(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査サンプル中の分析物を検出する方法であって、当該方法は、
ｉ）
（ａ）検出ゾーンの上流に位置するサンプルローディングゾーン；
（ｂ）プレ報告担体ゾーンであって、報告担体と有能酵素とを有する前記プレ報告担体ゾーン;
（ｃ）サンプルローディングゾーンと検出ゾーンとの間に位置する報告担体ゾーンであって、前記報告担体ゾーンは、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有し、前記報告担体は担体及び１個以上の有能酵素カセットを有する報告担体ゾーン；及び
（ｄ）検出ゾーンであって、分析物のための捕捉成分及びインジケータを有する検出ゾーン、
を包含するクロマトグラフ媒体を有するラテラルフローアッセイデバイスを用意するステップ；
ｉｉ）プレ報告担体を検査サンプルに添加するステップ；
ｉｉｉ）サンプルローディングゾーンを検査サンプルと接触させるステップであって、検査サンプルは、報告担体ゾーンを通り抜け、クロマトグラフ媒体に沿って、サンプルローディングゾーンから検出ゾーンまで、そして検出ゾーンを超えて移動するステップ；及び
ｉｖ）基質を検出ゾーンに添加するステップであって、基質は、報告担体を含有する有能酵素分析物の存在下に反応を受けるステップ；及び
ｖ）検査サンプル中に分析物の存在もしくは不在に対応する検出ゾーン内でインジケータの応答を発生させるステップ、
を有する、方法。
【請求項２】
ラテラルフローデバイスはさらに、検出ゾーンの下流にコントロールゾーンを有し、コントロールゾーンは報告担体のための捕捉成分及びインジケータを有する、請求項１に記載の方法であって；
基質をコントロールゾーンに添加する（ここで基質は、報告担体を含有する有能酵素分析物の存在下に反応を受ける）；及び
報告担体の存在もしくは不在に対応するコントロールゾーン内でインジケータの応答を発生させる、
方法。
【請求項３】
さらに反応温度を維持することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分析物がタンパク質である；
分析物が小分子である；もしくは
分析物が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
有能酵素結合体が抗体を有する；
有能酵素結合体が核酸を有する；もしくは
有能酵素結合体が、ウレアーゼ、ホスホコリンホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、キシロースレダクターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ネオプルラナーゼ、サブチリシン、４−フィターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ラッカーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチターゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、凝固因子ＶＩＩａ、トリプシン、ベータ−フルクトフラノシダーゼからなるグループから選択される有能酵素を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酵素活性をまだ維持しながら、反応温度は約４℃、約９５℃、もしくはそれ以上に維持される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
抗体が有能酵素と非共有結合的に相互作用して、有能酵素結合体を形成する；
抗体が有能酵素と共有結合して、有能酵素結合体を形成する、
請求項５に記載の方法。
【請求項８】
核酸が有能酵素と共有結合して、有能酵素結合体を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
検出ゾーンに１個以上の不活性プロ酵素をさらに用意する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
有能酵素補助反応の効果をモニタリングすることにより有能酵素結合体の活性を検出する；
有能酵素補助反応の効果はプロトン放出である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
プロトン放出がｐＨ変化を引き起こし；
メンブレン上に固定されるｐＨ感受性１−ヒドロキシ−４−［１−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）フェニルアゾ］―ナフタレン―２−スルホン酸カリウムインジケータポリマーを使用して前記ｐＨ変化を求める；もしくは
ｐＨ感受性酢酸セルロース結合染料を使用して前記ｐＨ変化を求める、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
有能酵素結合体の活性を比色分析変化により検出する；
有能酵素結合体の活性を蛍光発光により検出する；もしくは
有能酵素結合体の活性を電気化学的方法により検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記比色分析変化は銀イオン還元によるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有能酵素結合体の活性を可溶性成分の沈殿により検出する；
前記可溶性成分はタンパク質もしくはｐH感受性ポリマーである;
前記タンパク質はＢＳＡである；及び／又は
前記ｐＨ感受性ポリマーはメチルアクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル、及びＮ−ヒドロキシメチルアクリルアミドからなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
クロマトグラフ媒体の末端に吸収性パッドをさらに有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
基質はヘキサン酸アリルであり、有能酵素はカルボキシルエステラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
検出ゾーンの上流に位置するサンプルローディングゾーン；
プレ報告担体ゾーンであって、報告担体と有能酵素とを有する前記プレ報告担体ゾーン；
サンプルローディングゾーンと検出ゾーンとの間に位置する報告担体ゾーンであって、前記報告担体ゾーンは、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有し、前記報告担体は担体及び１個以上の有能酵素カセットを有する前記報告担体ゾーン；及び
検出ゾーンであって、前記検出ゾーンは分析物のための捕捉成分及びインジケータを有し、インジケータは有能酵素の存在下基質の反応を検出し、それにより分析物の存在を検出する検出ゾーン、
を包含するクロマトグラフ媒体、
を有する、検査サンプル内の分析物の存在を検出するラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項１８】
コントロールゾーンをさらに有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイスであって、
コントロールゾーンは報告担体のための捕捉成分及び有能酵素の存在下基質の反応を検出するためのインジケータを有し；
酵素報告担体複合体及び基質の生成物が検出され、それにより報告担体の存在を検出する、
ラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項１９】
有能酵素結合体が抗体を有する；
有能酵素結合体が核酸を有する；もしくは
有能酵素結合体が、ウレアーゼ、ホスホコリンホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、キシロースレダクターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ネオプルラナーゼ、サブチリシン、４−フィターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ラッカーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチターゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、凝固因子ＶＩＩａ、トリプシン、ベータ−フルクトフラノシダーゼからなるグループから選択される有能酵素を有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２０】
抗体が有能酵素と非共有結合的に相互作用して、有能酵素結合体を形成する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２１】
核酸が有能酵素と共有結合して、有能酵素結合体を形成する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２２】
検出ゾーンに１個以上の不活性プロ酵素をさらに用意する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２３】
有能酵素補助反応の効果をモニタリングすることにより有能酵素結合体の活性を検出する；
インジケータがｐＨ感受性インジケータである；
ｐＨ感受性インジケータが１−ヒドロキシ−４−［１−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）フェニルアゾ］―ナフタレン―２−スルホン酸カリウムである；及び／又は
ｐＨ感受性インジケータが酢酸セルロース結合染料である、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２４】
報告担体ゾーンは結合体パッドを有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２５】
サンプルローディングゾーンはサンプルローディングパッドを有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２６】
剛性もしくは可撓性の裏当て材をさらに有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２７】
抗体は非共有結合的相互作用により有能酵素と会合している、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２８】
抗体もしくは核酸は有能酵素と共有結合している、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項２９】
１個以上の不活性プロ酵素の供給源をさらに有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３０】
検出ゾーンはｐＨ変化の検出により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは比色分析変化により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは蛍光発光により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは電気化学的方法により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは有能酵素結合体の生成物を可溶性成分の沈殿により検出する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３１】
ｐＨ感受性ヒドロゲルを使用してｐＨ変化を求める、請求項３０に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３２】
比色分析変化は銀イオン還元によるものである、請求項３１に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３３】
可溶性成分はタンパク質もしくはｐＨ感受性ポリマーである；又は
前記タンパク質はＢＳＡである、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３４】
ｐＨ感受性ポリマーはメチルアクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル、及びＮ−ヒドロキシメチルアクリルアミドからなるグループから選択される、請求項３３に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３５】
クロマトグラフ媒体の末端に吸収性パッドをさらに有する、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３６】
基質はヘキサン酸アリルであり、有能酵素はカルボキシルエステラーゼである、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項３７】
検査サンプル内の分析物の存在を検出するラテラルフローアッセイキットであって、
サンプルローディングゾーン；
プレ報告担体ゾーンであって、報告担体と有能酵素とを有する前記プレ報告担体ゾーン；
ローディングゾーンの下流に位置する報告担体ゾーンであって、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有する前記報告担体ゾーン；
報告担体ゾーンの下流に位置する検出ゾーンであって、捕捉成分及びインジケータを有する前記検出ゾーン；及び
有能酵素のための基質であって；検査サンプルはラテラルフローデバイス中を流れるようにした後、前記基質は検出ゾーンに適用され、酵素及び基質の生成物が検出される前記基質、
を有する多孔質メンブレンを有するラテラルフローアッセイデバイスを有する、ラテラルフローアッセイキット。
【請求項３８】
