(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物成熟体細胞を、再プログラミングされた複能性（multi-potent）神経前駆細胞へ再プログラミングする方法であって、
ａ）Sox 2 およびPax 6転写因子、またはSox 2およびPax 6をコードする核酸、を前記体細胞に送達し、ここで前記転写因子の組合せは哺乳動物成熟体細胞から複能性神経前駆細胞への転換を誘導するものであり；そして
ｂ）ステップａ）で得られた前記体細胞を、前記複能性神経前駆細胞の培養が可能な条件下で培養する
段階を含む、上記方法。
【請求項２】
前記哺乳動物成熟体細胞が、肺線維芽細胞、腎線維芽細胞、心臓線維芽細胞、間質線維芽細胞、包皮線維芽細胞、または皮膚線維芽細胞から選択される哺乳動物成熟線維芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物成熟体細胞がヒト成熟皮膚線維芽細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物成熟体細胞が、神経学的疾患および傷害であって組織再生がその治癒の一部である疾患および傷害から選択される状態にある患者から過去に採取された細胞である、請求項１から３のいずれかに記載される方法。
【請求項５】
前記複能性神経前駆細胞が、Pax6、Sox2、Hes1、Hes5、Sox1、Sox3、Mash1/Ashl1、およびneurogenin 2から成る群から選択される少なくとも１つの神経細胞系統マーカーを発現する、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記Sox 2 およびPax 6転写因子を前記体細胞に送達する前記段階が、前記Sox 2 およびPax 6転写因子を、タンパク質形質導入を介して、または非ウイルスベクターもしくはウイルスベクターからのタンパク質発現を介して送達することを含む、請求項１から５のいずれかに記載される方法。
【請求項７】
前記体細胞を培養する前記段階が、前記神経前駆細胞の増殖を支持する能力を有する培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項１から６のいずれかに記載される方法。
【請求項８】
前記培地が、クロマチンの脱アセチル化を阻害するクロマチン修飾剤を含有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記クロマチン修飾剤がバルプロ酸であり、該バルプロ酸を１μMの濃度で使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載される方法によって生成される、再プログラミングされた複能性神経前駆細胞。
【請求項１１】
前記複能性神経前駆細胞が、Pax6、Sox2、Hes1、Hes5、Sox1、Sox3、Mash1/Ashl1、およびneurogenin 2から成る群から選択される少なくとも１つの神経細胞系統マーカーを発現する、請求項１０記載の再プログラミングされた複能性神経前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、哺乳動物体細胞の再プログラミング、特に、哺乳動物成熟体細胞の再プログラミングに関する。
【０００２】
本発明は、第一義的には、ヒト成熟線維芽細胞から系統特異的神経前駆細胞への再プログラミング法に使用するために開発されたものであり、これについては、本明細書に関連して後述する。しかしながら、認識されるように、本発明はこの特定の分野での使用に制限されるものではない。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本明細書全体にわたる従来技術に関する記述は、それらの従来技術が公知であること、または当該分野の一般的な知識の一部を成すものであることを認めるものではない。
【０００４】
哺乳動物胚盤胞の内部細胞塊から誘導される胚性幹細胞は、無制限に増殖する能力を有すると同時に、体内の全てのタイプの細胞および組織を形成する能力を保持する（多能性（pluripotency））。これらの特性から、ヒト胚性幹細胞（hESC）は、種々の疾患および傷害に罹患した患者の治療に有用であり、再生医療に革命をもたらすことが期待されている。
【０００５】
幹細胞を用いる細胞移植療法は、脳疾患または脳損傷（例えばパーキンソン病、ハンチントン病、卒中、または脊髄損傷）患者にとって、疾患によって喪失した細胞を新たな細胞で置換することによる、実行可能な治療戦略となりうる。しかしながら、hESCの臨床適用は、胚を使用することに伴う倫理的問題、および、患者とドナー細胞間の免疫学的不適合による移植後の組織拒絶反応という困難に直面している。
【０００６】
これらの問題を解決するための１つの方法は、ある種の遺伝子を「強制」発現させることによって、成熟体細胞から胚性幹細胞様（多能性）細胞を人工的に誘導することである。それらの人工的に誘導された胚性幹細胞様細胞は人工多能性幹（iPS）細胞として知られ、多くの点で胚性幹細胞と同一であると考えられている（Hochedlinger, K.およびPlath, K; (2009) Development 136, 509-523）。患者から直接回収した成熟体細胞（例えば線維芽細胞）からiPS細胞を作製することにより、治療における倫理的問題および／または組織拒絶反応に関する問題が回避され、再生医療に適した細胞供与源となりうる。
【０００７】
