(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養空間を形成する底面基板、側面基板および上面基板と、
前記細胞培養空間内の細胞を細胞スフェロイド形成領域に誘電泳動力により誘導する誘導機構を有し、
前記誘導機構が、前記細胞培養空間に不均一電界を発生する、側面基板の周方向に設けた複数対の電極から成ることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養容器において、
前記側面基板の周方向に設けた複数対の電極が、容器の上下方向に多層に分割されていることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の細胞培養容器において、更に、
細胞スフェロイドを固定する固定機構を有することを特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞培養容器において、
前記細胞スフェロイドを固定する固定機構が、前記底面基板および前記上面基板に設けられ、前記細胞培養空間に不均一電界を発生する対の電極であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項５】
請求項３に記載の細胞培養容器において、
前記細胞スフェロイドを固定する固定機構が、前記底面基板に設けられた細胞接着領域であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞培養容器において、更に、
前記底面基板および前記上面基板に設けた直流電圧を印加する電極から成り、直流電界によって接着細胞を剥離する剥離機構を備えることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
細胞培養空間を形成する底面基板、側面基板および上面基板と、
前記細胞培養空間内の細胞を細胞スフェロイド形成領域に誘電泳動力により誘導する誘導機構を有し、
前記誘導機構が、前記細胞培養空間に不均一電界を発生する、前記底面基板に設けた複数の突起の表面に形成した導電性皮膜の電極と、前記上面基板に設けた対向電極から成ることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養容器において、
前記複数の突起が、中心部の突起が周囲の突起よりも高い構造であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の細胞培養容器において、更に、
前記底面基板に設けた導電性皮膜の電極および前記上面基板に設けた対向電極に直流電圧を印加する剥離機構を備えることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１つに記載の細胞培養容器において、
前記電極が、白金、金、クロム、パラジウム、ロジウム、銀、アルミニウム、タングステン、ＩＴＯの何れか１つ、またはこれらの組み合わせの材料からなる細胞培養容器。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１つに記載の細胞培養容器と、
前記誘導機構の電極に交流を印加する交流電源から成る細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞培養装置において、
前記誘導機構の電極に印加する交流の周波数は１００Ｈｚ〜１０ＭＨｚである細胞培養装置。
【請求項１３】
請求項１１に記載の細胞培養装置において、
周期的に細胞スフェロイドに電界を印加するように構成した細胞培養装置。
【請求項１４】
請求項１１に記載の細胞培養装置において、更に、
前記底面電極および前記上面電極に設けた電極間のインピーダンスを測定するインピーダンス測定装置を備え、測定したインピーダンスにより細胞スフェロイドのサイズや厚みを評価するように構成した細胞培養装置。
【請求項１５】
請求項１〜１０の何れか１つに記載の細胞培養容器を用いて、前記電極に交流を印加することにより、前記細胞培養空間内の細胞を細胞スフェロイド形成領域に誘電泳動力により誘導する細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器を用いて動物細胞を培養し、細胞の球状組織（三次元組織）の細胞スフェロイドを形成する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞工学の発展および再生医療に注目が集まっており、生体外で適切な形で培養した細胞を、治療応用および医薬品開発のシミュレーターとして使用する試みが活発に行なわれている。これらの目的において、培養される細胞は各種臓器機能の担い手である実質細胞が中心であるが、一般に生体外で実質細胞の機能を維持した状態で長期の培養を行なうことは困難であり、この点を解決するための様々な試みがなされている。【０００３】
