(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・サーモフィルス及びビフィドバクテリウム・ブレーベを含有する発酵乳を有効成分とする経口用皮膚性状改善剤であって、前記皮膚性状改善が、角層水分含量の上昇促進及び／又は紫外線照射による角層水分含量の低下抑制である、皮膚性状改善剤。
【請求項２】
前記ストレプトコッカス・サーモフィルスがストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３７）又はストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７９）である請求項１に記載の皮膚性状改善剤。
【請求項３】
前記ビフィドバクテリウム・ブレーベがビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）である請求項１又は２に記載の皮膚性状改善剤。
【請求項４】
さらにガラクトオリゴ糖を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚性状改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口摂取により、角質水分含量等の皮膚性状を改善する皮膚性状改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、紫外線の暴露により炎症、免疫抑制、酸化、ＤＮＡ損傷等を引き起し、その結果水分量の低下、シワ形成、弾力性の低下、皮膚の老化促進等が生じる。これら皮膚性状の悪化に対しては、保湿剤、その他の成分を外用剤の形態で投与するのが一般的である。【０００３】
これに対し、近年、保湿成分や抗炎症成分等を経口的に摂取することにより皮膚性状を改善する手段が報告されている（特許文献１、２）。さらに、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌がアトピー性皮膚炎を抑制すること（特許文献３）、及びビフィドバクテリウム属細菌が皮膚の厚さ、弾力性の低下を改善すること（特許文献４）がそれぞれ報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２５２０４８号公報
【特許文献２】特開２００５−２０６５７８号公報
【特許文献３】特開２００７−３９４２３号公報
【特許文献４】特開２０１０−６７５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の経口用皮膚性状改善剤は、その効果が十分でなく、さらに優れた皮膚性状改善効果を有する素材が望まれていた。
従って、本発明の課題は、経口摂取で優れた効果を奏する皮膚性状改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の乳酸菌群及びそれを用いた発酵乳を経口投与し、紫外線照射による皮膚トラブルに対する作用を検討してきたところ、ストレプトコッカス・サーモフィルス属細菌とビフィドバクテリウム属細菌とを併用すれば、それぞれの皮膚性状改善効果が相乗的に増強され、優れた経口投与用皮膚性状改善剤が得られることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、ストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌、又は当該２種の細菌を含有する発酵乳を有効成分とする経口用皮膚性状改善剤を提供するものである。
また、本発明は、経口摂取して皮膚性状を改善するための、ストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌の組み合わせ、又は当該２種の細菌を含有する発酵乳を提供するものである。
さらに本発明は、ストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌、又は当該２種の細菌を含有する発酵乳を経口摂取することを特徴とする皮膚性状の改善方法を提供するものである。
さらに、本発明は、経口用皮膚性状改善剤製造のための、ストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌、又は当該２種の細菌を含有する発酵乳の使用を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の皮膚性状改善剤は経口的に摂取することにより、特に紫外線照射による角層水分含量の低下を抑制又は角層水分含量の上昇促進作用を有し、皮膚のバリア機能を改善し、角層形態（配列規則性、細胞形態明瞭性等）を改善し、皮膚の肥厚を抑制し、皮膚のシワ形成を抑制し、経表皮水分蒸散量の増加を抑制し、角化関連酵素活性（カテプシンＬ様活性）の上昇作用を有する等、皮膚性状を顕著に改善する。また、本発明の皮膚性状改善剤は、経口摂取可能なストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有しているので安全性が高く、継続的な摂取を実現可能とし、しかもその菌の状態は生死に関係なく上記作用効果を発揮するので様々な嗜好に応じて摂取時の形態を設定することができ、経口用医薬品や飲食品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各試験群の体重変化を示す図である。
【図２】各試験群の摂餌量変化を示す図である。
【図３】各試験群の角質水分量を示す図である。
【図４】各試験群の経表皮水分蒸散量を示す図である。