コントロールゾーンをさらに有する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキットであって、
コントロールゾーンは報告担体のための捕捉成分及び有能酵素の存在下基質の反応を検出するためのインジケータを有し；
酵素報告担体複合体及び基質の生成物が検出され、それにより報告担体の存在を検出する、
ラテラルフローアッセイキット。
【請求項３９】
有能酵素結合体が抗体を有する；
有能酵素結合体が核酸を有する；もしくは
有能酵素結合体が、ウレアーゼ、ホスホコリンホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、キシロースレダクターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ネオプルラナーゼ、サブチリシン、４−フィターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ラッカーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチターゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、凝固因子ＶＩＩａ、トリプシン、ベータ−フルクトフラノシダーゼからなるグループから選択される有能酵素を有する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４０】
抗体が有能酵素と非共有結合的に相互作用して、有能酵素結合体を形成する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４１】
核酸が有能酵素と共有結合して、有能酵素結合体を形成する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４２】
検出ゾーンに１個以上の不活性プロ酵素をさらに用意する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４３】
有能酵素補助反応の効果をモニタリングすることにより有能酵素結合体の活性を検出する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４４】
インジケータがｐＨ感受性インジケータである；
前記ｐＨ感受性インジケータが１−ヒドロキシ−４−［１−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）フェニルアゾ］―ナフタレン―２−スルホン酸カリウムである；
インジケータがｐＨ感受性酢酸セルロース結合染料である、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４５】
報告担体ゾーンは結合体パッドを有する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４６】
サンプルローディングゾーンはサンプルローディングパッドを有する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４７】
剛性もしくは可撓性の裏当て材をさらに有する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４８】
抗体は非共有結合的相互作用により有能酵素と会合している、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項４９】
抗体もしくは核酸は有能酵素と共有結合している、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５０】
１個以上の不活性プロ酵素の供給源をさらに有する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５１】
検出ゾーンはｐＨ変化の検出により有能酵素の生成物を検出する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５２】
ｐＨ感受性ヒドロゲルを使用して前記ｐＨ変化を求める、請求項５１に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５３】
検出ゾーンは比色分析変化により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは蛍光発光により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは電気化学的方法により有能酵素の生成物を検出する；
検出ゾーンは有能酵素結合体の生成物を可溶性成分の沈殿により検出する、請求項３７に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５４】
比色分析変化は銀イオン還元によるものである、請求項５３に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５５】
可溶性成分はタンパク質もしくはｐＨ感受性ポリマーである；もしくは
タンパク質はＢＳＡである、請求項５３に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５６】
ｐＨ感受性ポリマーはメチルアクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル、及びＮ−ヒドロキシメチルアクリルアミドからなるグループから選択される、請求項５５に記載のラテラルフローアッセイキット。
【請求項５７】
クロマトグラフ媒体の末端に吸収性パッドをさらに有する、請求項３６に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【請求項５８】
基質はヘキサン酸アリルであり、有能酵素はカルボキシルエステラーゼである、請求項３６に記載のラテラルフローアッセイデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、分子診断、核酸検査（NAT）、医学及びビオテクノロジーの一般的分野に関わる。本発明は、生物学的サンプル、物質、有機もしくは無機サンプルを排他的でなく包含するサンプルにおいてきわめて低濃度で存在する化学的及び／又は生物学的標的の痕跡を検出もしくはモニタするのに適している。化学的及び／又は生物学的標的の痕跡は、例えばゲノム薬理学、病原体検出及びモニタリング、遺伝的素質の決定、臨床試験のための遺伝的分類、診断学、予後診断、感染症診断及びモニタリング、バイオデフェンス、法医学分析、親子鑑定、動物及び植物交配、食品検査、人物鑑定、遺伝子組み換え生物検査、化学汚染、食品安全、生産チェーンのモニタリング及びトラッキング、及び生産インラインモニタリング／コントロールの分野における看護／現場（site）／興味及び実験室のポイントにおける適用を有する、生物学的／化学的生成物、フラグメントもしくは標的全体、例えば核酸配列、細胞、ウイルス、病原体、化学製品、を包含し得る。
【背景技術】
【０００２】
分子診断は、生物学的検出及びモニタリングのためのルーチンの臨床検査室手順であった。様々な生物学的源由来の生物学的サンプルの検体は、通常化学物質の混合物、代謝物、高分子、細胞、ビリオン、生物、及び核酸配列を含む。典型的には、検出及びモニタリングのためには二つの共通する問題、すなわちバックグラウンド干渉と検出限界（ＬＯＤ）、が存在する。つまり、標的生物学的サンプルは、該生物学的サンプル中の他のバックグラウンド成分と比較して通常きわめて少量で存在する。このような非標的バックグラウンド成分は、下流での検出を干渉し得る。サンプル中に不十分な標的コピーしか存在しない場合、ＬＯＤは問題となる。そのＬＯＤ問題は、分析作業のために高度に複雑化した器具を通常必要とする化学分析におけるＬＯＤ問題と同じである。実例は、食品サプライチェーンにおけるビス（ｎ−ブチル）フタレート可塑剤汚染、ミルクにおけるメラミン汚染、土壌もしくは食品におけるカドミウム及び重金属汚染を検出するために質量分析法を使用することを包含する。バックグラウンド干渉は、汚染物質よりも一桁以上高い。例えば、オンサイト分析は、ガスクロマトグラフィー分析計もしくは質量分析計のような装置を有する実験室における広範囲の処理なしには通常難しい。
【０００３】
バックグラウンド干渉は、通常、調製段階中にサンプルを生成することにより解決される。標的は捕捉され、バックグラウンド成分は一回以上の洗浄手順により除去される。典型的な例は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及び様々なクロマトグラフィー方法を包含する。バックグラウンド成分を固定化標識から除去する間、標的を捕捉するのにラテラルフロー（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ）プラットフォームをも使用できる。核酸標的の精製手順の別の例は、精製キットであり、例えばQuiagenのＱＩＡｍｐ  ＤＳＰ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔである。
【０００４】
核酸のＬＯＤ問題は、通常、何よりもまずサンプル標的の増幅により解決される。その増幅は、後に蛍光発光、電気的及び電子的方法、例えばボルタメトリー、電流測定、静電容量測定、もしくはインピーダンス分光法、による検出を可能にする。これら検出もしくは増幅方法において、光を提供するためもしくは電気的／電子的検出を行うため電力が必要とされる。低含量核酸標的によるＬＯＤ問題を解決する一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してインビトロで核酸標的を増幅することによる。標的配列の存在に関連したシグナルは、蛍光法によりさらに増幅できる。蛍光タグにより標識される各ＰＣＲアンプリコンは、当該アンプリコンを検出するのに蛍光ビーコンもしくはプローブを使用する場合、単一励起／測定期間において１０００個乃至１００００個以上のプロトンを生成できる。別の例は、カンピロバクターのような生体検査であり、そこではヘリコバクター・ピロリ細胞が培養中で増殖し、よって増幅される。またそこでは、細胞の個数が検出閾値を超えた後に、増幅された細胞から分泌されるウレアーゼは検出可能である。さらに別の例は、ＭＲＳＡのスクリーニングである。この検出方法は、培養培地で増殖及び増幅した細胞のコロニーを識別する。
【０００５】
しかしながら、バックグラウンド干渉及び増幅検出の様々な組み合わせの除去に頼る現行方法は、資源が限られた環境に適応する、豊富で、費用対効果のある、迅速な、使いやすい標的の検出方法に関する要求を満たしていなかった。装置に電力を供給することもしくは培養に温度を提供することにより電流検査を行うための電力源のための条件は、資源に乏しい地域もしくは状態におけるこのテクノロジーへのアクセスを制限してきた。現行方法を実行するのに必要な時間は長い。十分な検出シグナルを生成するため十分な生物学的標的を生成するのに、数時間乃至数日が必要とされる。病原体検出、代謝物定量もしくは核酸配列検出に使用される増幅ステップは、通常高価な実験室機器及びおの機器を動かすために訓練された専門家を必要とする。ＰＣＲの場合、不安定な試薬を取り扱うため注意が必要とされ、サンプル間での汚染を避けるため特別な努力が必須である。そのうえさらに、ＰＣＲを行うために必要な機器は高価で複雑である。上記の考慮事項はシビアな制限であり、ＰＯＣ（ポイント・オブ・ケア）使用もしくは３０分未満の迅速なサンプルから結果までを提供するのを妨げる。本発明は、これら及び他の要求に対する解決策を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ２０１１０８６３５９号
【特許文献２】ＷＯ２００４０９２３４２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，２００４，Ｖ７６，Ｐ８８８
【非特許文献２】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，Ｖ８１，Ｐ１６６０
【発明の概要】
【０００８】
概要
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
分子検出もそくは診断アッセイのための方法及びデバイスが本発明により提供される。ここに開示される方法は、
生物学的、化学的及び物質的なもの（ただしこれらに排他的に限定されない）を包含するサンプルにきわめて低濃度で存在する１個以上の標的を検出もしくはモニタリングするのに適しており、一般に標的の複製または標的のフラグメントもしくは一部の増幅なしで検出を可能にする。本発明の方法及びデバイスは、電源へアクセスする必要のないポイント・オブ・ケア検出になじみやすい。
【００１０】
一態様において本発明は、以下のステップ：
ｉ）
（ａ）検出ゾーンの上流に位置するサンプルローディングゾーン；
（ｂ）サンプルローディングゾーンと検出ゾーンとの間に位置する報告担体ゾーン（ここで前記報告担体ゾーンは、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有し、前記報告担体は担体及び１個以上の有能（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）酵素カセットを有する）；及び
（ｃ）検出ゾーン（ここで検出ゾーンは分析物のための捕捉成分及びインジケータを有する）、
を包含するクロマトグラフ媒体を有するラテラルフローアッセイデバイスを用意すること；
ｉｉ）サンプル適用ゾーンを検査サンプルと接触させること（ここで検査サンプルは、報告担体ゾーンを通り抜け、クロマトグラフ媒体に沿って、サンプルローディングゾーンから検出ゾーンまで、そして検出ゾーンを超えて移動する）；及び
ｉｉｉ）基質を検出ゾーンに添加すること（ここで基質は、報告担体を含有する有能酵素分析物の存在下に反応を受ける）；及び
ｉｖ）検査サンプル中に分析物の存在もしくは不在に対応する検出ゾーン内でインジケータの応答を発生させること、
を実施することにより、分析物を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
