(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラポックスウイルス、および狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含み、異種ＤＮＡがパラポックスウイルスのゲノムに挿入されており、異種ＤＮＡが狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含み、パラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株である、組換えパラポックスウイルス。
【請求項２】
異種ＤＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項３】
異種ＤＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項４】
異種ＤＮＡが、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内に挿入されている、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項５】
異種ＤＮＡが、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列内に挿入されている、請求項４に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項６】
パラポックスウイルスがＡＴＣＣ（登録商標）寄託番号ＰＴＡ−１１６６２のヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧである、請求項１に記載のパラポックスウイルス。
【請求項７】
請求項１に記載の組換えパラポックスウイルスを作製する方法であって、異種ＤＮＡをヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のゲノムに挿入することを含む方法。
【請求項８】
異種ＤＮＡが狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異種ＤＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
組換えパラポックスウイルスがＡＴＣＣ（登録商標）寄託番号ＰＴＡ−１１６６２のヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えパラポックスウイルス、およびキャリヤーを含む、免疫原組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の免疫原組成物を調製する方法であって、組換えパラポックスウイルスをキャリヤーと組み合わせることを含む方法。
【請求項１３】
狂犬病の治療または予防に使用される請求項１１に記載の免疫原組成物。
【請求項１４】
動物において狂犬病ウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬の調製における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。
【請求項１５】
感染動物をワクチン接種動物から判別するための生体外のアッセイにおける、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、狂犬病ウイルス（ＲＶ）由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルス、ならびに免疫原組成物およびワクチンにおけるそれらの使用に関する。本発明はまた、狂犬病ウイルスにより引き起こされる疾患に対してワクチン接種し、それらを治療し、または予防するための方法に関する。本発明はさらに、診断法のための組換えパラポックスウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルス科(Poxviridae)のウイルスは、卵形のかなり大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである。パラポックスウイルス属(Parapoxvirus)（ＰＰＶ）はこれらのウイルスに含まれる。それらは、ほぼ長さ２２０〜３００ｎｍ、幅１４０〜１７０ｎｍの大きさである。それらは、それらを他のポックスウイルスと区別する独特のらせんコートを備えている。
【０００３】
ＰＰＶは３つの異なる種に分類されている。しかし、これらのウイルスがパラポックスウイルス属内の自律種であるか、あるいはそれらが同一種であるかは、まだ解明されていない。第１の種、ヒツジパラポックスウイルス(Parapoxvirus ovis)はこの属の原型であると考えられている。それは、接触伝染性膿疱ウイルス(ecthyma contagiosum virus)、接触伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス(contagious pustular dermatitis virus)、またはオルフウイルス（羊鵞口瘡ウイルス）(orf virus)とも呼ばれる。第２のウシパラポックスウイルス(Parapoxvirus bovis)１は、ウシ丘疹性口内炎ウイルス(bovine papular stomatitis virusまたはstomatitis papulosa virus)とも呼ばれる。第３のウシパラポックスウイルス２は、乳房ポックスウイルス(udderpoxvirus)、パラワクシニアウイルス(paravaccinia virus)、偽牛痘ウイルス(pseudocowpox virus)、または搾乳者小結節ウイルス(milker's nodule virus)とも呼ばれる。
【０００４】
パラポックスウイルス種は反芻動物に固有である。ＰＰＶは、アカシカ(red deer)、トナカイ(reindeer)、アカリス(red squirrel)、およびゴマフアザラシ((harbor seal)に発見された。ＰＰＶ感染は、動物およびヒトの両方に局所疾患を引き起こす可能性がある。ＰＰＶ種の人獣共通伝染性宿主(zoonotic host)はヒツジ、ヤギ、およびウシである。それらはヒトにおいて感染動物との直接接触により、局所表皮領域と反応して感染症を引き起こし、それは瘢痕なしに治癒する。ワクチンなどの予防措置を用いてそれらの疾患を抑制することができる。
【０００５】
アビポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、カプリポックスウイルス、豚痘ウイルス、またはワクシニアウイルスを基礎にして外来遺伝情報を発現させるためのベクターは、これまでに記載されている(参照：US 5,942,235およびUS 7,094,412)。パラポックスウイルスは、ベクターワクチンに使用できる別の候補である。しかし、個々の属のポックスウイルス間の形態上、構造上および遺伝上の相異のため、これらのポックスウイルスに用いる方法はパラポックスウイルスには使用できない。そのような相異の一例はＯＲＦＶがチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を欠如することであり、これは種々のオルソポックスウイルスにおける組換え体の選択に利用される。また、あるポックスウイルスは表面タンパク質であるヘマグルチニンにより仲介される赤血球凝集能力をもち、一方、パラポックスウイルスはこれをもたない。
【０００６】
ＰＰＶは脊椎動物において全身（非特異的）免疫反応を刺激するので、免疫調節作用をもつことができる。それらは動物の全身抵抗性を増強するための動物用医薬に効果的に用いられている。それらを対応（同一）抗原および／または非対応（異種）抗原と組み合わせて、急速な非−病原体特異的作用だけでなく数ヶ月間ないし数年間持続する病原体特異的作用をもつワクチンを得ることができる。
【０００７】
ヒツジパラポックスウイルスは、US Patent 6,365,393およびRziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145に記載されるように、これまでベクターとして用いられている。それは、ベクターとして用いた場合、きわめて狭い宿主範囲、全身感染性の欠如、短期のベクター特異的免疫性（反復免疫化が可能）、早期ワクチン接種（免疫の誘導を母体抗体の存在下で開始できる）、および有益な免疫調節特性を含めた、顕著な利点をもたらす。本発明は、パラポックスウイルスを狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡのためのベクターとして使用することに関する。
【０００８】
ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株は高度に弱毒化された株であって、細胞培養において野生型ウイルスのものに匹敵する力価で増殖させることができる。それは、感染性ベクターウイルスの複製を支持する宿主（たとえば、ヒツジおよびヤギ）および支持しない宿主（たとえば、イヌ、ブタ、ウマ、マウス、およびラット）の両方において卓越した免疫刺激特性をもつ。Ｚｙｌｅｘｉｓ（登録商標）（以前はＢａｙｐａｍｕｎｅ（登録商標）として知られていた）、すなわちＤ１７０１株由来の化学不活性化ヒツジパラポックスウイルスの製剤が、動物の感染性疾患の予防処置、中間処置(metaphylaxis)および治療処置のために、またストレス誘発性疾患のために用いられる。
【０００９】
狂犬病ウイルス（ＲＶ）であるニューロトロピック・リッサウイルス(Neurotropic lyssavirus)は、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)科のメンバーである。それはヒトおよび他の哺乳動物に致死性疾患を引き起こす向神経性ウイルスである。狂犬病は狂犬病の動物が咬むことにより伝染する場合が最も多く、その動物の唾液を介して伝染が起きる。米国疾病対策および防止センター(United States Centers for Disease Control and Prevention)（ＣＤＣ）に毎年報告される大部分の狂犬病の症例は、アライグマ、スカンク、コウモリおよびキツネなどの野生動物に起きている。狂犬病は、特に開発途上国ではなお罹患率の高い疾患である。毎年約５０，０００人が狂犬病により死亡している。ヒトに対する感染の最高リスクは狂犬病の動物からのものである。
【００１０】
狂犬病ウイルスは、５種類のタンパク質をコードする一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスである：核タンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、およびポリメラーゼ（Ｌ）。平均してほぼ１８０ｎｍの長さおよび７５ｎｍの幅をもつ成熟した砲弾形ウイルスは、リボ核タンパク質コア、タンパク質コート、および脂質エンベロープをもつ。長さ約５〜１０ｎｍおよび直径約３ｎｍである糖タンパク質の突起がウイルスの外面を覆っている。それらは約４００の三量体形の密に配列したスパイクを形成する。
【００１１】
ＲＶは神経組織に対して高い親和性をもつ。その理由は分かっていない。しかし、狂犬病ウイルスＧタンパク質がアセチルコリン受容体（神経伝達物質受容体）に結合できるからであろう。ＲＶがウイルスＧタンパク質を介して宿主細胞に結合した後、ウイルスは貪食(engulfment)により細胞内へ吸収される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】US 5,942,235
【特許文献２】US 7,094,412
【特許文献３】US Patent 6,365,393
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、一般に組換えパラポックスウイルス、特にヒツジパラポックスウイルス(Parapoxvirus ovis)（ＰＰＶＯ）に関する。組換えパラポックスウイルスは、狂犬病ウイルスに対する持続的な外来遺伝子特異的免疫だけでなく、急速な自然免疫応答を仲介するために用いられる。１態様において、組換えパラポックスウイルスは狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む。１態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株を含む。１態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ株を含む。
【００１５】
１態様において、組換えパラポックスウイルスは、狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む。１態様において、組換えパラポックスウイルスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも約９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。１態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内に挿入される。他の態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列内に挿入される。さらに他の態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧである。
【００１６】
