(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を標的遺伝子とし、カナマイシン耐性遺伝子を相同組換えによって宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、モーレラ（Moorella）属細菌の遺伝子組換え方法であって、
前記相同組換えが、前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域が、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、前記カナマイシン耐性遺伝子を発現するように連結され、かつ、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域および前記カナマイシン耐性遺伝子が前記上流領域、前記下流領域または前記上流領域と前記下流領域との間に配置された相同組換用ベクターを用いて行われる、モーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項２】
前記相同組換用ベクターが、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の塩基配列をさらに含み、
前記ｐｙｒＦが前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、
前記ｐｙｒＦがその本来の発現プロモーターによって発現されるように連結された相同組換えベクターを用いて行われる、請求項１に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項３】
前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列をさらに含み、
前記外来遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現される、請求項１または２に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項４】
前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列と、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーター領域の塩基配列とをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーター領域に含まれる発現プロモーターによって発現される、請求項１または２に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項５】
前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項４に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項６】
前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項３〜５のいずれか１項に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項７】
前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項８】
前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法によって得られる遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１０】
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に、カナマイシン耐性遺伝子が配置され、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーターが配置され、前記カナマイシン耐性遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現される、遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１１】
さらに、前記Ｇ３ＰＤプロモーターの下流、かつ、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流または下流に、外来遺伝子が位置し、前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、請求項１０に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１２】
さらに、前記Ｇ３ＰＤプロモーターと前記カナマイシン耐性遺伝子との間を除く、前記ｐｙｒＦの上流または下流に、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターと、外来遺伝子とが位置し、前記発現プロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、請求項１０に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１３】
前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１２に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１４】
前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１５】
前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項１６】
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を標的遺伝子とし、カナマイシン耐性遺伝子を相同組換えによって宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むための相同組換用ベクターであって、
前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域が、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、前記カナマイシン耐性遺伝子を発現するように連結され、かつ、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域および前記カナマイシン耐性遺伝子が前記ｐｙｒＦの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置された、相同組換用ベクター。
【請求項１７】
前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子をさらに含み、かつ、前記外来遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現される、請求項１６に記載の相同組換用ベクター。
【請求項１８】
前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現される、請求項１６に記載の相同組換用ベクター。
【請求項１９】
前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１８に記載の相同組換用ベクター。
【請求項２０】
前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の相同組換用ベクター。
【請求項２１】
前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の相同組換用ベクター。
【請求項２２】
前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の相同組換用ベクター。
【請求項２３】
宿主モーレラ属細菌と同一株またはその野生株のモーレラ属細菌および大腸菌のいずれでも増殖可能なシャトルベクターである、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の相同組換用ベクター。
【請求項２４】
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を標的遺伝子とし、カナマイシン耐性遺伝子を相同組換えによって宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むための相同組換用ベクターの作製方法であって、
前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域が、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、前記カナマイシン耐性遺伝子を発現するように連結され、かつ、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域および前記カナマイシン耐性遺伝子が前記ｐｙｒＦの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置された相同組換え領域を、骨格となるプラスミドベクターに組み込む工程を備える、相同組換用ベクターの作製方法。
【請求項２５】
前記相同組換え領域が、外来遺伝子をさらに含み、かつ、前記外来遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現されるように配置された、請求項２４に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【請求項２６】
前記相同組換え領域が、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現されるように配置され、かつ、前記外来遺伝子および前記発現プロモーターが前記ｐｙｒＦの上流領域または下流領域に配置された、請求項２４に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【請求項２７】
前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項２６に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【請求項２８】
前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【請求項２９】
前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【請求項３０】
