(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物を産生する方法であって、この方法は、
（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；
（ｂ）前記基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも２．４μｇ／Ｌの最終銅濃度を得るステップ；
（ｃ）ｒＶＷＦタンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；
（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養し、ｒＶＷＦを発現させ、これを前記細胞から培養液上清中へ排出させるステップであって、ここで、前記培養液上清のＮＨ４＋含量が１０ｍＭ未満の濃度で維持されている、ステップ；および
（ｅ）少なくとも一部の前記培養液上清を回収するステップ、
を含み、
前記回収上清が、少なくとも３０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数の細胞の培養の前に、前記基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加水分解物が、植物加水分解物である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記加水分解物が、大豆加水分解物である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記基本細胞培地が、動物タンパク質不含培地である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記基本細胞培地が、タンパク質不含培地である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基本細胞培地が合成培地である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、少なくとも４μｇ／Ｌ銅である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、２．４μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ銅である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基本細胞培地を補充する銅が、銅塩，銅キレート，またはこれらの組み合わせとして提供される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記銅塩が、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の細胞が、哺乳動物細胞である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞のバッチ培養を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞の連続培養を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の連続培養が、ケモスタット方式で行われる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞の連続培養が、灌流方式で行われる請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の細胞が、少なくとも１００Ｌの前記補充基本細胞培地中で培養される請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、細胞密度が２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも一部の前記培養液上清の回収ステップが、その一部の培養液上清から細胞を取り出すための濾過または遠心分離を含む請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記回収上清が、少なくとも４０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記回収上清が、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記回収上清が、少なくとも６０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記回収上清が、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記回収上清が、少なくとも８０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記上清中の少なくとも１０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体に存在する請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記上清中の少なくとも２０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体に存在する請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記上清中の少なくとも３０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体に存在する請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記上清が、１４〜２２の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体を含む請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養液上清のＮＨ４＋含量が、４ｍＭ未満の濃度で維持される請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ｒＶＷＦが、組換え型因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と同時発現する請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記回収上清中に存在する少なくとも５０％のｒＦＶＩＩＩからｒＶＷＦを精製するステップをさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記精製ステップ後のｒＶＷＦのｒＦＶＩＩＩに対する比率が、少なくとも１０：１である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ｒＶＷＦ富化ステップをさらに含む請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願の相互参照
本出願は、２０１０年７月８日出願の米国特許仮出願第６１／３６２，６３５号の優先権を主張する。本開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真核細胞培養、さらに具体的には、哺乳動物細胞培養を含む、細胞培養（特に、大規模細胞培養）を使った治療用タンパク質の組み換え体発現では、効率的細胞増殖のための栄養物質を与える特殊な培地の使用が必要である。細胞培地配合に対し、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、動物由来タンパク質および／またはウシ由来タンパク質加水分解物、ならびに植物または酵母由来タンパク質加水分解物を含む一連の添加物の補充がよく行われる。このような培養の１つの課題は、細胞培地の配合が変化しない場合でも、産生されたタンパク質の量ならびにタンパク質の全活性および比活性が、異なる細胞培養間で変化することが多いということである。この変動は、特に、１０Ｌ〜２０，０００Ｌを越える容量の細胞培養を利用した大規模製造プロセスの場合は特に顕著である。加水分解物を含む細胞培地は、特に、細胞培養毎に変動する傾向があり、総タンパク質産生量の低下、ならびに全活性および比活性の低下の原因となる。
【０００３】
異なる細胞培養間で見られる変動に対する１つの可能な理由は、加水分解物等の添加物中の混入物がバッチ毎に変化しているということである。一般的に、血清または血清由来物質、例えば、アルブミン、トランスフェリンまたはインスリンは、細胞培養およびそれから得られる生物学的産物を汚染する可能性のある望ましくない薬剤を含むことがある。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清を介して感染しうる肝炎ウイルスおよびＨＩＶ等の全ての既知ウイルスに関して、試験しなければならない。さらに、ウシ血清およびそれ由来産物は、ＢＳＥ汚染のリスクがある。さらに、全ての血清由来産物は、未知物質に汚染されている可能性がある。ヒトまたは動物ソース由来の血清またはタンパク質添加物を細胞培養に使用する場合、特に、細胞がヒト投与用薬剤またはワクチン剤の製造に使われる場合、多くの問題（例えば、異なるバッチ組成物間の品質変動およびマイコプラズマ、ウイルスまたはＢＳＥの感染のリスク）がある。このため、血清や他の動物タンパク質化合物を必要としない効率的な宿主系および培養条件を提供することを目的として、多くの試みがなされてきた。
【０００４】
このような無血清培地は、植物または酵母由来のタンパク質抽出物をベースに開発されてきた。例えば、大豆加水分解物は発酵プロセスに有用であることが知られており、多くの選好性生物、酵母および真菌の増殖を高めることができる。特許文献１には、大豆ミールのパパイン消化は、炭水化物と窒素の源であり、多くの成分が組織培養に使用できることが記載されている。非特許文献１は、特定の大豆およびコムギ加水分解物ペプチド画分の増殖および生産性促進効果について記載している。
【０００５】
特許文献２には、脊椎動物細胞増殖およびウイルス産生プロセス用の合成基本培地および酵母抽出物から構成される無血清培地が開示されている。特許文献３には、コメペプチドならびに酵母抽出物およびその酵素消化物、および／または動物細胞増殖用植物脂質を含む基本細胞培地から構成される培地配合物が開示されている。組換え型細胞培養用の精製大豆加水分解物を含む培地が、特許文献４で開示されている。特許文献５には、大豆加水分解物および酵母抽出物を含む培地が開示されているが、組換え型の動物タンパク質、例えば、増殖因子の存在も必要である。
【０００６】
特許文献６には、操作ＣＨＯ細胞培養用の生物合成培地が記載されており、これは、動物ソースから単離されたタンパク質、脂質および炭水化物を含まず、組換え型インスリンまたはインスリン類似体、１％〜０．０２５％ｗ／ｖのパパイン消化大豆ペプトンおよびプトレシンを含む。特許文献７には、加水分解大豆ペプチド（１〜１０００ｍｇ／Ｌ）、０．０１〜１ｍｇ／Ｌプトレシンおよびアルブミン、フェチュイン、種々のホルモンおよび他のタンパク質等の種々の動物由来成分を含む無血清真核細胞培養液が記載されている。これに関連して、プトレシンも０．０８ｍｇ／Ｌの濃度でＤＭＥＭ／ハムＦ１２のような標準的培地中に含まれていることが知られていることに留意されたい。
【０００７】
しかし、植物および／または酵母加水分解物は、オリゴペプチドおよび他の未知成分ならびに汚染物からなる不確定の混合物である。しかも、市販の加水分解物のロットの品質は、極端にばらついている。結果として、使用される加水分解物のロットに応じて（「ロット間変動」）、組換え型タンパク質の産生またはウイルス性産物に大きな変動（３つの因子までの変動）が生ずる。この欠点が、細胞の増殖、ならびに各細胞のタンパク質発現に影響を与える。特許文献８には、組換え型タンパク質バイオ医薬品の大規模産生に有用な種々の動物タンパク質不含およびオリゴペプチド不含の、合成培地が記載されている。
【０００８】
止血は、最終的に血栓形成の原因となる種々の止血反応経路の相互作用を伴う。血栓は、血管壁の表面上の血液成分の沈着物であり、これは、主に凝集血小板および不溶性の架橋フィブリンから構成されている。フィブリン形成は、凝固酵素であるトロンビンによるフィブリノゲンの限定されたタンパク質分解の結果である。トロンビンは、活性化した血小板および白血球ならびに種々の血管細胞表面上で起こる連続した酵素前駆体活性化である凝固カスケードの最終生成物である（概説は、非特許文献２、を参照）。
【０００９】
凝固カスケードの重要な機能は、活性化された第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）と活性化された第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子）の複合体による第Ｘ因子の活性化にある。この複合体の成分の欠損または機能不全は、血友病として既知の血液疾患に関連している（Ｇ．Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｅｄｓ．）：血液疾患の分子的基盤（Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８７、ｐｐ．５７６−６０２、中のＪ．Ｅ．Ｓａｄｌｅｒ  ＆  Ｅ．Ｗ．Ｄａｖｉｅ：血友病Ａ、血友病Ｂ、およびフォン・ヴィレブランド病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ、ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ））。血友病Ａは、第ＩＩＩ因子活性の欠損に関係し、一方、血友病Ｂは、第ＩＸ因子欠損に関係している。現在の治療は、正常な凝集因子からなる製剤を使った補充療法で構成される。これらの血小板障害の内で、血友病Ａは、発生が他より多く、１０，０００人に約１人が罹患する。血友病Ａ患者の補充療法は、正常な第ＶＩＩＩ因子を含む製剤の静脈内注入による反復投与を伴う。注入間隔は、血液循環中の第ＶＩＩＩ因子活性の低下の関数である。注入後の第ＶＩＩＩ因子活性の半減期は、各個人毎に異なり、１０〜３０時間の範囲である。従って、予防的治療では、２〜３日毎に注入が必要となる。これは、静脈内注入のための高頻度針穿刺後の局所的抗凝血化（ｃｉｔｒａｔｉｚａｔｉｏｎ）により静脈注入が困難になった場合は特に、血友病患者の生活にとって重荷になる。
【００１０】
延長された半減期を有する第ＶＩＩＩ因子を使って、注入頻度が少なくなることがあれば、特に好都合となるであろう。非活性化した第ＶＩＩＩ因子ヘテロダイマーの半減期は、フォン・ヴィレブランド因子の存在に強く依存することは当技術分野でよく知られている。フォン・ヴィレブランド因子は、第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子ではなく）に対し高い親和性を示し、キャリアタンパク質としての役目をする（Ｇ．Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｅｄｓ．）：血液疾患の分子的基盤（Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８７、ｐｐ．５７６−６０２、中のＪ．Ｅ．Ｓａｄｌｅｒ  ＆  Ｅ．Ｗ．Ｄａｖｉｅ：血友病Ａ、血友病Ｂ、およびフォン・ヴィレブランド病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ、ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ））。３型フォン・ヴィレブランド病の患者は血液循環中に検出可能なフォン・ヴィレブランド因子を持たず、さらに、第ＶＩＩＩ因子も持たず、２つ目の欠損となっていることが知られている。さらに、これらの患者における静脈内投与第ＶＩＩＩ因子の半減期は、２〜４時間であり、血友病Ａ患者の１０〜３０時間に比べてかなり短い。これらの知見から、第ＶＩＩＩ因子が血液循環から急速クリアランスの傾向があり、このプロセスは、天然のキャリア：フォン・ヴィレブランド因子との複合体形成によりある程度抑制されるということが結論づけられる。
【００１１】
フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）は、血漿中にあって一連の多量体として循環する糖タンパク質であり、通常、約５００〜２０，０００ｋＤの大きさ（またはｖＷＦの２〜４０二量体）の範囲である。ｖＷＦの二量体と多量体型は、ジスルフィド結合により一緒に連結された２５０ｋＤポリペプチドサブユニットからなる。ｖＷＦは、傷害性血管壁の内皮下層への初期の血小板接着を媒介する；より大きな多量体のみが止血活性を示す。多量体化ＶＷＦは、ＶＷＦのＡ１ドメイン中の相互作用により、血小板表面糖タンパク質Ｇｐ１ｂαに結合し、血小板接着を促進する。内皮細胞が、大きな多多量体型ｖＷＦを分泌し、低分子量を有するｖＷＦ型（低分子量ｖＷＦ）は、タンパク分解による切断から生ずると考えられている。大きな分子質量の多量体は、内皮細胞のワイベル・パラード小体中に貯蔵され、刺激により放出される。
【００１２】
ｖＷＦタンパク質レベルまたは低下したＦＶＩＩＩ結合親和性によるＦＶＩＩＩ結合活性の減少は、３つの型のフォン・ヴィレブランド病の内の１つをもたらす。さらに、または代わりに、特定の型のフォン・ヴィレブランド病は、Ｇｐ１ｂα媒介血小板結合レベルの増加または減少、すなわち、２Ａ、２Ｂ、および２Ｍ型を特徴とする（総説：Ｃａｓｔａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８８（１）：９４−１０８（２００３））。従って、ｖＷＦとＦＶＩＩＩおよびＧｐ１ｂαとの相互作用の調節は、血友病とフォン・ヴィレブランド病の両方の治療に対し実現可能な戦略である。
【００１３】
ｖＷＦの生物学的重要性を考えれば、当技術分野において、治療への応用のためのｖＷＦ産生方法の改善に対する引き続くニーズが存在する。ｖＷＦが、内在ソース、例えば、ヒト血漿から単離できることはよく知られている。単離ｖＷＦは、その生物学的機能の実行のための高比活性を有し、従って、フォン・ヴィレブランド病等の関連疾患の治療のための治療用タンパク質として効果的に使用できるという点で有利である。通常、血漿ｖＷＦは、約１００ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を有するが、ヒト血漿からの単離には、不都合がある。理由は、例えば、血漿は種々のウイルス、例えば、ＨＩＶおよび／または肝炎ウイルスを含む可能性があり、これが患者に感染する可能性があるからである。さらに、血漿は、限定的リソースであり、従って、血漿の不足が、治療用ｖＷＦの充分な供給の点で問題となり得る。従って、ｖＷＦ産生のための組換え法は、ｖＷＦのソースとしての血漿依存に関連する問題の一部に対処できる点で、有利である。組換え型産生のために、ｖＷＦの完全長のｃＤＮＡをクローン化した。プロポリペプチドは、完全長プレプロｖＷＦのアミノ酸残基２３〜７６４に対応する（Ｅｉｋｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １、７７９０）。
【００１４】
残念ながら、ｖＷＦは、複雑な翻訳後修飾を伴った分子である。また、ゴルジ体中でのｖＷＦ二量体の大きな、さらに超大型多量体への多量体化は、哺乳動物細胞中での発現にとって問題である。例えば、ヒト初代内皮細胞等の細胞培養中に発現した高分子量ｖＷＦは、ワイベル・パラード小体中での超大型ｖＷＦ分子の特異的貯蔵に依存する。このような細胞培養は、治療用タンパク質の産生に適さない。他の細胞培養法が報告されており、種々の方法において、細胞培養条件がｖＷＦ産生に影響する可能性があることが知られている、例えば、高濃度のアンモニウム（ＮＨ４＋）は、翻訳後修飾を妨害することが示されている。Ｍａｙａｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（２３）：１３４９７−１３５０３、１９８９）は、２５ｍＭアンモニウムのレベルで、内皮細胞中でのｖＷＦ多量体化が減少し、これがさらに、組換え型ｖＷＦ特異的リストセチン活性に悪影響することを示した。多量体化の減少は、通常、組換え型ｖＷＦの活性の減少、特に、特異的リストセチン活性に関連する。
【００１５】
いまでも、どのパラメータが、特定のタンパク質の産生、特に、第ＶＩＩＩ因子とｖＷＦ等の複合体糖タンパク質の産生に対し正や負に影響するのかを予測するのは困難なままである。例えば、特定の成分の細胞培地が第ＶＩＩＩ因子の産生に影響することが示されている。米国特許第５，８０４，４２０号で開示されているように、ポリオール、銅、および他の痕跡の金属の添加は、第ＶＩＩＩ因子の産生収率に対し、正に影響を与える可能性がある。さらに国際公開第２００９／０８６３０９号で記載されているように、銅を使った細胞培養プロセスが、第ＶＩＩＩ因子の産生を改善することが示されている。また、組換え型ＣＨＯ細胞中のｖＷＦの発現が、Ｍｉｇｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）により報告されている。しかし、これらの例のいずれも、ｖＷＦの比活性またはその多量体分布に関する情報を提供していない。
【００１６】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｍｏｔｉｆｓ））タンパク質は、メタロプロテイナーゼファミリーであり、亜鉛依存触媒ドメイン、システィンリッチドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、および少なくとも１つの、大抵の場合複数のトロンボスポンジンＩ型反復、等のいくつかの保存ドメインを含む（概説に関しては、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ｆｅｂ  ４；５（１）：１１、を参照）。メタロプロテイナーゼのＡＤＡＭおよびＭＭＰファミリーに進化的に関連しているこれらのタンパク質（Ｊｏｎｅｓ  ＧＣ、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；７（１）：２５−３１）は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４Ｊａｎ；４１（１）：４−１４）、結合組織障害、癌、炎症（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、および重篤な熱帯熱マラリア原虫マラリア（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２００９  Ｍａｒ；５（３）：ｅ１０００３４９）等の、いくつかの疾患と状態に連関している分泌酵素である。これらの関連性から、ＡＤＡＭＴＳ酵素は、いくつかの病理に対する有望な治療の標的と認識されてきた（Ｊｏｎｅｓ  ＧＣ、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；７（１）：２５−３１）。従って、高比活性を有する、ウイルス、ＢＳＥ、および病原体用マイコプラズマ細菌、等の汚染物質を含まないＡＤＡＭＴＳタンパク質の高収率産生法が必要とされている。
【００１７】
１つのＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーのＡＤＡＭＴＳ１３は、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）を残基Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６の間で切断し、大きなｖＷＦ多量体のインビボ分解に関与する機能を有する。ＡＤＡＭＴＳ１３活性の減少は、いくつかの状態、例えば、ＴＴＰ（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊａｎ；４１（１）：４−１４）、急性および慢性炎症（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００８  Ｓｅｐ  １；２０５（９）：２０６５−７４）、ならびに、ごく最近では、重篤な熱帯熱マラリア原虫マラリア（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２００９  Ｍａｒ；５（３）：ｅ１０００３４９）に結びつけられている。
【００１８】
ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼは、主に肝臓で産生される１９０ｋＤａのグリコシル化タンパク質である（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：４８８−４９４；Ｆｕｊｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１６６２−１６６６；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：４１０５９−４１０６３；Ｓｏｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．２００１；１３０：４７５−４８０；およびＧｅｒｒｉｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１６５４−１６６１）。高次ｒＶＷＦ多量体に酷似して、哺乳動物細胞培養での大きなＡＤＡＭＴＳ１３の組み換え体発現は、多くの問題を呈する。
【００１９】
従って、一貫した総タンパク質収率および／または異なる細胞培養間で産生されたタンパク質の一貫した全活性および比活性が得られる細胞培養条件、特に、大規模製造培養条件を提供する必要がある。大規模製造プロセスにおける培養間の一貫性は、治療用タンパク質の製造に重要である。また、正常なヒト血漿中に存在するＶＷＦと同程度またはそれより優れた多量体分布および特異的リストセチン活性を有するｒＶＷＦの大規模産生用細胞培養条件の必要性もある。同様に、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、いくつかの疾患と状態に関与しているので、医薬製剤および投与に適した高比活性を有する組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質の大規模生産方法に対し、当技術分野でのニーズがある。本発明は、当技術分野での組換え型フォン・ヴィレブランド因子および組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３の産生のための、これらおよび他のニーズに適合する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第９６／２６２６６号
【特許文献２】国際公開第９６／１５２３１号
【特許文献３】国際公開第９８／１５６１４号
【特許文献４】国際公開第０１／２３５２７号
【特許文献５】国際公開第００／０３０００号
【特許文献６】欧州特許出願公開第０４８１７９１号明細書
【特許文献７】国際公開第９８／０８９３４号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００７／０２１２７７０号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｅｋ、等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（２０００）１６、６８８−６９２）
【非特許文献２】Ｋ．Ｇ．Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９０、Ｖｏｌ．７６、ｐｐ．１−１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
特定の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）および組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）の発現に使われる細胞培地の補充により、タンパク質発現および酵素活性の顕著な改善がもたらされるという意外な知見に基づいている。
【００２３】
第１の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物を提供する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも２．４μｇ／Ｌの最終銅濃度を得るステップ；（ｃ）ｒＶＷＦタンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）銅を補充した細胞培地中で、１つまたは複数の細胞を培養し、ｒＶＷＦを発現させ、細胞から培養液上清に排泄させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収上清が少なくとも３０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【００２４】
上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、１つまたは複数の細胞の培養の前に、基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む。
【００２５】
上記で提供される方法の一実施形態では、加水分解物は、植物加水分解物である。具体的な実施形態では、加水分解物は、大豆加水分解物である。
【００２６】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、動物タンパク質を含まない培地である。
【００２７】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、タンパク質を含まない培地である。
【００２８】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、合成培地である。
【００２９】
上記で提供される方法の一実施形態では、銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも４μｇ／Ｌ  銅である。
【００３０】
上記で提供される方法の一実施形態では、銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、２．４μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ  銅である。
【００３１】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地に補充する銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして提供される。
【００３２】
上記で提供される方法の一実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。
【００３３】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００３４】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞の培養は、前記細胞のバッチ培養を含む。
【００３５】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞の培養は、細胞の連続培養を含む。具体的な実施形態では、細胞の連続培養はケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、細胞の連続培養は灌流方式で行われる。
【００３６】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞が、少なくとも１００Ｌの補充した基本細胞培地中で培養される。
