(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の標的核酸のコピー数および第２の標的核酸のコピー数を決定する方法であって、
ａ）均一系での反応混合物を形成するために、第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させ、かつ第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させ、かつ単一の検出標識を加えることであって、ここで、前記第１の標的核酸配列の前記コピー数が前記第２の標的核酸配列の前記コピー数よりも大きい、ことと、
ｂ）第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成するために第１のプライマーセットを用いて第１の標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、かつ前記第１のＴｍより高い第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成するために第２プライマーセットを用いて第２の標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することと、
ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応中に、前記第１のＴｍより低い第１のシグナル取得温度で検出標識の量を測定することと、
ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応中に、前記第１のＴｍより高くかつ前記第２のＴｍより低い第２のシグナル取得温度において前記検出標識の量を測定することと、
ｅ）（ｂ）から（ｄ）までのステップを少なくとも１回繰り返すことと、
ｆ）前記第２の標的核酸と比較して前記第１の標的核酸の相対的コピー数を決定することとを含む方法。
【請求項２】
前記増幅ステップのそれぞれの間に、前記検出標識の前記量が前記第１のシグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度で検出される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のＴｍと前記第２のＴｍとの差が少なくとも４℃である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの５’末端でＧＣクランプを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーの３’末端が互いに相補的である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のプライマーセットのうちの１つのプライマーが前記プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むミスマッチプライマーであり、前記ヌクレオチドが前記標的核酸に相補的ではないが、前記第１のプライマーセット中の別のプライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のプライマーセットの前記ミスマッチプライマーの伸長産物が、前記第１のプライマーセット中の前記別のプライマーとハイブリダイズすることができる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプライマーセットの前記プライマーのうちの１つが、前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされた前記プライマーが、その３’末端でミスマッチ塩基を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出標識がインターカレーティング染料である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数が、それぞれ前記第２の核酸と比較して前記第１の核酸の相対量を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の標的核酸がタンデムリピート配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の標的核酸が試料から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の標的核酸の前記コピー数が前記試料中に存在する前記タンデムリピート配列の数を決定する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が少なくとも３つの連続するステージのサイクルを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの第１のステージが、前記ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度がサイクルの第２のステージのアニーリング温度よりも高い１つのポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第２のステージが、サイクルの第１のステージのアニーリング温度よりもポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度が低い１つのポリメラーゼ連鎖反応を含み、およびポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの第３のステージが、前記ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度がサイクルの前記第１のステージのアニーリング温度よりも低く、かつサイクルの前記第２のステージのアニーリング温度よりも高い請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第１のステージの間に、前記第１のアンプリコンだけが形成される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第２のステージの間に、前記第２のアンプリコンだけが形成される請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第３のステージの間に、前記第１および第２の両アンプリコンが形成される請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のシグナル取得温度で検出標識が決定されるまで前記増幅ステップが繰り返される請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅ステップのそれぞれの間に、前記検出標識の量が前記第１シグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度で検出される請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のＴｍと前記第２のＴｍとの間の差が少なくとも４℃である請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが前記プライマ−の５’末端でＧＣクランプを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが、ＡおよびＴのヌクレオチドを有する５’配列を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のプライマーセットの前記プライマーの３’末端が互いに相補的である請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のプライマーセットのうちの１つのプライマーが、前記プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むミスマッチプライマーであり、前記ヌクレオチドが前記標的核酸には相補的でないが前記第１のプライマーセット中の第２のプライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のプライマーセット中の前記ミスマッチプライマーの伸長産物が、前記第１のプライマーセット中の前記第２のプライマーとハイブリダイズすることができる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーのうちの１つが前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされる請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされる前記プライマーがその３’末端で１つのミスマッチ塩基を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出標識がインターカレーティング染料である請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数が前記第２の核酸と比較して前記第１の核酸の相対量を測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の標的核酸がタンデムリピート配列を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の標的核酸が試料から得られる請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の標的核酸の前記コピー数が前記試料中に存在する前記第１の標的核酸内に含まれるタンデムリピート配列の相対的コピー数を決定する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のシグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度の間に決定される前記検出標識の量が対照と比較される請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のシグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度の間に決定される前記検出標識の量が対照と比較される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／１３９，８９０号の優先権を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦支援による研究または開発に関する陳述）
本明細書に開示される研究と発明の一部は、ＮＩＨ  ５Ｒ２１ＡＧ０３００３４の機関を通してアメリカ合衆国政府助成を受けた。アメリカ合衆国は本発明にある一定の権利を保有する。
【０００３】
これらの方法を実施する際に有用な単一検出標識およびキットを使用する単一反応において、第２の標的核酸配列と比較して第１の標的核酸配列の相対的および絶対的コピー数を測定する方法を開示する。
【背景技術】
【０００４】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ＱＰＣＲ）により各反応ウェルについて、Ｃｔ、すなわち、蛍光（産生物形成に比例）が上昇してベースライン蛍光を数倍の標準偏差値分上回るセット閾値を交差する分画サイクル数を測定する。（非特許文献１）。Ｃｔ対ログ（入力標的ＤＮＡ量）プロットは線形であり、これによって同じプレートにおいて、参照ＤＮＡ試料の段階希釈を増幅することによって得られた検量線と比較した未知数の相対定量ができる。
【０００５】
多くのＱＰＣＲ応用について、研究者は、標的配列のシグナル（Ｔ）を参照配列のシグナル（Ｒ）に対して標準化することを望んでいる。初期の研究によって、ＴおよびＲを二本鎖ＤＮＡに挿入すると蛍光を発する色素、例えば、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲグリーンＩ、と別々に反応（モノプレックス）させて測定した。このアプローチは存続している。より最近の研究では、数量化されるＤＮＡ配列それぞれに対して独特の励起／発光スペクトルを持つ異なる光色素を使って、多色マルチプレックスＱＰＣＲで同じ反応容器内のＴとＲを測定してきた。（非特許文献２）。マルチプレックスＱＰＣＲによりＴ／Ｒ比を測定することによって実行すべき別々のＰＣＲ反応回数を半分に減らせる。さらに、ＴおよびＲのシグナルの両方をそれぞれの反応容器内で収集するので、モノプレックスＱＰＣＲの別々のウェルでＴとＲを測定する時のように、反復反応のためにピペットする所定のＤＮＡ試料の変動量によるＴ／Ｒ比の変動は生じない。
【０００６】
多色マルチプレックスＱＰＣＲの主な不利点は、蛍光プローブの相対的に高いコストと２つ以上の蛍光色の読み取りを備えて特化したＱＰＣＲ装置であるための高いコストである。マルチプレックスＰＣＲ法への伝統的アプローチ（ＰＣＲ法が定量的であるかどうかに関わらず）では、１つのプライマー対による高い鋳型コピー数の初期増幅が第２のプライマー対よる別のより低い鋳型複製数の後期増幅を抑制してしまうのを防ぐようなプライマーセットとプライマー濃度を同定するのにもしばしば過剰に時間を消費している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｆｏｃｋｌｅｒ，Ｃ．，Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．、Ｋｉｎｅｔｉｃ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），（１９９３）１１，１０２６−１０３０
【非特許文献２】Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ．，Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｕｎｄｒｙ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ  Ｅｌｅｎｉｔｏｂａ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００１）２５，４３０−４４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、単一の検出標識を使って単一反応内の２つ以上の標的核酸配列のコピー数を測定する方法を提供する。テロメアの配列のコピー数を測定する方法をも開示する。このデータは、測定したテロメア長を、１つの集団内で観察したテロメア長に対応する死亡リスクおよび疾病出現率に関係づけるために使うことができる。
【０００９】
単一検出標識を使用し、均一システムである単一ウェルでの単色マルチプレックス定量ＰＣＲ（ＭＭＱＰＣＲ）による第２の標的核酸配列のコピー数と比較して第１の標的核酸配列の相対的かつ絶対的コピー数を測定する方法と構成を本明細書で開示する。
【発明の効果】
【００１０】
開示された方法と構成のその他の有利点は、以下に続く記載に一部説明し、一部その記載から理解でき、または開示された方法と構成を実施することにより習得できるはずである。開示された方法と構成の利点は、添付の請求項に特に指摘してある要素と組み合わせによって実現し獲得することができるだろう。上記の一般的な記載と次の詳細な記載は例示的かつ説明のためのみのものであり、本発明を請求された通りに制限するものではない。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
第１の標的核酸のコピー数および第２の標的核酸のコピー数を決定する方法であって、

ａ）均一系での反応混合物を形成するために、第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させ、かつ第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させ、かつ単一の検出標識を加えることと、
ｂ）第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成するために第１のプライマーセットを用いて第１の標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、かつ前記第１のＴｍより高い第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成するために第２プライマーセットを用いて第２の標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することと、
ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応中に、前記第１のＴｍより低い第１のシグナル取得温度で検出標識の量を測定することと、
ｄ）前記反応混合物の前記温度を前記第１のＴｍより高くかつ前記第２のＴｍより低い第２のシグナル取得温度まで上げて、前記検出標識の量を測定することと、
ｅ）（ｂ）から（ｄ）までのステップを少なくとも１回繰り返すことと、
ｆ）前記第１の標的核酸および前記第２の標的核酸の相対的コピー数を決定することとを含む方法。
（項目２）
前記第１の標的核酸配列の前記コピー数が前記第２の標的核酸配列の前記コピー数よりも大きい項目１に記載の方法。
（項目３）