本発明は、組換えパラポックスウイルスを作製する方法であって、異種ＤＮＡをパラポックスウイルスのゲノムに挿入することを含む方法を包含する。１態様において、この方法はヒツジパラポックスウイルスの使用を含む。１態様において、この方法はヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株の使用を含む。１態様において、この方法はＤ１７０１−Ｖの使用を含む。１態様において、この方法に用いる異種ＤＮＡは、狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む。１態様において、この方法に用いる異種ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも約９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。この方法の１態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内に挿入される。他の態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列内に挿入される。１態様において、この方法はヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの作製を含む。
【００１７】
本発明は、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルス、およびキャリヤーを含む、免疫原組成物を包含する。本発明は、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスとキャリヤーを組み合わせることを含む、免疫原組成物の調製方法を包含する。本発明はまた、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルス、およびキャリヤーを含む、ワクチンを包含する。本発明は、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスとキャリヤーを組み合わせることを含む、ワクチンの調製方法を包含する。これらのある態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスを含み、一方、ある態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株を含み、他の態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ株を含む。これらのある態様において、異種ＤＮＡは狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含み、一方、他の態様において、異種ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも約９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。これらのある態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内に挿入される。これらの他の態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列内に挿入される。これらのある態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧである。
【００１８】
本発明は、動物において狂犬病ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、その動物に、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスおよびキャリヤーを含む、免疫学的有効量の免疫原組成物を投与することを含む方法を包含する。本発明は、動物を狂犬病ウイルスに対してワクチン接種する方法であって、その動物に、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスおよびキャリヤーを含む、療法有効量のワクチン組成物を投与することを含む方法を包含する。本発明は、動物において狂犬病ウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬の調製における、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの使用を包含する。本発明は、動物において狂犬病ウイルスにしてワクチン接種するための医薬の調製における、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの使用を包含する。これらのある態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスを含み、一方、ある態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株を含み、他の態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ株を含む。これらのある態様において、異種ＤＮＡは狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含み、一方、他の態様において、異種ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも約９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。これらのある態様において、異種ＤＮＡはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内に挿入される。これらの他の態様において、異種ＤＮＡは、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列内に挿入される。これらのある態様において、組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧである。これらのある態様において、抗−Ｇタンパク質特異的防御免疫応答が誘導される。他のそのような態様において、免疫応答は抗−Ｇタンパク質血清抗体の誘導である。さらに他のそのような態様において、誘導により０．５国際単位／ｍｌを超える抗体価が得られる。
【００１９】
本発明は、動物に存在するパラポックスウイルスの起源を判定する方法を提供する。本明細書に記載するパラポックスウイルスは、それらのゲノム組成および発現するタンパク質の両方において、野生型株から区別する(distinguish)ことができる。そのような区別により、ワクチン接種動物と感染動物を識別(distcrimination)できる。本発明は、感染動物をワクチン接種動物から判別する(differetiation of infected from vaccinated animal)（ＤＩＶＡ）ためのアッセイにおける、本明細書に教示する組換えパラポックスウイルスの使用を包含する。１態様において、組換えヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをＤＩＶＡアッセイに使用する。
【００２０】
これらおよび他の態様は、以下の詳細な記述により開示および包括される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
添付の図面を参照することによって本発明をより良く理解できるであろう：
【図１】図１は、ｐｄＶ−ＲａｂＧの構造を示す。狂犬病ウイルスのＧ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐｄＶ−Ｒｅｃ１の多重クローニング部位（四角で囲んだ塩基）中へ挿入すると、プラスミドｐｄＶ−ＲａｂＧ（７．７ｋｂｐのサイズ）が得られる。プライマーＯＲＦ３２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＯＲＦ３１Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の位置を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を図中に示す；  略号：Ｓｍ＝ＳｍａＩ、Ｈ３＝ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＶ＝ＥｃｏＲＶ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｋ＝ＫｐｎＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｓ＝ＳａｌＩ。Ｆ９ＬおよびＯＲＦ３は、ＰＰＶＯ遺伝子Ｆ９Ｌ（ＯＲＦ  １３１）およびＯＲＦ３（ＯＲＦ  １３３）の存在を示す。Ｐｖｅｇｆは、挿入したＧ遺伝子の制御発現に用いたｖｅｇＦ−Ｅプロモーターの存在を示す。（Ｐ）および（Ｈ３）は、プラスミドｐＳＰＴ−１８のベクター主鎖の破壊されたＰｓｔＩ−およびＨｉｎｄＩＩＩ−制限部位を表わし、それぞれｐＳＰＴ−１８のＴ７およびＳＰ６プロモーターが指示されている。この図は正確な縮尺で描かれてはいない。
【図２】図２は、種々の用量のＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧで免疫化した後のウイルス中和血清抗体(neutralizing serum antibody)（ＳＮＴ）応答を示す。Ｃ５７／ＢＬ６マウスのグループ（各日につきｎ＝６または７）を、Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの単回投与で、１０７ＰＦＵ（プラーク形成単位）（Ａ）、１０６ＰＦＵ（Ｂ）、１０５ＰＦＵ（Ｃ）、および１０４ＰＦＵ（Ｄ）を用いて免疫化した。個々の血清を免疫化後１４日間、毎日採取した（１日目〜１４日目）。
【図３】図３は、免疫化したマウスの攻撃実験を示す。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに指示した単回量のＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧ（１０７〜１０４ＰＦＵ）を投与し、２週間後に少なくとも３，４００ＬＤ５０（４．８×１０５ＰＦＵ）のＲＶビルレント株ＣＶＳで頭蓋内攻撃感染させた。（Ａ）は各グループの個々の動物の生存曲線を示し、一方（Ｂ）には同じ結果を生存動物のパーセントでプロットした。
【図４】図４はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−狂犬病ウイルスのＧ遺伝子の全長コード領域の配列（１５７５ｎｔ）＋制限酵素分析（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）用のリンカー配列としての５’末端側の７ｎｔおよび３’末端側の６ｎｔを示す。
【図５Ａ】図５は、防御免疫に対するＴ細胞の役割を示す。ＣＤ４−Ｉｍｍは、ＣＤ４細胞に対して特異的な抗血清で免疫化したグループである。ＣＤ８−Ｉｍｍは、ＣＤ８−Ｔ細胞に対して特異的な抗血清で免疫化したグループである。ＣＤ４／８−Ｉｍｍは、ＣＤ４／ＣＤ８−Ｔ細胞に対して特異的な抗血清で免疫化したグループである。Ｉｍｍ  ＣはＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをワクチン接種した対照グループであり、これらには抗血清を投与しなかった。ｎｏｎ−Ｉｍｍ  Ｃは、Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをワクチン接種せず、かつ抗血清を投与しなかった対照グループである。“Ｄａｙｓ  ｐ．ｃｈａｌｌ”は、狂犬病ＣＶＳ株で攻撃した後の日数である。
【図５Ｂ】図５Ａの説明と同じ。
【図６】図６は、被曝後ワクチン接種でみられた防御を示す。ｎｏｎ−Ｉｍｍは、Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをワクチン接種しなかった対照グループである。Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧはＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをワクチン接種したグループである。ＣＶＳは狂犬病ビルレント株である。“Ｄａｙｓ  ｐ．ｃｈａｌｌ”は、ＲＶ  ＣＶＳ株で攻撃した後の日数である。
【図７】図７は、種々の被曝後ワクチン接種計画でみられた防御を示す。灰色の四角はマウスにＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをワクチン接種した日を示す。
【図８】図８は、免疫化後６日目および１３日目の血清抗体応答（血清中和抗体(serum neutralization antibody)ＳＮＴとして測定）を示す。マウスをＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧで、鞘膜内(intravaginally)（ｉ．ｖａｇ．）、乱刺法(scarification)、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または静脈内（ｉ．ｖ．）免疫化した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書中で別に定義しない限り、本発明に関して用いる科学用語および技術用語は当業者が一般に理解している意味をもつはずである。さらに、状況により別の要求がなされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
【００２３】
