(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項２】
前記神経幹細胞は、脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項３】
前記神経細胞抽出物は、１５〜２５％（ｖ／ｖ）の濃度で含まれることを特徴とする請求項１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項４】
前記神経幹細胞抽出物は、毛乳頭細胞で成長因子、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）及びＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の発現を促進させることを特徴とする請求項１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項５】
前記成長因子は、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、インショリン様成長因子(ＩＧＦ)、肝細胞成長因子(ＨＧＦ)、及びケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)からなる群で選択される一つ以上を含むことを特徴とする請求項４に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項６】
前記神経幹細胞抽出物は、毛乳頭細胞でＴＧＦ−β１またはＩＬ−６の発現を抑制するることを特徴とする請求項１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項７】
前記神経幹細胞抽出物は、毛嚢内幹細胞を活性化させることを特徴とする請求項１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項８】
前記幹細胞の活性化は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはＢＭＰ６の発現抑制及びＴｍｅｆｆ１またはＴＧＦ−２の発現増加を介して行われることを特徴とする請求項７に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項９】
前記組成物は、薬学組成物であることを特徴とする請求項１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれかに記載の組成物を有効性分として含有する脱毛治療剤。
【請求項１１】
（ａ）神経幹細胞を培養する工程及び（ｂ）前記神経幹細胞培養液から神経幹細胞抽出物を分離する工程を含む、発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）の神経幹細胞は、脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）は、Ｎ−２添加剤、ヘパリン、繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が含まれたヒト神経球培養培地（ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）で１０〜１４日間培養後、不滅化して得た細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｅｉｆｉｅｅ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｅｉｕｍ）、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地で培養することを特徴とする請求項１１に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物及びこれの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、外胚葉由来神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物の新しい用途に関し、ヒト脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を培養して製造された神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を発毛促進または脱毛防止用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
髪の毛は、一定の毛周期（Ｈａｉｒ  ｃｙｃｌｅ）を持って、毛乳頭周囲にある毛母細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が分裂増殖する期間を成長期といい、毛髪の成長が止まって毛乳頭から分離する時期である退化期を経て毛母細胞が成長せずにいた後、一定期間後抜ける休止期を経る。毛周期は、このような成長期、退化期、休止期、及び成長期の過程を繰り返すことになる。通常成人の毛髪成長期は、個人差はあるが、一般に男性が３〜５年、女性が４〜６年であり、毛髪の約１５％が退化期と休止期であるといわれている。ヒトの毛髪は、各々独立した成長周期を持って、一方では抜けて、他方では生えて全体的に同じ毛髪数を維持して、これを生理的自然脱毛という。しかし、正常な成長周期の休止期の他にも、疾病、ヘアー製品（ジェル、ワックスなど）、ストレスなどで脱毛現象が発生したりもするが、このような場合は、原因が除去されると再び回復する。
【０００３】
ハゲは髪の毛が抜けて生えないのではなく次第に細くなって細い毛になることであり、進行されながら毛根に存在する毛乳頭が小さくなる。毛乳頭が小さくなれば、髪の毛の太さも細くなると同時に毛周期も短くなって、新しく生えてきた毛はさらに細くなる。ハゲが進行し続けると、髪の毛は細い毛に変わり、毛周期はさらに短くなって少し育った後抜ける。また、自己免疫疾患で発生するといわれている円形脱毛症と内分泌疾患、栄養不足、薬、出産など、身体的、精神的ストレス後発生する一時的な脱毛とは異なり、よく知っているハゲは遺伝する傾向があって、頭がはげる程度も様々であり、体内血中男性ホルモン（アンドロゲン、ａｎｄｒｏｇｅｎ）と関係があると知られている。
【０００４】
現在脱毛初期には局所塗布剤であるミノキシジルと経口用薬剤であるプロペシア（ｆｉｎａｓｔｅｒｏｉｄ成分）を使えば、それ以上の進行はある程度遅らせることができると知られているが、すでに進行された脱毛に対しては正常に回復するのに困難があり、このような場合は、毛髪移植を検討することができる。毛髪移植は、ホルモンの感受性が少なくて、脱毛の影響が少ない耳の上側部分の横髪と後頭部の毛髪を平均１０００〜３０００毛前後で切開法（または、非切開法）を利用して採取して、これを移植する方法があるが、これも回数に制限がある。
【０００５】
現在市販されている製品は、脱毛防止効果は知られているが、発毛と関連しては僅かな効果を示す。また、使用時中断すると、再び問題が生じて、コストの側面でも負担になる。
【０００６】
最近遺伝子を利用した脱毛治療方法及び幹細胞を利用した脱毛治療方法が開発されている。本発明の背景になる技術として、大韓民国登録特許第１０−０７７１１７１号（２００７年１０月２９日）には、毛嚢幹細胞を分離、増殖して、毛嚢細胞に分化させる方法及びハゲ治療用組成物について記載されていて、大韓民国公開特許第１０−２００８−００９７５９３号（２００８年１１月０６日）には、脂肪組織由来幹細胞及び毛嚢細胞を適切に混合して組成された細胞治療剤に対して記載されている。また、大韓民国登録特許第１０−１２１８１０１号（２０１３年０１月０３日）には、羊水内胎児由来中間葉幹細胞の培養液を有効性分として含む発毛促進または脱毛防止用組成物に関して記載されている。しかし、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を利用した優秀な効果の発毛促進または脱毛防止用組成物に対しては知られていない。
【０００７】
