(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程（ｉ）一般式（２）
【化１】
0005953429.tif 000120
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、塩基、酸、又はエステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／若しくは該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、一般式（３）
【化２】
0005953429.tif 000121
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；
工程（ｉｉ）前記一般式（３）で表される化合物に、縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させて、一般式（４）
【化３】
0005953429.tif 000122
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義であり、Ｘは−ＯＰ（Ｏ）(ＯＰｈ)２、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＥｔ)２、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３又はハロゲン原子を表し、Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数
７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物を得る工程；
工程（ｉｉｉ）前記一般式（４）で表される化合物に、アジド化剤を作用させて、一般式（５）
【化４】
0005953429.tif 000123
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；
工程（ｉｖ）前記一般式（５）で表される化合物を、クルチウス転位反応によって変換し、一般式（６）
【化５】
0005953429.tif 000124
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；及び
工程（ｖ）前記一般式（６）で表される化合物のイソシアネート基をアミノ基へと変換する工程、エステル基を加水分解する工程、及び酸を作用させてｔｅｒｔ-ブチル基を除去する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（１）
【化６】
0005953429.tif 000125
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
【請求項２】
前記工程（ｉ）において、
前記酵素が、（Ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、前記一般式（３）で表される化合物のうち立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）
【化７】
0005953429.tif 000126
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質、又は、
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、前記一般式（３）で表される化合物のうち立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質であり、
前記一般式（１）で表されるα−置換システインが、以下の立体配置がＳである一般式（１Ｓ）
【化８】
0005953429.tif 000127
（式中、Ｒ２は前記一般式（１）のＲ２と同義である。）で表されるα−置換システインである、請求項１に記載のα−置換システイン又はその塩の製造方法。
【請求項３】
工程（ｉ）一般式（２）
【化９】
0005953429.tif 000128
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物にエステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／又は該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させる工程；
を含むことを特徴とする、前記一般式（３）
【化１０】
0005953429.tif 000129
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）におけるＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物のうち、立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）
【化１１】
0005953429.tif 000130
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）におけるＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
【請求項４】
前記酵素が、
（Ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、立体配置がＳ体である前記一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質、又は、
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、立体配置がＳ体である前記一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質である、
請求項３に記載の前記一般式（３Ｓ）で表される化合物の製造方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）一般式（３）
【化１２】
0005953429.tif 000131
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、クロロギ酸エステルを作用させる工程；
を含むことを特徴とする、一般式（４−１）
【化１３】
0005953429.tif 000132
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物の製造方法。
【請求項６】
工程（ｉｉｉ）一般式（４−１）
【化１４】
0005953429.tif 000133
（式中、Ｒ１とＲ３はそれぞれ独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、アジド化金属類を作用させる工程；
を含むことを特徴とする、一般式（５）
【化１５】
0005953429.tif 000134
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（４−１）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
【請求項７】
工程（ｉｖ）一般式（５）
【化１６】
0005953429.tif 000135
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物を、クルチウス転位反応により変換する工程；
を含むことを特徴とする、
一般式（６）
【化１７】
0005953429.tif 000136
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（５）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
【請求項８】
工程（ｖ）一般式（６）
【化１８】
0005953429.tif 000137
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物のイソシアネート基をアミノ基へと変換する工程、エステル基を加水分解する工程、及び酸を作用させてｔｅｒｔ-ブチル基を除去する工程；
を含むことを特徴とする一般式（１）
【化１９】
0005953429.tif 000138
（式中、Ｒ２は前記一般式（６）のＲ２と同義である。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
【請求項９】
前記工程（ｖ）が、
工程（ｖｉ−１）一般式（６）
【化２０】
0005953429.tif 000139
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物に酸を作用させチアゾリジノン環を構築することにより一般式（７−１）
【化２１】
0005953429.tif 000140
（式中、Ｒ１、及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１、及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換する工程；
工程（ｖｉ−２）前記一般式（７−１）で表される化合物に酸、又は塩基を作用させてエステル基を加水分解することにより、一般式（７−２）
【化２２】
0005953429.tif 000141
（式中、Ｒ２は前記一般式（７−１）のＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；及び
工程（ｖｉｉ）前記一般式（７−２）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させてチアゾリジノン環を開環し、前記一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩を製造する工程；
を含むことを特徴とする請求項８に記載の一般式（１）
【化２３】
0005953429.tif 000142
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
【請求項１０】
工程（ｖｉ−１）一般式（６）
【化２４】
0005953429.tif 000143
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸を作用させてチアゾリジノン環を構築する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（７−１）
【化２５】
0005953429.tif 000144
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
【請求項１１】
工程（ｖｉ−２）一般式（７−１）
【化２６】
0005953429.tif 000145
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させてエステル基を加水分解する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（７−２）
【化２７】
0005953429.tif 000146
（式中、Ｒ２は前記一般式（７−１）のＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
【請求項１２】
工程（ｖｉｉ）一般式（７−２）
【化２８】
0005953429.tif 000147
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させチアゾリジノン環を開環する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（１）
【化２９】
0005953429.tif 000148
（式中、Ｒ２は前記一般式（７−２）のＲ２と同義である。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
【請求項１３】
一般式（４−１）
【化３０】
0005953429.tif 000149
（式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
【請求項１４】
一般式（６）
【化３２】
0005953429.tif 000150
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
【請求項１５】
一般式（７Ｓ）
【化３３】
0005953429.tif 000151
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物。
【請求項１６】
工程（ｘｉ）一般式（９）
【化３４】
0005953429.tif 000152
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物を、塩基の存在下、アルキル化剤と作用させる工程；
を含むことを特徴とする、一般式（２）
【化３５】
0005953429.tif 000153
（式中、Ｒ１は前記一般式（９）のＲ１と同義であり、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品等の中間体として有用な、α−置換システインもしくはその塩又はα−置換システイン合成中間体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−置換システインのうち、特に光学活性α−置換システインは医薬品の中間体として有用であり、α−置換システイン又はその塩の製造方法としては、従来から様々な方法が知られている（例えば、特許文献１）。
しかしながら、従来の方法は、ブチルリチウム等の高価な塩基を用いた低温反応が必要であったり、工程数が長くて煩雑で、さらに高価な試薬を多く使う必要があったりする等、工業的規模での安定生産が困難であり、実用的とは言い難いものであった。【０００３】
特許文献１のように高価な試薬や低温反応を必要としない方法として、特許文献２に、ラセミ体のＮ−カルバモイル−α−メチルシステインをヒダントイナーゼによってＤ体選択的に環化させて、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインとし、次いでＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインの加水分解、脱カルバモイル化及び硫黄原子の脱保護（ｔｅｒｔ−ブチル基の脱離）を行うα−メチル−Ｄ−システインの製造方法が記載されている。なお、このα−メチル−Ｄ−システインは、光学活性α−置換システインの一つであり、鉄過剰症治療薬の中間体として有用である。【０００４】
特許文献３に、ベンジル基で保護されたチオールを有するジエステルにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼを作用させることで（Ｓ）−モノエステルとした後、クルチウス転位によって生成するイソシアネート基をアミノ基に変換してベンジル基保護α−メチル−Ｄ−システインを得る方法が記載されている。【０００５】
また、非特許文献１に、ベンジル基ではなくｔｅｒｔ−ブチル基で保護されたジエステルをブタ肝臓エステラーゼで（Ｒ）−モノエステル化し、カルボキシル基のｔｅｒｔ−ブチルエステル化、メチルエステルの加水分解を経て（Ｓ）−モノエステルを得て、その後、クルチウス転位によって生成するイソシアネート基をカーバメート保護されたアミノ基へと変換し、カーバメート保護を脱保護することによってｔｅｒｔ−ブチル保護α−メチル−Ｄ−システインを得る方法が開示されている。【０００６】
非特許文献２には、非特許文献１に記載のｔｅｒｔ−ブチル保護ジエステルとｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンとメチルジアルキルマロネートとを、塩基の存在下、反応させて製造する方法が記載されている。また、ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンの製法として、ジクロロメタン中で、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン、パラホルムアルデヒド及び塩化水素を反応させる方法が記載されている。ここで、ホルムアルデヒドと塩化水素が接触するとビスクロロメチルエーテルが発生することが知られている（例えば、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００１／０７２７０２号
【特許文献２】国際公開第２００３／１０６６８９号
【特許文献３】国際公開第２００７／１０６０２２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Organic Chemistry  (2003),  68(13),  p.5403-5406
【非特許文献２】Synlett (2010), (19), p.2941-2943
【非特許文献３】Chemische Berichte, 88, 1737(1955)
【発明の概要】
【０００９】
特許文献２に記載の方法においては、ヒダントインの加水分解、脱カルバモイル化、硫黄原子の脱保護の各工程において非常に長い反応時間を必要とするため生産効率が低い。また、Ｄ体を得るための手法として光学分割を用いているため、光学分割を行なう対象となるＮ−カルバモイル−α−メチルシステインを、目的とする量に対して少なくとも２モル当量製造することが必要とされる。さらに、不要なＬ体の廃棄処理が必要となる。
また、特許文献３に記載の方法では、ジエステルから理論収率１００％で（Ｓ）−モノエステルが得られる（即ち、ベンジル基保護α−メチル−Ｄ−システインもジエステルから理論収率１００％で得られる）ため、上述の特許文献２のような問題は生じないが、α−メチル−Ｄ−システインを得るためには、保護基である硫黄原子上のベンジル基を脱離する必要がある。ベンジル基の脱離には、一般的に、液体アンモニアと金属ナトリウムを使用したバーチ還元法が採用されている。この方法では、極低温条件が必要とされ、また発火性の非常に高い金属ナトリウムを使用しなければならないため、工業的生産には適していない。また、脱保護体のα−メチル−Ｄ−システインは有機溶媒での抽出が困難な化合物であるため、反応で生成する金属塩を除去することが難しい。
非特許文献１に記載の方法では、ｔｅｒｔ−ブチル基の脱離は塩酸で加熱することにより達成されるため、特許文献３のような問題は生じないが、しかし、（Ｒ）−モノエステルを（Ｓ）−モノエステルへと変換する操作が煩雑であるため、工業的生産には適していない。また、この方法で得られる（Ｓ）−モノエステルの光学純度は（Ｒ）−モノエステルによって決まるが、（Ｒ）−モノエステルの光学純度は９１％ｅ．ｅ．であり、医薬品を製造するための中間体としては光学純度が不充分である。
また、ｔｅｒｔ−ブチル保護ジエステルを非特許文献２に記載の方法で製造すると、発がん性が極めて高いため、特に日本では安全衛生法第五十五条において製造禁止物質として定められているビスクロロメチルエーテルが発生してしまう可能性がある。
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、医薬品等の中間体として有用な、α−置換システイン又はその塩を、入手が容易であり、かつ安価な原料によって、より簡便に短時間で安全に製造でき、工業的規模において安定生産可能な実用的な方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、α−置換システイン又はその合成中間体を製造する方法について鋭意検討した結果、２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸を経ることにより、従来、非常に長い反応時間を必要としたｔｅｒｔ−ブチル保護基を短時間で除去できることを見出した。さらに、２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル−２−置換マロン酸ジアルキルの製造について、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノール、又は２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］マロン酸ジアルキルから合成する工程を採用することにより、発がん性のあるビスクロロメチルエーテルを発生させることなく安全に製造することが可能であることを見出した。
また、本発明者らは、鉄過剰症治療薬の中間体として特に有用なα−置換−Ｄ−システインの製造において、煩雑な２−[（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル]−２−置換マロン酸ジアルキルを（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−置換マロン酸アルキルに変換する工程を、酵素反応等により１段階で行うことが可能であることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
［１］  工程（ｉ）一般式（２）
【化１】
0005953429.tif 000002
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、塩基、酸、又はエステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／若しくは該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、一般式（３）
【化２】
0005953429.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；
工程（ｉｉ）前記一般式（３）で表される化合物に、縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させて、一般式（４）
【化３】
0005953429.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義であり、Ｘは−ＯＰ（Ｏ）(ＯＰｈ)２、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＥｔ)２、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３又はハロゲン原子を表し、Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物を得る工程；
工程（ｉｉｉ）前記一般式（４）で表される化合物に、アジド化剤を作用させて、一般式（５）
【化４】
0005953429.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；
工程（ｉｖ）前記一般式（５）で表される化合物を、クルチウス転位反応によって変換し、一般式（６）
【化５】
0005953429.tif 000006
（６）
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；及び
工程（ｖ）前記一般式（６）
で表される化合物のイソシアネート基をアミノ基へと変換する工程、エステル基を加水分解する工程、及び酸を作用させてｔｅｒｔ-ブチル基を除去する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（１）
【化６】
0005953429.tif 000007
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
［２］前記工程（ｉ）において、
前記酵素が、（Ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列と３５％以上の同一性を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、前記一般式（３）で表される化合物のうち立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）
【化７】
0005953429.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質、
又は、（Ｃ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、前記一般式（３）で表される化合物のうち立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質であり、
前記一般式（１）で表されるα−置換システインが、以下の立体配置がＳである一般式（１Ｓ）
【化８】
0005953429.tif 000009
（式中、Ｒ２は前記一般式（１）のＲ２と同義である。）で表されるα−置換システインである、［１］に記載のα−置換システイン又はその塩の製造方法。
［３］工程（ｉ）一般式（２）
【化９】
0005953429.tif 000010
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物にエステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／又は該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させる工程；
を含むことを特徴とする、前記一般式（３）
【化１０】
0005953429.tif 000011
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）におけるＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物のうち、立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）
【化１１】
0005953429.tif 000012
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）におけるＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
［４］前記酵素が、
（Ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列と３５％以上の同一性を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、立体配置がＳ体である前記一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質、又は、
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、立体配置がＳ体である前記一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質である、
［３］に記載の前記一般式（３Ｓ）で表される化合物の製造方法。
［５］工程（ｉｉ）一般式（３）
【化１２】
0005953429.tif 000013