以下の定義は本発明の態様の記載に用いる用語に適用できる。それらは、本明細書に援用した各参考文献それぞれに矛盾する定義が含まれればそれらに代わるものである。
【００２４】
“約”または“ほぼ”は、測定可能な変数に関して用いる場合、その変数の指示した数値、およびその変数の指示した数値の実験誤差内（たとえば、平均の９５％信頼区間内）または指示した数値の１０パーセント以内（いずれか大きい方）にあるすべての数値を表わす；ただし、約を週の時間間隔に関して用いる場合、“約３週”は１７〜２５日であり、約２〜約４週は１０〜４０日である。
【００２５】
本明細書中で用いる“アジュバント”は、免疫応答の非特異的刺激物質として作用するいずれかの物質を表わす。アジュバントの詳細な記載については後記を参照。
【００２６】
本明細書中で用いる用語“動物”または“動物対象”は、狂犬病感染を受けやすいいずれかの動物を含み、これには家畜化されたものと野生の両方の哺乳動物が含まれる。
【００２７】
本明細書中で用いる“抗体”は、起源、調製方法または他の特性に関係なく、抗原結合部位を含むいずれかのポリペプチドである。それは、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、抗原に対する免疫応答の結果としてその抗原に特異的に結合するものを表わす。免疫グロブリンは、“定常”部および“可変”部をもつ“軽”および“重”ポリペプチド鎖から構成される血清タンパク質であり、定常部の組成に基づいてクラス分けされる（たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）。特定の抗原に“特異的”である抗体とは、その抗体の可変部が特異的抗原だけを認識して結合することを示す。抗体は、ポリクローナル混合物またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、天然源または組換え源からの無傷の免疫グロブリンであってもよく、あるいは無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。“抗体”は抗原結合タンパク質と言い換えることができ、これには抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で用いる用語“抗原”または“免疫原”は、対象に曝露した際にその抗原に対して特異的な免疫応答を誘導するであろう１以上のエピトープ（線状、コンホメーショナル、または両方）を含む分子を表わす。用語“抗原”は、弱毒化、不活性化または修飾した生存状態の細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物を表わすことができる。本明細書中で用いる用語“抗原”は、自然界でその抗原が随伴する全生物体から分離および孤立化したサブユニット抗原をも表わすことができる。抗原という用語は、抗体、たとえば抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープ(mimotope)をも表わすことができる。用語“抗原”は、たとえばＤＮＡ免疫化適用に際してインビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも表わすことができる。
【００２９】
“緩衝液”は、他の化学物質の濃度の変化を阻止する化学的系を意味する；たとえば、プロトンのドナーおよびアクセプターの系は、水素イオン濃度（ｐＨ）の著しい変化を阻止する緩衝液として作用する。緩衝液の他の例は、弱酸とそれの塩（共役塩基）または塩基とそれの塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【００３０】
本明細書中で用いる用語“細胞系”または“宿主細胞”は、その中でウイルスを複製または維持できる原核細胞または真核細胞を意味する。
【００３１】
“細胞性免疫応答”または“細胞仲介免疫応答”は、Ｔリンパ球もしくは他の白血球または両方により仲介されるものであり、活性化したＴ細胞、白血球または両方により産生されるサイトカイン、ケモカインおよびこれらに類する分子の産生を含む。
【００３２】
“保存的置換”は、当技術分野で定義され、当業者に既知であり、残基をそれらに関連する物理的特性に従って分類するものと認識されている。
【００３３】
本明細書中で用いる用語“培養物”は、他の種またはタイプの不存在下で増殖している細胞または微生物の集団を意味する。
【００３４】
本明細書中で用いる用語“ＤＩＶＡ”は、感染動物をワクチン接種動物から判別すること(Differentiate Infected from Vaccinated Animals)を意味する。
【００３５】
“用量”は、対象に投与するワクチンまたは免疫原組成物を表わす。“第１用量”または“初回抗原刺激ワクチン”は、０日目に投与するそのような組成物の用量を表わす。“第２用量”または“第３用量”または“年用量”は、第１用量に続いて投与するそのような組成物の量を表わし、それは第１用量と同一のワクチンまたは免疫原組成物であってもよく、同一でなくてもよい。
【００３６】
“エピトープ”は、Ｔ細胞受容体または特異的抗体に結合する、抗原の特異的部位であり、一般に約３個のアミノ酸残基から約２０個のアミノ酸残基までを含む。
【００３７】
“賦形剤”は、ワクチンまたは免疫原組成物のいずれかの成分であって、抗原ではないものを表わす。
【００３８】
“フラグメント”は、タンパク質または遺伝子のトランケートした部分を表わす。“機能性フラグメント”および“生物活性フラグメント”は、全長のタンパク質または遺伝子の生物学的特性を保持しているフラグメントを表わす。“免疫原活性フラグメント”は、免疫応答を誘発するフラグメントを表わす。
【００３９】
本明細書中で用いる用語“Ｇタンパク質”は、狂犬病ウイルスの外面を覆う糖タンパク質突起中のタンパク質を表わす。
【００４０】
本明細書中で用いる用語“異種”は、異なる種または株に由来することを意味する。
【００４１】
本明細書中で用いる用語“同種”は、同じ種または株に由来することを意味する。
【００４２】
“相同性”または“相同性パーセント”は、配列をアラインさせ、必要ならば最大の配列同一性を達成するためにギャップを導入し、かついずれかの保存的置換を配列同一性の一部として考慮した後に、比較配列中の残基と同一である、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントを表わす。
【００４３】
“体液性免疫応答”は、少なくとも一部が抗体により仲介されるものを表わす。
【００４４】
“同一性”または“同一性パーセント”は、両配列をアラインさせ、必要ならば最大の配列同一性を達成するためにギャップを導入した後に、いずれかの保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、比較配列中の残基と同一である、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントを表わす。
【００４５】
対象における“免疫応答”は、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性と細胞性の免疫応答の発生を表わす。免疫原応答は、診断目的または他の検査のために十分であればよく、あるいは病原体感染により引き起こされる疾患の徴候または症状（その健康に対する有害作用または合併症を含む）を阻止するのに適切であればよい。免疫応答は、通常は当技術分野で既知の標準的なイムノアッセイ法および中和アッセイ法を用いて判定できる。
【００４６】
本明細書中で用いる“免疫原性の”または“免疫原性”は、ある抗原に対して特異的に向けられた免疫応答を誘発する能力を表わす。
【００４７】
本明細書中で用いる用語“免疫原組成物”または“免疫原として有効な量”または“免疫応答を発生させるのに有効な量”は、単独でまたは医薬的に許容できるキャリヤーと共に動物に投与した際に、免疫系が認識して特異的免疫応答を発生させることができる（すなわち、免疫原活性をもつ）組成物または抗原を表わす。
【００４８】
本明細書中で用いる“分離された”は、それの自然環境から分離されて、単独で、または異種宿主細胞または染色体もしくはベクター（たとえば、プラスミド、ファージなど）中にあることを意味する。“分離された細菌”、“分離された嫌気性細菌”、“分離された細菌株”、“分離されたウイルス”、“分離されたウイルス株”などは、細菌またはウイルスが、たとえばそれの自然環境から分離された際に実質的に他の微生物を含まない組成物、たとえば培養中のものを表わす。“分離された”は、いずれか特に定めた物質、たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチドを記載する際に用いる場合、その物質−たとえばポリペプチドまたは核酸−が通常みられる元の細胞環境から分離された物質を表わす。したがって、例示にすぎないが、本明細書中で用いる場合、本発明のポリヌクレオチドで構築した組換え細胞系は“分離された”核酸を利用する。あるいは、特定のタンパク質または特異的な免疫原フラグメントをワクチンまたは他の組成物として権利請求または使用する場合、それは同定され、分離され、かつ自然界で存在する可能性がある状態と比較してある程度は精製されているので、分離されているとみなされる。そのタンパク質またはその特異的な免疫原フラグメントが、その抗原を産生する組換え細菌または真核細胞発現ベクターにおいて産生されるならば、それは分離されたタンパク質または核酸として存在するとみなされる。たとえば、ポリヌクレオチドを用いて構築された組換え細胞系は“分離された”核酸を利用する。
【００４９】
“医薬”は、疾患の予防、治癒もしくは改善、またはある生理的状態もしくは発症の予防に有用な、いずれかの作用薬を表わす。
【００５０】
用語“感染多重度”（ＭＯＩ）は、細胞当たりの生物数の比率を表わし、それはその感染に使用する予定の接種量の詳細を示す。
【００５１】
本明細書中で用いる用語“パラポックスウイルス”、“パラポックスウイルス株”は、ポックスウイルス科、パラポックスウイルス属に属するウイルスを表わす。
【００５２】
本明細書中で用いる用語“ヒツジパラポックスウイルス”および“パラポックスウイルスＯＲＦＶ”は、ポックスウイルス科、パラポックスウイルス属、ヒツジパラポックスウイルス種に属するウイルスを表わす。これらのウイルスは、接触伝染性膿疱ウイルス、接触伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、またはオルフウイルス（羊鵞口瘡ウイルス）とも呼ばれる。それらは、それらを他のポックスウイルスと区別する独特のらせんコートを備えている。
【００５３】
用語“ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株”は、US Patent 6,365,393（本明細書に援用する）に記載されるウイルスを表わす。“ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ株”は、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株をサル細胞系Ｖｅｒｏに適応させたものを表わす。
【００５４】
“非経口投与”は、消化管を含まない経路を介して、または経路により、ワクチンなどの物質を対象の体内へ導入することを表わす。非経口投与には、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、および静脈内投与が含まれる。
【００５５】
本明細書中で用いる用語“病原体”または“病原性微生物”は、宿主動物に疾患、疾病、または異常な状態を誘発または発生させる能力をもつ微生物−たとえば狂犬病ウイルス−を意味する。
【００５６】
“医薬的に許容できる”は、適正な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに対象の組織と接触させて使用するのに適し、妥当な損益比に相応し、かつそれらの目的用途に有効である物質を表わす。
【００５７】
本明細書中で用いる用語“ポックスウイルス”は、ポックスウイルス科に属するウイルスを表わす。これらのウイルスは、卵形のかなり大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである。
【００５８】
本明細書中で用いる用語“ポリヌクレオチド”または“ポリヌクレオチド分子”は、鎖状に共有結合したヌクレオチドモノマーから構成される有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は異なる生物学的機能をもつポリヌクレオチドの例である。
【００５９】
本明細書中で用いる用語“阻止する”、“阻止すること”“阻止”などは、微生物の複製を阻害し、微生物の伝播を阻害し、または微生物がそれの宿主内に定着するのを阻害することを意味する。本明細書中で用いるこれらの用語などは、感染症の１以上の徴候または症状の阻害または遮断も意味することができる。微生物負荷が軽減すれば、その処置は治療とみなされる。
【００６０】
本明細書中でワクチンまたは他の組成物に関して用いる“防御”、“防御すること”などは、ワクチンまたは組成物中に用いた抗原（単数または複数）が由来する微生物により引き起こされる疾患の症状をそのワクチンまたは組成物が阻止または軽減することを意味する。用語“防御”、“防御すること”などは、ワクチンまたは組成物を用いて、対象に既に存在する疾患またはその疾患の１以上の症状を療法処置できることをも意味する。
【００６１】
用語“狂犬病ウイルス”は、ラブドウイルス科のメンバーであるニューロトロピック・リッサウイルスを表わす。それは、それの外面に糖タンパク質の突起をもつ一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスである。
