(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者の１型糖尿病の予防、治療または改善のための医薬であって、当該医薬はデルタ様リガンド（Ｄｌｌ４）とノッチレセプター間の相互作用を遮断する抗Ｄｌｌ４抗体またはそのフラグメントを含み、糖尿病が予防、治療または改善される、医薬。
【請求項２】
対象者において、血中グルコース濃度を低下させるための、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
抗体またはそのフラグメントが、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号２２、２４および２６）を含む重鎖可変域（ＨＣＶＲ）、または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列（それぞれ配列番号３０、３２および３４）を含む軽鎖可変域、または両方を含む、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
抗体またはそのフラグメントが、配列番号２０または配列番号１１６のＨＣＶＲ配列、または配列番号２８または配列番号１１８のＬＣＶＲ配列を含む、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
抗体またはそのフラグメントが、配列番号２０／２８または１１６／１１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ組み合わせを含む、請求項３に記載の医薬。
【請求項６】
血糖降下剤と組み合わせて使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
血糖降下剤が、インスリンまたはそのアナログである、請求項６に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）アンタゴニストを用いた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞またはＴｒｅｇｓ）の数を増加させることが有益である疾患、障害、または状態の治療法に関する。より具体的には、本発明の方法は、Ｄｌｌアンタゴニストを用いて、Ｄｌｌ４のノッチレセプターへの結合を遮断し、それによってＴｒｅｇの数を増加させることにより、糖尿病を予防、治療、または改善させることができる。さらに、本発明は、Ｄｌｌ４アンタゴニストと一緒に、血中グルコース濃度の低下、または（インスリンおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）に対する抗体を含む）自己抗体の産生を低減もしくは遮断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノッチレセプターとそれらのリガンドとの間の相互作用は、細胞の運命決定のためだけではなく、造血における系統決定の調節および胸腺の発達に重要な進化的に保存された経路を示す（非特許文献１〜３）。最近、Ｄｌｌ４−ノッチ１の阻害が、胸腺内でＰｒｏ−Ｔ細胞からＤＣへの運命の変換を生じ得る、Ｂ細胞の異所性出現および樹状細胞（ＤＣ）の増殖に付随するＴ細胞の発達における完全な遮断を導くことが示されている（非特許文献４〜６）。このように、ノッチシグナル伝達は、造血前駆細胞からの細胞運命決定の測定のために重要であるという蓄積された証拠が存在する。さらに、インビボでのＤＣによる調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）ホメオスタシスのフィードバックコントロールが示されている（非特許文献７）。しかしながら、ＤＣの起源およびその発達ならびにその後のＴｒｅｇホメオスタシスの制御におけるノッチシグナル伝達の役割は未だ不明である。Ｔｒｅｇ増殖を誘導する新規の方法を確認することにより、自己免疫疾患および障害の治療として用いることができるため、これは、非常に重要な問題である。
【０００３】
ヒトＤｌｌ４（ｈＤｌｌ４）の核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に示されている。Ｄｌｌアンタゴニストおよびそれらの使用は、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５に開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ２００７／１４３６８９
【特許文献２】ＷＯ  ２００７／０７０６７１
【特許文献３】ＷＯ  ２００８／０７６３７９
【特許文献４】ＷＯ  ２００８／０４２２３６
【特許文献５】ＷＯ／２００８／０１９１４４
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：７７０−７７６
【非特許文献２】Ｓｋｏｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４：１５２５−１５３１
【非特許文献３】Ａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｅｌｌ  １１７：５１５−５２６
【非特許文献４】Ｈｏｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５（１１）：２５０７−２５１３
【非特許文献５】Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５（１１）：２５１５−２５２３
【非特許文献６】Ｆｅｙｅｒａｂｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０：１−１３
【非特許文献７】Ｄａｒｒａｓｓｅ−Ｊeｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６（９）：１８５３−１８６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、本発明者による、Ｄｌｌ４を特異的に結合し、Ｄｌｌ４のノッチレセプターへの結合を遮断する抗体が、ヒト多発性硬化症の動物モデルであるマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を完全に防止する一方、コントロール抗体はＥＡＥを防止しないという発見に一部基づいている。さらに、本発明者らは、抗Ｄｌｌ４抗体のこの効果が、Ｔｒｅｇ細胞の数の増加に関連していることを発見した。その上、抗Ｄｌｌ４抗体は、血中グルコース濃度を増加させ、Ｉ型糖尿病の動物モデルであるＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪマウスの膵島の数および形態を保存し、かつこのような効果は、少なくとも部分的にＴｒｅｇｓの増大によって仲介されることがさらに観察された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、第１の局面において、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞の数を増加させる方法を特徴とし、この方法は、有効量のＤｌｌ４アンタゴニストをそれが必要な対象者に投与する工程を包含し、ここでこのＤｌｌ４アンタゴニストはＤｌｌ４とノッチレセプターとの間の相互作用を遮断して、Ｔｒｅｇ細胞の数を増加させる。
【０００８】
第２の局面において、本発明はＴ細胞の数を増加させることが有益である疾患または障害を治療または改善させる方法を特徴とし、該方法は、治療的有効量のＤｌｌ４アンタゴニストをそれが必要な対象者に投与する工程を包含する。本発明の方法によって処置可能な疾患または障害は、Ｄｌｌ４活性の除去、阻害または低減、それによる処置される対象者中のＴｒｅｇ細胞数の増加によって利益を受ける（すなわち、向上する、改善する、阻害されるまたは予防される）任意の疾患、障害または状態である。本発明の方法によって治療可能な疾患または障害のうちの１つは糖尿病（すなわち、１型および２型糖尿病）である。従って、一実施態様において、本発明は、１型または２型糖尿病を予防、治療、または改善させる方法であって、それが必要な対象者に治療的有効量のＤｌｌ４アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法を提供する。
【０００９】
第３の局面において、本発明は、血中グルコース濃度を低下させる方法であって、それを必要とする対象者に治療的有効量のＤｌｌ４アンタゴニストを投与する工程を包含する方法を特徴とする。
【００１０】
第４の局面において、本発明は、自己抗体の産生を低減または防ぐ方法であって、それを必要とする対象者に治療的有効量のＤｌｌ４アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法を特徴とする。
【００１１】
自己抗体は、インスリンに対する抗体、ＧＡＤに対する抗体などを含み得る。
【００１２】
一実施態様において、本発明の方法で用いられるＤｌｌ４アンタゴニストは、高い親和性でＤｌｌ４を特異的に結合し、Ｄｌｌ４のノッチレセプターへの結合を遮断するか、および／またはＤｌｌ４−ノッチシグナル伝達経路を遮断する、Ｄｌｌ４抗体またはそのフラグメント（「抗Ｄｌｌ４  Ａｂ」または「Ｄｌｌ４Ａｂ」）である。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂ）、キメラ、ヒト化、もしくは完全ヒト化抗体またはこれらのフラグメントであってもよい。この抗体フラグメントは、一本鎖抗体、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ’）2であってもよい。
【００１３】
一実施態様において、このＤｌｌ４  Ａｂまたはその抗原結合フラグメントは、ｈＤｌｌ４（配列番号：２）のＮ末端ドメイン（残基Ｓ２７−Ｒ１７２）、またはＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ−２（ＤＳＬ）ドメイン（残基Ｖ１７３−Ｃ２１７）、またはＮ末端−ＤＳＬドメイン（残基Ｓ２７−Ｃ２１７）内のエピトープに結合する。別の実施態様において、このＤｌｌ４  Ａｂまたはその抗原結合フラグメントは、ＥＧＦドメイン、すなわちｈＤｌｌ４（配列番号：２）の、およそアミノ酸残基Ｑ２１８−Ｎ２５１（ドメイン１）、Ｅ２５２−Ｄ２８２（ドメイン２）、Ｄ２８４−Ｅ３２２（ドメイン３）、Ｅ３２４−Ｅ３６０（ドメイン４）、Ｓ３６２−Ｅ４００（ドメイン５）、Ｋ４０２−Ｅ４３８（ドメイン６）、Ｈ４４０−Ｅ４７６（ドメイン７）、またはＳ４８０−Ｅ５１８（ドメイン８）のうちの１つの中のエピトープに結合する。いくつかの実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、上に列挙したエピトープを１つより多く含む、立体エピトープを結合することができる。本発明の方法に用いられるＤｌｌ４  Ａｂまたはそのフラグメントは、高い親和性でヒトＤｌｌ４を結合することができ、表面プラズモン共鳴によって測定される、約１ｎＭ以下、約５００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約５０ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫD）を有している。
【００１４】
一実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｂまたはそのフラグメントは、３つの重鎖相補性決定領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３（それぞれ配列番号：２２、２４および２６のアミノ酸配列を有する）を含む、重鎖可変域（ＨＣＶＲ）を含む。別の実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、３つの軽鎖相補性決定領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３（それぞれ配列番号：３０、３２および３４のアミノ酸配列を有する）を含む軽鎖可変域（ＬＤＶＲ）を含む。別の実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｂまたはそのフラグメントは、配列番号：２２、２４、２６、３０、３２および３４のＣＤＲ配列組み合わせを含む、重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。さらに別の実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｂは、配列番号：２０もしくは１１６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、または配列番号：２８もしくは１１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。さらに別の実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｃは、配列番号：２０／２８（ＲＥＧＮ２８１）または１１６／１１８（ＲＥＧＮ４２１）のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ組み合わせを含む。
【００１５】
