(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものを含む農業用組成物：
農学的に許容される担体；および
以下の式（Ｉ）の抗菌性化合物、その塩、互変異性体、立体異性体、水和物または溶媒和物
【化１】
0005956439.tif 000010
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノースおよびＣ−β−Ｌ−ガラクトフラノース。）
【請求項２】
以下のものを含む、微生物感染の治療のための医薬組成物：
薬学的に許容される担体または希釈剤；および
以下の式（Ｉ）の抗菌性化合物、その塩、互変異性体、立体異性体、水和物または溶媒和物
【化２】
0005956439.tif 000011
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノースおよびＣ−β−Ｌ−ガラクトフラノース。）
【請求項３】
前記組成物が粉末形態である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の組成物を含む抗菌溶液。
【請求項５】
植物における微生物感染の治療のための組成物の製造における、以下の式（Ｉ）の化合物、その塩、互変異性体、立体異性体、水和物または溶媒和物の使用：
【化３】
0005956439.tif 000012
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノースおよびＣ−β−Ｌ−ガラクトフラノース。）
【請求項６】
前記微生物感染が真菌感染である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記植物が果実作物の植物または野菜作物の植物である、請求項５または請求項６に記載の使用。
【請求項８】
動物における微生物感染の治療のための薬剤の製造における、以下の式（Ｉ）の化合物、その塩、互変異性体、立体異性体、水和物または溶媒和物の使用：
【化４】
0005956439.tif 000013
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノースおよびＣ−β−Ｌ−ガラクトフラノース。）
【請求項９】
前記動物がヒトである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
以下のステップを含む、植物における微生物感染を防止するか、除去するか、または抑制する方法：
以下の式（Ｉ）の化合物、その農学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、水和物または溶媒和物を含む治療有効量の組成物を、前記植物に適用するステップ
【化５】
0005956439.tif 000014
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノースおよびＣ−β−Ｌ−ガラクトフラノース。）
【請求項１１】
前記微生物感染が、ボトリチス属またはレカニシリウムの感染である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
微生物感染を防止するか、治療するか、または寛解させる方法であって、かかる防止、治療もしくは寛解を必要としている対象に、請求項２に記載の組成物、または請求項２に記載の組成物を含む抗菌溶液を投与することを含み、ここで前記対象は非ヒト動物対象である、方法。
【請求項１３】
前記投与が、前記組成物の局所投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
対応出願の陳述
本出願は、ニュージーランド特許出願第５８７４９０号に関連して提出された仮明細書に基づいており、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、抗菌剤組成物に関する。特に、排他的ではないが、本発明は、天然の殺菌剤として使用するための糸状菌株Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ（同義語：Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）から単離された真菌の漏出物に関する。
【背景技術】
【０００３】
真菌は、成長している作物または収穫した作物、特に、果実作物または野菜作物に深刻な被害を引き起こし得る。殺菌剤は、動物における真菌感染症を治療するためにも使用される。
【０００４】
伝統的に、真菌増殖の主な制御法は、合成的に生産された殺菌剤化学物質の使用である。これらの合成殺菌剤は、ヒトおよび他の生物に高い毒性を有することが多い。このため、合成殺菌剤の使用は、それらの毒性の社会的関心のために、より制限されている。
【０００５】
合成化学物質に変わるものとして、生分解が改善されたために、収穫した作物の環境および消費者の両方に対して毒性が低下する可能性によって、天然の殺菌剤の使用はより魅力的になってきている。
