(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ、すなわち
局在光学顕微鏡法により撮像可能な状態に移行可能であるマーカーを用いて試料構造（２、３４）を準備するステップと、
像毎に、各々、前記マーカーのうちの全体のサブセットのみが、光学顕微鏡法により撮像可能な状態に移行するようにして、前記試料構造（２、３４）を逐次撮像することにより、個々の像データセットを生成するステップであって、前記サブセットのそれぞれの前記マーカーが、それぞれ撮像されたマーカーの１つを表す光分布の範囲を決める光学顕微鏡法撮像の解像限界よりも大きい平均間隔を互いの間に有する、個々の像データセットを生成するステップと、
複数の連続した個々の像データセットがそれぞれ結合された少なくとも２つのデータブロックを生成するステップと、
前記データブロックのそれぞれに含まれる前記個々の像データセットをデータブロック毎に重ねて、対応する重畳像データセットをもたらすステップと、
前記少なくとも２つのデータブロックの前記重畳像データセット間のドリフトに基づいた像オフセットを識別するステップであって、ドリフトに基づいた像オフセットのそのような識別が、撮像された試料構造（２，３４）それ自体にだけ基づいて識別するステップと、
前記識別された像オフセットに基づいて、前記データブロックの１つの前記重畳像データセットのうちの少なくとも１つに含まれる前記個々の像データセットを補正するステップと、
前記撮像されたマーカーを表す前記光分布の中心点位置を特定するステップと、
前記中心点位置をオフセット補正済みの局在顕微鏡法の全体像に組み入れるステップと、
を有する、試料構造（２、３４）を光学顕微鏡法で撮像する方法。
【請求項２】
前記データブロックのそれぞれに結合される連続した個々の像データセットの数は、前記データブロック間の相互相関により生成される相関係数が所定の閾値（ＳＷ）よりも大きくなるように定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３つ以上の重畳像データセットの状況では、前記重畳像データセットのうちの１つは基準データセットとして決定され、その他の重畳像データセットのそれぞれの前記像オフセットは、前記基準データセットに対して特定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
３つ以上の重畳像データセットの状況では、前記像オフセットは、２つの連続する重畳像データセット間で、各々特定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
補間関数が、前記識別された像オフセットに基づいて決定され、前記関数により求められる値は、前記重畳像データセット内の前記個々の像データセットが補正される基となる個々の像オフセット値を構成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
最初に、前記少なくとも１つの重畳像データセットに含まれる前記個々の像データセットが、前記識別された像オフセットに基づいて補正され、次に、前記撮像されたマーカーを表す前記光分布の前記中心点位置が特定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
最初に、前記撮像されたマーカーを表す前記光分布の前記中心点位置が、前記個々の像データセットにおいて特定され、次に、前記少なくとも１つの重畳像データセットに含まれる前記個々の像データセットの中心点位置が、前記識別された像オフセットに基づいて補正される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記像オフセットはＩＣＰアルゴリズムに従って識別される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記像オフセットは、前記重畳像データセット内の共通の下位構造を検出することにより識別される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
像オフセットの連続経時変化が、複数のサイクルで前記像オフセットを繰り返し識別することにより、および、サイクル毎に、前記データブロックに結合される個々の像データセットの数を変更することにより識別される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記像オフセットを識別する状況では、品質パラメータが決定され、前記品質パラメータに基づいて、全体像の分解能を示す変数が識別される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記中心点位置は３つの空間寸法で特定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記データブロックの１つの前記重畳像データセットのうちの少なくとも１つに含まれる前記個々の像データセットを補正する代わりに、光学顕微鏡（２０）の構成要素が、前記光学顕微鏡（２０）の像生成系に対する前記試料構造（２、３４）のドリフト移動を補償するために、前記識別された像オフセットに従って移動する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行する手段を有する装置（２０）。