前記増幅ステップのそれぞれの間に、前記検出標識の前記量が前記第１のシグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度で検出される項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１のＴｍと前記第２のＴｍとの差が少なくとも４℃である項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第２のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの５’末端でＧＣクランプを含む項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが、ＡおよびＴのヌクレオチドを有する５’配列を含む項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーの３’末端が互いに相補的である項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第１のプライマーセットのうちの１つのプライマーが前記プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むミスマッチプライマーであり、前記ヌクレオチドが前記標的核酸に相補的ではないが、前記第１のプライマーセット中の別のプライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的である項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第１のプライマーセットの前記ミスマッチプライマーの伸長産物が、前記第１のプライマーセット中の前記別のプライマーとハイブリダイズすることができる項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のプライマーセットの前記プライマーのうちの１つが、前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされる項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされた前記プライマーが、その３’末端でミスマッチ塩基を含む項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記検出標識がインターカレーティング染料である項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数が、それぞれ前記第２の核酸と比較して前記第１の核酸の相対量を測定する項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の標的核酸がタンデムリピート配列を含む項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記第１の標的核酸が試料から得られる項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の標的核酸の前記コピー数が前記試料中に存在する前記タンデムリピート配列の数を決定する項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の標的核酸配列の前記コピー数が前記第２の標的核酸配列の前記コピー数と同様である項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が少なくとも３つの連続するステージのサイクルを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの第１のステージが、前記ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度がサイクルの第２のステージのアニーリング温度よりも高い１つのポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第２のステージが、サイクルの第１のステージのアニーリング温度よりもポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度が低い１つのポリメラーゼ連鎖反応を含み、およびポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの第３のステージが、前記ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度がサイクルの前記第１のステージのアニーリング温度よりも低く、かつサイクルの前記第２のステージのアニーリング温度よりも高い項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第１のステージの間に、前記第１のアンプリコンだけが形成される項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第２のステージの間に、前記第２のアンプリコンだけが形成される項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルの前記第３のステージの間に、前記第１および第２の両アンプリコンが形成される項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記第２のシグナル取得温度で検出標識が決定されるまで前記増幅ステップが繰り返される項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記増幅ステップのそれぞれの間に、前記検出標識の量が前記第１シグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度で検出される項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のＴｍと前記第２のＴｍとの間の差が少なくとも４℃である項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記第２のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが前記プライマ−の５’末端でＧＣクランプを含む項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーのうちの少なくとも１つが、ＡおよびＴのヌクレオチドを有する５’配列を含む項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記第１のプライマーセットの前記プライマーの３’末端が互いに相補的である項目１８に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のプライマーセットのうちの１つのプライマーが、前記プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むミスマッチプライマーであり、前記ヌクレオチドが前記標的核酸には相補的でないが前記第１のプライマーセット中の前記別のプライマーの前記３’末端ヌクレオチドに相補的である項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記第１のプライマーセット中の前記ミスマッチプライマーの前記伸長産物が、前記第１のプライマーセット中の前記別のプライマーとハイブリダイズすることができる項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記第１のプライマーセット中の前記プライマーのうちの１つが前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされる項目１８に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の標的核酸をプライミングすることからブロックされる前記プライマーがその３’末端で１つのミスマッチ塩基を含む項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記検出標識がインターカレーティング染料である項目１８に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数が前記第２の核酸と比較して前記第１の核酸の相対量を測定する項目１８に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の標的核酸がタンデムリピート配列を含む項目１８に記載の方法。
（項目３５）
前記第１の標的核酸が試料から得られる項目１８に記載の方法。
（項目３６）
前記第１の標的核酸の前記コピー数が前記試料中に存在する前記タンデムリピート配列の数を決定する項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第１のシグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度の間に決定される前記検出標識の量が対照と比較される項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記第１のシグナル取得温度および前記第２のシグナル取得温度の間に決定される前記検出標識の量が対照と比較される項目１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
付随する図は、本明細書に組み込まれて本明細書の一部を構成し、開示された方法と構成と更にその記載のいくつかの実施の形態を説明し、開示された方法と構成の原理を説明する役割をはたす。
【図１】サイクル１で、ｔｅｌｇプライマーは未変性のテロメア配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ合成を刺激する図である。ｔｅｌｃプライマーは、未変性のテロメア配列とハイブリダイズするが、３’末端のミスマッチによりＤＮＡ合成を刺激することができない。図示されるように互いにハイブリダイズすると、図示されない別の配置で、それぞれの３’末端塩基を含むｔｅｌｇとｔｅｌｃとが複数のミスマッチを起し、従って、プライマー二量体形成が抑制される。ｔｅｌｇおよびｔｅｌｃの３’末端が完全に相補の３つの塩基対が重なり整合できるが、効率的にプライマー二量体形成させるのに充分安定していない。サイクル２において、ｔｅｌｃは、サイクル１で合成されたｔｅｌｇのプライマー伸長産物にそってハイブリダイズするが、その他の配置はｔｅｌｃの３’末端塩基でミスマッチを生じるので、示された配置でハイブリダイズする時のみＤＮＡ合成を刺激することができる。ｔｅｌｇ伸長産物では、上線は、ｔｅｌｇプライマーそれ自体の配列を特徴付け、またイタリックの塩基は、ＰＣＲのサイクル１で新しく合成した配列を特徴付ける。プライマーの５’末端の非鋳型の大文字の配列は、テロメアＰＣＲ産物の３’末端がテロメアＰＣＲ産物のその他のコピーの中央でＤＮＡ合成を刺激するのを抑制する。
【図２】テロメアプライマーのみ（丸印）と、アルブミンプライマーのみ（×印）と、または両方のプライマーセットのみ（三角形）とヒトゲノムＤＮＡ１５０ｎｇを一緒に２５サイクル増幅（材料と方法の章に与えられた温度プロファイル）した後の融解曲線を示す図である。鋳型コントロール無しの融解曲線は黒色でシンボルはない。最後の８８℃でのインキュベーションの後、反応は７２℃にまで冷却し、シグナルは７２℃〜９５℃まで０．５℃刻み（各ステップ３０秒間の休止）で獲得した。テロメアおよびアルブミンアンプリコンの融解温度は約１１度の温度差がある。
【図３】長いテロメア（丸印）、中程度の長さのテロメア（×印）、または短いテロメア（三角）を以前に有すると示された３つの参照ヒトＤＮＡ試料のそれぞれ２０ｎｇの単色マルチプレックス定量ＰＣＲ（ＭＭＱＰＣＲ）の結果である。鋳型コントロール無しの増幅曲線は黒色四角で示される。パネル上：片対数プロット；パネル下：線形プロット。
【図４】相対的Ｔ／Ｓ比を測定するために使った検量線を示す図である。８１倍の範囲でまたがる標準的ヒトゲノムＤＮＡ試料の５つの濃度は、３倍の段階希釈（１ウェルにつき、１５０ｎｇ、５０ｎｇ、１６．７ｎｇ、５．５５ｎｇ、および１．８５ｎｇ）で調整し、そして９６ウェルのＰＣＲプレートに２つ組でアリコートした。標的と参照蛍光性シグナルの両方を各反応ウェルから収集した。丸印は、８８℃で得た単一コピー遺伝子アルブミンのデータを表し、三角形は、７４℃で得たテロメア反復配列のデータを表す。同じ標準ＤＮＡを、この実験の全てのプレートの検量線反応をセットアップするために使った。
【図５】９５個体からの全血ＤＮＡ試料の、単一コピー遺伝子としてのアルブミンを使用した単色マルチプレックス定量ＰＣＲ法によって測定した相対的Ｔ／Ｓ比とサザンブロット法で測定した平均末端制限断片（ＴＲＦ）長との相関を示す図である。各Ｔ／Ｓ値は３つ組の測定平均である。各平均ＴＲＦ長は二重測定の平均である。線形回帰式と相関係数を、マイクロソフトエクセルを使って求めた。
【図６】ＭＭＱＰＣＲアッセイの独立の組の相対的Ｔ／Ｓ比の再現性を表す図である。図４でアッセイされた同じ９５ＤＮＡ試料は、翌日に再びアッセイされ、各ＤＮＡ試料で占有された特定のＭｙｉＱＰＣＲ装置および反応ウェルの位置は前日とは異なるように管理した。線形回帰式と相関係数を、マイクロソフトエクセルを使って求めた。
【図７】単一コピー遺伝子としてのアルブミンから得たＴ／Ｓ比と単一コピー遺伝子としてのβグロビンから得たＴ／Ｓ比との相関を示す図である。相対的Ｔ／Ｓ比を、同じ９５ＤＮＡ試料について、三重測定を、２回の別々のランでアルブミンプライマーをβグロビンプライマーで置換して測定した。各試料について、アルブミンを単一コピー遺伝子（ｘ軸）とする２回の別々のランからの平均Ｔ／Ｓを、βグロビンを単一コピー遺伝子（ｙ軸）とする２回のランからの平均Ｔ／Ｓに対してプロットする。線形回帰式と相関係数を、マイクロソフトエクセルを使って求めた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１つ以上の標的核酸のコピー数を測定することを目的とする方法およびシステムを含む。開示された方法と構成は、以下の特定の実施形態およびそこに含まれた実施例の詳細な説明記載、および図とそれらの前後の記載を参照することによってより容易に理解されうる。
【００１３】
開示された構成と方法は、標的核酸を実時間で検出することに利用できる。実時間検出は、増幅反応または操作の間または直後に実行する検出である。一般に、そのような検出は、増幅中の１つ以上の別々の時刻に、増幅の１つ以上の部分を連続的に、または、別々の時刻と連続した時間の組み合わせで増幅産物を検出することによって達成できる。実時間検出は、増幅反応または操作を中断させることなく検出できる検出可能なシグナルを具体化または産生する標識または成分を使用して促進できる。蛍光ラベルは、実時間検出のために有用な標識の例である。実時間検出を得るのに特に有用な手段は、増幅において検出標識を使用することである。好適にデザインされた検出標識を使用して、蛍光シグナルを含む検出シグナルは、増幅が進行するに従って生成できる。多くの場合、検出シグナルは、増幅産物および／または標的配列もしくは標的分子の量に比例する。
【００１４】
本明細書で開示されたのは、第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数を測定する方法である。標的核酸は、試料から得ることができるか、または本明細書の別のところに記載されているように人工的に産生することができる。
【００１５】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、出版物は、本明細書の前後を問わず本明細書で記載され、請求された時点において、当業者には既知の最先端の技術をより十分に記載するために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本発明は、特定の合成方法、特に他に指定がなければ特定の組換バイオテクノロジー、特に他に指定がなければ特定の試薬、医薬品のキャリア、特定の医薬品の処方、または投与計画、もちろんそれぞれはそれなりに異なるが、に限定されるものでないことを理解されたい。
【００１７】
定義と用語
本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を記載する目的のみであり、これに制限されるものではない。
【００１８】
明細書と付随する請求の範囲で使用されるとき、単数形の、「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」は、文脈から明確に他のものが指示されているのでなければ、複数形の意味を有することができる。従って、例えば、「化合物」（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）という表現は、複数の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の混合物を含み、「医薬担体」（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）という参照は、２つ以上のそのような担体などの混合物を含む。成分という表現は、文脈が明確に他のものを指示するのでなければ、単一のもしくは複数の成分、または複数の成分の混合物を含むことができる。
【００１９】
範囲は、「約」（ａｂｏｕｔ）特定の値から、および／または、「約」別の特定の値までとして本明細書では表現する。用語「約」は、本明細書では、近似的に、〜の辺りで、おおよそ、近傍に、の意味で使われる。用語「約」が、数値的範囲と共に使われる場合は、言及した数値の上下に境界を広げることによって範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、ある数値を、その値の上下に分散２０％分だけ修飾する意味で本明細書では使われる。そのような範囲が表現されるとき、別の実施形態はある特定の値から、および／または別の特定の値までを含む。同様に、数値が「約」という先行詞によって近似の意味として表現される時は、特定の値で別の実施形態が成立しうることを理解されたい。範囲の各終末点は、もう一方の終末点との関係において、またもう一方の終末点とは独立に意味を持つことを更に理解されたい。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「または」（ｏｒ）は、ある特定のリストのメンバーの内の１つを意味し、さらにそのリストのメンバーの任意の組み合わせをも含む。
【００２１】
「試料」とは、動物のことを意味する；動物の組織または器官；細胞（対象内か、対象から直接取り出したもの、または培養中に維持された細胞、または培養細胞系統由来のもの）：細胞可溶化物（または可溶化液画分）または細胞抽出液；または細胞もしくは細胞物質（例えば、ポリペプチドもしくは核酸）由来の１つ以上の分子を含む溶液、それぞれは本明細書で記載されるようにアッセイされる。試料は、細胞または細胞成分を含む任意の体液または排泄物（例えば、以下に限定されるものではないが、血液、尿、糞便、唾液、涙、胆汁）である。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、句「核酸」は、（ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド一本鎖もしくは二重鎖の、センスもしくはアンチセンスであるかに関わらず）ワトソン−クリック塩基対形成による相補的核酸にハイブリダイズすることのできる自然発生もしくは合成されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを言及する。本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）と非リン酸ジエステルヌクレオシド間連鎖（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル（ｔｈｉｏｄｉｅｓｔｅｒ））連鎖をも含むことができる。特に、核酸は、制限なしに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
「特異的に結合する」とは、同族の標的を認識し、物理的に相互作用することを意味する。例えば、プライマーは標的核酸に特異的に結合することができる。例えば、第１のプライマーセットのプライマーは、第１の標的核酸配列に特異的に結合することができるが、
その他の標的または標的核酸配列を有意に認識したり、また相互作用したりしない。
【００２４】
「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」とは、相補的配列（「標的」）含む第２のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と塩基対形成をすることができる明確な配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。結果として生じるハイブリットの安定性は、生起する塩基対形成の範囲に依存する。塩基対形成の範囲は、プローブおよび標的分子の相補性の度合いとハイブリダイズ条件の厳密性の度合いのなどのパラメータによって影響される。ハイブリダイズの厳密性の度合いは、温度、塩濃度、およびホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメータによって影響され、当業者に知られた方法で測定する。標的核酸（例えば、遺伝子および／またはｍＲＮＡ）に特異的なプローブまたはプライマーは、ハイブリダイズする標的領域と少なくとも８０％〜９０％の配列相補性、少なくとも９１％〜９５％の配列相補性、少なくとも９６％〜９９％配列相補性、または少なくとも１００％の配列相補性を有する。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、当業者に知られた方法によって放射線または非放射線で検出可能な標識をつけることができる。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書で記載した単色マルチプレックス定量ＰＣＲ法（ＭＭＱＰＣＲ）、同様に核酸シークエンス逆転写および／またはポリメラーゼ連鎖反応法による核酸増幅、一本鎖立体構造の多型（ＳＳＣＰ）解析、制限酵素断片多型（ＲＦＬＰ）解析、サザンブロット法、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）などの核酸ハイブリダイゼーションに関わる方法に使われる。
【００２５】
「プライマーセット」とは、少なくとも２つのプライマーを意味し、各プライマーは、
同じ標的配列の逆鎖に相補的配列を含む。プライマーセットにおいて、２つのプライマーの内少なくとも１つは「順方向プライマー」であり、２つのプライマーの内少なくとも１つは「逆方向プライマー」である。「順方向プライマー」は、標的核酸のセンス鎖に相補的なプライマーであり、逆方向プライマーは、標的核酸のセンス鎖に相補的な鎖に相補的なプライマーである（標的核酸のアンチセンス鎖とも呼ばれる）。プライマーセットは、ＰＣＲ反応に使うことができるプライマー対である。
