(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物またはその塩。
【化１】
0005840763.tif 000054
式中、
ＸおよびＹは、独立にＣＨまたはＮを表し、但し、ＸおよびＹの少なくとも１はＣＨであり、
Ｒ1は、基Ｃ（Ｏ）ＯＲ4を表し、ここでＲ4はＣ1-4アルキルまたはＣ3-7シクロアルキルを表すか、または
Ｒ1は、フェニル、ピリジル、ピラジニルおよびピリミジニルから選択される基を表し、前記基はハロゲン、Ｃ1-4アルキルおよびＣＮから選択される１または２の置換基により置換されていてもよく、
Ｒ2は、Ｃ1-4アルキルを表し、
Ｒ3は、Ｃ1-4アルキルを表し、
Ｒ5およびＲ6は、独立にＣ1-4アルキル基を表し、または、
Ｒ5およびＲ6は、それらが結合するＮと一緒に５または６員ヘテロシクリルを形成し、
Ｒ7は、存在しないか、またはＣ1-4アルキルを表し、
ｍは、０、１または２を表し、
ｎは、１または２を表す。
【請求項２】
ＸおよびＹが両方ともＣＨを表す、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
ＸがＣＨを表し、ＹがＮを表す、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
Ｒ1が基Ｃ（Ｏ）ＯＲ4（ここで、Ｒ4はイソプロピルを表す）を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
Ｒ1が、ハロゲン、Ｃ1-4アルキルおよびＣＮから選択される１または２の置換基により置換されていてもよいフェニルまたはピリジルを表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
Ｒ1が４−クロロフェニルまたは５−シアノピリジン−２−イルを表す、請求項５に記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
Ｒ2がメチルを表す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項８】
Ｒ3がメチルを表す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項９】
ｍが０を表す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項１０】
Ｒ5およびＲ6が両方ともメチルを表す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項１１】
Ｒ7が存在しない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が（２Ｓ，４Ｒ）光学異性体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項１３】
２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエートである化合物またはその塩。
【請求項１４】
２−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム；
３−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプロパン−１−アミニウム；
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート；
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート；
２−（ジメチルアミノ）エチル  ６−（（２Ｒ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート；
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート、および
２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
から選択される化合物またはその塩。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項１６】
請求項１５において定義された化合物またはその薬学上許容可能な塩および１以上の薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
１以上の他の治療的に活性な薬剤と一緒に、請求項１５において定義された式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を含む、組み合わせ医薬製品。
【請求項１８】
治療において使用するための、請求項１５において定義された化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項１９】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療において使用するための、請求項１５において定義された化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項２０】
疾患または病態が慢性の自己免疫性のおよび／または炎症性の病態である、請求項１９に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項２１】
疾患または病態が癌である、請求項１９に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項２２】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療のための薬剤の製造における、請求項１５に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラヒドロキノリン誘導体、このような化合物を含む医薬組成物および治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のゲノムは、細胞の核内で高度に組織化されている。二本鎖ＤＮＡの長い鎖は、ヒストンタンパク質のオクタマー（ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の２つのコピーを含むことが最も通常である）の周りに巻き付いてヌクレオソームを形成する。その後、この基本単位は、ヌクレオソームの凝集およびフォールディングによってさらに圧縮され、高度に凝縮したクロマチン構造を形成する。ある範囲の異なる凝縮状態が可能であり、この構造の密集度は細胞周期の間に変化し、細胞分裂のプロセスの間が最もコンパクトである。クロマチン構造は、遺伝子転写の調節において非常に重要な役割を果たし、遺伝子転写は、高度に凝縮したクロマチンからは効率よく起こり得ない。クロマチン構造は、ヒストンタンパク質、特にヒストンＨ３およびＨ４に対する、最も一般的には、コアのヌクレオソーム構造を越えて延びるヒストン尾部内での一連の翻訳後修飾によって制御される。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化が含まれる。これらのエピジェネティックなマークは、ヒストン尾部内の特定の残基の上にタグを付ける特異的な酵素によって書き込まれ消去されることによりエピジェネティックコードを形成し、次に、これが細胞によって読み取られてクロマチン構造の遺伝子特異的調節、およびこれにより転写が可能になる。
【０００３】
ヒストンのアセチル化は、この修飾によって、静電気が変化することによりＤＮＡとヒストンオクタマーとの相互作用が緩むので、最も通常では、遺伝子転写の活性化と関連する。この物理的変化に加えて、特異的タンパク質がヒストン内のアセチル化されたリジン残基に結合し、エピジェネティックコードを読み取る。ブロモドメインは、もっぱらヒストンに関連してというわけではないが一般的にアセチル化されたリジン残基に結合する、タンパク質内の小さい（約１１０アミノ酸）明確なドメインである。ブロモドメインを含むことが知られている約５０のタンパク質のファミリーがあり、それらは、細胞内で一定範囲の機能を有する。
【０００４】
ブロモドメイン含有タンパク質のＢＥＴファミリーは、ごく近傍の２つのアセチル化されたリジン残基に結合して、相互作用の特異性を高めることができるタンデム型のブロモドメインを含む４つのタンパク質（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４およびＢＲＤ−ｔ）を含む。ＢＲＤ２およびＢＲＤ３は、活発に転写される遺伝子に沿ってヒストンと結合することが報告されており、転写伸長を容易にすることに関与し得るが（Ｌｅｒｏｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００８  ３０（１）：５１−６０）、他方で、ＢＲＤ４は、誘導遺伝子へのｐＴＥＦ−β複合体の補充に関与し、ＲＮＡポリメラーゼのリン酸化および増大した転写のアウトプットを生じると思われる（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｃｅｌｌ，２００９  １３８（１）：１２９−１４５）。ＢＲＤ４またはＢＲＤ３は、ＮＵＴ（精巣の中の核タンパク質）と融合し、上皮新生物(epithelial neoplasma)の非常に悪性型である新規な融合腫瘍遺伝子ＢＲＤ４−ＮＵＴまたはＢＲＤ３−ＮＵＴを形成し得る（Ｆｒｅｎｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３０４−３０７およびＦｒｅｎｃｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，２２（２０），４１３５−４１３９）ということも報告されている。データは、ＢＲＤ−ＮＵＴ融合タンパク質は発癌に寄与するということを示唆する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７，２２３７−２２４２）。ＢＲＤ−ｔは、精巣および卵巣でユニークに発現される。すべてのファミリーのメンバーは、細胞周期の諸相を制御または実行する上で何らかの機能を有すると報告されており、細胞分裂の際、染色体と複合して留まることが示されている。これは、エピジェネティックな記憶の維持における１つの役割を示唆する。さらに、いくつかのウイルスは、ウイルス複製のプロセスの一部としてそれらのゲノムを宿主細胞のクロマチンにつなぐためにこれらのタンパク質を利用する（Ｙｏｕら、Ｃｅｌｌ，２００４  １１７（３）：３４９−６０）。
【０００５】
特開２００８−１５６３１１号公報は、ウイルス感染／増殖に関して有用性を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤であると言われるベンゾイミダゾール誘導体を開示する。
【０００６】
国際公開第２００９／０８４６９３号は、抗癌剤として有用であると言われる、アセチル化されたヒストンとブロモドメイン含有タンパク質との間の結合を阻害すると言われる一連のチエノトリアゾロジアゼピン誘導体を開示する。
【０００７】
ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６９３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６７０１は、ＢＥＴファミリーブロモドメインとアセチル化されたリジン残基との結合を阻害する一連のテトラヒドロキノリン誘導体を開示する。
【０００８】
ブロモドメインとその同族のアセチル化されたタンパク質との結合を阻害する新規なクラスの化合物、より具体的には、アセチル化されたリジン残基へのＢＥＴファミリーブロモドメインの結合を阻害する１つのクラスの化合物が見出された。このような化合物は、本明細書中で以降、「ブロモドメイン阻害剤」と呼ばれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１５６３１１号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０８４６９３号
【特許文献３】ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６９３
【特許文献４】ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６７０１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｅｒｏｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００８  ３０（１）：５１−６０
【非特許文献２】Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｃｅｌｌ，２００９  １３８（１）：１２９−１４５
【非特許文献３】Ｆｒｅｎｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３０４−３０７およびＦｒｅｎｃｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，２２（２０），４１３５−４１３９
【非特許文献４】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７，２２３７−２２４２
【非特許文献５】Ｙｏｕら、Ｃｅｌｌ，２００４  １１７（３）：３４９−６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様では、式（Ｉ）の化合物またはその塩、より具体的にはその薬学上許容可能な塩が提供される。
【化１】
0005840763.tif 000002
【００１２】
本発明の第２の態様では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩および、１以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明の第３の態様では、治療に、特にブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容可能な塩が提供される。
【００１４】
本発明の第４の態様では、治療有効量の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を投与する工程を含む、それを必要としている被験体におけるブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療方法が提供される。
【００１５】
本発明の第５の態様では、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療のための薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容可能な塩の使用が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は式（Ｉ）の化合物、またはその塩に関する。
【化２】
0005840763.tif 000003
【００１７】
［式中、
ＸおよびＹは、ＸおよびＹの少なくとも１がＣＨであるという条件で、独立にＣＨまたはＮを表し、
Ｒ１は、基Ｃ（Ｏ）ＯＲ４（ここでＲ４はＣ１−４アルキルまたはＣ３−７シクロアルキルを表す）を表し、または
Ｒ１は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキルおよびＣＮから選択される１または２の置換基により置換されていてもよい、フェニル、ピリジル、ピラジニルおよびピリミジニルから選択される基を表し、
Ｒ２は、Ｃ１−４アルキルを表し、
Ｒ３は、Ｃ１−４アルキルを表し、
Ｒ５およびＲ６は、独立にＣ１−４アルキル基を表し、または、
Ｒ５およびＲ６は、それらが結合するＮと一緒に５または６員ヘテロシクリルを形成し、
Ｒ７は、存在しない、またはＣ１−４アルキルを表し、
ｍは、０、１または２を表し、
ｎは、１または２を表す］
に関する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明は、テトラヒドロキノリン環の２位および４位における置換基に関してｃｉｓの相対的な立体化学を有する式（Ｉ）の化合物を提供する。１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物またはその塩は（２Ｓ，４Ｒ）光学異性体である。
【００１９】
１つの実施形態では、ＸおよびＹは両方ともＣＨを表す。さらなる実施形態では、ＸはＣＨを表し、ＹはＮを表す。
【００２０】
１つの実施形態では、Ｒ１は、基Ｃ（Ｏ）ＯＲ４（ここでＲ４はイソプロピルを表す）を表す。
【００２１】
さらなる実施形態では、Ｒ１は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキルおよびＣＮから選択される１または２の置換基により置換されていてもよいフェニルまたはピリジルを表す。さらに、さらなる実施形態では、Ｒ１は、４−クロロフェニルまたはＲ１は、５−シアノピリジン−２−イルを表す。
【００２２】
１つの実施形態では、Ｒ２は、メチルを表す。
【００２３】
１つの実施形態では、Ｒ３は、メチルを表す。
【００２４】
１つの実施形態では、ｍは０を表す。
【００２５】
１つの実施形態では、ｎは０を表す。さらなる実施形態では、ｎは１を表す。
【００２６】
１つの実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、両方ともメチルを表す。
【００２７】
Ｒ７がＣ１−４アルキルを表す時は、４級アンモニウム部分を形成することがわかるであろう。１つの実施形態では、Ｒ７は、存在しない。
【００２８】
それぞれの可変基に関する実施形態を、各可変基について一般に別々に上に記載したが、本発明は、それらの塩を含めて上記の実施形態の全ての組み合わせを包含するものとする。
【００２９】
本発明に係る特定の化合物は、
２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート；
２−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム；
３−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプロパン−１−アミニウム；
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート；
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート；
２−（ジメチルアミノ）エチル  ６−（（２Ｒ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート；
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート；および
２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
またはそれらの塩である。
【００３０】
本明細書においては、特に明記しない限り、
・用語「ハロゲン」はフッ素、塩素または臭素から選択される基を記載する為に使用される。
【００３１】
・用語「Ｃ１−４アルキル」および「Ｃ１−６アルキル」は、それぞれ、１〜４または１〜６の炭素原子を含む線状又は分岐状のアルキル基を有する基またはそのような基の一部を記載する為に使用される。これらの基の好適な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルを含む。
【００３２】
・用語「Ｃ３−７シクロアルキル」は、少なくとも３、多くとも７の炭素原子を含む芳香族ではないカルボシクリル環を記載する為に使用される。Ｃ３−７シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルを含む。
【００３３】
・用語「５または６員ヘテロシクリル」は、非芳香族性であり、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１、２または３のヘテロ原子を含む飽和環を示す。これらの基の例は、ピロリジニル、モルホリニル、ピペリジニルおよびピペラジニルを含む。
【００３４】
本発明が、遊離塩基としての、およびその塩としての、例えばその薬学上許容可能な塩としての式（Ｉ）の化合物を包含することは理解されるであろう。１つの実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩に関する。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物の塩は医薬において使用される可能性が高いため、式（Ｉ）の化合物の塩は、望ましくは薬学上許容可能なものである。好適な薬学上許容可能な塩としては、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る。本明細書において使用される用語「薬学上許容可能な塩」は、本発明の化合物の全ての薬学上許容可能な塩または水和物を意味し、レシピエントへの投与の際に（直接的にまたは間接的に）与えることができる。好適な塩に関する総説として、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。典型的には、薬学上許容可能な塩は、所望の酸または塩基を適宜使用することにより、容易に調製され得る。得られる塩は、溶液から沈殿され、濾過によって集められてもよく、または溶媒の蒸発によって回収されてもよい。
【００３６】
薬学上許容可能な塩基付加塩は、好適な溶媒の中で行われてもよい、式（Ｉ）の化合物と、好適な無機または有機の塩基（例えばトリエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、コリン、アルギニン、リジンまたはヒスチジン）との反応で形成され得、この塩は通常、例えば結晶化および濾過によって単離される。薬学上許容可能な塩基塩としては、アンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウムの塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウムの塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの第一級、第二級および第三級アミンの塩を含めた有機塩基との塩が挙げられる。
