば、コアマクロモジュール）を含んでよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび／またはマクロモジュールは組換えコンピテントである（例えば、エントリーベクター内に含有される）。例えば、上記ライブラリーは、組換えコンピテントである、複数の異なるＥ１モジュール、複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、複数の異なるＥ３モジュール、複数の異なるＥ４モジュール、および／または複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールを含んでよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび／またはマクロモジュールはハイブリダイゼーションコンピテント（例えば、線形化後などのＳＬＩＣコンピテント）である。例えば、いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、ハイブリダイゼーションコンピテントである、複数の異なるＥ１モジュール、複数の異なるＥ２−Ｌ２モジュール、複数の異なるＬ３−Ｌ４モジュール、複数の異なるＥ３モジュール、複数の異なるＥ４モジュール、および／または複数の異なるＥ２−Ｌ４マクロモジュールを含む。
【００９１】
本明細書において提供されるライブラリーの部分は、異なる使用者が創製し、異なる使用者間で共有することができる。種々のアデノウイルス遺伝子モジュールを混合し、調和させて、所望の機能性を有するかまたは機能性が欠乏した新規のアデノウイルスの構築物を確立することができる。したがって、本明細書における当該方法およびライブラリーにより、種々のアデノウイルス血清型由来の部分を混合し、調和させることによって新規のアデノウイルス血清型のキメラを創製することができるようになる。アデノウイルス遺伝子モジュールのライブラリーにより、使用者に、その理想的なアデノウイルスベクターを確立するための複数の選択肢がもたらされる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールは、細菌に対して毒性であり得る。例えば、図１８には、ヒトＡｄ５のＥ１モジュールの毒性が実証されている。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールは、より少ないコピー数（例えば、ｐ１５Ａ複製開始点）で維持されるプラスミド内に含有されることを必要とする場合がある。
【００９３】
いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールの毒性、サイズ、または他の因子により、ＳＳＲ法（例えば、ゲートウェイ反応）におけるそれらの使用が妨げられる可能性がある。例えば、図１５には、５種のヒトＡｄ５アデノウイルス遺伝子モジュールについての標準のゲートウェイＢＰ反応効率が詳述されている。いくつかの実施形態では、ＳＳＲ法（例えば、ゲートウェイ反応）を用いると効率的でないアデノウイルス遺伝子モジュールを、代替のクローニング方法（例えば、ＳＬＩＣ）によって操作することができる。図１７には、エントリーベクターを創製するために、ＳＳＲ法の代わりにＳＬＩＣを用いる戦略（例えば、ゲートウェイクローニング酵素を用いる）が図示されている。
【００９４】
ＩＩＩ．キット
別の態様では、本明細書において提供される方法およびライブラリーにおいて使用するための、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュール（または下記のその変異体）から選択される２種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む核酸を含むキットが提供される。上記キットの適切な構成成分は、上のセクションＩおよび／またはＩＩに記載されている組成物および構成成分を含む。
【００９５】
例えば、いくつかの実施形態では、キットは、Ｅ１モジュール、Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、Ｅ３モジュール、Ｅ４モジュールまたはアデノウイルスマクロモジュールから選択される３種、４種または５種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む核酸を含んでよい。上記核酸は、上記の通り、ベクター（例えば、プラスミド）の一部を形成し得る（例えば、デスティネーションベクターまたはドナーベクター）。
【００９６】
一部の態様では、本明細書において提供されるキットは、アデノウイルス遺伝子モジュールを有するベクターまたは有さないベクターを含んでよい。上記キットにおいて有用なベクターとしては、１つまたは複数の組換え部位核酸配列および／または一本鎖核酸オーバーハング（または適切な酵素と接触すると一本鎖核酸オーバーハングを形成することができる核酸配列）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、上記ベクターは、上記の通り、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクター、ＳＬＩＣコンピテントなベクターまたはドナーベクターである。上記ベクターは、１種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記ベクターは、対抗選択カセットを含む。
