(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオディーゼルとして用いられる、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の製造プロセスであって、
(i)微胞子虫門類およびシオグサ類の群、または培養されたクロレラバリアビリスから選択される、天然の海生微細藻類マットを採取し、藻類バイオマスを得る；
(ii)前記バイオマスを、残留水分レベルが５−１０％となるまで自然乾燥する；
(iii)蒸気噴射または浸透圧性ショックによりステップ(ii)のバイオマスを前処理して、細胞壁を破壊する；
(iv)溶媒としてヘキサンを用いることにより、ステップ(iii)の藻類バイオマスから脂質を抽出し、原料油を得る；
(v)ヘキサンを除去し、結果物である原料油を酸性白土で処理する、または任意選択でステップ(ii)の抽出物を酸性白土で直接処理することにより、リン脂質、色素およびその他不純物を除去する；
(vi)濾過して浮遊固体を除去し、必要に応じて、ステップ(v)の油抽出物をさらに処理して遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の含有量を低減することにより、精製油を得る；
(vii)ステップ(vi)の精製油をアルカリ触媒によりエステル交換することで、前記ＦＡＭＥを分離して、さらに精製し、ＦＡＭＥを得る；
工程を有する、バイオディーゼルとして用いられる、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の製造プロセス。
【請求項２】
前記脂質は、微胞子虫門類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９７）からなる海生微細藻類マットからヘキサンを用いて抽出され、ＧＣ−ＭＳにより分析された脂質組成において、１４：０の脂肪酸を０．６％、１６：０の脂肪酸を９．４％、１６：１の脂肪酸を０．７％、１８：０の脂肪酸を３．７％、１８：１の脂肪酸を３３．２％、１８：２の脂肪酸を５０．４％、２０：０の脂肪酸を０．７％、２２：０の脂肪酸を１．３％、含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記脂質は、海生微細藻類クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）からヘキサンを用いて抽出され、ＧＣ−ＭＳにより分析された脂質組成において、１４：０の脂肪酸を０．４％、１６：０の脂肪酸を１２．１％、１６：１を１．０％、１６：２の脂肪酸を１．０％、１８：０の脂肪酸を４．２％、１８：１を２９．４％、１８：２の脂肪酸を４５．７％、１８：３の脂肪酸を４．８％、２２：０を１．４％、含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記脂質は、シオグサ類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９９）からなる海生微細藻類マットからヘキサンを用いて抽出され、ＧＣ−ＭＳにより分析された脂質組成において、１４：０の脂肪酸を０．９％、１５：０の脂肪酸を０．４％、１６：０の脂肪酸を２１．５％、１６：１の脂肪酸を１％、１８：０の脂肪酸を２．９％、１８：１の脂肪酸を２１．２％、１８：２の脂肪酸を２２．３％、２０：０の脂肪酸を０．５％、２０：１の脂肪酸を１６．３％、２２：０の脂肪酸を０．４％、２２：１の脂肪酸を１１．４％、２４：０の脂肪酸を０．７％、２４：１の脂肪酸を０．６％、含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
微胞子虫門類から得られる脂質画分が精製されてエステル交換されることで、ＧＣ−ＭＳにより分析された組成において、１６：０の脂肪酸を９．９２％、１８：０の脂肪酸を２．４４％、１８：１の脂肪酸を２８．２７％、１８：２の脂肪酸を５９．３７％、およびＢＨＴ抗酸化物質を５−３０ｐｐｍ、含有するＦＡＭＥを得る、請求項２に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ＦＡＭＥは、透明な黄色い液体であり、密度が０．８７２ｇｍ／ｍｌ、４０℃での粘度が４．５ｃＳｔ、総グリセロールが０．１０１４％、遊離グリセロールが０．００８６％、標準熱量測定試験で測定される発熱量が９８７９ｋｃａｌ／ｋｇである、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ＦＡＭＥは、未改良のレギュラーバイオディーゼル車にＢ２０混合として満載状態で用いられ、排気規則を準拠する、請求項５又は６に記載のプロセス。
【請求項８】
クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）から得られる脂質画分が精製されてエステル交換されることで、ＧＣ−ＭＳにより分析された組成において、１６：０の脂肪酸を６．９％、１８：０の脂肪酸を３．１％、１８：１の脂肪酸を３２．６％、１８：２の脂肪酸を５７．３％、およびＢＨＴ抗酸化物質を５−３０ｐｐｍ、含有するＦＡＭＥを得る、請求項３に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ＦＡＭＥは、透明なからし色の液体であり、２５℃および４０℃での密度が０．８７０４ｇ／ｃｍ３および０．８５９１ｇ／ｃｍ３、４０℃での粘度が４．８ｃＳｔ、総グリセロールが０．１５％、遊離グリセロールが０．０２％、ＣＦＰＰが−５℃、水分含有量が０．０２９％、亜リン酸が５．１ｐｐｍ、酸化安定性が２５℃で０．４３年、４０℃で０．１２年、標準熱量測定試験で測定される発熱量が９８４３ｋｃａｌ／ｋｇである、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ＦＡＭＥは、Ｂ１００バイオディーゼルとして、未改良のレギュラーバイオディーゼル車に満載状態で用いられ、排気規則を準拠する、請求項８又は９に記載のプロセス。
【請求項１１】
微胞子虫門類における海生微細藻類マットが、７月から１２月、東経７０°５４．９５９′、北緯２０°４２．３９１′で採取された、請求項１および５〜７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
前記クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）は、東経７２°０７．３１６′、北緯２１°４７．４８８８′、海抜２８フィートに位置する塩田において独立栄養条件で１月から６月まで培養された、請求項１，３および８〜１０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
天日塩田におけるクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）の成長速度が、１１．６７−４５．５６ｇ／ｍ２／日の範囲内である、請求項１，３，８〜１０および１２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
微胞子虫門類のマットをヘキサンで抽出したときの前記脂質の収率が、５．２２−１６．３２％の範囲内である、請求項１〜２，５〜７および１１のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
前記培養されたクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）をヘキサンで抽出したときの前記脂質の収率が、１１．１１−１１．２１％の範囲内である、請求項１，３，８〜１０および１２〜１３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
前記クロレラバリアビリスの成長速度および脂質の収率が、海水培地１０００Ｌにつき、重炭酸ナトリウム３−６ｋｇ、硝酸ナトリウム１−２ｋｇおよび硫酸第一鉄０．０１−０．０２ｋｇを添加することにより、影響を受ける、請求項１，３，８〜１０，１２〜１３および１５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