【００２６】
「アンプリコン」とは、自然のまたは人工的な増幅現象の産生物として形成したＤＮＡ断片を意味する。例えば、これらは、本明細書で記載した方法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）またはリガーゼ連鎖反（ＬＣＲ）、同様に自然な遺伝子重複により形成することができる。
【００２７】
「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが認識し、高い厳密な条件の下、実質的に相補的核酸（例えば、標的核酸）と物理的に相互作用し（即ち、塩基対）、そして他の核酸と実質的に塩基対を形成しないことを意味する。
【００２８】
「高い厳密性条件」とは、少なくとも長さ４０ヌクレオチドのＤＮＡプローブを、温度６５℃で、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（画分Ｖ）、を含有する緩衝液、温度４２℃で、４８％ホルムアミド、４．８Ｘ  ＳＳＣ、０．２Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ  ７．６、１Ｘデンハート溶液、１０％デキストラン硫酸と、０．１％ＳＤＳ、を含有する緩衝液を使用した場合の結果に匹敵する条件を意味する。高い厳密性のハイブリダイズ法のその他の条件は、例えば、ＰＣＲ法、ノーザンブロット解析、サザンブロット解析、または、インサイツハイブリダイゼーション、ＤＮＡシークエンシングなどが分子生物学の分野ではよく知られている（例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，１９９８を参照）。
【００２９】
材料
目的として使用でき、共に使うことができ、調製目的として使用できる材料、構成、および、成分を開示し、もしくは開示した方法と構成の産物を開示する。これらとその他の材料は本明細書で開示される、またこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合は、これらの化合物の様々な個々と集合の組み合わせと順列の特定の言及は明示的に開示できないが、その各々は、特に十分考慮されて本明細書で記載されていることを理解されたい。従って、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、同様に分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、ならびに組み合わせの分子の例Ａ−Ｄも開示されるならば、それぞれは個別に列挙しないとしても、それぞれは個別にまたはひとまとめにして熟慮されている。従って、この例では、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの組み合わせのそれぞれを特に熟慮し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；組み合わせＡ−Ｄの例の開示により開示されたものとして見なされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた特に熟慮し開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループを特に熟慮するが、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；組み合わせＡ−Ｄの例の開示により開示されたものとして見なされるべきである。この概念を、それに限定されるわけではないが、開示した構成を精製し使用する方法の各段階を含むこの開示の全ての態様に対して適用する。従って、遂行されるはずの様々な付加的段階があるならば、これらの付加的段階のそれぞれは、特定の実施形態または開示された方法の実施形態の組み合わせを使って遂行でき、さらに組み合わせのそれぞれも特に熟慮され開示されたものと見なすべきであることを理解されたい。
【００３０】
Ａ．標的試料
標的試料は、標的分子を有するまたは有し得る任意の源由来であっても良い。標的試料は、例えば、核酸などの標的分子を含むことができる。標的試料は標的核酸の源でも良い。標的試料は、自然の標的核酸、化学的に合成した標的核酸、またはその両方を含むことができる。標的試料は、例えば、１つ以上の細胞、組織、または血液、尿、精液、リンパ性液体、脳脊髄液などの体液、または羊水、または組織培養、細胞、頬綿棒で採取した試料、口腔洗浄、糞便、組織スライス、組織診吸引物などのその他の生物学的試料、および骨やミイラ化した組織などの考古学的試料からの試料であって良い。有用な標的試料の種類は、血液試料、尿、試料、精液試料、リンパ性液体試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検組織試料、針吸引生検試料、癌試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞可溶化物試料、粗製細胞可溶化物試料、法医学的試料、考古学的試料、感染症試料、院内感染試料、産生試料、薬標本試料、生物学的分子産生試料、タンパク質標本試料、脂質標本試料および／または炭水化物標本試料を含む。
【００３１】
１．標的核酸
標的試料は、標的分子を有するか、有し得る任意の源由来であっても良い。核酸試料は、標的核酸などの核酸分子と塩基配列を源とする。核酸試料は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその両方を含んで良い。標的核酸はｃＤＮＡであっても良い。さらに加えて、ｍＲＮＡは、逆転写されて、本明細書で記載した方法で使用する標的核酸の役割を果たすｃＤＮＡを形成することができる。
【００３２】
「標的核酸」または「標的配列」とは二重のまたは一本鎖核酸上の核酸配列を意味する。本明細書において、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に等価なものは、共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合には、別の主鎖を持つことができる核酸類似体が含まれる。この主鎖は、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：  １９２５−６３（１９９３）、とその中の参考文献；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｒｎ．  ３５：  ３８００−０３（１９７０）；  Ｓｐｒｉｎｚｌ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８１：  ５７９−８９（１９７７）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：３４８７−９９（１９８６）；  Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｒｎ．  Ｌｅｔｔ．  ８０５（１９８４）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  １．  Ａｍ．  Ｃｈｅｒｎ．  Ｓｏｃ．  １１０：  ４４７０（１９８８）；  および  Ｐａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１−４９（１９８６））、  ホスホロチオエート（Ｍａｇ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：１４３７−４１（１９９１）；と米国特許第５，６４４，０４８号）、ジチオリン酸（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １．  Ａｍ．  Ｃｈｅｒｎ．  Ｓｏｃ．２０  １１１  ：２３２１  （１９８９）），Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  （ｓｅｅ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１）、およびペプチド核酸主鎖連鎖（Ｅｇｈｏｌｍ，  Ｍ．，  Ａｍ．  Ｃｈｅｒｎ．  Ｓｏｃ．  １１４：  １８９５−９７  （１９９２）；  Ｍｅｉｅｒ  ｅｔａｌ．，  Ｃｈｅｒｎ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｉ．  ３１：１００８  （１９９２）；  Ｅｇｈｏｌｍ，  Ｍ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：  ５６６−６８  （１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：  ２０７  （１９９６）、参照により全てを組み込む）を含む。その他の核酸類似体は、ポジティブバックボーン（Ｄｅｍｐｃｙ，  Ｒ．  ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：６０９７−１０１  （１９９５））；非イオン性のバックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号；  ５，６３７，６８４号；  ５，６０２，２４０号；  ５，２１６，１４１号；と４，４６９，８６３号；  Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｒｎ．  Ｉｎｔｉ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３  （１９９１）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  １．  Ａｍ．  Ｃｈｅｒｎ．  Ｓｏｃ．  １１０：４４７０  （１９８８）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：  １５９７  （１９９４）���  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，  ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，  ”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．  ｙ．  Ｓ．  Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔ．  ４：  ３９５  （１９９４）；  Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７  （１９９４））、および米国特許第５，２３５，０３３号と５，０３４，５０６号とＣｈａｐｔｅｒｓ  ６と７，  ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，  ”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，  Ｅｄ．  Ｙ．  Ｓ．  Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載された非リボースバックボーン、を含む。１つ以上の炭素環状糖も核酸の定義内に含まれる。（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｒｎ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．  １６９−１７６  （１９９５）、を参照）を含む。全ての参照文献は参照により明示的に組み込む。
【００３３】
測定、同定、検出またはそのコピー数を測定しようと求められている任意の核酸配列も標的核酸配列の役割を果たすことができる。本明細書で記載した方法では、１つ以上の標的核酸配列があるはずである。２つの標的核酸配列が存在する場合は、第１および第２の標的核酸配列とそれぞれ呼ぶ。３つの標的核酸配列が存在する場合は、第１、第２および第３の標的核酸配列とそれぞれ呼ぶ、等々。本明細書の方法に記載した標的核酸は、同じか、同様のまたは異なるコピー数を持つ。例えば、第１の標的核酸は、複数のコピー数の核酸配列であり、第２の標的核酸は単一コピー遺伝子である。例えば、第１の標的核酸はテロメアの反復配列、ｍｔＤＮＡ、ｒＤＮＡまたはＡｌｕ反復ＤＮＡである。例えば、第１の標的核酸は高いコピー数のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであり、第２の標的核酸低いコピー数のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡである。
【００３４】
単一コピー遺伝子は、一倍体ゲノムにつき単一のコピーを持つ遺伝子である。単一コピー遺伝子は、したがって１つの細胞につき２つのコピー持つ。単一コピー遺伝子は、以下に限定されるものではないが、アルブミン遺伝子またはβグロビンを含む。
【００３５】
テロメアは、真核生物の線形染色体の一端に見いだされる特別の構造である。
テロメアは、一般にその生物体に特有のテロメラーゼ酵素によって特定される反復配列単位からなる短いタンデム反復から構成される。テロメア反復配列は種々の生物体に認められる。脊椎動物、植物、ある種のカビ、ならびにいくつかの原虫について、配列は完全な反復である。例えば、ヒト反復配列単位は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎである。（配列番号：１）その他の生物体では、反復配列は可変のＧ１−３Ｔ／Ｃ１−３Ａであるパン酵母の配列のように不規則である。いくつかの真核生物では、テロメアは短いタンデム配列反復ではなく、テロメアとして機能する配列エレメントからなる。例え、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）では、テロメアは、レトロトランスポゾンエレメントのＨｅＴ−ＡとＴＡＲＴとからの複合物であり、一方、蚊ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）ではテロメアは、複合配列タンデム反復からなる配列である。本発明の目的のために、異なる構造のテロメアは、本発明の意図するところの範囲内にある。
【００３６】
反復配列にさらに加えていくつかのテロメアの３’末端は一本鎖領域を含み、これはヒトについては、Ｇリッチ鎖に位置する。一本鎖は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎから構成される。（配列番号：１）は反復し、多少の前後することもあるが、ｎは一般に約９−３５である。本明細書で使用されるとき、３’一本鎖領域の長さは死亡リスクにも相関する。
【００３７】
典型的に、鎖合成に引き続いて分解する短いＲＮＡプライマーを使用して
ＤＮＡ核酸複製機構は５’から３’の方向に作用し、またラギング鎖合成は不連続に起こる。直鎖ＤＮＡの３’末端の配列は、以前にＲＮＡプライマーによって占有されていた領域を完全に合成するのに有用でないので、線形染色体の３’末端領域は反復しない。この「末端反復問題」は、テロメラーゼ、テロメア特異的リボ核タンパク質逆転写酵素の作用によって解決する。テロメラーゼ酵素は、テロメア３’末端を伸長するための鋳型として作用するのに不可欠なＲＮＡ成分を持つ。テロメラーゼ活性による伸長の反復によってテロメラーゼ結合ＲＮＡ鋳型からコピーしたテロメア反復配列を産生する。テロメラーゼによる伸長に引き続いて、ＤＮＡポリメラーゼによるラギング鎖合成によって二重鎖テロメアの構造の形成を完了する。
【００３８】
正常ヒト体細胞では、テロメラーゼは発現しないか低レベルで発現する。従って、テロメアは、細胞が分裂寿命に達するまで各細胞分裂に付き５０−２００塩基対だけ短縮し、寿命に達した時点で細胞は増殖する能力を失う。細胞が複製する限られた能力は、一般にＨａｙｆｌｉｃｋ限界と呼ばれ、細胞に計数機序、即ち、細胞分裂を数え細胞発生を制御する有糸分裂の時計を提供する。対応して、テロメラーゼ活性が不足する細胞内でテロメラーゼを活性化すると、例えば、レトロウイルス性プロモータ組織からテロメラーゼを発現させるか、内生のポリメラーゼを活性化させることにより、細胞が増殖能力を維持し細胞の不死化に至る。
【００３９】
興味深いことに、これらの不死化細胞は短い安定なテロメアを有し、最も短いテロメアが伸長する。この現象は、テロメラーゼ酵素がある閾値の長さ以下になったこれらのテロメアを伸長して、短いテロメアがさらに短くなることを防ぐことを示唆する。従って、テロメアがある長さである時は、テロメラーゼ活性の存在は必ずしも必要でない。しかし、その長さが限界点以下に落ちるとテロメアの統合性を維持するのが危険になる。
【００４０】
テロメアの長さと統合性は、染色体の好適な分離と細胞増殖に重要であることが良く確立された。例えば、多くの型の癌の発生はテロメア維持の活性化に相関するが、一方細胞老化はテロメア統合性の損失に相関する。テロメラーゼ活性を抑制することで誘発したテロメアの短縮は、増殖性老化および細胞のアポトーシスを導く。（Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２３８８−９９  （１９９９））。さらに、マウスのテロメラーゼＲＮＡを遺伝的ノックアウトすると発達不良、加齢による病変、癌感受性の上昇が動物にみられる（Ｒｕｄｏｌｐｈ，  Ｋ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９６：  ７０１−１２  （１９９９）；  Ｈｅｒｒｅｒａ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １８：  ２９５０−６０  （１９９９））。同様に、テロメラーゼのＲＮＡ成分をコードする遺伝子の変異から起こる先天性角化異常症の常染色体優性遺伝疾患（ＤＫＣ）において、罹っている患者は、テロメア短縮を加速させる様相を見せていて、通常骨髄機能不全に二次的な重症感染症から年齢中央値１６歳（最大約５０年）で死亡する。ＤＫＣ患者の臨床的特徴は、さらに加齢促進を示唆するが、早発性白髪と脱毛；皮膚色素沈着異常；創傷治癒異常；重症感染症のリスク増大；および悪性腫瘍の発生率上昇、骨粗鬆症、肺線維症を含む。さらに加えて、正常な高齢者の個人からの血液ＤＮＡで測定した平均最短テロメア長は、ＤＫＣ患者由来の血液で測定した平均最長テロメア長と重なる。
【００４１】
細胞増殖および細胞老化においてテロメアが果たした役割の見解から、テロメアの長さに基づいて加齢による疾病出現と死亡リスクを予想する方法が望まれている。ＭＭＱＰＣＲ法を含む本明細書で記載した方法によって、癌や高血圧などの加齢に伴う特定の病を発症するリスクが高まった個人を特定するための基礎が提供され、初期の処置を高リスクグループの個人に施すことができる。
【００４２】
本明細書に記載した方法では、細胞内の単一染色体のテロメアのコピー数を測定することができる。ある１つの態様において、テロメアの平均コピー数もしくは平均テロメアコピー数を、単一細胞について測定する。別の実施形態では、テロメアの平均コピー数もしくは平均テロメアコピー数を、細胞集団について測定する。テロメアコピー数の変化とは、テロメアコピー数が増加するまたは減少することであり、特に、平均テロメアコピー数の増加または減少のことを指す。この変化は、ある特定時刻に対しての相対的である、すなわち、しばらくした後の時刻ｔ２におけるテロメア長と比較しての時刻ｔ１における生物体のテロメアコピー数である。テロメアコピー数変化または差分はまた、特定の細胞集団または生命体集団の平均テロメアコピー数に対しても比較することができる。ある態様では、テロメアコピー数の変化または差分はさらに、疾病条件から影響を受けていない集団の平均テロメアコピー数に対して比較することができる。ある実施形態では、テロメアコピー数の変化を、異なる期間に存在する集団に対して測定する。
【００４３】