別の態様において本発明は、
検出ゾーンの上流に位置するサンプルローディングゾーン；
サンプルローディングゾーンと検出ゾーンとの間に位置する報告担体ゾーン（ここで前記報告担体ゾーンは、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有し、前記報告担体は担体及び１個以上の有能酵素カセットを有する）；及び
検出ゾーン（ここで検出ゾーンは分析物のための捕捉成分及びインジケータを有し、インジケータは有能酵素の存在下基質の反応を検出し、それにより分析物酵素報告担体複合体の生成物を検出し、そして基質が検出され、それにより分析物の存在を検出する）、
を包含するクロマトグラフ媒体、
を有することにより、分析物を検出するデバイスを提供する。
【００１２】
一態様において本発明は、
ラテラルフローアッセイデバイスは、
サンプルローディングゾーン；
ローディングゾーンの下流に位置する報告担体ゾーン（ここで前記報告担体ゾーンは、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有する）；
報告担体ゾーンの下流に位置する検出ゾーン（ここで検出ゾーンは捕捉成分及びインジケータを有する）；及び
有能酵素のための基質（ここで、検査サンプルはラテラルフローデバイス中を流れるようにした後、基質は検出ゾーンに適用され、酵素及び基質の生成物が検出される）、
を有する多孔質メンブレン、
を有する、分析物を検出するキットを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上に記載した順序でなく、これらのステップを有する方法を実施することも可能である。例えば、
（ａ）分析物を含むのではないかと疑われるサンプルからの分析物を固定化すること、
（ｂ）固定化した分析物を報告担体と接触させて、報告担体−分析物複合体を形成すること（ここで報告複合体は有能酵素を有する）、
（ｃ）有能酵素のための基質を用意すること、及び
（ｄ）有能酵素補助反応の結果としての変動、例えば反応生成物、を検出し、それにより分析物の存在を検出すること、
が可能である。
【００１４】
この態様の様々な実施形態において、分析物はタンパク質、核酸、細胞、細胞もしくは病原体の一部、病原体、ビリオン、細胞のもしくは細胞外のマトリックスの成分、又は小分子である。この態様の様々な実施形態において、報告担体は抗体もしくは核酸を含む。
【００１５】
この態様のある実施形態において、有能酵素はウレアーゼ、ホスホコリンホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、キシロースレダクターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ネオプルラナーゼ、サブチリシン、４−フィターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ラッカーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチターゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、凝固因子ＶＩＩａ、トリプシン、ベータ−フルクトフラノシダーゼであってよい。
【００１６】
この態様の一実施形態において、抗体は非共有結合的相互作用により有能酵素と関係している。あるいは、抗体もしくは核酸は有能酵素と共有結合している。
【００１７】
この態様の追加の実施形態において、当該方法は１個以上の不活性プロ酵素をさらに使用する。プロ酵素とは、酵素の不活性前駆体であり、活性になるには何らかの変化（例えば活性酵素をマスクしているフラグメントの加水分解）を必要とする化合物のグループのいずれかである。
【００１８】
この態様の別の実施形態において、有能酵素の生成物の検出はｐH変化の検出による。このｐH変化は、ｐH変化に対応して変色する金ナノ粒子を有してよいｐH感受性ヒドロゲルを使用して決定してよい。
【００１９】
この態様のさらなる実施形態において、有能酵素の生成物の検出は比色分析変化による。ここで比色分析変化は、有能酵素補助反応の結果としての変動、例えば染料のプロトン化もしくは脱プロトン化又は銀イオン還元、によるものである。
【００２０】
この態様のなおさらなる実施形態において、有能酵素の生成物の検出は有能酵素補助反応の効果の結果としての沈殿、例えば可溶性成分の沈殿、による。該可溶性成分はＢＳＡを包含するタンパク質、もしくはｐH変化により凝集体を形成するｐH感受性ポリマーであってよい。ｐHの変化はポリマーの表面電荷をシフトさせる。表面電荷変動の結果、ポリマー分子の３D構造が変化し、ポリマーの疎水性部分が露出される。ポリマーの疎水性領域の露出はエントロピーを増す。ポリマーのこれらの疎水性部分は、非共有結合的相互作用を形成することになり、よって凝集体を形成する。ｐH感受性ポリマーの例は、メチルアクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル、及びＮ−ヒドロキシメチルアクリルアミドを包含する。
【００２１】
別の態様において本発明は、
（ａ）サンプルローディングゾーン、
（ｂ）報告担体ゾーン（ここで報告担体ゾーンは、報告担体及び有能酵素を有する）、
（ｃ）有能酵素のための基質の供給源、及び
（ｄ）検出ゾーン（ここで検出ゾーンは捕捉成分を含む）、
を有する分子診断デバイスを提供する。
【００２２】
この態様のいくつかの実施形態において、デバイスは陽性対照ゾーンを有する。
【００２３】
この態様のいくつかの実施形態において、サンプルローディングゾーンはサンプルローディングパッドである。
【００２４】
この態様のいくつかの実施形態において、報告担体ゾーンは結合体パッドである。
【００２５】
この態様のいくつかの実施形態において、検出エリアは多孔質メンブレンを有する。
【００２６】
この態様のいくつかの実施形態において、デバイスは剛性もしくは可撓性の裏当て材を有する。
【００２７】
この態様の様々な実施形態において、報告担体は抗体もしくは核酸を有する。
【００２８】
この態様のある実施形態において、有能酵素は、ウレアーゼ、ホスホコリンホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、キシロースレダクターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、
サブチリシン、４−フィターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ラッカーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチターゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、凝固因子ＶＩＩａ、トリプシン、ベータ−フルクトフラノシダーゼであってよい。本発明のある実施形態において、プロ酵素を使用する場合、当該プロ酵素は上記有能酵素のプロ酵素からなるグループから選択されるプロ酵素であってよい。
【００２９】
この態様の実施形態において、抗体は非共有結合的相互作用により有能酵素と関係している。あるいは、抗体もしくは核酸は有能酵素と共有結合している。
【００３０】
この態様の追加の実施形態において、当該方法は１個以上の不活性プロ酵素をさらに使用する。
【００３１】
この態様の別の実施形態において、有能酵素の生成物の検出はｐH変化の検出による。このｐH変化は、ｐH変化に対応して変色する金ナノ粒子を有してよいｐH感受性ヒドロゲルを使用して決定してよい。
【００３２】
この態様のさらなる実施形態において、有能酵素の生成物の検出は比色分析変化による。ここで比色分析変化は、有能酵素補助反応の効果、例えば染料のプロトン化もしくは脱プロトン化又は銀イオン還元、によるものである。
【００３３】
この態様のなおさらなる実施形態において、有能酵素の生成物の検出は有能酵素補助反応の変動の結果としての沈殿、例えば可溶性成分の沈殿、による。該可溶性成分はＢＳＡを包含するタンパク質、もしくはｐH感受性ポリマーであってよい。ｐH感受性ポリマーの例は、メチルアクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル、及びＮ−ヒドロキシメチルアクリルアミドを包含する
別のさらなる態様において本発明は、
（ａ）サンプルローディングゾーン、
（ｂ）もし存在するならば、プレ報告担体ゾーン（ここでプレ報告担体ゾーンは、報告担体及び有能酵素を有する）、
（ｃ）有能酵素のための基質の供給源及びプレ報告担体のための報告担体、及び
（ｄ）検出ゾーン（ここで検出ゾーンは捕捉成分を含む）、
を有する分子診断デバイスを提供する。
【００３４】
別のさらなる態様において本発明は、検出ゾーン（ここで検出ゾーンは捕捉成分を含む）を有する分子診断デバイスを提供する。プレ報告担体、報告担体、もしくは基質は順次検出に添加可能であった。
【００３５】
別のさらなる態様において本発明は、検出ゾーン（ここで検出ゾーンは捕捉成分を含む）を有する分子診断デバイスを提供する。プレ報告担体、報告担体及び基質の１種以上を収容する多数の試薬容器に囲まれて検出ゾーンは配置されても、動かされてもよかった。
【００３６】
なお別のさらなる態様において本発明は、上の段落（国際公開の原文の段落００３１、００３２及び００３３）で強調したプロセスの組み合わせを使用する分子診断デバイスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｆｉｇ．１は、サンプル調製、シグナル担体結合、シグナル担体固定化、過剰な分子の除去及び結果表示を包含する標的検出のための一般的ステップを示す。
【図２】Ｆｉｇ．２は核酸検出のための一般的ステップを示す。
【図３】Ｆｉｇ．３はラテラルフローデバイスにおける実施を示す。
【図４Ａ】Ｆｉｇ．４Ａはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｂ】Ｆｉｇ．４Ｂはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｃ】Ｆｉｇ．４Ｃはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｄ】Ｆｉｇ．４Ｄはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｅ】Ｆｉｇ．４Ｅはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｆ】Ｆｉｇ．４Ｆはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｇ】Ｆｉｇ．４Ｇはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図４Ｈ】Ｆｉｇ．４Ｈはラテラルフローデバイスの一実施形態を示す。
【図５Ａ】Ｆｉｇ．５Ａはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｂ】Ｆｉｇ．５Ｂはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｃ】Ｆｉｇ．５Ｃはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｄ】Ｆｉｇ．５Ｄはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｅ】Ｆｉｇ．５Ｅはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｆ】Ｆｉｇ．５Ｆはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｇ】Ｆｉｇ．５Ｇはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｈ】Ｆｉｇ．５Ｈはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｉ】Ｆｉｇ．５Ｉはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｊ】Ｆｉｇ．５Ｊはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｋ】Ｆｉｇ．５Ｋはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図５Ｌ】Ｆｉｇ．５Ｌはラテラルフローデバイスの機能の一実施形態を示す。
【図６Ａ】Ｆｉｇ．６Ａは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｂ】Ｆｉｇ．６Ｂは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｃ】Ｆｉｇ．６Ｃは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｄ】Ｆｉｇ．６Ｄは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｅ】Ｆｉｇ．６Ｅは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｆ】Ｆｉｇ．６Ｆは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｇ】Ｆｉｇ．６Ｇは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｈ】Ｆｉｇ．６Ｈは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図６Ｉ】Ｆｉｇ．６Ｉは核酸標的の検出のためのプレ報告担体の一実施形態を示す。
【図７】Ｆｉｇ．７は陽性の検査結果を有するラテラルフローデバイスを示す。
【図８】Ｆｉｇ．８は陰性の検査結果を有するラテラルフローデバイスを示す。詳細な説明  本発明は一般に、検出に先立ち増幅ステップの必要を減らすもしくは取り除くため、じゅうぶんに低い検出限界（ＬＯＤ）を有するサンプル中の分析物及び標的を検出する方法及びデバイスを提供する。ここに開示の方法は、サンプル純度について軽減された要求を有する著しくより単純なプロセスを提供する。本発明の方法及びデバイスは、サンプル濃縮、精製、標識及び検出を包含する合理化されたサンプル調製プロセスを提供する。