【００６２】
“組換えＰＰＶ”または“組換えＰＰＶ”は、それらのゲノム中に挿入および／または欠失をもつＰＰＶである。それらの挿入および欠失は、分子生物学的方法を用いて作製される。
【００６３】
“種相同体”には、２以上の異なる種にみられる遺伝子であって、実質的なポリヌクレオチド配列相同性をもち、かつ同一または類似の生物学的機能および／または特性をもつものが含まれる。好ましくは、種相同性を示すポリヌクレオチド配列は、たとえば本明細書に記載する中等度の緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ同一または類似の生物活性および／または特性をもつであろう。他の観点において、種相同性を示すポリヌクレオチドは、約６０％を超える配列相同性、約７０％を超える配列相同性、約８０％を超える配列相同性、約９０％を超える配列相同性、約９５％を超える配列相同性、約９６％を超える配列相同性、約９７％を超える配列相同性、約９８％を超える配列相同性、約９９％を超える配列相同性をもつであろう。
【００６４】
用語“特異的結合”、“特異的に結合する”などは、２以上の分子が生理的またはアッセイ条件下で測定できる選択的な複合体を形成することと定義される。抗体または他の阻害薬は、適切に選択した条件下でそのような結合が実質的に阻害されず、一方では同時に非特異的結合が阻害されれば、あるタンパク質に“特異的に結合する”と言われる。特異的結合は、その化合物またはタンパク質に対して高い親和性を特徴とし、かつ選択的である。非特異的結合は、通常は低い親和性をもつ。たとえばＩｇＧ抗体における結合は、一般に少なくとも約１０−７Ｍ以上、たとえば少なくとも約１０−８Ｍ以上、または少なくとも約１０−９Ｍ以上、または少なくとも約１０−１０以上、または少なくとも約１０−１１Ｍ以上、または少なくとも約１０−１２Ｍ以上の親和性を特徴とする。この用語は、たとえばある抗原結合ドメインが多数の抗原により保有されない特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用でき、その場合はその抗原結合ドメインを保有する抗体は一般に他の抗原を結合しないであろう。
【００６５】
本明細書中で用いる“特異的免疫原フラグメント”は、配列の一部分であってその配列に対して特異的な抗体またはＴ細胞により認識される部分を表わす。
【００６６】
“対象”は、狂犬病感染を受けやすいいずれかの動物を表わし、これには家畜化されたものと野生の両方の哺乳動物が含まれる。
【００６７】
本明細書中で用いる“実質的に同一”は、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一度を表わす。
【００６８】
本明細書中で用いる“療法有効量”は、抗原またはワクチンまたは組成物が投与される対象（たとえばイヌ）において免疫応答を誘導するであろう抗原またはワクチンまたは組成物の量であって、ウイルス、細菌、寄生体または真菌などの病原体の感染により引き起こされる疾患の徴候または症状（その健康に対する有害作用または合併症を含む）を阻止または軽減するのに適切な量を表わす。体液性免疫もしくは細胞仲介性免疫、または体液性と細胞仲介性の両方の免疫を誘導することができる。抗原、ワクチンまたは組成物に対する動物の免疫原応答は、抗体価の測定、リンパ球増殖アッセイによって間接的に、または野生型株で攻撃した後の徴候および症状のモニタリングによって直接的に、評価することができる。ワクチンまたは組成物により与えられる防御免疫は、シェッディングした攻撃生物の減少、ならびに／あるいは死亡率、罹患率、体温などの臨床徴候の低下、ならびに対象の全般的な身体状態、健康状態および性能により評価することができる。ワクチンまたは組成物の療法有効量は、用いる個々の免疫原または対象の状態に応じて異なる可能性があり、当業者が決定できる。
【００６９】
本明細書中で用いる用語“治療する”、“治療すること”または“治療”などは、微生物による感染症を軽減または排除することを意味する。これらの用語などは、微生物の複製を低下させること、微生物の伝播を低下させること、または微生物がそれの宿主内に定着する能力を低下させることを意味することもできる。本明細書中で用いるこれらの用語などは、微生物による感染症の１以上の徴候もしくは症状を軽減、改善もしくは排除すること、または微生物による感染症からの回復を促進することを意味することもできる。
【００７０】
本明細書中で用いる用語“ワクチン接種する”および“ワクチン接種すること”などは、ワクチンまたは免疫原組成物を動物に投与することを意味する。
【００７１】
本明細書中で用いる用語“ワクチン”および“ワクチン組成物”は、感染症を阻止もしくは軽減する組成物、または感染症の１以上の徴候もしくは症状を阻止もしくは軽減する組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の防御効果は、普通は対象において免疫応答を誘導することにより達成される。一般に、感染症の発症の終止もしくは低下、徴候もしくは症状の改善、または感染対象からの微生物の排除の促進が、ワクチン組成物の防御効果の指標である。本発明のワクチン組成物は、狂犬病ウイルスにより引き起こされる感染症に対して防御効果をもたらす。
【００７２】
本明細書中で用いる用語“変異体”は、特定のタンパク質および／または遺伝子の配列の誘導体を表わし、その際、誘導された配列は変異による相異以外は本質的にその特定の配列と同じである。そのような相異は自然に発生するか、または合成もしくは遺伝により形成される可能性がある。
【００７３】
“ベクター”または“ベクターウイルス”は、異種ＤＮＡの挿入に適したＰＰＶであり、それは挿入したＤＮＡを細胞内または生物内へ輸送することができ、かつ適切な場合にはその異種ＤＮＡを発現させることができる。
【００７４】
本明細書中で用いる用語“獣医学的に許容できるキャリヤー”は、適正な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに動物の組織と接触させて使用するのに適し、妥当な損益比に相応し、かつそれらの目的用途に有効である物質を表わす。
【００７５】
以下の記載は当業者が本発明を実施するのを補助するために提示される。ただし、当業者は本明細書中で考察する態様を本発明の知見の精神および範囲から逸脱することなく改変および変更することができるので、この記載は本発明を不当に限定すると解釈すべきではない。
【００７６】
ウイルス、免疫原組成物、およびワクチン
本発明は、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの作製のための、パラポックスウイルスの使用を包含する。
【００７７】
１態様において、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの作製のために、ヒツジパラポックスウイルス（ＰＰＶＯ）を使用する。他の態様において、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株を使用する。さらに他の態様において、ヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ株を使用する。
【００７８】
パラポックスウイルスに挿入される遺伝子配列は、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む。１態様において、異種ＤＮＡは、狂犬病ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む。１態様において、異種ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも約９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。この遺伝子の構造はさらに、たとえばAnilionis et al., Nature 294, 275-278 (1981)により示されている。挿入配列は１５８８ｎｔのサイズである。挿入配列の完全配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を図４に示す。それは狂犬病ウイルスのＧ遺伝子の全長コード領域（１５７５ｎｔ）＋制限酵素分析（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）用のリンカー配列としての５’末端側の７ｎｔおよび３’末端側の６ｎｔを含む。
【００７９】
ポリヌクレオチドの配列が分かれば、そのポリヌクレオチドのあらゆる可能なフラグメントを容易に得ることができる。したがって本発明は、Ｇタンパク質のフラグメントを提供する。１態様において、機能性フラグメントが提供される。他の態様において、生物活性フラグメントが提供される。フラグメントは常法によって、たとえば濾過またはクロマトグラフィーによって精製できる。フラグメントは、当業者に既知の方法による組換えによって調製できる。
【００８０】
組換えパラポックスウイルスの作製に際して、異種ＤＮＡをヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内に挿入する。他の態様において、異種ＤＮＡをヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１株のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨ／Ｈ内のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列内に挿入する。異種ＤＮＡをパラポックスウイルスに挿入するために用いられる方法は標準法であり、当業者に既知である。それらはUS Patent 6,365,393に記載されている。
【００８１】
１態様において、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧである。
【００８２】
１態様において、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスはＤ１７０１−ＶｒＶ  ＲａｂＧ（Ｋ−ＵＣ１００２）であり、それは特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)に基づいて、The American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ（登録商標）)、Manassas, VA, 20108 USAにＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託番号ＰＴＡ−１１６６２で寄託されている。
【００８３】
プラスミドｐｄＶ−ＲａｂＧ（７．６９２ｎｔ）の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、それは配列表に示されている。
【００８４】
本発明はまた、本明細書に記載する配列に対して少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９３％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性および／または相同性をもつポリヌクレオチド配列を包含する。
【００８５】
本発明はまた、本明細書に記載するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか１つの非コード鎖または相補配列に中等度ないし高度の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、およびその種相同体を包含する。高度の緊縮条件の例には、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを含む６５℃〜７５℃の緩衝液中での最終洗浄が含まれ、一方、中等度の緊縮条件の例には、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを含む３５℃〜４５℃の緩衝液中での最終洗浄が含まれる。温度および緩衝液または塩濃度の変更によって同等の緊縮性を達成できることは当技術分野で理解されている；Ausubel, et al.(Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 - 6.4.10に記載。
【００８６】
組換えＰＰＶを細胞、細胞系および宿主細胞内で増殖させることができる。それらの細胞、細胞系または宿主細胞は、たとえば哺乳動物細胞および哺乳動物以外の細胞であってもよいが、これらに限定されない。ＰＰＶを増殖させることができる細胞、細胞系および宿主細胞は当業者に既知であり、容易に入手できる。１態様において、Ｖｅｒｏ細胞が用いられる。他の態様において、ウシ腎細胞またはヒツジ精巣細胞を使用する。
【００８７】
組換えＰＰＶを、免疫原組成物またはワクチンに使用する前にさらに弱毒化または不活性化することができる。弱毒化および不活性化の方法は当業者に周知である。弱毒化のための方法には、適切な細胞系での細胞培養における連続継代、紫外線照射、および化学的変異形成が含まれるが、それらに限定されない。不活性化のための方法には、ホルマリン、ベータプロプリオラクトン(betapropriolactone)（ＢＰＬ）もしくはバイナリーエチレンイミン(binary ethyleneimine)（ＢＥＩ）による処理、または当業者に既知である他の方法が含まれるが、それらに限定されない。
【００８８】
