(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇａｌＰ遺伝子における変異を含む単離された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）バクテリア細胞であって、前記バクテリア細胞は、ＰＥＰ−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の活性を減少させる少なくとも１つの変異を含み、Ｃ５およびＣ６糖を同時に利用し、エタノール、ブタノール、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩およびリンゴ酸塩からなる群から選択される産業上有用な化学物質を生産し、ｇａｌＰ遺伝子における前記変異は位置２９７におけるグリシン残基のアスパラギン酸残基への交換を含む、細胞。
【請求項２】
少なくとも１つの非−ＰＴＳ糖輸送体の活性を増大させる少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項３】
前記非−ＰＴＳ糖輸送体がＡＴＰ結合カセット輸送体である、請求項２に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項４】
前記非−ＰＴＳ糖輸送体が主要ファシリテータースーパーファミリーのメンバーである、請求項２に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項５】
前記非−ＰＴＳ糖輸送体がタンパク質共輸送体である、請求項２に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項６】
発酵経路にかかわる１または複数の遺伝子の発現を不活性化する少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項７】
トリカルボン酸サイクルと関連する１または複数の遺伝子を不活性化する少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項８】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ＮＡＤＨ  依存性リンゴ酸酵素をコードする遺伝子、およびＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の少なくとも１つにおける変異をさらに含む、請求項１に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項９】
外因性ピルビン酸カルボキシラーゼをさらに含む、請求項１に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項１０】
増大したホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性をさらに含む、請求項１に記載の単離された大腸菌バクテリア細胞。
【請求項１１】
有機酸の微生物の生産のためのプロセスであって、
ａ．  ＰＥＰ−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の活性を減少させる少なくとも１つの変異およびｇａｌＰ遺伝子における変異を有する単離された大腸菌バクテリア細胞を提供すること、ここで前記バクテリア細胞は、ペントースおよびヘキソース糖を同時に利用し、乳酸、コハク酸、フマル酸およびリンゴ酸からなる群から選択される産業上有用な有機酸を生産し、ｇａｌＰ遺伝子における前記変異は位置２９７におけるグリシン残基のアスパラギン酸残基への交換を含む；
ｂ．  ペントースおよびヘキソース糖の両方を同時に含有する培地において、工程（ａ）のバクテリア細胞を培養すること；ならびに
ｃ．  培養培地から有機酸を随意的に回収すること、
を含むプロセス。
【請求項１２】
有機酸の微生物の生産のためのプロセスであって、
ａ．  ＰＥＰ−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の活性を減少させる少なくとも１つの変異およびｇａｌＰ遺伝子における変異を有する単離された大腸菌バクテリア細胞を提供すること、ここで前記バクテリア細胞は、ペントースおよびヘキソース糖を同時に利用し、乳酸、コハク酸、フマル酸およびリンゴ酸からなる群から選択される産業上有用な有機酸を生産し、ｇａｌＰ遺伝子における前記変異は欠失である；
ｂ．  ペントースおよびヘキソース糖の両方を同時に含有する培地において、工程（ａ）のバクテリア細胞を培養すること；ならびに
ｃ．  培養培地から有機酸を随意的に回収すること、
を含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００９年１１月１８日に出願された米国仮出願６１／２８１，４８３の優先権を主張する。
【０００２】
政府支援
この発明は、米国エネルギー省から承認された協定の下での米国政府支援で承認番号ＤＥ−ＥＥ０００２８７８／００１で行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
「Ｔｏｐ  ｖａｌｕｅ  ａｄｄｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｍａｓｓ」と題する２００４年の米国エネルギー省の報告は、生体触媒を用いて再生可能な原料から生産することができる１２の化学的成分を同定した。その１２の糖ベースの成分は、１，４−二酸（コハク酸、フマル酸、およびリンゴ酸）、２，５−フランジカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ソルビトール、およびキシリトール／アラビニトールである。
【０００４】
化学的成分は、有用な分子の新ファミリーに変換される潜在力を保有する多数の官能基を有する分子である。これら１２の成分は、次に多数の高−価値なバイオをベースとした化学物質または材料に変質させることができる。
【０００５】
ジカルボン酸、アミノ酸、およびジオールなどの生物学的発酵性のプロセスに由来する多くの天然代謝産物は、重合および重合体の化学物質合成に適した官能基を有する。近年、産業上の利用に適した単量体の化学物質化合物を生産するための微生物の効率が、遺伝学的操作を通して顕著に増えた。しかしながら、生物学的発酵性のプロセスを通して産業上の化学物質を生産することのコストは、いまだに非常に高い。現在、産業上の化学物質を生産するための生物学的発酵性のプロセスは、炭素の供給源として精製されたグルコース、およびコーンスターチなどの炭水化物を使用し、そしてそれにより、産業上の化学物質を生産するための発酵性プロセスにコストを付加する。
【０００６】
産業上の化学物質生産するための発酵プロセスのコストは、発酵プロセスにおける炭素の供給源としてリグノセルロース系バイオマスを用いることによって劇的に低下することができる。リグノセルロース系バイオマスは、農業残渣、食物処理廃棄物、まき、および紙およびパルプ工業からの廃棄物を含む多数の供給源から得ることができる。バイオマスは、おおよそ４０−５０％のヘキソース糖（６つの炭素原子を有する糖）、および１０−３０％のペントース糖（５つの炭素原子を有する糖）からなる。ヘキソース糖は、本技術分野においてＣ６糖として知られている。ペントース糖は、本技術分野において、Ｃ５糖として知られている。加水分解した場合、リグノセルロース系材料は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、およびガラクトースを含む糖の混合物を産出する。しかしながら、産業上の化学物質を生産するための多数の発酵プロセスは、それらの増殖および代謝のための炭素の供給源としての純粋なグルコースとともに発展してきた。例えば、米国特許７，２２３，５６７において説明される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、炭素の供給源としてグルコースを補った富栄養培地を使用する。Ｊａｎｔａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００８ａ；２００８ｂ）によって、および公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ／２００８／０２１１４１Ａ２およびＷＯ２０１０／１１５０６７Ａ２において説明された、コハク酸の生産に有用である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＪ１２２は、最小培地上で増殖することができるが、炭素の供給源としてグルコースまたは別の糖を必要とする。高効率で産業上の化学物質を生産する能力を有するこれらの生物がリグノセルロースの加水分解に由来する糖の混合物において増殖させることができれば理想的であろう。発明者らは、特殊な産業上の化学物質を生産することに既に最適化された微生物に、リグノセルロース系原料の加水分解に由来するＣ５およびＣ６糖の混合物を使用させることを可能にする方法を発見した。
【０００７】
多重的な糖を同時に使用する微生物の能力は、ある生化学調整系の存在によって限定される。微生物の細胞内のこれら生化学調整系は、遺伝学的基礎を有する。遺伝学的操作を通してこれらの調整系を克服するための努力がなされてきた。
【０００８】
多くの場合において、産業上の微生物は、炭素の供給源としてグルコースまたはスクロースを含有する培地において増殖する。増殖培地におけるグルコースの存在は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および産業上微生物の他の種における他の糖の使用を抑制する。これらの微生物によるペントース糖であるキシロースなどの他の糖の消費は、増殖培地におけるグルコースが完全に消費された後のみにおいて開始する。産業上の微生物における炭素利用に関するこの現象は、異化生成物抑制またはジオーキシー増殖といわれる。商業の規模における産業上の化学物質の生産の間、異化生成物抑制の軽減を通してＣ５およびＣ６糖などの異なる糖を微生物に共同利用させる方法は、発酵によって生産される産業上の化学物質のコストを低下させるのに決定的であろう。
【０００９】
微生物は、細胞質膜に位置する一連の輸送体タンパク質を通して糖を取り込む。微生物の糖輸送体は、３つの主要なカテゴリーにおさまる。バクテリアにおける糖輸送体の最大の群は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体として知られている。名称が暗示するように、ＡＢＣ輸送体は、バクテリア細胞に輸送された糖の各分子についてＡＴＰの分子を必要とする。ＸｙｌＦＧＨは、ペントース糖であるキシロースを細胞に輸送するためのＡＢＣ輸送体である。ＡｒａＦＧＨは、別のペントース糖であるアラビノース輸送のためのＡＢＣ輸送体である。
【００１０】
第二のタイプのバクテリア糖輸送体は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）の下、グループ分けされる。ＭＦＳ糖輸送体の内、輸送体の２つの異なるカテゴリーが認められる。ＭＦＳは、Ｈ＋−連動共輸送体、Ｎａ＋−連動共輸送体−対向輸送体、および単輸送体を含む。単輸送体は、糖輸送のための単純なファシリテーターであり、そして、細胞へ輸送された糖の各分子についてＡＴＰの分子を必要としない。ザイモノナス・モビリス（Ｚｙｍｏｎｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）における膜貫通タンパク質Ｇｌｆは、ファシリテーターの例である。Ｈ＋−共輸送体は、細胞に輸送された各糖分子について細胞外プロトンを必要とする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧａｌＰタンパク質は、ヘキソース糖であるガラクトースの細胞への輸送のための共輸送体である。ＧａｌＰは、１２の膜貫通ループを有する非常に良く特徴付けられる共輸送体である。ＧａｌＰは、細胞膜を越えてグルコースを輸送する能力を有するとも報告されている。ＡｒａＥは、細胞膜を越えたアラビノースの輸送のためのプロトン−連動共輸送体である。同様に、ＸｙｌＥタンパク質は、キシロースの輸送のためのプロトン−連動共輸送体である。
【００１１】
グルコースなどのヘキソース糖の取り込みに最初に関与する第三の糖輸送体は、ホスホエノールピルビン酸塩：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）として知られている。ＰＴＳから他の２糖輸送系を分化させることの方法として、他の２糖輸送系（ＡＢＣ輸送体、およびＭＦＳ輸送体のメンバー）は非−ＰＴＳ糖輸送体と呼ばれる。ＰＴＳによって触媒されるホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）からのホスホリル基の移動は、グルコースおよび他の糖の輸送およびホスホリル化を推進し、そして、細胞の内部においてホスホリル化した糖およびピルビン酸の形成を結果する。ＰＴＳ生成ピルビン酸は、グルコースが唯一の炭素の供給源である好気性培養条件下、ＰＥＰにリサイクルされないらしい。むしろ、ピルビン酸塩は、トリカルボン酸サイクルを経由して炭素二酸化物に酸化される。このように、グルコースの各単一分子の輸送のために、１分子のＰＥＰが消費される。細胞の生体エネルギーに関して、ＰＴＳを通した糖の輸送は、エネルギー集中的プロセスである。したがって、産業上有用な化学物質の生産のために細胞内にホスホエノールピルビン酸塩容量を保存する必要がある嫌気的に増殖している細胞において、細胞に輸送された糖の各分子のためにＰＥＰの分子を必要としない他の非−ＰＴＳ糖輸送体にＰＴＳを交換できることが望ましい。