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、クロロギ酸エステルを作用させる工程；
を含むことを特徴とする、一般式（４−１）
【化１３】
0005953429.tif 000014
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物の製造方法。
［６］工程（ｉｉｉ）一般式（４−１）
【化１４】
0005953429.tif 000015
（式中、Ｒ１とＲ３はそれぞれ独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、アジド化金属類を作用させる工程；
を含む
ことを特徴とする、一般式（５）
【化１５】
0005953429.tif 000016
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（４−１）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
［７］工程（ｉｖ）一般式（５）
【化１６】
0005953429.tif 000017
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物を、クルチウス転位反応により変換する工程；
を含むことを特徴とする、
一般式（６）
【化１７】
0005953429.tif 000018
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（５）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
［８］工程（ｖ）一般式（６）
【化１８】
0005953429.tif 000019
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物のイソシアネート基をアミノ基へと変換する工程、エステル基を加水分解する工程、及び酸を作用させてｔｅｒｔ-ブチル基を除去する工程；
を含むことを特徴とする一般式（１）
【化１９】
0005953429.tif 000020
（式中、Ｒ２は前記一般式（６）のＲ２と同義である。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
［９］前記工程（ｖ）が、工程（ｖｉ−１）一般式（６）
【化２０】
0005953429.tif 000021
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物に酸を作用させチアゾリジノン環を構築することにより一般式（７−１）
【化２１】
0005953429.tif 000022
（式中、Ｒ１、及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１、及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換する工程；
工程（ｖｉ−２）前記一般式（７−１）で表される化合物に酸、又は塩基を作用させてエステル基を加水分解することにより、一般式（７−２）
【化２２】
0005953429.tif 000023
（式中、Ｒ２は前記一般式（７−１）のＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程；及び
工程（ｖｉｉ）前記一般式（７−２）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させてチアゾリジノン環を開環し、前記一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩を製造する工程；
を含むことを特徴とする［８］に記載の一般式（１）
【化２３】
0005953429.tif 000024
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
［１０］工程（ｖｉ−１）一般式（６）
【化２４】
0005953429.tif 000025
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸を作用させてチアゾリジノン環を構築する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（７−１）
【化２５】
0005953429.tif 000026
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
［１１］工程（ｖｉ−２）一般式（７−１）
【化２６】
0005953429.tif 000027
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させてエステル基を加水分解する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（７−２）
【化２７】
0005953429.tif 000028
（式中、Ｒ２は前記一般式（７−１）のＲ２と同義である。）で表される化合物の製造方法。
［１２］工程（ｖｉｉ）一般式（７−２）
【化２８】
0005953429.tif 000029
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させチアゾリジノン環を開環する工程；
を含むことを特徴とする、一般式（１）
【化２９】
0005953429.tif 000030
（式中、Ｒ２は前記一般式（７−２）のＲ２と同義である。）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法。
［１３］一般式（４−１）
【化３０】
0005953429.tif 000031
（式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
［１４］一般式（５）
【化３１】
0005953429.tif 000032
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
［１５］一般式（６）
【化３２】
0005953429.tif 000033
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
［１６］一般式（７Ｓ）
【化３３】
0005953429.tif 000034
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物。
［１７］工程（ｘｉ）一般式（９）
【化３４】
0005953429.tif 000035
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物を、塩基の存在下、アルキル化剤と作用させる工程；
を含むことを特徴とする、一般式（２）
【化３５】
0005953429.tif 000036
（式中、Ｒ１は前記一般式（９）のＲ１と同義であり、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物の製造方法。
［１８］工程（ｖｉｉｉ）ｔｅｒｔ-ブチルメルカプタンとホルムアルデヒドとを反応させ、ｔｅｒｔ-ブチルチオメタノールを得る工程；
工程（ｉｘ）ｔｅｒｔ-ブチルチオメタノールを塩基の存在下、クロル化剤と反応させ、ｔｅｒｔ-ブチルチオクロロメタンを得る工程；及び
工程（ｘ）ｔｅｒｔ-ブチルチオクロロメタンを塩基の存在下、一般式（８）
【化３６】
0005953429.tif 000037
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物と作用させ、前記一般式（２）で表される化合物を得る工程；
を含むことを特徴とする一般式（２）
【化３７】
0005953429.tif 000038
（式中、Ｒ１は前記一般式（８）のＲ１と同義であり、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、α−置換システイン又はその塩を、入手容易であり安価な原料によって、簡便かつ短時間で安全に製造でき、工業的規模において安定して生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の製造方法の一実施態様を示す図である。
【図２】２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル−２−メチルマロン酸ジエチルに、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ３１０８株由来の酵素を作用させて、得られた反応生成物の光学純度をＨＰＬＣにより分析した結果である（実施例１２）。上段がバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ３１０８株由来の酵素を作用させた結果であり、下段は、対照実験として、ラセミ体標品の光学純度を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法]
本発明の下記一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法は、（ｉ）の工程の後に、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の工程を有することを特徴とする。本発明の製造方法は、（ｉ）の工程の前に、（ｘｉ）の工程、又は（ｖｉｉｉ）、（ｘｉ）、及び（ｘ）の工程を有するものであることが好ましい。また、本発明の製造方法は、（ｉｖ）の工程の後に（ｖ）の工程、特に好ましくは（ｖｉ−１）、（ｖｉ−２）、及び（ｖｉｉ）の工程を有することが好ましい。
一般式（１）
【化３８】
0005953429.tif 000039
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【００１５】
＜工程（ｉ）＞
まず、（ｉ）の工程について説明する。
（ｉ）の工程は、一般式（２）
【化３９】
0005953429.tif 000040
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に塩基、酸、又は、エステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／若しくは該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、「エステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／若しくは該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液」のことを「本発明の酵素等」と称する場合がある。）を作用させて、一般式（３）
【化４０】
0005953429.tif 000041
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程である。
【００１６】
一般式（２）で表される化合物は、非特許文献２の通り、ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンとメチルマロン酸ジアルキルを塩基存在下に反応させて製造することができる。ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンの製造方法についても、ジクロロメタン中、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン、パラホルムアルデヒド及び塩化水素を反応させる方法が同文献に記載されている。しかし、非特許文献３によれば、ホルムアルデヒドと塩化水素とが接触すると発がん性が極めて高いビスクロロメチルエーテルが発生する可能性があるため、この製造方法は、作業者の健康上好ましくない。
【００１７】
よって、一般式（２）で表される化合物の製法としては、ホルムアルデヒドと塩化水素を接触させずにｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンを製造する工程（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）、もしくはｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンを使用しない工程（ｘｉ）を有する製造方法が好ましい。工程（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉ）については後述する。
【００１８】
一般式（２）で表される化合物において、Ｒ１のうち「置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基」のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、ノルマルヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の炭素数１〜１０の直鎖状若しくは分岐状若しくは環状のアルキル基等が挙げられる。当該アルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、当該アルキル基に置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００１９】
一般式（２）で表される化合物において、Ｒ１のうち「置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基」のアラルキル基としては、例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、１−フェニルエチル基、１−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、３−フェニルプロピル基等が挙げられる。当該アラルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基等の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、当該アラルキル基に置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００２０】
一般式（２）で表される化合物において、Ｒ１のうち「置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基」のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。当該アリール基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基等の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、当該アリール基に置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００２１】
上述した中でも、Ｒ１としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、ノルマルヘキシル基等の炭素数１〜１０の無置換の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基が入手の容易さから好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４の無置換の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基が安価であることからより好ましく、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基等の炭素数１〜４の無置換の直鎖状のアルキル基が酸や塩基、酵素との反応性が高いことからさらに好ましい。特に（ｉ）の工程において酵素を用いる場合は、Ｒ１が小さい構造の方が酵素の反応サイトに取り込まれやすく、反応速度がさらに上がることから、メチル基、又はエチル基が最も好ましい。
【００２２】
また、一般式（２）で表される化合物において、二つのＲ１は必ずしも同一である必要は無く、それぞれ異なっていてもよい。Ｒ１が異なる場合、前記一般式（２）で表される化合物にはＲ体、Ｓ体の二つのエナンチオマーが存在するが、その混合比についても特に制限はない。
【００２３】
一般式（２）で表される化合物において、Ｒ２、即ち、炭素数１〜４のアルキル基は、目的とする前記一般式（１）で表される化合物のＲ２と同一である必要がある。Ｒ２としては、例えばメチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。製造し易さの点ではメチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基等の炭素数１〜４の無置換かつ直鎖状のアルキル基がより好ましい。特に、本発明の酵素等を用いる場合は、Ｒ２が小さい構造の方が酵素の反応サイトに取り込まれやすく、反応速度がさらに上がることから、メチル基、又はエチル基がさらに好ましい。また、後述する一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩のうち、鉄過剰症治療薬の中間体として有用なα−メチル−Ｄ−システインを製造する場合は、Ｒ２はメチル基でなければならない。
【００２４】
一般式（２）で表される化合物としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化４１】
0005953429.tif 000042
上述した化合物の中でも、一般式（２）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化４２】
0005953429.tif 000043
【００２５】
一般式（２）で表される化合物に、塩基、酸、又は、エステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／若しくは該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて加水分解することにより、一般式（３）で表される化合物を得ることができる。
【００２６】
一般式（３）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２は上述の一般式（２）のＲ１及びＲ２と同義である。
【００２７】
【化４３】
0005953429.tif 000044
一般式（３）で表される化合物としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
上述した化合物の中でも、一般式（３）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化４４】
0005953429.tif 000045
【００２８】
また、一般式（３）で表される化合物は、一般式（３Ｓ）
【化４５】
0005953429.tif 000046
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表されるＳ体化合物、もしくは一般式（３Ｒ）
【化４６】
0005953429.tif 000047
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表されるＲ体化合物のうちどちらか一方が選択的に含まれるキラル化合物であってもよく、重量比が１：１のラセミ化合物であっても構わない。このうちＳ体は、後述の工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）によって、一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩のうち、医薬品等の中間体として特に有用なα−置換−Ｄ−システイン又はその塩へと変換できることから、Ｓ体化合物であることが好ましい。
【００２９】
前記一般式（３Ｓ）で表される化合物としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化４７】
0005953429.tif 000048
上述した化合物の中でも、一般式（３Ｓ）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化４８】
0005953429.tif 000049
【００３０】
前記一般式（３Ｒ）で表される化合物としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化４９】
0005953429.tif 000050
上述した化合物の中でも、一般式（３Ｒ）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化５０】
0005953429.tif 000051
【００３１】
（ｉ）の工程では、前記一般式（２）で表される化合物に、塩基、酸、又は、本発明の酵素等を作用させる。以下、それぞれの場合について詳細を説明する。
（塩基を作用させる場合）
塩基を作用させて加水分解する場合、当該塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物や、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩が挙げられる。これらの塩基はそれぞれ単独で用いてもよいし、２種以上混合して用いてもよい。
【００３２】
前記塩基の使用量は、例えば、一般式（２）で表される化合物に対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能である。収率及びコストの点で、０．９モル当量〜２モル当量が好ましく、一般式（３）で表される化合物のエステル基がさらに加水分解を受けるのを防ぐため０．９モル当量〜１．２モル当量がさらに好ましい。
【００３３】
塩基を作用させる場合、反応温度は、例えば、−５０℃〜８０℃の範囲から適宜選択可能である。容易に温度制御を行い、副反応を抑制するためには０℃〜４０℃の範囲とすることが好ましい。
【００３４】
塩基を作用させる場合、反応時間としては、例えば、０．５時間〜５０時間の範囲で適宜選択可能であり、２時間〜１０時間の範囲とすることが好ましい。
【００３５】
塩基を作用させる場合、反応溶媒としては、通常、水のみ、もしくは水と有機溶媒との混合溶媒が用いられる。ここで、有機溶媒としては、グリセロール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、t-ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
中でも、反応速度を上げるためには、アルカリ金属水酸化物やアルカリ金属炭酸塩に対して溶解度の高い水と、一般式（２）で表される化合物に対して溶解度が高く、さらに水とも良く混和する水溶性溶媒を用いて反応混合物を均一にするのが好ましい。水溶性溶媒としてはグリセロール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、t-ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン等のケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。中でも、溶媒留去のし易さの観点から、沸点の低いメタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフランがより好ましい。
なお、本発明の（ｉ）の工程においては、酸よりも塩基を作用させた方が、一般式（２）に含まれるエステル基が、一方だけでなく両方とも加水分解される副反応を抑制することができ、一般式（３）で表される化合物が高収率で得られるため好ましい。
【００３６】
（酸を作用させる場合）
一般式（２）で表される化合物に酸を作用させて加水分解する場合、当該酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の無機酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−トルエンスルホン酸は、一水和物であることが好ましい。以下、同様である。）等の有機酸等が挙げられる。これらの酸はそれぞれ単独で用いてもよいし、２種以上混合して用いてもよい。
【００３７】
酸の使用量は、例えば、一般式（２）で表される化合物に対して０．１モル当量〜２０モル当量の範囲で適宜設定可能である。収率及びコストの点で、１．０モル当量〜１０モル当量が好ましい。
【００３８】
酸を作用させる場合、反応温度は、例えば、０℃〜２００℃の範囲から適宜選択可能である。反応時間を短縮し、かつ温度制御を容易にするには３０℃〜１００℃の範囲とすることが好ましい。
【００３９】
酸を作用させる場合、反応時間としては、例えば、０．５時間〜５０時間の範囲で適宜選択可能であり、２時間〜２０時間の範囲とすることが好ましい。
【００４０】
酸を作用させる場合、反応溶媒としては、通常、水のみ、もしくは水と有機溶媒との混合溶媒が用いられる。ここで、有機溶媒としては、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
中でも、酸に対する安定性の観点から、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
【００４１】
（本発明の酵素等を作用させる場合）
また、一般式（２）で表される化合物に、本発明の酵素等、即ち、エステル基を加水分解する活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／又は該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させることによっても、一般式（３）で表される化合物を得ることができる。
特に、一般式（３）のうち、一般式（３Ｓ）もしくは（３Ｒ）のどちらか一方を選択的に含むキラル化合物を得ることを目的とする場合には、立体選択性が高いことから、上述の酸や塩基を作用させるよりも本発明の酵素等を作用させることが好ましい。
【００４２】
本発明の製造方法において用いることのできる、エステル基を加水分解する活性を有する酵素は、当該活性を有する限り特に制限されないが、例えば、（Ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のカルボキシエステラーゼＮＰである。
【００４３】
また、本発明においては、これらのホモログであって、かつ、前記の酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとしては、例えば、以下の（Ｂ）、（Ｃ）が挙げられる。
（Ｂ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８のアミノ酸配列と３５％以上の同一性を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、前記式一般式（３）で表される化合物のうち立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）