【００３７】
薬学上許容可能な酸付加塩は、有機溶媒などの好適な溶媒の中で行われてもよい、式（Ｉ）の化合物の、好適な無機または有機の酸（例えば、臭化水素酸、塩化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸などのナフタレンスルホン酸、またはヘキサン酸）との反応で形成され得、この塩は通常、例えば結晶化および濾過によって単離される。式（Ｉ）の化合物の薬学上許容可能な酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得、またはこれらであり得る。
【００３８】
他の薬学上許容可能でない塩、例えばギ酸塩、シュウ酸塩またはトリフルオロ酢酸塩は、例えば式（Ｉ）の化合物の単離において使用され得るため、本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
本発明は、その範囲内に、式（Ｉ）の化合物の塩のすべての可能な化学量論形態および非化学量論形態を含む。
【００４０】
多くの有機化合物が、その反応が行われるかまたは沈殿もしくは結晶化する際に使用される溶媒と複合体を形成し得ることは理解されるであろう。これらの複合体は「溶媒和物」として知られる。例えば、水との複合体は「水和物」として知られる。高沸点を有しおよび／または水素結合を形成することができる溶媒、例えば水、キシレン、Ｎ−メチルピロリジノン、メタノールおよびエタノールは、溶媒和物を形成するために使用され得る。溶媒和物の同定のための方法は、ＮＭＲおよび微量分析を含むが、これらに限定されない。式（Ｉ）の化合物の溶媒和物は本発明の範囲内にある。
【００４１】
本発明は、その範囲内に、式（Ｉ）の化合物の溶媒和物のすべての可能な化学量論形態および非化学量論形態を含む。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物は、結晶性形態または非晶性形態であり得る。さらに、式（Ｉ）の化合物の結晶性形態のうちのいくつかは、多形として存在し得、この多形は本発明の範囲内に含まれる。式（Ｉ）の化合物の多形形態は、特に限定されないが、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターン、赤外（ＩＲ）スペクトル、ラマンスペクトル、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）および固体状態核磁気共鳴（ＳＳＮＭＲ）を含むいくつかの従来の分析技法を使用して特徴づけおよび区別され得る。
【００４３】
本明細書に記載される化合物はキラル原子を含有し、その結果、光学異性体、例えば鏡像異性体またはジアステレオ異性体が形成され得る。従って、本発明は、実質的に他の異性体を含まないもの（すなわち純粋である）として単離された個々の異性体としてであろうと、または混合物（すなわちラセミ化合物およびラセミ混合物）としてであろうと、式（Ｉ）の化合物のすべての異性体を包含する。実質的に他の異性体を含まないもの（すなわち純粋である）として単離された個々の異性体は、他の異性体が１０％未満、特に約１％未満、例えば約０．１％未満存在するように単離され得る。
【００４４】
異性体の分離は、当業者に公知の従来の技法によって、例えば分別晶出、クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって達成され得る。
【００４５】
特定の式（Ｉ）の化合物は、いくつかの互変異性体のうちの１つとして存在し得る。本発明は、個々の互変異性体としてであろうと、またはこれらの混合物としてであろうと、式（Ｉ）の化合物のすべての互変異性体を包含することは理解されるであろう。
【００４６】
特定の式（Ｉ）の化合物は、いくつかの互変異性体のうちの１つとして存在し得る。本発明は、個々の互変異性体としてであろうと、またはこれらの混合物としてであろうと、式（Ｉ）の化合物のすべての互変異性体を包含することは理解されるであろう。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物およびその塩は、標準的な化学を含めた様々な方法によって製造され得る。特段の記載がない限り、これまでに定義された変更要素のいずれも、これまでに定義された意味を持ち続ける。例示的な一般的な合成方法が以下に示され、その後、具体的な式（Ｉ）の化合物またはその塩が、実施例で調製される。
【００４８】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物またはその塩の製造方法を提供し、この方法は、以下の（ａ）および（ｂ）から選択される工程を含み、
（ａ）は、式（ＩＩ）の化合物
【化３】
0005840763.tif 000004
【００４９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｙおよびｍは、式（Ｉ）において定義した通りである）を、式（ＩＩＩ）の化合物
【化４】
0005840763.tif 000005
【００５０】
（式中、Ｒ５、Ｒ６およびｎは、式（Ｉ）において定義した通りである）
と反応することを含み、
（ｂ）は、式（ＩＩ）の化合物またはその塩を、式（ＩＶ）の化合物
【化５】
0005840763.tif 000006
【００５１】
（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびｎは、式（Ｉ）において定義した通りであり、Ｈａｌはハロゲンを表す）と反応することを含む。
【００５２】
工程（ａ）
式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）の化合物の間の反応は、好適な活性化剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ））および好適なアシル移動触媒（例えば、４−ジメチルアミノピリジン）の存在下で、好適な溶媒（例えば、ジクロロメタンまたはＤＭＦ）において実施され得る。
【００５３】
式（ＩＩ）の化合物は、本明細書に記載されている方法、またはそれに類似の方法により製造することができる。式（ＩＩＩ）の化合物は市販されている。
【００５４】
工程（ｂ）
工程（ｂ）について、好適なＨａｌ基はブロモである。式（ＩＩ）と式（ＩＶ）の化合物の間の反応は、典型的には、好適な溶媒（例えば、ＤＭＦ）において、好適な塩基（例えば炭酸カリウム）の存在下で実施される。
【００５５】
式（ＩＩ）の化合物は、本明細書に記載されている方法、またはそれに類似の方法により製造することができる。式（ＩＶ）の化合物は市販されている。
【００５６】
上記の化合物の１以上の官能基を保護することが好都合であり得ることは、当業者によって理解されるであろう。保護基およびそれら保護基の除去のための手段の例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００６）に見出され得る。好適なアミン保護基は、アシル（例えば、アセチル、カルバメート（例えば、２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカルボニル））およびアリールアルキル（例えば、ベンジル）を含み、これらの基は、適宜、加水分解（例えば、ジオキサン中の塩化水素酸またはジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸などの酸を使用する）によって、または還元的に（例えばベンジルもしくはベンジルオキシカルボニル基の水素化分解または酢酸中で亜鉛を使用する２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル基の還元的除去）除去され得る。他の好適なアミン保護基は、塩基触媒による加水分解によって除去され得るトリフルオロアセチル（−ＣＯＣＦ３）を含む。
【００５７】
本明細書により記載された合成方法のいずれにおいても、種々の基および部分が分子へと導入される合成工程の正確な順序は変わり得ることは理解されるであろう。このプロセスの１つの段階で導入される基または部分が、その後の変換および反応によって影響を受けないことを確実にすること、およびそれに応じて合成工程の順序を選択することは、当業者の技能の範囲内であろう。
【００５８】
式（ＩＩ）の特定の中間体化合物は、新規であると考えられ、従って本発明のなおさらなる態様を形成する。
【００５９】
式（Ｉ）の化合物およびその塩はブロモドメイン阻害剤であり、従って、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療において潜在的な有用性を有すると考えられる。
【００６０】
従って、本発明は、治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を提供する。式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩は、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療において使用され得る。
【００６１】
従って、本発明は、ブロモドメイン阻害剤が適応されるすべての疾患または病態の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を提供する。
【００６２】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療のための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩の使用もまた提供される。
【００６３】
治療有効量の、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を投与する工程を含む、それを必要としている被験体におけるブロモドメイン阻害剤が適応される疾病または病態の治療方法もまた提供される。
【００６４】
好適には、それを必要としている被験体は哺乳動物、特にヒトである。
【００６５】
本明細書で使用する用語「有効量」は、例えば研究者または臨床医によって求められている組織、系、動物またはヒトの生物学的応答または医学的応答を引き出すであろう、薬物または医薬品の量を意味する。さらに、用語「治療有効量」は、そのような量を投与されたことがない対応する被験体と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の改善された治療、治癒、予防、もしくは寛解、または疾患もしくは障害の進行の速度の低下を生じるいずれかの量を意味する。また、この用語は、その範囲内に、正常な生理学的機能を高めるために有効な量を包含する。
【００６６】
ブロモドメイン阻害剤は、全身性炎症または組織の炎症、感染または低酸素症に対する炎症反応、細胞の活性化および増殖、脂質代謝、線維症に関連する様々な疾患または病態の治療、ならびにウイルス感染症の予防および治療において有用であると考えられる。
【００６７】
ブロモドメイン阻害剤は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、急性痛風、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、喘息、慢性閉塞性気道疾患、間質性肺炎、心筋炎、心膜炎、筋炎、湿疹、皮膚炎（例えば、アトピー皮膚炎）、脱毛症、白斑、水疱性皮膚症、腎炎、血管炎、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、うつ病、シェーグレン症候群、唾液腺炎、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、アーヴァイン−ガス症候群（白内障後および手術後）、網膜色素変性、扁平部炎、バードショット網膜脈絡膜症、網膜前膜、嚢胞様黄斑浮腫、傍中心窩毛細血管拡張症、牽引性黄斑症、硝子体黄斑牽引症候群、網膜剥離、視神経網膜炎、突発性黄斑浮腫疾患、網膜炎、涙液減少症（乾性角結膜炎）、春季角結膜炎、萎縮性角結膜炎、前部ブドウ膜炎、全ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、ブドウ膜炎関連黄斑浮腫、強膜炎、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑変性症、肝炎、膵炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、アジソン病、下垂体炎、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病および移植された臓器の急性拒絶反応などの実に様々な慢性の自己免疫性のおよび／または炎症性の病態の治療において有用であり得る。
【００６８】
ブロモドメイン阻害剤は、急性痛風、巨細胞性動脈炎、ループス腎炎を含む腎炎、糸球体腎炎などの臓器障害を伴う血管炎、巨細胞性動脈炎を含む血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、川崎病、高安動脈炎、壊疽性膿皮症、臓器障害を伴う血管炎および移植された臓器の急性拒絶反応などの実に様々な急性の炎症性の病態の治療において有用であり得る。
【００６９】
ブロモドメイン阻害剤は、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物またはそれらの毒素による感染に対する炎症反応を伴う疾患または病態、例えば、敗血症、敗血症症候群、敗血症性ショック、内毒血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群、毒素性ショック症候群、急性肺傷害、ＡＲＤＳ（成人呼吸促迫症候群）、急性腎不全、劇症肝炎、熱傷、急性膵炎、手術後症候群、サルコイドーシス、ヘルクスハイマー反応、脳炎、脊髄炎、髄膜炎、マラリア、ならびにインフルエンザ、帯状疱疹、単純ヘルペスおよびコロナウイルスなどのウイルス感染症と関連するＳＩＲＳの予防または治療において有用であり得る。
【００７０】
ブロモドメイン阻害剤は、心筋梗塞、脳血管虚血（発作）、急性冠症候群、腎臓再灌流傷害、臓器移植、冠動脈バイパス移植、心肺バイパス術、肺、腎臓、肝臓、胃腸内または肢末梢部の塞栓症などの虚血再灌流傷害と関連する病態の予防または治療において有用であり得る。
【００７１】
ブロモドメイン阻害剤は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病などのＡＰＯ−Ａ１の調節を介する脂質代謝の障害の治療において有用であり得る。
【００７２】
ブロモドメイン阻害剤は、特発性肺線維症、腎臓の線維化、術後狭窄、ケロイド傷生成、強皮症（斑状強皮症を含む）および心臓繊維化などの繊維性の病態の治療において有用であり得る。
【００７３】
ブロモドメイン阻害剤は、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルスおよびポックスウイルスならびに他のＤＮＡウイルスなどのウイルス感染症の予防および治療において有用であり得る。
【００７４】
ブロモドメイン阻害剤は、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫）、上皮癌（肺癌、乳癌および結腸癌を含む）、正中線悪性腫瘍（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、間葉系腫瘍、肝腫瘍、腎腫瘍および神経腫瘍を含む癌の治療において有用であり得る。
【００７５】
ブロモドメイン阻害剤は、悪性でない黒色腫（紫外線角化症および基底細胞）などの真皮の病態、上皮内黒色腫、扁平上皮癌および皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療において有用であり得る。
【００７６】
１つの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、全身性炎症反応症候群に関連する疾患、例えば敗血症、熱傷、膵炎、重症外傷、出血および虚血から選択される。この実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、ＳＩＲＳ、ショック発症、多臓器不全症候群（これは、急性肺傷害、ＡＲＤＳ、急性の腎臓、肝臓、心臓および胃腸内の傷害の発症を含む）の発生率および死亡率を低下させるために、診断の時点で投与されるであろう。別の実施形態では、このブロモドメイン阻害剤は、高いリスクの敗血症、出血、広範囲の組織の損傷、ＳＩＲＳまたはＭＯＤＳ（多臓器不全症候群）に関連する手術または他の処置に先だって投与されるであろう。特定の実施形態では、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、敗血症、敗血症症候群、敗血症性ショックまたは内毒血症である。別の実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、急性膵炎または慢性膵炎の治療に適応される。別の実施形態では、ブロモドメインは熱傷の治療に適応される。
【００７７】
１つの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、単純ヘルペスの感染および再賦活、口唇ヘルペス、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）の感染および再賦活、水痘、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、頸部新生物、アデノウイルス感染（急性呼吸器疾患を含む）、牛痘および天然痘などのポックスウイルス感染およびアフリカブタ熱ウイルスから選択される。１つの特定の実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、皮膚または子宮頸部上皮のヒトパピローマウイルス感染の治療に適応される。
【００７８】
用語「ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態」は、上記の病状のいずれかまたはすべてを包含することが意図されている。
【００７９】
１つの実施形態では、ブロモドメインを式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩と接触する工程を含む、ブロモドメインを阻害するための方法が提供される。
【００８０】
治療に使用するため、式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩はそのままの化学物質として投与され得ることが可能であるが、一方で、活性成分を医薬組成物として提供することが一般的である。
【００８１】
従って、さらなる態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物または薬学上許容可能な塩および、１以上の薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は上記のとおりである。担体（１または複数）、希釈剤（１または複数）または賦形剤（１または複数）は、その組成物の他の成分と適合性でありかつ組成物のレシピエントにとって有害ではないという意味で許容できるものである必要がある。本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容可能な塩を、１以上の薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法も提供される。この医薬組成物は、本明細書に記載される病態のいずれかの治療において使用され得る。
【００８２】
式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は医薬組成物に使用することが意図されるため、それらは、各々、実質的に純粋な形態、例えば少なくとも６０％純粋、より好適には少なくとも７５％純粋、好ましくは少なくとも８５％純粋、特に少なくとも９８％純粋（重量基準に対する重量％）で与えられることが好ましいことはすぐに理解されるであろう。
【００８３】
医薬組成物は、単位用量あたり所定の量の活性成分を含む単位用量形態で提供され得る。好適な単位投薬組成物は、１日用量もしくは分割日量、またはその適切な一部分、の活性成分を含む組成物である。従ってこのような単位用量は、１日１回よりも多く投与され得る。好適な単位投薬組成物は、本明細書中ですでに記載したように、１日用量もしくは（１日１回よりも多い投与のための）分割日量、またはその適切な一部分、の活性成分を含む組成物である。
【００８４】
医薬組成物は、いずれかの適切な経路による、例えば経口（口腔内または舌下を含む）、経直腸、吸入、鼻腔内、局所（口腔内、舌下または経皮を含む）、眼（局所、眼内、結膜下、強膜上またはテノン嚢下を含む）、膣内または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与のために適応し得る。このような組成物は、薬学の技術分野で公知のいずれかの方法によって、例えばこの活性成分を担体（１または複数）または賦形剤（１または複数）と合わせることによって調製され得る。
【００８５】
１つの実施形態では、この医薬組成物は、非経口投与、特に静脈内投与に適応している。
【００８６】
１つの実施形態では、この医薬組成物は経口投与に適応している。
【００８７】
１つの実施形態では、この医薬組成物は局所投与に適応している。
【００８８】
ブロモドメイン化合物の全身曝露を増加または減少ために閉塞及び皮膚浸透の改良が得られる好適な剤型は、限定されないが、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩（アルギン酸エステル）、ゼラチンまたはポリビニルピロリドンの薬学上許容可能な形態を含む。
【００８９】
