(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＤＬＬ４に結合することができる抗原結合ドメインを含む結合タンパク質であって、抗原結合ドメインがＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の６つのＣＤＲを含み、前記６つのＣＤＲのアミノ酸配列が、下記（ａ）〜（ｉ）である、前記結合タンパク質：
（ａ）配列番号１３７（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１３８（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１３９（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号２４９（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号２５０（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号２５１（ＣＤＲ−Ｌ３）；
（ｂ）配列番号１５７（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１５９（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号２６９（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号２７０（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号２７１（ＣＤＲ−Ｌ３）；
（ｃ）配列番号１７３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１７４（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１７５（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号２７３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号２７４（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号２７５（ＣＤＲ−Ｌ３）；
（ｄ）配列番号１７７（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１７８（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１７９（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号２７７（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号２７８（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号２７９（ＣＤＲ−Ｌ３）；
（ｅ）配列番号１８５（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１８６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１８７（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号２９３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号２９４（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号２９５（ＣＤＲ−Ｌ３）；
（ｆ）配列番号１８９（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９０（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１９１（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号２８１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号２８２（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号２８３（ＣＤＲ−Ｌ３）；
（ｇ）配列番号２０１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２０２(ＣＤＲ−Ｈ２)、配列番号２０３(ＣＤＲ−Ｈ３)、配列番号２８５(ＣＤＲ−Ｌ１)、配列番号２８６(ＣＤＲ−Ｌ２)および配列番号２８７(ＣＤＲ−Ｌ３)；
（ｈ）配列番号３５８の残基３１−３７番(ＣＤＲ−Ｈ１)、配列番号３５８の残基５２−６７番(ＣＤＲ−Ｈ２)、配列番号３５８の残基１００−１１０番(ＣＤＲ−Ｈ３)、配列番号３５９の残基２３−３３番(ＣＤＲ−Ｌ１)、配列番号３５９の残基４９−５５番(ＣＤＲ−Ｌ２)および配列番号３５９の残基８８−９６番(ＣＤＲ−Ｌ３)；
または
（ｉ）配列番号３６０の残基３１−３７番(ＣＤＲ−Ｈ１)、配列番号３６０の残基５２−６７番(ＣＤＲ−Ｈ２)、配列番号３６０の残基１００−１１０番(ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号３６１の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号３６１の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号３６１の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）。
【請求項２】
さらに、ヒトアクセプターフレームワークを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７および配列番号９８
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
前記結合タンパク質が、２つの可変ドメインを含み、前記２つの可変ドメインのアミノ酸配列が、
配列番号１３６および２４８を含む、配列番号１５６および２６８を含む、配列番号１７２および２７２を含む、配列番号１７６および２７６を含む、配列番号１８４および２９２を含む、配列番号１８８および２８０を含む、又は配列番号２００および２８４を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
さらに、ヒトＩｇＭ定常ドメイン；ヒトＩｇＧ１定常ドメイン；ヒトＩｇＧ２定常ドメイン；ヒトＩｇＧ３定常ドメイン；ヒトＩｇＧ４定常ドメイン；ヒトＩｇＥ定常ドメインおよびヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される、重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
重鎖免疫グロブリン定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１定常ドメインであり、前記ヒトＩｇＧ１定常ドメインが、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
さらに、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含み、前記軽鎖免疫グロブリン定常ドメインが、アミノ酸配列の配列番号４を含むヒトＩｇκ定常ドメインである、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
さらに、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含み、前記軽鎖免疫グロブリン定常ドメインが、アミノ酸配列の配列番号５を含むヒトＩｇλ定常ドメインである、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
前記結合タンパク質が、免疫グロブリン分子、ｓｃＦｖ、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異的抗体、二特異的抗体、二重特異的抗体および二重可変ドメイン結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
前記結合タンパク質がヒト抗体または二重可変ドメイン結合タンパク質である、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、Ｎｏｔｃｈ−４およびそれらの組合せからなる群から選択されるＮｏｔｃｈタンパク質との、ＤＬＬ４の相互作用をブロックすることが可能である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
Ｎｏｔｃｈ−１およびＮｏｔｃｈ−４との、ＤＬＬ４の相互作用をブロックすることが可能である、請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
ＤＬＬ４を中和することが可能である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、正常な血管新生を減少することが可能である、結合タンパク質。
【請求項１５】
前記結合タンパク質が、最大で１０−７Ｍ；最大で１０−８Ｍ；最大で１０−９Ｍ；最大で１０−１０Ｍ；最大で１０−１１Ｍ；最大で１０−１２Ｍ；および最大で１０−１３Ｍからなる群から選択される解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含み、前記結合タンパク質が検出可能な標識にコンジュゲートされている、標識結合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含むコンジュゲートであって、治療薬または細胞傷害性薬にコンジュゲートされている、前記抗体コンジュゲート。
【請求項１８】
治療薬または細胞傷害性薬が、抗代謝薬、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生薬、抗有糸分裂薬、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス薬からなる群から選択される、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される真核細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
真核細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、または酵母細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
結合タンパク質を作製する方法であって、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、培地中で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法に従って作製される結合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質と、医薬として許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
さらに、ＤＬＬ４活性が有害である障害を治療するための少なくとも１つの追加の治療剤を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
追加の治療剤が、血管新生阻害剤；キナーゼ阻害剤；共刺激分子遮断剤；接着分子遮断剤；抗サイトカイン抗体；メトトレキサート；コルチコステロイド；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；および非ステロイド系抗炎症薬からなる
群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ヒトＤＬＬ４活性を減少させるための医薬組成物であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させることを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
ＤＬＬ４活性が有害である障害を患っているヒト対象において、ヒトＤＬＬ４活性を減少させるための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
障害が、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌、女性生殖路癌、男性生殖路癌、内分泌腺癌、皮膚癌、血管腫、悪性黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血性悪性病変から生じる固形腫瘍、腫瘍転移、目の血管新生、浮腫、関節リウマチ、多発性硬化症、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水症、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、および膵炎、多嚢胞性卵巣疾患（ＰＯＤ）、子宮内膜症、子宮筋腫、良性前立腺肥大症、並びに異常なＤＬＬ４活性により特徴付けられる他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ＤＬＬ４が有害である障害の治療において使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む医薬組成物であって、
前記結合タンパク質は、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合することができる抗体；メトトレキサート；ヒトＴＮＦに結合することができる抗体；コルチコステロイド、シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；および非ステロイド系抗炎症薬からなる群から選択される第二の作用物質を投与する前、同時、または後に投与することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３４】
ヒトＤＬＬ４に結合可能である結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が抗体またはその抗原結合部分であり、前記抗体が
配列番号１５６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン、
配列番号２６８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン
を含む、前記結合タンパク質。
【請求項３５】
さらに、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン定常ドメイン、および配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項３４に記載の結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年８月２９日提出の米国特許仮出願第６１／２３８，１５２号の、および２００９年１１月１６日提出の米国特許仮出願第６１／２６１，７２８号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、癌、腫瘍および／または目の血管新生などの他の血管新生依存性疾患、または自己免疫疾患などの異常なＤＬＬ４発現もしくは活性により特徴付けられる血管新生非依存性疾患の抑制、予防および／または治療における改良されたＤＬＬ４結合タンパク質の開発および使用およびその使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
分化、増殖およびホメオスタシスなどの多くの生物学的過程には細胞間情報交換が必要である。広範囲な真核生物により利用されている１つのシステムは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路である。この経路、特にＮｏｔｃｈ受容体は、機能的腫瘍血管新生にとり極めて重要でもある。したがって、Ｎｏｔｃｈ受容体機能の抑制、Ｎｏｔｃｈ受容体の遮断、および／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の遮断は、抗癌組成物および療法のための潜在的戦略である。Ｎｏｔｃｈ受容体の小分子阻害剤は、身体全体でＮｏｔｃｈ受容体の野生型（正常）組織発現を抑制するために有毒であることが判明している。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の異なるメンバーは、治療薬のための潜在的標的であると見なされるべきである。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈ受容体の血管系リガンドは、デルタ４またはデルタ様４（ＤＬＬ４）である。大部分が血管系において発現されているが、ＤＬＬ４は血管発生には極めて重要である（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３（２４）：７２４３−７２４６頁（２００７）；Ｓｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４（１１）：１３１３−１３１８頁（２０００）；Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（４５）：１５９４９−１５９５４頁（２００４）；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４（１１）：１３４３−１３５２頁（２０００））。ＤＬＬ４がヘテロ接合性のマウスは、血管発生における大きな欠損のせいで胎児期に致命的である（Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（４５）：１５９４９−１５９５４頁（２００４）；Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１８（２０）：２４７４−２４７８頁（２００４）；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１８（２０）：２４６９−２４７３頁（２００４））。ＤＬＬ４の発現はＶＥＧＦにより誘導することが可能である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２３（１）：１４−２５頁（２００３）；Ｌｏｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４（９）：３２１９−３２２４頁（２００７））。次に、ＤＬＬ４は、一部にはＶＥＧＦＲ２を抑圧しＶＥＧＲ１を誘導することを通じて、ＶＥＧＦシグナル伝達を否定的に調節することが可能である（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、７５（２）：１４４−１５４頁（２００８）；Ｓｕｃｈｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４（９）：３２２５−３２３０頁（２００７））。ＤＬＬ４とＶＥＧＦの間の精巧な調整は、機能的血管新生には不可欠である。
【０００５】
その生理学的役割に加えて、ＤＬＬ４は腫瘍血管において上方調節されている（Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（４５）：１５９４９−１５９５４頁（２００４）；Ｍａｉｌｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、６９（２−３）：１３５−１４４頁（２００１）；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６５（１９）：８６９０−８６９７頁（２００５）；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１２（１６）：４８３６−４８４４頁（２００６）；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０３２−１０３７頁（２００６））。ＤＬＬ４の遮断は、複数のモデルにおいて原発性腫瘍増殖を強力に抑制した（Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０３２−１０３７頁（２００６）；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０８３−１０８７頁（２００６）；Ｓｃｅｈｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、１０９（１１）：４７５３−４７６０頁（２００７））。ＤＬＬ４の抑制は、抗ＶＥＧＦ療法に抵抗性である腫瘍に対して効果的でさえあった。ＤＬＬ４とＶＥＧＦ両方の組合せ的抑制は、増強された抗腫瘍活性を与えた。興味深いのは、腫瘍血管形成を減少させるＶＥＧＦ抑制と違って、ＤＬＬ４遮断により、腫瘍血管密度が増加して、血管が異常になり、十分な血液輸送を支えることができず、効果的に非機能的になる。このように、ＤＬＬ４は癌治療に潜在的標的を提供する。
【０００６】
ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ経路を標的にし、それによって腫瘍血管新生および増殖を抑制する、または予防さえすることができる治療薬の必要性が当技術分野には存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３（２４）：７２４３−７２４６頁（２００７）
【非特許文献２】Ｓｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４（１１）：１３１３−１３１８頁（２０００）
【非特許文献３】Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（４５）：１５９４９−１５９５４頁（２００４）
【非特許文献４】Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１４（１１）：１３４３−１３５２頁（２０００）
【非特許文献５】Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１８（２０）：２４７４−２４７８頁（２００４）
【非特許文献６】Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１８（２０）：２４６９−２４７３頁（２００４）
【非特許文献７】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２３（１）：１４−２５頁（２００３）
【非特許文献８】Ｌｏｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４（９）：３２１９−３２２４頁（２００７）
【非特許文献９】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、７５（２）：１４４−１５４頁（２００８）
【非特許文献１０】Ｓｕｃｈｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４（９）：３２２５−３２３０頁（２００７）
【非特許文献１１】Ｍａｉｌｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、６９（２−３）：１３５−１４４頁（２００１）
【非特許文献１２】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６５（１９）：８６９０−８６９７頁（２００５）
【非特許文献１３】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１２（１６）：４８３６−４８４４頁（２００６）
【非特許文献１４】Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０３２−１０３７頁（２００６）
【非特許文献１５】Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４４（７１２２）：１０８３−１０８７頁（２００６）
【非特許文献１６】Ｓｃｅｈｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、１０９（１１）：４７５３−４７６０頁（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＤＬＬ４に結合することができる抗体、ＣＤＲ移植された抗体およびこの結合断片を含む、ＤＬＬ４に結合するタンパク質を提供する。好ましくは、本明細書に記載される結合タンパク質は高親和性でＤＬＬ４に結合する。さらに好ましくは、本発明に従った結合タンパク質はＤＬＬ４を中和することができる。本発明は、ヒトＤＬＬ４結合タンパク質を含む、ＤＬＬ４結合タンパク質を作製し使用する方法も提供する。有利には、本発明は、ヒト化ＤＬＬ４結合タンパク質を調製する必要性をなくし、それによってヒト化ＤＬＬ４結合タンパク質に伴う面倒を取り除く。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号９９）、
（Ｘ１はＳまたはＮであり；
Ｘ２はＳ、ＧまたはＮであり；
Ｘ３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＧまたはＲであり；
Ｘ４はＹであり；
Ｘ５はＹまたはＨであり；
Ｘ６はＷであり；および
Ｘ７はＧである。）；
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号１００）、
（Ｘ１はＤであり；
Ｘ２はＩであり；
Ｘ３はＹ、ＮまたはＳであり；
Ｘ４はＹであり；
Ｘ５はＴ、Ｎ、Ａ、Ｉ、ＳまたはＲであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＳ、Ｎ、ＴまたはＧであり；
Ｘ８はＴであり；
Ｘ９はＹであり；
Ｘ１０はＹであり
Ｘ１１はＮであり；
Ｘ１２はＰであり；
Ｘ１３はＳであり；
Ｘ１４はＬであり；
Ｘ１５はＫであり；および
Ｘ１６はＳ、Ｎ、ＤまたはＧである。）；
ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１０１）、
（Ｘ１はＥ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｗ、ＬまたはＡであり；
Ｘ２はＤ、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、ＥまたはＮであり；
Ｘ３はＶ、Ｍ、Ｌ、ＰまたはＡであり；
Ｘ４はＩ、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、ＭまたはＥであり；
Ｘ５はＬ、Ｙ、ＦまたはＭであり；
Ｘ６はＲ、Ｇ、Ｓ、ＱまたはＡであり；
Ｘ７はＧであり；
Ｘ８はＧ、ＡまたはＳであり；
Ｘ９はＳ、Ａ、Ｌ、Ｖ、ＲまたはＧであり；
Ｘ１０はＤであり；および
Ｘ１１はＹ、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｃ、Ｉ、Ｍ、Ｔ、ＱまたはＫである。）；
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１０２）、
（Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＧであり；
Ｘ３はＱ、ＥまたはＤであり；
Ｘ４はＲ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｋ、ＬまたはＴであり；
Ｘ５はＬであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＤまたはＥであり；
Ｘ８はＫであり；
Ｘ９はＹであり；
Ｘ１０はＡまたはＶであり；および
Ｘ１１はＳである。）；
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号１０３）、
（Ｘ１はＥまたはＱであり；
Ｘ２はＤであり；
Ｘ３はＳ、Ｌ、Ｔ、Ａ、ＥまたはＦであり；
Ｘ４はＫ、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＭであり；
Ｘ５はＲであり；
Ｘ６はＰであり；および
Ｘ７はＳである。）；
ならびに
ＣＤＲ−Ｌ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０４）、
（Ｘ１はＱであり；
Ｘ２はＡであり；
Ｘ３はＷであり；
Ｘ４はＤであり；
Ｘ５はＲ、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、ＧまたはＫであり；
Ｘ６はＤまたはＥであり；
Ｘ７はＴ、Ｖ、Ａ、ＳまたはＭであり；
Ｘ８はＧ、ＡまたはＣであり；および
Ｘ９はＶである。）
からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数のＣＤＲを含む、ヒトＤＬＬ４に結合することができる抗原結合ドメインを含む結合タンパク質に関する。
【００１０】
好ましくは、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質の抗原結合ドメインは、配列番号１の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号１１１の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号１１１の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号１１１の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号１１７（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１１８（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１１９（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１２１（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１２２（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１２３（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１２５（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１２６（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１２７（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１２９（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１３０（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１３１（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１３３（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１３４（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１３５（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１３７（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１３８（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１３９（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１４１（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１４２（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１４３（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１４５（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１４６（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１４７（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１４９（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１５０（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１５１（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１５３（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１５４（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１５５（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１５７（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１５８（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１５９（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１６１（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１６２（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１６３（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１６５（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１６６（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１６７（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１６９（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１７０（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１７１（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１７３（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１７４（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１７５（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１７７（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１７８（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１７９（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１８１（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１８２（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１８３（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１８５（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１８６（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１８７（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１８９（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１９０（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１９１（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１９３（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１９４（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１９５（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号１９７（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１９８（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１９９（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号２０１（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号２０２（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号２０３（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号２０５（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号２０６（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号２０７（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号２０９（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号２１０（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号２１１（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号２１３（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号２１４（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号２１５（ＣＤＲ−Ｈ３）；配列番号２１７（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２１８（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２１９（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２２１（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２２２（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２２３（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２２５（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２２６（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２２７（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２２９（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２３０（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２３１（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２３３（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２３４（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２３５（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２３７（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２３８（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２３９（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２４１（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２４２（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２４３（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２４５（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２４６（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２４７（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２４９（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２５０（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２５１（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２５３（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２５４（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２５５（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２５７（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２５８（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２５９（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２６１（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２６２（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２６３（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２６５（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２６６（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２６７（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２６９（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２７０（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２７１（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２７３（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２７４（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２７５（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２７７（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２７８（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２７９（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２８１（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２８２（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２８３（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２８５（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２８６（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２８７（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２８９（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２９０（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２９１（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２９３（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２９４（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２９５（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号２９７（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号２９８（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号２９９（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号３０１（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３０２（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３０３（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号３０５（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３０６（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３０７（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号３０９（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３１０（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３１１（ＣＤＲ−Ｌ３）；配列番号３１３（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３１４（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３１５（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３４の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３３４の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３３４の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３３５の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３５の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３５の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３６の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３３６の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３３６の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３３７の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３７の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３７の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３８の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３３８の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３３８の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３３９の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３９の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３９の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３４０の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３４０の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３４０の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３４１の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３４１の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３４１の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３４２の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３４２の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３４２の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３４３の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３４３の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３４３の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３４４の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３４４の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３４４の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３４５の残基２４−３４番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３４５の残基５０−５６番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３４５の残基８９−９７番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３４６の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３４６の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３４６の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３４７の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３４７の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３４７の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３４８の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３４８の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３４８の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３４９の残基２４−３４番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３４９の残基５０−５６番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３４９の残基８９−９７番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３５０の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３５０の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３５０の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３５１の残基２４−３４番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３５１の残基５０−５６番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３５１の残基８９−９７番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３５２の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３５２の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３５２の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３５３の残基２４−３４番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３５３の残基５０−５６番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３５３の残基８９−９７番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３５４の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３５４の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３５４の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３５５の残基２４−３４番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３５５の残基５０−５６番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３５５の残基８９−９７番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３５６の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３５６の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３５６の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３５７の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３５７の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３５７の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３５８の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３５８の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３５８の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３５９の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３５９の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３５９の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３６０の残基３１−３７番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３６０の残基５２−６７番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３６０の残基１００−１１０番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３６１の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３６１の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３６１の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００１１】
