(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を分離する分離部と、試料をイオン化するイオン源と、特定の質量電荷比を有するイオンを単離するイオン単離部と、イオンを解離するイオン解離部と、イオンを質量分析する質量分析部と、イオンの単離を制御する制御部と、計算処理部を有する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
イオンの質量スペクトルを取得する工程と、
前記計算処理部において、前記質量スペクトルで検出されたイオン情報をピークリストに格納する工程と、
前記計算処理部において、前記ピークリストに記載されたイオンから任意の１イオンを選択する工程と、
前記計算処理部において、選択したイオンとピークリストに記載されたその他の各イオンとの質量差を算出する工程と、
前記計算処理部において、質量差が所望分子の組み合わせ合計値と一致した場合、前記選択したイオンと質量差が所望分子の組み合わせ合計値と一致した全てのイオンをインクルージョンリストに実時間で格納する工程と、
前記計算処理部において、インクルージョンリストの中からプリカーサイオンを選択する工程と、
前記計算処理部において、選択したプリカーサイオンを解離させた質量スペクトルを取得する工程と、
を有する質量分析方法。
【請求項２】
前記イオンの質量スペクトルを取得する工程の前に、前記所望分子及び／又はその分子量を設定する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項３】
前記イオンの質量スペクトルを取得する工程の前に、修飾が想定される前記所望分子及び／又はその分子数範囲を設定する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の質量分析方法。
【請求項４】
前記分離部は、液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーを用いる
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項５】
前記所望分子の組み合わせが異なる糖ペプチドごとに前記インクルージョンリストを作成する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項６】
前記プリカーサイオンとして選択されたイオン、又は前記プリカーサイオンが格納されていた前記インクルージョンリストに記載の全てのイオンを前記インクルージョンリストから除外する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項７】
前記プリカーサイオンの強度情報に基づいて、前記選択したプリカーサイオンを解離して質量スペクトルを取得するためのデータ取得時間を設定する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項８】
第１の糖ペプチドについて作成された第１のインクルージョンリストから選択された第１のプリカーサイオンを解離させた質量スペクトルからフラグメントイオンの積算量を算出する工程と、
前記フラグメントイオンの前記積算量が閾値以上の場合、前記第１の糖ペプチドとは異なる第２の糖ペプチドについて作成された第２のインクルージョンリストからプリカーサイオンを選択し、第２のプリカーサイオンを解離させた質量スペクトルを取得する工程と、
前記フラグメントイオンの前記積算量が閾値以下の場合、前記第１のプリカーサイオンを解離させた質量スペクトルを再取得し、前記第１のプリカーサイオンについて前回取得された質量スペクトルに加算し、前記フラグメントイオンの前記積算量を再算出する工程と
を実行することを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項９】
前記インクルージョンリストから選択した任意のプリカーサイオンを衝突誘起解離、又は赤外多光子吸収解離で解離して得られたＭＳ／ＭＳスペクトル中に所望のイオンが観察された場合、前記インクルージョンリストの中からプリカーサイオンを選択し、選択した前記プリカーサイオンを解離させた質量スペクトルを取得する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項１０】
前記ピークリストに所望のイオンが観察された場合、前記ピークリストに記載されたイオンの中から任意の１イオンを選択し、前記ピークリストに所望のイオンが観察されなかった場合、前記イオンの質量スペクトルを取得する工程の再度の実行により、前記イオンの質量スペクトルを再取得する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項１１】
前記質量スペクトルに含まれる全イオンを衝突誘起解離、又は赤外多光子吸収解離で解離する
ことを特徴とする請求項１０に記載の質量分析方法。
【請求項１２】
前記プリカーサイオンの候補から除外されたイオンを任意の１イオンとして選択する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項１３】
質量差が所望分子の組み合わせ合計値と一致したイオンについて、分析中又は分析後に、その分子組み合わせ構造を表示する
ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項１４】
試料を分離する分離部と、
試料をイオン化するイオン源と、
特定の質量電荷比を有するイオンを単離するイオン単離部と、
イオンを解離するイオン解離部と、
イオンを質量分析する質量分析部と、
イオンの単離を制御する制御部と、
イオンから取得された質量スペクトルで検出されたイオン情報をピークリストに格納する機能と、前記ピークリストに記載されたイオンから任意の１イオンを選択する機能と、選択したイオンと前記ピークリストに記載されたその他の各イオンとの質量差を算出する機能と、算出された質量差が所望分子の組み合わせ合計値と一致した場合、前記選択したイオンと質量差が所望分子の組み合わせ合計値と一致した全てのイオンをインクルージョンリストに実時間で格納する機能と、前記インクルージョンリストの中からプリカーサイオンを選択する機能と、選択したプリカーサイオンを解離させた質量スペクトルを取得させる機能と、を含む計算処理部と
を有する質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析における効率的なイオン選択技術に関する。本発明は、例えば翻訳後修飾された生体高分子を効率的にイオン解離分析することができる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにはおよそ数万種のタンパク質が存在すると言われている。タンパク質の機能は、プロテアーゼによる切断、糖鎖やリン酸基等の付加による活性・相互作用調節など、様々な翻訳後修飾により巧妙な調節を受けている。特に真核生物においては、遺伝子配列に基づいて合成されたタンパク質がそのままの状態で機能を発揮することはまれであり、例えばリボソーム上での合成後その場で、又は細胞内での最終的な局在が決まるまでの様々な段階で、多種多様な修飾を受ける。リン酸化修飾は、通常、タンパク質のセリン、スレオニン、チロシン残基に起きる。糖鎖修飾は、アスパラギン、セリン、スレオニン残基に起き、単糖がグリコシド結合によって鎖状に連結した構造、あるいは分岐した構造を持つ。また、同じタンパク質の同一アミノ酸であっても、修飾される糖鎖構造は様々である（非特許文献１）。これらの翻訳後修飾は疾患と深い関わりがあり、翻訳後修飾されたタンパク質の分析は近年特に注目されている。翻訳後修飾の構造解析では「どんな翻訳後修飾が」、「どのタンパク質の」、「どのアミノ酸に」修飾されているかを決定することが求められる。しかしながら、タンパク質の構造は、単にゲノム情報のみでは決定することができない上、タンパク質を増幅する技術も存在しないことからタンパク質を直接解析する必要がある。
【０００３】
タンパク質の構造解析手段の１つとして、質量分析法（mass spectrometry: MS）は広く普及している。質量分析法を用いれば、アミノ酸がペプチド結合でつながったポリペプチド（ペプチドやタンパク質）の配列情報や翻訳後修飾情報を得ることができる。通常、分子量に比例して質量分析や解析が困難になるため、タンパク質は酵素を用いてペプチドに断片化される。ペプチドに断片化された試料は、複雑な混合物であるため、液体クロマトグラフィー（Liquid chromatography :LC）装置等に代表される試料を分離する前処理手段で分離され、カラム出口から質量分析装置に直接導入される。一般的な２時間以内のＬＣ分離条件では、各ペプチドは数十秒から１分程度の短いバンドとして検出されるため、高速分析が可能な質量分析装置が使用される。特に高周波電場を用いたイオントラップや四重極質量フィルターを用いた質量分析法や飛行時間型質量分析法（Time-of-Flight mass spectrometer : TOF-MS）は高速分析が可能なため、ＬＣとの結合性が良い。そのため、これらの高速質量分析法は、多種類の試料を連続解析することが求められるプロテオーム解析等の目的に合致しており、幅広く利用されている。
【０００４】
