(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得する方法であって、
被験体から分離された試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異は、表１に記載の変異の１つ以上であり、
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異は、表２に記載の変異の１つ以上である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化していることを確認する工程と、
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを確認する工程と
をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのキットであって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項５】
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方において、変異を有することを特徴とするDravet症候群の発症モデル非ヒト動物。
【請求項６】
請求項５に記載のDravet症候群の発症モデル非ヒト動物の作製方法であって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型に変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型に変異を導入する工程と
を含むことを特徴とする作製方法。
【請求項７】
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方において変異を有することを特徴とする細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞の製造方法であって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型に変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型に変異を導入する工程と
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項９】
請求項５に記載のDravet症候群の発症モデル非ヒト動物に、候補薬剤を投与する工程と、
当該候補薬剤の投与によって、上記Dravet症候群の発症モデル非ヒト動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とするDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の細胞に、候補薬剤を投与する工程と、
当該候補薬剤の投与によって、上記細胞における、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性および／または電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化したか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とするDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Dravet症候群の発症の可能性を判定する方法およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱性けいれんは小児の約８％にみられる発症率の高い疾病である。熱性けいれんの主な症状として、感冒等のウイルス感染や細菌感染等による３８℃以上の発熱に伴って、全身のけいれんが１〜５分間持続することが知られている。生後６ヶ月から５歳頃までの間に発症する熱性けいれんは、その症例の大多数が６歳までに治癒する。熱性けいれんに対しては、積極的な治療を必要としないことが多い。このため、熱性けいれんは、原則として良性の疾患と考えられている。【０００３】
しかし、１歳未満で発症する熱性けいれんの患者のなかには、通常の熱性けいれんとして終息する良性疾患の患者の他に、６歳以後もけいれんが持続する患者や、Dravet症候群（以前は『乳児重症ミオクロニーてんかん（Severe Myoclonic Epilepsy in Infancy; SMEI）』と呼ばれていた。）という難治性のてんかん患者が混在している。【０００４】
Dravet症候群の患者では、１歳未満でけいれんが発症する。Dravet症候群の患者における平均的なけいれん発症年齢は、生後４ヶ月から６ヶ月である。Dravet症候群の患者におけるけいれんの初発発作は、一般に、全身性または片側性の強直間代または間代性けいれんであり、乳幼児期にはけいれん重積状態をきたすことが多い。また、このけいれん発作は、発熱や入浴によって誘発されやすい。【０００５】
従来、熱性けいれんは、主に一般小児科医または家庭医が診断および治療しており、Dravet症候群の診断についても、けいれん発作等のDravet症候群に特徴的な臨床症状に基づいて行われている。しかし、Dravet症候群の臨床症状が出そろう２〜３歳の頃には、Dravet症候群の患者は何度もけいれんを繰り返し、てんかん重積等、危険な状態をしばしば経験している。このため、一次診療に携わる一般小児科医および家庭医が、できるだけ早期にDravet症候群を検知することができる診断方法の開発が必要である。より早期にDravet症候群を検知することが可能になれば、事前にてんかん専門医が対応することができ、患者が重篤な状態になることを防ぐことが可能となる。【０００６】
近年、Dravet症候群患者の３０〜８０％では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子において、ミスセンス変異（アミノ酸置換を伴う変異）、およびナンセンス変異（蛋白合成が途中で止まってしまう変異）が存在することが報告されている（非特許文献１および２）。このような観点から、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の異常を検査して、Dravet症候群を遺伝子レベルで診断する試みがなされている。【０００７】
例えば、特許文献１〜４には、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異が、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＥＭＩ）に関与することが開示されている。また、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異を指標として、乳児重症ミオクロニーてんかんを診断できることが開示されている。【０００８】
具体的には、特許文献１には、ＳＣＮＡ１Ａ遺伝子に存在するＳＭＥＩに関連した複数の遺伝子変異を総合的に判断することによってＳＭＥＩの診断を行うことが開示されている。【０００９】
特許文献２には、ＳＭＥＩにおける神経のＳＣＮ１Ａ遺伝子において多頻度に生じる遺伝子変異のいずれかが存在するかを検出することにより、ＳＭＥＩ診断を行うことが開示されている。【００１０】
特許文献３および４には、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における変化を検出し、その変化が、ＳＭＥＩもしくはＳＭＥＩに関係する症候群に関連することが知られているか、またはＳＭＥＩもしくはＳＭＥＩに関係する症候群に関連しないことが知られているかどうかを確認することによって、ＳＭＥＩまたはＳＭＥＩに関係する症候群を含むてんかん症候群を診断する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００４−３２９１５３号公報（２００４年１１月２５日公開）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００４−７３０５８号公報（２００４年  ３月１１日公開）」
【特許文献３】日本国公表特許公報「特表２００８−５４６３７６号公報（２００８年１２月２５日公表）」
【特許文献４】日本国公表特許公報「特表２００６−５２４４９０号公報（２００６年１１月  ２日公表）」
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Sugawara T, Mazaki-Miyazaki E, Fukushima K, Shimomura J, Fujiwara T, Hamano S, Inoue Y, Yamakawa K. 2002. Frequent mutations of SCN1A in severe myoclonic epilepsy in infancy. Neurology 58:1122-1124.
【非特許文献２】Ohmori I, Ouchida M, Ohtsuka Y, Oka E, Shimizu K. 2002. Significant correlation of the SCN1A mutations and severe myoclonic epilepsy in infancy. Biochem Biophys Res Commun 295: 17-23.
【非特許文献３】Escayg A, Heils A, MacDonald BT, Haug K, Sander T, and Meisler MH. (2001). A novel SCN1A mutation associated with generalized epilepsy with febrile seizures plus-and prevalence of variants in patients with epilepsy. Am J Hum Genet. 68: 866-873.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、非常に多くのDravet症候群患者（３０〜８０％）において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異が認められる。しかし、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異があるからといって、Dravet症候群が発症するとは限らないことが明らかになってきた。【００１４】
例えば、非特許文献３には、難治性のDravet症候群の患者のみならず、熱性けいれんの患者や、ある種の良性てんかん（例えば、ＧＥＦＳ＋（全般性熱性けいれんプラス：Generalized epilepsy with febrile seizure plus））の患者においても、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異が生じていることが報告されている。【００１５】
このように、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異は、Dravet症候群に特異的な現象ではない。従って、特許文献１〜４に示されたようなＳＣＮ１Ａ遺伝子の異常のみを検査する従来の方法では、Dravet症候群を特異的に診断するためには十分ではないと言える。【００１６】
このため、良性の熱性けいれんの患者とDravet症候群の患者とを選別し、Dravet症候群の患者に対して、専門医の適切な治療を行うためにも、Dravet症候群をより精度よく診断できる技術のさらなる開発が必要である。【００１７】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Dravet症候群の発症の可能性を高精度に（特異的に）判定する方法およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
ＧＥＦＳ＋の患者とDravet症候群の患者とでは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異を有する点で共通しているが、本発明者らは独自の観点から、疾病の悪性度が異なる点に着目し、Dravet症候群の発症には、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異のみではなく、他の要因が関与しており、それがDravet症候群の悪性化、および難治化に関わっていると考え、鋭意検討を行った。その結果、多くのDravet症候群患者において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異、および、Ｐ／Ｑ型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を構成するα１サブユニットをコードするＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子にも変異が生じていることを独自に見出した。【００１９】
さらに、この知見に基づいて、上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子、および上記ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方に変異を有するラットを作製し、上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子および上記ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方に変異を有するラットでは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のみの変異を有するラットに比べて、けいれんの発作が悪性化することを実証した。【００２０】
そして、これらの遺伝子解析の結果および動物実験の結果に基づいて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異を検出することによって、Dravet症候群の発症の可能性を高精度に判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００２１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。【００２２】
本発明に係る判定方法は、Dravet症候群の発症の可能性を判定する方法であって、
被験体から分離された試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程とを含むことを特徴としている。好ましくは、本発明に係る判定方法は、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得する方法である。【００２３】
本発明に係るキットは、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのキットであって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドとを備えていることを特徴としている。本発明に係るキットは、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得するためのキットであってもよい。【００２４】
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方において、変異を有することを特徴としている。【００２５】
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の作製方法は、上述したDravet症候群の発症モデル動物の作製方法であって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子に、アミノ酸変化を伴う変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子に、アミノ酸変化を伴う変異を導入する工程と、を含むことを特徴としている。【００２６】
本発明に係る細胞は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方において変異を有することを特徴としている。【００２７】
本発明に係る細胞の製造方法は、上述した細胞の製造方法であって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型に変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型に変異を導入する工程とを含むことを特徴としている。【００２８】
本発明に係るDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法は、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物に、候補薬剤を投与する工程と、
当該候補薬剤の投与によって、上記Dravet症候群の発症モデル動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する工程とを含むことを特徴としている。【００２９】
本発明に係るDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法は、本発明に係る細胞に、候補薬剤を投与する工程と、
当該候補薬剤の投与によって、上記細胞における、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性および／または電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化したか否かを判定する工程とを含むことを特徴としている。【００３０】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係るDravet症候群の発症の可能性を判定する方法は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異を検出することにより、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得することができる。【００３２】
良性てんかんであるＧＥＦＳ＋の患者では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異は家系内に遺伝して受け継がれている。これに対し、Dravet症候群の患者では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異の約９０％が、de novo変異、すなわち両親には変異がないのに子供には変異が生じる、新規突然変異である。このように、ＧＥＦＳ＋の患者とDravet症候群の患者とでは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異を有する点で共通しているが、疾病の悪性度が異なる原因は不明であった。しかし、本発明者らにより、ＳＣＮ１Ａ遺伝子およびＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方において変異が生じることが、Dravet症候群の悪性化、および難治化に関与していることが初めて明らかになった。【００３３】
上述したように、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型（以下、「ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット」と称する）における変異がDravet症候群の発症に関連することは既に報告されている。しかし、Dravet症候群と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型（以下、「カルシウムイオンチャネルα１サブユニット」と称する）における変異とが関連することについての報告は全くない。【００３４】
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニット以外のサブユニットの変異が、Dravet症候群に関与することが報告されている（Iori Ohmori et. Al., Neurobiology of Disease 32 (2008) 349-354を参照）。具体的には、上記文献（Iori Ohmori et. Al.）には、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のβ４サブユニット（以下、単に「カルシウムイオンチャネルβ４サブユニット」と称する）における変異がDravet症候群に関与することが示されている。【００３５】
しかし、上記文献には、Dravet症候群に関して「ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット」における変異とともに、「カルシウムイオンチャネルβ４サブユニット」における変異が重要であることが強く教示されており、文献の記載は、Dravet症候群の検出目的に好適な変異がカルシウムイオンチャネルα１サブユニットに存在することに想到する動機付けを妨げている。【００３６】
そもそも、特定のチャネルに関して、特定のサブユニットにおける変異と疾患との関連が知られているからといって、それ以外のサブユニットにもその疾患と関連する変異があるなどという考えを当業者は想起しない。少なくともDravet症候群に関する電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１についての知見は、「α１サブユニット」における変異しか知られておらず、他のサブユニットにおける変異を解析することを動機付けるものではない。【００３７】
カルシウムイオンチャネルα１サブユニットの変異については、（１）反復発作性失調症２型（発作性の小脳失調を特徴とする）、（２）家族性片麻痺性片頭痛１型（片麻痺、半盲、嚥下障害、脈拍性頭痛など）、および（３）脊髄小脳失調症６型（失調性歩行、四肢の失調、小脳性構音障害、眼振など）と関連することが報告されている（井本敬二ら，「医学の歩み」，Vol.201 No.13（２００２年６月２９日発行）；常深泰司ら，「医学の歩み」，Vol.201 No.13（２００２年６月２９日発行）を参照）。しかし、上記（１）〜（３）の疾患は、てんかんの症状を呈するものではなく、Dravet症候群と関連する疾患でもない。少なくともカルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異についての知見は、これらの（１）〜（３）の疾患と関連することが知られているが、上記（１）〜（３）の疾患と全く関連のないDravet症候群におけるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの変異を解析することを動機付けるものではない。【００３８】
本発明に係る判定方法は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異を検出するため、Dravet症候群を高精度に検出することができる。従って、本発明に係る判定方法によれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異を検出する従来の方法と比較して、Dravet症候群の検出の可能性の信頼性をより高くすることができるという効果を奏する。さらに、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型の変異、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の変異は、１歳未満の乳児においても検出が可能である。それゆえ、本発明に係る判定方法によれば、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを、発症早期または難治性経過を示す前の段階の患者、特に１歳未満の乳児において取得できるという効果を奏する。【００３９】
また、後述する実施例に示すように、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異を検出することによって、Dravet症候群の患者の検出感度が飛躍的に上昇するという効果を奏する。【００４０】
さらに、本発明に係るキットを用いれば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異を容易に検出することができる。このため、本発明に係るキットは、一般小児科医が、１歳未満の病初期に良性の熱性てんかんのなかから、専門医の治療が必要なDravet症候群の患者を選別するために有用である。【００４１】