【００９７】
本明細書において提供される方法を実施するためのキットの追加的な構成成分は、Ａｄｓｅｍｂｌｙ法およびライブラリーについての本記載を考慮すると容易に明らかになる（例えば、エキソヌクレアーゼ、インテグラーゼ、プロモーター配列など）。
【実施例】
【００９８】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求された発明を限定するものではない。
【００９９】
Ａ．ウイルスを構築する方法
１．次世代のウイルスベクターおよび、反復溶解がん療法を開発するために化学的性質を「組み合わせること」およびウイルスゲノムを「組換えること」
本発明者らは、複数の改変および異種性エレメントを系統的に組み合わせることを可能にする、構成要素の部分からウイルスゲノムを急速に新規に構築するための組換え戦略の使用を開発した。
【０１００】
いくつかの適用におけるアデノウイルスベクターの潜在性は、工学的に作製し、複数の遺伝子改変を急速かつ系統的に組み合わせる能力により妨げられている。使用されている主要な方法は、大部分が、そのゲノム内の適切な位置における独特の適切な制限酵素部位の利用可能性に依存し、系統的な使用または正確な化合物の改変を急速な単一のステップで創製することには一般に受け入れられていない。大きなゲノムＤＮＡ断片を操作すること、および独特の制限部位が不足していることにより、これは技術的に困難になり、限定される。別の方法には、改変しようとするゲノム領域を伴うより小さな「シャトル」ベクター、および上記ウイルスゲノムを伴う「バックボーン」ベクターを生成することが必要である。これらのベクターに対する主要な律速ステップは組換えであり、哺乳動物の細胞における相同組換えによって（非常に低頻度の事象、ランダムな部位で起こり、所望の組換え体を単離するために複数回のプラーク精製を必要とする）か、または、特別な細菌株における相同組換えのいずれかによって生じる。これらの方法は限定されている。
【０１０１】
現行の技術の制限を克服するために、本発明者らは、複合ウイルス変異体を一晩で急速かつ系統的に生成することを可能にする新規のアデノウイルスゲノム構築戦略を開発した。これにより、哺乳動物細胞における非効率的かつ不正確な組換え、利用可能なＢＡＣまたはシャトルベクターの必要性、時間がかかり骨の折れるプラーク精製がなくなる。この戦略により、１）ウイルス遺伝子に対する複数の変異／改変、２）他のウイルスサブタイプ由来の遺伝子、例えば、異なる受容体に結合し血清型を切り換える、ウイルスコートタンパク質、３）異所性の遺伝子、例えば、強力な腫瘍バイスタンダー効果を誘導するためのプロドラッグ変換酵素、４）ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像診断および診断学のための蛍光レポーターまたは蛍光タグの付加、および５）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける定方向のウイルス進化、を含む新規のウイルスゲノムをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて構成要素の部分から急速に構築することができるようになる。さらに、この技術では、天然のウイルス転写構築様式を利用し、これは、ヒトＡｄ５については、３６遺伝子（スプライスバリアントは含まない）をコードし、したがって多タンパク質複合体および全体の経路を構築し、アデノウイルスの感染を介して送達し、共発現させることができる。
【０１０２】
Ａｄ２／５および現在の方法論の制限を克服するために、本発明者らは、ゲノム構成要素の部分および異種性エレメントから、アデノウイルスゲノムをｉｎ  ｖｉｔｒｏで急速に新規に構築することを可能にするＡｄｓｅｍｂｌｙ法を開発した。バイオインフォマティクスの手法を用いて、本発明者らは、異なるアデノウイルスゲノム（３６〜３８ｋｂ）を、進化的に保存された配列、転写モジュールおよび機能的モジュールに基づいて５単位に分割した。これらの５単位はそれぞれ、工学的に作製した変異または異種性エレメントによってその機能および多様性が変更され、異なるアデノウイルス血清型、変異体および種由来の同等の単位を付加することによってさらに拡大したゲノムを確立する「部分ライブラリー」に適合する区画を含む。独特の性質を有する新しいアデノウイルスを創製するために、上記ライブラリーから上記各単位の各々のうちの１つを選択し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ（例えば、Ａｄ−ＳｌｉｃＲ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全なゲノムに急速に再構築する。Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、多部位特異的組換えによって、トランスフェクションするとプラスミド骨格から自己除去され、複製して新規のウイルスを産生する新規のゲノムを構築することができる。Ａｄ−ＳｌｉｃＲは、より強力なウイルス複製（必要であれば）および臨床使用のために、挿入された組換え配列を消去するために用いることができる戦略である。本明細書に開示されている戦略では、Ａｄ２／５に対する異なる向性および他の望ましい特性を有する、または機能性が変更されるように遺伝子改変されたヒトおよび／または動物のアデノウイルスから創製されたライブラリーゲノムの基本要素を使用することができる。