【００３７】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞培養ステップの間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００３８】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞培養ステップの間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００３９】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞培養ステップの間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００４０】
上記で提供される方法の一実施形態では、少なくとも一部の培養液上清の回収ステップは、濾過または遠心分離して一部の培養液上清から細胞を取り出すことを含む。
【００４１】
上記で提供される方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも４０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらなる具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも６０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらなる具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。またさらに具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも８０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【００４２】
上記で提供される方法の一実施形態では、上清中の少なくとも１０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。具体的な実施形態では、少なくとも１５％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２５％のｒＶＷＦが、１０超の二量体超の高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも３０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。
【００４３】
上記で提供される方法の一実施形態では、上清は、１４〜２２二量体の高分子量ＶＷＦ多量体を含む。
【００４４】
上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のＮＨ４＋含量は、１０ｍＭ未満の濃度に維持される。
【００４５】
上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のＮＨ４＋含量は、４ｍＭ未満の濃度に維持される。
【００４６】
上記で提供される方法の一実施形態では、ｒＶＷＦは、組換え型第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）と同時発現する。具体的な実施形態では、方法は、回収上清中に存在する少なくとも５０％のｒＦＶＩＩＩから分離してｒＶＷＦを精製するステップをさらに含む。一実施形態では、精製ステップ後のｒＶＷＦのｒＦＶＩＩＩに対する比率は、少なくとも１０：１である。
【００４７】
上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、ｒＶＷＦ濃縮ステップをさらに含む。
【００４８】
第２の態様では、本発明は、本明細書で提供される方法により調製された組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物を提供する。
【００４９】
上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、組換え型第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）をさらに含む。具体的な実施形態では、ｒＶＷＦのｒＦＶＩＩＩに対する比率は、少なくとも１０：１である。
【００５０】
上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与の目的で処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内投与の目的で処方される。
【００５１】
第３の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清を提供し、この上清は、本明細書で提供される方法で調製される。
【００５２】
第４の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清を提供し、上清中の少なくとも１５％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。具体的な実施形態では、上清中の少なくとも１０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも２０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも２５％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも３０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーの形で存在する。さらに別の上記で提供される上清の具体的な実施形態では、上清は本明細書で提供される方法に従って調製される。
【００５３】
第５の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清を提供し、上清は少なくとも０．４ＩＵリストセチンコファクター活性／ｍＬを含む。具体的な実施形態では、上清は少なくとも０．５ＩＵリストセチンコファクター活性／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも０．６ＩＵリストセチンコファクター活性／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも０．７ＩＵリストセチンコファクター活性／ｍＬを含む。さらに別の上記で提供される上清の具体的な実施形態では、上清は本明細書で提供される方法に従って調製される。
【００５４】
第６の態様では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも１．０μｇ／Ｌ最終銅濃度とするステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養してｒＡ１３を発現させ、細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収培養液上清中に、少なくとも１５００ユニット／Ｌ補充基本細胞培地／日のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性が存在する。
【００５５】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、動物タンパク質を含まない培地である。
【００５６】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、タンパク質を含まない培地である。
【００５７】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、合成培地である。
【００５８】
上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも１μｇ／Ｌ  銅である。
【００５９】
上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも２μｇ／Ｌ  銅である。
【００６０】
上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも４μｇ／Ｌ  銅である。
【００６１】
上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、１μｇ／Ｌ〜６μｇ／Ｌ  銅である。
【００６２】
上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、２μｇ／Ｌ〜４μｇ／Ｌ  銅である。
【００６３】
上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地を補充する銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして提供される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。
【００６４】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００６５】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞の培養は細胞のバッチ培養を含む。
【００６６】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞の培養は、細胞の連続培養を含む。具体的な実施形態では、細胞の連続培養はケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、細胞の連続培養は灌流方式で行われる。
【００６７】
上記で提供される方法の一実施形態では、１つまたは複数の細胞が、少なくとも１００Ｌの補充基本細胞培地中で培養される。
【００６８】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００６９】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００７０】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００７１】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００７２】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００７３】
上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【００７４】
上記で提供される方法の一実施形態では、少なくとも一部の培養液上清の回収ステップは、濾過または遠心分離して一部の培養液上清から細胞を取り出すことを含む。
【００７５】
上記で提供される方法の一実施形態では、回収培養液上清中に、少なくとも２０００ユニット／Ｌ補充した基本細胞培地／日のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性が存在する。
【００７６】
上記で提供される方法の一実施形態では、回収培養液上清中に、少なくとも２５００ユニット／Ｌ補充した基本細胞培地／日のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性が存在する。
【００７７】
上記で提供される方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも８００ｍＵ／μｇのｒＡ１３特異的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を有する。
【００７８】
上記で提供される方法の好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも１２００ｍＵ／μｇのｒＡ１３特異的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を有する。
【００７９】
上記で提供される方法のまた他の実施形態では、回収上清は、少なくとも１６００ｍＵ／μｇのｒＡ１３特異的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を有する。
【００８０】
上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のＮＨ４＋含量は、１０ｍＭ未満の濃度に維持される。
【００８１】
上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のＮＨ４＋含量は、５ｍＭ未満の濃度に維持される。
【００８２】
上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のＮＨ４＋含量は、４ｍＭ未満の濃度に維持される。
【００８３】
上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、ｒＡ１３濃縮ステップをさらに含む。
【００８４】
第７の態様では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）を含む細胞培養上清を提供し、上清は、本明細書で提供される方法で調製される。
【００８５】
第８の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清を提供し、上清は、少なくとも５Ｕ  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを含む。具体的な実施形態では、上清は少なくとも６Ｕ  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも７Ｕ  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも８Ｕ  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも９Ｕ  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも１０Ｕ  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを含む。上記に提供される上清のさらに別の具体的な実施形態では、上清は、本明細書で提供される方法に従って調製される。
【００８６】
第９の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清を提供し、上清は少なくとも２μｇ  ｒＡ１３／ｍＬを含む。具体的実施形態では、上清は少なくとも３μｇ  ｒＡ１３／ｍＬを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも４μｇ  ｒＡ１３／ｍＬを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも５μｇｒＡ１３／ｍＬを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも６μｇ  ｒＡ１３／ｍＬを含む。上記に提供される上清のさらに別の具体的な実施形態では、上清は、本明細書で提供される方法に従って調製される。
【００８７】
第１０の態様では、本発明は、上述の方法のいずれか１つの方法により調製される組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物を提供する。
【００８８】
上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与を目的として処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内投与を目的として処方される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物を産生する方法であって、この方法は、
（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；
（ｂ）前記基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも２．４μｇ／Ｌの最終銅濃度を得るステップ；
（ｃ）ｒＶＷＦタンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；
（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養し、ｒＶＷＦを発現させ、これを前記細胞から培養液上清中へ排出させるステップ；および
（ｅ）少なくとも一部の前記培養液上清を回収するステップ、
を含み、
前記回収上清が、少なくとも３０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する方法。
（項目２）
前記１つまたは複数の細胞の培養の前に、前記基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む項目１に記載の方法。
（項目３）
前記加水分解物が、植物加水分解物である項目２に記載の方法。
（項目４）
前記加水分解物が、大豆加水分解物である項目３に記載の方法。
（項目５）
前記基本細胞培地が、動物タンパク質不含培地である項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記基本細胞培地が、タンパク質不含培地である項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記基本細胞培地が合成培地である項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、少なくとも４μｇ／Ｌ銅である項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、２．４μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ銅である項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記基本細胞培地を補充する銅が、銅塩，銅キレート，またはこれらの組み合わせとして提供される項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記銅塩が、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記１つまたは複数の細胞が、哺乳動物細胞である項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記１つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞のバッチ培養を含む項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記１つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞の連続培養を含む項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞の連続培養が、ケモスタット方式で行われる項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞の連続培養が、灌流方式で行われる項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記１つまたは複数の細胞が、少なくとも１００Ｌの前記補充基本細胞培地中で培養される項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、細胞密度が２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される項目１９に記載の方法。
（項目２２）
少なくとも一部の前記培養液上清の回収ステップが、その一部の培養液上清から細胞を取り出すための濾過または遠心分離を含む項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記回収上清が、少なくとも４０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記回収上清が、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記回収上清が、少なくとも６０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記回収上清が、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記回収上清が、少なくとも８０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記上清中の少なくとも１０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体に存在する項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記上清中の少なくとも２０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体に存在する項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記上清中の少なくとも３０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体に存在する項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記上清が、１４〜２２の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体を含む項目１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞培養液上清のＮＨ４＋含量が、１０ｍＭ未満の濃度で維持されている項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞培養上清のＮＨ４＋含量が、４ｍＭ未満の濃度で維持される項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ｒＶＷＦが、組換え型因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と同時発現する項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記回収上清中に存在する少なくとも５０％のｒＦＶＩＩＩからｒＶＷＦを精製するステップをさらに含む項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記精製ステップ後のｒＶＷＦのｒＦＶＩＩＩに対する比率が、少なくとも１０：１である項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ｒＶＷＦ富化ステップをさらに含む項目１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法により調製される、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清。
（項目３９）
組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清であって、少なくとも２０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体の高分子量ＶＷＦ多量体として存在する上清。
（項目４０）
組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む細胞培養上清であって、少なくとも０．５ＩＵリストセチンコファクター活性／ｍＬを含む上清。
（項目４１）
項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法により調製される組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物。
（項目４２）
組換え型因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）をさらに含む項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
ｒＶＷＦのｒＦＶＩＩＩに対する比率が、少なくとも１０：１である項目４２に記載の組成物。
（項目４４）
医薬品投与用に処方される項目４２または４３に記載の組成物。
（項目４５）
静脈内投与用に処方される項目４２〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】（１Ａ）実施例２に記載のように、低（１．０μｇ／Ｌ）および高（４．３μｇ／Ｌ）濃度の銅の存在下の哺乳動物細胞培養で発現したｒＶＷＦの低解像度（１％）アガロースゲル電気泳動の図である。培養３日目は、表７と表８のバッチ１日目に相当することに注意されたい。（１Ｂ）図１Ａで明確化したバンドで示される１〜１０二量体（バンド番号１）および１０超の二量体（バンド番号２）を有するＶＷＦ多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
【図１Ｂ】（１Ａ）実施例２に記載のように、低（１．０μｇ／Ｌ）および高（４．３μｇ／Ｌ）濃度の銅の存在下の哺乳動物細胞培養で発現したｒＶＷＦの低解像度（１％）アガロースゲル電気泳動の図である。培養３日目は、表７と表８のバッチ１日目に相当することに注意されたい。（１Ｂ）図１Ａで明確化したバンドで示される１〜１０二量体（バンド番号１）および１０超の二量体（バンド番号２）を有するＶＷＦ多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
【図２Ａ】（２Ａ）高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたｒＶＷＦ細胞培養上清の平均ｒＶＷＦ比活性のインターバルプロットである。（２Ｂ）高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたｒＶＷＦ細胞培養上清中に認められた平均ＮＨ４＋濃度のインターバルプロットである。
【図２Ｂ】（２Ａ）高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたｒＶＷＦ細胞培養上清の平均ｒＶＷＦ比活性のインターバルプロットである。（２Ｂ）高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたｒＶＷＦ細胞培養上清中に認められた平均ＮＨ４＋濃度のインターバルプロットである。
【図３Ａ】漸増レベルの銅の存在下、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３を発現した細胞培養由来の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。ｒＡ１３は、銀染色（３Ａ）および抗Ａ１３（３Ｂ）ウェスタンブロッティングによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に可視化された。
【図３Ｂ】漸増レベルの銅の存在下、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３を発現した細胞培養由来の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。ｒＡ１３は、銀染色（３Ａ）および抗Ａ１３（３Ｂ）ウェスタンブロッティングによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に可視化された。
【図４】は、ｒＡ１３生産性に対する最適銅濃度効果の外挿（実線）を示す量的生産性（Ｐ  Ｆｒｅｔ）データｖｓ銅濃度のプロットである。
【図５Ａ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｂ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｃ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｄ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｅ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｆ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｇ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｈ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｉ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｊ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図５Ｋ】基本レベルの銅（０．６６μｇ／Ｌ）の効果を最終濃度の２μｇ／Ｌ銅に補充した培養液の効果と比較した、８週間の培養時間の間にｒＡ１３を発現した連続浮遊（ケモスタット）細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、１週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
【図６Ａ】（６Ａ）実施例３に記載のように、低（１．０μｇ／Ｌ）および高（４．３μｇ／Ｌ）濃度の銅の存在下、高および低細胞密度の哺乳動物細胞培養で発現したｒＶＷＦの低解像度（１％）アガロースゲル電気泳動法測定結果である。８日目と１７日目の培養（「ＣＳＴ８」と「ＣＳＴ１７」）は、表１０〜表１３の８日目と１７日目に同じであることに注意されたい。（６Ｂ）図６Ａで明確化したバンドで示される１〜１０二量体および１０超の二量体を有するＶＷＦ多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
【図６Ｂ】（６Ａ）実施例３に記載のように、低（１．０μｇ／Ｌ）および高（４．３μｇ／Ｌ）濃度の銅の存在下、高および低細胞密度の哺乳動物細胞培養で発現したｒＶＷＦの低解像度（１％）アガロースゲル電気泳動法測定結果である。８日目と１７日目の培養（「ＣＳＴ８」と「ＣＳＴ１７」）は、表１０〜表１３の８日目と１７日目に同じであることに注意されたい。（６Ｂ）図６Ａで明確化したバンドで示される１〜１０二量体および１０超の二量体を有するＶＷＦ多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
発明の詳細な説明
Ｉ．緒言
組換え型ｖＷＦ（ｒＶＷＦ）および組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）は、大規模哺乳動物細胞培養における発現により産生出来る。しかし、標準的細胞培養条件を使って産生された場合、これらのタンパク質の活性は、全体の培地配合が変更されない場合でも、細胞培養間で変動することが多く、また、組換え型タンパク質の比活性は、血漿由来のｖＷＦおよびｒＡ１３の比活性と同じでないことが多い。さらに、哺乳動物細胞培養で発現したｒＶＷＦは、低い（１０％未満の）パーセンテージの高次多量体（高次多量体には、１０超のＶＷＦ二量体を含む分子が含まれる）のタンパク質組成物を産生する傾向がある。ｒＶＷＦおよびｒＡ１３の標準的産生方法のこれらの欠点は、大規模生産用の培養（すなわち、１０〜２０，０００Ｌを越える培養）を開発する場合に、特に問題となる。
【００９１】
異なる細胞培養バッチでよく見られる変動の１つの可能な原因は、細胞培地の成分中の混入物の存在である。これらの混入物は、異なるバッチ中に異なる量で存在する可能性があり、ｒＶＷＦおよびｒＡ１３の産生において変動する原因となる。種々の細胞培地添加物中に認められる異なる混入物を調査後、本発明者等は、加水分解物の存在が細胞培地中の銅濃度の変動の原因であることを見出した。さらなる調査により、合計銅濃度を少なくとも約１μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌにするための細胞培地への銅濃度の補充により、常に、ｒＶＷＦおよびｒＡ１３の全活性および比活性を増加させ、および／または、また、総タンパク質収率の増加に繋げることができるという意外な結果が得られた。従って、本発明は、高比活性を有するｒＶＷＦおよびｒＡ１３タンパク質の高収率生産のための方法と組成物を提供する。