【００３８】
検査サンプル中の分析物の存在を検出するラテラルフロー分子診断デバイスは、
（ａ）検出ゾーンの上流に位置するサンプルローディングゾーン；
（ｂ）サンプルローディングゾーンと検出ゾーンとの間に位置する報告担体ゾーン（ここで前記報告担体ゾーンは、分析物との複合体を形成可能な報告担体を有する）；
（ｃ）有能酵素のための基質；
（ｄ）検出ゾーン（ここで検出ゾーンは分析物のための捕捉成分及び有能酵素のための基質を有し、ここで酵素及び基質の生成物が検出される）、
を包含するクロマトグラフ媒体を有する。
【００３９】
検査サンプル中の分析物の存在を検出するラテラルフロー診断デバイスは、検出ゾーンの下流に陽性対照ゾーンをさらに有してよい。
【００４０】
枕元近くの環境で使用するための核酸検出デバイス開発の試みがなされてきた。いくつかの製品は、臨床検査室の外に検査を持っていくことにより部分的にこの要求を満たしてきた。しかしながらこれらのアプローチは、
（１）増幅ステップ及び関連した装置への依存を除去しない、
（２）検出物質のための貯蔵条件を減らさない、
（３）増幅由来の光学シグナルを読み取る複雑なアナライザへの依存を除去しない、もしくは
（４）電源供給への依存を除去しない。
前記核酸増幅検査の結果としての増幅核酸フラグメントは、サンプル間の相互汚染のリスクを原則的には増加させてきた。
【００４１】
スキャナもしくはアナライザの必要性に取って替わることを求めるラテラルフローデバイスが、例えばＵＳ２０１１０８６３５９、ＷＯ２００４０９２３４２、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ，２００４，Ｖ７６，Ｐ８８８、及びＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，Ｖ８１，Ｐ１６６０にも記載されている。しかしながら、これらの方法は複雑なアナライザを必要としないながら、プレ増幅なしでの直接検出のための感受性に欠けるという不利があった。例えば、病原体核酸検出は、十分な感受性を達成するために通常１０００コピー以上が必要であり、他のレポートでは検出のためには増幅した標的が最低１０００，０００，０００コピーについての必要条件を記載している。これらの方法は、貯蔵状態に対して敏感である増幅装置及び試薬についての条件を有し；標的核酸の増幅を実施するための専門家を必要とし：同じ増幅機器の繰り返し使用による相互汚染に敏感である。
【００４２】
病原体の存在を検出するラピッドキット、例えばＣＬＯ(http://www.medicinenet.eom/helicobacter_pylori/article.htm#2diagnosis)、もあるが、これらの方法は、
（１）生物学的標的を増殖するために長いインキュベーション時間（数時間乃至数日）、
（２）生検を取るための専門家、及び
（３）結果を解釈するための専門家、
を必要とする。
【００４３】
ここに詳しく記載したように、本発明は、検出に先立ち最小限の増幅をするもしくは増幅なしで、生物学的、化学的もしくは物質的標的を包含する、１個以上の標的を検出するための方法及びデバイスを提供する。プレ増幅なしに生物学的標的を直接検出できるようにする安定で豊富な有能酵素システムの使用により、ある程度このことは達成される。核酸検出の場合、標的は複製されないし、デバイス全体が使い捨てなので、相互汚染のリスクは減る。検出時間はかなり減らされ、１時間未満もしくは１５分と短いサンプルから結果までの時間を有する。本発明で使用される酵素は好ましくは室温で安定である。いくつかの実施形態において、本発明は、複雑な器具類なしに、したがって本発明をポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）適用になじみやすくする検出を可能にする。
【００４４】
したがって、本発明の方法及びデバイスは、著しく減ったセットアップコスト及びポイント・オブ・ケア検出のための設備要件を提供し、使い捨てキットへ適用しやすい。これらの特徴は、使用前の事前トレーニングなしに消費者もしくは他の人員により直接操作可能な実施形態を考慮している。さらに、本発明の方法及びデバイスは、検出限界（ＬＯＤ）及び／又は検出時間を向上するように現存するワークフローへ一体化可能である。
定義
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物もしくは生物学的システム（それらは当然変化し得る）に限定されないことを理解すべきである。ここで使用する用語は特定の態様を説明する目的だけであり、限定を意図していないことをも理解すべきである。本明細書及び付属の請求項で使用されているように、内容が他に明示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数照応指示を包含する。
【００４５】
ここで使用されるように測定値、例えば量、継続時間その他、を指す場合、用語「約」は具体的な値から±２０％もしくは±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％、及びなおより好ましくは±０．１％のバリエーションを包含することを意味している。このようなバリエーションは開示方法を実施するのに適当である。
【００４６】
他に定義しない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の普通の専門家により共通に理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載されたものと類似もしくは同等のいかなる方法及び材料も本発明の検査の実際において使用可能であるが、好ましい材料及び方法はここに記載されている。
【００４７】
「分析物」および「標的」は、検出されるべき化合物を指す。そのような化合物は、細胞、細胞もしくは病原体の一部、病原体、ビリオン、細胞のもしくは細胞外マトリックスの成分、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸並びに他の化学的成分を包含可能である。
【００４８】
クロマトグラフ媒体は、検査サンプルがそれを通過可能な様々な材料のいずれのものからできていてよい。例えば、クロマトグラフ媒体は、合成もしくは天然材料、例えば多糖類（例えばセルロース材料、例えば紙及びセルロース誘導体、例えば酢酸セルロース及びニトロセルロース）；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；
ポリマー、例えば塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、を有する無機材料、例えば不活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ４、もしくは多孔質ポリマーマトリックス中に均等に分散された他の無機微細材料；
天然（例えば綿）及び合成（例えばナイロンもしくはレーヨン）の両方の布；多孔質ゲル、例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン；高分子フィルム、例えばポリアクリルアミド；その他、から形成された多孔質メンブレンでよい。ある特定の実施形態において、クロマトグラフ媒体はニトロセルロース及び／又はポリエーテルスルホン材料から形成される。用語「ニトロセルロース」はセルロースの硝酸エステルを指し、これはニトロセルロース単独でも、硝酸及び他の酸、例えば１乃至７個の炭素原子を有する脂肪族刈るボン酸、の混合エステルでもよい、と理解すべきである。
【００４９】
クロマトグラフ媒体の寸法及び形は、当業者により容易に認識されるように通常変化し得る。例えば、多孔質メンブレンストリップは、長さ約１０乃至約１００ミリメートル、いくつかの実施形態において約２０乃至約８０ミリメートル、及びいくつかの実施形態において約４０乃至約６０ミリメートルを有してよい。該メンブレンストリップの幅は、約０．５乃至約２０ミリメートル、いくつかの実施形態において約１乃至約１５ミリメートル、及びいくつかの実施形態において約２乃至約１０ミリメートルの範囲内でよい。同様に、該メンブレンストリップの厚さは通常小さく、透過に基づく検出を可能にさせるのに十分である。例えば、メンブレンストリップは、厚さ約５００マイクロメーター未満、いくつかの実施形態において約２５０マイクロメーター未満、及びいくつかの実施形態において約１５０マイクロメーター未満を有してよい。
【００５０】
上述のように、サポート材料はクロマトグラフ媒体を担持する。例えば、サポート２１は、Ｆｉｇ．３に示されるようにクロマトグラフ媒体に直接隣接して置かれていても、あるいは１個以上の介在層がクロマトグラフ媒体とサポート材料との間に置かれていてもよい。とにかく、サポート材料は通常、クロマトグラフ媒体を担持可能ないかなる材料から形成されていてよい。サポート材料は、光透過性である材料、例えば透明もしくは光学的拡散（例えば半透明）材料、から形成されてよい。また、媒体じゅうを流れる液体がサポート材料を通して漏れないように、サポート材料は液体不浸透性であることが通常望まれる。サポートに適当な材料の例は（ただし限定されない）、ガラス；高分子材料、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル（例えばＭｙｌａｒ（登録商標）フィルム）、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリカーボネート、エポキシド、メタクリレート、及びポリメラミン；その他を包含する。クロマトグラフ媒体に十分な構造的裏当てを提供するために、サポート材料は、ある最低限の厚さを有するように通常選択される。同様に、サポート８の厚さは典型的には、その光学的特性に悪影響を及ぼすほどには大きくない。よって例えば、サポート材料は厚さ約１００乃至約５０００マイクロメーター、いくつかの実施形態では約１５０乃至約２０００マイクロメーター、及びいくつかの実施形態では約２５０乃至約１０００マイクロメーター、を有してよい。
【００５１】
当技術分野で周知のように、クロマトグラフ媒体はサポート材料上へ注型されてよく、そこでは得られるラミネートは所望のサイズ及び形にダイカットされてよい。あるいは、クロマトグラフ媒体を例えば接着剤を有するサポート材料に対してラミネートするだけもよい。いくつかの実施形態において、ニトロセルロースもしくはナイロン多孔質メンブレンはフィルムに接着している。
【００５２】
ラテラルフローデバイスは、サンプルローディングゾーンから最も遠方のクロマトグラフ媒体の端である、末端のクロマトグラフ媒体に連接して置かれた吸収性材料をも有する。吸収性材料は、毛細管現象を促進すること、及び液体がクロマトグラフ媒体じゅうを流れるのを補助する。加えて、吸収性材料は、クロマトグラフ媒体全体を通って移動してきた液体を受け止め、且つしたがって「偽陽性」の可能性を減らすのを助けるように、如何なる未反応成分を検出及びコントロール領域から引き離す。本発明で使用してよいいくつかの吸収性材料は（ただし限定されない）、ニトロセルロース、セルロース材料、多孔性ポリエチレンパッド、ガラス繊維ろ紙、その他を包含する。吸収性材料は、デバイスに組み込まれる前に濡れていても乾いていてもよい。予湿法は、何らかの液体の毛管フローを促進するが、ただし典型的に必要ではない。さらに当該技術で周知なように、吸収性材料はウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）プロセスを補助する界面活性剤で処理してもよい。
【００５３】
サンプルローディングゾーンは、セパレート材料、例えばパッド、により形成してよい。そのようなサンプルパッドを形成するのに使用してよい、いくつかの適当な材料は（ただし限定されない）、ニトロセルロース、セルロース、多孔性ポリエチレンパッド及びガラス繊維ろ紙を包含する。所望により、サンプルローディングゾーンは、該ゾーンに拡散的もしくは非核酸的に付属した１種以上の予備処理試薬を有してもよい。模式化した実施形態において、検査サンプルは、サンプルローディングゾーンから該サンプルローディングゾーンと連絡している報告担体ゾーンまで移動する。報告担体ゾーンはクロマトグラフ媒体上に形成されてよい。あるいはＦｉｇ．３に示すように、報告担体ゾーンはセパレート材料もしくはパッドから形成される。このような試薬パッドは、検査サンプルが通過可能である、いずれの材料、例えばガラス繊維、から形成されていてもよい。
【００５４】
「インジケータ」は、別の物質の存在、不在もしくは濃度、もしくは２種以上の物質間の反応の程度を、特徴的な変化、特に色における変化、によって示す様々な物質、例えばリトマス、フェノールフタレイン、もしくはブロモチモールブルー、１−ヒドロキシ−４−［１−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）フェニルアゾ］―ナフタレン―２−スルホン酸カリウム、及びその他、のいずれか、を意味する。
【００５５】
「サンプル」は、分析物もしくは標的分子を含有することが疑われるいずれかの源を意味する。本発明を使用して検査され得るサンプルの例は（ただし限定されない）、血液、漿液、血漿、尿、唾液、髄液、組織及び組織及び細胞抽出物、細胞培養上清、生検材料、パラフィン包埋組織、土壌、果物、ジュース、油、ミルク、食物、水、等を包含する。サンプルは液体材料、例えばバッファー、抽出溶媒、溶媒、その他、中に浮遊もしくは溶解してもよい。
【００５６】
「報告担体」（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｃａｒｒｉｅｒ）は、標的もしくは分析物と結合し、複合体を形成し、標的もしくは分析物の存在を報告する実体を意味する。報告担体は、タンパク質もしくは核酸又は分析物もしくは標的分子とともに複合体を形成可能な別の部分、を有し得る。報告酵素は有能酵素カセットと関係している、該カセットは酵素と基質の組み合わせを有し得、該組み合わせは標的もしくは分析物が存在する場合に唯一活性である。酵素カセットは報告担体に結合した少なくとも１個の有能酵素を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、担体は抗体もしくはオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
