(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における敗血症の検出を補助する方法であって、前記対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、ここで、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡであり、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号２３５、２５３、３０２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、ここで、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい前記試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルは前記対象における敗血症の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記方法が、前記試料中の前記少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを前記少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルと比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における敗血症の検出を補助する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することであって、ここで、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡであり、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号２３５、２５３、３０２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むことと、
（ｂ）前記対象が敗血症を有するかどうかを決定する目的で検出結果を医療実施者に報告することと、を含む方法。
【請求項４】
試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することがＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象における敗血症の検出を補助する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料を前記試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出するために実験室に提供することであって、ここで、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡであり、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号２３５、２５３、３０２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むことと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを示す報告を前記実験室から受け取ることと、を含み、
ここで、前記少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい前記少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルは敗血症の存在を示す、方法。
【請求項６】
前記方法が前記試料から核酸を単離することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がＤＮＡから分離されたＲＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の成熟形態の標的ＲＮＡが３０個未満のヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２種の標的ＲＮＡのレベルが検出され、ここで、前記少なくとも２種の標的ＲＮＡは、配列番号２３５、２５３、３０２、６３１、および６６２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２種の標的ＲＮＡのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも３種の標的ＲＮＡのレベルが検出され、ここで、前記少なくとも３種の標的ＲＮＡは、配列番号２３５、３０２、２５３、６３１、および６６２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２種の標的ＲＮＡのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも３種の標的ＲＮＡのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象由来の試料が血液試料である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が単球である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／１４９,２７７号に対する優先権を主張し、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
敗血症とは、病原性微生物またはその毒素が血液または他の組織中に存在し、同時に、その感染により引き起こされる全身性炎症反応症候群（「ＳＩＲＳ」）として知られる、宿主の炎症反応が起こることである。免疫反応は、微生物によって広く共有されているが、宿主分子とは区別できる構造的に保存された分子を認識するｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）と呼ばれる一群のタンパク質によって仲介される。
【０００３】
ひとたび微生物が皮膚または腸管などのバリアを破壊すると、体内のＴＬＲはこれらを認識し、免疫反応を刺激する。したがって、敗血症は、微生物感染それ自体によって生じる症状の他に、宿主の免疫反応によってもたらされる急性炎症の症状も特徴とする。これらの後者の症状には、発熱と白血球数の上昇、または白血球数の低下と低体温も含まれ得る。ＳＩＲＳは、血行動態の悪化や結果として生じる代謝調節異常を特徴とし、高い心拍数、高い呼吸数および体温上昇などの症状を伴うことがある。免疫学的反応はまた、急性期タンパク質の活性化の拡大を引き起こして、補体系や凝固経路を侵し、これが次に、血管系や器官の損傷を引き起こす。その後、様々な神経内分泌対抗調節系（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｏｙ  ｓｙｓｔｅｍ）も活性化され、問題が悪化することが多い。
【０００４】
敗血症は、多くの場合、集中治療室において静脈内輸液や抗生物質および／または抗ウイルス化合物で治療される。しかしながら、敗血症は急速に進行するため、早急かつ積極的な治療を施した場合でさえも、重症敗血症によって臓器不全や死に至ることがある。重症敗血症によって、急性心筋梗塞、卒中または肺炎よりも多い、年間２１５，０００件の死亡が米国で生じていると推定されており、これは、敗血症の診断の遅れまたは誤診による可能性が高い。
【０００５】
したがって、敗血症を検出する上での早期の分子マーカーが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
対象における敗血症の存在を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜８６から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であるか、または（ｉｉ）配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含むか、または（ｉｉｉ）配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルは、対象における敗血症の存在を示す。
【０００７】
対象における敗血症の検出を容易にする方法も提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜８６から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であるか、または（ｉｉ）配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含むか、または（ｉｉｉ）配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象が敗血症を有するかどうかを決定する目的で検出結果を医療実施者に報告することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することは、試料の核酸を試料中の標的ＲＮＡに相補的な少なくとも１種のポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および標的ＲＮＡの相補体から選択される少なくとも１つの核酸にハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの複合体の検出をさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、対象における敗血症の存在を検出する方法は、対象から試料を得ることと、この試料を試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出する実験室に提供することとを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、（ｉ）配列番号１〜８６から選択される配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であるか、または（ｉｉ）配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含むか、または（ｉｉｉ）配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを示す報告を実験室から受け取ることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルは、敗血症の存在を示す。
【００１０】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、または少なくとも１０種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルの検出は、敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい少なくとも２種の標的ＲＮＡのレベルの検出は敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい少なくとも３種の標的ＲＮＡのレベルの検出は、敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい少なくとも５種の標的ＲＮＡのレベルの検出は、敗血症の存在を示す。
【００１１】
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）配列番号１〜８６から選択される配列を有する核酸に特異的にはハイブリダイズせず、（ｉｉ）配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含まず、（ｉｉｉ）配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含まない、少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドは第１の領域を含み、この第１の領域は、配列番号１〜６７、２１５〜３９９、および９５０のうちの１つの少なくとも８個の連続するヌクレオチドの配列と同一または相補的な少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、または少なくとも１８個の連続するヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の領域は、標的ＲＮＡの領域と同一または相補的である。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域と同一または相補的でない第２の領域を含む。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＦＲＥＴ標識を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、複数の合成ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、合成ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１種のポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰを含む。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態および詳細を以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アゴニストのＰａｍ３ＣＳＫ４で８時間刺激した後のヒト単球細胞株ＴＨＰ−１から実施例１に記載したように精製されたトータルＲＮＡの品質を評価するために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００で得られたエレクトロフェログラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
４．１．敗血症の検出
４．１．１．一般的な方法
マイクロＲＮＡ種のレベルを測定することにより敗血症を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ種のレベル上昇は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ種のレベル低下は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１〜８６から選択される配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常を上回るレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常を上回るレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常を上回るレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。標的ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡである。
【００１７】
本開示において、「から選択される配列」は、「から選択される１つの配列」と「から選択される１以上の配列」の両方を包含する。したがって、「から選択される配列」が用いられるとき、記載された配列のうちの１つか、または２つ以上が選ばれ得ることが理解されるべきである。
【００１８】
標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい標的ＲＮＡのレベルの検出は、試料が採取された患者における敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、検出は定量的に行なわれる。他の実施形態では、検出は定性的に行なわれる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの検出は、ポリヌクレオチドと、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および標的ＲＮＡの相補体から選択される核酸とを含む複合体の形成を含む。いくつかの実施形態では、次に、この複合体のレベルを検出し、同じ複合体の正常レベルと比較する。この複合体のレベルは、いくつかの実施形態では、試料中の標的ＲＮＡのレベルと相関する。
【００１９】
「敗血症」は、内在性の炎症メディエーターの血流中への放出と関連する全身症状を示す急性炎症反応（全身性炎症反応症候群）を伴う感染症である。治療しないでおくと、敗血症は、重症敗血症になることがあり、これは、多くの場合、少なくとも１つの臓器の不全または敗血症性ショックを伴う。敗血症性ショックは、初期の急速輸液にあまり反応しない臓器血流の低下や低血圧症を伴う重症敗血症である。全身性炎症反応は、ｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）によって仲介される。
【００２０】
「Ｔｏｌｌ様受容体」または「ＴＬＲ」は、宿主分子と区別できる微生物表面の特定の構造的に保存された分子を認識し、かつ免疫細胞反応を仲介する、脊椎動物や無脊椎動物における一群のタンパク質である。ＴＬＲは、細胞表面上かまたは細胞コンパートメント内のいずれかにあり、表１に示すように、それらが認識し、それらを刺激する分子の種類によって分類される。
【表１】
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【００２１】
様々なＴＬＲの刺激により、表２に示すような、１種以上の標的ＲＮＡの過剰発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡは、細菌を認識するＴＬＲのサブセット（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４またはＴＬＲ５）の刺激の結果として過剰発現される。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡは、ウイルスを認識するＴＬＲのサブセット（例えば、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７）の刺激の結果として過剰発現される。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡは、細菌とウイルスの両方に共通の分子を認識するＴＬＲのサブセット（ＴＬＲ９）の刺激の結果として過剰発現される。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡは、グラム陰性細菌を認識するＴＬＲのサブセット（例えば、ＴＬＲ４ａおよびＴＬＲ４ｂ）の刺激の結果として過剰発現される。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡは、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方を認識するＴＬＲのサブセット（例えば、ＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂおよびＴＬＲ５）の刺激の結果として過剰発現される。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌およびマイコバクテリアを認識するＴＬＲのサブセット（例えば、ＴＬＲ２ａ）の刺激の結果として過剰発現される。
【００２２】
下の表２には、様々なｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（リガンド）で刺激したヒト単球における標的ＲＮＡに相補的であり、かつこれらの標的ＲＮＡにハイブリダイズすることが見出された８６個のハイブリダイゼーションプローブが記載されている。これらの標的ＲＮＡは、実施例１に示すような刺激されたＴＨＰ−１細胞において上昇したレベルで検出することができる。これらのプローブのうち６７個は、ヒト細胞で発現している新規の標的ＲＮＡ種に相補的であり、かつこれらの標的ＲＮＡ種にハイブリダイズする。他の１９個のプローブは、他者によってｍｉＲＢａｓｅに提出されている公知のマイクロＲＮＡ、すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂに相補的であり、かつこれらのマイクロＲＮＡにハイブリダイズする（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６：１５４−１５８を参照されたい）。しかしながら、本発明者らの知る限りでは、これらの既知のマイクロＲＮＡが敗血症の検出に対する有用性を有することは開示されていない。これらのマイクロＲＮＡの配列を表４に示す。表２に記載の特定のプローブにハイブリダイズし得る特定の候補マイクロＲＮＡを表１１に示す。
【００２３】
下の表１２には、敗血症患者試料中に上昇したレベルで存在するマイクロＲＮＡが記載されている。表１２に記載のマイクロＲＮＡのいくつかの対は同じ配列を有する。そのような場合、そのマイクロＲＮＡ配列の前駆遺伝子はゲノム中の多くの位置にあるので、この配列はこれらの遺伝子のいずれかに由来するものであり得る。特定のマイクロＲＮＡ配列の前駆遺伝子がゲノム中の多くの位置に存在する場合、（各々の前駆遺伝子に基づいて）同じ順位および同じ配列の多数の候補名が示されている。これらの候補のうちの１つまたは複数は、敗血症患者試料において上方調調節されている可能性がある。表１２に記載のマイクロＲＮＡのうちのいくつかは、互いにアイソｍｉｒである。多数のアイソｍｉｒが表１２に記載されている場合、アイソｍｉｒのうちの１つかまたは２つ以上は、敗血症患者由来の試料において上昇したレベルで存在し得る。
【００２４】
表１４には、敗血症患者試料において上昇したレベルで存在する、ｍｉＲＢａｓｅから得られたマイクロＲＮＡが記載されている。
【００２５】
表１６には、敗血症患者試料において上昇したレベルで存在するマイクロＲＮＡスターフォームが記載されている。記載されたスターフォームの成熟マイクロＲＮＡが同定され、ｍｉＲＢａｓｅに提出されているが、本発明者らの知る限りでは、表１６のスターフォームの中に、これまでに同定されているかまたはｍｉＲＢａｓｅに提出されているものはない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、方法は、単一のプローブによる多数のアイソｍｉｒの検出を含む。１つまたは多数のアイソｍｉｒの上昇レベルの検出は、敗血症を示すものであると考えられる。多数のマイクロＲＮＡが、同じ配列を有するけれども、異なる遺伝子から発現されるとき、これらの遺伝子のうちの１つ以上が敗血症患者において上方調節されている可能性がある。これらの遺伝子のうちのいずれか１つから発現されたマイクロＲＮＡの検出は、敗血症を示すものであると考えられる。
【００２７】
限定目的のためではなく、本明細書における参照の便宜のために、いくつかの「標的ＲＮＡ」種を本明細書および実施例１に示す表において「マイクロＲＮＡ」と命名する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、表２に示すハイブリダイゼーションプローブに特異的にハイブリダイズすることが可能な単一の成熟マイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む単一の成熟マイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む単一の成熟マイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡには、複数の標的ＲＮＡが含まれてもよく、その全てが、（例えば、２種以上の標的マイクロＲＮＡがアイソｍｉｒである場合）単一の相補的プローブ配列に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、そのように命名された「マイクロＲＮＡ」は、それぞれのハイブリダイゼーションプローブに特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上のＲＮＡ種であり、そのため、１種以上の標的ＲＮＡは、成熟マイクロＲＮＡの標準的な定義を満たさない。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、「標的ＲＮＡ」は、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、すなわち、大きさ（２６〜３１ｎｔ）の点でマイクロＲＮＡと異なり、転写レベルでの遺伝子抑制に関与するＰｉｗｉタンパク質と異なる複合体を形成する、動物で発現される低分子ＲＮＡである。
【００２８】
成熟ヒトマイクロＲＮＡは、典型的には、１７〜２７個の連続するリボヌクレオチドから構成され、多くの場合、２１または２２ヌクレオチド長である。本開示に従って検出可能ないくつかの標的マイクロＲＮＡの配列を、表３、１３、１５、および１７に示すプレ−マイクロＲＮＡ配列（配列番号８７〜１７７、４００〜５６４、７０８〜８６２、および８９８〜９３２）の中に見出すことができる。いくつかの公知のマイクロＲＮＡの配列を表４および１４に示す。さらに、いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡは、表１１、１２、または１６の配列（配列番号２１５〜３９９、９５０、および８６３〜８９７）の少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、または少なくとも２６個の連続するヌクレオチドを含む。
【００２９】
理論に束縛されることを望むわけではないが、哺乳動物マイクロＲＮＡは本明細書に記載されたように成熟する。マイクロＲＮＡをコードする遺伝子が転写され、「プリ−マイクロＲＮＡ」または「プリ−ｍｉＲＮＡ」として知られるマイクロＲＮＡ前駆体が生成される。プリ−ｍｉＲＮＡは、多数のプリ−ｍｉＲＮＡを含むポリシストロン性ＲＮＡの一部であることもある。ある状況下では、プリ−ｍｉＲＮＡは、ミスマッチ塩基を含み得るステムループを有するヘアピンを形成する。プリ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼタンパク質であるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは、プリ−ｍｉＲＮＡの末端ループを認識し、約２巻きのらせん状回転を切断してステムにし、「プレ−マイクロＲＮＡ」または「プレ−ｍｉＲＮＡ」として知られる６０〜７０ヌクレオチドの前駆体を生成させることができる。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼに特徴的な互い違い切断によってプリ−ｍｉＲＮＡを切断し、５’リン酸と約２ヌクレオチドの３’突出とを有するプレ−ｍｉＲＮＡステムループを生じさせることができる。Ｄｒｏｓｈａ切断部位を超えて伸びたステムの約１巻きのらせん状回転（約１０ヌクレオチド）は、効率的なプロセッシングに不可欠である可能性がある。その後、プレ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび輸送受容体エクスポーチン−５によって核から細胞質へと能動的に輸送される。
【００３０】
プレ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒという別のＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼによって認識され得る。ある状況下では、Ｄｉｃｅｒがプレ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムを認識する。Ｄｉｃｅｒは、ステムループの塩基の５’リン酸と３’突出も認識し得る。Ｄｉｃｅｒは、末端ループの２巻きのらせん状回転をステムループの塩基から切り離して、５’リン酸と約２ヌクレオチドの３’突出とをさらに生じさせ得る。得られるｓｉＲＮＡ様二重鎖はミスマッチを含み得るが、この二重鎖は成熟マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ＊として知られる同様の大きさの断片とを含む。マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ＊は、プリ−ｍｉＲＮＡとプレ−ｍｉＲＮＡの反対のアームに由来し得る。その後、成熟マイクロＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質複合体のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）に搭載される。場合により、マイクロＲＮＡ＊も遺伝子サイレンシング活性または他の活性を有する。
【表２】
0005890686.tif 000003
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【表３】
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【表４】
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【００３１】
表２において、同定された各々のＴＬＲの刺激について測定された標的ＲＮＡの発現レベルは、健康ドナーのヒト単球由来のトータルＲＮＡにおいて測定された発現レベルと比べた発現の変化倍数として表されている（実施例１参照）。
【００３２】