【化５１】
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（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を加水分解し、前記式一般式（３）で表される化合物のうち立体配置がＳ体である一般式（３Ｓ）で表される化合物へと変換させる活性を有するタンパク質。
【００４４】
ここで、前記（Ｂ）のタンパク質は、エステル基を加水分解する活性を有していれば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有すればよい。なお、前記タンパク質の同一性検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のプログラムを用いて行うことができる。
また、前記（Ｃ）のタンパク質は、前記エステル基を加水分解する活性を害さない範囲内において、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００４５】
本発明で用いるエステル基を加水分解する活性を有する酵素は、該酵素の一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、該酵素活性を有する任意の微生物から該酵素をコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡで大腸菌等の宿主生物の形質転換を行ない、該酵素を宿主生物で発現させることによって得ることができる。
また、本発明で用いるエステル基を加水分解する活性を有する酵素は、該酵素活性を有する微生物、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。
【００４６】
バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられる。これらの菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構から入手可能である。あるいはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ａｔｃｃ.ｏｒｇ/）に記載されている菌株については、該ＡＴＣＣから入手できる。
【００４７】
本発明の製造方法においては、一般式（２）で表される化合物に、前記酵素を作用させてもよいが、該酵素に代えて、あるいは、該酵素に加えて、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／又は該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させてもよい。該酵素を生産する能力を有する細胞としては、該酵素をコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。細胞としては、微生物（宿主生物）や培養細胞等を用いることができるが、その生死は問わず、例えば、休止菌体等も好適に用いることができる。
また、該細胞の処理物としては、例えば、該細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の細胞調製物、細胞中の酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。
また、該細胞を培養して得られた培養液としては、前記細胞を培養して得られた培養液、すなわち、該酵素を含む培養液を、直接用いてもよく、例えば、該細胞と液体培地の懸濁液や、該細胞が分泌発現型細胞である場合は該細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物も用いることができる。
【００４８】
ここで、形質転換等に用いる該酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。あるいは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を前記一般式（３）で表される化合物に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示されるアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。エステル基を加水分解する活性を有するタンパク質をコードしていれば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列のホモログであってもよい。すなわち、該酵素をコードするＤＮＡとしては、以下に示すものが挙げられる。
（Ｄ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を前記一般式（３）で表される化合物に変換する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ、前記一般式（２）で表される化合物を前記一般式（３）で表される化合物に変換する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
なお、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列は、ｃＤＮＡの配列である。
【００４９】
前記（Ｅ）のＤＮＡにおいて、数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下、最も好ましくは５個以下である。
【００５０】
前記（Ｆ）のＤＮＡにおいて、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味する。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００５１】
エステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、エステル基を加水分解する活性を有する酵素を前記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ等の酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、該酵素を生産する微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、該酵素をコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、該酵素を生産する微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、エステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００５２】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、該酵素を生産する微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ（Genetics vol. 120，p621-623（1988））を行うことにより、該酵素をコードするＤＮＡを得ることも可能である。ここで、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有するＤＮＡは、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列に基いて設計したプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができる。
【００５３】
なお、該酵素をコードするＤＮＡは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００５４】
当業者であれば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Adv．Biochem．Eng. vol. 43，p75-102（1990）、Yeast vol. , Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、PCR: A Practical Approach, IRL Press, p200（1991））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／又は付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるエステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００５５】
また、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列の全部又はその一部や、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列の全部又は一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、エステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に菌株からのＰＣＲ等により該酵素をコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００５６】
さらに、エステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列の全部又は一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、該酵素活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに充分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００５７】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ３ｒｄ  Ｅｄｔ．（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、2001））中のＣｈａｐｔｅｒ１等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５８】
前記のようにして単離された、エステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、エステル基を加水分解する活性を有する酵素の発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換した細胞を培養することにより、該酵素を該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにエステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを発現可能な状態で組み込むことによっても得ることができる。
【００５９】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、エステル基を加水分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接、宿主生物のゲノム中に該酵素をコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写及び翻訳させる必要がある。
【００６０】
このとき、該酵素をコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを該酵素がコードされるＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv．Biochem．Eng． vol． 43，p75-102（1990）、Yeast vol. 8，p423-488（1992）などに詳細に記述されている。
【００６１】
本発明のエステル基を加水分解する活性を有する酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主生物としては、宿主生物自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００６２】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００６３】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００６４】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００６５】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００６６】
中でも、好ましい宿主微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００６７】
形質転換細胞作製のための手順、宿主生物に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Molecular Cloning 3rd Edt．（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、2001）、参照）。
【００６８】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫（蚕など）等の動物細胞中（Nature vol. 315, p592-594 （1985））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物細胞中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽等の無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００６９】
また、エステル基を加水分解する活性を有する酵素としては、具体的には、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来プロテアーゼ（シグマアルドリッチ社製）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来カルボキシエステラーゼＮＰ（配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ１（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ３（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、ブタ肝臓由来エステラーゼ（シグマアルドリッチ社製）等を使用することができ、目的により適宜選択可能である。
【００７０】
中でも、一般式（３Ｓ）で表されるＳ体化合物を選択的に含むキラル化合物を得ることを目的とする場合の酵素としては、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来プロテアーゼ（シグマアルドリッチ社製）や、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来カルボキシエステラーゼＮＰが好ましい。
【００７１】
この時、得られる一般式（３Ｓ）で表される化合物の光学純度は一般的に９０．０％ｅ．ｅ．以上であるが、医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【００７２】
また、一般式（３Ｒ）で表されるＲ体化合物を選択的に含むキラル化合物を得ることを目的とする場合の酵素としては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ１（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ３（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、ブタ肝臓由来エステラーゼ（シグマアルドリッチ社製）を使用することが好ましく、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ１（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ３（ユーリッヒファインケミカルズ社製）等が好ましい。
【００７３】
この時、得られる一般式（３Ｒ）で表される化合物の光学純度は一般的に９０．０％ｅ．ｅ．以上であるが、医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【００７４】
酵素、該酵素を生産する能力を有する細胞、該細胞の処理物、及び／又は該細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて加水分解を実施する場合、通常、水系溶媒中で実施されるが、少なくとも１種の有機溶媒の存在下で実施することも可能である。
有機溶媒を使用する場合、例えば、グリセロール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン等の脂肪族炭化水素、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等を使用することができる。酵素の有機溶媒耐性の観点から、有機溶媒を使用せず、水のみを用いることが好ましい。
【００７５】
反応温度は、例えば、０℃〜８０℃の範囲から選択でき、酵素の熱安定性の観点から、２０℃〜５０℃が好ましい。
【００７６】
反応時間としては、例えば、１時間〜１２０時間の範囲で適宜選択可能であるが、反応時間を長くすることにより一般式（３）で表される化合物のエステル基が加水分解を受けて収率が低下する傾向にあることから２時間〜４０時間が好ましい。
【００７７】
反応に適したｐＨは、使用する酵素等により適宜選択でき、例えば、ｐＨ２．０〜ｐＨ１２．０が挙げられ、中でも、ｐＨ６．０〜ｐＨ１１．０が好ましく、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０がより好ましい。これは、酵素が関与しない加水分解を防ぐためであるが、酵素が関与しない加水分解においては、目的の反応の後に一般式（３）で表される化合物のエステル基が加水分解を受けて収率が低下したり、一般式（３Ｓ）で表される化合物を得る反応において意図せず一般式（３Ｒ）で表される化合物が生成したり、又は一般式（３Ｒ）で表される化合物を得る反応において意図せず一般式（３Ｓ）で表される化合物が生成したりして純度が低下する原因となるため、これらの現象を抑制することができるｐＨで実施するのが好ましい。
本発明の酵素等を作用させる場合においても、ｐＨを好ましい範囲に調整するために、酸又は塩基を添加することことができる。
【００７８】
（後処理）
反応後の後処理としては、必要に応じて、例えば、微生物の不活化、遠心分離、凝集剤処理、ろ過、抽出、濃縮、カラム等の精製等を行ってもよい。抽出を行う場合は、反応液に酸を加えて一般式（３）をカルボン酸として遊離させた後、非水溶性の有機溶媒を用いて抽出すればよい。精製しなくても一般式（３）で表される化合物の純度が充分に高い場合は、精製は行わずに、ろ過、抽出、濃縮のみを行なうことが簡便であるため好ましい。抽出を行なう場合、次の工程で使用する反応溶媒で抽出し、ろ過と、抽出のみ行なうことがさらに好ましい。
【００７９】
前記抽出に使用する非水溶性の有機溶媒としては、例えば、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類等が挙げられ、これらの混合溶媒を用いてもよい。
中でも、抽出効率の観点から、芳香族炭化水素類、エステル類が好ましく、ベンゼン、トルエン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル又はこれらの混合溶媒を用いることがより好ましく、酸性での耐性が高く再利用可能であることから、トルエンを用いることがさらに好ましい。
【００８０】
＜工程（ｉｉ）＞
次に、（ｉｉ）の工程について説明する。
（ｉｉ）の工程は、一般式（３）
【化５２】
0005953429.tif 000053
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させて、一般式（４）
【化５３】
0005953429.tif 000054
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（３）のＲ１及びＲ２と同義である。Ｘは、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＰｈ)２、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＥｔ)２、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、又はハロゲン原子を表す。Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物を得る工程である。
【００８１】
前記一般式（３）及び（４）で表される化合物における、前記Ｒ１及びＲ２については上述の工程（ｉ）の記載と同様である。
【００８２】
前記一般式（４）で表される化合物はラセミ化合物でもよく、キラル化合物でもよい。医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、光学純度の高いキラル化合物であることが好ましく、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【００８３】
一般式（４）におけるＸとしては、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＰｈ)２基、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＥｔ)２基、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３基（Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）又はハロゲン原子を挙げることができる。中でも、Ｘが−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３である一般式（４−１）
【化５４】
0005953429.tif 000055
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記一般式（４）のＲ１、Ｒ２、及びＲ３と同義である。）で表される化合物は、水に対する安定性が高く、後述の工程（ｉｉｉ）における取り扱いが容易になることから好ましい。
【００８４】
Ｒ３のうち、「置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基」のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、ノルマルヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の炭素数１〜１０の直鎖状若しくは分岐状若しくは環状のアルキル基等が挙げられる。当該アルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、当該アルキル基の置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００８５】
Ｒ３のうち、「置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基」のアラルキル基としては、例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、１−フェニルエチル基、１−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、３−フェニルプロピル基等が挙げられる。当該アラルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基等の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、当該アラルキル基の置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。  
【００８６】
Ｒ３のうち、「置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基」のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。当該アリール基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基等の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、当該アリール基の置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００８７】
以下、一般式（４）におけるＸの種類ごとに、好ましい縮合剤又は酸ハロゲン化剤と、好ましいＸの構造について説明する。
【００８８】
Ｘが−ＯＰ（Ｏ）（ＯＰｈ)２である前記一般式（４）で表される化合物、すなわち、前記一般式（４−１）で表される化合物を得たい場合は、縮合剤としてジフェニルリン酸アジドを使用すればよい。
Ｘが−ＯＰ（Ｏ）（ＯＥｔ)２である前記一般式（４）で表される化合物を得たい場合は、縮合剤としてジエチルリン酸アジドを使用すればよい。
【００８９】
また、Ｘが−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３である前記一般式（４）で表される化合物を得たい場合は、縮合剤又は酸ハロゲン化剤としてはＣｌＣ（Ｏ）ＯＲ３と表記されるクロロギ酸エステル類を使用すればよい。入手しやすいクロロギ酸エステルとしては、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸ノルマルプロピル、クロロギ酸イソプロピル、クロロギ酸ノルマルブチル、クロロギ酸イソブチル、クロロギ酸ｔｅｒｔ−ブチル等の炭素数が１〜６の直鎖状もしくは分岐状のクロロギ酸エステル類、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸ベンジル等が好ましい。
Ｘが−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３である場合のＲ３としては、クロロギ酸エステルとして入手しやすいものであることが好ましいため、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数が１〜６の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基、フェニル基、又はベンジル基が好ましい。
【００９０】