【００９２】
一態様では、本発明は、血漿由来ｖＷＦ（ｐｄＶＷＦ）または血漿由来ＡＤＡＭＴＳ１３（ｐｄＡ１３）の活性と同等またはそれより高い活性を有するｒＶＷＦおよびｒＡ１３を大量生産する細胞培養方法および組成物を提供する。さらなる態様では、本発明に従い産生されたｒＶＷＦおよびｒＡ１３タンパク質は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を使った標準的細胞培養方法で産生されたタンパク質よりも、一貫して高い活性を示す。好都合にも、本明細書で提供される方法および組成物の特定の実施形態では、本発明に従って産生されたｒＶＷＦおよびｒＡ１３タンパク質は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を使った標準的細胞培養方法で産生されたタンパク質よりも、一貫して高い比活性（すなわち、Ｕ／ｍｇタンパク質）を示す。同様に、本明細書でｒＶＷＦおよびｒＡ１３の産生用に提供される方法は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を利用した標準的細胞培養方法に比べて、より高い全活性／培養容量（すなわち、Ｕ／Ｌ／Ｄ）を与える。
【００９３】
さらなる態様では、本発明は、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約１μｇ／Ｌの合計濃度になる細胞培養方法を提供する。他の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約２μｇ／Ｌの合計濃度になる。さらに他の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約１μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌの合計濃度になる。一部の実施形態では、銅の合計濃度は、約１．５〜４．５μｇ／Ｌである。特定の実施形態では、細胞培地を補充して、約１、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０μｇ／Ｌの銅、またはそれより高い濃度の銅になる。基本細胞培地は、通常、１μｇ／Ｌ未満の微量の濃度の銅を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明は、ｒＶＷＦの産生のために、基本細胞培地に約１．０〜約２０μｇ／Ｌの銅を補充する細胞培養方法を提供する。さらなる実施形態では、ｒＶＷＦの産生のために、基本細胞培地に１．５〜１５、２．０〜１０、２．５〜８、３．０〜６、４．０〜５．０μｇ／Ｌの銅を補充する。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、補充した銅に加えて、１つまたは複数の加水分解物を含んでもよい。
【００９５】
他の実施形態では、本発明は、ｒＡ１３の産生のために、基本細胞培地に約１．５〜約４μｇ／Ｌの銅を補充する細胞培養方法を提供する。さらなる実施形態では、ｒＡ１３の産生のために、基本細胞培地に約１．６〜３．８、１．７〜３．６、１．８〜３．４、１．９〜３．２、２．０〜３．０、２．１〜２．８、２．２〜２．６、２．３〜２．４μｇ／Ｌの銅を補充する。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、補充した銅に加えて、１つまたは複数の加水分解物を含んでもよい。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、銅および／または１つまたは複数の加水分解物に加えて、約１．０〜約３０μＭの亜鉛を含む。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、銅および／または１つまたは複数の加水分解物および／または亜鉛に加えて、約０．５〜約５．０ｍＭのカルシウムをさらに含む。
【００９６】
上記のいずれかに基づいた、またさらなる態様では、本発明は、細胞培養溶液のアンモニウムレベルが低い（１０ｍＭ未満）細胞培養方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法は、１、２、３、４、または５μｇ／Ｌより高い濃度の銅を、低レベルのアンモニウムと組み合わせて含む細胞培地を利用する。
【００９７】
本発明の方法および組成物の利点の１つは、大規模細胞培養による生産を適用できる点である。これらの大規模細胞培養は、少なくとも１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、５００Ｌ、７５０Ｌ、１，０００Ｌ、１，５００Ｌ、２，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、または２０，０００Ｌ培養である。
【００９８】
特定の態様では、本発明の方法は、全体的に見て、必ずしも、より多い量の組換え型タンパク質を生成しないが、産生された組換え型タンパク質（ｒＶＷＦまたはｒＡ１３）は、標準的細胞培養を使って産生したタンパク質で見られるものより、特に、細胞培地が追加の銅で補充されていない細胞培養で産生されたタンパク質に比べて、高い全活性および比活性を示す。さらなる態様では、銅補充培地で細胞培養されたｒＶＷＦおよびｒＡ１３タンパク質は、銅を補充していない基本細胞培地で培養した細胞に比べて、一貫して１Ｌの細胞培養液当たりの活性増加を示す。またさらなる態様では、本発明の銅補充培地は、銅を補充していない培地に比べて、タンパク質収率の増加、培養液中の細胞数の増加、および／または１Ｌ培養液当たりの全活性の増加をもたらす。
【００９９】
本発明の方法と組成物のまたさらなる利点は、高パーセンテージ（１０％超）の高次多量体化ｒＶＷＦを含むタンパク質集団が得られることである。
【０１００】
多くの本明細書のＡＤＡＭＴＳタンパク質に関する考察は、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の観点から行われているが、全てのＡＤＡＭＴＳタンパク質は、共通のコアドメイン構造および共通の構造−機能関係性を共有するので、本明細書記載の方法と組成物は、ｒＡ１３だけでなく、いずれのＡＤＡＭＴＳタンパク質の産生にも適用可能であることは理解されよう。
【０１０１】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される「組換え型ｖＷＦ」は、組換えＤＮＡ技術経由で得られたｖＷＦを含む。特定の実施形態では、本発明のｖＷＦタンパク質は、例えば、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ等の１９８６年１０月２３日付け公報の国際公開第１９８６／０６０９６号および１９９０年７月２３日出願の米国特許公開第０７／５５９，５０９号に記載のように調製された構築物を含んでもよい。これらの特許は、組換え型ｖＷＦの産生方法に関する参照により本明細書に組み込まれる。本発明のｖＷＦは、単量体および多量体型を含む全ての可能な形態、を含んでもよい。本発明は、組み合わせて使用されるべき異なる形のｖＷＦを包含することは理解されよう。例えば、本発明のｖＷＦは、異なる多量体、異なる誘導体ならびに両方の生物学的に活性な誘導体および生物学的に活性でない誘導体を含んでもよい。
【０１０２】
例えば、細胞もしくは核酸、タンパク質、またはベクターへの参照に伴って使用される場合の用語「組換え型」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変化の導入により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを指す。従って、例えば、組換え型細胞は、ネイティブ（非組換え）型の細胞内に認められない遺伝子を発現する、または、他の方法では、異常発現するか、低発現するか、または全く発現しないネイティブ遺伝子を発現する。
【０１０３】
本発明においては、組換え型ｖＷＦは、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、および生物学的に活性なそれらの誘導体由来のｖＷＦファミリーのいずれのメンバーも包含する。好ましい実施形態では、組換え型ＶＷＦは、ヒトＶＷＦである。活性を有する突然変異および変種ｖＷＦタンパク質も、包含され、ｖＷＦタンパク質の機能性断片および融合タンパク質も包含される。さらに、本発明のｖＷＦは、精製、検出、またはそれら両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書記載のｖＷＦは、治療用成分またはインビトロまたはインビボでの画像処理に適した成分でさらに改変されてもよい。
【０１０４】
用語「高次多量体ｖＷＦ」、「高分子量ｖＷＦ」、および「ＨＭＷ  ＶＷＦ」は、同義に使用でき、１０超のＶＷＦ二量体を含む共有結合ｖＷＦ多量体を指す。特定の実施形態では、ＨＭＷ  ＶＷＦは、少なくとも１１ＶＷＦ二量体、または少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくはさらに多い数のＶＷＦ二量体を含む。
【０１０５】
本明細書で使用される「ＡＤＡＭＴＳタンパク質」は、メタロプロテイナーゼファミリーのトロンボスポンジンＩ型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼのポリペプチドを指す。このファミリーのメンバーには、ヒトタンパク質ＡＤＡＭＴＳ１（ＮＭ＿００６９８８）、ＡＤＡＭＴＳ２（ＮＭ＿０１４２４４；ＮＭ＿０２１５９９）、ＡＤＡＭＴＳ３（ＮＭ＿０１４２４３）、ＡＤＡＭＴＳ４（ＮＭ＿００５０９９）、ＡＤＡＭＴＳ５（ＮＭ＿００７０３８）、ＡＤＡＭＴＳ６（ＮＭ＿０１４２７３）、ＡＤＡＭＴＳ７（ＮＭ＿０１４２７２７）、ＡＤＡＭＴＳ８（ＮＭ＿００７０３７）、ＡＤＡＭＴＳ９（ＮＭ＿１８２９２０；ＮＭ＿１８２９２１；ＮＭ＿０２０２４９）、ＡＤＡＭＴＳ１０（ＮＭ＿０３０９５７）、ＡＤＡＭＴＳ１２（ＮＭ＿０３０９５５）、ＡＤＡＭＴＳ１３（ＮＭ＿１３９０２５；ＮＭ＿１３９０２６；ＮＭ＿１３９０２７；ＮＭ＿１３９０２８）、ＡＤＡＭＴＳ１４（ＮＭ＿１３９１５５；ＮＭ＿０８０７２２）、ＡＤＡＭＴＳ１５（ＮＭ＿１３９０５５）、ＡＤＡＭＴＳ１６（ＮＭ＿１３９０５６）、ＡＤＡＭＴＳ１７（ＮＭ＿１３９０５７）、ＡＤＡＭＴＳ１８（ＮＭ＿１９９３５５；ＮＭ＿１３９０５４）、ＡＤＡＭＴＳ１９（ＮＭ＿１３３６３８）、およびＡＤＡＭＴＳ２０（ＮＭ＿０２５００３、ＮＭ＿１７５８５１）が含まれる。ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、完全長タンパク質、および少なくとも部分生物活性、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の、またはそれより多い量の、完全長タンパク質により示される活性、特に完全長タンパク質により示されるプロテアーゼ活性を示す部分ポリペプチドの両方を含む。特定の例では、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、例えば、酵素的または化学的手段により、インビボまたはインビトロで、翻訳後修飾される。あるいは、本発明のＡＤＡＭＴＳタンパク質は、スプライスされたアイソフォーム、保存的に改変されたタンパク質、実質的に同じタンパク質、相同体、等を含むことが理解されよう。
【０１０６】
本発明においては、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、および生物学的に活性なそれらの誘導体由来のＡＤＡＭＴＳファミリーのいずれかのメンバーを包含する。活性を有する突然変異および変種ＡＤＡＭＴＳタンパク質もまた、包含され、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の機能性断片および融合タンパク質も包含される。さらに、本発明のＡＤＡＭＴＳタンパク質は、精製、検出、または両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書記載のＡＤＡＭＴＳタンパク質は、治療用成分またはインビトロまたはインビボでの画像処理に適した成分でさらに改変されてもよい。
【０１０７】
本明細書で使用される「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質」は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性、特にＶＷＦの残基Ｔｙｒ−８４２およびＭｅｔ−８４３の間でペプチド結合を切断する能力、を有するいずれかのタンパク質またはポリペプチドを指す。代表的実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム１、プレプロタンパク質）またはＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム１、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５〜１４２７のアミノ配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。別の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ＿６２０５９６（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム２、プレプロタンパク質）またはＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム２、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５〜１３７１のアミノ酸配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。また別の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ＿６２０５９５（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム３、プレプロタンパク質）またはＮＰ＿６２０５９５（ＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォーム１、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５〜１３４０のアミノ酸配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本明細書で使用されるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ｖＷＦ切断活性を有する天然変異体およびｖＷＦ切断活性を有する人工構築物を含む。本発明で使われるＡＤＡＭＴＳ１３は、一部の基本的活性を保持している任意の天然変異体、代替配列、アイソフォームまたは変異タンパク質を包含する。ヒト集団で見つかったＡＤＡＭＴＳ１３変異の例には、限定されないが、Ｒ７Ｗ、Ｖ８８Ｍ、Ｈ９６Ｄ、Ｒ１０２Ｃ、Ｒ１９３Ｗ、Ｔ１９６Ｉ、Ｈ２３４Ｑ、Ａ２５０Ｖ、Ｒ２６８Ｐ、Ｗ３９０Ｃ、Ｒ３９８Ｈ、Ｑ４４８Ｅ、Ｑ４５６Ｈ、Ｐ４５７Ｌ、Ｃ５０８Ｙ、Ｒ５２８Ｇ、Ｐ６１８Ａ、Ｒ６２５Ｈ、Ｉ６７３Ｆ、Ｒ６９２Ｃ、Ａ７３２Ｖ、Ｓ９０３Ｌ、Ｃ９０８Ｙ、Ｃ９５１Ｇ、Ｇ９８２Ｒ、Ｃ１０２４Ｇ、Ａ１０３３Ｔ、Ｒ１０９５Ｗ、Ｒ１１２３Ｃ、Ｃ１２１３Ｙ、Ｔ１２２６Ｉ、Ｇ１２３９Ｖ、Ｒ１３３６Ｗが含まれ、これらの多くは、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）と関連することが解っている。ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、また、翻訳後修飾を含むポリペプチドを含む。例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３は、残基６１４、６６７、および１３５４の位置で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）により修飾されることが示され、また、残基１４２、１４６、５５２、５７９、７０７、８２８、および１２３５もまた、同様の方式で修飾される可能性があると予測されている。
【０１０８】
タンパク分解性活性組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２、Ｂｌｏｏｄ．１５；１００（１０）：３６２６−３２）および米国特許公開第２００５／０２６６５２８号（この特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、哺乳動物細胞培養での発現により調製できる。細胞培養での組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３の発現方法は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ．（Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊａｎ；４１（１）：２４−３３および米国特許公開第２０１１／００８６４１３号（この特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）で開示されている。
【０１０９】
また、本明細書で使用される用語「生物学的に活性な誘導体」は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質に関連して使われる場合、組換えＤＮＡ技術により得られたポリペプチドを包含する。これは、（ｉ）遺伝子工学、例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅による組換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）トランスフェクション、すなわち、電気穿孔または微量注入による原核生物または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）前記形質転換された細胞の、例えば、連続またはバッチ方式で培養、（ｉｖ）例えば、恒常的な、または誘導時のＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現、および（ｖ）例えば、培地からの、または形質転換細胞を回収することにより前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質を単離し、（ｖｉ）実質的に精製された組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等により得ること、のために当技術分野で既知のいずれかの方法を含んでもよい。用語の「生物学的に活性な誘導体」は、また、キメラ分子、例えば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質、またはその機能性断片を、第２のポリペプチド、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインまたはアルブミンドメインと組み合わせて含み、生物学的／薬理学的特性、例えば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の哺乳動物、特にヒトの循環系中半減期を改善する。
【０１１０】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、実質的にまたは基本的に、ネイティブ状態で認められるような通常随伴する成分を含まない材料を指す。純度と均一性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーを使って測定される。一実施形態では、配合物中の主な種であるｒＶＷＦは、充分に精製されている。別の実施形態では、配合物中の主な種であるｒＡ１３は、充分に精製されている。用語の「精製された」は、一部の実施形態では、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に一本のバンドを生ずることを意味する。他の実施形態では、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも５０％純粋であること、より好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに純粋であることを意味する。他の実施形態では、「精製する」または「精製」は、精製されるべき組成物から少なくとも１つの混入物を除去することを意味する。この意味では、精製は、精製された化合物が同種、例えば、１００％純粋であることを必要としない。
【０１１１】
ｖＷＦの生物活性は、既知のインビトロアッセイで測定できる。例えば、リストセチンコファクターアッセイは、ｖＷＦの存在下で抗生物質リストセチンにより誘導された、新鮮な、またはホルマリン固定した血小板の凝集に基づいている。血小板凝集度は、ｖＷＦ濃度に依存し、例えば、血小板凝集計を使って比濁法により測定できる（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７０８−２７１６、１９７３；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅｅｔａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４：３０６−３０８、１９７５）。本明細書に提供されるように、本発明のｖＷＦ特異的リストセチンコファクター活性は、インビトロアッセイを使って測定されるｖＷＦをｍＵ／μｇに換算して記載される。
【０１１２】
本明細書で使用される「１ユニットのＡＤＡＭＴＳ活性」は、使用されるアッセイに関係なく、１ｍＬのプールされた正常なヒト血漿中の活性の量として定義される。例えば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質がＡＤＡＭＴＳ１３の場合、１ユニットのＡＤＡＭＴＳ１３  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性は、１ｍＬのプールされた正常なヒト血漿により切断されるのと同量のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基質（Ｋｏｋａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５  Ａｐｒ；１２９（１）：９３−１００）を切断するのに必要な活性の量である。便宜上、ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、機能アッセイ、例えば、修飾フォン・ヴィレブランド因子ペプチドをＡＤＡＭＴＳ１３の基質として用いる機能アッセイ（Ｔｒｉｐｏｄｉｅｔａｌ．ＪＴｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８  Ｓｅｐ；６（９）：１５３４−４１）により測定できる。組換え型ヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の好ましい測定方法は、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎｅｔａｌ．（分解されたｖＷＦのコラーゲン結合親和性減少に基づく、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）切断プロテアーゼのアッセイ：血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の診断ツール（Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｖＷＦ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ（ＴＴＰ））  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９９；８２：１３８６−１３８９）で開示されている。一実施形態では、上記で定義のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質と見なされるべきポリペプチドまたはタンパク質は、ネイティブＡＤＡＭＴＳ１３の少なくとも１％のｖＷＦ切断活性を有する必要がある。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ネイティブＡＤＡＭＴＳ１３の活性の少なくとも１０％の活性を含む。さらに他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ネイティブＡＤＡＭＴＳ１３の活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の活性を含む。また、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の量は、例えば、Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（２００６、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００６  ９５（２）：２１２−２０）で開示のＥＬＩＳＡ法を使ってＡＤＡＭＴＳ１３抗原の測定により決定できる。当技術分野で充分確立された約束事は、１ｍＬのプールされた正常なヒト血漿が、１μｇのＡＤＡＭＴＳ１３を含むということである。従って、当技術分野の約束事は、１μｇの血漿由来ＡＤＡＭＴＳ１３は、１ユニットのＡＤＡＭＴＳ１３活性を有するということである。
【０１１３】
用語「細胞培養溶液」、「細胞培地または培地」、および「細胞培養上清」は、通常当技術分野でよく知られた細胞培養プロセスの態様を指す。本発明においては、細胞培養溶液は、細胞培地および細胞培養上清を含んでもよい。細胞培地は、任意選択の補充剤と一緒に、細胞培養溶液に外部から添加され、栄養素およびｒＶＷＦまたはｒＡ１３発現細胞培養用の他の成分を供給する。細胞培養上清は、栄養素および細胞培地ならびに培養中に細胞から放出され、代謝され、および／または排泄された産物由来の他の成分を含み、細胞それ自体を含まない細胞培養溶液を指す。したがって、ある文脈では、細胞培養上清は、細胞培養溶液の液相（すなわち、細胞を除く細胞培養溶液）を指してもよい。例えば、培養液上清のアンモニウム濃度は、通常、細胞培養溶液中に存在するアンモニウム濃度を指す。他の文脈では、細胞培養上清は、細胞が除かれている細胞培養溶液（すなわち、回収細胞培養上清）を指す。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「ビタミンＢ３」、「ニコチン酸アミド」、「ナイアシンアミド」、「ナイアシン」、および「ニコチン酸」は、同義に使用でき、ビタミンのＢ３ファミリーのメンバーを指す。従って、このファミリーのいずれのメンバーも、本発明の方法で使用される培地を補充するために使用できる。
【０１１５】
本明細書で使用される用語「合成培地」または「合成培地（複数）」は、合成増殖培地を指し、全成分の素性および濃度は既知である。合成培地は、細菌、酵母、動物、または植物抽出物を含まないが、個別の植物または動物由来成分（例えば、タンパク質、ポリペプチド、等）を含んでも、含まなくてもよい。市販の合成培地の非限定例には、種々のダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥ）培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ；ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ）、ハム栄養混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ；ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ）、こら等の組み合わせ、等が含まれる。合成培地の調製方法は、当技術分野で、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許公開第２００８／０００９０４０号および同２００７／０２１２７７０号により既知である。これら特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「オリゴペプチド不含培地」または「オリゴペプチド不含培地（複数）」は、オリゴペプチド、例えば、タンパク質加水分解物由来のオリゴペプチドを含まないタンパク質不含培地を指す。一実施形態では、培地は、２０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の一実施形態では、培地は、１５以上のアミノ酸を含むオリゴペプチドを含まない。本発明の別の実施形態では、培地は、１０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。一実施形態では、培地は、７以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。別の実施形態では、培地は、５以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらに別の実施形態では、培地は、３以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらなる本発明の実施形態によれば、培地は、２以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。オリゴペプチド不含培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同６，９３６，４４１号、国際公開２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許公開第２００８／０００９０４０号および同２００７／０２１２７７０号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「無血清培地」または「無血清培地（複数）」は、動物血清で補充していない培地を指す。無血清培地は、合成培地であることが多いが、無血清培地は、個別の動物または植物タンパク質またはタンパク質画分で補充してもよい。無血清培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許公開第２００８／０００９０４０号および同２００７／０２１２７７０号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
本明細書で使用される用語「動物タンパク質不含培地」または「動物タンパク質不含培地（複数）」は、動物血清、タンパク質、またはタンパク質画分を補充しない培地を指す。動物タンパク質不含培地は、合成培地であることが多いが、動物タンパク質不含培地は、植物または酵母加水分解物を含んでもよい。動物タンパク質不含培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許公開第２００８／０００９０４０号および同２００７／０２１２７７０号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「基本細胞培地」または「基本細胞培地（複数）」は、加水分解物、例えば、植物または酵母加水分解物を補充していない、合成培地、オリゴペプチド不含培地、無血清培地、または動物タンパク質不含培地を指す。基本培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭｃＣｏｙ、またはＲＰＭＩが当技術分野でよく知られている。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに炭水化物ソース等のいくつかの成分を含んでもよい。各成分は、細胞の培養を補助する量で存在できるが、このような量は、通常、当業者には既知である。培地は、補助的物質、例えば、緩衝物質、例えば、炭酸水素ナトリウム、抗酸化剤、機械的な応力に対抗するための安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。必要に応じ、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体および／または混合物を添加してもよい。
