(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症状を緩和する、または腫瘍性障害の進行を阻害するための製薬組成物であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）の治療的有効量を含み、環境影響因子が哺乳動物の癌性細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察されたレベルに向かって、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発するものであり、環境影響因子がコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）ではなく、以下の（a）〜（g）：
（a）バニリン酸、
（b）アセチルグリシン、
（c）４−ヒドロキシベンゾエートとベンゾキノンとの組み合わせ、
（d）酢酸フェニルとベンゾキノンとの組み合わせ、
（e）Ｌ−フェニルアラニンとベンゾキノンとの組み合わせ、
（f）Ｌ−フェニルアラニンとファルネシルとの組み合わせ、
（g）４−ヒドロキシベンゾエートとファルネシルとの組み合わせ、
からなる群より選択されるＣｏＱ１０のビルディングブロックである、製薬組成物。
【請求項２】
環境影響因子が哺乳動物の非癌性細胞において、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項４】
哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項５】
腫瘍性障害がコエンザイムＱ１０による処置に応答性または感受性である、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項６】
環境影響因子が癌性細胞中でアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項７】
環境影響因子が癌性細胞中で血管新生を阻害する、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項８】
環境影響因子が癌性細胞中の微小環境内で免疫関連要素の調節を誘導する、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項９】
環境影響因子が癌性細胞中で細胞周期制御の変化を誘導する、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項１０】
環境影響因子が：
（ａ）Ｂｃｌ−２発現を阻害するおよび／もしくはカスパーゼ−３発現を増進する；ならびに／または
（ｂ）細胞増殖を阻害する、
請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項１１】
環境影響因子がグルコースの嫌気的使用を下方調節して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節する、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍性障害が白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項１３】
追加の治療剤とともに投与されるか、または処置レジメンと同時に使用される、請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍性障害の処置を必要とする哺乳動物の癌性細胞において、グルコースの嫌気的使用（解糖）を選択的に遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を増強するための製薬組成物であって、少なくとも１つの環境影響因子の治療的有効量を含み、環境影響因子が前記哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用を選択的に遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を正常な生理学的条件下で哺乳動物の正常細胞において観察されるレベルに向かって増強するものであり、環境影響因子がコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）ではなく、以下の（a）〜（g）：
（a）バニリン酸、
（b）アセチルグリシン、
（c）４−ヒドロキシベンゾエートとベンゾキノンとの組み合わせ、
（d）酢酸フェニルとベンゾキノンとの組み合わせ、
（e）Ｌ−フェニルアラニンとベンゾキノンとの組み合わせ、
（f）Ｌ−フェニルアラニンとファルネシルとの組み合わせ、
（g）４−ヒドロキシベンゾエートとファルネシルとの組み合わせ、
からなる群より選択されるＣｏＱ１０のビルディングブロックである、製薬組成物。
【請求項１５】
環境影響因子がさらに、
（１）正の倍率変化を有する表２〜４および６〜２８に示す遺伝子から成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を上方調節し；ならびに／または
（２）負の倍率変化を有する表２〜４および６〜２８に示す遺伝子から成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を下方調節する、請求項１４に記載の製薬組成物。
【請求項１６】
環境影響因子が、ＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体１、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩから成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現をさらに調節する、請求項１４に記載の製薬組成物。
【請求項１７】
腫瘍性障害が白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１８】
追加の治療剤とともに投与されるか、または処置レジメンと同時に使用される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１９】
哺乳動物のＣｏＱ１０反応性障害を処置する、ＣｏＱ１０反応性障害の症状を緩和する、またはＣｏＱ１０反応性障害の進行を阻害するための製薬組成物であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）の治療的有効量を含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルに向かって、細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発するものであり、ＣｏＱ１０反応性障害が腫瘍性障害であり、環境影響因子がコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）ではなく、以下の（a）〜（g）：
（a）バニリン酸、
（b）アセチルグリシン、
（c）４−ヒドロキシベンゾエートとベンゾキノンとの組み合わせ、
（d）酢酸フェニルとベンゾキノンとの組み合わせ、
（e）Ｌ−フェニルアラニンとベンゾキノンとの組み合わせ、
（f）Ｌ−フェニルアラニンとファルネシルとの組み合わせ、
（g）４−ヒドロキシベンゾエートとファルネシルとの組み合わせ、
からなる群より選択されるＣｏＱ１０のビルディングブロックである、製薬組成物。
【請求項２０】
環境影響因子がさらに、
（１）正の倍率変化を有する表２〜４および６〜２８に示す遺伝子から成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を上方調節し；ならびに／または
（２）負の倍率変化を有する表２〜４および６〜２８に示す遺伝子から成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を下方調節する、請求項１または１９に記載の製薬組成物。
【請求項２１】
環境影響因子が、ＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体１、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩから成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現をさらに調節する、請求項１または１９に記載の製薬組成物。
【請求項２２】
腫瘍性障害が白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される、請求項１９に記載の製薬組成物。
【請求項２３】
追加の治療剤とともに投与されるか、または処置レジメンと同時に使用される、請求項１９に記載の製薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍性障害が、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、骨癌、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、および黒色腫からなる群より選択される、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項２５】
腫瘍性障害が侵襲性腫瘍性障害である、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項２６】
侵襲性腫瘍性障害が、膵臓癌腫、肝細胞癌腫、ユーイング肉腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、脳腫瘍、神経内分泌癌、結腸癌、肺癌、骨肉腫、アンドロゲン非依存性前立腺癌、卵巣癌、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項２５に記載の製薬組成物。
【請求項２７】
腫瘍性障害が非侵襲性腫瘍性障害である、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項２８】
非侵襲性腫瘍性障害が、非転移性乳癌、アンドロゲン依存性前立腺癌、小細胞肺癌、および急性リンパ球性白血病からなる群より選択される、請求項２７に記載の製薬組成物。
【請求項２９】
注射または輸液により投与される、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項３０】
静脈内注射、静脈内輸液、および腹腔内注射からなる群より選択される経路で投与される、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項３１】
局所投与される、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項３２】
追加の薬剤とともに投与される、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項３３】
追加の薬剤が化学治療剤である、請求項３２に記載の製薬組成物。
【請求項３４】
化学治療剤が、シクロホスファミド、タキサン、ブスルファン、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メルファラン、クラドリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、クロランブシル、タモキシフェン、カンプトテシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、エトポシド、ポドフィロトキシン、および５−フルオロウラシルからなる群より選択される、請求項３３に記載の製薬組成物。
【請求項３５】
タキサンがパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項３４に記載の製薬組成物。
【請求項３６】
追加の薬剤が、ホルモン、抗体、成長因子、およびサイトカインからなる群より選択される生物剤である、請求項３２に記載の製薬組成物。
【請求項３７】
追加の薬剤が抗血管新生剤である、請求項３２に記載の製薬組成物。
【請求項３８】
追加の癌処置レジメンとともに用いられる、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項３９】
追加の癌処置レジメンが、外科手術および放射線療法からなる群より選択される、請求項３８に記載の製薬組成物。
【請求項４０】
０．００１％〜３０％ｗ／ｗの環境影響因子を含む、請求項１、１４および１９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項４１】
１％〜２０％ｗ／ｗの環境影響因子を含む、請求項４０に記載の製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑ１０）”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４１（代理人整理番号：１１７７３２−００６０１）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４３（代理人整理番号：１１７７３２−００７０１）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４４（代理人整理番号：１１７７３２−００８０１）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４５（代理人整理番号：１１７７３２−００９０１）、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４６（代理人整理番号：１１７７３２−０１００１）の優先権を主張する。上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
癌は現在、先進国における主要な死亡原因の１つであり、現代社会にとって深刻な脅威である。癌はいずれの年齢のいずれの器官のいずれの組織においても発症する可能性がある。世界中で、毎年１０００万人超が癌と診断され、この数は２０２０年までに毎年、新患１５００万人に増加することが推定される。癌は世界中で毎年６００万件または死亡の１２％を引き起こすと考えられる。
【０００３】
癌の病因は明確には理解されていない。癌は、遺伝的感受性、染色体切断障害、ウイルス、環境因子および免疫障害を含む、長年の継続中の研究にわたる多くの因子に結び付けられてきた、または関連してきた。癌は、病状の大きなカテゴリを網羅する。癌細胞は、体のほぼいずれの器官および／または組織にでも発生する可能性がある。体の一部において細胞が制御不能な増殖または分化を開始するときに、癌が発症する。
【０００４】
最近の研究は腫瘍形成の分子機構の多くの我々の理解を大いに向上させ、癌の処置に多数の新たな手段を提供してきたが、大半の悪性腫瘍の標準処置は完全摘出、化学療法、および放射線療法のままである。これらの各処置はますます成功しているが、多数の望ましくない副作用を引き起こし得る。例えば外科手術は疼痛、健常組織への外傷、および瘢痕化を生じ得る。放射線療法は癌細胞を死滅させる利点を有するが、同時に非癌性組織も損傷する。化学療法は、各種の抗癌薬の患者への投与を包含する。これらの標準処置は、有害な副作用、例えば悪心、免疫抑制、胃潰瘍および２次腫瘍形成を伴うことが多い。
【０００５】
多くの個人および会社は長年にわたって、幅広い癌の処置での改善を求めて広範囲に及ぶ研究を実施してきた。会社は、癌のためのより有益な療法を提供することを望んで、化学的実体、例えば小型分子、および生物製剤、例えば抗体を含む生物活性剤を開発している。試験された生物活性剤には、一部の個人または癌の種類で作用して、有益な治療効果を提供したものもあれば、この試験プロトコルで失敗した、または最小の治療効果を有したものもあった。今日までに研究された他の生物活性剤は、完全に理解されていない作用機序を有する。
【０００６】
本明細書でＣｏＱ１０、Ｑ１０、ユビキノン、またはユビデカレノンとも呼ばれるコエンザイムＱ１０は、普及している栄養補助食品であり、ＣｏＱ１０の還元型であるユビキノールの抗酸化特性を通じて免疫系の保護を助けるビタミン様栄養補助食品として、カプセル剤形で栄養食品店、健康食品店、薬局などにて見出すことができる。ＣｏＱ１０は、当分野で認識されており、その全体の開示が参照により本明細書に組み入れられている、国際公開番号ＷＯ２００５／０６９９１６にさらに記載されている。
【０００７】
ＣｏＱ１０は、人体の大半の組織および他の哺乳動物の組織のいたるところで見出される。ヒトにおけるＣｏＱ１０の組織分布および酸化還元状態は、Ｂｈａｇａｖａｎ  ＨＮ，ｅｔ  ａｌ．による総説論文、Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑ１０：Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｔｉｓｓｕｅ  ｕｐｔａｋｅ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（５），４４５−４５３（２００６）（以下、Ｂｈａｇａｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．）で総説されている。著者らは、「一般原則として、心臓、腎臓、肝臓および筋肉などのエネルギー要求または代謝活性の高い組織は、比較的高濃度のＣｏＱ１０を含有する」ことを報告している。著者らはさらに「脳および肺を除く組織中のＣｏＱ１０の大部分はヒドロキノンまたはユビキノール（ｕｎｉｑｕｉｎｏｌ）としての還元型であり、このことはこれらの２つの組織における酸化ストレスの上昇を反映するものと思われる」ことを報告している。特にＢｈａｇａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、心臓、腎臓、肝臓、筋肉、腸（ｉｎｔｅｎｓｔｉｎｅ）および血液（血漿）において、ＣｏＱ１０のそれぞれ約６１％、７５％、９５％、６５％、９５％および９６％が還元型であることも報告している。同様に、Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｉｎｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ−１０  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ−１０（ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑ１０）ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ  Ａ  １１７５（２），２４２−２４８（２００７）（以下、Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｉｎｅｚ，ｅｔ  ａｌ．）は、ヒト血漿がＱ１０およびＱ１０の還元型（Ｑ１０Ｈ２）について評価されたときに、分子の大部分（９０％）が還元型で見出されたことを報告している。
【０００８】
ＣｏＱ１０は非常に親油性であり、大部分は水に不溶性である。水へのその不溶性、脂質への限定された溶解性、および比較的大きい分子量のために、経口投与されたＣｏＱ１０の吸収効率は不十分である。Ｂｈａｇａｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．は「ラットを用いた１つの研究において、経口投与されたＣｏＱ１０のわずか約２〜３％が吸収されることが報告された」ことを報告している。Ｂｈａｇａｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．はさらに「ラットの研究からのデータは、腸での吸収の間または後のどちらかに、ＣｏＱ１０がユビキノールに還元されることを指摘している」ことを報告している。
【０００９】
ＣｏＱ１０は、文献において長年にわたって癌に関係してきた。文献で報告された関連の、いくつかの代表的ではあるが、完全に包括的というわけではない例が下に記載される。Ｋａｒｌ  Ｆｏｌｋｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑ１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  １９２，２４１−２４５（１９９３）（以下「Ｆｏｌｋｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．」）は、「ＣｏＱ１０による療法を受けた」癌患者の８つの病歴および「５〜１５年の期間にわたる」この生存履歴について記載している。ＣｏＱ１０は、膵臓癌腫、腺癌、喉頭癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌および前立腺癌を含む、異なる種類の癌を有する患者８名に経口投与された。Ｆｏｌｋｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．は「これらの結果が今や、全身的プロトコルを正当化する」と述べている。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｑ１０  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ２１２，１７２−１７７（１９９５）（以下「Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．」）は、ビタミンＱ１０を用いた乳癌の療法の進歩」について報告している別の総説論文である。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．は、非腫瘍および腫瘍組織におけるビタミンＱ１０の可変レベルを明らかにした、動物およびヒトに対する３５年間の国際的研究を扱い、腫瘍を有する処置マウスの中の生存マウスの増加に基づく宿主防御系に固有のビタミンＱ１０に関するデータを含む」Ｆｏｌｋｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．に言及している。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．はさらに、乳癌症例における可変欠乏レベルを明らかにした、スウェーデンおよびアメリカの癌患者１９９名のＣｏＱ１０の血中レベルを決定した研究に依拠して、「ヒト癌のビタミンＱ１０療法の可能性が１９６１年に明白となった」ことを述べている。２００２年７月９日に発行された米国特許第６，４１７，２３３（以下Ｓｅａｒｓ，ｅｔ  ａｌ．）は、ミトコンドリア病の予防および／または処置のための脂溶性ベンゾキノン、例えばコエンザイムＱ１０を含有する組成物について記載している。Ｓｅａｒｓ，ｅｔ  ａｌ．は、「ＣｏＱ１０処置が癌患者にいくつかの利益を提供することが報告されている（第２欄、３０〜３１行を参照）」ことを述べている。
【００１０】
本出願の出願日時点で、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、癌処置におけるＣｏＱ１０の、多数の患者を包含する良好に設計臨床試験が行われていないのは、「研究が行われた方法および報告された情報の量によって、利益がコエンザイムＱ１０またはその他によって生じたのか否かが不明確にされたためである」ことを報告している。ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｐｄｑ／ｃａｍ／ｃｏｅｎｚｙｍｅＱ１０／ｐａｔｉｅｎｔ／ａｌｌｐａｇｅｓ（２００８年９月２９日）にて利用できる、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）を参照。ＮＣＩは特に、乳癌患者における標準処置後のアジュバント療法としての、数名の患者が処置によって助けられたように思われるＣｏＱ１０の使用に関する３つの小規模な研究を引用し、「しかし、研究設計および報告の弱点によって、利益がコエンザイムＱ１０またはその他によって生じたのか否かが不明確にされたためである」ことを繰返し述べている。ＮＣＩは「これらの研究は以下の弱点を有した：研究はランダム化または制御されていなかった；患者はコエンザイムＱ１０に加えて他の栄養補助食品を使用した；患者は、コエンザイムＱ１０療法の前または間に標準処置を受けた；および詳細事項が研究のすべての患者に報告されていなかった」ことを明記している。ＮＣＩはさらに「逸話的報告において、コエンザイムＱ１０が膵臓癌、肺癌、結腸癌、直腸癌および前立腺癌を有する患者を含む、数名の癌患者がより長く生存するのを助けた」ことを報告しているが、「しかしこれらの報告で記載された患者は、化学療法、放射線療法および外科手術を含む、コエンザイムＱ１０以外の他の処置も受けた」ことを示している。
【００１１】
２００６年２月１６日に公開された米国特許公開番号２００６／００３５９８１（以下「Ｍａｚｚｉｏ  ２００６」）は、宿主とは反対である、エネルギーを得るグルコースの非酸化的リン酸化のためのこの嫌気的要件に関して癌の脆弱性を活用する組成物を使用して、ヒトおよび動物の癌を処置または予防する方法および製剤について記載している。Ｍａｚｚｉｏ  ２００６の製剤は、酸化的代謝を相乗的に促進するおよび／または乳酸デヒドロゲナーゼもしくは嫌気的グルコース代謝を妨げる１つ以上の化合物を含有して、さらに詳細には「２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン（本明細書では「ＤＭＢＱ」とも呼ばれる）（キノイドベース）ならびに対応するヒドロキノン、ユビクロメノール、ユビクロマノールまたは合成／天然誘導体および類似体を含む一連のユビキノン全体についての選択肢を含有すると記載されている。Ｍａｚｚｉｏ  ２００６、３ページ、段落００１０を参照。Ｍａｚｚｉｏ  ２００６は、「抗癌剤としての短鎖ユビキノン（ＣｏＱ＜３）を確認し、「２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン（ＤＭＢＱ）が抗癌剤としてＣｏＱ１０よりも１０００倍を超えて強力であることをなおさらに確認している。Ｍａｚｚｉｏ  ２００６、３ページ、段落００１１を参照。Ｍａｚｚｉｏ  ２００６はさらに、研究が「ＣｏＱ１０が予想されたほど致死性であることを見出さず」および「癌に対してＣｏＱ１０を用いた同様の以前の研究が多少矛盾していた」ことを述べている。本記述を裏付ける引用の広範囲に及ぶリストについては、Ｍａｚｚｉｏ  ２００６の３〜４ページを参照。
【００１２】
２００７年１０月２５日に公開された米国特許公開番号２００７／０２４８６９３（以下「Ｍａｚｚｉｏ  ２００７」）はまた、癌を処置または予防する栄養補給組成物およびこの使用について記載している。再度、公開された本特許出願は、短鎖ユビキノンに焦点を合せており、本発明の不可欠な構成要素でないことを明確に述べている。Ｍａｚｚｉｏ  ２００７によると、「ＣｏＱ１０は、癌細胞においてミトコンドリア複合体ＩＩ活性のＶｍａｘを上昇させることができるが（Ｍａｚｚｉｏ  ａｎｄ  Ｓｏｌｉｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７：１１６７−８４，２００４）、これは複合体ＩＶを通じてミトコンドリア呼吸またはＯ２利用の速度を制御しなかった。そしてＣｏＱ１０は、予想されたほど致死性ではなかった。同様に、癌に対するＣｏＱ１０の結果が矛盾していた」。Ｍａｚｚｉｏ  ２００７、５ページ、段落００１９を参照。
【発明の概要】
【００１３】
出願人らは以前に、動物対象における腫瘍増殖速度を低下させるためのＣｏＱ１０の局所製剤および方法について記載した（Ｈｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５年８月４日に公開されたＷＯ２００５／０６９９１６）。Ｈｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．に記載された実験において、ＣｏＱ１０は皮膚癌細胞の培養物においてアポトーシス速度を上昇させたが、正常な細胞では上昇させなかったことが示された。その上、腫瘍担持動物のＣｏＱ１０の局所製剤を用いた処置は、動物の腫瘍増殖速度を劇的に低下させることが示された。
【００１４】
本発明は、少なくとも一部は、ヒトおよび／または細胞内でのＣｏＱ１０の役割をより完璧に理解することに基づく。特に、本発明の方法および製剤は、少なくとも一部は、ヒト臨床試験を設計および実行することによってならびに／またはＣｏＱ１０をヒト対象に投与して、これらの試験および／または処置レジメンの間に出現する驚くべきおよび予想外の結果を観察することによって習得された、腫瘍性障害に対するＣｏＱ１０の治療活性について得られた知識に基づいている。本発明の方法および製剤はさらに、少なくとも一部は、インビトロでの細胞のＣｏＱ１０処置の広範囲に及ぶ研究から得られた、ＣｏＱ１０の治療機構への洞察に基づいている。
【００１５】
具体的に、少なくとも１つの実施形態において、本発明の方法および製剤は明確に、少なくとも一部は、コエンザイムＱ１０（本明細書ではＣｏＱ１０またはＱ１０とも呼ばれる）の細胞への適用が、正常な細胞増殖に対する効果なしに、またはいくつかの場合において有効な効果と共に、癌細胞におけるアポトーシス応答の選択的誘導を生じるという驚くべき発見に基づいている。その上、少なくとも１つの追加の実施形態において、侵襲性癌から誘導された株化細胞は、より低い侵襲性癌または非侵襲性癌から誘導された株化細胞と比較して、ＣｏＱ１０に対して感受性である（例えば細胞傷害および／またはアポトーシスの誘導のために必要なＣｏＱ１０の濃度がより低いおよび／または処置時間がより短い）ことが予想外に見出された。ミトコンドリアＱ１０レベルの時間および用量応答が観察され、４８時間後に細胞ミトコンドリア中のＱ１０のレベルは６倍上昇した。少なくとも１つの追加の実施形態において、本発明はさらに、Ｑ１０がいずれの著しい量でも供給された酸化型（酸化促進）で維持されて、Ｑ１０Ｈ２の還元（抗酸化）型に変換されないという驚くべきおよび予想外の発見に基づいている。別の実施形態において、本発明はなおさらに、著しい数の遺伝子の発現が、酸化型のＱ１０によって処置された細胞において調節されるという発見に基づいている。これらの調節されたタンパク質は、アポトーシス，癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
【００１６】
まとめると、本明細書に記載する結果は、Ｑ１０の治療機構への洞察を提供した。例えば理論に拘束されることを望むものではないが、出願人の発見は、Ｑ１０および特に、Ｑ１０の酸化型が細胞微小環境への代謝シフトを誘導することを指摘している。癌細胞には示差的代謝が出現することが公知であり（ワーブルグ効果）、これにより大半の癌細胞は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化（ピルビン酸塩の酸化）によってよりもむしろ、主にサイトゾルにおける解糖とこれに続く乳酸発酵によってエネルギーを産生する。出願人の発見は、Ｑ１０が癌細胞の代謝状態を、グルコースの嫌気的使用からミトコンドリア酸化的リン酸化にシフトできることを指摘している。
【００１７】
本明細書に示す出願人のデータに基づいて、Ｑ１０は多次元細胞内分子（ＭＩＭ）およびエピメタボリックシフター（エピシフター）として同定された。本発明は、他のＭＩＭおよび／またはエピシフターを同定する方法を提供する。本発明はさらに、ＭＩＭ、エピシフターおよびこれを使用することによって腫瘍性障害を処置する方法を提供する。
【００１８】
したがって、本発明は第１の態様において、腫瘍性障害を処置または予防するのに十分な量の、コエンザイムＱ１０でない環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）をヒトに投与することと、これによりヒトの腫瘍性障害を処置または予防することとを備える、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
【００１９】
関連する態様において、本発明は、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む製薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを備え、環境影響因子が哺乳動物の癌性細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察されたレベルに向かって、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症状を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法を提供する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「解糖」は、ピルビン酸塩から乳酸塩を産生する関係する乳酸塩生合成を場合により包含する。
【００２１】
ある実施形態において、環境影響因子は、哺乳動物の非癌性細胞において、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない。
【００２２】
ある実施形態において、哺乳動物はヒト、または非ヒト哺乳動物である。
【００２３】
ある実施形態において、環境影響因子は、コエンザイムＱ１０、またはその代謝産物もしくはその類似体（イソプレニルリピートを有さないまたは少なくとも１つのイソプレニルリピートを有する類似体を含む）ではない。
【００２４】
ある実施形態において、腫瘍性障害はコエンザイムＱ１０またはその代謝産物もしくはその類似体による処置に応答性または感受性である。
【００２５】
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中でアポトーシスまたは細胞死機構を誘導する。
【００２６】
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中で血管新生を阻害する。
【００２７】
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中の微小環境内で免疫関連要素の調節を誘導する。
【００２８】
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中で細胞周期制御の変化を誘導する。
【００２９】
ある実施形態において、環境影響因子は：（ａ）ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも１つの分子、および（ｂ）イソプレノイドユニットの合成および／またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも１つの分子を備える。
【００３０】
ある実施形態において、ベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも１つの分子は：Ｌ−フェニルアラニン、ＤＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、ＤＬ−チロシン、Ｄ−チロシン、４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデル酸（バニリンマンデル酸またはＶＭＡ）、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを備える。
【００３１】
ある実施形態において、イソプレノイドユニットの合成および／またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも１つの分子は：酢酸フェニル、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチル−ＣｏＡ、またはファルネシルを備える。
【００３２】
ある実施形態において、環境影響因子は：（ａ）Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、および４−ヒドロキシフェニルピルビン酸の１つ以上；ならびに（ｂ）４−ヒドロキシベンゾエート、酢酸フェニル、およびベンゾキノンの１つ以上を備える。
【００３３】
ある実施形態において、環境影響因子は：（ａ）Ｂｃｌ−２発現を阻害するおよび／もしくはカスパーゼ−３発現を増進する；ならびに／または（ｂ）細胞増殖を阻害する。
【００３４】
１実施形態において、ｅｎｖ影響因子は多次元細胞内分子（ＭＩＭ）である。ある実施形態において、ＭＩＭは：アルファケトグルタル酸塩／アルファケトグルタル酸、リンゴ酸塩／リンゴ酸、コハク酸塩／コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン２リン酸、グルクロニド／グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン／フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される。１実施形態において、ＭＩＭはアセチルＣｏ−Ａ、パルミチルＣｏ−Ａ、Ｌ−カルニチン、およびアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステイン）から成る群より選択される。
【００３５】
１実施形態において、ｅｎｖ影響因子はエピメタボリックシフター（エピシフター）である。ある実施形態において、エピメタボリックシフターは：トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルＣｏＡシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される方法。１実施形態において、エピシフターはビタミンＤ３およびＥＣＭ構成要素から成る群より選択される。１実施形態において、ＥＣＭ構成要素はフィブロネクチン；免疫調節薬（例えばＴＮＦαまたはインターロイキン、例えばＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３のいずれか）血管新生因子；およびアポトーシス因子から成る群より選択される。
【００３６】
１実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも２５％は、処置されている障害に対して治療的である全身的環境影響因子（例えばコエンザイムＱ１０）レベルを有した。他の実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上は、処置されている障害に対して治療的である全身的環境影響因子（例えばコエンザイムＱ１０）レベルを有した。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば１０％〜２５％、１５％〜３５％、２５％〜５０％、３５％〜６０％、４０％〜７０％、５０％〜７５％、６０％〜８５％または７０％〜９０％も本発明の一部であると意図されることが理解されるべきである。
【００３７】
１実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも２５％が癌の組織病状、臨床観察、写真分析、ＣＴスキャン、ＭＲＩ画像、血液、血清または血漿マーカー含む、当分野で認識されたエンドポイントによって測定されるような症候の減少（ｄｉｍｉｓｈｍｅｎｔ）を有した。
【００３８】
１実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも５０％が癌の組織病状、臨床観察、写真分析、ＣＴスキャン、ＭＲＩ画像、血液、血清または血漿マーカー含む、当分野で認識されたエンドポイントによって測定されるような症候の減少（ｄｉｍｉｓｈｍｅｎｔ）を有した。
【００３９】
他の実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上が癌の組織病状、臨床観察、写真分析、ＣＴスキャン、ＭＲＩ画像、血液、血清または血漿マーカー含む、当分野で認識されたエンドポイントによって測定されるような症候の減少（ｄｉｍｉｓｈｍｅｎｔ）を有した。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば１０％〜２５％、１５％〜３５％、２５％〜５０％、３５％〜６０％、４０％〜７０％、５０％〜７５％、６０％〜８５％または７０％〜９０％も本発明の一部であると意図されることが理解されるべきである。
【００４０】
各種の実施形態において、処置されたヒトの集団は、約３名の患者、約５名の患者、約１０名の患者、約１５名の患者、約２０名の患者、約２５名の患者、約３０名の患者、約３５名の患者、約４０名の患者、約５０名の患者、約６０名の患者、約７０名の患者、約８０名の患者、約９０名の患者、約１００名の患者、約１２５名の患者、約１５０名の患者、約１６０名の患者、約１７５名の患者、約２００名の患者、約２５０名の患者、約３００名の患者、約４００名の患者またはそれ以上であり得る。１実施形態において、（処置されたヒトの集団は）上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば約１０〜約２５名の、約１５〜約３５名の、約２５〜約５０名の、または約２０〜約１６０名の患者も本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【００４１】
当業者が１つ以上の当分野で認識されたエンドポイントの検査時に、当分野の常識に基づいて症候の減少を有した患者を認識できることが理解されるであろう。例えば当業者は、インサイチュ皮膚扁平上皮細胞癌腫などの皮膚癌病巣の写真（例えば本明細書の実施例で提供された写真など）を処置前後で検査および比較することができ、例えば病巣のサイズの減少、病巣の色、または癌を通例示す病巣のその他の視覚的特徴に基づいて症候の減少を認識することができるであろう。別の例において、当業者は、例えば皮膚癌の組織病状を処置前後で検査および比較することができ、癌の発癌能または重症度の減少を示す組織病状の変化に基づいて症候の減少を認識することができるであろう。別の例において、当業者は、転移病巣の腫瘍または部位のＣＴスキャンまたはＭＲＩ画像を処置前後で検査および比較することができ、例えば原発性腫瘍のサイズの減少または転移病巣のサイズもしくは数の減少に基づいて症候の減少を認識することができるであろう。
【００４２】
１実施形態において、ヒトの腫瘍性障害を処置するのに十分な量は、グルコースの嫌気的使用（および／または乳酸塩生合成）を下方調節して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節する。
【００４３】
１実施形態において、処置されている腫瘍性障害は、通例、局所投与によって処置される障害、例えば乳癌または前立腺癌ではなく、治療的に有効なレベルでの活性剤の全身送達が期待される。
【００４４】
１実施形態において、処置されているヒト組織におけるｅｎｖ影響因子の濃度は、健常または正常状態を表すヒト組織の対照標準のｅｎｖ影響因子の濃度とは異なる。
【００４５】
１実施形態において、ヒトに投与されたｅｎｖ影響因子の型は、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢型とは異なる。
【００４６】
１実施形態において、処置は、ｅｎｖ影響因子と、表１〜２８に挙げられた遺伝子の群（例えば表２〜４、６〜２８；とりわけ同じ細胞タイプで異なるアッセイ方法を使用して、上方もしくは下方調節が一貫して示された遺伝子、または異なる細胞タイプにわたって、同じアッセイ方法または異なるアッセイ方法のどちらかによって、上方または下方調節が一貫して示された遺伝子；好ましくは上方または下方調節の規模は同じであるかまたは類似している（例えば最大倍の上昇または低下は、最小倍の上昇または低下の１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、または５倍を超えない）〜選択された遺伝子との相互作用を介して行われる。
【００４７】
１実施形態において、処置は、ｅｎｖ影響因子と、ＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体１、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１Ｃ、カムキナーゼＩＩ、および／または表１〜２８（例えば表２〜４、６〜２８）に挙げられた遺伝子のいずれかから成る群より選択されるタンパク質との相互作用を介して行われる。
【００４８】
１実施形態において、腫瘍性障害は：白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される。
【００４９】
１実施形態において、方法はさらに、追加の治療剤または処置レジメンを投与することを備える。
【００５０】
別の態様において、本発明は、より低い侵襲性癌または非侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンよりも低い選択された用量で環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）をヒトに投与することと、これにより侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
【００５１】
関連する態様において、本発明は、侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンを超える選択されたより高い用量で環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）をヒトに投与することと、これにより非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
【００５２】
１実施形態において、腫瘍性障害は、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される。
【００５３】
１実施形態において、侵襲性腫瘍性障害は、膵臓癌腫、肝細胞癌腫、ユーイング肉腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、脳腫瘍（星状細胞腫、神経膠芽腫）、神経内分泌癌、結腸癌、肺癌、骨肉腫、アンドロゲン非依存性前立腺癌、卵巣癌および非ホジキンリンパ腫から成る群より選択される。
【００５４】
１実施形態において、非侵襲性腫瘍性障害は、非転移性乳癌、アンドロゲン依存性前立腺癌、小細胞肺癌、急性リンパ球性白血病から成る群より選択される。
【００５５】
１実施形態において、方法は、外科手術、放射線療法、ホルモン療法、抗体療法、成長因子を用いた療法、サイトカイン、および化学療法から成る群より選択される処置レジメンをさらに備える。
【００５６】
また別の態様において、本発明は、哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用を選択的に遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を、正常な生理学的条件下で哺乳動物の正常細胞において観察されるレベルに向かって増強するために、少なくとも１つのｅｎｖ影響因子の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍性障害の処置を必要とする哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用（解糖）を（選択的に）遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を増強する方法を提供する。
【００５７】
１実施形態において、方法は、（１）正の倍率変化を有する表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）に示す遺伝子から成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を上方調節すること；および／または（２）負の倍率変化を有する表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）から成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を下方調節することをさらに備える。
【００５８】
１実施形態において、方法は、ＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体１、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩから成る群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む。
【００５９】
１実施形態において、腫瘍性障害は、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される。
【００６０】
１実施形態において、方法は、外科手術、放射線療法、ホルモン療法、抗体療法、成長因子を用いた療法、サイトカイン、および化学療法から成る群より選択される処置レジメンをさらに備える。
【００６１】
なおさらなる態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防するために有効な環境影響因子を同定する方法であって：（１）腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと；（２）罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと；（３）罹患した生物試料および正常な生物試料中に存在する、正の倍率変化を有するおよび／または負の倍率変化を有する、表１〜２８（例えば表２〜４および６〜２８）に挙げられたマーカーから成る群より選択される、１つ以上のマーカーの発現レベルを決定することと；（４）罹患した生物試料および正常な生物試料中の１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）マーカーの発現レベルを比較して；有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中で正の倍率変化を有する１つ以上のマーカーを上昇させるおよび／または負の倍率変化を有する１つ以上のマーカーの発現レベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇／低下させない候補環境影響因子として同定されることと；を備えた方法を提供する。
【００６２】
関連する態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって：（１）腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと；（２）罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと；（３）罹患した生物試料および正常な生物試料中に存在する、正の倍率変化を有するおよび／または負の倍率変化を有する、表１〜２８に挙げられたマーカーから成る群より選択される、１つ以上のマーカーの発現レベルを決定することと；（４）罹患した生物試料および正常な生物試料中の１つ以上のマーカーの発現レベルを比較して；有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中で正の倍率変化を有する１つ以上のマーカーを上昇させるおよび／または負の倍率変化を有する１つ以上のマーカーの発現レベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇／低下させない候補環境影響因子として同定されることと；（５）有効な環境影響因子を哺乳動物に投与して；これにより哺乳動物の腫瘍性障害を処置することと；を備えた方法を提供する。
【００６３】
また別の関連する実施形態において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防するために有効な環境影響因子を同定する方法であって：（１）腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと；（２）罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと；（３）候補環境影響因子との接触前後の罹患した生物試料および正常な生物試料中の解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを決定して；有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中でミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを上昇させるおよび／または解糖のレベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇／低下させない候補環境影響因子として同定されることと；を備えた方法を提供する。
【００６４】
また別の関連する実施形態において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって：（１）腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと；（２）罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと；（３）候補環境影響因子との接触前後の罹患した生物試料および正常な生物試料中の解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを決定して、有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中でミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを上昇させるおよび／または解糖のレベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇／低下させない候補環境影響因子として同定されることと；（４）有効な環境影響因子を哺乳動物に投与して；これにより哺乳動物の腫瘍性障害を処置することと；を備えた、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法を提供する。
【００６５】
ある実施形態において、解糖のレベルはＥＣＡＲとして測定され、および／またはミトコンドリア酸化的リン酸化はＯＣＲとして測定される。
【００６６】
１実施形態において、ｅｎｖ影響因子はコエンザイムＱ１０でない。
【００６７】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）細胞を内因性分子と接触させることと；（ｂ）細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を監視することと；（ｃ）細胞微小環境プロフィールに対して変化を誘導する内因性分子を同定して；これにより多次元細胞内分子（ＭＩＭ）を同定することを備えた、多次元細胞内分子（ＭＩＭ）を同定する方法を提供する。
【００６８】
１実施形態において、方法は、罹患した細胞および正常な対照細胞の細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を比較することと；罹患した細胞の細胞微小環境プロフィールに対する変化を、正常な対照細胞と比較して示差的に発する内因性分子を同定して；これによりＭＩＭを同定することをさらに備える。
【００６９】
１実施形態において、細胞微小環境プロフィールに対する効果は、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質および代謝産物から成る群より選択される細胞分子のレベルまたは活性の変化を測定することによって監視される。
【００７０】
別の態様において、本発明は、（ａ）示差的疾患状態を提示する２つ以上の細胞または組織の分子プロフィールを比較することと；（ｂ）レベルの変化が疾患状態に相関する分子プロフィールから分子を同定することと；（ｃ）分子を細胞に導入することと；（ｄ）分子の細胞の代謝性状態をシフトさせる能力を評価して；細胞の代謝性状態をシフトすることができる分子がエピメタボリックシフター（エピシフター）として同定されることを備えた、エピメタボリックシフター（エピシフター）を同定する方法を提供する。
【００７１】
１実施形態において、分子プロフィールは、代謝産物プロフィール、脂質プロフィール、タンパク質プロフィールまたはＲＮＡプロフィールから成る群より選択される。
【００７２】
１実施形態において、分子は、正常な細胞の健康または増殖に悪影響を及ぼさない。
【００７３】
また別の態様において、本発明は、腫瘍性障害の処置に有効である薬剤を同定する方法であって：（１）候補環境影響因子を提供することと；（２）候補環境影響因子が細胞の代謝状態をシフトする能力を決定することと；（３）腫瘍性障害の処置に有効か否かを決定して；細胞の代謝状態をシフトすることができ、腫瘍性障害の処置に有効である候補環境影響因子が腫瘍性障害の処置に有効な薬剤として同定されることを備えた方法を提供する。
【００７４】
１実施形態において、ｅｎｖ影響因子は、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、脂質レベル、代謝産物レベル、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数の１つ以上の変化を測定することによって、細胞の代謝状態をシフトできるとして同定される。
【００７５】
また別の態様において、本発明は、本発明の上述の方法によって同定された薬剤を備えた組成物を提供する。
【００７６】
別の態様において、本発明は：少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む製薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを備え、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルに向かって、細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、哺乳動物のＣｏＱ１０反応性障害もしくは状態を処置する、ＣｏＱ１０反応性障害もしくは状態の症状を緩和する、ＣｏＱ１０反応性障害もしくは状態の進行を阻害する、またはＣｏＱ１０反応性障害もしくは状態を予防する方法を提供する。
【００７７】
ある実施形態において、ＣｏＱ１０反応性障害は腫瘍性障害である。
【００７８】
適用可能な場合または明確に否定されていない場合、本明細書に記載する実施形態のいずれの１つもその他の１つ以上の実施形態と、実施形態が本発明の別の態様の下に記載されていても、併用可能であることが考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＳＫ−ＭＥＬ−２８の感受性。
【図２】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＳＫＢＲ３の感受性。
【図３】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＰａＣａ２の感受性。
【図４】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＰＣ−３の感受性。
【図５】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＨｅｐＧ２の感受性。
【図６】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＭＣＦ−７の感受性。
【図７】アポストランドＥＬＩＳＡ法によって測定されたような、Ｑ１０による２４時間処置時のアポトーシス細胞の測定。
【図８】２次元ゲル電気泳動のゲル分析例。同定のために切除されたスポットがマーキングされている。
【図９】ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中でＱ１０によって調節されているような、２次元ゲル電気泳動によって同定されたタンパク質間の相互作用のネットワーク。
【図１０】Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１  ６８（５）：１０８６−１０９２）から転載された、ペントースリン酸経路。
【図１１】ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のミトコンドリア高濃度物質の２次元ゲル。切除され、質量分析キャラクタリゼーションによって同定されたスポットがマーキングされている。
【図１２】培養培地中への１００μＭ  Ｑ１０の外部からの添加後の、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ミトコンドリアに存在するＱ１０の相対量の比較プロット。
【図１３Ａ】公知のプロセスのアポトーシス経路マッピング。
【図１３Ｂ】公知のプロセスのアポトーシス経路マッピング。
【図１４】Ｂｃｌ−ｘｌのウェスタンブロット分析。
【図１５】ビメンチン抗体によって証明されたＳＫ−ＭＥＬ−２８試料セットのウェスタンブロット分析。
【図１６】酸化的リン酸化複合体（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ番号ＭＳ６０１）をターゲティングする５種類の抗体によって評価されたいくつかの株化細胞からの細胞溶解のウェスタンブロット分析。
【図１７】Ｆ１−アルファレベルのウェスタンブロット比較。
【図１８】Ｃ−ＩＩＩ−Ｃｏｒｅ２とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図１９】Ｃ−ＩＩ−３０とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２０】Ｃ−ＩＶ−ＣＯＸＩＩとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２１】Ｃ−Ｉ−２０（ＮＤ６）とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２２】５種類のミトコンドリアタンパク質に対する多種多様の細胞タイプのウェスタンブロット分析。
【図２３】複合体Ｖタンパク質Ｃ−Ｖ−αとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２４】Ｃ−ＩＩＩ−Ｃｏｒｅ１とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２５】ポリン（ＶＤＡＣ１）とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２６】シクロフィリンＤとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２７】シトクロムＣとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２８】Ｈｅｌｉｘ  １０オープン立体配座のＨＮＦ４アルファ（１Ｍ７Ｗ．ｐｄｂ）の脂質結合チャネルに挿入されたＱ１０（球）の理論モデル。
【図２９】透過エンハンサを有する本開示の組成物による処置後の、オスブタにおける表皮ＣｏＱ１０濃度を示すグラフ。
【図３０】対照組成物の処置後の、メスブタにおける表皮ＣｏＱ１０濃度を示すグラフ。
【図３１】前処置されたターゲット病変（ｌｅｇｉｏｎ）１の写真描写。
【図３２】後処置されたターゲット病変１の写真描写。
【図３３】前処置されたターゲット病変２の写真描写。
【図３４】後処置されたターゲット病変２の写真描写。
【図３５】前処置されたターゲット病変３の写真描写。
【図３６】後処置されたターゲット病変３の写真描写。
【図３７】正常酸素条件および低酸素条件での各種のグルコース条件におけるＨＤＦａ細胞のＯＣＲ。
【図３８】正常酸素条件および低酸素条件での各種のグルコース条件におけるＨＡＳＭＣ細胞のＯＣＲ。
【図３９】３１５１０およびストレッサの非存在および存在下でのＭＣＦ−７乳癌細胞のＯＣＲ値。
【図４０】３１５１０およびストレッサの非存在および存在下でのＰａＣａ−２膵臓癌細胞のＯＣＲ値。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
Ｉ．概要および定義
【００８１】
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれが、本セクションおける用語と関連する意味を有する。
【００８２】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象のうち１つまたは１つを超える（すなわち少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。１例として、「要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００８３】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるわけではないが、含む」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、含む」と互換的に使用される。
【００８４】
「または」という用語は、状況が別途明らかに指摘しない限り、「および／または」という用語を意味するために本明細書で使用され、「および／または」という用語と互換的に使用される。
【００８５】
「などの」という用語は、「限定されるわけではないが、などの」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、などの」と互換的に使用される。
【００８６】
本発明の方法によって処置される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物のどちらか、好ましくは哺乳動物を意味することができる。本明細書に記載する臨床観察がヒト対象によって行われ、少なくともいくつかの実施形態において、対象はヒトであることに注目すべきである。
【００８７】
「治療的有効量」は、疾患を処置するために患者に投与されたときに疾患に対してこのような処置をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。疾患を予防するために投与されたときに、量は、疾患の開始を回避または遅延するのに十分である。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに処置される患者の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
【００８８】
「予防すること」または「予防」は、疾患または障害を獲得するリスクの低減（すなわち疾患の臨床症候の少なくとも１つを、疾患に曝露され得るまたは疾患の素因があり得るが、疾患の症候をまだ経験または提示していない患者において発症させないようにすること）を指す。
【００８９】
「予防」または「治療」処置という用語は、対象組成物の１つ以上の対象への投与を指す。望ましくない症状（例えば宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床顕在化の前に投与される場合、ここで処置は予防的であり、すなわち処置は宿主が望ましくない症状を発症することから保護するのに対して、望ましくない症状の顕在化後に投与される場合、処置は治療である（すなわち既存の望ましくない症状またはそれからの副作用を減少、緩和または維持するものとする）。
【００９０】
「治療効果」という用語は、動物、特に哺乳動物、およびさらに詳細にはヒトにおいて薬理学的活性物質によって引き起こされる、局所または全身効果を指す。該用語はそれゆえ、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、軽減、処置もしくは予防でのまたは所望の身体的もしくは精神的発達および状態の増強での使用が意図されるいずれの物質も意味する。「治療的有効量」という句は、いずれの処置にも適用できる合理的な利益／リスク比にてある望ましい局所または全身効果を産生するような物質の量を意味する。ある実施形態において、化合物の治療的有効量は、その治療指数、溶解性などに依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある化合物は、このような処置に適用できる合理的な利益／リスク比を産生するために十分な量で投与され得る。
【００９１】
「患者」とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、魚およびトリを含む、少なくとも１つの医療的介入（例えば処置、診断／予後試験など）を受けることができるいずれかの動物（例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物）を意味する。
【００９２】
「代謝経路」は、１つの化合物を別の化合物に変換して、中間体および細胞機能のためのエネルギーを提供する、一連の酵素媒介反応を指す。代謝経路は線形または環式であることができる。
【００９３】
「代謝状態」は、各種の化学的および生物学的指標が健康または疾患の状態に関連するため、各種の化学的および生物学的指標によって測定されるような所与の時点における特定の細胞、多細胞または組織環境の分子内容物を指す。
【００９４】
「マイクロアレイ」という用語は、基質、例えば紙、ナイロンもしくは他の種類の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、またはその他の好適な固体支持体上で合成された別個のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド（例えば抗体）またはペプチドのアレイを指す。
【００９５】
「障害」および「疾患」という用語は、包括的に使用され、体のいずれの部分、器官または系（またはそのいずれの組合せ）の正常な構造または機能からのいずれの逸脱も指す。特異的疾患は、生物学的、化学的および物理的変化を含む特徴的症候および徴候によって明らかとなり、限定されるわけではないが、人口統計学的因子、環境因子、雇用因子、遺伝的因子および病歴因子を含む、多種多様の他の因子と関連することが多い。ある特徴的な徴候、症候、および関連因子は、重要な診断情報を産する多種多様の方法によって定量化することができる。
【００９６】
「発現」という用語は、ポリペプチドがＤＮＡから産生されるプロセスを意味するために本明細書で使用される。プロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびこのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を包含する。使用される状況に応じて、「発現」は、ＲＮＡ、タンパク質またはその両方の産生を指す。
【００９７】
「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子発現レベル」という用語は、ｍＲＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡ新生転写物、転写プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡおよび分解生成物のレベル、または細胞中の遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルを指す。
【００９８】
「調節」という用語は、応答の上方調節（すなわち活性化または刺激）、下方調節（すなわち阻害または抑制）、または組合されたもしくは別々のその２つを指す。「モジュレーター」は、調節する化合物または分子であり、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター、刺激物質、サプレッサー、または阻害剤であり得る。
【００９９】