別の実施形態では、前記結合タンパク質は上に開示される少なくとも３つのＣＤＲを含む。
【００１２】
好ましくは、本発明に従ったＤＬＬ４結合タンパク質は、上に開示される１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに好ましくは、前記結合タンパク質は上に開示される３つまたはそれより多いＣＤＲを含む。最も好ましくは、本発明に従ったＤＬＬ４結合タンパク質は、上記の６つのＣＤＲ、すなわち、上記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００１３】
好ましい実施形態では、前記結合タンパク質は、上に開示される配列からなる群から選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む。
【００１４】
さらに好ましくは、前記結合タンパク質は、下の群から選択される一組の可変ドメインＣＤＲから選択される３つのＣＤＲを含む。
ＶＨ  Ｅ９  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１１１の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１１１の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１１１の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９．４  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１１７
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１１８
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１１９
ＶＬ  Ｅ９．４  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２２９
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２３０
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２３１
ＶＨ  Ｅ９．１１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１２３
ＶＬ  Ｅ９．１１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２３３
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２３４
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２３５
ＶＨ  Ｅ９．１４  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２５
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２６
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１２７
ＶＬ  Ｅ９．１４  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２３７
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２３８
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２３９
ＶＨ  Ｅ９．１７  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２９
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１３０
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１３１
ＶＬ  Ｅ９．１７  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２４１
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２４２
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２４３
ＶＨ  Ｅ９．１８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１３３
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１３４
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１３５
ＶＬ  Ｅ９．１８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２４５
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２４６
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２４７
ＶＨ  Ｅ９．１９  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１３７
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１３８
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１３９
ＶＬ  Ｅ９．１９  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２４９
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２５０
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２５１
ＶＨ  Ｅ９．２２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１４１
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１４２
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１４３
ＶＬ  Ｅ９．２２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２５３
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２５４
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２５５
ＶＨ  Ｅ９．４８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１４５
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１４６
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１４７
ＶＬ  Ｅ９．４８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２５７
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２５８
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２５９
ＶＨ  Ｅ９．６５  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１４９
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１５０
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１５１
ＶＬ  Ｅ９．６５  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２６１
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２６２
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２６３
ＶＨ  Ｅ９．６６  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１５３
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１５４
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１５５
ＶＬ  Ｅ９．６６  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２６５
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２６６
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２６７
ＶＨ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１５７
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１５８
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１５９
ＶＬ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２６９
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２７０
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２７１
ＶＨ  Ｅ９．１３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１６１
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１６２
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１６３
ＶＬ  Ｅ９．１３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２１７
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２１８
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２１９
ＶＨ  Ｅ９．１６  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１６５
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１６６
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１６７
ＶＬ  Ｅ９．１６  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２２１
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２２２
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２２３
ＶＨ  Ｅ９．３８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１６９
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１７０
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１７１
ＶＬ  Ｅ９．３８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２２５
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２２６
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２２７
ＶＨ  Ｅ９．２Ｂ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１７３
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１７４
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１７５
ＶＬ  Ｅ９．２Ｂ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２７３
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２７４
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２７５
ＶＨ  Ｅ９．１Ｆ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１７７
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１７８
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１７９
ＶＬ  Ｅ９．１Ｆ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２７７
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２７８
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２７９
ＶＨ  Ｅ９．１０Ｈ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１８１
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１８２
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１８３
ＶＬ  Ｅ９．１０Ｈ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３０１
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３０２
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３０３
ＶＨ  Ｅ９．５Ｅ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１８５
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１８６
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１８７
ＶＬ  Ｅ９．５Ｅ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２９３
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２９４
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２９５
ＶＨ  Ｅ９．１０Ｃ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１８９
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１９０
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９１
ＶＬ  Ｅ９．１０Ｃ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２８１
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２８２
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２８３
ＶＨ  Ｅ９．７Ｅ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１９３
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１９４
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９５
ＶＬ  Ｅ９．７Ｅ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２８９
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２９０
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２９１
ＶＨ  Ｅ９．１２Ｂ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１９７
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１９８
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９９
ＶＬ  Ｅ９．１２Ｂ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２９７
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２９８
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２９９
ＶＨ  Ｅ９．１０Ｅ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２０１
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２０２
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２０３
ＶＬ  Ｅ９．１０Ｅ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２８５
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２８６
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２８７
ＶＨ  Ｅ９．６Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２０５
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２０６
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２０７
ＶＬ  Ｅ９．６Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３０５
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３０６
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３０７
ＶＨ  Ｅ９．７Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２０９
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２１０
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２１１
ＶＬ  Ｅ９．７Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３０９
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３１０
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３１１
ＶＨ  Ｅ９．８Ｈ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２１３
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２１４
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２１５
ＶＬ  Ｅ９．８Ｈ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３１３
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３１４
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３１５
ＶＨ  Ｅ９．１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３３４の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３３４の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３３４の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９．１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３５の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３５の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３５の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３３６の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３３６の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３３６の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３７の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３７の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３７の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３３８の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３３８の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３３８の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３９の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３９の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３９の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３４０の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３４０の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３４０の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３４１の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３４１の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３４１の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ４  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３４２の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３４２の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３４２の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ４  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３４３の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３４３の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３４３の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ５  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３４４の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３４４の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３４４の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ５  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３４５の残基２４−３４番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３４５の残基５０−５６番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３４５の残基８９−９７番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ６  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３４６の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３４６の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３４６の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ６  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３４７の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３４７の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３４７の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ７  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３４８の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３４８の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３４８の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ７  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３４９の残基２４−３４番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３４９の残基５０−５６番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３４９の残基８９−９７番
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３５０の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３５０の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３５０の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＳＥ８  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３５１の残基２４−３４番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３５１の残基５０−５６番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３５１の残基８９−９７番
ＶＨ  Ｅ９−ＦＲ１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３５２の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３５２の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３５２の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＦＲ１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３５３の残基２４−３４番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３５３の残基５０−５６番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３５３の残基８９−９７番
ＶＨ  Ｅ９−ＦＲ２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３５４の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３５４の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３５４の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９−ＦＲ２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３５５の残基２４−３４番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３５５の残基５０−５６番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３５５の残基８９−９７番
ＶＨ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３５６の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３５６の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３５６の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３５７の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３５７の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３５７の残基８８−９６番
ＶＬ  Ｅ９．７１（Ｍ）ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３５８の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３５８の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３５８の残基１００−１１０番
ＶＬ  Ｅ９．７１（Ｍ）ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３５９の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３５９の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３５９の残基８８−９６番
ＶＨ  Ｅ９．７１（Ｌ）ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３６０の残基３１−３７番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３６０の残基５２−６７番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３６０の残基１００−１１０番
ＶＨ  Ｅ９．７１（Ｌ）ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３６１の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３６１の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３６１の残基８８−９６番
別の実施形態では、結合タンパク質は、上の群における３つのＣＤＲの任意のＶＨ組から選択される３つのＣＤＲの可変重鎖（ＶＨ）組および上の群における３つのＣＤＲの任意のＶＬ組から選択される３つのＣＤＲの可変軽鎖（ＶＬ）組を含む。
【００１５】
さらに別の実施形態では、結合タンパク質は、下の群からの名前を付けられた３つのＣＤＲのＶＨ組および対応する名前を付けられた３つのＣＤＲのＶＬ組を含む。好ましくは、本発明に従った結合タンパク質は、
ＶＨ  Ｅ９  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．４  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．４  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１１  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１１  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１４  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１４  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１７  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１７  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１８  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１８  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１９  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１９  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．２２  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．２２  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．４８  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．４８  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．６５  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．６５  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．６６  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．６６  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１３  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１３  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１６  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１６  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．３８  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．３８  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．２Ｂ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．２Ｂ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１Ｆ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１Ｆ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１０Ｈ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１０Ｈ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．５Ｅ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．５Ｅ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１０Ｃ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１０Ｃ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．７Ｅ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．７Ｅ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１２Ｂ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１２Ｂ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．１０Ｅ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．１０Ｅ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．６Ａ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．６Ａ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．７Ａ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．７Ａ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．８Ｈ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．８Ｈ  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ１  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ１  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ２  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ２  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ３  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ３  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ４  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ４  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ５  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ５  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ６  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ６  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ７  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ７  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＳＥ８  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＳＥ８  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＦＲ１  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＦＲ１  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９−ＦＲ２  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９−ＦＲ２  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．７１  ＣＤＲ組、
ＶＨ  Ｅ９．７１（Ｍ）ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．７１（Ｍ）ＣＤＲ組、および
ＶＨ  Ｅ９．７１（Ｌ）ＣＤＲ組およびＶＬ  Ｅ９．７１（Ｌ）ＣＤＲ組
からなる可変ドメインＣＤＲ組の群から選択される少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲ組を含む。
【００１６】
さらに別の実施形態では、上記の結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。好ましくは、前記ヒトアクセプターフレームワークは、
重鎖アクセプターフレームワーク配列、配列番号６−２２、
重鎖アクセプター配列、配列番号３５−６２、
軽鎖アクセプター配列、配列番号２３−３４および
軽鎖アクセプター配列、配列番号６３−９８
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の実施形態では、上記結合タンパク質は、フレームワークのアミノ酸配列が前記ヒトアクセプターフレームワークの配列に少なくとも６５％同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークに同一の少なくとも７０アミノ酸残基を含む、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワークを含む。
【００１８】
別の実施形態では、本明細書に記載される結合タンパク質は、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
ヒトＤＬＬ４と相互作用をすることができる残基；
カノニカル残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基；
バーニヤ（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン内の残基；および
コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）定義された可変重鎖ＣＤＲ１とカバット（Ｋａｂａｔ）定義された第一の重鎖フレームワーク間を重複する領域における残基
からなる群から選択されるキーとなる残基に少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワークを含む。
【００１９】
好ましくは、キーとなる残基は２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、２６Ｈ、２７Ｈ、２９Ｈ、３４Ｈ、３５Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４４Ｈ、４５Ｈ、４７Ｈ、４８Ｈ、４９Ｈ、５０Ｈ、５１Ｈ、５８Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、６３Ｈ、６７Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９３Ｈ、９４Ｈ、２Ｌ、４Ｌ、２５Ｌ、２９Ｌ、２７ｂＬ、３３Ｌ、３４Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、４６Ｌ、４７Ｌ、４８Ｌ、４９Ｌ、５５Ｌ、５８Ｌ、６２Ｌ、６４Ｌ、７１Ｌ、８７Ｌ、８９Ｌ、９０Ｌ、９１Ｌ、９４Ｌ、９５Ｌからなる群から選択される。
【００２０】
別の実施形態では、本明細書に記載される結合タンパク質は、コンセンサスヒト可変ドメインを含む。
【００２１】
好ましい実施形態では、上記結合タンパク質は、配列番号１、１１１、１１６、２２８、１２０、２３２、１２４、２３６、１２８、２４０、１３２、２４４、１３６、２４８、１４０、２５２、１４４、２５６、１４８、２６０、１５２、２６４、１５６、２６８、１６０、２１６、１６４、２２０、１６８、２２４、１７２、２７２、１７６、２７６、１８０、３００、１８４、２９２、１８８、２８０、１９２、２８８、１９６、２９６、２００、２８４、２０４、３０４、２０８、３０８、２１２、３１２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、および３６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明に従った結合タンパク質は、配列番号１および１１１、配列番号１１６および２２８、配列番号１２０および２３２、配列番号１２４および２３６、配列番号１２８および２４０、配列番号１３２および２４４、配列番号１３６および２４８、配列番号１４０および２５２、配列番号１４４および２５６、配列番号１４８および２６０、配列番号１５２および２６４、配列番号１５６および２６８、配列番号１６０および２１６、配列番号１６４および２２０、配列番号１６８および２２４、配列番号１７２および２７２、配列番号１７６および２７６、配列番号１８０および３００、配列番号１８４および２９２、配列番号１８８および２８０、配列番号１９２および２８８、配列番号１９６および２９６、配列番号２００および２８４、配列番号２０４および３０４、配列番号２０８および３０８、配列番号２１２および３１２、配列番号３３４および３３５、配列番号３３６および３３７、配列番号３３８および３３９、配列番号３４０および３４１、配列番号３４２および３４３、配列番号３４４および３４５、配列番号３４６および３４７、配列番号３４８および３４９、配列番号３５０および３５１、配列番号３５２および３５３、配列番号３５４および３５５、配列番号３５６および３５７、配列番号３５８および３５９、配列番号３６０および３６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２つの可変ドメインを含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明に従った結合タンパク質は、好ましくは、
配列番号１、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、３３４、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８および３６０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００２４】
さらに別の実施形態では、本発明に従った結合タンパク質は、好ましくは、
配列番号１１１、２２８、２３２、２３６、２４０、２４４、２４８、２５２、２５６、２６０、２６４、２６８、２１６、２２０、２２４、２７２、２７６、３００、２９２、２８０、２８８、２９６、２８４、３０４、３０８、３１２、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９および３６１
