(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとり、温度応答性ポリマーの含量は３０〜９０ｗｔ％であるブロックコポリマーが、基材表面に温度応答性ポリマー分として０．８〜３．０μｇ／ｃｍ2の割合で被覆されている、細胞培養用温度応答性基材。
【請求項２】
基材表面に水不溶性ポリマー分として０．０９〜７．０μｇ／ｃｍ2の割合で被覆されている、請求項１記載の細胞培養用温度応答性基材。
【請求項３】
基材表面が相分離構造を有する、請求項１または２記載の細胞培養用温度応答性基材。
【請求項４】
ブロックコポリマー内の温度応答性ポリマーの平均分子量が３０００以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養用温度応答性基材。
【請求項５】
温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテルのいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞培養用温度応答性基材。
【請求項６】
温度応答性ポリマーがポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞培養用温度応答性基材。
【請求項７】
基材が板状の単独、もしくは２種以上を組み合わせたものであることを特徴とする請求項１〜６いずれか１項記載の温度応答性基材。
【請求項８】
水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとり、温度応答性ポリマーの含量は３０〜９０ｗｔ％であるブロックコポリマーを有機溶媒に溶解、もしくは分散させ、当該ブロックコポリマー溶液を基材表面へスピンコートすることで均一に塗布し、乾燥させることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養用温度応答性基材の製造方法。
【請求項９】
ブロックコポリマーが可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって得られるものである、請求項８記載の細胞培養用温度応答性基材の製造方法。
【請求項１０】
ブロックコポリマーを溶解する溶媒が、アセトニトリルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合液である、請求項８または９記載の細胞培養用温度応答性基材の製造方法。
【請求項１１】
アセトニトリルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合溶媒の混合比率が、体積比で５：１である、請求項１０記載の細胞培養用温度応答性基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学等の分野において有用な細胞培養基材に関するものである。本出願は、２０１０年８月３１日に提出された日本特許出願（特願２０１０−２０８５０６号）を基礎とする優先権主張出願である。
【背景技術】
【０００２】
今日、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化するだけでなく、今や細胞やその表層蛋白質を分析することで有用な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で増殖させ、或いはその細胞の機能を高めた後、患者の生体内へ戻して治療することも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術は、多くの研究者に注目されている。【０００３】
ところで、ヒト細胞を含め動物細胞の多くは付着依存性のものである。すなわち、動物細胞を生体外で培養しようとするときは、それらを一度、足場となる何らかの基材に付着させる必要性がある。そのような背景のもと、以前より多くの研究者らによって細胞にとってより好ましい基材表面の設計および考案がなされてきた。しかし、これらの技術は何れも細胞培養時に関係するものばかりであった。付着依存性の培養細胞は何かの基材に付着する際、自ら接着性蛋白質を産生する。従ってその細胞を剥離させるときには、従来技術では、例えば、酵素処理等によってその接着性蛋白質を破壊しなければならなかった。その結果、細胞が培養中に産生した各種細胞固有の細胞表層蛋白も同時に破壊されてしまうという欠点があったにもかかわらず、現実には解決する手段が全くなく、特に検討されていなかった。【０００４】
このような背景のもと、特開平２−２１１８６５号公報（特許文献１）には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で細胞を培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特開平０５−１９２１３８号公報（特許文献２）には、特開平２−２１１８６５号公報（特許文献１）記載の温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。さらに、特願２００７−１０５３１１号公報（特許文献３）には、特開平２−２１１８６５号公報（特許文献１）記載の温度応答性細胞培養基材を用いた培養細胞の表層蛋白質の修復方法が記載されている。このように温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。【０００５】
しかしながら、従来技術は、化学的に不活性なエンジニアプラスチックの表面を電子線等のような高エネルギーを使って被覆加工するものであり、そのためには電子線照射装置のような大掛かりな装置が必要であり、従って、基材の価格も必然的に高くなるという問題点がある。【０００６】
