(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のペプチド断片を含む組成物であって、
前記複数のペプチド断片は、
配列番号１２のアミノ酸４３−５３のいずれかから始まりアミノ酸９６−１２１のいずれかに終わる配列からなるポリペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、最初のポリペプチド、
配列番号１２のアミノ酸９６−１２１のいずれかから始まりアミノ酸１１１−１４７のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、二番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１１１−１４７のいずれかから始まりアミノ酸１６８−１８０のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、三番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２２０−２５１のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、四番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１９０−２４１のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２６９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、五番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸２４１−２６９のいずれかから始まりアミノ酸３０９−３２９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、六番目のペプチド、及び
配列番号１２のアミノ酸３０９−３２９のいずれかから始まりアミノ酸３８４−３９６のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、七番目のペプチド、
を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
(i) 前記最初のペプチドと前記二番目のペプチドは相互に１から６のアミノ酸が重複する、
(ii) 前記二番目のペプチドと前記三番目のペプチドは相互に１から１０のアミノ酸が重複する、
(iii) 前記三番目のペプチドと前記四番目のペプチドは相互に１から１３のアミノ酸が重複する、
(iv) 前記四番目のペプチドと前記五番目のペプチドは相互に１から９のアミノ酸が重複する、
(v) 前記五番目のペプチドと前記六番目のペプチドは相互に１から１０のペプチドが重複する、及び／又は
(vi) 前記六番目のペプチドと前記七番目のペプチドは相互に１から７のペプチドが重複する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
複数のペプチド断片を含む組成物であって、
前記複数のペプチド断片は、
配列番号１２のアミノ酸４３−５３のいずれかから始まりアミノ酸９６−１２１のいずれかに終わる配列からなるポリペプチドであって、前記ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、最初のポリペプチド、
配列番号１２のアミノ酸９６−１２１のいずれかから始まりアミノ酸１１１−１４７のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって前記ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、二番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１１１−１４７のいずれかから始まりアミノ酸１６８−１８０のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって前記ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、三番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２６９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって前記ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、四番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸２４１−２６９のいずれかから始まりアミノ酸３０９−３２９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって前記ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、五番目のペプチド、及び
配列番号１２のアミノ酸３０９−３２９のいずれかから始まりアミノ酸３８４−３９６のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって前記ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、六番目のペプチド、
を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項４】
(i) 前記最初のペプチドと前記二番目のペプチドは相互に１から６のアミノ酸が重複する、
(ii) 前記二番目のペプチドと前記三番目のペプチドは相互に１から１０のアミノ酸が重複する、
(iii) 前記三番目のペプチドと前記四番目のペプチドは相互に１から１２のアミノ酸が重複する、
(iv) 前記四番目のペプチドと前記五番目のペプチドは相互に１から１０のペプチドが重複する、及び／又は
(v) 前記五番目のペプチドと前記六番目のペプチドは相互に１から７のペプチドが重複する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号５、及び配列番号６を持つペプチドの組み合わせ、
(ii) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６を持つペプチドの組み合わせ、又は
(iii) 配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１を持つペプチドの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
乾燥粉末形状で提供される、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
薬理学的に許容できる担体又は希釈剤を更に含む、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
アジュバントを更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ブタクサ花粉アレルギー患者に対する特異的免疫療法に使用するためのアレルゲンであって、
前記アレルゲンは、