非経口投与に適応させた医薬組成物は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、および組成物を意図されたレシピエントの血液と等張性であるようにする溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。この組成物は、単位用量容器または複数用量容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルに入れて提供され得、使用直前に、注入のために、滅菌した液体担体、例えば水の添加だけを必要とするフリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保存され得る。すぐに使用できる注射液および懸濁液は、滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００９０】
経口投与に適応させた医薬組成物は、カプセルもしくは錠剤、粉末もしくは顆粒、水性もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤、食用フォームもしくはホイップ、または水中油型エマルションもしくは油中水型エマルションなどの個別単位として提供され得る。
【００９１】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与のために、活性薬物成分は、エタノール、グリセロール、水などの、経口用の、無毒な薬学上許容可能な不活性な担体と組み合わされ得る。錠剤またはカプセルの中へと組み込むのに好適な粉末は、その化合物を（例えば微粉化によって）好適な微細サイズへと細かく砕き、例えば、デンプンまたはマンニトールなどの食用炭水化物などの、同様に調製した薬学上の担体と混合することにより調製され得る。着香剤、保存剤、分散剤および着色剤も存在し得る。
【００９２】
カプセルは、粉末混合物を上記のように調製し、形成されたゼラチンシースに充填することにより作製され得る。コロイドシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは固体ポリエチレングリコールなどの滑剤および潤滑剤が、充填操作の前に、この粉末混合物に添加され得る。カプセル剤が服用されるときの薬剤の利用能を改善するために、寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムなどの崩壊剤または溶解補助剤も、加えられ得る。
【００９３】
さらに、所望される場合または必要な場合、好適な結合剤、滑剤、潤滑剤、甘味剤、香料、崩壊剤および着色剤も当該混合物の中へと組み込まれ得る。好適な結合剤は、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどを含む。これらの剤形の中で使用される潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを含む。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを含むが、これらに限定されない。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、顆粒にするかまたは小塊にし、潤滑剤および崩壊剤を添加し、そして錠剤へと押し固めることにより製剤化される。粉末混合物は、その化合物、好適には細かく砕いた化合物を上記のような希釈剤またはベースと、そして必要に応じてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩もしくはアルギン酸エステル、ゼラチン、もしくはポリビニルピロリドンなどの結合剤、パラフィンなどの溶解遅延剤、第四級塩などの再吸収促進剤、および／またはベントナイト、カオリンもしくはリン酸二カルシウムなどの吸収剤と混合することにより調製される。この粉末混合物は、シロップ、デンプンペースト、アラビアゴム粘液、またはセルロース誘導体もしくは高分子材料の溶液などの結合剤を用いて湿らせ、ふるいに押し通すことにより顆粒化され得る。顆粒化に代わるものとして、粉末混合物は錠剤機に通され得、その結果物は不完全に形成された小塊であり、これが顆粒へと破壊される。この顆粒は、錠剤形成押型への付着を防止するために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルクまたは鉱油の添加によって潤滑され得る。この潤滑された混合物は、その後、錠剤へと圧縮される。また、式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は、自由流動性の不活性な担体と組み合わされて、顆粒化または小塊化の工程を経ることなく直接錠剤へと圧縮され得る。セラックの封止被膜、糖または高分子材料のコーティング、およびワックスの艶出しコーティングからなる透明または不透明な保護コーティングが設けられ得る。異なる単位投薬量を区別するために、色素がこれらのコーティングに添加され得る。
【００９４】
液剤、シロップおよびエリキシル剤などの経口用液体は、所与の量が所定の量の化合物を含むように、投薬単位形態で調製され得る。シロップは、化合物を好適に風味付けされた水性溶液に溶解させることにより調製され得るのに対し、エリキシル剤は、無毒なアルコール性のビヒクルの使用によって調製される。懸濁剤は、化合物を無毒なビヒクルに分散させることにより製剤化され得る。エトキシル化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテルなどの可溶化剤および乳化剤、保存剤、ペパーミント油などの香料添加物、または天然甘味料もしくはサッカリンもしくは他の人工甘味料なども、添加され得る。
【００９５】
適宜、経口投与のための投薬単位組成物はマイクロカプセル化され得る。この製剤は、例えば、微粒子物質をポリマー、ワックスなどでコーティングするかまたは微粒子物質をポリマー、ワックスなどの中に埋め込むことにより、放出を長期化または持続させるようにも調製され得る。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は、小型単層小胞体(small unilamellar vesicle)、大型単層小胞体(large unilamellar vesicle)および多層小胞体(multilamellar vesicle)などのリポソーム送達システムの形態でも投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成され得る。
【００９７】
局所投与に適応させた医薬組成物は、軟膏剤、クリーム、懸濁剤、エマルション、ローション、粉末、液剤、ペースト、ゲル、スプレー、泡状物質、エアロゾルまたはオイルとして製剤化され得る。このような医薬組成物は、限定されないが、保存剤、薬剤浸透を助ける溶媒、共溶媒、皮膚軟化剤、噴霧剤、粘度調整剤（ゲル化剤）、界面活性剤および担体を含む従来の添加剤を含有し得る。一つの実施形態では、組成物の重量の０．０１〜１０％、または０．０１〜１％の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容可能な塩を含む局所投与に適応させた医薬組成物が提供される。
【００９８】
目または他の外部組織、例えば口および皮膚の治療のために、組成物は、好適には、局所用の溶剤、懸濁剤、エマルション、軟膏剤、クリーム、ゲル、スプレーまたは泡状物質として適用される。軟膏剤として製剤化されるとき、活性成分は、パラフィン系軟膏基剤または水混和性軟膏基剤のいずれかとともに用いられ得る。あるいは、活性成分は、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤とともにクリームとして製剤化され得る。泡状物質として製剤化されるとき、活性な薬剤は、噴霧剤、界面活性剤、溶媒、共溶媒および粘度調整剤と共に製剤化され得る。
【００９９】
目への局所投与に適応させた医薬組成物は、活性成分が好適な担体、特に水性溶媒中に溶解または懸濁されている点眼薬を含む。目への投与のための組成物は、目に適合可能なｐＨおよびオスモル濃度（浸透圧）を有するであろう。１以上の目に適合可能なｐＨ調整剤および／または緩衝剤を本発明の組成物中に含むことができ、例えば酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩化水素酸などの酸、例えば水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウムなどの塩基、例えばクエン酸塩／ブドウ糖、炭酸水素ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの緩衝液を含む。このような酸、塩基および緩衝液は、組成物のｐＨを目に許容可能な範囲に維持するために必要な量を含むことができる。１以上の目に許容可能な塩は、組成物のオスモル濃度を目に許容可能な範囲にするために十分な量を組成物中に含めることができる。このような塩は、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムカチオンおよび塩化物、クエン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、リン酸、炭酸水素、硫酸、チオ硫酸または重亜硫酸アニオンを有する塩を含む。
【０１００】
眼科供給装置は、複数の決まった放出速度並びに持続投薬の動力学および浸透性で１以上の治療薬を制御放出するように設計され得る。制御した放出は、生物分解性／生体侵食性のポリマー（例えばポリ（エチレンビニル）アセテート（ＥＶＡ）、超加水分解ＰＶＡ）、ヒドリキシアルキルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリカプロラクトン、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳酸）、ポリ無水物、ポリマー分子量、ポリマー結晶度、コポリマー比率、加工処理条件、表面仕上げ、幾何学、賦形剤の添加およびポリマー被覆についての異なる選択肢および特性を組み込んだ高分子マトリックスの設計を通して得ることができ、これは、薬物の拡散、侵食、溶解および浸透を高める。
【０１０１】
眼科供給のための医薬組成物はまた、その場でゲル化する水性組成物を含む。このような組成物は、目または涙液と接触してゲル化が促進するために効果的な濃度のゲル化剤を含む。好適なゲル化剤は、限定されないが、熱硬化性ポリマーを含む。本明細書で使用する用語「その場でゲル化する」は、目または涙液と接触してゲルを形成する低粘度の液体だけではなく、目への投与の際に実質上増加した粘度またはゲル剛性を示す、例えば半流動体およびチキソトロピー性のゲルなどのより粘性の高い液体も含む。例えば、Ｌｕｄｗｉｇ（２００５）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３；５７：１５９５−６３９を参照されたい。この文献は、眼科薬物の供給において使用するポリマーの例の教示のために参照により本明細書に援用される。
【０１０２】
鼻内投与または吸入投与のための剤形は、エアロゾル、液剤、懸濁剤、ゲルまたは乾燥粉末として製剤化されることが便利であり得る。
【０１０３】
吸入投与に好適および／または吸入投与に適応させた組成物について、式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は、例えば微粉化によって得られる粒子サイズを小さくした形態にあることが好ましい。サイズを小さくした（例えば、微粉化した）化合物または塩の好適な粒子サイズは、約０．５〜約１０ミクロン（例えば、レーザー回折を使用して測定される）のＤ５０値によって規定される。
【０１０４】
例えば吸入投与のためのエアロゾル製剤は、薬学上許容可能な水性または非水性の溶媒の中の活性物質の溶液または微細懸濁液を含み得る。エアロゾル製剤は、噴霧装置もしくは吸入器と共に使用するためのカートリッジまたは詰め替え容器の形態をとり得る密閉容器中の滅菌された形態で単回用量または複数用量の量で提供され得る。あるいは、この密閉容器は、容器の内容物を使い尽くすと処分することが意図されている、計量弁（定量吸入器）が内蔵された単回投与の鼻吸入器またはエアロゾルディスペンサーなどの単一の分注デバイスであり得る。
【０１０５】
剤形がエアロゾルディスペンサーを含む場合、その剤形は、好適には、圧縮空気、二酸化炭素またはヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）などの有機噴霧剤などの加圧下の好適な噴霧剤を含む。好適なＨＦＣ噴霧剤は、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む。このエアロゾル剤形はポンプ噴霧器の形態も取り得る。加圧されたエアロゾルは、活性化合物の溶液または懸濁液を含有し得る。これは、懸濁液製剤の分散特性および均質性を改善するために、さらなる賦形剤、例えば共溶媒および／または界面活性剤の組み込みを必要とし得る。液剤製剤は、エタノールなどの共溶媒の添加も必要とし得る。
【０１０６】
吸入投与に好適および／または吸入投与に適応させた医薬組成物について、医薬組成物は、乾燥粉末吸入用組成物であり得る。このような組成物は、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトールまたはデンプンなどの粉末基剤と、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩（好適には、粒子サイズを小さくした形態、例えば微粉化した形態にある）および、必要に応じて性能調整剤(performance modifier)、例えばＬ−ロイシンもしくは別のアミノ酸および／またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどのステアリン酸の金属塩を含み得る。好適には、この乾燥粉末吸入用組成物は、ラクトース、例えばラクトース一水和物および式（Ｉ）の化合物またはその塩の乾燥粉末混合物を含む。このような組成物は、例えば英国特許出願公開第２２４２１３４（Ａ）号に記載されている、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって販売されているＤＩＳＫＵＳ（登録商標）デバイスなどの好適なデバイスを使用することによって、患者に投与され得る。
【０１０７】
式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は、液体ディスペンサー、例えば、使用者が加えた力が液体ディスペンサーのポンプ機構に加えられた際に定量の液体製剤が分注されるときに通る分注用ノズルまたは分注用オリフィスを有する液体ディスペンサーからの送達のための液体製剤として製剤化され得る。このような液体ディスペンサーは、一般に、液体製剤の複数定量のタンクを具え、用量は連続的なポンプ操作によって分注することができる。分注用のノズルまたはオリフィスは、鼻腔の中への液体製剤のスプレー分注のために、使用者の鼻孔の中へと挿入するように構成され得る。上述のタイプの液体ディスペンサーは、国際公開第２００５／０４４３５４（Ａ１）号に記載、説明されている。
【０１０８】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩の治療有効量は、例えば動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な病態、病態の重症度、製剤の性質、および投与経路を含むいくつかの要因に依存し、最終的には、この治療有効量は、主治医または主治獣医の判断によることになろう。医薬組成物では、経口投与または非経口投与のための各投薬量単位は、遊離塩基として算出して、好適には０．０１〜３０００ｍｇ、より好適には０．５〜１０００ｍｇの本発明の化合物を含む。鼻内投与または吸入投与のための各投薬量単位は、遊離塩基として算出して、好適には０．００１〜５０ｍｇ、より好適には０．０１〜５ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を含む。
【０１０９】
薬学上許容可能な式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩は、遊離塩基として算出して、例えば、１日あたり０．０１ｍｇ〜３０００ｍｇもしくは１日あたり０．５〜１０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学上許容可能な塩の経口用量もしくは非経口用量、または１日あたり０．００１〜５０ｍｇもしくは１日あたり０．０１〜５ｍｇの式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学上許容可能な塩の鼻内用量もしくは吸入用量の（成人の患者についての）１日用量で投与され得る。この量は、１日あたり単回投与で、またはより通常は、合計の１日用量が同じであるように１日あたりある数（例えば、２、３、４、５または６）の分割用量で与えられ得る。その塩の有効量は、式（Ｉ）の化合物自体の有効量のある割合として決定され得る。
【０１１０】
式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて用いられ得る。従って、本発明に係る併用治療は、少なくとも１の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩の投与、および少なくとも１の他の薬学的に活性な薬剤の使用を含む。好適には、本発明に係る併用治療は、少なくとも１の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩、および少なくとも１の他の薬学的に活性な薬剤の投与を含む。式（Ｉ）の化合物（１または複数）およびその薬学上許容可能な塩、ならびに他の薬学的に活性な薬剤（１または複数）は、単一の医薬組成物として一緒に、または別々に投与され得、別々に投与されるとき、これは、同時にまたは任意の順序で連続的に行われ得る。式（Ｉ）の化合物（１または複数）およびその薬学上許容可能な塩、および他の薬学的に活性な薬剤（１または複数）の量ならびに相対的な投与のタイミングは、所望の複合的な治療効果を成し遂げるように選択されるであろう。従って、さらなる態様では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩および少なくとも１の他の薬学的に活性な薬剤を含む組合せ医薬製品が提供される。
【０１１１】
従って、１つの態様では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩、および式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩を含む医薬組成物は、例えば抗生物質、抗ウイルス薬、グルココルチコステロイド、ムスカリンアンタゴニスト、β−２アゴニストおよびビタミンＤ３類似体から選択される１以上の他の治療薬と組み合わせて使用され得、またはこのような１以上の他の治療薬を含み得る。さらなる態様では、本発明に係る式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩は、癌の治療に好適なさらなる治療薬と組み合わせて使用され得る。
【０１１２】
吸入経路、静脈内経路、経口経路または鼻腔内経路によって通常投与される他の治療薬と組み合わせて式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容可能な塩が投与されるとき、得られる医薬組成物は同じ経路によって投与され得ることは理解されるであろう。あるいは、その組成物の個々の構成成分は、異なる経路によって投与され得る。
【０１１３】
本発明の１つの実施形態は、１または２の他の治療薬を含む組み合わせを包含する。
【０１１４】
適宜、他の治療成分の活性および／または安定性および／または例えば溶解性などの物理的特性を最適化するために、その治療成分（１または複数）は、例えばアルカリ金属塩もしくはアミン塩として、または酸付加塩としての塩の形態で、またはプロドラッグ、または例えば低級アルキルエステルなどのエステルとして、または例えば水和物などの溶媒和物として使用され得ることは、当業者には明らかであろう。適宜、この治療成分は光学的に純粋な形態で使用され得ることも明らかであろう。
【０１１５】
上記の組み合わせは、医薬組成物の形態で使用のために提供されることが便利であり得、従って、薬学上許容可能な希釈剤または担体と一緒に、上で定義された組み合わせを含む医薬組成物は本発明のさらなる態様を表す。
【０１１６】
式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩は、以下に記載される方法によって、または類似の方法によって調製され得る。従って、以下の中間体および実施例は、式（Ｉ）の化合物およびその薬学上許容可能な塩の調製を例証する働きをするが、決して、本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。
【実施例】
【０１１７】
すべての温度は℃で表す。
【０１１８】
以下の化合物の名前は、化合物命名プログラム「ＡＣＤ  Ｎａｍｅ  Ｐｒｏ  ６．０２」または  Ｃｈｅｍ  Ｄｒａｗ  Ｕｌｔｒａ  １２．０を使用して得た。
【０１１９】
略語
ＡｃＯＨは、酢酸を示し、
ＢＩＮＡＰは、２，２'−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１'−ビナフチルを示し、
ＢＯＣは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを示し、
ＣＶは、カラム容量を示し、
ＤＣＭは、ジクロロメタンを示し、
１，２−ＤＣＥは、１，２−ジクロロエタンを示し、
ＤＣＣは、ジシクロヘキシルカルボジイミドを示し、
ＤＩＰＥＡは、ジイソプロピルエチルアミンを示し、
ＤＭＡＰは、４−ジメチルアミノピリジンを示し、
ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示し、
ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを示し、
エーテルは、ジエチルエーテルを示し、
Ｅｔ２Ｏは、ジエチルエーテルを示し、
ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルを示し、
ＦＭＯＣは、９−フルオレニルメトキシカルボニルを示し、
ＨＡＴＵは、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを示し、
ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィーを示し、
ＩＰＡは、プロパン−２−オールを示し、
