(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチン顆粒を含み、
質量基準で８００％以上の吸水率と、
１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率と、
を示す組織修復材。
【請求項２】
前記ゼラチン顆粒が１４００μｍの目開きのふるいを通過する顆粒状のゼラチンである請求項１に記載の組織修復材。
【請求項３】
前記ゼラチン顆粒が、ゼラチンの架橋物を含む請求項１又は請求項２に記載の組織修復材。
【請求項４】
前記ゼラチン顆粒が、ゼラチンの熱架橋物を含む請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の組織修復材。
【請求項５】
前記組織修復材が顆粒状である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の組織修復材。
【請求項６】
骨再生用基材である請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の組織修復材。
【請求項７】
ゼラチンを含み、
質量基準で８００％以上の吸水率と、
１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率と、
を示すブロック状組織修復材。
【請求項８】
真皮再生用である請求項７に記載のブロック状組織修復材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織修復材に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った、生体組織又は臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
このうち、整形外科領域又は歯科領域の骨再生は、再生医療領域において非常に注目を集めている領域である。骨疾患が足や腰の場合は、疾患に起因して発生した骨欠損により、歩行不能となり、骨疾患が歯周組織の場合は食事摂取が困難となることから、骨疾患は著しいＱＯＬの低下を引き起こす。
再生医療の分野では、生体親和性の高いコラーゲン又はゼラチンが基材として用いられている。【０００３】
例えば、国際公開第２０１１／０２７８５０号には、組換えゼラチンを含み、補填材担体自体で骨再生を促進できる骨再生剤及び骨補填製剤が開示されている。
特開平８−１９６６１８号公報には、多数の空孔が存在するスポンジ状のコラーゲンマトリクスからなる細胞侵襲性コラーゲン製剤が開示されている。
一方、顆粒状の骨補填剤として、特開２００１−２１２１０５号公報及び特開２０１０−０４６２４９号公報には、バイオセラミックの顆粒を用いた骨補填剤が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特開平８−１９６６１８号公報に開示された細胞侵入性コラーゲン製剤のようにブロック状のスポンジを用いた場合、ブロック内部への細胞侵入性を確保するためにスポンジ空孔間の連通性を高くする必要があり、ブロック全体としての弾性を高くすることが困難である。さらに、コラーゲンを材料として用いる場合はコラーゲン溶液の濃厚化が困難であり、高い弾性を持ったスポンジ状材料を作製することが難しい。このため、このような材料を補填材として用いた場合、骨の欠損部が常態的に圧力がかかる部位であるときには欠損部の容積が保持されないことがある。また、バイオセラミックス顆粒による骨補填剤では、長期間にわたり体内に残存して、再生した骨との置換場所を提供できないことがある。このため、上記の技術のいずれも、骨等の組織の再生を促進する組織修復材を得るという観点から未だに改善の余地がある。【０００５】
本発明は、良好な骨等の組織の再生能を有する組織修復材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下のとおりである。
［１］  ゼラチン顆粒を含み、質量基準で８００％以上の吸水率と、１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率と、を示す組織修復材。
［２］  ゼラチン顆粒が１４００μｍの目開きのふるいを通過する顆粒状のゼラチンである［１］に記載の組織修復材。
［３］  ゼラチン顆粒が、ゼラチンの架橋物を含む［１］又は［２］に記載の組織修復材。
［４］  ゼラチン顆粒が、ゼラチンの熱架橋物を含む［１］〜［３］のいずれか１つに記載の組織修復材。
［５］  組織修復材が顆粒状である［１］〜［４］のいずれか１つに記載の組織修復材。
［６］  骨再生用基材である［１］〜［５］のいずれか１つに記載の組織修復材。
［７］  ゼラチンを含み、質量基準で８００％以上の吸水率と、１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率と、を示すブロック状組織修復材。
［８］  真皮再生用である［７］に記載のブロック状組織修復材。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、良好な骨等の組織の再生能を有する組織修復材を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の効果が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【０００９】
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列を、当業界で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する場合がある。
【００１０】
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
本発明において、対比される２種のポリペプチドのアミノ酸配列に関する「同一性」とは、以下の式で計算される値を指す。なお、複数のポリペプチドの対比（アライメント）は、同一となるアミノ酸残基の数が最も多くなるように常法に従って行うものとする。
同一性（％）
＝{（同一となるアミノ酸残基の数）／（アラインメント長）｝×１００
【００１１】
以下、本発明について説明する。
【００１２】
本発明の組織修復材は、ゼラチン顆粒を含み、質量基準で８００％以上の吸水率と、１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率と、を示す組織修復材である。
上記の残存率は換言すると、１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で４０％以上の分解率を意味する。
以下、上記の残存率を酸残存率と称する場合がある。
【００１３】
本発明の組織修復材は、ゼラチン顆粒を含み、上記の吸水率及び酸残存率を示す組織修復材とすることにより、良好な組織再生能を示す組織修復材となる。これを更に説明すれば、以下のように考えることができる。即ち、組織修復材は、所定の吸水率を有することにより組織の欠損部において血餅の保持が可能となり、また所定の酸残存率、すなわち所定の分解率を有することにより、所望の期間、強度が担保され欠損部の容積を保持しつつ、再生した骨との置換場所となりうる。この結果、欠損部に組織修復材を配置することにより骨等の組織の再生が良好に進行すると推定される。ただし、本発明はこの理論に拘束されない。
【００１４】
本発明の組織修復材は、必要に応じて他の成分を含んでもよい。
【００１５】
本発明において、「ゼラチン顆粒」とは、特に断らない限り、ゼラチン顆粒の集合体を意味する。
【００１６】
本発明の組織修復剤に含まれるゼラチン顆粒は、顆粒状のゼラチンを調製する工程を経たのち、顆粒同士が独立していても互いに結着していても構わないが、互いに独立していることが好ましい。
【００１７】
本発明のゼラチン顆粒を含む組織修復材は顆粒状であることが好ましい。ここで、「組織修復材が顆粒状である」とは、互いに独立ないし結着した顆粒が、目開き４ｍｍのふるいを通過する状態であることを意味する。
【００１８】