ある態様では、テロメアコピー数は全ての真核生物で測定できるが、テロメアコピー数は、以下に制限されることなく、両生類、トリ、および哺乳類、例えば、げっ歯類、有蹄動物、および霊長類、特にヒトを含む脊椎動物で測定できる。テロメアコピー数は、長寿が望ましい特性であるか、疾病に対する長寿と感受性が相関している場合に測定することができる。別の態様では、テロメアは、これらの生物体における改変したテロメア統合性に付随する死亡リスクまたは疾患感受性を評価するために、生物体のクローンに対して測定することができる。
【００４４】
上記したようなテロメアの核酸配列は、標的配列としての役目を果たすことができる。テロメアの核酸配列またはその他の標的核酸は、より長い配列が特徴的であるが、任意の長さであって良い。いくつかの実施形態では、核酸試料を断片化または切断して、１００〜１０，０００塩基対の断片にすることが望ましい。ある態様では、約５００ベース対の断片を使うことができる。断片化または切断は、機械的、化学的および酵素を使った方法を含む当業者に良く知られたいくつかの方法でできる。従って、核酸は、超音波処理、フレンチプレス、剪断、またはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡａｓｅ、制限酵素、ＲＮａｓｅなど）ならびに化学的切断薬剤（例えば、酸／ピペリジン、ヒドラジン／ピペリジン、鉄−ＥＤＴＡ複合体、１，１０−フェナントロリン銅（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅｃｏｐｐｅｒ）複合体、など）での処置の対象ある。
【００４５】
２．ポリメラーゼ
本明細書で記載した方法で、増幅酵素が必要である。例えば、プライマーを標的核酸に接触させることに引き続いて、この反応は増幅酵素で処置できる。増幅酵素は、一般にＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼである。種々の適したポリメラーゼが当業者に良く知られており、以下に制限されるものではないが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｔｆｌポリメラーゼ、ＤｙｎａＺｙｍｅなどを含む。一般に、全てのポリメラーゼが本発明に適用できる。ある態様では、ポリメラーゼは３’ｔｏ  ５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損している耐熱性ポリメラーゼ、または酵素３’ｔｏ  ５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させたか、非機能の３’ｔｏ  ５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｐｆｕ（エキソ）、Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｐｙｒａ（エキソ）、など）であるポリメラーゼである。なぜならば、強い３’ｔｏ  ５’エキソヌクレアーゼ活性のポリメラーゼを使用すると、いくつかの適用例ではプライマー二量体増幅を防ぐか遅延させるために、またその他の適用では、アリル特異的な増幅を実行するために必要であったミスマッチの３’末端ヌクレオチドを除去する傾向が見られるからである。さらに適用できるのは、ハイブリダイズしたプライマーを至適に伸長するのに使われたポリメラーゼ混合物である。別の態様では、本発明に有用なポリメラーゼ酵素を処方し増幅に適した温度でのみ活性化する。
【００４６】
増幅温度で不活性化し、または増幅温度に達するまで酵素を利用できない状態にレンダリングして酵素を隔離する抗体を抑制するポリメラーゼの存在は、
は全て好適である。これらのポリメラーゼの処方によって、非標的核酸配列を刺激するのを防ぎながら、単一反応容器内の全ての成分を混合できる。
【００４７】
さらに加えて、当業者は、多様な薬剤を反応に加えるとポリメラーゼの処理能力を高め、不活性化からポリメラーゼを安定化させ、これらのプライマーの非特異的ハイブリダイズを減少させ、または複製効率を高めることの真価を認めるであろう。そのような添加物は、以下に限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、アセトアミド、グリセリン、ポリエチレングリコール、またはタンパク質性の大腸菌、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、などのタンパク質性の薬剤を含む。別の態様では、当業者は、特定の型の配列、例えば、ＧＣリッチまたは反復配列の増幅のために様々なヌクレオチド類似体を使うことができる。これらの類似体は、とりわけ、ｃ７−ｄＧＴＰ、ヒドロキシメチルーｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、などを含む。
【００４８】
３．プライマー
本明細書で使用されるとき、「プライマー」、「プライマー核酸」、「オリゴヌクレオチドプライマー」、「オリゴヌクレオチドプロー」または文法的に等価なものは、標的核酸の部分とハイブリダイズする核酸を意味する。本発明のプライマーまたはプローブは、本発明の標的配列とプライマーのハイブリダイズが起こるように標的配列に実質的に相補になるようデザインされている。
【００４９】
いくつかの態様では、プライマーは、１つを除き全ての配置の標的核酸のプライミング伸長をするのを阻止するようデザインされる。例えば、プライマーセットの１つのプライマーは、プライマーの３’末端の塩基をミスマッチさせることによって、プライマーが標的核酸のプライミング伸長をするのを阻止するようデザインされる。そのようなプライマーをデザインし利用すると、プライマーは相補的配列といまだハイブリダイズすることができる。しかしながら、それはＤＮＡ合成を刺激するという１つの確認であり、こうしてアンプリコンサイズの予測と、したがってアンプリコンの融解温度の予測ができる。
【００５０】
例えば、本明細書で開示されたのは、プライマーおよびプライマーセットであり、ここで第１のプライマーセットの１つのプライマーはプライマーの３’末端に近接した少なくとも１つのヌクレオチドを含み、上記ヌクレオチドは、標的核酸にミスマッチし相補的でないが、
プライマーセットのもう一方のプライマー３’末端ヌクレオチドと相補的である。
【００５１】
さらに、本明細書で開示されたのは、プライマーとプライマーセットであり、ここで第１のプライマーセットの１つのプライマーはプライマーの３’末端に近接した少なくとも１つのヌクレオチドを含み、上記ヌクレオチドは、標的核酸にミスマッチし相補的でないが、プライマーセットのもう一方のプライマー３’末端ヌクレオチドと相補的であり、プライマーセットのミスマッチを含むプライマーの伸長産物は、プライマーセットのもう一方のプライマーとハイブリダイズし、もう一方のプライマーが上記伸長産物にそってＤＮＡ合成を刺激する。
【００５２】
抑制されたプライマーが単一特定の配置のみで刺激するのを保証するために、抑制されたプライマーを含むプライマーセットは、プライマーセットの複数のプライマーが、抑制されたプライマーに存在するミスマッチした塩基の領域と完全な相補性をもって重なるようにデザインされる。そのようなデザインは、
プライマー二量体形成を防ぐように、また２つのプライマーが互いに刺激しあうような能力を最小化するようになされる。そのようなデザインは、標的核酸配列が、テロメアで見られる反復（テロメア配列）などのマルチプレックス反復を含む配列である時に、利用できる。そのような方法は、下記の実施例を含む本明細書の別の場所に記載してある。
【００５３】
本明細書で記載したように、テロメア反復配列を直接増幅するプライマーは、標的核酸の第１の１本鎖とハイブリダイズする第１のプライマーと標的核酸の第２の１本鎖およびハイブリダイズする第２のプライマーから構成することができ、ここで第１および第２の鎖は実質的に相補的である。プライマーは、それぞれの鎖とハイブリダイズする時ポリメラーゼによってプライマー伸長することができる。即ち、標的核酸とハイブリダイズするプライマーは、プライマーがポリメラーゼによって伸長できるように標的核酸上のヌクレオチド残基と相補的であるそれぞれの３’末端ヌクレオチド残基を持つ。選択されたプライマーは、反復領域の反復単位群に相補的である。例えば、複数のプライマーの内少なくとも１つのプライマーの少なくとも１つのヌクレオチド残基が変化させられ、プライマーがハイブリダイズする少なくとも１つの反復性単位からなるヌクレオチド残基とのミスマッチを起こす、ここで、プライマーが互いにハイブリダイズする時変化したヌクレオチド残基もまたもう一方のプライマーの３’末端ヌクレオチド残基とミスマッチを起こす。ミスマッチが含まれるとプライマー伸長とプライマー−プライマーハイブリッドを防ぎ、制限する。
【００５４】
テロメア反復配列の直接増幅のためのプライマーセットは、第１のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチド残基が、変化して変化した残基とプライマーがハイブリダイズする第１鎖の少なくとも１つの反復性単位を持つヌクレオチド残基との間にミスマッチを生じるプライマーセットから構成できる。ここでプライマーが互いにハイブリダイズする時変化したヌクレオチド残基もまたもう一方のプライマーの３’末端ヌクレオチド残基とミスマッチを起こす。変化したヌクレオチド残基は、プライマーが標的核酸とハイブリダイズする時、ポリメラーゼによって効率的な伸長ができる３’末端ヌクレオチドからの１つ以上のヌクレオチド残基である。例えば、変化したヌクレオチド残基は、３’末端ヌクレオチドからの少なくとも１つのヌクレオチド残基、少なくとも２つのヌクレオチド残基、または少なくとも３つのヌクレオチド残基が変化したプライマーが標的核酸とハイブリダイズする時に、ポリメラーゼによって効率的な伸長ができる。
【００５５】
本明細書の別のところで考察したように、プライマーセットのプライマーは、同様のＴｍｓをもつようにデザインされて望ましくない増幅産物が生成されるのを制限し、単一の反応量でいくつかの標的核酸を増幅し検出できる。さらに加えて、様々な生物体のテロメアは異なる反復単位配列を持つので、特定の生物体のテロメアを増幅する時は、各異なる生物体の反復性単位に特異的なプライマーを用いる。ヒトテロメアの配列は、タンデムに反復する核酸配列の直接増幅と定量化のための本発明の実施を説明するために本明細書では使われていているが、この発明は開示された特定の実施形態に制限されるものではない。
【００５６】
さらに開示されたのは、結果として生じるアンプリコンの融解温度（Ｔｍ）を、本明細書で記載した方法の他のアンプリコンの融解温度より高くさせるプライマーである。これらのプライマーは、「ＧＣ−クランプ」から構成されるプライマーと呼べる。「ＧＣ−クランプ」は、ＧとＣ塩基間の強い結合により３’末端での特異的結合を促進するのを手助けするプライマーの３’末端からの最後５塩基内のＧまたはＣ塩基の存在を典型的に指す。典型的に、プライマーの３’末端での最後５塩基では、３つより多いＧ’ｓまたはＣ’ｓは回避すべきである。しかしながら、本明細書で記載した方法では、「ＧＣ−クランプ」からなるプライマーとは、ＧＣ−クランプなしの場合の融解温度以上に結果として生じるＰＣＲ産物（アンプリコン）に高い融解温度を与える５’ｔａｇ配列（ＧＣ−クランプ）からなるプライマーである。「ＧＣ−クランプ」から構成されるプライマーの５’ｔａｇ配列は、標的核酸配列のどの部分とも相補的でないプライマー配列の５’末端にＧＣ−クランプを含む。「ＧＣ−クランプ」とは、アンプリコンの融解温度を上昇させるためにプライマーの５’末端と連結できるＧおよびＣのヌクレオチド系列である。ＧＣ−クランプは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０のまたはより長いヌクレオチドである。ＧＣ−クランプは、ＧＣリッチ領域またはＧＣリッチタグと呼ぶこともできる。
【００５７】
ＧＣ−クランプは、本明細書で記載した方法で使ってアンプリコンの１つの融解温度を上昇させることができる。アンプリコンの融解温度を上昇させることによって、他のアンプリコンを完全に融解するのに十分な温度で蛍光性シグナルを獲得でき、従って、２つ以上の異なる温度で２つ以上の異なるアンプリコンに対する蛍光性シグナルを獲得できる。ＧＣ−クランプのプライマーは、同じ増幅反応で使われるためにデザインされ、増幅反応を休止させてしまうヘアピン形成またはプライマー二量体を防止するように異なるプライマー上のＧＣ−クランプは互いに異なっている。
【００５８】
標的核酸とハイブリダイズするプライマーは、プライマー伸長をすることができなければならず、第１および第２のプライマーの変更は、反復性単位の非相補的ヌクレオチド上でなければならない。従って、１つの態様では第１および第２のプライマーの両方が交互に変わる残基から構成される場合、変化は反復単位に隣接するヌクレオチドの位置にある。別の態様では、変化は反復単位に隣接しないヌクレオチドの位置にある。一般に、隣接するヌクレオチドの位置でのミスマッチは、変化したヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に、塩基対か相補的残基を最も多くもたらす。このことは、短い反復配列（即ち、３−６塩基対）を効率的に増幅するのに重要かもしれない。
【００５９】
プライマーの標的核酸に対する相補性は完全である必要はない。従って、本明細書での「相補的」または「実質的に相補的」は、プローブが正常な反応条件の下でハイブリダイズする標的配列に対して十分に相補的であることを意味する。完全に相補からの偏差は、偏差が完全にハイブリダイズを防止するのに十分でない限り、許容できる。しかしながら、変化または変異の数が、下記に定義してあるような最も緩やかなハイブリダイズ条件の下でもハイブリダイズが起こることができないほど十分であれば、配列は相補的標的配列ではない。
【００６０】
プライマーは一般に一本鎖であるが、明記してあるように、本明細書で記載する核酸は、一本鎖または二重鎖であり、または二重鎖または一本鎖配列のどちらかの部分を含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、２つのハイブリッドであり、核酸は、デオキシリボとリボヌクレオチドを含む任意の組み合わせ、および、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、などを含む塩基の任意の組み合わせを含む。本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド、同様にヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、およびアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾したヌクレオシドを含む。さらに加えて、「ヌクレオシド」は非天然発生の類似構造体を含む。従って、例えば、ペプチド核酸の個々ユニット（各ユニットは塩基を含む）は本明細書ではヌクレオチドと呼ぶ。
【００６１】
プライマー核酸の大きさは異なり当業者で認識されているように、一般に長さが５から５００のヌクレオチドである。例えば、１０か１００のヌクレオチドのプライマー、１２か７５のヌクレオチドのプライマー、１５から５０のヌクレオチドのプライマーが、その用途、必要となる詳細、増幅技術によって使用できる。
【００６２】
どのプライマー対についても、プライマーが互いにハイブリダイズする能力は、第１のプライマー配列を第２のプライマーへ整列させることによって検査する。ハイブリッドの安定性、特に熱性融解温度（Ｔｍ）は、下記の方法と当業者に良く知られた方法によって測定できる。これは、以下に制限されるものではないが、最近接熱力学的計算
（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８８９３−９７  （１９８６）；  Ｗｅｔｍｕｒ，  １．  Ｇ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  ＢｉｏＩ．２５  ２６：２２７−５９  （１９９１）；  Ｒｙｃｈｌｉｋ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  １．  ＮＩＨ  Ｒｅｓ．  ６：７８  （１９９４））、ウオレス規則推定（Ｓｕｇｇｓ，  Ｓ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ  ”Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅｓ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｂｒｏｗｎ，  ｅｄ．，ｐｐ  ６８３−６９３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８１）、およびボルトンとマッカーシに基づく融解温度推定（Ｂａｌｄｉｎｏ，  Ｆ．  １．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １６８：  ７６１−７７  （１９８９）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  １．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （２００１）を参照）を含む。全ての参照文献は参照により本明細書に組み込まれる。様々なパラメータの効果は、以下を含むがそれに制限されなく、ハイブリッド安定性を評価する時にはイオン強度、プローブ長、Ｇ／Ｃ含有量、およびミスマッチを考慮する。これらの因子を考慮することは、当業者に良く知られている。（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，を参照）。
【００６３】
本明細書で記載した方法で使うことのできるプライマーは、様々な標的核酸を増幅するために使うことができる。単一プライマーセット、例えばプライマー対は単一標的核酸を増幅するために使っても良い。別の実施形態では、複数のプライマーセットを複数の標的核酸を増幅するために使って良い。増幅は、マルチプレックスを使う当業者では一般に知られたプライマーセットの組み合わせを使って、各唯一のプライマーセットについてまたは単一の反応容器のなかで別々に行って良い。複数のプライマーセットが単一の反応で使われる時、プライマーは、望ましくない産物の形成を制限し、また各プライマーセットのプライマー同士が干渉するのを制限するように、デザインされる。
【００６４】
一般のＰＣＲ増幅反応は、先に述べたように上記した当業者に良く知られた手順に従って遂行することができる。（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照）。プライマー伸長段階の時間と温度は、ポリメラーゼ、増幅される標的核酸の長さ、および増幅に採用されたプライマー配列、に依存する。標的核酸を十分に増幅するのに必要となる反復数は、各サイクルの増幅効率と標的核酸の開始コピー数に依存する。当業者に知られているように、これらのパラメータは当業者によって調整して所望のレベルの増幅をもたらす。当業者は、本発明が増幅プロセス適用した時間、温度、緩衝液条件、増幅サイクルの変動に制限されるものでないことを理解している。
【００６５】
開示された増幅反応においてプライマーを標的核酸にハイブリダイズさせる場合、アッセイを標的核酸の存在下でハイブリッドを形成させるという厳密な条件の下で一般に行う。当業者は、ハイブリダイズを厳密にコントロールし、さらに非特異的標的とのハイブリダイズを最小化する温度、塩濃度、水素イオン指数、有機溶剤、カオトロピック薬剤、またはその他の変数のパラメータを変更できる（即ち、「ホットスタート」ＰＣＲまたは「タッチダウン」ＰＣＲの使用によって）。
【００６６】
４．検出標識