「コエンザイム生合成経路の中間体」という用語は、本明細書で使用する場合、チロシンおよびアセチル−ＣｏＡのユビキノン（ｕｑｉｑｕｉｎｏｎｅ）への化学的／生物学的変換の間に形成される化合物を特徴付ける。コエンザイム生合成経路の中間体は、３−ヘキサプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート、３−ヘキサプレニル−４，５−ジヒドロキシベンゾエート、３−ヘキサプレニル−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンゾエート、２−ヘキサプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−ヘキサプレニル−３−メチル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−ヘキサプレニル−３−メチル−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート、２−オクタプレニルフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ（ｍｅｔｈｏｌｘｙ）フェノール、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−３−メチル−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−３−メチル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−６−メトキシフェノール、３−デカプレニル−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンゾエート、３−デカプレニル−４，５−ジヒドロキシベンゾエート、３−デカプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニル乳酸、４−ヒドロキシ−ベンゾエート、４−ヒドロキシ桂皮酸およびヘキサプレニル（ｈｅｘａｐｒｅｎｙ）２リン酸を含む。
【０１００】
「トロラミン」という用語は、本明細書で使用する場合、トロラミンＮＦ、トリエタノールアミン、ＴＥＡｌａｎ（登録商標）、ＴＥＡｌａｎ  ９９％、トリエタノールアミン、９９％、トリエタノールアミン、ＮＦまたはトリエタノールアミン、９９％、ＮＦを指すこれらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、例えば本明細書に記載するＭＩＭまたはエピシフターは、それを必要とする対象においてコエンザイムＱ１０応答性状態を処置するために使用される。「コエンザイムＱ１０応答性状態」、または「ＣｏＱ１０応答性状態／疾患」という専門語は、コエンザイムＱ１０の投与によって処置、予防、またはそうでなければ改善することができる疾患、障害、状態および／または症状を含む。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではなく、本明細書でさらに記載されるように、細胞微小環境への代謝シフト、例えば正常状態細胞における酸化的リン酸化の種類および／またはレベルに向けたシフトを誘導することによって、少なくとも部分的に機能することが考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、ＣｏＱ１０応答性状態は、細胞微小環境の代謝の改変から生じる状態である。コエンザイムＱ１０応答性状態は、例えば解糖および乳酸塩生合成に向かって偏り得る、例えば腫瘍性障害を含む。いくつかの実施形態において、ＣｏＱ１０応答性腫瘍性障害は数ある中でも、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、または骨癌、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、黒色腫、および光線性角化症を含む。コエンザイムＱ１０応答性状態は、本明細書に記載するような他の腫瘍性障害をさらに含む。
【０１０２】
コエンザイムＱ１０応答性状態は、例えば肥満、糖尿病、糖尿病前症、メタボリックシンドローム、満腹、および内分泌異常などの代謝性障害も含む。コエンザイムＱ１０応答性状態は、本明細書に記載するような他の代謝性障害をさらに含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、例えば本明細書に記載するＭＩＭまたはエピシフターは、コエンザイムＱ１０と共通の活性を共有する。本明細書で使用する場合、「コエンザイムＱ１０と共通の活性を共有する」という句は、化合物がコエンザイムＱ１０と同じまたは類似の活性の少なくとも一部を呈する能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の２５％またはそれ以上を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の最大約１３０％（１３０％を含む）を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、または１３０％を呈する。本段落に挙げられた各値が「約」という用語によって修飾され得ることが理解される。加えて、本段落に挙げられたいずれの２つの値によって定義されたいずれの範囲も、本発明に含まれることを意味することが理解される。例えばいくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の約５０％〜約１００％を呈する。いくつかの実施形態において、コエンザイムＱ１０および本発明の化合物によって共有される活性は、細胞代謝におけるシフトを誘導する能力である。ある実施形態において、ＣｏＱ１０および本発明の化合物はによって共有される活性は、ＯＣＲ（酸素消費速度）および／またはＥＣＡＲ（細胞外酸性化速度）によって測定される。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」は、限定されるわけではないが：白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、ヒトに見出されるあらゆる種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語または専門語は、互換的におよび単数形または複数形のどちらかで使用され、これらを宿主生物に対して病的にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。いくつかの実施形態において、腫瘍性障害はコエンザイムＱ１０応答性状態である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、腫瘍性障害または癌は、アポトーシスの欠如によって特徴付けられる。他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、血管新生の増加によって特徴付けられる。他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解によって特徴付けられる。また他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、細胞周期制御の消失によって特徴付けられる。なお他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、ミトコンドリア酸化的リン酸化から乳酸塩および解糖流量に対する利用および／または依存性の向上への代謝管理のシフトによって特徴付けられる。さらなる実施形態において、腫瘍性障害または癌は、免疫監視（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌａｎｃｅ）を逃れて適応した免疫調節機構によって特徴付けられる。１実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも２つ、例えば血管新生の増加またはＥＣＭの分解によって特徴付けられる。１実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも３つによって特徴付けられる。１実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも４つによって特徴付けられる。１実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも５つによって特徴付けられる。１実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の６つすべてによって特徴付けられる。
【０１０６】
したがっていくつかの実施形態において、本発明の化合物は、アポトーシスの能力を回復することまたはアポトーシスを誘導することによって機能する。他の実施形態において，本発明の化合物は、血管新生を減少、低下または阻害することによって機能する。なお他の実施形態において、本発明の化合物は、再建している細胞外マトリクスを回復することによって機能する。他の実施形態において、本発明の化合物は、細胞周期制御を回復することによって機能する。なお他の実施形態において、本発明の化合物は、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化へ代謝管理を逆にシフトすることによって機能する。さらなる実施形態において、本発明の化合物は、免疫監視を回復するまたは体が癌細胞を異物として認識する能力を回復することによって機能する。
【０１０７】
いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、通例、一体となって癌を発症する協調された段階的に起こるイベントがあると考えられる。すなわち、いくつかの実施形態において、癌は、１遺伝子−１タンパク質−根本因果関係のみに依存しているわけではない。いくつかの実施形態において、癌は、腫瘍となる組織変化および改変、改変された組織状態、例えばエネルギー特性、転移能を与える損なわれた細胞外マトリクス完全性、免疫監視（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌａｎｃｅ）の欠如および／または改変された血管新生状態となって現れる生理学的疾患状態である。
【０１０８】
原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換の部位付近から得た細胞）は、十分に確立された技法、特に組織学的検査によって、非癌性細胞からただちに区別することができる。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけではなく、癌幹細胞、ならびに癌前駆細胞または癌祖先細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｎｃｅｓｔｏｒ）に由来するいずれの細胞も含む。これは転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および株化細胞を含む。固形腫瘍として正常に現れる癌細胞の種類に言及するとき、「臨床的検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて；例えばＣＡＴスキャン、ＭＲ画像、Ｘ線、超音波もしくは触診、などの手順によって検出可能であるおよび／または患者から入手可能な試料中の１つ以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能である腫瘍である。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、「正の倍率変化」は、関連する表に挙げられた遺伝子の「上方調節」または「（発現の）上昇」を指す。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「負の倍率変化」は、関連する表に挙げられた遺伝子の「下方調節」または「（発現の）低下」を指す。
【０１１１】
ある実施形態において、特定の挙げられた遺伝子が、処置後の異なる期間または各種の濃度の潜在的な環境影響因子（例えばＣｏＱ１０）による処置などの、１を超える処置条件に関連している場合、その特定の遺伝子の倍率変化は最長記録処置時間を指す。他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、最短記録処置時間を指す。他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、ｅｎｖ影響因子（例えばＣｏＱ１０）の最高濃度による処置を指す。他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、ｅｎｖ影響因子（例えばＣｏＱ１０）の最低濃度による処置を指す。また他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、ｅｎｖ影響因子の治療効果と一致する方式における調節（例えば上方または下方調節）を指す。
【０１１２】
ある実施形態において、正または負の倍率変化は、表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、１つの表を除く（例えば表１を除く、表５を除くなど）、表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、いずれか２つの表を除く（例えば表１および５を除く、表２および１６を除くなど）、表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、いずれか３つの表を除く；またはいずれか４つの表を除く；またはいずれか５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上の表を除く、表２および１６を除くなど）、表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、表１、５、９、および１２を除く、表１〜２８（例えば２〜４および６〜２８）のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。
【０１１３】
ここで本発明の好ましい実施形態への参照が詳細になされるであろう。本発明は好ましい実施形態と併せて記載されるが、本発明をこれらの好ましい実施形態に制限することが意図されていないことが理解されるであろう。反対に、添付請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲に含まれ得る代替、修正、および均等物を扱うことが意図される。
【０１１４】
ＩＩ．環境影響因子
本発明は、環境影響因子の投与により腫瘍性障害を処置する方法を提供する。「環境影響因子」（ｅｎｖ影響因子）に、ヒト（または非ヒト哺乳動物）の疾患環境を、正常状態をもたらす正常環境または健常環境へシフトさせる、これらの環境を再建させるまたこれらの環境を保持させる有益な方式で、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の疾患環境に影響するまたは疾患環境を調節する分子である。ｅｎｖ影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子（ＭＩＭ）およびエピメタボリックシフター（エピシフター）の両方を含む。
【０１１５】
ある実施形態において、本明細書で開示するＭＩＭおよびエピシフターは、栄養補助食品として慣習的に使用されているものを除く。ある実施形態において、本明細書で開示されるこれらのＭＩＭおよび／またはエピシフターは製薬グレードである。ある実施形態において、製薬グレードのＭＩＭおよび／またはエピシフターは、約９５％と約１００％の間の純度を有し、９５％と１００％の間のすべての値を含む。ある実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターの純度は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９または１００％である。ある実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターは、内毒素を含まない、または実質的に含まない。他の実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターは、異種タンパク質材料を含まない、または実質的に含まない。ある実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターはＣｏＱ１０である。
【０１１６】
１．多次元細胞内分子（ＭＩＭ）
「多次元細胞内分子（ＭＩＭ）」という用語は、体によって自然に産生されるおよび／またはヒトの少なくとも１つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。ＭＩＭは、以下の機能の１つ以上、２つ以上、３つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。ＭＩＭは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。ＭＩＭは、細胞内でシグナル伝達および／または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。ＭＩＭは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。ＭＩＭはまた、疾患状態において１つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばＣｏＱ−１０の場合、ＶＥＧＦの存在下での黒色腫細胞へのＣｏＱ−１０の投与は、Ｂｃｌ２レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、ＣｏＱ−１０およびＶＥＦＧの同時投与は、Ｂｃｌ２のレベルに対する効果は有さない。好ましくは、ＭＩＭは疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の（マッチング）細胞において実質的に効果を有さない。好ましくは、ＭＩＭは疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、ｍＲＮＡ／タンパク質発現レベルなどで正常な状態の（マッチング細胞）に選択的に近づける。
【０１１７】
１実施形態において、ＭＩＭはエピシフターでもある。別の実施形態において、ＭＩＭはエピシフターではない。当業者は、本発明のＭＩＭが２つ以上の内因性分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の１つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の内因性分子は、混合物がＭＩＭとして機能するような比で存在する。
【０１１８】
ＭＩＭは、脂質ベース分子または非脂質ベース分子であることができる。ＭＩＭの例は、限定されるわけではないが、ＣｏＱ１０、アセチルＣｏ−Ａ、パルミチルＣｏ−Ａ、Ｌ−カルニチン、例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステインなどのアミノ酸を含む。１実施形態において、ＭＩＭは小型分子である。本発明の１実施形態において、ＭＩＭはＣｏＱ１０でない。ＭＩＭは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、ビタミンＢファミリーの化合物、またはビタミンＢファミリーの化合物を備えるヌクレオシド、モノヌクレオチドもしくはジヌクレオチドを含む。ビタミンＢファミリーの化合物は、例えばチアミン（ビタミンＢ１）、ナイアシン（ニコチン酸またはビタミンＢ３としても公知）、またはピリドキシン（ビタミンＢ６）ならびにパンテノール（プロビタミンＢ５）などのプロビタミンを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、チアミン、ナイアシンおよびピリドキシンから選択される。ビタミンＢファミリーの化合物を備えるヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドは例えば、アデニンまたはナイアシン（ニコチン酸）分子を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、アデノシン、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、フラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ、ビタミンＢ２およびＡＤＰの一部を備える）およびニコチン酸ジヌクレオチドから選択される。
【０１２０】
他の実施形態において、ＭＩＭはアミノ酸を含む。アミノ酸の例は、例えばチロシン（例えばＬ−チロシン）、システイン、フェニルアラニン（例えばＬ−フェニルアラニン）およびアラニンを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸はフェニルアラニンまたはアラニンである。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸またはアセチルグリシンなどのアミノ酸誘導体を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭはグルコース類似体、例えば１個の−ＯＨまたは−ＣＨ２ＯＨ置換基が−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−または−ＮＨ２置換基によって置換されているグルコース分子である。グルコース類似体の例は、グルコサミン、グルクロン酸、グルクロニドおよびグルクロン酸塩を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、式（Ｉ）の化合物から選択され：
【化１】
0005903734.tif 000002
式中
ｎは０または１の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を形成し；
Ｗは−ＣＯＯＨまたは−Ｎ（ＣＨ３）３＋であり；ならびに
Ｘは、水素、負の電荷またはＮａ＋などのアルカリ金属カチオンである。
【０１２３】
ｎが０であるとき、ＣＨＲ３基がＷ置換基に結合されていることが理解される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、Ｗは−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、Ｌ−カルニチンなどのカルニチンである。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭはジカルボン酸である。いくつかの実施形態において、Ｗは−ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は水素である。いくつかの実施形態において、ｎは０である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、Ｗは−ＣＯＯＨであり、Ｒ３は水素であり、ｎは０であり、ならびにＲ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ４は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ４はヒドロキシルである。いくつかの実施形態において、Ｗは−ＣＯＯＨであり、Ｒ３は水素であり、ｎは１であり、ならびにＲ１およびＲ２は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を形成する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭはクレブス回路の中間体であり、過剰な中間体がクレブス回路を生産的な酸化的リン酸化に向けて操縦する。ＭＩＭである例示的なクレブス回路中間体は、コハク酸またはコハク酸塩、リンゴ酸またはリンゴ酸塩、およびα−ケトグルタル酸またはα−ケトグルタル酸塩を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、以下の構造を有する、ＣｏＱ１０の構成単位である。
【化２】
0005903734.tif 000003
【０１２８】
それゆえ、ＣｏＱ１０の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデル酸、バニリン酸、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸および４−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
【０１２９】
（ｉ）ＭＩＭを同定する方法
本発明は、ＭＩＭを同定する方法を提供する。ＭＩＭを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、および／または代謝産物レベルの１つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。１実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。１実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。１実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される（例えば１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれ以上、上昇する）。
【０１３０】
例えば形態、生理機能、および／または組成（例えばｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、代謝産物）のいずれか１つ以上における改変により検出されるような、細胞中の変化を誘導する分子は、細胞微小環境プロフィールに対して誘導された変化が疾患細胞状態と正常な細胞状態との間で異なるか否かを判定するためにさらに評価され得る。多様な組織源、細胞タイプ、または疾患状態の細胞（例えば細胞培養系統）が、比較評価のために評価され得る。例えば癌細胞の細胞微小環境プロフィールにおける誘導された変化は、非癌性または正常な細胞に誘導された変化と比較され得る。細胞の微小環境プロフィールにおける変化を誘導すること（例えば細胞の形態、生理機能および／または組成、例えばｍＲＮＡ、タンパク質、脂質もしくは代謝産物の変化を誘導する）および／または正常な細胞と比較して罹患細胞の微小環境プロフィールにおける変化を示差的（例えば優先的）に誘導することが観察される内因性分子は、ＭＩＭとして同定される。
【０１３１】
本発明のＭＩＭは、脂質ベースＭＩＭまたは非脂質ベースＭＩＭであり得る。脂質ベースＭＩＭを同定する方法は、脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、脂質ベース内因性分子は、細胞中の脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。１実施形態において、脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれ以上、上昇する。脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。脂質ベース分子の製剤および送達の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、担体分子、リポソーム、分散剤、懸濁剤、ナノ粒子分散剤、乳剤、例えば水中油型または油中水型乳剤、多相乳剤、例えば油中水中油型乳剤、ポリマー捕捉および封入を含む。脂質ベースＭＩＭの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞脂質の抽出およびＭＩＭの定量によって確認することができる。
【０１３２】
非脂質ベースＭＩＭを同定する方法は、非脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、非脂質ベース内因性分子は、細胞中の非脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。１実施形態において、非脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれ以上、上昇する。非脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。非脂質ベース分子の製剤および送達様式の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、、担体分子、能動輸送、ポリマー捕捉または吸着、ポリマーグラフト化、リポソーム封入およびターゲット化送達系を用いた製剤を含む。非脂質ベースＭＩＭの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出およびＭＩＭの定量によって確認され得る。
【０１３３】
２．エピメタボリックシフター（エピシフター）
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」（エピシフター）は、健常（または正常な）状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および／または宿主の健康を維持または再建する分子（内因性または外因性）である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境（例えば代謝状態）に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが２つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の１つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、ＣｏＱ−１０；ビタミンＤ３；フィブロネクチンなどのＥＣＭ構成要素；ＴＮＦαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３；血管新生因子；およびアポトーシス因子を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、エピシフターは、クレブス回路における１つ以上の反応への触媒作用に直接関与する、またはクレブス回路中間体（過剰な中間体がクレブス回路を操縦する）を産生するかのどちらかである酵素などの、酵素である。いくつかの実施形態において、酵素は、トランスアルドラーゼ、またはトランスケトラーゼなどのペントースリン酸経路の非酸化的段階の酵素である。他の実施形態において、酵素は、シンターゼまたはリガーゼなどの、クレブス回路を容易にする構成要素酵素または酵素複合体である。例示的な酵素は、スクシニルＣｏＡシンターゼ（クレブス回路酵素）またはピルビン酸カルボキシラーゼ（クレブス回路中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を形成するために、ピルビン酸の可逆的カルボキシル化を触媒するリガーゼ）を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、エピシフターはＣｏＱ１０の構成単位である。ＣｏＱ１０の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデル酸、バニリン酸、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、エピシフターは、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸および４−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、エピシフターはビタミンＢファミリーの化合物である。ビタミンＢファミリーの化合物は例えば、リボフラビン（ビタミンＢ２）、またはその類似体を含む。エピシフターは、本明細書に記載する内因性ＭＩＭなどの、内因性ＭＩＭのいずれにもインビボで代謝され得る、いずれの類似体またはプロドラッグも含む。
【０１３７】
１実施形態において、エピシフターもＭＩＭである。１実施形態において、エピシフターはＣｏＱ１０でない。エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
【０１３８】
（ｉ）エピシフターを同定する方法
エピメタボリックシフター（エピシフター）は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常（または正常な）状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および／または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与（他の治療分子によるエピシフターの調節）効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
【０１３９】
エピメタボリックシフターの同定は概して、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、例えば代謝産物、脂質、タンパク質またはＲＮＡの分子プロフィール（個別のまたは併用されたプロフィール）を確立することを包含する。レベルの変化（例えばレベルの上昇または低下）が疾患状態、進行または侵襲性に相関するプロフィールからの分子は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１４０】
１実施形態において、エピシフターはＭＩＭでもある。潜在的なエピシフターは、当分野で公知のいくつもの所定の技法を使用することによって、および本明細書に記載する方法のいずれかを使用することによって、細胞への外部からの添加時に細胞に進入するその能力が評価され得る。例えば、潜在的エピシフターの細胞中への進入は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出および潜在的エピシフターの定量によって確認され得る。これにより、細胞に進入することができる潜在的エピシフターは、ＭＩＭとして同定される。
【０１４１】
エピシフターを同定するために、潜在的エピシフターは次に、細胞の代謝状態をシフトする能力について評価される。潜在的エピシフターが細胞微小環境の代謝状態をシフトする能力は、細胞に潜在的エピシフターを導入すること（例えば外部から添加すること）ならびに細胞において：遺伝子発現の変化（例えばｍＲＮＡもしくはタンパク質発現の変化）、脂質もしくは代謝産物レベルの濃度変化、生体エネルギー分子レベルの変化、細胞エネルギー特性の変化、および／またはミトコンドリアの機能もしくは数の変化の１つ以上を監視することによって評価される。細胞微小環境の代謝状態をシフトすることが可能である潜在的エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。潜在的エピシフターは、罹患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトする能力について（または反対に、正常細胞の代謝状態をを罹患状態に向けてシフトする能力について）、さらに評価される。それゆえ、罹患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトする（または健常な正常細胞の代謝状態を罹患状態に向けてシフトする）ことが可能である潜在的エピシフターは、エピシフターとして同定される。好ましい実施形態において、エピシフターは、正常細胞の健康および／または増殖に悪影響を及ぼさない。
【０１４２】
本発明のエピメタボリックシフターは、限定されるわけではないが、小型分子代謝産物、脂質ベース分子、ならびにタンパク質およびＲＮＡを含む。小型分子内因性代謝産物のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、代謝産物プロフィールが確立される。各細胞または組織の代謝産物プロフィールは、細胞または組織から代謝産物を抽出することならびに次に例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用して、代謝産物を同定および定量することによって決定される。レベルの変化（例えばレベルの上昇または低下）が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する代謝産物は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１４３】
内因性脂質ベース分子のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、脂質プロフィールが確立される。各細胞または組織の脂質プロフィールは、脂質抽出法と、続いての例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用する脂質の同定および定量によって決定される。レベルの変化（大量または微量レベルの上昇または低下）が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する脂質は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１４４】
タンパク質およびＲＮＡのクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、遺伝子発現プロフィールが確立される。各細胞または組織の発現プロフィールは、例えば本明細書に詳細に記載されているような標準プロテオミクス法、ｍＲＮＡアレイ法、またはゲノムアレイ法を使用して、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで決定される。発現の変化（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの発現の上昇または低下）が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する遺伝子は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１４５】
（例えば可溶性代謝産物、脂質ベース分子、タンパク質、ＲＮＡ、または他の生物学的クラスの組成物について）上記の分子プロフィールがいったん確立されると、細胞および生化学経路分析が行われて、細胞環境における同定された潜在的エピシフターの間の公知の連関が解明される。このような細胞および／または生化学経路分析によって得られた本情報は、経路および潜在的エピシフターを分類するために利用され得る。
【０１４６】
エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、当分野で公知のまたは本明細書で詳細に記載されたいくつものアッセイを使用して、当業者がさらに評価および確認することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、エピシフターの細胞または生物への直接外因性送達によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は代わりに、エピシフター（例えばエピシフターのレベルまたは活性）を直接調節する分子の発生によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性はまた、エピシフターと同じ経路に配置された（例えばＲＮＡまたはタンパク質レベルで調節される）遺伝子などの他の分子を調節することによる、エピシフター（例えばエピシフターのレベルまたは活性）を間接的に調節する分子の発生によって評価することができる。
【０１４７】
本明細書に記載するエピメタボローム手法は、細胞微小環境に存在し、そのレベルが遺伝子機構、ｍＲＮＡ機構、またはタンパク質ベース機構を通じて検知および管理される内因性分子の同定を容易にする。本発明のエピシフターが引き起こす、正常細胞で見出される調節応答経路は、誤調節または罹患細胞環境における治療価値を提供し得る。加えて、本明細書に記載するエピメタボリック手法は、臨床患者選択における、疾患診断キットにおける、または予後指標としての使用のための診断指示を提供し得るエピシフターを同定する。
【０１４８】
ＩＩＩ．ＭＩＭ／エピシフターを同定するのに有用なアッセイ
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが：液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）、および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場２重収束型装置、透過型４重極装置、４重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置（ＴＯＦ）、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置（ＦＴ−ＭＳ）およびマトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）の使用を含むことが、さらに理解される。
【０１４９】
生体エネルギー分子レベルの定量
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル（例えばＡＴＰ、ピルビン酸、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ、アセチルＣｏＡ、ＦＡＤＨ２）の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）、蛍光、および／または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
【０１５０】
細胞内のＡＴＰのレベルは、当分野で公知のいくつかのアッセイおよび系を用いて測定することができる。例えば１つの系において、溶解細胞から放出された細胞質ＡＴＰは、ルシフェリンおよび酵素ルシフェラーゼと反応して、光を産生する。本生物発光はバイオルミノメータによって測定され、溶解細胞の細胞内ＡＴＰ濃度を計算することができる（ＥｎｚｙＬｉｇｈｔ（商標）ＡＴＰアッセイキット（ＥＡＴＰ−１００）、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）。別の系において、例えばＡＴＰおよびその脱リン酸化型のＡＤＰの両方が生物発光を介して計算される；ＡＴＰレベルが計算された後、ＡＤＰはＡＴＰに変換されて、次に同じルシフェラーゼ系（ＡｐｏＳＥＮＳＯＲ（商標）  ＡＤＰ／ＡＴＰ比アッセイキット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して検出および計算される。
【０１５１】
ピルビン酸塩は、細胞代謝経路において重要な中間体である。ピルビン酸塩は、細胞の代謝状態に応じて、糖新生を介して炭水化物に変換され得るか、アセチルＣｏＡを介して脂肪酸に変換もしくは代謝され得るか、またはアラニンもしくはエタノールに変換され得る。それゆえピルビン酸塩レベルの検出は、細胞試料の代謝性活性および状態の尺度を提供する。ピルビン酸塩を検出する１つのアッセイは例えば、比色および蛍光定量の両方を使用して、異なる範囲内でのピルビン酸濃度を検出する（ＥｎｚｙＣｈｒｏｍ（商標）ピルビン酸アッセイキット（カタログ番号ＥＰＹＲ−１００）、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）。
【０１５２】
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞中での生体エネルギー分子の発生および維持に関与している細胞中のミトコンドリアによって行われる、酸化的リン酸化のプロセスに影響を及ぼし得る。細胞培養物および試料の細胞エネルギー特性の変化を直接検出するアッセイ（後述する）に加えて、細胞中のミトコンドリアの別々の酵素および複合体に対する化合物の効果を検出および定量するアッセイが存在する。例えばＭＴ−ＯＸＣ  ＭｉｔｏＴｏｘ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＯＸＰＨＯＳ活性アッセイ（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）は、ミトコンドリアから抽出された複合体Ｉ〜Ｖに直接適用された化合物の効果を検出および定量することができる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉ）、シトクロムｃオキシダーゼ（複合体ＩＶ）およびＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）などの個別のミトコンドリア複合体に対する効果の検出および定量のアッセイも利用可能である（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
【０１５３】
細胞エネルギー特性の測定
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の１例は、分子酸素の消費および／または細胞培養物の培地のｐＨの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばＸＦ２４アナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ，Ｉｎｃ．）を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびｐＨ変化のリアルタイム検出が可能となる。ＸＦ２４アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度（ＯＣＲ）および解糖の尺度である細胞外酸化（ＥＣＡＲ）を測定および比較する。
【０１５４】
酸化的リン酸化およびミトコンドリア機能の測定
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ＡＴＰが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なＡＴＰ源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および／または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびＡＴＰ合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および／または同定され得る。
【０１５５】
酸化的リン酸化に関与するプロセスを行うミトコンドリア膜埋込みタンパク質複合体は、特異的タスクを実行し、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶとナンバリングされる。これらの複合体は、内膜貫通膜ＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖとしても公知）と共に、酸化的リン酸化プロセスに関与する主要な実体である。環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の、一般にミトコンドリア機能、および特に酸化的リン酸化プロセスに対する効果を検査できるアッセイに加えて、個別の複合体に対するエピシフターの効果を、他の複合体と別に検査するために使用できるアッセイが利用可能である。
【０１５６】
ＮＡＤＨ−コエンザイムＱオキシドレダクターゼまたはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとしても公知の複合体Ｉは、電子輸送鎖中の第１のタンパク質である。いくつかの実施形態において、複合体ＩによるＮＡＤ＋の産生に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば複合体は、９６ウェルプレート中の試料から免疫捕捉することができる；ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への酸化は、４５０ｎＭにて吸光度の上昇を有する染料分子の還元と同時に起こる（複合体Ｉ酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
【０１５７】
シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）としても公知の複合体ＩＶは、電子輸送鎖中の最後のタンパク質である。いくつかの実施形態において、シトクロムｃの酸化および複合体ＩＶによる酸素の水への還元に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えばＣＯＸをマイクロウェルプレート中で免疫捕捉して、ＣＯＸの酸化を比色アッセイ（複合体ＩＶ酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって測定することができる。
【０１５８】
酸化的リン酸化プロセスの最後の酵素は、他の複合体によって生成されたプロトン勾配を使用して、ＡＤＰからのＡＴＰの合成を促進する、ＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）である。いくつかの実施形態において、ＡＴＰシンターゼの活性に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば試料中のＡＴＰシンターゼの活性およびＡＴＰシンターゼの量はどちらも、マイクロウェル・プレート・ウェル中で免疫捕捉されたＡＴＰシンターゼについて測定され得る。酵素は、ある条件下でＡＴＰアーゼとしても機能することができ、それゆえＡＴＰシンターゼ活性についての本アッセイにおいて、ＡＴＰがＡＤＰに還元される速度は、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への同時酸化を検出することによって測定される。ＡＴＰの量は、ＡＴＰアーゼに標識された抗体を使用して計算される（ＡＴＰシンターゼ・デュプレクシング（活性＋量）マイクロプレート・アッセイ・キット、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。酸化的リン酸化の追加のアッセイは、複合体ＩＩおよびＩＩＩの活性に対する効果を試験するアッセイを含む。例えばＭＴ−ＯＸＣ  ＭｉｔｏＴｏｘ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＯＸＰＨＯＳシステム（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、複合体ＩＩおよびＩＩＩならびに複合体Ｉ、ＩＶおよびＶに対する効果を評価し、酸化的リン酸化系全体に対する化合物の効果についてのデータを提供することができる。
【０１５９】
上記のように、無処置細胞試料のリアルタイム観察は、細胞培養培地における酸素消費およびｐＨの変化のためのプローブを使用して行うことができる。細胞エネルギー特性のこれらのアッセイは、ミトコンドリア機能の大まかな概要および試料の細胞内のミトコンドリアの活性に対する潜在的環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の効果を提供する。
【０１６０】
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）の形成のために透過性の上昇を経験する現象である、ミトコンドリア膜透過性遷移（ＭＰＴ）にも影響を及ぼし得る。ミトコンドリア透過性の上昇は、ミトコンドリア膨潤、すなわち酸化的リン酸化およびＡＴＰ発生および細胞死の実行不能をもたらすことができる。ＭＰＴは、アポトーシスの誘導に関与し得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｈａｌｅｓｔｒａｐ，Ａ．Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３４：２３２−２３７（２００６）およびＬｅｎａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．７：１３−２６（２００９）を参照）。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ＭＰＴおよびＭＰＴＰの形成、中断および／または遂行に対する環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の効果の検出および定量が測定される。例えばアッセイは、ミトコンドリアおよび他のサイトゾルコンパートメントの内膜内に局在する特殊化染料分子（カルセイン）の使用を通じて検出することができる。別の分子、ＣｏＣｌ２の適用は、サイトゾル中でのカルセイン染料の蛍光をスケルチするよう働く。しかしＣｏＣｌ２はミトコンドリア内部にアクセスできず、それゆえＭＰＴが起こって、ＣｏＣｌ２がＭＰＴＰを介してミトコンドリア内部にアクセスできない限り、ミトコンドリア中のカルセイン蛍光はスケルチされない。ミトコンドリア特異的蛍光シグナルの消失は、ＭＰＴの発生を通知する。フローサイトメトリが使用されて、細胞および細胞小器官の蛍光を評価することができる（ＭｉｔｏＰｒｏｂｅ（商標）遷移孔アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。追加のアッセイは、実験結果を評価するために蛍光顕微鏡を利用する（Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）  ＬＩＶＥミトコンドリア遷移孔アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
【０１６２】
細胞増殖および炎症の測定
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞増殖および／または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリクスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
【０１６３】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、強力な血管新生特性、血管特性および分裂促進特性を有する成長因子である。ＶＥＧＦは内皮透過性および膨潤を刺激し、ＶＥＧＦ活性は、関節リウマチ、転移性癌、老年性黄斑変性および糖尿病性網膜症を含む多数の疾患および障害に関わっている。
【０１６４】
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、ＶＥＧＦの産生に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば低酸素条件またはアシドーシスを模倣する条件で維持された細胞は、ＶＥＧＦ産生の向上を呈するであろう。培地中に分泌されたＶＥＧＦは、ＥＬＩＳＡまたは、利用可能な抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用する他の抗体ベースアッセイを使用してアッセイすることができる。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、細胞のＶＥＧＦへの応答性に対するその効果に基づいておよび／またはＶＥＧＦ受容体の発現もしくは活性に対するその効果に基づいて同定および／または特徴付けされ得る。
【０１６５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、健常免疫系機能ならびに自己免疫疾患の両方に関わり、炎症および免疫系活性化の主要なメディエータである。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、ＴＮＦの産生または活性に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば培養細胞により産生され、培地中に分泌されたＴＮＦは、ＥＬＩＳＡおよび当分野で公知の他の抗体ベースアッセイを介して定量することができる。さらに、いくつかの実施形態において、環境影響因子は、ＴＮＦの受容体（ヒトＴＮＦ  ＲＩ  Ｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の発現に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。
【０１６６】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の構成要素は、細胞および組織の構造ならびにシグナル伝達プロセスの両方において役割を果たす。例えば潜在型形質転換成長因子ベータ結合タンパク質は、ＥＣＭ内に形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）のリザーバを生成するＥＣＭ構成要素である。マトリクス結合ＴＧＦβは、マトリクス再構築のプロセスの間に放出され、付近の細胞に成長因子効果を及ぼすことができる（Ｄａｌｌａｓ，Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：２３１−２４３（２０００））。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、培養された細胞のＥＣＭの生成に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。研究者らは、細胞によるＥＣＭの生成、ならびにＥＣＭの組成を研究および定量することができる技法を開発してきた。例えば細胞によるＥＣＭの合成は、インキュベーションの前に細胞をハイドロゲルに埋込むことによって評価することができる。細胞によって発生したＥＣＭに対する生化学的分析および他の分析は、細胞収集およびハイドロゲルの消化の後に遂行される（Ｓｔｒｅｈｉｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ，Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５２２：３４９−３６２（２００９））。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、生物中のＥＣＭまたはその構成要素の１つの産生、状態または欠失に対する環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の効果は同定および特徴付けされ得る。別々の種類の細胞中でまたは発生のあるステージにおいてのみ特定のＥＣＭ遺伝子のノックアウトを可能にする条件的ノックアウト（ＫＯ）マウスを生成する技法が開発されている（Ｂｒａｎｃａｃｃｉｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．５２２：１５−５０（２００９））。特定の組織中でまたは発生の特定のステージにおける特定のＥＣＭ構成要素の活性または非存在に対するエピシフターまたは潜在的エピシフターの適用または投与の効果は、それゆえ評価され得る。
【０１６９】
原形質膜完全性および細胞死の測定
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および／または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
【０１７０】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のアッセイは、細胞ステータスおよび損傷のレベルの測定を提供することができる。ＬＤＨは、安定で比較的豊富な細胞質酵素である。原形質膜が物理的完全性を失うとき、ＬＤＨは細胞外コンパートメントへ逃れる。ＬＤＨのより高い濃度は、原形質膜損傷および細胞死のより高いレベルと相関する。ＬＤＨアッセイの例は、試料中のＬＤＨのレベルを検出および定量する比色系を使用し、テトラゾリウム塩の還元型がＬＤＨ酵素の活性を介して産生されるアッセイを含む（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）乳酸デヒドロゲナーゼキット（ＤＬＤＨ−１００）、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ；ＬＤＨ細胞傷害性検出キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。
【０１７１】
アポトーシスは、多種多様の異なる開始イベントを有し得るプログラムされた細胞死のプロセスである。いくつかのアッセイを使用して、アポトーシスを受ける細胞の速度および／または数の変化を検出することができる。アポトーシスを検出および定量するために使用される１種類のアッセイは、カスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）アッセイである。カスパーゼ（Ｃａｐａｓｅ）は、アポトーシスの間のタンパク質分解切断を介して活性化される、アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼである。活性化カスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）を検出するアッセイの例は、ＰｈｉＰｈｉＬｕｘ（登録商標）（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。比較試料中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージまたは数の変化を検出できる追加のアッセイは、ＴＵＮＥＬ／ＤＮＡ断片化アッセイを含む。これらのアッセイは、アポトーシスの実行段階の間にヌクレアーゼによって発生した１８０〜２００塩基対ＤＮＡフラグメントを検出する。例示的なＴＵＮＥＬ／ＤＮＡ断片化は、インサイチュ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＤｅａｄＥｎｄ（商標）比色および蛍光定量ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。
【０１７２】
いくつかのアポトーシスアッセイは、アポトーシスおよび／または非アポトーシス状態に関連するタンパク質を検出および定量する。例えばＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、単一基質の蛍光定量（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）システムを使用して、生細胞および死細胞に特異的なプロテアーゼを検出および定量し、それゆえ細胞または組織試料における生細胞の、アポトーシスを受けた細胞に対する比を提供する。
【０１７３】
アポトーシスを検出または定量するために利用可能な追加のアッセイは、細胞透過性（例えばＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）アポトーシスアッセイ、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、ＵＫ）およびアネキシンＶについてのアッセイ（例えばアネキシンＶ−ビオチンアポトーシス検出キット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を含む。
【０１７４】
ＩＶ．腫瘍性障害の処置
本発明は、腫瘍性障害を処置または予防するのに十分な量の環境影響因子をヒトに投与して、これにより腫瘍性障害を処置または予防することを含む、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。１実施形態において、環境影響因子はＣｏＱ１０でない。
【０１７５】
本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」は、限定されるわけではないが：白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、ヒトに見出されるあらゆる種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語または専門語は、互換的におよび単数形または複数形のどちらかで使用され、これらを宿主生物に対して病的にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換の部位付近から得た細胞）は、十分に確立された技法、特に組織学的検査によって、非癌性細胞からただちに区別することができる。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけではなく、癌幹細胞、ならびに癌前駆細胞または癌祖先細胞に由来するいずれの細胞も含む。これは転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および株化細胞を含む。固形腫瘍として正常に現れる癌細胞の種類に言及するとき、「臨床的検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて；例えばＣＡＴスキャン、ＭＲ画像、Ｘ線、超音波もしくは触診、などの手順によって検出可能であるおよび／または患者から入手可能な試料中の１つ以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能である腫瘍である。
【０１７６】
「肉腫」という用語は概して、胚性結合組織のような物質から成り、概して線維物質または均質物質に埋込まれた密に充填された細胞から構成される腫瘍を指す。本発明の環境影響因子によって処置できる肉腫の例は、限定されるわけではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバネシー（Ａｂｍｅｔｈｙ’ｓ）肉腫、脂肪肉腫、リポ肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛癌腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽細胞肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細管拡張性（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ）肉腫を含む。
【０１７７】
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。本発明の環境影響因子によって処置できる黒色腫は、限定されるわけではないが、例えば末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫を含む。
【０１７８】
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。本発明の環境影響因子によって処置できる癌腫は、限定されるわけではないが、例えば腺房癌腫、腺房細胞癌腫、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫性癌腫、副腎皮質の癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ）癌腫、基底細胞（ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）癌腫、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ）癌腫、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、コロイド癌腫、面皰癌腫、子宮体癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、硬癌腫、胎児性癌腫、脳様癌腫、類表皮（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ）癌腫、腺様上皮癌腫、外向発育癌腫、潰瘍癌腫、線維（ｆｉｂｒｏｓｕｍ）癌腫、膠様（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ）癌腫、膠様（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ）癌腫、巨細胞（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ）癌腫、巨細胞（ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血性（ｈｅｍａｔｏｉｄ）癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫、明細胞腺（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ）癌腫、小児胎児性癌腫、上皮内癌腫、表皮内癌腫、上皮内癌腫、Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ癌腫、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ）癌腫、レンズ状（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）癌腫、脂肪性癌腫、リンパ上皮癌腫、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫、軟癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫、粘液分泌癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌腫、粘液性類表皮癌、粘膜癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘膜癌腫（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、上咽頭癌、燕麦細胞、骨化性癌腫、類骨癌腫、乳頭状癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、有棘細胞癌腫、粥状癌腫（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎細胞癌腫、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド（ｓｏｌａｎｏｉｄ）癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、ストリング癌腫（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張性癌腫、毛細管拡張症様癌腫、移行細胞癌腫、結節状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節状癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、いぼ状癌腫、および絨毛癌腫を含む。
【０１７９】
一般に環境影響因子は、いずれの新生物も予防的にまたは治療的に処置するために使用され得る。１実施形態において、本発明の環境影響因子は、固形腫瘍を処置するために使用される。本発明の各種の実施形態において、環境影響因子（例えばＣｏＱ１０）は、各種の種類の皮膚癌（例えば扁平上皮細胞癌腫または基底細胞癌腫）、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、または骨癌の処置に使用される。１実施形態において、環境影響因子、例えばＣｏＱ１０は、限定されるわけではないが、扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣＩＳ（上皮内）およびさらに侵襲性扁平上皮細胞癌腫を含む）、基底細胞癌腫（表在癌腫、結節性癌腫および浸潤性基底細胞癌腫を含む）、黒色腫、および光線性角化症を含む、皮膚腫瘍性障害の処置に使用される。しかし、環境影響因子を使用する処置は、上述の種類の癌に限定されない。環境影響因子を用いた処置に適する癌の例は、限定されるわけではないが、脳腫瘍、頭部頸部癌、前立腺癌、乳癌、精巣癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、中皮腫、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、肉腫、骨癌、胃癌および髄芽細胞腫を含む。
【０１８０】
本発明の環境影響因子によって処置することができる追加の癌は、例えばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵島細胞腺腫、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌を含む。１実施形態において、環境影響因子、例えばＣｏＱ１０によって処置することができる腫瘍性障害または癌は、黒色腫ではない。
【０１８１】
本発明は、腫瘍性障害に罹患しているヒト対象を選択することと、グルコースの嫌気的使用の遮断およびミトコンドリア酸化的リン酸化の増強が可能であるｅｎｖ影響因子の治療的有効量を前記ヒトに投与して、これにより腫瘍性障害を処置または予防することとを含む、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法をさらに提供する。
【０１８２】
癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、嫌気的解糖（例えばサイトゾルにおける解糖とそれに続く乳酸発酵）、好気的解糖もしくはミトコンドリア酸化的リン酸化（例えばミトコンドリアにおける解糖とそれに続くピルビン酸の酸化）、または嫌気的解糖および好気的解糖の組合せによってエネルギーを産生する癌細胞を含むことを意図する。１実施形態において、癌細胞は、主に嫌気的解糖によってエネルギーを産生する（細胞のエネルギーの例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上が嫌気的解糖によって産生される）。１実施形態において、癌細胞は、主に嫌気的解糖によってエネルギーを産生する（細胞のエネルギーの例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上が嫌気的解糖によって産生される）。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する細胞および好気的解糖によってエネルギーを産生する細胞を備える癌細胞集団または癌細胞の混合物を含むことも意図される。１実施形態において、癌細胞集団は、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する細胞を主に備える（集団の細胞の例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上が嫌気的解糖によってエネルギーを産生する）。１実施形態において、癌細胞集団は、好気的解糖によってエネルギーを産生する細胞を主に備える（集団の細胞の例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）。
【０１８３】
本明細書で使用する場合、「グルコース嫌気的使用」または「嫌気的解糖」または「解糖経路」という句は、サイトゾルでの解糖によるエネルギーの細胞産生とそれに続く乳酸発酵を指す。例えば多くの癌細胞は、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する。
【０１８４】
本明細書で使用する場合、「好気的解糖」または「ミトコンドリア酸化的リン酸化」は、ミトコンドリアでの解糖によるエネルギーの細胞産生とそれに続くピルビン酸の酸化を指す。
【０１８５】
本明細書で使用する場合、「グルコースの嫌気的使用の遮断およびミトコンドリア酸化的リン酸化の増強が可能である」または「解糖経路からミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｏｎｄｒｉａｌ）酸化的リン酸化へのシフト」という句は、環境影響因子（例えばエピメタボリックシフター）の、嫌気的解糖から好気的解糖またはミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞の代謝状態のシフトまたは変化を誘導する能力を指す。本明細書で使用する場合、「（解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への）シフト」は、好ましくは正常細胞で見られるレベルに向かう、解糖経路に対するエネルギー依存性の低下を指す。同時に（Ｃｏｎｃｏｍｍｉｔｔａｎｔｌｙ）、ミトコンドリア酸化的リン酸化の絶対レベルは低減または低下もし得るが、好ましくはミトコンドリア酸化的リン酸化の効率向上と関連している。
【０１８６】
本発明のいくつかの実施形態において、処置される腫瘍性障害は、治療的有効レベルでの活性剤の全身送達を期待した局所投与を介して通例処置される障害ではない。本明細書で使用する場合、「局所投与を介して通例処置される障害ではない」という句は、局所投与を介して治療剤によって通例または日常的に処置されないが、むしろ例えば静脈内投与を介して治療剤によって通例処置される腫瘍性障害を指す。局所投与を介して通例処置されない腫瘍性障害は、限定されるわけではないが、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、および骨癌を含む。
【０１８７】
本発明は、より低い侵襲性癌または非侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンよりも低い選択された用量で環境影響因子をヒトに投与することと、これにより侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンを超える選択されたより高い用量で環境影響因子をヒトに投与することと、これにより非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
【０１８８】
本明細書で使用する場合、「侵襲性腫瘍性障害」という用語は、急成長腫瘍を包含する腫瘍性障害を指す。侵襲性腫瘍性障害は通例、治療処置に応答しない、または不十分にしか応答しない。侵襲性腫瘍性障害の例は、限定されるわけではないが、膵臓癌腫、肝細胞癌腫、ユーイング肉腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、脳腫瘍（星状細胞腫、神経膠芽腫）、神経内分泌癌、結腸癌、肺癌、骨肉腫、アンドロゲン非依存性前立腺癌、卵巣癌および非ホジキンリンパ腫を含む。
【０１８９】
本明細書で使用する場合、「非侵襲性腫瘍性障害」という用語は、低成長腫瘍を包含する腫瘍性障害を指す。非侵襲性腫瘍性障害は通例、治療処置に有利にまたは中程度に応答する。非侵襲性腫瘍性障害の例は、限定されるわけではないが、非転移性乳癌、アンドロゲン依存性前立腺癌、小細胞肺癌および急性リンパ球性白血病を含む。１実施形態において、非侵襲性腫瘍性障害は、侵襲性腫瘍性障害でないいずれの腫瘍性障害も含む。
【０１９０】
侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるＣｏＱ１０の低い用量は、より低い侵襲性または非侵襲性の腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも低い投薬量を含むことを意図する。各種の実施形態において、選択されるＣｏＱ１０のより低い投薬量は、より低い侵襲性または非侵襲性の腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも、約１．５倍低い、約２倍低い、約３倍低い、約４倍低い、約５倍低いまたは約１０倍低い。選択されるＣｏＱ１０のより低い投薬量は、より低い侵襲性または非侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される処置時間または投与プロトコルと比較して、ＣｏＱ１０のより短い処置時間（例えば１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍または１０倍短い処置時間）またはＣｏＱ１０のより低頻度の投与（例えば半分の頻度、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍または２４倍低い頻度）を含むことが理解されるであろう。各種の実施形態において、侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるコエンザイムＱ１０のより低い投薬量は、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０００１〜約５．０ｍｇ、約０．００１〜約１．０ｍｇ、約０．００１〜約０．５ｍｇ、約０．００１〜約０．４ｍｇ、約０．００１〜約０．３０ｍｇ、約０．００１〜約０．２５ｍｇ、約０．００１〜０．２０ｍｇ、約０．００１〜約０．１２ｍｇ、または約０．００１〜約０．０９ｍｇを含む。他の実施形態において、コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０００１ｍｇ、０．００１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．１１ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１３ｍｇ、０．１４ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．１６ｍｇ、０．１７ｍｇ、０．１８ｍｇ、０．１９ｍｇ、０．２０ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．２２ｍｇ、０．２３ｍｇ、０．２４ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．２６ｍｇ、０．２７ｍｇ、０．２８ｍｇ、０．２９ｍｇ、０．３０ｍｇ、０．３１ｍｇ、０．３２ｍｇ、０．３３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．３６ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．３８ｍｇ、０．３９ｍｇ、０．４０ｍｇ、０．４１ｍｇ、０．４２ｍｇ、０．４３ｍｇ、０．４４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．４６ｍｇ、０．４７ｍｇ、０．４８ｍｇ、０．４９ｍｇまたは０．５ｍｇの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．００５〜約０．０９ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０１９１】
非侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるＣｏＱ１０のより高い投薬量は、侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも高い投薬量を含むことを意図される。各種の実施形態において、選択されるＣｏＱ１０のより高い投薬量は、侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍または約１０倍高い。選択されるＣｏＱ１０のより低い投薬量は、侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される処置時間または投与プロトコルと比較して、ＣｏＱ１０のより長い処置時間（例えば１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍または１０倍長い処置時間）またはＣｏＱ１０のより高い頻度の投与（例えば１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍または２４倍高い頻度）を含むことが理解されるであろう。各種の実施形態において、侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるコエンザイムＱ１０のより高い用量は、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．００１〜約１０．０ｍｇ、約０．００５〜約１０．０ｍｇ、約０．０１〜約１０．０ｍｇ、約０．０５〜約５．０ｍｇ、約０．０５〜約２．０ｍｇ、約０．０５〜約１．０ｍｇ、約０．０５〜約０．７ｍｇ、約０．１０〜約０．５０ｍｇ、または約０．１２〜０．５ｍｇを含む。他の実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．００１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．１１ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１３ｍｇ、０．１４ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．１６ｍｇ、０．１７ｍｇ、０．１８ｍｇ、０．１９ｍｇ、０．２０ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．２２ｍｇ、０．２３ｍｇ、０．２４ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．２６ｍｇ、０．２７ｍｇ、０．２８ｍｇ、０．２９ｍｇ、０．３０ｍｇ、０．３１ｍｇ、０．３２ｍｇ、０．３３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．３６ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．３８ｍｇ、０．３９ｍｇ、０．４０ｍｇ、０．４１ｍｇ、０．４２ｍｇ、０．４３ｍｇ、０．４４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．４６ｍｇ、０．４７ｍｇ、０．４８ｍｇ、０．４９ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇまたは１．０ｍｇの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．１５〜約０．５ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０１９２】
１実施形態において、本発明の環境影響因子は、腫瘍サイズを縮小する、腫瘍増殖を阻害する、および／または腫瘍担持対象の生存時間を延長する。したがって本発明は、ヒトまたは他の動物の腫瘍を、このようなヒトまたは動物に環境影響因子の有効な非毒性量を投与することによって処置する方法にも関する。当業者は、所定の実験によって、悪性腫瘍を処置する目的での環境影響因子の有効な非毒性量を決定できるであろう。例えば環境影響因子の治療的活性量は、疾患ステージ（例えばステージＩ対ステージＩＶ）、対象の年齢、性別、医学的合併症（例えば免疫抑制性症状または疾患）および体重、ならびに環境影響因子が対象において望ましい応答を誘導する能力などの因子に従って変動し得る。投薬レジメンは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、複数の分割用量が毎日投与され得る、または用量は、治療状況の緊急性によって指示されるように比例的に低減され得る。
【０１９３】
Ｖ．腫瘍性障害の治療ターゲット
本発明は、腫瘍性障害の治療ターゲットを同定する方法を提供する。本発明は、このような方法によって同定された治療ターゲットをさらに提供する。治療ターゲットの同定は概して、ｅｎｖ影響因子または候補ｅｎｖ影響因子の細胞または株化細胞のパネルへの外因性適用、および続いての、処置細胞に対して誘導された変化の、未処置細胞と比較した評価を包含する。監視される誘導された細胞変化は、限定されるわけではないが、細胞の形態、生理機能または組成物、例えばＲＮＡ、タンパク質、脂質または代謝産物のレベルに対する変化を含む。候補ｅｎｖ影響因子による処置の結果として誘導された細胞変化は、本明細書に記載するアッセイのいずれを使用しても監視することができる。例えばｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の変化はリアルタイムＰＣＲアレイによって評価することができるが、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は抗体マイクロアレイおよび２次元ゲル電気泳動を使用することによって監視することができる。候補ｅｎｖ影響因子によって調節されているとして（例えばｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで）同定された遺伝子は次に、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ＩＰＡソフトウェア）からおよび公知の文献の検討によって評価される。潜在的な治療ターゲットとして同定された遺伝子を次に、ウェスタンブロット分析、ｓｉＲＮＡノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。次にスクリーニングアッセイを使用して、ターゲットのモジュレーターを同定することができる。治療ターゲットのモジュレーターは、腫瘍性障害の新規治療剤として有用である。治療ターゲットのモジュレーターは、本明細書で詳細に記載するスクリーニングアッセイを使用して、または当業者に公知の所定の方法を使用することによって、日常的に同定することができる。
【０１９４】
ＭＩＭ／エピシフター、ＣｏＱ１０によって調節されている（例えばｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのどちらかで上方調節または下方調節されている）として本明細書で同定された遺伝子は、本発明の薬物ターゲットである。本発明の薬物ターゲットは、限定されるわけではないが、続いて本明細書の表１〜２８に続いて挙げられた遺伝子を含む。出願人によって本明細書に記載された実験の結果に基づいて、Ｑ１０によって調節された主要なタンパク質は、転写因子、アポトーシス応答、ペントースリン酸経路、生合成経路、酸化ストレス（酸化促進物質）、膜改変、および酸化的リン酸化代謝を含む異なる経路または分子の群に関連する、または分類することができる。本明細書で提供された結果に基づいて、ＣｏＱ１０によって調節される主要なタンパク質は下のようにまとめられる。ＣｏＱ１０によって調節され、転写因子である主要なタンパク質は、ＨＮＦ４アルファである。ＣｏＱ１０によって調節され、アポトーシス応答に関連する主要なタンパク質は、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、およびｃＭｙｃを含む。ＣｏＱ１０によって調節され、ペントースリン酸経路に関連する主要なタンパク質は、トランスアルドラーゼ１である。ＣｏＱ１０によって調節され、生合成経路に関連する主要なタンパク質は、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼおよび４−ヒドロキシベンゾエートを含む。ＣｏＱ１０によって調節され、酸化ストレス（酸化促進物質）に関連する主要なタンパク質は、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａおよびスーパーオキシドディスムターゼ２（ミトコンドリア）を含む。ＣｏＱ１０によって調節され、酸化的リン酸化代謝に関連する主要なタンパク質は、シトクロムｃ、複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩおよび複合体ＩＶを含む。ＣｏＱ１０によって直接または間接的に調節されるさらなる主要なタンパク質は、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩを含む。
【０１９５】
したがって、本発明の１実施形態において、薬物ターゲットはＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体１、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩを含み得る。好ましい実施形態において、薬物ターゲットはＨＮＦ４Ａ、トランスアルドラーゼ、ＮＭ２３およびＢＳＣｖを含み得る。１実施形態において、薬物ターゲットはＴＮＦ４Ａである。１実施形態において、薬物ターゲットはトランスアルドラーゼである。１実施形態において、薬物ターゲットはＮＭ２３である。１実施形態において、薬物ターゲットはＢＳＣｖである。同定された薬物ターゲットのモジュレーターを同定するのに有用なスクリーニングアッセイが下に記載される。
【０１９６】
ＶＩ．スクリーニングアッセイ
本発明は、本発明の同定された治療ターゲットの発現および／または活性を調節する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または薬剤（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小型分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）も提供する。このようなアッセイは通例、本発明の治療ターゲットと１つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を備える。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組合せのどちらかであり得る。本明細書に記載するアッセイなどのアッセイを介して同定された化合物は、腫瘍性障害を処置または予防するのに有用であり得る。
【０１９７】
本発明のスクリーニングアッセイで使用される試験化合物は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリーを含む、いずれの利用可能な供給源からも取得され得る。試験化合物はまた：生物ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの官能基を有するが、酵素分解の抵抗性であるが、それにもかかわらず生物活性を保持する新規の非ペプチド主鎖を持つ、分子のライブラリー；例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５を参照）；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用するライブラリー法を含む、当分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の手法のいずれによっても取得され得る。生物ライブラリーおよびペプトイドライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されているが、他の４つの手法は化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは小型分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１９８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出すことができる。
【０１９９】
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏ技法ｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌および／もしくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ，ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、プラスミドの上に（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージの上に（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ、上掲）提供され得る。
【０２００】
本発明のスクリーニング方法は、細胞を試験化合物と接触させることと、試験化合物が細胞中での本発明の治療ターゲットの発現および／または活性を調節する能力を決定することとを備える。本発明の治療ターゲットの発現および／または活性は、本明細書に記載するように決定することができる。本発明の治療ターゲットの発現および／または活性は、当業者に公知の所定の方法によっても決定することができる。１実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および／または活性を上昇させるその能力に基づいて選択される。１実施形態において、化合物は、表１〜２８に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および／または活性を上昇させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはＣｏＱ１０によって上方調節されている（例えば正の倍率変化を呈する）。１実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および／または活性を低下させるその能力に基づいて選択される。１実施形態において、化合物は、表１〜２８に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および／または活性を低下させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはＣｏＱ１０によって下方調節されている（例えば負の倍率変化を呈する）。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。また別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分に結合する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物が治療ターゲットに直接結合する能力を決定することは、例えば、化合物の薬物ターゲットへの結合が複合体中の標識マーカー化合物を検出することによって決定できるように、化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングすることによって達成することができる。例えば化合物（例えばマーカー基質）に１３１Ｉ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈを直接または間接的のどちらかで標識して、放射性同位体を電波放出の直接カウントによってまたはシンチレーションカウントによって検出することができる。あるいはアッセイ構成要素に例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを酵素標識して、酵素標識を適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
【０２０２】
本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤にさらに関する。したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載するように同定された薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば本明細書に記載するように同定された本発明のマーカーの発現および／または活性を調節することができる薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤を用いた処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは本明細書に記載するように同定された薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤の作用機序を決定することができる。さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された、上記処置のための新規薬剤の使用に関する。
【０２０３】
ＶＩＩ．製薬組成物および製薬的投与
本発明の環境影響因子を対象への投与に好適な製薬組成物中に組み入れることができる。通例、製薬組成物は、本発明の環境影響因子および製薬的に許容され得る担体を備える。本明細書で使用する場合、「製薬的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同様のものを含む。製薬的に許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、ならびにその組合せを含む。多くの場合において、等張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。製薬的に許容され得る担体は、環境影響因子の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液などの微量の補助物質をさらに含み得る。
【０２０４】
本発明の組成物は、多種多様の形であり得る。これらは例えば、液体剤（例えば注射用および輸液用液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤、クリーム、ローション、リニメント剤、軟膏またはペースト剤、眼、耳または鼻に投与するための滴剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体投薬形を含む。好ましい形は、投与および治療用途の所期の様式に依存する。
【０２０５】
本発明の環境影響因子は、当分野で公知の多種多様の方法によって投与することができる。多くの治療用途では、好ましい投与経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または輸液である。当業者によって認識されるように、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。ある実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、高速放出から化合物を保護するであろう担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許が取得されているか、または概して当業者に公知である。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照。１実施形態において、投与様式は非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１実施形態において、環境影響因子は、静脈内輸液または注射によって投与される。別の実施形態において、環境影響因子は、筋肉内または皮下注射によって投与される。好ましい実施形態において、環境影響因子は局所投与される。
【０２０６】
治療組成物は通例、製造および貯蔵条件下で滅菌および安定性でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルション、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤することができる。滅菌注射用液剤は、要求される量の活性化合物（すなわち環境影響因子）を、必要に応じて上で列挙した各種の他の成分を含む適切な溶媒に組み入れ、それに続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒および上に列挙されたものから要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌凍結乾燥粉剤の場合、好ましい調製方法は、その先に滅菌濾過した溶液から活性成分およびいずれかの追加の望ましい成分の粉剤を産する、真空乾燥および噴霧乾燥技法である。液剤の適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射用組成物の延長吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０２０７】
技法および製剤は一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
【０２０８】
経口投与では、製薬組成物は、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬的に許容され得る賦形剤を用いて慣習的な手段によって調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形をとり得る、またはこれらは、使用前の水または他の好適なビヒクルによる構成のための無水生成物として提供され得る。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えばアチオンド油（ａｔｉｏｎｄ  ｏｉｌ）、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬的に許容され得る添加剤を用いて慣習的な手段によって調製され得る。調製物は必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
【０２０９】
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように好適に製剤され得る。頬側投与では、組成物は、慣習的な方式で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形を取り得る。吸入による投与では、本発明による使用のための化合物は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用による加圧パックまたはネブライザからのエアゾールスプレー提供の形で便利に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達する弁を設けることによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースの粉末ミックスを含有して製剤され得る。
【０２１０】
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射用製剤は、保存料が添加されて、単位投薬形で、例えばアンプルでまたは複数用量容器で与えられ得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤としてのこのような形を取り得て、懸濁化剤、安定剤および／または分散化剤などの製剤化剤を含有し得る。あるいは活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水による構成のための粉末形であり得る。
【０２１１】
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの慣習的な坐剤用ベースをを含有する、坐剤または留置浣腸などの経直腸組成物としても製剤され得る。
【０２１２】
先に記載した製剤に加えて、化合物はデポー調製物としても調合され得る。このような長期作用型製剤は、インプラントによって（例えば皮下的にまたは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与され得る。それゆえ、例えば化合物は、好適なポリマー材料または疎水性材料（例えば許容され得る油中の乳剤として）もしくはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤され得る。
【０２１３】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても可能である。経粘膜または経皮投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知であり、含む，例えば経粘膜投与のためには、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含み、加えて洗剤が透過を容易にするために使用され得る。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用により得る。局所投与では、本発明の化合物は、概して当分野で公知の軟膏、塗布剤、ゲル、またはクリームに製剤される。洗浄液を局所的に使用して、傷害または炎症を処置し、治癒を加速することができる。
【０２１４】
組成物は所望ならば、活性成分を含有する１つ以上単位投薬形を含有し得るパックまたはディスペンサデバイスで与えられ得る。パックは例えば、金属箔またはブリスターパックなどのプラスチック箔を備え得る。パックまたはディスペンサデバイスは、投与のための説明書が添付され得る。
【０２１５】
核酸の投与を包含する療法では、全身および局所または局在投与を含む多種多様の投与様式のために、本発明の化合物を製剤することができる。技法および製剤は一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、結節内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
【０２１６】
１実施形態において、環境影響因子を備える組成物は局所投与される。活性成分、すなわちｅｎｖ影響因子を製薬的製剤として与えることが好ましい。活性成分は、局所投与のの場合、最終生成物において製剤の重量で約０．００１％〜約２０％ｗ／ｗを構成し得るが、活性成分は製剤の３０％ｗ／ｗ、好ましくは約１％〜約２０％ｗ／ｗをも構成し得る。本発明の局所製剤は、活性成分を１つ以上のそのための許容され得る担体および場合によりその他の治療成分と共に備える。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味で、「許容され得る」べきである。
【０２１７】
目的の障害を呈している患者を処置するにあたって、これらのような１つまたは複数の薬剤の治療的有効量が投与される。治療的有効用量は、患者における症候の改善または生存の延長を生じる化合物の量を指す。
【０２１８】
このような化合物の毒性および治療有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にとって治療的有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物の標準製薬手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、治療指数は比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を呈する化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から取得したデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を製剤するのに使用することができる。このような化合物の投薬量は好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に存在する。投薬量は、用いた投薬形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０２１９】
本発明の方法で使用されるいずれの化合物でも、治療的有効用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば用量は、細胞培養で決定されたようなＩＣ５０を含む循環血漿濃度を達成する動物モデルにおいて、製剤することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより的確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定され得る。
【０２２０】
正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の症状を考慮して個別の医師によって選定されることができる（例えばＦｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照）。担当医が毒性、または器官障害のために投与を中止、中断、または調整する方法および時点を理解していることに注目すべきである。反対に、担当医は（毒性を除く）臨床応答が十分でなかった場合に、処置をより高レベルに調整することも理解しているであろう。目的の発癌（ｏｎｅｏｇｅｎｉｃ）障害の管理における投与用量の大きさは、処置される症状の重症度および投与経路によって変動するであろう。症状の重症度は、例えば一部は、標準予後評価方法によって評価され得る。さらに用量およびおそらく投薬頻度も、個別の患者の年齢、体重、および応答によって変動するであろう。獣医学において、上述のプログラムに匹敵するプログラムが使用され得る。
【０２２１】
処置されている特異的症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
【０２２２】
上記の組成物は、いずれの好適な製剤中でも対象に投与され得る。ＣｏＱ１０の局所製剤による腫瘍性障害の処置に加えて、本発明の他の態様において、ＣｏＱ１０は他の方法によって送達されるかもしれない。例えば、ＣｏＱ１０は非経口送達のために、例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腫瘍内注射のために製剤されるかもしれない。送達の他の方法、例えばリポソーム送達または組成物を含浸させたデバイスからの拡散が使用されるかもしれない。組成物は、単回ボーラス、複数回注射で、または連続輸液によって（例えば静脈内にまたは腹膜透析によって）によって投与され得る。非経口投与では、組成物は好ましくは、発熱物質を含まない滅菌形で製剤される。本発明の組成物は、組成物を細胞が含有されている流体に単に添加することによって、（例えばインビトロ培養物中の癌細胞のアポトーシスを誘導するために）インビトロで細胞に投与することもできる。
【０２２３】
処置されている特異的症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
【０２２４】
注射では、本発明の薬剤は水溶液で、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液、または生理学的生理食塩水緩衝液で製剤され得る。このような経粘膜投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知である。
【０２２５】
本発明の実施のために本明細書で開示された化合物を全身投与に好適な投薬形に製剤するための、製薬的に許容され得る担体の使用は、本発明の範囲内である。担体の適正な選出および好適な製造実施によって、本発明の組成物、特に液剤として製剤された組成物は、静脈内注射になどによって非経口的に投与され得る。化合物は、当分野で周知の製薬的に許容され得る担体を使用して、経口投与に好適な投薬形にただちに製剤することができる。このような担体によって、本発明の化合物を処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤することができる。
【０２２６】
細胞内投与されることを意図される薬剤は、当業者に周知の技法によって投与され得る。例えばこのような薬剤は、リポソーム中に封入され、次に上記のように投与され得る。リポソームは、水性の内部を有する球状脂質２重層である。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在するすべての分子は、水性の内部に組み入れられる。リポソームの内容物は、外部微小環境から保護されながらも、リポソームが細胞膜と融合するために、細胞質中に効率的に送達される。加えて、小型有機分子は、その疎水性のために、細胞内に直接投与され得る。
【０２２７】
本発明での使用に好適な製薬組成物は、その所期の目的を達成する有効量で含有されている組成物を含む。有効量の決定は、とりわけ本明細書で提供された詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。活性成分に加えて、これらの製薬組成物は、製薬的に使用することができる活性化合物の調製物への処理を容易にする賦形剤および助剤を備えた、好適な製薬的に許容され得る担体を含有し得る。経口投与用に製剤された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または液剤の形であり得る。本発明の製薬組成物は、それ自体公知である方式で、例えば慣習的混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、浮上、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
【０２２８】
局所投与に好適な製剤は、皮膚を通じた処置が必要である部位への浸透に好適なリニメント剤、液剤、クリーム、軟膏またはペースト剤、および眼、耳または鼻への投与に好適な滴剤などの液体または半液体調製物を含む。本発明による滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁剤を備え得て、殺菌剤および／または殺真菌剤および／またはその他の好適な保存料の、および好ましくは表面活性界面活性剤を含む好適な水溶液に、活性成分を溶解することによって調製され得る。得られた溶液は次に、濾過によって清澄および滅菌され、無菌技法によって容器に移され得る。滴剤への包含に好適な殺菌剤および殺真菌剤は、硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性液剤の調製に好適な溶媒は、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
【０２２９】
本発明によるローションは、皮膚または眼への適用に好適なローションを含む。眼用ローションは、場合により殺菌剤を含有する滅菌水溶液を備え得て、液剤の調製方法に類似した方法によって調製され得る。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤は、アルコールもしくはアセトンなどの乾燥を促進して皮膚を冷やす薬剤および／またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油も含み得る。
【０２３０】
本発明によるクリーム、軟膏またはペースト剤は、外部適用のための活性成分の半固体製剤である。これらは単独のまたは水性もしくは非水性流体による溶液または懸濁液中の微粉化形または粉末化形の活性成分を、好適な機械を用いてグリースまたは非グリース基剤と混合することによって作製され得る。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸；滑粘薬；アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然源の油；羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールなどのアルコールまたはマクロゲルと共にステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸を備え得る。製剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤またはソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの非イオン性界面活性剤などのいずれの好適な界面活性剤も組み入れ得る。天然ゴム、セルロース誘導体などの懸濁化剤またはケイ質（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ）シリカなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分も含まれ得る。
【０２３１】
非経口投与のための製薬的製剤は、水溶形の活性化合物の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油など脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪油、またはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有し得る。場合により、懸濁剤は、高濃度の液剤の調製を可能にするために、好適な安定剤または化合物の溶解性を上昇させる薬剤も含有し得る。
【０２３２】
経口使用のための製薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せて、場合により得られた混合物を粉砕し、所望の場合には錠剤または糖衣錠コアを取得するための好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理することによって取得することができる。好適な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望ならば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩が添加され得る。
【０２３３】
糖衣錠コアは、好適なコーティングを施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る、濃縮糖溶液が使用され得る。色素または顔料は、同定のためにまたは活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０２３４】
経口的に使用することができる製薬調製物は、ゼラチンで作製されたプッシュ・フィット・カプセル剤、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作製された軟シールカプセル剤を含む。プッシュ・フィット・カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤が添加され得る。
【０２３５】
組成物は所望ならば、緩衝液系を含むことができる。緩衝液系は、組成物のｐＨを望ましい範囲内に維持または緩衝するように選定される。「緩衝液系」または「緩衝液」という用語は本明細書で使用する場合、１つまたは複数の溶質剤であって、水溶液中にあるときに、酸または塩基がそれに添加された場合のｐＨ（または水素イオン濃度もしくは活性）の大きな変化に対してこのような溶液を安定させる溶質剤を指す。それゆえ上で指摘された範囲における開始時の緩衝ｐＨ値からのｐＨの抵抗または変化に関係する、１つまたは複数の溶質剤は周知である。無数の好適な緩衝剤があるが、リン酸カリウム１水和物が好ましい緩衝液である。
【０２３６】
製薬組成物の最終ｐＨ値は、生理学的に適合可能な範囲内で変動し得る。最終ｐＨ値は、ヒト皮膚を必ずしも刺激する値ではなく、好ましくは活性化合物、すなわちＣｏＱ１０の経皮輸送が促進されるような値である。ｐＨは、本制約に反することなく、ＣｏＱ１０化合物の安定性を改善し、必要なときには稠度を調整するように選択され得る。１実施形態において、好ましいｐＨ値は、約３．０〜約７．４、さらに好ましくは約３．０〜約６．５、最も好ましくは約３．５〜約６．０である。
【０２３７】
好ましい局所送達ビヒクルでは、組成物の残りの構成要素は、必然的に精製されている水、例えば脱イオン水である。このような送達ビヒクル組成物は、組成物の総重量に基づいて、約５０〜約９５パーセントを超える範囲の水を含有する。しかし存在する水の明確な量は重要ではなく、所望の粘度（通常約５０ｃｐｓ〜約１０，０００ｃｐｓ）および／または他の構成要素の濃度を取得するように調整することができる。局所送達ビヒクルは好ましくは、少なくとも約３０センチポイズの粘度を有する。
【０２３８】
他の公知の経皮浸透エンハンサを使用して、ＣｏＱ１０の送達を容易にすることもできる。例証的なのは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのスルホキシド；１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン（アゾン（商標）、Ｎｅｌｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．の登録商標）などの環式アミド；Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）Ｎ，Ｎ−ジエチルトルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルデカアミドなどのアミド；Ｎ−メチル−２−ピロリドン、２−ピロリドン、２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロリドンまたはその脂肪酸エステル、１−ラウリル−４−メトキシカルボニル−２−ピロリドン、Ｎ−タローアルキルピロリドンなどのピロリドンの誘導体；プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ヘキサントリオールなどのポリオール；オレイン酸、リノレン酸、ラウリン酸、吉草酸、ヘプタン酸、カプロン酸、ミリスチン酸、イソ吉草酸、ネオペンタン酸、トリメチルヘキサン酸、イソステアリン酸などの直鎖または分枝脂肪酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、オクタノール、オレイル、ステアリル、リノレイルなどのアルコール；ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤；塩化ベンザルコニウム、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、セチルトリメチル臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤；プロポキシ化ポリオキシエチレンエーテル、例えばポロキサマー２３１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８４など、エトキシ化脂肪酸、例えばツイン２０，Ｍｙｊｒ４５など、ソルビタン誘導体、例えばツイン４０、ツイン６０、ツイン８０、スパン６０など、エトキシ化アルコール、例えばポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ９３）など、レシチンおよびレシチン誘導体などの非イオン性界面活性剤；Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−カレン、α−テルピネオール、カルボール、カルボン、メントン、酸化リモネン、酸化α−ピネン、ユーカリ油などのテルペンである。サリチル酸、サリチル酸メチル、クエン酸、コハク酸などの有機酸およびエステルも、皮膚浸透エンハンサとして好適である。
【０２３９】
１実施形態において、本発明は、ＣｏＱ１０組成物およびその調製方法を提供する。好ましくは、組成物は少なくとも約１％〜約２５％ｗ／ｗのＣｏＱ１０を備える。ＣｏＱ１０は旭化成Ｎ＆Ｐ（北海道、日本）から、ユビデカレノン（ＵＳＰ）として入手することができる。ＣｏＱ１０は、Ｋａｎｅｋａ  Ｑ１０から粉末形のＫａｎｅｋａＱ１０（ＵＳＰ  ＵＢＩＤＥＣＡＲＥＮＯＮＥ）（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）として取得することもできる。本明細書で例示された方法で使用されるＣｏＱ１０は、以下の特徴を有する：残りの溶媒はＵＳＰ  ４６７の必要条件を満足する；水含有率は、０．０％未満、０．０５％未満、または０．２％未満である；強熱残分は０．０％、０．０５％未満、または０．２％未満である；重金属含有率は０．００２％未満、または０．００１％未満である；純度は９８〜１００％もしくは９９．９％、または９９．５％。組成物を調製する方法は、下の実施例のセクションに提供されている。
【０２４０】
本発明のある実施形態において、コエンザイムＱ１０を、処置または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法が提供され、ここでコエンザイムＱ１０がターゲット組織に皮膚１平方センチメートルに付きコエンザイムＱ１０約０．０１〜約０．５ミリグラムの範囲で適用される、局所ビヒクル中のコエンザイムＱ１０の局所用量がヒトに投与される。１実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０９〜約０．１５ｍｇで適用される。各種の実施形態において、コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．００１〜約５．０ｍｇ、約０．００５〜約１．０ｍｇ、約０．００５〜約０．５ｍｇ、約０．０１〜約０．５ｍｇ、約０．０２５〜約０．５ｍｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ、約０．０５〜約０．３０ｍｇ、約０．１０〜約０．２５ｍｇ、または約０．１０〜０．２０ｍｇの範囲で適用される。他の実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．１１ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１３ｍｇ、０．１４ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．１６ｍｇ、０．１７ｍｇ、０．１８ｍｇ、０．１９ｍｇ、０．２０ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．２２ｍｇ、０．２３ｍｇ、０．２４ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．２６ｍｇ、０．２７ｍｇ、０．２８ｍｇ、０．２９ｍｇ、０．３０ｍｇ、０．３１ｍｇ、０．３２ｍｇ、０．３３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．３６ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．３８ｍｇ、０．３９ｍｇ、０．４０ｍｇ、０．４１ｍｇ、０．４２ｍｇ、０．４３ｍｇ、０．４４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．４６ｍｇ、０．４７ｍｇ、０．４８ｍｇ、０．４９ｍｇまたは０．５ｍｇの用量で適用される。１実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．１２ｍｇの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０３〜約０．１２ｍｇ、約０．０５〜約０．１５ｍｇ、約０．１〜約０．２０ｍｇ、または約０．３２〜約０．４９ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０２４１】
本発明の別の実施形態において、コエンザイムＱ１０はＣｏＱ１０クリームの形で、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム０．５〜１０ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでＣｏＱ１０クリームは１〜５％のコエンザイムＱ１０を備える。１実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約３％のコエンザイムＱ１０を備える。他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％のコエンザイムＱ１０を備える。各種の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約０．５〜約５．０ｍｇ、約１．５〜２．５ｍｇ、または約２．５〜５．５ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０２４２】
別の実施形態において、コエンザイムＱ１０はＣｏＱ１０クリームの形で、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム３〜５ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでＣｏＱ１０クリームは１〜５％のコエンザイムＱ１０を備える。１実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約３％のコエンザイムＱ１０を備える。他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％のコエンザイムＱ１０を備える。各種の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５．０ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約３．０〜約４．０ｍｇ、約３．３〜５．３ｍｇ、または約４．５〜４．９ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０２４３】
本発明のある態様は、コエンザイムＱ１０を処置または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供し、ここでコエンザイムＱ１０は２４時間につき１回以上、６週間以上にわたって局所適用される。
【０２４４】
本発明のある態様は、相Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを調製するステップと、３％ＣｏＱ１０クリームの水中油型乳剤が形成されるようにすべての相を合せるステップとを含む、コエンザイムＱ１０クリーム３％を調製する方法を提供する。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、相Ａ成分は、４．００％ｗ／ｗのアルキルＣ１２−１５ベンゾエートＮＦ、２．００％ｗ／ｗのセチルアルコールＮＦ、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００および１．５０％ｗ／ｗのステアリルアルコールＮＦを含むが、相Ｂ成分は、５．００％ｗ／ｗのジエチレングリコールモノエチルエーテルＮＦ、２．００％ｗ／ｗのグリセリンＵＳＰ、１．５０％ｗ／ｗのプロピレングリコールＵＳＰ、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノールＮＦ、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰおよび４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤２％を含み、相Ｃ成分は、０．５０％ｗ／ｗの乳酸ＵＳＰ、２．００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰ、１．３０％ｗ／ｗのトロラミンＮＦ、および２．５０％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰを含む。さらにこれらの実施形態において、相Ｄ成分は１．００％ｗ／ｗの二酸化窒素ＵＳＰを含むが、相Ｅ成分は１５％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を含む。
【０２４６】
ある他の実施形態において、相Ａ成分は、４．００％ｗ／ｗのカプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、２．００％ｗ／ｗのセチルアルコールＮＦ、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００および１．５０％ｗ／ｗのステアリルアルコールＮＦを含むが、相Ｂ成分は、５．００％ｗ／ｗのジエチレングリコールモノエチルエーテルＮＦ、２．００％ｗ／ｗのグリセリンＵＳＰ、１．５０％ｗ／ｗのプロピレングリコールＵＳＰ、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノールＮＦ、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰおよび４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤２％を含み、相Ｃ成分は、０．５０％ｗ／ｗの乳酸ＵＳＰ、２．００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰ、１．３０％ｗ／ｗのトロラミンＮＦ、および２．５０％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰを含む。さらにこれらの実施形態において、相Ｄ成分は１．００％ｗ／ｗの二酸化窒素ＵＳＰを含むが、相Ｅ成分は１５％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を含む。
【０２４７】
本発明のある実施形態において、（１）相Ａ成分を好適な容器に添加して、水浴内で７０〜８０℃まで加熱するステップと；（２）カルボマー分散剤を除く相Ｂ成分を好適な容器に添加して、混合して混合相Ｂを形成するステップと；（３）相Ｅ成分を好適な容器に入れ、水浴を使用して５０〜６０℃にて相Ｅ成分を溶融して、溶融相Ｅを形成するステップと；（４）カルボマー分散剤を混合タンクに添加して、混合しながら７０〜８０℃まで加熱するステップと；（５）温度を７０〜８０℃に維持しながら、混合相Ｂを混合タンクに添加するステップと；（６）温度を７０〜８０℃に維持しながら、相Ｃ成分を混合タンクに添加するステップと；（７）相Ｄ成分を混合タンクに添加して、次に混合タンクの内容の混合および均質化を続けるステップと；次に（８）均質化を停止して、混合タンクの内容物を５０〜６０℃に冷却するステップと；次に（９）混合を中止して、溶融相Ｅを混合タンクに添加して分散剤を形成するステップと；（１０）次に、分散剤が滑らかで均一になるまで混合を再開するステップと；次に（１１）混合タンクの内容物を４５〜５０℃まで冷却するステップとを含む、コエンザイムＱ１０クリーム３％の調製方法が提供される。
【０２４８】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム３％を備える製薬組成物が提供される。クリームは、組成物の４．００％ｗ／ｗのＣ１２−１５アルキルベンゾエート、組成物の２．００％ｗ／ｗのセチルアルコール、組成物の１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００を有する相Ａ；２．００％ｗ／ｗのグリセリン、１．５％ｗ／ｗのプロピレングリコール、５．０％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水を有するＢ相；１．３００％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．５００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液、２．５％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；および１５．０００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー９４０を含む。
【０２４９】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム３％を備える製薬組成物が提供される。クリームは、組成物の４．００％ｗ／ｗのカプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、組成物の２．００％ｗ／ｗのセチルアルコール、組成物の１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００を有する相Ａ；２．００％ｗ／ｗのグリセリン、１．５％ｗ／ｗのプロピレングリコール、５．０％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水を有するＢ相；１．３００％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．５００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液、２．５％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；および１５．０００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー９４０を含む。
【０２５０】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム１．５％を備える製薬組成物が提供される。クリームは、５．０００％ｗ／ｗのＣ１２−１５アルキルベンゾエート、２．０００％ｗ／ｗのセチルアルコール、１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５００％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００ステアリン酸を有するＡ相；２．０００％ｗ／ｗのグリセリン、１．７５０％ｗ／ｗのプロピレン、５．０００％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４６３％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、５０％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、および１１．３７７％ｗ／ｗの精製水を有する相Ｂ；１．３％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．４００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液および４．２１０％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；ならびに１．５００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。
【０２５１】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム１．５％を備える製薬組成物が提供される。クリームは、５．０００％ｗ／ｗのカプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、２．０００％ｗ／ｗのセチルアルコール、１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５００％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００ステアリン酸を有するＡ相；２．０００％ｗ／ｗのグリセリン、１．７５０％ｗ／ｗのプロピレン、５．０００％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４６３％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、５０％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、および１１．３７７％ｗ／ｗの精製水を有する相Ｂ；１．３％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．４００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液および４．２１０％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；ならびに１．５００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノールおよびプロピレングリコールを含む。
【０２５２】
１．併用療法
ある実施形態において、本発明の環境影響因子および／またはその製薬組成物は、異なる環境影響因子および／またはその製薬組成物であり得る、少なくとも１つの他の治療剤を用いる併用療法で使用することができる。環境影響因子および／またはその製薬組成物ならびに他の治療剤は、相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用することができる。１実施形態において、環境影響因子および／またはその製薬組成物は、別の治療剤の投与と同時に投与される。別の実施形態において、化合物および／またはその製薬組成物は、他の治療剤の投与の前にまたはそれに続いて投与される。
【０２５３】
１実施形態において、本発明の治療方法は、追加の薬剤を備える。例えば１実施形態において、本発明の治療方法で使用するための追加の薬剤は、化学治療剤である。
【０２５４】