【０００６】
Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ（同義語：Ｅ.ｎｉｇｒｕｍ）は、通常、老化した植物組織および土壌に関連づけられている腐生糸状菌である。この菌は、この菌が成長する培地に黄／オレンジ（ｐＨ依存性）の色を与える色素を含む高濃度の２次産物を産生する。オレバクタエン（ｏｒｅｖａｃｔａｅｎｅ）と名付けられているオレンジ色素は、Ｅ.ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓから単離され、その構造について記載されている（Ｓｈｕ,Ｙ.Ｚ.,ｅｔ ａｌ.,Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ,１９９７ ７（１７）：ｐ.２２９５−２２９８；図１参照)。オレバクタエンは、ＨＩＶ−１調節タンパク質とそのウイルスＲＮＡ結合部位の結合を阻害することが判明した。オレバクタエンは、カンジダ・アルビカンスに対して適度な抗真菌活性（ＭＩＣ２５０μｇ／ｍＬ）を有することが判明した。オレバクタエンの構造は、図１に示すものであると決定された。
【０００７】
いくつかの真菌代謝物も、２００６年の論文（Ｋｅｍａｍｉ Ｗａｎｇｕｎ,Ｈ.,Ｖ,２００６,フリードリヒ・シラー：イェーナ大学）に記載されるとおり、Ｅ.ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓから単離された。黄色油が単離され、オレバクタエンと同定された。
【０００８】
他のＥ.ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ株が分泌する他の生理活性化合物は、細菌および真菌に対する抗菌活性を示すフラビピン（ｆｌａｖｉｐｉｎ）（Ｂｒｏｗｎ ＡＥ.ｅｔ ａｌ.,Ｓｏｉｌ Ｂｏｉｌ.１９８７ Ｂｉｏｃｈｅｍ.１９：６５７−６６４およびＢｕｒｇｅ ＷＲ.ｅｔ ａｌ.,１９７６ Ｊ.Ａｇｒｉｃ.Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ.２４；５５５−５５９）、およびエピコカミド（ｅｐｉｃｏｃｃａｍｉｄｅｓ）（Ｗａｎｇｕｎ ＨＶＫ.ｅｔ ａｌ.,２００７ Ｊ.Ｎａｔ.Ｐｒｏｄ.７０：１８００−１８０３；Ｗｒｉｇｈｔ ＡＤ.ｅｔ ａｌ.,２００３ Ｏｒｇ.Ｂｉｏｍｏｌ.Ｃｈｅｍ.１：５０７−５１０）ならびに抗癌活性を有することが実証されているチオルニシン（ｔｈｉｏｒｎｉｃｉｎ）（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＣＢ.ｅｔ ａｌ.,１９８１ Ｂｉｏｃｈｅｍ.２０：２４３６−２４３８）を含むと特徴づけられている。
【０００９】
作物における真菌増殖の生物的防御としてＥ.ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ株の潜在的使用が報告されている（Ｂｈｕｉｙａｎ ＳＡ.ｅｔ ａｌ.,２００３ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈ.５２：６０−６７；Ｍａｒｉ Ｍ.ｅｔ ａｌ.,２００７ Ｊ.Ｓｃｉ.Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ.８７：１２７１−１２７７；Ｓｚａｎｄａｌａ ＥＳ ａｎｄ Ｂａｃｋｈｏｕｓｅ Ｄ ２００１ Ａｕｓｔ.Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈ.３０：１６５−１７０）、しかし、主として、環境条件下でのＥ.ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ株の十分でない増殖および活性が原因で、効果的な防御剤として実証されていない。
【発明の概要】
【００１０】
前述の問題に対処すること、または少なくとも有用な選択を公衆に提供することが本発明の目的である。
【００１１】
本明細書で引用する全ての特許または特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。全ての参考文献が先行技術を構成するとは認められない。参考文献の考察には、それらの著者が主張していることが記載されており、本出願者らは、引用する文書の正確さおよび適切性を疑う権利を確保する。多くの先行技術の公表文献を本明細書で参照するが、この参照は、これらの文書の全てが、当該技術分野、ニュージーランドまたは任意の他の国の中で一般的な知識の一部を形成すると承認するわけではないことがはっきりと理解されるであろう。
【００１２】
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎ）」などのその変化は、記載の要素、整数もしくはステップ、または記載の一群の要素、整数もしくはステップを包含するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または任意の他の一群の要素、整数もしくはステップを排除しないことを意味することが理解されるであろう。