前記プラスミドベクターが宿主モーレラ属細菌と同一株またはその野生株のモーレラ属細菌および大腸菌のいずれでも増殖可能なシャトルベクターである、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はモーレラ（Moorella）属細菌の遺伝子組換え法に関する。より詳細には、本発明は、抗生物質耐性遺伝子をマーカー遺伝子として用いるモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法、その方法によって得られる遺伝子組換えモーレラ属細菌ならびに宿主モーレラ属細菌株で発現する抗生物質耐性遺伝子を導入した相同組換用ベクターおよびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モーレラ（Moorella）属細菌は、合成ガス（Ｈ２＋ＣＯ２＋ＣＯ）からの物質生産における宿主として有望である。
【０００３】
モーレラ属細菌の遺伝子組換え方法としては、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｙｒＥ）をマーカー遺伝子として用いる方法がある（特許文献１）。
【０００４】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、オロト酸とホスホリボシルピロリン酸からオロチジル酸を合成する酵素であり、オロチジル酸デカルボキシラーゼと共に、ウリジル酸（ウリジン−リン酸、ＵＭＰ）合成酵素の部分反応を構成する。チミン、シトシンおよびウラシル等のピリミジン塩基は、ウリジル酸を中心に相互変換されるため、ｐｙｒＥを破壊した菌株は、ウラシル要求性変異株となる。このウラシル要求性変異株に、ｐｙｒＥおよび外来遺伝子を相同組換えによって導入すると、外来遺伝子を持つ遺伝子組換え株を得ることができ、ｐｙｒＥの有無、すなわちウラシル要求性によって、外来遺伝子が導入された遺伝子組換え株をスクリーニングすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１７１３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ｐｙｒＥをマーカー遺伝子として用いるモーレラ属細菌の遺伝子組換え法では、宿主としてｐｙｒＥ破壊株を用いる必要があるため、より簡便に遺伝子組換えを行いたいという要望に応えることができなかった。
【０００７】
一方、遺伝子組換え株のスクリーニングにおいて、抗生物質耐性遺伝子がマーカー遺伝子として繁用されているが、モーレラ属細菌では、従来、抗生物質耐性遺伝子をマーカー遺伝子として用いる遺伝子組換え方法は存在していなかった。
【０００８】
そこで、本発明は、抗生物質耐性遺伝子をマーカー遺伝子として用いるモーレラ（Moorella）属細菌の遺伝子組換え方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねたところ、モーレラ属細菌株のゲノムの、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）領域に、抗生物質耐性遺伝子およびそれを発現する宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来するＧ３ＰＤ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターを、相同組換えによって導入すると、抗生物質耐性株を得ることができることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３０）を提供する。
【００１０】
（１）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を標的遺伝子とし、カナマイシン耐性遺伝子を相同組換えによって宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、モーレラ（Moorella）属細菌の遺伝子組換え方法であって、
前記相同組換えが、前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域が、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、前記カナマイシン耐性遺伝子を発現するように連結され、かつ、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域および前記カナマイシン耐性遺伝子が前記上流領域、前記下流領域または前記上流領域と前記下流領域との間に配置された相同組換用ベクターを用いて行われる、モーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（２）前記相同組換用ベクターが、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の塩基配列をさらに含み、
前記ｐｙｒＦが前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、
前記ｐｙｒＦがその本来の発現プロモーターによって発現されるように連結された相同組換えベクターを用いて行われる、上記（１）に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（３）前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列をさらに含み、
前記外来遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現される、上記（１）または（２）に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（４）前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列と、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーター領域の塩基配列とをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーター領域に含まれる発現プロモーターによって発現される、上記（１）または（２）に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（５）前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記（４）に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（６）前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記（３）〜（５）のいずれか１つに記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（７）前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（８）前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子である、上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法によって得られる遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１０）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に、カナマイシン耐性遺伝子が配置され、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーターが配置され、前記カナマイシン耐性遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現される、遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１１）さらに、前記Ｇ３ＰＤプロモーターの下流、かつ、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流または下流に、外来遺伝子が位置し、前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、上記（１０）に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１２）さらに、前記Ｇ３ＰＤプロモーターと前記カナマイシン耐性遺伝子との間を除く、前記ｐｙｒＦの上流または下流に、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターと、外来遺伝子とが位置し、前記発現プロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、上記（１０）に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１３）前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記（１２）に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１４）前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記（１１）〜（１３）のいずれか１つに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１５）前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、上記（１０）〜（１４）のいずれか１つに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（１６）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を標的遺伝子とし、カナマイシン耐性遺伝子を相同組換えによって宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むための相同組換用ベクターであって、
前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域が、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、前記カナマイシン耐性遺伝子を発現するように連結され、かつ、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域および前記カナマイシン耐性遺伝子が前記ｐｙｒＦの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置された、相同組換用ベクター。
（１７）前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子をさらに含み、かつ、前記外来遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現される、上記（１６）に記載の相同組換用ベクター。
（１８）前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現される、上記（１６）に記載の相同組換用ベクター。