開示された構成と方法を使って標的核酸のコピー数を測定することを助けるために、検出標識は、増幅される核酸に直接的に取り込むか、検出分子に結合することができる。本明細書で使用されるとき、検出標識は、直接的にまたは間接的に、増幅される核酸に付随することのできる任意の分子であり、また直接的にまたは間接的に、測定可能で検出可能なシグナルを生み出す。本明細書で記載した方法で単一の検出標識を使うことができる。「シグナル検出標識」とは、単一の型の検出標識を意味する。例えば、単一の検出標識は、本明細書で記載したような任意の検出標識でも良い、しかしながら、唯一１つの型の検出標識が、各同種のシステムで使うことができる。例えば、単一の検出標識は、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセン、またはテキサスレッドの何れかであるが、全ての組み合わせではない。従って、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセン、またはテキサスレッドはそれぞれの単一検出標識であり、例えば、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、単一検出標識であり、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は単一検出標識であり、５，６−カルボキシメチルフルオレセンは単一検出標識であり、またテキサスレッドは単一検出標識である。
【００６７】
別の例では、ＳＹＢＲグリーンが、異なる標的のコピー数を測定するのに使われる「単一検出標識」である下記の例題中に提供されている。さらに加えて、単一検出標識は、単一単色検出標識とも呼ばれる。「単一単色検出標識」は、唯一単色の単一検出標識である。例えば、単一、単色検出標識は、検出できる単一色を放射する検出標識である。
【００６８】
多くのそのような核酸に取り込まれた標識、または核酸プローブと結合した標識は当業者に知られている。開示された方法で使用するのに適した検出標識の例は、放射性同位元素、リン光の分子、酵素、抗体、およびリガンド、同様に蛍光色素と蛍光ラベルを含む蛍光性分子である。蛍光ラベルは、実時間の増幅検出に有用である。
【００６９】
例えば、本明細書で記載した方法は、ＰＣＲ反応中で優先的に二重鎖核酸増幅産物に結合する蛍光色素を使うことができ、それによって産物合成を連続的にモニタリングをすることができる（Ｈｉｇｕｃｈｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：  １０２６−１０３０  （１９９３）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｔ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：  ９５４−９６２  （１９９８）を参照）。
【００７０】
好適な蛍光ラベルの例は、以下に制限されるものではないが、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−ｌ，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシル塩化物、ローダミン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎグリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン類、アクリジン類、オキサジン類、フィコエリトリン、量子色素ＴＭなどのランタニドイオンのマクロ環状キレート類、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光性エネルギー移動色素類、およびシアニン色素類Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含む。その他の具体的な蛍光ラベルの例は以下を含む：３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、フクシン酸、アリザリンコンプレキソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、Ａｎｔｈｒｏｙｌステアリン酸、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロフォスフィン（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、オーロフォスフィンＧ、ＢＡＯ９（Ｂｉｓａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、ＢＣＥＣＦ、ベルベリン硫酸塩、Ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｅ、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＦＦＧ溶液、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＳＶ、  ＢｏｄｉｐｙＦ１、  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ  ＦＦ、Ｃａｌｃｉｅｎブルー、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、ＣａｌｃｏｐｈｏｒホワイトＡＢＴ溶液、Ｃａｌｃｏｐｈｏｒホワイト標準溶液、Ｃａｒｂｏｓｔｙｒｙｌ、カスケードイエロー、カテコラミン、Ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ、ＣｏｒｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（Ｉ−ジメチルアミノＮａｐｈａｌｉｎｅ５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノＮａｐｈｔｙｌスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、Ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ジフェニル  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎｅ  ７ＧＦＦ、  ドーパミン、エリスロシＩＴＣ、Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘発する蛍光）、Ｆｌａｚｏオレンジ、Ｆｌｕｏ３、フルオレサミン、Ｆｕｒａ−２、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  ＢｒｉｌｌｉａｎｔレッドＢ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔイエロー  １０ＧＦ、Ｇｅｎａｃｒｙｌピンク３Ｇ、Ｇｅｎａｃｒｙｌイエロー５ＧＦ、Ｇｌｏｘａｌｉｃ酸、顆粒状ブルー、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｉｎｄｏ−Ｉ、Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ  Ｃｆ液体、  ＬｅｕｃｏｐｈｏｒＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ＬｕｃｉｆｅｒイエローＣＨ、ＬｕｃｉｆｅｒイエローＶＳ、Ｍａｇｄａｌａレッド、Ｍａｒｉｎａブルー、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔフラビン１０  ＧＦＦ、  Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンＰｙｒｏｎｉｎｅスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｄｏｌｅ、ノルアドレナリン、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔレッド、Ｎｕｃｌｅａｒイエロー、Ｎｙｌｏｓａｎ  ＢｒｉｌｌｉａｎｔフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ（Ｆｅｕｌｇｅｎ）、ＰｈｏｒｗｉｔｅＡＲ溶液、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ、  Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、Ｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ  Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅブルーブラック、ポルフィリン、Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ、Ｐｒｏｃｉｏｎイエロー、Ｐｙｒｏｎｉｎｅ、Ｐｙｒｏｎｉｎｅ  Ｂ、Ｐｙｒｏｚａｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミＢ２００、ローダミンＢ  Ｅｘｔｒａ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔレッド２Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔレッド４Ｇ、Ｓｅｖｒｏｎ  ＢｒｉｌｌｉａｎｔレッドＢ、Ｓｅｖｒｏｎオレンジ、ＳｅｖｒｏｎイエローＬ、ＳＩＴＳ（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）、ＳＩＴＳ（スチルベン  Ｉｓｏｔｈｉｏｓｕｌｐｈｏｎｉｃ酸）、スチルベン、Ｓｎａｒｆ  １、ｓｕｌｐｈｏ  ローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、ＳｕｌｐｈｏローダミンＧ  Ｅｘｔｒａ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ＴＣＮ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ５、Ｔｈｉｏｌｙｔｅ、Ｔｈｉｏｚｏｌオレンジ、Ｔｉｎｏｐｏｌ  ＣＢＳ、トルーブルー、Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ、  Ｕｒａｎｉｎｅ  Ｂ、Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣ。蛍光ラベルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ；  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  Ｏｈｉｏ．などを含む種々の市販の源から得ることができる。
【００７１】
５．機器
開示した方法と構成の使用に適した機器は、以下に制限されるものではないが、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒｓ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ；  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標），Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄ．，  ＵＳＡ．を含む。
【００７２】
様々なアルゴリズムを、本明細書で記載した試料中の標的核酸のコピー数を計測するのに使うことができる（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  ソフトウェア  バージョン１．７；Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）  ソフトウェア  バージョン３を参照、（参照により組み入れる））。コピー数を測定するにはコピー数が知られた標的核酸の標準試料の使用と標準値とサイクルの対数の閾値（Ｃｔ）とからの検量線の生成が関わる。一般に、ＣｔはＰＣＲサイクルまたは分画ＰＣＲサイクルであり、増幅産物によって産生した蛍光は蛍光ベースラインの偏差値数倍上である（上記のＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，）。ＭＭＱＰＣＲは大きさが約７〜８のオーダーでの線形性を提供する、これによって広い動的範囲での標的核酸コピー数を測定することができる。標的核酸コピーの絶対数検量線のＣｔ値と試料のそれとの比較から導ける。
【００７３】
標的核酸コピー数は、比較ＭＭＱＰＣＲによっても測定できるコピー数が既知または一定の核酸の使用によって試料中の標的核酸のコピー数を定量できる。標準は、コピー数が既知である核酸の単一コピー遺伝子であっても良く、または、ＤＮＡコピー数を定量化する時は、恒常的に発現するハウスキーピング遺伝子でも良い（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍ．Ｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７８：  １７５−１８４  （２０００）；  Ｂｏｕｌａｙ，  Ｊ．−Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７：  ２２８−２３２  （１９９９）を参照）。
【００７４】
方法
本明細書で開示した方法は、第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットで増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットで増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで第２のＴｍは第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い；ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い；ｅ）（ｂ）から（ｄ）の段階を少なくとも１回繰り返すこと；およびｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定することを含む。
【００７５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）は、標的核酸配列の１つ以上の（即ち
コピー数を増やす）コピーを増幅する技術である。増幅は、かなりのオーダーの大きさにまたがり、特定のＤＮＡ配列のコピー十億を産生する。ポリメラーゼ連鎖反応は温熱性サイクルに依存し、ＤＮＡの融解と核酸の酵素による複製を達成する加温と冷却の反復のサイクルから成り立つ。ＰＣＲ法が進行するに従って、産生したＤＮＡはそれ自体が複製のための鋳型として使われ、鋳型ＤＮＡが指数関数的に増幅する連鎖反応の挙動を設定する。
【００７６】
ＰＣＲ法は、通常サイクルと呼ばれる一連の温度変化反復サイクルから成り立ち、各サイクルは典型的に２ないし３の別々の温度段階から成り立っている。
ＰＣＲ法は、各サイクルが異なる温度でなされる、３から４の段階からなるサイクルでもって遂行できる。サイクリルは、二重鎖の標的核酸配列十分に融解（即ち、一本鎖にする）するために、ホールドと呼ばれる単一の高温（＞９０℃）段階がしばしば先行し、続いて、１セットの温度変化の反復を行い、この間に標的核酸の増幅が起こる。最終産物の伸長または短期の貯蔵のために最後に最終のホールドが続く。各サイクルで適用した採用温度と時間の長さは、サイクル様々なパラメータに依存する。これらは、ＤＮＡ合成のために使った酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、反応中の二価イオンとｄＮＴＰの濃度、プライマーの融解温度、および増幅産物の融解温度を含む。
【００７７】
ＰＣＲ法は、少なくとも変性段階、アニーリング段階、および伸長段階を含む。伸長段階は、拡張段階とも呼ばれる。ＰＣＲ法で、変性、アニーリング、および伸長段階がこの順番で少なくとも一回起こる（別名単一「サイクル」）、しかし典型的に４０サイクルまで反復する。使用したＤＮＡポリメラーゼが熱活性を必要とする時、初期化段階と呼ばれる付加的段階は、ＰＣＲ法のサイクルステージに先行する。各段階は、それぞれに付随するそれぞれの温度がある。各段階に付随する温度を、初期化温度、変性温度、アニーリング温度、ならびに拡張または伸長温度とそれぞれ呼ぶ。
【００７８】
初期化段階は、反応を初期化温度９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、および９８℃に加温することからなり、それぞれは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５分間保持する。初期化段階は、典型的にＰＣＲ法で使うＤＮＡポリメラーゼが熱活性を必要とする時のみ必要とする。例えば、耐熱性ポリメラーゼが使われると、初期化温度を９８℃にする初期化段階が利用できる。
【００７９】
変性段階は、典型的にＰＣＲ法の反復サイクルの第一段階であって、反応を変性温度、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、および９８℃を１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５秒間加熱することから成り立つ。変性段階は、相補的塩基間の水素結合を破壊することによって鋳型ＤＮＡを融解し、一本鎖ＤＮＡを産生する。
【００８０】
アニーリング段階は、典型的にＰＣＲ法の反復サイクルの第一段階であって温度をアニーリング温度の４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０℃に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、および４５秒間下げて、プライマーセットのプライマーをアニーリングして標的核酸とハイブリダイズさせる。アニーリング温度は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０℃で、使用したプライマーの温度（Ｔｍ）より下である。安定したＤＮＡ−ＤＮＡ水素結合は、プライマー配列非常に密接に鋳型配列とマッチングした時に形成される。ポリメラーゼはプライマー−鋳型ハイブリッドと結合し、ＤＮＡ合成を開始する。
【００８１】
拡張／伸長段階は、核酸ポリメラーゼが、５’→３’方向に標的核酸と相補的なｄＮＴＰｓを加えることによって標的核酸鎖と相補的な新しい核酸鎖を合成する段階で、この時、ｄＮＴＰｓの５’−リン酸基は新生の（伸長しつつある）標的核酸鎖の末端の３’−ヒドロキシル基と縮合する。拡張時間は使用する核酸ポリメラーゼと増幅される標的核酸の長さの両方に依存する。経験則として、最適温度では核酸ポリメラーゼは、毎分１０００塩基を重合する。最適条件の下、すなわち、基質または試薬に制限がない場合は、各伸長段階で、標的核酸の量は２倍になり、特定の標的核酸を指数関数的（幾何的）に増幅する。この段階での伸長温度は、使用する核酸ポリメラーゼに依存する。例えば、Ｔａｑポリメラーゼは、７５℃〜８０℃の温度で最適の活性を持ち、一般に温度７２℃がこの酵素と一緒に使われる。
【００８２】
ＰＣＲ法は、最後の伸長段階をも含む。最終の伸長は、全ての一本鎖ＤＮＡが十分に複製され二本鎖ＤＮＡ産物になるのを保証するために、最後のＰＣＲ法サイクルの後に最終伸長温度６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４および７５℃を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５分間遂行する。
【００８３】
ＰＣＲ法は、検出標識量を測定するシグナル獲得段階をも含むことができる。シグナル獲得段階は、標的配列の増幅中に遂行される。いくつかの態様では、シグナル獲得段階は、変性段階、アニーリング段階、および伸長段階に続く。シグナル獲得段階は、シグナル獲得温度で遂行される。シグナル獲得温度は任意の温度であって良く、ＰＣＲ法内で、数回その温度を実施する。２つ以上の標的核酸のコピー数を、本明細書で記載してあるように測定する時、シグナル獲得温度は、各複製配列の検出標識によって異なるようにすべきである。
例えば、２つ以上のシグナル獲得温度は、第１のシグナル獲得温度が、第１のアンプリコンのＴｍより低く、第２のシグナル獲得温度は上記の第１のＴｍより高く、第２のアンプリコンのＴｍより低くなるように選択すべきである。２つ以上のシグナル獲得温度間の差は、３、４、５、６、７、８、９、および１０℃である。シグナル獲得段階は、獲得温度で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５秒間遂行される。