【０１０３】
これを実現するために、「ゲートウェイ」としても公知の、特異性および効率が改善された改変λファージ部位特異的組換え系を利用する。ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲと称される４つのクラスの組換え部位が存在し、これらは別個のファージ酵素により組み換えられる。最近、複数のＤＮＡ断片を定義済みの順序および配向で同時に組換えることを可能にする新規のａｔｔ部位特異性が同定された。本明細書には、新規のウイルスゲノム全体をゲノムの構成要素の部分から構築するための、この系の新規の適用が開示されている。目ざましいことに、この技術により、アデノウイルスベクターの開発および潜在的な適用が改革される。
【０１０４】
ａｔｔＢ部位（１〜６の番号を付けた）の独特の対を組み入れたプライマーのセットを使用して、一致した隣接する群においてウイルスゲノムを増幅する。上記Ａｄ５アデノウイルスゲノムは３６ｋｂであり、時間的に「初期」（Ｅ）転写単位および「後期」（Ｌ）転写単位に分けられ、それらは３６〜４０遺伝子を共にコードする。
【０１０５】
野生型Ａｄ５／２、Ａｄ５／２の変異体および異なるアデノウイルスサブタイプまたは動物ウイルスをＤＮＡ鋳型として使用する。ＰＣＲ断片を「エントリー」ベクターへと組み換えて、上記アデノウイルスゲノムの構成エレメントのライブラリーを生成する。デスティネーションベクターへのＬＲ組換えにより、個々のエレメントの複数の順列を、新規のウイルスゲノムへと構築する（図１Ｂ）。これは、デスティネーションベクターの抗生物質耐性に対する陽性選択、および毒性遺伝子であるｃｃｄＢによってもたらされるＥ．ｃｏｌｉにおける未反応のデスティネーションベクターの陰性選択によって容易になる（Hartleyら、２０００年）。断片の数またはサイズにより組換え効率が限定される場合、第２のＢＰ／ＬＲ反応においてモジュラーの置き換えまたは完全な構築が起こる中間のデスティネーションベクターを創製する。ウイルスＤＮＡ操作のこの急速かつ新規の方法は、ＤＮＡ組換えの本質的な化学的性質を利用することによって、新規のウイルスの工学的作製を変容させる。
追加的な組み合わせ、例えば、ＣＤ４６細胞受容体に結合し、Ａｄ２／５ウイルスに対して産生される中和抗体から逃れるアデノウイルス３４線維を組み込む。
【０１０６】
２．材料および方法
上記の手引きを使用して、以下の参照構成成分を用いて改変アデノウイルスを作製した。ゲートウェイＤＯＮＲベクターを使用した。ヒトＡｄ５の例では、ＰＣＲによって上記Ｅ１モジュールを得、ＳＬＩＣを用いてベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４に挿入した。ａｔｔＬ１組換え部位およびａｔｔＬ４組換え部位を含むｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４ベクターの骨格を、ＰＣＲを使用して増幅し、ＳＬＩＣによってＡｄ５のＥ１モジュールと組み合わせた。代替の対抗選択カセットを生成するために、ベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４を改変した。ａｔｔＰ１組換え部位およびａｔｔＰ４組換え部位を含むこのベクター骨格を、ＰＣＲを使用して増幅し、ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ変異およびテトラサイクリン抵抗性カセット（ｐＥＮＴＲ  Ｌ３−ｐＬａｃ−Ｔｅｔ−Ｌ２由来のｐＬａｃ−Ｔｅｔカセット）と組み合わせて、新しいＤＯＮＲベクターを創製した。次いで、新しいＤＯＮＲベクター由来のａｔｔＲ１−ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ−Ｔｅｔ（ｒ）−ａｔｔＲ４断片をＰＣＲによって増幅し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターに挿入した。「ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ」、カタログ番号１２５３７−１００；およびSone、T.ら  J  Biotechnol.  ２００８年９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁を参照されたい。
【０１０７】
ヒトＡｄ５の例では、Ｅ３モジュールをゲートウェイＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ３ｒベクターに挿入した。上記Ｅ４モジュールをゲートウェイＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ  Ｐ３Ｐ２ベクターに挿入した。ｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ２ベクター由来のａｔｔＲ５−ｃｃｄＢ−Ｃｍ（ｒ）−ａｔｔＲ２断片をＰＣＲによって増幅し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターに挿入した。「ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ」、カタログ番号１２５３７〜１００；およびSone、T.ら  J  Biotechnol.  ２００８年９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁を参照されたい。
