(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢ１．Ｆ３がヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されてなり、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣｈＡＴを発現することを特徴とするヒト神経幹細胞。
【請求項２】
ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はヘルパー依存型アデノウイルスベクターである請求項１に記載のヒト神経幹細胞。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載のヒト神経幹細胞を有効成分として含むことを特徴とするアルツハイマー病治療用薬剤学的組成物。
【請求項４】
請求項１から２のいずれかに記載のヒト神経幹細胞を有効成分として含むことを特徴とする認知機能障害改善用組成物。
【請求項５】
認知機能障害が、脳におけるアセチルコリンの分泌減少によるものである請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
認知機能が、学習能力又は記憶能力である請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
アルツハイマー病の治療方法に使用するための薬剤学的組成物であって、
配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含み、
前記ヒト神経幹細胞が、ＨＢ１．Ｆ３がＣｈＡＴをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されてなることを特徴とする薬剤学的組成物。
【請求項８】
認知機能障害の治療方法に使用するための薬剤学的組成物であって、
配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含み、
前記ヒト神経幹細胞が、ＨＢ１．Ｆ３がＣｈＡＴをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されてなることを特徴とする薬剤学的組成物。
【請求項９】
ＨＢ１．Ｆ３をヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換する工程を含み、
配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣｈＡＴを発現するヒト神経幹細胞を製造することを特徴とするヒト神経幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されてヒトＣｈＡＴ酵素を安定的に発現するヒト神経幹細胞及びその用途に関し、より詳細には、上記ヒトＣｈＡＴを発現するヒト神経幹細胞を含むアルツハイマー病治療用薬剤学的組成物及び認知機能障害改善用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は、学習及び記憶力損傷のような認知能力の欠損を特徴とする、最も破壊的な神経変性疾患の一つである（非特許文献１）。アルツハイマー病患者において、シナプス前部のコリン性システムの機能障害が認知機能障害の主な原因の一つであり（非特許文献２〜３）、ここで、アセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＡＣｈ）合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）酵素の活性減少が観察される（非特許文献４〜５）。現在まで、アルツハイマー病の治療は、アセチルコリン分解酵素であるアセチルコリンエストラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ，ＡＣｈＥ）を抑制することによりアセチルコリンの濃度を増加させるようにデザインされた小さな分子の薬物に基づいて行われている（非特許文献５〜６）。しかしながら、組職損傷の進行に対する強力な保護効果がない薬物治療は、一時的な症状改善の効果に過ぎないため、ＡＤ患者に対する効果的かつ実質的な治療が要求されており、アルツハイマー病をターゲッティングする幹細胞に基づいた治療アプローチが、上記のような要求を満たすものと期待されてきた。様々な神経障害に対して、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症ＡＬＳ）、脳卒中及び脊髓損傷のような疾患を治療するために、幹細胞ベースの治療研究が始まりつつある（非特許文献７〜９）。
【０００３】
薬物による身体機能の一時的な向上とは対照的に、幹細胞は宿主細胞の死滅を抑制するか遅延させ、損傷された組職を回復させることができるものと期待されている（非特許文献７〜１０）。本発明者らは、多様な機能遺伝子、特に成長因子をコードする遺伝子を発現するヒト神経幹細胞の移植によって宿主細胞を保護し、脳卒中、ＰＤ、ＡＬＳ及び脊髓損傷の動物モデルにおいて身体機能を回復させることができることを確認した（非特許文献１１〜１４）。不死化されたヒト神経幹細胞は、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）内への遺伝子伝達及び遺伝子操作に非常に効果的な細胞ソースとして認められており、遺伝的に改変された神経幹細胞は、正常又は損傷された脳の中への移植後に生存し、宿主組職に統合されてニューロン及びグリア細胞に分化する（非特許文献９）。
【０００４】
本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３，７７（１９８０）．
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５，１２３７（１９８２）．
【非特許文献３】Ｃｏｙｌｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．，ＤｅＬｏｎｇ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９，１１８４（１９８３）．
【非特許文献４】Ｋ．，Ｋａｓａ，Ｐ．，Ｒａｋｏｎｃｚａｙ，Ｚ．，Ｇｕｌｙａ，Ｋ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５２，５１１（１９９７）．
【非特許文献５】Ｔｅｒｒｙ，Ａ．Ｖ．，Ｂｕｃｃａｆｕｓｃｏ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０６，８２１（２００３）．
【非特許文献６】Ｍｕｓｉａｌ，Ａ．，Ｂａｊｄａ，Ｍ．，Ｍａｌａｗｓｋａ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１４，２６５４（２００７）．
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｓ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７，８６２（２００５）．
【非特許文献８】Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．，Ｋｏｋａｉａ，Ｚ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，１０９４（２００６）．