本発明のブロック状組織修復材において「ブロック状」とは、組織修復材の少なくとも１軸の長さが５ｍｍ以上であることを意味する。１軸の長さが５ｍｍ以上であれば、他の軸は、５ｍｍ以下の軸である形状、例えば、棒状やシート状の形状であってもよい。
【００１９】
本発明において「組織修復材」とは、生体内に埋植されることにより埋植部位における組織の形成に寄与する材料のことであり、細胞を含んでいても含んでいなくても構わない。また、増殖因子や薬剤のような生体の反応を促す成分を含んでいても含んでいなくても構わない。さらに、ハイドロキシアパタイト等の無機材料と混合、ないしコンポジットを作成して適用しても構わない。ただし、本発明に係る吸水率および酸残存率を測定する際は、これら細胞や無機材料を除いた質量を基準として測定するものとする。
本発明における「組織修復材」とは、埋植部位に通常存在する正常組織の形成に必ずしも寄与するものではなく、瘢痕組織等を含む非正常組織の形成を促進する材料も包含するものである。
【００２０】
［ゼラチン］
ゼラチンは、天然型のゼラチンであっても、天然型とは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる変異型又は組換え体であってもよい。天然型のゼラチンとは、天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチン、又は天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチンと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。特に断らない限り、本明細書では変異型又は組換え体のゼラチンを総称して、組換えゼラチンと称する。天然型のゼラチン又はその組換えゼラチンは、例えば、魚類、哺乳類等の動物に由来するものが挙げられるが、哺乳類の動物の天然型ゼラチン又はその組換えゼラチンであることが好ましい。哺乳類の動物としては、例えば、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラット等が挙げられ、ヒト又はブタであることがより好ましい。天然型ゼラチンとしてはブタ又はヒトに由来するものであることが好ましく、組換えゼラチンとしてはヒト由来組換えゼラチンであることが好ましい。
【００２１】
ゼラチンは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示されるアミノ酸配列を連続して６以上含むポリペプチドを意味し、ポリペプチド中にＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示されるアミノ酸配列以外に他のアミノ酸残基を１以上有していてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示されるアミノ酸配列は、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列に相当する配列であり、この配列の繰り返しはコラーゲンに特徴的な配列を意味する。
【００２２】
ゼラチン１分子中の複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。また、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列中Ｘ及びＹは繰返し単位ごとに独立であり、同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基、即ちプロリン残基又はオキシプロリン残基が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、ゼラチン１分子中の１０％〜４５％を占めることが好ましい。ゼラチン１分子中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【００２３】
ゼラチンとしては、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示されるアミノ酸配列を連続して６以上有するコラーゲンをコードする遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列に対して、１つ以上の塩基又はアミノ酸残基の変更を加えた塩基配列又はアミノ酸配列を、常法により、適当な宿主に導入し発現させて得られた組換えゼラチンであることが好ましい。このような組換えゼラチンを用いることにより、骨再生能を高め、且つ、天然のゼラチンを用いる場合と比較して種々の特性を発現させることができ、例えば、生体による拒絶反応などの不都合な影響を回避することができるなどの利点を有する。
【００２４】
組換えゼラチンとしては、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２Ｂ１、ＷＯ２００４／８５４７３Ａ２、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１、特表２０１０−５１９２９３号公報、特表２０１０−５１９２５２号公報、特表２０１０−５１８８３３号公報、特表２０１０−５１９２５１号公報、ＷＯ２０１０／１２８６７２Ａ１及びＷＯ２０１０／１４７１０９Ａ１等に開示されているものを特に好ましく用いることができる。
【００２５】
組換えゼラチンは、２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の分子量であることが好ましく、５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましく、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましい。
【００２６】
組換えゼラチンは、生体親和性の点で、細胞接着シグナルを更に含むものであることが好ましく、一分子中に細胞接着シグナルを２つ以上有するものであることが、より好ましい。このような細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、好ましくは、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列を挙げることができ、ＲＧＤ配列であることが特に好ましい。ＲＧＤ配列のうち、ＥＲＧＤ配列であることが更に好ましい。
【００２７】
組換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ配列間のアミノ酸残基数が０〜１００であることが好ましく、２５〜６０であることがより好ましい。また、ＲＧＤ配列は、上記アミノ酸残基数の範囲内で、不均一に配置されていることが好ましい。
組換えゼラチンにおけるアミノ酸残基の総数に対するＲＧＤ配列の割合（ＲＧＤ配列の合計アミノ酸残基数／アミノ酸残基の総数×１００）は、少なくとも１．２％であることが好ましく、組換えゼラチンが２５０以上のアミノ酸残基を含む場合、２５０アミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。
組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸残基あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも３つＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含むことが更に好ましい。
【００２８】
組換えゼラチンの配列は、以下の態様であることが好ましい：（１）セリン残基及びスレオニン残基を含まない、（２）セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、及びシステイン残基を含まない、（３）Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで示されるアミノ酸配列を含まない。組換えゼラチンは、この好ましい配列の態様（１）〜（３）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものであってもよい。