「有能酵素」もしくは「高収率酵素」は、拡散限界に接近する高率で生成物をもたらす酵素を意味する。
【００５９】
「捕捉成分」は一般に、報告担体が同一の標的もしくは分析物との複合体を形成するのをじゃますることなく、標的もしくは分析物を特異的に認識し複合体化する分子を意味する。通常、捕捉成分はクロマトグラフメンブレン上のマトリックスに固定化される。
【００６０】
「プレ報告担体」は通常、報告担体と会合する前の分析物に特異的に結合する分子を意味する。プレ報告担体は通常、有能酵素を含まない。
【００６１】
「有能酵素結合体」（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は通常、報告担体に結合された有能酵素を意味する。相互作用の性質は、共有結合的もしくは非共有結合的もしくは両者の混成である。
成分及び方法
報告担体
Ａ．担体
報告担体は典型的には２個の成分を有する。その第１の成分は、生物学的、化学的もしくは他のタイプであり得る標的もしくは分析物と特異的複合体を形成可能な担体である。他方の成分は、１個以上の有能酵素カセットである。本発明の実施において使用可能な担体は、標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸、抗体、アプタマー、中空でない（ｓｏｌｉｄ）もしくは多孔質マイクロ粒子、及び標的の少なくとも一部と相補的な刷り込み構造を有する合成ポリマーを包含する（ただしこれらに限定されない）。中空でない、シェルコア型（ｓｈｅｌｌ−ｃｏｒｅ）のもしくは多孔質のマイクロ粒子は、反応パッドへ担体を導く流れの制御を向上させることができる担体の一部であり得る。この制御は、担体のサイズもしくは密度を変更することにより、又はもし粒子が磁気分極し得るならば、磁石駆動粒子移動の効用をもたらすこと、例えば常磁性粒子、により達成可能である。
【００６２】
別の実施形態において、有能酵素を含まないプレ報告担体は、プレ報告担体−分析物複合体、複合体Ａ、を形成する。前記複合体Aは、インモビライザにより捕捉され、固定化され得る。プレ報告担体単独ではインモビライザと結合しない。分析物の存在なしでは、複合体形成はなく、プレ報告担体は流失する。
【００６３】
報告担体は分析物に特異的である。プレ報告担体は、分析物との複合体を形成するのに使用可能であった。３つの成分全てが溶液中に存在する場合、このような会合が可能である。好ましい実施形態において、サンプル溶液がラテラルフローアッセイデバイスに適用される前に、プレ報告担体をサンプル溶液に添加する。分析物プレ報告担体複合体は、報告担体ゾーンに接触するようになり、該ゾーンでは報告担体は複合体との会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を形成する。分析物は検出ゾーンにおける表面捕捉剤により捕捉され、固定化される。分析物及びプレ報告担体の会合は、分析物の固定化を阻害しない。分析物及びプレ報告担体の存在下、前記２成分の複合体は、検出ゾーンにおける分析物及び表面捕捉剤の相互作用により固定化される。複合体と会合している場合、報告担体はその時固定化される。分析物もしくはプレ報告担体分析物複合体が存在しない場合、報告担体は固定化されないし、そして溶剤が動き且つ任意の流れがラテラルフローデバイスを下っていくにつれて報告担体は検出ゾーンを通り越して移動する。
【００６４】
プレ報告担体の目的は多種多様である。一つは、標的分析物への特異性を増すことである。報告担体への酵素の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、バックグラウンド非標的の上で標的分析物への結合選択制を最大化する能力を制限し得る。核酸の場合、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）酵素由来の立体障害もしくはクーロン電荷効果が、ハイブリダイゼーションの選択性に影響を及ぼし得る。他の目的は、カスケード結合によるシグナル増幅プロセスを増すことである。一例は、小さな分析物の検出である。分析物の分子サイズが小さすぎる場合、１個の分析物と複合体を形成する報告担体を１個以上有するのは難しい。分析物分子がプレ報告担体と複合体、前記複合体Ａ、を形成した後では、分析物分子当たりの表面積はより大きい。より大きい表面面積及び官能基が複合体Ａ形成の結果として作り出される。追加された表面積及び官能基は、１個以上の報告担体を１個の分析物を有する複合体と会合させる。より多くの報告担体はより多くのシグナルを生成し、従ってシグナル対ノイズ比をさらに改善する。プレ報告担体の使用は、分析物当たりの報告担体特異的結合イベントをより多く生じさせるために、標的表面積を増やす。
【００６５】
別の実施形態は、報告担体デザインの複雑性を減らし、標的分析物の多様性（例えばウイルス遺伝子多型もしくは多重核酸配列標的）を増やす。様々なプレ報告担体の混合物が、各特異的遺伝子型もしくは配列と反応させるために、設計可能である。全てのプレ報告担体は、報告担体に特異的なタグ１個以上を有する。同じ単独タグを使用する場合、報告担体はタグに特異的に結合するが、プレ報告担体どうしに区別はない。種々のタグを使用する場合、異なる報告担体が各タグに対してデザインされるならば、いくつかの標的を別々に分類するのが有用である。
【００６６】
Ｆｉｇ．６Ａ乃至６Ｉは、核酸標的検出において使用するプレ報告担体の様々な例を示す。例えば、Ｆｉｇ．６Ｂ及びＦｉｇ．６Ｃに示すように、プレ報告担体はユニークな標的結合領域（例えばＩ乃至Ｎ）を有してよく、各々はユニークなタグを有する（例えばａ１乃至ａ３）。ユニークなタグの各々は異なる報告担体により結合される。このバリエーションの一つの利点は、プレ報告担体（及びしたがって対応する報告担体も）は様々な標的位置で結合することである。これは、プレ報告担体もしくは報告担体が間違った反応スポットに誤って結合することに由来する、誤った陽性のリスクを減らす。Ｆｉｇ．６Ｄが示す一例では、ユニークな標的結合領域（Ｉ乃至Ｎ）それぞれは同一タグ（「ａ」）を保持している。Ｆｉｇ．６Ｅ乃至６Ｆに示すように、各プレ報告担体は、有能酵素結合体を担持する報告担体の単一種を使用する検出により、同じ標的の一部にハイブリダイズ可能である。さらなる例において、同じタグ（「ａ」）を有する各プレ報告担体は、同じ標的の様々な部分と対照的に、様々な標的に結合可能である（Ｆｉｇ．６Ｇ乃至６Ｉ）。
【００６７】
「抗体」は、いずれの免疫グロブリンもしくはインタクト分子、並びに本発明の実施において使用してよい特異的エピトープに結合するそれらのフラグメントを意味する。そのような抗体は、抗体全体及びその変異体のポリクローナル、モノクローナル、キメラの、ヒト化、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’フラグメント及び／又はＦ（ｖ）部分を包含する（ただしこれらに限定されない）。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを包含する、全てのアイソタイプはこの用語により網羅され、本発明の実施において使用されてよい。
【００６８】
「抗体フラグメント」は具体的には、抗体の全配列の不完全なもしくは単離した部分意味し、当該部分は親抗体の抗原結合機能を保持しており、本発明においても使用してよい。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；ディアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００６９】
本発明における使用のためのインタクト「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に連絡した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を有する。各重鎖は重鎖可変領域（ここではＨＶＲもしくはＨＬと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨＩ、ＣＨ２及びＣＨ３、からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここではＬＣＶＲもしくはＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、超可変性の、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた領域、より保存された領域とともに散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられた領域に細分化可能である。各ＶＨ及びＶＬは３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなり、これらはアミノ末端からカルボキシル末端まで以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫システムの様々な細胞及び古典的補体の第１成分（Ｃｌｑ）を包含する、免疫グロブリンの宿主組織もしくは宿主因子への結合を仲介し得る。用語抗体は、結合する能力を保持するインタクト抗体の抗原結合部分を包含する。結合の例は、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩドメインからなる１価のフラグメント；
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２個のＦａｂフラグメントを有する２価のフラグメント；
（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；
（ｉｖ）抗体の単一腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；  
（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント  （Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４１  ：５４４−  ５４６  （１９８９））；及び
（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、
を包含する。
【００７０】
「一本鎖抗体」もしくは「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」も本発明において使用してよい。この用語は、Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬ及びＶＨ、の抗体融合分子を意味する。Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬ及びＶＨ、は別々の遺伝子によりコードされるが、これら２個のドメインは組み換え方法を使用し、これら２個のドメインを単一タンパク鎖にできる合成リンカーにより結合可能である。当該鎖においてＶＬ及びＶＨ領域は１価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：４２３−  ４２６  （１９８８）；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８）を参照）を形成するペアとなる。このような一本鎖抗体は用語「抗体」フラグメントに含まれる。「抗体」フラグメントは組み換え技術又はインタクト抗体の酵素的もしくは化学的開裂により製造され得る。
【００７１】
「モノクローナル抗体」を本発明において使用してよい。モノクローナル抗体は、単一分子組成物の抗体分子の調製物である。モノクローナル抗体組成物は、単一結合特異性及び特定のエピトープについて親和性を示す。
【００７２】
本発明の実施において使用してよい抗体の特異性についての非限定的例は、特有の抗原に対して特異的なもの；メチル化ＤＮＡの検出のためのメチル化特異的抗体；及びリンタンパク質の検出のためのホスホリル化特異性抗体、等を包含する。例えば、ウイルス特異性抗体を、サンプル中のビリオンの存在を検出するのに使用可能である。上に記載した抗体及びフラグメントの全ては、抗体もしくはフラグメントを有能酵素に結合させる基によって修飾してよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、核酸を担体として使用する。核酸を使用するならば、標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用してよい。核酸を合成する方法は当該技術において周知である。本発明の核酸は、当該核酸を有能酵素に結合させる基によって修飾されてよい。標的に対する担体核酸の選択塩基１個もしくは数個のミスマッチが導入され得る。人為的に導入したミスマッチを利用して、エンタルピー及びエントロピー変化の結果として様々なサンプルにおいて担体の選択性をデザインもしくは加工するように、結合エネルギーを調節可能であった。
【００７４】
天然塩基を有するオリゴヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドアナログを有するオリゴヌクレオチド、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、を使用してよい。ＤＮＡ及びＲＮＡと対照的に、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合により結合されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン繰り返しユニットからなる。ロックド核酸（ＬＮＡ）は変性したＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素及び４’炭素を接続する特別の架橋により修飾されている。架橋は３’−ｅｎｄｏ（北）立体配置におけるリボースを「ロックし」、これはしばしばAフォーム二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）において見られる。ＬＮＡヌクレオチドは、必要によりオリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡもしくはＲＮＡ残基と混合可能である。このようなオリゴマーは化学的に合成可能で、商業的に入手可能である。
