(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を、クエン酸濃度が６２．５ｍＭ以上である液体培地中で培養すること、及び
培養開始時における液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満であり、かつ、
酵母の増殖状態が誘導期又は対数増殖期に、液体培地のクエン酸濃度を６２．５〜２００ｍＭに調整することを含む、酵母の培養方法。
【請求項２】
培養開始時における液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満であり、かつ、
培養開始後９時間以内に、液体培地のクエン酸濃度を６２．５〜２００ｍＭに調整することを含む、請求項１記載の酵母の培養方法。
【請求項３】
前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌である請求項１又は２に記載の酵母の培養方法。
【請求項４】
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母の培養方法。
【請求項５】
酵母を、クエン酸濃度が６２．５ｍＭ以上である液体培地中で培養すること、及び
培養開始時における液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満であり、かつ、
酵母の増殖状態が誘導期又は対数増殖期に、液体培地のクエン酸濃度を６２．５〜２００ｍＭに調整することを含む、酵母のグルタチオン含有量を高める方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母の培養方法で培養された酵母を回収することを含む、酵母の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母の培養方法で培養された酵母から、酵母エキスを抽出することを含む、酵母エキスの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母の培養方法で培養された酵母、及び前記酵母から調製された酵母エキスからなる群より選択される１以上の製造物を原料として用いることを含む、飲食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌体中のグルタチオン含有量を高めることができる酵母の培養方法、及び、前記培養方法で培養された酵母から酵母エキスを製造する方法に関する。
本願は２０１０年３月２６日に日本に出願された特願２０１０−０７３８１８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ビール酵母やパン酵母を始めとするサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌に属する酵母は、天然のビタミンＢ群、アミノ酸、及びミネラル等をバランス良く含有しており、ビールやパンの製造に使われる以外にも有効活用されている。例えば、乾燥酵母は我が国において長年にわたって医薬品、食品原料、及び調味料などとして使われており、栄養価と安全性の高い素材として認知されている。また、近年は酵母エキスの原料酵母としても広く用いられている。【０００３】
酵母エキスとは、酵母の培養物から調製され、アミノ酸等を豊富に含むものであり、従来から、旨味やコクを付与するための調味料等のような食品添加剤として使用されている。特に昨今の天然志向の高まりから、調味料としての酵母エキスの需要は増加傾向にある。呈味成分を豊富に含む酵母から調製された酵母エキスは、より優れた調味料として使用し得ることが期待できるため、呈味成分をより多く含む酵母の開発が盛んに行われている。【０００４】
酵母菌体内の代表的な含硫化合物として、グルタチオンとＳ−アデノシルメチオニンがあげられる。グルタチオンは肝機能回復、及び抗酸化活性等を有するきわめて有用な物質であり、近年、調味料や健康食品等の飲食品の添加剤や、化粧品の基材等、幅広い用途が期待されている。一方、Ｓ−アデノシルメチオニンは、様々な生体反応においてメチル基の供与体として作用することが知られている。その他、抗うつ作用、関節症の緩和、及び肝機能回復等の効果が報告されており、これら含硫化合物が生体に対して重要な役割を果たしていることが知られている。【０００５】
含硫化合物は、通常、メチオニンやシステイン等の含硫アミノ酸を用いて、ＭＥＴ遺伝子（メチオニン合成遺伝子）群をはじめとする多くの遺伝子の転写及び翻訳産物により合成される。そこで、より含硫化合物を高生産する酵母を得るために、酵母が有しているこれらの含硫化合物の合成に係る遺伝子に変異を生じさせ、含硫化合物高含有酵母変異株を製造することが広く行われている。例えば、グルタチオン高含有酵母を製造する方法として、（１）突然変異処理により、エチオニン及び亜硫酸塩を同時に含む培地に生育可能となったキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母の変異株を好気的に培養することにより、菌体中のグルタチオン含有量を高める方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１５１８９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グルタチオン自体やグルタチオンを豊富に含む酵母エキス等を、より低コストで効率よく工業上量産するためには、グルタチオン含有量の高い酵母を利用することが重要である。
特許文献１に記載の方法のように、変異処理等を行い遺伝的な改変が施された酵母の中から、よりグルタチオン含有量の高い酵母をスクリーニングする方法によっても、グルタチオン高含有酵母を得ることができるが、変異処理及びスクリーニングは手間と労力を要し、また、必ずしもグルタチオン高含有酵母を得ることができない場合も多い。
また、組換え体よりも天然の酵母（野生株）が求められる場合があり、変異処理を行うことなく、酵母中のグルタチオン含有量を高める方法の開発が望まれている。例えば、酵母自体や酵母エキスを食用として用いる場合には、組換え体よりも野生株が好まれる場合がある。【０００８】
本発明は、遺伝的な改変を施すことなく、菌体中のグルタチオン含有量を高めることができる酵母の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、サッカロマイセス属菌等の酵母を培養する際に、液体培地に所定量以上のクエン酸を添加することにより、当該酵母のグルタチオン含有量を高められることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、
（１） 酵母を、クエン酸濃度が６２．５ｍＭ以上である液体培地中で培養すること、及び 培養開始時における液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満であり、かつ、酵母の増殖状態が誘導期又は対数増殖期に、液体培地のクエン酸濃度を６２．５〜２００ｍＭに調整することを含む、酵母の培養方法、