【０１２０】
ＩＩＩ．細胞培地および細胞培養上清
本発明の一態様は、基本細胞培地を使って産生したｒＶＷＦおよびｒＡ１３に比べて、活性が増加したｒＶＷＦおよび／またはｒＡ１３を産生する細胞培地に関する。一態様では、本発明は、基本細胞培地に１つまたは複数の追加の物質を補充したｒＶＷＦおよび／またはｒＡ１３産生用細胞培地に関する。以下でさらに詳細に考察するように、具体的な実施形態では、本発明の細胞培養条件は、少なくとも１．０μｇ／Ｌの銅を有する基本細胞培地を含む。さらなる実施形態では、使用する細胞培地および本発明のプロセス由来の上清は、また、低レベル（１０ｍＭ未満）のアンモニウムを含む。特定の実施形態では、ｒＶＷＦおよび／またはｒＡ１３の発現に使われる細胞培養条件は、細胞培養上清が低レベルのアンモニウム、すなわち、１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ未満のアンモニウムを維持するように制御される。
【０１２１】
本発明の培地は、当技術分野でよく知られた適切な基本培地、例えば、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭｃＣｏｙ、またはＲＰＭＩをベースにしてもよい。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに炭水化物ソース等のいくつかの成分を含んでもよい。各成分は、細胞培養を補助する量で存在してもよく、このような量は、通常、当業者には既知である。培地は、補助物質、例えば、緩衝物質、例えば、炭酸水素ナトリウム、抗酸化剤、機械的な応力に対抗する安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。必要に応じ、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体および／または混合物を添加してもよい。
【０１２２】
一般的に、基本培地は、１μｇ／Ｌ未満の銅を含み、例えば、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２は、約０．３μｇ／Ｌの濃度の銅を含む。このような濃度の銅は、本発明の高比活性を示すｒＶＷＦおよびｒＡ１３タンパク質の産生を支援するのに充分な銅イオンを供給しない。
【０１２３】
銅は、種々の方式により、例えば、培地補充剤の添加により本発明細胞培地に供給できる。一部の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物を含んでもよく、これを供給して培地中の銅濃度を増加させることができる。加水分解物は、当技術分野でよく知られたいずれかの加水分解物、例えば、植物加水分解物、大豆加水分解物、およびコムギグルテン加水分解物を含んでもよい。特定の実施形態では、加水分解物の添加により、約０．２〜約１０μｇ／ＬのＣｕ２＋の銅濃度の増加に寄与できる。一部の実施形態では、加水分解物より供給される銅の量は、加水分解物中の銅の量ならびに添加される加水分解物の量に依存する。加水分解物の銅含量は、元素分析、例えば、原子吸光分光法（ＧＦＡＡ：黒鉛炉原子吸光）、または質量分析法（例えば、ＩＣＰ−ＭＳ）により測定できる。
【０１２４】
特定の実施形態では、銅は、培地のみに、または適切な銅塩または銅キレートを含む培地補充剤を用意して、加水分解物に添加することにより供給できる。適切な銅塩には、限定されないが、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅が含まれる。適切な銅キレート剤には、限定されないが、アルブミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ポリアミンキレート化剤、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミンヒドロクロリド、テトラエチレンペンタミンヒドロクロリド、ペンタエチレンヘキサミンヒドロクロリド、テトラエチルペンタアミン、カプトプリル、ペニシルアミン、Ｎ、Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１、３−プロパンジアミン、Ｎ、Ｎ、ビス（２アニモエチル）１、３−プロパンジアミン、１、７−ジオキサ−４、１０−ジアザシクロドデカン、１、４、８、１１−テトラアザシクロテトラデカン−５、７−ジオン、１、４、７−トリアザシクロノナントリヒドロクロリド、１−オキサ−４、７、１０−トリアザシクロドデカン、１、４、８、１２−テトラアザシクロペンタデカン、および１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカンを含んでもよい。
【０１２５】
特定の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して約１．０〜約２０μｇ／Ｌの合計銅濃度になる。具体的な実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して約１．０〜約１０μｇ／Ｌの最終濃度になる。さらなる実施形態では、基本細胞培地に補充して約１．０〜５．０、１．２〜４．０、１．３〜３．０、１．４〜２．９、１．５〜２．８、１．６〜２．７、１．７〜２．６、１．８〜２．５、１．９〜２．４、２．０〜２．３、２．１〜２．２μｇ／Ｌの最終銅濃度になる。さらなる実施形態では、本発明の方法で使われる基本細胞培地に補充して約１．２〜９．５、１．４〜９、１．６〜８．５、１．８〜８、２．０〜７．５、２．２〜７、２．４〜６．５、２．６〜６．０、２．８〜５．５、３．０〜５．０、３．２〜４．５、３．４〜４、および２〜４μｇ／Ｌの銅濃度になる。さらに他の実施形態では、本発明の方法で使われる基本細胞培地に補充して約１−６、２〜５、３〜４μｇ／Ｌの銅濃度になる。一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも１μｇ／Ｌの合計銅濃度になる。別の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも２μｇ／Ｌの合計銅濃度になる。さらに別の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも４μｇ／Ｌの合計銅濃度になる。特定の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも１μｇ／Ｌ、もしくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０μｇ／Ｌ、またはさらに高い合計銅濃度になる。特定の実施形態では、本明細書でさらに詳細に考察されるように、ｒＡ１３産生用培養液は、約２〜４μｇ／Ｌの銅を含んでもよく、一方、ｒＶＷＦ産生用培養液は、少なくとも２μｇ／Ｌの銅を含んでもよい。
【０１２６】
上記で示した濃度は、銅二価型（Ｃｕ２＋）の純粋な銅のそれぞれの濃度である。銅誘導体、例えば、銅含有水和塩、または化合物、例えば、銅キレート剤が使用される場合は、誘導体またはキレート剤の量は、銅の最終濃度が本明細書記載の範囲に入るように添加される。例えば、２μｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏは、約０．５１μｇ／Ｌの銅濃度（硫酸塩および５Ｈ２Ｏを除いた）と等価である。
【０１２７】
好都合なことに、細胞培養溶液中で（すなわち、培養液上清中で）低アンモニウム（ＮＨ４＋）濃度を生ずる細胞培養プロセスにおける細胞培地の使用は、高比活性を有する組換え型ＶＷＦおよび／またはｒＡ１３の発現をもたらすことが明らかとなった。従って、特定の実施形態では、上清のＮＨ４＋濃度は、１０ｍＭ以下である。好ましい実施形態では、上清のＮＨ４＋濃度は、５ｍＭ以下である。好ましい実施形態では、上清のＮＨ４＋濃度は、４ｍＭ以下である。また別の実施形態では、上清のＮＨ４＋濃度は、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに少ない濃度である。
【０１２８】
従って、特定の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、上清中に１０ｍＭ以下のＮＨ４＋濃度を生ずるプロセスで使用される、銅を補充した（例えば、少なくとも２μｇ／Ｌの最終濃度に）基本細胞培地の使用に基づいている。また別の実施形態では、表１の組み合わせのバリエーション１〜４４０の内のいずれかに対応した最終の銅とアンモニウム濃度を得るように基本細胞培地が補充される。
【表１−１】
0005953502.tif 000002
【表１−２】
0005953502.tif 000003
【０１２９】
一部の実施形態では、本発明の銅補充培地は、動物タンパク質不含および／または合成の基本培地を補充することにより産生される。動物タンパク質不含および合成培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許公開第２００８／０００９０４０号および同２００７／０２１２７７０号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、本明細書記載の方法で使用される基本培地は、動物タンパク質不含またはオリゴペプチド不含培地である。特定の実施形態では、培地は、合成できる。特定の実施形態では、培地は、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの濃度で少なくとも１つのポリアミンを含んでもよい。
【０１３０】
さらなる実施形態では、上記で提供のいずれかの記載に加えて、基本培地に銅および少なくとも１つのカルシウム、亜鉛、および／またはビタミンＢ３を補充した本発明の培地が提供される。特定の実施形態では、培地は、動物タンパク質不含、オリゴペプチド不含、または合成培地であってもよい。特定の実施形態では、動物タンパク質不含またはオリゴペプチド不含培地は、米国特許第６，１７１，８２５号および同６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許公開第２００８／０００９０４０号および同２００７／０２１２７７０号で教示のように調製される。これらの特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの内の両方が、あらゆる目的、およびに対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、追加の銅および任意選択の１つまたは複数のカルシウム、亜鉛、およびビタミンＢ３で補充される。具体的な実施形態では、合成培地は、ダルベッコ変法イーグル培地／ハムＦ１２の１：１混合物（ＤＭＥＭ／ハムＦ１２）に類似であってもよく、これは追加の銅および任意選択のカルシウム、亜鉛、および／またはビタミンＢ３で補充されており、培地中で培養された細胞で発現したｒＶＷＦまたはｒＡ１３の比活性を増加させる。また別の実施形態では、培地は、動物成分不含である。別の実施形態では、培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清等の血清由来の動物タンパク質を含む。別の実施形態では、培養液は、外部から添加された組換え型タンパク質を有する。別の実施形態では、タンパク質は、認定された病原体不含動物由来である。
【０１３１】
特定の実施形態では、培地は、正確にまたは約０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの濃度の少なくとも１つのポリアミンを含む。別の実施形態では、培地は、正確にまたは約０．５ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの少なくとも１つのポリアミンを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの少なくとも１つのポリアミンを含む。特定の実施形態では、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン等の群由来である。好ましい実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態では、培地は、正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌのプトレシンを含む。
【０１３２】
一実施形態では、培地は、正確にまたは約０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの濃度の少なくとも１つのポリアミンならびに表１で設定されたバリエーション１〜４４０の内のいずれか１つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。別の実施形態では、培地は、正確にまたは約０．５ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの少なくとも１つのポリアミンならびに表１で設定されたバリエーション１〜４４０の内のいずれか１つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの濃度の少なくとも１つのポリアミンならびに表１で設定されたバリエーション１〜４４０の内のいずれか１つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン等の群由来である。好ましい実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態では、培地は、正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌのプトレシンならびに表１で設定されたバリエーション１〜４４０の内のいずれか１つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。
【０１３３】
さらなる態様では、銅に加えて、本発明で使用の細胞培地は、１つまたは複数の追加のカルシウム、亜鉛、１つまたは複数のビタミン、およびこれらのいずれかの組み合わせをさらに含んでもよい。
【０１３４】
一般的に、任意のカルシウム塩が、本発明の培地を補充するために使用可能で、受容可能な塩の非制限的例には、ＣａＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣａＦＰＯ３・２Ｈ２Ｏ、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２Ｃａ、（ＣＨＯ２）２Ｃａ、（Ｃ６Ｈ７Ｏ６）２Ｃａ、（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）２Ｃａ３・２Ｈ２Ｏ、等が含まれる。特定の実施形態では、薬学的に許容可能なカルシウム塩が、本発明の培地の補充に使用可能である。
【０１３５】
一般的に、任意の亜鉛塩が、本発明の培地を補充するために使用可能で、受容可能な塩の非制限的例には、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ３・２Ｈ２Ｏ、（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）２Ｚｎ３・２Ｈ２Ｏ、ＺｎＢｒ２、ＺｎＢｒ２・２Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２、Ｚｎ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ、Ｚｎ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ、（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２Ｚｎ・２Ｈ２Ｏ、等が含まれる。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な亜鉛塩が、本発明の培地の補充に使用される。他の実施形態では、亜鉛含有ペプチドまたはタンパク質配合物、例えば、インスリンが、本明細書で提供される培養液を補充するのに使用可能である。
【０１３６】
またさらなる態様では、銅および上記で考察の１つまたは複数の追加の材料を補充した基本細胞培地は、さらに、上清中の低アンモニウムレベルの培養液中で使用可能である。特定の実施形態では、本発明で使用する補充細胞培地は、細胞培養溶液中の１０ｍＭ未満のアンモニウムレベルを生ずる。さらなる実施形態では、本発明の補充細胞培地は、約０．５〜９．５、１．０〜９．０、１．５〜８．５、２．０〜８．０、２．５〜７．５、３．０〜７．０、３．５〜６．５、４．０〜６．０、４．５〜５．５ｍＭの細胞培養アンモニウムレベルで使用される。
【０１３７】
一実施形態では、細胞培地および細胞培養上清の銅とアンモニウム濃度は、製造プロセスの間の長期間維持される。具体的な実施形態では、細胞培養の銅とアンモニウム濃度は、製造プロセスの間、すなわち、ｒＶＷＦまたはｒＡ１３が発現し、大規模細胞培養から回収される時間の間、維持される。特定の実施形態では、銅とアンモニウム濃度は、培養溶液中で、表１に設定のバリエーション１〜４４０の内のいずれか１つで、維持される。好ましい実施形態では、銅とアンモニウム濃度は、このような産生プロセスの全体時間にわたり維持される。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明により提供される培地は、液体またはドライまたは粉末形態で提供できる。培地は、単一使用に適した量で事前分注してもよく、または２つ以上の細胞培養に使用可能な多量で提供されてもよい。一般的に、本発明の培地は、無菌の方法で提供されることになる。
【０１３９】
ｒＶＷＦまたはｒＡ１３を産生するために使用する細胞培地の具体的詳細については、下記で考察される。下記では、ｒＶＷＦまたはｒＡ１３のいずれかに関して考察されるが、下記のｒＶＷＦに関する考察のいずれもｒＡ１３に対し適用可能であり、逆もまた同じであることは理解されよう。
【０１４０】
Ａ．組換え型ＶＷＦ細胞培地
本発明の一態様は、組換え型ｖＷＦ、さらに具体的には、高比活性を有する高分子量ｖＷＦ、を産生するための細胞培養溶液に関し、これは本明細書でさらに記載される。一実施形態では、本発明高分子量、組換え型ｖＷＦを産生するための細胞培養溶液を提供し、この溶液は、少なくとも約２．４μｇ／Ｌの濃度の銅を含む細胞培地、および約１４〜約２２の二量体および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を含む高次多量体ｖＷＦを発現する複数の細胞を含む。
【０１４１】
一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む．好ましい実施形態では、細胞培養液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した銅およびアンモニウム濃度を有する。特定の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、上記で与えられた濃度で長期間保持される。例えば、一実施形態では、アンモニウム濃度は、少なくとも３日間、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日、またはさらに多くの日数の間、低濃度で維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間維持される。具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも１４日間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも１４日間維持される。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液を使ってｒＶＷＦを産生している合計時間の間）、低レベルで維持される。
【０１４２】
本発明の一実施形態では、細胞培地は、少なくとも約２．４μｇ／Ｌ、別の実施形態では、少なくとも約３μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、少なくとも約４μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、少なくとも約８μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、少なくとも約１０μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、少なくとも約１５μｇ／Ｌ、およびさらなる実施形態では、少なくとも約２０μｇ／Ｌの濃度の銅を含んでもよい。
【０１４３】
他の実施形態では、本発明の細胞培地中の銅濃度は、約２．４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌ、別の実施形態では、約２．４μｇ／Ｌ〜約１５μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約２．４μｇ／Ｌ〜約１０μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約２．４μｇ／Ｌ〜約８μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約２．４μｇ／Ｌ〜約６μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約２．４μｇ／Ｌ〜約４μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約４μｇ／Ｌ〜約１５μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約４μｇ／Ｌ〜約１０μｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では、約４μｇ／Ｌ〜約８μｇ／Ｌの範囲、また、さらなる実施形態では、約４μｇ／Ｌ〜約６μｇ／Ｌの範囲であってもよい。
【０１４４】
本発明は、また、高比活性を有するｒＶＷＦの発現に適した培地を含む、ｒＶＷＦの発現または産生用のキットを提供する。
【０１４５】
Ｂ．ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）細胞培地
一態様では、本発明は、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に有用な培地を提供する。好都合にも、培地に銅を補充することにより、補充した培地中で培養した細胞で発現した組換え型ＡＤＡＭＴＳ（例えば、ｒＡＤＡＭＴＳ１３）酵素の活性が大きく高められ、一方、この酵素は、非補充培地中で培養した細胞より発現レベルが高くない場合は、その細胞と同レベルで発現することが明らかになった。
【０１４６】
一態様では、本発明は、高比活性を有する組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現のための銅を補充した細胞培地を提供する。一実施形態では、培地に補充して約２〜約４μｇ／Ｌの合計銅濃度になる。さらなる実施形態では、培地に補充して、約１〜３、２〜３、３〜４μｇ／Ｌの合計銅濃度になる。一実施形態では、培地は、少なくとも１μｇ／Ｌの銅濃度を含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌの銅を含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも４μｇ／Ｌの銅を含む。他の実施形態では、培地は、２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの銅を含む。別の実施形態では、培地は、１μｇ／Ｌ〜６μｇ／Ｌの銅を含む。別の実施形態では、培地は、２μｇ／Ｌ〜５μｇ／Ｌの銅を含む。別の実施形態では、培地は、３μｇ／Ｌ〜４μｇ／Ｌの銅を含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも１μｇ／Ｌ、または少なくとも２μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、４μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、７μｇ／Ｌ、８μｇ／Ｌ、９μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１１μｇ／Ｌ、１２μｇ／Ｌ、１３μｇ／Ｌ、１４μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ、１６μｇ／Ｌ、１７μｇ／Ｌ、１８μｇ／Ｌ、１９μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ、またはそれより高い濃度の銅を含む。
【０１４７】
一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下の、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、表１で設定のバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した銅とアンモニウム濃度を有する。特定の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、上述の濃度で長期間維持される。例えば、一実施形態では、アンモニウム濃度は、少なくとも３日間、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはそれを越える日数の間、低濃度で維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間、維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間、維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも１４日間、維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも１４日間、維持される。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液を使ってｒＡ１３を産生する全体時間の間）低レベルで維持される。
【０１４８】
一実施形態では、少なくとも１μｇ／Ｌ銅および少なくとも２μＭ亜鉛を含む培地が、組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ｒＡＤＡＭＴＳ１３）の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌの銅または少なくとも４μｇ／Ｌの銅を含む。培地が銅で補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約５μＭの亜鉛も含む。一実施形態では、培地は、また、正確にまたは約２μＭ〜１２μＭのｌ亜鉛を含む。別の実施形態では、培地は、また、正確にまたは約５μＭ〜１２μＭの亜鉛を含む。また別の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは２μＭ、または少なくとも正確にまたは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、またはさらに多い亜鉛を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表２で設定されるバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１４９】
一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、１０ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、６ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、６ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間保持される。
別の好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、５ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間保持される。別の好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、４ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間保持される。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、（すなわち、培養液を使ってｒＡ１３が産生される全時間の間）低レベルで維持される。
【０１５０】
一実施形態では、少なくとも１μｇ／Ｌの銅および少なくとも正確にまたは約０．５ｍＭカルシウムを含む培地が、組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ｒＡＤＡＭＴＳ１３）の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌの銅または少なくとも４μｇ／Ｌの銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも１．５ｍＭカルシウムを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭカルシウムを含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約０．５ｍＭ、または少なくとも正確にまたは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、またはさらに多いカルシウムを含んでもよい。一実施形態では、培地は、表３に設定されるバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウムを含む。
【表３−１】
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【表３−２】
0005953502.tif 000008
【表３−３】
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【０１５１】
一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、１０ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培地は、６ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、６ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。別の好ましい実施形態では、細胞培地は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、５ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。別の好ましい実施形態では、細胞培地は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、４ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。また別の実施形態では、細胞培地は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度およびならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、（すなわち、培養液を使ってｒＡ１３が産生される全時間の間）低レベルで維持される。