また、Ｒ３の構造は後述の工程（ｉｉｉ）にも影響を及ぼす。前記一般式（４−１）で表される化合物は混合酸無水物として、基質のマロン酸誘導体由来のカルボニル基と、縮合剤に由来するカルボニル基の２つを持っている。工程（ｉｉｉ）における反応では、まずアジドアニオンが求核攻撃することから始まるが、目的とするマロン酸誘導体由来のカルボニル基に選択的に求核攻撃が起こらない場合、一般式（５）
【化５５】
0005953429.tif 000056
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（４）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物の収率が低下する傾向にある。通常の場合、２つのカルボニル基の電子密度を考慮すれば、目的通りに求核攻撃が起こる。しかし、一般式（４−１）で表される化合物については２置換のマロン酸誘導体であるため、マロン酸誘導体由来のカルボニル基周辺の立体障害が大きく、一般式（４−１）で表される化合物におけるＲ３の構造が特に小さい場合に目的とする求核攻撃が選択的に起こりにくくなることがある。
よって、Ｒ３としては、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、フェニル基、又は、ベンジル基であることがより好ましい。これに対応するクロロギ酸エステルとしては、クロロギ酸エチル、クロロギ酸ノルマルプロピル、クロロギ酸イソプロピル、クロロギ酸ノルマルブチル、クロロギ酸イソブチル、クロロギ酸ｔｅｒｔ−ブチル、クロロギ酸フェニル、又はクロロギ酸ベンジルが好ましい。また、後述の工程（ｉｉｉ）においてはＲ３ＯＨで表記されるアルコールが副生するため、副生したアルコールを水洗もしくは濃縮により除去する必要があるが、このアルコールの除去し易さを考慮して、Ｒ３としてはエチル基、又はイソプロピル基がさらに好ましい。これらに対応するクロロギ酸エステルとしてはクロロギ酸エチル、又はクロロギ酸イソプロピルが挙げられる。
【００９１】
よって、前記一般式（４−１）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化５６】
0005953429.tif 000057
上述した化合物の中でも、一般式（４−１）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化５７】
0005953429.tif 000058
【００９２】
また、Ｘがハロゲン原子である前記一般式（４）で表される化合物を得たい場合は、（ｉｉ）の工程において酸ハロゲン化剤を使用すればよい。
ここで、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、化合物の安定性の観点からは塩素原子が好ましい。
【００９３】
酸ハロゲン化剤としては、例えば、塩化チオニル、塩化スルフリル、臭化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ三塩化リン、三臭化リン、五臭化リン、オキシ三臭化リン、塩化オキサリル、臭化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲン、シアヌル酸クロリド等が挙げられる。中でも、上述の通りＸとしては塩素原子が好ましいことから、塩化チオニル、塩化スルフリル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ三塩化リン、塩化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲン、シアヌル酸クロリドが好ましく、毒性が低いことから塩化チオニル、塩化スルフリル、塩化オキサリルがさらに好ましい。
【００９４】
以下、縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させる反応の条件は、一般式（４）におけるＸの種類や、Ｒ３の構造等によって変わってくるので、適宜設定すればよいが、例えば、以下の反応条件で反応させることができる。
縮合剤又は酸ハロゲン化剤の使用量は、通常、一般式（３）で表される化合物に対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定できる。原料を完全に消失させて収率を向上させるためには１．０モル当量〜５．０モル当量とすることが好ましく、また、精製負荷を減らす観点から１．０モル当量〜１．５モル当量とすることがさらに好ましい。
【００９５】
縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させる反応には、塩基を使用することができる。当該塩基としては、求核性を持たない塩基であれば特段の制限はないが、３級アミン類やピリジン類が好ましい。
３級アミン類としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリイソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリイソブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアミン、Ｎ−ブチルジメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等が挙げられる。
ピリジン類としては、例えば、ピリジン、２−クロロピリジン、３−クロロピリジン、２−メチルピリジン、３−メチルピリジン、２，３−ルチジン、２，４−ルチジン、２，５−ルチジン、２，６−ルチジン、３，４−ルチジン、３，５−ルチジン等が挙げられる。
上述した中でも、３級アミン類が好ましい。前記一般式（４）で表される化合物が前記塩基で中和されて生成する塩が有機溶媒に溶解しやすく、反応を円滑に進行させる効果があるからである。３級アミン類の中でも、安価であることからトリエチルアミンがより好ましい。
【００９６】
塩基の使用量としては、例えば、一般式（３）で表される化合物に対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定できる。原料を完全に消失させて収率を向上させるためには１．０モル当量〜５．０モル当量とすることが好ましく、また、精製負荷を減らす観点から１．０モル当量〜１．５モル当量がより好ましく、副生成物を抑制するためには縮合剤又は酸ハロゲン化剤と同じモル当量を用いることがさらに好ましい。
【００９７】
また、縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させる反応に使用する反応溶媒としては、例えば、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
中でも、アセトン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、プロピオニトリルは、前記一般式（４）で表される化合物が前記塩基で中和されて生成する塩の溶解度が高く反応効率が良いため好ましい。また、アセトン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフランは、安価で入手が容易な上、後処理をすることなく続く工程（ｉｉｉ）を実施しても悪影響を及ぼさないことからプロセス簡略化の観点でさらに好ましい。水やアルコール類の極性溶媒を用いると、縮合剤又は酸ハロゲン化剤や前記一般式（４）で表される化合物と反応し、収率が低下する傾向にある。
【００９８】
反応溶媒の使用量は、例えば、前記一般式（３）で表される化合物に対して０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能であるが、発熱制御又は容積効率の観点から１倍体積量〜２０倍体積量が好ましく、撹拌効率の観点から、４倍体積量〜１０倍量がさらに好ましい。
【００９９】
本工程では、前記一般式（３）で表される化合物と前記塩基と縮合剤又は酸ハロゲン化剤とを適宜混合して実施することができるが、収率の観点から、前記一般式（３）で表される化合物と塩基を先に混合することが好ましい。
【０１００】
反応温度は、適宜設定可能であるが、例えば、−１００℃〜１００℃の範囲で適宜を設定できる。温度制御を容易にするためには極低温条件は避けることが好ましく、また前記一般式（４）で表される化合物は高温での安定性が低いことから、−５０℃〜５０℃が好ましく、−１０℃〜３０℃がさらに好ましい。
【０１０１】
反応時間は、例えば、５分間〜１０時間の範囲で適宜設定可能であるが、一般的には混合後すぐに反応が終了するため、５分間〜５時間が好ましく、１５分間〜２時間がさらに好ましい。
【０１０２】
この反応の後処理としては、必要に応じて、析出した塩をろ過により除去したり、水と非水溶性有機溶媒を加えて溶媒抽出したり、溶媒抽出後に濃縮して溶媒を除去してもよい。また、純度が不充分である場合はカラム精製してもよいが、後処理や精製を実施しなくても後述の工程（ｉｉｉ）への悪影響は小さいため、プロセス簡略化の観点から、工程（ｉｉ）の反応液をそのまま工程（ｉｉｉ）に用いることが好ましい。
【０１０３】
＜工程（ｉｉｉ）＞
次に、（ｉｉｉ）の工程について説明する。
（ｉｉｉ）の工程は、一般式（４）
【化５８】
0005953429.tif 000059
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｘは、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＰｈ)２、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＥｔ)２、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３又はハロゲン原子を表す。Ｒ３は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物にアジド化剤を作用させ、一般式（５）
【化５９】
0005953429.tif 000060
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（４）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程である。
【０１０４】
前記一般式（４）で表される化合物における前記Ｒ１及びＲ２については、上述の工程（ｉｉ）の記載と同様である。
前記一般式（５）で表される化合物における前記Ｒ１及びＲ２については上述の工程（ｉ）および工程（ｉｉ）の記載と同様である。
【０１０５】
よって、一般式（５）で表される化合物の具体例としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
【化６０】
0005953429.tif 000061
上述した化合物の中でも、前記一般式（５）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化６１】
0005953429.tif 000062
【０１０６】
また、前記一般式（５）はラセミ化合物でもよく、キラル化合物でもよい。医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、光学純度の高いキラル化合物であることが好ましく、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【０１０７】
前記アジド化剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化リチウム等のアジ化金属類や、アジ化トリメチルシリル等のアジ化トリアルキルシリル等が挙げられる。アジ化トリアルキルシリルは副生成物としてトリアルキルシラノールが発生し、一般式（５）で表される化合物との分離操作が必要となることがあるから、アジ化金属類が好ましい。中でも、入手が容易であることからアジ化ナトリウムがより好ましい。
【０１０８】
アジド化剤の使用量は、例えば、一般式（４）で表される化合物に対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、収率及びコストの観点で、１．０モル当量〜５．０モル当量が好ましく、１．０モル当量〜２．０モル当量がさらに好ましい。
【０１０９】
反応溶媒としては、例えば、水、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
反応溶媒としてアルコール類を用いると、一般式（４）で表される化合物と反応し、収率が低下してしまうことがある。上述した中でも、アセトン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフランが、コスト及び入手容易性の観点から、また、前記（ｉｉ）の工程と連続で実施できるためプロセス簡略化の観点から好ましい。
特に、アジド化剤としてアジド化金属類を用いる場合、これらの溶媒に水を加えると、アジド化金属類が水に溶解し、反応が効率的に進行するのでより好ましい。中でも、トルエンもしくはキシレンと、水の組み合わせでは、新たに溶媒を追加することなく後述する水洗及び抽出といった後処理操作ができるため、さらに好ましい。
【０１１０】
アジド化剤としてアジド化金属類を用いる場合において、溶媒として水を使用するときは、反応の原料となる前記一般式（４）で表される化合物は水による分解を起こしにくい化合物であることが好ましく、上述のＸが−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３である一般式（４−１）で表される化合物を用いることがさらに好ましい。
【０１１１】
反応溶媒の使用量としては、例えば、一般式（４）で表される化合物に対して０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能であるが、発熱制御又は容積効率の観点から、１倍体積量〜２０倍体積量が好ましく、撹拌の容易性の観点から５倍体積量〜１０倍体積量がさらに好ましい。
【０１１２】
反応温度は、例えば、−１００℃〜１００℃の範囲で適宜設定可能であるが、−３０℃〜５０℃が温度制御を容易にするために極低温条件は避けた方がよく、また、高温になるにつれて一般式（５）で表される化合物が副反応を起こして収率が低下することがあるため、−１０℃〜２０℃がさらに好ましい。
【０１１３】
反応時間は、例えば、５分間〜１００時間の範囲で適宜設定可能であるが、低温においても一般式（５）で表される化合物の保存安定性が高くないことから１時間〜４０時間が好ましく、１時間〜１０時間がさらに好ましい。
【０１１４】
この反応の後処理としては、必要に応じて、析出した塩をろ過や水洗により除去したり、水と非水溶性の有機溶媒を加えて抽出したりすることができる。特にアジド化剤を過剰に使用した場合、爆発性のあるアジド化剤を除去せずに次工程に進むと危険なことがあるため、充分にアジド化剤を反応系外に除く操作として、水と非水溶性の溶媒を用いて水洗を実施することが好ましい。この時、トルエンやキシレンといった非水溶性の溶媒中で実施した工程（ｉｉ）から溶媒を追加、又は置換することなく連続して工程(ｉｉｉ)を行うと、新たに非水溶性の溶媒を追加することなく、水洗することができるため、経済的でありさらに好ましい。一般式（５）で表される化合物のような酸アジド化合物は一般的に爆発性があることから、溶媒を留去することは避けるべきである。
【０１１５】
なお、非特許文献１では、前記工程（ｉｉ）として、１，２−ジクロロエタン中、塩基としてトリエチルアミンを用い、縮合剤としてジフェニルリン酸アジドを作用させている。つまり、非特許文献１では、一般式（４）で表される化合物のうちＸが−ＯＰ（Ｏ）（ＯＰｈ)２である化合物を経由して、一般式（５）で表される化合物が得られており、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の工程を１段階で行なっている。これはジフェニルリン酸アジドの代わりにジエチルリン酸アジドを用いた場合も同様である。しかし、このような方法では、溶媒として毒性や環境負荷の面で問題のある１，２−ジクロロエタンを使用しており、工業的規模での実施には不向きである。よって、工業的規模で実施する場合は、本発明のように段階的に、ハロゲンを含まない溶媒を用いて、工程（ｉｉ）でクロロギ酸エステル類を作用させることにより一般式（４）で表される化合物を得て、続いて工程（ｉｉｉ）でアジド化金属類を作用させることが好ましい。また、ジフェニルリン酸アジド、ジエチルリン酸アジドと比べて、クロロギ酸アルキル類とアジド化金属類の組み合わせが安価であることから、コストの面でも好ましい。
【０１１６】
＜工程（ｉｖ）＞
次に、（ｉｖ）の工程を説明する。
（ｉｖ）の工程は、クルチウス転位反応によって一般式（５）
【化６２】
0005953429.tif 000063
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物のアジド基をイソシアネート基へと変換し、一般式（６）
【化６３】
0005953429.tif 000064
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記一般式（５）のＲ１、Ｒ２と同義である。）で表される化合物を得ることを特徴とする、一般式（６）で表される化合物の製造方法である。
【０１１７】
前記一般式（５）及び（６）におけるＲ１、Ｒ２については、上述の工程（ｉ）の記載と同様である。
【０１１８】
よって、一般式（６）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化６４】
0005953429.tif 000065
上述した化合物の中でも、一般式（６）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化６５】
0005953429.tif 000066
【０１１９】
また、前記一般式（６）で表される化合物はラセミ化合物でもキラル化合物でもよい。医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、光学純度の高いキラル化合物であることが好ましく、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【０１２０】
クルチウス転位は、酸アジド化合物である一般式（５）で表される化合物を加熱することによって、アジド基の窒素分子の脱離を伴いつつ、イソシアネート化合物へ変換させる反応であり、特段の反応剤を加えなくても反応を進行させることができる。
【０１２１】
この工程に使用できる有機溶媒としては、例えば、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
中でも、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼンは、沸点が高いため、反応温度を高く設定して反応速度を上げることができ、工程時間の短縮に繋がるので好ましい。また、トルエン、キシレンは、前記工程（ｉｉｉ）から続けて使うことが可能であるため、爆発性のある一般式（５）で表される化合物の濃縮及び溶媒置換を避けることができ、かつ経済的であるためさらに好ましい。水、アルコール類は、一般式（６）で表される化合物と反応し、ウレア構造を有する二量体やカーバメートを副生して収率が低下する可能性がある。
【０１２２】
有機溶媒の使用量は、例えば、一般式（５）で表される化合物に対して０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定することができるが、３倍体積量〜３０倍体積量が発熱制御又は容積効率の観点から好ましく、７倍体積量〜１５倍体積量がさらに好ましい。
【０１２３】
反応温度は、例えば、０℃〜３００℃の範囲で適宜設定可能であるが、反応時間を短縮でき、かつ一般式（６）で表される化合物の分解を防ぐという観点から４０℃〜１５０℃が好ましく、７０℃〜１１０℃がさらに好ましい。前記の反応温度よりも高い場合、生成した一般式（６）で表される化合物が分解して収率が下がる傾向がある。一方、前記の反応温度よりも低い場合には、一般式（５）で表される化合物がクルチウス転位を起こすことなく反応系内に溜まりこみ、その後の温度上昇によって一気に反応が進み、短時間で大量の窒素が発生してしまう可能性があるため、安全上の観点から、適宜、窒素の発生量をコントロールすることが好ましい。
なお、本工程では反応が進行するに連れて窒素が発生するため、特に工業スケールでの製造においては、安全上の観点から窒素の発生量をコントロールする必要がある。そのためには一般式（５）で表される化合物が即座にクルチウス転位を起こす温度まで加温した溶媒に、一般式（５）で表される化合物を滴下し、滴下量で窒素の発生量をコントロールするのが好ましい。
【０１２４】
反応時間は、前項に記載の安全面の観点から、一般式（５）で表される化合物を添加した後すぐに反応が完結するような温度設定にすることが理想的であるが、実際には反応を完結させるために一般式（５）で表される化合物を添加後０時間〜５時間加熱を続けることが好ましく、０時間〜３時間加熱を続けることがより好ましい。
【０１２５】
この反応の後処理としては、必要に応じて、塩をろ過により除去したり、水を加えて溶媒抽出したり、濃縮して溶媒を除去したりしてもよい。純度次第ではカラム精製してもよいが、一般式（６）で表される化合物は水分と反応しウレア構造を有する二量体を形成し易いため、後処理は実施しない方が好ましい。
【０１２６】
なお、非特許文献１では、前記工程（ｉｉ）の代わりに、１，２−ジクロロエタン中、塩基としてトリエチルアミンを用い、縮合剤としてジフェニルリン酸アジドを作用させ、加熱している。このような方法では、一般式（５）で表される化合物が得られるが、加熱下で実施しているので、実際には一般式（５）で表される化合物は即座にクルチウス転位を起こし、一般式（６）で表される化合物へと変換されてしまう。つまり、非特許文献１に記載の方法では、工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）を一段階で得ることができ、これはジフェニルリン酸アジドの代わりにジエチルリン酸アジドを用いた場合も同様である。しかし、この方法ではリン酸ジフェニルやリン酸ジエチルが副生するため、これらの副生物を除くための操作が必要となる。非特許文献１ではフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製を実施しているが、この操作は工業的規模での生産にはふさわしくない。この精製に代わる手段として、水洗が考えられるが、一般式（６）で表される化合物と水とを接触させると、上述の通り、ウレア構造を有する二量体が副生し、また、副生するリン酸ジフェニルやリン酸ジエチルが一般式（６）で表される化合物と副反応を起こしやすく、収率低下を招きやすい。
よって、（ｉｉ）〜（ｉｖ）の工程は、前記のように工程（ｉｉ）で、例えば、クロロギ酸エステル類を作用させることにより一般式（４）で表される化合物を得た後、工程（ｉｉｉ）でアジド化金属類を作用させることにより、一般式（５）で表される化合物を得て、工程（ｉｖ）では一般式（５）で表される化合物をクルチウス転位によって一般式（６）で表される化合物へと変換するといったように、段階的に行う方が品質及び収率の両面で好ましい。
【０１２７】
（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を経た後、一般式（６）で表される化合物を一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩へと変換することができる。このときの方法としては、特に限定されないが、例えば、後述する（ｖ）の工程を有する方法により変換することが好ましい。
【０１２８】
＜工程（ｖ）＞
（ｖ）の工程を説明する。
（ｖ）の工程は、一般式（６）
【化６６】
0005953429.tif 000067
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物の（ａ）イソシアネート基をアミノ基に変換する工程、（ｂ）エステル基を加水分解する工程、及び（ｃ）酸を作用させてｔｅｒｔ−ブチル基を除去する工程を含む、一般式（１）
【化６７】
0005953429.tif 000068
（式中、Ｒ２は前記一般式（６）と同義である。）で表されるα−置換システイン又はその塩を得る工程である。
【０１２９】
前記一般式（１）及び（６）で表される化合物における、前記Ｒ１、及びＲ２については、上述の工程（ｉ）の記載と同様である。
【０１３０】
よって、一般式（１）で表されるα−置換システインの具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化６８】
0005953429.tif 000069
上述した化合物の中でも、一般式（１）で表されるα−置換システインとしては、以下の化合物が好ましい。
【化６９】
0005953429.tif 000070
【０１３１】
また、一般式（１）で表されるα−置換システインは塩を形成していてもよい。α−置換システインの塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、マンデル酸塩等のカルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等のスルホン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、フェネチルアミン塩、ピリジン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。中でも、塩酸塩が好ましい。
【０１３２】
また、前記一般式（１）で表される化合物はラセミ化合物でもよく、キラル化合物でもよいが、医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、光学純度の高いキラル化合物であることが好ましく、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【０１３３】
（ａ）イソシアネート基をアミノ基に変換する工程で行なう反応としては、公知の方法を適宜用いることができる。具体的には、酸、又は塩基を作用させることにより直接アミノ基へと変換する方法、アルコールを作用させることによりカーバメートへと変換した後、酸や塩基、もしくは接触還元によってアミノ基へと変換する方法等が挙げられる。
直接アミノ基へと変換する方法において用いられる酸、塩基としては、例えば、塩酸、硫酸等の無機酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が挙げられる。この場合の反応温度は、通常、０℃〜２００℃であり、反応時間は、通常、３０分間〜５０時間である。
また、カーバメートを経由する方法としては、例えば、ベンジルアルコール、ｐ-メトキシベンジルアルコール等を作用させ、ベンジルオキシカルボニル保護アミノ基へと変換した後、接触還元によりベンジルオキシカルボニル基を脱保護する方法や、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールを作用させてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（以下、「Ｂｏｃ」）保護アミノ基へと変換した後、酸を作用させてＢｏｃ基を脱保護する方法等が挙げられる。