ＦＡＭＥプロセスにおける副生成物流からの粗製グリセロールは、任意選択で添加され、バイオマスの生産性を５０−２００％向上させる、請求項１，３，８〜１０，１２〜１３および１５〜１６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１８】
夏季以外の期間の開放培養において、太陽反射鏡により、前記クロレラバリアビリスの成長速度および脂質生産性を向上させる、請求項１，３，８〜１０，１２〜１３および１５〜１７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１９】
脂質の溶媒抽出の後の残留バイオマスは、バイオ肥料、水性栄養、カロテノイド源およびエネルギー源の製造に用いられる、請求項１〜１８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２０】
副生成物流の粗製グリセロールは、混合栄養成長による藻類製造、および／または生分解性バイオポリマーの製造に用いられる、請求項１〜１８のいずれかに記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成するために、インドの西海岸で採取され、天然の脂質を産出する微細藻類マットを用いること、および、後の乗用車の走行への適合性を明らかにすることに関する。また、本発明は、天日塩田において容易に採取可能な脂質を産出する微細藻類バイオマス（クロレラバリアビリス受入番号ＰＴＡ−１２１９８から培養される）を培養すること、および、それらを、エンジンに値するＦＡＭＥにさらに変換することに関する。
【背景技術】
【０００２】
Daemon FairlessのThe little shrub that could - may be.（Nature（2007）449, 652-655）という論文、およびLaurent LardonらのLife-Cycle Assessment of Biodiesel Production from Microalgae（Environmental Science & Technology（2009）43:17, 6475- 6481）によれば、食糧と燃料との対立という複雑な問題が明らかにされており、食糧問題を妨げないようなバイオマス源が必要であると強調されている。
【０００３】
D.H. LeeのAlgal biodiesel economy and competition among bio-fuels（Bioresource
Technology（2011）102, 43-49）によれば、耕作地の不足、および燃料製造に有用なバ
イオマスを生成する代替地の必要性があるが、微細藻類の培養は、広いエリアの耕作地を必要としない。さらに、培養場所は、砂漠地帯であっても沿岸の浅瀬であってもよい。
【０００４】
Ghoshらの米国特許第7666234号によれば、エンジンに値するバイオディーゼルの製造のために耕作限界地を用いることが開示されている。バイオマスの問題点は、陸上起源であることである。
【０００５】
B. D. WahlenらのBiodiesel production by simultaneous extraction and conversion
of total lipids from microalgae, cyanobacteria, and wild mixed-cultures（Bioresource Technol., 2011, 102, 2724-2730）という表題の論文が参照される。
【０００６】
DoanらのScreening of marine microalgae for biodiesel feedstock（Biomass and Bioenergy（2011）35:7; 2534-2544）という論文、および松永らのCharacterization of marine microalga, Scenedesmus sp. strain JPCC GA0024 toward biofuel production（Biotechnology Letters（2009）31: 1367-1372）によれば、海生微細藻類種は、バイオディーゼル源として役割を果たす脂質を含むことが報告されている。
【０００７】
Nasrin Moazamiらの米国特許第7977076号によれば、ペルシャ湾やゲシュム島から離れ
た海生微細藻類によるバイオマスおよび脂質の生産について言及されている。
【０００８】
BrennanらのBiofuels from microalgae: A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products.（Renewable and Sustainable Energy Reviews（2010）14: 557-577）という論文によれば、通常、微細藻類は、限
られた陸地部分もしくはバイオマスが生成可能な室内の光バイオリアクターを必要としており、低容量かつ高価値で培養される、ということが述べられている。
【０００９】
HankamerらのPhotosynthetic biomass and H2 production by green algae: from bioengineering to bioreactor scale-up（Physiologia Plantarum（2007）131: 10-21）とい
う論文、およびWangらのCO2 bio-mitigation using microalgae.（Applied Microbiology
and Biotechnology（2008）79: 5; 707-718）という論文によれば、バイオ燃料の生産用の微細藻類バイオマスを光合成により製造することの重要性が強調されている。
【００１０】
DouskovaらのSimultaneous flue gas bioremediation and reduction of microalgal biomass production costs（Applied Microbiology & Biotechnology（2009）, 82:179-185）という論文によれば、微細藻類のバイオマス生産は、豊富なＣＯ２源である排気ガス
を用いることにより、高まることが主張されている。
【００１１】
GriffithsらのLipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production.（Journal of Applied Phycology 2009, 21:493-507）
という論文、およびTom BrutonらによりSustainable Energy Irelandに作成されたA Review of the Potential of Marine Algae as a Source of Biofuel in Ireland （2009）というレポートによれば、バイオディーゼル源としての海生微細藻類の重要性については言及されているが、大規模なバイオディーゼル生産に関連するような規模の培養を、どこで、どのようにして取り組むかについては開示されていない。
【００１２】
PittmanらのThe potential of sustainable algal biofuel production using wastewater resources（Bioresource Technology（2011）102, 17-25）という論文が参照される
。しかしながら、それらをバイオディーゼル生産に利用することについては全く言及されないばかりか、農業廃棄物から微胞子虫門類を混合培養することについても究明されておらず、また脂質にさえ用いられていない。
【００１３】
Syed Zahir Shah及びHabib-ur-Rehman Khattakの、Some Green Algae from Paddy Fields of Mathra（District Peshawar）, Syed Zahir Shah及びHabib-ur-Rehman Khattak, Department of Botany, Islamia College, Peshawarという研究によれば、生物多様性の研究の一環としてシンド川付近の微胞子虫門類の存在について開示されている。バイオマスの利用性については一切言及されていない。
【００１４】