【００１２】
ＰＴＳは、Ｅ１およびＨＰｒと名付けられた２つの細胞質成分、および膜−結合成分ＥＩＩから構成される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、少なくとも１５の異なるＥＩＩ複合体を含有する。それぞれのＥＩＩ成分は、輸送されるべき糖タイプに特異的であり、そして、２つの疎水性内在性膜ドメイン（ＣおよびＤ）、ならびに２つの親水性ドメイン（ＡおよびＢ）含有する。これらの４つのドメインは、ともに、糖分子の輸送およびホスホリル化に関与する。ＥＩタンパク質は、ＰＥＰからのリン酸基をＨＰｒタンパク質に移動させる。ＥＩＩタンパク質は、ホスホリル化ＨＰｒタンパク質からのリン酸基を糖分子に移動させる。
【００１３】
ＥＩは、ｐｔｓＩ遺伝子によってコードされる。ＨＰｒは、ｐｔｓＨ遺伝子によってコードされる。腸内バクテリアのグルコース−特異的ＥＩＩ複合体は、２つの異なるタンパク質、すなわち、遺伝子ｃｒｒによってコードされるＥＩＩＡＧｌｃ、および遺伝子ｐｔｓＧによってコードされる膜結合タンパク質ＥＩＩＣＢＧｌｃからなる。ＰＴＳ介在性糖輸送は、ＰＴＳと関連するタンパク質をコードするこれらの遺伝子の１を変異させることによって阻害されることができる。代わりのホスホエノールピルビン酸塩−非依存性取り込みおよびホスホリル化活性（非−ＰＴＳ）によるＰＴＳの機能的交換は、グルコースからの生産収量、および代謝産物のいくつかのクラスについての生産性における有意な改良をもたらした。
【００１４】
ＰＴＳ−介在性グルコース取り込みにおける減少とともに、グルコース取り込みのための他の系が、産業上有用な化学物質の生産のための細胞内におけるグルコースの継続した入手可能性を確実にするために活性化されることができる。例えば、グルコース単輸送体であるグルコースパーミアーゼをコードするｇｌｆ遺伝子は、ＰＴＳ介在性グルコース取り込みの喪失の代わりになることが示されてきた。同様に、ｇａｌＰおよびｇｌｋ遺伝子の過剰発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐｔｓ−株においてグルコース取り込みおよびホスホリル化を増進させることが報告されている。ＧａｌＰは、ヘキソース糖であるガラクトースの取り込みのための共輸送体である。ＧａｌＰは、ｐｔｓ−株においてグルコースを輸送することが報告されてきた。ＧａｌＰ介在性グルコース取り込みの意義は、ｐｔｓ−変異体におけるｇａｌＰ遺伝子の不活性化が、グルコース上での増殖を阻害することが見出されるという事実によって証明される（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＰＴＳの不存在において、Ｇｌｋは、解糖に進入することができる前に、グルコース分子のリン酸化を達成することが必要である。ｐｔｓ−株におけるＧａｌＰタンパク質の発現は、構成的プロモーター下でｇａｌＰ遺伝子を発現させることによって、またはｇａｌＳおよびｇａｌＲなどのｇａｌＰ遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子における変異を通してｇａｌＰ遺伝子発現の抑制を軽減することのいずれかによって達成することができる。
【００１５】
細胞への糖の輸送において負担するエネルギーコストを低下させることに加えて、ＰＴＳと関連するタンパク質をコードする遺伝子への変異の導入は、ペントースおよびヘキソース糖を含む培養培地に存在する全ての糖の同時輸送および利用を同じく可能にするであろう異化生成物抑制を軽減することが期待される。Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ（２００１）は、グルコースの輸送のためのＰＴＳを欠く大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によって、グルコース、アラビノース、およびキシロースを含む糖混合物の利用を研究した。ｐｔｓ−変異体は、その野生型親株と同程度に迅速に非−ＰＴＳメカニズムによって糖を取り込むことができた。グルコース−キシロース、またはグルコース−アラビノース混合物を補った最小培地において増殖させる培養において、グルコースは、野生型株におけるアラビノースまたはキシロース−利用を抑制した。同一培養条件下、ｐｔｓ−変異体は、グルコースおよびアラビノースを共代謝した。しかしながら、グルコースが、いまだキシロース消費に対して部分的抑制的効果を及ぼした。グルコース−アラビノース−キシロースの３つの混合物とともに増殖する培養において、野生型株は、グルコース、アラビノース、および最後にキシロースを連続して利用した。対照的に、ｐｔｓ−株は、キシロースはグルコース−アラビノース枯渇後に利用されたが、グルコースおよびアラビノースを共代謝した。グルコース−アラビノース共代謝の結果として、ｐｔｓ−株は、野生型株よりも１６％早く培養培地に含まれる糖の総量を消費した。
【００１６】
グルコースおよびキシロースを共代謝する能力を有するｐｔｓ−変異体株は、培地における糖の消費の比率におけるさらなる増大を引き起こし、生産性における増大をもたらすであろう。これらの２つの糖は原料セルロース系加水分解物に存在する主要な糖を表すので、このように、本技術分野においては、グルコースおよびキシロースを共代謝することができた微生物の必要がある。さらに、ｐｔｓＧ遺伝子機能の除去が、有機酸を生産するように代謝的に改変された微生物の増殖の比率を減少させることができたことが報告されてきた（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、増殖比率および商業的に重要な化学物質および化学物質中間体の生産の比率を妥協することなしに多重的な糖を同時に使用する能力を達成する必要性もさらにある。
【００１７】
本発明の目的は、生産性を低下させることなしに、多重的な糖を同時に用いて高レベルの産業上の化学物質を生産することができる微生物を代謝的に進化させることであった。発明者らは、代謝的進化を通して複数の糖を同時に消費する微生物を作るためのプロセスを驚くべきことに同定した。代謝的進化のこのプロセスは、迅速な増殖などの任意のその最初の特徴に影響することなしに細胞が複数の糖を使用する能力、および商業的に意味のある量において特定の産業上の化学物質を生産する能力を獲得することを可能にする。
【００１８】
発明者らは、グルコースおよびキシロースを同時に使用する微生物の能力のための新規な遺伝学的基礎も同定した。全体−ゲノムシーケンシングが、有機酸の生産において複数の糖を同時に使用する能力を微生物に与える遺伝学的修飾を同定するために使用された。
【００１９】
本発明の前には、ヘキソース糖およびペントース糖の両方を同時に利用する能力が単純な遺伝学的操作を通して達成することができるかどうかは不確かであったであろう。分子の遺伝学に関する本発明は、バイオマス−由来糖の全体の範囲を効率的に代謝する能力を達成する潜在力を提示する。初めて、本発明は、ホスホエノールピルビン酸の支出に偏性的に連関しないグルコースおよびキシロースの同時取り込みを達成するための遺伝学的取り組みを提供する。
【発明の概要】
【００２０】
発明の要旨
遺伝学的に修飾され、そして、炭素の供給源としてグルコースを含有する最小増殖培地において発酵性のプロセスを通して商業的に意味のある量の有機酸を生産することに最適化された微生物が、最初に最適化された有機酸生産比率を維持しながら、炭素の供給源として複数の糖を同時に使用するためにさらに代謝的に進化することができることを我々は意外にも発見した。
【００２１】
増殖、および有機酸生産のために、炭素の供給源として複数のタイプの糖分子を同時に使用する能力を、発酵性のプロセスを通して有機酸を生産する微生物に与えるための方法を提供することは本発明の目的である。原料セルロース系加水分解物を用いて高い産出収量の有機酸を生産する発酵プロセスを提供することは、本発明の別の目的である。
【００２２】
本発明の特性は、遺伝学的に修飾された、およびグルコースから有機酸を生産することに最適化された微生物がヘキソースおよびペントース糖を同時に使用する能力を獲得することを可能にするための代謝的進化のプロセスの利用である。
【００２３】
本発明の１つの実施態様において、炭素の供給源としてグルコースを有する培地において有機酸を生産することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリアは、有機酸生産の同一の比率を維持し、そして、炭素の供給源としてグルコースを使用することができる能力を保持しながら、炭素の供給源として付加的なタイプの糖を使用するように代謝的に進化している。
【００２４】
好ましい実施態様において、本発明は、１を超えるタイプの糖を同時に用いて最小増殖培地において有機酸を生産することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリアを提供する。
【００２５】
いまだ別の好ましい実施態様において、本発明は、炭素の供給源としてリグノセルロース系加水分解物を含む植物加水分解物を用いて最小増殖培地において有機酸を生産することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリアを提供する。
【００２６】
いまだ別の好ましい本発明の実施態様において、グルコースおよびキシロースを同時に用いてコハク酸を生産する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリアが提供される。
【００２７】
いまだ別の好ましい本発明の実施態様において、リグノセルロース系加水分解物を含む植物加水分解物を用いて最小増殖培地においてコハク酸を生産する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリアが提供される。
【００２８】
本発明は、リグノセルロース系材料を用いる生物学的発酵性のプロセスを通して非常に費用効果的な方法で高度に精製された有機酸を生産することに、特に有用である。
【００２９】
いまだ別の実施態様において、本発明は、非−ＰＴＳ輸送体タンパク質をコードする遺伝子を変異させること、それに加えて、ＰＴＳ糖輸送体と関連するタンパク質をコードする遺伝子の活性を低下させることによって、複数の糖を同時に使用する微生物を作るための方法を提供する。
【００３０】
より好ましい実施態様において、低下した活性を有するＰＴＳ糖輸送体、および変異した形態のガラクトース共輸送体を有する微生物が提供される。
【００３１】
この発明のさらなる利点は、次の説明から見てすぐに分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図１。８％キシロースを補った無機塩培地における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２株についての発酵プロファイル。発酵は、１６８時間の総期間に実行された。黒円において示されるキシロース利用は、約９６時間に開始し、白丸に示される５５０ｎｍでの光学密度における増大に関して測定されるバクテリア細胞密度における増大を伴った。黒四角において示されるコハク酸塩濃度における増大は、約９６時間に生じた。１６８時間の発酵の過程において培地における酢酸塩、ピルビン酸塩、およびリンゴ酸塩の濃度における変更も、図に示される。
【００３３】
図２。８％キシロースを補った無機培地におけるキシロースの代謝に適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２株についての発酵プロファイル。発酵は、１６８時間の総期間に実行された。黒円に示されるキシロース利用は、約７２時間で開始し、白丸に示される５５０ｎｍでの光学密度における増大に関して測定されるバクテリア細胞密度における増大を伴った。黒四角に示されるコハク酸塩濃度における増大は、約７２時間で生じた。１６８時間の発酵の過程における培地中の酢酸塩、ピルビン酸塩、およびリンゴ酸塩の濃度における変更も、図に示される。
【００３４】
図３。８％キシロースを補った無機培地における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＧ４００株についての発酵プロファイル。発酵プロファイルは、１２０時間の期間、観測された。黒円に示されるキシロース利用は、約３０時間に開始し、白丸に示される５５０ｎｍでの光学密度における増大に関して測定されるバクテリア細胞密度における増大を伴った。黒四角に示されるコハク酸塩濃度における増大は、約３０時間で生じた。１２０時間の発酵の過程における培地中の酢酸塩、ピルビン酸塩、およびリンゴ酸塩の濃度における変更も、図に示される。
【００３５】
図４。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２およびＴＧ４００株による混合糖発酵のプロファイル。発酵は、１４４時間の総期間、観測された。発酵培地は、グルコースおよびキシロースの両方を含有した。グルコース濃度における減少によって示されるグルコース利用は、白四角によって示される。キシロース濃度における減少によって示されるキシロース利用は、黒円によって示される。発酵培地中のコハク酸塩濃度における増大は、黒四角によって示される。１４４時間の発酵の過程における５５０ｎｍでの光学密度によって測定される細胞密度における変更は、白丸によって示される。１４４時間の発酵の過程における酢酸塩、ピルビン酸塩、およびリンゴ酸塩の濃度における変更も、図に示される。