（２）培養開始時における液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満であり、かつ、培養開始後９時間以内に、液体培地のクエン酸濃度を６２．５〜２００ｍＭに調整することを含む、前記（１）記載の酵母の培養方法、
（３） 前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌である前記（１）又は（２）に記載の酵母の培養方法、
（４） 前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母の培養方法、
（５） 酵母を、クエン酸濃度が６２．５ｍＭ以上である液体培地中で培養すること、及び培養開始時における液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満であり、かつ、酵母の増殖状態が誘導期又は対数増殖期に、液体培地のクエン酸濃度を６２．５〜２００ｍＭに調整することを含む、酵母のグルタチオン含有量を高める方法、
（６） 前記（１）〜（４）のいずれかの酵母の培養方法で培養された酵母を回収することを含む、酵母の製造方法、
（７） 前記（１）〜（４）のいずれかの酵母の培養方法で培養された酵母から、酵母エキスを抽出することを含む、酵母エキスの製造方法、
（８） 前記（１）〜（４）のいずれかの酵母の培養方法で培養された酵母、及び前記酵母から調製された酵母エキスからなる群より選択される１以上の製造物を原料として用いることを含む、飲食品の製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の酵母の培養方法によれば、十分量のクエン酸を含む液体培地中で培養するという簡単な工程によって、サッカロマイセス属菌等の酵母のグルタチオン含有量を増大させることができる。また、当該培養方法によって培養された酵母は、グルタチオン含有量が十分に高いため、当該酵母を用いることにより、グルタチオン含有量が高い酵母エキスや飲食品を、簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、液体培地中のクエン酸濃度ごとに、ＧＳＨ含有率（％）を示したグラフである。
【図２Ａ】実施例２において、各培養物のＧＳＨ含有率（％）を、糖蜜培地（１）に添加したクエン酸濃度ごとに示したグラフである。
【図２Ｂ】実施例２において、培養終了時点における液体培地のｐＨ（終ｐＨ）を、糖蜜培地（１）に添加したクエン酸濃度ごとに示したグラフである。
【図３Ａ】実施例５において、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１２２株の、ＧＳＨ含有率及びＯＤ６００の測定結果を示した図である。
【図３Ｂ】実施例５において、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１２４株の、ＧＳＨ含有率及びＯＤ６００の測定結果を示した図である。
【図４】実施例１１において、各サンプル中の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した結果を示した図である。
【図５】参考例１において、培養前後の各上清中のクエン酸含有量の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明及び本願明細書においては、特に記載がない限り、グルタチオンとは、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの双方を意味し、総グルタチオン含量とは、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンの合計含量を意味する。
【００１４】
本発明及び本願明細書において、酵母の乾燥菌体重量当たりのグルタチオン含有量は、微生物中のグルタチオン含有量を定量する場合に通常行われる方法により求めることができる。例えば、酵母の乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量は、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従い、測定することができる。当該方法は、５，５’−ジチオビス（２ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）によって還元される反応において、当該反応の反応速度がグルタチオン存在量に比例することを利用して、グルタチオン量を測定する方法である。
【００１５】
本発明の酵母の培養方法は、酵母を、クエン酸濃度が２０ｍＭ以上である液体培地中で培養することを特徴とする。この培養方法を用いて酵母を培養することにより、酵母のグルタチオン含有量を高めることができ、グルタチオン高含有酵母（グルタチオン含有量が高い酵母）を得ることが可能になる。このようなグルタチオン高含有効果（酵母のグルタチオン含有量を高める効果）が得られる理由は明らかではない。ただし、後記実施例３に示すように、他の酸を液体培地に添加した場合には当該効果は観察されておらず、かつ、ｐＨ制御環境下においても、クエン酸添加により当該効果が得られたことから、単に液体培地のｐＨ調整効果ではなく、クエン酸に特有の何らかの作用により、グルタチオンの産生が促進されるか、若しくは菌体外への排出が抑制されることにより、酵母菌体内にグルタチオンが蓄積されるためと推察される。
【００１６】
本発明の酵母の培養方法の１つの側面は、グルタチオン高含有酵母の製造方法であって、酵母を、クエン酸濃度が２０ｍＭ以上である液体培地中で培養することにより、前記酵母を含む培養物を得ること、及び前記培養物から前記酵母を回収することを含む、グルタチオン高含有酵母の製造方法である。
本発明のグルタチオン高含有酵母とは、親株と比較して菌体内のグルタチオン含量が優位に増加している酵母をいう。
また培養物とは、酵母菌体及び酵母の培養に用いた培地を含む培養物を意味する。
【００１７】
本発明の酵母の培養方法に供される酵母は特に限定されるものではないが、サッカロマイセス属菌又はキャンディダ属菌であることが好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、及びキャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）等を用いることができる。本発明においては、特に良好なグルタチオン高含有効果が得られることから、サッカロマイセス・セレビシエ又はキャンディダ・ユティリスの培養に用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の酵母の培養方法は、野生株（天然の酵母）を培養した場合のみならず、変異処理により得られた変異株を培養した場合であっても、グルタチオン高含有効果が得られる。なお、本発明及び本願明細書において、「野生株」とは、自然界に元々存在していた酵母、すなわち、遺伝子に対して人工的な変異処理を施していない酵母を意味する。これに対して、「変異株」とは、遺伝子に対して人工的な変異処理を施して得られた酵母を意味する。
