(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＧＡポリペプチドを測定するためのサンドイッチイムノアッセイ法であって、
試料を、ＣＧＡポリペプチドの存在または量を測定するために、少なくとも２つのモノクローナル抗体に反応させることを含み、
第１のモノクローナル抗体が、ヒトＣＧＡのアミノ酸配列のアミノ酸配列２３６〜２５１によって表されるＣＧＡポリペプチド（配列番号２によって表される）のエピトープに反応し、第２のモノクローナル抗体が、ヒトＣＧＡのアミノ酸配列のアミノ酸配列２６４〜２７９によって表されるＣＧＡポリペプチド（配列番号３によって表される）のエピトープに反応することを特徴とするサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項２】
（１）ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２３６〜２５１によって表されるポリペプチド（配列番号２で表される）のエピトープに反応するモノクローナル抗体、および（２）ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２６４〜２７９によって表されるポリペプチド（配列番号３で表される）のエピトープに反応するモノクローナル抗体からなる群から選択されることを特徴とする、ＣＧＡポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体を含む免疫試薬であって、前記モノクローナル抗体が、
ａ）マイクロタイタープレートの壁などの固体支持体、または
ｂ）酵素、放射性元素もしくは化合物などの検出可能な標識、または
ｃ）ビオチンもしくはストレプトアビジンなどの特異的結合試薬のいずれかに結合することを特徴とする免疫試薬。
【請求項４】
ＣＧＡポリペプチドを検出するためのサンドイッチイムノアッセイキットであって、少なくとも、
ａ）ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２３６〜２５１によって表されるポリペプチド（配列番号２で表される）のエピトープに反応するモノクローナル抗体と、
ｂ）ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２６４〜２７９によって表されるポリペプチド（配列番号３で表される）のエピトープに反応するモノクローナル抗体とを含むことを特徴とするサンドイッチイムノアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）の測定のための方法に関する。さらに本発明は、ＣＧＡに対するモノクローナル抗体と、それに基づく免疫試薬であって、本発明に係る測定法において用いることができる免疫試薬と、ＣＧＡを測定するための方法において用いるための試験キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロモグラニン（ＣＧ’ｓ）およびセクレトグラニンは、脳内および散在性神経内分泌系に存在する、神経伝達物質およびペプチドホルモンと共に蓄えられる酸性タンパク質ファミリーを構成する(Winkler, H. & Fischer-Colbrie, R., 1992)。これらのタンパク質は、異なる遺伝子の産物であるが、それらは酸性アミノ酸残基の豊富さ、および翻訳後切断の潜在的位置としての塩基性アミノ酸の数対などのいくつかの全体的な構造特性を共有する。ＣＧ’ｓは、全身の神経内分泌細胞において、神経ペプチドおよびホルモンと共に蓄えられ、共放出される。ホルモン顆粒およびホルモンパッケージの産生におけるＣＧ’ｓの機能が示唆される。また、ＣＧ’ｓは、ホルモン放出の抑制、血管拡張および抗微生物効果などの生物学的活性を示す、より小さな断片に切断されてもよい（Stridsberg M、2000）。
【０００３】
通常、神経内分泌由来の腫瘍は、ＣＧＡの血中／血漿濃度の増加を示す(O ’Connor, DT, Deftos LJ, 1986)。神経内分泌腫瘍は、神経内分泌細胞に由来し、典型的な神経内分泌腫瘍は、カルチノイド腫瘍、褐色細胞腫、神経芽腫、小細胞肺癌、副甲状腺腺腫、下垂体腫瘍および膵島腫瘍であり、ＭＥＮ１およびＭＥＮ２症候群を含む。これは、異なる神経内分泌腫瘍症候群、すなわちガストリン産生腫瘍、インスリン分泌性膵島細胞腫、グルカゴン産生腫瘍、ソマトスタチン産生腫瘍、膵ポリペプチド（ＰＰ）産生腫瘍（ＰＰｏｍａｓ）、および非機能性内分泌腫瘍も含む(Eriksson, B. et al., 2000)。これらの腫瘍において、ＣＧＡが最高の血中マーカであることが示された(Bajetta, E. et al., 1999)。
【０００４】
このような理由から、ＣＧＡの定性的および定量的測定のための、特異的、正確かつ迅速な測定法を有することが望ましい。
【０００５】
ＣＧＡのためのいくつかの測定方法が報告された。ＵＳ４，７５８，５２２は、標識ＣＧＡとＣＧＡに対する抗体とを用いる競合測定法に基づいて、試料中のヒトＣＧＡを測定する方法に関する。抗体に結合した、または結合していない標識ＣＧＡの量は、試料中のＣＧＡの尺度として測定される。ＣＧＡ試料は、内分泌または副腎由来の組織から得られてもよい。
【０００６】