【非特許文献９】Ｋｉｍ，Ｓ．Ｕ．，ｄｅＶｅｌｌｉｓ，Ｊ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８７，２１８３（２００９）．
【非特許文献１０】Ｂｌｕｒｔｏｎ−Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，１３５９４（２００９）．
【非特許文献１１】Ｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，１２０４（２００７）．
【非特許文献１２】Ｌｅｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １３１，６１６（２００８）．
【非特許文献１３】Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６，１２４９７（２００６）．
【非特許文献１４】Ｈｗａｎｇ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６，１０３４（２００９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、幹細胞移植方法を用いてアルツハイマー病で発生するアセチルコリンの欠乏による認知機能、例えば学習能力又は記憶能力の障害を回復させることができる細胞治療技術を開発するために研究努力した。まず、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）遺伝子を過剰発現するヒト神経幹細胞の形質転換体を確立し、該形質転換体をアルツハイマー病動物モデルの脳に移植して、移植された細胞が安定的に分化してアセチルコリンを分泌し、これによって動物モデルの認知機能が改善することを実験的に確認して本発明を完成した。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を提供することにある。
【０００８】
本発明の別の目的は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を含むアルツハイマー病治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を含む認知機能障害改善用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた別の目的は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞の薬剤学的有効量を、アルツハイマー病を患う対象に投与するステップを含むアルツハイマー病を治療する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた別の目的は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞の薬剤学的有効量を、認知機能障害を患う対象に投与するステップを含む認知機能障害を治療する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のまた別の目的は、アルツハイマー病の治療方法に使用するための、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた別の目的は、認知機能障害の治療方法に使用するための、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によって、さらに明確に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞及びその製造に用いたベクターを示す図である。図１のパネルＡは、ヒトＣｈＡＴ完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＬＰＣＸ．ＣｈＡＴを持つレトロウイルスベクターの構成を示す。本発明のＦ３．ＣｈＡＴヒト神経幹細胞株は、上記ベクターをＦ３ヒト神経幹細胞に感染させて製造した。図１のパネルＢは、ＣｈＡＴ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す写真である。図１のパネルＣは、Ｆ３細胞及びＦ３．ＣｈＡＴ細胞の形態を示す。図１のパネルＤは、Ｆ３細胞（左）及びＦ３．ＣｈＡＴ細胞（右）においてＣｈＡＴタンパク質を免疫細胞化学的に確認した結果である。スケールバーは５０μｍである。不死化された神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ＮＳＣ）株である、ＨＢ１．Ｆ３（Ｆ３）は、妊娠１５週ヒト胎児の脳の初代培養細胞をｖ−ｍｙｃがん遺伝子をコードするレトロウイルスベクターで感染させて確立した（参考文献９、１１、２８）。Ｆ３  ＮＳＣ細胞株は、ヒトＣｈＡＴ遺伝子をコードするレトロウイルスで感染させた。完全長ヒトＣｈＡＴ  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＬＰＣＸ．ＣｈＡＴを使用した。ＰＧ１３マウスパッケージング細胞株をＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬を使用してｐＬＰＣＸ．ＣｈＡＴベクターでトランスフェクションさせ、安定化ＰＧ１３細胞株を５μｇ／ｍＬのプロマイシンを７日間使用して選別した。ＰＧ１３．ＣｈＡＴ細胞から収集された複製不能レトロウイルスベクターをＦ３ヒトＮＳＣの感染のために使用し、プロマイシン耐性Ｆ３．ＣｈＡＴクローンを分離して、この中の一つのクローンであるＦ３．ＣｈＡＴ．Ｄ２を増やして移植に使用した。ＣｈＡＴ  ｍＲＮＡ発現分析のためにＲＴ−ＰＣＲを行い、ＣｈＡＴタンパク質の確認のために培養物をヒトＣｈＡＴに特異的な一次抗体とインキュベーションした後、蛍光二次抗体とインキュベーションし、ＤＡＰＩで染色した。細胞をａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液を使用してスライドガラス上に装着して、Ｏｌｙｍｐｕｓのレーザ走査型共焦点顕微鏡下で観察した。
【図２】図２は、ＡＦ６４Ａが注入されたラットにヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞を移植した後のラット脳における、ヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞の分布、ＣｈＡＴ生成分布、並びに星状細胞及び神経細胞への分化を示す図である。図２のパネルＡ〜Ｄは、ＡＦ６４Ａが注入されたラットにヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞を移植（１×１０６細胞／ラット）した後、９週にラット脳におけるヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞（ｈＮｕＭＡ陽性反応によって確認）の分布を示す。図２のパネルＥは、ＡＦ６４Ａが注入されたラットにヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞を移植（１×１０６細胞／ラット）した後、９週にラット脳におけるヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞（ｈＮｕＭＡ陽性反応によって確認）によるＣｈＡＴ生成分布を示す。図２のパネルＦ及びＧは、ＡＦ６４Ａが注入されたラットにヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞を移植（１×１０６細胞／ラット）した後、９週にラット脳におけるヒトＦ３．ＣｈＡＴ細胞（ｈＮｕＭＡ染色）が星状細胞（ＧＦＡＰ染色；パネルＦ）及び神経細胞（ＮＦ−Ｍｉｘ染色；パネルＧ）にそれぞれ分化することを示す。スケールバーは５０μｍである。