一般に質量分析法では、試料分子をイオン化して真空中に導入し（又は真空中でイオン化し）、電磁場中におけるそのイオンの運動を測定することにより、対象とする分子イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）が測定される。取得されたデータをＭＳ１スペクトルと呼ぶ。得られる情報が質量と電荷の比という巨視的な量であるため、質量分析操作を単に１回実行するだけでは、その内部構造情報までは得ることができない。そこで、タンデム質量分析法と呼ばれる方法が用いられる。
【０００５】
タンデム質量分析法では、まず１回目の質量分析操作において、試料分子イオンを特定する又は単離する。特定又は単離されたイオンを「プリカーサイオン」と呼ぶ。続いて、プリカーサイオンを何らかの手法で解離する。解離したイオンを「フラグメントイオン」と呼ぶ。このフラグメントイオンを更に質量分析すると、フラグメントイオンの生成パターンの情報が得られる（ＭＳ／ＭＳスペクトルと呼ぶ）。解離手法により、解離パターンの法則性があるため、プリカーサイオンの構造を推定することが可能となる。特にアミノ酸を骨格とする生体分子の分析では、イオン解離手法として衝突励起解離（Collision-Induced-Dissociation:CID）法、赤外多光子吸収解離（Infra-Red-Multi-Photon-Dissociation:IRMPD）法、電子捕獲解離（Electron-Capture-Dissociation:ECD）法、電子移動解離（Electron-Transfer-Dissociation：ETD）法、電子脱離解離（Electron-Detachment-Dissociation :EDD）法が用いられる。なお、ＭＳ／ＭＳスペクトルで検出されるフラグメントイオン強度が高いほど高精度な構造解析が可能なため、プリカーサイオンはイオン強度順に選択されるのが一般的である。場合により価数や質量電荷比の値が考慮されることもある。
【０００６】
タンパク質の解析において、現在もっとも広く使われている手法は、プリカーサイオンに運動エネルギーを与えてガスと衝突させるＣＩＤ法である。ＣＩＤ法では、ガスとの衝突によりプリカーサイオンの分子振動が励起され、分子鎖の切れやすい部分で解離が起こる。
【０００７】
また、最近使われるようになった方法が、プリカーサイオンに赤外レーザ光を照射して多数の光子を吸収させるＩＲＭＰＤ（Infrared Multi-Photon Dissociation）法である。ＩＲＭＰＤ法では、プリカーサイオンの分子振動が励起され、分子鎖の切れやすい部位で解離が起こる。ポリペプチドの解離部位を図２に示す。図中のａ、ｂ、ｃは、ＮＨ2 末端側を含む分子、ｘ，ｙ，ｚはＣＯＯＨ末端側を含む分子である。
【０００８】
ＣＩＤ法やＩＲＭＰＤ法で切れ易い部位は、アミノ酸配列からなる主鎖のうち、ｂ−ｙで命名されている部位であるが、翻訳後修飾を受けた生体高分子をＣＩＤ法やＩＲＭＰＤ法で解離した場合、アミノ酸の側鎖に存在する修飾物質が優先的に解離し、アミノ酸配列主鎖は解離しないことが多い。一方、ＥＣＤ法やＥＴＤ法で切れ易い部位は、アミノ酸配列の主鎖上のｃ−ｚ命名されている部位である。ＥＣＤ法やＥＴＤ法はアミノ酸の側鎖に存在する修飾物質を切断し難いという特徴をもっているので、翻訳後修飾を受けた生体高分子でもアミノ酸配列や修飾位置を同定することができる。なお、正に帯電したプリカーサイオンと電子を反応させる手法はＥＣＤ法と呼ばれ、正に帯電したプリカーサイオンと負に帯電したイオンを反応させ、電子の授受を経由して、ＥＣＤ法と同様の解離を引き起こす手法はＥＴＤ法と呼ばれる。
【０００９】
例えば糖鎖修飾されたペプチド（糖ペプチド）をＣＩＤ法やＩＲＭＰＤ法で分析した場合、糖鎖が優先的に解離するため糖鎖構造を推定（場合により決定）できるが、アミノ酸配列と修飾されていたアミノ酸は決定できない。一方、糖ペプチドをＥＣＤ法やＥＴＤ法で分析した場合、ポリペプチドが優先的に解離するため、アミノ酸配列と修飾されていたアミノ酸を決定できるが、糖鎖構造は決定できない（非特許文献２）。糖ペプチドの例のように翻訳後修飾分析においては、ＣＩＤ法（あるいはＩＲＭＰＤ法）とＥＣＤ法（あるいはＥＴＤ法）は相補的な解離手段として知られている。
【００１０】
先述したようにポリペプチドを体系的に分析するプロテオーム解析では、ＬＣの利用により、試料を分離する必要がある。その分離手段として逆相クロマトグラフィーが広く利用されている。逆相クロマトグラフィーでは極性の高い（あるいは疎水性の低い）物質から溶出される。ここで逆相クロマトグラフィーを用いたＬＣ−ＭＳの分析例を図３に示す。
【００１１】
糖タンパク質であるヒトトランスフェリンをリジルエンドペプチダーゼで消化した試料を逆相クロマトグラフィーで分離し、質量分析した。試料分離は６０分のリニアグラジエント（４％アセトニトリルから４０％アセトニトリル）で行われ、３５分から４５分の間のクロマトグラフを示している。トランスフェリンは３か所糖鎖修飾されることが知られており、主要な糖鎖構造は決定されている（非特許文献３）。
【００１２】
図中、（Ａ）に示すグラフは、全イオンクロマトグラフと呼ばれ、ＭＳ１スペクトルで検出されたイオンのイオン強度の合算値をプロットしている。（Ｂ）に示すグラフ（ＸＩＣ（９２１．１））は、ＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫにバイアンテナ型（構造は図中に表記）と呼ばれる糖鎖が修飾した糖ペプチドの４価イオンであるｍ／ｚが９２１．１のイオン強度をプロットしたマスクロマトグラフである。（Ｃ）に示すグラフ（ＸＩＣ（１０８５．２））は、ＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫにトリアンテナ型（構造は図中に表記）と呼ばれる糖鎖が修飾した糖ペプチドの４価イオンであるｍ／ｚが１０８５．２のマスクロマトグラフである。（Ｄ）に示すグラフ（ＸＩＣ（１１１０．３））は、ＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫ にバイアンテナ型糖鎖が修飾した 糖ペプチドの５価イオンであるｍ／ｚが１１１０．３のマスクロマトグラフである。（Ｅ）に示すグラフ（ＸＩＣ（１２４１．５））は、ＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫにトリアンテナ型糖鎖が修飾した糖ペプチドの５価イオンであるｍ／ｚが１２４１．５のマスクロマトグラフである。（Ｆ）に示すグラフ（ＸＩＣ（６５７．２））は、糖鎖ＮｅｕＡｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃの１価イオンであるｍ／ｚが６５７．２のマスクロマトグラフである。ＮｅｕＡｃは、α-Ｎ-Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄを表し、Ｈｅｘはβ-Ｄ-Ｇlｕｃｏｓｅ（Ｇｌｃ）、β-Ｄ-Ｍａｎｎｏｓｅ（Ｍａｎ）、β-Ｄ-Ｇａｌａｃｔｏｓｅ（Ｇａｌ）を表し、ＨｅｘＮＡｃはβ-Ｄ-Ｎ-Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＧｌｃＮＡｃ）、β-Ｄ-Ｎ-Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）を表す。
【００１３】
図３の結果から逆相クロマトグラフィーを用いて糖ペプチドを分離した場合、アミノ酸配列に依存して分離し、糖鎖構造の影響が小さいことがわかる。また、糖ペプチドがイオン化される際に糖鎖が解離する現象（インソースディケイ）によって、ＭＳ１スペクトルから糖鎖イオンが観察され、糖鎖イオンが観察される時間帯と糖ペプチドが観察される時間帯は一致していることがわかる。
【００１４】
図４に保持時間４２．４分に観察されたＭＳ１スペクトルを示す。図より、ＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫに対し、バイアンテナ型、トリアンテナ型、トリアンテナ型（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ付加）糖鎖が修飾した糖ペプチドが同時に検出されていることがわかる。
【００１５】
糖ペプチドは、未修飾ペプチドよりも大幅に感度が低いことが知られている。しかも多量の未修飾ペプチドと同時にイオン化されると検出感度は著しく低下する（非特許文献４）。さらに糖鎖構造の不均一性によってスペクトルは複雑化することが知られている。
【００１６】
図５にＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫ にバイアンテナ型糖鎖が修飾した５価イオンであるｍ／ｚが１１１０．３のＥＣＤスペクトルを示す。一般的なＥＣＤスペクトルでは、プリカーサイオン（[Ｍ＋５Ｈ]５＋）、チャージリデューススピーシーズ（ [Ｍ＋５Ｈ]４＋；電子と反応したが解離しなかったプリカーサイオン）、フラグメントイオンが観察される。ＥＣＤやＥＴＤでは、ＣＩＤやＩＲＭＰＤと異なり、全てのプリカーサイオンがフラグメントイオンに変換されるわけではない（残存プリカーサイオンやチャージリデューススピーシーズが残る）。このため、ＣＩＤスペクトルで観察されるフラグメントイオンよりも微弱なフラグメントイオンとなる。高精度にアミノ酸配列や修飾位置を同定するには、Ｓ／Ｎの高いＭＳ／ＭＳスペクトル（ＥＣＤスペクトル）を取得することが求められる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Takegawa. Y. et al ; J Sep Sci, 2008, 31, 1585-1593.