【図５】ヒトにおける飲用前後の角層水分含量（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ）変化を示す図である。
【図６】ヒトにおける飲用前後の角層水分含量（ＳＫＩＣＯＮ）変化を示す図である。
【図７】ヒト角層細胞の染色画像を示す図である。
【図８】角層形態（配列規則性）のスコア推移を示す図である。
【図９】角層形態（細胞形態明瞭性）のスコア推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の経口用皮膚性状改善剤は、ストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌、又は当該２種の細菌を含有する発酵乳を有効成分として含有する。
本発明に用いられるストレプトコッカス属細菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍ．ともいう）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）等が挙げられるが、皮膚性状改善効果の点から、ストレプトコッカス・サーモフィルスが好ましい。ストレプトコッカス・サーモフィルスの具体例としては、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３７：寄託日  ２００１年４月５日）、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７９：寄託日  ２００７年７月２４日）、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３８：寄託日  ２００１年４月５日）が挙げられる。
【００１１】
本発明に用いられるビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ．ともいう）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ズイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（Ｂ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ）等が挙げられる。中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは以前から乳製品に数多く使用され安全性等のデータが積み重ねられており、また、皮膚性状改善効果の点から好ましく、特にビフィドバクテリウム・ブレーベが好ましい。ビフィドバクテリウム・ブレーベの具体例としては、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０：寄託日  ２０１１年１月２０日）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３：寄託日  １９９８年１月１６日）が挙げられる。前記のストレプトコッカス・サーモフィルス及びビフィドバクテリウム・ブレーベは、〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１２】
前記２種の細菌は、生菌体をそのままの状態で皮膚性状改善剤として使用できる他、例えば、生菌体の凍結乾燥物、加熱処理やアルコール処理等の殺菌処理を施した死菌体、当該菌体を含む培養物又はさらにこれらを加工した物を、皮膚性状改善剤として使用することができる。
【００１３】
本発明の皮膚性状改善剤は経口的に摂取することにより、特に紫外線照射による角層水分含量の低下を抑制又は角層水分含量の上昇促進作用を有し、皮膚のバリア機能を改善し、角層形態（配列規則性、細胞形態明瞭性等）を改善し、皮膚の肥厚を抑制し、皮膚のシワ形成を抑制し、経表皮水分蒸散量の増加を抑制し、角化関連酵素活性（カテプシンＬ様活性）の上昇作用を有する等、皮膚性状を顕著に改善する。
【００１４】
本発明において、紫外線照射による角層水分含量の低下抑制とは、例えば後述の実施例に示す方法により角層水分含量を測定した場合に、紫外線照射による角層水分含量の低下を抑制する作用をいい、また、角層水分含量の上昇促進作用とは、紫外線照射の有無を問わず、紫外線非照射の健常な皮膚と同等もしくはそれ以上のレベルにまで角層水分含量を上昇促進させる作用をいう。ここで、角層水分含量の測定法としては、後述の実施例に示す方法に限定されない。
【００１５】
本発明の皮膚性状改善剤には、皮膚性状改善作用を高める目的で、さらに難消化性糖質を添加することができる。難消化性糖質としては、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖等のオリゴ糖が好ましく、特にガラクトオリゴ糖が好ましい。これら難消化性糖質の１回当たりの使用量は、服用する対象者の症状、年齢、体重等によっても異なるため、一概に決定することは出来ないが、およそ０．１〜１０ｇ程度とすればよい。
【００１６】
本発明の皮膚性状改善剤は、常法に従って、薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬組成物とすることができる。
例えば、上記菌株又はその加工物等に、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、アルギン酸ナトリウム、カテキン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム等の崩壊剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を加え、常法により顆粒剤、錠剤、カプセル剤等を製造することができる。さらに、錠剤については、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或いは二重錠、多重錠とすることもできる。