いくつかの実施形態では、患者における敗血症の状況または進行をモニタリングするために、１つまたは複数の時点で回収された試料において標的ＲＮＡを測定することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、試験される臨床試料は、３８℃を超えるまたは３６℃未満の体温、９０拍／分を上回る心拍数、２０呼吸／分を上回る呼吸数（または３２ｍｍＨｇ未満のＰａｃｏ２）、および１２，０００細胞／μＬを上回るもしくは４０００細胞／μＬ未満の白血球数、または未成熟形態の含量が１０％を超える白血球数をはじめとする、全身性炎症反応の１以上の症状を示す個人から得られる。いくつかの実施形態では、試験される臨床試料は、上記の症状の２つ以上を示す個人から得られる。いくつかの実施形態では、試験される臨床試料は、高齢者、免疫不全者、重病人、または現在入院中の患者、もしくは最近退院した人などの、敗血症にかかる危険性がある無症候者から得られる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ヒト細胞（例えば、日常的な血液検査で得られるもの）の試料における敗血症の早期検出に用いられる。いくつかの実施形態では、ヒト細胞の試料は、ヒト白血球の試料である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞の試料は、ヒト単球の試料である。単純化するために、以下の議論ではヒト単球の試料に言及するが、当業者であれば、開示された方法で使用可能なヒト細胞の試料には、ＴＬＲが発現されている任意のヒト細胞が含まれ得ることを理解するであろう。
【００３５】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法を、敗血症の危険性がある個人の日常的なスクリーニングに用いることができる。いくつかの実施形態では、本明細書中の方法は、（１）高齢者のスクリーニング、（２）免疫不全者のスクリーニング、（３）重病人のスクリーニング、または（４）現在入院中の患者、もしくは最近退院した人のスクリーニングに用いられる。いくつかの実施形態では、本明細書中の方法は、発熱した新生児（生後９０日未満）のスクリーニングに用いられる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて、敗血症個体における潜在する感染の源を明らかにし、潜在する感染を標的治療することができる。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂ、ＴＬＲ４ａ、ＴＬＲ４ｂまたはＴＬＲ５の刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、敗血症個体における細菌感染の存在を示す。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４ａまたはＴＬＲ４ｂの刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、敗血症個体におけるグラム陰性細菌感染の感染の存在を示す。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４ａまたはＴＬＲ４ｂのいずれかの同時刺激を伴わないＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂまたはＴＬＲ５の刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、敗血症個体におけるグラム陽性細菌感染の存在を示す。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４ａまたはＴＬＲ４ｂのいずれかの同時刺激を伴わないＴＬＲ２ａの刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、グラム陽性細菌感染またはマイコバクテリア感染のいずれかの存在を示す。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７の刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、ウイルス感染の存在を示す。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、ウイルス感染および／または細菌感染の存在を示す。いくつかの実施形態では、（ｉ）ＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂ、ＴＬＲ４ａ、ＴＬＲ４ｂまたはＴＬＲ５の刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡ；および（ｉｉ）ＴＬＲ３またはＴＬＲ７の刺激と関連する１種以上の標的ＲＮＡの発現レベルの増加は、ウイルス感染と細菌感染の両方の存在を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて、患者における敗血症の治療の有効性を評価することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現レベルを、治療期間中、何度も測定し、敗血症の何らかの兆候が現われる前に、または治療が開始される前に、例えば、血液検査によって、患者から採取された記録保管用試料の標的ＲＮＡ発現レベルと比較する。理想的には、正常血液試料中の標的ＲＮＡ発現レベルは、標的ＲＮＡ発現レベルの異常な変化を示さない。したがって、そのような実施形態では、敗血症個体の治療の進展は、健康であったときのまたは治療を開始する前の同じ個体由来の試料との比較によって評価することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、試験される試料は、血液、痰、粘液、唾液、尿、精液などのような体液である。いくつかの実施形態では、試験される試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は、全血、血漿、血清、または血球である。いくつかの実施形態では、血液試料は、分離された単球および／またはリンパ球である。単球および／またはリンパ球は、任意の方法により全血から分離することができる。いくつかの実施形態では、単球は、例えば、単球上の細胞表面受容体（例えば、ＣＤ１４）に対する抗体を用いて、全血または全血の分画部分もしくは分離部分から分離することができる。いくつかのそのような実施形態では、抗体は、磁気ビーズなどのビーズに結合している。
【００３９】
試験される臨床試料は、いくつかの実施形態では、新鮮に得られる。他の実施形態では、試料は、新鮮な凍結標本である。
【００４０】
本方法が２種以上の標的ＲＮＡの発現の検出を含む実施形態では、複数の標的ＲＮＡの発現レベルは、同じアッセイ反応において、一斉にまたは同時に検出されてもよい。いくつかの実施形態では、発現レベルは、別々のアッセイ反応において、一斉にまたは同時に検出される。いくつかの実施形態では、発現レベルは、例えば、連続的なアッセイ反応において、異なる時に検出される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含み、その場合、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルの検出は、対象における敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することと、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルと比較することとを含み、その場合、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルは、対象における敗血症の存在を示す。
【００４２】
いくつかの実施形態では、対象における敗血症の診断を容易にする方法を提供する。このような方法は、対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象由来の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルに関する情報を医療実施者に報告する。本明細書で用いられる「医療実施者」は、患者を診断および／または治療する個人または団体、例えば、病院、クリニック、診療所、医師、看護師、または前述の団体もしくは個人のいずれかの代理人を指す。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出することは、医療実施者または医療実施者の代理人から対象の試料を受け取った実験室で行なわれる。実験室は、本明細書に記載の方法を含む任意の方法によって検出を行ない、その後、結果を医療実施者に報告する。本明細書で用いられるとき、結果は、何らかの手段で医療実施者に提供された場合に、「報告される」。いくつかの実施形態では、そのような報告は、口頭もしくは書面で行なわれてもよいし、電話で、本人が直接話して、ｅ−メールで、手紙もしくは他の配達便で行なわれてもよいし、または例えば、医療実施者がアクセス可能なデータベース（医療実施者が管理していないデータベースを含む）に情報を直接預けることにより行なわれてもよい。いくつかの実施形態では、情報は電子形態で維持される。いくつかの実施形態では、情報は、メモリまたは他のコンピュータ可読媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、コンピュータチップ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、磁気テープなど）に保存することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、敗血症の存在を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、敗血症を診断する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象由来の試料を得ることと、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡレベルを検出するためにこの試料を実験室に提供することとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、実験室から試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡレベルを示す報告を受け取ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルが少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常レベルよりも大きい場合、敗血症は存在する。本明細書で用いられる「実験室」は、本明細書に記載の方法を含む任意の方法により試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを検出し、そのレベルを医療実施者に報告する任意の施設である。いくつかの実施形態では、実験室は、医療実施者の管理下にある。いくつかの実施形態では、実験室は、医療実施者の管理下にない。
【００４４】
実験室が医療実施者に少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを報告するとき、いくつかの実施形態では、実験室は、正常レベルの数値を提供してまたは提供しないで、試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを表す数値を報告する。いくつかの実施形態では、実験室は、「高い」、「上昇している」などのような、定性的な値を提供することにより、少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルを報告する。
【００４５】
本明細書で用いられるとき、方法が敗血症の検出、敗血症の存在の決定、および／または敗血症の診断に関する場合、本方法は、本方法の工程は実施されるが、敗血症の存在について結果が陰性である活動を含む。すなわち、敗血症の検出、決定および診断は、（例えば、標的ＲＮＡレベルが正常であろうと、正常よりも大きいものであろうと）陽性または陰性のいずれかの結果が得られる方法を実施する例を含む。
【００４６】
本明細書で用いられるとき、「対象」という用語は、ヒトを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、非ヒト動物由来の試料に対して用いられてもよい。
【００４７】
ゲノム中で互いに物理的に近接している標的ＲＮＡの共通の、すなわち対等の発現によって、そのような染色体上で近接する標的ＲＮＡを本明細書中の方法において有益に使用することが可能になる。
【００４８】
表３では、表２の配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な８６種の標的ＲＮＡの各々の染色体位置が特定されている。表１３では、表１２の配列番号２２６〜３９９および９５０から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な標的ＲＮＡの染色体位置が特定されている。表１５では、表１４の配列番号５６５〜７０７から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な標的ＲＮＡの染色体位置が特定されている。表１７では、表１６の配列番号８６３〜８９７から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な標的ＲＮＡの染色体位置が特定されている。したがって、いくつかの実施形態では、表２および表１４の染色体位置の約１キロベース（ｋｂ）以内、約２ｋｂ以内、約５ｋｂ以内、約１０ｋｂ以内、約２０ｋｂ以内、約３０ｋｂ以内、約４０ｋｂ以内、および約５０ｋｂ以内にすらある１種以上の標的ＲＮＡの発現のレベルを、本明細書に記載の方法におけるそれぞれの表に示した標的ＲＮＡの発現の測定の代わりに、またはその測定に加えて、検出する。Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ  Ｄ．Ｐ．（２００５）  ＲＮＡ  １１：２４１−２４７を参照されたい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜６７から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの検出および／または配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの検出および／または配列番号１〜６７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む１種以上の標的ＲＮＡの検出と組み合わせて、本明細書中の方法は、ヒトｍｉＲＮオーム由来の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現レベルを検出することをさらに含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも一部に相補的な少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、２種以上の標的ＲＮＡが１回の反応において同時に検出される。いくつかの実施形態では、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、または少なくとも１０種の標的ＲＮＡが１回の反応において同時に検出される。いくつかの実施形態では、全ての標的ＲＮＡが１回の反応において同時に検出される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、試料中の表２の配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、血液または組織の試料が採取された個体における敗血症の存在を示すものである。いくつかの実施形態では、試料中の表２の配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも一部に相補的な少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、血液または組織の試料が採取された個体における敗血症の存在を示すものである。いくつかの実施形態では、試料中の配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、血液または組織の試料が採取された個体における敗血症の存在を示すものである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、表２の配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３５、３６、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６０、６１、６３、６５、６６、６８、７１、７７、８０、８１、８２、８３または８５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、ウイルス感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、細菌感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号６、１１、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、５６、５８、６９、７１、７３、７６、８４または８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、グラム陰性細菌の感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号２３、３０、３９、５２、５７、６０
６５、６７または７９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、グラム陽性細菌の感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４または７８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、グラム陽性細菌またはマイコバクテリアの感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、細菌感染および／またはウイルス感染によって生じた非メチル化ＣｐＧ核酸の存在を示すものである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３５、３６、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６０、６１、６３、６５、６６、６８、７１、７７、８０、８１、８２、８３または８５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、ウイルス由来分子を認識するｔｏｌｌ様受容体の刺激を示すものである。いくつかの実施形態では、これらのｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ３およびＴＬＲ７から選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、細菌由来分子を認識するｔｏｌｌ様受容体の刺激を示すものである。いくつかの実施形態では、これらのｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂ、ＴＬＲ４ａ、ＴＬＲ４ｂおよびＴＬＲ５から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号６、１１、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、５６、５８、６９、７１、７３、７６、８４または８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、グラム陰性細菌に由来する分子を認識するｔｏｌｌ様受容体の刺激を示すものである。いくつかの実施形態では、これらのｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂ、ＴＬＲ４ａ、ＴＬＲ４ｂおよびＴＬＲ５から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号２３、３０、３９、５２、５７、６０  ６５、６７または７９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、グラム陽性細菌に由来する分子を認識するｔｏｌｌ様受容体の刺激を示すものである。いくつかの実施形態では、これらのｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ２ａ、ＴＬＲ２ｂおよびＴＬＲ５から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４または７８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、グラム陽性細菌またはマイコバクテリアに由来する分子を認識するｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ２ａ）の刺激を示すものである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表２の配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、細菌感染および／またはウイルス感染によって生じる非メチル化ＣｐＧ核酸を認識するＴＬＲ９の刺激を示すものである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、および８６３〜８６８から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、および６４８から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、および６３２から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、および３５２から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、および２８７から選択される配列の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの発現の増加は、敗血症を示すものである。
【００６０】
４．１．２．例示的な対照
いくつかの実施形態では、各標的ＲＮＡの正常レベル（対照）は、正常ヒト単球または他の参照物質の特徴を示す平均のレベルまたは範囲として測定することができ、この平均のレベルまたは範囲に対して、試料中で測定されたレベルを比較することができる。正常対象中の標的ＲＮＡの測定された平均または範囲は、敗血症を示す正常を上回るまたは正常を下回るレベルの標的ＲＮＡを検出するための基準として用いることができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルは、１人以上の個人、例えば、健常人または疾患の臨床的重症度は敗血症症候群と診断された患者と類似している（例えば、ＩＣＵ臨床（ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）スコアが一致している）が、敗血症症候群とは診断されていない集中治療患者の個々のまたはプールされたＲＮＡ含有試料を用いて測定することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常な発現レベルの決定は、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および標的ＲＮＡの相補体から選択される核酸にハイブリダイズしたプローブを含む複合体の検出を含む。すなわち、いくつかの実施形態では、正常な発現レベルは、標的ＲＮＡそれ自体ではなく、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、または標的ＲＮＡの相補体を検出することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、そのような複合体の正常レベルを測定し、対照として用いる。複合体の正常レベルは、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルと相関する。したがって、標的の正常レベルを本明細書で論じるとき、そのレベルは、いくつかの実施形態では、そのような複合体を検出することによって測定することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、対照は、１人の個人、例えば、健常人または疾患の臨床的重症度は敗血症の検査を受けている患者と類似している（例えば、ＩＣＵ臨床（ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）スコアが一致している）が、敗血症症候群とは診断されていない集中治療患者の細胞由来のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対照は、多数の個人からの細胞のプール由来のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対照は、例えば、ＣＤ１４＋細胞由来のトータルＲＮＡなどの、市販のヒトＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、正常レベルまたは正常範囲は、試料のレベル上昇を検査する前に既に予め決定されている。
【００６３】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルは、１種以上の継代細胞株、通常、正常ヒト単球における発現レベルと近似する少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを有することがこれまでに示されている細胞株から決定することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルと比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを少なくとも１種の標的ＲＮＡの対照発現レベルと比較することをさらに含む。少なくとも１種の標的ＲＮＡの対照発現レベルは、いくつかの実施形態では、正常細胞における少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルである。いくつかのそのような実施形態では、対照レベルは、正常レベルと呼ばれてもよい。いくつかの実施形態では、正常細胞における少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルと比べた少なくとも１種の標的ＲＮＡのより大きな発現レベルは、敗血症を示す。  いくつかの実施形態では、正常細胞における少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルと比べた少なくとも１種の標的ＲＮＡの低下した発現レベルは、敗血症を示す。
【００６５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを、例えば、確認された敗血症症候群症例の患者由来の参照発現レベルと比較する。いくつかのそのような実施形態では、参照試料と比べた少なくとも１種の標的ＲＮＡの同様の発現レベルは、敗血症を示す。
【００６６】
いくつかの実施形態では、それぞれの少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルよりも少なくとも約２倍大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、正常細胞から構成される対照試料中のそれぞれの少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルよりも少なくとも約２倍大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。様々な実施形態では、正常細胞から構成される対照試料中のそれぞれの少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルよりも少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。様々な実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルよりも少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍大きい少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。
【００６７】
いくつかの実施形態では、それぞれの少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルと比べて少なくとも約２倍低下した少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。いくつかの実施形態では、正常細胞から構成される対照試料中のそれぞれの少なくとも１種の標的ＲＮＡのレベルと比べて少なくとも約２倍低下した少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。様々な実施形態では、正常細胞から構成される対照試料中のそれぞれの少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルと比べて少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍低下した少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。様々な実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルと比べて少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍低下した少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルは、敗血症の存在を示す。