【非特許文献２】Deguchi, K. et al ; Rapid Commun Mass Spectrom, 2007, 21, 691-698.
【非特許文献３】Satomi, Y. et al ; FEBS Lett, 2004, 576, 51-56.
【非特許文献４】Annesly, T.M. et al ; Clin Chem, 2003, 49, 1041-1044.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
糖鎖修飾を受けたタンパク質やペプチドの定性解析では、アミノ酸配列の同定だけでなく、糖鎖修飾の種類や糖鎖の構造又は修飾位置の同定が求められる。通常タンパク質は質量分析・解析を容易にするため、酵素でタンパク質を切断した消化物を試料とする。しかし、これらの試料は多種類のペプチド混合物であるため、逆相クロマトグラフィー等のＬＣと結合して質量分析される。試料は貴重であるため、少量の試料からできるだけ多くの糖ペプチドの構造を同定することが求められる。糖ペプチドを優先的に分析したい場合、各イオンの質量電荷比や価数情報から糖ペプチドを特定することはできず、実際にＣＩＤ（あるいは、ＩＲＭＰＤ）で解離してみて初めて糖ペプチドであることが確認できる。さらに、一般的にプリカーサイオンはイオン強度順に選択されるが、糖ペプチドはイオン化効率が低いことや、糖鎖構造の不均一性によって、未修飾ペプチドよりも相対的に検出されにくいため、プリカーサイオンとして選択されにくい。
【００１９】
また、特にＥＣＤ（あるいは、ＥＴＤ）による同定では、Ｓ／Ｎの高いフラグメントイオンで構成されるスペクトルを取得する必要がある。しかし、糖ペプチドは未修飾ペプチドよりもイオン強度が低くなる傾向があるため、未修飾ペプチドと同様の条件でＭＳ／ＭＳ測定を行った場合、未修飾ペプチドよりもＳ／Ｎの低いスペクトルを取得することとなる。
【００２０】
そこで、本発明は、以上説明した技術的な課題を解決し、物質の構造に関する情報の取得効率を向上させる質量分析方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明による質量分析方法は、分離された試料をイオン源によりイオン化する工程と、生成された試料イオンの質量スペクトルを取得する工程と、検出されたイオン情報をピークリストに格納する工程と、ピークリストに記載されたイオンから任意の１イオンを選択し、当該イオンと他のイオンとの質量差を算出する工程と、算出された質量差から修飾構造を推定する工程と、修飾構造が推定されたイオンからプリカーサイオンを選択する工程と、選択されたプリカーサイオンの強度情報に基づきデータ取得時間を設定する工程を有する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、実時間で所望の修飾物質を保持したイオンを推定することが可能であり、所望のイオンを優先的に分析することが可能となる。また、プリカーサイオン強度情報に基づきデータ取得時間を設定することにより、Ｓ／Ｎの高いデータを取得することが可能になる。これにより、質量分析による物質の同定において、物質の構造に関する情報を取得する効率が向上し、測定及び物質同定の時間が短縮する。また、同定精度が向上する。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】発明の実施の形態１における制御フローを説明する図。
【図２】ポリペプチドの解離パターンを説明する図。
【図３】トランスフェリン消化物のＬＣ−ＭＳ分析実験図。全イオンクロマトグラフ（Ａ）、糖ペプチドイオンｍ/ｚ：９２１．１のマスクロマトグラフ（Ｂ）、糖ペプチドイオンｍ/ｚ：１０８５．２のマスクロマトグラフ（Ｃ）、糖ペプチドイオンｍ/ｚ：１１１０．３のマスクロマトグラフ（Ｄ）、糖ペプチドイオンｍ/ｚ：１２４１．５のマスクロマトグラフ（Ｅ）、糖鎖イオンｍ/ｚ：６５７．２のマスクロマトグラフ（Ｆ）
【図４】図３の保持時間４２．４分に観察されたＭＳ１スペクトル実験図。
【図５】糖ペプチドＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫにバイアンテナ型糖鎖が修飾した５価イオンであるｍ／ｚ：１１１０．３のＥＣＤスペクトルを示す実験図。
【図６】発明の実施の形態１に基づく質量分析システムの構成例を示す図。
【図７】ＭＳ１スペクトルの模式図。
【図８】ピークリスト例を示す図。
【図９】分子量情報を含むピークリスト例を示す図。
【図１０】質量差情報を含むピークリスト例を示す図。
【図１１】質量差算出において任意イオンの選び方を説明する図。
【図１２】推定糖鎖構造情報を含むピークリスト例を示す図。
【図１３】インクルージョンリスト例を示す図。
【図１４】実施の形態１による制御フローを動作した結果、推定された糖鎖構造情報が記載されているＭＳ１スペクトルの模式図。
【図１５】発明の実施の形態１における分析条件設定画面例を示す図。
【図１６】単糖組み合わせ質量ファイル例を示す図。
【図１７】イオンピークを説明する模式図。
【図１８】分析終了後に表示されるインクルージョンリストを示す図。
【図１９Ａ】発明の実施の形態２における制御フローを説明する図（１／２）。
【図１９Ｂ】発明の実施の形態２における制御フローを説明する図（２／２）。
【図２０】発明の実施の形態２における分析条件設定画面例を示す図。
【図２１】発明の実施の形態３における制御フローを説明する図。
【図２２】糖ペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルの模式図。
【図２３】発明の実施の形態４における制御フローを説明する図。
【図２４Ａ】発明の実施の形態５における制御フローを説明する図（１／２）。
【図２４Ｂ】発明の実施の形態５における制御フローを説明する図（２／２）。
【図２５】イクスクルージョンリストにおける排除時間内イオンの有無を説明する図。
【図２６】排除時間内イオンを用いて糖鎖構造を推定した場合の糖鎖構造情報を含むピークリスト例を示す図。
【図２７】発明の実施の形態５による制御フローを動作した結果、情報が更新されたイクスクルージョンリストを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。なお、後述する本発明の実施の形態は一例であって、公知又は周知の技術との組み合わせや置換によって他の形態を実現することもできる。また、修飾物質として糖鎖を例として説明するが、他の修飾物でもかまわない。
【００２５】
（Ａ）実施の形態１
本形態例においては、プリカーサイオン強度に基づいてデータ取得時間を設定する方法について説明する。
【００２６】
（質量分析システムの構成）
図６に、イオン解離法としてＣＩＤ法、あるいは、ＥＣＤ法を用いる質量分析システムの構成例を示す。分析対象となる試料２１は、試料分離装置２２（図では、液体クロマトグラフィー（ＬＣ））の前処理により分離される。なお、試料分離装置２２には、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いることもできる。
【００２７】
分離された試料は、イオン源２３においてイオン化され、質量分析装置に導入される。ＭＳ１スペクトル取得の場合、導入されたイオンは、リニアイオントラップ（ＬＩＴ）２４で蓄積され、排出される。排出されたイオンは、Ｑディフレクター２５を経由し、ＴＯＦ検出器２８で検出される。ＴＯＦ検出器２８の前段には高分解能であるＴＯＦ２７が存在する。