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明に従った結合タンパク質は、好ましくは、ＶＨおよびＶＬが上に開示される配列のうちのいずれかである、ＶＨおよびＶＬを含む。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、
配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ定常重領域；
配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ定常軽領域；
配列番号１、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、３３４、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８および３６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ可変重領域；ならびに
配列番号１１１、２２８、２３２、２３６、２４０、２４４、２４８、２５２、２５６、２６０、２６４、２６８、２１６、２２０、２２４、２７２、２７６、３００、２９２、２８０、２８８、２９６、２８４、３０４、３０８、３１２、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９および３６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ可変軽領域
を含む、ヒトＤＬＬ−４に結合することができる結合タンパク質を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様は、ヒトＤＬＬ４に結合することができる抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１０５）、
（Ｘ１はＳ、ＮまたはＤであり；
Ｘ２はＨまたはＹであり；
Ｘ３はＷであり；
Ｘ４はＭであり； 
Ｘ５はＳまたはＨである。）；
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号１０６）、
（Ｘ１はＩ、Ｄ、ＭまたはＴであり；
Ｘ２はＩであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＹ、Ｎ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｔ、ＨまたはＤであり；
Ｘ５はＤであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＳ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、ＨまたはＮであり；
Ｘ８はＮ、Ｙ、Ｓ、ＩまたはＴであり；
Ｘ９はＫ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、ＡまたはＬであり；
Ｘ１０はＹ、ＤまたはＥであり
Ｘ１１はＳまたはＹであり；
Ｘ１２はＡであり；
Ｘ１３はＤであり；
Ｘ１４はＳであり；
Ｘ１５はＶであり；
Ｘ１６はＫであり；および
Ｘ１７はＧである。）；
ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号１０７）、
（Ｘ１はＡであり；
Ｘ２はＧ、ＡまたはＲであり；
Ｘ３はＧであり；
Ｘ４はＧ、ＳまたはＡであり；
Ｘ５はＮであり；
Ｘ６はＶまたはＭであり；
Ｘ７はＧであり；
Ｘ８はＦ、Ｌ、ＹまたはＭであり；
Ｘ９はＤであり；および
Ｘ１０はＩ、ＳまたはＬである。）；
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１０８）、
（Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＡまたはＧであり；
Ｘ３はＤであり；
Ｘ４はＫ、Ｎ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
Ｘ５はＬであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＴ、Ｓ、Ｎ、Ａ、ＧまたはＥであり；
Ｘ８はＫ、Ｑ、ＮまたはＲであり；
Ｘ９はＹであり；
Ｘ１０はＶまたはＩであり；
Ｘ１１はＳである。）；
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号１０９）、
（Ｘ１はＱであり；
Ｘ２はＤであり；
Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｗ、ＳまたはＤであり；
Ｘ４はＫ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、ＩまたはＥであり；
Ｘ５はＲであり；
Ｘ６はＰであり；および
Ｘ７はＳである。）；
ならびに
ＣＤＲ−Ｌ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１１０）、
（Ｘ１はＱであり；
Ｘ２はＳまたはＡであり；
Ｘ３はＷであり；
Ｘ４はＤであり；
Ｘ５はＲ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、ＷまたはＭであり；
Ｘ６はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、ＲまたはＴであり；
Ｘ７はＤまたはＧであり；
Ｘ８はＶ、Ａ、ＰまたはＥであり；および
Ｘ９はＶである。）；
からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数のＣＤＲを含む、結合タンパク質に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質の抗原結合ドメインは、
配列番号１１２の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号１１２の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号１１２の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号１１３の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号１１３の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号１１３の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３１６の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３１６の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３１６の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３１７の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３１７の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３１７の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３１８の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３１８の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３１８の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３１９の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３１９の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３１９の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２０の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２０の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２０の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２１の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２１の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２１の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２２の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２２の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２２の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２３の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２３の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２３の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２４の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２４の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２４の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２５の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２５の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２５の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２６の残基３１−３５番（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号３２６の残基５０−６６番（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３２６の残基９９−１０８番（ＣＤＲ−Ｈ３）；
配列番号３２７の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３２７の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３２７の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３２８の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３２８の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３２８の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３２９の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３２９の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３２９の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３０の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３０の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３０の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３１の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３１の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３１の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３２の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３２の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３２の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）；
配列番号３３３の残基２３−３３番（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号３３３の残基４９−５５番（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号３３３の残基８８−９６番（ＣＤＲ−Ｌ３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００２９】
別の実施形態では、前記結合タンパク質は上に開示される少なくとも３つのＣＤＲを含む。
【００３０】
好ましくは、本発明に従ったＤＬＬ４結合タンパク質は、上に開示される１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに好ましくは、前記結合タンパク質は上に開示される３つまたはそれより多いＣＤＲを含む。最も好ましくは、本発明に従ったＤＬＬ４結合タンパク質は、上記の６つのＣＤＲ、すなわち、上記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００３１】
好ましい実施形態では、前記結合タンパク質は、上に開示される配列からなる群から選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、結合タンパク質は、下の群から選択される一組の可変ドメインＣＤＲから選択される３つのＣＤＲを含む。
ＶＨ  Ａ１０  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１１２の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１１２の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１１２の残基９９−１０８番
ＶＬ  Ａ１０  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１１３の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１１３の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１１３の残基８８−９６番
ＶＨ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３１６の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３１６の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３１６の残基９９−１０８番
ＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３２７の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３２７の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３２７の残基８８−９６番
ＶＨ  Ａ１０．Ｋ３０  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３１７の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３１７の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３１７の残基９９−１０８番
ＶＨ  Ａ１０．Ｋ４２  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３１８の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３１８の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３１８の残基９９−１０８番
ＶＨ  Ａ１０．９Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３１９の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３１９の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３１９の残基９９−１０８番
ＶＨ  Ａ１０．８Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２０の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２０の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２０の残基９９−１０８番
ＶＨ  Ａ１０．１Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２１の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２１の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２１の残基９９−１０８番
ＶＨ  Ａ１０．５Ｄ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２２の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２２の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２２の残基９９−１０８番
ＶＨ  Ａ１０．３Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２３の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２３の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２３の残基９９−１０８番
ＶＬ  Ａ１０．３Ａ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３０の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３０の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３０の残基８８−９６番
ＶＨ  Ａ１０．６Ｂ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２４の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２４の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２４の残基９９−１０８番
ＶＬ  Ａ１０．６Ｂ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３１の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３１の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３１の残基８８−９６番
ＶＨ  Ａ１０．３Ｄ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２５の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２５の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２５の残基９９−１０８番
ＶＬ  Ａ１０．３Ｄ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３２の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３２の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３２の残基８８−９６番
ＶＨ  Ａ１０．４Ｃ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号３２６の残基３１−３５番
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号３２６の残基５０−６６番
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号３２６の残基９９−１０８番
ＶＬ  Ａ１０．４Ｃ  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３３３の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３３３の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３３３の残基８８−９６番
ＶＬ  Ａ１０．Ｌ４５  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３２８の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３２８の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３２８の残基８８−９６番
ＶＬ  Ａ１０．Ｌ７３  ＣＤＲ組
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３２９の残基２３−３３番
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３２９の残基４９−５５番
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号３２９の残基８８−９６番
別の実施形態では、結合タンパク質は、上の群における３つのＣＤＲの任意のＶＨ組から選択される３つのＣＤＲの可変重鎖（ＶＨ）組および上の群における３つのＣＤＲの任意のＶＬ組から選択される３つのＣＤＲの可変軽鎖（ＶＬ）組を含む。
【００３３】
さらに別の実施形態では、結合タンパク質は、下の群から３つのＣＤＲの名前を付けられたＶＨ組および３つのＣＤＲの対応する名前を付けられたＶＬ組を含む。好ましくは、本発明に従った結合タンパク質は、
ＶＨ  Ａ１０  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組：
ＶＨ  Ａ１０．３Ａ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３Ａ組；
ＶＨ  Ａ１０．６Ｂ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．６Ｂ組；
ＶＨ  Ａ１０．３Ｄ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３Ｄ  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．４Ｃ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．４Ｃ  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．Ｋ３０  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．Ｋ４２  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．Ｌ４５  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．Ｌ７３  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．９Ａ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．８Ａ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組；
ＶＨ  Ａ１０．１Ａ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組；および
ＶＨ  Ａ１０．５Ｄ  ＣＤＲ組およびＶＬ  Ａ１０．３  ＣＤＲ組からなる可変ドメインＣＤＲ組の群から選択される少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲ組を含む。
【００３４】
さらに別の実施形態では、上記の結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。好ましくは、前記ヒトアクセプターフレームワークは、
重鎖アクセプターフレームワーク配列、配列番号６−２２
重鎖アクセプター配列、配列番号３５−６２
軽鎖アクセプター配列、配列番号２３−３４および
軽鎖アクセプター配列、配列番号６３−９８
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
別の実施形態では、上記結合タンパク質は、フレームワークのアミノ酸配列が前記ヒトアクセプターフレームワークの配列に少なくとも６５％同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークに同一の少なくとも７０アミノ酸残基を含む少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む、ヒトアクセプターフレームワークを含む。
【００３６】
別の実施形態では、本明細書に記載される結合タンパク質は、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
ヒトＤＬＬ４と相互作用することができる残基；
カノニカル残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基；
バーニヤゾーン内の残基；および
コチア定義された可変重鎖ＣＤＲ１とカバット定義された第一重鎖フレームワーク間で重複する領域における残基
からなる群から選択されるキーとなる残基に少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワークを含む。好ましくは、前記キーとなる残基は、２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、２６Ｈ、２７Ｈ、２９Ｈ、３４Ｈ、３５Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４４Ｈ、４５Ｈ、４７Ｈ、４８Ｈ、４９Ｈ、５０Ｈ、５１Ｈ、５８Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、６３Ｈ、６７Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９３Ｈ、９４Ｈ、２Ｌ、４Ｌ、２５Ｌ、２９Ｌ、２７ｂＬ、３３Ｌ、３４Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、４６Ｌ、４７Ｌ、４８Ｌ、４９Ｌ、５５Ｌ、５８Ｌ、６２Ｌ、７１Ｌ、８７Ｌ、８９Ｌ、９０Ｌ、９１Ｌ、９４Ｌ、９５Ｌからなる群から選択される。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書に記載される結合タンパク質は、コンセンサスヒト可変ドメインを含む。
【００３８】
好ましい実施形態では、上記結合タンパク質は、配列番号１１２、１１３、３１６、３２７、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３３０、３２４、３３１、３２５、３３２、３２６、３３３、３２８および３２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。
【００３９】
別の実施形態では、上記結合タンパク質は、配列番号１１２および１１３、配列番号３１６および３２７、配列番号３２３および３３０、配列番号３２４および３３１、配列番号３２５および３３２ならびに配列番号３２６および３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２つの可変ドメインを含む。
【００４０】
一実施形態では、本発明に従った結合タンパク質は、好ましくは配列番号１１２、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明に従った結合タンパク質は、好ましくは配列番号１１３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２および３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、
配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ定常重領域；
配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ定常軽領域；
配列番号１１２、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５および３２６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ可変重領域ならびに
配列番号１１３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２および３３３
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ可変軽領域
を含む、
ヒトＤＬＬ−４に結合することができる結合タンパク質を提供する。
【００４３】
本発明に従えば、本明細書に記載されるＤＬＬ４結合タンパク質の可変重（ＶＨ）ドメインおよび可変軽（ＶＬ）ドメインは、本明細書に記載されるＶＨおよびＶＬドメインの様々な組合せを含む追加のＤＬＬ４結合タンパク質を作製し選択するために当技術分野で利用することができる組換え技法を使用してシャッフルしてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明に従ったＤＬＬ４結合タンパク質は、ヒトＤＬＬ４（ｈｕ  ＤＬＬ４）および少なくとも１つの他の種のＤＬＬ４に結合する。さらに好ましくは、本明細書に記載されるＤＬＬ４結合タンパク質は、ヒトＤＬＬ４ならびにマウスＤＬＬ４（ｍｕ  ＤＬＬ４）、カニクイザルＤＬＬ４（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ＤＬＬ４、ｃｙｎｏ  ＤＬＬ４）、ラットＤＬＬ４およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤＬＬ４に結合する。
【００４５】
別の実施形態では、ＤＬＬ４結合タンパク質は、完全なヒト抗体またはこの抗原結合部分である。
【００４６】
別の実施形態では、ＤＬＬ４結合タンパク質は、ＣＤＲ移植された抗体である。さらに好ましくは、ＤＬＬ４結合タンパク質は、ＣＤＲ移植された抗体または上記１つもしくは複数のＣＤＲを含むこの抗原結合部分である。
【００４７】
さらに好ましくは、前記ＣＤＲ移植された抗体またはこの抗原結合部分は、上記可変ドメインを含む。さらに好ましくは、ＣＤＲ移植された抗体またはこの抗原結合部分は、上記の２つの可変ドメインを含む。好ましくは、前記ＣＤＲ移植された抗体またはこの抗原結合部分は、ヒトアクセプターフレームワークを含む。さらに好ましくは、前記ヒトアクセプターフレームワークは、上記のヒトアクセプターフレームワークのいずれか１つである。
【００４８】
さらに好ましくは、結合タンパク質は、ヒトＤＬＬ４、マウスＤＬＬ４、カニクイザルＤＬＬ４、ラットＤＬＬ４およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤＬＬ４の活性を中和することができる。ＤＬＬ４の活性の中和を調べることは、当技術分野で公知のいくつかのインビトロおよびインビボアッセイを介して評価することが可能である。ＤＬＬ４活性の中和を評価するための例となるパラメータには、Ｎｏｔｃｈ受容体および／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路とのＤＬＬ４相互作用を約少なくとも１０−６Ｍ；少なくとも１０−７Ｍまたは少なくとも１０−８ＭのＩＣ５０値で抑制する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
一実施形態では、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１のＤＬＬ４に対する結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。好ましくは、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、１０２Ｍ−１ｓ−１から１０３Ｍ−１ｓ−１の間、１０３Ｍ−１ｓ−１から１０４Ｍ−１ｓ−１の間、１０４Ｍ−１ｓ−１から１０５Ｍ−１ｓ−１の間、または１０５Ｍ−１ｓ−１から１０６Ｍ−１ｓ−１の間のＤＬＬ４に対する結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００５０】
別の実施形態では、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、最大で約１０−３ｓ−１、最大で約１０−４ｓ−１、最大で約１０−５ｓ−１、または最大で約１０−６ｓ−１のＤＬＬ４に対する解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。好ましくは、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、１０−３ｓ−１から１０−４ｓ−１の、１０−４ｓ−１から１０−５ｓ−１の、または１０−５ｓ−１から１０−６ｓ−１のＤＬＬ４に対する解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の結合タンパク質は、最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ、最大で約１０−１２Ｍ、または最大で１０−１３ＭのＤＬＬ４に対する解離定数（ＫＤ）を有する。好ましくは、本発明の結合タンパク質は、１０−７Ｍから１０−８Ｍの、１０−８Ｍから１０−９Ｍの、１０−９Ｍから１０−１０Ｍの、１０−１０Ｍから１０−１１Ｍの、１０−１１Ｍから１０−１２Ｍの、または１０−１２Ｍから１０−１３ＭのＤＬＬ４に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００５２】
本発明の一実施形態は、上に開示されるＤＬＬ４結合タンパク質のいずれか１つおよびリンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインを含む抗体構築物を提供する。好ましい実施形態では、本発明に従った抗体構築物は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植された抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異的抗体、二重特異的抗体および二特異的抗体からなる群から選択される。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメインおよびヒトＩｇＡ定常ドメイン、ならびにＦｃガンマ受容体結合、ＦｃＲｎ結合、Ｃｌｑ結合を変更し得る、薬物動態特性および／またはＦｃエフェクター機能を変更し得る上記Ｉｇアイソタイプの変異体からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【００５４】
別の実施形態では、抗体構築物はグリコシル化されている。好ましくは、前記グリコシル化はヒトグリコシル化パターンである。
【００５５】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ４結合タンパク質は、作用物質にコンジュゲートされている。本発明の結合タンパク質コンジュゲートは、本明細書に記載される抗体構築物が作用物質にコンジュゲートしている抗体コンジュゲートを含む。好ましくは、前記作用物質は、免疫接着分子、造影剤、治療剤および細胞毒性剤からなる群から選択される。好ましい実施形態では、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される。さらに好ましくは、造影剤は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である。好ましい実施形態では、前記治療剤または細胞毒性剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス剤からなる群から選択される。
【００５６】
別の実施形態では、上に開示されるＤＬＬ４結合タンパク質、抗体構築物または結合タンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートを含む）は結晶として存在する。好ましくは、前記結晶は無担体医薬徐放結晶である。好ましい実施形態では、このような結晶化された結合タンパク質、結晶化された抗体構築物または結晶化された抗体コンジュゲートは、その可溶性相当物よりもインビボにおいて大きな半減期を有する。別の好ましい実施形態では、前記結晶化された結合タンパク質、結晶化された抗体構築物または結晶化された結合タンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートを含む）は、結晶化後、生物学的活性を保持している。
【００５７】
本発明の一態様は、ＤＬＬ４結合タンパク質、抗体構築物、ＤＬＬ４結合抗体コンジュゲートまたはこのＤＬＬ４結合部分をコードする単離された核酸に関する。特に好ましいのは、上記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含むポリペプチド、上記のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドまたは両ポリペプチドの組合せからなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸である。
【００５８】
追加の実施形態は、上に開示される単離された核酸を含むベクターを提供する。好ましい実施形態では、前記ベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０（２ｅ９）：１−９頁（２００２））、ｐＴＴ３（余分な複数のクローニング部位のあるｐＴＴ）、ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８（１７）：５３２２頁（１９９０））、ｐＨｙｂＥ、ｐＢＶ、ｐＪＶおよびｐＢＪならびに原核細胞または真核細胞に適している他の任意の発現ベクターからなる群から選択される。
【００５９】
本発明の別の態様では、上に開示されるベクターを用いて形質転換された宿主細胞が提供される。前記宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。好ましい原核宿主細胞はエシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。好ましくは、真核細胞は、原性生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。さらに好ましくは、前記宿主細胞は、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞である。好ましい真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるが、これに限定されない。好ましい昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００６０】
本発明の別の態様は、ヒトＤＬＬ４に結合する結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、上に開示される宿主細胞のいずれか１つを培地において培養するステップを含む、ヒトＤＬＬ４に結合する結合タンパク質を作製する方法を提供する。別の実施形態は、上に開示される方法に従って作製される結合タンパク質を提供する。
【００６１】
一実施形態は、次に上で開示される結晶化されたＤＬＬ４結合タンパク質、結晶化された抗体構築物または結晶化された結合タンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートを含む）および成分ならびにさらに少なくとも１つのポリマー担体を含む製剤を含む、本発明に従ったＤＬＬ４結合タンパク質を放出するための組成物を提供する。好ましくは、前記ポリマー担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリル酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）またはＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチラート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）、硫酸ポリサッカライド、これらの混合物およびコポリマーからなる群のうちの１つまたは複数から選択されるポリマーである。好ましくは、前記成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される。
別の実施形態は、上に開示される結晶化されたＤＬＬ４結合タンパク質、結晶化された抗体構築物または結晶化されたタンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートを含む）を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。
【００６２】
本発明は、上に開示されるＤＬＬ４結合タンパク質、抗体構築物または結合タンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートを含む）および医薬として許容される担体を含む医薬組成物も提供する。追加の実施形態では、前記医薬組成物は少なくとも１つの追加の作用物質を含む。前記追加の作用物質は、ＤＬＬ４が有害である障害を治療するための治療剤であり得る。好ましくは、医薬組成物は、治療剤、造影剤、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤（例えば、ＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チュブリン剤、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ジェムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン）、および受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、キナーゼ阻害剤および血管新生阻害剤（抗ＶＥＧＦ抗体もしくはＶＥＧＦトラップを含むがこれらに限定されない）；共刺激分子遮断剤（抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０抗体を含むがこれらに限定されない）；接着分子遮断剤（抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌ選択抗体、および小分子阻害剤を含むがこれらに限定されない）；抗サイトカイン抗体またはこの機能的断片（抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦおよび抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含むがこれらに限定されない）；メトトレキサート；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；検出可能な標識またはレポーター分子；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ剤；筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性医薬、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたはその類似体、サイトカイン、およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される追加の作用物質を含む。
【００６３】
別の態様では、本発明は、ヒトＤＬＬ４が阻害されるまたは中和されるように、ヒトＤＬＬ４を上に開示される結合タンパク質に接触させることを含む、ヒトＤＬＬ４活性を抑制するための方法を提供する。関連する態様では、本発明は、ヒト対象におけるヒトＤＬＬ４が阻害され治療が達成されるように、上に開示される結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、ＤＬＬ４が有害である障害に罹っているヒト対象においてＤＬＬ４活性を抑制するための方法を提供する。好ましくは、前記障害は、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱および尿路上皮を含む）、女性生殖路（子宮頚部、子宮および卵巣ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖路（前立腺、精嚢、精巣および生殖細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎および下垂体を含む）および皮膚の癌腫ならびに血管腫、悪性黒色腫、肉腫（骨および軟部組織から生じるものならびにカポジ肉腫を含む）、脳、神経、眼および髄膜の腫瘍（星状膠細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫および髄膜腫を含む）、白血病などの造血性悪性病変から生じる固形腫瘍およびリンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方）、腫瘍転移、目の血管新生（糖尿病性失明、網膜症、年齢誘発黄斑変性およびルベオーシスを含む）、浮腫、関節リウマチ、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化巣、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、熱傷および膵臓炎、多嚢胞性卵巣疾患（ＰＯＤ）、子宮内膜症、子宮筋腫、良性前立腺肥大症および異常ＤＬＬ４活性に特徴付けられる他の血管新生非依存性および依存性疾患を含む、原発性および転移性癌を含む群から選択される。
【００６４】
別の態様では、本発明は、上記の第二の作用物質の投与前、同時または後に上に開示される結合タンパク質のうちのいずれか１つを投与するステップを含む、ヒトＤＬＬ４が有害である障害に罹った患者を治療する方法を提供する。好ましい実施形態では、前記第二の作用物質は、放射線治療剤、抗悪性腫瘍薬、化学療法剤（例えば、ＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チュブリン剤、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソール、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ジェムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン）、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、キナーゼ阻害剤および血管新生阻害剤（抗ＶＥＧＦ抗体もしくはＶＥＧＦトラップを含むがこれらに限定されない）；共刺激分子遮断剤（抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０抗体を含むがこれらに限定されない）；接着分子遮断剤（抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌ選択抗体、小分子阻害剤を含むがこれらに限定されない）；抗サイトカイン抗体またはこの機能的断片（抗ＩＬ−１８、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体）；メトトレキサート；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；検出可能な標識またはレポーター；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ剤；筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性医薬、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたはこの類似体、サイトカイン、およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される。
【００６５】
好ましい実施形態では、上に開示される医薬組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、結腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内および経皮からなる群から選択される少なくとも１つの方法により対象に投与される。
【００６６】
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも１つのＤＬＬ４結合タンパク質に、少なくとも１つのＤＬＬ４抗イディオタイプ抗体を与える。前記抗イディオタイプ抗体には、本発明の結合タンパク質に組み込むことが可能な、重もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはこのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域およびこれらの任意の部分などの、しかしこれらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子が含まれる。
【００６７】
様々な免疫検出アッセイフォーマットのうちのいずれでも、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を用いて、混合物、溶液または生物学的試料においてＤＬＬ４を検出するよう適応させ得る。このような免疫検出アッセイフォーマットには、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット（例えば、ウェスタン）、基質に吸着されたまたは固定化された本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を含むイムノストリップ（例えば、イムノディップスティック）、ＦＡＣＳなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を使用するＤＬＬ４の検出は、混合物、溶液上でまたは生物学的試料においてインビトロで行うことができる。試料中のＤＬＬ４を検出するまたは測定するために本発明の結合タンパク質に接触させ得る生物学的試料には、尿、唾液、口腔スワブ（頬側の、舌のまたは咽頭スワブ）、皮膚スワブ、皮膚スクレープ、直腸スワブ、膣スワブ、全血試料、血漿試料、血清試料、組織生検および当技術分野で公知の手法により個人から得られる他のすべての試料が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、ＤＬＬ４結合タンパク質を用いて、Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を含むがこれらに限定されない、種々の断層撮影および走査法などにより、ＤＬＬ４をインビボで検出し得る。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、ＤＬＬ４結合タンパク質、特に抗ＤＬＬ４抗体、またはＤＬＬ４に結合するこの抗原結合部分に関する。本発明の種々の態様は、抗体および抗体断片、ならびにこの医薬組成物、ならびにこのような抗体および断片を作製するための核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞に関する。ヒトＤＬＬ４またはマウスＤＬＬ４を検出するために本発明の抗体を使用する方法、ヒトもしくはマウスＤＬＬ４および／またはヒトもしくはマウスＶＥＧＦＲ２もしくはＶＥＧＲ１活性をインビトロもしくはインビボのどちらかで抑制する方法、ならびに遺伝子発現を調節する方法も本発明により包含されている。
【００６９】
本明細書に別段の定義がなければ、本発明に関連して使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。しかしながら、何らかの曖昧さが伏在している場合には、用語の意味および範囲は明確であるべきであり、本明細書中に付与されている定義は、すべての辞書または本明細書外の定義に優越する。さらに、文脈上別段の必要がなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本願において、「または」の使用は、別段の記載がなければ、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語ならびに「含む」および「含まれた」などのその他の形式の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、別段の記載がなければ、１つのユニットを含む要素および成分ならびに１より多いサブユニットを含む要素および成分をともに包含する。
【００７０】