Picketts-HeapsのCell division and wall structure in Microspora（New Phytologist,（1973）72,347-355）という表題の論文によれば、微胞子虫門類の細胞学について議論されている。その中で、藻がマット形状で生息することについて述べられている。さらに、藻が脂質を含むか含まないかについて述べられている。このようなマットをバイオディーゼル生産に利用する試みについては全く言及されていない。
【００１５】
MataらのMicroalgae for biodiesel production and other applications（A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews（2010）14: 217-232）という論文によれば
、脂質を産出し、ある意味でバイオディーゼル源として潜在的に興味深い海生微細藻類の様々な種について列挙されている。
【００１６】
Greenwellらのplacing microalgae on the biofuels priority list: a review of the
technological challenges（Journal of the royal society interface（2010）, 7: 703-726）という論文によれば、異なる微細藻類は、異なる速度で成長し、あるものは高い
含油率を有する一方で、成長速度が遅い、バイオマスの採取が困難である等の他の理由によりそれらを利用することが実現困難であることについて言及されている。
【００１７】
US2009/0298159 A1によれば、光独立栄養性の藻を培養し、その細胞を濃縮してから、
従属栄養性の培養をする発酵槽に移転させる、といった一連の工程を含むバイオディーゼル製造に用いられるクロレラバリアビリスの独立栄養性および従属栄養性の２段階の成長期を用いて、藻からバイオディーゼルを製造する方法が提供されている。従属栄養培養ス
テップの間、有機炭素を添加する。そのプロセスは、閉鎖系で行われ、エネルギー集約的な細胞の濃度を必要とすることは明らかである。さらに、バイオディーゼルの特性ばかりか、車に用いる試みについて、一切言及されていない。
【００１８】
サイト（www.treehugger.com/chevron-backs-solazyme-to-develop-algal-biodiesel-technology.html）における、２００８年２月２日の「Chevron Backs Solazyme to Develop Algal Biodiesel Technology」という表題の記事によれば、Solazymeは、暗闇の中で発酵により糖類源からバイオディーゼルを製造している。
【００１９】
従来技術から明らかなように、天然の微細藻類マットから得られ、培養または採取されたバイオマスから脂肪酸メチルエステルを製造するコスト効率の高いプロセスは一切開示されていない。本発明は、これらの基本的限界を克服し、微細藻類マットから、廃棄物下流からの副生成物に付加価値を有すると共に、脂肪酸メチルエステルを製造する、新規で簡易化され、かつコスト効率の高いプロセスを展開しようとする。その場所での水のカーボン総量は、後の採取とともに減少することがわかった。それは、おそらく同じ場所から頻繁に採取することによる。
【００２０】
Ghoshらの特許出願PCT/IN2010/000192によれば、クロレラ海生微細藻類の培養、および混合栄養成長の利点について開示されている。そこには、バイオマスからバイオディーゼルを製造することだけでなく、バイオマスは、大規模で実際に培養することにより、大量に入手可能な原料であると認識されていることについても言及されていない。
【００２１】
Greenwellらのplacing microalgae on the biofuels priority list: a review of the
technological challenges（Journal of the royal society interface（2010）, 7: 703-726）という記事、Chisti, YのBiotechnology Advances（2003）によれば、微細藻類のバイオマスの下流プロセスの困難さ、および結果的な高いエネルギー損失について明らかにされている。これらの中でも、高度に希薄された懸濁液からバイオマスを採取することの困難さが真っ先に挙げられる。
【００２２】
記事（http://www.treehugger.com/renewable-energy/chevron-backs-solazyme-to-develop-algal-biodiesel-technology.html及びhttp://www.treehugger.com/cars/solazyme-b100-algae-biodiesel-goes-on-the-road.html）によれば、微細藻類バイオディーゼルＢ１００で車を動かすことについて開示されている。しかしながら、その記事では、バイオマスが、有機炭素源として糖類を用いて従属栄養性条件下で培養されることについて言及されている。
【００２３】
天日塩田での独立栄養成長の実際条件下で培養された、天然の海生微細藻類マットまたは耐熱性の海生微細藻類バイオマスから得られる、バイオディーゼルの特性については報告されていない。
【００２４】
西海岸に沿って潜在的な微細藻類について研究する間、我がチームは、Google earthソフトウェアで観察された画像から、いくつかの望ましい微細藻類が得られる可能性のある場所を見つけた。見つけた場所の１つは、インドにおいて、経度東経７０°５４．９５９′、緯度北緯２０°４２．３９１′（場所１）に位置しており、もう１つは、経度東経６８°５９．８７６′、緯度北緯２２°２３．９７５′（場所２）に位置しており、濃い微細藻類マットを示した。そのマットの顕微鏡検査（形態学）で、マットは様々な藻類種を含んでおり、その中で微胞子虫門類が主要であることが確認された。藻類からのバイオディーゼルを利用する方法では、エネルギーの消費が大きい。したがって、海生微細藻類からバイオディーゼルを製造するコスト効率の高いプロセスの開発が試みられている。
【００２５】
Bligh, E.G., Dyer, W.JのA rapid method for total lipid extraction and purification（Canadian Journal of Biochemistry and Physiology （1959）. 37, 911-917）、
およびLeeらのComparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae（Bioresource Technology 101（2010） S75-S7）によれば、海生微細藻類バイオマスから脂質を抽出する方法は、一般に、バイオディーゼル製造において望ましくない、極性溶媒の抽出、および多量のリン脂質の産出に加えてトリグリセリドを引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の主な目的は、天然の海生微細藻類共同体マット、および天日塩田で培養された自動定住の海生微細藻類を、エンジンに値する脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の源として利用することである。
【００２７】
本発明の他の目的は、上述した海生微細藻類共同体マットにおける主要種として、シオグサ類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９）および微胞子虫門類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９７）を特定することである。
【００２８】
他の目的は、天日塩田に浮かぶようなマットを人工的に培養すること、及び／又は、応力条件の適用から脂質含有量を向上させることである。
【００２９】
他の目的は、インドの西海岸から離れたクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）を、自動定住かつ耐熱性の海生微細藻類種として利用し、理想的なインド、グジャラートの夏季条件下において天日塩田で培養することである。
【００３０】