ＥＰ１０７８２６６Ｂ１は、ヒトＣＧＡの配列１４５〜２３４のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体の使用に基づくＣＧＡ免疫測定法に関する。より具体的には、それは、ＣＧＡのための免疫測定法において、ヒトＣＧＡの配列１４５〜１９７のエピトープに特異的に結合する抗体、および／またはヒトＣＧＡの配列２１９〜２３４のエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。必要に応じて、これら２つの抗体は、ＣＧＡの測定法において、ヒトＣＧＡの配列２５０〜３０１のエピトープに特異的に結合する抗体に組み合わせることができる。
【０００７】
当技術分野で公知の方法の欠点は、主に、天然ＣＧＡに隣接して一般的に存在するＣＧＡ由来ペプチドとの交差反応によって、偽陽性または偽陰性の結果が得られることである。特に、ポリクローナル抗体を用いる測定法は、そのような欠点に悩まされる。この問題を克服するために、モノクローナル抗体を用いることが示唆されたが、実際には、従来技術に記載されたようなモノクローナル抗体に基づくＣＧＡ測定法は、ポリクローナル抗体に基づく測定法よりもさらに劣るものである。
【０００８】
本発明は、これらの欠点を克服または改善する方法に関する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明に係る免疫測定法は、２つの新規で異なる抗体に特異的に結合するという事実に基づいて、ＣＧＡポリペプチドを検出する。１つの抗体は、ＣＧＡポリペプチドのエピトープの１つに特異的に結合し、他方の抗体は、ＣＧＡポリペプチドの別のエピトープに結合する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、ＣＧＡポリペプチドを測定するための方法であって、試料を、ＣＧＡポリペプチドの存在または量を測定するためにモノクローナル抗体のセットに反応させることを含み、少なくとも１つのモノクローナル抗体が、ヒトＣＧＡのアミノ酸配列のアミノ酸配列２３６〜２５１によって表わされるＣＧＡポリペプチド（配列番号２によって表わされる）のエピトープに反応し、少なくとも１つの他のモノクローナル抗体が、ヒトＣＧＡのアミノ酸配列のアミノ酸配列２６４〜２７９によって表わされるＣＧＡポリペプチド（配列番号３によって表わされる）のエピトープに反応する方法に関する。
【００１１】
本明細書において、ヒトＣＧＡのアミノ酸配列は、１９８７年にKoneckiらによって報告された４３９アミノ酸長の配列を意味し、配列番号１によって表わされる。用語ＣＧＡポリペプチドは、上述の疾患の診断に有用である、ヒトＣＧＡの全長ポリペプチド配列またはその断片を表すことを意味する。好ましくは、そのような断片は、配列番号１および配列番号２に含まれるアミノ酸配列に反応するモノクローナル抗体に反応するエピトープを少なくとも含むべきである。
【００１２】
本発明に係る免疫測定法は、様々な形態をとることができる。好ましくは、免疫測定法は、ＣＧＡタンパク質が２つの異なる抗体の間に挟まれるサンドイッチ形態に基づくものである。ＣＧＡに対する抗体の特異的結合の検出に適した形態は、たとえば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫測定法（ＲＩＡ）である。また、他の検出方法が好適に用いられてもよい。
【００１３】
他の実施形態によれば、本発明は、ＣＧＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２３６〜２５１によって表されるポリペプチドのエピトープに反応するモノクローナル抗体に関する。
【００１４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、ＣＧＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２６４〜２７９によって表されるポリペプチドのエピトープに反応するモノクローナル抗体に関する。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明に係る方法に用いるための試験キットに関する。そのような試験キットは、少なくとも２つのモノクローナル抗体に基づく免疫試薬を含み、１つはヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２３６〜２５１によって表わされるポリペプチドのエピトープに反応し、他方は、ヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸２６４〜２７９によって表わされるポリペプチドのエピトープに反応する。
【００１６】
各抗体は、捕捉抗体として、または検出抗体として用いられてもよい。試験キットに含まれる免疫試薬は、測定方法および形態によって異なる。
【００１７】
一実施形態では、抗体の少なくとも１つは、直接的または間接的に、酵素または放射性マーカなどの標識に結合してもよい。
【００１８】
さらなる実施形態では、抗体の少なくとも１つは、マイクロタイタープレートなどの好適な固相に結合してもよい。
【００１９】
さらなる実施形態では、抗体の少なくとも１つは、（お互いに結合することができることが知られている）ビオチンまたはストレプトアビジンなどの普遍的連結剤に結合してもよい。そのような連結剤は、測定法の工程の前またはその間に、固相または標識へ、抗体を間接的に結合させるために利用することができる。