そこで、本発明者等は、ヒトの毛乳頭細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ；ｈＤＰＣｓ）に神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を適用して、その特徴を解明して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣ５７ＢＬ／６マウスを利用して発毛促進または脱毛防止効果を確認することによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０７７１１７１号（２００７年１０月２９日）
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２００８−００９７５９３号（２００８年１１月０６日）
【特許文献３】大韓民国登録特許第１０−１２１８１０１号（２０１３年０１月０３日）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物を提供するところにある。
本発明の他の目的は、神経幹細胞を利用した発毛促進または脱毛防止用組成物を製造する方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的及びメリットは、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物の全体タンパク質含有量をＢｒａｄ−ｆｏｒｄ  ａｓｓａｙを介して確認した結果である。
【図２Ａ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時細胞毒性及び細胞形態をＷＳＴ−１分析及び位相差顕微鏡で確認した結果である。
【図２Ｂ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時細胞毒性及び細胞形態をＷＳＴ−１分析及び位相差顕微鏡で確認した結果である。
【図３】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時毛乳頭細胞の増殖をＷＳＴ−１分析で確認した結果である。
【図４Ａ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時  様々な成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ）及びサイトカイン（Ｗｎｔ５ａ、ＢＭＰ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２等）発現が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図４Ｂ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時  様々な成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ）及びサイトカイン（Ｗｎｔ５ａ、ＢＭＰ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２等）発現が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図４Ｃ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時  様々な成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ）及びサイトカイン（Ｗｎｔ５ａ、ＢＭＰ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２等）発現が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図４Ｄ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時  様々な成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ）及びサイトカイン（Ｗｎｔ５ａ、ＢＭＰ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２等）発現が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図４Ｅ】本発明による神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞に処理時  様々な成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ）及びサイトカイン（Ｗｎｔ５ａ、ＢＭＰ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２等）発現が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図５Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物によって毛髪の成長期を誘導するレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）とサイトカインであるＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の発現量が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である
【図５Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物によって毛髪の成長期を誘導するレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）とサイトカインであるＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の発現量が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である
【図６Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物によって毛髪の退化期を誘導するＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｔａ  １）の発現とＩＬ−６の発現が阻害されることをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図６Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物によって毛髪の退化期を誘導するＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｔａ  １）の発現とＩＬ−６の発現が阻害されることをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した図面である。
【図７Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに一定期間塗布時発毛が促進されることを確認した写真である。
【図７Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに一定期間塗布時発毛が促進されることを確認した写真である。
【図８Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに一定期間塗布後発毛が促進されることを毛の長さ及び重量で確認した図及びグラフである。
【図８Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに一定期間塗布後発毛が促進されることを毛の長さ及び重量で確認した図及びグラフである。
【図８Ｃ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに一定期間塗布後発毛が促進されることを毛の長さ及び重量で確認した図及びグラフである。