【００８４】
ＰＣＲ法は、最後のホールド段階をも含む。この最終ホールド段階は、最後のホールド温度であり：この段階では、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５℃で不定時間である。最終段階は、反応の短期貯蔵のために採用できる。
【００８５】
ポリメラーゼ連鎖反応は、連続したサイクルのステージをも持つ。各連続したサイクルのステージは、１つ以上の上記のＰＣＲ法の段階を含む。各連続したサイクルのステージは、ＰＣＲ法の「サイクル」と呼べる。各連続したサイクルのステージは、ＰＣＲ法の各サイクルで同じか異なる温度で遂行する。ＰＣＲ法の１回以上のサイクルでアニーリング温度が変化するようにＰＣＲ法が遂行されうる。例えば、ＰＣＲ法は全部で４０サイクル遂行するが、ここでアニーリング温度は、第１のステージのサイクルについて同じである、次いでアニーリング温度は第２のステージのサイクルについて上げ、アニーリング温度は、第３のステージのサイクルについて下げる。
【００８６】
「均一システム」とは、標的核酸の増幅と検出が同じ反応で起こることである。均一システムは、標的配列の増幅中に検出可能なシグナルを生成するシステムである。「増幅中」とは、ＰＣＲ法のあるサイクルの後で、しかしＰＣＲ法の次のサイクルの前のことである。「増幅中」とは、ＰＣＲ法の間で最終段階の前のことである。
【００８７】
相対的コピー数は、本明細書で別の場所で記載した方法で遂行される。例えば、本明細書で記載した方法は、参照ＤＮＡと比較して１セットの反応ウェルの実験のＤＮＡ核酸試料中のテロメア（Ｔ）反復配列の量とまた異なるウェルの単一コピー遺伝子（Ｓ）の量を測定することに使うことができ、平均テロメア長に比例する相対的Ｔ／Ｓ比を得る。ある態様では、Ｓシグナルがベースラインより上になる前にＴシグナルが初期のサイクルで収集され、またテロメア産物を完全に融解する温度でＳシグナルが収集され、そのシグナルをベースラインに送る。Ｔ／Ｓ比の相関は、コピー数を測定するためにサザンブロットにより測定した末端制限断片（ＴＲＦ）長にも相関する。
【００８８】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、第１の標的核酸のコピー数は第２の標的核酸のコピー数より大きく、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸と上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００８９】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）上記第２のシグナル獲得温度で検出標識を測定されるまで（ｂ）から（ｄ）までの段階を反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸と上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９０】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで第２のＴｍは第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、またここで検出標識の量は、上記増幅段階のそれぞれで、上記第１および上記第２のシグナル検出温度で検出される、ｅ）ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９１】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで第２のＴｍは第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、またここで、上記第１のＴｍおよび上記第２のＴｍの温度差は少なくとも４℃である、ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９２】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ここで第２のプライマーセットのプライマーの内少なくとも１つが、プライマの５’末端にＧＣクランプを含む、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）上記第２のシグナル獲得温度で検出標識を測定する（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９３】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ここで第１のプライマーセットのプライマーの内少なくとも１つが、ＡとＴのヌクレオチドを含む５’配列を含む、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９４】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ここで第１のプライマーセットのプライマーの３’末端は互いに相補であり、また第１のプライマーセットの１つのプライマーが、プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのミスマッチのプライマーからなる、さらにここで、上記ヌクレオチドは標的核酸と相補ではないが、第１のプライマーセットの他のプライマーの３’末端ヌクレオチドと相補である。ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸と上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９５】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ここで第１のプライマーセットのプライマーの１つが、第１の標的核酸を刺激することを阻止される、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９６】
さらに本明細書で開示された方法は、第１の標的核酸と第２の標的核酸のコピー数を測定する方法であって、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させること、第２の標的核酸を第２のプライマーセットと接触させること、単一の検出標識を加えて均一なシステムの反応混合物を形成させること、ここで検出標識は挿入色素である、ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により第１の標的核酸を第１のプライマーセットでもって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を持つ第１のアンプリコンを形成し、またポリメラーゼ連鎖反応により第２の標的核酸を第２のプライマーセットでもって増幅して第２の融解温度（Ｔｍ）を持つ第２のアンプリコンを形成すること、ここで上記第２のＴｍは上記第１のＴｍより高い、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の間、第１の獲得温度で検出標識の量を測定すること、ここで上記第１のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより低い、ｄ）反応混合物の温度を上昇させて第２のシグナル獲得温度にして、検出標識の量を測定すること、ここで上記第２のシグナル獲得温度は上記第１のＴｍより高く、上記第２のＴｍより低い、ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの段階を少なくとも１回反復すること、ｆ）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を測定すること、を含む。
【００９７】
本明細書で記載した方法のいくつかの態様では、第１と第２の標的核酸のコピー数は、第１の核酸の第２の核酸と比較した相対的量を測る。
【００９８】
いくつかの態様において、標的と参照配列は、初期増幅鋳型の増幅が後期増幅鋳型の増幅を妨害するのを防ぐ戦略によって、唯一の蛍光色素としてＳＹＢＲグリーンＩを、また単一色検出専用のＱＰＣＲ機器を利用するマルチプレックスＱＰＣＲで正確に定量化できる。いくつかの態様では、ＭＭＱＰＣＲによるＤＮＡ試料セットの２つの鋳型を定量化するために、２つの要件を満たさなければならない。始めに、セット内の各ＤＮＡ試料について、初期増幅の産物がサイクル閾値に達する時、後期増幅産物の増幅シグナルは未だベースラインにあるようにＰＣＲ法条件は満たさなければならない。第２に、後期増幅産物の蛍光を二重鎖が維持するのに十分な低い温度でモニターできるように、しかし、初期増幅産物を完全に融解するのに十分な高い温度になるように後期増幅産物は初期増幅産物より高い融解温度を持たねばならなく、こうして蛍光シグナルをベースラインに送る。両方のＰＣＲ産物を小さく維持できるようにプライマーをデザインし、ＧＣ−クランプなどのＧＣリッチな５’タグを後期増幅産物のためのプライマーに加えることによって、後期増幅産物はより高い融解温度を持てることが保証される。
【００９９】
本明細書で記載した方法は、生物学的試料の中の２つの異なる鋳型のレベルを定量化することに使うことができ、各鋳型のコピー数は異なるが、第１と第２の鋳型のコピー数の範囲には重なりがない。例えば、細胞は、単一コピー核内遺伝子のコピーより遙かに多いテロメア反復のコピーを持つ。同じ状況が、ｍｔＤＮＡコピー対単一コピー遺伝子、ｒＤＮＡコピー対単一コピー遺伝子、ＡｌｕＤＮＡコピー対単一コピー遺伝子などについても適用する。同様に、マルチプレックス逆転写酵素ＱＰＣＲ（ＲＴ−ＱＰＣＲ）によるｍＲＮＡレベルの実験では、コピー数は異なるがコピー数の範囲は重ならない２つの異なるｍＲＮＡ種のレベルを数量化することをしばしば目的としている。鋳型のこれらの対のそれぞれについて、豊富でない鋳型からの増幅シグナルがベースラインにある時、豊富な鋳型のＣｔは収集できる。またＧＣリッチな産物を二重鎖のままにする高温で、豊富でない鋳型のＣｔが収集でき、同時に豊富な鋳型産物からのシグナルは完全に融解し除去される。ＰＣＲ法サイクルを通じての２つの異なる温度で蛍光シグナルを収集し、これらのシグナルを別々に分析することにより、単一単色検出標識を使って２つの鋳型をそれぞれ独立に定量化できる。
【０１００】
今までに、単一ＤＮＡ介入色素を使うマルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応の２つの異なるＤＮＡ配列の相対コピー数を測定することは不可能だと考えられてきた、なぜなら両方のアンプリコンから蛍光性シグナルが起こり蓄積するからである。本明細書で記載した方法は、２つのアンプリコンからのシグナルを収集する戦略を提案する。第１のアンプリコンのサイクル閾値（Ｃｔｓ）は、初期サイクルで収集されが、その時第２のアンプリコンからのシグナルは未だベースラインである。第２のアンプリコンのＣｔｓは、第１のアンプリコンの融解温度（Ｔｍ）を遙かに超える温度で収集され、第１のアンプリコン一本鎖を提供し、そのシグナルをベースラインに送る。プライマーは、両方のアンプリコンを小さくし、また第２のアンプリコンをＧＣリッチにして、そのＴｍを上昇させるようにデザインされる。コピー数の範囲に重複がない多数もしくは少数種の生物学的試料で起こる鋳型対は、このアプローチの自然な標的である。ほぼ同等のコピー数を持つ２つの鋳型でさえ、１つのアンプリコンの増幅を遅らせるプライマーと熱サイクルデザインを適用することによって区別できる。本明細書で記載した方法は、ヒトＤＮＡ試料の相対的テロメア長を測定するのに使うことができる。
【０１０１】
同様のコピー数の方法
また、第１の標的核酸および第２の標的核酸のコピー数を決定する方法を本明細書で開示する。第１の標的核酸配列のコピー数が第２の標的核酸配列のコピー数と同様である本方法は、ａ）第１の標的核酸を第１のプライマーセットと接触させ、第２の標的核酸を第２のプライマーセトと接触させ、かつ均一系での反応混合物を形成するために単一の検出標識を付加することと、ｂ）上記第１のＴｍよりも高い第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成するために、第１のプライマーセットを用いて第１の標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成し、かつ第２のプライマーセットを用いて第２の標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することと、ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応中に、上記第１のＴｍより低い第１のシグナル取得温度で検出標識の量を測定することと、ｄ）上記第１のＴｍより高くかつ上記第２のＴｍより低い第２のシグナル取得温度まで反応混合物の温度を上げて、検出標識の量を測定および決定することと、ｅ）ステップ（ｂ）から（ｄ）を少なくとも１回繰り返すことと、ｆ）上記第１および第２の標的核酸の相対的コピー数を決定することとを含む。
【０１０２】
第１の標的核酸配列のコピー数が第２の標的核酸配列のコピー数と同様であるとき、ＰＣＲのサイクルまたはＰＣＲの個々のステップを変更するまたは変えることができる。たとえば、第１の標的核酸配列のコピー数が第２の標的核酸配列のコピー数と同様であるとき、本方法のポリメラーゼ連鎖反応は少なくとも３つの連続的なステージをさらに含むことができ、ここでポリメラーゼ連鎖反応の第１のステージが、ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度が第２のステージのアニーリング温度よりも高いポリメラーゼ連鎖反応のサイクルを含み、ポリメラーゼ連鎖反応の第２のステージが、ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度が第１のステージのアニーリング温度よりも低いポリメラーゼ連鎖反応のサイクルを含み、かつポリメラーゼ連鎖反応の第３のステージが、ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度が第１のステージのアニーリング温度よりも低く、かつ第２のステージのアニーリング温度よりも高いポリメラーゼ連鎖反応のサイクルを含む。
【０１０３】
いくつかの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応を連続的なステージで用いるとき、ポリメラーゼ連鎖反応の第１ステージの間に第２のアンプリコンだけが形成される。いくつかの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応を連続的なステージで用いるとき、ポリメラーゼ連鎖反応の第２ステージの間に第１のアンプリコンだけが形成される。いくつかの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応を連続的なステージで用いるとき、ポリメラーゼ連鎖反応の第３ステージの間に第１および第２の両アンプリコンが形成される。いくつかの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応を連続的なステージで用いるとき、ポリメラーゼ連鎖反応の第１のステージの間に第２のアンプリコンだけが形成され、かつポリメラーゼ連鎖反応の第３のステージの間に第１および第２の両アンプリコンが形成される。
【０１０４】
ＰＣＲのプライマー組成物および種々の温度は、用いられるまたは生成されるプライマー、アンプリコンおよびポメラーゼの標的ならびにＴｍに応じて変更することもできる。
【０１０５】
いくつかの態様では、同様の存在量の２つの鋳型をＭＭＱＰＣＲによって定量化するために、これらの鋳型のうちの１つを増幅することで、数サイクル遅らせる。たとえば、１つのプライマー対を６８℃でアニールし、別の対を５０℃でアニールするように設計することができる。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの最初の１５分間の活性化およびゲノムＤＮＡ試料の変性の後、少なくとも４サイクル中、９４℃と６８℃の間でサイクリングさせることで、第１の鋳型の増幅において４サイクル（またはそれ以上）をヘッドスタートさせ、第２の鋳型をアンプライムのままにしておく。次に、２サイクルの間、９４℃と５０℃の間でサイクリングさせ、第１の鋳型の増幅を続けるが、第２の鋳型からの増幅も開始する。ここで留意すべきは、第２の鋳型のプライマーは、ＧＣクランプなどのＧＣリッチな５’タグを有し、高い融解温度をそれらのＰＣＲ産物に与えることができることである。２サイクルの間、９４℃と５０℃の間でサイクリングさせると、これらのプライマーの完全長と相補的な配列を合成するのに十分であるので、これらの２サイクルが終了した時点でアニーリング温度を再び上げて、プログラムの残りのサイクルは、下記のプロトコール（材料および方法の節を参照されたい）のステージ３の熱プロファイルと同様のプロファイルを有することができ、その間に各サイクル中に２つの異なる温度で蛍光シグナルを収集することになる。
【０１０６】
別の態様では、１つの鋳型の増幅を数サイクル遅らせる第２のアプローチを提供して、両プライマー対が産物形成を開始し、次いで低融解アンプリコンを融解させるのに十分に高いが高融解アンプリコンを融解させるまで高くない変性温度を４サイクル以上に適用し、次いで最終的に、残りのサイクル中にステージ３の熱プロファイル（材料および方法の節を参照されたい）と同様のプロファイルに切り替えることが可能になる。変性温度を低下させた状態でのサイクリングのステージは依然として、その増幅を遅らせるように意図された最初の鋳型からの線形増幅を可能にすることもある。この問題の解決法は、ＧＣクランプなどの５’タグによって与えられる、比較的低い最初のアニーリング温度、たとえば５０℃を有するが、ＰＣＲアンプリコンにとってはより高いその後のアニーリング温度を有する、両方のプライマー対を用いることである。２サイクル中に９４℃と５０℃との間でサイクリングさせることによって、最初のＰＣＲ産物を十分に生成させ、その後アニーリング温度が、元のＤＮＡ鋳型がそれ以上プライミングしないように抑制する十分な温度まで高くなるだろう。
【０１０７】
一態様では、第１の標的核酸は第１の核酸内に存在し、上記第２の標的核酸は第２の核酸内に存在する。この態様では、第１および第２の標的核酸のコピー数は、上記第２の核酸と比較して上記第１の核酸の相対量を測定する。別の態様では、第１の標的核酸は第１の核酸内に存在し、第２の標的核酸は第２の核酸内に存在する。第１の標的核酸のコピー数は、非タンデムリピートが上記第１のプライマー対によって非依存的に増幅される第１の核酸内の第１の標的核酸の非タンデムリピートを測定する。
【０１０８】
また、第２の標的核酸のコピー数と比較して、第１の標的核酸のコピー数をマルチプレックス定量ＰＣＲによって決定するための方法を開示する。第１の標的核酸はタンデムリピートを含み、かつ上記第１の標的核酸配列のコピー数は上記第２の標的核酸配列のコピー数よりも大きい。本方法は、（１）第１の標的核酸および第２の標的核酸を含む試料を第１のプライマーセットと、第２のプライマーセットと、インターカレーティング染料とに接触させることであって、第１のプライマーセットが第１の標的核酸をＰＣＲ増幅させて第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成することができ、上記第１のプライマーが第１の鎖とハイブリダイズするとき、第１のプライマー対の第１のプライマーが、上記第１の標的核酸の上記第１の鎖中のヌクレオチドと塩基対をなさない３’末端以外でミスマッチヌクレオチドを含み、および上記第２のプライマーがＰＣＲ転写物とハイブリダイズするとき、上記第１のプライマー対の第２のプライマーが、上記第１の核酸の第２の鎖中でヌクレオチドと塩基対をなさないが上記第１の鎖の上記ＰＣＲ転写物中の上記ミスマッチヌクレオチドと塩基対をなす３’ヌクレオチドを有し、それによってＰＣＲサイクルを繰り返すことで生成される第１のアンプリコンが上記第１のＴｍで規定される大きさを有し、および上記第２のプライマーセットが上記第２の標的核酸を増幅して、上記第１のＴｍよりも高い第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成することができる、接触させることと、（２）第１および第２のアンプリコン中の染料のインターカレーションを測定するための第１および上記第２のシグナル取得温度を含む温度プロファイルを介して試料のＰＣＲサイクリングを行うことであって、第１のシグナル取得温度が第１のＴｍより低く、および上記第２のシグナル取得温度が第１のＴｍより高くかつ第２のＴｍより低い、ＰＣＲサイクリングを行うことと、（３）ＰＣＲサイクリングステップを繰り返すことと、および（４）少なくとも２つの異なるＰＣＲサイクル中に、第１および上記第２のシグナル取得温度で染料のインターカレーションからのインターカレーションシグナルを測定して、第１および第２の標的核酸の相対的コピー数を決定することとを含む。