特定の実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｂは、以下から選択される重鎖ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３の組み合わせおよび軽鎖ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３の組み合わせを含む：それぞれ配列番号：６／８／１０および配列番号：１４／１６／１８；それぞれ配列番号：３８／４０／４２および配列番号：４６／４８／５０；それぞれ配列番号：５４／５６／５８および配列番号：６２／６４／６６；それぞれ配列番号：７０／７２／７４および配列番号：７８／８０／８２；それぞれ配列番号：８６／８８／９０および配列番号：９４／９６／９８；それぞれ配列番号：１０２／１０４／１０６および配列番号：１１０／１１２／１１４。別の実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｂは、配列番号：４、３６、５２、６８、８４、もしくは１００のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、または配列番号：１２、４４、６０、７６、９２、もしくは１０８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。さらに別の実施態様において、Ｄｌｌ４  Ａｂは、以下から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ組み合わせを含む：配列番号：４／１２（ＲＥＧＮ２７９）；配列番号：３６／４４（ＲＥＧＮ２９０）；配列番号：５２／６０（ＲＥＧＮ３０６）；配列番号：６８／７６（ＲＥＧＮ３０９）；配列番号：８４／９２（ＲＥＧＮ３１０）；および配列番号：１００／１０８（ＲＥＧＮ２８９）。
【００１６】
配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６および１１８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５および１１７と示される。
【００１７】
別の実施態様において、本発明の方法において利用可能なＤｌｌ４アンタゴニストは、多量体形成成分に融合した、Ｄｌｌ４を結合し得る少なくとも１つの可溶性ノッチレセプターまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質である。一実施態様において、この可溶性ノッチレセプターは、ヒトノッチ１またはノッチ４である。別の実施態様において、本発明のＤｌｌ４アンタゴニストは、ノッチレセプターを結合し得る、改変Ｄｌｌ４タンパク質であるが、このような結合はこのレセプターの活性化をもたらさない。特定の実施態様において、本発明のＤｌｌ４アンタゴニストは、多量体形成成分に融合されたＤｌｌ４またはそのフラグメントの細胞外ドメイン（例えば、免疫グロブリンドメイン（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃドメイン））を含む融合タンパク質である。特定の実施態様において、これらのＤｌｌ４アンタゴニストは、Ｄｌｌ４−ノッチ相互作用を遮断することのできる低分子および他の薬剤を含む。
【００１８】
第５の局面において、本発明は、上記の方法のいずれかを特徴として、ここでＤｌｌ４アンタゴニストは、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば血糖降下剤（例えば、インスリン、インスリンアナログなど）、血糖降下剤（例えば、インスリン、インスリンアナログなど）（これらの多くは、互いにオーバーラップしている治療効果を有していてもよい）と同時にかまたは逐次投与される。Ｄｌｌ４アンタゴニストと組み合わせて用いられる適切な免疫抑制剤としては、限定するわけではないが、グルココルチコイド、シクロスポリン、メトトレキサート、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、タクロリムス、シロリムス、アザチオプリン、メルカプトプリン、オピオイド、ミコフェノール酸、ＴＮＦ−結合タンパク質（例えば、インフリキシマブ、エタナセプト、アダリムマブなど）、細胞毒性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシンなど）、免疫細胞を標的とする抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３抗体など）が挙げられる。抗Ｄｌｌ４アンタゴニストとの組み合わせ治療に適切な抗炎症剤および／または適切な抗炎症剤および／または鎮痛剤としては、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンなど）、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、アセトアミノフェン、モルヒネ様作用薬などが挙げられる。
【００１９】
第６の局面において、本発明はＤｌｌ４アンタゴニスト、少なくとも１つのさらなる治療剤、および薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を特徴とする。一実施態様において、このＤｌｌ４アンタゴニストは、高い親和性でＤｌｌ４に特異的に結合し、Ｄｌｌ４活性を中和する、Ｄｌｌ４  Ａｂまたはそのフラグメントであり、少なくとも１つのさらなる治療剤は、上に記載した血糖降下薬、免疫抑制剤、抗炎症剤、鎮痛剤などのいずれかである。
【００２０】
第７の局面において、本発明は本発明の医薬組成物を含む容器、および使用に際する説明書を備えた添付文書を含むキットを特徴とする。一実施態様において、キットは、その中にｈＤｌｌ４を特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む容器、その中に上に記載した少なくとも１つのさらなる治療剤を含む別の容器を含んでいてもよい。
【００２１】
他の目的および利点は、以下の詳細な説明を精査することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｄｌｌ４遮断がＴ細胞、Ｂ細胞に対して及ぼす影響を示す図で、図１Ａおよび１Ｂは、胸腺におけるＴ細胞およびＢ細胞の集団を示す。
【図２】Ｄｌｌ４遮断がＢ細胞の発達などに対して影響を及ぼさないことを示す図で、図２Ａおよび２Ｂは骨髄中Ｂ細胞および末梢脾臓中Ｂ細胞亜集団を示す。
【図３Ａ】Ｄｌｌ４遮断が樹状細胞（ＤＣ）に及ぼす影響を確認した図で、図３Ａは胸腺中のｃＤＣおよびｐＤＣの増殖を誘発することを示す。
【図３Ｂ】Ｄｌｌ４遮断が樹状細胞（ＤＣ）に及ぼす影響を確認した図で、図３Ｂはその増殖の経過を示す。
【図３Ｃ】Ｄｌｌ４遮断が樹状細胞（ＤＣ）に及ぼす影響を確認した図で、図３Ｃはｐｒｅ−ＤＣの増殖が胸腺に限定されることを示す。
【図３Ｄ】Ｄｌｌ４遮断が樹状細胞（ＤＣ）に及ぼす影響を確認した図で、図３Ｄはｐｒｏ−Ｔ細胞集団内で有意な増殖があることを示す。
【図４】Ｄｌｌ４Ａｂ処置したＣＤを胸腺内移植した細胞の増殖性を示す図である。
【図５】ＤＣの発達に関与するＣＳＦ−１の血清レベルが、Ｄｌｌ４Ａｂ処置で増加したことを示す図である。
【図６】タモキシフェン処置したマウスにおけるＢ細胞、ｐＤＣ、ｃＤＣが胸腺中で増殖したことを示す図である。
【図７Ａ】Ｄｌｌ４遮断がＴｒｅｇの恒常性に影響を及ぼすかを確認した図であり、図７Ａは胸腺内でＴｒｅｇの強い増殖をもたらすことを示す図である。
【図７Ｂ】Ｄｌｌ４遮断がＴｒｅｇの恒常性に影響を及ぼすかを確認した図であり、図７Ｂはその経過を示す図である。
【図７Ｃ】Ｄｌｌ４遮断がＴｒｅｇの恒常性に影響を及ぼすかを確認した図であり、図７Ｃは、タモキシフェン処置によるＤｌｌ４条件付不活化が胸腺中のＴｒｅｇの増殖をもたらすことを示す図である。
【図８Ａ】Ｄｌｌ４Ａｂ処置したマウスのＤｌｌ遮断による胸腺中の細胞に及ぼす影響を確認した図で、図８Ａは治療後ｃＤＣ、ｐＤＣにおいて顕著な増加を示したことを示す図である。
【図８Ｂ】Ｄｌｌ４Ａｂ処置したマウスのＤｌｌ遮断による胸腺中の細胞に及ぼす影響を確認した図で、図８ＢはＴｒｅｇ集団において顕著な増加を示したことを示す図である。
【図９】Ｄｌｌ４遮断による処置が自己免疫疾患の進行を予防したことを示す図であり、図９Ａは罹患率を、図９Ｂは平均スコアを示す。
【図１０】Ｄｌｌ４Ａｂ処置したマウスのリンパ節中のＩＬ−７およびＩＦＮ−γの産生を減少させることを示す図である。
【図１１−１】Ｄｌｌ４遮断の糖尿病に対する効果の試験結果を示す図であり、図１１Ａは、糖尿病におけるＤｌｌ４Ａｂは少なくとも部分的にＴｒｅｇによって媒介されることを示す図である。
【図１１−２】Ｄｌｌ４遮断の糖尿病に対する効果の試験結果を示す図であり、図１１Ｂは、ＤｌｌＡｂ処置が抗インスリン自己抗体などを遮断することを示す図である。
【図１１−３】Ｄｌｌ４遮断の糖尿病に対する効果の試験結果を示す図であり、図１１Ｃおよび１１Ｄは、Ｄｌｌ４Ａｂ処置したマウスが、コントロールと比較して正常数の膵島が認められ、細胞浸潤が観察されなかったことを示す図である。
【図１１−４】Ｄｌｌ４遮断の糖尿病に対する効果の試験結果を示す図であり、図１１Ｅは、Ｄｌｌ４Ａｂ処置により糖尿病マウスの血中グルコース濃度が減少したことを示す図である。
【００２３】
図１Ａ−１Ｂは、Ｔ細胞およびＢ細胞の発達におけるＤｌｌ４遮断の効果を示している。マウスに抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ５７７）またはコントロールのヒトＦｃフラグメント（ｈＦｃ）を注射した。１４日後、胸腺を採取し、Ｔｓａｉｂｏｕ  およびＢ細胞のサブセットをフローサイトメトリーで評価した。図１Ａ：ドットプロットは、ＣＤ４-ＣＤ８-（ダブルネガティブの胸腺前駆体または「ＤＰ」）、ＣＤ４+ＣＤ８+（ダブルポジティブの胸腺前駆体または「ＳＰ」）、ＣＤ４+またはＣＤ８+（シングルポジティブの胸腺前駆体または「ＳＰ」）、およびＤＮ／ＣＤ４４+ＣＤ２５-（ＤＮ１ステージにおける胸腺前駆体）Ｔ細胞を示している。ドットプロットの数は、全ての胸腺細胞の中のＴ細胞分集団のパーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。図１Ｂ：ヒストグラムは、ＤＮ１細胞（すなわち、ＣＤ４-ＣＤ８-ＣＤ４４+ＣＤ２５-でゲート）中のＢ細胞（Ｂ２２０+）のパーセンテージ（平均値±ＳＤ）を示している。
【００２４】
図２Ａ−２Ｂは、骨髄中のＢ細胞の発達段階（図２Ａ）および脾臓におけるＢ細胞の恒常性（図２Ｂ）におけるＤｌｌ４遮断の効果を示している。ドットプロット内の数字は、骨髄中または脾臓中の総細胞のうちＢ細胞サブセットのパーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。ＧＣ：胚中心Ｂ細胞；Ｔ１およびＴ２：Ｂ細胞サブセット；およびＦｏ：濾胞性Ｂ細胞。
【００２５】
図３Ａ−３Ｄは、樹状細胞（ＤＣ）の発達におけるＤｌｌ４遮断の効果を示している。図３Ａ：ドットプロットは、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ処置における胸腺中の従来のＤＣ（“ｃＤＣｓ”；Ｂ２２０-ＣＤ１１Ｃ+）および形質細胞様ＤＣ（“ｐＤＣｓ”；ＰＤＣＡ１+Ｂ２２０+ＣＤ１１Ｃ+）の増殖を示している。ドットプロット内の数字は、１４日目における総細胞中のＤＣの平均パーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。図３Ｂ：この棒グラフは、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置したマウス（■）とｈＦｃ−コントロール処置したマウス（□）におけるｃＤＣおよびｐＤＣ増殖の動態を示している。図３Ｃ：ドットプロットは、胸腺におけるＰｒｅＤＣ（ＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃintＣＤ１３５+Ｓｉｒｐ−αint）および後期のＰｒｅＤＣ（ＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint）に対するＤｌｌ４  Ａｂの効果を示している。ドットプロット中の数字は、１４日目における総細胞中のＰｒｅＤＣの平均パーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。図３Ｄ：ドットプロットは、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したマウスの胸腺中のＤＮ１（ＣＤ４-ＣＤ８-ＣＤ４４+ＣＤ２５-）プロ−Ｔ細胞集団におけるＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣの存在を示しているが、ｈＦｃコントロールＡｂで処置したマウスの胸腺ではない。ドットプロット中の数は、３日目におけるＤＮ１プロＴ細胞集団中のＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣの平均数（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。
【００２６】
図４は、通常のＴ／ＤＣ  ＤＮ１前駆細胞に由来している未熟ＤＣ（ｉｍＤＣｓ）中への、胸腺内代替ＤＣ系統の発達における、Ｄｌｌ４遮断の効果を示している。ＤＮ１ ＣＤ４５．１+Ｌｉｎ-を挿入した細胞を、Ｄｌｌ４  Ａｂ（■）またはｈＦｃ  コントロール  Ａｂ（□）で処置したＣＤ４５．２+ホストマウス中に胸腺内移植した。
【００２７】
図５は、ＤＣの発達に関与する重要なサイトカインであるＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）の血清中濃度におけるＤｌｌ４遮断の効果を示している。未処置
【化１】
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のマウス、またはアイソタイプコントロールＡｂ（□）、もしくはＤｌｌ４  Ａｂ（■）で処置したマウスの血清中ＣＳＦ−１濃度を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
【００２８】
図６は、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ構築物であるＣｒｅＥＲＴ２を含むＤＬＬ４ＣＯＩＮマウス中のＢ細胞およびＤＣホメオスタシスに対して、タモキシフェン処置の際の遺伝子のＤｌｌ欠損の効果を示している。ドットプロットの数は、胸腺内の総細胞中のＢ細胞およびｐＤＣｓとｃＤＣｓの両方の平均パーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。
【００２９】