【００１７】
本発明の経口用皮膚性状改善剤においては、ストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌を含んでいればよいが、当該２種の細菌を含有する発酵乳を用いてもよい。当該発酵乳としては、乳成分を含む培地中で前記２種の細菌を培養したものであればよく、乳成分を含む培地中で前記２種の細菌の１種を培養した発酵乳をそれぞれ製造して混合したものでもよいし、乳成分を含む培地中で前記２種の細菌を混合培養したものでもよい。
【００１８】
培地に含まれる乳成分としては、牛乳、山羊乳等の獣乳、脱脂乳、粉乳、脱脂粉乳、生クリーム等を用いることができる。培養は通常の発酵乳の製造法に準じればよく、例えば２５〜４６℃、好ましくは３５〜４２℃で、６〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間行えばよい。培養方法は、静置、撹拌、振盪等いずれでもよい。
【００１９】
また、上記菌体またはその加工物等を食品に直接添加することにより、または、乳成分等の可食性の培地を用いた場合には、当該菌株を用いて発酵乳等の発酵食品を製造することにより、各種の飲食品として利用することができる。飲食品の好ましい例としては、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、発酵豆乳、アイスクリーム、果汁飲料、スープ、クッキーなどを例示することができる。
【００２０】
本発明の皮膚性状改善剤、特に発酵乳の形態の場合には、通常用いられる種々の食品素材を配合することができる。具体的には、ショ糖、グルコース、フルクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖等の糖質、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴などの糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコール等の各種増粘安定剤、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチンなどの乳化剤、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分を挙げることができる。
【００２１】
また、本発明の皮膚性状改善剤には、経口的に摂取することにより皮膚性状に有益な作用を与える素材を配合することができる。このような素材としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等のビタミン類、β−カロテン、γ−カロテン、ルテイン等のカロテノイド、リノール酸、リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ等の脂肪酸類、コラーゲン、ムコ多糖類、セラミド等の皮膚構成成分等を例示することができる。
【００２２】
さらに、本発明の皮膚性状改善剤には、経口摂取が可能であって生体に有益な機能を与える乳酸菌を含むものであってもよい。
このような乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ・サブスピーシーズ  ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ・サブスピーシーズ  ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）等のラクトバチルス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ  ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ  クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトコッカス属細菌、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ  クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ロイコノストック・ラクチス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）等のロイコノストック属細菌、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス・ハロフィラス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）等のペディオコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）等のエンテロコッカス属細菌を例示することができる。これらは、単独又は２種以上併用してもよい。
【００２３】
本発明の経口摂取可能な皮膚性状改善剤におけるストレプトコッカス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌の１回当たりの使用量は、服用する対象者の症状、年齢、体重等によっても異なるため、一概に決定することは出来ないが、およそ菌数としてそれぞれ１０３〜１０１３ＣＦＵ程度とすればよく、それぞれ特に１０６〜１０１３ＣＦＵ程度とするのが好ましい。