【０１５２】
一実施形態では、細胞培地に銅、亜鉛およびカルシウムが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも１．５ｍＭのカルシウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。また別の実施形態では、培地は、少なくとも０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、またはさらに高いカルシウム濃度、ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。
【０１５３】
一実施形態では、少なくとも１μｇ／Ｌの銅および少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含む培地が、組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ｒＡＤＡＭＴＳ１３）の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌの銅または少なくとも４μｇ／Ｌの銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも７ｍｇ／Ｌのニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、またはそれより高い濃度のニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表４に設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【０１５４】
一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、培地は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度ならびに表４に設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、１０ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、６ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表４に設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、６ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。別の好ましい実施形態では、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表４に設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、５ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。別の好ましい実施形態では、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度ならびに表４に設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、４ｍＭ以下の濃度で少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度ならびに表４に設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、（すなわち、培養液を使ってｒＡ１３が産生される全時間の間）低レベルで維持される。
【０１５５】
一実施形態では、細胞培地に銅、亜鉛およびニコチン酸アミドが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも７ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度ならびに表２に設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。
【０１５６】
一実施形態では、細胞培地に銅、カルシウムおよびニコチン酸アミドが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも７ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度ならびに表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。
【０１５７】
ＩＶ．高比活性を有する血液因子の産生方法
Ａ．細胞培養法
本発明は、組換え型タンパク質（例えば、ｒＶＷＦおよびｒＡ１３）の大規模産生方法を提供する。特定の実施形態では、このような大規模産生方法では、これらの治療用組換え型タンパク質の製造に、攪拌式（ｓｔｉｒｒｅｄ／ａｇｉｔａｔｅｄ）タンク型反応器を利用する。
【０１５８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、バッチまたは連続方式で操作される細胞培養システムの使用を含めてもよい。例えば、バッチ式細胞培養が利用される場合は単一バッチ、流加バッチ、または繰返しバッチ方式により操作できる。同様に、連続細胞培養は、例えば、灌流、タービドスタットまたはケモスタット方式により操作できる。バッチおよび連続細胞培養は、浮遊または接着状態で行うことができる。浮遊状態で操作する場合は、細胞は、自由に浮遊し、培地内で混合される。あるいは、接着状態では、細胞は、固相、例えば、マイクロキャリア、多孔性マイクロキャリア、ディスクキャリア、セラミックカートリッジ、中空繊維、フラットシート、ゲルマトリックス、等に固定される。
【０１５９】
バッチ培養は、通常、単一バッチとして、細胞接種材料が、タンクまたは培養槽中で最大密度に培養され、採取され、さらに処理される大規模細胞培養である。流加バッチ培養は、通常、新鮮な栄養素（例えば、増殖制限基質）または添加物（例えば、産物の前駆物質）が供給されるバッチ培養である。供給液は、通常、バイオリアアクターの希釈を避けるために高濃縮される。繰返しバッチ培養では、細胞は、培地中に置かれ、所望の細胞密度まで増殖される。次に、衰退期および細胞死発生を避けるために、細胞が最大濃度に達する前に、培養液が完全増殖培地で希釈される。希釈の量および頻度は、広く変化し、細胞株の増殖特性および培養プロセスの都合に依存する。このプロセスは、必要に応じ何回でも繰り返すことができ、継代培養時に細胞と培地が廃棄されない限り、培養液の容量は希釈毎に段階的に増えることになる。容量の増加は、充分な大きさの反応器にして容器内での希釈を可能にするか、または希釈した培養液をいくつかの容器に分けることにより対処できる。このタイプの培養の原理は、指数関数的増殖状態中で細胞を維持することである。連続継代培養は、培養液の容量が段階的に増加し、複数回の細胞採取ができ、細胞が増殖を続け、さらにそのプロセスを望む限り続けることができるという点が特徴である。特定の実施形態では、組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ｒＡＤＡＭＴＳ１３）は、バッチ培養の上清採取後、回収できる。他の実施形態では、組換え型ＶＷＦは、バッチ培養の上清採取後、回収できる。
【０１６０】
連続培養は、新しい培地の流入により栄養素が連続的に供給される浮遊培養であってもよく、この場合、培養液容量は、通常、同時に生ずる消費された培地の除去により、一定に保持される。ケモスタットおよびタービドスタット法では、抽出した培地は、細胞を含む。従って、細胞培養容器に残っている細胞は、定常状態を維持するために増殖する必要がある。ケモスタット法では、成長速度は、通常、希釈速度、すなわち、新しい培地が添加される速度を調節することにより制御される。培養液中の細胞の成長速度は、希釈速度を変えることにより、例えば、準最大成長速度に制御できる。対称的に、タービドスタット法では、希釈速度は、ｐＨや温度等の所与の操作条件で細胞が到達できる最大成長速度を可能とするように設定される。特定の実施形態では、ｒＶＷＦまたはｒＡ１３は、連続培養の上清採取の後で回収される。連続細胞培養の代表的方法は、国際公開第２０１１／０１２７２５号（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。
【０１６１】
灌流培養では、抽出した培地は細胞が枯渇しており、細胞は、例えば、濾過または遠心法により培養液中への細胞を再導入して培養容器中で維持される。しかし、通常、濾過に使用される膜では、１００％の細胞を保持できないので、培地が抽出される際に、一部は除去される。大部分の細胞は培養容器中に保持されるので、非常に大きい成長速度で灌流培養を行う目的に対しては、これは重要なことではないであろう。特定の実施形態では、ｒＶＷＦまたはｒＡ１３は、灌流培養の上清を採取後、回収される。
【０１６２】
攪拌式タンク型反応器システムは、浮遊または接着方式で操作されるバッチおよび連続細胞培養に対し使用できる。一般的に、攪拌式タンク型反応器システムは、いずれかの型の攪拌器、例えば、  Ｒｕｓｈｔｏｎ翼，    水中翼，  傾斜翼，  または船舶翼と組み合わせて、どの従来の攪拌式タンク型反応器としても操作できる。
【０１６３】
特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法にマイクロキャリアの使用を含めてもよい。一部の実施形態では、その実施形態の細胞培養を、大きなバイオリアクター中で、高細胞密度およびタンパク質発現を得るための高容量特異的培養表面積の提供に適した条件下で行うことができる。このような増殖条件を得る１つの手段は、攪拌式タンク型バイオリアクター中で細胞培養用マイクロキャリアを使うことである。マイクロキャリア上での細胞増殖の概念は、最初にｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ（ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ、Ａ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２１６：６４−５（１９６７））により記載され、増殖培地中に懸濁された小さい固体粒子の表面上の細胞接着を考慮している。これらの方法は、高表面−対−容量比率を与え、その結果として、効率的な栄養素利用を可能とする。さらに、真核細胞株中の分泌タンパク質の発現に関しては、増加した表面−対−容量比率が、より高レベルの分泌、およびその結果の培養液上清中のより高いタンパク質収率を可能とする。最終的に、これらの方法は、真核生物発現培養の規模拡大を容易にする。
【０１６４】
ｖＷＦおよび／またはｒＡ１３を発現している細胞は、細胞培養増殖中に球状または多孔性マイクロキャリアに結合できる。マイクロキャリアは、Ｂｕｔｌｅｒ（１９８８．Ｓｐｉｅｒ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２８３−３０３）により記載されているような、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチンおよびセルロース、等をベースとしたマイクロキャリア分から選択されるマイクロキャリアであってよい。また、細胞を球状マイクロキャリア上で生物量に増殖させて、最終培養槽生物量達した後に多孔性マイクロキャリア上の発現タンパク質を産生する前に、またはその逆の場合に、細胞を継代することが可能である。適切な球状マイクロキャリアには、スムーズ表面マイクロキャリア、例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）２、およびＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ならびにマクロ多孔性マイクロキャリア、例えば、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）１、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）１、およびＣｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含めてもよい。
【０１６５】
上述のように、本発明は、銅濃度を増加させた細胞培地を含む。上記「細胞培地」セクションで記載された全ての実施形態および濃度が、本明細書記載の発明の方法に適用できることを理解されたい。
【０１６６】
特定の実施形態では、培養は、少なくとも約７日、または少なくとも約１４日、２１日、２８日、または少なくとも約５週、６週、７週、８週、９週、または少なくとも約２ヶ月、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月の間またはさらに長い期間の間、維持してもよい。細胞培養が組換え型ｖＷＦまたは組換え型ｒＡ１３タンパク質の産生のために維持される細胞密度は、タンパク質発現に使われる培養条件および培地に依存する。当業者なら、ｒＶＷＦまたはｒＡ１３産生細胞培養用の最適細胞密度を容易に決定できるであろう。一実施形態では、培養は、約０．５ｘ１０６〜４ｘ１０７細胞／ｍＬの細胞密度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約１．０ｘ１０６〜約１．０ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約１．０ｘ１０６〜約４．０ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約１．０ｘ１０６〜約４．０ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で長期間維持される。また他の実施形態では、細胞密度は、約２．０ｘ１０６〜約４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、または約１．０ｘ１０６〜約２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、または約１．５ｘ１０６〜約３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、またはいずれかの他の類似の範囲の濃度で長期間維持できる。
【０１６７】
一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７日間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも１４日間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２１日間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２８日間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも５週間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも６週間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７週間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも８週間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも９週間、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。
【０１６８】
一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７日間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも１４日間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２１日間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２８日間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも５週間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも６週間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７週間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも８週間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも９週間、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７日間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも１４日間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２１日間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２８日間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも５週間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも６週間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７週間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも８週間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも９週間、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。
【０１７０】
一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７日間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも１４日間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２１日間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２８日間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも５週間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも６週間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７週間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも８週間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも９週間、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。
【０１７１】
別の実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７日間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも１４日間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２１日間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２８日間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも５週間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも６週間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７週間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも８週間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも９週間、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。
【０１７２】
別の実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７日間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも１４日間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２１日間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも２８日間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも５週間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも６週間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも７週間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも８週間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも９週間、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度に維持される。
【０１７３】
以下に、ｒＶＷＦおよびｒＡ１３産生方法に関する具体的詳細内容を提供する。これから分かるように、ｒＶＷＦまたｒＡ１３に対し条件が具体的に提示されているが、ｒＶＷＦに対する条件は、ｒＡ１３の産生に使用可能であり、逆もまた同様である。
【０１７４】
Ｂ．高分子量組換え型ｖＷＦの産生方法
別の態様では、本発明は、さらに、銅濃度を増加させた細胞培地を含む細胞培養条件下でのｖＷＦ産生方法に関する。特定の実施形態では、培養液は、また、低アンモニウム濃度をも含む。本明細書で使用される用語の「細胞培養」および「細胞培養溶液」は同義に使用される。
【０１７５】
一実施形態では、本発明は、高分子量、組換え型ｖＷＦの産生方法を提供し、この方法は：ａ）細胞培養液を用意すること；ｂ）ｖＷＦをコードする核酸配列を導入すること；ｃ）核酸配列を含む細胞を選択すること；および、ｄ）少なくとも約２．４μｇ／Ｌの銅濃度を含む細胞培地および約１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培養条件下、細胞中でｖＷＦを発現させることを含み、ここでｖＷＦは、約１４〜約２２二量体および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む高次多量体ｖＷＦである。さらなる実施形態では、本発明の方法を使って産生された多量体ｒＶＷＦは、約１０〜３０、１２〜２８、１４〜２６、１６〜２４、１８〜２２、２０〜２１の二量体を含む。またさらなる実施形態では、本発明により産生されたｒＶＷＦは、少なくとも約２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３２．５、３５、３７．５、４０、４２．５、４５、４７．５、５０、５２．５、５５、５７．５、６０、６２．５、６５、６７．５、７０、７２．５、７５、７７．５、８０ｍＵ／μｇ、またはさらに高い比活性を有する．具体的な実施形態では、ｒＶＷＦ産生用連続細胞培養の細胞密度は、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度で長期間維持される。他の具体的な実施形態では、細胞密度は、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、１．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、０．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下、またはさらに少ない密度で維持される。一実施形態では、細胞密度は、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ〜２．５ｘ１０６細胞／ｍＬで維持される。
【０１７６】
一実施形態では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも２．０μｇ／Ｌの最終銅濃度とするステップ；（ｃ）ｒＶＷＦタンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）銅補充細胞培地に入れた１つまたは複数の細胞を培養し、ｒＶＷＦを発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収上清が少なくとも３０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ未満のアンモニウム濃度で、少なくとも７間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１７７】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも２．４μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１７８】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも３μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１７９】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも４μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８０】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも４．３μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８１】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８２】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して３μｇ／Ｌ〜１０μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８３】
上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して４μｇ／Ｌ〜７．５μｇ／Ｌの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で、少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間（すなわち、培養液が使われｒＶＷＦを産生している全時間の間）低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８４】
一実施形態では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅を補充するステップ；（ｃ）ｒＶＷＦタンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）銅補充細胞培地中で１つまたは複数の細胞を培養し、ｒＶＷＦを発現させ、細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで上清のＮＨ４＋濃度が低レベルで少なくとも７日間維持され、さらに、回収上清が少なくとも３０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。具体的な実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８５】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも１４日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８６】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも２１日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８７】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも２８日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８８】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも５週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１８９】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも６週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９０】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも７週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９１】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも８週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９２】
一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびＮＨ４＋濃度は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応した濃度で少なくとも９週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９３】
一実施形態では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）組成物の産生方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅を補充し少なくとも２．０μｇ／Ｌの最終銅濃度を得るステップ；（ｃ）ｒＶＷＦタンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＶＷＦを発現させ、細胞から培養液上清中へ排出させるステップ；（ｅ）培養液上清のアンモニウム濃度をモニタリングするステップ；および（ｆ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで１０ｍＭより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清がｒＶＷＦ組成物産生に使用されず、さらに、回収上清が少なくとも３０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも２．４μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、４μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、７μｇ／Ｌ、８μｇ／Ｌ、９μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、２〜２０μｇ／Ｌ、２〜１０μｇ／Ｌ、３〜８μｇ／Ｌ、または４〜６μｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９４】