【請求項１５】
前記手段はグラフィックスプロセッサ（２４）を含む、請求項１４に記載の装置（２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料構造を光学顕微鏡法で撮像する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個々のマーカー（特に、蛍光分子）の逐次確率的局在化に基づいて、従来の光学顕微鏡の回折に関連する解像限界よりも小さな試料構造を表示可能な光学顕微鏡撮像法が開発された。そのような方法は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５；非特許文献１；非特許文献２に記載されている。顕微鏡のこの新しい部門は「局在顕微鏡法」とも呼ばれる。該当する方法は、例えば、ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、（Ｆ）ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭＩＲＡ、又はＧＳＤＩＭの名称の下でも文献において既知である。
【０００３】
この新しい方法では共通して、撮像すべき試料構造は、２つの区別可能な状態、すなわち、「明」状態及び「暗」状態を有するマーカーを用いて準備される。例えば、蛍光染料がマーカーとして使用される場合、明状態は蛍光可能状態であり、暗状態は非蛍光可能状態である。試料構造を、像生成光学系の従来の解像限界よりも小さな分解能で撮像するには、マーカーの小さなサブセットが繰り返し、明状態に準備される。このサブセットを以下、「アクティブサブセット」と呼ぶ。アクティブサブセットは、明状態−−ひいては光学顕微鏡法により撮像可能な状態−−での隣接マーカーの平均間隔が、撮像光学系の撮像限界よりも大きくなるように選択しなければならない。アクティブサブセットの輝度信号が、空間分解光検出器、例えば、ＣＣＤカメラに撮像される。したがって、像生成光学系の解像限界によってサイズが決まる光点の形態の光の分布が、各マーカーから取得される。
【０００４】
結果として、複数の個々の未処理データ像が、個々の像データセットの形態で取得され、像データセットのそれぞれでは、異なるアクティブサブセットが撮像される。像解析プロセスでは、次に、光分布（明状態のマーカーを表す）の中心点が、個々の各未処理データ像で特定される。次に、個々の未処理データ像から識別された光分布の中心点が、全体像データセットの形態の１つの全体図に組み合わせられる。この全体図により生成される高分解能全体図は、マーカーの分布を反映する。したがって、「未処理データ」は以下、中心点位置を特定するために、像解析プロセスをまだ受けていないデータとして理解される。
【０００５】
撮像すべき試料構造を表現する複製のために、十分に多数の信号を検出しなければならない。しかし、特定のアクティブサブセット内のマーカーの数は、明状態で２つのマーカーの間に存在しなければならない最小平均間隔により制限されるため、試料構造を完全に撮像するには、非常に多数の個々の未処理データ像を取得しなければならない。個々の未処理データ像の数は通常、１０，０００〜１００，０００の範囲内にある。
【０００６】
個々の未処理データ像の取得に必要な時間の最短端は、光検出器の最高像取得速度により制限される。これは、全体図に必要な一連の個々の未処理データ像の合計取得時間が比較的長くなることに繋がる。したがって、合計取得時間は、数時間という長い時間になり得る。
【０００７】
この長い合計取得時間にわたり、像生成光学系に対する撮像中の試料の移動が生じ得る。すべての個々の未処理データ像は、高分解能全体像を生成するために、中心点特定後に結合しなければならないため、２つの連続した個々の未処理データ像の取得中に生じる試料と像生成光学系とのいかなる相対移動も、全体像の空間分解能を低下させる。多くの場合、この相対移動は、例えば、熱膨張若しくは熱収縮により、機械的応力により、又は機械部品に使用される潤滑剤の一貫性の変化により生じるシステムの系統的な機械的移動（「機械的ドリフト」とも呼ばれる）から生じる。
【０００８】
上述した問題を図１〜図３を参照して以下に説明する。
【０００９】
図１ａは、３つの同心円環で構成される試料構造２を概略的に示す。以下、撮像すべきこの試料構造２の構造的特徴、特に同心円環の互いの間隔が小さく、光学顕微鏡法撮像の回折限界解像限界を下回ると仮定する。
【００１０】