配列番号１２のアミノ酸４３−５３のいずれかから始まりアミノ酸９６−１２１のいずれかに終わる配列であって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、最初のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸９６−１２１のいずれかから始まりアミノ酸１１１−１４７のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、二番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１１１−１４７のいずれかから始まりアミノ酸１６８−１８０のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、三番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２２０−２５１のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、四番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸１９０−２４１のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２６９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、五番目のペプチド、
配列番号１２のアミノ酸２４１−２６９のいずれかから始まりアミノ酸３０９−３２９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、六番目のペプチド、及び
配列番号１２のアミノ酸３０９−３２９のいずれかから始まりアミノ酸３８４−３９６のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、七番目のペプチド、
からなる群から選ばれるペプチドのうち、少なくとも五つのペプチドを含むアレルゲン。
【請求項１１】
前記アレルゲンが皮内注射、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、経皮、鼻腔内、経口、舌下、眼球又は髄腔内技術を用いて投与される、請求項１０に記載のアレルゲン。
【請求項１２】
前記七つのペプチドのうち少なくとも六つのペプチドを含む、請求項１０に記載のアレルゲン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は２０１１年６月２７日に提出された米国仮出願第６１／５０１６９０号に基づく優先権による利益を主張するものであり、当該仮出願の開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明はＡｍｂａ１ブタクサ花粉主要アレルゲン由来の連続する重複ペプチド（ＣＯＰ）及び医薬におけるこのような化合物の使用に関する。本発明の治療の化合物と方法は、ブタクサ花粉アレルギーの治療に有用であり治療を大いに促進することが期待される。
【背景技術】
【０００３】
ＩｇＥが介在するアレルギー疾患は、特に工業先進国で非常によくみられ、そこでは最大で人口の四分の一がアレルギー性鼻炎に冒されている（非特許文献１）。さらに、アレルギー性鼻炎を患う人々は健康な人よりも低いクオリティーオブライフ（生活の質）を示しており（非特許文献２）、自然に寛解に向かうのはごくわずかである。
【０００４】
ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）はキク科の植物で、この属の中では最も重要なアレルギー源である。Ａｍｂｒｏｓｉａ  ｓｐ．は北アメリカ東部及び中央部原産であるが、中央及び南ヨーロッパにも持続的に広がっている。ブタクサ花粉に対するアレルギー人口は特にアメリカ合衆国で増加している（非特許文献３）。アメリカ北部では、アレルギーをもつ人々の４５％がブタクサ花粉アレルギーを患っている。ヨーロッパでは、ブタクサの多い地域（例えばフランス、イタリア、オーストリア、ハンガリー、クロアチア及びブルガリア）においてアトピー感作が絶えず増加している。
【０００５】
いくつかのアレルゲンタンパク質がブタクサアレルギーに関連している。このようなブタクサアレルゲン（Ａｍｂａ）の配列はヌクレオチドタンパクデータベース（ＮＣＢＩ）で見つけることができる。これらのアレルゲンは、配列（ＮＣＢＩデータベース）により以下の６つのグループに分けられる（非特許文献４）。
【０００６】
Ａｍｂａ１／Ａｍｂａ２（患者の９５％）、ペクチン酸リアーゼファミリー
【０００７】
Ａｍｂａ３／Ａｍｂａ７（それぞれ３０−５０％、１０−２０％）、プラストシアニン塩基性タンパク質
【０００８】
Ａｍｂａ５同族体
【０００９】
Ａｍｂａ６（患者の２１％）、脂質輸送タンパク質
【００１０】
Ａｍｂａ８（患者の３５％）プロフィリン
【００１１】
Ａｍｂａ９（患者の１０−１５％）Ｃａ結合タンパク質
【００１２】
Ａｍｂａ１／ａ２グループが明らかにブタクサに対するアレルギー人口の大半を占める事が広く認められている。さらに、４つのＡｍｂａ１の変異型が報告されている。すなわち１．１、１．２、１．３及び１．４で、これらは高い配列同一性を共有する。組換え型Ａｍｂａ１．１と特異的に反応したのは患者のＩｇＥのごく一部で、殆どの患者のＩｇＥはＡｍｂａ１．１にもＡｍｂａ１．２及びＡｍｂａ１．３タンパク質にも反応した。Ａｍｂａ１．４という別のＡｍｂａ１ファミリーメンバーが同定され、これはＡｍｂａ１ファミリーの微量構成要素であるように思われる。さらに、Ａｍｂａ２はＡｍｂａ１と６５％の同一性を持つ（非特許文献４）。Ａｍｂａ１陽性の患者の大多数がＡｍｂａ１．１に反応するため、その配列のＣＯＰが選択された。
【００１３】
Ａｍｂａ１は酸性（ｐＩ４−６）の非グリコシル化単鎖タンパク質で分子量はおよそ３８ｋＤａである。それはクロマトグラフィーによる精製中にタンパク質分解を経て、非共有結合した２６ｋＤａのアルファ鎖と１２ｋＤａのベータ鎖に切断される（非特許文献５）。
【００１４】
ＩｇＥが介在するアレルギーの原因を対象とする唯一の治療は特異的免疫療法（ＳＩＴ）である。この治療は、アレルギー患者に寛容性を誘導するために、長期間（３年から５年）にわたり用量を漸増させながらアレルゲンを注射するものである。いくつかの研究は、特に長期間の治療において、アレルギー反応に対しこの治療法に利点があることを示した（非特許文献６及び非特許文献７）。しかし、特に超急速療法（ｕｌｔｒａ  ｒｕｓｈ  ｔｈｅｒａｐｙ）の間に多くの副作用が見られ、患者の３０％がこの治療の過程でアレルギー症状に対する処置を受けなくてはならなかった（非特許文献８）。よって、より短い治療期間で許容できる安全性を有する、従来のＳＩＴの代替が医学的に強く望まれている。
【００１５】
ＳＩＴの安全性と効力を向上させるために異なる取り組みが検証されてきた。処方と既存の抽出物は、ＭＰＬ  （Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（非特許文献６）、ＤＮＡ配列（非特許文献９）又はＣｐＧと組み合わせたバクテリオファージ（非特許文献１０）などのような、ＴＨ１免疫反応を増加させることでアレルゲン抽出物の量を減らすことができるアジュバントを加えることで改良されてきた。抽出物全体でなく定義されたアレルゲンが用いられた。カバノキ花粉の場合では、組換えＢｅｔｖ１を用いた臨床試験でカバノキ花粉抽出物全体と同等の効力が示された（非特許文献１１）。ブタクサの場合、予備研究において免疫賦活性のＤＮＡ配列と関連するＡｍｂａ１が長期間の臨床効力を表した（非特許文献１２）。