【００１９】
なお、本発明において、変異処理とは、酵母等の生物が有する遺伝子の一部を変異させ得る処理であれば、特に限定されるものではなく、酵母等の微生物の変異株を作製する場合に通常用いられるいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、変異原として、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｕｆｏｎａｔｅ、以下ＥＭＳと略記する）等を用いて酵母を処理することにより、酵母に変異処理を行うことができる。
【００２０】
本発明の酵母の培養方法に用いられる液体培地のクエン酸濃度は、２０ｍＭ以上であればよい。クエン酸濃度が２０ｍＭ以上であることにより、グルタチオン高含有効果が奏されるために十分量のクエン酸を、酵母に作用させることができる。本発明においては、液体培地のクエン酸濃度は、２０〜２００ｍＭであることが好ましく、２０〜１２０ｍＭであることがより好ましく、２０〜１００ｍＭであることがさらに好ましく、５０〜１００ｍＭであることが特に好ましい。液体培地に過剰量のクエン酸を添加した場合には、グルタチオン高含有効果が期待するほどは得られない上に、酵母の生育性を阻害する等のおそれがあるが、液体培地のクエン酸濃度を２００ｍＭ以下とすることにより、酵母の生育性に対する影響を抑えつつ、十分なグルタチオン高含有効果を得ることができる。
【００２１】
なお、液体培地のｐＨを制御していない条件で培養を行う際には、クエン酸以外の酸を添加した場合であっても、添加していない液体培地と比べて、グルタチオン含有量がやや高くなる。これは、酸添加による緩衝作用により、液体培地のｐＨが調整されたためと推察される。つまり、ｐＨを制御していない場合には、液体培地に添加されたクエン酸のうちの一部は液体培地のｐＨ制御に利用されることになる。このため、同程度のグルタチオン高含有効果を得るために必要な液体培地のクエン酸濃度は、ｐＨを制御していない培養条件のほうが、ｐＨを制御した培養条件よりも高くなる傾向がある。
【００２２】
このため、液体培地のｐＨを制御しない場合には、本発明の酵母の培養方法では、液体培地のクエン酸濃度が、６０〜１１０ｍＭで酵母を培養することが好ましく、７５〜９０ｍＭで酵母を培養することがより好ましい。一方で、液体培地のｐＨが４．０〜６．０に制御されている場合には、本発明の酵母の培養方法では、液体培地のクエン酸濃度が、２０〜１００ｍＭで酵母を培養することが好ましく、２０〜７５ｍＭで酵母を培養することがより好ましい。
【００２３】
本発明の酵母の培養方法においては、クエン酸濃度が２０ｍＭ以上であるように予め調整された液体培地を用いて酵母を培養してもよく、培養開始後に、液体培地中にクエン酸を添加してもよい。すなわち、培養開始時の液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ以上で酵母を培養してもよく、培養開始時に、液体培地のクエン酸濃度が２０ｍＭ未満（クエン酸を全く含まない液体培地も含まれる）で酵母を培養し、培養開始後に、液体培地のクエン酸濃度を２０〜２００ｍＭに調整してもよい。
液体培地のクエン酸濃度を調整する方法においては、液体培地に固体のクエン酸を添加し調整してもよく、クエン酸水溶液を添加し調整してもよい。
【００２４】
サッカロマイセス属やキャンディダ属の酵母、特にサッカロマイセス属の多くの菌株において、液体培地へのクエン酸の添加時期が早いほど、より高いグルタチオン高含有効果が得られる傾向がある。出芽が盛んな状態の酵母に対して十分な濃度のクエン酸を作用させることにより、グルタチオン高含有効果が十分に発揮される。このため、培養開始後に液体培地のクエン酸濃度を調整する場合、定常期に移行する前に、すなわち、酵母の増殖状態が誘導期又は対数増殖期に、好ましくは培養開始後から対数増殖期の中期までの間に、より好ましくは培養開始後から対数増殖期の前期までの間に、調整することが好ましい。
なお、対数増殖期は、回分及び流加培養においては、吸光度等を指標として培養容器中の酵母の量を経時的に測定した場合に、対数的に増大することが観察される時期である。
一方、連続培養においては、培養容器中の酵母の量がほぼ一定であることが観察される時期である。
誘導期は、回分及び流加培養において、培養開始後から対数増殖期に至る前の時期である。
一方、連続培養においては、メルクマールとなるパラメータを一定値に制御するまでの時期である。
例えば、培養開始から９時間以内、好ましくは３時間以内に液体培地のクエン酸濃度を調整することにより、出芽が盛んな状態の酵母に対して十分な濃度のクエン酸を作用させることができる。
【００２５】
本発明の酵母の培養方法に用いられる液体培地としては、酵母が増殖可能な液体培地に、クエン酸濃度が２０ｍＭ以上となるように適宜クエン酸を添加したものが用いられる。
クエン酸が添加される液体培地としては、炭素源、窒素源、及び無機塩等を含んでいるものであって、通常サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母の培養に用いられるいずれの培地も用いることができる。
【００２６】
液体培地に含有される炭素源としては、例えば、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、及び亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選択される１又は２種以上の物質を用いることができる。また、窒素源としては、含窒素無機塩であってもよく、含窒素有機物であってもよい。例えば、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、コーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキス、及びペプトン等からなる群より選択される１又は２種以上の物質を用いることができる。また、無機塩としては、過リン酸石灰やリン安等のリン酸成分、塩化カリウムや水酸化カリウム等のカリウム成分、及び硫酸マグネシウムや塩酸マグネシウム等のマグネシウム成分等を用いることができる。その他、亜鉛、銅、マンガン、及び鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。さらに、本発明の酵母の培養方法に用いられる液体培地には、ビタミン、及び核酸関連物質等を適宜添加しても良い。
【００２７】
本発明の酵母の培養方法に用いられる液体培地としては、ＳＤ培地等の合成培地であってもよく、ＹＰＤ培地や糖蜜培地等の半合成培地であってもよい。また、糖蜜培地のように、元々少量のクエン酸を含有している培地であってもよい。さらに、これらを改変した培地であってもよい。なお、糖蜜培地（糖濃度３％）は、ロット等により含有量に差があるものの、一般的には、全有機酸濃度が１〜３．５ｇ／Ｌ程度であり、クエン酸濃度が５０〜４００ｍｇ／Ｌである。つまり、クエン酸の分子量１９２から、酵母の培養に用いられる糖蜜培地は、通常、０．２〜２ｍＭのクエン酸を含有していると算出される。