他の目的は、バイオマスから脂質を単離することに付随するエネルギー損失を最小限に抑制することである。
【００３１】
他の目的は、エネルギー損失を低減する手段として、容易に採取可能なバイオマスを利用することである。
【００３２】
他の目的は、天日塩の製造に利用できる余剰な土地のｃａ．０．１ミリオンエーカーを利用し、海生微細藻類バイオマスを大規模で培養する機会を設けることである。
【００３３】
他の目的は、海水、安い無機物性栄養素を用いて、培地の撹拌により機器装置を用いることなく培養することで、投入コストを最小限に抑制しつつ、夏季期間における１日毎の成長速度の最大値、４５ｇ／ｍ２／日（乾燥量基準）を達成することである。
【００３４】
他の目的は、重力を利用した栄養供給および塩田から塩田への液体の移送等の天日塩製造における基本的手段を活用することである。
【００３５】
他の目的は、採取されたバイオマスを自然乾燥することである。
【００３６】
他の目的は、ヘキサンのような揮発性の無極性溶媒を用いて、自然乾燥されたバイオマスから脂質を抽出し、抽出された脂質塊の全体における、望ましくない脂質の割合を最小限に抑制することである。
【００３７】
他の目的は、抽出プロセスに化石ディーゼルを任意選択で利用し、混合バイオディーゼルを用いることである。
【００３８】
他の目的は、抽出および脂質の単離プロセスに太陽熱エネルギーを利用して、投入比率
に対してエネルギー産出を最大限にすることである。
【００３９】
他の目的は、使用済みのバイオマスから最大値を引き出すことである。
【００４０】
他の目的は、簡易かつコスト効率の高い手段により原料油を精製することである。
【００４１】
他の目的は、その後、米国特許7666234に開示されるような公知のＦＡＭＥの製造プロ
セスを利用することである。
【００４２】
他の目的は、粘度、遊離脂肪酸含有量、酸化安定性、遊離および総量のグリセロール、リン含有量、水分含有量などの基本パラメータに望ましい特徴を有する海生微細藻類ＦＡＭＥを製造することを明らかにすることである。
【００４３】
他の目的は、海生微細藻類マットから製造されるＢ２０バイオディーゼル、およびクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）から製造されるＢ１００バイオディーゼルを用いて、標準的な車を駆動させることを明らかにすることである。
【００４４】
他の目的は、副生成物である粗製グリセロール流を利用して、従来技術に開示されたような培養された微細藻類の成長を加速させ、脂質含有量を増加させることである。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
（発明の概要）
本発明は、天然に浮かぶ海生微細藻類マット、又は天日塩田での培養により形成されて定住した海生微細藻類の厚い層、またはこれらの混合物から製造される、バイオディーゼルとして用いられる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を提供する。
【００４６】
本発明の一態様によれば、バイオディーゼルの生成に用いられるマットが、脂質を産出する微胞子虫門類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９７）又はシオグサ類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９）を主要種として含有し、天日塩田で培養された海生微細藻類の厚い層が、耐熱性のクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）を含有する、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）１が開示される。
【００４７】
本発明のさらに別の態様によれば、脂質は、微胞子虫門類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９７）からなる海生微細藻類マットからヘキサンを用いて抽出され、脂質は、ＧＣ−ＭＳにより分析された脂質組成において、１４：０の脂肪酸を０．６％、１６：０の脂肪酸を９．４％、１６：１の脂肪酸を０．７％、１８：０の脂肪酸を３．７％、１８：１の脂肪酸を３３．２％、１８：２の脂肪酸を５０．４％、２０：０の脂肪酸を０．７％、２２：０の脂肪酸を１．３％、含有する、ＦＡＭＥが開示される。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、脂質は、クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ１２１９８）からなる海生微細藻類からヘキサンを用いて抽出され、脂質は、ＧＣ−ＭＳにより分析された脂質組成において、１４：０の脂肪酸を０．４％、１６：０の脂肪酸を１２．１％、１６：１を１．０％、１６：２の脂肪酸を１．０％、１８：０の脂肪酸を４．２％、１８：１を２９．４％、１８：２の脂肪酸を４５．７％、１８：３の脂肪酸を４．８％、２２：０を１．４％、含有する、ＦＡＭＥが開示される。
【００４９】
本発明のさらに別の態様によれば、脂質は、シオグサ類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９９）からなる海生微細藻類マットからヘキサンを用いて抽出され、脂質は、ＧＣ−ＭＳにより分析された脂質組成において、１４：０の脂肪酸を０．９％、１５：０の脂肪酸を０．４％、１６：０の脂肪酸を２１．５％、１６：１の脂肪酸を１％、１８：０の脂
肪酸を２．９％、１８：１の脂肪酸を２１．２％、１８：２の脂肪酸を２２．３％、２０：０の脂肪酸を０．５％、２０：１の脂肪酸を１６．３％、２２：０の脂肪酸を０．４％、２２：１の脂肪酸を１１．４％、２４：０の脂肪酸を０．７％、２４：１の脂肪酸を０．６％、含有する、ＦＡＭＥが開示される。
【００５０】
本発明の別の態様によれば、微胞子虫門類から得られる脂質画分が精製されてエステル交換されることで、ＧＣ−ＭＳにより分析された組成において、１６：０の脂肪酸を９．９２％、１８：０の脂肪酸を２．４４％、１８：１の脂肪酸を２８．２７％、１８：２の脂肪酸を５９．３７％、およびＢＨＴ抗酸化物質を５−３０ｐｐｍ、含有するＦＡＭＥを得る、ＦＡＭＥが開示される。
【００５１】
本発明のさらに別の態様によれば、透明な黄色い液体であり、密度が０．８７２ｇｍ／ｍｌ、４０℃での粘度が４．５ｃＳｔ、総グリセロールが０．１０１４％、遊離グリセロールが０．００８６％である、微胞子虫門類からのＦＡＭＥが開示される。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、未改良のレギュラーバイオディーゼル車にＢ２０混合として満載状態で用いられ、排気規則を準拠する、ＦＡＭＥが開示される。
【００５３】
本発明のさらに別の態様によれば、クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）から得られる脂質画分が精製されてエステル交換されることで、ＧＣ−ＭＳにより分析された組成において、１６：０の脂肪酸を６．９％、１８：０の脂肪酸を３．１％、１８：１の脂肪酸を３２．６％、１８：２の脂肪酸を５７．３％、およびＢＨＴ抗酸化物質を５−３０ｐｐｍ、含有するＦＡＭＥが開示される。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、透明なからし色の液体であり、２５℃および４０℃での密度が０．８７０４ｇ／ｃｍ３および０．８５９１ｇ／ｃｍ３、４０℃での粘度が４．８ｃＳｔ、総グリセロールが０．１５％、遊離グリセロールが０．０２％、ＣＦＰＰが−５℃、水分含有量が０．０２９％、亜リン酸が５．１ｐｐｍ、酸化安定性が２５℃で０．４３年、４０℃で０．１２年、標準熱量測定試験で測定される発熱量が９８４２ｋｃａｌ／ｋｇである、クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）からのＦＡＭＥが開示される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、Ｂ１００バイオディーゼルとして、請求項８と同様の未改良のレギュラーバイオディーゼル車に満載状態で用いられ、排気規則を準拠する、ＦＡＭＥが開示される。