化学治療剤は一般に、例えば：１．トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（細胞傷害性抗生物質）、例えばアントラサイクリン／アントラセンジオン、例えばドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびネモルビシン、アントラキノン、例えばミトキサントロンおよびロソキサントロン、ならびにポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｉｌｌｏｔｏｘｉｎｅｓ）、例えばエトポシドおよびテニポシド；２．微小管形成に影響を及ぼす薬剤（有糸分裂阻害剤）、例えば植物アルカロイド（例えば生物活性および細胞傷害性である、植物に由来するアルカリ性窒素含有分子のファミリーに属する化合物）、例えばタキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン、ならびにポドフィロトキシンの誘導体；３．アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキルならびにニトロソウレア、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファランなどのアルキル化作用を有する他の化合物；４．抗代謝産物（ヌクレオシド阻害剤）、例えば葉酸塩、例えば葉酸、フルオロピリミジン（ｆｉｕｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ）、プリンまたはピリミジン類似体、例えば５−フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびエダトレキサート；５．トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばトポテカン、イリノテカン、ならびに９−ニトロカンプトテシン、およびカンプトテシン誘導体；ならびに６．トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばトポテカン、イリノテカン、ならびに９−ニトロカンプトテシン、およびカンプトテシン誘導体；ならびに６．白金化合物／錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンを含む各種のクラスに属する。本発明の方法で使用するための例示的な化学治療剤は、限定されるわけではないが、アミフォスチン（エチヨル）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ｃａｒｒｎｕｓｔｉｎｅ）（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−Ｉｌｌ、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、Ｓ−Ｉカペシタビン、フトラフル、５’デオキシフルオロウリジン，ＵＦＴ、エニルウラシル、デオキシシチジン、５−アザシトシン、５−アザデオキシシトシン、アロプリノール、２−クロロアデノシン、トリメトレキサート、アミノプテリン、メチレン−１０−デアザアミノプテリン（ＭＤＡＭ）、オキサプラチン、ピコプラチン、テトラプラチン、サトラプラチン、プラチナ−ＤＡＣＨ、オルマプラチン、ＣＩ−９７３、ＪＭ−２１６、およびその類似体、エピルビシン、リン酸エトポシド、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、カレニテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＴＡＳ１０３、ビンデシン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、イホスファミド  メフォスファミド、ペルフォスファミド，トリホスファミド  カルムスチン、セムスチン、エポチロンＡ−Ｅ、トムデックス、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アムサクリン、リン酸エトポシド、カレニテシン、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、ラミブジン、ジドブジン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ペントスタチン、トリメトレキセート、クラドリビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、シスプラチン，ドキソルビシン，パクリタキセル（タキソール）およびブレオマイシン、ならびに特定の腫瘍または癌の適切な治療標準に基づいて当業者にただちに明らかにとなるその組合せを含む。
【０２５５】
別の実施形態において、本発明の併用療法で使用するための追加の薬剤は、生物剤である。
【０２５６】
生物剤（生物製剤とも呼ばれる）は、生物系の生成物、例えば生物、細胞、または組換え系の生成物である。このような生物剤の例は、核酸分子（例えばアンチセンス核酸分子）、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、抗体、例えばモノクローナル抗体、抗血管新生剤、およびサイトカインを含む。例示的な生物剤は、下でさらに詳細に議論され、一般に、例えば：１．ホルモン、ホルモン類似体、およびホルモン複合体、例えばエストロゲンおよびエストロゲン類似体、プロゲステロン、プロゲステロン、プロゲステロン類似体およびプロゲスチン、アンドロゲン、アデノコルチコステロイド、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、抗テストステロン、副腎ステロイド阻害剤、および抗黄体形成ホルモン；ならびに２．酵素、タンパク質、ペプチド、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体、例えばインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子などを含む各種のクラスに属する。
【０２５７】
１実施形態において、生物製剤はインターフェロンである。インターフェロン（ＩＦＮ）は、体内で自然に発生するタイプ生物剤である。インターフェロンは実験室でも産生されて、生物療法にて癌患者に与えられる。インターフェロンは、癌患者の免疫系が癌細胞に対して作用する方法を改善することが示されている。
【０２５８】
インターフェロンは、癌細胞に直接働いて、その増殖を遅延させ得る、またはインターフェロンは癌細胞をより正常な挙動を有する細胞に変化させ得る。いくつかのインターフェロンは、癌細胞への対抗を補助する血流中の白血球のタイプである、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージも刺激し得る。
【０２５９】
１実施形態において、生物製剤はインターロイキンである。インターロイキン（ＩＬ）は、多くの免疫細胞の増殖および活性を刺激する。インターロイキンは、体内で自然に出現するが、実験室でも作製することができるタンパク質（サイトカインおよびケモカイン）である。
【０２６０】
いくつかのインターロイキンは、癌細胞を破壊するよう働く、リンパ球などの免疫細胞の増殖および活性を刺激する。
【０２６１】
別の実施形態においては、生物製剤はコロニー刺激因子である。
【０２６２】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、患者に投与されて、骨髄内の幹細胞がより多くの血液細胞を産生するよう促進するタンパク質である。体は常に、とりわけ癌が存在するときに、新たな白血球、赤血球、および血小板を必要とする。ＣＳＦは、化学療法と共に投与されて、免疫系を増強するのを補助する。癌患者が化学療法を受けるとき、骨髄が新たな血液細胞を産生する能力は抑制され、患者は感染をより発症しやすくなる。免疫系の一部は血液細胞なしでは機能できず、それゆえコロニー刺激因子は、骨髄幹細胞が白血球、血小板、および赤血球を産生するよう促進する。
【０２６３】
他の癌処置は適正な細胞産生によって、患者が引き続いてより高い用量の化学療法を安全に受けられるようにできる。
【０２６４】
別の実施形態において、生物製剤は抗体である。抗体、例えばモノクローナル抗体は、癌細胞に結合する、実験室で産生される物質である。
【０２６５】
癌破壊剤が体内に導入されるとき、癌破壊剤は抗体を探し出して、癌細胞を死滅させる。モノクローナル抗体剤は、健常細胞を破壊しない。モノクローナル抗体は、各種の機構を通じてその治療効果を達成する。モノクローナル抗体は、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死を産生するのに直接効果を有することができる。モノクローナル抗体は、増殖因子受容体を遮断することができ、腫瘍細胞の増殖を有効に停止させる。モノクローナル抗体を発現する細胞において、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体の形成を引き起こすことができる。
【０２６６】
本発明の併用処置で使用され得る自体の例は、抗ＣＤ２０抗体、例えば限定されるわけではないが、セツキシマブ、トシツモマブ、リツキシマブ、およびイブリツモマブを含む。抗ＨＥＲ２抗体も、癌の処置のために環境影響因子と併用して使用され得る。１実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブ（ヘルセプチン）である。癌の処置のために環境影響因子と併用して使用され得る抗体の他の例は、抗ＣＤ５２抗体（例えばアレムツズマブ）、抗ＣＤ−２２抗体（例えばエピラツズマブ）、および抗ＣＤ３３抗体（例えばゲムツズマブオゾガマイシン）を含む。抗ＶＥＧＦも、癌の処置のために環境影響因子と併用して使用され得る。１実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。他の実施形態において、生物剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブである抗体である。別の実施例は、抗糖タンパク質１７−１Ａ抗体のエドレコロマブである。
【０２６７】
別の実施形態において、生物製剤はサイトカインである。サイトカイン療法はタンパク質（サイトカイン）を使用して、対象の免疫系が癌性である細胞を認識および破壊するのを補助する。サイトカインは、免疫系によって体内で自然に産生されるが、実験室でも作製することができる。本療法は、進行した黒色腫によって、およびアジュバント療法（原発性癌処置の後に、またはこれに加えて投与される療法）と共に使用される。サイトカイン療法は体のあらゆる部分に到達して、癌細胞を死滅させ、腫瘍が増殖するのを防止する。
【０２６８】
別の実施形態において、生物製剤は融合タンパク質である。例えば、組換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は併用療法で使用され得る。Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬは、アポトーシス（プログラムされた細胞死）の調節に関与するアポトーシス促進性受容体ＤＲ４およびＤＲ５を両方とも活性化するように設計された、第１の２重アポトーシス促進性受容体アゴニストである。
【０２６９】
１実施形態において、生物製剤はアンチセンス核酸分子である。
【０２７０】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的である、ｍＲＮＡ配列に相補的である、または遺伝子のコード鎖に相補的であるヌクレオチド配列を備える。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。
【０２７１】
１実施形態において、生物剤は、例えば血管新生を増強する分子の、例えばｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＥＧＦＲのｓｉＲＮＡ分子である。１実施形態において、血管新生を阻害する生物剤はＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して、ｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後ターゲット遺伝子サイレンシング技法である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７，２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲ，ａｎｄ  Ｄｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３．７３７−４７）。プロセスが行われるのは、内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを切断して、低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる、より短い、例えば２１または２２ヌクレオチド長ＲＮＡにするときである。次により小さいＲＮＡセグメントが、ターゲットｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成キットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＡｍｂｉｏｎから市販されている。１実施形態において、アンチセンスＲＮＡで使用するための１つ以上の化学薬品を、ＲＮＡｉを媒介する分子中で用いることができる。
【０２７２】
細胞における特定のタンパク質の発現を下方調節するためのアンチセンス核酸の使用は、当分野で周知である（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６；Ａｓｋａｒｉ，Ｆ．Ｋ．ａｎｄ  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３１６−３１８；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｓ．Ｍ．（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：１９８１−１９９３；Ｍｅｒｃｏｌａ，Ｄ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：４７−５９；Ｒｏｓｓｉ，ＪＪ．（１９９５）Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１．２１７−２２５；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照）。アンチセンス核酸分子は、別の核酸分子のコード鎖に相補的であるヌクレオチド配列（例えばｍＲＮＡ配列）を備え、したがって他の核酸分子のコード鎖に水素結合することができる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコード領域、ｍＲＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域またはコード領域と非翻訳領域を橋架けする領域（例えば５’非翻訳領域とコード領域の接合部にて）に見出される配列に相補的であることができる。さらにアンチセンス核酸は順次、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の調節領域、例として転写開始配列または調節要素に相補的であることができる。好ましくは、アンチセンス核酸は、コード鎖上のまたはｍＲＮＡの３’未翻訳領域内の開始コドンに先行するまたは開始コドンに及ぶ領域に相補的であるように設計されている。
【０２７３】
血管新生を強化する分子のコード鎖配列を考えると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であることができるが、さらに好ましくはｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の部分のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであることができる。
【０２７４】
本発明のアンチセンス核酸は、当分野で公知の手順を使用する化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して作製することができる。例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然型ヌクレオチドまたは分子の生物安定性を向上させるまたはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された２本鎖の物理的安定性を向上させるように設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を発生させるために使用できる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン，２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル，５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。細胞における発現を阻害するために、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。あるいはアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向で中にサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる（すなわち以下の小節でさらに記載されるように、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的のターゲット核酸に対してアンチセンス配向であろう）。
【０２７５】
また別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、ａ−アノマー核酸分子である。ａ−アノマー核酸分子は、通常のａ−ユニットとは反対に、鎖が相互に平行に並んだ、相補的ＲＮＡとの特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も備えることができる。
【０２７６】
別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡｉを媒介する化合物である。ＲＮＡ干渉剤は、限定されるわけではないが、ターゲット遺伝子またはゲノム配列と相同であるＲＮＡ分子を含む核酸分子、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、「「短ヘアピン」または「小ヘアピンＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるターゲット遺伝子の発現を妨害または阻害する小型分子を含む。ＲＮＡ干渉は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して、ｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後ターゲット遺伝子サイレンシング技法である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７，２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，３１９１−３１９７（１９９９））。プロセスが行われるのは、内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを切断して、低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる、より短い、例えば２１または２２ヌクレオチド長ＲＮＡにするときである。次により小さいＲＮＡセグメントが、ターゲットｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成キットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＡｍｂｉｏｎから市販されている。１実施形態においてアンチセンスＲＮＡで使用するための上述の１つ以上の化学薬品を用いることができる。
【０２７７】
例えば血管新生を阻害する分子をコードする核酸分子は、対象の細胞でのコード化タンパク質の発現に好適な形で対象中に導入され得て、本発明の方法においても使用され得る。血管新生を阻害する例示的な分子は、限定されるわけではないが、ＴＳＰ−Ｉ、ＴＳＰ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＦＮ−ａ、アンギオスタチン、エンドスタチン、ツマスタチン、カンスタチン、ＶＥＧＩ、ＰＥＤＦ、バソヒビン、およびプロラクチン２−メトキシエストラジオールの１６ｋＤａフラグメントを含む（総説については、Ｋｅｒｂｅｌ（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１４：８８４を参照）。
【０２７８】
例えば全長または部分ｃＤＮＡ配列は組換え発現ベクター中にクローニングされ、ベクターは標準分子生物学技法を使用して細胞中に形質移入される。ｃＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅によってまたは適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、標準ＰＣＲ方法によるｃＤＮＡの増幅を可能にするＰＣＲプライマの設計に、または標準ハイブリダイゼーション方法を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用できるハイブリダイゼーションプローブの設計に使用することができる。ｃＤＮＡの単離または増幅の後に、ＤＮＡフラグメントは好適な発現ベクター中に導入される。
【０２７９】
本発明の方法で使用するための例示的な生物剤は、限定されるわけではないが、ゲフィチニブ（イレッサ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、ジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｅｒｏｌ）、エストラジオール、プレマリン、ラロキシフェン、プロゲステロン、ノルエチノドレル、エチステロン（ｅｓｔｈｉｓｔｅｒｏｎｅ）、ジメチステロン（ｄｉｍｅｓｔｈｉｓｔｅｒｏｎｅ）、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、メチルテストステロン、テストステロン、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン、コルチゾール、ソルメドロール、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、アミノグルテチミド、テストラクトン、ドロロキシフェン、アナストロゾール、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、ゴセレリン、フルタミド、ロイプリド、トリプトレリン、アミノグルテチミド、ミトタン、ゴセレリン、セツキシマブ、エルロチニブ、イマチニブ、トシツモマブ、アレムツズマブ，トラスツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、ベバシズマブ、デニロイキンジフチトクス、ダクリズマブ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、抗４−ｌＢＢ、抗４−ｌＢＢＬ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ１５４、抗ＯＸ４０、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ２７、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＧＩＴＲ、抗ＧＩＴＲＬ、抗ＣＴＬＡ−４、可溶性ＯＸ４０Ｌ、可溶性４−ＩＢＢＬ、可溶性ＣＤ１５４、可溶性ＧＩＴＲＬ、可溶性ＬＩＧＨＴ、可溶性ＣＤ７０、可溶性ＣＤ８０、可溶性ＣＤ８６、可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＧＶＡＸ（登録商標）、および特定の腫瘍または癌の適切な標準治療に基づいて当業者にただちに明らかとなるその組合せを含む。薬剤の可溶形は、薬剤を例えばＩｇ−Ｆｃ領域と作動的に連結することによって、例えば融合タンパク質として作製され得る。
【０２８０】
１を超える、例えば１、２、３、４、５の薬剤が環境影響因子と併用して投与され得ることに注目すべきである。例えば１実施形態において、２つの化学治療剤が環境影響因子と併用して投与され得る。別の実施形態において、化学治療剤、生物剤、および環境影響因子が投与され得る。
【０２８１】
各種の生物剤の各種の形が使用され得る。これらは制限なく、腫瘍中にインプラント、注射またはそうでなければ挿入されたときに生物的に活性化される、プロフォーム分子、非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミドなどのような形を含む。
【０２８２】
本発明は、制限するとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本願を通じて引用されているすべての参考文献ならびに公開された特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられている。
【実施例】
【０２８３】
本発明はここで一般に記載されており、当業者が、本明細書の上記の教示および以下の実施例から、他のアッセイ、細胞の種類、薬剤、作製物、またはデータ分析方法が、すべて制限なく、請求された本発明の範囲から逸脱せずに使用できることを認識しているので、単に本発明の実施形態のある態様の例証の目的のために含まれており、本発明を制限する意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【０２８４】
本出願のいずれの箇所で参照されたいずれの特許、特許出願、特許公報、または科学論文の内容も、その全体が本明細書に組み入れられている。
【０２８５】
本発明の実施は、適切な場合および別途指摘しない限り，当業者の技法範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣習的な技法を用いるであろう。このような技法は、文献に記載されている。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：２００１）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｄａｓｓｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｈａｒｆｏｒｄ，およびＹａｍａｄａ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照。
【０２８６】
実施例１：ＭＩＭとしてのＣｏＱ１０の同定
潜在的なＭＩＭとしてＣｏＱ１０を評価するために、酸化型のＣｏＱ１０を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態／生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として罹患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、ＣｏＱ１０、および特にＣｏＱ１０の酸化型をＭＩＭとして同定した。実験の第１セットでは、細胞形態／生理機能に対する変化をＣｏＱ１０に対する細胞の感受性およびアポトーシス応答を検査することによって評価した。対照株化細胞（ケラチノサイトおよびメラノサイトの初代培養）および複数の皮膚癌株化細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、非転移性皮膚黒色腫；ＳＫ−ＭＥＬ−２、転移性皮膚黒色腫；またはＳＣＣ、扁平上皮細胞癌腫；ＰａＣａ２、膵臓癌株化細胞；またはＨＥＰ−Ｇ２、肝臓癌株化細胞）を含む皮膚株化細胞のパネルを各種のレベルのコエンザイムＱ１０によって処置した。これらの実験結果は、癌株化細胞が、対照株化細胞と比較して改変された用量依存性応答を癌細胞のみにおけるアポトーシスおよび細胞死の誘導と共に呈することを証明した。例示的な実験を下の実施例３に詳細に記載する。
【０２８７】
次に、ＣｏＱ１０による処置後に細胞の組成の変化を影響評価するアッセイを用いた。リアルタイムＰＣＲアレイ法を使用して、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例６および９〜１３に詳細に記載する。相補的実験において、抗体マイクロアレイ法、２次元ゲル電気泳動、それに続く質量分析キャラクタリゼーションを使用するタンパク質同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｕａｔｉｏｎ）を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例４、７および８にそれぞれ詳細に記載する。これらのアッセイからの結果は、検査された株化細胞において、遺伝子発現の著しい変化がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で、酸化型ＣｏＱ１０の添加により誘導されることを証明した。ＣｏＱ１０処置によって調節された遺伝子は、アポトーシス、癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
【０２８８】
ＣｏＱ１０の細胞中への進入を確認し、細胞中に存在するＣｏＱ１０のレベルおよび型を決定するために実験を行った。特に、ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＱ１０のレベル、ならびにＣｏＱ１０の型（すなわち酸化型または還元型）を、ＣｏＱ１０で処置した細胞からのミトコンドリア濃縮調製物を分析することによって決定した。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＱ１０のレベルは、外因性Ｑ１０の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。驚くべき予想外の結果において、ＣｏＱ１０はミトコンドリア中に主に酸化型で存在することが決定された。加えて、濃縮試料からのタンパク質のレベルの変化を２次元ゲル電気泳動および質量分析キャラクタリゼーションによるタンパク質同定によって分析した。これらの実験からの結果は、検査された時間経過でのミトコンドリア中の酸化型ＣｏＱ１０のレベルが、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特異的タンパク質のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの調節によって明示されるように、多岐にわたる細胞変化に相関することを証明した。例示的な実験を下の実施例５に詳細に記載する。
【０２８９】
本明細書で出願人らによって記載された結果は、内因性分子ＣｏＱ１０、および特にＣｏＱ１０の酸化型をＭＩＭとして同定した。例えば結果がＣｏＱ１０をＭＩＭとして同定したのは、ＣｏＱ１０がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の変化を誘導することが観察されたためである。結果が、ＣｏＱ１０が多次元特徴を有するとして同定したのは、ＣｏＱ１０が、正常な（例えば非癌性）状態と比較した疾患状態（例えば癌）において、細胞形態／生理機能および細胞組成物の示差的変化（例えばｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の示差的変化）を誘導したためである。その上、結果は、ＣｏＱ１０が細胞に進入することができ、それゆえ治療効果および担体効果の両方を呈するという点で多次元特徴を有するとして同定した。
【０２９０】
実施例２：腫瘍性障害の疾患関連プロセスおよびバイオマーカーを同定する方法
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をｍＲＮＡアレイ、タンパク質抗体アレイ、および２次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からＭＩＭまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ＩＰＡソフトウェア）および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質をウェスタンブロット分析、ｓｉＲＮＡノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供した。
【０２９１】
実施例３〜８の物質および方法
コエンザイムＱ１０ストック
５００μＭコエンザイムＱ１０（細胞増殖培地中５％イソプロパノール）を以下のように調製した。５００μＭコエンザイムＱ１０ストック１０ｍＬは、毎回更新した。分子量：８６３．３４
（０．０００５ｍｏｌ／Ｌ）（０．０１０Ｌ）（８６３．３４ｇ／ｍｏｌ）＝０．００４３１７ｇ
【０２９２】
５００μＭストック１０ｍＬを作製するために、４．３２ｍｇコエンザイムＱ１０を１５ｍＬファルコンチューブに秤量して、イソプロパノール５００μＬを添加した。溶液を完全に溶解するために撹拌しながら、５０〜６０℃の水浴で加温した。本溶液に培地９．５ｍＬ（細胞を培養したのと同じ培地）を添加した。
【０２９３】
細胞培養
細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＧｉｂｃｏから取得した。細胞を５％ウシ胎仔血清、０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００ＵｍＬ−１ペニシリンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。細胞を３７℃の９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。
【０２９４】
コエンザイムＱ１０処置および全タンパク質単離
細胞をＱ１０に曝露する前に８５％コンフルエントまで培養した。補足培地をＱ１０によって５０および１００マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、５０μＭＱ１０、および１００μＭＱ１０によって３通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから４、８、１２、および２４時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はｐＨ７．４の氷冷ＰＢＳ  ５ｍＬによって３回洗浄した。細胞を次にＰＢＳ  ３ｍＬ中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、ｐＨ７．４の溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、８０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ）に再懸濁させた。ＢＣＡ法を使用してタンパク質濃度を定量した。
【０２９５】
株化細胞
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は５％血清を含むＤＭＥＭＦ−１２であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、７５〜８０％コンフルエント（クリアスペーシング（ｃｌｅａｒ  ｓｐａｃｉｎｇ））まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した：
ＳＫ−ＭＥＬ−２８（非転移性皮膚黒色腫）
ＳＫ−ＭＥＬ−２（転移性皮膚黒色腫）
ＨＥＫａ（ケラチノサイト、皮膚対照）
ＨＥＭａ（メラノサイト、皮膚対照）
ｎＦＩＢ（新生児線維芽細胞）
ＨＥＰ−Ｇ２（肝臓癌）［ＳＢＨ株化細胞］
ＳｋＢｒ−３（乳癌、Ｈｅｒ２過剰発現）
ＭＣＦ−７（乳癌、ｐ５３突然変異）
ＰＣ−３（前立腺癌）［ＳＢＨ株化細胞］
ＳｋＢｒ−３（ヒト乳腺癌）
ＮＣＩ−ＥＳ−０８０８
ＳＣＣ（扁平上皮細胞癌腫）
ＰａＣａ−２
ＮＩＨ−３Ｔ３
【０２９６】
細胞培養：
細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＧｉｂｃｏから取得した。細胞を５％ウシ胎仔血清、０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００ＵｍＬ−１ペニシリンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。細胞を３７℃の９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。
【０２９７】
皮膚悪性黒色腫ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞を５％ＦＢＳ、アンホテリシンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したグルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養および維持した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２によって増殖させた。追加の株化細胞および成長条件の詳細事項を下の表で概説する。
【０２９８】
【表１】
0005903734.tif 000004
【０２９９】
ＳＫＭＥＬ２８細胞のＱ１０処置：
ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞を１００μＭ  Ｑ１０または対照ビヒクルによって処置した。Ｑ１０の製剤は以下の通りである。１５ｍＬキャップ付きチューブに、Ｑ１０  ４．３２ｍｇ（Ｃｙｔｏｔｅｃｈより供給）を移し、次にイソプロパノール５００μｌの添加により溶解させた。得られた溶液を６５℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Ｑ１０／イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、１０ｍＬにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Ｑ１０の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して（培地８ｍＬによりストック２ｍＬ）１００μ  ＭＱ１０の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地９．５ｍＬをイソプロパノール５００μＬに添加した。対照ストック（ストック２ｍＬ）を培地８ｍＬでさらに希釈した。細胞を処置開始の６、１６、２４、４８または７２時間後に収集した。
【０３００】
ＳＣＣ細胞のＱ１０処置：
ＳＣＣ細胞を１００μＭ  Ｑ１０（上記のように調製）によって６時間または２４時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、ＲＮＡを下記のようにＸＴＡＬにて単離するまで−８０℃にて貯蔵した。
【０３０１】
ＲＮＡ単離：
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にＲＮＡ単離のために溶解させた。ＲＮＡを２６０ｎｍにおける光学密度を測定することによって定量した。
【０３０２】
第１鎖合成：
第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ２第１鎖合成キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）をメーカーの推奨に従って使用して、全ＲＮＡ  １μｇから合成した
【０３０３】
リアルタイムＰＣＲ：
第１鎖合成からの生成物を水で希釈して、ＳＹＢＲグリーン・マスター・ミックス（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）と混合し、ＰＣＲアレイ上に添加した。リアルタイムＰＣＲをＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９６でＰＣＲアレイ（アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ）（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に対して実行した。
【０３０４】
アポトーシスのためのネキシンアッセイによる、コエンザイムＱ１０に対する株化細胞感受性の決定：
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムＱ１０処置の２４時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムＱ１０に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、ＰａＣａ２、ＨｅｐＧ２、ＰＣ−３、ＳＫＢｒ３、ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＭＥＬ２８であった。細胞を９６ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、５０μＭ  Ｑ１０または１００μＭコエンザイムＱ１０のいずれかによって処置した。２４時間後、アポトーシス細胞の存在がＰＣＡ９６フローサイトメータ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての４μＭスタウロスポリンで２時間処置した。細胞を最初にＰＢＳで洗浄して、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）５０μＬによって室温にて剥離させた。１％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬１００μＬ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を各ウェルに添加した。暗所での２０分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は２種類の染料を含有している。アネキシン−Ｖ−ＰＥは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）セリンを細胞の外部にて検出する。第２の染料７−ＡＡＤは、生（健常）および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。４つの細胞集団；生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Ｃｙｔｏｓｏｆｔ  ２．５．７ソフトウェア（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を使用して決定した。
【０３０５】
免疫ブロッティング
試料当りおよそ５０μｇのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて３通り実行した。タンパク質を１２％ＴＲＩＳ−ＨＣｌゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、１次抗体によるインキュベーションの前に５％牛乳およびＴＢＳＴ溶液を使用して遮断した。１次抗体を５％ＢＳＡおよびＴＢＳＴ溶液中４℃にて一晩インキュベートした。２次抗体を４℃にて１時間インキュベートした。すべての抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗体は、１：５０００の比のβアクチンを除いて、１：１０００の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はＮＩＨ  Ｊａｖａベースの濃度計分析ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
【０３０６】
２次元電気泳動
等電点電気泳動（ＩＥＦ）の前に、試料を４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、および１％Ｃ７両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、１０ｍＭアクリルアミドによって室温にて９０分間アルキル化した。試料を１０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａデバイスに通した後、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、および２％ＣＨＡＰＳから成る少なくとも３倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質１００マイクログラムを、１１ｃｍ  ｐＨ３〜１０、ｐＨ４〜７またはｐＨ６〜１１の固定化ｐＨ勾配ストリップ（ＧＥ，Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）にて１００，０００ボルト時までＩＥＦに供した。ＩＥＦの後、固定化ｐＨ勾配ストリップを６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０、および０．０１％ブロムフェノールブルー中で平衡にして、８〜１６％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌプレキャストゲル１ｍｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは２通り実行した。これらにどちらも固定、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ、８０ｍＬ／ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）での染色およびＦｕｊｉ  ＦＬＡ−５１００レーザスキャナでの撮像、またはＰＶＤＦ膜上への移動を行った。
【０３０７】
対照試料についての追加の情報を取得して、ｄＰＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｉｎｃ．）選択的ｐＩ分画、それに続くｄＰＣプラグのトリプシン消化を質量分析同定および半定量（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）（ＮａｎｏｍａｔｅまたはＬＣ／ＬＴＱ／ＭＳ）と共に利用する方法を使用して、タンパク質同定の有用性を試験した。対照試料を用いて遂行したｄＰＣ分析は、タンパク質の大型サブセットの同定でその有用性を証明した。試験の間に産生された材料は、将来、必要が生じた場合に資源として利用され得るように保存した。
【０３０８】
２次元ゲル画像分析：
すべてのゲル画像の分析は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、ＵＫ）を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲル画像のデータをエクスポートした。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙでスチューデントのｔ検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した（ｐ＞０．０５）。
【０３０９】
抗体アレイ：
抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ、Ｓｉｇｍａ）を利用して７００超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Ｑ１０処置細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＣＣ）におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるＣｙＤｙｅ（Ｃｙ３またはＣｙ５）によってそれぞれ標識された２つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して（試験試料対参照試料）、２つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
【０３１０】
高用量のコエンザイムＱ１０は、培養されたＳＫＭＥＬ−２８細胞のアポトーシス経路、糖尿病経路および酸化ストレス経路に関与する遺伝子の発現を調節する。
【０３１１】
実験詳細事項：５％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンを補足した、グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０５６５−０４２）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２中で培養されたＳＫＭＥＬ−２８細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−７２）は、非転移性、皮膚黒色腫細胞であり、ビヒクルまたは１００ｕＭ  コエンザイムＱ１０によって各種の長さの時間にわたって処置した。コエンザイムＱ１０処置の結果として生じる遺伝子発現のいずれの変化も、リアルタイムＰＣＲアレイ（アポトーシスカタログ番号ＰＡＨＳ−１２、糖尿病カタログ番号ＰＡＨＳ−０２３および酸化ストレスカタログ番号ＰＡＨＳ−０６５）（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を使用して定量した。
【０３１２】
５００ｕＭコエンザイムＱ１０のストック濃縮物を、イソプロパノール５００ｕｌ中に４．３２ｍｇを溶解することによって調製して、これを培地の添加により１０ｍｌまでさらに希釈した。ボルテックスおよび６５℃までの加熱を交互に行って、コエンザイムＱ１０を溶解させた。ストック溶液２ｍｌを培地により１０ｍｌに希釈して、１００ｕＭ  Ｑ１０含有培地を得て、これを細胞の処置に使用した。コエンザイムＱ１０を添加しないことを除いた類似のプロトコルによって、ビヒクルを並行して調製した。
【０３１３】
ＳＫＭＥＬ−２８細胞を６ウェルプレートにて１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞が結合して５０％コンフルエントであるときに、ビヒクルまたは１００ｕＭ  Ｑ１０のどちらかを添加した。細胞をＱ１０処置の６、１６、２４、４８または７２時間後に収集したが、ビヒクル処置細胞は２４時間後に収集した。スピンカラムおよびオンカラムＤＮアーゼ処置を用い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ  カタログ番号７４１０４）キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にＲＮＡ単離のために溶解させた。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってＲＮＡを定量した。
【０３１４】
リアルタイムＰＣＲを、全ＲＮＡ０．４〜１ｕｇをテンプレートとして使用する第１鎖ｃＤＮＡ合成によって、ゲノムＤＮＡ消失ステップを用いるＲＴ２第１鎖合成キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、カタログ番号Ｃ−０３）をメーカーの推奨に従って用いて行った。第１鎖合成からの生成物を水で希釈して、ＳＹＢＲグリーン・マスター・ミックス（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ、カタログ番号ＰＡ−０１０−１２）と混合し、共通経路内で連結された８４種類の異なる遺伝子、正規化に使用される５種類のハウスキーピング遺伝子、逆転写およびＰＣＲ対照を含有するＰＣＲアレイ上に添加した。リアルタイムＰＣＲをＢｉｏｒａｄ  Ｃｆｘ９６に対して実行した。酵素を活性化させるホットスタートによって増幅を開始し、それぞれ（９５℃−１５秒変性ステップおよび６０℃−１分アニーリングおよび伸長ステップ）の４０サイクルがに続き、溶融曲線プログラムが続いた。すべての処置群のＰＣＲのＰＣＲサーモサイクラからの出力であるＣｔ値をＥｘｃｅｌスプレッドシートで整理して、ｗｗｗ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒ／ａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ．ｐｈｐで利用可能な比較分析ソフトウェアにロードした。
【０３１５】
ミトコンドリア濃縮試料の精製：
実験詳細事項：１００μＭ  Ｑ１０によって２４または４８時間処置されたＳＫＭＥＬ−２８細胞、ＮＣＩ−ＥＳ０８０８細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ｔ＝０にて収集された細胞と共に、Ｔ１６０フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−８０℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ）（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ、カタログ番号ＭＳ８５２）によって推奨された試薬およびプロトコルを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分を一定分量に分割して、−８０℃にて貯蔵した。
【０３１６】
コエンザイムＱ１０およびユビキノール−１０の定量方法：
コエンザイムＱ１０（Ｑ１０）および還元型ユビキノール−１０（Ｑ１０Ｈ２）の同時決定の方法は、最近公開された方法（Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，２００７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１７５，２４２−２４８）に基づいて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と共に使用することによって行った。Ｑ１０およびＱ１０Ｈ２の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。１００μＭ  Ｑ１０によって処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿（１−プロパノール３００μｌ中で超音波処理された充填細胞１００μｌ）、液液抽出（上清に水１００μｌを添加して、Ｘ３をｎ−ヘキサン２００μｌで抽出する）、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および９５：５  メタノール／ヘキサン（ｖ／ｖ）５０μｌでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Ｐｒｉｓｍ  ＲＰ  １×１００ｍｍ、５μｍ粒径カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ  ３連４重極質量分析計（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによった。流速５０μｌ／分での２０％イソプロピルアルコール８０％メタノール中の４ｍＭギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料１０μｌを注入した。ＭＲＭ分析は、ｍ／ｚ８８２．７＞１９７．００（Ｑ１０Ｈ２）およびｍ／ｚ８８０．８０＞１９７．００（Ｑ１０）トランジションをコーン電圧４０および衝突エネルギー３０と共に使用して遂行した。
【０３１７】
実施例３：ＣｏＱ１０に対する株化細胞の感受性
いくつかの株化細胞のＱ１０に対する感受性を、適用の２４時間後に２種類の染料、７ＡＡＤおよびアネキシン−Ｖ−ＰＥの組合せを含有する試薬（ネキシン試薬）を使用することによって試験した。７ＡＡＤ染料は、透過性細胞膜によって細胞；主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−Ｖ−ＰＥは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
【０３１８】
ＰａＣａ２細胞は、５０μＭ  Ｑ１０および１００μＭ  Ｑ１０によりＱ１０適用の２４時間後に、早期および後期アポトーシス細胞の両方で上昇を示した（ゲート細胞の５〜１０％の間）。ＰＣ−３細胞も、５０μＭおよび１００μＭ  Ｑ１０によって早期および後期アポトーシス集団で上昇を示したが、上昇はＰａＣａ２細胞と比較して小さかった。ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＭＥＬ２８細胞は５０μＭおよび１００μＭ  Ｑ１０によって、早期アポトーシス集団のみで上昇を示した。ＨｅｐＧ２細胞も５０μＭ  Ｑ１０処置に感受性であり、後期アポトーシスステージおよび早期アポトーシスステージに集まったゲート細胞の約２０％の上昇があった。ＳＫＢｒ３は、５０μＭまたは１００μＭ  Ｑ１０処置のどちらによっても早期および後期アポトーシスで大きな上昇を少しも示さなかった、試験した中で唯一の株化細胞であった。結果を図１〜６に示す。
【０３１９】
Ｑ１０処置がＨｅｐＧ２肝臓癌細胞でアポトーシス応答を引き起こすことをさらに確認するために、第２のアポトーシスアッセイを、単鎖ＤＮＡを測定するＡｐｏＳｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡベース法を使用して評価した。ＡｐｏＳｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡは、アポトーシス細胞中のＤＮＡのホルムアミド変性に対する感受性および単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対するモノクローナル抗体による変性ＤＮＡの検出に基づく。肝臓癌株化細胞ＨｅｐＧ２の５０および１００μＭ  Ｑ１０による処置は、それぞれ１７％および３２％の用量応答で検出可能なアポトーシスを生じた（図７）。これらの結果は、他の組織からの他の癌株化細胞（例えばＳＣＣ、ＳＫＭＥＬ−２８、ＭＣＦ−７、およびＰＣ−３）においてアポトーシスを誘導するＱ１０の観察結果と一致する。
【０３２０】
実施例４：Ｑ１０によって処置した細胞のプロテオミクス分析
Ｑ１０によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、２次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。３つの細胞タイプ（ＳＫＭＥＬ−２８、ＳＣＣ、およびｎＦｉｂ）をＱ１０によって処置して、２次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
【０３２１】
Ｑ１０によって処置したＳＫＭＥＬ−２８細胞のプロテオミクス分析
ウェスタンブロットおよび２次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第１の実験セットは、皮膚癌株化細胞ＳＫＭＥＬ−２８であった。本実験セットは、０、５０または１００μＭ  Ｑ１０によって３、６、１２、および２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を包含していた。
【０３２２】
Ｑ１０処置ＳＫ−ＭＥＬ−２８試料のセットを、２次元ゲル電気泳動に供して（図８）、対照試料に対するタンパク質レベルの変化を同定するために分析した。すべての２４時間ゲルにわたる９４３スポットの比較分析を遂行して、対照試料を処置試料すべてに対して比較した。分析は、上昇、低下、または翻訳後修飾による、時間経過にわたるスポット変化の同定を含んでいた。
【０３２３】
分析は、３２の統計的に有意な示差的スポット変化を見出した。これより、２０個の非冗長性スポットを切除して、トリプシン消化によるタンパク質同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。キャラクタリゼーションされたペプチドをＭａｓｃｏｔ  ａｎｄ  ＭＳＲＡＴソフトウェア分析を用いてタンパク質データベースで検索して、タンパク質を同定した（表２）。
【０３２４】
【表２】
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【０３２５】
本実験の主要な発見は、トランスアルドラーゼ１の減少であり、このことはＱ１０が癌細胞内の代謝状態を改変することにより作用するという前提を裏付けた。トランスアルドラーゼ１は、ペントースリン酸経路（ヘキソースモノリン酸分路としても公知）中の酵素である。トランスアルドラーゼ（ＥＣ：２．２．１．２）は、３炭素ケトールユニットのセドヘプツロース７−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸への可逆的移動を触媒して、エリトロース４−リン酸およびフルクトース６−リン酸を形成する。本酵素は、トランスケトラーゼと共に、解糖経路とペントース−リン酸経路との間に連結を提供する。このことはヌクレオチドおよびＮＡＤＰＨ合成に関連しており、生合成反応のための還元等価物の産生および還元環境の維持を容易にする。
【０３２６】
最近の刊行物（Ｂａｓｔａ，Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．Ａｕｇｕｓｔ  ２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，３２，２００−２０８）は、トランスアルドラーゼにおける遺伝的多型の証拠を提供し、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌腫に結び付けられた。最近の別の刊行物（Ｑｉａｎ，Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．Ｍａｙ  ２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，４１５，１２３−１３４）は、ミトコンドリアホメオスタシスのモジュレーターとしてのトランスアルドラーゼの欠乏、Ｃａ２＋流入およびアポトーシスを同定した。
【０３２７】
これらの初期の結果から、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中でＱ１０によって調節されているような、２次元ゲル電気泳動によって同定された残りのタンパク質を公知の関係について分析した（図９）。これらのタンパク質の機能性評価は、１４−３−３−媒介シグナル伝達に関与する群（ＰＤＣＰ６ＩＰ、ＹＷＨＡＺ、およびＶＩＭ）が、多種多様のプロセス［細胞周期；ペントースリン酸経路（ＴＡＬＤＯ１）；セラミドシグナル伝達（ＣＴＳＤ）；アミノアシル−ｔＲＮＡ生合成（ＧＡＲＳ）、およびミトコンドリアタンパク質インポート（ＴＯＭ２２）］に結び付けられた個別のタンパク質と共にあることを明らかにした。
【０３２８】
Ｑ１０によって処置したＳＣＣ細胞のプロテオミクス分析
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣ）も調製して、前のＳＫ−ＭＥＬ−２８分析の追跡実験として、２次元ゲル電気泳動によって分析した。ＳＣＣ細胞を１００μＭ  Ｑ１０によって、収集前に６時間または２４時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料を２次元電気泳動に供した（２通り）。比較試験での６００個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を６時間および２４時間処置に対して比較した。
【０３２９】
上位２５の統計的に有意な示差的スポット変化を２次元電気泳動ゲルの比較分析から評価した。これより、２０個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した（結果を下の表３にまとめる）。
【０３３０】
【表３】
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【０３３１】
トランスアルドラーゼ１：Ｑ１０で処置したＳＫＭＥＬ−２８細胞で先に観察されたように、酵素トランスアルドラーゼ１はレベルの低下によって調節された。これは、Ｑ１０とトランスアルドラーゼの改変（およびそれゆえ細胞の代謝状態）との連関についての以前の観察結果を独立して確証するものである。
【０３３２】
トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の非酸化的段階における酵素である（図１０）。ペントースリン酸経路は、還元的生合成のためのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型ＮＡＤＨ）の発生のための細胞の代謝状態において、ならびにＡＴＰ、ＤＮＡ、およびＲＮＡの必須構成要素であるリボースの形成において重要である。トランスアルドラーゼはまた、ペントースリン酸経路を解糖に連結する。解糖は、酸化的リン酸化のミトコンドリアプロセスが利用されないため、癌細胞が細胞生存に必要なエネルギーを取得する代謝経路である。Ｑ１０は、酸化的リン酸化およびミトコンドリアＡＴＰ産生に必要とされる必須のコエンザイム因子である。
【０３３３】
ＢＳＣｖ：スポット２３は、ＢＳＣｖという名称の、染色体２０からの新規ヒトタンパク質であった。ＢＳＣｖタンパク質は、脂肪細胞血漿膜結合型タンパク質（遺伝子名：ＡＰＭＡＰまたはＣ２０ｏｒｆ３）としても公知であり、タンパク質のストリクトシジン・シンターゼ・ファミリーに配列類似性を有するシングルパスＩＩ型膜タンパク質であることが予測されている。Ｑ１０処置は、本タンパク質のレベルの低下を引き起こした。本タンパク質は、十分に特徴付けもされておらず、ストリクトシジンシンターゼとのその相同性も確認されてもいない。興味深いことに、本タンパク質は脂肪細胞分化の役割に関連してきた（Ａｌｂｒｅｋｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ヒト大網脂肪組織の最近のプロテオミクス研究はＢＳＣｖを、病的肥満女性による多嚢胞性（ｐｏｌｃｙｓｔｉｃ）卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の差次的発現を有する９種類のタンパク質のうちの１つとして同定した（Ｃｏｒｔｏｎ，２００８  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：６５１−６６１に概説されている）。Ｑ１０に応答する細胞表面タンパク質としてのＢＳＣｖに対する抗体は、バイオマーカーとして有用であろう。現在の結果および入手可能な文献に基づいて、ＢＳＣｖは癌および糖尿病で潜在的な役割を有し得る。
【０３３４】
ＮＭ２３Ａ：非転移性細胞１タンパク質（ＮＭ２３Ａ、ＮＭＥ１としても公知）は、転移サプレッサーとであると考えられる。本遺伝子（ＮＭＥ１）は、高転移性細胞におけるその低下したｍＲＮＡ転写レベルのために同定された。該タンパク質は、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）としての活性を有し、「Ａ」アイソフォーム（本遺伝子によりコードされた）および「Ｂ」アイソフォーム（ＮＭＥ２によりコードされた）で構成されたヘキサマーとして存在する。本遺伝子における突然変異は、侵襲性神経芽細胞腫において同定されている。ＮＤＫ活性は、例えばクエン酸（クレブス）回路で産生されたＧＴＰがＡＴＰに変換されるときなどに、異なるヌクレオシド３リン酸の濃度の間で平衡を維持する。ＮＤＫ複合体は、ＳＴＲＡＰとの相互作用を通じてｐ５３に関連している。ＳＴＲＡＰがＨＮＦ４Ａに連結されていることは注目に値する。それゆえＮＭ２３Ａは、細胞制御および疾患処置に重要な経路に関与する潜在的タンパク質である。
【０３３５】
Ｒｈｏ  ＧＤＰ解離阻害剤（ＧＤＩ）アルファ：ＧＤＩは、Ｒｈｏタンパク質からのＧＤＰの解離、および続いてのＲｈｏタンパク質へのＧＴＰの結合を阻害することによって、ＲｈｏタンパクのＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を調節する。該タンパク質は、癌細胞において上方調節される。
【０３３６】
実施例５：ミトコンドリア濃縮分析
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびＱ１０応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第１に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Ｑ１０の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Ｑ１０を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第２に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Ｑ１０は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた（Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、シトクロムｃ）。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質ＴＯＭ２２のタンパク質レベルの調節によって例示されるように（本明細書に記載する実験を参照）、新たなミトコンドリアタンパク質がＱ１０処置によって調節されていることが同定された。
【０３３７】
ミトコンドリア濃縮試料の産生
皮膚癌ＳＫＭＥＬ−２８細胞を１００μＭ  Ｑ１０または偽ビヒクルによって６、１９、または４８時間にわたって処置した。細胞をＴ−１６０フラスコ（各時点ごとに４個）から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−８０℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号ＭＳ８５２）から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量７５μＬ（１試料に付き、４〜５個の一定分量）に分け、−８０℃にて貯蔵した。
【０３３８】
Ｑ１０によって処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞から単離されたミトコンドリア濃縮試料のプロテオミクス分析
２次元ゲル電気泳動は、１００μＭ  Ｑ１０によって６、１９、および４８時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８ミトコンドリア濃縮試料に２個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して（対応する偽ビヒクル対照と共に）遂行した。試料を２次元電気泳動に供した（２通り）。５２５個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した（図１１）。
【０３３９】
９つの統計的に有意な示差的スポット変化を２次元電気泳動ゲルの比較分析から選択した。９個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。
【０３４０】
【表４】
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【０３４１】
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ７：アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ７（ＡＣＯＴ７）は、脂肪アシル−ＣｏＡの遊離脂肪酸およびＣｏＡの加水分解を触媒する酵素ファミリーのメンバーである。本酵素はそれゆえ、脂質代謝および細胞シグナル伝達の調節に役割を果たす。ＡＣＯＴ７は、８〜１６個の炭素原子（Ｃ８−Ｃ１６）の脂肪酸鎖を有する長鎖アシルＣｏＡ基質に対する選択性を有する。ＡＣＯＴ７における正確な細胞機能は、十分に理解されていない。本遺伝子の転写は、ステロール調節要素結合タンパク質２によって活性化され、それゆえコレステロール代謝における機能を示唆する。
【０３４２】
本実施例の結果は、ＡＣＯＴ７がＱ１０の代謝に直接または間接的に潜在的に関与することを指摘する。それゆえターゲティングＡＣＯＴ７は、Ｑ１０の細胞間レベルの調節を促進して、それゆえ細胞Ｑ１０効果に影響を及ぼすことができる。
【０３４３】
ピルビン酸キナーゼ：ピルビン酸キナーゼは、解糖の最後のステップに関与する酵素である。ピルビン酸キナーゼは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からＡＤＰへのリン酸基の移動を触媒して、ピルビン酸１分子およびＡＴＰ１分子を産する。
【化３】
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【０３４４】
タンパク質は、これがミトコンドリア濃縮ＳＫ−ＭＥＬ−２８試料から同定されたので、おそらく２型アイソフォームのＰＫＭ２のタンパク質である。本アイソフォームは、腫瘍細胞形成および調節に関与することが周知である。
【０３４５】
ミトコンドリアにおけるＱ１０レベルの定量
コエンザイムＱ１０（Ｑ１０）および還元型ユビキノール−１０（Ｑ１０Ｈ２）の同時決定の方法は、最近公開された方法（Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，２００７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ  Ａ，１１７５，２４２−２４８）に基づいて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と共に使用することによって実行した。Ｑ１０およびＱ１０Ｈ２の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。１００μＭ  Ｑ１０によって処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および９５：５  メタノール／ヘキサン（ｖ／ｖ）での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