ｉ−Ｐｒ２Ｏは、ジ−イソプロピルエーテルを示し、
ＬｉＡｌＨ４は、水素化アルミニウムリチウムを示し、
ＭＤＡＰは、質量基準自動分取(Mass directed autoprep)、分取質量基準ＨＰＬＣを示し、
ＭｅＣＮは、アセトニトリルを示し、
ＭｅＯＨは、メタノールを示し、
ＭｇＳＯ４は、硫酸マグネシウムを示し、
Ｍｐは、融点を示し、
ｒ．ｔ．は、室温を示し、
Ｒｔは、保持時間を示し、
Ｎａ２ＳＯ４は、硫酸ナトリウムを示し、
ＴＭＥＤＡは、テトラメチルエチレンジアミンを示し、
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を示し、
ＴＨＦは、テトラヒドロフランを示し、
ＴＬＣは、薄層クロマトグラフィーを示す。
【０１２０】
ＬＣ／ＭＳ方法論（特定の中間体および基準化合物に使用）
本明細書において参照されるＬＣ−ＭＳ法Ａ〜Ｆの実験詳細は以下の通りである。
【０１２１】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）は、アンモニア溶液でｐＨ１０に調整した１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて、４０℃で、１ｍＬ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜１．５分  １−９７％Ｂ、１．５〜１．９分  ９７％Ｂ、１．９〜２．０分  １００％Ｂで溶出する、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×内径２．１ｍｍ、充填直径１．７μｍ）で実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から総和したシグナルであった。質量スペクトルは、Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレーを使用してＷａｔｅｒｓ  ＺＱ質量分析計で記録した。イオン化データは整数に四捨五入した。
【０１２２】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）は、０．１％ｖ／ｖギ酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖギ酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、４０℃で、１ｍＬ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜１．５分  ３−１００％Ｂ、１．５〜１．９分  １００％Ｂ、１．９〜２．０分  ３％Ｂで溶出する、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×内径２．１ｍｍ、充填直径１．７μｍ）で実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から総和したシグナルであった。質量スペクトルは、Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレーを使用してＷａｔｅｒｓ  ＺＱ質量分析計で記録した。イオン化データは整数に四捨五入した。
【０１２３】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｃ）は、０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、４０℃で、１ｍＬ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜１．５分  ３−１００％Ｂ、１．５〜１．９分  １００％Ｂ、１．９〜２．０分  ３％Ｂで溶出する、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×内径２．１ｍｍ、充填直径１．７μｍ）で実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から総和したシグナルであった。質量スペクトルは、正エレクトロスプレーを使用してＷａｔｅｒｓ  ＺＱ質量分析計で記録した。イオン化データは整数に四捨五入した。
【０１２４】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）は、０．１％  ＨＣＯ２Ｈおよび０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）ならびに９５％アセトニトリルおよび０．０５％ＨＣＯ２Ｈ水溶液（溶媒Ｂ）用いて、３ｍＬ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜０．７分  ０％Ｂ、０．７〜４．２分  ０→１００％Ｂ、４．２〜５．３分  １００％Ｂ、５．３〜５．５分  １００→０％Ｂをで溶出する、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣＡＢＺ＋ＰＬＵＳカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×内径４．６ｍｍ）で実施した。質量スペクトル（ＭＳ）は、エレクトロスプレー陽イオン化［（［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋ＮＨ４］＋分子イオンを得るためのＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（［Ｍ−Ｈ］−分子イオンを得るためのＥＳ−ｖｅ］モードを使用してＦｉｓｏｎｓ  ＶＧ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で記録した。この装置からの分析データは以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与えられる。
【０１２５】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｅ）は、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて、５ｍｌ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜４分  ０−１００％Ｂ、４〜５分  １００％Ｂで溶出する、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ  １８カラム（１００×内径４．６ｍｍ）で実施した。質量スペクトル（ＭＳ）は、大気圧化学陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためのＡＰ＋ｖｅ］または大気圧化学陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためのＡＰ−ｖｅ］モードを使用してｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＬＣ質量分析装置で記録した。この装置からの分析データは以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与えられる。
【０１２６】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｆ）は、０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、３０℃で、３ｍｌ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜０．１分  ３％Ｂ、０．１〜４．２分  ３−１００％Ｂ、４．２〜４．８分  １００％Ｂ、４．８〜４．９分  １００−３％Ｂ、４．９〜５．０分  ３％Ｂで溶出する、Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８カラム（３０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、充填直径３．５μｍ）で実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から平均化したシグナルであり、質量スペクトルは、陽イオンエレクトロスプレーイオン化を使用して質量分析計で記録した。イオン化データは整数に四捨五入した。
【０１２７】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｇ）は、０．１％ｖ／ｖギ酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖギ酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、４０℃で、１ｍｌ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜１．５分  １−９７％Ｂ、１．５〜１．９分  ９７％Ｂ、１．９〜２．０分  ９７−１００％Ｂで溶出する、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×内径２．１ｍｍ、充填直径１．７μｍ）で実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から総和したシグナルであった。質量スペクトルは、Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレーを使用してＷａｔｅｒｓ  ＺＱ質量分析計で記録した。イオン化データは整数に四捨五入した。
【０１２８】
ＬＣ／ＨＲＭＳ：分析用ＨＰＬＣは、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて、１．３ｍＬ／分の流速で、以下の溶出グラジエント、０〜０．５分  ５％Ｂ、０．５〜３．７５分  ５→１００％Ｂ、３．７５〜４．５  １００％Ｂ、４．５〜５  １００→５％Ｂ、５〜５．５  ５％Ｂで溶出する、Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ−ｈｓｃカラム（３μｍ  ３３×内径３ｍｍ）で実施した。質量スペクトル（ＭＳ）は、エレクトロスプレー陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためのＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためのＥＳ−ｖｅ］モードを使用して、ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ質量分析計で記録した。
【０１２９】
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）は、シリカゲル６０Ｆ２５４でコーティングしたＭｅｒｃｋによって販売されているＴＬＣプレートの使用を指す。
【０１３０】
「質量基準自動分取(mass directed auto-prep)」／「分取用質量基準ＨＰＬＣ(preparative mass directed HPLC)」は例えば、Ｗａｔｅｒｓ  ６００  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｕｍｐ、Ｗａｔｅｒｓ  ２７６７  ｉｎｊｅｃｔ  ／  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｒ、Ｇｉｌｓｏｎ  Ａｓｐｅｃ  −  ｗａｓｔｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ｇｉｌｓｏｎ  １１５  ｐｏｓｔ−ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＵＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒおよびＣｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを含むＷａｔｅｒｓ  ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ  ｓｙｓｔｅｍで実行された。使用したカラムは典型的に、内径２０ｍｍ×長さ１００ｍｍの寸法を有するＳｕｐｅｌｃｏ  ＬＣＡＢＺ＋＋カラムである。固定相粒子サイズは５μｍである。流速は、適切な溶出グラジエントを使用する０．１％ギ酸またはトリフルオロ酢酸のいずれかの水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ギ酸またはトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）で、２０ｍＬ／分を使用した。質量スペクトルは、エレクトロスプレー正および負モード、Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｓｃａｎを使用するＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ質量分析装置で記録した。使用したソフトウエアはＭａｓｓＬｙｎｘ４．０または等価な代わりのシステムであった。
【０１３１】
ＬＣＭＳ方法論
ギ酸法（ギ酸修飾子）
ＬＣ条件
ＵＰＬＣ分析は、４０℃で、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×内径２．１ｍｍ、充填直径１．７μｍ）で行った。
【０１３２】
用いた溶媒は以下の通りであった。
【０１３３】
Ａ＝０．１％  ｖ／ｖ  ギ酸水溶液
Ｂ＝０．１％  ｖ／ｖ  ギ酸アセトニトリル溶液
用いたグラジエントは以下の通りである。
【表１】
0005840763.tif 000007
【０１３４】
ＵＶ検出は、２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長からの総和シグナルであった。
【０１３５】
ＭＳ条件
ＭＳ  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ
イオン化モード  ：  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレー
スキャン範囲  ：  １００〜１０００  ＡＭＵ
スキャン時間  ：  ０．２７秒
インタースキャンディレイ  ：  ０．１０秒。
【０１３６】
ＨｐＨ法（炭酸水素アンモニウム修飾子）
ＬＣ条件
ＵＰＬＣ分析は、４０℃で、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×内径２．１ｍｍ、充填直径１．７μｍ）で行った。
【０１３７】
用いた溶媒は以下の通りであった。
【０１３８】
Ａ＝アンモニア溶液を用いてｐＨ１０に調整した１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液
Ｂ＝アセトニトリル
用いたグラジエントは以下の通りである。
【表２】
0005840763.tif 000008
【０１３９】
ＵＶ検出は、２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長からの総和シグナルであった。
【０１４０】
ＭＳ条件
ＭＳ  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ
イオン化モード  ：  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレー
スキャン範囲  ：  １００〜１０００  ＡＭＵ
スキャン時間  ：  ０．２７秒
インタースキャンディレイ  ：  ０．１０秒。
【０１４１】
ＭＤＡＰ方法論
ギ酸法（ギ酸修飾子）
ＬＣ条件
ＨＰＬＣ分析は、周囲温度で、Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×内径１９ｍｍ、充填直径５μｍ）またはＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×内径３０ｍｍ、充填直径５μｍ）のいずれかで行った。
【０１４２】
用いた溶媒は以下の通りであった。
【０１４３】
Ａ＝０．１％  ｖ／ｖ  ギ酸水溶液
Ｂ＝０．１％  ｖ／ｖ  ギ酸アセトニトリル溶液
２０ｍｌ／分（１００ｍｍ×内径１９ｍｍ、充填直径５μｍ）または４０ｍｌ／分（１５０ｍｍ×内径３０ｍｍ、充填直径５μｍ）の流速で、１５または２５分（延長したラン）のいずれかにわたるグラジエントとして実行した。
【０１４４】
ＵＶ検出は、２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長からの総和シグナルであった。
【０１４５】
ＭＳ条件
ＭＳ  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ
イオン化モード  ：  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレー
スキャン範囲  ：  １００〜１０００  ＡＭＵ
スキャン時間  ：  ０．５０秒
インタースキャンディレイ  ：  ０．２０秒。
【０１４６】
ＨｐＨ法（炭酸水素アンモニウム修飾子）
ＬＣ条件
ＨＰＬＣ分析は、周囲温度で、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×内径１９ｍｍ、充填直径５μｍ）またはＸｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×内径３０ｍｍ、充填直径５μｍ）のいずれかで行った。
【０１４７】
用いた溶媒は以下の通りであった。
【０１４８】
Ａ＝アンモニア溶液を用いてｐＨ１０に調整した１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液
Ｂ＝アセトニトリル
２０ｍｌ／分（１００ｍｍ×内径１９ｍｍ、充填直径５μｍ）または４０ｍｌ／分（１００ｍｍ×内径３０ｍｍ、充填直径５μｍ）の流速で、１５または２５分（延長したラン）のいずれかにわたるグラジエントとして実行した。
【０１４９】
ＵＶ検出は、２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長からの総和シグナルであった。
【０１５０】
ＭＳ条件
ＭＳ  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ
イオン化モード  ：  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ−ｓｃａｎ正および負のエレクトロスプレー
スキャン範囲  ：  １００〜１０００  ＡＭＵ
スキャン時間  ：  ０．５０秒
インタースキャンディレイ  ：  ０．２０秒。
【０１５１】
中間体１
１−（（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−６−ブロモ−２−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）エタノン
【化６】
0005840763.tif 000009
【０１５２】
ＤＣＭ（４８０ｍＬ）中の塩化アルミニウム（４１．２ｇ、３０９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、０℃、窒素下で、ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のイソプロピル（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）カルバメート（３０ｇ、８１ｍｍｏｌ）の溶液でカニューレにより処理し、得られた混合物をこの温度で、３０分間撹拌した。その後、反応混合物を、トリエチルアミン（１３６ｍＬ、９７５ｍｍｏｌ）とメタノール（４８ｍＬ）の混合物でカニューレによりゆっくりと処理した。得られた形成ケーキを酢酸エチル（８００ｍＬ）中で撹拌し、濾過により分離し、その後、ＤＣＭ（８００ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（８００ｍＬ）に分配した。酒石酸カリウムナトリウム（３００ｇ）を加え、得られた混合物を２時間、勢いよく撹拌した。層を分離し、ＤＣＭ層を焼結漏斗に通して濾過した。ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮し、第１のバッチの１−（（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−６−ブロモ−２−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）エタノン（１９．６ｇ、６９．２ｍｍｏｌ、収率８５％）を黄色の泡状物として得た。水相を、さらにＤＣＭ（８００ｍＬ）で処理し、二相の混合物を一晩撹拌した。その後、層を分離し、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮して、第２のバッチの１−（（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−６−ブロモ−２−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）エタノン（３．４ｇ、１２．０１ｍｍｏｌ、収率１４．７８％）を得た。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝０．７７分、ＭＨ＋＝２８３（１Ｂｒ）。
【０１５３】
中間体２
６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル
【化７】
0005840763.tif 000010
【０１５４】
