(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端へ、以下：
ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥβ
を含む、キメラｆＨｂｐであって、
ＶＡαがVAADIGAGLA DALTAPLDHK DKSLQSLTLD QSVRKNEKLK LAAQGAEKTY GNGDSLN TGKLKNDKV（配列番号１５）に対して少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有し、前記下線部のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で代替し得る残基であり、
Ｉ３がアミノ酸配列ＳＲＦＤＦ（配列番号３）であり、
ＶＢαがIRQIEVDGQL ITLES（配列番号８５）に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有し、前記下線部のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で代替するかまたは欠失し得る残基であり、
Ｉ４がアミノ酸配列ＧＥＦＱ（配列番号４）であり、
ＶＣαがVYKQSHSALT ALQTEQVQDS EHSGKMVAKR QFRIGDIAGE HTSFDKLPEG GRATYRGTAF GS（配列番号９６）に対して少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有し、前記下線部のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で代替するかまたは欠失し得る残基であり、
Ｉ５がアミノ酸配列ＤＤであり、
ＶＤβがPNGRLHYSID FTKKQGYGR（配列番号１９２）に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有し、前記下線部のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で代替するかまたは欠失し得る残基であり、
Ｉ６がアミノ酸配列ＩＥＨＬＫ（配列番号５）またはＩＥＨＬＥ（配列番号６）であり、
ＶＥβがTPEQNVELAS AELKADEKSH AVILGDTRYG GEEKGTYHLA LFGDRAQEIA GSATVKIREK VHEIGIAG（配列番号２６２）に対して少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有し、前記下線部のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で代替するかまたは欠失し得る残基である、キメラｆＨｂｐ。
【請求項２】
ＶＡα、ＶＢα、ＶＣα、ＶＤβおよびＶＥβが、それぞれ配列番号１５、８５、９６、１９２および２６２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラｆＨｂｐ。
【請求項３】
ＶＡαが配列番号１５に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、
ＶＢαが配列番号８５に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有し、
ＶＣαが配列番号９６に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、
ＶＤβが配列番号１９２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有し、
ＶＥβが配列番号２６２に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のキメラｆＨｂｐ。
【請求項４】
Ｎ末端からＣ末端へ、以下：
Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７
を含み、
Ｉ１がＣＳＳＧ（配列番号２）であり、
Ｎｔｅが、ＧまたはＧＧまたはＳＧＧまたはＧＧＧＳ（配列番号７）またはＳＧＳＧＧ（配列番号８）またはＧＧＧＳＧＧ（配列番号９）またはＧＧＧＳＧＳ（配列番号１０）であり、
Ｉ２がＧＧであり、
Ｉ７がＫＱである、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラｆＨｂｐ。
【請求項５】
前記ｆＨｂｐが、ＪＡＲ−４（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９３４）、ＪＡＲ−５（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９４１）、ＪＡＲ−１０（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９４０）、ＪＡＲ−１１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９３８）、ＪＡＲ−３２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９４２）およびＪＡＲ−３３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９３９）からなる群から選択されるモノクローナル抗体によって結合されるエピトープを含み、
ＪＡＲ−４に結合されるエピトープは２５〜２７位に残基ＤＨＫと５７〜５９位に残基ＹＧＮを含み、
ＪＡＲ−５が結合するエピトープは残基Ｇ１２１およびＫ１２２を含み、
ＪＡＲ−１０が結合するエピトープは残基Ｋ１８０およびＥ１９２を含み、
ＪＡＲ−１１が結合するエピトープは残基Ａ１７４を含み、
ＪＡＲ−３２が結合するエピトープは残基Ｋ１７４を含み、
ＪＡＲ−３３が結合するエピトープは残基Ｒ１８０およびＥ１９２を含み、
残基の番号付けは、シグナル配列を欠くＭＣ５８菌株ｖ．１ｆＨｂｐのアミノ酸配列（配列番号１）に基づく、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラｆＨｂｐ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の第１のキメラｆＨｂｐと薬学的に許容される賦形剤とを含む免疫原性組成物。
【請求項７】
前記キメラｆＨｂｐが、外膜小胞（ＯＭＶ）、微小胞（ＭＶ）、またはＯＭＶおよびＭＶの混合物を含む小胞調製物内にあり、小胞がナイセリア細菌から調製される、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ナイセリア細菌が、内因性ｆＨｂｐポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されている、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記キメラｆＨｂｐが、前記ｆＨｂｐを産生するように遺伝子改変されているナイセリア細菌によって産生される、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記小胞調製物が、前記キメラｆＨｂｐを産生する菌株と同じナイセリア−メニンギティディス由来であるかまたは、前記ナイセリア細菌が莢膜多糖合成を欠いている、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
第２のｆＨｂｐをさらに含み、前記第２のｆＨｂｐが前記第１のキメラｆＨｂｐとは異なる、請求項６から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ヒトなどの哺乳動物において抗体応答を誘発する方法に用いるための、請求項６から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
哺乳動物に前記組成物を投与することにより、２種以上のｆＨｂｐに結合する抗体が産生される、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のキメラｆＨｂｐをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年４月３０日に出願された米国仮出願第６１／１７４，４２４号の優先権を主張し、その仮出願は、全体として、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
連邦支援の研究に関する言明
本発明は、公衆衛生総局助成金番号Ｒ０１  ＡＩ４６４６４およびＣ０６  ＲＲ１６２２６における政府支援でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ナイセリア−メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）によって引き起こされる疾患についてのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００４】
ナイセリア−メニンギティディスは、ヒト上気道にコロニー形成するグラム陰性細菌であり、最も顕著には髄膜炎および敗血症の、世界的な孤発性および周期性の流行的発生の原因である。発病率および罹患率は、２歳未満の小児で最も高い。他のグラム陰性細菌のように、ナイセリア−メニンギティディスは、典型的には、原形質膜、ペプチドグリカン層、莢膜多糖と共に細胞壁を構成する外膜、および外側の環境へ突き出す線毛を有する。ナイセリア−メニンギティディスの被包性菌株は、小児および若年成人における細菌性髄膜炎および敗血症の主な原因である。侵襲性ナイセリア−メニンギティディス感染症の流行および経済的重要性によって、異なる菌株にわたる、特に異なる血清型または血清亜型を有する遺伝子的に多様なＢ群菌株にわたる免疫を与えることができる効果的なワクチンについての研究が促されている。
【０００５】
Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ、当技術分野においてリポタンパク質２０８６（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００４；７２：２０８８〜２１００）、ゲノム由来ナイセリア抗原（ＧＮＡ）１８７０（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３；１９７：７８９〜９９）、または「７４１」とも呼ばれる）は、表面に露出したリポタンパク質として細菌内で発現するＮ．メニンギティディスのタンパク質である。ｆＨｂｐの重要な機能は、ヒト補体ｆＨを結合して、それが補体活性化を下方制御することである。ｆＨの細菌表面への結合は、病原体が非免疫性ヒト血清または血液中で生存して、自然宿主防御を逃れる重要な機構である。
【０００６】
遺伝的および地理的多様性を代表する、第１の研究における７１のＮ．メニンギティディス株、および第２の研究における２００超の菌株の分析から、Ｎ．メニンギティディス菌株は、（アミノ酸配列変異性および免疫的交差反応性に基づいた変種１（ｖ．１）、変種２（ｖ．２）、および変種３（ｖ．３）と呼ばれる（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３；１９７：７８９〜９９））３つのｆＨｂｐ変種群に細分されている。他の研究者（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００４）は、Ａ（Ｍａｓｉｇｎａｎｉのｖ．２およびｖ．３を含む）およびＢ（ｖ．１）と名付けられた２つのサブファミリーへそのタンパク質を細分している。変種１菌株は、疾患を引き起こすＢ群分離株の約６０％を占める（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３、前記）。各変種群内において、アミノ酸配列の約９２％以上くらいの保存性がある。具体的には、各変種群内の保存性は、８９％から１００％の間の範囲であるが、変種群の間（例えば、ｖ．１とｖ．２の間）では、５９％程度まで低くなり得る。そのタンパク質は、Ｎ．メニンギティディスの全ての知られた菌株によって発現している。
【０００７】
異なるｆＨｂｐ変種を発現する広域の菌株に対して効果的である殺菌抗体応答を誘発することができる単一のｆＨｂｐポリペプチドの必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００８】
Ｎ．メニンギティディスの異なるｆＨｂｐ変種株に対して殺菌性である抗体を誘発することができるキメラｆＨｂｐおよび使用方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−１Ｇ】約６９個の固有のＨ因子結合タンパク質の供給源菌株および特性を列挙する表７を示す図である。
【図２Ａ−２Ｅ】ｆＨｂｐ可変セグメントＡ〜Ｅにおける固有配列、およびセグメントＩＤを含む各変種群由来の固有ペプチドの数を列挙する表８を示す図である。セグメントＩＤは、各可変セグメントについての識別名である。別個の配列変種は、セグメントを表すための文字、Ａ〜Ｅで始まり、続いて、それぞれ、ペプチドＩＤ  １（ｆＨｂｐ  ｖ．１）かまたはペプチドＩＤ  ２８（ｆＨｂｐ  ｖ．３）かのいずれか由来の対応するｆＨｂｐセグメントとのそのセグメントの相同性を示すためのαまたはβ、その後に各別個の配列についての番号が続く固有の識別名が割り当てられた。変種群１、２、および３における数は、副表において各セグメント（Ａ〜Ｅ）の一部のセグメントＩＤについて提供されている。
【図３】６９個の固有のアミノ酸配列に基づいたｆＨｂｐの系統樹を示す図である。
【図４】パネルＡは、可変セグメント（Ｖ）と共に縦に長い長方形として示された、リンカーの位置を示すｆＨｂｐの概略図であり、そのリンカーは、本明細書では不変セグメント（Ｉ）とも呼ばれている。パネルＢは、各不変セグメントについてのアミノ酸配列を列挙する表である。
【図５】可変セグメントＡ（残基８〜７３）（パネルＡ）およびＢ（残基７９〜９３）（パネルＢ）における固有ｆＨｂｐアミノ酸配列の系統樹を示す図である。
【図６】可変セグメントＣ（残基９８〜１５９）（パネルＡ）およびＤ（残基１６２〜１８０）（パネルＢ）における固有ｆＨｂｐアミノ酸配列の系統樹を示す図である。
【図７】可変セグメントＥ（残基１８６〜２５３）における固有ｆＨｂｐアミノ酸配列の系統樹を示す図である。
【図８】パネルＡは、より一般的な６個のモジュラー群型を含む、系統学的分析から推定された９個のｆＨｂｐモジュラー構造の概略図である。灰色セグメントは、ペプチドＩＤ  １に相同的なα祖先配列を表し、一方、白色セグメントは、ペプチド２８に相同的なβ祖先配列を表す。本明細書で分析された固有ｆＨｂｐアミノ酸配列の約９４％は、最初の６個のモジュラー群型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ）のうちの１つに属する。パネルＢ：分析されたｆＨｂｐのうちの４個が、示された３個のモジュラー構造のうちの１つとして分類されている。その構造は、矢印によって指定された、可変セグメント内の接合点を含む。パネルＣは、可変セグメント内でα祖先配列がβへ切り替わり、または逆である地点（Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３）のアミノ酸残基を列挙する表である。
【図９】ヒトＨ因子の断片との複合体におけるｆＨｂｐの座標に基づいたＨ因子結合タンパク質の構造的モデルを表す図である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：８９０〜３）。下に続くパネルのそれぞれにおける左のモデルは、膜側を向けるｆＨｂｐを示す；中央のモデルは露出側を向けている；および右のモデルはｆＨｂｐの膜側を下に描いている。パネルＡ：２つの構造的ドメインを描く略画表示。Ｂ：Ｈ因子結合性残基が黒色で描かれ、不変セグメントのアミノ酸残基が白色で描かれている、空間充填モデル。Ｃ：不変セグメントのアミノ酸残基がパネルＢにおいてのように白色で描かれ、抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体のエピトープに影響する残基は黒色で示されている、空間充填モデル。
【図１０Ａ−１０Ｉ】２７５個のペプチドＩＤを含む、分析に用いられた固有のＨ因子結合タンパク質変種の特定の特性を列挙する表９を示す図である。Ｎ末端可変配列についての配列識別名は以下の通りである：ＧＧＧＳ（配列番号７）、ＳＧＳＧＧ（配列番号８）、ＧＧＧＳＧＧ（配列番号９）、ＧＧＧＳＧＳ（配列番号１０）、ＧＳＧＧ（配列番号１１）、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１３）、およびＧＧＳＧＧ（配列番号１４）。
【図１１】赤外線検出でのイムノブロッティングにより測定されたｆＨｂｐ発現を示す図である。パネルＡおよびＣ：モジュラー群Ｉ（ＩＤ  １）もしくはＶＩ（ＩＤ  ７７）における組換えタンパク質、または対応するモジュラー群におけるｆＨｂｐを発現する菌株由来の加熱死菌細胞。モジュラー群Ｉタンパク質は、モジュラー群ＩおよびＩＶにおけるほぼ全てのｆＨｂｐを認識するマウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体ＪＡＲ  ５で検出された。モジュラー群ＶＩタンパク質は、モジュラー群ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＶＩにおけるほぼ全てのタンパク質を認識する抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体ＪＡＲ  ３１で検出された（実施例セクションにおける表６参照）。パネルＢおよびＤ：パネルＡおよびＣに示された組換えタンパク質の対応する結合からの標準曲線。
【図１２】系統的に収集されたＮ．メニンギティディスＢ群症例分離株の間でのｆＨｂｐモジュラー群の頻度を示す図である。データは、Ｍｕｒｐｈｙら［１６］によって報告された米国（Ｎ＝４３２）、英国（Ｎ＝５３６）、およびフランス（Ｎ＝２４４）において収集された分離株の配列、ならびにカリフォルニア（２００３〜２００４年）、メリーランド（１９９５年および２００５年）、および９つの州における小児科病院（２００１〜２００５年）からの１４３個の追加の米国分離株の新しく得られた配列からである。
【図１３】モジュラー群Ｉ〜ＶＩからのｆＨｂｐで免疫されたマウス由来の血清プールの血清殺菌活性を示す図である。黒色バーは、同種試験菌株に対して試験された各モジュラー群についての３〜４つの血清プールの中央値力価を表す。白色バーは、試験菌株に対するそれぞれの異種性血清プールの中央値力価を表す。＋は、菌株のそれぞれによるｆＨｂｐの相対的発現を指す；＋／−を有する菌株は、低ｆＨｂｐ発現株を表す（実施例セクションにおける表５の値を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明および本発明の特定の例示的実施形態を記載する前に、当然ながら、そのようなものは変化し得るため、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。本明細書に用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるから、限定的であることを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００１１】
値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに他の指示がない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値の間のそれぞれの介在する値、およびその述べられた範囲における任意の他の述べられた値または介在する値が本発明内に含まれることは理解されている。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、そのより小さい範囲に独立して含まれることができ、その述べられた範囲における任意の具体的に除外された限界に従って、同様に本発明内に含まれる。述べられた範囲がその限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１２】
他に規定がない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似または等価の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料はここで記載されている。本明細書で言及された全ての刊行物は、その引用されている刊行物に関連した方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み入れられている。
【００１３】
本明細書および添付された特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他に規定されていない限り、複数の指示対象を含むことは留意されなければならない。したがって、例えば、「１つの抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は、複数のそのような抗原を含み、「そのタンパク質（ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、１つまたは複数のタンパク質への言及を含むなどである。
【００１４】
本明細書で論じられている刊行物は、ただ単に、本出願の出願日前のそれらの開示として提供されている。本発明が、先発明という理由でそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきことは本明細書には存在しない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、その実際の刊行日を別途、確認する必要があり得る。
【００１５】
本発明の例示的実施態様の詳細な説明
本開示は、Ｎ．メニンギティディスの異なるｆＨＢＰ変種株に対して殺菌性である抗体を誘発することができるキメラｆＨｂｐを提供する。
【００１６】
定義
ＧＮＡ１８７０、ＧＮＡ  １８７０、ＯＲＦ２０８６、ＬＰ２０８６（リポタンパク質２０８６）、および「７４１」としても文献中で知られている「Ｈ因子結合タンパク質」（ｆＨｂｐ）は、Ｎ．メニンギティディスの表面上に提示されるリポタンパク質であるＮ．メニンギティディスのポリペプチドを指す。Ｎ．メニンギティディス株は、アミノ酸配列変異性および免疫的交差反応性に基づいて（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３；１９７：７８９〜９９）、３つのｆＨｂｐ変種群（いくつかの報告（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３、前記）において、変種１（ｖ．１）、変種２（ｖ．２）、および変種３（ｖ．３）、ならびに他の報告（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００４  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２０８８〜２１００参照）においてファミリーＡおよびＢと呼ばれる）へ細分されている。Ｎ．メニンギティディスに見出されるそれぞれ固有のｆＨｂｐはまた、図１Ａ〜１Ｇ（表７）および図１０Ａ〜１０Ｉ（表９）に示されているように、ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇによるペプチドＩＤを割り当てられている。明確にするために、本開示は、ｖ．１、ｖ．２、およびｖ．３という専門用語を用いる。（菌株８０４７、ペプチドＩＤ  ７７由来の）変種２（ｖ．２）ｆＨｂｐタンパク質および（菌株Ｍ１２３９、ペプチドＩＤ  ２８由来の）変種３（ｖ．３）ｆＨＢＰの長さは、ＭＣ５８（ペプチドＩＤ  １）のそれと、それぞれ、−１アミノ酸残基および＋７アミノ酸残基、異なるため、ｖ．２およびｖ．３ｆＨｂｐタンパク質の残基を指すために用いられる番号付けは、これらのタンパク質の実際のアミノ酸配列に基づく番号付けとは異なる。したがって、例えば、ｖ．２またはｖ．３  ｆＨＢＰ配列の位置１６６におけるロイシン残基（Ｌ）は、ｖ．２タンパク質の位置１６５およびｖ．３タンパク質の位置１７３の残基を指す。
【００１７】