【０１０８】
上記Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターのベクター骨格は、３種の異なる供給源由来の部分で構成される。Ａｍｐ（ｒ）カセットおよびｌａｃＺ遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９から増幅した。これを、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭ２００７年のパーツ配布の一部である、プラスミドｐＳＢ３Ｋ５−Ｉ５２００２から入手したｐ１５Ａ複製開始点と組み合わせた。Ｅ１毒性を低下させるために、プラスミドをより少ないコピー数（１０〜１２）で維持するｐ１５Ａ  ｏｒｉが必要である。最後に、自己除去性ウイルスを創製するために、上記酵素Ｉ−ＳｃｅＩに対する哺乳動物発現カセットについて、プラスミドｐＡｄＺ５−ＣＶ５−Ｅ３＋からＰＣＲを行なった。このカセットを上記ベクターの骨格にクローニングして、ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩと称されるベクターを創製した。これは、ゲノム構築を開始するために使用するベクターである。ヒトＡｄ５の例では、その遺伝子モジュールは、全て、野生型Ａｄ５ウイルスから精製したＤＮＡまたはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかから得た。
【０１０９】
上記ＤＥＳＴベクターに関して、ヒトＡｄ５の例では、上記Ｅ２モジュールおよび上記Ｌ３モジュールをプラスミドｐ１５Ａ−ＳｃｅＩに３断片ＳＬＩＣによって挿入した。ａｔｔＲ５部位およびａｔｔＲ２部位が隣接するｃｃｄＢおよびＣｈｌｏｒ（ｒ）を発現している対抗選択マーカーを、プラスミドｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ２からＰＣＲによって得た。その第２の対抗選択マーカー（ＰｈｅＳ−Ｔｅｔ）を、ベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４  ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ−ＴｅｔからＰＣＲによって得た（上記を参照されたい）。上記ＤＥＳＴベクターを創製するために上記Ｅ２モジュールおよび上記Ｌ４モジュールの末端に工学的に作製した独特の制限酵素で切断した後、ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４の右側（ｃｃｄＢ／Ｃｍ）および左側（ＰｈｅＳ／Ｔｅｔ）に２つの対抗選択マーカーをＳＬＩＣによって挿入した。
【０１１０】
アデノウイルス遺伝子モジュールを含有するマルチサイトゲートウェイエントリーベクターに関して、ヒトＡｄ５の例では、上記Ｅ１モジュールをｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４にＳＬＩＣによって挿入した。上記Ｅ３モジュールをｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ３ＲにゲートウェイＢＰ反応によって挿入した。上記Ｅ４モジュールをｐＤＯＮＲ  Ｐ３Ｐ２にゲートウェイＢＰ反応によって挿入した。
【０１１１】
Ａｍｐ（ｒ）カセット：プラスミドｐＵＣ１９に関しては、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ：プラスミドｐＳＢ３Ｋ５−Ｉ５２００２は、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭの２００７年パーツ配布の一部であった。上記アデノウイルス遺伝子モジュールに関しては、Ａｄ５粒子から精製したＤＮＡ、またはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれか。ＤＯＮＲベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４、Ｐ５Ｐ２、Ｐ５Ｐ３Ｒ、Ｐ３Ｐ２は、Ｊｏｎ  Ｃｈｅｓｎｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。ＰｈｅＳ遺伝子は、ＤＨ５アルファ細菌ゲノムＤＮＡから得、その後、クイックチェンジによって変異させてＰｈｅＳＡ２９４Ｇ変異体を創製した。Ｔｅｔ（ｒ）遺伝子に関しては、プラスミドｐＥＮＴＲ  Ｌ３−ｐＬａｃ−Ｔｅｔ−Ｌ２をＪｏｎ  Ｃｈｅｓｎｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。
【０１１２】