【００６８】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの対照発現レベルは、例えば、同じアッセイまたは同じバッチのアッセイにおいて、試料中の標的ＲＮＡの発現レベルと同時に測定される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの対照発現レベルは、試料中の標的ＲＮＡの発現レベルと同時には測定されない。いくつかのそのような実施形態では、対照発現レベルは事前に測定されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、例えば、標的ＲＮＡが正常細胞で非常に低レベルで発現するか、または全く発現しないことが知られている場合、標的ＲＮＡの発現レベルは、対照発現レベルと比較されない。このような実施形態では、試料中の高レベルの標的ＲＮＡの検出は敗血症を示す。
【００７０】
４．１．３．例示的なＲＮＡ調製方法
標的ＲＮＡを任意の適切な方法により調製することができる。トータルＲＮＡを、限定するものではないが、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．（１９８８）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（２２）：１０，９３３；およびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．（１９８８）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（２２）：１０９３４に示されたプロトコルをはじめとする任意の方法によって、または市販のキットもしくは試薬、例えば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、トータルＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、トータルＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）などを用いて、単離することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、低分子ＲＮＡを単離または濃縮する。いくつかの実施形態では、「低分子ＲＮＡ」は、長さが約２００ヌクレオチド（ｎｔ）よりも小さいＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、「低分子ＲＮＡ」は、約１００ｎｔよりも小さい、約９０ｎｔよりも小さい、約８０ｎｔよりも小さい、約７０ｎｔよりも小さい、約６０ｎｔよりも小さい、約５０ｎｔよりも小さい、または約４０ｎｔよりも小さいＲＮＡ分子を指す。
【００７２】
低分子ＲＮＡの濃縮を方法により達成することができる。このような方法としては、限定するものではないが、有機抽出の後に、特殊な結合溶液と洗浄溶液を用いて核酸分子をガラス繊維フィルターに吸着させることを含む方法や、スピンカラム精製を用いる方法が挙げられる。低分子ＲＮＡの濃縮を、市販のキット、例えば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒ（商標）マイクロＲＮＡ単離キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）ＲＮＡ単離キット（Ｅｘｉｑｏｎ）、マイクロＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）などを用いて達成してもよい。いくつかの実施形態では、クロロホルムを添加するフェノール／イソチオシアナート溶液を用いて、ＲＮＡ含有水性相を分離するＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）法を用いて精製を達成することができる。その後、イソプロピルアルコールで沈殿させて、低分子ＲＮＡを水性相から回収する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー法、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なｆｌａｓｈＰＡＧＥ（商標）Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒを用いたゲル電気泳動を用いて、低分子ＲＮＡを精製することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを濃縮するために、（例えば、２００ヌクレオチド長またはそれ未満、例えば、１００ヌクレオチド長未満、例えば、５０ヌクレオチド長未満、例えば、約１０〜約４０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子を含む）低分子ＲＮＡ画分が、より大きなＲＮＡ分子に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも純粋であるが、決して１００％純粋ではないことを意味する、実質的に純粋となる程度まで、低分子ＲＮＡを他のＲＮＡ分子から単離する。あるいは、低分子ＲＮＡの濃縮は、濃縮倍数の形で表すことができる。いくつかの実施形態では、低分子ＲＮＡは、試料中のＲＮＡ単離物またはトータルＲＮＡにおけるより大きなＲＮＡの濃度に対して、約、少なくとも約、または多くても約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍もしくはそれより大きく、またはその中で導出可能な任意の範囲だけ濃縮される。
【００７４】
また他の実施形態では、ＲＮＡが最初に細胞から精製されていない試料中で発現を測定する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを検出する前にＲＮＡを修飾する。いくつかの実施形態では、修飾されるＲＮＡはトータルＲＮＡである。他の実施形態では、修飾されるＲＮＡは、トータルＲＮＡまたは細胞ライセートから精製された低分子ＲＮＡ、例えば、２００ヌクレオチド長未満、例えば、１００ヌクレオチド長未満、例えば、５０ヌクレオチド長未満、例えば、約１０〜約４０ヌクレオチド長のＲＮＡである。本明細書に記載の方法で利用可能なＲＮＡ修飾としては、限定するものではないが、化学的にもしくは酵素的に、および／または小分子（例えば、ビオチン）の付加によって達成可能なポリ−ｄＡまたはポリ−ｄＴテールの付加が挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡを逆転写する。いくつかの実施形態では、存在する場合、逆転写するときに（例えば、ポリ−ｄＡまたはポリ−ｄＴテールを逆転写中にｃＤＮＡに付加するときに）、ＲＮＡを修飾する。他の実施形態では、逆転写する前にＲＮＡを修飾する。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡを逆転写する。他の実施形態では、ＲＮＡを逆転写する前に低分子ＲＮＡを単離または濃縮する。
【００７７】
標的ＲＮＡを逆転写するとき、標的ＲＮＡの相補体が形成される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡそれ自体（またはそのＤＮＡコピー）ではなく、標的ＲＮＡの相補体を検出する。したがって、本明細書で論じられる方法が、標的ＲＮＡを検出するか、または標的ＲＮＡのレベルを測定することを示すとき、そのような検出または測定は、標的ＲＮＡそれ自体の代わりに、または標的ＲＮＡそれ自体に加えて、標的ＲＮＡの相補体に対して実施されてもよい。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡではなく、標的ＲＮＡの相補体を検出するとき、標的ＲＮＡの相補体に相補的なプローブを用いる。このような実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡと配列が同一である少なくとも部分を含むが、ウリジンの代わりにチミジンを含んでいてもよく、かつ／または他の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡの検出方法は、該標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの増幅を含む。このような増幅を任意の方法により達成することができる。例示的な方法としては、限定するものではないが、リアルタイムＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、および例えば、Ｉｍｐｌｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＳｅｎｓｅＡｍｐ  Ｐｌｕｓ（商標）キットにより提供される、ｃＤＮＡにアニールしたＴ７プロモーターからのＴ７ポリメラーゼを用いた増幅が挙げられる。
【００７９】
標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを増幅するとき、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが形成される。ＤＮＡアンプリコンは、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡアンプリコンが一本鎖の場合、ＤＮＡアンプリコンの配列は、センスまたはアンチセンスのいずれかの向きの標的ＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡそれ自体ではなく、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンを検出する。したがって、本明細書で論じられる方法が、標的ＲＮＡを検出するか、または標的ＲＮＡのレベルを測定することを示すとき、そのような検出または測定は、標的ＲＮＡそれ自体の代わりに、または標的ＲＮＡそれ自体に加えて、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンに対して実施されてもよい。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡではなく、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンを検出するとき、標的ＲＮＡの相補体に相補的なプローブを用いる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡではなく、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンを検出するとき、標的ＲＮＡに相補的なプローブを用いる。さらに、いくつかの実施形態では、多数のプローブを用いてもよく、いくつかのプローブは、標的ＲＮＡに相補的であってもよく、いくつかのプローブは、標的ＲＮＡの相補体に相補的であってもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡの検出方法は、下記のようなＲＴ−ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡの検出は、任意の方法により達成可能なＲＴ−ＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリングを含む。このような方法としては、限定するものではないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、分子ビーコン、またはスコーピオンプローブ（すなわち、ＦＲＥＴプローブ）の使用や、インターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯなど）の使用が挙げられる。
【００８１】
４．１．４．例示的な解析方法
上記のように、患者由来の試料中で敗血症を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、対照試料、例えば、敗血症症候群と診断されていない患者由来の試料、または正常ヒト単球の試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルよりも大きい、表２に示す配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルよりも大きい、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む試料中の１種以上の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルよりも大きい、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む試料中の１種以上の標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【００８２】
上記の実施形態などのいくつかの実施形態では、本方法は、対照試料中の少なくとも１種の標的ＲＮＡの正常な発現レベルよりも大きい、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にはハイブリダイズせず、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含まない試料中のヒトｍｉＲＮオームの少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現レベルを検出することをさらに含む。本明細書で用いられるとき、「ヒトｍｉＲＮオーム」という用語は、ヒト細胞中の全てのマイクロＲＮＡ遺伝子およびそれから生成される成熟マイクロＲＮＡを指す。
【００８３】
所望の少なくとも１種の標的ＲＮＡの特異的かつ定量化可能な（または半定量化可能な）検出を可能にする任意の解析手順を本明細書に提示される方法において使用し得る。このような解析手順としては、限定するものではないが、実施例１に示すマイクロアレイ法、実施例２に示すマイクロビーズ法、および当業者に公知の方法が挙げられる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの検出は、標的ＲＮＡまたはその相補体に相補的なポリヌクレオチドと、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、および標的ＲＮＡの相補体から選択される核酸とを含む複合体の形成を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの相補体、例えば、標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンと複合体を形成する。二本鎖ＤＮＡアンプリコンが、本明細書で用いられるような複合体の一部であるとき、この複合体は、ＤＮＡアンプリコンの一方または両方の鎖を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、複合体は、ＤＮＡアンプリコンの一方の鎖のみを含む。いくつかの実施形態では、複合体は三重鎖であり、ポリヌクレオチドとＤＮＡアンプリコンの両方の鎖とを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ポリヌクレオチドと、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡの相補体、または標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンとのハイブリダイゼーションによって形成される。ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、方法は、複合体の検出を含む。いくつかの実施形態では、複合体は、検出の時点で会合している必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、複合体を形成させ、その後、複合体を何らかの方法で解離させるかまたは破壊し、複合体由来の成分を検出する。そのような系の一例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドがプライマーである場合、複合体の検出は、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡの相補体、または標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンの増幅を含み得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に示す方法における少なくとも１種の標的ＲＮＡの検出に用いられる解析方法には、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲが含まれる。Ｃｈｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１７９およびＰＣＴ国際公開第２００７／１１７２５６号を参照されたく、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの検出に用いられる解析方法には、米国特許公開第２００９／０１２３９１２  Ａ１号に記載の方法が含まれ、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。その刊行物に記載された例示的な方法では、第１の部分と第２の部分を含む伸長プライマーを用いてマイクロＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを作製し、ここで、第１の部分は、特定のマイクロＲＮＡの３’末端に選択的にハイブリダイズし、第２の部分は、ユニバーサルプライマーの配列を含む。その後、マイクロＲＮＡの５’末端に選択的にハイブリダイズするリバースプライマーとユニバーサルプライマーとを用いて、定量的ＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅させる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの検出に用いられる解析方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの使用を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡの検出に用いられる解析方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により販売されているＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイなどのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを含む。例示的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、トータルＲＮＡは試料から単離される。いくつかの実施形態では、アッセイを用いて、マイクロＲＮＡを含む約１０ｎｇのトータルＲＮＡインプット試料、例えば、約９ｎｇのインプット試料、例えば、約８ｎｇのインプット試料、例えば、約７ｎｇのインプット試料、例えば、約６ｎｇのインプット試料、例えば、約５ｎｇのインプット試料、例えば、約４ｎｇのインプット試料、例えば、約３ｎｇのインプット試料、例えば、約２ｎｇのインプット試料、およびわずか約１ｎｇのインプット試料さえも解析することができる。
【００８８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、標的ＲＮＡの３’末端に特異的に相補的なステムループプライマーが利用される。例示的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、ステムループプライマーを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせた後に、標的ＲＮＡ鋳型を逆転写し、プライマーの３’末端を伸長させる。逆転写の結果は、ステムループプライマー配列がアンプリコンの５’末端にあり、標的ＲＮＡのｃＤＮＡが３’末端にあるキメラ（ＤＮＡ）アンプリコンである。標的ＲＮＡの定量は、全ステムループ標的ＲＮＡプライマーの５’末端の配列に相補的な配列を有するユニバーサルリバースプライマー、標的ＲＮＡ特異的フォワードプライマー、および標的ＲＮＡ配列特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって達成される。
【００８９】
アッセイでは、合成されたＰＣＲ産物を検出および定量するために、蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）が用いられる。典型的には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、色素とクエンチャーが接近して、クエンチャーがＦＲＥＴによって色素の蛍光シグナルを抑制するように、５’末端に結合した蛍光色素分子と３’末端に結合したクエンチャー分子とを含む。ポリメラーゼが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合しているキメラアンプリコン鋳型を複製するとき、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼはプローブを切断し、色素とクエンチャーを分断し、その結果、ＦＲＥＴが無効になって、蛍光シグナルが発生する。蛍光は、切断されるプローブの量に比例して、各ＲＴ−ＰＣＲサイクルとともに増加する。
【００９０】
さらなる例示的なＲＮＡ検出方法および／または定量方法は、例えば、米国特許公開第２００７／００７７５７０号（Ｌａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＣＴ国際公開第２００７／０２５２８１号（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許公開第２００７／００５４２８７号（Ｂｌｏｃｈ）、ＰＣＴ国際公開第２００６／０１３０７６１号（Ｂｌｏｃｈ）、およびＰＣＴ国際公開第２００７／０１１９０３号（Ｌａｏ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されており、これらは、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果の定量は、既知濃度の核酸から標準曲線を構築し、次に、未知濃度の標的ＲＮＡの量的情報を推定することによって行なわれる。いくつかの実施形態では、標準曲線の作成に用いられる核酸は、既知濃度のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標準曲線の作成に用いられる核酸は、精製された二本鎖プラスミドＤＮＡまたはインビトロで生成された一本鎖ＤＮＡである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、標的核酸と内在性参照の増幅効率がほぼ等しい場合、定量は、比較Ｃｔ（サイクル閾値、例えば、蛍光シグナルがバックグラウンドを超えるのに必要なＰＣＲサイクル数）法により達成される。Ｃｔ値は、試料中の核酸標的の量に反比例する。いくつかの実施形態では、目的の標的ＲＮＡのＣｔ値は、対照または校正物質、例えば、正常組織由来のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）と比較することができる。いくつかの実施形態では、校正物質と目的の標的ＲＮＡ試料のＣｔ値を、適当な内在性ハウスキーピング遺伝子に対して標準化する。
【００９３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの他に、本明細書で提示される方法におけるＰＣＲ産物の検出および定量に有用な他のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ化学物質としては、限定するものではないが、以下に論じるような、分子ビーコン、スコーピオンプローブおよびインターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯなど）が挙げられる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出は、単一の標的ＲＮＡの発現を特異的に検出および定量するために行なわれる。標的ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な標的ＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４および８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、 配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８および７９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９および８４から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、および７８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３および８５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号９、５０、５１、７０、７２および７５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、および６４８から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的��ＮＡはマイクロＲＮＡである。
【００９５】
様々な実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出は、１回の多重反応において、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種の標的ＲＮＡを検出するために用いられる。少なくとも１種の標的ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、または少なくとも４０種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４および８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、または少なくとも１５種の標的ＲＮＡの１回の多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて、正常よりも大きい発現を検出することを含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８および７９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、または少なくとも１５種の標的ＲＮＡの１回の多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて、正常よりも大きい発現を検出することを含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９および８４から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、および７８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、または少なくとも３０種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３および８５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも６種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号９、５０、５１、７０、７２および７５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、または少なくとも３０種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、および６４８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、および６３２から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７０種の標的ＲＮＡの多重ＲＴ−ＰＣＲ反応における発現の検出を含み、ここで、各標的ＲＮＡは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、および８６３〜８６８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【００９７】