次に、図１ａに示される試料構造２にマーカーが提供され、これらのマーカーを明状態にすると（それにより、光学顕微鏡法により撮像できる）、結果として生成されるのは、光学顕微鏡法撮像の回折限界分解性能により、図１ｂに示される類いの顕微鏡像であり、この像では、マーカーが提供された試料構造２の個々の円環はもはや区別不可能である。図１ｂでは（及び図２及び図３でも）、図１ａに示される試料構造２は破線の円形線で示されて、この状況を示す。図１ｂに示されるように、ここでの結果はぼやけ、したがって、ハッチングで示される空間的に分解されていない光分布４である。
【００１１】
図２ａは、一連の個々の未処理データ像を示し、像のそれぞれでは、マーカーのアクティブサブセットが撮像される。アクティブマーカーは、個々の未処理データ像では、像生成光学系の解像分解によってサイズが決まる広がった光点６として見える。図２ａが示すように、光点６はそれぞれ、光点６のサイズを決めるこの解像限界よりも大きな、平均間隔を互いの間にあけて存在している。
【００１２】
図２ｂは、個々の未処理データ像から、上述した像解析プロセスで光点６の中心点位置８が識別される様式を示す。次に、個々の未処理データ像から特定される中心点位置８を結合して、図２ｃに示される全体図にする。したがって、２ｃの全体図は、図１ａに示される試料構造２の高分解能全体像を示す。
【００１３】
図３ａ及び図３ｂは、撮像中の試料構造２と像生成光学系との、２つの連続した個々の未処理データ像の取得中に生じる相対移動の結果として、全体像の空間分解能の低下がどのように生じ得るかを示す。この例では、単に説明のために、第１の個々の未処理データ像から特定される中心位置は、円１０で示され、第１の個々の未処理データ像の直後の第２の個々の未処理データ像から特定される中心点位置は、正方形１２で示されるものと仮定する。
【００１４】
図３ａは、機械的ドリフトがない理想的な状況を示す。２つの個々の未処理データ像から識別された中心点位置１０及び１２は、図１ａに示される試料構造２を精密に再現する。図３ｂは、機械的ドリフトが、第１の個々の未処理データ像に対して第２の個々の未処理データ像を変位させる場合を示す。第２の個々の未処理データ像から導出される中心点位置１２は、それに対応して、第１の個々の未処理データ像から導出される中心点位置１０からずれる。この結果は、全体像の空間分解能の低下である。
【００１５】
機械的ドリフトを補償するいくつかの方法が既知である。例えば、参照マーカー、例えば、金ナノ粒子又は蛍光ナノ粒子で試料構造に印を付け、像取得中に同時に、例えば、さらなる検出器を用いて位置を光学的に感知することが提案されている。或いは、機械的ドリフトは、適したセンサ、例えば、容量性距離測定装置を使用して測定することもできる。次に、ドリフトを補償するため、又は識別された中心点位置を補正するために、適した制御を機構に適用して、感知された像オフセットを使用することができる。しかし、あらゆる場合で、機械的ドリフトを補償するために必要な費用は割合高い。
【００１６】
特許文献６には、機械的ドリフトの補償が提供される局在顕微鏡法が開示されている。このために、個々の像間の相関が計算され、補正変数がそこから識別される。さらなる局在顕微鏡法が開示される文献（特許文献７、特許文献８及び特許文献９）をさらに参照する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ ２００６／１２７６９２ Ａ２号
【特許文献２】ＤＥ １０ ２００６ ０２１ ３１７ Ｂ３
【特許文献３】ＷＯ ２００７／１２８４３４ Ａ１号
【特許文献４】ＵＳ ２００９／０１３４３４２ Ａ１
【特許文献５】ＤＥ １０ ２００８ ０２４ ５６８ Ａ１
【特許文献６】ＵＳ ２００８／０１８２３３６ Ａ１
【特許文献７】ＵＳ ７，６７５，０４５ Ｂ１
【特許文献８】ＤＥ１０ ２００８ ０４９ ８７８ Ａ１
【特許文献９】ＷＯ ２０１０／０６２３６４ Ａ１
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】「Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy（ＳＴＯＲＭ）」，Nature Methods ３，７９３−７９６（２００６），M．J．Rust，M．Bates，X．Zhuang
【非特許文献２】「Resolution of Lambda／１０ in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching」，Geisler C．et al，Appl．Phys．A，８８，２２３−２２６（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、わずかな技術的費用で機械的ドリフトを確実に補償可能な、試料構造を光学顕微鏡法で撮像する方法及び装置を記載することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、以下のステップ、すなわち、
局在光学顕微鏡法により撮像可能な状態に移行可能なマーカーを用いて試料構造を準備するステップと、