上述の方法の一実施形態では、６ｍＭより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、ｒＶＷＦ組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも２．４μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、４μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、７μｇ／Ｌ、８μｇ／Ｌ、９μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、２〜２０μｇ／Ｌ、２〜１０μｇ／Ｌ、３〜８μｇ／Ｌ、または４〜６μｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９５】
上述の方法の一実施形態では、５ｍＭより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、ｒＶＷＦ組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも２．４μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、４μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、７μｇ／Ｌ、８μｇ／Ｌ、９μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、２〜２０μｇ／Ｌ、２〜１０μｇ／Ｌ、３〜８μｇ／Ｌ、または４〜６μｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９６】
上述の方法の一実施形態では、４ｍＭより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、ｒＶＷＦ組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも２．４μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、４μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、７μｇ／Ｌ、８μｇ／Ｌ、９μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、２〜２０μｇ／Ｌ、２〜１０μｇ／Ｌ、３〜８μｇ／Ｌ、または４〜６μｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも５０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも７０ｍＵ／μｇ  ｒＶＷＦのｒＶＷＦ特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０１９７】
組換え型ｖＷＦは、適切な真核生物宿主系での発現により産生出来る。真核細胞の例には、限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２；昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞；ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞、が含まれる。一実施形態では、ｖＷＦは、酵母細胞、昆虫細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株、等中で発現可能である。一特定実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞株である。通常、哺乳動物細胞、例えば、連続継代性細胞株由来のＣＨＯ細胞は、本発明のｖＷＦの発現に使用可能である。
【０１９８】
特定の実施形態では、ｖＷＦをコードする配列を含む核酸配列は、ベクターであってもよい。ベクターは、ウイルスにより送達されてもよく、プラスミドであってもよい。タンパク質をコードする核酸配列は、特定の遺伝子でも、またはそれの生物学的に機能的な部分であってもよい。一実施形態では、タンパク質は、少なくともｖＷＦの生物学的に活性な部分である。
【０１９９】
各種ベクターをｖＷＦの発現に使用でき、真核生物発現ベクターから選択できる。真核生物発現用ベクターの例には、：（ｉ）ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴ等のベクターが、ＡＯＸ１、ギャップ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１、等のプロモーターを使って酵母中での発現用として；（ｉｉ）、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ、等のベクターが、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ、等のプロモーターを使って、昆虫細胞中での発現用として、ならびに（ｉｉｉ）ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ、等のベクター、および、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、等のウイルス系由来のベクターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチン等のプロモーターを使って、哺乳動物細胞中での発現用として、含まれる。ｒＶＷＦ発現用代表的ベクターは、Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８９  Ｍａｒ；９（３）：１２３３−４２）により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。
【０２００】
本発明の一部の実施形態では、核酸配列は、タンパク質の発現制御のために適した他の配列、例えば、当業者には通常既知である、プロモーター配列、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限酵素部位、ポリＡ配列、タンパク質プロセッシング配列、選択マーカー、等をさらに含む。
【０２０１】
銅濃度の増加した細胞培地に加えて、本発明細胞培養条件は、培養系の上流プロセス全体にわたって約２５ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含んでもよい。一実施形態では、細胞培養条件には、約２５ｍＭ未満、別の実施形態では約２０ｍＭ未満、さらに別の実施形態では約１５ｍＭ未満、さらに別の実施形態では約１０ｍＭ未満、およびさらなる実施形態では約５ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、本発明のアンモニウム濃度は、細胞培養系の全上流プロセスにわたり一定に保持される。本発明により使用される細胞は、例えば、この分野で通常知られている従来のバッチ培養および流加培養に比べて、改良されている方法により培養できる。しかし、このような従来の技術は、培養の最後に高濃度のアンモニウムを生じる可能性がある。本発明の方法は、例えば、灌流またはケモスタット培養等の技術により培地の連続的供給が可能な産生系を採用することによりこの問題を克服する。宿主細胞の培養後、ｖＷＦは、限外濾過または遠心分離等の標準的な方法を使って、消費培地から回収できる。所望により、ｖＷＦは、例えば、イオン交換および／またはサイズ排除クロマトグラフィー、等により精製できる。
【０２０３】
連続培養（例えば、灌流またはケモスタット培養）は、新しい培地の流入により栄養素を連続的に供給する浮遊培養であってもよく、この場合、培養容量は常に一定である。同様に、連続発酵は、バイオリアクターから細胞懸濁液の除去により正確に平衡が保たれている新しい培地の連続追加により、細胞または微生物が指数増殖期に培養液中で維持されるプロセスを意味しうる。さらに、攪拌式タンク型反応器システムは、浮遊、灌流、ケモスタット、および／またはマイクロキャリア培養に対し使用可能である。通常、攪拌式タンク型反応器システムは、いずれかの型の攪拌器、例えば、Ｒｕｓｈｔｏｎ翼、水中翼、傾斜翼、または船舶翼と組み合わせて、どの従来の攪拌式タンク型反応器としても操作できる。
【０２０４】
Ｃ．組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の産生方法
別の態様では、本発明は、さらに銅濃度を増やした細胞培地を含む細胞培養条件下で、ｒＡ１３を産生する方法に関する。特定の実施形態では、培養液は、また、低アンモニウム濃度を含む。
【０２０５】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも１．０μｇ／Ｌの最終銅濃度を得るステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清中へ排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで少なくとも１５００ユニットのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日（すなわち、１５００ユニットのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／日／Ｌ細胞培養；Ｐ  ＦＲＥＴＳ）が回収培養液上清中に存在する。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも２μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、４μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、１〜６μｇ／Ｌ、２〜５μｇ／Ｌ、２〜４μｇ／Ｌ、または３〜４μｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。特定の実施形態では、この方法は、量的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３生産性（Ｐ  ＦＲＥＴＳ）の持続性のある改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。具体的な実施形態では、ｒＡ１３の産生用連続細胞培養の細胞密度は、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度で長期間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞密度は、３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、１．０ｘ１０６細胞／ｍＬ以下、またはさらに低い密度で維持される。一実施形態では、細胞密度は、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ〜４．０ｘ１０６細胞／ｍＬで維持される。
【０２０６】
上述の方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも４ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬ上清（ＦＲＥＴＳ）を有する。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも６ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬ上清を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも８ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬ上清を有する。最も好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも１０ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬ上清を有する。特定の実施形態では、この方法は、ＦＲＥＴＳ産生の持続的改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、少なくとも４ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを有する上清が、毎日、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間回収される。好ましい実施形態では、少なくとも６ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを有する上清が、毎日、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間回収される。さらに好ましい実施形態では、少なくとも８ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを有する上清が、毎日、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間回収される。最も好ましい実施形態では、少なくとも１０ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／ｍＬを有する上清が、毎日、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間回収される。
【０２０７】
上述の方法の一実施形態では、細胞培養は、少なくとも８００ｍＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中の１０６細胞／日（すなわち、ｑ  ＦＲＥＴＳ）を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも１ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中の１０６細胞／日を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも１．２ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中の１０６細胞／日を生ずる。最も好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも１．４ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中の１０６細胞／日を生ずる。特定の実施形態では、この方法は、細胞特異的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３生産性（ｑ  ＦＲＥＴＳ）の持続的改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも８００ｍＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中１０６細胞を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも１ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中１０６細胞を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも１．２ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中１０６細胞を生ずる。最も好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも１．４ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／培養液中１０６細胞を生ずる。
【０２０８】
上述の方法の一実施形態では、細胞培養は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも１ｍｇのｒＡ１３／Ｌ培養液／日（Ｐ  ＥＬＩＳＡ）を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも１．５ｍｇのｒＡ１３／Ｌ培養液／日（Ｐ  ＥＬＩＳＡ）を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも２ｍｇのｒＡ１３／Ｌ培養液／日（Ｐ  ＥＬＩＳＡ）を生ずる。特定の実施形態では、この方法は、ｒＡ１３産生の持続した改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも１ｍｇのｒＡ１３／Ｌ培養液を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも１．５ｍｇのｒＡ１３／Ｌ培養液を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも２ｍｇのｒＡ１３／Ｌ培養液を生ずる。
【０２０９】
上述の方法の一実施形態では、細胞培養は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも０．５μｇのｒＡ１３／培養液中１０６細胞／日（すなわちｑ  ＥＬＩＳＡ）を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも０．７μｇのｒＡ１３／培養液中１０６細胞／日を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも０．９μｇのｒＡ１３／培養液中１０６細胞／日を生ずる。特定の実施形態では、この方法は、ｑ  ＥＬＩＳＡ産生の持続した改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも０．５μｇのｒＡ１３／培養液中１０６細胞を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも０．７μｇのｒＡ１３／培養液中１０６細胞を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも０．９μｇのｒＡ１３／培養液中１０６細胞を生ずる。
【０２１０】
上述の方法の一実施形態では、回収上清は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも３μｇのｒＡ１３／ｍＬ上清を有する。好ましい実施形態では、回収上清は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも４μｇのｒＡ１３／ｍＬ上清を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも５μｇのｒＡ１３／ｍＬ上清を有する。最も好ましい実施形態では、回収上清は、ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも６μｇのｒＡ１３／ｍＬ上清を有する。特定の実施形態では、この方法は、ｒＡ１３産生の持続した改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、少なくとも３μｇのｒＡ１３／ｍＬを有する上清が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。好ましい実施形態では、少なくとも４μｇのｒＡ１３／ｍＬを有する上清が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。さらに好ましい実施形態では、少なくとも５μｇのｒＡ１３／ｍＬを有する上清が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。最も好ましい実施形態では、少なくとも６μｇのｒＡ１３／ｍＬを有する上清が、少なくとも７日間、または少なくとも１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。
【０２１１】
上述の方法の一実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、１０ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、５ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、４ｍＭ以下のアンモニウム濃度で少なくとも７日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、１０ｍＭ以下、または９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間（すなわち、培養液が使用されｒＡ１３を産生している全時間の間）、低レベルで維持される。特定の実施形態では、培養溶液は、表１で設定されたバリエーション１〜４４０のいずれか１つに対応する銅およびアンモニウム濃度を有する。
【０２１２】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅および亜鉛を補充するステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が、回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも１μｇ／Ｌ銅および少なくとも２μＭ亜鉛を含む。他の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌ銅または少なくとも４μｇ／Ｌ銅を含む。培地が銅で補充される一実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約５μＭ亜鉛を含む。一実施形態では、培地は、また、正確にまたは約２μＭ〜１２μＭ亜鉛を含む。別の実施形態では、培地は、また、正確にまたは約５μＭ〜１２μＭ亜鉛を含む。また他の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約２μＭ、または少なくとも正確にまたは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、またはさらに多い亜鉛を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応する銅および亜鉛濃度を含む。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が、回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が、回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が、回収培養液上清中に存在する。
【０２１３】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅およびカルシウムを補充するステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも１μｇ／Ｌ銅および少なくとも０．５ｍＭカルシウムを含む。他の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌ銅または少なくとも４μｇ／Ｌ銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも１．５ｍＭカルシウムを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭカルシウムを含む。また他の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約０．５ｍＭ、または少なくとも正確にまたは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、またはさらに多いカルシウムを含んでもよい。一実施形態では、培地は、表３に設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。
【０２１４】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物産生方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地の銅、亜鉛、およびカルシウムを補充するステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清中へ排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウム濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも１．５ｍＭのカルシウム濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、またはさらに多いカルシウム濃度、および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。
【０２１５】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物の産生方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅およびニコチン酸アミドを補充するステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも１μｇ／Ｌ銅および少なくとも２ｍｇ／Ｌニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含む。他の実施形態では、培地は、少なくとも２μｇ／Ｌ銅または少なくとも４μｇ／Ｌ銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも７ｍｇ／Ｌニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含む。また他の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、またはさらに高い濃度のニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表４で設定されたバリエーション１３２１〜１７６０のいずれか１つに対応した銅とニコチン酸アミド濃度を含む。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。
【０２１６】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物の産生方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅、亜鉛、およびニコチン酸アミドを補充するステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、細胞培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも７ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度および表２で設定されたバリエーション４４１〜８８０のいずれか１つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。
【０２１７】
一実施形態では、本発明は、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）組成物を産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）基本細胞培地を用意するステップ；（ｂ）基本細胞培地に銅、カルシウム、およびニコチン酸アミドを補充するステップ；（ｃ）ｒＡ１３タンパク質をコードする核酸を含む１つまたは複数の細胞を用意するステップ；（ｄ）１つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、ｒＡ１３を発現させ、これを細胞から培養液上清に排出させるステップ；および（ｅ）少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも１５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、細胞培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度および表３で設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも７ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度および表３で設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのニコチン酸アミド濃度および表３で設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度、および表３で設定されたバリエーション８８１〜１３２０のいずれか１つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。好ましい実施形態では、少なくとも２０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２５００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも３０００ユニットＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／Ｌ補充基本細胞培地／日が回収培養液上清中に存在する。
【０２１８】
組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、いずれかの適切な原核生物または真核生物宿主系での発現により産生出来る。真核細胞の例には、限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２；昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞；ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞が含まれる。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、細菌性細胞、酵母細胞、昆虫細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株、等中で発現させてもよい。一特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞株である。好ましい実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。具体的な実施形態では、安定にｒＡ１３を発現できるＣＨＯクローンは、ｒＡ１３およびジヒドロ葉酸還元酵素（例えば、マウスｄｈｆｒ遺伝子）用のコード配列を有するＣＨＯ細胞で同時形質移入し、漸増量のメトトレキサートの存在中での増殖に対し選択することにより調製される。
【０２１９】
一実施形態では、細胞は、培養、好ましくは、製造プロセス（すなわち、少なくとも１０Ｌ、好ましくは、少なくとも１００Ｌ）中で培養してＡＤＡＭＴＳ１３等の所望のＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生可能ないずれの哺乳動物細胞でもよい。例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（浮遊培養での増殖用にサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ、例えば、ＤＵＫＸ−Ｂ１１サブクローン（ＣＨＯ、Ｕｒｉａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ、２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ    ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）が含まれる。好ましくは、細胞株は、げっ歯類細胞株、特に、ハムスター細胞株、例えば、ＣＨＯまたはＢＨＫである。