図７Ａ−７Ｃは、ＴｒｅｇホメオスタシスにおけるＤｌｌ４遮断／欠損の効果を示している。図７Ａ：ドットプロットは、ｈＦｃコントロールＡｂで処置したマウスと比較して、Ｄｌｌ４−Ａｂで２週間処置したマウスの胸腺内でのＴｒｅｇの増殖を示している。ドットプロットの数は、胸腺中のＣＤ３+ＣＤ４+  Ｔ細胞中のＴｒｅｇの平均パーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。図７Ｂ：棒グラフは、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したマウス（■）およびｈＦｃコントロールＡｂで処置したマウス（□）の胸腺（上パネル）および脾臓（下パネル）におけるＴｒｅｇの発達の動態を示している。図７Ｃ：ドットプロットは、トウモロコシ油コントロールで処置したコントロールＤＬＬ４ＣＯＩＮと比較して、タモキシフェン（ＴＡＭ）で処置したＤＬＬ４ＣＯＩＮマウスの胸腺内におけるＴｒｅｇの増殖を示している。ドットプロット中の数は、胸腺内のＣＤ３+ＣＤ４+  Ｔ細胞中のＴｒｅｇの平均パーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。
【００３０】
図８Ａ−８Ｂは、治療の中止後２週間および２８日目に、Ｄｌｌ４−Ａｂ（ＲＥＧＮ４２１）処置（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）またはｈＦｃ処置（５ｍｇ／ｋｇ）後７日目および１４日目で観察された、ヒトＤｌｌ４（ｈＤｌｌ４）を発現するマウスの胸腺中のＤＣ（図８Ａ）およびＴｒｅｇ恒常性（図８Ｂ）に対するＤｌｌ４遮断の効果を示している。ドットプロット中の数は、胸腺中の総細胞の中の、ｐＤＣｓおよびｃＤＣｓ（図８Ａ）またはＴｒｅｇｓ（図８Ｂ）の平均パーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）を表わしている。
【００３１】
図９Ａ−９Ｂは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルにおけるＤｌｌ４遮断の効果を示している。図９Ａ：このグラフは、治療群あたりのＥＡＥ疾患の発生率（％）を示している。図９Ｂ：このグラフは、平均的な疾患のスコアに基づいて、ＤＡＤの発達を示している。治療は、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ（ＲＥＧＮ５７７）プレ誘導（▼）；アイソタイプコントロール  Ａｂ  ｐｕｒｅ  誘導（◆）；ＲＥＧＮ５７７誘導後（▲）；または抗−ＶＬＡ−４  Ａｂ（ＰＳ／２）プレ誘導（■）であった。
【００３２】
図１０は、ＥＡＥマウスのリンパ節におけるＩＬ−１７およびＩＦＮ−γ生産に対するＤｌｌ４遮断の効果を示している。Ｄｌｌ４  Ａｂ（■）またはｈＦｃコントロールＡｂ（□）で治療したＥＡＥマウスのリンパ節中のＩＬ−１７（左パネル）およびＩＦＮ−γ（右パネル）の濃度を、ＥＬＩＳＡによって１２日目および１８日目に測定した。
【００３３】
図１１Ａ−１１Ｅは、ＮＯＤマウス糖尿病モデルにおけるＤｌｌ４  Ａｂの効果を示している。図１１Ａは、９週齢でｈＦＣコントロールＡｂ（●）または抗Ｄｌｌ４Ａｂ（ＲＥＧＮ５７７）（■）のいずれかを受けたマウスの中での糖尿病発生（２５０ｍｇ／ｄＬより高い血中グルコース濃度を２回連続して読み取り）の割合を示している。Ｄｌｌ４  Ａｂで処置し、その後ＰＣ６１  Ａｂを注射した５匹のマウスの２０週での糖尿病発症率（％）もまた示している（◆）。ＰＣ６１  Ａｂは、抗ＣＤ２５抗体であり、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇している。図１１Ｂは、未処置の野性型（ＷＴ）マウスと比較して、Ｄｌｌ４  ＡｂまたはｈＦｃコントロールで処置したＮＯＤマウス中の抗インスリン自己抗体（□）および抗グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）抗体（■）の、ＥＬＩＳＡによる測定を示している。図１１Ｃは、Ｄｌｌ４Ａｂ（左パネル）またはｈＦｃコントロール（右パネル）で処置したＮＯＤマウスのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｄ）で染色した膵臓切片を示している。黒色矢印は、個々の膵島を示しており、白色矢印は、その島内の湿潤細胞を示している（右パネル）。図１１Ｄは、ｈＦｃコントロール処置（□）またはＤｌｌ４  Ａｂ処置（■）したマウスの膵臓における、膵島の数（左パネル）または、湿潤膵島の割合（％）（右パネル）を示している。図１１Ｅは、処置後４２日を超えての、Ｄｌｌ４  Ａｂ（●）またはｈＦｃコントロール（□）で処置したマウスにおける、疾患の発症時における血中グルコース濃度の変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の方法を記載する前に、本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されるものではなく、方法および実験は変更できることが理解されるべきである。同様に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書で使用する専門用語は特定の態様の説明のみを目的にしており限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形の「１つの（ａ）」「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」とは、文脈上で明確に規定されない限り、複数の言及も含む。したがって、例えば「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つまたは複数の方法、ならびに／または本明細書に記載される種類の段階、および／もしくは本開示およびその他を読むことで当業者に明白となる種類の段階を含む。
【００３６】
特記されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書中で述べられている全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。
【００３７】
（定義）
用語「Ｄｌｌ４アンタゴニスト」は、本明細書中で用いる場合、Ｄｌｌ４のノッチレセプター（例えばノッチ１およびノッチ４）への結合を遮断および／またはＤｌｌ４−ノッチシグナル伝達経路を遮断（例えば、ＷＯ  ２００８／０７６３７９を参照）することのできる、Ｄｌｌ４に対する抗体およびそのフラグメント、多量体形成成分に融合するＤｌｌ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質またはそのフラグメント（例えば、米国特許公開公報番号２００６／０１３４１２１および２００８／０１０７６４８を参照）、ペプチドおよびペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）（例えば、米国特許第７，１３８，３７０号を参照）など（これらは、Ｄｌｌ４とノッチレセプターとの間の相互作用を遮断する）を含む。従って、特定の実施態様において、この用語は、ノッチレセプター（例えば、抗ノッチ１抗体、抗ノッチ４抗体）を特異的に結合し、Ｄｌｌ４−ノッチシグナル伝達経路を遮断する低分子、抗体またはその抗原結合フラグメントなどをも包含する。
【００３８】
本明細書で使用される用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に連結した４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子を指すことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶH」）及び重鎖定常領域（ＣH１、ＣH２及びＣH３ドメインから構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶL」）及び軽鎖定常領域（ＣL）から構成される。ＶH及びＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより良く保存された領域が組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分される。各ＶH及びＶLは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００３９】
ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は、当該分野で公知であり、本明細書中に開示されている特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲの同定に適用することができる。ＣＤＲの境界を同定するのに用いられ得る慣例としては、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義およびＡｂＭによる定義を含む。一般的な用語において、Ｋａｂａｔの定義は、配列の変動性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造的なループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭによる定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との間の折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８（１９９７）；および  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。公開されているデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するのに利用可能である。
【００４０】
１つ又はそれ以上のＣＤＲ残基の置換又は１つ又はそれ以上のＣＤＲの脱落もまた可能である。１つ又は２つのＣＤＲが結合のために省くことができる抗体は、科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１３３−１３９）は、公表された結晶構造を基準にして抗体とそれらの抗原間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約１／５〜１／３だけが実際に抗原と接触していると結論した。Ｐａｄｌａｎは、また、  １つ又は２つのＣＤＲが、抗原と接触したアミノ酸を有さない多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ３２０：４１５−４２８も参照）。
【００４１】
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ外にあるＫａｂａｔＣＤＲの領域から、分子モデリングにより及び／又は経験的に、過去の研究（例えばＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は頻繁には必要とされない）に基づいて同定することができる。ＣＤＲ又はその残基が脱落している場合、それは通常別のヒト抗体配列又は当該配列のコンセンサス中で対応する位置を占有するアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換位置及び置換するアミノ酸は経験的に選択することもできる。経験的置換は保存的置換又は非保存的置換であってよい。
【００４２】
用語「抗体」はまた、改変されたグリコシル化パターンを有する抗体も包含する。いくつかの適用において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変、または例えば、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）機能を増加するフコース部分の除去（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照）が有用である。他の適用において、Ｎ−グリコシル化部位の除去は、治療抗体に対する望ましくない免疫反応を低減するかまたは抗体の親和性を増加させることができる。さらに他の的湯において、ガラクトシル化の改変は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を改変するためになされ得る。
【００４３】
本明細書で使用される用語、抗体の「抗原結合フラグメント」（又は簡単に「抗体フラグメント」）は、ｈＤｌｌ４、または任意の他の企図される標的タンパク質に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂフラグメント、抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲを含むフラグメント、または単離ＣＤＲ）を含むことができる。他の操作分子（例えば、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーなど）もまた、本明細書中用いられる場合の表現「抗原結合フラグメント」に包含される。特定の実施態様において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、治療部分（「免疫結合体」）、例えば細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位体に結合され得る。
【００４４】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。この可変ドメインは、任意のサイズのドメインまたはアミノ酸組成物であり得、一般的に少なくとも１つのＣＤＲ（１つまたはそれ以上のフレームワーク配列を有するフレームに隣接しているかその中にある）を含んでいる。ＶLドメインに結合しているＶHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶHおよびＶLドメインは任意の適切な配置で互いに関連して位置され得る。例えば、可変域は２部分からなり得、ＶH−ＶH、ＶH−ＶLまたはＶL−ＶLの２量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶHまたはＶLドメインを含み得る。
【００４５】