いくつかの多重実施形態では、各々異なるＲＮＡ標的に特異的な複数のプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）が用いられる。いくつかの実施形態では、各標的ＲＮＡ特異的プローブは、同じ多重反応において用いられる他のプローブとスペクトル的に区別可能である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、二本鎖ＤＮＡ産物に結合する色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯなど）を用いて達成される。いくつかの実施形態では、アッセイは、Ｑｉａｇｅｎ製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲグリーンＰＣＲアッセイである。このアッセイでは、まず、試料からトータルＲＮＡを単離する。次に、トータルＲＮＡを３’末端でポリアデニル化し、５’末端にポリ−ｄＴが付いたユニバーサルプライマーを用いて逆転写する。いくつかの実施形態では、多数の標的ＲＮＡをアッセイするのに１回の逆転写反応で十分である。次に、標的ＲＮＡ特異的プライマーと５’末端にポリ−ｄＴ配列を含むｍｉＳｃｒｉｐｔユニバーサルプライマーとを用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを達成する。ＳＹＢＲグリーン色素は、二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合し、励起すると光を放出する。いくつかの実施形態では、プライマーのＰＣＲ鋳型への特異性の高いアニーリングを促進する緩衝液条件（例えば、Ｑｉａｇｅｎ製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲグリーンＰＣＲキットで利用可能なもの）を用いて、ＳＹＢＲグリーンに結合して定量に悪影響を及ぼす非特異的ＤＮＡ二重鎖およびプライマー二量体の形成を防ぐことができる。したがって、ＰＣＲ産物が蓄積するにつれて、ＳＹＢＲグリーンからのシグナルが増加し、特異的産物の定量が可能になる。
【００９９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、当該技術分野で利用可能な任意のＲＴ−ＰＣＲ機器を用いて行なわれる。通常、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータの収集と解析に用いられる機器は、サーマルサイクラーと、蛍光励起および放出回収のための光学と、場合によっては、コンピュータと、データ取得および解析ソフトウェアとを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられる解析方法は、ＤＡＳＬ（登録商標）（ｃＤＮＡを介するアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション）アッセイ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．から入手可能なマイクロＲＮＡ発現プロファイリングアッセイである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙＷｏｒｋｆｌｏｗ．ｐｄｆ参照）。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡを解析すべき試料から任意の方法で単離する。さらに、いくつかの実施形態では、低分子ＲＮＡを解析すべき試料から任意の方法で単離する。その後、トータルＲＮＡまたは単離された低分子ＲＮＡをポリアデニル化してもよい（反応混合物中のＲＮＡの３’末端に１９個以上のＡ残基を付加する）。５’末端から３’末端にかけて、ＰＣＲプライマー部位と、試料ＲＮＡのポリ−ｄＡテールに結合するポリ−ｄＴ領域とを含む配列を含むビオチン標識ＤＮＡプライマーを用いて、ＲＮＡを逆転写する。次に、得られるビオチン化ｃＤＮＡ転写産物を、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して固体支持体にハイブリダイズさせ、１種以上の標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドと接触させる。標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端にかけて、ＰＣＲプライマー部位を含む領域、アドレス配列を含む領域、および標的ＲＮＡ特異的配列を含む。
【０１０１】
いくつかのＤＡＳＬ（登録商標）実施形態では、標的ＲＮＡ特異的配列は、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ特異的配列は、ヒトｍｉＲＮオームのマイクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的なプローブ配列を含む。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションの後、標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドを伸長させ、次に、伸長産物を、固定化したｃＤＮＡアレイから溶出させる。蛍光標識したユニバーサルプライマーを用いる第２のＰＣＲ反応によって、標的ＲＮＡ特異的配列を含む蛍光標識ＤＮＡが生成される。次に、検出および定量のために、標識ＰＣＲ産物をマイクロビーズアレイにハイブリダイズさせる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現の検出および定量に用いられる解析方法は、ビーズに基づくフローサイトメトリーアッセイである。Ｌｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３４−８３８を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ビーズに基づくフローサイトメトリーアッセイの例は、Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．のｘＭＡＰ（登録商標）技術である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｍｉｎｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照）。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡを試料から単離した後、ビオチンで標識する。次に、標識ＲＮＡを、マイクロビーズに共有結合した標的ＲＮＡ特異的捕捉プローブ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｍｉｎｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｓｓａｙｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでＬｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．により販売されているＦｌｅｘｍｉＲ（商標）製品）にハイブリダイズさせる。このマイクロビーズは各々、異なる蛍光強度を有する２種の色素で標識されている。ストレプトアビジン結合レポーター分子（例えば、ストレプトアビジン−フィコエリスリン、別名「ＳＡＰＥ」）を、捕捉された標的ＲＮＡに付着させ、フローサイトメトリーを用いて各ビーズの独特のシグナルを読み取る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料（トータルＲＮＡまたは濃縮された低分子ＲＮＡ）をまずポリアデニル化し、その後、試料ＲＮＡのポリ−ｄＡテールの３’末端と、ビオチン化デンドリマーに付着したポリヌクレオチドの５’末端とに相補的な架橋ポリヌクレオチドを用いて、ビオチン化３ＤＮＡ（商標）デンドリマー（すなわち、多数のビオチン分子がそれに結合している多重アームＤＮＡ）（例えば、Ｍａｒｌｉｇｅｎ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによりＶａｎｔａｇｅ（商標）マイクロＲＮＡ標識キットとして販売されているもの）で標識する。次に、ストレプトアビジン結合レポーター分子を、フローサイトメトリーによる解析の前にビオチン化デンドリマーに付着させる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｒｌｉｇｅｎ．ｃｏｍ／ｖａｎｔａｇｅ−ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｌａｂｅｌｉｎｇ−ｋｉｔ．ｈｔｍｌを参照されたい。いくつかの実施形態では、ビオチン標識ＲＮＡをまずＳＡＰＥに暴露させ、その後、ＲＮＡ／ＳＡＰＥ複合体を、９００個ものビオチン分子に結合させることができるＤＮＡデンドリマーに付着した抗フィコエリスリン抗体に暴露させる。これにより、多数のＳＡＰＥ分子がビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介してビオチン化デンドリマーに結合し、それにより、アッセイからのシグナルを増加させることができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現の検出および定量に用いられる解析方法は、ゲル電気泳動および標識プローブ（例えば、放射性標識または化学発光標識で標識されたプローブ）を用いる検出によるもの（例えば、ノーザンブロッティングによるもの）である。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡを試料から単離した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、サイズで分離する。次に、分離されたＲＮＡをメンブレンにブロットし、放射性標識された相補的プローブとハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態では、例示的なプローブは、以下で論じるような１以上の親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、デオキシリボース糖またはリボース糖の代わりに二環式糖部分を含むロックされた核酸（「ＬＮＡ」）類似体を含む。例えば、Ｖaｒａｌｌｙａｙ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ３（２）：１９０−１９６を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡ試料をさらに精製して、低分子ＲＮＡを濃縮することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを、例えば、標的ＲＮＡの両方の末端に相補的な長いプローブ（「南京錠プローブ」）を用いるローリングサイクル増幅と、プローブを環状化するためのライゲーションと、それに次ぐ、環状化プローブにハイブリダイズした標的ＲＮＡをプライマーとして用いるローリングサイクル複製とによって増幅することができる。例えば、Ｊｏｎｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ＲＮＡ  １２：１−６を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。その後、例えば、ゲル電気泳動やノーザンブロッティングを用いて、増幅産物を検出および定量することができる。
【０１０５】
代わりの実施形態では、標識プローブを、溶液中の単離されたトータルＲＮＡとハイブリダイズさせ、その後、ＲＮＡを速やかに、一本鎖ＲＮＡ（例えば、プローブのハイブリダイズしていない部分またはハイブリダイズしていない標的ＲＮＡ）のリボヌクレアーゼ消化に供する。これらの実施形態では、次に、リボヌクレアーゼ処理した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥや、例えば、ノーザンブロッティングによる放射性標識プローブの検出によって解析する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ＣａｔＮｕｍ．ｐｈｐ？１５５２でＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により販売されているｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ検出キットの製品カタログを参照されたい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における少なくとも１種の標的ＲＮＡの発現の検出および定量に用いられる解析方法は、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションによるものである。例えば、Ｌｉｕ，Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９７４０−９７４４；Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９−７７３（これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）および実施例１を参照されたい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイを用いた標的ＲＮＡの検出および定量は、表面プラズモン共鳴により達成される。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｎａｎｏ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓ＿ｃｅｎｔｅｒ／ｎａｎｏｔｅｃｈ＿ｎｅｗｓ＿２００６−１０−３０ｂ．ａｓｐ．で入手可能なＮａｎｏｔｅｃｈ  Ｎｅｗｓ（２００６）を参照されたい。これらの実施形態では、トータルＲＮＡを試験されている試料から単離する。場合により、ＲＮＡ試料をさらに精製して、低分子ＲＮＡの集団を濃縮する。精製後、ＲＮＡ試料を、マイクロアレイ上の規定の位置にプローブを含むアドレス指定可能なマイクロアレイに結合させる。非限定的で例示的なプローブとしては、配列番号１〜８６に示す配列を含むプローブが挙げられる。例示的なプローブとしては、限定するものではないが、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６８〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含むもプローブ挙げられる。例示的なプローブとしては、限定するものではないが、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むプローブも挙げられる。いくつかの実施形態では、プローブは、以下で論じるような１以上の親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、ロックされた核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド類似体を含む。マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、アレイにハイブリダイズしたＲＮＡをまずポリアデニル化し、次に、アレイを、それに結合したポリ−ｄＴを有する金粒子に暴露させる。結合した標的ＲＮＡの量を表面プラズモン共鳴を用いて定量する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、ＲＮＡをプライマーとしたアレイに基づくクレノー酵素（「ＲＡＫＥ」）アッセイで利用される。Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １（２）：１−７；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ＲＮＡ  １２（２）：１−５を参照されたく、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡを試料から単離する。いくつかの実施形態では、低分子ＲＮＡを試料から単離する。次に、ＲＮＡ試料を、アドレス指定可能なアレイ上の５’末端で固定化されたＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。ＤＮＡプローブは、いくつかの実施形態では、５’末端から３’末端にかけて、全てのプローブについて同一の「スペーサー」配列を含む第１の領域、３つのチミジン含有ヌクレオシドを含む第２の領域、および目的の標的ＲＮＡに相補的な配列を含む第３の領域を含む。
【０１０９】
例示的な目的の標的ＲＮＡとしては、限定するものではないが、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることができる標的ＲＮＡ、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに同一な領域を含む標的ＲＮＡ、および配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む標的ＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡとしては、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にはハイブリダイズしないｍｉＲＮオーム中の標的ＲＮＡも挙げられる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【０１１０】
試料をアレイにハイブリダイズさせた後、それをエキソヌクレアーゼＩに暴露させて、ハイブリダイズしていないプローブを消化する。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片をビオチン化ｄＡＴＰととも適用し、ハイブリダイズした標的ＲＮＡが、ＤＮＡプローブを鋳型として用いるこの酵素のプライマーとして働くのを可能にする。次に、スライドを洗浄し、ストレプトアビジン結合フルオロフォアを適用して、ハイブリダイズしかつクレノーにより伸長した試料由来の標的ＲＮＡを含むアレイ上のスポットを検出および定量する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料を逆転写する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料をビオチン／ポリ−ｄＡランダムオクタマープライマーを用いて逆転写する。そのプライマーを用いる場合、ＲＮＡ鋳型を消化し、ビオチン含有ｃＤＮＡを、標的ＲＮＡの特異的検出を可能にするプローブを結合させたアドレス指定可能なマイクロアレイにハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列に全く同じように存在するか、またはこれらの配列の領域と相補的である少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１種のプローブを含む。ｃＤＮＡのマイクロアレイへのハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをストレプトアビジン結合検出可能マーカー（例えば、蛍光色素）に暴露させ、結合したｃＤＮＡを検出する。Ｌｉｕ  Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４：２２−３０を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを、マイクロタイタープレートのウェルに結合したプローブを用いるＥＬＩＳＡ様アッセイで検出および定量する。Ｍｏｒａ  Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｇｅｔｔｓ  Ｒ．Ｃ．（２００６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４１：４２０−４２４およびＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４１（４）：１−５の補助資料；Ｇｅｔｔｓらに対する米国特許公開第２００６／００９４０２５号を参照されたく、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの実施形態では、低分子ＲＮＡが濃縮されているＲＮＡの試料をポリアデニル化するか、または逆転写してｃＤＮＡをポリアデニル化するかのいずれかにする。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを、マイクロタイタープレートのウェルに固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、その場合、これらのプローブは各々、ＲＮＡをアレイにハイブリダイズさせるか、ｃＤＮＡをアレイにハイブリダイズさせるかによって、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、もしくはこれらの領域と相補的である配列、またはヒトｍｉＲＮオームの１種以上の標的ＲＮＡ配列（もしくはその逆相補体）などの配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のビオチン分子または複数のセイヨウワサビペルオキシダーゼ分子で標識されたＤＮＡデンドリマー（例えば、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ＿３ｄｎａ．ｈｔｍｌから入手可能なもの）などの捕捉配列と、捕捉された核酸のポリ−ｄＡテールに結合する５’末端のポリ−ｄＴ配列および捕捉配列の領域に相補的な３’末端の配列を含む架橋ポリヌクレオチドとを用いて、ハイブリダイズしたＲＮＡを標識する。捕捉配列がビオチン化されている場合、マイクロアレイをストレプトアビジン結合セイヨウワサビペルオキシダーゼに暴露させる。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などのセイヨウワサビペルオキシダーゼ基質を添加し、４５０ｎＭで溶液の吸光度を測定することにより、標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションを検出する。
【０１１３】
さらに他の実施形態では、アドレス指定可能なマイクロアレイを用いて、量子ドットを用いて標的ＲＮＡを検出する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｒｔｉｃｌｅｒｅｎｄｅｒ．ｆｃｇｉ？ａｒｔｉｄ＝５４８３７７で入手可能なＬｉａｎｇ，Ｒ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（２）：ｅ１７を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、トータルＲＮＡを試料から単離する。いくつかの実施形態では、低分子ＲＮＡを試料から単離する。標的ＲＮＡの３’末端をビオチン−Ｘ−ヒドラジンを用いてビオチン化する。ビオチン化標的ＲＮＡを、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７のうちの１つもしくは複数に全く同じように存在するか、もしくはこれらの領域と相補的である配列を含む固定化されたプローブおよび／またはヒトｍｉＲＮオームの１種以上のマイクロＲＮＡに相補的な配列以外の配列を含むプローブを含むマイクロアレイ上で捕捉させる。次に、ハイブリダイズした標的ＲＮＡをビオチン−ストレプトアビジン結合を介して量子ドットで標識する。共焦点レーザーにより、量子ドットは蛍光を発し、シグナルを定量することができる。代わりの実施形態では、低分子ＲＮＡを比色アッセイを用いて検出することができる。これらの実施形態では、低分子ＲＮＡをストレプトアビジンが結合した金で標識し、次いで銀で増感させる。ハイブリダイズした標的ＲＮＡに結合した金ナノ粒子により、銀イオンの金属銀への還元が触媒され、次に、この金属銀をＣＣＤカメラを用いて比色分析で検出することができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡの検出および定量は、マイクロ流体装置および単分子検出を用いて達成される。いくつかの実施形態では、単離されたトータルＲＮＡの試料中の標的ＲＮＡを、一方は標的ＲＮＡの５’末端の核酸に相補的で、もう一方は標的ＲＮＡの３’末端に相補的な２種のプローブにハイブリダイズさせる。各プローブは、いくつかの実施形態では、１以上の親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡヌクレオチド類似体を含み、各々は、異なる蛍光放出スペクトルを有する異なる蛍光色素で標識されている。次に、この試料をマイクロ流体キャピラリーに流す。このキャピラリー中では、独特の同時光子バーストによって特定の標的ＲＮＡが同定され、特定の独特の同時光子バーストの数を計数して、試料中の標的ＲＮＡの量を定量することができるように、多数のレーザーで蛍光プローブを励起する。Ｎｅｅｌｙらに対する米国特許公開第２００６／０２９２６１６号を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの代わりの実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プローブを、例えば、フルオロフォア、電子スピン標識などから選択される３種以上の別個の標識で標識し、次に、ＲＮＡ試料（例えば、トータルＲＮＡ）、または低分子ＲＮＡが濃縮されている試料にハイブリダイズさせることができる。非限定的で例示的な標的ＲＮＡ特異的プローブとしては、配列番号１〜８６から選択される配列を含むプローブが挙げられる。非限定的で例示的な標的ＲＮＡ特異的プローブとしては、配列番号１〜８６から選択される配列に相補的な配列を含むプローブが挙げられる。非限定的で例示的な標的ＲＮＡ特異的プローブとしては、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、または配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの相補体を含むプローブも挙げられる。
【０１１５】
場合により、試料ＲＮＡをハイブリダイゼーション前に修飾する。次に、標的ＲＮＡ／プローブ二重鎖を、３種の標識の独特のシグナルを記録する検出器を含む、マイクロ流体装置内のチャネルに通す。このようにして、個々の分子は、その独特のシグナルによって検出され、計数される。Ｆｕｃｈｓら，Ｕ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．に対する米国特許第７,４０２,４２２号および第７,３５１,５３８号を参照されたく、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡの検出および定量は、溶液ベースのアッセイ（例えば、改変されたインベーダーアッセイ）によって達成される。Ａｌｌａｗｉ  Ｈ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  ＲＮＡ  １０：１１５３−１１６１を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、改変されたインベーダーアッセイは、細胞の未分画洗浄剤ライセートに対して行なうことができる。他の実施形態では、改変されたインベーダーアッセイは、細胞から単離されたトータルＲＮＡまたは低分子ＲＮＡが濃縮されている試料に対して行なうことができる。試料中の標的ＲＮＡを、ヘアピン構造を形成する２種のプローブにアニールさせる。第１のプローブは、ヘアピン構造を５’末端に、また、標的ＲＮＡの５’末端の領域の配列に相補的な配列を有する領域を３’末端に有する。第１のプローブの３’末端は、「侵襲的ポリヌクレオチド」である。第２のプローブは、５’末端から３’末端にかけて、標的ＲＮＡに相補的でない第１の「フラップ」領域、標的ＲＮＡの３’末端に相補的な配列を有する第２の領域、およびヘアピン構造を形成する第３の領域を有する。この２種のプローブが標的ＲＮＡ標的に結合すると、これらは、標的ＲＮＡ鋳型上で重なり合うプローブ形状を生成する。これは、クリベース酵素によって認識され、それにより、第２のプローブのフラップが溶液中に放出される。その後、フラップ領域は、二次反応鋳型（「ＳＲＴ」）の３’末端の相補領域に結合する。ＦＲＥＴポリヌクレオチド（５’末端に結合した蛍光色素と、３’末端により近いところで結合した色素をクエンチするクエンチャーとを有する）は、ＳＲＴの５’末端の相補領域に結合し、結果的に、フラップの３’末端とＦＲＥＴポリヌクレオチドの５’末端の重なり合う形状が生成される。クリベースは、重なり合う形状を認識し、ＦＲＥＴポリヌクレオチドの５’末端を切断し、色素が溶液中に放出されたときに、蛍光シグナルを発生させる。
【０１１７】
４．１．５．例示的なポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いられる合成ポリヌクレオチドは、化学的にかまたは酵素的にかのいずれかでインビトロで合成されたポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの化学合成としては、限定するものではないが、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのようなポリヌクレオチド合成装置を用いた合成が挙げられる。酵素合成としては、限定するものではないが、酵素的増幅（例えば、ＰＣＲ）によるポリヌクレオチドの産生が挙げられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列ならびに配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７に相補的な配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４、または少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７のいずれにも見出されない、またはこれらに相補的でない配列を有する領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号１〜６７、２１５〜３９９、９５０、および８６３〜８９７から選択される配列、ならびに配列番号１〜６７、２１５〜３９９、９５０、および８６３〜８９７に相補的な配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜６７、２１５〜３９９、９５０、もしくは８６３〜８９７のいずれにも見出されない、またはこれらに相補的でない配列を有する領域をさらに含む。
