(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を再プログラムする方法であって、前記細胞内でのＴｂｘ３の発現および／または活性をアップレギュレートすることを含み、前記細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４が導入されてなり、前記Ｔｂｘ３は配列番号１、２、３又は４で表される、方法。
【請求項２】
前記細胞が幹細胞などの多能性細胞になる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
体細胞などの細胞が多能性細胞の１つ以上の特徴を示すようにする方法であって、前記細胞内でのＴｂｘ３の発現および／または活性をモジュレートすることを含み、前記細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４が導入されてなり、前記Ｔｂｘ３は、配列番号１、２、３又は４で表される、方法。
【請求項４】
前記方法がさらに、前記細胞内でのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の１つ以上、組合せ、またはすべての発現および／または活性を、場合により前記細胞内へのｃ−Ｍｙｃの導入を行わずに、モジュレートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、多能性細胞の１つ以上の特徴、たとえば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、およびＴｂｘ３などの１つ以上の多能性マーカーの発現を示し、前記Ｔｂｘ３は配列番号１、２、３又は４で表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、たとえば、異なる遺伝的背景の胚に導入された場合、キメラ現象に寄与しうる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、生殖腺への生殖細胞寄与などにより生殖組織に定着しうる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、高い生殖系列分化能を有して、または高い生殖系列伝播頻度で、生殖組織に定着する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、四倍体胚盤胞相補法を介して正期生産の子孫を生成し得、ここで前記子孫が非ヒトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、マウス細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞株を取得する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施すること、それから細胞株を得ることを含む方法。
【請求項１２】
細胞の分化を増強しうる分子を特定する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を候補分子の存在下で実施すること、および前記候補分子の不在下と比較して、前記細胞による多能性の誘導の低減、前記細胞の再プログラミングの低減または前記細胞による多能性細胞の１つ以上の特徴の発現の低減を検出することを含む方法。
【請求項１３】
細胞の分化を増強しうる分子を特定する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により誘導再プログラム多能性細胞または幹細胞を取得すること、前記細胞を候補分子に暴露すること、および前記細胞の分化を検出することを含む方法。
【請求項１４】
細胞の多能性を増強または誘導しうる分子を特定する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を候補分子の存在下で実施すること、前記候補分子の不在下と比較して、前記細胞による多能性の誘導の増大、細胞の再プログラミングの増大、または前記細胞による多能性細胞の１つ以上の特徴の発現の増大を検出すること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生、細胞生物学、分子生物学、および遺伝学の分野に関する。より具体的には、本発明は、体細胞の再プログラミング、体細胞からの幹細胞の取得、および体細胞での多能性の誘導を行うための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳＣは、多能性であり、限りなく自己複製が可能である。こうした性質は、一群のコア因子により付与され、ＥＳＣの個性を決定する。
【０００３】
成体体細胞は、主要転写因子が導入された場合、ＥＳＣに似るように再プログラミングが可能であることが示されている1。誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、規定の因子を体細胞内に導入することにより取得可能である。このことから、互いの細胞の個性の入れ替えは、さまざまな細胞型に存在する特有のレギュレート分子群により主に規定されることが示唆される。
【０００４】
多能性幹細胞の誘導は、マウスおよびヒトの細胞の両方でいくつかの遺伝子のウイルス形質導入により達成可能であるが、ただし、低効率である。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３に対する阻害剤などの化学化合物を追加すると再プログラミングの効率が改良されることが報告されている2-5。
【０００５】
最近、ｉＰＳ細胞の生成は、ウイルスベクターを用いずに達成されている。ＯＳＫ＋ｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＣ）を過剰発現するプラスミドの反復トランスフェクションにより外因性ＤＮＡ組込みを伴わずにｉＰＳ細胞が得られた6。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の組合せ（ＯＳＫ）は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）からｉＰＳ細胞を生成するのに必要な最小限の要件を構成する。
【０００６】
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、網羅的遺伝子発現解析に基づいて胚性幹細胞（ＥＳＣ）に似ていると考えられる。ＥＳＣ様ｉＰＳ細胞は、これらの方法を用いて慣例に従って取得可能であるが、それらの生殖系列寄与および伝播頻度を注意深く調べた研究はきわめて少ない。
【０００７】
かくして、ｉＰＳ細胞は、独特の形態を有し、ＥＳＣに非常に類似した分子マーカーを発現するが、キメラへのそれらの寄与能および寄与度は、非常にさまざまであった4,7-9。このことから、ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣに完全に似ているわけではなく10、さまざまなｉＰＳ細胞株の質に顕著な相違が存在することが示唆される。
【０００８】
とくに、キメラ現象、生殖組織への定着、ならびに最も重要なこととして、四倍体相補法を用いて生成されたｉＰＳ細胞からの生殖系列伝播および生命誕生への寄与に関して、これらのｉＰＳ細胞クローンの能力および効率は、確立されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、高い生殖系列分化能に関するその能力により規定される再プログラムｉＰＳ細胞の質を改良するために、ＯＳＫの基本要件に加えて他の因子の必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、体細胞などの細胞で多能性を誘導または増強する方法におけるＴｂｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５９９６．３、ＮＰ  ００５９８７．３、ＮＭ  ０１６５６９．３、ＮＰ  ０５７６５３．３）の使用を提供する。
【００１１】
本発明の第２の態様によれば、細胞を再プログラムする方法を提供する。この方法は、細胞内でのＴｂｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５９９６．３、ＮＰ  ００５９８７．３、ＮＭ  ０１６５６９．３、ＮＰ  ０５７６５３．３）の発現および／または活性をモジュレートすることを含む。
【００１２】
この方法または使用は、細胞が幹細胞などの多能性細胞になるようにしうるものであってもよい。
【００１３】
本発明の第３の態様によれば、体細胞などの細胞が多能性細胞の１つ以上の特徴を示すようにする方法を提供する。この方法は、細胞内でのＴｂｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５９９６．３、ＮＰ  ００５９８７．３、ＮＭ  ０１６５６９．３、ＮＰ  ０５７６５３．３）の発現および／または活性をモジュレートすることを含む。
【００１４】
この使用または方法はさらに、細胞内でのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の１つ以上、組合せ、またはすべての発現および／または活性を、場合により細胞内へのｃ−Ｍｙｃの導入を行わずに、モジュレートすることを含みうる。
【００１５】
この方法または使用は、細胞が多能性細胞の１つ以上の特徴（たとえば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、およびＴｂｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５９９６．３、ＮＰ  ００５９８７．３、ＮＭ  ０１６５６９．３、ＮＰ  ０５７６５３．３）などの１つ以上の多能性マーカーの発現を示すようにしうるものであってもよい。
【００１６】
この使用または方法は、細胞が、たとえば、異なる遺伝的背景の胚に導入された場合、キメラ現象に寄与できるようにしうるものであってもよい。
【００１７】
この使用または方法は、細胞が生殖腺への生殖細胞寄与などにより生殖組織に定着できるようにしうるものであってもよい。
【００１８】
この使用または方法は、細胞が高い生殖系列分化能を有してまたは高い生殖系列伝播頻度で生殖組織に定着できるようにしうるものであってもよい。
【００１９】
この使用または方法は、細胞が四倍体胚盤胞相補法を介して正期生産子孫を生成できるようにしうるものであってもよい。
【００２０】
本発明の第４の態様として、細胞で多能性を誘導する方法、細胞を再プログラムする方法、または細胞が多能性細胞の１つ以上１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）の特徴を示すようにする方法で使用するためのＴｂｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ  ００５９９６．３、ＮＰ  ００５９８７．３、ＮＭ  ０１６５６９．３、ＮＰ  ０５７６５３．３）を提供する。この場合、細胞は、たとえば体細胞を含む。
【００２１】
この使用または方法は、細胞がマウス細胞やヒト細胞などの哺乳動物細胞を含むようにしうるものであってもよい。
【００２２】
本発明の第５の態様によれば、幹細胞株を取得する方法を提供する。この方法は、以上に明記された方法を実施することと、それから細胞株を得ることと、を含む。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、記載の方法により取得可能な誘導再プログラム多能性細胞もしくは誘導再プログラム多能性幹細胞、または細胞株を提供する。
【００２４】
本発明の第７の態様では、細胞の分化を増強しうる分子を同定する方法を提供する。この方法は、以上に明記された方法を候補分子の存在下で実施することと、候補分子の不在下と比較して、細胞による多能性の誘導の低減、細胞の再プログラミングの低減、または細胞による多能性細胞の１つ以上の特徴の出現の低減を検出することと、を含む。
【００２５】
本発明の第８の態様によれば、細胞の分化を増強しうる分子を同定する方法を提供する。この方法は、以上に明記された方法により誘導再プログラム多能性細胞または誘導再プログラム多能性幹細胞を取得することと、細胞を候補分子に暴露することと、細胞の分化を検出することと、を含む。
【００２６】
本発明の第９の態様によれば、細胞の多能性を増強または誘導しうる分子を同定する方法を提供する。この方法は、以上に明記された方法を候補分子の存在下で実施することと、候補分子の不在下と比較して、細胞による多能性の誘導の増大、細胞の再プログラミングの増大、または細胞による多能性細胞の１つ以上の特徴の出現の増大を検出することと、を含む。
【００２７】
本発明を実施する際、とくに指定がないかぎり、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術が利用されるものとする。そのような技術は、文献に説明されている。たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．  Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４４−７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ０−８２４７−０５６２−９）、およびＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ  Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的典拠はそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ−１Ｆ】Ｔｂｘ３が細胞融合媒介再プログラミングを支援することが網羅的遺伝子発現プロファイリングにより明らかにされることを示す図である。
【図１Ａ】Ｎａｎｏｇ過剰発現（ＯＥ）またはＴｃｆ３  ＲＮＡｉを有する改変ＥＳＣをＭＥＦと融合してネオマイシンおよびピューロマイシンに耐性の四倍体ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドを生成した。
【図１Ｂ】Ｎａｎｏｇ  ＯＥ、Ｔｂｘ３  ＯＥ、およびＴｃｆ３  ＲＮＡｉは、ＭＥＦの細胞融合媒介再プログラミングを増強した。代表例は、ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドコロニーの出現を示す。Ｔｃｆ３  ＲＮＡｉ、Ｎａｎｏｇ  ＯＥ、またはＴｂｘ３  ＯＥのＥＳＣは、融合後、多数のハイブリッドクローンを生成したが、ＭＥＦとの対照ＥＳＣ融合体は、１回の実験あたり平均１個であった。
【図１Ｃ】Ｎａｎｏｇ  ＯＥ  ＥＳＣは、ＭＥＦの再プログラミングに関して効率的であり、１３個のコロニーを生成し、次いで、Ｔｃｆ３  ＲＮＡｉ（１０個）およびＴｂｘ３  ＯＥ（４．５個）であった。個数は、４回の独立した融合実験の平均値を表す。*は、ベクターと有意差があることを示し、+は、対照ｓｈＲＮＡと有意差があることを示す。
【図１Ｄ】ヒートマップは、対照と比較して処理ＥＳＣで増大されたすべての遺伝子を示している。Ｔｂｘ３は、Ｎａｎｏｇ  ＯＥおよびＴｃｆ３  ＲＮＡｉのＥＳＣで最も高度にアップレギュレートされた遺伝子であった。左端の赤色カラムは、それぞれ、ＣｈＩＰ−ＰＥＴ29およびＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ14データベースに基づいてＮａｎｏｇまたはＴｃｆ３の直接遺伝子標的を表している。
【図１Ｅ】ＥＳＣでのＴｂｘ３のＲＮＡｉノックダウンは、自己複製の低下を引き起こし、分化を誘導した。
【図１Ｆ】ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲにより測定したときのＴｂｘ３遺伝子上のＴｃｆ３およびＮａｎｏｇ占有の富化。
【図２Ａ−２Ｅ】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＴｂｘ３レトロウイルス形質導入を用いたｉＰＳ細胞の生成を示す図である。
【図２Ａ】ＯＳＫＣおよびＯＳＫＣＴは、約３００個のＥＳＣ様コロニー（５×１０4個のＭＥＦあたり）を誘導し、その約１０％は、ＧＦＰを発現した。同一の実験条件下で、ＯＳＫＴは、平均でＯＳＫからの２６個のＥＳＣ様コロニーと比較して３８個を誘導し、ＧＦＰ活性化は、それぞれ、８９％および７４％であった。１６日目にコロニーをアッセイしカウントした。データは、３回の独立した形質導入実験の平均値を表す。*は、ＯＳＫと有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【図２Ｂ】ＯＳＫおよびＯＳＫＴのｉＰＳ細胞クローンは、密なドーム形ＥＳＣ様形態およびコロニー全体にわたり均一なＧＦＰ発現を示したが、ＯＳＫＣクローンは、まばらなＧＦＰ発現を有する扁平形トランスフォーム細胞として出現した。スケールバー＝１００μｍ。
【図２Ｃ】ＯＳＫＴは、感染９〜１０日後に初代ＭＥＦ由来のｉＰＳでＯｃｔ４−ＧＦＰトランスジーンの活性化を誘導したが、ＯＳＫおよびＯＳＫＣの組合せは、１４日間を必要とすることが４回の独立した形質導入実験で観測された。
【図２Ｄ】ＰＣＲ分析では、さまざまな組合せを用いて生成されたｉＰＳ細胞で特定因子に対する過剰発現プラスミドのゲノム組込みが確認された。
【図２Ｅ】ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１に特異的な抗体によりおよびアルカリ性ホスファターゼ活性により検出される典型的なＥＳＣタンパク質を発現した。スケールバー＝１００μｍ。
【図３Ａ−３Ｂ】ｉＰＳ細胞クローンのトランスクリプトームが再プログラミング因子のさまざまな組合せで生成したことを示す図である。
【図３Ａ】網羅的発現プロファイリングの階層的クラスタリングでは、ＯＳＫＴおよびＯＳＫクローンは、ＯＳＥよりも野生型ＥＳＣに類似しているが、相関係数（Ｒ2＝０．９４）に基づいて互いと区別できないことが示された。Ｒ2値は、各組合せですべてのｉＰＳクローンの平均個別遺伝子シグナル強度から得られ、Ｒ１  ＥＳＣと比較された。クローンが単離された独立した形質導入実験は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤとして示されている。
【図３Ｂ】個別ＥＳＣ関連遺伝子プロファイルの分析では、ＯＳＫＴ由来ｉＰＳ細胞とＯＳＫ由来ｉＰＳ細胞とを識別しうるサブセットが明らかにされた。「識別性」ＥＳＣ遺伝子は、ＯＳＫＴとＥＳＣとの間では類似したレベルで発現されたが、ＯＳＫでは有意に低いレベルで発現された。他のＥＳＣ関連遺伝子の大部分は、「非識別性」であり、ＯＳＫＴおよびＯＳＫの両者間で類似したレベルで存在する。*は、ＯＳＫＴと有意差があることを示し、+は、ＥＳＣと有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。マイクロアレイに基づく遺伝子発現の変化をｑＰＣＲにより確認した（図Ｓ９）。
【図４Ａ−４Ｇ】ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞が増強された生殖系列寄与および伝播を示すことを示す図である。
【図４Ａ】４〜８細胞桑実胚中へのＧＦＰ+ｉＰＳ細胞の注入（上側パネル）ならびにそれに続く胚盤胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟および代理動物中への再留置。ＧＦＰ+細胞は、とくにＩＣＭに局在化する（下側パネル）。
【図４Ｂ】キメラＥ１３．５胎仔の生殖腺中におけるさまざまな再プログラミング因子の組合せを用いて生成されたＧＦＰ+細胞の量的寄与および空間分布を示す代表的写真。
【図４Ｃ】さまざまな組合せの因子を用いたときのキメラ胎仔の生殖腺へのＧＦＰ+ｉＰＳ細胞由来生殖細胞の寄与およびそれらの空間分布を比較した表。ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞は、ＯＳＫおよびＯＳＥのｉＰＳ細胞と比較して生殖腺への定着に関して最も効果的であった。*は、ＯＳＫと有意差があることを示す（ｐ＜０．０１）。ＯＳＫ対ＯＳＫＴの比較のために１１セットの独立したマイクロインジェクションを行った。
【図４Ｄ】アルビノマウスと交雑した後のＦ2子孫のキメラ被毛および誕生へのｉＰＳ細胞の寄与を示す代表的写真。黒色子孫は、ｉＰＳ細胞の生殖系列伝播の指標となる（ｉｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ）。
【図４Ｅ】さまざまな組合せの因子を用いて生成されたｉＰＳ細胞の生殖系列伝播頻度をまとめた表。各組合せに対して、２〜６つのｉＰＳ細胞株を用いて生存キメラを取得し、各組合せでそのうちの少なくとも１匹の雄をアルビノ雌と交差して黒色Ｆ2の頻度を決定した。*は、ＯＳＫおよびＯＳＥと有意差があることを示す（それぞれ、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．００１）。
【図４Ｆ】四倍体相補法から生存動物を生成する能力に関して２つのＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞株を試験した。ＯＳＫＴ  ＃１４では代理雌の子宮退縮の疑いがあったため、四倍体相補法で生成された初期の３３個の胚に由来する２匹の胎仔をＥ１９で帝王切開により取得した。ＯＳＫＴ  ＃１６では、５０個の胚から１０匹の生産仔を取得した。８匹は１日目、５匹は２日目、３匹は１週目まで生存した。１匹の過体重出生仔は、２週目前に死亡し、２匹の残りのマウスは、２ヶ月を過ぎて生存した。
【図４Ｇ】多重転写因子結合遺伝子座内の転写因子（ＴＦ）群の共起。ヒートマップの色は、ＴＦの各対の共局在化頻度を反映する（黄色は、より高頻度で共局在化されることを意味し、赤色は、より少ないことを意味する）。
【図５】ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッド細胞の核型分析を示す図である。初代ＭＥＦは、分裂中期に正常二倍体核型を示した（ｎ＝４０）。Ｎａｎｏｇ  ＯＥ  ＥＳＣ／ＭＥＦおよびＴｃｆ３  ＲＮＡｉ  ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドは、中央値染色体数が８０個の四倍体であった。合計２０個の分裂中期スプレッドを各条件で分析した。
【図６】Ｎａｎｏｇ  ＯＥおよびＴｃｆ３  ＲＮＡｉのＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドが親ＥＳＣ系に似ていていることを示す図である。Ｎａｎｏｇ  ＯＥおよびＴｃｆ３  ＲＮＡｉのＥＳＣは、野生型ＥＳＣが分化するＬＩＦの不在下で増殖可能であった（Ｔａｍ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔ−ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６，２０１９−３１（２００８）、Ｓｉｌｖａ，Ｊ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．，Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｓ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｎａｎｏｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｆｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，９９７−１００１（２００６））。また、これらの細胞に由来する誘導ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドは、ＬＩＦを用いずに増殖可能であったが、対照ハイブリッド細胞は、増殖不能であった。未分化ＥＳＣは、アルカリホスファターゼ陽性（赤色）であった。スケールバー＝１００μｍ。
【図７】Ｎａｎｏｇプロモーターのエピジェネティクス解析を示す図である。ＭＥＦのＮａｎｏｇ近位プロモーターは、ＣｐＧ部位で高度にメチル化されていたが、ＥＳＣではメチル化されていなかった。細胞融合すると、Ｎａｎｏｇ  ＯＥおよびＴｃｆ３  ＲＮＡｉの両ＥＳＣに由来するＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドは、ＭＥＦ  Ｎａｎｏｇプロモーターの完全脱メチル化を示し、四倍体細胞の非メチル化ＣｐＧ部位を生じた。黒丸はメチル化ＣｐＧ部位を表し、一方、白丸は非メチル化を表している。
【図８】細胞融合事象の頻度のＦＡＣＳ解析。遺伝子操作の結果として再プログラミングの増強が細胞融合事象の増加に起因しうる可能性を排除するために、対照ＥＳ細胞と対比して改変ＥＳ細胞で細胞融合効率を追跡した。改変されたＥＳＣ（Ｎａｎｏｇ  ＯＥ、Ｔｂｘ３  ＯＥ、またはＴｃｆ３  ＲＮＡｉ）およびＭＥＦをそれぞれ蛍光染料（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ）ＳＮＡＲＦ−１およびＣＤＦＡ−ＳＥで標識し、続いて、細胞融合および平板培養を行った。２４時間後、標識細胞の割合をＦＡＣＳにより解析した。ＭＥＦと融合された３つの改変ＥＳＣ系のいずれでも、対照ＥＳＣと比較して、二重染料標識パーセントに差がなかった。
【図９Ａ】ｑＰＣＲにより測定されたＴｂｘ３の発現変化を示す図である。ＥＳＣでのＮａｎｏｇ  ＯＥおよびＴｃｆ３  ＲＮＡｉノックダウンは両方とも、Ｔｂｘ３のレベルをアップレギュレートしたことから、図１Ｄに示されるマイクロアレイデータが確証された（ｎ＝３）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図９Ｂ】ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドクローンの遺伝子発現プロファイリングを示す図である。Ｎａｎｏｇ  ＯＥまたはＴｃｆ３  ＲＮＡｉ  ＥＳＣとのＭＥＦ融合から得られたハイブリッドを対照ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドと比較した。Ｎａｎｏｇ  ＯＥまたはＴｃｆ３  ＲＮＡｉ  ＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドでアップレギュレートされたすべての遺伝子のうち、Ｔｂｘ３は、最も上昇した遺伝子群に属していた。各ヒートマップの左端のカラムの赤色バーは、ＮａｎｏｇまたはＴｃｆ３の直接標的である遺伝子を示している。
【図１０】感染４８時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のｐＬｅｎｔｉ６−ＵＢＣおよびｐＭＸｓプラスミドからのＴｂｘ３の過剰発現を示すウェスタンブロット解析を示す図である。
【図１１】ｉＰＳ細胞株単離のまとめを示す図である。Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランスジーンの再活性化を示す合計３６のｉＰＳ細胞株（形質導入実験セットＡおよびＢから）を再プログラミング因子の各組合せで単離した。これらを平均６回の継代培養で拡大増殖した後、ｉｎ  ｖｉｖｏ発生能のマイクロアレイ解析および検証を行った。組合せＯＳＫおよびＯＳＫＴは、約９０％の効率で安定なｉＰＳ細胞株を生成したが、ｉＰＳ系を誘導する効率は、ＯＳＫＣＴでは３３．３％、ＯＳＫＣでは５０％であった。
【図１２】奇形腫へのｉＰＳ細胞の分化を示す図である。誘導ＰＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍増殖は、すべての場合で観測され、取り出され、固定され、パラフィン包埋され、薄片にされ、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。ＯＳＫＣ、ＯＳＫ、およびＯＳＫＴを用いて誘導されたｉＰＳ細胞から得られた奇形腫はすべて、さまざまな細胞型への広範なｉｎ  ｖｉｖｏ分化を示した。