その一例として、多数の細胞を三次元的に凝集させた状態を作って培養を行なうスフェロイド培養系は、細胞極性および細胞間相互作用の維持という観点から、生体外における優れた実質細胞培養系である。これまでに骨芽細胞、肝細胞など、多種類の細胞に適用した様々な報告がある。中でも肝細胞のスフェロイド培養は、人工肝臓に適用できる可能性、また生体外における薬物代謝シミュレーターに応用できる可能性などがあることから、これまでに数多くの報告例がある。【０００４】
ここで細胞スフェロイド培養は生体外における優れた実質細胞培養系であるが、難点として、細胞にダメージを与えずにスフェロイド化させる手法、およびスフェロイド化した細胞を維持する簡便な手法が確立していないことが挙げられる。【０００５】
主な細胞スフェロイド形成の手法として、（１）物理的な力（培養液の撹拌など）で細胞を強制的に浮遊状態に保ち、細胞同士の接着確率を高める方法（非特許文献１）、もしくは（２）細胞培養表面の改質、あるいは培養容器の形状により、スフェロイド化を促進する方法（非特許文献２）が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０（１９９６）ｐｐ．４０４−４１５
【非特許文献２】Ｙａｍａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４７（２００１）ｐｐ．１６５−１７１
【非特許文献３】Ｈ．Ｐｏｈｌ：Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９７８）ｐｐ．６０−７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術で述べた手法で形成された細胞スフェロイドは、器材からの剥離性が高く、培地交換の過程で失われる、サイズ制御できず品質を維持することが困難であるという課題がある。またさらに、細胞の自己組織化による細胞スフェロイドの形成に時間がかかる、形成した細胞スフェロイドのハンドリング性が低いという課題を有している。【０００８】
そこで本発明は、細胞操作に有効な誘電泳動を用い、細胞三次元組織の細胞スフェロイドを、均一かつ効率的に形成することができる細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、例えば請求の範囲に記載の構成を採用する。【００１０】
本発明の細胞培養容器の一例を挙げるならば、細胞培養空間を形成する底面基板、側面基板および上面基板と、前記細胞培養空間内の細胞を細胞スフェロイド形成領域に誘電泳動力により誘導する誘導機構を有し、前記誘導機構が、前記細胞培養空間に不均一電界を発生する電極を有するものである。【００１１】
本発明の細胞培養容器において、前記電極を有する誘導機構が、側面基板の周方向に設けた複数対の電極から成るものでよい。【００１２】
また、本発明の細胞培養容器において、前記電極を有する誘導機構が、前記底面基板に設けた複数の突起の表面に形成した導電成膜の電極と、前記上面基板に設けた電極から成るものでよい。【００１３】
本発明の細胞培養装置は、上記の細胞培養容器と、前記誘導機構の電極に交流を印加する交流電源から成るものである。【００１４】
また、本発明の細胞培養方法は、上記の細胞培養容器を用いて、前記電極に交流を印加することにより、細胞培養空間内の細胞を細胞スフェロイド形成領域に誘電泳動力により誘導するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞三次元組織の細胞スフェロイドを、均一かつ効率的に形成することが可能となる。さらに、電気力線のイオン誘導効果により細胞外マトリックスの形成を促進し、より速く細胞スフェロイドを形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例１に係る細胞培養容器の一構成例を示す図である。
【図２】図１の細胞培養容器の断面を示す図である。
【図３】交流電界の周波数とクラウジウス・モソッティ数の実部Ｒｅ［Ｋ］の関係を示す図である。
【図４】本発明の実施例１に係る細胞培養容器の他の構成例を示す図である。
【図５】電極間の細胞の等価回路を説明する図である。
【図６】細胞培養プレートの構成を示す図である。
【図７】本発明の実施例２に係る細胞培養容器の構成例を示す図である。
【図８】本発明の実施例３に係る細胞培養容器の構成例を示す図である。
【図９】本発明の実施例３に係る細胞培養容器の他の構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施例を、図面に基づいて詳細に説明する。なお、実施例を説明するための全図において、同一の機能を有する要素には同一の名称、符号を付して、その繰り返しの説明を省略する。
【００１８】
以下の実施例では、細胞操作に有効な誘電泳動を用いたスフィロイド作製培養容器について詳述するが、理論としての前提について、以下に説明する。下記の説明に用いる理論はあくまで一例であり、これに限るものではない。
【００１９】
誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の式１で与えられる（非特許文献３）。以下、誘電体粒子が細胞である場合を例として説明する。
【００２０】
【数１】
0005903156.tif 000002
【００２１】
ここで、ａ：球形近似したときの細胞の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：培地の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、∇は勾配を表す演算子である。この場合、∇Ｅ２は、電界強度の二乗Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜をもっているか、つまり電界が空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、式２で表される。ここで、εｂ＊およびεｍ＊はそれぞれ、細胞および培地の複素誘電率を表す。Ｒｅ［Ｋ］は、クラウジウス・モソッティ数の実部を表すと定義すると、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、細胞は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電界集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。
【００２２】
【数２】
0005903156.tif 000003
【００２３】
一般に複素誘電率εｒ＊は式３で表される。
【００２４】
【数３】
0005903156.tif 000004
【００２５】
ここで、εｒ：細胞あるいは培地の比誘電率、σ：細胞あるいは培地の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。式１、式２、式３から、誘電泳動力は、細胞の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部および電界強度に依存することがわかる。また、クラウジウス・モソッティ数の実部は、培地および細胞の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することがわかる。
【実施例１】
【００２６】
本発明の実施例１に係る細胞培養容器の一構成例を、図１および図２に基づいて説明する。図１は細胞培養容器の平面図、図２は、図１のＡ−Ａ’断面図である。【００２７】
図において、１は細胞培養容器の天井基板、２は細胞培養容器の底面基板、３は細胞培養容器の側面基板である。５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは細胞培養容器の側面基板に設けた細胞を誘導する電極である。また、４Ａ、４Ｂは細胞凝集体を固定する電極である。８は培養容器の内部空間で、細胞７が含まれた培地で充満している。９と１０は交流電源、１１は電極対４Ａ，４Ｂ間のインピーダンスを計測するインピーダンス計測装置である。１２Ａは電極５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ間の電気力線、１２Ｂは電極４Ａ、４Ｂ間の電気力線を示す。【００２８】
上述の天井基板１および底面基板２は、ガラス、シリコン、石英、またはプラスチック類およびポリマー類等の絶縁性の固体基板を基材として形成することが可能である。より望ましくは光学顕微鏡等での観察が可能な程度の光透過性を有し、さらに底面基板２は細胞を表面に付着させないように、前処理により基板の表面改質を行うことができる材質を備えることが望ましい。【００２９】
電極には、白金、金、クロム、パラジウム、ロジウム、銀、アルミニウム、タングステン、ＩＴＯの何れか１つ、またはこれらの組み合わせの材料を用いることができる。【００３０】
細胞培養、特に動物細胞培養には、イオンリッチの高導電率培地（１０００ｍＳ／ｍ以上）が一般的に使われている。図３は、交流電界の周波数とクラウジウス・モソッティ数の実部Ｒｅ［Ｋ］の関係を示す図である。培地の導電率が１０００ｍＳ／ｍ以上になると、誘電泳動が周波数１０９Ｈｚ以内において全て負の誘電泳動になることがわかる。つまり、細胞は電界集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。なお、誘電泳動力は、Ｒｅ［Ｋ］の大きさに比例するため、印加周波数は１００〜１０ＭＨｚが望ましい。【００３１】
本実施例の細胞誘導機構電極は、図１に示すように、４つの電極５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂの中央部に弱電界部を形成している。そのため、高導電率培地中の細胞がこの弱電界部に移動して凝集することができる。なお、上記実施例では、誘導機構電極の形状について円形状を説明したが、四角形や多角形などの形状でもよいことは言うまでもない。また、電極数を４つで説明したが、４つ以上の偶数電極でもよい。【００３２】