そのような問題点を解決するために、これまでに幾つかの技術が開発されてきた。例えば、Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，５，２９３７−２９４６（２００９）（非特許文献１）、Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，４，１１５１−１１５７（２００７）（非特許文献２）に記載されているように、特定の分子構造を有するポリマーを合成し、基材表面へ被覆する方法が知られている。しかし、いずれの技術も、従来の細胞培養用基材と同等に細胞を培養でき、上記電子線を用いて作製した細胞培養用温度応答性基材と同等に細胞を温度変化するだけで剥離させ、または、培養細胞がコンフルエントの状態になった場合には細胞シートとして剥離させる得る技術レベルには達していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開平０５−１９２１３８号公報
【特許文献３】特願２００７−１０５３１１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，５，２９３７−２９４６（２００９）
【非特許文献２】Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，４，１１５１−１１５７（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想に基づいて創作した新規な細胞培養用温度応答性基材およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、本発明者らは、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーを基材表面に温度応答性ポリマー分として０．８〜３．０μｇ／ｃｍ2の割合で被覆すると、効率良く細胞を培養でき、しかも基材面の温度を変えるだけで効率良く培養細胞または細胞シートを剥離できることを見出した。これらの知見は、本発明者らが、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーの持つ立体規則性、並びに基材表面上での形態に着目し、鋭意研究した結果に基づくものである。さらに、このような細胞培養用基材は、従来技術の温度応答性細胞培養用基材よりも高性能であることが分かった。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【００１１】
本発明によれば、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーが、基材表面に温度応答性ポリマー分として０．８〜３．０μｇ／ｃｍ2の割合で被覆されている細胞培養用温度応答性基材が提供される。なお、本発明の細胞培養用応答性基材は、限定されないが、好ましい態様として下記の態様を含む。【００１２】
本発明の一態様では、基材表面に水不溶性ポリマー分として０．０９〜７．０μｇ／ｃｍ2の割合で被覆されている。
本発明の一態様では、基材表面が相分離構造を有する。
本発明の一態様では、ブロックコポリマー内の温度応答性ポリマーの含量が３０〜９０ｗｔ％である。
本発明の一態様では、ブロックコポリマー内の温度応答性ポリマーの平均分子量が３０００以上である。なお、図２で示したように、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比が１に近いことから、本発明の効果を得るためには、いずれの平均分子量を採用してもよい。
本発明の一態様では、温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテルのいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる。
本発明の一態様では、温度応答性ポリマーがポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである。
本発明の一態様では、基材が板状の単独、もしくは２種以上を組み合わせたものであることを特徴とする。【００１３】
また、本発明によれば、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーを有機溶媒に溶解、もしくは分散させ、当該ブロックコポリマー溶液を基材表面へスピンコートすることで均一に塗布し、乾燥させることを特徴とする細胞培養用温度応答性基材の製造方法が提供される。なお、本発明の細胞培養用応答性基材の製造方法は、限定されないが、好ましい態様として下記の態様を含む。【００１４】
本発明の一態様では、ブロックコポリマーが可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって得られるものである。
本発明の一態様では、ブロックコポリマーを溶解する溶媒が、アセトニトリルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合液である。
本発明の一態様では、アセトニトリルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合溶媒の混合比率が、体積比で５：１である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る細胞培養用温度応答性基材を使用することにより、効率良く細胞を培養することができ、しかも基材面の温度を変えるだけで効率良く培養細胞または細胞シートを剥離することができる。また、本発明によれば、このような機能性表面を簡便に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１のブロックコポリマーの合成経路を示す図である。