【００２８】
なお、酵母を培養する際に、炭素源としてクエン酸を用いてもよいことは、従来から知られている。しかしながら、クエン酸は培地のｐＨに影響を与えるため、一般的には、培地に積極的にクエン酸を添加すること（例えば、１０ｍＭ以上となるようにクエン酸を添加すること）は行われていなかった。さらに、後記参考例１において示すように、培養後の液体培地中のクエン酸量は培養前よりも増大していることから、本発明においては、液体培地に添加されたクエン酸は炭素源として用いられていないことが明らかである。さらに、液体培地にクエン酸を添加することにより、酵母中のグルタチオン含有量が増大することは、本発明者らによって初めて見出された知見である。
【００２９】
培養形式は、液体培地を用いるものであれば、特に限定されるものではなく、培養スケール、及び得られた培養物の使用用途等を考慮して適宜決定することができる。液体培地における培養形式として、例えば、回分培養、流加培養、及び連続培養等が挙げられる。
【００３０】
本発明の酵母の培養方法の培養条件は、所定濃度のクエン酸を含む液体培地を用いる以外は、特に限定されるものではなく、酵母を培養する場合に一般的に用いられる条件により培養することができる。例えば、培養温度は２０〜４０℃であることが好ましく、２５〜３５℃であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜８．０であることが好ましく、４．０〜６．０であることがより好ましい。特に、工業的に培養物を量産する場合には、培地中のｐＨを定期的に測定し、ｐＨ４．０〜６．０に維持するよう調整することが好ましい。
【００３１】
また、通気及び攪拌を行いながら培養することが好ましい。通気の量と攪拌の条件は、培養の容量と時間、及び菌の初発濃度を考慮して、適宜決定することができる。例えば、通気は０．２〜２Ｖ．Ｖ．Ｍ．（Ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｓ)程度、攪拌は５０〜８００ｒｐｍ程度で行なうことができる。
【００３２】
本発明の酵母の培養方法により、グルタチオン含有量の高い酵母を培養することができる。例えば、本発明の酵母の培養方法を用いて培養することにより、クエン酸濃度が２０ｍＭ未満である液体培地（クエン酸を全く含まない液体培地を含む）で培養した場合よりも、乾燥酵母菌体中に含まれるグルタチオン含有量を１０％以上増大させることができる。
【００３３】
なお、乾燥菌体重量とは、菌体を乾燥させた後の重量を意味する。乾燥後の菌体重量を求める方法では、例えば、まず、酵母の培養物を遠心分離処理することにより、菌体を沈殿として回収する。回収した菌体を遠心分離操作により２回水洗した後、１０５℃で５時間乾燥させた後の重量を測定することにより、乾燥菌体重量を求めることができる。
【００３４】
即ち本発明の、酵母をクエン酸濃度が２０ｍＭ以上である液体培地中で培養することを含む酵母の培養方法により、グルタチオン高含有酵母を含む培養物を得ることができ、公知の方法で前記培養物から前記酵母を回収することができる。
前記培養物から酵母を回収する方法は、特に限定されるものではなく、酵母の培養物から酵母を回収する場合に通常行なわれている回収方法のいずれを用いてもよい。前記培養物から酵母を回収する方法として、例えば、酵母の培養物を遠心分離処理する方法等が挙げられる。
【００３５】
本発明の酵母の培養方法により得られた培養物から酵母を回収することにより、グルタチオン含有量の非常に高い酵母を製造することができる。また本発明の酵母エキスは、本発明の酵母の培養方法で培養された酵母から酵母エキスを抽出することにより、調製することができる。従って、本発明の酵母の培養方法により製造された酵母からグルタチオン含有量の高い酵母エキスを調製し、製造することができる。前述のように、グルタチオンは、様々な生理活性を有する物質である。つまり、従来の培養方法に替えて本発明の酵母の培養方法を適用するだけで、従来よりも付加価値の高い酵母や酵母エキスを製造することができる。
【００３６】
本発明の酵母の培養方法により培養された酵母からの酵母エキスの調製は、特に限定されるものではなく、酵母エキスを調製する場合に通常行われている調製方法のいずれを用いてもよい。前記調製方法として、例えば、酵母菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して菌体を可溶化する酵素分解法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸あるいはアルカリを添加して菌体を可溶化する酸・アルカリ分解法、凍結及び融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、及び物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法等がある。物理的破砕法において用いられる物理的刺激としては、例えば、超音波処理、高圧下におけるホモジェナイズ、及びグラスビーズ等の固形物との混合による磨砕等がある。
【００３７】
その他、本発明の酵母の培養方法により得られた培養物を、乾燥処理することにより、グルタチオン含有量が高い乾燥酵母菌体を得ることができる。前記培養物を乾燥処理する方法は、特に限定されるものではなく、乾燥酵母菌体を調製する場合に通常行われている調製方法のいずれを用いてもよい。前記調製方法として、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、及びドラムドライ法等がある。さらに、得られた乾燥酵母菌体を粉末状に加工することにより、取り扱い性に優れたグルタチオン含有量が高い乾燥酵母菌末を得ることができる。
【００３８】
その他、本発明の酵母の培養方法により得られた培養物から、グルタチオンを含有する分画物を得てもよい。培養物からグルタチオンを含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよい。例えば、熱水抽出、又は菌体破砕による抽出等により得られた抽出物を、含硫化合物と親和性の高い物質を担持したアフィニティカラムを用いて分画することにより、グルタチオンを高濃度に含む画分に濃縮精製することが可能となる。
【００３９】
本発明の酵母の培養方法により得られたグルタチオン高含有酵母、前記酵母の乾燥酵母菌体、前記酵母から調製される酵母エキス、及び前記酵母エキス粉末は、調味料組成物としてもよい。なお、前記調味料組成物は、本発明の酵母エキス等のみからなるものであってもよく、本発明の酵母エキス等の他に、安定化剤、及び保存剤等の他の成分を含有していてもよい。
前記調味料組成物は、他の調味料組成物と同様に、様々な飲食品に適宜用いることができる。
【００４０】