【０１３４】
（ｂ）エステル基を加水分解する工程では、前記一般式（６）で表される化合物に、水と、酸又は塩基を作用させる。
塩基を作用させて加水分解する場合、当該塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物や、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩等が挙げられる。
酸を作用させて加水分解する場合、酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の無機酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等が挙げられる。
塩基を作用させる場合も酸を作用させる場合も、反応温度は、通常、０℃〜２００℃であり、反応時間は、通常、３０分間〜５０時間である。
【０１３５】
（ｃ）酸を作用させてｔｅｒｔ−ブチル基を除去する工程では前記一般式（６）で表される化合物に、酸を作用させる。
用いることができる酸としては、ｔｅｒｔ−ブチル基を除去することができれば特に制限はないが、強酸が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の無機酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等が挙げられる。上述した中でも、安価であることから塩酸、硫酸が好ましい。
この場合の反応温度は、通常、５０℃〜２００℃であり、反応時間は、通常、１０時間〜１５０時間である。
【０１３６】
上述の（ａ）イソシアネート基をアミノ基に変換する工程、（ｂ）エステル基を加水分解する工程、（ｃ）ｔｅｒｔ−ブチル基を除去する工程の三つの工程は、どの順番で行ってもよく、二つ以上の工程を同時に行ってもよい。
【０１３７】
また、工程（ｖ）としては、以下に述べる（ｖｉ−１）、（ｖｉ−２）、（ｖｉｉ）の工程を経由することがさらに好ましい。（ｖｉ−１）の工程を経由することにより一般的に長時間の反応を必要とするｔｅｒｔ−ブチル基の除去が速やかに進行し、一般式（７−１）
【化７０】
0005953429.tif 000071
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得ることができる。また、続いて（ｖｉ−２）の工程を経由することにより一般式（７−２）
【化７１】
0005953429.tif 000072
（式中、Ｒ２は前記一般式（６）のＲ２と同義である。）で表される化合物が得られる。前記一般式（７−２）で表される化合物は結晶性が高く、中和点以下のｐＨの水や非極性溶媒に対する溶解度が低いため、無機塩を始めとする水溶性の不純物も、各反応中間体のような非水溶性の不純物も晶析によって容易に除去することができる。よって、続く（ｖｉｉ）の工程の後に得られる一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩を高純度で得ることができる。
【０１３８】
＜工程（ｖｉ−１）、（ｖｉ−２）＞
次に、（ｖｉ−１）と（ｖｉ−２）の工程について説明する。
（ｖｉ−１）の工程は、一般式（６）
【化７２】
0005953429.tif 000073
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に酸を作用させてチアゾリジノン環を構築することにより一般式（７−１）
【化７３】
0005953429.tif 000074
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程である。
【０１３９】
前記一般式（６）及び（７−１）で表される化合物における、前記Ｒ１、Ｒ２については上述の工程（ｉ）の記載と同様である。
【０１４０】
よって、一般式（７−１）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化７４】
0005953429.tif 000075
上述した化合物の中でも、一般式（７−１）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化７５】
0005953429.tif 000076
【０１４１】
また、前記一般式（７−１）はラセミ化合物でもキラル化合物でもよいが、医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、光学純度の高いキラル化合物であることが好ましく、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【０１４２】
工程（ｖｉ−１）で用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の無機酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等が挙げられる。中でも、塩酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸がコストの点でさらに好ましい。
【０１４３】
酸の使用量は、一般式（６）で表される化合物に対して０．０１モル当量〜５０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、コスト及び後処理の煩雑さを考慮すると、０．１モル当量〜１０モル当量が好ましく、０．５モル当量〜３モル当量がさらに好ましい。
【０１４４】
用いられる反応溶媒としては、例えば、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。水、アルコール類を用いると、一般式（６）で表される化合物と反応してウレア構造を有する二量体やカーバメートを副生してしまい、収率が低下する傾向にあるため、工程（ｖｉ−１）の主溶媒として用いることは好ましくない。水、アルコール類を無機酸、無機塩基の溶解に使用する場合は、最小限に留めるのが好ましい。
したがって、上述した中でも、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類が、酸に対する安定性の点で好ましく、前記工程（ｉｖ）から溶媒を変更せず、続けてトルエン、又はキシレンを用いて実施することがコストの点でさらに好ましい。
【０１４５】
反応温度は、例えば、−３０℃〜１００℃の範囲で適宜設定可能である。しかし、７０℃〜１００℃の範囲で実施すると、生成する一般式（７−１）で表される化合物は、一般式（７−２）で表される化合物へと短時間で変換される。そのため、一般式（７−１）で表される化合物を単離したい場合は、−３０℃〜５０℃の範囲で実施するのが好ましく、０℃〜３０℃の範囲で実施するのがさらに好ましい。
【０１４６】
反応時間は、例えば、０．５時間〜２０時間の範囲で適宜設定可能である。設定温度によっては、１０時間〜２０時間の範囲で実施すると、生成する一般式（７−１）で表される化合物が一般式（７−２）で表される化合物へと変換される傾向にあるため、一般式（７−１）で表される化合物を単離したい場合は、０．５時間〜１０時間が好ましく、０．５時間〜３時間がさらに好ましい。
【０１４７】
後処理としては、必要に応じて、塩基を加えて中和してもよく、水と非水溶性有機溶媒を用いて抽出してもよく、揮発性の酸であれば濃縮除去してもよい。特に後処理を実施せずに、後述する（ｖｉ−２）の工程を実施することがプロセス簡略化の観点で好ましい。
【０１４８】
（ｖｉ−２）の工程は、一般式（７−１）
【化７６】
0005953429.tif 000077
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（６）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物に酸又は塩基を作用させてエステル基を加水分解し、一般式（７−２）
【化７７】
0005953429.tif 000078
（式中、Ｒ２は前記一般式（６）のＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程である。
【０１４９】
前記一般式（７−１）及び（７−２）における、前記Ｒ２については上述の工程（ｉ）の記載と同様である。
【０１５０】
よって、一般式（７−２）で表される化合物の具体例としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
【化７８】
0005953429.tif 000079
上述した化合物の中でも、一般式（７−２）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化７９】
0005953429.tif 000080
【０１５１】
また、前記一般式（７−２）はラセミ化合物でも、キラル化合物でもよいが、医薬品又はその中間体として製造する場合、一般的に高い光学純度が求められることから、光学純度の高いキラル化合物であることが好ましく、９５．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．０％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上が特に好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が最も好ましい。
【０１５２】
工程（ｖｉ−２）で用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の無機酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等が挙げられる。中でも、塩酸、硫酸、リン酸がコストの点でさらに好ましく、揮発性の酸であるため濃縮除去が容易であるという点で塩酸がさらに好ましい。
また、塩基を作用させて加水分解してもよい。用いられる塩基としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩等が挙げられる。
塩基を用いる場合は、上述の通り、前記一般式（７−２）で表される化合物は酸性の水に対する溶解度が低く、反対に塩基性に水に対する溶解度が高いため、ろ過で回収する際には酸を加えてｐＨを調整する必要が出てくる。また、中和の際に発生する無機塩混入のリスクも発生するため、品質の観点からは酸を使用することが好ましい。
工程（ｖｉ−１）においても酸を使用するため、工程（ｖｉ−１）で使用した酸を変更せずに続けて作用させ、工程（ｖｉ−１）と工程（ｖｉ−２）とを連続して実施してもよい。あるいは、工程（ｖｉ−２）でさらに酸を追加してもよく、その場合、工程（ｖｉ−１）で使用した酸と同一の酸でも異なる酸でもよい。しかし、プロセス簡略化の観点からは、工程（ｖｉ−１）の後に特に後処理を行わず、工程（ｖｉ−１）で使用した酸を続けて作用させて、これらの工程を連続して実施することが好ましい。即ち、工程（ｖｉ−１）で得られた前記一般式（７−１）で表される化合物を含む反応液を、そのまま、反応温度を変更する等して、工程（ｖｉ−２）に用いることが好ましい。
【０１５３】
酸を用いる場合、酸の使用量は、一般式（７−１）で表される化合物に対して０．０１モル当量〜５０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、コスト及び後処理の煩雑さを考慮すると、０．１モル当量〜１０モル当量が好ましく、０．５モル当量〜２モル当量がさらに好ましい。
【０１５４】
酸を用いる場合、反応溶媒としては、例えば、水、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
アルコールは加水分解の進行を阻害する傾向にあるため、上述した中でもベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類が、酸に対する安定性の点で好ましい。ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼンが高温での加熱が可能なことからさらに好ましく、前記工程（ｖｉ−１）から続けてトルエン、又はキシレンを用いて実施するとコストの点で最も好ましい。
【０１５５】
酸を用いる場合、溶媒の使用量は、一般式（６）で表される化合物に対して、例えば、０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能であり、容積効率の点では０倍体積量〜２０倍体積量が好ましく、０倍体積量〜５倍体積量がさらに好ましい。
【０１５６】
酸を用いる場合、反応温度は、例えば、−３０℃〜２００℃の範囲で適宜設定可能である。転化率向上と溶媒の沸点を考慮すると、２０℃〜１２０℃が好ましく、温度を上げすぎると一般式（７−２）で表される化合物の分解が進行し収率低下を招くため、５０℃〜９０℃がさらに好ましい。
【０１５７】
酸を用いる場合、反応時間は、例えば、０時間〜１００時間の範囲で適宜設定可能である。温度によっては、長時間実施すると一般式（７−２）で表される化合物の分解が進行し、収率低下を招くため、０時間〜３０時間が好ましく、転化率向上の観点からは５時間〜３０時間がさらに好ましい。
【０１５８】
酸を用いる場合、この反応の後処理としては、一般式（７−２）で表される化合物が酸性溶液中で固体であることを利用して、反応溶媒中から晶析回収する方法が挙げられる。あるいは、必要に応じて濃縮して溶媒を除去するだけでもよく、酸もしくは塩基を用いて反応液を中和した後、目的物をイオン交換樹脂に吸着させて塩を分離してから晶析回収してもよく、酸もしくは塩基をイオン交換樹脂に吸着させて除去した上で溶出液から晶析回収してもよく、純度次第ではカラムや再結晶により精製してもよい。酸のみを使用した場合は、一般式（７−２）で表される化合物は一般的に結晶性が高く、かつ高純度で回収可能なため、反応溶媒中からの晶析回収のみを実施することが好ましい。
【０１５９】
また、塩基を用いる場合、反応溶媒としては、塩基に対する安定性の観点から、例えば、水、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。中でもベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類が挙げられる。中でも、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼンが高温での加熱が可能なことからさらに好ましく、前記工程（ｖｉ−１）から続けてトルエン、キシレンを用いて実施することがコストの点で最も好ましい。
【０１６０】
塩基を用いる場合、塩基は、一般式（７−１）で表される化合物に対して０．９モル当量〜２０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、コスト及び後処理の煩雑さを考慮すると、０．９モル当量〜５．０モル当量が好ましく、１．０モル当量〜３．０モル当量がさらに好ましい。工程（ｖｉ−１）の後に特に後処理を行わず、工程（ｖｉ−１）で使用した酸を続けて作用させ、工程（ｖｉ−１）から連続して実施する場合には、酸を中和するのに必要な塩基をさらに追加すればよい。
【０１６１】
塩基を用いる場合、溶媒の使用量は、一般式（６）で表される化合物に対して、例えば、０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能であり、容積効率の点では０倍体積量〜２０倍体積量が好ましく、０倍体積量〜５倍体積量がさらに好ましい。
【０１６２】
塩基を用いる場合、反応温度は、例えば、−３０℃〜１００℃の範囲で適宜設定可能である。副反応を抑制するためには０℃〜８０℃が好ましく、温度を上げすぎると一般式（７−２）で表される化合物の分解が進行して収率低下を招くことがあるため、０℃〜５０℃がさらに好ましい。
【０１６３】
塩基を用いる場合、反応時間は、例えば、０時間〜１００時間の範囲で適宜設定可能である。温度によっては、長時間反応させると一般式（７−２）で表される化合物の分解が進行して収率低下を招くことがあるため、０時間〜３０時間が好ましく、転化率向上の観点からは５時間〜３０時間がさらに好ましい。
【０１６４】
塩基を用いる場合、この反応の後処理としては、一般式（７−２）で表される化合物が酸性溶液中で固体であることを利用して、反応溶媒中から晶析回収することができる。具体的には、酸によって塩基を中和した後、さらに酸を加えればよい。その他、濃縮して溶媒を除去するだけでもよく、酸を用いて反応液を中和した後、目的物をイオン交換樹脂に吸着させて塩を分離してから晶析回収してもよく、塩基をイオン交換樹脂に吸着させて除去した上で溶出液から目的物を晶析回収してもよい。純度次第ではカラムや再結晶により精製してもよいが、酸のみを使用した場合、一般式（７−２）で表される化合物は一般的に結晶性が高く、かつ高純度で回収可能なため、反応溶媒中からの晶析回収のみを実施することが好ましい。
【０１６５】
一般式（７−２）で表される化合物のうち、一般式（７Ｓ−２）
【化８０】
0005953429.tif 000081
（式中、Ｒ２は、前記一般式（７−２）のＲ２と同義である。）及び、一般式（７Ｒ−２）
【化８１】
0005953429.tif 000082
（式中、Ｒ２は、前記一般式（７−２）のＲ２と同義である。）は、ラセミ体と比べて結晶性がさらに高い。従って、ラセミ体よりも、一般式（７Ｓ−２）もしくは一般式（７Ｒ−２）のどちらか一方を選択的に含むキラル体の方が、晶析等により光学純度を向上させることが容易である。
上述の後処理を行なった後に、一般式（７−２）で表される化合物が目的とする光学純度に達していない場合には、再晶析を繰り返すことによって、光学純度を向上させればよい。特に後述する工程（ｖｉｉ）において一般式（１）で表される化合物がキラル体である場合は、原料である一般式（７−２）で表される化合物の光学純度を、あらかじめ晶析によって求められる光学純度まで向上させておくことが好ましい。
【０１６６】
一般式（７−２）で表される化合物の晶析溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。このうち１種類の溶媒を用いても良く、２種類以上の溶媒を混合して使用してもよい。
特に、溶解性が高く精製効率が高いことから、例えば、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒が好ましい。中でも沸点が低く、減圧乾燥による除去がしやすいことから、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類がさらに好ましい。
回収率を向上させるために、これらの極性溶媒にベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類等の低極性溶媒を貧溶媒として加えることが好ましい。
【０１６７】
＜工程（ｖｉｉ）＞
次に、（ｖｉｉ）の工程について説明する。
（ｖｉｉ）の工程は、一般式（７−２）
【化８２】
0005953429.tif 000083
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物に、酸又は塩基を作用させてチアゾリジノン環を開環し、一般式（１）
【化８３】
0005953429.tif 000084
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換システイン又はその塩を得る工程である。
【０１６８】
工程（ｖｉｉ）で用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の無機酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等が挙げられる。
また、塩基としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩等が挙げられる。中でも強塩基が好ましく、具体的には水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が挙げられる。
塩基を用いると、生成したα−置換システインが二量化してジスルフィドを形成しやすくなることから、収率及び品質の点で酸を使用することが好ましい。中でも塩酸、トリフルオロ酢酸、臭化水素、フッ化水素、ヨウ化水素等の揮発性の酸は濃縮だけで除去が可能であることからさらに好ましく、コストの観点から塩酸が最も好ましい。
【０１６９】
また、工程（ｖｉｉ）で用いられる酸又は塩基のうち少なくとも一部は、工程（ｖｉ−２）で用いた酸又は塩基を流用することも可能である。すなわち、工程（ｖｉ−２）の後、特に後処理を行わずに、工程（ｖｉ−２）得られた反応液をそのまま後述する工程（ｖｉｉ）の反応条件に供することで、一般式（１）
【化８４】
0005953429.tif 000085
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換システイン又はその塩を得ることもできる。
しかし、一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩を高純度で製造する場合は、原料となる一般式（７−２）で表される化合物も高純度であることが求められる。そのため、上述の通り、工程（ｖｉ−２）の後は一般式（７−２）で表される化合物を晶析回収する操作を実施して不純物を除いた後に、工程（ｖｉｉ）を実施するのが品質管理の観点で好ましい。
【０１７０】
酸又は塩基の使用量としては、例えば、一般式（７）で表される化合物に対して０．１モル当量〜２００モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、１モル当量〜３０モル当量が容積効率の点で好ましい。また、酸を用いる場合、反応時間を短縮するためには一般式（７）で表される化合物が酸に完全に溶解している状態が好ましく、また、酸を除去する工程のプロセス負荷を考慮すると５モル当量〜２０モル当量とすることが、さらに好ましい。
【０１７１】
また、必要に応じて溶媒の存在下で反応させてもよく、当該溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。酸を用いる場合は、酸との副反応を起こさないものが好ましく、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類が好ましいが、酸の濃度が高いほど反応が促進されるため、溶媒を用いず、酸を溶媒として利用するのがさらに好ましい。
【０１７２】
反応温度は、例えば、−３０℃〜３００℃の範囲で適宜設定可能であり、溶媒の沸点を考慮すると、２５℃〜１５０℃が好ましい。中でも揮発性の酸を用いる場合、反応温度が沸点を超えると酸が揮発するため、酸濃度が下がって反応速度が遅くなることから、８０℃〜１１０℃がさらに好ましい。密閉可能な耐圧性の反応容器を用いることで酸の揮発を防ぎながら実施することもできるが、この場合の好ましい範囲は前記に限らない。
【０１７３】
反応時間としては、例えば、１時間〜３００時間の範囲で適宜設定可能である。収率の観点から、１０時間〜２００時間が好ましく、特に酸を用いる場合は４０時間〜１００時間がさらに好ましい。
【０１７４】
酸を用いる場合、この反応の後処理は、α−置換システインを塩として回収するのか否かによって適宜選択可能である。例えば、酸との塩として回収する場合は、濃縮して溶媒を除去すればよい。α−置換システインとして回収する場合は、反応液に中和点まで塩基を加え、α−置換システインを析出させてろ過により回収してもよく、反応液を陽イオン交換樹脂に通してα−置換システインを吸着させることで酸を除いた後、α−置換システインの溶出液を濃縮して回収してもよい。α−置換システイン又はその塩を高純度で得るためには、再晶析を実施し、純度を上げることが好ましい。
【０１７５】
再晶析する場合には、晶析溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、このうち１種類の溶媒を用いても良く、２種類以上の溶媒を混合して使用してもよい。メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類に対しては精製の効果が高いことから好ましい。
α−置換システインはこれらの溶媒に対する溶解度が高く、単一溶媒で晶析を行なうと回収率が低いため、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類といった非極性溶媒を貧溶媒として加えることがより好ましい。中でも、メタノール、エタノール、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類とベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類の組み合わせが精製効果と高い回収率を両立できるためさらに好ましく、ろ過後の乾燥による溶媒除去のしやすさの面と作業者の安全を考慮するとメタノール、エタノール、もしくはイソプロピルアルコールと、トルエンとの組み合わせが最も好ましい。
［一般式（１Ｓ）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法］
【０１７６】
前記一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩のうち、立体配置がＳ体である式（１Ｓ）
【化８５】
0005953429.tif 000086
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩は医薬品等の中間体として有用である。中でもＲ２がメチル基であるα−メチル−Ｄ−システイン又はその塩は、特に鉄過剰症治療薬の中間体として有用であることが知られており、工業的なスケールでの生産可能な製造法の確立が期待されている。
【０１７７】
前記一般式（１Ｓ）で表されるα−置換システインの具体例としては、以下の化合物が挙げられる。
【化８６】
0005953429.tif 000087
上述した化合物の中でも、化合物（１Ｓ）としては、以下の化合物が好ましい。
【化８７】
0005953429.tif 000088
【０１７８】
一般式（１Ｓ）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩が医薬品の中間体として使用される場合、上述の通り高い光学純度が要求される。一般的には９９．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が特に好ましい。
【０１７９】
以下、一般式（１Ｓ）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩の製造方法について説明するが、各工程の反応条件等については[一般式（１）で表されるα−置換システイン又はその塩の製造方法]の記載と同様である。
一般式（１Ｓ）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩を製造するためには、前記工程（ｉ）で製造した一般式（３Ｓ）
【化８８】
0005953429.tif 000089