iPS細胞は、2006年にYamanakaらによって、マウス線維芽細胞から初めて作製された（Cell 126, 663-676）。iPS細胞を誘導する方法は、伝統的に、ある種の胚性幹細胞関連遺伝子を非多能性細胞（例えば成熟線維芽細胞）にトランスフェクトすることを伴う。トランスフェクションは通常、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス）を介して行う。Yamanakaら（(2006) Cell 126, 663-676）はまず、多能性幹細胞生成のために不可欠な、キーとなる４つの遺伝子：Oct-3/4、Sox2、c-Myc、およびKlf4を同定した。更なる研究により、細胞多能性の重要な別の決定因子として、Nanogが必要であることが明らかになった（Okita, K., Ichisaka, T.およびYamanaka, S. (2007)  Nature 448, 313-317；Wernig, M.ら(2007) Nature 448, 318-324；およびMaherali, N.ら(2007)  Cell Stem Cell 1, 55-70）。2007年には、２つの独立した研究グループで、ヒト細胞からiPS細胞が作製された（Takahashi, K.ら(2007) Cell 131, 861-872；およびYu, J.ら(2007) Science 318, 1917-1920）。先にマウス細胞で用いられたのと同じ原理を適用して、Yamanakaら（Takahashi, K.ら(2007) Cell 131, 861-872）は、同じ４つの重要遺伝子、Oct-3/4、Sox2、c-Myc、およびKlf4をレトロウイルス・トランスフェクション系で使用し、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することに成功した。Thomsonら（Yu, J.ら(2007) Science 318, 1917-1920）は、レンチウイルス・トランスフェクション系を用いて、Oct4、Sox2、Nanog、およびLin28を使用した。これらの実験においてc-Mycが使用されていないのは、c-Mycに発がん性があり、細胞多能性の促進に必要ではないという根拠に基づく。
【０００８】
hESCまたはiPS細胞に由来する神経前駆細胞の使用は、置換神経細胞の生成による神経学的疾患および傷害（例えばパーキンソン病、ハンチントン病、卒中、または脊髄損傷）の治療に、多大な治療可能性をもたらす。現在、神経前駆細胞の細胞移植療法には、インビトロにおけるhESCまたはiPS細胞から神経前駆細胞への分化が必要とされる。
【０００９】
報告によれば、hESCおよびiPS細胞はいずれも、自発的分化または因子によって誘導される分化のプロトコルのいずれかを用いて、効率的に神経前駆細胞に分化させることができる。それらの神経前駆細胞は、培養液中およびインビボのいずれでも、神経細胞およびグリア細胞を生じさせる能力を有する（Wernig, M.ら(2009) Proceeding of the National Academy of Science 105, 5856-5861；Dottori, M.およびPera, M.F. (2008) Methods Mol Biol 438, 19-30；Reubinoff, B.E.ら(2001) Nature Biotechnology 19, 1134-1140；Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C.-Y., Trounson, A.およびBongso, (2000) Nature Biotechnology 18, 399-404；Itsykson, P.ら(2005) Molecular and Cellular Neuroscience 30, 24-36；Pera, M.F.ら(2004) Journal of Cell Science 117, 1269-1280）。
【００１０】
過去の研究（本発明者の研究も含む）において、hESC由来またはiPS由来の神経前駆細胞は、傷害された成体げっ歯類の脳に移植しても生存し、神経細胞およびグリア細胞のいずれにも向けて分化し、一部の研究では、機能の回復を示すことが明らかになっている（Bjorklund, Sanchez-Pernauteら(2002) PNAS 99: 2344-2349；Kim, Auerbachら(2002) Nature 418: 50-56；Ben-Hur, Idelsonら(2004) Stem Cells 22(7): 1246-1255, Dinsmore, Ratliffら(1996) Cell Transplantation 5(2): 131-143；Dihne, Bernreutherら(2006) Stem Cells 24(6): 1458-1466；Riess, Molcanyiら(2007) Journal of Neurotrauma 24(1): 216-225；Song, Leeら(2007) Neuroscience Letters 423(1): 58-61；Aubry, Bugiら(2008) PNAS；Dali, Zhi-Jianら(2008) Stem Cells 26(1): 55-63；Hatami, Mehrjardiら(2009) Cytotherapy 11(5): 618-630；Hicks, Lappalainenら(2009) European Journal of Neuroscience 29(3): 562-574, Vazeyら(2010) Cell Transplantation, 19;1055-1062）。
【００１１】
しかしながら、多くの研究において、hESC由来神経前駆細胞の移植後に腫瘍（例えば奇形腫）の形成が観察されており（Roy, N.S.ら(2006) Nat Med 12, 1259-1268；Erdo, F.ら(2003) J Cereb Blood Flow Metab 23, 780-785 (2003)；Hedlund, E.ら(2007) Stem Cell 25, 1126-1135；Pruszak, J., Sonntag, K.-C., Aung, M.H., Sanchez-Pernaute, R.およびIsacson, O. (2007) Stem Cells 25, 2257-2268；Bjorklund, L.M.ら(2002) Proceeding of the National Academy of Science 99, 2344-2349；Riess, Molcanyiら(2007) Journal of Neurotrauma 24(1): 216-225；Aubry, Bugiら(2008) PNAS；Vazeyら(2010) Cell Transplantation, 19;1055-1062）、また、Wernigら（(2009) Proceeding of the National Academy of Science 105, 5856-5861）の、iPS細胞由来神経前駆細胞をパーキンソン病モデル6-OHDA病変に移植した最近の研究でも、そのような知見が得られている。奇形腫の形成は、未分化（すなわち多能性）状態のままにある、一部の移植細胞によって起こると考えられる。従って、hESC由来またはiPS細胞由来の神経前駆細胞を移植した後の奇形腫の形成は、幹細胞療法の臨床適用に対する重大な障壁であり、これは、ヒト患者における細胞移植療法の臨床結果として腫瘍が形成することは容認できないものであるからである。