【図２】実施例１で得られたブロックコポリマーの特性を示す図である。
【図３】実施例１で得られた温度応答性表面の特性を示す図である。ＡＴＲ／ＦＴ−ＩＲ測定による温度応答性ポリマー修飾量と被覆膜の安定性を評価した。
【図４】実施例１で得られた温度応答性表面の特性を示す図である。ＰＩＰＡＡｍ固定量と静的接触角測定（水中気泡法）による表面ぬれ性を評価した。
【図５】実施例１で得られた各修飾量の温度応答性表面と細胞挙動の関係を示す図である。
【図６】実施例１で得られた各修飾量の温度応答性表面と細胞挙動の関係を示す写真である。ＴＣＰＳ（Ａ）上、並びにＴＣＰＳ上にそれぞれＢ７９−ＩＰ１２０を０．１ｗ／ｖ％（Ｂ）、０．３ｗ／ｖ％（Ｃ）、および０．５ｗ／ｖ％（Ｄ）で被覆した温度応答性表面に、３７℃にて細胞を播種後、７２時間における接着細胞の顕微鏡写真を示す。その後、２０℃へと温度を低下させ、さらに２時間培養した後の細胞の形態をそれぞれ（Ｅ）〜（Ｈ）に示す。細胞の播種：５．０×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2。
【図７】ＰＩＰＡＡｍ分子鎖長と細胞挙動の関係を示す図である。
【図８】ブロックコポリマーの鎖長と細胞挙動の関係を示す図である。
【図９】実施例１で得られた温度応答性表面上で細胞を培養して検討した結果を示す図である。
【図１０】実施例１乃至３で得られた温度応答性表面と細胞シート形成の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーが、基材表面に０．８〜３．０μｇ／ｃｍ2の割合で被覆されている細胞培養用温度応答性基材である。基材表面に被覆されたブロックコポリマーの水不溶性ポリマー部分は、細胞培養中、並びに温度変化に基づいて培養細胞または細胞シートを剥離させるときにおいても基材表面から遊離されないという効果を有する。
【００１８】
一般に、「ブロックコポリマー」とは、少なくとも２種の組成的に別個のセグメントを有するポリマーを意味し、当業者に理解されているように、例えば、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、ランダムブロックコポリマー、星状枝分れブロックコポリマーまたはハイパーブランチブロックコポリマーが挙げられる。本発明で使用されるブロックコポリマーは、典型的には、水不溶性ポリマーセグメント（Ａ）と温度応答性ポリマーセグメント（Ｂ）を有するが、以下の構造：２つのブロックセグメントを含むＡ−Ｂ構造；３つのブロックセグメントを含むＡ−Ｂ−Ａ又はＢ−Ａ−Ｂ；および複数のブロックを含む−（Ａ−Ｂ）n−（ここで、ｎは２以上の整数である）のいずれであってもよい。なお、本発明の細胞培養用温度応答性基材に使用され得るブロックコポリマーは、上記の構造に照らせば、Ａ−Ｂ構造が好ましい。本明細書においては、Ａ−Ｂ構造を有するブロックコポリマーが、例えば、水不溶性ポリマーセグメント（Ａ）としてポリ−ｎ−ブチルメタクリレート（ＰＢＭＡ）のセグメントと温度応答性ポリマーセグメント（Ｂ）としてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）のセグメントからなる場合、ブロックコポリマーは、各ポリマーのモノマー単位の数（例えば、ＢＭＡが７９個、ＩＰＡＡｍが１２０個）を用いて、「Ｂ７９−ＩＰ１２０」等と表記する場合がある（実施例１参照）。
【００１９】
本明細書で用いられる「水不溶性ポリマー」には、水に不溶なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ポリ−ｎ−ブチルアクリレート、ポリ−ｔ−ブチルアクリレート等のポリアルキルアクリレート、ポリ−ｎ−ブチルメタクリレート、ポリ−ｔ−ブチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート等のポリアルキルメタクリレート、ポリスチレン等が挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる「温度応答性ポリマー」とは、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマーおよび／または上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）を有するポリマーを意味するが、それらのホモポリマー、コポリマー、或いは混合物のいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体、ポリビニルアルコール部分酢化物が挙げられる。コポリマーの場合は、これらモノマーの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合体、ポリマー同士のグラフトまたは共重合体、あるいはポリマーおよび／またはコポリマーの混合物を用いてもよい。また、必要に応じて、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
【００２１】
通常、分離される物質が生体物質であることから、５℃〜５０℃の範囲で対象とする生体物質を分離するのに適した温度応答性ポリマーを選択する必要がある。本発明に使用され得る温度応答性ポリマーは、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテルのいずれか１つ、または２以上の組み合わせであってもよい。より具体的には、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。好ましくは、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである。