【００３６】
図５。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ４００株による、２．５％（ｗ／ｖ）コーンスティープリカーを補った解毒された濃縮バガスＣ５  加水分解物の発酵のプロファイル。発酵は、１６８時間の期間、実行された。キシロースの濃度における減少によって測定されるキシロース利用は、黒円に示される。発酵培地中のコハク酸塩濃度における増大は、黒四によって示される。１６８時間の発酵の過程における培地中のピルビン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、および乳酸塩の濃度における変更も、図に示される。
【００３７】
図６。グルコースおよびキシロースの両方を含有する培地における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＷＧ３７株の発酵プロファイル。発酵は、１２０時間の期間、実行された。培地中のグルコース濃度における減少によって測定されるグルコース利用は、白四角に示される。培地中のキシロース濃度における減少によって測定されるキシロース利用は、黒円に示される。１２０時間の発酵の過程における５５０ｎｍでの光学密度によって測定されるバクテリア細胞密度における変更は、白丸によって示される。コハク酸塩濃度における増大は、黒四角に示される。１２０時間の発酵の過程における酢酸、ピルビン酸、およびリンゴ酸の濃度における変更も、図に示される。
【００３８】
図７。４％キシロース、および７％グルコースを含有する増殖培地におけるバクテリアのＴＧ４００、ＷＧ３７、およびＫＪ１２２株によるコハク酸生産の対照比較。発酵は、１２０時間の期間、実行された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＧ４００（黒円）、ＫＪ１２２（黒三角）、およびＷＧ３７（逆三角）株を用いた発酵培地中のコハク酸の濃度における増大が、１２０時間の期間、観測された。
【００３９】
図８。１０％キシロースのみを含有する増殖培地におけるバクテリアのＴＧ４００、ＷＧ３７、および、ＫＪ１２２株によるコハク酸生産の対照比較。発酵は、１２０時間の期間、実行された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＧ４００（黒円）、ＫＪ１２２（逆三角）、およびＷＧ３７（三角）株を用いた発酵培地中のコハク酸の濃度における増大が、１２０時間の期間、観測された。
【００４０】
図９。１０％グルコースのみを含有する増殖培地におけるバクテリアのＴＧ４００、ＷＧ３７、およびＫＪ１２２株によるコハク酸生産の対照比較。発酵は、１２０時間の期間、実行された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＧ４００（黒円）、ＫＪ１２２（三角）、およびＷＧ３７（逆三角）株を用いた発酵培地中のコハク酸の濃度における増大が、１２０時間の期間、観測された。
【００４１】
図１０。唯一の炭素の供給源としてキシロースを含有する増殖培地における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２およびＳＩ０１４株増殖プロファイル。バクテリア増殖は、９７時間の総期間、６００ｎｍでの光学密度に関して観測された。ＫＪ１２２株（黒円）は、非常に遅いのみを示した。一方、ＳＩ０１４株（黒四角）は、２７時間内で、早い増殖を示し、続いて、細胞密度はゆっくり減少した。
【００４２】
図１１。唯一の炭素の供給源としてキシロースを含有する培地における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２およびＳＩ０１４株によるキシロース利用およびコハク酸塩生産についてのプロファイル。キシロース利用は、９７時間の期間、培地中のキシロース濃度における減少に関して測定され、ＳＩ０１４株を用いたキシロース利用（黒四角）は、ＫＪ１２２株によるキシロース利用（黒円）に比べた場合、ずっと早かった。同様に、ＳＩ０１４株を用いたコハク酸生産（白四角）は、ＫＪ１２２株によるコハク酸生産（白丸）に比べると、ずっと早かった。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、組換え微生物によって、炭素化合物の発酵から、商業的に意味のある量において有機酸を生産するためのプロセスを提供する。より具体的には、この本発明は、発酵性のプロセスを通した有機酸の生産に適した微生物を提供する。本発明の微生物は、有機酸の商業的に意味のある量の生産のための発酵性のプロセスにおいて複数の糖を使用する能力を保有する。
【００４４】
発酵性のプロセスを通したコハク酸の生産に適した微生物が、本発明において開示される。本発明は、遺伝学的に修飾されたバクテリア株によって、炭素化合物から、商業的に意味のある量におけるコハク酸の生産のためのプロセスを提供するけれども、本発明の教示は、多数の他の化学物質の産業上の生産に等しく応用できる。
【００４５】
本発明の説明の目的で、次の定義が使用されるものとする。
【００４６】
多数の産業上有用な化学物質が、本発明を用いて製造することができる。このような化学物質の例は、エタノール、ブタノール、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、スレオニン、メチオニン、およびリジンを含むが、それらに限定されない。有機酸は、遊離酸、および塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウムの塩、塩化物、硫酸塩、炭素塩、重炭酸塩等が挙げられるが、それらに限定されない）の両方として存在することができるので、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、スレオニン、メチオニン、およびリジンなどの化学物質名は、遊離酸およびその任意の塩の両方を含むことを意味するものとする。同様に、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩などの任意の塩は、遊離酸も含むことを意味するものとする。
【００４７】
本発明は、代謝的進化のプロセスと、特定の遺伝学的修飾の技術を組合わせて、炭水化物基質を有する無機塩培地における嫌気性増殖条件下コハク酸生産について高産出収量、力価および容量生産性を示す株を得る。
【００４８】
本発明において使用する場合、用語「力価」は、発酵ブロス中の特定の化合物のモル濃度を意味する。このように、本発明に従ってコハク酸を生産するための発酵プロセスにおいて、１００ｍＭのコハク酸力価は、測定の時点での発酵ブロスが、発酵ブロスのリットルごとに１００ｍモルのコハク酸を含有したことを意味するであろう。
【００４９】
本発明において使用する場合、用語「産出収量」は、発酵プロセスの間、消費された原料のモルごとの特定の化合物生産のモルを参照する。このように、原料としてグルコースを用いるコハク酸の生産のための発酵性のプロセスにおいて、用語「産出収量」は、消費されたグルコースのモルごとに生産されたコハク酸のモルの数を参照する。
【００５０】
本発明において使用する場合、用語「容量生産性」は、ユニット時間ごとのユニット体積ごとの生産されたグラムにおける特定の化合物の量を参照する。このように、コハク酸についての０．９ｇＬ−１ｈ−１の容量生産性値は、増殖の時間の間、０．９グラムのコハク酸が発酵ブロスの１リットルに蓄積することを意味するであろう。
【００５１】
本発明において使用する場合、用語「遺伝子」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム、ならびに上流および下流調整配列を含む。上流調整領域は、遺伝子のプロモーター領域とも呼ばれる。下流調整領域は、ターミネーター配列領域とも呼ばれる。
【００５２】
語句「機能的に類似する」は、本明細書において開示される方法によって同一または異なる生物において見出される、任意の野生型、または変異したＤＮＡ配列、遺伝子、酵素、タンパク質と同等である、またはそれに類似する生物学的機能を有する、任意の生物からの、任意の野生型、または変異したＤＮＡ配列、遺伝子、酵素、タンパク質を広く意味する。機能的な類似は、配列相同性を必要としなくてもよい。対立遺伝子は、特定の遺伝子の２またはそれを超える形態のＤＮＡ配列の１つである。それぞれの遺伝子は、異なる対立遺伝子を有する。変異を有する対応する遺伝子に比べた場合、いかなる変異も有さない遺伝子は、野生型対立遺伝子と呼ばれる。
【００５３】
ホモログは、共通祖先ＤＮＡ配列からの系統による第二の遺伝子に関する遺伝子である。用語ホモログは、種形成の事象によって分類される遺伝子の間の関係に、または遺伝学的重複の事象によって分類される遺伝子の間の関係に適用されてもよい。オーソログは、種形成によって共通祖先遺伝子から進化した異なる種における遺伝子である。普通は、オーソログは、進化の過程において、同一の機能を保持する。オーソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測に不可欠である。種形成は、それが生じる種から新しい方法で生物を作ることができる新種の起点である。このプロセスの一部として、それは、親種との遺伝学的交換に対するいくつかの障壁も獲得した。パラログは、ゲノム内の重複に関係する親種遺伝子である。オーソログは、進化の過程において同一の機能を保持するが、たとえこれらが最初のものに関するとしても、パラログは、新たな機能を進化させる。
【００５４】
「変化した活性」を有する遺伝子またはタンパク質は、関連性がある野生型遺伝子またはタンパク質と比べた場合、測定可能な特性における測定可能な相違を産出する遺伝子またはタンパク質として広く定義される。変化した活性は、変化した遺伝子またはタンパク質を含有する株の増殖比率またはコハク酸塩生産の効率を増大させること、または減少させることによる一般的な方法において、それ自体明白に示すことができた。他の測定可能な特性は、酵素活性、酵素の基質特定性、基質に対する親和性または比率などの酵素の動力学的パラメーター、酵素の安定性、酵素の調整特性、遺伝子発現レベル、様々な条件下での遺伝子発現の調整等を含むが、それらに限定されない。
【００５５】
本発明において使用する場合、用語変異は、オープンリーディングフレーム、上流調整領域、および下流調整領域を含む遺伝子に対して行われる遺伝学的修飾を参照する。遺伝子変異は、遺伝子のオープンリーディングフレームの転写の上方調整、または下方調整を生じさせるか、または完全阻害を生じさせるかのいずれかである。遺伝子変異は、遺伝子の全体のコード領域、またはコードするヌクレオチド配列の部分を欠失させること、または、フレームシフト変異、ミスセンス変異、および挿入を導入すること、または終止コドン、またはその組合わせを導入することのいずれかによって達成される。変異は、酵素反応、または細胞膜を越えた有機分子の輸送などの生物学的機能に直接にかかわるタンパク質をコードする構造的遺伝子において生じてもよい。また、変異は、生物学的機能に直接にかかわるタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする調整遺伝子において生じてもよい。他の遺伝子の発現を制御するタンパク質は、調整タンパク質と呼ばれ、そして、これらの調整タンパク質をコードする遺伝子は、調整遺伝子と呼ばれる。
【００５６】
「変異」は、関連性がある野生型生物ものと比較したＤＮＡ配列における任意の変更も含むものとする。例えば、株ＫＪ１２２に見出される変異は、変異した領域のＤＮＡ配列がＡＴＣＣ  ８７３９としても知られる親野生型株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃのものと比較する場合に見出すことができるＤＮＡ配列における任意の変更である。変異は、任意の数の塩基対の付加的ＤＮＡの挿入、または任意の数の塩基対のＤＮＡの欠失であることができる。特定のタイプの挿入変異は、遺伝子重複である。遺伝子は、第二のコピーの遺伝子が最初のコピーに隣接して位置することができる自然発生的変異事象によって重複することができる、または遺伝子は、遺伝子の第二のコピーが最初のコピーから遠いゲノムにおける部位に位置することができる遺伝学的改変によって重複することができる。変異は、ある塩基タイプから別の塩基タイプに変更、例えば、アデニンからグアニン塩基に変更することができる。遺伝学の専門語において、変異は、ミスセンス（コドンによってコードされるアミノ酸を変更する）、ナンセンス（コドンを終止コドンに変更する）、フレームシフト（３ではない複数である多数の塩基の挿入、または欠失であり、そして、リーディングフレームを変更し、変異から下流でコードされるアミノ酸配列を変化させ、しばしば変異から下流で終止コドンを導入する）、または反転（極性が切り替わったが欠失していないＤＮＡ配列からもたらされる）であることができる。
【００５７】
「ヌル変異」は、関連性がある遺伝子の全体のオープンリーディングフレームの欠失のものと実質的に同一である表現型を与える、または関連性がある遺伝子の全ての測定可能な活性を除去する変異である。
【００５８】
「変異体」は、１または複数のを含有するゲノムを有する微生物である。
【００５９】