用語「異種性の」または「キメラの」は、異なる源に由来する構造によって定義される２つの構成要素を指す。例えば、「異種性の」がキメラポリペプチドとの関連で用いられる場合、キメラポリペプチドには、異なる系統学的な分類の異なるポリペプチド由来であり得る作動可能に連結されたアミノ酸配列（例えば、α祖先アミノ酸配列由来の第１の構成要素およびβ祖先アミノ酸配列由来の第２の構成要素）が挙げられる。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの関連における「異種性の」には、異なる遺伝子由来であり得る作動可能に連結された核酸配列（例えば、ｆＨｂｐ  ｖ．１ポリペプチドをコードする核酸由来の第１の構成要素およびｆＨｂｐ  ｖ．２ポリペプチドをコードする核酸由来の第２の構成要素）が挙げられる。本明細書に記載されているようなキメラポリペプチドは、異なるポリペプチドに通常見出される単一のポリペプチドにおけるエピトープの提示を提供する。他の例示的な「異種性」核酸には、コード配列を含む核酸が、そのコード配列のとは異なる遺伝的起源の由来である制御エレメント（例えば、プロモーター）に、（例えば、そのプロモーター、そのコード配列、または両方に対して異なる遺伝的起源であり得る、関心対象の宿主細胞において発現を提供するために）作動可能に連結している、発現構築物が挙げられる。例えば、ｆＨｂｐポリペプチドまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチオドに作動可能に連結したＴ７プロモーターは、異種性核酸であると言われる。組換え細胞との関連における「異種性の」は、その核酸が存在する宿主細胞とは異なる遺伝的起源である核酸（またはポリペプチドなどの遺伝子産物）の存在を指す。例えば、１つの菌株のナイセリアのアミノ酸配列または核酸配列は、別の菌株のナイセリア宿主に対して異種性である。
【００１８】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列との関連における「由来の」（例えば、ｖ．１  ｆＨｂｐ「由来の」アミノ酸配列）とは、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸(例えば、天然のｆＨｂｐタンパク質またはコード核酸)の配列に基づいている配列を有することを示すように意図され、タンパク質または核酸が作製される供給源または方法に関して限定的であることを意図するものではない。細菌株との関連における「由来の」とは、菌株が、親株の継代インビボもしくはインビトロ培養によって得られ、および／または親株の改変によって得られた組換え細胞であることを示すように意図される。
【００１９】
「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基を、そのアミノ酸側鎖の化学的および物理的性質（例えば、電荷、サイズ、疎水性／親水性）を共有する別のものの代わりにすることを指す。「保存的置換」は、アミノ酸残基の以下の群内での置換を含むことが意図される：ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒ。本明細書に開示されたキメラｆＨＢＰとの関連における保存的アミノ酸置換は、関心対象のエピトープの提示を保存するように選択される。そのような置換のガイダンスは、関心対象のエピトープを提示するポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントから引き出すことができる。
【００２０】
用語「防御免疫」とは、哺乳動物に投与されるワクチンまたは免疫スケジュールが、ナイセリア−メニンギティディスによって引き起こされる疾患の発生を防ぎ、遅らせ、もしくは疾患の重症度を低下させ、または疾患の症状を減少させ、もしくは完全に除去する免疫応答を誘導することを意味する。ナイセリア−メニンギティディスに対する殺菌抗体の産生が、ヒトにおけるワクチンの保護効果を予測するものとして当分野で受け入れられていることは留意されるべきである（Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９６９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １２９：１３０７；Ｂｏｒｒｏｗら、２００１  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６９：１５６８）。
【００２１】
語句「ナイセリア−メニンギティディスの莢膜群Ｂの菌株によって引き起こされる疾患」は、ナイセリア−メニンギティディスの莢膜群Ｂのメンバーによるヒトの感染において存在する任意の臨床症状または臨床症状の組合せを含む。これらの症状には、ナイセリア−メニンギティディスの莢膜群Ｂの病原株による上気道のコロニー形成、細菌の粘膜および粘膜下血管床への侵入、敗血症、敗血症性ショック、炎症、出血性皮膚病変、線維素溶解および血液凝固の活性化、腎不全、肺不全、および心不全などの臓器不全、副腎出血および筋肉梗塞、毛細管漏出、浮腫、末梢性肢虚血、呼吸促迫症候群、心膜炎、ならびに髄膜炎が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２２】
語句「広域防御免疫」とは、ワクチンまたは免疫スケジュールが、ナイセリア−メニンギティディスの少なくとも１つより多い菌株に対して（および少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの菌株に対して、少なくとも８つ、またはそれ以上の菌株に対してであり得る）「防御免疫」を誘発することを意味し、菌株のそれぞれは、異なるｆＨｂｐ亜変種またはｆＨｂｐ変種を発現する。本開示は、具体的には、任意の莢膜群（例えば、Ａ、Ｂ、またはＣ）のメンバーによって引き起こされる疾患に対して保護を与えるワクチンまたはワクチン投与計画を企図し、含む。ナイセリア−メニンギティディスの莢膜群Ｂの菌株によって引き起こされる疾患に対する保護は、この莢膜群に関する疾患を引き起こす菌株の疫学的蔓延および広く効果的な群Ｂワクチンの欠如によって関心をもたれている。
【００２３】
抗原（例えば、ポリペプチド抗原）との関連における句「抗体に特異的に結合する」または「特異的免疫反応性である」とは、他の分子の異種性集団も含む可能性がある試料において抗原の存在に基づき、および／または抗原の存在の証拠となる結合反応を指す。したがって、指定された条件下で、特定化された１つまたは複数の抗体は、試料において特定の１つまたは複数の抗原に結合し、試料に存在する他の分子に有意な量では結合しない。抗原のエピトープ（例えば、ポリペプチドのエピトープ）との関連における「抗体に特異的に結合する」または「特異的免疫反応性である」とは、他のエピトープの異種性集団も、加えて抗原の異種性集団も含む可能性がある抗原（例えば、ポリペプチド）におけるエピトープの存在に基づき、および／またはエピトープの存在の証拠となる結合反応を指す。したがって、指定された条件下で、特定化された１つまたは複数の抗体は、抗原の特定のエピトープに結合し、その抗原内および／または試料中に存在する他のエピトープに有意な量では結合しない。
【００２４】
語句「免疫応答を誘発するのに十分な量で」とは、特定の抗原調製物の投与前と後に測定される免疫応答指標間に検出可能な差があることを意味する。免疫応答指標には、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、殺菌性アッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈降法、オークタロニー免疫拡散法；例えば、スポット、ウェスタンブロット、または抗原アレイの結合検出アッセイ；細胞毒性アッセイなどのアッセイによって検出されるような、抗体力価または特異性が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
「表面抗原」は、ナイセリア−メニンギティディスの表面構造に存在する抗原（例えば、外膜、莢膜、線毛など）である。
【００２６】
「単離された」とは、その化合物が天然で存在し得る環境とは異なる環境にある関心対象の実体を指す。「単離された」とは、関心対象の化合物について実質的に濃縮され、および／または関心対象の化合物が部分的もしくは実質的に精製されている試料内にある化合物を含むことを意図される。
【００２７】
「濃縮された」とは、関心対象の化合物が生体試料（例えば、その化合物が天然で存在する試料、またはそれが投与後に存在する試料）などの出発試料、または化合物が（例えば、細菌性ポリペプチド、抗体、キメラポリペプチドなどとして）作製された出発試料中のその化合物の濃度より高い濃度（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも６４倍高い、またはそれ以上）で存在するように、試料が非自然的に（例えば、実験者または臨床医によって）操作されることを意味する。
【００２８】
標的遺伝子の「ノックアウト」とは、例えば、標的遺伝子発現が検出できず、もしくはわずかであり、および／または遺伝子産物が機能的でなく、もしくは有意に機能的であるとはいえないように、標的遺伝子の機能の減少を結果として生じる、遺伝子の配列の変化を指す。例えば、ＬＰＳ合成に関与する遺伝子の「ノックアウト」は、遺伝子の発現が検出できず、もしくはわずかなレベルでのみ存在し、および／または遺伝子産物の生物活性（例えば、酵素活性）が改変前に対して有意に低下し、もしくは検出できないように、実質的に減少しているという意味を示す。「ノックアウト」は、標的遺伝子の変化が、例えば、所定の条件設定（例えば、温度、モル浸透圧濃度）への暴露、標的遺伝子変化を促進する物質への暴露などによって生じ得るコンディショナルノックアウトを含む。標的遺伝子の「ノックイン」は、標的遺伝子によって提供される機能の増加を結果として生じる、宿主細胞ゲノムにおける遺伝子変化を指す。
【００２９】
本明細書に用いられる場合、「非天然の」とは、天然で通常では見出されず、その代わりに、ヒトによって人工的に作製および／または改変されているタンパク質（例えば、ｆＨｂｐ）を指す。非天然の対象ｆＨｂｐは、化学的合成または組換え方法によって作製することができる。例えば、「非天然のキメラ」は、「人間が作り出したキメラ」を指し、天然では見出されない異種性構成要素を有するｆＨｂｐを含む。
【００３０】
ｆＨｂｐおよびｆＨｂｐコード核酸
本開示によって企図されるさらなる例示的なキメラｆＨｂｐを記載する前に、天然のｆＨｂｐを記載することは有益である。
【００３１】
便宜上、かつ明確にするために、Ｎ．メニンギティディス株ＭＣ５８のｖ．１  ｆＨＢＰ（ペプチドＩＤ  １）の天然のアミノ酸配列を、全ての天然のｖ．１、ｖ．２、およびｖ．３  ｆＨｂｐアミノ酸配列について、加えて本明細書に記載されたキメラｆＨｂｐについての参照配列として独断的に選択した。特に断りのない限り、アミノ酸残基の位置もまた、本明細書ではペプチドＩＤ  １を参照して付けられる。ペプチドＩＤ  １の配列は下記に示されている：
ＣＳＳＧＧＧＧＶＡＡＤＩＧＡＧＬＡＤＡＬＴＡＰＬＤＨＫＤＫＧＬＱＳＬＴＬＤＱＳＶＲＫＮＥＫＬＫＬＡＡＱＧＡＥＫＴＹＧＮＧＤＳＬＮＴＧＫＬＫＮＤＫＶＳＲＦＤＦＩＲＱＩＥＶＤＧＱＬＩＴＬＥＳＧＥＦＱＶＹＫＱＳＨＳＡＬＴＡＦＱＴＥＱＩＱＤＳＥＨＳＧＫＭＶＡＫＲＱＦＲＩＧＤＩＡＧＥＨＴＳＦＤＫＬＰＥＧＧＲＡＴＹＲＧＴＡＦＧＳＤＤＡＧＧＫＬＴＹＴＩＤＦＡＡＫＱＧＮＧＫＩＥＨＬＫＳＰＥＬＮＶＤＬＡＡＡＤＩＫＰＤＧＫＲＨＡＶＩＳＧＳＶＬＹＮＱＡＥＫＧＳＹＳＬＧＩＦＧＧＫＡＱＥＶＡＧＳＡＥＶＫＴＶＮＧＩＲＨＩＧＬＡＡＫＱ（配列番号１）
【００３２】
図１Ａ〜１Ｇ（表７）および図１０Ａ〜１０Ｉ（表９）に列挙された配列についての変種群および他の分類体系の多様性にもかかわらず、下記の実施例に記載されているような、６９個の固有のｆＨｂｐ配列の第１の分析および全ての２７５個のペプチドＩＤの第２の分析によって、ｆＨｂｐ内のアミノ酸配列の数個の異なるひと続きが、分析された全てのｆＨｂｐの間で保存されていることが明らかにされた。下記の実施例セクションに示された系統学的研究によって示されているように、これらの保存アミノ酸配列は、それぞれの可変セグメントが由来し得る２つの祖先配列を定義する系統樹においてクラスター形成するアミノ酸配列のモジュラーセグメントへｆＨｂｐを分離する。図５〜７に示されているように、ｆＨｂｐにおける可変セグメントのそれぞれは、２つの祖先アミノ酸配列（便宜上、αまたはβと名付ける）の１つであると分類することができる。
【００３３】
モジュラーセグメントに基づいてｆＨｂｐを特徴づけるために用いられる命名構造は、図４のパネルＡに示されている。図４のパネルＡにおける四角形は、保存配列（Ｉ）を表し、可変セグメントはＮ末端エレメント、ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、またはＶＥセグメントと名付けられている。保存配列のアミノ酸配列は図４のパネルＢに列挙されている。
【００３４】
したがって、天然のｆＨｂｐは、式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ−Ｉ７（式中、「Ｎｔｅ」はＮ末端エレメントを指し、「Ｉ」は「不変」セグメントを指し、「Ｖ」はα祖先型かまたはβ祖先型のいずれかの可変セグメントを指す）によって定義することができる。
【００３５】
より詳細に下記で開示されているように、本開示の非天然のキメラｆＨｂｐは、Ｉセグメントが隣接するＶセグメントの様々な組合せによって構築することができる。そのようなキメラｆＨｂｐの構築に用いることができる不変セグメントおよび可変セグメントは、Ｎ末端からＣ末端へ下記でより詳細に記載されている。このモジュラー分類はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇウェブサイト（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｐｅｒｌ／ａｇｄｂｎｅｔ／ａｇｄｂｎｅｔ．ｐｌ？ｆｉｌｅ＝ｎｍ＿ｆｈｂｐ．ｘｍｌ）に見出すことができる。ウェブサイトにおいて、下記のような祖先群αおよび祖先群βは、それぞれ、１および２と呼ばれている。例えば、ＶＡα２−ＶＢα１−ＶＣβ５−ＶＤα５−ＶＥα８はＡ１．２−Ｂ１．１−Ｃ２．５−Ｄ１．５−Ｅ１．８となる。
【００３６】
不変セグメント
ｆＨｂｐは、本明細書で分析された全てのｆＨｂｐアミノ酸配列の間で保存されているアミノ酸配列を含む。保存配列は、α祖先アミノ酸配列かまたはβ祖先アミノ酸配列のいずれかに由来する可変セグメントに隣接する。これらの保存配列は、本明細書では「不変配列」または「不変セグメント」と呼ばれ、天然のｆＨｂｐにおける組換えの部位としての役割を果たし得る。これらの不変セグメントが可変セグメントに隣接している場合、不変セグメントは「リンカー」配列と呼ばれる場合がある。これらの配列は、本明細書に開示されたｆＨｂｐ間でアミノ酸配列同一性を示すが、そのようなアミノ酸配列は、なお特定の保存的アミノ酸置換を許容することができる。したがって、本明細書に用いられる場合、用語「不変セグメント」は、本明細書に記載された特定のアミノ酸配列に限定されると解釈されるべきではなく、少なくとも、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。
【００３７】
図４に示されているように、天然のｆＨｂｐに見出される最もＮ末端側の不変セグメントは残基１から始まり、アミノ酸配列ＣＳＳＧ（配列番号２）である。最初の不変セグメントＣＳＳＧ（Ｉ１）のすぐＣ末端側は、約１個〜約６個のグリシンまたはセリン残基の可変Ｎ末端エレメントである。様々なＮ末端エレメントは図１Ａ〜１Ｇ（表７）および図１０Ａ〜１０Ｉ（表９）に列挙されている。２番目の不変セグメント（Ｉ２）はアミノ酸配列ＧＧであり、それは、Ｎ末端エレメントのＣ末端側に位置し、Ｎ末端エレメントの長さに依存して残基６、７、または１１から始まる（例えば、変種３のペプチドＩＤ  ２８において、Ｉ２は残基１１から始まる）。次の不変セグメント、Ｉ３は、ＳＲＦＤＦ（配列番号３）のアミノ酸配列によって定義され、Ｉ２および可変セグメントのＣ末端側の残基７４に位置する。Ｉ３のＣ末端側であるＩ４は、アミノ酸配列ＧＥＦＱ（配列番号４）によって定義され、残基９４に位置する。Ｉ５はアミノ酸配列ＤＤによって定義され、Ｉ４のＣ末端側の残基１５９にある。Ｉ５のＣ末端側に位置するＩ６は、ＩＥＨＬＫ（配列番号５）またはＩＥＨＬＥ（配列番号６）によって定義され、残基１８０から始まる。最後に、天然のｆＨｂｐにおける最もＣ末端側の不変セグメントは残基２５２から始まり、ＫＱのアミノ酸配列によって定義される。
【００３８】
各不変セグメントが始まる上記に列挙された残基位置は、Ｎ末端エレメントの長さおよび可変セグメントのアミノ酸配列に依存して１残基から８残基までシフトする場合がある。上記で述べられているように、本開示を通して非天然のキメラｆＨｂｐに関して用いられる残基番号付けは、便宜上、かつ明確にするために、変種１菌株であるＭＣ５８のｆＨｂｐ（ペプチドＩＤ  １）のアミノ酸配列番号付けに基づいている。
【００３９】
本明細書で分析された配列に基づいて、不変セグメントの長さは、約２アミノ酸残基から約５アミノ酸残基までの範囲である。
【００４０】
可変セグメント
上記で述べられているように、可変セグメント（Ｖ）は、本明細書で不変セグメント（Ｉ）とも呼ばれるリンカーに隣接している。可変Ｎ末端エレメントに加えて、ｆＨｂｐにおいて５つの可変セグメントがあり、それらは、Ｎ末端からＣ末端へＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥと名付けられており、それぞれは、上記で論じられた不変セグメントに隣接している。前に言及されているように、可変セグメントのそれぞれは、２つの祖先アミノ酸配列：αまたはβのうちの１つからであると分類することができる。例えば、ＶＡαは、可変セグメントＡがα祖先アミノ酸配列に由来し、ＶＡβはβ祖先アミノ酸配列に由来する可変セグメントＡを指す。より具体的な例において、ＶＡα１は、可変セグメントＡが、図２Ａ（表８、セグメントＡ）におけるセグメントＩＤ  Ａ．α．１として示されるアミノ酸配列であり、それは、可変セグメントのα祖先配列の１つの対立遺伝子である。下記のように、本開示のキメラｆＨｂｐは、各セグメントが、非依存的に、α祖先型かβ祖先型のいずれかから選択され得る可変セグメントの非天然の組合せ、および／または図２Ａ〜２Ｅ、表８に示された対応するセグメントの任意の対立遺伝子の非天然の組合せを含む。
【００４１】
α祖先可変セグメントおよびβ祖先可変セグメントは、それぞれ、特定のシグネチャアミノ酸残基によって定義される。加えて、α祖先可変セグメントは変種１群のｆＨｂｐ（例えば、ペプチドＩＤ  １）との配列類似性を示し、一方、β祖先可変セグメントは変種３群のｆＨｂｐ（例えば、ペプチドＩＤ  ２８）との配列類似性を示す。各可変セグメントについてのαまたはβ祖先のシグネチャアミノ酸残基は下記で論じられている。
【００４２】
それらの対応するアミノ酸シグネチャ配列によって定義されることに加えて、同じ祖先型の可変セグメントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を共有し、１００％であり得る。異なる祖先型の同じ可変セグメントのアミノ酸配列を比較した場合、アミノ酸配列同一性は少なくとも１０％〜４０％減少する。
【００４３】
セグメントによる配列群内および配列群間のアミノ酸同一性について、実施例セクションにおける表４を参照されたい。
【００４４】
各可変セグメントについての様々な対立遺伝子およびそれらの配列は、図２Ａ〜２Ｅ（表８）に示されており、下記で詳細に記載されている。
【００４５】
最もＮ末端側の可変セグメントは、本明細書では、Ｎ末端エレメント（Ｎｔｅ）と呼ばれる（図４）。分析されたｆＨｂｐに見出される様々なＮ末端エレメントは図１Ａ〜１Ｇ（表７）、および図１０Ａ〜１０Ｉ（表９）にも列挙されている。それらは、長さが１残基から６残基までのグリシンまたはグリシンとセリンの組合せの範囲である。
【００４６】
可変セグメントＶＡは、Ｉ２のＣ末端側の残基７から始まり、Ｉ３のＮ末端側の残基７３で終わる。α祖先のＶＡ（ＶＡα）は、図２Ａ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ａ．α．１：ＶＡＡＤＩＧＡＧＬＡ  ＤＡＬＴＡＰＬＤＨＫ  ＤＫＳＬＱＳＬＴＬＤ  ＱＳＶＲＫＮＥＫＬＫ  ＬＡＡＱＧＡＥＫＴＹ  ＧＮＧＤＳＬＮ  ＴＧＫＬＫＮＤＫＶ（配列番号１５）と約８９〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＡαは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＱＳＶによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＡα間で代替アミノ酸残基を有し得る特定の残基は、下線が引かれている。
【００４７】
β祖先のＶＡ（ＶＡβ）は、図２Ａ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ａ．β．１：ＶＡＡＤＩＧＴＧＬＡ  ＤＡＬＴＡＰＬＤＨＫ  ＤＫＧＬＫＳＬＴＬＥ  ＤＳＩＰＱＮＧＴＬＴ  ＬＳＡＱＧＡＥＫＴＦ ＫＡＧＤＫＤＮＳＬＮ  ＴＧＫＬＫＮＤＫＩ（配列番号６７）と約８９〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＡβは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＤＳＩおよび／またはＫＤＮによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＡβ間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００４８】
可変セグメントＶＢは、残基７９から始まり、Ｉ４が位置している所のＮ末端側の残基９３で終わる。α祖先のＶＢ（ＶＢα）は、図２Ｂ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｂ．α．１：ＩＲＱＩＥＶＤＧＯＬ  ＩＴＬＥＳ（配列番号８５）と約８０〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＢαは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＩＲＱによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＢα間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００４９】
β祖先のＶＢ（ＶＢβ）は、図２Ｂ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｂ．β．１：ＶＱＫＩＥＶＤＧＱＴ  ＩＴＬＡＳ（配列番号９５）と約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＢβは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＶＱＫによってさらに特徴づけられる。
【００５０】
可変セグメントＶＣは、Ｉ４のＣ末端側の残基９８から始まり、Ｉ５のＮ末端側の残基１５８で終わる。α祖先のＶＣ（ＶＣα）は、図２Ｃ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｃ．α．１：ＶＹＫＱＳＨＳＡＬＴ  ＡＬＱＴＥＱＶＱＤＳ  ＥＨＳＧＫＭＶＡＫＲ  ＱＦＲＩＧＤＩＡＧＥ  ＨＴＳＦＤＫＬＰＥＧ ＧＲＡＴＹＲＧＴＡＦ  ＧＳ（配列番号９６）と約８５〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＣαは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＱＤＳによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＣα間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００５１】
β祖先のＶＣ（ＶＣβ）は、図２Ｃ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｃ．β．１：ＩＹＫＱＤＨＳＡＶＶ  ＡＬＱＩＥＫＩＮＮＰ  ＤＫＩＤＳＬＩＮＱＲ  ＳＦＬＶＳＧＬＧＧＥ  ＨＴＡＦＮＱＬＰＧ ＧＫＡＥＹＨＧＫＡＦ  ＳＳ（配列番号１５２）と約９３〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＣβは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＮＮＰによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＣβ間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００５２】
可変セグメントＶＤは、Ｉ５のＣ末端側の残基１６１から始まり、Ｉ６のＮ末端側の残基１７９で終わる。α祖先のＶＤ（ＶＤα）は、図２Ｄ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｄ．α．１：ＡＧＧＫＬＴＹＴＩＤ  ＦＡＡＫＱＧＨＧＫ（配列番号１７４）と約８９〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＤαは、シグネチャアミノ酸残基ＡＧまたはＡＳによってさらに特徴づけられ、それらのうちＡＧは、配列において太字で示されている。異なるｆＨｂｐのＶＤα間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００５３】