【００２２】
本発明で使用される温度応答性ポリマーは、上記ブロックコポリマー内の含量として３０〜９０ｗｔ％の範囲が良く、好ましくは４０〜８５ｗｔ％の範囲が良く、さらに好ましくは４５〜６０ｗｔ％の範囲が良い。３０ｗｔ％より少ない場合、温度を変えても当該ポリマー上の培養細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に９０ｗｔ％より多いと、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となり、本発明の細胞培養基材として好ましくなく、また、本ブロックコポリマーの水不溶性ポリマー部分が少なくなり基材表面から遊離し易くなり好ましくない。
【００２３】
本発明で使用される温度応答性ポリマーは、平均分子量として３０００以上のものが良く、好ましくは５０００以上のものが良く、さらに好ましくは１００００以上のものが良く、最も好ましくは１２０００以上が良い。分子量が３０００より少ない場合、温度を変えても当該ポリマー上の培養細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。また、本発明によれば、本発明で使用される温度応答性ポリマーの分子量は、上記下限値であれば、分子量の上限値に制限されずに培養細胞の剥離を効率良く行うことができる。一態様として、温度応答性ポリマーの平均分子量の上限値は、３５０００であってもよく、好ましくは３００００であり、より好ましくは２５０００である。
【００２４】
本発明に係る細胞培養用温度応答性基材は、上記ブロックコポリマーにおける温度応答性ポリマー分として０．８〜３．０μｇ／ｃｍ2の範囲で被覆されたものであり、好ましくは０．９〜２．０μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは１．３〜１．８μｇ／ｃｍ2である。０．８μｇ／ｃｍ2より少ない被覆量のとき、温度を変えても当該ブロックコポリマー上の培養細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に３．０μｇ／ｃｍ2より多いと、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となり、本発明の細胞培養基材として好ましくない。なお、被覆量の測定は常法に従えばよく、例えばＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法、元素分析法、ＥＳＣＡ等を利用すればよく、いずれの方法を用いてもよい。
【００２５】
本発明に係る細胞培養用温度応答性基材は、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントがそれぞれ所定の割合で結合した構造をとるブロックコポリマーが基材表面に被覆されていることを特徴とする。ここで、「水不溶性ポリマー」の割合は、上記の通り、温度応答性ポリマーが９０ｗｔ％を超える場合、すなわち、水不溶性ポリマーが１０ｗｔ％より少ない場合には、ブロックコポリマーが基材表面から遊離し易くなるため、ブロックコポリマーにおける水不溶性ポリマーの割合は１０ｗｔ％以上であればよい。また、本発明に係る細胞シートを製造する場合、主にブロックコポリマーを構成する温度応答性ポリマーの被覆量が重要となるため、ブロックコポリマーにおける水不溶性ポリマー含量は、培養基材に上記の所望の範囲量の温度応答性ポリマーが被覆できるように適宜調整しさえすればよい。より具体的には、本発明に係る細胞培養用温度応答性基材は、上記ブロックコポリマーにおける水不溶性ポリマー分として０．０９〜７．０μｇ／ｃｍ2の範囲で被覆されたものであってもよく、好ましくは０．１４〜４．５μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは０．２〜３．０μｇ／ｃｍ2である。
【００２６】
上記の通り、本発明のブロックコポリマーは、水不溶性ポリマーセグメントと水に親和性を有する温度応答性ポリマーセグメントが結合したものである。従って、本ブロックコポリマーを基材表面に被覆、乾燥させると、基材表面に微細なラメラ構造、海島構造、シリンダー構造、共連続構造などの相分離構造を形成することが期待される。相分離構造の形態、サイズ等は特に限定されるものではないが、細胞が基材表面に付着する際に、基材表面に相分離構造があると細胞の変性を抑えることが可能となり好都合である。
【００２７】
一般に、ブロックコポリマーの製造では、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合法、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法、アニオン重合法またはリビングラジカル重合法が使用されることが多い。本発明において、ブロックコポリマーの製造法は、上記重合法およびその他の重合法に限定されないが、ＲＡＦＴ重合法を用いることが好ましい。ＲＡＦＴ重合法を用いてブロックコポリマーを製造した場合、ＲＡＦＴ剤の構造の一部であるジチオエステル系官能基が、生成したブロックコポリマーの末端に残存することになる。これはＲＡＦＴ重合法に特徴的な現象であり、重合反応が終了した後、さらにその末端から重合反応を開始させることが可能となる。