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、図１に示すような弱電界部を形成させる電極形状であれば、高導電率培地中の細胞を負の誘電泳動力によって弱電界部に移動させること、または固定することができる。さらに、細胞スフェロイドの形を制御するために、図４に示すような多層式誘導電極５Ａ１、５Ａ２、５Ａ３、６Ａ１、６Ａ２、６Ａ３、５Ｂ１、５Ｂ２、５Ｂ３を設けてもよい。この細胞培養容器において、各層の電極に異なる交流電界を印加し、各層に発生する強さの異なる誘電泳動力により細胞凝集体の形を制御することができる。例えば、中央部の電極５Ａ２、６Ａ２、５Ｂ２に、上側および下側の電極５Ａ１、５Ａ３、６Ａ１、６Ａ３、５Ｂ１、５Ｂ３に対して弱い交流電界を印加することにより、上側及び下側から中央部に細胞を移動させ、球状の細胞凝集体を作成することができる。ここでは、３層電極について説明したが、２層または４層以上の電極でもよいことは言うまでもない。【００３３】
以下、本発明の細胞培養容器を用いた細胞スフェロイド形成のフローについて、図１および図２を用いて説明する。【００３４】
培養容器の培養空間８に細胞７を播種する。細胞播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で、まず図１の交流電源９より細胞誘導電極５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂに交流電界を印加する。その結果、従来法の細胞自己組織化や重力による凝集化に比べ、負の誘電泳動力によって細胞が速やかに培養容器の中央部に集まり、細胞の凝集体になる。次に、そのまま培養することにより、細胞間接着構造あるいは細胞外マトリックスが形成されて、細胞スフェロイドが形成される。この時点で交流電源９を切る。ここから培地交換を行なう。図２に示すように、培地交換時、細胞スフェロイドを固定するために、交流電源１０から電極４Ａ、４Ｂに交流電界を印加する。その結果、負の誘電泳動力により電極４Ｂ側に固定された細胞スフェロイドは、培地交換時に流されることがなく、培養容器内に保持される。一定期間の静置培養より、大きさの揃った球状の三次元組織が形成される。これは、本来保持している細胞の活性を失わせることがないと考えられるため、細胞アッセイ等に有効な培養方法である。【００３５】
また、電気力線１２Ａ、１２Ｂは、細胞間イオンの移動を促進する効果があるため、周期的に細胞スフェロイドに印加することによって、細胞外マトリックスの形成を促進することが可能となる。【００３６】
また、電極４Ａ、４Ｂの電極ギャップ間のインピーダンス変化をインピーダンス計測装置１１で計測することより、弱電界部に誘導される細胞数やスフェロイドのサイズなどを推定できる。以下、固定機構電極４Ａ、４Ｂ間のインピーダンスを計測することによって細胞スフェロイドのサイズや厚みを推定する方法について説明する。電極間インピーダンスをＺ、静電容量をＣ、リアクタンスをｘ、レジスタンスをｒ、抵抗をＲとして、図５と式４〜式８を用いて説明する。【００３７】
【数４】
0005903156.tif 000005
【００３８】
【数５】
0005903156.tif 000006
【００３９】
【数６】
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【００４０】
【数７】
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【００４１】
【数８】
0005903156.tif 000009
【００４２】
式４はＣＲ並列等価回路の合成インピーダンスＺを表す式、式５はＣＲ並列等価回路のレジスタンスｒを表す式、式６はＣＲ並列等価回路のリアクタンスｘを表す式、式７はＣＲ並列等価回路の抵抗Ｒを表す式、式８はＣＲ並列等価回路の静電容量Ｃを表す式である。【００４３】
図５は、細胞培養容器の電極１３間の電気的状態を等価回路で示したものである。電極１３間には細胞を含んだ培地が存在している。細胞が電極間に移動する前には、培地を電極間誘電体として構成される静電容量Ｃ１４と培地による電気伝導抵抗Ｒ１５とが、並列に電極１３間を結んでいる。つまり、培養容器の上部下部電極４Ａ，４Ｂ間のインピーダンスの変化量によって局所の細胞数や細胞凝集体のサイズなどを推定することができる。その結果、光学顕微鏡観察の代わりに、電気信号を利用して、簡便かつ迅速に細胞スフェロイド形成状況を評価できる。【００４４】
大量にスフェロイドを形成するための培養プレートは、図６に示すように、前記細胞培養容器を集約する細胞培養プレートホール１７と枠体１６で構成される。本培養プレートは同時に多数の細胞スフェロイドを形成することができ、毒性など比較実験に適する。培養プレートの誘導電極や固定電極は、半導体の微細配線技術などによって作製することができる。【００４５】