【００２８】
ＣＩＤによるＭＳ／ＭＳスペクトル取得の場合、質量分析システムに導入されたイオンはＬＩＴ２４で蓄積され、ある特定のイオンが単離された後、ＬＩＴ２４内でＣＩＤによって解離される。解離したイオンはＬＩＴ２４から排出され、Ｑディフレクター２５を経由し、ＴＯＦ２７でイオンの質量電荷比ｍ／ｚに応じて分離される。イオン解離方法としてＣＩＤ法を用いているが、ＩＲＭＰＤ法を用いても良い。
【００２９】
ＥＣＤによるＭＳ／ＭＳスペクトル取得の場合、質量分析システムに導入されたイオンはＬＩＴ２４で蓄積され、ある特定のイオンが単離された状態で排出される。排出されたイオンはＱディフレクター２５を経由し、ＥＣＤセル２６に入る。ここで、イオンは電子と反応し、フラグメントイオンは排出される。排出されたフラグメントイオンは再びＱディフレクター２５を経由し、ＴＯＦ２７でイオンの質量電荷比ｍ／ｚに応じて分離される。
【００３０】
イオン源２３は、エレクトロスプレイイオン源、大気圧化学イオン化によるイオン源、マトリックス支援レーザ脱離イオン源、電気衝撃イオン源、化学イオン化によるイオン源、フィールドイオン化によるイオン源から選択される。
【００３１】
ＬＩＴ２４は多くのイオンが蓄積できるため、高感度検出が可能であるが、三次元四重極イオントラップ、四重極質量フィルター、コリジョンセル、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分離部でも構わない。
【００３２】
ＥＣＤセル２６は、ＬＩＴ、三次元四重極イオントラップ、コリジョンセル、四重極質量フィルター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析部の中から選択される。また、本装置構成では、イオン解離方法としてＥＣＤ法を用いているが、ＥＴＤ法やＥＤＤ法を用いても良い。ＥＤＤ法の場合、イオン化は負イオンモードで実施する。
【００３３】
ＴＯＦ２７は高分解能で質量精度も高いので好ましいが、四重極質量フィルター、イオントラップ、磁場型質量分析器、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器、オービトラップ型分析器でも構わない。
【００３４】
ＴＯＦ検出器２８で検出された各イオン情報は、全体処理部３０に与えられる。全体処理部３０は、後述するようなデータ整理及び又はデータ処理を実行する。なお、全体処理部３０は、ハードウェア的な回路構造を有する場合だけでなく、コンピュータシステム上で動作するプログラムの処理機能を通じても実現することができる。全体処理部３０の一部であるプリカーサイオン選択部３１は、データ格納部４１とソフトウエア部３２によって構成される。データ格納部４１は、ピークリスト３８、単糖組み合わせ質量ファイル４７、インクルージョンリスト３９、データ取得時間設定テーブル４０で構成され、ソフトウエア部３２は、分子量算出部３３、質量差算出部３４、糖ペプチド推定部３５、イオン分類部３６、プリカーサイオン決定部３７で構成される。
【００３５】
ピークリスト３８はＭＳ１スペクトルで検出されたイオン情報を格納し、例えば質量電荷比、価数、イオン強度、ＬＣ保持時間等の情報を含む。分子量算出部３３ではピークリスト３８に格納されている各イオンの質量電荷比と価数からイオンごとの分子量を算出する。質量差算出部３４ではピークリスト３８に格納されている任意の１イオンとその他のイオンとの質量差を算出する。糖ペプチド推定部３５では質量差算出部３４で算出された質量差と単糖組み合わせ質量ファイル４７とのマッチングを行う。マッチしたイオンペアはイオン分類部３６によってインクルージョンリスト３９に格納される。インクルージョンリスト３９には、質量電荷比、価数、イオン強度、ＬＣ保持時間等の情報を含む。プリカーサイオン決定部３７は、インクルージョンリスト３９に格納されているイオンからプリカーサイオンを選択し、選択したイオンのイオン強度情報とデータ取得時間設定テーブル４０を用いて設定すべきデータ取得時間情報を入手する。入手した情報はプリカーサイオン決定部３７から質量分析装置内にある制御部２９を介してＬＩＴ２４、Ｑディフレクター２５、ＥＣＤセル２６に伝達される。全体処理部３０が、特許請求の範囲における「計算処理部」に対応する。
【００３６】
ＭＳ１スペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトル、質量電荷比、価数、イオン強度、ＬＣ保持時間、任意イオンとの質量差、推定された修飾構造、ＣＩＤ解離強度、ＥＣＤ解離強度、ＬＩＴ２４の制御パラメータ、試料分離装置２２の溶媒混合比、流量等はデータ表示部４２に表示される。全体処理部３０に対する所望の修飾情報、マッチング誤差、ＭＳ／ＭＳターゲット数等は、パラメータ入力部４３を通じて入力する。
【００３７】
（処理動作の概要）
図１に、実施の形態１に基づく制御フローを示す。分析前には分析条件設定を行い（ステップ１）、ＬＣ／ＭＳ分析をスタートさせる（ステップ２）。分析条件設定（ステップ１）の詳細は後述する。ＬＣ／ＭＳ分析では、複数物質の混合物である試料２１を試料分離装置２２に導入する。クロマトグラフィーには、物質の性質によって分離させるための分離カラムが装着されており、分離カラムを通過した試料は、成分ごとに異なる時間に溶出する。溶出した試料の各成分は、イオン源２３にてイオン化される。イオンは質量分析装置内のＬＩＴ２４に導入されて蓄積され、排出口から排出される。排出されたイオンはＴＯＦ検出器２８において検出され、横軸をｍ／ｚ、縦軸をイオン強度とするＭＳ１スペクトルを得る（ステップ３）。ＭＳ１スペクトルの模式図を図７に示す（ここではＡ〜Ｉのイオンが検出される）。なお、横軸はｍ／ｚであり、縦軸はイオン強度である。
【００３８】
次に、ＭＳ１スペクトルの情報（質量電荷比、価数、イオン強度、ＬＣ保持時間等）は、プリカーサイオン選択部３１中のピークリスト３８に格納される（ステップ４）。一定イオン強度以上のイオンのみをピークリスト３８に格納してもよい。また多くの場合、ペプチドイオンは２価以上になるため、１価イオンはピークリスト３８に格納しなくてもよい。ピークリスト３８の一例を図８に示す。Ｃｈａｒｇｅは価数、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙはイオン強度、ＲＴは液体クロマトグラフィーの保持時間を示す。分子量算出部３３によってピークリスト３８に格納されている各イオンの質量電荷比と価数から分子量が算出され、得られた分子量情報はピークリスト３８に追加される。分子量計算後、一定値以内（例えば０．０５Ｄａ以内）のイオンは、同一分子量イオンと判断してもよい。分子量情報が追加されたピークリストの一例を図９に示す。Ｍ．Ｗ．が分子量を示す。ここでは、分子量情報をピークリスト３８に追加したが、別ファイルとして保持してもよい。分子量算出動作の詳細については後述する。次に、質量差算出部３４によってピークリスト３８に格納されている任意の１イオンとその他のイオンとの質量差を算出する（ステップ５）。質量差情報が追加されたピークリスト３８の一例を図１０に示す。ここでは、任意の１イオンとしてＥイオンを選択し、Ｅイオンとその他のイオンとの質量差を求めている。Ｄｅｌｔａ ｍａｓｓ（Ｅ）がこれにあたる。質量差情報は複数個排出されるので、個別ファイルとして保持するのが望ましい。ここでは、説明のため、ピークリスト３８に質量差情報を追加している。任意の１イオンの選択方法を図１１に示す。（Ａ）に示すグラフは、全てのイオンを任意の１イオンとする場合であり、ピークリスト３８に格納されているイオンの数だけ質量差リストを作成する。図８のピークリストでは９つ差分リストを作成することとなる。（Ｂ）に示すグラフは、一定以上のイオン強度をもつイオンを任意の１イオンとする場合であり、計算処理時間を低減することができる。多くの場合、ペプチドイオンは２価以上になるため、１価イオンは質量差計算するイオン候補から除外してもよい。次に、糖ペプチド推定部３５は算出された質量差が単糖組み合わせ質量ファイル４７に存在するかを検証する（ステップ６）。検証の際、単糖組み合わせ理論質量にある一定の誤差を設けることが望ましい。