【０３４６】
本分析において、Ｑ１０、Ｑ１０Ｈ２、およびＱ９を定量した（表５）。関連する分子Ｑ９のレベルは低く、検出レベル付近であった。未処置試料のレベルは、この同じレベルを有する６時間Ｑ１０処置試料と比較的一致していた。全材料の試料分散を制御するために、コレステロールのレベルも測定して、差が試料サイズ誤差によるものでないことを確認した。Ｑ１０レベルが同じミトコンドリア調製物の他の一定分量のタンパク質抽出によって取得された全タンパク質値に対して補正されたときに、相対比は比較可能であった。それゆえＱ１０レベルの著しい上昇が１９時間後に得られ（約３倍）、４８時間時点までになお大きな上昇（約６倍）が得られた（図１２）。
【０３４７】
【表５】
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【０３４８】
本試験からの驚くべき結果は、Ｑ１０が酸化型として細胞に供給されるという発見であった。４８時間試料では、還元型Ｑ１０Ｈ２も測定され、著しく低い量で存在することが見出された（ＣｏＱ１０  ４６．６３ｎｇ／試料と比較して、ＣｏＱ１０Ｈ２  ０．２８ｎｇ／試料）。Ｑ１０処置４８時間試料においてＱ１０Ｈ２のレベルの一般的な上昇（３倍）があったが、レベルはアッセイの推定検出限界付近であった。興味深いことに、酸化型（Ｑ１０）は、生物系において酸化エンハンサとして作用することができる。文献によれば、ヒト血漿をＱ１０およびＱ１０Ｈ２を評価したとき、分子の大部分（９０％）は、抗酸化剤として作用することができる、Ｑ１０Ｈ２の還元型で見出された（Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，２００７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ  Ａ，１１７５，２４２−２４８）。
【０３４９】
それゆえこれらの結果は、培地へのＱ１０の外部からの添加時にＱ１０のレベルがミトコンドリア中で上昇することを確認および定量する。驚くべきおよび予想外の発見は、Ｑ１０がいずれの著しい量でも供給された酸化型（酸化促進）で維持されて、Ｑ１０Ｈ２の還元（抗酸化）型に変化されないことであった。
【０３５０】
実施例６：リアルタイムＰＣＲアレイ
実験１：アポトーシスアレイ
実施例３で上述したように、癌細胞のＱ１０への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Ｑ１０応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子／タンパク質についてのｍＲＮＡのレベルの変化を同定した。
【０３５１】
それゆえＰＣＲアレイをスクリーニングツールとして使用して、細胞内のＱ１０の生物学的作用の様式への洞察を潜在的に供給する一連の分子ターゲットを評価した。８０の経路特異的ターゲットを含有する事前に選択されたサブセットのｍＲＮＡレベルを影響評価するためのリアルタイムＰＣＲ定量を使用して、ｍＲＮＡの変化を評価した。
【０３５２】
ｍＲＮＡ結果の解釈のために、そのｍＲＮＡ転写が２倍のレベルで改変された遺伝子を同定および評価した。ｍＲＮＡのみを産生する遺伝子転写のレベルは、発現されたタンパク質のレベルの潜在的な変化の大まかな推定値を提供する。当業者は、各ｍＲＮＡが非効率的なことに、ｍＲＮＡの分解またはその翻訳で異なる速度を有し得て、それゆえ異なる量のタンパク質を生じることを認識するであろう。
【０３５３】
５０ｕｍ  Ｑ１０によって２４時間処置したＳｋＢｒ−３細胞
ＲＴ−ＰＣＲのアッセイ方法を利用して、合計８４のアポトーシス経路関連タンパク質に対するｍＲＮＡレベルの変化の尺度を提供した。Ｑ１０（２４時間）を用いた、ＳｋＢｒ３に対するリアルタイムＰＣＲアポトーシス分析による実験は、以下のｍＲＮＡ：Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ２Ｌ１、Ｂｃｌ２Ｌ１１、Ｂｉｒｃ６、Ｂａｘ、Ｘｉａｐ、Ｈｐｒｔ１、Ａｐａｆ１、Ａｂｌ１、Ｂｒａｆが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Ｑ１０処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
【０３５４】
【表６】
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【０３５５】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞による３つの独立した実験からの一致した結果を下の表６Ｂにまとめる。１００μＭ  Ｑ１０処置により多くの遺伝子は、ＳＣＣ細胞において同様に調節される。ＳＣＣ細胞で調節されると思われるアポトーシスアレイの遺伝子を表７に記載する。我々は、多くの遺伝子がＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞およびＳＣＣ細胞の両方で６時間後に調節されていることを見出している。２４時間までに調節は低下する。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞およびＳＣＣ細胞の両方で調節されると思われる遺伝子を表８に記載する。
【０３５６】
【表７】
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【０３５７】
【表８】
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【０３５８】
【表９】
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【０３５９】
興味深いことに、改変されたｍＲＮＡレベルは、一連のアポトーシスタンパク質において著しい上方調節を示し、Ｂｃｌ−ｘｌは最も高いものの１つであった。これはＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に対するタンパク質アレイ実験でも観察された。
【０３６０】
Ｂｃｌ−ｘｌは、ミトコンドリア中の膜貫通分子である（Ｂｃｌ−ｘｌは「基底細胞リンパ腫−特大」を表す）。Ｂｃｌ−ｘｌは、ＦＡＳ−Ｌのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである複数の抗アポトーシスタンパク質の１つである。Ｂｃｌ−ｘｌは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトＢｃｌ−ｘｍＲＮＡの選択的スプライシングが少なくとも２種類の別個のＢｃｌ−ｘｍＲＮＡ種、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物（２３３アミノ酸）は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のＢｃｌ−ｘ  ｍＲＮＡであるＢｃｌ−ｘＬである（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７４，５９７−６０８）。他方では、Ｂｃｌ−ｘＳは、Ｂｃｌ−２が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。利用した使用アッセイは、どのＢｃｌ−ｘのアイソフォームが上方調節されているかを識別しない。これらの研究でＣｏＱによって上方調節されているＢｃｌ−ｘアイソフォームは、当分野で公知の所定の方法によって、例えばＲＴ−ＰＣＲ方法を使用することによって決定され、２種類のｍＲＮＡスプライシングアイソフォームの比（Ｂｃｌ−ｘＬ対Ｂｃｌ−ｓＬ）が評価され得る。
【０３６１】
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がＢＣＬ−２ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと（ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ２、ＢＡＧ１、ＨＲＫ、ＢＡＫ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１）が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
【０３６２】
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ３／７タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−９の上方調節（１６時間）によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出およびａｐａｆ−１（アポトソーム）の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−９のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−９はプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
【０３６３】
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結もある。
【０３６４】
腫瘍タンパク質ｐ７３の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、ｐ７３の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびＤＮＡの合成に関与する体内の転写因子（すなわち：Ｅ２Ｆ−１）の調節解除された過剰発現がｐ７３の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、ｐ７３は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するｐ５３タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。アポトーシス経路のマッピングを示す概略図を図１３に示す。
【０３６５】
ＳＫＭＥＬ−２８細胞
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がＢＣＬ−２ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと（ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ２、ＢＡＧ１、ＨＲＫ、ＢＡＫ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１）が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
【０３６６】
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ３／７タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−９の上方調節（１６時間）によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出およびａｐａｆ−１（アポトソーム）の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−９のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−９はプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
【０３６７】
【表１０】
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【０３６８】
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結がある。
【０３６９】
腫瘍タンパク質ｐ７３の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、ｐ７３の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびＤＮＡの合成に関与する体内の転写因子（すなわち：Ｅ２Ｆ−１）の調節解除された過剰発現がｐ７３の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、ｐ７３は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するｐ５３タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。
【０３７０】
実験２：酸化ストレスおよび抗酸化防御アレイを使用するリアルタイムＰＣＲアレイ
Ｑ１０応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子／タンパク質についてのｍＲＮＡのレベルの変化を同定した。
【０３７１】
下の表１０は、１００μＭ  Ｑ１０処置によりＳＫ−ＭＥＬ２８細胞で調節される遺伝子を挙げる。結果は、２つの独立した実験で調節されるこのような遺伝子のみについて与える。６時間では著しい量の遺伝子調節が見られるが、４８時間ではＲＮＡレベルの最も著しい変化が見られる。
【０３７２】
【表１１】
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【０３７３】
好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２、６５ｋＤａ、慢性肉芽腫性疾患、常染色体２）は、初期トップ誘導ｍＲＮＡの１つであった（６時間にて観察された）。続いて１６時間の時点以降、好中球サイトゾル因子１（ＮＣＦ１）（慢性肉芽腫性疾患、常染色体１）は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
【０３７４】
好中球サイトゾル因子２は、好中球に普通見出されるＮＡＤＰＨオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。
【０３７５】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）は、膜結合酵素複合体である。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは６つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは：
【０３７６】
１つのＲｈｏグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）、通常Ｒａｃ１またはＲａｃ２（Ｒａｃは、Ｒｈｏ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質を表す）
【０３７７】
５つの「ｐｈｏｘ」ユニット（Ｐｈｏｘは、食細胞オキシダーゼを表す。）
・Ｐ９１−ＰＨＯＸ（ヘムを含有する）
・ｐ２２ｐｈｏｘ
・ｐ４０ｐｈｏｘ
・ｐ４７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ１）
・ｐ６７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ２）
【０３７８】
別のＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ｃａ（２＋）依存性方式でＨ＋チャネルとして機能する新規ＮＡＤＰＨオキシダーゼである、ＮＯＸ５である。
【０３７９】
加えて、ホスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸依存性ＲＡＣ交換因子１（ＰＲＥＸ１）も上方調節された。本タンパク質は、小型ＧＴＰ結合タンパク質（ＲＡＣ）のＲＨＯファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているＧＤＰを遊離ＧＴＰと交換することによって、ＲＡＣ１を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−３リン酸およびヘテロトリマーＧタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
【０３８０】
第２の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ２Ａ（誘導性、肝細胞）（ＮＯＳ２Ａ）であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
【０３８１】
スーパーオキシドディスムターゼ２、ミトコンドリア（ＳＯＤ２）は、鉄／マンガンスーパーオキシドディスムターゼファミリーのメンバーである。これはホモテトラマーを形成し、サブユニットに付きマンガンイオン１個を結合するミトコンドリアタンパク質をコードする。本タンパク質は、酸化的リン酸化のスーパーオキシド副生成物に結合して、これらを過酸化水素および２原子酸素に変換する。本遺伝子の突然変異は、関連する特発性心筋症（ＩＤＣ）、早期老化、散発性運動ニューロン疾患、および癌に関連してきた。
【０３８２】
下方調節されたタンパク質の例は、内因性ＦＯＸＭ１発現がＳ期およびＧ２／Ｍ期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）である。最近の研究は、Ｇ２／Ｍ特異的遺伝子、例えばＰｌｋ１、サイクリンＢ２、Ｎｅｋ２およびＣＥＮＰＦの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。ＦＯＸＭ１遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。ＦＯＸＭ１の異常な上方調節は、基底細胞癌腫（ＢＣＣ）の腫瘍形成に関与している。ＦＯＸＭ１上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、子宮頸部、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。ＢＣＣおよびＱ１０によるさらなる研究によってＦＯＸＭ１レベルを評価すべきである。
【０３８３】
ＳＫＭＥＬ−２８細胞
ＳＫＭＥＬ−２８細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、１００μＭ  Ｑ１０によって処置されたＳＫＭＥＬ−２８細胞中に存在するｍＲＮＡのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なＲＮＡ品質管理のための、９６ウェルプレートでの最適化リアルタイムＰＣＲプライマアッセイのセットである。ＰＣＲアレイは、マイクロアレイのリアルタイムＰＣＲ感受性および多遺伝子プロファイリング能力を用いて遺伝子発現分析を遂行する。
【０３８４】
【表１２】
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【０３８５】
【表１３】
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【０３８６】
好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２、６５ｋＤａ、慢性肉芽腫性疾患、常染色体２）は、初期トップ誘導ｍＲＮＡの１つであった（６時間にて観察された）。続いて１６時間の時点以降、好中球サイトゾル因子１（ＮＣＦ１）（慢性肉芽腫性疾患、常染色体１）は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
【０３８７】
好中球サイトゾル因子２は、好中球に普通見出されるＮＡＤＰＨオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）は、膜結合酵素複合体である。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは６つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは：
・１つのＲｈｏグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）、通常Ｒａｃ１またはＲａｃ２（Ｒａｃは、Ｒｈｏ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質を表す）
・５つの「ｐｈｏｘ」（食細胞オキシダーゼ）ユニット
・Ｐ９１−ＰＨＯＸ（ヘムを含有する）
・ｐ２２ｐｈｏｘ
・ｐ４０ｐｈｏｘ
・ｐ４７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ１）
・ｐ６７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ２）である。
【０３８８】
別のＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ｃａ（２＋）依存性方式でＨ＋チャネルとして機能する新規ＮＡＤＰＨオキシダーゼである、ＮＯＸ５である。
【０３８９】
加えて、ホスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸依存性ＲＡＣ交換因子１（ＰＲＥＸ１）も上方調節された。本タンパク質は、小型ＧＴＰ結合タンパク質（ＲＡＣ）のＲＨＯファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているＧＤＰを遊離ＧＴＰと交換することによって、ＲＡＣ１を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−３リン酸およびヘテロトリマーＧタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
【０３９０】
第２の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ２Ａ（誘導性、肝細胞）（ＮＯＳ２Ａ）であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
【０３９１】
下方調節されたタンパク質の例は、内因性ＦＯＸＭ１発現がＳ期およびＧ２／Ｍ期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、ＦＯＸＭ１である。最近の研究は、Ｇ２／Ｍ特異的遺伝子、例えばＰｌｋ１、サイクリンＢ２、Ｎｅｋ２およびＣＥＮＰＦの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。ＦＯＸＭ１遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。ＦＯＸＭ１の異常な上方調節は、基底細胞癌腫（ＢＣＣ）の腫瘍形成に関与している。ＦＯＸＭ１上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、頸部、子宮、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。
【０３９２】
実験３：熱ショックアレイを使用するリアルタイムＰＣＲアレイ
ＳＣＣ細胞に熱ショックアレイを実行して、調節された遺伝子のデータを下の表１３にまとめる。
【０３９３】
【表１４】
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【０３９４】
実験４：糖尿病アレイを使用するリアルタイムＰＣＲアレイ
本実施例に記載した実験を遂行して、Ｑ１０が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。１００μＭ  Ｑ１０によって処置したＳＫＭＥＬ−２８細胞からのｍＲＮＡを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のｍＲＮＡ発現レベルが改変されることを証明している（表１４にまとめる）。
【０３９５】
【表１５】
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【０３９６】
本初期実験の結果は、多種多様のインスリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが両方向に調節されたことを示す。結果は、糖尿病の処置および／または評価に影響を有するであろうことを指摘する。
【０３９７】
次にさらなる実験を行って、Ｑ１０によって処置したＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞から取得した上の結果を確認した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中の遺伝子の多くが、Ｑ１０処置の早くも６時間後に調節されている。しかし初期調節は、１６時間および２４時間までにより明らかでなくなる。４８時間付近で、我々は糖尿病アレイの多くの遺伝子が再度強力に調節されることを見出している。２つ以上の独立した実験からの一致した結果を下の表１５にまとめる。ＳＣＣ細胞もＱ１０処置の６時間後および２４時間後の両方に、いくつかの遺伝子における調節を呈するように思われる。表１６にはＳＣＣ細胞のこれらの結果をまとめ、表１７にはＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞およびＳＣＣ細胞の両方で調節される遺伝子をまとめる。
【０３９８】
【表１６】
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【０３９９】
【表１７】
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【０４００】
【表１８】
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【０４０１】
多種多様のインスリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが両方向に調節された。Ｑ１０は細胞代謝に対して影響を有し、それゆえ糖尿病などの代謝調節疾患に影響する。著しく調節された２種類のタンパク質について、下でさらに述べる。
【０４０２】
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。ＭＡＰキナーゼは、複数の生化学シグナルの統合点として作用し、増殖、分化、転写調節および発生などの多岐にわたる細胞プロセスに関与している。本実験の結果は、ＭＡＰＫ１４が著しく下方調節されたことを示す。
【０４０３】
肝細胞核因子４、アルファ（ＨＮＦ４Ａ）：ＨＮＦ４（肝細胞核因子４）は、肝臓発生に不可欠である肝臓、腸、腎臓、および膵臓ベータ細胞で大部分が発現される核受容体タンパク質である。ヒトにおいては、２種類の別々の遺伝子ＨＮＦ４ＡおよびＨＮＦ４ＧによってそれぞれコードされたＮＨＦ４の２種類のアイソフォーム、アルファおよびガンマがある（例えばＣｈａｒｔｉｅｒ  ＦＬ，Ｂｏｓｓｕ  ＪＰ，Ｌａｕｄｅｔ  Ｖ，Ｆｒｕｃｈａｒｔ  ＪＣ，Ｌａｉｎｅ  Ｂ（１９９４）．“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４  ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ”．Ｇｅｎｅ  １４７（２）：２６９−７２を参照）。
【０４０４】
ＨＮＦ４は当初、オーファン受容体として分類された。しかしＨＮＦ４は後に、多種多様の脂肪酸に連続的に結合されるために構成的に活性であることが見出された（例えばＳｌａｄｅｋ  Ｆ（２００２）．“Ｄｅｓｐｅｒａｔｅｌｙ  ｓｅｅｋｉｎｇ．．．ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ”．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０（２）：２１９−２２１およびＪｕｍｐ  ＤＢ，Ｂｏｔｏｌｉｎ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｘｕ  Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｂ，Ｄｅｍｅｕｒｅ  Ｏ（２００５）．“Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｊ  Ｎｕｔｒ  １３５（１１）を参照）。ＨＮＦ４のリガンド結合ドメインは、他の核受容体と同様に、基準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）アルファらせんサンドイッチフォールディングを取り（例えばＷｉｓｅｌｙ  ＧＢ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＢ，Ｄａｖｉｓ  ＲＧ，Ｔｈｏｒｎｑｕｅｓｔ  ＡＤ  Ｊｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｒ，Ｓｐｉｔｚｅｒ  Ｔ，Ｓｅｆｌｅｒ  Ａ，Ｓｈｅａｒｅｒ  Ｂ，Ｍｏｏｒｅ  ＪＴ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＢ，ＷｉｌｌｓｏｎＴＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＰ（２００２）．“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４  ｉｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １０（９）：１２２５−３４およびＤｈｅ−Ｐａｇａｎｏｎ  Ｓ，Ｄｕｄａ  Ｋ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｍ，Ｃｈｉ  ＹＩ，Ｓｈｏｅｌｓｏｎ  ＳＥ（２００２）．“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＮＦ４  ａｌｐｈａ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ”．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（４１）：３７９７３−６を参照）、コアクチベータータンパク質と相互作用する（例えばＤｕｄａ  Ｋ，Ｃｈｉ  ＹＩ，Ｓｈｏｅｌｓｏｎ  ＳＥ（２００４）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＨＮＦ−４ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（２２）：２３３１１−６に概説されている）。
【０４０５】
ＨＮＦ４−α遺伝子の突然変異は、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）と結び付けられてきた（例えばＦａｊａｎｓ  ＳＳ，Ｂｅｌｌ  ＧＩ，Ｐｏｌｏｎｓｋｙ  ＫＳ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ”．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５（１３）：９７１−８０を参照）。
【０４０６】
肝細胞核因子４（ＨＮＦ４）は、肝細胞および膵臓細胞において多数の遺伝子を調節することが公知の組織特異的転写因子である。ＨＮＦ４は腎臓のいくつかの部位で高度に発現されることが公知であるが、本器官におけるその役割についておよび腎臓細胞におけるＨＮＦ４調節遺伝子についてはほとんど知られていない。ＨＮＦ４の存在量および活性は腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）では頻繁に低下し、腎臓細胞におけるＨＮＦ４の多少の腫瘍抑制機能を示す。興味深いことに、ＨＮＦ４によって調節された遺伝子の多くは、ＲＣＣマイクロアレイ試験では調節解除されることが示されている。これらの遺伝子（ＡＣＹ１、ＷＴ１、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＣＯＢＬ、ＥＦＨＤ１、ＡＧＸＴ２Ｌ１、ＡＬＤＨ５Ａ１、ＴＨＥＭ２、ＡＢＣＢ１、ＦＬＪ１４１４６、ＣＳＰＧ２、ＴＲＩＭ９およびＨＥＹ１）は、ＲＣＣにおけるＨＮＦ４の低下時に活性が変化する遺伝子の良好な候補である。
【０４０７】
ＨＮＦ４アルファのリガンド結合ドメインの構造において（１Ｍ７Ｗ．ｐｄｂ；Ｄｈｅ−Ｐａｇａｎｏｎ（２００２）ＪＢＣ，２７７，３７９７３）；小型脂質が観察され、大腸菌産生から同時精製された。結晶はタンパク質の２種類の立体配座を含有し、ここで伸長らせん１０および短らせん１２が交互の立体配座を有している。脂質結合領域の検査時に、興味深いことに、２つの出口領域があることが見出された。一方の領域は小型脂質の頭基を保持して、複数のポケット領域が本出口ポートと共局在していることが注目される。仮説は、Ｑ１０が本転写因子に特異的に結合するということである。本脂質結合トンネル中にモデル化されるとき、Ｑ１０環は表面ポケット中に適合するであろう（図２８）。公知の機能喪失型突然変異（Ｅ２７６Ｑ）は、本表面ポケットを裏打ちするように残基を配列する潜在能を有し、それゆえ推定上のＱ１０結合に悪影響を有するであろう。
【０４０８】
加えて、本Ｑ１０結合モデルによって、疎水性尾部は内部空洞から延出して、次に伸長らせん１０と相互作用するであろう。それゆえ、本相互作用は、らせん１０／１２基の立体配座を潜在的に改変することができる。このことは次に、転写因子活性の活性化／不活性化平衡を改変し得る。
【０４０９】
実施例７：抗体マイクロアレイ分析
Ｑ１０の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、７００超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
【０４１０】
Ｑ１０によって処置された細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価するための初期実験は、抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ、Ｓｉｇｍａ）および６時間または２４時間処置したＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を用いて行った。細胞を収集および抽出して、可溶性タンパク質上清を取得した。各試料（１ｍｇ／ｍＬの）からのタンパク質の２つの分量（合計約１ｍｇ）を蛍光染料（それぞれＣｙ３およびＣｙ５）によってそれぞれ標識した。過剰な染料をタンパク質から除去して、材料をマイクロアレイインキュベーションに利用した。２つの時点の試料を比較するために、等量のタンパク質を異なる標識タイプである各試料と混合した（例えばＣｙ３で標識された３時間抽出物を、Ｃｙ５で標識された２４時間抽出物と混合した）。（メーカーの推奨プロトコルに従った）マイクロアレイチップによるインキュベーション後に、チップを洗浄および乾燥した。マイクロアレイを蛍光レーザスキャナによってスキャンして、Ｃｙ３およびＣｙ５染料の相対蛍光強度を測定した。
【０４１１】
【表１９】
0005903734.tif 000026
【０４１２】
【表２０】
0005903734.tif 000027
【０４１３】
先に観察されたアポトーシスタンパク質を確認するために、およびより多数のアポトーシス促進および抗アポトーシスタンパク質への評価を拡張するために、潜在的に包含される広範なタンパク質のファミリーをスクリーニングすることができる２種類のアッセイ方法を選定した。
【０４１４】
第１に、抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ，Ｓｉｇｍａ）を利用して７００超のタンパク質抗体をスクリーニングし、５０μＭ  Ｑ１０によって２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
【０４１５】
以下は、Ｑ１０（２４時間）を用いたＳＫＭＥＬ−２８に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である：Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｍｆ、ＢＴＫ、ＢＬＫ、ｃＪｕｎ（ｐＳｅｒ６３）、コネキシン３２、ＰＵＭＡ  ｂｂｃ３、ＢＩＤ、Ｐａｒ４、ｃＣｂｌ。本初期試験からの主な結論は、予想されたアポトーシス促進タンパク質が改変されたことであった。
【０４１６】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８の抗体マイクロアレイ
抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ，Ｓｉｇｍａ）を利用して７００超のタンパク質抗体をスクリーニングし、５０μＭ  Ｑ１０によって２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
【０４１７】
【表２１】
0005903734.tif 000028
【０４１８】
以下は、Ｑ１０（２４時間）を用いたＳＫＭＥＬ−２８に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である：Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｍｆ、ＢＴＫ、ＢＬＫ、ｃＪｕｎ（ｐＳｅｒ６３）、コネキシン３２、ＰＵＭＡ  ｂｂｃ３、ＢＩＤ、Ｐａｒ４、ｃＣｂｌ。これらのデータは、外部から添加されたＱ１０のレベルの上昇により、アポトーシス促進タンパク質のレベルがインキュベーション時に改変されることを確認している。
【０４１９】
Ｂｃｌ−ｘｌ（「基底細胞リンパ腫−特大」）は、ミトコンドリア中の膜貫通分子である。Ｂｃｌ−ｘｌは、ＦＡＳ−Ｌのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである複数の抗アポトーシスタンパク質の１つである。Ｂｃｌ−ｘｌは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトＢｃｌ−ｘｍＲＮＡの選択的スプライシングが少なくとも２種類の別個のＢｃｌ−ｘｍＲＮＡ種、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物（２３３アミノ酸）は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のＢｃｌ−ｘ  ｍＲＮＡであるＢｃｌ−ｘＬである（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７４，５９７−６０８）。他方では、Ｂｃｌ−ｘＳは、Ｂｃｌ−２が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。
【０４２０】
【表２２】
0005903734.tif 000029
【０４２１】
【表２３】
0005903734.tif 000030
【０４２２】
実施例８：ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットおよび２次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第１の実験を皮膚癌株化細胞ＳＫＭＥＬ−２８に対して行った。本実験セットは、５０または１００μＭ  Ｑ１０によって３、６、１２、および２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を包含していた。
【０４２３】
多種多様の細胞タイプを、Ｂｃｌ−ｘＬの抗体（図１４）、ビメンチンの抗体（図１５）、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能の一連の抗体（図１６〜２１）およびミトコンドリア膜完全性に関連する一連の抗体（図２２〜２７）に対してウェスタンブロット分析によって評価した。これらの実験による結果は、複数の検査されたタンパク質がＱ１０による細胞処置の結果として上方調節または下方調節されることを証明した。
【０４２４】
実施例９：１００ｕｍ  Ｑ１０による膵臓癌細胞ｓ（ＰａＣａ２）の処置によってｍＲＮＡレベルが調節されているとして同定された糖尿病関連遺伝子
１００ｕＭ  Ｑ１０によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は、本質的に上記のように行った。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２３に要約される。結果は、Ｑ１０処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した：ＡＢＣＣ８、ＡＣＬＹ、ＡＤＲＢ３、ＣＣＬ５、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＢＲＡ、ＦＯＸＧ１、ＦＯＸＰ３、Ｇ６ＰＤ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＰＤ１、ＨＮＦ４Ａ、ＩＣＡＭ１、ＩＧＦＢＰ５、ＩＮＰＰＬ１、ＩＲＳ２、ＭＡＰＫ１４、ＭＥ１、ＮＦＫＢ１、ＰＡＲＰ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＴＰＮ１、ＰＹＧＬ、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＮＡＰ２５、ＨＮＦ１Ｂ、ＴＮＲＦＳＦ１Ａ、ＴＲＩＢ３、ＶＡＰＡ、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ４ＲおよびＩＬ６。
【０４２５】
【表２４】
0005903734.tif 000031
【０４２６】
実施例１０：１００μＭ  Ｑ１０を用いる膵臓癌細胞（ＰａＣａ２）の処理によってｍＲＮＡレベルが調節されるとして同定される血管新生関連遺伝子
処理後の様々な時点において１００μＭ  Ｑ１０で処理された試料について血管新生アレイが実行された。実験は、本質的に上記のように行った。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２４に要約される。結果は、Ｑ１０処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した：ＡＫＴ１、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＥＰ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ４、ＣＸＣＬ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＩＤ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、ＫＤＲ、ＮＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＰＲＯＫ２、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＰＨＫ１、ＳＴＡＢ１、ＴＧＦＢ１、ＶＥＧＦＡ、およびＶＥＧＦＢ。
【０４２７】
【表２５】
0005903734.tif 000032
【０４２８】
実施例１１：１００μＭ  Ｑ１０を用いる膵臓癌細胞（ＰａＣａ２）の処理によってｍＲＮＡレベルで調節されるとして同定されるアポトーシス関連遺伝子
処理後の様々な時点において１００μＭ  Ｑ１０で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は、本質的に上記のように行った。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２５に要約される。結果は、Ｑ１０処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、Ｂｃｌ２Ｌ１、ＢｃｌＡＦ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ６、ＣＩＤＥＡ、ＦＡＤＤ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＴＮＦＳＦ１０Ａ、およびＴＮＦＳＦ１０。
【０４２９】
【表２６】
0005903734.tif 000033
【０４３０】
実施例１２：肝臓癌（ＨｅｐＧ２）細胞上でのＰＣＲ糖尿病アレイ
ＨｅｐＧ２（肝臓癌）細胞は、２４時間ビヒクルで、または様々な時間の間１００μＭ  Ｑ１０のいずれかで処理された。処理は、ＰａＣａ２細胞において利用された手順に従って（上記、実施例９〜１１）、ウェルあたり１×１０５細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたＲＮＡの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、１μｇの総ＲＮＡ（２６０ｎｍにおける測定によって決定される）を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は８μｌである。ＲＮＡ濃度が低いので、ビヒクル、ならびに１６時間および４８時間Ｑ１０処理された試料を使用するＲＴ−ＰＣＲアレイ分析が、０．４４μｇのＲＮＡを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表２６において要約されるように、１００μＭ  Ｑ１０処理を用いる、ＨｅｐＧ２遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＫＡＡ１、およびＳＮＡＰ２５の各々が処理の１６時間後に下方調節されたことを示した（それぞれ、約２０倍、６倍、および５倍）。処理後４８時間において、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＰＲＫＡＡ１は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、ＳＮＡＰ２５は約２倍下方調節された。
【０４３１】
【表２７】
0005903734.tif 000034
【０４３２】
実施例１３：肝臓癌（ＨＥＰＧ２）細胞上のＰＣＲ血管新生アレイ
ＨｅｐＧ２（肝臓癌）細胞は、２４時間ビヒクルで、または様々な時間の間１００μＭ  Ｑ１０のいずれかで処理された。処理は、ＰａＣａ２細胞において利用された手順に従って（上記、実施例９〜１１）、ウェルあたり１×１０５細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたＲＮＡの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、１μｇの総ＲＮＡ（２６０ｎｍにおける測定によって決定される）を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は８μｌである。ＲＮＡ濃度が低いので、ビヒクル、ならびに１６時間および４８時間Ｑ１０処理された試料を使用するＲＴ−ＰＣＲアレイ分析が、０．４４μｇのＲＮＡを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表２７において要約されるように、１００μＭ  Ｑ１０処理を用いる、ＨｅｐＧ２遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２７に要約される。結果は、遺伝子ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＥＮＧ、ＭＭＰ２、およびＴＩＭＰ３の各々が処理の１６時間後に上方調節されたことを示した（それぞれ、対照のそれよりも、約５．５倍、３倍、３倍、３．２倍、３倍、３倍、１倍、および６．５倍、６倍および５倍）。ＩＤ３は、Ｑ１０処理の１６時間後に、対照の約５倍下方調節された。処理の４８時間後に、ＡＮＧＰＴＬ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＥＮＧ、およびＴＩＭＰ３はまだ上方調節されたのに対して（それぞれ、対照よりも約３．５倍、１．５倍、３．１７５倍、２倍、および３倍）、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＸＣＬ５、ＩＤ３、およびＭＭＰ２は、対照よりも、それぞれ、約１倍、１倍、２倍、および１８倍下方調節された。
【０４３３】
【表２８】
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【０４３４】
血管新生のプロセスに関与していることが知られているタンパク質は、ＲＴ−ＰＣＲアレイの構成要素であった。血管新生は、癌細胞が悪性になる決定的なプロセスである。これらのタンパク質のいくつかは糖尿病にも関わりがある。
【０４３５】
ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ４：ＡＮＧＰＴＬ３に関連する文献は、このタンパク質を脂質代謝の調節に関連付けている。特に、この文献（Ｌｉ，Ｃ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ．２００６  Ａｐｒ；１７（２）：１５２−６）は、アンジオポエチンとアンジオポエチン様タンパク質の両方が類似のドメイン構造を共有することを教示している。ＡＮＧＰＴＬ３および４は、リポタンパク質リパーゼ活性を阻害するこのスーパーファミリーの２つのみのメンバーである。しかし、ＡＮＧＰＴＬ３および４は、複数のレベルで示差的に調節されており、インビボでの冗長でない機能を示唆している。ＡＮＧＰＴＬ３および４は、タンパク質分解的に２つの半分にプロセスされ、核受容体によって示差的に調節されている。ＡＮＧＰＴＬ４のトランスジェニック過剰発現ならびにＡＮＧＰＴＬ３または４のノックアウトは、これらの２つのタンパク質が脂質タンパク質代謝において本質的な役割を果たしていることを実証している：肝臓由来のＡＮＧＰＴＬ３は食事を与えられた状態で主にリポタンパク質リパーゼ活性を阻害するのに対して、ＡＮＧＰＴＬ４は、食事を与えられた状態と絶食状態の両方で重要な役割を果たしている。加えて、ＡＮＧＰＴＬ４は、リポタンパク質誘導脂肪酸の組織特異的送達を調節する。このように、ＡＮＧＰＴＬ４は、発現のその部位に依存して、リポタンパク質リパーゼのエンドクリンまたはオートクリン／パラクリン阻害剤である。
【０４３６】
リポタンパク質リパーゼは、キロミクロンおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）において見い出されるものなどのリポタンパク質中の脂質を、３つの遊離脂肪酸と１つのグリセロール分子に加水分解する酵素である。所定の組織中でのリポタンパク質リパーゼ活性は、トリグリセリド誘導脂肪酸の取り込みのための律速段階である。脂肪酸の分配のバランスの悪さは、大きな代謝的な結果を有する。高脂肪食はＬＰＬの組織特異的過剰発現を引き起こすことが示されており、これは、組織特異的インスリン抵抗性および結果としての２型糖尿病の発症に関わってきた。
【０４３７】
本実施例の結果は、Ｑ１０が脂質代謝に関わっている調節タンパク質であり、従って、ＡＮＧＰＴＬ３／ＡＮＧＰＴＬ４およびそれらの関連する経路のさらなる研究を正当化することを示す。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３／ＡＮＧＰＴＬ４は、以下の経路において役割を果たすことに関わっている：。Ａｋｔ、コレステロール、脂肪酸、ＨＤＬ−コレステロール、ＨＮＦ１Ａ、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧ８３、Ｌ−トリヨードチロニン（ｔｒｉｌｏｄｏｔｈｙｎｏｎｉｎｅ）、ＬＩＰＧ、ＬＰＬ、Ｍａｐｋ、Ｎｒｔｈ、ＮＲ１Ｈ３、ＰＰＡＲＤ、ＰＴＫ２、ＲＸＲＡ、トリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｅｒｏｌ）、および９−シス−レチノイン酸
【０４３８】
実施例１４：肝臓癌（ＨＥＰＧ２）細胞上のＰＣＲアポトーシスアレイ
アポトーシスアレイは、上記のように、１６時間および４８時間、１００μＭ  Ｑ１０で処理された試料について実行された。しかし、４８時間のアレイは、ＳＹＢＲの代わりに蛍光団としてＦＡＭを選んで実行された。ＦＡＭとＳＹＢＲの両方は同じ波長で蛍光を発する。
【０４３９】
Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２８に要約される。これらの結果は、ＣＡＳＰ９がＱ１０処理の１６時間後に対照の約６１倍上方調節されたのに対し、ＢＡＧ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ａは、処理の１６時間後に対照よりもそれぞれ約６倍および４倍下方調節されたことを示す。処理後４８時間では、ＣＡＳＰ９、ＢＡＧ１、およびＴＮＦＲＳＦ１Ａは、対照よりもそれぞれ約５５倍、１倍、および１倍上方調節された。
【０４４０】
【表２９】
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【０４４１】
実施例１５：腫瘍性障害を治療するためのＭＩＭまたはエピシフターの能力の評価
選択されたＭＩＭまたはエピシフター、例えば、ＣｏＱ１０が、腫瘍性障害、例えば、黒色腫を治療する能力は、マウスモデルにおいて評価される。黒色腫腫瘍は皮下層へのＳＫ−ＭＥＬ２８注射によってマウスの中で誘導される。動物研究は、各々が４匹のマウスを含む対照群と治療群の両方からなる。これらのマウスは２つの腫瘍を接種される。ＭＩＭまたはエピシフターの局所製剤は、３０日間の期間にわたって毎日処置群中の腫瘍に適用され、その後、腫瘍は切除され、重量が測定される。ＭＩＭまたはエピシフターは、処置群の全体の平均重量の差異が対照と比較して顕著であるときに、腫瘍を処置する際に有効であると同定される。
【０４４２】
実施例１６：腫瘍性障害と関連するＭＩＭの同定
潜在的なＭＩＭとしての候補分子（例えば、環境影響因子）を評価するために、選択された候補ＭＩＭが、疾患（癌）細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および／または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
【０４４３】
細胞形態学／生理学の変化は、候補ＭＩＭに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例３に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、少なくとも１つの対照細胞系統および少なくとも１つの癌細胞系統からなる細胞系統のパネルが、種々の濃度の候補ＭＩＭで処理される。潜在的なＭＩＭに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。潜在的ＭＩＭに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、２種の染料、７ＡＡＤおよびアネキシン−Ｖ−ＰＥの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Ａｐｏｓｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡ方法論を使用する、一本鎖ＤＮＡを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。正常細胞と比較されるような疾患細胞において、示差的な細胞傷害性を表示し、および／またはアポトーシス性応答を示差的に誘導する分子がＭＩＭとして同定される。
【０４４４】
候補ＭＩＭを用いる下の処置後の細胞の組成の変化が評価される。ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の変化がリアルタイムＰＣＲアレイ方法論を使用して分析される。これらの実験は、実施例６および９〜１３において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補ＭＩＭは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む１種以上の細胞系統に外因的に加えられ、ｍＲＮＡは処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、例えば、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。２倍レベル以上でｍＲＮＡ転写が変化される遺伝子が同定および評価される。細胞中でｍＲＮＡレベルの変化を誘導し、および／または正常細胞と比較して疾患細胞において１種以上のｍＲＮＡのレベルの示差的な変化を誘導する分子はＭＩＭとして同定される。
【０４４５】
相補実験において、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は、抗体マイクロアレイ方法論、二次元ゲル電気泳動、続いて質量分析による特徴付けを使用するタンパク質の同定を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例７、４、および８において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補ＭＩＭは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む１種以上の細胞系統に外因的に加えられ、可溶性タンパク質が、処置後の様々な時点、例えば、６時間または２４時間で細胞から抽出される。タンパク質レベルで誘導された候補ＭＩＭによる変化が、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている７００種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補ＭＩＭは、例えば、疾患細胞および正常対照細胞系統を含む１種以上の細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、二次元ゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、ＭａｓｃｏｔおよびＭＳＲＡＴソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の二次元ゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補ＭＩＭによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。細胞中でタンパク質レベルの変化を誘導し、および／または正常細胞と比較して疾患細胞において１種以上のタンパク質のレベルの示差的な変化を誘導する分子がＭＩＭとして同定される。
【０４４６】
前述の実験から候補ＭＩＭを用いる処置によって調節されることが見い出された遺伝子は、細胞および生化学的経路分析に供され、それによって、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む種々の細胞経路に分類できる。
【０４４７】
候補ＭＩＭの細胞への侵入を確認するため、候補ＭＩＭが細胞内に局在化されるようになるか否かを決定するため、ならびに細胞中に存在する候補ＭＩＭのレベルおよび型を決定するための実験が実行される。これらの実験は、例えば、実施例５に詳細に記載されているように実行される。例えば、ミトコンドリアに存在する候補ＭＩＭのレベルおよび型を決定するために、候補ＭＩＭで処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物が調製および分析される。ミトコンドリアに存在する候補ＭＩＭのレベルは、それによって、外因性候補ＭＩＭの添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認できる。加えて、ミトコンドリア富化試料からのタンパク質のレベルの変化は、全体の細胞タンパク質試料のために上記に記載されたように、二次元ゲル電気泳動および質量分析の特徴付けによるタンパク質同定を使用することによって分析される。細胞に侵入することが見い出され、例えば、ミトコンドリアにおいて増加レベルで存在することが見い出された候補ＭＩＭは、ＭＩＭとして同定される。試験された時間経過にわたる細胞中の、または例えば、具体的には、ミトコンドリア中の候補ＭＩＭのレベルは、例えば、特定のタンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの調節によって証明されるように、他に観察される細胞の変化と相関できる。
【０４４８】
細胞組成の変化を誘導すること、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を誘導することが観察された候補ＭＩＭは、ＭＩＭとして同定される。正常（例えば、非癌性）状態と比較して疾患状態（例えば、癌）において、細胞の形態学、生理学、または細胞組成の示差的な変化（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルにおける遺伝子発現の示差的な変化）を誘導することが観察された候補ＭＩＭは、ＭＩＭとして、特に多次元性質を有するとして同定される。細胞に入ることが可能であることが見い出された候補ＭＩＭは、候補ＭＩＭがそれによって治療効果に加えてキャリア効果を提示するので、ＭＩＭとして、特に、多次元性質を有するとして同定される。
【０４４９】
実施例１７：腫瘍性障害に付随するエピシフターとしてのＣｏＱ１０の同定
対照細胞系統（ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養）およびいくつかの皮膚癌細胞系統（非転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２８；転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２；または扁平上皮細胞癌であるＳＣＣ；膵臓癌細胞系統であるＰａＣａ２；または肝臓癌細胞系統であるＨＥＰ−Ｇ２）からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムＱ１０で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例３に提示される。
【０４５０】
アッセイは、ＣｏＱ１０を用いる処置後に上記に同定される細胞のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでの組成の変化を評価するために利用される。ｍＲＮＡ発現の変化は、アポトーシス、酸化ストレスおよび抗酸化剤、血管新生、および糖尿病の各々について特異的であるリアルタイムＰＣＲマイクロアレイを使用して分析された。タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析およびウェスタンブロット分析を使用して分析された。これらのアッセイからの結果は、ｍＲＮＡとタンパク質の両方のレベルで、コエンザイムＱ１０の添加に起因して、細胞系統中で、遺伝子発現の有意な変化が起こっていたことを実証した。細胞の代謝プロセスに付随するか、またはそれに関与することが知られている多数の遺伝子が、ＣｏＱ１０を用いる処置の結果として、調節されるものとして観察された。例えば、核受容体タンパク質ＨＮＦ４Ａの発現は、Ｑ１０処置後に細胞中で上方調節されていることが見い出された。トランスアルドラーゼ１（ＴＡＬ）の発現もまた、Ｑ１０で処置された細胞中で調節された。ＴＡＬはＮＡＤＰＨおよび反応性酸素中間体のレベルのバランスをとり、それによって、ミトコンドリアの膜電位を調節し、これは、ＡＴＰ合成および細胞生存の決定的なチェックポイントである。腫瘍性障害への特定の関連性の中でも、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖に付随することが知られている多数の遺伝子が、Ｑ１０によって調節されるとして同定された。詳細な例示的な実験が、例えば、本明細書の実施例４、６、７、８、および９に提示されている。
【０４５１】
Ｑ１０は、エネルギー産生のためにミトコンドリアの中での酸化的（ｅｘｉｄａｔｉｖｅ）リン酸化プロセスのための必須のコファクターである。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＣｏＱ１０のレベルは、ＣｏＱ１０の型と同様に、ＣｏＱ１０で処置された細胞からミトコンドリアが富化された調製物を分析することによって決定される。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＱ１０のレベルは、外因性Ｑ１０の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。時間経過は、代謝およびアポトーシス経路と関連する特定のタンパク質についてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの調節において観察されるような広範な種々の細胞の変化と相関した。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例５に提示される。
【０４５２】
本明細書に記載された結果は、エピシフターとして内因性分子ＣｏＱ１０を同定した。特に、結果は、細胞中で、代謝状態のシフト、および部分的にミトコンドリア機能の回復を誘導するとしてＣｏＱ１０を同定した。これらの結論は、本明細書に記載されているデータの以下の解釈、および関連分野における現在の知見に基づいている。
【０４５３】
Ｑ１０は、合成され、ミトコンドリア内膜に能動輸送され、そこで富化され、およびそこで利用されることが知られている。Ｑ１０はまた、エネルギー産生のためのミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のプロセスのための必須のコファクターであることも知られている。しかし、多くの癌細胞は、多くの正常細胞のようにミトコンドリアにおいてピルビン酸の酸化によるのではなく、解糖とその後の細胞質ゾル中での乳酸発酵によって、優勢にエネルギーを生産する。酸化的リン酸化は、電子伝達系およびシトクロムｃを含む。アポトーシスはミトコンドリアの破壊を含み、アポトーシス促進性因子によるミトコンドリア内膜の浸透能（ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を伴う。様々な代謝エネルギー合成経路を利用することによって、癌細胞は、細胞中の異常に対する通常のアポトーシス性応答を軽減することが可能である。理論によって束縛されることを望まないが、出願人は、酸化的リン酸化経路のタンパク質を上方調節すること、従って、発癌の欠陥を認識し、アポトーシスの引き金を引く状態に戻るようにミトコンドリアの機能にスイッチを入れることによってＱ１０が機能していることを提案する。したがって、Ｑ１０は、細胞の代謝状態をシフトすることによってエピシフターとして作用している。
【０４５４】
実施例１８：腫瘍性障害に付随するエピシフターの同定
対照細胞系統（例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養）および癌細胞系統（例えば、非転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２８；転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２；または扁平上皮細胞癌であるＳＣＣ；膵臓癌細胞系統であるＰａＣａ２；または肝臓癌細胞系統であるＨＥＰ−Ｇ２）からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学／生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例３に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、２種の染料、７ＡＡＤおよびアネキシン−Ｖ−ＰＥの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Ａｐｏｓｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡ方法論を使用する、一本鎖ＤＮＡを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
【０４５５】
候補エピシフターを用いる処置後に上記に同定された細胞のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでの組成物の変化を評価するためのアッセイが利用される。ｍＲＮＡレベルの変化はリアルタイムＰＣＲマイクロアレイを使用して分析される。これらの実験は、実施例６および９−１３において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、ｍＲＮＡは、処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。２倍レベル以上でｍＲＮＡ転写が変化される遺伝子が同定および評価される。
【０４５６】
タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析、質量分析特徴付けと連動した二次元ゲル電気泳動分析、およびウェスタンブロット分析を使用して分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例７、４、および８において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、可溶性タンパク質は、候補エピシフターを用いる処置後の様々な時間、例えば、６時間または２４時間で細胞から抽出される。候補エピシフターによってタンパク質レベルまで誘導された変化は、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている７００種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補エピシフターは、細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、２−Ｄゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、ＭａｓｃｏｔおよびＭＳＲＡＴソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の二次元ゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補ＭＩＭによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。
【０４５７】
候補エピシフターは、候補エピシフターの添加に起因して、細胞系統中で、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルで遺伝子発現に誘導される変化に基づいて評価される。特に、候補エピシフターは、細胞代謝プロセスに付随するかまたはそれに関与することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。腫瘍性障害に特に関連するものとして、候補エピシフターは、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖に付随することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。
【０４５８】
細胞または特定の細胞位置に存在する候補エピシフターのレベル、ならびに候補エピシフターの型は、当業者に公知である日常的な方法を使用して決定される。例えば、経時的かつ一定の範囲の用量にわたるミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、候補エピシフターを用いて処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物を分析することによって決定される。時間経過にわたってのミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、観察された他の細胞の変化、例えば、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特定のタンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの調節と比較および相関できる。
【０４５９】
