(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子をそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrev遺伝子および抗生物質耐性遺伝子である選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクター；および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV repタンパク質オープンリーディングフレーム（ORF）を含有する発現プラスミド
から成る、レンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定して発現する系。
【請求項２】
ハイブリッドベクターの2つの発現カセットがテール・ツー・テール配向でありかつそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項１に記載の系。
【請求項３】
プロモーターがCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される、請求項１または２に記載の系。
【請求項４】
プロモーターがCMV IEプロモーターである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の系。
【請求項５】
選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項１〜４のいずれか1項に記載の系。
【請求項６】
選択マーカーがハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項５に記載の系。
【請求項７】
選択マーカーが内部リボソーム侵入部位（IRES）下流にクローニングされる、請求項１〜６のいずれか1項に記載の系。
【請求項８】
repタンパク質がrep78である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の系。
【請求項９】
第1の発現カセットがレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrev遺伝子および抗生物質耐性遺伝子である選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも１つのコピーを安定してそのゲノム中に組み込んで含有することで特徴付けられる、安定してレンチウイルスのgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞から成る半-安定なレンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１０】
細胞がHEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項９に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１１】
2つの発現カセットがテール・ツー・テール配向でありかつそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項９または１０のいずれか1項に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１２】
プロモーターがCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される、請求項９または１１のいずれか1項に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１３】
プロモーターがCMV IEプロモーターである、請求項１２に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１４】
選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項９〜１３のいずれか1項に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１５】
選択マーカーがハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項１４に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１６】
選択マーカーが内部リボソーム侵入部位（IRES）下流にクローニングされている、請求項９〜１５のいずれか1項に記載の半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。
【請求項１７】
i. 請求項９〜１６いずれか1項に記載の半-安定パッケージング細胞株を培養するステップ、
ii. 半-安定パッケージング細胞株にenv遺伝子を挿入するステップ、および
iii. 半-安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップ
を含むレンチウイルスベクター産生する方法。
【請求項１８】
env遺伝子がVSV-G env遺伝子、MLV 4070 env遺伝子、RD114 env遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-proをコードする遺伝子、バキュロウイルスGP64 env遺伝子またはGALV env遺伝子から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
env遺伝子が、キメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子である、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子治療用レンチウイルスベクター（LV）の産生に関する。さらに特に、本発明は半-安定レンチウイルスパッケージング細胞株、ならびに構造および調節レンチウイルスタンパク質の安定な組込みのためにハイブリッド・バキュロ−アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いてパッケージング細胞株を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
史上初の2001年のAIDSに対するLV第Ｉ相臨床試験以後、遺伝子送達ビヒクルとしてHIV系LVを使用する38件の第I〜II相および2件の第II〜III相試験が行政機関の精査を受けており、そのうちの3件はなお審査中である。最も多数の試験には一遺伝子障害が含まれ、多いのは、例えばクーリー貧血またはβサラセミアメジャー（4件）である。癌および感染性疾患（ほとんどはHIV-1感染）がそれに続く。一般に、第Ｉ/II相に登録される患者数は限られるが、第III相においてはそうでない。従って、将来望まれる多数の達成可能な第III相試験用のLV大量生産需要に対処するために、第2（LTRに基づく）および第3（SINに基づく）LV世代に対する安定なパッケージング細胞株が緊急に必要である。一過性プロトコルに基づくLV産生は、安全、コストおよび再現性の点で世界的に応用するには全く非実用的である。
【０００３】
増加する確証は、LV、すなわち、最も新しく開発された遺伝子治療用ウイルス組込みベクターが最終的に分化したまたは分裂中の細胞のどちらにも広く応用可能であり、長期トランスジーン発現の持続に理想的であり、そして最初恐れられたよりも安全であることを示す。過去20年間にわたりモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）γ-レトロウイルスベクター（γRV）で蓄積された経験がLV送達系における迅速な進歩を手引きし、その開発はレトロウイルスが非分裂細胞を形質導入する能力を持たないことを克服する必要から始まったものである。特に、自己不活化（SIN）導入ベクターの作製は、効率の高い製造プロセスの拡大と最適化ができれば、ヒト臨床試験におけるLVの大量使用の見込みをさらに実現可能にする［1］。しかし、いくつかのヒトおよびマウスの市販パッケージング細胞株により産生することができるγRVとは対照的に、LVは現在研究グレードだけでなく、GMPグレードについてもほとんど独占的に一過性形質導入により産生されている。この技法は高価であり、標準化およびスケールアップが難しく、かつ多数の下流の確証試験を必要とする。さらに、パッケージングおよび導入ベクター構築物中のウイルス配列間の組換えを通して生じうる複製コンピテントレンチウイルス（RCL）のリスクは、稀であるが安定な産生よりも一過性産生中に多く起こりうる事象である。
【０００４】
レトロウイルスと等価の安定なLV用のパッケージング細胞株の開発は時間がかかりかつ困難であることが判っており、その理由は、γレトロウイルスとは対照的に、レンチウイルスのタンパク質、例えば、env、プロテアーゼおよびいくつかのアクセサリータンパク質の発現はヒト細胞にとって有毒であるからである。この問題を克服するために、極く初期バージョンのパッケージング細胞に存在したアクセサリー遺伝子はその後、最近の世代では除去された。第1世代のSIV-およびHIV-系LVパッケージング細胞株はパッケージングシグナルの除去などの少数の重要な改変を行ったレンチウイルスゲノムを用いて遺伝子操作で作られたサルVero、またはヒトCOS、HeLaおよびHEK293接着細胞から得られた［2〜5］。gp120 envおよびほとんどのアクセサリー遺伝子は事実上維持された。得られるLV力価は非常に低く［2〜5］、そしてさらに重要なのは、これらのベクターの応用の可能性は必然的に抗-AIDS遺伝子治療手法のためのCD4+T細胞に限られた。その後、効率的なLV産生のために不必要であることが証明されたので、gp120 envは小胞口内炎ウイルス（VSV-G）由来の糖タンパク質で置き換えられ、また全てのアクセサリー遺伝子は除去された。VSV-Gについても記載された毒性を防止するため、その発現は様々な異なる系、例えば、Tet、エクジソン、Rev、およびTetとキュメート（cumate）の組み合わせなどにより条件付きで誘導された［6］。同様に、クローン選択中のウイルスプロテアーゼの有毒な効果を減ずるために、Tet、およびドキシサイクリンとキュメート薬物の組み合わせによる、gag-pol遺伝子の条件付き発現が記載されている［6］。全てのこれらの系において、gag-pol、revおよびenv遺伝子はプラスミドDNAの一過性トランスフェクションにより組み込まれ、次いで薬物選択および細胞クローニングが行われた。
【０００５】
真に安定なパッケージング細胞株を満たすための重要な事象の1つは最良のウイルス遺伝子送達ビヒクルの選択である。ほとんどの研究者はgag-pol、revおよびenv遺伝子をプラスミドDNAの一過性トランスフェクションにより組込み、次いで薬物選択および細胞クローニングを行った［2-9］。この技法は、時間とともに、遺伝子サイレンシングおよび遺伝子喪失に悩まされ［10］、これらは両方ともパッケージングクローンの長期安定性を危うくしうることは公知である。
【０００６】
代わりの遺伝子送達ビヒクルは特にSTAR[11]においておよび、さらに最近開発されたGPRG-TL-20[12]パッケージング細胞株（ここでは、gag、polおよびrev遺伝子はMLV-シャトルベクターによりHEK293T細胞中に組み込まれた）において開示されている。再コードしたgag-pol遺伝子の2コピーが安定してSTARに組み込まれたが、GPRG-TL-20 [12]についてはかかる情報は得られてない。env遺伝子がトランスフェクトされたSTARとは対照的に、GPRG-TL-20では、全ての残りのウイルス遺伝子はSIN-MLVにより導入された。
【０００７】
外来ゲノムの宿主細胞中への安定な組込みを可能にするいくつかの系が存在する。Palomboら、1998［13］は宿主細胞中へ特異的に組込むためのハイブリッドバキュロウイルス-AAVベクターを開示している。かかるベクターは、もし前記ハイブリッドバキュロウイルス-AAVベクターにrep遺伝子が含まれれば、非常に有効であるらしい。この参考文献において、本発明の構築物の記載はなく、ましてこの種のLV産生用の系の示唆もない。
【０００８】
過去ほとんど20年間にわたり、安定なLVパッケージング細胞株を作製するいくつかの企てがなされている。今日まで開示された色々な技法にも関わらず、これらのパッケージング細胞株はどれも臨床試験に採用されていないしまたはまだ市場を占めてない。それ故に、生産能力の点で有効でありかつ安全、費用効果的かつ再現性のある新しいLV大規模産生系が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Schambach A, Baum C. Clinical application of lentiviral vectors - concepts and practice. Curr Gene Ther. 2008;8:474-482.