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は前記一般式（１Ｓ）と同義である）で表される化合物を用いて前記工程（ｉｉ）〜（ｖ）を実施すればよい。
【０１８０】
まず、工程（ｉｉ）において前記一般式（３Ｓ）に縮合剤又は酸ハロゲン化剤を作用させて一般式（４Ｓ）
【化８９】
0005953429.tif 000090
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（３Ｓ）のＲ１及びＲ２と同義である。Ｘは、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＰｈ)２、−ＯＰ（Ｏ）(ＯＥｔ)２、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３又はハロゲン原子を表す。）で表される化合物を得ればよい。一般式（４Ｓ）で表される化合物は、Ｘの種類に応じてＳ体となることもＲ体となることもあり得る。
中でもクロロギ酸エステル類を作用させてＸが−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３である一般式（４Ｓ−１）
【化９０】
0005953429.tif 000091
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記一般式（４）のＲ１、Ｒ２及びＲ３と同義である。）で表される化合物を得るのが好ましい。
【０１８１】
前記一般式（４Ｓ−１）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化９１】
0005953429.tif 000092
上述した化合物の中でも、化合物（４Ｓ−１）としては、以下の化合物が好ましい。
【化９２】
0005953429.tif 000093
【０１８２】
次に工程（ｉｉｉ）において前記一般式（４Ｓ）で表される化合物にアジド化剤を作用させて一般式（５Ｓ）
【化９３】
0005953429.tif 000094
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（４Ｓ）のＲ１及びＲ２と同義である）で表される化合物を得ればよい。中でもＸが−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３基である前記一般式（４Ｓ−１）で表される化合物を原料として使用するのが好ましい。
【０１８３】
前記一般式（５Ｓ）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化９４】
0005953429.tif 000095
上述した化合物の中でも、一般式（５Ｓ）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化９５】
0005953429.tif 000096
【０１８４】
次に工程（ｉｖ）において前記一般式（５Ｓ）で表される化合物をクルチウス転位反応により、一般式（６Ｓ）
【化９６】
0005953429.tif 000097
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（５Ｓ）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換すればよい。
【０１８５】
前記一般式（６Ｓ）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化９７】
0005953429.tif 000098
上述した化合物の中でも、一般式（６Ｓ）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化９８】
0005953429.tif 000099
【０１８６】
次に、工程（ｖ）において（ａ）イソシアネート基をアミノ基へと変換する工程、（ｂ）エステル基を加水分解してカルボキシル基に変換する工程、（ｃ）酸を作用させてｔｅｒｔ−ブチル基を除去する工程を経て前記一般式（１Ｓ）が得られる。中でも、前記一般式（６Ｓ）で表される化合物を得た後は、前記工程（ｖｉ−１）、（ｖｉ−２）、（ｖｉｉ）を経由することが好ましい。
【０１８７】
すなわち工程（ｖｉ−１）において前記一般式（６Ｓ）に酸を作用させチアゾリジノン環を構築することにより一般式（７Ｓ−１）
【化９９】
0005953429.tif 000100
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（６Ｓ）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換する。次いで工程（ｖｉ−２）において前記一般式（７Ｓ−１）で表される化合物に酸、又は塩基を作用させてエステル基を加水分解することにより、一般式（７Ｓ−２）
【化１００】
0005953429.tif 000101
（式中、Ｒ２は、前記一般式（７Ｓ−１）のＲ２と同義である。）で表される化合物へと変換する。次に、工程（ｖｉｉ）において前記一般式（７Ｓ−２）に酸、又は塩基を作用させてチアゾリジノン環を開環することにより、前記一般式（１Ｓ）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩が得られる。
【０１８８】
言い換えれば、工程（ｖｉ−１）を経由することにより一般的に長時間の反応を必要とするｔｅｒｔ−ブチル基の除去が速やかに進行し、一般式（７Ｓ−１）で表される化合物を短時間で得ることができる。また続く工程（ｖｉ−２）で得られる一般式（７Ｓ−２）で表される化合物は結晶性が高く、中和点以下のｐＨの水や非極性溶媒に対する溶解度が低いため、無機塩を始めとする水溶性の不純物と各反応中間体のような非水溶性の不純物の何れについても晶析によって除去することが容易であり、続く工程（ｖｉｉ）の後、一般式（１Ｓ）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩を高純度で得ることができる。加えて、一般式（７Ｓ−２）で表される化合物は当該化合物のラセミ体と比べて結晶性がさらに高いことから、晶析によって光学純度を向上させることも容易である。よって、以下の一般式（７Ｓ）
【化１０１】
0005953429.tif 000102
（式中、Ｒ２は前記一般式（６）と同義である。Ｒ５は、水素原子、又は、前記一般式（６Ｓ）のＲ１と同義である。）で表される化合物は、高品質の一般式（１Ｓ）で表されるα−置換システイン又はその塩を短時間で製造するための重要な中間体であると言える。
ここで、一般式（７Ｓ）は、一般式（７Ｓ−１）と一般式（７Ｓ−２）を含むものである。
【０１８９】
前記一般式（７Ｓ）で表される化合物の具体例としては、以下の化合物が挙げられる。
【化１０２】
0005953429.tif 000103
上述した化合物の中でも、一般式（７Ｓ）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化１０３】
0005953429.tif 000104
【０１９０】
一般式（１Ｓ）で表されるα−置換−Ｄ−システイン又はその塩が医薬品の中間体として使用される場合、上述の通り高い光学純度が要求されることから、前駆体である一般式（７Ｓ）で表される化合物の光学純度も９９．０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、９９．５％ｅ．ｅ．以上がさらに好ましく、９９．８％ｅ．ｅ．以上が特に好ましい。工程（ｖｉ−２）を実施した後、一般式（７−２）が目的とする光学純度に達していない場合は、再晶析を繰り返すことによって、光学純度を向上させればよい。
【０１９１】
［一般式（２）で表される化合物の製造方法］
前記で述べた（ｉ）〜（ｖｉｉ）の工程の出発物質は、一般式（２）
【化１０４】
0005953429.tif 000105
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物であり、当該化合物の従来の製造方法では、発がん性物質であるビスクロロメチルエーテルが生成する可能性があったため、工業的には好ましくないものであった。
【０１９２】
そこで、本発明者らは、ビスクロロメチルエーテルを生成せず、安全に一般式（２）で表される化合物を製造する方法を見出したので、以下にその説明をする。
【０１９３】
一般式（２）で表される化合物の製造方法は、（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）又は（ｘｉ）の何れかの工程を含む。
【０１９４】
＜工程（ｖｉｉｉ）＞
まず、（ｖｉｉｉ）の工程について説明する。
（ｖｉｉｉ）の工程は、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンとホルムアルデヒドを反応させることにより、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールを生成する工程である。
【０１９５】
ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンは、市販されているものを使用すればよい。ホルムアルデヒドは、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、１，３，５−トリオキサンの形で市販されているものをいずれも使用可能であるが、コストの点及び取り扱いの容易さの観点から、ホルマリンが好ましい。
【０１９６】
ホルムアルデヒドは、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンに対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能であり、定量的にｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールを得るためには、０．９モル当量〜２．０モル当量が好ましく、コストの観点及び後処理の簡便さから０．９モル当量〜１．２モル当量がさらに好ましい。
【０１９７】
本工程では、溶媒を使用してもよいが、溶媒を使用せずホルマリンを溶媒として実施しても反応が進行するため、溶媒を使用しないほうがコストの観点で好ましい。
【０１９８】
反応温度は、例えば、−５０℃〜２００℃の範囲で適宜設定可能であるが、−２０℃〜１００℃が好ましく、また、反応性及び、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンの沸点を考慮して、４０℃〜８０℃がさらに好ましい。
【０１９９】
反応時間は、例えば、０．５時間〜１００時間の範囲で適宜設定可能であるが、１時間〜４０時間が好ましく、５時間〜２０時間がさらに好ましい。
【０２００】
本工程の反応の後、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノール内にホルムアルデヒドが残ると、次に説明する工程（ｉｘ）においてクロロ化剤のような塩化水素を発生させる物質と反応し、発がん性物質であるビスクロロメチルエーテル生成の要因となる。よって、過剰にホルムアルデヒドを使用した場合は、後処理として、ホルムアルデヒドを除去する工程を加える必要がある。例えば、水と非水溶性有機溶媒を加えて水洗することでホルムアルデヒドを水層に除去する、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールを蒸留精製する、固体のパラホルムアルデヒドをろ過する等の方法を用いることができる。中でも、水と非水溶性有機溶媒を加えて水洗するのがホルムアルデヒドの除去効率が高いため好ましい。
水洗に用いる非水溶性有機溶媒は、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類等が挙げられる。中でも、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類が、水との分離性が高く、また低沸点であるため蒸留により除去しやすく、再利用可能であるため好ましい。
溶媒として水を用いる場合は、使用する非水溶性有機溶媒にもよるが、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールの水洗による水層へのロスを最小限にするために無機塩を溶解した水を用いるのが好ましく、コストの観点から食塩水を用いるのがより好ましい。
【０２０１】
＜工程（ｉｘ）＞
次に、（ｉｘ）の工程について説明する。
（ｉｘ）の工程は、前記（ｖｉｉｉ）の工程で得られたｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールに、塩基の存在下、クロル化剤を作用させて、ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンを得る工程である。
【０２０２】
クロル化剤としては、例えば、塩化水素、塩化ピバロイル、塩化アセチル、塩化ベンゾイル、塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ三塩化リン、塩化オキサリル、塩化スルフリル等が挙げられる。中でも、塩化チオニルが安価でかつ反応選択性が高いため好ましい。
【０２０３】
クロル化剤の使用量は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールに対し０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能である。コスト及び後処理の容易さから０．８モル当量〜３モル当量が好ましく、ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンを定量的に得るためには、０．９モル当量〜１．２モル当量がさらに好ましい。
【０２０４】
また、塩基としては、求核性を持たない塩基であれば特段の制限はないが、例えば、ピリジン、２−クロロピリジン、３−クロロピリジン、２−メチルピリジン、３−メチルピリジン、２，３−ルチジン、２，４−ルチジン、２，５−ルチジン、２，６−ルチジン、３，４−ルチジン、３，５−ルチジン等のピリジン類、トリエチルアミン、トリイソプロピルアミン、ジメチルイソプロピルアミン、ジメチルブチルアミン、ジエチルメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等の３級アミン等が挙げられる。コストの観点からピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンが好ましく、後述する後処理法において副生する塩酸塩の溶解性の低いことが有利であることと、収率の観点から、ピリジンがさらに好ましい。
【０２０５】
塩基の使用量は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールに対して、０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、０．８モル当量〜５モル当量が好ましく、コスト及び後処理の容易さから０．９モル当量〜１．５モル当量がさらに好ましい。また、クロル化剤の使用量に対して、１．０モル当量〜１．１モル当量であることが最も好ましい。
【０２０６】
（ｉｘ）の工程は、反応溶媒を使用してもよく、例えば、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
中でも、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルムは、酸に不活性なので副反応を起こしにくく、再利用可能であるため、好ましい。また、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類は、副生する塩基の塩酸塩を溶かしにくい溶媒であり後述する後処理工程での除去がしやすいため、さらに好ましい。
水、アルコール類は、クロル化剤を分解しやすいことから、混入量を最小限にすることが好ましい。
【０２０７】
反応溶媒の使用量は、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールに対して、例えば、０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能である。当該工程は発熱が大きいため、溶媒を使用しないのはプロセス安全上問題があること、また容積効率の観点から、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールに対して１倍体積量〜２０倍体積量の反応溶媒を使用することが好ましい。また、副生する塩基の塩酸塩が析出した際の攪拌効率の確保及び容積効率を考慮して、５倍体積量〜１５倍体積量がさらに好ましい。
【０２０８】
反応温度は、例えば、−８０℃〜１００℃の範囲で適宜設定可能であり、−５０℃〜５０℃が好ましい。また、温度が高すぎるとｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンが分解し収率が低下することから、−１５℃〜２５℃がさらに好ましい。
【０２０９】
反応時間は、例えば、０．５時間〜５０時間の範囲で適宜設定可能であり、１時間〜２０時間が好ましい。また、長時間反応させるとｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンが分解し収率が低下することから、１時間〜８時間がさらに好ましい。
【０２１０】
この後処理としては、反応液中に析出してくる塩基の塩酸塩をろ過や水洗で除去すればよい。除去後は、純度次第で溶媒を除去するだけでもよく、蒸留精製してもよい。例えば塩基としてピリジンを用いた場合、上述の通りピリジン塩酸塩は溶媒への溶解度が低いことから、ろ過実施後は溶媒除去だけでも充分だが、さらに蒸留操作を加えると、高純度のｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンが得られるため好ましい。
【０２１１】
＜工程（ｘ）＞
次に、（ｘ）の工程について説明する。
（ｘ）の工程は、前記工程（ｉｘ）で得られたｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンに、塩基の存在下、一般式（８）
【化１０５】
0005953429.tif 000106
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物を作用させて、一般式（２）
【化１０６】
0005953429.tif 000107
（式中、Ｒ１及びＲ２は、前記一般式（８）のＲ１及びＲ２と同義である。）で表される化合物を得る工程である。
【０２１２】
一般式（８）で表される化合物において、前記Ｒ１、Ｒ２については前記工程（ｉ）の記載と同様である。
よって、一般式（８）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化１０７】
0005953429.tif 000108
上述した化合物の中でも、一般式（８）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化１０８】
0005953429.tif 000109
【０２１３】
一般式（８）で表される化合物は市販されているものを使用しても良く、Tetrahedron Letters (2008), 49, (15), 2446-2449.に記載の方法等に従い、マロン酸ジアルキルと塩基、アルキル化剤との組み合わせによって製造してもよい。
【０２１４】
また、一般式（８）で表される化合物においてＲ１は必ずしも同一である必要は無く、それぞれ異なっていてもよい。Ｒ１が異なる場合、前記一般式（８）で表される化合物にはＲ体、Ｓ体の二つのエナンチオマーが存在するが、その混合比は特に問わない。
【０２１５】
ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンの使用量は、例えば、前記一般式（８）で表される化合物に対して、０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、前記一般式（２）で表される化合物を定量的に得るためには０．９モル当量〜５モル当量が好ましく、１．０モル当量〜１．５モル当量がコストの点からさらに好ましい。
【０２１６】
また、塩基としては、例えば、アルカリ金属アルコキシド、又はアルカリ金属水素化物が挙げられる。アルカリ金属アルコキシドとしては、リチウムエトキシド、リチウムメトキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等が挙げられる。アルカリ金属水素化物としては、水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム等が挙げられる。
中でも、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシドは、反応時に水素の発生が無く安全に取り扱え、かつアルカリ金属水素化物に含まれるミネラルオイルを除去する操作を必要としないため好ましく、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドが、有機溶媒への溶解度が高く求核性が低いことからさらに好ましい。
【０２１７】
塩基は、例えば、一般式（８）で表される化合物に対して、０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、前記一般式（２）で表される化合物を定量的に得るためには０．９モル当量〜５モル当量が好ましく、コストの観点及び副反応を低減するためには０．９モル当量〜１．５モル当量がさらに好ましい。
【０２１８】
当該工程においては反応溶媒を使用してもよい。反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
中でも、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジメチルスルホキシド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性の極性溶媒は、一般式（８）で表される化合物と塩基が反応して生成するアルカリ金属塩の溶解度が高いことから反応を促進する効果があるため好ましく、テトラヒドロフランが、安価、かつ入手容易であることからさらに好ましい。
【０２１９】
反応溶媒の使用量は、ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンに対して、例えば、０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能である。中でも、一般式（８）で表される化合物のアルカリ金属塩を溶解させる溶媒を加えることで反応が進行しやすくなること、及び、容積効率の観点から、１倍体積量〜２０倍体積量が好ましく、３倍体積量〜８倍体積量がさらに好ましい。
【０２２０】
反応温度は、例えば、−１００℃〜２００℃の範囲で適宜設定可能であり、−５０℃〜１００℃が好ましい。温度が低すぎると一般式（８）で表される化合物のアルカリ金属塩の溶媒への溶解度が下がることで反応が遅くなり、高すぎると副反応が生じて収率が低下する可能性があることから、−１０℃〜５０℃がさらに好ましい。
【０２２１】
反応時間は、例えば、０．５時間〜１００時間の範囲で適宜設定可能であり、１時間〜２０時間が好ましい。長すぎると副反応が生じて収率が低下する可能性があるため、１時間〜１０時間がさらに好ましい。
【０２２２】
この反応の後処理としては、反応液中に析出してくる無機塩をろ過で除くか、水と非水溶性溶媒を加えて水洗で除去するのが好ましい。中でも、使用する反応溶媒によっては該反応溶媒へ無機塩が溶解することから、水洗を加えるのがより好ましい。また、反応液に水を加えると水層は塩基性になるため、一般式（８）で表される化合物中のエステル基の加水分解を抑制するためには、反応液中に低温下で酸性の水を加える、水を加えた後に酸を添加して水層のｐＨを中性にコントロールする、反応液を酸性の水溶液に添加する等の方法を用いることができる。水を加えた後に酸を添加して水層のｐＨを中性にコントロールするのが好ましい。無機塩の除去後は、純度次第では濃縮して溶媒を除去するだけでもよいし、カラム精製してもよい。
【０２２３】
後処理において用いられる非水溶性溶媒としては、例えば、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類等の溶媒を使用して抽出すればよい。
中でも、一般式（２）で表される化合物の溶解性が高いことから、トルエン、キシレン、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルが好ましく、コストの面からトルエンがさらに好ましい。
【０２２４】
前記（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）の工程により、出発物質である一般式（２）で表される化合物を製造することが可能である。
【０２２５】
また、以下に述べる（ｘｉ）の工程により、（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）とは別の方法で、前記一般式（２）で表される化合物を製造することができる。
【０２２６】
＜工程（ｘｉ）＞  
（ｘｉ）の工程は、一般式（９）
【化１０９】
0005953429.tif 000110
（式中、Ｒ１は、独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物に、塩基の存在下で、アルキル化剤を作用させて、一般式（２）
【化１１０】
0005953429.tif 000111
（式中、Ｒ１は、前記一般式（９）のＲ１と同義である。Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物を得る工程である。
【０２２７】
一般式（９）で表される化合物は、例えば国際公開第２０１０／１２９０６６や、Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ, １９５８, ３８，２２に記載の方法で合成したメチレンマロン酸ジアルキルにｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンを作用させることで得られる。
【０２２８】
前記一般式（９）で表される化合物における前記Ｒ１、及びＲ２については、上述の工程（ｉ）の記載と同様である。
よって、一般式（９）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。
【化１１１】
0005953429.tif 000112
上述した化合物の中でも、一般式（９）で表される化合物としては、以下の化合物が好ましい。
【化１１２】
0005953429.tif 000113
【０２２９】
また、一般式（９）で表される化合物においてＲ１は必ずしも同一である必要は無く、それぞれ異なっていてもよい。Ｒ１が異なる場合、前記一般式（９）で表される化合物にはＲ体、Ｓ体の二つのエナンチオマーが存在するが、その混合比については特に制限はない。
【０２３０】
