(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において、以下の（１）〜（４）の全ての領域がＲＮＡであって（１）と（３）のＲＮＡ領域の塩基数が同一であり、残りの領域がＤＮＡである二本鎖ポリヌクレオチドを含有する遺伝子発現阻害剤。
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基までの領域
（２）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
（３）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基までの領域
（４）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
【請求項２】
第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基及び第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基がＲＮＡである、請求項１に記載の遺伝子発現阻害剤。
【請求項３】
第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて２番目と３番目の２塩基及び第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて２番目と３番目の２塩基がＲＮＡである、請求項１に記載の遺伝子発現阻害剤。
【請求項４】
前記二本鎖ポリヌクレオチドを構成する二本のポリヌクレオチド鎖のうち、少なくとも一方が、その３’末端に、１−３塩基のヌクレオチドから成るオーバーハングを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子発現阻害剤。
【請求項５】
前記オーバーハングを構成する前記ヌクレオチドがＤＮＡであることを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子発現阻害剤。
【請求項６】
細胞内での遺伝子発現阻害方法であって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子発現阻害剤を、前記細胞（ヒト個体内の細胞を除く）に導入することを特徴とする方法。
【請求項７】
遺伝子発現を阻害するための二本鎖ポリヌクレオチドのスクリーニング方法であって、
パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基
が同数の塩基からなるＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
の両方の領域をＲＮＡに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成する工程と、
前記変異二本鎖ポリヌクレオチドについて、前記遺伝子発現の阻害活性と細胞毒性を調べる工程と、を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現阻害剤及び阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法として、近年、簡便性のためにＲＮＡ干渉（RNA interference; RNAi）が最もよく利用されている。  
ＲＮＡ干渉法では、典型的には、標的遺伝子と相同な配列を有する２１−２３塩基長の二本鎖リボヌクレオチド（siRNA）が用いられ、このsiRNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子の遺伝子発現を抑制できる（特許文献１参照）。  
ＲＮＡ干渉法の成功は、主にsiRNAの設計にかかっており、これまで、修飾塩基の利用やＤＮＡへの置換（特許文献２、非特許文献１参照）など、様々な試みがなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許公報  US2004/0259247
【特許文献２】国際特許公報  WO03/044188
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ui-Tei, K., et al. Nuc. Acids Res. 2008, vol.36. p.2136-2151
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞毒性が低く、効率よく遺伝子発現を抑制することのできるsiNAを含有する遺伝子発現阻害剤を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、阻害効率の良いsiRNAは、細胞毒性が強いことに着目し、siRNAの細胞毒性を抑制するための方法を開発しようと鋭意努力した結果、以下に記載の二本鎖ポリヌクレオチドであれば、細胞毒性が低いにもかかわらず、効率よく遺伝子発現を抑制することができることを見出した。このような二本鎖ポリヌクレオチドの発見は、細胞毒性と遺伝子発現抑制能は独立のファクターであることを示す重要な知見であり、この重要な発見を通じて、その二本鎖ポリヌクレオチドを含有する遺伝子発現阻害剤を完成させた。
【０００７】
本発明の一実施形態において、遺伝子発現阻害剤は、パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において、以下の領域がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡである二本鎖ポリヌクレオチドを含有する。  
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基
（２）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上、好ましくは３’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基