【００１６】
治療がもたらすアレルギー症状の発生を減少させるため、異なるグループが、低アレルギーの可能性を持つ、つまり低下したＩｇＥ結合を示す製品の使用を研究した。特に、限られた数のＴ細胞エピトープを囲むペプチドがネコの鱗屑のアレルゲン免疫療法に使われたが効力は限定的であった（非特許文献１３）。しかしアレルゲンは、部分的に患者のHLA型に依存して、非常に多種のＴ細胞エピトープを有している。例えば、Ｔ細胞エピトープはＡｍｂａ１配列を通して散らばっている（非特許文献１４）。よって、効率的な免疫療法の製品は選択されたＴ細胞エピトープよりはアレルゲンの完全な配列を含むことが好ましい。
【００１７】
ヒトＩｇＥはアレルゲンの断片化により分離可能な非連続エピトープを主に認識するという証拠に基づいて、アレルゲン断片の使用は依然魅力的である。二つの連続するＢｅｔｖ１断片又はＢｅｔｖ１の三量体形状がヒトの第１相試験において検証され、健康状態（ｗｅｌｌ  ｂｅｉｎｇ）を向上させる傾向を示したが、症状薬物スコアの明確な向上は見られなかった（非特許文献１５）。この研究ではしかし、多くの逆の事象が見られ、その多くは注射後数時間経過してから起こった（非特許文献１６）。ハチ毒の主要なアレルゲンの三つの断片、すなわちフォスフォリパーゼＡ２がヒトにおいても検証され、低下したＩｇＥ結合のため優れた安全性を示した一方、ＩｇＧ４及びＩＬ−１０のレベル上昇を誘発した（非特許文献１７）。アレルギー治療のため連続する重複ペプチド（ＣＯＰ）を選択するのに、ある方法が考案された。重複ペプチドは共にアレルゲンのアミノ酸配列全体を形成するので、アレルゲンの全ての存在しうるＴ細胞エピトープを提供する一方、抑制されたＩｇＥ結合を持つ（特許文献１）。このような選択された断片はアレルゲンの元の三次構造を再編成する能力の低下を示し、もしあるなら、ＩｇＥへの結合能力が低下し、よってヒトにおけるアレルギー反応を誘発する能力が抑制される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許７９２３２０９号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Settipane, R.A.,Allergy Asthma Proc, 22(4):185-9 (2001)
【非特許文献２】Bousquet, J., et al., J Allergy Clin Immunol, 94(2):182-8 (1994)
【非特許文献３】Gadermaier, Allergy, 63(11): 1543-9 (2008)
【非特許文献４】Wopfner et al, IAAI, 138(4):337-46 (2005)
【非特許文献５】Wopfner et al, Mol Immunol 46(10):2090-7 (2009)
【非特許文献６】Drachenberg, K.J. et al., Allergol Immunopathol, 31(2):77-82 (2003)
【非特許文献７】Dam Petersen, K. et al., Allergol Immunopathol 33(5)264-269 (2005)
【非特許文献８】Birnbaum et al., Clin. Exp. Allergy, 33(1):58-64 (2003)
【非特許文献９】Hartl, A. et al., Allergy, 59(1):65-73 (2004)
【非特許文献１０】Martinez Gomez, J.M. et al., Pharm. Res., 24(10):1927-35 (2007)
【非特許文献１１】Pauli, G. et al., J. Allergy Clin. Immunol, 122(5):951-60 (2008)
【非特許文献１２】Creticos et al., N Engl J Med, 355:1445-55 (2006)
【非特許文献１３】Campbell, JD et al., J Exp Med., 206(7):1535-47 (2009)
【非特許文献１４】Jahn-Schmid B. et al., J Allergy Clin Immunol, 126(5):1068-1071 (2010)
【非特許文献１５】Niederberger, V. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101(2):14677-82 (2004)
【非特許文献１６】Purohit, A. et al, Clin Exp Allergy (2008)
【非特許文献１７】Fellrath et al., J. Allergy Clin. Immunol, 111:854-861 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、ブタクサ花粉アレルギーの治療のための連続する重複ペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一つの態様によれば、本発明はブタクサ花粉アレルギー治療のための組成物として連続する重複ペプチド（ＣＯＰ）を提供する。具体的には、ＣＯＰはブタクサ花粉の主要アレルゲンＡｍｂａ１の配列から提供され、全ての存在しうるＴ細胞エピトープを提供するが元のアレルゲンの三次構造を持たないため、ＩｇＥに結合する能力を潜在的に抑制、望ましくは消去する。本発明の特に好ましい態様によれば、不溶若しくは水にわずかしか溶解しない他のペプチドと比較して、溶解特性が向上したことを特徴とするペプチドが提供される。 
【００２２】
更なる態様によれば、本発明は短期間で数回の投与の後にアレルギー症状を抑制することのできる特異的免疫療法（ＳＩＴ）に関する。この治療法は、ブタクサ花粉アレルギーを患うヒトに特定のＣＯＰを繰り返し投与することからなる。投与は全身投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、または経口経路で投与してもよく、または舌下及び腸管経路を含む粘膜経路で投与してもよい。現在のＳＩＴが３年から５年要するのと比較して、本発明のいくつかの態様においては投与は２か月の間に５回繰り返される。活性製品（ＣＯＰ）の投与量は、ＳＩＴ療法で３年の間に投与されるＡｍｂａ１の量と同等のモル量の累積した値に達し得る。
【００２３】
具体的に本発明は、複数の連続する重複ペプチド断片からなる組成物を提供する。連続する重複ペプチド断片は以下のペプチドからなる。配列番号１２のアミノ酸４３−４５のいずれかから始まりアミノ酸９６−１２１のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、最初のペプチド。配列番号１２のアミノ酸９６−１２１のいずれかから始まりアミノ酸１１１−１４７のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、二番目のペプチド。配列番号１２のアミノ酸１１１−１４７のいずれかから始まりアミノ酸１６８−１８０配列のいずれかに終わるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、三番目のペプチド。配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２２０−２５１のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、四番目のペプチド。配列番号１２のアミノ酸１９０−２４１のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２６９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、五番目のペプチド。配列番号１２のアミノ酸２４１−２６９のいずれかから始まりアミノ酸３０９−３２９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、六番目のペプチド。配列番号１２のアミノ酸３０９−３２９のいずれかから始まりアミノ酸３８４−３９６のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、七番目のペプチド。