上記Ａｄｓｅｍｂｌｙ法の実施形態に関しては、一般には２つの対抗選択カセットが隣接するコアモジュールを含有する二重ＤＥＳＴベクター２０ｆｍｏｌを、遺伝子モジュールを含有する残りのエントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌと組み合わせる。Ａｄ５の例では、これは、Ｅ２−Ｌ３二重ＤＥＳＴベクター２０ｆｍｏｌを、Ｅ１モジュールエントリーベクター、Ｅ３モジュールエントリーベクター、およびＥ４モジュールエントリーベクターのそれぞれ１０ｆｍｏｌと組み合わせることを含む。いくつかの場合では、上記エントリーベクターのうちの１種または複数種の量が増加することにより効率が上昇し得る（例えば、Ａｄ５について上記Ｅ１モジュールエントリーベクター５０ｆｍｏｌを使用する）。これらのベクターを、最終の体積１０μｌ中２μｌのＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み合わせる。その反応物を２５℃で一晩インキュベートする（１２〜１６時間）。その反応を、プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを添加することによって停止させ、３７℃で１０分インキュベートする。次いで、上記反応物５μｌを、ｃｃｄＢ遺伝子産物に対して感受性である高コンピテンス細菌（＞１×１０９ｃｆｕ／μｇ）に形質転換し、ＹＥＧ−Ｃｌ寒天プレート（Kast、P.  Gene、１３８巻（１９９４年）１０９〜１１４頁に記載の通り；ＰｈｅＳＡ２９４Ｇ対抗選択を用いる場合）または上記ベクターにおいて使用する対抗選択のための他の適切な培地に播いた。その後、コロニーを単離し、完全なゲノムについてスクリーニングする。
【０１１３】
ＰＣＲに関しては、全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＮＥＢ）を使用して実施した。Ａｄ５からアデノウイルス遺伝子（ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＧＥＮＥ）モジュールを得るためのＰＣＲは、１×ＨＦ緩衝液、各ｄＮＴＰ２００μＭ、各プライマー０．５μＭ、および鋳型１０ｎｇを用いて実施した。上記Ｅ２−Ｌ２モジュールについては、３％のＤＭＳＯも加えた。鋳型は、プラスミドｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅ２−Ｌ２モジュール、Ｌ３−Ｌ４モジュール、およびＥ４モジュールについて）またはＡｄ５ゲノムＤＮＡ（Ｅ１モジュールおよびＥ３モジュールについて）であった。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。Ｅ２−Ｌ２およびＬ３−Ｌ４：９８℃で３０秒間−９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間（２サイクルごとに温度を１℃低下）、７２℃で７分間を１０サイクル−９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で８分間を２９サイクル−７２℃で１０分間−４℃で保持。Ｅ３：９８℃で３０秒間−９８℃で１０秒間、７０℃で３０秒間（サイクルごとに温度を０．５℃低下）、７２℃で２分３０秒間を１０サイクル−９８℃で１０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で２分３０秒間を２５サイクル−７２℃で１０分間−４℃で保持。Ｅ４：９８℃で３０秒間−９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間（サイクルごとに温度を０．５℃低下）、７２℃で２分間を６サイクル−９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間を２９サイクル−７２℃で５分間−４℃で保持。
【０１１４】
精製されたウイルスからウイルスゲノムＤＮＡを得ることに関して、精製されたウイルス最大１００μｌを、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および０．２％のＳＤＳを含有する溶解緩衝液３００μｌに加える。混合物を６０℃で５分間インキュベートし、その後、プロテイナーゼＫストック（約２０ｍｇ／ｍＬ）５μｌを加え、６０℃で１時間さらにインキュベートする。次いで、試料を氷上に５分間置き、その後１５Ｋ×ｇで１５分間回転させる。上清を取り出し、等体積のイソプロパノールに加え、よく混合し、４℃、１５Ｋ×ｇで１５分間回転させる。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃で１５分間、再度回転させる。そのペレットを乾燥させ、使用するために再懸濁させる。
【０１１５】
ＳＬＩＣに関しては、線状の断片を、以下の反応物２０μｌ中、室温で２０分間エキソヌクレアーゼ処理する：５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２００ｍＭの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、および０．５μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ。その反応を、０．５ＭのＥＤＴＡを１μｌ添加することによって停止させ、その後７５℃で２０分間インキュベートする。次いで、等量のＴ４処理したＤＮＡを混合して新しいチューブ中の体積をおよそ２０μｌにする。２断片を組み合わせるＳＬＩＣのために各反応物１０μｌを使用する。３断片を組み合わせるＳＬＩＣのために各反応物７μｌを使用する。断片を、１０分間６５℃まで加熱することによってアニーリングさせ、その後、その温度を５秒ごとに０．５℃低下させて２５℃に至るまでゆっくり冷却する。アニーリング後、上記反応物５μｌを形質転換し、クローンをスクリーニングする。