前述の実験から得られた結果に基づいて細胞の代謝状態のシフトを誘導することが観察された候補エピシフターは、エピシフターとして同定される。例えば、細胞傷害性を表示し、および／または細胞中でアポトーシスを誘導する候補エピシフターは、エピシフターとして同定される。好ましくは、正常細胞と比較して、疾患（癌）細胞において示差的な細胞傷害性を表示し、および／またはアポトーシス性応答を示差的に誘導する候補エピシフター（例えば、正常細胞と比較して、癌細胞においてアポトーシスに関与しているタンパク質の発現を示差的に調節するエピシフター）は、エピシフターとして同定される。
【０４６０】
実施例１９：エピシフターとしてのビタミンＤ３の同定
ビタミンＤ３、すなわち、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオールとしてもまた知られる）は、ビタミンＤから２段階酵素プロセスによって合成されるビタミンＤ代謝物である。ビタミンＤ３はその遍在性核ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンＤ３は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：６８４−７００に概説されている）。
【０４６１】
ビタミンＤ３の抗癌効果は、細胞周期のＧ１期での増殖停止、アポトーシス、腫瘍細胞分化、増殖因子媒介性細胞生存シグナルの破壊、ならびに血管新生および細胞接着の阻害を含む、複数のメカニズムを含むことが報告されている（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：６８４−７００に概説されている）。例えば、特にアポトーシスに関して、ビタミンＤ３は、アポトーシスの鍵となる媒介因子を調節すること、例えば、抗アポトーシス性の、生存促進性タンパク質ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬの発現を逆行すること、またはアポトーシス促進性タンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、およびＢＡＤ）の発現を誘導することによってアポトーシスを誘導することが報告されている（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。さらなる例において、特に血管新生に関連して、ビタミンＤ３は、いくつかの腫瘍由来内皮細胞の増殖を阻害すること、および腫瘍において血管新生を誘導する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害することが報告されてきた（Ｍａｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００６  Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５（４）：７９７−８０７０に概説されている）。別の例において、特に細胞周期停止に関して、ビタミンＤ３は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２１ＷＡＦＩ／ＣＩＰＩの遺伝子転写を誘導すること、ならびにサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２７ＫＩＰＩタンパク質の合成および／または安定化を誘導することが報告されており、これらの両方とも、Ｇ１停止の誘導のために決定的である（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０４６２】
上述の観察に基づいて、すなわち、細胞の代謝状態をシフトされるその能力により、ビタミンＤ３はエピシフターとして同定される。ビタミンＤ３は、細胞中でアポトーシスを誘導するその能力により、特に、正常細胞と比較した場合に、疾患（癌）細胞において示差的に細胞増殖を阻害し、およびアポトーシス性応答を誘導するその能力に基づいて、エピシフターである（例えば、正常細胞と比較した場合に、癌細胞においてアポトーシスに関与する、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＡＸなどのタンパク質の発現を示差的に調節する）。
【０４６３】
実施例２０：コエンザイムＱ１０に対する発癌性細胞および正常細胞の相対的感受性
種々の発癌性および正常細胞系統に対するコエンザイムＱ１０処置の効果が試験および比較された。コエンザイムＱ１０に対する細胞の感度は、アポトーシスの誘導を監視することによって評価された。細胞のＣｏＱ１０処置は、材料および方法において以下に詳細に記載されるように実行された。アポトーシスの誘導は、以下に記載されるように、早期アポトーシスの指標（例えば、Ｂｃｌ−２発現、カスパーゼ活性化、およびアネキシンＶアッセイを使用することによって）を監視することによって処置された細胞中で評価された。これらの研究から、細胞系統のパネルにおいてアポトーシスを誘導するために必要である最小限のＣｏＱ投薬量、例えば、ＣｏＱ１０の濃度および処置の時間が決定された。
【０４６４】
予測されずかつ驚くべき結果において、データは、コエンザイムＱ１０処置の効力が、発癌性の増加および／またはより大きな転移の潜在能力を示した細胞型、すなわち、より攻撃的な癌または腫瘍から誘導された細胞型においてより大きかったことを実証した。これらの研究の結果は、表２９において以下に要約されている。このデータは、ＣｏＱが、より攻撃的な癌の状態にある細胞に対して、時間と濃度の両方に依存的な様式でより有効であることを実証する。さらに、驚くべき相違する効果が、発癌性細胞と比較した場合に、正常細胞に対して観察された。具体的には、コエンザイムＱ１０は、正常組織環境においてわずかに支持的な役割を示すことが予想に反して見い出され、ここで、増殖および移動の増加が、ケラチン形成細胞および皮膚線維芽細胞を含む正常細胞において観察された。
【０４６５】
癌における遺伝子調節およびタンパク質メカニズムに対するコエンザイムＱ１０の効果は、正常細胞においては異なっている。膜の流動性、輸送メカニズム、免疫調節、血管新生、細胞周期制御、ゲノム安定性、酸化制御、解糖流量、代謝制御、および細胞外マトリックスタンパク質の完全性などの、鍵となる細胞の機構および構成要素は、異常調節され、従って、細胞の遺伝的および分子的な指紋が変化している。疾患環境は、細胞制御プロセスの支配が優勢である。本明細書に提供されるデータは、アポトーシス能力の回復を可能にする様式で鍵となる上述のプロセスのいくつかを正常化することによって、ＣｏＱ１０が、より高いレベルの効力を発揮していることを示唆する（例えば、正常細胞に対する癌細胞において、およびより攻撃的でなくまたは非攻撃的な癌状態の細胞と比較した場合のより攻撃的な癌状態の細胞において）。
【０４６６】
【表３０】
0005903734.tif 000037
【０４６７】
材料および方法
細胞の調製および処置
ディッシュまたはフラスコで調製された細胞
細胞は、３７℃インキュベーター中、５％ＣＯ２レベルで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ＰＳＡ（ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｅｌｌｇｒｏ）を補充した関連培地を有するＴ−７５フラスコ中で、７０〜８０％コンフルエンスに達するまで培養された。処置のために細胞を収穫するために、フラスコに１ｍＬトリプシンが加えられ、吸引され、さらに３ｍＬでトリプシン処置され、そして３７℃で３〜５分間インキュベートされた。次いで、細胞は、等量の培地で中和され、その結果生じた溶液は１０，０００ｒｐｍで８分間遠心分離された。上清は吸引され、細胞は８．５ｍｌの培地で再懸濁された。５００μｌの再懸濁物と９．５ｍｌのイソプロパノールの混合物が、コールターカウンターによって２回読み取られ、各ディッシュに播種される適切な細胞の数が決定された。対照および０〜２００μＭの濃度範囲の群が３連で試験された。５００μＭ  ＣｏＱ−１０ストック溶液から段階希釈が実施されて、適切なディッシュ中での所望の実験濃度を達成した。ディッシュは、細胞型および実験プロトコールに依存して、５％ＣＯ２レベルで０〜７２時間の間、３７℃インキュベーター中でインキュベートされた。
【０４６８】
タンパク質の単離および定量
ディッシュ中で調製される細胞
細胞処置インキュベーション時間が完了後、タンパク質の単離が実施された。すべての処置群のディッシュは、２ｍｌの氷冷１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、１ｍｌで１回洗浄された。ＰＢＳは最初の２回の洗浄後のみ、ディッシュから吸引された。細胞は穏やかにかき取られ、３回目の洗浄からの最終量を使用して微量遠心分離チューブに収集され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。遠心分離後、上清は吸引され、ペレットは５０μＬの溶解緩衝液（１００μＬの溶解緩衝液毎に１μＬのプロテアーゼおよびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）インヒビター）で溶解された。次いで、試料は−２０℃で一晩凍結された。
【０４６９】
フラスコ中で調製される細胞
細胞処置インキュベーション時間が完了後、タンパク質の単離が実施された。すべての処置群のフラスコは、５ｍｌの氷冷１×ＰＢＳで２回、３ｍｌで１回洗浄された。ＰＢＳは最初の２回の洗浄後のみ、フラスコから吸引された。細胞は穏やかにかき取られ、３回目の洗浄からの最終量を使用して１５ｍＬ遠心分離チューブに収集され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。遠心分離後、上清は吸引され、ペレットは適切な量の溶解緩衝液（１００μＬの溶解緩衝液毎に１μＬのプロテアーゼおよびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）インヒビター）で溶解された。溶解緩衝液の量はペレットサイズに依存した。試料は微量遠心チューブに移され、−２０℃で一晩凍結された。
【０４７０】
タンパク質の定量
試料は−４℃で融解し、超音波処理して、タンパク質単離の翌日における均質化を確実にした。タンパク質の定量は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施された。免疫ブロッティングのための試料を調製するために、βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）対試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１：１９溶液が調製された。試料は、βメルカプトエタノール−試料緩衝液を用いて１：１に希釈され、９５℃で５分間煮沸し、そして−２０℃で一晩凍結させた。
【０４７１】
免疫ブロッティング
Ｂｃｌ−２、カスパーゼ、９、シトクロムｃ
ウェルあたりロードするための試料の量は、ＢＣＡタンパク質アッセイから得られたそのままの平均タンパク質濃度を使用して決定された。約３０〜６０μｇのタンパク質が各処置の時点のためにロードされた。タンパク質は、１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌレディーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）またはハンドキャストゲル上で、１×泳動緩衝液中で、８５および１００ボルトにて３連で泳動された。次いで、タンパク質は、１００ボルトで１時間、ニトロセルロースペーパーに転写され、５％ミルク溶液中でさらに１時間ブロッキングされた。膜は、一晩、−４℃で一次抗体（１μＬ  Ａｂ：１０００μＬ  ＴＢＳＴ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中に配置された。翌日、膜は、１０分間を３回、各々Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で洗浄され、および二次抗体（抗ウサギ；１μＬ  Ａｂ：１０００μＬ  ＴＢＳＴ）が−４℃で１時間適用された。膜は、再度、１０分間を３回、ＴＢＳＴで洗浄され、ピコまたはフェムト基質を使用する化学発光が完了した（Ｐｉｅｒｃｅ）。次いで、膜は、最良の視覚的結果を生じる時間間隔で発色された。発色後、膜は、アクチンレベルが測定可能になるまで、ＴＢＳＴ中で−４℃に維持された。
【０４７２】
アクチン
膜は、−４℃で１時間、一次アクチン抗体（１μＬ  Ａｂ：５０００μＬ  ＴＢＳＴ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中に配置され、１０分間を３回、各々ＴＢＳＴで洗浄され、二次抗体（抗マウス；１μＬ  Ａｂ：１０００μＬ  ＴＢＳＴ）が−４℃で１時間適用された。膜は、再度、１０分間を３回、各々ＴＢＳＴで洗浄され、ピコ基質を使用する化学発光が完了した（Ｐｉｅｒｃｅ）。次いで、膜は、最良の視覚的結果を生じる時間間隔で発色された。
【０４７３】
アネキシンＶアッセイ
細胞は、ＰＢＳ１０Ｘ中で２回洗浄し、結合緩衝液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１．４Ｍ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁された。１００μｌの試料が、５μｌのアネキシン−ＰＥ染料または７−ＡＤＤとともに、培養チューブに加えられた。細胞は混合され、遮光して、室温にて１５分間インキュベートされた。その後、４００μｌの１×結合緩衝液が各試料に加えられ、これらはフローサイトメトリーによる分析に供された。
【０４７４】
実施例２１〜２５は、国際出願ＷＯ２００８／１１６１３５から本明細書に取られたものである。その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。一貫性のために、これらの実施例における表の番号は付け直されていないが、これらの表の番号は、特許請求の範囲に引用されている表とは一致していない。
【０４７５】
実施例２１：ペンチレングリコールを含むＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を調製する方法
【０４７６】
脂溶性生物活性剤としてＣｏＱ１０を有する濃縮物が製造された。約１０キログラム（ｋｇ）のポリソルベート８０が真空ケトルに配置され、約５０℃〜約６５℃の温度まで加熱された。約８．８ｋｇのＣｏＱ１０がポリソルベート８０に加えられ、約５０℃〜約６５℃に維持された温度で、真空が適用され、内容物が約１５分間混合された。得られた材料は、本明細書ではＣｏＱ１０相または第１相と称してもよい。真空ケトルを密封し、真空を適用し、そしてポリソルベート／ＣｏＱ１０の混合物の温度を約５０℃〜約５５℃にして、ＣｏＱ１０はポリソルベート８０に溶解された。
【０４７７】
別個のケトルに、約１５．８ｋｇの水を約５０℃〜約５５℃の温度に加熱し、約０．２ｋｇのフェノキシエタノールおよび約２ｋｇのハイドロライト５（登録商標）ペンチレングリコール、ＵＳＰが水に加えられ、透明かつ均一になるまで混合された。次いで、約８ｋｇのホスホリポン（登録商標）８５Ｇが、分散されるまで加えられた。得られた材料は、本明細書では、水相または第２相と称してもよい。水相は均一な分散およびホスホリポン型レシチンの水和を達成し、約５０℃〜約５５℃の温度で、以下に記載されるように、ＣｏＱ１０／ポリソルベート液体に加えられた。
【０４７８】
実験室スケールバッチのために使用されるＳｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ４ＲＴモデルに類似したＳｉｌｖｅｒｓｏｎインライン製造スケールホモジナイザーが、上記の２つの相（すなわち、ＣｏＱ１０相および水相）を合わせるために利用された。均質化は、可溶化したＣｏＱ１０が完全にカプセル化し、均一に分散され、それによって、濃厚な、均一なリポソーム分散液を生じるまで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ標準エマルジョンヘッドスクリーンを使用し、全能力（約７０００ｒｐｍ〜約１０，０００ｒｐｍ）で、計約５分間にわたって、密閉した再循環ループを通して、真空下で（約１８ｍｍ〜約２０ｍｍＨｇ）、約５０℃〜約５５℃の温度で、ゆったりした撹拌で混合することによって行われた。得られたＣｏＱ１０濃縮物は、約２２重量％の濃度でＣｏＱ１０を有した。ホスホリポン（登録商標）８５Ｇ濃縮物は、約８重量％の総組成物であったが、これは、上記の２つの相を合わせたものである。
【０４７９】
別個の実験において、１ｋｇ実験室バッチの上記の２２％ＣｏＱ１０濃縮物が製造され、試料は均質化の間に５分間隔でとられた。様々なサンプリング時間におけるリポソームの粒径は、レーザー回折装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  ２０００）を製造業者の説明書に従って利用して決定された。均質化プロセスおよび均質化の間に得られた粒径の詳細は表１において以下に示される。
【表３１】
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表１から見ることができるように、ＣｏＱ１０濃縮製剤および上記のプロセスは、１０７ｎｍの平均直径、および約５９ｎｍ〜約２７９ｎｍのサイズ内で製造されたすべてのリポソームの８５％を含んだ粒子分布を有するリポソームを製造することが可能であった。短い処置時間（約５分間）は、長い処置時間（約４５分間）と全く同じ効率でＣｏＱ１０のリポソーム分散液を製造した。上記からもまた見ることができるように、ＣｏＱ１０が約５５℃よりも上の温度に曝露されなかった場合に、最適なリポソーム粒子が得られた。
【０４８０】
実施例２２：２％カルボマー分散液を調製する方法
架橋アクリル酸ポリマー分散液が、クリーム組成物中の粘性剤としての使用のために調製された。利用されたアクリル酸、カルボマー９４０は、表２において下記に示される以下の成分を用いて２％分散液中で調製された。
【表３２】
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【０４８１】
製造プロセスは以下のように行われた。装置は最初に清掃され、消毒された。実験台の上で、相１成分は、透明かつ均一になるまで混合された。必要とされる量の水（相２）が秤量され、実施例１において上記に記載されるホモジナイザーの相容器ケトルに加えられた。この水は、熱水／蒸気ジャケットを用いて、約６０℃〜約６５℃の温度に加熱された。次いで、相１は、透明かつ均一になるまで適度な撹拌を行いながら、相２の水に加えられた。相１の容器は処置水ですすがれ、温度は約６０℃〜約６５℃に維持された。次いで、撹拌機を高出力でオンにし、カルボマー９４０粉末（相３）が加えられた。
【０４８２】
温度は約６０℃〜約６５℃に維持され、混合は中速から高速である約５００ｒｐｍ〜約８００ｒｐｍで、すべてのカルボマー９４０粉末が加えられるまで継続された。カルボマー粉末は、相１および２の混合物のボルテックスにゆっくりと加えられた。粉末は、カルボマーの総量が約１０分間以上で加えられるように、ゆっくりと手でふるいにかけるように加えられた。
【０４８３】
混合は、すべての粉末が徹底的に分散され、「斑点（ｆｉｓｈ−ｅｙｅｓ）」が存在しなくなるまで、中程度−高度の撹拌で継続された。製造プロセスは、すべての中和されていないカルボマー９４０粉末が完全に分散されて完全に水和したカルボマーポリマーの滑らかな半透明な分散液を生じるように行われた。このバッチの撹拌は、目に見える渦を作るのに十分に高速であったが、このバッチのしぶきを引き起こすほど高速ではなかった。このバッチの適切な混合は、約６０分間〜約９０分間の時間の間にわたって、約８００ｒｐｍ〜約１３００ｒｐｍの高速で行われた。バッチ温度は、混合の開始の時点で約６０℃〜約６５℃に、混合の間に約５５℃〜約６５℃に維持された。温度の上昇は、カルボマーポリマーの分散を補助し、凝集を防ぐことを助けた。
【０４８４】
このバッチは、約２５℃〜約３０℃に、冷却水を用いて、ジャケットを通して冷却され、混合は、中程度−高度の撹拌を用いて継続された。次いで、微量品質、ｐＨ、比重、および粘度を決定するために試料がとられた。
【０４８５】
実施例２３：ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を使用する、ＣｏＱ１０クリーム（１．５％、３．０％、および５．０％）を調製する方法
クリームエマルジョンベースは、実施例１のリポソームを有するＣｏＱ１０濃縮物との組み合わせのためのいくつかの相を利用して形成された。相Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが合わされてベースクリームを形成した。相Ｅは実施例１のＣｏＱ１０  ２２％濃縮物であった（２２％ｗ／ｗ  ＣｏＱ１０）。クリームエマルジョンベースの調製および引き続く実施例１のＣｏＱ１０  ２２％濃縮物の付加の詳細は、以下に示される。
【０４８６】
１．５重量％でＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を有するクリーム（「ＣｏＱ１０クリーム１．５％」）の調製のために、種々の相を合わせるための手順は以下の通りであり、表３−７において以下に示される成分を用いる。
【表３３】
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【０４８７】
相Ａ（「油相」）は、軟化および塗布性のための加えられる軽いエステルであるＣ１２−１５アルキルベンゾエートを含む。セチルアルコールおよびステアリルアルコールは、粘りまたは質感をクリームに与えるために加えられるワックスであり、ステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００ステアリン酸混合物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンを形成するために加えられる主要な乳化剤であった。実験台上で、相Ａ成分は真空ケトル中で秤量され、ウォーターバス中で約７０℃〜約７５℃まで加熱された。
【表３４】
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【０４８８】
Ｂ相（「水相」）は、皮膚に湿気を与えることおよび保湿性のためのグリセリン；皮膚への浸透を補助するため、および微生物学的保存プロフィールを改善するための、保湿性のためのプロピレングリコール；リポソームのＣｏＱ１０皮膚浸透を増強するためのエトキシジグリコール；微生物学的保存のためのフェノキシエタノール；相溶媒としての精製水、ならびにクリーム製剤のレオロジー特性を制御するため、および一次エマルジョンに安定性を加えるために、上記の実施例２のカルボマー９４０分散液を含んだ。
【０４８９】
Ｂ相成分は、別個の混合ケトル中に配置された。これらの成分は、約７０℃〜約７５℃に加熱しながら（真空なし）、適度なスウィープ混合で混合された。Ｂ相成分が約７０℃〜約７５℃に到達したとき、Ａ相成分は、適度なスウィープ混合で約７０℃〜約７５℃で加えられる。Ａ相およびＢ相の混合物は、実施例１に上記に記載されるようにＳｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを通して再循環され（標準ヘッド）、次の処理パートに続いた。
【表３５】
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【０４９０】
Ｃ相（「中和および緩衝液相」）において、精製水が、この相における他の成分としての溶媒および希釈剤として働く。トリエタノールアミンは水相（Ｂ相）におけるカルボマーアクリル酸コポリマーの主な中和剤であり；乳酸ナトリウム溶液（水中６０％ｗ／ｗ）および乳酸が、クリームの最終ｐＨを約５〜約５．５に調整および維持するための緩衝系として加えられ、これは、皮膚の中性ｐＨ範囲内にある。
【０４９１】
実験台上で、Ｃ相成分は、秤量され、均一になるまで混合され、約６０℃〜約６５℃に加熱された。次いで、Ｃ相混合物は、スウィープミキサーを用いて、中速から高速で、Ａ相およびＢ相を含む真空混合ケトルに加えられた。
【０４９２】
混合は、処理の次のパートまで移動する間継続した。
【表３６】
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【０４９３】
相Ｄ（「色素相」）。水分散グレードの二酸化チタン粉末が、最終クリーム色の色を明るくする目的のために、唯一、製剤中で使用された。ＣｏＱ１０によって付与されたクリームの黄色−オレンジ色は、約１％ｗ／ｗ二酸化チタンの添加によって実質的に減少され、美容上改善された。
【０４９４】
プロセスのＤ相のために、秤量されたＴｉＯ２がバッチに加えられ（Ａ相、Ｂ相、およびＣ相）、約１０分間または完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまで（確認するために色がチェックされた）、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー（高剪断ヘッド）を通して混合および再循環された。
【０４９５】
スウィープ混合ブレード上で二酸化チタンの凝集または固まりがないことを確実にすることが重要であった；これは目視によって確認される。実施例１において上記に記載されているＳｉｌｖｅｒｓｏｎインラインホモジナイザーは、最大限の二酸化チタンの脱凝集および粉砕を保証するために高剪断スクリーンとともに使用された。二酸化チタンの最終分散液は、Ｈｅｇｍａｎ  ＰＨ−１７５粉末度の粉砕ゲージを用いてチェックされた。
【表３７】
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【０４９６】
再循環は停止され、このバッチは、培地上のスウィープミキサーを用いて、約３０ｒｐｍの速度で、約５０℃〜約５５℃に冷却された。実施例１からの以前に秤量されたＣｏＱ１０  ２２％濃縮物（Ｅ相）は、約４５℃〜約５０℃にあたためられ、バッチに加えられた（Ａ相、Ｂ相、Ｃ相、およびＤ相）。
【０４９７】
すべての相は、均質になるまで、真空を適用しながら、約６０ｒｐｍのスウィープ撹拌で混合された。温度は約５０℃に維持された。
【０４９８】
このバッチは、約６０ｒｐｍで混合し、真空を適用しながら、約３５℃〜４５℃に冷却された。
【０４９９】
得られた材料は保持容器に配置された。
【０５００】
ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を３重量％で有するクリーム（「ＣｏＱ１０クリーム３％」）の調製のために、ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を１．５重量％で有するクリーム（「ＣｏＱ１０クリーム１．５％」）を形成するための上記と正確に同じ手順に従った。各相の材料、および利用される量は、表８〜１２において以下に示される。
【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【０５０１】
類似のクリームは、約２５重量％の量の実施例１からのＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を使用して調製され、約５重量％の濃度のＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を有するクリームを生じる。
【０５０２】
１．５重量％ＣｏＱ１０、３重量％ＣｏＱ１０、および５重量％ＣｏＱ１０を有するＣｏＱ１０クリームの内容物の要約は、以下の表１３、１４、および１５においてそれぞれ示される。ＣｏＱ１０クリームについての上記および下記に示す製剤の実施例すべてにおいて、使用されたＣｏＱ１０  ２２％濃縮物の量は、標的濃度よりの上の約５％のＣｏＱ１０  ２２％濃縮物の最終理論濃度を実際に生じることに注意のこと。したがって、「ＣｏＱ１０クリーム１．５％」については、使用された実際のバッチ量は、１．５８％ｗ／ｗ  ＣｏＱ１０を生じた、７．５重量％のＣｏＱ１０  ２２％濃縮物であった。「ＣｏＱ１０クリーム３％」は、３．１５重量％ＣｏＱ１０の理論含量を生じた、１５重量％のＣｏＱ１０  ２２％濃縮物で作られた。５％過剰薬物が、全体の製品の有効期間を延長し、ラベルまたは予測される薬物含量約９０％〜約１１０％の薬物含量を維持するために加えられた。
【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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注記：ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物の５％製造過多量が、ＣｏＱ１０クリーム１．５％、ＣｏＱ１０クリーム３．０％、およびＣｏＱ１０クリーム５％のバッチに加えられた（１．５％プラス０．０７５％、３％プラス０．１５％、および５％プラス２．５％）。
【０５０３】
実施例２４：ＣｏＱ１０クリーム（１．５％、３．０％、または５．０％）の局所適用
上記の実施例３において製造されたＣｏＱ１０を有するクリーム（すなわち、ＣｏＱ１０クリーム１．５％、ＣｏＱ１０クリーム３％、およびＣｏＱ１０クリーム５％）がブタ皮膚に適用された。局所用量研究が、各々１匹は雄性であり、１匹は雌性である、各２匹ずつのブタに対して行われた。各動物は６つの試験領域；各々の側に３つの試験領域を有した。各ブタについて、１つの側（３部位）に７日間、１日に１回投薬されたのに対し、各ブタについて、逆の試験側（３試験領域）は１日目に１回のみ投薬された。エトキシジグリコールとともに調製された実施例３からのクリームは、雄性動物に対して使用された。雌性動物は、５％エトキシジグリコールの代わりに５％１，３−ブチレングリコールを含んだこと以外は、上記の実施例３において製造された試料と同じ成分を含んだ３つの試験製剤を受容した。１．５重量％ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物、３重量％ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物、および５重量％ＣｏＱ１０  ２２％濃縮物を有する、１，３−ブチレングリコールで作製されたこれらの製剤の詳細は、それぞれ、表１６、１７、および１８において以下に示される。
【表４６】
0005903734.tif 000053
【表４７】
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【表４８】
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【０５０４】
すべての動物は、同じ用量の各製剤を受容し、これは、２００ｍｇであり、１２１ｃｍ２適用領域に、１回、または毎日７日間適用された。
【０５０５】
適用後、皮膚試料は、以下のように入手および分析された。皮膚試験領域は、刺激の少ない石けんと水の混合液（例えば、水中の１％Ｉｖｏｒｙ  Ｓｏａｐまたは等価物）で穏やかに洗浄され、いかなる残りの局所試験製剤も除去された。切除されるべき領域が投薬された領域よりも大きい場合、投薬された領域は消えないインクで境界を定め、投薬されなかった皮膚領域を線引きした。十分な厚さの皮膚切片が、約１０ｃｍ×１０ｃｍのサイズで、脂肪層の深さまで、かつそれを含むように、外科用メスによって取り出された。切除後、皮膚切片は平らにして置き、２層のプラスチックラップ（ＳＡＲＡＮ  ＷＲＡＰ（商標）または等価物）に包み、約−７０℃以下でタイミングよく凍結させた。各皮膚切片は適切であると同定された（例えば、動物の同定、研究の数、日時など）。試料は、試験するまで、約−７０℃以下に維持された。
【０５０６】
各皮膚切片は、防水プラスチックバッグ中に配置され、約３０℃〜約３５℃のウォーターバスの中で融解された。一旦融解すると、各皮膚切片は、蒸留脱イオン水で穏やかにすすがれ、いかなる残りの表面投薬および血液も除去された。すべての皮下組織（例えば、脂肪）は、丘疹性皮膚のレベルまで、外科用メスによって除去された。
【０５０７】
次いで、各皮膚切片は、約１０〜２５％の表面の輝きが観察されるまで、約１０〜約２０回、テープストリップ（３Ｍ製ＴＲＡＮＳＰＯＲＥ（商標））を行った。このプロセスは、角質層およびいかなる残りの表面投薬も除去した。
【０５０８】
各々の完全皮膚シート上で、６つの領域がインクで境界を定められた。境界を定められた領域は１ｃｍ２の面積であった。
【０５０９】
各皮膚切片は、防水プラスチックバッグ中に配置し、約６５℃（＋／−３℃）ウォーターバスに浸漬し、真皮から表皮の分離プロセスを開始した。次いで、試験部位がパンチによって皮膚シートから切除され、表皮がピンセットによって真皮から取り出された。個々の皮膚切片は秤量され、重量が記録された。個々の皮膚切片は外科用メスでみじん切りされ、あらかじめラベルを付けたチューブに配置し、そして引き続く分析のために保管された。
【０５１０】
皮膚試料は、イソプロパノール（ＩＰＡ）中で、シェーカー上で約４７時間抽出され、次いで、さらに処理されるまで、約−２０℃で保存された。次いで、これらの試料は、約１３，５００ｒｐｍで約１０分間、遠心分離され、そして上清は２ｍＬ褐色バイアルに収集された。
【０５１１】
ＣｏＱ１０の定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＵＶ）によって実施された。手短に述べると、ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＬＣ／ＭＳＤを伴ったＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム上で行われた。約６５％エタノールおよび約３５％メタノールを含む溶媒系が、Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（約３ｍｍ×約１００ｍ、５μ）を通して、約１ｍＬ／分の流速で流された。１０マイクロリットルの試料が注入された。ピーク面積は、未処理の標準から準備された外部標準曲線を使用して濃度に対して定量された。この曲線は、水中のＣｏＱ１０の溶解度の問題に起因して、ＩＰＡにスパイクを生じた。
【０５１２】
ミニブタ皮膚におけるＣｏＱ１０含量についての結果は、図１および２、ならびに以下の表１９および２０に要約されている。皮膚切片あたり６つの複製が組織重量に対して補正され、そして平均化されて、各投薬部位についての平均が得られた。
【表４９】
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【表５０】
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【０５１３】
このデータは、測定可能な量のＣｏＱ１０が、すべての表皮試料および選択された真皮試料において観察されたことを示した。
【０５１４】
表皮についてのすべての投薬部位は、非投薬部位よりも有意に高いレベルでＣｏＱ１０を含むことが見い出された（ｐ＜０．００１）。
【０５１５】
雄性または雌性のいずれかのブタ皮膚切片において、３つの投薬濃度にわたって、ＣｏＱ１０表皮含量の間で有意な違いはなかった（ｐ＞０．０２）。
【０５１６】
雄性ブタと雌性ブタの間で、動物の右側からの部位については（１日投与）、雄性皮膚からの１．５％ＣｏＱ１０および５％ＣｏＱ１０適用用量についての表皮含量は、雌性皮膚中で見られたものよりも顕著に高かったが（ｐ＜０．００３）、しかし、３％ＣｏＱ１０投薬についてはそうではなかった（ｐ＝０．０３２９）。したがって、データから見ることができるように、単回用量ベースでのＣｏＱ１０の浸透は、エトキシジグリコール製剤について、ブチレングリコール製剤よりも有意に高かった（１．５％および５％用量についてｐ＜０．００３、３％用量についてｐ＝０．０３２９）。
【０５１７】
雄性と雌性の両方の皮膚切片についての表皮レベルは、３つすべての用量適用について、７日間の投薬期間の間（左側）、統計学的に同一であった。
【０５１８】
真皮含量は、７日間の投薬期間からの１．５％ＣｏＱ１０および５％ＣｏＱ１０用量適用（左側）、ならびに１日間の投薬期間からの１．５％ＣｏＱ１０用量適用（右側）については、雄性皮膚切片においてのみ観察された。
【０５１９】
データの要約は表２１において以下に提供される：
【表５１】
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【０５２０】
表２１から皮膚の全体の領域までデータを外挿する場合、ＣｏＱ１０の浸透は表２２において以下に示される通りである。
【０５２１】
【表５２】
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【０５２２】
ＣｏＱ１０クリーム製剤の単回適用は、それぞれ、５％、３％、および１．５％ＣｏＱ１０クリーム製剤について、適用された用量の平均で１２％、１７％、または７０％を送達した。一般的に、単回用量ベースでのＣｏＱ１０の浸透は、エトキシジグリコール製剤について、ブチレングリコール製剤と比較して有意に高かった（１．５％および５％用量についてはｐ＜０．００３であり、ならびに３％用量についてはｐ＝０．０３２９）。データは、３％ＣｏＱ１０までの適用濃度を用いて、表皮含量の上昇が存在し、５％ＣｏＱ１０用量は３％ＣｏＱ１０用量と本質的に等しいことを示した。このことは、３％ＣｏＱ１０用量において皮膚がＣｏＱ１０で飽和されるようになること、またはビヒクルが３％ＣｏＱ１０濃度より上ではより多くのＣｏＱ１０を送達が不可能であったことを示唆する。７日間の局所投与後に皮膚において達成されたレベルは２匹の動物間で同一であったことが見られ得る。
【０５２３】
エトキシジグリコール製剤について、および単回適用データについては、それぞれ、１．５％、３％、および５％エトキシジグリコール含有クリームについて、７３．８％、１６．６％、および１３．３％の平均浸透が得られた。
【０５２４】
興味深くかつ予測されなかった知見は、試験されたＣｏＱ１０の最小用量である１．５％クリームについて、表皮で見い出された不釣り合いな量のＣｏＱ１０であった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、このＣｏＱ１０の浸透の増強は、クリーム製剤中のエトキシジグリコールに対するＣｏＱ１０の比率の関数であるのかもしれず、または、おそらく、ＣｏＱ１０およびリン脂質リポソームに対するエトキシジグリコールの比率に関するかもしれない。より低い濃度のＣｏＱ１０を含むクリーム中で使用されるＣｏＱ１０に対するエトキシジグリコールの比較的高い比率は、表皮で見い出されるより高い量のＣｏＱ１０の原因であり得る。
【０５２５】
１．５％クリームおよび３％クリームはまた、９週間の加速試験（約３５℃および約５０℃で保存）を首尾よく完了し；プラスチックジャーと金属チューブパッケージングの両方でパッケージされた５回の凍結−融解サイクルを通過し；そしてＵＳＰ微生物学的チャレンジ試験を通過した。結果は、複数の発色バッチを用いて、そしてクリームプロトタイプ製剤ベース中での１．５重量％、３重量％、および５重量％のＣｏＱ１０濃度で、同じ系について確認された。
【０５２６】
実施例２５：ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を使用するＣｏＱ１０クリーム（１．５％、３．０％、および５．０％）を形成する方法
クリームは、ペンチレングリコール（１，２−ペンタンジオール；ハイドロライト−５，Ｓｙｍｒｉｓｅ）の代わりにプロピレングリコールが利用されたこと以外は、上記の実施例３に記載されたのと同様に製造された。濃縮物は、上記の実施例１に記載されたように最初に製造され、成分は表２３において以下に列挙されている。
【表５３】
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【０５２７】
得られたＣｏＱ１０濃縮物（ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物）は、約２１重量％の濃度でＣｏＱ１０を有した。
【０５２８】
カルボマー分散液は、表２４において以下に列挙される成分を用いて、クリームを形成する際の使用のために上記の実施例２に記載されたように調製された。
【表５４】
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【０５２９】
１．５重量％ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有するクリーム、および３重量％ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する別のクリームが、実施例３において上記に記載されるように、表２５および２６において以下に列挙される成分を用いて調製された。
【表５５】
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【表５６】
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【０５３０】
実施例２６：プロピレングリコールを含むＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を形成する方法
ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物組成物は、以下に記載されるように、Ａ相およびＢ相を合わせることによって調製された。Ａ相は、ユビデカレノンＵＳＰ（ＣｏＱ１０）を２１％ｗ／ｗで、およびポリソルベート８０ＮＦを２５％ｗ／ｗで含んだ。Ｂ相は、プロピレングリコールＵＳＰを１０．００％ｗ／ｗで、フェノキシエタノールＮＦを０．５０％ｗ／ｗで、レシチンＮＦ（ホスホリポン８５Ｇ）を８．００％ｗ／ｗで、および精製水ＵＳＰを３５．５０％ｗ／ｗで含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のＣｏＱ１０  ２１％濃縮物組成物の重量に対してである。それらのパーセンテージおよびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表５７】
0005903734.tif 000064
【０５３１】
フェノキシエタノールおよびプロピレングリコールは、適切な容器に配置され、透明になるまで混合された。必要量の水が第２の容器に加えられた（混合タンク１）。混合タンク１は、混合しながら、４５℃〜５５℃の間に加熱された。フェノキシエタノール／プロピレングリコール溶液が水に加えられ、これが透明かつ均一になるまで混合された。混合タンク１中の内容物が４５〜５５℃の範囲内にあるとき、低速〜中速で混合しながら、ホスホリポンＧが加えられた。いかなる発泡も回避しながら、混合タンク１の内容物は、ホスホリポン８５Ｇが均質に分散されるまで混合された。ポリソルベート８９は適切な容器に加えられ（混合タンク２）、５０〜６０℃の間に加熱された。次いで、ユビデカレノンが混合タンク２に加えられた。５０〜６０℃の間の温度を維持しながら、混合タンク２は、すべてのユビデカレノンが溶解されるまで混合された。すべてのユビデカレノンが溶解された後、水相はゆっくりと混合タンク２に移された。すべての材料が合わされたとき、分散液が滑らかかつ均質になるまで、内容物はホモジナイズされた。過熱しないように注意を払いながら、温度は５０〜６０℃に維持された。次いで、均質化は停止され、混合タンク２の内容物は保存のために適切な容器に移された。
【０５３２】
実施例２７：プロピレングリコールを含むＣｏＱ１０  ２１％濃縮物の０．５ｋｇバッチを形成する方法
０．５ｋｇのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物組成物が、以下に記載されるように、Ａ相およびＢ相を合わせることによって調製された。Ａ相は、ユビデカレノンＵＳＰ（ＣｏＱ１０）を２１％ｗ／ｗで、およびポリソルベート８０ＮＦを２５％ｗ／ｗで含んだ。Ｂ相は、プロピレングリコールＵＳＰを１０．００％ｗ／ｗで、フェノキシエタノールＮＦを０．５０％ｗ／ｗで、レシチンＮＦ（ホスホリポン８５Ｇ）を８．００％ｗ／ｗで、および精製水ＵＳＰを３５．５０％ｗ／ｗで含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のＣｏＱ１０クリーム２１％濃縮物組成物の重量に対してである。それらのパーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表５８】
0005903734.tif 000065
【０５３３】
すべての装置は清浄かつ衛生的であった。ポリソルベート８０は、ＰＫ−２ケトル中で直接的に秤量され、真空ケトルＰＫ−２中で５０〜５５℃に加熱された。ユビデカレノンＵＳＰは実験台上で秤量され、重量は、風袋付きＰＫ−２容器に加えることによってダブルチェックされた（撹拌機オフ）。ＰＫ−２は閉じられ、密封された。閉じられ、密封されたＰＫ−２は、５０〜５５℃温度および真空オンで１５分間維持しながら、低速のスィープミキサーを用いて混合された。すべての粉末がポリソルベートに溶解したことを保証するために、次の段階に移動する前に相が試験された。ＰＫ−１において、水の必要量が加えられ、５０〜５５℃に加熱された。実験台上で、フェノキシエタノールおよびハイドロライト−５が秤量され、透明かつ均一になるまで混合され、そして中速で混合しながら、透明かつ均一になるまで、水が加えられた。上記の水混合液が５０〜５５℃に到達したとき、レシチンが低速から中速で混合しながら、発泡を回避しながら加えられ、分散するまで混合された。水相はＰＫ−１から５ガロン容器に移された。５０〜５５℃の水相とＣｏＱ１０相の両方を用いて、水相は、中速スウィープ混合を用いてＣｏＱ１０相に加えられた。一旦、すべての材料がＰＫ−２に移されると、バッチは、標準剪断ヘッドを用いるＳｉｌｖｅｒｓｏｎを通して、７０００ｒｐｍで３〜５分間、閉鎖したＰＫ−２容器および真空オンを用いて、再循環された。温度は５０〜５５℃に維持され、過熱は許容されなかった。再循環は停止され、バッチは中速スウィープ混合を用いて３０〜３５℃に冷却された。濃縮液は一次輸送容器にポンプで送られた。
【０５３４】
実施例２８：プロピレングリコールを含むＣｏＱ１０  ２１％濃縮物の２０ｋｇバッチを調製する方法
ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物の２０ｋｇバッチが、Ａ相、Ｂ相、およびＣ相の成分を合わせることによって調製された。Ａ相はポリソルベート８０ＮＦを２５．００％ｗ／ｗで、およびユビデカレノンＵＳＰを２１．００％ｗ／ｗで含んだ。Ｂ相は、プロピレングリコールＵＳＰを１０．００％ｗ／ｗで、およびフェノキシエタノールＮＦを０．５０％ｗ／ｗで含んだ。Ｃ相は、精製水ＵＳＰを３５．５０％ｗ／ｗで、およびレシチンＮＦを８．００％ｗ／ｗで含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表において提示される。
【表５９】
0005903734.tif 000066
【０５３５】
ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物の２０ｋｇバッチを調製する際に、領域は洗浄され、清浄であることが確認された。すべての装置は洗浄され、有効期限／較正の範囲内にあった。１００．０ｇｍフェノキシエタノールが秤量され、清浄なビーカーに配置された。
【０５３６】
Ｂ相を調製するために、２０００グラム（２，０００ｇｍ）のプロピレングリコールが秤量され、清浄な２−Ｌ  ＳＳビーカーに配置された。さらに、２０００ｇｍの精製水が秤量され、「すすぎ用水」とラベルされた清浄容器に配置された。
【０５３７】
あらかじめ秤量した２，０００ｇｍプロピレングリコールを含む２−Ｌ  ＳＳビーカーに、あらかじめ秤量した１００ｇｍフェノキシエタノールが加えられた。フェノキシエタノールを含んだビーカーは、すすぎ用水の１／３を用いて２−Ｌビーカー中にすすがれた。２−Ｌビーカーの内容物は、透明および均一になるまでスパチュラで混合し、Ｂ相とラベルされた。
【０５３８】
続く工程において、１，６００ｇｍのレシチンが秤量され、５，１００ｇｍの精製水が秤量された。適切にラベルされたチャートが、ＰＫ−１については温度レコーダーＴＩＣ−１に、ＰＫ−２についてはＴＩＣ−２に配置された。５，１００ｇｍの精製水がＰＫ−１に加えられ、そして水は、ＰＫ−１においては、手動で５０〜５５℃に加熱された。撹拌機はオンにされ、わずかなボルテックスが維持された。次いで、Ｂ相溶液が、２−Ｌ  ＳＳビーカーからＰＫ−１にゆっくりと加えられた。次いで、ＳＳビーカーは、すすぎ用水の約１／３を用いてすすがれた。すすぎ液がＰＫ−１にゆっくりと加えられた。温度は手動で５０〜５５℃に維持された。次いで、レシチンＮＦがゆっくりと加えられ、これが分散されるまで混合された。温度は手動で５０〜５５℃に維持され、Ｂ相がＰＫ−２への移動のための準備ができるまで、混合は継続された。
【０５３９】
Ａ相を調製するために、５，０００ｇｍのポリソルベート８０が清浄容器に秤量および配置され、一方、４，２００ｇｍのユビデカレノンＵＳＰが秤量された。濃縮物を混合するために、設備は、Ｌｅｅ真空タンク（ＰＫ−２）、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー（Ｐ−２）、およびＷａｕｋｅｓｈａポンプ（Ｐ−１）を備えた。最初に、ＰＫ−２のボトムバルブが閉じていることが確認された。次いで、あらかじめ秤量された５，０００ｇｍのポリソルベート８０が点検窓入り口を通してＰＫ−２に加えられた。点検窓は、添加が完了した後、ＰＫ−２上で交換された。
【０５４０】
次いで、ＰＫ−２撹拌機がオンにされ、ポリソルベート８０はＰＫ−２の中で手動で５０〜５５℃に加熱された。ポリソルベート８０の温度がこの温度範囲に達したとき、４，２００ｇｍのあらかじめ秤量されたユビデカレノンＵＳＰが、ＰＫ−２のアクセス入り口を通して加えられた。スパチュラが使用されて、添加の間に撹拌ブレードにこびりついたいかなるユビデカレノンも除去された。添加が完了されたとき、点検窓は交換された。温度は、５０〜５５℃の間に手動で維持され、１５分間混合された、ＰＫ−２の内容物は、点検窓入り口を通して検査され、ユビデカレノンがポリソルベート８０に溶解されたか否かが評価された。次いで、ＰＫ−１撹拌機（Ａ−１）はオフにされた。
【０５４１】
ＰＫ−２のアクセス入り口を通して、ＰＫ−１の内容物（Ｂ相）がＰＫ−２に加えられた。次いで、ＰＫ−１は、残りの「すすぎ用水」ですすがれた。ＰＫ−２は５０〜５５℃に手動で加熱された。次いで、ＰＫ−２の内容物は、Ｐ−１およびＰ−２を通して、Ｐ−２中のＳｉｌｖｅｒｓｏｎ高剪断スクリーンを用いて、最大ｒｐｍで５〜１０分間、再循環された。真空がオンにされ、発泡を回避するために最大で維持された。温度は手動で５０〜５５℃に維持された。
【０５４２】
４つの試料が取り出された：２つの３０ｇｍ試料は微量試験のためであり、２つの４００ｇｍ試料は物理／化学試験のためであった。１つのセットの試料は保管とラベルされた。次いで、生成物は清浄なＨＤＰＥ上端閉鎖容器に移された。バッチサイズは２０，０００ｇｍであった。
【０５４３】
実施例２９：ＣｏＱ１０クリーム１．５％を調製する方法
ＣｏＱ１０クリーム１．５％組成物は、以下に記載されるようにＡ相−Ｅ相を合わせることによって調製された。Ａ相は、アルキルＣ１２−１５ベンゾエートＮＦを５．０００％ｗ／ｗで、セチルアルコールＮＦを２．０００％ｗ／ｗで、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸を４．５％ｗ／ｗで、およびステアリルアルコールＮＦを１．５％ｗ／ｗで含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
【表６０】
0005903734.tif 000067
【０５４４】
Ｂ相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦを５．０００％ｗ／ｗ、グリセリンＵＳＰを２．０００％ｗ／ｗ、プロピレングリコールＵＳＰを１．７５０％ｗ／ｗ、フェノキシエタノールＮＦを０．４６３％ｗ／ｗ、精製水ＵＳＰを１１．３７７％ｗ／ｗ、およびカルボマー分散液２％を５０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
【表６１】
0005903734.tif 000068
【０５４５】
Ｃ相は、乳酸ＵＳＰを０．４００％ｗ／ｗ、乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰを２．０００％ｗ／ｗ、トロラミンＮＦを１．３００％ｗ／ｗ、および精製水ＵＳＰを４．２１０％ｗ／ｗで含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
【表６２】
0005903734.tif 000069
【０５４６】
Ｄ相は二酸化チタンＵＳＰを１．０００％ｗ／ｗ含んだ。Ｅ相はＣｏＱ１０  ２１％濃縮物、２１％を７．５００％ｗ／ｗで加えた。すべての重量パーセンテージは全体の１．５％ＣｏＱ１０クリーム組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
【表６３】
0005903734.tif 000070
【表６４】
0005903734.tif 000071
【０５４７】
ＣｏＱ１０クリーム１．５％組成物を調製する際に、Ａ相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。カルボマー分散液を除くＢ相成分はＰＫ−２ケトルに加えられ、７０〜８０℃の間に加熱されながら中速のスウィープ混合で混合される。Ｃ相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。Ｅ相ＣｏＱ１０濃縮物は適切な容器中に配置され、均一性を保証するために必要に応じて混合しながら、ウォーターバスを使用して５０〜６０℃の間で融解された。カルボマー分散液は適切な容器（混合タンク）に加えられ、混合しながら７０〜８０℃の間に加熱された。混合することを継続しながら、Ｂ相成分は、温度を維持しながら、混合タンク中の加熱したカルボマー分散液に加えられた。混合することを継続しながら、Ｃ相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。この混合タンクは、継続的に混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーはオフにされたが、混合タンクにＤ相成分を加えながら、均質化が継続された。次いで、ミキサーはオンにされ、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまで、成分が混合およびホモジナイズされた（色をチェックする）。次いで、均質化が停止され、バッチは５０〜６０℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したＣｏＱ１０濃縮物が混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物が混合／再循環された。次いで、混合タンクの内容物は、４５〜５０℃の間に冷却された。次いで、冷却された内容物は、パッケージングまで、保存のために適切な容器に移された。
【０５４８】
実施例３０：ＣｏＱ１０クリーム１．５％の０．５ｋｇバッチを調製する方法
１．５％ＣｏＱ１０クリーム組成物は以下に記載されるようにＡ相−Ｅ相を合わせることによって調製された。Ａ相は、アルキルＣ１２−１５ベンゾエートＮＦを５．０００％ｗ／ｗで、セチルアルコールＮＦを２．０００％ｗ／ｗで、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸を４．５％ｗ／ｗで、およびステアリルアルコールＮＦを１．５％ｗ／ｗで含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
【表６５】
0005903734.tif 000072
【０５４９】
Ｂ相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦを５．０００％ｗ／ｗ、グリセリンＵＳＰを２．０００％ｗ／ｗ、プロピレングリコールＵＳＰを１．７５０％ｗ／ｗ、フェノキシエタノールＮＦを０．４６３％ｗ／ｗ、精製水ＵＳＰを１１．３７７％ｗ／ｗ、およびカルボマー分散液２％を５０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
【表６６】
0005903734.tif 000073
【０５５０】
Ｃ相は、乳酸ＵＳＰを０．４００％ｗ／ｗ、乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰを２．０００％ｗ／ｗ、トリエタノールアミンＮＦを１．３００％ｗ／ｗ、および精製水ＵＳＰを４．２１０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
【表６７】
0005903734.tif 000074
【０５５１】
Ｄ相は二酸化チタンＵＳＰを１．０００％ｗ／ｗ含んだ。一方Ｅ相はＣｏＱ１０濃縮物、２１％を７．５００％ｗ／ｗで含んだ。すべての重量パーセンテージは全体の１．５％ＣｏＱ１０クリーム組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
【表６８】
0005903734.tif 000075
【０５５２】
１．５％ＣｏＱ１０クリーム組成物を調製する際に、Ａ相成分は秤量され、ウォーターバス中で７０〜７５℃の間に加熱された。Ｂ相成分はＰＫ−２ケトルに加えられ、７０〜７５℃の間に加熱されながら、中速のスウィープ混合で混合された。Ｂ相が７０〜７５℃に到達したとき、Ａ相が中速のスウィープ混合で７０〜７５℃で加えられた。次いで、Ａ相とＢ相がＳｉｌｖｅｒｓｏｎを通して再循環された。Ｃ相成分は秤量され、均質になるまで混合され、６０〜６５℃に加熱された。次いで、Ｃ相成分は、中速から高速でスウィープミキサーを用いてＰＫ−２ケトルに加えられた。混合することを継続しながら、Ｄ相はＰＫ−２ケトル中のバッチに加えられた。このバッチは、１０分間または完全に均一になりかつ十分に引き伸ばされるまで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎを通して継続して混合および再循環された。
【０５５３】
循環は中断され、バッチは培地上のスウィープミキサーを用いて５０〜５５℃の間に冷却された。Ｅ相成分を４５〜５０℃の間にあたためた後、これらはバッチに加えられ、バッチは、均一になるまで、中速で真空を用いて混合された。温度は５０℃に維持された。次いで、バッチは低速から中速の混合および真空を用いて、３０〜３５℃まで冷却された。次いで、バッチはポンプで保持容器まで送られた。
【０５５４】
実施例３１：２０ｋｇバッチＣｏＱ１０クリーム１．５％を調製する方法
ＣｏＱ１０クリーム１．５％組成物の２０ｋｇバッチは、Ａ相−Ｅ相の成分を合わせることによって調製された。各層についての成分の重量パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表において提示される。
【表６９】
0005903734.tif 000076
【０５５５】
化学物質は、秤量パンにこぼれることを防ぐよう特別な注意を払いながら秤量された。最初に２００ｇｍの二酸化チタン（Ｄ相）が秤量された。次いで、６００ｇｍの精製水が秤量され、「すすぎ用水−Ｂ相」とラベルされた。
【０５５６】
Ａ相成分を調製する際に、１０００ｇｍのトリカプリン酸グリセリル／トリカプリル酸グリセリル、４００ｇｍのセチルアルコールＮＦ、３００ｇｍのステアリルアルコールＮＦ、および９００ｇｍのステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００が秤量された。次いで、これらのあらかじめ秤量されたＡ相成分は４−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられ、容器はＡ相とラベルされた。このプレミックスは２４時間以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、Ａ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０５５７】
Ｂ相を調製する際に、１０，０００ｇｍのカルボマー分散液２％が、実施例１１Ａにおけるように秤量された。さらに、４００ｇｍのグリセリンＵＳＰ、３５０ｇｍのプロピレングリコール、１，０００ｇｍのジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦ、および９３ｇｍフェノキシエタノールＮＦが秤量された。１６７５ｇｍの精製水が秤量され、容器は「Ｂ相用精製水」とラベルされた。これらのあらかじめ精製されたＢ相成分は１０−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられ、Ｂ相とラベルされた。このプレミックスは２４時間以内に使用されなければならないことに注意のこと。Ｂ相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、Ｂ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０５５８】
Ｃ相を調製する際に、２６０ｇｍのトリエタノールアミンＮＦ、４００ｇｍの乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰ、６０％、８４２ｇｍの精製水（「Ｃ相用精製水」とラベルされた）、および８０ｇｍの乳酸ＵＳＰが秤量された。次いで、これらのあらかじめ秤量されたＣ相成分は、以下の順番で２−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられた：（１）２６０ｇｍのトリエタノールアミン、（２）４００ｇｍ乳酸ナトリウム溶液、６０％、（３）８４２ｇｍＣ相用精製水ＵＳＰ、および（４）８０ｇｍ乳酸ＵＳＰ。このプレミックスは２４時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、Ｃ相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、Ｃ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０５５９】
Ｅ相を調製する際に、１５００ｇｍのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物が秤量され、Ｅ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０５６０】
２０ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム１．５％を調製する際に、２つのウォーターバスが必要とされた。Ａ相ビーカーは７０〜７５℃に設定したウォーターバスに配置され、内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、Ｃ相ビーカーは６０〜６５℃に設定したウォーターバスに配置され、Ｃ相ビーカーの内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。同様に、Ｅ相ビーカーはウォーターバスに配置され、５０〜５５℃に設定された。Ｅ相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。
【０５６１】
使用されるさらなる設備には、ウォーターバス（Ｅ−１）、Ｌｅｅ真空タンク（ＰＫ−２）、Ｗａｕｋｅｓｈａポンプ（Ｐ−１）、およびＳｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー用四角穴高剪断スクリーンが含まれた。
【０５６２】
最初に、ＰＫ−２のバルブの底が閉じていること、およびＰＫ−２が適切にシールされていることが確認された。次いで、点検窓がＰＫ−２から取り外された。次いで、あらかじめ秤量した１０，０００ｇｍのカルボマー分散液２．０％が、点検窓入り口を通してＰＫ−２に加えられた。スパチュラが使用されて、カルボマー分散液２．０％がその容器の壁面から移された。次いで、ＰＫ−２用のＴＩＣ−２（温度記録装置）がオンにされ、適切な操作を保証するためにチェックされた。次いで、ＰＫ−２（Ａ−２）用の撹拌機はオンにされ、ＰＫ−２中のカルボマー分散液２．０％は蒸気ジャケットを用いて７０〜８０℃に加熱された。真空がオフにされた。次いで、点検窓がＰＫ−２から取り外され、ＳＳビーカーからのＢ相は、点検窓入り口を通してＰＫ−２にゆっくりと加えられた。次いで、Ｂ相容器は、「Ｂ相すすぎ用水」ですすがれた。このすすぎ液は、点検窓入り口を通してＰＫ−２に加えられた。次いで、Ａ相がゆっくりとＰＫ−２に加えられた。スパチュラが使用されて、ＳＳビーカーの壁面からのいかなるＡ相も移された。ＰＫ−２に加えられるとき、Ａ相の温度は７０〜８０℃の間でなければならないことに注意のこと。次いで、ＰＫ−２からの底バルブが開かれた。Ｐ−１（Ｗａｕｋｅｓｈａポンプ）およびＰ−２（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー）はオンにされ、ＰＫ−２（真空タンク）の内容物がホモジナイズされた。Ｃ相は、アクセスポートを通してゆっくりとＰＫ−２に加えられた。ＰＫ−２に加えられるとき、温度は７０〜８０℃の間でなければならないことに注意のこと。次いで、均質化が５分間よりも長く、次いで、Ａ−２（撹拌機）がオフにされたことが確実にされた。あらかじめ秤量した２００．０ｇｍ二酸化チタンのＤ相が、１００メッシュふるいを通してＰＫ−２にゆっくりとふるい掛けされた。スパチュラが使用されて、ＰＫ−２のブレードにこびりついたいかなる二酸化チタンも除去された。
【０５６３】
次いで、点検窓が取り外され、Ａ−２がオンにされた。内容物は、Ｐ−１（Ｗａｕｋｅｓｈａポンプ）およびＰ−２を通して再循環しながら、継続して混合された。内容物は、１０分間、または完全に均質かつ十分に引き伸ばされるまで（色がチェックされた）ホモジナイズされた。Ｐ−２は１０分後に停止された。ＰＫ−２の内容物は５０〜６０℃に冷却された。点検窓は取り外され、融解したＣｏＱ１０  ２１％濃縮物（Ｅ相、実施例７Ａにおけるのと同様）がＰＫ−２にゆっくりと加えられた。次いで、点検窓が取り外された。
【０５６４】
ＰＫ−２の内容物は、均一になるまで混合され、Ｐ−１を通して再循環された。温度は５０〜６０℃に維持された。窒素ＮＦフローが開始され、次いで、Ｃ−２（真空ポンプ）はオンにされた。生成物の発泡を回避することが最もよいことに注意のこと。次いで、バッチは４５〜５０℃に冷却され、真空と窒素ＮＦの両方がオンにされた。生成物がその温度まで冷却されたとき、Ｃ−２はオフにされ、窒素ＮＦを用いていかなる真空も取り除かれた。窒素ＮＦ流はオンのままであった。次いで、出口バルブは、試料を収集することまたは生成物をパッケージングすることの前に生成物でパージされた。生成物は、あらかじめ秤量し、清浄な、ＨＤＰＥ閉鎖トップ容器に移された。Ａ−２、Ｐ−１、および窒素ＮＦ流はオフにされ、バッチは完了され、そしてＴＩＣ−２チャート上に示された。
【０５６５】
２つの３０ｇｍ（最少）試料が微量試験のために取り出され、２つの４００ｇｍ（最少）試料が物理／化学試験のために取り出された。１セットの試料が「保持」とラベルされた。満たされた容器は秤量された。生じたバッチサイズは２０，０００ｇｍであった。
【０５６６】
実施例３２：１８ｋｇバッチのカルボマー分散液２％を調製する方法
１８ｋｇバッチのカルボマー分散液２．０％組成物が、以下に記載されるようなＡ相−Ｃ相を合わせることによって調製された。Ａ相は、プロピレングリコールＵＳＰを０．５０％ｗ／ｗおよびフェノキシエタノールＮＦを５．００％ｗ／ｗで含んだ。Ｂ相は精製水ＵＳＰを９２．５０％ｗ／ｗで含み、一方、Ｃ相はカルボマー９４０ＮＦを２．００％ｗ／ｗを含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のＣｏＱ１０クリーム２．０％組成物の重量に対してである。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
【表７０】
0005903734.tif 000077
【０５６７】
適切な容器中で、透明および均一になるまで、Ａ相成分が混合された。第２の容器（混合タンク）に、Ｂ相の精製水が加えられた。精製水の一部（「すすぎ用水」）がＡ相容器をすすぐために保持された。第２の容器中の水が６０〜６５℃の間に加熱された。Ａ相成分はＢ相の水に加えられ、「すすぎ用水」はＡ相容器をすすぐために使用された。次いで、透明かつ均一になるまで、Ａ相容器の内容物は混合された。相Ｃのカルボマー９４０を混合タンクにゆっくりと加えながら（振りかけながら）、ミキサースピードは増加された。すべての粉末が徹底的に分散され、「斑点」が存在しなくなるまで、混合は継続された。温度は６０〜６５℃の間に維持された。次いで、内容物は保存のために適切な容器に移された。
【０５６８】
実施例３３：３ｋｇバッチのカルボマー分散液２％を調製する方法
３ｋｇバッチのカルボマー分散液２．０％組成物は、以下に記載されるＡ相−Ｃ相を合わせることによって調製された。Ａ相は、プロピレングリコールＵＳＰを５．００％ｗ／ｗおよびフェノキシエタノールＮＦを０．５０％ｗ／ｗで含んだ。Ｂ相は精製水ＵＳＰを９２．５０％ｗ／ｗで含み、一方、Ｃ相はカルボマー９４０ＮＦを２．００％ｗ／ｗを含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のＣｏＱ１０クリーム２．０％組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表７１】
0005903734.tif 000078
【０５６９】
すべての設備は清浄化および消毒された。実験台上で、Ａ相成分は透明および均一になるまで混合された。水の必要量は秤量され、ケトルＰＫ−１（相容器）に加えられた。ＰＫ−１中の水は、熱水／蒸気ジャケットで６０〜６５℃に加熱された。Ａ相は透明かつ均一になるまで、中速の撹拌でＢ相の水に加えられた。Ａ相容器は、６０〜６５℃の温度を維持しながら、処理水相ですすがれた。混合は、すべての粉末が徹底的に分散され、「斑点」が存在しなくなるまで、中速から高速撹拌で継続された。内容物は、微量品質、ｐＨ、比重、および粘度のためにサンプリングされた。次いで、バッチは、明細書内のｐＨ、比重、および粘度に基づいて、清浄かつ消毒された５ガロンの閉鎖トップカーボイにポンプされた。
【０５７０】
実施例３４：１８ｋｇバッチのカルボマー分散液２％を調製する方法
１８ｋｇバッチのカルボマー分散液２％は、Ａ相、Ｂ相、およびＣ相の成分を合わせることによって調製された。Ａ相は、フェノキシエタノールＮＦを０．５０％ｗ／ｗ、プロピレングリコールＵＳＰを５．００％ｗ／ｗ、精製水ＵＳＰを９２．５０％ｗ／ｗおよびカルボマー９４０ＮＦを２．００％ｗ／ｗ含んでいた。
【表７２】
0005903734.tif 000079
【０５７１】
このバッチ調製物中で使用される設備は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂａｌａｎｃｅ，Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｂａｌａｎｃｅ，Ｃｈａｒｔ  Ｒｅｃｏｒｄｅｒ，Ｌｅｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｔａｎｋ、および２−Ｌステンレス鋼（ＳＳ）ビーカーを含んだ。
【０５７２】
成分を秤量する前に、製造領域は清浄化され、清浄であることが確認された。すべての設備は同様に清浄化され、清浄であることが確認され、有効期限／較正の範囲内にあった。はかりの較正はチェックおよび記録された。秤量容器は秤量パンにこぼれることを回避するために風袋が計られた。最初に、１，６５０ｇｍの精製水が秤量され、「すすぎ用水」とラベルされた容器の中に配置された。別の１５，０００ｇｍの精製水もまた秤量された。３６０ｇｍのカルボマー９４０ＮＦもまた秤量された。
【０５７３】
Ａ相は、９０ｇｍのフェノキシエタノールをビーカーに秤量することによって調製された。次いで、９００ｇｍのプロピレングリコールＵＳＰが、２−Ｌ  ＳＳビーカーに秤量された。次いで、あらかじめ秤量されたフェノキシエタノールＮＦが、あらかじめ秤量されたプロピレングリコールを含有する２−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられた。ビーカー中に残るフェノキシエタノール残渣は、「すすぎ用水」の約１／３ですすがれた。次いで、容器はＡ相とラベルされた。プレミックスは２４時間以内に使用されなければならばいことに注意のこと。
【０５７４】
Ａ相は、透明かつ均一になるまでスパチュラで混合された。スパチュラは、「すすぎ用水」の１／３ですすぎながら取り出した。
【０５７５】
Ａ相の調製後、分散液は、Ｌｅｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｔａｎｋ（ＰＫ−１）を使用して混合された。適切なラベルされたチャートがＴＩＣ−１（温度レコーダー）に配置された。ＴＩＣ−１（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｃｏｒｄｅｒ）がオンにされ、適切に操作することを確実にした。一旦、ＰＫ−１の底バルブが閉じていることが確認されたら、あらかじめ秤量した精製水ＵＳＰがＰＫ−１に加えられた。ＳＳビーカーは、残りの「すすぎ用水」でＰＫ−１にすすがれた。