【００５６】
本発明のさらに別の態様によれば、微胞子虫門類における海生微細藻類マットの優先種が、７月から１２月、東経７０°５４．９５９′、北緯２０°４２．３９１′で採取された、ＦＡＭＥが開示される。
【００５７】
本発明のさらに別の態様によれば、クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）は、東経７２°０７．３１６′、北緯２１°４７．４８８８′、海抜２８フィートに位置する塩田において独立栄養条件で１月から６月まで培養される、ＦＡＭＥが開示される。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、天日塩田におけるクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）の成長速度が、１１．６７−４５．５６ｇ／ｍ２／日の範囲内である、ＦＡＭＥが開示される。
【００５９】
本発明のさらに別の態様によれば、微胞子虫門類のマットをヘキサンで抽出したときの
脂質の収率が、５．２２−１６．３２％の範囲内である、ＦＡＭＥが開示される。
【００６０】
本発明のさらに別の態様によれば、培養されたクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ  １２１９８）をヘキサンで抽出したときの脂質の収率が、１１．１１−１１．２１％の範囲内である、ＦＡＭＥが開示される。
【００６１】
本発明のさらに別の態様によれば、クロレラバリアビリスの成長速度および脂質の収率が、海水培地１０００Ｌにつき重炭酸ナトリウム３−６ｋｇ、硝酸ナトリウム１−２ｋｇおよび硫酸第一鉄０．０１−０．０２ｋｇを添加することにより、影響を受ける、ＦＡＭＥが開示される。
【００６２】
本発明のさらに別の態様によれば、ＦＡＭＥプロセスにおける副生成物流による粗製グリセロールは、任意選択で添加され、バイオマスの生産性を５０−２００％向上させる、ＦＡＭＥが開示される。
【００６３】
本発明のさらに別の態様によれば、夏季以外の期間の開放培養において、太陽反射鏡により、クロレラバリアビリスの成長速度および脂質生産性を向上させる、ＦＡＭＥが開示される。
【００６４】
本発明のさらに別の態様によれば、脂質の溶媒抽出の後の残留バイオマスは、バイオ肥料、水性栄養、カロテノイド源およびエネルギー源の製造に用いられる、ＦＡＭＥが開示される。
【００６５】
本発明のさらに別の態様によれば、副生成物流の粗製グリセロールは、混合栄養成長による藻類製造、および／または生分解性バイオポリマーの製造に用いられる、ＦＡＭＥが開示される。
【００６６】
本発明の別の側面によれば、微胞子虫門（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９７）およびシオグサＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９の共同体からなり、自然から採取される浮遊マットと、大量に培養されて選択された耐熱性の微細藻類種（クロレラバリアビリスＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）と一緒に培養された微細藻類マットとから、エンジンに値する脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）を生成するための、ならびに微細藻類マスからの副生成物および脂肪酸メチルエステルからの副生成物を利用するための、総合プロセスが提供され、前記プロセスは以下のステップを有する：
a）異なる場所から微細藻類マット共同体を採取し、洗浄して付着した砂やほこりの粒子
を除去する、ii）マットに存在する微細藻類の種を特定し、実験室条件下で、海水およびCSMCRI実験塩田（ESF）の海塩（5°Be¢）を用いてマットを培養して、さらなる増殖のためのタンクにおいて自然条件をシミュレーションする、
b）マットから、油を産出する微細藻類種（微胞子虫門、ホソネダシグサ、ラセン藻、ク
ロレラ、シオグサ目、珪藻、オシラトリア等）を単離する、
c）油を産出する微細藻類種を、１８ｍ２および９０ｍ２のタンクの実験塩田において、
外部で大量培養し、次のバッチの接種のための栄養素として上澄みを採取しやすく、かつリサイクルしやすくさせるバイオマスを自動定住させる、
d）微細藻類マットを乾燥し、続いて乾燥した微細藻類マットを細かい粉末にすりつぶす
。
e）ボールミル／蒸気を用いたバイオマスの前処理を含む、バイオマスからの油の効率的
な抽出を行い、続いてソックレー等により無極性溶媒を抽出して溶媒をリサイクルする。f）原料油を精製する、
g）続いて、公知のエステル交換プロセスを行い、従来技術と同様の、エンジンに値する
バイオディーゼルを生成する、
h）従来技術（特許出願PCT/IN2011/000655）に開示されるように混合栄養成長により藻の生産性を向上させるため、及び／又は、生分解性バイオポリマー（WIPO特許出願WO/2011/027353）等の他の有用物質を製造するため、バイオディーゼルの副生成物流を利用する、i）使用済みのバイオマスと、バイオガスを製造するためにバイオディーゼルを合成する
間に生じた廃水とを利用する、
j）使用済みのバイオマスを水性栄養およびバイオ肥料として利用する、
k）ブリケットを生成するために、残留バイオマスと脱油した固形物とを利用する、
l）脱油した残留バイオマスからカロテノイドを抽出する、
m）満載でエンジンが一切改良されていない走行車両（シボレー  タベラ）に適したＢ２
０およびＢ１００をブレンドする。
【００６７】
本発明の一態様によれば、バイオディーゼルとして用いられる、エンジンに値する脂肪酸メチルエステルの製造プロセスが開示され、前記プロセスは以下のステップを有する：（i）微胞子虫門類およびシオグサ類の共同体と、培養されたクロレラバリアビリスとを
有する天然の微細藻類マットを採取して、藻類バイオマスを得る；
（ii）バイオマスを残留水分レベルが５−１０％となるまで自然乾燥する；
（iii）蒸気噴射または浸透圧性ショックによりステップ（ii）のバイオマスを前処理し
て、細胞壁を破壊する；
（iv）溶媒としてヘキサンを、又は任意選択でディーゼルを一緒に混合状態で用いることにより、ステップ（iii）の藻類バイオマスから脂質を抽出し、原料油を得る；
（v）ヘキサンを除去し、結果物である原料油を酸性白土で処理する、または任意選択で
ステップ（ii）の抽出物を酸性白土で直接処理することにより、リン脂質、色素およびその他不純物を除去する；
（vi）濾過して浮遊固体を除去し、必要に応じて、ステップ（v）の油抽出物をさらに処
理して遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の含有量を低減することにより、精製油を得る；
（vii）ステップ（vi）の精製油をアルカリ触媒によりエステル交換することで、ＦＡＭ
Ｅを分離して、さらに精製し、エンジンに値するＦＡＭＥを得る。
【００６８】
本発明の他の態様によれば、微胞子虫門類から得られるＦＡＭＥが、ＧＣ−ＭＳにより分析された組成において、１６：０の脂肪酸を９．９２％、１８：０の脂肪酸を２．４４％、１８：１の脂肪酸を２８．２７％、１８：２の脂肪酸を５９．３７％、およびＢＨＴ抗酸化物質を５−３０ｐｐｍ、含有する、ＦＡＭＥの製造プロセスが開示される。
【００６９】
本発明のさらに他の態様によれば、クロレラバリアビリスから得られるＦＡＭＥが、ＧＣ−ＭＳにより分析された組成において、１６：０の脂肪酸を６．９％、１８：０の脂肪酸を３．１％、１８：１の脂肪酸を３２．６％、１８：２の脂肪酸を５７．３％、およびＢＨＴ抗酸化物質を５−３０ｐｐｍ、含有する、プロセスが開示される。
【００７０】
本発明の一態様によれば、自然の微細藻類マット、および大量に培養されて選択された微細藻類種と一緒に培養された微細藻類マットから、エンジンに値する脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）を生成するための、ならびに微細藻類マスからの副生成物および脂肪酸メチルエステルからの副生成物を利用するための、総合プロセスが提供される。
【００７１】
本発明の他の態様によれば、微細藻類マットは、主要種として微胞子虫門およびシオグサ類ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９を有する異なる微細藻類種の共同体である。