【００１２】
hESCおよびiPS細胞で明らかとなった制限（倫理的問題、組織拒絶反応、および腫瘍原性など）を考慮すると、中枢神経系（CNS）移植療法のための細胞供与源が必要とされている。
【００１３】
上述のように、iPS細胞の作製によって明らかにされたように、成熟体細胞の再プログラミングにより、hESCの使用によってもたらされる倫理的問題は解消され、また、患者自身の体から得た細胞を移植することが可能となり（自家移植）、組織拒絶反応の問題も解決される。しかしながら、iPS細胞の使用によっては、移植療法において、未分化の運命決定されていない多能性細胞の一部が共に移植されることによって起こる腫瘍形成の問題は解決されない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Hochedlinger, K.およびPlath, K; (2009) Development 136, 509-523
【非特許文献２】Yamanakaら, (2006) Cell 126, 663-676
【非特許文献３】Okita, K., Ichisaka, T.およびYamanaka, S. (2007)  Nature 448, 313-317
【非特許文献４】Wernig, M.ら(2007) Nature 448, 318-324
【非特許文献５】Maherali, N.ら(2007)  Cell Stem Cell 1, 55-70
【非特許文献６】Takahashi, K.ら(2007) Cell 131, 861-872
【非特許文献７】Yu, J.ら(2007) Science 318, 1917-1920
【非特許文献８】Wernig, M.ら(2009) Proceeding of the National Academy of Science 105, 5856-5861
【非特許文献９】Dottori, M.およびPera, M.F. (2008) Methods Mol Biol 438, 19-30
【非特許文献１０】Reubinoff, B.E.ら(2001) Nature Biotechnology 19, 1134-1140
【非特許文献１１】Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C.-Y., Trounson, A.およびBongso, (2000) Nature Biotechnology 18, 399-404
【非特許文献１２】Itsykson, P.ら(2005) Molecular and Cellular Neuroscience 30, 24-36
【非特許文献１３】Pera, M.F.ら(2004) Journal of Cell Science 117, 1269-1280
【非特許文献１４】Bjorklund, Sanchez-Pernauteら(2002) PNAS 99: 2344-2349
【非特許文献１５】Kim, Auerbachら(2002) Nature 418: 50-56
【非特許文献１６】Ben-Hur, Idelsonら(2004) Stem Cells 22(7): 1246-1255
【非特許文献１７】Dinsmore, Ratliffら(1996) Cell Transplantation 5(2): 131-143
【非特許文献１８】Dihne, Bernreutherら(2006) Stem Cells 24(6): 1458-1466
【非特許文献１９】Riess, Molcanyiら(2007) Journal of Neurotrauma 24(1): 216-225
【非特許文献２０】Song, Leeら(2007) Neuroscience Letters 423(1): 58-61
【非特許文献２１】Dali, Zhi-Jianら(2008) Stem Cells 26(1): 55-63
【非特許文献２２】Hatami, Mehrjardiら(2009) Cytotherapy 11(5): 618-630
【非特許文献２３】Hicks, Lappalainenら(2009) European Journal of Neuroscience 29(3): 562-574
【非特許文献２４】Vazeyら(2010) Cell Transplantation, 19;1055-1062
【非特許文献２５】Roy, N.S.ら(2006) Nat Med 12, 1259-1268
【非特許文献２６】Erdo, F.ら(2003) J Cereb Blood Flow Metab 23, 780-785 (2003)
【非特許文献２７】Hedlund, E.ら(2007) Stem Cell 25, 1126-1135
【非特許文献２８】Pruszak, J., Sonntag, K.-C., Aung, M.H., Sanchez-Pernaute, R.およびIsacson, O. (2007) Stem Cells 25, 2257-2268
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくとも１つを解決もしくは改善すること、または有用な代替を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
予想外にも、哺乳動物成熟体細胞（例えば哺乳動物成熟線維芽細胞）を、複能性系統特異的前駆細胞に直接再プログラミングできることが明らかになった。この再プログラミングは、人工多能性幹（iPS）細胞で必要とされるような、細胞の遺伝子プロファイルを多能性状態に再プログラミングする必要がなく、特定の組み合わせの系統特異的転写因子が体細胞に送達されることによって、体細胞が運命決定された（すなわち系統特異的)複能性前駆細胞に再プログラミングされることを示している。
【００１７】
本発明者は、驚くべきことに、例えば転写因子Sox2およびPax6をヒト成熟線維芽細胞に送達すると、線維芽細胞が複能性系統特異的神経前駆細胞に再プログラミングされ、これが神経前駆細胞および成熟神経マーカーPax6、Sox2、Hes1、Sox3、Ngn2、およびMash1を発現することを発見した。