【図３】図３は、２週間のＡＦ６４Ａ前処理（３ｎｍｏｌ／ラット）に続き、Ｆ３細胞又はＦ３．ＣｈＡＴ細胞（１×１０６細胞／ラット）を後移植したラットの脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるアセチルコリン濃度の測定結果を示すグラフである。パネルＡとＢは、それぞれ移植後５週時点及び９週時点の結果を示す。脳脊髄液におけるＡＣｈ濃度は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアセチルコリン／アセチルコリンエストラーゼ分析キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して測定した。この分析において、ＡＣｈはＡＣｈＥによって加水分解されてコリンを放出し、これはさらにコリンオキシダーゼによってベタイン及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に酸化される。Ｈ２Ｏ２は西洋ワサビペルオキシダーゼの存在下でＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ）と相互作用して、非常に高い蛍光特性を持つレゾルフィンを生成する。生成された蛍光は５３０ｎｍ〜５６０ｎｍ範囲の放出及び〜５９０ｎｍ範囲の励起を用いて蛍光マイクロプレートリーダー内で測定した。
【図４】図４は、２週間のＡＦ６４Ａ前処理（３ｎｍｏｌ／ラット）に続き、Ｆ３細胞又はＦ３．ＣｈＡＴ細胞（１×１０６細胞／ラット）を後移植したラットの４〜５週時点（パネルＡ及びＣ）及び８〜９週時点（パネルＢ及びＤ）での受動的回避試験（パネルＡ及びＢ）及び水迷路実験（パネルＣ及びＤ）の結果を示すグラフである。●：正常対照群、▼：ＡＦ６４Ａ単独投与群、■：ＡＦ６４Ａ＋Ｆ３移植群、◆：ＡＦ６４Ａ＋Ｆ３．ＣｈＡＴ移植群。受動的回避試験においては、ラットが明室からギロチンドアを通過して暗室に入ったとき、１ｍＡで２秒間の電気ショックを与えた。照明がついた時から明室にとどまる時間を記録した。記憶の完全な習得を意味する終了点は３００秒にセットした。毎日１回ずつ４日間の試験後、１週間が過ぎた時点で、記憶力維持を確認するために５回目の試験を行った。水迷路実験では、ラットを連続４日間、１日に３回で構成される実験を行い、記憶力維持を確認するために４週時点又は８週時点での４日間の試験から１週間が過ぎた時点で、５回目を行った。プラットフォームへの平均逃避時間を計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一様態によれば、本発明は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞に関するものである。
【００１７】
本発明において「コリンアセチルトランスフェラーゼ」とは、アセチルＣｏＡをコリンに結合させて神経伝達物質であるアセチルコリンを生成する機能を持つ酵素である。これは神経細胞のボディ（ｂｏｄｙ）で合成されて軸索流に沿って神経末端に移動される。ヒトではコリンアセチルトランスフェラーゼ酵素はＣｈＡＴ遺伝子によってコードされている［Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｊａｙａｋａｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９，３９６−３９８（１９９１）］。
【００１８】
本発明の好ましい実現例によれば、上記ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６５５７４）を含む。
【００１９】
本発明においてヒトの「神経幹細胞」（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）とは、増殖を続ける能力、すなわち自己複製能（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗ）を持っており、中枢神経系を構成する神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ又はｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）などの細胞に分化することができる多分化能を持つ未分化細胞を意味する。
【００２０】
本発明の好ましい実現例によれば、上記神経幹細胞は、初代培養神経幹細胞又は遺伝的に改変された不死化された（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）神経幹細胞である。
【００２１】
本発明の形質転換体である神経幹細胞は、ヒトの組職から分離及び培養された初代培養神経幹細胞であってもよい。例えば、ヒト胎児又は大人の脳から分離した神経幹細胞、ヒト臍帯血由来の造血幹細胞から誘導された神経幹細胞、ヒト骨髓幹細胞から誘導された神経幹細胞、又はヒト胚から誘導された神経幹細胞を形質転換に使用することができる。
【００２２】
また、本発明において遺伝的に改変されて不死化された神経幹細胞も、形質転換に使用することができる。例えば、ヒト胎児の脳から分離した神経幹細胞にｖ−ｍｙｃがん遺伝子を含むレトロウイルスベクターを導入して確立された不死化されたヒト神経幹細胞株を使用することができる。
【００２３】
ヒト神経幹細胞は幹細胞マーカーとしてネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）の陽性染色によって確認される。
【００２４】
神経幹細胞の具体的な分離方法は、米国登録特許５，６５４，１８３に開示されており、この文献は本明細書に参照として組み込まれる。神経幹細胞は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、又はＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）の成長因子を好適な濃度範囲、例えば５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で培地に添加して培養することができる。
【００２５】
本発明のヒト神経幹細胞は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された遺伝的に改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）された細胞である。
【００２６】
下記本発明の具体的な一実施例から立証されるように、本発明のヒト神経幹細胞に発現ベクターに挿入された形態で導入されたヒトコリンアセチルトランスフェラーゼは安定的に発現し、アルツハイマー病動物モデルの脳に移植された場合、移植された脳組職に安定的に統合、生存及び分化し、アセチルコリンの濃度を正常な水準に上昇させ、最終的に、正常動物と比較可能な程度に認知機能を回復させた。