β祖先のＶＤ（ＶＤβ）は、図２Ｄ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｄ．β．１：ＰＮＧＲＬＨＹＳＩＤ  ＦＴＫＫＱＧＹＧＲ（配列番号１９２）と約８４〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＤβは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＰＮによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＤβ間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００５４】
可変セグメントＶＥは、Ｉ６のＣ末端側の残基１８５あたりから始まり、Ｉ７のＮ末端側の残基２５３で終わる。α祖先のＶＥ（ＶＥα）は、図２Ｅ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｅ．α．１：ＳＰＥＬＮＶＤＬＡＡ ＡＹＩＫＰＤＥＫＨＨ  ＡＶＩＳＧＳＶＬＹＮ  ＱＡＥＫＧＳＹＳＬＧ  ＩＦＧＧＫＡＱＥＶＡ  ＧＳＡＥＶＫＴＶＮＧ  ＩＲＨＩＧＬＡＡ（配列番号１９５）と約８６〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＥαは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＳＬＧＩによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＥα間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００５５】
β祖先のＶＥ（ＶＥβ）は、図２Ｅ（表８）に示されているようなセグメントＩＤ  Ｅ．β．１：ＴＰＥＱＮＶＥＬＡＳ  ＡＥＬＫＡＤＥＫＳＨ  ＡＶＩＬＧＤＴＲＹＧ ＧＥＥＫＧＴＹＨＬＡ  ＬＦＧＤＲＡＱＥＩＡ  ＧＳＡＴＶＫＩＲＥＫ  ＶＨＥＩＧＩＡＧ（配列番号２６２）と約９４〜１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＶＥβは、配列において太字で示されたシグネチャアミノ酸残基ＨＬＡＬによってさらに特徴づけられる。異なるｆＨｂｐのＶＥβ間で代替アミノ酸残基を有し、またはアミノ酸残基が欠失している特定の残基は、下線が引かれている。
【００５６】
上記で述べられているように、便宜上、かつ明確にするために、本開示を通して非天然のキメラｆＨｂｐに関して用いられる残基番号付けは、ＭＣ５８のｆＨｂｐ（ペプチドＩＤ  １）のアミノ酸配列番号付けに基づいている。加えて、各可変セグメントが始まり、および終わる上記に列挙された残基位置は、Ｎ末端エレメントの長さおよび可変セグメントのアミノ酸配列に依存して１残基から８残基までシフトする場合がある。
【００５７】
ｆＨｂｐモジュラー群
天然のｆＨｂｐアミノ酸配列は、図１Ａ〜１Ｇ（表７）および図１０Ａ〜１０Ｉ（表９）に示されているように、不変セグメントに隣接しているα祖先セグメントまたはβ祖先セグメントの組合せに基づいたモジュラー構造に従って記載することができる。下記の実施例に記載されているように、天然ｆＨｂｐは、モジュラーセグメントの特定の組合せを示し、図８に示されているように、それに応じて、９つの型のモジュラー群に分類することができ、灰色の可変セグメントはα祖先配列に対応し、白色のセグメントはβ祖先配列に対応している。
【００５８】
Ｉ型モジュラー群は、全ての可変セグメントがα祖先アミノ酸配列に由来している可変セグメントによって特徴づけられる。Ｉ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥα−Ｉ７によって表すことができる。Ｉ型モジュラー群であるｆＨｂｐの例は、菌株ＭＣ５８由来のペプチドＩＤ  １である。上記で述べられているように、ペプチドＩＤは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇにおけるＨ因子結合タンパク質データベースからである。
【００５９】
ＩＩ型モジュラー群は、全部の可変セグメントがβ祖先に由来している可変セグメントによって特徴づけられる。ＩＩ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢβ−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。ＩＩ型モジュラー群であるｆＨｂｐの例は、菌株Ｍ１２３９由来のペプチドＩＤ  ２８である。図１Ａ〜１Ｇ（表７）におけるｆＨｂｐのほぼ６０％は、Ｉ型かまたはＩＩ型のいずれかのモジュラー群に属する。
【００６０】
しかしながら、いくつかのｆＨｂｐは、α祖先およびβ祖先の両方由来の可変セグメントを有する。両方の祖先由来の可変セグメントによって定義される１つのモジュラー群はＩＩＩ型であり、それにおいて、可変セグメントＶＡおよびＶＢは、α祖先由来であり、残りの可変セグメントは、β祖先由来である。ＩＩＩ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。ＩＩＩ型モジュラー群に属するｆＨｂｐの１つの例は、菌株ＲＭ１０９０由来のペプチドＩＤ  ２２である。
【００６１】
両方の祖先に由来する可変セグメントによって定義される別のモジュラー群はＩＶ型である。ＩＶ型は、β祖先由来の可変セグメントＶＡ、およびα祖先由来の残りの可変セグメントを有するモジュラー群である。ＩＶ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥα−Ｉ７によって表すことができる。ＩＶ型モジュラー群に属するｆＨｂｐの１つの例は、菌株ＮＭ４５２由来のペプチドＩＤ  １５である。
【００６２】
さらなるモジュラー群はＶ型であり、それにおいて、可変セグメントＶＤはα祖先に由来し、残りの可変セグメントはβ祖先に由来する。Ｖ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢβ−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。Ｖ型モジュラー群に属するｆＨｂｐの１つの例は、菌株Ｓ３０３２由来のペプチドＩＤ  ７９である。
【００６３】
図８に示された別のモジュラー群はＶＩ型であり、それにおいて、可変セグメントＶＣおよびＶＥはβ祖先に由来し、残りの可変セグメントはα祖先に由来する。ＶＩ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。ＶＩ型モジュラー群に属するｆＨｂｐの１つの例は、菌株９６１−５９４５由来のペプチドＩＤ  １６である。
【００６４】
図８に示された別のモジュラー群はＶＩＩ型であり、それにおいて、可変セグメントＶＥはβ祖先に由来し、残りの可変セグメントはα祖先に由来する。ＶＩ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。ＶＩ型モジュラー群を有することが見出された１つのｆＨｂｐは、菌株０１６７／０３由来のペプチドＩＤ  ２０７である。
【００６５】
図８に示された別のモジュラー群はＶＩＩＩ型であり、それにおいて、可変セグメントＶＢはα祖先に由来し、残りの可変セグメントはβ祖先に由来する。ＶＩ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。ＶＩＩＩ型モジュラー群を有することが見出された１つのｆＨｂｐは、菌株ＭＡ−５７５６由来のペプチドＩＤ  ６７である。
【００６６】
図８に示された最後のモジュラー群はＩＸ型であり、それにおいて、可変セグメントＶＢおよびＶＤはα祖先に由来し、残りの可変セグメントはβ祖先に由来する。ＶＩ型モジュラー群に属するとして分類されたｆＨｂｐは、以下の式：Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥβ−Ｉ７によって表すことができる。ＩＸ型モジュラー群に属するｆＨｂｐの１つの例は、菌株１９４９８由来のペプチドＩＤ  １７５である。
【００６７】
本明細書で分析された固有のｆＨｂｐアミノ酸配列の９８％より多くは、上記および図８に模式的に示された最初の６つの型のモジュラー群（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ）の１つに属する。モジュラー群のそれぞれに属する固有のｆＨｂｐの数もまた、図８の概略図の右側に列挙されている。
【００６８】
４つの天然のｆＨｂｐは、この命名法から少なくともわずかに異なり、図８のパネルＡに示された最初の６つの型のモジュラー群へ正確には当てはまらない。これらの４つのｆＨｂｐは、上記のような基準可変セグメント内にある残基位置で、１つの祖先アミノ酸配列から別のものへ「切り替わっている」。結果として、それらはそれぞれ、異種性可変セグメントを含み、それらの接合点は、上記で定義されたＩ３、Ｉ４、Ｉ５、またはＩ６にあることが見出された残りのｆＨｂｐの接合点から逸脱している。矢印がそれぞれについての接合点を指し示している、これらの４つのｆＨｂｐのモジュラー構造について、図８のパネルＢを参照されたい。しかしながら、これらの４つの天然のｆＨｂｐの接合点は、それでもなお、可変セグメント内に見出される（１つまたは複数の）保存残基に存在する。図８のパネルＣにおける表を参照されたい。
【００６９】
１つのそのようなｆＨｂｐは、ＶＡβがＶＡαへ切り替わっている接合点がＶＡの中央に存在する、菌株ＣＤＣ−１５７３由来の天然ｆＨｂｐ（ペプチドＩＤ  ５５）である。ペプチドＩＤ  ５５の異種性ＶＡは、ＶＡ（β→α）と表すことができ、可変セグメントＡが、Ｎ末端から始まるβ祖先アミノ酸配列を含み、Ｃ末端に向けてα祖先アミノ酸配列に切り替わっていることを示す。ペプチドＩＤ  ５５の接合点（Ｊ１）は、残基位置５０から始まる、全てのＶＡ配列間で保存されたＡＱＧＡＥ（配列番号２７８）の配列に存在する。Ｉ３、Ｉ４、Ｉ５、またはＩ６の残基位置にはない接合点を含む２つの他のｆＨｂｐは、菌株Ｍ０８  ２４０１１７および菌株６２７５、それぞれに由来するペプチドＩＤ  ２４およびペプチドＩＤ  ２５である。ＶＢαがＶＢβに切り替わっている接合点（Ｊ２）は、ＶＢの中央（残基８２）に存在し、そこには、全てのＶＢ間で保存されたＩＥＶのアミノ酸配列がある。ペプチドＩＤ  ２４および２５のＶＢは、ＶＢ（α→β）と表すことができる。最後に、菌株ＭＤ１４７５由来のペプチドＩＤ  ８２は、全てのＶＥ間で保存されている残基Ａ１９６（Ｊ３）でＶＥαからＶＥβへ切り替わっている。ペプチドＩＤ  ８２の可変セグメントＥはＶＥ（α→β）と表すことができる。
【００７０】
下記で詳細に論じられるように、キメラｆＨｂｐは、このモジュラー構造の不変セグメントおよび可変セグメントを用いて構築し、天然には見出されないアミノ酸配列を生じることができる。
【００７１】
ｆＨｂｐセグメントをコードする核酸
本開示のキメラｆＨｂｐのセグメントが由来し得るｆＨｂｐポリペプチドおよびコードする核酸は、任意の適切なＮ．メニンギティディス株からであり得る。当技術分野において知られているように、Ｎ．メニンギティディス株は、異なる表面抗原と相互作用するポリクローナル抗体（Ｆｒａｓｃｈ，Ｃ．Ｅ．およびＣｈａｐｍａｎ、１９７３、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  １２７：１４９〜１５４）またはモノクローナル抗体との反応に基づいて、血清群（莢膜群）、血清型（ＰｏｒＢ表現型）、および亜型（ＰｏｒＡ表現型）へ分けられる。莢膜分類は、伝統的には、莢膜多糖における免疫学的に検出可能なバリエーションに基づいているが、構造的に異なる莢膜多糖の生合成に関与する特定の酵素をコードする遺伝子のＰＣＲに取って代わられつつある。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９−Ｅ、およびＷ−１３５を含む）約１２個の莢膜群が知られている。莢膜群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５の菌株が、ほとんど全ての髄膜炎菌性疾患の原因となっている。血清型分類は、伝統的に、ポリンＢ（ＰｏｒＢ）と呼ばれる外膜タンパク質における、モノクローナル抗体によって定義される抗原性の差異に基づいている。約２１個の血清型を定義する抗体が現在知られている（Ｓａｃｃｈｉら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：３４８）。血清亜型分類は、ポリンＡ（ＰｏｒＡ）と呼ばれる外膜タンパク質上における、抗体によって定義される抗原性の差異に基づいている。血清型分類および血清亜型分類の両方は、モノクローナル抗体反応性と関連している、ＰｏｒＢおよびＰｏｒＡ、それぞれの可変領域をコードする遺伝子の同定のためのＰＣＲおよび／またはＤＮＡシーケンシングに取って代わられつつある（例えば、Ｓａｃｃｈｉ、Ｌｅｍｏｓら、前記；Ｕｒｗｉｎら、１９９８、Ｅｐｉｄｅｍ．ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔ．１２０：２５７）。
【００７２】
任意の莢膜群のＮ．メニンギティディスを用いてもよいが、莢膜群ＢのＮ．メニンギティディス株は、ｆＨｂｐをコードする核酸およびそのドメインが由来する源として特に興味深い。
【００７３】
本明細書は、キメラｆＨｂｐが由来し得るｆＨｂｐの例のアミノ酸配列を提供するが、これは限定することを意図するものではない。例えば、キメラｆＨｂｐは、天然ｆＨｂｐと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００７４】
本明細書に企図されたキメラｆＨｂｐの構築に用いるｆＨｂｐポリペプチドをコードする核酸は当技術分野において知られている。ｆＨｂｐポリペプチドの例は、例えば、ＷＯ  ２００４／０４８４０４；Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：７８９〜７９９；Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００４  ２０８８〜２１００；Ｗｅｌｓｃｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４  １７２：５６０６〜５６１５；およびＷＯ  ９９／５７２８０に記載されている。ｆＨｂｐ変種および亜変種の核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション番号：ＮＣ＿００３１１２、ＧｅｎｅＩＤ：９０４３１８（ＮＣＢＩ参照  ＮＰ＿２７４８６６）、Ｎ．メニンギティディス株ＭＣ５８由来のペプチドＩＤ  １；ＡＹ５４８３７１（ＡＡＴ０１２９０．１）（Ｎ．メニンギティディス株ＣＵ３８５由来）；ＡＹ５４８３７０（ＡＡＴ０１２８９．１）  （Ｎ．メニンギティディス株Ｈ４４／７６由来）；ＡＹ５４８３７７（ＡＡＳ５６９２０．１）Ｎ．メニンギティディス株Ｍ４１０５由来のペプチドＩＤ  ４；ＡＹ５４８３７６（ＡＡＳ５６９１９．１）（Ｎ．メニンギティディス株Ｍ１３９０由来）；ＡＹ５４８３７５（ＡＡＳ５６９１８．１）（Ｎ．メニンギティディス株ＮＺ９８／２５４由来）；ＡＹ５４８３７４（ＡＡＳ５６９１７．１）（Ｎ．メニンギティディス株Ｍ６１９０由来）；ＡＹ５４８３７３（ＡＡＳ５６９１６．１）（Ｎ．メニンギティディス株４２４３由来）；およびＡＹ５４８３７２（ＡＡＳ５６９１５．１）（Ｎ．メニンギティディス株ＢＺ８３由来）としてＧｅｎＢａｎｋに提供されている。
【００７５】
本明細書に開示されたキメラｆＨｂｐに用いるために企図される関連アミノ酸配列を同定することを目的として、未熟ｆＨｂｐタンパク質は、約１９残基のリーダー配列を含むことは留意されるべきである。さらに、アミノ酸配列が提供される場合、当業者は、そのようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る核酸の配列を容易に構想し、ポリペプチドの発現を提供することができる。
【００７６】
本明細書に提供された特定のアミノ酸配列および核酸配列に加えて、本開示はまた、そのアミノ酸および核酸と配列において少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である配列を有するポリペプチドおよび核酸も企図する。２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列との関連における用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、指定された領域、例えばＶＥ、または少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくはそれ以上のアミノ酸長もしくはヌクレオチド長であり、かつ参照アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列の完全長（例えば、完全長ｆＨｂｐ）までであり得る領域に対して比較して、最大限一致するように整列させた場合、同じである、または同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する（例えば、特定化された領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一の）、２つ以上の配列または部分配列を指す。本開示は、具体的には、天然の多型と、合成的に作製されたアミノ酸配列およびそれらのコードする核酸との両方を企図する。
【００７７】
配列比較について、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列（例えば、天然のｆＨｂｐポリペプチド配列）としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列は、コンピュータプログラムへ入力され、必要ならば、配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。その後、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列（複数可）についてパーセント配列同一性を計算する。
【００７８】
パーセント配列同一性を決定するのに適しているアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９〜３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公表されている。さらに、例示的なアルゴリズムとして、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで入手できるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．ら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３〜４６８０）が挙げられる。
【００７９】
一実施形態において、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンである；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。
【００８０】
２つの核酸間の配列同一性はまた、ストリンジェントな条件下で２つの分子のお互いとのハイブリダイゼーションに関して記載することもできる。ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野における標準方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム／１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもう１つの例は、溶液：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断化サケ精子ＤＮＡにおける４２℃での一晩のインキュベーション、続いて、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でフィルターを洗浄することである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも上記の代表的な条件と同じくらいストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件であり、その場合、条件は、上記の特定のストリンジェントな条件の少なくとも約８０％ストリンジェント、典型的には少なくとも９０％ストリンジェントであるならば、少なくともストリンジェントであるとみなされる。
【００８１】
本開示のキメラｆＨｂｐは、上記のモジュラー構造との関連において下記でより詳細に記載されている。
【００８２】
キメラＨ因子結合タンパク質
本開示のキメラｆＨｂｐは、図８のパネルＡおよびＢに示されているようなモジュラー構造、ならびに図８のパネルＡおよびＢに示されていないモジュラー構造によって記載することができるｆＨｂｐを含む、非天然キメラｆＨｂｐを指す。用語「キメラＨ因子結合タンパク質」または「キメラｆＨｂｐ」は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥによって表される５つの可変セグメントの群であって、その群におけるα／β祖先セグメントの組合せおよび／またはその対立遺伝子の組合せが天然で見出されない群を含むポリペプチドを指す。本開示のキメラｆＨｂｐの１つの例は、キメラｆＨｂｐにおける少なくとも１つの他の可変セグメントとは異なる祖先由来の少なくとも１つまたは複数の可変セグメントを含むことができる。言い換えれば、キメラｆＨｂｐは、α祖先アミノ酸配列の少なくとも１つの可変セグメントおよびβ祖先の少なくとも１つの可変セグメントを、その組合せが天然で見出されないように含む。別の例において、ｆＨｂｐはまた、各セグメントが、対立遺伝子の組合せが天然で見出されないように対立遺伝子からなる、図８のパネルＡに示されたモジュラー構造（例えば、全ての可変セグメントがそれぞれ、αまたはβであるモジュラーＩまたはＩＩ）であり得る。
【００８３】
可変セグメントは、可変セグメントについてのリンカーとしての役割を果たすことができる、不変セグメント（Ｉ２、Ｉ３、Ｉ４、Ｉ５、Ｉ６、Ｉ７）に隣接してもよい。したがって、本開示のキメラｆＨｂｐは、以下の式によって記載することができる：
ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ
式中、各可変セグメント（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥ）はα祖先アミノ酸配列かβ祖先アミノ酸配列かのいずれかに由来し得る。
【００８４】
キメラｆＨｂｐは、任意で、リーダー配列を、例えば、細菌宿主細胞の細胞表面上にキメラｆＨｂｐの発現を与えるために、含むことができる。キメラｆＨｂｐはまた、Ｎ末端エレメント（Ｎｔｅ）および／またはＣ末端エレメント（Ｃｔｅ）として約１個、５個、１０個、またはそれ以上の残基を含んでもよい。例えば、Ｎｔｅは、最もＮ末端の不変セグメント（Ｉ１）の後に１個、２個、または６個のグリシン残基、または約６個の残基の、グリシンとセリンの混合物を含んでもよい。
【００８５】
加えて、本開示のキメラｆＨｂｐは、任意で、Ｎ末端エレメント、Ｎ末端エレメントに隣接する一方もしくは両方の不変セグメント、および／または最もＣ末端の不変セグメント（Ｉ７）を含むことができる。これらの任意の特徴の１つまたは複数を含むキメラｆＨｂｐは以下の式によって記載することができる：
Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ；
Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ；
Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ；
ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ−Ｉ７；
Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ−Ｉ７；
Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ−Ｉ７；および
Ｉ１−Ｎｔｅ−Ｉ２−ＶＡ−Ｉ３−ＶＢ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ−Ｉ７。
式中、各可変セグメント（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥ）はα祖先アミノ酸配列かβ祖先アミノ酸配列かのいずれかに由来し得る。
【００８６】