【０１０９】
また、第２の標的核酸のコピー数と比較して第１の標的核酸のコピー数をマルチプレックス定量ＰＣＲによって決定するための方法を開示する。ここで第１の標的核酸配列のコピー数は第２の標的核酸配列のコピー数と同様である。本方法は、（１）第１の標的核酸および第２の標的核酸を含む試料を第１のプライマーセットと、第２のプライマーセットと、インターカレーティング染料とに接触させることであって、第１のプライマーセットが第１の標的核酸を増幅させて、第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成することができ、および第１のプライマー対と第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーション複合体が第１のプライマーＴｍを有し、および第２のプライマーセットが第２の標的核酸を増幅して第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成することができ、および
上記第２のプライマーセット対および上記第２の標的核酸の間のハイブリダイゼーション複合体が第２のプライマーＴｍを有し、ここで上記第２のＴｍが上記第１のＴｍよりも大きく、および上記第１のプライマーＴｍが上記第２のプライマーＴｍよりも大きい、接触させることと、（２）上記試料を所定数のＰＣＲサイクルにかけることであって、所定のＰＣＲサイクル中のプライマーのアニーリング温度が、上記第２の標的核酸の増幅を抑制するために上記第２のプライマーＴｍより高い、ＰＣＲサイクルにかけることと、（３）温度プロファイルを介して上記試料のＰＣＲサイクルを行うことであって、プライマーのアニーリング温度が上記第２のプライマーＴｍであるかまたはそれより低く、それによって上記第１および上記第２の標的核酸がＰＣＲ増幅され、かつ、上記温度プロファイルが、上記第１および第２のアンプリコン中の上記染料のインターカレーションを測定するための第１および第２のシグナル取得温度を含み、ここで上記第１のシグナル取得温度が上記第１のＴｍより低く、および上記第２のシグナル取得温度が上記第１のＴｍより高くかつ上記第２のＴｍより低い、ＰＣＲサイクルを行うことと、（４）上記ＰＣＲサイクルのステップを繰り返すことと、および（５）少なくとも２つの異なるＰＣＲサイクル中に上記第１および上記第２のシグナル取得温度で上記染料のインターカレーションからのインターカレーションシグナルを測定することであって、上記第１および上記第２の標的核酸の相対的コピー数が、上記インターカレーションシグナルおよび上記所定数のＰＣＲサイクルから決定される、測定することを含む。
【０１１０】
また、第２の標的核酸のコピー数と比較して第１の標的核酸のコピー数をマルチプレックス定量ＰＣＲによって決定するための方法を開示する。ここで上記第１の標的核酸配列のコピー数は上記第２の標的核酸配列のコピー数と同様である。本方法は、（１）上記第１の標的核酸および上記第２の標的核酸を含む試料を第１のプライマーセットと、第２のプライマーセットと、インターカレーティング染料とに接触させることであって、上記第１のプライマーセットが上記第１の標的核酸配列を増幅させて第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成することができ、および上記第１のプライマー対と上記第１の標的核酸のハイブリダイゼーション複合体が第１のプライマーＴｍを有し、および上記第２のプライマーセットが上記第２の標的核酸を増幅させて第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成することができ、および上記第２のプライマー対と上記第２の標的核酸のハイブリダイゼーション複合体が第２のプライマーＴｍを有し、ここで上記第２のＴｍが上記第１のＴｍよりも大きく、かつ上記第１のプライマーＴｍが上記第２のプライマーＴｍよりも大きい、接触させることと、（２）上記試料を第１の所定数のＰＣＲサイクルにかけることであって、上記所定のＰＣＲサイクル中のプライマーのアニーリング温度が、上記第１および上記第２の標的核酸を増幅するために上記第１のプライマーＴｍであるかまたはそれより低い、ＰＣＲサイクルにかけることと、（３）上記試料を第２の所定数のＰＣＲサイクルにかけることであって、上記第２の標的核酸のさらなる増幅を抑制するために変性温度が上記第２のＴｍより低い、ＰＣＲサイクルにかけることと、（４）温度プロファイルを介して上記試料のＰＣＲサイクルを行うことであって、プライマーのアニーリング温度が上記第２のプライマーＴｍであるかまたはそれより低く、それによって上記第１および上記第２の標的核酸がＰＣＲ増幅され、および上記温度プロファイルが、上記第１および第２のアンプリコン中の上記染料のインターカレーションを測定するための第１および第２のシグナル取得温度を含み、ここで上記第１のシグナル取得温度が上記第１のＴｍより低く、かつ上記第２のシグナル取得温度が上記第１のＴｍより高くかつ上記第２のＴｍより低い、ＰＣＲサイクルを行うことと、（５）上記ＰＣＲサイクルのステップを繰り返すことと、（６）少なくとも２つの異なるＰＣＲサイクル中に、上記染料のインターカレーションからのインターカレーションシグナルを上記第１および上記第２のシグナル取得温度で測定することであって、上記第１および上記第２の標的核酸の相対的コピー数が、上記インターカレーションシグナルおよび上記第２の所定数のＰＣＲサイクルから決定される、測定することとを含む。
【０１１１】
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、第２の試料は、コピー数を測定するための参照として用いられることができる。本方法はさらに、既知のコピー数の上記第１および上記第２の標的核酸と、上記第１および上記第２のプライマー対と、上記インターカレーティング染料とを含む参照核酸を有する少なくとも１つの参照試料を含み、ここで上記第２の試料は上記第１の試料と同じＰＣＲ条件下におかれ、上記第１および上記第２の標的核酸の絶対コピー数の判定の目安とするために、上記第１の試料で上記第１および第２のシグナル取得温度での上記第２の試料用のインターカレーションシグナルが、上記第１および第２のシグナル取得温度でインターカレーションシグナルと比較される。
【０１１２】
いくつかの態様では、本方法は、（１）上記第１の標的核酸を含む試料を第１のプライマーセットと接触させ、次いで上記第２の標的核酸を第２のプラマーセットと接触させることとであって、上記第１のプライマーセットが上記第１の標的核酸を増幅させて、第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１のアンプリコンを形成することができ、次いで上記第２のプライマーセットが上記第２の標的核酸を増幅させて、第２のＴｍを有する第２のアンプリコンを形成することができ、ここで上記第１のアンプリコンが、上記第２のアンプリコンがまだ融解し始めない温度で完全に融解することを確実にするために、上記第２のＴｍは上記第１のＴｍよりも十分に大きい、二本鎖ＤＮＡへのインターカレーション後直ちに蛍光を発する任意の単一の検出標識の存在下で、接触させることと、（２）上記第１および第２のアンプリコン中で上記染料のインターカレーションを測定するための第１および第２のシグナル取得温度を含む温度プロファイルを介して、上記試料のＰＣＲサイクルの繰り返しを行うことであって、上記第１のシグナル取得温度が、上記第１のアンプリコンが依然として融解し始めない上記第１のＴｍより十分に低く、かつ上記第２のシグナル取得温度が、第１のアンプリコンが完全に融解する上記第１のＴｍより十分に高く、かつ第２のアンプリコンが依然として融解し始めない上記第２のＴｍより十分に低い、ＰＣＲサイクルの繰り返しを行うことと、（３）少なくとも２つの異なるＰＣＲサイクル中に、上記第１および上記第２のシグナル取得温度で上記染料からのインターカレーションシグナルを測定して、上記第２のシグナルが依然としてベースラインにあるサイクル数で、上記第１のシグナルが検出の閾値を越えることができる一連の条件下で、上記第１および上記第２の標的核酸の相対的コピー数を決定すること、とを含む。
【０１１３】
キット
上述の材料ならびに他の材料は、開示した方法を実行するため、またはその実行の際に役立つ有用なキットとしてどのような好適な組み合わせでも共にパッケージにすることができる。所与のキット内のキット構成成分を開示した方法で共に使用するように設計し適合させる場合に、有用である。たとえば、１つまたは複数の標的核酸のコピー数を決定するためのキットを開示し、このキットは１つまたは複数の試薬組成物および１つまたは複数の標的核酸のコピー数を決定するための１つまたは複数の組成物または試薬を含む。たとえば、このキットは１つまたは複数の試薬組成物および１つまたは複数のプライマーセット、検出標識、核酸ポリメラーゼ、または組合せを含むことができる。キットの別の形は、複数の試薬組成物を含むことができる。このキットは、たとえば、ヌクレオチド、バッファ、リガーゼ、オープンサークルプローブ、ギャップオリゴヌクレオチド、または組合せを含むことができる。
【０１１４】
このような方法で用いることができるキットを開示する。このキットは、第１および第２の標的核酸を増幅するために、少なくとも第１および第２のＰＣＲプライマー対を含むことができる。このような構成要素をＰＣＲ増幅装置での使用に適している第１の容器に入れることができる。一態様では、試験試料は容器に入れられ、次いでＰＣＲ増幅が開示された方法によって実施される。このキットは、デオキシヌクレオチド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび検出標識を含む、ＰＣＲを実施するための構成成分のうちの１つもしくは複数、またはすべてを含むこともできる。
【０１１５】
一態様では、このキットは、ＰＣＲ装置での使用にも適している第２の容器を備えることができ、既知のコピー数の第１および上記第２の標的核酸と、ＰＣＲを実施するために必要とされる任意の別の構成成分とを有する参照核酸を含む第２の試料を含有し、第１および第２のプライマー対およびインターカレーティング染料を含む。この第２の容器は、第１の容器の試料と同じＰＣＲ条件下にする。第２の容器は、既知のコピー数の第１および第２の標的核酸に対する参照インターカレーションシグナルを提供し、それによって試験試料中の第１および上記第２の標的核酸の絶対コピー数の決定を促進する。異なるコピー数の第１および第２の標的核酸を有する参照核酸を含有する追加の容器を、このキットに含むこともできる。このような容器は、絶対コピー数の比の範囲にわたって異なる参照点をもたらす追加のインターカレーションシグナルを提供する。このような追加の容器は、試験試料中の第１および第２の標的核酸のコピー数が広い範囲にわたって変動できるときに特に有用である。
【０１１６】
また、ＰＣＲ装置での使用に適した第１の容器を有するキットも開示する。このキットの上記第１の容器は、既知のコピー数の第１および第２の標的核酸を含む参照核酸を含む。このキットは、上記第１の容器の参照核酸と比べると、コピー数が異なる第１および第２の標的核酸を有する第２の参照核酸を含む少なくとも１つの追加の容器をさらに含んでもよい。これらの容器は、ＰＣＲで必要とされるインターカレーティング染料および他の構成成分を任意に含有する。このようなキットは、１つまたは複数の異なる参照核酸のためのＰＣＲ装置からのインターカレーションシグナルを標準化する際に有用である。
【０１１７】
システム
開示した方法を実施するために、または実施の際に役に立つ有用なシステムを開示する。また、試薬組成物を生成するためのシステムを開示する。システムは通常、たとえば構造体、装置、デバイスなど、および組成物、化合物、材料などの製造品の組み合わせを含む。開示される、または開示により明白であるこのような組み合わせが考えられる。たとえば、固体支持体および試薬組成物を含むシステムが開示され、考えられる。
【０１１８】
データ構造体およびコンピュータ制御
開示した方法において用いられる、方法によって生成される、または方法から生成されるデータ構造体を開示する。データ構造体とは通常、組成物または媒体に収集され、構築され、保存され、および／または、具体化された任意の形式のデータ、情報、および／またはオブジェクトである。電子的方式、たとえばＲＡＭまたはストレージディスクに保存された標的フィンガープリントは、ある種のデータ構造体である。
【０１１９】
開示した方法、もしくはその任意の部分、またはそのための前処理は、コンピュータ制御によって制御する、管理する、さもなければ支援することができる。このコンピュータ制御は、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって達成可能であり、データ構造体を使用することおよび／または生成すること、ならびにコンピュータプログラムを使用することも可能である。このようなコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造体、およびコンピュータプログラムが考えられ、かつ本明細書に開示されると理解されたい。
【実施例】
【０１２０】
実施例１
研究課題
【０１２１】
標準手順によってゲノムＤＮＡを血液試料から直接抽出して、ＴＥ−４（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で、４℃で、マイクロリットルあたり１００ｎｇにほぼ等しい濃度で長期保存した。ＤＮＡのストックを、ＱＰＣＲランを開始する直前に純水で希釈した。モノプレックス定量ＰＣＲ法によるテロメア長の測定を記載した我々の以前の論文（Ｃａｗｔｈｏｎ，  Ｒ．Ｍ．  （２００２）  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０，  ｅ４７）で解析した試料は、９５名のユタ在住の個人（女性４７名および男性４８名、年齢の範囲５歳〜９４歳）に由来するものである。
単色マルチプレックス定量ＰＣＲ（ＭＭＱＰＣＲ）
【０１２２】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙｉＱ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに対応する９６ウェルプレートの各反応ウェルにマスターミックス溶液を１５マイクロリットルに等分し、続いてＤＮＡ実験試料を純水に希釈した約２０ナノグラムのＤＮＡを含有する各ＤＮＡ試料を１０マイクロリットルに等分して、１反応あたり２５マイクロリットルの最終量にして、ＰＣＲ反応を開始した。本研究では９６ウェルプレートごとに二重に、ＤＮＡ濃度が８１倍の範囲におよぶ参照ＤＮＡ試料（「標準ＤＮＡ」）の５つの濃度を段階希釈によって調製して解析した。これらの反応は、相対定量で用いる標準曲線の作成のためのデータをもたらした。すべてのＤＮＡ実験試料を３つ組でアッセイした。
【０１２３】
このＰＣＲでの試薬の最終濃度は、０．７５×ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１Ｍ  ベタイン（Ｕ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であった。各２５マイクロリットルの反応に、０．６２５  Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を与えた。マルチプレックスＱＰＣＲの場合、テロメアプライマー対のｔｅｌｇおよびｔｅｌｅ（それぞれ９００ｎＭの最終濃度）を、アルブミンプライマー対のａｌｂｕおよびａｌｂｄ（それぞれ９００ｎＭの最終濃度）またはβ−グロビンプライマー対のｈｂｇｕおよびｈｂｇｄ（それぞれ５００ｎＭの最終濃度）のいずれかとマスターミックス溶液中で混合した。すべてのプライマー配列およびそれらの設計原理を結果の節に示す。
【０１２４】
熱サイクルプロファイルは、ステージ１：９５℃で１５分間、ステージ２：９４℃で１５秒間、４９℃で１５秒間での２サイクル、およびステージ３：９４℃で１５秒間、６２℃で１０秒間、７４℃で１５秒間のシグナル収集、８４℃で１０秒間、８８℃で１５秒間のシグナル収集での３２サイクルであった。７４℃での読み取りは、テロメア鋳型の増幅のためのＣｔ値をもたらした。８８℃での読み取りは、単一コピー遺伝子の鋳型の増幅のためのＣｔ値をもたらした。
【０１２５】
熱サイクルおよび生データの収集を終了した後、ＭｙｉＱソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５  ２．０  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、各プレートの標準曲線、１つはテロメアシグナルの曲線であり、１つはｓｃｇシグナルの曲線である２つを作成した。ＤＮＡ実験試料のＴ／Ｓ比は、Ｔ（テロメア鋳型のコピー数のための実験試料にマッチする標準ＤＮＡのナノグラム数）をＳ（ｓｃｇのコピー数のための実験試料にマッチする標準ＤＮＡのナノグラム数）で割ったものである。各実験試料を３つ組でアッセイしたので、各試料に対して３つのＴ／Ｓ結果を得た。所与のランでの試料に対する最終的に報告された結果は、３つのＴ／Ｓ値の平均である。平均Ｔ／Ｓは、１細胞あたりの平均テロメア長と比例すると予想される。Ｔ／Ｓ＞１．０の試料は、標準ＤＮＡのそれよりも大きい平均テロメア長を有し、Ｔ／Ｓ＜１．０の試料は、標準ＤＮＡのそれよりも短い平均テロメア長を有する。
【０１２６】
平均末端制限酵素断片（ＴＲＦ）長の決定
以前に記載した（Ｃａｗｔｈｏｎ、Ｒ．Ｍ．  （２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０，ｅ４７）ように、平均ＴＲＦ長を２つ組で決定した。手短に言えば、ＤＮＡをＨａｅＩＩＩ制限酵素で消化して、消化した試料をＤＮＡサイズ標準物と混合してから、アガロースゲル電気泳動およびナイロンメンブレン上へのサザンブロットを行った。放射性テロメアのオリゴヌクレオチドプローブ（ＴＴＡＧＧＧ）７（配列番号１）によるブロットのハイブリダイゼーションおよびテロメアスメア画像のキャプチャーに続いて、ＤＮＡサイズ標準物に特異的な放射性プローブを用いてブロットを取り除いて、ハイブリダイズした。次いで、サイズ標準物の画像とテロメアスメアの画像を重ね合わせて、テロメアスメア内のサイズ間隔の位置を捜し出した。次いで、平均ＴＲＦ長をΣ（ＯＤｉ）／Σ（ＯＣｉ／Ｌｉ）として算出した。ここでＯＤｉは間隔ｉ内のバックグランド上の総放射活性であり、Ｌｉは塩基対内のｉの平均長である。
【０１２７】
結果
テロメアタンデム六量体のリピートに由来する固定長の産物を増幅するプライマー
相対的平均テロメア長は、テロメア六量体のリピートをハイブリダイズするプライマーを用いる定量ＰＣＲ法によって測定できる。平均テロメア長が増加すると、プライマーの結合部位の数が増加するからである。シングルプレックスＱＰＣＲ（１）によるテロメア長の測定のための我々のオリジナルのｔｅｌ１およびｔｅｌ２プライマーは双方とも、テロメアＤＮＡのタンデムリピートにそって複数の位置でプライムすることが可能である。したがって、これらのプライマーは種々のサイズの一連の産物を生成し、そのなかにはｓｃｇのアンプリコンの融解曲線に重なるのに十分に高い温度で融解するものもある。したがって、ｔｅｌ１およびｔｅｌ２がテロメアプライマーであるとき、ＭＭＱＰＣＲを成功させるために必要とされるように、二本鎖テロメアＰＣＲ産物からの任意の干渉シグナルなしで、ｓｃｇの二本鎖アンプリコンからのＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ蛍光シグナルを高温で「明確に」読み取ることは可能でない。