Ｂ．有能酵素もしくは担体酵素
上に記載した担体は、本発明の実施において様々な有能酵素もしくは担体酵素と非共有結合的に会合もしくは共有結合可能である。本発明の実施において特に有用な酵素は、拡散限界に接近する反応速度を特徴とする。本発明の有能酵素は、典型的にはターンオーバー定数１０３／秒／酵素乃至１０８以上／秒／酵素を有しえる。
【００７５】
適当な有能酵素もしくは担体酵素の例は、以下のＥＣクラス、オキシドレダクターゼ（ＥＣ１）、加水分解酵素（ＥＣ３）、リアーゼ（ＥＣ４）もしくはリガーゼ（ＥＣ６）、又は酵素、酵素類似核酸、又はプロトン濃度を生成する反応を触媒する酵素類似触媒、に包含される（ただしこれらに限定されない）。
【００７６】
このような酵素の例は当該技術において知られている。本発明の実施において有用な酵素の例、それらの特徴及び基質は、以下に示したものを包含する（ただしこれらに限定されない）。
１．ウレアーゼ
ＥＣ番号：  ３．５．１．５，加水分解酵素
ａ．  ターンオーバー数：  ２．９７ｘ１０３Ｓ−１
ｂ．  基質：  尿素  
Ｒｅｆ１：  ＰＤＢ：  ｌｆｗｊ．  
Ｒｅｆ２：  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  ＜Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ＞  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０００，  ３９（２９）  ｐ  ８５７５−８５８４  
２．ホスホコリンホスファターゼ
ＥＣ番号：  ３．１．３．７５  別名ホスホエタノールアミン
Ｓｐｅｃ：  ＰＡＯ１ゲノム野生型におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ５２９２遺伝子（プラスミド構築におけるトランケーション及びモディフィケーションによる構築）  
ａ．  ターンオーバー数：  ５−７ｘ１０６Ｓ−１
ｂ．  基質：  ｐ−ニトロフェニルホスフェート
ｃ．  生成物：  ｐ−ニトロフェノール
Ｒｅｆ１：  Ｂｅａｓｓｏｎｉ，  Ｐ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６  ５２（６），  ｐ５３４−５３９
３．ベータガラクトシダーゼ
ＥＣ番号：  ３．２．１．２３  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ由来
ａ．  ターンオーバー数：  ２．７ｘ１０６Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  ４−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド
Ｒｅｆ１：  ＯＣｏｎｎｅｌｌ，  Ｓ．  ｅｔ．  ａｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７  Ｖ１４１（ｌ）  ｐｌ−１３  
４．  キシロースレダクターゼ
ＥＣ番号：  １．１．１．３０７  Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来
ａ．  ターンオーバー数：  １−３ｘ１０5Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  Ｄ−キシロース，  ＮＡＤＰＨ  
Ｒｅｆ１：  Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．３４（６）  ２００９  ｐ８８１−８９０  
５．  シキミ酸デヒドロゲナーゼ
ＥＣ  １．１．１．２５  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  
Ｓｐｅｃｉｅｓ：  野生型（シキメート），変異体Ｓ２２Ａ，Ｙ３９Ｆ，Ｄ１０７Ａ，Ｓ６７Ａ，Ｔ１０６Ａ  
ａ．  ターンオーバー数：  １ｘ１０5Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  シキメート，もしくはキネート，もしくはＮＡＤ＋  
Ｒｅｆ１：  Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｈ．Ａ．  Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ｖ２８０，  Ｐ  ７１６２−７１６９  
６．  リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
ＥＣ番号：  １．１．１．３７  Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  ｏｒ  Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ  
ａ．  ターンオーバー数  ：  １ｘ１０5Ｓ−１
ｂ．  基質：  ＮＡＤＨ  
Ｒｅｆ１：  Ｍａｌｏｎｅｙ，  Ａ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７１  ２００４  ｐ  ３１１５−３１２６  
７．  ネオプルラナーゼ
ＥＣ番号：  ３．２．１．１３５  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来
ａ．  ターンオーバー数：  １ｘ１０5Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  デンプン（プルラン・フィルム  別名Ｅ１２０４）  
Ｒｅｆ１：  Ｚａｒｅｉａｎ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０  ４６  ｐ５７−６３  
８．  サブチリシン
ＥＣ番号：  ３．４．２１．６２  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来
ａ．  ターンオーバー数：  １ｘ１０5Ｓ−１
ｂ．  基質：  Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド
Ｒｅｆ１：  Ｔｏｏｇｏｏｄ，  Ｈ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２０００  ２５０，  ｐ３２１−３２８  
９．  ４−フィターゼ
ＥＣ番号；  ３．１．３．２６  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来
ａ．  ターンオーバー数：  ３．５−４．１ｘ１０5Ｓ−１
ｂ．  ４−ニトロフェニルホスフェートもしくはｍｙｏ−イノシトール六リン酸
Ｒｅｆ１：  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０００  ２６８（２）  ｐ３７３−３７８  
１０．  アセチルコリンエステラーゼ
ＥＣ番号：  ３．１．１．７  
ａ．  ターンオーバー数：  １．４ｘ１０5Ｓ−１
ｂ．  基質：  アセチルコリン
Ｒｅｆ１：  Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １６８  （１）  ｐ２２３−２３１  
１１．  ラッカーゼ
ＥＣ番号：  １．１０．３．２  Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ由来
ａ．  ターンオーバー数：  ０．６ｘ  １０5Ｓ−１
ｂ．  基質：  ２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）  
Ｒｅｆ１：  Ｊｏｒｄａａｎ，  Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４  Ｖ３４，  Ｐ６３５−６４１  
１２．  細菌性ロイシルアミノペプチターゼ
ＥＣ番号：  ３．４．１１．１０  Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ由来
ａ．  ターンオーバー数：  ０．３  ｘ１０6Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  Ｌ−Ｃｙｓ−７−アミド−４−メチルクマリン
Ｒｅｆ１：  Ａｃｏｓｔａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ２００８，  Ｖ１５８（ｌ）  ｐ５２−６４．  
１３．  トリペプチジル−ペプチダーゼＩ
ＥＣ番号：  ３．４．１４．９  Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ由来
ａ．  ターンオーバー数：  ０．５５  ｘ１０6Ｓ−１
ｂ．  基質：  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド
Ｒｅｆ１：  Ｋｒｉｍｐｅｒ，  Ｒ．Ｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １９９９  ４７（６）  ｐｌ０７９−１０８８  
１４．  凝固因子ＶＩＩａ  
ＥＣ番号：  ３．４．２１．２１  ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来
ａ．  ターンオーバー数：  ０．３５  ｘ１０6Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  Ｎ−メチルスルホニル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド
Ｒｅｆ１：  Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ，  Ｐ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２  ４１  ｐ３３６４−３３７１  
１５．  トリプシン
ＥＣ番号：  ３．４．２１．４  Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ由来  
ａ．  ターンオーバー数：  ０．９１ｘ１０6Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  ｏ−アミノベンゾイル−ＡＧＳＲＧＡＧＱ−（２，３−ジニトロフェニル−エチレンジアミン）  
Ｒｅｆ１：  Ｍａｒａｎａ，  Ｓ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００２  ２９０  ｐ４９４−４９７  
１６．  ベータ−フルクトフラノシダーゼ
ＥＣ番号：３．２．１．２６  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ由来  
ａ．  ターンオーバー数：  ０．７３  ｘ  １０6Ｓ−１ 
ｂ．  基質：  スクロース
Ｒｅｆ１：  Ｄｉｐａｓｑｕａｌｅ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ２００９  １３  ｐ３４５−３５４
【００７７】
分析物検出の感受性及び特異性は、温度ジャンプもしくは勾配を利用することによりさらに向上され得る。もっとも安定な酵素のいくつかは、最適化した活性のため、もしくは酵素を活性化するトリガーとして、より高温を要求する。反応温度はしたがって、その温度において反応が依然として実行可能であるならば室温より高くてよい。温度が最適化領域よりも低い場合、酵素の活性は大きく減ずる。反応汚染物質もしくはサンプル由来のバックグラウンド分子は、最適化ゾーンに温度を上げる前にまず除去もしくは中和可能である。反応汚染物質の一つは、溶液内に溶解した二酸化炭素であり得る、これはｐH変化の妨害である。温度上昇は、二酸化炭素の溶解性を減らし、したがって妨害を減らす。温度は、物理的方法、例えば集光型太陽熱発電、により、もしくは発熱式化学的方法、例えば硫酸マグネシウムもしくは塩化カルシウムの溶媒和のエンタルピー変化、により、もしくは電気的方法、例えばヒートポンプ、により上昇可能である。同様に、温度を減ずることにより反応を最適化するために、反応速度を徐々に減ずることも可能である。化学的方法の一例は、硝酸アンモニウムの溶媒和である。電気極性を切り替えることにより温度を減ずるのに、ヒートポンプを使用可能である。いくつかの実施形態において、反応温度は、その間酵素活性を依然として維持している約４℃、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃乃至約９５℃以上であり、あるいは前記温度範囲内の任意の温度である。
【００７８】
上に表示した酵素及び基質システムに加えて、本発明は１個もしくは２個以上の追加のプロ酵素（Ｂ、Ｃ、Ｄもしくはそれ以上）を使用可能である。そのような実施形態において、基質としてのプロ酵素Ｂは報告グループ中の酵素カセットＡにより活性化され得る。いったん酵素Ｂが活性化させると、酵素Ｂはさらに酵素Ｃを活性化し得、酵素Cは酵素Ｄを活性化することになり、そして同様なことが続く。このようにリンクしたシステムにおける有効ターンオーバー定数は、各活性化プロ酵素のターンオーバー定数の倍数である。例えば、各酵素（Ｂ、Ｃ、Ｄもしくはそれ以上）のターンオーバー定数は極力低く１０もしくは１０２／秒／酵素であり得る。しかしながら、掛け合わせたターンオーバー数は、１０４／秒／酵素以上になる。ある例は血液凝固カスケードを包含し、そこでは活性化因子Ｘａがトロンビンを活性化し、該トロンビンはフィブリノーゲン由来フィブリンを活性化する。活性化したトロンビンは、因子ＶＩＩＩａ及びＩＸａを介して因子Ｘａをも活性化する。