【０１１９】
「領域」は、特定の配列（例えば、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７のいずれか）の全長配列、もしくは全長配列の相補体を含むことができるか、または「領域」は、特定の配列（例えば、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７のいずれか）のサブ配列、もしくはサブ配列の相補体を含むことができる。このようなサブ配列は、いくつかの実施形態では、特定の配列番号またはその相補体由来の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドを含み得る。
【０１２０】
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、５００個未満、３００個未満、２００個未満、１５０個未満、１００個未満、７５個未満、５０個未満、４０個未満、または３０個未満のヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、８〜２００ヌクレオチド長、８〜１５０ヌクレオチド長、８〜１００ヌクレオチド長、８〜７５ヌクレオチド長、８〜５０ヌクレオチド長、８〜４０ヌクレオチド長、または８〜３０ヌクレオチド長である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプライマーである。いくつかの実施形態では、プライマーは、検出可能な部分で標識されている。いくつかの実施形態では、プライマーは標識されていない。本明細書で用いられるプライマーは、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡまたは標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡから増幅されたアンプリコン（「鋳型」と総称される）に特異的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、鋳型、ポリメラーゼならびに好適な緩衝液および試薬の存在下で伸長して、プライマー伸長産物を形成することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプローブである。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な部分で標識されている。本明細書で用いられる検出可能な部分には、直接的に検出可能な部分（例えば、蛍光色素）と間接的に検出可能な部分（例えば、結合ペアのメンバー）の両方が含まれる。検出可能な部分が結合ペアのメンバーであるとき、いくつかの実施形態では、プローブは、プローブを結合ペアの第２のメンバーに結合した検出可能な標識とインキュベートすることにより検出可能となり得る。いくつかの実施形態では、例えば、プローブが、例えば、マイクロアレイまたはビーズ上の捕捉プローブである場合、プローブは標識されていない。いくつかの実施形態では、プローブは、例えば、ポリメラーゼによって伸長されない。他の実施形態では、プローブは伸長される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、５’末端では蛍光色素（ドナー）で標識され、３’末端ではクエンチャー（アクセプター）で標識されているＦＲＥＴプローブである。クエンチャーは、これらの基が接近したときに（すなわち、同じプローブに付着したときに）色素からの蛍光放出を吸収する（すなわち、抑制する）化学基である。他の実施形態では、ドナーとアクセプターは、ＦＲＥＴプローブの末端にはない。したがって、いくつかの実施形態では、ドナー部分の放出スペクトルは、アクセプター部分の吸収スペクトルと相当に重なり合うはずである。
【０１２４】
４．１．５．１．例示的なポリヌクレオチド修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１種の標的ＲＮＡの検出方法は、修飾された１以上のポリヌクレオチド、例えば、１以上の親和性増強ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドを利用する。本明細書に記載の方法において有用な修飾ポリヌクレオチドとしては、逆転写用のプライマー、ＰＣＲ増幅プライマー、およびプローブが挙げられる。いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチドの組込みは、デオキシリボヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドと比較した場合、その標的核酸に対するポリヌクレオチドの結合親和性と特異性を増大させ、より短いポリヌクレオチドを使用することまたはポリヌクレオチドと標的核酸の間の相補的な領域をより短くすることを可能にする。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類似体は、１以上の塩基修飾、糖修飾および／または骨格修飾を含むヌクレオチドを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類似体において用いられる修飾塩基としては、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン、キサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類似体は、２’−置換糖（例えば、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、および２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース（２’ＭＯＥ）糖）などの修飾糖を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾糖は、アラビノース糖、またはｄ−アラビノ−ヘキシトール糖である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類似体は、骨格修飾、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ；例えば、アミノ酸骨格で連結されているヌクレオ塩基を含むオリゴマー）の使用を含む。他の骨格修飾としては、ホスホロチオアート結合、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルとホスホロチオアート核酸の組合せ、メチルホスホナート、アルキルホスホナート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオアート、ホスホルアミダート、カルバマート、カルボナート、リン酸トリエステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾塩基を有する少なくとも１つの親和性増強ヌクレオチド類似体、修飾糖を有する（同じヌクレオチドであり得る）少なくともヌクレオチド、および／または天然には生じない少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類似体は、二環式糖であるロックされた核酸（「ＬＮＡ」）糖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられるポリヌクレオチドは、ＬＮＡ糖を有する１以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＮＡ糖を有するヌクレオチドからなる１以上の領域を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドが入り交じったＬＮＡ糖を有するヌクレオチドを含む。例えば、Ｆｒｉｅｄｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１４（１１）：１１３８−１１４２を参照されたい。
【０１３１】
４．１．５．２．例示的なプライマー
いくつかの実施形態では、プライマーを提供する。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドと同一または相補的である。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡと同一または相補的でない部分または領域も含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡと同一または相補的でないプライマーの任意の領域によって同一または相補的な領域が分断されないように、標的ＲＮＡと同一または相補的なプライマーの領域は連続している。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡに全く同じように存在する部分を含む。いくつかのそのような実施形態では、標的ＲＮＡに全く同じように存在する領域を含むプライマーは、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、または標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡの増幅によって生成されたアンプリコンに選択的にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、使用される特定のアッセイの条件下でｃＤＮＡまたはアンプリコンに選択的にハイブリダイズするようにｃＤＮＡまたはアンプリコンの十分な部分に相補的である。
【０１３３】
本明細書で用いられるとき、「選択的にハイブリダイズする」とは、ポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）が、同じ試料中に存在し、ハイブリダイズする領域において異なるヌクレオチド配列を有する別の核酸にハイブリダイズするよりも少なくとも５倍大きい親和性で試料中の特定の核酸にハイブリダイズすることを意味する。例示的なハイブリダイゼーション条件は実施例１に論じられている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じ試料中に存在し、ハイブリダイズする領域において異なるヌクレオチド配列を有する別の核酸にハイブリダイズするよりも少なくとも１０倍大きい親和性で試料中の特定の核酸にハイブリダイズする。
【０１３４】
非限定的で例示的なプライマーとしては、配列番号１〜８６から選択される配列に全く同じように存在するか、またはこれらの領域に相補的である配列を含むプライマーが挙げられる。例示的なプライマーとしては、限定するものではないが、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドと同一または相補的な領域を含むプライマーも挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、プライマーは、例えば、本明細書で論じられているような標的ＲＮＡを逆転写するために用いられる。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡまたはそれから逆転写されるｃＤＮＡを増幅するために用いられる。このような増幅は、いくつかの実施形態では、例えば、本明細書で論じられているような定量的ＰＣＲである。いくつかの実施形態では、プライマーは検出可能な部分を含む。
【０１３６】
４．１．５．３．例示的なプローブ
様々な実施形態では、敗血症の存在を検出する方法は、ヒト試料の核酸をプローブとハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡに相補的な部分を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡに全く同じように存在する部分を含む。いくつかのそのような実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、使用される特定のアッセイの条件下で標的ＲＮＡに選択的にハイブリダイズするように標的ＲＮＡの十分な部分に相補的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、標的ＲＮＡの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、標的ＲＮＡの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。すなわち、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、標的ＲＮＡに相補的でない部分または領域も含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的でないプローブの任意の領域によって相補的な領域が分断されないように、標的ＲＮＡに相補的なプローブの領域は連続している。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡに全く同じように存在する部分を含む。いくつかのそのような実施形態では、標的ＲＮＡに全く同じように存在する領域を含むプローブは、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、または標的ＲＮＡもしくはｃＤＮＡの増幅によって生成されたアンプリコンに選択的にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、プローブは、使用される特定のアッセイの条件下でｃＤＮＡまたはアンプリコンに選択的にハイブリダイズするようにｃＤＮＡまたはアンプリコンの十分な部分に相補的である。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的なプローブは、ｃＤＮＡまたはアンプリコンの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、ｃＤＮＡまたはアンプリコンの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。すなわち、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的なプローブは、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的でない部分または領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的でないプローブの任意の領域によって相補的な領域が分断されないように、ｃＤＮＡまたはアンプリコンに相補的なプローブの領域は連続している。
【０１３８】
非限定的で例示的なプローブとしては、配列番号１〜８６に示す配列を含むプローブが挙げられる。非限定的で例示的なプローブとしては、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列に全く同じように存在するか、またはこれらの領域に相補的である配列を含むプローブが挙げられる。例示的なプローブとしては、限定するものではないが、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドと同一または相補的な領域を含むプローブも挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡを検出可能に定量する方法は、（ａ）トータルＲＮＡを単離することと、（ｂ）標的ＲＮＡを逆転写して、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを生成させることと、（ｃ）（ｂ）からｃＤＮＡを増幅することと、（ｄ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび検出プローブを用いて標的ＲＮＡの量を検出することとを含む。
【０１４０】
上記のように、いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出は、限定するものではないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブおよびスコーピオンプローブをはじめとする、ＦＲＥＴプローブを用いて行なわれる。いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出と定量は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、すなわち、通常、ＤＮＡの一方の末端で共有結合した蛍光色素とＤＮＡのもう一方の末端で共有結合したクエンチャー分子とを有する線状プローブを用いて行なわれる。ＦＲＥＴプローブは、ＦＲＥＴプローブがｃＤＮＡにハイブリダイズしているときには、色素蛍光がクエンチされ、プローブがｃＤＮＡの増幅中に消化されたときには、色素がプローブから放出されて蛍光シグナルを生じるように、ｃＤＮＡの領域に相補的な配列を含む。このような実施形態では、試料中の標的ＲＮＡの量は、ｃＤＮＡ増幅中に測定される蛍光の量に比例する。
【０１４１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、プローブが、得られたＰＣＲアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるように、通常、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ鋳型から逆転写されるその相補ｃＤＮＡの領域に相補的な配列を有する連続するヌクレオチドの領域を含む（すなわち、プローブ領域の配列は、検出される標的ＲＮＡに相補的であるかまたは検出される標的ＲＮＡに全く同じように存在する）。いくつかの実施形態では、プローブは、標的ＲＮＡ鋳型から逆転写されるｃＤＮＡの領域に完全に相補的であるかまたはこのｃＤＮＡの領域に全く同じように存在する配列を有する少なくとも６個の連続するヌクレオチドの領域を含み、例えば、検出される標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡの領域に相補的であるかまたはこのｃＤＮＡの領域に全く同じように存在する配列を有する少なくとも８個の連続するヌクレオチド、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、少なくとも１４個の連続するヌクレオチド、または少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列に相補的な配列を有するｃＤＮＡの領域は、ｃＤＮＡ分子の中央または中央付近にある。いくつかの実施形態では、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチドのｃＤＮＡが、相補的な領域の５’末端および３’末端に独立に存在する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、分子ビーコンを用いて、ＰＣＲ産物を検出および定量することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと同様に、分子ビーコンは、ＦＲＥＴを用いて、プローブの末端に付着した蛍光色素とクエンチャーを有するプローブを介してＰＣＲ産物を検出および定量する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとは異なり、分子ビーコンは、ＰＣＲサイクルの間、無傷であり続ける。分子ビーコンプローブは、溶液中で遊離しているときは、ステムループ構造を形成し、それにより、色素とクエンチャーが十分に接近して、蛍光クエンチングを生じさせる。分子ビーコンが標的にハイブリダイズすると、ステムループ構造が破壊され、その結果、色素とクエンチャーが空間的に離れるようになり、色素が蛍光を発する。分子ビーコンは、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ（商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓｉｔｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｂｉｎｔｒｏ．ａｓｐ参照）から入手可能である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、スコーピオンプローブを、配列特異的プライマーとしてならびにＰＣＲ産物の検出および定量のために用いることができる。分子ビーコンと同じく、スコーピオンプローブは、標的核酸にハイブリダイズしていないときは、ステムループ構造を形成する。しかしながら、分子ビーコンとは異なり、スコーピオンプローブは、配列特異的プライミングとＰＣＲ産物検出の両方を達成する。蛍光色素分子はスコーピオンプローブの５’末端に付着し、クエンチャーは３’末端に付着している。プローブの３’部分は、ＰＣＲプライマーの伸長産物に相補的であり、この相補領域は、非増幅可能部分によってプローブの５’末端に連結される。スコーピオンプライマーが伸長した後、プローブの標的特異的配列は、伸長したアンプリコン内部のその相補体に結合して、ステムループ構造を開かせ、５’末端上の色素が蛍光を発して、シグナルを発生させるのを可能にする。スコーピオンプローブは、例えば、Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ＿ｎｏｔｅｓ／Ｓｃｏｒｐｉｏｎ．ｈｔｍｌ参照）から入手可能である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブに対して使用可能な標識としては、比色標識および蛍光標識、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）；カスケードブルー；カスケードイエロー；クマリンおよびその誘導体（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリンおよびヒドロキシクマリン）；シアニン色素（例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５）；エオシンおよびエリトロシン；フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアナート）；ランタニドイオンの大環状キレート（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ色素（商標）；マリーナブルー；オレゴングリーン；ローダミン色素（例えば、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびローダミン６Ｇ）；テキサスレッド；蛍光エネルギー移動色素（例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体）；ならびにＴＯＴＡＢが挙げられる。
【０１４６】
色素の具体例としては、限定するものではないが、上で特定されたものおよび以下のもの：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０；アミン反応性ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、およびＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ）；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、ならびにＴＥＴが挙げられる。
【０１４７】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において用いられるＲＴ−ＰＣＲプローブの調製において有用な蛍光標識リボヌクレオチドの具体例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能であり、これらのものとして、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−５−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１４−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ、およびＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ＵＴＰが挙げられる。他の蛍光リボヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手可能であり、例えば、Ｃｙ３−ＵＴＰやＣｙ５−ＵＴＰがある。
【０１４８】
本明細書に記載の方法において用いられるＲＴ−ＰＣＲプローブの調製において有用な蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの例としては、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１’−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−５−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−５−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−１２−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１６−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−１２−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰが挙げられる。蛍光標識ヌクレオチドは市販されており、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入することができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、色素および他の部分（例えば、クエンチャー）を、修飾ヌクレオチドを介して、本明細書に記載の方法において用いられるポリヌクレオチド（例えば、ＦＲＥＴプローブ）に導入する。「修飾ヌクレオチド」は、化学的に修飾されているが、なおもヌクレオチドとして機能するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、共有結合で付着した化学的部分（例えば、色素またはクエンチャー）を有し、例えば、ポリヌクレオチドの固相合成により、ポリヌクレオチドに導入することができる。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの核酸への組込みの前に、組込み中に、または組込み後に色素またはクエンチャーと反応可能な１以上の反応基を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アミン修飾ヌクレオチド、すなわち、反応性アミン基を有するように修飾されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン、および／またはシトシンなどの修飾塩基部分を含む。特定の実施形態では、アミン修飾ヌクレオチドは、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰおよび８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ；Ｎ６−（４−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ビス−（エチルアミン）］−ＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシル−ＡＴＰ；８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノ−ＡＴＰ；５−プロパルギルアミノ−ＣＴＰ、５−プロパルギルアミノ−ＵＴＰから選択される。いくつかの実施形態では、異なるヌクレオ塩基部分を有するヌクレオチドは、例えば、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰの代わりに、５−（３−アミノアリル）−ＧＴＰで同じように修飾されている。多くのアミン修飾ヌクレオチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｉｇｍａ、Ｊｅｎａ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＴｒｉＬｉｎｋから市販されている。
【０１５０】
例示的な検出可能な部分としては、限定するものではないが、結合ペアのメンバーも挙げられる。いくつかのそのような実施形態では、結合ペアの第１のメンバーは、ポリヌクレオチドに連結されている。結合ペアの第２のメンバーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）に連結されている。結合ペアの第１のメンバーに連結されたポリヌクレオチドを、検出可能な標識に連結された結合ペアの第２のメンバーとインキュベートすると、結合ペアの第１のメンバーと第２のメンバーが会合して、ポリヌクレオチドを検出することができる。例示的な結合ペアとしては、限定するものではないが、ビオチンとストレプトアビジン、抗体と抗原などが挙げられる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、多数の標的ＲＮＡが１回の多重反応において検出される。いくつかのそのような実施形態では、独特のｃＤＮＡにターゲッティングされる各プローブは、プローブから放出されると、スペクトル的に区別可能である。したがって、各標的ＲＮＡは独特の蛍光シグナルにより検出される。