【００１８】
従って、本発明の第１の観点は、哺乳動物成熟体細胞を、再プログラミングされた複能性系統特異的前駆細胞へ再プログラミングする方法に関し、該方法は、
ａ）１つまたはそれ以上の因子を該体細胞に送達し（ここで、該１つまたはそれ以上の因子は該前駆細胞の系統特異性を決定する）；そして
ｂ）該体細胞を、該系統特異的前駆細胞の培養が可能な条件下で培養する
段階を含む。
【００１９】
好ましくは、哺乳動物成熟体細胞は哺乳動物成熟線維芽細胞である。本発明の方法に使用する場合、線維芽細胞は任意の供与源（例えば肺線維芽細胞、腎線維芽細胞、心臓線維芽細胞、間質線維芽細胞、包皮線維芽細胞など）から得ることができる。しかしながら、認識されるように、ヒト成熟皮膚線維芽細胞は便宜な体細胞の供与源である。線維芽細胞は、便宜に市販の供与源から得るか、または、必要により、十分確立および報告されている実験技術および装置を用いて、組織供与源から単離してもよい。
【００２０】
ある好ましい態様では、哺乳動物成熟体細胞は神経学的疾患または傷害に罹患した患者由来の細胞であり、組織再生は治癒の一部であり、再プログラミングされた複能性系統特異的前駆細胞は、疾患特異的に再プログラミングされた複能性系統特異的前駆細胞である。
【００２１】
ある好ましい態様では、再プログラミングされた複能性系統特異的前駆細胞は複能性神経前駆細胞である。好ましくは、複能性神経前駆細胞は、Pax6、Sox2、Hes1、Hes5、Sox1、Sox3、Mash1/Ashl1、およびneurogenin 2から成る群から選択される神経細胞系統マーカーを少なくとも１つ発現する。
【００２２】
好ましくは、１つまたはそれ以上の因子を体細胞へ送達する該段階は、該１つまたはそれ以上の因子を、タンパク質形質導入を介して、または非ウイルスベクターもしくはウイルスベクターからのタンパク質発現を介して、当該分野で公知の方法を用いて送達することを含む。
【００２３】
好ましくは、該１つまたはそれ以上の因子は、タンパク質、例えば転写因子、該転写因子をコードする核酸、体細胞中に含有される該転写因子の量に影響を与えることができる小分子、またはそれらを任意に組み合わせたものから選択される。より好ましくは、該因子は、転写因子Sox2およびPax6、または、単独もしくは組み合わせることによって本発明にかかる方法で複能性神経前駆細胞を生じさせることができる任意の既知の転写因子である。
【００２４】
一般に、体細胞を培養する該段階は、前駆細胞の増殖を支持する能力を有する任意の培地（例えば幹細胞培地）中で細胞を培養することを含む。
【００２５】
好ましくは、該培地は、体細胞の再プログラミングを促進する能力を有するクロマチン修飾剤を含有する。該クロマチン修飾剤は、クロマチンのアセチル化を促進する物質、クロマチンの脱アセチル化を阻害する物質、クロマチン内のヒストンのメチル化状態を変更する物質、またはクロマチン内でDNAの脱メチル化を引き起こす物質から選択することができる。好ましくは、該クロマチン修飾剤はバルプロ酸である。更に好ましくは、１μMの濃度のバルプロ酸である。
【００２６】
第２の観点では、本発明は第１の観点にかかる方法によって生成される、再プログラミングされた複能性系統特異的前駆細胞に関する。好ましくは、該前駆細胞は複能性神経前駆細胞である。
【００２７】
定義
本明細書においては、以下の用語を以下のように定義する。
【００２８】
「含有する」
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、「含有する」、「含有し」などの単語は、排他的または網羅的な意味の対語としての、包括的な意味；すなわち、「包含するが、それに限定されない」と言う意味であると解釈される。
【００２９】
「成熟」
この用語が細胞に関して使用される場合、その最終分化状態に達した細胞、すなわち、もはやそれ以上分化する可能性がない細胞を示すものと解釈される。それらの細胞は、種々の発達段階（胚芽期、出生後期、または成体期など）に見られるが、認識されるように、最も便宜には成体を供与源とする。
【００３０】
「神経」
この用語が神経系の細胞に関して使用される場合、「神経」細胞および「グリア」細胞を包含すると解釈される。
【００３１】
「系統」
この用語が細胞系統に関して使用される場合、系統は、有糸分裂を通した関係にある細胞の系統である。
【００３２】
「系統特異的」
この用語が細胞に関して使用される場合、ある細胞がその特定の分化状態になるように運命決定されていることを意味する。
【００３３】
「前駆細胞」
この用語が細胞に関して使用される場合、ある細胞系統の複数の細胞タイプおよび／または組織タイプに分化する能力がある細胞を意味する。
【００３４】
「多能性（pluripotent）」
この用語が細胞に関して使用される場合、追加の(extra)胚性細胞タイプおよび／または組織タイプを除く、全ての細胞系統の細胞タイプおよび／または組織タイプに分化する能力のある細胞を意味する。
【００３５】
「複能性（multi-potent）」
この用語が細胞に関して使用される場合、全ての細胞系統ではなく、複数の細胞系統の細胞タイプおよび／または組織タイプに分化する能力のある細胞を意味する。
【００３６】
「人工複能性神経前駆（iMNP）細胞」
この用語は、非多能性供与源または非複能性供与源（一般的には成熟体細胞）から、神経系統の細胞に特徴的なある種の遺伝子の発現を誘導することによって人工的に誘導された、あるタイプの多能性前駆細胞をさす。従って、iMNP細胞は、神経系の細胞タイプおよび／または組織タイプにしか分化できない。
【００３７】
ここで、本発明の好ましい態様について、単に一例として、添付の図面に関して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】当該分野で公知の、人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された神経前駆細胞から、ニューロン、星状膠細胞、および乏突起膠細胞を生じさせるために必要な段階（Ａ)と、本発明の方法によってヒト成熟線維芽細胞から誘導された人工複能性神経前駆（iMNP）細胞から、それらの細胞を生じさせるために必要な段階（Ｂ）を比較するフローチャートを示す。