さらに、本発明の酵母の培養方法により得られたグルタチオン高含有酵母、前記酵母の乾燥酵母菌体、前記酵母から調製される酵母エキス、及び前記酵母エキス粉末は、原料として直接飲食品に含有させることもできる。これにより、グルタチオンを高濃度に含む飲食品を効率的に製造することができる。これらの飲食品としては、通常乾燥酵母、酵母エキス、及びこれらを含む調味料組成物を添加しうる飲食品であれば何れでもよいが、例えばアルコール飲料、清涼飲料、発酵食品、調味料、スープ類、パン類、及び菓子類等を挙げることができる。その他、前記培養物等は、ソフトカプセル剤やハードカプセル剤、及び打錠剤等に加工することにより、サプリメント等として摂食することもできる。
【００４１】
具体的には、飲食品の製造工程において、上記グルタチオン高含有酵母、前記酵母の乾燥酵母菌体、前記酵母から調製される酵母エキス、及び前記酵母エキス粉末等を、他の原料と同様に添加することにより、グルタチオンを高濃度に含む飲食品を製造することができる。
【実施例】
【００４２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含有量（％（ｗ／ｗ））」は、「ＧＳＨ含有率（％）」と言い換えることがある。【００４３】
また、以下の実施例において用いられている酵母のうち、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４２株、サッカロマイセス・セレビシエＮＣＹＣ５０６株、及びシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＪＣＭ１８４６株は野生株である。【００４４】
サッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株＜ＭＡＴａ／α  ｇｐｉ１０／ｇｐｉ１０  ｕｒａ３／ＵＲＡ３  ｌｅｕ２／ＬＥＵ２＞は、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する変異株である（例えば、国際公開２００６／０２５２９５号パンフレット参照。）。サッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３９０）（原寄託の寄託日：２００４年７月１３日、国際寄託への移管日：２００５年８月３日）。【００４５】
サッカロマイセス・セレビシエＡＢ１３株は、以下のようにして得られたグルタチオン高含有変異株である。まず、サッカロマイセス・セレビシエの野生株に対してＥＭＳ処理を行い、得られた変異株の中から親株よりもグルタチオン含有量の高い変異株を選抜した。次いで、この選抜された変異株に対してＥＭＳ処理を行い、得られた変異株の中から親株よりもグルタチオン含有量の高い変異株を選抜した。この工程を２回以上繰り返すことにより、サッカロマイセス・セレビシエＡＢ１３、ＫＫ１０１株、ＫＫ１２２株、及びＫＫ１２４株を得た。【００４６】
また、以下の実施例において、酵母の培養に用いた半合成培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、及び糖蜜培地｛（１）、（２）｝の組成、並びに、それに添加するＴｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ及びＶｉｔａｍｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎの組成を表１〜７にそれぞれ示す。【００４７】
【表１】
0005883780.tif 000002
【００４８】
【表２】
0005883780.tif 000003
【００４９】
【表３】
0005883780.tif 000004
【００５０】
【表４】
0005883780.tif 000005
【００５１】
【表５】
0005883780.tif 000006
【００５２】
【表６】
0005883780.tif 000007
【００５３】
【表７】
0005883780.tif 000008
【００５４】
＜実施例１＞
サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株に対して、半合成培地を用いて本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。
まず、−８０℃でグリセロール中に保存していたＫＫ１０１株を、ＹＰＤ寒天培地上に塗沫して３０℃にて３日間培養した。その後、ＹＰＤ寒天培地に生育した酵母１ループ分を、３ｍＬのＹＰＤ培地を含む１３ｍＬ容アシストチューブに接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで１〜３日間、振盪培養した。得られた培養液を、前培養液とし、以下の本培養に用いた。
１５０μＬの前培養液を、０〜１００ｍＭとなるようにクエン酸を添加した半合成培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。【００５５】
得られた培養物中の菌体に含有される総グルタチオン量を、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、乾燥菌体重量で除することにより、ＧＳＨ含有率（乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含有量）を算出した。具体的には、まず、得られた培養物に対して、６０００ｒｐｍ×５分間、４℃で遠心分離処理を行い、回収された酵母菌体を精製水で２回洗浄した。この酵母菌体に２ｍＬの精製水を添加して懸濁した後、この懸濁液５００μＬをアルミ皿に入れて１０５℃で５時間以上乾燥し、さらにデシケーター中で１時間以上放置した後、乾燥重量を測定し、これを乾燥菌体重量とした。一方、懸濁液５００μＬを湯浴中で５分間煮沸後、直ちに氷浴中で冷却し、１５０００ｒｐｍ×５分間、４℃で遠心分離処理を行い、回収した上清を、グルタチオン定量のためのサンプルとした。１ｍＭのＥＤＴＡを混合した０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍＬに対して、５μＬのグルタチオンレダクターゼと５００μＬのＮＡＤＰＨとを添加した溶液を４ｍＬ容ディスポーザルセルに入れ、測定直前に、１０μＬのサンプルと１００μＬのＤＴＮＢとを加えて転倒混和し、反応開始後から３０秒間、４１２ｎｍにおける吸収の増加を分光光度計で測定した。予め濃度既知のグルタチオン存在下で得られた測定値から求めた検量線を用いて、得られた測定値からグルタチオン量を算出し、これを培養物中の総グルタチオン量とした。この総グルタチオン量を、別途測定した乾燥菌体重量で除することにより、ＧＳＨ含有率（％）を算出した。【００５６】
図１は、液体培地中のクエン酸濃度ごとに、ＧＳＨ含有率（％）を示したグラフである。この結果、液体培地中にクエン酸を添加することによりＧＳＨ含有率（％）が増大することが分かった。ＧＳＨ含有率（％）はクエン酸濃度依存的に増大し、本実施例の条件では、クエン酸濃度９０ｍＭで最大値をとった。【００５７】
＜実施例２＞
サッカロマイセス・セレビシエＡＢ１３株に対して、糖蜜培地（１）を用いて本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。