【図９Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を塗布後毛穴の成長が誘導されたことをＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）を介して確認した結果である。
【図９Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を塗布後毛穴の成長が誘導されたことをＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）を介して確認した結果である。
【図１０Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後細胞の成長が増加したことを組織免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を介して確認した結果である。
【図１０Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後細胞の成長が増加したことを組織免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を介して確認した結果である。
【図１１】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後組織内で毛乳頭細胞のマーカーであるＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ（Ａｋｐ）の発現量が増加することをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１２】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後組織毛穴内幹細胞の分化を抑制するＢＭＰ  ｆａｍｉｌｙの発現量が減少することをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１３Ａ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後組織毛穴内幹細胞の分化を抑制するＢＭＰの発現を抑制するＴｍｅｆｆ１の増加及び前記Ｔｍｅｆｆ１の発現を増加させるＴＧＦβ−２の増加をｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１３Ｂ】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後組織毛穴内幹細胞の分化を抑制するＢＭＰの発現を抑制するＴｍｅｆｆ１の増加及び前記Ｔｍｅｆｆ１の発現を増加させるＴＧＦβ−２の増加をｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１４】本発明による神経幹細胞の培養液及び神経幹細胞抽出物を、毛を除去したマウスに塗布後組織毛穴内ＢＭＰｓの減少による幹細胞（ＣＤ３４＋）の分化程度を組織免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を介して確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一観点において、本発明は、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物に関する。
【００１２】
本発明で、前記組成物を製造するための神経幹細胞は、その種類に制限されない。好ましくは胎児から由来した成体幹細胞であり、本発明の具体的な実施例では胎児脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞を利用して神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を製造した。
【００１３】
本発明で「神経幹細胞培養液」とは、外胚葉幹細胞の一種である神経幹細胞を継代培養して収得した培地内に含まれた構成成分を含む物質で、「神経幹細胞抽出物」とは、外胚葉幹細胞の一種である神経幹細胞を継代培養して神経幹細胞培養液を収得して遠心分離して上澄み液をろ過して、この時分離した沈殿物をホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｚｅｒ）で均質化して製造された混合物を遠心分離して得た上澄み液で収得した細胞内に含まれた構成成分を含む物質である（実施例１参照）。
【００１４】
本発明で神経細胞抽出物は、細胞毒性を示さない範囲の有効濃度で１０〜３０％（ｖ／ｖ）で含まれて、好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）であり、最も好ましくは２０％（ｖ／ｖ）で含まれる。
【００１５】
本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物が発毛促進機能を活性化させるかを確認するために、神経幹細胞培養液（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）及び抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ；Ｅｘｔ.）から得た全体タンパク質をＢｒａｄ−ｆｏｒｄ  ａｓｓａｙを介して確認した（図１）。
【００１６】
本発明の神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞（Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ）に３日間処理後、細胞毒性をＷＳＴ−１分析で、細胞形態を位相差顕微鏡を介して確認した（図２Ａ〜図２Ｂ）。
【００１７】
本発明の神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を毛乳頭細胞（Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ）に処理後、２４時間単位で最大７２時間毛乳頭細胞の増殖をＷＳＴ−１分析を介して確認した（図３）。
【００１８】
本発明の神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物は、細胞内の様々な成長因子及びサイトカインを含んで発毛促進機能を行って、好ましくは発毛促進を決める毛乳頭細胞（Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ）で毛髪成長に関与する様々な成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）分泌を誘導することを確認した（図４Ａ〜図４Ｅ）。前記毛髪成長因子は、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、インショリン様成長因子(ＩＧＦ)、肝細胞成長因子(ＨＧＦ)、及びケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)からなる群で選択される一つ以上を含む。
【００１９】
本発明の神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物は、細胞内の様々な成長因子及びサイトカインを含んで発毛促進機能を行って、好ましくは発毛促進を決める毛髪の成長期を誘導するサイトカインであるＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の発現を促進させることを確認した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【００２０】
本発明の神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物は、対照群とは異なり毛髪の退化期を誘導するＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｔａ  １）の発現を阻害させることを確認した（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００２１】