【００２９】
組換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３０】
組換えゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂのアミノ酸配列を有することが好ましい。ここで、Ａは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１又は２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。ｍは、２〜１０の整数を表し、３〜５の整数を表すことが好ましい。ｎは３〜１００の整数を表し、１５〜７０の整数を表すことが好ましく、５０〜６０の整数を表すことがより好ましい。ｍ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【００３１】
より好ましくは、組換えゼラチンは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙのアミノ酸配列を有する。ここで、６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【００３２】
組換えゼラチンの繰り返し単位は、天然に存在するコラーゲンのアミノ酸配列の一部を一単位とし、この一単位を複数結合して形成されていることが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとしては、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型及びＶ型が挙げられる。より好ましくは、Ｉ型、II型又はIII型とすることができる。コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラットを挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
【００３３】
組換えゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、更に好ましくは７〜９．５とすることができる。
【００３４】
組換えゼラチンの好ましい態様としては以下のものを挙げることができる：（１）カルバモイル基が加水分解されていない、（２）プロコラーゲンを有しない、（３）テロペプタイドを有しない、（４）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である。組換えゼラチンは、この好ましい態様（１）〜（４）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものであってもよい。
【００３５】
組換えゼラチンは、組織修復能の高さから、好ましくは、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかとすることができる。
（Ａ）  下記配列番号１で示されるポリペプチド。
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
（Ｂ）  （Ａ）のアミノ酸配列中、第４番目〜第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有し、且つ、組織再生能を有するポリペプチド。
（Ｃ）  （Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、組織再生能を有するポリペプチド。
【００３６】
（Ｂ）における配列同一性としては、組換えゼラチンの組織再生能の観点から、より好ましくは９０％以上とすることができ、更に好ましくは９５％以上とすることができる。
【００３７】
（Ｂ）の配列における部分アミノ酸配列は、配列番号１で示される配列の繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列である。（Ｂ）のポリペプチドに繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列が複数存在する場合には、配列同一性が８０％以上となる繰り返し単位を１つ、好ましくは２つ以上含むポリペプチドとすることができる。
また、（Ｂ）で規定されるポリペプチドは、繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を、合計のアミノ酸残基数として、全アミノ酸残基数の８０％以上含むことが好ましい。
【００３８】
（Ｂ）で規定されるポリペプチドの長さとしては、１５１個〜２２６０個のアミノ酸残基数とすることができ、架橋後の分解性の観点から、１９３個以上、安定性の観点から、９４４個以下のアミノ酸残基数であることが好ましく、３８０個〜７５６個のアミノ酸残基数であることがより好ましい。
【００３９】
（Ｃ）で規定されるポリペプチドにおいて欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数としては、１個又は数個であればよく、組換えゼラチンの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２個〜１５個、好ましくは２個〜５個とすることができる。
【００４０】
組換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２Ｂ１、ＷＯ２００４／８５４７３Ａ２、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１等に記載の方法に準じて製造することができる。
【００４１】
（Ｂ）又は（Ｃ）で規定されるポリペプチドの組織再生能の評価は、組換えゼラチンを用いて得られた組織修復材を用いて行えばよい。評価方法は、目的の組織により異なる。
例えば、骨再生能は、ラットの頭頂骨に所定の大きさの骨欠損部を作製し、組織修復材を骨欠損部へ充填後、皮膚を縫合し、手術後４週目にマイクロＣＴを用いて骨量を計測して、骨欠損部の容積に対する再生した骨体積の割合として評価することができる。
【００４２】
ゼラチン顆粒は、ゼラチンの架橋物を含むことが、必要な期間、骨欠損部に設けられた製剤層の体積を維持できる点で好ましい。架橋物としては、架橋剤を用いた化学的架橋物及び熱架橋物を挙げることができ、架橋剤を使用しないという点で熱架橋物であることが好ましい。ゼラチン顆粒が架橋物を含むことは、ゼラチン顆粒が温水に溶けない状態となっていることによって確認することができる。ここで「温水に溶けない状態」とは、３７℃の水に対する溶解度が５０質量％以下であることを意味する。
【００４３】
本明細書において「製剤層」との語は、組織修復材を所定の空間に配置させることにより形成された層を意味し、粉体層（Particle Bed）という技術用語のごとく、所定の空間内に充填された複数の粒子状製剤と製剤間の空隙の双方を含んだ総体のことを示す。
【００４４】
［ゼラチン顆粒］
組織修復材に含まれるゼラチン顆粒は、４ｍｍの目開きのふるいを通過する粒子である。ゼラチン顆粒は、細胞侵入性の観点から、１４００μｍの目開きのふるいを通過する粒子群であることが好ましく、１０００μｍの目開きのふるいを通過する粒子群であることがより好ましく、７１０μｍの目開きのふるいを通過する粒子群であることが更に好ましい。また、製剤層の弾性確保の観点より、ゼラチン顆粒は目開き７５μｍのふるいに残留する粒子群であることが好ましく、３００μｍのふるいに残留する粒子群であることがさらに好ましい。
なお、ゼラチン顆粒のふるい分けにはＩＳＯ３３１０規格の試験ふるいを使用し、ふるい分けの方法は、第１６改正日本薬局方３．０４節の第２法に記載のふるい分け法に準じる。すなわち、５分間の振とうを断続的に複数回行い、振とう後にふるい上に残った粒子群の質量が、振とう前のふるい上の粒子群の質量に対して５％以下となったとき、終了する。
本発明において「通過する」との語は、上記終点時にふるい上に残る粒子がふるい前の全質量の１０質量％以下であることを意味し、「残留する」との語は、上記終点時にふるい上に残る粒子がふるい前の全質量の９５質量％以上であることを意味する。
【００４５】