実施例１と同様にして調製した１５０μＬの前培養液（１）を、添加されたクエン酸の濃度が０〜６０ｍＭとなるようにクエン酸を添加した糖蜜培地（１）を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。糖蜜培地中には元々数ｍＭのクエン酸が含まれているため、実際の糖蜜培地中のクエン酸濃度は、添加されたクエン酸濃度よりも若干高くなる。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。さらに、培養終了時点における液体培地のｐＨも測定した。
図２Ａ及び図２Ｂは、各培養物のＧＳＨ含有率（％）〔図２Ａ〕及び培養終了時点における液体培地のｐＨ（終ｐＨ）〔図２Ｂ〕を、糖蜜培地（１）に添加したクエン酸濃度ごとに示したグラフである。この結果、糖蜜培地（１）に対しても、クエン酸を１０ｍＭ以上添加することにより、酵母のＧＳＨ含有率（％）を、添加前よりも１０％以上増大させることができた。また、クエン酸を添加することにより、培養終了時点の液体培地のｐＨが上昇していたが、添加するクエン酸量が２０ｍＭ以上の場合には、ｐＨ５．２前後で安定していた。【００５８】
＜実施例３＞
サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株を、様々な酸を添加した半合成培地を用いて培養した場合の、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定し、酵母のグルタチオン含有量に対する液体培地中の各酸の影響を調べた。
実施例１と同様にして調製した１５０μＬの前培養液を、表８記載の各種の塩を表記載の濃度となるように添加した半合成培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。
培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。さらに、培養終了時点における液体培地のｐＨ（終ｐＨ）及びＯＤ６００も測定した。測定結果を表８〜１０に示す。【００５９】
【表８】
0005883780.tif 000009
【００６０】
【表９】
0005883780.tif 000010
【００６１】
【表１０】
0005883780.tif 000011
【００６２】
この結果、リン酸以外の酸では、液体培地に５０ｍＭ以上の酸を添加することにより、液体培地のｐＨが４．０〜６．０に調整されること、及び、この添加量範囲において、酸の添加量は液体培地のｐＨにあまり影響しないことが分かった。リン酸では、添加量に依存して液体培地のｐＨが高くなり、添加量の影響が大きいことが分かった。
また、いずれの液体培地を用いた場合も、培養終了時のＯＤ６００の値は３０前後であり、酵母の生育性に対する、液体培地に添加する酸の種類や量の影響は小さいことが分かった。【００６３】
一方で、ＧＳＨ含有率は、クエン酸以外の酸においては、いずれも２．８％前後であり、特に差はなかった。なお、リン酸濃度を５０ｍＭとした液体培地ではＧＳＨ含有率２．４％と他よりも低かったが、これは、液体培地のｐＨが４未満であったためと推察される。これに対してクエン酸を含有させた液体培地では、クエン酸含有量依存的にＧＳＨ含有率が高くなる傾向が確認された。
これらの結果から、クエン酸含有培地で酵母を培養することにより得られるグルタチオン高含有効果は、クエン酸に特有の効果であることが明らかである。なお、液体培地のクエン酸濃度を５０ｍＭとした場合と、他の酸を５０ｍＭ以上添加した場合とで、ＧＳＨ含有率と液体培地の終ｐＨがほぼ同等であったことから、半合成培地を用いる場合には、クエン酸濃度が５０ｍＭとなるように添加されたクエン酸のうちの大部分は、液体培地のｐＨの調整に利用されていると推定される。【００６４】
＜実施例４＞
サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株に対して、ｐＨを調整した状態でさらにクエン酸を添加した液体培地を用いて本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。
実施例１と同様にして調製した１５０μＬの前培養液を、表１１記載のコハク酸濃度及びクエン酸濃度となるように両酸を添加した半合成培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
さらに、培養終了時点における液体培地のｐＨ（終ｐＨ）も測定した。測定結果を表１１に示す。
この結果、コハク酸を添加することによって液体培地のｐＨを５．５〜６．０に調整した状態で、液体培地にさらにクエン酸を添加することにより、無添加の場合よりもＧＳＨ含有率が飛躍的に増大した。具体的には、クエン酸濃度が０ｍＭ（無添加）の場合は２．８％であったＧＳＨ含有率が、クエン酸濃度が５０ｍＭの場合には３．７％となり、３０％以上増大した。一方、クエン酸濃度が７５ｍＭ及び９０ｍＭの場合にはいずれも４．３％となり、無添加の場合のＧＳＨ含有率よりも５０％以上増大した。
実施例３の結果と比較すると、液体培地中のクエン酸濃度が同じ場合でも、コハク酸をともに添加した本実施例のほうが、ＧＳＨ含有率が高く、この比較からも、実施例３では、液体培地に添加されたクエン酸の一部が液体培地のｐＨを制御することに利用されていたといえる。
すなわち、これらの結果から、ｐＨが４．０〜６．０に制御された液体培地にクエン酸を添加することにより、ｐＨが４．０〜６．０に制御されていない液体培地にクエン酸を添加した場合よりも、より少ないクエン酸添加量でより高いグルタチオン高含有効果が得られることが明らかである。【００６５】
【表１１】
0005883780.tif 000012
【００６６】
＜実施例５＞
サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１２２株及びＫＫ１２４株に対して、ジャーファーメンターを用いてｐＨを調整した培養条件で、本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。
まず、実施例１と同様の方法により、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１２２株及びＫＫ１２４株の前々培養液を、それぞれ調製した。各前々培養液１００μＬを、１０ｍＬのＹＰＤ培地を含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで１日間、振盪培養した。得られた培養液を、前培養液とし、以下の本培養に用いた。
１０ｍＬの各前培養液を、半合成培地又はクエン酸濃度が９０ｍＭとなるようにクエン酸ナトリウムを添加した半合成培地（９０ｍＭクエン酸含有培地）を１Ｌ含む２Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、初発ｐＨが６．８、攪拌速度３００ｒｐｍ、通気量１Ｖ．Ｖ．Ｍ．、３０℃の条件で、４８時間、通気攪拌培養した。培養中、ｐＨの下限値が６．０となるように、１Ｎ  水酸化ナトリウム溶液で調整した。培養開始から１２時間ごとにサンプリングし、ＯＤ６００を測定した。また、培養開始後２４、３６、及び４８時間にサンプリングしたサンプルについては、実施例１と同様にしてＧＳＨ含有率も測定した。