【非特許文献２】Carroll R, Lin JT, Dacquel EJ, Mosca JD, Burke DS, St Louis DC. A human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-based retroviral vector system utilizing stable HIV-1 packaging cell lines. J Virol. 1994;68:6047-6051.
【非特許文献３】Yu H, Rabson AB, Kaul M, Ron Y, Dougherty JP. Inducible human immunodeficiency virus type 1 packaging cell lines. J Virol. 1996;70:4530-4537.
【非特許文献４】Poeschla E, Corbeau P, Wong-Staal F. Development of HIV vectors for anti-HIV gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:11395-11399.
【非特許文献５】Corbeau P, Kraus G, Wong-Staal F. Efficient gene transfer by a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-derived vector utilizing a stable HIV packaging cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:14070-14075.
【非特許文献６】Broussau S, Jabbour N, Lachapelle G, et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol Ther. 2008;16:500-507.
【非特許文献７】Srinivasakumar N, Chazal N, Helga-Maria C, Prasad S, Hammarskjold ML, Rekosh D. The effect of viral regulatory protein expression on gene delivery by human immunodeficiency virus type 1 vectors produced in stable packaging cell lines. J Virol. 1997;71:5841-5848.
【非特許文献８】Kaul M, Yu H, Ron Y, Dougherty JP. Regulated lentiviral packaging cell line devoid of most viral cis-acting sequences. Virology. 1998;249:167-174.
【非特許文献９】Cockrell AS, Ma H, Fu K, McCown TJ, Kafri T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Mol Ther. 2006;14:276-284.
【非特許文献１０】Bestor TH. Gene silencing as a threat to the success of gene therapy. J Clin Invest. 2000;105:409-411.
【非特許文献１１】Ikeda Y, Takeuchi Y, Martin F, Cosset FL, Mitrophanous K, Collins M. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nat Biotechnol. 2003;21:569-572.
【非特許文献１２】Throm RE, Ouma AA, Zhou S, et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 2009;113:5104-5110.
【非特許文献１３】Palombo F, Monciotti A, Recchia A, Cortese R, Ciliberto G, La Monica N. Site-specific integration in mammalian cells mediated by a new hybrid baculovirus-adeno-associated virus vector. J Virol. 1998;72:5025-5034.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はレンチウイルスベクター（LV）産生の分野に関する。いくつかの遺伝子治療の臨床試験がLVを遺伝子送達ビヒクルとして使って進行中である。全てのこれらの試験において、LV産生はまだ一過性プロトコルに基づいている。
【００１１】
本発明はHIV-1-系パッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。かかる戦略は、AAV逆方向末端反復配列（ITR）に隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター、いわゆるバキュロ-AAVハイブリッド系の、repタンパク質をコードするプラスミドと組み合わせての使用に基づく。この系は構造および調節HIV-1タンパク質gag/polおよびrevの安定な組込みを得ることを可能にする。本発明の系は、a）2つの発現カセット、すなわち、レンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードするものと他のレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードするものを含有することを特徴とするバキュロ-AAVハイブリッドベクター、および、b）repタンパク質をコードするプラスミドを含む。提起した系は、宿主細胞をかかるレンチウイルスタンパク質で安定してかつ効果的に遺伝子操作するために、構造および調節HIV-1タンパク質を送達する新しくかつ有利な道を表す。この系を用いて半-安定なLV産生に用いる構造および調節HIV-1タンパク質gag/polおよびrevだけを含む第1の中間体を得た、またはこれを出発点として用いて、任意に、調節タンパク質（tat）と目的のエンベロープタンパク質を含むかまたはエンベロープタンパク質だけを含む、第2および第3世代パッケージング細胞株、ならびに導入ベクターも含むプロデューサー細胞株を得た。
【００１２】
第1中間体はHIV-1 gag-polおよびrev遺伝子をトリシストロンの立体配置で発現する2コピーの組換えバキュロ-AAVパッケージング構築物を運ぶ。かかる中間体はPK-7と呼ばれて、実施例におけるPK-7を意味する。ITR-介在型AAVベクター組込みに必要であることが公知のAAV rep78タンパク質の一過性発現により、バキュロ-AAVパッケージングベクターのゲノム組込みを促進した［14］。かかる第1中間体は1年間の培養に対して驚くべき遺伝安定性を有することを示し、これは残存する遺伝エレメントの一過性トランスフェクション後の機能的LVの連続産生を証明した。さらに、かかる細胞においてサイレンシング現象は観察されなかった。さらに、非コード遺伝子内の転写活性領域中の2つの直列に組み込まれたパッケージングAAVの組込み部位を正確にマッピングすることにより、本発明者らは、そのmRNAがLVにそして究極的には宿主細胞に組み込まれうる危険遺伝子の活性化の可能性に対する安全性の論拠を与えた。
【００１３】
レンチウイルスのgag-polおよびrevの安定な発現のためのハイブリッドバキュロ-AAVベクターの使用に基づいて開発したパッケージング系を「MolPack」と呼ぶ。本発明で使用する発現系は有利なことに、わずか1回のトランスフェクションとクローニングで、構造（gag/pol）および調節（rev）HIVタンパク質の安定かつ安全な導入を可能にする。現在臨床試験で使われているLVの産生は未だに全ての必要なタンパク質の一過性トランスフェクションに基づく。対照的に、本発明の発現系で得られる中間体は安定であり、サイレンシング現象を示さず、LVの半-安定産生を開発することを可能にし、経済的視点から大きい利点がある。実際、半-安定産生では、最終産物を得るために必要なトランスフェクトすべき構築物の数が少なくて済む。さらに、注目すべきは、本発明の半-安定産生を用いると、一過的にLVを産生する場合と比較しうる力価を有するLVを得るのに、一過性トランスフェクションによる産生で使うDNA量のわずか3分の1で十分であることが見出された。さらに、トランスフェクトする構築物の数が減ずると、RCLの形成を伴う組換え事象の可能性が減少し、従ってレンチウイルス粒子産生をより安全なものにする。それ故に、本発明の発現系、半-安定パッケージング細胞株および産生方法は、現在臨床試験で応用されるツールおよび方法と比較して非常に有利である。