ホルマリンによる不活性化は、ウイルス懸濁液を３７％ホルムアルデヒドと混合して最終ホルムアルデヒド濃度０．０５％にすることにより実施できる。このウイルス−ホルムアルデヒド混合物を、室温で約２４時間の定速撹拌により混合する。不活性化されたウイルス混合物を次いで適切な細胞系での増殖についてアッセイすることにより、残留する生存ウイルスを検査する。
【００８９】
ＢＥＩによる不活性化は、本発明のウイルス懸濁液を０．１Ｍ  ＢＥＩ（２−ブロモ−エチルアミン，０．１７５Ｎ  ＮａＯＨ中）と混合して最終ＢＥＩ濃度１ｍＭにすることにより実施できる。このウイルス−ＢＥＩ混合物を室温で約４８時間の定速撹拌により混合し、続いて１．０Ｍチオ硫酸ナトリウムを最終濃度０．１ｍＭになるように添加する。混合をさらに２時間続ける。不活性化されたウイルス混合物を次いで適切な細胞系での増殖についてアッセイすることにより、残留する生存ウイルスを検査する。
【００９０】
組換えＰＰＶは免疫原組成物およびワクチンに使用できる。
【００９１】
免疫原組成物およびワクチンは、場合により１種類以上の獣医学的に許容できるキャリヤーを含有することができ、それには医薬用のビヒクル、賦形剤または媒体として作用する液体、半固体または固体希釈剤が含まれる。本明細書中で用いる“獣医学的に許容できるキャリヤー”には、あらゆる溶剤、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌薬および抗真菌薬、等張化剤、吸着遅延剤などが含まれる。希釈剤には水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含めることができる。等張化剤には、特に当業者に既知の塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖を含めることができる。安定剤には、特に当業者に既知のアルブミンが含まれる。保存剤には、特に当業者に既知のメルチオレート(merthiolate)が含まれる。
【００９２】
アジュバントには特に当業者に既知である下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油型乳剤、油中水型乳剤、たとえば完全および不完全フロイントアジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ，ジョージア州アトランタ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，カリフォルニア州エメリービル）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，マサチュセッツ州ケンブリッジ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，アラバマ州バーミンガム）または他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質−アミンアジュバント、大腸菌(E.coli)由来の熱不安定エンテロトキシン（組換え体その他）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチド。本発明に関して有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は当業者が容易に決定できる。１態様において、本発明は、約５０μｇから約２０００μｇまでのアジュバントを含む免疫原組成物およびワクチンを考慮する。他の態様において、アジュバントは約１００μｇから約１５００μｇまで、または約２５０μｇから約１０００μｇまで、または約３５０μｇから約７５０μｇまでの量で含有される。他の態様において、アジュバントは約５００μｇ／２ｍｌ（免疫原組成物およびワクチン用量）の量で含有される。
【００９３】
免疫原組成物およびワクチンは、抗生物質を含有してもよい。そのような抗生物質には、アミノグリコシド類、カルバペネム類、セファロスポリン類、糖ペプチド類、マクロライド類、ペニシリン類、ポリペプチド類、キノロン類、スルホンアミド類、およびテトラサイクリン類のクラスのものが含まれるが、これらに限定されない。１態様において、本発明は、約１μｇ／ｍｌから約６０μｇ／ｍｌまでの抗生物質を含む免疫原組成物およびワクチンを考慮する。他の態様において、免疫原組成物およびワクチンは、約５μｇ／ｍｌから約５５μｇ／ｍｌまでの抗生物質、または約１０μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌまでの抗生物質、または約１５μｇ／ｍｌから約４５μｇ／ｍｌまでの抗生物質、または約２０μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌまでの抗生物質、または約２５μｇ／ｍｌから約３５μｇ／ｍｌまでの抗生物質を含む。さらに他の態様において、免疫原組成物およびワクチンは約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含む。
【００９４】
免疫原組成物およびワクチンは、組換えＰＰＶのほかに他の抗原を含んでもよい。抗原は不活性化された微生物の全製剤もしくは部分製剤の形態、または遺伝子工学的技術もしくは化学合成により得られた抗原性分子の形態であってもよい。本発明に従って用いるのに適した他の抗原には、病原性細菌または病原性ウイルスに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
イヌの場合、組換え狂犬病免疫原組成物およびワクチンは、場合により１以上の追加のイヌ抗原、たとえば下記のものとの混合物を含有してもよい：エールリキア・カニス(Ehrlichia canis)、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌジステンパー、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、イヌアデノウイルスＩＩ型（ＣＡＶ−２）、イヌアデノウイルス（ＣＤＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、レプトスピラ・イクテロヘモラギア(Leptospira icterohemorrhagiae)（ＬＩ）、レプトスピラ・カニコラ(Leptospira canicola)（ＬＣ）、レプトスピラ・グリポチホサ(Leptospira grippotyphosa)（ＬＧ）、レプトスピラ・ポモナ(Leptospira pomona)（ＬＰ）、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)など。抗原の１組合わせは、イヌパルボウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、およびイヌパラインフルエンザウイルスの分離株を含み、コロナウイルスおよびレプトスピラ（出現しつつある血清型レプトスピラ・グリポチホサおよびレプトスピラ・ポモナを含む）を含むかまたは含まない。
【００９６】
ネコの場合、組換え狂犬病免疫原組成物およびワクチンは、場合により１以上の追加のネコ抗原、たとえば下記のものとの混合物を含有してもよい：ネコカリチウイルス(feline calicivirus)（ＦＣＶ）、クラミドフィラ・フェリス(Chlamydophila felis) (C. felis、以前は、また一般に、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)（ＦＣＰ）としても知られている)、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、バルトネラ・ヘンゼレ(Bartonella henselae)（たとえば、猫ひっかき病）など。
【００９７】
ウマの場合、組換え狂犬病免疫原組成物およびワクチンは、場合により１以上の追加のウマ抗原、たとえば下記のものとの混合物を含有してもよい：ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス１および４、ウマアルテリウイルス(Equine arterivirus)、西ナイルウイルス、ウマロタウイルス、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、破傷風トキソイドなど。
【００９８】
本明細書に記載する免疫原組成物およびワクチンを動物に投与して、ＲＶに対する有効な免疫応答を誘導することができる。したがって、ＲＶに対する有効な免疫応答を刺激する方法であって、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスを含む、療法有効量の免疫原組成物またはワクチンを投与することを含む方法を本明細書に記載する。この方法により、抗−Ｇタンパク質血清抗体が生成する。
【００９９】
本明細書に記載する免疫原組成物およびワクチンを動物に投与して、動物を狂犬病に対してワクチン接種することができる。この免疫原組成物およびワクチンを動物に投与して、動物の狂犬病を予防または治療することができる。したがって、動物を狂犬病に対してワクチン接種し、および狂犬病を予防または治療する方法であって、狂犬病ウイルス由来の異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスを含む、療法有効量の免疫原組成物またはワクチンを投与することを含む方法を本明細書に記載する。
【０１００】
投与の形態、用量、経路
免疫原組成物およびワクチンは、投与経路に応じて多様な形態で調製できる。たとえば、免疫原組成物およびワクチンは注射用として適した無菌水性液剤または分散液剤の形態で調製でき、あるいは凍結乾燥法を用いて凍結乾燥形態で調製できる。凍結乾燥した免疫原組成物およびワクチンは、一般に約４℃に保持され、安定化溶液、たとえば生理食塩水および／またはＨＥＰＥＳ中に再構成することができる。あるいは、免疫原組成物およびワクチンは凍結乾燥により保存できる。免疫原組成物およびワクチンは、懸濁液剤または乳剤としても調製できる。
【０１０１】
免疫原組成物およびワクチンは、療法有効量の前記の組換えＰＰＶを含有する。精製したウイルスをそのまま免疫原組成物またはワクチン中に使用でき、あるいはさらに弱毒化または不活性化することができる。一般に、免疫原組成物またはワクチンは約１×１０２〜約１×１０１２ＰＦＵ、または約１×１０３〜約１×１０１１ＰＦＵ、または約１×１０４〜約１×１０１０ＰＦＵ、または約１×１０５〜約１×１０９ＰＦＵ、または約１×１０６〜約１×１０８ＰＦＵを含有する。免疫原組成物またはワクチン中の防御効果を与えるのに有効な厳密なウイルス量は、当業者が決定できる。
【０１０２】
免疫原組成物およびワクチンは一般に、約０．５ｍｌ〜約５ｍｌの容量の獣医学的に許容できるキャリヤーを含む。他の態様において、キャリヤーの容量は約１ｍｌ〜約４ｍｌ、または約２ｍｌ〜約３ｍｌである。他の態様において、キャリヤーの容量は約１ｍｌであり、または約２ｍｌであり、または約３ｍｌであり、または約５ｍｌである。免疫原組成物およびワクチン中に使用するのに適した獣医学的に許容できるキャリヤーは、本明細書に記載するいずれかのキャリヤーであってよい。
【０１０３】
投与前にウイルスを弱毒化または不活性化する必要があるかどうかは当業者が容易に判定できる。他の態様において、組換えＰＰＶをさらに弱毒化せずにそのまま動物に投与できる。ウイルスの療法有効量は、動物の状態および感染症の程度を含めた幾つかの要因のいずれかに応じて異なる可能性があり、当業者が決定できる。
【０１０４】
本発明の方法に従って、単回量を動物に投与してもよく、あるいは約２週から約１０週までの間隔をおいて２回以上の接種を行なってもよい。追加免疫計画が必要になる可能性があり、投与計画は最適免疫化が得られるように調整することができる。最適な投与計画は当業者が容易に決定できる。
【０１０５】
免疫原組成物およびワクチンを血流中、筋肉内、または内臓内へ直接投与することができる。非経口投与に適した手段には、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が含まれる。非経口投与に適した器具には、針（マイクロニードルを含む）注射器、無針注射器、および注入法が含まれる。
【０１０６】
非経口配合物は一般に水性液剤であり、賦形剤、たとえば塩類、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、約３から約９まで、または約４から約８まで、または約５から約７．５まで、または約６から約７．５まで、または約７から約７．５までのｐＨにする）を含有することができるが、ある用途については、それらを無菌非水性液剤として、または発熱物質を含まない無菌水など適切なビヒクルと併せて使用する乾燥形態として配合する方が適切である可能性がある。
【０１０７】
無菌条件下での非経口配合物の調製、たとえば凍結乾燥によるものは、当業者に周知の標準的な製薬技術を用いて達成できる。
【０１０８】
本明細書に記載する組換えパラポックスウイルスならびに免疫原組成物およびワクチンは、動物を狂犬病に対してワクチン接種するための医薬の調製に使用できる。
【０１０９】
本発明は、動物に存在するパラポックスウイルスの起源を判定する方法を提供する。
【０１１０】
ＤＩＶＡワクチン−感染動物をワクチン接種動物から判別できるもの−を用いるワクチン接種は、動物に存在するパラポックスウイルスの起源を判定する手段を提供する。この区別は、種々の診断法のいずれかにより達成でき、それにはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法およびＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。これらおよび他の方法は当業者に容易に認識され、既知である。