【００２０】
ＣＧＡの特定されたエピトープの１つに対するモノクローナル抗体を産生する細胞は、たとえば１９７５年にKoelerおよびMilsteinによって記載された方法によって得ることができる。
【００２１】
さらに本発明は、それぞれヒトＣＧＡアミノ酸配列のアミノ酸配列２３６〜２５１および２６４〜２７９によって表わされるポリペプチドのエピトープに反応するモノクローナル抗体に関する。
【００２２】
結論として、本発明は、ポリクローナル抗体を採用する測定法の欠点を回避すると同時に、モノクローナル抗体を採用する従来技術の方法と比較して向上した特異性および感度を有する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＣＧＡの検量線。
【図２】商用試験（Dako）と本発明に係る試験との比較。
【図３】第２商用試験（CIS-BIO）と本発明に係る試験との比較。
【図４】NEOLISAで分析された、１０７人の神経内分泌患者の血漿と１２０人の献血者の血漿とに由来する血漿。参照領域＜３．０（赤線）。
【実施例】
【００２４】
材料
ＣＧＡのペプチド２３６〜２５１に対するモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイターストリップ（１２×８）。
希釈液中にヒトＣＧＡを含む検量用試料。Ｃａｌ１＝０ｎｍｏｌ／Ｌ（希釈液）、Ｃａｌ２＝１ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｃａｌ３＝５ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｃａｌ４＝１５ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｃａｌ５＝３０ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｃａｌ６＝５０ｎｍｏｌ／Ｌ。
凍結乾燥ローコントロール（Ｌ）。
凍結乾燥ハイコントロール（Ｈ）。
３０ｍＬの希釈液（Ｄｉｌ）。
ＣＧＡのペプチド２６４〜２７９に対する、ＨＲＰ標識抗体を含むコンジュゲート１５０μＬ。１００倍に濃縮した。
１５ｍＬのコンジュゲートバッファ
１５ｍＬのＴＭＢ基質
１５ｍＬの停止液（０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）。
３５ｍＬの洗浄液、２０倍に濃縮した。
クロモグラニンＡのＥＬＩＳＡ法
【００２５】
手順
全ての溶液を室温で使用した。インキュベーションを室温（２０〜３０℃）で行った。
試料の希釈およびインキュベーション
【００２６】
全ての試料を、試験プレートに移す前に、別の希釈プレートで５倍希釈した。検量用試料と、ローコントロールと、ハイコントロールと、患者の血漿とを、使用前に全て５０μＬの血漿＋２００μＬの希釈剤で希釈した。その後、その１００μＬを試験プレートへ２重に移す前に、上下にピペッティングして十分に混合した。試験プレートを６０分間インキュベートした。
試料のインキュベート後
【００２７】
試験プレートは、ウェル毎に３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、各回についてウェルを満たし、空にした。最後の洗浄後、吸収紙上でストリップを軽くたたいてウェルを空にした。
コンジュゲートの添加
１００μＬのコンジュゲートを各ウェルに添加した。
試験プレートを３０分間インキュベートした。
コンジュゲートのインキュベート後
試験プレートを、上述のように洗浄した。
基質溶液を添加した。
１００μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、試験プレートを１５分間、暗所でインキュベートした。
停止液の添加
１００μＬの停止液を各ウェルに添加した。ＯＤ（光学密度）を、マイクロプレートリーダで２時間以内に４５０ｎｍで読み取った。６２０ｎｍのＯＤを基準波長として読み取った。
実施例１
モノクローナル抗体
【００２８】
ヒトＣＧＡの、それぞれアミノ酸配列２３６〜２５１（さらに抗体２Ｅ８として本明細書に示される）およびアミノ酸配列２６４〜２７９（さらに抗体１Ｈ６として本明細書に示される）によって表わされるポリペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体は、基本的に１９７５年のKoelerおよびMilsteinの方法によって調製された。
【００２９】
抗体２Ｅ８は、捕捉抗体としてＥＬＩＳＡ法に用いられ、抗体１Ｈ６は、ＨＲＰに結合する検出用抗体として用いられる。
実施例２
ＣＧＡの酵素結合免疫測定法における検量線
６つの検量用試料のセットは、それぞれ検量用試料１について０ｎｍｏｌ／Ｌ、検量用試料２について１ｎｍｏｌ／Ｌ、検量用試料３について５ｎｍｏｌ／Ｌ、検量用試料４について１５ｎｍｏｌ／Ｌ、検量用試料５について３０ｎｍｏｌ／Ｌ、検量用試料６について５０ｎｍｏｌ／Ｌの値となるように準備される。
キット内の検量用試料は、ＣＧＡに対応する合成ペプチドである。ペプチドの検量用試料は、精製されたＣＧＡの天然断片に等しい反応をもたらすように設定される（Stridsberg, M et al. 1993, Stridsberg et al. 1995）。
【００３０】
検量線は、６つの検量用試料のｎｍｏｌ／Ｌの値に対するＯＤをプロットすることによって描かれる。