【００１４】
発明の表明
本発明の第1の態様によれば、
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター；および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV Repオープンリードフレーム（ORF）を含有する発現プラスミド
から成るレンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定発現する系が提供される。
【００１５】
好ましくは、ハイブリッドベクターの2つの発現カセットはテール・ツー・テール（tail-to-tail）配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMV IEプロモーターである。
【００１６】
好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【００１７】
さらに好ましくは、選択マーカーは内部リボソーム侵入部位（IRES）の下流にクローニングされる。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、レンチウイルスのgag polおよびrevを安定して発現する細胞から成る半-安定レンチウイルスパッケージング細胞株であって、かかる細胞はそのゲノム中に安定して組み込まれた少なくとも1コピーのAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有し、この組込みカセットは第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むことを特徴とする、前記細胞株が提供される。
【００１９】
好ましくは、細胞は好ましくはHEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株、より好ましくは細胞株はHEK293-Tである。
【００２０】
好ましくは、2つの発現カセットはテール・ツー・テール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、構成的プロモーターはCMV IEプロモーターである。
【００２１】
好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子である。より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。
【００２２】
好ましくはAAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。
【００２３】
他の態様によれば、レンチウイルスベクターを産生する方法であって、
i. レンチウイルスのgag、polおよびrevを安定して発現する細胞から成る半-安定レンチウイルスのパッケージング細胞株を培養するステップであって、かかる細胞は、安定してゲノム中に組込まれたAAV ITRに隣接した2つの発現カセットを含む組込みカセットの少なくとも１つのコピーを含有し、第1の発現カセットはレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットはレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードすることを特徴とする前記ステップ；
ii.半-安定パッケージング細胞株にenv遺伝子を挿入するステップ；
iii.半-安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップ
を含むものである前記方法が提供される。
【００２４】
好ましくは、2つの発現カセットはテール・ツー・テール（tail-to-tail）配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、構成的プロモーターはCMV IEプロモーターである。
【００２５】
好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択され；好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは。IRESの下流にクローニングされる。
【００２６】
エンベロープタンパク質は宿主細胞に、AAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同組換えを用いて挿入することができる。
【００２７】
好ましくは、env遺伝子はプラスミドを用いて一過性トランスフェクションにより挿入される。
【００２８】
好ましくは、env遺伝子はVSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、キメラエンベロープタンパク質RD114-TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64 envまたはGALV envまたはそれらの誘導体から選択され、より好ましくはRD114-TRをコードするenv遺伝子である。
【００２９】
好ましくは、導入ベクターはSINレンチウイルスベクターを用いて挿入される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】RD-MolPack開発の模式図。(a)本研究に用いたDNAプラスミドの模式図による表現。pPolh、ポリヘドリンプロモーター；attB1、アタッチメントB1；ITR、逆方向末端反復；CMV、サイトメガロウイルスプロモーター；In、イントロン；RRE、rev応答エレメント；A、ポリA配列；IRES、内部リボソーム侵入部位；SD、スプライスドナー；SA、スプライスアクセプター；Ψ、パッケージングシグナル；WPRE、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント；cPPT、中央ポリプリン配列；hPGK、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター。(b)AAV-GPRベクターのRep78介在型ゲノム組込みの一例。AAV Rep78はITR-隣接AAV-GPRカセットの切除を促進しかつそのヒト染色体中への組込みを容易にする。(c)半-安定パッケージング細胞系による産生のフローチャート。GOIは目的の遺伝子（gene of interest）である。
【図１−２】（図１−１の1続き）
【図２】PKクローンの特徴付け。(a) AAV-GPRベクター組込みのサザンブロット分析である。カセットのコピー数と完全性を確立するために、PKクローンから誘導したゲノムDNA（10μg）を2つの異なる制限酵素、BamHIおよびSnaBIでそれぞれ消化した。(b) GPRカセットから産生したウイルスタンパク質のウェスタンブロット分析である。左パネル、PKクローンから得た細胞抽出物（50μｇ/レーン）を、HIV-1タンパク質を認識する抗-HIVヒト血清とハイブリダイズさせた。メンブランを逐次、抗-rev特異的Abとハイブリダイズさせた。右パネル、PKクローンから産生されたウイルス様粒子（VLP）の30ng p24Gag等価物を細胞抽出物と同一の方法で処理した。(c) 位置2q32.1における染色体2のロングアームのDNA切断点を特定するLM-PCR技法によるGPR-カセット組込みの模式図によるマッピングである。(d) AAV-GPRカセットとヒトHox4遺伝子の染色体2中への共局在化を示す。PK-7分裂中期染色体のin situハイブリダイゼーションをgag特異的（赤色）およびHox4特異的（緑色）プローブをそれぞれ用いて行った。(e) PK-7クローン中の2つのGPR組込みカセットの再配置およびそれらのテール・ツー・ヘッド配向の模式図表現である。