像毎に、各々、マーカーのうちの全体のサブセットのみが、光学顕微鏡法により撮像可能な状態に移行するようにして、試料構造の逐次撮像により個々の像データセットを生成するステップであって、各サブセットのマーカーは互いの間に平均間隔を有し、平均間隔は、撮像される各マーカーの１つを表す光分布の範囲を決める光学顕微鏡法撮像の解像分解よりも大きい、ステップと、
複数の連続した個々の像データセットがそれぞれ結合される少なくとも２つのデータブロックを生成するステップと、
各データブロックに含まれる個々の像データセットをデータブロック毎に重ねて、対応する重畳像データセットをもたらすステップと、
前記少なくとも２つのデータブロックの重畳像データセット間のドリフトに基づいた像オフセットを識別するステップであって、ドリフトに基づいた像オフセットのそのような識別が、撮像された試料構造（２，３４）それ自体にだけ基づいて識別するステップと、
識別された像オフセットに基づいて、前記データブロックの１つの重畳像データセットのうちの少なくとも１つに含まれる個々の像データセットを補正するステップと、
撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置を特定するステップと、
中心点位置をオフセット補正済みの局在顕微鏡法の全体像に組み入れるステップと、
によりこの目的を方法に関して達成する。
【００２１】
本発明は、個々の像データセットを結合して、少なくとも２つの（しかし、一般には３つ以上の）データブロックにし、各データブロックに含まれる個々の像データセットを重ねて、重畳像データセットをもたらすことを提供する。すると、重畳像データセットは、個々の各像データセットよりもはるかに多数のマーカーを含む。各データブロックが大きいほど、すなわち、各重畳像データセットをもたらすために重ねられる個々の像データセットが多いほど、各重畳像データセットに含まれる構造情報はより完全になる。次に、重畳像データセットに含まれる構造情報を使用して、連続した各重畳像データセット間の像オフセットを識別する。
【００２２】
各像オフセットが識別される時間分解能は、各重畳像データセットに含まれる個々の像データセットの数と相関する。その数が小さいほど、時間分解能は高くなる（個々の各像の像取得時間が一定であると仮定して）。したがって、一方では、像オフセットの提供に十分な構造情報が提供され、他方では、可能な限り最高の時間分解能が達成されるように設定された、各重畳像データセットに結合される個々の像データセットの数を選択することが望ましい。
【００２３】
本発明による方法は、ドリフト補償のために別個の測定装置を必要とせずに、又は追加の準備費用なし、例えば、参照マーカーの使用なしで、ドリフト補償を達成できるという利点を有する。したがって、ドリフトは、適したソフトウェアプログラムを使用して純粋に計算で補償して、像生成系に対する試料構造の望ましくない機械的移動を補償することができる。
【００２４】
本発明による方法は、すべての既知の顕微鏡方法、特に、ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、（Ｆ）ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭＩＲＡ、又はＧＳＤＩＭ等のすべての局在顕微鏡方法で使用可能である。これは、マーカー（通常、光活性化可能な分子）を明状態（すなわち、光学顕微鏡法で撮像可能）と暗状態とで切り替えるプロセスがどのように実現されるかに関係なく当てはまる。
【００２５】
結合されて各データブロックになる連続した個々の像データセットの数は、好ましくは、データブロック間の相互相関により作られた補正係数が所定の閾値よりも大きくなるように定義される。相互相関は、一方では、実行できる補正ステップ数が可能な限り多くなるように可能な限り小さく、しかし他方では、データブロックが全体的に確率的な性質のものではない大きな実際像のオフセットを特定するために十分な構造情報を含むのに十分に大きくもなるようにブロックサイズを定義する能力を提供する。ここで、補正係数は、データブロックに含まれる構造情報の重要性表示を表す。
【００２６】
各データブロック内の連続した個々の像データセットの数は、別の方法で決定することもできる。例えば、この数は、各重畳像データセット内で識別された中心点位置の平均間隔に基づいて決定することができる。各重畳像データセットで感知されるマーカーの数を利用して、重畳像データセットをもたらすために重ねられる個々の像データセットの数を定義することもできる。さらなる可能性は、各重畳像データセット内で感知されたマーカーの確率的分布を解析し、個々の像データセットの数をそこから決定することである。
【００２７】
この数は、個々の重畳像データセットで同じである必要はない。特に、スイッチオフプロセス、すなわち、明状態から暗状態へのマーカーの変換が、漂白により行われる場合（例えば、国際公開第２００６／１２７６９２  Ａ３号パンフレットの場合のように）、重畳像データセットを時間順に大きくすることが有利であり得る。
【００２８】