一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリッド形成に関連して使用される命名法およびこれらの技術は、周知のものであり、本分野において一般的に使用されている。一般に、本発明の方法および技術は、別段の記載がなければ、本分野において周知の慣用方法に従い、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献中に記載されているように、実施することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、本分野で一般的に遂行されているように、または本明細書に記載されているように、実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および医薬品化学および薬化学に関して使用される命名法、ならびに本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および医薬品化学および薬化学の実験室操作および技術は、周知のものであり、本分野で一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、調合、および送達、および患者の治療に対しては、標準的な技術を使用し得る。
【００７１】
本発明をさらに容易に理解し得るように、いくつかの用語を以下に定義する。
【００７２】
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のあらゆるポリマー鎖を表す。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と互換的に使用され、同じく、アミノ酸のポリマー鎖を表す。「ポリペプチド」という用語は、固有または人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体または多量体であり得る。本明細書における「ポリペプチド」の使用は、別段の言及がなければ、ポリペプチドならびにその断片およびバリアント（バリアントの断片を含む）を包含するものとする。抗原性ポリペプチドでは、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの連続したまたは非線形エピトープを場合によって含有する。少なくとも１つのエピトープ断片の正確な境界は、本分野における通常の技術を使用して確認され得る。断片は、少なくとも約５個の連続したアミノ酸（少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、少なくとも約１５個の連続したアミノ酸または少なくとも約２０個の連続したアミノ酸など）を含む。ポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載されている通りである。
【００７３】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その由来起源または由来源のために、その固有の状態において当該タンパク質またはポリペプチドとともに存在する天然に随伴される成分を伴わないタンパク質またはポリペプチドであり、同じ種に由来する他のタンパク質を実質的に含まず、異なる種から得られた細胞によって発現され、または天然には存在しない。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、またはポリペプチドが本来由来する細胞とは異なる細胞系の中で合成されたポリペプチドは、それに本来付随している成分から「単離」されている。タンパク質は、本分野で周知のタンパク質精製技術を使用し、単離によって、本来付随している成分が実質的に存在しないようにすることもできる。
【００７４】
本明細書において使用される「回収する」という用語は、例えば、本分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって、ポリペプチドなどの化学種を、本来付随する成分を実質的に含まないようにする方法を表す。
【００７５】
本明細書で使用される「ヒトＤＬＬ４」（「ｈＤＬＬ４」または「ｈｕＤＬＬ４」として本明細書では略記される）という用語は、いくつかのＥＧＦ様ドメインおよび受容体結合に必要とされるＤＳＬドメインを含む。前記用語は、約７４−７５ｋＤａを含むタンパク質を含む。ヒトＤＬＬ４の構造ならびに推定されるＤＮＡおよびタンパク質配列は、例えば、Ｓｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、４：１３１３−１３１８頁（２０００）にさらに記載されている。「ヒトＤＤＬ４」という用語は、標準組換え発現法により調製することが可能である組換えヒトＤＬＬ４（ｒｈＤＬＬ４）を含むものとする。
【００７６】
ＤＬＬ４に関して本明細書で使用される「生物学的活性」は、ＤＬＬ４のすべての固有の生物学的特性である。ＤＬＬ４の生物学的特性には、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化する、ＶＥＧＦシグナル伝達を負に調節する、ＶＥＧＦＲ２を抑圧する、およびＶＥＧＲ１を誘導することが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
第二の化学種との抗体、タンパク質またはペプチドの相互作用に関して、本明細書において使用される「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、相互作用が、化学種、例えば、抗体上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存し、例えば、抗体がタンパク質一般ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的であれば、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応中での、エピトープＡを含有する分子（すなわち、標識されていない遊離のＡ）の存在は、抗体に結合した、標識されたＡの量を減少させる。
【００７８】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）から構成されるあらゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持したすべての機能的断片、変異体、バリアントまたはこれらの誘導体を広く表すものとする。このような変異体、バリアントまたは誘導体抗体のフォーマットは、本分野において公知である。これらの非限定的な実施形態は、以下に論述されている。
【００７９】
完全長の抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略称される。）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略称される。）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。）が散在された超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。）へ、さらに細分割することが可能である。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００８０】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、固有配列のＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、場合によって、ＣＨ４ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基を置換することが、本分野において周知である（米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／排除速度を媒介する。いくつかの事例において、これらのエフェクター機能は、治療用抗体のために望ましいが、別の事例では、治療目的に応じて、必要でない場合があり得、または有害である場合さえあり得る。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれ、ＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑへの結合を介して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体のエフェクター機能が変化されるように、抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域において置換されている。免疫グロブリンの２つの同一の重鎖の二量体化は、ＣＨ３ドメインの二量体化によって媒介され、ヒンジ領域内のジスルフィド結合によって安定化される（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；２６４：４１５−４２０頁（１９７６）；Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２９３：６７−７９頁（１９９９））。重鎖−重鎖ジスルフィド結合を防止するための、ヒンジ領域内のシステイン残基の変異は、ＣＨ３ドメインの二量体化を不安定化させる。ＣＨ３二量体化にとって必要とされる残基が同定されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７：９２６６−９２７３頁（１９９８））。したがって、一価の半Ｉｇを生成することが可能である。興味深いことに、これらの一価の半Ｉｇ分子は、ＩｇＧおよびＩｇＡ両サブクラスに対して、天然に見出されている（Ｓｅｌｉｇｍａｎ，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：８５５−７０頁（１９７８）；Ｂｉｅｗｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５１：３９５−４００頁（１９８３））。ＦｃＲｎ：ＩｇＦｃ領域の化学量論は、２：１であることが決定されており（Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３９：９６９８−９７０８頁（２０００））、半Ｆｃは、ＦｃＲｎ結合を媒介するのに十分である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：５４２−５４８頁（１９９４））。ＣＨ３二量体化にとって重要な残基がＣＨ３ｂシート構造の内部界面上に位置しているのに対して、ＦｃＲｎ結合に必要とされる領域は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの外側界面に位置しているので、ＣＨ３ドメインの二量体化を崩壊させるための変異は、そのＦｃＲＮ結合に対して、より大きな悪影響を有さない可能性が��る。しかしながら、半Ｉｇ分子は、通常の抗体と比較するとサイズが小さいので、組織透過においてある種の利点を有し得る。一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、重鎖の二量体化が破壊されて、半Ｉｇ分子をもたらすように、本発明の結合タンパク質の定常領域、例えば、Ｆｃ領域において置換されている。ＩｇＧの抗炎症活性は、ＩｇＧ  Ｆｃ断片のＮ結合グリカンのシアリル化に完全に依存する。抗炎症活性での正確なグリカンの必要性が決定されており、その結果適当なＩｇＧ１  Ｆｃ断片が作製され得、それによって効力が大いに増強された完全な組換えシアリル化ＩｇＧ１  Ｆｃが得られる（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７３−３７６頁（２００８））。
【００８１】
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＤＬＬ４のエピトープなどの特定の抗原のエピトープ）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を表す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行可能であることは示されている。このような抗体の実施形態は、二特異的、二重特異的または多重特異的フォーマットでもあり得、２つまたはそれ以上の異なる抗原（または同じ抗原の２つまたはそれ以上の異なるエピトープ）に特異的に結合する。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６頁（１９８９）、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖として、これらの作製を可能とする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６頁（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３頁（１９８８）を参照）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上にある２つのドメイン間での対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、両ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を作出する二価の二特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８頁（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１−１１２３頁（１９９４）を参照）。このような抗体結合部分は、本分野において公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１），７９０頁（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）を参照）。さらに、一本鎖抗体も、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する直列Ｆｖセグメントの対を含む「直鎖抗体」（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）に含まれる（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６���頁（１９９５）；および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００８２】
本明細書で使用される「抗体構築物」（または「ＤＬＬ４抗体構築物」）という用語は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１つまたは複数の抗原結合部分を含むポリペプチドを表す。リンカーポリペプチドはペプチド結合により結合された２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つまたは複数の抗原結合部分を連結するのに使用される。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野では周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８頁（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１−１１２３頁（１９９４）参照）。免疫グロブリン定常ドメインとは、重または軽鎖定常ドメインを表す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は当技術分野では公知であり、表１に示されている。
【００８３】
【表１】
0005903382.tif 000002
0005903382.tif 000003
【００８４】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、前記抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質もしくはペプチドとの共有結合または非共有結合により形成されるさらに大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６：９３−１０１頁（１９９５））ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１：１０４７−１０５８頁（１９９４））を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、全抗体のそれぞれパパインまたはペプシン消化などの従来の技法を使用して全抗体から調製することが可能である。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載され、当技術分野で知られている標準組換えＤＮＡ技法を使用して得ることが可能である。
【００８５】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体（例えば、ｈＤＬＬ４に特異的に結合する単離された抗体はｈＤＬＬ４以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない。）を表すものとする。しかし、ｈＤＬＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、他の種（例えば、ｍｕＤＬＬ４）由来のＤＬＬ４分子などの他の抗原に交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質が実質的にないことがあり得る。
【００８６】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」ならびに略語「ＭＡｂ」および「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を表す。すなわち、該集団を構成する各抗体は、わずかな量で存在する可能性がある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対して誘導される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と異なり、各ｍＡｂ抗体は、抗原上の単一の決定基に対して誘導される。「モノクローナル」という修飾語は、いずれかの特定の方法によって、抗体を産生することを要求するものと解釈すべきではない。
【００８７】
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＥ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな突然変異導入もしくは部位特異的突然変異導入によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないものとする。
【００８８】
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：６２−７０頁（１９９７）；Ａｚｚａｚｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５：４２５−４４５頁（２００２）；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９：１２８−１４５頁（２０００）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１：３７１−３７８頁（２０００））、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入されている動物（例えば、マウス）から単離された抗体（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：６２８７−６２９５頁（１９９２）；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：５９３−５９７頁（２００２）；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１：３６４−３７０頁（２０００）参照）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段によって調製され、発現され、作製され、もしくは単離された抗体など、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、もしくは単離されたすべてのヒト抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異導入（または、ヒトＩｇ配列に対して遺伝子導入された動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異導入）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらの配列に関連しつつも、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には、天然に存在しない場合があり得る配列である。
【００８９】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列ならびに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体を表す。
【００９０】
本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を表す。重鎖および軽鎖の各可変領域中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、各可変領域に対して、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。本明細書において使用される「ＣＤＲ組」という用語は、抗原に結合する単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を表す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。カバットによって記載された系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１））は、抗体のいずれの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、「カバットＣＤＲ」と称され得る。コチアおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７頁（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３頁（１９８９））は、カバットＣＤＲ内のある種の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、「Ｌ１」、「Ｌ２」および「Ｌ３」または「Ｈ１」、「Ｈ２」および「Ｈ３」（「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表記する。）と表記される。これらの領域は、コチアＣＤＲと称される場合があり、これは、カバットＣＤＲと重複する境界を有する。カバットＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界が、Ｐａｄｌａｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９，１３３−１３９頁（１９９５）およびＭａｃＣａｌｌｕｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２（５）：７３２−４５頁（１９９６）によって記載されている。さらに別のＣＤＲ境界定義が、本明細書の系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、カバットＣＤＲと重複するが、これらは、特定の残基または残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測または実験的な発見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、ある実施形態は、カバットまたはコチアによって定義されたＣＤＲを使用する。
【００９１】
「カバット番号」、「カバット定義」および「カバット標識」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。本分野において認められているこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基に比べて、より可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に付番するシステムを表す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，１９０：３８２−３９１頁（１９７１）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＮＯ．９１−３２４２（１９９１））。重鎖可変領域（ＶＨ）の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０２にわたる。軽鎖可変領域（ＶＬ）の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７にわたる。
【００９２】
この２０年にわたる可変重および軽領域のアミノ酸配列の大規模な公開データベースの増加および解析により、可変領域配列内のフレームワーク領域（ＦＲ）とＣＤＲ配列間の典型的な境界について理解が生まれ、当業者であればカバット付番、コチア付番または他のシステムに従ってＣＤＲを正確に決定することができるようになった。例えば、Ｍａｒｔｉｎ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｉｎ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ、ｅｄｓ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００１）ｃｈａｐｔｅｒ  ３１、４３２−４３３頁を参照されたい。可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）領域のアミノ酸配列内のカバット  ＣＤＲのアミノ酸配列を決定する有用な方法は以下に与えられている。
ＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列を同定する：
ＶＬ領域のアミノ末端からほぼ２４アミノ酸残基で開始する；
ＣＤＲ−Ｌ１配列の前の残基は常にシステイン（Ｃ）である；
ＣＤＲ−Ｌ１配列の後の残基は常にトリプトファン（Ｗ）残基であり、典型的にはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（Ｗ−Ｙ−Ｑ）であるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｗ−Ｌ−Ｑ）、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｗ−Ｆ−Ｑ）、およびＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（Ｗ−Ｙ−Ｌ）もある；
長さは典型的には１０から１７アミノ酸残基である。
ＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列を同定する：
常にＣＤＲ−Ｌ１の末端の１６残基後から開始する；
ＣＤＲ−Ｌ２配列前の残基は一般にはＩｌｅ−Ｔｙｒ（Ｉ−Ｙ）であるが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（Ｖ−Ｙ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｉ−Ｋ）およびＩｌｅ−Ｐｈｅ（Ｉ−Ｆ）もある；
長さは常に７アミノ酸残基である。
ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を同定する：
常にＣＤＲ−Ｌ２の末端の３３アミノ酸後から開始する；
ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列前の残基は常にシステイン（Ｃ）である；
後の残基は常に、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｆ−Ｇ−Ｘ−Ｇ）（配列番号３７４）であり、Ｘは任意のアミノ酸である；
長さは典型的には７から１１アミノ酸残基である。
ＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列を同定する：
ＶＨ領域のアミノ末端からほぼ３１アミノ酸残基および常にシステイン（Ｃ）の９残基後から開始する；
前の残基は常にＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（配列番号３７５）であり、Ｘは任意のアミノ酸；
後の残基は常にＴｒｐ（Ｗ）、典型的にはＴｒｐ−Ｖａｌ（Ｗ−Ｖ）であるが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ（Ｗ−Ｉ）およびＴｒｐ−Ａｌａ（Ｗ−Ａ）もある；
長さは典型的には５から７アミノ酸残基である。
ＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列を同定する：
常にＣＤＲ−Ｈ１の末端の１５アミノ酸残基後から開始する；
前の残基は典型的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｉ−Ｇ）（配列番号３７６）であるが、他の変動もある；
後の残基はＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ（Ｋ／Ｒ−Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｔ／Ａ−Ｔ／Ｓ／Ｉ／Ａ）である；
長さは典型的には１６から１９アミノ酸残基である。
ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を同定する：
常にＣＤＲ−Ｈ２の末端の３３アミノ酸残基後および常にシステイン（Ｃ）の３つ後から開始する；
前の残基は常にＣｙｓ−Ｘ−Ｘ（Ｃ−Ｘ−Ｘ）であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｃ−Ａ−Ｒ）である；
後の残基は常にＴｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇ）（配列番号３７７）であり、Ｘは任意のアミノ酸である；
長さは典型的には３から２５アミノ酸残基である。
【００９３】
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、１つの種由来の重および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／もしくはＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数の配列が、マウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）のうちの１つまたは複数がヒトＣＤＲ配列ですでに置き換えられているマウス重および軽鎖可変領域を有する抗体などの、別の種のＣＤＲ配列で置き換えられている抗体を表す。
【００９４】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えば、マウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒト類似に」、すなわち、ヒト生殖系列可変配列により類似するように改変された抗体を表す。「ヒト化抗体」は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体もしくは断片である。ＣＤＲに関して、本明細書において使用される「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを表す。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）のすべてを実質的に含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。一実施形態において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。この抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域も含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／またはヒト化重鎖のみを含有する。
【００９５】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むどんなクラスの免疫グロブリンからでも、および限定なしにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むどんなアイソタイプからでも選択され得る。ヒト化抗体は、１つを超えるクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得、特定の定常ドメインを、当技術分野で周知の技法を使用して所望のエフェクター機能を最適化するように選択し得る。
【００９６】
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲは、親配列に正確に一致する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、その部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基がドナー抗体にもコンセンサスフレームワークにも一致しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失により変異誘発され得る。しかし、好ましい実施形態では、このような変異は広範にはならない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％は、親ＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に一致する。本明細書において、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を表す。本明細書において、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を表す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８７）参照）。したがって、「コンセンサス免疫グロブリン配列」は、「コンセンサスフレームワーク領域（複数可）」および／または「コンセンサスＣＤＲ（複数可）」を含み得る。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列における各位置は、そのファミリーにおいてその位置に最も頻繁に存在するアミノ酸により占められている。２つのアミノ酸が同じように頻繁に存在する場合、どちらでもコンセンサス配列に含まれることが可能である。
【００９７】
「親和性成熟された」抗体とは、変化を有しない親抗体と比べて、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ中に、標的抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす１つまたは複数の変化を有する抗体である。典型的な親和性成熟された抗体は、標的抗原に対してｎＭの親和性を有し、またはｐＭの親和性さえ有する。親和性成熟された抗体を産生するための様々な操作が、本分野において公知である。例えば、「Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３頁（１９９２）」は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基の無作為な突然変異導入は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３頁（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７−１５５頁（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４−２００４頁（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０−３３１９頁（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６頁（１９９２）によって記載されている。活性増強アミノ酸残基による選択的突然変異導入位置および接触または過剰変異位置での選択的突然変異は、米国特許第６，９１４，１２８Ｂ１号に記載されている。
【００９８】
「多価結合タンパク質」という用語は、２つまたはそれより多い抗原結合部位（本明細書では「抗原結合ドメイン」とも呼ばれる）を含む結合タンパク質を表す。多価結合タンパク質は好ましくは、３つまたはそれより多い抗原結合部位を有するように操作され、一般に、天然に存在する抗体ではない。「多重特異的結合タンパク質」という用語は、同じ標的分子の２つまたはそれより多い異なるエピトープに結合することができる結合タンパク質を含む、２つまたはそれより多い関連する標的または無関係な標的に結合することができる結合タンパク質を表す。
【００９９】
本明細書に使用される「二特異的抗体」という用語は、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：５３７−５４０頁（１９８３）参照）によって、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的連結によって（Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４（６０１２）：６２８−６３１頁（１９８５）参照）、またはノブ・イントゥ・ホールもしくはＦｃ領域中に変異を導入する類似のアプローチによって（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１４）：６４４４−６４４８頁（１９９３）参照）作製され、そのうち１つのみが機能的な二特異的抗体である複数の異なる免疫グロブリン種をもたらす、完全長抗体を表す。分子機能によって、二特異的抗体は、その２つの結合アーム（ＨＣ／ＬＣの１つの対）の１つの上に存在する１つの抗原（またはエピトープ）に結合し、その第二のアーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）の上に存在する異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。この定義によって、二特異的抗体は、（特異性およびＣＤＲ配列の両者において）２つの異なる抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して一価である。
【０１００】
本明細書において使用される「二重特異的抗体」という用語は、その２つの結合アーム（ＨＣ／ＬＣの対）の各々の中に存在する２つの異なる抗原（またはエピトープ）に結合することが可能な完全長抗体を表す（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０２７７３参照）。したがって、二重特異的結合タンパク質は、同一の特異性と同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して二価である。
【０１０１】
本発明の「二重可変ドメイン」（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２つまたはそれより多い抗原結合部位を含み、二価（２つの抗原結合部位）、四価（４つの抗原結合部位）または多価結合タンパク質であり得る。ＤＶＤは、単一特異的であり得る、すなわち、１つの抗原（または１つの特異的エピトープ）に結合することができ、または多重特異的であり得る、すなわち、２つもしくはそれより多い抗原（すなわち、同じ標的抗原分子の２つもしくはそれより多いエピトープまたは異なる標的抗原の２つもしくはそれより多いエピトープ）に結合することができる。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含む好ましいＤＶＤ結合タンパク質は、「ＤＶＤ免疫グロブリン」または「ＤＶＤ−Ｉｇ」と呼ばれる。したがって、このようなＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は四量体であり、ＩｇＧ分子を暗示するが、ＩｇＧ分子よりも多くの抗原結合部位を提供する。したがって、四量体ＤＶＤ−Ｉｇ分子の各半分はＩｇＧ分子の１半分を暗示しており、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むが、単一の抗原結合ドメインを提供するＩｇＧ分子の一対の重と軽鎖とは違って、ＤＶＤ−Ｉｇの一対の重と軽鎖は２つまたはそれより多い抗原結合部位を提供する。
【０１０２】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の各抗原結合部位は、ドナー（「親」）モノクローナル抗体由来であり、したがって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、抗原結合部位あたり合計で６つのＣＤＲが抗原結合に関与している。したがって、２つの異なるエピトープ（すなわち、２つの異なる抗原分子の２つの異なるエピトープまたは同じ抗原分子の２つの異なるエピトープ）に結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、第一の親モノクローナル抗体由来の抗原結合部位および第二の親モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む。
【０１０３】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合分子の設計、発現および特徴付けの説明は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００７／０２４７１５、米国特許第７，６１２，１８１号、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５：１２９０−１２９７頁（２００７）において提供されている。このようなＤＶＤ−Ｉｇ分子の好ましい例は、構造式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（ＶＤ１は第一の重鎖可変ドメイン、ＶＤ２は第二の重鎖可変ドメイン、Ｃは重鎖定常ドメイン、Ｘ１はリンカーであり（但し、Ｘ１はＣＨ１ではない。）、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０または１であるが、好ましくは１である。）を含む重鎖、および構造式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（ＶＤ１は第一の軽鎖可変ドメイン、ＶＤ２は第二の軽鎖可変ドメイン、Ｃは軽鎖定常ドメイン、Ｘ１はリンカーであり（但し、Ｘ１はＣＨ１ではない。）、Ｘ２はＦｃ領域を含まず、ｎは０または１であるが、好ましくは１である。）を含む軽鎖を含む。このようなＤＶＤ−Ｉｇは２つのこのような重鎖および２つのこのような軽鎖を含み得、各鎖は可変領域間に介在する定常領域がない縦一列に連結された可変ドメインを含み、重鎖と軽鎖は会合して直列の機能的抗原結合部位を形成し、一対の重鎖と軽鎖は別の対の重鎖と軽鎖と会合して、４つの機能的抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成し得る。別の例では、ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、それぞれが可変領域間に介在する定常領域がない縦一列に連結された３つの可変ドメイン（ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３）を含む重鎖および軽鎖を含み得、一対の重鎖と軽鎖は会合して３つの抗原結合部位を形成し得、一対の重鎖と軽鎖は別の対の重鎖と軽鎖と会合して、６つの抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成し得る。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本発明に従ったＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、その親モノクローナル抗体が結合しているのと同じ標的分子に結合するだけではなく、その親モノクローナル抗体のうちの１つまたは複数の１つまたは複数の所望の特性を有してもいる。好ましくは、このような追加の特性は、その親モノクローナル抗体のうちの１つまたは複数の抗体パラメータである。その親モノクローナル抗体のうちの１つまたは複数由来のＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質に寄与し得る抗体パラメータには、抗原特異性、抗原親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、タンパク質安定性、タンパク質可溶性、産生効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性およびオルソロガス抗原結合性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明に従ったＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、ヒトＤＬＬ４タンパク質の少なくとも１つのエピトープに結合する。本発明に従ったＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の非限定的例には、ヒトＤＬＬ４の１つまたは複数のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質、ヒトＤＬＬ４のエピトープおよび別の種（例えば、マウス）のＤＬＬ４のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質、ならびにヒトＤＬＬ４のエピトープおよび別の標的分子（例えば、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ１）のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質が含まれる。
【０１０６】
結合タンパク質の「機能的抗原結合部位」とは、標的抗原に結合することが可能な部位である。抗原結合部位の抗原結合親和性は、必ずしも、当該抗原結合部位が由来する親抗体と同程度に強力であるとは限らないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体結合を評価するための公知の様々な方法のいずれか１つを用いて測定可能でなければならない。さらに、本明細書において、多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は、定量的に同一である必要はない。
【０１０７】
本明細書において、「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域（ＦＲ）のうちの１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％を提供するまたはコードする抗体または核酸配列を表す。いくつかの実施形態では、「アクセプター」という用語は、定常領域（複数可）を提供するまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を表す。さらに別の実施形態では、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域および定常領域（複数可）のうちの１つまたは複数を提供するまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を表す。特定の実施形態では、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域のうちの１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％を提供するヒト抗体アミノ酸またはコードする核酸配列を表す。本実施例に従えば、アクセプターは、ヒト抗体の１つまたは複数の特定の位置に存在しない少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも１０アミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域（複数可）は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体または市販されている抗体）に由来するまたはから得られ得る。
【０１０８】
本明細書において、「カノニカル」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９０７頁（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９−８１７頁（１９９２）、これらの両文献は参照により本明細書に組み込まれている。）により定義される特定のカノニカルＣＤＲ構造を定義するＣＤＲまたはフレームワークにおける残基を表す。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．によれば、多くの抗体のＣＤＲの決定的に重要な部分は、アミノ酸配列のレベルでは大きな多様性があるにもかかわらずほぼ同一のペプチド骨格確証を有している。各カノニカル構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の近接セグメントに対して一組のペプチド骨格回旋角を特定する。
【０１０９】
本明細書において、「ドナー」および「ドナー抗体」という用語は、１つまたは複数のＣＤＲを提供する抗体を表す。好ましい実施形態では、ドナー抗体はフレームワーク領域が得られるまたは由来する抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体という状況では、「ドナー抗体」という用語は１つまたは複数のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を表す。
【０１１０】
本明細書で使用される「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残りの配列を表す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なる系によって決定され得るので（例えば、上記参照）、フレームワーク配列の意義は、これに対応して、異なる解釈に供せられる。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）は、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域も、各鎖上の４つの亜領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者によって表記されるように、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定の亜領域を特定せずに、フレームワーク領域は、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書において使用される、１つのＦＲは、４つの亜領域の１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの亜領域の２つまたはそれ以上を表す。
【０１１１】
ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は当技術分野では公知である。本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は表２および表３に記載されている配列から選択される。
【０１１２】
【表２】
0005903382.tif 000004
0005903382.tif 000005
【０１１３】
【表３】
0005903382.tif 000006
0005903382.tif 000007
【０１１４】
本明細書において使用されるように、「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝的再編成および変異をもたらす成熟過程を経ていない非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を表す。（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２（３）：１８３−２００頁（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４８４：１３−３０頁（２００１）参照）。本発明の様々な実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子は、成熟抗体遺伝子より、種内の個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存する傾向がより大きく、このため、その種において治療的に使用された場合に、外来源に由来するものと認識される可能性がより低いという認識から生じる。
【０１１５】
本明細書において、「キーとなる残基」という用語は、抗体、特にヒト化抗体の結合特異性および／または親和性により多くの影響を及ぼす可変領域内のある種の残基を表す。キーとなる残基には、以下の：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（はＮ−またＯ−グリコシル化部位のどちらかであり得る）、希少残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基、バーニヤゾーン内の残基および可変重鎖ＣＤＲ１のコチア定義と第一の重鎖フレームワークのカバット定義間で重複する領域における残基のうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書において、「バーニヤ」ゾーンとは、Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９頁（１９９２））により記載されているように、抗原に合わせてＣＤＲ構造を適合させそのフィットを微調整し得るフレームワーク残基のサブセットを表す。バーニヤゾーン残基はＣＤＲの基礎をなす層を形成し、ＣＤＲの構造および抗体の親和性に影響を及ぼし得る。