（３）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基
（４）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上、好ましくは５’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基
【０００８】
前記二本鎖ポリヌクレオチドを構成する二本のポリヌクレオチド鎖のうち、少なくとも一方が、１−３塩基のヌクレオチドから成るオーバーハングを有しても良い。このオーバーハングを構成する前記ヌクレオチドがＤＮＡであることが好ましい。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、細胞内での遺伝子発現阻害方法は、上記いずれかの遺伝子発現阻害剤を、前記細胞に導入することを特徴とする方法。この細胞は、ヒト個体内の細胞であっても、ヒト個体内の細胞でなくてもよい。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子発現阻害剤を製造するための二本鎖ポリヌクレオチドの使用方法であって、当該二本鎖ポリヌクレオチドは、パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において、以下の領域がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡである。  
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
（２）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域、好ましくは３’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基
（３）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
（４）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域、好ましくは５’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子発現を阻害するための二本鎖ポリヌクレオチドのスクリーニング方法は、パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から順に、
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から順に、
両方の鎖で少なくとも１塩基ずつＲＮＡに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成する工程と、前記変異二本鎖ポリヌクレオチドについて、前記遺伝子発現の阻害活性と細胞毒性を調べる工程と、を含むスクリーニング方法である。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子発現を阻害するための二本鎖ポリヌクレオチドのスクリーニング方法は、パッセンジャー鎖である第一の鎖とガイド鎖である第二の鎖から成り、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
をＲＮＡに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成する工程と、前記変異二本鎖ポリヌクレオチドについて、前記遺伝子発現の阻害活性と細胞毒性を調べる工程と、を含むスクリーニング方法である。
【００１３】
なお、本明細書で「二重鎖領域の最も５’（または３’）側の塩基」は、「二重鎖領域の５’（または３’）端」とも称する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、細胞毒性が低く、効率よく遺伝子発現を抑制することのできるsiNAを含有する遺伝子発現阻害剤を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】標的遺伝子をFLuc、RLuc、HPV16 E6、及びHPV16 E7とし、siRNAガイド鎖５’端から６塩基と８塩基、およびそのパッセンジャー鎖相補部分をDNAに置換したdsRDC-6およびdsRDC-8の遺伝子発現抑制能を測定した結果を示す図である。
【図２】標的遺伝子をFLucとしたdsRDC-8のガイド鎖のDNAを５’端より順次RNAに戻したsiNA（Ａ，Ｂ）、及びパッセンジャー鎖のDNAを二重鎖領域の３’端より順次RNAに戻したsiNA（Ｃ，Ｄ）の遺伝子発現抑制能を測定した結果を示す図である。
【図３】標的遺伝子をFLucとし、dsRDC-6およびdsRDC-8のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを二重鎖領域の５’端及び３’端より順次１〜３個分だけRNAに戻したsiNAの遺伝子発現抑制能を測定した結果を示す図である。
【図４】標的遺伝子をRLuc、HPV16 E6、またはHPV16 E7とし、dsRDC-8のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを二重鎖領域の５’端及び３’端より順次RNAに戻したsiNAの遺伝子発現抑制能を測定した結果を示す図である。
【図５】標的遺伝子をFLucとし、dsRDC-8において置換したDNAを、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖で、それぞれ二重鎖領域の５’端及び３’端より、連続した２塩基ずつを順にRNAに戻したsiNAの遺伝子発現抑制能を測定し、dsRDC-6やsiRNAと比較した結果を示す図である。
【図６】標的遺伝子をFLucとしたdsRDC-6、及びdsRDCのガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを二重鎖領域の５’端及び３’端より順次RNAに戻したsiNAの細胞毒性を測定した結果を示す図である。