【０１１１】
本明細書に記載するパラポックスウイルスは、それらのゲノム組成および発現するタンパク質の両方において、野生型株から区別できる。そのような区別により、ワクチン接種動物と感染動物を識別できる。たとえば、特定の試験室検査でパラポックスウイルスについて陽性の検査結果を示す動物が、野生型パラポックスウイルス株を保有するか、あるいは先にワクチン接種により得られた組換え産生パラポックスウイルスを保有するかについて、判定を行なうことができる。
【０１１２】
判定を行なうためには多様なアッセイ法を使用できる。たとえば、パラポックスウイルスについて陽性の検査結果を示す動物からウイルスを分離し、核酸に基づくアッセイ法を用いて、先のワクチン接種の指標となるパラポックスウイルスゲノムの存在を判定することができる。核酸に基づくアッセイ法には、サザンブロットまたはノーザンブロット分析、ＰＣＲ、および配列決定法が含まれる。あるいは、タンパク質に基づくアッセイ法を採用できる。タンパク質に基づくアッセイ法では、パラポックスウイルスについて陽性の検査結果を示す動物から感染が疑われる細胞または組織を分離することができる。そのような細胞または組織から細胞抽出物を調製し、そしてウイルスタンパク質に対する適切な抗体であって先にワクチン接種した組換え産生パラポックスウイルスまたは野生型パラポックスウイルスのいずれかの存在を区別同定できる抗体を用いて、たとえばウェスタンブロット法を行なうことができる。
【０１１３】
動物に誘導される免疫応答の程度および性質は、多様な手法を用いて評価できる。たとえば、接種動物から血清を採集し、パラポックスウイルスに特異的な抗体の存在または不存在を、たとえば一般的なＥＬＩＳＡで検査する。リンパ組織における応答性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の検出は、細胞性免疫応答の誘導の指標としてのＴ細胞増殖などのアッセイにより達成できる。関連技術は当技術分野で、たとえばColigan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)に十分に記載されている。
【０１１４】
組換えヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧは、ＤＩＶＡアッセイに使用できる。１態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病Ｎ遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。他の態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病Ｐ遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。さらに他の態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病Ｌ遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。さらに他の態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病Ｍ遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。
【０１１５】
本発明を説明のための、限定ではない実施例によってさらに記載する。
【実施例】
【０１１６】
ＲＶのＧタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えヒツジパラポックスウイルスを作製した。Ｇタンパク質の発現を、組換えウイルスのＲＶに対する免疫刺激特性および防御特性として評価した。
【０１１７】
実施例１
狂犬病Ｇタンパク質を発現する組換えウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの作製
ＲＶのＧタンパク質をコードする遺伝子を含む、組換え作製によるヒツジパラポックスウイルスを作製した。Ｇタンパク質の発現を評価し、かつＲＶに対する組換えウイルスの免疫刺激および防御特性を評価した。
【０１１８】
伝達プラスミドの構築
組換えヒツジパラポックスウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの作製のために、ヒツジパラポックスウイルス（ＰＰＶＯ）ベクター系(US Patent 6,365,393; Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145; Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323; Henkel et al., 2005, J. Virol. 79, 314-325)を用いた。狂犬病ウイルスＧタンパク質遺伝子は化学合成され（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；米国）、ｐＵＣプラスミド中において提供されている。完全Ｇ遺伝子を１．５８２ｂｐのサイズのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントとしてアガロースゲル（０，８％  ｗ／ｖ）電気泳動によって分離し、Ｑｉａｅｘ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ；ドイツ）によって精製した。プラスミドｐｄＶ−Ｒｅｃ１(Fischer et al., 2003)をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化してライゲーションに用いた（迅速ライゲーションキット，Ｐｒｏｍｅｇａ；ドイツ）。大腸菌ＤＨ５αＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を形質転換した後、挿入配列陽性コロニーをプラスミドＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限消化により選択した。その結果、伝達プラスミドｐｄＶ−ＲａｂＧ（図１）が得られ、これをＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；ドイツ）で調製し、ＤＮＡ配列決定に用いた。このために、ｐｄＶ−Ｒｅｃ１中の挿入部位の上流に位置するプライマーＯＲＦ３２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；５’−ＧＣＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＣＧＣ−３’）および挿入部位の下流に位置するプライマーＯＲＦ３１Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；５’−ＧＣＡＴＣＣＣＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＣ−３’）、ならびに内部Ｇ遺伝子特異的プライマーＲａｂＧ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；５’−ＧＧＡＧＴＣＴＣＴＣＧＴＴＡＴＣＡＴＡＴＣＴＣ−３’）およびＲａｂＧ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；５’−ＣＴＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＴＴＣＧＴ−３’）をそれぞれ用いた。これにより、挿入Ｇ遺伝子の完全配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を決定することができた。
【０１１９】
Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ染色による組換え体の選択
Ｖｅｒｏ細胞（１０６個）に０．１ＭＯＩ（感染多重度）のｌａｃＺ発現ウイルスＤ１７０１−ＶｒＶを感染させ、２時間後に２μｇのｐｄＶ−ＲａｂＧプラスミドＤＮＡを、製造業者（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ，Ｌｏｎｚａ；ドイツ）の推奨に従ってｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによりトランスフェクションした。ウイルス溶解物を３〜４日後に収穫し、６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）内でＶｅｒｏ細胞における力価判定に用いた。プラークが目視できる状態になった時点で、記載に従ってアガロース含有Ｂｌｕｏ−Ｇａｌをオーバーレイした(Fischer et al., 2003)。白色の外観をもつウイルスプラークを採取し、単一プラーク溶出物（４℃で一夜、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中）を、４８ウェルプレートの単一ウェル内のＶｅｒｏ細胞（１×１０５個）の同時感染に用いた。
【０１２０】
プラーク−ＰＣＲによる組換え体の選択
各ウイルスプラーク分離物からのＤＮＡの分離を、Ｐasamontes et al. (J. Virol. Methods 35:137 - 141; 1991)の改変により実施した。ウイルス溶解物（０．２ｍｌ）を、３回、凍結（−７０℃）および融解（３７℃）し、氷上で３回、２０〜３０秒間、音波処理した（音波水浴）。フェノールおよびクロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿の前に１０μｇの酵母ｔＲＮＡまたは３μｌのＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（Ａｍｂｉｏｎ；ドイツ）を添加した。ＤＮＡペレットを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで２回洗浄し、乾燥させた後に１４μｌの二回蒸留水(aqua bidest)に溶解した。
【０１２１】
ＲａｂＧ特異的ＰＣＲのために、４μｌのＤＮＡを氷上で、４．０ｐｍｏｌのＲａｂＧ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および４．０ｐｍｏｌ  ＲａｂＧ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）プライマーならびに５μｌのＲｅｄｄｙＭｉｘ  ２×ＰＣＲ（Ａｂｇｅｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）からなるプライマーミックス１μｌと混合した。ＰＣＲをＴｒｉｏ  Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ；ドイツ）内で下記のインキュベーションにより実施した：９８℃で２分間、続いて４０サイクルを９６℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、そして最終延長工程を７２℃で２分間。ＰＣＲ生成物を水平１％（ｗ／ｖ）アガロース−臭化エチジウム（０．３マイクログラム／ｍｌ）ゲルで分離した。４３３ｂｐのサイズのＧ遺伝子特異的ＰＣＲフラグメントを示すプラーク分離物からのウイルス溶解物を希釈し、前記に従って少なくとも３回、Ｂｌｕｏ−Ｇａｌアガロースオーバーレイを用いてさらにプラーク精製した。最後に、Ｇ遺伝子について陽性である組換えウイルスプラーク分離物のＤＮＡを、ＬａｃＺ遺伝子特異的ＰＣＲで、４μｌのＤＮＡ、３．９５ｐｍｏｌのプライマーｌａｃＺ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；５’−ＣＧＡＴＡＣＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡ−３’）、および４．１３ｐｍｏｌのプライマーｌａｃＺ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；５’−ＣＡＡＣＴＣＧＣＣＧＣＡＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴ−３’）により検査した。５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を添加した後、ＰＣＲを下記の加熱により実施した：９８℃で２分間、続いて４０サイクルを９６℃で１分間、６２℃で３０秒間および６８℃で９０秒間、最終延長工程を６８℃で２分間。ＰＣＲ生成物の分離を前記に従って実施した。５０８ｂｐのサイズのＬａｃＺ遺伝子特異的フラグメントの不存在は、対応する組換えウイルスプラーク分離物が３ラウンドのプラーク精製後にＬａｃＺ発現性の親ウイルスＤ１７０１−ＶｒＶを含まないことを証明した。Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの高力価ウイルス原液の調製後、ウイルスＤＮＡを下記に従って調製し、ＲａｂＧ−ＰＣＲおよびＬａｃＺ−ＰＣＲにおける検査に用いた。
【０１２２】
組換えウイルスプラークの免疫組織学的染色（ＩＰＭＡ）