【００３９】
検証結果の一例を図１２に示す。質量差が糖鎖組み合わせと一致するイオンが存在する場合（ステップ７で肯定結果の場合）は、糖ペプチドのインクルージョンリスト化を実施する（ステップ１０）。ここでは、インクルージョンリスト１、インクルージョンリスト２、インクルージョンリストｎに分類されたと想定する。図１２の例では、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇイオンが一つのインクルージョンリストに格納される。インクルージョンリストの一例を図１３に示す。インクルージョンリスト３９に一旦格納されたイオンは、質量差算出におけるイオン候補から除外してもよい。この除外により、計算処理時間を低減することができる。プリカーサイオン決定部３７は、インクルージョンリスト３９の中から最もイオン強度の高いイオンをプリカーサイオンとして選択し（ステップ１１）、選択したプリカーサイオン強度とデータ取得時間設定テーブル４０を用いてデータ取得時間を決定する（ステップ１２）。プリカーサイオンは、イオン強度順に選択されるのが一般的であるが、価数や分子量を考慮に入れて選択しても良い。プリカーサイオンの質量電荷比、データ取得時間の情報は、プリカーサイオン決定部３７によって質量分析装置内部の制御部２９を介して、ＬＩＴ２４、Ｑディフレクター２５、ＥＣＤセル２６に伝達され、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を実施する。分析されたイオンは、インクルージョンリスト３９から除去される（ステップ１４）。通常、質量分析前には、ＭＳ／ＭＳターゲット数を設定する（後述する図１５のＭａｘｉｍｕｍ ＭＳ/ＭＳ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｍｂｅｒがこれに当たる）。インクルージョンリスト数（１、２、、ｎ）がＭＳ／ＭＳターゲット数を下回った場合、再度インクルージョンリストからプリカーサイオンを選択することが可能である。この場合、すでに分析したイオンをＭＳ／ＭＳ分析する必要はないため、インクルージョンリスト３９から除去した。また、ここではＭＳ／ＭＳ分析したイオンだけをインクルージョンリスト３９から除去したが、格納されている全てのイオンを除去してもよい。この場合、一度プリカーサイオンが選択されたインクルージョンリストから再度プリカーサイオンが選択され、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）されることはない。別のインクルージョンリストが存在する場合は、そのインクルージョンリスト３９の中からプリカーサイオンを選択し（ステップ１５、１７）、イオン強度に応じたデータ取得時間を設定し（ステップ１２）、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を実施する。分析されたイオンは、インクルージョンリスト３７から除去され（ステップ１６、１８）、ＭＳ１測定（ステップ３）に戻る。図１４に、ＭＳ１スペクトルで観察されたイオンに推定構造を表示した。Ｅイオンに特定の糖鎖を付加、あるいは、除去したイオンがＤ、Ｆ、Ｇイオンであることが推定されている。
【００４０】
従来法では、糖ペプチドを優先的に分析したい場合であっても、単に各イオンの質量電荷比や価数やイオン強度情報から糖ペプチドを特定することはできない。そのため、イオン強度順にプリカーサイオンは選択される。しかし、本形態例では、各イオンの分子量差から糖ペプチドを推定することが可能であり、糖ペプチドを優先的に分析することが可能になる。さらに、本発明では、糖鎖構造が推定できるイオン群のうち１イオン（あるいは１部のイオン）にターゲットを絞り、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を行うことで、アミノ酸配列の異なる糖ペプチドを網羅的に分析することができる。
【００４１】
また、従来法のようにどのイオンに対しても同一条件でＭＳ／ＭＳ測定をする場合、イオン強度の低いプリカーサイオンでは、Ｓ／Ｎの低いスペクトルとなり、同定できないことも想定される。本発明では、イオン強度に応じてデータ取得時間を制御することで、どのプリカーサイオンに対しても一定基準以上のスペクトルを取得することができる。
【００４２】
本形態例では、ある保持時間に検出されたイオンのみで質量差計算を行っているが、以前の保持時間に検出されたイオン、構造が推定されたイオン、あるいは別分析で得られたイオンと質量差計算を行ってもよい。
【００４３】
本形態例では、イオン解離手段としてＣＩＤを用いているが、ＩＲＭＰＤ、ＥＣＤ、ＥＴＤ、ＥＤＤあるいはその他の解離手段でもよい。
【００４４】
なお、全体処理部３０による、分子量算出、質量差算出、修飾構造推定、プリカーサイオンの決定は、いずれも分析を妨げないように、実時間で実施される必要がある。
【００４５】
（分析条件設定）
設定画面の一例を図１５に示す。ユーザーは分析する対象となる修飾の種類を選択する。ここでは、糖鎖（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を選択している。分析取得方法によりモードを選択する。例えば本形態例を動作させる場合は、モード１を選択した。まず、想定される単糖の種類を選択する。サンプルの由来から単糖の種類を絞り込むことが可能な場合がある。また、すでに糖鎖解析を実施している場合は、糖鎖の種類や各単糖の範囲を指定することも可能である。この表示例では、Ｈｅｘ、ＨｅｘＮＡｃ、ＮｅｕＡｃで構成される糖鎖修飾が想定され、その個数範囲はそれぞれ３−７、２−６、１−４としている。これらの組み合わせ、及び分子量の表をプログラムの処理機能を通じて分析前に作成しておくことが望ましい。この表が単糖組み合わせ質量ファイル４７に相当する。単糖組み合わせ質量ファイル４７の作成方法は後述する。
【００４６】
質量差算出部３４によって算出された各質量差は単糖組み合わせ質量ファイル４７と照らし合わせ、ユーザー指定の誤差範囲で一致する修飾物を探索する。この誤差範囲を指定するのが、Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｃｙである。図中では、±０．３Ｄａが入力されている。
【００４７】
ユーザーはＭＳ／ＭＳターゲットの上限を指定するのが望ましい。図中では、Ｍａｘｉｍｕｍ ＭＳ/ＭＳ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｍｂｅｒ がこれにあたる。一回のシークエンス（ＭＳ１＋ＭＳ／ＭＳ分析×ｎ回）で最大３イオンをＭＳ／ＭＳ分析に進める（ｎが最大３を意味する）。あるいは、ＭＳ／ＭＳ測定を特定回数実施する条件でもよい。
【００４８】