【図３】バキュロ-AAV-GPRゲノムおよびRep78の組込みの可能性に関する対照実験。(a) 組換えバキュロウイルス-AAV DNAのサザンブロット分析である。DNAをバキュロウイルス粒子から抽出し、一晩、MluI制限酵素で消化し、ブロットした後、11-kb GPRカセット特異的プローブで探索した。エントリー-GPRプラスミド（1pg）およびバキュロウイルス空DNA（100ng）をそれぞれポジティブおよびネガティブ対照として装填した。(b) PK-7細胞中への推定残留rep78プラスミドDNA組込みの検出である。Rep78特異的PCRをサンプルテンプレートとしてPK-7ゲノムDNAおよびポジティブ対照としてCMV-rep78（1pg）プラスミドを用いて行った。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい特徴および実施形態の詳細な説明を非限定の例を用いて説明しよう。
【００３２】
当業者は、特に断らない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技法を使うことにより本発明を実施に移すことができる。全てのかかる技法は、出版されている文献に開示されかつ説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；Current Protocols in Immunology, ch. 12, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J . M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press；M. J . Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press；および、D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.を参照されたい。全てのこれらの出版物は参照により組み込まれる。
【００３３】
バキュロ-AAVハイブリッド系
本発明はHIV-1-に基づくパッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。LV用の産生系の最適化は、LV技法に基づく遺伝子治療薬開発のために解決を要する重要な課題である。この技法を用いる臨床試験数が増加するにも関わらず、LVはかかる試験においてなお一過性トランスフェクションプロトコルを用いて作製されている。この方法では、LVの作製は未だに非常に高価でありかつ多数の患者向けには不満足である。この理由で、LV用の安定パッケージング細胞株を開発する多くの努力がなされてきた。安定なレンチウイルスパッケージング細胞株の開発における重要な課題の1つは宿主細胞を遺伝子操作するための正しいビヒクルの選定である。多くの場合、宿主細胞はプラスミドを用いて遺伝子操作で作られてきたが、かかる場合、ゲノム不安定性および遺伝子サイレンシング現象も観察されている。他の2例ではgag/polおよびrev遺伝子を安定して組み込むために、レトロウイルスベクターが使われている。今まで開発された安定パッケージング細胞株はいずれも臨床試験に用いられていない。
【００３４】
本発明の戦略は、レンチウイルスの構造および調節HIVタンパク質を安定して発現する系であって、第1の発現カセットはレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットはレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクターと一緒に、プロモーターの調節下にあるAAV rep ORFを含有する発現プラスミドから成る前記系の使用に基づくものである。バキュロウイルスの主鎖の存在は、いくつかの異なるタンパク質をコードする2つの発現カセットを含む大きくかつ複雑な組込みカセットの宿主であることを可能にする。得られるバキュロ-AAVパッケージングベクターは、わずか1回の感染処置を介して安定かつ効果的にLVを産生するために必要とするウイルスタンパク質を用いて宿主細胞を遺伝子操作することを可能にする。
【００３５】
バキュロ-AAVパッケージングベクターのゲノム組込みはAAV repタンパク質の一過性発現により得た。この系により、非コード域の遺伝子間転写活性領域におけるAAVベクターの組込みが得られ、従って、そのmRNAがLVに、究極的には、宿主標的細胞に組込まれうる危険遺伝子の活性化を排除することができる。
【００３６】
提示した系は、構造および調節レンチウイルスタンパク質を用いて宿主細胞を安定してかつ効果的に遺伝子操作する新しいかつ先進的な方法である。
【００３７】
好ましい実施形態において、バキュロ-AAVパッケージング構築物に含まれる2つの発現カセットはテール・ツー・テール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMV IEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、AAVパッケージングベクターに含まれる選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、好ましくは、マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。
【００３８】
バキュロ-AAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR-介在型AAVベクター組込み用のAAV repタンパク質の一過性発現により得た。好ましい実施形態においては、repタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくは、タンパク質はrep78である。
【００３９】
この系を用いて、HIV-1タンパク質gag/polおよびrevを安定して発現するように遺伝子操作された細胞を得ることが可能であった、そしてかかる細胞を本発明者らはこれを半-安定パッケージング細胞と呼ぶ。特に、本発明は、かかる遺伝子操作が行われた細胞およびそれらの半-安定なLV産生のための使用を開示しかつ請求の範囲とする。
【００４０】
半-安定パッケージング細胞株
本発明の半-安定パッケージング細胞株は、HIV-1 gag-polおよびrev遺伝子を発現する組換えバキュロ-AAVパッケージング構築物の少なくとも１つのコピーを運ぶ宿主細胞から成る。バキュロ-AAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR-介在型AAVベクター組込みを得る目的でAAV repタンパク質の一過性発現により得ている。好ましくは、2つの発現カセットはテール・ツー・テール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され；、好ましくは、プロモーターはCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される。より好ましくは、構成的プロモーターはCMV IEプロモーターである。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され；好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。
【００４２】
好ましくは、AAV repタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。半-安定パッケージング細胞株を得るために遺伝子操作することができる宿主細胞は、HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株であり、より好ましくは細胞株はHEK293-Tである。
【００４３】
かかる半-安定なパッケージング細胞株は、半-安定産生系において色々なenvおよび色々な導入ベクターを用いて潜在的に多様なLVを産出するのに好適である。これは、コスト削減を可能にするので、LVのより有効な産生に大きい利点を表し、これはgag-polおよびrevをコードするGMPグレードのプラスミドDNAを用いる必要がなく、一過性トランスフェクション中のプラスミド間の組換え事象に二次的に付随するRCL形成のリスクを減ずる。
【００４４】
半-安定パッケージング細胞株は多目的に使用できるツールであり、LVを産生するために臨床試験で現在使われている他のツールより安全性および経済性の点で優れている。
【００４５】