また、本発明の皮膚性状改善剤の摂取開始時期や摂取期間等は特に制限はなく、紫外線照射に伴う皮膚障害の発生前後に経口的に摂取すればよいが、十分な効果を得るためには、紫外線の照射に伴う皮膚障害の発生等の有無を問わず、継続的に経口摂取することが好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら制約されるものではない。【００２５】
参考例１
交互継代培養法によるビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  １０００１、ＹＩＴ  ４１２５の育種改良
ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  １０００１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―８２０５）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４１２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８１３）を親株として交互継代濃縮を行った。【００２６】
（１）２０．７％全粉乳培地を１３５℃、３．５秒殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  １０００１株又はＹＩＴ  ４１２５株のシードスターター１を０．５％、ビフィドバクテリウム・ビフィダムのシードスターターを１％接種し、３３℃でｐＨ５．３まで混合培養して菌液Ａ１（４００ｍＬ）を調製した。
（２）菌液Ａ１に、パラチノースの終濃度が１０％となるようにシロップ液Ａを調合して乳製品Ａ１（６３０ｍＬ）を調製した。乳製品Ａ１（２００ｍＬ）を３００ｍＬ容コルベンに分注し、綿栓をした好気的条件下、５℃、１週間撹拌（９０ｒｐｍ）保存（以後、好気撹拌保存と略す）した後、試験管に満杯充填してブチル栓をした嫌気条件下、１０℃、１週間静置保存（以後、嫌気静置保存と略す）した。
（３）本条件で保存した乳製品Ａ１（１ｍＬ）をセファロシン添加ミルク培地（１２％脱脂粉乳、０．１％酵母エキス、０．０３％Ｌ−システイン塩酸塩、０．２％沈降性炭酸カルシウム、セファロシン５μｇ／ｍＬ、以後、セファロシン添加ミルク培地と略す）１０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター２とした。マザースターター２（０．０３ｍＬ）をミルク培地（１２％脱脂粉乳、０．１％酵母エキス、０．０３％Ｌ−システイン塩酸塩、０．２％沈降性炭酸カルシウム、以後、ミルク培地と略す）３０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのシードスターター２を調製した。シードスターター２を用いて上記と同様の操作を繰り返した。すなわち、シードスターター２で調製した乳製品Ａ２を好気撹拌保存後、嫌気静置保存し、ビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター３、さらにシードスターター３を調製した。
（４）次に、２３．５％脱脂粉乳培地を１２０℃、３．５秒殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベのシードスターター３を２％、ラクトコッカス・ラクチスのシードスターターを０．０１％接種し、３７℃でｐＨ４．４まで混合培養して菌液Ｂ１（１００ｍＬ）を調製した。
（５）また、１２０℃、３．５秒殺菌した１９．７％脱脂粉乳培地に乳ペプチドを０．０８％添加した後、ストレプトコッカス・サーモフィラスのシードスターターを０．５％接種し、３７℃でｐＨ４．３まで培養して菌液Ｃ１（７００ｍＬ）を調製した。菌液Ｂ１に菌液Ｃ１を加え（混合比１：２）、さらに、還元麦芽糖水あめの終濃度が５％となるようにシロップ液Ｂを調合して乳製品Ｂ１（８７０ｍＬ）を調製した。
（６）乳製品Ａ１と同様に、好気撹拌保存後、嫌気静置保存した乳製品Ｂ１（１ｍＬ）をセファロシン添加ミルク培地１０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター４とした。マザースターター４（０．０３ｍＬ）をミルク培地３０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのシードスターター４を調製した。シードスターター４を用いて上記と同様の操作を繰り返した。すなわち、シードスターター４で調製した乳製品Ｂ２を好気撹拌保存後、嫌気静置保存し、ビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター５、さらにシードスターター５を調製した。【００２７】
このように、乳製品Ａの調製、好気撹拌保存、及び嫌気静置保存を２回繰り返した後、生残したビフィドバクテリウム・ブレーベを用いて、乳製品Ｂの調製、好気撹拌保存、及び嫌気静置保存を２回繰り返し、ビフィドバクテリウム・ブレーベの濃縮操作を行った。本一連の工程を１サイクルとし、合計４サイクル繰り返した。最終的に１０℃、２週間嫌気静置保存した乳製品Ａ８及び乳製品Ｂ８から、各々１ｍＬをセファロシン５μｇ／ｍＬを添加したＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業）に塗沫し、３７℃でアネロパック（三菱ガス化学）で嫌気培養してコロニーを分離した。本コロニー分離を繰り返すことにより純化し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  １０００１株及びＹＩＴ  ４１２５株由来の単一コロニーを乳製品Ａ８から計２１株、乳製品Ｂ８から計２１株、合計４２株を分離した。【００２８】