１−（（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−６−ブロモ−２−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）エタノン（調製については、中間体１を参照）（２．２８ｇ、８．０５ｍｍｏｌ）および６−クロロニコチノニトリル（２．２３１ｇ、１６．１０ｍｍｏｌ）の混合物に、ＮＭＰ（２０ｍＬ）を加え、混合物をＤＩＰＥＡ（４．２２ｍＬ、２４．１６ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を２つのフラスコに分配し、それぞれのフラスコを窒素でフラッシュし、密封し、マイクロ波照射下、２００℃で２時間撹拌した。反応混合物を合わせて、水とＥｔＯＡｃに分配した。水層をＥｔＯＡｃ（×４）で抽出し、合わせた有機層を、水（×３）、その後、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。茶色の固体残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン中ＥｔＯＡｃグラジエント）により精製し、６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（１．９４０ｇ、５．０４ｍｍｏｌ、収率６２．５％）を淡黄色の泡状物として得た。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝１．０２分、ＭＨ＋＝３８６（１Ｂｒ）。
【０１５５】
中間体３
メチル４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
【化８】
0005840763.tif 000011
【０１５６】
６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（調製については、中間体２を参照）（１０００ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、（４−（メトキシカルボニル）フェニル）ボロン酸（５６１ｍｇ、３．１１ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３００ｍｇ、０．２６０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１０７６ｍｇ、７．７９ｍｍｏｌ）を装填したフラスコに、ＤＭＥ（２０ｍＬ）および水（４．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物を１００℃、窒素下で１時間撹拌し、その後、室温へと冷却し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃと水に分配し、層を分離した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮し、残渣をクロマトグラフィー（１０ｇカラム、ＭｅＯＨ／ＤＣＭグラジエント）により精製し、メチル４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（１００２ｍｇ、２．２７５ｍｍｏｌ、収率８８％）をオレンジ色の泡状物として得た。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝１．０９分、ＭＨ＋＝４４１。
【０１５７】
中間体４
４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）安息香酸
【化９】
0005840763.tif 000012
【０１５８】
室温において、ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中のメチル４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（調製については、中間体３を参照）（１．０ｇ、２．２７０ｍｍｏｌ）の溶液を水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ、２．２７ｍＬ、４．５４ｍｍｏｌ）で処理し、得られた混合物をこの温度で２４時間撹拌した。メタノールの大半を真空下で蒸発させ、水性残渣を酢酸（０．３９ｍＬ、６．８１ｍｍｏｌ）で処理し、得られた沈殿を濾過により分離し、真空下４０℃で乾燥することで、４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）安息香酸（８２０ｍｇ、１．９２３ｍｍｏｌ、収率８５％）を黄色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝０．６４分、ＭＨ＋＝４２７。
【０１５９】
中間体５
６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル
【化１０】
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【０１６０】
６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（調製については、中間体２を参照）（８４７ｍｇ、２．１９９ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１２２８ｍｇ、４．８４ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（１６１ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（３２４ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を装填したフラスコに、ＤＭＳＯ（７ｍＬ）を加え、混合物を窒素下で脱気し、窒素下で１時間、８０℃で撹拌した。ビス（ピナコラト）ジボロン（１ｇ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（１００ｍｇ）および酢酸カリウム（１５０ｍｇ）の追加部分を加え、混合物を４５分間撹拌した。ビス（ピナコラト）ジボロン（１ｇ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（１００ｍｇ）および酢酸カリウム（１５０ｍｇ）の追加部分を加え、混合物を４５分間撹拌した。反応混合物を室温へと冷却し、ＥｔＯＡｃと水で処理した。二相混合物をＣｅｌｉｔｅＴＭ（１０ｇ）のパッドを通して濾過し、層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（×２）で抽出し、合わせた有機層を、水（×４）、その後、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（５０ｇカラム、ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエント）により精製し、６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（８００ｍｇ、１．８５０ｍｍｏｌ、収率８４％）を赤色のガム状物として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝１．０８分、ＭＨ＋＝４３３。
【０１６１】
中間体６
メチル６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート
【化１１】
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【０１６２】
６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（調製については、中間体５を参照）（８００ｍｇ、１．８５０ｍｍｏｌ）、メチル６−ブロモニコチネート（４４０ｍｇ、２．０３６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（７６７ｍｇ、５．５５ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２１４ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を装填したフラスコに、トルエン（８ｍＬ）およびエタノール（８ｍＬ）を加えた。得られた混合物を９０℃、窒素下で３時間撹拌し、その時点で、炭酸カリウム（３８４ｍｇ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０７ｍｇ）およびメチル６−ブロモニコチネート（２２０ｍｇ）の部分を加え、反応混合物の撹拌を５時間続けた。その後、混合物を室温へと冷却し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃと水に分配した。相を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（２５ｇカラム、ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエント）により精製し、メチル６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート（６００ｍｇ、１．３１７ｍｍｏｌ、収率７１．２％）を白色の泡状物として得た。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝１．０７分、ＭＨ＋＝４５６。
【０１６３】
中間体７
６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチン酸
【化１２】
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【０１６４】
エタノール（１０ｍＬ）中のメチル６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート（調製については、中間体６を参照）（５８０ｍｇ、１．２７３ｍｍｏｌ）の溶液を水酸化リチウム水溶液（１Ｎ、２．５５ｍＬ、２．５５ｍｍｏｌ）で処理し、得られた混合物を２時間撹拌した。エタノールの大半を真空下で蒸発させ、残渣を水（約５ｍＬ）で希釈した。混濁した混合物を酢酸（０．１４６ｍＬ、２．５５ｍｍｏｌ）で処理し、形成した沈殿物を濾過により分離し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、６０℃で１６時間乾燥させて、６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチン酸（４１０ｍｇ、０．９５９ｍｍｏｌ、収率７５％）を淡黄色の固体として得て、さらに精製することなく次の工程に使用した。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝０．６３分、ＭＨ＋＝４２８。
【０１６５】
中間体８
エチル２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）アセテート
【化１３】
0005840763.tif 000016
【０１６６】
トルエン（１０ｍＬ）およびエタノール（１０．０ｍＬ）中の６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（調製については、中間体５を参照）（１．６７ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）、エチル２−（４−ブロモフェニル）アセテート（１．１２７ｇ、４．６４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．６０２ｇ、１１．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．４４６ｇ、０．３８６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を１００℃で１時間加熱し、その後、ＥｔＯＡｃと水に分配した。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ／シクロヘキサングラジエント（１０〜８０％）で溶出するシリカゲル（２５ｇ）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適切な画分を合わせて、真空下で濃縮して、エチル２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）アセテート（７５２ｍｇ、４２％）を粘着性の無色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝１．１０分、ＭＨ＋＝４６９。
【０１６７】
中間体９
２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）酢酸リチウム塩
【化１４】
0005840763.tif 000017
【０１６８】
メタノール（５ｍＬ）中のエチル２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）アセテート（調製については、中間体８を参照）（３００ｍｇ、０．６４０ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム溶液（０．７６８ｍＬ、０．７６８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を４０℃で２時間撹拌し、その後、真空下で濃縮し、２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）酢酸の粗製カルボン酸リチウム塩（２８６ｍｇ、１００％）を白色固体として得て、さらに精製することなく次の工程に使用した。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝１．１０分、ＭＨ＋＝４３３。
【０１６９】
中間体１０
３−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）プロパン酸
【化１５】
0005840763.tif 000018
【０１７０】
トルエン（６ｍＬ）およびエタノール（６ｍＬ）中の６−（（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）アミノ）ニコチノニトリル（調製については、中間体５を参照）（３８２ｍｇ、０．８８４ｍｍｏｌ）および３−（４−ブロモフェニル）プロパン酸（２４３ｍｇ、１．０６０ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０２ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（３６６ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を連続して加えた。得られた混合物を８０℃、２時間撹拌し、その後、水とＥｔＯＡｃに分配した。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。粗製残渣をシクロヘキサン中のＥｔＯＡｃ（１０〜７０％）で溶出するシリカゲル（２５ｇ）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適切な画分を合わせて、減圧下で濃縮して、３−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）プロパン酸（２０９ｍｇ、５２％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．９１分、ＭＨ＋＝４５５。
【０１７１】
中間体１１
１−メチルエチル（２Ｅ）−２−ブテノイルカルバメート
【化１６】
0005840763.tif 000019
【０１７２】
イソプロピルカルバメート（３０ｇ、２９１ｍｍｏｌ、ＴＣＩから市販）を３ＬのＬａｒａ容器に装填し、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１５０ｍｌ）を加えた。（２Ｅ）−２−塩化ブテノイル（３１．２ｍｌ、３２６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈから市販）を窒素下で加え、ジャケットを−３０℃まで冷却した。溶液の温度が−１７℃に達した時に、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍ、６５５ｍＬ、６５５ｍｍｏｌ）を２時間にわたりぜん動ポンプによって加え、反応物を−１０℃から−１８℃の温度に維持した。添加が完了してから、混合物を３０分間撹拌し、０℃にした。ジエチルエーテル（４５０ｍｌ）および塩酸（１Ｍ、３７５ｍＬ）を加え、混合物を勢いよく撹拌しながら２０℃にした。撹拌を停止し、層を分離させ、水層を流した。ブライン（３７５ｍＬｌ）を加え、混合物を勢いよく撹拌した。撹拌を停止し、層を分離し、水層を流出させた。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させて、茶色の油（６０ｇ）を得た。これをシリカカラム（４０＋Ｍ  Ｂｉｏｔａｇｅ）に適用し、ＤＣＭ／酢酸エチル（１：１〜０：１、１０ＣＶ）で溶出した。生成物を含む画分を乾燥するまで蒸発させ、Ｒｅｄｉｓｅｐ  Ｉｓｃｏシリカカラム（１５００ｇ）上に載せ、シクロヘキサン中の酢酸エチルグラジエント（０〜４０％）で溶出した。透明な、生成物を含む画分を蒸発させて、オフホワイト色の固体（１５．４１ｇ）を得た。ＬＣＭＳ（方法Ｃ）、Ｒｔ＝０．６８、ＭＨ＋＝１７２。
【０１７３】
中間体１２
１−メチルエチル｛（３Ｓ）−３−［（４−ブロモフェニル）アミノ］ブタノイル｝カルバメート
【化１７】
0005840763.tif 000020
【０１７４】
１−メチルエチル（２Ｅ）−２−ブテノイルカルバメート（調製については、中間体１１を参照）（９．３８ｇ、５４．８ｍｍｏｌ）をトルエン（２８１ｍＬ）中で、窒素下で撹拌し、（Ｒ−ＢＩＮＡＰ）ジトリフレートビス（アセトニトリル）パラジウム（ＩＩ）（中間体２４、３．３５ｇ、３．０１ｍｍｏｌ）を加えた。触媒は粘着性のボールを形成し、溶液は不透明な黄色の混合物に変わり、これを２０分間撹拌した。４−ブロモアニリン（１４．１４ｇ、８２ｍｍｏｌ）を加ると、溶液は透明の淡茶色に変わり、粘着性の触媒がさらに溶解した。混合物を１６時間撹拌した。同様に、第２のバッチの１−メチルエチル（２Ｅ）−２−ブテノイルカルバメート（中間体１１、８．５１ｇ、４９．７ｍｍｏｌ）を、トルエン（２５５ｍＬ）中で、窒素下で撹拌し、（Ｒ−ＢＩＮＡＰ）ジトリフレートビス（アセトニトリル）パラジウム（ＩＩ）（３．０４ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）を加えた。触媒は粘着性のボールを形成し、溶液は不透明な黄色の混合物に変わり、これを２０分間撹拌した。４−ブロモアニリン（１２．８３ｇ、７４．６ｍｍｏｌ）を加えたところ、溶液は透明の淡茶色に変わり、粘着性の触媒がさらに溶解した。混合物を１６時間撹拌した。
【０１７５】
２つの反応混合物を合わせて、１．５ｋｇのＩｓｃｏシリカＲｅｄｉｓｅｐカラムに載せた。カラムをＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０％→０．５％、１９ＣＶ）で溶出した。透明の、生成物を含む画分を蒸発させて、淡茶色の油を得た。混合物を、真空オーブン中で、一晩４０℃で、乾燥させて、白色の固体（２４．２ｇ、全体で６７％）を得た。ＬＣＭＳ（方法Ｃ）、Ｒｔ＝０．９１、ＭＨ＋＝３４３．ｅｅ＝９２％。
【０１７６】
中間体１３
１−メチルエチル［（２Ｓ，４Ｒ）−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−４−キノリニル］カルバメート
【化１８】
0005840763.tif 000021
【０１７７】
１−メチルエチル｛（３Ｓ）−３−［（４−ブロモフェニル）アミノ］ブタノイル｝カルバメート（調製については、中間体１２を参照）（１７．９ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）をエタノール（１５０ｍＬ）中に取り、ＣＯ２／アセトン槽中で−１０℃（内部温度）より低い温度に冷却した。ＮａＢＨ４（１．３８１ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を加え、その後、−５℃より低い温度を維持しながら、水中（２５ｍＬ）の塩化マグネシウム六水和物（１１．３５ｇ、５５．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を＜０℃で１時間撹拌し、その後、室温まで加温し、１時間、撹拌した。得られた濃厚な懸濁液を、クエン酸（２５．０５ｇ、１３０ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ（水中１Ｍ、２０５ｍＬ、２０５ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（２０５ｍＬ）の混合物に注いだ。二相の混合物を室温で１時間撹拌した。層を分離し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、生成物を淡茶色の固体（１４．１ｇ）として得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）、Ｒｔ＝１．１３、ＭＨ＋＝３２７。
【０１７８】
中間体１４
１−メチルエチル［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−４−キノリニル］カルバメート
【化１９】
0005840763.tif 000022
【０１７９】
１−メチルエチル［（２Ｓ，４Ｒ）−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−４−キノリニル］カルバメート（調製については、中間体１３を参照）（１４．１ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）を、窒素下で、室温にてＤＣＭ（４００ｍＬ）中に取った。ピリジン（１０．４６ｍＬ、１２９ｍｍｏｌ）、その後、塩化アセチル（４．６０ｍＬ、６４．６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１６時間撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃ（２０００ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（８００ｍＬ）に分配した。層を分離し、有機相を、水、その後、ブライン（各１５００ｍＬ）で洗浄し、その後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮し、紫色の固体を得た。この粗製生成物を、最小限のＤＣＭ中に取り、３３０ｇのＣｏｍｐａｎｉｏｎ  ＸＬカラムに適用し、シクロヘキサン中の１２〜６３％の酢酸エチルのグラジエントで溶出し、オフホワイト色の固体（１２．３７ｇ）として生成物を得た。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）、Ｒｔ＝１．０３、ＭＨ＋＝３６９。［アルファ］Ｄ＝＋２８１．１０２５°（Ｔ＝２０．７℃、１０ｍｍセル、ｃ＝０．５０８ｇ／１００ｍｌ、エタノール）。