この発明において使用する場合、用語「外因性」は、細胞の外に由来する分子または活性が、宿主微生物に導入されることを意味することが意図されている。微生物の細胞に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、非依存性プラスミドとして存在するかもしれず、または宿主染色体ＤＮＡに組み入れられてもよい。タンパク質をコードする外因性核酸は、プロモーターおよびターミネーター配列などのそれ自身の調整配列とともに、発現可能な形態において微生物の細胞に導入されてもよい。また、外因性核酸分子は、宿主染色体ＤＮＡに組み入れられてもよく、そして、宿主調整配列の制御下であってもよい。
【００６０】
用語「内因性」は、宿主細胞内に存在する分子および活性を参照する。生合成活性に関して使用される場合、用語「外因性」は、宿主参照生物に導入される活性を参照する。供給源は、例えば、宿主微生物への導入に続いて参照活性を発現する同種または異種コード核酸であることができる。タンパク質をコードする核酸が微生物の同一種から得られる場合、それは、同種ＤＮＡと呼ばれる。核酸が異なる微生物の種が由来した場合、それは、異種ＤＮＡと呼ばれる。ＤＮＡの特質、それが同種であるか、または異種であるか、宿主細胞に導入した時に関係なく、ＤＮＡ、ならびにＤＮＡを導入した活性由来形態は、外因性と呼ばれる。したがって、本発明のコードする核酸の外因性発現は、異種および同種コード核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。
【００６１】
「Ｃ５およびＣ６糖を同時に利用する」細胞は、細胞が実質的な濃度のＣ５およびＣ６糖の両方を含有する培地において増殖する場合、測定可能な比率で、および培地への前記細胞の接種の始まりにおける任意の実質的な遅延なしに、キシロース、アラビノース、リボース等などのＣ５糖、およびグルコース、フルクトース、ガラクトース等などのＣ６糖の両方を消費する細胞を意味する。Ｃ５およびＣ６糖の両方を含有する培地は、精製した糖から作ることができる、またはそれは、バイオマス加水分解物に由来することができる。
【００６２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・アサイイ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｓａｉｉ）、アクロモバクター・デルマーベ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｌｍａｒｖａｅ）、アクロモバクター・ビスコーサス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、アクロモバクター・ラクティカム（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｃｔｉｃｕｍ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）、アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルスロバクター・トゥメセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｕｍｅｓｃｅｎｓ）、アリスロバクター・パラフィニス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）サペルダエ（ｓａｐｅｒｄａｅ）、アゾトバクター  インディカス（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｉｃｕｓ）、ブレビバクテリウムアンモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ディバリカツム（ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウムラクトファーメンツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウムグロボサム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ブレビバクテリウムフスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｕｓｃｕｍ）、ブレビバクテリウムケトグルタミクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウムヘルコルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｌｃｏｌｕｍ）、バクテリウム・プシルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｕｓｉｌｌｕｍ）、ブレビバクテリウムテスタセウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｓｔａｃｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｉｕｍ）、ブレビバクテリウム・リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｎｅｎｓ）、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｒｏｔｏｐｈａｒｍｉａｅ）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・フカタム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｕｃａｔｕｍ）、フラボバクテリウム・アウランティナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｕｒａｎｔｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・レナヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｅｎａｎｕｍ）、フラボバクテリウム・セワネンセ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｅｗａｎｅｎｓｅ）、フラボバクテリウム・ブレベ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒｅｖｅ）、フラボバクテリウム・メニンゴセブチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＣＣＭ８２５、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ノカルジア・オパカ（ノカルジア・オパカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｐａｃａ））、ノカルジア・ルゴサ（ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｕｇｏｓａ）、プラノコッカス・ユーシナタス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｃｉｎａｔｕｓ）、プロテウス・レッゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロピオニバクテリウム・セルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、シュードモナス・シンキサンサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｖａｌｉｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｌａｎｓ）、シュードモナス・ムシドレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・テストステロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ロドクロラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＡＴＣＣ  １５５９２、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＡＴＣＣ  １９０７０、スポロサルシナ・ウレア（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅ）、スタフィローコッカス・オーリーアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ��ｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・メッシュニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）、ビブリオ・チロゲネス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｔｙｒｏｇｅｎｅｓ）、アクチノマヅラ・マヅレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｍａｄｕｒａｅ）、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、キタサトスポリア・パルロサ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ  ｐａｒｕｌｏｓａ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・フラベラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｅｌｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・バージニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・カカオイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｃａｏｉ）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・シルクランス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・チアミノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｙｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、エシェリキア・フロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、セラシア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ショットムレリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅｒｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）およびキサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）を含む多数の微生物が本発明に適している。本発明に最も適した組換え微生物は、好ましくは、エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ファミリーに由来する。好ましい微生物は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、プロ��デンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびセラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）から選択される。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）がもっとも好ましい。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のうち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）種が、特に好ましい。
【００６３】
意味のある量の有機酸を生産することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、本技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許出願公開２００９／０１４８９１４は、化学的に純粋な酢酸塩および／またはピルビン酸塩の生産のための生体触媒として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株を提供する。米国特許７，６２９，１６２は、乳酸の生産のために構築された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ０１１株の派生物を提供する。特許協力条約の下で公開された国際特許出願ＷＯ２００８／１１５９５８  およびＷＯ２０１０／１１５０６７は、ｐＨ−制御したバッチ発酵中で炭素の供給源としてグルコースを含有する最小無機塩培地においてコハク酸塩およびリンゴ酸塩を生産するように改変された微生物を提供する。
【００６４】