特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合している少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。非限定的に、本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見いだされ得る可変ドメインおよび定常ドメインの構成例として以下が挙げられる：（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３；および（ｘｉｖ）ＶL−ＣL。上に列挙した構成例のいずれかを含む可変ドメインおよび定常ドメインの任意の構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または、完全または部分的なヒンジ領域またはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変および／または定常ドメイン間に可動性または反可動性の結合をもたらす少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いにおよび／または１つまたはそれ以上のモノマーＶHもしくはＶLドメインと（例えば、ジスルフィド結合によって）非共有結合で、上に列挙した可変ドメインと定常ドメインの構成のうちのいずれかのホモダイマーまたはヘテロダイマー（または他のマルチマー）を含み得る。
【００４６】
完全抗体分子を有する場合、抗原結合フラグメントは、単一特異的または多重特異的（例えば、二重特異的）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは別の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合し得る。任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該分野で利用可能な通常の技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合フラグメントと関連して使用するために適合され得る。
【００４７】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂｓは、例えばＣＤＲ特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異により又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）によってコード化されないアミノ酸残基を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系から由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植された、ｍＡｂｓを含むことを意図するものではない。
【００４８】
本明細書中に開示される完全ヒト抗Ｄｌｌ４抗体は、対応する生殖系列配列と比較した場合、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含み得る。このような変異は、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と本明細書中に開示されているアミノ酸配列を比較することにより、容易に確認することができる。本発明は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列のいずれかから誘導される抗体、およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異を起こさせる（このような配列変化は、「生殖細胞変異」と総称される）。当業者は、本明細書中に開示されている重鎖および軽鎖可変域配列で開始することで、１つまたはそれ以上の個々の生殖系列の復帰突然変異を含む多くの抗体および抗原結合フラグメントまたはこれらの組み合わせを容易に生産することができる。特定の実施態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖系列配列中に見出される残基に復帰変異される。他の次実施態様において、特定の残基のみが、元の生殖系列配列に復帰変異される（例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出された変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内で見いだされた変異残基のみ）。他の実施態様において、このフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの１つまたはそれ以上が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含み得る（例えば、ここで特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異されるが、元の生殖系列配列と異なる特定の他の残基は、維持されるかまたは、異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される）。一旦得られると、１つまたはそれ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合フラグメントは、１つまたはそれ以上の所望の特性（例えば、結合特異性、結合親和性の向上、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性（場合により）の向上または増強、免疫原性の低減など）について簡単に試験される。この一般的な方法で得られた抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。
【００４９】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する、基本明細書中に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗Ｄｌｌ４抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書中に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列と相対的な、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、２個または１個の保存的アミノ酸置換を持つＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗Ｄｌｌ４抗体を含む。一実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に１０個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に８個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に６個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に４個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１６のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に２または１個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１６のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に１０個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１８のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に８個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１８のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に６個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１８のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に４個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１８のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、ＨＣＶＲは、その中に２または１個以下の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号：１１８のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
「中和」または「遮断」抗体は、そのＤｌｌ４への結合が、Ｄｌｌ４の生物学的活性の阻害をもたらす抗体を意味することが意図される。このＤｌｌ４の生物学的活性の阻害は、Ｄｌｌ４の生物学的活性の、一つまたは複数の指標を測定することによって評価され得る。Ｄｌｌ４の生物学的活性のこれらの指標は、当技術分野において公知のいくつかの標準的なインビトロまたはインビボアッセイの一つまたは複数によって評価され得る（以下の実施例を参照のこと）。好ましくは、Ｄｌｌ４活性を中和する抗体の能力は、ノッチ受容体へのＤｌｌ４の結合の阻害によって評価される。同様に、この用語はまた、ノッチ１およびノッチ４のような他の標的に対する抗体にも適用可能であり、このような抗体は標的の生物学的活性を阻害し、それによりＤｌｌ４−ノッチの相互作用またはシグナル伝達経路を阻害する。
【００５１】
用語「特異的に結合する」等は、抗体又はその抗原結合フラグメントが生理的条件下に相対的に安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０-6Ｍ以下（例えば、小さいＫDはより強固な結合を示す）の平衡解離定数によって特徴付けることができる。２分子が特異的に結合するかどうかを測定する方法は当技術分野で周知であり、そして例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。しかしながら、Ｄｌｌ４を特異的に結合する単離抗体は、他の種からのＤｌｌ４分子のような他の抗原に対して交差反応を呈する。更に、Ｄｌｌ４及び１つ又はそれ以上の更なる抗原に結合する多特異性抗体（例えば二重特異体）は、それでも本明細に記載のＤｌｌ４を「特異的に結合する」検討された抗体である。
【００５２】
本明細書において使用される「ＫD」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を意味することが意図される。
【００５３】
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））によって測定される、約１ｎＭ以下、または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、または約１００ｐＭ以下、または約５０ｐＭ以下のＫｐによってＤｌｌ４に結合する抗体を意味する。
【００５４】
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイム生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。
【００５５】
用語「エピトープ」は抗体によって結合される抗原の領域を指す。エピトープは構造又は機能と定義される。機能エピトープは一般的に構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するそれらの残基を有する。エピトープは、立体配座性でもあり、すなわち非線形アミノ酸から構成されてもよい。特定の実施態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的活性表面グルーピングである決定因子を含んでもよく、そして特定の実施態様では、特異的３次元構造特性、及び／又は特異的電荷特性を有してもよい。エピトープは、典型的には少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を特有の立体配座中に含んでいる。
【００５６】
本明細書中で用いられる場合、用語「処置」または「処置すること」は、本明細書中で用いられる場合、他に指示のない限り、予防手段（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  またはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）および治療手段の両方を意味することが企図されている。治療の必要のある対象者は、特定の状態、障害または疾患を発症しているものだけではなく、このような状態、障害または疾患を発症することが予測されるかまたはその可能性のあるもの、および予防的手段によって利益を受け、その結果そのような状態、障害または疾患が生じた場合に、処置をしていない対象者と比較してその発症もしくは再発、または進行が低減されるものも含む。
【００５７】
語句「治療的有効量」、「予防的有効量」、または「有効量」は、それが投与されることで所望の効果をもたらす量を意味する。正確な量は、処置の目的、処置される対象者の年齢および大きさ、投与経路などに依存し、公知の技術を用いて当業者により確認される（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【００５８】
一般的記載
本発明は、Ｄｌｌ４特異的抗体によるＤｌｌ４の遮断が、マウスにおいてＴｒｅｇ細胞の数の増加をもたらし、次にＥＡＥまたは糖尿病の進行を予防、低減、または遅延させるという知見に一部基づいている。完全ヒトＤｌｌ４  Ａｂの記載については、組み換えヒトＤｌｌ４  Ａｂを含む（国際特許公開公報番号ＷＯ  ２００８／０７６３７９を参照のこと）。
【００５９】
治療的投与および処方