【０１８０】
中間体１５
エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート
【化２０】
0005840763.tif 000023
【０１８１】
１−メチルエチル［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−４−キノリニル］カルバメート（調製については、中間体１４を参照）（３９．０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）、｛４−［（エチルオキシ）カルボニル］フェニル｝ボロン酸（２２．５ｇ、１１６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．８３ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＥ（４３０ｍＬ）中で混合し、得られた混合物をＮａ２ＣＯ３水溶液（２Ｎ、２１０ｍＬ、４２０ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を、家庭用掃除機下で、窒素で数度クエンチして脱気し、その後、１０５℃にて窒素下で約６時間撹拌し、その後、室温へと冷却させた。混合物をＥｔＯＡｃと水とに分配し、層を分離した。水相をＥｔＯＡｃで抽出し、合わせた有機相をブラインで洗浄した。その後、有機相を、７０ｇのシリカカートリッジを通して濾過し、ＥｔＯＡｃでカートリッジを洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を真空下で濃縮した。残渣を、Ｅｔ２Ｏで摩砕し、その後、濾過した。得られた固体を空気乾燥し、エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート（３５．２ｇ、８０．２ｍｍｏｌ、７６％）を灰色の固体として得た。濾液を真空下で濃縮し、得られた残渣をＥｔ２Ｏで摩砕した（約３０ｍＬ）。形成した固体を濾過により分離し、空気乾燥して、エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート（５．９６ｇ、１３．５ｍｍｏｌ、１３％）を灰色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、保持時間１．１６分、ＭＨ＋＝４３９。
【０１８２】
中間体１６
エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−アミノ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート
【化２１】
0005840763.tif 000024
【０１８３】
エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート（調製については、中間体１５を参照）（８．９０ｇ、２０．３０ｍｍｏｌ）を、氷／水槽で冷却したＤＣＭ中（１６０ｍＬ）中の塩化アルミニウム（１０．３ｇ、７７ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。添加後、温度が０℃から約６℃に上昇した。得られた混合物を、約０℃で２０分間攪拌し、その後、〜３０秒にわたり、メタノール（１８ｍＬ）およびトリエチルアミン（３４ｍＬ、２４５ｍｍｏｌ）の溶液で処理した。得られた混合物を、０℃で〜３０分間撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃと飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に分配した。
【０１８４】
同じ反応を、エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート（調製については、中間体１５を参照）（０．８９ｇ、２．０３０ｍｍｏｌ）、塩化アルミニウム（１．０３ｇ、７．７２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３．４ｍＬ、２４．５３ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１６ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１．３ｍＬ）を用いて並行して行った。双方の反応の生成物をこの段階で合わせ、得られた混合物を、室温で約１０分間、撹拌した（総体積：約１Ｌ）。混合物をＣｅｌｉｔｅＴＭを通して濾過し、不溶性の残渣を、ＥｔＯＡｃおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、層を分離した。水相をＥｔＯＡｃで抽出し、合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥させ（疎水性フリット）、真空下で濃縮し、エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−アミノ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート（６．６ｇ、８４％−さらなる並行の実験が可能）をクリーム色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、保持時間０．７３分、［Ｍ−ＮＨ２］＋＝３３６。
【０１８５】
中間体１７
エチル４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝ベンゾエート
【化２２】
0005840763.tif 000025
【０１８６】
エチル４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−アミノ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］ベンゾエート（調製については、中間体１６を参照）（６．６ｇ、１８．７３ｍｍｏｌ）、１−ブロモ−４−クロロベンゼン（３．９４ｇ、２０．６０ｍｍｏｌ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（６９０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）および［２’−（ジシクロヘキシルホスファニル）−２−ビフェニリル］ジメチルアミン（Ｄａｖｅ−ｐｈｏｓ）（５９０ｍｇ、１．４９９ｍｍｏｌ））を、トルエン（１２０ｍＬ）中に混合し、得られた混合物を、ナトリウムｔ−ブトキシド（２．５２ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を家庭用掃除機下で、窒素で数度クエンチして脱気し、７０℃にて窒素下で１６時間加熱し、その後、室温まで冷却させ、濾過した。不溶性の残渣をトルエン、その後、Ｅｔ２Ｏで洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を水（×２）で洗浄し、その後、塩酸（２Ｎ、×２）で抽出し、オレンジ色の油を沈殿させ、これを酸性水性相と共に回収した。酸性抽出物をＥｔ２Ｏで洗浄し、合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥させ（疎水性フリット）、真空下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサングラジエント（５〜４５％）で溶出するシリカカートリッジ（３３０ｇ）のクロマトグラフィーにより精製した。適切な画分を合わせて、真空下で乾燥し、淡黄色の泡状物を得た。この泡状物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に溶解させ、機能性のチオ尿素シリカ（０．５６ｇ、パラジウムスカベンジャー）で処理した。混合物を室温（空気雰囲気）で、〜２０分間撹拌し、その後、室温で１６時間放置した。混合物を濾過し、不溶性の残渣をＥｔＯＡｃで洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を真空下で濃縮し、エチル４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝ベンゾエート（３．７ｇ、８．０ｍｍｏｌ、３２％）を黄色の油として得た。
【０１８７】
中間体１８
４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝安息香酸
【化２３】
0005840763.tif 000026
【０１８８】
エチル４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝ベンゾエート（調製については、中間体１７を参照）（５．４１ｇ、１１．６９ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）中に溶解させ、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、５０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を、室温（空気雰囲気）で約２時間撹拌し、その後、エタノールの殆どを真空で取り除いた。得られた黄色の溶液を水で希釈した（油状の黄色の沈殿物を形成した）。水相を２度、ＤＣＭで洗浄し（これは、先に形成された沈殿物を溶解しなかった）、その後、塩酸（２Ｎ）でｐＨ１まで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（×２）で抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ相をブラインで洗浄し、乾燥させ（疎水性フリット）、真空下で濃縮した。残渣の黄色の泡状物を約１時間にわたりＥｔ２Ｏで摩砕した。得られた固体を濾過により分離し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、空気乾燥させ、４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝安息香酸（４．４１ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、８７％）をクリーム色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ）、保持時間１．０８分、［Ｍ−Ｈ］−＝４３３。
【０１８９】
中間体１９
メチル４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
【化２４】
0005840763.tif 000027
【０１９０】
ＤＭＥ（５０ｍＬ）および水（１０．０ｍＬ）中のイソプロピル（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−６−ブロモ−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−イル）カルバメート（５ｇ、１３．５４ｍｍｏｌ）およびメチル４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンゾエート（３．９０ｇ、１４．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（１．５６５ｇ、１．３５４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５．６１ｇ、４０．６ｍｍｏｌ）を連続して加えた。得られた混合物を１００℃で、１時間撹拌し、その後、反応物を室温へと冷却させ、ＣｅｌｉｔｅＴＭを通して濾過した。濾液を真空下で濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃと水に分配した。水相をＥｔＯＡｃ（×３）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗製化合物を、シクロヘキサン中のＥｔＯＡｃ（５〜６０％）で溶出するシリカゲルカートリッジ（５０ｇ）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適切な画分を合わせて、減圧下で濃縮して、メチル４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（４．６４ｇ、８１％）を白色のガム状物として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝１．０９分、ＭＨ＋＝４２５。
【０１９１】
中間体２０
リチウム４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
【化２５】
0005840763.tif 000028
【０１９２】
メタノール（２０ｍＬ）中のメチル４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（調製については、中間体１９を参照）（１．６３ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（４．６１ｍＬ、４．６１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を４０℃で６時間撹拌し、その後、減圧下で濃縮して、リチウム４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（１．６５ｇ、１００％）を得て、これを、精製をせずに、続く工程に直接使用した。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．８７、ＭＨ＋＝４１１。
【０１９３】
中間体２１
４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）安息香酸
【化２６】
0005840763.tif 000029
【０１９４】
リチウム４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（１．０５ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）（調製については、中間体４７参照）をＥｔＯＡｃと塩酸（２Ｍ）に分配した。相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）安息香酸（８９８ｍｇ、８７％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．８７、ＭＨ＋＝４１１。
【０１９５】
中間体２２
エチル２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）アセテート
【化２７】
0005840763.tif 000030
【０１９６】
エチル（４−ブロモフェニル）アセテート（０．１７４ｍＬ、１．０００ｍｍｏｌ）、１−メチルエチル［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−４−キノリニル］カルバメート（４１６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４１５ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（７３．２ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を装填したフラスコに、１，４−ジオキサン（６ｍＬ）および水（２．０ｍＬ）を加え、フラスコを窒素でフラッシュした。得られた混合物を、マイクロ波照射下、１２０℃で３０分間撹拌し、その後、室温へと冷却した。ジオキサンの大半を真空下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃと水に分配した。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（２５ｇカラム、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、エチル２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）アセテート（２７０ｍｇ、収率５９．７％）を得た。この化合物は、さらに精製することなく次の工程に使用した。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝１．１６、ＭＨ＋＝４５３。
【０１９７】
中間体２３
２−（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）フェニル）酢酸
【化２８】
0005840763.tif 000031
【０１９８】
メタノール（６ｍＬ）および水（２．０ｍＬ）中のエチル｛４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］フェニル｝アセテート（調製については、中間体２２を参照）（２７０ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ、０．５９７ｍＬ、１．１９３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を６時間撹拌した。水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ、０．５ｍＬ）を加え、混合物を一晩静置した。メタノールの大半を真空下で除去し、得られた残渣を、水とＥｔ２Ｏに分配し、層を分離した。水層を塩酸（２Ｎ、２ｍＬ）で酸性化し、２回ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮して、｛４−［（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−２−メチル−４−（｛［（１−メチルエチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル］フェニル｝酢酸（２００ｍｇ、０．４７１ｍｍｏｌ、収率７９％）を茶色の泡状物として得た。この化合物は、さらに精製することなく次の工程に使用した。ＬＣＭＳ（ＨｐＨ、２分）、Ｒｔ＝０．６５、ＭＨ＋＝４２５。
【０１９９】
中間体２４
（Ｒ−ＢＩＮＡＰ）ジトリフレートビス（アセトニトリル）パラジウム（ＩＩ）
【化２９】
0005840763.tif 000032
【０２００】
Ｒ−（＋）−ＢＩＮＡＰ（６．０８ｇ、９．７６ｍｍｏｌ、Ａｖｏｃａｄｏから市販）をＤＣＭ（６２６ｍｌ）中で撹拌し、ジクロロビス（アセトニトリル）パラジウム（ＩＩ）（２．５ｇ、９．６４ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈから市販）を加えた。混合物を窒素下で３０分間撹拌し、懸濁液は溶液とはならず、さらにＤＣＭ（１００ｍｌ）を加えた。混合物をさらに３０分撹拌し、アセトニトリル（２５０ｍｌ）中に溶解した銀トリフレート（５．００ｇ、１９．４７ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈから市販）を加えた。混合物はオレンジ色の混濁した懸濁液から黄色の懸濁液へと変化した。混合物を１時間撹拌し、ＣｅｌｉｔｅＴＭを通して濾過し、蒸発させてオレンジ色の固体を得た。残渣を真空下（約１４ｍｂａｒ）、室温で週末の間乾燥させて、目的の生成物を得た（１０．６９ｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＣＮ−ｄ３）  δ  ｐｐｍ  ２．０（ｓ，６Ｈ）、６．７（ｄ，２Ｈ）、６．９（ｂｒ  ｍ，４Ｈ）、７．１（ｂｒ  ｔ，２Ｈ）、７．２（ｔ，２Ｈ）、７．５−７．９（ｍ，２２Ｈ）。
【０２０１】
実施例１
２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート塩酸塩
【化３０】
0005840763.tif 000033
【０２０２】
４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝安息香酸（調製については、中間体１８を参照）（１００ｍｇ、０．２３０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）中に懸濁させた。ＤＭＡＰ（３３．７ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（５２．２ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間撹拌し、透明な黄色の溶液を生成した。ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中の２−（ジメチルアミノ）エタノール（２０．５ｍｇ、０．２３０ｍｍｏｌ）を続けて加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物をＤＣＭ（８．５ｍｌ）で希釈し、ＮａＯＨ（２Ｎ）、水およびブライン（それぞれ１０ｍｌ）で洗浄し、その後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して、真空下で濃縮して、オフホワイト色の半固体を生成した。粗製生成物を最小容量のＤＣＭ（溶解を助けるために数滴のＭｅＯＨを含む）中に溶解し、２５ｇのカートリッジに適用した。カートリッジを真空下、４０℃で１時間乾燥し、その後、２ＣＶに対して１％の２Ｍのメタノール中のＮＨ３／ＤＣＭで溶出し、その後、１０ＣＶにわたってＤＣＭ中１〜５％の２Ｍのメタノール中のアンモニアで溶出し、その後、５ＣＶに対して５％で保持した。適切な画分を真空下で濃縮して、アミンのない生成物（１８．８ｍｇ）を透明な油として得た。後者を最小のＤＣＭ中に溶解し、Ｅｔ２Ｏ中のＨＣｌ（１Ｎ、０．１９ｍＬ、０．１９０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒を窒素気流下で蒸発させた。少量のＥｔ２Ｏ（〜１ｍＬ）を加え、窒素下で蒸発させて、２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル）ベンゾエート塩酸塩（７６．７ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ、収率５８．６％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．９１分、ＭＨ＋＝５０６。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １．１６  （３Ｈ，ｄ）、１．３０（１Ｈ，ｍ）、２．２１（３Ｈ，ｓ）、２．６５−２．７４（７Ｈ，ｍ）、３．２４（２Ｈ，ｍ）、４．３６（１Ｈ，ｍ）、４．５６（２Ｈ，ｍ）、４．７６（１Ｈ，ｍ）、６．３８（１Ｈ，ｄ）、６．８０（２Ｈ，ｄ）、７．１９（２Ｈ，ｄ）、７．５２（１Ｈ，ｓ）、７．５４（１Ｈ，ｄ）、７．７２（１Ｈ，ｄｄ）、７．７７（２Ｈ，ｄ）、８．１３（２Ｈ，ｄ）、９．９２（１Ｈ，ｂｓ）。