【００２７】
本発明において、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼをヒト神経幹細胞に導入させるために使用されるベクターは、好ましくは次のベクターを使用することができるが、これに限定されるものではない。：（ｉ）アデノウイルスベクター；（ｉｉ）レトロウイルスベクター；（ｉｉｉ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｉｖ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｖ）ＳＶ４０ベクター；（ｖｉ）ポリオーマウイルスベクター；（ｖｉｉ）パピローマウイルスベクター；（ｖｉｉｉ）ピコルナウイルスベクター；（ｉｘ）ワクシニアウイルスベクター；（ｘ）ヘルパー依存型アデノウイルスベクター。
【００２８】
本発明のベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、Ａｄｅｎｏ複製起点、ＡＡＶ複製起点及びＢＢＶ複製起点などを含むが、これに限定されるものではない。
【００２９】
本発明のベクターに使用することができるプロモーターとしては、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＨＳＶ  ｔｋプロモーター）を用いることができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列が含まれ、例えばＳＶ４０由来ｐｏｌＡ配列及びＢＧＨ  ｐｏｌＡ配列などがある。
【００３０】
本発明において用いられるベクターは選択マーカーとして、当業界で通常用いられる抗生物質耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００３１】
本発明の具体的な一実施例によれば、本発明のヒトコリンアセチルトランスフェラーゼを含む発現ベクターの構成は、図１のパネルＡに開示されている。
【００３２】
本発明のベクターをヒト神経幹細胞内に導入する方法は、公知のトランスフェクション方法を使用することができ、例えば、マイクロインジェクション法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ  ２２，４７９（１９８０））、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６（１９７３））、エレクトロポレーション法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，８４１（１９８２））、リポソームトランスフェクション法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０，８７（１９８０））、ＤＥＡＥデキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５，１１８８−１１９０（１９８５））、及びパーティクル・ガン法（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，９５６８−９５７２（１９９０））などがあるが、これに限定されない。
【００３３】
形質転換されたヒト神経幹細胞を選別するステップは、上述した選択マーカーによって発現される表現型を用いて、容易に実施することができる。例えば、上記選択マーカーが特定の抗生物質耐性遺伝子である場合には、上記抗生物質が含有された培地で形質転換体を培養することで形質転換体を容易に選別することができる。
【００３４】
本発明の別の一様態によれば、本発明は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されてＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含むアルツハイマー病治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【００３５】
本発明の薬剤学的組成物は、典型的に細胞を含む懸濁液形態の注射剤として製造されることができる。注射に適した製薬形態は、直ちに準備可能な溶液又は分散液のための滅菌された溶液又は分散液を含む。いずれの場合にも注射液形態の薬剤は滅菌されなければならず、注射が容易な程度に流動性を持たなければならない。
【００３６】
本発明の薬剤学的組成物は、有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。上記「薬剤学的に許容される」とは、人間に投与されたとき、アレルギー反応や類似する不利な反応を起こさないということを意味する。このような担体としては、特定の溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬剤学的に活性である物質にこのような媒質及び製剤を使用することは当業界に公知されている。薬剤学的組成物の担体は、例えば、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒質であってもよい。レシチンのようなコーティング剤の使用によって流動性を維持することができる。微生物汚染を防ぐためにパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような多様な抗菌剤及び抗真菌剤が含まれてもよく、糖又は塩化ナトリウムなどの等張剤も含まれてもよい。また、体内投与時に吸収作用を延長させるために、組成物に吸収を遅延させる製剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含ませてもよい。滅菌注射溶液は、必要によって上述した種々の異なる成分を有する好適な溶媒に必要な量の活性化合物を混合した後、濾過滅菌して製造される。
【００３７】
本発明の薬剤学的組成物は、好ましくは非経口で投与することができ、即ち、腹腔内、真皮内、筋肉内、静脈内、脳質内、脊髄内の経路で投与、又は局所投与することができ、より好ましくは、脳部位に直接注入によって投与することができる。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物は、剤形と両立する方式で治療的に効果的な量で投与される。また、治療対象の状態又は条件によって投与量を調節することができる。水性の注射溶液で非経口投与するために、溶液は必要によって適宜緩衝されなければならず、まず、液体希釈剤を十分な食塩水又はグルコースで等張性とする。これら特殊な水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、真皮内、脳質内、脊髄内及び腹腔内投与に好適である。これに係り、本組成物に使用されることができる担体及び製剤、媒質に関する内容は当業界に公知されている（”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９５，１５版参照）。
【００３９】
本発明のまた別の一様態によれば、上述のヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含む認知機能障害改善用組成物に関するものである。
【００４０】
本発明の好ましい実現例によれば、上記認知機能は、学習能力又は記憶能力である。