本発明に係る判定方法およびキットを用いることにより、これまで検出が困難であった１歳未満の時点で、Dravet症候群の患者を高精度に検出することができる。また、採血された血液を検査センターに輸送後、遺伝子異常を検査することによって、遠隔地の個人病院等であっても、Dravet症候群の患者を高精度に検出することが可能となる。【００４２】
また、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物および細胞は、難治性のDravet症候群の発症メカニズムの解明や、Dravet症候群の治療薬の開発等に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ヒトのＳＣＮ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列およびラットのＳｃｎ１ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を表す図である。
【図２】パッチクランプ法を用いて、ナトリウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。（ａ）は、正常型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルにおける電位の変化に伴うナトリウム電流の代表例を示している。（ｂ）は、不活性化の時定数（τ）を検討した結果を示している。
【図３】パッチクランプ法を用いて、ナトリウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。（ａ）は電流−電圧関連、（ｂ）はナトリウムイオンチャネルの活性化曲線、（ｃ）はナトリウムイオンチャネルの不活性化曲線、および（ｄ）はナトリウムイオンチャネルの不活性からの回復曲線を示している。
【図４】パッチクランプ法を用いて、ナトリウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。（ａ）は、ナトリウムイオンチャネルに流れるナトリウム電流を示している。（ｂ）は、ナトリウムイオンチャネルに流れる持続性ナトリウム電流量の相対値（％）を示している。
【図５】親ラット（Ｐ）、雑種第一世代（Ｆ１）ラットおよび雑種第二世代（Ｆ２）ラットの遺伝子型を表す図である。（ａ）は親ラット（Ｐ）およびＦ１ラットの遺伝子型を表す図である。（ｂ）はＦ１ラットおよびＦ２ラットの遺伝子型を表す図である。
【図６】Ｆ２ラットにおけるＳｃｎ１ａ遺伝子およびＣａｃｎａ１ａ遺伝子の遺伝子型を、シークエンス法によって特定する方法を示す図である。
【図７】Ｆ２ラットにおけるＳｃｎ１ａ遺伝子の遺伝子型を、制限酵素消化によって特定する方法を示す図である。（ａ）は変異型Ｓｃｎ１ａ遺伝子（Ｎ１４１７Ｈ）において変異が生じている塩基配列と、これに対応する野生型Ｓｃｎ１ａ遺伝子の塩基配列を示す。（ｂ）は制限酵素消化により期待されるＤＮＡ断片のサイズを示す。（ｃ）は電気泳動の結果を示す。
【図８】Ｆ２ラットにおけるＣａｃｎａ１ａ遺伝子の遺伝子型を、制限酵素消化によって特定する方法を示す図である。（ａ）は変異型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子（Ｍ２５１Ｋ）において変異が生じている塩基配列と、これに対応する野生型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の塩基配列を示す。（ｂ）は制限酵素消化により期待されるＤＮＡ断片のサイズを示す。（ｃ）は電気泳動の結果を示す。
【図９】Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異ラットにおよぼすＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異の影響を調べた結果を示す図である。（ａ）はけいれん発症時の体温（けいれん閾値）、（ｂ）は重症度スコア、および（ｃ）はけいれんの持続時間を表す。
【図１０】グループ（３）のラット（Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロ）の発作時の脳波の一部を表す図である。
【図１１】ヒトのＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列およびラットのＣａｃｎａ１ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を表す図である。
【図１２】電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニットにおける変異を検出した結果を表す図である。（ａ）はＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子における遺伝子変異解析の結果を表し、（ｂ）はカルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおいて変異が検出された部位を模式的に表している。
【図１３】パッチクランプ法を用いて、カルシウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。（ａ）は、正常型カルシウムイオンチャネルおよび変異型カルシウムイオンチャネルにおける電位の変化に伴うバリウム電流記録を示している。（ｂ）は電流−電圧関連、（ｃ）はピーク時の電流値（ｐＡ）、電荷の総和（ｐＦ）およびピーク電流密度（ｐＡ／ｐＦ）を示している。
【図１４】パッチクランプ法を用いて、カルシウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。（ａ）はカルシウムイオンチャネルの活性化曲線を示している。（ｂ）はカルシウムイオンチャネルの電位依存的活性化の時定数を示している。（ｃ）は２０ｍＶでの電位依存的活性化の時定数を示している。（ｄ）はカルシウムイオンチャネルの電位依存的な不活性化曲線を示している。（ｅ）は不活性化の時定数（τ）を検討した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。尚、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００４５】
〔１．本発明に係る判定方法〕
本発明に係るDravet症候群の発症の可能性を判定する方法（「本発明に係る判定方法」ともいう。）は、被験体から分離した試料を用いて、当該被験体がDravet症候群の発症の可能性を判定する方法である。尚、本明細書において、上記「Dravet症候群の発症の可能性」とは、Dravet症候群をすでに発症している可能性と、Dravet症候群を将来的に発症する可能性との両方の意味を包含するものである。
【００４６】
尚、上記被験体は、特に限定されるものではなく、Dravet症候群を発症している者（発症する可能性のある者）であってもよいし、Dravet症候群を発症していない者（発症する可能性がない者）であってもよい。中でも、乳幼児、または小児に適用することが好ましい。
【００４７】
本発明に係る判定方法は、具体的には、被験体から分離した試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程とを含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。
【００４８】
ここで、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１は、αサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットから構成されている。β１サブユニットおよびβ２サブユニットは、補助的なサブユニットである。
【００４９】
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型（以下、「ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット」と称する）としては、GenBankアクセション番号AB093548に登録されるポリペプチド（すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列）を挙げることができる。また、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードする遺伝子（以下、「ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子」と称する）としては、ＳＣＮ１Ａ遺伝子として、GenBankアクセション番号AB093548に登録されている塩基配列（すなわち、配列番号２に示される塩基配列）からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５０】
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１は、αサブユニット１型、βサブユニット、γサブユニット、およびα２δサブユニットから構成されている。
【００５１】
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型（以下、「カルシウムイオンチャネルα１サブユニット」と称する）としては、GenBankアクセション番号NM 023035に登録されるポリペプチド（すなわち、配列番号３に示されるアミノ酸配列）を挙げることができる。また、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型をコードする遺伝子（以下、「カルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子」と称する）としては、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子として、GenBankアクセション番号NM 023035に登録されている塩基配列（すなわち、配列番号４に示される塩基配列）からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５２】
尚、本明細書においては、例えば、「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型」と記載した場合、「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型タンパク質」を指す。つまり、本明細書においては、「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードする遺伝子」または「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型遺伝子」のように、遺伝子を意図していることを明記しない限り、タンパク質を意図している。この表記方法は、「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型」に限られたものではなく、「電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型」についても同様に表記するものとする。
【００５３】
本発明に係る判定方法では、上述した変異の有無を検出する工程に加えて、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化していることを確認する工程と、上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを確認する工程とをさらに含むことが好ましい。
【００５４】
本発明に係る判定方法は、上記変異を検出するために、上記生体から分離した試料を前処理する工程等を含んでいてもよい。当該「前処理」とは、例えば、上記生体から分離した試料からＤＮＡを抽出する処理、上記生体から分離した試料からＲＮＡを抽出する処理、上記生体から分離した試料からタンパク質を抽出する処理等を指す。これらの前処理については、従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００５５】
尚、本発明に係る判定方法は、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得する方法であり得る。この場合、本発明は医師による判断工程を含まない。
【００５６】
（１−１．変異の有無を検出する工程）
本明細書において、上記「変異の有無を検出する工程」とは、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程とを指している。
【００５７】
本発明に係る判定方法では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出する工程との、どちらの工程を先に行ってもよく、これら２つの工程を同時に行ってもよい。
【００５８】
上記ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、および上記カルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方における、変異の有無を検出することによって、Dravet症候群の発症の可能性を、精度よく判定することを可能にするデータを取得することができる。
【００５９】
本発明に係る判定方法によって検出する変異は、遺伝子における塩基配列の変異であってもよく、タンパク質におけるアミノ酸の変異であってもよい。上記「遺伝子における塩基配列の変異」は、野生型の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と比較して、塩基配列の変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が変化する変異であればよく、その具体的な変異の種類は特に限定されるものではない。このような、塩基配列の変異としては、例えば、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失によりアミノ酸コドンのフレームがずれ、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（当該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入または欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）等が意図される。このような塩基配列の変異としては、突然変異のみに限定されず、遺伝子多型も含まれる。
【００６０】
また、本発明に係る判定方法においては、これらの遺伝子から生じるｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびタンパク質を、変異の有無を検出する対象としてもよい。
【００６１】
本明細書において、「遺伝子」とは、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用されるものである。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）が包含される。
【００６３】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、またはそれらの組合せで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロン等の非コード配列を含む、「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロン等の非コード配列を含まない、「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００６４】
ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異としては、具体的には、例えば、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１４１７位のアスパラギン（Ｎ）の変異、好ましくは第１４１７位のアスパラギン（Ｎ）のヒスチジン（Ｈ）への変異（表１における「Ｎ１４１７Ｈ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４２４９位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第４２４９位のアデニン（Ａ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ａ４２４９Ｃ）によってもたらされる。
【００６５】
また、別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１０２７位のリジン（Ｋ）の変異、好ましくは第１０２７位のリジン（Ｋ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｋ１０２７Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３０７９位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第３０７９位のアデニン（Ａ）のチミン（Ｔ）への置換（Ａ３０７９Ｔ）によってもたらされる。
【００６６】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１４５０位のグルタミン（Ｑ）の変異、好ましくは第１４５０位のグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）への変異（表１における「Ｑ１４５０Ｒ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４３４９位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第４３４９位のアデニン（Ａ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ａ４３４９Ｇ）によってもたらされる。
【００６７】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１０８２位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１０８６位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｔ１０８２ｆｓＸ１０８６」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３２４５位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３２４５位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ３２４５ｄｅｌ）によってもたらされる。
【００６８】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第５４７位のリジン（Ｋ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第５７０位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｋ５４７ｆｓＸ５７０」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第１６４１位の変異、好ましくは第１６４１位へのアデニン（Ａ）の挿入（１６４１ｉｎｓＡ）によってもたらされる。
【００６９】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第７０７位のプロリン（Ｐ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第７１４位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｐ７０７ｆｓＸ７１４」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２１２０位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２１２０位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ２１２０ｄｅｌ）によってもたらされる。
【００７０】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第７１２位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第７１２位のアルギニン（Ｒ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｒ７１２Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２１３４位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２１３４位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２１３４Ｔ）によってもたらされる。
【００７１】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１２６５位のロイシン（Ｌ）の変異、好ましくは第１２６５位のロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）への変異（表１における「Ｌ１２６５Ｐ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３７９４位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第３７９４位のチミン（Ｔ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｔ３７９４Ｃ）によってもたらされる。
【００７２】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第４６０位〜第５５４位のアミノ酸の欠失（表１における「Ｅｘｏｎ１０」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第１３７８位〜第１６６２位のヌクレオチド（エキソン１０）の欠失によってもたらされる。
【００７３】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第８６５位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第８６５位のアルギニン（Ｒ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｒ８６５Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２５９３位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２５９３位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２５９３Ｔ）によってもたらされる。
【００７４】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１６４８位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第１６４８位のアルギニン（Ｒ）のシステイン（Ｃ）への置換（表１における「Ｒ１６４８Ｃ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４９４２位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４９４２位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ４９４２Ｔ）によってもたらされる。
【００７５】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第９３１位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第９３１位のアルギニン（Ｒ）のシステイン（Ｃ）への置換（表１における「Ｒ９３１Ｃ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２７９１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２７９１位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２７９１Ｔ）によってもたらされる。