本発明は、Ｔｒｅｇ細胞の数を増加させることが有益である、疾患または障害の予防、治療または改善方法を提供し、この方法は、Ｄｌｌ４  ＡｂのようなＤｌｌ４アンタゴニストを含む治療的有効量の医薬組成物を投与する工程を包含する。この医薬組成物は、免疫抑制剤、抗炎症剤、鎮痛剤、血糖降下剤などのような１種またはそれ以上のさらなる治療剤（以下の章を参照のこと）をさらに含むことができる。本発明に基づいた医薬組成物の投与は、好適な担体、賦形剤、及び移動、送達、耐容性などの改良を提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤とともに投与することができる。適切な製剤の数量は、すべての製剤化学者に公知の処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ。これらの製剤は、例えば、散剤、パスタ剤、軟膏剤、ジェリー剤、ろう剤、油、脂質類、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含む脂質（陽イオン性又は陰イオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収パスタ剤、水中油及び油中水懸濁剤、懸濁剤カーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル剤、及びカーボワックスを含む半固形混合剤を含む。またＰｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１をも参照されたい。
【００６０】
全身投与のために、初めに、治療有効用量は、インビトロアッセイから推定され得る。例えば、用量は、細胞培養において決定されたＩＣ50を含む循環濃度範囲を動物モデルにおいて達成するように、処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量を、より正確に決定するために使用され得る。最初の投薬量もまた、当該分野において周知の技術を使用して、インビボデータ（例えば、動物モデル）から推定され得る。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化し得る。
【００６１】
この用量は、投与される対象者の年齢およびサイズ（例えば体重または体表面積）、標的疾患、状態、投与経路などに基づいて変化させることができる。Ｄｌｌ４アンタゴニスト（特にＤｌｌ４抗体）の全身投与について、静脈内投与の典型的な投薬量範囲は、一日用量で、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．２〜約１０ｍｇ／ｋｇである。皮下投与については、この抗体は少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約１２５ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１７５ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、または約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で、少なくとも１日あたり１〜５回、１週間あたり１〜５回、または１ヶ月あたり１〜５回、約１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４００ｍｇ、約３０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約２００ｍｇ投与され得る。あるいは、この抗体は、最初に静脈内注射により投与され、その後連続的に皮下投与される。
【００６２】
種々の送達システムは公知であり、本発明の医薬組成物、例えば、リポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス、を投与するために使用することができる（例えば  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２を参照）。導入の方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含むが、これらに限定されるものではない。組成物は、いずれかの好都合な経路により、例えば、輸注又は静脈内ボーラスにより、上皮又は皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、結腸及び腸粘膜など）を通した吸収により投与してもよく、そして他の生理活性物質と一緒に投与してもよい。投与は全身的又は局所的であってよい。
【００６３】
医薬組成物はベシクルで、特にリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，  ｉｂｉｄ．，  ｐｐ．  ３１７−３２７を参照；一般に同書を参照）で送達することもできる。
【００６４】
特定の状況では、医薬組成物は放出制御システムで送達することもできる。１つの実施態様では、ポンプを使用してもよい（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１を参照）。別の実施態様では、高分子材料を使用してもよい；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）を参照。尚別の実施態様では、放出制御システムは、組成物標的に近接して留置することができ、その結果全身投与用量のわずかだけが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ｓｕｐｒａ，  ｖｏｌ．２，  ｐｐ．  １１５−１３８，  １９８４を参照）。
【００６５】
注射製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射用剤形、点滴静注などの剤形を含んでよい。これらの注射製剤は公知の方法により調製することができる。例えば、注射製剤は、例えば、通常注射用に便利に使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中で、上記の抗体又はその塩を溶解、懸濁又は乳化することにより調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の助剤などを含む等張液があり、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体）などの適切な可溶化剤との組み合わせで使用してもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの適切な可溶化剤との組み合わせで使用してもよい。このように調製した注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。本発明の医薬組成物は、標準注射針及びシリンジにより皮下又は静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物を送達するのに容易な適用性を有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能又は使い捨て可能となり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、一般的に医薬組成物を含む交換可能カートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になった時点で、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含む別のカートリッジと交換することができる。このようにペン送達デバイスは再使用することができる。使い捨てペン送達デバイスでは、交換式カートリッジはない。むしろ使い捨てペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバに貯められる医薬組成物であらかじめ充填される。リザーバの組成物が空になった時点で、全デバイスは廃棄される。
【００６６】
多くの再利用可能なペン及び自己注射送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用性を有する。例としては、例えば、わずか数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン，ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及び  ＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むが、それらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物の皮下送達において適用を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）を含むが、それらに限定されるものでない。
【００６７】
有利には、上記の経口または非経口用の医薬組成物は、活性成分の用量に合わせて適した単位用量の剤形に調製される。単位用量でのこのような剤形は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、座薬などを含む。含まれるＤｌｌ４アンタゴニスト（例えばＤｌｌ４抗体）の量は、一般的には単位用量の剤形あたり約０．１〜約８００ｍｇであり；特に注射剤の形では、抗体は約５〜約１００ｍｇで含まれるのが好ましく、他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇが好ましい。
【００６８】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物を処置の必要な場所に局所的に投与することが望まれる場合があり；これは、例えば、限定の方法ではなく、手術中の局所注入、局所適用によって、例えば、注射、カテーテル、またはインプラントの集団によって達成され得、このインプラントは多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の物質であり、シリコンゴム膜、ファイバーまたは市販の皮膚代替物などが含まれる。
【００６９】
併用療法
本発明の治療法において、Ｄｌｌ４アンタゴニストは、単独でかまたは免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔまたはｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）、抗炎症剤、鎮痛剤、直接的もしくは間接的血糖降下剤などのような１しゅまたはそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて提供され得る。適切な免疫抑制剤としては、限定されるわけではないが、グルココルチコイド、シクロスポリン、メトトレキサート、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、タクロリムス、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、アザチオプリン、メルカプトプリン、オピオイド、ミコフェノール酸、ＴＮＦ−結合タンパク質（例えば、インフリキシマブ、エタナセプト、アダリムマブなどの結合タンパク質）、抗悪性腫瘍性抗生物質（例えば、ダクチオマイシン、アントラサイクリン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシンなど）、免疫細胞を標的化する抗体（例えば抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３０抗体など）が挙げられる。抗Ｄｌｌ４アンタゴニストとの併用療法に適切な抗炎症剤および／または鎮痛剤としては、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンなど）、ＴＮＦ−αアンタゴニスト（例えば、インフリキシマブまたはＣｅｎｔｏｃｏｒ  Ｉｎｃ．のＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｉｎｃ．のゴリムマブ；Ａｍｇｅｎ／ＷｙｅｔｈのエタネルセプトまたはＥＮＢＲＥＬ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのアダリムマブまたはＨＵＭＩＲＡ（登録商標）など）、ＩＬ−１アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１結合融合タンパク質、例えばＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．のＡｒｃａｌｙｓｔ（登録商標）（米国特許第６，９２７，０４４号を参照））、ＩＬ−６アンタゴニスト（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号に開示されるような抗ＩＬ−６レセプター抗体）、アセトアミノフェン、モルヒネ様作用薬などが挙げられる。適切な血糖降下薬としては、限定するわけではないが、インスリンおよびそのアナログ、鼻ぐア二度、スルホンアミドおよびその尿素誘導体、α−グリコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオンおよびその誘導体、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤、グアーガム、レパグリニド、ナテグリニド、エキセナチド、プラムリンチド、ベンフルオレックス、リラグルチド、ミチグリニド、アルドース還元酵素阻害薬などが挙げられる。
【００７０】
ｈＤｌｌ４  ＡｂまたはそのフラグメントのようなＤｌｌ４アンタゴニスト、および上記のさらなる治療剤は、一緒に共投与されるかまたは別々に投与することができる。別々の剤形が用いられる場合、本発明の抗体またはそのフラグメントおよび追加薬は同時に投与され得るかまたは時差的に（すなわち、適切な順に順番に）分けて投与され得る。
【００７１】
キット
本発明はさらに、梱包材、容器および容器内に収納された医薬品を含む、製造品またはキットを提供し、ここでこの医薬品は、Ｄｌｌ４抗体のような少なくとも１種のＤｌｌ４アンタゴニスト、および少なくとも１種のさらなる治療剤を含み、また梱包材は、ラベルまたは使用の際の指示および使用法を示す添付文書を含む。一実施態様において、Ｄｌｌ４アンタゴニストとさらなる治療剤は別々の容器に収納されていてもよい。
【００７２】
実施例