【００４１】
本発明の別の好ましい実現例によれば、上記認知機能障害は、脳におけるアセチルコリンの分泌減少によるものである。
【００４２】
本発明の別の好ましい実現例によれば、上記認知機能障害改善用組成物は、薬剤学的組成物の形態で製造することができる。薬剤学的組成物に関する内容は、上記アルツハイマー病治療用薬剤学的組成物に関する内容と同一である。したがって、本明細書を複雑にさせるような過度の重複を避けるため、両者に共通する記載を省略する。
【００４３】
本発明の別の一様態によれば、本発明は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞の薬剤学的有効量を、アルツハイマー病を患う対象に投与するステップを含むアルツハイマー病を治療する方法を提供する。
【００４４】
本発明のまた別の一様態によれば、本発明は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞の薬剤学的有効量を認知機能障害を患う対象に投与するステップを含む認知機能障害を治療する方法を提供する。
【００４５】
本発明のまた別の一様態によれば、本発明は、アルツハイマー病の治療方法に使用するための、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含む薬剤学的組成物を提供する。
【００４６】
本発明のまた別の一様態によれば、本発明は、アルツハイマー病治療剤の製造のための、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞の使用を提供する。
【００４７】
本発明のまた別の一様態によれば、本発明は、認知機能障害の治療方法に使用するための、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞を有効成分として含む薬剤学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明のまた別の一様態によれば、本発明は、認知機能障害治療剤の製造のための、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されて、ＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞の使用を提供する。
【００４９】
本発明は、ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されてＣｈＡＴ酵素を発現するヒト神経幹細胞、この細胞を有効成分として含むアルツハイマー病治療用薬剤学的組成物、及び認知機能障害改善用組成物に関するものである。本発明の利点及び効果を要約すると、次の通りである。
（ｉ）本発明のヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するように遺伝的に改変されたヒト神経幹細胞は、アルツハイマー病（ＡＤ）動物モデルの脳内に直接移植又は血管注射のような他の経路で移植された場合、宿主脳組職に成功裏に統合されて神経細胞及びグリア細胞に分化する。
（ｉｉ）本発明のヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ発現ベクターで形質転換されたヒト神経幹細胞株は、ＡＤ動物モデルの脳内に直接移植又は血管注射のような他の経路で移植されてＣｈＡＴ酵素を安定的に発現させることで、減少していたアセチルコリンの濃度を正常な水準に回復させる。
（ｉｉｉ）本発明のＣｈＡＴ発現ヒト神経幹細胞は、学習能力及び記憶能力が損傷されたＡＤ動物モデルの認知能力を正常な水準に復旧させる。
（ｉｖ）本発明のＣｈＡＴ発現ヒト神経幹細胞株は、アルツハイマー病の治療及びこの病による認知機能障害改善の用途に使用することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者に自明であろう。
【００５１】
実施例１：ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）クローニング及びｃＤＮＡコンストラクト
ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）完全長ｃＤＮＡは、ラットの末梢型ＣｈＡＴに関する公知文献に既に記述された方法（参考文献２９）によって、ヒト小腸Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）からＰＣＲ方法により得た。プラスミドＤＮＡの配列分析は、ＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。
【００５２】
実施例２：ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）
ＨＢ１．Ｆ３（Ｆ３）ヒトＮＳＣ（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）株（参考文献８、９、１１、２８）に、ヒトＣｈＡＴ完全長ｃＤＮＡを含むｐＬＰＣＸ．ＣｈＡＴ遺伝子を持つレトロウイルスを感染させて、プロマイシン耐性細胞を選別した（参考文献１３）。ＣｈＡＴ過剰発現クローンであるＦ３．ＣｈＡＴを分離し、ＣｈＡＴの発現をＲＴ−ＰＣＲ及び免疫蛍光顕微鏡で分析した。
【００５３】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用してヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）培養物から抽出した。相補的ＤＮＡ鋳型は、オリゴｄＴプライマーとともに４００ＵのＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して２５ＰＣＲサイクルを行って準備し、ＲＴ−ＰＣＲ産物はエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１．２％アガロースゲル上から分離した。ＣｈＡＴ  ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは次の通りである。センス：５’−ＣＴＧＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号２］）；アンチセンス：５’−ＣＡＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号３］）。
【００５４】
実施例４：ＮＳＣ細胞株の兔疫細胞化学的分析
Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞はポリ−Ｌ−リジンコートされたＡｃｌａｒプラスチックカバースリップ上にプレーティングし、０．１Ｍリン酸塩緩衝液内の４％パラホルムアルデヒド中で、常温で５分間固定させた。固定された培養物をヒトＣｈＡＴに特異的な抗体（１：１００，ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と共に４℃で２４時間インキュベーションし、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８が結合したウサギ抗体ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に常温で１時間インキュベーションした。細胞を、細胞の核を確認できるように４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で対照染色した。