【図７】E6E7（+）および（-）細胞において、標的遺伝子をHPV16 E6としたdsRDC-6とdsRDC-8において置換したDNAを、両側鎖で、５’端及び３’端より２塩基ずつRNAに戻したsiNAの腫瘍細胞残存率と細胞毒性を測定し、dsRDCやsiRNAと比較した結果を示す図である。
【図８】HeLa細胞とFL-SiHa-2細胞において、標的遺伝子をHPV16 E6（配列497）およびHPV16 E7（配列752）としたdsRDC-6とdsRDC-8において置換したDNAを、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖で、それぞれ二重鎖領域の５’端及び３’端より２塩基ずつRNAに戻したsiNAの標的腫瘍細胞（FL-SiHa-2）残存率と非標的細胞(HeLa)生存率を測定し、dsRDCやsiRNAと比較した結果を示す図である。
【図９】dsRDC-6、及びdsRDCのガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを５’端及び３’端より順次RNAに戻したsiNAの血清中での安定性を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００１７】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１８】
＝＝遺伝子発現阻害剤＝＝
本発明の遺伝子発現阻害剤は、二重鎖領域が１５−３０塩基長、好ましくは１９−２３塩基長、より好ましくは１９−２１塩基長、最も好ましくは１９塩基長であって、当該二重鎖領域において、以下の領域（１）〜（４）がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡである二本鎖ポリヌクレオチドを含有する。なお、本明細書で、二重鎖とは、二重になった２本のポリヌクレオチド鎖からなり、１重のポリヌクレオチド鎖からなる領域は含まないものとし、二本鎖とは、２本のポリヌクレオチド鎖からなればよく、オーバーハングなど１重のポリヌクレオチド鎖からなる領域を含んでも構わないものとする。  
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基、より好ましくは１０乃至１１塩基、最も好ましくは１１塩基の領域
（２）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域、好ましくは３’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基
（３）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基、より好ましくは１０乃至１１塩基、最も好ましくは１１塩基の領域
（４）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域、好ましくは５’側の塩基から数えて１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基
【００１９】
いわゆるsiNAにおいては、第一の鎖はパッセンジャー鎖に相当し、第二の鎖はガイド鎖に相当する。本明細書で、siNAとは、RNA干渉に用いることのできるsiRNA及びその一部又は全部がDNAに置換された分子を含むものとする。この二本鎖ポリヌクレオチドを構成する二本のポリヌクレオチド鎖のうち、少なくとも一方が、その３’末端にオーバーハングを有しても良い。このオーバーハングを構成するヌクレオチドの長さやヌクレオチドの種類や配列は特に限定されないが、１−３塩基のヌクレオチドから成ることが好ましく、安定性の面からＤＮＡであることが好ましい。
【００２０】
二重鎖部分の配列は、発現を抑制する標的遺伝子をコードする塩基配列に基づいて、siDirect（商標）などの公知の方法で決定することができる。二重鎖を構成するＤＮＡ及びＲＮＡは、発現抑制能を失わない限り、2'-O-メチル、2'-フルオロなどによって、任意に修飾されていても構わない。
【００２１】
このような構造を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、従来のsiRNAと同等の発現抑制活性を有するにもかかわらず、より細胞毒性が低いという特徴を有する。これによって、例えば、２種の細胞が混在しており、一方の細胞のみで特異的に、特定の遺伝子を抑制したい場合に、大いに効果を発揮する。例えば、がん細胞を特異的に殺す遺伝子発現阻害剤は、正常細胞に作用しても細胞毒性が低いため、副作用の少ない抗がん剤を開発できる。
【００２２】
二本鎖ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、公知の方法を用いればよいが、化学合成が最も簡便で好ましい。
【００２３】
＝＝遺伝子発現阻害剤の使用方法＝＝
この遺伝子発現阻害剤を細胞に導入することにより、その細胞内で標的遺伝子の発現を阻害することができる。細胞は、培養細胞でも、組織にあっても、個体（ヒト個体であってもヒト以外の動物個体であってもよい）にあってもよく、細胞タイプも限定されず、それぞれに適した公知の導入方法を用いればよい。標的遺伝子の発現抑制の目的は、特に限定されず、研究であっても医療であってもよく、遺伝子発現阻害剤が試薬であっても医薬であっても構わない。
【００２４】
＝＝遺伝子発現阻害剤のスクリーニング方法＝＝
本発明者らは、二重鎖領域において、第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基、より好ましくは１０乃至１１塩基、及び、第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基、より好ましくは１０乃至１１塩基がＲＮＡであって、残りがＤＮＡであるような二本鎖ポリヌクレオチド（本明細書では、dsDRCと称する。）は、細胞毒性が弱いが、発現抑制活性も弱いことを知り、その解決法として、第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて数塩基、及び、第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えてほんの数塩基をＲＮＡに戻すことにより、細胞毒性を増強させずに、発現抑制活性だけを増強できることを見出した。