（１９）前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記（１８）に記載の相同組換用ベクター。
（２０）前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記（１７）〜（１９）のいずれか１つに記載の相同組換用ベクター。
（２１）前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、上記（１７）〜（２０）のいずれか１つに記載の相同組換用ベクター。
（２２）前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子である、上記（１７）〜（２１）のいずれか１つに記載の相同組換用ベクター。
（２３）宿主モーレラ属細菌と同一株またはその野生株のモーレラ属細菌および大腸菌のいずれでも増殖可能なシャトルベクターである、上記（１６）〜（２２）のいずれか１つに記載のベクター。
（２４）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を標的遺伝子とし、カナマイシン耐性遺伝子を相同組換えによって宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むための相同組換用ベクターの作製方法であって、
前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域が、前記カナマイシン耐性遺伝子の上流に、前記カナマイシン耐性遺伝子を発現するように連結され、かつ、前記Ｇ３ＰＤプロモーター領域および前記カナマイシン耐性遺伝子が前記ｐｙｒＦの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置された相同組換え領域を、骨格となるプラスミドベクターに組み込む工程を備える、相同組換用ベクターの作製方法。
（２５）前記相同組換え領域が、外来遺伝子をさらに含み、かつ、前記外来遺伝子が前記Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現されるように配置された、上記（２４）に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
（２６）前記相同組換え領域が、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現されるように配置され、かつ、前記外来遺伝子および前記発現プロモーターが前記ｐｙｒＦの上流領域または下流領域に配置された、上記（２４）に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
（２７）前記発現プロモーターが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記（２６）に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
（２８）前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記（２５）〜（２７）のいずれか１つに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
（２９）前記カナマイシン耐性遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子である、上記（２４）〜（２８）のいずれか１つに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
（３０）前記プラスミドベクターが宿主モーレラ属細菌と同一株またはその野生株のモーレラ属細菌および大腸菌のいずれでも増殖可能なシャトルベクターである、上記（２４）〜（２９）のいずれか１つに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、抗生物質耐性遺伝子をマーカー遺伝子として用いるモーレラ（Moorella）属細菌の遺伝子組換え方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、大腸菌から抽出したプラスミドの制限酵素（ＨｉｎｃＩＩおよびＮｃｏＩ）消化物およびｋａｎｒ遺伝子領域のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルで電気泳動して得られた電気泳動像である（レーン１〜５：制限酵素消化物、レーン６〜１０：ＰＣＲ増幅産物、Ｍ：１０ｋｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ）。
【図２】図２（Ａ）は、野生株（レーン１，４）およびｋａｎｒ導入候補株（レーン２，５：組換株１／レーン３，６：組換株２）の、ｐｙｒＦ上流領域からｋａｎｒ部分までのＰＣＲ増幅産物（レーン１〜３）、およびＭｏｔｈ＿２２８１遺伝子のＰＣＲ増幅産物（レーン４〜６）をアガロースゲルで電気泳動して得られた電気泳動像である（レーンＭ：１０ｋｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ）。図２（Ｂ)は、野生株（レーン１，４）およびｋａｎｒ導入候補株（レーン２，５：組換株１／レーン３，６：組換株２）の、ｐｙｒＦ上流領域からｐｙｒＦ下流領域までの部分のＰＣＲ増幅産物（レーン１〜３）、およびそのＰＣＲ産物の制限酵素（ＫｐｎＩ）消化物（レーン４〜６）をアガロースゲルで電気泳動して得られた電気泳動像である（レーンＭ：１０ｋｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ）。
【図３】図３は、野生株（■）およびｋａｎｒ導入株（●：組換株１，▲：組換株２）の、カナマイシン存在下での菌体濁度の経時的変化を表すグラフである。（Ａ）：カナマイシン濃度２００μｇ／ｍＬ、（Ｂ）：カナマイシン濃度３００μｇ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、宿主モーレラ属細菌株を、前記宿主モーレラ属細菌株で発現する抗生物質耐性遺伝子を含む相同組換用ベクターを用いて形質転換する工程を含むモーレラ（Moorella）属細菌の遺伝子組換え方法（以下「本発明の遺伝子組換え方法」という場合がある。）を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記モーレラ属細菌の遺伝子組換え方法によって得られる遺伝子組換えモーレラ属細菌（以下「本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌」という場合がある。）を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、上記モーレラ属細菌の遺伝子組換え方法に用いることができる、宿主モーレラ属細菌株で発現する抗生物質耐性遺伝子を含む相同組換用ベクター（以下「本発明の遺伝子組換え用ベクター」という場合がある。）を提供する。
【００１６】
本発明の遺伝子組換え方法は、所望により、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）破壊と組み合わせ、抗生物質耐性およびウラシル要求性をマーカーとして用いることができるモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法を提供することもできる。
【００１７】
本発明の遺伝子組換え方法は、所望により、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｙｒＥ）破壊と組み合わせ、抗生物質耐性およびウラシル要求性をマーカーとして用いることができるモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法を提供することもできる。
【００１８】
［モーレラ属細菌］
遺伝子組換えを行うモーレラ属細菌（本発明において「宿主モーレラ属細菌」ともいう。）は、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（M. thermoautotrophica）、モーレラ・グリセリニ（M. glycerini）もしくはモーレラ・ムルデリ（M. mulderi）に分類される細菌または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されない。
【００１９】
好ましいモーレラ属細菌としては、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株およびその遺伝子組換え株、モーレラ  ｓｐ．（クロストリジウム  ｓｐ．）  ＨＵＣ  ２２−１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター  ＦＥＲＭＰ−１８８５２）およびその遺伝子組換え株等が挙げられる。ここで、ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）を表す。
【００２０】
モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株の遺伝子組換え株としては、ＡＴＣＣ  ３９０７３株の、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）破壊変異株であるＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７株、ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７株のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）および乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子導入変異株（Ｔ−ｌｄｈ導入株）であるＮＩＴＥ−Ｐ１１５４株等が挙げられる。
【００２１】
モーレラ  ｓｐ．  ＨＵＣ  ２２−１株の遺伝子組換え株としては、ＨＵＣ  ２２−１株の、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｙｒＥ）破壊変異株である、ＮＩＴＥ  Ｐ−６０６株等が挙げられる。
【００２２】
ここで、細菌分類学的にモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属に分類される細菌とは、ＩＪＳＥＭ（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology）誌にモーレラ（Moorella）属として発表された細菌またはバージェイズ・マニュアル（De Vos, Paul、外７名編、"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"、第２版、第３巻、米国、シュプリンガー、２００９年）に従って分類した場合にモーレラ属に分類することが適当であると認められる細菌をいう。
【００２３】