【００５５】
実施例５：アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）モデル及び神経幹細胞の移植
２２０ｇ〜２３０ｇ体重の雄スプラークドーレイラット（Ｏｒｉｅｎｔ−Ｂｉｏ，Ｓｅｏｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）をエンフルランで麻酔し、定位脳手術フレーム（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｆｒａｍｅ）に配置した。肌を切開して穴あけした後、新しく準備したＡＦ６４Ａ（ＲＢＩ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）溶液（３ｎｍｏｌ／３μＬ／ラット）（参考文献１７、２０）を矢状縫合と冠状縫合の十字縫合（ｂｒｅｇｍａ）から後方位０．８ｍｍ、側位１．５ｍｍ及び腹部位４．０ｍｍの脳定位座標で右側脳室の中に０．５μＬ／分の流速で脳室内（ｉｃｖ）投与した（参考文献１７、２１）。２週後に、Ｆ３又はＦ３．ＣｈＡＴ細胞（１×１０６細胞／ラット）を、学習及び記憶力損傷を示すラット（ｎ＝１５／グループ）に同一の脳定位座標部位にｉｃｖ投与によって移植した。
【００５６】
実施例６：学習能力／記憶力テスト
ラットは細胞を移植した後、４週〜５週（ｎ＝８／グループ）又は８週〜９週（ｎ＝７／グループ）に学習及び記憶能力テストを行った。記憶習得及び維持に対する評価のために、受動的回避試験を連続４日間１日１回ずつ行い、５回目の実験は４回目の実験から１週間後、すなわち１１日目に行った。ラットを暗室で電気ショック（１ｍＡで２秒間）を経験させた後、照明がついてから明室から暗室に入って行く前にとどまる時間を記録した。水迷路実験（ｗａｔｅｒ−ｍａｚｅ  ｔｒｉａｌ）は、２２±２℃に維持される水で満たされた丸い水槽で行った。水槽領域は４つの区画に分けて、隠された逃避プラットフォーム（直径１０ｃｍ）を１つの区画の中央の水中に、見えないように入れた。ラットは迷路外部にあるいくつかの標識を見て、隠されたプラットフォームを捜すように訓練させた。連続４日のそれぞれの日に５分おきで３回ずつ実験を行い、４回目の実験から１週間後に５回目の実験を行った。プラットフォーム上への平均逃避時間を記録した。
【００５７】
実施例７：脳脊髄液におけるアセチルコリン濃度の分析
学習及び記憶能力テストの終了後にラットを犠牲にして、アセチルコリン（ＡＣｈ）含量を分析するために、脳脊髄液（ＣＳＦ）を採取した。脳脊髄液におけるアセチルコリンの濃度は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアセチルコリン／アセチルコリンエストラーゼ分析キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、キット製造者のマニュアルに従って測定した。
【００５８】
実施例８：脳組職に対する免疫組職化学染色
ラットの脳を４％パラホルムアルデヒド溶液で還流固定し、４８時間、後固定した後、３０％スクロースに７２時間置いて凍結保護した。横断面で３０μｍ厚みの凍結切片を準備し、ｈＮｕＭＡ（１：１００，ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣｈＡＴ（１：１００，ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＮＦ−Ｍｉｘ（１：１，０００，ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）又はＧＦＡＰ（１：１，０００，ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する特異的抗体を使用して、ヒト細胞確認用のｈＮｕＭＡ（ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｔｉｇｅｎ）、機能を持つタンパク質ＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、神経細胞確認用のＮＦ−Ｍｉｘ（ニューロフィラメントタンパク質）、星状細胞確認用の酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対して二重染色を行った。脳組職スライドを一次抗体と４℃で一晩中インキュベーションして、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５９４（１：１，０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が結合した二次抗体と常温で１時間インキュベーションした。
【００５９】
実施例９：統計分析
データは平均±標準誤差で示した。行動データに対するグループ間の比較における統計学的な有意性は、一元変量分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及び二元変量分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって決定した。Ｐ値が＜０．０５である場合は、統計学的に有意なものと見なした。
【００６０】
実施例１０：ＣｈＡＴ発現ヒト神経幹細胞株の確立
ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）遺伝子のＦ３ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）へのトランスフェックションに対して、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）分析を行って、Ｆ３．ＣｈＡＴ神経幹細胞内でコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）ｍＲＮＡが正常に発現していることを確認した（図１のパネルＡ及びパネルＢ参照）。Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞はＦ３細胞に比べてコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のｍＲＮＡ発現及びタンパク質合成水準が非常に高かった（図１のパネルＢ及びＤ）。Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞はこれらの親細胞であるＦ３細胞と類似する形態を示し（図１のパネルＣ）、Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞はＣｈＡＴ抗体に対して高い陽性の免疫反応を示した（図１のパネルＤ）。
【００６１】
実施例１１：Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞のＡＦ６４Ａ処理されたラット脳への移植結果