それぞれがα祖先アミノ酸配列かβ祖先アミノ酸配列かのいずれかに由来する、可変セグメントの様々な組合せを有することに加えて、本開示のキメラｆＨｂｐはまた、α祖先アミノ酸配列およびβ祖先アミノ酸配列に対して異種性である１つまたは複数の可変セグメントを含んでもよい。異種性可変セグメントは、本明細書で「接合点」と呼ばれる、アミノ酸配列が他の祖先配列に「切り替わっている」点と共に、連続したα祖先アミノ酸配列および連続したβ祖先アミノ酸配列の両方を含む可変セグメントを指す。例えば、ペプチドＩＤ  ５５のＶＡ、ペプチドＩＤ  ２４およびＩＤ  ２５のＶＢ、ならびにペプチドＩＤ  ８２のＶＥを参照されたい。特に、ペプチドＩＤ  ５５、２４、２５および８２についての上記の可変セグメント内の接合点（Ｊ１、Ｊ２、またはＪ３）の１つまたは複数は、異種性可変セグメントを有するキメラｆＨｂｐを構築するために用いてもよい。接合点としての役割を果たす各可変セグメント内の保存残基について、図８のパネルＣの表を参照されたい。
【００８７】
本開示の非天然キメラｆＨｂｐの可変セグメントは、天然ｆＨｂｐにおける対応するセグメントと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有してもよく、アミノ酸配列において１００％同一であり得る。
【００８８】
キメラｆＨｂｐの例として、以下の可変セグメントの１つまたは複数を含むものが挙げられる。各セグメントは、非依存的に、図２Ａ〜２Ｅの表８に示された対応するセグメントにおける任意の対立遺伝子から選択することができる。可変セグメントは、例として特定の対立遺伝子を用いて、下記でより詳細に記載されている。
【００８９】
ＶＡは、セグメントＡについて図２Ａ（表８）に示されたアミノ酸配列の１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一、例えば、図２Ａ（表８）に示されたセグメントＩＤ  Ａ．α．１またはＡ．β．１（配列番号１５または６７）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である連続したアミノ酸配列を含む。
【００９０】
ＶＢは、セグメントＢについて図２Ｂ（表８）に示されたアミノ酸配列の１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一、例えば、図２Ｂ（表８）に示されたセグメントＩＤ  Ｂ．α．１またはＢ．β．１（配列番号８５または９５）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である連続したアミノ酸配列を含む。
【００９１】
ＶＣは、セグメントＣについて図２Ｃ（表８）に示されたアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一、例えば、図２Ａ（表８）に示されたセグメントＩＤ  Ｃ．α．１またはＣ．β．１（配列番号９６または１５２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である連続したアミノ酸配列を含む。
【００９２】
ＶＤは、セグメントＤについて図２Ｄ（表８）に示されたアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一、例えば、図２Ａ（表８）に示されたセグメントＩＤ  Ｄ．α．１またはＤ．β．１（配列番号１７４または１９２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である連続したアミノ酸配列を含む。
【００９３】
ＶＥは、セグメントＥについて図２Ｅ（表８）に示されたアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一、例えば、図２Ａ（表８）に示されたセグメントＩＤ  Ｅ．α．１またはＥ．β．１（配列番号１９５または２６２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である連続したアミノ酸配列を含む。
【００９４】
本開示のキメラｆＨｂｐにおける可変セグメントはまた、図２Ａ〜２Ｅ（表８）に列挙された対応するセグメントと類似した長さであってもよい。例えば、可変セグメントは、図２Ａ〜２Ｅ（表８）に示された対応するアミノ酸配列の１つより約５０個、３０個、２０個、１０個、５個、または１個のアミノ酸残基だけ少なく、または多くあってもよい。
【００９５】
本開示のキメラｆＨｂｐは、天然ｆＨｂｐに見出されない完全長アミノ酸配列を有する。α祖先配列のみまたはβ祖先配列のみまたはその組合せを含む天然ｆＨｂｐのほとんどは、以下のモジュラー群：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸの１つに分類される（図８参照）。本開示の非天然ｆＨｂｐはまた、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸ以外のモジュラー群であり得る。本開示の非天然ｆＨｂｐは、本明細書に記載されたモジュラー構造に基づいて構築される非天然のアミノ酸配列を含む新しいモジュラー群によって記載することができる。本開示のキメラｆＨｂｐのいくつかの例は下記に示されている。
【００９６】
キメラｆＨｂｐの例
本開示のキメラｆＨｂｐは、例えば、不変セグメントおよび可変セグメントならびにそれらの祖先型、モノクローナル抗体によって特異的に結合されるエピトープ（複数可）の存在もしくは非存在、またはキメラｆＨｂｐに存在する可能性があるそのような特徴の任意の組合せの１つまたは複数に関して記載され得るものを含む。
【００９７】
多数の組合せは、異なる型のモジュラー群についてαセグメントまたはβセグメントを、様々なセグメントに出たり入ったり切り替えることによって作成することができる。αセグメントまたはβセグメントの任意の対立遺伝子もまた、非依存的に、図２Ａ〜２Ｅ（表８）に示されたものから選択することができる。モジュラー群はまた、特定の抗体エピトープを維持し、または含むように設計することができる。特定の抗体は、Ｎ．メニンギティディスの特定の変種に対して殺菌性であるが、異なる変種に対しては殺菌性ではないことが見出されている。モジュラー群のキメラｆＨｂｐが複数のエピトープを提示する可変セグメントを含み、それぞれのエピトープが、異なる変種に対して殺菌性の抗体に特異的である場合には、キメラｆＨｂｐは、広域のＮ．メニンギティディスに対して効果的な抗体または免疫応答を誘発するのに有用であり得る。例えば、ＪＡＲ４、ＪＡＲ３、およびＪＡＲ３２抗体についてのエピトープが知られており、ｆＨｂｐに組み入れることが望ましい場合、キメラｆＨｂｐは、ＶＡα、ＶＣα、およびＶＤβを含み、それぞれにＪＡＲ４、ＪＡＲ３、およびＪＡＲ３２のエピトープが存在するように作製してもよい。
【００９８】
例えば、キメラｆＨｂｐは、β祖先配列に由来するＶＤを有し、一方、残りの可変セグメントはα祖先配列からの由来物のままであり得る。そのようなキメラｆＨｂｐは、ＶＡα、ＶＢα、ＶＣα、ＶＤβ、およびＶＥαとして表される可変セグメントを含み、その１番目および２番目の接合点は、それぞれ、Ｉ５およびＩ６にある。異なる例において、非天然キメラｆＨｂｐを含む別のモジュラー群に属するｆＨｂｐは、ＶＡα、ＶＢα、ＶＣα、ＶＤβ、およびＶＥβを含み得、その接合点はＩ５に存在する。モジュラー群のさらなる例は、不変セグメントとしてＶＡα、ＶＢα、ＶＣα、ＶＤα、およびＶＥβを含む非天然ｆＨｂｐを含む。
【００９９】
したがって、上記のものを含む非天然キメラｆＨｂｐの例は、以下の式によって表されるモジュラー群であり得るが、それらに限定されない：
ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥα；
ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥβ；
ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥβ；
ＶＡα−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥα；
ＶＡα−Ｉ３−ＶＢβ−Ｉ４−ＶＣ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ；
ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥβ；
ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣα−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥα；
ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢα−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤ−Ｉ６−ＶＥ；
ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢβ−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤα−Ｉ６−ＶＥα；または
ＶＡβ−Ｉ３−ＶＢβ−Ｉ４−ＶＣβ−Ｉ５−ＶＤβ−Ｉ６−ＶＥα；
【０１００】
可変セグメント（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、またはＶＥ）の後にαまたはβが続いていない上記に示された任意の群（例えば、上から５番目のモジュラー群におけるＶＣ、ＶＤ、およびＶＥ）は、α祖先アミノ酸配列またはβ祖先アミノ酸配列のいずれの由来でもあり得る可変セグメントを表す。式はまた、上記の式において省略された、可変Ｎ末端エレメント、その隣接する不変配列（Ｉ１およびＩ２）、または最もＣ末端側の不変セグメント（Ｉ７）を含み得る。本開示のｆＨｂｐについて上記で述べられているように、上記の式によって記載されるｆＨｂｐの各可変セグメントは、任意の対立遺伝子であり得る。
【０１０１】
別の例において、本開示のキメラｆＨｂｐはまた、全部αセグメントまたは全部βセグメントを含むものを包含し、各セグメントが、全部αまたは全部βの対立遺伝子セグメントの組合せが天然で見出されないような対立遺伝子である。
【０１０２】
異種性可変セグメントを含むキメラｆＨｂｐ
特定の場合において、本開示の非天然ｆＨｂｐは、１つまたは複数の異種性可変セグメントを含んでもよい。これらの異種性可変セグメント含有ｆＨｂｐもまた、図８のパネルＡに示されたもの以外のモジュラー構造によって記載することができる。したがって、例えば、本開示の非天然キメラｆＨｂｐは以下を有するものを含む：異種性ＶＡ（β→α）、ただし、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥの全てについてα祖先配列を有しない；異種性ＶＢ（α→β）、ただし、β祖先配列のＶＣ、ＶＤ、およびＶＥと共に、α祖先配列のＶＡを有しない；ならびに異種性ＶＥ（α→β）、ただし、ＶＤについてα祖先配列と共に、ＶＡ、ＶＢ、およびＶＣの全てについてβ祖先配列を有しない。例示的な非天然ｆＨｂｐは、下記のいくつかの例によって示され、それぞれが１つの異種性可変セグメントを含んでいる。しかしながら、非天然ｆＨｂｐは、その例に限定されず、例えば、ｆＨｂｐは１つより多い異種性可変セグメントを含んでもよい。
【０１０３】
例えば、異種性可変セグメント含有ｆＨｂｐは、ペプチドＩＤ５５によって例示されているようにＶＡ（β→α）などの異種性ＶＡを含むものであってもよく、ＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥの全てがα祖先アミノ酸配列であるとは限らない。非天然ｆＨｂｐはまた、ＶＡ（α→β）を含んでもよく、かつＶＢ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥが非依存的にαおよびβから選択される。別の例示的な非天然ｆＨｂｐは、ペプチドＩＤ  ２４によって例示されているようにＶＢ（α→β）を含んでもよく、ＶＡはα祖先であり、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥの全てがβ祖先アミノ酸配列であるとは限らない。非天然ｆＨｂｐはまたは、ＶＢ（α→β）を含んでもよく、ＶＡはβ祖先である。非天然ｆＨｂｐは、ＶＢ（β→α）を含んでもよく、ＶＡ、ＶＣ、ＶＤ、およびＶＥが非依存的にαおよびβから選択される。さらに、非天然ｆＨｂｐは、ＶＤαと共に、ペプチドＩＤ  ８２に見られるＶＥ（α→β）などの異種性ＶＥを含んでもよく、ＶＡ、ＶＢ、ＶＣの全てがβ祖先起源であるとは限らない。非天然ｆＨｂｐは、ＶＤβと共にＶＥ（α→β）を含んでもよく、ＶＡ、ＶＢ、およびＶＣが非依存的にαおよびβから選択される。異種性可変セグメントを含む非天然ｆＨｂｐの別の例は、ＶＥ（β→α）を含むものであり、ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ、およびＶＤが非依存的にαおよびβから選択される。
【０１０４】
改変エピトープ（複数可）を有するキメラｆＨｂｐ
本開示のキメラｆＨｂｐは、１つまたは複数の残基が関心対象のエピトープを導入するために天然ｆＨｂｐに見出されるアミノ酸配列に対して変異し得る、１つまたは複数の可変セグメントを含んでもよい。これらのエピトープは、それらが存在する可変セグメントに対して異種性であるため、本明細書では「異種性エピトープ」と呼ばれる。そのようなエピトープを天然では含まない可変セグメントへ関心対象の特定の抗体についての１つまたは複数の異種性エピトープを導入するために部位特異的突然変異誘発を用いることができる。したがって、１つまたは複数のアミノ酸残基を挿入、除去、または置換する突然変異を用いて、本開示のキメラｆＨｂｐを作製してもよい。ワクチンとして効果的であり、または殺菌抗体を誘発し得る免疫原性であり得るｆＨｂｐについて様々な突然変異をまたスクリーニングしてもよい。
【０１０５】
例えば、ｆＨｂｐは、通常にはβ祖先配列のＶＥに見出され、かつα祖先配列内には見出されない、抗体ＪＡＲ１３に結合するエピトープを含んでもよい。ＶＥαを含み、同時にＪＡＲ１３エピトープを含むｆＨｂｐを作製するために、そのエピトープをＶＥα配列へ導入してもよい。選択的突然変異によって、ＶＥのアミノ酸配列が、ＪＡＲ１３エピトープについての特定の部位を除いてα祖先型に由来することが可能になる。したがって、キメラｆＨｂｐの可変セグメントの配列を導き出すために用いられるアミノ酸配列にかかわらず、所望の抗原性の領域を含み、または維持するために、対応する可変セグメントへエピトープを導入することができる。
【０１０６】
キメラｆＨｂｐはまた、抗体を誘発する２つまたはそれ以上のエピトープを含むキメラｆＨｂｐであって、それらの抗体が、両方がそれらの個々のエピトープに結合している場合、いずれか一方が単独で結合している場合よりＮ．メニンギティディスに対して殺菌活性の増強を示す、キメラｆＨｂｐを含む。例えば、ＪＡＲ４およびＪＡＲ５のモノクローナル抗体の組合せは、それぞれがヒト補体媒介性アッセイにおいて単独で用いられる場合より高いＮ．メニンギティディスに対する殺菌活性のレベルを示す。キメラｆＨｂｐは、そのようなエピトープが維持されることを保証するように、またはそのようなエピトープの組合せが導入されるように設計することができる。キメラｆＨｂｐはまた、ｆＨｂｐに結合している場合、ｆＨ結合を阻害する抗体を誘発するエピトープ（複数可）を含むように設計することもできる。例えば、モノクローナル抗体ＪＡＲ３、ＪＡＲ５、ＪＡＲ１１、またはＪＡＲ３２／３５によって結合されるエピトープが抗体によって結合されている場合、ｆＨｂｐのｆＨへの結合は阻害される。したがって、キメラｆＨｂｐポリペプチドにおけるそのようなｆＨ結合性エピトープの存在は、この経路を通して保護を促進することができる抗体の産生を供給することができる。
【０１０７】
キメラｆＨｂｐのセグメントにおいて導入または維持される、関心対象であり得るエピトープを結合する抗体は、ＷＯ  ０９／１１４４８５に開示されており、その特許出願の開示は参照により全体として組み入れられている。対応するＪＡＲモノクローナル抗体に関する関心対象の特定のエピトープは、下記の表１に示されており、図９のパネルＣに指摘されている。
【０１０８】
0005883380.tif 000002
【０１０９】
対象とする他の特徴
本明細書に記載されたキメラポリペプチドは、例えば、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））における発現の結果としてＮ末端メチオニンもしくはその誘導体（例えば、ピログルタメート）を提供するため、および／またはそのＮ末端もしくはＣ末端に融合パートナーを有するキメラポリペプチドを提供するために、追加の異種性アミノ酸配列を含むことができる。関心対象の融合パートナーには、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｈｉｓ６タグなど、および他のタンパク質、特にリポタンパク質由来のリーダーペプチドが挙げられる。融合パートナーは、キメラポリペプチドの単離および精製を促進するにおいてなどの追加の特徴を提供することができる。
【０１１０】
天然ｆＨｂｐは、通常、脂質部分が共有結合性に付着することができるＮ末端システインを含む。このシステイン残基は、通常、天然タンパク質において脂質付加され、本明細書に開示されたキメラｆＨｂｐにおいて脂質付加することができる。したがって、（任意の配列リストに示されたものを含む）本明細書に記載されたアミノ酸配列において、この位置における「システイン」または「Ｃ」への言及は、具体的には、非修飾システインと、（例えば、翻訳後修飾により）脂質付加されているシステインの両方への言及を含む。したがって、キメラｆＨｂｐは、脂質付加されていてもよいし、脂質付加されてなくてもよい。脂質付加されたタンパク質のインビトロ（例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、２００１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５５（１−２）：１３５〜４８参照）またはインビボでの産生方法は、当技術分野において知られている。例えば、脂質付加されたｆＨｂｐは、以前には、界面活性剤抽出法（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００４  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７２（４）：２０８８〜１００）によって大腸菌タンパク質の膜画分から精製されており、その方法は、脂質付加されたキメラｆＨｂｐの作製に適応することができる。脂質付加されたタンパク質は、可溶性タンパク質より免疫原性が高いため、関心対象であり得る（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００４  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７２（４）：２０８８〜１００参照）。
【０１１１】
キメラｆＨＢＰをコードする核酸
キメラｆＨｂｐは、関心対象のキメラｆＨｂｐをコードする構築物を提供するために、当技術分野において知られた異なるｆＨｂｐの核酸を操作する組換え技術を用いて作製することができる。上記で述べられているように、Ｎ．メニンギティディスの様々の異なるｖ．１  ｆＨｂｐ、ｖ．２  ｆＨｂｐ、およびｖ．３  ｆＨｂｐをコードする核酸が当技術分野において入手でき、それらのヌクレオチド配列は知られている。
【０１１２】
天然ｆＨｂｐのアミノ酸配列および核酸配列は、図２Ａ〜２Ｅ（表５）に提供されており、当技術分野において入手できる。キメラｆＨｂｐをコードするヌクレオチド配列は、関心対象の宿主細胞（例えば、大腸菌、Ｎ．メニンギティディス、（ＤＮＡに基づいたワクチンの場合のように）ヒトなど）において発現を促進するためにコドン使用を最適化するように改変することができる。コドン最適化配列の作成方法は、当技術分野において知られている。
【０１１３】
スクリーニング方法
本開示はまた、キメラｆＨｂｐを含む免疫原性組成物、細菌病原体に対するワクチン、抗体、およびそれをコードする核酸についてスクリーニングする方法を特徴とする。方法は、特定のキメラｆＨｂｐの、殺菌抗体を誘発する能力および／または細菌病原体に対する広域免疫を提供する能力を評価することを含み得る。方法は、本開示のキメラｆＨｂｐでの免疫化によって誘発される抗体の、多様な変種群のＮ．メニンギティディスのｆＨｂｐへのｆＨ結合を阻害する能力、および／または殺菌活性を誘発する能力を評価することを含み得る。抗体は、本開示のキメラｆＨｂｐを含む免疫原性組成物で免疫された宿主動物において誘発され得、または候補キメラｆＨｂｐへのその特異的親和性についてファージディスプレイライブラリーにおいてスクリーニングされ得る。とりわけ、方法は、殺菌活性および／または抗悪性腫瘍活性を有する抗体を同定および／または評価するのに特に用途を見出せる。
【０１１４】
一実施形態において、抗体の細菌細胞への結合を評価する方法が提供される。方法は、（ａ）本開示のキメラｆＨｂｐを含む組成物で宿主動物を免疫する段階、（ｂ）キメラｆＨｂｐへの結合親和性を有する宿主動物から抗体を単離する段階、（ｃ）細菌細胞を単離された抗体と接触させる段階、および（ｄ）抗体の細菌細胞への結合を評価する段階を含む。追加の段階は、ヒトＨ因子との、抗体のｆＨｂｐへの競合的結合を評価する段階、インビトロで補体とインキュベートした場合の細菌病原体に対する殺菌活性を評価する段階、または動物に投与された抗体の、感染に対して受動的保護を与える能力を評価する段階を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体集団内であり、方法はさらに、（ｅ）細菌細胞を結合する抗体集団の１つまたは複数の抗体を単離する段階を含む。特徴的な態様は、細菌細胞に対して殺菌性である単離された抗体であり、その殺菌性には、例えば、補体媒介性殺菌活性および／またはヒト血液における細菌の生存率を減少させることができるオプソニン作用活性が挙げられる。本方法はまた、キメラｆＨｂｐを含むワクチンを投与された宿主動物の細菌病原体に対する感受性を評価することを含み得る。
【０１１５】
特に関心対象となる細菌病原体は、Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂ、Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、Ｎ．メニンギティディス血清群Ｘ、Ｎ．メニンギティディス血清群Ｙ、Ｎ．メニンギティディス血清群Ｗ−１３５などの多様な莢膜群の任意の、または全てのｆＨｂｐ変種群のＮ．メニンギティディスである。
【０１１６】
作製方法
キメラｆＨｂｐは、組換え方法および非組換え方法（例えば、化学合成）を含む任意の適切な方法によって作製することができる。キメラｆＨｂｐが組換え技術を用いて作製される場合、方法は、任意の適切な構築物および任意の適切な宿主細胞を含み得、その宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、通常には細菌宿主細胞または酵母宿主細胞、より通常には細菌細胞であり得る。遺伝物質の宿主細胞への導入方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム方法などが挙げられる。移入のための方法は、導入されるキメラｆＨｂｐコード核酸の安定な発現を提供するように選択され得る。キメラｆＨｂｐコード核酸は、遺伝性エピソームエレメント（例えば、プラスミド）として提供され得、またはゲノム的に組み込まれ得る。
【０１１７】
キメラｆＨｂｐコード核酸を移入するのに適したベクターは、組成によって異なり得る。組込みベクターは、条件的複製または自殺プラスミド、バクテリオファージなどであり得る。構築物は、様々なエレメントを含み得、そのエレメントには、例えば、プロモーター、選択遺伝子マーカー（例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはゲンタマイシン）耐性を与える遺伝子）、（宿主細胞、例えば、細菌宿主細胞において複製を促進するための）複製開始点などが挙げられる。ベクターの選択は、増殖が望まれる細胞の型および増殖の目的などの様々な因子に依存する。増幅して大量の所望のＤＮＡ配列を生じるのに特定のベクターが有用である。培養中の細胞における発現には他のベクターが適している。動物全体における細胞内での移入および発現にはさらに他のベクターが適している。適切なベクターの選択は十分、当技術分野の技術で対応できる範囲内である。多くのそのようなベクターは市販されている。
【０１１８】
ベクターは、選択薬物耐性マーカー、および異なる宿主細胞において（例えば、大腸菌およびＮ．メニンギティディスの両方において）自律複製を提供するエレメントを含むエピソームプラスミドに基づいた発現ベクターであり得る。そのような「シャトルベクター」の１つの例は、プラスミドｐＦＰ１０（Ｐａｇｏｔｔｏら、Ｇｅｎｅ  ２０００  ２４４：１３〜１９）である。
【０１１９】