【００１３】
本発明のさらなる態様および利点は、実施例のみによって与えられる以下の説明から明らかになるであろう。
【００１４】
発明の開示
本発明の別の態様によると、以下のものを含む農業用組成物を提供する：
農学的に許容される担体；および
以下の式（Ｉ）の抗菌性化合物、その塩、誘導体、互変異性体、立体異性体、水和物、溶媒和物または糖類似体。
【００１５】
【化１】
0005956439.tif 000002
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｌ−ガラクトフラノース、または関連するピラノース。）
【００１６】
本発明の別の態様によると、以下のものを含む医薬組成物を提供する：
薬学的に許容される担体もしくは希釈剤；および
以下の式（Ｉ）の抗菌性化合物、その塩、誘導体、互変異性体、立体異性体、水和物、溶媒和物、糖類似体、プロドラッグ。
【００１７】
【化２】
0005956439.tif 000003
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｌ−ガラクトフラノース、または関連するピラノース。）
【００１８】
好ましくは、この組成物は粉末形態である。
【００１９】
本発明の別の態様によると、植物またはその植物部分における微生物感染の治療のための組成物の製造における、以下の式（Ｉ）の化合物、その塩、誘導体、互変異性体、立体異性体、水和物、溶媒和物または糖類似体の使用を提供する：
【００２０】
【化３】
0005956439.tif 000004
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｌ−ガラクトフラノース、または関連するピラノース。）
【００２１】
好ましくは、この微生物感染は真菌感染である。
【００２２】
好ましくは、この植物部分は、果実作物の植物または野菜作物の植物である。
【００２３】
本発明の別の態様によると、動物またはその動物部分における微生物感染の治療のための薬剤の製造における、以下の式（Ｉ）の化合物、その塩、誘導体、互変異性体、立体異性体、水和物、溶媒和物、糖類似体またはプロドラッグの使用を提供する：
【００２４】
【化４】
0005956439.tif 000005
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｌ−ガラクトフラノース、または関連するピラノース。）
【００２５】
好ましくは、この動物はヒトである。
【００２６】
本発明の別の態様によると、以下のステップを含む、植物またはその植物部分における微生物感染を防止するか、除去するか、または抑制する方法を提供する：
以下の式（Ｉ）の化合物、その農学的に許容される塩、誘導体、互変異性体、立体異性体、水和物、溶媒和物または糖類似体を含む治療有効量の組成物を、植物もしくはその植物部分に適用するステップ。
【００２７】
【化５】
0005956439.tif 000006
（式中、Ｒは、以下のものからなる群から選択される：
Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｄ−ガラクトフラノース、Ｃ−β―Ｌ−ガラクトピラノース、Ｃ−α−Ｌ−ガラクトフラノース、Ｃ−β−Ｌ−ガラクトフラノース、または関連するピラノース。）
【００２８】
好ましくは、この方法は以下のステップも含む：
ボトリチス属またはレカニシリウムの増殖を防止するか、または抑制するために、治療有効量の組成物を、植物もしくはその植物部分に適用するステップ。
【００２９】
好ましくは、この植物部分は、果実または野菜である。
【００３０】
かかる防止、治療または寛解を必要とする対象に対して微生物感染を防止するか、治療するか、または寛解する方法。
【００３１】
好ましくは、この対象は、非ヒト動物対象である。
【００３２】
好ましくは、この投与は、この組成物の局所投与を含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、実施例のみによって、かつ添付の図を参照して与えられる以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】既知化合物オレバクタエンの化学構造である。
【図２Ａ】エピピロン（ｅｐｉｐｙｒｏｎｅ）Ａの形態の、本発明の有効成分の化学構造である。
【図２Ｂ】エピピロンＢおよびエピピロンＣの形態の、図１に示す構造と関連する化合物の化学構造である。
【図３Ａ】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した陰イオン質量スペクトルを示す。
【図３Ｂ】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した陽イオン質量スペクトルを示す。
【図４Ａ】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した陰イオンについての衝突誘起解離（ＣＩＤ）を示す。