本発明においては、宿主モーレラ属細菌株に遺伝子組換えを行った結果作製されるモーレラ属細菌は、形態、資化性、醗酵性その他の表現形質が種の定義に合致しない場合であっても、宿主モーレラ属細菌と同種とみなす。
【００２４】
（モーレラ属細菌種）
本発明において、モーレラ属細菌の種レベルの分類群に着目する場合、モーレラ属細菌種、宿主モーレラ属細菌種という場合がある。
【００２５】
（モーレラ属細菌株）
本発明において、モーレラ属細菌の株レベルの分類群に着目する場合、モーレラ属細菌株、宿主モーレラ属細菌株という場合がある。
【００２６】
［抗生物質耐性遺伝子］
宿主モーレラ属細菌のゲノムに導入される抗生物質耐性遺伝子は、特に限定されないが、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
【００２７】
上記構成物質耐性遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするカナマイシン耐性遺伝子が好ましく、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子がより好ましい。
【００２８】
なお、本発明において、遺伝コードは標準コードと一部異なり、翻訳開始コドンとして、ＡＴＧ（ＡＵＧ）の他、ＴＴＧ（ＵＵＧ）、ＣＴＧ（ＣＵＧ）、ＧＴＧ（ＧＵＧ）、ＡＴＴ（ＡＵＵ）、ＡＴＣ（ＡＵＣ）、ＡＴＡ（ＡＵＡ）も使用され得る。翻訳開始コドンとして使用されるときはメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）をコードするが、翻訳開始コドン以外として使用されるときは、標準コードと同じく、ＴＴＧ（ＵＵＧ）およびＣＴＧ（ＣＵＧ）はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）を、ＡＴＴ（ＡＵＵ）、ＡＴＣ（ＡＵＣ）およびＡＴＡ（ＡＵＡ）はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）を、ＧＴＧ（ＧＵＧ）はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）を、それぞれコードする。
【００２９】
また、本発明においては、上記抗生物質耐性遺伝子は、その上流に導入されるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）により発現される。
【００３０】
［グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）］
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（リン酸化）（ＧＡＰＤＨ，ＥＣ  １．１．１．１２）は、解糖系／糖新生に関与する酵素であり、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸と１，３−ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し（下記反応式）、常時発現している。
【００３１】
【化１】
0005963538.tif 000002
【００３２】
宿主モーレラ属細菌のゲノムに導入されるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）は、宿主モーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、宿主モーレラ属細菌株もしくはその野生株（宿主モーレラ属細菌株が野生株でない場合に限る。）に由来するもの、または宿主モーレラ属細菌株もしくはその野生株（宿主モーレラ属細菌株が野生株でない場合に限る。）のＧ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列と同一であるもの、が好ましい。
【００３３】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列は、配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれるものが好ましい。
【００３４】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターは、その周辺の領域とともに宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれてもよく、Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が上記抗生物質耐性遺伝子の上流に直接連結されて宿主モーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流領域または下流領域に組み込まれることが好ましい。
【００３５】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域は、上記Ｇ３ＰＤプロモーターが上記ＬＤＨ遺伝子を発現しうるものであれば、Ｇ３ＰＤプロモーター部分以外のＤＮＡ塩基配列は特に限定されないが、上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域のＤＮＡ塩基配列としては、そのＧ３ＰＤプロモーターが由来する菌株のＧ３ＰＤプロモーターおよびその周辺領域のＤＮＡ塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号３のＤＮＡ塩基配列からなるものがより好ましい。
【００３６】
［オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）］
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ，ＥＣ  ４．１．１．２３）をコードする遺伝子である。
【００３７】
ＯＭＰデカルボキシラーゼは、ピリミジンの生合成に関与する酵素であり、オロチジンモノリン酸（ＯＭＰ）を脱炭酸してウリジンモノリン酸（ＵＭＰ）に変換する反応を触媒する（下記化学式）。この酵素はウリジン三リン酸およびシチジン三リン酸のｄｅ  ｎｏｖｏの生合成に不可欠である。したがって、ｐｙｒＦが破壊された菌株は、ウラシル要求性変異株となる。
【００３８】
【化２】
0005963538.tif 000003
【００３９】
上記オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）は、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、宿主モーレラ属細菌株に由来するものであってもよいし、外来性のｐｙｒＦであってもよい。
【００４０】
外来性のｐｙｒＦとしては、宿主モーレラ属細菌種と同一種の細菌に由来するものが好ましく、宿主モーレラ属細菌株と同一株またはその野生株（宿主モーレラ属細菌株が野生株でない場合に限る。）に由来するものがより好ましい。
【００４１】
上記ｐｙｒＦとしては、配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするものが好ましく、そのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなるものがより好ましい。
【００４２】
本発明の遺伝子組換え方法によれば、モーレラ属細菌のゲノムにおいて、ｐｙｒＦの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域とのあいだに、Ｇ３ＰＤプロモーター領域および抗生物質耐性遺伝子が導入されるが、遺伝子組換体にウラシル要求性を付与しない場合には、ｐｙｒＦ、Ｇ３ＰＤプロモーターおよび抗生物質耐性遺伝子の配置は、Ｇ３ＰＤプロモーターおよび抗生物質耐性遺伝子がｐｙｒＦの上流領域または下流領域に導入された配置であって、ｐｙｒＦおよび抗生物質耐性遺伝子が正常に発現する配置であれば特に限定されない。
【００４３】
また、本発明の遺伝子組換え方法においては、抗生物質耐性遺伝子を宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むのと同時に、ｐｙｒＦを破壊することもできる。具体的には、例えば、相同組換用ベクターに含まれるｐｙｒＦの塩基配列を欠損または改変し、宿主モーレラ属細菌で正常なオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼを発現できなくすることによって、宿主モーレラ属細菌のｐｙｒＦを破壊することができる。
【００４４】
［相同組換用ベクター］
本発明の遺伝子組換え方法で用いる相同組換用ベクターは、骨格となるプラスミドベクターと相同組換え領域とを有する。
【００４５】
〈相同組換え領域〉
上記相同組換え領域は、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流領域および下流領域、抗生物質耐性遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が上記抗生物質耐性遺伝子の上流に上記抗生物質耐性遺伝子を発現するように連結され、上記Ｇ３ＰＤプロモーターおよび上記抗生物質耐性遺伝子が、上記ｐｙｒＦの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置されたものが好ましく、上流領域または下流領域に配置されたものがより好ましい。
【００４６】
ｐｙｒＦ、Ｇ３ＰＤプロモーターおよび抗生物質耐性遺伝子は、上記したとおりである。
【００４７】
上記相同組換え領域は、さらに、外来遺伝子を、所望により、その外来遺伝子を発現するための宿主モーレラ属細菌種に由来する発現プロモーターとともに、含んでもよい。
【００４８】
上記外来遺伝子は、特に限定されないが、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成に関与する遺伝子が好ましい。
上記エタノール合成系に関与する遺伝子は、特に限定されないが、具体的には、例えば、ピルビン酸の脱炭酸を触媒するピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が挙げられる。
上記ピルビン酸合成系に関与する遺伝子は、特に限定されないが、具体的には、例えば、ピルビン酸と乳酸との相互変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挙げられる。
【００４９】
上記発現プロモーターは、宿主モーレラ属細菌種と同一のモーレラ属細菌種に由来し、上記外来遺伝子を発現するものであれば特に限定されないが、ＣＯデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルｔＲＮＡシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つが好ましい。これらが発現する遺伝子は常時発現している遺伝子であるので、高い発現効率を得ることができるからである。
【００５０】
〈骨格となるプラスミドベクター〉