この方法の有利な実施形態では、補間関数が、識別された像オフセットに基づいて決定され、上記関数の値は個々の像オフセット値を構成し、それに基づいて、各重畳像データセット内の個々の像データセットが補正される。それにより、各重畳像データセットに含まれる個々の各像データセットを、別個の像オフセット値を用いて補正することが可能であり、それにより、さらに高精度のドリフト補償が可能になる。
【００２９】
撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置は、オフセット補正前又は後に特定することができる。前者の場合、最初に、少なくとも１つの重畳像データセットに含まれる個々の像データセットは、識別された像オフセットに基づいて補正され、次に、撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置が特定される。後者の場合、逆に、最初に、撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置が、個々の像データセット内で特定され、次に、少なくとも１つの重畳データセットに含まれる個々の像データセットの中心点位置が、識別された像オフセットに基づいて補正される。
【００３０】
像オフセットは、様々な方法を使用して識別することができる。好ましい実施形態では、像オフセットは、例えば、「Object Modeling by Registration of Multiple Range Images」，Y．Chen and G．Medioni，Proc．ＩＥＥＥ Conf．On Robotics and Automation，１９９１；並びに「A Method for Registration of ３−Ｄ Shapes」，P．Besl and M．McKay，Trans．ＰＡＭＩ，Vol．１４，No．２，１９９２に記載のように、「反復最近点」（ＩＣＰ）アルゴリズムに従って識別される。このアルゴリズムを用いて、いわゆるポイントクラウドを互いに適合させることが可能であり、ポイントクラウドの間隔が最小化されるようなポイントクラウドの座標変換が決定される。これは、１つのポイントクラウドのポイント毎に、その他のポイントクラウドの各最近傍ポイントを特定することを含む。間隔の二乗和は、変換パラメータを適合することにより最小化される。これは、最適が見つけられるまで繰り返し行われる。
【００３１】
しかし、像オフセットの識別は、上述した方法に限定されない。例えば、像オフセットは、重畳像データセット内の共通の下位構造を検出することにより識別することもできる。下位構造の検出は、ここでは、適した像解析、例えば、エッジ検出又はパターン認識により行われる。
【００３２】
相互相関により、２つの重畳像データセットの像オフセットを特定することも可能である。
【００３３】
この方法のさらなる有利な改良形態では、複数のサイクルで像オフセットを繰り返し識別し、データブロックに結合される個々の像データセットの数をサイクル毎に変更することにより、像シフトの連続した時間経過が識別される。これは、本発明による像オフセット解析が、異なるデータブロック分類で繰り返され、それにより、像ドリフトの連続時間経過を検出することを意味する。
【００３４】
像オフセットを識別する状況の中では、品質パラメータを決定し、品質パラメータに基づいて、全体像の分解能を示す変数を識別することが好ましい。上述した方法、例えば、ＩＣＰアルゴリズム又は相互相関により、像重畳精度の表示であり、したがって、像重畳精度の品質パラメータを表す特徴付けパラメータ（例えば、ＩＣＰアルゴリズムの様々なマトリックス又は相互相関係数）を決定することができる。そのような品質パラメータに基づいて、連続したドリフト補正後に予期される有効像分解能を示すことができる。
【００３５】
さらに有利な改良形態では、中心点位置が３つの空間寸法で特定される。これは、本発明によるドリフト補償を、一平面（通常、Ｘ−Ｙ平面と呼ばれる）のみならず、さらにその平面に直交する平面（通常、Ｚ方向と呼ばれる）でも行うことができることを意味する。この種のいわゆる「３Ｄ」用途に関しては、例えば、「Three-dimensional sub-１００ nm resolution fluorescence microscopy of thick samples」，Juette，Manuel F．et al，Nature Methods ５，２００８，ｐｐ．５２７−５２９を参照する。
【００３６】
本発明による方法は、識別された像オフセットに基づいて個々の像データセットの補正を提供する。この方法ステップへの追加又は代替として、識別された像オフセットを使用し、識別された像オフセットに従って光学顕微鏡の構成要素を移動させて、光学顕微鏡の像生成系に対する試料構造のドリフト移動を補償することも可能である。光学顕微鏡の上述した構成要素は、例えば、試料構造が保持される試料ホルダである。制御は、この状況では、閉制御ループで顕微鏡構成要素に適用することができる。この改良形態には、技術費用の増大が関連するが、恐らく、光軸に沿った機械的ドリフト、すなわち、焦点面ドリフトの補償に関して有利である。