Ｃ．報告担体の形成
担体は、有能酵素もしくは担体酵素と非共有結合的にもしくは共有結合的に会合可能である。結合の例は、担体としてのキメラタンパク質をクローニングすることもしくは発現すること；化学修飾カルボジイミド−ＮＨＳ反応の使用、Ｓ−Ａｕ錯体、トシル−アミン反応、ホルムアルデヒド結合、ジスルフィド結合、分子インプリンティング、及びこれらの方法を使用する部位特異的結合もしくはランダム結合；並びにキメラビオチン−アビジンもしくはトロンビン−ヒルジン会合による非共有結合、を包含する（ただしこれらに限定されない）。
【００７９】
プロセスに関係する２個の分子を結合するのに使用してよいカップリングもしくは架橋化学（しばしば生物結合と呼ばれる）のさらなる例は、当該技術において知られている。普通のカップリング化学は、リシンアミノ酸残基のアミンカップリング（典型的にはアミノ反応性スクシンイミジルエステルにより）及びシステイン残基のスルフヒドリルカップリング（スルフヒドリル反応性マレイミドを介して）を利用する。他の結合は、環付加反応もしくは「クリックケミストリー」により生成可能である。例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｇｒｅｇ．  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６；  “Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，  Ｋａｌｉａ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，  Ｒ．Ｔ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １４：  １３８−１４７  （２０１０）を参照。
【００８０】
あるいは、もし２個のタンパク質を結合するならば、担体は標準の分子生物学及びタンパク質精製技術を使用する融合タンパク質として作られてよい。いったん所望の融合タンパク質をコードする配列が調製されたら、その配列はいずれの適当なベクターもしくはレプリコンにクローン化可能である。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、適切なクローニングベクターをどれにするかは選択の問題である。クローニングのための組み換えＤＮＡベクター及び形質転換可能な宿主細胞の例は、バクテリオファージ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．  ｃｏｌｉグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（Ｅ．  ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びウシパピローマウイルス（哺乳類細胞）を包含する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，ｓｕｐｒａ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｕｐｒａ；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，ｓｕｐｒａを参照。プロモータ、リボソーム結合部位（細菌発現のため）及び、任意にはオペレータ（ここではまとめて「制御」エレメントと呼ぶ）の制御下、遺伝子を配置可能であり、その結果所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、この発現構築を含むベクターにより宿主細胞中のＲＮＡに転写される。コード配列は、シグナルペプチドもしくはリーダー配列を含有してもしなくてもよい。リーダー配列は翻訳後プロセシングにおいてホストにより除去可能である。例えば米国特許第４，４３１，７３９号；第４，４２５，４３７号；第４，３３８，３９７号を参照。
【００８１】
それから発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するのに使用される。多くの哺乳類細胞株が当該技術において知られており、当該細胞株は、
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞(例えばＨｅｐＧ２)、メイディン・ダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、並びにその他、を包含する（ただしこれらに限定されない）。同様に、細菌性ホスト、例えばＥ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．にも当該発現構築物を使用できる。本発明で有用な酵母ホストは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを包含する（ただしこれらに限定されない）。バキュロウイルス発現ベクターによる用途のための昆虫細胞は、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｍｇｉｐｅｒｄａ及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉを包含する（ただしこれらに限定されない）。
捕捉成分
捕捉成分は、報告担体−標的複合体を捕捉するためメンブレンの表面に固定化可能である。捕捉分子は、報告担体が同じ標的分子との複合体形成するのを妨げることなく、標的との複合体を認識及び形成する。標的と複合体を形成した報告担体だけが、捕捉成分によって固定化される。Ｆｉｇ．１に示すように、報告担体−標的捕捉成分の固定化は、サンドイッチ構造の形成という結果になる。構造の一部ではない報告担体は可溶性であり、例えばラテラルフローフォーマットにおいて、液体の流れもしくは洗浄により除去される。洗浄溶液を使用する場合、ｐＨ約８乃至約９．５を有するバッファーが好ましい。プロトン生成酵素及び基質を使用する場合、バッファーの緩衝能力は予期されるｐＨ変化以下でなければならない。典型的洗浄バッファー溶液は、濃度約０．０３ｍＭ乃至約０．１ｍＭを有する。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）及びリン酸塩を有する水性、アルコール水性及び塩類バッファーは、適当な緩衝溶液の比限定的な例である。一般に、捕捉成分はタンパク質もしくは核酸である。捕捉成分は、当該技術において知ら得た方法を使用してクロマトグラフ媒体の表面に固定化可能である。例えばＮａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ５：  １６１−１９７  （２００８）を参照。表面に核酸を固定化する方法も知られている。例えばＷｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ．  Ｅｄｎ．，  １９：  ７２５−７５３  （２００８）を参照。一度の検査で、多様な標的を検出するため、捕捉成分及び報告担体の多様なタイプを使用してよい。例えば多様な標的は、多様な核酸もしくは核酸及び非核酸の組み合わせ、例えばタンパク質標的、であり得る。当該技術において知られている、共有結合的及び非共有結合的両方の、多くの固定化方法のいずれも、本発明の実施において使用してよい。
一般的検出方法
Ｆｉｇ．１は、サンプル調製、標的への報告担体の結合、シグナル担体−標的固定化、過剰な試薬の洗い流し及び結果の表示を伴う、一般的標的検出のための様々なステージを示す。
サンプル調製：
第１のステップとして、本発明の方法及びデバイスで使用するため、サンプルを調製する。当業者により理解されるように、このステージ内での可能なステップは、実施及び標的分子タイプにより変化する。このステージにおいて使用されるステップの例は、標的分子の濃度を改善する方法、細胞からの核酸抽出及びサンプルの精製、を包含する（ただしこれらに限定されない）。いくつかの実施形態において、サンプル（例えば血液もしくは尿のような液体サンプル）の適用前に広範囲にわたるサンプル調製は必要ない。
報告担体を結合：
Ｆｉｇ．１に示すように、このステップは酵素カセットを含有する報告担体を使用する。報告担体は、関係する標的分子との複合体を形成する。
報告担体を固定化：
捕捉成分のインモビライザアレイを、生物学的標的を捕捉するのに使用する。Ｆｉｇ．１に示すように、報告担体との複合体中にある標的のインモビライザ捕捉において、インモビライザ−生物学的標的報告担体のサンドイッチ構造が形成される。様々な実施形態において、様々な標的分子のためのアレイにおいて、多様なインモビライザ（もしくは捕捉成分）を有することが可能である。
過剰な分子を洗い流す：
この任意ステップは、他の分子、過剰なサンプル、報告担体もしくはインモビライザアレイによって捕捉されない他の分子、を洗い流す。毛細管現象により洗浄溶液が検出ゾーン及び対照ゾーン、もし存在するなら、を通り検査ストリップの末端の吸収性パッドまで移動するように、洗浄溶液を検出ゾーンの上流に適用する。任意洗浄溶液の量は、検査ストリップのサイズ及び検査の性質に依存し、当技術の熟練者によって容易に決定される。
結果を表示する：
このステージにおける固定化報告担体は、試薬、通常は基質と混合される。基質は担体における有能酵素もしくは高収率酵素と反応し、急速に観察可能な生成物を形成する。生成物の形成を促進するため、すなわち反応カスケードを形成するように、１個以上の酵素をも添加してよい。酵素及び試薬の選択に依存して、様々な検出方法が利用可能である。その方法は、例えば数ある中でｐＨ変化、変色、変色の密度もしくは発光、を包含する（ただしこれらに限定されない）。基質は典型的には、スプレー、ペインティング、スポイドもしくは注ぐものによりクロマトグラフ検査ストリップに適用される。
【００８２】
Ｆｉｇ．２は核酸検査における本発明の適用を説明する。核酸標的分子に適用されるときの全般的ワークフローは、Ｆｉｇ．１におけるものと同様である。
サンプル調製：
この適用のために、サンプル調製は、ルーチンのステップ、例えば核酸抽出、サンプル濃縮、ＲＮＡ抽出及びヌクレアーゼ阻害、を包含可能である。いくつかの適用ために、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、のサイズを、例えば当該方法における使用前にせん断により、分解する必要がある。
報告担体を結合：
この適用において、高有能もしくは高収率酵素を合成ポリヌクレオチドに結合し、報告担体もしくは酵素カセットを形成する。いくつかの実施形態において、核酸標的についてポリヌクレオチド１個以上が存在可能である。報告担体におけるポリヌクレオチドは、標的核酸をハイブリダイズされる。
報告担体を固定化：
Ｆｉｇ．２に示すように、インモビライザアレイは、標的核酸に特異的なポリヌクレオチド１個以上を有し得る。二者が適合したら、インモビライザは標的核酸とハイブリダイズして、報告担体−標的−インモビライザの複合体を形成する。この複合体の形成は、適所に報告担体をロックする。報告担体中のポリヌクレオチド及びインモビライザの選択は、一本鎖ヌクレオチド変異、メチル化もしくは標的の配列決定、を包含する（ただしこれらに限定されない）種々の応用に使用可能である。
過剰な分子を洗い流す：
このステージにおいて、結合した報告担体−標的複合体を残し、過剰な分子及び酵素カセットを洗い流す。
シグナルを表示する：
報告担体を次いで基質試薬と反応させて、観察可能な生成物を形成する。いくつかの実施形態において、追加の酵素１個以上を反応を促進するために添加可能である。
ラテラルフロープラットフォーム
Ｆｉｇ．３はラテラルフロープラットフォームにおける本発明の実施を説明する。もっとも最適な性能のためのプラットフォームの様々なセクションにおいて様々な成分の配置に関して様々なサンプルタイプによって実施は変化し得る、ということ理解されよう。Ｆｉｇ．３において、サンプルパッド１は結合体パッド２の上流にあり、結合体パッド２はクロマトグラフメンブレン３の上流にあり、クロマトグラフメンブレン３は検出ゾーン（検査ライン）４の上流にあり、検出ゾーン４はコントロールゾーン（コントロールライン）５の上流にあり、コントロールゾーン５は吸収性パッド６の上流にある。デバイス全体はサポート材料８の上である。
【００８３】
ラテラル―フローの他の形態と同様に、サンプルはサンプルパッドでデバイスに進入し、裏当て材の先端のメンブレンに沿って移動することにより最終的に吸収性パッドに到達する。報告担体は結合体パッドに堆積可能であり、インモビライザアレイはセンス及びコントロールラインに存在可能である。よういに理解されるように、コントロール及びセンスラインの順序は違っていてよく、いくつかの実施形態においては多種多様なセンスラインが存在可能である。基質試薬及び追加の酵素（もし必要ならば）もコントロール及びセンスラインに存在可能である。
【００８４】
サンプルが結合体パッドを通って移動するにつれ、報告担体の複合体及び標的が形成される。サンプル最前部がセンスラインに到達したとき、報告担体との複合体を形成した標的は、アレイに固定化される。次いでモニター可能な十分な生成物を形成する反応が起こる。もし固定化プローブ（捕捉成分）がサンプル中の標的とマッチしないならば、サンプル核酸は、検出ラインに最低濃度の酵素を残して、メンブレンを通って流れる。コントロールラインは、デバイスにおいて陽性対照としてふるまう。陽性対照は検査ストリップが機能していることを証明し、それにより偽の陰性検査結果を最小化する。
【００８５】
Ｆｉｇ．７は陽性検査結果を説明する。検出ゾーン４は、分析物−報告担体複合体が検出ゾーンに捕捉されたことを示す酵素の存在を示す。陽性インジケータ応答は、検出ゾーンを通り越した検査サンプルの移動後に検査ストリップに添加される基質の結果である。コントロールゾーン５は、非複合化報告担体が検査デバイスの長さを移動し、コントロールゾーンで捕捉されたことを示す酵素の存在をも示しており、非複合化報告担体の存在を立証する酵素基質の適用後のインジケータにおける変化をもたらす。