本発明の半-安定なパッケージング細胞株は、1年間の培養に対して驚くべき遺伝安定性を有することを示し、これは残りの遺伝エレメントの一過性トランスフェクション後の機能的LVの連続産生を証明した。さらに、非サイレンシング現象が実際に観察され、この中間体を用いて得たLVの力価と感染性の両方が1年間影響されないで残った。かかるデータは選択圧力の存在または非存在の両方で確認された。注目すべきこととして、文献においてAAV-ITR介在型カセットの組込み安定性に関する比較しうるデータは見当たらない。唯一の関連情報は、野生型AAV血清2型（AAV-2）で感染したヒト骨髄由来の繊維芽細胞様細胞株（Ruddle's Detroit 6 cells）は潜伏状態で少なくとも47および118継代の間、ウイルス配列を維持したことである。実施例に示したように、本発明の半-安定なパッケージング細胞株は少なくとも102継代の間、生存した。
【００４６】
それ故に、本発明はLVを産生する方法であって、
i. 前記の半-安定パッケージング細胞株を培養するステップ、
ii. 半-安定パッケージング細胞株にenv遺伝子を挿入するステップ、
iii. 半-安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップ
を含む前記方法を提供する。
【００４７】
エンベロープタンパク質はAAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同組換えを用いて宿主細胞中に挿入してもよい。
【００４８】
好ましくはenv遺伝子は、プラスミドを用いて一過性トランスフェクションにより挿入する。
【００４９】
好ましくはenv遺伝子はVSV-G env、MLV4070 env、RD114 env、キメラエンベロープタンパク質RD114-TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64 envまたはGALV envまたはそれらの誘導体から選択される。より好ましくは、本発明はRD114の細胞質テール（tail）をMLVエンベロープの細胞質テールにより置換えたキメラエンベロープタンパク質RD114-TR envを用いてもよい。好ましくは、導入ベクターをSIN-LVを用いて挿入する。
【００５０】
本発明の半-安定パッケージング細胞株は、感染性の意味で一過性トランスフェクションにより産生したものと「定性的に」等しいLVを産生することができる。LVの半-安定産生の応用について考慮すべき非常に重要な事象は、半-安定パッケージング細胞株が容易にトランスフェクトされる能力を失わなかったことである。実際、PK-7細胞は親細胞株HEK293Tと同じレベルでトランスフェクトされる。この特性は、遺伝子改変およびパッケージング構築物によるHEK293細胞のクローニング後に失われるのが全く普通である。逆に、本発明で使われるgag/polおよびrevの安定な組込みのための発現系は半-安定パッケージング細胞株のトランスフェクション能力に対して何の問題も生じない。
【００５１】
さらに、半-安定パッケージング細胞株およびLVを産生する方法におけるその使用は生産コストにとって大きい利点を有する。特に、わずか3つのさらなる構築物、例えばプラスミド（それぞれ、tat、envおよび導入ベクター）が第2世代LVの産生に、または2つの構築物（それぞれ、envおよび導入ベクター）が第3世代LVの産生に必要である。逆に、現在臨床試験に使われるGMPの方法は、本発明の半-安定パッケージング細胞株で用いるものに加えて、gag/polおよびrevをそれぞれコードする2つのさらなる構築物が必要である。
【００５２】
さらに、本発明の方法およびツールでトランスフェクトする構築物の数が少ないことも、上記のLVの安全性に追加される利点である。
【００５３】
さらにまた、本発明の半-安定産生を用いると、一過性トランスフェクションによる産生で使うDNAの総量のわずか3分の1で、一過的に産生したレンチウイルスの力価と比較しうる力価を有するレンチウイルスを十分に得られることも明らかになった。それ故に、本発明の発現系、半-安定パッケージング細胞株および産生方法は、現在臨床において施用されているツールおよび方法と比較して非常に有利である。
【００５４】
（実施例）
【実施例１】
【００５５】
一般的方法
プラスミド
野生型HIV-1 gag、polおよびrev遺伝子を、pCG719-pKLgagpol（以後、簡略化のためにCMV-GPRと呼ぶ）（図1a、模式図9）およびpCG720-pKrev（以後、CMV-Revと呼ぶ）（図1a、模式図5）プラスミドからそれぞれMluI/NarIおよびMluI/NotI消化により切除した[25]。そのウイルス遺伝子を2つの異なる発現カセット（各カセットはCMV IEプロモーターにより駆動され、polyA配列を運ぶ）に入れて、Gateway(登録商標)pENTRTM4シャトルベクター（Invitrogen、Co.、Carlsbad、CA）中にテール・ツー・テール配向で挿入した。第1のカセットはgagとpol遺伝子を発現するが、第2のカセットはrev遺伝子と選択マーカーハイグロマイシン耐性（hygro）遺伝子を発現し；hygroはIRESの下流にクローニングしてバイシストロン（bi-cistronic）翻訳を可能にした。2つの発現ユニットを感染性AAVゲノムを運ぶ組換えpSUB201プラスミドのXbaI部位中に導入した[17]。得られる5'ITR-CMV-gagpol-polyA-polyA-hygro-IRES-rev-CMV-ITR3'カセットを次いで切除し、Gateway(登録商標)pENTRTM4シャトルベクター（Invitrogen, Co., Carlsbad, CA）中に挿入した。組換えハイブリッドバキュロ-AAVパッケージングベクター（バキュロ-AAV-GPR）（図1a、模式図1）を、2つのカセットを含有するpENTRTM4シャトルエントリーベクターとBaculoDirect直鎖DNA（BaculoDirectTMバキュロウイルス発現系, Invitrogen, Co.）との間のバクテリオファージλ部位-特異的組換え系を用いて得た。相同組換え中に、BaculoDNAのポリヘドリン遺伝子はその際、GPR二重カセットで置換えられた。pABCMV-rep78発現プラスミド（CMV-AAV-rep78）は、Recchia et al., 2004[18]に記載の発現ベクターpABS.43のCMV IEプロモーター下のAAV-rep78 ORFをクローニングすることにより得た（図1a、模式図4）。pMD.Gプラスミド（CMV-VSV-G）[19]は小胞性口内炎エンベロープ糖タンパク質（VSV-G）をコードする（図1a、模式図6）。第3世代導入ベクター、pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp（SIN-eGFP）[20]は構成的プロモーターhPGK下のeGFP遺伝子（図 1a、模式図2）を発現する。抗-HIV-1 Chim3トランスジーンを発現する第2世代PΔN-Chim3導入ベクターはPorcellini ら, 2009 & 2010 [21,22]に記載されている（図1a、模式図3）。pCMV-RD114-TR（CMV-RD114-TR）（図1a、模式図7）プラスミドは、ネコ内因性レトロウイルスRD114エンベロープの細胞外および膜貫通ドメインならびにA-MLVenv 4070Aの細胞質テール（TR）から作られたキメラRD114-TRエンベロープをコードする[23]。第2世代パッケージングpCMV-ΔR8.74（CMV-GPRT）構築物（図1a、模式図8）はHIV-1gag、pol、revおよびtat遺伝子をコードする[19]。
【００５６】
細胞
Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞（Invitrogen, Co.）は10％FCS（EuroClone Ltd、UK）およびペニシリン-ストレプトマイシンとグルタミン（PSG）の組み合わせを補充したTC-100培地（Invitrogen, Co.）の懸濁液中で27℃にてCO2の非存在のもとで増殖した。ヒト胎児腎293T（HEK293T）細胞およびその誘導体クローン（PK-7）は10％FCSおよびPSGを補充したDulbecco改変Eagle培地（DMEM）で増殖した。CEM A3.01およびSupT1 Tリンパ芽球腫細胞は10％FCSおよびPSGを補充したRPMI 1640中で増殖した。CD34+造血幹細胞（HSC）および新生児白血球は臍帯血（UCB）からFicoll-Hypaque 勾配遠心分離（Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway）で精製した。勾配分離の後、回収したUCB単核細胞環から、CD34マイクロビーズキットおよびMiniMACS分離カラム（Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA）を用いてポジティブ選択により、CD34+ HSCを単離した。CD34+細胞純度（>92％）はFACS分析（FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA）およびFlowJoソフトウエア（Tree Star, Inc., Ashland, OR）により、抗-CD34-PEAb（BD PharmingenTM, San Diego, CA）を用いて確立した。CD34+細胞はヒト幹細胞因子（h-SCF）100ng/ml（R&D Systems, Minneapolis, MN）、h-Flt3L 100 ng/ml（Peprotech, Rocky Hill, NJ）、h-IL-620ng/ml（R&D Systems）およびヒトトロンボポエチン（h-Tpo）20ng/ml（Peprotech）を含有する20％血清Iscove改変Dulbecco培地（IMDM）で24時間、前刺激し、形質導入の間、同じ培地中で維持した。新生児白血球は48時間、RPMI中の可溶性抗-ヒトCD3（30ng/ml）（Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK）および組換えヒトIL-2（rhIL-2）50U/ml（Chiron, Emeryville, CA）で刺激し、次いで、10％FCS、PSG、およびrhIL-2を補充したRPMI中に保った。
【００５７】
バキュロウイルス産生とHEK293T細胞のバキュロ-GPR感染
組換えハイブリッドバキュロ-AAV-GPR DNAゲノムを運ぶバキュロウイルスをGateway（登録商標）適合化バキュロウイルスDNAシステム（Invitrogen、Co.）を用いてBaculoDirect法に従い作製した。組換えバキュロウイルス力価をプラークアッセイにより評価すると、Sf9細胞中の3継代のウイルス増幅後に1×1011 pfu/mlに対応した。1.5×106 HEK293T細胞を4μgのAAV-rep78発現プラスミドでトランスフェクトし、24時間後に組換えバキュロ-AAV-GPRに1,000のMOIにて感染することによりPK-7クローンを得た。細胞をハイグロマイシン無しで4日間維持し、次いで5×105細胞を、ハイグロマイシン（100μg/ml）の連続希釈濃度の存在する22枚の10cmディッシュに播いた。22枚のディッシュをELISAによるp24gag産生についてスクリーニングした。細胞を3.7×104細胞/ディッシュで播いたわずか1枚のディッシュが上清中に十分なp24gagを放出した。このディッシュは40コロニーを含有し、それらを全て拾い上げてスクリーニングした。そのうちの、p24gag産生に対してポジティブの評価を得た3コロニーをさらに特徴付けた。
【００５８】
レンチウイルスベクター（LV）産生と力価測定
HEK293T細胞から産生される偽型LVは、次のプラスミド：パッケージング構築物CMV-GPR（第3世代）[またはCMV-GPRT（第2世代）]、VSV-GまたはRD114-TRエンベロープ構築物、および第3世代SIN-eGFP[24]または第2世代PΔN-Chim3導入ベクター[21]の一過性共トランスフェクションにより得た。パッケージング：エンベロープ：導入ベクターの比は、特に断らない限り、6.5：3.5：10μg DNAであった。PK-7クローンからのLVはenv発現プラスミドと導入ベクターを共トランスフェクトすることにより作製した。一過性トランスフェクションは標準Ca++-リン酸法またはFugene6（登録商標）系を用いて製造業者の取扱説明書（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN）に従って実施し、類似の結果を得た。上清をトランスフェクション後48時間に収穫し、0.45μmフィルターを通して濾過した。力価を、SupT1、CEMA3.01、一次活性化末梢血液単核細胞（PBMC）および臍帯血由来のCD34+ HSCについて、実験の型に応じて計算した。概要を説明すると、SupT1と一次活性化末梢血液単核細胞細胞はポリブレン（8μg/ml）（Sigma-Aldrich, StLouis, MO）の存在のもとで2サイクルのスピノキュレーション（1,240×g、1時間）により形質導入し、一晩静置して相を分離し；CD34+ HSCは24時間レトロネクチンをコーティングしたプレート（Takara Bio、Otsu、Japan）上でポリブレン無しで形質導入した。形質導入効率はeGFP発現（SIN-eGFP）のフローサイトメトリー分析（FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA）またはPorcellini et al., 2009および2010[21,22]に記載のFlowJoソフトウエア（Tree Star, Inc., Ashland, OR）を用いるΔLNFGR発現（PΔN-Chim3）によってモニターした。5〜20％ポジティブ細胞の範囲の形質導入値だけを用いて、次式：
TU=[細胞数×（％GFP/100）]/vol sup（mlで）に従って各LV調製物の力価を計算した。
【００５９】
サザンブロットアッセイ
ゲノムDNA（gDNA）をQIAamp Miniキット（QIAGEN GmbH、Germany）により製造業者の取扱説明書に従って単離した。バキュロウイルスDNAをウイルス粒子からQIAamp DNAマイクロキット（QIAGEN）により抽出した。示した制限酵素を用いて一晩消化後、10μgのgDNAを0.8％アガロースゲルに流し、サザンキャピラリートランスファーによりナイロン膜上にブロットし（Duralon, Stratagene, TX, USA）、次いでPerfectHyb PLUSハイブリダイゼーションバッファー中の1×106 dpm/mlの32P-ランダムプライムド標識した600-bp CMVまたは11-kb GPRカセットとハイブリダイズさせた。
【００６０】
分析用PCR分析
AAV-Rep78プラスミドの残りの組込みのスクリーニングに対するPCR分析を300ngのゲノムDNAについて、プライマーのセット：AAV-Rep78 フォワード： 5'-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3'； AAV-Rep78 リバース： 5'-ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3'を次のPCR条件：98℃にて7分間、30サイクルの94℃にて30秒間、66℃にて30秒間、および72℃にて1.5分間で用いることにより、実施した。
【００６１】
2つのGPRカセットの配向を確立するためにPCR分析を300ng gDNAについて、プライマーのセット：rev フォワード： 5'- CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3'；β-グロビンリバース： 5'- CCC TGT TAC TTC TCC CCT TCC -3'；rev ネスト化フォワード： 5'- TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3'；β-グロビン ネスト化リバース：5'- TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3'を次の条件：98℃にて2分間、35サイクルの94℃にて30秒間、52℃にて30秒間、および72℃にて1.5分間で用いることにより実施した。
【００６２】
p24gag ELISA
培養上清中の物理的LV産生をAlliance HIV-1 p24抗原ELISAキット（Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc. Waltham, MA）により製造業者取扱説明書に従い、1pg p24gagが1×104 物理的粒子に対応すると仮定して測定した。
【００６３】
ウェスタンブロット分析
PK-7細胞から誘導した全細胞および核抽出物ならびに単離された細胞を含まないVLPまたはLV由来のウイルスタンパク質を先に記載のように調製した[21,22]。タンパク質をSDS-PAGEによりサイズ分画し、Hybond ECLニトロセルロース膜（GE Healthcare、Life Sciences、UK Ltd、UK）にエレクトロブロットした。膜を5％低脂肪ドライミルクでブロックし、次いで適当な一次Abとインキュベートした。AIDS患者から得た抗-HIV-1血清を1：2,000希釈で用い；HIV-1revMoAb（Rev-6, sc-69730）（S. Cruz Biotechnology, Inc., S. Cruz, CA）を1：200希釈で用いた。Ab結合を強化化学発光系ECL（ECL, Amersham）により、製造業者の取扱説明書に従って可視化した。