【００７２】
本発明のさらに他の態様によれば、海水は、必須微量栄養素であるCSMCRI-ESF塩を有しており、微細藻類の外部での大量培養に用いられる。
【００７３】
本発明のさらに他の態様によれば、油抽出は、ヘキサン、クロロホルム、メタノール、
アセトン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルからなる群から選択される溶媒を用いて行われ、好ましくは、ヘキサン、クロロホルムおよびメタノールである。
【００７４】
本発明のさらに他の態様によれば、バイオディーゼルの副生成物流は、ＰＨＡバイオポリマー、バイオガス、ガス化、肥料、水性栄養、カロテノイドの製造およびブリケットの製造に用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
ある望ましい微細藻類を得られる可能性を示す、いくつかの場所は、Google earthソフトウェアで観察された画像を通して選択された。その場所の１つは、インドにおいて、経度東経７０°５４．９５９′、緯度北緯２０°４２．３９１′（場所１）に位置しており、もう１つは、経度東経６８°５９．８７６’、緯度北緯２２°２３．９７５′（場所２）に位置している。それは、濃い浮遊微細藻類マットを示した。そのマットの顕微鏡検査（形態学）で、マットは様々な藻類種を含んでおり、その中で微胞子虫門類とシオグサ類ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９とが主要であることが確認された。藻類からのバイオディーゼルを利用する方法では、エネルギーの消費が大きい。したがって、海生微細藻類マットと、離れて大量に培養されたクロレラバリアビリスＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８の種との共同体からバイオディーゼルを製造する、コスト効率の高いプロセスの開発が試みられている。
【００７６】
バイオディーゼルを製造するため、総合プロセスに、微胞子虫門およびシオグサ類ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９（それぞれ場所１及び２からの優先種）を含む微細藻類マットを利用することが特有である。自然のマットは、広範囲に広がっており、採取された後、数週間で再生することが知られている。その上、他の実験場所でも再生することが観察されている。優先種である微胞子虫門およびシオグサ類ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９からなる共同体のマットは、環境パラメータの可変範囲において生き延びて成長することが知られている。
【００７７】
（本発明の新規な特徴）
主な進歩性は、以下の通りである。
・微細藻類の採取がエネルギー集約的であること、そして主要な種として微胞子虫門類（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９７）およびシオグサ類（ＰＴＡ−１２１９９）を有するような、脂質を産出する浮遊海生微細藻類マットを自然に作り出すという創意工夫をうまく利用することによれば、水から最良の部分を簡易に取り出して処理をさらに行っていることが認められる。
・ある自然条件が海生微細藻類マットの自然な成長に貢献している一方で、このような自然な成長は、モンスーン後の数カ月のある特定の期間に限られ、それらの発生は夏季などの他の月の間ではわずかであることが認められる。さらに、多大な作業の後、自然条件をシミュレーションすることが常に簡易でないこと、そして海生微細藻類の他の種類が培養により適していること、が認められる。
・仮に、天然資源を補充し、また一年中採取するため、海生微細藻類を培養する必要があるならば、モンスーンの次の期間の間、自然から適切な方法で採取し、その後、天日塩田で海生微細藻類を培養することに頼ることが有用なアプローチであると認められ、インドにおいて休耕している塩製造用の土地の５０％と同量のものを得られる大規模培養の望ましい機会を提供し、これらは生産的に利用される。
・インドの水からのクロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）を、
夏季の間、独立栄養条件でよく成長し、最小限の栄養素の添加で、実際の乾燥バイオマスの最大限の生産性が４５ｇ／ｍ２／日となる耐熱性種として同定し、また、水路池に導入され、連続的に撹拌するエネルギー集約的な手法を避ける。
・また、クロレラの選択された種が、夏季の間、支配的な高温条件下で成長し、定住した後、次の培養のバッチのための接種として作用する浮遊物を汲みほした後、容易に採取する厚い層が底で形成されることを観察する。
・夏季以外の期間であっても、塩田に太陽反射鏡を設けることにより、クロレラを成長させることが実現可能であることを認識すれば、塩田での放射線入射を向上し、その結果として、バイオマス生産性および脂質産出においてプラス効果をもたらす温度および入射光子を向上させる。
・脂質が極性または非極性タイプであり、最近、エンジンに値するバイオディーゼルが必要とされていることを考慮すれば、望ましい脂質画分のために脂質の高い産出を犠牲にした後、ヘキサンなどの非極性溶媒と、従来用いられたメタノール／クロロホルム等の極性溶媒の代わりのディーゼルとを用いて、バイオマスを抽出する。
・抽出のための非極性溶媒を用いることで石油留分を洗浄しているにも関わらず、微細藻類の細胞壁の除去が非効率的であることを考慮すると、結果的に、抽出に先立ち、前処理として蒸気噴射を設けることによって、プロセスは、太陽で駆動されるならば、よりよいエネルギー効率となる。
・フラーズ・アース等でろ過するといった簡易な手段を用いることにより原料油を精製し、その後、エンジンに値する脂肪酸メチルエステルを製造する従来技術に開示されるような塩基触媒のエステル交換などの従来方法を用いる。
・採取されて培養された自然の海生微細藻類の両方から、普通バイオディーゼル車に用いるのに適した品質を有するメチルエステルを製造する。
・従来技術に開示される混合栄養条件下で、バイオマス生産性および脂質含有量を改善するため、栄養素として、海生微細藻類バイオディーゼル製造からの副生成物であるグリセロール流を用いる。
・脂質抽出の後の残留バイオマスを、肥料、カロテノイド源、水性栄養、エネルギー源などの様々な用途に用いる。
・生活排水、および塩化ナトリウムは少ないが、カルシウム、マグネシウムおよび硫酸塩などの栄養素は多い天然の海塩は、添加培地として、微細藻類マットおよび離れて培養された海生微細藻類の成長に用いられる。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
Google Maps（登録商標）を用いることにより、我々が浮遊海生微細藻類マットの可能性を確認する手助けとなる、沿岸水における緑区画について、研究を行った。ゴア（Madkai；北緯１５°４１．０６１６′、東経７３°９５．６２２７′）、ケーララ（Vellanathuruthu Road；北緯９°０１．６６５９′、東経７６°５２．５０２２′）、西ベンガル（Port Canning；北緯２２°３１．５５７７′、東経８８°６７．３３０７′、Dongajora；北緯２２°１３．２６９６′、東経８８°６０．２６７６′、Haldia refinery；北緯２２°０４．９４０８′、東経８８°０７．３０８′）、ディーウ（Nagoa road side；東経７０°５４．９５９′、北緯２０°４２．３９１′）、そして、グジャラート（Okha；６８°５９．８７６′、２２°２３．９７５′）の沿岸地域において、いくつかの優れた緑区画を発見した。ディーウおよびグジャラートで確認された場所において現地踏査したところ、緑色の浮遊海生微細藻類マットを実際に発見した。
【００７９】
（実施例２）