【００７６】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第５０１位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第５４３位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｒ５０１ｆｓＸ５４３」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第１５０２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第１５０２位のグアニン（Ｇ）の欠失（Ｇ１５０２ｄｅｌ）によってもたらされる。
【００７７】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１００２位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１００９位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ａ１００２ｆｓＸ１００９」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３００６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３００６位のシトシン（Ｃ）の欠失によってもたらされる。
【００７８】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第９０２位のフェニルアラニン（Ｆ）の変異、好ましくは第９０２位のフェニルアラニン（Ｆ）のシステイン（Ｃ）への変異（表１における「Ｆ９０２Ｃ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２７０５位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第２７０５位のチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ｔ２７０５Ｇ）によってもたらされる。
【００７９】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１６７４位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１６７４位のグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）への置換（表１における「Ｇ１６７４Ｒ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第５０２０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第５０２０位のグアニン（Ｇ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｇ５０２０Ｃ）によってもたらされる。
【００８０】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１３９０位のバリン（Ｖ）の変異、好ましくは第１３９０位のバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）への変異（表１における「Ｖ１３９０Ｍ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４１６８位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第４１６８位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ４１６８Ａ）によってもたらされる。
【００８１】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第６０７位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第６２２位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｓ６０７ｆｓＸ６２２」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第１８２０位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第１８２０位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ１８２０ｄｅｌ）によってもたらされる。
【００８２】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１４３４位のトリプトファン（Ｗ）の変異、好ましくは第１４３４位のトリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換（表１における「Ｗ１４３４Ｒ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４３００位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第４３００位のチミン（Ｔ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｔ４３００Ｃ）によってもたらされる。
【００８３】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１９０９位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは第１９０９位のスレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換（表１における「Ｔ１９０９Ｉ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第５７２６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第５７２６位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ５７２６Ｔ）によってもたらされる。
【００８４】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１２８９位のフェニルアラニン（Ｆ）の変異、好ましくは第１２８９位のフェニルアラニン（Ｆ）欠失（表１における「Ｆ１２８９ｄｅｌ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３８６７位のシトシン（Ｃ）、第３８６８位のチミン（Ｔ）および第３８６９位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第３８６７位のシトシン（Ｃ）、第３８６８位のチミン（Ｔ）および第３８６９位のチミン（Ｔ）の欠失によってもたらされる。
【００８５】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１２７１位のトリプトファン（Ｗ）の変異、好ましくは第１２７１位のトリプトファン（Ｗ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｗ１２７１Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３８１２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第３８１２位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ３８１２Ａ）によってもたらされる。
【００８６】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１４２９位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１４４３位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ａ１４２９ｆｓＸ１４４３」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４２８６位から第４２９０位間の５塩基ＣＣＡＣＡの変異、好ましくは第４２８６位から第４２９０位間のＣＣＡＣＡのＡＴＧＴＣＣへの置換によってもたらされる。
【００８７】
また、別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１８８０位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１８８１位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｇ１８８０ｆｓＸ１８８１」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第５６４０位から第５６４５位間の６塩基ＡＧＡＧＡＴの変異、好ましくは第５６４０位から第５６４５位間の６塩基ＡＧＡＧＡＴのＣＴＡＧＡＧＴＡへの置換によってもたらされる。
【００８８】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１６８５位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは第１６８５位のアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換（表１における「Ａ１６８５Ｄ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第５０５４位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第５０５４位のシトシン（Ｃ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｃ５０５４Ａ）によってもたらされる。
【００８９】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第３７７位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第３７７位のアルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）への置換（表１における「Ｒ３７７Ｌ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第１１３０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第１１３０位のグアニン（Ｇ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｇ１１３０Ｔ）によってもたらされる。
【００９０】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１５７４位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは第１５７４位のセリン（Ｓ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｓ１５７４Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４７２１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７２１位のシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ｃ４７２１Ｇ）によってもたらされる。
【００９１】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１２７７位のグルタミン（Ｑ）の変異、好ましくは第１２７７位のグルタミン（Ｑ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｑ１２７７Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３８２９位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３８２９位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ３８２９Ｔ）によってもたらされる。
【００９２】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１７７位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１７７位のグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）への変異（表１における「Ｇ１７７Ｒ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第５２９位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは５２９位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ５２９Ａ）によってもたらされる。
【００９３】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第７８８位のグルタミン酸（Ｅ）の変異、好ましくは第７８８位のグルタミン酸（Ｅ）のリシン（Ｋ）への置換（表１における「Ｅ７８８Ｋ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２３６２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第２３６２位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ２３６２Ａ）によってもたらされる。
【００９４】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１４２９位以降のスプライシング異常、好ましくは第１４２９位以降の欠失（表１における「ｉｎｔｒｏｎ  ２１」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４２８４位と４２８５位との間のゲノムＤＮＡに存在するイントロン２１のうち、最後から２つ目の位置（−２位）のアデニン（Ａ）の変異、好ましくはイントロン２１の最後から２つ目の位置（−２位）のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異（イントロン２１ ａｇ（−２）ｇｇ）によってもたらされる。つまり、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４２８４（エキソン２１）と４２８５位（エキソン２２）の間のゲノムＤＮＡに存在するイントロン２１の最後から２つの塩基配列はａｇであり、エキソン２２の始めにつながる。一般的に、イントロン２１の上記ａｇはスプライシングを受ける認識配列であるため、ここに異常があると、イントロンがまだ続いているとみなされ、その直後のエキソン（もしくはその下流）は異常なスプライシングを生じてしまい、全長のタンパク質ができなくなってしまう。
【００９５】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１５７４位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは第１５７４位のセリン（Ｓ）のストップコドンへの変異（表１における「Ｓ１５７４Ｘ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４７２１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７２１位のシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への置換によってもたらされる。
【００９６】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第２１２位のバリン（Ｖ）の変異、好ましくは第２１２位のバリン（Ｖ）のアラニン（Ａ）への置換（表１における「Ｖ２１２Ａ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第６３５位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第６３５位のチミン（Ｔ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｔ６３５Ｃ）によってもたらされる。
【００９７】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１５３９位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは第１５３９位のスレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への変異（表１における「Ｔ１５３９Ｐ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４６１５位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第４６１５位のアデニン（Ａ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ａ４６１５Ｃ）によってもたらされる。
【００９８】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第７３８位のトリプトファン（Ｗ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第７４６位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｗ７３８ｆｓＸ７４６」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２２１３位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第２２１３位のグアニン（Ｇ）の欠失（Ｇ２２１３ｄｅｌ）によってもたらされる。
【００９９】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第９９０位のロイシン（Ｌ）の変異、好ましくは第９９０位のロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）への変異（表１における「Ｌ９９０Ｆ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２９７０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第２９７０位のグアニン（Ｇ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｇ２９７０Ｔ）によってもたらされる。
【０１００】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１６３位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１６３位のグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への変異（表１における「Ｇ１６３Ｅ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４８８位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第４８８位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ４８８Ａ）によってもたらされる。
【０１０１】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１６６２位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは第１６６２位のアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）への変異（表１における「Ａ１６６２Ｖ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第４９８５位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４９８５位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ４９８５Ｔ）によってもたらされる。
【０１０２】
さらに別の実施形態として、配列番号１に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１０５７位のリジン（Ｋ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１０７３位に終止コドンを生じる変異（表１における「Ｋ１０５７ｆｓＸ１０７３」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号２に示されるナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３１７０位から第３１８３位の間の１４塩基（ＡＧＡＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＴ）の変異、好ましくは第３１７０位から第３１８３位の間の１４塩基のＴＣＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧへの置換によってもたらされる。
【０１０３】
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型の変異は、上記例示的に示した変異に限定されないことはいうまでもない。
【０１０４】
カルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異としては、具体的には、例えば、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第２４９位のメチオニン（Ｍ）の変異、好ましくは第２４９位のメチオニン（Ｍ）のリジン（Ｋ）への変異（表２における「Ｍ２４９Ｋ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第７４６位のチミジン（Ｔ）の変異、好ましくは第７４６位のチミジン（Ｔ）のアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｔ７４６Ａ）によってもたらされる。
【０１０５】
また、別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第９２１位のグルタミン酸（Ｅ）の変異、好ましくは第９２１位のグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）への変異（表２における「Ｅ９２１Ｄ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２７６２位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第２７６２位のアデニン（Ａ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ａ２７６２Ｃ）によってもたらされる。
【０１０６】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第９９６位のグルタミン酸（Ｅ）の変異、好ましくは第９９６位のグルタミン酸（Ｅ）のバリン（Ｖ）への変異（表２における「Ｅ９９６Ｖ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２９８７位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第２９８７位のアデニン（Ａ）のチミン（Ｔ）への置換（Ａ２９８７Ｔ）によってもたらされる。