【図１３】ｑＰＣＲによる図３Ｂのマイクロアレイから得られた遺伝子発現レベルの検証を示す図である。対象の遺伝子の転写レベルを内部対照としてのβ−アクチンに対して規格化し、続いて、Ｒ１  ＥＳＣ−１に対して規格化した。各ｉＰＳ細胞クローンでｎ＝３の技術反復試験。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図１４】ｉＰＳ細胞の生殖系列伝播能の解析のスキームを示す図である。ＭＥＦは、Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランスジーンを保有するＢ６マウス［ＣＢＡ−Ｔｇ（Ｐｏｕ５ｆ１−ＥＧＦＰ）２Ｍｎｎ／Ｊ］に由来するものであった。誘導ＰＳ細胞をアルビノマウスの４〜８細胞胚に注入し、内部細胞塊中にＧＦＰ+細胞を含有する胚盤胞に成熟させ、そして偽妊娠の代理マウスに移植した。Ｅ１３．５でマウスの半分を屠殺してキメラの生殖腺へのｉＰＳ細胞の寄与を評価した。この段階では、Ｏｃｔ４は、生殖細胞内でのみ再活性化されるであろう。生存キメラ（Ｆ1）を残りの代理マウスから取得し、続いて、アルビノマウスと交配した。Ｆ2子孫は、黒色アルビノマウスおよびヘテロ接合マウスを含む。黒色Ｆ2生成は、ｉＰＳ細胞からの少なくとも１つの対立遺伝子（毛色を特定する）および染色体の伝播の指標となる。
【図１５】キメラの生殖腺へのｉＰＳ細胞の寄与を示す図である。野生型胚へのｉＰＳ細胞の注入により得られたＥ１３．５キメラの精巣および卵巣へのｉＰＳ細胞の寄与を評価した。各生殖腺内のＧＦＰ+細胞の分布パーセントの任意参照基準を目視評価に基づいて＞９０％、５０〜９０％、および＜５０％に設定した。各組合せでＧＦＰ+ｉＰＳ由来生殖細胞寄与を有する生殖腺のみが示されている。
【図１６】ｉＰＳ細胞での組込みトランスジーンのサイレンシングを示す図である。再プログラミング因子を用いたＭＥＦのレトロウイルス感染の４日後、トランスジーンに特異的なｑＰＣＲプライマーを用いて外因性因子の発現を検出することが可能である。十分に再プログラムされたｉＰＳ細胞では、トランスジーンの発現は検出できなかった。各ｉＰＳ細胞クローンにつきｎ＝３の技術反復試験。
【図１７】サザンハイブリダイゼーション解析によりＯＳＫおよびＯＳＫＴクローンの両方でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４トランスジーンの多重組込みが明らかにされることを示す図である。組込みの頻度は、両組合せを用いて誘導された種々のクローン間で類似して現れた。Ｔｂｘ３組込みは、さまざまな頻度でＯＳＫＴクローンでのみ検出された。
【図１８】図である。
【図１９】十分な発生能への体細胞ゲノムの再プログラミングの進行を評価するために利用可能な「多能性ランドマーク」のモデルを示す図である。さまざまな因子の組合せを用いることにより、多能性の進行「ランドマーク」を基軸としてかなり異なる発生能を有するｉＰＳ集団およびクローンが生成される。既存の再プログラミング因子にＴｂｘ３を追加すると、再プログラム細胞の全集団内でＥＳＣと等価なまたはそれに最も近い多能性状態を達成したｉＰＳ細胞の確率頻度が増加する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｔｂｘ３による多能性の増強
ｉＰＳ細胞の質を有意に改良する転写因子としてＴｂｘ３を同定した。とくに、Ｔｂｘ３が幹細胞などの細胞の多能性を増強しうることを確証する。
【００３０】
実施例で実証されるように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４（ＯＳＫ）＋Ｔｂｘ３（すなわちＯＳＫＴ）を用いて生成された誘導ＰＳ細胞は、生殖腺への生殖細胞寄与および生殖系列伝播頻度の両方で優れている。とくに、網羅的遺伝子発現プロファイリングではＯＳＫ  ｉＰＳ細胞とＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞とを区別できないことを見いだした。
【００３１】
さらに、ＥＳＣでのＴｂｘ３結合部位のゲノムワイドＣｈＩＰ配列解析から、Ｔｂｘ３が、多くの共通した下流のレギュレート標的をＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＳｍａｄ１と共有することに加えて、多能性関連因子および再プログラミング因子をレギュレートすることが示唆されることを実施例で示す。
【００３２】
したがって、体細胞や幹細胞（誘導多能性幹細胞を含む）などの細胞の多能性を増強または誘導する方法を一般的に記述する。そのような細胞で多能性を誘導する方法を記述する。誘導多能性幹細胞などの幹細胞を調製する方法を記述する。
【００３３】
本方法は、Ｔｂｘ３を含む再プログラミング因子の活性もしくは発現またはその両方のアップレギュレーションに依拠する。とくに、１種以上の再プログラミング因子およびＴｂｘ３の存在下で体細胞や幹細胞（誘導多能性幹細胞を含む）などの細胞の多能性の増強または誘導を行う方法を記述する。本方法は、腫瘍原性因子の疑いのあるｃ−Ｍｙｃを用いても用いなくても利用可能である。
【００３４】
Ｔｂｘ３の存在下でＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子（または以上の任意の組合せ）などの核再プログラミング誘導遺伝子を体細胞内に導入することにより、細胞の多能性を増大させうることおよび誘導多能性幹細胞を効率的に調製しうることを確認した。
【００３５】
したがって、Ｔｂｘ３の存在下での核再プログラミング因子を用いた核再プログラミングを含む、誘導多能性幹細胞の調製方法および幹細胞の多能性の増強方法を記述する。Ｔｂｘ３は、Ｔｂｘ３の存在下でその不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有しうる。
【００３６】
たとえば、本方法は、胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルでＴｂｘ３を発現することを含みうる。本方法は、Ｔｂｘ３がＴｂｘ３の存在下でＴｂｘ３の不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有するという特徴を含みうる。
【００３７】
本方法は、核再プログラミング前に体細胞内に存在するレベルと比較して増大されたレベルのＴｂｘ３の存在下で核再プログラミングが行われるという特徴を含みうる。
【００３８】
本明細書に記載の方法および組成物で使用するのに好適な細胞は、任意の好適な起源に由来するものでありうる。例としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル、およびハムスターの細胞、たとえば、ヒトまたはマウスに由来する体細胞または幹細胞、たとえば、ヒトに由来する体細胞または幹細胞が挙げられる。
【００３９】
体細胞は、ヒト胚細胞または成人由来体細胞を含みうる。体細胞は、１個体以上に特異的なもの、たとえば、個体群または集団からの体細胞の集まりでありうる。
【００４０】
体細胞は、患者から集められた体細胞を含みうる。
【００４１】
さらに、本明細書に記載の方法および組成物により作製可能な幹細胞または多能性が増強された細胞（誘導多能性幹細胞を含む）を提供する。さらに、そのような細胞からの分化を誘導することにより得られる体細胞を提供する。さらに、そのような細胞を患者に導入または移植することを含む療法（これは幹細胞療法と呼びうる）を提供する。
【００４２】
体細胞が患者に導入または移植される療法も記述する。そのような体細胞は、本明細書に記載の方法に従って得られる誘導多能性幹細胞などの細胞からの分化を誘導することにより取得可能である。体細胞源は、患者から単離および捕集することが可能である。
【００４３】
本文書に記載の方法により得られる多能性が増強された細胞（たとえば誘導多能性幹細胞）からの分化を誘導することにより得られる種々の細胞を用いて、化合物、薬剤、または毒性物質の生理学的作用または毒性を評価する方法も記述する。
【００４４】
胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルで発現されかつＴｂｘ３の存在下でその不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有するＴｂｘ３を使用する、体細胞や幹細胞（誘導多能性幹細胞を含む）などの細胞の多能性を増強または誘導する方法、たとえば、誘導多能性幹細胞を調製する方法を記述する。
【００４５】
胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルで発現されかつＴｂｘ３の存在下でＴｂｘ３の不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有するＴｂｘ３を使用する、体細胞の核再プログラミング方法を記述する。
【００４６】
本明細書に記載の方法は、体細胞や幹細胞（誘導多能性幹細胞を含む）などの細胞の多能性を増強もしくは誘導するためのまたは誘導多能性幹細胞を調製するための、胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルで発現され（たとえば、Ｔｂｘ３は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット解析により決定されるように、ＥＳ細胞内で、分化したまたは分化を開始したＥＳ細胞と比較してより高いレベルで発現されうる）かつＴｂｘ３の存在下でその不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有するＴｂｘ３の使用を含む。
【００４７】
体細胞の核再プログラミングのための、胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルで発現されかつＴｂｘ３の存在下でその不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有するＴｂｘ３の使用に関する方法を記述する。言い換えれば、核再プログラミングひいては誘導多能性幹細胞の生成または多能性の増強は、Ｔｂｘ３の存在下およびＴｂｘ３の不在下で実施可能である。
【００４８】
核再プログラミングはまた、たとえば、Ｔｂｘ３のレベルが核再プログラミング前の体細胞内で増大されたときに核再プログラミングの効率が増大されるように、Ｔｂｘ３の種々の量および／または形態たとえば（ｓｕｓｈ  ａｓ）アイソフォーム（本文書中の他の箇所に記載される）の存在下で実施可能である。
【００４９】
体細胞や幹細胞（誘導多能性幹細胞を含む）などの細胞の多能性を増強または誘導するための、たとえば、誘導多能性幹細胞を調製するための、Ｔｂｘ３の存在下でその不在下よりも高い核再プログラミング効率を提供する性質を有するＴｂｘ３の使用を含む方法も記述する。
【００５０】
たとえば、追加されたＴｂｘ３の存在は、Ｔｂｘ３の不在下での形成不足と比較して誘導多能性幹細胞の形成を提供可能である。また、たとえば、Ｔｂｘ３を追加しておよび追加せずに同一濃度で同一成分を含有する核再プログラミング因子の存在下で同一数の体細胞を用いて核再プログラミングを行った場合、Ｔｂｘ３の追加を含むサンプルでＴｂｘ３が追加されていないサンプルよりも多数の誘導多能性幹細胞が生成されたとき（またはより多数の細胞が多能性の特徴を示したとき）、効率の増大が観測されうる。
【００５１】
他の例では、核再プログラミング前の体細胞内に存在するＴｂｘ３量と比較して増大された量のＴｂｘ３を用いて、誘導多能性幹細胞の生成の効率の増大が達成されうる。
【００５２】
核再プログラミング因子
本方法は、Ｔｂｘ３の存在下で体細胞、幹細胞、または誘導多能性幹細胞などの細胞を１種以上の核再プログラミング因子（たとえばこれらの組合せ）に暴露することに依拠する。
【００５３】
核再プログラミング因子は、核再プログラミング活性を有する単一物質または複数の物質の組合せのいずれかを含みうる。
【００５４】
核再プログラミング活性は、当技術分野で公知のいくつかの方法、たとえば、国際公開第２００５／８０５９８Ａ１号パンフレットに開示される方法によりアッセイまたは検出することが可能である。本文書はさらに、核再プログラミング因子をスクリーニングする方法を記述する。そのようなスクリーニング方法で検出されるかまたは核再プログラミング活性が陽性と判断される分子はいずれも、幹細胞を調製するためにまたはその多能性を増大させるために本文書に記載の方法および組成物で使用可能である。
【００５５】
当業者であれば、以上の公開を参照することにより本明細書に記載の方法および組成物で使用するための核再プログラミング因子をスクリーニングすることが可能である。それに加えて、核再プログラミング因子はまた、以上のスクリーニング方法に適切な修正または変更を加えた方法を用いることにより確認することも可能である。
【００５６】
核再プログラミング因子は、単一の遺伝子産物、すなわち、単一の遺伝子の発現産物を含みうる。他の選択肢としてまたは追加として、国際公開第２００５／８０５９８Ａ１号パンフレットに開示されるような好適なアッセイにより核再プログラミング因子活性がいずれも陽性とみなしうる複数の遺伝子などのいくつかの遺伝子の遺伝子産物の組合せを含む。
【００５７】
本明細書に記載の方法および組成物で記載の核再プログラミングは、以上で決定されるような核再プログラミング活性を有するとアッセイされる適合物質（１種もしくは複数種の遺伝子などの複数の物質を含む）を体細胞など細胞内に導入することによる核再プログラミング因子を用いた核再プログラミングを含みうる。
【００５８】
また、１種もしくは複数種の遺伝子または１種もしくは複数種の物質を幹細胞（たとえば誘導多能性幹細胞）などの細胞内に導入することも可能である。そうすることにより、細胞が幹細胞になるように（体細胞である場合）または幹細胞の１つ以上の特徴または活性を示すようにすることが可能である。他の選択肢としてまたは追加として、本方法は、誘導多能性幹細胞などの幹細胞の多能性を増大または増強しうる。
【００５９】
核再プログラミング活性を有する物質は、状況に合った任意の手段によりおよび任意の好適な形態で体細胞または幹細胞または誘導多能性幹細胞など細胞内に導入可能である。たとえば、核再プログラミング活性を有する物質は、組換えベクターの形態で導入可能である。
【００６０】
たとえば、核再プログラミング活性を有する物質は、遺伝子を含みうる。また、その遺伝子は、体細胞または幹細胞または誘導多能性幹細胞などの細胞内に導入される組換えベクター中に含有されうる。
【００６１】
核再プログラミング因子の組合せ
再プログラミング因子をコードする遺伝子の組合せの例は、国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレットならびにその対応出願の米国特許出願第１２／２１３，０３５号明細書および米国特許出願第１２／２８９，８７３号明細書（「核再プログラミング因子および誘導多能性幹細胞」という名称で２００８年１１月６日に出願された）（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。
【００６２】
当業者であれば、以上の公開を参照することにより本明細書に記載の方法に使用可能な遺伝子を適切に選択することが可能である。それに加えて、再プログラミング因子をコードする遺伝子の組合せの他の例は、たとえば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−２０，２００７（その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。
【００６３】
したがって、当業者であれば、再プログラミング因子をコードする遺伝子のさまざまな組合せを理解することが可能であり、また、国際公開第２００５／８０５９８Ａ１号パンフレットに記載の核再プログラミング因子のスクリーニング方法を用いることにより、国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレットやＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−２０，２００７に開示されていない組合せで遺伝子の適切な組合せを本明細書に記載の方法で利用することが可能である。
【００６４】
本明細書に記載の方法に使用可能な再プログラミング因子をコードする遺伝子の例としは、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子、たとえば、Ｍｙｃファミリー遺伝子を除いて、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子、たとえば、２種の遺伝子の組合せ、たとえば、３種の遺伝子の組合せ、たとえば、４種の遺伝子の組合せが挙げられうる。
【００６５】
Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子に関して、これらのファミリー遺伝子の特定例は、国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレットに記載されている。Ｌｉｎファミリー遺伝子に関して、当業者であれば、類似の方法でファミリー遺伝子を抽出することが可能である。Ｌｉｎファミリー遺伝子の例としては、たとえば、Ｌｉｎ２８およびＬｉｎ２８ｂが挙げられる。Ｌｉｎ２８のＮＣＢＩ受託番号は、ＮＭ  １４５８３３（マウス）およびＮＭ  ０２４６７４（ヒト）である。Ｌｉｎ２８ｂのＮＣＢＩ受託番号は、ＮＭ  ００１０３１７７２（マウス）およびＮＭ  ００１００４３１７（ヒト）である。
【００６６】
低分子量化合物
それに加えて、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子によりコードされる再プログラミング因子は、たとえばサイトカインまたはいくつかの場合には１種以上の他の低分子量化合物で置き換えることが可能である。
【００６７】
そのような低分子量化合物の例としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、およびＮａｎｏｇ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子の発現に対して増強作用を有する低分子量化合物が挙げられうる。当業者であれば、そのような低分子量化合物を容易にスクリーニングすることが可能である。
【００６８】
遺伝子の特定の組合せは、次のとおりである。すなわち、（ａ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＳｏｘファミリー遺伝子とを含む２種の遺伝子の組合せ、（ｂ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＳｏｘファミリー遺伝子とを含む３種の遺伝子の組合せ、（ｃ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＳｏｘファミリー遺伝子とＬｉｎファミリー遺伝子とＮａｎｏｇ遺伝子とを含む４種の遺伝子の組合せ、（ｄ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とを含む２種の遺伝子の組合せ、および（ｅ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＭｙｃファミリー遺伝子とを含む３種の遺伝子の組合せ。しかしながら、これら組合せは、限定されるとみなされるものではない。
【００６９】
これらの遺伝子はすべて、ヒトを含めて哺乳動物に一般に存在する。本明細書に記載の方法および組成物に従って以上の遺伝子を使用するために、任意の哺乳動物に由来する（たとえば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびサルなどの哺乳動物に由来する）遺伝子を利用することが可能である。
【００７０】
それに加えて、野生型遺伝子産物、さらには、いくつかのアミノ酸（たとえば１〜１０個のアミノ酸、たとえば１〜６個のアミノ酸、たとえば１〜４個のアミノ酸、たとえば１〜３アミノ酸、たとえば１または２個のアミノ酸）の置換、挿入、および／または欠失がありかつ野生型遺伝子産物に匹敵する等価な機能を有する突然変異遺伝子産物を使用することも可能である。
【００７１】
たとえば、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子産物に関して、野生型と同様に安定型変異体（たとえば（Ｔ５８Ａ）など）を使用することも可能である。同一の原理は、他の遺伝子産物にも適用可能である。
【００７２】
遺伝子の不死化
以上の遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子を組み合わせることも可能である。国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレットに開示されるように、たとえば、ＴＥＲＴ遺伝子および次の遺伝子、すなわち、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、およびＢｍｉｌから選択される１種以上の遺伝子）を単独で使用するかまたは適切な組合せで一緒に使用することが可能である。
【００７３】
特定の他の組合せは、次のとおり、たとえば、（ｅ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＳｏｘファミリー遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子とを含む４種の遺伝子の組合せ、（ｆ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＳｏｘファミリー遺伝子とＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子とを含む４種の遺伝子の組合せ、および（ｇ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＳｏｘファミリー遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子とＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子とを含む５種の遺伝子の組合せである。Ｋｌｆファミリー遺伝子は、以上の組合せから削除可能である。
【００７４】
他の遺伝子
さらに、以上の遺伝子に加えて、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｅｌｌ、およびβ−カテニンから選択される１種以上の遺伝子を組み合わせることが可能であり、かつ／またはＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、およびＧｒｂ２から選択される１種以上の遺伝子を組み合わせることが可能である。これらの組合せは、とくに、国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレットに記載されている。
【００７５】
遺伝子の他の組合せは、次のとおり、すなわち、（１）Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２とを含む２種の遺伝子の組合せ、（２）Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４とＳｏｘ２とを含む３種の遺伝子の組合せ、（３）Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２とＬｉｎ２８とＮａｎｏｇとを含む４種の遺伝子の組合せ、（４）Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２とＴＥＲＴとＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子とを含む４種の遺伝子の組合せ、（５）Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４とＳｏｘ２とＴＥＲＴとＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子とを含む５種の遺伝子の組合せ、（６）Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４とを含む２種の遺伝子の組合せ、（７）Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４とｃ−Ｍｙｃとを含む３種の遺伝子の組合せ、および（８）Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２とＫｌｆ４とｃ−Ｍｙｃとを含む４種の遺伝子の組合せである。しかしながら、これら組合せは、限定されるとみなされるものではない。
【００７６】
以上に挙げた遺伝子産物を含む因子はまた、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｅｌｌ、およびβ−カテニンから選択される遺伝子の１種以上の遺伝子産物と組み合わせることも可能である。さらに、これらの因子はまた、たとえば、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、およびＧｒｂ２から選択される遺伝子の１種以上の遺伝子産物と組み合わせることも可能である。
【００７７】
これらの遺伝子産物は、国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレットに開示されている。しかしながら、本明細書に記載の核再プログラミング因子に含まれうる遺伝子産物は、以上に具体的に記載された遺伝子の遺伝子産物に限定されるものではない。
【００７８】
本明細書に記載の核再プログラミング因子は、核再プログラミング因子さらには分化、発生、または増殖に関与する１種以上の因子および他の生理学的活性を有する因子として機能しうる他の遺伝子産物を含みうる。
【００７９】
これらの遺伝子のうち、１種以上の遺伝子産物が再プログラムされる体細胞内ですでに発現されている場合、そのような遺伝子産物は、導入される因子から除外可能である。たとえば、すでに発現されている遺伝子以外の１種以上の遺伝子は、適切な遺伝子導入方法たとえば組換えベクターを使用する方法により体細胞内に導入可能である。
【００８０】
他の選択肢として、これらの遺伝子のうち、１種以上の遺伝子産物が、ＨＩＶウイルス由来ＴＡＴペプチドおよび／または核移行シグナルの添加による融合タンパク質の形成などの技術、または核マイクロインジェクションなどの技術、または単純に、形質膜を横切って拡散可能な小分子の添加により、核内に導入される場合、他の１種以上の遺伝子は、適切な遺伝子導入方法たとえば組換えベクターを使用する方法により導入可能である。
【００８１】
融合産物およびマーカー
それに加えて、核再プログラミング因子として機能する遺伝子産物は、それ自体が以上に挙げた遺伝子から産生されるタンパク質でありうるか、またはそのようなタンパク質と他のタンパク質、ペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態をとりうる。
【００８２】
たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する融合タンパク質およびヒスチジンタグなどのペプチドを有する融合遺伝子産物を使用することも可能である。さらに、ＨＩＶウイルス由来ＴＡＴペプチドを有する調製された融合タンパク質を使用すれば、細胞膜を介する核再プログラミング因子のエンドサイトーシスの促進が可能になり、さらには、遺伝子導入などの複雑な操作を回避しつつ培地中に単にそのような融合タンパク質を添加するだけで再プログラミングの誘導が可能になる。
【００８３】
以上に挙げた融合遺伝子産物の調製方法は、当業者に周知であり、したがって、当業者であれば、目的に合わせて適切な融合遺伝子産物を容易に設計および調製することが可能である。
【００８４】
以上に記載したように、多能性は、Ｔｂｘ３の追加により増強可能である。
【００８５】
ＴＢＸ３
ＴＢＸ３はまた、Ｔ−ｂｏｘ  ３としても、ＵＭＳ、ＸＨＬ、ＴＢＸ３−ＩＳＯ、ＴＢＸ３としても知られる。ＴＢＸ３の配列は、ＮＧ  ００８３１５．１  ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅを含む。