【図４Ｂ】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した陽イオンについての衝突誘起解離（ＣＩＤ）を示す。
【図５Ａ】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した陽イオンフラグメンテーション経路を示す図である。
【図５Ｂ】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した陰イオンフラグメンテーション経路を示す図である。
【図６】図１に示す化合物の化学構造の解明に使用した、水酸基のアセチル化の反応スキームを示す図である。
【図７】図１に示す化合物の解明に使用した、水酸基のアセチル化の反応スキームを示す図である。
【図８】ＨＰＬＣ法１を用いる、Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ（同義語：Ｅ.ｎｉｇｒｕｍ株ＳＦ７４８９）培養物のエタノール抽出物のクロマトグラムおよびＵＶスペクトルスキャンを示すグラフである。
【図９】ＨＰＬＣ法２を用いる、図８の培養物のエタノール抽出物のクロマトグラムおよびＵＶスペクトルスキャンを示すグラフである。
【図１０】ＨＰＬＣ法１を用いる、図８の培養物の塩基抽出物のクロマトグラムおよびＵＶスペクトルスキャンを示すグラフである。
【図１１】ＨＰＬＣ法２を用いる、図８の培養物の塩基抽出物のクロマトグラムおよびＵＶスペクトルスキャンを示すグラフである。
【図１２】ＨＰＬＣ法１を用いる、図８の培養物の酸抽出物のクロマトグラムおよびＵＶスペクトルスキャンを示すグラフである。
【図１３】ＨＰＬＣ法２を用いる、図８の培養物の酸抽出物のクロマトグラムおよびＵＶスペクトルスキャンを示すグラフである。
【実施例】
【００３５】
発明を実施するための最良の形態
実験１：有効成分の抽出および同定
ダイオードアレイ検出を伴う高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を設定し、精製中の色素を監視した。同じＨＰＬＣ法を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）解析のために用いた。
【００３６】
４ＬのＥｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ培養物を調製した。この培養物を遠心し、水性上清から菌糸体を分離した。（図２に示すとおり）エピピロンＡの９０％がこの菌糸体に存在していることをＨＰＬＣ分析が示したので、この水性上清を廃棄した。菌糸体６００ｇを凍結乾燥し、褐色粉末５９ｇを得た。この褐色粉末をメタノールで数回抽出し、赤色油１１．６ｇを得た。この赤色油を０．１％ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）２００ｍＬに溶解し、酢酸エチル２００ｍＬで２回抽出し、中性化合物および塩基性化合物を除去した。エピピロンＡが酢酸エチル層に抽出されていないことを、全ての画分に対してＨＰＬＣで調べた。
【００３７】
水層を８５％リン酸でｐＨ３まで酸性化し、エピピロンＡを酢酸エチル２００ｍＬで抽出した。少量のエタノールを加え、２層の分離を促進させた。この酢酸エチルを回転蒸発により除去し、乾燥残留物の重量は１．６ｇであった。この残留物を、２５％ＮＨ4ＯＨ１００μＬを含む水４０ｍＬに溶解した。
【００３８】
Ｓｔｒａｔａ Ｘポリマー樹脂を充填したカラム１１０ｍｍ×３８ｍｍを、メタノール、続いて、（希釈Ｈ3ＰＯ4でｐＨ２．５に調整した）６０％アセトニトリルおよび３０％アセトニトリル（ｐＨ２．５）で平衡化した。エピピロンＡを含む抽出物４０ｍＬのうちの２ｍＬを、３０％アセトニトリル（ｐＨ２．５）１８ｍＬで希釈し、このカラムにロードした。このカラムを、以下のステップ勾配を用いて、真空により溶出した：
３０％アセトニトリル（ｐＨ２．５）２００ｍＬ
４０％アセトニトリル（ｐＨ２．５）２００ｍＬ
５０％アセトニトリル（ｐＨ２．５）５００ｍＬ
５５％アセトニトリル（ｐＨ２．５）７００ｍＬ。
【００３９】
オレンジ色のバンドが溶出し始めた時点で、画分を収集した。これは、５５％アセトニトリル（ｐＨ２．５）を用いた時に始まった。合計５つの画分を収集した。酢酸エチルを、この５つの画分のそれぞれに加え、オレンジ色の色素を酢酸エチル層に移動させた。ＨＰＬＣ分析により、エピピロンＡの７５％（約９．６ｍｇ）が最初の２つの画分に存在することが判明し、これらを合わせて、乾燥させた。
【００４０】