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）などの菌株保存（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）から得られる野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、続いて商業的に意味のある量で、もうひとつの有機酸を生産するための増進した能力を有する株を得るように、遺伝学的に改変されている、および代謝的に進化していることができる。
【００６５】
本明細書において使用する場合、用語「遺伝学的に改変している」または「遺伝学的改変」は、微生物のゲノムのＤＮＡまたはプラスミドを操作することを通して、微生物において１または複数の酵素の発現を変化させることの実行を参照する。ゲノムの操作は、ゲノムのＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列を変化させること、付加すること、または除去することのいずれかを伴う。遺伝学的操作は、微生物のゲノムのＤＮＡ配列へ外来ＤＮＡ配列を挿入することも伴う。本発明の最も好ましい実施態様において、遺伝学的操作は、任意の外来ＤＮＡを導入することなく、微生物のゲノムのＤＮＡから特定のＤＮＡ配列を除去することによって達成される。特定のタンパク質生産物をコードする遺伝子の発現を不活性化することに必要である、ある遺伝学的操作は、微生物のゲノムへの外来ＤＮＡ配列の挿入を必要とする。本発明の最も好ましい実施態様において、導入された外因性ＤＮＡ配列は、遺伝学的改変プロセスの終わりにおける微生物がその最初のゲノムのＤＮＡにおいて外因性ＤＮＡを有さないように、微生物のゲノムのＤＮＡから最終的には除去される。本発明の好ましい実施態様の目的を達成するために必要である様々な技術が、Ｊａｎｔａｍａ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９９：  １１４０−１１５３、およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０１：８８１−８９３）において詳細に説明されてきた。公開された米国特許７，６２９，１６２、および米国特許出願２００９／０１４８９１４、ならびに特許協力条約の下で国際公開番号ＷＯ２００８／１１５９５８およびＷＯ２０１０／１１５０６７として公開された国際特許出願も、本発明の様々な実施態様を実施するのに有用な遺伝学的改変技術を説明している。これらの科学的出版物、ならびに特許文献は、本発明に有用な遺伝学的改変技術についての詳細を提供する目的で、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本発明の実施に適した微生物は、好気的に（酸素の存在において）、または嫌気的に（酸素の完全な不存在において）、または微好気的に（低比率の酸素供給で）増殖することができる。また、本発明に適した微生物は、二相増殖レジームにおいて増殖することができ、ここで、微生物は、商業的に意味のある量での望まれる有機酸の生産を達成するためにそれを嫌気性増殖条件に移動する前に、あるレベルの細胞増殖に到達するように、好気性増殖条件において最初に増殖させる。微生物に特定の有機酸を生産させるために、糖分解経路、トリカルボン酸サイクル（Ｋｒｅｂｓサイクル、またはＴＣＡサイクルとも呼ばれる）、およびグリオキシル酸短絡回路を含む多数の微生物の代謝的経路にかかわる様々な酵素が、上の段落における参考文献によって引用され、そして、組み込まれる科学的および特許文献において説明される様々な遺伝学的改変技術によって操作することができる。それらの参考文献の全てが、参照によって、この特許出願に組み込まれる。様々な微生物の代謝的経路についての詳細は、ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、およびＬｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒによるｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙなどの標準的な生化学テキストブックに見出すことができる。
【００６７】
好ましい有機酸のタイプに依存して、代謝的経路は、微生物が我々の選択する特定の有機酸を生産するように、遺伝学的に改変される。該微生物は、乳酸、酢酸、およびコハク酸を含む多数の有機酸を合成することができる。知られている遺伝学的改変技術を用いて操作することがきる、微生物の発酵性の経路において活性である酵素の一覧は、イソクエン酸シンテターゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸塩シンターゼ（ａｃｅＢ）、グリオキシル酸短絡回路オペロン（ａｃｅＢＡＫ）、酢酸塩キナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）；アコニターゼヒドラターゼ１および２（ａｃｎＡおよびａｃｎＢ）；アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）；クエン酸塩シンターゼ（ｃｉｔＺ）；フマル酸塩レダクターゼ（ｆｒｄ）；乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）；リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）；ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）；ピルビン酸塩蟻酸塩リアーゼ（ｐｆｌ）；ピルビン酸塩オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）；およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）を含むが、それらに限定されない。解糖、微生物の代謝的経路のトリカルボン酸サイクル、およびグリオキシル酸短絡経路に直接にかかわるこれらの遺伝子に加えて、有機酸の合成のためのエネルギーの供給源として有用である炭素化合物の取り込みにかかわる遺伝子の遺伝学的操作は、炭素取り込みを増進するように、または有機酸生産におけるエネルギー利用の効率を増進するように、操作することもできる。例えば、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によるグルコース取り込みにおける減少は、微生物の細胞へのグルコース取り込みに費やされるエネルギーを低下させることに役立つことができた。ＰＴＳを操作することによって保存されたエネルギーは、有機酸生産の効率を改良することに向かわせることができる。ホスホトランスフェラーゼ系遺伝子ｐｔｓＨおよびｐｔｓＧは、グルコース取り込みにおけるエネルギーを保存し、それによって微生物による有機酸生産の効率を改良するように操作することができる。このように、微生物の代謝的経路の分野において入手可能なデータを検索することによって、大半の代謝的経路をブロックして、そして、特定の有機酸の生産に炭素流動を向かわせるように、一連の遺伝子を欠失させることができる。
【００６８】
中心代謝的経路、および糖取り込みメカニズムに加えて、バクテリア細胞内のカルボキシル化酵素は、有機酸の発酵性の生産を改良するように操作することもできる。発酵性生産におけるカルボキシル化酵素の役割は、現在よく確立している。少なくとも４つの異なるタイプのカルボキシル化酵素が、バクテリア細胞内で機能的であることが知られている。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰｃａｓｅまたはＰＰＣ）は、ホスホエノールピルビン酸をカルボキシル化し、オキサロ酢酸の形成をもたらす。リンゴ酸酵素は、ピルビン酸をカルボキシル化し、リンゴ酸の形成をもたらし、そして、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどの還元した共因子を必要とする。ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）として知られる第三のカルボキシル化酵素は、ピルビン酸をカルボキシル化し、オキサロ酢酸を産出する。ホスホエノールピルビン酸塩カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）として知られる第四のカルボキシル化酵素は、ホスホエノールピルビン酸分子のカルボキシル化から生産されたオキサロ酢酸塩の各分子についてＡＴＰの１分子の生産で、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸塩にカルボキシル化する。これらのカルボキシル化酵素の任意の１つも、産業上有用な化学物質の発酵性生産を改良するために、ヘキソースおよびペントース糖を同時に利用する能力を有するバクテリア株において適切に操作することができる。
【００６９】
ホスホエノールピルビン酸塩カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）は、トリカルボン酸サイクルへの炭素の流動を改良するために遺伝学的に操作することができる。ｐｃｋの活性を改良することにおける利点は、この酵素は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸塩にカルボキシル化しながら、生産されたオキサロ酢酸塩の各分子についてＡＴＰの分子の生産をもたらすという事実にある。ＡＴＰ産出収量における増大は、細胞の増殖比率を増大させるであろう。
【００７０】
発酵性のコハク酸塩生産のための生来ｐｃｋの動員は、ｐｃｋ遺伝子の転写に正に影響を与える任意の変異によって達成することができる。ＰＣＫ活性のレベルにおける増大は、生来プロモーター、または遺伝子の発現を増大させることが知られている任意の他のプロモーター配列を有する多コピープラスミドにおいてｐｃｋ遺伝子を発現させることによって達成することができる。細胞内でｐｃｋ遺伝子の発現を増大させるための別の方法は、トランスポゾンを用いて付加的コピーのｐｃｋ遺伝子を組み入れることである。本発明の別の実施態様において、ｐｃｋ遺伝子の生来プロモーターは、活性のレベルを増進することが知られているいくつかの他のプロモーター要素と交換することができる。ｐｃｋ遺伝子の増大した発現は、遺伝子のプロモーター領域における変異によって、またはｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域と相互作用することが知られている調整要素の遺伝学的操作によって、達成することもできる。ｐｃｋ遺伝子の調整タンパク質をコードする遺伝子は、ｐｃｋ遺伝子の発現を増大させるために、いくつかの方法において、変異させる、または欠失させる、または過剰発現させることができる。単一点変異（ｐｃｋ遺伝子のＡＴＧ開始コドンと比較して位置−６４におけるＧからＡへの転位）は、ｐｃｋ遺伝子の転写を増大させることができ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ酵素活性における対応する増大を伴った。ｐｃｋ遺伝子発現における類似する増大は、ｐｃｋ遺伝子の発現を調整することが知られているタンパク質をコードする遺伝子を遺伝学的に操作することによって達成こともできる。
【００７１】
遺伝学的に改変した微生物による有機酸の生産は、本技術分野においてよく知られている適切な技術を用いることによって、確認すること、および定量化することができる。例えば、ＨＰＬＣ技術は、選択されたクローンによって生産された有機酸の量を測定するために使用することができる。ＨＰＬＣ技術は、選択されたクローンによって生産された有機酸の純度を測定することにおいても有益である。
【００７２】
本発明の微生物は、微生物学の分野においてよく知られている多数の異なる培養培地において増殖することができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の野生型および変異体株は、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、および０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地において増殖する。遺伝学的に修飾された微生物を生体触媒にする発酵性のプロセスを用いた有機酸の商業の生産のために、炭素供給源を補った最小無機塩培地が好ましい。ＬＢ培地のような富栄養培地とは対照的に最小無機塩培地の使用は、商業の規模における有機酸の生産のためのコストを低下させる。本発明に適した最小無機培地は、ＮＢＳ培地（Ｃａｕｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、およびＡＭ１培地（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を含む。ＮＢＳ培地は、１ｍＭベタイン、２５．７２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２８．７１ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２６．５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．  ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２０、０．１５ｍＭ  チアミンＨＣｌ、５．９２μＭ  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２０、０．８４μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．５９μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．４７μＭ  ＺｎＣｌ２、０．８３μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、および０．８１μＭ  Ｈ３ＢＯ３を含有する。ＡＭ１培地は、１ｍＭベタイン、１９．９２ｍＭ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、７．５６ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１．０ｍＭベタイン−ＫＣｌ、８．８８μＭ  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２０、１．２６μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．８８μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２．２０μＭ  ＺｎＣｌ２、１．２４μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、１．２１μＭ  Ｈ３ＢＯ３  および２．５０μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏを含有する。