【０１２８】
この問題を解決するために、一対のテロメアプライマーを設計した。すなわちｔｅｌｇ、ＡＣＡＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴ（配列番号２）およびｔｅｌｅ、ＴＧＴＴＡＧＧＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号３）であり、これらは短い、固定長の産物を生成する（図１）。ｔｅｌｇだけは、天然のテロメアＤＮＡ配列にそってＤＮＡ合成をプライムすることができる。ｔｅｌｅプライマーは、その３’末端でミスマッチ塩基によって天然のテロメアＤＮＡをプライミングすることからブロックされる。しかし、ｔｅｌｅはｔｅｌｇプライマーの伸長産物の種々のストレッチにそってハイブリダイズすることができ、かつそれらのハイブリダイゼーションのまさに１つの配置がＤＮＡ合成のプライミングを可能にし、それによって単一の固定長の産物の生成を可能にする。これは、ｔｅｌｇおよびｔｅｌｅのプライマーの最後の３つの塩基が完全な相補性で重なるように、ｔｅｌｇ中の３’末端から３番目の塩基にヌクレオチド変化を導入することによって達成される。この重複は、ｔｅｌｇおよびｔｅｌｅの天然のプライマーに互いに効率的にプライムを与えることを可能にするには十分でなく、したがってプライマー二量体の形成は、テロメア長の定量化が起こる数サイクルにわたって検出できない。しかし、ｔｅｌｇ伸長産物をｔｅｌｅとハイブリダイズすると、この３つの塩基の重複は、ｔｅｌｅの３’末端がＤＮＡ合成を効率的にプライムすることができる部位のみになる。たとえば、米国特許公報第２００３／０１６２２６６号を参照されたい。したがって、結果として生じるＰＣＲ産物は固定長であり、かつ３つの塩基はそれを生成するのに用いた２つのプライマーの長さの計よりも短い。この産物の急な融解曲線（図２での緑の曲線）は、特定の固定長の産物の形成と一致し、および６％ゲルでのアガロースゲル電気泳動は、予想された７９ｂｐ産物だけを示した（データ図示せず）。また、図２が示しているのは、テロメアＰＣＲ産物の融解曲線がアルブミンＰＣＲ産物の融解曲線（図２での青の曲線）から十分に離れており、アルブミンからのＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩシグナルがテロメアＰＣＲ産物を完全に融解する温度で読み取れることを可能にしていることである。
【０１２９】
単一コピー遺伝子（アルブミンとβ−グロビン）用プライマーの設計
ｓｃｇアンプリコンがテロメアアンプリコンよりもかなり高い温度で融解するようにプライマーを設計した。その結果、ｓｃｇアンプリコンからの蛍光シグナルは、テロメアアンプリコンを完全に融解するに十分に高い温度で得ることが可能になり、シグナルへのその寄与を排除するが、ｓｃｇアンプリコン二本鎖を維持するのに十分低い温度であり、したがってＳＴＢＲ  ＧｒｅｅｎＩを結合できる。
【０１３０】
ｓｃｇアルブミンを増幅するためのプライマーは、ａｌｂｕ：ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧａａａｔｇｃｔｇｃａｃａｇａａｔｃｃｔｔｇ（配列番号４）およびａｌｂｄ：ＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧｇａａａａｇｃａｔｇｇｔｃｇｃｃｔｇｔｔ（配列番号５）である。予測される産物のサイズは９８ｂｐである。ｓｃｇ  β−グロビンを増幅するためのプライマーは、ｈｂｇｕ：ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧｃｔｔｃａｔｃｃａｃｇｔｔｃａｃｃｔｔｇ（配列番号６）およびｈｂｇｄ：ＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧｇａｇｇａｇａａｇｔｃｔｇｃｃｇｔｔ（配列番号７）である。予測される産物のサイズは、１０６ｂｐである。大文字で書いた塩基は、非鋳型５’タグ配列であり、結果としてもたらすＰＣＲ産物に極めて高い融解温度を与える。アルブミンプライマー用のこの５’タグ配列はβ−グロビンプライマーで用いたものと同一であることに留意されたい。各プライマーセット中の２つのＧＣリッチ５’タグ付け配列は、互いに全く異なることにも留意されたい。これらの配列が同じ場合、増幅を停止するヘアピン形成がＰＣＲ作用中に起こる可能性があるだろう。
【０１３１】
遺伝子を点変異のために変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（２）によってスクリーニングするとき、ＰＣＲ産物の一方の末端の融解温度を上げるためにＧＣクランプをＰＣＲプライマーの５’末端に付加することはよく行われる。ｓｃｇを増幅するために用いる両プライマーに５’ＧＣクランプを添加して、標的ゲノム配列を短く保つことによって、極めて高い融解温度を有するＰＣＲ産物が生成される。二重にＧＣクランプしたアルブミンＰＣＲ産物のＴｍが９１℃であることを図２は示している。６％ゲルでのアガロースゲル電気泳動は、予想されたサイズの産物だけを示した。二重にＧＣクランプしたβ−グロビンＰＣＲ産物に対しても同様の結果が得られた（データは図示せず）。
【０１３２】
また、５’ＧＣクランプは、ｓｃｇを増幅するために用いる両プライマーが、それらのアンプリコンに対して、テロメアＰＣＲ産物のＴｍよりも高いＴｍを確実に有するようにする。この設計の利点を後述する（熱プロファイルおよびサイクリング設計を参照されたい）。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒプログラム（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）を使用した解析では、４つのｓｃｇプライマー（ａｌｂｕ、ａｌｂｄ、ｈｂｇｕ、およびｈｂｇｄ）のすべてが本研究で用いるバッファ組成物で８４℃より高いＴｍを有することを示した。
【０１３３】
熱プロファイルおよびサイクリング設計
熱サイクリングプロトコールのステージ１では、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを加熱によって活性化して、ゲノムＤＮＡ試料を変性させる。ステージ２では、プライマー二量体ＰＣＲ産物（１）の形成および増幅を抑制する、意図的に導入した変異がそれらのプライマーに存在するため、テロメアプライマーを効果的にアニールして伸長するために比較的低い温度での２サイクルが必要とされる。
【０１３４】
ステージ３では、従来のＱＰＣＲに特有であるシグナル取得による変性、アニーリング、および伸長のステップによる繰り返しサイクルを開始する。これらのサイクルの後に、従来にはない２つのステップ；第２のシグナル取得による、８４℃で１０秒間のインキュベーションと、８８℃で１５秒間のインキュベーションが続く。８４℃までの加熱により、初期の増幅テロメア産物を融解させ、ｓｃｇＰＣＲ産物で作用するためのＤＮＡポリメラーゼ（二本鎖ＤＮＡを結合するが、一本鎖ＤＮＡを結合しない、参照番号３）を放出させ、ｓｃｇプライマーの高いアニーリング温度（８４℃を超える）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼが８４℃でも強い活性を維持する能力のためにＤＮＡ合成が進行できる（４）。
【０１３５】
従来のマルチプレックスＰＣＲでは、初期の産物によるＤＮＡポリメラーゼの上述の結合のため、高濃度の最も早い増幅産物は、多くない鋳型の後の増幅が抑制されることが多い。通常の推奨される解決策は、産物がより少なく形成され、非結合で自由なＤＮＡポィメラーゼを十分に残し、多くない鋳型を連続してコピーできるように、より多い標的配列のためのプライマー濃度を限定することである。しかし、プライマー濃度を低下させると、ＰＣＲ効率の低下、または標的配列増幅の完全な失敗さえ生じることが多い。効率の低下は、複写物間のＣｔ値の大きなばらつきの一因にもなる。ＭＭＱＰＣＲにおけるこの８４℃インキュベーションステップは、第２の産物を効率的に合成できるように、より多い鋳型のためのプライマー濃度を限定する必要性を排除し、対応する高濃度のＰＣＲ産物からでもポリメラーゼを放出させる。
【０１３６】
第２のシグナル取得ステップのために８８℃までさらに加熱することで、テロメアＰＣＲ産物を完全に融解し、蓄積するｓｃｇアンプリコンからの上昇するＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ蛍光シグナルの収集を妨げることが確実にできなくする。
【０１３７】
テロメア長の自然の範囲にわたるＭＭＱＰＣＲ法の有効性
図３は、高平均、中間平均、または低平均のテロメア長（テロメア長の約３倍の範囲）を有することを以前に示した３つのヒトゲノムＤＮＡの参照試料に対して２つの異なる温度（７４℃と８８℃）で収集した増幅曲線を示す。図２に示した融解プロファイルに基づいて、７４℃での読み取りはテロメアおよびアルブミンの両ＰＣＲ産物を検出するはずであり、８８℃での読み取りはアルブミン産物だけを検出するはずである。しかし、各ＤＮＡ試料中のアルブミン鋳型はテロメア鋳型よりコピー数がはるかに低いので、対応するアルブミンシグナルが依然としてベースラインにあったときにすべて収集した７４℃のＣｔｓは、テロメア増幅だけの目安である。（テロメアプライマーなしの反応物では、単一コピー遺伝子シグナルは、７４℃で収集されようと８８℃で収集されようと基本的には同じサイクル数でベースラインを超えて上昇することが確認されている。）最も短いテロメア（およそ１，６７０ｂｐ）、したがって最も右方シフトする増幅曲線（青の曲線）、を有する試料でも、アルブミン遺伝子の増幅シグナルが依然としてベースラインにあるときのサイクル数で閾値を越える。年齢５歳〜９４歳の被験者からの９５例の全血ＤＮＡ試料についての本研究では、各試料のｓｃｇ増幅シグナルは、対応するテロメアシグナルのＣｔを収集したときベースラインにあった。
【０１３８】
テロメアおよび単一コピー遺伝子のための別個の標準曲線
図４は、１つはテロメアリピートのための、もう１つはｓｃｇアルブミンのための２つの独立した標準曲線を示す。これらはサイクリングプロトコールのステージ３の各サイクルにおいて、２つの異なる温度（テロメアシグナルの場合は７４℃、アルブミンシグナルの場合は８８℃）でＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ蛍光シグナルを得ることによって標準ＤＮＡに対して決定した。この同じＤＮＡ試料を用いて、本研究でのそれぞれ別のＰＣＲ反応プレートに対して２つの標準曲線を作成した。ＤＮＡ濃度対サイクル閾値のこの片対数プロットでは、両曲線は８１倍のＤＮＡ濃度範囲にわたり線形になる。テロメアおよびアルブミンの両増幅のＰＣＲ効率は、９０％を超え、ほぼ等しかった。この特定の標準ＤＮＡ試料の場合、各ＤＮＡ濃度でのアルブミンのＣｔは、サイクリングにおいてテロメアリピートのＣｔよりもほぼ６サイクル後に生じた。
【０１３９】
図３では、７４℃で観察されたＣｔにおける差がテロメア長における差だけに反映するように、基本的に同量のＤＮＡを反応物にインプットした（ＯＤ２６０ＵＶ分光光度計の目盛りに基づく）。（通常の実行では、ＴシグナルをＳシグナルに標準化する手順がこの問題に対応するので、インプットＤＮＡのための実験的試料を正確にマッチさせる必要はない。広範なインプットＤＮＡの量は、ＴおよびＳの両シグナルがＴおよびＳの標準曲線の範囲内に入っている限り、許容される。図４を参照されたい。）この単一コピー遺伝子（アルブミン遺伝子）のみが８８℃で収集されるので、この温度で得られる３つの増幅曲線がほぼ完全に重複することが予想される。下部パネルは、アルブミンシグナルが依然としてベースラインにあるとき、テロメアシグナルのサイクル閾値が７４℃で収集できることを示す。（テロメアプライマーなしの反応物では、単一コピー遺伝子シグナルは、７４℃で収集されようと８８℃で収集されようと基本的には同じサイクル数でベースラインを超えて上昇することが確認されている。また、単一コピー遺伝子プライマーなしの反応物では、図２に示した融解プロファイルに基づいて予想されるように、８８℃で読み取るとき、ＰＣＲのラン全体にわたりテロメア増幅シグナルは完全に変化がないまたはゼロであることが確認されている。）Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙｉＱソフトウェアは１回にただ１つの温度の増幅曲線を表示することができるので、７４℃および８８℃の読み取りの表示は重ねられていた。
【０１４０】
平均ＴＲＦ長と相対的Ｔ／Ｓ比の相互関係
テロメア長の測定へのＭＭＱＰＣＲアプローチの有効性を試験するために、年齢５歳〜９４歳の９５名の個人に由来する全血ＤＮＡ試料で相対的テロメア長（平均Ｔ／Ｓ比）をＭＭＱＰＣＲによって３つ組で測定し、従来のサザンブロットアプローチ（１）によって測定されたものと同じこれらのＤＮＡ試料の平均末端制限酵素断片（ＴＲＦ）と比べた。図５は、これらの極めて異なる技法によって測定された相対的テロメア長における強い相互関係を示す（Ｒ２＝０．８４４）。この相互関係は、シングルプレックスＱＰＣＲによってこれらの同じ試料で測定されたＴ／Ｓ比対それらの平均ＴＲＦ長について以前に報告された（１）ように、その相互関係よりも高い（Ｒ２＝０．６７７）。
【０１４１】
Ｔ／Ｓ比測定の再現性
ＭＭＱＰＣＲによるＴ／Ｓ測定のアッセイ内の再現性を調べるために、Ｔ／Ｓに対する変動係数（平均値で割った標準偏差）を、ｓｃｇとしてアルブミンを使用した単回のＭＭＱＰＣＲアッセイにおいて、３つ組でアッセイした９５例のＤＮＡ試料それぞれに対して決定した。変異係数のアッセイ内幾何平均は、５．２２％であった。アッセイ間の再現性を調べるために、同じ９５例のＤＮＡ試料でＴ／Ｓの測定を再び３つ組で、別の日に繰り返した。アッセイをこれら２回別個に実行した際に、各ＤＮＡ試料が使用した特定のＭｙｉＱ  ＰＣＲ装置および反応ウェルの位置が異なるように注意して行った。図６は、第１および第２のランによって決定した平均Ｔ／Ｓ比間の強い相関を示す（Ｒ２＝０．９１）。データを通して線形回帰線の勾配は予想どおり、ほぼ単一であり、ほぼゼロのｙ切片であった。これら２回の別個のランからの９５対の平均Ｔ／Ｓ値のそれぞれの変異係数を決定した。変異係数のアッセイ間の幾何平均は、３．１３％であった。
【０１４２】
使用した単一コピー遺伝子のＴ／Ｓ比は非依存的である
ｓｃｇとしてアルブミンの代わりにβ−グロビンを使用することで、明らかに相対的テロメア長を変化させるかどうかを試験するために、アルブミンプライマーの代わりにβ−グロビンプライマーを用いて、同じ９５例のＤＮＡ試料でのＴ／Ｓ測定を三重測定で、２回の別々のランで繰り返した。図７は、ｓｃｇとしてアルブミンを用いた２回のランからの平均Ｔ／Ｓ値（ｘ軸）に対してｓｃｇとしてβ−グロビンを用いた２回のランからの平均Ｔ／Ｓ値（ｙ軸）をプロットしている。アルブミンを用いて得たＴ／Ｓ値は、β−グロビンを用いて得たＴ／Ｓ値と一致し、高い相関を示した（Ｒ２＝０．９３４）。
【０１４３】
記載した単色マルチプレックス定量ＰＣＲ法によって９５例のＤＮＡ試料で測定した相対的テロメア長（Ｔ／Ｓ比）は、サザンブロットによって測定した相対的末端制限断片と極めて高い相関を示した。元のシングルプレックスＱＰＣＲアッセイによってこれらの同じ試料で測定したＴ／Ｓ比は、ＴＲＦ長ほど高い相関を示さなかった。これらの結果は、ＭＭＱＰＣＲによるテロメア長の測定がシングルプレックスＱＰＣＲによるテロメア長測定よりも正確であることを示唆している。さらに、ＭＭＱＰＣＲによって得られたＴ／Ｓ結果は、アッセイの別個のランにおいて高度に再現可能であった。テロメアＱＰＣＲアッセイを多重化することでスループットを高めかつテロメア長の疫学的研究コストを下げることを可能にする。さらに、高価なオーダーメイドの多色蛍光プローブを合成または購入しなければならないマルチプレックスアッセイへの転換に付随する通常の追加費用も、この方法を採用することで避けることができる。
【０１４４】
ＭＭＱＰＣＲは、非常に異なるコピー数で天然に存在する、たとえばｍｔＤＮＡコピー対単一コピー遺伝子、ｒＤＮＡコピー対単一コピー遺伝子、およびＡＩｕＤＮＡコピー対単一コピー遺伝子などＤＮＡ鋳型の多数の対についての研究に容易に適応させることができる。同様に、極めて異なるコピー数を有するＲＮＡ種の対をｃＤＮＡに逆転写した後で本方法によって定量化することも可能である。標的の大部分の対の場合、わずかに付加的なガイドラインによって、プライマー設計の標準原則を理解することができる。このガイドラインとは、より多い鋳型用のプライマーは、そのＴｍが好適に低く（＜８３℃）になるように、比較的に短い産物（４０〜８０ｂｐ）を生成することも可能であり、多くない鋳型用のプライマーは、そのＴｍが十分に高く（＞９０℃）なるように、本明細書に示した５’ＧＣクランプ（または同様のもの）を含有し、短い産物を生成することも可能である、というガイドラインである。さらに、より多い鋳型を増幅するために用いるプライマー濃度を限定しなければならない従来のマルチプレックスＱＰＣＲでは、妨害および付随する障害は、ＭＭＱＰＣＲでは排除される。本明細書でのｔｅｌｇおよびｔｅｌｅのテロメアプライマイーの設計上の特徴を、プライマーによって短いタンデムリピートを増幅し、これらのリピートとハイブリダイズするために使用した。ＭＭＱＰＣＲによるテロメア長の測定に加えて、ｍｔＤＮＡ対ｎＤＮＡの比をこのアプローチによって測定した。このアプローチは功を奏した。同様のコピー数を有する鋳型対でも、１つのアンプリコンの増幅を遅らせる、プラマーおよび熱プロファイルの設計を適用することによるこのアプローチによって研究を行うことも可能である。
【０１４５】
実施例２−同様に多い２つの標的核酸のＭＭＱＰＣＲ法  ２つの標的核酸が同様に大量にある現象では、ＭＭＱＰＣＲ法を用いることができる。これを行うために、１つの標的核酸の増幅を人為的に遅らせ、一方ではもう１つの標的核酸の増幅を続けることができるようにする。たとえば、第１および第２の標的核酸が同様に多いとき、実施例１に記載した組成物および方法を用いて第１の標的核酸のコピー数を決定し、次いで第２の標的核酸のコピー数を決定する。これを行うために、提供されたＰＣＲサイクリングパラメーターを除いた、上述の方法を用いる。熱サイクルプロファイルは、ステージ１：９５℃で１５分間、ステージ２：９４℃で１５秒間、４９℃で１５秒間の２サイクル、ステージ３：８８℃で１５秒間、６２℃で１０秒間、７４℃で１５秒間を２〜６サイクル、ステージ４：９４℃で１５秒間、６２℃で１０秒間、７４℃で１５秒間のシグナル取得、８４℃で１０秒間、８８℃で１５秒間のシグナル取得を３２サイクルであり得る。
【０１４６】
上述のステージ３では、８８℃で完全に融解するためにテロメア産物の指数関数的増幅が可能となるであろう。しかし、単一コピー遺伝子の産物は、８８℃で完全に二本鎖化されるの、このステージ３のサイクリングで、単一コピー遺伝子プライマーはこの単一コピー遺伝子の産物にのって増幅することができない。
【０１４７】
別段定義されない限り、本明細書で用いた技術用語および科学用語は、開示した方法および組成物が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細に記載した方法および材料と同様のまたは同等のいかなるものも、本方法および組成物の実行または試験において用いることが可能であるが、特に有用な方法、装置、および材料は記載したとおりである。本明細書で引用した刊行物およびそれらが引用する材料を、特に参照によって援用する。本発明が先行発明を理由にこの開示に先行する権利を有しないことの承認として解釈すべきものは本明細書には含まれていない。
【０１４８】
当業者は、ただ通例の実験を用いることで本明細書に記載した方法および組成物の具体的な実施形態と同等である多くのものを認識し、または確認することができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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