【００６４】
リアルタイムTaqMan PCRによるLV DNAコピー数の定量
組込まれたGPRベクターのコピー数を定量TaqMan PCRにより、ABI Prism 7,900 FAST 計器（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて確立し、SDS 2.3ソフトウエア （Applied Biosystems）により分析した。ゲノムDNA（gDNA）を、次のプライマーとgag遺伝子から誘導したプローブを用いて増幅した：フォワード：5'-ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT-3'；リバース：5'-ATC TGG CCT GGT GCA ATA GG-3'；プローブ：FAM 5'-CAT CAA TGA GGA AGC TGC AGA ATG GGA タグ A-3' TAMRA。PCR条件は次の通りであった：2分間50℃にておよび5分間95℃にて、次いで40サイクルの15秒間95℃にておよび15秒間60℃にて（0.1℃/サイクルの増分で）。
【００６５】
ライゲーション介在型（LM）-PCR６
ゲノムDNAをPK-7細胞からQIAamp DNA Miniキット（QIAGEN）により製造業者の取扱説明書に従って抽出し、そしてBglIIおよびBamHIを用いて37℃にて一晩消化した。5'-GATC-3'粘着末端と適合しうるアダプター76-bpオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションを標準条件で実施した。LM-PCRは次のネスト化プライマーのカップルを用いて行った：ITRフォワード：16s：5'-GTA GCA TGG CGG GTT AAT CA-3'、および17s/ロングネスト化：5'-TTA ACT ACA AGG AAC CCC タグ TGA TGG-3'；リンカーリバースプライマー：リンカー-1：5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3'およびリンカー-2ネスト化：5'-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3'。リンカー配列は5'-GAT CGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA タグ TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT CGG GAT ATC ACT CAG CAT AAT G-3'に対応する。2ラウンドのLM-PCRをAmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ （Applied Biosystems）を用いて行い、それぞれ30サイクルから成った（95℃にて30秒間、52℃にて30秒間、72℃にて2分間）。PCRアンプリコンをTOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen、Co.）を用いてクローニングし、そしておよそ100〜200bpのインサートを運ぶプラスミドコロニーを選択し、配列決定を行った。配列相同性はBLASTサーチ、NCBIにより同定した。
【００６６】
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）
分裂中期染色体はPK-7細胞をコルヒチン（10μg/ml）（Sigma#C9754）で37℃にて2時間処理することによって得た。リン酸バッファー生理食塩水（PBS）で洗浄した後、細胞を低浸透圧溶液（75mM KCl）中に室温にて6分間保持し、メタノール／酢酸（3：1）で4回洗浄して固定し、次いで清浄なガラススライド上に延ばした。細胞遺伝子サンプルを70％ホルムアミド溶液中で2分間72℃にて変性し、冷温の70％、85％、および95％エタノールの連続洗浄により脱水し次いで空気乾燥した。特異的プローブを次の通り調製した：GPRカセットを含有する13-kbプラスミドDNAはランダムプライムドDNA標識キット（Roche Applied Science、Indianapolis、IN）を用いてSpectrumOrangeTM-dUTP （Vysis、Inc.、Downers Grove、IL）で標識したが、ヒトhox4遺伝子を含有する対照30-kbコスミドDNAはFISHBrightTM核酸標識キット（Kreatech Biotechnology、Amsterdam、The Netherlands）を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、5ng/μlの各プローブを含む250μlの50％ホルムアミド、2×SSC、および10％硫酸デキストランおよび50ng/μlのヒトC0T-1 DNAハイブリダイゼーションバッファー（Invitrogen）をインキュベートすることにより実施した。サンプルを変性したプローブで10分間75℃にてコートし、Parafilm（登録商標）Mで覆い、そして一晩37℃にて加湿室でインキュベートした。サンプルを1回、0.4×SSC中で、pH＝7、72℃にて2分間；1回、4×0.0025％ Tween-20を含有するSSC中で、pH＝7、RTにて30秒間；ならびに2回、PBS 1×RTにて1分間洗浄した。スライドを0.02μg/μlの49,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（Sigma）で対比染色した。可視化と写真撮影はNikon 80i正立顕微鏡（Nikon Instruments S.p.A.、Italy）で、（FITC）およびスペクトルオレンジ色（スペクトルオレンジ色）フィルター照明を用いて行った。画像はGenikonソフトウエア（Nikon）で処理した。
【実施例２】
【００６７】
第1中間体PK-7クローンの作製
第2または第3世代LVの連続産生用のRD-MolPackパッケージング細胞株を得るために、いくつかのHEK293T由来の中間体クローンを得た。最初のものは、PK-7と名付けられ、組換えハイブリッドバキュロ-AAVベクター（rhバキュロ-AAV-GPR）（図1a、模式図1）を使ってHIV-1 gag、polおよびrev遺伝子を安定して組み込むことにより得た。この送達系は、一過性で与えられるAAV-rep78タンパク質のインテグラーゼ活性を利用し、AAV ITR-隣接組込みカセットを切除してヒト染色体中に組み込む（図1b）。rh-バキュロ-AAVベクターはBaculoDirect Linear DNAとITR-隣接GPRカセットを含有するGateway（登録商標）pENTRTM4エントリープラスミドの間の相同組換えにより作製した（図1a、模式図1）。Sf9昆虫細胞における3サイクル（p3）の組換えバキュロウイルス増幅の後、ハイブリッドバキュロ-AAV DNAの力価と潜在的組換え事象をプラークアッセイおよびウイルスのゲノムDNAサザンブロットによりそれぞれチェックした。p3における力価は6×1010pfu/mlに対応し、サザンブロット分析は単一の鋭いバンドを現し、ウイルス増幅プロセス中に組換え事象が無いことを示した（図3）。
【００６８】