その際、温度応答性ポリマーの末端に存在するジチオエステル系官能基は、２−エタノールアミンなどを添加することにより、容易にチオール基に置換される。この反応は特別な条件下で行われる必要はなく、簡便でありまた短時間で進行する。その結果、反応性の高いチオール基を有するポリマー鎖を得ることができるため、マレイミド基、チオール基などの官能基を有する機能性分子を選択的かつ効率的にポリマー鎖末端に修飾できる。従って、本発明の細胞培養用温度応答性基材表面に新たな機能性を付与することが可能となる。なお、官能基の種類については特に限定されるものではないが、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基等が挙げられる。また、上記で製造されたポリマー鎖末端には細胞接着を促進させるようなペプチドや蛋白質が固定化されていてもよい。これに関連して、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が末端官能基の親水性・疎水性に依存して変化することから、本発明のようなポリマー鎖末端への官能基導入は、基材表面の温度応答性を別の観点から制御する新たな手法としても期待される。
【００２８】
上記の通り、本発明のブロックコポリマーは、ＲＡＦＴ重合法、すなわち、ＲＡＦＴ剤共存下でラジカル重合させ、温度応答性ポリマーを成長させる方法で得られる。その際に使用する開始剤は特に限定されるものではないが、例えば、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０）、２，２’−アゾビス［（２−カルボキシエチル）−２−（メチルプロピオンアミジン）］（Ｖ−０５７）などが挙げられる。本発明では、この開始剤よりポリマー鎖を成長させることができる。また、使用されるＲＡＦＴ剤としては特に限定されるものでないが、ベンジルジチオベンゾエート、ジチオ安息香酸クミル、２−シアノプロピルジチオベンゾエート、１−フェニルエチルフェニルジチオアセテート、クミルフェニルジチオアセテート、ベンジル１−ピロールカルボジチオエート、クミル１−ピロールカルボジチオエート等が挙げられる。
【００２９】
本発明で重合時に使用する溶媒については特に限定されないが、ベンゼン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）等が好適である。この溶媒についても何ら限定されるものではないが、重合反応に使用するモノマー、ＲＡＦＴ剤および重合開始剤の種類によって、適宜、選択できる。
【００３０】
本発明は、１，４−ジオキサンなどの溶媒を使用して、ＲＡＦＴ剤共存下で、開始剤を用いた表面開始型ラジカル重合法により、モノマーから０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長させる方法である。その他の重合時の開始剤濃度、ＲＡＦＴ剤濃度、反応温度、反応時間等は特に限定されるものではなく、目的に応じて変更してよい。さらに反応液の状態は静置させても攪拌してもよい。本発明で使用されるＲＡＦＴ法は、金属イオン等を使わずに反応を進行させることができるため、反応後の生成物の精製が容易であり、反応工程そのものも簡便な操作で済み好都合である。
【００３１】
本発明の細胞培養用温度応答性基材は、典型的には、こうして得られたブロックコポリマーを溶媒に溶解もしくは分散させ、当該コポリマーを基材表面へ均一に被覆することによって得られる。その際、使われる溶媒は、当該ブロックコポリマーを溶解もしくは分散させることができ、基材表面を極力溶解させないものを適宜選択すればよく、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、イソプロピルアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、メチルエチルケトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、クロロホルム、ジクロロメタン、或いはアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等が挙げられる。複数の溶媒を併用する場合はその混合比は特に限定されるものではなく、例えば、アセトニトリルとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合液の場合、体積比で、アセトニトリルが５でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが１の割合、アセトニトリルが４でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが１の割合、またはアセトニトリルが６でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが１の割合が好ましい。溶媒として水を利用し、必要に応じて乳化剤を添加してブロックコポリマーを溶解、乳化、分散させる方法もあるが、該方法では、ブロックコポリマーの組成によっては水中で均一になることができない場合がある。その結果、均一、かつ平滑にブロックコポリマーを基材表面に被覆させることができず、細胞を培養する過程で細胞が基材表面に均一に付着せず、均一に増殖できなくなり、基材を被覆する方法としては好ましくない。また、水を溶媒として利用しブロックコポリマーを基材表面へ被覆した場合、塗布後、乾燥までに時間がかかる点においても好ましくない。
【００３２】