図３Ａ及び３Ｂは、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１２２株〔図３Ａ〕及びＫＫ１２４株〔図３Ｂ〕の、ＧＳＨ含有率及びＯＤ６００の測定結果を示した図である。図中、棒グラフがＧＳＨ含有率（％）の結果であり、折れ線グラフがＯＤ６００の結果である。また、「９０ｍＭ  クエン酸」が９０ｍＭクエン酸含有培地で培養した結果を、「０ｍＭ  クエン酸（無添加）」が半合成培地で培養した結果を、それぞれ示す。この結果、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１２２株及びＫＫ１２４株についても、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株と同様に、クエン酸を含有する液体培地中で培養することにより、ＧＳＨ含有率が高くなった。また、両株とも、９０ｍＭクエン酸含有培地で培養した場合には、半合成培地で培養した場合よりも、若干ＯＤ６００グラフの傾きが小さかったが、培養終了時点のＯＤ６００値は、同程度であった。このことから、液体培地にクエン酸を添加することにより、若干立ち上がりに遅れが観察されるものの、最終的にはクエン酸無添加の場合と同じように酵母は培養でき、クエン酸添加による酵母の生育性への影響は小さいといえることが確認された。【００６７】
＜実施例６＞
様々なサッカロマイセス属菌に対して、半合成培地を用いて本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。実施例３の結果に基づき、クエン酸濃度を５０ｍＭとした場合を基準（対照）とし、クエン酸濃度依存的にＧＳＨ含有率の増大が観察された場合には、本発明のグルタチオン高含有効果が奏されていることが確認できるとした。
まず、実施例１と同様の方法により、表１２に記載の菌株の前培養液をそれぞれ調製した。次いで、１５０μＬの各前培養液を、５０〜１５０ｍＭとなるようにクエン酸を添加した半合成培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
測定結果を表１２に示す。この結果、変異株であるサッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株、ＫＫ１２２株、ＫＫ１２４株、及びＡＢ１３株のみならず、野生株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株、ＢＹ４７４２株、及びＮＣＹＣ５０６株のいずれにおいても、クエン酸濃度が７５〜１５０ｍＭの場合に、５０ｍＭの場合よりもＧＳＨ含有率が１０％以上高くなっていた。これらの結果から、本発明の酵母の培養方法は、特定の変異株のみならず、野生株に対して適用した場合でも、本発明のグルタチオン高含有効果が得られることが明らかである。【００６８】
【表１２】
0005883780.tif 000013
【００６９】
＜実施例７＞
様々なサッカロマイセス属菌に対して、ＹＰＤ培地を用いて本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。クエン酸濃度依存的にＧＳＨ含有率の増大が観察された場合には、本発明のグルタチオン高含有効果が奏されていることが確認できるとした。
まず、実施例１と同様の方法により、表１３に記載の菌株の前培養液をそれぞれ調製した。次いで、１５０μＬの各前培養液を、クエン酸濃度が０〜９０ｍＭとなるように適宜クエン酸を添加したＹＰＤ培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
測定結果を表１３に示す。この結果、サッカロマイセス・セレビシエの各菌株は、変異株と野生株のいずれも、ＹＰＤ培地においても本発明のグルタチオン高含有効果が得られることが確認された。【００７０】
【表１３】
0005883780.tif 000014
【００７１】
＜実施例８＞
サッカロマイセス属以外の酵母に対しても本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。具体的には、キャンディダ・ユティリス１５６１株を、クエン酸を含有させたＹＰＤ培地で培養し、ＧＳＨ含有率を測定した。
まず、実施例１と同様の方法により、キャンディダ・ユティリス１５６１株の前培養液を調製した。次いで、１５μＬの各前培養液を、クエン酸濃度が０〜６２．５ｍＭとなるように適宜クエン酸を添加したＹＰＤ培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し（接種倍率が０．１％）、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４０時間、振盪培養した。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
測定結果を表１４に示す。この結果、キャンディダ・ユティリス１５６１株においても、サッカロマイセス属菌と同様に本発明のグルタチオン高含有効果が得られることが確認された。【００７２】
【表１４】
0005883780.tif 000015
【００７３】
＜実施例９＞
キャンディダ属に属する他の菌株の酵母に対しても本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。具体的には、キャンディダ・ユティリス１５６０株を、クエン酸を含有させた糖蜜培地（２）で培養し、ＧＳＨ含有率を測定した。
まず、実施例１と同様の方法により、キャンディダ・ユティリス１５６０株の前培養液を調製した。次いで、４５μＬの各前培養液を、クエン酸濃度が０〜６２．５ｍＭとなるように適宜クエン酸を添加した糖蜜培地（２）を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し（接種倍率が０．３％）、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで２４時間、振盪培養した。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
測定結果を表１５に示す。この結果、キャンディダ・ユティリス１５６０株においても、サッカロマイセス属菌と同様に本発明のグルタチオン高含有効果が得られることが確認された。【００７４】
【表１５】
0005883780.tif 000016
【００７５】
＜実施例１０＞
サッカロマイセス属菌に対して、ＳＤ培地を用いて本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。クエン酸濃度依存的にＧＳＨ含有率の増大が観察された場合には、本発明のグルタチオン高含有効果が奏されていることが確認できるとした。