組織修復材に含まれるゼラチンを、ブロック（塊）体等ではなく、顆粒とすることにより、高濃度のゼラチン溶液を調製して使用することが可能となり、より高密度の基材であっても欠損部中央までの細胞侵入性を確保することが可能となる。これにより、組織修復材を欠損部に配置して製剤層を形成したときに、圧力が加えられても製剤層の体積の減少を生じることなく、良好な組織再生能、特に骨再生能を示すことが可能となる。
【００４６】
組織修復材における個々のゼラチン顆粒は、空隙を有する多孔質体であることが組織形成能の観点から好ましい。また、細胞侵入性の観点から、ゼラチン顆粒を欠損部に配置することにより形成される製剤層では粒子間に空隙を有することが好ましく、製剤層全体の空隙率は、好ましくは７０％以上９６．５％以下であり、さらに好ましくは８０％以上９０％以下である。なお、空隙率は、下記のタップ密度（ρｔ）と真密度（ρc）により、空隙率（Ｐ＝（１−ρｔ／ρｃ）×１００（％））として求めたものとする。タップ密度（ρt）は、後述する方法により求める。真密度（ρc）は、ハバード型比重瓶の比重瓶法により求める。
【００４７】
組織修復材における個々のゼラチン顆粒は、連通孔を有するものであってもよい。連通孔が存在することによって、組織修復材の外部から深部に至るまで、空隙が連なることにより、組織修復材の外部に接触した細胞が、組織修復材の内部へと分散又は拡散可能となる。連通孔の孔径は、上記機能を発揮するため、１０μｍ以上２５００μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以上２５００μｍ以下であることがより好ましく、１００μｍ以上１０００μｍ以下であることが特に好ましい。
【００４８】
［タップ密度］
タップ密度は、ある体積にどれくらいの顆粒を密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、顆粒の構造がより複雑になる傾向があり、また、サイズ分布が広くなる傾向があり、また、粗に充填される傾向がある。凍結時につくられるゼラチンの構造の相違から粉砕後に得られる顆粒の形状が異なること、及び、粉砕により様々なサイズの顆粒が得られることから、本明細書でいうタップ密度は、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下、より好ましくは３０ｍｇ／ｃｍ３以上４５０ｍｇ／ｃｍ３以下、更に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ３以上４２０ｍｇ／ｃｍ３以下、更により好ましくは１４０ｍｇ／ｃｍ３以上２８０ｍｇ／ｃｍ３以下である。タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ３以上であれば、製剤層の弾性を高くしやすく、欠損部の容積を維持しやすい傾向がある。一方、タップ密度が５００ｍｇ／ｃｍ３以下であれば、細胞の侵入性の低下を抑制しやすく十分な治癒効果を得られやすい傾向がある。
【００４９】
タップ密度の測定方法は、以下である。測定の為に、直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状（容量０．６１６ｃｍ２）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する（ｗｔ）。その後、キャップとロートとを連結し、顆粒がキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量の顆粒を入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、キャップの縁を超えて盛り上がっている顆粒をスパチュラですりきる。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する（ｗｇ）。キャップのみの質量との差から顆粒のみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求める。
タップ密度：ρｔ＝（ｗｇ−ｗｔ）／０．６１６
【００５０】
［吸水率］
組織修復材は、質量基準で８００％以上の吸水率を示す。吸水率が８００％未満では、良好な組織再生能が得られない。組織修復材の吸水率は、組織修復時の血餅保持の観点で９００％以上であることが好ましく、１２００％以上であることがより好ましく、１４００％以上であることが更に好ましい。組織修復材の吸水率の上限値は、特に制限はないが、好ましくは９９００％以下、より好ましく５０００％以下、更に好ましくは３０００％以下である。組織修復材の吸水率は、組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の吸水率とする。
【００５１】
本発明における組織修復材の「吸水率」とは、以下のようにして測定される物理的特性のことを称する。測定は、２１℃〜２６℃の温度範囲、好ましくは２５℃の温度条件で、相対湿度３０％〜６０％、好ましくは４０％の室内で行う。
メッシュ１５０本／２．５４ｃｍ／線径６μｍ、オープニング１０８μｍ相当、オープニングエリア４１％、厚さ１０６μｍ、３ｃｍ×３ｃｍの測定用のナイロン製メッシュ袋（以下メッシュ袋）の質量を測定する（Ａ）。顆粒状の組織修復材については組織欠損部に配置させる形態のまま加工せず１５．０（±１．０）ｍｇを秤量、ブロック状の組織修復材については約１．５ｍｍ×約２ｍｍ×約１２ｍｍの直方体の検体を作製し、質量を測定し（Ｂ）、測定用のメッシュ袋に入れる。組織修復材を入れず空の状態の測定用のメッシュ袋をブランク用メッシュ袋として使用し、質量を測定する（Ｃ）。双方のメッシュ袋の上面をクリップで挟み、超純水８０ｍｌ入りの１００ｍｌビーカーに吊るす。メッシュ袋内の組織修復材が全て水に浸かる位置に、双方のメッシュ袋を保持させて２時間以上放置する。２時間以上経過した後、ビーカー内の水を捨て双方のメッシュ袋を取出し、それぞれ、同一の角度で斜めに吊るし、１０分間静置して余分な水分を切る。その後、ブランクメッシュ袋の質量（Ｄ）、及び、組織修復材入りメッシュ袋の質量（Ｅ）を測定し、下記計算式（１）及び（２）を用いて吸水率を算出する。
ブランク吸水率（Ｆ）＝Ｄ／Ｃ・・・（１）
吸水率＝（Ｅ−Ａ×Ｆ）／Ｂ×１００（％）・・・（２）
【００５２】
組織修復材の吸水率は、組織修復材に含まれる成分、特にゼラチン顆粒の種類や個々のゼラチンの形態によって異なるが、例えば、後述する組織修復材の製造方法における凍結工程、又は架橋工程の温度、処理時間等によって調整することができる。一般に、凍結工程の温度を高くする、又は架橋工程の温度を低くする、又は架橋時間を短くすると、吸水率が高まる傾向がある。
【００５３】
［酸分解性］
組織修復材は、１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率を示す。１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準での残存率が６０％より高い場合は、組織再生能が充分とは言えない。組織修復材の酸残存率は、欠損部位での製剤層の体積の維持、再生する組織との置換の観点から、５質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがより好ましく、４０質量％以上であることが更に好ましい。組織修復材の酸残存率は、組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の酸残存率とする。
【００５４】