構築物は、例えば、関心対象のポリヌクレオチドを構築物バックボーンへ、典型的には、ベクター内の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ付着を用いて、挿入することによって、調製することができる。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、相同組換えまたは部位特異的組換えによって挿入することができる。典型的には、相同組換えは、ベクターの所望のヌクレオチド配列の隣接部に相同の領域を付着させることによって達成され、一方、部位特異的組換えは、部位特異的組換えを促進する配列（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘ、ａｔｔ部位など）の使用を通して達成される。そのような配列を含む核酸は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または相同の領域と所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって、付加することができる。
【０１２０】
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を与えることができ、または宿主細胞ゲノムへの組込みを与えることができる。ベクターは、当業者によく知られた多数の刊行物に十分記載されており、その刊行物には、例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９９）  Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓが挙げられる。ベクターは、キメラｆＨＢＰをコードする核酸の発現を与えることも、本核酸の増殖を与えることも、または両方を与えることもできる。
【０１２１】
用いることができるベクターの例として、組換えバクテリオファージＤＮＡ由来のもの、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ  １９／１８、ｐＵＣ  １１８、１１９などのプラスミドベクターおよびＭ１３  ｍｐシリーズのベクターを用いることができる。ｐＥＴ２１もまた、用いることができる発現ベクターである。バクテリオファージベクターには、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ／Ｒ、およびＥＭＢＬシリーズのバクテリオファージベクターを挙げることができる。さらに利用することができるベクターには、ｐＪＢ８、ｐＣＶ  １０３、ｐＣＶ  １０７、ｐＣＶ  １０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６、およびカロミド（ｃｈａｒｏｍｉｄ）９シリーズのベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２２】
関心対象のキメラｆＨｂｐの発現のために、発現カセットを用いてもよい。したがって、本開示は、対象核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターは、転写制御配列および翻訳制御配列を提供し、コード領域が転写開始領域の転写調節下で作動可能に連結されている場合の誘導性発現または構成的発現、ならびに転写終結領域および翻訳終結領域を提供することができる。これらの調節領域は、キメラｆＨｂｐが由来するｆＨｂｐにとって本来のものであってもよいし、外因的源由来であってもよい。一般的に、転写制御配列および翻訳制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、それらに限定されない。プロモーターは、構成的かまたは誘導性かのいずれかであり得、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７など）であり得る。
【０１２３】
発現ベクターは、一般的に、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を与えるために、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。発現宿主において作動する選択マーカーは、ベクターを含む細胞の選択を容易にするために存在してもよい。加えて、発現構築物は、追加のエレメントを含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有してもよく、それにしたがって、それが生物体内で、例えば、発現のための哺乳類細胞または昆虫細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主内で、維持されることが可能になる。加えて、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は、当技術分野においてよく知られており、用いられる宿主細胞で異なる。
【０１２４】
本開示のキメラｆＨｂｐは、検出可能な標識、例えば、放射標識、蛍光標識、ビオチン標識、免疫学的に検出可能な標識（例えば、ＨＡタグ、ポリヒスチジンタグ）などの追加のエレメントを含んでもよい。キメラｆＨｂｐの追加のエレメントは、様々な方法（例えば、親和性捕獲など）を通して単離を促進するために（例えば、ビオチンタグ、免疫学的に検出可能なタグ）、提供することができる。キメラｆＨｂｐは、任意で、共有結合性または非共有結合性付着を通して支持体上に固定化することができる。
【０１２５】
キメラｆＨｂｐの単離および精製は、当技術分野において知られた方法に従って達成することができる。例えば、キメラｆＨｂｐは、キメラｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変された細胞の可溶化液から、または合成反応混合物から、免疫親和性精製によって単離することができ、その免疫親和性精製は、一般的には、試料を抗キメラｆＨｂｐ抗体（例えば、ＪＡＲ５などの抗キメラｆＨＢＰモノクローナル抗体、または本明細書に記載された適切なＪＡＲモノクローナル抗体）と接触させる段階、特異的に結合していない材料を除去するために洗浄する段階、および特異的に結合したキメラｆＨｂｐを溶出する段階を含む。単離されたキメラｆＨｂｐは、透析、およびタンパク質精製方法に通常用いられる他の方法によってさらに精製することができる。一実施形態において、キメラｆＨｂｐは、金属キレートクロマトグラフィー方法を用いて単離することができる。
【０１２６】
宿主細胞
いくつかの適切な宿主細胞のいずれかを、キメラｆＨｂｐの産生に用いることができる。一般的に、本明細書に記載されたキメラｆＨｂｐは、従来の技術に従って、原核生物または真核生物、通常には細菌、より通常には大腸菌またはナイセリア（例えば、Ｎ．メニンギティディス）内で発現することができる。したがって、本開示はさらに、キメラｆＨＢＰをコードする核酸を含む、遺伝子改変された宿主細胞を提供する。キメラｆＨＢＰの（ラージスケール産生を含む）産生のための宿主細胞は、様々な利用可能な宿主細胞のいずれかから選択することができる。発現のための例示的な宿主細胞には、細菌（例えば、大腸菌株）、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種など）などの原核または真核単細胞生物のものが挙げられ、昆虫、脊椎動物、特に哺乳動物（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫなど）などの高等生物にもともと由来した宿主細胞を挙げることができる。一般的に、細菌宿主細胞および酵母は、キメラｆＨＢＰ産生にとって特に関心対象になる。
【０１２７】
キメラｆＨｂｐは、実質的に純粋な形または実質的に単離された形（すなわち、他のナイセリアまたは宿主細胞のポリペプチドを実施的に含まない）または実質的に単離された形で調製することができる。特定の実施形態において、キメラｆＨｂｐは、存在する可能性がある他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に対してそのポリペプチドについて濃縮されている組成物中に存在する。精製されたキメラｆＨｂｐは、他の発現したポリペプチドを実質的に含まない、例えば、組成物の９０％未満、通常には６０％未満、より通常には５０％未満が他の発現したポリペプチドで構成される組成物中に、そのポリペプチドが存在するように提供することができる。
【０１２８】
小胞産生のための宿主細胞
（下記でより詳細に論じられているように）キメラｆＨｂｐが膜小胞内に提供されることになっている場合、ナイセリア宿主細胞は、キメラｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変される。様々なナイセリア種のいずれかを、キメラｆＨｂｐを産生するように改変することができ、任意で、それは、ＰｏｒＡなどの関心対象の他の抗原を産生し、または産生するように改変することができ、本明細書に開示された方法に用いることができる。
【０１２９】
ナイセリア株の遺伝子改変および所望のポリペプチドの発現を提供するための方法およびベクターは、当技術分野において知られている。ベクターおよび方法の例は、ＷＯ  ０２／０９７４６およびＯ’Ｄｗｙｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００４；７２：６５１１〜８０に提供されている。強力なプロモーター、特に強力な構成的プロモーターは特に関心対象である。例示的なプロモーターとして、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｌｂｐＢ、ｔｂｐＢ、ｐ１１０、ｈｐｕＡＢ、ｌｇｔＦ、ｏｐａ、ｐ１１０、ｌｓｔ、ｈｐｕＡＢ．、およびｒｍｐが挙げられる。
【０１３０】
病原性ナイセリア種、または病原性ナイセリア種由来の菌株、特にヒトにとって病原性の菌株、またはヒトにとって病原性もしくは共生する菌株由来の菌株が、膜小胞産生に用いるための特に関心対象である。ナイセリア種の例には、Ｎ．メニンギティディス、Ｎ．フラベセンス（Ｎ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｎ．ゴノレア（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｎ．ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）、Ｎ．ポリサッカレア（Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ）、Ｎ．シネレア（Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ）、Ｎ．ムコーサ（Ｎ．ｍｕｃｏｓａ）、Ｎ．サブフラバ（Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ）、Ｎ．シッカ（Ｎ．ｓｉｃｃａ）、Ｎ．エロンガータ（Ｎ．ｅｌｏｎｇａｔａ）などが挙げられる。
【０１３１】
Ｎ．メニンギティディス株は、キメラｆＨｂｐを発現するために遺伝子改変するのに、および小胞産生に用いるのに、特に関心対象である。小胞産生に用いる菌株は、望ましくあり得るいくつかの異なる特性に従って選択することができる。例えば、菌株は、所望のＰｏｒＡ型（上記のように、「血清亜型」）、莢膜群、血清型など；減少した莢膜多糖産生などに従って選択してもよい。例えば、産生株は、任意の所望のＰｏｒＡポリペプチドを産生することができ、（自然にかまたは遺伝子操作によるかのいずれでも）１つまたは複数のＰｏｒＡポリペプチドを発現してもよい。菌株の例として、Ｐｌ．７、１６；Ｐｌ．１９、１５；Ｐｌ．７、１；Ｐｌ．５、２；Ｐｌ．２２ａ、１４；Ｐｌ．１４；Ｐｌ．５、１０；Ｐｌ．７、４；Ｐｌ．１２、１３の血清亜型を与えるＰｏｒＡポリペプチドを産生するもの；および血清亜型分類に用いられる従来の血清学的試薬との反応性を保持することができ、または保持することができない、そのようなＰｏｒＡポリペプチドの変種が挙げられる。ＰｏｒＡ可変領域（ＶＲ）分類に従って特徴づけられたＰｏｒＡポリペプチドもまた関心対象である（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００４  １０：６７４〜６７８；Ｓａｃｃｈｉ  ＣＴら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；５：８４５〜５５；Ｓａｃｃｈｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０００；１８２：１１６９〜１１７６参照）。相当な数の別々のＶＲ型が同定されており、それらは、ＶＲ１およびＶＲ２ファミリー「プロトタイプ」へ分類することができる。この命名法、および以前の分類スキームとのそれの関係を記載するウェブアクセス可能なデータベースは、ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｎｍ／ｔｙｐｉｎｇ／ｐｏｒａに見出される。例示的なＰｏｒＡ  ＶＲ１型およびＶＲ２型のアラインメントは、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００４  １０：６７４〜６７８に提供されている。
【０１３２】
代替として、または加えて、産生株は、莢膜欠損株であり得る。莢膜欠損株は、ワクチンが投与される対象において（例えば、宿主細胞表面上のシアル酸と交差反応する抗体の産生による）有意な自己抗体応答を誘発するリスクの低減を与える小胞に基づいたワクチンを提供することができる。本明細書に用いられる場合、「莢膜欠損」または「莢膜多糖の欠損」とは、天然株のより低い、または、その菌株が遺伝子改変されている場合、莢膜欠損株が由来する親株のより低い、細菌表面上の莢膜多糖のレベルを指す。莢膜欠損株には、表面莢膜多糖産生が少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上減少している菌株が挙げられ、莢膜多糖が細菌表面上で（例えば、抗莢膜多糖抗体を用いる細胞全体のＥＬＩＳＡにより）検出できない菌株が挙げられる。
【０１３３】
莢膜欠損株には、自然発生の、または組換え的に生じた遺伝子改変による莢膜欠損であるものが挙げられる。自然発生の莢膜欠損株（例えば、Ｄｏｌａｎ−Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００３）  １８７（１０）：１６１６〜２８参照）、および莢膜欠損株を同定および／または作製する方法（例えば、Ｆｉｓｓｅｈａら、（２００５）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ７３（７）：４０７０〜４０８０；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、（１９９１）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９（１１）：４０９７〜１０２；Ｆｒｏｓｃｈら、（１９９０）  ＭｏＩ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９０  ４（７）：１２１５〜１２１８参照）は、当技術分野において知られている。
【０１３４】
莢膜多糖の産生の減少をもたらすためのナイセリア宿主細胞の改変には、莢膜合成に関与する１つまたは複数の遺伝子の改変が挙げられ、その改変は、例えば、改変前の親細胞に対して莢膜多糖のレベルの減少をもたらす。そのような遺伝子改変には、（例えば、１つまたは複数の莢膜生合成遺伝子における１つまたは複数の挿入、欠失、置換などによる）菌株を莢膜欠損にする１つまたは複数の莢膜生合成遺伝子におけるヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の変化を挙げることができる。莢膜欠損株は、１つまたは複数の莢膜遺伝子を欠くことができ、またはそれについての機能を喪失し得る。
【０１３５】
特に関心対象であるのは、シアル酸生合成を欠く菌株である。そのような菌株は、ヒトシアル酸抗原と交差反応する抗シアル酸抗体を誘発するリスクを低減する小胞の産生を与えることができ、さらに、製造安全性の向上をもたらすことができる。（自然発生の改変または操作された改変のいずれかにより）シアル酸生合成に欠陥を有する菌株は、シアル酸生合成経路におけるいくつかの異なる遺伝子のいずれかが欠損し得る。特に関心対象であるのは、（ｓｙｎＸ  ＡＡＦ４０５３７．１またはｓｉａＡ  ＡＡＡ２０４７５として知られた）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸２−エピメラーゼ遺伝子によってコードされる遺伝子産物を欠損する菌株であり、不活性化されたこの遺伝子を有する菌株がとりわけ関心対象である。例えば、一実施形態において、莢膜欠損株は、機能性ｓｙｎＸ遺伝子産物の産生の破壊によって生じる（例えば、Ｓｗａｒｔｌｅｙら、（１９９４）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６（５）：１５３０〜４参照）。
【０１３６】
莢膜欠損株はまた、非組換え技術を用いて、例えば、莢膜多糖が低下した菌株を選択するために殺菌性抗莢膜抗体の使用によって、天然の菌株から生み出すことができる。
【０１３７】
本開示が、（例えば、異なる菌株由来のキメラｆＨｂｐ提示小胞を含む抗原性組成物を作製するために）２つ以上の菌株の使用を含む場合、菌株は、１つまたは複数の菌株特性の点で異なるように、例えば、用いられるキメラｆＨｂｐ、ＰｏｒＡなどの点で異なる小胞を提供するために、選択することができる。
【０１３８】
小胞の調製
本開示によって企図される抗原性組成物は、一般的に、キメラｆＨｂｐを発現するナイセリア細胞から調製される小胞を含む。本明細書で言及される場合、「小胞」とは、外膜小胞および微小胞（ブレブとも呼ばれる）を含むことを意図される。
【０１３９】
抗原性組成物は、キメラｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変されたナイセリア−メニンギティディス種の培養株の外膜から調製された外膜小胞（ＯＭＶ）を含み得る。ＯＭＶは、ブロス培地または固形培地で成長したナイセリア−メニンギティディスから、好ましくは、培地から細菌細胞を（例えば、濾過により、または細胞をペレット状にする低速遠心分離によるなどで）分離し、細胞を（例えば、界面活性剤の添加、浸透圧ショック、超音波処理、キャビテーション、ホモジナイゼーションなどにより）溶解し、細胞質分子から外膜画分を（例えば、濾過により；または外膜および／もしくは外膜小胞の示差的沈殿または凝集により、または外膜分子を特異的に認識するリガンドを用いる親和性分離方法により、または外膜および／もしくは外膜小胞をペレット状にする高速遠心分離によるなどで）分離することにより、得ることができ、外膜画分はＯＭＶを生じさせるために用いることができる。
【０１４０】
抗原性組成物は、キメラｆＨｂｐを含む微小胞（ＭＶ）（または「ブレブ」）を含むことができ、ＭＶまたはブレブが、キメラｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変されたナイセリア−メニンギティディス株の培養中に放出される。例えば、ＭＶは、ブロス培地中でナイセリア−メニンギティディスの株を培養し、ブロス培地から細胞全体を（例えば、濾過により、または細胞のみをペレット状にし、より小さいブレブをペレット状にしない低速遠心分離によるなどで）分離し、その後、細胞を含まない培地中に存在するＭＶを（例えば、濾過、ＭＶの示差的沈殿もしくは凝集により、またはブレブをペレット状にする高速遠心分離によるなどで）収集することによって得てもよい。ＭＶの産生に用いる菌株は、一般的に、培養中に産生されるブレブの量に基づいて選択することができる（例えば、細菌は、本明細書に記載された方法における単離および投与に適したブレブの産生を提供するのに妥当な数で培養することができる）。高レベルのブレブを産生する菌株の例は、国際公開特許第０１／３４６４２号に記載されている。ブレブ産生に加えて、ＭＶ産生に用いる菌株はまた、ＮｓｐＡ産生に基づいて選択してもよく、より高レベルのＮｓｐＡを産生する菌株は特に関心対象である（例えば、異なるＮｓｐＡ産生レベルを生じるＮ．メニンギティディス株について、Ｍｏｅら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５６６４参照）。ブレブの産生に用いる関心対象の他の菌株には、細胞分離、膜構造、および病原性に必要とされるリポタンパク質をコードする不活性化ＧＮ３３遺伝子を有する菌株が挙げられる（例えば、Ａｄｕ−Ｂｏｂｉｅら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４；７２：１９１４〜１９１９参照）。
【０１４１】
本開示の抗原性組成物は、１つの菌株由来、または２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上の菌株由来の小胞を含むことができ、それらの菌株は、お互いに同種であってもよいし、異種であってもよく、通常、異種である。例えば、菌株は、ＰｏｒＡに関して同種でも異種でもよい。小胞はまた、異なる変種（ｖ．１、ｖ．２、またはｖ．３）または亜変種（例えば、ｖ．１、ｖ．２、またはｖ．３の亜変種）由来のｆＨｂｐアミノ酸配列で構成され得る１つより多いキメラｆＨｂｐ（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のキメラｆＨｂｐ）を発現する菌株から調製することができる。
【０１４２】
抗原性組成物は、同じまたは異なるキメラｆＨｂｐを提示するＯＭＶおよびＭＶの混合物を含むことができ、キメラｆＨｂｐは任意で、ｆＨｂｐ変種および／または亜変種の異なる組合せ由来のエピトープを提示してもよく、かつＯＭＶおよび／またはＭＶは、同じ菌株由来でも異なる菌株由来でもよい。異なる菌株由来の小胞は、混合物として投与することができ、または連続的に投与することができる。抗原性組成物は、１つまたは複数の異なるキメラｆＨｂｐを含む小胞を含んでもよく、その組成物中、小胞およびｆＨｂｐは両方とも同じ宿主細胞に由来している。組成物はまた、異なる宿主細胞に由来している小胞およびｆＨｂｐから作製することができ、それゆえに、小胞およびｆＨｂｐはそれらの別個の精製後に混合される。
【０１４３】
望ましい場合（例えば、小胞を産生するために用いられる菌株が内毒素または特に高レベルの内毒素に関連している場合）、小胞は、任意で、内毒素を低減するために、例えば、投与後の毒性を低減するために、処理される。下記で論じられているようにあまり望ましくはないが、内毒素の低減は、適切な界面活性剤（例えば、ＢＲＩＪ−９６、デオキシコール酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ＴＷＥＥＮ  ８０（それぞれ、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜２％の濃度において）、およびＳＤＳ）での抽出によって達成することができる。界面活性剤抽出物を用いる場合、デオキシコール酸塩以外の界面活性剤を用いることが好ましい。
【０１４４】
抗原性組成物の小胞は、界面活性剤なしに、例えば、デオキシコール酸塩の使用なしに、調製することができる。界面活性剤処理は内毒素活性を除去するのに有用であるが、小胞産生中の抽出によって天然ｆＨｂｐリポタンパク質および／または（脂質付加されたキメラｆＨｂｐを含む）キメラｆＨｂｐを枯渇させる可能性がある。したがって、界面活性剤を必要としないテクノロジーを用いて内毒素活性を減少させることが特に望ましい。１つのアプローチにおいて、ヒトに使用する前に最終調製物から内毒素を除去する必要性を避けるために、比較的低い内毒素（リポ多糖、ＬＰＳ）の産生株である菌株を用いる。例えば、小胞は、リポオリゴ糖、またはワクチンにおいて望ましくない可能性がある他の抗原（例えば、Ｒｍｐ）が低下し、または除去されているナイセリア突然変異体から調製することができる。
【０１４５】
結果として、リピドＡの毒性活性の減少、または検出不可能を生じる遺伝子改変を含むＮ．メニンギティディス株から小胞を調製することができる。例えば、そのような菌株は、リピドＡ生合成において遺伝子改変することができる（Ｓｔｅｅｇｈｓら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９９；６７：４９８８〜９３；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００１；６９：５９８１〜９０；Ｓｔｅｅｇｈｓら、Ｊ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：１１３〜９；Ｆｉｓｓｈａら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３：４０７０，２００５）。免疫原性組成物は、ｌｐｘＬ１またはｌｐｓＬ２、それぞれによってコードされる酵素の下方制御および／または不活性化などのＬＰＳの改変によって解毒することができる。ｌｐｘＬ１突然変異体において生成されるペンタアシル化リピドＡの産生は、ｌｐｘＬ１によってコードされた酵素が、ＧｌｃＮ  ＩＩの２’位におけるＮ結合型３−ＯＨ  Ｃ１４にＣ１２を付加することを示す。ｌｐｘＬ２突然変異体に見出される主なリピドＡ種はテトラアシル化されており、ｌｐｘＬ２によってコードされる酵素が他のＣ１２を、つまり、ＧｌｃＮ  Ｉの２位におけるＮ結合型３−ＯＨ  Ｃ１４に付加することを示す。これらの遺伝子の発現の減少（もしくは消失）（またはこれらの遺伝子の産物の活性の減少もしくは消失）を生じる突然変異は、結果として、リピドＡの毒性活性の変化を生じる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙら、２００１；６９：５９８１〜９０）。テトラアシル化（ｌｐｘＬ２突然変異体）リピドＡおよびペンタアシル化（ｌｐｘＬ１突然変異体）リピドＡは、野生型リピドＡより毒性が低い。リピドＡ４’−キナーゼコード遺伝子（ｌｐｘＫ）における突然変異はまた、リピドＡの毒性活性を減少させる。小胞（例えば、ＭＶまたはＯＭＶ）の産生に用いるのに特に関心対象であるのは、機能性ＬｐｘＬ１コード化タンパク質の減少または検出不可能をもたらすように遺伝子改変されたＮ．メニンギティディス株である。そのような小胞は、キメラｆＨｂｐの免疫原性を保持しながら、ＬＰＳ産生について野生型であるＮ．メニンギティディス株と比較して毒性の低下を提供する。