【００２５】
このような二本鎖ポリヌクレオチドは、事実上、以下のようなスクリーニング方法によって見出された。従って、新たな配列に対しても、このスクリーニング方法を用いることにより、細胞毒性が低く、効率よく遺伝子発現を抑制することのできるsiNAを特定することができる。
【００２６】
すなわち、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡである二本鎖ポリヌクレオチドにおいて
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から順に、
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から順に、
両方の鎖で少なくとも１塩基ずつＲＮＡに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成し、遺伝子発現抑制活性と細胞毒性を調べることにより、遺伝子発現抑制活性が強く、かつ細胞毒性の弱い二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。両方のポリヌクレオチド鎖とも、５番目の塩基まで、好ましくは４番目の塩基まで、さらに好ましくは３番目の塩基まで、ＲＮＡへ戻すことで、目的の二本鎖ポリヌクレオチドを見つけることができる。両方のポリヌクレオチド鎖で、ＲＮＡに戻す塩基数は異なっていても良く、例えば、４塩基、３塩基、２塩基あるいは１塩基異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。
【００２７】
特に、以下のようなスクリーニング方法は、より効率よく、細胞毒性が低く、効率よく遺伝子発現を抑制することのできるsiNAを特定することができる。  
すなわち、二重鎖領域が１９−２３塩基長であって、当該二重鎖領域において
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて９乃至１５塩基の領域
がＲＮＡであって、残りの領域がＤＮＡであり、前記遺伝子発現の阻害活性を有する二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、
（１）第一の鎖の当該二重鎖領域の最も３’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
（２）第二の鎖の当該二重鎖領域の最も５’側の塩基から数えて３塩基までのうちで連続する２塩基以上の領域
をＲＮＡに戻した変異二本鎖ポリヌクレオチドを作成し、遺伝子発現抑制活性と細胞毒性を調べることにより、遺伝子発現抑制活性が強く、かつ細胞毒性の弱い二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００２８】
選択された二本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性は、もとの二本鎖ポリヌクレオチドであるdsRDC-6やdsRDC-8よりも強ければよいが、もとの二本鎖ポリヌクレオチドと同じ配列を有するsiRNAに対し、５０％以上の活性を有することが好ましく、６０％以上の活性を有することがより好ましく、７０％以上の活性を有することがより好ましく、８０％以上の活性を有することがより好ましく、９０％以上の活性を有することがさらに好ましく、９５％以上の活性を有することがさらに好ましく、有意差の無い活性を有することがさらに好ましく、より強い活性を有することが最も好ましい。ここで、遺伝子発現抑制活性とは、二本鎖ポリヌクレオチドを導入しない時の標的遺伝子の発現レベルに対する、二本鎖ポリヌクレオチドを導入した時の標的遺伝子の発現レベルの割合（％）を計算し、１００から引いた値とする。標的遺伝子の発現レベルの測定方法は、当業者に公知の方法であれば特に限定されない。もし、標的遺伝子の発現を抑制することで、細胞増殖、細胞死、組織の肥厚、高次機能（知能や運動能など）などの特定の機能が抑制され、それが定量的に測定できる効果であれば、発現レベルの低下の代わりに、機能の低下によって、遺伝子発現抑制活性を定義してもよい。例えば、特定の遺伝子の発現を抑制することにより、細胞増殖が抑制される場合、遺伝子発現抑制活性とは、二本鎖ポリヌクレオチドを導入しない時の細胞増殖能に対する、二本鎖ポリヌクレオチドを導入した時の細胞増殖能の割合（％）を計算し、１００から引いた値としてもよい。
【００２９】
また、選択された二本鎖ポリヌクレオチドの細胞毒性は、もとの二本鎖ポリヌクレオチドと同じ配列を有しＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチドよりも細胞生存率が高ければよいが、もとの二本鎖ポリヌクレオチドに対し、５０％以上の細胞生存率を有することが好ましく、６０％以上の細胞生存率を有することがより好ましく、７０％以上の細胞生存率を有することがより好ましく、８０％以上の細胞生存率を有することがより好ましく、９０％以上の細胞生存率を有することがさらに好ましく、９５％以上の細胞生存率を有することがさらに好ましく、有意差の無い細胞生存率を有することがもっとも好ましい。（ここで、細胞生存率とは、二本鎖ポリヌクレオチドを細胞集団に導入した時に生き残る細胞の割合（％）のことであって、その測定方法は、当業者に公知の方法であれば特に限定されない。
【実施例】
【００３０】
[実験方法]
＜１＞ 細胞株
ＨＰＶ１６陽性子宮頸癌細胞株（ＳｉＨａ）、ＨＰＶ１８陽性子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。細胞は、１０％仔牛血清加ダルベッコ改変MEM（ＤＭＥＭ）を用いて３７℃ 、５％  ＣＯ２存在下で培養した。  