【図２】ProDeliverIn（Ｂ)またはProteofectene（Ｃ）形質導入システムのいずれかを用いてフィコエリトリン（PE）を形質導入した細胞の落射蛍光画像を示す。PE蛍光シグナルは、ProDeliverIn（Ｂ)およびProteofectene（Ｃ）形質導入細胞のいずれでも観察されたが（矢印）、コントロール実験（Ａ）では、細胞内にPE蛍光シグナルは観察されなかった。（Ｄ）および（Ｅ）に、一連の蛍光活性化細胞選別（FACs）ブロットを示す。（Ｄ）は、ProDeliverInおよびProteofecteneシステムを用いてPEを形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（HDF）の分析を示す。（Ｅ）は、図２（Ｄ）と同様のFACSブロットで、PE：ProDeliverIn＝1:1、1:2、および1:3を比較したものである。
【図２Ｄ】ProDeliverIn（Ｂ)またはProteofectene（Ｃ）形質導入システムのいずれかを用いてフィコエリトリン（PE）を形質導入した細胞の落射蛍光画像を示す。PE蛍光シグナルは、ProDeliverIn（Ｂ)およびProteofectene（Ｃ）形質導入細胞のいずれでも観察されたが（矢印）、コントロール実験（Ａ）では、細胞内にPE蛍光シグナルは観察されなかった。（Ｄ）および（Ｅ）に、一連の蛍光活性化細胞選別（FACs）ブロットを示す。（Ｄ）は、ProDeliverInおよびProteofecteneシステムを用いてPEを形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（HDF）の分析を示す。（Ｅ）は、図２（Ｄ）と同様のFACSブロットで、PE：ProDeliverIn＝1:1、1:2、および1:3を比較したものである。
【図２Ｅ】ProDeliverIn（Ｂ)またはProteofectene（Ｃ）形質導入システムのいずれかを用いてフィコエリトリン（PE）を形質導入した細胞の落射蛍光画像を示す。PE蛍光シグナルは、ProDeliverIn（Ｂ)およびProteofectene（Ｃ）形質導入細胞のいずれでも観察されたが（矢印）、コントロール実験（Ａ）では、細胞内にPE蛍光シグナルは観察されなかった。（Ｄ）および（Ｅ）に、一連の蛍光活性化細胞選別（FACs）ブロットを示す。（Ｄ）は、ProDeliverInおよびProteofecteneシステムを用いてPEを形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（HDF）の分析を示す。（Ｅ）は、図２（Ｄ）と同様のFACSブロットで、PE：ProDeliverIn＝1:1、1:2、および1:3を比較したものである。
【図３】（Ａ）は、ProDeliverIn形質導入システムを用いてフィコエリトリン（PE）を形質導入した細胞の落射蛍光画像を示す。（Ｂ）および（Ｃ）は、コントロール（Ｂ）、およびProDeliverInシステム（PE：ProDeliverIn＝1:2）を用いてPEタンパク質を形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（HDF）の蛍光活性化細胞選別（FACs）ブロットを示す。（Ｃ）は約50％の形質導入効率が得られたことを示している。
【図４】pCMV-huSox2およびpCMV-huPax6プラスミドのプラスミドマップを示す図である。
【図５】（Ａ）は、Lipofectamine LTX遺伝子送達試薬を用いて緑色蛍光タンパク質（eGFP）を形質導入したHDF細胞の落射蛍光画像である。（Ｂ）および（Ｃ）は、コントロール（Ｂ）、およびLipofectamine LTX遺伝子導入システム（6:1（v/m））を用いてeGFPでトランスフェクトしたHDF細胞の蛍光活性化細胞選別（FACs）ブロットを示す。（Ｃ）は約12％の形質導入効率が得られたことを示している。
【図６】iMNPコロニー形成の明視野像である（Ａ-Ｅ）。（Ａ）は、Sox2/Pax6プラスミドトランスフェクション前の、培地中の成熟HDF細胞を示す。(Ｂ)は、Lipofectamine LTX遺伝子送達試薬を用いてSox2/Pax6プラスミドで共トランスフェクトした約30日後の、iMNPコロニーの形成を示す。（Ｃ）から（Ｅ）は、１次コロニー分離後の２次コロニーの形成を示す。（Ｃ）は、１次コロニー分離１日後の２次コロニーの画像である。（Ｄ）は、１次コロニー分離４日後の２次コロニーの画像である。（Ｅ）は、１次コロニー分離１０日後の２次コロニーの画像である。（Ｆ）は、分離前（pre diss）、分離６日後、１０日後、および１４日後における、所定のサイズ（直径）のiMNPコロニー数を総コロニー数のパーセンテージで表したグラフである。分離前に測定されたコロニーが１次コロニーである。分離後に測定されたコロニーは２次コロニーの形成を示す。該グラフは、分離６日後までに２次コロニーが形成されたことを示している。分離後に形成された２次コロニーのサイズは、１次コロニーより大きい。
【図７】コントロール（GFPまたはPE）、および、Sox2/Pax6でトランスフェクトまたは形質導入したiMNPコロニーにおける、神経前駆細胞マーカー遺伝子および未成熟神経マーカー遺伝子（Hes1、Sox3、 Pax6、Sox2、Ngn2、およびMash1）、並びに、多能性マーカー遺伝子（Oct3/4）の発現を示す。ポジティブコントロールは、ヒト胚性幹細胞培養液（hESC）およびヒト神経前駆細胞培養液（hNP）由来のサンプルである。
【図８】未成熟神経マーカーMash1（赤色；ＡおよびＤ）およびNgn2（緑色；ＢおよびＥ）を発現しているSox2/Pax6トランスフェクトiMNPコロニーの落射蛍光画像である。（Ｃ）および（Ｆ）の画像は、Mash1（赤色）およびNgn2（緑色）の共発現を示す。DAPI（青色）は、個々の細胞核を検出するために使用した（Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥ）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の好ましい態様
幹細胞を用いる細胞移植療法は、脳疾患または脳損傷（例えばパーキンソン病、ハンチントン病、卒中、または脊髄損傷）患者にとって、疾患によって喪失した細胞を新たな細胞で置換することによる、実行可能な治療戦略となりうる。胚性幹細胞は、無制限に増殖する能力を有すると同時に、体内の全てのタイプの細胞を形成する能力を保持する。これらの特性から、ヒト胚性幹細胞は、種々の疾患および傷害（脳損傷および脳疾患など）に罹患した患者の治療に有用であり、再生医療に革命をもたらすことが期待されている。