【０１１７】
本明細書において、「中和する」という用語は、結合タンパク質が抗原に特異的に結合する場合の抗原の生物学的活性を中和することを表す。一実施形態では、前記中和結合タンパク質が抗原に結合すると、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上減少させる。
【０１１８】
「活性」という用語は、抗原に対する抗体、例えば、ＤＬＬ４抗原に結合する抗ｈＤＬＬ４抗体の結合特異性／親和性、および／または抗体もしくはｈＤＬＬ４への結合がｈＤＬＬ４の生物学的活性を抑制する抗ｈＤＬＬ４抗体の中和効力などの活性、例えば、リガンド受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害またはヒトＮｏｔｃｈレポーターアッセイにおける受容体活性化の抑制または内皮細胞発芽アッセイにおける内皮細胞増殖の刺激を含む。
【０１１９】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合する任意のポリペプチド決定基が含まれる。ある種の実施形態において、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホリルなどの分子の化学的に活性な表面基が含まれ、ある種の実施形態において、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープとは、抗体によって結合される抗原の領域である。このように、エピトープは特異的結合パートナー上の相補的部位に結合することが公知である抗原の領域（またはこの断片）のアミノ酸残基からなる。抗原または抗原断片は１より多いエピトープを含有することが可能である。したがって、抗体分子のすべての「抗原結合部位」は抗原分子のエピトープに結合し、すべての抗原分子が１つ、２つ、いくつかまたは多くのエピトープを有し得ることは当業者により理解されている。さらに、抗原分子に対する２つの独立的に単離された抗体は、抗原分子上の同じエピトープでまたは２つの異なるエピトープで結合し得ることは当業者により理解されている。
【０１２０】
ある種の実施形態において、抗体が、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原を認識する場合に、抗体は抗原を特異的に結合すると言われる。抗体が交差競合する（一方が他方の結合または調節作用を妨げる）場合、抗体は「同じエピトープに結合する」と言われる。さらに、エピトープの構造上の定義（重複、類似、同一）は有益であるが、機能上の定義は、構造上（結合）および機能上（調節、競合）のパラメータを包含するので、しばしばより重要である。
【０１２１】
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムな生物特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を表す。さらなる記載については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６頁（１９９３）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：６２０−６２７頁（１９９１）；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，８：１２５−１３１頁（１９９５）；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８：２６８−２７７頁（１９９１）を参照されたい。
【０１２２】
本明細書において使用される「Ｋｏｎ」という用語は、本分野で知られている結合パートナー／同族のパートナー（例えば、抗体／抗原）複合体を形成する、結合タンパク質（例えば、抗体）と同族のパートナー（例えば、抗原）についての結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）定数を表すものとする。「Ｋｏｎ」は、「結合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）定数」または「ｋａ」という用語によっても知られ、これらは本明細書において互換的に使用される。抗体とその標的抗原の結合速度または抗体と抗原間での複合体形成の速度を示しているこの値は、以下の方程式によっても示される：
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ
【０１２３】
本明細書において使用される「Ｋｏｆｆ」という用語は、結合タンパク質（例えば、抗体）の、本分野で知られている例えば、抗体／抗原複合体からの解離についての解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）定数を表すものとする。「Ｋｏｆｆ」は、「解離速度定数」または「Ｋｄ」という用語によっても知られ、これらは本明細書において互換的に使用される。この値は、抗体のその標的抗原からの解離速度またはＡｂ−Ａｇ複合体の遊離抗体および抗原への経時的な分離を示し、以下の方程式によって示される：
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ。
【０１２４】
本明細書において互換的に使用される「平衡解離定数」または「ＫＤ」という用語は、平衡状態での滴定測定においてまたは解離速度定数（ｋｏｆｆ）を結合速度定数（ｋｏｎ）で割ることによって得られた値を表す。結合速度定数、解離速度定数および平衡解離定数は、抗体と抗原の結合親和性を表すために使用される。結合および解離速度定数を決定する方法は本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術の使用は、高い感度を提供し、平衡状態で生理的緩衝液中の試料を調べることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴（生体分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチおよび機器を使用することが可能である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動態排除アッセイ）アッセイも使用することが可能である。
【０１２５】
「標識」および「検出可能な標識」は、例えば、抗体および分析物などの特異的結合対のメンバー間での反応を検出可能にするために、抗体または抗体によって結合される分析物などの特異的結合パートナーに結合した部分を意味する。そのように標識された特異的結合パートナー、例えば抗体および分析物は「検出可能に標識された」と呼ばれる。したがって、本明細書において使用される「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の同定を与える標識が取り込まれたタンパク質を表す。一実施形態において、標識は、視覚または計測手段によって検出可能な信号を生成することができる、検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取込み、または印を付けたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析法によって検出することができる、蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するアビジンまたはストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの付着である。ポリペプチド用の標識の例には、以下の放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍ）、色原体、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミンおよびランタニドリン光体）、酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメインおよびエピトープタグ）およびガドリニウムキレートなどの磁気作用物質が含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイに一般に使用される標識の代表例には、光を生じる部分、例えばアクリジニウム化合物および蛍光を生じる部分、例えばフルオレセインが含まれる。他の標識は当技術分野で知られている、または本明細書に記載されている。この関連で、部分自体が検出可能に標識され得るが、さらに別の部分との反応後に検出可能にされ得る。「検出可能に標識された」の使用は、後者のタイプの検出可能な標識化を包含するものとする。
【０１２６】
「抗体コンジュゲート」という用語は、第二の化学部分（治療剤または細胞毒性剤など）に化学的に連結された、抗体などの結合タンパク質を表す。本明細書において、「作用物質」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子または生物由来物質から作製された抽出物を表記するために使用される。好ましくは、治療剤または細胞毒性剤には、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらの類似体または相同体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
本明細書において使用される「結晶」および「結晶化された」という用語は、結晶の形態で存在する結合タンパク質（例えば、抗体）またはその抗原結合部分を表す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、これは、非晶質の固体状態または液体の結晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）または分子集合体（例えば、Ｆａｂ／抗原複合体を含む抗原／抗体複合体）の規則的な反復する三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って整列されている。結晶中で反復されている基礎的単位または構築ブロックは、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶的対称性に合致する配置での非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を与える。すべての三次元中での規則的な転換による単位格子の反復は、結晶を与える。Ｇｉｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅｄ．，（Ｄｕｃｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｇｉｅｇｅ，ｅｄｓ．）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）、第１章、１−１６頁を参照されたい。
【０１２８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、２つまたはそれ以上のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態）のポリマー形態を意味する。本用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。
【０１２９】
「単離されたポリペプチド」という用語は、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはこれらのいくつかの組合せの）ポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、「単離されたポリヌクレオチド」が本来その中でともに見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない、本来連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されている、またはより大きな配列の一部として本来存在しない、ことを意味する。
【０１３０】
「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる該核酸分子を表すものとする。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中へ導入されて、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクターなどの（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）発現ベクターのような他の形態を含むものとする。ベクター（ＲＮＡウイルスベクターを含む）のＲＮＡの型も本発明での使用に見出し得る。
【０１３１】
「作用可能に連結された」という用語は、記載された成分がそれらを所期の様式で機能させることができる関係にある併置状態を表す。コード配列に「作用可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるようにライゲートされている。「作用可能に連結された」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、トランスで、すなわち目的の遺伝子とは異なる核酸分子に位置していて作用する発現制御配列、ならびに目的の遺伝子と同じ核酸分子上に位置しているが、目的の遺伝子から離れている発現制御配列が含まれる。本明細書において使用される「発現制御配列」という用語は、ライゲートされているコード配列の発現およびプロセッシングに影響を与えるために必要であるポリヌクレオチド配列を表す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望であれば、タンパク質分泌を増強させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセッシングに不可欠である成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列および融合対配列も含むことが可能である。
【０１３２】
「形質転換」とは、外来核酸（例えば、ＤＮＡ分子）が宿主細胞に入る任意のプロセスを表す。形質転換は、本分野で周知の様々な方法を使用して、自然の条件または人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核または真核宿主細胞中へ外来核酸配列を挿入するためのいずれの公知の方法にも依拠し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、細胞膜を通じてのプラスミド取込み、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェションおよび粒子照射を含み得るが、これらに限定されない。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとして、または宿主染色体の一部として、その中で複製することできる安定に形質転換された細胞が含まれる。これら細胞には、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを、限られた時間にわたって一過性に発現する細胞も含まれる。
【０１３３】
「組換え宿主細胞」（または単に、「宿主細胞」）という用語は、外来ＤＮＡがその中に導入されている細胞を表すものとする。一実施形態において、宿主細胞は、米国特許第７，２６２，０２８号に記載されている宿主細胞などの非限定的な例によると、２つまたはそれ以上の（例えば、複数の）、抗体をコードする核酸を含む。このような用語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表す。突然変異または環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲になお含まれる。一実施形態において、宿主細胞には、生物のいずれかの界から選択される原核および真核細胞が含まれる。別の実施形態において、真核細胞には、原生生物、真菌、植物および動物細胞が含まれる。別の実施形態において、宿主細胞には、エシェリキアコリなどの原核細胞種；ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２およびＰＥＲ．Ｃ６などの哺乳動物細胞株；昆虫細胞株Ｓｆ９；およびサッカロミセス・セレビシアエなどの真菌細胞種が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３４】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対しては標準的な技術が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、または本分野で一般的に遂行されているように、または本明細書に記載されているように、実施され得る。一般に、先述の技術および手順は、本分野で周知の慣用的な方法に従い、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献中に記載されているように、実施し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）を参照されたい。
【０１３５】
本分野において公知である「トランスジェニック生物」とは、導入遺伝子を含有する細胞を有する生物を表し、生物中に導入された導入遺伝子（または生物の子孫）は、生物中に自然に発現されていないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」とは、細胞のゲノム中に安定におよび作用可能に組み込まれているＤＮＡ構築物であり、この細胞からトランスジェニック生物が発達し、トランスジェニック生物の１つまたは複数の細胞種または組織中で、コードされた遺伝子産物の発現を誘導する。
【０１３６】
「制御する」または「調節する」という用語は互換的に使用され、本明細書において使用される場合、目的の分子の活性（例えば、ｈＤＬＬ４の生物学的活性）の変化または変更を表す。調節は、目的の分子の一定の活性または機能の規模の増加または減少であり得る。分子の典型的な活性および機能には、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化およびシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
これに対応して、本明細書において使用される「調節物質」という用語は、目的の分子の活性または機能（例えば、ｈＤＬＬ４の生物学的活性）を変化または変更させることが可能な化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子のある種の活性または機能の規模の増加または減少を引き起こし得る。ある種の実施形態において、調節物質は、分子の少なくとも１つの活性または機能の規模を減少させる阻害剤である。典型的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチバディ、炭水化物または小有機分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ペプチバディは記載されている。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／８３５２５を参照。
【０１３８】
本明細書において使用される「アゴニスト」という用語は、目的分子と接触したときに、アゴニストの不存在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子のある種の活性または機能の規模の増加を引き起こす調節物質を表す。特定の対象のアゴニストには、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバー、ＤＬＬ４ポリペプチドおよび核酸、炭水化物またはＤＬＬ４に結合する他のすべての分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３９】
本明細書において使用される「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、目的分子と接触したときに、アンタゴニストの不存在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子のある種の活性または機能の規模の減少を引き起こす調節物質を表す。具体的な対象のアンタゴニストには、ＤＬＬ４、特にヒトＤＬＬ４（ｈＤＬＬ４）の生物学的または免疫学的活性を遮断または調節するアンタゴニストが含まれる。ｈＤＬＬ４のアンタゴニストおよび阻害剤には、タンパク質、核酸、炭水化物またはｈＤＬＬ４および／またはげっ歯類ＤＬＬ４に結合する他のすべての分子が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【０１４０】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、疾患もしくはその１つもしくはそれ以上の症候の重度および／または持続時間を低下もしくは軽減し；疾患の進行を阻害または抑制し；疾患の退行を引き起こし；疾患に伴う１つもしくはそれ以上の症候の再発、発達、発症もしくは進行を阻害または予防し；疾患を検出し；または別の療法（例えば、予防的または治療的剤）の予防的または治療的効果を増強もしくは改善するのに十分である療法の量を表す。
【０１４１】
「患者」および「対象」は、霊長類（例えば、ヒト、サルおよびチンパンジー）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスおよびクジラ）を含む哺乳動物、鳥（例えば、アヒルまたはガチョウ）およびサメなどの動物を表すために本明細書において互換的に使用され得る。好ましくは、患者または対象は、疾患、障害もしくは状態について治療もしくは評価されているヒト、疾患、障害もしくは状態のリスクがあるヒト、疾患、障害もしくは状態を有するヒトおよび／または疾患、障害もしくは状態について治療されているヒトなどのヒトである。さらに好ましくは、患者または対象は、既存の異常なＤＬＬ４発現が癌または他の疾患を支持しＤＬＬ４活性の抑制または破壊が癌または他の疾患を治療するのに望ましい癌または他の疾患について治療されているまたは評価されている。
【０１４２】
本明細書で使用される「試料」という用語は、最も広義で使用される。本明細書において使用される「生物学的試料」は、生物または生物であったものから得られた物質のいずれかの量を含むが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよびその他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節および脾臓が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「複数の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」および「少なくとも１つの成分」は、本明細書に記載されている方法または本分野において知られている他の方法による、患者の尿、血清または血漿試料などの試験試料のアッセイ用のキット中に含めることが可能である捕捉抗体、検出または連結抗体、対照、較正物質、一連の較正物質、感受性パネル、容器、緩衝液、希釈液、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止溶液などを一般に表す。したがって、本開示との関連で、「少なくとも１つの成分」、「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」および「複数の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」は、抗分析物（例えば、抗ポリペプチド）抗体との結合などにより固体支持体上に場合によって固定化されたポリペプチドなどの分析物を含む組成物などの上記のポリペプチドまたは他の分析物を含み得る。いくつかの成分は、溶液中に存在するまたはアッセイで使用するための再構成用に凍結乾燥させることが可能である。
【０１４４】
「リスク」は、現在または将来のある時点で特定の事象が起こる可能性または確率を表す。「リスク層別」は、医師が、特定の疾患、障害または状態を発症する低度、中程度、高度または最も高度のリスクに患者を分類することを可能にする一連の既知の臨床的リスク因子を表す。
【０１４５】
特異的結合対（例えば、抗原またはその断片および抗体またはその抗原結合断片）のメンバー間の相互作用との関連で「特異的な」および「特異性」は、相互作用の選択的な反応性を表す。「に特異的に結合する」という語句および類縁の語句は、対象の分子（またはその断片）に特異的に結合し、他の実体に特異的に結合しない抗体（またはその抗原結合断片）の能力を表す。
【０１４６】
「特異的結合パートナー」は、特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学的または物理的な手段を介して互いに特異的に結合する２つの異なる分子を含む。したがって、抗原および抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物およびレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを含み得る。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば、分析物類似体であるメンバーを含み得る。免疫反応性特異的結合メンバーには、単離または組換えで産生された抗原、抗原断片およびモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む抗体ならびにその複合体、断片およびバリアント（バリアントの断片を含む）が含まれる。
【０１４７】
本明細書において使用される「バリアント」は、アミノ酸の付加（例えば、挿入）、欠損または保存的置換によってアミノ酸配列が所与のポリペプチド（例えば、ＤＬＬ４ポリペプチドまたは抗ＤＬＬ４抗体）と異なるが、所与のポリペプチドの生物学的活性を保持する（例えば、バリアントＤＬＬ４は、前記バリアントＤＬＬ４が野生型ＤＬＬ４の元の抗体結合部位（エピトープ）を保持している場合、抗ＤＬＬ４抗体との結合をめぐって野生型ＤＬＬ４と競合し得る。）ポリペプチドを意味する。アミノ酸の保存的置換、すなわち特性が類似する（例えば、親水性ならびに荷電領域の程度および分布）異なるアミノ酸とのアミノ酸の置き換えは、微小変化が典型的に関与すると本分野で認識されている。これらの微小変化は、本分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシーインデックスを考慮することにより部分的に特定することが可能である（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２頁（１９８２）参照）。アミノ酸のヒドロパシーインデックスは、この疎水性および荷電の考慮を基礎とする。ヒドロパシーインデックスの類似したアミノ酸を置換することが可能であり、これらのアミノ酸はタンパク質の機能を依然として保持することが本分野において知られている。一態様において、±２のヒドロパシーインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質となる置換を明らかにするために使用することも可能である。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性を考慮すると、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算が可能となる（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号参照）。本分野で理解されているように、類似した親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。一態様において、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて置換が行われる。アミノ酸のヒドロパシーインデックスと疎水性値はどちらもそのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この観察に一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特に、疎水性、親水性、荷電、サイズおよび他の特性によって明らかにされるこれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されている。「バリアント」は、タンパク質分解、リン酸化または他の翻訳後修飾などによって異なる形でプロセシングされているが、その生物活性または抗原反応性、例えばＤＬＬ４に結合する能力を保持するポリペプチドまたはその断片を示すために使用することも可能である。本明細書における「バリアント」の使用は、別段文脈上矛盾しない限り、バリアントの断片を包含するものとする。
【０１４８】
本明細書で使用される「試料」という用語は、その最も広義で使用される。本明細書において使用される「生物学的試料」は、生物または生物であったものから得られた物質のいずれかの量を含むが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよびその他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節および脾臓が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
Ｉ．ヒトＤＬＬ４に結合する抗体
本発明の一態様は、高親和性で、遅い解離速度で、および／または高中和能力でＤＬＬ４に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはこの抗原結合部分を提供する。有利には、ＤＬＬ４に結合するこのようなヒト抗体またはこの抗原結合部分は、投与された治療ＤＬＬ４結合タンパク質に対して患者の免疫系が最小の応答しかないまたはまったく応答しないヒト患者に投与することが可能なヒト治療薬として用途が見つかる。したがって、患者は反復投与の経過中このように完全にヒトＤＬＬ４結合タンパク質の恩恵を得ることができる。本発明の別の態様は、ＤＬＬ４に結合するキメラ抗体およびＤＬＬ４に結合するＣＤＲ移植された抗体、またはこの抗原結合部分を提供する。好ましくは、前記抗体またはこの部分は単離された抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、中和ヒト抗ＤＬＬ４抗体である。
【０１５０】
Ａ．抗ＤＬＬ４抗体を作製する方法
本発明の抗体は本技術分野で公知のいくつかの技法のうちのいずれかにより作製し得る。好ましい方法は、本明細書の実施例２に例示されているＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術である。別の方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の機能的相補体を坦持するトランスジェニックげっ歯類（例えば、トランスジェニックマウス）をヒトＤＤＬ４またはこの抗原部分を用いて免疫し、続いて標準ハイブリドーマ技術によりヒトＤＬＬ４に結合する完全なヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを作製することである。このような方法により得られる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。このような方法によれば、完全なヒトＤＬＬ４結合タンパク質が提供されて、モノクローナルＤＬＬ４抗体分子の非ヒト抗原性の供給源を減らすために他の方法であれば１回または複数回のヒト化を実施する必要性が取り除かれる。したがって、複数の種由来の材料を利用する技法はそれほど好ましくないが、使用し得る。
【０１５１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されないことも注目される。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核、原核、またはファージクローンを含むが抗体を作製するのに用いる方法は含まない、単一クローンに由来する抗体を表す。
【０１５２】
本発明に従ったＤＬＬ４モノクローナル抗体分子を得るために用いられ得る種々の技法の追加の態様は下に記載されている。
【０１５３】
１．ハイブリドーマ技術を使用する抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリッドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せの使用など、本分野で公知の多様な技術を用いて調製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、本分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（前記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。）に教示されているものなど、ハイブリッドーマ技術を用いて作製することが可能である。
【０１５４】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的な抗体を作製しスクリーニングするための方法は当技術分野では常用であり周知である。一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法の他にも本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により産生される抗体も提供し、好ましくは、前記ハイブリドーマは本発明の抗原で免疫されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次に本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンを求めて前記融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。簡潔に述べると、マウスはＤＬＬ４抗原で免疫することが可能である。好ましい実施形態では、ＤＬＬ４抗原はアジュバンドと一緒に投与されて免疫応答を刺激する。このようなアジュバンドは、完全または不完全フロイントアジュバンド、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）を含む。このようなアジュバンドは、ポリペプチドを限局性沈着に隔離することによりポリペプチドを急速な分散から保護し得、または該アジュバンドは、宿主を刺激してマクロファージおよび免疫系の他の成分に対して走化性である因子を分泌させる物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免疫スケジュールは、数週間にわたり繰り広げられるポリペプチドの２回以上の投与を含むことになる。しかし、ポリペプチドの単回投与も使用できる。
【０１５５】
ＤＬＬ４抗原を用いた動物の免疫化後、抗体および／または抗体産生細胞は前記動物から得られる。抗ＤＬＬ４抗体含有血清は、動物を出血させるまたは屠殺することにより動物から得る。血清はそれが動物から得られるままに使用してもよく、免疫グロブリン画分を血清から得てもよく、または抗ＤＬＬ４抗体を血清から精製してもよい。このようにして得られる血清または免疫グロブリンはポリクローナルであり、したがって、不均一に並んだ特性を有する。
【０１５６】
免疫応答が検出される、例えば、マウス血清中で抗原ＤＬＬ４に特異的な抗体が検出されると、マウス脾臓が回収されて脾細胞が単離される。次に、脾細胞は、周知の技法により、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳ）から入手可能な細胞系統ＳＰ２０由来の細胞に融合される。ハイブリドーマは限界希釈により選択されクローニングされる。次に、ハイブリドーマクローンは、ＤＬＬ４に結合することができる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によりアッセイされる。腹水液は、一般に高レベルの抗体を含有するが、マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫することにより作製することが可能である。
【０１５７】
別の実施形態では、抗体産生不死化ハイブリドーマは免疫された動物から調製し得る。免疫後、動物は屠殺され、脾Ｂ細胞は当技術分野で周知の不死化骨髄腫細胞に融合される。例えば、上記Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅを参照されたい。好ましい実施形態では、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞系統）。融合および抗生物質選択後、ハイブリドーマは、ＤＬＬ４もしくはこの一部、またはＤＬＬ４を発現している細胞を使用してスクリーニングされる。好ましい実施形態では、最初のスクリーニングは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して実施される。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ００／３７５０４に提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５８】
抗ＤＬＬ４抗体産生ハイブリドーマは、選択され、クローニングされ、頑強なハイブリドーマ増殖、高抗体産生および下でさらに考察されるような所望の抗体特徴を含む所望の特徴についてさらにスクリーニングされる。ハイブリドーマは、同系動物において、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいて、またはインビトロ細胞培養において、インビボで培養し拡大し得る。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、拡大する方法は当業者には周知である。
【０１５９】
好ましい実施形態では、ハイブリドーマは、上記のようにマウスハイブリドーマである。別の実施形態では、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマなどの非ヒト非マウス種において産生される。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト非分泌骨髄腫が抗ＤＬＬ４抗体を発現するヒト細胞と融合されているヒトハイブリドーマである。
【０１６０】
特異的エピトープを認識する抗体断片は公知の技法により作製し得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質切断により作製し得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨＩドメインを含有する。
【０１６１】
２．ＳＬＡＭを使用する抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体
本発明の別の態様では、組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９２／０２５５１；Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：７８４３−７８４８頁（１９９６）に記載されているように、当技術分野で選択リンパ球抗体法（ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ（ＳＬＡＭ））と呼ばれる手法を使用して単一の単離されたリンパ球から作製される。この方法では、対象の抗体を分泌する単細胞、例えば、セクションＩ．Ａ．１（上記）に記載されている免疫された動物のいずれか１つに由来するリンパ球は、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用してスクリーニングされ、抗原ＤＬＬ４、ＤＬＬ４のサブユニットまたはその断片は、ビオチンなどのリンカーを使用してヒツジ赤血球に結合され、ＤＬＬ４に対する特異性を有する抗体を分泌する単細胞を同定するのに使用される。対象の抗体分泌細胞の同定に続いて、重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により細胞から救出され、次にこれらの可変領域は、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）という状況で発現されることが可能である。増幅された免疫グロブリン配列で形質移入され、インビボで選択されたリンパ球に由来する宿主細胞は、次いで、例えば、ＤＬＬ４に対する抗体を発現する細胞を単離するために、形質移入された細胞をパニングすることによって、インビトロで、さらに分析および選択を行うことが可能である。増幅された免疫グロブリン配列は、さらに、インビトロでのアフィニティー成熟方法によるなど、インビトロで操作することが可能である。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１およびＰＣＴ公開ＷＯ００／５６７７２を参照。
【０１６２】
３．トランスジェニック動物を使用する抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、抗体は、ＤＬＬ４抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつかまたはすべてを含む非ヒト動物を免疫することによって産生される。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウス（ヒト免疫グロブリン遺伝子座の巨大断片を含み、マウス抗体産生を欠失している改変されたマウス系統）である。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１頁（１９９４）ならびに米国特許第５，９１６，７７１号；第５，９３９，５９８号；第５，９８５，６１５号；第５，９９８，２０９号；第６，０７５，１８１号；第６，０９１，００１号；第６，１１４，５９８号および第６，１３０，３６４号を参照されたい。ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１；ＷＯ９４／０２６０２；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９９／４５０３１；ＷＯ９９／５３０４９；ＷＯ００／０９５６０；およびＷＯ００／３７５０４も参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスは、完全なヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびｘ軽鎖遺伝子座のメガ塩基サイズの生殖系列配置ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーの約８０％を含有する。その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６頁（１９９７）；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５頁（１９９８）を参照されたい。
【０１６３】
４．組換え抗体ライブラリーを使用する抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法も使用することが可能であり、抗体ライブラリーは、所望のＤＬＬ４結合特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングの方法は、本分野において周知であり、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１７２７１（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２０７９１（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６７９（Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０１２８８（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０（Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７０−１３７２頁（１９９１）；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：８１−８５頁（１９９２）；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１頁（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４頁（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：７２５−７３４頁（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６頁（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８頁（１９９１）；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０頁（１９９２）；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７３−１３７７頁（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７頁（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２頁（１９９１）；米国特許出願公開第２００３／０１８６３７４号；およびＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１（これらは各々、その内容が参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている方法が含まれる。
【０１６４】
組換え抗体ライブラリーは、ＤＬＬ４またはＤＬＬ４の一部で免疫された対象由来であり得る。代わりに、組換え抗体ライブラリーは、未処置の対象、すなわち、ヒトＤＬＬ４で免疫されたことのないヒト対象由来のヒト抗体ライブラリーなどの、ＤＬＬ４で免疫されたことのない対象由来であり得る。本発明の抗体は、ヒトＤＬＬ４を含むペプチドを用いて組換え抗体ライブラリーをスクリーニングし、それによりＤＬＬ４を認識する抗体を選択することにより選択される。このようなスクリーニングおよび選択を行うための方法は、前段落における参考文献において記載されるように、当技術分野では周知である。特定のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離する抗体などの、ＤＬＬ４に対して特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するためには、表面プラズモン共鳴という当技術分野で公知の方法を使用して、所望のＫｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のＩＣ５０を有する抗体などの、ｈＤＬＬ４に対して特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するためには、ＤＬＬ４活性の阻害を評価するための当技術分野で公知の標準法を使用し得る。
【０１６５】
一態様では、本発明は、ヒトＤＬＬ４に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分に関する。好ましくは、前記抗体は中和抗体である。様々な実施形態では、前記抗体は組換え抗体またはモノクローナル抗体である。
【０１６６】
例えば、本発明の抗体は、本分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することも可能である。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、これらをコードしているポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために使用することが可能である。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて、選択または同定することが可能である。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィドで安定化されたＦｖ抗体ドメインとともにファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することが可能なファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１−５０頁（１９９５）；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６頁（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８頁（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８頁（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１−２８０頁（１９９４）；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号（これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
【０１６７】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ヒト抗体または他の所望されるすべての抗原結合断片を含む完全な抗体を作製するために、ファージから得た抗体コード領域を単離および使用し、例えば、以下に詳述されているように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌など、あらゆる所望の宿主中で発現させることが可能である。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９頁（１９９２）；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：２６−３４頁（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３頁（１９８８）（前記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。）に開示されている方法などの本分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に産生するための技術も使用することが可能である。一本鎖Ｆｖおよび抗体を作製するために使用することが可能な技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６−８８頁（１９９１）；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７９９５−７９９９頁（１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１頁（１９８８）に記載されているものが含まれる。
【０１６８】
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングに代えて、巨大なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための本分野で公知の他の方法を、本発明の抗体の同定のために適用することが可能である。代替的発現系の１つの種類は、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３１７００（Ｓｚｏｓｔａｋ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ）ならびにＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−１２３０２頁（１９９７）に記載されているような、組換え抗体ライブラリーがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されるものである。この系において、ピューロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質をそれらの３’末端に担持する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって、ｍＲＮＡおよびこれがコードするペプチドまたはタンパク質の間に共有結合的融合物が作製される。したがって、特異的なｍＲＮＡは、コードされているペプチドまたはタンパク質、例えば抗体またはその一部の特性（抗体またはその一部の、二重特異性抗原への結合など）に基づいて、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から濃縮することが可能である。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された、抗体またはその一部をコードする核酸配列は、上記のような組換え手段によって（例えば、哺乳動物宿主細胞中で）発現されることが可能であり、さらに、最初に選択された配列中に変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによって、または上記のように、組換え抗体のインビトロでの親和性成熟のためのその他の方法によって、さらなる親和性成熟に供することが可能である。この方法の好ましい例は、実施例（以下の）に使用されているＰＲＯｆｕｓｉｏｎディスプレイ技術である。
【０１６９】