１ｇのＳｔｒａｔａ Ｓｉ−１ ＳＰＥカラムを、クロロホルム１０ｍＬで平衡化した。（約９．６ｍｇのエピピロンＡを含む）乾燥残留物を、５：９５メタノール／クロロホルム５ｍＬに溶解し、シリカカラムにロードした。このカラムを５：９５メタノール／クロロホルム、続いて、１０：９０メタノール／クロロホルムで溶出した。全部で９つの画分を収集し、ＨＰＬＣにより分析した。画分６および画分７を合わせ、Ｎ2ブローダウンで乾燥させた。この残留物を５０％メタノールに溶解し、１ｇのＳｔｒａｔａ×ＳＰＥカラムにロードした。このカラムを３：７メタノール／水２０ｍＬで洗浄し、シリカ微粒子を除去し、エピピロンＡをメタノール１５ｍＬで溶出した。このメタノールをＮ2ブローダウンにより除去し、残留物を、４８時間、フリードライヤーの高真空下に置き、残留溶媒を除去した。この残留物の重量は５．４ｍｇであった。
【００４１】
純度の評価
エピピロンＡの精製中のＨＰＬＣ分析により、（図２に示すとおり）少なくとも２つの密接に関連する化合物エピピロンＢおよびエピピロンＣの存在が明らかになった。さらなる分析により、これらの化合物が同じ分子量、ＵＶ吸光度および類似のＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを共有することが示された。精製の最終段階中に、エピピロンＡからのエピピロンＢおよびエピピロンＣの分離を達成したが、これらの化合物は相互に変換可能であることがすぐに見出された。出発組成（エピピロンＡ：エピピロンＢ＋エピピロンＣ）に関わらず、この混合物の最終組成は、エピピロンＡ７０％およびエピピロンＢ＋エピピロンＣ３０％となった。この相互変換は酸性触媒によるものと思われた。エピピロンＢおよびエピピロンＣは、Ｅ.ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ培養物中にも存在するので、精製プロセスの人為産物ではない。
【００４２】
ダイオードアレイを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣＤＡＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって、エピピロンＡ、エピピロンＢおよびエピピロンＣの混合物は、約１００：２５：７の比であり、９５％を超える純度であることが判明した。
【００４３】
化合物エピピロンＢおよびエピピロンＣは、α−フラノシド異性体およびβ−フラノシド異性体である。
【００４４】
実験２：有効成分の抽出および同定
エタノール抽出
Ｅｐｉｃｃｏｃｕｍ ｎｉｇｒｕｍ株ＳＦ７４８９の培養物を、１０分間、３０００ｇで遠心し、液体ブロスから菌糸体を分離した。菌糸体（１２００ｇ）を、手で持って操作するブレンダーを用いて均質化することによって、エタノールを合計１．２Ｌ用いて２回抽出した。固体を遠心により除去し、エタノール上清を保持した。もともと菌糸体から分離した液体ブロスと菌糸体エタノール抽出物の両方をＨＰＬＣにより分析し、比較のために下記のような２つの異なるＨＰＬＣ法１およびＨＰＬＣ法２を用いて、黄色色素の濃度を特定し、測定した（結果を、それぞれ図８および図９に示した）。
【００４５】
黄色色素の約１５％は液体培養ブロス中に存在した。この液体ブロスをエタノール抽出物と合わせ、抽出物３．６Ｌを得た。この試料の１０倍希釈物をＨＰＬＣ分析のために調製した。エタノール抽出物を、２つの等しい部分に分割した。１つの部分には方法１を用いて、もう１つの部分には方法２を用いて抽出し、定量化した。
【００４６】
ＨＰＬＣ法１：
移動相Ａ−０．１％酢酸；移動相Ｂ−アセトニトリル；カラム−Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｃ８ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２．７μｍ ５０×２．１ｍｍ；流速−０．５ｍＬ／分；注入量−１μＬ；カラムオーブン−１５℃；勾配−５分間にわたり３０％Ｂ〜７０％Ｂ、次いで、１分かけて３０％まで戻し、２分間、再平衡化した；検出器−４３７ｎＭにおけるフォトダイオードアレイスキャン２５０ｎＭ〜５００ｎＭ抽出クロマトグラム。
【００４７】
方法１において、純粋なエピピロンから確立された減衰係数を用いて、様々な試料中の化合物の濃度を定量化した。
【００４８】
ＨＰＬＣ法２：
移動相Ａ−水中ＮＨ4ＯＨ  ｐＨ１０；移動相Ｂ−１：４イソプロパノール／メタノール；カラム−Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ５μｍ １５０×２ｍｍ；流速−０．２ｍＬ／分；注入量−１μＬ；カラムオーブン−１５℃；勾配−１２分間にわたり２５％Ｂ〜１００％Ｂ、１分間保持し、次いで、２分かけて初期条件に戻し、５分間、再平衡化した；検出器−４２８ｎＭにおけるフォトダイオードアレイスキャン１９０ｎＭ〜５００ｎＭ抽出クロマトグラム。
【００４９】
本出願者らは、方法２についての減衰係数を有していなかったので、単に、相対ピーク面積を調べた。
【００５０】
酸抽出
抽出物の体積を、回転蒸発により０．８Ｌまで減少させた。次いで、これを、リン酸を用いてｐＨ２．５まで酸性化した。プロトン化化合物は水溶性ではないので、酸の添加により、色素が沈殿した。次いで、酸性溶液を、１０分間、３０００ｇで遠心した。上清をＨＰＬＣ法１（結果を図１０に示した）およびＨＰＬＣ法２（結果を図１０に示した）により試験し、この色素を約１０ｍｇ含むことが判明した。固体を、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液８０ｍＬに再び溶解した。ＨＰＬＣ分析のために、この試料の２００倍希釈物を調製した。この試料の残りを−２０℃で保存した。