ＡＦ６４Ａ処理されたラットにＦ３．ＣｈＡＴ細胞（１×１０６細胞／ラット）を脳室内に移植した後、９週時点で観察した結果、Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞が脳全体領域に分布したことを確認した（図２のパネルＡないしＤ参照）。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）に対する免疫反応性は、海馬、視床、視床下部、皮質及び隔膜から検出された。移植されたＦ３．ＣｈＡＴ細胞がコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性を発現することをインビボで確認するために、ヒト核マトリックス抗原（ｈＮｕＭＡ）及びＣｈＡＴに特異的な抗体を使用して二重免疫染色を行った。その結果、ｈｕＮｕＭＡ陽性Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞のうち大部分は移植後９週でＣｈＡＴを強く発現することが観察された（図２のパネルＥ参照）。さらに、ｈＮｕＭＡ及びＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）に対して二重陽性であると共にｈＮｕＭＡ及びＮＦ（神経フィラメント）に対して二重陽性であるＦ３．ＣｈＡＴ細胞が発見された。上記結果は、Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞が星状細胞及び神経細胞に成功裏に分化したことを暗示するものである（図２のパネルＦ及びＧ参照）。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）タンパク質は移植した後に脳全体領域に分布したＦ３．ＣｈＡＴ細胞から検出され、インビボで９週時点まで生存した（図２参照）。
【００６２】
実施例１２：Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞移植によるアセチルコリン濃度の回復
ＡＦ６４Ａ（エチルコリンマスタードアジリジニウムイオン）は、高親和性コリン輸送システムによってのみ吸収されて、コリン性神経細胞内部に移動され、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のｍＲＮＡ発現及び酵素活性に変化を起こすコリンアナログである（参考文献１５〜１７）。ＡＦ６４Ａを脳に投与するとアセチルコリン（ＡＣｈ）の放出が減少し、これによって学習及び記憶能力欠乏を含む認知能の損傷が誘導される（参考文献１６〜１８）。したがって、本発明においては、Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞移植による記憶力向上の概念を測定するために、ＡＦ６４Ａ動物モデルを使用した。例えば、アセチルコリン（ＡＣｈ）レベルが２５％〜３０％程度だけ減少しても、β−アミロイド形質転換マウス（Ｔｇ２５７６）（参考文献１９）においてだけでなく、ＡＦ６４Ａ投与動物モデルにおいても深刻な記憶力損傷を示すが、かかる症状は２週以内に始まって１１週以上持続する（参考文献１６〜１８、２０）。
【００６３】
コリン性毒素であるＡＦ６４Ａ（３ｎｍｏｌ／ラット）をラットの脳室内に投与した後、７週及び１１週時点で脳脊髄液（ＣＳＦ）内のアセチルコリン（ＡＣｈ）濃度を測定した結果、ＡＦ６４Ａを投与したラットの方が、生理食塩水を投与した対照群ラットに比べてアセチルコリンの濃度が顕著に減少した（図３のパネルＡ及びＢ）。一方、ＡＦ６４Ａ投与後２週時点でＦ３．ＣｈＡＴ細胞移植を受けたラットの脳では、ＡＦ６４Ａ投与によって減少していたアセチルコリン（ＡＣｈ）レベルが完全に回復したが、比較群としてＦ３細胞移植を受けたラットでは、アセチルコリン（ＡＣｈ）レベルが依然に低く維持された。
【００６４】
移植された神経幹細胞の拡散分布のために、特定の脳領域よりは脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）の濃度を分析した。Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞からのコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のｍＲＮＡ発現（図１のパネルＢ参照）及びタンパク質の生成（図１のパネルＤ参照）によって、脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）レベルを増加させたものと見られる。
【００６５】
実施例１３：Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞移植による学習及び記憶能力の回復
ＡＦ６４Ａ処理されたラット（▼で表示）は、ＡＦ６４Ａ投入後２週時点（細胞移植前）、６週〜７週（細胞移植後４週〜５週）時点（図４のパネルＡ及びパネルＣ）及び１０週〜１１週（細胞移植後８週〜９週）時点（図４のパネルＢ及びＤ）で行われた受動的回避試験（図４のパネルＡ及びパネルＢ）及び水迷路実験（図４のパネルＣ及びＤ）によって測定されたように、正常動物（●で表示）と違って学習能力及び記憶能力の深刻な損傷を示した。
【００６６】
興味深いことに、ＡＦ６４Ａ処理後Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞を移植されたラット（◆で表示）は、移植後４週〜５週及び８週〜９週時点で学習能力及び記憶能力が回復したのに対し、比較のためにＡＦ６４Ａ処理後Ｆ３細胞を移植した場合（■で表示）は、上記のような効果が生じなかった［●：正常対照群、▼：ＡＦ６４Ａ単独投与群、■：ＡＦ６４Ａ＋Ｆ３移植群、◆：ＡＦ６４Ａ＋Ｆ３．ＣｈＡＴ移植群］。
【００６７】
上述した実施例１２のように、Ｆ３．ＣｈＡＴ（１×１０６細胞／ラット）の移植は、脳におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）レベルを全面的に回復させ（図３参照）、これによりＡＦ６４Ａ処理されたラットの学習能力及び記憶能力を正常動物の水準に向上させたものと推定される（図４参照）。Ｆ３親細胞の場合には、脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）の含量を少し増加させたが、記憶能力の向上に対してはほぼ無視できるような効果を示した。Ｆ３及びＦ３．ＣｈＡＴ細胞は、傷部位に移動して神経細胞及び星状細胞に分化し、移植後９週後まで生存した（図２参照）。脳全体領域に拡散して分布しているため、脳切片での細胞の正確な数を数えることは不可能だった。ところが、大部分のｈＮｕＭＡ陽性Ｆ３．ＣｈＡＴ細胞がＣｈＡＴを発現することを確認した（図２参照）。このことは移植されたＦ３．ＣｈＡＴ細胞が宿主の脳組職の新しい環境内で正常に機能するということを示唆するものであり、これは脳脊髄液（ＣＳＦ）において増加されたアセチルコリン（ＡＣｈ）レベルによって裏付けられる（図３参照）。
【００６８】
上記本発明の実験を通じて、ＣｈＡＴを発現するヒト神経幹細胞をＡＦ６４Ａ誘導されたＡＤモデルラットの脳に移植した場合、脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）レベルをほぼ正常な水準に回復させて、学習能力及び記憶能力の回復に寄与することを確認した。
【００６９】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるのではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言えよう。
【００７０】