【００７３】
増殖培地における有機酸の蓄積は、培地のｐＨを減少させがちであるので、培養培地に必要とされる適切な中和剤を添加することが必要である。培養器のｐＨは、ｐＨプローブを用いて連続的に観測することができ、そして、適切な塩基が、増殖培地のｐＨを約中性ｐＨに維持するために添加することができる。微生物の培養のｐＨを維持することに適した塩基は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３および（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む。この目的に適した塩基は、単独でまたは組合わせて使用することができる。
【００７４】
微生物の増殖のための無機培地は、炭素供給源が補われている。本発明に有用である炭素供給源は、キシロースのようなペントース糖、およびグルコース、フルクトース、およびガラクトースのようなヘキソース糖を含むが、それらに限定されない。炭素供給源は、グルコースおよびキシロースの組合わせなどの異なる糖の組合わせを提供することによって満たすことができる。炭素供給源は、でんぷんまたはリグノセルロースの加水分解に由来することができる。でんぷんおよびリグノセルロースなどの複合体炭水化物の加水分解は、本技術分野においてよく知られている熱化学変質プロセスまたは酵素的方法を用いることによって、達成することができる。微生物の発酵を用いる有機酸の産業上の生産のための好ましい炭素供給源は、農業または林業廃棄物の加水分解に由来するリグノセルロース系加水分解物である。リグノセルロース系加水分解物は、ヘキソース濃縮、およびペントース濃縮分画を産出するようにさらに分画化してもよく、そして、それらの分画は、微生物の発酵プロセスを用いる有機酸の商業の生産のための炭素の供給源として役立つことができる。ある濃度より上で、多数の微生物に毒性であることが見出されるフルフラールなどのある化学物質を除去するために、リグノセルロース系加水分解物は、さらに解毒化することができる。
【００７５】
遺伝学的改変から得られた微生物の株は、有機酸の生産に期待される遺伝子型を有する。しかしながら、最小無機塩培地におけるその増殖比率、または必要とされる比率で特定の有機酸を生産するそれらの能力、またはリグノセルロース系加水分解物に由来する炭素供給源におけるある化学物質に耐えるそれらの能力は、大規模発酵プロセスを通した有機酸の商業の生産のための生体触媒としてこれらの遺伝学的に修飾された微生物を用いることには適していないかもしれない。遺伝子欠失から得られた遺伝学的に修飾された微生物の株は、次に、代謝的適応または進化を介して最も代表的なクローンについて選択される。選択の間で生じた１または複数の自然発生的変異が、早い細胞増殖、異なる炭素供給源の迅速な消費、複数の糖を同時に使用する能力、炭素供給源における毒性化学物質に耐える能力、および高生産産出収量、および望まれる有機酸の生産性だが他の有機酸の低い生産を示す表現型をもたらすクローンを達成するための期間、代謝的進化の間、選択された培養は、新鮮最小培地に反復して移動された。代謝的進化の間、望ましい表現型を有するクローンを選択することが注目される。特定の有機酸を生産するように遺伝学的に改変された微生物は、商業的に魅力的な増殖比率を有さないかもしれず、そして、その結果、特定の有機酸のものの期待される産出収量を示さないかもしれない。代謝的進化は、特定の有機酸のものの生産のための増大した比率を伴う有意な増殖を示す株を進化させるために、続いて行うことができる。炭素供給源を補った無機培地における非常に良好な増殖比率を示すが、望まれる有機酸の産出収量において改良しなかった、代謝的進化からもたらされるクローンは、望ましいクローンではない。
【００７６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２株は、本発明の好ましい実施態様において使用される。ＫＪ１２２は、遺伝学的改変および代謝的進化の両方の組合せにかかわる複数段階を通して野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株に由来した。遺伝学的改変技術を用いて、乳酸塩ヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、蟻酸塩共輸送体（ｆｏｃＡ）、酢酸塩キナーゼ（ａｃｋＡ）、ピルビン酸塩−蟻酸塩リアーゼ（ｐｆｌＢ）、メチルグリオキサルシンターゼ（ｍｓｇＡ）、ピルビン酸塩オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、酢酸塩キナーゼ活性を有するプロピオン酸塩キナーゼ（ｔｄｃＤ）、α−ケト酪酸蟻酸塩リアーゼ（ｔｄｃＥ）、クエン酸塩リアーゼ（ｃｉｔＦ）、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、およびリンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）を含む１２の異なる遺伝子が、染色体のＤＮＡの染色体のＤＮＡから欠失された。ＫＪ１２２株をもたらすＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ株ＡＴＣＣ  ８７３９に対して行われた遺伝学的操作は、Ｊａｎｔａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００８ａ  ２００８ｂ）詳細に説明されてきた。
【００７７】
代謝的進化のプロセスの間、選択的圧力を用いて、生物に望ましい表現型を獲得させるために、２つの可能な変更が生じることができた。生物は、単純にそれ自体を選択的圧力に適応させ、そして、変更した表現型を示すことができた。また、生物は、選択的圧力下で、ある遺伝学的変更を経て、そして、変更した表現型を永続的に示すかもしれない。適応のみがあった、および遺伝学的変更がない場合、生物は、いったん選択圧力が軽減されれば、その最初の表現型に復帰する。これらの生物は、「適応した」生物といわれる。「適応した」微生物は、変更した表現型を示すためには、選択圧力下で、別の新鮮な段の代謝的進化を経なければならない。一方、付随する遺伝学的変更がある場合、変更した表現型は、選択圧力がない場合であっても、存在し続けるであろう。ある遺伝学的変更を伴う代謝的進化が望ましい。代謝的進化の間で安定な遺伝学的変更を獲得している微生物は、選択圧力を有する新鮮培地にそれを移動するいくらか前に、任意の選択圧力なしに最初の増殖培地において微生物を増殖させることによって容易に同定することができる。これらの生物が、任意の遅延期なしに良好な増殖および期待される表現型を示すことができるならば、該生物は、代謝的進化の間で、変更した遺伝子型を獲得したと考えられる。
【００７８】
代謝的進化の間で獲得される遺伝学的変更の塩基は、生物の染色体のＤＮＡをシーケンシングすること、および配列データを親株のものと比較することによって決定することができる。ゲノムの配列データは、本技術分野においてよく知られている次の技術によって得ることができる。このように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ  ８７３９から得られる親株ＫＪ１２２は、望ましい新しい表現型を有する株を得るために、代謝的進化にさらされることができる。代謝的に進化した新株のゲノムは、親株ＫＪ１２２とともに、配列決定することができ、そして、変更した表現型を説明する代謝的に進化した株における変異は、同定することができる。
【００７９】
この発明において定義される場合、用語変異は、遺伝子内のヌクレオチド配列における任意の変更を含む。遺伝子内のヌクレオチド変更は、別のアミノ酸残基への１アミノ酸残基の交換をもたらす三つ組コドン内の単一ヌクレオチド変更であってもよい。また、遺伝子のオープンリーディングフレーム内のヌクレオチド変更は、オープンリーディングフレームの部分、または全体のオープンリーディングフレームの欠失を伴ってもよい。オープンリーディングフレーム内のヌクレオチド変更は、終止コドンの導入を含み、結果として、オープンリーディングフレームが完全長タンパク質の代わりに短縮タンパク質をコードすることもできる。本発明において使用する場合、用語変異は、オープンリーディングフレームの上流または下流におけるヌクレオチド配列における変更も含む。オープンリーディングフレームの上流および下流の領域は、いくつかの調整ヌクレオチド配列を含有し、そして、オープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質の発現にかかわる。これらの調整領域に生じている変異は、遺伝子発現を変化させ、遺伝子機能の上方−調整または下方−調整をもたらすことができる。別の可能性は、フレームシフト変異をもたらすヌクレオチド挿入または欠失である。
【００８０】
本発明から獲得された知識に基づき、ペントースおよびヘキソース糖の同時の利用をもたらす遺伝学的修飾は、炭素の供給源としてグルコースを用いる１または複数の産業上の化学物質の生産のために既に遺伝学的に改変された任意のバクテリア株において実行することができる。また、ヘキソースおよびペントース糖の同時利用に必要である遺伝学的修飾は、任意の野生型バクテリア株において実行することができ、そして、このように、ヘキソースおよびペントース糖の同時利用のために修飾された野生型バクテリア株は、商業的規模における産業上の化学物質の生産に適した微生物を開発するために、さらに、遺伝学的修飾にさらされることができる。
【実施例】
【００８１】
実験的セクション
一般的注釈
株および接種材料調製：
ＫＪ１２２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ、ΔｌｄｈＡ、ΔａｄｈＥ、ΔａｃｋＡ、ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ、ΔｍｇｓＡ、ΔｐｏｘＢ、ΔｔｄｃＤＥ、ΔｃｉｔＦ、ΔａｓｐＣ、ΔｓｆｃＡ）が、本発明において使用された。ＫＪ１２２は、Ｊａｎｔａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００８ａ；  ２００８ｂ）、および特許協力条約の下で公開される国際特許出願である国際公開ＷＯ２００８／１１５９５８およびＷＯ２０１０／１１５０６７によって説明される遺伝学的修飾を通した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ（ＡＴＣＣ  ８７３９）株に由来した。これらの全て文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＪ１２２は、塩基付加について正規化された８８ｇ／Ｌコハク酸塩を生産するために、７２時間、ＡＭ１無機物培地において１０％グルコースを発酵することができる。ＡＭ１培地は、２．６３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８７ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．０ｍＭベタイン、および１．５ｍｌ／Ｌ微量元素を含有する。微量元素は、１０００Ｘストックとして調製され、そして、次の成分が含められる：１．６ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、０．２ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２、０．２ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ  ＮａＭｏＯ４、０．０５ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、および０．３３ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ。発酵ブロスのｐＨは、１：４（６Ｎ  ＫＯＨ：３Ｍ  Ｋ２ＣＯ３）（１．２Ｎ  ＫＯＨ、２．４Ｍ  Ｋ２ＣＯ３）で７．０に維持される。