本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物が発毛促進機能を活性化させるかを確認するために、毛を除去したＣ５７ＢＬ／６マウスの背中に神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を種々の濃度で処理した。その結果、対照群（Ｍｏｃｋ）とは異なって、神経幹細胞培養液（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）処理群及び神経幹細胞抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ；Ｅｘｔ.）処理群で発毛の増加が誘導されることを確認した（図７Ａ及び図７Ｂ）。
【００２２】
神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物処理群で対照群とは異なり毛髪の成長期が誘導されて、全般的な発毛の長さと発毛の量も増加することを確認した（図８Ａ〜図８Ｃ）。
【００２３】
神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物処理群で対照群とは異なり同じ時間の間活性化する毛穴の数が多くなるのを確認した（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【００２４】
対照群と神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物処理群で細胞増殖を示すマーカーであるＫｉ−６７を確認した結果、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を塗布した群で細胞増殖が活性化して、細胞死滅も起きないことを確認した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。
【００２５】
また、対照群と神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物処理群で組織内で毛乳頭細胞のマーカーであるａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ａｋｐ）ｍＲＮＡ発現量の増加を確認した（図１１）。
【００２６】
対照群と神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物処理群で毛穴内幹細胞（ｂｕｌｇｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）の分化を抑制して毛髪成長を抑制する物質として知られるＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ｆａｍｉｌｙの発現量を確認した結果、対照群（Ｍｏｃｋ）及び神経幹細胞培養液（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）処理群とは異なり神経幹細胞抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ；Ｅｘｔ.）処理群で発現量が減少することを確認した（図１２）。
【００２７】
対照群と神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物処理群でＢＭＰｓ発現を抑制するＴｍｅｆｆ１及びＴｍｅｆｆ１を増加させるＴＧＦβ−２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｔａ  ２）のｍＲＮＡ発現量を確認した結果、神経幹細胞抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ；Ｅｘｔ.）処理群でＴｍｅｆｆ１及びＴＧＦβ−２の発現量が増加することを確認した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
【００２８】
対照群と神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物処理群でＢＭＰｓの発現減少による幹細胞（ＣＤ３４＋）の分化程度を確認した結果、神経幹細胞抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ；Ｅｘｔ.）処理群で毛嚢内幹細胞が活性化することを確認した（図１４）。
【００２９】
本発明の神経幹細胞培養のための培地は、当業界に知られた基本培地を制限なしに用いることができる。基本培地は人為的に合成して製造することができ、商業的に製造された培地を用いることもできる。商業的に製造される培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ａ−ＭＥＭ（ａ−Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ'ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）及びＩｓｏｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられるが、これらに限定さず、ＤＭＥＭ培地であってもよい。
【００３０】
前記基本培地には０.０１〜１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むことが好ましく、本発明の具体的な実施例では、ＤＭＥＭ培地に１０％  ＦＢＳが添加された培地で培養された神経幹細胞を利用して毛髪成長効果を測定した。
【００３１】
本発明において、「発毛促進または脱毛防止用組成物」とは、前記神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を含む組成物として、その剤形はいずれの形態でも可能である。このような剤形の例として、前記発毛促進または脱毛防止用組成物を利用して製造された形態は、溶液、ゲル、クリーム類、ローション類、パウダー、化粧水類、ファンデーション類及び個体化した石鹸類などであってもよい。本発明の目的を達成するために、このような剤形のうちいずれの形態でも製造されて商用化できるが、前記例に限定されない。本発明の発毛促進または脱毛防止用組成物に含まれる成分は、有効成分以外に発毛促進または脱毛防止用組成物に通常利用される成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、そして担体を含んでもよい。
【００３２】
さらに、本発明は、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用薬学組成物を提供することができる。
【００３３】
本発明の薬学組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるもので、ラクトース、テクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるのではない。本発明の薬学組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。適する薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００３４】
本発明の薬学組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性といった要因によって多様であるが、通常の熟練した医師は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一方、本発明の薬学組成物の投与量は、これに限定されないが、１日当たり０.０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよい。
【００３５】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口で投与できて、非経口で投与される場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の薬学組成物は、適用される疾患の種類によって投与経路が決定されることが好ましい。例えば、本発明の薬学組成物は、発毛促進または脱毛の予防及び治療に用いられるので、皮膚に局所的に適用される方式で投与されることが好ましい。