【００８６】
Ｔ−ｂｏｘ転写因子ＴＢＸ３は、ヒトではＴＢＸ３遺伝子によりコードされるタンパク質である（Ｌｉ  ＱＹ，Ｎｅｗｂｕｒｙ−Ｅｃｏｂ  ＲＡ，Ｔｅｒｒｅｔｔ  ＪＡ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＩ，Ｃｕｒｔｉｓ  ＡＲ，Ｙｉ  ＣＨ，Ｇｅｂｕｈｒ  Ｔ，Ｂｕｌｌｅｎ  ＰＪ，Ｒｏｂｓｏｎ  ＳＣ，Ｓｔｒａｃｈａｎ  Ｔ，Ｂｏｎｎｅｔ  Ｄ，Ｌｙｏｎｎｅｔ  Ｓ，Ｙｏｕｎｇ  ＩＤ，Ｒａｅｂｕｒｎ  ＪＡ，Ｂｕｃｋｌｅｒ  ＡＪ，Ｌａｗ  ＤＪ，Ｂｒｏｏｋ  ＪＤ（Ｊａｎ  １９９７）．”Ｈｏｌｔ−Ｏｒａｍ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＴＢＸ５，ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ”．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５（１）：２１−９）。
【００８７】
この遺伝子は、共通のＤＮＡ結合ドメインＴ−ｂｏｘを共有する系統発生的に保存された遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｔ−ｂｏｘ遺伝子は、発生過程のレギュレーションに関与する転写因子をコードする。このタンパク質は、転写リプレッサーであり、四肢動物の前肢の前後軸で役割を果たすと考えられる。この遺伝子での突然変異は、肢、アポクリン腺、歯、毛髪、および生殖器発育に影響する尺骨・乳房症候群を引き起こす。
【００８８】
この遺伝子の選択的スプライシングの結果として、異なるアイソフォームをコードする３つの転写変異体が得られる（以下に記載されるとおり）。
【００８９】
Ｔｂｘ３は、体細胞が再プログラムされる標的動物と同一の動物種に由来するものでありうる。本明細書に記載の方法および組成物で使用するのに好適なＴｂｘ３としては、野生型Ｔｂｘ３、さらには、１〜数個のヌクレオチド（たとえば１〜６個のヌクレオチド、たとえば１〜４個のヌクレオチド、たとえば１〜３個のヌクレオチド、たとえば１または２個のヌクレオチド、たとえば１個のヌクレオチド）の置換、挿入、および／または欠失がありかつｉｎ  ｖｉｖｏで野生型Ｔｂｘ３と等価な機能を発揮しうるＴｂｘ３が挙げられる。
【００９０】
たとえば、使用可能なＴｂｘ３としては、１〜数個のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失がありかつｉＰＳ細胞生成の効率を増大させるＴｂｘ３が挙げられる。本明細書に記載のＴｂｘ３としてはまた、１〜数個のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失がありかつ核再プログラミングの効率を改良するＴｂｘ３が挙げられる。
【００９１】
本明細書に記載の方法で使用可能なＴｂｘ３の例としては、以下に詳細に明記されるようなＴｂｘ３アイソフォームが挙げられうるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
ＴＢＸ３アイソフォーム１
Ｔｂｘ３のこの変異体（１）は、転写変異体であり、このタンパク質のより短いアイソフォーム（１）をコードする。ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１を有する。タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ  ００５９８７．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１を有する。
【００９３】
配列源としては、ＡＦ１４０２４０、ＡＫ０５４６０４、およびＢＣ０２５２５８が挙げられる。コンセンサスＣＤＳは、受託番号ＣＣＤＳ９１７５．１を有する。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号は、Ｏ１５１１９である。関連するＥｎｓｅｍｂｌ配列は、受託番号ＥＮＳＰ０００００２５７５６７、ＥＮＳＴ０００００３４９１５５を有する。
【００９４】
【化１】
0005939985.tif 000002
【００９５】
ＴＢＸ３アイソフォーム２
Ｔｂｘ３のこの変異体（２）は、変異型１と比較して代替インフレームエキソンを含有する。得られるアイソフォーム（２）は、アイソフォーム１と比較して同一のＮ末端およびＣ末端を有しかつより長い。
【００９６】
ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有する。タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ  ０５７６５３．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有する。配列源としては、ＡＦ１４０２４０、ＡＫ０５４６０４、およびＢＣ０２５２５８が挙げられる。コンセンサスＣＤＳは、受託番号ＣＣＤＳ９１７６．１を有する。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号は、Ｏ１５１１９である。関連するＥｎｓｅｍｂｌ配列は、受託番号ＥＮＳＰ０００００２５７５６６、ＥＮＳＴ０００００２５７５６６を有する。
【００９７】
【化２】
0005939985.tif 000003
【００９８】
Ｔｂｘ３アイソフォーム３
【００９９】
【化３】
0005939985.tif 000004
【０１００】
ＴＢＯＸ
ＴＢＯＸとは、転写レギュレーターのＴ−ｂｏｘファミリーのＴ−ｂｏｘ  ＤＮＡ結合ドメインを意味する。Ｔ−ｂｏｘファミリーは、すべての動物種で発生に決定的な役割を果たすと思われる古代型である。これらの遺伝子は、このファミリーを決定付ける特徴であるネズミＢｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）遺伝子産物のＤＮＡ結合ドメインとの類似性に基づいて明らかにされた。
【０１０１】
Ｔ−ｂｏｘファミリーメンバーにより共有される共通した特徴は、ＤＮＡ結合活性および転写レギュレート活性、発生における役割、ならびに保存された発現パターンであり、すべての種において既知の遺伝子のほとんどは、中胚葉または中胚葉前駆体で発現される。
【０１０２】
Ｔｂｘ３ポリペプチド
本明細書に記載の方法および組成物では、以下に詳細に記載されるＴｂｘ３ポリペプチドを利用する。
【０１０３】
Ｔｂｘ３はまた、Ｔ−ｂｏｘ  ３としても、ＵＭＳ、ＸＨＬ、ＴＢＸ３−ＩＳＯ、ＴＢＸ３としても知られる。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、「Ｔｂｘ３ポリペプチド」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ  ００５９８７．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１またはＮＰ  ０５７６５３．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有する配列を意味するものとする。
【０１０５】
「Ｔｂｘ３ポリペプチド」は、ヒトＴｂｘ３ポリペプチドを含みうるかまたはそれよりなりうる。
【０１０６】
これらのポリペプチドのいずれか、いくつか、または全部の相同変異体およびその誘導体もまた含まれる。
【０１０７】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合（すなわちペプチドアイソスター）により互いに連結された２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」とは、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーとして一般に参照される短鎖と、タンパク質として一般に参照されるより長い鎖と、の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有しうる。
【０１０８】
「ポリペプチド」としては、翻訳後プロセシングなどの自然過程によりまたは当技術分野で周知の化学修飾技術により修飾されたアミノ酸配列が挙げられる。そのような修飾については、基本的な教科書およびより詳細な研究書さらには多量の研究文献に詳細に記載されている。ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端をはじめとするポリペプチド中の任意の位置で修飾を行うことが可能である。同一タイプの修飾が所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同一程度または異なる程度で存在しうることが理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有しうる。
【０１０９】
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状でありうる。また、分枝を含んでまたは含まずに環状でありうる。環状、分枝状、および分枝環状のポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じうるか、または合成法により作製されうる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｋｉｎｇ）、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｒｏｓｓ−ｉｎｋｓ）の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加たとえばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３およびＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２  ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６、ならびにＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａＬ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照されたい。
【０１１０】
「ポリペプチド」という用語は、当技術分野で公知の種々の合成ペプチド変異体、たとえば、レトロインベルソＤペプチドを包含する。ペプチドは、抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープでありうる。ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性でありうる。ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで中和抗体を誘導可能でありうる。
【０１１１】
Ｔｂｘ３に適用される場合、得られるアミノ酸配列は、Ｔｂｘ３ポリペプチド（たとえばヒトＴｂｘ３ポリペプチド）と共通の生物活性などの１つ以上の活性を有しうる。たとえば、Ｔｂｘ３相同体は、Ｔｂｘ３に暴露された細胞で暴露されていない細胞と比較して多能性を増強する能力を有しうる。とくに、「相同体」という用語では、得られるアミノ酸配列がＴｂｘ３活性を有することを条件として構造および／または機能に関する同一性が考慮される。配列同一性（すなわち類似性）に関しては、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性が存在しうる。少なくとも９５％、たとえば、少なくとも９８％の配列同一性が存在しうる。これらの用語はまた、Ｔｂｘ３核酸配列の対立遺伝子変異であるアミノ酸に由来するポリペプチドを包含する。
【０１１２】
Ｔｂｘ３などのポリペプチドの「活性」または「生物学的活性」が参照された場合、類似の活性もしくは改善された活性または望ましくない副作用が低減されたこれらの活性を含めて、これらの用語は、Ｔｂｘ３の代謝機能または生理学的機能を意味するものとする。また、Ｔｂｘ３の抗原活性および免疫原活性も包含される。そのような活性ならびにこれらの活性をアッセイよび定量する方法の例は、当技術分野で公知であり、本文書中の他の箇所に詳細に記載されている。
【０１１３】
他のＴｂｘ３ポリペプチド
Ｔｂｘ３の変異体、相同体、誘導体、および断片もまた、本明細書に記載の方法および組成物に有用である。
【０１１４】
Ｔｂｘ３に関連する「変異体」、「相同体」、「誘導体」、または「断片」という用語は、配列からのまたは配列への１個（もしくはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を包含する。文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「Ｔｂｘ３」の参照対象は、Ｔｂｘ３のそのような変異体、相同体、誘導体、および断片の参照対象を包含する。
【０１１５】
本明細書で用いられる場合、「欠失」とは、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ不在であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかの変化として定義されるものである。本明細書で用いられる場合、「挿入」または「付加」とは、天然に存在する物質と比較してそれぞれ１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の追加をもたらすヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化のことである。本明細書で用いられる場合、「置換」とは、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換から生じるものである。
【０１１６】
本明細書に記載のＴｂｘ３ポリペプチドはまた、サイレント変化を起こして機能的に等価なアミノ酸配列を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有しうる。意図的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて実施可能である。たとえば、負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正荷電アミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、類似の親水性値を有する非荷電極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０１１７】
保存的置換は、たとえば、以下の表に従って実施可能である。第２の列の同一区画および第３の列の同一行に示されるアミノ酸は、互いに置換可能である。
【０１１８】
【表１】
0005939985.tif 000005
【０１１９】
Ｔｂｘ３ポリペプチドは、異種アミノ酸配列を典型的にはＮ末端またはＣ末端たとえばＮ末端にさらに含みうる。異種配列は、細胞内または細胞外タンパク質ターゲッティングに影響を及ぼす配列（たとえばリーダー配列）を含みうる。異種配列はまた、Ｔｂｘ３ポリペプチドの免疫原性を増大させる配列ならびに／またはポリペプチドの同定、抽出、および／もしくは精製を容易にする配列を含みうる。使用可能な他の異種配列は、Ｎ末端でありうるポリヒスチジンなどのポリアミノ酸配列である。少なくとも１０アミノ酸たとえば少なくとも１７アミノ酸ただし５０アミノ酸未満のポリヒスチジン配列を利用することが可能である。
【０１２０】
Ｔｂｘ３ポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態をとりうるかまたは融合タンパク質などのより大きいタンパク質の一部分でありうる。多くの場合、分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基などの精製に役立つ配列、または組換え産生時の安定性のための追加配列を含有する追加のアミノ酸配列を含有することが有利である。
【０１２１】
本明細書に記載のＴｂｘ３ポリペプチドは、公知の技術を用いて組換え手段により有利に作製される。しかしながら、固相合成などの当業者に周知の技術を用いて合成手段により作製することも可能である。そのようなポリペプチドはまた、たとえば、抽出および精製を支援するために、融合タンパク質として生成することも可能である。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）、ならびにβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質パートナーと対象のタンパク質配列との間にトロンビン切断部位などのタンパク質分解切断部位を組み込んで融合タンパク質配列を取り出せるようにすることが便利なこともある。融合タンパク質は、対象配列のタンパク質の機能を妨害しないものでありうる。
【０１２２】
Ｔｂｘ３ポリペプチドは、実質的に単離された形態をとりうる。この用語は、人の手を経て天然の状態から変更を加えたことを意味するものとする。「単離された」組成物または物質が天然に存在するものである場合、それは、その元の環境から変化しているかもしくは取り出されているかまたはその両方である。たとえば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチド、核酸、またはポリペプチドは、「単離された」ものではないが、その天然の状態の共存材料から分離された同一のポリヌクレオチド、核酸、またはポリペプチドは、その用語が本明細書で利用される場合、「単離された」ものである。
【０１２３】
しかしながら、当然のことであろうが、Ｔｂｘ３ポリペプチドは、タンパク質の所定の目的を妨害しない担体または希釈剤と混合可能であり、それでもなお実質的に単離されているとみなすことが可能である。Ｔｂｘ３ポリペプチドはまた、実質的に精製された形態をとりうる。その場合、それは、一般的には、調製物中にタンパク質を含み、調製物中のタンパク質の９０％超、たとえば、９５％、９８％、または９９％が、Ｔｂｘ３ポリペプチドである。
【０１２４】
異なる種に由来するＴｂｘ３配列をアライメントすることにより、異なる種間でアミノ酸配列のどの領域が保存されるか（「相同領域」）および異なる種間でどの領域が異なるか（「異種領域」）を決定することが可能である。
【０１２５】
したがって、Ｔｂｘ３ポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に対応する配列を含みうる。相同領域は、少なくとも２つの種間で高度の相同性を示す。たとえば、相同領域は、以上に記載の試験を用いてアミノ酸レベルで少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を示しうる。相同領域に対応する配列を含むペプチドは、以下でさらに詳細に説明されるように、治療的戦略に使用可能である。他の選択肢として、Ｔｂｘ３ペプチドは、異種領域の少なくとも一部に対応する配列を含みうる。異種領域は、少なくとも２つの種間で低度の相同性を示す。
【０１２６】
Ｔｂｘ３相同体
使用のために開示されるＴｂｘ３ポリペプチドとしては、任意の供給源から得られる相同配列、たとえば、関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞性相同体、および合成ペプチド、さらにはそれらの変異体または誘導体が挙げられる。したがって、ポリペプチドとしてはまた、動物、たとえば、哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、またはウサギ）、具体的には霊長類、より具体的にはヒトをはじめとする他の種に由来するＴｂｘ３の相同体をコードするものが挙げられる。より具体的には、相同体はヒト相同体を含む。
【０１２７】
本文書との関連では、相同配列は、たとえば、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００個、またはそれ以上のアミノ酸にわたり、適合Ｔｂｘ３配列の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％の同一性、たとえば、少なくとも９５または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとみなされる。
【０１２８】
とくに、相同性は、典型的には、非必須隣接配列に関してではなくタンパク質機能に不可欠であることが知られている配列の領域に関して検討しなければならない。これは、遠縁の生物に由来する相同配列を検討する場合、とくに重要である。例としては、Ｔ−ｂｏｘを含むＤＮＡ結合のための残基番号１０７〜２２０、Ｔ−ｂｏｘを含むＤＮＡ結合のための残基番号２４１〜３０５の第１部分、および転写抑制のための残基番号５４４〜６９５の第２部分が挙げられる。
【０１２９】
相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に基づいて検討ことも可能であるが、本文書との関連では、配列同一性により相同性を表すことが可能である。
【０１３０】
相同性比較は、目測でまたはより一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて実施可能である。これらの公共および市販のコンピュータープログラムを用いて、２つ以上の配列間の同一性％を計算することが可能である。
【０１３１】
同一性％は、コンティグ配列にわたり計算可能である。すなわち、一方の配列を他方の配列にアライメントし、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と１回に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップ無し」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップ無しアライメントは、比較的少ない個数の残基（たとえば、５０個未満のコンティグアミノ酸）にわたり行われるにすぎない。
【０１３２】
これは非常に単純かつ一貫性のある方法であるが、たとえば、１つの挿入または欠失があると、それ以外は同一である配列対であっても、それ以降のアミノ酸残基がアライメントできなくなるという点が考慮されていないので、グローバルアライメントを行った場合、相同性％が大幅に減少する可能性がある。したがって、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアに過度のペナルティーを課すことなく可能性のある挿入および欠失を考慮した最適アライメントを生成するようにデザインされる。これは、局所的な同一性または類似性を最大化するように試行して配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１３３】
しかしながら、これらのより複合的な方法では、同一アミノ酸の個数が同数の場合、できるかぎり少ないギャップを有する配列アライメントが、２つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを課しかつギャップ中のそれぞれの後続残基により小さいペナルティーを課する「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。当然ながら、ギャップペナルティーが高ければ、より少ないギャップを有する最適化アライメントが生成されるであろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更できるようになっている。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いることが可能である。たとえば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップ１つにつき−１２、各伸長ごとに−４である。
【０１３４】
したがって、最大相同性％の計算では、最初に、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを生成することが必要である。そのようなアライメントを行うのに好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行いうる（ｔｈａｎ  ｃａｎ  ｐｅｒｆｏｒｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８），ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０を参照されたい）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはいずれも、オフライン検索およびオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０を参照されたい）。ＧＣＧ最良あてはめプログラムを使用することが可能である。
【０１３５】
同一性に基づいて最終相同性％を求めることが可能であるが、アライメント法自体は、典型的には、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいてそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリックスが広く使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは、一般的には、パブリックデフォルト値または供給されるのであればカスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージではパブリックデフォルト値を、またはＢＬＯＳＵＭ６２などの他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックスを、使用することが可能である。
【０１３６】
ソフトウェアを用いて最適アライメントを生成させた後、相同性％たとえば配列同一性％を計算することが可能である。典型的には、ソフトウェアにより配列比較の一部分としてこれを行い、数値結果を生成させる。
【０１３７】
アミノ酸配列に関連する「変異体」または「誘導体」という用語は、得られるアミノ酸配列が非修飾型配列と実質的に同一の活性を保持することを条件として、たとえば、少なくともＴｂｘ３ポリペプチドと同一の活性を有することを条件として、配列からのまたは配列への１個（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を包含する。
【０１３８】
本明細書に開示されるＴｂｘ３アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片もしくは相同体は、本明細書中に記載の方法および組成物で使用するために修飾可能である。典型的には、配列の生物活性を保持する修飾が行われる。修飾型配列が非修飾型配列の生物活性を保持することを条件として、アミノ酸置換、たとえば、１、２、または３個から１０、２０、または３０個までの置換を行うことが可能である。他の選択肢として、本明細書に記載のポリペプチドの１つ以上の機能性ドメインを意図的に不活性化するように修飾を行うことが可能である。アミノ酸置換は、たとえば、治療のために投与されるポリペプチドの血漿中半減期を増大させるために、天然に存在しない類似体の使用を含みうる。
【０１３９】
Ｔｂｘ３断片
本明細書に記載の方法および組成物で使用するためのポリペプチドはまた、以上に規定したＴｂｘ３ポリペプチドのいずれかの全長配列の断片を含む。フラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含みうる。エピトープを同定する方法は、当技術分野で周知である。断片は、典型的には、少なくとも６個のアミノ酸、たとえば、少なくとも１０、２０、３０、５０、または１００個のアミノ酸を含むであろう。
【０１４０】
