(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、次の工程：
（ａ）所定量のブロッキングされたヌクレオチドを準備すること；
（ｂ）前記ブロッキングされたヌクレオチドをデブロッキングして、デブロッキングされたヌクレオチドを生成すること；
（ｃ）前記デブロッキングされたヌクレオチドを活性化すること；
（ｄ）前記デブロッキングされたヌクレオチドをホスホロアミダイトと反応させて、ホスファイトオリゴマーを生成すること；
（ｅ）無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールと反応させることにより、未反応の前記デブロッキングされたヌクレオチドをキャッピングすること；
（ｆ）前記ホスファイトオリゴマーを酸化してオリゴヌクレオチドを生成し、または前記ホスファイトオリゴマーを硫化してホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを生成すること；及び
（ｇ）任意的に（ｂ）から（ｆ）の工程を反復すること；
を含む方法であって、前記Ｎ−メチルイミダゾールが、Ｎ−メチルイミダゾールの重量を基準にして１０ｐｐｍ以下の含有量の１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを有する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記デブロッキングが、トルエンまたはジクロロメタン中でのジクロロ酢酸との反応を含む方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ホスファイトオリゴマーの酸化が、水およびピリジン中でヨウ素と接触させることによって実施される方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ブロッキングされたヌクレオチドがヘテロ環式核酸塩基のなかから選択される方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ブロッキングされたヌクレオチドが支持体に共有結合している方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、（ｂ）から（ｆ）の工程を、所望のオリゴヌクレオチド長またはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチド長に達するまで反復する方法。
【請求項７】
ホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法において、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールと反応させることにより、未反応のデブロッキングされたヌクレオチドをキャッピングする方法であって、前記Ｎ−メチルイミダゾールが、Ｎ−メチルイミダゾールの重量を基準にして１０ｐｐｍ以下の含有量の１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／９８０，０６３号の優先権を主張するものであり、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しないＮ−メチルイミダゾールのキャッピング剤を使用しながら、オリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドおよびホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのカップリングにより合成される。合成には、一般に次の工程：（ａ）デブロッキング（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、（ｂ）活性化／カップリング（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、（ｃ）キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）、および（ｄ）酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ；オリゴヌクレオチドの場合）または硫化（ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ；ホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドの場合）が含まれる。このサイクルを、カップリングする塩基の数に応じて連続的に反復することができる。
【０００４】
キャッピングの工程は、一般的にＮ−メチルイミダゾールと無水酢酸との組合せの存在下で実施される。Ｎ−メチルイミダゾールを使用するいくつかのオリゴヌクレオチド合成では、望ましくない付加化合物を有するいくつかのオリゴヌクレオチドが生成し得ることが観察されている。付加化合物によって、オリゴヌクレオチドの分子量は８５ダルトン増加したことが観察されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最終生成物が、望ましくない付加化合物を実質的に含有しない、オリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを合成する方法を有することは望ましいことである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法が提供される。