【０１１６】
ＡｄＳｌｉｃＲに関しては、Ａｄ５の例について、３断片ＳＬＩＣ反応を、１００ｎｇのＴ４処理したｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ（ＰＣＲにより線形化する）、ならびに上記Ｅ２モジュールおよび上記Ｌ３モジュールのそれぞれ３００ｎｇ（それらのそれぞれのエントリーベクターからＰＣＲによって得られる）を使用して実施する。これにより、ベクターｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４が創製される。５μｇのｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４をＳｗａＩで切断し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉａｅｘＩＩを使用してゲル精製する。上記Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールを、それらのそれぞれのエントリーベクターからＰＣＲによって得る。線形化されたベクターのそれぞれ（４５０ｎｇ）およびＰＣＲ産物（２００ｎｇ）をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳＬＩＣを、ベクター１５０〜２００ｎｇおよび約１００ｎｇの各モジュールＰＣＲを用いて通常通り実施する。陽性のクローンを単離した後、新しいベクター５μｇをＰａｃＩで切断し、ゲル精製し、次いで、新しいＳＬＩＣ反応物中、Ｅ１のＰＣＲ産物（Ｔ４処理した１００ｎｇ）と組み合わせる。これによりゲノム構築が完了し、上記プラスミドについて、ウイルスを再構成するためにトランスフェクトする状態にある。
【０１１７】
Ｂ．改変アデノウイルス
アデノウイルスは、遺伝子移入の適用のために頻繁に使用される。例えば、アデノウイルスは、遺伝子治療のために、培養物中の細胞に、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物組織に、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒト細胞に、導入遺伝子を送達するために使用される。アデノウイルスのこのような使用における１つの限定因子は遺伝子発現が一過性であることである。アデノウイルスは非組み込み型のウイルスであり、したがって、細胞分裂に際して上記導入遺伝子の発現は失われる。組み込み型の他のウイルスの系、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスが、これらの同じ遺伝子移入の目的で使用される。しかし、これらの天然で組み込み型であるウイルスは小さく、したがって、発現させることができる導入遺伝子の量が限られ、高力価まで成長させることが難しく、それから複数の導入遺伝子を発現させることが難しく、また、ゲノム内のランダムな位置に組み込まれる。
【０１１８】
ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより、約２８０ｂｐのａｔｔＢ配列を含有する外来の環状ＤＮＡの、宿主細胞の染色体の偽性ａｔｔＰ部位として公知の特定の位置への組み込みが媒介され得ることが実証されている。このプロセスは、環状プラスミドＤＮＡを用いて実証されているが、アデノウイルスなどのウイルスを用いては実証されておらず、これはおそらくアデノウイルスゲノムが線状であり、したがって、組み込まれないか、または組み込みにより染色体の破壊が生じることに起因する。ここで本発明者らは、形質導入すると、上記ゲノムの一部がｌｏｘＰ部位のｃｒｅ媒介性組換えによって環状になり、したがって、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ／ａｔｔＢを介した標的化組み込みが可能になるように組換えアデノウイルスゲノムが創製される系を提供する。
【０１１９】
この技術のために、上記アデノウイルスゲノムをいくつかのやり方で改変する（図３１〜３３を参照されたい）。まず、複数の導入遺伝子の発現を可能にするために上記Ｅ１領域およびＥ３領域を欠失させる。上記Ｅ４領域を、ｃｒｅリコンビナーゼおよび上記ＰｈｉＣ３１インテグラーゼを発現しているカセットで置き換える。これらの酵素の発現は、ｔｅｔ反応性プロモーターまたは他の同様の調節可能なエレメントを用いて制御する。そのゲノム内に２つのｌｏｘＰ部位を配置し、１つは上記導入遺伝子が発現するＥ１領域の左端に、２つ目は線維と上記Ｅ４領域の間に配置する。したがって、これらの２つのｌｏｘＰ部位の間にある全てのものが細胞の染色体に挿入される。最後に、ＰｈｉＣ３１ａｔｔＢ部位を上記Ｅ３領域に配置するが、この短い配列の特定の配置は、それが上記ｌｏｘＰ部位の間にある限りは、他の位置にあってもよい（本実施例では、上記ｃｒｅリコンビナーゼおよびＰｈｉＣ３１インテグラーゼを、上記ｌｏｘＰ部位および導入遺伝子を含有する同じアデノウイルスから発現させるが、これらの酵素を別々のウイルスから発現させることもできる）。
【０１２０】