【００８３】
いくつかの実験において、コーンスティープリカーが添加された。それは、コーン湿潤製粉工業からの副産物である。酵母抽出物およびペプトンに比べた場合、それは、ビタミンおよび微量元素の安価な供給源である。
【００８４】
発酵：コハク酸を生産するように遺伝学的に改変し、そして、−８０℃冷凍庫において貯蔵された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のグリセロールストックを、新鮮ＮＢＳ−２％キシロースプレート上に、画線することによって、発酵を開始した。１６時間（３７℃）後、プレートからの細胞をかき集め、発酵器に直接に植菌した。発酵器は、３５０ｍｌの作業体積を有する。この第一の発酵は、「種」培養といわれ、そして、データを蓄積するために使用された。全ての発酵における培地は、０．０３Ｍ  ＫＨＣＯ３、１ｍＭベタイン、および８％キシロース（特に断りのない限り）を補った従来のＡＭ１培地であり、そして、１．２Ｎ  ＫＯＨおよび２．４Ｍ  Ｋ２ＣＯ３からなる塩基を用いて中和された。発酵器は、１５０ｒｐｍで撹拌して、７．０のｐＨ、３７℃に維持された。２４時間後、種培養は、新培養を（バッチ実験または「移動」）、０．０５の開始ＯＤ５５０に植菌するために使用された。毎日の移動を例外として、全ての実験が、３通り、実施された。Ｃ５／Ｃ６共発酵実験は、４％キシロース、７％グルコース、０．５％アラビノース、０．４％ガラクトース、および０．３％マンノース（純粋糖）を含み、そして、唯一の炭素供給源としてのキシロース、および０．０８％フルフラール上で増殖する培養から植菌された。Ｃ５／Ｃ６共発酵は、８％キシロースおよび１％グルコースの混合物を用いて実施された。これらの実験は、１％  酢酸塩を用いて、または０．１％フルフラールを用いて、阻害剤の付加なしに３通り実施された．
【００８５】
細胞増殖：  細胞量は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）で光学密度を測定することによって推定された。
【００８６】
有機酸および糖分析：  様々な有機酸および糖の濃度が、ＨＰＬＣによって測定された。発酵ブロスに存在するコハク酸および他の有機酸が、ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを用いるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ装置上で分析された。ＢｉｏＲａｄ  Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ＋が、保護カラムとして使用された。ＨＰＬＣ分析のための標準は、０．００８Ｎ硫酸において調製された。ＨＰＬＣカラム温度は、５０ｏＣに維持された。０．００８Ｎ濃度での硫酸が、０．６ｍｌ／分の流動比率での移動相として使用された。様々な成分の定量化は、２１０ｎｍでのその吸光度を測定することによって行われた。
【００８７】
代謝的進化：ｐＨ制御した発酵からの細胞は、増殖ベースの選択を通した代謝的進化を促すために２４時間で連続的に移動された。新培地の体積の約１／１００で、接種材料は、予熱した新鮮培地に直接に添加し、開始ＯＤ５５００．０５とした。改良した発酵特徴を有するクローンが単離された。代謝的進化戦略は、キシロース発酵を改良することに応用された。
【００８８】
バガスの調製：
典型的にはエネルギーのために燃やすことによって使用される廃棄産物であるサトウキビバガスは、フロリダの製糖所からから得られる。この廃棄産物は、希酸前処理を用いるヘミセルロースおよびセルロース分画の調製のための開始材料として使用される。
【００８９】
サトウキビバガスは、約１０％の含水率に乾燥し、ナイフミルを用いて挽いた。材料は、中温度で希硫酸を用いて蒸気反応装置（ｓｔｅａｍ  ｒｅａｃｔｏｒ）（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ  ＆  Ｐａｒｒ）において処理する。希酸前処理のための典型的な前処理条件は、反応装置において、０．１−３％酸濃度、１００−２００℃温度、および１−３０分滞留時間である。最小糖分解で最大キシロース産出収量を達成するための最適反応装置条件は、反応装置において、約０．５％酸濃度、１６０℃、および１０分滞留時間である。
【００９０】
ＰＣＲ、およびＤＮＡシーケンシング：  一連の２つのｇａｌＰ特異的プライマーＢＹ３８およびＢＹ３９（表１）が、Ｅ．ｃｏｌｉのＴＧ４００、ＫＪ１２２、およびＷＧ３７株からｇａｌＰ遺伝子を得るために使用された。ＰＣＲは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの２ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ｋｉｔを用いる標準的プロトコルを用いて実行された。ＰＣＲ産物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のこれら異なる株のそれぞれからのＰＣＲ産物のサイズを測定するために、０．８％アガロースゲル上で泳動した。ＰＣＲ産物は、ボストン、マサチューセッツ州、ＵＳＡにおけるタフツ（Ｔｕｆｔｓ）ＤＮＡ  シーケンシングコア施設（Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって、Ｓａｎｇｅｒ方法を用いて配列決定した。配列データは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ソフトウェアプログラムを用いて分析した。
【００９１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＷＧ３７株の構築：  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＷＧ３７株は、ｇａｌＰ遺伝子の全体のコード領域を欠失させることによってＫＪ１２２株から派生させた。ｇａｌＰ遺伝子は、相同組換えを伴う２工程において欠失させた。第一の段階において、ｇａｌＰ遺伝子配列は、抗生物質マーカーおよびｓａｃＢ遺伝子配列を含有するカセットと交換させた。組換え体は、抗生物質を有するＬＢプレート上で選択された。第二の段階において、抗生物質カセットは、染色体のＤＮＡから除去され、そして、組換え体は、スクロースを含有する培地上で選択された。スクロース含有プレート上で増殖するコロニーは、ｓａｃＢカセットの欠失につき高度に濃縮している。
【００９２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＷＧ３７株の構築において、ｋａｎカセットは、テンプレートとしてのＸｍｎＩ消化ｐＧＷ１６２プラスミド、およびプライマー５１ａおよび５１ｂ（表１）を用いるＰＣＲによって増幅された。ｋａｎ−ｓａｃＢカセットのＤＮＡ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２株に導入された。第一の工程において、形質転換体は、カナマイシンを有するＬＢ  プレート上で選択され、そして、プライマー４９ａ、４９ｂ（表１）を用いるＰＣＲによって確認された。この株は、ＷＧ３５として設計された。ｇａｌＰ遺伝子および隣接する３００ｂｐ領域は、プライマー４９ａ、４９ｂ（表１）を用いて増幅され、そして、ｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにクローン化し、プラスミドｐＧＷ１８０を得た。このプラスミドＤＮＡの希釈した調製物は、プライマー５０ａ、５０ｂ（表１）を用いるインサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）増幅のためのテンプレートとして役立った。結果として生じた断片は、セルフライゲーションして、プラスミドｐＧＷ１８１を構築した。ｐＧＷ１８１（表１）において、ｇａｌＰ遺伝子が欠失された。ｇａｌＰ欠失を含有するＤＮＡ断片が、テンプレートとしてのプラスミドｐＧＷ１８１、およびプライマー４９ａ、４９ｂを用いるＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物は、ＷＧ３５に導入され、そして、形質転換体は、１０％スクロースを有するＬＢプレート上で選択された。結果として生じたクローンが、カナマイシン耐性の喪失について試験された。最終ｇａｌＰ欠失株は、ＷＧ３７として設計され、そして、特定の遺伝子欠失が、プライマー４９ａ、および４９ｂ（表１）を用いるＰＣＲによって確認された。
【００９３】
実施例１
Ｃ５利用
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）株ＫＪ１２２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ、ΔｌｄｈＡ、ΔａｄｈＥ、ΔａｃｋＡ、ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ、ΔｍｇｓＡ、ΔｐｏｘＢ、ΔｔｄｃＤＥ、ΔｃｉｔＦ、ΔａｓｐＣ、ΔｓｆｃＡ）は、グルコース、キシロース、およびアラビノース上で好気的に増殖することができた。本発明の目的は、ヘキソースおよび他のペントース糖の両方を含有する培地において微好気的に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２株を増殖させること、および両方のタイプの糖を同時に使用することができる生物を選択することである。
【００９４】
Ｃ５利用についての初期スクリーニングは、２％のキシロースを補ったＮＢＳ無機培地プレート上での好気性増殖によって実施された。プレートは、３７℃で一晩インキュベートした。キシロースプレート上に現れるコロニーは−連続して３回、新鮮プレート上に筋をつけて播いた。２％キシロースを有する固体ＮＢＳ無機培地上の第三の移動の最後に、プレートからの細胞が、そぎ落とされ、そして、０．０３Ｍ  ＫＨＣＯ３、１ｍＭベタイン、および８％キシロースを補ったＡＭ１無機培地を含有する発酵フラスコに直接に植菌された。発酵培地は、３７ｏＣで７．０のｐＨに維持するため、１．２Ｎ  ＫＯＨおよび２．４Ｍ  Ｋ２ＣＯ３からなる塩基で中和させた。培養物は、１５０ｒｐｍの速度で操作した磁気撹拌子を用いて撹拌した。液体培養物は、２４時間の初期期間、増殖させ、そして、０．０５の初期ＯＤ５５０で新培養を開始するための種培養物として使用した。
【００９５】
キシロースを有するＡＭ１無機培地におけるこの培養物は、初期７２時間遅延フェーズを示し、その間、ＫＪ１２２の増殖は、認められなかった。この初期遅延期の最後に、ＫＪ１２２株は、増殖を示し始めた。５５０ｎｍでのＯＤにおける増大によって測定されたバクテリア細胞の増殖と並んで、培地中のキシロースの濃度において、減少があり、それは、増殖培地中のコハク酸の濃度における比例的増大を伴った。
【００９６】
キシロース含有培地における２１６時間増殖期間の最後に、この培養物のグリセロールストックを調製し、−８０ｏＣで保存した。２１６時間増殖期間の最後の新鮮培養、または２１６時間増殖期間の最後に調製された培養物のグリセロールストックのいずれかが、８％キシロースを補ったＡＭ１無機培地を有する新鮮発酵器で植菌するために使用された。接種材料の供給源に関係なく、それが、新鮮培養からのものであったか、またはグリセロールストックからのものであったかどうかに関係なく、第二の発酵器における培養物は、任意の遅延期なしに増殖した。コハク酸生産は、任意の遅延期なしにバクテリア増殖も伴った。このように、２１６時間の期間の単一増殖サイクルが続く２％キシロースを有する固体無機培地上での３段増殖は、キシロースを含有する培地上で微好気的に増殖することができるＫＪ１２２の「適応した株」をもたらした。
【００９７】
実施例２
ＫＪ１２２の代謝的進化
本発明の別の実施態様において、ＫＪ１２２株は、代謝的進化にさらされた。キシロース糖を補った液体ＡＭ１培地において微好気的に増殖するＫＪ１２２培養物は、２週間の期間、２４時間ごとに、８％キシロースを含有する新鮮液体ＡＭ１培地に移動された。これら複数の移動の最後に、ＫＪ１２２株は、８％キシロースを補ったＡＭ１培地を有する新鮮発酵槽に移動された。発酵槽におけるＫＪ１２２の嫌気性増殖比率、ならびにコハク酸生産、およびキシロース利用の動力学が、観測された。発酵槽におけるコハク酸生産は、任意の遅延期なしに直ちに開始し、そして、より高い最終力価も産出し、そして、この株は、「代謝的に進化した株」と呼ばれる。我々の株コレクションにおいて、この代謝的に進化した株は、ＴＧ４００として呼ばれてきた。
【００９８】
ＫＪ１２２の「適応した株」および「代謝的に進化した」ＴＧ４００株が、それらの変更した表現型についての任意の遺伝学的基礎を有するかどうかを決定するために、次の実験が実行された。非修飾ＫＪ１２２株、「ＫＪ１２２の適応した株」および「代謝的に進化した」ＴＧ４００株は、２％グルコースを含有する新鮮無機培地を有するプレート上に筋をつけて播かれた。結果として生じたコロニーは、２％グルコースを有する新鮮プレート上に筋をつけて播かれた。このストリーキングは、１１日間連続して毎日行われた。１１日目の最後に、培養物は、キシロースを含有する寒天プレート上に筋をつけて播いた。キシロースプレート上で増殖するコロニーは、新鮮キシロース含有プレート上に再び筋をつけて播いた。これに続いて、第二のキシロース含有プレート上で増殖するコロニーを、液体培養に移動した。増殖比率、コハク酸生産、動力学、および培養培地中のキシロースの濃度における減少の比率が観測された。