【００３６】
本発明の薬学組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体及び／または、賦形剤を利用して製剤化することによって、単位容量形態で製造されるか、または多用量容器内に内含させて製造されることができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態やエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「発毛促進」または「脱毛防止」とは、当業界で利用される他の用語養毛または育毛促進を含む意味である。
【００３８】
本発明の組成物が適用されることができる部位は、頭皮だけでなく発毛を必要とする身体部位であればどこにも適用することができる。例えば、外傷による傷跡で毛髪または毛が損傷した部位または単に美容効果を目的とする広い額またはＭ型額、まつげまたは眉毛及び無毛症の状態好転にも用いることができる。
【００３９】
他の観点において、本発明は、（ａ）神経幹細胞を培養する工程及び（ｂ）前記神経幹細胞培養液から神経幹細胞抽出物を分離する工程を含む、発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法に関する。
【００４０】
前記組成物の製造は、通常用いられるいずれの方法でも製造でき、神経幹細胞抽出物を分離する過程は、本発明の方法に限定されず当業界で通常実行される方法で実施可能である。例えば、培養中の神経幹細胞をトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）で処理して継代培養して、神経幹細胞培養液を収得して遠心分離して上澄み液をろ過し、この時、沈殿物細胞をホモジナイザーで均質化した後、遠心分離して上澄み液を収得して神経幹細胞抽出物を製造することができる。前記神経幹細胞抽出物である上澄み液には細胞内に含まれた構成成分が含まれている。神経幹細胞抽出物分離工程で既存の抽出物製造技術を利用して、当業者が容易に神経幹細胞抽出物の濃度を調節できるのは自明である。
【００４１】
これに限定されるのではないか、好ましくは、前記工程（ａ）の神経幹細胞は、脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞を不滅化させて得た細胞である。これに限定されるのではないか、前記工程（ａ）で神経幹細胞は、０.０１〜１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含む培地で培養する。本発明の具体的な実施例では、胎児脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を利用して、これを不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌ）させて細胞を得た。前記不滅化は、細胞培養条件下で動物細胞が半永久的な増殖活性を取得して死滅することなく増殖し続けるようになる状態をいって、本発明の属する技術分野で公示された技術を利用して不滅化させることができる。前記不滅化された細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、及び１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが含まれた非誘導性培地に培養して非接着性細胞は除去した。前記過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を継代培養する過程で培養液を収得して、これを遠心分離して上澄み液をろ過して、神経幹細胞抽出物は、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）過程で得た細胞を均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｚｉｚａｔｉｏｎ）を介して収得した。
上述した通り、本発明に係る外胚葉由来神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物は、発毛を促進したり脱毛を予防乃至治療できる医薬（外）品開発の原料として有用に使用できる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４３】
実施例１:神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物生産
胎児脳の脳室領域（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌ）させて細胞を得た。具体的には、１４週の胎児神経細胞組織（ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ）を０.１％  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅと０.１％  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ溶液を３７℃で１時間処理して０.０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  ２−３分処理して、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓで分離した後、ｍａｒｋｅｒｓ（ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−）を利用してＦＡＣＳで分離した。これをＮ−２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、０.２ｍｇ／ｍｌ  ｈｌｅａｒｉｎ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｅｅｉｅｌｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、そして１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦが添加されたヒト神経球培養培地（ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）に培養した。
【００４４】
１０〜１４日経過後、形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓにｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを処理してｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓで分離してレトロウイルス媒介体（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）を利用してｖ−ｍｙｃ遺伝子を形質導入（ｔｒａｎｓｅｕｃｔｉｏｎ）して選別（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）過程で得た細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、及び１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが含まれた非誘導性培地に培養した（Ｅｎｇｒａｆｔａｂｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｅｌｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｕｅｓ,ｒｅｐｌａｃｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ,ａｎｄ  ｅｓｐｒｅｓｓ  ｆｏｒｅｖｅｌ  ｇｅｎｅｓ.,Ｆｌａｘ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,ｖｏｌ.１６,１９９８；Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｃｏｎｔｉｏｎｅｅ  ｍｅｅｉａ  ｉｎ  ｉｎ  ｖａｘｒｏ  ｍｏｅｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ.,Ｌｉｍ  Ｈ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ.,Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３５,ｐｐ１７５−１８０,２００８）。