【０２２０】
各種のベクターをＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現用に使用可能であり、真核生物および原核生物発現ベクターから選択できる。特定の実施形態では、プラスミドベクターが、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現のための使用に意図されている。一般的に、プラスミドベクターは、宿主細胞に適合する種由来で、これらの宿主と連携して使われるレプリコンおよび制御配列を含む。ベクターは、複製部位、ならびに形質転換細胞中で表現型の選択を提供できるマーカー配列を持つことができる。プラスミドは、１つまたは複数の制御配列、例えば、プロモーターと機能的に連結されたＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２２１】
組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを調製するための好ましい方法は、以下の通りである。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＵＫＸ−Ｂ１１にＤＨＦＲ発現ベクターで形質移入し、関連組換え型タンパク質を発現させる。代表的な方法は、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ．２００２  Ｎｏｖ１５；１００（１０）：３６２６−３２．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｊｕｌ  １２）により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。選択をヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）不含培地中での増殖および組換え型ＡＤＡＭＴＳタンパク質発現関連領域コードの増幅により行い、また、ＤＨＦＲ遺伝子は、漸増濃度のメトトレキサート中での細胞増殖により得られる。基本的には、米国特許第６、１００、０６１号（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｌｍｍｕｎｏ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）で記載されているように、適切な場合には、ＣＨＯ細胞株は、血清および／またはタンパク質不含培地中での増殖に適している。
【０２２２】
別の好ましい実施形態では、安定なＨＥＫ２９３細胞は、ヒグロマイシン選択可能マーカーを含む構築物で形質移入し、抗生物質耐性により形質転換体を選択することにより調製される。
【０２２３】
特定のウイルスの、細胞に感染する能力、または受容体媒介エンドサイトーシスによる細胞へ侵入する能力、および宿主細胞ゲノム中へ組み込み、ウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力は、ウイルスを外部核酸の細胞（例えば、哺乳動物細胞）中への移入のための魅力的な候補にしている。従って、特定の実施形態では、ウイルスベクターを使ってＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現のために宿主細胞中に導入する。ウイルスベクターは、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする１つまたは複数の制御配列、例えば、プロモーターに機能的に連結されたヌクレオチド配列を含む。あるいは、ウイルスベクターは、制御配列を含まず、代わりに、宿主細胞内の制御配列に依存してＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現を進行させてもよい。核酸を送達するために使用できるウイルスベクターの非制限的例には、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれる。
【０２２４】
一実施形態では、アデノウイルス発現ベクターは、構築物のパッケージングを支援し、最終的にその中に挿入されているＡＤＡＭＴＳ構築物を発現するために充分なアデノウイルス配列を含む構築物を含む。アデノウイルスベクターは、７ｋｂまでの外部配列の挿入を可能とする（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００（２）：５３５−５４６、１９９２））。
【０２２５】
別の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞中に導入するのに使用できる。ＡＡＶ系は、以前記載されており、一般的には当技術分野でよく知られている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１７（６）：１１１０−７、１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９（１３）：６０９４−６０９８、１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎ、１３（２−３）：１４１−６４、１９９４；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８：９７−１２９、１９９２）。ｒＡＡＶベクターの生成と使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同４，７９７，３６８号に記載されている（それぞれ、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２６】
一実施形態では、レトロウイルス発現ベクターは、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞中に導入するのに使用できる。これらの系は、以前に記載されており、一般的には、当技術分野でよく知られている（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３３：１５３−１５９、１９８３；Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ、ベクター：分子クローニングベクターの概要と使用法（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ）、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ、ｅｄｓ．、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ中の、ｐｐ．４９４−５１３、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、遺伝子移入（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、中のｐｐ．１４９−１８８、１９８６）。具体的な実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２（５２５９）：２６３−２６７、１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５（９）：８７１−８７５、１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７１（９）：６６４１−６６４９、１９９７；米国特許第第６，０１３，５１６号および同５，９９４，１３６号、を参照）。
【０２２７】
原核生物発現のためのベクターの非制限的例には、プラスミド、例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤ、等が含まれ、原核生物発現ベクターで使われるプロモーターには、ラック、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、等が含まれる。真核生物発現のためのベクターの例には、（ｉ）プロモーター、例えば、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１、等を使った酵母中での発現用ベクター、例えば、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴ；（ｉｉ）プロモーター、例えば、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ、等を使った昆虫細胞中での発現用ベクター、例えば、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ、等、および（ｉｉｉ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチンを使った哺乳動物細胞中での発現用ベクター、例えば、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ、等、およびウイルス系、例えば、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、等由来のベクターが含まれる。ｒＡ１３発現用の代表的ベクターは、Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ．２００２  Ｎｏｖ  １５；１００（１０）：３６２６−３２．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｊｕｌ  １２）により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法は、マイクロキャリアの使用を含んでもよい。本発明は、他の態様の中でも特に、大規模ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現方法を提供する。一部の実施形態では、高細胞密度およびタンパク質発現を実現するために、大容量に特異的な培養表面積を得るのに適した条件下で、大きなバイオリアクター中で細胞培養を行うことができる。このような増殖条件を得る１つの手段は、攪拌式タンク型バイオリアクター中での細胞培養用のマイクロキャリアを使うことである。別の実施形態では、これらの増殖要件は、浮遊細胞培養の使用により満たされる。
【０２２９】
Ｖ．具体的な実施形態
Ａ．組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）
組換え型ｖＷＦは、哺乳動物細胞中で発現させることができるが、ｖＷＦの比活性は、細胞培養条件により大きく変動する可能性があり、血漿から単離されたｖＷＦの比活性に匹敵するか、または等しい値が今まで得られたことがない。本発明は、一部は、少なくとも２．４μｇ／Ｌの銅を有する細胞培地が、高比活性を有する高分子量ｖＷＦの発現を促進する好都合な効果を与えるという予期せぬ結果に基づいている。特に、本発明の高分子量、組換え型ｖＷＦは、約１４〜約２２の二量体をおよび少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む高次多量体型を含むことができる。本発明による細胞培養プロセスは、また、細胞培養系の上流プロセスの間に、低ＮＨ４＋レベル（例えば、１０ｍＭ未満）の維持を可能とし、それにより、翻訳後修飾に対する有害作用を減らすことができる。本発明は、高比活性を有する高次多量体ｖＷＦを発現するための、上清中の適切な銅濃度を適切なアンモニウムレベルと組み合わせて有する培地を含む初めての細胞培養条件を提供すると考えられる。
【０２３０】
一態様では、本発明は、高比活性の組換え型、高分子量ｖＷＦを産生する細胞培養条件に関する。本発明の細胞培養条件は、例えば、増加した銅濃度および／または低アンモニウム（ＮＨ４＋）濃度の細胞培養上清を有する細胞培地を含んでもよい。本発明は、また、高比活性の高分子量ｖＷＦを発現するための細胞培養条件下で細胞を培養する方法を提供する。
【０２３１】
一態様では、本発明は、高分子量、組換え型ｖＷＦタンパク質を産生するための細胞培養溶液を提供し、細胞培養溶液は、少なくとも約２．４μｇ／Ｌの銅濃度を含む細胞培地；１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清；および高次多量体ｖＷＦタンパク質を発現する複数の細胞を含み、ｖＷＦタンパク質は、少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む。
【０２３２】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、細胞培養溶液は、銅を含む培地補充剤を含む。
【０２３３】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、培地補充剤は、加水分解物、任意選択で、大豆加水分解物を含む。
【０２３４】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、培地補充剤は、銅塩、銅キレート、およびこれらの組み合わせを含む。
【０２３５】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。
【０２３６】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、銅濃度は、少なくとも約４μｇ／Ｌである。
【０２３７】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、銅濃度は、約２．４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌである。
【０２３８】
上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、ｖＷＦタンパク質は、約１４〜約２２の二量体を含む。
【０２３９】
一態様では、本発明は、高分子量、組換え型ｖＷＦタンパク質を産生する方法を提供し、この方法は、ａ）組換え型ｖＷＦタンパク質コードする核酸を含む細胞培養液を用意するステップ；ｂ）少なくとも約２．４μｇ／Ｌの銅濃度および約１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を有する細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下でｖＷＦタンパク質を細胞中で発現させるステップを含み、ｖＷＦタンパク質は、高次多量体ｖＷＦタンパク質であり、少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む。
【０２４０】
上述の方法の一具体的な実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
【０２４１】
上述の方法の一具体的な実施形態では、細胞は、連続継代細胞株由来である。
【０２４２】
上述の方法の一具体的な実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０２４３】
上述の方法の一具体的な実施形態では、銅濃度は、少なくとも約４μｇ／Ｌである。
【０２４４】
上述の方法の一具体的な実施形態では、銅濃度は、約２．４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌである。
【０２４５】
上述の方法の一具体的な実施形態では、組換え型ｖＷＦタンパク質は、少なくとも約５０ｍＵ／μｇ少なくとも約５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０２４６】
上述の方法の一具体的な実施形態では、組換え型ｖＷＦタンパク質は、約３０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０２４７】
上述の方法の一具体的な実施形態では、組換え型ｖＷＦタンパク質は、約１４〜約２２二量体を含む。
【０２４８】
一態様では、本発明は、あるプロセスにより産生された高分子量、組換え型ｖＷＦタンパク質を提供し、そのプロセスは、ａ）組換え型ｖＷＦタンパク質をコードする核酸を含む細胞培養液を用意するステップ；およびｂ）少なくとも２．４μｇ／Ｌの銅濃度および１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でｖＷＦタンパク質を発現させるステップを含み、ｖＷＦタンパク質は、高次多量体ｖＷＦタンパク質であり、少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む。
【０２４９】
上述のｒＶＷＦ組成物の一具体的な実施形態では、組換え型ｖＷＦタンパク質は、少なくとも約５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０２５０】
上述のｒＶＷＦ組成物の一具体的な実施形態では、組換え型ｖＷＦタンパク質は、約３０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０２５１】
上述のｒＶＷＦ組成物の一具体的な実施形態では、組換え型ｖＷＦタンパク質は、約１４〜約２２二量体を含む。
【０２５２】
一態様では、本発明は、高分子量、組換え型ｖＷＦタンパク質を産生するための細胞培養溶液を提供し、この細胞培養溶液は、少なくとも約２．４μｇ／Ｌの銅濃度を含む細胞培地；１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清；および高次多量体ｖＷＦタンパク質を発現する複数の細胞を含み、ｖＷＦタンパク質は、約１４〜約２２二量体および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む。
【０２５３】
一態様では、本発明は、高比活性の高次多量体型である組換え型高分子量ｖＷＦを産生する細胞培養条件に関する。本発明の細胞培養条件は、例えば、増加した銅濃度および低アンモニウム（ＮＨ４＋）濃度を有する細胞培養上清を有する細胞培地を含んでもよい。本発明は、また、高比活性の高分子量ｖＷＦを発現するための細胞培養条件中で細胞を培養する方法を提供する。
【０２５４】
一態様では、本発明は、高分子量、組換え型ｖＷＦ産生用細胞培養溶液を含み、細胞培養溶液は、少なくとも約２．４μｇ／Ｌの銅濃度；１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清；および約１４〜約２２二量体および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む高次多量体ｖＷＦを発現する複数の細胞を含む細胞培地を含む。上述の細胞培養溶液の一実施形態では、少なくとも１０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも１５％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２５％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも３０％のｒＶＷＦが、１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。特定の実施形態では、銅濃度は、少なくとも約４μｇ／Ｌであってよく、または銅濃度は、約２．４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌの範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞培地は、銅を含む培地補充剤を含む。特定の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物または銅塩、銅キレート、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、または酸化銅を含んでもよい。特定の実施形態では、細胞は、連続継代細胞株由来であってもよく、また、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を含んでもよい。一部の実施形態では、組換え型ｖＷＦは、少なくとも約５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有し、または特異的リストセチンコファクター活性は、約３０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇの範囲であってもよい。
【０２５５】
別の態様では本発明は、高分子量、組換え型ｖＷＦを産生する方法を含み、この方法は、ａ）細胞培養液を用意するステップ；ｂ）ｖＷＦをコードする核酸配列を導入するステップ；ｃ）その核酸配列を有する細胞を選択するステップ；および、ｄ）少なくとも約２．４μｇ／Ｌの銅濃度および約１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度の細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でｖＷＦを発現させるステップを含み、ここで、ｖＷＦは約１４〜約２２二量体、および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む高次多量体ｖＷＦである。上述の細胞培養上清の一実施形態では、少なくとも１０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも１５％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２０％のｒＶＷＦが１０超の別の具体的な実施形態では、少なくとも２５％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも３０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。一部の実施形態では、細胞は、連続継代細胞株由来でもよく、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、銅濃度は、少なくとも約４μｇ／Ｌでもよく、または銅濃度は、約２．４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌの範囲であってよい。一部の実施形態では、細胞培地は、銅を含む培地補充剤を含む。特定の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物または銅塩、銅キレート、もしくはそれらの組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、または酸化銅を含んでもよい。一部の実施形態では、組換え型ｖＷＦは、少なくとも約５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有してもよく、または約３０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇの範囲の特異的リストセチンコファクター活性であってもよい。
【０２５６】
また別の態様では、本発明は、あるプロセスで産生された高分子量、組換え型ｖＷＦを含み、そのプロセスは、ａ）細胞培養液を用意するステップ；ｂ）ｖＷＦをコードする核酸配列を導入するステップ；ｃ）その核酸配列を有する細胞を選択するステップ；および、ｄ）少なくとも２．４μｇ／Ｌの銅濃度および１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でｖＷＦを発現させるステップを含み、ｖＷＦは、約１４〜約２２二量体および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む高次多量体ｖＷＦである。上述の細胞培養上清の一実施形態では、少なくとも１０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも１５％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２５％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも３０％のｒＶＷＦが１０超の二量体高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。一部の実施形態では、細胞は、連続継代性細胞株由来であってよく、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、銅濃度は、少なくとも約４μｇ／Ｌであってよく、または銅濃度は、約２．４μｇ／Ｌ〜約２０μｇ／Ｌの範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞培地は、銅を含む培地補充剤を含む。特定の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物または銅塩、銅キレート、もしくはこれらの組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、または酸化銅を含んでもよい。一部の実施形態では、組換え型ｖＷＦは、少なくとも約５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有し、または特異的リストセチンコファクター活性は、約３０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇの範囲であってもよい。
【０２５７】
一態様では、本発明は、少なくとも３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する組換え型フォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも４０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも６０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも７０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。またさらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも８０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を有する。
【０２５８】
上述の組成物の一実施形態では、組成物中の少なくとも１０％のｒＶＷＦが１０超の二量体の高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも１５％のｒＶＷＦが１０超の二量体の高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２０％のｒＶＷＦが１０超の二量体の高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも２５％のｒＶＷＦが１０超の二量体の高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも３０％のｒＶＷＦが１０超の二量体の高分子量ＶＷＦマルチマーとして存在する。
【０２５９】
上述の組成物の一実施形態では、組成物は、培養液上清を含む。一具体的な実施形態では、培養液上清は、哺乳動物細胞培養液上清である。さらなる具体的な実施形態では、哺乳動物細胞培養液上清は、ＣＨＯ細胞上清である。
【０２６０】
上述の組成物の一実施形態では、ｒＶＷＦは、少なくとも２．４μｇ／Ｌ銅を含む細胞培養液中で発現する。具体的な実施形態では、細胞培養は、少なくとも４μｇ／Ｌ銅を含む。さらなる具体的な実施形態では、培養液は、２．４μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ銅を含む。一実施形態では、銅は、銅塩、銅キレート、またはこれらの組み合わせとして提供される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。
【０２６１】
上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養である。
【０２６２】
上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、連続培養である。具体的な実施形態では、連続培養は、ケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、連続培養は、灌流方式で行われる。
【０２６３】
上述の組成物の一実施形態では、培養液中のＮＨ４＋のレベルは、４ｍＭ未満の濃度に維持される。
【０２６４】
上述の組成物の一実施形態では、培養液の細胞密度は、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【０２６５】
上述の組成物の一実施形態では、培養液の細胞密度は、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【０２６６】
上述の組成物の一実施形態では、培養液は、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【０２６７】
上述の組成物の一実施形態では、ｒＶＷＦは、組換え型第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）と同時発現する。具体的な実施形態では、大部分の同時発現したｒＦＶＩＩＩは、除去された。さらなる具体的な実施形態では、組成物中のｒＶＷＦのｒＦＶＩＩＩに対する比率は、少なくとも１０：１である。
【０２６８】
上述の組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与用に処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与用に処方される。
【０２６９】
上述の組成物の一実施形態では、組成物は凍結乾燥される。
【０２７０】
また別の態様では、本発明は、あるプロセスで産生された高分子量、組換え型ｖＷＦを含み、そのプロセスは、ａ）細胞培養液を用意するステップ；ｂ）ｖＷＦをコードする核酸配列を導入するステップ；ｃ）細胞を有するその核酸配列を選択するステップ；および、ｄ）少なくとも２．４μｇ／Ｌの銅濃度および１０ｍＭ未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でｖＷＦを発現させるステップを含み、ここで、ｖＷＦは、約１４〜約２２二量体および少なくとも約３０ｍＵ／μｇの特異的リストセチン活性を含む高次多量体ｖＷＦである。上記「細胞培地」および「組換え型ｖＷＦの導入方法」セクション中で記載されている全ての実施形態および濃度は、ここでも適用できることは理解されよう。
【０２７１】
本発明の組換え型ｖＷＦは、高比活性の高分子量組換え型ｖＷＦタンパク質を含んでもよい。一実施形態では、本発明のｖＷＦは、ｖＷＦの高次多量体型である。一部の実施形態では、ｖＷＦの高次多量体型は、少なくとも約１４二量体までを含み、他の実施形態では、少なくとも約２２二量体までを含む。また他の実施形態では、ｖＷＦの高次多量体型は、約１０〜約２０二量体、または約１５〜約２５二量体、または約２０〜約４０二量体の範囲であってもよい。特定の実施形態では、組換え型ｖＷＦは、血漿ｖＷＦに匹敵する。
【０２７２】
本明細書に記載のように、本発明は、細胞培地中の増加させた銅濃度により、高比活性の高分子量ｖＷＦを産生出来るという予期せぬ結果を提供する。例えば、約２．４μｇ／Ｌを越える銅濃度を含む細胞培地は、銅を含まない培地に比べて、組換え型多量体ｖＷＦの収率を増やすことができる。特定の実施形態では、多量体ｖＷＦ（すなわち、少なくとも２つの二量体を含むｒＶＷＦ）の割合は、約５０％超、または約７５％超、または約９０％超となりうる。ｖＷＦの多量体分布は、標準的な方法、例えば、非還元条件下のアガロース電気泳動法を使って分析可能である。