挿入した外来遺伝子の発現成功を、まずＩＰＭＡによりアッセイした；これは、２４ウェルプレート内でＶｅｒｏ細胞において力価判定する、組換えウイルスプラークの免疫組織学的染色を伴う。ウイルスプラークが出現した後、各ウェルから培地を吸引し、層流フード内でプレートを約１０分間開いたままにすることにより細胞を乾燥させた。その後、氷冷した無水メタノールにより−２０℃で１５〜２０分間、細胞を固定した。氷冷したＰＢＳ中１％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で２回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢＳにより室温（ＲＴ）で９０分間、細胞をブロックした。室温で６０分間、Ｇタンパク質特異的マウスモノクローナル抗体Ｇ５５９と共にインキュベートした後、ＰＢＳ中１％  ＦＣＳ（ＦＬＩ−Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ；ドイツ）に１：２００希釈した。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼカップリングした抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．，ＤＩＡＮＯＶＡ；ドイツ）を１：２０００希釈して添加し、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴおよびＰＢＳで徹底的に洗浄した後、基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｏｖａ  Ｒｅｄ，Ａｘｘｏｒａ；ドイツ）を製造業者の推奨に従って赤褐色の陽性染色が目視できるようになるまで添加した。陰性対照として、非感染細胞およびＤ−１７０１−ＶｒＶまたはＤ−１７０１−Ｖに感染させた細胞をインキュベートした。ウイルスプラークおよび感染細胞は、狂犬病Ｇタンパク質について強い陽性がみられた。
【０１２３】
実施例２
Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの特性分析
ウイルス原液の調製
高力価組換えウイルス原液を得るために、１０〜２０個のＴ１５０培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ；ドイツ）にＭＯＩ  ０．５で同時感染させた。３日後、約８０％の細胞病原作用(cytopathogenic effect)（ＣＰＥ）がみられ、すべてのフラスコの細胞および上清を収穫および採集して遠心（１３，０００ｒｐｍ、４℃で２時間）に用いた。上清を慎重に除去し、ウイルスペレットを４℃で一夜、１〜２ｍｌのＰＢＳに溶解した。このウイルス懸濁液を氷上での音波処理（Ｓｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ，Ｂｒａｎｓｏｎ；ドイツ）により、１０秒間の３パルス（１００Ｗ）（各パルス間に１０秒間の中断）を用いて完全分散させ、続いて遠心（５００〜７００×ｇ，１０分間，４℃）して細胞屑を除去した。上清を氷上に貯蔵し、一方、細胞ペレットを１．０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で音波処理した（２０秒間を２回、その間に１０秒間の中断を伴い、次いで３０秒間を１回）。低速遠心の後、上清を第１上清と合わせ、部分量に分割し、力価判定し、−７０℃に貯蔵した。
【０１２４】
ウイルスＤＮＡの特性分析
Ｖｅｒｏ細胞にＭＯＩ  ０．５で感染させ、２〜３日後に（約８０％のＣＰＥ）トリプシン処理および４℃で短時間の低速遠心により収穫した。Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｚｙｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡを分離した。
【０１２５】
Ｇ遺伝子が適正な遺伝子座に挿入されたことを確認するために、２μｇのＤＮＡを制限酵素消化し、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、サザンブロットハイブリダイゼーションのためにナイロン膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ドイツ）へ移した。狂犬病ウイルス特異的プローブ（Ｒａｂｇ−Ｆ／−Ｒ  ＰＣＲの生成物）をゲル分離し、ＲｅｄｉＰｒｉｍｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ドイツ）を用いて放射性標識した（３２Ｐ−ｄＣＴＰ，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；ドイツ）。次いでこれをサザンブロットハイブリダイゼーションに用いた；０．５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、１．０％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および０．５ｍｇ／ｍｌの変性ウシ胸腺ＤＮＡ（ＫＴ−ＤＮＡ，Ｓｉｇｍａ；ドイツ）を含有する４×ＳＳＰＥ（１×＝０．１８Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＰＰ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）中、５０℃の条件下で実施。Ｘ線（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ；ドイツ）照射した後、０．４Ｎ  ＮａＯＨ中４５℃で３０〜６０分間のインキュベーション、続いて１００℃で０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中における短時間のインキュベーションにより、プローブをフィルターから分離した。２回目のハイブリダイゼーションには、Ｄ１７０１−ＶのｖｅｇＦ−Ｅ遺伝子座を含むＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＨを記載に従って用いた(Cottone et al., 1998. Virus Res. 56, 53-67)。サザンブロット法の結果により、Ｇ遺伝子がＤ１７０１−ＶｒＶのゲノム内へ適正に挿入されたことが確認された。
【０１２６】
Ｇ遺伝子特異的ＲＮＡの検出
Ｖｅｒｏ細胞にＭＯＩ  ３〜５で感染させ、感染後（ｐ．ｉ．）の種々の時点でＳｕｒｅＰｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を用いて総ＲＮＡを分離した。さらに、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ；０．０４ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ；ドイツ）またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ，０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｅｒｖａ；ドイツ）の存在下で感染させた細胞からＲＮＡを抽出して、挿入Ｇ遺伝子の早期発現を検査した。対照として、非感染細胞からＲＮＡを分離した。ホルムアルデヒドを含有する変性１％アガロースゲルでＲＮＡを分離し、記載に従ってナイロン膜へ移した(Kroczek, R.A. & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990)。放射性標識した狂犬病Ｇ  ＰＣＲ（ＲａｂＧ−Ｆ／−Ｒ）フラグメントをハイブリダイゼーションプローブとしてＵｌｔｒａＨｙｂ溶液（Ａｍｂｉｏｎ；ドイツ）中、４２℃で用いた。それらの結果により、狂犬病Ｇ遺伝子はＯＲＦＶの早期ｖｅｇＦ−Ｅプロモーター(Rziha et al. 1999, J. Biotechnol., 73, 235-242)の制御下で調節されているためきわめて早期に発現されることが証明された。
【０１２７】
免疫蛍光法によるＧタンパク質の検出
免疫蛍光法のために、Ｖｅｒｏ細胞（１×１０５個／ｍｌ）に４チャンバースライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ；ドイツ）内においてＭＯＩ  ０．１または３．０で感染させた。感染後の種々の時点で、細胞を培地で洗浄し、メタノールを含まない３．７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）により３７℃で１５分間固定した。ＰＢＳで３回の洗浄後、細胞を０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３７℃、５分間の処理によって透過性にした。ＰＢＳ洗浄後、細胞をＰＢＳ中５％  ＦＣＳにより３７℃で３０〜４０分間ブロックした。Ｇタンパク質検出のために、細胞を３７℃で１時間、１％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ中に１：１０００希釈したマウスモノクローナル抗体Ｇ５５９（ＦＬＩ；ドイツ、チュービンゲン）と共にインキュベートした。ＰＢＳ中で５回の洗浄後、スライドを暗所において３７℃で３０分間、ＰＢＳ中に１：１０００希釈した二次抗マウスＡｌｅｘａ−５５５抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；ドイツ）と共にインキュベートした。
【０１２８】
ＯＲＦＶ感染後、後期の細胞検出を、Ｄｒ．Ｒｕｄｉｇｅｒ  Ｒａｕｅ（Ｐｆｉｚｅｒ，英国）により提供されたＯＲＦＶ特異的ウサギ抗血清ＰＡＳ２２７４の使用により実施した。血清を１％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ中に１：１０００希釈し、二次抗体である抗ウサギＡｌｅｘａ−４８８を１：１０００の希釈度で用いた。
【０１２９】
Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−６４７により製造業者（Ｂｉｏｔｉｕｍ；ドイツ）の指示に従ってアクチン染色を実施し、続いて０．０４μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；ドイツ）により室温で暗所において２０〜３０分間、核の染色を実施した。ＰＢＳ中で徹底的に洗浄した後、スライドをＭｏｗｉｏｌ−ＤＡＢＣＯで包埋し、Ｚｅｉｓｓ  ＡｐｏＴｏｍｅでＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて蛍光イメージングを実施した。
【０１３０】
それらの結果により、Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧ感染後、早期（感染後４時間目）および後期（感染後２４時間目）の強いＧタンパク質発現が明らかに証明された。後期感染した細胞は、抗血清ＰＡＳ２２７４で特異的染色することによってさらに同定できる。さらに、蛍光染色はＧタンパク質の表面発現の証拠を示した。染色の特異性を非感染細胞の使用により調べた。
【０１３１】
ウェスタンブロット法によるＧタンパク質の検出
Ｖｅｒｏ細胞（３×１０５個）にＭＯＩ  １．０で同時感染させ、３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。感染後の種々の時点で細胞プラス上清を収穫し、遠心し（８，９００×ｇ，１０分間，４℃）、細胞沈降物を１．０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する０．１５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。氷上で３０分後、細胞溶解物を１５．０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のために保存した。このために、３部の溶解物を１部の４×  ＤｕａｌＣｏｌｏｒタンパク質装填用緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；ドイツ）と混合し、５分間煮沸し、音波処理し、約１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、８％（ｗ／ｖ）ＰｒｏＳｉｅｖｅ５０ゲルをＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ流動用緩衝液と共に用いて推奨に従って分離した（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｉｏｚｙｍ；ドイツ）。Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；ドイツ）を分子量マーカーとして用いた。電気泳動の後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に製造業者の指示に従って移した（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）。膜を３×  Ｒｏｔｉｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ；ドイツ）中、室温で３時間ブロックした後、狂犬病ウイルスＧタンパク質のＣ末端に対して特異的なウサギ抗ペプチド抗血清（好意的にＤｒ．Ｋ．−Ｋ．Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎにより提供，Ｍａｘ−ｖｏｎ−Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ドイツ、ミューニッヒ）を、１×  ＲｏｔｉＢｌｏｃｋ中に１：１０，０００希釈して用いた。４℃で一夜のインキュベーション後、膜をＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）中で５回、徹底的に洗浄し、ペルオキシダーゼカップリングした抗ウサギ抗体（１：２０，０００；Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．，Ｄｉａｎｏｖａ；ドイツ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ洗浄後、ＥＣＬ基質を推奨に従って用いた（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ドイツ）。反応したタンパク質を化学発光Ｘ線フィルム（ＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）の使用により検出した。