【００２４】
別の態様によれば、本組成物は６つのペプチド断片のみから構成されてもよく、四番目及び五番目の断片の機能は配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２９６のいずれかに終わる配列からなるペプチドにより果たされる。ここで該ペプチドにおいて、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＴリンパ球との反応性は維持されている。
【００２５】
ペプチドのブタクサ花粉にアレルギーのある被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性を「消去する」とは、臨床的に関連するペプチド濃度（Ｔリンパ球との反応の維持が可能であるなど）に対する被験者による臨床的に明らかな反応をなくすことであり、当業者に認識される、皮膚試験などのｉｎ  ｖｉｖｏ試験及び／又は好塩基球脱顆粒試験などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により証明することができる。本発明は天然アレルゲンへの結合に対して１０−４及び１０−５低いＩｇＥ結合を持つＣＯＰのセットを提供することができる。このような結合レベルは、アレルギーを持つ被験者による臨床的に明らかな反応がないことと一致する。
【００２６】
本発明の好ましい態様によれば、最初と二番目のペプチドは相互に１から６のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、二番目と三番目のペプチドは相互に１から１０のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、三番目と四番目のペプチドは相互に１から１３のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、四番目と五番目のペプチドは相互に１から９のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、五番目と六番目のペプチドは相互に１から１０のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、六番目と七番目のペプチドは相互に１から７のアミノ酸が重複している。
【００２７】
特に好ましい組成物は配列番号１を持つペプチド、配列番号２を持つペプチド、配列番号３を持つペプチド、配列番号１４を持つペプチド、配列番号１５を持つペプチド、配列番号５を持つペプチド、及び配列番号６を持つペプチドの組み合わせからなる。
【００２８】
好ましいＣＯＰ組成物には、ペプチドが水溶液に可溶なものが含まれる。具体的には配列番号１から３、１４、１５及び５−６のペプチドのセットが配列番号７から１１を持つペプチドよりも好ましい。
【００２９】
配列番号１−１１及び１３−１５のペプチドと９０％、８０％、７０％又はより高い配列同一性を持つペプチドも提供される。これらは好ましくは、Ｔリンパ球の反応性を維持しながら、ブタクサ花粉にアレルギーのある被験者のＩｇＥ抗体への反応性が抑制又は消去されている。
【００３０】
このようなペプチドは化学合成や組換え法を含む様々な方法のいずれにより得てもよい。
【００３１】
本発明のＣＯＰ及びペプチドは乾燥粉末形状で提供され得るが、許容できる担体や希釈剤との組み合わせで提供されてもよい。加えて、前記組成物は更にアジュバントを含んでもよい。好ましいアジュバントとしては水酸化アルミニウムがある。そのようなものとして前記組成物がワクチン組成物として特徴づけられ、ワクチン組成物として用いられてもよい。
【００３２】
必要な患者に一つ又はそれ以上のアレルゲンを投与することからなる、ブタクサ花粉アレルギーに対する特定の免疫療法（ＳＩＴ）も提供される。アレルゲンは次の群から選ばれる：配列番号１２のアミノ酸４３−５３のいずれかから始まりアミノ酸９６−１２１のいずれに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている最初のペプチド；配列番号１２のアミノ酸９６−１２１のいずれかから始まりアミノ酸１１１−１４７のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、二番目のペプチド；配列番号１２のアミノ酸１１１−１４７のいずれかから始まりアミノ酸１６８−１８０のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、三番目のペプチド；配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２２０−２５１のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、四番目のペプチド；配列番号１２のアミノ酸１９０−２４１のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２６９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、五番目のペプチド；配列番号１２のアミノ酸２４１−２６９のいずれかから始まりアミノ酸３０９−３２９のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、六番目のペプチド；及び、配列番号１２のアミノ酸３０９−３２９のいずれかから始まりアミノ酸３８４−３９６のいずれかに終わる配列からなるペプチドであって、該ペプチドの、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者由来のＴリンパ球との反応性は維持されている、七番目のペプチド。この方法は６つのペプチド断片のみから構成され、四番目及び五番目の断片は配列番号１２のアミノ酸１６８−１９０のいずれかから始まりアミノ酸２５１−２６９のいずれかに終わる配列からなる１つのペプチドに合わさり、ここで該ペプチドにおいて、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ被験者のＴリンパ球との反応性は維持されている組成物においても実施され得る。
【００３３】
このような方法において、ペプチドは皮内注射、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、経皮、鼻腔内、経口、舌下、眼球又は髄腔内技術を用いて投与され得る。
【００３４】