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造し、使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが彼らの発明と考えるものの範囲を限定することは意図されない。使用される数値（例えば量、温度など）に関して正確さを確実にしようとする努力がなされるが、いくらかの実験誤差及び偏差が存在するはずである。別に指示がなければ、部は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧力は大気圧又はその付近であり、図のエラーバー＝平均値±ＳＥＭである。
【００７３】
以下の実施例において、３％のＦＣＳを補充したダルベッコＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））１×中の以下の抗体を、フローサイトメトリーの目的のために細胞を染色するのに用いた：ＤＣ用、シグナル調節タンパク質αに対する抗体（Ｓｉｒｐ−α；カタログ番号Ｐ８４；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂ２２０（カタログ番号ＲＡ３−６Ｂ２）、ＰＤＣＡ−１（カタログ番号ｅＢｉｏ９２７）、ＣＤ８（カタログ番号５３−６．７）、ＣＤ１１ｂ（カタログ番号Ｍ１／７０）、ＭＨＣＩＩ（カタログ番号Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１１ｃ（カタログ番号Ｎ４１８）、およびＣＤ１３５（カタログ番号Ａ２Ｆ１０）；Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞用、ＣＤ４に対する抗体（カタログ番号ＧＫ１．５またはＬ３Ｔ４）、ＣＤ３（カタログ番号１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ２５（カタログ番号ＰＣ６１または７Ｄ４）、ＣＤ４４（カタログ番号ＩＭ７）、ＦｏｘＰ３（カタログ番号ＦＪＫ１６ｓ）；およびＦ４／８０（カタログ番号ＢＭ８）、ＮＫ１．１（カタログ番号ＰＫ１３６）、ＩｇＭ（カタログ番号ＩＩ／４１）、ＩｇＤ（カタログ番号２６−１１ｃ）、ＣＤ４３（カタログ番号Ｓ７）、ＣＤ２１（カタログ番号ｅＢｉｏ４Ｅ３）、ＨＳＡ（カタログ番号Ｍ１／６９）、およびＣＤ２３（カタログ番号Ｂ３Ｂ４）（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより）。
【００７４】
（実施例１：Ｂ細胞、樹状細胞およびＴ細胞の発達におけるＤｌｌ４遮断の影響）
Ｄｌｌ４−ノッチ１阻害は、Ｂ細胞の異所性の出現を伴うＴ細胞の分化における完全な遮断および胸腺内でＰｒｏ−Ｔ細胞からＤＣへの細胞運命の転換を生じ得る樹状細胞（ＤＣ）の増殖につながることが示されている（Ｈｏｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５（１１）：２５０７−２５１３；Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５（１１）：２５１５−２５２３；およびＦｅｙｅｒａｂｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０：１−１３）。しかしながら、ＤＣ発達の特定の段階がＤｌｌ４遮断によって直接的に影響を受けているかはまだ不明である。
【００７５】
この問いに答えるために、６週齢のＣ５７Ｂ１／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ（ＲＥＧＮ５７７）（ｎ＝５）またはヒトＦｃフラグメント（コントロール）（ｎ＝５）を２週間、１週間につき２度、皮下注射した。ＲＥＧＮ５７７を、公開されている配列（ＷＯ  ２００７／１４３６８９）に基づいて社内で準備した。ＲＥＧＮ  ５７７は、ヒトおよびマウスのＤｌｌ４に結合するが、ヒトＤｌｌ１およびＪＡＧ１を検出可能に結合しない。注射の１４日後、胸腺および脾臓を採取し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補い、コラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む完全ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３０分間、３７℃で消化した。反応を停止させるために、２ｎＭのＥＤＴＡを加え、この臓器懸濁液を７０ｍｍのセルストレーナーを通過させた。１０％  ＦＣＳを補った完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中の大腿骨と脛骨を洗い流すことにより、各マウスから骨髄（ＢＭ）を回収し、細胞をＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。細胞を上記の特異的マーカーに対する抗体で染色した後に、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＤＣサブセットをフローサイトメトリーにより評価した。染色された細胞はＢＤTM  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．８．６；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて解析した。
【００７６】
図１Ａおよび１Ｂは、胸腺におけるＴ細胞およびＢ細胞の集団を示している。図１Ａに示されるように、Ｄｌｌ４遮断は、胸腺内でダブルネガティブ（「ＤＮ」：ＣＤ４-ＣＤ８-）のＴ細胞数における顕著な増加、およびダブルポジティブ（「ＤＰ」：ＣＤ４+ＣＤ８+）のＴ細胞数における現象を引き起こした。さらに、同じ処置は、Ｐｒｏ−Ｔ細胞（すなわち、ＤＮ１ステージにおけるＣＤ４４+ＣＤ２５-ＣＤ４-ＣＤ８-細胞）から生じた、胸腺内でのＢ細胞の異所性の出現を誘発した（図１Ｂを参照）。対照的に、Ｄｌｌ４遮断は、骨髄中のＢ細胞の発達（図２Ａ）または末梢脾臓Ｂ細胞亜集団（図２Ｂ）には影響を及ぼさなかった。さらに、Ｄｌｌ４遮断は、胸腺中の通常のＤＣ（「ｃＤＣ」；Ｂ２２０-ＣＤ１１ｃ+）および形質細胞様ＤＣ（「ｐＤＣｓ」；ＰＤＣＡ１+Ｂ２２０+ＣＤ１１Ｃ+）の増殖を誘発し（図３Ａ）、大幅な増殖はＤｌｌ４  Ａｂの最初の注射後７日目（ｐ＜０．００１）に始まり、１４日目（ｐ＜０．００１）を通過して、２１日目（ｐ＜０．０１）も通過して続いた（図３Ｂ）。図３Ａのドットプロットの数は、１４日目での総細胞の中のＤＣの平均パーセンテージを表わしている。さらに、ＤＣはＤｌｌ４  Ａｂ（ＲＥＧＮ５７７）で処置したマウスの末梢中に増殖された。コントロールマウス（ｈＦｃ  処置したもの）と比較したＤｌｌ４  Ａｂでの処置の際の脾臓中のＤＣのパーセンテージおよび絶対数の増加倍数は、表１に示される。
【００７７】
【表１】
0005883801.tif 000003
【００７８】
リンパ組織のｃＤＣ、ｐＤＣおよび単球は、「マクロファージおよびＤＣ前駆体」または「ＭＤＰ」（その表面表現型「Ｌｉｎ−ｃＫｉｔｈｉＣＤ１１５+ＦＬＴ３+」で同定され得る）と呼ばれる共通の祖先を共有するが、一方「Ｌｉｎ-ｃＫｉｔloＣＤ１１５+ＦＬＴ３+」を持つ「通常のＤＣ前駆体」または「ＣＤＰ」と呼ばれる別の祖先は、ｃＤＣおよびｐＤＣの生産を制限されることが知られている。単球は、炎症状態下でＤＣの表現型の特徴の多くを発達させることができ、ｃＤＣ、ｐＤＣおよび単球系統は、それらが組織に到達する時間によって分けられ、そして単球もｐＤＣも定常状態下ではｃＤＣ中に発達しない。単球およびｐＤＣとは異なり、リンパ組織中のｃＤＳは、リンパ器官中でさらに分化および分裂せねばならない未熟細胞として骨髄から出てくると考えられている。Ｐｒｅ−ＤＣ（ＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃintＣＤ１３５+Ｓｉｒｐ−αint）および後期のｐｒｅ−ＤＣ（ＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint）は、主に骨髄中に生じるｃＤＣの前駆体である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：３９２−３９７）。
【００７９】
ＤＣ前駆細胞の恒常性におけるＤｌｌ４  Ａｂの効果を確認するために、胸腺、骨髄および脾臓中のＭＤＰおよびＣＤＰレベルをフローサイトメトリーで評価した。ＭＤＰおよびＣＤＰは、骨髄中でのみ検出され、胸腺でも脾臓でも検出されなかった（データは示さず）。さらに、Ｄｌｌ４遮断は、コントロール処置をしたマウスと比較して、骨髄中に初期の前駆細胞の増殖を誘発しなかった。従って、この結果は、Ｄｌｌ４  Ａｂが、ＭＤＰおよびＣＤＰよりもＤＣの発達の後期段階（すなわちｐｒｅ−ＤＣ段階）において作用することができることを示唆した。
【００８０】
従って、胸腺および骨髄中のｐｒｅ−ＤＣおよび後期ｐｒｅ−ＤＣを、フローサイトメトリーを用いて探索した。図３Ｃに示されるように、骨髄中に正常に存在するＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣは、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置の１４日後に胸腺中にのみ増殖したが、ＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣの増殖は、同じマウスのＢＭ中では増殖されなかった（データは示さず）。従って、このｐｒｅ−ＤＣ段階に由来するＤＣ増殖は、胸腺に限定された。胸腺中のＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣの起源を評価するために、ＤＮ１（ＣＤ４-ＣＤ８-ＣＤ４４+ＣＤ２５-）ｐｒｏ−Ｔ細胞中のＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣを同定するフローサイトメトリーを実施した。図３Ｄに示されるように、３日目にＤｌｌ４遮断時のＤＮ１  ｐｒｏ−Ｔ細胞集団内でＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣが検出された。ＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣは、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置なしだけではなく、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置時のＤＮ２、ＤＮ３およびＤＮ４  Ｔ細胞集団内で検出されなかった（データは示さず）。Ｄｌｌ４  Ａｂ処置時の末梢ＤＣ恒常性の変化は観察されなかった（データは示さず）。従って、Ｄｌｌ４遮断は、３日目（ｐ＜０．０１）にＤＮ１  ｐｒｏ−Ｔ細胞集団内でＭＨＣＩＩloＣＤ１１ｃint  ＤＣの有意な増殖（図３Ｄ）、１４日目（ｐ＜０．００１）に増殖のピークを誘発した（データは示さず）。一方、未熟ＤＣサブセットは、上で議論したように、胸腺中で７日目（ｐ＜０．００１）から２１日目（ｐ＜０．０１）をとおして増殖した（図３Ｂを参照）。
【００８１】
ＤＣ増殖が、分化の方向性のない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）Ｔ細胞前駆体を起源とし得るか否かを調べるために、ＤＮ１  ＣＤ４５．１+Ｌｉｎ-を挿入した細胞を抗Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したＣＤ４５．２+宿主マウス中に胸腺内移植した。ＣＤ４５．１+細胞は、ＤＮ１段階で蓄積し、未熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）が検出されかつ胸腺中で増殖したことが分かった（図４）（ｐ＜０．０１）。コントロールのＡｂ処置マウスにおいては細胞が観察されず、おそらくはＤＮ１移行細胞のほとんどが、Ｔ細胞ネガティブ選択によって排除されたからであろう。Ｄｌｌ４遮断は、通常のＴ／ＤＣ  ＤＮ１前駆細胞由来の胸腺内代替ＤＣ系統の発達を促進することが結論付けられた。
【００８２】
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）は、ＤＣ中への骨髄前駆細胞の分化および末梢ＤＣの発達に十分かつ不可欠である。Ｆｌｔ３−Ｌの血清レベルは、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ処置したＷＴ動物中で変化しなかった（データは示さず）。さらに、以下の表２および３に示されるように、胸腺中のＤＣの割合は、野性型マウス（ＷＴ（表２および３））、ＦＬｔ３−Ｌノックアウトマウス（Ｆｌｔ３−Ｌ-/-）（ｐ＜０．０５）（表２）、およびＦｌｔ３−Ｒノックアウトマウス（Ｆｌｔ３−Ｒ-/-）（ｐ＜０．００１）（表３）で増殖され、全てＤｌｌ４  Ａｂで処置され、コントロールＡｂで処置されたマウスと比較されている。従って、Ｄｌｌ４遮断は、胸腺中でＦｌｔ３依存性のＤＣ増殖を誘導する。
【００８３】
【表２】
0005883801.tif 000004
【００８４】
【表３】
0005883801.tif 000005
【００８５】