【００３７】
本発明はさらに、上述した方法を実行する手段を有する装置に関する。
【００３８】
これらの手段は、好ましくは、グラフィックスプロセッサを含む。この種のグラフィックスプロセッサ（ＧＰＵ）は、方法を構成する方法ステップの並列化の良好な性能により、本発明による方法の実行に特に適する。これは特に、像オフセットを識別する方法ステップ及び撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置を特定する方法ステップに当てはまる。
【００３９】
本発明について図を参照してさらに詳細に以下において説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】光学顕微鏡法により撮像すべき構造上の特徴が光学顕微鏡法撮像の解像限界よりも小さい例示的な試料構造を概略的に示す。
【図１ｂ】マーカーを用いて準備された図１ａによる試料構造の分解能が制限された光学顕微鏡像を示す概略図である。
【図２ａ】それぞれでマーカーのアクティブサブセットが撮像された一連の個々の未処理データ像を示す。
【図２ｂ】個々の未処理データ像から識別された中心点位置を有する図２ａの像シーケンスに対応するシーケンスを示す。
【図２ｃ】図２ｂに示される中心点位置が結合される高分解能全体像である。
【図３ａ】２つの連続した個々の未処理データ像からの中心点位置が、例示のために結合される、図１ａによる試料構造のドリフトのない全体像である。
【図３ｂ】図３ａにより、２つの連続した個々の未処理データ像の中心点位置が結合される、図１ａによる試料構造のドリフトの影響を受けた全体像である。
【図４】本発明による方法を実行する光学顕微鏡の構築を示す。
【図５ａ】複数のデータブロックに結合される一連の個々の未処理データ像を示す。
【図５ｂ】各データブロックに結合される個々の未処理データ像が重ねられた重畳像を示す。
【図５ｃ】図５ｂに示される像に対応し、識別された中心点位置が示される重畳像を示す。
【図６】ドリフト関連の像オフセットを識別し補正する本発明による方法ステップを有するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図４は、例示的な実施形態として、試料構造を撮像する本発明による方法の実行に適した光学顕微鏡２０を示す。
【００４２】
光学顕微鏡２０は光源２２を含み、光源２２は、２枚のレンズ２４及び２６から構成されるレンズ系に励起光を発する。このレンズ系は、光源２２から発せられた励起光を所望のようにコリメートするように機能する。次に、コリメートされた励起光は集束レンズ２８に入射する。集束レンズ２８は、励起光を対物レンズ３０の開口部に結像し、励起光はまず、励起光にとって透明なダイクロイックミラー３２を通過する。対物レンズ３０から出た励起光は、標本スライド３６に搭載された試料構造３４に入射する。
【００４３】
上述したように、試料構造３４は、マーカー、例えば、蛍光分子を用いて準備される。上述した方法を利用して、これらのマーカーの各部分を明状態に移行させ、それにより、アクティブサブセットを生成することができる。
【００４４】
試料構造３４から発せられた光は、対物レンズ３０を通過し、ダイクロイックミラー３２に入射する。ダイクロイックミラー３２は、試料構造３４から発せられた光を反射し、それにより、光を光検出器４０、例えば、ＣＣＤカメラに向けて集束させるレンズ３８に向けるように実施される。光検出器４０は、受けた光を電気信号に変換し、電気信号をグラフィックスプロセッサ４２に出力する。
【００４５】
図４の光学顕微鏡により実行される方法の本発明による態様を、図５ａ、図５ｂ、及び図５ｃを参照して以下に示す。ここでは、図４にただ示された試料構造３４が図１ａによる試料構造２と同一であると仮定する。
【００４６】
図５ａは、１〜ｎｍと順に付番された一連の個々の像を示し、ｎｍは１よりも大きな整数である。これらの個々の像１，…，ｎｍのそれぞれは、試料構造３４の準備に用いられたマーカーの異なるアクティブサブセットを示す。特定のサブセットのマーカーは、図４による光学顕微鏡２０の回折限界解像限界よりも大きな平均間隔だけ互いに離間された空間分布を示す。簡潔にするために、示される個々の像のうちの最初の３つのみの、マーカーの光学顕微鏡法撮像により生成される光分布を図５ａに示す。
【００４７】
光検出器４０により生成された図５ａによる個々の像１，…，ｎｍは、グラフィックスプロセッサ４２により処理可能な未処理データを含む対応する個々の像データセットに変換される。個々の像データセットが生成されると、像データセットを結合して、図５ａに示されるｍ個のデータブロックにする。この例では、１番目のデータブロックはＮ１個の個々の像データセットを含み、２番目のデータブロックはＮ２個の個々の像データセットを含み、…、ｍ番目のデータブロックはＮｍ個のデータセットを含む。
【００４８】