初代培養ヒトケラチノサイトＨＤＫに由来するＨＰＶ１６ Ｅ６Ｅ７不死化細胞株ＨＤＫ１Ｅ６Ｅ７（Haga，T他、Cancer Sci  98：147-154，2007）およびＨＤＫ由来ＴＥＲＴ不死化細胞株ＨＤＫ１Ｔは、清野透博士（国立がんセンター研究所）より供与された。これらケラチノサイト由来の細胞は、ヒト組換え上皮増殖因子およびウシ下垂体抽出物添加ケラチノサイトSFM （インビトロジェン社）を用いて培養した。
【００３１】
＜２＞ プラスミド（hRL-ΔN16E6/pZeoSV2、 hRL-16E7/pZeoSV2）
HPV16遺伝子（アクセション番号K02718.1）のΔNE6 フラグメント（231-559）と E7フラグメント（562 - 858）が、それぞれpsiCheck-2 （アクセション番号AY535007）に挿入されたプラスミドである16ΔNE6/psiCheck-2及び16E7psiCheck-2（Yamato, K. et al., Cancer Gene Therapy 15:140-153, 2008）から、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と各断片が融合したRLuc-ΔN16E6断片とRLuc -16E7断片を制限酵素Nhe IとNot Iで切り出し、pZeoSV2のNhe I/Not Iサイトに挿入し、それぞれhRL-ΔN16E6/pZeoSV2およびhRL-16E7/pZeoSV2と命名した。
【００３２】
＜３＞トランスフェクション
プラスミドのトランスフェクションにはLipofectamine 2000（インビトロジェン社）を用いた。  
また、siNAのトランスフェクションにはLipofectamine RNAiMAX（Invitrogen社）を用いた。具体的には、Lipofectamine RNAiMAX 0.6〜0.8 μLをOpti-MEM I（Invitrogen社）を用いて50 μLに稀釈し、５分間室温で静置後、Opti-MEM Iで50 μL に稀釈したsiRNAと混和し、２０分間室温で静置後、培養細胞の培地に0.5 mlに全量を加え、アッセイまでそのまま培養を続けた。不死化ケラチノサイトはトランスフェクション後、５時間通常条件で培養後、培地交換を行い再び培養をおこなった。  
プラスミドとsiNAとのコトランスフェクションにはLipofectamine 2000を用いた。
【００３３】
＜４＞siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体
psiCheck-2プラスミド由来ホタルルシフェラーゼ（2532〜4184）を標的とするsiRNA配列FLuc 2900とpsiCheck-2プラスミド由来ウミシイタケルシフェラーゼ（694〜1629）を標的とするsiRNA配列RLuc 1383について、表１及び表２に、siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体の配列を示す。なお、本明細書で、dsRDC-n（nは整数）とは、siRNAにおいてその塩基配列に関わらず、オーバーハングを除く二重鎖部分について、パッセンジャー鎖の３’端より、n個分の塩基をDNAに置換したsiNAを言うものとする。また、dsRDCとは、dsRDC-nの総称とする。そして、dsRDC-nG12...jP12...k（j及びkは整数）とは、dsRDC-nに対し、置換されたDNAのうち、パッセンジャー鎖で1からkまで、ガイド鎖で1からjまでの塩基がRNAに戻されたことを言うものとする。パッセンジャー鎖またはガイド鎖の一方だけがRNAに戻された場合、dsRDC-nG12...jまたはdsRDC-nP12...kとして表される。
【表１】
0006002382.tif 000002
【表２】
0006002382.tif 000003
【００３４】
HPV16  E6を標的とするsiRNA配列497、及びE7を標的とするsiRNA配列752とsiRNA配列573（Yamato、 K. et al.、 Cancer Gene Ther 15:140-153、 2008）について、それぞれ表３〜５に、siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体の配列を示す。また、コントロールに用いた配列は表６に示す。
【表３】
0006002382.tif 000004
【表４】
0006002382.tif 000005
【表５】
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【表６】
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【００３５】
なお、これらの配列は、siDirect ソフトウエアシステム（http://design.RNAi.jp/）を用いて選択された。そして、表中では、RNAは大文字、DNAは小文字で表記されている。  
各配列を有する２１塩基リボヌクレオチドを化学合成し、脱塩後バッファー（100 mM potassium acetate、30 mM HEPES-KOH pH 7.4、2 mM magnesium acetate）中でアニーリングした。
【００３６】
＜５＞ウミシイタケルシフェラーゼ-（RLuc）-ΔNE6融合mRNAあるいはRLuc-E7融合mRNAとFLucを安定同時発現するSiHa細胞の作成
ホタルルシフェラーゼ（FLuc）安定発現SiHa細胞（FL-SiHa-2）（Yamato、K. et al., Cancer Gene Therapy vol.15, p.140-153, 2008）にhRL-ΔN16E6/pZeoSV2またはhRL-16E7/pZeoSV2をトランスフェクション後、G418（1 mg/ml）とZeocin （1 mg/ml）存在下で培養し、FLucとRLuc-ΔNE6あるいはFLucとRLuc-E7を同時に発現するSiHa細胞クローンを分離し、それぞれRLE6-FL-SiHa-10、及びRLE7-FL-SiHa-2と命名した。
【００３７】