【０２７３】
本明細書で提供のように、本発明の方法により産生された組換え型ｖＷＦは、高比活性、例えば、高特異的リストセチンコファクター活性を持つことができる。一実施形態では、本発明の方法により産生された組換え型ｖＷＦは、少なくとも３０ｍＵ／μｇ、および別の実施形態では、少なくとも５０ｍＵ／μｇの特異的リストセチンコファクター活性を含んでもよい。他の実施形態では、特異的リストセチンコファクター活性は、約３０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇまたは約５０ｍＵ／μｇ〜約１００ｍＵ／μｇの範囲であってもよい。
【０２７４】
Ｂ．組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）
ＡＤＡＭＴＳタンパク質（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ−１〜ＡＤＡＭＴＳ−２０）は、共通モジュラードメイン組織を共有する分泌亜鉛メタロプロテイナーゼファミリーである（Ｆｌａｎｎｅｒｙ  Ｃ．Ｒ．、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００６  Ｊａｎ  １；１１：５４４−６９のレビュー参照）。全てのＡＤＡＭＴＳタンパク質は、シグナルペプチド、続けて、亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジンＩ型反復、システィンリッチドメイン、およびスペーサードメインから構成される共通コアドメイン構造を共有する（ＡｐｔｅＳ．Ｓ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９  Ｎｏｖ  １３；２８４（４６）：３１４９３−７）。さらに、ＡＤＡＭＴＳ−４以外の全てが、少なくともさらに１つのトロンボスポンジンＩ型反復ドメインを含み、さらに多くのＡＤＡＭＴＳタンパク質が１つまたは複数の追加の付随ドメインを含む。特に、全ＡＤＡＭＴＳタンパク質が、メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン内の位置に少なくとも１つのカルシウム結合部位および少なくとも１つの亜鉛結合部位を含むとみられることが報告されている（Ａｎｄｒｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００５、４（３）、ｐｐ８８１−８８８）。
【０２７５】
ＡＤＡＭＴＳタンパク質の生物学的役割が、種々の疾患および状態に関し報告がなされており、これには、血管新生抑制、間質性腎線維症、骨リモデリング、卵胞形成、アテローム性動脈硬化、泌尿生殖器形成、および腫瘍増殖／リモデリング（ＡＤＡＭＴＳ−１）；エーラス・ダンロス症候群７Ｃ型およびウシ・デルマトスパラキシス（ＡＤＡＭＴＳ−２）；関節炎、アテローム性動脈硬化、および腱障害（ＡＤＡＭＴＳ−４）；関節炎および神経膠芽細胞腫（ＡＤＡＭＴＳ−５）；関節炎（ＡＤＡＭＴＳ−７）；血管新生抑制、悪性脳腫瘍、関節炎、およびアテローム性動脈硬化（ＡＤＡＭＴＳ−８）；関節炎（ＡＤＡＭＴＳ−９、−１２）；血栓性血小板減少性紫斑病（ＡＤＡＭＴＳ−１３）；ならびに抗血栓症／脳卒中（ＡＤＡＭＴＳ−１８）がある（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｕ、Ｏｐｅｎ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００９：１１２１−１３１、の概説参照）。
【０２７６】
以前、組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）を哺乳動物細胞で発現させたことがあるが、比活性は、細胞培養条件に依存して大きく変動する。ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイで測定した活性比率として表し、抗原含量に対しては、ＥＬＩＳＡで測定して表して、多くの市販の培地は、高比活性ｒＡ１３の発現には十分ではないことが明らかになった。一態様では、本明細書で提供される方法は、全および比活性のレベルが増加したｒＡ１３の細胞培養発現を可能とするいくつかの好都合な知見に基づいている。
【０２７７】
従って、分泌メタロプロテイナーゼＡＤＡＭＴＳファミリーの間の共有構造−機能関係に起因して、本発明によって提供される方法は、細胞培養中での全てのＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現および細胞培地からの回収を可能とする。
【０２７８】
一態様では、本発明は、少なくとも１６００ｍＵ／μｇの特異的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ活性を有する組換え型ＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）を含む組成物を提供する。
【０２７９】
上述の組成物の一実施形態では、ｒＡ１３は、少なくとも８００ｍＵ／μｇの特異的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ活性を有する。
【０２８０】
上述の組成物の一実施形態では、組成物は、培養液上清を含む。具体的な実施形態では、培養液上清は、哺乳動物細胞培養液上清である。さらなる具体的な実施形態では、哺乳動物細胞培養液上清は、ＣＨＯ細胞上清である。
【０２８１】
上述の組成物の一実施形態では、ｒＡ１３は、少なくとも１μｇ／Ｌ銅含有細胞培養液中で発現する。具体的な実施形態では、細胞培養液は、少なくとも２μｇ／Ｌ銅を含む。さらなる具体的な実施形態では、培養液は、２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ銅を含む。
【０２８２】
上述の組成物の一実施形態では、銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして供給される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。
【０２８３】
上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養である。
【０２８４】
上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、連続培養である。具体的な実施形態では、連続培養をケモスタット方式で行う。別の具体的な実施形態では、連続培養を灌流方式で行う。
【０２８５】
上述の組成物の一実施形態では、培養液中のＮＨ４＋のレベルは、５ｍＭ未満の濃度で維持される。
【０２８６】
上述の組成物の一実施形態では、培養液中のＮＨ４＋のレベルは、４ｍＭ未満の濃度で維持される。
【０２８７】
上述の組成物の一実施形態では、培養液の細胞密度は、４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。具体的な実施形態では、培養液の細胞密度は、３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。具体的な実施形態では、培養液の細胞密度は、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。さらなる具体的な実施形態では、培養液の細胞密度は、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満に維持される。
【０２８８】
上述の組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与用に処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与用に処方される。
【０２８９】
上述の組成物の一実施形態では、組成物は、凍結乾燥される。
【０２９０】
ＶＩ．製剤
一態様では、本発明の組換え型治療用タンパク質ｒＶＷＦまたはｒＡ１３を含む製剤は、投与に先立ち凍結乾燥される。凍結乾燥は、当技術分野で通常の技術を使って行い、開発される組成物用に最適化されるべきである［Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２１：１９１−２００、（２００４）およびＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：２４３−９（１９９６）］。
【０２９１】
医薬製剤調製方法は、１つまたは複数の以下のステップを含んでもよい：凍結乾燥の前に、本明細書記載の安定化剤を前記混合物に加えるステップ、凍結乾燥の前に、それぞれ本明細書に記載の増量剤、浸透圧調節剤、および界面活性剤、から選択される少なくとも１つの薬剤を前記混合物に加えるステップ。凍結乾燥した製剤は、一態様では、少なくとも１つまたは複数の緩衝液、増量剤、および安定剤から構成される。この態様では、界面活性剤の有用性が評価され、凍結乾燥ステップまたは再構成の間に凝集が問題となる場合に適用される。適切な緩衝剤が含まれ、凍結乾燥中、製剤を安定ｐＨ領域内に維持する。
【０２９２】
凍結乾燥材料に対し行われる標準的再構成は、一定容量の注射用純水または無菌の水（ＷＦＩ）（通常、凍結乾燥中に除去した容量に等しい）を加え戻すことであるが、抗菌剤の希釈溶液が非経口の投与用医薬品の産生で使用されることがある［Ｃｈｅｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１８：１３１１−１３５４（１９９２）］。従って、本発明の凍結乾燥組換え型ＶＷＦ組成物に希釈剤を加えるステップを含む、再構成組換え型ＶＷＦ組成物の調製方法が提供される。
【０２９３】
凍結乾燥材料は、水溶液として再構成してもよい。種々の水性キャリア、例えば、注射用無菌水、多用量使用向け防腐剤含有水、または適切な量の界面活性剤含有水（例えば、水性懸濁液製造用に適した賦形剤を含む混合物中に活性化合物を含む水性懸濁液）がある。種々の態様では、このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、限定されないが、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴム；分散または湿潤剤は、天然ホスファチド、例えば、限定されないが、レシチン、またはアルキレン酸化物と脂肪酸の縮合物、例えば、限定されないが、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、限定されないが、ヘプタデカエチルエネオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来部分エステルの縮合物およびヘキシトール、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来部分エステルの縮合物およびヘキシトール無水物、例えば、限定されないが、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。種々の態様では、水性懸濁液は、また、１つまたは複数の防腐剤、例えば、限定されないが、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾアートを含む。
【０２９４】
組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む。語句の「薬学的に」または「薬理学的に」受容可能な、は下記で記載される当技術分野でよく知られた経路を使って投与される場合に、安定で、産物の凝集や切断等のタンパク質分解を抑制し、さらに、アレルギー性、または他の有害反応を生み出さない分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容可能なキャリア」は、上記で開示の薬剤を含むいずれかおよび全ての臨床的に有用な溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、等を含む。
【０２９５】
医薬製剤は、静脈内、経口、局所、経皮的、非経口、吸入噴霧、経膣、直腸、または頭蓋内注射により、投与される。本明細書で使われる用語の非経口は、皮下、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または注入を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳腺内、腹腔内、鞘内、眼球後、肺内注射による投与、および／または特定部位の外科移植も同様に意図されている。通常、組成物は、基本的に、発熱物質、ならびにレシピエントに有害となりうる他の不純物を含まない。
【０２９６】
組成物の単回または複数回の投与が治療医師により選択される量とパターンを用いて行われる。疾患の予防または治療のための適切な投与量は、治療される疾患の種類、重症度および疾患の経過、薬剤投与は予防目的か治療目的か、治療歴、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。
【０２９７】
一態様では、本発明の製剤は、初期ボーラスに続けて、連続注入により投与され、製剤の治療循環濃度が維持される。別の例として、発明の化合物は、１回のみの投与量として投与される。当業者なら、良質の医療のための原則、および個別患者の臨床状態により定まる、効果的な投与量および投与計画を容易に最適化できるであろう。投薬頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータおよび投与経路に依存する。最適医薬製剤は、投与経路および所望の投与量に応じて当業者により決定される。例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．１８０４２）ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２、を参照。本文献の開示は、ここでの参照によって組み込まれる。このような製剤は、投与薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響する。投与経路に応じ、適切な用量は、体重、体表面積または器官サイズに従って計算される。適切な投与量は、適切な用量反応データと併せて、血中濃度測定用の確立されたアッセイを使って確認できる。最終投与計画は、薬剤の作用を変える種々の因子、例えば、薬剤の比活性、損傷の重症度および患者の応答性、年齢、状態、体重、患者性別と食事、何らかの感染症の重症度、投与の時間および他の臨床的因子、を考慮して、主治医により決定される。例としてではあるが、典型的な本発明の組換え型ｖＷＦの用量は、約５０Ｕ／ｋｇ（＝５００μｇ／ｋｇ）である。研究が継続中なので、種々の疾患および状態に対し、適切な投与量レベルおよび治療持続期間に関するさらなる情報が得られるであろう。
【０２９８】
ＶＩＩ．治療方法
本発明は、さらに、本明細書記載の方法により作られたｒＶＷＦまたはｒＡ１３を必要としている患者の治療方法を意図している。このような治療方法は、本発明の組換え型ｒＡ１３または高分子量、組換え型ｖＷＦを含む医薬製剤の投与を含むことができる。
【０２９９】
別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるｒＶＷＦまたはｒＡ１３組成物の投与を含む治療または予防的治療方法を提供する。一般的に、治療への応用のために、「治療有効量」の製剤が、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能障害に関連した疾患または状態の対象、またはその他にそれを必要としている対象に、投与される。これらの使用に有効な製剤および量は、疾患または状態の重症度および患者の健康の全身状態に依存する。製剤の単回または複数回の投与は、患者により必要とされ、耐容される投与量および頻度に応じて実行できる。
【０３００】
一実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能障害に関連する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。さらなる実施形態では、組換え型ｖＷＦを含む医薬製剤は、ｖＷＦ、例えば、フォン・ヴィレブランド病または血友病に関連する疾患を治療するために投与できる。別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供のｒＡ１３組成物の投与を含む１つまたは複数の血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療を必要としている対象の１つまたは複数の血栓を分解する方法を提供する。また他の実施形態では、本発明は、治療を必要としている対象の梗塞の治療または予防方法を提供する。通常、本発明で提供される方法は、本明細書で提供されるｒＡＤＡＭＴＳ１３組成物を、治療を必要としている対象に投与することを含む。
【０３０１】
１つまたは複数の血栓の形成および／または存在に関連する傷害の非制限的例には、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳卒中、敗血症、および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）が含まれる。
【０３０２】
梗塞に関連する傷害の非制限的例には、限定されないが、心筋梗塞（心臓発作）、肺血栓症、脳血管イベント、例えば、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患（壊疽、等）、抗リン脂質抗体症候群、敗血症、巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）、ヘルニア、および腸捻転が含まれる。
【実施例】
【０３０３】
ＶＩＩＩ．実施例
本発明は、次に、下記の非制限的実施例を用いてさらに説明する
【０３０４】
実施例１
連続細胞培養実験を、ｖＷＦを発現する組換え型ＣＨＯ細胞株の培養液を使って行った。基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２で、約０．３μｇ／ＬのＣｕ２＋を含む。培地に大豆加水分解物および硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）を補充し、培地中の最終銅濃度を少なくとも２．４μｇ／Ｌを越える濃度とした。
【０３０５】
ｖＷＦを発現する組換え型ＣＨＯ細胞を、アンモニウムレベル（ＮＨ４＋）を約１０ｍＭ未満の濃度で保持して、連続細胞培養で培養した。従来のバッチまたは供給バッチ技術は、培養の最後に高ＮＨ４＋濃度を生成するために、培地の連続供給を行う産出システム（例えば、灌流またはケモスタット培養）が好ましいことが分かった。培養の最後に、高次多量体ｖＷＦを単離し、ｖＷＦの特異的リストセチンコファクター活性を測定した。
【０３０６】
実施例２
ＧＤ８／６バッチ細胞培養で組換え型第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）およびフォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を同時発現、培地の組成がＶＷＦ発現および活性に与える効果を測定した。簡単に説明すると、変法ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本粉末（表５）および４ｇ／Ｌの大豆加水分解物（表６参照）も含む追加の補充剤からなる基本ＢＡＶ−ＳＰ培地に、銅補充の追加の有る場合と無い場合の培地で、ＧＤ８／６細胞をバッチ培養した。低い銅濃度のｒＶＷＦ発現および活性に与える効果を試験するために、基本ＢＡＶ−ＳＰ培地を使用した。０．３μｇ／Ｌ銅を含む基本培地に、大豆加水分解物を補充し、これが、実験的に測定して、追加の０．７μｇ／Ｌ銅に相当し、１．０μｇ／Ｌの最終銅濃度を与える。比較として、使用したバッチ培養用のＢＡＶ−ＳＰ培地に、追加の３．３μｇ／ＬのＣｕ２＋をさらに補充し、４．３μｇ／Ｌの最終銅濃度とし、高銅濃度のＶＷＦ発現および活性に及ぼす効果を測定した。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表６】
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【０３０７】
ｒＶＷＦを発現するＧＤ８／６細胞を、低銅培地（表７）または高銅培地（表８）中で７日間増殖させた。２日後、培養液を継代培養して、５日間、バッチ培養を行った。培養液上清の試料で、毎日、ｒＶＷＦ含量（ｖＷＦＥＬＩＳＡ）、リストセチンコファクターアッセイにより全活性（リストセチン）および特異的活性（比活性）の試験を行った。細胞数、細胞生存率、およびアンモニウム濃度等の、種々の培養パラメータも、毎日モニターした（バッチ３日目および４日目を除く）。
【０３０８】
予想に反し、高銅濃度下で増殖させた細胞培養が、顕著に高い全および特異的ｒＶＷＦ活性を含む上澄みを生成した（表７および表８の結果を比較されたい）。例えば、バッチ４日目に、高銅濃度下増殖させた細胞培養液は、低銅培養液の場合の０．２ＩＵのｒＶＷＦ活性／ｍＬに比べて、１．５２ＩＵのｒＶＷＦ活性／ｍＬを含んでいた。これは、低銅細胞培養が、高銅細胞培養のほぼ２倍量のｒＶＷＦを産生したという事実にもかかわらずである。さらに、高銅培養液から採取した上清の比活性は、低銅培養液上清のそれの１３倍高かった（８３１ｍＵ／１０μｇ  ｒＶＷＦ対６２ｍＵ／１０μｇ  ｒＶＷＦ）。
【０３０９】
表７および表８から解るように、バッチ１日目の高銅培養液の全および特異的リストセチンコファクター活性は、低銅培養液のそれの２倍であった。さらに、高銅培養液で観察されたその後の活性増加とは対称的に、低銅細胞培養液では、バッチ１日目後、リストセチンコファクター活性量の増加は観察されなかった。この結果と一致して、ｒＶＷＦマルチマー状態のアガロースゲル電気泳動法分析は、バッチ１日目に、低分子量ｒＶＷＦ種の濃度に比べ、低濃度の高分子量ｒＶＷＦが低銅細胞培養の上清中に存在し、相対的濃度が時間と共にさらに減少したことを示した（図１Ａと１Ｂ）。対称的に、培地のＣｕ２＋による補充で、バッチ培養の４日目まで、リストセチンコファクター（ＲｉＣｏＦ）活性抗原の一貫した形成が生じた。バッチ培養の４日目まで、常に、安定な高分子量ｒＶＷＦ多量体量の減少が起こらなかった（図１Ａと１Ｂ）。図１Ｂのアガロース電気泳動ゲルの濃度測定結果は、低銅条件下の培養液は、バッチ培養１日目は、１０％（すなわち、１６．３％）を越えるｒＶＷＦが１０超の二量体を有する分子として存在するｒＶＷＦ集団を産生出来るのみであり（すなわち、図１Ａアガロースゲルのレーン３の「３日目」試料）、また、特に、この集団は、バッチ培養の５日目には、ただの４％に低下した（レーン６の「７日目」試料）。高銅条件下では、対称的に、１０超の二量体を有するｖＷＦ多量体の相対量は、バッチ培養４日目まで、一貫して凡そ３０％であることを示した（レーン７〜１０の「３日目」〜「６日目」；２８％〜３１．４％）。
【０３１０】
特に、高銅バッチ培養のバッチ５日目から始まるが、ＮＨ４＋レベルが１００ｍｇ／Ｌを越える（約５．０ｍＭを越える）場合、追加の抗原の発現（１８．３対３５．４μｇ／Ｌ；表８のバッチ４日目と５日目を比較）は、上清のＲｉＣｏＦ活性の同時増加を生じなかった。この結果と一致して、高分子量ｒＶＷＦ多量体のバッチ５日目（培養の７日目）のレベルは、低分子量ｒＶＷＦ多量体の濃度に比べて減少した。また、バッチ５日目（レーン１１の培養「７日目」試料）のみで、１０超の二量体を有するｖＷＦの相対的量が２１．４％に減少した。
【０３１１】
まとめると、上記で提供されるデータは、ｒＶＷＦを発現する細胞培養液への銅濃度の補充が、全および特異的ｒＶＷＦリストセチンコファクター活性、さらには、高分子量ｒＶＷＦ多量体の安定な産生を劇的に増加させることを示す。さらに、データは、細胞培養液中の高ＮＨ４＋濃度の存在とｒＶＷＦリストセチンコファクター活性および高分子量ｒＶＷＦマルチマー産生の低下の間の相関を示す。
【表７】
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【表８】
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【０３１２】
実施例３
ケモスタット条件下で操作したＧＤ８／６連続細胞培養で、組換え型第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）およびフォン・ヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を同時発現させて、培地組成のＶＷＦ発現および活性に与える効果を測定した。簡単に説明すると、ＧＤ８／６細胞を、実施例２で記載のように、銅補充のある場合と無い場合について、４ｇ／Ｌの大豆加水分解物を含むＢＡＶ−ＳＰ培地中で培養した。低銅の濃度のｒＶＷＦ発現および活性に与える効果を試験するために、基本ＢＡＶ−ＳＰ培地を使用した。基本培地は、０．３μｇ／Ｌ銅を含み、さらに大豆加水分解物で補充したが、これは、追加の０．７μｇ／Ｌ銅に相当し、１．０μｇ／Ｌの最終銅濃度となる。比較のため、バッチ培養に使用されたＢＡＶ−ＳＰ培地に追加の３．３μｇ／ＬのＣｕ２＋をさらに補充し、４．３μｇ／Ｌの最終銅濃度として、高銅濃度のＶＷＦ発現および活性に与える効果を測定した。高および低銅濃度下で増幅した培養液を高（２．８ｘ１０６細胞／ｍＬ）および低（約、１．４ｘ１０Ｅ０６細胞／ｍＬ）細胞密度を使って培養した。
【０３１３】
前述のように、培養液上清の試料に対し、ｒＶＷＦ含量（ｖＷＦ  ＥＬＩＳＡ）、全活性（リストセチン）および特異的（比活性）活性を、リストセチンコファクターアッセイにより試験した。また、細胞数、細胞生存率、およびアンモニウム濃度、等の種々の培養パラメータをモニターした。データは、ケモスタット培養の２週目および３週目の定常段階から作成した（表９〜表１３）。
【表９】
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【表１０】
0005953502.tif 000019
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０３１４】
図２Ａに示すように、低細胞密度および高銅濃度で増殖させた連続ｒＶＷＦ細胞培養液から採取した上清は、高比活性（平均６００ｍＵ／１０μｇ）を含み、一方、高細胞密度下、高または低銅濃度の存在中で増殖させたｒＶＷＦ細胞培養液および低銅濃度の存在中で低細胞密度下、増殖させたｒＶＷＦ細胞培養液から採取した上清は、低比活性（１００ｍＵ／１０μｇ未満）を含んでいた。バッチ培養に対する観察結果と一致して、図２Ｂは、高比活性を有するｒＶＷＦを発現する連続哺乳動物細胞培養液は、低比活性を有するｒＶＷＦを産生する培養液よりも低いＮＨ４＋濃度を有することを示す。このデータは、細胞培養液中のＮＨ４＋濃度および培養により産生されるｒＶＷＦの比活性の間の相関をさらに強める。特に、細胞培養における高銅濃度と低アンモニウム濃度の組み合わせは、著しく改善されたｒＶＷＦ活性の生成を可能にする。
【０３１５】
この結果と一致して、ケモスタット培養のｒＶＷＦマルチマー状態のアガロースゲル電気泳動法分析（図６）は、高銅および低細胞密度ならびにその結果の低アンモニウムで操作された培養液由来の上清のみが、一貫した発現高次多量体ｖＷＦ（それぞれ、ＣＳＴレーン４、８、および１２の８、１７および２４日目の約２３％〜２７％）の発現をもたらすことを示した。すべての他の条件は、延長培養期間にわたり、１０超の二量体を有するｖＷＦが１０％を越える一貫した高い量に達しない。
【０３１６】
実施例４
培地銅濃度のｒＡ１３の発現および比活性に与える効果を測定するために、ｒＡ１３を発現する哺乳動物細胞培養液を、ケモスタット連続培養条件下、変法ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地ＢＥＳＰ８４５および０．６６μｇ／Ｌ（追加の銅補充なし）から追加銅補充の４μｇ／Ｌまでの範囲の銅濃度を含む追加の補充剤（表１４）を含むＡＤＡＭＴＳ１３培地中で、４週間増殖させた。表１５で示すように、細胞培地中の漸増量の銅濃度により、量的（Ｐ）および比（ｑ）生産性（それぞれ、合計ｒＡ１３活性／Ｌ培養液／日、および合計ｒＡ１３活性／細胞／日、で表される）の顕著な増加を生じた。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０３１７】
増加した銅濃度が発現したｒＡ１３の健全性に影響するかどうかを判断するために、０．６６μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、および４μｇ／Ｌ銅を含む培地中で増殖させたｒＡ１３細胞培養液から採取した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により調べた。図３Ａ（銀染色）および図３Ｂ（抗Ａ１３ウェスタンブロット）から解るように、ゲル電気泳動での明らかな産物の品質の変化は観察されなかった。具体的には、切断型１７０ｋＤまたは他の低ＭＷｒＡ１３変異体レベルの増加、および他の追加のまたは増加したＨＣＰバンドは、増加した銅濃度の存在下のｒＡ１３発現からは生じなかった。
【０３１８】
ｒＡ１３の活性に対する銅の最適濃度を推定するために、表１５からＰ  Ｆｒｅｔｓ  ｖｓ銅濃度（図４）のデータの外挿を行うことにより、最適効果は、約２μｇ／Ｌで得られ、控えめに見積もっても、約４μｇ／Ｌを越えるとマイナスの効果が生じる可能性があることがわかる。
【表１５】
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【０３１９】
上記の結果を踏まえ、追加の実験を行い、０．６６μｇ／Ｌ銅と２．０μｇ／Ｌ銅含有細胞培地中でのｒＡ１３の発現を比較した。表１６に示すように、基本細胞培地に対し、最終濃度２．０μｇ／Ｌ銅への銅の補充により、８週間にわたり、量的（Ｐ）および比（ｑ）生産性（それぞれ、合計ｒＡ１３活性／Ｌ培養液／日、および合計ｒＡ１３活性／細胞／日、で表される）の顕著な増加を生じた。２つの培養のｒＡ１３産生の各週の具体的データを図５に示す。これらのデータから、銅補充が、細胞代謝、比増殖速度およびｒＡ１３生産性に測定可能な有益な効果を与えることが明らかである。
【表１６】
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【０３２０】
本明細書記載の実施例および実施形態は、例証のみが目的であるが、当業者には、前記を踏まえると、種々の修正または変形が想起され、これらが本出願の趣旨と範囲内ならびに添付請求項の範囲内に含まれることは理解されよう。本明細書で引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。
【図３Ａ】
0005953502.tif 000027
【図３Ｂ】
0005953502.tif 000028
【図５Ｃ】
0005953502.tif 000029
【図５Ｄ】
0005953502.tif 000030
【図５Ｅ】
0005953502.tif 000031
【図５Ｆ】
0005953502.tif 000032
【図５Ｈ】
0005953502.tif 000033
【図５Ｉ】
0005953502.tif 000034
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005953502.tif 000036
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
0005953502.tif 000040
【図５Ｂ】
0005953502.tif 000041
【図５Ｇ】
0005953502.tif 000042
【図５Ｊ】
0005953502.tif 000043
【図５Ｋ】
0005953502.tif 000044
【図６Ａ】
0005953502.tif 000045
【図６Ｂ】
0005953502.tif 000046