別のアプローチにおいて、本発明の抗体は、本分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて作製することも可能である。酵母ディスプレイ法では、抗体ドメインを酵母細胞壁に繋留し、これらを酵母の表面上にディスプレイするために、遺伝学的な方法が使用される。特に、このような酵母は、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために使用することが可能である。本発明の抗体を作製するために使用することが可能な酵母ディスプレイ法の例には、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９９，６５８号（Ｗｉｔｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されているものが含まれる。
【０１７０】
Ｂ．組換えＤＬＬ４抗体の作製
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技法のうちのいずれによっても作製され得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）が標準技法により宿主細胞にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現。「トランスフェクション」という用語の様々な形は、外来性ＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために一般に使用される多種多様な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションおよび同類のものを包含するものとする。本発明の抗体を原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも発現させることは可能であるが、真核細胞における抗体の発現のほうが好ましく、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞においてである。なぜならば、このような真核細胞（および、特に哺乳動物細胞）は原核細胞よりも正確にフォールディングされ免疫学的に活性な抗体を組立て分泌する可能性が高いからである。
【０１７１】
本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１−６２１頁（１９８２）に記載されているＤＨＦＲ選択マーカーと一緒に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６−４２２０頁（１９８０）に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されると、宿主細胞において抗体の発現を、またはさらに好ましくは、宿主細胞が培養されている培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することにより抗体は産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培地から回収することが可能である。
【０１７２】
宿主細胞を使用して、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を作製することも可能である。上の手法の変動は本発明の範囲内であることは理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のどちらかの機能的断片をコードするＤＮＡを用いて宿主細胞をトランスフェクトするのが望ましいこともある。組換えＤＮＡ技術を使用して、対象の抗原への結合に必要ではない軽鎖と重鎖のどちらかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去することも可能である。このような切断型ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に包含される。さらに、１つの重鎖および１つの軽鎖が本発明の抗体でありもう１つの重鎖および軽鎖が対象の抗原以外の抗原に特異的である二機能的抗体は、標準化学架橋法により本発明の抗体を第二の抗体に架橋させることにより作製し得る。
【０１７３】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための好ましい系では、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターはリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ前記遺伝子の高レベルの転写を推進するＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに作用可能に連結されている。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も担っており、これのせいでメトトレキサート選択／増幅を使用して前記ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択が可能になる。選択された形質転換体宿主細胞は培養されて、抗体重鎖および軽鎖の発現が可能になり無傷の抗体は培地から回収される。標準分子生物学技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体について選択し、前記宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。さらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで適切な培地において本発明の宿主細胞を培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。前記方法は、培地から組換え抗体を単離することをさらに含むことが可能である。
【０１７４】
１．抗ＤＬＬ４抗体
ヒトＤＬＬ４に結合する単離された完全なヒト抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、表４のクローンＥ９およびＡ１０で示されている（下の実施例参照）。Ｅ９およびＡ１０抗体の単離された抗ＤＬＬ４抗体ＣＤＲ配列は、本発明に従って単離され、Ｅ９およびこの親和性成熟クローン由来のまたはＡ１０およびこの親和性成熟クローン由来のＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含むＤＬＬ４結合タンパク質の２つの新規ファミリーを確立している。Ｅ９モノクローナル抗体およびこの親和性成熟誘導体の可変領域およびＣＤＲは表４、８、１４、１８および１９に列挙されている。Ａ１０モノクローナル抗体およびこの親和性成熟誘導体の可変領域およびＣＤＲは表４、９および１０に列挙されている。ヒトＤＬＬ４に関して好ましいＤＬＬ４結合および／または中和活性を有する本発明に従った結合タンパク質を作製し選択するために、本発明の結合タンパク質を作製しその結合タンパク質のＤＬＬ４結合および／または中和特徴を評価するための当技術分野で公知の、本明細書に具体的に記載されている方法を含むが、これらに限定されない標準法を使用し得る。
【０１７５】
本明細書に記載される抗ＤＬＬ４抗体Ｅ９クローンの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲのアミノ酸配列の配列比較に基づいて、本発明は、ヒトＤＬＬ４に結合することができる抗原結合ドメインを含むＤＬＬ４結合タンパク質を提供し、前記抗原結合ドメインは
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号９９）、
（Ｘ１はＳまたはＮであり；
Ｘ２はＳ、ＧまたはＮであり；
Ｘ３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＧまたはＲであり；
Ｘ４はＹであり；
Ｘ５はＹまたはＨであり；
Ｘ６はＷであり；および
Ｘ７はＧである。）；
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号１００）、
（Ｘ１はＤであり；
Ｘ２はＩであり；
Ｘ３はＹ、ＮまたはＳであり；
Ｘ４はＹであり；
Ｘ５はＴ、Ｎ、Ａ、Ｉ、ＳまたはＲであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＳ、Ｎ、ＴまたはＧであり；
Ｘ８はＴであり；
Ｘ９はＹであり；
Ｘ１０はＹであり
Ｘ１１はＮであり；
Ｘ１２はＰであり；
Ｘ１３はＳであり；
Ｘ１４はＬであり；
Ｘ１５はＫであり；および
Ｘ１６はＳ、Ｎ、ＤまたはＧである。）；
ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１０１）、
（Ｘ１はＥ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｗ、ＬまたはＡであり；
Ｘ２はＤ、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、ＥまたはＮであり；
Ｘ３はＶ、Ｍ、Ｌ、ＰまたはＡであり；
Ｘ４はＩ、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、ＭまたはＥであり；
Ｘ５はＬ、Ｙ、ＦまたはＭであり；
Ｘ６はＲ、Ｇ、Ｓ、ＱまたはＡであり；
Ｘ７はＧであり；
Ｘ８はＧ、ＡまたはＳであり；
Ｘ９はＳ、Ａ、Ｌ、Ｖ、ＲまたはＧであり；
Ｘ１０はＤであり；および
Ｘ１１はＹ、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｃ、Ｉ、Ｍ、Ｔ、ＱまたはＫである。）；
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１０２）、
（Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＧであり；
Ｘ３はＱ、ＥまたはＤであり；
Ｘ４はＲ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｋ、ＬまたはＴであり；
Ｘ５はＬであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＤまたはＥであり；
Ｘ８はＫであり；
Ｘ９はＹであり；
Ｘ１０はＡまたはＶであり；および
Ｘ１１はＳである。）；
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号１０３）、
（Ｘ１はＥまたはＱであり；
Ｘ２はＤであり；
Ｘ３はＳ、Ｌ、Ｔ、Ａ、ＥまたはＦであり；
Ｘ４はＫ、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＭであり；
Ｘ５はＲであり；
Ｘ６はＰであり；および
Ｘ７はＳである。）；
ならびに
ＣＤＲ−Ｌ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０４）、
（Ｘ１はＱであり；
Ｘ２はＡであり；
Ｘ３はＷであり；
Ｘ４はＤであり；
Ｘ５はＲ、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、ＧまたはＫであり；
Ｘ６はＤまたはＥであり；
Ｘ７はＴ、Ｖ、Ａ、ＳまたはＭであり；
Ｘ８はＧ、ＡまたはＣであり；および
Ｘ９はＶである。）
からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数のＣＤＲを含む。
【０１７６】
好ましくは、上記の１つまたは複数のＣＤＲを含むＤＬＬ４結合タンパク質は、ヒト（「ｈｕ」、「ｈ」）ＤＬＬ４ならびにマウス（「ｍｕｒｉｎｅ」、「ｍｕ」）ＤＬＬ４、カニクイザル（「ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ」、「ｃｙｎｏ」）ＤＬＬ４およびラットＤＬＬ４からなる群から選択される１つまたは複数のＤＬＬ４タンパク質にも結合する。
【０１７７】
本明細書に記載される抗ＤＬＬ４抗体Ａ１０クローンの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲのアミノ酸配列の配列比較に基づいて、本発明は、
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１０５）、
（Ｘ１はＳ、ＮまたはＤであり；
Ｘ２はＨまたはＹであり；
Ｘ３はＷであり；
Ｘ４はＭであり；および
Ｘ５はＳまたはＨである。）；
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号１０６）、
（Ｘ１はＩ、Ｄ、ＭまたはＴであり；
Ｘ２はＩであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＹ、Ｎ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｔ、ＨまたはＤであり；
Ｘ５はＤであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＳ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、ＨまたはＮであり；
Ｘ８はＮ、Ｙ、Ｓ、ＩまたはＴであり；
Ｘ９はＫ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、ＡまたはＬであり；
Ｘ１０はＹ、ＤまたはＥであり
Ｘ１１はＳまたはＹであり；
Ｘ１２はＡであり；
Ｘ１３はＤであり；
Ｘ１４はＳであり；
Ｘ１５はＶであり；
Ｘ１６はＫであり；および
Ｘ１７はＧである。）；
ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号１０７）、
（Ｘ１はＡであり；
Ｘ２はＧ、ＡまたはＲであり；
Ｘ３はＧであり；
Ｘ４はＧ、ＳまたはＡであり；
Ｘ５はＮであり；
Ｘ６はＶまたはＭであり；
Ｘ７はＧであり；
Ｘ８はＦ、Ｌ、ＹまたはＭであり；
Ｘ９はＤであり；および
Ｘ１０はＩ、ＳまたはＬである。）；
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１０８）、
（Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＡまたはＧであり；
Ｘ３はＤであり；
Ｘ４はＫ、Ｎ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
Ｘ５はＬであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＴ、Ｓ、Ｎ、Ａ、ＧまたはＥであり；
Ｘ８はＫ、Ｑ、ＮまたはＲであり；
Ｘ９はＹであり；
Ｘ１０はＶまたはＩであり；および
Ｘ１１はＳである。）；
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号１０９）、
（Ｘ１はＱであり；
Ｘ２はＤであり；
Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｗ、ＳまたはＤであり；
Ｘ４はＫ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、ＩまたはＥであり；
Ｘ５はＲであり；
Ｘ６はＰであり；および
Ｘ７はＳである。）；
ならびに
ＣＤＲ−Ｌ３：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１１０）、
（Ｘ１はＱであり；
Ｘ２はＳまたはＡであり；
Ｘ３はＷであり；
Ｘ４はＤであり；
Ｘ５はＲ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、ＷまたはＭであり；
Ｘ６はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、ＲまたはＴであり；
Ｘ７はＤまたはＧであり；
Ｘ８はＶ、Ａ、ＰまたはＥであり；および
Ｘ９はＶである。）；
からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数のＣＤＲを含む、ヒトＤＬＬ４に結合することができる抗原結合ドメインを含むＤＬＬ４結合タンパク質を提供する。
【０１７８】
好ましくは、上記の１つまたは複数のＣＤＲを含むＤＬＬ４結合タンパク質は、ヒト（「ｈｕ」）ＤＬＬ４およびカニクイザル（「ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ」、「ｃｙｎｏ」）ＤＬＬ４にも結合する。
【０１７９】
２．抗ＤＬＬ４キメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの抗体の異なる部分が異なる動物種由来である分子である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２−１２０７頁（１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４頁（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１−２０２頁（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第４，８１６，５６７号、および米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライスすることにより、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法を使用することが可能である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５頁（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４−６０８頁（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２−４５４頁（１９８５）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１８０】
３．抗ＤＬＬ４  ＣＤＲ移植された抗体
本発明の単離された抗ＤＬＬ４抗体ＣＤＲ配列を使用してＣＤＲ移植された抗体を作製し、元の抗体の特性を調節し得る。このような特性には、結合動態、親和性、生物学的活性、種交差反応性、分子交差反応性、エピトープ、物理化学的性質、薬物動態特性、薬物力学的性質または薬理学的性質が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤＲ移植された抗体は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数が元の抗ＤＬＬ４抗体のＣＤＲ配列で置き換えられている、ヒト抗体または非ヒト霊長類抗体由来の重および軽鎖可変領域配列を含む。任意のヒトまたは非ヒト霊長類抗体由来のフレームワーク配列は、ＣＤＲ移植のための鋳型としての役目を果たし得る。しかし、このようなフレームワーク上で直鎖置換を行うと、抗原に対する結合親和性をある程度消失することが多い。ヒトまたは他の種抗体が元のヒト抗体に対して相同であるほど、ＣＤＲと新しいヒトフレームワークまたは非ヒト霊長類フレームワークを組み合わせた場合に親和性または他の特性を減少するおそれのある歪みをＣＤＲに導入する可能性はそれだけ少なくなる。したがって、ＣＤＲを除いてヒト可変領域フレームワークと置き換わるために選ばれる可変フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも３０％配列同一性を有するのが好ましい。ＣＤＲを除いてヒト可変領域フレームワークと置き換わるために選ばれる可変フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも４０％配列同一性を有するのがさらに好ましい。ＣＤＲを除いてヒト可変フレームワークと置き換わるために選ばれる可変領域フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも５０％配列同一性を有するのがさらに好ましい。ＣＤＲを除いてヒト可変フレームワークと置き換わるために選ばれる可変領域フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも６０％配列同一性を有するのがさらに好ましい。ＣＤＲを除いて新しいヒトまたは非ヒト霊長類および元のヒト可変領域フレームワークは、少なくとも７０％配列同一性を有するのがさらに好ましい。ＣＤＲを除いて新しいヒトまたは非ヒト霊長類および元のヒト可変領域フレームは、少なくとも７５％配列同一性を有するのがさらに好ましい。ＣＤＲを除いて新しいヒトまたは非ヒト霊長類および元のヒト可変領域フレームワークは、少なくとも８０％配列同一性を有するのが最も好ましい。元のヒト抗ＤＬＬ４抗体のＣＤＲを移植するために高度に相同なヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークを使用しても、それでも得られた移植された抗体が抗原に対する結合親和性をある程度失う場合がある。このような場合、親和性を回復するためには、新たに移植された抗体の対応する位置に元の抗体の少なくとも１つまたは複数のキーフレームワーク残基（複数可）置換を含む必要がある。このようなキーとなる残基は、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
ヒトＤＬＬ４と相互作用することができる残基；
カノニカル残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基；
バーニヤゾーン内の残基；および
コチア定義された可変重鎖ＣＤＲ１とカバット定義された第一重鎖フレームワーク間で重複する領域の残基
からなる群から選択し得る。
【０１８１】
４．抗ＤＬＬ４ヒト化抗体
本発明の組成物はヒト化抗体を作製する必要性を取り除くが、ヒト化ＤＬＬ４抗体は本発明の組成物を使用して調製し得る。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。公知のヒトＩｇ配列は、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ．）を介して利用できるウェブサイト、例えば：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｍ．ｅｈｉｍｅｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕ−ｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ  ｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｎａ．ｈｔｍｌ；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）（各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に開示されている。このような導入された配列は、免疫原性を低下させるために、または結合、親和性、結合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期もしくは本分野で公知の他のいずれかの適切な特性を減少、増強もしくは修飾するために使用することが可能である。
【０１８２】
ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるために、好ましくは抗原結合を改善させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、本分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するために、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングすることによって、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８５，０８９号（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７頁（１９８８）を参照されたい。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列が採り得る三次元立体構造を図式および表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基は、所望される抗体特性（標的抗原に対して増加された親和性など）が達成されるように、コンセンサスおよび輸入配列から選択され、組み合わせることが可能である。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接、および最も実質的に関与する。抗体は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６頁（１９８８）、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６−２３０８頁（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１頁（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９頁（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２頁（１９９３）、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８頁（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４頁（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−９７３頁（１９９４）；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；ＷＯ９９／０６８３４（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０），ＷＯ９７／２００３２（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８），ＷＯ９２／１１２７２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０），ＷＯ９２／０３４６１（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９），ＷＯ９４／１８２１９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４），ＷＯ９２／０１０４７（ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４）、ＷＯ９３／０６２１３（ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５），ＷＯ９０／１４４４３，ＷＯ９０／１４４２４およびＷＯ９０／１４４３０；欧州公開ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６およびＥＰ０２３９４００��米国特許第５，５６５，３３２号；第５，７２３．３２３号；第５，９７６，８６２号；第５，８２４，５１４号；第５，８１７，４８３号；第５，８１４，４７６号；第５，７６３，１９２号；第５，７２３，３２３号；第５，７６６，８８６号；第５，７１４，３５２号；第６，２０４，０２３号；第６，１８０，３７０号；第５，６９３，７６２号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，２２５，５３９号および第４，８１６，５６７号（各々の全体がその中で引用される参考文献を含めて参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの（但し、これらに限定されない。）、本分野で公知の様々な技術を用いてヒト化することが可能である。
【０１８３】
Ｃ．抗体および抗体産生細胞系統の作製
好ましくは、本発明の抗ＤＬＬ４抗体は、例えば、本技術分野で公知のいくつかのインビボおよびインビトロアッセイのうちのいずれか１つにより評価される、腫瘍血管新生活性を減らすまたは中和する高い能力を示す。ＤＬＬ４活性の中和を評価することは、本技術分野で公知のいくつかのインビトロおよびインビボアッセイを介して評価することが可能である。ＤＬＬ４活性の中和を評価するための例となるパラメータには、Ｎｏｔｃｈ受容体とのＤＬＬ４相互作用および／または約少なくとも１０−６Ｍ；少なくとも１０−７Ｍ；または少なくとも１０−８のＩＣ５０値でＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を阻害する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８４】
好ましくは、本発明の抗ＤＬＬ４抗体は、ＤＬＬ４活性を減少するまたは中和する高い能力も示す。
【０１８５】
好ましい実施形態では、単離された抗体またはこの抗原結合部分はヒトＤＬＬ４に結合し、前記抗体もしくはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定された場合、約０．１ｓ−１もしくはそれ未満のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離する、または約１×１０−６Ｍもしくはそれ未満のＩＣ５０でＤＬＬ４および／もしくはヒトＤＬＬ４を抑制する。代わりに、前記抗体もしくはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定された場合、約１×１０−２ｓ−１もしくはそれ未満のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離し得る、または約１×１０−７Ｍもしくはそれ未満のＩＣ５０でＤＬＬ４および／もしくはヒトＤＬＬ４活性を抑制し得る。代わりに、前記抗体もしくはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定された場合、約１×１０−３ｓ−１もしくはそれ未満のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離し得る、または約１×１０−８Ｍもしくはそれ未満のＩＣ５０でヒトＤＬＬ４を抑制し得る。代わりに、前記抗体もしくはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定された場合、約１×１０−４ｓ−１もしくはそれ未満のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離し得る、または約１×１０−９Ｍもしくはそれ未満のＩＣ５０でＤＬＬ４活性を抑制し得る。代わりに、前記抗体もしくはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定された場合、約１×１０−５ｓ−１もしくはそれ未満のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離し得る、または約１×１０−１０Ｍもしくはそれ未満のＩＣ５０でＤＬＬ４および／もしくはヒトＤＬＬ４活性を抑制し得る。代わりに、前記抗体もしくはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定された場合、約１×１０−５ｓ−１もしくはそれ未満のＫｏｆｆ速度定数でヒトＤＬＬ４から解離し得る、または約１×１０−１１Ｍもしくはそれ未満のＩＣ５０でＤＬＬ４および／もしくはヒトＤＬＬ４活性を抑制し得る。
【０１８６】
ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域、すなわち、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のどちらかを含むことが可能である。好ましくは、抗体はκ軽鎖定常領域を含む。代わりに、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片または一本鎖Ｆｖ断片であることが可能である。
【０１８７】
抗体エフェクター機能を変えるＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は当技術分野では公知である（米国特許第５，６４８，２６０号および米国特許第５，６２４，８２１号（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）参照）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／排除速度を媒介する。いくつかの場合、これらのエフェクター機能は治療抗体に望ましいが、他の場合には治療目的によっては不必要であるまたは有害でさえあることもある。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれＡＤＣＣならびにＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑへの結合を介したＣＤＣを媒介する。新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する決定的に重要な成分である。さらに別の実施形態では、抗体のエフェクター機能が変わるように、抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。
【０１８８】
一実施形態は、標識された結合タンパク質を提供し、ここで、本発明の抗体または抗体部分は、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）へ誘導体化され、または連結される。例えば、本発明の標識された結合タンパク質は、別の抗体（例えば、二特異的抗体またはダイアボティ）、検出可能作用物質、細胞毒性剤、薬剤および／または別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との、抗体または抗体部分の会合を媒介可能なタンパク質もしくはペプチドなどの１つまたは複数の他の分子実体へ、（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有会合またはその他によって）本発明の抗体または抗体部分を機能的に連結することによって誘導することが可能である。
【０１８９】
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化し得る有用な検出可能作用物質には、蛍光化合物が含まれる。典型的な蛍光検出可能作用物質には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素でも誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合には、検出可能な反応産物を生成させるために、本酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって抗体が検出される。例えば、検出可能作用物質西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、検出可能な発色した反応産物をもたらす。抗体は、ビオチンを用いて誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定を通じても検出され得る。
【０１９０】
本発明の別の実施形態は、結晶化されたＤＬＬ４結合タンパク質を提供する。好ましくは、本発明は、本明細書に開示される、全抗ＤＬＬ４抗体、この断片、ならびに抗体構築物および結合タンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートを含む）を含む、本明細書に記載されるＤＬＬ４結合タンパク質の結晶、ならびにこのような結晶を含む製剤および組成物に関する。一実施形態において、結晶化された結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性対応物より大きなインビボ半減期を有する。別の実施形態において、結合タンパク質は、結晶化後の生物活性を保持する。本発明の結晶化された結合タンパク質は、本分野で公知の方法に従って、および参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０７２６３６に開示されているように産生され得る。
【０１９１】
本発明の別の実施形態は、抗体またはその抗原結合部分が１つまたは複数の炭水化物残基を含む、グリコシル化された結合タンパク質を提供する。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセッシングを経ることがあり得る。特に、糖（グリコシル）残基は、酵素的に付加され得る（グリコシル化として知られる方法）。共有結合されたオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化されたタンパク質または糖タンパク質として知られる。タンパク質グリコシル化は、対象のタンパク質のアミノ酸配列およびその中でタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシル転移酵素およびグリコシダーゼ）を産生し得、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し得る。このような要因のために、タンパク質グリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成は、タンパク質がその中で発現されている宿主系に応じて異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。好ましくは、グリコシル化された結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるように、グリコシル残基を含む。
【０１９２】
異なるタンパク質グリコシル化は異なるタンパク質特性をもたらし得ることが、当業者に公知である。例えば、酵母などの微生物宿主中で産生され、酵母内在経路を用いてグリコシル化された治療用タンパク質の効力は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞中で発現された同じタンパク質の効力と比べて低下され得る。また、このような糖タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性であり得、投与後に、減少したインビボ半減期を示し得る。ヒトおよび他の動物中の特異的な受容体は、特異的なグリコシル残基を認識し得、血流からのタンパク質の迅速な除去を促進し得る。他の有害な効果は、タンパク質の折り畳み、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、運搬、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質または因子による認識、抗原性またはアレルゲン性の変化が含まれ得る。したがって、当業者は、グリコシル化の特異的な組成およびパターン、例えば、ヒト細胞中または意図される対象動物の種特異的細胞中で産生されるものと同一または少なくとも類似のグリコシル化組成およびパターンを有する治療タンパク質を選択し得る。
【０１９３】
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化されたタンパク質を発現することは、異種グリコシル化酵素を発現するために宿主細胞を遺伝的に修飾することによって達成され得る。本分野で公知の技術を使用して、当業者は、ヒトタンパク質グリコシル化を呈する抗体またはその抗原結合部分を作製し得る。例えば、酵母株中で産生されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）が、動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を呈するように（米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号および第２００２／０１３７１３４号）、酵母株は、天然に存在しないグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に修飾されている。
【０１９４】
さらに、ライブラリーのメンバー宿主細胞がバリアントグリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝学的に改変された宿主細胞のライブラリーを用いて、目的のタンパク質を発現させ得ることが、当業者によって理解されている。次いで、当業者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択および単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、改善または改変された生物学的特性を示す。
【０１９５】
Ｄ．ＤＬＬ４結合タンパク質の使用
本発明に記載されているＤＬＬ４抗体およびその抗体部分を含むＤＬＬ４結合タンパク質は、ヒトＤＬＬ４およびマウスＤＬＬ４に結合することができるので、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学など当技術分野で知られている慣用のイムノアッセイのいずれかを用いて、試料中（例えば、血液、血清または血漿などの混合物、溶液または生物学的試料中で）のＤＬＬ４を検出または測定するために使用することが可能である。本発明は、試料をＤＬＬ４結合タンパク質に接触させ、ヒトＤＬＬ４および／もしくはマウスＤＬＬ４に結合しているＤＬＬ４結合タンパク質または非結合結合タンパク質のどちらかを検出して、それにより試料中のヒトＤＬＬ４および／またはマウスＤＬＬ４を検出することを含む、試料中のヒトＤＬＬ４および／またはマウスＤＬＬ４を検出するための方法を提供する。本明細書に記載されているＤＬＬ４結合タンパク質は、結合したまたは結合していないＤＬＬ４結合タンパク質の検出を促進するために、検出可能な物質で直接または間接的に標識され得る。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる；および適切な放射性材料の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍが含まれる。
【０１９６】
ＤＬＬ４についてアッセイすることが可能な生物学的試料には、尿、糞便、血液、血清、血漿、汗、唾液、口腔スワブ（頬側、舌、咽頭）、膣スワブ、直腸スワブ、皮膚スワブ、皮膚スクレープ、組織生検ならびに当技術分野で利用できる方法により得られる他の任意の組織試料が含まれる。
【０１９７】
結合タンパク質を標識することに代わって、ヒトＤＬＬ４は、検出可能な物質で標識された組換えヒト（ｒｈ）ＤＬＬ４標準と本明細書に記載されている非標識ＤＬＬ４結合タンパク質を利用する競合免疫アッセイにより生体液中でアッセイすることが可能である。このアッセイでは、生物試料、標識されたｒｈＤＬＬ４標準およびＤＬＬ４結合タンパク質を組み合わせて、非標識結合タンパク質に結合している標識されたｒｈＤＬＬ４標準の量が決定される。生物試料中のヒトＤＬＬ４の量は、ＤＬＬ４結合タンパク質に結合している標識されたｒｈＤＬＬ４標準の量に反比例している。同様に、ヒトＤＬＬ４は、検出可能な物質で標識されたｒｈＤＬＬ４標準と本明細書に記載されている非標識ＤＬＬ４結合タンパク質を利用する競合免疫アッセイにより生体液中でアッセイすることも可能である。
【０１９８】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は好ましくは、インビトロでもインビボでもＤＬＬ４活性、特にｈＤＬＬ４活性を中和することができる。したがって、本発明のこのような結合タンパク質を使用して、例えば、ＤＬＬ４を含有する細胞培養物において、ヒト対象においてまたは本発明の結合タンパク質が交差反応するＤＬＬ４を発現する他の哺乳動物対象においてＤＬＬ４活性を阻害することができる。一実施形態では、本発明は、ＤＬＬ４活性が阻害されるように、ＤＬＬ４を本発明のＤＬＬ４抗体またはその抗体部分に接触させることを含む、ＤＬＬ４活性を阻害するための方法を提供する。例えば、ＤＬＬ４を含有する、または含有すると疑われる細胞培養物において、本発明の抗体または抗体部分を、培養物中のＤＬＬ４活性を阻害するために培地に添加することができる。
【０１９９】
別の実施形態では、本発明は、ＤＬＬ４またはＤＬＬ４活性が有害である疾患または障害に罹っている対象から有利に、対象におけるＤＬＬ４活性を減少するための方法を提供する。本発明は、その方法が、対象におけるＤＬＬ４またはＤＬＬ４活性が減少するように本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を対象に投与することを含む、このような疾患または障害に罹っている対象においてＤＬＬ４またはＤＬＬ４活性を減少させるための方法を提供する。好ましくは、ＤＬＬ４はヒトＤＬＬ４であり、対象はヒト対象である。代わりに、対象は、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質が結合することができるＤＬＬ４を発現している哺乳動物であることが可能である。さらに、対象はＤＬＬ４が導入されている（例えば、ＤＬＬ４の投与によりまたはＤＬＬ４トランス遺伝子の発現により）哺乳動物であることが可能である。本発明の抗体または他のＤＬＬ４結合タンパク質は、治療目的でヒト対象に投与することが可能である。さらに、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、獣医学目的でまたはヒト疾患の動物モデルとして結合タンパク質が結合することができるＤＬＬ４を発現している非ヒト哺乳動物に投与することが可能である。後者に関しては、このような動物モデルは本発明の抗体およびＤＬＬ４結合タンパク質の治療効果を評価するため（例えば、投与量の試験および投与の時間経過）に有用であり得る。
【０２００】
本明細書において使用される「ＤＬＬ４および／またはＮｏｔｃｈシグナル活性が有害である疾患」という用語は、本疾患に罹患している対象中でのＤＬＬ４および／またはＮｏｔｃｈシグナル活性の存在が、疾患の病態生理の原因であることがまたは疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、または疑われている、癌などの疾病およびその他の疾患を含むものとする。したがって、ＤＬＬ４および／またはＮｏｔｃｈシグナル活性が有害である疾患は、ＤＬＬ４および／またはＮｏｔｃｈシグナル活性の低下が疾患（例えば、腫瘍増殖）の症候および／または進行を緩和することが予測される疾患である。このような疾患は、例えば、本疾患に罹患している患者の血管新生の増加（例えば、腫瘍増殖中および腫瘍形成中における対象の血清、血漿、滑液中などの当技術分野で知られている様々なタンパク質濃度の増加）（これは、例えば、上記のように抗ＤＬＬ４抗体を用いて検出され得る。）によって明らかとされ得る。本発明の抗体で治療することが可能な疾患の非限定的な例には、本発明の抗体の医薬組成物に関する以下のセクションに論述されている疾患が含まれる。
【０２０１】
ＩＩ．医薬組成物
本発明は、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物も提供する。本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を含む医薬組成物は、疾患を診断し、検出し、もしくはモニタリングし、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を予防し、治療し、管理し、もしくは軽減する上で、および／または研究において使用されるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、１つまたは複数の本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を含む。別の実施形態において、医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の結合タンパク質、およびＤＬＬ４および／またはＤＬＬ４活性が有害である疾患を治療するための、本発明の結合タンパク質以外の１つまたは複数の予防または治療剤を含む。好ましくは、予防剤または治療剤は、癌または腫瘍などの疾患または１つもしくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理または軽減に有用であることが知られており、または疾患または１つもしくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理または軽減においてこれまで使用されており、もしくは現在使用されている。これらの実施形態に従えば、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。
【０２０２】
本発明の結合タンパク質は、対象に投与するのに適した医薬組成物中に取り込ませることが可能である。典型的には、医薬組成物は、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質（またはＤＬＬ４結合タンパク質の結合部分）および医薬として許容される担体を含む。本明細書において使用される「医薬として許容される担体」には、生理的に適合性がある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬として許容される担体の例には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つまたは複数およびこれらの組合せが含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。医薬として許容される担体は、抗体または抗体部分の保存期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの補助物質の微量をさらに含み得る。
【０２０３】
様々な送達系が公知であり、例えば、リポソーム、微粒子、ミクロカプセル、ＤＬＬ４結合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体によって媒介されるエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２頁（１９８７）参照）、レトロウイルスまたは他のベクターなどの一部としての核酸の構築物に封入して、本発明の１つもしくはそれ以上のＤＬＬ４結合タンパク質または本発明の１つもしくはそれ以上の結合タンパク質および疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を予防し、管理し、治療し、もしくは軽減する（例えば、腫瘍血管新生を低減する）のに有用な予防剤または治療剤の組合せを投与するために使用することが可能である。本発明の予防剤または治療剤を投与する方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与および粘膜投与（例えば、鼻内および経口経路）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、例えば、吸入装置または噴霧器およびエアロゾル化剤を加えた製剤の使用によって、経肺投与を使用することが可能である。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；第５，９８５，３２０号；第５，９８５，３０９号；第５，９３４，２７２号；第５，８７４，０６４号；第５，８５５，９１３号；第５，２９０，５４０号；および第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３（これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。一実施形態において、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質、組合せ療法または本発明の組成物は、ＡｌｋｅｒｍｅｓＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）を用いて投与される。特定の実施形態において、本発明の予防剤または治療剤は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、経肺または皮下投与される。予防剤または治療剤は、あらゆる都合のよい経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮下の裏打ち（例えば、口粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与され得、生物学的に活性な他の作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身または局所であり得る。
【０２０４】
特定の実施形態において、治療を必要としている部位へ局所的に、本発明の予防剤または治療剤を投与することが望ましい場合があり得る。これは、例えば、局所的注入によって、注射によって、またはインプラントの手段によって達成され得るが、これらに限定されるものではなく、前記インプラントは、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、ポリマー、繊維性マトリックス（例えば、Ｔｉｓｓｕｅｌ（登録商標））またはコラーゲンマトリックスなどの、膜およびマトリックスを含む多孔性または非多孔性材料である。一実施形態において、本発明のアンタゴニストの１つまたは複数のＤＬＬ４結合タンパク質の有効量は、疾患またはその症候を予防し、治療し、管理し、および／または軽減するために、対象の罹患した部位へ局所的に投与される。別の実施形態において、本発明の１つまたは複数のＤＬＬ４結合タンパク質の有効量は、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を予防し、治療し、管理し、および／または軽減するために、本発明の結合タンパク質以外の１つまたは複数の治療薬（例えば、１つまたは複数の予防剤または治療剤）の有効量と組み合わせて、対象の罹患した部位へ局所的に投与される。
【０２０５】