本実施例によれば、本発明の細胞培養容器を用いることにより、より短期間で均一サイズの細胞スフェロイドを作製することができる。【００４６】
以下に、本実施例の細胞培養容器を用いてラット肝細胞スフェロイドを形成した実験結果を示す。【００４７】
肝細胞の調製は、ｉｎ  ｓｉｔｕコラゲナーゼ貫流法に従う。詳しくは以下の通りである。Ｆｉｓｈｅｒ３４４系雄ラット（７〜１０週齢）をペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前還流液（Ｃａ２＋とＭｇ２＋不含、ＥＴＣＡを含むハンクス液）を注入する。肝臓を切り離し、冷やしたハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより、細胞まで分散する。続いてガーゼ濾過により未消化の組織を除去する。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返すことにより、非実質細胞を除去する。ついで等張パーコール液を使用して５００Ｇ、５分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことはいうまでもない。調製した肝細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの播種濃度で培養容器に播種する。細胞播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で、まず図１の交流電源９より細胞誘導電極５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂに周波数１００ｋＨｚ、電圧２０Ｖｐｐの交流電界を印加する。その結果、負の誘電泳動力によって肝細胞が培養容器の中央部に集まり、肝細胞の凝集体になる。次に、そのまま１２時間培養することにより、肝細胞間接着構造を形成し肝細胞スフェロイドが形成された。この時点で交流電源９を切り、２４時間毎に培地交換を行なう。培地交換時、細胞スフェロイドを固定するために、交流電源１０から電極４Ａ、４Ｂに周波数１００ｋＨｚ、電圧２０Ｖｐｐの交流電界を印加する。その結果、負の誘電泳動力により固定された肝細胞スフェロイドは、培地交換時に流されることがなく培養容器内に保持される。７２時間の静置培養より、大きさの揃った球状の三次元組織が形成された。これは、本来保持している細胞の活性を失わせることがないと考えられるため、細胞アッセイ等に有効な培養方法である。【００４８】
本実施例では、ラット肝細胞を用いた例を示すが、上述のように様々な動植物の細胞種に適用可能であり、特に細胞種は限定されない。
【実施例２】
【００４９】
本実施例は、細胞接着性の底面基板電極４Ｂを有する細胞培養容器である。なお、細胞を誘導する細胞誘導電極５Ａ，５Ｂ，６Ａ，６Ｂは、図１と同様である。本実例を図７に基づいて説明する。【００５０】
電極４Ｂの表面は実施例１と異なり、細胞接着ための表面処理を施す。培養容器の培養空間８に細胞７を播種する。細胞播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で、まず図１の交流電源９より細胞誘導電極５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂに交流電界を印加する。その結果、従来法の細胞自己組織化や重力による凝集化に比べ、負の誘電泳動力によって細胞が速やかに培養容器の中央部に集まり、細胞の凝集体になる。底面基板電極４Ｂの表面は細胞接着性があるため、細胞凝集体を固定することができる。次にそのまま培養することにより、細胞間接着構造あるいは細胞外マトリックスが形成されて、細胞スフェロイドが形成される。この時点で交流電源９を切る。ここから培地交換を行なう。細胞スフェロイドは、底面基板電極の表面に固定されているため、流されることはない。その後、一定期間の静置培養より、大きさの揃った球状の三次元組織が形成される。細胞スフェロイドを培養面から剥離するには、直流電源１８から電極４Ａ、４Ｂの間に直流電界を印加し、電極４Ｂ表面に起こる培地の電気分解の効果により、細胞スフェロイドを培養面４Ｂから剥離することができる。従来の細胞剥離に使われる酵素（例えば、トリプシン）を使わずに細胞スフェロイドを剥離することができる。これにより、蛋白質分解などの細胞損傷を回避することができる。【００５１】
本実施例によれば、本発明の細胞培養容器を用いることにより、より短期間で均一サイズの細胞スフェロイドを作製することができる。
【実施例３】
【００５２】
本実施例は、培養容器底面基板にナノピラー構造を有する培養シートを設けたものである。図８，９に、本実施例の培養容器の断面構造を示す。【００５３】
図８の細胞培養容器は、ナノピラー構造１９を有する培養シートを培養容器底面基板２に設け、その表面に導電性皮膜２０を蒸着し、さらに対向電極２１を設ける構造である。この構造では、ナノピラー先端を強電界領域にするため、正の誘電泳動力で細胞スフェロイドを形成することとなる。そのため、前記の培地の導電率を正の誘電泳動が働く領域以下に下げる必要がある（図３に参照）。この導電率調整は、培地に低導電率の糖溶液などを混合することにより処理できる。【００５４】