次に、AAV-Rep78プラスミドトランスフェクションおよびrh-バキュロ-AAV感染の用量および時間ならびに感染したHEK293T細胞のクローニング条件を注意深く規定した（図1c）。実際、これらの実験設定の選択は結果的に重要であった。このように広範囲の条件を試験した後に、最終的に確立したのは、単一用量のAAV-rep78プラスミドDNAをトランスフェクトしてから24時間後における1,000のMOIでのバキュロ-AAV感染が最良の実験設計に対応することであった。さらに、22枚の90mm-ペトリディッシュに配給した合計5×105細胞の播種、すなわち、各ディッシュに異なる濃度で播いてかつ播種から4日後にハイグロマイシン100μg/mlを加えて播くことが最大数の細胞クローンを得る最良の条件であった。数えた360クローンのうちわずかに3クローン、PK-7、PK-17およびPK-18が100 pg/mlの設定閾値を上回った。クローンのサザンブロット分析は、各クローンが2コピーの正しいサイズのベクターを含有することを明らかにした（図2a）。残りのAAV-Rep78プラスミドDNAの組込みの可能性を排除するためにrep78特異的PCRをPK-7 gDNAについて行い、ポジティブシグナルを検出しなかった（図 3b）。GPRカセットから発現されたHIV-1タンパク質発現パターンを3つのPKクローンおよび培地に放出されるそれらに整合するウイルス様粒子（VLP）のウェスタンブロットによりモニターした。全てのウイルスタンパク質は適当に処理され、サイズが正しく、そして正しい相対比率であった（図 2b）。SupT1細胞について、VSV-Gプラスミドおよび第3世代導入ベクターSIN-eGFP（表1）で共トランスフェクトした後の3つのクローンから産生したLVの効力を計算することにより、将来役立つPKクローンを選択した。注目すべきは、一過性トランスフェクションにより産生された対照HEK293T LVの力価はPK-7およびPK-18LVより5倍以上高かったが、その感染性はPK LVとほとんど同一であり、PKクローンは、「品質」の視点で通常の方法により産生したものと比較しうることである（表1）。PK-7とPK-18LVの効力は類似しているが、形態学、増殖、生存率およびp24gag産生値の評点がPK-1
8クローンより優れているPK-7クローンをさらなる遺伝子操作の対象に選定した（表1）。
【表１】
0005897576.tif 000002
【００６９】
次に、PK-7クローン中のITR-隣接カセットの組込みを定量LM-PCR、TaqManPCR（図2c）およびFISH技法（図2d）により徹底的に特徴付けた。組込み部位を正確にマッピングするために、染色体2、2q32.1（図2c）における分断点にスポットライトを当てたLM-PCR研究を行った。この結果を、アーム長とセントロメア位置に基づいて染色体2中に単一スポットを当てた特異的GPRプローブとのin situハイブリダイゼーションにより確認した（図2d）。この位置付けを確認するために、染色体2q31.2中にマッピングすることが公知であるHOX4プローブを用いた。HEK293T細胞は三倍体であり、HOX4は正しく全ての3つの染色体2中に検出された（図2d）。最後に、定量TaqMan PCRによって2つのコピーが組込まれたこと、および、適当なプライマーの設計をしたネスト化PCRによって2つのコピーが縦列配向、テール・ツー・ヘッドであることが確認された。テール・ツー・ヘッド配向は、野生型AAVおよびほとんどのrAAVベクター・コンカタマーの宿主細胞ゲノム中への組込みに対して観察される自然な立体配置である[16]。テール・ツー・ヘッド接合点を包含するアンプリコンの配列分析は、303-bpの第1カセットの3'CMVプロモーターと共に第1および第2カセットのITRおよび第2カセットの全5'CMVプロモーターが喪失したことを明らかにした（図2e、赤色ボックス）。このベクター−細胞の組換え事象の大部分は実際にはベクターのITR配列内で起こる。この再配列はPK-7細胞に第2カセットのgag-pol遺伝子の転写欠如および恐らく第1カセットのrevおよびhygro遺伝子の転写欠如を生じさせる。しかし、記載に値するのは、欠失されたCMVプロモーターの残された285-bp領域（模式図の中央の灰色三角形）はなお、1つもしくは2つのrevおよびhygro遺伝子の転写を駆動するのに十分なTATAボックスを含有しうることである。結論として、PK-7は2つの組込まれたカセットを含有し、これらが共同で1つのgag-pol遺伝子および1つもしくは2つのrevおよびhygro遺伝子を転写する。
【００７０】
PK-7クローンの長期にわたる安定性を実証するために、細胞をハイグロマイシンの存在または非存在で420細胞倍加に対応する350日間培養し、そして細胞当たり基準でのp24gag産生を測定した（表2）。ハイグロマイシンの存在のもとでの平均産生は15.34±8.47SD ng p24gag/1×106細胞に対応するが、抗生物質の非存在のもとでは6.70±3.51SD ng p24gag/1×106細胞である（表 2）。
【００７１】
この相違はおそらくハイグロマイシン薬物圧がhygro耐性遺伝子およびそれによりクロマチンの転写も同様に「on」に保つという事から導かれるようである。これはgag-pol遺伝子のより高い転写を好都合にしうる。PK-7クローンから作製されるVLPが100の倍加後にでも機能的であるかどうかを評価するために、PK-7細胞にp60およびp102にてVSV-GエンベロープとSIN-eGFP導入ベクターを共トランスフェクトし、そしてLV効力を計算した。注目すべきは、選択薬物の存在および非存在共に、産生されたLVの力価と感染性はかかる時間の延長後でもなお通常のレベルを維持した（表2）。これらのデータは薬物圧の存在または非存在に関わらず、GPRカセットの遺伝子不安定性を実証し、将来の特徴付け試験におけるハイグロマイシンの使用を回避することを容認した。AAV-ITR介在型カセットの組込み安定性に関する比較しうるデータは文献に見当たらない。唯一の関連情報は、野生型 AAV血清2型（AVV-2）に感染したヒト骨髄由来の繊維芽細胞様細胞株（Ruddle's Detroit 6 細胞）が少なくとも47継代および118継代の間、潜伏状態でウイルス配列を維持したことである[22、23]。注目すべきこととして、PK-7細胞は少なくとも102継代の間生存した。
【表２】
0005897576.tif 000003
【実施例３】
【００７２】
半-安定LV産生のためのPK-7の使用
PK-7クローンからの半-安定LV産生がHEK293T細胞からの一過性LV産生のそれと全体に比較し得るかどうかをよく確立するために、両方の細胞型を、同じ量の必要なプラスミドによりトランスフェクトし、異なる標的細胞に対するトランスフェクションのパーセントおよびそれらのそれぞれのLVの効力を測定した（表3）。この条件において、HEK293T細胞での11回の実験のトランスフェクションのパーセントの平均値は90.54±3.6 SEMであり、そしてPK-7細胞での12回の実験のそれは91±5.3 SEMであり、PK-7細胞がその高いレベルのトランスフェクション能力を維持することを示した。そこで、LV力価を、本発明者らの標準参照細胞型としてのSupT1細胞、靭帯血液由来のCD34+ HSC、および抗-CD3/IL-2活性化靭帯血単核細胞（表3でT lymph.と記した）（表 3）において計算した。
【表３】
0005897576.tif 000004
【００７３】
とりわけ、PK-7細胞から作製された第3世代LV、SIN-eGFPの感染性は、力価をSupT1およびCD34+細胞についてそれぞれ計算した場合、対照LVより約1-log低くかつほとんど等しかったが、活性化Tリンパ球についてはハーフ-log高かった。PK-7細胞から作製された第2世代LV、PΔN-Chim3の感染性は、力価をSupT1およびCD34+またはCEM A3.01細胞について計算した場合、対照LVのそれとほとんど等しかった。総括すると、これらの知見はPK-7クローンが一過的に共トランスフェクトしたHEK293T細胞により産生されたものと「定性的に」等しいLVを産生することを示す。LVの半-安定産生におけるPK-7の応用について考慮すべき非常に重要な事象は、PK-7クローンが容易にトランスフェクトされる能力を失わなかったことである。この特性は、遺伝子改変およびパッケージング構築物によるHEK293細胞のクローニング後に失われるのが全く普通である。
【００７４】
力価測定実験を実施してPK-7細胞から最適なLVを産生するために用いるエンベローププラスミドおよび導入ベクターの総DNAの用量を確立した。注目すべきは、SupT1およびCEM A3.01細胞株の両方において、DNAの標準量（1mg）で産生されるLVの力価と比較しうる力価を持つLVを作製するのにDNAの総量の3分の1（0.3mg）以下でも十分であることが確立された。それ故に、LVの半-安定産生用のPK-7をHEK293T細胞の代わりに用いると、GMP-グレードのプラスミドDNAの高いコストを劇的に削減しうる。
【表４】
0005897576.tif 000005
【００７５】
参考文献
0005897576.tif 000006
【００７６】
0005897576.tif 000007
【図１−１】
0005897576.tif 000008
【図１−２】
0005897576.tif 000009
【図２】
0005897576.tif 000010
【図３】
0005897576.tif 000011
【配列表】
0005897576000001.app