【０１４６】
ＬＰＳ毒性活性はまた、ポリミキシンＢ耐性（そのような耐性はリピドＡの４’ホスフェートへのアミノアラビノースの付加と関連づけられている）に関与する遺伝子／座位に突然変異を導入することによって変化させることができる。これらの遺伝子／座位は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするｐｍｒＥ、またはアミノアラビノース合成および転移に関与し得る多くの腸内細菌科に共通した抗菌性ペプチド耐性遺伝子の領域であり得る。この領域に存在する遺伝子ｐｍｒＦは、ドリコールリン酸マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｇｕｎｎ  Ｊ．Ｓ．、Ｋｈｅｎｇ，Ｂ．Ｌ．、Ｋｒｕｅｇｅｒ  Ｊ．、Ｋｉｍ  Ｋ．、Ｇｕｏ  Ｌ．、Ｈａｃｋｅｔｔ  Ｍ．、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓ．Ｉ．１９９８．ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：１１７１〜１１８２）。
【０１４７】
リン中継の２つの成分制御系（例えば、ＰｈｏＰ構成性表現型、ＰｈｏＰｃ）であるＰｈｏＰ−ＰｈｏＱ制御系における突然変異、または（ＰｈｏＰ−ＰｈｏＱ制御系を活性化する）低Ｍｇ＋＋環境条件もしくは培養条件は、４’−ホスフェートへのアミノアラビノースの付加およびミリステートと置き換わる２−ヒドロキシミリステート（ミリステートのヒドロキシル化）をもたらす。この改変されたリピドＡは、ヒト内皮細胞によるＥ−セレクチン発現およびヒト単球からのＴＮＦ分泌を刺激する能力の低下を示す。
【０１４８】
ポリミキシンＢ耐性株もまた、そのような菌株はＬＰＳ毒性が低下していることが示されているため、使用に適している（例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙら、１９９４．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｎｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｇｕｉｌｄｈａｌｌ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｅｎｇｌａｎｄ参照）。あるいは、ポリミキシンＢの結合活性を模倣する合成ペプチドを、ＬＰＳ毒性活性を低下させるために抗原性組成物に加えてもよい（例えば、Ｒｕｓｔｉｃｉら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３６１〜３６５；Ｐｏｒｒｏら、Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．１９９８；３９７：３１５〜２５参照）。
【０１４９】
内毒素はまた、培養条件の選択を通して低下させることができる。例えば、１リットルの培地あたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇのアミノアラビノースを含む成長培地で菌株を培養することにより、脂質毒性の低下がもたらされる（例えば、ＷＯ０２／０９７６４６参照）。
【０１５０】
製剤
本明細書では、「抗原組成物」、「抗原性組成物」、または「免疫原性組成物」は、便宜上、本明細書に開示されているようなキメラｆＨｂｐを含む組成物を総称的に指すために用いられ、そのキメラｆＨｂｐは任意で、免疫原性をさらに増強するためにコンジュゲートされていてもよい。抗体、特にナイセリア−メニンギティディスＢ群（ＮｍＢ）に対する抗体をヒトにおいて誘発するのに有用な組成物は、本開示によって具体的に企図される。抗原性組成物は、２つ以上の異なるキメラｆＨｂｐを含むことができ、キメラｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ変種および／または亜変種の異なる組合せ由来のエピトープを提示してもよい。
【０１５１】
抗原性組成物は、一般的に、免疫学的有効量のキメラｆＨｂｐを含み、必要に応じて、他の適合する成分をさらに含んでもよい。「免疫学的有効量」とは、単一用量か、または一連の同じもしくは異なる抗原性組成物の一部としてかのいずれかでのその量の個体への投与が、例えば、ナイセリア、具体的にはＮ．メニンギティディス、より具体的にはＢ群Ｎ．メニンギティディスによる感染の症状、または感染によって引き起こされる疾患の処置または予防に有効な抗体応答を誘発するのに有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、年齢、抗体を産生する個体の免疫系の能力、望まれる保護の程度、ワクチンの剤形、処置を行う医師による医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変化する。量は、日常的試行によって決定することができる比較的広い範囲に収まるだろうことが予想される。
【０１５２】
投与計画は、単一用量スケジュールでも、異なる時間における投与される抗原性組成物の単位剤形での複数回用量スケジュールでもよい。本明細書に用いられる場合、用語「単位剤形」は、ヒト対象および動物対象についての単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、所望の効果を生じるのに十分な量で所定量の本開示の抗原性組成物を含み、その組成物が薬学的に許容される賦形剤（例えば、薬学的に許容される希釈剤、担体、または媒体）と付随して提供される。抗原性組成物は、他の免疫制御剤と組み合わせて投与してもよい。
【０１５３】
抗原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に提供することができ、その賦形剤は、滅菌水溶液などの溶液、多くの場合、食塩水であり得、または粉末の形で提供することができる。そのような賦形剤は、必要に応じて、実質的に不活性であり得る。
【０１５４】
抗原性組成物は、アジュバントをさらに含み得る。ヒトに用いることができる公知の適切なアジュバントの例には、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％  ｗ／ｖのスクワレン、０．５％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、０．５％  ｗ／ｖのＳｐａｎ  ８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンが非メチル化されている）、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ  Ａ、インターロイキンなどが挙げられるが、必ずしもそれらに限定されない。実験動物については、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰと呼ばれるＣＧＰ  １１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれるＣＧＰ  １９８３５Ａ）、およびＲＩＢＩ（細菌から抽出された３つの成分である、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０乳濁液中に含む）を用いることができる。アジュバントの効果は、免疫原性抗原またはその抗原性エピトープに対して産生される抗体の量を測定することによって決定することができる。
【０１５５】
組成物の効果を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとして、（１）水中油形乳剤（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤とともにまたはなしで）、例えば、（ａ）マイクロ流動化装置を用いてサブミクロン粒子へ製剤化された、５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５を含む（任意でＭＴＰ−ＰＥを含む）ＭＦ５９（商標）（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５の１０章）、（ｂ）サブミクロン乳剤へマイクロ流動化されたかまたはより大きい粒子サイズの乳剤を生じるようにボルテックスされたかのいずれかの、１０％のスクワレン、０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０、５％のプルロニックブロック化ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、および（ｃ）２％のスクワレン、０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含むＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；（２）ＱＳ２１などのサポニンアジュバント、またはＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）もしくはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）などのそれから作製された粒子を用いてもよい（ＩＳＣＯＭＳは追加の界面活性剤を欠いていてもよい、例えば、ＷＯ  ００／０７６２１）；（３）完全フロイントのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）任意で、肺炎球菌サッカライドと共に用いる場合、ミョウバンの実質的非存在下における（例えば、ＷＯ００／５６３５８）、モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４；（６）例えば、ＱＳ２１および／または水中油乳剤と３ｄＭＰＬの組合せ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含む、すなわち、シトシンが非メチル化されている場合、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００、１９、６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ  Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ２００１  ３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、８１０−８７６；Ｃｈｕら���Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；国際公開特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９、およびＷＯ９８／５２５８１）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、ＷＯ９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫賦活剤および金属塩の粒子、例えば、ＷＯ００／２３１０５；（１２）サポニンおよび水中油形乳剤、例えば、ＷＯ９９／１１２４１；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意で＋ステロール）、例えば、ＷＯ９８／５７６５９；（１４）組成物の効力を増強するための免疫賦活剤として働く他の物質が挙げられるが、それらに限定されない。ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。ヒトへの投与に適したアジュバントは特に関心対象である。
【０１５６】
抗原組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩などの他の成分を含んでもよい。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などなどの適切な生理的条件に必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムを含んでもよい。
【０１５７】
製剤中のキメラｆＨｂｐの濃度は、大きく異なり得（約０．１重量％未満から、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％くらいまたはそれ以上まで）、通常には、主に、液体容量、粘度、および選択された特定の投与様式および患者の要求に応じた患者に基づく因子に基づいて、選択される。
【０１５８】
キメラｆＨＢＰ含有製剤は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアゾールなどの形で提供することができる。経口投与は、組成物の消化からの保護を必要とし得る。これは、典型的には、組成物を酸性および酵素的加水分解に対して抵抗性にする作用物質との組成物の会合によるか、または適切に抵抗性である担体中に組成物をパッケージングすることによるかのいずれかで達成される。消化から保護する手段は当技術分野においてよく知られている。
【０１５９】
キメラｆＨｂｐ含有製剤はまた、投与後のキメラｆＨＢＰの血中半減期を向上させるように提供することができる。例えば、単離されたキメラｆＨｂｐが注射用に製剤化される場合、キメラｆＨｂｐは、リポソーム製剤中に提供され、コロイドとして調製され、または血中半減期を延ばすための他の従来技術を用いて調製することができる。リポソームを調製するために、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、および第４，８３７，０２８号に記載されているような様々な方法が利用できる。調製物はまた、放出制御または持続放出の形で提供してもよい。
【０１６０】
免疫化
キメラｆＨｂｐ含有抗原性組成物は、一般的に、ナイセリア疾患に罹るリスクがあるヒト対象に、疾患およびその合併症の発生を防ぎ、または少なくとも部分的に停止させるように投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効量」として定義される。治療的使用に有効な量は、例えば、抗原性組成物、投与様式、患者の体重および全身的健康状態、および処方医師の判断に依存する。抗原性組成物の単一用量または複数回用量は、患者に必要とされ、かつ忍容される用量および頻度、ならびに投与経路に依存して投与され得る。
【０１６１】
キメラｆＨｂｐ含有抗原性組成物は、一般的に、宿主において免疫応答、特に体液性免疫応答を誘発するのに有効な量で投与される。上記で述べられているように、免疫化のための量は、様々であり、一般的には、７０ｋｇの患者あたり約１μｇから１００μｇまで、通常には、５μｇ〜５０μｇ／７０ｋｇの範囲であり得る。実質的により高い用量（例えば、１０ｍｇ〜１００ｍｇまたはそれ以上）は、経口、経鼻、または局所投与経路において適している場合がある。初回投与の後に、同じまたは異なるキメラｆＨｂｐ含有抗原性組成物の追加免疫が続くことができる。通常には、ワクチン接種は、少なくとも１回の追加免疫、より通常には２回の追加免疫を含む。
【０１６２】
一般的に、免疫化は、任意の適切な経路による投与によって達成することができ、その投与には、経口で、経鼻で、経鼻咽頭で、非経口で、経腸で、経胃で、局所的に、経皮で、皮下に、筋肉内に、錠剤、固体、粉末化、液体、エアゾールの形で、局部的にまたは全身的に、賦形剤の添加有りまたはなしでの組成物の投与が挙げられる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際的な方法は、当業者に知られているだろう、または明らかであろうし、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８０）のような刊行物内でより詳細に記載されている。
【０１６３】
抗キメラｆＨｂｐ免疫応答は、公知の方法によって（例えば、初回免疫化の前および後に個体から血清を採取し、個体の免疫状態における変化を、例えば、免疫沈降アッセイ、またはＥＬＩＳＡ、または殺菌アッセイ、またはウェスタンブロット、またはフローサイトメトリーアッセイなどにより示すことによって）評価することができる。
【０１６４】
抗原性組成物は、ナイセリア−メニンギティディスに関して免疫学的にナイーブであるヒト対象に投与することができる。特定の実施形態において、対象は、約５歳以下、好ましくは約２歳以下のヒトの小児であり、抗原性組成物は以下の時間のうちの任意の１時点または複数時点に投与される：生後２週間目、１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、４ヶ月目、５ヶ月目、６ヶ月目、７ヶ月目、８ヶ月目、９ヶ月目、１０ヶ月目、もしくは１１ヶ月目、もしくは１年目、もしくは１５ヶ月目、１８ヶ月目、２１ヶ月目、または２歳、３歳、４歳、５歳時点。
【０１６５】
一般的には、疾患症状の最初の兆候前に、または（例えば、ナイセリアによる暴露または感染による）感染もしくは疾患への可能性のある、もしくは実際の暴露の最初の兆候時点で、免疫化を開始することが望ましい場合がある。
【０１６６】
ＡＴＣＣ寄託
ＪＡＲ  ４、ＪＡＲ  ５、ＪＡＲ  １１、およびＪＡＲ  ３２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に、下記の表に示された日付に寄託し、下記の表に提示された呼称が割り当てられた。
【０１６７】
0005883380.tif 000003
【０１６８】
ＪＡＲ  ５モノクローナル抗体は、ＪＡＲ  ３モノクローナル抗体によって特異的に結合されるエピトープと少なくとも重複するエピトープに特異的に結合すること、およびＪＡＲ  ３２モノクローナル抗体は、ＪＡＲ  ３５モノクローナル抗体によって特異的に結合されるエピトープと少なくとも重複するエピトープに特異的に結合することに留意されるべきである。
【０１６９】
これらの寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の条項およびブダペスト条約による規定下でなされた。これは、受託者によって受け取られた寄託物の試料の提供について寄託日から３０年間、および最も近い依頼後少なくとも５年間、寄託物の生存可能な培養の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項によってＡＴＣＣにより入手可能になり、受託者により寄託された物質の一般者の入手可能性に課せられた全ての制限が関連米国特許の認可で決定的に解除されるだろうことを保証するオークランドのＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｅｒとＡＴＣＣとの間の協定に従って、関連米国特許が発行され次第、または任意の米国特許出願もしくは外国特許出願が公衆へ公開され次第、どれが最初になろうとも、一般者への寄託物の培養物の子孫の永久的かつ無制限の入手可能性を保証し、かつ３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ  §１２２およびそれに準ずる米国特許商標庁長官の規定（特に８８６  ＯＧ  ６３８を参照する、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４を含む）に従って長官によりその権利があると決定された者への子孫の入手可能性を保証する。
【０１７０】
本出願の譲受人（複数可）は、もし万一、寄託された物質の培養物が、適切な条件下で培養された場合に、死滅または消失し、または破壊されたならば、その物質は、通知の上、速やかに同じ別のものと交換されるだろう。寄託物質の入手可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って認可された権利に違反して本発明を実施する実施権として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７１】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例示を目的とするのみであること、およびそれを鑑みての様々な改変または変化が当業者に示唆されるであろうし、本出願の精神および権限内、ならびに添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれ得ることは、理解されている。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１７２】
材料および方法
以下の方法および材料を下記の実施例に用いた。
【０１７３】
ｆＨｂｐシークエンシング。ｆＨｂｐ遺伝子を、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で調製されたゲノムＤＮＡから、以前に記載されたプライマーＡ１およびＢ２ならびにサイクリングパラメータ（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３、１９７：７８９〜９９）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。ＰＣＲ産物をＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、３０μｌの滅菌脱イオンＨ２Ｏ中に溶出した。ｆＨｂｐ  ＤＮＡ配列を以前に記載されたプライマーＡ１および２２（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３）を用いる市販のシークエンシング設備によって決定した。
【０１７４】
データの供給源。第１の研究において分析されたタンパク質配列については、米国（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００７、１９５：１４７２〜９）、ヨーロッパ（ＢｅｅｒｎｉｎｋおよびＧｒａｎｏｆｆ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００８，７６：２５６８〜２５７５；Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００８、７６：４２３２〜４２４０）、およびアフリカ（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００９、ｄｏｉ：１０．１０８６／５９７８０６）からのナイセリア−メニンギティディス症例分離株由来の６９  ｆＨｂｐ遺伝子によりコードした。このデータセットは、本発明者らの以前の研究の一部として決定された４８個の配列および本研究について実施された２１個の新しい配列を含んだ。９５個の追加のｆＨｂｐ遺伝子配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から、菌株ＭＣ５８（変種１／サブファミリーＢ）およびＭ１２３９（変種３／サブファミリーＡ）由来のｆＨｂｐアミノ酸配列に関して翻訳ＢＬＡＳＴ（ｔｂｌａｓｔｎ）検索を実行することによって得た。３つのゲノム配列（Ｐａｒｋｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００、４０４：５０２〜５０６；Ｐｅｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８，９１：７８〜８７；Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００、２８７：１８０９〜１８１５）を含む、本発明者らのコレクションおよびＧｅｎｂａｎｋからのこれらの１６４個のヌクレオチド配列の中から、６３個の固有のタンパク質配列をコードするｆＨｂｐ遺伝子を同定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ  ｆＨｂｐペプチドデータベース（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ）から得られたこれらの６３個、プラス６個の追加の固有ｆＨｂｐアミノ酸配列を、６９個の固有ｆＨｂｐペプチドの分析として用いた。個々のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号および／またはペプチド識別番号ならびに供給源菌株の特性は、図１Ａ〜１Ｇ（表７）に列挙されている。