別の実施形態において、予防剤または治療剤は、調節された放出系または徐放系に入れて送達することが可能である。一実施形態において、調節された放出または徐放を達成するためにポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３頁（１９９０））；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０１−２４０頁（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７−５１６頁（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１：５７４−５７９頁（１９８９）参照）。別の実施形態において、本発明の治療薬の調節された放出または徐放を達成するために、ポリマー材料を使用することが可能である。（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．ＩＩ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，（Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．），（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８４），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，１１５−１３８頁；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．）（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４）；Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，Ｃ２３：６１−１２６頁（１９８３）を参照されたい。Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２頁（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２５：３５１−３５６頁（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７１：１０５−１１２頁（１９８９））；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３も参照されたい。徐放製剤中で使用されるポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態において、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性であり、溶脱可能な不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、生物分解性である。さらに別の実施形態において、調節された放出系または徐放系は、予防剤または治療剤の近くに配置されて、全身投薬量の一部のみを必要とするようにすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（１９８４），１１５−１３８頁参照）。
【０２０６】
徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３頁（１９９０））による概説中に論述されている。本発明の１つまたは複数の治療剤を含む徐放製剤を作製するために、当業者に公知のあらゆる技術を使用することが可能である。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ，”Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．，３９：１７９−１８９頁（１９９６），Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，５０：３７２−３７７頁（１９９６），Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：８５３−８５４頁（１９９７）およびＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．：２４：７５９−７６０頁（１９９７）（これらは各々、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０２０７】
本発明の組成物が予防剤または治療剤をコードする核酸である特定の実施形態において、適切な核酸発現ベクターの一部として、核酸を構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）の使用によって、または直接の注射によって、または微粒子照射（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎ）の使用によって、核酸が細胞内となるように核酸を投与し、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤でコーティングし、または核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して核酸を投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８頁（１９９１）参照）、核酸がコードしている予防剤または治療剤の発現を促進するために、核酸をインビボで投与することが可能である。あるいは、相同的組換えによる発現のために、核酸を細胞内に導入し、宿主細胞ＤＮＡ内に取り込むことが可能である。
【０２０８】
本発明の医薬組成物は、その予定された投与経路と適合的であるように製剤化される。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与が含まれるが、これらに限定されない。特異的な実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内または局所投与に適合された医薬組成物として、定型的な手法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤および注射の部位における痛みを和らげるための局所麻酔剤（リグノカムンｌｉｇｎｏｃａｍｎｅ）なども含み得る。
【０２０９】
本発明の組成物が局所的に投与されるべき場合には、組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態でまたは当業者に周知の他の形態で製剤化することが可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌａｖａｎｉａ，（１９９５）を参照されたい。噴霧不能な局所剤形の場合には、局所適用に適合性のある担体または１つもしくはそれ以上の賦形剤を含み、好ましくは水より大きな動粘性係数を有する粘性ないし半固体または固体の形態が通常使用される。適切な製剤は、所望であれば、滅菌され、または、例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合された、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、粉末、リニメント剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）など（これらに限定されない）を含む。他の適切な局所剤形には、好ましくは固体または液体不活性担体と組み合わされた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、ＦＲＥＯＮ（登録商標）などの気体状噴射剤）との混合物中または搾り出し瓶中に梱包されている噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれる。所望であれば、医薬組成物および剤形に、加湿剤または湿潤剤も添加することが可能である。このような追加の成分の例は、本分野において周知である。
【０２１０】
本発明の方法が組成物の鼻内投与を含む場合には、組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミスト中に、または点鼻薬の形態で製剤化することが可能である。特に、本発明に従って使用するための予防剤または治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体）を用いて、加圧されたパックまたは噴霧器からエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達することが可能である。加圧されたエアロゾルの場合には、投薬単位は、定量された量を送達するためのバルブを付与することによって決定され得る。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入装置またはガス注入装置で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される。）を製剤化し得る。
【０２１１】
本発明の方法が経口投与を含む場合、錠剤、カプセル、カシェ剤、ゲルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で、組成物を経口的に製剤化することが可能である。錠剤またはカプセルは、従来の手段によって、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、イモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、医薬として許容される賦形剤とともに調製することが可能である。錠剤は、本分野において周知な方法によって被覆され得る。経口投与用の液体調製物は、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態（これらに限定されない。）を採り得、または、使用前に、水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として与えられ得る。このような液体調製物は、慣用の手段によって、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの医薬として許容される添加物とともに調製され得る。調製物は、適宜、緩衝液塩、着香剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。経口投与用調製物は、予防剤または治療剤の遅い放出、調節された放出または徐放のために、適切に製剤化され得る。
【０２１２】
本発明の方法は、例えば、吸入装置または噴霧器の使用、エアロゾル化剤とともに製剤化された組成物の使用によって、経肺投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；第５，９８５，３２０号；第５，９８５，３０９号；第５，９３４，２７２号；第５，８７４，０６４号；第５，８５５，９１３号；第５，２９０，５４０号；および第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３（これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。特定の実施形態において、本発明の抗体、組合せ療法および／または本発明の組成物は、ＡｌｋｅｒｍｅｓＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）を用いて投与される。
【０２１３】
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射または連続的注入による）非経口投与のために製剤化された組成物の投与を含み得る。注射用製剤は、添加された防腐剤とともに、単位剤形で（例えば、アンプルまたは複数投薬容器に入れて）与え得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態を採り得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末形態であり得る。
【０２１４】
本発明の方法は、さらに、デポ調製物として製剤化された組成物の投与を含み得る。このような長期作用製剤は、（例えば、皮下または筋肉内への）植え込みによって、または筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、組成物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）調合され得る。
【０２１５】
本発明の方法は、中性または塩形態として製剤化された組成物の投与を包含する。医薬として許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンとともに形成された塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンとともに形成された塩が含まれる。
【０２１６】
一般的には、組成物の成分は、別個に、または単位剤形中に（例えば、活性剤の量を示した注射器またはにおい袋など、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥粉末または無水濃縮物として）一緒に混合されて供給される。投与の様式が注入である場合には、組成物は、医薬等級の無菌水または生理的食塩水を含有する注入瓶を用いて分配することが可能である。投与の様式が注射による場合には、注射用の無菌水または生理的食塩水の注射器は、投与前に成分が混合され得るように提供することが可能である。
【０２１７】
特に、本発明は、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または本発明の医薬組成物が、薬剤の量を示した注射器またはにおい袋など、密閉された容器中に梱包されることも提供する。一実施形態において、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または医薬組成物は、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥無菌粉末または無水濃縮物として供給され、対象に投与するための適切な濃度になるように（例えば、水または生理的食塩水で）再構成することができる。好ましくは、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位投薬量で、密封された容器中の凍結乾燥された乾燥無菌粉末として供給される。本発明の凍結乾燥された予防もしくは治療剤または医薬組成物は、その元の容器中で、２℃と８℃の間で保存されるべきであり、本発明の予防剤もしくは治療剤または医薬組成物は、再構成後、１週以内、好ましくは５日以内、７２時間以内、４８時間以内に、２４時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、５時間以内に、３時間以内に、または１時間以内に投与されるべきである。別の実施形態において、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または本発明の医薬組成物は、薬剤の量および濃度を示す密閉された容器中に、液体形態で供給される。好ましくは、投与された組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで、密封された容器中に供給される。液体形態は、その元の容器中で、２℃と８℃の間で保存されるべきである。
【０２１８】
本発明の結合タンパク質は、非経口投与に適した医薬組成物中に取り込ませることが可能である。好ましくは、結合タンパク質は、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、フリント容器または琥珀色の容器、注射器または予め充填されたシリンジ中の液体または凍結乾燥された剤形から構成され得る。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ）、最適には５−１０ｍＭであり得る。他の適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。０−３００ｍＭの濃度に（最適には、液体剤形に対して１５０ｍＭ）の溶液の毒性を修飾するために、塩化ナトリウムを使用することが可能である。凍結乾燥された剤形に対して、凍結保護剤、主に、０−１０％のスクロース（最適には、０．５−１．０％）を含めることが可能である。他の適切な凍結保護剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥された剤形に対して、充填剤、主に、１−１０％のマニトール（最適には、２−４％）を含めることが可能である。液体および凍結乾燥された両剤形において、安定化剤、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には、５−１０ｍＭ）を使用することが可能である。他の適切な充填剤には、グリシン、アルギニンが含まれ、０−０．０５％のポリソルベート−８０（最適には、０．００５−０．０１％）として含めることが可能である。さらなる界面活性剤には、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１９】
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）など、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソームおよび坐薬などの、液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、予定される投与の様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体を用いたヒトの受動免疫に対して使用される組成物と同様の組成物など、注射可能溶液または注入可能溶液の形態である。投与の好ましい様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、本明細書に記載されているＤＬＬ４結合タンパク質は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、ＤＬＬ４結合タンパク質は、筋肉内注入または皮下注射によって投与される。
【０２２０】
治療組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化することが可能である。無菌注射可能溶液は、本明細書に列記されている成分の１つまたは組合せを加えた適切な溶媒中に、必要な量で活性な化合物（すなわち、抗体、抗体部分）を取り込ませた後、必要に応じて、濾過滅菌を行うことによって調製することが可能である。一般的に、分散液は、塩基性分散溶媒および上記に列記されたものから得られる必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込ませることによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための凍結乾燥された無菌粉末の場合には、好ましい調製の方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、あらゆる追加の所望される成分を加えた活性成分の粉末を与える真空乾燥および粉末乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
【０２２１】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、本分野で公知の様々な方法によって投与することが可能であるが、多くの治療用途において、好ましい投与経路／様式は皮下注射、静脈内注射または注入である。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変動する。ある種の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよび微小封入された送達系を含む徐放製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など、生物分解可能な生物適合性ポリマーを使用することが可能である。このような製剤の多くの調製方法は、特許が付与されているまたは一般的に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８）を参照されたい。
【０２２２】
ある種の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口投与され得る。また、化合物（および、所望であれば、その他の成分）は、硬いもしくは軟らかい殻のゼラチンカプセル中に封入され、錠剤へと圧縮され、または患者の食事中に直接取り込ませ得る。経口治療投与の場合、化合物は、賦形剤とともに取り込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用され得る。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活化を妨げるための物質で化合物を被覆し、またはその不活化を妨げるための物質とともに化合物を同時投与することが必要であり得る。
【０２２３】
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることが可能である。ある種の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ４活性が有害である疾患を治療するのに有用である、１つまたは複数のさらなる治療剤とともに共製剤化され、および／または同時投与される。例えば、本発明の抗ｈｕＤＬＬ４抗体または抗体部分は、他の錠剤に結合する１つまたは複数のさらなる抗体（例えば、他のサイトカインに結合する抗体または細胞表面分子に結合する抗体）とともに共製剤化され、および／または同時投与され得る。さらに、本発明の１つまたは複数の結合タンパク質は、先述の治療剤の２つまたはそれ以上と組み合わせて使用され得る。このような組合せ療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に使用し得るので、様々な単独療法に伴って生じ得る毒性または合併症が回避される。
【０２２４】
ある種の実施形態において、本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、本分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６６０，８４３号および公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９９／２５０４４に記載されている。
【０２２５】
特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質または本発明の別の予防剤もしくは治療剤をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列は、遺伝子治療によって、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を治療し、予防し、管理し、または軽減するために投与される。遺伝子治療は、発現された核酸または発現可能な核酸の、対象への投与によって実行される治療を表す。本発明の本実施形態において、核酸は、予防的効果または治療的効果を媒介する、本発明のコードされたそれらの結合タンパク質または予防剤もしくは治療剤を産生する。
【０２２６】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれも、本発明に従って使用することが可能である。遺伝子治療の方法の概説は、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｙ，１２：４８８−５０５頁（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３：８７−９５頁（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５７３−５９６頁（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２頁（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：１９１−２１７頁（１９９３）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１（５）：１５５頁（１９９３）を参照されたい。使用可能な組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られた方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０））に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な記述は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００４２６６４Ａ１号に開示されている。
【０２２７】
別の態様では、本発明は、対象におけるＤＬＬ４関連腫瘍を治療する（例えば、治癒する、抑制する、寛解する、遅延する、またはＤＬＬ４関連腫瘍の発症を妨げる、またはＤＬＬ４関連腫瘍の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）もしくは再発（ｒｅｌａｐｓｅ）を妨げる）または予防する方法を提供する。前記方法には、ＤＬＬ４結合タンパク質、例えば、本明細書に記載される抗ＤＬＬ４抗体またはこの断片を、ＤＬＬ４関連腫瘍または癌を治療するまたは予防するのに十分な量で対象に投与することが含まれる。ＤＬＬ４アンタゴニスト、すなわち、抗ＤＬＬ４抗体またはこの断片は、単独でまたは本明細書に記載される他の治療法と組み合わせて対象に投与し得る。
【０２２８】
ＤＬＬ４は、免疫および炎症性の要素、特に癌および腫瘍血管新生を含む様々な疾患に伴う病態において極めて重要な役割を果たしている。ＤＬＬ４関連障害の例には、以下の生物学的プロセス：ニューロン機能および発生；動脈内皮運命および血管新生の安定化；弁原初および心室発生の形成中と分化中両方の心内膜と心筋間の極めて重要な細胞伝達事象の調節；心臓弁の恒常性ならびに心血管系に関連する他のヒト障害における関連；膵臓内分泌部および外分泌部両方の時宜を得た細胞系統特異化；腸内での分泌性および吸収性系統から選択しなければならない細胞のバイナリー運命決定の影響；骨発生中の造血幹細胞コンパートメントの拡大および骨粗鬆症などの造骨細胞系統への関与への参加；いくつかの明確な発生段階での乳腺における細胞運命決定の調節；ならびにチロシンキナーゼＡｂｌを通じたアクチン細胞骨格の制御などのある種の非核機序に悪影響を与える障害が含まれるが、これらに限定されない。さらに具体的には、ＤＬＬ４関連障害には、癌、Ｔ−ＡＬＬ（Ｔ細胞急性リンパ性白血病）、ＣＡＤＡＳＩＬ（皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症）、ＭＳ（多発性硬化症）、ファロー四徴症およびアラジール症候群が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本明細書に記載される抗体およびこの抗原結合部分を使用して、癌および腫瘍を治療する。
【０２２９】
本発明に従った結合タンパク質は、癌、腫瘍またはＤＬＬ４への結合、ＤＬＬ４の抑制および／もしくはＤＬＬ４の中和が個人の健康にとり望ましいもしくは他の点で利益となると見なされる他の障害を治療するために、単独でまたは組み合わせて、すなわち、本明細書に記載される１より多いＤＬＬ４結合タンパク質を使用することが可能である。
【０２３０】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、単独でまたは追加の作用物質、例えば、治療薬と組み合わせて使用することも可能であり、前記追加の作用物質は、その意図された目的のために技能実践者により選択されることは理解されるべきである。例えば、追加の作用物質は、ＤＬＬ４への結合またはＤＬＬ４の抑制が癌、腫瘍または他の疾患もしくは病状を治療するのに望ましいまたは有利であると見なされる癌、腫瘍または他の疾患もしくは病状を治療するのに有用であると本技術分野で認識されている治療薬であり得る。追加の作用物質は、治療組成物に有益な属性を与える作用物質、例えば、前記組成物の粘度に影響を与える作用物質でもあり得る。
【０２３１】
本発明に含まれるべき組合せは、それらの意図される目的に対して有用な組合せであることをさらに理解すべきである。以下に記されている作用物質は、例示を目的とするものであって、限定を意図するものではない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体および以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の作用物質であり得る。当該組合せにおいて、形成された組成物がその意図される機能を実行することが可能であれば、組合せは、２以上の追加の作用物質、例えば、２または３個の追加の作用物質を含むこともできる。
【０２３２】
好ましい組合せは、ＮＳＡＩＤとも称される非ステロイド性抗炎症薬（イブプロフェンのような薬物が含まれる。）である。他の好ましい組合せは、プレドニゾロンなどのコルチコステロイドである。ステロイド使用の周知の副作用は、本発明の抗ＤＬＬ４抗体と組み合わせて患者を治療するときに必要とされるステロイド用量を徐々に減らすことによって、低減することが可能であり、または除去することさえ可能である。本発明の抗体または抗体部分とともに組み合わせることが可能な関節リウマチに対する治療剤の非限定的な例には、以下のもの：サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；その他のヒトサイトカインまたは増殖因子（例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ）に対する抗体またはこれらのアンタゴニストが含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、ＣＴＬＡまたはＣＤ１５４を含むこれらのリガンド（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）などの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることが可能である。
【０２３３】
治療薬の好ましい組合せは、腫瘍化促進または血管新生促進シグナル伝達経路に異なる時点で干渉し得る。本発明の方法および組成物において有用な治療薬の好ましい例には、抗悪性腫瘍薬、放射線療法、ならびにＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チュブリン剤、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソール、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ジェムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）およびキナーゼ阻害剤などの化学療法が含まれる。
【０２３４】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジン、クロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、金チオリンゴ酸塩（筋肉内および経口）、アザチオプリン、コルヒチン、コルチコステロイド（経口、吸入および局所注射）、β−２アドレナリン作動性受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリカート、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノラート・モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作用薬、ＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する作用物質（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１ｂＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、Ｔ細胞変換酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴＮＦαシグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびそれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標）およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））、ｓＩＬ−ＩＲ１、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、炎症抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、硫酸ヒドロキシクロロキン、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム、酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、トリムシノロン・アセトニド、プロポキシフェンナプシラート／ａｐａｐ、フォラート、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、塩酸オキシコドン、ヒドロコドン二酒石酸塩／ａｐａｐ、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組換え、塩酸トラマドール、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロナートナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、塩酸リドカイン、インドメタシン、硫酸グルコサミン／コンドロイチン、塩酸アミトリプチリン、スルファジアジン、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸オロパタジン、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、シクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８ＢＰ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２，ＡＭＧ−５４８、ＶＸ７４０、ロフルミラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１およびメソプラムなどの作用物質とも組み合わされ得る。好ましい組合せには、メトトレキ���ートまたはレフルノミドが含まれ、中度または重度の関節リウマチの症例では、シクロスポリンが含まれる。
【０２３５】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質とともに組み合わせることが可能な癌に対する治療剤の非限定的な例には、以下のもの：ブデノシド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチラート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；および他のヒトサイトカインまたは増殖因子（例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ）に対する抗体またはこれらのアンタゴニストが含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０これらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることが可能である。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノラート・モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作用薬、ＩＬ−１を妨害する作用物質（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＴＮＦαなどの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびそれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）および炎症抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの作用物質とも組み合わされ得る。
【０２３６】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質を組み合わせることが可能な治療剤の他の例には、以下のもの：ＴＮＦアンタゴニスト、例えば、抗ＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（ＰＣＴ公開第９７／２９１３１号；ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、ＣＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＬＥＮＥＲＣＥＰＴ））およびＰＤＥ４阻害剤が含まれる。本発明の結合タンパク質は、コルチコステロイド、例えば、ブデノシドおよびデキサメタゾンと組み合わせることが可能である。本発明の結合タンパク質は、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸およびオルサラジンなどの作用物質、ならびにＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインの合成または作用を妨害する作用物質（例えば、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤およびＩＬ−１ｒａ）とも組み合わされ得る。本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤６−メルカプトプリンとともに使用され得る。本発明のＤＬＬ４結合タンパク質は、ＩＬ−１１と組み合わせることが可能である。本発明の結合タンパク質は、メサラミン、プレドニゾン、アザチオプリン、メルカプトプリン、インフリキシマブ、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、ジフェノキシラート／硫酸アトロピン、塩酸ロペラミド、メトトレキサート、オメプラゾール、フォラート、シプロフロキサシン／デキストロース−水、重酒石酸ヒドロコドン／ａｐａｐ、テトラサイクリン塩酸塩、フルオシノニド、メトロニダゾール、チメロサール／ホウ酸、コレスチラミン／スクロース、塩酸シプロフロキサシン、硫酸ヒヨスチアミン、塩酸メペリジン、塩酸ミダゾラム、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸プロメタジン、リン酸ナトリウム、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、セレコキシブ、ポリカルボフィル、ナプシル酸プロポキシフェン、ヒドロコルチゾン、マルチビタミン、バルサラジド二ナトリウム、リン酸コデイン／アセトアミノフェン（ａｐａｐ）、塩酸コレセベラム、シアノコバラミン、葉酸、レボフロキサシン、メチルプレドニソロン、ナタリズマブおよびインターフェロンγと組み合わせることが可能である。
【０２３７】
本発明の結合タンパク質と組み合わせることが可能な治療剤の非限定的な例には、以下のもの：アスピリン、ニトログリセリン、イソソルバイド・モノニトラート、コハク酸メトプロロール、アテノロール、酒石酸メトプロロール、ベシル酸アムロジピン、塩酸ジルチアゼム、硝酸イソソルビド、重硫酸クロピドグレル、ニフェジピン、アトロバスタチンカルシウム、塩化カリウム、フロセミド、シンバスタチン、塩酸ベラパミル、ジゴキシン、塩酸プロプラノロール、カルベジロール、リシノプリル、スピロノラクトン、ヒドロクロロチアジド、マレイン酸エナラプリル、ナドロール、ラミプリル、エノキサパリンナトリウム、ヘパリンナトリウム、バルサルタン、塩酸ソタロール、フェノフィブラート、エゼチミブ、ブメタニド、ロサルタンカリウム、リシノプリル／ヒドロクロロチアジド、フェロジピン、カプトプリルおよびフマル酸ビソプロロールが含まれる。
【０２３８】
本発明の医薬組成物は、本発明の結合タンパク質の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」は、所望の治療的結果を達成するための投薬量で、および所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。結合タンパク質の治療的有効量は、当業者によって決定され得、病状、年齢、性別および個体の体重ならびに結合タンパク質が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、結合タンパク質のあらゆる毒性効果または有害効果が、治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、および所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。典型的には、疾病のより初期段階の前にまたは疾病のより初期段階において、予防的投薬が患者に使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量より少ない。
【０２３９】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答または予防的応答）を与えるように調整され得る。例えば、単一のボーラスを投与することができ、複数の分割された用量を経時的に投与することができ、または、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少もしくは増加させ得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される投薬単位形態は、治療されるべき哺乳動物患者に対する統一された投薬として適した、物理的に分離された単位を表し、各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の投薬単位形態に対する規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき具体的な治療効果または予防効果ならびに（ｂ）個体における過敏症の治療用のこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。
【０２４０】
本発明のＤＬＬ４結合タンパク質の治療的または予防的有効量の例となる非限定的範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量値は、軽減される病状の種類および重症度に応じて変化し得ることは注目すべきである。いかなる特定の対象でも、特定の投与計画は、個人の必要性および前記組成物を投与するまたは前記組成物の投与を監督する人物の専門的判断に従って、時間をかけて調整すべきであること、ならびに、本明細書に記載された投与量範囲は例にすぎず、主張される組成物の範囲または実践を限定するためのものではないことはさらに理解されるべきである。
【０２４１】
本明細書に記載された本発明の方法の他の適切な改変および適応は明らかであり、本明細書に開示された本発明または実施形態の範囲を逸脱することなく適切な等価物を使用して実行し得ることは当業者には容易に明らかになる。この時点で本発明を詳細に説明し終えたので、同じ内容は以下の実施例を参照することによりさらにはっきりと理解されることになるが、以下の実施例は説明目的のためにのみ含まれるもので、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【０２４２】
［実施例１］
ＤＬＬ４抗体の機能的活性を判定するのに使用されるインビトロアッセイ
実施例１．１：ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術を使用する親和性決定
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳ）は、結合速度および解離速度定数の動態測定値を用いて抗体の親和性を決定する。精製された組換えＤＬＬ４細胞外ドメインへのＤＬＬ４抗体の結合は、２５℃でランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を使用してＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００、またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００のいずれか；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳ）を用いた表面プラズモン共鳴を基礎とする測定により決定される。例えば、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に希釈されたほぼ９０００  ＲＵのヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳ）は、製造業者の使用説明書および手順に従って標準アミンカップリングキットを２５μｇ／ｍｌで使用して、ＣＭ５研究等級のバイオセンサーチップ全体に直接固定化された。バイオセンサー表面上の未反応部分はエタノールアミンを用いてブロックされる。動態解析では、１対１ラングミュア結合モデルから導き出される反応速度式は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０．１ソフトウェアまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して複数の抗原注入物に同時にフィットされる（グローバルフィット解析を使用して）。精製された抗体は、ヤギ抗ヒトＦｃ反応表面にわたる捕捉のためにランニングバッファーに希釈される。リガンドとして捕捉される抗体（１μｇ／ｍｌ）は１０μｌ／分の流速で反応マトリックス全体に注入される。前記アッセイ中、すべての測定値は捕捉表面単独（すなわち、捕捉された抗ＤＬＬ４抗体なしで）に対して照合された。会合および解離速度定数、Ｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）およびＫｏｆｆ（ｓ−１）は８０μｌ／分の連続流速下で決定される。速度定数は、３倍連続希釈として、１．２３−９００ｎＭの範囲の異なる抗原濃度で、緩衝液のみの注入物を含んで（二重照合のために使用される）動態結合測定を行うことにより導かれる。次に、抗体と標的抗原間の反応の平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）は、以下の式：ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎにより速度論的速度定数から計算される。結合は時間の関数として記録され、速度論的速度定数が計算される。このアッセイでは、１０６Ｍ−１ｓ−１もある結合速度およびわずか１０−６ｓ−１の解離速度を測定することが可能である。
【０２４３】
実施例１．２：ＥＬＩＳＡにより決定される可溶性ＤＬＬ４細胞外ドメインへのＤＬＬ４抗体の結合
方法１（捕捉ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート（＃４３９４５４）をＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０）中ヒトＩｇＧに対する５μｇ／ｍｌ抗体（Ｆｃｇ断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−００５−０９８、１００μｌ／ウェル）を用いて被膜し、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートは洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、次に２５℃で１時間、２００ｍｌ／ウェル  ブロッキング緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いてブロックした。プレートは３回洗浄され、２５℃で１時間、１００μｌ／ウェルＤＬＬ４抗体（０．０００１−１００ｎＭ、ブロッキング緩衝液中１０倍連続希釈）と一緒にインキュベートされ、その後再び３回洗浄された。捕捉されたＤＬＬ４抗体を含有するプレートは２５℃で１時間、ビオチン標識されたヒトＤＬＬ４細胞外ドメイン（ブロッキング緩衝液中１０ｎＭ、１００μｌ／ウェル）と一緒にインキュベートされ、３回洗浄され、２５℃で１時間、ＨＲＰをコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＫＰＬ＃４７４−３０００、ブロッキング緩衝液中１対１００００希釈、１００μｌ／ウェル）と一緒にインキュベートされた。最終洗浄後、プレートは１００μｌ／ウェルＥＬＩＳＡ基質（１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ＃３４０２８０）と一緒にインキュベートされた。反応は２５℃で２分後、１００μｌ／ウェル  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止され、吸光度は４５０ｎｍで読み取られた。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析され、ＥＣ５０値が報告された。
【０２４４】
方法２（銅被膜プレート）
９６ウェル銅被膜プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１５１４３）は使用前に洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄され、次に２５℃で１時間、ＰＢＳ中１μｌ／ｍｌのヒトＤＬＬ４−ｈｉｓまたはマウスＤＬＬ４−ｈｉｓまたはｃｙｎｏＤＬＬ４−ｈｉｓの１００μｌ／ウェルと一緒に攪拌しながらインキュベートされた。次にプレートは３回洗浄された。次に、１００μｌ／ウェルの組換えラット／ヒトキメラまたは組換えヒト抗ＤＬＬ４抗体は、２５℃で１時間、攪拌しながらプレートに添加され（０．００１６４−２７ｎＭ、ＥＬＩＳＡ緩衝液＝ＰＢＳＴ中４倍連続希釈、１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ＃３７５１５））その後再び３回洗浄された。プレートは、２５℃で１時間、攪拌しながらヤギ抗ヒトＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１４１２）（ＥＬＩＳＡ緩衝液中１対４００００希釈、１００μｌ／ウェル）と一緒にインキュベートされ、その後３回洗浄された。最終洗浄後、プレートは１００μｌ／ウェルＥＬＩＳＡ基質（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ８６６５）と一緒にインキュベートされた。反応は２５℃で８分後、１００μｌ／ウェル  １Ｎ  ＨＣｌを用いて停止され、吸光度は４５０ｎｍで読み取られた。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析され、ＥＣ５０値が報告された。
【０２４５】
実施例１．３：フローサイトメトリーにより評価されるヒト腫瘍細胞系統の表面へのＤＬＬ４モノクローナル抗体の結合（ＦＡＣＳ）
細胞表面ＤＬＬ４を過剰発現している安定した細胞系統は、組織培養フラスコから収穫され、４回洗浄され、１％ウシ血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁された。１．５×１０５細胞は、氷上で６０分間、ＦＡＣＳ緩衝液中様々な濃度の抗体と一緒にインキュベートされた。細胞は２回洗浄され、５０μＬのＲ−フィコエリトリンコンジュゲートされた抗ラットＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片（ＦＡＣＳ緩衝液中１対２００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳ、カタログ番号１１２−１１６−０７２）が添加された。氷上でのインキュベーション（４℃、６０分）に続いて、細胞は３回洗浄され、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁された。蛍光は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ−ＨＴＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）を使用して測定された。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析され、ＥＣ５０値は、ＤＬＬ４発現細胞に結合する最大ＤＬＬ４抗体の５０％に到達するための抗体の濃度として報告された。
【０２４６】
実施例１．４：ＤＬＬ４抗体による可溶性ＤＬＬ４細胞外ドメインとのＮｏｔｃｈ−１相互作用の抑制（競合ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート（ｈｕＤＬＬ４  ＥＬＩＳＡでは＃４３９４５４）および９６ウェルＣｏｓｔａｒプレート（ｍｕＤＬＬ４  ＥＬＩＳＡでは＃９０１８）は１６ｎＭヒトＮｏｔｃｈ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃３６４７−ＴＫ、Ｄ−ＰＢＳ中１００μｌ／ウェル）を用いて被膜され、４℃で一晩インキュベートされた。次に、プレートは洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄され、２５℃で１時間、２００μｌ／ウェル  ブロッキング緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０））でブロックされた。ブロッキング中、ビオチン標識されたヒトＤＬＬ４細胞外ドメイン（１４ｎＭ）は２５℃で１時間、抗体（３０ｐＭ−６６ｎＭ、ブロッキング緩衝液中３倍連続希釈）と攪拌しながら混合された。アッセイプレートはブロッキング後洗浄され、ＤＬＬ４／抗体混合物と一緒にインキュベートされた（１００μｌ／ウェル、攪拌しながら２５℃で１時間）。プレートは再び洗浄され、ＨＲＰをコンジュゲートされたストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃６５Ｒ−Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ、ブロッキング緩衝液中１対５０００に希釈される）１００μｌ／ウェルは２５℃で１時間攪拌しながら添加された。最終洗浄後、プレートは１００μｌ／ウェル基質（ＴＭＢ  Ｓｉｇｍａ＃８６６５）を使用して展開され、反応は、２５℃での８分間インキュベーション後（ｍｕＤＬＬ４  ＥＬＩＳＡでは）および２５℃での２０分間インキュベーション後（ｈｕＤＬＬ４  ＥＬＩＳＡでは）１００μｌ／ウェル  １Ｎ  ＨＣｌを使用して停止され、吸光度は４５０ｎｍで読み取られた。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析され、ＩＣ５０値は、Ｎｏｔｃｈ１に結合しているＤＬＬ４の５０％減少を達成するための抗体の濃度として報告された。