【００４５】
１５０ｍｍ培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈｅｓ）に前記細胞を５Ｘ１０５を分株して、培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｅｉｕｍ）１５ｍｌ添加後、３７℃、５％  ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒで８０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ時に培養液を収得した。この時、培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが含まれた非誘導性培地であり、培養後非接着性細胞は除去した。前記過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を継代培養する過程で培養液を収得して、これを遠心分離して上澄み液をろ過して、神経幹細胞抽出物は、ＰＢＳで二回洗浄した後、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）過程で得た細胞を３次蒸溜水１００ｍｌを入れて、ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で６０００ＲＰＭで５分間均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｚｉｚａｔｉｏｎ）して、これを遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）して上澄み液を収得した。
【００４６】
実施例２:神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物の全体タンパク質量
９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にタンパク質量が１０〜１００μｇになるべく試料を入れて、全体積を１００ｕｌに合わせた。この時Ｂｌａｎｋとしては、１００μｌの蒸溜水だけ入れた。以後、染色剤であるクマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）を入れてマイクロプレーリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を利用して５９５ｎｍで測定した。
その結果、図１に示された通り、神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物の全体タンパク質含有量が高く測定された。
【００４７】
実施例３:神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物の細胞毒性及び細胞増殖測定
９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にウェル（ｗｅｌｌ）当たり１Ｘ１０３個の細胞を接種して、その翌日神経幹細胞培養液と神経幹細胞抽出物を各々０％〜１００％（培養液だけ該当する）ずつ１００μｌに合わせて処理した。２４時間単位で、ａｓｓａｙ（ＷＳＴ−１）物質をウェル（ｗｅｌｌ）当たり１０μｌずつ添加して、インキュベーターで反応させた。以後、マイクロプレーリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を利用して４４０ｎｍで測定した。
その結果、図２Ａ及び図３に示された通り、神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物の細胞毒性及び細胞増殖が測定された。
【００４８】
実施例４:定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）を介した毛髪成長因子及びサイトカインの発現量確認
この実験のために毛乳頭細胞を２４−ウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にウェル（ｗｅｌｌ）当たり１.５Ｘ１０４個の細胞を接種して、その翌日神経幹細胞培養液と神経幹細胞抽出物を各々０％〜１００％（培養液だけ該当する）ずつ処理した。７２時間処理後、リン酸化緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄して、トリゾル試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）を利用して全体ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を得た後、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を利用してｃＤＮＡを合成してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、図３Ａ〜図６Ｂに示された通り、神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物処理群で毛髪成長に関与するＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ成長因子または毛髪の成長期を誘導するＳｈｈの発現量が高く現れ、また、退化期を誘導するＴＧＦ−β１は少なく発現することが示された。
【００４９】
実施例５:神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を塗布したＣ５７ＢＬ／６Ｊ皮膚組織での毛髪成長促進効果確認
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｍｉｃｅ）を２４±２℃で７日間順応過程を経た後、背中（ｂａｃｋ）の毛を除去して、１日１回本発明による神経幹細胞培養液（１００％、ｖ／ｖ）と神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）を１ｍｌ処理した。対照群としては、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大１６日後マウスの毛髪成長促進効果を確認した。
その結果、図７Ａ及び図７Ｂに示された通り、神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）及び神経幹細胞培養液が対照群に比べて毛髪成長促進効果があることが示された。
【００５０】
実施例６:神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物を塗布したＣ５７ＢＬ／６Ｊ皮膚組織での毛髪成長促進効果分析
１．毛の長さ及び重量分析
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｍｉｃｅ）を２４±２℃で７日間順応過程を経た後、背中（ｂａｃｋ）の毛を除去して、１日１回本発明による神経幹細胞培養液（１００％、ｖ／ｖ）と神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）を１ｍｌ処理した。対照群としては、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大１６日後マウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させて、毛髪成長促進効果のために毛の長さと重量を確認した。