上記骨格となるプラスミドベクターは特に限定されないが、宿主モーレラ属細菌株および他の細菌の両方で増殖することができるシャトルベクターが好ましい。前記他の細菌としては、例えば、大腸菌を挙げることができる。
【００５１】
上記骨格となるプラスミドベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＫ１８、ｐＫ１９、ｐＫ１８ｍｏｂ、ｐＫ１９ｍｏｂ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ系プラスミド等が挙げられる。
【００５２】
［形質転換］
上記相同組換用ベクターを上記ｐｙｒＦ破壊株に形質転換をする方法は特に限定されず、相同組換用ベクターの骨格となるプラスミドベクターに合わせて適宜選択することが好ましい。本発明の遺伝子組換え方法においては、エレクトロポレーションが好ましい方法の一つである。
【００５３】
［遺伝子組換えモーレラ属細菌］
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌は、本発明の遺伝子組換え方法によって作製される遺伝子組換えモーレラ属細菌であれば特に限定されない。
【００５４】
上記方法によって形質転換をして製造されたモーレラ属細菌としては、好ましくは、受領番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３５４」として、独立行政法人製品技術評価基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託申請されている「ＭＴＡ−ｋａｎｒ株」が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
本実施例では、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株（以下、「野生株」または「ＷＴ」という場合がある。）のｐｙｒＦ破壊株である、ウラシル要求性変異株（以下、単に「ｐｙｒＦ破壊株」または「ｄｐｙｒＦ株」という場合がある。）に、ＡＴＣＣ  ３９０７３株由来のｐｙｒＦ、ｐＩＫＭ１由来のカナマイシン耐性遺伝子（以下、単に「ｋａｎｒ」という場合がある。）およびｋａｎｒを発現するためのＡＴＣＣ  ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を導入して、ウラシル要求性の除去およびカナマイシン耐性の付与を行い、カナマイシン耐性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌（ｋａｎｒ導入株）を作製した。
【００５６】
１．ｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）の作製
モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを破壊し、ウラシル要求性変異株を作製した。
【００５７】
（１）遺伝子破壊ベクターｐＫ１８−ｄｐｙｒＦの構築
以下の手順でモーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｐｙｒＦを破壊するためのベクターを構築した。
【００５８】
［遺伝子破壊ベクターｐＫ１８−ｄｐｙｒＦの構築］
モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株を完全合成培地（改変ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ  Ｍｅｄｉｕｍ、表２２Ａを参照）に植菌し、５５℃で嫌気的に培養した。
培養後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いてトータルＤＮＡを抽出した。
【００５９】
まず、表１に示したプライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６：5'-tgacgttctagaccctacctctccaagattacc-3'）とｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１（配列番号７：5'-tgacgtactagtggcaagcaggccagaag-3'）との組合せ、およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１（配列番号８：5'-tgacgtactagtaacttcggcctgctttcatgc-3'）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９：5'-tgacctgatatctgtccaagcttatgcaccttcc-3'）との組合せを用いて、表２に示す反応液の組成で、表３に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦの上流領域および下流領域のそれぞれ約１０００ｂｐを増幅した。表２において、プライマーＦとプライマーＲとの組合せは、上記組合せである。また、テンプレートＤＮＡは、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のトータルＤＮＡである。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【００６０】
【表１】
0005963538.tif 000004
【００６１】
【表２】
0005963538.tif 000005
【００６２】
【表３】
0005963538.tif 000006
【００６３】
プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）およびｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１（配列番号７）は、ｐｙｒＦの上流の隣接領域を増幅し、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１（配列番号８）およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）は、ｐｙｒＦの下流の隣接領域を増幅する。
【００６４】
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理した後に、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｅｒ  Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて精製を行い、ｐｙｒＦ上流領域のＰＣＲ産物を５μＬ、下流領域のＰＣＲ産物を５μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡）を１０μＬ混合し、１６℃で３０分間インキュベートし、ライゲーション産物をテンプレートＤＮＡとして、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）およびｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１（配列番号７）を用いて、表４に示す反応液組成で、表５に示す条件でＰＣＲを行った。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【００６５】
【表４】
0005963538.tif 000007
【００６６】
【表５】
0005963538.tif 000008
【００６７】
得られたＰＣＲ産物をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った後、２μＬのＳｍａＩ処理をしたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く撹拌した後、氷中に１０分静置し、４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【００６８】
ＳＯＣ培地を１ｍＬ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫し、３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００６９】
［遺伝子破壊ベクターの確認］
上記「遺伝子破壊ベクターｐｋ１８−ｄｐｙｒＦの構築」で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したＬＢ培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表１に示すｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆｌ（配列番号６）、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの反応液組成を表６に、反応条件を表７に示す。コロニーを反応液に入れてＰＣＲを行った。なお、ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （２×Ｐｒｅｍｉｘ）および滅菌蒸留水は、ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。
【００７０】
【表６】
0005963538.tif 000009
【００７１】
【表７】
0005963538.tif 000010
【００７２】
得られたＰＣＲ産物について、電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【００７３】
吸光度による濃度測定および電気泳動による確認後、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的の遺伝子破壊ベクターｐｋ１８−ｄｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
【００７４】
（２）ｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）の作製
上記（１）で構築した遺伝子破壊ベクターｐＫ１８−ｄｐｙｒＦを、以下の手順で、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってｐｙｒＦが破壊された株（ｄｐｙｒＦ株）を選抜した。
【００７５】
［ＡＴＣＣ  ３９０７３株への遺伝子破壊ベクターの導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ  ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ７に合わせたＨＳ緩衝液を調製し、２０分間Ｎ２ガスで溶存酸素を置換した。
【００７６】
８０％の水素、２０％の二酸化炭素の混合ガスを基質とし、改変型ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ培地、またはグリシンを終濃度５ｇ／Ｌになるように添加した改変型ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ培地で、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株を培養した。