本発明では、上記ブロックコポリマー溶液を基材表面へ均一に塗布する必要がある。その方法は特に限定されるものではないが、スピンコーターを利用する方法、基材を水平な台の上に静置させる方法等が挙げられる。塗布後、溶媒を除去することにより、本発明である細胞培養用温度応答性基材が得られる。なお、溶媒の除去方法は特に限定されるものではないが、室温／大気中で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法、室温／溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法、加熱して蒸発させる方法、減圧して蒸発させる方法等が挙げられるが、最終的な細胞培養用温度応答性基材の表面をきれいに作製する上で、前二者の方法が良く、特に室温／溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法が好ましい。
【００３３】
被覆が施される細胞培養基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等のみならず、一般に形態付与が可能である材料、限定されないが、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類などを用いることができる。細胞培養基材の形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿に限定されることはなく、プレート（板状）、ファイバー（糸状）、（多孔質）粒子（粒状）、チューブ状、フィルム状の基材、またはそれらを２種以上を組み合わせた基材であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器の形状（フラスコ等）を有したものであっても差し支えない。好ましくは、本発明で使用される細胞培養基材の形状は、板状の単独、または２種以上を組み合わせたものである。また、上記の一般に使用される細胞培養基材にブロックコポリマーを被覆する場合、細胞培養基材の表面は疎水性であることが好ましい。したがって、ガラス基板などのその表面が親水性である細胞培養基材を用いる場合、予め疎水化処理をすることが好ましい。疎水化処理は、特に限定されないが、シランカップリング剤（例えば、ヘキシルトリエトキシシラン）を用いた処理であってもよい。
【００３４】
本発明で得られる細胞培養用温度応答性基材表面に対して使用され得る細胞は、その由来に限定されることはなく、さらにその入手先、作製方法も特に限定されるものではない。本発明で使用される細胞には、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。典型的には、動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が好ましい。また、本発明で用いる培地は、動物細胞用の培地であれば特に限定されないが、例えば、無血清培地、血清含有培地等が挙げられる。そのような培地は、さらにレチノイン酸、アスコルビン酸等の分化誘導物質を添加してもよい。基材表面への細胞の播種密度は適宜変更可能であり、その播種密度は常法に従って決定することができる。
【００３５】
また、本発明の細胞培養用温度応答性基材を用いれば、培養基材の温度を、単に培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上もしくは下限臨界溶解温度以下にすることによって培養細胞または細胞シートを酵素処理なく剥離することができる。上記の剥離は、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて行うことができる。細胞をより早く、より高効率に剥離し、さらに回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、またはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。
【００３６】
本発明の細胞培養用温度応答性基材を利用することで、各組織から得られた細胞を効率良く培養できるようになる。この培養方法を利用すれば、温度を変えるだけで損傷なく、効率良く培養細胞または細胞シートを剥離することができるようになる。従来、こうした作業には手間と作業者の技術を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなり、細胞の大量処理ができるようになる。本発明によれば、このような培養基材表面は、リビングラジカル重合法を利用することで作製され得ることを示す。特にＲＡＦＴ重合法（リビングラジカル重合法の１つ）によって、培養基材表面を簡便に精密に設計でき、さらに分子鎖末端に簡便に官能基を導入することができるため、本発明の細胞培養用温度応答性基材およびそれを製造する方法は、極めて有利な細胞培養技術である。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００３８】
実施例１：温度応答性表面の調製と特性
本実施例においては、温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）のセグメントと水不溶性ポリマーであるポリ−ｎ−ブチルメタクリレート（ＰＢＭＡ）のセグメントからなる温度応答性ブロックコポリマーを調製し、基材表面にスピンコーティングした。作製した温度応答性ブロックコポリマー被覆表面について、ポリマーの表面導入量や表面ぬれ性などの物性評価、並びに、温度変化による基材表面への細胞接着性の違いについても検討した。【００３９】
（１）温度応答性ブロックコポリマーの調製