細胞播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で、まず図８の交流電源１０より電極２０、２１に交流電界を印加する。その結果、従来法の細胞自己組織化や重力による凝集化に比べ、正の誘電泳動力によって、細胞が速やかに強電界領域であるナノピラー１９上に集まり細胞の凝集体になる。ナノピラー１９表面は細胞接着性があるため、細胞凝集体を固定することができる。次にそのまま培養することにより、細胞間接着構造あるいは細胞外マトリックスが形成されて、細胞スフェロイドが形成される。この時点でスイッチ２２ＡをＯＦＦとし、交流電源１０を切る。ここから培地交換を行なう。細胞スフェロイドは、ナノピラー構造に固定されているため、流されることはない。その後、一定期間の静置培養より、大きさの揃った球状の三次元組織が形成される。細胞スフェロイドを培養面から剥離するには、スイッチ２２ＢをＯＮにし、直流電源１８から電極２０，２１の間に直流電界を印加し、電極２０表面に起こる培地の電気分解の効果により、細胞スフェロイドをナノピラー１９から剥離することができる。さらに、インピーダンス計測装置１１を用いて電極２０，２１間のインピーダンスを測定し、培養容器の電極２０，２１間のインピーダンスの変化量によって細胞数や細胞スフェロイドのサイズなどを推定することができる。【００５５】
図９の細胞培養容器は、図８のナノピラー構造を変形したもので、図８のナノピラー構造の中心部のピラーが周囲のピラーより高い構造である。この構造を用いることにより、図に示すように、中心部の高いピラーに電界が集中し、正の誘電泳動力によって細胞が速やかに培養容器のナノピラー１９上に集まり細胞の凝集体を形成することが可能となる。さらに、この構造で形成する細胞スフェロイドは、所在位置がナノピラーシートの中心にあり、観察や計測を簡単に行うことができる。【００５６】
以下に、実施例３の細胞培養容器を用いてラット肝細胞スフェロイドを形成した実験結果を示す。【００５７】
実験条件は、実施例１の実験と同様である。ラット肝細胞懸濁液の導電率を７０ｍＳ／ｍ以下に調製し実施例３の細胞培養容器に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの播種濃度で播種した。播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で、まず図８の交流電源１０より細胞誘導電極２０、２１に周波数１００ｋＨｚ、電圧２０Ｖｐｐの交流電界を印加する。その結果、正の誘電泳動力によって肝細胞が培養容器中央部に形成された細胞接着性を有するナノピラー１９上に集まり、肝細胞の凝集体になる。次にそのまま１２時間培養することにより、肝細胞間接着構造を形成して肝細胞スフェロイドが形成された。この時点で交流電源１０を切る。ここから２４時間毎に培地交換を行なう。肝細胞スフェロイドは接着性を有するナノピラー上に接着したため、培地交換時に剥離することがなく、培養容器中に維持される。また、培養時におけるインピーダンス計測装置１１による電極間のインピーダンス変化の計測により、肝細胞スフェロイドの大きさや厚みを推定することができる。７２時間の静置培養より、大きさの揃った球状の三次元組織が形成された。培養後、直流電源１８から電極２０、２１に１Ｖ電圧を印加して、肝細胞スフェロイドをナノピラー上から剥離することができる。【００５８】
本発明の特徴を損なわない限り、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の形態についても、本発明の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００５９】
１  培養容器の天井基板
２  培養容器の底面基板
３  培養容器の側面基板
４Ａ  天井電極
４Ｂ  底面基板電極
５Ａ  側面電極
５Ａ１、５Ａ２、５Ａ３  側面電極
５Ｂ  側面電極
５Ｂ１、５Ｂ２、５Ｂ３  側面電極
６Ａ  側面対向電極
６Ａ１、６Ａ２、６Ａ３  側面電極
６Ｂ  側面対向電極
６Ｂ１、６Ｂ２、６Ｂ３  側面電極
７  細胞
８  培養空間
９  交流電源
１０  交流電源
１１  インピーダンス計測装置
１２Ａ  電気力線
１２Ｂ  電気力線
１３  電極
１４  静電容量Ｃ
１５  抵抗Ｒ
１６  細胞培養プレート枠体
１７  細胞培養プレートホール
１８  直流電源
１９  ナノピラー
２０  底面電極
２１  天井電極
２２Ａ  スイッチ
２２Ｂ  スイッチ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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