参考例２
生残性確認試験
親株と分離株を用いて、参考例１の方法で乳製品Ａ、Ｂを各々調製し、好気条件下、５℃、１週間撹拌保存後、嫌気条件下、１０℃、２週間静置保存した。乳製品Ａ、Ｂ両方で生残性が良好であったビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＹＩＴ  ４１２５株由来、乳製品Ａ８より分離）を選抜した。
ＹＩＴ１２２７２株、対照菌（ＹＩＴ  １０００１株、ＹＩＴ  ４１２５株）の乳製品Ａ、Ｂでの生残性の結果を表１に示す。ＹＩＴ１２２７２株は、乳製品Ａ、Ｂ何れにおいても、好気条件下、５℃、１週間撹拌保存後、嫌気条件下、１０℃、２週間静置保存しても３×１０７ｃｆｕ／ｍＬ以上の生菌が生残した。一方、対照菌で作製した乳製品Ａ、Ｂのどちらか一方では３×１０７ｃｆｕ／ｍＬ以上の生菌が生残したが、両方の製品で良好な生残性を示さなかった。
また、乳製品Ａ、Ｂの物性を表２に示す。菌液ＡにシロップＡを調合して乳製品Ａを調製したところ、乳製品ＡのｐＨ、酸度は各々５．６、３．４であり、浸透圧は菌液Ａでは５５０ｍＯｓｍであったが、乳製品Ａでは９５０ｍＯｓｍに増加した。一方、菌液Ｂに菌液ＣとシロップＢを調合して乳製品Ｂを調製したところ、乳製品ＢのｐＨ、酸度は各々４．４、７．５であり、浸透圧は菌液Ｂでは９００ｍＯｓｍであったが、乳製品Ｂでは６００ｍＯｓｍに減少した。【００２９】
以上より、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株は、培養温度、ｐＨ、酸度、シロップ調合による浸透圧変化、無脂乳固形分、乳脂肪分の異なる乳製品Ａ、Ｂの両方で、対照菌と比べて生残性が強化されていることが明らかになった。【００３０】
【表１】
0005903380.tif 000002
【００３１】
【表２】
0005903380.tif 000003
【００３２】
実施例１
（１）実験動物と飼育方法
５週令雌へアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１）を用いた。ＣＳケージにて群飼し、１週間ＡＩＮ９３Ｇ飼料で馴化した後、体重に差がでないように群分けし、試験食で２週間飼育した。飼育条件は実験期間を通じて恒温（２４±１℃）、恒湿（６０±５％）とし、明暗周期は１２時間とした。飼料及び水は自由摂取させた。飼料はＡＩＮ９３Ｇ組成を改変し、作製した。飼料は、乳鉢で混合後、脱イオン水を適量加えてペースト状とし、凍結乾燥トレイに移してブロック状に切り分けた。凍結乾燥後、真空パックし冷蔵保存した。飼料組成を表３に示す。【００３３】
【表３】
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【００３４】
（２）実験群【００３５】
【表４】
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【００３６】
（３）試験飼料
（ａ）Ｂ．ｂｒｅｖｅ．菌末・・・ｍ−ＩＬＳ液体培地を定法に従い調製し、１２１℃１５分間滅菌処理し、気相Ｎ２置換条件でシードスタータを１％接種し、３７℃で２３時間培養した。培養上がりの生菌数は、１．１６×１０９ＣＦＵ／ｍＬであった。この培養液を生理食塩水で洗浄し、培地成分を除去した後、改変ＡＩＮ−９３Ｇ飼料に混合した。混合後凍結乾燥して固形飼料を作製した。【００３７】
（ｂ）Ｂ．ｂｒｅｖｅ．発酵乳・・・１０％脱脂粉乳（よつばＹＡＡ）に０．０３％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔを加えた培地を調製し、１２１℃１５分間滅菌処理し、気相Ｎ２置換条件で定法に従って調製したシードスタータを１％接種し、３７℃で４４時間培養した。培養上がりの生菌数は１．０２×１０８ＣＦＵ／ｍＬであった。この培養液を凍結乾燥して粉末化した後、飼料に混合した。混合後、凍結乾燥して固形飼料を作製した。【００３８】
（ｃ）Ｓ．ｔｈｅｒｍ．発酵乳・・・１０％脱脂粉乳にシードスタータを０．１％接種し、別滅菌したハイニュートＤＨ（不二製油）を加え、ジャーファーメンタ（丸菱バイオエンジ）にて３７℃、１００ｒｐｍ、ｐＨ６．８で２４時間培養した。培養上がりの生菌数は５×１０８ＣＦＵ／ｍＬであった。この培養液を凍結乾燥して粉末化した後、飼料に混合した。混合後、凍結乾燥して固形飼料を作製した。【００３９】
（ｄ）Ｂ．ｂｒｅｖｅ  ＋  Ｓ．ｔｈｅｒｍ．混合発酵乳・・・上記の方法で培養し、粉末化したＢ．ｂｒｅｖｅ．発酵乳とＳ．ｔｈｅｒｍ．発酵乳粉末をそれぞれ１０％添加して飼料を作製した。【００４０】
（４）菌数測定方法
乳鉢で均質化した餌を滅菌した０．１％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）にて適宜希釈し、寒天平板培地に塗抹して生菌数を測定した。【００４１】
（５）実験スケジュール
試験食摂取１１日目より紫外線照射装置（東芝ＳＥ−ＦＬ−２０）を用いて４０ｍＪ／ｃｍ２／ｄａｙで４日間紫外線照射を行い、翌日解剖した。体重測定は週１回、摂餌量測定は週２〜３回程度行い、その他は日常観察を行った。【００４２】
（６）測定項目
試験食開始から１５日目に皮膚計測機器を用いて皮膚性状を測定した。
（ａ）経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）
Ｔｅｗａ  ｍｅｔｅｒ  ＴＭ２１０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）を用いて経表皮水分蒸散量を測定し、バリア機能の指標とした。数値は２秒毎に３０秒間測定した平均値を算出して表した。【００４３】