具体的には、ＲＡＦＴ重合により合成した水不溶性ポリマーであるＰＢＭＡをマクロＲＡＦＴ剤として、ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍブロックコポリマーを調製した（図１）。また、ＲＡＦＴ重合により分子量を制御して合成されたＰＢＭＡおよびＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍの分析値を図２に示す。なお、本明細書において、例えば、ＢＭＡとＩＰＡＡｍのモノマー単位の比が７０：２４であるＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍブロックコポリマーを「Ｂ７９−ＩＰ２４」として表した。【００４０】
（２）温度応答性ブロックコポリマーの特性
得られたポリマーを核磁気共鳴分光法（1Ｈ−ＮＭＲ）やゲル浸透クロマトグラフィー法（ＧＰＣ）により評価した。ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍを０．１ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、または０．５ｗ／ｖ％の各濃度でアセトニトリル／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド混合溶媒（５／１  ｉｎ  ｖ／ｖ）に溶解した。またコントロールとして、ＰＢＭＡ溶液（０．５ｗ／ｖ％）およびＰＩＰＰＡｍ（０．５ｗ／ｖ％）を同様に調製した。次に、ポリマー溶液を細胞培養用ポリスチレン（ＴＣＰＳ）基材表面にスピンコートし（３０００ｒｐｍ，３０ｓｅｃ）、一晩室温で乾燥した後、水で基材表面を洗浄し、６時間室温で減圧乾燥させることによって、温度応答性表面を調製した。また、ポリマー溶液で被覆していないＴＣＰＳ、およびＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（セルシード社製、日本）もコントロールとして用いた。【００４１】
水中におけるポリマー被覆の安定性を検討するため、水中に３７℃で２４時間静置後、４℃の水中にて６時間振とうし、減圧乾燥した。最初に、この基材の表面ポリマー量を全反射型フーリエ変換型赤外分光（ＡＴＲ／ＦＴ−ＩＲ）法により決定し、処理前後におけるポリマー量の違いを比較検討した（図３参照）。次に、水中気泡法による静的接触角測定法により、２０℃および３７℃におけるぬれ性について評価した。ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍ被覆基材の表面安定性についてＡＴＲ／ＦＴ−ＩＲを用いて検討した結果、処理（水中における３７℃で２４時間静置、続く４℃の水中にて６時間の振とう）前後でＰＩＰＡＡｍ修飾量に変化はほとんど観察されなかった。このことから、水中におけるＬＣＳＴ（ＰＩＰＡＡｍの場合は３２℃）を境とした温度変化でブロックコポリマーは基材上に安定に被覆された状態にあることが分かった（図３）。この結果は、水不溶性ポリマー鎖であるＰＢＭＡが、細胞培養基材として使用したポリスチレン基材と疎水性相互作用により安定的に物理吸着しているためであると考えられる。またポリマー被覆基材についてＰＩＰＡＡｍ鎖のＬＣＳＴを挟んだ温度における表面ぬれ性の違いについて評価したところ、ＰＢＭＡ被覆基材と同様に、ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍ被覆基材においても変化が見られなかった（図４）。このことは従来の温度応答性細胞培養基材表面のような基材表面全体が温度応答性鎖であるＰＩＰＡＡｍに覆われている状態と異なり、ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍ被覆基材では、ＰＢＭＡ鎖とＰＩＰＡＡｍ鎖が相分離してそれぞれのドメインを基材表面上に形成するため、マクロな環境変化を追跡する表面ぬれ性測定では顕著な変化は観察されないのではないかと考えられる。また、ＰＢＭＡ鎖とＰＩＰＡＡｍ鎖からなるブロックコポリマーに占めるＰＩＰＡＡｍ鎖の比率（図２参照）に応じて相分離構造を形成していると推測される。【００４２】
実施例２：グラフト量と細胞挙動の検討
実施例１の記載に従って、ＴＣＰＳに各種濃度のＢ７９−ＩＰ１２０を被覆した基材を調製し、該作製した基材上にウシ頸動脈由来血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を１．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2濃度で播種し、ポリマー被覆基材表面上への３７℃における細胞の接着性および２０℃での低温処理による細胞の脱着挙動について評価した。図５中の黒丸はポリマーを被覆していないＴＣＰＳ基材を示し、黒菱形および白菱形はＴＣＰＳにＢ７９−ＩＰ１２０をそれぞれ０．３および０．５ｗ／ｖ％で被覆した基材上における細胞挙動の変化を表す。図５は、ＢＡＥＣ細胞を各基材に播種し、７２時間培養後に、培養温度を３７℃から２０℃に変化させた場合の細胞接着率（％）の変化を示す。より具体的には、３７℃での培養により細胞接着率が上昇するが、細胞培養用のＴＣＰＳでは接着率が高く、次いで、０．３ｗ／ｖ％でＢ７９−ＩＰ１２０を被覆した基材が高かった。一方、０．５ｗ／ｖ％でＢ７９−ＩＰ１２０を被覆した基材では細胞接着率が低かった。実際にＴＣＰＳに被覆されたＰＩＰＡＡｍの量を測定すると、濃度が０．３ｗ／ｖ％の場合では１．４４μｇ／ｃｍ2であり、０．５ｗ／ｖ％の場合では１．８１μｇ／ｃｍ2であり、ＰＩＰＡＡｍの被覆量が多くなると細胞接着率が減少する傾向にあると言える。次に、３７℃から２０℃に温度変化させた場合の細胞接着率の変化は、ＰＩＰＡＡｍの被覆量が１．４４μｇ／ｃｍ2である基材を用いた場合に顕著に現れた。ＴＣＰＳでは、温度変化に伴う細胞接着率にほとんど変化が見られなかった。一方、ＰＩＰＡＡｍの被覆量が１．８１μｇ／ｃｍ2である基材では、３７℃から２０℃へ温度変化させた場合、速やかに細胞が剥離する現象が見られたが、３７℃における細胞接着率が低く、細胞を培養するには好ましくない条件であると考えられる。