【０１５２】
当業者は、選択されるアッセイ（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ）に好適な検出方法を選択することができる。選択される検出方法は、上記の方法である必要はなく、いかなる方法であってもよい。
【０１５３】
４．２．例示的な組成物およびキット
別の態様では、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられる組成物を提供する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１種のプライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１種のプライマーと少なくとも１種のプローブとを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的プライマーを含む組成物を提供する。「標的ＲＮＡ特異的プライマー」という用語は、（ｉ）配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、または（ｉｉ）配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに見られる連続するヌクレオチドの領域の配列に相補的である配列を有する連続するヌクレオチドの領域を有するプライマーを包含する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的プローブを含む組成物を提供する。「標的ＲＮＡ特異的プローブ」という用語は、（ｉ）配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、または（ｉｉ）配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに見られる連続するヌクレオチドの領域の配列に相補的である配列を有する連続するヌクレオチドの領域を有するプローブを包含する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよびプローブは、デオキシリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよびプローブは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。非限定的で例示的なヌクレオチド類似体としては、限定するものではないが、ＬＮＡ類似体やペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体をはじめとする、本明細書に記載の類似体が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プライマーおよびプローブは、ハイブリダイゼーション結合エネルギー（例えば、上で論じた親和性増強ヌクレオチド類似体）を増大させる少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物中の標的ＲＮＡ特異的プライマーまたはプローブは、試料中の１種の標的ＲＮＡに結合する。いくつかの実施形態では、単一のプライマーまたはプローブは、多数の標的ＲＮＡ（例えば、多数のアイソｍｉｒ）に結合する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、単一の標的ＲＮＡに特異的な２種以上のプライマーまたはプローブが組成物中に存在し、これらのプライマーまたはプローブは、標的ＲＮＡの重なり合う領域または空間的に離れている領域に結合することができる。
【０１５９】
これ以降、明示的に記述されていない場合であっても、本明細書に記載の組成物が、標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡにハイブリダイズするように設計されているいくつかの実施形態では、組成物が、標的ＲＮＡ（またはその領域）に全く同じように存在する配列を有する少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的プライマーまたはプローブ（またはその領域）を含むことが理解されるであろう。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４および８６から選択される配列を含む少なくとも１種のプローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８および７９から選択される配列を含む少なくとも１種の核酸プローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９および８４から選択される配列を含む少なくとも１種の核酸プローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、および７８から選択される配列を含む少なくとも１種の核酸プローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３および８５から選択される配列を含む少なくとも１種の核酸プローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号９、５０、５１、７０、７２および７５から選択される配列を含む少なくとも１種の核酸プローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列を含む少なくとも１種の核酸プローブに特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、および６４８から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、および６３２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、および８６３〜８６８から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種の標的ＲＮＡの各々に対する複数の標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび／またはプローブを含み、これらの標的ＲＮＡは、配列番号８７〜１７７、４００〜５６４、７０８〜８６２、および８９８〜９３２のうちの１つに全く同じように存在する配列を有する連続するヌクレオチドの領域を含む。いくつかの実施形態では、複数には、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、または少なくとも１２種の標的ＲＮＡの各々に特異的な標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび／またはプローブが含まれ、これらの標的ＲＮＡは、配列番号８７〜１７７、４００〜５６４、７０８〜８６２、および８９８〜９３２のうちの１つに全く同じように存在する配列を有する連続するヌクレオチドの領域を含む。いくつかの実施形態では、複数には、配列番号８７〜１７７、４００〜５６４、７０８〜８６２、および８９８〜９３２のうちの１つに全く同じように存在する配列を有する連続するヌクレオチドの領域を含む少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも７５種、または少なくとも１００種の標的ＲＮＡの各々に特異的な標的ＲＮＡ特異的プライマーおよび／またはプローブが含まれる。いくつかの実施形態では、表３、１３、１５、または１７に示す配列中のチミン（Ｔ）塩基が、標的ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）塩基に置き換えられていることを除いて、本明細書に記載の標的ＲＮＡは、表３、１３、１５、または１７に示す配列に全く同じように存在する配列を含むことが理解されるであろう。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、組成物は水性組成物である。いくつかの実施形態では、水性組成物は、以下で論じられているような、緩衝剤成分（例えば、リン酸塩、ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなど）および／または追加成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、乾燥して（例えば、凍結乾燥されて）おり、流体を添加して再構成するのに好適である。乾燥組成物は、緩衝剤成分および／または追加成分を含み得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、組成物は１以上の追加成分を含む。追加成分としては、限定するものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２などの塩；熱安定性ポリメラーゼをはじめとするポリメラーゼ；ｄＮＴＰ；ＲＮアーゼインヒビター；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など；β−メルカプトエタノールなどの還元剤；ＥＤＴＡなどが挙げられる。当業者であれば、組成物の意図された使用に応じて好適な組成物成分を選択することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、基板に付着した標的ＲＮＡ特異的プローブを含むアドレス指定可能なマイクロアレイ成分を提供する。
【０１６５】
本明細書に記載の方法において用いられるマイクロアレイは、プローブが共有結合または非共有結合で付着している固体基板を含む。いくつかの実施形態では、１種以上の標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズ可能なプローブは、規定の位置で基板に付着している（「アドレス指定可能なアレイ」）。当業者に理解されるように、プローブを、多種多様な方法で基板に付着させることができる。いくつかの実施形態では、プローブをまず合成し、その後、基板に付着させる。他の実施形態では、プローブを基板上で合成する。いくつかの実施形態では、光重合やフォトリソグラフィーなどの技術を用いて、プローブを基板表面で合成する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、固体基板は、プローブの付着または会合に適した個々別々の部位を含むように修飾され、かつ少なくとも１つの検出方法に適している材料である。基板の代表例としては、ガラスおよび修飾または機能性ガラス、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどを含む）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカ系材料（シリコンおよび修飾シリコンを含む）、炭素、金属、無機ガラス、ならびにプラスチックが挙げられる。いくつかの実施形態では、基板は、感知できるほどの蛍光がなくても光を検出することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、基板は平坦である。他の実施形態では、試料容量を最小限に抑えるために、プローブを（例えば、フロースルー試料解析用の）チューブの内側表面に付ける。他の実施形態では、プローブを、マルチウェルプレートのウェルに入れることができる。さらに他の実施形態では、プローブを、アドレス指定可能なマイクロビーズアレイに付着させることができる。また他の実施形態では、プローブを、軟質基板、例えば、特定のプラスチックから作られた独立気泡フォーム（ｃｌｏｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｆｏａｍｓ）をはじめとする軟質フォームに付着させることができる。
【０１６８】
基板とプローブは各々、後からこの２つを付着させるための官能基で誘導体化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、基板を、限定するものではないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基およびチオール基をはじめとする、１以上の化学的官能基で誘導体化する。いくつかの実施形態では、プローブを、１以上の官能基を介して基板に直接付着させる。いくつかの実施形態では、プローブを、リンカー（すなわち、ハイブリダイゼーションと検出に関与するプローブ領域を基板表面から引き離す連続するヌクレオチドの領域）を介して基板に間接的に付着させる。いくつかの実施形態では、プローブを、５’末端を介して固体支持体に付着させる。他の実施形態では、プローブを、３’末端を介して固体支持体に付着させる。さらに他の実施形態では、プローブを、内部ヌクレオチドを介して基板に付着させる。いくつかの実施形態では、プローブを、非共有結合的に、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して固体支持体に付着させ、その場合、プローブはビオチン化され、基板表面はストレプトアビジンで共有結合的にコーティングされている。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、組成物は、基板に付着したプローブを有するマイクロアレイを含み、その場合、これらのプローブ（またはその領域）のうちの少なくとも１種は、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、または少なくとも１００種のプローブは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的プローブと、ヒトｍｉＲＮオームの標的ＲＮＡに全く同じように存在するか、またはこれらの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的プローブとを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、マイクロアレイ上のたった１つの位置に各々の標的ＲＮＡ特異的プローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、マイクロアレイ上の多数の位置に少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的プローブを含む。
【０１７０】
本明細書で用いられるとき、標的ＲＮＡ（またはその標的領域）に「相補的」または「部分的に相補的」という用語、および標的ＲＮＡ配列の「相補性」のパーセンテージに対するプローブ配列の「相補性」のパーセンテージは、標的ＲＮＡの配列の逆相補体に対する「同一性」パーセンテージである。本明細書に記載の組成物において用いられるプローブ（またはその領域）と標的ＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されているもの）との間の「相補性」の程度を決定するとき、この「相補性」の程度は、プローブ（またはその領域）の配列とそれと最も良くアラインする標的ＲＮＡの配列の逆相補体の間の同一性パーセンテージとして表される。パーセンテージは、２つの配列間で同一のアラインされた塩基の数を数えて、プローブ中の連続するヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより求められる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、標的ＲＮＡの標的領域に完全に相補的な配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。他の実施形態では、マイクロアレイは、標的ＲＮＡの最も良くアラインされた標的領域の配列と比較したときに、１以上の塩基ミスマッチを含む配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。
【０１７２】
上述のように、本明細書で用いられる、プローブまたは標的ＲＮＡの「領域」は、特定の配列番号またはその相補体由来の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個もしくはそれより多くの連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、またはこれらのヌクレオチドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、領域は、プローブまたは標的ＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、領域は、プローブまたは標的ＲＮＡの長さよりも短い。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１〜６８、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の連続するヌクレオチドの領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４および８６のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、または少なくとも４０種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８または７９のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８および７９のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、または少なくとも１５種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８および７９のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、または少なくとも１５種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、または少なくとも３０種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも６種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、または少なくとも３０種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、または少なくとも２０種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する少なくとも１種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を各々含む少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７０種のプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有さない追加のプローブをさらに含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、ヒトｍｉＲＮオーム（すなわち、他者らによりｍｉＲＢａｓｅ（本マイクロアレイが製造されている時点で、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）に登録されている公知のマイクロＲＮＡ）の相当な部分、例えば、ヒトｍｉＲＮオームの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む標的ＲＮＡに相補的な配列を有する領域を有するプローブを含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、ヒトｍｉＲＮオームの相当な部分、例えば、ヒトｍｉＲＮオームの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む標的ＲＮＡに全く同じように存在する配列を有する領域を有するプローブを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、その各々が、各ビーズの独特のシグナルを発生させるために内部で様々な強度の赤色フルオロフォアと赤外フルオロフォアで染色されているマイクロビーズ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘにより販売されているもの）に付着したプローブを含む構成要素を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実施するのに有用な組成物は、各々独特のスペクトルシグナチャーを有する、複数のマイクロビーズを含む。各々の独特に標識されたマイクロビーズは、ビーズ中の色素由来の独特のスペクトルシグナチャーが特定のプローブ配列と関連するように、独特の標的ＲＮＡ特異的プローブに付着している。非限定的で例示的なプローブ配列としては、配列番号１〜８６が挙げられる。非限定的で例示的なプローブ配列としては、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列に全く同じように存在するか、またはこれらの配列に相補的である領域を含むプローブも挙げられる。いくつかの実施形態では、プローブ配列は、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域と相補的である少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、または少なくとも２４個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、独特に標識されたマイクロビーズは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。他の実施形態では、独特に標識されたマイクロビーズは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７、ならびに配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７に相補的な配列から選択される最もよく似た配列と比較したときに、１以上の塩基ミスマッチを含む配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含む組成物を提供し、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の連続するヌクレオチドの領域を有するプローブをそれに付着させている。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、そのうちの少なくとも１種は、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、または少なくとも４０種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８または７９のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８または７９のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、または少なくとも１８種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８または７９のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、または少なくとも１８種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、または少なくとも３５種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも６種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、または少なくとも３０種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、または少なくとも２０種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、少なくとも１種のマイクロビーズは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有する独特の標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７０種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含み、その場合、複数には、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている少なくとも１種のマイクロビーズが含まれる。いくつかの実施形態では、複数には、その各々が、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、少なくとも７５種、または少なくとも１００種のマイクロビーズが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちのいずれかに全く同じようには存在しないか、またはこれらの領域に相補的でない配列を有する領域を有する標的ＲＮＡ特異的プローブをそれに付着させている少なくとも１種の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、組成物は、そのうちの少なくとも１種が、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域と相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている複数の独特に標識されたマイクロビーズと、ヒトｍｉＲＮオーム由来の標的ＲＮＡに全く同じように存在するか、またはこれらの領域に相補的である配列を有する領域を有するプローブをそれに付着させている少なくとも第２のビーズとを含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、ヒトｍｉＲＮオームの相当な部分、例えば、ヒトｍｉＲＮオームの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む標的ＲＮＡに相補的な領域を有する独特のプローブをそれに付着させている、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒトｍｉＲＮオームの相当な部分、例えば、ヒトｍｉＲＮオームの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む標的ＲＮＡに全く同じように存在する配列を有する領域を有する独特のプローブをそれに付着させている、複数の独特に標識されたマイクロビーズを含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的ＲＮＡを検出するための少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素反応用のプライマーとして用いられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、増幅用のプライマーとして用いられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーとして用いられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１種の標的ＲＮＡを検出するためのプローブとして用いられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＦＲＥＴプローブである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、またはスコーピオンプローブである。