【０５７６】
撹拌機が中速までオンにされ、ＰＫ−１の内容物が、熱水／蒸気ジャケットを用いて６０〜６５℃まで加熱された。受容可能な範囲には、５５〜７０℃もまた含まれる。撹拌機は、しぶきを引き起こすことない最高速に設定された。あらかじめ秤量したカルボマー９４０ＮＦは、少なくとも１５分間、しかし２０分間を超えないような時間の間にわたって、５０メッシュふるいを通して、ＰＫ−１に均一にふるい掛けされた。標的とされた温度は６０〜６５℃であったが、しかし、受容可能な範囲は５５〜７０℃であった。次いで、撹拌機は高速までオンにされた。すべての粉末が徹底的に分散されかつ「斑点」が存在しなくなるまで、少なくとも１時間、高速撹拌で、混合が継続された。スパチュラが使用されて、端に付着されたいかなる粉末も分散してボルテックスした。
【０５７７】
分散液の２つの３０ｇｍ試料が微量試験のために、２つの４００ｇｍセールス（ｓａｌｅｓ）が物理／化学試験のために取り出された。１つのセットは「保持」とラベルされた。次いで、生成物は清浄なＨＤＰＥ閉鎖トップ容器に移された。得られたバッチサイズは１８，０００ｇｍであった。
【０５７８】
実施例３５：ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物およびアルキルベンゾエートを含むＣｏＱ１０クリーム３％を調製する方法
ＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。Ａ相は、アルキルＣ１２−１５ベンゾエートＮＦを４．００％ｗ／ｗで、セチルアルコールＮＦを２．００％ｗ／ｗで、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸を４．５０％ｗ／ｗで、およびステアリルアルコールＮＦを１．５％ｗ／ｗで含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表７３】
0005903734.tif 000080
【０５７９】
Ｂ相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦを５．００％ｗ／ｗ、グリセリンＵＳＰを２．００％ｗ／ｗ、プロピレングリコールＵＳＰを１．５０％ｗ／ｗ、フェノキシエタノールＮＦを０．４７５％ｗ／ｗ、精製水ＵＳＰを１６．７２５％ｗ／ｗ、およびカルボマー分散液、２％を４０％ｗ／ｗ含んだ。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
【表７４】
0005903734.tif 000081
【０５８０】
Ｃ相は乳酸ＵＳＰを０．５０％ｗ／ｗ、乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰを２．００％ｗ／ｗ、トリエタノールアミンＮＦを１．３０％ｗ／ｗ、および精製水ＵＳＰを２．５０％ｗ／ｗ含んだ。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
【表７５】
0005903734.tif 000082
【０５８１】
Ｄ相は二酸化チタンＵＳＰを１．００％ｗ／ｗ含んだのに対して、Ｅ相はＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を１５．００％ｗ／ｗ含んだ。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
【表７６】
0005903734.tif 000083
【０５８２】
すべての重量パーセントは、全体のＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物の重量に対してである。
【０５８３】
Ａ相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。カルボマー分散液を含まないＢ相成分は、適切な容器に加えられ、混合された。Ｃ相成分もまた、適切な容器に加えられ、次いでウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。Ｅ相のＣｏＱ１０濃縮物は適切な容器に配置され、ウォーターバスを使用して、５０〜６０℃の間で融解された。これらの成分は、必要に応じて均一性を確実にするために混合された。次いで、カルボマー分散液は、適切な容器（混合タンク）に加えられ、混合されながら、７０〜８０℃の間に加熱された。成分が混合されながら、Ｂ相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。内容物は、継続して混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーがオフにされ、しかし、均質化は持続された。均質化が継続されながら、Ｄ相の二酸化チタンが混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーがオンにされ、内容物は混合され、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまでさらにホモジナイズされた（色がチェックされた）。次いで、均質化が停止され、バッチは５０〜６０℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したＣｏＱ１０濃縮物が混合タンクに加えられた。続いてミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物は混合／再循環された。次いで、混合タンクの内容物は４５〜５０℃の間に冷却された。次いで、内容物は開封まで、保存のために適切な容器に移された。
【０５８４】
実施例３６：ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物およびアルキルベンゾエートを含む０．５ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム３％を調製する方法
０．５ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。Ａ相は、Ｃ１２−１５アルキルベンゾエートを４．００％ｗ／ｗ、セチルアルコールＮＦを２．００％ｗ／ｗ、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸を４．５０％ｗ／ｗ、およびステアリルアルコールＮＦを１．５％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
【表７７】
0005903734.tif 000084
【０５８５】
Ｂ相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦを５．００％ｗ／ｗ、グリセリンＵＳＰを２．００％ｗ／ｗ、プロピレングリコールＵＳＰを１．５０％ｗ／ｗ、フェノキシエタノールＮＦを０．４７５％ｗ／ｗ、精製水ＵＳＰを１６．７２５％ｗ／ｗ、およびカルボマー分散液、２％を４０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージおよび量は以下の対応する相の表に列挙されている。
【表７８】
0005903734.tif 000085
【０５８６】
Ｃ相は、乳酸ＵＳＰを０．５０％ｗ／ｗ、乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰを２．００％ｗ／ｗ、トリエタノールアミンＮＦを１．３０％ｗ／ｗ、および精製水ＵＳＰを２．５０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表７９】
0005903734.tif 000086
【０５８７】
Ｄ相は二酸化チタンＵＳＰを１．００％ｗ／ｗ含んだのに対して、Ｅ相はＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を１５．００％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表８０】
0005903734.tif 000087
【０５８８】
すべての重量パーセントは、全体のＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物の重量に対してである。
【０５８９】
Ａ相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。カルボマー分散液を含まないＢ相成分は、適切な容器に加えられ、混合された。Ｃ相成分もまた、適切な容器に加えられ、次いでウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。Ｅ相のＣｏＱ１０  ２１％濃縮物は、適切な容器に配置され、ウォーターバスを使用して５０〜６０℃の間で融解された。これらの成分は、必要に応じて均一性を確実にするために混合された。次いで、カルボマー分散液は、適切な容器（混合タンク）に加えられ、混合されながら、７０〜８０℃の間に加熱された。成分が混合されながら、Ｂ相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。内容物は、継続して混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーがオフにされ、しかし、均質化は持続された。均質化が継続されながら、Ｄ相の二酸化チタンが混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーがオンにされ、内容物は混合され、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまでさらにホモジナイズされた（色がチェックされた）。次いで、均質化が停止され、バッチは５０〜６０℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したＣｏＱ１０  ２１％濃縮物が混合タンクに加えられた。続いてミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物は混合／再循環された。次いで、混合タンクの内容物は４５〜５０℃の間に冷却された。次いで、内容物は開封まで、保存のために適切な容器に移された。
【０５９０】
実施例３７：ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物およびトリカプリル酸グリセリル／トリカプリン酸グリセリルを含む０．５ｋｇバッチＣｏＱ１０クリーム３％を調製する方法
０．５ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。Ａ相は、トリカプリル酸グリセリル／トリカプリン酸グリセリルを４．００％ｗ／ｗ、セチルアルコールＮＦを２．００％ｗ／ｗ、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸を４．５０％ｗ／ｗ、およびステアリルアルコールＮＦを１．５％ｗ／ｗを含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
【表８１】
0005903734.tif 000088
【０５９１】
Ｂ相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦを５．００％ｗ／ｗ、グリセリンＵＳＰを２．００％ｗ／ｗ、プロピレングリコールＵＳＰを１．５０％ｗ／ｗ、フェノキシエタノールＮＦを０．４７５％ｗ／ｗ、精製水ＵＳＰを１６．７２５％ｗ／ｗ、およびカルボマー分散液、２％を４０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージおよび量は以下の対応する相の表に列挙されている。
【表８２】
0005903734.tif 000089
【０５９２】
Ｃ相は、乳酸ＵＳＰを０．５０％ｗ／ｗ、乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰを２．００％ｗ／ｗ、トリエタノールアミンＮＦを１．３０％ｗ／ｗ、および精製水ＵＳＰを２．５０％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表８３】
0005903734.tif 000090
【０５９３】
Ｄ相は二酸化チタンＵＳＰを１．００％ｗ／ｗ含んだのに対して、Ｅ相はＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を１５．００％ｗ／ｗ含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
【表８４】
0005903734.tif 000091
【０５９４】
すべての重量パーセントは、全体のＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物の重量に対してである。
【０５９５】
Ａ相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。カルボマー分散液を含まないＢ相成分は、適切な容器に加えられ、混合された。Ｃ相成分もまた、適切な容器に加えられ、次いでウォーターバス中で７０〜８０℃の間に加熱された。Ｅ相のＣｏＱ１０  ２１％濃縮物は、適切な容器に配置され、ウォーターバスを使用して５０〜６０℃の間で融解された。これらの成分は、必要に応じて均一性を確実にするために混合された。次いで、カルボマー分散液は、適切な容器（混合タンク）に加えられ、混合されながら、７０〜８０℃の間に加熱された。成分が混合されながら、Ｂ相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。内容物は、継続して混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーがオフにされ、しかし、均質化は持続された。均質化が継続されながら、Ｄ相の二酸化チタンが混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーがオンにされ、内容物は混合され、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまでさらにホモジナイズされた（色がチェックされた）。次いで、均質化が停止され、バッチは５０〜６０℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したＣｏＱ１０  ２１％濃縮物が混合タンクに加えられた。続いてミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物は混合／再循環された。次いで、混合タンクの内容物は４５〜５０℃の間に冷却された。次いで、内容物は開封まで、保存のために適切な容器に移された。
【０５９６】
実施例３８：ＣｏＱ１０  ２１％濃縮物およびトリカプリル酸グリセリル／トリカプリン酸グリセリルを含む２０ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム３％を調製する方法
【０５９７】
２０ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物は、Ａ相−Ｅ相の成分を合わせることによって調製された。各相の成分の重量パーセント、量、およびさらなる詳細は以下の表に提示されている。
【表８５】
0005903734.tif 000092
【０５９８】
２０ｋｇバッチのＣｏＱ１０クリーム３％を調製する際に、以下の手順に従った。化学成分が秤量される前に、領域およびすべての設備が清浄であることを確実にするように特別な注意が払われた。最初に、化学成分が秤量され、秤量パンへのいかなるこぼれも防ぐよう特別な注意が払われた。
【０５９９】
最初に２００ｇｍの二酸化チタン（Ｄ相）が秤量された。次いで、６００ｇｍの精製水が秤量された（「すすぎ用水−Ｂ相」とラベルされた）。
【０６００】
Ａ相成分を調製する際に、８００ｇｍのトリカプリン酸グリセリル／トリカプリル酸グリセリル、４００ｇｍのセチルアルコールＮＦ、３００ｇｍのステアリルアルコールＮＦ、および９００ｇｍのステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００ステアリン酸が秤量された。次いで、これらのあらかじめ秤量されたＡ相成分は４−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられ、Ａ相とラベルされた。このプレミックスは２４時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、Ａ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０６０１】
Ｂ相を調製する際に、８，０００ｇｍのカルボマー分散液２．０％、４００ｇｍのグリセリンＵＳＰ、３００ｇｍのプロピレングリコール、１，０００ｇｍのジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルＮＦ、９５ｇｍのフェノキシエタノールＮＦ、および２，７４５ｇｍの精製水ＵＳＰ（「Ｂ相用精製水」とラベルされた）が秤量された。次いで、これらのあらかじめ精製されたＢ相成分は１０−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられた。このプレミックスは２４時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。Ｂ相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、Ｂ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０６０２】
Ｃ相を調製する際に、２６０ｇｍのトリエタノールアミンＮＦ、４００ｇｍの乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰ、６０％、５００ｇｍの精製水（「Ｃ相用精製水」とラベルされた）、および１００ｇｍの乳酸ＵＳＰが秤量された。次いで、これらのＣ相成分は、以下の順番で２−Ｌ  ＳＳビーカーに加えられた：（１）２６０ｇｍのトロラミン、（２）４００ｇｍの乳酸ナトリウム溶液、６０％、（３）５００ｇｍのＣ相用精製水、および（４）１００ｇｍの乳酸ＵＳＰ。この容器はＣ相とラベルされた。このプレミックスは２４時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、Ｃ相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、Ｃ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０６０３】
Ｅ相を調製する際に、３，０００ｇｍのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物が秤量され、Ｅ相とラベルされた容器に配置された。Ｅ相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
【０６０４】
ＣｏＱ１０クリーム３％を混合する際に、Ａ相、Ｃ相、およびＥ相を加熱するために２つのウォーターバスが使用された。最初に、Ａ相ビーカーは７０〜７５℃に設定したウォーターバスに配置され、内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。Ｃ相ビーカーは６０〜６５℃に設定したウォーターバスに配置された。Ｃ相ビーカーの内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。Ｅ相ビーカーはウォーターバスに配置され、５０〜５５℃の温度に設定された。Ｅ相ビーカーの内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。
【０６０５】
クリームを混合するために、ウォーターバス（Ｅ−１）、Ｌｅｅ真空タンク（ＰＫ−２）、Ｗａｕｋｅｓｈａポンプ（Ｐ−１）、およびＳｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー用四角穴高剪断スクリーンが使用された。
【０６０６】
最初に（Ｆｉｓｔ）、ＰＫ−２の底バルブが閉じていること、およびＰＫ−２が適切にシールされていることが確認された。次いで、点検窓がＰＫ−２から取り外され、あらかじめ秤量した１０，０００ｇｍのカルボマー分散液２．０％が、点検窓入り口を通してＰＫ−２タンクに加えられた。スパチュラが使用されて、いかなるカルボマー分散液２．０％もその容器の壁面から移された。次いで、ＰＫ−２用のＴＩＣ−２（温度記録装置）がオンにされ、この記録装置が適切に操作するのを保証ことを確実にした。
【０６０７】
ＰＫ−２のための撹拌機（Ａ−２）はオンにされ、カルボマー分散液２．０％は蒸気ジャケットを用いて７０〜８０℃に加熱された。次いで、点検窓はＰＫ−２から取り外され、Ｂ相が、ＳＳビーカーからＰＫ−２まで、点検窓入り口を通してゆっくりと加えられた。次いで、Ｂ相容器は、「Ｂ相すすぎ用水」ですすがれた。次いで、すすぎ液が、点検窓入り口を通してＰＫ−２に加えられた。
【０６０８】
次いで、Ａ相がゆっくりとＰＫ−２に加えられた。スパチュラが使用されて、ＳＳビーカーの壁面からのいかなるＡ相も移された。ＰＫ−２に加えられるとき、Ａ相の温度は７０〜８０℃の間でなければならないことに注意のこと。
【０６０９】
次いで、ＰＫ−２の底バルブが開かれ、Ｐ−１ポンプおよびＰ−２（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー）はオンにされた。ＰＫ−２の内容物がホモジナイズされた。
【０６１０】
次いで、Ｃ相は、アクセスポートを通してゆっくりとＰＫ−２に加えられた。加えられるときに、温度は７０〜８０℃の間でなければならないことに注意のこと。均質化が少なくとも５分間持続され、次いで、Ａ−２攪拌機がオフにされたことが確実にされた。次いで、あらかじめ秤量した２００ｇｍ二酸化チタンＵＳＰが、１００メッシュふるいを通してＰＫ−２にゆっくりとふるい掛けされた。スパチュラが使用されて、ＰＫ−２のブレードにこびりついたいかなる二酸化チタンも除去された。
【０６１１】
次いで、点検窓が取り外され、Ａ−２撹拌機がオンにされた。内容物は、Ｐ−１およびＰ−２を通して再循環しながら、継続して混合された。均質化は、１０分間、または完全に均質かつ十分に引き伸ばされるまで継続させられた。１０分後にＰ−２は停止された。次いで、ＰＫ−２の内容物は５０〜６０℃に冷却された。次いで、点検窓は取り外され、Ｅ相の融解したＣｏＱ１０  ２１％濃縮物）がアクセスポートを通してゆっくりと加えられた。次いで、点検窓が取り外された。
【０６１２】
次いで、ＰＫ−２の内容物は、均一になるまでＡ−２と混合された。温度は５０〜６０℃に維持され、内容物はＰ−１を通して再循環された。次いで、窒素ＮＦフローが開始され、Ｃ−２真空ポンプはオンにされた。生成物の発泡の回避が好ましいことに注意のこと。次いで、バッチは４５〜５０℃に冷却され、真空と窒素の両方がオンにされた。生成物がその温度まで冷却されたとき、Ｃ−２（真空ポンプ）はオフにされ、窒素ＮＦを用いていかなる真空も取り除かれた。窒素ＮＦ流はオンのままであった。出口バルブは、試料を収集することまたは生成物をパッケージングすることの前に生成物でパージされた。
【０６１３】
次いで、生成物は、あらかじめ秤量し、清浄な、ＨＤＰＥ閉鎖トップ容器に移された。Ａ−２撹拌機、Ｐ−１  Ｗａｕｋｅｓｈａポンプ、および窒素ＮＦ流はオフにされた。バッチは完了され、ＴＩＣ−２チャート上に示された。
【０６１４】
２つの３０ｇｍ（最少）試料が微量試験のために取り出され、２つの４００ｇｍ（最少）試料が物理／化学試験のために取り出された。１セットの試料が「保持」とラベルされた。満たされた容器は秤量された。２０ｋｇのバッチサイズが得られた。
【０６１５】
実施例３９：ＣｏＱ１０クリーム３％の局所適用によってＳＣＣＩＳを処置する方法
上記のような（例えば、実施例１５および１６）ＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物は、インサイチュで皮下扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＩＳ）に局所適用された。３５例の対象が、３．０％ＣｏＱ１０油中水型エマルジョンクリームベース医薬で局所処置された。この医薬品は、遮光容器中、室温にて出荷および保存された。
【０６１６】
分析集団は、（１）処置意図集団（ＩＴＴ）、（２）安全性集団、（３）プロトコールによる（ＰＰ）集団と定義された。ＩＴＴ集団は、治験薬（ＣｏＱ１０  ３％）を投薬されたすべての対象を含んだ。安全性集団は、少なくとも１回用量の治験薬を取り込んだすべての対象を含んだ。ＰＰ集団は、ベースラインにおける組織学的結果を介して確認されたＳＣＣＩＳを有し、６週間目の組織学的試験を有し、そしていかなる暫定訪問も欠席しなかったすべての対象を含む。
【０６１７】
対象は、組織学的に確定された少なくとも１つの非顔面ＳＣＣＩＳ病変を有する、その他の点では健常な雄性または雌性成体であった。切除のために適切なＳＣＣＩＳ病変は、最小面積０．５ｃｍ２および最大直径２．０ｃｍを有し、研究の間に衣類によって日光から保護できる位置にあった。各々朝のほぼ同時刻に、対象は病変部位を洗浄し、次いで、１枚のワックス紙またはアプリケーターに小さなエンドウマメサイズの（５０〜１００ｍｇ）量の局所クリーム医薬を調剤した。次いで、対象は、コットンスワブまたはアプリケータースティックを使用して、適切な量のクリームを病変およびその周囲の領域に適用した。処置領域は、適用後少なくとも８時間、洗浄されなかった。各々夕方のほぼ同時刻に、手順が反復された。病変および周囲の領域は、衣類を用いて日光から保護された。
【０６１８】
処置の最初の日に、疾患の直径が測定され、面積が計算された。病変は写真も撮られた。１週目、２週目、３週目、４週目、および５週目において、対象が評価され、記録が彼らのバイタルサイン：血圧、脈拍数、呼吸数、口腔体温が取られた。以下の表に基づいて、以下の皮膚炎症の臨床的徴候／症候：紅斑、剥離、乾燥、掻痒、灼熱／刺される痛みもまた、ＣｏＱ１０  ３％処置の安全性の尺度として等級付けされた。
【０６１９】
【表８６】
0005903734.tif 000093
【０６２０】
【表８７】
0005903734.tif 000094
【０６２１】
【表８８】
0005903734.tif 000095
【０６２２】
【表８９】
0005903734.tif 000096
【０６２３】
【表９０】
0005903734.tif 000097
【０６２４】
紅斑による安全性評価：ベースラインにおいて、３２例の対象（９１．４％）がある程度の紅斑を有した。この徴候は、多くの対象（２８例の対象、８０％）においてわずかから軽度と考えられ、４例の対象（１１．４％）は顕著な（グレード３）赤みを有した。６週目において、紅斑は４例の対象（１１．８％）において存在せず、３０例の対象（８８．２％）においてわずかまたは軽度であったのに対して、グレード３紅斑は観察されなかった。７例の対象において研究の間に観察され、ベースラインと比較して改善された最大紅斑スコアは、１５例の対象において変化しなかったが、１３例の対象において悪化した。最終紅斑スコアは、１１例の対象において、ベースラインに対して改善されたが、２２例の対象においては変化がなく、そして２例の対象において悪化した。
【０６２５】
剥離／スケーリングによる安全性評価：ベースラインにおいて、２７例の対象（７７．１％）はある程度の剥離またはスケーリングを有し、８例の対象（２２．９％）は有さなかった。６週目において、目に見える剥離またはスケーリングは１６例の対象（４７．１％）について存在せず、１７例の対象（５０％）においてわずかであり、そして１例のみの対象（２．９％）で中度であった。研究の間に観察された剥離／スケーリングについての最大スコアは、７例の対象においてベースラインと比較して改善され、２０例の対象において変化せず、８例の対象において悪化した。最終剥離／スケーリングスコアは、１６例の対象においてベースラインと比較して改善され、１４例の対象において変化せず、そして５例の対象において悪化した。
【０６２６】
乾燥による安全性評価：８例の対象（２２．９％）は、ベースラインにおいてわずかまたは中度の乾燥を有したのに対して、７７．１％は、処置領域において乾燥なしであるか（グレード１）または油状光沢（グレード０）を有した。６週目において、１例の対象以外は、グレード０またはグレード１の乾燥を有した（９７．１％）。研究の間に観察された最大乾燥スコアは、７例の対象においてベースラインと比較して改善され、２３例の対象において変化せず、そして５例の対象において悪化した。最終乾燥スコアは、１３例の対象においてベースラインと比較して改善され、２１例の対象において変化せず、そして１例の対象において悪化した。
【０６２７】
掻痒による安全性評価：ベースラインにおいて対象の大部分は、掻痒なし（７４．３％）または軽度、たまの掻痒（２０％）と報告されたのに対し、２例の対象（５．７％）がグレード２または３の掻痒と報告された。６週目において、掻痒は、９４．１％が掻痒を有さないように改善され、２例の対象（５．９％）のみが、軽度、たまの掻痒を有した。１週目〜６週目まで、どの対象もグレード１（軽度、たまの掻痒）よりも悪化した掻痒を有さなかった。研究の間に観察された最大掻痒スコアは、５例の対象においてベースラインと比較して改善され、２４例の対象において変化せず、そして６例の対象において悪化した。最終掻痒スコアは、９例の対象においてベースラインと比較して改善され、２４例の対象において変化せず、そして２例の対象において悪化した。
【０６２８】
灼熱／刺される痛みによる安全性評価：ベースラインにおいて、灼熱または刺される痛みは大部分の対象（９４．３％）において存在せず、２例の対象（５．７％）において軽度であった。これらのスコアは、研究の間、実質的に変化しないままであった。どの対象もグレード１（軽度）より上のスコアを有さず、２例を超えない対象が１日目（ベースライン）〜６週目までの任意の訪問の際にグレード１スコアを有した。研究の間に観察された灼熱／刺される痛みの最大スコアは、２例の対象においてベースラインと比較して改善され、２８例の対象において「灼熱／刺される痛みなし」から変化せず、そして５例の対象において悪化した（なしから軽度まで）。最終灼熱／刺される痛みスコアは、２例の対象においてベースラインと比較して改善され、３１例の対象において変化せず、そして２例の対象において悪化した。
【０６２９】
病変の直径もまた測定され、面積がＣｏＱ１０  ３％処置の効力を評価するために計算された。６週間の処置期間の最後に、中断訪問があり、ここでは、バイタルサインの記録が取られ、臨床徴候／症候が等級付けされた。身体検査もまた、６週間の中断訪問の際に実施された。中断訪問において、絶食血液試料もまた、最終クリーム適用の３時間以内に収集されて、ＣｏＱ１０血漿濃度を決定した。病変は写真に撮られ、直径は測定され、そして面積が計算された。
【０６３０】
ＣｏＱ１０クリーム３％を用いるＳＣＣＩＳの局所処置の結果は、図４〜９の前後の写真に示されるような効力を示した。第１の効力の終点は、６週目の標的病変のネガティブ組織学的評価として規定される完全な応答を有する対象のパーセンテージであった。第２の効力の終点は、６週目の処置病変の面積（２つの主要な直径の積）の少なくとも５０％減少として規定される部分的な応答を有する対象のパーセンテージに反映される。結果は、ＩＴＴ集団の２３．５％が６週目に完全な応答を有したのに対して、ＰＰ集団の１８．５％が６週目に完全な応答を有したことを示した。
【０６３１】
第２の効力の結果は、６週目にＩＴＴ集団が２６．５％が部分的な５０％応答を有し、２．９％が７５％の部分的な応答を有したことを示した。部分的な応答は、２例の対象において１週目に、８例の対象において２週目まで初期に観察された。最高の部分的応答割合は４週目および５週目であった。興味深いことに、６週目に完全な応答を有した８例の対象のうち、４例の対象は、目視検査に基づく部分応答を有さず、どの対象も７５％応答を有さなかった。ＰＰ集団においては、２２．２％が５０％部分応答を有したのに対して、０％が７５％部分応答を有した。病変領域における平均変化および平均パーセンテージ変化は、６週目のＩＴＴ集団において、それぞれ−０．３ｃｍ２および−２６．１％であり、ＰＰ集団において、それぞれ−０．３ｃｍ２および−２３．４％であった。
【０６３２】
全体として、ＣｏＱ１０  ３％クリームは安全であり、十分に耐容性があった。完全な治癒は、ＩＴＴ集団の対象の約２５％によって達成された。
【０６３３】
実施例４０：ＣｏＱ１０クリーム３％の局所適用によってＢＣＣを治療する方法
基底細胞癌（ＢＣＣ）は、最も一般的な型の皮膚悪性腫瘍であり、米国において全体として最も一般的な型の癌である。米国癌協会（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、８００，０００を超える基底細胞癌の新規な症例が毎年診断されていると見積もっている。表在性基底細胞癌（ｓＢＣＣ）はまれに転移し、通常は外科的切除または局所製剤を通して治癒可能である。
【０６３４】
実施例３５〜３６において上記に記載されるようなＣｏＱ１０クリーム３．０％組成物は、１つ以上の組織学的に確認された表在性基底細胞癌（ｓＢＣＣ）病変を有し、他の点では健常である１６０例の雄性または雌性成体に局所適用された。０．５ｃｍ２の最小面積および２．０ｃｍの最大直径を有する１つの標的病変が、治療のために指定された。ｓＢＣＣ病変は非顔面であり、研究の間に日光から防御可能であった。
【０６３５】
本研究は、ランダム化された、二重盲検ビヒクル対照を設けた、並行研究であった。各対象は、４つの研究アーム：１．５％ＣｏＱ１０クリーム１日１回（毎日１回）＋ビヒクルクリーム１日１回（毎日１回）、３．０％ＣｏＱ１０クリーム１日１回（毎日１回）＋ビヒクルクリーム１日１回（毎日１回）、３．０％ＣｏＱ１０クリーム１日２回（毎日２回）、またはビヒクルクリーム１日２回（毎日２回）のうちの１つにランダム化された。各アームは４０例の患者を有した。
【０６３６】
【表９１】
0005903734.tif 000098
【０６３７】
最初のスクリーニング訪問において、病変直径が測定され、面積が計算された。この面積は、２つの最大の垂直な直径を測定すること、およびｃｍ２の結果のために乗算することによって決定される。対象のバイタルサインが取られ、記録され、そして身体検査が実施された。絶食血液試料が収集され、完全血液計数（ＣＢＣ）テストが、脂質パネルテストを伴う臨床化学と同様に実施された。血液試料は、ベースラインＣｏＱ１０血漿濃度の決定のために収集され、２連試料が収集され、パッケージングされた。尿検査もまた実施され、出産可能な女性については、尿妊娠検査が実施された。次いで、対象は、以下の皮膚炎症の臨床徴候／症候：紅斑、剥離、乾燥、掻痒、および灼熱／刺される痛みについて等級付けされた。
【０６３８】
研究の最初の日に（１日目）、対象のバイタルサインが再度記録され、皮膚炎症の臨床徴候／症候がスクリーニング訪問において等級付けされた。対象はまた、有害な事象、併用局所製剤の使用、および併用医薬の使用についてインタビューを受けた。次いで、標的ｓＢＣＣ病変は写真撮影され、スクリーニング訪問においてと同様に直径および面積について測定された。次いで、対象は、ＣｏＱ１０医薬を含む医薬キットを与えられた。ＣｏＱ１０クリームは、６週間の間、１日２回、患者によってｓＢＣＣ病変および１ｃｍの周囲の皮膚に適用された。
【０６３９】
投薬レジメンは、各朝のほぼ同じ時刻に病変部位を洗浄すること、ＡＭタブから１枚のワックス紙またはアプリケーターに、小さなエンドウマメサイズ（５０〜１００ｍｇ）の量の局所クリームを分配することからなった。次いで、対象は、Ｑチップまたはアプリケータースティックを使用して、病変および周囲の領域に適切な量のクリームを適用した。処置領域は、少なくとも８時間の間、洗浄されなかった。各夕方のほぼ同じ時刻に、ＰＭチューブからの局所クリームを使用して手順は反復された。
【０６４０】
対象による暫定的な訪問があり、これは、１週目、２週目、３週目、４週目、および５週目に行われた。これらの訪問の各々において、初期処置訪問におけるのと同様にバイタルサインが記録され、臨床徴候／症候が等級付けされた。病変直径が測定され、面積が計算された。次いで、対象は、有害な事象、併用局所製剤の使用、および併用医薬の使用についてインタビューを受けた。臨床評価は毎週行われた。
【０６４１】
処置期間、６週間の最後に、初期処置訪問におけるのと同様にバイタルサインが記録され、臨床徴候／症候が等級付けされた。病変直径が測定され、面積が計算された。身体検査もまた実施された。最終クリーム適用後に、絶食血液試料もまた収集された。ＣｏＱ１０血漿濃度の決定のための最終クリーム適用後３時間を超えないうちに、血液試料が収集された。完全血液計数（ＣＢＣ）テストが実施され、脂質パネル試験を伴う臨床化学が実施された。
【０６４２】
処置後４週間で（研究１０週目）、対象は最終評価およびｓＢＣＣ病変部位の切除のために戻った。バイタルサインが取られ、記録され、そして初期のスクリーニング訪問におけるものと類似である臨床徴候／症候が等級付けされた。
【０６４３】
処置結果は、１１０例の対象の病理を再検討後、ＣｏＱ１０クリーム３％を用いて局所処置された患者の少なくとも２０％が、当該分野で認められる終点によって測定されるような徴候の減少を実証したことを示した。特に、１１０例の対象のうちの２４例で、８週目の病変部位の生検に基づくｓＢＣＣの証拠がなかった。
【０６４４】
実施例４１：ＣｏＱ１０局所処置の薬物動態学的結果
７２例のＢＡＬＢ／ｃマウスが、各８匹のマウスの９グループにランダムに分けられた（グループＩ〜ＩＸ）。グループＩは未処置であった。０日目に、グループＩＩ〜ＶＩＩＩは、０．１ｇの試験物品（Ｃ−１４放射性標識ＡＰＩ３１５１０でスパイクした３％ｗ／ｗＣｏＱ１０クリームを含む水中油型クリームエマルジョン）で、５ｍｇ／ｃｍ２の速度で局所処置された。放射活性ＡＰＩ３１５１０は３％クリームバッチに加えられ、約５０μＣｉ／ｇの生成物または５μＣｉ／適用用量の比活性を有する実験クリーム製剤を生じた。試験物品は、ガラス棒を用いて、グループＩＩ〜ＩＸの各マウスの背の皮膚に局所適用された。投薬直後にグループＩＩ動物は屠殺され、測定された量の血液、尿、糞便、および標的器官（肝臓、膵臓、および脾臓）が収集され、秤量された。血液は血清について処理され、各器官はホモジナイズされた。グループＩＩＩ〜ＶＩＩＩは、投薬後、それぞれ、２、４、８、１２、１８、および２４時間後に屠殺され、同じ試料が収集された。グループＩＸは、７日間の間（０日目〜６日目）、０．１ｇの試験物品を用いて局所的に処置された。６日目の試験物品の最終適用の２４時間後である７日目に、グループＩおよびＩＸが屠殺され、同じ試料が以前の群と同様に収集された。各試料は、１分間あたりの崩壊（ＤＰＭ）について測定され、平均ＤＰＭ／試料型が各グループについて計算された。
【０６４５】
評価は、種々の時点において、２４時間にわたる試験物品の皮膚浸透の相対レベルを決定すること、および適用の方法に伴って薬物が蓄積する場所を決定することの目的を用いて、血清、尿、糞便、および標的器官（肝臓、膵臓、および脾臓）の放射能レベルの測定に基づいた。
【０６４６】
各グループについての平均試料重量グラムの要約は以下のチャートに提示される。
【０６４７】
【表９２】
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【０６４８】
１分間あたりの崩壊（ＤＰＭ）は表６３に提示され、各動物からの組織試料の各型についてシンチレーションカウンター上で測定された。各試料型についての平均ＤＰＭが計算された。結果が１ｍＬ量に転換された後、次いで、平均が平均器官重量によって除算され、組織グラムあたりのＤＰＭの結果が得られた。次いで、対照（グループＩ）の結果は、バックグラウンド放射量を取り除くため、およびグループ内での各試料についての組織グラムあたりの平均ＤＰＭの実際の数値を得るために、他のグループの結果の各々から減算された。２，２２０，０００の定数で除算することによって、結果は、組織グラムあたりのマイクロキュリーに転換された。最終結果は、組織グラムあたりのピコキュリー（マイクロキュリー×１０００）を表す。器官についての結果は、以下のチャートおよびグラフに提示された。
【０６４９】
【表９３】
0005903734.tif 000100
【０６５０】
【表９４】
0005903734.tif 000101
【０６５１】
このデータは、試験物品が投薬後約８時間で膵臓中に実質的に蓄積したこと、およびまた、投薬後約８時間で肝臓中により少ない量で蓄積したことを反映している。脾臓および膵臓における組織グラムあたりのピコキュリーの量は、投薬後１８時間までにほぼゼロまで減少した。時間０の肝臓結果は、投薬後ゼロ時間での指数関数的に高い量のＤＰＭを有する単一の動物のために異常であった。この異常に高い結果のための１つの可能な説明は、動物が、それ自体の皮膚をなめること、または投薬部位の摩擦後にその肢をなめることのいずれかによって、試験物品を直接に消化してしまったことである。この可能性は、試験物品を、皮下吸収よりもはるかに迅速に肝臓に送達する。８時間ピークの後、肝臓量は１２時間でわずかに減少したが、しかし、次いで、１８時間でわずかに増加し、そして２４時間を通して一貫したままであった。
【０６５２】
標的器官の結果（続き）
グループＩＩ〜ＶＩＩＩのすべての動物についての標的器官の各々において蓄積した試験物品の量のうち、組織グラムあたりのピコキュリーのパーセンテージが以下のチャートに提示される。
【０６５３】
【表９５】
0005903734.tif 000102
【０６５４】
グループＩＩ〜ＶＩＩＩは、４．１１２マイクロキュリーの試験物品を投薬された。以下のチャートは、各時間において各標的器官におけるマイクロキュリーの量を提示している。
【０６５５】
【表９６】
0005903734.tif 000103
【０６５６】
４．１１２（各用量中のマイクロキュリーの量）でこれらの数値を除算することによって、パーセンテージ結果は、各時間における各器官中にある試験物品の量を表す。以下のチャートはこれらのパーセンテージを提示する。
【０６５７】
【表９７】
0005903734.tif 000104
【０６５８】
標的器官に到達するマイクロキュリーでの試験物品の平均パーセントは、膵臓、肝臓、および脾臓について、それぞれ、０．０３％、０．０７％、および０．０１％である。
【０６５９】
体内の老廃物サンプルについては、最終結果はｍＬあたりピコキュリーで提示された。この量は、ＤＰＭを１ｍＬに転換すること、グループＩ結果を減算すること、次いで定数２，２２０，０００によって除算し、ｍＬあたりのマイクロキュリーを得ることによって得られた。この結果に１０００を掛けることによって、ｍＬあたり１０００ｍＬが得られた。糞便および尿あたりのｍＬあたり平均ピコキュリーが、以下のチャートおよびグラフに提示される。
【０６６０】
【表９８】
0005903734.tif 000105
【０６６１】
【表９９】
0005903734.tif 000106
【０６６２】
このデータは、投薬の８時間後に糞便中に実質的に蓄積した試験物品が、投与後１２時間において存在し続けていたが、投与後１８時間までに実質的に低下したことを反映している。研究の間のある時点で試験物品が尿に蓄積するという兆候はなかった。
【０６６３】
血液の結果は、老廃物試料結果が計算されたのと同じ方法で計算された。グループＩ−対照の血液結果における大量のＤＰＭのために、血液中ｍＬあたりピコキュリーの計算は負の数を生じた。これは、血中の予測されたＤＰＭ読みとりよりも多くを有する２匹の動物の結果であった。血液についての結果は以下のチャートおよびグラフに提示されている。
【０６６４】
【表１００】
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【０６６５】
【表１０１】
0005903734.tif 000108
【０６６６】
このデータは、試験物品が投薬の１８時間後に血液中に存在しなかったかもしれないことを例外として、試験物品が血液中に蓄積しなかったことを示す。とりわけ、試験物品が肝臓および膵臓において観察されたので、血液中で見い出された有意な量の試験物品が存在しなかったことは奇異であった。１つの説明は、皮膚を通して器官への直接的な試験物品の経皮吸収である；しかし、試験物品が皮膚への浸透後に血液に入らないという可能性は低い。別の可能性は、血液が外来物質をすぐに認識し、肝臓中に試験物質を蓄積したことである。グループＩＩの最後の投薬は１０：２３ａｍであり、グループＩＩが最初に屠殺されたのは１０：４５ａｍであった。２２分間は、血液がそれ自体から外来物質を取り除くための十分な時間であり得る。
【０６６７】
グループＩＸの動物が１回の代わりに反復して投薬されたので、グループＩＸデータは別々に投与され、試験物品を７日間吸収することが許容された。グループＩＸデータは以下のチャートに提示される。
【０６６８】
【表１０２】
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【０６６９】
グループＩＩ〜ＶＩＩＩの組織グラムあたりの平均ピコキュリーは、膵臓、肝臓、および脾臓について、それぞれ、１．２４、２．８３、および０．３８であった。器官についてのグループＩＸの結果は、膵臓については平均よりも低く、肝臓については平均に近接し、そして脾臓については平均よりも高かった。データは、７日目までに脾臓において試験物品の量が増加していることを示し、７日目において肝臓中で試験物品の量が、投薬後に１８時間および２４時間において肝臓中で見い出された同じ量に匹敵したことを示す。
【０６７０】
【表１０３】
0005903734.tif 000110
【０６７１】
グループＩＩ〜ＶＩＩＩについての糞便の平均ピコキュリーは２７．５５であり、尿については０．００６４であった。グループＩＸの糞便および尿の結果は異常ではなく、糞便における試験物品の最小徴候のみを示した。
【０６７２】
【表１０４】
0005903734.tif 000111
【０６７３】
他のグループと同様に、グループＩＸの血液の結果は、試験物品が血液中に存在しなかったことを示す。
【０６７４】
全体の結果は、グループ間での標的器官、糞便、尿、または血液の量の重量の違いの中で有意な違いがなかったことを示す。有意な量の試験物品が尿中で検出されなかった。グループＩ（対照）、ＩＩ（０時間）、またはＶＩ（１２時間）からは尿が収集されなかった。グループＶＩＩ（投薬の１８時間後）を別として、試験物品は、研究の間の任意の時点で血液中の有意な量では検出されなかった。組織グラムあたりのピコキュリーおよびｍＬあたりのピコキュリーの最高量がグループＶについて記録され（投薬８時間後）、その時点で大部分が糞便および膵臓に濃縮されたことが見い出された。グループＶにおいてもまた、組織グラムあたりのピコキュリーのレベルの増加が肝臓において見い出された。肝臓の中で、１２時間のわずかな浸漬後、レベルは１８時間および２４時間で一貫したままであり、比較し得るレベルがグループＩＸ（７日目動物）において見い出された。投薬８時間後のピークの後、膵臓量はほぼゼロレベルまで低下し、これにはグループＩＸ結果が含まれた。脾臓量は４時間で上昇し、次いで、１８時間までにほぼゼロレベルまで減少した。しかし、これらの動物は、グループＩＸについては増加し、７日目における脾臓における試験物品の蓄積を示す。この化合物は肝臓および膵臓において見い出されたので、試験物品または試験物質の代謝物の経皮吸収が存在した。輸送の予想経路は血流であるので、試験物質が血液中に有意な量で存在しなかったことは奇妙である。可能性のある説明は、肝臓および膵臓による血液からの試験物品の迅速なクリアランスであり得る。別の可能性は、試験物品が、投薬それ自体をなめること、または投薬部位上で摩擦された肢をなめることのいずれかによって、動物によって直接消化できたことである。
【０６７５】
実施例４２：コエンザイムＱ１０を用いて処置された細胞のウェスタン分析
過去５０年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性／外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、ＤＮＡ構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している（Ｗｏｏｓｔｅｒ，２０１０；Ｈａｉｍａｎ，２０１０）。１９２０年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたＯｔｔｏ  Ｗａｒｂｕｒｇおよび他の研究者は、２つの主要な観察（ａ）Ｗａｒｂｕｒｇ効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのＡＴＰの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに（ｂ）ミトコンドリアＡＴＰの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割の再調査であった。
【０６７６】
歴史的には、遺伝子の変異が遺伝子発現の変化の原因であると考えられてきたけれども、発癌を支持する遺伝子発現に影響を与える際に決定的な役割を果たす後成的プロセスを支持している文献が蓄積しつつある。これは、多くの遺伝子の突然変異率が低く、癌細胞において見い出される多数の（スペクトルの）変異を説明できないという観察によって証明されている。後成的変化は、ヒストンテールのメチル化および修飾によって調節され、両方の変化は、ヒストンアセチル化のために、コファクター、例えば、アセチルＣｏＡ要求の利用性を必要とするので、細胞のエネルギー（栄養）状態に固有に連関している（参照）。アセチルＣｏＡの生合成は、解糖とクレブス回路に依存し、細胞内エネルギー状態を遺伝子の発現および活性の調節に直接連関させる。
【０６７７】
正常細胞において、ミトコンドリアの酸化的リン酸化は、十分なＡＴＰを生成して、正常な生理学的活性および細胞生存を維持するためのエネルギー要求に合致している。ミトコンドリアのエネルギー産生の結果は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成であり、その異常な産生はミトコンドリアの損傷に導く（参照）。発癌の病因論に関わりがある現象である、ミトコンドリアによる長期ＲＯＳ生成は、遺伝子の変異の累積的蓄積をもたらすことが十分に確立されている。癌細胞はＲＯＳ生成を最小化するようにミトコンドリア呼吸を減少し、エネルギー産生を維持するために解糖に切り替わることが示唆されてきた。したがって、酸化的リン酸化から解糖へのエネルギー産生の進行的シフトは、生理学的機能を維持するためにエネルギー産生を維持するために細胞にとって必須であり、正常細胞の表現型から癌細胞の表現型への進行に付随し得る。ミトコンドリアの遺伝的構成における変化（変異）の蓄積と連携した細胞のエネルギー（生体エネルギー）プロフィールの進行性シフトは、細胞メタボロームを変化させる。解糖の推移に対するミトコンドリアのリン酸化の結果としての全細胞メタボロームプロフィールの変化は、異常な生体エネルギー誘導性メタボロームプロフィールに対応し、発癌を支持する根底にある原因である。非癌性正常ミトコンドリア酸化的リン酸化関連細胞生体エネルギーの状態に向かって細胞メタボロームシフトを誘発するために内因性分子を使用する標的化介入は、癌の処置における治療の評価項目を表す。
【０６７８】
エピ−メタボロームシフトを引き起こすＭＩＭとしてのコエンザイムＱ１０
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムＱ１０を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で鍵となる生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムＱ１０の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、ＨＤＦａ（正常ヒト成体線維芽細胞）、ＨＡＳＭＣ（正常ヒト大動脈平滑筋細胞）、ｎＦｉｂ（正常線維芽細胞）、およびＨｅＫａ（正常ヒトケラチン生成細胞）におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）、ＰａＣａ−２（膵臓癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＳＫ−ＭＥＬ（黒色腫）、およびＳＣＣ−２５（扁平上皮細胞癌）におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始／進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムＱ１０の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムＱ１０曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
【０６７９】
正常細胞において、解糖アウトプットの終点は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）、すなわち、クレブスサイクル（トリカルボン酸回路、ＴＣＡ、またはクエン酸回路としても知られる）に入るための解糖経路を経由したグルコースからピルビン酸の生成に連関しており、還元当量を生成して、ＡＴＰ産生のためにＯＸＰＨＯＳをサポートする。したがって、正常細胞において、解糖に関与する遺伝子産物の発現および機能的な方向付けは、ピルビン酸の十分な生成およびそれがクレブスサイクルに入ることに向けて準備される。癌細胞における解糖およびクレブスサイクルに関与する鍵となるタンパク質の発現および機能の異常調節は、ミトコンドリア機能の顕著な減少に伴う解糖の増強を生じる。ミトコンドリア呼吸鎖に選択的に影響を与える内因性分子であるコエンザイムＱ１０への癌細胞の曝露は、解糖およびクレブスサイクル経路のタンパク質の発現を変化させ（正常化し）、エネルギー産生（すなわち、ＡＴＰ生成）がミトコンドリアに回復されるように、生体エネルギーシフトを容易にする。
【０６８０】
実験手順
ウェスタンブロット実験１
実験のために使用された細胞はＨＤＦａ細胞およびＭＣＦ−７細胞であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４時間後に収穫された。全細胞ペレットが１ｍＬのＣ７緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた１５ｍＬチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号１４の設定で６回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は２５００ｇで短時間遠心分離し、試料は２ｍｌチューブに移された。５０ｍＬ試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のｐＨが確認された（ｐＨは９．０である）。
【０６８１】
試料のアルキル化および還元は、１０μｌの１Ｍアクリルアミド、２５μｌのトリブチルホスフィン（ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｈｅｎｅ）を加えること、および断続的に混合しながらの９０分間のインキュベーションによって、各試料について実施された。インキュベーション後、１０μｌの１Ｍ  ＤＴＴが加えられ、チューブは２０，０００ｇで２０℃にて１０分間遠心分離され、そして１０ｋカットオフを有するラベルしたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＵＦＣ８０１０２４）に上清が移された。試料は、２分間隔で、２５００ｇで１５分間遠心分離された。電気伝導度は、Ｃｈａｐｓ単独ならびに試料について、電気伝導度メーターを使用して測定された。試料の電気伝導度が高い場合、１ｍｌのｃｈａｐｓが緩衝液交換のために加えられ、体積が２５０μｌに下がるまで、２５００ｇで再度遠心分離された。電気伝導度が２００以下であったとき、試料は、上清の体積が１５０〜１００μｌの間になるまで、５分間隔で２５００ｇで遠心分離された。試料上清はエッペンドルフチューブに移され、ＢＳＡを標準として使用してＢｒａｄｆｏｒｄアッセイが実施された。
【０６８２】
試料は上記のような標準のプロトコールに従って処置され、各試料中のタンパク質の量はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定された。１０μｇタンパク質に等価な試料体積が、以下に示されるように、Ｌａｍｅｌｌｉローディング染料（ＬＤＳ）およびＭｉｌｌｉＱ水を用いて調製され、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＮＰ０３２３Ｂｏｘ）上で泳動された。
【０６８３】
ゲルは、１×ＭＯＰＳ緩衝液を使用し、ＮＯＶＥＸ  Ｘｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋシステムを使用して、２００Ｖで５０分間泳動された。次いで、ゲルは、ＮＯＶＥＸ  Ｘｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ湿式転写プロトコールを使用して、３０Ｖで１時間転写された。ブロットは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（ＬＣ６０６５）で染色された。
【０６８４】
ＨＤＦａおよびＭＣＦ−７試料におけるＩＤＨ１およびＡＴＰクエン酸リアーゼレベル
転写後、各ブロットは、２枚のＷｈａｔｍａｎ濾紙の間に配置され、１５〜２０分間乾燥された。乾燥後、ブロットは、日付、試料の型、およびブロット１かブロット２のいずれかをＨＢ鉛筆でラベルされた。分子量マーカーは、鉛筆で輪郭が描かれ、１本線は青色であり、２本線は着色マーカーであった。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で１時間室温でブロッキングされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄された。ブロット１は５％ＢＳＡを有するＴＢＳＴ中のＩＤＨ１に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号３９９７）（１：１０００希釈）でプローブされ、ブロット２は、振盪しながら４℃で一晩のインキュベーションによって、１：１０００希釈の５％ＢＳＡ中のＡＴＰクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号４３３２）を用いた。一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６８５】
ＨＤＦａおよびＭＣＦ−７試料におけるアクチンレベル
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして１：５０００希釈の５％ＢＳＡ中のアクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ５３１６、クローンＡＣ−７４）で、振盪しながら、室温で１時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との１時間のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６８６】
ウェスタンブロット実験２
この実験において使用された細胞は、ＳＫＭＥＬ２８、ＳＣＣ−２５、ｎＦｉｂ、およびＨｅｋａであり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の３、６、および／または２４時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
【０６８７】
４つの細胞系統についてのＩＤＨ１のレベル
転写後、ブロットは１５〜２０分間乾燥され、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄された。次いで、これは、５％ＢＳＡを有するＴＢＳＴ中のＩＤＨ１に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号３９９７）（１：１０００希釈）を用いて、振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。ＩＤＨ１に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）を用いて、室温で１時間プローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６８８】
４つの異なる細胞系統におけるＡＴＰクエン酸リアーゼレベル
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄された。次いで、これは、１：１０００希釈の５％ＢＳＡ中のＡＴＰクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号４３３２）で、振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。ＡＴＰクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた
【０６８９】
異なる４つの細胞系統におけるアクチンレベル
ＡＴＰクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：５０００希釈の５％ＢＳＡ中のアクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ５３１６、クローンＡＣ−７４）で、振盪しながら、室温で１時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との１時間のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６９０】
ウェスタンブロット実験３
この実験において使用された細胞は、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＡＳＭＣ細胞、およびＰＡＣＡ２細胞であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の４８時間後に収穫された。この実験において（ウェスタンブロット実験３）、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて（すなわち、ウェスタンブロット実験４〜９）、細胞は、５ｍＭグルコース（「５Ｇ」）または２２ｍＭグルコース（「２２Ｇ」）のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
【０６９１】
ＨＡＳＭＣ対ＰＡＣＡ２およびＨｅｐＧ２におけるＩＤＨ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、およびアクチンレベル
ＩＤＨ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、ＩＤＨ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
【０６９２】
ウェスタンブロット実験４
この実験において使用された細胞はＨｅｐＧ２であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
【０６９３】
ＨｅｐＧ２細胞における乳酸デヒドロゲナーゼレベル
転写後、各ブロットは１５〜２０分間乾燥され、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。次いで、このブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で、室温で１時間ブロッキングされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、５％ＢＳＡ中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体（ａｂｃａｍ  ａｂ２１０１；ポリクローナル）（１：１０００希釈）を用いて、振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、二次抗体（ウサギ抗ヤギ；１：１０，０００希釈）を用いて、室温で１時間プローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６９４】
ＨｅｐＧ２細胞における筋肉型ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ２）レベル
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：５００希釈の５％ＢＳＡ中のピルビン酸キナーゼＭ２に対するウサギポリクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳカタログ番号Ｈ００００５３１５−Ｄ０１Ｐ）で、振盪しながら、室温で１時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼＭ２に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６９５】
ＨｅｐＧ２細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼβレベル
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびＥＣＦ試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：５０００希釈の５％ＢＳＡ中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体（ＡＢＮＯＶＡカタログ番号Ｈ００００５１６２−Ｍ０３）で、振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０６９６】
ＨｅｐＧ２細胞におけるアクチンレベル
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
【０６９７】
ウェスタンブロット実験５
この実験において使用された細胞はＭＩＡＰＡＣＡ２（ＰＡＣＡ２）であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。ＰＡＣＡ２試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０６９８】
ＰａＣａ２細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）レベル
ＬＤＨおよびＰＤＨのレベルは、本質的に上記のように、ＬＤＨおよびＰＤＨに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
【０６９９】
ＰａＣａ２細胞におけるカスパーゼ３レベル
ブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、５％ＢＳＡ中のカスパーゼ３に対する抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ番号ｓｃ７２７２、１：２００希釈）で、振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。カスパーゼ３に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７００】
ウェスタンブロット実験６
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はＰＣ−３、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７、ＨＤＦａ、およびＰＡＣＡ２であり、これらは、２コエンザイムＱ１０  ＩＶ製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０７０１】
異なる細胞型におけるカスパーゼ（Ｃａｐａｓｅ）３およびアクチンレベル
カスパーゼ３およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ３およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
【０７０２】
ウェスタンブロット実験７
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋（ＨＡＳＭＣ）細胞であり、これは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。本質的に上記のように、ＨＡＳＭＣ試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０７０３】
アクチンのための実験プロトコール：
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
【０７０４】
Ｈｉｆ  １α、カスパーゼ３、およびＰＤＨＢのための実験プロトコール：
アクチンブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：２００希釈の５％ＢＳＡ中のＨｉｆ  １α、カスパーゼ３、またはＰＤＨＢに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。Ｈｉｆ  １αに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１８５；抗ウサギ）は、５％ＢＳＡ中で１：５００希釈であった。カスパーゼ３に対する一次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｓｃ７２７２；抗ウサギ）は、５％ＢＳＡ中で１：２００希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ（ＰＤＨＢ）に対する一次抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｈ００００５１６２−Ｍ０３；抗マウス）は、５％ＢＳＡ中で１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、室温にて１時間、二次抗体（ＰＤＨＢ抗マウス；Ｈｉｆ  １ａ、およびカスパーゼ３抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７０５】
ＰＫＭ２、ＳＤＨＢ、およびＳＤＨＣのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ中のＰＫＭ２、ＳＤＨＢ、またはＳＤＨＣに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、４℃で一晩プローブされた。ＳＤＨＣに対する一次抗体（ＡＢＮＯＶＡ  Ｈ００００６３９１−Ｍ０２；抗マウス）は１：５００希釈であった。ＳＤＨＢに対する一次抗体は、Ａｂｃａｍ  ａｂ４７１４−２００から；抗マウス；１：１０００希釈であっった。ピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２）に対する一次抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｈ００００５３１５−Ｄ０ＩＰから；抗ウサギ；１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（ＳＤＨＢ＆Ｃ抗マウス；およびＰＫＭ２抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７０６】
ＬＤＨおよびＢｉｋのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、５％ＢＳＡ中のＬＤＨまたはＢｉｋに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、４℃で一晩プローブされた。ＬＤＨに対する一次抗体はＡｂｃａｍ  ａｂ２１０１から；抗ヤギ；１：１０００希釈であった。Ｂｉｋに対する一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号９９４２から；抗ウサギ；１：１０００希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（ＬＤＨ抗ヤギ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＢｉｋ抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７０７】
ウェスタンブロット実験９
使用された細胞はＨｅｐＧ２細胞であり、これは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。本質的に上記のように、ＨｅｐＧ２試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０７０８】