さらに、上記各種基材上で培養したＢＡＥＣ細胞の温度変化による脱着を観察した結果を写真に示す。０．３ｗ／ｖ％濃度のＢ７９−ＩＰ１２０で被覆した基材上において３７℃、３日間培養したところ、細胞の接着および伸展を確認した（図６）。次に、細胞接着した基材を２０℃で２時間低温処理した結果、細胞は基材表面から自発的に脱着することが明らかとなった。一方、ＰＢＭＡ被覆基材において同様の操作を行ったが、細胞の接着および伸展は観察されたが、低温処理による細胞の脱着は観察されなかった（データ示さず）。以上の結果から、基材表面に導入されたＰＩＰＡＡｍ鎖がＬＣＳＴ以下の低温処理により水和することで、基材表面の特性が変化し、接着した細胞が自発的に剥離したと考えられる。【００４３】
実施例３：ブロックコポリマーによる細胞挙動変化の詳細な分析
（１）ＰＩＰＡＡｍ分子鎖長と細胞挙動の関係
ブロックコポリマー中のＢＭＡのモノマー単位数（量体数）を一定にし、ＩＰＡＡｍのモノマー単位を変化させたブロックコポリマーを実施例１の製造法に従って調製した。実施例１と同様に、ＴＣＰＳにブロックコポリマーを被覆させ、温度変化に伴うＢＡＥＣ細胞の接着率の変化を調べた（図７）。上記実施例２と同様に、ＰＩＰＡＡｍの被覆量の減少に伴って、細胞接着率が増加した。また、温度変化により細胞の脱着については、ＰＩＰＡＡｍの被覆量が低い基材（１．１８μｇ／ｃｍ2）においては、より被覆量の高い基材（１．４４，１．６０，１．６３μｇ／ｃｍ2）に比べて緩やかに脱着し、被覆量が高い基材（１．４４，１．６０，１．６３μｇ／ｃｍ2など）では、温度変化後、速やかに脱着することが分かった。
（２）ブロックコポリマー鎖長と細胞挙動の関係
鎖長が異なる３種のブロックコポリマー（Ｂ３６−ＩＰ５２、Ｂ７９−ＩＰ１２０、およびＢ１４２−ＩＰ２３１）を調製した。実施例２と同様に、これらのブロックコポリマーをＴＣＰＳに被覆した基材を調製し、その後、各基材に播種したＢＡＥＣ細胞の接着、続く温度変化による細胞の脱着挙動の変化を細胞接着率によって評価した（図８）。使用した３種のブロックコポリマーは、それらの鎖長は著しく異なるが、ＴＣＰＳに被覆されたＰＩＰＡＡｍの量にほとんど差がなかった。また、各基材に播種された細胞の接着および脱着についても、各基材のブロックコポリマーの鎖長による顕著な違いは見られなかった。このことから、温度変化による細胞の接着および脱着の制御には、基材表面へのＰＩＰＡＡｍの修飾量が重要な要因の１つであると言える。
（３）ブロックコポリマーによる細胞シートの形成
図９には、ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍブロックコポリマー（０．３ｗ／ｖ％濃度のＢ７９−ＩＰ１２０）で被覆した基材上で形成させた細胞シートと、温度変化による細胞シートの剥離後の写真を示す。ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍブロックコポリマー（０．３ｗ／ｖ％濃度のＢ７９−ＩＰ１２０）を被覆した基材上でＢＡＥＣ細胞を３７℃にて培養し、コンフルエントになるまで培養した後、２０℃で保温すると、隣接した細胞同士の細胞間結合は維持したまま、細胞シートを形成した。
図１０では、鎖長、モノマー単位、およびグラフト量の異なる各種ブロックコポリマーを調製し、各ブロックコポリマーで被覆した基材上での細胞がコンフルエントになるまでに要する時間（Period for confluent）、および２０℃へ変化させた後に細胞シートとして剥離するまでに要する時間（Cell sheet harvest at 20℃）を検討した。その結果、ＰＩＰＡＡｍの被覆量が高いもの（例えば、１．４５μｇ／ｃｍ2以上）になると、細胞がコンフルエントになるまでに７日以上の時間を要するようになることが分かった。一方で、ＰＩＰＡＡｍの被覆量が０．８μｇ／ｃｍ2より低くなると、細胞がうまく剥離できず、細胞シートが形成されないことが分かった。以上の結果から、ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＩＰＡＡｍを被覆した基材表面の使用により、細胞培養、並びに温度変化に応じた培養細胞または細胞シートの剥離を効率良く実現できることを確信した。【００４４】
比較例１：水系溶媒を利用した温度応答性表面の作製
実施例２で用いたＢ７９−ＩＰ１２０を０．１ｗ／ｖ％の濃度で水中に分散させることを試みた。その結果、本ポリマーは水中で分散、乳化させられず均一な溶液を得ることはできなかった。得られた溶液をＴＣＰＳ基材表面へ被覆したが、目視できる程度に器材表面が不均一となり、本発明として好ましいものではなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の温度応答性細胞培養基材を利用することで、各組織から得られた細胞を効率良く培養できるようになる。この培養方法を利用すれば、温度を変えるだけで損傷なく、効率良く培養細胞または細胞シート剥離することができるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図６】
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【図９】
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