【０１０７】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１１２６位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第１１２６位のアルギニン（Ｒ）のヒスチジン（Ｈ）への変異（表２における「Ｒ１１２６Ｈ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３３７７位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第３３７７位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ３３７７Ａ）によってもたらされる。
【０１０８】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第２２０１位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第２２０１位のアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）への変異（表２における「Ｒ２２０１Ｑ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第６６０２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第６６０２位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ６６０２Ａ）によってもたらされる。
【０１０９】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第１１０８位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１１０８位のグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）への変異（表２における「Ｇ１１０８Ｓ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第３３２２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第３３２２位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ３３２２Ａ）によってもたらされる。
【０１１０】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第９２４位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは第９２４位のアラニン（Ａ）のグリシン（Ｇ）への変異（表２における「Ａ９２４Ｇ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第２７７１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２７７１位のシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ｃ２７７１Ｇ）によってもたらされる。
【０１１１】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第２６６位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第２６６位のグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）への変異（表２における「Ｇ２６６Ｓ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第７９６位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第７９６位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ７９６Ａ）によってもたらされる。
【０１１２】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第４７２位のリジン（Ｋ）の変異、好ましくは第４７２位のリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への変異（表２における「Ｋ４７２Ｒ」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第１４１５位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第１４１５位のアデニン（Ａ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ａ１４１５Ｇ）によってもたらされる。
【０１１３】
さらに別の実施形態として、配列番号３に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニットのアミノ酸配列における第２２０２位から第２２０５位のアミノ酸の欠失（表２における「ｄｅｌ２２０２−２２０５」）を挙げることができる。この変異は、例えば、配列番号４に示されるカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の塩基配列における第６６０５位から第６６１６位のＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧの変異、好ましくは第６６０５位から第６６１６位のＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧの欠失（ｄｅｌ６６０５−６６１６）によってもたらされる。
【０１１４】
電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の機能異常に関与する変異は、上記例示的に示した変異に限定されないことはいうまでもない。
【０１１５】
上述したナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異を、それぞれ表１および表２にまとめた。
【０１１６】
【表１】
0005846372.tif 000002
【０１１７】
【表２】
0005846372.tif 000003
【０１１８】
本発明に係る判定方法では、上記ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異は、具体的には、表１に記載の変異の１つ以上であり、上記カルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異は、具体的には、表２に記載の変異の１つ以上であることが好ましい。
【０１１９】
本発明に係る判定方法において、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
【０１２０】
ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方における変異の有無を検出する場合は、例えば、ＰＣＲを利用したＤＮＡシークエンス法、ＳＳＣＰ（Single strand conformation polymorphism）、ＤＨＰＬＣ法（denaturing high performance liquid chromatography）等の変異検出法；リアルタイムＰＣＲやＤＮＡチップを用いた多型検出方法；遺伝子の各エキソンのmicro−deletionを検出する方法；ｍＲＮＡの増減を検出する、Northern blot法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Real-time PCR法、およびｃＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。また、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質の両方における変異の有無を検出する場合は、例えば、ウエスタンブロット法、免疫染色法、タンパクアレイ法等を挙げることができる。
【０１２１】
以下に、（Ａ）被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて遺伝子の変異を検出する実施形態、（Ｂ）被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて遺伝子の変異を検出する実施形態、および（Ｃ）被験体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いてタンパク質の変異を検出する実施形態に分けて、より具体的に説明する。
【０１２２】
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる実施形態
被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて遺伝子の変異を検出する実施形態では、まず、被験体から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。
【０１２３】
上記「被験体から分離された試料」としては、特に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡを抽出可能なものを用いることができる。具体的には、例えば、血液、口腔粘膜細胞、骨髄液、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞等を挙げることができる。また、被験体から分離した細胞を培養し、増殖させた細胞からゲノムＤＮＡを抽出してもよい。
【０１２４】
また、抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等の通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
【０１２５】
こうして調製されたゲノムＤＮＡを含有する試料を用いて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法等を挙げることができる。
【０１２６】
より具体的には、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異を検出するためのポリヌクレオチド、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異を検出するためのポリヌクレオチドを用いて、ゲノムＤＮＡから、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方における変異の有無を検出する。
【０１２７】
上記「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異を検出するためのポリヌクレオチド」とは、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子における特定の領域（例えば、エキソンを含む領域、またはエキソンとイントロンとの境界領域等）と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを意図している。上記「電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異を検出するためのポリヌクレオチド」とは、カルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子における特定の領域（例えば、エキソンを含む領域、またはエキソンとイントロンとの境界領域等）と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを意図している。
【０１２８】
上記「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異を検出するためのポリヌクレオチド」としては、具体的には、例えば、配列番号５，６，９〜６２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、上記「電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異を検出するためのポリヌクレオチド」としては、具体的には、例えば、配列番号７，８，６３〜１４３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１２９】
かかるポリヌクレオチドは、２種類を組み合わせてプライマー対として用いてもよく、１種類をプローブとして用いてもよい。２種類を組み合わせてプライマー対として用いる場合は、後述する実施例に示す組合せにて用いることができる。
【０１３０】
これらのポリヌクレオチドを２種類組み合わせてプライマー対として用いる場合は、例えば、上記遺伝子における特定の領域を、対応するプライマー対を用いて、ＰＣＲ法を用いて増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスすることによって上記遺伝子における変異の有無を検出することができる。
【０１３１】
また、蛍光標識したポリヌクレオチドを２種類組み合わせてプライマー対として用いて、上記遺伝子の特定の領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動を行い、各シグナルの強さを検討する方法により、上記遺伝子における変異の有無を検出することも可能である。
【０１３２】
また、これらのポリヌクレオチドの１種類を単独でプローブとして用いる場合は、例えば、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、切断されたゲノムＤＮＡ断片のサイズの違いをサザンブロッティング等で検出することによっても、遺伝子における変異の有無を検出することができる。
【０１３３】
このように、被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子と、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子との両方における変異の有無を検出することにより、被験体がDravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方において変異が見出された場合には、この被験体はDravet症候群の発症の可能性が高いと判定することができる。
【０１３４】
尚、変異の検出方法において使用されるプライマー対およびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザー等により作製することができる。
【０１３５】
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる実施形態
被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験体から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出する。
【０１３６】
上記「被験体から分離された試料」としては、特に限定されるものではなく、ｍＲＮＡを抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子を発現している、または発現している可能性があるものを用いることができる。上記「被験体から分離された試料」は、例えば、患者の末梢血白血球細胞、皮膚線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞または筋細胞であることが好ましい。
【０１３７】
続いて、その抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製する。さらに、得られたｃＤＮＡを必要に応じて、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等の通常行われる遺伝子増幅法により増幅してもよい。
【０１３８】
こうして調製されたｃＤＮＡを含有する試料を用いて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記「（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる実施形態」で説明した、ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子の変異を検出する場合と同様の方法を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子の変異の有無を検出することができる。
【０１３９】
このように、被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方における変異の有無を検出することにより、被験体がDravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子の両方において変異が見出された場合には、この被験体はDravet症候群の発症の可能性が高いと判定することができる。
【０１４０】
（Ｃ）タンパク質を用いる実施形態
被験体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験体から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、タンパク質を抽出する。
【０１４１】
上記被験体から分離された試料は、特に限定されるものではなく、タンパク質を抽出可能であり、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質の両方を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
【０１４２】
こうして調製されたタンパク質を含有する試料を用いて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質の両方における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、特定の変異を有するタンパク質のみを特異的に認識する抗体を作製し、当該抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法により変異を検出することができる。尚、本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」または「ペプチド」と交換可能に使用される。
【０１４３】
また、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となるタンパク質を単離し、単離したタンパク質を、直接または必要に応じて、酵素等で消化し、プロテインシークエンサーや、質量分析装置を利用して変異を検出することができる。または、単離したタンパク質の等電点に基づいて、変異を検出することもできる。
【０１４４】
このように、被験体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質の両方における変異の有無を検出することにより、被験体がDravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットタンパク質の両方における変異が見出された場合には、この被験体はDravet症候群の発症の可能性が高いと判定することができる。
【０１４５】
（１−２．活性の変化を確認する工程）
本明細書において、上記「活性の変化を確認する工程」とは、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化していることを確認する工程と、上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを確認する工程とを指している。
【０１４６】
後述する実施例に示すように、上記ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、および上記カルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方における変異によって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の両方の活性が変化することが、Dravet症候群の発症と関連していると考えられる。このため、上記ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異の位置は特に限定されるものではないが、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性を変化させる位置における変異であることが好ましい。また、上記カルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異の位置は特に限定されるものではないが、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性を変化させる位置における変異であることが好ましい。
【０１４７】
ここで、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性とは、具体的には、膜電位依存性に細胞内へのナトリウムイオン（Ｎａ＋）を透過させる活性である。上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性の変化は、特に限定されるものではなく、活性の亢進であってもよいし、活性の低下であってもよい。すなわち、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性の異常を示す変化であればよい。
【０１４８】
尚、本明細書において、「電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化している」とは、野生型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性と比較して、変異を有するナトリウムイオンチャネルα１サブユニットを含む変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が、有意差検定により統計的に有意差を示す値であることを指し、好ましくは、Student’s ｔ検定によりｐ≦０．０５であることを指す。
【０１４９】
また、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性とは、具体的には、膜電位依存性に細胞内へのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を透過させる活性である。上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の機能の変化は、特に限定されるものではなく、活性の亢進であってもよいし、活性の低下であってもよい。すなわち、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性の異常を示す変化であればよい。
【０１５０】
尚、本明細書において、「電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化している」とは、野生型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性と比較して、変異を有するカルシウムイオンチャネルα１サブユニットを含む変異型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が、有意差検定により統計的に有意差を示す値であることを指し、好ましくは、Student’s ｔ検定によりｐ≦０．０５であることを指す。
【０１５１】
変異によって上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化していることを確認する方法としては、例えば、変異を有するナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子と、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成する、上記α１サブユニット以外のサブユニット（β１サブユニットおよびβ２サブユニット）をコードする遺伝子（β１サブユニット遺伝子およびβ２サブユニット遺伝子）の野生型とを、発現ベクター等を用いて、培養細胞内において共発現させ、得られた培養細胞を用いて、変異を有する電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性を測定し、野生型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性と比較することによって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化していることを確認することができる。電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、従来公知のパッチクランプ法、蛍光プローブ等を用いたイメージング法等を用いることができる。