本発明における組織修復材の「酸残存率」とは、以下のようにして測定される物理的特性値のことを称する。測定用のマイクロチューブ（商品名ミニスーパーチューブ、アイビス社製、容量２ｍｌ、以下チューブと称する）の質量を測定する（Ａ）。顆粒状の修復材については組織欠損部に配置させる形態のまま加工せず５．０（±０．２）ｍｇを秤量、ブロック状の修復材については、直径６ｍｍ×厚み約１ｍｍの円柱の検体を作製し、質量を測定し（Ｂ）、測定用チューブに充填する。組織修復材入りのチューブに、１モル／ＬのＨＣｌを１．０ｍｌ添加し、３７℃にて、振とう恒温器（ＨＢ−８０（タイテック）、シーソー、１分間の往復回数：６０回）で３時間振とうさせる。規定時間後、チューブを氷上に立て反応を止め、あらかじめ４℃に設定した遠心器で１０，０００×ｇ、１分間遠心する。組織修復材が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を１ｍｌ添加して、上記と同一の条件で再度、遠心する。上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心する。上清を吸い取ったのち、凍結乾燥する。凍結乾燥機から取り出した後、空気中の水分を組織修復材が吸い取るのを防ぐためすばやくチューブのキャップを閉める。チューブごと質量を測定し（Ｃ）、下記計算式（３）を用いて酸残存率を算出する。
酸残存率＝（Ｃ−Ａ）／Ｂ×１００（％）・・・・（３）
【００５５】
組織修復材の酸残存率は、組織修復材に含まれる成分、特にゼラチン顆粒の種類や形態によって異なるが、例えば、後述する組織修復材の製造方法における架橋工程の温度、処理時間等によって調整することができる。一般に、架橋工程の処理時間を短くすると、酸残存率が低くなる傾向がある。
【００５６】
［その他の成分］
組織修復材は、ゼラチン顆粒に加えて、組織の修復又は再生に寄与しうる他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、骨誘導薬剤等の骨再生又は骨新生に関する成分を挙げることができる。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。
【００５７】
［組織修復材の製造方法］
組織修復材は、ゼラチン顆粒を含み、上述した所定の吸水率及び酸残存率を示すものであれば、製造方法は特に制限されないが、例えば、以下の方法により得ることができる。
組織修復材の一の製造方法は、（ａ）水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を準備すること（以下、ゼラチン溶液調製工程という）、（ｂ）ゼラチン溶液を凍結乾燥に供して凍結乾燥体を得ること（以下、凍結乾燥工程という）、（ｃ）ゼラチンの凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得ること（以下、粉砕工程という）、及び、（ｄ）粉砕物を架橋して基材を得ること（以下、架橋工程という）を含む。
【００５８】
ゼラチン溶液調製工程で準備されるゼラチン溶液の水性媒体としては、ゼラチンを溶解可能であり、生体組織に対して使用可能なものであれば特に制限はなく、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等、当分野で通常使用可能なものを挙げることができる。
【００５９】
ゼラチン溶液におけるゼラチンの含有率については、ゼラチンが溶解可能な含有率であればよく、特に制限はない。ゼラチン溶液中のゼラチンの含有率は、例えば、０．５質量％〜２０質量％とすることが好ましく、２質量％〜１６質量％であることがより好ましく、４質量％〜１２質量％であることが更に好ましい。０．５質量％以上とすることにより、強度がより高まる傾向があり、２０質量％以下とすることにより、均一性の高い網目構造をより形成しやすくなり組織再生能が良好になる傾向がある。
【００６０】
ゼラチン溶液を調製する工程では、材料としてのゼラチンを準備し、該ゼラチンを水性媒体に溶解させることにより調製する。材料としてのゼラチンは、粉末状のものであってもよく、固体状のものであってもよい。ゼラチン溶液は、調製済みのものを準備して用いてもよい。
【００６１】
ゼラチン溶液を調製する際の温度については、特に制限はなく、通常用いられる温度、例えば、０℃〜６０℃、好ましくは、３℃〜３０℃程度であればよい。
またゼラチン溶液には、後述する各工程に必要な成分、例えば架橋剤や、組織修復材に所定の特性を付加するために有用な成分等が、必要に応じて含有されていてもよい。
【００６２】
空隙を有するゼラチン顆粒を得るには、凍結乾燥工程の前に、ゼラチン溶液を氷晶形成温度以下に冷却する工程を設けることが好ましい。
これにより、内部に適当な大きさの氷晶を有するゼラチン含有中間体を得ることができる。形成された氷晶によりゼラチンのペプチド鎖の粗密が生じてゼラチン含有中間体が固体化するため、氷晶が消失した後には、ゼラチン含有中間体の網目の空隙が形成される。氷晶の消失は、後段の乾燥工程により容易に行われる。ゼラチン含有中間体の網目の孔径は、氷晶温度、冷却時間又はこれらの組み合わせにより調整することができる。
【００６３】
氷晶形成温度は、ゼラチン溶液の少なくとも一部が凍結する温度を意味する。氷晶形成温度は、ゼラチン溶液中のゼラチンを含む固形分濃度によって異なるが、一般に−１０℃以下とすることができる。好ましくは、ゼラチン溶液を−１００℃〜−１０℃に冷却することができ、より好ましくは−８０℃〜−２０℃に冷却することができ、−４０℃〜−６０℃に冷却することができる。−１００℃以上であれば、網目サイズが十分な大きさになる傾向があり、−１０℃以下であれば、ゼラチン含有中間体における網目の孔径の均一性が高く、良好な骨再生能を発揮できる傾向がある。
【００６４】
氷晶形成温度以下に維持する時間としては、氷晶形成が均一に生じやすいという点で１時間〜６時間とすることが好ましい。
【００６５】
氷晶形成温度処理を行うことにより、網目構造を有するゼラチン含有中間体が得られる。本明細書において「網目構造」との語は、内部に多量の空隙を含む構造を意味しており、平面的なものに限定されない。また、構造部が繊維状であるもののみでなく、壁状であるものも含むものとする。さらに、ゼラチンを含む材料の構造物の構造を意味しており、コラーゲン繊維等の分子レベルの構造は含まない。
「網目構造を有する」とは、ゼラチンを含む材料で構成される壁状構造によりミクロンオーダー以上の空隙が形成されていること、即ち、１μｍ以上の孔径を有することを意味する。
【００６６】
ゼラチン含有中間体における網目の形状については、特に制限はなく、ハニカムのような二次元的な構造でも、海綿骨のような三次元的な構造でもよい。網目の断面形状は、多角形であっても、円又は楕円等であってもよい。ゼラチン含有中間体における網目の三次元形状は、柱状であっても球状であってもよい。
【００６７】
ゼラチン含有中間体には、空隙が連続して形成される連通孔が存在していてもよい。連通孔が存在することによって、ゼラチン含有中間体の外部から深部に至るまで、空隙が連なる。このような空隙の繋がりが存在すると、ゼラチン含有中間体から得られた組織修復材の外部に、細胞が接触した場合に、多孔質体の内部へと、細胞が分散又は拡散可能となる。また、連通孔は、このような機能を発揮するため、孔径１０μｍ以上であることが好ましい。
【００６８】
ゼラチン含有中間体の網目の孔径は、長軸方向の径（長径）の平均として評価する。長径の平均は、次のようにして評価する。
まず、ゼラチン含有中間体を乾燥した後に得られる乾燥中間体を、水平及び鉛直方向に切断する。次いで、各断面をスタンプ台に密着させることにより染色し、２．０ｍｍ×２．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察する。観察領域内における、染色された材料で囲まれた領域（１個の網目）に外接する長方形のうち、長方形の対向する二辺の距離が最大となる外接長方形を選択する。この対向する二辺の距離が最大となる外接長方形の長辺の長さを、水平方向の断面及び鉛直方向の断面のそれぞれにおける観察領域内において、５０個ずつ計測し、その平均を当該ゼラチン含有中間体の網目の長径の平均値とする。
【００６９】
個々の網目について、と同様にして求めた水平方向の断面の長径の平均値と鉛直方向の断面の長径の平均値のうち小さい方をｄ１、他方をｄ２とし、この比率ｄ２／ｄ１を網目アスペクト比と呼ぶ。この網目アスペクト比が１〜３の場合を「球状」とし、この範囲外のものを「柱状」とする。
網目の形状が柱状である場合（網目アスペクト比が１〜３の範囲外の場合）には、網目アスペクト比は、骨接着の観点から４又は５であることが好ましい。５以下であれば、骨接着が増加する傾向がある。
網目の形状としては、組織の修復能の観点から球状（網目アスペクト比が１〜３）であることが好ましい。