アルキル化剤としては、例えば、Ｒ２Ｙ、（Ｒ２Ｏ）２ＳＯ２（式中、Ｒ２は前記一般式（２）と同義であり、Ｙはハロゲン原子、又は置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリールスルホニルオキシ基、炭素数１〜１０のアルキルスルホニルオキシ基、及び炭素数７〜２０のアラルキルスルホニルオキシ基を表す）等が使用可能である。
前記Ｙのハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。炭素数６〜１２のアリールスルホニルオキシ基としては、ベンゼンスルホニルオキシ基、１−ナフタレンスルホニルオキシ基、２−ナフタレンスルホニルオキシ基が挙げられる。炭素数１〜１０のアルキルスルホニルオキシ基としては、メタンスルホニルオキシ基、エタンスルホニルオキシ基、プロパンスルホニルオキシ基が挙げられる。炭素数７〜２０のアラルキルスルホニルオキシ基としては、ベンジルスルホニルオキシ基等が挙げられる。当該アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、アラルキルスルホニルオキシ基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチル基、エチル基等の炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ニトロ基等が挙げられる。置換基の数は特に限定されないが、置換基が２個以上ある場合は、置換基の種類は同一でも異なっていてもよい。
Ｒ２としては塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子,メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、４−トルエンスルホニルオキシ基が好ましい。中でも、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルオキシ基、及びｐ−トルエンスルホニルオキシ基が、反応性の高さから好ましく、ヨウ素原子がさらに好ましい。
【０２３１】
アルキル化剤の使用量は、例えば、一般式（９）で表される化合物に対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能であるが、速やかに反応を進行させて副反応を抑えるために、多少過剰な方がよく、１．０モル当量〜３．０モル当量が好ましい。また、コストの観点、及び過剰過ぎると副反応が進行しやすいことから、１．１モル当量〜２．０モル当量がさらに好ましい。
【０２３２】
塩基としては、例えば、アルカリ金属アルコキシド又はアルカリ金属水素化物が挙げられ、アルカリ金属アルコキシドとしては、リチウムエトキシド、リチウムメトキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等が挙げられる。アルカリ金属水素化物としては、水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム等が挙げられる。
一般式（９）で表される化合物は、塩基の存在下、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基の脱離と付加を繰り返す。脱離が起こると前記一般式（９）はメチレンマロン酸ジアルキルへと変換されるが、ここに求核性のある塩基が存在するとメチレンマロン酸ジアルキルへのマイケル付加反応を起こし、収率が低下する可能性がある。一方、求核性の無い塩基はこのような副反応を起こすことがない。よって前記塩基としては、求核性の無い水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物が好ましく、コスト及び安全面の観点から水素化ナトリウムがさらに好ましい。
【０２３３】
塩基の使用量は、例えば、一般式（９）で表される化合物に対して０．７モル当量〜１０モル当量の範囲で適宜設定可能である。溶媒等の水分により一部失活しやすいことから０．９モル当量〜４．０モル当量が好ましく、また、コスト及び副反応抑制の観点から１．０モル当量〜２．０モル当量がさらに好ましい。
【０２３４】
反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
中でも、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性の極性溶媒は、一般式（９）で表される化合物と塩基が反応して生成する塩の溶解度が高いことから反応を促進する効果があるため好ましい。また、沸点が低く濃縮除去が容易である点から、テトラヒドロフランがさらに好ましい。
【０２３５】
反応溶媒の使用量は、一般式（９）で表される化合物に対して、例えば、０倍体積量〜１００倍体積量の範囲で適宜設定可能であるが、塩基の種類によっては反応熱が大きく、溶媒に懸濁させずに実施するのが危険であること、及び、容積効率の観点から、１倍体積量〜３０倍体積量が好ましく、８倍体積量〜２０倍体積量がさらに好ましい。
【０２３６】
反応温度は、例えば、−１００℃〜２００℃の範囲で適宜設定可能であり、−５０℃〜１００℃が好ましい。反応温度が低すぎると一般式（９）で表される化合物と塩基とからなる塩の反応溶媒への溶解量が下がることで反応が遅くなり、反応温度が高すぎると二量体の生成等の副反応が生じる可能性があることから、−１０℃〜５０℃がさらに好ましい。
【０２３７】
反応時間は、例えば、０時間〜３０時間の範囲で適宜設定可能であり、５分〜５時間が好ましい。反応時間が長すぎると副反応が生じる可能性があるため、１５分〜２時間がさらに好ましい。
【０２３８】
この反応の後処理としては、反応液中に析出してくる無機塩をろ過や水洗で除去するのが好ましいが、使用する溶媒次第では反応溶媒へ無機塩が溶解することから、水洗を加えるのがより好ましい。また、反応液に水を加えると水層は塩基性になるため、一般式（８）もしくは一般式（９）で表される化合物中のエステル基の加水分解を抑制するためには、反応液中に低温下で酸性の水を加える、水を加えた後に酸を添加して水層のｐＨを中性にコントロールする、反応液を酸性の水溶液に添加する等の方法を用いることができ、水を加えた後に酸を添加して水層のｐＨを中性にコントロールするのが好ましい。無機塩の除去後は、純度次第では濃縮して溶媒を除去するだけでもよいし、カラム精製してもよい。
【０２３９】
当該工程において後処理の水洗操作に用いられる非水溶性溶媒としては、例えば、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類等の溶媒を使用して抽出すればよい。
中でも、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、ノルマルヘプタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジクロロメタンは、沸点が低く除去効率が良いことから好ましく、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルは、抽出効率が良いことからさらに好ましい。
【０２４０】
[新規化合物]
本発明により、以下に示す新規化合物を提供することができる。
本発明の新規化合物は、本発明の製造方法により製造することができ、また、通常の有機化学手法を用いて、合成することも可能である。
なお、以下の一般式（４−１）、（５）、（６）、および（７Ｓ）におけるＲ１、Ｒ２、及びＲ３の具体例、及び一般式（４−１）、（５）、（６）、および（７Ｓ）で表される化合物の具体例は、上述の[一般式（１）で表されるα‐置換システイン又はその塩の製造方法]、又は[一般式（１Ｓ）で表されるα‐置換システイン又はその塩の製造方法]に記載のものと同様である。
＜一般式（４−１）で表される化合物＞
一般式（４−１）
【化１１３】
0005953429.tif 000114
（式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
＜一般式（５）で表される化合物＞
一般式（５）
【化１１４】
0005953429.tif 000115
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
＜一般式（６）で表される化合物＞
一般式（６）
【化１１５】
0005953429.tif 000116
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）で表される化合物。
＜一般式（７Ｓ）で表される化合物＞
一般式（７Ｓ）
【化１１６】
0005953429.tif 000117
（式中、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換されていてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換されていてもよい炭素数６〜１２のアリール基を表す。）で表される化合物。
【実施例】
【０２４１】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本実施例における定量分析は、ＧＣ（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈy）もしくはＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。
＜ＧＣ−１＞
カラム：ＧＬサイエンスＴＣ−５（０．５３ｍｍ×３００ｍｍ、膜厚５μｍ）
キャリヤーガス：ヘリウム、カラム流量３．９３ｍＬ／分（スプリット比２０：１）、入り口圧：２２．２ｋＰａ、全流量：８５．４ｍＬ／分（線速度：３０ｃｍ／秒）
カラム温度：５０℃（５分保持）→昇温１０℃／分→２００℃（１０分保持）
インジェクション温度：２２０℃
ディテクション温度：２３０℃
検出器：ＦＩＤ、水素：４０ｍＬ／分、空気：４００ｍＬ／分、メイクアップガス窒素：３０ｍＬ／分、信号アッテネーション×２−３
試料注入量：１．０μＬ
＜ＨＰＬＣ−１＞
カラム：ナカライテスク  ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳＩＩ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌテトラフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル＝３０／７０（体積比）
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ
＜ＨＰＬＣ−２＞
カラム：ダイセル  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＺ−３Ｒ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
移動相：０．０２重量％テトラフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル＝７５／２５（体積比）
流速：０．７ｍＬ／分
カラム温度：３０℃
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ
＜ＨＰＬＣ−３＞
カラム：ＳＩＥＬＣ  ｐｒｉｍｅｓｅｐ  １００（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ）
移動相：Ａ：０．１重量％トリフロオロ酢酸水溶液  Ｂ：アセトニトリル
グラジエント（Ｂ濃度）：０分１０％→１５分３０％→２０分８０％
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
＜ＨＰＬＣ−４＞
カラム：資生堂  Ｃｈｉｒａｌ  ＣＤ−Ｐｈ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）
移動層：（１００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸＋０．２重量％リン酸）水溶液／アセトニトリル＝９９／１（体積比）
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：３０℃
検出波長：２０５ｎｍ【０２４２】
［実施例１］工程（ｖｉｉｉ）：ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールの製造
窒素気流下、１Ｌの反応器にｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン２４０ｇ（２．６６ｍｏｌ）、ホルマリン（３７重量％）２１６ｇ（２．６６ｍｏｌ）を室温で加えて攪拌した。６０℃で９時間反応させた後、反応器を５０℃〜６０℃の範囲に保ちながらシクロヘキサン１６０ｇを加えて分液抽出し、水相を除去した。その後、シクロヘキサン層を減圧濃縮してシクロヘキサンを留去し、得られた粗ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールを７０℃／２．０ｋＰａで減圧蒸留したところ、ｔｅｒｔ−ブチルチオメタノールが２０８ｇ（１．７３ｍｍｏｌ、収率６５．０％）で得られ、＜ＧＣ−１＞でのＧＣ分析の結果、純度は９９面積％だった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．４１（９Ｈ，ｓ），２．１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），４．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）．【０２４３】
［実施例２］工程（ｉｘ）：ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンの製造
窒素気流下、３Ｌの反応器に実施例１で製造したｔｅｒｔ−ブチルチオメタノール１９０ｇ（１．５８ｍｏｌ）、シクロヘキサン１．４４ｋｇを室温で加えた。ここに内温を０℃に保ちながらピリジン１５０ｇ（１．９０ｍｏｌ）を加えた。この混合液に、内温を−２℃〜６℃の範囲に保ちながら塩化チオニル２２６ｇ（１．８９ｍｏｌ）を滴下した。−４℃〜０℃の範囲で１時間攪拌した後、シクロヘキサン３８０ｇを添加し、析出した塩をろ別した。得られたろ液を濃縮してシクロヘキサンを留去した後、得られた粗ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンを５７℃／３．０ｋＰａで減圧蒸留したところ、ｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタンが１４０ｇ（１．０１ｍｏｌ、収率６３．９％）得られ、＜ＧＣ−１＞でのＧＣ分析の結果、純度は９８面積％だった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．４２（９Ｈ，ｓ），４．８６（２Ｈ，ｓ）【０２４４】
［実施例３］工程（ｘ）：２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルの製造
窒素気流下、３Ｌの反応器にカリウム‐ｔｅｒｔ−ブトキシド１０７ｇ（０．９５３ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン７９０ｇを加えた。そこに内温１８℃〜２６℃の範囲でメチルマロン酸ジエチル１５８ｇ（０．９０７ｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。さらに３０分攪拌した後、内温１８℃〜２６℃の範囲に保ちながら、実施例２で製造したｔｅｒｔ−ブチルチオクロロメタン１３２ｇ（０．９５３ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。さらに３時間攪拌した後、トルエン３９５ｇと２重量％塩酸３９５ｇ（０．２２９ｍｏｌ）を加え３０分攪拌した後、水層を分離した。続いてトルエン層に水３９５ｇを加え１時間攪拌した後に、分液により水層を除去する操作を２回繰り返した。トルエン層を濃縮してトルエンを留去した後、得られた粗２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルにエタノール２５０ｇを加えて攪拌した後、溶媒を留去する操作を２回繰り返した結果、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルが２４６ｇ（０．８４８ｍｏｌ、収率９３．５％）得られ、＜ＧＣ−１＞でのＧＣ分析の結果、ＧＣ純度は９５．２面積％だった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２６（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．４８（３Ｈ，ｓ），３．０３（２Ｈ，ｓ），４．２０（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２４５】
［参考例１］２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］マロン酸ジエチルの製造窒素気流下、１００ｍＬの三つ口フラスコにパラホルムアルデヒド７０６ｍｇ（２３．５ｍｍｏｌ）、酢酸銅（Ｉ）一水和物６２８ｍｇ（３．１５ｍｍｏｌ）、酢酸１．３２ｇ（２２．０ｍｍｏｌ）、トルエン６．６７ｍＬ、マロン酸ジエチル３．００ｇ（１８．７ｍｍｏｌ）を加えた後、ディーンスターク管を取り付けて１１０℃で６時間攪拌した。反応液を室温に戻してトルエン４ｍＬを加えた後、水１０ｍＬで２回、飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬで１回有機層を洗浄した。そこにｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン１．００ｍＬ（８．８８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．３０ｍＬ（９．３３ｍｍｏｌ）を加え２５℃で１．５時間攪拌した。この反応溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液６ｍＬで２回、飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬで１回洗浄した。得られたトルエン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸ナトリウムをろ別した。ろ液を濃縮してトルエンを留去した後、得られた粗２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］マロン酸ジエチルをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］マロン酸ジエチル１．３２ｇ（５．０２ｍｍｏｌ、収率２６．８％）を得た。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３３（９Ｈ，ｓ），３．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．１７−４．２８（４Ｈ，ｍ）【０２４６】
［実施例４］工程（ｘｉ）：２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルの製造
窒素気流下、５０ｍＬの三つ口フラスコに、テトラヒドロフラン３．５０ｍＬ、６０重量％水素化ナトリウムを０．１６０ｇ（４．００ｍｍｏｌ）を加えて氷冷した。そこに参考例１で製造した２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］マロン酸ジエチル０．７００ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン３．５０ｍＬの混合溶液を滴下した。１０分間攪拌した後、ヨウ化メチル０．１８３ｍＬ（２．９４ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン２．００ｍＬの混合溶液を１５分かけて滴下した。さらにヨウ化メチル０．０４１０ｍＬ（０．６５９ｍｍｏｌ）を２回滴下し、２０分攪拌した。水３．５ｍＬを添加した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル７．０ｍＬで２回、抽出した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を合わせた後、飽和食塩水３．５ｍＬで洗浄し、分液した。得られたｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を濃縮し、無色油状物質を０．７１０ｇ取得した。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルを０．６４６ｇ（２．３４ｍｍｏｌ、収率８７．６％）含有することが分かった。【０２４７】
[実施例５］工程（ｉ）：２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルの製造
窒素気流下、１００ｍＬナスフラスコに、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチル４．２０ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、エタノール２５ｍＬを加えて２℃に冷却し、内温２℃〜５℃の範囲で１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１６．０ｍＬ（１６．０ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下した。さらに２２℃で３時間攪拌した後、エタノールを留去した。得られた反応液はトルエン４．２ｍＬで２回洗浄した。水層に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１７ｍＬ加えてｐＨ１に調整した後、トルエン４．２ｍＬで３回抽出した。トルエン層を合わせて無水硫酸ナトリウム４．２０ｇで乾燥させ、硫酸ナトリウムをろ別した。ろ液を濃縮してトルエンを留去した後、得られた粗２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、無色油状物質を３．２６ｇ得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルを３．１６ｇ（１２．７ｍｍｏｌ、収率８３．５％）含有することが分かった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５４（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２４８】
[実施例６］工程（ｉｉ）：２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−３−［（エトキシカルボニル）オキシ］−２−メチル−３−オキソプロパン酸エチルの製造
窒素気流下、２００ｍＬの四つ口フラスコに、実施例５で製造した２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチル２．２１ｇ（８．９０ｍｍｏｌ）、トルエン２８ｍＬを加え０℃に冷却した。ここに内温１℃〜８℃の範囲でトリエチルアミン１．３６ｍＬ（９．７６ｍｍｏｌ）を２分間かけて滴下した。続いて、クロロギ酸エチル９３２μＬ（９．７９ｍｍｏｌ）を内温１℃〜８℃の範囲で４分かけて滴下し、内温０℃でさらに１時間攪拌した。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この反応液は２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−３−［（エトキシカルボニル）オキシ］−２−メチル−３−オキソプロパン酸エチルを含むことが分かった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３２（９Ｈ，ｓ），１．３５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．５５（３Ｈ，ｓ），３．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），３．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２４９】
[実施例７］工程（ｉｉｉ）：２−（アジドカルボニル）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］プロパン酸エチルの製造
実施例６で製造した２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−３−［（エトキシカルボニル）オキシ］−２−メチル−３−オキソプロパン酸エチルを含むトルエン溶液を０℃まで冷却し、アジ化ナトリウム９０８ｍｇ（１０．７ｍｍｏｌ）と水４．４ｍＬを混合した水溶液を内温０℃〜３℃の範囲で加え、内温０℃でさらに６時間攪拌した。続いて水層を除去し、得られたトルエン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬで洗浄した。得られたトルエン層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、硫酸ナトリウムをろ別した。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この溶液は２−（アジドカルボニル）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］プロパン酸エチルを含むことが分かった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５４（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２５０】
[実施例８］工程（ｉｖ）：２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルの製造
窒素気流下、３００ｍＬの四つ口フラスコに、実施例７で製造した２−（アジドカルボニル）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］プロパン酸エチルを含むトルエン溶液を内温７５℃〜８０℃の範囲で３時間攪拌し、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルのトルエン溶液を２３．１ｇ得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この溶液中の２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルの含有量は１．６５ｇ（６．７２ｍｍｏｌ、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルから収率７５．５％）だった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３０（９Ｈ，ｓ），１．５２（３Ｈ，ｓ），２．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），２．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．２３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２５１】