参考文献
１．Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３，７７（１９８０）．
２．Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５，１２３７（１９８２）．
３．Ｃｏｙｌｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．，ＤｅＬｏｎｇ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９，１１８４（１９８３）．
４．Ｋ．，Ｋａｓａ，Ｐ．，Ｒａｋｏｎｃｚａｙ，Ｚ．，Ｇｕｌｙａ，Ｋ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５２，５１１（１９９７）．
５．Ｔｅｒｒｙ，Ａ．Ｖ．，Ｂｕｃｃａｆｕｓｃｏ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０６，８２１（２００３）．
６．Ｍｕｓｉａｌ，Ａ．，Ｂａｊｄａ，Ｍ．，Ｍａｌａｗｓｋａ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１４，２６５４（２００７）．
７．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｓ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７，８６２（２００５）．
８．Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．，Ｋｏｋａｉａ，Ｚ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，１０９４（２００６）．
９．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｕ．，ｄｅＶｅｌｌｉｓ，Ｊ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８７，２１８３（２００９）．
１０．Ｂｌｕｒｔｏｎ−Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，１３５９４（２００９）．
１１．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，１２０４（２００７）．
１２．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １３１，６１６（２００８）．
１３．Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６，１２４９７（２００６）．
１４．Ｈｗａｎｇ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６，１０３４（２００９）．
１５．Ｆａｎ，Ｑ．Ｉ．，Ｈａｎｉｎ，Ｉ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２４，１５（１９９９）．
１６．Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋａｔｏ，Ｋ．，Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｅ．，Ｎａｇａｏｋａ，Ａ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ．）  １０３，２１５（１９９１）．
１７．Ｂｅｓｓｈｏ，Ｔ．，Ｔａｋａｓｈｉｎａ，Ｋ．，Ｅｇｕｃｈｉ，Ｊ．，Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｓａｉｔｏ，Ｋ．，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．１１５，１０１９（２００８）．
１８．Ａｂｅ，Ｅ．，Ｍｕｒａｉ，Ｓ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｙ．，Ｓａｉｔｏ，Ｈ．，Ｉｔｏｈ，Ｔ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０８，３８７（１９９３）．
１９．Ｔｓａｉ，Ｋ．−Ｊ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．−Ｃ．，Ｓｈｅｎ，Ｃ．−Ｋ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４，１２７３（２００７）．
２０．Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．，Ｍａｎｔｉｏｎｅ，Ｃ．Ｒ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｄ．Ｊ．，Ｈａｎｉｎ，Ｉ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２２２，１４０（１９８２）．
２１．Ｔａｋａｓｈｉｎａ，Ｋ．，Ｂｅｓｓｈｏ，Ｔ．，Ｍｏｒｉ，Ｒ．，Ｅｇｕｃｈｉ，Ｊ．，Ｓａｉｔｏ，Ｋ．，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．１１５，１０２７（２００８）．
２２．Ｓｈｉｍａｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４，１１３２（２００７）．
２３．Ｘｕａｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．４４０，３３１（２００８）．
２４．Ｗｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７５，１８６（２００８）．
２５．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｎ．，Ｓｅｔｈ，Ｋ．，Ｋｈａｎｎａ，Ｖ．Ｋ．，Ａｎｓａｒｉ，Ｒ．Ｗ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ａ．Ｋ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，１０３（２００９）．
２６．Ｂｅｃｋ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３，３３９（１９９５）．
２７．Ｓｃｈｂｉｔｚ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ  ３１，２２１２（２０００）．
２８．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｕ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２４，１５９（２００４）．
２９．Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．４６，４２３（２００５）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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