各データブロックに含まれる個々の像データセットが結合されて、重畳像データセットになる。したがって、１番目のデータブロックのＮ１個の個々の像データセットは、１番目の対応する像データセットをもたらし、２番目のデータブロックのＮ２個の個々の像データセットは２番目の重畳像データセットをもたらし、…、ｍ番目のデータブロックのＮｍ個の個々の像データセットはｍ番目の重畳像データセットをもたらす。対応する重畳像を図５ｂに示す。重畳像データセットは、個々の各像よりもはるかに多数のマーカー信号を含む（特定のデータブロックサイズＮ１、Ｎ２、…、Ｎｍに応じて）。
【００４９】
データブロックサイズＮ１、Ｎ２、…、Ｎｍは、一方では、２つの連続した重畳像データセット間の像オフセットを識別するのに十分な構造情報を重畳像データセットが含むように選択される。他方、データブロックサイズＮ１、Ｎ２、…、Ｎｍは、可能な限り多数のデータブロックが作成され、２つの連続した重畳像データセットのそれぞれ間の像オフセットを可能な限り頻繁に識別できるように、十分に小さくなるようにも意図される。結果として、像ドリフトを高い時間分解能で補正することができる。適したデータブロックサイズＮ１、Ｎ２、…、Ｎｍを決定する方法の例について、図６のフローチャートを参照して後述する。
【００５０】
図５ｂによる重畳像データセットは、マーカーに対応する光分布を含み、上記分布の範囲は光学顕微鏡２０の回折限界分解能力によって決まる。したがって、重畳像データセットはなお未処理データ、すなわち、中心点補正前のデータを含む。連続した重畳像データセット間の像オフセットは、未処理データ自体に基づいて（すなわち、図５ｂに示される重畳像データセットに基づいて）識別することもでき、又は個々の像データセット内の中心点位置を特定し、中心点位置を重ねた後に識別することもできる。像オフセットを識別するために、後者の場合に利用されるデータセットを図５ｃに示す。
【００５１】
ドリフト関連の像オフセットの、本発明による識別及び補正の具体的で例示的な実施形態について、図６のフローチャートを参照して後述する。
【００５２】
まず、ステップＳＴ１及びＳＴ２において、１番目及び２番目のデータブロックに適したブロックサイズが決定される。これは、各データブロックに含まれる個々の像データセットの数が決定されることを意味する。例示的な本実施形態では、相互相関方法が、ステップＳＴ１においてこのために使用される、すなわち、大きさＳ１と大きさＳ２との相互相関（記号○の中に×で示される）が計算される。２つの大きさＳ１及びＳ２は、上述した重畳像データセットを構成し、Ｓ１は１番目のデータブロックに関連付けられた個々の像データセットＡｎの和又は重畳であり、Ｓ２は２番目のデータブロックに関連付けられた個々の像データセットＡｍの和又は重畳である。ステップＳＴ１において、ｎ及びｍのそれぞれは制御変数を示し、ｎ１は、１番目のデータブロック又は１番目の重畳像データセットの最後の個々の像データセットの数を示し、ｎ２は、２番目のデータブロック又は２番目の重畳像データセットの最後の個々の像データセットの数を示す。ステップＳＴ１及びＳＴ２により構成されるループの開始時に、ｎ１は初期値Δに設定される。大きさＣ１は相互相関マトリックスを表す。
【００５３】
相互相関マトリックスが、ステップＳＴ１において最初に計算されると、ステップＳＴ２は、ステップＳＴ２においてＭａｘ（Ｃ１）として示されるマトリックスＣ１の最大が、所定の閾値ＳＷよりも大きいか否かを判断する。閾値ＳＷは、Ｍａｘ（Ｃ１）が閾値ＳＷよりも大きい場合、相互相関が有意であり、すなわち、２つの大きさＳ１及びＳ２のそれぞれが、２つの対応する重畳像データセット間のオフセットの特定に十分な構造情報を含むように事前に決定される。ステップＳＴ２でのＭａｘ（Ｃ１）が閾値ＳＷよりも大きい場合、方法はステップＳＴ３に続く。その他の場合、ｎ１はΔだけ増やされ、ステップＳＴ１が再び実行される。したがって、ＳＴ１及びＳＴ２で構成されるループは、Ｍａｘ（Ｃ１）が所定の閾値ＳＷよりも大きくなるのに十分な回数を通して循環される。
【００５４】
ステップＳＴ３において、１番目のデータブロックに対応する１番目の重畳像データセットと２番目のデータブロックに対応する２番目の重畳像データセットとの平均オフセット
【数１】
0005883855.tif 000002
が、相互相関マトリックスＣ１内の大きさＭａｘ（Ｃ１）の位置に基づいて特定され、保存される。次に、方法はステップＳＴ４及びＳＴ５で構成されるループに進む。ステップＳＴ１に対応するステップＳＴ４において、２つの重畳像データセットＳｉとＳｉ＋１との相互相関が計算されて、相互相関マトリックスＣｉを識別する。したがって、ステップＳＴ４が最初に実行される場合、制御変数ｉは２に等しい。これは、２番目の重畳像データセットと３番目の重畳像データセットとの相互相関が特定されていることを意味する。
【００５５】
ステップＳＴ５は、Ｍａｘ（Ｃ１）が閾値ＳＷよりも大きいか否かを判断する。大きい場合、ｉは１だけインクリメントされて、方法は再びＳＴ４に飛び、３番目の重畳像データセットと４番目の重畳像データセットとの相互相関が特定される。他方、ステップＳＴ５において大きさＭａｘ（Ｃ１）が閾値ＳＷ以下の場合、ｎｉ＋１がΔだけ増やされる。すなわち、さらなる個々の像データセットが３番目の重畳像データセットに追加される（Δの大きさに従って）。次に、ステップＳＴ４及びＳＴ５が、Ｍａｘ（Ｃ１）が閾値ＳＷを超えるのに十分な回数、繰り返される。