本発明の好ましい態様によれば、最初と二番目のペプチドは相互に１から６のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、二番目と三番目のペプチドは相互に１から１０のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、三番目と四番目のペプチドは相互に１から１３のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、四番目と五番目のペプチドは相互に１から９のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、五番目と六番目のペプチドは相互に１から１０のアミノ酸が重複している。他の好ましい態様によれば、六番目と七番目のペプチドは相互に１から７のアミノ酸が重複している。本発明の一つの好ましい態様によれば、患者は七つのペプチドのうち少なくとも五つを用いて治療され、他の好ましい態様によれば患者は七つのペプチドのうち少なくとも六つを用いて治療される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、Ａｍｂａ１と比較した、選択されたＣＯＰのＩｇＥへの競合的結合を示す。ＣＯＰはセットＡ（ＡｌｌｅｒＲ１からＡｌｌｅｒＲ６）又はセットＢ（ＡｌｌｅｒＲ７からＡｌｌｅｒＲ１１）として等モル量混合され、ブタクサ花粉アレルギーを持つ三人の被験者由来の血清と指示された濃度でプレインキュベートされた(それぞれパネルＡ、Ｂ、及びＣ中の番号１７７９４、１８３４２及びＦＢ)。残存Ａｍｂａ１特異的ＩｇＥは、ｎＡｍｂａ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いて監視された。ｎＡｍｂａ１はポジティブコントロールとして用いられた。
【図２】図２は、Ｂａｓｏｔｅｓｔ（登録商標）分析におけるｎＡｍｂａ１のヒト好塩基球脱顆粒を誘発する能力を示す。セットＡ又はセットＢ中の混合されたＣＯＰは、試験されたどの濃度においても好塩基球脱顆粒を誘発しない。
【図３】図３はラットの好塩基球細胞脱顆粒を用いた、アレルギーを持つ被験者のパネル由来のＩｇＥに対するＡｌｌｅｒＲの非反応性を示す。ヒトＩｇＥ受容体を発現しているＲＢＬ細胞はアレルギー患者スパン（ｓｐａｎ）のアパネル（ａｐａｎｅｌ）由来の血清とプレインキュベートされた。コントロールのｎＡｍｂａ１は様々な度合いで脱顆粒を引き起こした（図３、パネルＡ）。ＡｌｌｅｒＲは試験された２１の血清のいずれでも脱顆粒を誘発しない（図３、パネルＢ）。
【図４】図４はＡｌｌｅｒＲの免疫原生及びそのＣＯＰそれぞれの免疫原生を示す。ＡｌｌｅｒＲ混合物及び個々のＣＯＰは、フロイントアジュバント（パネルＡ）又はアジュバントとしての水酸化アルミニウム（パネルＢ）とともにＢａｌｂ／ｃマウスに注射された。腹腔内注射の後に測定されたＩｇＥレベルは、ＡｌｌｅｒＲ１からＡｌｌｅｒＲ６のそれぞれのペプチドがＩｇＧ応答を引き起こすことができることを示した。さらに、ＡｌｌｅｒＲ混合物により産生されたＩｇＧは天然Ａｍｂａ１を認識する（図４パネルA）。
【図５】図５はｎＡｍｂａ１を繰り返し皮下注射することにより感作されたＢａｌｂ／ｃマウスのアナフィラキシー反応を示す。マウスは低用量ｎＡｍｂａ１の５回目の注射の７日後、一度に高用量のアレルゲンで攻撃された。パネルＡは０（無症状）から５（動物の死）の範囲で予め定義された基準に従って点数化されたアナフィラキシー症状を示す。図５Ｂは体温を示す。図５Ｃは感作されたマウスのＩｇＥのレベルを示す。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は下記の実験手順及び結果を参照して、以下に例として説明される。
【００３７】
低下させたＩｇＥ結合を持つ製品として選択するため、Ａｍｂａ１アレルゲン全体を含み、よって全ての存在しうるＴ細胞エピトープを提供する、長い（３０−９０アミノ酸）連続する重複ペプチド（ＣＯＰ）の２つのセットが考案された。最初のセット（Ａ）は、ＩｇＥエピトープとＡｍｂａ１の三次構造に基づく分析から導き出された、二次構造を形成する能力の低下した６つのペプチドＡｌｌｅｒＲ１、−Ｒ２、Ｒ３、−Ｒ４、−Ｒ５及び-Ｒ６を包含する。５つのＣＯＰからなる二番目のセット（セットＢ）ＡｌｌｅｒＲ７、−Ｒ８、Ｒ９、−Ｒ１０及び-Ｒ１１が選ばれた。ＡｌｌｅｒＲ８は水に容易に溶解し、ＡｌｌｅｒＲ１０はｐＨ７で水性緩衝液に溶解した。しかしＡｌｌｅｒＲ７、８、９及び１１はＤＭＳＯにのみ溶解し水には溶けなかった。これらの予期せぬ溶解性の問題で、更なる開発にはセットＡが好ましいだろう。
【００３８】
セットＡにおいて、水に溶解するのが困難なペプチドはＡｌｌｅｒＲ４（配列番号：４）のみであったが、このペプチドは競合ＥＬＩＳＡ及び脱顆粒試験に見られるとおり、ＩｇＥに結合しなかった。合成及び精製が困難であることから、ＡｌｌｅｒＲ４は重複する末端を持つ二つの部分、ＡｌｌｅｒＲ４．１（配列番号１３）とＡｌｌｅｒＲ４．２（配列番号１５）に分けられた。精製によりＡｍｂａ１が二つの分子に分かれると、細胞中でその天然の状態を反映していないように見える（Ｗｏｐｆｎｅｒ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９））ことから、ＡｌｌｅｒＲ４はＮ末端において前のペプチド、つまりＡｌｌｅｒＲ３と重複するよう延長された。よって、ＡｌｌｅｒＲ４．３（配列番号１４）とＡｌｌｅｒＲ４．２（配列番号１５）に置き換えられたＡｌｌｅｒＲ４以外の、セットＡに含まれる全てのペプチドを含む三番目のセット（セットＣ）が選ばれた。この変更の目的は完全な天然配列を提供すると同時に、ＡｌｌｅｒＲ４それ自体よりも溶解性の高いペプチドを提供することである。本発明の方法は全てＡｌｌｅｒＲ４をＡｌｌｅｒＲ４．３とＡｌｌｅｒＲ４．２に置き換えることにより実施され得る。
【００３９】
ＡｌｌｅｒＲ４は最大６０％まで精製され、５０％酢酸中にのみ可溶であった。ＡｌｌｅｒＲ４のＣ末端部分であるＡｌｌｅｒＲ４．２は改善された合成を示し、最高で純度７０％までの精製が達成された。ＡｌｌｅｒＲ４．２は水に不溶であったが、５ｍＭのＨＣｌ（１：４ｗ／ｖ）と０．１ＭのＮａＯＨ（ＨＣＬに対し１：４．５ｖ／ｖ）、ｐＨ５．６の０．１Ｍクエン酸緩衝液（１ｍｇ／ｍｌに達する容積）を順次加えた後、１ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＡｌｌｅｒＲ４のＮ末端部分であるＡｌｌｅｒＲ４．３は改善された合成を示し、最高で純度６０％までの精製が達成された。
【００４０】
ペプチドのセットＡ，セットＢ及びセットＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏのＩｇＥ競合試験と好塩基球脱顆粒試験の組み合わせを通して試験され本来のアレルゲンｎＡｍｂａ１と比較された。
【００４１】
＜材料と方法＞
アレルゲン 
ｎＡｍｂａ１はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｓ  （ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によりブタクサ花粉から精製された。
【００４２】
ペプチドの選択と合成 
目的はＡｍｂａ１配列中に全てのＴ細胞エピトープを示す一方で、Ｂ細胞エピトープの安定した三次構造の形成を防止することであった。結果として、Ａｍｂａ１配列に沿って重複する次のＣＯＰが選ばれた。
【００４３】
配列番号１
ＡｌｌｅｒＲ１：ａａ４３−１０１（５９残基）
分子量：６２２２．７
【００４４】
【化１】
0005897120.tif 000002
【００４５】
配列番号２
ＡｌｌｅｒＲ２：ａａ９６−１４７（５２残基）