【０１５２】
変異によって上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを確認する方法としては、変異を有するカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を構成する、上記α１サブユニット以外のサブユニット（βサブユニット、γサブユニット、およびα２δサブユニット）をコードする遺伝子（βサブユニット遺伝子、γサブユニット遺伝子、およびα２δサブユニット遺伝子）の野生型とを、発現ベクター等を用いて、培養細胞内において共発現させ、得られた培養細胞を用いて、変異を有する電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性を測定し、野生型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性と比較することによって、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを確認することができる。電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、従来公知のパッチクランプ法、および、光プローブやカルシウムインジケーター、ケージド化合物を用いたイメージング法等を用いることができる。
【０１５３】
本発明に係る判定方法は、上述した構成を備えているため、被験体がDravet症候群を発症する可能性を判定するためのデータを取得することができる。そのため、本発明に係る判定方法によれば、予後不良のDravet症候群を、高精度に、且つ早期に発見することが可能となり、Dravet症候群の患者に対して、早期から、てんかん専門医による治療管理体制を整えることができる。この結果、患者の治療成績の向上、家族の精神的負担の軽減、および経済的負担の軽減が可能となる。さらには、Dravet症候群の患者に対して適切な治療を施すことができるので、医療費を削減することができる。
【０１５４】
〔２．本発明に係るキット〕
本発明には、本発明に係る判定方法を用いて、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのキット（以下、単に「本発明に係るキット」ともいう）も含まれる。
【０１５５】
本発明に係るキットは、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出するための試薬と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異の有無を検出するための試薬とを少なくとも含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
【０１５６】
上記「１．本発明に係る判定方法」の項で述べたように、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異の有無を検出するためには、（Ａ）被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する、（Ｂ）被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出することが考えられる。
【０１５７】
従って、本発明に係るキットとしては、被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡまたは被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出するために、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドとを備えている。このようなポリヌクレオチドは、例えば、プライマー対、プローブとして用いることができる。これらのポリヌクレオチドは、単独で含まれてもよく、また、複数の組合せで含まれていてもよい。
【０１５８】
本発明に係るキットとしては、（Ａ）被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出するキット、および（Ｂ）被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出するキットが含まれる。上記（Ａ）または（Ｂ）のそれぞれのキットの形態に含まれる試薬について、以下に具体的に説明する。
【０１５９】
（Ａ）被験体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出するキット
例えば、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットについて、それぞれの遺伝子のゲノムＤＮＡまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマー対や、変異型または野生型の一方のゲノムＤＮＡのみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、上記「１．本発明に係る判定方法」の「（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる実施形態」の項で説明したとおりであるので、ここでは説明は省略する。
【０１６０】
さらに、このようなキットでは、上記プライマー対やプローブに加えて、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬等、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１６１】
尚、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、本発明に係るキットには、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【０１６２】
（Ｂ）被験体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出するキット
例えば、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットについて、それぞれの遺伝子のｃＤＮＡまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマー対や、変異型または野生型の一方のｍＲＮＡのみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。このようなポリヌクレオチドは、上記「１．本発明に係る判定方法」の「（（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる実施形態」の項で説明したとおりであるので、ここでは説明は省略する。
【０１６３】
さらに、このようなキットでは、上記プライマー対やプローブに加えて、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬等、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１６４】
尚、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、本発明に係るキットには、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【０１６５】
本発明に係るキットは、上記例示した構成物をどのように組み合わせて含んでいてもよい。さらに、上記キットは、上記例示する試薬以外のその他の試薬を含んでいてもよい。
【０１６６】
上記「１．本発明に係る判定方法」の項で述べたように、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方における変異の有無を検出するためには、（Ｃ）被験体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出することも考えられる。
【０１６７】
従って、本発明に係るキットには、例えば、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットについて、それぞれのタンパク質のうち、野生型または変異型のタンパク質のみに特異的に結合する抗体が含まれていてもよい。さらに、上記抗体に加えて、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法に用いられる試薬等を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１６８】
さらに、本発明に係るキットは、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性測定に用いられる試薬、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性測定に用いられる試薬等を含んでいてもよい。
【０１６９】
上説したような本発明に係るキットを用いることにより、被験体がDravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを容易に取得することができる。本発明に係るキットが適用される被験体は、特に限定されるものではないが、乳幼児、または小児に適用することが好ましい。
【０１７０】
〔３．本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物およびその作製方法〕
本発明には、Dravet症候群の発症モデル動物、およびその作製方法も含まれる。
【０１７１】
（３−１．本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物）
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において変異を有する。ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異については、上記「１．本発明に係る判定方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
【０１７２】
上記Dravet症候群の発症モデル動物では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性の両方が、野生型の動物と比較して変化していることが好ましい。この活性の変化は特に限定されるものではなく、活性の亢進であってもよいし、活性の低下であってもよい。本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物が有する電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が、野生型と比較して変化しているかどうかを確認する方法、および本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物が有する電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の両方における活性が、野生型と比較して変化しているかどうかを確認する方法は、特に限定されない。例えば、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の個体または、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物から採取した細胞において、従来公知のパッチクランプ法、スライスパッチ法、蛍光プローブ等を用いたイメージング法等を用いて活性を測定することによって確認することができる。
【０１７３】
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方に変異が導入されているため、Dravet症候群を発症する。このようなDravet症候群の発症モデル動物は、難治性のDravet症候群の発症メカニズムの解明や、Dravet症候群の治療薬の開発等に有用に使用され得る。
【０１７４】
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１７５】
（３−２．本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の製造方法）
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の作製方法としては、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットに変異を導入する工程と、カルシウムイオンチャネルα１サブユニットに変異を導入する工程とを含んでいる。
【０１７６】
具体的には、モデル動物が有する遺伝子を操作することによって、それぞれの遺伝子に変異を導入することができる。ここで、上記「モデル動物が有する遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作することが意図される。具体的には、モデル動物の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、当該遺伝子を変異型遺伝子で置換したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。
【０１７７】
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の作製方法では、上述した工程以外の工程を含んでいてもよい。具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１７８】
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の製造方法によれば、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において、変異が導入されるように、モデル動物が有するこれらの遺伝子を操作することにより、Dravet症候群を発症したモデル動物を製造することができる。
【０１７９】
〔４．本発明に係る細胞およびその製造方法〕
本発明には、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において変異を有する細胞、およびその製造方法も含まれる。
【０１８０】
（４−１．本発明に係る細胞）
本発明に係る細胞は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において変異を有する細胞である。ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットにおける変異については、上記「１．本発明に係る判定方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
【０１８１】
本発明に係る細胞としては、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において変異を有する実験用の培養細胞が意図される。具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル等の哺乳動物、およびその他の脊椎動物に由来する実験用の培養細胞が挙げられる。
【０１８２】
このような細胞では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性の両方が変化していることが好ましい。この活性の変化は特に限定されるものではなく、活性の亢進であってもよいし、活性の低下であってもよい。本発明に係る細胞が有する電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が、野生型と比較して変化しているかどうかを確認する方法、および本発明に係る細胞が有する電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の両方における活性が、野生型と比較して変化しているかどうかを確認する方法は、上記「１．本発明に係る判定方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは詳細な説明は省略する。
【０１８３】
このような細胞は、難治性のDravet症候群の発症メカニズムの解明や、Dravet症候群の治療薬の開発等に有用に使用され得る。例えば、Dravet症候群の治療薬剤のスクリーニングに好適に用いることができる。つまり、このような細胞は、Dravet症候群の治療薬剤のスクリーニング細胞ともいうことができる。従って、本発明には、Dravet症候群の治療薬剤のスクリーニング細胞（以下、単に「スクリーニング細胞」ともいう）およびその製造方法も含まれる。
【０１８４】
（４−２．本発明に係る細胞の製造方法）
本発明に係る細胞の製造方法は、上記の特性を有する細胞を製造する方法であり、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットに変異を導入する工程と、カルシウムイオンチャネルα１サブユニットに変異を導入する工程とを含んでいる。より具体的には、以下の３つの実施形態を挙げることができる。ここでは、以下の３つの実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１８５】
（１）発現ベクター等を用いる方法
この方法では、変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１および変異型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を発現する細胞を、発現ベクター等を用いて作製する。具体的に説明すると、変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を細胞に発現させるために、例えば、アミノ酸変化を伴う変異を有するナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子と、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成する、上記α１サブユニット以外のサブユニット（β１サブユニットおよびβ２サブユニット）をコードする遺伝子（β１サブユニット遺伝子およびβ２サブユニット遺伝子）の野生型とを、発現ベクター等を用いて、宿主となる培養細胞内において共発現させる。これにより、変異型のナトリウムイオンチャネルα１サブユニットを含む変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を、細胞に発現させることができる。
【０１８６】
同様に、変異型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を細胞に発現させるために、例えば、アミノ酸変化を伴う変異を有するカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を構成する、上記α１サブユニット以外のサブユニット（βサブユニット、γサブユニット、およびα２δサブユニット）をコードする遺伝子（βサブユニット遺伝子、γサブユニット遺伝子、およびα２δサブユニット遺伝子）の野生型とを、発現ベクター等を用いて、宿主となる培養細胞内において共発現させる。これにより、変異型のカルシウムイオンチャネルα１サブユニットを含む変異型の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を、細胞に発現させることができる。
【０１８７】
このとき、宿主となる培養細胞は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１が発現していない細胞であることが好ましい。このような細胞を用いれば、内在の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１、および内在の電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の影響を受けることがない。
【０１８８】
（２）人為的な変異導入を用いる方法
この方法では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の両方を発現している培養細胞において、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方に変異を導入する。これにより、本発明に係る細胞を製造することができる。
【０１８９】
上記培養細胞に変異を導入する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の遺伝子操作技術を適宜組み合わせて用いればよい。
【０１９０】
（３）本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物を用いる方法
この方法では、上述した本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物から組織を摘出し、その組織から培養細胞を作製する。本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物については、上記「３．本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物およびその作製方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。当然のことながら、摘出される上記「組織」とは、変異が導入されたナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、および変異が導入されたカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方が発現している組織を意図している。
【０１９１】
これにより、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において変異を有する細胞を容易に製造することができる。Dravet症候群の発症モデル動物から摘出する組織の種類は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１９２】
本発明に係る細胞の製造方法では、上述した工程以外の工程を含んでいてもよい。具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１９３】
〔５．Dravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法〕
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物および本発明に係る細胞は、新たなDravet症候群の治療方法や治療薬剤の開発に用いることができる。したがって、本発明には、Dravet症候群の治療薬の治療薬剤をスクリーニングするDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法（以下、「本発明に係るスクリーニング方法」ともいう）が含まれる。
【０１９４】
ここでは、本発明に係るスクリーニング方法の一実施形態として、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物を用いる実施形態と、本発明に係るスクリーニング細胞を用いる実施形態とについて説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１９５】
すなわち、例えば、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物に代えて、他のDravet症候群の発症モデル動物を用いる実施形態とすることもできる。
【０１９６】
（１）本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物を用いる場合
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物に候補薬剤を投与する工程と、当該候補薬剤が投与されたDravet症候群の発症モデル動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する工程とを含んでいればよい。