本方法には、次の工程：（ａ）所定量のブロッキングされたヌクレオチド（ａ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を準備すること；（ｂ）前記ブロッキングされたヌクレオチドをデブロッキング（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）して、ブロッキングされていないヌクレオチド（ａｎ  ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を生成すること；（ｃ）前記デブロッキングされたヌクレオチドを活性化すること；（ｄ）前記デブロッキングされたヌクレオチドとホスホロアミダイトをカップリングして、ホスファイトオリゴマー（ａ  ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）を生成すること；（ｅ）所定量の無水酢酸、および１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しない所定量のＮ−メチルイミダゾールと反応させることにより、前記デブロッキングされたヌクレオチドのうちカップリングしなかったものをキャッピングすること；（ｆ）前記ホスファイトオリゴマーを酸化してオリゴヌクレオチドを生成し、または前記ホスファイトオリゴマーを硫化してホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを生成すること；及び（ｇ）任意的に（ｂ）から（ｆ）の工程を反復すること；が含まれる。
【０００７】
さらに、本発明によれば、ヒドロキシル部位を有するヌクレオチドをキャッピングする方法が提供される。本方法は、ヌクレオチドを、所定量の無水酢酸、および１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しない所定量のＮ−メチルイミダゾールと反応させる工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の方法の一実施形態を示す循環図である。
【図２】本発明の方法のデブロッキング工程を示す図である。「ＣＰＧ」という頭字語は、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；制御された細孔を有するガラス）を表す。
【図３】ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基で保護された４種類のヌクレオチド（ホスホロアミダイト）を示す図である。
【図４】本発明の方法のキャッピング工程を示す図である。
【図５】１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】ＧＣＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析法）クロマトグラムにより得られた、工業ロットのＮ−メチルイミダゾールの不純物プロファイルを示す図である。
【図７】ＧＣＭＳクロマトグラムにより得られた、工業ロットのＮ−メチルイミダゾールの不純物プロファイルを示す図である。
【図８】１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンのＧＣＭＳピークを示す図である。
【図９】１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンのＧＣＭＳピークを示す図である。
【図１０】１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンのＧＣＭＳピークを示す図である。
【図１１】１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンがそのシッフ塩基と平衡状態にあることを示す図である。
【図１２】オリゴヌクレオチド付加化合物を生成するプロセスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
生成物であるオリゴヌクレオチド中の望ましくない付加化合物の供給源は、合成プロセスで使用されたキャッピング剤の１つであるＮ−メチルイミダゾール中の不純物であると特定された。この不純物は、いくつかの工業ロットのＮ−メチルイミダゾール中に、１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンおよび／またはそのシッフ塩基であるＮ−メチレンメタンアミンとして認められた。この２つの不純物は、通常Ｎ−メチルイミダゾール中で平衡状態で存在している。便宜上および参照しやすいように、この２つの不純物を、まとめて、１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンと呼ぶ。Ｎ−メチルイミダゾール中のかかるトリアジンの含有量は、約４０〜約７０ｐｐｍ（１００万重量部当たりの重量部）と高いことが観察されている。このトリアジンは、Ｎ−メチルイミダゾール中でガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣＭＳ）およびプロトンＮＭＲなどの分析技法により同定することができる。
【００１０】
本発明の方法では、不純物を含有するＮ−メチルイミダゾールの問題は、前記トリアジンを実質的に含有しない工業ロットのＮ−メチルイミダゾールを求めることによって解決された。好ましくは、このＮ−メチルイミダゾールは、Ｎ−メチルイミダゾールの重量を基準にして約１０重量ｐｐｍ以下しか前記トリアジンを含有しない。最も好ましくは、このＮ−メチルイミダゾールは、約１ｐｐｍ以下しか前記トリアジンを含有しない。
【００１１】
本方法の第１の工程では、ブロッキングされたヌクレオチドを準備する。最初に使用するブロッキングされたヌクレオチドは、好ましくはシリカまたはポリマーなどの支持体に共有結合させた形態で提供される。ブロッキングされたヌクレオチドは、利用可能なヘテロ環式核酸塩基のなかから様々に誘導されおよび選択される。