上記アデノウイルスを細胞に形質導入すると、上記ｃｒｅリコンビナーゼおよびＰｈｉＣ３１インテグラーゼが誘導される。ｃｒｅにより、上記アデノウイルスゲノム内のｌｏｘＰ部位の組換えが容易になる。これにより、上記ｌｏｘＰ部位の間に位置するＤＮＡの環状化が導かれる。次いで、これにより、上記インテグラーゼが断片内のａｔｔＢ部位を用いて環状の断片を細胞の染色体に組み換えることが可能になる（図３３参照）。その最終結果は、上記アデノウイルスゲノムの選択された部分が、その宿主細胞の染色体に、限られた数の位置の１つにおいて安定に（非可逆的に）組み込まれることである。この組み込みにより上記導入遺伝子が安定に発現される。そのプロセスにおいて１）上記Ｅ１領域を欠失させ、２）上記ウイルスゲノムの末端を欠失させているので、アデノウイルスが複製または再活性化する危険性はない。これらの領域はどちらも、ウイルスの転写および複製に必要である。
【０１２１】
既存のレトロウイルス系およびレンチウイルス系に対するこの系の利点としては、１）ランダムではなく、ゲノム内の限られた数の位置に組み込まれること、２）導入遺伝子を発現させるためのサイズの許容度が増すこと、３）線維の改変により、上記アデノウイルスを特定の細胞または組織に再標的化することができること（図３９〜４２）または他のアデノウイルス血清型および種を使用すること（図４５）、４）Ａｄｓｅｍｂｌｙ系を用いた操作が容易であること、５）高力価のウイルスを産生することが容易であること、および６）単一のベクターからの多重遺伝子発現が容易であることが挙げられる。
【０１２２】
この系は、現在のＰｈｉＣ３１組み込み技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより、製品の「Ｊｕｍｐ−Ｉｎ」として販売された）よりも、ウイルス媒介性ＤＮＡ送達の使用により進歩している。既存の技術はプラスミドベースのみであり、したがって、効率的にトランスフェクトまたは電気穿孔することができる細胞に限られる。それに加えて、既存の技術は、特定のトランスジェニックマウスを創製しない限りｉｎ  ｖｉｖｏにおいて用いることができない。アデノウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入遺伝子を送達するために常套的に使用され、したがって、これにより既存の技術の能力が著しく拡大される。１つの具体化は、力価決定が可能で標的化された特定の組織への改変アデノウイルスの送達による、多重遺伝子発現カセットを用いてのマウスモデルの創製である。別の具体化は、標的化ノックインするためのａｔｔ部位を含有するマウス系統である。別の具体化は、ｉＰＳについてである。
【０１２３】
Ｃ．Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いた、完全に野生型に近いアデノウイルス５型の創製
以下の戦略を用い、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて、野生型に近い型（version）のＡｄ５を構築した。ゲートウェイ対抗選択カセットが隣接する野生型コア配列を、野生型Ａｄ５のＥ１モジュール、野生型Ａｄ５のＥ３モジュール、および野生型Ａｄ５のＥ４モジュールと混合した（図２１）。完全に構築されたゲノムを含有するクローン単離し、２９３細胞にトランスフェクトした。７日後にプラークが明らかとなった。そのウイルスを回収し、さらなる２９３細胞において増大させた。成長分析により、この野生型に近いウイルス（真の野生型ウイルスと比較して３種のａｔｔＢ挿入を含有する）が真の野生型ウイルスよりもほんのわずかだけ低下した力価まで成長したことが明らかになった（図２８）。
【０１２４】
Ｄ．複製欠損性であり、ＧＦＰを発現し、代替の血清型由来の線維タンパク質を含有する変異体Ａｄ５の創製
本発明者らは、Ａｄｓｅｍｂｌｙを用いて変異体Ａｄ５を創製した。上記Ａｄ５のＥ１モジュールを、そのＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域が欠失し、したがって、この新しいベクターを用いて作製されるウイルスのいずれにも複製欠損するように変化させた。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを除去した後、ＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよびＧＦＰ遺伝子を含有する哺乳動物の発現カセットを挿入した。上記Ａｄ５のＥ３モジュールを、上記Ａｄ５の線維遺伝子がＡｄ３４由来の線維遺伝子で置き換えられるように変化させた。これらの変異体Ｅ１線維モジュールおよびＥ３−線維モジュールを、標準のＡｄｓｅｍｂｌｙ反応において、野生型Ａｄ５のＥ４モジュールおよびゲートウェイ対抗選択カセットが隣接する野生型Ａｄ５のコアモジュールと組み合わせた（図２１）。完全に構築されたゲノムである生じたクローンを単離し、２９３細胞にトランスフェクトした。７日後にプラークが明らかとなった。そのウイルスを回収し、さらなる２９３細胞において増大させた。このウイルスの成長により、この戦略が、Ａｄ５バックグラウンドにおける１）導入遺伝子の発現、２）蛍光遺伝子の発現、３）複製欠損ウイルスの構築、４）キメラアデノウイルスの創製、および５）代替の線維の発現のために使用することができることが示される。
【０１２５】