包含されるのは、適合Ｔｂｘ３アミノ酸配列に由来する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１  １５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００個、またはそれ以上の残基を含むかまたはそれらよりなる断片である。
【０１４１】
さらに、本明細書に記載のＴｂｘ３ポリペプチドの一部分を含むペプチド類を記述する。したがって、Ｔｂｘ３の断片およびその相同体、変異体、または誘導体が包含される。ペプチドは、２〜２００アミノ酸残基長たとえば４〜４０アミノ酸残基長でありうる。ペプチドは、たとえばトリプシンなどの好適な酵素で消化することにより、本明細書に開示されたＴｂｘ３ポリペプチドから誘導可能である。他の選択肢として、ペプチド、断片などは、組換え手段により作製可能であるかまたは合成により合成可能である。
【０１４２】
そのようなＴｂｘ３断片は、たとえば、そのような断片に対して生成された抗体を介して、Ｔｂｘ３発現を優先的に検出するプローブを生成するために使用可能である。これらの抗体は、Ｔｂｘ３に特異的に結合すると予想され、本明細書に開示される診断および治療の方法に有用である。
【０１４３】
Ｔｂｘ３ならびにその断片、相同体、変異体、および誘導体は、組換え手段により作製可能である。しかしながら、固相合成などの当業者に周知の技術を用いて合成手段により作製することも可能である。タンパク質はまた、たとえば、抽出および精製を支援するために、融合タンパク質として生成することも可能である。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）、ならびにβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質パートナーと対象のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を組み込んで融合タンパク質配列を取り出せるようにすることが便利なこともある。融合タンパク質は、対象のタンパク質配列の機能を妨害しないものでありうる。タンパク質はまた、動物細胞に由来する細胞抽出物の精製により取得することも可能である。
【０１４４】
本明細書に開示されるＴｂｘ３ポリペプチド、変異体、相同体、断片、および誘導体は、実質的に単離された形態で存在可能である。当然のことであろうが、そのようなポリペプチドは、タンパク質の所定の目的を妨害しない担体または希釈剤と混合可能であり、それでもなお実質的に単離されているとみなすことが可能である。Ｔｂｘ３の変異体、相同体、断片、または誘導体はまた、実質的に精製された形態で存在可能であり、その場合、一般的には、調製物中にこのタンパク質を含み、調製物の９０％超、たとえば、９５％、９８％、または９９％は、タンパク質である。
【０１４５】
本明細書に開示されるＴｂｘ３ポリペプチド、変異体、相同体、断片、および誘導体は、認識可能な標識を用いて標識可能である。認識可能な標識は、ポリペプチドなどの検出を可能にする任意の好適な標識でありうる。好適な標識としては、放射性同位体たとえば125Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、およびリンカーたとえばビオチンが挙げられる。標識化ポリペプチドは、サンプル中のポリペプチドの量を決定するイムノアッセイのような診断手順で使用可能である。ポリペプチドまたは標識化ポリペプチドはまた、標準的プロトコルを用いて動物およびヒトにおける当該ポリペプチドに対する免疫反応性を検出するための血清学的アッセイまたは細胞媒介免疫アッセイで使用可能である。
【０１４６】
本明細書に開示されるＴｂｘ３ポリペプチド、変異体、相同体、断片、および誘導体（場合により標識されていてもよい）はまた、固相、たとえば、イムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定可能である。そのような標識化および／または固定化ポリペプチドは、好適な試薬、対照、説明書などと共に、好適な容器内にキットの形態でパッケージ化可能である。そのようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによるポリペプチドに対する抗体およびその対立遺伝子変異体または種変異体の検出の方法で使用可能である。
【０１４７】
イムノアッセイ法は、当技術分野で周知であり、一般的には、（ａ）当該タンパク質に対する抗体が結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供することと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で当該ポリペプチドと共に生物学的サンプルをインキュベートすることと、（ｃ）当該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを決定することと、を含むであろう。
【０１４８】
本明細書に開示されるＴｂｘ３ポリペプチド、変異体、相同体、断片、および誘導体は、疾患におけるそれらの機能を含めて、細胞機能におけるそれらの対応する遺伝子およびその相同体の役割を調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞培養系で使用可能である。たとえば、トランケート型もしくは修飾型のポリペプチドを細胞内に導入して、細胞内で生じる正常機能を破壊することが可能である。組換え発現ベクターからポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕ発現させることにより、ポリペプチドを細胞内に導入することが可能である（下記参照）。発現ベクターは、場合により、ポリペプチドの発現を制御するために誘導プロモーターを保有しうる。
【０１４９】
昆虫細胞や哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞を使用すれば、組換え発現産物に最適生物活性を付与するために必要とされうる翻訳後修飾（たとえば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、リピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）、およびチロシンリン酸化、セリンリン酸化、またはトレオニンリン酸化）が提供されると期待される。本明細書中に開示されるＴｂｘ３ポリペプチド、変異体、相同体、フラグメント、および誘導体が発現されるそのような細胞培養系は、細胞内でポリペプチドの機能を阻害または増強する候補物質を同定するアッセイ系で使用可能である。
【０１５０】
ＴＢＸ３核酸
本明細書に記載の方法および組成物は、Ｔｂｘ３の発現レベル、Ｔｂｘ３ポリヌクレオチド、Ｔｂｘ３ヌクレオチド、およびＴｂｘ３核酸、さらにはこれらのいずれかの変異体、相同体、誘導体、および断片を検出するための手段として利用可能である。それに加えて、本明細書に記載の診断方法に有用な特定のＴｂｘ３断片を開示する。Ｔｂｘ３核酸はまた、記載の治療または予防の方法に使用可能である。
【０１５１】
「Ｔｂｘ３ポリヌクレオチド」、「Ｔｂｘ３ヌクレオチド」、および「Ｔｂｘ３核酸」という用語は、同義的に使用可能であり、とくに、ｃＤＮＡおよびゲノムのＴｂｘ３配列の両方を包含すると理解しなければならない。これらの用語はまた、Ｔｂｘ３ポリペプチドおよび／またはこれの断片、誘導体、相同体、もしくは変異体をコードしうる核酸配列を包含するものとする。
【０１５２】
Ｔｂｘ３核酸が参照された場合、これは、核酸のＴｂｘ３ファミリーの任意のメンバーへの参照とみなさなければならない。とくに興味深いのは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２よりなる群から選択されるＴｂｘ３核酸である。
【０１５３】
また、以下に「他のＴｂｘ３核酸配列」として明記された核酸配列のいずれか１つ以上が包含される。
【０１５４】
たとえば、Ｔｂｘ３核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有するヒトＴｂｘ３配列を含みうる。
【０１５５】
Ｔｂｘ３核酸は、さまざまな手段に、たとえば、体細胞、幹細胞、および誘導多能性幹細胞などの細胞で多能性を増強または誘導するために、使用可能である。Ｔｂｘ３核酸はまた、Ｔｂｘ３ポリペプチドの発現または産生に使用可能である。
【０１５６】
「ポリヌクレオチド」とは、一般的には、未修飾型のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾型のＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を意味する。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物でありうるＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。それに加えて、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドという用語はまた、１個以上の修飾型塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性のためにまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾型」塩基としては、たとえば、トリチル化塩基およびイノシンなどの特殊塩基が挙げられる。さまざまな修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことが可能であり、したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見いだされるように化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、さらにはウイルスおよび細胞に特有な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドとして参照されることが多い比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【０１５７】
多くのヌクレオチド配列が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードしうることは、当業者であればわかるであろう。
【０１５８】
本明細書で用いられる場合、「ヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ならびにそれらの変異体、相同体、断片、および誘導体（たとえばそれらの一部分）を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはそれらの組合せにかかわらず二本鎖または一本鎖でありうるゲノム由来、合成由来、または組換え由来のＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。ヌクレオチド配列という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されるものであってもよい（たとえば組換えＤＮＡ）。
【０１５９】
「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡを意味しうる。
【０１６０】
他の核酸
Ｔｂｘ３核酸の断片、相同体、変異体、または誘導体である核酸も提供する。Ｔｂｘ３核酸に関連する「変異体」、「相同体」、「誘導体」、または「断片」という用語は、Ｔｂｘ３ヌクレオチド配列の配列からのまたは配列への１個（もしくはそれ以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を包含する。文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「Ｔｂｘ３」の参照対象および「Ｔｂｘ３」は、Ｔｂｘ３のそのような変異体、相同体、誘導体、および断片の参照対象を包含する。
【０１６１】
得られるヌクレオチド配列は、いずれか１つ以上のＴｂｘ３活性を有するポリペプチドをコードしうる。「相同体」という用語では、得られるヌクレオチド配列がＴｂｘ３活性を有するポリペプチドをコードするように構造および／または機能に関する同一性が考慮されるとみなされうる。たとえば、Ｔｂｘ３の相同体などは、幹細胞、体細胞、または誘導多能性幹細胞などの細胞で、そのような細胞に暴露された場合、暴露されていない細胞と比較して、多能性を誘導または増強することが可能でありうる（ｍａｙ  ｈａｖｅ  ｂｅ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ）。
【０１６２】
配列同一性（すなわち類似性）に関しては、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の配列同一性が存在しうる。適合配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有するＴｂｘ３配列）に対して少なくとも９５％、たとえば少なくとも９８％配列同一性が存在しうる。これらの用語はまた、配列の対立遺伝子変異を包含する。
【０１６３】
変異体、誘導体、および相同体
Ｔｂｘ３核酸の変異体、断片、誘導体、および相同体は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。それらは、一本鎖もしくは二本鎖でありうる。それらはまた、それらの中に合成ヌクレオチドまたは修飾型ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでありうる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格または分子の３’末端および／もしくは５’末端へのアクリジンもしくはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本文書の目的では、当然のことながら、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法により修飾可能である。そのような修飾は、対象のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実施可能である。
【０１６４】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖の両方の鎖が、単独または組合せのいずれかで、本明細書中に記載の方法および組成物に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、当然のことながら、そのポリヌクレオチドの相補的配列もまた包含される。
【０１６５】
ヌクレオチド配列に関連する「変異体」、「相同体」、または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への１個（もしくはそれ以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を包含する。当該変異体、相同体、または誘導体は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードしうる。Ｔｂｘ３のそのような断片、相同体、変異体、および誘導体は、以上に明記されるモジュレートされた活性を含みうる。
【０１６６】
以上に述べたように、配列同一性に関して、「相同体」は、適合配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有するＴｂｘ３配列）に対して、少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【０１６７】
少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性が存在しうる。ヌクレオチド同一性比較は、以上に記載したように実施可能である。使用可能な配列比較プログラムは、以上に記載のＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ最良当てはめプログラムである。デフォルトスコア行列は、各同一ヌクレオチドごとにマッチ値１０および各ミスマッチごとに−９を有する。各ヌクレオチドごとに、デフォルトギャップ生成ペナルティーは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは−３である。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション
さらに、本明細書に提示された配列またはその任意の変異体、断片、もしくは誘導体のいずれかにまたは以上のいずれかの相補体に選択的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を記述する。ヌクレオチド配列は、少なくとも１５ヌクレオチド長、たとえば、少なくとも２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド長でありうる。
【０１６９】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と一体化するプロセス」さらにはポリメラーゼ連鎖反応技術中で行われるような増幅のプロセスを含むものとする。
【０１７０】
本明細書に提示されたヌクレオチド配列にまたはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、本明細書に提示された対応するヌクレオチド配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有するＴｂｘ３配列）に対して、少なくとも４０％の相同、少なくとも４５％の相同性、少なくとも５０％の相同性、少なくとも５５％の相同性、少なくとも６０％の相同性、少なくとも６５％の相同性、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性でありうる。そのようなポリヌクレオチドは、一般的には、少なくとも２０、たとえば、少なくとも２５または３０、たとえば少なくとも４０、６０、もしくは１００個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたり、対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０もしくは９０％、または少なくとも９５％もしくは９８％の相同性でありうる。
【０１７１】
「選択的にハイブリダイズ可能」という用語は、バックグラウンドを有意に超えるレベルで標的ポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズすることが見いだされる条件下で、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが使用されることを意味する。他のポリヌクレオチドが、たとえば、スクリーニングされるｃＤＮＡライブラリー中またはゲノムＤＮＡライブラリー中に存在するので、バックグラウンドハイブリダイゼーションが起こる可能性がある。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用により生成されるシグナルのレベルを示し、このレベルは、標的ＤＮＡを用いたときに観測される特異的相互作用の強度の１／１０未満たとえば１／１００未満である。相互作用の強度は、たとえば、32Ｐもしくは33Ｐを用いてまたは非放射性プローブ（たとえば、蛍光染料、ビオチン、もしくはジゴキシゲニン）を用いて、プローブを放射性標識することにより、測定可能である。
【０１７２】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  （１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下で説明されるように定義される「ストリンジェンシー」を付与する。
【０１７３】
最大ストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）で生じ、高ストリンジェンシーは、Ｔｍよりも約５℃〜１０℃低いところで生じ、中間ストリンジェンシーは、Ｔｍよりも約１０℃〜２０℃低いところで生じ、そして低ストリンジェンシーは、Ｔｍよりも約２０℃〜２５℃低いところで生じる。当業者であればわかるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用可能であり、一方、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似のもしくは関連のあるポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用可能である。
【０１７４】
ストリンジェント条件下で（たとえば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ3クエン酸塩  ｐＨ７．０））、Ｔｂｘ３核酸、断片、変異体、相同体、または誘導体にハイブリダイズ可能でありうるヌクレオチド配列を提供する。
【０１７５】
相同体、変異体、および誘導体の生成
適合配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００５９９６．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ０１６５６９．３  Ｔ−ｂｏｘ  ３タンパク質アイソフォーム２を有するＴｂｘ３配列）に対して１００％の同一性ではないが同様に包含されるポリヌクレオチド、さらにはＴｂｘ３の相同体、変異体、および誘導体は、いくつかの方法で取得可能である。配列の他の変異体は、たとえば一連の個体、たとえば異なる集団に由来する個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブすることにより取得可能である。たとえば、Ｔｂｘ３相同体は、他の個体または他の種から特定可能である。さらなる組換えＴｂｘ３核酸およびポリペプチドは、相同体中の対応する位置を特定し、本文書中の他の箇所に記載されるように分子を合成または生成することにより、作製可能である。
【０１７６】
それに加えて、他のウイルス性／細菌性または細胞性の相同体、具体的には、哺乳動物細胞（たとえば、ラット、マウス、ウシ科動物、および霊長動物の細胞）に見いだされる細胞性相同体を取得することが可能であり、そのような相同体およびその断片は、一般的には、ヒトＴｂｘ３に選択的にハイブリダイズ可能であろう。そのような相同体は、非ヒトＴｂｘ３核酸、断片、変異体、および相同体を設計するために使用可能である。突然変異誘発は、さらなる変種を生成するために当技術分野で公知の手段により実施可能である。
【０１７７】
Ｔｂｘ３相同体の配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより、ならびにＴｂｘ３核酸、断片、変異体、および相同体、またはＴｂｘ３の他の断片のいずれかの全部もしくは一部を含むプローブを用いてそのようなライブラリーを中〜高ストリンジェンシーの条件下でプローブすることにより、取得可能である。
【０１７８】
同様の考慮事項は、本明細書に開示されるポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体の取得にもあてはまる。
【０１７９】
Ｔｂｘ３核酸の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体内および相同体内の配列を標的とするよう設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて、変異体および系統／種相同体を取得することも可能である。保存配列は、たとえば、いくつかの変異体／相同体に由来するアミノ酸配列をアライメントすることにより、予測可能である。配列アライメントは、当技術分野で公知のコンピューターソフトウェアを用いて実施可能である。たとえば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムは、広く使用されている。
【０１８０】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含有するであろう。また、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いて、配列のクローニングに使用されるよりも低いストリンジェンシー条件で使用されるであろう。遠縁の生物に由来する配列間の全体的ヌクレオチド相同性は、おそらく非常に低いと思われるので、これらの状況では、縮重ＰＣＲは、Ｔｂｘ３配列の標識断片を用いてライブラリーをスクリーニングするよりも好ましい方法でありうることは、当業者であればわかるであろう。
【０１８１】
それに加えて、相同配列は、一連のＢＬＡＳＴプログラムなどの検索アルゴリズムを用いてヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを検索することにより特定可能である。
【０１８２】
他の選択肢として、そのようなポリヌクレオチドは、たとえば、Ｔｂｘ３核酸、または変異体、相同体、誘導体、もしくは断片などの特徴的配列の部位指向性突然変異誘発により、取得可能である。これは、たとえば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対してコドン優先性を最適化するためにサイレントコドン変化が配列に必要とされる場合、有用でありうる。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するためにまたはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質または機能を改変するために望まれることもある。
【０１８３】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、プライマー、たとえば、ＰＣＲプライマー、他の選択肢の増幅反応用のプライマー、プローブ、たとえば、放射性もしくは非放射性の標識を用いた従来の手段により、認識可能な標識で標識されたプローブを生成するために使用可能であるか、またはポリヌクレオチドは、ベクター中にクローニング可能である。そのようなプライマー、プローブ、および他の断片は、少なくとも８、９、１０、または１５、たとえば、少なくとも２０、たとえば、少なくとも２５、３０、または４０ヌクレオチド長であろう。それらはまた、本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語に包含される。
【０１８４】
ポリヌクレオチド、たとえば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡプローブは、組換えにより、合成により、または当業者の利用可能な任意の手段により、生成可能である。それらはまた、標準的技術によりクローニング可能である。
【０１８５】
一般的には、プライマーは、１回に１個のヌクレオチドを用いた所望の核酸配列のステップワイズ製造を含む合成手段により生成されるであろう。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当技術分野で容易に利用可能である。
【０１８６】
Ｔｂｘ３の断片を含むプライマーは、Ｔｂｘ３発現のアップレギュレーションなどのＴｂｘ３発現の検出方法にとくに有用である。Ｔｂｘ３の増幅に好適なプライマーは、Ｔｂｘ３の任意の好適な鎖から生成可能である。使用可能なプライマーとしては、特異的なＴｂｘ３の配列を増幅可能なものが挙げられる。
【０１８７】
Ｔｂｘ３プライマーは単独で提供可能であるが、それらは、最も有用には、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含むプライマー対として提供される。
【０１８８】