分類学的同定のため、実施例１のマットを採取し、顕微鏡（Carl Zeiss Axio Imagerの４０x）で観察した。いずれのマットも、緑藻類種が優位を占めている微細藻類の共同体であることが明らかとなった。東経７０°５４．９５９′、北緯２０°４２．３９１′から採取された１つは、優性型として微胞子虫門類を含む一方、６８°５９．８７６′、２２°２３．９７５′から採取された１つは、シオグサ類が優位を占めていた。段階希釈法により、共同体から関連種を分離した。藻類マットを蒸留水で洗浄して、付着する泥や不純物を除去し、さらに遠心分離を行った。上澄みを採取し、異なる培地（BG-11、BBM、Zarrouk’s、ASN-III等）の組織培養皿で２４時間、植菌した。１：１０の希釈物を用いて段階希釈を行った。組織培養皿を、人工光（３００ｌｕｘ）の明暗周期１２時間、２５℃の状態に保った。明らかな成長の後、固体１％のアガロース皿に、富栄養の培養物を縞状に付けた。人工光（３００ｌｕｘ）の明暗周期１２時間、２５℃の環境下でペトリ皿を培養した。分離した培養物を、無菌で、液体培地に植菌し、人工光（３００ｌｕｘ）の明暗周期１２時間、２５℃の状態に保った。上述の２つの場所からのマットを凍結乾燥し、受入番号の割り当てに先立って、生死判別試験のため、American Type Culture CollectionCentre（ＡＴＣＣ）に送った。脂質を産出する主要種としてシオグサを含むマットの１
つは、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９９が付与された一方、脂質を産出する主要種と
して微胞子虫門を含むマットのもう１つは、生死判別試験の最中である。
【００８０】
（実施例３）
微細藻類が優位を占める東経７０°５４．９５９′、北緯２０°４２．３９１′の場所から、天然の海生微細藻類マットをすくい取った。マットの再成長を研究するため、その場所を３−４週間、定期的に訪れた。夏季の間、バイオマスの生産性を２２．２２ｇ／ｍ２／日、脂質の総含有量を１０％、モンスーンの間、バイオマスの生産性を６．０３ｇ／ｍ２／日、脂質の総含有量を９．６１％、そして、冬季の間、バイオマスの生産性を１６ｇ／ｍ２／日、脂質の総含有量を１２．８５％、を達成した。この実施例によれば、持続可能な方法で自然から微細藻類マットを採取することが適していることが分かる。
【００８１】
（実施例４）
高められた太陽放射の、ＡＴＣＣ−クロレラバリアビリスのバイオマス生産性への影響については、冬季の間（空気温度２５−３０℃）、開放タンクにおいて研究した。２００Ｌの海水媒質を含む、面積１．５１ｍ２、深さ０．３ｍのタンク２つに、クロレラ培養物（ＯＤ５４０ｎｍ＝１．６５）の１０％の接種材料を用いて、植菌した。反射鏡を用いた１４日後の乾燥バイオマスの収率は５．０３ｇ／ｌである一方、制御されたタンクにおけるその収率は４．０７ｇ／ｌであった。この実施例によれば、太陽反射鏡は、培養プロセス、特に環境温度が最適条件より低いときに有益な効果をもたらすことが分かる。
【００８２】
（実施例５）
機関の実験塩田（北緯２１°４７．４８８′、東経７２°０７．３１６′、海抜２８フィート）において、クロレラバリアビリスＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８の大量培養を行った。培養は、３月−６月の間行った。培養の間、屋外の温度は、４５±３℃であった。この目的に必要とされる培養物を、面積１８ｍ２の２つのタンクそれぞれで成長させ、接種材料のタンクとして始めに用いる。ｐＨ、５４０ｎｍでのＯＤおよびバイオマスの収率を測定することにより、タンクを定期的にモニタリングした。細胞濃度が５ｇ／ｌ（水分基準）まで達したら、面積１８ｍ２のタンクの７つ以上のそれぞれと、面積９０ｍ２のタンクの３つのそれぞれと、に培養物を植菌した。ｐＨ、５４０ｎｍでのＯＤ、バイオマスの収率および環境パラメータを定期的にモニタリングした。両端をひもで結ばれる中空管を用いて、タンクを手動で１８日撹拌した（１日に３回）。培養の２０日後に、バイオマスが、タンクの底で厚い層を自動的に形成し、安定していることが観察された。バイオマス生産性のデータを以下の表に示す。
0006002756.tif 000002
それぞれのタンクからの上澄みを空のタンクへと移し、安定したバイオマスを採取して自然乾燥した。この実施例によれば、クロレラバリアビリス（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１９８）を天日塩田で培養する実現可能性が分かる。
【００８３】
（実施例６）
実施例５の実験をさらに２つの塩田で繰り返し行った。５０００Ｌの海水培地に、２５ｋｇの重炭酸ナトリウム、６ｋｇの硝酸ナトリウムおよび６２．５ｋｇの硫酸鉄を添加した。以下の表から分かるように、バイオマス生産性が増加することが発見された。
0006002756.tif 000003
この実施例によれば、バイオマス生産性は、海水培地にある重要な栄養素を添加することにより向上できることが分かる。
【００８４】
（実施例７）
自然から採取された微細藻類マットに、脂質のヘキサン抽出を行った。ヘキサンを溶媒として用いた。そのデータを以下の表に示す。見て分かるように、脂質含有量が５−１６％で変化した。
0006002756.tif 000004
【００８５】
（実施例８）
実施例７の研究を、実施例５，６のクロレラバリアビリスのバイオマスを用いて繰り返し行った。そのデータを以下の表に示す。この実施例によれば、培養されたバイオマスに
より、油収率をより確実にできることが分かる。
0006002756.tif 000005
【００８６】
（実施例９）
以下の表は、上述のＧＣ−ＭＳにより測定された、実施例７，８の原料油の脂肪酸組成物に関連する関連データを示す。
0006002756.tif 000006
【００８７】
（実施例１０）
実施例８のバッチ１で得られた１８．７３８ｋｇの油を、ステンレス鋼の器に入れ、９０℃で加熱した。それに、１．８ｋｇのフラーズ・アースを添加した。油をろ過し、１５．９１６ｋｇの精製油を得た。ＦＦＡ含有量について精製油を分析したところ、ＦＦＡ含有量が０．６％であることが分かった。６５ｍｌの水中に１３ｇｍのＮａＯＨを添加し、溶解した。用意したアルカリ溶液を精製油に添加し、１５分間撹拌した。それをろ過し、石鹸を除去した。ろ過物である澄んだ油は、１５．２１０ｋｇの重さがあった。２．９２ｋｇ（３．７５６Ｌ）のメタノールおよび３９９．２４ｇのＫＯＨを用いて、精製油をエステル交換した。中身を環境温度で９０分間撹拌し、６０分置いておいた。過剰のアルコールおよびＫＯＨを含むグリセロール層を分離したところ、グリセロール層の重さが４ｋｇであった。バイオディーゼル層を６８２ｇｍのグリセロールで洗浄し、６０分間落ち着かせた。グリセロール洗浄物は６８７ｇｍの重さがあった。それから、ｐＨが７となるまで、バイオディーゼル層を１Ｌの水で洗浄した。中身を１１０℃で加熱することにより、それを乾燥した。得られた１３．３５ｋｇのバイオディーゼルについて、遊離グリセロール、総グリセロール、水分、粘度および濃度を分析した。そのデータを以下の表に示す。
0006002756.tif 000007
【００８８】
（実施例１１）
実施例７のバッチ２から得られた油を用いて、実施例１０の研究を行った。そのデータを以下の表６に示す。
0006002756.tif 000008
【００８９】
（実施例１２）
以下の表は、それぞれＧＣ−ＭＳにより分析された実施例１０，１１の脂肪酸メチルエステルの脂肪酸組成を示す。その組成物がとてもきれいであることは明らかである。
0006002756.tif 000009
【００９０】
（実施例１３）
実施例１２のデータによると、実施例１０，１１の海生微細藻類バイオディーゼルが確かにエンジンに値することが分かる。実施例１１の脂肪酸メチルエステルから得られたＢ２０バイオディーゼル、および実施例１０のＢ１００バイオディーゼルは、一切改造されていない標準的なタベラに直接用いることができる。車を走行するときに、何の問題点も確認されず、走行可能距離は、化石ディーゼルと同等であると評価された。ある記者は、実施例１１のＢ１００バイオディーゼルの車を走行することについて述べている。「この
記者は、大臣により旗を掲げられたタベラを試乗した。この体験は、ディーゼルエンジンによる単調なブンブン音が伴い、その他のディーゼル車と同等であった。中央事務局エリアの周囲２ｋｍの運転は、順調であり、ちょっとした問題も生じなかった。」（Dinsa Sachan, “Biodiesel from microalgae becomes a reality”, Down to Earth, March 30, 2012; www.downtoearth.org.in）.