【００８６】
Ｆｉｇ．８は、検出ゾーンで分析物報告担体複合体が形成も捕捉もされなかった場合の陰性検査結果を説明する。コントロールゾーンにおいて示された陽性応答は、検査ストリップが適正に機能していたこと、及び酵素と報告担体が存在し有効であることを証明する。
【００８７】
本発明を実施するための具体的態様についての以下の実施例は、説明目的にのみ提供するのであり、本発明の範囲を限定する意図は全くない。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ラテラルフローデバイスの実施形態
Ｆｉｇ．４は、本発明の実施において使用可能なラテラルフローデバイスの様々な実施形態を示す。サンプルローディングゾーン１を備える。矢印で示された方向の流れは、報告担体ローディングゾーン２にみられる報告担体７とサンプルとの相互作用という結果になる。検出ゾーン４は捕捉成分（上向きの塗りつぶした矢印）及び表示結果材料、例えば基質、及び必要ならば、さらにシグナルを増幅するための追加のプロ酵素を含む。陽性コントロールゾーン５を備えていてもよい。そこをサンプルが通過する支持台（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）マトリックスは、もし存在するなら、多孔質マトリックスもしくは分枝ポリマーの化学的コーティングもしくはメンブレンであり得る。Ｆｉｇ．４Ｂ乃至４Ｄに示すように、支持台マトリックスは中空でない非多孔質裏当て８の上に載せてよく、裏当ては可撓性もしくは多孔質でよい。いくつかの実施形態において、検出ゾーン１は、インモビライザアレイ８の１タイプ（例えば抗体、抗原、核酸等）もしくはインモビライザアレイの多様なタイプ含有してよい。インモビライザアレイは、検出ゾーン４ａ、４ｂ及び４ｃにおける様々な空間位置に置かれてよい。Ｆｉｇ．４Ｅは、インモビライザアレイに不活性プロ酵素９が存在可能であることを説明する。プロ酵素は、活性化された場合、システムに高い総合ターンオーバーをもたらし得る。さらなる実施形態において、インモビライザアレイの近隣の支持台マトリックスは、ｐＨ感受性材料、例えば１０を有するｐH感受性ヒドロゲル、例えば金ナノ粒子１０ａを有してよい。このようなｐＨ感受性材料は、その触媒活性がｐＨ変化となる酵素の反応を検出するのに使用してよい。Ｆｉｇ．４Ｇ及び４Ｈに示すように、本発明を実施するのに使用可能な表面ｐＨ感受性表示分子の例は、アクリジンオレンジ、シアニン、リポソーム、蛍光標識デキストラン１１もしくは可溶性分子、例えばＢＳＡ１２、を包含する。
実施例２：ラテラルフローデバイスの実施形態の操作
Ｆｉｇ．５は本発明の様々な実施形態の操作を説明する。サンプル標的１３は、サンプルローディングゾーン１に導入可能である（ステップＡ）。矢印で示した方向のラテラルフローは、サンプル標的１３を報告担体７と接触させる（ステップＢ）。さらにラテラルフローは、サンプル標的及び報告担体１４の複合体を検出ゾーン５へ運ぶ（ステップＣ）。検出ゾーンにおける捕捉成分（上向きの塗りつぶした矢印）及び表示結果材料は、サンプル標的及び報告担体１５の複合体を固定化する（ステップＤ及び４−Ｅ）。様々な実施形態において、捕捉成分は変異体の単数もしくはクラスターでよい（ステップＤとＥにおける上向きの矢印を比較せよ）。捕捉成分並びにサンプル標的及び報告担体の固定化複合体に沿ったラテラルフローは、過剰な材料、例えば非結合報告担体、非結合サンプル標的及び類似物、を除去し、洗浄ステップとして役立つ（ステップＦ）。ステップＧにおいて、酵素基質及び他の可溶性分子はインモビライザアレイゾーンに適用可能である。様々な実施形態において、酵素は基質を生成物１７、１８に変換する単一有能酵素であり得る。または多様な結合プロ酵素１９を使用可能である。ステップＪ乃至Ｌに多くの可能な表示オプションを示す。例えば、反応生成物１７の検出は、ヒドロゲル、例えば金ナノ粒子１０、１０ｂ、２１、２２を含有するｐＨ感受性ヒドロゲル、の色の変化によって表示可能である（ステップＪ）。他の表示オプションは、色変化（例えば銀還元）１１、２３、２４に依存してよい（ステップＫ）。別の実施形態では、可溶性分子、例えばＢＳＡ，のｐＨ感受性沈殿を視覚化１２、２５のために使用してよい（ステップＬ）。
【００８９】
本開示の好ましい実施形態において、デバイスは、任意のラテラルフローユニットである。デバイス全体は極めて低コスト、形態可能で、器具不要、且つ高感度である。デバイスは、明瞭な態様により特徴づけられる。一つは酵素が結合体に結合されていることであり、もう一つはインジケータが検出ゾーンにプリントされもしくは固定化されていることである。酵素反応由来の生成物は、インジケータと反応して、検出ゾーンにおいて視覚的相違を与える。
【００９０】
インジケータはｐＨ感受性でよく、インジケータのプロトン化状態が変化した場合、色もしくは蛍光を変化させる。実施形態の一つにおいて、ｐＨインジケータは担体メンブレン、例えば酢酸セルロース、と反応した。別の実施形態において、ｐＨインジケータはプロトン透過性プラスチックにカプセル化される（“Ｆｕｌｌ−ｒａｎｇｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐＨ  ｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ｃａｐｅｌ−Ｃｕｅｖａｓ，  Ｓ．，  Ｃｕｅｌｌａｒ，  Ｍ．Ｐ．，  ｄｅ  Ｏｒｂｅ−Ｐａｙａ，  Ｉ．，  Ｐｅｇａｌａｊａｒ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｃａｐｉｔａｎ−Ｖａｌｌｖｅｙ，  Ｌ．Ｆ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ６８１  （２０１０）  ７１−８１）。いずれの場合も、ｐＨインジケータのメンブレンへの堆積は、ラテラルフローデバイスにおいて結合体結合を妨げなかった。
【００９１】
好ましい実施形態において、インジケータは、ラインもしくはゾーンを形成するため結合体パッドの下流のメンブレンにプリントされもしくはスプレーされる。各ラインもしくはゾーンは、インジケータなしのメンブレンの緩衝領域により、インジケータの他のラインもしくはゾーンから分離されている。緩衝領域は、異なるライン／ゾーン間での交差反応を防止するために固定化バッファー成分の層をも含有可能である。
【００９２】
一実施形態において、ブロモチモールブルー２．１ｍｇ；  塩化トリドデシルメチルアンモニウム（ＴＤＭＡＣ）２．８ｍｇ；セバシン酸ジオクチル（ＤＯＳ）１９．６ｍｇ；エチレングリコール１９．６ｍｇ及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍｌを混合して、染料（ブロモチモールブルー）を調製する。エアブラシガンを使用して、インジケータ−ポリマー溶液をメンブレンにスプレー塗布した。エアブラシスプレーガンはＩｗａｔａにより製造されたＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃ  ＰＬＵＳ  Ａｉｒｂｒｕｓｈである。ラテラルフローストリップ上のコントロール／検査ラインの領域のみがポリマー／インジケータによりコートされた。スプレー後、ストリップ全体を使用前１６時間デシケータに放置した。
【００９３】
好ましい実施形態において、ｐＨインジケータはポリマー、例えばセルロース（ＵＳ４，０２９，５９７）、と共有結合可能であった。一実施形態において、ｐＨ感受性染料は、染料分子とセルロースの共有結合化学のためのヒドロキシスルホニル末端基により特別にデザインされる。ｐＨ感受性染料分子は、室温で硫酸で処理され、末端スルホエステル基を形成する。その後、硫酸中の染料溶液を脱イオン水で希釈し、水酸化ナトリウムで中和する。この段階で溶液に酢酸セルロースを添加する。５分後炭酸ナトリウムを、さらに５分後水酸化ナトリウムを溶液に添加する。強アルカリ性条件下スルホエステル基はビニルスルホン末端基を形成し、酢酸セルロースは加水分解して末端ヒドロキシル基を有するセルロースを形成する。同じアルカリ性条件下、染料分子上のビニルスルホン基はセルロースのヒドロキシル基と反応してｐＨインジケータ染料とセルロースとの間に共有結合を形成する。最終反応生成物を脱イオン水で洗浄する。ｐＨ感受性セルロースを溶媒に溶解し、１０重量％溶液を調製する。水溶液が好ましい。ラテラルフローデバイス上にｐＨインジケータ染料を固定化するため、インジケータ溶液をニトロセルロースメンブレンにスプレー塗布する。
【００９４】
カルボキシルエステラーゼのための好ましい基質溶液は、以下の組成を有する：
１０ｍＭヘキサン酸アリル
０．１ｍＭトリスｐＨ８．５
５％イソプロパノール。
【００９５】
基質はヘキサン酸アリルである。加水分解において、ヘキサン酸アリル一分子は、ヘキサン酸１個及び２−プロエノール１個を生成する。反応の開始ｐＨは、ｐＨ８．５の０．１ｍＭトリスにより規定される。基質溶液の緩衝能力は、５０マクロモル未満である。ｐＨ８．５の総合プロトンバランスは、プロトン余剰を生み出し、加水分解の結果としてｐＨ値は減少する。
【００９６】
加水分解の結果としてのｐＨ変化は、例えば上記のようなブロモチモールブルーのインジケータを青から黄色に変える原因となる。
【００９７】
好ましい実施形態において、デバイスは空気中の二酸化炭素（これは溶液ｐＨを次第にｐＨ６．５に動かす）から保護される。保護は、ラミネート化もしくはハウジングによりなされる。
【００９８】
好ましい担体は、直径約１０ｎｍ乃至約５００ｎｍを有するマイクロ粒子である。好ましくは、該粒子は直径約１０  ｎｍ乃至約１００ｎｍを有する。好ましい粒子はラテックスもしくは金による。粒子は、有能酵素が結合可能もしくは複合化可能な材料でコートされている。好ましいコーティングはストレプトアビジンである。好ましい粒子は、ストレプトアビジンコーティングを有する２０ｎｍ金粒子である。好ましい酵素はカルボキシルエステラーゼである。カルボキシルエステラーゼのための好ましい基質は、ｐＨ８の０．１ｍＭトリスバッファー中の酪酸フェネチル、及び５％イソプロパノール中０．１ｍＭトリスｐＨ８．５バッファー中１０ｍＭヘキサン酸アリルである。
【００９９】
好ましい粒子組成物は、以下のプロトコルによりストレプトアビジンでコートされた４０ｎｍＩｎｎｏｖａｃｏａｔ金粒子である。
１．ｐＨ７．４のリン酸バッファー中のストレプトアビジン０．２ｍｇ／ｍＬを調製。
２．Ｉｎｎｏｖａｃｏａｔ金キット(http://www.innovabiosciences.com/gold-conjugation-kits/innovacoat-gold.html)（２０ＯＤ４０ｎｍ）由来反応バッファー４２μＬを,
ストレプトアビジン１２μＬと混合。
３．混合部４５μＬをＩｎｎｏｖａｃｏａｔ金の一部に移す。
４．キット中のクエンチャー５μＬにより停止する前に、室温で１０分間インキュベート。
５．粒子を遠心沈殿し、上清を除去。
６．１００μＬＰＢＳバッファーで再浮遊させる。
７．ステップ５を繰り返す。
８．５０μＬＰＢＳに再浮遊させ、最終０．１％ＢＳＡ及び０．０１％（２０Ｋ  ＭＷ）ポリエチレングリコールに添加する。
９．ビオチニル化抗体（約１２μｇ／ｍＬ）１μＬ、ビオチニル化カルボキシルエステラーゼ（約７μｇ／ｍＬ）２μＬ、ストレプトアビジン変性Ｉｎｎｏｖａｃｏａｔ金２μＬを混合し、報告担体即ち結合体を形成。
【０１００】
本発明の具体的態様を記載及び説明したが、このような態様は本発明の説明についてのみ考慮されるべきであり、添付の請求項によって解釈されるような発明を限定するものとして考慮すべきではない。
【０１０１】
本明細書中に引用した出版物及び特許出願は、その全体を本願の参照として取り入れられる。
【０１０２】
上述の発明は理解を明瞭にする目的で図及び実施例によりいくらか詳しく説明したが、添付の請求項の精神もしくは範囲から逸脱しなければある変更及び修正を加えることができることは、本発明の開示に照らせば当業者には明らかであろう。
【図１】
0005903492.tif 000002
【図２】
0005903492.tif 000003
【図３】
0005903492.tif 000004
【図４Ａ】
0005903492.tif 000005
【図４Ｂ】
0005903492.tif 000006
【図４Ｃ】
0005903492.tif 000007
【図４Ｄ】
0005903492.tif 000008
【図４Ｅ】
0005903492.tif 000009
【図４Ｆ】
0005903492.tif 000010
【図４Ｇ】
0005903492.tif 000011
【図４Ｈ】
0005903492.tif 000012
【図５Ａ】
0005903492.tif 000013
【図５Ｂ】
0005903492.tif 000014
【図５Ｃ】
0005903492.tif 000015
【図５Ｄ】
0005903492.tif 000016
【図５Ｅ】
0005903492.tif 000017
【図５Ｆ】
0005903492.tif 000018
【図５Ｇ】
0005903492.tif 000019
【図５Ｈ】
0005903492.tif 000020
【図５Ｉ】
0005903492.tif 000021
【図５Ｊ】
0005903492.tif 000022
【図５Ｋ】
0005903492.tif 000023
【図５Ｌ】
0005903492.tif 000024
【図６Ａ】
0005903492.tif 000025
【図６Ｂ】
0005903492.tif 000026
【図６Ｃ】
0005903492.tif 000027
【図６Ｄ】
0005903492.tif 000028
【図６Ｅ】
0005903492.tif 000029
【図６Ｆ】
0005903492.tif 000030
【図６Ｇ】
0005903492.tif 000031
【図６Ｈ】
0005903492.tif 000032
【図７】
0005903492.tif 000033
【図８】
0005903492.tif 000034