より長いポリヌクレオチドは、一般的には、組換え手段を用いて、たとえば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成されるであろう。これは、１対のプライマー（たとえば、約１５〜３０ヌクレオチドのプライマー）を作製することと、動物細胞またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにプライマーを接触させることと、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うことと、増幅されたフラグメントを単離することと（たとえば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、増幅されたＤＮＡを回収することと、を含むであろう。増幅されたＤＮＡを好適なクローニングベクター中にクローニングできるように、好適な制限酵素認識部位を含有するプライマーをデザインすることが可能である。
【０１８９】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、認識可能な標識を有しうる。好適な標識としては、32Ｐや35Ｓなどの放射性同位体、ジゴキシゲニン、蛍光染料、酵素標識、またはビオチンなどの他のタンパク質標識が挙げられる。そのような標識は、ポリヌクレオチドまたはプライマーに付加可能であり、それ自体公知の技術を用いて（ｕｓｉｎｇ  ｂｙ）検出可能である。標識されたまたは標識されていないポリヌクレオチドもしくはプライマーまたはそれらの断片は、人体または動物体でポリヌクレオチドの検出または配列決定のために、核酸に基づく試験で当業者により使用可能である。
【０１９０】
検出のためのそのような試験は、一般的には、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物学的サンプルをポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブにハイブリダイズ条件下で接触させることと、プローブとサンプル中の核酸との間で形成された任意の二本鎖を検出することと、を含む。そのような検出は、ＰＣＲなどの技術を用いることにより、またはプローブを固体担体上に固定し、プローブにハイブリダイズされないサンプル中の核酸を除去し、次いで、プローブにハイブリダイズされた核酸を検出することにより、達成可能である。他の選択肢として、サンプル核酸を固体担体上に固定し、そのような担体に結合されたプローブの量を検出することが可能である。この方式および他の方式の好適なアッセイ方法は、たとえば、国際公開第８９／０３８９１号パンフレットおよび国際公開第９０／１３６６７号パンフレットに見いだしうる。
【０１９１】
Ｔｂｘ３核酸などのヌクレオチドの配列決定を行う試験は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物学的サンプルをポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブにハイブリダイズ条件下で接触させることと、たとえばＳａｎｇｅｒジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）により、配列を決定することと、を含む。
【０１９２】
そのような方法は、一般的には、好適な試薬の存在下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な鎖の合成によりプライマーを伸長させ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕ残基の１つ以上で伸長反応を選択的に停止させることと、鎖伸長反応および停止反応を引き起こすことと、伸長した産物をサイズに従って分離して取り出し、選択的停止が起こったヌクレオチドの配列を決定することと、を含む。好適な試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、緩衝液、およびＡＴＰが挙げられる。ジデオキシヌクレオチドは、選択的停止に使用される。
【０１９３】
Ｔｂｘ３制御領域
いくつかの目的では、Ｔｂｘ３の制御領域を利用したり調べたりすることが必要なこともある。そのような制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、および遺伝子座制御領域が挙げられる。制御領域とは、それに機能しうる形で結合されたコード配列の発現をモジュレートしうる核酸配列または構造体を意味する。
【０１９４】
たとえば、制御領域は、Ｔｂｘ３を発現するトランスジェニック動物を作製するのに有用である。さらに、制御領域は、Ｔｂｘ３の発現構築物を作製するために使用可能である。これについては、以下でさらに詳細に説明する。
【０１９５】
Ｔｂｘ３の制御領域の特定は、単純明快であり、いくつかの方式で実施可能である。たとえば、Ｔｂｘ３のコード配列は、プローブとしてヒトまたはマウスＴｂｘ３  ｃＤＮＡ配列を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、生物から取得可能である。５’配列は、適切なゲノムライブラリーをスクリーニングすることによりまたは当技術分野で公知のプライマー伸長により取得可能である。ゲノムデータベースのデータベース探索を利用することも可能である。とくに興味深いそのような５’配列は、非コード領域を含む。５’領域を目視によりまたはコンピュータープログラムの助けを借りて調べることによって検査し、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の存在の指標となる配列モチーフを特定することが可能である。
【０１９６】
さらに、２つ以上の生物に由来するＴｂｘ３核酸配列の配列アライメントを行うことが可能である。異なる種に由来するＴｂｘ３配列をアライメントすることにより、アミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存されているかを決定することが可能である。そのような保存領域は、対象の遺伝子（すなわちＴｂｘ３）に対する制御領域を含有するであろう。本明細書に開示されるマウスおよびヒトのゲノム配列、たとえばマウスＴｂｘ３ゲノム配列は、この目的に利用可能である。さらに、他の生物に由来するＴｂｘ３相同体は、マウスおよびヒトのＴｂｘ３配列から生成された適切なプローブを用いてスクリーニングする標準的方法により取得可能である。フグ（トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ））またはゼブラフィッシュのゲノムをスクリーニングしてＴｂｘ３相同体を特定することも可能であり、したがって、Ｔｂｘ３のいくつかのゼブラフィッシュ配列を特定した（上述）。フグまたはゼブラフィッシュのＴｂｘ３遺伝子の５’非コード領域とマウスまたはヒトのゲノムＴｂｘ３配列との比較を行って、制御領域を含有する保存領域を特定することが可能である。
【０１９７】
また、欠失試験を行ってＴｂｘ３のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を特定することも可能である。
【０１９８】
推定制御領域の同一性は、候補配列をレポーター遺伝子に結合してレポーターの発現を検出する分子生物学実験により確認可能である。
【０１９９】
Ｔｂｘ３への細胞の暴露
Ｔｂｘ３は、多能性を増強するために１種以上の核再プログラミング因子の存在下で細胞に暴露することが可能である。
【０２００】
本明細書に記載の方法および組成物で使用するためのＴｂｘ３の産生方法は、とくに限定されるものではないが、産生は、たとえば、化学合成方法または遺伝的組換え技術を用いる方法により、達成可能である。
【０２０１】
遺伝的組換え技術を用いる方法により産生を行う場合、本明細書に記載の方法および組成物で使用するためのＴｂｘ３は、たとえば、ＤＮＡ鋳型と遺伝子組換えを利用して得られるＲＮＡポリメラーゼとを用いて転写反応を介して産生可能である。使用可能なＲＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０２０２】
他の選択肢として、Ｔｂｘ３の発現を可能にする組換えベクターは、適切なベクターの発現制御配列（プロモーター配列およびエンハンサー配列など）の制御下にＴｂｘ３コードＤＮＡを挿入することにより産生可能である。ここで用いられるベクターのタイプは、とくに限定されるものではないが、具体的には、ＤＮＡベクターを使用することが可能である。例としては、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターが挙げられうる。ウイルスベクターは、とくに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを利用することが可能である。それに加えて、以上のプラスミドに関して、当業者に周知である哺乳動物発現プラスミドを利用することが可能である。
【０２０３】
ベクターとしてレトロウイルスを使用する方法は、国際公開第２００７／６９６６６Ａ１号パンフレット、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６，２００６、およびＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２，２００７（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる（ｉｎｃｏｒｐｏｒｔａｔｅｄ）ものとする）に開示されている。ベクターとしてレンチウイルスを使用する方法は、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０，２００７（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。ベクターとしてアデノウイルスを使用する方法は、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４５−９４９，２００８（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。非ウイルスベクターとしてプラスミドを使用する方法は、米国特許仮出願第６１／０７１，５０８号明細書、米国特許仮出願第６１／１３６，２４６号明細書、米国特許仮出願第６１／１３６，６１５号明細書、およびＯｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４９−９５３，２００８（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。当業者であれば、以上の公知の方法の中からまたは先行技術で利用可能な他の公知の方法またはベクターのいずれかから適切な方法を選択し使用することが可能である。
【０２０４】
核再プログラミングは、任意の数の方法によりＴｂｘ３の存在下で行うことが可能である。Ｔｂｘ３を提供する方式は、とくに限定されるものではないが、その例としては、Ｔｂｘ３を体細胞の核に直接注入する方法およびＴｂｘ３の発現が可能な適切な組換えベクターを体細胞内に導入する方法が挙げられうる。しかしながら、これら方法は、限定されるとみなされるものではない。
【０２０５】
組換えベクターを体細胞内に導入する方法は、とく限定されるものではなく、当業者に周知の任意の方法により実施可能である。利用可能な方法の例はとしては、一過性トランスフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿方法、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、および遺伝子銃の使用を含む方法が挙げられうる。
【０２０６】
多能性の誘導または増強
本明細書に記載の方法および組成物により処理された細胞は、誘導または増強された多能性を示す。言い換えれば、そのような細胞は、幹細胞（たとえば霊長類またはヒトの幹細胞）の少なくとも１つの特徴を取得または達成することが可能である。そのような細胞は、１回以上の継代培養後、特徴を保持しうる。それらは、複数回の継代培養後もそうである。
【０２０７】
多能性または幹細胞の特徴は、形態学的特徴、免疫組織化学的特徴、分子生物学的特徴などを含みうる。特徴は、生物学的活性を含みうる。
【０２０８】
幹細胞の特徴
多能性が増強または誘導された本方法により処理された細胞は、以下の幹細胞の特徴のいずれかを示しうる。
【０２０９】
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１の発現の増大を示しうる。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２、およびｃ−ｋｉｔのいずれか１つ以上の発現は、低減されうる。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して短い細胞周期を示しうる。
【０２１０】
幹細胞は、規定の形態を示しうる。たとえば、二次元の標準的顕微鏡画像では、ヒト胚性幹細胞は、画像平面内での高い核／細胞質比、顕著な核小体、および、識別しにくい細胞間結合を有する緻密コロニー形成を示す。
【０２１１】
幹細胞はまた、以下にさらに詳細に記載されるように発現される細胞マーカーにより特徴付け可能である。
【０２１２】
多能性マーカーの発現
保持される生物学的活性は、多能性マーカーの発現を含みうる。
【０２１３】
ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚細胞型の特徴である。ＳＳＥＡマーカー用の抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．）から入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能である（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，ｉｎ  Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９８７，ｓｕｐｒａ）。ヒト胚性幹細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陽性である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｐＰＳ細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現の低下をもたらし、ＳＳＥＡ−  １の発現の増大をもたらす。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリ性ホスファターゼ活性の存在により特徴付け可能であり、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してから製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．）の説明に従って基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを用いて発色させることにより検出可能である。
【０２１４】
胚性幹細胞はまた、典型的には、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、市販のキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ  Ｎ．Ｙ．またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌｕｓ，Ｃａｔ．２，０１３，８９、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を用いてＴＲＡＰ活性アッセイ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１，１９９７）により決定可能である。ｈＴＥＲＴ発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで評価可能である。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ定量キット（Ｃａｔ．３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、研究目的に市販されている。
【０２１５】
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、およびＴＲＡ−１−６０などをはじめとするこれらの多能性マーカーのいずれか１つ以上を本明細書に記載の方法および組成物により産生された細胞により保持することが可能である。
【０２１６】
マーカーの検出は、当技術分野で公知の任意の手段により、たとえば免疫学的に、達成可能である。組織化学的染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣ）、ウェスタンブロット、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを使用することが可能である。
【０２１７】
細胞表面マーカーを検出するためにフロー免疫細胞化学を使用することが可能であり、細胞内または細胞表面マーカーに対して免疫組織化学（たとえば固定細胞または組織切片で）を使用することが可能である。ウェスタンブロット解析は、細胞抽出物で実施可能である。酵素結合イムノアッセイは、細胞抽出物または培地中に分泌された産物に対して使用可能である。
【０２１８】
この目的のために、供給業者から入手可能なものとして多能性マーカーに対する抗体を使用することが可能である。
【０２１９】
ステージ特異的胚抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）をはじめとする幹細胞マーカーを同定するための抗体は、たとえば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）からを市販品として入手可能である。モノクローナル抗体を使用するこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特性付けるために広く使用されてきた（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６−１３７３１；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ．（２０００）．ＰＮＡＳ  ９７：１１３０７−１１３１２、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．（１９９８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．（２０００）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．（２００２）．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９−３３７、Ｐｅｒａ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ．（２０００）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：５−１０．）。
【０２２０】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション解析、または標準的増幅方法で配列特異的プライマーを使用して逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルで検出可能である。本開示で列挙された特定のマーカーに関する配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）などの公共データベースから取得可能である。さらに詳しい内容については米国特許第５，８４３，７８０号明細書を参照されたい。
【０２２１】
本明細書に記載の方法および組成物により処理された細胞の実質的にすべてまたはそれらの実質的部分は、マーカーを発現しうる。たとえば、１種もしくは複数種のマーカーを発現する細胞のパーセントは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２２２】
細胞生存率
生物学的活性は、本明細書に記載の方法および組成物による処理の後または処理に続く増殖の後の細胞生存率を含みうる。細胞生存率は、種々の方法により、たとえばトリパンブルー排除により、アッセイすることが可能である。
【０２２３】
生体染色のプロトコルは次のとおりである。適切なチューブに好適な体積の細胞懸濁液（２０〜２００μＬ）を入れ、同体積の０．４％トリパンブルーを添加して穏やかに混合し、室温で５分間放置する。血球計数器に１０μｌの染色細胞を入れ、生存（無染色）および死滅（染色）の細胞の数をカウントする。各四分区画中の無染色細胞の平均数を計算し、２×１０4を掛け算して細胞／ｍｌ単位にする。生存細胞のパーセントは、生存細胞の数を死滅細胞および生存細胞の数で割り算した値である。
【０２２４】
細胞の生存率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２２５】
核型
本明細書に記載の方法および組成物により処理された細胞（多能性が増強または誘導される）は、増殖時または増殖後、正常核型を保持しうる。「正常」核型とは、繁殖体の由来源の親幹細胞の核型と同等、それと類似、もしくはそれと実質的に類似した核型、またはそれと異なるがなんら実質的に異なるわけではない核型のことである。たとえば、転座、染色体損失、欠失などの大きな異常は、存在してはならない。
【０２２６】
核型は、いくつかの方法により、たとえば光学顕微鏡観察下で目視により評価可能である。核型は、ＭｃＷｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、およびＧａｌｌｉｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載されるように準備し分析することが可能である。また、標準的Ｇバンド技術（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂ  ａｔ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｃａｌｉｆ．などの日常的核型分析業務を提供する多くの臨床診断機関で利用可能である）を用いて細胞の核型分析を行い、報告されている幹細胞核型と比較することが可能である。
【０２２７】
本明細書に記載の方法および組成物により処理された細胞のすべてまたは実質的部分は、正常核型を保持しうる。この割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２２８】
多能性
本方法により処理された細胞は、３つすべての細胞株列、すなわち、内胚葉、外胚葉、および中胚葉に分化する能力を保持しうる。これらの各系列に分化するように幹細胞を誘導する方法は、当技術分野で公知であり、細胞の分化能をアッセイするために使用可能である。処理細胞のすべてまたは実質的部分は、この能力を保持すしうる。これは、処理細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２２９】
ＴＢＸ３による核再プログラミングのアッセイ
Ｔｂｘ３を用いたときと用いなかったときの核再プログラミング効率の差は、たとえば、次のような形で理解しうる。
【０２３０】
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする配列および抗生物質（たとえばネオマイシンまたはピューロマイシン）耐性遺伝子を、発現がＥＳ細胞に特異的である遺伝子プロモーター領域（たとえばＮａｎｏｇ）の下流に挿入することにより、トランスジェニックマウスを作製することが可能である。次いで、３種の遺伝子（たとえば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４）ならびに種々のＴｂｘ３をこれらのトランスジェニックマウスに由来する胚性線維芽細胞内に導入して核再プログラミングを誘導し、続いて、誘導多能性幹細胞の産生効率を確認する。
【０２３１】
産生効率は、たとえばコロニー数をカウントすることにより、決定可能である。より具体的には、次のようにしてコロニー数を比較することが可能である。すなわち、以上の遺伝子およびＴｂｘ３の導入後２１日目から薬剤選択を開始し、全コロニー数およびＮａｎｏｇ  ＧＦＰ陽性コロニー数（Ｎａｎｏｇ遺伝子プロモーター領域により発現が誘導されるＧＦＰは、蛍光顕微鏡観察下で観測可能である）を２８日目にカウントする。
【０２３２】
しかしながら、当然のことであるが、核再プログラミング効率の確認は、以上の方法に限定されるものではなく、以上の方法に適切な修正および変更を加えることが可能であり、当業者であれば、任意の適切な方法を利用することが可能である。
【０２３３】
共培養およびフィーダー
本方法は、共培養の存在下または不在下で幹細胞を培養することを含みうる。「共培養」という用語は、一緒に増殖させる２つ以上の異なる種類の細胞の混合物を意味する（たとえば間質フィーダー細胞）。２つ以上の異なる種類の細胞は、粒子や細胞容器表面などの同一表面上でまたは異なる表面上で増殖させることが可能である。異なる種類の細胞は、異なる粒子上または容器表面上で増殖させることが可能である。
【０２３４】
フィーダー細胞とは、その用語が本文書で用いられる場合、異なるタイプの細胞の培養に使用されるかまたは必要とされる細胞を意味しうる。幹細胞培養との関連では、フィーダー細胞は、生存、増殖、およびＥＳ細胞多能性の維持を確実にする機能を有する。ＥＳ細胞多能性は、フィーダー細胞を直接共培養することにより達成可能である。他の選択肢としてまたは追加として、フィーダー細胞は、培地中でそれを馴化するために培養可能である。馴化された培地は、幹細胞を培養するために使用可能である。
【０２３５】
培養ディッシュなどの容器の内表面は、分裂しないように処理されたマウス胎仔皮膚細胞のフィーダー層で被覆可能である。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞の増殖に必要とされる栄養素を培養培地中に放出する。幹細胞は、そのような被覆容器内で増殖させることが可能である。
【０２３６】
フィーダー細胞は、粒子上でそれ自体を増殖させることが可能である。それらは、幹細胞に対して記載したのと同様に粒子上に接種可能である。増殖させる幹細胞は、そのようなフィーダー粒子と一緒にまたはそれとは別に増殖させることが可能である。したがって、幹細胞は、そのようなフィーダー細胞被覆粒子上の層上で増殖させることが可能である。一方、幹細胞は、別の粒子上で増殖させることが可能である。これらの構成のいずれかの任意の組合せ、たとえば、粒子上で増殖させたフィーダー細胞と、フィーダー細胞および幹細胞を有する粒子と、増殖中の幹細胞を有する粒子と、を含む培養物もまた可能である。これらの組合せは、フィーダー層を有するまたは有していない容器中で増殖させることが可能である。
【０２３７】
フィーダー細胞が不在であるかまたは必要とされない構成もまた、可能である。たとえば、細胞は、フィーダー細胞または幹細胞により馴化された培地中で増殖させることが可能である。
【０２３８】
培地およびフィーダー細胞
多能性幹細胞の単離および増殖のための培地は、得られる細胞が所望の特徴を有しかつさらなる増殖が可能であるかぎり、いくつかの異なる処方のいずれかを有しうる。
【０２３９】