分子量：５９００．７
【００４６】
【化２】
0005897120.tif 000003
【００４７】
配列番号３
ＡｌｌｅｒＲ３：ａａ１３８−１８０（４３残基）
分子量：４５８１．３
【００４８】
【化３】
0005897120.tif 000004
【００４９】
配列番号４
ＡｌｌｅｒＲ４：ａａ１９０−２６９（８０残基）
分子量：８４６５．３
【００５０】
【化４】
0005897120.tif 000005
【００５１】
配列番号５
ＡｌｌｅｒＲ５：ａａ２６０−３２９（７０残基）
分子量：７８６４．７
【００５２】
【化５】
0005897120.tif 000006
【００５３】
配列番号６
ＡｌｌｅｒＲ６：ａａ３２３−３９４（７２残基）
分子量：７３６５．２
【００５４】
【化６】
0005897120.tif 000007
【００５５】
配列番号７
ＡｌｌｅｒＲ７：ａａ４３−１２１（７９残基）
分子量：８５７９．５
【００５６】
【化７】
0005897120.tif 000008
【００５７】
配列番号８
ＡｌｌｅｒＲ８：ａａ１１１−１８０（７０残基）
分子量：７９０９．２
【００５８】
【化８】
0005897120.tif 000009
【００５９】
配列番号９
ＡｌｌｅｒＲ９：ａａ１９０−２５１（６２残基）
分子量：６４６８．１
【００６０】
【化９】
0005897120.tif 000010
【００６１】
配列番号１０
ＡｌｌｅｒＲ１０：ａａ２４１−３１９（７９残基）
分子量：８７９４．７
【００６２】
【化１０】
0005897120.tif 000011
【００６３】
配列番号１１
ＡｌｌｅｒＲ１１：ａａ  ３０９−３９４  （８６残基）
分子量：８９６９．０
【００６４】
【化１１】
0005897120.tif 000012
【００６５】
配列番号１２
【００６６】
【化１２】
0005897120.tif 000013
【００６７】
配列番号１３
ＡｌｌｅｒＲ４．１：ａａ１９０−２２８（３９残基）
分子量：３９４８．３３
【００６８】
【化１３】
0005897120.tif 000014
【００６９】
配列番号１４
ＡｌｌｅｒＲ４．３：ａａ１６８−２２８（６０残基）
分子量：６２０３．９１
【００７０】
【化１４】
0005897120.tif 000015
【００７１】
配列番号１５
ＡｌｌｅｒＲ４．２：ａａ２２０−２６９（５０残基）
分子量：５４７７．１０
【００７２】
【化１５】
0005897120.tif 000016
【００７３】
全てのＣＯＰはＩｇＥ結合の定量ができるよう固相ｆｍｏｃ化学により研究規模で合成された。他に記載のない限り、分取ＨＰＬＣが９０％を超える純度の凍結乾燥されたペプチドを得るのに用いられた。ペプチドは２ｍｇ／ｍｌで水、又はｍｌ当たり１０から２０ｍｇでＤＭＳＯに再懸濁され、一定分量で凍結された。
【００７４】
（競合ＥＬＩＳＡ）
０．５μｇ／ｍｌの組換えＡｍｂａ１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏより得られた、精製されたｎＡｍｂａ１）は９６ウェルＮｕｎｃマキシソープ（登録商標）イムノプレート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で一晩コーティングされた。１％ＢＳＡでブロッキングした後、特定のＩｇＥ濃度によって１０倍、２０倍、３０倍又は４０倍のいずれかの希釈をされた患者の血清を加え、５μｇ／ｍｌのビオチンマウス抗ヒトｍＡｂＩｇＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を加えた。抗体はストレプトアビジンＨＲＰ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）と基質ＴＭＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９７５  Ｔｏｒｒｅｙａｎａ  Ｒｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）により明らかにされた。３人のアレルギー患者の血清が、高ＩｇＥレベル及びバックグランドに対する明確なシグナルのために選択され、ペプチドとの競合試験に用いられた。指示された濃度のそれぞれのＣＯＰセットの段階希釈物、つまりセットＡ，セットＢ及びセットＣは３つの選択された血清とともに４℃で一晩プレインキュベートされた。その後血清はｎＡｍｂａ１コーティング９６ウェルプレート上でインキュベートされ、残存ＩｇＥ結合が上述の通り定量された。ｎＡｍｂａ１希釈物は阻害のコントロールとして用いられた一方、ＢＳＡは可能性のある非特異的阻害のコントロールとして用いられた。 
【００７５】
好塩基球脱顆粒試験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの好塩基球脱顆粒の定量測定にＢａｓｏｔｅｓｔＲ（ＯＲＰＥＧＥＮ  Ｐｈａｒｍａ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）が用いられた。最初にアレルギーを持たないドナー（ＡＣＴ）由来のヘパリン添加血清（１００μｌ）がブタクサ花粉にアレルギーを持つ患者（ＦＢ）由来の血清（２５μｌ）とともに２時間プレインキュベートされた。混合液は更に緩衝液（試薬Ｂ）で３７℃において１０分間刺激され、その後、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして、走化性ペプチドホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ）とともに、またはそれなしで刺激された。血液の一定分量は生理食塩水で希釈された１００μｌのアレルゲン溶液とともに並行して３７℃において２０分間インキュベートされた。用量反応曲線は２５０、１２．５、０．６２５、０．０３１ナノモーラーｎＡｍｂａ１（加えられた濃度）で実施され、同様にその１０倍高い濃度で始まるＡｌｌｅｒＲ混合セット（ＡｌｌｅｒＲ１−Ｒ６及びＡｌｌｅｒＴ７−１１）で実施された。活性化過程は血液サンプルを４℃で５分間インキュベートすることにより停止された。その後サンプルは＋４℃で２０分間インキュベートされた（２０μｌのフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＩｇＥおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ｇｐ５３（ＣＤ６３）とともに、暗条件）。続いて２ｍｌの溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を添加することにより赤血球が除去された。細胞はＰＢＳ溶液で２回洗浄され、２００μｌのＰＢＳ溶液に再懸濁され、２時間以内にフローサイトメトリー（ＦＡＳＣ−ＬＳＲＩＩ−ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析された。好塩基球集団はＰＥ抗ＩｇＥ陽性細胞上にゲートされ、ｇｐ５３（ＣＤ６３）の発現がこの集団について分析された。取得は各試料に対し１０００細胞について行われ、結果は好塩基球（ＩｇＥ陽性細胞）発現ｇｐ５３（ＣＤ６３）のパーセンテージとして与えられた。
【００７６】