（ｂ）角層水分含量
３．５ＭＨＺの高周波電導度測定装置（ＳＫＩＣＯＮ−２００、ＩＢＳ）を用いて、マウス背部皮膚角質層のコンダクタンス値を測定した。【００４４】
（７）統計
統計処理はＳＡＳの前臨床パッケージを用いて、有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。【００４５】
（８）
ａ．体重及び摂餌量
体重及び摂餌量の経時変化を図１及び２に示す。いずれの群間においても有意差は認められず、紫外線照射やサンプルの差異によるマウスの生育や健康状態の違いは見られなかった。【００４６】
（ｂ）皮膚性状
ｂ−１．角層水分含量
角層水分含量を図３に示す。角層水分含量は紫外線照射により著しく低下したが、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びストレプトコッカス・サーモフィルス混合発酵乳群において有意に低下が抑制した。その結果は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ又はストレプトコッカス・サーモフィルスそれぞれ単独投与群に対して、相乗的であった。その値は紫外線照射をしていないブランク群をも上回る結果であり、極めて顕著な効果を示した。すなわち、本発明の皮膚性状改善剤は、紫外線照射による角層水分含量の低下を単に抑制するのみならず、紫外線非照射の健常な皮膚と同等以上のレベルにまで角層水分含量を上昇促進する作用を有しており、極めて実用性が高いものであることが示された。【００４７】
ｂ−２．経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）
ＴＥＷＬを図４に示す。紫外線照射によりＴＥＷＬが著しく亢進し表皮バリア機能が低下したことが示唆された。すべての群においてこれを有意に改善した。その改善効果はビフィドバクテリウム・ブレーベ及びストレプトコッカス・サーモフィルス混合発酵乳群で最も高かった。【００４８】
実施例２
（１）ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２及びストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０２１を含有する発酵乳の製造
１２０℃、３．５秒間プレート殺菌した脱脂粉乳溶液（ＳＮＦ２０．７％）にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２の前培養液を２％接種し、３７℃で２４時間培養しビフィズス菌発酵乳を得た。また同様にプレート殺菌した脱脂粉乳溶液（ＳＮＦ１７．４％）にストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０２１の前培養液を０．５％接種し、３７℃で２４時間培養し乳酸菌発酵乳を得た。これらの菌液を混合し、還元麦芽糖水あめ、ポリデキストロース、ガラクトオリゴ糖、乳化鉄、アスパルテームなどを混合したシロップ溶液を調合し、発酵乳を得た。
プラセボとして、前記細菌およびガラクトオリゴ糖を含まない未発酵乳を製造した。未発酵乳には上記発酵乳に含まれる量と等量の乳酸および酢酸を添加した。【００４９】
各飲料の成分組成を表５に示す。試験飲料の飲用開始時のＹＩＴ１２２７２の平均生菌数及び平均総乳酸菌数は、各々６．９×１０８  ＣＦＵ／ｍＬ、５．１×１０８  ＣＦＵ／ｍＬであった。また、飲用終了時のＹＩＴ１２２７２の平均生菌数及び平均総乳酸菌数は、各々６．６×１０８  ＣＦＵ／ｍＬ、５．１×１０８  ＣＦＵ／ｍＬであった。【００５０】
【表５】
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【００５１】
（２）プラセボ群と試験群各２０名（女性）に４週間毎日１本（１００ｍＬ）ずつ飲用させた。飲用前、飲用後及び後観察後（飲用終了２週間後）に皮膚性状を評価した。【００５２】
皮膚計測については、洗顔クリームによる洗顔で化粧を落とし、３０分間リラックスした状態で肌を馴化した後、仰向けの状態でベットに横になり、左頬（目尻と鼻の交点）の角層水分含量をＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（商標）ＣＭ８２５（株式会社インテグラル製）とＳＫＩＣＯＮ−２００（ＩＢＳ社製）を用い、５回測定して平均化した。また、左頬の水分蒸散量をＣｕｔｏｍｅｔｅｒ  ＭＰＡ  ５８０（商標）（株式会社インテグラル製）を用いて測定した。
シワの計測については、被験者の左目尻からシリコンゴム（ＳＩＬＦＬＯ，Ｆｌｅｘｉｃｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）を用いてネガティブレプリカを作製し、本レプリカの画像をデジタルマイクロスコープにて取り込んだ後、画像解析（ＷｉｎＲＯＯＦ  Ｐｒｏ  Ｖｅｒ．６．１：三谷商事）を行った。シワは日本化粧品工業連合会が作成したシワ計測法のガイダンスに従って解析し、計測パラメータとして、シワ最大深さ（ｍｍ）で表した。
肌のターンオーバーの正常化の指標として、角化関連酵素であるカテプシンＬ様活性を測定した。方法は、定法に従い、合成ペプチドであるＺ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として用いた蛍光分析を行った。