【０１９７】
つまり、本発明に係るDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法によれば、Dravet症候群の発症モデル動物に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与されたDravet症候群の発症モデル動物において、Dravet症候群が改善または治癒していることを指標として、上記候補薬剤がDravet症候群の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
【０１９８】
尚、候補薬剤が投与されたDravet症候群の発症モデル動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、Dravet症候群に特徴的な症状を指標に判定すればよい。例えば、後述する実施例に示した「けいれん発症時の体温（けいれん閾値）」、「重症度スコア」、「けいれんの持続時間」等について、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子およびカルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有さない対照動物（つまり、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方において変異を有さない動物）と、本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物とを比較することによって、Dravet症候群が改善または治癒していることを確認することができる。
【０１９９】
上記候補薬剤は、特に限定されるものではないが、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の発現および／または電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の発現に影響を及ぼすことが期待される化合物、または電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性および／または電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性に影響を及ぼすことが期待される化合物（例えば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の両方に効果を有する阻害剤や阻害剤の候補物質、または作動薬や作動薬の候補物質）であることが好ましい。
【０２００】
また、上記候補薬剤は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであってもよい。また、カルシウムイオンチャネルα１サブユニット遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであってもよい。
【０２０１】
このような候補薬剤を、本発明に係るDravet症候群発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０２０２】
（２）本発明に係るスクリーニング細胞を用いる場合
本発明に係るスクリーニング細胞に候補薬剤を投与する工程と、当該候補薬剤が投与されたDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング細胞において、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性および／または電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化したかを判定する工程とを少なくとも含む。
【０２０３】
つまり、本実施形態に係るスクリーニング方法によれば、本発明に係るスクリーニング細胞に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与されたスクリーニング細胞における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性および／または電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを指標として、上記候補薬剤がDravet症候群の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
【０２０４】
また、当該候補薬剤が投与されたスクリーニング細胞における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化したか否かを判定する方法、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化したか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、電気生理学的測定機器や蛍光色素観察機器等を用いて判定すればよい。
【０２０５】
上記候補薬剤は、特に限定されるものではなく、上記「（１）本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物を用いる場合」の項で説明したものと同様の物質を挙げることができる。
【０２０６】
このような候補薬剤を本発明に係る細胞に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０２０７】
本発明に係る判定方法では、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異は、表１に記載の変異の１つ以上であり、
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型における変異は、表２に記載の変異の１つ以上であることが好ましい。
【０２０８】
本発明に係る判定方法では、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化していることを確認する工程と、
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の活性が変化していることを確認する工程とをさらに含むことが好ましい。
【０２０９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０２１０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【０２１１】
〔実施例１：Dravet症候群の発症を予測する危険因子の同定〕
岡山大学医学部・歯学部附属病院および関連病院に来院したDravet症候群患者の４７例の末梢血よりＤＮＡを抽出し、各種遺伝子の変異について解析した。本研究は岡山大学「ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会」の承認を得て行われた。【０２１２】
具体的には、ＤＮＡ抽出キット（ＷＢ  ｋｉｔ；Nippon gene, Tokyo, Japan）を用いて患者の末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、全エキソンをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、５０ｎｇ  ヒトゲノムＤＮＡ、２０ｐｍｏｌ  各プライマー、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１×reaction buffer、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ユニット  AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を含む２５μｌの反応液を用いた。用いたプライマー対の塩基配列（配列番号９〜６２）は、後述する「プライマーの配列」の項を参照のこと。【０２１３】
得られたＰＣＲ産物を、PCR products pre-sequencing kit（Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England）を用いて精製した。続いて、Big Dye Terminator FS ready-reaction kit（Applied Biosystems）を用いて、シークエンス反応を行い、蛍光シークエンサー（ABI PRISM3100 sequencer ;Applied Biosystems）を用いて、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。【０２１４】
まず、Dravet症候群患者４７名について電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型（「α１サブユニット」とも称する）をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子の遺伝子変異解析を行った。その結果、Dravet症候群患者４７名のうち３８名において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異を見出した。変異を検出できなかった９名の患者について、さらにMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification法（ＭＬＰＡ；MRC-Holland社;SALSA MLPA kit P137）を用いてＳＣＮ１Ａ遺伝子の遺伝子コピー数を解析した。その結果、患者１名において、エキソン１０の欠失を検出した。ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異が検出されなかった患者は８名であった。ＳＣＮ１Ａ遺伝子に検出された変異は、表１に示したとおりである。【０２１５】
次に、４７名の患者のＤＮＡを用いて、ＧＡＢＲＧ２遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子、ＣＡＣＮＢ４遺伝子、ＳＣＮ１Ｂ遺伝子およびＳＣＮ３Ａ遺伝子について遺伝子解析を行った。それぞれの遺伝子は、以下のタンパク質をコードしている。【０２１６】
ＧＡＢＲＧ２：ＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット遺伝子
ＣＡＣＮＡ１Ａ：電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニット
ＣＡＣＮＢ４：電位依存性カルシウムイオンチャネルのβ４サブユニット
ＳＣＮ１Ｂ：電位依存性ナトリウムイオンチャネルのβ１サブユニット
ＳＣＮ３Ａ：電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．３のα３サブユニット
ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の遺伝子解析に用いたプライマー対の塩基配列（配列番号６３〜１４３）については、後述する「プライマーの配列」の項に示した。【０２１７】
その結果、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を構成するαサブユニット１型（「α１サブユニット」とも称する）をコードするＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子において、多種類の遺伝子変異を見出した（表２および図１２を参照）。【０２１８】
表３にDravet症候群患者で検出されたSCN1AとCACNA1Aの遺伝子変異を示す。【０２１９】
【表３】
0005846372.tif 000004
【０２２０】
以下に記載の変異は、今回検出されたＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異である。これらの変異は、アミノ酸置換を伴う変異、アミノ酸置換を伴わない変異、イントロンの変異であった。
（１）ミスセンス変異
Ｇ２６６Ｓ      １例
Ｋ４７２Ｒ      １例
Ｅ９２１Ｄ    １１例
Ａ９２４Ｇ      １例
Ｅ９９６Ｖ    １１例
Ｇ１１０８Ｓ    ３例
Ｒ１１２６Ｈ    ４例
Ｒ２２０１Ｑ    ４例
（２）アミノ酸の欠失
４アミノ酸の欠失（deletion ２２０２−２２０５）  １例。
（３）エキソン中のアミノ酸変化を伴わない遺伝子変異
Ｅ２９２Ｅ（ｒｓ１６００６）、Ｅ３９４Ｅ（ｒｓ２２４８０６９）、Ｉ５２５Ｉ（ｒｓ１６０１０）、Ｔ６９８Ｔ（ｒｓ１６０１６）、Ｒ１０２３Ｒ（ｒｓ１６０２５）、Ｆ１２９１Ｆ（ｒｓ１６０３０）、Ｔ１４５８Ｔ（新規ＳＮＰまたは突然変異）、Ｓ１４７２Ｓ（新規ＳＮＰまたは突然変異）、Ｖ１８９０Ｖ（ｒｓ１７８４６９２１）、Ｈ２２２５Ｈ（ｒｓ１６０５１）
（４）イントロン中の遺伝子変異
エキソン１上流（ｒｓ１６０００）、イントロン１（ｒｓ１６００３）、イントロン３（ｒｓ１７８４６９４２）、イントロン８（ｒｓ２３０６３４８）、イントロン１１（ｒｓ１０４０７９５１）、イントロン１７（ｒｓ１６０１８）、イントロン３９（ｒｓ３８１６０２７）、イントロン４０（ｒｓ１７８４６９２５）、イントロン４２（新規ＳＮＰまたは突然変異）。【０２２１】
上記（１）、（２）で示された、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異型を表４に示す。【０２２２】
【表４】
0005846372.tif 000005
【０２２３】
これらの変異をＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の遺伝子多型（Single Nucleotide Polymorphism; SNP）データベースと比較検討したところ、９種類の変異型のうち３種類の変異型は、遺伝子多型（Single Nucleotide Polymorphism;ＳＮＰ）としてＳＮＰデータベースに登録されていることが明らかになった。【０２２４】
上記（３）、（４）で示された遺伝子変異に関しては、ＳＮＰデータベースに登録されている遺伝子多型、または新規遺伝子多型または突然変異であった。括弧内にＳＮＰデータベースの登録番号を記載している。【０２２５】
既に報告のある上記のＳＮＰのうち、アミノ酸変化を伴う変異に関しては、おそらく、その個例がＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のＳＮＰを有するだけでは発作は起こらないが、同時にＳＣＮ１Ａ遺伝子の異常が存在する場合は、症状の悪性化に何らかの形で関わっていると考えられた。【０２２６】
Dravet症候群患者４７名のうち、ＳＣＮ１Ａ遺伝子とＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の遺伝子変異を有している患者数を比較すると以下の通りであった。【０２２７】
ＳＣＮ１ＡおよびＣＡＣＮＡ１Ａの両方に変異を有している患者；１９例
ＳＣＮ１Ａのみに変異を有している患者；２０例
ＣＡＣＮＡ１Ａのみに変異を有している患者；２例
ＳＣＮ１ＡおよびＣＡＣＮＡ１Ａの両方に変異を有していない患者；６例
これまでDravet症候群の患者におけるＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の異常については全く報告されていない。本研究結果は、Dravet症候群患者は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のα１サブユニット遺伝子であるＳＣＮ１Ａおよび電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニット遺伝子であるＣＡＣＮＡ１Ａにおいて、高頻度の変異を有することを示している。【０２２８】
尚、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のβ４サブユニット（単に「カルシウムイオンチャネルβ４サブユニット」と称する）における変異がDravet症候群に関与することを開示した文献（Iori Ohmori et. Al., Neurobiology of Disease 32 (2008) 349-354）には、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルβ４サブユニットの両方において変異を有するDravet症候群の患者は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおいて変異が検出された患者３８例中、１例であることが記載されている。【０２２９】
これに対して、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方において変異を有するDravet症候群の患者は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットにおいて変異が検出された患者３９例中、１９例（エキソン中のアミノ酸変化を伴う登録済みＳＮＰを有する患者を除くと６例）であった。この結果は、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα１サブユニットの両方における変異を検出することによって、ナトリウムイオンチャネルα１サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルβ４サブユニットの両方における変異を検出するよりも、Dravet症候群の患者の検出感度が飛躍的に上昇することを示している。【０２３０】
尚、本明細書において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの番号、およびＳＣＮ１Ａのタンパク質におけるアミノ酸の番号に関してはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号AB093548に従い、開始コドン（ＡＴＧ）がコードするメチオニンを第１位のアミノ酸として番号を付け、開始コドンの最初のＡを第１位のヌクレオチドとして番号を付けている。【０２３１】
またＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のゲノム配列に関しては、GenBankアクセッション番号NC_000019に従った。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの番号、およびＣＡＣＮＡ１Ａタンパク質におけるアミノ酸の番号に関しては、GenBankアクセッション番号NM 023035に従い、開始コドン（ＡＴＧ）がコードするメチオニンを第１位のアミノ酸として番号を付け、開始コドンの最初のＡを第１位のヌクレオチドとして番号を付けている。【０２３２】
〔実施例２：良性の熱性けいれん患者における遺伝子変異の検討〕
良性の熱性けいれん患者におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子およびＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の異常の検討を行った。岡山大学病院および関連病院に来院した良性の全般てんかん熱性けいれんプラス（generalized epilepsy with febrile seizure plus: GEFS+）患者の５０例の末梢血よりＤＮＡを抽出し、各種遺伝子の変異について解析した。ＤＮＡ抽出、遺伝子のＰＣＲ増幅、シークエンス反応は上記記載の方法で行った。【０２３３】
まず、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＳＣＮ１Ａ遺伝子の遺伝子変異解析を行ったところ、６例にアミノ酸変化を伴う遺伝子変異を検出した。次に、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の９種類について変異解析を行ったところ、１６例に変異を検出した。それぞれの変異を表５に示す。【０２３４】
【表５】
0005846372.tif 000006
【０２３５】
良性てんかん患者５０例のうち、ＳＣＮ１Ａ遺伝子とＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方に同時に変異を有している患者は存在しないことが確認された。【０２３６】
悪性のDravet症候群４７例と、良性の熱性けいれん患者５０例とをあわせて、合計９７例の患者の遺伝子変異の解析結果を以下に示す。【０２３７】
（１）９７例の患者から、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異を有している患者をスクリーニングした結果、３９例のDravet症候群患者（４７例のうち３９例）と、６例の良性てんかん患者（５０例のうち６例）が検出された。【０２３８】
（２）９７例の患者から、ＳＣＮ１Ａ遺伝子およびＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方に変異を有している患者をスクリーニングした結果、１９例のDravet症候群患者（４７例のうち１９例）が検出され、良性てんかん患者では０例であった。【０２３９】
このことは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子変異およびＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子変異の両方を検査することによって、ＳＣＮ１Ａ遺伝子変異のみを検査するよりも、擬陽性（良性の熱性けいれん患者）を排除することができ、Dravet症候群患者を高精度で検出することができる可能性を示唆している。【０２４０】
〔実施例３：健常人における遺伝子変異の検討〕
ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の９種類のうち、登録済みの３種類を除く、残りの６種類の遺伝子変異が遺伝子多型（ＳＮＰ）かどうかを調べるために、健常人１９０例の血液から採取したＤＮＡについて、同様にＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の遺伝子変異の解析を行った。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の９種類についての結果を表６に示す。その結果、１種類のＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異（Ｇ２６６Ｓ）は健常人からは検出されなかった。この結果より、Ｇ２６６ＳのＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異は、ＳＮＰではなく、健常人１９０例、およびＮＣＢＩのＳＮＰデータベースにも無い、新規遺伝子変異（遺伝子異常）であることが判明した。【０２４１】
【表６】
0005846372.tif 000007
【０２４２】
健常人とDravet症候群患者とにおける変異頻度の比較検討を行ったところ、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子変異Ｒ１１２６Ｈは、Dravet症候群に統計的有意に多い（ｐ＝０．００６１）ことが示され、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子変異Ｒ２２０１Ｑも、Dravet症候群に多い傾向があることが明らかになった（ｐ＝０．０５２）。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子においてＲ１１２６ＨおよびＲ２２０１Ｑの両方の変異を同時に有している患者は、Dravet症候群にのみ有意に検出され（４７例中４例）、健常人には検出されなかった（ｐ＝０．００１４）。この４例の患者の両親のＤＮＡを検査することにより、Ｒ１１２６ＨおよびＲ２２０１Ｑの両方の変異は１つの染色体上、すなわち同じＣＡＣＮＡ１Ａタンパク質分子内に、２つの変異を同時に有していること、およびその２重変異は親から遺伝したことが明らかになった。【０２４３】
〔実施例４：遺伝子型と症状の関連についての検討〕
ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の９種類が、疾患の症状悪化にどのように影響を与えているか検討を行った。発作症状データが詳細に整っているDravet症候群患者において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子変異のみを有している患者２０例と、ＳＣＮ１Ａ遺伝子およびＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方に変異を有している１９例の患者に関して、１歳未満での発作症状を比較検討した。その結果を表７に示す。尚、表７に記載の「ＧＴＣ」は、全身性強直・間代発作（generalized tonic-clonc seizure）の略語であり、「ＣＰＳ」は、複雑部分発作（complex partial seizure）の略語である。【０２４４】