【００３１】
検量用試料の測定結果は、表１および図１に示される。
【００３２】
【表１】
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実施例３
【００３３】
実施例１に係る試験系と、市販の試験キット（Dako）との間の相関関係
この比較のために、患者試料は、本発明の実施例１に係る試験系において試験され、続いてＤａｋｏ（Dako Denmark A/S; Produktionsvej 42; DK-2600 Glostrup; Denmark）から商業的に得られたクロモグラニンＡ  ＥＬＩＳＡキット（コードＫ００２５）に用いられた。後者の試験キットは、広く用いられており、簡略化された２重ポリクローナル抗体サンドイッチ法に基づき、試料と、ペロキシダーゼ共役抗クロモグラニンＡとを、抗クロモグラニンＡで被覆されたマイクロウェルにおいて同時にインキュベートした。この試験キットにおける全ての抗体は、ウサギポリクローナル抗体であると報告されている。Ｄａｋｏ試験キットは、製造メーカの使用説明書に従って用いられた。この測定法において、ＯＤを４５０ｎｍと、６５０ｎｍとで読み取った。
【００３４】
この比較の結果は、図２に示される。本明細書において、Ｘ軸での値は、本発明に係る試験キット（ED NeoLisa）からｎｍｏｌ／ｌで得られるデータであり、Ｙ軸の値は、Ｄａｋｏ試験キット（DAKO）から得られるＵ／Ｉで得られるデータである。
【００３５】
本発明に係る試験キットとＤａｋｏのＥＬＩＳＡとの間の相関関係は、良好であると結論付けることができる。相関係数：０，９４２。
実施例４
【００３６】
実施例１に係る試験システムと、第２商用試験キット（CIS-BIO）との間の相関関係
この比較のために、患者試料の一群は、本発明の実施例１に係る試験系において試験され、続いてＣＩＳ  ＢＩＯから商業的に得られたＣＩＳ−ＢＩＯ  クロモグラニンＡ  ＥＬＩＳＡキット（Chromo@; Prod. no.: CGA-ELISA）に用いられた。後者の試験キットは、ＥＰ１０７８２６６Ｂ１に記載された試験キットに対応する。それは、サンドイッチ法に基づき、前記捕捉抗体は、ヒトクロモグラニン配列のアミノ酸配列１４５〜１９７のエピトープに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体であり、前記検出抗体は、ヒトクロモグラニン配列のアミノ酸配列２１９〜２３４のエピトープに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体である。ＣＩＳ−ＢＩＯ試験キットは、製造メーカの使用説明書に従って用いた。
【００３７】
この比較の結果は、図３に示される。本明細書において、Ｘ軸での値は、ｎｇ／ｌでＣＩＳ−ＢＩＯ試験キット（CIS-BIO）から得られるデータであり、Ｙ軸の値は、ｎｍｏｌ／ｌで本発明に係る試験キット（ED NeoLisa）から得られるデータである。
【００３８】
我々のNEOLISAと、CisBio CgA ELISAとの間の相関関係は、乏しいものであった。相関係数：０，４５１。
実施例５
【００３９】
臨床的感度
臨床特性を有する、全部で１０７検体のヘパリン血漿試料を、１２０人の献血者の血漿試料に続いて測定した。表２および図４に結果を要約する。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
参考文献
1.  Bajetta, E., Ferrari, L., Martinetti, A., Celio, L., Procopio, G., Artale, S., Zilembo, N., Di Bartolomeo, M., Seregni, E. and Bombardieri, E. Chromogranin A, neuron specific enolase, carcinoembryonic antigen, and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours. Cancer1999, 86:858-865. 
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3.  Koehler and Milstein. Nature 1975, 256:495.
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8.  Stridsberg, M. Measurements of chromogranins and chromogranin-related peptides by immunological methods. Advanced Experimental and Medical Biology2000, 482:319-327.
9.  Winkler, H. and Fischer-Colbrie, R. The chromogranin A and B: The first 25 years and future perspectives. Neuroscience 1992, 49:497-528.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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