【００１２】
ブロッキングされたヌクレオチドをデブロッキングして、ブロッキングされていないヌクレオチドを生成する。本発明の一実施形態において、かかるデブロッキングは、好ましくはトルエンまたはジクロロメタン（ＤＣＭ）の存在下、所定量のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）と反応させることにより実施される。
【００１３】
次いで、デブロッキングされたヌクレオチドを活性化して、それを調製し、ホスホロアミダイトとカップリングさせる。活性化は、アクチベーターとの接触により実施される。
【００１４】
活性化した後、前記デブロッキングされたヌクレオチドをホスホロアミダイトとカップリング、すなわち反応させて、ホスファイトオリゴマーを生成する。ホスホロアミダイトは、利用可能なすべてのホスホロアミダイトのなかから様々に選択される。有用なオリゴヌクレオチドの生成では、このカップリング工程を、所望のオリゴヌクレオチド長が実現されるまで反復することが好ましい。
【００１５】
典型的には、かかるカップリング工程中に、一部分のデブロッキングされたヌクレオチドのみがホスホロアミダイトと反応する。未反応のヌクレオチドにはキャッピングを行わなければならない。キャッピングは、この未反応のヌクレオチドを、所定量の無水酢酸、および１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しない所定量のＮ−メチルイミダゾールと反応させることによって実施される。キャッピングしたオリゴヌクレオチドは、もはやその後のヌクレオチド付加に利用されることはない。
【００１６】
キャッピングした後、ホスファイトオリゴマーは、酸化または硫化される。本方法の一実施形態において、このホスファイトオリゴマーを、水およびピリジンの存在下、ヨウ素と反応させることにより酸化する。
【００１７】
オリゴヌクレオチドを生成する方法に関するさらなる開示は、米国特許第７，１６９，９１６Ｂ２号明細書に記載され、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本発明の特徴は、次の実施例によりさらに明らかになるであろう。実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。
【実施例】
【００１９】
実施例１：
ホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って、１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しないＮ−メチルイミダゾールのキャッピング剤を使用しながら、合成することができる。
【００２０】
図２を参照すると、ＣＰＧ固体支持体に結合している第一の塩基であるシチジンヌクレオチドは、活性部位がすべて保護されているので最初は不活性である。次の塩基を付加させるために、５’−ヒドロキシル基を保護しているジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を除去しなければならない（デブロッキング工程）。ＤＣＭ（ジクロロメタン）中（またはトルエン中）の３％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）を添加することで、ＤＭＴ基が除去され、５’−ヒドロキシル基が反応部位になることが可能になる。
【００２１】
次の塩基モノマーは、活性化される（活性化工程）まで付加することはできない。活性化は、５−エチルチオテトラゾールのようなテトラゾール系アクチベーターなどのアクチベーターをカラムに添加することによって行われる。前述した塩基の活性な５’−ヒドロキシル基と、新たに活性化されたリンとが結合して、この２つの塩基が一緒に緩く結合する。これによって、不安定なホスファイト結合が形成される。次いで、この反応カラムをアセトニトリルで洗浄して、過剰のアクチベーター、未結合のホスホロアミダイト、および副生物を除去する。ＤＭＴで保護されたヌクレオチド（ホスホロアミダイト）は４種類あり、図３に示されている。
【００２２】
反応しなかった第１の塩基はいずれも、図４に示すようにＮＭＩ（Ｎ−メチルイミダゾール）でキャッピングする（キャッピング工程）。これらの反応しなかった塩基は、合成サイクルにおいてさらに役割を果たすことはない。左側の塩基（固体の支持体にすでに結合されている）は、活性化工程で塩基に結合しなかった。未反応の５’−ヒドロキシルは、アセチル化によるさらなる反応でブロッキングされる。
【００２３】
活性化工程で、次の所望の塩基を、前の塩基に付加し、不安定なホスファイト結合を形成する。この結合を安定化するために、水およびピリジンに溶かした希ヨウ素酸化溶液を反応カラムに添加する。不安定なホスファイト（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）結合を酸化して、より安定なホスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合を形成する（酸化工程）。
【００２４】
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ  アルドリッチ社）のウェブサイト（ＳＩＡＬ．ＣＯＭ）から取得した１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図５に示す。１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンのＧＣＭＳプロファイルを図８〜１０に示す。１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンの同定されたＧＣＭＳピークを下記の表１に示す。