もう一つの方法として、脱顆粒は、アレルギー患者の血清とともに最初から組み込まれているヒトＩｇＥ受容体の一部を発現するラットの好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ）を用いて監視された（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｌｌｅｒｇｙ  ６０：  １０２１-１０２８  （２００５）)。基本的にＲＢＬ−３０／２５細胞は、リヨン（Ｆｒａｎｃｅ，  Ｂｉｏｍｎｉｓ）の周囲の地域のアレルギー患者、また同様にアメリカ合衆国（Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のアレルギー患者の血清とともに一晩プレインキュベートされた。ベータヘキソサミニダーゼの分泌を増加及び安定させるため、５０％のＤ２Ｏが分析に用いられたタイロード緩衝液に加えられた。ＩｇＥ架橋で細胞がベータヘキソサミニダーゼを放出する能力を反映して、ＩｇＥが抗ＩｇＥ抗体に架橋した後のベータヘキソサミニダーゼの放出が放出１００％と設定された。Ａｍｂａ１特異的放出はＩｇＥが介在する放出のパーセントとして示されている。
【００７７】
ＡｌｌｅｒＲの免疫原性
Ａｍｂａ１及び個々のＣＯＰはＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射された。ペプチドはアジュバント、すなわち完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム（１ｍｇ／ｍｌ  Ａｌ）と一緒に与えられた。注射は不完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム（１ｍｇ／ｍｌ  Ａｌ）とともに、一か月の間隔で二度繰り返された。最後の注射から１５日後に後眼窩洞から血液が採取され、標準の方法により血清が調製された。結果はＩｇＧ濃度に対応して任意単位（Ａ．Ｕ．）で表され、その値から免疫前血清の値が差し引かれた。
【００７８】
マウスにおけるアナフィラキシー反応
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１４日間の間隔で低用量（ｌμｇ）のアレルゲンＡｍｂａ１を５回繰り返し皮下注射する反復注射により感作された。マウスは最後の注射から７日後に高用量のＡｍｂａ１（３０μｇ／動物）又はＡｌｌｅｒＲ  ＣＯＰ（４０μｇ／動物）で攻撃された。アナフィラキシー症状は、Ｓａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ａｌｌｅｒｇｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；  １７（６）：  ３７９−３８５  （２００７）を出典とする６等級の基準（０：無症状から５：死亡）を用いて点数化された。攻撃の後、直腸の温度がデジタル温度計を用いて１５分間の間隔で６０分間監視された。クエン酸緩衝液が、感作と、更なる二つのマウスグループにつながる攻撃のコントロールとして用いられた。
【００７９】
＜実験結果＞
ペプチドの選択
Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ由来のＡｍｂａ１．１は３９６のアミノ酸（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２７７５９）からなるタンパク質である。最初の２５のアミノ酸はシグナルペプチドの特性を持ち、成熟型はアミノ酸２６−３９６からなる。精製後の切断産物の末端配列は、アルファサブユニットがＡ１９０で始まりＣ３９６で終わる一方、ベータサブユニットがＴ４３で始まりＫ１８０で終わることを示している（Ｗｏｐｆｎｅｒ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９））。二つのＳ−Ｓ架橋、すなわちＣ５３−Ｃ７０とＣ２１０−Ｃ２３５が見られた。ｎＡｍｂａ１はブタクサ花粉粒子上異なるアイソフォームで存在し（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２７７５９，  Ｐ２７７６０．１，  Ｐ２７７６１．１，  Ｐ２８７４４．１）、これらは数個のアミノ酸が異なる。さらに、アレルゲンＡｍｂａ２（Ｐ２７７６２．１）はＡｍｂａ１ファミリーと６５％の配列同一性を示す。 
【００８０】
興味深いことにＡｍｂａ１は、それぞれアメリカ合衆国と日本のヒマラヤスギの主要アレルゲンであるＪｕｎａ１（Ｐ８１２９４．１）及びＣｒｙｊ１（Ｐ１８６３２．２）とも相同性を示す。これらの全ての分子はペクチン酸リアーゼ酵素ファミリーに属する。よってアレルゲン性の領域は分子の三次構造における同等の部位で発見されるかもしれず、どこにＣＯＰの末端をセットするかを更に予測することができる。
【００８１】
文献におけるＢ細胞エピトープ又はＩｇＥエピトープに関する記述はいくぶん少ない。組換えＡｍｂａ１はアレルギーを持つ患者のＩｇＥと反応するのに還元及び熱処理を要した（Ｗｏｐｆｎｅｒ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９））。ニトロセルロース上で再度折りたたまれている可能性があると解釈される。また、Ｅ  ｃｏｌｉにおける不適切な折りたたみにより隠された直鎖状のエピトープが存在するかもしれない。
【００８２】
ｎＡｍｂａ１又はその組換え型（Ｗｏｐｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  ３８，  ２１９-２２６  （２００７））に対する多くのモノクローナル抗体が産生された。Ａｍｂａ１アルファサブユニット（ａａ  １８１−３９６）はベータタンパク質分解物よりも低いＩｇＥ反応を示したが、エピトープマッピングは行われなかった。モノクローナル抗体を用いてブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ（当時はＡｍｂａ１）（Ｏｌｓｏｎ  ＪＲ，  Ｋｌａｐｐｅｒ  ＤＧ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８６；  １３６：２１０９-１５）上の二つのアレルゲン部位が確認されたが、正確なマッピングは行われなかった。
【００８３】
可能性のあるエピトープは、免疫エピトープ及びデータベース及び分析資源（ＩＥＤＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／）で提唱されたエピトープコンピューター予測ツールを用いて予測できる。特にＥｌｌｉＰｒｏはタンパク質抗原の三次構造に基づいて、直鎖状で非連続的な抗体エピトープを予測した。最初の残基を失っている成熟したタンパク質についての知識、可能性のある直鎖状のエピトープの予測及び非連続的なエピトープの予測を合わせて、配列番号１から１１に表される二つのＣＯＰセットが提案された。
【００８４】
選択されたＣＯＰのＩｇＥ結合のｎＡｍｂａ１との比較 
ＣＯＰセットＡ及びＢは最初に、材料と方法で記載された通り競合ＥＬＩＳＡにより、低下したＩｇＥ結合についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験された。図１に見られるように、ｎＡｍｂａ１は濃度範囲１０−１１から１０−８Ｍで血清中に存在するＩｇＥと競合した一方、ＢＳＡは試験した全ての濃度において検出できる阻害を示さなかった。セットＡとセットＢはどちらも競合を示さなかった。競合分析は三人のアレルギー患者（１７７９４，１８３４２及びＦＢ）由来の血清で行われ、Ａｍｂａ１と組み合わせされたセットの、ＩｇＥ結合に対する競合の不存在を確認した（それぞれ図１、パネルＡ、Ｂ及びＣ）。