【０２００】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する少なくとも１種のＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を有する、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、少なくとも７５種、または少なくとも１００種のＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブがＰＣＲ反応中に消化されたときに、特異的標的ＲＮＡと関連する独特の蛍光放出をもたらすように、ＦＲＥＴプローブはドナー／アクセプター対で標識されている。いくつかの実施形態では、組成物が多数のＦＲＥＴプローブを含む場合、プローブがＰＣＲ反応中に消化されたときに、プローブ１つ１つが特異的なプローブ配列および／または標的ＲＮＡと関連する独特の蛍光放出をもたらすように、各々のプローブは異なるドナー／アクセプター対で標識されている。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブの配列は、標的ＲＮＡの標的領域に相補的である。他の実施形態では、ＦＲＥＴプローブは、標的ＲＮＡの最も良くアラインされた標的領域の配列と比較したとき、１以上の塩基ミスマッチを含む配列を有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドからなるＦＲＥＴプローブを含み、ここで、この配列の少なくとも一部は、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域と相補的である。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域と相補的である。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブは、配列番号１〜８６、１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、または８６３〜８９７のうちの１つの配列または相補体と比較したときに、１個、２個または３個の塩基ミスマッチを有する配列を有する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、各々６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４または８６のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、または少なくとも４０種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８または７９のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８または７９のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、または少なくとも１８種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９または８４のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、または少なくとも１８種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、または７８のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３または８５のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、または少なくとも３５種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号９、５０、５１、７０、７２または７５のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも６種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、または６４８のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、または少なくとも３０種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、または６３２のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、または少なくとも２０種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む少なくとも１種の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、その各々が、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、または８６３〜８６８のうちの別の１つに全く同じように存在するか、またはこれらのうちの１つの領域に相補的である配列を含む、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７０種の独特に標識された標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、キットは、上で論じたポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、上で論じた少なくとも１種のプライマーおよび／またはプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、熱安定性ポリメラーゼなどの少なくとも１種のポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットはｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法において用いられるキットは、１種以上の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブおよび／または標的ＲＮＡの逆転写用の１種以上のプライマーおよび／または標的ＲＮＡもしくはそれから逆転写されるｃＤＮＡの増幅用の１種以上のプライマーを含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、１種以上のプライマーおよび／またはプローブは「線状」である。「線状」プライマーは、一本鎖分子で、通常、プライマーが内部二重鎖を形成するくらい同じポリヌクレオチド内の別の領域に相補的な、例えば、少なくとも３個、４個または５個の連続するヌクレオチドの短い領域を含まない、ポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、逆転写において用いられるプライマーは、標的ＲＮＡの５’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個またはそれより多くの連続するヌクレオチドの領域に相補的な配列を有する３’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個またはそれより多くの連続するヌクレオチドの領域を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、キットは、標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを増幅するための１種以上の線状プライマー対（「フォワードプライマー」と「リバースプライマー」）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第１のプライマーは、標的ＲＮＡの５’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの領域の配列と同一の配列を有する少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの領域を含む。さらに、いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、標的ＲＮＡの３’末端の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの領域の配列に相補的な配列を有する少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの領域を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１〜８６のうちの１つに全く同じように存在する配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡおよび／または配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡを増幅するための少なくとも第１のプライマーセットを含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、キットは、その各々が、配列番号１〜８６から選択される配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な異なる標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡおよび／または配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡを増幅するためのものである、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、少なくとも７５種、または少なくとも１００種のプライマーセットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、試料中の標的ＲＮＡから逆転写される２種以上のｃＤＮＡを増幅することが可能な少なくとも１種のプライマーセットを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物において用いられるプローブおよび／またはプライマーは、デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物において用いられるプローブおよび／またはプライマーは、デオキシリボヌクレオチドおよび１以上のヌクレオチド類似体（例えば、上記のＬＮＡ類似体または他の二重鎖安定化ヌクレオチド類似体）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物において用いられるプローブおよび／またはプライマーは、全てのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、プローブおよび／またはプライマーは、相補的な領域に１以上の二重鎖安定化ヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡ類似体）を含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物はまた、プローブ、およびＲＴ−ＰＣＲの場合、標的ＲＮＡの量を標準化するのに用いられる１種以上のハウスキーピング遺伝子に特異的なプライマーを含む。このようなプローブ（およびプライマー）としては、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４４、ＲＮＵ４８、Ｕ４７、７ＳＬ  ｓｃＲＮＡ、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、およびＵ８７  ｓｃａＲＮＡから選択されるハウスキーピング遺伝子の１以上の産物に特異的なプローブが挙げられる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で用いられるキットは、逆転写反応および増幅反応で用いられる試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、酵素（例えば、逆転写酵素）と、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、逆転写および増幅で用いられるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。さらなる実施形態では、キットは、プローブおよびプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに最適化された緩衝液を含む。
【０２１８】
４．２．１．例示的なＲＮＡレベルの標準化
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ発現レベルの定量では、細胞当たりのトータルＲＮＡと試料調製時の試料損失の程度とについて推定を行なう必要がある。異なる試料間または異なる条件の下で調製された試料間の違いを補正するために、いくつかの実施形態における標的ＲＮＡの量は、少なくとも１種の内在性ハウスキーピング遺伝子の発現に対して標準化される。
【０２１９】
本明細書に記載の方法における参照遺伝子として用いるのに適当な遺伝子としては、それに関して、産物の量が、正常試料と敗血症患者由来の試料の間、または異なる細胞株間または異なる増殖条件および試料調製条件の下で変化しないものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における標準化対照として有用な内在性ハウスキーピング遺伝子としては、限定するものではないが、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４４、ＲＮＵ４８、Ｕ４７、７ＳＬ  ｓｃＲＮＡ、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、およびＵ８７  ｓｃａＲＮＡが挙げられる。典型的な実施形態では、測定されたマイクロＲＮＡの量を標準化するのに用いられる少なくとも１種の内在性ハウスキーピング遺伝子は、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４４、ＲＮＵ４８、Ｕ４７、７ＳＬ  ｓｃＲＮＡ、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、およびＵ８７  ｓｃａＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、１種のハウスキーピング遺伝子が標準化に用いられる。いくつかの実施形態では、２種以上のハウスキーピング遺伝子が標準化に用いられる。
【０２２０】
４．２．２．例示的な定量方法
いくつかの実施形態では、方法は、正常な標的ＲＮＡプロファイル（いくつかの例示的な実施形態では、対照試料の標的ＲＮＡプロファイル）と比較したときの、ヒト試料から作成された標的ＲＮＡプロファイルの量的変化を検出することを含む。発現プロファイルのいくつかの量的変化は、対象由来の試料における敗血症の存在を示すものである。「標的ＲＮＡプロファイル」という用語は、同じ試料中の複数の標的ＲＮＡの同時発現に関するデータセットを指す。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡのうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、または少なくとも４０種の標的ＲＮＡは、配列番号６、８、１１、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２３、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３８、３９、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７１、７３、７４、７６、７８、７９、８４および８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡのうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、または少なくとも１８種の標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、２３、３０、３９、５２、５７、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６７、７４、７６、７８および７９から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡのうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、または少なくとも１８種の標的ＲＮＡは、配列番号６、１７、１９、２０、２１、２７、２９、３３、３４、３５、３８、４５、４６、４７、４８、４９、６９および８４から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡのうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または少なくとも８種の標的ＲＮＡは、配列番号８、１４、５９、６２、６３、６４、７４、および７８から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡのうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、または少なくとも３５種の標的ＲＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、７、１０、１２、１６、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３７、４１、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６１、６６、６８、７７、８０、８１、８２、８３および８５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡのうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも６種の標的ＲＮＡは、配列番号９、５０、５１、７０、７２および７５から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７５種の複数の標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、または少なくとも７５種、または少なくとも１００種の複数の標的ＲＮＡは、配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、または少なくとも２５種の複数の標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、３５２、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、および６４８から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、または少なくとも２５種の複数の標的ＲＮＡは、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、２８７、５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、および６３２から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７０種の複数の標的ＲＮＡは、配列番号２２６〜２８９、５６５〜６０４、および８６３〜８６８から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、または少なくとも７５種の複数の標的ＲＮＡは、配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、その成熟形態で、３０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。
【０２２３】
標的ＲＮＡ発現プロファイルの調製に用いられる定量的発現データは、本明細書に提示された解析方法を含む、任意の好適な解析方法を用いて得られる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、例えば、同時発現データは、例えば、上記のようなマイクロアレイを用いて得られる。したがって、上記のような特異的標的ＲＮＡの定量的発現レベルアッセイに用いるのに加えて、ｍｉＲＮオームの相当な部分に相補的な配列を有するプローブを含むマイクロアレイは、標的ＲＮＡ発現パターンの解析のための、標的ＲＮＡ遺伝子発現プロファイリングを実施するために利用され得る。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、個別の標的ＲＮＡシグナチャーを敗血症の確立されたマーカーと関連付ける。いくつかの実施形態では、個別の標的ＲＮＡシグナチャーを、細菌感染によって引き起こされる敗血症（例えば、グラム陽性細菌感染によって引き起こされる敗血症、グラム陰性細菌感染によって引き起こされる敗血症またはマイコバクテリア感染によって引き起こされる敗血症）の確立されたマーカーと関連付ける。いくつかの実施形態では、個別の標的ＲＮＡシグナチャーを、ウイルス感染によって引き起こされる敗血症の確立されたマーカーと関連付ける。いくつかの実施形態では、個別の標的ＲＮＡシグナチャーを、多重感染によって（例えば、細菌とウイルスの共感染によって、または２種以上のウイルスもしくは２種以上の細菌株による共感染によって）引き起こされる敗血症の確立されたマーカーと関連付ける。いくつかの実施形態では、個別の標的ＲＮＡシグナチャーを敗血症の重症度のレベルと直接関連付ける。
【０２２６】
本発現プロファイリング法により、いくつかの実施形態では、敗血症を有することが疑われる対象由来の試料からのトータルＲＮＡを定量的に逆転写して、試料中のＲＮＡに相補的な標識オリゴヌクレオチドのセットを提供する。次に、オリゴヌクレオチドを標的ＲＮＡ特異的プローブを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は、試料中の標的ＲＮＡの発現パターンを表す試料のハイブリダイゼーションプロファイルである。ハイブリダイゼーションプロファイルは、試料から逆転写されたオリゴヌクレオチドのマイクロアレイ中の標的ＲＮＡ特異的プローブへの結合に由来するシグナルを含む。いくつかの実施形態では、プロファイルは結合の有無（シグナルとゼロシグナル）として記録される。いくつかの実施形態では、記録されるプロファイルは、各ハイブリダイゼーションに由来するシグナルの強度を含む。プロファイルは、正常、すなわち、敗血症でない試料、またはいくつかの実施形態では、対照試料から作成されるハイブリダイゼーションプロファイルと比較される。シグナルの変化は、対象における敗血症の存在を示すものである。
【０２２７】
４．３．例示的な追加の標的ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、配列番号１〜８６から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な１種以上の標的ＲＮＡの検出および／または配列番号１９６〜３９９、９５０、５６５〜７０７、および８６３〜８９７から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む１種以上の標的ＲＮＡの検出および／または配列番号１〜８６から選択される配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む１種以上の標的ＲＮＡの検出と組み合わせて、本明細書中の方法は、敗血症と関連する少なくとも１種の他のマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標準的でないヘアピンを有する敗血症関連低分子ＲＮＡの発現変化の検出をさらに含む。
【０２２９】
代わりの実施形態では、本明細書に記載の方法は、染色体共依存物（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｏｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、すなわち、一緒に調節される傾向にあるヒトゲノム中で互いに近くに密集している標的ＲＮＡの検出をさらに含む。したがって、さらなる実施形態では、本方法は、表２のプレ−マイクロＲＮＡ配列の染色体位置からわずか５０，０００ｂｐしか離れていない染色体に各々存在する１種以上の標的マイクロＲＮＡの発現の検出を含む。
【０２３０】
以下の実施例は説明目的のためであるに過ぎず、決して限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２３１】
５．実施例
５．１  実施例１：単球由来のマイクロＲＮＡ
個別のマイクロＲＮＡが、病原体模倣物（アゴニスト）による刺激に応答して、単球で過剰発現することを示すために、マイクロアレイ解析を用いた。
【０２３２】
細胞株
ヒト末梢血起源の急性単球性白血病細胞株である単球細胞株ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）からトータルＲＮＡを調製した。
【０２３３】
単球の刺激
ＴＨＰ−１細胞とプールした健康ドナー由来ヒト単球の両方を、下記の表５に示す様々なＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストで刺激した。
【表５】
0005890686.tif 000018
【０２３４】
ＴＨＰ−１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＴＨＰ−１細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにて、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００ユニット／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ培地１６４０中で、２．５×１０６／ｍＬの濃度まで増殖させた。ＣＤ１４陽性磁気マイクロビーズ陽性選択（製造元のプロトコルによる、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ヒト単球を健康ドナー（Ｓｔ  Ｇｕｙ’ｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＵＫ）の全血から単離した。次に、単離した単球をＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、６ウェルプレート中で２.５×１０６／ｍＬの濃度まで培養し、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにて培養した。
【０２３５】
ｍｉＲＮＡ発現を解析するために、細胞を上記の表５に示す刺激で８時間または２４時間処理した。濃度は、製造元の奨めおよび刊行物：Ｔａｇａｎｏｖ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，１０３（３３），ｐ．１２４８１−６に従って選択した。
【０２３６】
標準的なＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを単離した。２つのコンフルエントな７５ｃｍ２フラスコからの細胞を回収した（＝約１０７細胞）。製造元のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、トータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡ試料は全て、ＲＮアーゼ不含水に希釈し、−８０℃（−１１２°Ｆ）で保存した。
【０２３７】
ＯＤ２６０／２８０比を計算してＲＮＡの品質を評価した。アゴニストＰａｍ３ＣＳＫ４で８時間刺激した後のヒト単球細胞株ＴＨＰ−１由来のトータルＲＮＡについて得られた図１に示すエレクトロフェログラムにより例示されるように、全ＲＮＡ試料の品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００を用いて評価したとき、高かった。同様のエレクトロフェログラムは、他の細胞試料由来のトータルＲＮＡについても同様に得られた
【０２３８】
マイクロＲＮＡ精製
Ｆｌａｓｈ  ＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、マイクロＲＮＡ精製を行なった。Ａｍｂｉｏｎゲル精製プロトコルによって、マイクロＲＮＡを含む４０ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の低分子ＲＮＡが濃縮される。簡潔に述べると、Ｆｌａｓｈ  ＰＡＧＥ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒを用いてトータルＲＮＡ試料をプレキャストゲルに充填した。ゲル移動後に、４０ｎｔより小さいトータルＲＮＡ画分（「マイクロＲＮＡ画分」）を回収し、ヌクレアーゼ不含水に再懸濁した。
【０２３９】
マイクロアレイ解析
プローブ設計およびスポッティング
マイクロアレイ調製に用いられたオリゴヌクレオチドプローブは、５’−ＮＨ２−（Ｃ）６−（スペーサー）−（オリゴマープローブ配列）−３’という構成であった。５’−アミノ基は、アレイ支持体への化学的化合を可能にした。各々は、オリゴヌクレオチドプローブとアレイ支持体との非特異的な相互作用を防ぐために、下に示すような、１５ｎｔの同一のスペーサー配列を含んでいた。
【化１】
0005890686.tif 000019
表２に示すプローブ配列はリンカーを含まない。
【０２４０】
Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による標準的なプロトコルに従ってプローブを合成した。Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（Ｓｃｈｏｔｔ）マイクロアレイガラススライドをマイクロアレイ用の固体支持体として用いた。
【０２４１】
スポッティングに用いられたオリゴヌクレオチドプローブ濃度は２５μｍｏｌであった。より大きいスポットサイズ（例えば、ＳＤＳを含まない７０〜１００ミクロンと比較して１００〜１５０ミクロン）を可能にするために１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）が添加されている、Ｓｃｈｏｔｔ製のアレイガラス支持体に備わっているＮｅｘｔｅｒｉｏｎスポッティング緩衝液を用いて、プローブを２つ１組でスポッティングした。使用されたスポッターは、Ｓｔｅａｌｔｈ  ＳＭＰ３ピン（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を備えたＱＡｒｒａｙ  ｍｉｎｉ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）であった。１つのシリーズのスポットを沈着させた後、スポッティング針を６０ｍＭのＮａＯＨで５回洗浄し、その後、次のシリーズのプローブをスポッティングした。３２ブロックのスポッティングされたプローブを含み、各ブロックが２０×２０の正方形のスポッティングされたプローブとなるよう、各スライドを設計した。各プローブを２つ１組でスポッティングした。スポッティングされたガラススライドを、使用するまで４℃で保存した。