【００９１】
（実施例１４）
１２１℃、圧力１５−ｐｓｉの蒸気を、発熱量４５９０ｋＣａｌ／Ｋｇのクロレラバイオマスを３０ｇ敷き詰めたものの間に１５分間、通り抜けさせた。溶媒容量が１５０ｍｌであり、４時間、８０℃で１００ｍｌのヘキサンを用いる自動ソックスレーにおいて、脂質抽出するため、この蒸気１０．１ｇで処理されたサンプルをセルロースシンブルに導入した。この研究は、蒸気前処理の後では、ヘキサン抽出がより効率的となり、完全抽出には、普通１６時間かかるのに対して、１０時間を必要とすることを示唆している。
【００９２】
（実施例１５）
容量１Ｌの密閉された反応器において、実施例８の脱油した微細藻類バイオマス５０ｇからカロテノイドを抽出した。８０％（ｖ／ｖ）のアセトン５００ｍｌを用いて抽出し、暗室において２００ｒｐｍの磁気撹拌を持続した状態に保った。連続的な磁気撹拌を３時間行った後、溶媒を蒸発させ、アセトンを含まない抽出物をろ紙を用いてろ過することで、残余分としてカロテノイドを得た。得られたカロテノイドは２−４％の範囲であった。
【００９３】
（実施例１６）
（マットおよびクロレラの脱油残余バイオマスからのバイオマス生産性）
実施例７，８からの残余バイオマスをバイオガスの製造に用いた。バイオガスを生成した後、たくさんの微量栄養素、炭素および窒素を含むバイオマスのスラリーをバイオ肥料として用いることができる。残余バイオマスは、水性栄養としても用いることができ、それは、タンパク質、糖質および必須微量栄養素を含む。残余バイオマスのブリケットを調合することができる。油抽出の後、廃棄微細藻類バイオマスからバイオガスを製造することは、将来的に実現可能であり、バイオマスからのエネルギー産出を大幅に増加することができる。したがって、微細藻類から継続的にバイオディーゼルを製造するためには、それは必要なステップと見なされる（Torres and Jeison, 2010）。
実施例７の脱油した固形物に、発熱量１８８４．５２ｋｃａｌ／ｋｇの脱油した残余バイオマスを添加し、実施例８の脱油した固形物に、発熱量１６７９．００Ｋｃａｌ／ｋｇの脱油した残余バイオマスを添加した。バイオガス工場からの消化されたスラリーを、バイオガス製造の接種材料として用いた。その一式を、（１）蒸解装置（５．０Ｌ）、（２）グラス・ホルダー・ボトル（１．０Ｌ）、（３）液体変位ボトル（１．０Ｌ）の３つに分割した。蒸解装置では、容量を４．０Ｌでマークし、その接合部をシリコンテープおよび真空グリースを用いることにより気密した。容量１．０Ｌのグラス・ホルダー・ボトルでは、発色試薬の１．０Ｌのマークまでいっぱいにした。その上に、ガスの製造を正確に測定するため、目盛りを刻んだスケールを貼り付けた。それぞれのテスト（残余バイオマス）のための連続したバッチ方式、および連続したバッチ操作のためのワンコントロール蒸解装置において、バイオガスの実験を行った。この実験での水力学的滞留時間（ＨＲＴ）を３０日、基質の供給を５％とし、連続蒸解装置では、１３４ｍｌ（４．０Ｌ／３０日＝０．１３３３、すなわち１３４ｍｌ）のサンプルを、栄養チューブを通して、１３４ｍｌテスト（５％（６．７ｇ）のバイオマス＋６７ｍｌのスラリー＋６７ｍｌ  ｔ／ｗ）で毎日置き換える一方、バッチ蒸解装置では、２００ｇのバイオマスを直接添加した（４．０Ｌに対して５％）。バイオガス製造のための微生物相の成長、および嫌気条件の維持を誘導するため、割合１：１０（マルチビタミン錠剤および塩酸システイン）で希釈された活性剤溶液を用いた。結果的に流出したスラリーについて、全固形物、総揮発性固形物、ｐＨ、電気伝導性、総有機炭素、可給態窒素および可給態リンなどのパラメータを毎日、
分析した。また、総バイオガス製造を毎日測定した。実施例７および８の脱油したバイオマスの蒸解装置において、バイオガス製造の１日平均は、バッチプロセスでは、それぞれ４２６．２６および４４６．０２ｍｌ／日であり、連続プロセスでは、２７０．５１および４７３．１５ｍｌ／日であった。
【００９４】
（実施例１７）
粗製グリセロールを含む微細藻類バイオディーゼル副生成物を、クロレラバリアビリスの混合栄養および従属栄養の成長のための栄養源として用いて、すべてのフラスコを、室温で混合栄養成長するため、藻類バイオディーゼル廃棄物残渣（ＡＢＷＲ）の異なる１００ｍｌの海水培地を含むものとした。植菌の後、ＯＤが５４０ｎｍで０．５であった。８日後のバイオマス生産性は、ＡＢＷＲ（混合栄養）の５ｇ／Ｌにおいて最大となることが観察された。この実施例によれば、バイオマス生産性を向上させるときには、粗製グリセロール流を用いることが分かる。
【００９５】
（実施例１８）
消費された微細藻類バイオマスを、成長を促すためのバイオ肥料として用いて、化学肥料の代わりに用いることができる。ＮＰＫ含有量は、シオグサ類では１．２：０．０３：０．６（％）であり、微胞子虫門では１．４：０．０１：１．１（％）であり、クロレラでは２．１９：０．０１：１．０（％）である。管理された（Ｋ２Ｏ）６レーンのトウモロコシ作物と、栄養素（Ｋ２Ｏ）基準で等しいシオグサ類、微胞子虫門およびクロレラ、それぞれの４レーンと、の２つのプロットで実験を行った。植物の高さ、植物当たりの葉の数、植物当たりの穂軸の数、穂軸の長さ及び幅、そしてクロロフィル指数について、成長の８週間後に測定した。結果に示すように、クロレラでは、最も良い結果が得られ、植物の平均高さが１６７．８±７．３４ｃｍ、植物当たりの葉が１４．８±０．５８３、植物当たりの穂軸が２、穂軸の長さが３２．０±０．８４ｃｍ、穂軸の幅が７．２４±０．２４ｃｍ、クロロフィル指数が４９．３１±０．０３（Opti-Sciences CCM-200, USA）であり、これに対して、管理されたもの（化学肥料Ｋ２Ｏ）では、植物の高さが１５８．４±２．７９ｃｍ、植物当たりの葉が１３．６±０．４、植物当たりの穂軸が１．６±０．２５、穂軸の長さが２８．６±０．７５ｃｍ、穂軸の幅が７．２４±０．２４ｃｍ、クロロフィル指数が４０．２５±１．９７である。クロレラをＫ２Ｏ（制御）の代わりにバイオ肥料として用いたとき、収率の増加が１６．４３％となることが観察された。これによれば、脱油した固形物をさらに利用できることが分かる。
【００９６】
（実施例１９）
実施例８の脱油した固形物は、発熱量が１７６５．９１ｋｃａｌ／ｋｇであった。藻類は、湿った牛糞が重量で１０％混合され、直径４ｃｍ、深さ２ｃｍの手作りのブリケットに変形され、自然乾燥に曝される。このような乾燥バイオマスの３０ｋｇは、それから、機関のＥＳＦ施設に設置されるバイオマスガス化装置に１５ｋｇ／時で投入される。ガス化装置での操作の約１０分後に、発生炉ガスの可燃成分は、オンラインのガス分析器を用いると言及されている。そのガスは、黄色の炎で燃えた。この実施例によれば、脱油した固形物は、バイオマスガス化装置でも用いられることが分かる。
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【００９７】
本発明の効果は：
・本発明によれば、藻類の自然のマットを適切な方法で採取することにより、海生微細藻
類バイオマスを生成するといった低コストのオプションを得られる。
・また、本発明は、開かれた天日塩田で、たとえ熱い夏季条件であってもバイオマス生産性を高く、かつ脂質含有量を高くして、耐熱性のクロレラ種を培養できる、という効果を有する。
・さらに、本発明は、バイオマスを培養するのに最小限の栄養素およびエネルギーの投入で十分である、という効果を有する。
・また、本発明は、バイオマスが容易に採取可能である、という効果を有する。
・さらに、本発明は、非極性溶媒により、脂質のうち、バイオディーゼル製造に適した有用な部分のみを選択的に抽出する、という効果を有する。
・さらに、本発明は、非極性溶媒の抽出により得られる粗製油を簡易な方法で精製し、その後、その油を高品質なバイオディーゼルへ公知の方法で容易に加工処理する、という効果を有している。
・さらに、本発明は、海生微細藻類源から得られるメチルエステルを、未希釈条件（Ｂ１００）であっても、エンジン未改良のレギュラーバイオディーゼル車を走らせられることを示す、という効果を有している。
・さらに、本発明は、ある副生成物流の直接利用及び／又は付加価値を示す、という効果を有している。