【０１７５】
６９個のペプチドのうちの３８個（５５％）は、Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３の変種１群に、１５個（２２％）は変種２群に、１６個（２３％）は変種３群に分類された。６９株の供給源菌株のうち、１株は莢膜群Ａであり、５７株は群Ｂであり、７株は群Ｃであり、２株はＷ−１３５群であり、２株はＸ群であった。多座配列型（ＭＬＳＴ）情報は、５８株について入手でき、その菌株のうち、１５株はＳＴ−２６９クローン複合体由来であり、１２株それぞれはＳＴ−１１由来であり、１０株はＳＴ−４１／４４複合体由来であり、４株はＳＴ−１６２由来であり、５株はＳＴ−２１３複合体由来であり、３株それぞれはＳＴ−８複合体およびＳＴ−３２複合体由来であった。６株は他のクローン複合体由来であり、配列型ＳＴ−４、ＳＴ−３５、ＳＴ−７５１、ＳＴ−４８２１、ＳＴ−５４０３、およびＳＴ−６８７４を有した。ＭＬＳＴ情報なしの１１株は試験に利用できなかった。
【０１７６】
第２の研究において、データセットは、２００９年１１月現在のＮｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｐｅｒｌ／ａｇｄｂｎｅｔ／ａｇｄｂｎｅｔ．ｐｌ？ｆｉｌｅ＝ｎｍ＿ｆｈｂｐ．ｘｍｌ）にその後加えられた１７２個の追加の別個の配列をさらに含んだ。その２４２個の固有タンパク質を記載するにおいて（図１０Ａ〜１０Ｉ、表９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇウェブサイトにおけるペプチドデータベースからのタンパク質識別（ＩＤ）番号を用いた。
【０１７７】
完全または部分的タンパク質配列の分析についてのアプローチの組合せを用いた。最高の精度のために設定されたＭＵＳＣＬＥ（ＥＢＩ、ｖ３．７、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｕｓｃｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（Ｅｄｇａｒ  ＲＣ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１７９２〜７；Ｅｄｇａｒ  ＲＣ（２００４）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．５：１１３）を用いて配列を整列させた。アラインメントの精度を、目視検査により、およびプログラムＪＡＬＶＩＥＷ（Ｗａｔｅｒ  ｈｏｕｓｅ  ＡＭら、（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：１１８９〜９１）を用いて確認した。個々のモジュラー可変セグメントについても不変残基ブロック間のアラインメントを行った。ネットワークを、デフォルトパラメータでのＳｐｌｉｔｓＴｒｅｅ、バージョン４．０（Ｈｕｓｏｎ  ＤＨら、（２００６）ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２３：２５４〜６７）を用いて作成した。ブランチのサポートについての統計学的検定を、ブートストラップ方法（１０００回反復）を用いて行った。
【０１７８】
系統学的分析。完全または部分的タンパク質配列の分析を、ｗｗｗ．ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒ（Ｄｅｒｅｅｐｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００８、３６：Ｗ４６５〜４６９）でのプラットフォームで行い、それは以下の段階を含んだ。最高の精度のために設定されたＭＵＳＣＬＥ（ｖ３．７）（Ｅｄｇａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００４、３２：１７９２〜７）を用いて配列を整列させた。最高３つまでの挿入部位または欠失部位を含む個々のアラインメントを、隣接する不変配列により検査および検証した。系統樹を、ＰｈｙＭＬプログラム（ｖ３．０  ａＬＲＴ）において実行される最尤法を用いて再構築した。内部ブランチについての信頼性について、ブートストラップ法（１００回のブートストラップ反復）を用いて評価した。系統樹を、ＭＥＧＡ  ４．０（Ｔａｍｕｒａら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２００７、２４：１５９６〜１５９９）で示した。整合性のためにペプチド１に系統樹をルーティングした。可変セグメント型の配列内および配列間のパーセント配列同定を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７、２３：２９４７〜２９４８）を用いて決定した。
【０１７９】
組換えタンパク質のクローニング、発現、および精製。発現プラスミドを、以前に記載されているように（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：７８９〜９９）、ゲノムＤＮＡからのｆＨｂｐ遺伝子のＰＣＲ増幅によって構築した。遺伝子は、ｆＨｂｐ  ＩＤ  １（モジュラー群Ｉ）、２８（群ＩＩ）、２２（群ＩＩＩ）、１５（群ＩＶ）、７９（群Ｖ）、および７７（群ＶＩ）をコードした。Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ付き組換えｆＨｂｐを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳ）に発現させ、別の所で記載されているように（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＰＴら、（２００８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：２５６８〜７５）、精製した。
【０１８０】
マウス抗血清。週齡５週間のＣＤ−１雌マウスの群（群あたり１０匹のマウス）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＤ、ＵＳ）から入手した。マウスに、腹腔内経路（ＩＰ）を介してワクチンの３回の投与を３週間間隔で与え、免疫した。各１００μｌ用量は、フロイントのアジュバント（ＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）（初回投与については完全ＦＡ、後の投与については不完全ＦＡ）と混合された２０μｇの組換えタンパク質を含んだ。最後の投与から３週間後に、末梢血試料を採取した。Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコール下で動物手順を実施した。
【０１８１】
細菌株。血清殺菌活性を測定するために用いるＮ．メニンギティディス株の特性は、表７および９に要約されている。２株の分離株それぞれを、モジュラー群Ｉ〜ＶＩから選択した。５つのモジュラー群について、各ペアの一方の菌株は、下記に記載されているように測定した場合、ｆＨｂｐの低発現株であり、他方はより高い発現株であった。モジュラー群Ｖについて、中間の量のｆＨｂｐを発現する株のみが同定され、したがって、それをアッセイに用いた。
【０１８２】
補体依存性血清殺菌抗体活性。殺菌アッセイを、別の所で記載されているように、０．２５％のグルコース（ｗ／ｖ）および０．０２ｍＭのシチジン５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）を追加したミュラー−ヒントンブロス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳ）中で約２時間成長した初期対数期細菌を用いて行った［１１］。補体の供給源は、正常な溶血性補体活性を有する非免疫の健康な成人由来の血清であった。血清を、タンパク質Ｇセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳ）を通過させて、ＩｇＧ抗体を除去した（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＰＴら、（２００９）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９：１３６０〜８）。
【０１８３】
ｆＨｂｐの定量的ウェスタンブロッティング。Ｎ．メニンギティディス細胞を、ブロス培養で初期対数期まで成長させ、加熱殺菌し（５６℃で１時間）、遠心分離によって収集し、ＰＢＳ中に０．６の最適密度に再懸濁した。加熱殺菌された細胞（１〜４×１０７ＣＦＵ）におけるタンパク質を、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、製造会社により規定されているように、分離し、ウェスタンブロットモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳ）に移した。ブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳ）中、４℃で一晩、ブロッキングした後、ｆＨｂｐモジュラー群ＩおよびＩＶ（変種１群）を抗ｆＨｂｐ  ＪＡＲ５で、またはモジュラー群ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、もしくはＶＩ（変種２群または３群）についてはＪＡＲ  ３１で検出した（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＰＴら、（２００８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：４２４３〜４０）。二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（１：１０，０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ、ＵＳ）であった。
【０１８４】
結合したタンパク質の量を決定するために、赤外線走査装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳ）を用いて８００ｎｍの波長で膜を走査し、バンドの積分強度を、製造会社によって提供されているソフトウェア（バージョン３．０．２１）を用いて計算した。６つのモジュラー群のそれぞれからの精製された組換えｆＨｂｐを試験した結果は、ＩＲシグナル強度が、０．０３〜２μｇの範囲で負荷された量のｌｏｇ１０に比例することを示した（モジュラー群ＩおよびＶＩにおける対照タンパク質についての代表的なデータは図１１に示されている）。代表的な発現データは、モジュラー群ＩにおけるｆＨｂｐに関する２つの菌株について、およびモジュラー群ＶＩにおける２つの菌株について示されている（図１１）。
【０１８５】
統計学的解析。統計学的計算を、Ｍａｃ  ＯＳＸ、バージョン５．０ａ用のＰｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳ）を用いて行った。各国における異なるモジュラー群でのｆＨｂｐに関する分離株の割合は、二項分布から計算されたそれぞれ９５パーセント信頼区間と共に計算した。それぞれのモジュラー群における分離株の割合に見出される差を、フィッシャー正確確率検定（両側）またはカイ二乗解析によって比較した。
【０１８６】
実施例の概要
成熟ペプチドの配列の以前の分析に基づいて、ｆＨｂｐを２つのサブファミリー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００４、７２：２０８８〜２１００）または３つの変種群（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３）に分類した（図３）。本明細書に示された分析は、髄膜炎菌性ｆＨｂｐの全体構造が５つの可変セグメントの限られた数の特定のモジュラーの組合せを含み、各セグメントが、ｆＨｂｐペプチド１（変種１群）またはペプチド２８（変種３群）のそれぞれのセグメントとの配列類似性に基づいて、αまたはβと名付けられた２つの型の１つと対応している。下記の実施例セクションに記載され、かつ図４に示されているように、２つのＮ．ゴノレー相同分子種のアミノ酸配列がモジュラー群Ｖにおける天然キメラに対応する構造を有する（図８）。ナイセリアが遺伝子を水平伝播する性向（Ｈｏｔｏｐｐら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６、１５２：３７３３〜３７４９）は、本明細書に記載された髄膜炎菌性および淋菌性ｆＨｂｐペプチドの類似したモジュラー構造と合わせると、進化の間、それぞれの祖先遺伝子が、接合の点であると仮定される不変の残基ブロックをコードする保存配列において組み換わったことを示唆する。
【０１８７】
６９個の別個の髄膜炎菌性ｆＨｂｐペプチドの中で、６５個（９４％）は、６つのモジュラー群のうちの１つに割り当てることができる（図８）。ペプチドのほぼ６０％が、α型セグメントのみまたはβ型セグメントのみをそれぞれ含むモジュラー群ＩまたはＩＩにある。残りのペプチドは、αセグメントとβセグメントの天然キメラであった。モジュラーｆＨｂｐ群ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶ（図８）は、それぞれ、単一の組換え事象によって２つの祖先型から生じている。モジュラーｆＨｂｐ群ＶＩは、２つの組換え事象によって生じている。同様に、実施例セクションに記載された４つの例外的な配列は、それぞれ、別の他の保存残基ブロックをコードする座位における組換えを通して生じている。それぞれが２つの型のうちの１つであり得る５つのセグメントを含むタンパク質について、２５＝３２個の理論上の独立したモジュラーの組合せがある。本発明者らがたった６個のモジュラー群を同定したということは、流行性のｆＨｂｐモジュラー群に見出されるモジュールの特定の組合せについて選択する分子への機能的または構造的制約があることを示唆する。
【０１８８】
ｆＨｂｐ構造データは、２つの最近のＮＭＲ研究（Ｃａｎｔｉｎｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００９、ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｃ８００２１４２００；Ｍａｓｃｉｏｎｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００９、ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０８８３１２００）および補体制御タンパク質との複合体におけるｆＨｂｐの結晶学的研究（Ｃａｎｔｉｎｉら、２００９；Ｍａｓｃｉｏｎｉら、２００９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００９、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７７６９）から入手できる。結晶構造において、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらは、ｆＨの短い共通反復領域６（ＳＣＲ  ６）に位置する残基への結合が、ｆＨに結合することが知られた糖分子の部分を模倣するｆＨｂｐ構造における荷電アミノ酸残基によって媒介されることを報告した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００９）。図９に示されているような分析は、これらのｆＨ接触残基が、本研究において同定された５つの可変セグメントのうちの３つに位置することを示した。２１個のｆＨ接触残基のうち、５個が、本発明者らの研究において分析された６９個の固有ｆＨｂｐペプチドの間では不変であり、１０個の他の接触残基が保存されていた。
【０１８９】
ｆＨ接触残基を含む全ての３つのｆＨｂｐ可変セグメントはまた、殺菌性マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに影響するアミノ酸を含んだ（図９）。アミノ末端ドメインまたはカルボキシル末端ドメインにおけるｆＨ接触残基の中心位置は、エピトープ発現に影響する残基の末梢位置と異なるように思われた。この相互関係は、ｆＨと接触するｆＨｂｐ構造がまれにしか殺菌抗体を誘発しなかったことを示唆する。
【０１９０】
ワクチン候補としてのｆＨｂｐの１つの制限は、抗原多様性である（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＆  Ｇｒａｎｏｆｆ、２００９；Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３）。したがって、変種１群における組換えｆＨｂｐに対する血清抗体は、主に変種１タンパク質を含む菌株に対してのみ殺菌性であったが（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００７；Fletcherら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００４、７２；２０８８〜２１００；Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３）、変種２群または３群におけるｆＨｂｐへの抗体は、主に同種の変種２または３タンパク質を含む菌株に対して活性を有するが、変種１群におけるｆＨｂｐを有する菌株に対して活性をもたなかった。これらの観察は、変種１タンパク質が変種２または３タンパク質のとは系統学的に分離される（図６および７）、ｆＨｂｐのＣおよびＥセグメントにおけるエピトープが、殺菌抗体を誘発することについて、Ａ、Ｂ、またはＤセグメントにおけるものより、より重要であり、変種１タンパク質が変種２および／または３タンパク質と共にクラスター形成することを示唆する（図５および６）。しかしながら、セグメントＢを例外として可変セグメントの全ては、マウス殺菌性抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに影響すると以前に同定された残基を含んだ（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００８；Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９ｂ、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２００９．０２．０２１；Ｇｕｉｌｉａｎｉら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００５、７３：１１５１〜１１６０）。さらに、ｆＨの細菌表面への結合を阻害するモノクローナル抗体の一部（Ｍａｄｉｃｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６、１７７：５０１〜５１０）、および個々には殺菌性ではないモノクローナル抗体のいくつかの組合せは、協同的殺菌活性を誘発した（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００８；Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００９ｂ；Ｗｅｌｓｃｈら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００８、１９７：１０５３〜１０６１）。後者には、モノクローナル抗体ＪＡＲ  ４が挙げられ、それは、可変セグメントＡ上のエピトープに特異的であり（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００９ｂ）、可変セグメントＣ（例えば、ＪＡＲ  ３または５）または可変セグメントＥ（例えば、ＪＡＲ  １３またはモノクローナル抗体５０２）上のエピトープを有する第２のモノクローナル抗体との協同的殺菌活性を誘発した。
【０１９１】
ｆＨｂｐ逃避突然変異体の可能性を最小限にするために、理想的な髄膜炎菌ワクチンは、ｆＨｂｐ以外の抗原性標的を含むべきである（Ｇｉｕｌｉａｎｉら、２００６）。しかしながら、必要とされる総タンパク質の用量が大量であること、低い忍容性、または個々の成分の免疫原性の損失のため、多成分性ワクチン内に組み合わせることができる組換えタンパク質の数への制限があり得る。個々のｆＨｂｐ成分の数を減少させるために、本発明者らは、接合点としてＧ１３６を用いて、変種２タンパク質のカルボキシル末端ドメインと共に、変種１  ｆＨｂｐのアミノ末端ドメインを含むキメラｆＨｂｐ分子を設計した（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＆  Ｇｒａｎｏｆｆ、２００８）。生じたキメラタンパク質は、全ての３つの変種群由来のエピトープを発現し、キメラｆＨｂｐワクチンは、ｆＨｂｐ変種１、２、または３を発現する遺伝的に多様な菌株のパネルに対して殺菌活性を有する血清抗体を誘発した。組換えキメラワクチンの作製のために選択された接合点は、可変Ｃセグメントの中央の不変部分に位置し、それは、本研究において、本明細書に記載された天然ｆＨｂｐキメラタンパク質のいずれの接合点としても同定されなかった。Ｃセグメントに隣接する天然の接合点を用いることにより、他のワクチンよりも広い殺菌抗体を誘発する組換えキメラｆＨｂｐワクチンの改善をもたらすことができる。異種性ｆＨｂｐ変種由来のエピトープを導入するために、可変セグメントの１つまたは複数にアミノ酸突然変異を導入することもまた可能であり得る（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＆  Ｇｒａｎｏｆｆ  ２００８；Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００９ｂ）。したがって、キメラｆＨｂｐポリペプチドにおけるそのようなｆＨ結合性エピトープの存在は、Ｎ．メニンギティディスに対する保護を促進することができる抗体の産生を提供することができる。
【０１９２】
結論として、本明細書における分析は、ｆＨｂｐの全体構造が、不変配列に隣接した可変セグメントの限られた数の特定のモジュラー組合せによって定義することができる。まとめて考えると、データは、組換えが、Ｎ．メニンギティディス祖先配列とＮ．ゴノレー祖先配列との間に起こって、髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質の抗原的に多様なファミリーを生じたことを示唆する。このように、実施例に示されたデータは、ｆＨｂｐ変種の進化への洞察を提供し、ペプチド変種の群の分類のための合理的根拠を提供する。集団ベースの調査研究は、保因および／または疾患を引き起こす菌株の間で異なるモジュラー群由来のｆＨｂｐの普及率、ならびにｆＨｂｐモジュラー群と、莢膜群、クローン複合体、およびＰｏｒＡ可変領域などの他の菌株特性との関係を定義するために必要とされるであろう。
【０１９３】
この発見をもたらした研究の詳細は下記に述べられている。
【０１９４】
(実施例１）
系統学的分析
６９個の固有のｆＨｂｐアミノ酸配列を整列させて、図３に示された系統樹を作成した。各配列について、ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇにおけるｆＨｂｐペプチドデータベースにおいて割り当てられたペプチド識別番号が示されており、既知の場合には、多座配列型（ＭＬＳＴ）クローン複合体が括弧に入れて示されている。下の方の左側のブランチは、Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３によって定義されているような変種群１を示す（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００４のサブファミリーＢ）；サブファミリーＡは、２つのブランチの変種群２および３を含んだ。変種群１、２、および３のそれぞれについての原型ペプチドは、矢印で示されており、それぞれの遺伝子の供給源菌株の名前を付けている。系統樹を、方法に記載されているように、複数の配列のアラインメントによって構築した。下端に示されたスケールバーは、１００残基あたり５アミノ酸の変化を示す。
【０１９５】