非Ｔ細胞表現型にに対して再駆動する初期Ｔ細胞前駆体の能力が観察されている（Ｊａｍｅｓ  Ｐ．Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ、２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：４４−４５）。遺伝子配列の分析を胸腺細胞とｐｒｏ−Ｔ細胞において実施し、ＢとＤＣの細胞系統の特定化に対し、Ｔ細胞に関与している遺伝子における抗Ｄｌｌ４  Ａｂ処置の効果を測定した。Ｔ細胞の拘束に重要な遺伝子（例えば、Ｔｃｆ７、Ｇａｔａ３、およびＥｔｓ１）がダウンレギュレートされ、一方Ｔ細胞の発達をそれぞれ遮断することのできる遺伝子（Ｌｙｌ１、Ｓｆｐｉ１）がアップレギュレートされたことがわかった（データは示さず；Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ、２０１０、上述、を参照のこと）。最も興味深いのは、ＤＣを制御する遺伝子（ＰＵ．１  および  Ｓｐｉ−Ｂ）およびＢ細胞の発達もまた、アップレギュレートされたことである（データは示さず；Ｍ．Ｍｅｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｂｏｏｄ  １１３：３４１８−３４２７を参照のこと）。さらに、ＤＣサブセット発達に関与する、ＲｅｌＢ  および  Ｉｄ２ならびにインターフェロン調節因子（ＩＲＦｓ）２、４および８（重要な転写因子）の発現が増加された（データは示さず；Ｍｅｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、上述、を参照のこと）。最後に、ＤＣの発達に関与する重要なサイトカインであるＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）の遺伝子発現は、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ処置においてアップレギュレートされることがわかった（ｐ＜０．０５；データは示さず）。さらに、ＣＳＦ−１血清レベルは、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ処置の際に増加した（図５；ｐ＜０．０５）（Ｂ．Ｆｒａｎｃｋｅ、ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｂｌｏｏｄ  １１１：１５０−１５９を参照のこと）。従って、Ｄｌｌ４−ノッチのシグナル伝達遮断は、Ｔ細胞系統の拘束に特異的な転写因子をダウンレギュレートし、ＤＣ発達に重要な他の因子をアップレギュレートすることが結論付けられる。
【００８６】
（実施例２：Ｔ細胞発達におけるＤｌｌ４欠失の効果）
上記の実施例１において観察されたＤＣ発達におけるＤｌｌ４の効果がＤｌｌ４に公有のものであるかを評価するために、Ｄｌｌ４が条件付きで不活性化されているＤＬＬ４ＣＯＩＮマウスを準備した。「コンディショナル−バイ−インバーション（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ−ｂｙ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）（ＣＯＩＮ）」対立遺伝子は、逆位要素（「ＣＯＩＮ要素」）を持つ条件付き対立遺伝子であり、リコンビナーゼ媒介性条件付き変異を提供する。ＤＬＬ４ＣＯＩＮマウスは、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ構築物、ＣｒｅＥＲＴ２を含んでおり、これは、変異体エストロゲンリガンド結合ドメイン（ＥＲＴ２）に融合するＣｒｅリコンビナーゼをコードする。ＣｒｅＥＲＴ２は、タモキシフェンの非存在下では主に不活性であり、内因性エストロフェンによっても活性化されない。マウスのタモキシフェン処置は、ＣｒｅＥＲＴ２を活性化し、ＣＯＩＮ挿入点の下流の全てのエクソンの転写を抑止するＣＯＩＮ要素の反転を引き起こし、それによりＤｌｌ４をノックアウトする。ＣｒｅＥＲＴ２リコンビナーゼ系の詳細については、Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２３７：７５２−７５７を参照のこと。
【００８７】
ＤＬＬ４ＣＯＩＮにタモキシフェン（ＴＡＭ）（カタログ番号Ｔ−５６４８、Ｓｉｇｍａ）を３ｍｇ／１５０μｌコーン油／マウスで、１週間あたり３回、２週間にわたって腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＤＬＬ４ＣＯＩＮコントロールマウス（ｎ＝６）にはタモキシフェンを含まないコーン油を与えた。同様に、野性型Ｃ５Ｂ１／６マウスをタモキシフェン（ｎ＝６）またはコーン油のみ（ｎ＝６）で処置した。マウスの苦痛の徴候（例えば、毛皮の外観、低活性など）、感染症、および体重の過度の損失についてモニタリングした。マウスの体重を１週間あたり約３度測定した。２０％より多く体重を落としたマウスを全て実験から除いた。この処置の２週間後、胸腺を採取し、胸腺細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【００８８】
図６に示されるように、Ｄｌｌ４の非存在下において（すなわち、タモキシフェン処置したマウス）、コーン油処置したマウスと比較して、Ｂ細胞およびｐＤＣおよびｃＤＣの両方が胸腺中で増殖し、実施例１で観察されたＤＣの発達および恒常性におけるＤｌｌ４の効果は、確かにＤｌｌ４に固有のものであることが示された。従って、Ｄｌｌ４−ノッチシグナル伝達は、ｐｒｏ−Ｔ細胞集団内で非Ｔ細胞系統の潜在能力を抑制することによりＴ細胞の拘束を維持するようである。
【００８９】
（実施例３：Ｔｒｅｇ恒常性におけるＤｌｌ４遮断またはＤｌｌ４欠失の効果）
近年、Ｔｒｅｇは、正常な数のＤＣを維持するのに必要であることが示されている。Ｔｒｅｇが枯渇すると、代償性のＦｍｓ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）に依存するＤＣの増加がある（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、前出）。
【００９０】
さらに、２つの独立したグループが、インビボでＤＣによる調節性Ｔ細胞恒常性のフィードバックコントロールを示していた：すなわち、ＤＣの数を増加させることで自己免疫疾患の進行を防止するＴｒｅｇの分裂および集積の増加につながる（Ｄａｒｒａｓｓｅ−Ｊｅｚｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６（９）：１８５３−１８６２；ａｎｄ  Ｓｗｅｅ  ＬＫ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｂｌｏｏｄ  １１３（２５）：６２７７−６２８７）。Ｄｌｌ４遮断がＴｒｅｇの恒常性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、実施例１でＤｌｌ４  ＡｂまたはヒトＦｃ（コントロール）で処置したマウスの胸腺中のＴｒｅｇ数をフローサイトメトリーで測定した。図７Ａに示すように、Ｄｌｌ４の遮断は最初の注射の１４日後に胸腺内でのＴｒｅｇの強い増殖をもたらした。この増殖は、最初の注射後、７日目に始まり（ｐ＜０．００１）、胸腺中で１４日目に最大効果に到達した（ｐ＜０．００１）（図７Ｂを参照）が、末梢（すなわち脾臓）のＴｒｅｇにおいては、１４〜２１日目（ｐ＜０．０５）のみ出現した（図７Ｂおよび表４を参照のこと）。表４に、コントロールマウス（ｈＦｃ処置）と比較して、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置した脾臓中のＴｒｅｇのパーセンテージおよび絶対数の増加倍数を示している。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
観察されたＴｒｅｇ増殖がＤｌｌ４分子に固有であるかどうかを評価するために、実施例２のＤＬＬ４ＣＯＩＮマウスの胸腺中のＴｒｅｇ数もまた、フローサイトメトリーで測定した。Ｄｌｌ４  ＡｂによるＤｌｌ４遮断で観察されるように、コーン油処置したマウス（図７Ｃを参照）ならびにタモキシフェンで処置した野性型マウス（データは示さず）と比較して、タモキシフェン処置によるＤｌｌ４の条件付き不活化もまた胸腺中のＴｒｅｇの増殖をもたらす。従って、Ｄｌｌ４−ノッチシグナル伝達は、ＤＣを維持し、結果的にＴｒｅｇの恒常性およびＴ細胞の拘束を維持する。
【００９３】
同様の実験を、ヒトＤｌｌ４のＮ末端ＤＳＬドメインを結合することが知られている抗Ｄｌｌ４  Ａｂを用いて（配列番号１１６および１１８のそれぞれＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列を有するＲＥＧＮ４２１）、ヒトＤｌｌ４を発現するマウス（「ヒト化Ｄｌｌ４マウス」）中で実施した。このヒト化Ｄｌｌ４マウスを、マウスＤｌｌ４遺伝子の細胞外ドメイン全体を、Ｆ１  Ｃ５７ＢＬ／６  ／１２９の胚性肝（ＥＳ）細胞中のヒトＤｌｌ４遺伝子（７ｋｂ）の対応する細胞外領域と置き換えることにより、準備した。ホモ接合体マウスを作製し、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに飼育した。ヒト化Ｄｌｌ４マウスを、５ｍｇ／ｋｇのｈＦｃ（コントロール；ｎ＝６）、または１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）もしくは５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）のＲＥＧＮ４２１  Ａｂで２週間、１週間あたり２度処置した。各処置グループからの２匹のマウスを７日目に屠殺し、各グループ２匹以上のマウスは１４日目に屠殺した。胸腺を採取し、細胞を染色して、フローサイトメトリーで試験した。残りのマウスは何も処置することなくにさらに４週間回復させ、処置の中止後２８日目に屠殺して、胸腺細胞をフローサイトメトリーで分析した。治療の２週間後、ｃＤＣおよびｐＤＣの増加（図８Ａ）ならびにＴｒｅｇ集団における顕著な増加（図８Ｂ）を抗Ｄｌｌ４  Ａｂ処置したマウスの胸腺中で確認した（ｐ＜０．０１）。Ｄｌｌ４  Ａｂを２週間受け、その後何の処置もせず４週間おいたマウスの胸腺において、ＤＣとＴｒｅｇの数は両方、各期間の終わりには正常レベルに戻った（図８Ａおよび８Ｂ）。一方、ＤＣおよびＴｒｅｇの増殖もまた、ｈＦｃ処置したマウスと比較して、Ｄｌｌ４−Ａｂ処置したマウスの末梢で確認された（データは示さず）。
【００９４】
（実施例４：Ｔｒｅｇにおけるノッチレセプターの効果）
ＤＣの増殖が、Ｔｒｅｇの増殖につながることは示されている（Ｄａｒｒａｓｓｅ−Ｊｅｚｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、２００９  ）。上で議論したように、Ｄｌｌ４遮断によって、ＤＣとＴｒｅｇの両方が胸腺中で増殖されることが観察された（図３Ａおよび図７Ａ）。さらに、ＤＣとＴｒｅｇのパーセンテージおよび絶対数の両方がＤｌｌ４−Ａｂ処置したマウスの末梢中で見いだされた（表１および４）。ノッチレセプターの遮断が、Ｄｌｌ４欠失のＮｉｃａｓｔｒｉｎノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｎｉｃ-/-）と同じ表現型を導くかどうかが研究された。Ｎｉｃａｓｔｒｉｎは、ノッチシグナル伝達経路に関与する分子であり、ｎｉｃａｓｔｒｉｎ欠失マウスにおけるｎｉｃａｓｔｒｉｎの遺伝手術は、ノッチレセプター１、２、３および４の下流のシグナル変換の遮断をもたらす（Ａｉｆａｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｕｎ−ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｄａｔａ）。Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ  ＫＯマウスは、胸腺ならびに脾臓において、パーセンテージと絶対数の両方において、Ｔｒｅｇの数が増加したＤｌｌ４欠失／遮断マウスと同様の表現型を表わすことが示された（表５を参照のこと）。
【００９５】
【表５】
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【００９６】
最終的に、Ｎｉｃ-/-マウス由来の骨髄細胞を、致死的に被ばくしたＷＴマウス中に移した場合、胸腺Ｔｒｅｇの増殖をＮｉｃ-/-→ＷＴキメラ中で観察され、このような増殖が、細胞の自律的な効果であり、抗Ｄｌｌ４  Ａｂを持つレシピエントマウスのＤｌｌ４遮断は付加的な効果を持たないことを示唆している（表６を参照のこと）。
【００９７】
【表６】
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【００９８】
これらの結果は、Ｄｌｌ４またはノッチレセプターのいずれかの遮断によるＤｌｌ４−ノッチシグナル伝達の妨害が、Ｔｒｅｇの増殖に関する同様の表現型をもたらすことを示唆している。
【００９９】
Ｄｌｌ４遮断におけるＴｒｅｇの増殖がＤＣの数と相関しているかどうかを確認するために（Ｄａｒｒａｓｓｅ−Ｊｅｚｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、２００９、前出）、ＤＣを欠いたマウスを準備して、実施例１のようにＤｌｌ４  Ａｂでを用いて試験した。霊長類のジフテリア毒素レセプター（ＤＴＲ）を発現するトランスジェニックマウスに、それらの細胞に感応するジフテリア毒素（ＤＴ）を与えた（その他ではＤＴ非感応性である）。ＤＴは、そのＢサブユニットと細胞ＤＴＲとの相互作用を介して細胞に入ると、エンドサイトーシスにより、ＤＴ  Ａサブユニットが放出され、伸長因子２のＡＤＰリボース化を触媒し、タンパク質合成の阻害とその後の有糸分裂および高分化細胞両方の急速なアポトーシスをもたらす。細胞除去の特殊性およびタイミングは、細胞のタイプ−制限プロモーター／エンハンサーエレメントによって、および毒素投与の計画によってそれぞれ決定され得る。ＤＴ感応性の標的をＤＴにするために、Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：２１１−２２０）は、ネズミのＣＤ１１ｃプロモーターの制御下で、サルのＤＴＲ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）融合タンパク質をコードする導入遺伝子を保持するマウス（ＣＤ１１ｃｒｅ−ＤＴＲマウス）を作製した。ＣＤ１１ｃは、ＤＣの全てをコードするため、ＣＤ１１ｃを発現する全てのネズミＤＣサブセットは、ＤＴの投与により除去される。
【０１００】