【０２４７】
実施例１．５：フローサイトメトリーにより評価される抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体によるＤＬＬ４過剰発現している２９３Ｇ細胞への可溶性Ｎｏｔｃｈ結合のブロッキング（競合ＦＡＣＳ）
Ｎｏｔｃｈブロッキングアッセイ：簡潔に述べると、細胞表面ＤＬＬ４を過剰発現している安定した細胞系統は、組織培養フラスコから収穫され、１％ウシ血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁された。ＨＥＫ２９３−ｈＤＬＬ４またはＨＥＫ２９３−ｍＤＬＬ４細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液中１．５×１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレート（ｖ形底）に分注された。細胞を遠心沈降させ上清を破棄した後、適切に希釈された５０μＬの精製されたＩｇＧは各ウェルに添加され、氷上４℃で６０分間インキュベートされ、続いてｈＤＬＬ４−２９３Ｇでは０．２μｇ／ｍＬのＮｏｔｃｈ−ビオチンを５０μｌ／ウェル、またはｍＤＬＬ４−２９３Ｇでは２．０μｌ／ｍＬのＮｏｔｃｈ−ビオチンを５０μｌ／ウェル（最終で１．０または０．１μｇ／ｍＬ）添加し、氷上４℃でさらに１時間インキュベートされた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、５０μＬのＲ−フィコエリトリンコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＦＡＣＳ緩衝液中１対１５０希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳ、カタログ番号０１６−１１０−０８４）が添加された。氷上でのインキュベーション（４℃、６０分）に続いて、細胞は３回洗浄され、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁された。蛍光は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ−ＨＴＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して測定された。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析され、ＩＣ５０値は、ＤＬＬ４発現細胞に結合しているＮｏｔｃｈの５０％減少に到達するための抗体の濃度として報告された。
【０２４８】
実施例１．６：ＤＬＬ４抗体によるＥＡ．ｈｙ９２６細胞におけるｓＶＥＧＦＲ１（ｓＦＬＴ１）のＤＬＬ４依存性増加の抑制
組織培養プレート、９６ウェル、はＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０）中１．６７ｍｇ／ｍｌのヒトＤＬＬ４細胞外ドメインの１００μｌ／ウェルで被膜され、４℃で一晩インキュベートされた。プレートはＤ−ＰＢＳを用いて１回洗浄され、４０００ＥＡ．ｈｙ９２６細胞／ウェルは抗体の非存在下または存在下で播種された。細胞増殖は、ＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｃ３５００７）を使用して４日後に測定された。条件培地におけるｓＶＥＧＦＲ１発現は、製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＤＶＲ１００Ｂ）の推奨を通じてＥＬＩＳＡキットにより検出された。ｓＶＥＧＦＲ１のレベルは、細胞増殖の違いを説明するために、ＣｙＱＵＡＮＴアッセイにより決定されるＲＦＵに正規化された。
【０２４９】
実施例１．７：Ｎｏｔｃｈレポーターアッセイを使用するＤＬＬ４抗体によるＥＡ．ｈｙ９２６細胞におけるＤＬＬ４依存性Ｎｏｔｃｈ活性化の抑制
９６ウェル黒色クリア底組織培養プレートは、Ｎｏｔｃｈ応答性プロモーターにより推進されるルシフェラーゼを発現する操作されたＥＡ．ｈｙ９２６細胞を７０００細胞／ウェルで一晩播種された。２００ｎＭから連続希釈された抗体は、完全長ＤＬＬ４を発現する５０００ＨＥＫ２９３Ｇ細胞／ウェルの等量と１５分間混合された。２９３Ｇ／ＤＬＬ４細胞は、試験抗体の存在下で２４時間ＥＡ．ｈｙ９２６Ｎｏｔｃｈレポーター細胞と同時培養された。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ２９４０）により解析された。
【０２５０】
実施例１．８：分子同一性および物理化学的特性特徴付けのための分析法および技法
ＰＥＧ沈降法
体積排除の原理に従って固体タンパク質の相分離を誘導するためのＰＥＧの使用は、タンパク質の可溶性を評価する実行可能なアプローチを表す。ＰＥＧは、他の沈殿剤よりも、外気温でのタンパク質の最小変性（タンパク質の三次構造に影響を及ぼさない）および４℃から３０℃の範囲内では温度管理を必要としない、すなわち実験台の外気温で沈殿実験を実施することが可能であることを含むいくつかの利点を有する。
【０２５１】
一般に、ＰＥＧによるタンパク質の沈殿は、体積排除効果に基づいて説明される。この理論によれば、タンパク質は溶剤中のＰＥＧ直鎖に占められている領域から立体的に排除される。その結果、タンパク質は濃縮され、その溶解度を上回ると最終的に沈殿する。熱力学的観点から、立体排除により、タンパク質の化学ポテンシャルはそれが純粋な固体状態の化学ポテンシャルを上回るまで増加し、タンパク質は沈殿する。主に、ＰＥＧとタンパク質間の相互作用の大きな好ましくない自由エネルギーのせいでこうしたことが起き、立体排除効果のせいでタンパク質の優先的水和が減少する。水溶液中では、優先的水和はタンパク質の天然構造を維持するのに寄与する。一般に、体積排除はＰＥＧの分子量が増加するに従って有効性は大きくなる、すなわち、ＰＥＧ分子量の増加に従ってタンパク質を沈殿させるのに必要なＰＥＧは少なくなることが明らかにされている。
【０２５２】
３０００のＰＥＧ分子量は、本特許が扱う抗体の溶解度を評価するために選択された。１ｍＬの水に対し１グラムのＰＥＧの割合でＰＥＧを脱イオン水に溶解することにより５０％ＰＥＧ溶液を作製した。次に、ＰＥＧ溶液は、最初は０．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で容積０．５ｍＬである抗体の溶液に添加される。最初の混濁が持続するようになるまで、ＰＥＧ溶液は絶えず添加され混合される。この沈殿を引き起こすのに必要なＰＥＧ３０００の割合は５０×（添加されたＰＥＧ３０００溶液の容積／ＰＥＧ添加前の抗体溶液の最初の容積）として計算される。
【０２５３】
沈殿に必要なＰＥＧ３０００の割合は、公知の水溶性を有するタンパク質の沈殿に必要な割合と比較される。例えば、アダリムマブの水溶性は２００ｍｇ／ｍｌを上回っている。したがって、目的のタンパク質を沈殿させるのに必要なＰＥＧ３０００の割合がアダリムマブを沈殿させるのに必要な割合に類似している場合、そのタンパク質の予想される溶解度はアダリムマブの溶解度に類似することになる。
【０２５４】
真正溶解度法
タンパク質が溶液から沈殿するのが観察されるまで、またはフィルターユニット内でタンパク質を濃縮させることが可能な最小容積に到達するまで溶液中のタンパク質を濃縮させるＡｍｉｃｏｎ遠心濾過器を使用することにより、真正溶解度は決定される。後者では、１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過器はほぼ５０μｌの最小容積を有し、４ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過器はほぼ１５μｌの最小容積を有している。
【０２５５】
先ず、タンパク質は特定の製剤（複数可）に透析される。これらの研究では、抗体量は１０ｍｇまたはそれよりはるかに少なかった。次に、タンパク質溶液は、Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過器リテンテート室に挿入される。前記室は、遠心力を受けると１０未満から３０キロダルトンまでの分子を通過させる孔のあるニトロセルロース膜と縦列に並んでいる。典型的には１４０キロダルトンを超える抗体は保持され、水、バッファー分子、小賦形剤および塩は通過する。次に、遠心濾過器は、タンパク質が溶液から沈殿するのが観察されるまで、またはフィルターユニット内でタンパク質を濃縮させることが可能な最小容積に到達するまで、製造業者の仕様書に従って遠心分離される。
【０２５６】
遠心分離後、タンパク質溶液はリテンテート室から取り除かれ、濃度は紫外吸光度により測定される。次に、溶液は１日から２日間２５℃および５℃で保管され、沈殿の兆候についてモニタリングされる。
【０２５７】
近ＵＶ−ＣＤ技法
近ＵＶ−ＣＤスペクトル測定は、タンパク質の三次構造について重要な情報を与え、この点に関して最もよく使用されている技法の１つである。ＣＤは、平面偏光放射の左と右の円偏光成分の示差吸光を表す。タンパク質では、近ＵＶＣＤ領域（２５０−３２０ｎｍ）における発色団は、芳香族アミノ酸、すなわち、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンならびにジスルフィド結合であり、ＣＤ効果は発色団が非対称（埋め込み）環境に存在するときに生じる。２５０−２７０ｎｍの領域中のシグナルはフェニルアラニン残基に起因し、２７０−２９０ｎｍからのシグナルはチロシンに起因し、２８０−３００ｎｍからのシグナルはトリプトファンに起因する。ジスルフィド結合は近ＵＶスペクトル全体に広く弱いシグナルを生じる。近ＵＶ−ＣＤスペクトルは、タンパク質間相互作用および／または製剤条件の変化に起因する変化などの三次構造の小さな変化に敏感であり得る。
【０２５８】
芳香族アミノ酸のＣＤスペクトルに影響を与えることが可能な要因が他にいくつか存在する。このなかには、（１）タンパク質の硬性、（２）水素結合の性質、および（３）様々な芳香族アミノ酸間の相互作用が存在する。さらに、このようなアミノ酸を多数有するタンパク質は、陽性および陰性バンドの解除せいでより小さなＣＤバンドを有し得る。
【０２５９】
簡潔に述べると、タンパク質は１ｍｇ／ｍｌの所望の製剤（複数可）に透析され、Ｊａｓｃｏ  ８００ＣＤ分光計を用いて２５０−３２０ｎｍまたは２４０−３２０ｎｍからスキャンされる。タンパク質のない対応する製剤もスキャンされ、その読みはタンパク質溶液のスキャンの読みから差し引かれる。近ＵＶ−ＣＤスペクトルは、モル楕円率対２５０または２４０から３２０ｎｍまでの波長のプロットである。
【０２６０】
抗体一般では、半Ｓ字形プロファイルを有する近ＵＶ−ＣＤスペクトルは、良好な三次構造フォールディングを示しており、もっと平坦で特徴の少ないプロファイルはアンフォールドする傾向が大きいことを示している。コンパクトなフォールディングは良好な安定性を伴い、フォールディングが不十分では疎水性の内部を曝露し、タンパク質分子間の疎水性相互作用をもたらし、望ましくない凝集体が形成され得る。
【０２６１】
ＤＳＣ技法
抗体の熱安定性は、ＤＳＣ装置を使用して評価された。使用されたＤＳＣ装置は、キャピラリーセルを備えた自動ＶＰ−ＤＳＣ機器（Ｍｉｃｒｏｃａｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．／Ｍｉｃｒｏｃａｌ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）であった。分子のアンフォールディングは、１ｍｇ／ｍＬの試料について２５℃−９５℃の温度範囲にわたり１℃／分スキャン速度を適用して調べられた。用いられた追加の測定パラメータは１６秒のフィティング期間、１０分のプレスキャンの待機時間であり、測定は非フィードバックモードで実施された。個々の測定につき、下で提供されるプレートフィルスキームを用いて４２０μＬの試料／ブランクがＤＳＣ測定試料ホルダーに充填された。得られた温度記録図は、中間温度および異なる遷移のエンタルピーを得るために非二状態モデルにフィットされた。
【０２６２】
成功する生物製剤開発候補の追加の必要条件は、タンパク質がその天然状態および立体構造のままであることである。水溶液中のタンパク質は、その天然（フォールディングされている）立体構造とその変性（アンフォールディングされている）立体構造間の平衡状態にある。天然状態の安定性は、その系のギブス自由エネルギー（ＤＧ）の大きさおよびエンタルピー（ＤＨ）とエントロピー（ＤＳ）変化間の熱力学的関係に基づいている。正のＤＧは、変性した状態よりも天然状態のほうが安定していることを示しており、すなわち、ＤＧが正であるほど、安定性は大きい。タンパク質がアンフォールドするためには、安定化力が壊される必要がある。立体構造エントロピーが安定化力を圧倒すると、エントロピーが優勢になる温度でタンパク質はアンフォールドする。ＤＳＣは、熱変性に起因するタンパク質アンフォールディングのＤＨを測定する。通例、遷移中点（Ｔｍ）が高くなるに従って、タンパク質はより低い温度でそれだけ安定すると述べることができる。同じ実験中、ＤＳＣはタンパク質変性のための熱容量の変化（ＤＣｐ）も測定する。タンパク質アンフォールディングを伴う熱容量変化は、主に、天然状態では埋もれていたが変性状態では溶剤曝露される側鎖の水和の変化に起因する。ＤＳＣは、タンパク質および他の生物学的巨大分子の液体製剤安定性についての貴重な予測因子であることが明らかにされている（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ａｎｄ  Ｇｏｍｂｏｔｚ、ＢｉｏＰｈａｒｍ．、１３：３６−４６頁（２０００）、ａｎｄ  Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１５：２００−２０８頁（１９９８））。
【０２６３】
ＳＥＣ技法
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、サイズに基づいてタンパク質を分離した。タンパク質は水系移動相におよびカラムに充填されている多孔性固定相樹脂を通して保持されている。カラム中の保持時間は、タンパク質の水力学的サイズと充填された樹脂床中の孔のサイズの関数である。分子が小さいほど、樹脂内のより小さな孔を貫通することが可能であり、大きな分子よりも長く保持される。カラムから溶出すると、タンパク質はＵＶ吸光度により検出される。前記ＳＥＣ法は、ＴＳＫゲルガード（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳ、カタログ番号０８５４３）およびＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ×Ｌ（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳ、カタログ番号０８５４１）を使用した。移動相は、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ６．８であった。流速は０．２５ｍＬ／分であった。注入量は２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ試料であった。カラム温度は室温であった。自動回収装置温度は２−８℃であった。全実行時間は５５分であった。検出は、２１４ｎｍ波長のＵＶ吸光度に基づいており、バンド幅は８ｎｍに設定され、バンド幅１００ｎｍの３６０ｎｍ基準波長を使用した。
【０２６４】
凍結融解法
所望の製剤（複数可）中１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液は、少なくとも４時間、−８０℃で凍結され、次に水浴中３０℃で融解される。その後、前記溶液は−８０℃で再凍結される。これを５サイクル繰り返す。特定の凍結融解サイクル、例えば、２回目および４回目後、前記溶液の一部は、再凍結前にＳＥＣによる分析のために回収され得る。凍結融解安定性試験は、変性させる氷−水界面へのタンパク質分子のより大きな曝露に起因する「悪化ケースのシナリオ」を得るために低いタンパク質濃度で実行される。濃度が高くなると、それに比例してタンパク質が氷−水界面に遭遇するのが少なくなり、代わりに他のタンパク質分子と相互作用する。
【０２６５】
加速安定性法
所望の製剤（複数可）中１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液は、無菌条件下で０．２２μｍＰＶＤＦフィルターを通され、少なくとも２１日間４０℃および／または５０℃でインキュベートされる。７日目および２１日目に、無菌条件下でアリコットは回収されＳＥＣによる分析に供される。次に、溶液はインキュベーションに戻される。
【０２６６】
［実施例２］
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術による抗ＤＬＬ４ヒトモノクローナル抗体Ｅ９およびＡ１０の作製および単離
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術（Ｃｈｕｎｇ−Ｍｉｎｇ  Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許出願公開第２０１０／００９９１０３号参照）を使用して、プールされたヒト脾臓およびリンパ節抗体ライブラリーはＤＬＬ４抗原に対して７ラウンドで選択された：１００ｎＭビオチン標識されたヒトＤＬＬ４細胞外ドメイン（ラウンド１および２）、５０ｎＭビオチン標識されたヒトＤＬＬ４細胞外ドメインと５０ｎＭビオチン標識されたマウスＤＬＬ４細胞外ドメインの混合物（ラウンド３）、１００ｎＭビオチン標識されたヒトＤＬＬ４細胞外ドメイン（ラウンド４および５）、ヒトＤＬＬ４を安定的に発現している２９３Ｇ細胞と１００ｎＭビオチン標識されたヒトＤＬＬ４細胞外ドメイン（ラウンド６）、ヒトおよびマウスＤＬＬ４を安定的に発現しているＢＡＦ３細胞（ラウンド７）。Ａ１０もＥ９も抗体ライブラリーのラウンド７選択から同定された（表４）。野生型ヒトＩｇＧ１に構築された場合、前記抗体はそれぞれＡ１０．１およびＥ９．１と新たに命名される。
【０２６７】
【表４】
0005903382.tif 000008
【０２６８】
［実施例３］
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体Ｅ９およびＡ１０のインビトロ特徴付け
Ｅ９およびＡ１０のＤＬＬ４抗原結合親和性は、実施例１．１に記載されたＢＩＡＣＯＲＥ技術により決定された。下の表５に示されるように、Ｅ９およびＡ１０はヒトＤＬＬ４（それぞれ３．３６および６．６８ｎＭのＫＤ）ならびにカニクイザルＤＬＬ４（それぞれ４．２および７．８ｎＭのＫＤ）に対して類似の平衡解離定数値を有する。Ｅ９はマウスおよびラットＤＬＬ４とも交差反応する（それぞれ１６および１５ｎＭのＫＤ）。
【０２６９】
【表５】
0005903382.tif 000009
【０２７０】
抗体−抗原結合活性も、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを基礎とするアッセイを使用して評価された（実施例１．２、１．３に記載されており、ＥＣ５０値は表３に報告されている）。組換えＤＬＬ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合に加えて、Ｅ９とＡ１０の両方は細胞表面で発現されるＤＬＬ４に結合することができる（表６）。
【０２７１】
ＤＬＬ４のその受容体Ｎｏｔｃｈ１との相互作用をブロックする抗体の能力は、実施例１．４および１．５に記載されたＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを基礎とする競合アッセイを用いて評価された。表６に示されるように、Ｅ９およびＡ１０はＤＬＬ４とのＮｏｔｃｈ１の相互作用を効率的にブロックした（ＥＣＤおよび細胞結合型）。さらに、ＤＬＬ４媒介細胞活性をインビトロで中和する抗体の能力をさらに決定するための細胞を基礎とする機能的アッセイが開発された（実施例１．６および１．７に記載されている）。Ｅ９もＡ１０も、ＤＬＬ４誘導Ｎｏｔｃｈ活性化およびＥＡ．ｈｙ９２６細胞におけるｓＶＥＧＦＲ１発現を抑制した（表６）。
【０２７２】
【表６】
0005903382.tif 000010
【０２７３】
［実施例４］
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体Ｅ９およびＡ１０の親和性成熟
抗ＤＬＬ４  Ｅ９親和性成熟
配列比較により、ＤＬＬ４抗体Ｅ９はヒト生殖系列ＶＨ４−３９／ＪＨ４およびＶ２−１／ＪＬ６に対する最も高い同一性を共有することが示された。ＤＬＬ４に対するＥ９の親和性を改善するために、高変異したＣＤＲ残基は、生殖系列ＶＨ４−３９およびＶ２−１に対する高い同一性も共有するＩｇＢＬＡＳＴデータベースにおける他のヒト抗体配列から同定された。次に、対応するＥ９  ＣＤＲ残基は、親和性成熟法の使用に適したｓｃＦｖフォーマットにおいて３つの抗体ライブラリーを作製するために、これらの位置に低縮重度を有するプライマーを用いてＰＣＲにより制限変異誘発に供された。第一のライブラリーはＶＨ  ＣＤＲ１および２における残基３０、３１、３２、３３、５０、５４、５６および６５（カバット付番）に変異を含有し、第二のライブラリーはＶＨ  ＣＤＲ３における残基９５から１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｃおよび１０２に変異を含有し、第三のライブラリーは３つのＶＬ  ＣＤＲにおける残基２７、３０、３１、３３、５２、５３、９３から９６に変異を含有した。ヒト生殖系列フレームワーク配列に対するＥ９の同一性をさらに増加するために、ＶＬ位置１０３のＡｒｇはＬｙｓに変異され、ＶＬ位置８０（Ａ／Ｐ）および１００（Ｓ／Ｙ）でのバイナリー縮重も第三のライブラリーに導入された（表７）。
【０２７４】
【表７】
0005903382.tif 000011
【０２７５】
これらのＥ９ライブラリーは細胞に形質転換され、磁気セルソーティングにより次に蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により低濃度のビオチン化ＤＬＬ４細胞外ドメインに対して選択される細胞表面上に提示された。改善された結合速度、解離速度、または両方のための選択が実施され、親和性調節Ｅ９クローンの抗体タンパク質配列（表８）は、ＩｇＧフォーマットに変換して戻し、さらに特徴付けをするために回収された。
【０２７６】
【表８】
0005903382.tif 000012
0005903382.tif 000013
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【０２７７】
抗ＤＬＬ４  Ａ１０親和性成熟
上記のＥ９親和性成熟に類似する方法で、配列比較により、ＤＬＬ４抗体Ａ１０はヒト生殖系列ＶＨ３−３０およびＶ２−１に対して最も高い同一性を共有していることが示された。それぞれＶＨ３−３０およびＶ２−１由来のヒトＶＨおよびＶλ配列は、ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔデータベースからダウンロードされ、配列ロゴを作製した。これらの配列ロゴを使用して、親和性成熟ライブラリーを作製するためにどの位置がドープされることになるかを決定した。
【０２７８】
Ａ１０ライブラリーは細胞に形質転換され、磁気セルソーティングにより次に蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により低濃度のビオチン化ＤＬＬ４細胞外ドメインに対して選択される細胞表面上に提示された。改善された結合速度、解離速度、または両方についての選択が実施され、親和性調節Ａ１０クローンの抗体タンパク質配列は、ＩｇＧフォーマットに変換して戻し、さらに特徴付けをするために回収された。親和性成熟クローンの重鎖（ＶＨ）領域は下の表９に示され、親和性成熟クローンの軽鎖（ＶＬ）領域は下の表１０に示されている。
【０２７９】
【表９】
0005903382.tif 000019
0005903382.tif 000020
0005903382.tif 000021
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【０２８０】
【表１０】
0005903382.tif 000023
0005903382.tif 000024
【０２８１】
［実施例５］
ＣＤＲ移植されたＥ９抗体の構築
Ｅ９  ＶＨのＣＤＲはＶＨ３コンセンサスフレームワーク上に移植され（移植されたＶＨ＝Ｅ９ｖｈ３ｇ２）、Ｅ９  ＶＬのＣＤＲは、抗ＤＬＬ４  Ａ１０抗体のＶＬ２−１フレームワーク上に（移植されたＶＬ＝Ｅ９ａ１０ｖｌｇ２）およびＡ１０生殖系列（Ｅ９  ＶＬとの相同性において最も近い生殖系列）のＶＫフレームワーク上に（移植されたＶＬ＝Ｅ９ＡＶＫ）移植された。代わりに、フレームワーク（ＦＷ）修復もＥ９  ＶＨを用いて実施された。すなわち、そのＦＷは維持されたが、抗体不安定性を引き起こし得るアミノ酸は取り換えられた（修復されたＶＨ＝Ｅ９ＶＨ４ｒ２）。フレームワーク逆変異は、抗体構造および機能性を維持するためにＣＤＲ移植とＦＷ修復の両方に組み込まれた（表１１および表１４）。
【０２８２】
Ｅ９のＣＤＲは、抗ＩＬ−１８および抗ＩＬ−１２抗体のフレームワーク上にも移植された。具体的には、Ｅ９  ＶＨのＣＤＲは抗ＩＬ−１８のＶＨ５−５１フレームワーク（移植されたＶＨ＝Ｅ９ＶＨ３２５）上におよび抗ＩＬ−１２のＶＨ２−７０フレームワーク（移植されたＶＨ＝Ｅ９ＶＨ１Ｄ４．１）上に移植された。Ｅ９  ＶＬのＣＤＲは抗ＩＬ−１２のＶＫ  Ｌ２／Ｌ１６フレームワーク（移植されたＶＬ＝Ｅ９ＶＬ３２５）上におよび抗ＩＬ−１２のＶＫ  Ｂ３フレームワーク（移植されたＶＬ＝Ｅ９ＶＬ１Ｄ４．１）上に移植された。フレームワーク逆変異は、抗体構造および機能性を維持するためにＣＤＲ移植に組み込まれた（表１５および表１８）。
【０２８３】
上記のインシリコ構築ＣＤＲ移植された抗体は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより一般に好まれるプラスミドに直接合成された。可変重鎖領域は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｃＤＮＡ断片上および２つのヒンジ領域アミノ酸変異を含有するヒトＩｇＧ１定常領域上のインフレームに挿入された。これらの変異は位置２３４（ＥＵ付番）でロイシンからアラニンへの変化および位置２３５でロイシンからアラニンへの変化である（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７頁（１９９１））。可変軽鎖領域はヒトラムダ定常領域と一緒におよびヒトカッパ定常領域と一緒にインフレームに挿入された。Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎから合成された構築物を受け取ると、ＤＮＡはスケールアップされ、配列が確認された。各抗体に対応する正確なＣＤＲ移植された重鎖および軽鎖（表１１および１４）（表１５および１８）は、ＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞に同時トランスフェクトされ、完全長ＣＤＲ移植された抗ヒトＤＬＬ４抗体が一過性で産生された。表１１は、作製されたすべてのＥ９抗体バリアントおよびＨＥＫ−２９３−６Ｅ発現データを要約している。細胞組換えヒト抗体を含有する細胞上清は、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより精製され、結合した抗体は酸緩衝液を添加することにより溶出された。抗体はＰＢＳ中に透析された。
【０２８４】
精製ＣＤＲ移植された抗体のＤＬＬ４に結合するまたはＤＬＬ４活性を抑制する能力は、ＥＬＩＳＡ（実施例１．２、方法２）、Ｂｉａｃｏｒｅ（実施例１．２）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）（実施例１．３）のような異なる種類のアッセイを使用して決定された。表１２および表１６には、ヒトＤＬＬ４、マウスＤＬＬ４およびカニクイザルＤＬＬ４について表１１および表１５にそれぞれ記載されているＥＬＩＳＡアッセイおよびＦＡＣＳアッセイからのＥＣ５０値ならびにＣＤＲ移植された抗体のＢｉａｃｏｒｅにより決定された親和性が示されている。表１３および表１７には、表１１および表１５にそれぞれ記載されているＣＤＲ移植された抗体についての、ヒトＤＬＬ４およびマウスＤＬＬ４を用いたブロッキングＥＬＩＳＡ（実施例１．４）およびブロッキングＦＡＣＳ（実施例１．５）からのＩＣ５０値が示されている。
【０２８５】
【表１１】
0005903382.tif 000025
【０２８６】
【表１２】
0005903382.tif 000026
【０２８７】
【表１３】
0005903382.tif 000027
【０２８８】
【表１４】
0005903382.tif 000028
0005903382.tif 000029
0005903382.tif 000030
0005903382.tif 000031
0005903382.tif 000032
0005903382.tif 000033
【０２８９】
【表１５】
0005903382.tif 000034
【０２９０】
【表１６】
0005903382.tif 000035
【０２９１】
【表１７】
0005903382.tif 000036
【０２９２】
【表１８】
0005903382.tif 000037
0005903382.tif 000038
【０２９３】
［実施例６］
親和性成熟抗体Ｅ９−７１の追加の操作
Ｅ９−７１（Ｍ）およびＥ９−７１（Ｌ）
親和性成熟抗ＤＬＬ４抗体Ｅ９−７１の重鎖と軽鎖両方がさらに操作された。Ｅ９−７１重鎖のＣＤＲ−Ｈ３中のメチオニン（Ｍ）は、変異ヌクレオチドを含有するフォワードおよびリバースオーバーラッププライマーを設計することによりロイシン（Ｌ）に変異された。変異ヌクレオチドを坦持する２つのプライマーおよび受け入れるベクターに相補的な重複配列を含有する２つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が二連続ステップで実施された。
【０２９４】
Ｅ９−７１（Ｍ）およびＥ９−７１（Ｌ）の軽鎖のために使用されるシグナルペプチドはラムダ１ａシグナルペプチドと呼ばれる。Ｅ９−７１軽鎖のフレームワーク４（ＦＷ４）領域ｈＪＬ−１は、抗体のｈｕＣＬ２定常領域とより適合性のあるｈＪＬ２に変えられた。変異ヌクレオチドを含有するフォワードおよびリバースプライマーが設計された。変異ヌクレオチドを坦持する２つのプライマーおよび受け入れるベクターに相補的な重複配列を含有する２つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が二連続ステップで実施された。
【０２９５】
各ｃＤＮＡアセンブリー由来のＰＣＲ産物はアガロースゲル上で分離され、予想される可変領域ｃＤＮＡに対応するバンドはサイズ切除され精製された。可変重領域は、細菌中の相同組換えにより２つのヒンジ領域アミノ酸変異を含有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｃＤＮＡ断片にインフレームで挿入された。これらの変異は位置２３４（ＥＵ付番）でのロイシンからアラニンへの変化および位置２３５でのロイシンからアラニンへの変化である（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７頁（１９９１））。可変軽鎖領域は、相同組換えにより、ヒトラムダ１ａシグナルペプチドとヒトラムダ定常領域間にインフレームで挿入された。細菌コロニーは単離され、プラスミドＤＮＡが抽出された。ｃＤＮＡインサートはその全体を塩基配列決定された。各抗体に対応する正確な重および軽鎖（表１９）はＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞に同時トランスフェクトされ、完全長Ｅ９−７１（Ｍ）またはＥ９−７１（Ｌ）抗ヒトＤＬＬ４抗体を一時的に産生した。Ｅ９．７１（Ｍ）もＥ９．７１（Ｌ）も同じ軽鎖を共有している。組換えヒト抗体を含有する細胞上清は、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより精製され、結合した抗体は酸緩衝液の添加により溶出され得る。抗体は中和されＰＢＳ中に透析された。
【０２９６】
【表１９】
0005903382.tif 000039
0005903382.tif 000040
【０２９７】
［実施例７］
Ｅ９−７１（Ｍ）シグナルペプチド操作
シグナルペプチドラムダ１ａは、抗ＤＬＬ４抗体Ｅ９−７１（Ｍ）の作製のために使用された。代わりのシグナルペプチドも調べられた。インターネット上で利用することが可能なＳｉｇｎａｌ  ＩＰ３．０サーバー（例えば、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）または他の数多くの等価なソフトウェアを使用する、ラムダおよびカッパシグナルペプチドファミリー由来の異なるシグナルペプチドを有するＥ９−７１（Ｍ）Ｎ−末端可変領域のインシリコ構築アミノ酸配列の哺乳動物発現中の正確な抗体切断の割合の予想は本技術分野では公知である。正確な切断の最も高い予想割合を有するシグナルペプチドは、各ファミリーから１つ、すなわち、ラムダファミリーからはラムダ３ｐが、カッパファミリーからはＬ２３が選択された。２つのアミノ酸変化（グリシンからアルギニンおよびセリンからバリン）を有する元のラムダ１ａシグナルペプチドの変異型も選択された。ラムダ１ａシグナルペプチドを含有する軽鎖の構築では、受け取りベクターに相補的な重複配列を含有し、そのうちの１つが変異ヌクレオチド配列を含有する２つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は一ステップで実施された。ラムダ３ｐシグナルペプチドおよびカッパＬ２３シグナルペプチドを含有する軽鎖の構築では、シグナルペプチド領域を構築するために２つの重複プライマーが設計され、次に、受け取りベクターに相補的な重複配列を含有する２つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。Ｅ９−７１可変領域の２つの型は、ラムダ３ｐおよびカッパＬ２３シグナルペプチドを使用して作製され、１つは完全長可変領域を有し、もう１つは可変領域Ｎ末端の最初のセリン（Ｓ）が消失していた。完全長可変領域のみがラムダ１ａシグナルペプチドを用いて作製された。各ｃＤＮＡアセンブリー由来のＰＣＲ産物はアガロースゲル上で分離され、予想される可変領域ｃＤＮＡに対応するバンドはサイズ切除され、精製された。可変重領域は、細菌中の相同組換えにより、２つのヒンジ領域アミノ酸変異を含有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｃＤＮＡ断片上にインフレームで挿入された。これらの変異は位置２３４（ＥＵ付番）でのロイシンからアラニンへの変化および位置２３５でのロイシンからアラニンへの変化である（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７頁（１９９１））。可変軽鎖領域は、相同組換えにより、ヒトラムダ定常領域と一緒にインフレームで挿入された。細菌コロニーが単離され、プラスミドＤＮＡが抽出され、ｃＤＮＡインサートはその全体を塩基配列決定された。各抗体に対応する正確な重および軽鎖はＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞に同時トランスフェクトされ、完全長Ｅ９−７１（Ｍ）抗ヒトＤＬＬ４抗体を一時的に産生した。組換えヒト抗体を含有する細胞上清は、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより精製され、結合した抗体は酸緩衝液の添加により溶出された。抗体はＰＢＳ中に透析された。精製されたＥ９．７１（Ｍ）抗体は、無傷の抗体配列の確認��ためにマススペクトル法（ＭＳ）により解析された。下の表２０は、Ｅ９．７１（Ｍ）の作製のために使用された異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示している。下の表２１は、マススペクトル法により解析されたＥ９．７１（Ｍ）切断部位を示している。
【０２９８】
【表２０】
0005903382.tif 000041
【０２９９】
【表２１】
0005903382.tif 000042
【０３００】
［実施例８］
操作されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体のインビトロ特徴付け
これら操作されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体の抗原結合親和性は、実施例１．１に記載されたＢＩＡＣＯＲＥ技術により決定され、表２２に示されている。代表的な抗体のインビトロ活性は、実施例１に記載された他の方法を使用してさらに評価され、結果は表２３に示された。
【０３０１】
【表２２】
0005903382.tif 000043
0005903382.tif 000044
【０３０２】
【表２３】
0005903382.tif 000045
0005903382.tif 000046
【０３０３】
［実施例８］
選択されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体の物理化学的特性
ＤＬＬ４に特異的なモノクローナル抗体の同一性は下記のようにマススペクトル法により判定された。
【０３０４】
Ｅ９−７１のマススペクトル解析
軽鎖および重鎖分子量解析：Ｅ９−７１試料はＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて１ｍｇ／ｍＬまで希釈された。１μＬの１Ｍ  ＤＴＴが２０μＬの希釈試料に添加された。前記試料は３７℃で３０分間インキュベートされた。１μＬの還元された試料は、Ｖａｒｉａｎジフェニルカラムを用いてＡｇｉｌｅｎｔ  ６５１０Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳシステムに注入された。緩衝液Ａは、水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、０．０８％ギ酸（ＦＡ）であった。緩衝液Ｂは、アセトニトリル中０．０２％ＴＦＡ、０．０８％ＦＡであった。勾配は５％Ｂで開始し、５分間で３５％Ｂまで増加し、１５分で３８％Ｂまで増加した。次に、勾配は１分間で９５％Ｂまで増加し、９５％Ｂで４分間とどまり、１分間で５％Ｂまで減少した。流速は５０μＬ／分であった。マススペクトル器は５キロボルトスプレー電圧で作動され、スキャン範囲は、電荷比に合わせて６００から３２００質量までであった。２２６４９ダルトンの軽鎖分子量は、アミノ酸ＹがＮ末端である理論値によく適合していた。分子量２２０１４ダルトン、２２７３７ダルトンおよび２２９３７ダルトンで３つの小ピークが観測された。２２０１４ダルトンのピークは、Ｎ末端６アミノ酸断片と一致していた。マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅することができるので、このピークは、ほぼ確実に完全長軽鎖からのインソースフラグメンテーションにより引き起こされた。前記２２７３７ダルトンは、アミノ酸ＳがＮ末端である理論値と一致していた。前記２２９３７ダルトンはＮ末端にアミノ酸「ＬＳ」のシグナルペプチド伸長のある軽鎖と一致していた。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、５０２６３ダルトン、５０４２６ダルトンおよび５０５８８ダルトンであり、１６２ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
【０３０５】
Ｅ９−７１（Ｍ）のマススペクトル解析
「Ｅ９−７１のマススペクトル解析」に記載されるのと同じ方法を使用して、Ｅ９−７１（Ｍ）試料を解析した。２２６４５ダルトンの軽鎖分子量は、アミノ酸ＳがＮ末端である理論値とよく適合した。分子量２２９８９ダルトンの小ピークが観測され、Ｎ末端にアミノ酸「ＳＷＡ」のシグナルペプチド伸長を有する軽鎖と一致していた。分子量２１９２３ダルトンの非常に小さなピークも観測されたが、マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅したので、このピークはインソースフラグメンテーションにより引き起こされた可能性が高かった。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、５０２６３ダルトン、５０４２６ダルトンおよび５０５８８ダルトンであり、１６２ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
【０３０６】
Ｅ９−７１（Ｌ）のマススペクトル解析
「Ｅ９−７１のマススペクトル解析」に記載されるのと同じ方法を使用して、Ｅ９−７１（Ｌ）試料を解析した。２２６４５ダルトンの軽鎖分子量は、アミノ酸ＳがＮ末端である理論値とよく適合した。分子量２２９８９ダルトンの小ピークが観測され、Ｎ末端にアミノ酸「ＳＷＡ」のシグナルペプチド伸長を有する軽鎖と一致していた。分子量２１９２３ダルトンの非常に小さなピークも観測されたが、マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅したので、このピークはインソースフラグメンテーションにより引き起こされた可能性が高かった。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、５０２４５ダルトン、５０４０７ダルトンおよび５０５６９ダルトンであり、１６２ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
【０３０７】
Ｅ９−７１（Ｍ）−３のマススペクトル解析
「Ｅ９−７１のマススペクトル解析」に記載されるのと同じ方法を使用して、Ｅ９−７１（Ｍ）−３試料を解析した。２２５５８ダルトンの軽鎖分子量は、理論値とよく適合した。分子量２１９２３ダルトンの非常に小さなピークも観測されたが、マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅したので、このピークはインソースフラグメンテーションにより引き起こされた可能性が高かった。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、５０２６３ダルトン、５０４２６ダルトンおよび５０５８８ダルトンであり、１６２ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
【０３０８】
前記抗体の溶解性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３０００沈殿により評価された。前記抗体の溶解性、すなわち、真正溶解度も、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いて、特定の溶液および／または緩衝液中で前記抗体を濃縮し次に２５℃および５℃でのどんな沈殿についても観測されることにより決定された。安定性は、近紫外線サーキュラー（ＵＶ−ＣＤ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により推測された。凍結および解凍に対するならびに高温での安定性（加速された安定性）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により評価された。詳細な技法は実施例１．８に記載されており、その結果は下の、ＰＥＧ沈殿結果による安定性評価に記載されている。
【０３０９】
表２４および２６では、一連のＥ９クローンに沈殿を誘導するのに必要なＰＥＧ３０００の割合が示されている。前記クローンおよびアダリムマブ基準は０．２ｍｇ／ｍｌで処方された。前記結果によれば、Ｅ９−４、Ｅ９−１４、Ｅ９−２２およびＥ９−１９などのクローンはアダリムマブの溶解度（ほぼ２００ｍｇ／ｍｌ）に類似する溶解度を有すると推定され、Ｅ９−１１およびＥ９−１７などのクローンはそれよりはるかに低い溶解度を有すると推定される。
【０３１０】
表２５では、一連の安定性操作されたＥ９クローンに沈殿を誘導するのに必要なＰＥＧ３０００の割合が示されている。前記クローンおよびアダリムマブ基準は０．２ｍｇ／ｍｌで処方された。前記結果によれば、Ｅ９−ＳＥ１などのクローンは、前記シリーズで最も高い溶解度を有しているが、アダリムマブの溶解度（ほぼ２００ｍｇ／ｍｌ）に類似する溶解度を有するとは予想されず、Ｅ９−ＳＥ５などのクローンはそれよりはるかに低い溶解度を有すると推定される。
【０３１１】
【表２４】
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【０３１２】
【表２５】
0005903382.tif 000048
【０３１３】
【表２６】
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【０３１４】
真正溶解度スクリーニング結果：Ｅ９、Ｅ９−１９、Ｅ９−７１、Ｅ９−２Ｂ、Ｅ９−１Ｆ
１２ｍｇのＥ９、Ｅ９−７１、Ｅ９−１ＦおよびＥ９−１９ならびに５．５ｍｇのＥ９−２Ｂを含有する溶液が得られた。Ｅ９はＩｇＧ１変異アイソタイプである。すべての溶液の容積は、Ａｍｉｃｏｎ  ３０Ｋ  １５ｍｌチューブを用いて超遠心分離により１ｍｌ未満に減らされた。
【０３１５】
このステップ後、以下の結果が観察された：Ｅ９−２ｂおよびＥ９−１９は透明であった。Ｅ９、Ｅ９−７１およびＥ９−１Ｆはわずかに濁っていた。
【０３１６】
１０ｍｌの１５ｍＭ  ヒスチジン緩衝液ｐＨ５．０３は各チューブに添加され、前記溶液は１ｍｌまで再濃縮された。次に、前記溶液はＡｍｉｃｏｎ  ３０Ｋ  ４ｍｌチューブに移され、できる限り低容積まで濃縮された。
【０３１７】
このステップ後、室温で以下の結果が観測された。
【０３１８】
Ｅ９：      １６３ｍｇ／ｍｌ；ｖｏｌ＝０．０５ｍｌ；ｐＨ＝５．１２  
Ｅ９−１９：１３２ｍｇ／ｍｌ；ｖｏｌ＝０．０５ｍｌ；ｐＨ＝５．０６
Ｅ９−７１：１９３ｍｇ／ｍｌ；ｖｏｌ＝０．０５ｍｌ；ｐＨ＝５．３２
Ｅ９−２Ｂ：６４ｍｇ／ｍｌ；ｖｏｌ＝０．１ｍｌ；ｐＨ＝５．２９
Ｅ９−１Ｆ：１００ｍｇ／ｍｌ；ｖｏｌ＝０．１ｍｌ；ｐＨ＝５．３１
Ｅ９−２ＢもＥ９−１Ｆもその他の３つよりも濃縮するのにはるかに長い時間が必要であった。このことから、製剤条件下ではその粘度は高いことが示唆され得る。
【０３１９】
次に前記溶液を２日間５℃に置いて、この温度での溶解度を評価した。以下の結果が観測された。
Ｅ９：５℃ではおよび室温に戻されたときには透明のままであった。
Ｅ９−７１：５℃ではおよび室温に戻されたときには透明のままであった。
Ｅ９−１Ｆ：５℃ではごくわずかな量の濁りを示したが、２０分後に室温に戻されたときには透明になった。
Ｅ９−２Ｂ：５℃ではごくわずかな量の濁りを示したが、２０分後に室温に戻されたときには透明になった。
Ｅ９−１９：５℃でははっきりした濁りを示したが、２０分後に室温に戻されたときには透明になった。
Ｅ９−７１についての真正溶解度スクリーニング結果  
Ｅ９−７１では、溶液中４ｍｇはＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いて６０ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。２５℃でも５℃での１日の保管後も沈殿も濁りも観察されなかった。
【０３２０】
近ＵＶ−ＣＤ結果による三次構造特徴付け
近ＵＶ−ＣＤを、１ｍｇ／ｍｌのＥ９、Ｅ９−１９、Ｅ９−７１、Ｅ９−２ＢおよびＥ９−１Ｆ試料上で実施した。スペクトルのプロファイルは、適切にフォールディングされた抗体について典型的に観察されたＳ字形を示している。この技法から、前記抗体についてはミスホールディングを示すものは何も観察されていない。
【０３２１】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による固有の安定性特徴付け
ＤＳＣを、１ｍｇ／ｍｌのＥ９、Ｅ９−１９、Ｅ９−７１、Ｅ９−２ＢおよびＥ９−１Ｆ試料上で実施した。前記結果は表２７に与えられている。開始は、アンフォールディングが始まる温度である。ＩｇＧ抗体も、典型的に３つのアンフォールディング遷移（Ｔｍ）を示し、無傷の抗体のアンフォールディングはＦｃ断片でのＣＨ２ドメインの溶解、Ｆｃ断片でのＣＨ３ドメインの溶解およびＦａｂ断片の溶解を伴う。開始値は、Ｅ９、Ｅ９−１９およびＥ９−７１が最も安定していることを示している。典型的には、高いほうのＴｍ値を有するクローンは、低いほうのＴｍ値を有するクローンよりも好ましい。
【０３２２】
【表２７】
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【０３２３】
凍結融解ストレスに対する安定性の評価
凍結融解ストレスに対する安定性は、１ｍｇ／ｍｌのＥ９、Ｅ９−１９、Ｅ９−７１、Ｅ９−２ＢおよびＥ９−１Ｆ試料について評価された。表２８は、５回の凍結融解サイクル後の試料のＳＥＣ解析の結果を示している。試験された抗体すべてが凍結融解ストレスに対して安定していた。５回の凍結融解サイクル後でもモノマーの明らかな消失は観察されなかった。
【０３２４】
【表２８】
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【０３２５】
昇温での安定性の評価（加速安定性）
昇温での安定性は、１ｍｇ／ｍｌのＥ９、Ｅ９−１９、Ｅ９−７１、Ｅ９−２ＢおよびＥ９−１Ｆ試料について評価された。表２９には、時間０でのおよび４０℃と５０℃での７日および２１日後の試料のＳＥＣ解析の結果が示されている。前記抗体すべての分解動態により、５０℃で２１日後のモノマーの割合のほぼ８％減少が明らかにされた。
【０３２６】
【表２９】
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【０３２７】
［実施例９］
抗ＤＬＬ４抗体のげっ歯類ＰＫ評価
抗ＤＬＬ４抗体の薬理動態特性を評価するために、ＳＣＩＤベージュマウス（抗体あたりｎ＝３）は、マウスＤＬＬ４に対する抗体の交差反応性に応じて、抗体の単回腹腔内（ＩＰ）用量を５または３０ｍｇ／ｋｇ濃度のどちらかで投与された。長期的血清試料（時点あたりＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中１対５０で希釈された５μｌの全血）は、２１日間にわたり各動物から収集された。血清濃度は、ＤＬＬ４特異的Ｂｉａｃｏｒｅプラットフォームを使用して決定された。簡潔に述べると、ヒトＤＬＬ４はセンサーチップに固定化され、試料は、５分間、１分あたり５μｌでフローセル上に注入され、得られた結合レベルは測定され、標準と比較された。血清濃度時間プロファイルを使用して、薬物動態パラメータＣｍａｘ（ピーク血清濃度）、ＣＬ（クリアランス）、およびｔ１／２（抗体半減期）を推定し、表３０に要約されている。Ｅ９とＡ１０  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体の両方では、その薬物動態特性は、親和性成熟の進行中ＣＤＲ−操作を通じて改善された。
【０３２８】
【表３０】
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【０３２９】
［実施例１０］
抗ＤＬＬ４抗体治療はインビトロで内皮細胞出芽を増加させた
ＨＵＶＥＣ（継代２−３、Ｌｏｎｚａ）のインビトロ血管新生活性を調べるために、線維素ゲルビーズ出芽アッセイを記載された通りに実施した（Ｎａｋａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、６６：１０２−１１２頁（２００３）。簡潔に述べると、フィブリノーゲン溶液は、アプロチニン（４Ｕ／ｍｌ）およびスロンビン（５０Ｕ／ｍｌ）を用いて再構成された。Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）は、ビーズあたり３５０から４００ＨＵＶＥＣを用いて一晩被膜された。９６ウェル組織培養プレートのウェルあたり約２０ＨＵＶＥＣ被膜ビーズが、フィブリンクロットに埋め込まれた。８０％コンフルエントの正常なヒト線維芽細胞（ＮＨＬＦ、Ｌｏｎｚａ）由来の条件培地をゲル上に蒔いた。１５μｇ／ｍｌのＤＬＬ４抗体および対照抗体ＫＬＨを前記ウェル上に添加した。１０日目および１２日目に、倒立顕微鏡およびＮｉｋｏｎ  ＣＣＤカメラを用いて画像が撮像された。Ｅ９およびＡ１０抗体を用いたＤＬＬ４抑制により、インビトロでの内皮細胞出芽が増強される（データは示されていない）。
【０３３０】
［実施例１１］
ＤＬＬ４抗体治療はインビボで腫瘍増殖を抑制した
腫瘍増殖に対する抗ＤＬＬ４抗体の効果は、ＳＣＩＤベージュマウスに移植された皮下Ｃａｌｕ−６移植片腫瘍上で評価された。簡潔に述べると、２×１０６細胞は、メスＳＣＩＤベージュマウスの右後部横腹の皮下に接種された。腫瘍は１４−１８日間で確立させ、その時点で腫瘍体積は電子キャリパー測定を使用して決定された。腫瘍サイズは、式：Ｌ×Ｗ２／２を使用して計算された。マウスは、動物の各コホートが処置の開始に先立って等価な平均腫瘍体積（典型的には１８０と２５０ｍｍ３の間）を有するように処置群に割り当てられた（群あたりｎ＝１０）。次に動物は２週間の間週２回（合計で４用量）抗ＤＬＬ４抗体を腹腔内に投与された。腫瘍体積は、各群の平均腫瘍体積が２，０００ｍｍ３以上の終点に到達するまで、実験期間中平均で週２回測定された。結果は表３１に示されている。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ抗体のＥ９シリーズでは、改善された薬物動態（実施例９に示されている）を有する抗体はインビボでより強力な抗腫瘍活性を有する傾向がある。
【０３３１】
【表３１】
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【０３３２】
本出願全体で引用されることがある引用されたすべての参考文献（文献参照、特許、特許出願およびウェブサイトを含む）の内容は、その箇所で引用される参考文献と同様に、いかなる目的でも参照によりその全体をこれによって明白に組み込まれている。
【０３３３】
均等
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の具体的な形態において体現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている本発明を限定するというよりはむしろ、すべての点において例示していると考えるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載によるというよりはむしろ、添付される特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内にあるすべての変更は本明細書に包含されることが意図される。
【配列表】
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