【００７７】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．３になるまで培養し、培養液約１００ｍＬ分を集菌した後、ＨＳ緩衝液で菌体を２回洗浄した。
【００７８】
洗浄した菌体を適当な量のＨＳ緩衝液（約３ｍＬ）に懸濁し、懸濁液３８０μＬとプラスミド２０μＬとを混合した。
【００７９】
Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭエレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）および電極間距離（ギャップ）０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の懸濁液を、ピルビン酸４０ｍＭの終濃度で添加した５ｍＬの培地に植菌し、５５℃で２日間培養後に、ウラシル１０μｇ／ｍＬ、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）０．２％の終濃度で添加した寒天培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【００８０】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）の確認］
上記寒天培地に形成された２０個のコロニーを、５ｍＬのウラシル１０μｇ／ｍＬ、５−ＦＯＡ  ０．２％の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養３日目に培地が濁っていることが確認できた６株を選択し、培養液１ｍＬを集菌した。
【００８１】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ／ｍＬ）＋リゾチーム（２０ｍｇ／ｍＬ）の入ったＴＥ緩衝液  ２０μＬで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートし、ＤＭＳＯを２０μＬ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【００８２】
下記表に示すプライマーのうち、ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ２（配列番号１０：5'-tgtcctcaacaccctcacc-3'）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ２（配列番号１１：5'-tcttcccaggtcctgtagg-3'）、ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ３（配列番号１２：5'-tgtcctcaacaccctcacc-3'）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ３（配列番号１３：5'-tcttcccaggtcctgtagg-3'）、またはｐｙｒＦ−Ｆ（配列番号１４：5'-acctgaagttccacgacatcc-3'）とｐｙｒＦ−Ｒ（配列番号１５：5'-ggtcacgatgacgaactc-3'）との組合せを用い、各々の組合せについて、表９に示す反応液組成で、表１０に示す反応条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行い、電気泳動によりバンドを確認した。表９において、プライマーＦとプライマーＲとの組合せは、上記組合せである。また、コロニーを反応液に入れてＰＣＲを行った。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【００８３】
【表８】
0005963538.tif 000011
【００８４】
【表９】
0005963538.tif 000012
【００８５】
【表１０】
0005963538.tif 000013
【００８６】
ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを２０株選択し、液体培地（１０μｇ／ｍＬ  ウラシル、０．２％  ５−ＦＯＡ）にて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトＰＣＲによる確認を行った。
【００８７】
培養３日目に増殖が確認できた６株について、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ２（配列番号１０）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ２（配列番号１１）との組合せ、またはｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ３（配列番号１２）とｐｙｒ−ｄｎ−Ｒ３（配列番号１３）との組合せを用いて、ｐｙｒＦの外側からＰＣＲを行ったところ、６株中１株において、野生株よりも短いバンドが確認できた。
【００８８】
さらに、プライマーｐｙｒ−Ｆ（配列番号１４）とｐｙｒＦ−Ｒ（配列番号１５）との組合せを用いて、ｐｙｒＦの内側をＰＣＲしたところ、前述の株においてはバンドが確認できなかった。
【００８９】
これらの結果から、野生株よりも短いバンドを確認できた株がｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）である可能性があると判断し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った後に、もう一度ＰＣＲを行った。その結果、ダイレクトＰＣＲの際と同様のバンドパターンが得られた。
【００９０】
さらに、ｐｙｒＦが破壊された部分には、制限酵素ＳｐｅＩサイトが１カ所付与されることから（プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１参照）、上記のＰＣＲ産物についてＳｐｅＩで消化したところ、ＳｐｅＩサイトで切断が起こり、バンドが２本になることを確認した。
【００９１】
次に、ｐｙｒＦ破壊候補株についてウラシル要求性試験を行った。酵母エキスを除いた改変型ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ培地に、ｐｙｒＦ破壊株を植菌し、１０μｇ／ｍＬの終濃度でウラシルを添加した場合と添加しなかった場合とで増殖の確認を行った。
【００９２】
その結果、ウラシルを添加したサンプルでは、培養２日目には菌体の増殖が確認できたが、ウラシルを添加しなかったサンプルにおいては、増殖が確認できなかった。これらの結果から、ｐｙｒＦの破壊が確認できた。
【００９３】
このｐｙｒＦ破壊株（ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株）は、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
【００９４】
２．カナマイシン耐性遺伝子導入用相補ベクターｐＫ１８−ｋａｎｒの構築
（１）ｐＫ１８−ｌｄｈの作製
（１−１）ｐＫ１８−ｅｐｙｒＦの作製
モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株を完全合成培地（改変ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ  Ｍｅｄｉｕｍ、表２２Ａを参照）に植菌し、５５℃で嫌気的に培養した。
培養後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いてトータルＤＮＡを抽出した。
【００９５】
ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）との組み合わせを用いて、以下の条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂの遺伝子断片を増幅した。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【００９６】
【表１１】
0005963538.tif 000014
【００９７】
【表１２】
0005963538.tif 000015
【００９８】
得られたＰＣＲ産物についてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った。
２μＬのＳｍａＩ処理をしたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６°Ｃで１時間インキュベートした。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く攪拌した。
氷中に１０分静置した。
４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
ＳＯＣ培地を１  ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫した。
３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００９９】
［ｐｙｒＦ相補ベクターの確認］
上記（１）で生育が見られたコロニーをカナマイシン添加ＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーはｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を以下に示す。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１００】
【表１３】
0005963538.tif 000016
【０１０１】
【表１４】
0005963538.tif 000017
【０１０２】
電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
【０１０３】
（１−２）ｐＫ１８−ｌｄｈの作製
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株の乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｔ−ｌｄｈ）を取得し、上記（２）で構築したｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦのｐｙｒＦ遺伝子領域へ挿入し、Ｔ−ｌｄｈ遺伝子導入用相補ベクターｐＫ１８−ｌｄｈを構築することを目的とした。
【０１０４】
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株のＴｏｔａｌ  ＤＮＡ、およびプライマーｐｙｒＦ−１７６５−Ｆ（配列番号１６：5'-tcggcctgctttcatgcttg-3'）とｐｙｒＦ−１７６４−Ｒ（配列番号１７：5'-agttattatttcaccatctctatttc-3'）とを用いて、ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦを鋳型として、ｐｙｒＦ領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１０５】