【０２０３】
実施例２
２−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウムギ酸塩
【化３１】
0005840763.tif 000034
【０２０４】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝安息香酸（調製については、中間体１８を参照）（２００ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）の溶液に、連続的に、Ｋ２ＣＯ３（９５ｍｇ、０．６９０ｍｍｏｌ）および（２−ブロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミド（１７０ｍｇ、０．６９０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、その後、減圧下で濃縮した。残渣を１：１ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解し、ＭＤＡＰ（ギ酸）により精製した。適切な画分を合わせ、真空下で濃縮して、２−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウムギ酸塩（１３３ｍｇ、５１％）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．８９分、ＭＨ＋＝５２０。
【０２０５】
実施例３
３−（（４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾイル）オキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプロパン−１−アミニウムギ酸塩
【化３２】
0005840763.tif 000035
【０２０６】
４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝安息香酸（調製については、中間体１８を参照）（１５０ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（４７．７ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）、その後、３−ブロモ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１−プロパンアミニウムブロミド（９０ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、その後、反応混合物を真空下で濃縮し、ＭＤＡＰ（ギ酸）により精製して、３−｛［４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝フェニル）カルボニル］オキシ｝−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１−プロパンアミニウムギ酸塩（４１ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、収率１９％）を黄色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．８６分、ＭＨ＋＝５３４。
【０２０７】
実施例４
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
【化３３】
0005840763.tif 000036
【０２０８】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の４−｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−［（４−クロロフェニル）アミノ］−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−キノリニル｝安息香酸（調製については、中間体１８を参照）（２５０ｍｇ、０．５７５ｍｍｏｌ）の溶液に、連続的に、３−（ジメチルアミノ）−１−プロパノール（７１．２ｍｇ、０．６９０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２２０ｍｇ、１．１５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７．０ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、その後、減圧下で濃縮し、１：１ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解し、ＭＤＡＰ（ＨｐＨ）により精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で濃縮して、３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（４−クロロフェニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（４１ｍｇ、１７％）を粘着性の無色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．９４分、ＭＨ＋＝５２０。
【０２０９】
実施例５
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート
【化３４】
0005840763.tif 000037
【０２１０】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチン酸（調製については、中間体７を参照）（１００ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（ジメチルアミノ）−１−プロパノール（１２１ｍｇ、１．１７０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（９０ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．８６ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、反応混合物を真空下で濃縮し、１：１ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解し、ＭＤＡＰ（ＨｐＨ）により精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で濃縮して、３−（ジメチルアミノ）プロピル  ６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート（２３ｍｇ、１９％）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．７０分、ＭＨ＋＝５１３。
【０２１１】
実施例６
２−（ジメチルアミノ）エチル  ６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート
【化３５】
0005840763.tif 000038
【０２１２】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の６−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチン酸（調製については、中間体７を参照）（５４ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２６．２ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）および２−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（２８．８ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３時間撹拌し、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を１：１ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解し、ＭＤＡＰ（ギ酸）により精製した。適切な画分を合わせ、真空下で濃縮して、２−（ジメチルアミノ）エチル  ６−（（２Ｒ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ニコチネート（１６．５ｍｇ、２４％）を粘着性の無色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．６９分、ＭＨ＋＝４９９。
【０２１３】
実施例７
３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
【化３６】
0005840763.tif 000039
【０２１４】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）安息香酸（調製については、中間体２１を参照）（１６４ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）および３−（ジメチルアミノ）プロパン−１−オール（２０６ｍｇ、１．９９８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（１５３ｍｇ、０．７９９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（４．８８ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃを加えた。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を１：１ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解し、ＭＤＡＰ（ＨｐＨ）により精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で濃縮して、３−（ジメチルアミノ）プロピル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（２９．３ｍｇ、１５％）を粘着性の無色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．７５分、ＭＨ＋＝４７６。
【０２１５】
実施例８
２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート
【化３７】
0005840763.tif 000040
【０２１６】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のリチウム４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（調製については、中間体２０を参照）（２４６ｍｇ、０．５９１ｍｍｏｌ）および２−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（１３５ｍｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１２２ｍｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１：１ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解し、ＭＤＡＰ（ギ酸）により精製した。適切な画分を合わせ、真空下で濃縮して、２−（ジメチルアミノ）エチル  ４−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−アセチル−４−（（イソプロポキシカルボニル）アミノ）−２−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）ベンゾエート（１４．５ｍｇ、５％）を粘着性の無色の油として得た。ＬＣＭＳ（ギ酸、２分）、Ｒｔ＝０．７２分、ＭＨ＋＝４８２。
【０２１７】
基準化合物
基準化合物Ａ：
２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン
【化３８】
0005840763.tif 000041
【０２１８】
５−メトキシアントラニル酸（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）（４１．８ｇ、０．２５ｍｏｌ）の溶液を、３．５時間、無水酢酸（２３０ｍＬ）中で還流し、その後、減圧下で濃縮した。その後、粗製化合物を、トルエンの存在下で２回濃縮し、その後、濾過して、エーテルで２回洗浄し、標題化合物（３３．７ｇ、収率７１％）を茶色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）、ｍ／ｚ  １９２［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｒｔ  １．６９分。
【０２１９】
基準化合物Ｂ：
［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン
【化３９】
0005840763.tif 000042
【０２２０】
０℃において、トルエン／エーテル（２／１）混合物（７６０ｍＬ）中の２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン（調製については、基準化合物Ａを参照）（４０．０ｇ、０．２１ｍｏｌ）の溶液に、４−クロロフェニルマグネシウムブロミド（１７０ｍＬ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ、０．１７ｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温まで加温して、１時間撹拌し、その後、１ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）でクエンチした。水層をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その後、粗製化合物を、ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）中に溶解し、６ＮのＨＣｌ（１６０ｍＬ）を加えた。反応混合物を、２時間還流し、その後、１／３の体積に濃縮した。得られた固体を濾過し、２回エーテルで洗浄し、その後、ＥｔＯＡｃ中に懸濁させ、１ＮのＮａＯＨで中和した。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を黄色の固体（３９ｇ、収率８８％）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）、ｍ／ｚ  ２６２［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｒｔ  ２．５７分。
【０２２１】
基準化合物Ｃ：
メチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート
【化４０】
0005840763.tif 000043
【０２２２】
メチルＮ−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパルチルクロリド（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９２、４０、１３−１８）（９３ｇ、０．２４ｍｏｌ）をＣＨＣｌ３（２７０ｍＬ）中に溶解し、［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン（調製については、基準化合物Ｂを参照）（５３ｇ、０．２ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、６０℃で１時間撹拌し、その後、冷却して、６０％の体積に濃縮した。エーテルを０℃で加え、得られた沈殿物を濾過し、取り除いた。濾液を減圧下で濃縮し、さらに精製せずに用いた。
【０２２３】
基準化合物Ｄ：
メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化４１】
0005840763.tif 000044
【０２２４】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のメチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート（調製については、基準化合物Ｃを参照）（推定０．２ｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５００ｍＬ、３．６５ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、２４時間還流し、その後、濃縮した。得られた粗製アミンを、１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）中に溶解し、ＡｃＯＨ（１０４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を注意して加えた。その後、反応混合物を６０℃で２時間撹拌し、真空下で濃縮し、ＤＣＭ中に溶解した。有機層を、１ＮのＨＣｌで洗浄し、水層をＤＣＭ（×３）で抽出した。合わせた有機層を２回水、およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製固体を、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（５１ｇ）を淡黄色の固体として得た。濾液を濃縮し、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、別の１０ｇの所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ１９Ｈ１８３５ＣｌＮ２Ｏ４についての計算値３７３．０９５５；実測値３７３．０９５７。
【０２２５】
基準化合物Ｅ：
メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化４２】
0005840763.tif 000045
【０２２６】
室温において、１，２−ＤＣＥ（７００ｍＬ）中のＰ４Ｓ１０（３６．１ｇ、８１．１ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（８．６ｇ、８１．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、２時間撹拌し、その後、メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｄを参照）（１６．８ｇ、４５．１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を７０℃で２時間撹拌し、その後、冷却して、濾過した。固体を、２回ＤＣＭで洗浄し、濾液を、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９９／１）により精製して、標題化合物（１７．２ｇ、収率９８％）を、黄色がかった固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）、ｍ／ｚ  ３８９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋、Ｒｔ  ２．６４分。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ１９Ｈ１８３５ＣｌＮ２Ｏ３Ｓについての計算値３８９．０７２７；実測値３８９．０７１４。
【０２２７】
基準化合物Ｆ：
メチル［（３Ｓ）−２−［（１Ｚ）２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化４３】
0005840763.tif 000046
【０２２８】
０℃において、ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のメチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｅを参照）（９．０ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジン一水和物（３．４ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を５℃から１５℃の間で５時間撹拌し、０℃に冷却した。その後、Ｅｔ３Ｎ（９．７ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、塩化アセチル（７．９５ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。その後、混合物を１６時間で室温まで加温し、その後、減圧下で濃縮した。粗製生成物をＤＣＭ中に溶解し、水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、粗製標題化合物（９．７ｇ、収率９８％）を得て、これをさらに精製せずに用いた。Ｒｆ＝０．４９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）。