[実施例９］工程（ｖｉ−１）：４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸エチルの製造
実施例８で製造した２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルを３５３ｍｇ（１．４４ｍｍｏｌ）含むトルエン溶液６．０１ｇにｐ−トルエンスルホン酸一水和物２８８ｍｇ（１．５１ｍｍｏｌ）をアセトン１．３０ｍＬに溶解して加え、内温２０℃で２．５時間攪拌した。続いて溶媒を濃縮し、水を１．４ｍＬ加えた後、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ７に調製した。トルエン１．１ｍＬで４回、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．１ｍＬで２回抽出した後、得られた有機層をまとめて濃縮し、薄黄色油状物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸エチルを含むことが分かった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．６１（３Ｈ，ｓ），３．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），３．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），４．２７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２５２】
[実施例１０］工程（ｖｉ−２）及び工程（ｖｉｉ）：４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸及びα−メチルシステイン塩酸塩の製造
窒素気流下、実施例９で製造した４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸エチルを含む油状物を５０ｍＬナスフラスコに入れ、６ｍｏｌ／Ｌの塩酸９．４ｍＬ（５６ｍｍｏｌ）を加えた後、内温１００℃で１０時間攪拌した。この反応液の１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この反応液は４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸を含むことが分かった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１．５２（３Ｈ，ｓ），３．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），３．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）
続いて、この反応液をさらに内温１００℃で３０時間攪拌した。この反応液の１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この反応液はα−メチルシステイン塩酸塩を含むことが分かった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１．５３（３Ｈ，ｓ），２．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ），３．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ）【０２５３】
［実施例１１］工程（ｉ）における加水分解酵素遺伝子のクローニング
バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴｈａｉＩ−８株由来加水分解酵素カルボキシエステラーゼＮＰ（ＣＥＮＰ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＡＣ４３２６２、配列番号２）をコードする遺伝子配列（ｃｅｎｐ、配列番号１）を元に、ｃｅｎｐ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｎｐｆｗ（配列番号１９）とｎｐｒｖ（配列番号２０）を設計、合成した。バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ３１０８株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ３２１５株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ３３３５株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ１４１４４株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ１４１９１株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ１４４７３株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ１０１２４６株、バチルス・サチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ１０１５９０株、の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーｎｐｆｗ（配列番号１９）とｎｐｒｖ（配列番号２０）を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行った。その結果、それぞれ約１．０ｋｂｐ、計８種のＤＮＡ断片を得た。
得られた計８種のＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩにより消化した。得られたＤＮＡ断片を、それぞれ、定法に従って、ＭｕｎＩ、ＸｂａＩにより消化したＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６９６８０に記載のプラスミドｐＫＷ３２のｔｒｃプロモーターの下流に導入し、プラスミドｐＫＣＥＮＰ１、ｐＫＣＥＮＰ２、ｐＫＣＥＮＰ３、ｐＫＣＥＮＰ４、ｐＫＣＥＮＰ５、ｐＫＣＥＮＰ６、ｐＫＣＥＮＰ７、ｐＫＣＥＮＰ８を得た。
得られた計８種のプラスミドに挿入された加水分解酵素遺伝子の配列を常法に従って解読した。各遺伝子配列は、それぞれｃｅｎｐ−１（配列番号３）、ｃｅｎｐ−２（配列番号５）、ｃｅｎｐ−３（配列番号７）、ｃｅｎｐ−４（配列番号９）、ｃｅｎｐ−５（配列番号１１）、ｃｅｎｐ−６（配列番号１３）、ｃｅｎｐ−７（配列番号１５）、ｃｅｎｐ−８（配列番号１７）であった。各遺伝子がコードする加水分解酵素のアミノ酸配列は、それぞれＣＥＮＰ−１（配列番号４）、ＣＥＮＰ−２（配列番号６）、ＣＥＮＰ−３（配列番号８）、ＣＥＮＰ−４（配列番号１０）、ＣＥＮＰ−５（配列番号１２）、ＣＥＮＰ−６（配列番号１４）、ＣＥＮＰ−７（配列番号１６）、ＣＥＮＰ−８（配列番号１８）であった。
得られた計８種のプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ１、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ２、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ３、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ４、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ５、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ６、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ７、ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ８を得た。当該遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌についてカナマイシン、及びｌａｃプロモーター誘導物質を含む液体ＬＢ培地を用いて３０℃で培養し、培養約２０時間目に集菌した。
得られた加水分解酵素のアミノ酸配列ＣＥＮＰ−１（配列番号４）に対する、得られたその他の加水分解酵素のアミノ酸配列（配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８）の相同性を、ＢＬＡＳＴを用いてそれぞれ算出し、表１に示す。
また、加水分解酵素のアミノ酸配列ＣＥＮＰ−１（配列番号４）に対する、市販酵素バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来プロテアーゼ（市販酵素、シグマ−アルドリッチ社製）、及びブタ肝臓由来エステラーゼ（市販酵素、シグマ−アルドリッチ社製）のアミノ酸配列の相同性を、ＢＬＡＳＴを用いて検索したところ、いずれも相同性は示されなかった。【０２５４】
【表１】
0005953429.tif 000118
【０２５５】
［実施例１２］工程（ｉ）における加水分解酵素のスクリーニング
１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムを含む水溶液中で、実施例１１で得られた８種の菌体各々と、３０ｇ／Ｌの２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルとを混合し、３０℃、ｐＨ 7 の条件で一晩振盪させながら反応させた。また、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来プロテアーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）についても同条件で一晩振盪させながら反応させた。
各々の反応後の溶液２００μＬに対し１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１００μＬを添加し反応を停止させた後、１００００ｒｐｍで遠心分離を行った。得られた遠心分離後の上清５０μＬは、５０体積％アセトニトリル、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌトリフルオロ酢酸溶液９５０μＬと混合した後、＜ＨＰＬＣ−２＞の条件により光学純度分析を行った。
また、市販酵素バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ１（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼＢＳ３（ユーリッヒファインケミカルズ社製）、又は、ブタ肝臓由来エステラーゼ（シグマ−アルドリッチ社製）の菌体各々と、５ｇ／Ｌの２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルとを、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムを含む水溶液中で、３０℃、ｐＨ ７の条件で一晩振盪させながら反応させた。反応後の溶液２５０μＬに対し２５０μＬのアセトニトリルを加えた後、１００００ｒｐｍで遠心分離を行った。得られた遠心分離上清を＜ＨＰＬＣ−２＞の条件で分析し、生成した２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルの光学純度分析を行った。
これらの結果を表２、及び図２に示す。【０２５６】
【表２】
0005953429.tif 000119
【０２５７】
［実施例１３］工程（ｉ）：（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルの製造
１Ｌのジャーファーメンター（エイブル社製、型式ＢＭＪ）に、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルを１４．４ｇ（５２．１ｍｍｏｌ）、１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７）を６５．０ｇ、実施例１１で調製した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＣＥＮＰ１を２６．０ｇ、脱塩水５５５ｇを投入した後、充分に混合した。その後、３０℃、５００ｒｐｍで１６時間反応させた。反応中、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．０に維持した。反応完了は＜ＨＰＬＣ１＞の条件で分析し、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチルの消失を確認することで判断した。
得られた反応液を８０００ｒｐｍで遠心分離し、反応液上清を得た。その後、０．２μｍの細孔の精密濾過膜処理により菌体を除去し、さらに分画分子量１００００の限外ろ過膜処理を行った。得られたろ液に対しトルエンを１６０ｍＬ加え、充分に攪拌した後に分液することで、残存する２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸ジエチル等の不純物を有機層に除去し、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルを含む水層を得た。水層のｐＨを６ｍｏｌ／Ｌ硫酸を用いてｐＨ２．０まで低下させた後、トルエンを１６０ｍＬ加え充分に攪拌することでトルエン層に２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルを抽出した。残った水層に対してトルエンを１６０ｍＬ加え充分に攪拌することで水層に残存する２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルもトルエン層に抽出した。
得られたトルエン溶液を＜ＨＰＬＣ１＞の条件で分析した結果、２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチル１１．７ｇ（４７．１ｍｍｏｌ、収率９０．４％）が得られたことを確認した。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５４（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
＜ＨＰＬＣ−２＞の条件で光学純度を分析した結果、得られた２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルの立体配置は（Ｓ）であり、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．であった。【０２５８】
［実施例１４］工程（ｉｉ）：（Ｒ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−３−［（エトキシカルボニル）オキシ］−２−メチル−３−オキソプロパン酸エチルの製造
窒素気流下、３００ｍＬの四つ口フラスコに、実施例１３で製造した（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチル２２．４ｇ（９０．１ｍｍｏｌ）、トルエン１３０ｍＬを加えた。これを５℃に冷却した後、内温５℃〜１０℃の範囲でトリエチルアミン１０．０ｇ（９９．１ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。窒素気流下、５００ｍＬの四つ口フラスコにクロロギ酸エチル１０．８ｇ（９９．２ｍｍｏｌ）、トルエン２２．４ｍＬを加え、５℃まで冷却した。ここに先に調製した（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルのトリエチルアミン塩のトルエン溶液を内温５℃〜１２℃の範囲で１５分かけて滴下した。続いて内温５℃のままさらに１時間攪拌した。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、このトルエン溶液は（Ｒ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−３−［（エトキシカルボニル）オキシ］−２−メチル−３−オキソプロパン酸エチルを含む溶液であることを確認した。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３２（９Ｈ，ｓ），１．３５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．５５（３Ｈ，ｓ），３．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），３．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２５９】
［実施例１５］工程（ｉｉｉ）：（Ｓ）−２−（アジドカルボニル）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］プロパン酸エチルの製造
実施例１４で製造した（Ｒ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−３−［（エトキシカルボニル）オキシ］−２−メチル−３−オキソプロパン酸エチルのトルエン溶液を２℃まで冷却し、アジ化ナトリウム９．１９ｇ（１０８ｍｍｏｌ）と水４０ｍＬを混合した水溶液を内温２℃〜４℃の範囲で４分かけて滴下した。内温２℃でさらに１時間攪拌した後、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸６０ｍＬ（６０．０ｍｍｏｌ）を内温２℃〜３℃の範囲で１０分かけて滴下した。トルエン層と水層に分液した後、水層はトルエン４５ｍＬを加えて再度抽出し、先のトルエン層と合わせて、５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液３５ｍＬ洗浄した。得られたトルエン層に無水硫酸マグネシウム１１．２ｇを加え、０℃で２時間攪拌した後、ろ過した。ろ別した硫酸マグネシウムはトルエン１１ｍＬで洗浄し、洗浄液はろ液と混合した。得られたトルエン溶液を１Ｈ−ＮＭＲ解析した結果、このトルエン溶液は（Ｓ）−２−（アジドカルボニル）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］プロパン酸エチルを含むことが分かった。得られたの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．５４（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２６０】
［実施例１６］工程（ｉｖ）：（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルの製造
窒素気流下、５００ｍＬの四つ口フラスコにトルエン４５ｍＬを加え、８５℃に加熱した。ここに、実施例１５で製造した（Ｓ）−３−（アジドカルボキシ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］プロパン酸エチルを２３．３ｇ（８５．３ｍｍｏｌ）含むトルエン溶液を内温８４℃〜９１℃の範囲で４時間かけて滴下した。滴下後さらに８５℃で１時間攪拌し、（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルのトルエン溶液を得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、このトルエン溶液に含まれる（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルは２１．５ｇ（８７．６ｍｍｏｌ、（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−メチルマロン酸エチルからの収率９７．２％）だった。得られた測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３０（９Ｈ，ｓ），１．５２（３Ｈ，ｓ），２．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），２．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．２３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）【０２６１】
［実施例１７］工程（ｖｉ−１）及び工程（ｖｉ−２）：（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸エチル及び（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸の製造
窒素気流下、２００ｍＬの四つ口フラスコに（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルを１１．２ｇ（４５．６ｍｍｏｌ）含むトルエン溶液３９．２ｇを加えた。ここに３５重量％塩酸９．１９ｇ（８８．４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４５分攪拌した。この反応液のトルエン層を１Ｈ−ＮＭＲ解析した結果、（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸エチルを含むことが分かった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．６０（３Ｈ，ｓ），３．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），３．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），４．２６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
続いてこの反応液を内温６０℃〜７０℃に昇温してさらに１時間攪拌した。トルエンを留去した後、水２２．６ｇ、３５重量％塩酸２．４０ｇ（２３．０ｍｍｏｌ）を加え、内温７０℃〜９０℃の範囲で４時間攪拌した。室温に冷却した後、析出した結晶をろ過によって取得した。得られた結晶をトルエン２３ｍＬ、水２３ｍＬで洗浄し、白色結晶５．９７ｇを得た。＜ＨＰＬＣ−３＞の条件でのＨＰＬＣ分析の結果、この白色結晶は（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸を５．５６ｇ（３４．５ｍｏｌ、収率７５．７％）含むことが分かった。得られた化合物の測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１．５２（３Ｈ，ｓ），３．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），３．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）【０２６２】
［実施例１８］工程（ｖｉ−１）及び工程（ｖｉ−２）：（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸エチル及び（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸の製造：（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸の製造
窒素気流下、５０ｍＬの試験管に（Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）メチル］−２−イソシアナトプロパン酸エチルを１．３３ｇ（５．４ｍｍｏｌ）含むトルエン溶液４．６２ｇを加えた。ここにｐ−トルエンスルホン酸1水和物１．５２ｇ（５．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で６０分攪拌した後、同温度にて２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液８ｍｌ（１６．０ｍｍｏｌ）を加えた。１．５時間撹拌の後、トルエン層を分液操作にて除去した。得られた水層に、室温で９８重量％硫酸０．４ｇを添加すると、結晶が析出した。混合物を内温５℃まで冷却後、析出している結晶をろ過によって取得した。得られた結晶を少量の水で洗浄し、（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸０．７０ｇ（４．３ｍｍｏｌ、収率７９．６％）を得た。【０２６３】
［実施例１９］工程（ｖｉｉ）：α−メチル−Ｄ−システイン塩酸塩の製造
窒素気流下、１００ｍＬの四つ口フラスコ、実施例１７で製造した（Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸３．７２ｇ（２３．１ｍｍｏｌ）を含む白色固体４．００ｇを加えた。ここに３５重量％塩酸６０ｍＬ（７２０ｍｍｏｌ）を加えた後、内温１００℃に加熱して５１時間攪拌した。３５重量％塩酸を留去し、トルエン５ｍＬを加えて３５重量％塩酸を共沸留去する操作を２回繰り返した。得られた粗α−メチル−Ｄ−システイン塩酸塩の固体に２−プロパノール１２ｍＬを加え、５０℃に加熱して溶解させた。この溶液にトルエン２０ｍＬを加えた後、８．５６ｇの溶媒を留去し、残った溶液を２時間かけて０℃まで冷却し、生成した結晶をろ過によって取得した。得られた結晶はトルエン４ｍＬで洗浄した後、２０℃で１．５時間減圧乾燥し、２．８９ｇの白色結晶を得た。＜ＨＰＬＣ−３＞の条件でのＨＰＬＣ分析の結果、この白色結晶はα−メチル−Ｄ−システイン塩酸塩を２．７１ｇ（収率６８．４％）含むことが分かった。＜ＨＰＬＣ−４＞の条件でのＨＰＬＣ分析の結果から、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．であった。得られた化合物の測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１．５３（３Ｈ，ｓ），２．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ），３．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ）
【産業上の利用可能性】
【０２６４】
本発明では、医薬品等の中間体として有用な、光学活性α−置換システイン又はその塩を、入手容易であり安価な原料によって、より簡便に短時間で安全に製造でき、工業的規模において安定生産が可能である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
0005953429000001.app