好適な供給源は、次のとおりである。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、ノックアウトＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８）、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７）、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０５０）、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２）、ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９）。例示的な血清含有胚幹（ＥＳ）培地は、８０％ＤＭＥＭ（典型的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、２０％限定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）非熱不活性化、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールを用いて作製される。培地は、濾過され、４℃で２週間以内貯蔵される。無血清胚幹（ＥＳ）培地は、８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代替物、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールを用いて作製される。効果的な血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地は、濾過され、４℃で２週間以内貯蔵される。使用直前、ヒトｂＦＧＦが４ｎｇ／ｍＬの最終濃度に添加される（Ｂｏｄｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、国際公開第９９／２０７４１号パンフレット）。
【０２４０】
培地は、１０％血清代替培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、および５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が追加されたノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含みうる。
【０２４１】
フィーダー細胞（使用する場合）は、９０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）、および２ｍＭグルタミンを含有するｍＥＦ培地中で増殖可能である。ｍＥＦは、細胞をサブコンフルエント状態に保持しながら１日おきにトリプシンで細胞を１：２に分割してＴ１５０フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させる。フィーダー細胞層を調製するために、増殖は阻害するがヒト胚性幹細胞を支援する重要因子の合成は許容する線量で細胞に照射する（約４０００ｒａｄのγ線照射）。１ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンを用いて３７℃で一晩インキュベートすることにより６ウェル培養プレート（たとえばＦａｌｃｏｎ＃３０４）に被覆を施し、１ウェルあたり３７５，０００照射ｍＥＦでプレーティングする。フィーダー細胞層は、典型的には、プレーティング５時間後〜４日後に使用される。培地は、ｐＰＳ細胞の接種直前に新しいヒト胚幹（ｈＥＳ）培地と入れ替える。
【０２４２】
他の幹細胞を培養する条件は、公知であり、細胞型に従って適切に最適化可能である。前の節で参照された特定の細胞型のための培地および培養技術は、引用文献に提供される。
【０２４３】
無血清培地
本明細書に記載の方法および組成物は、幹細胞などの細胞を無血清培地中で培養することを含みうる。
【０２４４】
「無血清培地」という用語は、ウシ胎仔血清などの血清タンパク質を含まない細胞培養培地を包含しうる。無血清培地は、当技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第５，６３１，１５９号明細書および同第５，６６１，０３４号明細書に記載されている。無血清培地は、たとえば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。
【０２４５】
無血清培地は、タンパク質、加水分解物、および未知組成の成分が欠如しているという点で無タンパク質でありうる。無血清培地は、すべての成分が既知の化学構造を有する既知組成培地を含みうる。既知組成無血清培地は、バラツキをなくし、改良された再現性およびより一貫性のある性能を可能にし、かつ外来因子による汚染の可能性を低減した、完全に定義された系を提供するので、有利である。
【０２４６】
無血清培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含みうる。
【０２４７】
無血清培地は、血清代替培地などの１つ以上の成分を、たとえば、５％、１０％、１５％などの濃度で追加可能である。無血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）製の１０％血清代替培地を追加可能である。
【０２４８】
分離または脱凝集された胚性幹細胞が培養される無血清培地は、１種以上の増殖因子を含みうる。ＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、ノギン、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＨＲＧ１β、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａなどをはじめとするいくつかの増殖因子は、当技術分野で公知である。増殖因子は、１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌなどの任意の好適な濃度で使用可能である。
【０２４９】
幹細胞
本文書で用いられる場合、「幹細胞」という用語は、分裂時に２つの発生上の選択肢に直面する細胞を意味する。すなわち、娘細胞は、原細胞と同等でありうるか（自己複製）またはそれよりも特殊化した細胞型の前駆体でありうる（分化）。したがって、幹細胞は、いずれか一方の経路を採用しうる（各細胞型の一方を形成しうるさらなる経路が存在する）。したがって、幹細胞は、最終分化されずに他の型の細胞を生成しうる細胞である。
【０２５０】
本文書で参照される幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、および複能性幹細胞を包含しうる。また、とくに誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を包含する。
【０２５１】
全能性幹細胞
「全能性」細胞という用語は、成体の体内の任意の細胞型または胚体外膜（たとえば胎盤）の任意の細胞になる能力を有する細胞を意味する。したがって、この無比の全能性細胞は、受精卵およびその卵割により生じた最初の４個程度の細胞である。
【０２５２】
多能性幹細胞
「多能性幹細胞」とは、体内の任意の分化細胞を作製する能力を有する真の幹細胞のことである。しかしながら、栄養芽細胞に由来する胚体外膜の作製に寄与できない。いくつかの型の多能性幹細胞が見いだされてきた。
【０２５３】
胚性幹細胞
胚幹（ＥＳ）細胞は、着床が起こる胚の発生段階である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離可能である。
【０２５４】
胚性生殖細胞
胚性生殖（ＥＧ）細胞は、流産胎児の生殖腺の前駆体から単離可能である。
【０２５５】
胚性癌腫細胞
胚性癌腫（ＥＣ）細胞は、奇形癌腫（胎児の生殖腺に生じることのある腫瘍）から単離可能である。最初の２つとは異なり、通常、異数体である。これらの型の多能性幹細胞は３つともすべて、胚または胎児の組織からのみ単離可能であり、培養下で増殖可能である。これらの多能性細胞の分化を防止する方法は、当技術分野で公知である。
【０２５６】
成体幹細胞
成体幹細胞は、神経幹細胞、皮膚幹細胞、および骨髄移植の有効成分である造血幹細胞をはじめとする多種多様な型を含む。これらの後者の幹細胞型はまた、臍帯由来幹細胞の主要な特徴である。成体幹細胞は、実験室内および体内の両方で機能性のあるより特殊化した細胞型に成熟可能であるが、細胞型の正確な数は、選択される幹細胞の型により限定される。
【０２５７】
複能性幹細胞
複能性幹細胞は、真の幹細胞であるが、限られた数の型にのみ分化可能である。たとえば、骨髄は、血液のすべての細胞を生成するが他の型の細胞を生成しない複能性幹細胞を含有する。複能性幹細胞は、成体動物に見られる。体内のすべての器官（脳、肝臓）は、それを含有し、死滅細胞または損傷細胞を置き換えることが可能であると考えられる。
【０２５８】
幹細胞を特徴付ける方法は、当技術分野で公知であり、クローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養、および分子生物学的技術（たとえば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびサザンブロッティング）などの標準的アッセイ方法の使用を含む。
【０２５９】
形態学的差に加えて、ヒトおよびマウスの多能性幹細胞は、いくつかの細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現が異なる。幹細胞のマーカーおよびその検出方法は、本文書中の他の箇所に記載されている（「幹細胞の特徴の維持」の項）。
【０２６０】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）
本方法は、増強された多能性を示す細胞（たとえば誘導多能性幹細胞）の調製を包含する。
【０２６１】
本文書では、「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」という用語は、ＥＳ細胞と類似の性質を有する細胞を意味し、より具体的には、この用語は、体細胞から再プログラムされかつ多能性および増殖能を有する未分化細胞を包含する。
【０２６２】
しかしながら、この用語は、いかなる意味でも限定的とみなされるべきものではなく、その最広義を有するとみなされるべきものである。したがって、たとえば、本明細書に記載の方法により処理されていない細胞と比較して胚性幹細胞の１つ以上の増強された特徴を示すことにより、増強された多能性レベルを示す細胞はいずれも、ｉＰＳ細胞として認定されうる。
【０２６３】
核再プログラミング因子を用いる誘導多能性幹細胞の調製方法は、国際公開第２００５／８０５９８Ａ１号パンフレット（この出版物では「ＥＳ様細胞」という用語が用いられている）に記載されており、誘導多能性幹細胞の単離方法もまた、具体的に記載されている。それに加えて、再プログラミング因子の具体例およびそのような再プログラミング因子を用いる体細胞の再プログラミング方法の具体例は、国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレットに開示されている。
【０２６４】
本明細書に記載の方法による体細胞からの誘導多能性幹細胞の調製方法は、とくに限定されるものではなく、体細胞および誘導多能性幹細胞が増殖可能な環境中でＴｂｘ３の存在下で核再プログラミング因子を用いる体細胞の核再プログラミングを可能にする方法であるかぎり、任意の方法を利用することが可能である。
【０２６５】
たとえば、核再プログラミング因子を発現可能な遺伝子を含むベクターを用いてそのような遺伝子を体細胞内に導入することが可能であり、同じまたは異なるタイミングで、Ｔｂｘ３を発現可能な組換えベクターを体細胞内に導入することが可能である。そのようなベクターを使用する場合、体細胞内でそれぞれの遺伝子産物の同時発現を行うように２つ以上の遺伝子をベクター中に組み込むことが可能である。
【０２６６】
以上の遺伝子を発現可能なベクターを用いて遺伝子および／またはＴｂｘ３を体細胞内に導入する場合、フィーダー細胞上で培養された体細胞内に発現ベクターを導入することが可能であるか、または発現ベクターを体細胞内に単独で導入することが可能である。後者の方法は、発現ベクターの導入効率を改良するのにより好適であることもある。
【０２６７】
フィーダー細胞に関しては、胚性幹細胞の培養で使用するために適切に使用されるフィーダー細胞が存在しうる。その例としては、放射線またはマイトマイシンＣなどの薬剤のいずれかを用いて処理された、１４または１５日齢マウス胚性線維芽細胞の初代培養細胞および線維芽細胞株のＳＴＯ細胞が挙げられうる。
【０２６８】
適切な条件下で核再プログラミング因子が導入された体細胞を培養すると自律的核再プログラミングが起こり、その結果として、誘導多能性幹細胞を体細胞から生成することが可能である。発現ベクターを用いて核再プログラミング因子および／またはＴｂｘ３をコードする遺伝子を体細胞内に導入することにより誘導多能性幹細胞を取得するプロセスは、たとえば、レトロウイルスを使用する方法に従って行うことが可能である。
【０２６９】
そのような方法の例としては、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−７６，２００６、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−７２，２００７、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−２０，２００７などの出版物に記載の方法が挙げられる。ヒト誘導多能性幹細胞を生成する場合、発現ベクターの導入後、細胞培養物密度を動物細胞培養の通常の場合よりも低く設定することが望ましい。たとえば、１×１０4〜１×１０5細胞／１０ｃｍディッシュ、たとえば、約５×１０4細胞／１０ｃｍディッシュの密度に培養物を保持することが可能性である。
【０２７０】
培養で使用するための培地は、とくに限定されるものではなく、当業者であれば適切に選択可能であるが、たとえば、ヒト誘導多能性幹細胞を生成するためにヒトＥＳ細胞培養に好適な培地を使用できることもある。培地選択および培養条件については、以上の出版物を参照することが可能である。
【０２７１】
こうして生成された誘導多能性幹細胞は、未分化細胞に特異的な種々のマーカーを用いて検査することが可能であり、そのための手段は、以上の出版物にとくに詳細に記載されている。たとえば、いくつか多能性細胞マーカーとしては、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン；βΙΙΙ−チューブリン；α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）；線維芽細胞増殖因子４（Ｆｇｆ４）、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ；ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔｌ）；（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌ１７；Ｓａｌ１４；未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；テロメラーゼ、ＴＥＲＴを含む；サイレントＸ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；Ｆ−ｂｏｘ含有タンパク質１５（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）；およびＴ細胞リンパ腫切断点１（Ｔｅｌｌ）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４が挙げられる。他のマーカーとしては、Ｄｎｍｔ３Ｌ；Ｓｏｘｌ５；Ｓｔａｔ３；Ｇｒｂ２；ＳＶ４０ラージＴ抗原；ＨＰＶ１６  Ｅ６；ＨＰＶ１６  Ｅ７、１３−カテニン、およびＢｍｉｌが挙げられうる。そのような細胞はまた、ｉＰＳ細胞が誘導される分化細胞に特徴的なマーカーのダウンレギュレーションにより特徴付け可能である。たとえば、線維芽細胞に由来するｉＰＳ細胞は、線維芽細胞マーカーＴｈｙ１のダウンレギュレーションならびに／またはＳＳＥＡ−３および４のアップレギュレーションにより特徴付け可能である。説明は、ここに列挙されたマーカーに限定されるものではなく、細胞表面マーカー、抗原などのマーカー、さらにはＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）、およびそれらの一部分をはじめとする他の遺伝子産物を包含するとみなされる。
【０２７２】
多能性を維持するための培地
ＥＳ細胞の未分化および多能性を適正に保持しうる種々の媒体ならびにこれらの性質を保持できない種々の媒体は、当技術分野で公知であり、これら培地の適切な組合せにより誘導多能性幹細胞の効率的な単離が可能になる。
【０２７３】
こうして単離された誘導多能性幹細胞の分化能および増殖能は、当業者であれば、ＥＳ細胞に対する一般的な検査手段を用いて容易に検査可能である。それに加えて、誘導多能性幹細胞のコロニーは、こうして生成された誘導多能性幹細胞を適切な条件下で増殖することにより取得可能であり、これらの誘導多能性幹細胞の存在は、それらのコロニーの形状に基づいて特定可能である。
【０２７４】
たとえば、マウス誘導多能性幹細胞は隆起コロニーを形成するが、ヒト誘導多能性幹細胞は平坦コロニーを形成することが知られている。これらのコロニー形状は、それぞれマウスＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞のものと非常に類似しており、したがって、当業者であれば、これらの生成された誘導多能性幹細胞をそれらのコロニーの形状に基づいて特定可能である。
【０２７５】
体細胞源
本明細書に記載の方法により再プログラムされる体細胞の型は、とくに限定されるものではなく、任意の体細胞を使用可能である。たとえば、任意の哺乳動物に由来する（たとえば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびサルなど哺乳動物に由来する）体細胞を利用することが可能である。
【０２７６】
胚性体細胞だけでなく新生児体細胞、成熟体細胞、および組織幹細胞を使用することも可能である。それに加えて、皮膚細胞、肝細胞、および胃粘膜細胞などの種々の体細胞を再プログラムすることが可能である。
【０２７７】
疾患に対する療法で誘導多能性幹細胞を使用するために、患者から単離された体細胞を使用することが望ましいこともある。たとえば、疾患に関与する体細胞および疾患の療法に関連した体細胞を使用することが可能である。
【０２７８】
使用
本明細書に記載の方法により生成される増強または誘導された多能性を示す細胞（たとえば誘導多能性幹細胞）の可能な使用は、とくに限定されるものではなく、これらの細胞は、ＥＳ細胞を用いて行われるすべての検査／試験およびＥＳ細胞を利用する任意の疾患療法に使用可能である。
【０２７９】
たとえば、本明細書に記載の方法により得られる誘導多能性幹細胞は、適切な組織を形成しうるように、レチノイン酸、増殖因子（たとえばＥＧＦ）、またはグルココルチコイドで処理することにより、所望の分化細胞（たとえば、神経細胞、心筋細胞、血液細胞、およびインスリン産生細胞）に誘導することが可能である。
【０２８０】
自己細胞移植を介する幹細胞療法は、以上のようにして得られたこれらの分化細胞または組織を患者に戻すことにより達成可能である。しかしながら、本明細書に記載の誘導多能性幹細胞の適用は、以上に挙げた特定の態様に限定されるものではない。
【０２８１】
使用
本明細書に記載の方法および組成物は、種々の手段に利用可能である。
【０２８２】
たとえば、本明細書に記載の方法および組成物により処理された細胞（これは増強または誘導された多能性を示す）は、さまざまな商業上重要な研究、診断、および治療の目的に使用可能である。処理細胞（幹細胞を含む）は、これらの目的に合わせて直接使用可能であるか、または当技術分野で公知の方法を用いて任意の選択された細胞型に分化させることが可能である。前駆細胞はまた、処理細胞（幹細胞を含む）からも誘導可能である。
【０２８３】
分化細胞もしくは前駆細胞またはその両方は、処理細胞（幹細胞を含む）の代わりにまたはそれと組み合わせて、同一の目的に使用可能である。したがって、処理細胞（幹細胞を含む）に関して本文書に記載された使用はいずれも、前駆細胞および処理細胞（幹細胞を含む）に由来する分化細胞にも同じようにあてはまる。同様に、分化細胞の使用はいずれも、その前駆体または前駆細胞である処理細胞（幹細胞を含む）にも同じようにあてはまるであろう。
【０２８４】
処理細胞（幹細胞などを含む）の使用は、一般に当技術分野で周知であるが、本明細書に簡潔に記載する。
【０２８５】
治療的使用
本明細書に記載の方法および組成物は、再生療法のために処理細胞（幹細胞を含む）を増殖すべく使用可能である。そのような細胞を拡大培養して患者に直接投与することが可能である。外傷後の損傷組織の再生に使用可能である。
【０２８６】
処理細胞（幹細胞を含む）は、直接使用可能であるか、または再生療法のために外胚葉、中胚葉、または内胚葉の前駆細胞集団を生成するために使用可能である。前駆細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大培養により作製可能であるか、または患者に直接投与可能である。また、外傷後の損傷組織の再生にも使用可能である。
【０２８７】
したがって、造血前駆細胞は、骨髄置換に使用可能であり、一方、心臓前駆細胞は、心不全患者に使用可能である。皮膚前駆細胞は、患者のための皮膚移植片を増殖すべく利用可能であり、および内皮前駆細胞は、ステントや人工心臓などの人工プロテーゼの内皮化のために利用可能である。
【０２８８】
処理細胞（幹細胞を含む）は、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの変性疾患の治療のために外胚葉、中胚葉、または内胚葉の前駆細胞源として使用可能である。処理細胞（幹細胞を含む）は、癌免疫療法のためにＮＫ細胞または樹状細胞に対する中胚葉または内胚葉の前駆体源として使用可能である。
【０２８９】
本明細書に記載の方法および組成物は、外胚葉、中胚葉、または内胚葉の前駆細胞（これらは、当然ながら、当技術分野で公知の方法を用いて、最終分化細胞型にさらに分化させることが可能である）の産生を可能にする。
【０２９０】
したがって、最終分化細胞の使用はいずれも、それらの起源である外胚葉、中胚葉、または内胚葉の前駆細胞（または幹細胞）にも同じようにあてはまる。
【０２９１】
本明細書に記載の方法および組成物により生成される処理細胞（幹細胞を含む）、外胚葉、中胚葉、または内胚葉の前駆細胞、および分化細胞は、疾患の治療のためにまたはそのための医薬組成物の調製のため使用可能である。そのような疾患には、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性疾患、たとえば、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、および癌をはじめとする、再生療法により治療可能な疾患が含まれうる。
【０２９２】
ライブラリー
たとえば、未分化細胞および分化細胞の集団は、分化表現型に特異的な抗体およびｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用可能である。抗体の作製、精製、および修飾、ならびにイムノアッセイおよび免疫隔離法でのそれらの使用で用いられる一般的技術については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｒ  ＆  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ＧｍｂＨ）に記載されている。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーの作製に関係する一般的技術については、ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）、ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｃｏｗｅｌｌ  ＆  Ａｕｓｔｉｎ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、およびＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｈｕｎｔ  ＆  Ｌｉｖｅｓｅｙ，ｅｄｓ．，２０００）に記載されている。比較的均一な細胞集団は、薬剤スクリーニングおよび治療用途で使用するのにとくに適している。
【０２９３】
薬剤スクリーニング
処理細胞（幹細胞を含む）および分化細胞はまた、処理細胞（幹細胞を含む）または分化細胞の特徴に影響を及ぼす因子（たとえば、溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または環境条件（たとえば、培養条件または操作）をスクリーニングするために使用可能である。
【０２９４】
処理細胞（幹細胞を含む）は、多能性または分化を促進する因子をスクリーニングするために使用可能である。いくつかの用途では、分化細胞は、成熟を促進するかまたは長期培養時のそのような細胞の増殖および維持を促進する因子をスクリーニングするために使用可能である。たとえば、候補の成熟因子または増殖因子は、さまざまなウェル中の細胞にそれらを添加してから、細胞のさらなる培養および使用に望ましい基準に従って生じた表現型変化を決定することにより、試験される。
【０２９５】
特定のスクリーニング用途は、薬剤研究での医薬化合物の試験に関する。読者は、一般的には、標準的教科書“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、および米国特許第５，０３０，０１５号明細書）、さらには本文書中の他の箇所の薬剤スクリーニングの一般的説明を参照されたい。候補医薬化合物の活性の評価は、一般的には、処理細胞（幹細胞を含む）または分化細胞を候補化合物と組み合わせることと、化合物に帰属可能な細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性の変化を決定することと（未処置細胞または不活性化合物で処理された細胞と比較して）、次いで、化合物の作用を観測された変化と相関付けることと、を含む。
【０２９６】
スクリーニングは、たとえば、化合物が特定の細胞型に対して薬理学的作用を有するように設計されるので、または他の箇所で作用を有するように設計された化合物が予期せぬ副作用を有することもありうるので、行われうる。可能性のある薬剤間相互作用を検出するために、２種以上の薬剤を組み合わせて（同時にまたは逐次的に細胞と組み合わせることにより）試験することが可能である。いくつかの用途では、化合物は、初期に、可能性のある毒性に関してスクリーニングされる（Ｃａｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．３７５−４１０  ｉｎ  “Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）。細胞傷害性は、第１の例では、細胞の生存率、生存期間、形態、および特定のマーカー、レセプター、または酵素の発現または放出に及ぼす影響により決定可能である。染色体ＤＮＡに及ぼす薬剤の影響は、ＤＮＡの合成または修復を測定することにより決定可能である。［3Ｈ］チミジンまたはＢｒｄＵ取込みは、とくに、細胞周期の予定外の時期の場合または細胞複製に必要とされるレベルを超える場合、薬剤作用と一致している。望ましくない作用としては、中期スプレッドにより決定される姉妹染色分体交換の異常な割合も挙げられうる。読者は、さらに詳細には、Ａ．Ｖｉｃｋｅｒｓ（ＰＰ３７５−４１０  ｉｎ“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）を参照されたい。
【０２９７】
組織再生
本明細書に記載の方法および組成物に従って生成された処理細胞（幹細胞を含む）（およびそれに由来する分化細胞）は、たとえば、組織の再構成または再生などを必要とする個別の患者での療法に使用可能である。細胞は、意図された組織部位に移植して機能的に欠陥のある領域を再構成または再生するように投与可能である。
【０２９８】
処理細胞（幹細胞を含む）またはそれに由来する分化細胞は、皮膚移植片の成長などの組織工学的処理に使用可能である。人工臓器もしくは人工組織の生物工学またはステントなどのプロテーゼに使用可能である。
【０２９９】
分化細胞はまた、それを必要とするヒト患者で組織の再構成または再生に可能である。細胞は、意図された組織部位に移植して機能的に欠陥のある領域を再構成または再生するように投与される。
【０３００】