【０２２９】
基準化合物Ｇ：
メチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート
【化４４】
0005840763.tif 000047
【０２３０】
粗製メチル［（３Ｓ）−２−［（１Ｚ）−２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｆを参照）（推定９．７ｇ）を、ＴＨＦ（１００ｍｌ）中に懸濁し、ＡｃＯＨ（６０ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物をこの温度で２日間撹拌し、その後、減圧下で濃縮した。粗製固体を、ｉ−Ｐｒ２Ｏ中で摩砕し、濾過して、標題化合物（３工程にわたって、８．７ｇ、９１％）をオフホワイト色の固体として得た。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ２１Ｈ２０ＣｌＮ４Ｏ３についての計算値４１１．１２２９；実測値４１１．１２４５。
【０２３１】
基準化合物Ｈ：
［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸
【化４５】
0005840763.tif 000048
【０２３２】
室温において、ＴＨＦ（１３０ｍＬ）中のメチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｇを参照）（７．４ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ（３６．２ｍＬ、３６．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をこの温度で５時間撹拌し、その後、１ＮのＨＣｌ（３６．２ｍＬ）でクエンチし、真空下で濃縮した。その後、水を加え、水層をＤＣＭ（×３）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、標題化合物（７ｇ、収率９８％）を淡黄色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）：ｍ／ｚ  ３９７［Ｍ＋Ｈ］＋
基準化合物Ｉ：
１，１−ジメチルエチル［５−（｛［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］カルバメート
【化４６】
0005840763.tif 000049
【０２３３】
［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸（調製については、基準化合物Ｈを参照）（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．９ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８８ｍｌ、５ｍｍｏｌ）の混合物を、８０分間室温で撹拌し、これに、１，１−ジメチルエチル（４−アミノブチル）カルバメート（１．０５ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈから市販）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、濃縮した。残渣をジクロロメタン中に取り、１ＮのＨＣｌで洗浄した。水層をジクロロメタンで２回抽出した。有機層を、１Ｎの水酸化ナトリウムで洗浄し、その後、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（９５／５）を用いて、シリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を、黄色の固体（１．２ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）、Ｒｔ＝３．０４分。
【０２３４】
基準化合物Ｊ：
Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドトリフルオロアセテート
【化４７】
0005840763.tif 000050
【０２３５】
ジクロロメタン（３ｍｌ）中の１，１−ジメチルエチル［５−（｛［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］カルバメート（調製については、基準化合物Ｉを参照）（０．２ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．０５３ｍｌ、０．６８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加えた。反応混合物を、３時間、０℃から室温で撹拌した。反応混合物を乾燥するまで濃縮して、標題化合物を吸湿性の黄色の油（２００ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｄ）、Ｒｔ＝２．３３分。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ２５Ｈ２９ＣｌＮ６Ｏ２についての計算値４８１．２１１９；実測値４８１．２１６２。
【０２３６】
基準化合物Ｋ：
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドの５−および６−異性体の混合物
【化４８】
0005840763.tif 000051
【０２３７】
Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドトリフルオロアセテート（調製については、基準化合物Ｊを参照）（７．６５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００μｌ）中に溶解し、エッペンドルフ遠心チューブ中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  カルボン酸スクシンイミジルエステル（５ｍｇ、７．７７μｍｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販の５および６の異性体の混合物、製造番号Ａ−２０１００）に加えた。ヒューニッヒ塩基（７．０μｌ、０．０４０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩、ボルテックスで混合した。１８時間後、反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残渣をＤＭＳＯ／水（５０％、合計＜１ｍｌ）中に再溶解し、分取Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラムに適用して、１５０分にわたって、１０ｍｌ／分の流速で、９５％Ａ：５％Ｂから１００％Ｂ（Ａ＝０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）のグラジエントで溶出した。同じ系を用いて、不純物画分を合わせて、再精製した。画分を合わせ、蒸発させて、標題生成物（２．８ｍｇ）を、示した２つの位置異性体の混合物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｆ）、ＭＨ＋＝９９９、Ｒｔ＝１．８８分。
【０２３８】
生物学的試験方法
蛍光異方性結合アッセイ
ブロモドメインＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４に対する式（Ｉ）の化合物の結合は、蛍光異方性結合アッセイを用いて評価し得る。
【０２３９】
ブロモドメインタンパク質、蛍光リガンド（上記の基準化合物Ｋを参照）および種々の濃度の試験化合物を一緒にインキュベートして、試験化合物の非存在下で蛍光リガンドが有意に（＞５０％）結合し、十分な濃度の有効な阻害剤の存在下で結合していない蛍光リガンドの異方性が結合値と測定可能な程度に異なるような条件下で熱力学的平衡に到達させる。
【０２４０】
全てのデータを、各プレートで１６の高いおよび１６の低いコントロールウェルの平均に正規化した。その後、以下の式の４つのパラメータ曲線フィットを適用した：
【数１】
0005840763.tif 000052
【０２４１】
式中、「ａ」は最小であり、「ｂ」はヒル勾配（Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ）であり、「ｃ」はｐＩＣ５０であり、「ｄ」は最大である。
【０２４２】
組換えヒトブロモドメイン（ＢＲＤ２（１−４７３）、ＢＲＤ３（１−４３５）およびＢＲＤ４（１−４７７））を、Ｎ末端の６個のＨｉｓ標識と共に大腸菌細胞（ｐＥＴ１５ｂベクター内）で発現させた。Ｈｉｓ標識化ブロモドメインを、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび超音波処理を用いて大腸菌細胞から抽出した。その後、ブロモドメインを、２０Ｃｖにわたり、線形１０〜５００ｍＭイミダゾールグラジエントで溶出する、ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰカラムでのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。さらなる精製を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分取グレートサイズ排除カラムにより完了した。精製したタンパク質を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で−８０℃にて保存した。
【０２４３】
ブロモドメイン  ＢＲＤ２についてのプロトコル：
全ての成分を、ＢＲＤ２、７５ｎＭ、蛍光リガンド  ５ｎＭの最終濃度で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成中に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（最終１％）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０２４４】
ブロモドメイン  ＢＲＤ３についてのプロトコル：
全ての成分を、ＢＲＤ３、７５ｎＭ、蛍光リガンド  ５ｎＭの最終濃度で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成中に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（最終１％）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０２４５】
ブロモドメイン  ＢＲＤ４についてのプロトコル：
全ての成分を、ＢＲＤ４、７５ｎＭ、蛍光リガンド  ５ｎＭの最終濃度で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成中に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（最終１％）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０２４６】
時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ
式（Ｉ）の化合物のブロモドメインＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４への結合を、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移結合アッセイを使用して評価した。この方法は、アセチル化ヒストンペプチドのブロモドメイン蛋白質への結合を測定する。
【０２４７】
プロモドメイン蛋白質、ヒストンペプチドおよび様々な濃度に調整した試験化合物を、熱力学平衡状態に達するまで一緒にインキュベートする。このアッセイは、試験化合物がない状態ではブロモドメインとぺプチドが十分に結合（〜３０％）し、効能のある阻害剤が十分な濃度で存在するとこの相互作用が乱されて、蛍光共鳴エネルギー転移に測定可能な低下が生じるように設定されている。
【０２４８】
ヒストンペプチド
Ｈ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＯＨ．３ＴＦＡ。
【０２４９】
この保護ペプチドは、予めロードしたＷａｎｇレジンを使用し、標準のＦｍｏｃ合成プロトコルを利用して固相合成機で組み立てた。Ｃ末端リジンは、酸に対して非常に不安定な基によって保護し、組立の最後に選択的に除去されビオチンを結合できるようにした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシランおよび水（９５：２．５：２．５）の混合物により室温で３時間かけてレジンから切り離すことによって粗製ペプチドを得、その後、０．１％ＴＦＡで緩衝された水／アセトニトリルグラジエントを利用したＣ１８逆相カラムを使用して精製した。得られた画分を分析し、分析ＨＰＬＣによって＞９５％純粋であり正しい分子量（ＭＡＬＤｉＴＯＦ質量分析法による）を示す画分をプールし、フリーズドライした。最終的な物質は、ＨＰＬＣによって分析して純粋なことを確認した。
【０２５０】
蛋白質の産生：
組換えヒトブロモドメイン（ＢＲＤ２（１−４７３）、ＢＲＤ３（１−４３５）およびＢＲＤ４（１−４７７））は、大腸菌細胞（ｐＥＴ１５ｂベクター）でＮ末端に６つのＨｉｓのタグが付いて発現される。Ｈｉｓタグを持つブロモドメインを、超音波処理を使用して大腸菌細胞から抽出し、ニッケルセファロース６ＦＦカラムを使用して精製し、その蛋白質を洗浄し、その後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭβ‐メルカプトエタノールおよび２０ｍＭイミダゾールで溶出した。０−５００ｍＭの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにて２０カラム容積にわたり溶出するＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰカラムのアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。最終的な精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅサイズ排除カラムによって完了した。精製した蛋白質は−８０℃で２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中に保存した。蛋白質はペプチドマスフィンガープリンティングによって同定し、質量分析法によって予測分子量を確かめた。
【０２５１】
ブロモドメインＢＲＤ２、３および４アッセイのプロトコル：
全てのアッセイ成分を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成物中に溶解した。ブロモドメイン蛋白質の最終濃度は１００ｎＭ、ヒストンペプチドは３００ｎＭであった。これらの成分を、プレミックスし、１時間、暗所で平衡化させた。８μｌのこの反応混合物を、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック小容積マイクロタイタープレートの様々な濃度に調整した試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（最終０．５％）５０ｎｌを含む全てのウェルに加え、暗所、６０分間、室温でインキュベートした。抗−６ｈｉｓ  ＸＬ６６５標識抗体およびユーロピウムクリプテートで標識されたストレプトアビジンを含む２μｌの検出混合物を全てのウェルに加え、さらに少なくとも３０分の暗所インキュベーションを行った。その後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った（λｅｘ＝３１７ｎｍ、ドナーλＥＭ＝６１５ｎｍ、アクセプターλＥＭ＝６６５ｎｍ；Ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ＬＡＮＣＥ  ｄｕａｌ）。時間分解蛍光強度測定を両方の発光波長で行い、アクセプター／ドナーの比を計算し、データ分析に使用した。全てのデータは、それぞれのプレートにおいて１６の高コントロールウェルおよび１６の低コントロールウェルの平均に対して規格化した。その後、次式の４パラメータ曲線に当てはめた。
【数２】
0005840763.tif 000053
【０２５２】
ここで、「ａ」は最小であり、「ｂ」はヒル勾配（Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ）であり、「ｃ」はｐＩＣ５０であり、「ｄ」は最大である。
【０２５３】
実施例１〜８を、それぞれの上記アッセイにおいて試験し、ｐＩＣ５０が６．３〜７．２の範囲を有することが判明した。
【０２５４】
全血からのＬＰＳ誘導ＩＬ−６分泌の測定
細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）などのｔｏｌｌ様受容体のアゴニストによる単球細胞の活性化は、ＩＬ−６を含む重要な炎症性メディエータの産生を生じる。このような経路は、様々な自己免疫および炎症性疾患の病態生理学に重要であると広く認められている。
【０２５５】
試験する化合物を希釈し、様々な適切な濃度を得て、その１μｌの希釈ストックを９６ウェルプレートに加える。全血（１３０μｌ）の添加後、プレートを３７℃（５％  ＣＯ２）にて３０分間インキュベートし、その後、１０μｌの２．８μｇ／ｍｌ  ＬＰＳを加え、完全ＲＰＭＩ  １６４０（最終濃度＝２００ｎｇ／ｍｌ）中で希釈して、１つのウェル当たり１４０μｌの全体積を得る。３７℃にて２４時間のさらなるインキュベーションの後、１４０μｌのＰＢＳを各ウェルに加える。プレートを密閉し、１０分間振盪し、その後、遠心分離する（２５００ｒｐｍ×１０分）。１００μｌの上清を取り出し、即座に、または−２０℃での保存後のいずれかで、免疫学的検定（典型的にメソスケールディスカバリー技術）によりＩＬ−６レベルを評価する。各化合物についての濃度反応曲線をデータから生成し、ＩＣ５０値を算出した。
【０２５６】
実施例１、２、３、５、６、７および８を、上記のアッセイにおいて試験し、ｐＩＣ５０が５．５〜６．７の範囲を有することが判明した。
【０２５７】
これらのデータは、上記の全血アッセイにおいて試験したブロモドメイン阻害剤が、重要な炎症性メディエータＩＬ−６の産生を阻害したことを示す。
【０２５８】
インビボでのマウス内毒素血モデル
動物に投与した高用量のエンドトキシン（細菌性リポ多糖）は、強力な炎症反応、心臓血管機能の異常調節、臓器不全および最終的に死亡を含む深刻なショック症候群を生じる。このパターンの反応は、ヒトの敗血症および敗血性ショックと非常に類似しており、顕著な細菌感染に対する身体の反応は同様に生命を脅かす危険性がある。
【０２５９】
本発明において使用する化合物を試験するために、８匹のＢａｌｂ／ｃオスのマウスの群に、腹腔内注射により致死量の１５ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳを与える。９０分後、動物にビヒクル（非発熱性水中の２０％シクロデキストリン  １％エタノール）または化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。動物の生存を４日目にモニターする。
【０２６０】
腫瘍細胞増殖アッセイ
ヒト細胞株（１５個のｈｅｍｅ細胞株、１４個の乳腺細胞株および４個の他の細胞株を含むｎ＝３３）を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で培養し、１つのウェルあたり１０００個の生存細胞を、４８μｌの培地入りの３８４ウェルブラック平底ポリスチレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＃７８１０８６）に播種した。全てのプレートを５％ＣＯ２、３７℃にて一晩静置した。次の日に、１つのプレートを、０（Ｔ０）測定に等しい時間、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ，Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７３）を用いて収集し、化合物（１４．７μＭ〜７ｐＭの２０点滴定）を残りのプレートに添加した。全てのウェル中のＤＭＳＯの最終濃度は０．１５％であった。細胞を７２時間または示した時間インキュベートし、各プレートを、ウェル中の細胞培養体積に等しい体積を用いてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬で発色させた。プレートを約２分間振盪し、化学発光シグナルを、Ａｎａｌｙｓｔ  ＧＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
【０２６１】
結果をＴ０の割合として表し、化合物濃度に対してプロットする。Ｔ０値を１００％に正規化し、化合物添加の時間の細胞数を表し、ＸＬフィットソフトウェア（モデル２０５）を用いて濃度反応データを４パラメーター曲線フィットにフィットさせた。細胞増殖を５０％阻害した濃度（ｇＩＣ５０）は「増殖窓（ｇｒｏｗｔｈ  ｗｉｎｄｏｗ）」の中間点である（Ｔ０とＤＭＳＯコントロールとの間）。Ｙｍｉｎ−Ｔ０値を、濃度反応曲線のフィットから決定したＹｍｉｎ値（％）からＴ０値（１００％）を減算することによって決定する。細胞を含まないウェルからの値を、バックグラウンド補正のために全てのサンプルから減算した。
【０２６２】
限定されないが、本明細書に記載した特許および特許出願を含む全ての文献は、各々の個々の文献が具体的かつ個々に完全に記載されているように本明細書に参照として組み込まれる。