その結果、図８Ａ〜図８Ｃに示された通り、発毛時期及び長さ、重量面で神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）処理群で毛髪成長促進効果があって、特に神経幹細胞抽出物処理群で効果が大きいことを確認した。
【００５１】
２．組織Ｈ＆Ｅ染色
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｍｉｃｅ）を２４±２℃で７日間順応過程を経た後、背中（ｂａｃｋ）の毛を除去して、１日１回本発明による神経幹細胞培養液（１００％）と神経幹細胞抽出物（２０％）を１ｍｌ処理した。対照群としては、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大１６日後マウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させて、毛髪成長促進効果のために毛穴の数を確認した。
その結果、図９Ａ〜図９Ｂに示された通り、発毛時期及び毛穴の数で神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）処理群で毛髪成長促進効果があって、特に神経幹細胞抽出物処理群で効果が大きいことを確認した。
【００５２】
３．細胞成長マーカー分析
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｍｉｃｅ）を２４±２℃で７日間順応過程を経た後、背中（ｂａｃｋ）の毛を除去して、１日１回本発明による神経幹細胞培養液（１００％、ｖ／ｖ）と神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）を１ｍｌ処理した。対照群としては、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大１６日後マウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させて、その皮膚組織を４％ホルムアルデヒドに固定して、組織のパラフィン製作後、３ｕｍ厚さで切断した組織をスライドに付けてパラフィン除去及び再水和過程（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅ  ａｎｄ  ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）を実施した。その後、抗体回収（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）と、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を処理して正常ロバ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ）をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を経て１次抗体を１:２５０で２４時間処理した。以後、２次抗体を利用して１時間処理してＤＡＰＩ染色を５分間進めた。ベクタシールドマウンティング（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）剤を利用してスライドに固定させた後、共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で結果を確認した。
その結果、図１０Ａ及び図１０Ｂに示された通り、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）で細胞成長を示すマーカーであるＫｉ−６７が増加することを確認した。
【００５３】
４．組織内遺伝子発現分析
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｍｉｃｅ）を２４±２℃で７日間順応過程を経た後、背中（ｂａｃｋ）の毛を除去して、１日１回本発明による神経幹細胞培養液（１００％、ｖ／ｖ）と神経幹細胞抽出物（２０％、ｖ／ｖ）を１ｍｌ処理した。対照群としては、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大１６日後マウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させて、その皮膚組織をトリゾル試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）を利用して全体ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を得た後に、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を利用してｃＤＮＡを合成してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、図１１及び図１４に示された通り、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物（２０％）で毛乳頭細胞マーカーであるａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ増加及び毛穴内増加したＴｍｅｆｆ１及びＴＧＦβ−２を介して幹細胞の分化を抑制するＢＭＰｓ発現が減少させて、幹細胞（ＣＤ３４＋）が活性化したことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明に係る外胚葉由来神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物は、様々の成長因子及びサイトカインを含んで発毛促進効果が優れることが確認された。特に、本発明による組成物は多様な毛髪成長に関連した成長因子及びＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）を調節することによって、より根本的に発毛促進効果を示す。
【００５５】
本発明による神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物、または、ここで分離した特定因子等を発毛促進関連医薬外品等の原料として使用できて、本発明は発毛促進、脱毛防止及びハゲ治療関連分野で非常に有用である。
【００５６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図２Ｂ】
0006002352.tif 000002
【図４Ｅ】
0006002352.tif 000003
【図７Ｂ】
0006002352.tif 000004
【図８Ｂ】
0006002352.tif 000005
【図９Ａ】
0006002352.tif 000006
【図１０Ａ】
0006002352.tif 000007
【図１４】
0006002352.tif 000008
【図１】
0006002352.tif 000009
【図２Ａ】
0006002352.tif 000010
【図３】
0006002352.tif 000011
【図４Ａ】
0006002352.tif 000012
【図４Ｂ】
0006002352.tif 000013
【図４Ｃ】
0006002352.tif 000014
【図４Ｄ】
0006002352.tif 000015
【図５Ａ】
0006002352.tif 000016
【図５Ｂ】
0006002352.tif 000017
【図６Ａ】
0006002352.tif 000018
【図６Ｂ】
0006002352.tif 000019
【図７Ａ】
0006002352.tif 000020
【図８Ａ】
0006002352.tif 000021
【図８Ｃ】
0006002352.tif 000022
【図９Ｂ】
0006002352.tif 000023
【図１０Ｂ】
0006002352.tif 000024
【図１１】
0006002352.tif 000025
【図１２】
0006002352.tif 000026
【図１３Ａ】
0006002352.tif 000027
【図１３Ｂ】
0006002352.tif 000028