たとえば、本明細書に記載の方法および組成物は、処理細胞（幹細胞を含む）の分化をモジュレートするために使用可能である。分化細胞は、皮膚移植片の成長などの組織工学的処理に使用可能である。処理細胞（幹細胞を含む）の分化のモジュレーションは、人工臓器もしくは人工組織の生物工学またはステントなどのプロテーゼに使用可能である。
【０３０１】
他の例では、神経幹細胞は、治療される疾患に応じて中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接に移植される。移植は、２５，０００〜５００，０００細胞／μＬの密度で単細胞懸濁液または小凝集体を用いて行われる（米国特許第５，９６８，８２９号明細書）。神経細胞移植の有効性は、ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１４１０，１９９９に記載されるように、ラットモデルで急性脊髄損傷に対して評価可能である。移植がうまく行けば、２〜５週間後、病変に移植由来細胞が存在し、星状細胞、乏突起膠細胞、および／またはニューロンに分化し、病変端から脊髄に沿って移行し、ゲート、協調、および体重負荷が改良されるであろう。
【０３０２】
特定の神経前駆細胞は、神経系の急性または慢性の損傷を治療すべく設計される。たとえば、興奮毒性は、癲癇、発作、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病をはじめとするさまざまな病態に関与しているとみなされてきた。本明細書に記載の方法に従って作製された特定の分化細胞はまた、ペリツェウス−メルツバッハー病、多発性硬化症、白質ジストロフィー、神経炎、および神経症などの髄鞘形成障害の治療に適合しうる。これらの目的に適合するのは、再ミエリン形成を促進する乏突起膠細胞または乏突起膠細胞前駆体に富んだ細胞培養物である。
【０３０３】
本方法を用いて調製された肝細胞および肝細胞前駆体は、肝損傷を修復する能力に関して動物モデルで評価可能である。そのような例の１つは、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射により引き起こされる損傷である（Ｄａｂｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６０６，１９９３）。治療の有効性は、肝細胞マーカーの免疫組織化学的染色、成長組織中に小管構造を生じるかの顕微鏡判定、および肝臓特異的タンパク質の合成を回復する治療能力により決定可能である。肝細胞は、直接投与により、または被験体の肝臓組織が劇症肝不全の後で再生している間、一時的肝機能を提供するバイオアシストデバイスの一部として、療法に使用可能である。
【０３０４】
心筋細胞は、Ｇｒａｉｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００７）に記載されるように、たとえば、特異的ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤ＳＢ２０３５８０によるＭＡＰキナーゼ経路のモジュレーション（ｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を行って幹細胞の分化を誘導することにより調製可能である。そのような心筋細胞の有効性は、治療しないと左室壁組織の５５％が瘢痕組織になる心臓凍結傷害に関して動物モデルで評価可能である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２５  ６２：６５４，１９９６、Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９，Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。治療がうまく行けばは、瘢痕領域が低減し、瘢痕拡大が抑制され、収縮期、拡張期、および発生圧によりを決定される心臓機能が改良されるであろう。心臓傷害はまた、左前下行動脈の遠位部分で塞栓形成コイルを用いてモデリング可能であり（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、治療の有効性は、組織学および心臓機能により評価可能である。心筋細胞調製物は、心筋を再生して不十分な心臓機能を治療すべく療法に使用可能である（米国特許第５，９１９，４４９号明細書および国際公開第９９／０３９７３号パンフレット）。
【０３０５】
癌
本明細書に記載の方法および組成物に従って生成された処理細胞（幹細胞を含む）およびそれに由来する分化細胞は、癌を治療するために使用可能である。
【０３０６】
「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無制御細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を意味または記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３０７】
そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、たとえば膠芽腫および神経繊維腫症、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、ならびに種々のタイプの頭頸部癌が可能である。さらなる例は、固形腫瘍癌、たとえば、結腸癌、乳癌、肺癌、および前立腺癌（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、造血器悪性疾患、たとえば、白血病およびリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚癌、および家族性腺腫性ポリポーシスである。さらなる例としては、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頸部新生物、眼新生物、肝新生物、肺新生物、膵新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜新生物、卵管新生物、直腸新生物、結腸新生物、腎新生物、胃新生物、および副甲状腺新生物が挙げられる。また、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫（ｌｙｍｐｙｈｏｍａ）、卵巣癌、子宮頸癌、および胆道癌が挙げられる。
【０３０８】
本明細書に記載の方法および組成物に従って生成され場合により分化させた処理細胞（幹細胞を含む）はまた、抗癌剤（たとえばエンドスタチンおよびアンギオスタチン）または細胞傷害剤または化学療法剤と組み合わせて使用可能である。たとえば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチナム、エトポシド、タキソール、タキソテールなどなどの（ｓｕｃｈ  ａｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ）薬剤、およびビンクリスチンなどのアルカロイド、およびメトトレキセートなどの抗代謝剤。本明細書で用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能の阻害もしくは妨害および／または細胞の破壊の誘発を行う物質を意味する。この用語は、放射性同位体（たとえば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、および毒素（たとえば、細菌、菌類、植物、もしくは動物に由来する酵素活性毒素またはその断片）を包含するものとする。
【０３０９】
また、この用語は、オンコジーン産物／チロシンキナーゼ阻害剤、たとえば、国際公開第９４／２２８６７号パンフレットに開示される二環式アンサマイシン、欧州特許第６００８３２号明細書に開示される１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、欧州特許第６００８３１号明細書に開示される６，７−ジアミノフタラジン−１−オン誘導体、欧州特許第５１６５９８号明細書に開示される４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体、またはＳＨ２含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド（たとえば国際公開第９４／０７９１３号パンフレットを参照されたい）を包含する。「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学化合物のことである。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号明細書を参照されたい）、メルファランおよび他の関連ナイトロジェンマスタード、ならびに内分泌療法剤（たとえば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗剤、プロゲスチン、抗プロゲスチンなど）が挙げられる。
【０３１０】
さらなる態様
次に、本発明のさらなる態様および実施形態を順に以下に明記する。本発明はこれらの態様を包含するとみなされるものとする。
【０３１１】
誘導多能性幹細胞を効率的に調製する方法を記述する。Ｔｂｘ３の存在下で誘導多能性幹細胞の効率的な調製を達成する方法を記述する。Ｔｂｘ３を含む核再プログラミング因子を用いる誘導多能性幹細胞の効率的な調製の方法を記述する。核再プログラミング前の体細胞内に存在するレベルと比較して増大されたＴｂｘ３の存在下で核再プログラミング因子を用いる誘導多能性幹細胞の効率的な調製の方法を記述する。核再プログラミング因子がｃ−Ｍｙｃを含まない、そのような方法を記述する。
【０３１２】
核再プログラミング因子およびＴｂｘ３を用いて体細胞を核再プログラムすることを含む、誘導多能性幹細胞の調製方法を記述する。この方法では、Ｔｂｘ３は、Ｔｂｘ３の不在下で核再プログラミング因子を用いる体細胞の核再プログラミングと比較して体細胞の核再プログラミングの効率を増大させる。
【０３１３】
Ｔｂｘ３が胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルで発現される、そのような方法を記述する。
【０３１４】
核再プログラミング因子および／またはＴｂｘ３をコードする遺伝子が体細胞内に導入される、そのような方法を記述する。
【０３１５】
当該遺伝子を含むベクターおよび／またはＴｂｘ３をコードするベクターが体細胞内に導入される、そのような方法を記述する。
【０３１６】
当該遺伝子を含むかまたはＴｂｘ３をコードするベクターがレトロウイルスベクターである、そのような方法を記述する。
【０３１７】
当該遺伝子がＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘファミリー遺伝子から選択される、そのような方法を記述する。
【０３１８】
当該遺伝子がＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２から選択される、そのような方法を記述する。
【０３１９】
核再プログラミング因子がＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２を含む、そのような方法を記述する。
【０３２０】
Ｔｂｘ３が核酸として体細胞内に導入される、そのような方法を記述する。
【０３２１】
核再プログラミング因子がｃ−Ｍｙｃを含まない、そのような方法を記述する。
【０３２２】
他の選択肢の実施形態では、核再プログラミング因子は、ｃ−ＭｙｃなどのＭｙｃファミリー遺伝子を含む。
【０３２３】
核再プログラミング因子がＯｃｔファミリー遺伝子メンバー、Ｓｏｘファミリー遺伝子メンバー、およびＫｌｆファミリー遺伝子メンバーを含む、そのような方法を記述する。
【０３２４】
核再プログラミング因子がＫｌｆファミリー遺伝子およびＯｃｔファミリー遺伝子を含む、そのような方法を記述する。
【０３２５】
核再プログラミング因子がＳｏｘファミリー遺伝子をさらに含む、そのような方法を記述する。
【０３２６】
核再プログラミング因子がＳｏｘファミリー遺伝子をさらに含む、そのような方法を記述する。
【０３２７】
核再プログラミング因子がＫＬＦ４およびＯＣＴ３／４を含む、そのような方法を記述する。
【０３２８】
核再プログラミング因子がＳｏｘファミリー遺伝子を除外する、そのような方法を記述する。
【０３２９】
核再プログラミング因子がＭｙｃファミリー遺伝子を除外する、そのような方法を記述する。
【０３３０】
体細胞が複数の体細胞を含む、そのような方法を記述する。
【０３３１】
生成される誘導多能性幹細胞の数が追加のＴｂｘ３の不在下よりも多くなるように核再プログラミング因子およびＴｂｘ３を体細胞に添加することを含む、核再プログラミングの効率の増大方法を記述する。
【０３３２】
体細胞を再プログラムすることにより誘導される誘導多能性幹細胞を記述する。この場合、再プログラミングは、Ｔｂｘ３を添加することによりかつ卵、胚、または胚幹（ＥＳ）細胞の不在下で行われる。
【０３３３】
誘導多能性幹細胞がヒト細胞である、そのような誘導多能性幹細胞を記述する。
【０３３４】
核再プログラミング因子およびＴｂｘ３を用いて体細胞を核再プログラムすることを含む誘導多能性幹細胞の調製方法により得られる誘導多能性幹細胞を記述する。この方法では、Ｔｂｘ３は、Ｔｂｘ３の不在下で核再プログラミング因子を用いる体細胞の核再プログラミングと比較して体細胞の核再プログラミングの効率を増大させる。
【０３３５】
生成される誘導多能性幹細胞の数が追加のＴｂｘ３の不在下よりも多くなるように核再プログラミング因子およびＴｂｘ３を体細胞に添加することを含む核再プログラミングの効率の増大方法により得られる多能性幹細胞を記述する。
【０３３６】
以上の多能性幹細胞のいずれかの分化の誘導により得られる体細胞を記述する。
【０３３７】
さらに、核再プログラミング因子およびＴｂｘ３を用いて体細胞を核再プログラムすることを含む、体細胞から誘導多能性幹細胞を調製する方法を記述する。この方法では、Ｔｂｘ３は、Ｔｂｘ３の不在下で核再プログラミング因子を用いる体細胞の核再プログラミングと比較して体細胞の核再プログラミングの効率を増大させ、かつ核再プログラミング因子は、少なくとも（ｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子、（ｉｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子、（ｉｉｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＮａｎｏｇ遺伝子、または（ｉｖ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＭｙｃファミリー遺伝子を含むが、Ｓｏｘファミリー遺伝子を含まない。
【０３３８】
そのほかにさらに、生成される誘導多能性幹細胞の数がＴｂｘ３の不在下よりも多くなるようにＴｂｘ３の存在下で体細胞を核再プログラミング因子による核再プログラミングに付すことを含む、体細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための核再プログラミングの効率の増大方法を記述する。この方法では、Ｔｂｘ３は、Ｔｂｘ３の不在下で核再プログラミング因子を用いる体細胞の核再プログラミングと比較して体細胞の核再プログラミングの効率を増大させ、かつ核再プログラミング因子は、少なくとも（ｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子、（ｉｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子、（ｉｉｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＮａｎｏｇ遺伝子、または（ｉｖ）Ｏｃｔファミリー遺伝子とＫｌｆファミリー遺伝子とＭｙｃファミリー遺伝子を含むが、Ｓｏｘファミリー遺伝子を含まない。
【０３３９】
Ｔｂｘ３が胚性幹細胞内で体細胞内よりも高レベルの発現される、そのような方法のそれぞれを記述する。
【０３４０】
Ｏｃｔファミリー遺伝子がＯｃｔ３／４遺伝子であるか、Ｋｌｆファミリー遺伝子がＫｌｆ４遺伝子であるか、Ｍｙｃファミリー遺伝子がｃ−Ｍｙｃ遺伝子であるか、またはＳｏｘファミリー遺伝子がＳｏｘ２遺伝子である、そのような方法のそれぞれについて記述する。
【０３４１】
核再プログラミング因子が（ｉ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、（ｉｉ）Ｏｃｔ３／４遺伝子とＫｌｆ４遺伝子との組合せ、（ｉｉｉ）Ｏｃｔ３／４遺伝子とＮｏｎｏｇ遺伝子との組合せ、（ｉｖ）Ｏｃｔ３／４遺伝子とＫｌｆ４遺伝子とｃ−Ｍｙｃ遺伝子との組合せである、そのよう方法のそれぞれを記述する。
【０３４２】
核再プログラミング因子をコードするＤＮＡを含むベクターの形態で核再プログラミング因子が体細胞内に導入される、そのような方法のそれぞれについて記述する。
【０３４３】
Ｔｂｘ３をコードするＤＮＡを含むベクターの形態でＴｂｘ３（Ｔｂｘ３ｉｓ）が体細胞内に導入される、そのような方法のそれぞれについて記述する。
【０３４４】
体細胞は、ヒト体細胞を含みうる。
【実施例】
【０３４５】
実施例１．材料および方法−細胞培養およびトランスフェクション
すべての細胞培養物を３７℃にて、５％ＣＯ2で維持した。マウスＲ１およびＤ３  ＥＳＣの培養については以前に記載した25。
【０３４６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたＤＭＥＭ中に維持した。
【０３４７】
マウスＥＳＣおよびＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
【０３４８】
レトロウイルスの産生に使用したＰｌａｔ−Ｅパッケージング細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＩＮＣ）は、製造業者の説明書に従って維持した。
【０３４９】
実施例２．材料および方法−プラスミド構築、ウイルスパッケージングおよび感染。
Ｔｂｘ３のコード配列は、ＲＴ−ＰＣＲによりマウスＥＳＣから増幅してｐＬｅｎｔｉ６−ＵＢＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＭＸｓベクター中にクローニングし、ｐＭＸ中のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手し、Ｅｓｒｒｂは、Ｆｅｎｇら7から入手した。
【０３５０】
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、以前に記載したとおり生成した1,26。
【０３５１】
ｉＰＳ細胞を生成するために、８ｎｇ・ｍｌ-1のポリブレンを含有する１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地で１０ｃｍ2ディッシュ中にプレーティングされた５×１０4個のＭＥＦに、さまざまな組合せの因子をコードする等量のウイルスを適用した。２４時間後、不活性化されたフィーダー細胞および新しい培地を添加し、次いで、最大２１日間まで培養物を維持した。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の設計およびｓｈＲＮＡ合成用プラスミドの構築のために、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら27のアルゴリズムに基づいて１９塩基対遺伝子特異的領域を設計した。
【０３５２】
オリゴヌクレオチドをｐＳｕｐｅｒ．ｐｕｒｏ（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）中にクローニングした。特異性を保証するためにすべての配列をＢＬＡＳＴにより解析した。
【０３５３】
実施例３．材料および方法−細胞融合
ＰＥＧ媒介融合のために、各型の細胞（約１×１０6個）を無血清ＤＭＥＭ中に混合し、ペレット化し、上清を除去した。ペレットを３００μｌの５０％ｗ／ｖＰＥＧ１５００中に再懸濁し、ときどき叩いて混合しながら３分間放置した。
【０３５４】
次いで、２ｍｌの培地を添加し、細胞を遠心沈降し、上清を廃棄した。ペレットをＥＳＣ培地中に再懸濁し、１０ｃｍ2ディッシュ上にプレーティングした。ピューロマイシン（１μｇ・ｍｌ-1）およびネオマイシン（３００ｍｇ・ｍｌ-1）を２４時間後に添加した。
【０３５５】
実施例４．材料および方法−遺伝子発現マイクロアレイおよび解析
細胞を氷冷ＰＢＳ中で２回濯いだ。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラム精製した。
【０３５６】
製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｏｕｓｅＲｅｆ−８ｖ１．１  ＢｅａｄＡｒｒａｙｓを用いてコード遺伝子の発現プロファイリングを行った。全チップデータをパブリックアクセスのためにＧＥＯリポジトリー受託番号（アップデート中）で寄託する。
【０３５７】
すべてのデータをバックグラウンド強度から引き算し、相互相関法28を用いてチップ全体にわたり規格化した。規格化されたデータを最初にｌｏｇ2変換し、次いで、２つの群の中央値強度の平均値から引き算した（すなわち、Ｎａｎｏｇ  ＯＥと対照ベクター、Ｔｃｆ３  ＲＮＡｉと対照ＲＮＡｉ）。
【０３５８】
クラスタリング前、データをさらにＮａｎｏｇまたはＴｃｆ３の直接標的に基づいて並び替え、続いて、倍率変化の降順に配置した。平均連結法による階層的クラスタリングを用いてクラスタリングツリーを生成した。
【０３５９】
実施例５．材料および方法−マウス分子遺伝学
Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ  Ｌａｂ，ｓｔｏｃｋ  ｎｏ．００４６５４）をＥ１３．５でＭＥＦ単離に使用した。
【０３６０】
アルビノ胚を２細胞期で単離し、４〜８細胞期まで成熟させ、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下でピエゾのマイクロマニピュレーター（ＰＭＡＳ−ＣＴ１５０、ＰＭＭ）を用いてｉＰＳ細胞をマイクロインジェクトし、キメラを生成した。注入された胚をＫＳＯＭ培地（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）で胚盤胞期まで培養し、次いで、Ｅ２．５偽妊娠Ｆ1（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）雌の子宮角に移した。生殖腺中のＧＦＰ発現の解析のためにキメラ胚をＥ１３．５で採取した。
【０３６１】
実施例６．材料および方法−四倍体相補法
電気細胞マニピュレーター（ＥＣＭ  ２００１，ＢＴＸ  Ｈａｒ  ａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）による２細胞融合を用いて四倍体（４ｎ）胚を生成し、ｉＰＳ細胞との凝集前に４〜８細胞期までＫＳＯＭ中でインキュベートした。酸性Ｔｙｒｏｄｅ液への短時間暴露により四倍体４〜８細胞期胚の透明帯を除去した。３個の四倍体胚および約４０個のｉＰＳ細胞を単一ウェル中で凝集させ、ＫＳＯＭ培地中で２４時間インキュベートし、桑実胚または胚盤胞を形成した16、17。
【０３６２】
約１０〜１４個の胚をＣＢＡＢ６Ｆ１偽妊娠マウスの子宮（胚盤胞の場合）または卵管（桑実胚の場合）に移した。
【０３６３】
実施例７．材料および方法−ＥＳＣの分化
ＬＩＦが含まれずかつａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（ＲＡ；１００ｎＭ）が添加されたＥＳＣ培地中でマウスＥＳＣを成長させ、０．１％ゼラチン被覆プレート上に維持し、２４時間ごとに培養培地を補充した。ＥＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ分化はＳＣＩＤマウスで行った。
【０３６４】
実施例８．材料および方法−ＳＣＩＤマウスでの腫瘍原性
食料および水を適宜与えて１２／１２時間の明／暗スケジュールで、温度制御室内の無菌条件下で６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスを飼育した。
【０３６５】
動物およびその世話に関与する手順はすべて、国内規則および国際規制に従った。
【０３６６】
各条件の５×１０6個の細胞をマウスの腰背部に皮下注射した。各条件につき５匹のマウスを使用した。３週間でマウスを安楽死させ、腫瘍を取り出した。
【０３６７】
免疫組織化学検査のために、厚さ４μｍのパラフィン包埋腫瘍組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０３６８】
実施例９．材料および方法−タンパク質抽出およびウェスタンブロッティング
タンパク質抽出物を取得するために、細胞を培養ディッシュから冷却ＰＢＳ中に掻き集め、４℃で４５０×ｇで４分間遠心分離し、再度ＰＢＳ中で洗浄し、そして新たに添加されたプロテアーゼ阻害剤（０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μｇ・ｍｌ-1ロイペプチン、２μｇ・ｍｌ-1アプロトニン）を含有する氷冷溶解緩衝液中で２０分間インキュベートした。
【０３６９】
４℃で１２，１００×ｇで１０分間遠心分離することにより溶解物を清浄化し、上清を液体窒素中でスナップ凍結した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質濃度を決定した。ＮｕＰＡｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１０μｇの全タンパク質を分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。
【０３７０】
膜を特異的抗体でプローブし、ＨＲＰコンジュゲート化抗体およびＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により抗体−タンパク質複合体を検出した。
【０３７１】
実施例１０．材料および方法−ＲＮＡｉアッセイ
先述したようにｓｈＲＮＡ構築物を設計した（Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｒｅ  Ｋｌｆ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０，３５３−６０（２００８））。Ｔｂｘ３用のｓｈＲＮＡ構築物は、１９塩基対（ｂｐ）転写物特異的領域を標的とするように設計した。ｓｈＲＮＡが標的とする配列は、以下のとおりである。
ＧＡＧＣＣＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡ
【０３７２】
対照ｓｈＲＮＡ配列は、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするＧＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡである。これらのオリゴヌクレオチドをｐＳｕｐｅｒｐｕｒｏ（ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位；Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）中にクローニングした。ｐＳｕｐｅｒｐｕｒｏプラスミドは、選択性マーカーとしてピューロマイシを発現する。製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｈＲＮＡプラスミドのトランスフェクションを行った。
【０３７３】
簡潔に述べると、２μｇのプラスミドを６０ｍｍプレート上でＥＳ細胞中にトランスフェクトした。１．０μｇ／ｍｌでトランスフェクトした１日後にピューロマイシ（Ｓｉｇｍａ）選択を導入し、３日間維持してから採取前した。
【０３７４】
実施例１１．材料および方法−ＣｈＩＰおよびＣｈＩＰ−ｓｅｑアッセイ
ＣｈＩＰアッセイは、先述したように行った（Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｒｅ  Ｋｌｆ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０，３５３−６０（２００８））。