【表１５】
0005963538.tif 000018
【０１０６】
【表１６】
0005963538.tif 000019
【０１０７】
プライマーＧ３ＰＤ−Ｆ１１（配列番号１８：5'-ggtgaaataataactggacggttgccaagtacc-3'）とＧ３ＰＤ−ＳＤ−Ｒ１２（配列番号１９：5'-tatgtactcctccttatatttattgtaacg-3'）とを用いて、ＡＴＣＣ  ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＳＤ配列を含むプロモーター領域（Ｇ３ＰＤプロモーター領域）を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１０８】
【表１７】
0005963538.tif 000020
【０１０９】
【表１８】
0005963538.tif 000021
【０１１０】
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株のＴｏｔａｌ  ＤＮＡ、およびプライマーｌｄｈ−Ｆ−１（配列番号２０：5'-aaggaggagtacataatgaacaaaatatctataataggttc-3'）とｌｄｈ−Ｒ−１（配列番号２１：5'-atgaaagcaggccgattatatatcaagctcttgtattacac-3'）との組合せを用いて、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株の乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｔ−ｌｄｈ）を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応終了後、各ＰＣＲ産物をゲル抽出した。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１１１】
【表１９】
0005963538.tif 000022
【０１１２】
【表２０】
0005963538.tif 000023
【０１１３】
下記表に記載の反応溶液でＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。反応条件は、３７℃３０分→５０℃１５分とした。なお、５×  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  バッファーおよびＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ）  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。
【０１１４】
【表２１】
0005963538.tif 000024
【０１１５】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μｌ加えて希釈した。
希釈したサンプル１０μｌを形質転換に用いた。
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
【０１１６】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。
ｌｄｈ−Ｆ−１およびｌｄｈ−Ｒ−１をプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＰｓｔＩ）処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてＴ−ｌｄｈの挿入が確認できた。
【０１１７】
完全合成培地の組成を表２２Ａに示す。炭素源としてフルクトースを添加する場合には終濃度５ｇ／Ｌで、ウラシルを添加する場合には終濃度０．０１ｇ／Ｌで、それぞれ添加した（特に断りがある場合を除く）。また、ロールチューブ法に用いる場合には、Ａｇａｒ高温用２０ｇ／Ｌを添加した。
【０１１８】
【表２２】
0005963538.tif 000025
【０１１９】
（２）相補ベクターｐＫ１８−ｋａｎｒの作製
（２−１）ｐＫ１８−ｌｄｈを鋳型として、プライマーｐｙｒＦ−ｌｄｈ−ｉｎｖ−Ｆ（配列番号２４）とｐｙｒＦ−ｌｄｈ−ｉｎｖ−Ｒ（配列番号２５）との組合せを用いて、ｐｙｒＦ領域を含む領域をＰＣＲ増幅し、線状ベクターを得た。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１２０】
【表２３】
0005963538.tif 000026
【０１２１】
【表２４】
0005963538.tif 000027
【０１２２】
【表２５】
0005963538.tif 000028
【０１２３】
（２−２）ｐＩＫＭ１を鋳型として、プライマーｋａｎＲ−ｉｎ−Ｆ２（配列番号２２）と、ｋａｎＲ−ｉｎ−Ｒ（配列番号２３）との組合せを用いてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１２４】
【表２６】
0005963538.tif 000029
【０１２５】
【表２７】
0005963538.tif 000030
【０１２６】
（３）Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、上記（１）で得た線状ベクターに、カナマイシン耐性遺伝子のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングを行った。すなわち、キット付属のプロトコールに従い、下記表に記載の反応溶液でＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。反応条件は、３７℃３０分→５０℃１５分とした。なお、５×  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  バッファーおよびＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ）  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。
【０１２７】
【表２８】
0005963538.tif 000031
【０１２８】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μｌ加えて希釈した。この希釈液を大腸菌に形質転換し、２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２×ＹＴ固体培地にプレーティングした。
１６時間培養後、出現したコロニーを２×ＹＴ液体培地に植菌した。
１６時間培養後、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（バイオラッド）を用いてプラスミド抽出を行った。
抽出したプラスミドが目的のプラスミドであるか否かを、制限酵素処理およびＰＣＲ（カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎｒ）の増幅）により確認した。ＰＣＲ反応液は表２６に記載の組成とし、ＰＣＲ条件は表２７に記載の条件とした。
結果を図１のアガロースゲル電気泳動に示す。
【０１２９】
制限酵素処理の結果では、２．７ｋｂｐ、１．９ｋｂｐおよび１．１ｋｂｐに、制限酵素（ＨｉｎｃＩＩ＋ＮｃｏＩ）消化産物のバンドが確認された（レーン１〜５）。これは、予想通りである。
また、ＰＣＲの結果では、レーン９を除き、ｋａｎｒの増幅産物のバンドが確認された（レーン６〜１０）。これは、予想通りである。
なお、レーン１と６、２と７、３と８、４と９、および５と１０は、それぞれ、同一のプラスミドである。
【０１３０】
４．カナマイシン耐性遺伝子導入用相補ベクターによるｐｙｒＦ破壊株の形質転換
宿主としては、Ｍ．  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３のｐｙｒＦ破壊株として、先に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託したｄｐｙｒＦ株（ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株，受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７）を用いた。ここでは、上記３で構築したカナマイシン耐性遺伝子導入用相補ベクターをｄｐｙｒＦ株の細胞内にエレクトロポレーション法によって導入し、ダブルクロスオーバーの相同組換えによって、ｄｐｙｒＦ株の染色体にカナマイシン耐性遺伝子を組み込むことを目的とした。
【０１３１】
（１）ｄｐｙｒＦ株の培養
ｄｐｙｒＦ株は完全合成培地（表２２Ａ）＋終濃度０．０１ｇ／Ｌのウラシルに植菌し、Ｈ２＋ＣＯ２を炭素源として５５℃で培養した。ＯＤ６００＝０．１前後まで培養した。
【０１３２】
（２）エレクトロポレーションによるカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎｒ）の導入
培養液を遠心分離（５８００×ｇ、１０ｍｉｎ）し、菌体を集菌した。
上清を捨て、２７２ｍＭスクロースバッファー１０ｍＬに再懸濁し、遠心分離（５８００×ｇ、１０ｍｉｎ）により集菌した。この操作を２回繰り返した。
洗浄終了後、２７２ｍＭスクロースバッファー５ｍＬに菌体を再懸濁し、そこから４００μＬをキュベットに分注した。さらにｋａｎｒ導入用ベクターを加えた。
１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦでパルスを与えた。
パルスを与えた懸濁液を、２分間氷上の静置した後、５ｍｌの完全合成培地＋終濃度０．０１ｇ／Ｌのウラシル＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
５５℃で４８時間キュアリングを行った。
キュアリング後、ロールチューブにより、ｋａｎｒ導入候補株の単離を行った。その結果、ｋａｎｒ導入候補株を１株得た。
【０１３３】
（３）ｋａｎｒ導入の確認
ｋａｎｒ導入候補株を液体培養し、十分に増殖したところで、培養液を１ｍＬ採取した。
培養液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）し、上清を捨てた。
残った菌体ペレットから、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ）を用いて、ゲノムを抽出した。抽出方法は添付のマニュアルに従った。
また、野生株である、Ｍ．  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株からも同様にしてゲノムを抽出した。
【０１３４】
以下の試験を行った。ｋａｎｒ導入候補株については２連で試験を行い、それぞれ、組換株１、組換株２と称する。