Ｅ．ＡｄＳｌｉｃＲを用いた複製コンピテントなＡｄ５の創製。
【０１２６】
ＡｄＳｌｉｃＲを用いて、アデノウイルス遺伝子モジュールから野生型Ａｄ５を構築した。野生型Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールは、それらのアデノウイルス遺伝子モジュールベクターからＰＣＲによって得た。これらを、標準のＳＬＩＣ反応において、ＳｗａＩで切断した野生型Ａｄ５のコアモジュールと組み合わせた（図２５）。上記Ｅ３モジュールおよびＥ４モジュールを伴うコアモジュールを首尾よく含有したクローンを単離し、ＰａｃＩで切断した。次いで、これを、第２のＳＬＩＣ反応において、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターからＰＣＲによって得た野生型Ａｄ５のＥ１モジュールと組み合わせた。完全に構築されたゲノムを含有するクローンを単離し、２９３細胞にトランスフェクトした。７日目までにプラークが明らかとなった。生じたウイルスを、さらなる２９３細胞において増大させた。このウイルスの成長分析により、このウイルスが野生型Ａｄ５と同じ力価まで成長することが明らかになった（図２８）。
【０１２７】
Ｖ．表
表１〜９には、本明細書において提供される方法を用いて調製したアデノウイルス遺伝子モジュールベクター、デスティネーションベクターおよびエントリーベクターの例が開示されている。
【０１２８】
【表１−１】
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【０１２９】
【表１−２】
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【０１３０】
【表１−３】
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【０１３１】
【表１−４】
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【０１３２】
【表１−５】
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【０１３３】
【表１−６】
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【０１３４】
【表２−１】
0005981916.tif 000009
【０１３５】
【表２−２】
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【０１３６】
【表２−３】
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【０１３７】
【表２−４】
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【０１３８】
【表３−１】
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【０１３９】
【表３−２】
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【０１４０】
【表３−３】
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【０１４１】
【表４】
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【０１４２】
【表５】
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【０１４３】
【表６】
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【０１４４】
【表７−１】
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【０１４５】
【表７−２】
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【０１４６】
【表８】
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【０１４７】
【表９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ）】
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【図２４Ｂ）】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４１】
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【図４３】
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【図２】
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【図１８】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３４】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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