【０３７５】
簡潔に述べると、１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを用いて細胞を室温で１０分間架橋し、次いで、１２５ｍＭグリシンの添加によりホルムアルデヒドを不活性化した。５００ｂｐの平均サイズを有するＤＮＡ断片を含有するクロマチン抽出物を抗Ｔｂｘ３抗体（ｓｃ−３１６５７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により免疫沈降させた。
【０３７６】
次いで、ＣｈＩＰ富化ＤＮＡを解架橋し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００配列検出システムおよびＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いてリアルタイムＰＣＲにより解析した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑアッセイでは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびキナーゼを用いて１０ｎｇのＣｈＩＰ  ＤＮＡを末端平滑化した。Ａ塩基を平滑化ＤＮＡ断片に付加し、続いて、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムで精製した。ＳｏｌｅｘａアダプターをＣｈＩＰ  ＤＮＡ断片にライゲートし、１５サイクルのＰＣＲ増幅により富化した。
【０３７７】
１５０〜３００ｂｐサイズ画分を選択的にゲルから切り出してＱｉａｇｅｎゲル抽出キットにより溶出させた。抽出されたＤＮＡをピコグリーンアッセイにより定量し、製造業者の説明書に従ってＳｏｌｅｘａ配列決定に付した。ＭＡＣＳプログラム4によりマウス参照ゲノムに対するＴｂｘ３結合ピークコーリングを行った。
【０３７８】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータを用いてＴｂｘ３結合部位と他のＴＦの部位との共局在化解析を行った（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １３３，１１０６−１７（２００８））。ＣｈＩＰ−ｓｅｑピーク間の２００ｂｐ距離を用いてＴＦ共起の事象をカウントした。
【０３７９】
実施例１２．材料および方法−サザンハイブリダイゼーション
ｉＰＳ細胞クローンから単離されたゲノムＤＮＡまたはＥＳＣ（ＷＴ）を制限酵素で消化し、アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２  Ｋｌｆ４またはＴｂｘ３に対するｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。Ｏｃｔ４：ＳａｌＩ＋ＥｃｏＲＩ；フォワードプライマー−ＡＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＣ；リバースプライマー−ＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣ
【０３８０】
Ｓｏｘ２：ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ；フォワードプライマー−ＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣ；リバースプライマー−ＡＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＣＣＡ  Ｋｌｆ４：ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎＤＩＩＩ；フォワードプライマー−ＴＴＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＴＣＴＣＴ；リバースプライマー−ＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＧＣ
【０３８１】
Ｔｂｘ３：ＣｌａＩ＋ＢａｍＨＩ；フォワードプライマー−ＡＧＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＡ；リバースプライマー−ＴＡＧＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＴ
【０３８２】
実施例１３．結果−Ｔｃｆ３の低減は体細胞ハイブリッド細胞の融合媒介再プログラミングを増強する
Ｔｃｆ３の低減が体細胞ハイブリッド細胞の融合媒介再プログラミングを増強すること実証するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、ネオマイシン耐性（ＮｅｏR）であるＮａｎｏｇ過剰発現（ＯＥ）ＥＳＣまたはＴｃｆ３  ＲＮＡｉ  ＥＳＣと、ピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏR）である初代ＭＥＦとの間の融合ハイブリッドを生成した。
【０３８３】
融合後、プレーティングされた細胞をネオマイシンおよびピューロマイシンを用いて二重選択した（図１Ａ）。これらの条件下では、再プログラムＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドのみが生存可能である。
【０３８４】
前回の観測結果に一致して、Ｎａｎｏｇ  ＯＥ  ＥＳＣは、対照と比較して再プログラミング効率の増強を示した（図１ＢおよびＣ）。Ｔｃｆ３欠損ＥＳＣ株を用いることにより、同様にハイブリッドクローンの数の顕著な増加が見られた（図１ＢおよびＣ）。核型分析により、これらは四倍体であることが確認された（図５）。
【０３８５】
これらのハイブリッドが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の欠如およびＮａｎｏｇプロモーターのエピジェネティック再プログラミングに対するそれらの応答を含めて、親改変ＥＳＣ株に類似した性質を有することを示した（図６および図７）。また、再プログラミング頻度の改良が細胞融合事象の増加に帰属されうる可能性を排除した13（図８）。
【０３８６】
実施例１４．
結果−Ｔｂｘ３はＮａｎｏｇおよびＴｃｆ３の共通下流メディエーターである
共通下流メディエーターを示唆しうるＮａｎｏｇ  ＯＥおよびＴｂｘ３  ＲＮＡｉのＥＳＣで増強された遺伝子のレパートリーを調べた。
【０３８７】
これらの２つ細胞株の交差遺伝子発現プロファイルから、両方の条件でアップレギュレートされたＤａｚｌ、Ｆｚｄ１０、Ｈａｌ、４９３０５０２Ｅ１８Ｒｉｋ、およびＥｒｆなどの１握りの遺伝子が明らかにされた。注目すべき点として、多能性の持続の役割を有することが報告された15ＥＳＣ関連転写因子Ｔｂｘ３は、強く増強された（図１Ｄおよび図９Ａ）。
【０３８８】
ＥＳＣでのＴｂｘ３のＲＮＡｉノックダウンは、多能性関連遺伝子の付随的ダウンレギュレーションを伴って顕著な分化を誘導した（図１Ｅ）、Ｔｂｘ３はまた、ＮａｎｏｇおよびＴｃｆ３の両方により直接結合されている（図１Ｆ）。再プログラムＥＳＣ／ＭＥＦハイブリッドでは、Ｔｂｘ３レベルは高度に増強された状態を維持した（図９Ａ）。
【０３８９】
細胞融合媒介再プログラミングにおけるＴｂｘ３の役割を試験するために、安定なＮｅｏR  Ｔｂｘ３過剰発現ＥＳＣ株を生成し（図１０）、続いて、ＭＥＦとの融合を行った。実際に、対照（図１ＢおよびＣ）と比較してＴｂｘ３  ＯＥ  ＥＳＣではハイブリッドの数は増加した。この場合も、機序として細胞融合の増加を排除した（図９）。
【０３９０】
実施例１５．結果−Ｔｂｘ３はｉＰＳ細胞の再プログラミング効率を改良する
ＯＳＫＣと共にＯｃｔ４−ＧＦＰトランスジーンを有するＭＥＦのレトロウイルス感染は、５×１０4個の出発細胞あたり約３００個のＥＳＣ様コロニーを誘導した（図２Ａ）。しかしながら、これらのわずか約１０％がトランスジーンの活性化を示したにすぎなかった。
【０３９１】
Ｔｂｘ３の追加（ＯＳＫＣＴ）では、ＧＦＰ+コロニー数の頻度は増加しなかった（図２Ａ）。３つの因子（ＯＳＫ）では、ＥＳＣ様コロニーの全数は、劇的に減少したが、偽陽性ｉＰＳ細胞もまた有意に排除された。ＯＳＫコロニーの７４％はＧＦＰを発現した（図２Ａ）。
【０３９２】
Ｔｂｘ３の追加（ＯＳＫＴ）では、ＯＳＫ（約２６個）と比較して全コロニー数が改良され（平均で約３８個）、ＧＦＰ+コロニーのパーセントもまた、有意に８９％に増加した（図２Ａ）。
【０３９３】
さまざまな因子の組合せを用いて得られたｉＰＳ細胞間に他の定性的な差が観測された。ＯＳＫＣを用いて得られたｉＰＳコロニーは、散在し、トランスフォームされた細胞とＧＦＰ発現を示さなかった部分的に再プログラムされた細胞とを識別するのは困難であった。ＯＳＫおよびＯＳＫＴのｉＰＳ細胞コロニーは、形態学的に類似し、個別のコロニー内で均一なＧＦＰ発現を示した（図２Ｂ）。
【０３９４】
しかしながら、Ｏｃｔ４の活性化は、ＯＳＫおよびＯＳＫＣでは典型的には感染後１４日間を必要としたが、ＯＳＫＴの使用では、９〜１０日間を要したことから、Ｔｂｘ３が再プログラミングプロセスを加速することが示唆された（図２Ｃ）。ＧＦＰ+コロニーからの安定なｉＰＳ細胞株の単離効率は、ＯＳＫおよびＯＳＫＴの形質導入間では類似していたが、ＯＳＫＣおよびＯＳＫＣＴのほぼ２倍であった（図１１）。得られたすべてのｉＰＳ細胞株で、ゲノムＤＮＡに関してＰＣＲ解析を行い、それぞれの形質導入された遺伝子プラスミドの組込みを確認した（図２Ｄ）。
【０３９５】
ＯＳＫＴに由来するｉＰＳ細胞の分子的特徴付けから、これらは、アルカリホスファターゼ陽性であり、かつＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ１を発現することを確認した（図２Ｅ）。ＥＳＣに類似して、それらはまた、ＳＣＩＤマウス中に異種移植した場合、多数の分化細胞型で構成された奇形腫を形成する（図１２）。
【０３９６】
実施例１６．結果−網羅的遺伝子発現プロファイル
次いで、さまざまな因子の組合せを用いて生成されたｉＰＳ細胞間の網羅的遺伝子発現プロファイルの差を調べようと試みた。
【０３９７】
取扱い技術から生じる可能性のあるいかなる変動をも排除するために、また、さまざまな組合せを用いて生成されたｉＰＳ細胞株に固有の性質の再現性をさらに保証するために、マイクロアレイプロファイリングのために個別の時間点で行われた２回以上の独立した形質導入実験からクローンを単離した。
【０３９８】
階層的クラスタリングから、ＯＳ＋Ｅｓｒｒｂ（ＯＳＥ）を用いて生成された最近報告されたｉＰＳ細胞7は、０．９２の相関係数（Ｒ2）で野生型Ｒ１およびＤ３  ＥＳＣと最も異なっていることが判明した（図３Ａ）。
【０３９９】
ＯＳＫおよびＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞は両方とも、ＥＳＣにより近い類似性を有していたが、互いと識別不能であった（Ｒ2＝０．９４）。そのため、網羅的発現プロファイリングは、これらのｉＰＳ細胞間の差の検出に関して十分な感度ではなかった。しかしながら、特異的遺伝子レベル変化を詳しく調べたところ、主要な差が明らかになった（図３Ｂ、図１３）。
【０４００】
ＯＳＫ、ＯＳＫＴ  ｉＰＳおよびＥＳ細胞の間で多能性関連遺伝子レベルを比較した。Ｓａｌｌ４、Ｔｃｆ３、Ｓｏｘ２、Ｚｆｘ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、およびＺｉｃ３などのこれらの遺伝子の大部分は、それらのレベルが類似していたため、ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞とＯＳＫ  ｉＰＳ細胞との間で非識別性であった。驚くべきことに、小さいサブセットの識別的特徴により、ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞とＯＳＫ  ｉＰＳ細胞とを特定することが可能であった。
【０４０１】
ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞中のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｇｄｆ３、Ｄｐｐａ４、およびＴｂｘ３のレベルは、ＥＳＣと同等であったが、ＯＳＫ  ｉＰＳ細胞では有意に低減された。このことから、外因性Ｔｂｘ３は、ＯＳＫ単独では完全には達成できない多能性の誘導に決定的に重要な特定のＥＳＣ因子の適切なレベルの再構築を支援するのに決定的に重要であることが示唆される。
【０４０２】
実施例１７．結果−Ｔｂｘ３はｉＰＳ細胞の質を改良する
次いで、ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞がＯＳＫおよびＯＳＥのｉＰＳ細胞よりも高い質をもつかを調べた（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。
【０４０３】
【表２】
0005939985.tif 000006
【０４０４】
各コロニー内でＯｃｔ４−ＧＦＰの均一な活性化を示した各因子の組合せから多数のｉＰＳ細胞株を次のとおり選択した。ＯＳＫＴ  ＃１、２、４、６、１１、１３、１４、１６〜２１；ＯＳＫ  ＃１〜３、１２、１３、１６、１７〜２１；ＯＳＥ  ＃１、２。
【０４０５】
これらのｉＰＳ細胞株は、異なる時間で行われた合計４回の独立した形質導入実験から誘導されたものであり、したがって、個別のクローンの確率的挙動から生じうるクローン選択のいかなる偏りをも排除されることに注目すべきである。次いで、誘導ＰＳ細胞を４〜８細胞胚に注入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞まで培養した（図４Ａ）。３つのｉＰＳ細胞株間で成熟効率（約９５％）に差はなかった（データは示されていない）。
【０４０６】
代理雌マウスに移植されたすべての胚盤胞は、初期に内部細胞塊（ＩＣＭ）へのＧＦＰ＋細胞の寄与を示し（図４Ａ）、生存キメラは３つの組合せから得られた。毛色により評価されるように、すべてのＯＳＫＴおよびＯＳＫ  ｉＰＳキメラは、ｉＰＳ細胞寄与を意味するさまざまな密度の黒毛を備えた被毛を示したが、ＯＳＥ  ｉＰＳキメラは、明らかに少ない黒毛を有していたことから（図４Ｄ、上側パネル）、ＯＳＥ  ｉＰＳ細胞はキメラ現象に十分に寄与しない傾向がある。
【０４０７】
更に興味深いことに、生殖組織に定着するそれらの能力では、ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞とＯＳＫ  ｉＰＳ細胞との間に明らかな差を識別しうる。Ｅ１３．５で、はＦ１キメラ胚から生殖腺（精巣または卵巣）を得た。ＯＳＫＴ  ｉＰＳ胚からの生殖腺の３４．９％は、ＧＦＰ発現を有してｉＰＳ細胞の寄与を示し、これとはきわめて対照的に、ＯＳＫ  ｉＰＳからは２３．６％およびＯＳＥ  ｉＰＳ胚からは１２．５％であった（図４Ｂ、図１５Ａおよび図１５Ｂ、ｐ＜０．０１）。
【０４０８】
これらの生殖腺内のＧＦＰ分布に基づくさらなる評価から、ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞による広範な寄与が明らかにされ、キメラ生殖腺の５７．５％は＞９０％のＧＦＰ+細胞を含有し、これとは対照的に、ＯＳＫ  ｉＰＳ胚からは２６．２％であった（図４Ｃ、ｐ＜０．０１）。このことから、ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞は、生殖組織への定着により効果的であり、ＯＳＫおよびＯＳＥのｉＰＳ細胞は、それほど効率的でないことが示唆される。
【０４０９】
ｉＰＳ細胞クローンの質および野生型ＥＳＣに対するそれらの類似性を実証する最も厳しい基準の１つを用いて、生殖系列伝播のそれらの頻度および生存可能なＦ２子孫の生成を試験した。この場合もまた、クローン選択におけるいかなるの確率的なクローン変動および偏りをも排除するために、各組合せからいくつかのｉＰＳ株を使用した。ＯＳＥを用いて生成された誘導ＰＳ細胞は、生殖系列伝播に関して非常に不十分な能力を有していた（図４Ｄ、下側パネル、および図４Ｅ）。
【０４１０】
アルビノマウスと交配された２つのｉＰＳ細胞株からの５つのキメラを用いて、合計７匹の同腹仔を得た。ただ１匹の同腹仔は、１０匹の子孫をうち、ｉＰＳ細胞誘導黒毛を有する２匹を含んでいた。ＯＳＫでは、５つのｉＰＳ細胞株からの９つのキメラを交配に使用した。１３匹の同腹仔が生成され、そのうち２匹だけは１００％黒色の子孫であり、他の４匹は、平均で約３３％であった。注目すべき点として、６つのｉＰＳ細胞株から得られた９つのＯＳＫＴキメラでは、１４匹の同腹仔のうち９匹は１００％黒色の子孫であり、３匹はそれぞれ４１％、５０％および２８％で、２匹だけゼロであった（図４Ｅ、ｐ＜０．００５）。
【０４１１】
先に報告したように、不適切なレトロウイルス性サイレンシングがｉＰＳ細胞の生成効率およびそれらの得られる性質を変化させる可能性がある。また、体細胞ゲノム中へのレトロウイルス組込みの頻度が、ＤＮＡ損傷の結果として、ｉＰＳ細胞の挙動に影響する可能性があることも示唆されている。
【０４１２】
これらの可能性を排除するために、試験した因子のすべての組合せについてｉＰＳ細胞クローンでレトロウイルスプラスミドからの外因性発現がサイレンシングされることを確認した（図１６）。サザンブロット解析から、ＯＳＫまたはＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞中へのさまざまなＯＳＫ因子のレトロウイルス組込みが同等であることが示された（図１７）。
【０４１３】
重要なこととして、外因性Ｔｂｘ３の追加の組込みでさえも、ｉＰＳ細胞は、一貫してより高い質であり、したがって、それらの性質に対するＤＮＡ損傷の影響は除外された。
【０４１４】
実施例１８．結果−ＯＳＫＴ由来ｉＰＳ細胞は生存可能なマウスを生成可能である
次いで、より高い質のＯＳＫＴ由来ｉＰＳ細胞を用いれば、四倍体相補法を介して全部が工学操作された細胞で構成された生存可能なマウスを生成しうると推測した16,17。
【０４１５】
このことは、以前には示されていなかった。おそらく、標準的な因子の組合せでは高い質のｉＰＳ細胞を生成するのが難しいからであろう。試験した２つの細胞株で、ＯＳＫＴ  ＃１４  ｉＰＳ細胞は、子宮退縮が疑われて帝王切開を行った場合、Ｅ１９まで２匹の胎仔の胚の成長を支持した。
【０４１６】
おそらく、この例では生産（ｌｉｖｅ  ｂｉｒｔｈｓ）が期待されうると思われる（図４Ｆ）。ＯＳＫＴ  ＃１６では、４匹の代理レシピエントに移された５０個の凝集胚からの１０匹の生産（２０％）を得ることに成功した。これらのうち、８匹は１日目まで、５匹は２日目まで、３匹は１週目まで生存し、２匹は２ヶ月を過ぎて生存して生育を続けた。
【０４１７】
実施例１９．結果−Ｔｂｘ３のレギュレート標的
Ｔｂｘ３がｉＰＳ細胞の質の改良にどのように寄与するかをよりよく理解するために、ＥＳＣ中のＴｂｘ３の直接的レギュレート標的を明らかにすべくＳｏｌｅｘａ  ＣｈＩＰ配列決定を行った。
【０４１８】
注目すべき点として、以前にマップされたＥＳＣ因子を用いたＴｂｘ３の階層的クラスタリングにより18、典型的な多能性関連転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＳｍａｄ１では多数の共通結合部位を共有することが明らかにされた（図４Ｇ）。
【０４１９】
Ｔｂｘ３はまた、ＥＳＣ因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｌｅｆｔｙ１／２、Ｚｆｐ４２を標的とし、さらには因子Ｋｌｆ２／４／５およびｎ／ｃ−Ｍｙｃを再プログラムすることも見いだされている（図１８Ａと図１８Ｂ）。この知見は、ＮａｎｏｇおよびＴｃｆ３によりレギュレートされるＴｂｘ３に焦点をあてた本最初の理由と一致し、ＬＩＦ非依存性ＥＳＣ増殖を支持し、Ｔｂｘ３またはＫｌｆ４過剰発現がＬＩＦ非依存性を付与するという最近の証拠19によりさらに支持される。
【０４２０】
実施例２０．結果−Ｔｂｘ３によるヒトｉＰＳの誘導
以上の実施例に記載のマウス細胞に関する実験をヒト細胞を用いて繰り返した。
【０４２１】
ヒト系では、得られたデータから、ＯＳＫＣとＴｂｘ３との組合せ（ＯＳＫＣＴ）は、ＯＳＫＣと比較した場合、ｉＰＳ細胞を生成するより高い効率をもたらすことが示される。
【０４２２】
さらにまた、ヒトｉＰＳ細胞のいくつかは、典型的な密でドーム状のコロニーを形成してマウスＥＳ細胞によりよく似て見える。
【０４２３】
最後に、ヒトｉＰＳクローンのいくつかは、ＦＧＦのないときでさえも、ＦＣＳおよびＬＩＦを備えたＥＳ培地に応答して成長増殖する。ヒトＥＳ細胞増殖に通常使用される増殖因子はＦＧＦである。従来のヒトＥＳ細胞はＬＩＦに応答できない。
【０４２４】
したがって、Ｔｂｘ３は、マウスＥＳ細胞に類似して多能性の可能性を有する新しい型のヒト多能性細胞を生成する主要因子であるように思われる。マウスＥＳ細胞が増殖、培養、および維持がはるかに容易であるので、これは、従来のヒトＥＳまたはヒトｉＰＳ細胞よりも優れた顕著な利点を提供するであろう。マウスＥＳ細胞は、胚盤葉上層期から誘導されると考えられるヒトＥＳ細胞と比較して、より原始胚段階から誘導されると考えられる。
【０４２５】
したがって、Ｔｂｘ３は、生殖細胞を含むさまざまな系列を発生させるための、より胚性の、より良好な、かつより汎用性のあるヒトｉＰＳ細胞を生成するのに有用でありうる。
【０４２６】
実施例２１．考察
以上をまとめると、本試験は、高効率で生殖系列伝播が可能な高い質のｉＰＳ細胞を生成するうえでＯＳＫＴの組合せの注目に値する成功が注目すべき点である。
【０４２７】
従来の試験では、ｉＰＳ細胞多能性の指標として形態学的評価および網羅的遺伝子発現解析を主に利用した。しかしながら、本発明では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析では、真にＥＳＣ様の性質を有する真正ｉＰＳ細胞と生殖系列分化能を有しない不十分な質のｉＰＳ細胞とを区別するには十分でないことを実証した。ＯＳＫＴ  ｉＰＳ細胞がまた四倍体相補法により高頻度で生産マウスを生成可能であるという本実証は、Ｔｂｘ３の定性的効果を示す本データをさらに強化する。
【０４２８】
改良された遺伝子的および化学的方法の出現、およびｉＰＳ細胞を誘導する最小限の再プログラミング因子の使用に対する重要性を考慮して、ＯＳＫＴ由来ｉＰＳ細胞により例示されるいくつかのベンチマークが、ｉＰＳ細胞の質および生物学的性質を評価するために利用されるべきであることを提案する（図１９）。
【０４２９】
ｉＰＳ細胞の質を大幅に改良するＴｂｘ３の特定の役割についての機序的説明をするには、より詳細な解明が必要である。Ｔｂｘ３は、ヒト疾患に対して広範な発生上の役割および意味を有する高度に保存されたＴ−ｂｏｘ遺伝子のファミリーに属する20-22。Ｔｂｘ３はまた、その欠損が分化を引き起こしてＥＳＣの多能性を維持することが示唆されている15,23。それは、胚盤胞のＩＣＭに局在化される着床前の胚発生時に発現される最初期のＴ−ｂｏｘメンバーである24。これらのことと本ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータとを合わせると、Ｔｂｘ３は、再プログラミングの開始時のＥＳＣ系の効果的な再確立およびそれに続くその維持に重要であることが示唆される。
【０４３０】
再プログラミングの開始時の外因性Ｔｂｘ３の存在は、多能、及びＯＳＫにより最適レベルに再活性化されるさらなる他の未確認の再プログラミング因子の適正量を保証して、真正ＥＳＣ様ｉＰＳ細胞のより高い頻度での出現をもたらしうる。したがって、確率の増大する段階的な方式で体細胞状態からの多能性の再確立が達成されるモデルを提案する（図１９）。
【０４３１】
さまざまな因子の組合せの使用により、多能性の発展的「ランドマーク」を基軸としてかなり異なる発生能を有するｉＰＳ集団およびクローンが生成される。再プログラミング因子の特定の組合せにＴｂｘ３を追加すると、再プログラム細胞の全集団内でＥＳＣと等価なまたはそれに最も近い多能性状態を達成しうるｉＰＳ細胞の確率頻度が増加する。
【０４３２】
参考文献
0005939985.tif 000007
0005939985.tif 000008
0005939985.tif 000009
【０４３３】
出願および特許のそれぞれの審査手続過程中を含め、本文書中に挙げられた出願および特許のそれぞれ、ならびに以上の出願および特許のそれぞれで引用または参照されたそれぞれの文書（「出願で引用された文書」）、さらには出願および特許のそれぞれでならびに出願で引用された文書のいずれかに引用されたまたは挙げられた任意の製品に対する任意の製造業者の使用説明書またはカタログは、参照により本書面をもって本明細書に組み入れられるものとされる。さらにまた、本文中に引用されたすべての文書、および本文中に引用された文書中に引用または参照されたすべての文書、ならびに本文中に引用されたまたは挙げられた任意の製品に対する任意の製造業者の使用説明書またはカタログは、参照により本書面をもって本明細書に組み入れられるものとされる。
【０４３４】
本発明に係る記載の方法およびシステムの種々の修正形態および変更形態は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に自明なものであろう。特定の好ましい実施形態に関連させて本発明について説明してきたが、当然のことながら、特許請求された本発明は、そのような特定の実施形態になんら限定されるものではない。実際上、本発明を実施するための記載の形態の種々の修正形態のうち分子生物学または関連分野の当業者に自明な修正形態は、特許請求の範囲内に含まれるものとみなされる。
【図１Ａ】
0005939985.tif 000010
【図１Ｂ】
0005939985.tif 000011
【図１Ｃ】
0005939985.tif 000012
【図１Ｄ】
0005939985.tif 000013
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
0005939985.tif 000016
【図２Ｂ】
0005939985.tif 000017
【図２Ｃ】
0005939985.tif 000018
【図２Ｄ】
0005939985.tif 000019
【図２Ｅ】
0005939985.tif 000020
【図３Ａ】
0005939985.tif 000021
【図３Ｂ】
0005939985.tif 000022
【図４Ａ】
0005939985.tif 000023
【図４Ｂ】
0005939985.tif 000024
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
0005939985.tif 000026
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
0005939985.tif 000030
【図６】
0005939985.tif 000031
【図７】
0005939985.tif 000032
【図８】
0005939985.tif 000033
【図９Ａ】
0005939985.tif 000034
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
0005939985.tif 000037
【図１２】
0005939985.tif 000038
【図１３】
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【図１４】
0005939985.tif 000040
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
0005939985.tif 000042
【図１６】
0005939985.tif 000043
【図１７】
0005939985.tif 000044
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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