（試験１）野生株およびｋａｎｒ導入候補株（組換株１、組換株２）のゲノムＤＮＡを、それぞれ鋳型として、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐｕｐ−Ｆ（配列番号２６）とｋａｎＲ−ｉｎｔｏ−Ｒ（配列番号２７）との組合せを用いて、以下の条件によりＰＣＲ増幅を行い、ｐｙｒＦ上流領域からカナマイシン耐性遺伝子部分を増幅した。ｋａｎｒ導入株では約３．８ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られるが、野生株ではＰＣＲ増幅されない。ＰＣＲ反応液の組成を表３０に、ＰＣＲ反応条件を表３１に示す。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１３５】
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を図２（Ａ）に示す（レーン１〜３、レーン１：野生株、レーン２：組換株１、レーン３：組換株２）。
ｋａｎｒ導入候補株（レーン２，３）では、約３．８ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物のバンドが確認された。一方、野生株（レーン１）ではＰＣＲ増幅産物のバンドは確認されなかった。
【０１３６】
【表２９】
0005963538.tif 000032
【０１３７】
【表３０】
0005963538.tif 000033
【０１３８】
【表３１】
0005963538.tif 000034
【０１３９】
（試験２）抽出したゲノムがモーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に由来するゲノムであるか否かを確認するため、野生株およびｋａｎｒ導入候補株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＭ２２８１−ＦとＭ２２８１−Ｒとの組合せを用いて、Ｍｏｔｈ＿２２８１遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＡＴＣＣ  ３９０７３株に由来するゲノムであれば、約２．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる。ＰＣＲ反応液の組成を表３２に、ＰＣＲ反応条件を表３３に示す。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１４０】
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を図２（Ａ）に示す（レーン４〜６、レーン４：野生株、レーン５：組換株１、レーン６：組換株２）。
野生株（レーン４）およびｋａｎｒ導入候補株（レーン５、６）のすべてで、約２．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物のバンドが確認された。
【０１４１】
【表３２】
0005963538.tif 000035
【０１４２】
【表３３】
0005963538.tif 000036
【０１４３】
（試験３）野生株およびｋａｎｒ導入候補株（組換株１、組換株２）のゲノムＤＮＡを、それぞれ鋳型として、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐｕｐ−Ｆ（配列番号２６）とｐｙｒＦ−ｄｎｄｎ−Ｒ（配列番号２８）との組合せを用いて、カナマイシン耐性遺伝子部分を含むｐｙｒＦ周辺領域をＰＣＲ増幅した。野生株では約４．７ｋｂｐの、ｋａｎｒ導入株では約５．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲ反応液の組成を表３４に、ＰＣＲ反応条件を表３５に示す。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  バッファー  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１４４】
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を図２（Ｂ）に示す（レーン１〜３、レーン１：野生株、レーン２：組換株１、レーン３：組換株２）。
野生株（レーン１）では約４．７ｋｂｐの、ｋａｎｒ導入候補株（レーン２、３）では約５．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
【０１４５】
【表３４】
0005963538.tif 000037
【０１４６】
【表３５】
0005963538.tif 000038
【０１４７】
（試験４）上記（試験３）で得られたＰＣＲ増幅産物をＫｐｎＩで制限酵素消化し、消化断片のサイズをアガロースゲル電気泳動により確認した。野生株では、５４１ｂｐ、８９５ｂｐ、９５６ｂｐおよび２２９８ｂｐの制限酵素消化断片が得られ、ｋａｎｒ導入株では、５４１ｂｐ、８９５ｂｐ、９５６ｂｐおよび３０９７ｂｐの制限酵素消化断片が得られる。
【０１４８】
アガロースゲル電気泳動像を図２（Ｂ）に示す（レーン４〜６、レーン４：野生株、レーン５：組換株１、レーン６：組換株２）。
野生株（レーン４）では、５４１ｂｐ、８９５ｂｐ、９５６ｂｐおよび２２９８ｂｐの制限酵素消化断片が得られ、ｋａｎｒ導入候補株（レーン５、６）では、５４１ｂｐ、８９５ｂｐ、９５６ｂｐおよび３０９７ｂｐの制限酵素消化断片が得られた。
【０１４９】
以上の結果から、ｋａｎｒ導入候補株として単離された１株（組換株１、組換株２の２連）は、カナマイシン耐性遺伝子が導入されたｋａｎｒ導入株であることが確認された。得られたｋａｎｒ導入株を、ＭＴＡ−ｋａｎｒ株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した。
【０１５０】
５．カナマイシン耐性の確認
得られたｋａｎｒ導入株（ＭＴＡ−ｋａｎｒ株）のカナマイシン耐性が表現形質として発現しているか否かを確認するため、以下の試験を行った。
（１）材料
野生株１株（ＡＴＣＣ  ３９０７３株）および得られたｋａｎｒ導入株１株（組換株１、組換株２の２連）を用いた。
（２）方法
（前培養）
野生株および組換株（組換株１、組換株２の２連）を、それぞれ、完全合成培地（表２２Ａ）にフルクトースを終濃度５ｇ／Ｌで添加した液体培地で、ＯＤ６００＝０．５〜０．８になるまで、５５℃で嫌気培養した。
（試験１）
培養した菌体を、それぞれ、完全合成培地（表２２Ａ）にフルクトースを終濃度５ｇ／Ｌで、カナマイシンを終濃度２００μｇ／ｍＬまたは３００μｇ／ｍＬで、それぞれ添加した液体培地に植菌し、ＯＤ６００を２０時間ごとに計測しながら、５５℃で嫌気培養した。
（試験２）
培養した菌体を、完全合成（表２２Ａ）にＡｇａｒ高温用２０ｇ／Ｌおよびカナマイシン２００μｇ／ｍＬ（終濃度）で添加した寒天培地を用いて嫌気性ロールチューブ法により、５５℃で培養した。
【０１５１】
（３）結果
（試験１）
培養時間（ｈｏｕｒ）に対してＯＤ６００測定値をプロットしたグラフを図３（Ａ）（カナマイシン濃度：２００μｇ／ｍＬ）および図３（Ｂ）（カナマイシン濃度：３００μｇ／ｍＬ）に示す。
カナマイシン濃度２００μｇ／ｍＬおよび３００μｇ／ｍＬのいずれにおいても、野生株は増殖が確認されなかったが、ｋａｎｒ導入株（組換株１、組換株２の２連）は増殖が確認された。
（試験２）
野生株ではコロニーの形成が確認できなかったが、ｋａｎｒ導入株（組換株１、組換株２の２連）ではコロニーの形成が確認できた。
【０１５２】
（４）まとめ
ｋａｎｒ導入株（ＭＴＡ−ｋａｎｒ株）はカナマイシン耐性を表現形質として発現していることが確認できた。
【０１５３】
（配列番号の説明）
配列番号１：カナマイシン耐性遺伝子産物のアミノ酸配列
配列番号２：カナマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ塩基配列
配列番号３：Ｇ３ＰＤプロモーター領域のＤＮＡ塩基配列
配列番号４：ｐｙｒＦ遺伝子産物のアミノ酸配列
配列番号５：ｐｙｒＦ遺伝子のＤＮＡ塩基配列
配列番号６：プライマー  ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１
配列番号７：プライマー  ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１
配列番号８：プライマー  ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１
配列番号９：プライマー  ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１
配列番号１０：プライマー  ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ２
配列番号１１：プライマー  ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ２
配列番号１２：プライマー  ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ３
配列番号１３：プライマー  ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ３
配列番号１４：プライマー  ｐｙｒＦ−Ｆ
配列番号１５：プライマー  ｐｙｒＦ−Ｒ
配列番号１６：プライマー  ｐｙｒＦ−１７６５−Ｆ
配列番号１７：プライマー  ｐｙｒＦ−１７６４−Ｒ
配列番号１８：プライマー  Ｇ３ＰＤ−Ｆ１１
配列番号１９：プライマー  Ｇ３ＰＤ−ＳＤ−Ｒ１２
配列番号２０：プライマー  ｌｄｈ−Ｆ−１
配列番号２１：プライマー  ｌｄｈ−Ｒ−１
配列番号２２：プライマー  ｋａｎＲ−ｉｎ−Ｆ２
配列番号２３：プライマー  ｋａｎＲ−ｉｎ−Ｒ
配列番号２４：プライマー  ｐｙｒＦ−ｌｄｈ−ｉｎｖ−Ｆ
配列番号２５：プライマー  ｐｙｒＦ−ｌｄｈ−ｉｎｖ−Ｒ
配列番号２６：プライマー  ｐｙｒＦ−ｕｐｕｐ−Ｆ
配列番号２７：プライマー  ｋａｎＲ−ｉｎｔｏ−Ｒ
配列番号２８：プライマー  ｐｙｒＦ−ｄｎｄｎ−Ｒ
配列番号２９：プライマー  Ｍ２２８１−Ｆ
配列番号３０：プライマー  Ｍ２２８１−Ｒ
【受託番号】
【０１５４】
識別の表示：ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７
寄託日：２０１１年  ２月１５日
受託機関：独立行政法人製品技術評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
識別の表示：ＭＴＡ−ｋａｎｒ
受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３５４
受領日：２０１２年  ５月２日
受託機関：独立行政法人製品技術評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
【図１】
0005963538.tif 000039
【図２】
0005963538.tif 000040
【図３】
0005963538.tif 000041
【配列表】
0005963538000001.app