＜６＞GFP発現ケラチノサイトの作成
レンチウイルス（ViraPower HiPerform Lentiviral Expression System、インビトロジェン社）を用いてそれぞれpsiCheck-2由来firefly luciferase (FLuc) （プロメガ社）とpd2GFP-N1由来d2EGFP（クロンテック社）の組換えレンチウイルスを作成した。FLuc cDNAおよびd2EGFPは、それぞれpsiCheck2およびpd2EGFP-N1プラスミドを鋳型とし、センスおよびアンチセンスプライマー（表７）とPlatinum PCR Supermix High Fidelity（インビトロジェン社）を用いてPCRによって増幅した。PCR産物は、Topoisomerase I（インビトロジェン社）を用いてpCR8/GW/TOPO （インビトロジェン社）に組み込んだ。さらにそこからFLuc cDNAをLR Clonase II （インビトロジェン社）を用いてレンチウイルス発現プラスミドであるpLenti6.3/V5-DEST（インビトロジェン社）に組み込み、このプラスミドをFLuc/pLenti6.3/V5-DESTおよびd2EGFP/pLenti6.3/V5-DESTと命名した。感染性組換えウイルスは、293FT 細胞（インビトロジェン社）にLipofectamine 2000を用いてレンチウイルス発現プラスミドとパッケージングプラスミド (pLP1, pLP2, pLP/VSVG) （インビトロジェン社）をコトランスフェクションすることによって得られた。トランスフェクション24時間後に培地交換をし、さらに96時間後に、感染性ウイルスを回収した。これらを用いてPolybren (6 μg/ml, シグマ  アルドリッチ)  存在下でHDK1TとHDK1E6E7に組換えレンチウイルスを感染させ、ブラストシチジン（2μg/ml）で選択し、ルシフェラーゼ発現HDK1T細胞（HDK1T-luc）とEGFP発現HDK1-E6E7細胞（HDK1-E6E7-EGFP）を作成した。
【表７】
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【００３８】
＜７＞siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体の血清存在下での安定性
siRNA、dsRDCおよびdsRDC RNA置換体（50 μM溶液）とFCSを１：１で混和、37℃でインキュベーションし、経時的にサンプリングし、Isogen（日本ジーン社）によって核酸を抽出した。サンプルは、10-20% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後SYBR Gold（インビトロジェン社）で染色し、FLA2000蛍光イメージ解析装置（富士フイルム社）で画像解析をおこなった。
【００３９】
＜８＞ルシフェラーゼ活性の測定
細胞におけるルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの４８時間後に、Dual Luciferase Reporter Assay System（プロメガ社）を用いて測定した。
【００４０】
なお、FLuc を標的とした時は、RLucを内部コントロールとし、RLuc、E6、E7を標的とした時はFLucを内部コントロールとし、測定値を内部コントロールの値で標準化した。そして、mockのみを導入した細胞のルシフェラーゼ活性を１００％とし、得られた測定値を相対値で表した。実験は、独立に三度測定し、グラフでは、平均値±標準偏差を示した。
【００４１】
＜９＞細胞毒性の測定
HeLa細胞に、各siNAをLipofectamine RNAiMAXを用いて1 nMまたは2 nMの濃度で導入し、5日目にWST-8によって生存細胞をしらべた。mockを導入した細胞の生存細胞を100%とし、各測定値を相対値で表し、細胞生存率とした。
【００４２】
細胞毒性＝100%-細胞生存率
[実施例１]
本実施例では、siRNAのRNAをDNAに置換すると、遺伝子発現抑制能が低下することを示す。  
ここで、siNAとして用いたdsRDC-6およびdsRDC-8では、それぞれsiRNAガイド鎖５’端から６塩基と８塩基、およびそのパッセンジャー鎖相補部分をDNAに置換した（図１Ａ）。なお、対照として、DNAに置換されていないsiRNAを用いた。
【００４３】
dsRDC-6およびdsRDC-8（図１Ｂ，Ｃ）またはdsRDC-6（図１Ｄ，Ｅ，Ｆ）を、図１のグラフに示す様々な濃度で、RLuc-E6融合遺伝子とFLuc遺伝子を発現するRLE6-FL-SiHa-10細胞（図１Ｂ，Ｃ，Ｄ）あるいはRLuc-E7融合遺伝子とFLuc遺伝子を発現するRLE7-FL-SiHa-2細胞（図１Ｅ，Ｆ）に導入して、４８時間後、FLuc活性とRLuc活性の測定をおこなった。表８に、細胞と抑制遺伝子の組み合わせをまとめた。図１Ｂ〜Ｆには、各濃度（concentration(pM)）におけるルシフェラーゼ活性（relative Luc activity）をプロットしたグラフを示し、表９には、Ｄ〜Ｆにおいて、遺伝子発現を５０％抑制するsiNAの濃度（pM）をまとめた。
【表８】
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【表９】
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【００４４】
このように、表８に示したいずれのsiRNAの場合も、６塩基をＤＮＡに置換すると、遺伝子発現抑制能は低下した。FLuc 2900及びRLuc 1383に対して８塩基を置換すると、抑制能はさらに低下した。
【００４５】
[実施例２]
本実施例では、dsRDC-8のガイド鎖のDNAを５’端より順次RNAに戻しても、パッセンジャー鎖のDNAを二重鎖部分の３’端より順次RNAに戻しても、抑制活性が事実上回復しないことを示す。
【００４６】