【０２４２】
マイクロＲＮＡ標識
マイクロＲＮＡ画分の標識は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＧｒｏｕｐによりＥＭＢＬ（Ｈｅｉｄｅｌｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で開発された公開プロトコル（Ｃａｓｔｏｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ｍｉＣｈｉｐ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）”，  ＲＮＡ  ２００６  Ｍａｙ；１２（５）：９１３−２０．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  １５、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をもとにした。簡潔に述べると、マイクロＲＮＡ画分を、ＲＮアーゼ不含水、８％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（０．７Ｕ／μｌ）とを含む１倍に希釈したＡｍｂｉｏｎ緩衝液中で、１０μＭの色素標識テトラヌクレオチド（５’−ｒＵｒＵｒＵｒＵ−Ｃｙ５−３’）（またはあるいは、５’−ｒＵｒＵｒＵｒＵ−Ｃｙ３−３’）（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む混合物とともに４℃で６時間インキュベートした。６５℃で１５分間混合物を加熱して標識反応を行なった。この手順により、ポリ−Ｕ色素標識テールが全てのマイクロＲＮＡの３’末端に連結された。標識された試料をハイブリダイゼーションするまで４℃で保存した。
【０２４３】
アレイハイブリダイゼーション
ディスカバリーハイブリダイゼーションステーション（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて、標識マイクロＲＮＡ画分をスポッティングしたアレイにハイブリダイズさせた。簡潔に述べると、１％ＢＳＡ、２×ＳＳＣ、および０．２％ＳＤＳの２ｍＬの混合物をチップとともに４２℃で３０分間インキュベートした。次に、チップをＥＺ  Ｐｒｅｐ緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて１回洗浄した後、Ｒｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）でさらに３回洗浄した。次に、２０μｌの標識マイクロＲＮＡ混合物と１８０μｌのＣｈｉｐＨｙｂｅ試薬（Ｖｅｎｔａｎａ）をアレイに添加した。アレイを３７℃で６分間加熱した後、４２℃で８時間インキュベートし、その後、加熱を停止した。チップをＲｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）で１回洗浄した後、３７℃で２分間加熱した。チップをＣｈｅａｐＣｌｅａｎ（Ｖｅｎｔａｎａ）を１滴添加したＲｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）で再び洗浄し、３７℃で２分間インキュベートした。チップをＲｉｂｏｗａｓｈ（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いてさらに２回洗浄した。チップを乾燥させて一晩保存した。翌日、ディスカバリーハイブリダイゼーションステーションについてのＶｅｎｔａｎａの取扱説明書に従って最後の洗浄を行なった。スライドを２×ＳＳＣ＋０．２×ＳＤＳ緩衝液で２回洗浄した後、０．１×ＳＳＣでもう１回洗浄した。全てのスライドを室温でＡｒｒａｙｉｔ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）製の高速遠心分離器を用いて乾燥させ、スキャンするまで暗所で保存した。
【０２４４】
ＣｈｉｐＨｙｂｅ試薬溶液（溶液１）に代わるものとして、以下の溶液をアレイハイブリダイゼーションに用いて（溶液２）、最終的な成分濃度が３Ｍ  ＴＭＡＣ、０．１０％サルコシル、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、および４ｍＭ  ＥＤＴＡとなるように、試料１部（ｖ：ｖ）に対して２部の１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液を混合し、アレイ上にて４２℃で８時間インキュベートすることにより、プローブ：標的ＲＮＡハイブリッドを形成させてもよい。
【表６】
0005890686.tif 000020
＊ＴＭＡＣは、テトラメチルアンモニウムクロリドである。
【０２４５】
アレイ画像取得
Ａｘｏｎ（商標）スキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）とそのＧｅｎｅｐｉｘ（商標）ソフトウェアを用いて、アレイをスキャンした。１６ビット／ピクセル（１６００＊１６００）の画像色深度で規定されるｔｉｆフォーマットで画像をフォーマット化した。このような設定では、ピクセルは、０〜６５，５３５の強度値を取ることができる。最大強度値を示すピクセルは「飽和して」おり  、これには６５，５３５の値が割り当てられた。アッセイスキャンの解像度は、１０μｍ／ピクセルに設定された。異なる蛍光色素（例えば、Ｃｙ５とＣｙ３）を用いるハイブリダイゼーション実験の場合、強度がより高いスポットに光電子倍増管（ＰＭＴ）を合わせた（Ｃｙ３は、Ｃｙ５よりも低いＰＭＴ設定でスキャンされる）。
【０２４６】
アレイ画像解析
レーザースキャナーのＰＭＴによって、スライドの各々の所与の「ポイント」について、捕捉された蛍光強度をデジタル化し、数値をそのポイントに対応するピクセルとして保存した。その後、このようなピクセルから構成される写真を解析した。
【０２４７】
画像解析の最初の作業は、セグメンテーションと呼ばれるプロセスを用いて、スポット位置を検出することであった。調整可能なまたは固定された半径の円でスポットをセグメント化した。正確にセグメント化および定量するために、スポット直径は、５〜６ピクセルよりも大きいものである必要があった。セグメンテーションの前に、インデックスグリッドを準備して、適切なスポット位置を提供した。セグメンテーション自体により、グリッド円付近のスポットの境界が検出された。簡潔に述べると、Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアによって、アレイ上の各スポットに円が割り当てられる（セグメンテーション）。スポットが完全に長方形のグリッド上にあることはほとんどないので、スポッティングの不完全性および／または支持体の歪みのために、セグメンテーションは、いくぶん柔軟に行なわれる必要があった。
【０２４８】
ソフトウェアによるセグメンテーションの後、アレイ上の全てのスポットが明確に同定されるまで、円は手作業で修正され、スポット上に合わせられた。この段階で、アレイが、本当のスポットとバックグラウンドとの区別を妨げる高バックグラウンドノイズを示す場合、アレイをさらに解析することは認めなかった。
【０２４９】
画像解析の第二の作業は、スポットを定量化し、データを結果ファイルにエクスポートすることであった。ひとたびスポットを画像上に位置付ければ、これは比較的簡単でかつ明確な作業であった。スポット強度を定量化するのに最もよく用いられる統計的手法は、スポットに属するピクセルの平均値と中央値であった。中央値の手法は、外れ値のピクセルが存在する場合は、平均値よりも頑健であった。しかしながら、実際には、平均値または中央値を用いて得られる結果にほとんど差はなかった。
【０２５０】
アレイデータ解析
アレイデータは全て、Ｒバイオコンダクターパッケージ（“Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００４；５（１０）：Ｒ８０．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｓｅｐ  １５、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて解析した。
【０２５１】
アレイデータについては、内部対照のスポット強度と比較することにより、まず品質を試験した（表７および８）。１つの内部対照（配列番号１７８）を標識対照として用い（この合成ＲＮＡは標識前に精製マイクロＲＮＡ画分に添加される）、７つの他の内部対照（配列番号１７９〜１８５）をデータの標準化に用いた（これらの合成ＲＮＡ対照は、ハイブリダイゼーション前に、各々５２０ｆｍｏｌ／アレイでトータルＲＮＡ画分に添加された）。
【表７】
0005890686.tif 000021
【表８】
0005890686.tif 000022
【０２５２】
スポットの強度が平均局所バックグラウンド強度＋その標準偏差の１.５倍よりも大きい全ての配列を発現マイクロＲＮＡとして分類した。アレイ強度データをさらなる解析に妥当であるとみなすためには、以下の基準を満たす必要があった。
１．ハイブリダイゼーション対照の特異性は、許容基準の範囲内でなければならなかった（例えば、ＣＴＬ２６とその対応する１塩基突然変異体のＣＴＬ２６＿ＭＵＴ、またはＣＴＬ１３とその対応する１塩基突然変異体のＣＴＬ１３＿ＭＵＴ）。
２．陽性対照の複製物のシグナル強度の近似等価性
３．各ブロックの陽性対照に基づくブロックシグナル強度中央値間の近似等価性
４．検出された全ての配列に基づくアレイシグナル中央値間の近似等価性
５．精製および標識対照（ＣＴＬ３０）のシグナル強度
【０２５３】
Ｌｏｇ２比が、２つ１組のスポットの平均強度シグナル／ブロックの全陽性対照の中央強度と等しい場合、Ｌｏｇ２比を計算してデータの統計的標準化を行なった。アレイの全ブロックの不均一な標識を避けるために、ブロック毎に標準化を行なった。このブロック毎の標準化は、スライドの全体的な標準化を用いるよりも効果的であることが示されている。得られた値はＬｏｇ２値である。
【０２５４】
各オリゴヌクレオチドプローブのスポットの強度を、ＴＨＰ−１細胞株由来の試料中で正常ヒト単球と比較し、各マイクロＲＮＡの相対発現を評価した。
【０２５５】
発現変化倍数は、２（Ｌｏｇ２比）に対応する。Ｌｏｇ２比は、比較された２つの条件の比、すなわち、ｌｏｇ２（Ｘ細胞株／Ｘ正常）であり、これは、（ｌｏｇ２Ｘ細胞株−ｌｏｇ２Ｘ正常）と同じであり、ここで、Ｘは測定された強度値である。「正常」条件からのシグナルがない場合、実験において最も低く測定された強度値をベースラインとして用い、それから変化倍数発現値を求めた。ゼロ未満の変化倍数値は、（１／変化倍数）倍の下方調節に相当する。
【０２５６】
データを表２に示す。このデータには、１以上のＴＬＲアゴニストによる刺激に応答して単球で過剰発現した全てのマイクロＲＮＡが含まれる。
【０２５７】
５．２ 実施例２：Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームでの刺激された単球由来のマイクロＲＮＡの解析
Ｌｕｍｉｎｅｘ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）は、プローブ標識ビーズの液相ハイブリダイゼーションと、それに続く様々な比の蛍光色素を含むビーズのフローサイトメトリー検出に基づくものである。最大１００の異なる色素比を含むビーズが利用可能であり、これにより、単一の試料を最大１００個の分析物について同時に調べることができる。
【０２５８】
単球試料
ＣＤ１４陽性磁気マイクロビーズ陽性選択（製造元のプロトコルによる、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ヒト単球を健康ドナーの全血から単離した。次に、単離した単球をＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにて６ウェルプレート中で２.５×１０６／ｍＬの濃度まで培養した。
【０２５９】
単球の刺激
ｍｉＲＮＡ発現を解析するために、細胞を上記の表５（実施例１）に示す刺激で８時間または２４時間処理した。
【０２６０】
単球試料からのトータルＲＮＡの単離
単球の刺激に使用された各々のアゴニストについて、２つのコンフルエントな７５ｃｍ２フラスコからの細胞を回収した（＝約１０７細胞）。製造元のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、トータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡ試料は全て、ＲＮアーゼ不含水に希釈し、−８０℃（−１１２°Ｆ）で保存した。
【０２６１】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズへのプローブの結合
各々の５’−アミノ−修飾プローブ（５’アミノＣ６−プローブ配列、すなわち、実施例１の構造に似ているが、リンカー配列を含まない構造を有する）のアリコートを、分子生物学的等級の水に０．１ｎｍｏｌ／μＬの濃度で調製する。製造元のプロトコル（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ結合プロトコル）に従ってカルボジイミド化学反応を用いて、プローブをビーズに結合させる。プローブ結合ビーズを４℃で保存する。
【０２６２】
Ｌｕｍｉｎｅｘ解析用のトータルＲＮＡ調製
８ｆｍｏｌｅの各々７種の内部対照（アレイ対照に用いられるのと同じ合成ＲＮＡ）を患者試料から単離されたトータルＲＮＡ画分に添加する。各試料について、３つの複製物を並行してアッセイする。各複製物について、２５０ｎｇのトータルＲＮＡを用いる。単一のＲＮＡ分子の環状化をもたらすデンドリマーの形成、または別のＲＮＡ分子への連結を防ぐために、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズとのハイブリダイゼーションの前に、トータルＲＮＡ調製物をウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理する。ＣＩＰによる前処理は製造元のプロトコルに従い、これによって、５’−リン酸基が除去される。
【０２６３】
ビーズ標識およびハイブリダイゼーション
ＣＩＰ処理の後、ＶａｎｔａｇｅマイクロＲＮＡ標識キット（Ｍａｒｌｉｇｅｎ）を用いて、トータルＲＮＡ画分をビオチンで標識する。Ｍａｒｌｉｇｅｎプロトコルを用いて、標識画分をＬｕｍｉｎｅｘビーズにハイブリダイズさせる。簡潔に述べると、ポリヌクレオチドビーズをＭａｒｌｉｇｅｎ  ハイブリダイゼーション溶液（１．５×ＴＭＡＣ）および標識トータルＲＮＡと混合する。ハイブリダイゼーションは、暗所にて６０℃で１時間行なわれる。ハイブリダイゼーション後、Ｌｕｍｉｎｅｘ標準６×ＳＳＰＥＴ洗浄緩衝液（リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）を用いて、ビーズを洗浄する。
【０２６４】
ビーズハイブリダイゼーションの検出
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズの検出は、ストレプトアビジンフィコエリスリン（ＳＡＰＥ）（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて行なわれる。Ｌｕｍｉｎｅｘプロトコルに従って、ＳＡＰＥを洗浄したビーズに添加する。良好な解像度を得るためにゲインの高い設定でＬｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ−２００機器を用いて、ビーズを読み取る。
【０２６５】
データ取得および解析
Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ−２００によって、反応混合物中の各色素比の少なくとも２５種のビーズが読み取られる。各色素比のビーズは、特定のプローブ配列に対応し、強度値は、読み取られた全てのビーズの平均値として戻される。合成ＲＮＡ対照を用いてまたはあるいは発現オリゴヌクレオチドの平均を用いて平均蛍光強度（ＭＦＩ）データを標準化し、Ｂｉｏｐｌｅｘソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびＲバイオコンダクターパッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００４；５（１０）：Ｒ８０．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｓｅｐ  １５）を用いて、正常試料と刺激された試料または罹患試料の間の変化倍数を計算する。
【０２６６】
表９には、ビーズとのハイブリダイゼーションの前にトータルＲＮＡに添加することができる例示的な内部対照ＲＮＡが記載されている。表１０には、対照ビーズに結合している対応するプローブ配列が示されている。
【表９】
0005890686.tif 000023
【表１０】
0005890686.tif 000024
【０２６７】
解析
結合したビーズの強度が５０ＭＦＩよりも高い全ての配列を発現マイクロＲＮＡと分類する。結合したビーズの強度をさらなる解析に妥当であるとみなすためには、以下の基準を満たす必要がある。
１．陽性対照の複製物のシグナル強度の近似等価性
２．各ウェルの陽性対照に基づくウェルシグナル強度中央値間の近似等価性
３．検出された全配列に基づくウェルシグナル中央値間の近似等価性
【０２６８】
Ｌｏｇ２比が、同じビーズ（各々同じオリゴ配列に結合したもの）の５０個の複製物の平均強度シグナルを１ウェル中の全陽性対照の中央強度で割ったものと等しい場合、Ｌｏｇ２比を計算してデータの統計的標準化を行なった。プレートの全ウェルの不均一な標識を避けるために、ウェル毎に標準化を行なった。このウェル毎の標準化は、プレートの全体的な標準化を用いるよりも効果的であることが示されている。得られた値はＬｏｇ２値である。
【０２６９】
各結合したビーズのビーズの強度を、細胞を活性化しないＰＭＩ培地で増殖させた健康ドナー由来の単球から得た試料中で、インビトロで刺激した単球（ＴＬＲアゴニストで刺激したかまたは細胞を活性化するＰＭＡ培地で増殖させたもの）と比較し、各マイクロＲＮＡの相対発現を評価した。
【０２７０】
発現変化倍数は、２（Ｌｏｇ２比）に対応する。Ｌｏｇ２比は、比較された２つの条件の比、すなわち、ｌｏｇ２（Ｘ細胞株／Ｘ正常）であり、これは、（ｌｏｇ２Ｘ細胞株−ｌｏｇ２Ｘ正常）と同じであり、ここで、Ｘは測定された強度値である。「正常」条件からのシグナルがない場合、実験において最も低く測定された強度値をベースラインとして用い、それから発現変化倍数値を求めた。ゼロ未満の変化倍数値は、（１／変化倍数）倍の下方調節に相当する。上方調節または下方調節のいずれかの２つの変化倍数を有意とみなす。
【０２７１】
５．３  実施例３：マイクロＲＮＡを同定するためのバイオインフォマティック解析
例えば、表２に示したプローブを用いて検出されるマイクロＲＮＡを同定するために、プローブ配列を用いて低分子ＲＮＡシークエンシング（ｓｍＲＮＡＳｅｑ）データセットを解析し、これらの配列により検出される発現マイクロＲＮＡを同定した。この解析により、１１個の群に対応する正確な末端を有する１１個の配列が同定された。これら１１個の候補マイクロＲＮＡ配列を表１１に示す。
【表１１】
0005890686.tif 000025
【０２７２】
５.４  実施例５：敗血症と関連するマイクロＲＮＡを同定するためのシークエンシング解析
敗血症患者由来のトータルＲＮＡをｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットの調製に用いた。簡潔に述べると、５μｇのトータルＲＮＡを、製造元により提供された標準的なライブラリー／シークエンシングプロトコルを用いたＳｏｌｅｘａ  ＧＡ  ＩＩ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での低分子ＲＮＡシークエンシングに用いた。
【０２７３】
次に、マイクロＲＮＡが敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットに現われる回数を、同じマイクロＲＮＡが７７個の非敗血症患者ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットに現われる回数と比較した。敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットが、特定のマイクロＲＮＡについて１番多いカウント数を含むとき、１位という順位を割り当てた。敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットが、特定のマイクロＲＮＡについて２番目に多いカウント数を含むとき、２位という順位を割り当てた。以下、このように順位を割り当てた。１位から５位までの順位の候補を全て保持した。１６５個の異なる群に相当する合計１７５個の候補マイクロＲＮＡ配列を、各配列に割り当てられた順位とともに、表１２に示す。マイクロＲＮＡが多数のアイソｍｉｒを有する場合、全てのアイソｍｉｒの全てのカウントの合計を比較に用いた。さらに、特定のマイクロＲＮＡ配列の前駆体遺伝子がゲノム中の多数の位置で存在するとき、同じ順位および同じ配列で、両方の候補名を示す。これらの候補のどちらかまたは両方は、敗血症患者試料中で増加したレベルで存在し得る。
【表１２】
0005890686.tif 000026
0005890686.tif 000027
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0005890686.tif 000030
【０２７４】
表１２に記載されたマイクロＲＮＡの予測されるマイクロＲＮＡ前駆体配列を表１３に示す。
【表１３】
0005890686.tif 000031
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【０２７５】
７７個の非敗血症患者ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットと比較したときに敗血症患者試料においてレベルが増加しているｍｉＲＢａｓｅ（ヒトバージョン１４．０）中のマイクロＲＮＡを同定するために、同様の解析を行なった。この場合もやはり、敗血症患者ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットが、特定のマイクロＲＮＡについて１番多いカウント数を含むかどうか、２番目に多いカウント数を含むかどうか、などよって、マイクロＲＮＡに１位〜５位の順位を付けた。結果を表１４に示す。
【表１４】
0005890686.tif 000044
0005890686.tif 000045
0005890686.tif 000046
0005890686.tif 000047
【０２７６】
表１４に記載のマイクロＲＮＡについてのマイクロＲＮＡ前駆体配列を表１５に示す。
【表１５】
0005890686.tif 000048
0005890686.tif 000049
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0005890686.tif 000060
【０２７７】
最後に、同様の解析により、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおいて増加したレベルで存在するｍｉＲＢａｓｅ（ヒトバージョン１４．０）中の新規のスターフォームのマイクロＲＮＡが同定された。前駆体と成熟マイクロＲＮＡはｍｉＲＢａｓｅにあるが、この解析で同定された新規のスターフォームはｍｉＲＢａｓｅにない。この場合もやはり、敗血症患者ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットが、１番カウント数の多い特定のマイクロＲＮＡを含むかどうか、２番目にカウント数の多い特定のマイクロＲＮＡを含むかどうか、などによって、マイクロＲＮＡに１位〜５位の順位を付けた。結果を表１６に示す。
【表１６】
0005890686.tif 000061
【０２７８】
表１６に記載のマイクロＲＮＡについてのマイクロＲＮＡ前駆体配列を表１７に示す。
【表１７】
0005890686.tif 000062
0005890686.tif 000063
0005890686.tif 000064
【０２７９】
５．６ 実施例６：ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットからのマイクロＲＮＡカウント比の解析
表１８は、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおけるカウント数と各々の新規マイクロＲＮＡについての全ての他のｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットの平均カウント数の比であって、その比が２以上のものを示す。
【表１８】
0005890686.tif 000065
0005890686.tif 000066
【０２８０】
マイクロＲＮＡ  １３４４６−Ｒ、１３６４２−Ｒ、１３６６１−Ｒ、１３６７７−Ｌ、１３６９４−Ｌ、１３７１９−Ｌ、１３７２９−Ｌ、１４０８６−Ｌ、１４０９３−Ｌ、１４１１１−Ｌ、１４１１３−Ｌ、１４１７７−Ｌ、１４３７１−Ｒ、１４４８２−Ｒ、６４１５−Ｒ、１３６４０−Ｌ、１４０８５−Ｌ、および１４５５６−Ｒ（それぞれ、配列番号２３１、２３６、２３７、２４２、２４５、２５３、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６９、２７５、２８７、３０３、３４２、および３５２）は、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおけるカウントが他のデータセットにおける平均カウントよりも少なくとも５倍大きかった。これらのうち、マイクロＲＮＡ  １３４４６−Ｒ、１３６４２−Ｒ、１３６７７−Ｌ、１４０８６−Ｌ、１４０９３−Ｌ、１４１７７−Ｌ、および６４１５−Ｒ（それぞれ、配列番号２３１、２３６、２４２、２６０、２６１、２６６、および２８７）は、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおけるカウントが他のデータセットにおける平均カウントよりも少なくとも１０倍大きかった。
【０２８１】
表１９は、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおけるカウント数とｍｉＲＢａｓｅ由来の各マイクロＲＮＡについての全ての他のｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットから得られる平均カウント数の比であって、その比が２以上のものを示す。
【表１９】
0005890686.tif 000067
【０２８２】
マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４４＊、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５３７、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１＊、ｍｉＲ−１８５＊、ｍｉＲ−２１１５＊、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２３＊、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−６１８、ｍｉＲ−６２７、ｍｉＲ−１４８ａ＊、ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２＊、ｍｉＲ−４２５＊、ｍｉＲ−４５４＊、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、および  ｍｉＲ−５９８（それぞれ、配列番号５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８８、５９１、５９８、６０１、６０８、６１２、６１３、６２４、６２６、６２９、６３２、６３５、６３７、６４１、６４２、６４４、および６４８）は、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおけるカウントが他のデータセットにおける平均カウントよりも少なくとも５倍大きかった。これらのうち、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４４＊、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２３＊、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−６１８、ｍｉＲ−６２７、ｍｉＲ−１４８ａ＊、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、およびｍｉＲ−１７＊（それぞれ、配列番号５６６、５６７、５６８、５７１、５７０、５７４、５８０、５８１、５８８、５９８、６０１、６０８、６２４、６２６、６２９、および６３２）は、敗血症ｓｍＲＮＡＳｅｑデータセットにおけるカウントが他のデータセットにおける平均カウントよりも少なくとも１０倍大きかった。
【０２８３】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、あたかも全ての目的のために参照により組み込まれることが個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８４】
様々な具体的実施形態が説明され、記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、変更を行なうことができることが理解されよう。
【図１】
0005890686.tif 000068