【００４０】
しかしながら、ヒト胚性幹細胞の臨床適用は、胚を使用することに伴う問題、および、患者とドナー細胞間の免疫学的不適合による移植後の組織拒絶反応という困難に直面している。これらの問題を解決するための１つの方法は、ある種の遺伝子を「強制」発現させることによって、成熟体細胞（例えば線維芽細胞）から幹細胞様細胞を人工的に誘導することである（図１Ａ）。それらの人工的に誘導された幹細胞は人工多能性幹細胞（iPS細胞）として知られ、多くの点で胚性幹細胞と同一であると考えられている。そのように、患者から直接回収した成熟体細胞（例えば線維芽細胞）からiPS細胞を作製することにより、治療における倫理的問題および組織拒絶反応に関する問題が回避され、再生医療に適した細胞供与源となりうる。
【００４１】
胚性幹細胞またはiPS細胞を脳疾患または脳損傷の治療に使用するためには、移植前に、まずそれらの細胞から神経（脳）前駆細胞を形成させなければならない。しかしながら、本発明者および他の研究者らの研究結果から、胚性幹細胞またはiPS細胞のいずれかに由来する神経前駆細胞の移植により、特定の細胞系統への運命決定がなされていない多能性細胞集団の混入による腫瘍形成が起こることが明らかになっている。
【００４２】
本発明は、再プログラミングされた細胞の系統特異性を決定する１つまたはそれ以上の選択された因子を細胞に送達することによる、哺乳動物体細胞の再プログラミングに関する。１つまたはそれ以上の好ましい態様では、本発明は、本発明の再プログラミング法における哺乳動物成熟線維芽細胞の使用法を提供する。線維芽細胞は線維性結合組織中に見られ、結合組織のコラーゲン繊維および基質の形成に関与する。任意の供与源由来の哺乳動物線維芽細胞（例えば肺線維芽細胞、腎線維芽細胞、心臓線維芽細胞、間質線維芽細胞、包皮線維芽細胞など）を本発明の方法に使用することができるが、哺乳動物成熟皮膚線維芽細胞が便宜な体細胞供与源である。それらの線維芽細胞は、便宜に市販の供与源から得るか、または、必要により、十分確立および報告されている実験技術を用いて、種々の組織から単離してもよい。
【００４３】
上記のように、本発明は、特に、ヒト成熟線維芽細胞を系統特異的複能性神経前駆細胞に再プログラミングする方法に関する（図１Ｂ）。
【００４４】
一般に、本発明に関連して、１つまたはそれ以上の選択された因子を哺乳動物成熟細胞に送達する段階は、例えばタンパク質または遺伝子のような因子を、標準的な送達方法によって送達することを含む。これらの標準的な技術は、例えば以下に報告されている：“Viral Vectors for Gene Therapy - Methods and Protocols” Series: Methods in Molecular Medicine, Vol. 76, Machida, Curtis A. (編) 2003, 608, 117ページ；Gene Therapy Protocols -Volume 2 “Design and Characterization of Gene Transfer Vectors” Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 434, LeDoux, Joseph (Ed.) 第３版, 2008, XII, 314, 59ページ；Gene Delivery to Mammalian Cells, Volume 2 “Viral Gene Transfer Techniques” Series: Methods in Molecular Biology, Vol.246, Heiser, William C. (編) 2004, 592, 69ページ；Gene Delivery to Mammalian Cells Volume 1 “Nonviral Gene Transfer Techniques”  Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 245, Heiser, William C. (編) 2004, 320, 36ページ；および／または、“RNA Silencing - Methods and Protocols” Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 309, Carmichael, Gordon (編) 2005, 352, 74ページ（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４５】
哺乳動物成熟細胞に送達される因子は、タンパク質、例えば転写因子、該転写因子をコードする核酸、体細胞中に含有される該転写因子の量に影響を与えることができる小分子、またはそれらを任意に組み合わせたものから選択してもよい。
【実施例】
【００４６】
以下の非制限的な実施例により、本発明について更に記載する。
【００４７】
実施例１：ヒト成熟皮膚線維芽（HDF）細胞の供与源および維持
本発明を代表する便宜なモデルとして、ヒト成熟皮膚線維芽（HDF）細胞をCell Applications社（米国サンディエゴ）から購入した。
【００４８】
HDF細胞の維持は、2％熱非動化FBS（Invitrogen社、米国）を含有する線維芽細胞増殖培地（Cell Applications社）中で、製造者の説明書と、一般的な細胞培養実験技術および装置に従って行った。
【００４９】
実施例２：ヒト成熟皮膚線維芽（HDF）細胞の培養およびプログラミング
タンパク質形質導入（実施例４）またはプラスミドトランスフェクション（実施例５）を行った後、HDF細胞をトリプシン処理によって回収し、６ウェルプレート（Nunc社、デンマーク）または２４ウェルプレート（Nunc社）のいずれかに播種した。トランスフェクションまたは形質導入の３日後、細胞培養液を、以下を含有するNeurobasal A（NBA）増殖培地に交換した：Neurobasal-A（Invitrogen社）、1％ D-グルコース（Sigma Aldrich社）、1% ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Invitrogen社）、2% B27サプリメント（レチノイン酸含有）（Invitrogen社）、0.2% EGF（Peprotech社、米国）、0.08% FGF-2（Peprotech社）、0.2%ヘパリン（Sigma Aldrich社、米国）、およびバルプロ酸（Sigma Aldrich社）（1μM）。培地は週３回交換し、細胞を定期的に再播種し（最大週１回の再播種で、２-８回。コロニーが形成され始めると、いっそう定期的になった。）、再プログラミングされていない細胞を除去し、これをコロニーが広範に形成されるまで行った。