【００５６】
ステップＳＴ４及びＳＴ５で構成されるループが十分な回数循環し、したがって、制御変数ｉが、全体の一連の個々の像データセット（図５ａ参照）が適したサイズの重畳像データセットに分割されたポイントまで増やされると、連続した重畳像データセット間の平均オフセット
【数２】
0005883855.tif 000003
が、ステップＳＴ６において特定され、保存される。
【００５７】
次に、ステップＳＴ７において、各重畳像データセットに含まれる個々の像データセットは、合算されたオフセット
【数３】
0005883855.tif 000004
に基づいて補正され、ｉｍａｘは、ステップＳＴ４及びＳＴ４で構成されるループの最後のサイクル後の制御変数ｉの値を示す。これは、例えば、２番目の重畳像データセット（ｊ＋１＝２）の個々の像データセットが平均オフセット
【数４】
0005883855.tif 000005
を用いて補正され、３番目の重畳像データセット（ｉ＋１＝３）の個々の像データセットが平均オフセット
【数５】
0005883855.tif 000006
を用いて補正され、４番目の重畳像データセット（ｉ＋１＝４）の個々の像データセットが平均オフセット
【数６】
0005883855.tif 000007
を用いて補正されること等を意味する。
【００５８】
次に、個々の像データセット内の撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置が特定され、それにより特定された中心点位置は、像ドリフトが補償されるオフセット補正済みの全体像に組み入れられる。
【００５９】
図６に示される方法は、単なる例として理解すべきである。この例示的な方法では、例えば、重畳像データセット間の像オフセットの識別は、未処理データに基づいて、すなわち、撮像されたマーカーを表す光分布の中心点位置をまだ含まないデータに基づいて行われる。しかし、まず、個々の像データセット内の中心点位置を識別し、次に、中心点位置に基づいて像オフセットを識別するだけでも同様に可能である。
【００６０】
上述した例示的な実施形態では、各々、２つの連続する重畳像データセット間の像オフセット
【数７】
0005883855.tif 000008
が特定される。しかし、重畳像データセットのうちの一方（通常、最初の重畳像データセット）を基準データセットとして決定し、次に、その基準データセットに対する、続く重畳像データセットのそれぞれの像オフセットを識別することも同様に可能である。
【００６１】
図６に示される方法は、連続する重畳像データセット間の像オフセットのみならず、各重畳像データセットに含まれる個々の像データセット間の像オフセットも特定され、次に補正されるように変更することもできる。これは、例えば、オフセット
【数８】
0005883855.tif 000009
に基づいて、言わば、離散した大きさ
【数９】
0005883855.tif 000010
を連続補間する関数を識別することにより行うことができる。この補間関数により、次に、個々の各像データセットの像オフセット値を特定することができ、個々の各像データセットをそれに対応して補正することができる。結果として、ドリフト補正はさらにより精密になる。
【００６２】
識別された像オフセット
【数１０】
0005883855.tif 000011
を使用して、ドリフト補償のために、光学顕微鏡２０の構成要素、例えば、試料ホルダ３６に制御を直接適用することも可能なことにさらに留意されたい。このために、例えば、グラフィックスプロセッサ４２は、像オフセット
【数１１】
0005883855.tif 000012
に対応して、制御変数を生成することができ、制御変数を用いて、位置決め部材（図４に示されず）、例えば、モータは、機械的ドリフトが補償されるように、対物レンズ３０に対して上述した顕微鏡構成要素を移動させるように制御される。この場合、状況によっては、個々の像データセットの上述したオフセット補正を省くことが可能である。
【図１ａ】
0005883855.tif 000013
【図１ｂ】
0005883855.tif 000014
【図２ａ】
0005883855.tif 000015
【図２ｂ】
0005883855.tif 000016
【図２ｃ】
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【図３ａ】
0005883855.tif 000018
【図３ｂ】
0005883855.tif 000019
【図４】
0005883855.tif 000020
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
0005883855.tif 000023
【図６】
0005883855.tif 000024