【０１３２】
予想した分子量（５８〜６０ｋＤａ）の狂犬病ウイルスＧタンパク質の発現が、感染後種々の時点で確認された。
【０１３３】
実施例３
Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧでマウスを免疫化した後の特異的免疫応答の誘導
用量依存性の抗Ｇ血清抗体誘導
Ｇタンパク質は防御免疫応答について最も重要な抗原であるとみなすことができ、誘導されたウイルス中和血清抗体(virus-neutralizing serum antibodies)（ＳＮＴ）の程度を狂犬病ウイルス攻撃感染に対する防御と相関させることができる。ＯＩＥ（World Organization of Animal Health）およびＷＨＯ（World Health Organization）によれば、０．５〜１．０ＩＵ／ｍｌ（国際単位）を超える抗体価のＳＮＴの存在は防御性があるとみなされる。したがって、Ｇタンパク質特異的ＳＮＴ抗体の誘導を、Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧでマウスを初回免疫化した後、１日目から１４日目まで測定した。
【０１３４】
ＦＬＩ(Friedrich-Loeffler-Institute, Federal Research Institute of Animal Health, Institute of Immunology;ドイツ、チュービンゲン)で繁殖させた６〜８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（グループ当たりｎ＝６または７）を、０．１ｍｌの指示したＰＦＵ（プラーク形成単位）のＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧ（各後足の大腿につき０．０５ｍｌ）で筋肉内免疫化した。個々の血清試料を毎日採取し、記載に従って迅速蛍光焦点抑制試験法(rapid fluorescence focus inhibition test)（ＲＦＦＩＴ）でのＳＮＴ測定に用いた(OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies, 下記のインターネットウェブサイトでも見ることができる: www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm; Cox, J.H. and L.G. Schneider, 1976, J. Clin. Microbiol. 3, 96-101.)。要約すると、ＲＰＭＩ培地中の系列５培血清希釈液を調製し、０．０５ｍｌの各希釈液を９６ウェルプレートのウェル内で０．０５ｍｌの狂犬病ウイルスＣＶＳ  １１株（ロットｎｏ．４７，１，７×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）と混合した（二重試験法で）。３７℃および５％  ＣＯ２で９０分間のインキュベーション後、０．１ｍｌのＢＨＫ２１細胞懸濁液（１×１０６個／ｍｌ）を各ウェルに添加し、混合し、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＰＢＳおよび予冷した８０％（ｖ／ｖ）アセトンで培養プレートのウェルを洗浄した後、細胞を新鮮な８０％（ｖ／ｖ）アセトン中、４℃でさらに３０分間、固定した。アセトンを除去し、風乾した後、０．０５ｍｌのＦＩＴＣ抗狂犬病モノクローナルグロブリン（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ；米国）を３７℃で３０分間添加して、狂犬病ウイルス感染細胞を染色した。ＰＢＳで１回、二回蒸留水で１回、洗浄した後、蛍光顕微鏡検査によりウイルス感染をモニターした。感染細胞数を５０％のまで減少させた血清希釈液を陽性として読み取った。血清の力価をＩＵ／ｍｌとして表記し、陽性ＷＨＯ基準血清と比較した。
【０１３５】
図２は、マウスを指示したＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧ組換えウイルスで筋肉内単回免疫化した後のＳＮＴの発生を証明する。免疫化後の指示した日（ｄ）にＦＦＩＴにより血清を検査した。図２（Ｄ）にみられるように、低用量（１０４ＰＦＵ）免疫化ですら、８日目までに平均ＳＮＴ  ５．５ＩＵ／ｍｌを生じ、免疫化後１４日目まで増加して約１３ＩＵ／ｍｌになった。１０６または１０７ＰＦＵを免疫化に用いると（図２Ａおよび２Ｂ）、１週間後までにそれぞれ平均ＳＮＴ  約１０〜２０ＩＵ／ｍｌが誘導され、それは初回免疫化後１４日目に約約５０ＩＵ／ｍｌまで増加した。１０７ＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧを用いると、免疫化後４日目までに防御血清抗体価（０．６〜３．０ＩＵ／ｍｌ）が検出され、それはより低い試験免疫化用量では達成されなかった（図２）。
【０１３６】
他のマウス実験（データを示していない）は、１０６または１０７ＰＦＵのいずれかの組換えウイルスを用いた追加免疫化が初回免疫化（１０６または１０７ＰＦＵで）後１４日目のＳＮＴをわずかに増加させるにすぎないことを証明した。
【０１３７】
まとめると、これらの結果は、種々の用量のＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧでマウスを免疫化した後の第１週中に防御ＳＮＴ抗体価の誘導に成功したことを証明する。
【０１３８】
実施例４
Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧにより仲介されるマウスの防御免疫応答
Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの防御能の評価を、ＯＩＥの推奨に従って種々の免疫化マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）の攻撃感染により実施した(Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies. www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm.でもみられる)。６〜８週齢で、マウス（グループ当たりｎ＝１１または１２）を、指示したＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧで前記に従って免疫化した。非免疫化対照マウス（ｎ＝１５）にはＰＢＳを注射した。免疫化の３週間後、すべての動物をビルレント狂犬病ウイルスＣＶＳ株（０．０３ｍｌ，４．８×１０５ＰＦＵを含有）で頭蓋内攻撃した。攻撃感染後２１日目まで毎日、動物を観察した。重篤な神経症状に罹患した瀕死の動物は安楽死させた。
【０１３９】
図３に示すように、１０７ＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧによる単回筋肉内免疫化は、高用量の頭蓋内適用した攻撃ウイルスに対してマウスを完全に防御した（１１／１１）。そのグループの１匹の免疫化動物が１２日目に死亡したが、これは攻撃した狂犬病ウイルス感染によるものではなかった。したがって、その動物をデータ分析から除外した。１０培少ない量（１０６ＰＦＵ）のＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧを含有する単回量の適用は、なお７３％の防御を達成した（８／１１の生存動物）。免疫化用量をさらに減少させると防御率は５８％（１０５ＰＦＵ；７／１２）、または２７％（１０４ＰＦＵ；３／１１）に低下し、これに対し対照免疫化マウス（ｎ＝１５）は攻撃感染後６〜９日目の間に死亡した（図３）。
【０１４０】
実施例５
防御免疫に対するＴ細胞の役割
以下の実験は、組換えＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧによる防御免疫の誘導に対するＴ細胞（ＣＤ４−、ＣＤ８−、またはＣＤ４／８−陽性細胞）の寄与をマウスにおいて調べた。図５Ａに示すように、１０７ＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧによる免疫化０日目の直前および直後（すなわち、−１、０、＋１および＋５日目）に、ＣＤ４−またはＣＤ８−Ｔ細胞に対する抗血清をマウスのグループ（図中に示した動物数（ｎ））に腹腔内投与して、インビボで各Ｔ細胞集団を枯渇させた。
【０１４１】
その後、１５日目にすべての動物を５００ＬＤ５０用量のビルレントＲＶ株ＣＶＳで脳内攻撃した。
【０１４２】
図５Ａに示すように、ＣＤ４−陽性Ｔ細胞を枯渇させた動物は非免疫化対照動物に対するものと類似の応答によって分かるように、一般に防御されなかった。
【０１４３】
図５Ｂにみられるように、動物のグループを０日目にＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧで免疫化し、次いで、１５日目のビルレントＲＶ株ＣＶＳによる攻撃感染の直前および直後に、すなわち１３（攻撃感染の２日前）、１５、１９、および２３日目に、ＣＤ４−および／またはＣＤ８−Ｔ細胞をインビボ枯渇させた。得られた結果は、Ｄ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧによる抗狂犬病ウイルス免疫応答の初回刺激に成功した後では、１４日後のＴ細胞枯渇は、Ｔ細胞集団をインビボ枯渇させた動物の７５〜９０パーセントが攻撃を受けても生存したという点で防御に対して有害に作用しないことを証明する。
【０１４４】
結論として、これらの結果は、ＣＤ４−陽性Ｔ細胞（抗Ｇ抗体産生に必要なヘルパーＴ細胞の可能性が最も高い）が、組換えＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧにより誘導される防御免疫の主要な決定因子であることを示す。
【０１４５】
実施例６
被曝後ワクチン接種
療法ワクチンとしての組換えＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの有効性をマウスにおいて検査した。このために、動物のグループに１０７ＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧを０、１、および４日目に筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種した。マウスを１×１０６ＰＦＵのビルレントＲＶ株ＣＶＳで０日目に攻撃した。図６に示すように、免疫化グループの１匹以外のすべてのマウスが狂犬病に対して防御された。
【０１４６】
ビルレントＲＶ株ＣＶＳに対する種々の被曝後免疫化計画を調べるために、マウスにおいて追加実験を実施した。図７において、灰色四角はマウスにＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧをワクチン接種した日を示す。結果（生存動物）をこの図にまとめる。
【０１４７】
それらの結果は、マウスの療法ワクチンとしてのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧの能力を証明する。図７にみられるように、攻撃日とその翌日に投与した二重ワクチン接種は８０％の防御を仲介し、少なくとも６０％の動物が末梢ＲＶ攻撃感染後３日目に開始した１日１回で４回の免疫化により防御された。
【０１４８】
実施例７：種々の免疫化経路により誘導された免疫応答
マウスを１×１０６ＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＲａｂＧで下記の投与経路により免疫化した：鞘膜内（ｉ．ｖａｇ．）、乱刺法、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、および静脈内（ｉ．ｖ．）。免疫化後６日目（灰色棒）および１３日目（黒色棒）に誘導された血清抗体応答（血清中和抗体、またはＳＮＴとして測定）を図８に示す。免疫化の１４日後に動物に１００ＬＤ５０のビルレントＲＶ株ＣＶＳを脳内感染させ、生存率を計算した。
【０１４９】
これらの結果は、最高ＳＮＴ力価（ＩＵ／ｍｌとして示す）が静脈内、腹腔内および筋肉内ワクチン接種により誘導されたことを示し、これによりそれぞれ８６％、１００％および７８％の最良防御率も得られた。
【図１】
0005890399.tif 000002
【図２】
0005890399.tif 000003
【図３】
0005890399.tif 000004
【図４】
0005890399.tif 000005
【図５Ａ】
0005890399.tif 000006
【図５Ｂ】
0005890399.tif 000007
【図６】
0005890399.tif 000008
【図７】
0005890399.tif 000009
【図８】
0005890399.tif 000010