【００５０】
実施例３：タンパク質形質導入法の確立および最適化
蛍光R-フィコエリトリンタンパク質（PE）をOz Bioscience社またはSigma-Aldrich社のいずれかから購入した。タンパク質形質導入を最適化するために、5x104のHDF細胞を、形質導入の24時間前に２４ウェルプレートに播種した。形質導入の1時間前に、線維芽細胞増殖培地を除去し、あらかじめ加温した血清未含有D-MEMで置換した。蛍光R-フィコエリトリンタンパク質（PE；1μg）を、ProDeliverIn（Oz Bioscience社、フランス）またはProteofectene（Biontex社、米国）のいずれかと、1:1、1:2、および1:3（m/v）で混合し、20分間インキュベートして複合体を形成させ、それぞれ、HDF細胞に添加した。3時間後に、形質導入培地を通常の線維芽細胞増殖培地で置換した。タンパク質形質導入効率を更に最適化するために、HDF細胞を、PE-タンパク質形質導入複合体と共に、通常の線維芽細胞増殖培地中で48時間インキュベートした。形質導入の24時間後、PEの取り込みを落射蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse TE2000U（Nikon社）使用）およびフローサイトメトリー分析（BD LSR-II（Becton Dickinson社、米国））によって分析した。コントロール実験は、形質導入試薬を使用せずにPEを細胞に添加して行った。
【００５１】
結果
ProDeliverInまたはProteofecteneのいずれかを用い、タンパク質：形質導入試薬＝１：２の比率で成熟HDFにタンパク質を形質導入した結果、蛍光PEタンパク質の細胞取り込みが起こったが、形質導入試薬を使用せずにPEを細胞に添加したコントロール実験では、細胞内にPEは観察されなかった（図２Ａ-Ｃ）。
【００５２】
FACS分析では、1μgのPEタンパク質を１：２の比率で使用した場合、ProDeliverInシステムでは23％の細胞が形質導入され、Proteofecteneシステムでは13%の細胞が形質導入された（図２Ｄ）。
【００５３】
PEタンパク質とProDeliverInの比率を変化させて比較すると、0.5μgのPEタンパク質を適用し、3時間インキュベートした場合、形質導入の48時間後では、１：２の比率でPEポジティブ細胞の量が最高であり（13%）、１：１の比率では6.5％、１：３の比率では11％であった（図２Ｅ）。形質導入効率は、ProDeliverInシステムで、5μgのPEタンパク質を１：２の比率で使用し、インキュベーション時間を48時間に延長すると、PEポジティブ細胞が54％まで増加できた（図３ＢおよびＣ）。蛍光PEタンパク質の細胞取り込み（赤色）を３Ａに示す。
【００５４】
実施例４：タンパク質形質導入を介する転写因子の送達
組換えSox2-TATタンパク質をPreprotech社から購入した。組換えPax6タンパク質はAbnova社から購入した。Sox2-TAT（Peprotech社）およびPax6（Abnova社、台湾）の完全長タンパク質の共形質導入を行うため、5x105の密度の成熟HDFを、コーティングしたまたはしていない６ウェルプレート中、5μgのタンパク質混合物およびProDeliverIn（１：２（m/v））と共に、線維芽細胞増殖培地中で48時間インキュベートした。48時間後、タンパク質形質導入培地をNBA増殖培地（1μMバルプロ酸含有）で置換し、更に24時間培養した。タンパク質形質導入を４サイクル、HDF細胞に行った後、完全に1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地に交換した。培地は2-3日ごとに交換し、週1回再播種し、広範なコロニーが観察されるまでこれを行った。その後、コロニーを単離し、PCRまたは免疫細胞化学分析を行った（図７および８）。
【００５５】
実施例５：プラスミド・トランスフェクションを介する転写因子の送達
Sox2およびPax6のcDNAをAddgene社およびInvitrogen社から購入し、それぞれを、pDNAバックボーンのCMVプロモーター制御下にクローニングした（図４参照）。これらのプラスミドを増幅させ、PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit（Invitrogen社）を用いて精製した。トランスフェクションはLipofectamine LTX試薬（invitrogen社）で行い、ウェル当たり5x105のHDF細胞を未コーティングの６ウェルプレートに播種し、24時間後にトランスフェクションを行った。Plus Reagent (Invitrogen社)を1μgの各pDNAとOptimem培地（Invitorogen社）中で混合した後、LTX遺伝子送達試薬を６：１（v/m）の比率で添加して、遺伝子導入複合体を形成させた。細胞をトランスフェクション混合物と共に5時間インキュベートし、その後、フレッシュな線維芽細胞増殖培地に交換した。3日後、細胞に1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地に交換した。コロニーが観察されるまで、培地を2-3日毎に交換し、定期的に再播種を行った。コロニーを単離し、PCRおよび免疫細胞化学分析を行った（図７および８）。コントロール実験は、eGFPコントロールプラスミドを用いて行った。
【００５６】
結果
FACS分析では、上記のようにLTX試薬を用いた場合には12％の細胞がeGFPでトランスフェクトされ、トランスフェクションを行っていない細胞では0％であった（図５Ｂ）。蛍光eGFPプラスミドの細胞取り込み（緑色）を図５Ａに示す。
【００５７】
実施例６：iMNP細胞のコロニー形成および増殖の評価