角層採取については、飲用前と後観察後では同じ部位を、飲用後では飲用前と異なる部位を選定し、各々テープストリップ法により同一部位より３層採取した。角層２層目の採取サンプルを、０．５％ブリリアントグリーン−１．０％ゲンチアナバイオレットＢ水溶液中、室温、８分間、染色した後、蒸留水で洗浄した。本画像をデジタルマイクロスコープにて取り込んだ後、前記の画像解析装置を用いて角質細胞面積、円形度及び周囲長の測定を行った。被験者１名につき３視野から３０個の角質細胞面積を測定した。また、角層形態（配列規則性および細胞形態明瞭性）を各々表６及び表７に示す評価基準にてスコア化し、観察者３名のスコアを平均した。【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
（３）結果
３−１．角層水分含量
角層水分含量の推移を図５〜６に示す。ＳＫＩＣＯＮで測定した結果、プラセボ群は飲用後、後観察後において飲用前に比べて有意に低下した。一方、試験群では飲用後では変化せずに後観察後で有意に低下した。ＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲで測定した結果、プラセボ群において飲用後、後観察後ともに有意な低下が認められたが、試験群では飲用前と比べて変化がなかった。試験群とプラセボ群との比較でも、飲用後、後観察後に試験群では有意差はなかったが、高値を示した。【００５６】
３−２．角化関連酵素
試験群において、カテプシンＬ様活性は飲用前と比べて飲用後で有意に上昇した。一方、プラセボ群においては変化がみられなかった。【００５７】
３−３．角層形態
角層細胞面積、周囲長及び円形度（４π×面積／（周囲長）２、０＜円形度≦１）の推移を検討した。角層細胞の形態は、形が大きく、より円形（正六角形）に近いことが良い状態であるので、いずれの測定項目も値が大きいほど角層の状態は良いと判定される。円形度は両群とも、飲用前と比べて飲用後、後観察後で有意に上昇した。一例として、試験群の５０代女性の角層細胞の染色画像を図７に示す。飲用前では細胞が小さく形も不均一であったが、飲用後には細胞が大きく、形も整っている（正六角形）状態が観察された。
角層形態（配列規則性および細胞形態明瞭性）をスコア化にて評価した結果（スコア値は飲用前との変化量（Δスコア）で示す）を図８及び図９に示す。試験群においてはプラセボ群と比較して飲用後のスコアの改善効果が高く、また、飲用による改善効果が後観察後も持続する傾向が確認された。【００５８】
３−４．シワ
シワ最大深さは、プラセボ群では変化がなかったが、試験群において飲用前と比べて有意に減少した。【００５９】
実施例３
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５及びストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０２１を含有する発酵乳の製造
１２０℃、３．５秒間プレート殺菌した脱脂粉乳溶液（ＳＮＦ２０．７％）にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５の前培養液を２％接種し、３７℃で２４時間培養しビフィズス菌発酵乳を得た。また同様にプレート殺菌した脱脂粉乳溶液（ＳＮＦ１７．４％）にストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０２１の前培養液を０．５％接種し、３７℃で２４時間培養し乳酸菌発酵乳を得た。これらの菌液を混合し、還元麦芽糖水あめ、ポリデキストロース、ガラクトオリゴ糖、乳化鉄、アスパルテームなどを混合したシロップ溶液を調合し、発酵乳を得た。
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５は、経口摂取による皮膚性状改善作用（ＴＥＷＬ、水分含量、皮溝・皮丘数等）において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２と同等の効果を奏することを確認しており、本実施例の発酵乳には本願発明の皮膚性状改善作用が期待できる。【００６０】
実施例４
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５及びストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４を含有する発酵乳の製造
１２０℃、３．５秒間プレート殺菌した脱脂粉乳溶液（ＳＮＦ２０．７％）にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５の前培養液を２％接種し、３７℃で２４時間培養しビフィズス菌発酵乳を得た。また同様にプレート殺菌した脱脂粉乳溶液（ＳＮＦ１７．４％）にストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４の前培養液を０．５％接種し、３７℃で２４時間培養し乳酸菌発酵乳を得た。これらの菌液を混合し、還元麦芽糖水あめ、ポリデキストロース、ガラクトオリゴ糖、乳化鉄、アスパルテームなどを混合したシロップ溶液を調合し、発酵乳を得た。
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５は、経口摂取による皮膚性状改善作用（ＴＥＷＬ、水分含量、皮溝・皮丘数等）において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２と同等の効果を奏することを確認しており、本実施例の発酵乳には本願発明の皮膚性状改善作用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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