【００７０】
ゼラチン含有中間体における網目の孔径は、網目の形状が柱状の場合には、骨接着の観点から、１０μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることが更に好ましい。ゼラチン含有中間体における網目の孔径の上限については特に制限はないが、物質強度安定の点で２５００μｍ以下であることが好ましく、１０００μｍ以下であることがより好ましい。
長軸方向の径が１０μｍ以上であれば、網目構造の内部に細胞が侵入しやすくなる傾向があり、２５００μｍ以下であれば、生体との親和性を高める傾向がある。
【００７１】
ゼラチン含有中間体における網目の孔径は、網目の形状が球状の場合には、骨接着の観点から、１０μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることが更に好ましい。ゼラチン含有中間体における網目の孔径の上限については特に制限はないが、一般に２５００μｍ以下であることが好ましく、骨接着の点で１０００μｍ以下であることが好ましい。網目の形状が球状の場合に、網目の孔径（アスペクト比が１を超える場合には長軸方向の径）が１０μｍ以上であれば、網目構造の内部に細胞が侵入しやすくなる傾向があり、２５００μｍ以下であれば、生体との親和性を高める傾向がある。
【００７２】
ゼラチン含有中間体の空隙率は、好ましくは８０％以上９９．９９％以下であり、さらに好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。なお、空隙率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、空隙率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））として求めたものとする。嵩密度（ρ）は、乾燥質量と体積から算出し、真密度（ρc）は、ゲイリュサック型比重瓶の比重瓶法により求めることができる。
【００７３】
凍結乾燥工程では、ゼラチン溶液を凍結乾燥に供して、凍結乾燥体を得る。ゼラチン溶液に対して氷晶形成処理を行った場合には、上記のゼラチン含有中間体をそのまま凍結乾燥処理に供してもよい。
凍結条件としては、タンパク質の凍結乾燥に通常用いられる条件をそのまま採用すればよい。凍結乾燥の期間としては、例えば、０．５時間〜３００時間とすることができる。使用可能な凍結乾燥器についても特に制限はない。
【００７４】
粉砕工程では、ゼラチンの凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得る。得られた粉砕物は、ゼラチン顆粒として組織修復材に含有されうる。粉砕は、ハンマーミルやスクリーンミル等の粉砕機を適用可能であり、一定の大きさに粉砕されたものから随時回収されるため試験ごとの粒径分布のばらつきが小さいという観点から、スクリーンミル（例えばクアドロ社製コーミル）が好ましい。粉砕の条件としては、粉砕物表面の構造を維持するため、破砕する方式より切断する方式のほうが好ましい。また、顆粒内部の構造を維持するため、粉砕中に強い圧縮がかからない方式とすることが好ましい。
【００７５】
粉砕工程の後には、整粒を目的として分級工程を含むことができる。これにより、均一な粒子径を有するゼラチン粉砕物を得ることができる。分級には、例えば、目開き３００μｍ〜７１０μｍのふるいを用いることが好ましい。
【００７６】
粉砕工程の後には、得られた粉砕物中のゼラチンを架橋する架橋工程を含むことが好ましい。架橋の方法としては、例えば、熱架橋、酵素による架橋、各種の化学架橋剤を用いた架橋、ＵＶ架橋など公知の方法を用いることができる。架橋の方法としては、化学架橋剤を用いた架橋又は熱架橋であることが好ましい。架橋（共有結合）のほかに、疎水性相互作用、水素結合、及びイオン性相互作用の少なくともいずれかにより、更に高次構造化されているものも好ましい。
【００７７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、生分解性材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。
【００７８】
本発明において、アルデヒド類又は縮合剤などの架橋剤で処理する際のゼラチンとの混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００７９】
架橋剤を混合して攪拌した後は、温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、ゼラチンの変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００８０】
化学架橋剤を用いた架橋法の場合には、グルタルアルデヒドを化学架橋剤として用いた架橋であることがより好ましい。化学架橋剤を用いた架橋法を採用する場合には、化学架橋剤は、ゼラチン溶液に添加して、乾燥工程の前に架橋を行ってもよい。
【００８１】
熱架橋法に適用される架橋温度は、１００℃〜２００℃であることが好ましく、１２０℃〜１７０℃であることがより好ましく、１３０℃〜１６０℃であることがさらに好ましい。熱架橋法を採用することにより、架橋剤の使用を回避することができる。
熱架橋の処理時間としては、架橋温度、ゼラチンの種類やどの程度の分解性を保持させるかによって異なる。例えば、ヒト由来組換えゼラチンとして後述する実施例で使用のＣＢＥ３を用いた場合の熱架橋条件は、次のとおりである。実温約１３６℃のとき、２時間〜２０時間であることが好ましく、３時間〜１８時間であることがより好ましく、５時間〜８時間であることが更に好ましい。熱架橋の処理は、酸化防止の点で減圧又は真空下又は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。減圧度としては、４ｈＰａ以下とすることが好ましい。不活性ガスとしては窒素が好ましく、均一な加熱の観点より真空下より不活性ガス雰囲気下での架橋が好ましい。加熱手段としては特に制限はなく、例えばヤマト科学製ＤＰ−４３のような真空オーブン等を挙げることができる。
【００８２】
組織修復材は、上述した製造方法により得られたゼラチン顆粒のみを含むものであってもよく、他の成分をゼラチン顆粒と配合することによって得てもよい。
【００８３】
良好な組織再生能、例えば骨再生能の観点から、好ましくは、組織修復材の製造方法は、７質量％〜９質量％のゼラチンを含有するゼラチン溶液を、−４０℃〜−６０℃で１時間〜６時間にわたって冷却した後に凍結乾燥処理を行って、ゼラチンの凍結乾燥体を得ること、凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得ること、粉砕物に対して、ヒト由来組換えゼラチンとして後述するＣＢＥ３の場合１４０℃〜１６０℃で窒素雰囲気下３時間〜７時間の熱架橋を行うこと、ブタゼラチンの場合１４０℃〜１６０℃で窒素雰囲気下２４時間〜７２時間の熱架橋を行うことを含む。
【００８４】
［治療方法、修復方法］
本発明は、組織再生能が良好な組織修復材を提供することができるので、組織の修復方法や、組織の損傷を伴う疾患等の治療方法も本発明に包含される。
具体的には、本発明における組織の修復方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程を含む。
【００８５】
本発明の組織修復材により修復可能な組織としては、歯、骨等の硬組織であることが好ましい。特に、組織修復材は、骨再生用基材として好適である。本発明の組織修復材は単独で骨再生用の治療剤として用いることができる。本治療剤が適用される疾患としては、骨再生又は骨新生が必要な治療となる疾患である限り、特に限定されるものではない。
【００８６】
本発明における損傷組織の治療方法又は修復方法は、欠損又は損傷した対象組織の部位に、組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程、を含む。他の工程としては、例えば、移植細胞及び／又は骨誘導剤を組織修復材の適用の前後、又は同時に組織修復材を適用する部位へ適用することが挙げられる。