HDF細胞を実施例５に記載するようにトランスフェクトし、トランスフェクションの3日後に1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地に交換し、実施例２に記載するように培養した。30日以内にコロニーが形成された。その後、一群のコロニーを、スクレイピングおよび機械的破砕によって5-10個の細胞コロニーに分離し、コロニーの自己再生能力および２次コロニー形成能力を評価した。分離したコロニーを、未コーティングの６ウェルプレート（Nunc社）に播種し、1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地中で培養した。5-10個の細胞コロニーが14日間で２次コロニーを形成した。２次コロニーの直径（サイズ）を測定し、測定されたコロニーのパーセンテージとして、4つの時点-分離前（「pre diss.」）、分離6日後、分離10日後、および分離14日後-に対してプロットした。
【００５８】
結果
１次iMNPコロニーが、Sox2/Pax6トランスフェクション後７日以内に形成され始めた。トランスフェクションの約30日後に広範なコロニーが形成されるまで、定期的な再播種によって、再プログラミングされていない細胞を除去した（図６ＡおよびＢ）。最も重要なことに、コロニー形成は、フィーダー細胞層の存在を必要としなかった。本発明者の推定によれば、コロニー形成効率は、播種した総HDFの約0.05％である。
【００５９】
Sox2/Pax6トランスフェクションから形成された人工MNPコロニーは、分離した１次iMNPコロニーからの２次iMNPコロニーの形成によって、自己再生をする能力も示した。２次コロニーは１次コロニーの分離４-６日後に形成された（図６Ｃ-Ｆ）。２次コロニーの数およびサイズはいずれも、１次コロニーに比較して、増加していた（図６Ｆ）。２次iMNPコロニーの形成は、分離6日後までにプラトーに達した。
【００６０】
実施例７：ヒト成熟皮膚線維芽細胞由来iMNP細胞のRT-PCRによるキャラクタリゼーション
PureLink RNA Mini Kit（Invitrogen社）を使用して、iMNP細胞および正常成熟HDF細胞から総RNAを抽出した。Superscript逆転写酵素（invitrogen社）を使用し、製造者のプロトコルに従って、総RNAからcDNAを生成させた。神経前駆細胞および未成熟神経マーカーの発現が、RT-PCRによって検出された（Taq DNAポリメラーゼ（New England社）および表１に示すプライマーを使用）。
【００６１】
【表１】
0006002581.tif 000002
【００６２】
結果
Sox2/Pax6 iMNPコロニーは、神経前駆細胞遺伝子、Hes1、Sox3、Sox2、およびPax6の全長を恒常的に発現した（図７）。更に、コロニーが、未成熟神経マーカー、Ngn2およびMash1を発現しているのが観察された（図７）。神経前駆細胞遺伝子および未成熟神経マーカー遺伝子の発現は、プラスミド・トランスフェクションまたはタンパク質形質導入のいずれによって形成されたコロニーでも観察された。コントロール（GFPでトランスフェクトした、またはPEを形質導入した）コロニーでは、Hes1、Sox3、Sox2、Pax6、Ngn2、またはMash1の発現が、場合によって検出された（図７；細胞系統11および細胞系統8）。これは、成熟HDF細胞を1μMバルプロ酸含有NBA増殖培地中で培養するだけで、神経前駆遺伝子の誘導を促進するのに十分でありえることを示唆している。しかしながら、図７に示す結果から明らかなように、広範な神経前駆細胞遺伝子および未成熟神経マーカー遺伝子を恒常的に誘導するためには、成熟HDF細胞のSox2およびPax6でのトランスフェクションまたは形質導入が必要である。
【００６３】
図７に、コントロール・コロニーおよびSox2/Pax6を形質導入またはトランスフェクトしたコロニーの両者における多能性遺伝子Oct3/4の発現も示す。Oct3/4の発現は、それ自体は、生じたコロニーの多能性を示すものではないが、成熟HDF細胞中でのOct3/4の発現を示している可能性が非常に高い（Zangrossiら, (2007) Stem Cells 25: 11675-1680；Chinら, (2009) Biochemical and Biophysical Research Communications 388: 247 - 251）。
【００６４】
実施例８：免疫細胞化学によるiMNP細胞由来の未成熟神経細胞のキャラクタリゼーション
コロニーを4％パラホルムアルデヒドで固定し、標準的な２重蛍光標識免疫細胞化学法を、未成熟神経マーカー、Mash1/Ashl1（Chemicon社）およびNeuroginin2（Chemicon社、米国）に対するヒト特異的抗体を用いて行った。DAPIを細胞核の対比染色剤として使用した。未処理のHDF細胞をネガティブコントロールとして使用した。標準的な蛍光免疫細胞化学法は、例えば“Immunocytochemical Methods and Protocols” Series: Methods in Molecular Biology, Constance OliverおよびMaria Celia Jamur編, 第3版, 2010 Humana Press（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に報告されている。
【００６５】
結果
Sox2/Pax6 iMNPコロニー集団は、未成熟神経マーカー、Mash1およびNgn2を発現していることが観察された（図８）。図８ＣおよびＦに示すように、Mash1を発現しているコロニー内の個々の細胞は、Ngn2も発現していた。これは、iMNPコロニー内の細胞集団が未成熟神経系統に再プログラミングされたことを示している。
【００６６】
本発明について、実施例を用いて記載したが、認識されるように、本明細書の範囲から逸脱することなく、変更および改変を行ってもよい。更に、特定の特徴に既知の同等物が存在する場合、それらの同等物は、本明細書において具体的に参照されるごとくに組み込まれる。
【図１】
0006002581.tif 000003
【図２】
0006002581.tif 000004
【図２Ｄ】
0006002581.tif 000005
【図２Ｅ】
0006002581.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006002581.tif 000011
【図８】
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【配列表】
0006002581000001.app