まず、図２Ａに示すように、FLuc 2900の配列を持つdsRDC-8のガイド鎖のDNAを５’端より１-４塩基分だけ、RNAに戻したsiNAを作製し、RLE6-FL-SiHa-10細胞に様々な濃度で導入し、FLuc活性を測定した。次に、図２Ｃに示すように、FLuc 2900の配列を持つdsRDC-8のパッセンジャー鎖のDNAを、二重鎖部分の３’端より１-４塩基分だけ、RNAに戻したsiNAを作製し、RLE6-FL-SiHa-10細胞に様々な濃度で導入し、FLuc活性を測定した。図２Ｂ及びＤには、各濃度におけるルシフェラーゼ活性をプロットしたグラフを示し、表１０には、遺伝子発現を５０％抑制するsiNAの濃度をまとめた。
【表１０】
0006002382.tif 000011
【００４７】
このように、置換した片側鎖のDNAを１〜４塩基分だけRNAに戻しても、siNAの遺伝子発現抑制能は事実上回復しなかった。
【００４８】
[実施例３]
本実施例では、dsRDC-8のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを二重鎖部分の５’端及び３’端より順次RNAに戻すと、両側で２個以上RNAに戻したときに抑制活性が顕著に回復することを示す。
【００４９】
ここでは、図３Ａ，Ｃ，Ｅに示すように、FLuc 2900の配列を持つdsRDC-6あるいはdsRDC-8のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを、二重鎖部分の５’端及び３’端より１-３塩基分だけ、RNAに戻したsiNAを作製し、RLE6-FL-SiHa-10細胞に様々な濃度で導入し、FLuc活性を測定した。図３Ｂ，Ｄ，Ｆには、各濃度におけるルシフェラーゼ活性をプロットしたグラフを示し、表１１には、遺伝子発現を５０％抑制するsiNAの濃度をまとめた。また、表１２には、１．６ｐＭ及び８．０ｐＭの濃度で導入した時の遺伝子発現阻害活性（％）を比較した。
【表１１】
0006002382.tif 000012
【表１２】
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【００５０】
このように、置換したDNAを、両側鎖で、二重鎖の５’端及び３’端より順次RNAに戻すと、両側で２個以上RNAに戻したときに（即ち、8G12P12及び8G12P123の場合）、抑制活性が顕著に回復した。
【００５１】
[実施例４] 
実施例３と同様の実験を、他の標的遺伝子を用いて行った。用いたsiNAの構造を表１３にまとめた。また、用いたsiNA、標的遺伝子、細胞の組み合わせを表１４にまとめた。そして、図４Ａ-Ｄには、各濃度におけるルシフェラーゼ活性をプロットしたグラフを示し、表１５には、遺伝子発現を５０％抑制するsiNAの濃度をまとめた。また、表１６には、１．６ｐＭ及び８．０ｐＭの濃度で導入した時の遺伝子発現阻害活性（％）を比較した。
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【００５２】
このように、置換したDNAを、両側鎖で、５’端及び３’端より順次RNAに戻すと、標的遺伝子に関わらず、実施例３と同様に、両側で２個以上RNAに戻したときに抑制活性が顕著に回復した。
【００５３】
[実施例５] 
本実施例では、dsRDCにおいて置換したDNAを、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両側鎖で、それぞれ５’端及び３’端より１番目と２番目の２塩基または２番目と３番目の２塩基をRNAに戻したときに、最も効率よく遺伝子発現を抑制できることを示す。
【００５４】
まず、図５Ａに示すように、FLuc 2900の配列を有するdsRDC-8のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを、二重鎖部分の５’端及び３’端より１番目と２番目の２塩基、２番目と３番目の２塩基、または３番目と４番目の２塩基をRNAに戻したsiNA（それぞれ、8G12P12、8G23P23、8G34P34と称する）を作製し、RLuc-E6融合遺伝子とFLuc遺伝子を発現するRLE6-FL-SiHa-10細胞に導入して、４８時間後、FLuc活性とRLuc活性の測定をおこなった。図５Ｂは、各濃度(pM)におけるルシフェラーゼ活性をプロットしたグラフを示した。図５Ｂに示すように、抑制活性において8G23P23は8G12P12と同様の挙動を示し、dsRDC-6や8G34P34に比べて抑制活性が強かった。
【００５５】
[実施例６]
本実施例では、siRNAは細胞毒性が強いこと、dsRDCは細胞毒性が弱く、dsRDCのガイド鎖及びパッセンジャー鎖のDNAを５’端及び３’端より順次RNAに戻すと、両側で３個までRNAに戻しても、細胞毒性が増強しないことを示す。
【００５６】
まず、FLucを標的としたFLuc 2900及びその置換体（1nM）をもちいて、HeLa細胞に対する細胞毒性を調べ、グラフにした。
【００５７】
図６に示したように、HeLa細胞において、いずれの置換体（dsRDC-6、8G12P12、8G12P123、9G123P123）も、siRNAに比べ有意（p<0.01）に低い細胞毒性を示した。
【００５８】
[実施例７]
本実施例では、dsRDCにおいて置換したDNAを、両側鎖で、５’端及び３’端より２塩基ずつRNAに戻したときに、細胞生存に影響を与えず、最も効率よく遺伝子発現を抑制できることを示す。
【００５９】
ここでは、HPV16 E6E7陽性ケラチノサイトおよび陰性ケラチノサイトの混合培養を用いたHPV16 高度異型上皮/早期癌病変モデルを利用した。HPV16 E6E7陽性ケラチノサイトでは、siNAによってHPV16の遺伝子発現を抑制すると増殖することができない。一方、陰性ケラチノサイトでは、siNAが細胞毒性を示すと、細胞の生存が維持できない。従って、HPV16 E6E7陽性ケラチノサイトに対しては増殖抑制し、HPV16 E6E7陰性ケラチノサイト対しては、細胞毒性を示さないsiNAが好ましい。そこで、これらを混合培養した細胞に、HPV16 E6を標的としたsiNA（497）を導入し、その細胞増殖抑制能や細胞毒性を調べた。