治療方法又は修復方法は、顎顔面領域における歯周組織欠損（periodontal defect）、インプラント欠損（implant defect）等；インプラント埋入時の予備的処置としてのＧＢＲ法、歯肉増大術（Ｒｉｄｇｅ  Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）法、サイナスリフト法、又はソケットリザベーション法；などに好ましく適用することができる。
【００８７】
［ブロック状組織修復材］
本発明のブロック状組織修復材は、ゼラチンを含み、質量基準で８００％以上の吸水率と、１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６０％以下の残存率と、を示す組織修復材である。本組織修復材によれば、組織の中でも特に真皮を良好に再生することができる。
したがって、本発明のブロック状組織修復材は、真皮再生用であることが好ましい。
【００８８】
本ブロック状組織修復材における各成分の好ましい態様及び数値範囲等については、ゼラチン顆粒を含む組織修復材におけるものと同様である。
本ブロック状組織修復材は、粉砕工程を行わない以外は、ゼラチン顆粒を含む組織修復材の製造方法と同様にして製造すればよい。
【００８９】
以下の実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００９０】
［実施例１］
組換えゼラチンとしてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、実施例１にかかる骨再生用基材を製造した。
ＣＢＥ３としては、以下記載のものを用いた（ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基は含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
アミノ酸配列（配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【００９１】
（凍結時に使用した容器の説明）
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
【００９２】
組換えゼラチンを８質量％で含むゼラチン水溶液を、円筒形容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−５０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収した。得られたゼラチン顆粒を、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で３．５時間処理し、試料１とした。
試料１における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、それぞれ以下のように評価した。
【００９３】
（１）吸水率
２５℃、相対湿度３０％において、以下の実験を行った。
メッシュ１５０本／２．５４ｃｍ／線径６μｍ、オープニング１０８μｍ相当、オープニングエリア４１％、厚さ１０６μｍ、３ｃｍ×３ｃｍの測定用のナイロン製メッシュ袋（以下メッシュ袋）の質量を測定した（Ａ）。試料１を１５．０（±１．０）ｍｇ秤量し（Ｂ）、測定用のメッシュ袋に入れた。試料１を入れず空の状態の測定用のメッシュ袋をブランク用メッシュ袋として使用し、質量を測定した（Ｃ）。双方のメッシュ袋の上面をクリップで挟み、超純水８０ｍｌ入りの１００ｍｌビーカーに吊るした。メッシュ袋内の試料１が全て水に浸かる位置に、双方のメッシュ袋を保持させて２時間以上放置した。２時間以上経過した後、ビーカー内の水を捨て双方のメッシュ袋を取り出し、それぞれ、同一の角度で斜めに吊るし、１０分間静置して余分な水分を切った。その後、ブランクメッシュ袋の質量（Ｄ），及び、試料１入りメッシュ袋の質量（Ｅ）を測定し、下記計算式（１）及び（２）を用いて吸水率を算出した。結果を表１に示す。
ブランク吸水率（Ｆ）＝Ｄ／Ｃ・・・（１）
吸水率＝（Ｅ−Ａ×Ｆ）／Ｂ×１００（％）・・・（２）
【００９４】
（２）酸残存率
２５℃、相対湿度３０％において、以下の実験を行った。測定用のマイクロチューブ（以下チューブ）の質量を測定した（Ａ）。試料１を５．０（±０．２）ｍｇ秤量し（Ｂ）、測定用チューブに充填した。試料１入りのチューブに１モル／ＬのＨＣｌを１．０ｍｌ添加し、３７℃振とう恒温器（ＨＢ−８０（タイテック）、シーソー、１分間の往復回数：６０回）で３時間振とうさせた。規定時間後、チューブを氷上に立て反応を止め、あらかじめ４℃に設定した遠心機で１０，０００×ｇ、１分遠心した。試料１が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を１ｍｌ添加して、上記と同一の条件で再度、遠心した。上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心した。上清を吸い取ったのち、凍結乾燥した。凍結乾燥後から取り出した後、空気中の水分を試料１が吸い取るのを防ぐためすばやくチューブのキャップを閉めた。チューブごと質量を測定し（Ｃ）、下記計算式（３）を用いて酸残存率を算出した。結果を表１に示す。
酸残存率＝（Ｃ−Ａ）／Ｂ×１００（％）・・・（３）
【００９５】
（３）骨再生評価
ＳＤラット（雄、１０〜１２週齢、０．３〜０．５ｋｇ）の頭頂骨に、直径５ｍｍの円形の骨欠損部を作製し、約３．６ｍｇの試料１を、作製した骨欠損部へ充填した後、縫合した。手術後２週目及び４週目にラットの頭頂骨についてマイクロＣＴを用いて骨量を計測し、欠損部体積に対する欠損部内部の骨体積を骨再生率とした。結果を表１に示す。
【００９６】
［実施例２］
７．５質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−４０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き１４００μｍのふるい下、且つ、目開き３００μｍのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で６時間処理し、試料２とした。
試料２における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【００９７】
［実施例３］
８質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−５０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で７時間処理し、試料３とした。
試料３における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【００９８】
［実施例４］
７．５質量％のブタゼラチン（ニッピ、ニッピハイグレードゼラチン（ｒ）ＡＰＡＴ）を含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−４０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で７２時間処理し、試料４とした。
試料４における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【００９９】
［比較例１］
７．５質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−４０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）したのち、４ｈＰａ以下１４２℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で５時間処理し、試料５とした。
試料５は各試験用に形をそれぞれ成形（下記参照）し、得られた試験用試料を用いて、吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
吸水率：約１．５ｍｍ×約２ｍｍ×約１２ｍｍの直方体
分解性：（直径）約６ｍｍ×（厚み）約１ｍｍの円柱
骨再生率：（直径）約５ｍｍ×（厚み）約１ｍｍの円柱
【０１００】