【表７】
0005846372.tif 000008
【０２４５】
ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子変異を有している患者では、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子変異を有していない患者と比較して、（i）発作の開始時期（Seizure onset）が有意に早くなること（ｐ＝０．０４９）、（ii）けいれん発作が１０分以上続く遷延発作（prolonged seizure）の回数が有意に多くなること（ｐ＝０．０１９）、および（iii）半身けいれん（Hemiconvulsion）の頻度が有意に高くなること（ｐ＝０．０４１）が明らかになった。このことは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の異常に加えて、多型を含むＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異を有している場合に、何らかの形で症状の悪性化につながる可能性があることを示している。【０２４６】
〔実施例５：変異型電位依存性カルシウムイオンチャネルの機能解析〕
変異型カルシウムイオンチャネルおよび正常型（野生型）カルシウムイオンチャネルについて、培養細胞を用いた機能解析を行った。まず、ヒトのＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子（配列番号４）のｃＤＮＡを用いて、変異型ＣＡＣＮＡ１Ａ（Ｇ２６６Ｓ；Ｒ１１２６Ｈ；Ｒ２２０１Ｑ；deletion ２２０２−２２０５；Ｒ１１２６ＨおよびＲ２２０１Ｑの２重変異）遺伝子を有する発現ベクターを作製した。各変異箇所を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて作製した後、その断片を正常型ｃＤＮＡの対応する断片と置換することにより変異型ｃＤＮＡを作製した。コントロールとして、正常型（野生型）のＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子を有する発現ベクター（pMO14X2-CACNA1A）を使用した。【０２４７】
変異型カルシウムイオンチャネルおよび正常型カルシウムイオンチャネルについて、培養細胞を用いて機能解析を行った。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子産物である電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型は、同じく電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１を構成する、α２δサブユニットおよびβ４サブユニットによる機能調節を受けている。このため、αサブユニット１型をコードするＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子有する発現ベクターと、β４サブユニットをコードするヒトＣＡＣＮＢ４遺伝子（GenBankアクセション番号 U95020）（配列番号１５１）およびα２δサブユニットをコードするウサギα２δ遺伝子（GenBankアクセション番号 NM_001082276）（配列番号１５２）を有する発現ベクターとを、トランスフェクション試薬を用いてヒト腎細胞ＨＥＫ２９３に共発現させた。全細胞記録によるパッチクランプ法で電気生理学的特性を検討した。【０２４８】
具体的には、カルシウムイオンチャネル電流の記録は、２２℃〜２４℃の室温において、トランスフェクション後７２時間に行った。multistage P-97 Flaming-Brown micropipette pullerを用いて、ホウケイ酸ガラス（borosilicate glass）からパッチ電極を作製した。【０２４９】
細胞内液の組成は、１１０ｍＭ  ＣｓＯＨ，２０ｍＭ  ＣｓＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，５ｍＭ  ＭｇＡＴＰ，５ｍＭ  creatine-phosphate，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした。一方、細胞外液の組成は、５ｍＭ  ＢａＣｌ，１５０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ，１０ｍＭ  グルコース，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした。増幅器はAxopatch200B（Axon Instruments）を用いた。【０２５０】
変異チャネルの電気生理学的特性は、電位依存性チャネル活性化、不活性化、不活性化からの回復、および持続性電流を調べ、正常型と比較検討した。活性化曲線および不活性化曲線はBoltzmann functionで解析させ、half-maximal activation/inactivation（Ｖ１／２）とslope factor（ｋ）とを求めた。不活性からの回復曲線は、two exponential functionで解析させた。統計はunpaired Student’s t testを用いた。データ解析にはClampfit 8.2ソフトウエアおよびOriginPro 7.0 (OriginLab)ソフトウエアを用いた。【０２５１】
図１３および図１４は、パッチクランプ法を用いて、カルシウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。図１３および図１４のグラフでは、正常型カルシウムイオンチャネルを「ＷＴ」と表記し、変異型カルシウムイオンチャネルを「Ｒ２６６Ｓ」、「Ｒ１１２６Ｈ」、「Ｒ２２０１Ｑ」、「Ｄｅｌ２２０２」、「ＲＨ＋ＲＱ」と表記している。上記変異「Ｄｅｌ２２０２」は、変異「Deletion２２０２−２２０５」を意味し、上記変異「ＲＨ＋ＲＱ」は、変異「Ｒ１１２６Ｈ＋Ｒ２２０１Ｑ」を意味している。【０２５２】
図１３の（ａ）は、正常型カルシウムイオンチャネルおよび変異型カルシウムイオンチャネルにおける電位の変化に伴うバリウム電流記録を示している。（ｂ）は電流−電圧関連、（ｃ）はピーク時の電流値（ｐＡ）、電荷の総和（ｐＦ）およびピーク電流密度（ｐＡ／ｐＦ）を示している。【０２５３】
具体的には、図１３の（ａ）は、脱分極刺激を−４０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ変化させることにより脱分極させ、流入するバリウム電流の計測を行った電流記録を示している。図１３の（ｂ）に示した電流−電圧関連は、静止膜電位よりも深い−１００ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−４０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ変化させ、各膜電位ごとに流れるバリウム電流を測定し、横軸に膜電位、縦軸に電流値をプロットしたものである。尚、図１３の（ｂ）のグラフの右下に示した図は、この実験では「静止膜電位よりも深い−１００ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−４０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ、３０ｍｓ（ミリ秒）変化させた」ことを表している。【０２５４】
その結果、正常型カルシウムイオンチャネルと比べて、変異型カルシウムイオンチャネル「Deletion２２０２−２２０５」および「Ｒ１１２６Ｈ＋Ｒ２２０１Ｑ」は、流れる電流量、ピーク時の電流値、およびピーク電流密度が有意に増加していることが明らかになった。【０２５５】
次に、カルシウムイオンチャネルの電気生理学的特性を詳細に検討するために、カルシウムイオンチャネルの電位依存的活性化（図１４の（ａ））、活性化の時定数（τ）（図１４の（ｂ）、（ｃ））、カルシウムイオンチャネルの不活性化（図１４の（ｄ））、および不活性化の時定数（τ）（図１４の（ｅ））を測定した。【０２５６】
図１４の（ａ）に示した活性化曲線は、上記図１３の（ｂ）のグラフから得られた最大ナトリウム電流値を１として、各膜電位ごとに流れるバリウム電流値を相対値で表し、得られた曲線をBoltzmann functionで解析することによって、half-maximal activation（Ｖ１／２）とslope factor（ｋ）とを求めた。尚、図１４の（ａ）のグラフの右下に示した図は、この実験では「静止膜電位よりも深い−１００ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−４０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ、３０ｍｓ（ミリ秒）変化させた」ことを表している。【０２５７】
カルシウムイオンチャネルの電位依存的活性化の解析の結果、（i）変異型カルシウムイオンチャネル「Ｇ２６６Ｓ」および「Ｒ１１２６Ｈ」は、正常型に比べて有意に過分極シフトを示していること、（ii）slope factor（ｋ）値の比較から、変異型カルシウムイオンチャネル「Ｒ１１２６Ｈ」および「Deletion２２０２−２２０５」は、正常型に比べて有意に電位依存性が増加していることが明らかになった（図１４の（ａ）および表８を参照）。このことは、変異型カルシウムイオンチャネル「Ｇ２６６Ｓ」、「Ｒ１１２６Ｈ」および「Deletion２２０２−２２０５」は、低い膜電位でも容易にチャネルが活性化してしまい、神経細胞の過剰興奮を引き起こす傾向にあることを意味している。【０２５８】
カルシウムイオンチャネルの電気生理学的特性を表８にまとめた。正常型ＣＡＣＮＡ１Ａと変異型ＣＡＣＮＡ１Ａとの統計的な比較は、Student's t testによって行った。表８中に記載される「＊」は、危険率５％未満において、正常型ＣＡＣＮＡ１Ａと変異型ＣＡＣＮＡ１Ａとの間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、正常型ＣＡＣＮＡ１Ａと変異型ＣＡＣＮＡ１Ａとの間に有意差があることを表す。【０２５９】
【表８】
0005846372.tif 000009
【０２６０】
図１４の（ｂ）は、チャネルの電位依存的活性化の時定数、すなわち、各電流での６６．７％に達するまでの時間を表している。また、図１４の（ｃ）は、２０ｍＶでの電位依存的活性化の時定数を表している。図１４の（ｂ）および（ｃ）から、変異型カルシウムイオンチャネル「Ｇ２６６Ｓ」は、正常型に比べて２０ｍＶでの電位依存的活性化の時定数が有意に小さいことが示された。このことは、変異型カルシウムイオンチャネル「Ｇ２６６Ｓ」は、短い脱分極の間に、多くの電流を流すと考えられる為、神経細胞の過剰興奮を引き起こす傾向にあることを意味している。【０２６１】
図１４の（ｄ）は、カルシウムイオンチャネルの電位依存的な不活性化曲線を表し、膜電位を変化させてカルシウムイオンチャネルを活性化させたのち、引き続いて脱分極刺激を与えてどのくらいのバリウム電流が流れるかを計測したものである。尚、図１４の（ｄ）のグラフの左下に示した図は、この実験では「−１００ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−１２０ｍＶから＋６０ｍＶまで２０ｍＶずつ、２ｓ（秒）変化させ、続けて２０ｍＶに変化させた」ことを表している。【０２６２】
カルシウムイオンチャネルの電位依存的な不活性化曲線に関しては、変異型も正常型も有為な差は認められなかった。【０２６３】
図１４の（ｅ）は、不活性化の時定数（τ）を検討した結果を示している。不活性化には、早い成分の不活性化と遅い成分の不活性化との二相性がある。図１４の（ｅ）中の左図「τｆａｓｔ」は、早い成分の不活性化が３３．３％に達するまでの時間を表した定数であり、右図「τｓｌｏｗ」は、遅い成分の不活性化が３３．３％に達するまでの時間を表した定数である。これらの不活性化の時定数は、具体的には、不活性化曲線をClampfit 8.2ソフトウエアを用いて解析することにより算出した。【０２６４】
その結果、正常型カルシウムイオンチャネルおよび変異型カルシウムイオンチャネルにおける不活性化の時定数に有意差はなかった。以上の変異型カルシウムイオンチャネルの生理学的特性を表９に示す。表９中に記載される上向きの矢印（↑）は、チャネル活性の増加が認められたことを表し、「−」は、チャネル活性に変化が認められなかったことを表す。【０２６５】
【表９】
0005846372.tif 000010
【０２６６】
カルシウムイオンチャネルにおける「Ｒ２２０１Ｑ」以外の変異は、gain of function型の変異であり、神経細胞が興奮しやすくなる傾向にあることが明らかになった。【０２６７】
〔実施例６：Dravet症候群の発症モデルラットの作製〕
上記知見より、ＳＣＮ１ＡおよびＣＡＣＮＡ１Ａの両方に何らかの変異を有していることが、Dravet症候群の発症に重要であると考えられた。そこで、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のα１サブユニット遺伝子Ｓｃｎ１ａの変異と、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニット遺伝子Ｃａｃｎａ１ａの変異の両方を有するラットを作製し、症状の悪性化について検討を行った（ヒトの遺伝子はＳＣＮ１ＡおよびＣＡＣＮＡ１Ａと表記し、ラットの遺伝子はＳｃｎ１ａおよびＣａｃｎａ１ａと表記した）。【０２６８】
具体的には、Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異を有するラット（F344-Scn1aKyo811）と、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の変異とを有するラット（GRY(groggy rat, Cacna1agry)）を親ラットとして用いた。それぞれのマウスを以下に説明する。【０２６９】
＜F344-Scn1aKyo811＞
ＥＮＵミュータジェネシスにより作製された、電位依存性ナトリウムチャンネルＮａＶ１．１のα１サブユニット遺伝子（Ｓｃｎ１ａ）にミスセンス変異を有するラット。第１４１７位のアミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）がヒスチジン（Ｈ）に変異している（「Ｎ１４１７Ｈ」と表す）。ヒト全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）のモデル動物。背景系統はＦ３４４／ＮＳｌｃラット。京都大学医学研究科附属動物実験施設より分与された。【０２７０】
＜GRY(groggy rat, Cacna1agry)＞
Scl:Wistarにメチルニトロソウレアを投与して作製された、運動失調および欠神様発作を主症状とするミュータントラット。常染色体劣性遺伝様式をとり、電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニットにミスセンス変異を有する。第２５１位のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）がリジン（Ｋ）に変異している（Ｍ２５１Ｋ）。京都大学医学研究科附属動物実験施設より分与された。【０２７１】
図１１は、ヒトのＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列およびラットのＣａｃｎａ１ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を表す図である。図１１に示すアミノ酸配列の上段は、ラットのＣａｃｎａ１ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBankアクセション番号NM_012918）（配列番号１４７）を表し、下段は、ヒトのＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBankアクセション番号NM_023035）（配列番号３）を表す。また、図１１中、四角で囲ったアミノ酸「Ｍ」は、ヒトの変異型ＣＡＣＮＡ１Ａ（Ｍ２４９Ｋ）タンパク質（配列番号１４８）、およびラットの変異型Ｃａｃｎａ１ａ（Ｍ２５１Ｋ）タンパク質（配列番号１４９）において、アミノ酸「Ｍ」からアミノ酸「Ｋ」に変異を生じるアミノ酸を表している。【０２７２】
図１１示すようにラットの電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニットにおける上記変異（Ｍ２５１Ｋ）は、ヒトの電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニットにおける変異（Ｍ２４９Ｋ）に相当する。【０２７３】
このようなF344-Scn1aKyo811と、GRY(groggy rat, Cacna1agry)とを交配させて、それぞれの遺伝子変異を有するラットを作製した。【０２７４】
（１．変異型電位依存的ナトリウムイオンチャネルの機能解析）
ラットを用いた検証を行う前に、変異型ナトリウムイオンチャネルおよび正常型ナトリウムイオンチャネルについての、培養細胞を用いた機能解析を行った。Ｓｃｎ１ａ遺伝子に変異を有するラット（F344-Scn1aKyo811）では、Ｓｃｎ１ａ遺伝子がコードするタンパク質の第１４１７位のアミノ酸であるアスパラギン（ＡＡＴ）がヒスチジン（ＣＡＴ）に変化している（Ｎ１４１７Ｈ）。第１４１７位のアスパラギンはナトリウムイオンチャネル第３ドメインのイオン透過に関わるポア形成領域に位置する。そこで、まず、F344-Scn1aKyo811が有する変異型電位依存的ナトリウムイオンチャネルの機能解析を行った。【０２７５】
具体的には、ヒトのＳＣＮ１Ａ遺伝子のｃＤＮＡを用いて、ミスセンス変異を有する変異型ＳＣＮ１Ａ（Ｎ１４１７Ｈ）遺伝子（配列番号１５０）を有する発現ベクターを作製した。コントロールとして、正常型（野生型）のＳＣＮ１Ａ遺伝子（配列番号２）を有する発現ベクターを作製した。【０２７６】
図１は、ヒトのＳＣＮ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列およびラットのＳｃｎ１ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を表す図である。図１に示すアミノ酸配列の上段は、ヒトのＳＣＮ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を表し、下段は、ラットのＳｃｎ１ａ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４４）を表す。また、図１中、四角で囲ったアミノ酸「Ｎ」は、ヒトの変異型ＳＣＮ１Ａ（Ｎ１４１７Ｈ）タンパク質（配列番号１４５）、およびラットの変異型ＳＣＮ１Ａ（Ｎ１４１７Ｈ）タンパク質（配列番号１４６）において、アミノ酸「Ｎ」からアミノ酸「Ｈ」に変異を生じるアミノ酸を表している。【０２７７】
変異型ナトリウムイオンチャネルおよび正常型ナトリウムイオンチャネルについて、培養細胞を用いて機能解析を行った。ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物である電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型は、同じく電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成する、β１サブユニットおよびβ２サブユニットによる機能調節を受けている。このため、αサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子有する発現ベクターと、β１サブユニットをコードするＳＣＮ１Ｂ遺伝子およびβ２サブユニットをコードするＳＣＮ２Ｂ遺伝子を有する発現ベクターとを、トランスフェクション試薬を用いてヒト腎細胞ＨＥＫ２９３に共発現させた。全細胞記録によるパッチクランプ法で電気生理学的特性を検討した。【０２７８】
具体的には、ナトリウムイオンチャネル電流の記録は、２２℃〜２４℃の室温において、トランスフェクション後２４時間〜４８時間に行った。multistage P-97 Flaming-Brown micropipette pullerを用いて、ホウケイ酸ガラス（borosilicate glass）からパッチ電極を作製した。【０２７９】
細胞内液の組成は、１１０ｍＭ  ＣｓＦ，１０ｍＭ  ＮａＦ，２０ｍＭ  ＣｓＣｌ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした。一方、細胞外液の組成は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣｌ，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした。増幅器はAxopatch200B（Axon Instruments）を用いた。【０２８０】
変異チャネルの電気生理学的特性は、電位依存性チャネル活性化、不活性化、不活性化からの回復、および持続性電流を調べ、正常型と比較検討した。活性化曲線および不活性化曲線はBoltzmann functionで解析させ、half-maximal activation/inactivation（Ｖ１／２）とslope factor（ｋ）とを求めた。不活性からの回復曲線は、two exponential functionで解析させた。持続性Ｎａ電流は、１０μＭ  テトロドトキシン（ＴＴＸ）の添加の前後で、−１０ｍＶ、１００ｍｓで脱分極させたときの持続電流の差から求めた。統計はunpaired Student’s t testを用いた。データ解析にはClampfit 8.2ソフトウエアおよびOriginPro 7.0 (OriginLab)ソフトウエアを用いた。【０２８１】
図２〜図４は、パッチクランプ法を用いて、ナトリウムイオンチャネルの機能解析を行った結果を示す図である。図２〜図４のグラフでは、正常型ナトリウムイオンチャネルを「ＷＴ」または「ＷＴ−ＳＣＮ１Ａ」と表記し、変異型ナトリウムイオンチャネルを「Ｎ１４１７Ｈ」と表記している。【０２８２】
図２の（ａ）は、正常型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルにおける電位の変化に伴うナトリウム電流の代表例を示している。具体的には、脱分極刺激を−８０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ変化させることにより脱分極させ、流入するナトリウム電流の計測を行った。その結果、正常型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルはいずれも、チャネルとしての機能を有しており、両者に有意差はなかった。【０２８３】
図２の（ｂ）は、不活性化の時定数（τ）を検討した結果を示している。不活性化には、早い成分の不活性化と遅い成分の不活性化との二相性がある。図２の（ｂ）中の「τ１」は、早い成分の不活性化が３３．３％に達するまでの時間を表した定数であり、「τ２」は、遅い成分の不活性化が３３．３％に達するまでの時間を表した定数である。これらの不活性化の時定数は、具体的には、不活性化曲線をClampfit 8.2ソフトウエアを用いて解析することにより算出した。その結果、正常型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルにおける不活性化の時定数に有意差はなかった。【０２８４】
次に、ナトリウムイオンチャネルの電気生理学的特性を詳細に検討するために、電流−電圧関連（図３の（ａ））、ナトリウムイオンチャネルの活性化（図３の（ｂ））、ナトリウムイオンチャネルの不活性化（図３の（ｃ））、およびナトリウムイオンチャネルの不活性化からの回復（図３の（ｄ））を測定した。【０２８５】
具体的には、図３の（ａ）に示した電流−電圧関連は、静止膜電位よりも深い−１２０ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−８０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ変化させ、各膜電位ごとに流れるナトリウム電流を測定し、横軸に膜電位、縦軸に電流値をプロットしたものである。尚、図３の（ａ）のグラフの左下に示した図は、この実験では「静止膜電位よりも深い−１２０ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−８０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ、２０ｍｓ（ミリ秒）変化させた」ことを表している。【０２８６】