【００９９】
図１、２、および３において示される結果が指し示すように、増殖培地におけるキシロースの消失によって観測されるキシロース利用は、最初のＫＪ１２２株、および「ＫＪ１２２の適応した株」の両方において、９６時間の遅延期を示した。代謝的に進化したＴＧ４００株の場合、培地におけるキシロースの大半は、第一の９６時間のうちに消費された。加えて、ＴＧ４００については、コハク酸生産は、いかなる遅延期も示さなかった。同様に、ＴＧ４００についての細胞増殖は、遅延期を示さなかったが、一方、ＫＪ１２２の「適応した株」、および最初のＫＪ１２２株は、約７２時間の初期遅延フェーズを示した（図１および２）。これらの観察は、代謝的に進化したＴＧ４００株が代謝的進化の間で、キシロース利用についての安定な遺伝子型を獲得したこと、およびこの能力は、この株がキシロースの不存在において数世代増殖した場合でさえ失われなかったことを明確に確証する。一方、キシロースのみを含有する培地における増殖に適したＫＪ１２２株は、キシロースの不存在下でグルコース含有培地において数世代増殖した場合、キシロースを使用するためのその能力を失っている。キシロースの不存在下で増殖したこのＫＪ１２２の「適応した株」は、炭素の供給源としてキシロースを使用することにそれ自体を再び適応させるためには、さらに９６時間を必要とした。このように、ＫＪ１２２の「適応した株」は、９６時間のキシロース含有培地におけるその適応の間、いかなる遺伝学的修飾も獲得しなかった。
【０１００】
ＴＧ４００は、炭素供給源としてキシロースを使用する能力を獲得する間、炭素の供給源としてグルコースを使用する能力をいまだ保持した（表２）。
【０１０１】
実施例３
Ｃ５＋Ｃ６共発酵
嫌気性増殖条件下におけるＫＪ１２２において、Ｃ５およびＣ６糖は、同時に代謝されない。Ｃ６糖は、一般的には最初に代謝され、そして、Ｃ５代謝に先立ち遅延が示される。したがって、同等量のＣ６およびＣ５糖の両方の存在下でのＴＧ４００の発酵特徴を測定することは必須であった。図４において示されるように、ＴＧ４００は、同一の比率で、グルコースおよびキシロースを使用することができ、そして任意の遅延期なしにコハク酸を生産した。ＫＪ１２２は、キシロースおよびグルコースの両方を使用することもできた。しかしながら、ＫＪ１２２株において、キシロース利用は、グルコース濃度における実質的な減少の後でのみ開始した。さらに、表３に示されるように、ＫＪ１２２によるキシロースおよびグルコース利用と比べた場合、ＴＧ４００は、グルコースよりも、モル基準においてより多くのキシロースを使用した。
【０１０２】
実施例４
Ｃ５糖が豊富な解毒したバガス加水分解物の発酵
代謝的進化を通して得られたＴＧ４００株は、バガスの加水分解に由来するキシロースを使用するためのその能力について試験された。濃縮バガス加水分解物は、２００ｒｐｍでのロータリーシェーカーにおいて、３５℃で６０分間、バガス加水分解物の各キログラムについて５０グラムの木炭でそれを処理することによって解毒した。活性炭処理したＣ５  豊富バガスは、ｐＨ調節し、ＡＭ１無機塩、ベタイン、および微量元素を補い、そして、ろ過滅菌した。加水分解物は、最初に、８％（ｗ／ｖ）キシロース（Ｃ５）、および約０．８％グルコース（Ｃ６）、０．１％ガラクトース（Ｃ６）、０．１％マンノース（Ｃ６）、および０．００２％アラビノース（Ｃ５）を含んだ。濃縮した解毒Ｃ５糖が豊富なバガス加水分解物は、さらに２．５％ｗ／ｖコーンスティープリカーを補い、そして、０．５の初期ＯＤ５５０ｎｍにＴＧ４００株に接種した。図５に示される結果が指し示すように、１２０時間以内で、培養培地における全ての糖が、消費され、そして、コハク酸塩が安定的に生産された。
【０１０３】
実施例５
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２、およびＴＧ４００株のゲノムのシーケンシング
親株ＫＪ１２２および代謝的進化を通してＫＪ１２２に由来するＴＧ４００株の全体のゲノムが、ボストン、マサチューセッツ州、ＵＳＡのタフツ（Ｔｕｆｔｓ）大学コア施設（Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩを用いて配列決定された。Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供される。ＫＪ１２２およびＴＧ４００について得られるゲノムのデータは、ＫＪ１２２からのＴＧ４００の代謝的進化を伴う遺伝学的変更を同定するために、他のそれぞれと比較された。ＴＧ４００およびＫＪ１２２の比較分析は、ＴＧ４００のｇａｌＰ遺伝子における変異的変更を明らかにした。ＴＧ４００におけるｇａｌＰ遺伝子は、そのオープンリーディングフレームのヌクレオチド位置８８９で点変異を示した。この位置でのシトシンヌクレオチドは、グアノシン残基に変更していた。このヌクレオチド変更の結果として、アミノ残基グリシンは、アスパラギン酸に変更していた。ｇａｌＰ遺伝子におけるこの変異は、ｇａｌＰ＊と呼ばれる。この変異は、ヌクレオチドレベルで、バクテリアのＫＪ１２２およびＴＧ４００株の間での唯一の相違であった。
【０１０４】
実施例６
ＴＧ４００およびＫＪ１２２におけるｇａｌＰ遺伝子配列のＰＣＲ  および配列分析
キシロースおよびグルコースを同時に使用する能力を説明するＴＧ４００株におけるｇａｌＰ遺伝子配列に変異があることを確立し、我々は、ＫＪ１２２およびＴＧ４００からｇａｌＰ遺伝子を得るために、ＰＣＲ技術を使用した。ＴＧ４００から得られたＰＣＲ産物、ならびにＫＪ１２２からのＰＣＲ産物が、配列決定された。配列データは、位置２９７におけるグリシン残基をアスパラギン酸残基に変更する（Ｇｌｙ２９７をＡｓｐへ）点変異を明らかにした。
【０１０５】
実施例７
ｇａｌＰ遺伝子欠失の効果
グルコースおよびキシロースを同時に使用する能力を伴うＴＧ４００におけるｇａｌＰ遺伝子変異があることを確立し、我々は、全体ｇａｌＰ遺伝子の欠失が、変異したｇａｌＰ遺伝子を有するＴＧ４００に見られるものと同一の表現型の効果を有するかどうか測定することを決定した。これらの実験において、我々は、親株として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２を使用した。
【０１０６】
我々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＪ１２２株からｇａｌＰ遺伝子配列を欠失させて、ＷＧ３７と呼ばれる新株を生産した。我々は、炭素の供給源としてグルコースおよびキシロースの両方を含有する最小培地において嫌気的に増殖するＫＪ１２２、ＴＧ４００、およびＷＧ３７株において、増殖動力学、糖利用パターン、およびコハク酸生産を測定した。ＷＧ３７は、９６時間の過程においてグルコースおよびキシロースの両方を同時に使用することができた（図６）。その増殖動力学、ならびに糖利用パターンは、変異した形態のｇａｌＰ遺伝子を有するＴＧ４００のものに類似した。キシロース利用が、２４時間の初期遅延を示した間、ＫＪ１２２において、グルコースは、７２時間内に完全に消費された。ＴＧ４００およびＷＧ３７の両方において、グルコースは、増殖の９６時間後でさえ使い果たされず、そして、意味のある量のグルコースが、増殖の９６時間で培地に残った。加えて、ＴＧ４００およびＷＧ３７の両方において、キシロース利用が、１２時間で早くも検出することができた。
【０１０７】
図７、８、および９は、本発明において使用された３株の全てにおけるコハク酸生産の動力学の対照比較を示す。４％キシロースおよび７％グルコースを含有する培地において増殖する場合、全ての株は、それらがインタクトｇａｌＰ遺伝子配列を有するか否かに関係なく、コハク酸生産について類似の動力学を示した。混合糖を含有する培地において、ＴＧ４００は、コハク酸生産についてわずかに高い比率を示した（図７）。
【０１０８】
炭素の唯一の供給源としてキシロースを含有する培地において、ＴＧ４００およびＷＧ３７株は、ＫＪ１２２株によるコハク酸生産の比率に比べた場合、コハク酸生産について、ずっと早い比率を示した（図８）。
【０１０９】
炭素の唯一の供給源としてグルコースを含有する培地において、ｇａｌＰ遺伝子配列における欠失を有する２つのバクテリア株ＴＧ４００およびＷＧ３７は、ＫＪ１２２によるコハク酸生産の比率と比べた場合、コハク酸生産について、より緩やかな比率を示した（図９）。
【０１１０】
実施例８
キシロース利用に対するｇａｌＰにおけるＧ２９７Ｄ点変異の効果
炭素の唯一の供給源としてキシロースを含有する発酵培地における増殖およびコハク酸塩生産に対する、Ｇ２９７Ｄ（ＧａｌＰタンパク質における位置２９７におけるグリシン残基のアスパラギン酸残基との交換）をもたらす点変異の効果を検討するために、Ｇ２９７Ｄ変異が、ＫＪ１２２株におけるｇａｌＰ遺伝子配列に導入された。ＳＩ０１４（ＫＪ１２２ΔｇａｌＰ：：ｇａｌＰ＊）は、プライマー１７ＡＳＰｇａｌＰ（配列番号９）および１８ＳＰｇａｌＰ（配列番号１０）を用いてＧ４００から変異体ｇａｌＰ＊遺伝子をＰＣＲ増幅させて、そして、温度条件付きプラスミドであるｐＫＤ４６からラムダレッドリコンビナーゼを発現するＷＧ３５（ＫＪ１２２  ΔｇａｌＰ：：ｋａｎ−ｓａｃＢ）内で組換えさせることによって作出された。プラスミドｐＫＤ４６は、次に、昇温での増殖によって除去された（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｅｒ，２０００）。
【０１１１】
ＫＪ１２２は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトースプレートから得られた。ＳＩ０１４（ＫＪ１２２ｇａｌＰ＊）は、ＬＢ２％グルコースプレートから取られた。プレートからかき集めたものが、２５ｍｌＬＢ  ２％グルコースを植菌するために使用された。培養物は、３７℃、１５０ｒｐｍで８時間、増殖させた。これらの培養物についての最終ＯＤ６００は、ＫＪ１２２については０．７１であり、ＳＩ０１４については０．５８であった。５ｍｌのそれぞれのＬＢグルコース培養物は、ＡＭ１  １０％グルコース培地を含有する３００ｍｌ種発酵槽を植菌するために使用された。これらの発酵は、２４時間、ｐＨ７．０、３７℃で保持された。これらの培養についての最終ＯＤ６００は、ＫＪ１２２については３．８２であり、そして、ＳＩ０１４については２．８９であった。これらの培養は、ＡＭ１  １０％キシロース培地を含有する３つの発酵槽を植菌するために使用された。目標最終ＯＤ６００  は０．１であり、そのため、３００ｍｌ発酵を植菌するために、ＫＪ１２２については７．８５ｍｌが使用され、そして、ＳＩ０１４については、１０．３８ｍｌが使用された。発酵は、９７時間、ｐＨ７．０および３７Ｃで維持された。ＯＤ６００および代謝産物分析のためにサンプルは、毎日取られた。全ての代謝産物および増殖データを、グラフに描き、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析した（２ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１１２】
位置２９７で１アミノ酸変更をもたらすｇａｌＰ遺伝子における点変異を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＩ０１４についての増殖プロファイルを、図１０に示す。炭素の唯一の供給源としてキシロースを含有する培地上において、ＫＪ１２２よりもＳＩ０１４株がより迅速に、およびより高密度に増殖することが、ＯＤ６００値によって非常に明らかである。これら２株の間の唯一の既知の相違は、ｇａｌＰ遺伝子における点変異である。図１１は、ＫＪ１２２と比べて、株ＳＩ０１４について、キシロースの消費が増大し、およびコハク酸生産が同時に増大したことを示す。
【０１１３】
本出願人の発明は、好ましい実施態様に特に参照して上で詳細に説明されてきた。上記の詳細な説明に詳しい当業者は、次の請求項の精神を逸脱することなく、任意の修正を行うことができる。
【０１１４】
【表１】
0005939986.tif 000002
【０１１５】
【表２】
0005939986.tif 000003
【０１１６】
【表３】
0005939986.tif 000004
【０１１７】
【表４】
0005939986.tif 000005
【０１１８】
参考文献
全ての参考文献は、読み手の便宜のために掲載される。それぞれの参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
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【０１２２】
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【０１２３】
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U.S Patent No. 7,371,558
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U.S. Patent No. 7,524,660
【０１２６】
U.S. Patent No. 7,629,162
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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