ユーザーはイオン強度に応じたデータ取得時間を設定する。図中では、プリカーサイオンのイオン強度が１０００以下の場合は、７秒間ＭＳ/ＭＳ分析を行い、１０００〜３０００の場合は、５秒間ＭＳ/ＭＳ分析を行い、３０００〜６０００の場合は、５秒間ＭＳ/ＭＳ分析を行い、６０００〜８０００の場合は、４秒間ＭＳ/ＭＳ分析を行い、８０００以上の場合は、３秒間ＭＳ/ＭＳ分析を行うことを示す。
【００４９】
（単糖組み合わせ質量ファイル作成方法）
ここでは、単糖組み合わせ質量ファイルの作成方法を説明する。分析条件設定画面設定したユーザー所望の単糖種類と個数から全ての単糖組み合わせと分子量を算出し、単糖組み合わせ質量ファイル７を作成する。一例を図１６に示す。例えば、[Ｈｅｘ]３[ＨｅｘＮＡｃ]２の組み合わせの場合、Ｈｅｘの分子量１８０．０６３×３＝５４０．１８９とＨｅｘＮＡｃの分子量２２１．０９×２＝４４２．１８０との和９８２．３６９から５つのグリコシド結合で失われる水の分子量９０．０５２（１８．０１×５）を差し引き、分子量８９２．３１７となる。グリコシド結合の数は糖鎖の個数と一致する。
【００５０】
（価数と分子量の算出）
ここでは、イオンの価数と分子量の算出方法について説明する。図１７に、質量分析で観測されるプロトン化［Ｈ＋］したイオンピークの模式図を示す。縦軸はイオン強度であり、横軸はｍ／ｚである。タンパク質の構成原子は主に炭素、水素、酸素、窒素である。自然界の炭素には質量数１２の１２Ｃの他に、約１％質量数１３の１３Ｃが存在する。そのため、タンパク質は、１２Ｃと一定の割合で１３Ｃを含有する混合物である。質量分析では、１２Ｃのみで構成されるモノアイソトピックピーク４００のほかに１３Ｃが混合した同位体が存在する。１３Ｃを1つ含む同位体、１３Ｃを２つ含む同位体、１３Ｃを３つ含む同位体はそれぞれ１２Ｃ体分子量＋１、１２Ｃ体分子量＋２、１２Ｃ体分子量＋３となり、同位体ピーク４０１と呼ばれている。
【００５１】
プロトン化イオンの場合、プロトン付加数が価数ｚに対応する。質量分析では、ｍ／ｚで表示される。このため、モノアイソトピックピーク４００のｍ／ｚ値は１２Ｃ体の分子量をＭとすると、（Ｍ＋ｚ）／ｚ、同位体ピーク４０１のｍ／ｚ値はそれぞれ（Ｍ＋１＋ｚ）／ｚ、（Ｍ＋２＋ｚ）／ｚ、（Ｍ＋３＋ｚ）／ｚとなる。これらのピークの差は１／ｚとなる。つまり、１価の場合のピーク間隔は１、２価の場合のピーク間隔は０．５となる。従って、ピークの間隔から価数を判定することが可能である。また、価数が判明すれば、価数とｍ／ｚ値から分子量を算出することが可能である。
【００５２】
（実施の形態の効果）
前述した実施の形態に係る質量分析方法の適用により、糖鎖構造だけが異なる同一アミノ酸配をもったグループのうちの一部だけをＭＳ／ＭＳ分析することで、アミノ酸配列の異なる糖ペプチドを網羅的に分析することができる。さらにＭＳ／ＭＳ分析では、プリカーサイオン強度に合わせて分析時間を調節することで、常にＳ／Ｎの高いデータを取得することができる。これにより微弱なピークの検出ができ、同定精度を向上することができる。また、分析終了後に分析中に検出されたイオンのイオン情報（質量電荷比、価数、イオン強度、ＬＣ保持時間等）と分析中に推定された構造を合わせて表示することができる。一例を図１８に示す。これらの情報は、次に分析をする場合、プリカーサイオン選択の基準となり得る。例えば、所望の単糖を含む糖ペプチドを優先的にＥＣＤ分析することや所望のイオンのみをプリカーサイオンとして選択し、優先的に分析することも可能である。
【００５３】
（Ｂ）実施の形態２
次に、ＭＳ／ＭＳ分析の結果に基づいてプリカーサイオンを選択する方法について説明する。
【００５４】
図１９Ａ及びＢに、実施の形態２に基づく制御フローを示す。なお、図１９Ａ及びＢには、図１との対応部分に同一符号を付して示している。
【００５５】
前述した実施の形態１では、プリカーサイオン強度に基づいてデータ取得時間を設定したが、本実施の形態では、プリカーサイオン強度に関わらず一定のデータ取得時間でＭＳ／ＭＳ分析を行い、ＭＳ／ＭＳスペクトルのフラグメントイオン強度合算値がユーザー所望の閾値以上の場合は、Ｓ／Ｎの高いスペクトルが取得できたと判断し、別のプリカーサイオンの分析を行い、ＭＳ／ＭＳスペクトルのフラグメントイオン強度合算値がユーザー所望の閾値以下の場合は、再度同じプリカーサイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する。
【００５６】
分析前には分析条件設定する（ステップ１）。分析条件設定画面の一例を図２０に示す。本形態例を動作させる場合は、モード２を選択した。本形態例では、データ取得時間を設定する。図中では、ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅがこれに当たる。次に、ＭＳ／ＭＳスペクトルのフラグメントイオン強度の合算値（Ｓｕｍ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を入力する。ＭＳ／ＭＳスペクトルのフラグメントイオン強度の合算値を算出し、算出した値がＳｕｍ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎｓの値を上回った場合は、充分なＳ／Ｎのスペクトルが得られたと判断する。図２０のその他のパラメータは実施の形態１と同様である。
【００５７】
糖ペプチドのインクルージョンリスト化を実施する（ステップ１０）。インクルージョンリスト１のイオンにおいて、最もイオン強度の高いイオンをプリカーサイオンとして選択する（ステップ１１）。プリカーサイオンはイオン強度順に選択されるのが一般的であるが、価数や分子量を考慮に入れて選択しても良い。選択されたプリカーサイオンは一定の測定時間だけＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を実施する。次に、同一プリカーサイオンの既取得ＭＳ／ＭＳスペクトルが他にも存在するか否かを判定する（ステップＳ２０）。ここで、同一プリカーサイオンの既取得ＭＳ／ＭＳスペクトルが他にも存在する場合（ステップＳ２０で肯定結果の場合）、同一プリカーサイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを積算し（ステップ２１）、全フラグメントイオン量を算出する（ステップ２２）。一方、同一プリカーサイオンの既取得ＭＳ／ＭＳスペクトルが他には存在しない場合（ステップＳ２０で否定結果の場合）、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）で所得したスペクトルから全フラグメントイオン量を算出する（ステップ２２）。次に全フラグメントイオン量がユーザー所望の閾値以上であるか判断する（ステップ２３）。閾値以上の場合（ステップ２３で肯定結果の場合）、Ｓ／Ｎの高いスペクトルが取得できたと判断し、分析されたイオンはインクルージョンリスト３９から除外される（ステップ１４）。ここではＭＳ／ＭＳ分析したイオンだけをインクルージョンリスト３９から排除したが、格納されている全てのイオンを除外してもよい。別のインクルージョンリストが存在する場合は、そのインクルージョンリスト３９の中からプリカーサイオンを選択し（ステップ１５、１７）、一定の測定時間だけＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を実施する。前述したように得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを積算してから全フラグメントイオン量を算出し、ユーザー所望の閾値以上であるか判断する（ステップ２３）。閾値以下の場合（ステップ２３で否定結果の場合）、再度同じプリカーサイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する。閾値以上の場合（ステップ２３で肯定結果の場合）、Ｓ／Ｎの高いスペクトルが取得できたと判断し、分析されたイオンはインクルージョンリスト３９から除外される（ステップ１６、１８）。ＥＣＤによって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルのフラグメントイオン強度の計算には、プリカーサイオンやチャージリデューススピーシーズは含めなくてもよい。その他の制御フローは実施の形態１と同様である。