【００８５】
ヒト好塩基球脱顆粒試験
よりヒトの体に近い試験におけるＩｇＥ結合の不存在を更に証明するため、ＣＯＰは好塩基球脱顆粒分析（Ｂａｓｏｔｅｓｔ（登録商標））で試験された。ヒト血清ＦＢとともに添加されたヒトの好塩基球はｎＡｍｂａ１で刺激された時、濃度に依存して脱顆粒した（図２）。対照的に、ＣＯＰの組み合わせ（ＡｌｌｅｒＲ１からＡｌｌｅｒＲ６、及びＡｌｌｅｒＲ７からＲ１１)はネガティブコントロールのレベル以上で脱顆粒を誘発することができなかった。最大半量の脱顆粒を誘発するＡｍｂａ１濃度の１０００倍の濃度のＣＯＰの濃度までを通して、脱顆粒は見られなかった（図２）。好塩基球の脱顆粒が起きなかったことは、ヒトに応用した際にアレルギー反応に介在するリスクが潜在的に減少したことを示す。これらの実験から、ＡｌｌｅｒＲと呼ばれるべき好ましい製品はセットＡに存在する可溶なペプチド組み合わせ、すなわちＡｌｌｅｒＲ１、−Ｒ２、−Ｒ３、−Ｒ４、−Ｒ５及び−Ｒ６の六つのペプチドの組み合わせを含むと結論づけられる。セットＡはセットＢ、すなわちＡｌｌｅｒＲ７、−Ｒ８、−Ｒ９、−Ｒ１０及び−Ｒ１１の組み合わせよりもブタクサ花粉アレルギーの治療のためのより良い候補を表している。後者のペプチドの５つ中３つはＤＭＳＯに溶解しなくてはならず、表１に見られるように溶解性の問題を示している。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
改良された組成
本発明の更なる改良は、ＡｌｌｅｒＲ４を、向上した精製と溶解特性を持つ二つのＣＯＰ、すなわちＡｌｌｅｒＲ４．３及びＡｌｌｅｒＲ４．２に分割することを含む。ＡｌｌｅｒＲ４．３はＡｌｌｅｒＲ４のＮ末端部分を含むだけでなく、ＡｌｌｅｒＲ３と重複するよう伸長され、よって全ての天然配列を包含している。実際、天然Ａｍｂａ１は精製によってのみ二つの部分に分かれるようである。
【００８８】
７つのＣＯＰ、すなわちＡｌｌｅｒＲ１、２、Ｒ４．３、４．２、５及び６からなる改良されたＡｌｌｅｒＲ組成はブタクサにアレルギーを持つ患者由来の血清のパネルを用いて、競合ＥＬＩＳＡ試験において検証された。２２の患者の血清は濃度を増加させたｎＡｍｂａ１又はＡｌｌｅｒＲとともにプレインキュベートされた（データは記載せず）。全ての血清は１０−１１から１０−８モーラーの範囲のｎＡｍｂａ１との競合を示した一方、どれも１０−５ＭまでのＡｌｌｅｒＲと反応せず、製品を構成するいずれのＣＯＰに対しても、検出できるＩｇＥ結合を欠いていることが確認された。
【００８９】
ＡｌｌｅｒＲは更に好塩基球脱顆粒を試験された。ヒトＩｇＥ受容体を発現するＲＢＬ細胞は同じアレルギー患者のパネル由来の血清とともにプレインキュベートされた。コントロールｎＡｍｂａ１は、おそらくＩｇＥレベルか親和性のどちらかの変動性を反映して、様々な程度に脱顆粒を引き起こした（図３、パネルＡ）。ＡｌｌｅｒＲは試験された２１の血清のいずれでも脱顆粒を誘発しなかった（図３、パネルＢ）。よってＡｌｌｅｒＲは試験した条件下において検出できるＩｇＥ結合を示さなかった。要約すれば、競合ＥＬＩＳＡにおいても脱顆粒試験においても、ＡｌｌｅｒＲのＩｇＥ結合能力はＡｍｂａ１のＩｇＥ結合能力よりも１０００００倍低い。
【００９０】
免疫化
ＡｌｌｅｒＲとそれぞれの単独のＣＯＰは個別で、フロイントアジュバントとともにＢａｌｂ／ｃマウスに注射された。腹腔内注射の後でＩｇＧレベルが測定された（図４）。ＡｌｌｅｒＲ１からＡｌｌｅｒＲ６のそれぞれのペプチドはＩｇＧ反応を誘発することができ、よってＡｌｌｅｒＲ混合物に対する免疫反応に貢献している。ＡｌｌｅｒＲ混合物により産生されたＩｇＧは天然Ａｍｂａ１を認識する（図４パネルA）。別の実験において、個々のＣＯＰに対するＩｇＧの存在はＡｌｌｅｒＲで免疫されたマウス由来の血清中で検出され得る。さらに、単一ペプチドで免疫されたマウス由来の血清をＡｍｂａ１特異的ＩｇＧに対して試験することが可能である。このような結果は、ＡｌｌｅｒＲがマウスにおいてｎＡｍｂａ１に対する免疫反応を誘発し得ること、ＡｌｌｅｒＲ中の７つのＣＯＰのそれぞれが免疫原性に貢献し得ることを示すだろう。
【００９１】
免疫原生はフロイントアジュバントの代わりに水酸化アルミニウムを用いても観察されたが、Ａｍｂａ１に対してのＩｇＧレベルはより変動的となった（図４、パネルＢ）。
【００９２】
感作と攻撃
Ｂａｌｂ／ｃマウスはｎＡｍｂａ１（１μｇ／ｍｌ）を繰り返し皮下注射することにより感作された。最後の注射から７日後にマウスは一度の大用量のアレルゲン（３０μｇ／ｍｌのＡｍｂａ１）又はＡｌｌｅｒＲ（３４μｇ／ｍｌ）で攻撃された。マウスは１時間観察され、０（無症状）から５（動物の死）の範囲で予め定義された基準に従ってアナフィラキシー症状が点数化された。感作されていない（クエン酸緩衝液注射のみ）、又はＡｍｂａ１で感作されクエン酸緩衝液のみで攻撃されたコントロールのマウスは低い症状スコアを示し貯えられた（図５、パネルA、コントロール）。おそらく直腸温度を測定されることへの動物のストレスから、症状スコアの増加が１時間後の結果に見られた。ＡｌｌｅｒＲは本質的にコントロールと同一の症状を示した一方で、Ａｍｂａ１での攻撃は１５分後において既に症状スコアの明確な増加を引き起こした。よってＡｌｌｅｒＲはＡｍｂａ１感作されたマウスにおいてアナフィラキシーショックを引き起こさない。
【００９３】
並行して、１５分毎に体温が測定された（図５、パネルＢ）。コントロールとＡｌｌｅｒＲの攻撃では本質的に体温の低下はなかったが、Ａｍｂａ１は顕著な直腸の温度低下を誘発した。感作されたマウスにおいてＩｇＧのレベルの増加の存在が測定された（図５、パネルＣ）。ＩｇＥの平均レベルは感作後免疫前の約５００倍増加した。これらの結果は、ＡｌｌｅｒＲは攻撃活性を欠いている点でＡｍｂａ１と異なることを示し、ＡｌｌｅｒＲがＡｍｂａ１により感作の間に産生されたイムノグロブリン（おそらくＩｇＥ）と相互作用しないことを示している。
【００９４】
本発明の変化
ＡｌｌｅｒＲ１からＲ６ＣＯＰの同族体も同じく考慮される。これらの同族体は、それぞれのペプチド中のアミノ酸の変化により産生され、同族体の、ブタクサ花粉にアレルギーを持つ患者ＩｇＥ抗体に対する反応性は消去されている一方、Ｔリンパ球に対する反応性は維持されている。更にＣＯＰの限界をブタクサ花粉主要アレルゲンＡｍｂａ１中でシフトさせることによるＣＯＰの同族体も考慮される。このような同族体は、同等の検出不可能なＩｇＥ結合及びＴリンパ球活性の特性を持つ製品を結果として生じるだろう。他に示されない限り、このような製品はヒトにおける安全性と効力に関しＡｌｌｅｒＲと同じ可能性を示すであろうと思われ、治療の機会という観点において等価なものであると認められるだろう。ブタクサ花粉ＩｇＥ抗体に対する反応性はないが、Ｔリンパ球に対する反応性は維持されていることにより特徴づけられる好適な同族体は、本明細書に記載された方法により同定され得る。Ｔリンパ球反応性は維持しながらＩｇＥ反応性は抑制又は消去され、可溶で及び／又は改善された合成及び精製を示すＣＯＰのセットもまた考慮される。
【００９５】
本発明を実施する際、その現在の好ましい態様を考慮した上で当業者に数多くの改良と変化が起きることが期待される。結果として、本発明の範囲を唯一制限するのは添付の特許請求の範囲に現れるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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