図３の（ｂ）に示した活性化曲線は、上記図３の（ａ）のグラフから得られた最大ナトリウム電流値を１として、各膜電位ごとに流れるナトリウム電流値を相対値で表し、得られた曲線をBoltzmann functionで解析することによって、half-maximal activation（Ｖ１／２）とslope factor（ｋ）とを求めた。尚、図３の（ｂ）のグラフの右下に示した図は、この実験では「静止膜電位よりも深い−１２０ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−８０ｍＶから＋６０ｍＶまで１０ｍＶずつ、２０ｍｓ（ミリ秒）変化させた」ことを表している。【０２８７】
図３の（ｃ）に示した不活性化曲線に関しては、同様に膜電位を変化させてチャネルを活性化させたのち、引き続いて脱分極刺激を与えてどのくらいのナトリウム電流が流れるかを計測し、half-maximal inactivation（Ｖ１／２）とslope factor（ｋ）とを求めた。尚、図３の（ｃ）のグラフの左下に示した図は、この実験では「−１２０ｍＶを保持電位として、脱分極刺激を−１４０ｍＶから＋０ｍＶまで１０ｍＶずつ、１００ｍｓ（ミリ秒）変化させ、続けて−１０ｍＶに変化させた」ことを表している。【０２８８】
図３の（ｄ）に示す不活性からの回復曲線に関しては、以下のように行った。パルス１（Ｐ１）で脱分極刺激を与えるとチャネルは開いた後、不活性化する。もとの−１２０ｍＶに戻すとナトリウムイオンチャネルは休止（resting）の状態に戻り、パルス２（Ｐ２）の刺激で再びチャネルが開く。このパルス１とパルス２の回復時間を変化させることによって、不活性化からの回復曲線を求めた。この曲線をtwo exponential functionで解析させた。正常型と比較して回復が早いか、または遅いかで、チャネルの機能がより興奮性にしやすくなったのか、反対に興奮しにくくなったのかを判定した。尚、図３の（ｄ）のグラフの右下に示した図は、この実験では「−１２０ｍＶを保持電位とし、脱分極刺激として−１０ｍＶを１００ｍｓ（ミリ秒）与えたのち、−１２０ｍＶに戻し、ｘ軸に示した各時間（ミリ秒）後に、−１０ｍＶを２０ｍｓ（ミリ秒）与えた」ことを表している。【０２８９】
その結果、電流−電圧関連、チャネルの活性化は、正常型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルで有意差は認められなかった（図３の（ａ）および（ｂ））。これに対して、チャネルの不活性化については、正常型ナトリウムイオンチャネルと変異型ナトリウムイオンチャネルとが５０％不活化する点について有意差検定をおこなったところ、変異型ナトリウムイオンチャネルでは脱分極側に有意にシフトしていた（ｐ＜０．０５）（図３の（ｃ））。【０２９０】
チャネルの不活性化からの回復に関しては、変異型ナトリウムイオンチャネルでは回復が有意に遅いことが明らかになった（図３の（ｄ））。尚、図３の（ｄ）において、不活性化からの回復の期間（Recovery period (ms)）が１〜８ｍｓの部分が、「速い成分」に相当し、不活性化からの回復の期間が１０〜１００ｍｓの部分が、「遅い成分」に相当する。【０２９１】
具体的には、不活性化からの回復における速い成分が不活性化から３３．３％回復するまでの時間を正常型ナトリウムイオンチャネルと異常型ナトリウムイオンチャネルとで比較すると、変異型ナトリウムイオンチャネルでは回復が有意に遅いことが明らかになった（正常型：τｆ＝１．７±０．１ｍｓ，ｎ＝１４；変異型：τｆ＝２．５±０．２ｍｓ（Ｐ＜０．０１），ｎ＝１２）。【０２９２】
同様に、不活性化からの回復における遅い成分が不活性化から３３．３％回復するまでの時間を正常型ナトリウムイオンチャネルと異常型ナトリウムイオンチャネルとで比較すると、変異型ナトリウムイオンチャネルでは回復が有意に遅いことが明らかになった（正常型：τｓ＝４０．３±５．３ｍｓ，ｎ＝１４；変異型：τｓ＝６０．９±７．９ｍｓ（Ｐ＜０．０５），ｎ＝１２）。【０２９３】
図４の（ａ）は、電位を変化させてナトリウムイオンチャネルを活性化させた後に、不活性化させても、全細胞記録では変異型ナトリウムチャネルは基線が元に戻っていないことより、変異型ナトリウムイオンチャネルにナトリウム電流が持続して流れていることが見て取れる。持続性ナトリウム電流は不活性化ゲートの障害と考えられている。図４の（ａ）の図から、正常型ナトリウムイオンチャネルに比べて変異型ナトリウムイオンチャネルでは時間が経過しても不活性化が不十分であることが確認された。【０２９４】
図４の（ａ）に示される持続性ナトリウム電流を求める目的のために、１００ミリ秒の脱分極刺激を与えたときに、８０ミリ秒から１００ミリ秒の間で流れる最終の電流量を、最大電流量で除した相対値（％）を求めた。結果を図４の（ｂ）に示す。これらの結果から、変異型ナトリウムイオンチャネルは、持続性ナトリウム電流が増大する特性を有することが明らかになった。【０２９５】
これらのデータは、上記変異によって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能が異常になっていることを示している。つまり、上記変異を有すると、神経細胞が過剰に興奮しやすい、すなわち、けいれんを起こしやすいことを意味している。【０２９６】
尚、ラットの電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のα１サブユニットにおける変異（Ｍ２５１Ｋ）によって、ラットの電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の機能が異常になることは、文献（Satoko Tokuda et.al., BRAINRESEARCH 1133 (2007) 168-177; Kenta Tanaka et.al., Neuroscience Letters 426 (2007) 75-80）に示されている。【０２９７】
従って、後述するＳｃｎ１ａ遺伝子およびＣａｃｎａ１ａ遺伝子の両方に上記の変異を有するラットにおいては、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１の両方の機能が異常になっていると考えられる。【０２９８】
（２．Dravet症候群の発症モデルラットにおける遺伝子変異の確認）
上述した親ラット（Ｐ）としてのF344-Scn1aKyo811と、GRY(groggy rat, Cacna1agryとの掛け合わせを行い、Ｆ１（雑種第一世代）ラットを作製し、Ｆ１ラット同士を掛け合わせてＦ２（雑種第二世代）ラットを作製した。図５は、親ラット（Ｐ）、Ｆ１ラットおよびＦ２ラットの遺伝子型を表す図である。図５の（ａ）に示すように、Ｆ１ラットは、Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異およびＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異のいずれもヘテロ接合型に有している（「Scn1a変異型ヘテロ＋Cacna1a変異型ヘテロ」と表記する）。また、図５の（ｂ）に示すように、Ｆ２ラットには９種類の遺伝子型を示すラットが生まれる。各種ラットの遺伝子型は、ラットの尾の先端組織を採取し、ＤＮＡを抽出した後に、抽出したＤＮＡを用いて、ＤＮＡシークエンス法による遺伝子変異を確認するか、または制限酵素による切断パターンを確認することによって特定した。【０２９９】
（ＤＮＡシークエンス法による遺伝子変異確認方法）
ＤＮＡシークエンス法による遺伝子変異確認は、以下のようにして行った。まず、変異点を挟むプライマー対（Ｓｃｎ１ａ増幅用プライマー対の塩基配列は配列番号５および配列番号６に示し、Ｃａｃｎａ１ａ増幅用プライマー対の塩基配列は配列番号７および配列番号８に示す）を用いてゲノムＤＮＡを増幅した後、得られたＰＣＲ産物を、PCR products pre-sequencing kit（Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England）を用いて精製した。用いたプライマー対の塩基配列は、後述する「プライマーの配列」の項を参照のこと。【０３００】
続いて、Big Dye Terminator FS ready-reaction kit（Applied Biosystems）を用いて、シークエンス反応を行い、蛍光シークエンサー（ABI PRISM3100 sequencer ;Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。【０３０１】
図６は、Ｆ２ラットにおけるＳｃｎ１ａ遺伝子およびＣａｃｎａ１ａ遺伝子の遺伝子型を、シークエンス法によって特定する方法を示す図である。図６に示すように、野生型Ｓｃｎ１ａ遺伝子では、第４２４９位のヌクレオチドは「Ａ」である。これに対して、変異型Ｓｃｎ１ａ遺伝子（Ｎ１４１７Ｈ）では、第４２４９位のヌクレオチドが「Ａ」から「Ｃ」に変異している。この結果、野生型Ｓｃｎ１ａ遺伝子では、第１４１７位のアミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）を指定するコドン「ＡＡＴ」が、変異型Ｓｃｎ１ａ遺伝子（Ｎ１４１７Ｈ）では、ヒスチジン（Ｈ）を指定するコドン「ＣＡＴ」に変異している。【０３０２】
また、野生型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子では、第７５２位のヌクレオチドは「Ｔ」である。これに対して、変異型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子（Ｍ２５１Ｋ）では、第７５２位のヌクレオチドが「Ｔ」から「Ａ」に変異している。その結果、第２５１位のアミノ酸であるメチオニンを指定するコドン「ＡＴＧ」が、リジンを指定するコドン「ＡＡＧ」に変異している。【０３０３】
（制限酵素消化による遺伝子変異確認方法）
制限酵素消化による遺伝子変異確認は、以下のようにして行った。Ｓｃｎ１ａ遺伝子における変異を検出する場合は、Ｓｃｎ１ａ遺伝子における変異点を挟むプライマー対（配列番号５および６）を用いてゲノムＤＮＡを増幅した後、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＢｃｌＩを用いて５０℃、３時間反応させた。その後、４％アガロースゲルを用いて制限酵素反応液を電気泳動し、バンドのサイズを確認した。図７は、Ｆ２ラットにおけるＳｃｎ１ａ遺伝子の遺伝子型を、制限酵素消化によって特定する方法を示す図である。【０３０４】
図７の（ａ）および（ｂ）に示すように、野生型Ｓｃｎ１ａ遺伝子はＢｃｌＩで切断されないので、バンドのサイズは、ＰＣＲ産物のサイズ（３８０ｂｐのヌクレオチド）のままであった。一方、変異型Ｓｃｎ１ａ遺伝子（Ｎ１４１７Ｈ）はＢｃｌＩで切断されるので、２本の断片（２７６ｂｐおよび１０４ｂｐのヌクレオチド）が確認された。野生型Ｓｃｎ１ａ遺伝子と変異型Ｓｃｎ１ａ遺伝子（Ｎ１４１７Ｈ）とのヘテロ接合型ラットの場合は、３本の断片（３８０ｂｐ、２７６ｂｐ、および１０４ｂｐのヌクレオチド）が確認された。図７の（ｃ）には、電気泳動の結果を示す。【０３０５】
Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子における変異を検出する場合は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子における変異点を挟むプライマー対（配列番号７および８）を用いてゲノムＤＮＡを増幅した後、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＰｃｉＩを用いて３７℃、１時間反応させた。その後、４％アガロースゲルを用いて制限酵素反応液を電気泳動し、バンドのサイズを確認した。【０３０６】
図８は、Ｆ２ラットにおけるＣａｃｎａ１ａ遺伝子の遺伝子型を、制限酵素消化によって特定する方法を示す図である。図８の（ａ）および（ｂ）に示すように、野生型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子はＰｃｉＩで切断されないので、バンドのサイズは、ＰＣＲ産物のサイズ（３５２ｂｐのヌクレオチド）のままであった。一方、変異型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子（Ｍ２５１Ｋ）は、ＰｃｉＩで切断されるので、２本の断片（２１９ｂｐおよび１３３ｂｐのヌクレオチド）が確認された。野生型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子と異常型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子（Ｍ２５１Ｋ）とのヘテロ接合型ラットの場合は、３本の断片（３５２ｂｐ、２１９ｂｐ、および１３３ｂｐのヌクレオチド）が確認された。図８の（ｃ）には、電気泳動の結果を示す。【０３０７】
〔実施例７：Dravet症候群の発症モデルラットの解析〕
Dravet症候群の発症モデルラットを用いて、Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異にＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異が加わると、発作にどのような影響（悪性化）を及ぼすかについて検討した。具体的には、温熱負荷によってけいれん発作を誘発したときの症状について、Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異のみをホモ接合型に有するラット（「Scn1a変異ホモ＋Cacna1a野生型ホモ」と表記する）と、Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異はホモ接合型で且つＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異をヘテロ接合型に有するラット（「Scn1a変異ホモ＋Cacna1a変異ヘテロ」と表記する）とを比較した。【０３０８】
Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a野生型ホモと、Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロとは、いずれもＳｃｎ１ａ遺伝子の変異（Ｎ１４１７Ｈ）がホモ接合型である。このため、ホモ接合型のＳｃｎ１ａ遺伝子の変異の条件下において、野生型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子と変異型Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子（Ｍ２５１Ｋ）とを比較することになる。【０３０９】
また、コントロールとして、Ｓｃｎ１ａ遺伝子もＣａｃｎａ１ａ遺伝子も野生型であるラット（「Scn1a野生型ホモ＋Cacna1a野生型ホモ」と表記する）、およびＳｃｎ１ａ遺伝子の変異は野生型ホモでＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異はヘテロ接合型であるラット（「Scn1a野生型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロ」と表記する）を用いた。実験に用いたラットの遺伝型を以下にまとめた。以下の（１）〜（４）の番号は、図５の（ｂ）に示した番号と対応している．
（１）Scn1awt/wtCacna1awt/wt（Scn1a野生型ホモ＋Cacna1a野生型ホモ）  雄１４匹
（２）Scn1amut/mutCacna1awt/wt（Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a野生型ホモ）  雄７匹
（３）Scn1amut/mutCacna1awt/mut（Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロ）  雄１７匹
（４）Scn1a wt/wtCacna1awt/mut（Scn1a野生型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロ）  雄１２匹。【０３１０】
上記グループ（１）〜（４）の５週齢の雄ラットに温浴負荷（４５℃）をかけ、けいれんが誘発されるときの体温、けいれんの持続時間、およびけいれんの重症度スコアを比較した。尚、けいれんが誘発されるときの体温は、発作開始時の直腸温度を測定した。けいれんの発作重症度のスコアは、０＝発作なし、１＝顔面のけいれん、２＝姿勢を保って両上肢の間体けいれん、３＝疾走またはジャンプ、４＝姿勢が保てなくなって全身のけいれん、５＝けいれんが持続して死亡、として評価した。【０３１１】
結果を図９に示す。図９は、Ｓｃｎ１ａ遺伝子の変異ラットにおよぼすＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異の影響を調べた結果を示す図である。尚、図９の（ａ）〜（ｃ）のグラフでは、Scn1amut/mutCacna1awt/wt（上記ラット（２））は「Ｓｃｎ１ａ変異ホモ」と表記した。Scn1amut/mutCacna1awt/mut（上記ラット（３））は「Ｓｃｎ１ａ変異ホモ＋Ｃａｃｎａ１ａ変異ヘテロ」と表記した。また、コントロールのScn1awt/wtCacna1awt/wt（上記ラット（１））は「ＷＴ」と表記し、コントロールのScn1awt/wtCacna1awt/mut（上記ラット（４））は「Ｃａｃｎａ１ａ変異ヘテロ」と表記した。【０３１２】
解析の結果、グループ（３）のラット（Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロ）は、グループ（２）のラット（Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a野生型ホモ）と比較して、けいれん発症時の体温（けいれん閾値）（図９の（ａ））、および重症度スコア（図９の（ｂ））に大きな差はなかった。しかし、けいれんの持続時間（図９の（ｃ））が有意に長くなることが明らかになった。この結果は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の変異が、けいれんの症状の悪性化に関わっていることを示している。【０３１３】
さらに、グループ（３）のラット（Scn1a変異型ホモ＋Cacna1a変異型ヘテロ）の発作時の脳波の一部を図１０に示す。このことから、Ｓｃｎ１ａ遺伝子とＣａｃｎａ１ａ遺伝子とに変異を有するラットは、難治性のDravet症候群のモデルラットになり得ると考えられた。当該モデルラットは、今後、難治性のDravet症候群の発症メカニズムの解明や、Dravet症候群の治療薬の開発等に有用に使用され得ると期待される。【０３１４】
また、これらの結果は、難治性のてんかんであるDravet症候群の患者においてＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異に加えてＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異が検出された、実施例１の遺伝子解析データを裏付けるものであると考えられる。つまり、本発明に係るDravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得する方法は、実施例の遺伝子解析結果、変異型チャネル機能解析結果、および動物実験の結果に裏付けられた技術であると言える。【０３１５】
〔まとめ〕
本発明は、難治性のDravet症候群の発症の分子基盤に基づいて開発されたものであり、本発明に係る判定方法は、Dravet症候群患者の早期発見方法として有用であるといえる。本発明に係る判定方法を用いることによって、予後不良のDravet症候群を、高精度に、且つ早期に発見することが可能となり、Dravet症候群の患者に対して、早期から、てんかん専門医による治療管理体制を整えることができる。この結果、患者の治療成績の向上、家族の精神的負担の軽減、および経済的負担の軽減が可能となる。また、Dravet症候群の患者に対して適切な治療を施すことができるので、医療費の削減に貢献し得ると考える。【０３１６】
さらに、本発明に係るキットを用いれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子およびＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の両方における変異を容易に検出することができる。このため、本発明に係るキットは、一般小児科医が、１歳未満の病初期に良性の熱性てんかんのなかから、専門医の治療が必要なDravet症候群の患者を選別するために有用である。【０３１７】
本発明に係る判定方法およびキットを用いることにより、これまで検出が困難であった１歳未満の時点で、Dravet症候群の患者を高精度に検出することができる。また、採血された血液を検査センターに輸送後、遺伝子異常を検査することによって、遠隔地の個人病院等であっても、Dravet症候群の患者を高精度に検出することが可能となる。【０３１８】
また、本発明に係るモデル動物および細胞は、難治性のDravet症候群の発症メカニズムの解明や、Dravet症候群の治療薬の開発等に有用に使用され得る。【０３１９】
＜プライマーの配列＞
Ｓｃｎ１ａ遺伝子の増幅、およびＣａｃｎａ１ａ遺伝子の増幅に用いたプライマー対の塩基配列を表１０に示す。【０３２０】
【表１０】
0005846372.tif 000011
【０３２１】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子ゲノムの検出に用いたプライマー対の塩基配列を表１１および表１２に示す。【０３２２】
【表１１】
0005846372.tif 000012
【０３２３】
【表１２】
0005846372.tif 000013
【０３２４】
ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子ゲノムの検出に用いたプライマー対の塩基配列を表１３および表１４に示す。表１３および表１４中、例えば、E1Fはエキソン１増幅用Sense primerを指し、E1Rvはエキソン１増幅用Antisense primerを指す。【０３２５】
【表１３】
0005846372.tif 000014
【０３２６】
【表１４】
0005846372.tif 000015
【産業上の利用可能性】
【０３２７】
以上のように、本発明では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方における変異の有無を検出することにより、Dravet症候群を発症していない被験者が、Dravet症候群を発症する可能性を判定するためのデータを高精度に取得することができる。そのため、１歳未満の病初期に良性の熱性けいれんのなかから、専門医の治療が必要なDravet症候群の患者を選別することができる。したがって、本発明は、医療機器、診断用キットなど診断医療の分野だけでなく、保健医学分野の産業に広く利用することができる。【０３２８】
また、本発明では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルＣａＶ２．１のαサブユニット１型の両方において変異を導入することにより、Dravet症候群の発症モデル動物を作製することができる。このようなDravet症候群の発症モデル動物は、Dravet症候群の治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図１】
0005846372.tif 000016
【図２】
0005846372.tif 000017
【図３】
0005846372.tif 000018
【図４】
0005846372.tif 000019
【図５】
0005846372.tif 000020
【図６】
0005846372.tif 000021
【図９】
0005846372.tif 000022
【図１０】
0005846372.tif 000023
【図１１】
0005846372.tif 000024
【図１２】
0005846372.tif 000025
【図１３】
0005846372.tif 000026
【図１４】
0005846372.tif 000027
【図７】
0005846372.tif 000028
【図８】
0005846372.tif 000029
【配列表】
0005846372000001.app