【００６０】
具体的には、GFP導入HPV16 E6E7陽性ケラチノサイト（HDK1E6E7-EGFP）とルシフェラーゼ導入HPV16 E6E7陰性ケラチノサイト（HDK1T-Luc）を2:1の細胞比で混和し、総細胞数5000で４ウェルチェンバースライドに播種した。翌日Lipofectamine RNAiMAXを用いてsiRNA、dsRDC-6、8G12P12、または9G123P123の導入を行った（終濃度0.5 nM）。トランスフェクション５日後、PBSで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドにより室温で１時間固定した。PBSにて洗浄後、DAPIを用いて核染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。それぞれ無作為に４視野における総細胞数とGFP陽性および陰性細胞数を数え、mockに対する割合（％）を算出した。実験は３重（トリプリケート）でおこない、平均±標準偏差を算出した。その結果、dsRDC-8G12P12は、siRNAにくらべて、HPV16 E6E7陰性ケラチノサイトに対して有意に低い細胞毒性を示し（p<0.001）、またsRDC-8G12P12およびsRDC-9G123P123は、dsRDC-6.0よりも、HPV16 E6E7陽性ケラチノサイトに対する強い増殖抑制効果を示した（p<0.05）。なお、この結果を図７Ａにグラフ化し、各siNAの効果を表１７にまとめた。また、その時の蛍光顕微鏡観察像を図７Ｂに示した。
【表１７】
0006002382.tif 000018
【００６１】
表１７及び図７Ａに示すように、sRDC-8G12P12は、細胞毒性が最も低く、腫瘍細胞数は顕著に減少させた。
【００６２】
図７Ｂでは、細胞が大きく明るく緑色に光っているのがHPV16 E6E7陽性ケラチノサイトであり、核だけが小さく暗く青色に光っているのがHPV16 E6E7陰性ケラチノサイトである。siRNAやsRDC-9G123P123を用いた場合、どちらの細胞も死んでしまって、ほとんど残存していない。一方、dsRDC-6.0ではHPV16 E6E7陽性ケラチノサイトがかなり残存していることがわかる。これらに対し、sRDC-8G12P12を用いた場合、HPV16 E6E7陰性ケラチノサイトはかなり残存しているにもかかわらず、HPV16 E6E7陽性ケラチノサイトは顕著に減少している。
【００６３】
このように、置換したDNAを、両側鎖で、５’端及び３’端より２塩基ずつRNAに戻したときに、細胞毒性が最も低く、それにもかかわらず効率よく遺伝子発現を抑制できた。
【００６４】
[実施例８]
本実施例では、正常細胞と腫瘍細胞に対し、腫瘍細胞特異的に細胞死を起こさせるsiRNAを導入し、正常細胞生存率／腫瘍細胞生存率を指標とすることにより、本発明のsiNAが最も副作用の少ない医薬として有効であることを示す。
【００６５】
まず、腫瘍細胞であるHPV16陽性FL-SiHa-2細胞に対し、497、752、及びそれらの置換体（即ち、siRNA、dsRDC-6、8G12P12、9G123P123、各2nM）を導入し、HPV16の遺伝子発現を抑制することにより細胞死を起こさせ、その細胞死を指標に各２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制効果を調べた。ここで、細胞生存率は、実施例６と同様に算定し、腫瘍細胞の生存率を、siRNAを用いた場合、＜各siRNAによる細胞生存率／対照siRNAによる細胞生存率＞として評価し、dsRDC-6及びその置換体を用いた場合、＜各siNAによる細胞生存率／対照dsRDC-6による細胞生存率＞として評価した。ここでも、実験は３重（トリプリケート）でおこない、平均±標準偏差を算出した。その結果を図８及び表１８に示す。
【表１８】
0006002382.tif 000019
【００６６】
次に、正常細胞として、HPV16陰性HeLa細胞に対し、FL-SiHa-2細胞と同様に各siNAを導入し、細胞生存率を測定し、評価した。その結果を図８及び表１９に示す。
【表１９】
0006002382.tif 000020
【００６７】
そして、各siNAの平均値について＜正常細胞の生存率／腫瘍細胞の生存率＞を算出し、副作用の少ない医薬となる可能性を評価した。腫瘍細胞の生存率が低く、正常細胞の生存率が高いほど、副作用の少ないと考えられるので、この値が大きいほど医薬として有望になる。
【表２０】
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【００６８】
このように、本発明に係るsiNAである8G12P12や9G123P123は、siRNAやdsRDC-6に比べ、医薬として有効であることがわかる。
【００６９】
[実施例９]
本実施例では、dsRDCにおいて置換したDNAを、両側鎖で、５’端及び３’端より２塩基ずつRNAに戻しても、血清中で安定に存在することを示す。
【００７０】
まず、siNA、dsRDC-6、8G12P12または9G123P123（50μM）にウシ胎児血清を１：１で混和し、37℃でインキュベーションし、図９に示した各時間に核酸抽出液（Isogen社）を加えて核酸を精製後、10-20% ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。
【００７１】
図９に示されるように、インキュベーション３０分後、dsRDC-6とdsRDC-8G12P12のバンドの位置は、あまり変化がないのに比べ、siRNAとdsRDC-9G123P123は移動度が大きくなっており、これらのsiNAが分解によって短くなっていた。このように、両側鎖で、５’端及び３’端より２塩基ずつRNAに戻しても、DNAに置換したsiNAと同様に安定であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006002382.tif 000030
【配列表】
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