【００５８】
（Ｃ）実施の形態３
ここでは、インクルージョンリスト作成後、ＣＩＤで糖ペプチドであることを確認する方法について説明する。
【００５９】
図２１に、実施の形態３に基づく制御フローを示す。なお、図２１には、図１との対応部分に同一符号を付して示している。
【００６０】
前述した実施の形態１では、実験で得られたイオン分子量の差分と単糖組み合わせ理論分子量を用いて糖ペプチドを推定している。しかし、形態１の方法では、糖ペプチド推定の結果として未修飾ペプチドが糖ペプチドに偶然に振り分けられる可能性がある。そこで、本形態３では、インクルージョンリスト作成後に、代表的な１イオンに対してＣＩＤを実施し、糖ペプチドであることを確認することで、未修飾ペプチドをＭＳ／ＭＳ分析してしまう時間を低減させる。
【００６１】
以下では、糖ペプチドのインクルージョンリスト化（ステップ１０）を実施する時点から説明する。インクルージョンリスト１のイオンにおいて、最もイオン強度の高いイオンをプリカーサイオンとして選択する（ステップ１１）。ここでは、最もイオン強度の高いイオンをプリカーサイオンとして選択したが、価数や分子量を考慮に入れて選択しても良い。選択されたプリカーサイオンはＣＩＤ測定（ステップ３０）を実施する。ＣＩＤの代わりにＩＲＭＰＤを用いてもよい。次に、得られたＣＩＤスペクトルに糖鎖関連イオンが存在するかを検証する（ステップ３１）。検証の際、糖鎖関連イオンのイオン強度や、理論分子量と測定分子量との誤差に閾値を設けることが望ましい。糖鎖関連イオンとは、糖鎖イオンやニュートラルロスイオンを指す。糖ペプチドイオンのＣＩＤスペクトルの模式図を図２２に示す。ＣＩＤによって、ＨｅｘＮＡｃイオン２００、ＨｅｘＨｅｘＮＡｃイオン２０１、糖ペプチドイオンからＨｅｘＮＡｃが失われたイオン２０２、糖ペプチドイオンからＨｅｘＨｅｘＮＡｃが失われたイオン２０３が検出されている。ＨｅｘＮＡｃイオン２００、ＨｅｘＨｅｘＮＡｃイオン２０１のように糖鎖のみで構成されるイオンをここでは糖鎖イオンと呼び、糖ペプチドイオンからＨｅｘＮＡｃが失われたイオン２０２、糖ペプチドイオンからＨｅｘＨｅｘＮＡｃが失われたイオン２０３のようにペプチドを含むイオンをここではニュートラルロスイオンと呼ぶ。ユーザー所望の糖鎖関連イオンがＣＩＤスペクトルに存在しない場合（ステップ３１で否定結果の場合）、インクルージョンリストに格納されているイオンは糖ペプチドではなかったと判定し、インスクルージョンリスト１を削除し（ステップ３２）、別のインクルージョンリストの分析へと進む。ここでは、インスクルージョンリスト１を削除することによりインクルージョンリスト１に格納されているイオンがプリカーサイオンとして選択されることを回避させた。インクルージョンリスト１からプリカーサイオンが選択されなければ、他の手法を用いてもよい。ユーザー所望の糖鎖関連イオンがＣＩＤスペクトルに存在した場合（ステップ３１で肯定結果の場合）、インクルージョンリスト１のイオンにおいて、最もイオン強度の高いイオンをプリカーサイオンとして選択し（ステップ１１）、選択したプリカーサイオン強度とデータ取得時間設定テーブル４０を用いてデータ取得時間を決定した後（ステップ１２）、ＭＳ／ＭＳ測定を実施する（ステップ１３）。プリカーサイオンはイオン強度順に選択されるのが一般的であるが、価数や分子量を考慮に入れて選択しても良い。また、ＣＩＤ測定（ステップ３０）を行うイオンとＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を行うイオンは同一であることが望ましい。ＭＳ／ＭＳ分析されたイオンはインクルージョンリスト１から除外される（ステップ１４）。ここではＭＳ／ＭＳ分析したイオンだけをインクルージョンリスト３９から排除したが、格納されている全てのイオンを除外してもよい。別のインクルージョンリストが存在する場合は、そのインクルージョンリストの分析（ステップ１７）へと進む。その他の制御フローは実施の形態１と同様である。
【００６２】
本形態例では、糖鎖関連イオンが検出された場合（ステップ３１で肯定結果の場合）、実施の形態１と同様に動作させているが、実施の形態２と同様に動作させてもよい。
【００６３】
（Ｄ）実施の形態４
ここでは、ＭＳ１で糖鎖イオンが観察された時間帯のみ、糖ペプチド推定を行う方法について説明する。
【００６４】
図２３に、本発明の実施の形態４に基づく制御フローを示す。なお、図２３には、図１との対応部分に同一符号を付して示している。
【００６５】
実施の形態１〜３では、ＭＳ１測定（ステップ３）からピークリスト３８を作成し（ステップ４）、ピークリスト３８に格納されている任意の１イオンとその他のイオンとの質量差が単糖組み合わせ質量ファイル４７に存在するかを分析中絶えず検証している（ステップ６）。しかし、糖ペプチドがイオン化される際に、糖ペプチドから糖鎖が解離する現象（インソースディケイ）が観察されることがあり、ＭＳ１スペクトルからＭＳ１スペクトルに糖ペプチドが存在するかを判定することが可能である。例えば糖ペプチドがインソースディケイによってＨｅｘＨｅｘＮＡｃが糖ペプチドから解離した場合、１価のＨｅｘＨｅｘＮＡｃイオンであるｍ/ｚ：３６６が観察される。
【００６６】
そこで、ピークリスト３８の作成後、糖鎖イオンが検出されるかを判定する（ステップ４０）。ピークリスト３８に閾値以上の糖鎖イオンが存在した場合（ステップ４０で肯定結果の場合）、任意の１イオンとその他のイオンとの質量差を算出し（ステップ５）、算出された質量差が単糖組み合わせ質量ファイル４７に存在するかを検証する（ステップ６）。以降の動作は実施の形態１と同様である。ピークリスト３８に閾値以上の糖鎖イオンが存在しない場合（ステップ４０で否定結果の場合）、ＭＳ１測定（ステップ３）に戻る。ここでは、ピークリスト３８に閾値以上の糖鎖イオンが存在しない場合（ステップ４０で否定結果の場合）、ＭＳ１測定（ステップ３）に戻ったが、任意のイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を行ってもよい。糖鎖イオンは分析前にユーザーが指定するのが望ましい。その他の制御フローは実施の形態１と同様である。また、糖ペプチドのインクルージョンリスト化（ステップ１０）以降は、実施の形態２と同様に動作させてもよい。本形態例では、インソースディケイによって糖鎖イオンが観察される時間帯のみ糖ペプチドのインクルージョンリスト化の作成を行ったが、ＭＳ１測定（ステップ３）の代わりに全イオンに対してＣＩＤやＩＲＭＰＤを行い、積極的に糖鎖イオンが観察される条件で分析してもよい。
【００６７】
（Ｅ）実施の形態５
ここでは、ＭＳ／ＭＳ分析したイオンをイクスクルージョンリストに追加する方法について説明する。