分析により、サブファミリーＡおよびＢと以前に名付けられた２つの主要なブランチが示された（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００４）。サブファミリーＡは、抗原性変種群２および３におけるｆＨｂｐ配列を含み、サブファミリーＢは、抗原性変種群１におけるｆＨｂｐに対応した（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３）。いくつかのクローン複合体について、変種群のそれぞれにおけるｆＨｂｐを有する菌株の例があった（例えば、ＳＴ−１１について、変種１群におけるペプチド２、３、６、９、１０、１１、および７８、変種２群におけるペプチド１７、２２、２３、および２７、ならびに変種３群におけるペプチド５９）。ＳＴ−３２クローン複合体由来の菌株は、変種群のうちの２つにおけるｆＨｂｐ（変種１群におけるペプチド１および８９、ならびに変種３群におけるペプチド７６）を有し、ＳＴ−８クローン複合体は、１つの変種群においてのみのｆＨｂｐ（変種２群におけるペプチド１６、５０、および７７）を有した。観察されたクローン複合体の全部におけるｆＨｂｐ変種の分布は、下記の表２に示されている。列挙されたペプチドＩＤは、ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇでのｆＨｂｐペプチドデータベースによって割り当てられている。
【０１９６】
0005883380.tif 000004
【０１９７】
（実施例２）
ｆＨｂｐの構造はモジュラーである
タンパク質を可変残基のセグメントへ分離する２〜５個の不変残基のブロックを同定した。詳細については図４を参照されたい。不変残基は、縦に長い長方形として示されている。上部の３つのパネルは、群１、２、および３における３つのＮ．メニンギティディスｆＨｂｐ変種（それぞれ、ペプチドＩＤ  １、１６、および２８）の代表的な構造を示す。３つの変種のそれぞれが、反復性アミノ末端エレメント（Ｎ−ｔｅｒｍ）、および可変セグメントＡ〜Ｅを有し、その可変セグメントは、場合によっては、変種間で長さが異なった。各可変セグメントにおける最後の残基のアミノ酸の位置が示されている。
【０１９８】
アミノ末端エレメントを除いて、２つのＮ．ゴノレー相同分子種（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００４９６９およびＣＰ００１０５０）において同一の個々の不変アミノ酸配列および同種の可変セグメントがあり、全体としては、髄膜炎菌のｆＨｂｐペプチド７９（変種３髄膜炎菌タンパク質）と９６％のアミノ酸配列同一性を有した。第１の研究において、全ての６９個のｆＨｂｐ配列変種は、５つのモジュラー可変セグメントに隣接する２〜５個の不変残基のブロックを有した（図４）。これらの不変残基はまた、研究２において分析された１７２個の追加のｆＨｂｐ変種のうちの１７０個にも保存されていた。１つの例外であるタンパク質ＩＤ  ３３は、ＡセグメントとＢセグメントの間にＳＲＦＤＦの代わりにＳＨＦＤＦを有し、他の例外であるタンパク質ＩＤ  １５０は、ＤセグメントとＡセグメントの間にＩＥＨＬＫの代わりにＩＥＨＬＥを有した（図４）。
【０１９９】
不変残基のブロックは、髄膜炎菌タンパク質および淋菌タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の組換えのための天然の接合点を表すように思われた。これらの接合点によって定義される可変セグメントそれぞれの系統発生を分析した。下記の６９個の別個の髄膜炎菌ｆＨｂｐペプチド変種の分析において、アミノ酸残基の番号付けは、変種１群におけるＭＣ５８由来の遺伝子によってコードされる成熟ｆＨｂｐペプチド１に基づいている（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００３）。それぞれの変種２タンパク質および変種３タンパク質についての番号付けは、変種１タンパク質のそれとそれぞれ、−１および＋７、異なる（図４）。
【０２００】
(実施例３)
アミノ末端反復性エレメント
全ての６９個の配列について、成熟ｆＨｂｐは、シグナルペプチダーゼＩＩによって脂質付加されるシステイン残基で始まり、その後、３個の不変アミノ酸残基ＳＳＧが続いた。この不変配列の後に、１〜６個のグリシンおよび／またはセリン残基からなる反復性可変配列、その後、２個の不変グリシン残基が続いた（図４）。アミノ末端エレメントの可変部分は、６９個のペプチドのうち３４個（ほぼ全部、変種１群内、下記に示された表３）について単一のグリシン残基からなり、またはペプチドのうちの１２個（全部、変種２群内）についてはＣＧ残基からなった。他の共通の可変配列は、ＧＧＧＳＧＧであった（変種１群において８個、変種３群において７個）。
【０２０１】
0005883380.tif 000005
【０２０２】
(実施例４）
下流可変セグメント
本発明者らがＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥと名付けた５つの可変セグメントがあった（図４）。特定のシグネチャアミノ酸残基の存在および配列類似性に基づいて（表４）、５つのセグメントのそれぞれが、２つの型のうちの１つへ分離することができた。その型の一方は、シグネチャアミノ酸残基、および抗原性変種１群におけるペプチドとの配列類似性を有した。他方の型は、シグネチャアミノ酸残基、および抗原性変種３群におけるペプチドとの配列類似性を有し、それはまた淋菌相同分子種のそれらと類似していた（図４参照）。下記に示された表４も参照されたい。
【０２０３】
0005883380.tif 000006
【０２０４】
分類を目的として、セグメントの第１群はα型と、第２群をβ型と名付けられている。α型またはβ型内でのそれぞれのセグメントのアミノ酸同一性は８０％から１００％までの範囲である（表４）。対照的に、型の間でのセグメントの同一性は、分子のＮ末端部分の保存領域に位置しているセグメントＡについての６９〜７８％から、そのタンパク質の非常に少ない保存領域における残基９８〜１５９を含むＣセグメントにおける３２〜４５％までの範囲であった（表４）。各セグメントについて、別個の配列変種は、可変セグメントを表すための文字、Ａ〜Ｅで始まり、続いて、上記のそれぞれの型を有する残基の存在を示すためのαまたはβ、その後に各別個の配列についての番号が続く、固有の識別名が割り当てられた（図２Ａ〜２Ｅ（表８）に列挙）。
【０２０５】
セグメントＡは、不変ＧＧ配列のすぐ後のアミノ酸残基８から始まり、位置７３にわたる（表４）。６９個のｆＨｂｐ変種の間において、セグメントＡは、１６個の別個のα配列変種および９個の別個のβ配列変種を含んだ（図５）。複数のペプチドがセグメント内に同一の配列を有する場合、ペプチドの数が括弧に入れて示されている。スケールバーは、１００残基あたり５アミノ酸の変化を示す。系統樹に基づいて、（図５に示された）変種１群におけるｆＨｂｐの大部分のＡセグメントは、変種２群におけるそれとクラスターを形成するが、変種３群におけるｆＨｂｐのＡセグメントは別々のクラスター内であった。最も一般的なα変種（Ｎ＝１４）をＡ．α．１と名付け、それは、変種１群において４個のｆＨｂｐペプチドに、および変種２群においては１０個に存在した。最も一般的なβ変種をＡ．β．１と名付け、それは変種３群の全てにおいて６個のペプチドに存在した。
【０２０６】
セグメントＢは、不変ＳＲＦＤＦ配列のすぐ後の位置７９から始まり、位置９３にわたる（表４）。６９個のｆＨｂｐペプチドの間において、セグメントＢは、７個の異なるα変種配列および単一のβ配列を含んだ（図５）。系統学的分析により、変種１群および２群におけるｆＨｂｐペプチドのＢセグメントが一緒にクラスターを形成し（図５）、それは変種３群におけるそれとは異なることが示された。最も一般的なＢセグメントであるＢ．α．１は、４０個のｆＨｂｐペプチドに存在した（変種１群において２８個、変種２群において１２個）。
【０２０７】
ＡセグメントおよびＢセグメントとは対照的に、変種２群および３群におけるｆＨｂｐのそれぞれのＣセグメント（残基９８〜１５９）およびＥセグメント（残基１８６〜２５３）は一緒にクラスターを形成し、変種１群におけるｆＨｂｐのそれとは分離していた（図６）。変種群１におけるｆＨｂｐに関して菌株のＤセグメント（残基１６２〜１８０）の全部がα型であったが、変種２群または３群におけるｆＨｂｐペプチドのそれはαまたはβであった（図７）。最も一般的なＤセグメントであるＤ．α．１（Ｎ＝３９）は、２１個のｆＨｂｐ  ｖ．１ペプチド、９個のｖ．２ペプチド、および９個のｖ．３ペプチドに存在した。
【０２０８】
(実施例５）
モジュラー群によるｆＨｂｐ変種の分類
上記のｆＨｂｐの可変セグメントの系統学的分析に基づいて、研究されたこれらの異なるｆＨｂｐ変種の大部分は、６つの別個のｆＨｂｐモジュラー群（Ｉ〜ＶＩ）に分類された（図８）。６９個のｆＨｂｐペプチドのうちの４０個（５８％）は、α型セグメントのみ（Ｎ＝３３）、またはβ型セグメントのみ（Ｎ＝７）を含み、それらは、それぞれ、ｆＨｂｐモジュラー群ＩおよびＩＩと名付けられた（図８）。αセグメントは灰色で示され、βセグメントは白色で示されている。残りの２９個のペプチド（４２％）は、異なるαセグメントまたはβセグメントの組換えに由来する４つのキメラのうちの１つに分類することができ（ｆＨｂｐモジュラー群ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩと名付けられた；Ｎ＝２５）、または下記のように、５つのセグメントのうちの１つが、他の保存された配列ブロックにおける例外的な接合位置を用いる他のキメラであった（Ｎ＝４）。図６において見られるように、各モジュラー群における代表的なペプチドは、ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇにおけるｆＨｂｐデータベースからのペプチド識別番号によって示されている。各ｆＨｂｐモジュラー群内で観察される固有の配列の数は右に示されている。この分析は、それらのセグメントの１つにおいて例外的な接合点を有する４つのペプチド配列を除外した。
【０２０９】
上記のアミノ末端反復性エレメントを、モジュラーｆＨｂｐ群を定義するために用いなかったが、モジュラー群Ｉ，ＩＩＩ、およびＶＩペプチド配列の大部分（８８〜１００％）は、１個または２個のグリシン残基のアミノ末端反復性エレメントを有した（表３）。対照的に、モジュラー群ＩＩ、ＩＶ、およびＶにおけるペプチドの大部分（７５〜１００％）は、３〜６個のグリシン残基およびセリン残基のアミノ末端エレメントを有した。このアミノ末端エレメントの長さは、細菌膜からのそのタンパク質の距離、および特定のエピトープの表面到達性に影響する可能性がある。
【０２１０】
第２の研究において、１７２個の新しいｆＨｂｐ変種のうち３個を除く全ては、６つのモジュラー群の１つに分類することができた（Ｉ〜ＶＩ、図４、パネルＡ）。３個の例外（タンパク質ＩＤ  ２０７、６７、および１７５）は、α型系統またはβ型系統由来のモジュラーセグメントの別個の組合せを有し、３つの新しいモジュラー群の１つに割り当てられた（それぞれ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸ）。
【０２１１】
拡大されたデータベースにおける２４２個の別個のｆＨｂｐ変種のうち、１２５個のタンパク質が、αセグメントのみを含むモジュラー群Ｉ内であり、２０個のタンパク質がモジュラー群ＩＩ（もっぱらβセグメント）内であった。残りの９７個のｆＨｂｐ配列変種は、αセグメントおよびβセグメントの天然のキメラであり、モジュラー群ＩＩＩ〜ＩＸに割り当てられた（合わせて、全変種の４０パーセント）。図４は、モジュラー群のそれぞれについてＭａｓｉｇｎａｎｉら、（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９７：７８９〜９９によって記載されているようなｆＨｂｐ変種群を示す。変種群は、それぞれのタンパク質の全体的なアミノ酸配列の関連性に基づいて割り当てられた。
【０２１２】
(実施例６）
可変セグメント内に接合点を含むキメラｆＨｂｐペプチド
４個のｆＨｂｐ配列は、セグメントの２つの間の接合点の１つが別の不変配列を利用することを除いて、上記のものと類似したモジュラー構造を有した。例えば、ｆＨｂｐペプチド５５は、Ａセグメントがβ型配列からα型配列へ、残基７４から始まるＳＲＦＤＦよりむしろ、残基５０から始まる不変ＡＱＧＡＥで切り替わることを除いて、モジュラー群ＩＶにおけるペプチドと類似した（図８）。このＡセグメントは、Ａ．β．９と名付けられた（他のβ型Ａセグメントに対して、α型Ａセグメントに対してより高い配列同一性という理由でβ；図５）。２つの他のｆＨｂｐペプチド、２４および２５（図２Ａ〜２Ｅ（表８））は、モジュラー群ＩＩＩにおけるペプチドと類似したモジュラー構造を有したが（図８）、位置９４におけるＧＥＦＱの代わりに残基８２から始まる不変ＩＥＶにおいてα型からβ型配列へ切り替わるＢセグメントを有した。Ｂ．α．３と名付けられたこの例外的Ｂセグメントは、他のα型Ｂセグメントに対して、β型Ｂセグメントに対してより高い配列同一性という理由でα型として分類された（図５）。４つ目の例外的ｆＨｂｐモジュラー構造、ペプチド８２（図２Ａ〜２Ｅ（表８））は、Ｅ．β．１０と名付けられたそれのＥセグメントが、位置１８１から始まるＩＥＨＬＫの代わりに残基Ａ１９６でα型配列からβ型へ切り替わることを除いて、Ｖ型と類似した（図６）。
【０２１３】
(実施例７）
可変および不変ｆＨｂｐセグメントの構造的特徴
ｆＨｂｐのそれぞれの可変セグメントおよび不変セグメントを、ｆＨｂｐ結晶構造からの公開された座標に基づいて分子モデルへマッピングした（図９）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００９）。パネルＡにおいてそれぞれ、ＮおよびＣとラベルされたアミノ末端およびカルボキシル末端は、パネルＢおよびＣにおいて同一の位置にある。ＰｙＭｏｌ（ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて図を構築した。パネルＡ、Ｂ、およびＣの中央にあるモデルは、左端の対応するモデルからＹ軸を中心に１８０度回転しており、右端のモデルは、真ん中のモデルと比較してＸ軸を中心に９０度回転している。
【０２１４】
パネルＡのリボンモデルは、２つの以前記載されたｆＨｂｐの主要なドメインを示し（Ｃａｎｔｉｎｉら、２００９；Ｍａｓｃｉｏｎｉら、２００９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００９）、それぞれが、非依存的に折り畳まれたβ構造を含み、それらのβ構造は、可変セグメントＣに位置する構造化された４つのアミノ酸残基リンカーによって一緒に連結されている。残基８から始まり残基１３６に及ぶアミノ末端ドメインは、可変セグメントＡ、および可変セグメントＢ、および可変セグメントＣの一部を含む（成熟タンパク質の最初の１４個の残基は結晶構造に存在しないことに留意されたい）。残基１４１から２５５に及ぶカルボキシル末端ドメインは、Ｃ可変セグメントのカルボキシル末端部分、ならびにＤ可変セグメントおよびＥ可変セグメントの全体を含む。
【０２１５】
パネルＢは、対応する空間充填モデルを示す。ｆＨｂｐ−ｆＨ複合体の構造に基づいてｆＨと接触することが以前に報告されたアミノ酸残基は、黒色で描かれている。これらの残基は、可変セグメントＡ、Ｃ、およびＥ上でクラスターを形成し、パネルＢの真ん中および右端に示されたモデルにおいて目に見える。ｆＨは、生きている細菌上のｆＨｂｐに結合することがわかっているので（Ｍａｄｉｃｏら、２００６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００６）、この結合部位は表面に露出していなければならない。５つの可変セグメントのそれぞれに隣接する不変の残基ブロックは、そのタンパク質の反対面に位置し、パネルＢおよびＣにおいて白色で示されている（左端モデル）。シグナルアンカーを含むアミノ末端は、そのタンパク質のこの面から伸びるので（パネルＢにおける右端のモデルの底表面）、不変残基は、細胞壁に繋ぎ止められた分子の表面上全体に位置すると予想される。膜結合表面におけるこれらの不変配列の存在は、おそらく細菌細胞膜上にｆＨｂｐを繋ぎ止め、および／または方向付けるためのパートナータンパク質の必要性を示す、構造的制約があることを示唆する。
【０２１６】
以前の研究では、１１個の殺菌性抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体のエピトープがマッピングされた（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００８；Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００９ｂ；Ｇｉｕｌｉａｎｉら、２００５；Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２００９、３８６：９７〜１０８）。パネルＣ（図９）において、これらのエピトープのそれぞれの発現に影響するアミノ酸は黒色で描かれており、前に定義されたｆＨ接触残基（パネルＢにおいてのように黒色で示されている）。セグメントＢを除いて、可変セグメントの全部は、殺菌性モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含んだ。エピトープに影響するアミノ酸は、一般的に、ｆＨｂｐのアミノ末端ドメインおよびカルボキシル末端ドメインの末梢に位置したが、ｆＨと接触する残基は、その２つのドメインのそれぞれの中央部分にクラスターとなって位置した。ｆＨのｆＨｂｐへの結合を阻害することが以前に報告されたＪＡＲ３、ＪＡＲ５、またはＪＡＲ１３などの特定のモノクローナル抗体のエピトープ（Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００８；Ｂｅｅｒｎｉｎｋら、２００９ｂ）は、ｆＨ接触残基の一部に近接して位置するアミノ酸を含んだ。しかしながら、２つのセットの残基間に重複の例はなかった。
【０２１７】
(実施例８）
異なる国における疾患を引き起こす分離株の間でのｆＨｂｐモジュラー群の頻度
上記の分析により、ｆＨｂｐモジュラー群多様性の程度に関する情報が提供された。この以下の分析について、Ｍｕｒｐｈｙら、（２００９）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００：３７９〜８９によって報告された米国およびヨーロッパにおける系統的に収集されたＢ群からのｆＨｂｐ配列データを用いた。分離株は、２００１年から２００５年の間の米国における症例（Ｎ＝４３２）由来、ならびに２００１年〜２００６年の間の英国（Ｎ＝５３６）、フランス（Ｎ＝２４４）、ノルウェー（Ｎ＝２３）、およびチェコ共和国（Ｎ＝２７）における症例由来であった。米国データに、別の研究の一部として米国における複数の場所で系統的に収集されている１４３株の追加の分離株のｆＨｂｐ配列を補充した（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ  ＰＴら、（２００７）  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９５：１４７２〜９）。
【０２１８】
合計１４０５個の系統的に収集されたＢ群分離株の中で、モジュラー群Ｉが５９．７％、群ＩＩが１．７％、群ＩＩＩが８．１％、群ＩＶが１０．６％、群Ｖが６．１％、および群ＶＩが１３．６％に見出された。新しいモジュラー群、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸは、それぞれ、≦０．１％に見出された。Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：７８９〜９９の変種群分類によって層別化した場合の異なる国におけるｆＨｂｐモジュラー群のそれぞれの分布は図１２に示されている。この分析について、ノルウェーおよびチェコ共和国からのデータは、これらの収集物のそれぞれにおける分離株の数がモジュラー群のそれぞれの頻度の正確な推定には小さすぎるため、除外された。２つの米国収集物におけるモジュラー群のそれぞれのパーセンテージは、別々に示されている。
【０２１９】
Ｍａｓｉｇｎａｎｉの変種１群における分離株は、モジュラー群Ｉ、ＩＶ、およびＶＩＩからなった。もっぱらα型セグメントを有するモジュラー群Ｉ菌株は、全ての３つの国において優勢であった（全分離株の５４〜６４パーセント）。しかしながら、英国において、全分離株の２３％は、２つの米国収集物における＜１％、およびフランス由来の分離株の３パーセントと比較して、α型セグメントおよびβ型セグメントの天然キメラであるモジュラー群ＩＶであった（カイ二乗によりＰ＜０．００１）。モジュラー群ＶＩＩにおいてたった１個の分離株だけがあったため（フランス）、このモジュラー群の頻度は図１２に示されていない。
【０２２０】
変種２群における分離株は、全てがα型セグメントおよびβ型セグメントの天然キメラであるモジュラー群ＩＩＩおよびＶＩを含んだ。モジュラー群ＩＩＩまたはＶＩは、２つの米国収集物においておよそ等しい割合の分離株に存在したが、モジュラー群ＶＩは、英国およびフランス由来の変種２群分離株の間で優勢であった。
【０２２１】
変種３群に関する分離株は、モジュラー群ＩＩ（もっぱらβ型セグメント）、およびキメラであるモジュラー群Ｖ、ＶＩＩＩ、およびＩＸを含んだ。フランスおよび英国において、モジュラー群Ｖは、変種３ｆＨｂｐに関する分離株の大部分を占めたが、２つの米国収集物においては、ほぼ等しい数のモジュラー群ＩＩまたはＶタンパク質があった。モジュラー群ＶＩＩＩおよびＩＸは、単離物の＜０．１％を占めた。低いパーセンテージのため、これらの群は図１２に示されていない。
【０２２２】
(実施例９）
モジュラー群およびｆＨｂｐ発現に関する抗ｆＨｂｐ血清殺菌活性への菌株の感受性
図１３は、モジュラー群Ｉ〜ＶＩを代表する組換えｆＨｂｐワクチンで免疫されたマウス由来の血清プールのヒト補体殺菌力価を示す。バーの高さは、特定の試験菌株に対して試験した場合の６つの抗血清（モジュラー群あたり３〜４つのプール）のそれぞれの代表的な中央値力価を表す。例えば、上部左パネルは、モジュラー群ＩにおけるｆＨｂｐの高発現株である（相対的発現は＋＋＋によって表されている；実際の値は下記の表５に示されている）、菌株Ｈ４４／７６についてのデータを示す。同種の抗ｆＨｂｐモジュラー群Ｉ抗血清（黒色バー）の中央値殺菌力価は約１：６０００であった。菌株Ｈ４４／７６に対する５つの異種性抗ｆＨｂｐモジュラー群抗血清（白色バー）のそれぞれの力価は、１〜２ｌｏｇ１０分の１であり、＜１：１０（抗血清対モジュラー群ＩＩ）〜約１：２００（抗血清対モジュラー群ＩＶ）の範囲であった。同種のｆＨｂｐモジュラー群ＩＩ（変種３パネル内の菌株ＳＫ１０４）またはＩＶ（変種１パネル内のＮＭ４５２）を有する対照菌株に対して試験した場合の抗モジュラー群ＩＩおよびＩＶ抗血清の対応する中央値力価は＞１：２０００であった。このように、これらおよび他の異種性抗血清は、それぞれの同種ｆＨｂｐモジュラー群を有する対照菌株に対して測定した場合、高抗体活性を有した。
【０２２３】
低ｆＨｂｐ発現株に対する殺菌力価は、高発現株に対してより低かった（［＋／−と表された］低発現株についてのデータを示す図１３の右側のそれぞれのグラフを、より高い発現株を示す左側のグラフと比較）。例えば、抗モジュラー群Ｉ抗血清は、高ｆＨｂｐモジュラー群Ｉ発現株のＨ４４／７６に対して１：６０００の力価を有するが、低ｆＨｂｐモジュラー群Ｉ発現株の菌株０３Ｓ−０４０８に対して約１：１００の力価を有した。（モジュラー群Ｖについて両方の試験株は、高ｆＨｂｐ発現株および低ｆＨｂｐ発現株のペアを入手できなかったため、中間の発現株であった。）
【０２２４】
異種性モジュラー群からのｆＨｂｐ低発現の菌株に対して、高発現株についてより、抗ｆＨｂｐ殺菌活性の交差反応性がより低い傾向があった（例えば、低発現株について０３Ｓ−０４０８（モジュラー群Ｉ）、Ｍ０１５７３（モジュラー群ＩＶ）、およびＲＭ１０９０（モジュラー群ＩＩＩ）についてのデータを参照。それらは、それぞれのより高いｆＨｂｐ発現株（Ｈ４４／７６、ＮＭ４５２、および０３Ｓ−０６７３；図１３）に対するより広い殺菌活性と比較して、それらそれぞれの同種モジュラー群によってのみ殺滅された）。菌株ＮＭＢ（ｆＨｂｐモジュラー群ＶＩ）は、抗ｆＨｂｐ殺菌活性に対して完全に耐性であり（力価＜１：１０）、それは、明らかに低ｆＨｂｐ発現の結果であった（表５）。ワクチンのアミノ酸配列を用いて、ＮＭＢによって発現したｆＨｂｐと単一のアミノ酸だけ異なる抗モジュラー群ＶＩ抗血清を調製し、その結果生じた抗血清は、ｆＨｂｐモジュラー群ＶＩに関するより高い発現株（９６１−５９４５）に対して殺菌性であった。さらに、耐性株のＮＭＢは、０．１５μｇ／ｍｌの濃度での対照抗ＰｏｒＡモノクローナル抗体によって殺滅され、それは、抗ｆＨｂｐ感受性９６１−５９４５株の殺滅に必要とされる抗ＰｏｒＡモノクローナル抗体のそれと一致した。
【０２２５】
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【０２２６】
ｆＨｂｐの定量的測定に用いられた抗体および各抗体に対する様々なモジュラー群タンパク質の反応性は、下記の表に示されている。
【０２２７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図２Ｅ−３】
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【図２Ｅ−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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