まず、実施例１と同様の方法により、表１６に記載の菌株の前培養液をそれぞれ調製した。次いで、１５０μＬの各前培養液を、クエン酸濃度が５０〜１５０ｍＭとなるように適宜クエン酸を添加したＹＰＤ培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
測定結果を表１６に示す。この結果、サッカロマイセス・セレビシエの各菌株は、変異株と野生株のいずれも、ＳＤ培地においても本発明のグルタチオン高含有効果が得られることが確認された。これらの結果から、本発明のグルタチオン高含有効果は、用いる液体培地の組成は特に限定されるものではなく、十分量のクエン酸を添加することにより、いずれの培地を用いても効果が得られるといえる。【００７６】
【表１６】
0005883780.tif 000017
【００７７】
＜実施例１１＞
培養開始後に、液体培地のクエン酸濃度を２０ｍＭ以上に調整することにより、本発明の酵母の培養方法により酵母の培養を行ない、培養後の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した。実施例３の結果に基づき、培養開始時点におけるクエン酸濃度を５０ｍＭとした場合を基準（対照）とし、これよりもＧＳＨ含有率が高い場合には、本発明のグルタチオン高含有効果が奏されていることが確認できるとした。
実施例１と同様の方法により、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株、ＫＫ１２２株、ＫＫ１２４株、及びＡＢ１３株の前培養液を、それぞれ調製した。
次いで、各菌株に対して、それぞれ次のように培養を行った。まず、１５０μＬの前培養液を、半合成培地を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコ５本にそれぞれ接種した。このうちの２本のフラスコには、それぞれ、クエン酸濃度が５０ｍＭ又は９０ｍＭとなるように、それぞれクエン酸を添加した（初期添加５０ｍＭサンプル、及び初期添加９０ｍＭサンプル）。これらの５本のフラスコを、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで振盪培養した。培養開始から３時間後、クエン酸を添加していない３本のうちの１本に、クエン酸濃度が９０ｍＭとなるようにクエン酸を添加し、そのまま培養を続けた（３時間後添加９０ｍＭサンプル）。さらに、培養開始から６時間後に、クエン酸を添加していない残る２本のうちの１本に、クエン酸濃度が９０ｍＭとなるようにクエン酸を添加し、そのまま培養を続けた（６時間後添加９０ｍＭサンプル）。最後に、培養開始から９時間後に、クエン酸を添加していない残る１本に、クエン酸濃度が９０ｍＭとなるようにクエン酸を添加し（９時間後添加９０ｍＭサンプル）、そのまま培養を続け、培養開始から４８時間後に全てのフラスコで培養を終了し、５サンプルを得た。各菌株に対して同様の培養操作を行い、合計２０サンプルを得た。【００７８】
図４は、各サンプル中の酵母のＧＳＨ含有率（％）を測定した結果を示した図である。
なお、ＧＳＨ含有率（％）の測定は、実施例１と同様にして行った。この結果、全ての菌株において、クエン酸の添加時期に関わらず、９０ｍＭのクエン酸を添加したサンプルのＧＳＨ含有率は、初期添加５０ｍＭサンプルよりも高いことが確認された。つまり、これらの結果から、培養開始後に、液体培地のクエン酸濃度を、本発明のグルタチオン高含有効果が奏されるために十分な濃度に調整した場合であっても、酵母のグルタチオン含有量を高められることが確認された。また、菌株ごとに多少の差異はあるが、基本的にいずれの菌株においても、初期添加９０ｍＭサンプルが最もＧＳＨ含有率が高く、かつ、クエン酸の添加時期が遅くなるほど、ＧＳＨ含有率が低くなる傾向が観察されたことから、培養開始後にクエン酸濃度を調整する場合には、少なくとも培養開始後９時間以内、つまり酵母の出芽が盛んな時期に行うことが好ましいと考えられた。【００７９】
＜参考例１＞
液体培地に添加されたクエン酸が、炭素源として資化されているかどうかを調べた。
まず、実施例１と同様の方法により、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ１０１株の前培養液を調製した。
１５０μＬの前培養液を、クエン酸濃度が５０ｍＭとなるようにクエン酸ナトリウムを添加した半合成培地（５０ｍＭクエン酸含有培地）、クエン酸濃度が９０ｍＭとなるようにクエン酸ナトリウムを添加した半合成培地（９０ｍＭクエン酸含有培地）、又はリン酸濃度が１００ｍＭとなるようにリン酸カリウムを添加した半合成培地（１００ｍＭりン酸含有培地）を１５ｍＬ含む２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに接種し、３０℃にて、攪拌速度２００ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。酵母接種後培養前に培養上清の一部を予め採取しておき、培養終了後の上清とともに、これらの上清中のクエン酸の含有量を測定した。クエン酸量の測定は、市販のキット（商品名：Ｆ−キットクエン酸、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いたＦ−ｋｉｔ法により行った。
図５は、培養前後の各上清中のクエン酸含有量の測定結果を示した図である。図中、「５０ｍＭ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ」は５０ｍＭクエン酸含有培地で培養した結果を、「９０ｍＭ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ」は９０ｍＭクエン酸含有培地で培養した結果を、「１００ｍＭ  Ｋ  Ｐｈｏｓｐａｔｅ」は１００ｍＭリン酸含有培地で培養した結果を、それぞれ示す。この結果、いずれの液体培地を用いた場合でも、上清中のクエン酸含有量は、培養前よりも培養後において若干増大していた。これは、培養工程において、酵母がクエン酸を生成したためと考えられる。つまり、これらの結果から、酵母は、液体培地中のクエン酸を資化しておらず、液体培地に添加されたクエン酸が炭素源として用いられていないことが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の酵母の培養方法により、サッカロマイセス属菌等の酵母のグルタチオン含有量を簡便に高めることができるため、当該培養方法は、特に食品分野等で利用が可能である。
【受託番号】
【００８１】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３９０
【図１】
0005883780.tif 000018
【図２Ａ】
0005883780.tif 000019
【図２Ｂ】
0005883780.tif 000020
【図３Ａ】
0005883780.tif 000021
【図３Ｂ】
0005883780.tif 000022
【図４】
0005883780.tif 000023
【図５】
0005883780.tif 000024