【００６８】
図２４Ａ及びＢに、本発明の実施の形態５に基づく制御フローを示す。なお、図２４Ａ及びＢには、図１との対応部分に同一符号を付して示している。
【００６９】
実施の形態１〜４では、ＭＳ／ＭＳ分析したイオンはインクルージョンリストから除外することにより、一回のシークエンスで同一イオンが重複分析されることを回避した。しかし、次のシークエンスのＭＳ１測定（ステップ３）の結果、類似のＭＳ１スペクトル（検出されるイオン種が同じ）が取得された場合、ほぼ同様のインクルージョンリストが作成され、既にＭＳ／ＭＳ分析を実施したイオンに対し、再度ＭＳ／ＭＳ分析を行うこととなる。ＭＳ／ＭＳ分析したイオンをイクスクルージョンリストに格納することで、既にデータ取得したイオンに対するＭＳ／ＭＳ測定を回避することができる。
【００７０】
まず、糖ペプチドのインクルージョンリスト化を実施する（ステップ１０）。インクルージョンリスト１のイオンにおいて、最もイオン強度の高いイオンをプリカーサイオンとして選択する（ステップ１１）。プリカーサイオンは、イオン強度順に選択されるのが一般的であるが、価数や分子量を考慮に入れて選択しても良い。選択されたプリカーサイオンは、イオン強度に応じたデータ取得時間を設定し（ステップ１２）、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）を実施する。ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）したイオンは、イクスクルージョンリスト１に追加される（ステップ６０）。別のインクルージョンリストが存在する場合は、前述と同様にように動作させる。ここでは、ＭＳ／ＭＳ測定（ステップ１３）したイオンのみをイクスクルージョンリストに追加したが、インクルージョンリスト１に格納されている全てのイオンをイクスクルージョンリストに追加してもよい。イクスクルージョンリストに格納されているイオンは再度ＭＳ／ＭＳ分析をする必要のないイオンであり、プリカーサイオンとして選択しない。しかし、イクスクルージョンリストに格納されたイオンと同じの質量電荷比と価数をもったイオンを分析終了まで同一イオンと判断されてしまうと、偶然に質量電荷比と価数が一致したイオンをＭＳ／ＭＳ測定することができなくなる。多くのペプチドイオンは数十秒から１分間程度のバンドとして検出されることを考慮し、イクスクルージョンリストに格納されている各イオンには排除時間を設定することが望ましい。ここでいう排除時間とは、あるイオンが検出されてから排除時間内に質量電荷比と価数が一致したイオンが再度検出された場合は、同一イオンであると判断し、分析対象とはしないことを意味する。
【００７１】
そこで、ピークリスト３８が作成されると（ステップ４）、イクスクルージョンリストに格納されている各イオンが排除時間内であるかを判定する（ステップ５０）。イクスクルージョンリストに排除時間のイオンが存在しない場合（ステップ５０で否定結果の場合）、ピークリストに記載の任意の１イオンと他イオンとの質量差を算出し（ステップ５）、質量差と単糖組み合わせの一致度を検証し（ステップ６）、質量差が糖鎖組み合わせと一致するイオンが存在する場合（ステップ７で肯定結果の場合）には糖ペプチドのインクルージョンリスト化（ステップ１０）へ進む。イクスクルージョンリストに排除時間内のイオンが存在した場合（ステップ５０で肯定結果の場合）、そのイオンが格納されているイクスクルージョンリストから任意の１イオンを選択する。イクスクルージョンリストの一例を図２５に示す。保持時間３１分のＭＳ１測定（ステップ３）でピークリスト３８が作成されたとする（図２５右図）。排除時間（Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ）が３分の条件では、イクスクルージョンリストに記載されたイオンのうち保持時間２８分以降に検出されたイオンは排除の対象となる。ここでは、Ｆ、Ｇイオンがこれに当たる。つまり、Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｌｉｓｔ＃のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇイオンから任意の１イオンを選択する。次に、選択したイオンとピークリスト記載イオンとの質量差を算出し（ステップ５２）、質量差と単糖組み合わせの一致度を検証する（ステップ６）。ここで、推定糖ペプチドが検出されない場合（ステップ５３で否定結果の場合）、ピークリストに記載の任意の１イオンと他イオンとの質量差の算出（ステップ５）へと進む。一方、推定糖ペプチドが検出された場合（ステップ５３で肯定結果の場合）、質量差算出に用いた選択イオンに糖鎖を付加、あるいは除去した糖ペプチドだと推定されるので、質量差算出に用いた選択イオンが格納されているイクスクルージョンリストに追加する（ステップ５４）。このとき、保持時間情報も格納してもよい。
【００７２】
ここで、図２６を用いて前述のフローを説明する。イクスクルージョンリストからＥイオンを任意のイオンとして選択し、保持時間３１分のピークリストに記載イオンとの質量差を算出した（Ｄｅｌｔａ ｍａｓｓ（Ｅ）の列）。この質量差からＬ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ＰイオンがＥイオンと同一イオン（Ｎイオン）、あるいは、Ｅイオンに糖鎖が付加（Ｏ、Ｐイオン）、あるいは、除去（Ｌ、Ｍイオン）した構造だと推定された。これらのイオンはイクスクルージョンリスト＃に格納され、プリカーサイオンとして選択しない。更新されたイクスクルージョンリスト＃を図２７に示す。このとき、保持時間の情報を追加することで、分析終了後に各イオン検出範囲の情報を表示することができる。イクスクルージョンリストに排除時間内のイオンが存在した場合（ステップ５０で肯定結果の場合）、そのイオンが格納されているイクスクルージョンリストから任意の１イオンを選択する。このとき、どのイオンを選択しても、糖ペプチドの推定は可能である。その他の制御フローは実施の形態１と同様である。
【００７３】
もっとも、糖ペプチドのインクルージョンリスト化（ステップ１０）以降は実施の形態２と同様に動作させてもよい。また、糖ペプチドのインクルージョンリスト化（ステップ１０）以降を、実施の形態３及び４の組み合わせとしてもよい。
【符号の説明】
【００７４】
２１…試料、２２…試料分離装置（ＬＣ又はＧＣ）、２３…イオン源、２４…リニアイオントラップ、２５…Ｑディフレクター、２６…ＥＣＤセル、２７…ＴＯＦ、２８…ＴＯＦ検出器、２９…制御部、３０…全体処理部、３１…プリカーサイオン選択部、３２…ソフトウエア部、３３…分子量算出部、３４…質量差算出部、３５…糖ペプチド推定部、３６…イオン分類部、３７…プリカーサイオン決定部、３８…ピークリスト、３９…インクルージョンリスト、４０…データ取得時間設定テーブル、４１…データ格納部、４２…データ表示部、４３…パラメータ入力部、４７…単糖組み合わせ質量ファイル、２００…ＨｅｘＮＡｃイオン、２０１…ＨｅｘＨｅｘＮＡｃイオン、２０２…ＥイオンからＨｅｘＮＡｃが失われたイオン、２０３…ＥイオンからＨｅｘＨｅｘＮＡｃが失われたイオン、４００…モノアイソトピックピーク、４０１…同位体イオンシリーズ、
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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