【００２５】
【表１】
0005956108.tif 000002
【００２６】
ＮＭＩ（Ｎ−メチルイミダゾール）の総イオンカウント数を示すＧＣＭＳクロマトグラムを図６に示す。不純物ピークが目に見えるように拡大したスケールで総イオンカウント数を示したＧＣＭＳクロマトグラムを図７に示す。データは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（島津製作所）  ＧＣＭＳ  ２０１０で収集した。
【００２７】
１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンとそのシッフ塩基の平衡式を図１１に示す。この式は、「Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｎｄ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｘｈｙｄｒｏ−１，３，５−Ｔｒｉａｌｋｙｌｔｒｉａｚｉｎｅｓ（ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアルキルトリアジンの赤外線およびＮＭＲスペクトルの研究）」、Ｃｈｅｍｉａ  Ｓｔｏｓｏｗａｎａ（１９７３年）、１７巻（３号）、３５９〜６６頁から抜粋した。
【００２８】
図１２は、１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンのオリゴマー化生成物を示す図である。
【００２９】
実施例２：
手順に従って、表２および３に記載の材料を用いて、ＤＮＡを合成する。
【００３０】
【表２】
0005956108.tif 000003
【００３１】
【表３】
0005956108.tif 000004
【００３２】
上記の説明は本発明の例示にすぎないと理解されたい。当業者は、本発明から逸脱することなく様々な代替形態および修正形態を考案することができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲内に入るような代替形態、修正形態、および変形形態をすべて包含するよう意図されている。
［本発明の態様］
１．オリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、次の工程：
（ａ）所定量のブロッキングされたヌクレオチドを準備すること；
（ｂ）前記ブロッキングされたヌクレオチドをデブロッキングして、デブロッキングされたヌクレオチドを生成すること；
（ｃ）前記デブロッキングされたヌクレオチドを活性化すること；
（ｄ）前記デブロッキングされたヌクレオチドとホスホロアミダイトをカップリングして、ホスファイトオリゴマーを生成すること；
（ｅ）所定量の無水酢酸、および１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しない所定量のＮ−メチルイミダゾールと反応させることにより、前記デブロッキングされたヌクレオチドのうちカップリングしなかったものをキャッピングすること；
（ｆ）前記ホスファイトオリゴマーを酸化してオリゴヌクレオチドを生成し、または前記ホスファイトオリゴマーを硫化してホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを生成すること；及び
（ｇ）任意的に（ｂ）から（ｆ）の工程を反復すること；
を含む、前記方法。
２．前記のブロッキングされたヌクレオチドがブロッキング基を含み、前記デブロッキングが、トルエンまたはジクロロメタン中、所定量のジクロロ酢酸と接触させることによって実施される、１に記載の方法。
３．前記のデブロッキングされたヌクレオチドの活性化が、所定量のアクチベーターとの接触によって実施される、１に記載の方法。
４．前記Ｎ−メチルイミダゾールが、Ｎ−メチルイミダゾールの重量を基準にして約１０ｐｐｍ以下の含有量の１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを有する、１に記載の方法。
５．前記ホスファイトオリゴマーを酸化し、かかる酸化が、水およびピリジン中、所定量のヨウ素と接触させることによって実施される、１に記載の方法。
６．（ｂ）から（ｆ）の工程を、所望のオリゴヌクレオチド長またはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチド長に達するまで反復する、１に記載の方法。
７．前記のブロッキングされたヌクレオチドがヘテロ環式核酸塩基のなかから選択される、１に記載の方法。
８．最初に使用する前記のブロッキングされたヌクレオチドが、支持体に共有結合している、１に記載の方法。
９．ヒドロキシル部位を有するヌクレオチドを、所定量の無水酢酸、および１，３，５−トリメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンを実質的に含有しない所定量のＮ−メチルイミダゾールと反応させることによりキャッピングすることを含む方法。
【図１】
0005956108.tif 000005
【図２】
0005956108.tif 000006
【図３】
0005956108.tif 000007
【図４】
0005956108.tif 000008
【図５】
0005956108.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
0005956108.tif 000012
【図９】
0005956108.tif 000013
【図１０】
0005956108.tif 000014
【図１１】
0005956108.tif 000015
【図１２】
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