［比較例２］
７．５質量％のブタゼラチン（ニッピ、ニッピハイグレードゼラチン（ｒ）ＡＰＡＴ）を含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−４０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）したのち、４ｈＰａ以下１４２℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で３３時間処理し、試料６とした。
試料６は各試験用に形をそれぞれ成形（下記参照）し、得られた試験用試料を用いて、吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
吸水率：約１．５ｍｍ×約２ｍｍ×約１２ｍｍの直方体
分解性：（直径）約６ｍｍ×（厚み）約１ｍｍの円柱
骨再生率：（直径）約５ｍｍ×（厚み）約１ｍｍの円柱
【０１０１】
［比較例３］
８質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−５０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で１８時間処理し、試料７とした。
試料７における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【０１０２】
［比較例４］
８質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約４ｍｌ流し込んだ後、−５０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ−Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で１５時間処理し、試料８とした。
試料８における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【０１０３】
［比較例５］
１２質量％のブタゼラチン（ニッピ、ニッピハイグレードゼラチン（ｒ）ＡＰＡＴ）を含むゼラチン水溶液を９℃で冷却したポット内でＴ．Ｋ．ホモディスパー２．５型を用い１４００ｒｐｍにて攪拌した後、−５０℃の冷凍庫内で８時間静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。なお、本条件での攪拌は、攪拌フルード数Ｆｒが２．２２、及び攪拌レイノズル数が３，７００の攪拌条件に相当する。このゼラチンブロックを凍結乾燥して、粉砕機（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、４ｈＰａ以下１６０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で１９時間処理し、試料９とした。
試料９における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【０１０４】
［比較例６］
７．５質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約２０ｍｌ流し込み、−２℃で静置した後、−３０℃まで冷やし、氷核ができたことを確認した後、−４．５℃まで戻した。その後、０．３℃／分の速度で冷却することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥し、粉砕機（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、４ｈＰａ以下１４２℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で３．５時間処理し、試料１０とした。
試料１０における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【０１０５】
［比較例７］
７．５質量％の実施例１に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約２０ｍｌ流し込み、−２℃で静置した後、−３０℃まで冷やし、氷核が出来たことを確認した後、−６℃まで戻した。その後、０．５℃／分の速度で冷却することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ５）によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下１３０℃（ヤマト科学、ＤＰ−４３）で１８時間処理し、試料１１とした。
試料１１における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例１と同様にして評価した。結果を表１に示す。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
表１から、８００質量％以上の吸水率及び６０質量％以下の酸残存率を示し、ゼラチン顆粒を含む試料１〜試料４の組織修復材であれば、良好な骨再生能を有し、特に４週間後の骨再生率は４５％を超えるものであった。吸水率８００質量％以上ではない、又は酸残存率が６０質量％を超える試料７〜試料１１はいずれも、試料１〜試料４の骨再生能よりも劣る。
【０１０８】
得られた試料１、試料３及び試料７の酸残存率は、試料１では８％、試料３では５９％、試料７では８４％であった（表１）。この結果から、架橋時間を短くすることにより酸分解性が高くなり、酸残存率が低くなることがわかった。このことから、組織修復材の酸分解性の調整には、架橋時間が寄与していることがわかる。
【０１０９】
顆粒状の試料３及び試料４と、ブロック状の試料５及び試料６の吸水率及び酸残存率から、吸水率及び酸残存率が同程度であっても、組織修復材の形状が異なることで、骨再生率がかわることがわかった（表１）。
これは、例えば架橋時間を調整して、欠損部のスペースを維持するための強度を持たせた場合、ブロック状の基材を用いると、細胞は基材を分解しながら増殖しなければならず、欠損部内部に細胞が到達しにくいが、顆粒状の基材を用いると、細胞が粒子間を通って欠損部内部まで容易に到達することができるようになるため、スムーズな骨再生が行われることに起因すると考えられた。このことから、骨再生基材の良好な骨再生率、欠損部容積維持の調整には、顆粒状の基材が寄与していることがわかる。
【０１１０】
［実施例５］
（試料の調製）
実施例１に記載の組換えゼラチンを用い、３％組換えゼラチン水溶液を作製し、その水溶液を円筒型容器に流し込んだ。その後−８０℃の冷凍庫内で、１時間静置した。その後凍結乾燥し、４ｈＰａ以下１６０℃で３時間熱架橋することにより、吸水率２６００％、酸残存率５０％のゼラチンブロックを得た。
【０１１１】
（ラット背部による真皮様組織（肉芽様組織）試験）
Ｗｉｓｔａｒラット（雄、１０週齢以降）を用い、塩酸ケタミンと塩酸キシラジンをそれぞれ９０ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与することより麻酔した。ラットの背部を脱毛後に直径１９ｍｍの円形の真皮欠損を作製した。直径１９ｍｍ、厚み約１．５ｍｍの上記ゼラチンブロックを真皮欠損部へ貼付後、ワセリン付ガーゼ（アダプティック（登録商標）、ジョンソン・エンド・ジョンソン）、ウェットコットン、ガーゼをのせ、固定した。固定後、２週目に麻酔下で、創傷被覆材を含む背部組織を摘出した。
その摘出組織をＨＥ染色して組織学的観察を行った結果、真皮様組織（肉芽様組織）の形成が認められた。
このことから、本試料は、特に真皮の再生に好適であることがわかった。
【０１１２】
このように本発明の実施例にかかる組織修復材は、良好な骨再生能を示す骨再生用基材であった。
従って、本発明によれば、良好な組織再生能を有する組織修復材を提供することができる。
【０１１３】
２０１３年３月１２日に出願された日本国特許出願２０１３−０４９３３９号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【配列表】
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