このように準備されたＤＣを欠くトランスジェニックマウスを、実施例１に記載のプロトコルに従ってＤｌｌ４  ＡｂまたはｈＦｃコントロールで処置した。処置の１４日後、胸腺および脾臓を採取し、分析用に調製した。どの特異的サブセットがＤｌｌ４  Ａｂと結合するかを決定するために、特異的ＤＣまたはＴ細胞サブセットの表面上のＤｌｌ４の発現レベルをフローサイトメトリーで評価した。これらの結果は、ＤＣとＴ細胞はそれらの表面上に検出可能なレベルのＤｌｌ４を発現しなかったことを示していた（データは示さず）。この知見は、Ｄｌｌ４が、胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）上に発現されるというレポートによって実証されている（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００８、前出）。しかし、最も重要なことに、ＤＣを欠いたマウスのＤｌｌ４  Ａｂ治療は、Ｔｒｅｇの発現を誘発することができなかったが、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置した野性型マウス（すなわち、ＤＣ非欠失マウス）は、ＣＤ３+ＣＤ４+細胞中でＴｒｅｇの集団を明らかに増加させ（ｐ＜０．００１）、Ｄｌｌ４  Ａｂ治療によるＴｒｅｇの増殖がＤＣ増殖を介して少なくとも一部媒介されたことを示唆している。
【０１０１】
（実施例５：  実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）におけるＤｌｌ４遮断の効果）
ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+天然調節性Ｔ細胞（すなわちＴｒｅｇ）は自己免疫寛容の維持ならびに、１型糖尿病、自己免疫性脳脊髄炎、ＧＶＨＤおよび炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような自己免疫疾患の抑制に重要な役割を果たしている（Ｄａｒｒａｓｓｅ−Ｊｅｚｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、２００９、ｓｕｐｒａ；Ｓｗｅｅ  ＬＫ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、ｓｕｐｒａ；ａｎｄ  ＭｃＧｒｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、１７５（５）：３０２５−３０３２）。
【０１０２】
Ｄｌｌ４遮断によってもたらされたＴｒｅｇの数の増加が、自己免疫疾患を予防しているかを確かめるために、ＥＡＥにおけるＤｌｌ４遮断の影響をマウスモデルにおいて研究した。このＥＡＥマウスモデルは、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバンド（ＣＦＡ）中で乳化させたミエリンオリゴデドロサイトグルコプロテイン（ＭＯＧ）ペプチドをＣ５７Ｂ１／６マウスの足蹠に注射し、そのと（２４時間後）疾患を誘発させる百日咳毒素（ＰＴＸ）注射をすることにより作製した。この疾患スコアを以下の症状に基づいて決定した：（０）症状なし；（１）弱々しい尾；（２）弱々しい尾および後ろ足の脱力感；（３）後ろ足の部分的な麻痺；（４）後ろ足の完全麻痺；（５）全ての肢の麻痺；および（６）瀕死の状態。免疫化の１２〜２４時間前、前侑同グループ（ｎ＝１０）のマウスには、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ（ＲＥＧＮ５７７）もしくはアイソタイプコントロールＡｂ（ＣＤ２０に特異的なヒト抗体であって、米国特許第２００８／０２６０６４１の開示に従って社内で準備される）、またはＰＳ／２（マウスインテグリン様細胞接着分子ＶＬＡ−４；ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１９１１）のいずれかを２５ｍｇ／ｋｇ皮下注射ラット／マウスＩｇＧ２ｂに皮下注射し、一方導入後グループのマウス（ｎ＝１０）のマウスは症状の表れた日に同じものを注射した。ＰＳ／２  Ａｂは、疾患の再発を悪化させ、再発型自己免疫性脳脊髄炎（Ｒ−ＥＡＥ）のマウスモデルにおいて中枢神経中のＣＤ４+  Ｔ細胞の蓄積を増加させることが知られている（Ｔｈｅｉｅｎ  ＢＥ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０７（８）：９９５−１００６）。抗体の注射を、２週間にわたり、１週間に２度実施した。実験の終わりに、マウスの脊髄を注意深く取り除き、粉砕してその後コラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中でインキュベーションした。２ｍＭのＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、その混合物を７０ｍｍの細胞ストレーナーを通過させ、細胞含有量をフローサイトメトリーで分析した。
【０１０３】
図９Ａおよび９Ｂに示されるように、アイソタイプコントロールＡｂで処置したマウスは、ＭＯＧ注射後、１０〜１４日あたりで始まり、１５〜２１日間のピークを持つ症状を発症（すなわち、「０」よりも大きい疾患スコアを有している）した。対照的に、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したマウスは、コントロールＡｂで処置したマウスと比較して、疾患の進行を完全に予防した。表７は、コントロールＡｂで処置したマウスと比較して、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したマウスの胸腺および脾臓におけるＴｒｅｇのパーセンテージおよび絶対数の増加倍数を示している。
【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
Ｔｒｅｇは、１８日あたりでは胸腺内で主に増殖し、２１日後のみ、末梢（すなわち、脾臓）中で明らかな増殖が見られるようである。この特定の事件条件下で、誘導後段階でのＤｌｌ４  Ａｂは、疾患の進行において有意な向上を示さなかった。Ｄｌｌ４  Ａｂの投薬量および／または頻度は、当業者の知識内でさらに調節される。しかしながら、重要なことに、誘導前Ｄｌｌ４  Ａｂを受けたマウスは、コントロールＡｂのマウスと比較して、１８日目にて脊髄中に細胞浸潤の明らかな減少を示した（以下の表８を参照のこと）。コントロールＡｂで処置されたマウスの脊髄中で観察された細胞浸潤は、コレラのマウスにおける疾患の進行に対する主要な寄与源であり得る。
【０１０６】
表８に示されるように、２１日目にコントロールＡｂで処置したマウスの脊髄と比較して、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したマウスの脊髄中では、マクロファージにおいて８倍の減少（ｐ＜０．０００１）、ＮＫ細胞において２．７倍の減少（ｐ＜０．０００１）、ＣＤ１１ｂ細胞において１．７倍の減少（ｐ＜０．００１）、およびＢ細胞において２．５倍の減少（ｐ＜０．００１）であった。
【０１０７】
【表８】
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【０１０８】
さらに、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置したマウスにおけるリンパ節中のＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの産生は、明らかに減少した（ｐ＜０．００１）（図１０）。従って、Ｄｌｌ４は、Ｔｈ１の発達を媒介することによってＥＡＥの病因に関与し得、Ｄｌｌ４  Ａｂ治療は、Ｔｈ１およびＴｈ１７サイトカインの分泌を遮断することによって疾患の誘発を防止することができる。
【０１０９】
（実施例６  糖尿病におけるＤｌｌ４遮断の効果）
糖尿病におけるＤｌｌ４遮断の効果もまた、１型糖尿病の多遺伝子モデルであるＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪマウスにおいて試験した（Ｍａｋｉｎｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８０、Ｊｉｋｋｅｎ  Ｄｏｂｕｔｓｕ  ２９（１）：１−１３；Ｓｅｒｒｅｚｅ  ＤＶ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８（８）：３９７８−８６）。ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪマウスにおける糖尿病は、膵島の膵島炎および白血球の浸潤によって特徴付けられる。膵臓のインスリン含有量の顕著な減少が、メスでは１２週齢、オスではその数週間後に自発的に生じる。結果的に、血漿グルコース濃度は２５０ｍｇ／ｄＬより大きくなる。ＮＯＤマウスの血中グルコース濃度をＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）  ｍｉｎｉ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．）を用いて１週間に２度検査した。連続して血中グルコース濃度が読み取り値２５０ｍｇ／ｄＬを超えた後、これらのマウスは糖尿病であると判断した。糖尿病の発症は、連続した糖尿病の測定の最初の日から始まった。これらのマウスに、ｈＦｃ（ｎ＝５）または抗Ｄｌｌ４  Ａｂ（Ｒｅｇｎ５７７）（ｎ＝１０）２５ｍｇ／ｋｇを、７週齢から初め、９週齢まで、１週間あたり２度注射した。血中グルコース濃度を尾からの血液サンプルで週に１度モニタリングした。
【０１１０】
図１１Ａに示されるように、ｈＦｃで処置したマウスは、１３週齢後、２５０ｍｇ／ｄＬより高い血中グルコース濃度で連続する糖尿病の発症が始まった（●）。対照的に、抗Ｄｌｌ４  Ａｂ（ＲＥＧＮ５７７）で処置したマウスは、２５週齢を超えてもグルコース濃度の増加の徴候が見られず（■）、その測定をさらに１０週間継続した。糖尿病発症前のＤｌｌ４−Ａｂは、糖尿病の発症を防止し、処置された動物は、ついに糖尿病を発症しなかった。興味深いことに、Ｄｌｌ  Ａｂで処置した１０匹のうち５匹のマウスに、２０週齢で抗ＣＤ２５（ＰＣ６１）ｍＡｂを注射して、Ｔｒｅｇを枯渇させると（◆）、それらの血中グルコース濃度はその後１〜２週間で増加しはじめ、それらのマウスは糖尿病となった。このことは、１型糖尿病におけるＤｌｌ４  Ａｂは、少なくとも部分的にはＴｒｅｇによって媒介されていることを示唆した（図１１Ａ）。
【０１１１】
インスリンおよびＧＡＤ６５は、糖尿病ＮＯＤマウスと同様、糖尿病個体の血清中で見いだされた２つの標準的な自己抗体である。従って、ｈＦｃコントロールまたはＤｌｌ４  Ａｂで処置されたマウス中の自己抗体の血清中濃度をＤＬＩＳＡにより測定した。図１１Ｂに示されるように、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置は、抗インスリン（□）自己抗体および抗ＧＡＤ６５自己抗体（■）の産生を、未処置のＷＴ  Ｃ５７Ｂｌ／６（すなわち、非ＮＯＤマウス；ネガティブコントロール動物）と同様のレベルで遮断した。対照的に、ｈＦｃコントロールを受けたＮＯＤ（糖尿病）マウスの血清中の自己抗体は高いレベルであった。さらに、Ｄｌｌ４  Ａｂで処置し、糖尿病の徴候を示していない２３週齢のマウスの膵臓分泌物を＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）で染色すると、保存された形態で、正常数の膵島（インスリンまたはグルカゴンを産生する細胞であり、これらの破壊は、糖尿病の発症と直接的に関連する）が観察された（図１１Ｃ、左パネル、および図１１Ｄ、左パネル）。さらに、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置したマウスでは、その膵島内での細胞浸潤が観察されなかった（図１１Ｃ、左パネル、および図１１Ｄ、右パネル）。対照的に、ｈＦｃコントロールで処置した糖尿病動物は、Ｄｌｌ４  Ａｂ処置したマウスよりも明らかに膵島の数が少なく（図１１Ｃ、右パネル、および図１１Ｄ、左パネル）、残りの非常に少ない膵島は高レベルの細胞浸潤を含んでいた（図１１Ｃ、右パネル、および図１１Ｄ、右パネル）。従って、Ｄｌｌ４  Ａｂは、長い期間にわたり完全に糖尿病を予防することができ、その効果は、少なくとも部分的にＴｒｅｇの増殖によって媒介されているようである。しかしながら、さらなる機構が膵島および／またはインスリンにおけるＤｌｌ４  Ａｂの保護効果に関与し得る可能性がある。
【０１１２】
Ｄｌｌ４  Ａｂで処置した糖尿病マウスの実際の血中グルコース濃度を測定し、ｈＦｃコントロールで処置したマウスの血中グルコース濃度と比較した。糖尿病マウスを、疾患の発症時（ｄａｙ  ０）に、２５ｍｇ／ｋｇのＤｌｌ４  Ａｂ（ｎ＝３）またはコントロールｈＦｃ（ｎ＝４）で処置した。Ｄｌｌ４  Ａｂ処置では、糖尿病マウスのグルコース濃度は、約３５０ｍｇ／ｄＬから正常濃度（約１２０−１３０ｍｇ／ｄＬ）まで、明らかに減少した（図１１Ｅ）。この効果は、平均４〜５週間続いた。一般的に、血中グルコースが３５０ｍｇ／ｄＬ未満の糖尿病マウスをＤｌｌ４  Ａｂで処置すると、それらのグルコース濃度は正常レベルまで低下し、この効果は処置の時点で３５０ｍｇ／ｄＬより高い血中グルコースを持つマウスよりも長く続いた。このことは、Ｄｌｌ４  Ａｂによる血中グルコース濃度のコントロールについて、長期にわたり効果的な治療には特定の機会のウインドウが存在することを示唆している。従って、本明細書中に記載される全ての特定のメカニズムによって縛られることなく、これらの知見は、Ｄｌｌ４抗体が、１型糖尿病の大きな治療能力を有していることを示唆している。
【０１１３】
上記の実験からの結果は、インビボでのＴｒｅｇ細胞とＤＣの数をコントロールする以前は未知であった調節ループの存在を明らかにした。この調節サーキットは、免疫と耐性のバランスが重要であるようであるが、最も重要なことは、最初に免疫系の３つの重要な構成要素間の連結（すなわち、Ｄｌｌ４−ＤＣ−Ｔｒｅｇ）を作製することである。従って、Ｄｌｌ４アンタゴニストによる治療は、インビボでＴｒｅｇの数を制御し、自己免疫疾患および関連する症状の進行を制御するために効果的な方法論である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−４】
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【図１１−３】
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【配列表】
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