アクチンのための実験プロトコール：
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
【０７０９】
カスパーゼ３およびＭＭＰ−６のための実験プロトコール：
アクチンブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、５％ＢＳＡ中のカスパーゼ３またはＭＭＰ−６に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、４℃で一晩プローブされた。カスパーゼ３に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ４４９７６−１００；抗ウサギ）は５％ＢＳＡ中１：５００希釈であった。ＭＭＰ−６に対する一次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｓｃＭＭ００２９−ＺＢ５；抗マウス）は５％ＢＳＡ中１：１００希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、室温にて１時間、二次抗体（ＭＭＰ−６抗マウス；カスパーゼ３抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７１０】
ＬＤＨのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、５％ＢＳＡ中または５％ミルク中のＬＤＨに対する一次抗体とのインキュベーションによって、４℃で一晩プローブされた。ＬＤＨ０８０３０９ｂ１に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１０１；抗ヤギ）は５％ＢＳＡ中１：１０００希釈であった。ＬＤＨ０８０３０９ｂ２に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１０１；抗ヤギ）は５％ミルク中１：１０００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  抗ヤギ；１：１０，０００希釈；３０５−０５５−０４５）で１時間プローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７１１】
トランスアルドラーゼおよびＨｉｆ１ａのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによって、５％ＢＳＡ中のトランスアルドラーゼまたはＨｉｆ１ａに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ６７４６７；抗マウス）は１：５００希釈であった。Ｈｉｆ１ａに対する抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１８５；抗ウサギ）は１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウスまたは抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７１２】
ＩＧＦＢＰ３およびＴＰ５３のための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによって、５％ＢＳＡ中のＩＧＦＢＰ３またはＴＰ５３に対する一次抗体で一晩プローブされた。ＩＧＦＢＰ３に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ７６００１；抗ウサギ）は１：１００希釈であった。ＴＰ５３に対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＡＶ０２０５５；抗ウサギ）は１：１００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７１３】
トランスアルドラーゼおよびＰＤＨＢのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによって、５％ＢＳＡ中のトランスアルドラーゼまたはＰＤＨＢに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｓｃ５１４４０；抗ヤギ）は１：２００希釈であった。ＰＤＨＢに対する一次抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｈ００００５１６２−Ｍ０３；抗マウス）は１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ヤギまたは抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０７１４】
結果
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−１−（ＩＤＨ−１）
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−１−（ＩＤＨ−１）は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するＴＣＡ回路の一部である酵素の１つである。しかし、ＩＤＨ１は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、２段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。ＩＤＨ１は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するＮＡＤＰ＋依存性型である。ＩＤＨ１はＳｅｒ１１３リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。ＩＤＨ１は、部分的にＨＩＦ−１の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである（Ｂａｙｌｅｙ２０１０；Ｒｅｉｔｍａｎ，２０１０）。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるＩＤＨ１の不活性化変異に関わっている（Ｂｌｅｅｋｅｒ，２００９；Ｂｌｅｅｋｅｒ，２０１０）。
【０７１５】
コエンザイムＱ１０での処置は、ＭＣＦ−７、ＳＫＭＥＬ２８、ＨｅｐＧ２、およびＰａＣａ−２細胞を含む癌細胞株におけるＩＤＨ１の発現を増加した。ＳＣＣ２５細胞系統においては中程度の発現の増加が存在した。ヒト由来初代線維芽細胞ＨＤＦａとは対照的に、ｎＦＩＢおよびヒト大動脈平滑筋細胞ＨＡＳＭＣは、コエンザイムＱ１０に応答して、ＩＤＨ１の発現パターンの有意な変化を実証しなかった。α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）は、ＴＣＡ回路における鍵となる中間体であり、イソクエン酸から生化学的に合成され、最終的にはスクシニルＣｏＡに転換され、薬物となり得るＭＩＭおよびエピシフターである。α−ＫＧはＴＣＡ回路の中間体を補充するために細胞によって使用でき、酸化的リン酸化を増加するための還元当量の生成を生じるので、α−ＫＧの生成はＴＣＡ回路における決定的な岐路として働く。したがって、コエンザイムＱ１０媒介性のＩＤＨ１発現の増加は、癌細胞における酸化的リン酸化を増強するためにミトコンドリアのＴＣＡ回路によって使用できる中間体の形成を生じる。結果は以下の表に要約される。
【０７１６】
【表１０５】
0005903734.tif 000112
【０７１７】
【表１０６】
0005903734.tif 000113
【０７１８】
【表１０７】
0005903734.tif 000114
【０７１９】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）は、細胞質ゾル中でアセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー（〜１２６ｋｄ）酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである（Ｔｏｗｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。栄養およびホルモンがこの鍵となる酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。ＡｋｔおよびＰＫＡによるＡＣＬのＳｅｒ４５４リン酸化が報告されている（Ｂｅｒｗｉｃｋ．，ＤＣ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐｉｅｒｃｅ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。
【０７２０】
データは、正常細胞および癌細胞におけるＡＴＰクエン酸リアーゼに対するコエンザイムＱ１０の効果を説明している。癌細胞において、ＡＣＬ酵素の発現の用量依存的な減少が存在することが一貫して観察されている。対照的に、正常細胞においては、ＡＣＬの発現の増加に向かう傾向が存在するようである。細胞質ゾルＡＣＬは、増殖因子刺激の間および分化の間に、細胞におけるヒストンアセチル化のために必須であることが実証されてきた。新生物プロセスにおいて重要なプロセスであるヒストンアセチル化のために必須であるアセチルＣｏＡを生成するために、ＡＣＬが細胞質ゾルのグルコース由来のクエン酸を利用するという事実は、癌細胞機能に影響を与える際のコエンザイムＱ１０誘導ＡＣＬ発現の役割を実証する。細胞質ゾルＡＣＬによってクエン酸から生成されたアセチル−ＣｏＡは、細胞分裂の間の新たな脂質およびコレステロールの生合成のための供給源として働く。したがって、コエンザイムＱ１０で誘導されるＡＣＬ発現の変化は、癌細胞に対して正常細胞における脂質およびコレステロールの合成のためのアセチルＣｏＡの利用可能性を変化させる。結果は以下の表に要約される。
【０７２１】
【表１０８】
0005903734.tif 000115
【０７２２】
【表１０９】
0005903734.tif 000116
【０７２３】
【表１１０】
0005903734.tif 000117
【０７２４】
【表１１１】
0005903734.tif 000118
【０７２５】
ピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２）
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）へのリン酸の転移の原因であり、ＡＴＰおよびピルビン酸を生成する。ＰＫＭ２は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、Ｍ２アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。ＰＫＭ２は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているＰＫＭ２アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。ＰＫＭ２を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み（代謝表現型のシフトを示す）、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。従って、癌細胞におけるＰＫＭ２の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の処置において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるＰＫＭ２の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムＱ１０での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、ＰＫＭ２のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた（図８１〜８５）。試験された癌細胞においてＰＫＭ２発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表に要約される。
【０７２６】
【表１１２】
0005903734.tif 000119
【０７２７】
【表１１３】
0005903734.tif 000120
【０７２８】
【表１１４】
0005903734.tif 000121
【０７２９】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
ＬＤＨは、ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびＡＴＰ生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート（乳酸）に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ＡＴＰおよび還元当量および還元ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳを生成するために解糖流入を維持するためにＬＤＨの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、ＴＣＡ回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトする。コエンザイムＱ１０を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアＯＸＰＨＯＳへのＡＴＰの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムＱ１０の役割を支持する。結果は以下の表に要約される。
【０７３０】
【表１１５】
0005903734.tif 000122
【０７３１】
【表１１６】
0005903734.tif 000123
【０７３２】
【表１１７】
0005903734.tif 000124
【０７３３】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ−Ｂ（ＰＤＨ−Ｅ１）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ（ＰＤＨ−Ｅ１）は、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の一部である第１の酵素成分である。ＰＤＨ−Ｅ１は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるＴＣＡサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルＣｏＡへの転換のために必須であるＰＤＣ複合体における最初の２つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるＰＤＨ−Ｅ１の発現の増加に伴って、同時に起こるＰＫＭ２およびＬＤＨの発現の減少は、ＡＴＰの生成のためにミトコンドリアＯＸＰＨＯＳを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるＰＤＨ−Ｅ１の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムＱ１０を用いる処置は、癌細胞におけるＰＤＨ−Ｅ１タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表に要約される。
【０７３４】
【表１１８】
0005903734.tif 000125
【０７３５】
【表１１９】
0005903734.tif 000126
【０７３６】
【表１２０】
0005903734.tif 000127
【０７３７】
カスパーゼ３
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−２、−９、および−８／１０のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−８は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３）を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−３は、他のカスパーゼ（６、７、および９）ならびに細胞中の関連する標的（例えば、ＰＡＲＰおよびＤＦＦ）を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−３タンパク質のレベルは、コエンザイムＱ１０に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、Ｐ３８ＭＡＰＫは、カスパーゼ−３をリン酸化し、その活性を抑制する（Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ａ）またはプロテインキナーゼＣデルタ（ＰＫＣデルタ）の活性化（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）は、カスパーゼ−３活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、ｐ３８ＭＡＰＫの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−３活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ３活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
【０７３８】
カスパーゼ−３はシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼであり、これは、細胞アポトーシスの実行フェーズで中心的な役割を果たす。癌細胞におけるカスパーゼ３のレベルは、コエンザイムＱ１０処置に伴って増加される。対照的に、正常細胞におけるカスパーゼ−３の発現は、正常細胞において中程度に減少された。結果は以下の表に要約される。
【０７３９】
【表１２１】
0005903734.tif 000128
【０７４０】
【表１２２】
0005903734.tif 000129
【０７４１】
【表１２３】
0005903734.tif 000130
【０７４２】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）
コハク酸−コエンザイムＱ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、ＴＣＡと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。ＴＣＡにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する（Ｂａｙｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００２）。ＳＤＨのＢ、Ｃ、およびＤサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された（Ｂａｙｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００）。
【０７４３】
ウェスタンブロッティング分析は、コエンザイムＱ１０で処置された癌細胞のミトコンドリア調製物においてＳＤＨサブユニットＢの発現を特徴付けるために使用された。結果は、コエンザイムＱ１０処置が、細胞のミトコンドリアにおけるＳＤＨタンパク質レベルの増加に関連することを示唆する。これらの結果は、コエンザイムＱ１０の作用のメカニズムの１つがＴＣＡ回路およびミトコンドリアに向かう細胞の代謝を、ＳＤＨＢなどのミトコンドリア酵素のレベルを増加することによってシフトされることを示唆する。結果は以下の表に要約される。
【０７４４】
【表１２４】
0005903734.tif 000131
【０７４５】
低酸素誘導因子−１
低酸素誘導因子（Ｈｉｆ）は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Ｈｉｆ１αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する２つの酵素ＰＤＨおよびＬＤＨの相対的な活性によって制御されると考えられる。Ｈｉｆは、ＰＤＫを刺激することによって、ＬＤＨレベルを誘導し、ＰＤＨ活性を阻害することによって、この決定的な分岐（ｂｉｆｕｒｇａｔｉｏｎ）点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Ｈｉｆは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられる。
【０７４６】
コエンザイムＱ１０での処置は、癌細胞のミトコンドリア調製物において、後でのＨｉｆ１αタンパク質レベルを減少させた。正常細胞の全細胞溶解物において、Ｈｉｆ１ａの下側のバンドが観察され、同様に減少を示した。結果は以下の表に要約される。
【０７４７】
【表１２５】
0005903734.tif 000132
【０７４８】
【表１２６】
0005903734.tif 000133
【０７４９】
実施例４３  ＣｏＱ１０で処置された正常細胞および癌細胞における酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化（ＥＣＡＲ）の分析
この実施例は、ストレッサー（例えば、高血糖、低酸素、乳酸）の非存在下および／または存在下で、本発明の代表的なＭＩＭ／エピシフター−ＣｏＱ１０−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖／乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化（ＥＣＡＲおよびＯＣＲ値によって測定されるような）へのシフトと関連することを実証する。
【０７５０】
出願人は、癌細胞中のＣｏＱ１０での処置が、解糖および乳酸生合成の同時に起こる減少を伴う、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を増強する特定のタンパク質の発現の変化と関連することを先のセクションで実証した。この実施例は、インビトロ実験モデルにおける溶存酸素および細胞外ｐＨレベルを測定する機器であるＳｅａＨｏｒｓｅ  ＸＦ分析装置（ＳｅａＨｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して細胞系統において酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定することによって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の直接測定を得ることができることを示す。
【０７５１】
細胞外微小環境のｐＨは、腫瘍中では、細胞内（細胞質）および周囲の正常組織のｐＨと比較して、比較的酸性である。この腫瘍の特徴は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に侵入する能力、続いてシグナル伝達カスケードを開始する腫瘍転移の代表的な特質を含む複数の目的に役立ち、このシグナル伝達カスケードは、以下をさらに調節する：
・腫瘍の血管新生
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫学的監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Ｂｃｌ−２、ＩＡＰ、ＥｎｄｏＧ、ＡＩＦなどの鍵となるアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
【０７５２】
任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、腫瘍における外部微小環境の酸性ｐＨは、解糖表現型の変化からの乳酸産生の増加に起因する、腫瘍細胞から押し出された水素イオン濃度の増加の結果である。
【０７５３】
この実験において、正常細胞系統におけるＯＣＲおよび細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、ベースラインの値を決定するために、ＣｏＱ１０の存在下および非存在下で得られた。そのネイティブな栄養環境において、正常細胞系統における基礎ＯＣＲ速度は異なっており、通常は、身体中の細胞の生理学的役割の関数であることが観察された。
【０７５４】
例えば、１つのセットの実験は、ヒト成体皮膚線維芽細胞系統である、非癌性細胞系統ＨＤＦａを使用して実施された。線維芽細胞は、最初に合成され、組織のために構造フレームワーク（ストロマ）を形成する、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分およびコラーゲンを分泌する。加えて、線維芽細胞は、創傷治癒および局所的免疫調節などの多数の機能の組織の使節（ａｍｂａｓｓａｄｏｒｓ）として働くことが知られている。正常な生理学的条件下では、正常な線維芽細胞におけるエネルギー要求は、解糖と酸化的リン酸化の組み合わせを使用することに合致する−解糖はＥＣＭの合成のための必要な栄養を提供する。
【０７５５】
ＨＤＦａと対照的に、ＨＡＳＭＣ（ヒト大動脈平滑筋細胞）は、動脈、静脈、リンパ管、胃腸管、呼吸管、膀胱、および興奮−収縮結合の調節を受ける能力を有する他の組織において見い出される。ＨＡＳＭＣ細胞などの平滑筋の収縮を受ける能力はＡＴＰによって提供されるエネルギーを要求する。これらの組織は、ＡＴＰがミトコンドリアから供給され得る低いエネルギーモードから、迅速なＡＴＰの生成のために解糖に切り換えることによってエネルギーが提供される高エネルギーモード（運動／ストレスの間）に移行する。したがって、正常平滑筋細胞は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳと解糖の組み合わせを使用でき、正常な生理学的環境下でのそれらのエネルギー要求を満たす。
【０７５６】
それらのそれぞれの生理学的役割（すなわち、ＨＤＦａおよびＨＡＳＭＣ）の違いは、ＳｅａＨｏｒｓｅ  ＸＦ分析装置を使用してこれらの細胞系統において測定される休止状態のＯＣＲ値で観察された。以下の図３７および３８は、生理学的に正常なグルコース（約４．６ｍＭ）状態および高グルコース（高血糖）状態において増殖されたＨＤＦａおよびＨＡＳＭＣ細胞におけるＯＣＲを説明している。
【０７５７】
正常な酸素利用能下でのいかなる処置も存在しないＨＤＦａについてのベースラインＯＣＲ値は、５．５ｍＭグルコースの存在下で約４０ピコモル／分（図３７；上記）である。この値は、細胞が２２ｍＭグルコースに維持されたときにわずかに上昇された。対照的に、ＨＡＳＭＣ細胞において、５．５ｍＭグルコースにおけるＯＣＲ値は約９０ピコモル／分であり、ＯＣＲ値は、２２ｍＭグルコースの間に約４０ピコモル／分まで下降した。したがって、高血糖条件下では、ＨＤＦａとＨＡＳＭＣの間の示差的な応答が存在し、それらのそれぞれの生理学的な構成および機能における固有の違いをさらに実証する。
【０７５８】
細胞におけるＣｏＱ１０での処置は、正常（５ｍＭ）グルコース条件において観察された状態に代表的であるＯＣＲの変化と関連する。生理学的応答の複雑性は、低酸素緊張の存在下で混合される。したがって、ＣｏＱ１０曝露は、特定の細胞に対して固有である生理学的状態に向かう正常細胞中のＯＣＲ速度の変化と関連する。
【０７５９】
以下の表９７は、５．５ｍＭおよび２２ｍＭグルコースにおける正常酸素および低酸素条件下でのＣｏＱ１０の存在下および非存在下でのＨＤＦａ細胞中のＥＣＡＲ値（ｍｐＨ／分）を説明する。正常細胞において、ＣｏＱ１０での処置は、それがたとえこれらの細胞においてＯＣＲに影響を与えたとしても、ＥＣＡＲ値に対して最小限の影響を有したことが観察できる。高グルコース低酸素条件において、ＣｏＱ１０での処置は、未処置の正常酸素条件において観察された値までの、上昇したＥＣＡＲの低下に関連した。
【０７６０】
【表１２７】
0005903734.tif 000134
【０７６１】
表９８において、ＨＡＳＭＣにおける測定されたベースラインＥＣＡＲ値（ｍｐＨ／分）はＨＤＦａのそれと比較して高かった。低酸素状態の誘導は、解糖の増加に続いて起こる細胞内低酸素誘導性アシドーシスと関連する可能性が最も高いＥＣＡＲの増加を引き起こした。
【０７６２】
【表１２８】
0005903734.tif 000135
【０７６３】
ＣｏＱ１０での処置は、正常酸素での正常グルコース条件において観察される値に向けた低酸素条件における高血糖ＨＡＳＭＣ細胞におけるＥＣＡＲ速度の下向きの傾向と関連することが観察された。これらのデータは、特定の細胞の型の生理学的役割に固有である生理学的変数、異常な状態において観察される変化（例えば、高血糖）の存在が、ＣｏＱ１０で処置されたときに正常に向けてシフトされることを実証する。
【０７６４】
対照的に、癌細胞（例えば、ＭＣＦ−７、ＰａＣａ−２）は、培養中の維持のための解糖表現型に起因して、正常細胞と比較してより高いレベルのグルコースでの培養に固有に準備されている。ＣｏＱ１０での処置は、ＯＣＲ値の一貫した減少を引き起こした（図３９および図４０）。
【０７６５】
ＭＣＦ−７およびＰａＣａ−２細胞におけるＯＣＲ値に対するＣｏＱ１０の効果は、正常ＨＤＦａおよびＨＡＳＭＣ細胞のそれと類似しており、この変動性応答は、癌細胞系統の個々の代謝プロフィールに基づいて治療応答を示唆するものであった。
【０７６６】
【表１２９】
0005903734.tif 000136
【０７６７】
表９９は、ＰａＣａ−２細胞におけるＥＣＡＲ値を記載する。正常細胞と比較して、癌細胞は、ＡＴＰ生成のために高グルコースを使用するように表現型的に準備されており（解糖の増強）、２１ｍｐＨ／分でより高いＥＣＡＲを生じる（表９９、未処置正常酸素についてのＥＣＡＲ１７ｍＭ）。ＣｏＱ１０での処置は、解糖で生成された乳酸の減少に付随する可能性が最も高い、これらの条件下でのＥＣＡＲ速度の有意な減少を生じる。これらの細胞におけるＯＣＲの関連する減少は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳの効率の増加と最も関連したようであった。
【０７６８】
ＯＣＲおよびＥＣＡＲの同様の比較（データ示さず）は、ＨＡＥＣ（正常ヒト大動脈内皮細胞）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）、および高度に転移性のＰＣ−３（前立腺癌）細胞系統を含む多数の他の正常細胞および癌細胞において決定された。試験された細胞系統のすべてにおいて、ストレッサー（例えば、高血糖、低酸素、乳酸）の非存在下および／または存在下でのＣｏＱ１０への曝露は、正常の生理学的条件下での正常細胞において観察される値に代表的なＯＣＲおよびＥＣＡＲの値のシフトと関連した。したがって、細胞死を含む、癌の処置におけるＣｏＱの全体的な効果は、解糖からミトコンドリアＯＸＰＨＯＳへの細胞の生体エネルギーのシフトと協調した、プロテオミクス的、ゲノム的、代謝学な結果に対するその集合的な影響の下流の効果である。
【０７６９】
実施例４４  ＣｏＱ１０の生合成のためのビルディングブロック分子
この実施例は、ＣｏＱ１０生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物（「ビルディングブロック成分」）が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Ｂｃｌ−２の下方調節、および／またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−３の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、ＣｏＱ１０投与と実質的に同じ結果を達成するために、ＣｏＱ１０前駆体がＣｏＱ１０の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
【０７７０】
実験において使用された特定の例示的な実験条件は以下に列挙される。
【０７７１】
Ｓｋｍｅｌ−２８黒色腫細胞は、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１×最終濃度の抗生物質を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養された。細胞は、８５％コンフルエンシーまで増殖され、３、６、１２、および２４時間の間、ビルディングブロック成分で処置された。次いで、細胞はペレット化され、ウェスタンブロット分析が実施された。
【０７７２】
試験ビルディングブロック成分は、Ｌ−フェニルアラニン、ＤＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、ＤＬ−チロシン、Ｄ−チロシン、４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸、フェニル酢酸、３−メトキシ４−ヒドロキシマンデル酸（バニリルマンデル酸またはＶＭＡ）、バニリン酸、４−ヒドロキシ−ベンゾエート、ピリドキシン、パンテノール、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチル−ＣｏＡ、ファルネシル、および２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノンを含んだ。
【０７７３】
ウェスタンブロット分析において、細胞は冷ＰＢＳ中でペレット化され、溶解され、そしてタンパク質レベルはＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量された。全細胞溶解物は、４％ローディング１２％泳動Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルにロードされた。次いで、タンパク質はニトロセルロースペーパーに転写され、次いで、５％ミルクＴｒｉｓ緩衝液で１時間ブロックされた。次いで、タンパク質は、一次抗体（Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３）に一晩曝露された。次いで、ニトロセルロースペーパーは、Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔに５分間曝露され、タンパク質発現が記録された。曝露後、アクチンが同じ方法を使用して定量された。ＩｍａｇｅＪを使用して、タンパク質発現のレベルが定量された。ｔ検定が使用されて統計学的有意さについて分析した。
【０７７４】
実験の例証的な結果は以下に要約される。
【０７７５】
ビルディングブロック成分Ｌ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：キノン環構造についての合成経路に着手する前に、Ｌ−フェニルアラニンがチロシンに転換される。ウェスタンブロット分析は、黒色腫細胞におけるアポトーシスタンパク質の発現の任意の変化を定量するように実施された。試験された濃度は５μＭ、２５μＭ、および１００μＭであった。初期の研究は、０．４Ｍの濃度のフェニルアラニンを含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＬ−フェニルアラニンを加えた。５μＭ、２５μＭ、および１００μＭについては、培地中のＬ−フェニルアラニンの最終濃度は、それぞれ、０．４０５Ｍ、０．４２５Ｍ、および０．５００Ｍであった。これらの最終濃度は、３、６、１２、および２４時間のインキュベーション時間の間、Ｓｋｍｅｌ−２８細胞に対して試験された。細胞は、８０％コンフルエンシーまで増殖され、その後、処置培地を加え、上記のようにウェスタンブロット分析手順を使用して収穫された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、３時間および１２時間のインキュベーション後に、１００μＭ  Ｌ−フェニルアラニンについて観察された。５μＭ  Ｌ−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、インキュベーションの６時間後に観察された。２５μＭ  Ｌ−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少、および統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加が１２時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、アポトーシス能力の変化を示し、統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加は細胞がアポトーシスを受けていることを確認する。たとえ試料サイズおよび標準偏差に起因して、この実験においてこれらの時点は統計学的に有意ではないとしても、対照と比較してＢｃｌ−２の減少の一定の傾向が存在した。
【０７７６】
ビルディングブロック成分Ｄ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：生物活性Ｌ−フェニルアラニンの化学合成型であるＤ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンに対する比較のために試験された。３つすべての濃度について（５μＭ、２５μＭ、および１００μＭのＤ−フェニルアラニン）、インキュベーションの６時間後にＢｃｌ−２発現の有意な減少が存在した。加えて、５μＭおよび２５μＭについては、インキュベーションの３時間後に有意な減少が存在した。５μＭおよび１００μＭ濃度については、カスパーゼ−３発現の有意な増加が、６時間のインキュベーション後に観察された。
【０７７７】
ビルディングブロック成分ＤＬ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：ＤＬ−フェニルアラニンもまた、Ｌ−フェニルアラニンとの比較のために試験された。再度、５μＭ、２５μＭ、および１００μＭの濃度がＳｋｍｅｌ−２８細胞に対して試験された。インキュベーション時間は、３、６、１２、および２４時間であった。統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加が３時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少が２４時間のインキュベーション後に観察された。Ｂｃｌ−２の減少およびカスパーゼ−３の増加の傾向が、すべての他の濃度およびインキュベーション時点であるが、これらは、この実験においては統計学的に有意ではなかった。
【０７７８】
ビルディングブロック成分Ｌ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンはＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のためのビルディングブロック成分である。Ｌ−チロシンの初期の試験は、ウェスタンブロット分析のために十分に高いタンパク質濃度を生じなかった。この研究から２５μＭより下の濃度がウェスタンブロット分析のために試験された。使用されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、０．３９８４６７ＭのＬ−チロシン二ナトリウム塩を含んだ。初期濃度は５００ｎＭ、５μＭ、および１５μＭ増加された。統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加は、１２時間のインキュベーション後に５００ｎＭ濃度について観察された。統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加もまた、５Ａについて観察され、統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、２４時間のインキュベーション後に５μＭ濃度について観察された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、２４時間のインキュベーション後に５００μＭおよび５μＭ濃度について観察された。
【０７７９】
ビルディングブロック成分Ｄ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンの合成型であるＤ−チロシンは、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｎａｌ）細胞に対するＬ−チロシンのアポトーシス性効果に対しての比較のために試験された。Ｌ−チロシンを用いる初期の研究に基づいて、ウェスタンブロット分析のために２５μＭより下の濃度が選ばれた。試験された濃度は１μＭ、５μＭ、および１５μＭであった。Ｄ−チロシンは、１２および２４時間の期間の間、５μＭおよび１５μＭ濃度についてＢｃｌ−２発現の減少を示した。カスパーゼ−３は、３、１２、および２４時間の期間で、５μＭ濃度について有意に増加された。１２および２４時間の期間で、１μＭについてカスパーゼ−３発現の増加もまた存在した。加えて、１２時間の期間で、５μＭについてカスパーゼ−３発現の増加が存在する。
【０７８０】
ビルディングブロック成分ＤＬ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンの合成型であるＤＬ−チロシンもまた、細胞に対するＬ−チロシンのアポトーシス効果に対する比較のために試験された。１２時間のインキュベーション後に１μＭおよび１５μＭ濃度において、ならびに２４時間のインキュベーション後に５μＭについて見られたＢｃｌ−２発現の統計学的な減少が存在する。カスパーゼ−３発現の増加もまた、１２時間のインキュベーション後に５μＭおよび１５μＭについて観察された。
【０７８１】
ビルディングブロック成分４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸のウェスタンブロット分析：４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸は、アミノ酸であるチロシンおよびフェニルアラニンから誘導され、環構造の合成において役割を果たす可能性がある。１μＭ、５μＭ、および１５μＭの濃度がＢｃｌ−２およびカスパーゼ−３発現のために試験された。５μＭおよび１５μＭ濃度について、２４時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２発現の有意な減少が存在し、１２時間のインキュベーション後にカスパーゼ−３発現の有意な増加が存在した。
【０７８２】
ビルディングブロック成分フェニル酢酸のウェスタンブロット分析：フェニル酢酸は、４−ヒドロキシ−ベンゾエートに転換される能力を有し、これは、環構造への側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、１μＭ、５μＭ、および１５μＭであった。フェニル酢酸については、１２時間および２４時間のインキュベーション後に５μＭおよび１５μＭの濃度についてＢｃｌ−２発現の減少が存在した。カスパーゼ−３発現の増加は、１２時間および２４時間のインキュベーション後に５μＭおよび１５μＭの濃度について観察された。
【０７８３】
ビルディングブロック成分３−メトキシ４−ヒドロキシマンデル酸（バニリルマンデル酸またはＶＭＡ）のウェスタンブロット分析：ＶＭＡは、ＣｏＱ１０キノン環構造の合成のためのさらなる成分である。試験された濃度は１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭであった。統計学的に有意なアポトーシス効果はこの実験において観察されなかったが、データはＢｃｌ−２発現の下向きの傾向を示した。
【０７８４】
ビルディングブロック成分バニリン酸のウェスタンブロット分析：バニリン酸（Ｖａｎｉｌｌｉｃ）はキノン環の合成のための前駆体であり、５００ｎｍ、５μＭ、および１５μＭの濃度で試験された。ウェスタンブロット分析は、Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３発現を測定した。バニリン酸は２４時間インキュベーション時点での５００ｎＭおよび５μＭの濃度についてＢｃｌ−２発現を有意に減少することが示された。１５μＭ濃度について、３時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２発現の減少が存在した。２４時間、１５μＭとともにインキュベートした細胞において、カスパーゼ−３発現の有意な増加が存在した。
【０７８５】
ビルディングブロック成分４−ヒドロキシベンゾエートのウェスタンブロット分析：４−ヒドロキシベンゾエートは、環構造へのイソプレノイド側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、５００ｎＭ、１μＭ、および５０μＭであった。２４時間のインキュベーション後、１５μＭ濃度でＢｃｌ−２発現の有意な減少が存在した。
【０７８６】
ビルディングブロック成分４−ピリドキシンのウェスタンブロット分析：ピリドキシンはＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のための別の前駆体ビルディングブロックである。この化合物のために試験された濃度は、５μＭ、２５μＭ、および１００μＭである。細胞はＢｃｌ−２およびカスパーゼ−３のそれらのレベルについてアッセイされた。ピリドキシンは黒色腫細胞中での２４時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２の有意な減少を示した。
【０７８７】
ビルディングブロック成分パンテノールのウェスタンブロット分析：パンテノールはＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のおいて役割を果たす。黒色腫細胞に対して試験された濃度は５μＭ、２５μＭ、および１００μＭである。この化合物は、２５μＭ濃度についてＢｃｌ−２発現の有意な減少を示した。
【０７８８】
ビルディングブロック成分メバロン酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ）のウェスタンブロット分析：メバロン酸はＣｏＱ１０の合成のための主要な成分の１つである。この化合物は、５００ｎＭ、１μＭ、２５μＭ、および５０μＭの濃度で試験された。この実験において、Ｂｃｌ−２発現の有意な減少またはカスパーゼ−３発現の有意な増加は存在しなかった。
【０７８９】
ビルディングブロック成分アセチルグリシンのウェスタンブロット分析：ＣｏＱ１０の合成のための別の経路は、イソプレノイド（側鎖）合成である。アセチルグリシンの付加は、コエンザイムＡをアセチル−ＣｏＡに転換し、これは、イソプレノイド合成のためのメバロン酸経路に入る。試験された濃度は５μＭ、２５μＭ、および１００μＭであった。アセチルグリシンの試験は、５μＭおよび２５μＭの濃度についての１２時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２発現の有意な減少を示した。Ｂｃｌ−２の有意な減少は、２４時間インキュベーションの時点で１００μＭ濃度について記録された。
【０７９０】
ビルディングブロック成分アセチル−ＣｏＡのウェスタンブロット分析：アセチル−ＣｏＡはＣｏＱ１０の合成のためのメバロン酸経路のための前駆体である。試験された濃度は５００ｎｍ、１μＭ、２５μＭ、および５０μＭであった。試験された時点および濃度について、Ｂｃｌ−２発現の有意な減少またはカスパーゼ−３発現の有意な増加は観察されなかった。
【０７９１】
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分Ｌ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンは、ＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のための前駆体の１つである。以前の実験は、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンとの、培地中のＬ−チロシンの反応を試験した。本研究において、Ｌ−チロシンは、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンの添加なしの培地中で試験された。本研究において、試験されたＬ−チロシンの最終濃度は、５００ｎＭ、５μＭ、および１５μＭであった。ファルネシルは、５０μＭの濃度で試験された。３時間および６時間の時点について、有意な応答は観察されなかった。
【０７９２】
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分Ｌ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：キノン環構造の合成のための前駆体であるＬ−フェニルアラニンは、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを含まない培地中でファルネシルと組み合わせて試験された。ウェスタンブロット分析は、Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３の発現をアッセイするために実施された。Ｌ−フェニルアラニンの最終濃度は、５μＭ、２５μＭ、および１００μＭであった。ファルネシルは５０μＭの濃度で加えられた。本研究は、以下の表に示されるような試験された濃度および組み合わせの多くについてＢｃｌ−２発現の減少を示した。
【０７９３】
【表１３０】
0005903734.tif 000137
【０７９４】
４−ヒドロキシ−ベンゾエートのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：この実験のセットは、細胞増殖に対する異なるビルディングブロック分子を組み合わせることの効果を評価するための細胞増殖アッセイを使用した。
【０７９５】
最初の研究は、４−ヒドロキシ−ベンゾエートをベンゾキノンと組み合わせる効果を試験した。細胞は４８時間インキュベートされ、その後、細胞の計数が生細胞について実施された。各試験群は対照と比較され、各組み合わせ群はベンゾキノン対照と比較された。化合物はベンゾキノンの付加のために統計学的に分析された。以下の表は細胞計数結果を要約し、ここで、Ｘ印は細胞数の統計学的な減少を示す。
【０７９６】
【表１３１】
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【０７９７】
４−ヒドロキシベンゾエート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ）およびベンゾキノンおよび組み合わせとともにインキュベートされた細胞の細胞数の有意な減少が存在した。７０μＭベンゾキノンと組み合わせた５０μＭ  ４−ヒドロキシベンゾエートの組み合わせについて、ベンゾキノン対照と比較して細胞数の有意な減少が存在した。これは、このモル比についての相乗効果を示唆する。
【０７９８】
さらなるモル比を試験するさらなる研究が実施された。最初の試験において、４−ヒドロキシベンゾエート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ）は、５００ｎＭ、１μＭ、および５０μＭの濃度で試験された。これらの濃度は、２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン（Ｂｅｎｚｏ）との組み合わせで試験された。試験されたＢｅｎｚｏの濃度は２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭであった。黒色腫細胞は８０％コンフルエンシーまで増殖され、ウェルあたり４０Ｋ細胞の濃度で、６ウェルプレートに播種された。細胞は、ＣｏＱ１０、４−ヒドロキシベンゾエート、Ｂｅｎｚｏ、および４−ヒドロキシベンゾエート／Ｂｅｎｚｏの組み合わせで処置された。
【０７９９】
Ｔ−検定が、ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとして実施された。Ｘは細胞数の統計学的減少を意味する。
【０８００】
【表１３２】
0005903734.tif 000139
【０８０１】
ＨＢを含有する処置培地について細胞増殖の有意な減少が存在する。さらに、ベンゾキノンとのＨＢの組み合わせは、対応するベンゾキノン濃度とともにインキュベートされた細胞と比較して、細胞数の有意な減少を示した。
【０８０２】
細胞増殖アッセイもまた、新生児線維芽細胞に対して実施された。試験されたＨＢの濃度は、５００ｎＭ、５μＭ、および２５μＭであった。ＨＢはまた、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭの濃度でベンゾキノンと組み合わせて試験された。黒色腫細胞は、ウェルあたり４０ｋ細胞で播種され、２４時間の間処置された。細胞はトリプシン処理され、コールターカウンターを使用して定量された。
【０８０３】
統計学的分析は、線維芽細胞の有意な減少を示さなかった。このことは、正常細胞における毒性は、最小限から全くないまでであることを示す。
【０８０４】
フェニル酢酸とベンゾキノンの組み合わせの細胞増殖アッセイ：フェニル酢酸は、４−ヒドロキシ安息香酸（環構造の結合を容易にする）の合成の前駆体である。細胞増殖アッセイが、ＣｏＱ１０およびベンゾキノンと組み合わせてフェニル酢酸をインキュベートすることの効果をアッセイするために実施された。
【０８０５】
【表１３３】
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【０８０６】
データは、ベンゾキノンと組み合わせたフェニル酢酸の付加が、細胞増殖を有意に減少したことを示す。ＣｏＱ１０とフェニル酢酸の組み合わせは、ＣｏＱ１０およびベンゾキノンの単独とのインキュベーションと比較して、細胞数を有意に減少する。
【０８０７】
４−ヒドロキシ−ベンゾエートのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：４−ヒドロキシ−ベンゾエートは、ファルネシルと組み合わせてインキュベートされた。結果の要約は以下に列挙される。４−ヒドロキシベンゾエートグループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。Ｘは細胞数の統計学的減少を意味する。
【０８０８】
【表１３４】
0005903734.tif 000141
【０８０９】
Ｌ−フェニルアラニンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：細胞増殖アッセイは、ベンゾキノンと組み合わせたＬ−フェニルアラニンの組み合わせを試験するために実施された。以下は、対照およびベンゾキノン対照と比較されたＬ−フェニルアラニンの結果の要約である。Ｘは統計学的な減少を意味する。
【０８１０】
【表１３５】
0005903734.tif 000142
【０８１１】
同様の相乗作用的役割は、ベンゾキノンと組み合わせたＬ−フェニルアラニンについて見られる。
【０８１２】
Ｌ−フェニルアラニンのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：ファルネシルと組み合わせてインキュベートされたＬ−フェニルアラニンの組み合わせ細胞増殖研究の予備的結果。Ｌ−フェニルアラニンは、対照およびファルネシル対照グループに対して比較された。Ｘは細胞数の統計学的減少を意味する。
【０８１３】
【表１３６】
0005903734.tif 000143
【０８１４】
Ｌ−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：Ｌ−チロシンはベンゾキノンと組み合わせてインキュベートされ、その後、細胞計数が実施された。グループは、対照グループおよびベンゾキノン対照グループと比較された。
【表１３７】
0005903734.tif 000144
【０８１５】
ベンゾキノンの付加は、細胞数に対するＬ−チロシンの効果を増幅しなかった。
【０８１６】
Ｌ−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：本研究は、Ｌ−チロシンのファルネシルとの組み合わせを試験した。グループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。
【０８１７】
【表１３８】
0005903734.tif 000145
【０８１８】
Ｌ−チロシンおよびファルネシルを組み合わせることは、この実験において細胞数を減少させることに対して相乗作用を有するようには見えない。
【０８１９】
ＣｏＱ１０の合成は２つの主要部分に分けられ、これは、環構造の合成および側鎖構造の合成からなる。ここで、発癌性細胞は、側鎖および環構造の構成要素の合成のための前駆体である化合物が補充された。本発明者らの結果は、環構造、および側鎖構造への環構造の結合において役割を果たす２つの化合物の合成に関与する３つの主要な構成要素に研究の焦点を当ててきた。Ｂｃｌ−２の有意な減少を示し、カスパーゼ−３発現を増加するこれら３つの化合物は、１）Ｌ−フェニルアラニン、２）Ｌ−チロシン、および３）４−ヒドロキシフェニルピルビン酸である。側鎖の環構造への結合に関与する２つの化合物は、１）４−ヒドロキシベンゾエートおよび２）フェニル酢酸である。
【０８２０】
本発明者らの結果はまた、２，３ジメトキシ５−メチル−ｐ−ベンゾキノン（ベンゾキノン）と組み合わせたこれらの化合物の外因性送達が、細胞増殖を有意に阻害することを示した。このことは、ベンゾキノン環への側鎖の結合のための化合物での環構造の補充は、損なわれたＣｏＱ１０合成メカニズムを補充し得ることを示す。このことはまた、細胞プロセスによって必要とされる機能的特性を維持するために分子の安定化を補助し得る。フェニル酢酸は、４−ヒドロキシベンゾエートの合成のための前駆体であり、ベンゾキノンと組み合わせたこの外因性送達は、発癌性細胞において同様の効果を有する。
【０８２１】
実施例４５  糖尿病のための細胞モデルにおけるコエンザイムＱ１０による遺伝子発現の調節
【０８２２】
コエンザイムＱ１０は、酸化的リン酸化に直接的に影響を与えることによって正常なミトコンドリア機能の維持において確立された役割を有する内因性分子である。糖尿病などの代謝性障害の鍵となる指標として治療の終点を示す様式で働く細胞内標的を調節する際のコエンザイムＱ１０の能力を実証する実験的な証拠が提示されている。
【０８２３】
糖尿病の原因または処置に関連する遺伝子の発現をコエンザイムＱ１０がいかにして調節するかを理解するために、ヒト腎臓由来の不死化初代腎臓近位尿細管細胞系統（ＨＫ−２）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）の初代培養が実験モデルとして使用された。ＨＫ−２およびＨＡＳＭＣ細胞は、５．５ｍＭグルコースで培養中に正常に維持され、これは、ヒト血液中で正常と考えられる範囲に対応する濃度である。しかし、糖尿病環境を刺激するために、両方の細胞系統は、続いて、２２ｍＭグルコースに維持され、これは、慢性高血糖に関連するヒト血液中で観察される範囲に対応する。続いて、細胞内調節プロセスが糖尿病状態を模倣するように機能的に適合されるように、細胞は３継代にわたり増殖させた。細胞系統の選択は、損なわれた心臓血管機能の進行性の病態生理学に加えて、腎機能不全および末期の腎臓病（ＥＳＲＤ）への進行に対する糖尿病の生理学的影響に基づいた。
【０８２４】
糖尿病ＰＣＲアレイを使用するＨＫ−２細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、同時に８４種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された４種の処置は以下の通りである。
・ＨＫ−２；
・ＨＫ−２  Ｈ維持された２２ｍＭグルコース；
・ＨＫ２（Ｈ）＋５０μＭコエンザイムＱ１０；および
・ＨＫ２（Ｈ）＋１００μＭコエンザイムＱ１０。
【０８２５】
糖尿病アレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ−０２３Ｅ，ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に対するＨＫ−２試料のリアルタイムＰＣＲデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がＨＫ−２正常未処置細胞よりも少なくとも２倍の調節ではなく、０．０５未満のｐ値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムＱ１０のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表１００に列挙され、それらの機能および細胞下局在（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ由来）は表１０１に列挙される。
【０８２６】
【表１３９】
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【０８２７】
【表１４０】
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【０８２８】
調節されたレベルを用いて検出されたＲＮＡ転写物の中で、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）が、特に、１００μＭコエンザイムＱ１０処置を用いて、ＨＫ２（Ｈ）細胞において高度に上方調節されているとして同定された。ＣＤ６６ａおよびＢＧＰ−Ｉとしてもまた知られているＣＥＡＣＡＭ−１は、ＣＥＡスーパーファミリーの膜結合ＣＥＡサブファミリーに属する、１１５−２００  ＫＤ  Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。細胞の表面上で、これは非共有結合性のホモ−およびヘテロダイマーを形成する。細胞外領域は、３つのＣ２型Ｉｇ様ドメインおよび１つのＮ末端Ｖ型Ｉｇ様ドメインを含む。Ｃ末端から第２のＣ２型ドメイン（ａａ３２０およびその向こう）を含む複数のスプライシング変異体が存在する。インタクトなマウスにおけるＣＥＡＣＡＭ１発現の欠如は、糖尿病に関連する代謝症候群を促進することが提案されているのに対して、ＣＥＡＣＡＭ１発現の増加はインスリンの内部化と関連し、これは、インスリン感受性の増加およびグルコースの利用（例えば、血液から細胞へのグルコースの移動）を示唆し、従って、２型糖尿病に特徴的な特質であるインスリン抵抗性を軽減する。
【０８２９】
表１００に示されるように、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）発現もまた、コエンザイムＱ１０で処置された糖尿病性ＨＫ−２細胞中で変化された。理論によって束縛されることは望まないが、コエンザイムＱ１０処置に伴うＩＮＳＲの発現の増加は、インスリン感受性を増強し（単独でまたはＣＥＡＣＡＭ１の発現に加えてのいずれかで）、糖尿病に関連する主要な生理学的／代謝的合併症を逆転する潜在能力を有する。
【０８３０】
ミトコンドリアアレイを使用するＨＫ−２細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ  ０８７Ｅ、ＳＡＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）を使用してアッセイされた。慢性高血糖および／またはコエンザイムＱ１０処置によって調節された遺伝子は表１０２に列挙され、一方それらの機能は表１０３に含まれる。
【０８３１】
【表１４１】
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【０８３２】
【表１４２】
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今日まで、糖尿病においてコエンザイムＱ１０で処置された糖尿病性ＨＫ−２細胞において同定された４種のミトコンドリア遺伝子（表１０２）の役割は特徴付けされていない。
【０８３３】
研究２：糖尿病ＰＣＲアレイを使用するＨＡＳＭＣ細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、同時に８４種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された４種の処置は以下の通りである。
・ＨＡＳＭＣ；
・ＨＡＳＭＣ  Ｈ維持された２２ｍＭグルコース；
・ＨＡＳＭＣ（Ｈ）＋５０μＭコエンザイムＱ１０；および
・ＨＡＳＭＣ（Ｈ）＋１００μＭコエンザイムＱ１０。
【０８３４】
糖尿病アレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ−０２３Ｅ，ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に対する  ＨＡＳＭＣ試料のリアルタイムＰＣＲデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がＨＡＳＭＣ正常未処置細胞よりも少なくとも２倍の調節ではなく、０．０５未満のｐ値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムＱ１０のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表１０４に列挙される。
【０８３５】
【表１４３】
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【０８３６】
ＨＡＳＭＣ細胞において、コエンザイムＱ１０での高血糖細胞の処置は、血管機能の調節に関与する遺伝子（ＡＧＴ）、インスリン感受性の調節に関与する遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＮＳＲ、ＳＥＬＬ）、および炎症／免疫機能の調節に関与する遺伝子（ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＣＣＬ５）の発現の変化を生じた。理論によって束縛されることは望まないが、ＩＮＳＲの発現の増加は、ＨＡＳＭＣ細胞におけるインスリン感受性の増加と関する可能性があり、これは、糖尿病の処置において有益である生理学的特性であり、一方、ＩＬ−６は、その免疫調節特性に加えて、骨格筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵臓β細胞、および神経内分泌細胞に対する作用によって、直接的と間接的の両方で、グルコースの恒常性および代謝に影響を与えることが提案されてきた。活性化の際に、正常Ｔ細胞は、ＲＡＮＴＥＳおよびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ５）を発現および分泌する。ＣＣＬ５は脂肪細胞によって発現され、血清レベルのＲＡＮＴＥＳは肥満および２型糖尿病において増加される。しかし、表１０４において示されるように、コエンザイムＱ１０でのＨＡＳＭＣ細胞の処置は、ＣＣＬ５の発現の有意な減少を引き起こす。前述のデータに基づいて、コエンザイムＱ１０の投与が、糖尿病の管理における処置的な利点を有することが予測される。
【０８３７】
ミトコンドリアアレイを使用するＨＡＳＭＣ細胞中での遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ  ０８７Ｅ、ＳＡＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）を使用してアッセイされた。慢性高血糖および／またはコエンザイムＱ１０処置によって調節された遺伝子は表１０５に示される。
【０８３８】
【表１４４】
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【０８３９】
コエンザイムＱ１０でのＨＡＳＭＣ細胞の処置は、プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを調節する遺伝子（ＢＣＬ２Ｌ１、ＮＯＸＡとしても知られるＰＭＩＡＰ１）、トランスポータータンパク質（ＳＬＣ２５Ａ１［クエン酸トランスポーター］、ＳＬＣ２５Ａ１３［アスパラギン酸−グルタミン酸エクスチェンジャー］、ＳＬＣ２５Ａ１９［チアミンピロリン酸トランスポーター］、およびＳＬＣ２５Ａ２２［グルタミン酸−水素同時トランスポーター］）、およびミトコンドリアマトリックス輸送タンパク質（ＭＦＮ１、ＴＩＭＭ４４、およびＴＯＭＭ４０）の発現の変化を生じた。これらのトランスポーターの活性は、クレブス回路のために必須の前駆体の調節、およびミトコンドリアの酸化的リン酸化の維持において重要な役割を果たしている。これらの結果は、コエンザイムＱ１０への糖尿病性ＨＡＳＭＣ細胞の曝露は、細胞質およびミトコンドリアの遺伝子の発現の変化と関連し、これは次には、コエンザイムＱ１０と一致しており、糖尿病の処置における治療の利点を提供する。
【０８４０】
コエンザイムＱ１０でＨＡＳＭＣ細胞およびＨＫ−２細胞を処置することによって、または高血糖性環境において得られたデータの比較は、４種の遺伝子が両方の細胞系統（例えば、遺伝子発現アッセイにおけるＰＩＫ３Ｃ２ＢおよびＳＥＬＬならびにミトコンドリアアレイアッセイにおけるＴＯＭＭ４０およびＴＳＰＯ）においてコエンザイムＱ１０によって共通して調節されることを明らかにする。これらの結果は、糖尿病環境におけるコエンザイムＱ１０での細胞の処置が、糖尿病の原因または処置に関与することが知られている遺伝子の発現の変化に関連することを実証する。
【０８４１】
実施例４６膵臓癌に対するコエンザイムＱ１０投与のインビボ効果
静脈内投与されたコエンザイムＱ１０の製剤が、動物モデルにおける膵臓癌を処置するために評価された。誘導された膵臓癌を有するラットが、グループにランダム分けされ、以下の９の処置のいずれかを受けた。
・グループＡ：対照
・グループＢ：生理食塩水溶液
・グループＣ：ビヒクル
・グループＤ：５ｍｇ／ｋｇコエンザイムＱ１０
・グループＥ：１０ｍｇ／ｋｇコエンザイムＱ１０
・グループＦ：２５ｍｇ／ｋｇコエンザイムＱ１０
・グループＧ：５０ｍｇ／ｋｇコエンザイムＱ１０
・グループＨ：５ｍｇ／ｋｇドキソルビシン
・グループＩ５０ｍｇ／ｋｇコエンザイムＱ１０および５ｍｇ／ｋｇドキソルビシン
【０８４２】
２８日後、グループＡおよびＢのすべての動物、ならびにグループＣの大多数の動物が死亡した。対照的に、グループＤ、Ｅ、およびＦの大部分の動物は生きたままであり、より高用量のコエンザイムＱ１０を受容した動物はより長く生きたままであった。確かに、最高用量のコエンザイムＱ１０（グループＧ）を受容した動物は２８日目においても生きたままであった。これらのデータは全体の用量応答曲線を実証し、ここでは、より高用量を受容した動物がより長い生存割合を有した。
【０８４３】
ドキソルビシンと組み合わせた、膵臓癌を処置する際のコエンザイムＱ１０の有効性を評価するために、グループＨはドキソルビシン単独で投与され、一方グループＩはドキソルビシンおよびコエンザイムＱ１０の組み合わせを投与された。２８日後、有意な数のグループＨの動物がドキソルビシンの毒性に起因して死亡したのに対して、グループＩの動物は生存割合の増加を有した。これらのデータは、膵臓癌と関連する生存率を増加させることに加えて、コエンザイムＱ１０は、化学療法レジメンの毒性副作用を軽減することもできることを示唆する。
【０８４４】
等価物
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
0005903734.tif 000153
【図３】
0005903734.tif 000154
【図４】
0005903734.tif 000155
【図５】
0005903734.tif 000156
【図６】
0005903734.tif 000157
【図７】
0005903734.tif 000158
【図８】
0005903734.tif 000159
【図９】
0005903734.tif 000160
【図１０】
0005903734.tif 000161
【図１１】
0005903734.tif 000162
【図１２】
0005903734.tif 000163
【図１３Ａ】
0005903734.tif 000164
【図１３Ｂ】
0005903734.tif 000165
【図１４】
0005903734.tif 000166
【図１５】
0005903734.tif 000167
【図１６】
0005903734.tif 000168
【図１７】
0005903734.tif 000169
【図１８】
0005903734.tif 000170
【図１９】
0005903734.tif 000171
【図２０】
0005903734.tif 000172
【図２１】
0005903734.tif 000173
【図２２】
0005903734.tif 000174
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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