【００５１】
塩基抽出
抽出物のもう一方の部分のｐＨを、ＮＨ4ＯＨでｐＨ１０に調整し、回転蒸発により蒸発乾固した。この試料を、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液８０ｍＬに溶解した。ＨＰＬＣ分析のために、この試料の２００倍希釈物を調製した（ＨＰＬＣ法１の結果を図１２に示し、ＨＰＬＣ法２の結果を図１３に示した）。この試料の残りを−２０℃で保存した。
【００５２】
培養固体の乾燥重量
エタノール抽出した菌糸体を室温で一晩乾燥させ、次いで、さらに１００℃で３時間、オーブン中で乾燥させ、残留溶媒を除去した。乾燥させた菌糸体の重量は１６ｇであった。回転蒸発後に、塩基抽出からのエタノール抽出物の重量を量ると、この抽出物は１３ｇであった。この抽出物は、全抽出物のわずか半分であったため、ブロス＋エタノール抽出物中の固体の総重量は２６ｇであった。培養物２．５Ｌからの固体の総重量は４２ｇであったので、培養液１Ｌあたり固体は１６．８ｇということになる。培養物２．５Ｌから抽出したエピピロンもしくはエピコカン（ｅｐｉｃｏｃｃａｎｅ）またはオレバクタエンと呼ばれる純粋な黄色色素の総重量は、２５０ｍｇであった。これは１００ｍｇ／Ｌに相当し、これは、前回の抽出の収量と一致する。
【００５３】
このことは、エピピロンのおおよその濃度が、液体培養物中０．０１％であるか、乾燥重量の０．６％であることを意味する。
【００５４】
結論
両方のＨＰＬＣ法による分析により、元のエタノール抽出物中の黄色色素ならびに酸性および塩基性の両方の試料抽出物中の黄色色素は、同一のクロマトグラフィー特性およびスペクトル特性を共有することが判明した。両方の抽出により、この色素は同じ量が得られた（１２０ｍｇおよび１３０ｍｇ）。したがって、本出願者らは、両方の方法から同じ化合物および同じ量の化合物が得られたので、抽出法は重要ではないと結論づける。
【００５５】
この結果は、ニンジン中の類似色素であるβカロチンの濃度と類似する。新鮮なニンジン中のβカロチンの濃度は、約０．０００８％であり、乾燥重量の０．１％である。βカロチンの濃度の情報源は、ウィキペディアｈｔｔｐ：／／ｅｎ.ｗｉｋｉｐｅｄｉａ.ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃａｒｒｏｔｓであり、ニンジンの水分含量の情報源は、ケンタッキー大学ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃａ.ｕｋｙ.ｅｄｕ／ｅｎｒｉ／ｐｕｂｓ／ｅｎｒｉ１２９.ｐｄｆであった。
【００５６】
有効成分の構造の解明
ＮＭＲ分光法
ＮＭＲ分析のために、上記の記載の精製試料をＣＤ3ＯＤに溶解した。
【００５７】
３，５，７，９，１１，１３−テトラデカヘキサエン酸,２−（２，４−ジメチルヘキシリデン）−１４−（３−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−６−イル）−４−メチル（エピピロンＡ）、３,５,７,９，１１，１３−テトラデカヘキサエン酸,２−（２，４−ジメチルヘキシリデン）−１４−（３−α−Ｄ−ガラクトフラノシル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−６−イル）−４−メチル（エピピロンＢ）および３,５,７，９，１１，１３−テトラデカヘキサエン酸,２−（２，４−ジメチルヘキシリデン）−１４−（３−β−Ｄ−ガラクトフラノシル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−６−イル）−４−メチル（エピピロンＣ）の構造を、１Ｈおよび１３Ｃのｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ（分極移動による無歪み増強）（１３５ＤＥＰＴ）、異核種単一量子コヒーレンス法（ＨＳＱＣ）、異核多結合相関（ＨＭＢＣ）、相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、回転座標系オーバーハウザー効果分光法（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＲＯＥＳＹ）、核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）、選択的全相関分光法（ＳＥＬＴＯＣＳＹ）および選択的回転座標系オーバーハウザー効果分光法（ＳＥＬＲＯＥＳＹ）実験を用いて解明した。ＮＭＲデータを、以下の表１に示す。
【００５８】
【表１】
0005956439.tif 000007
【００５９】
エピピロンＡについてのＣＤ3ＯＤ中の化学シフトは、ＤＭＳＯ−ｄ６中のオレバクタエンについて、Ｓｈｕらによって記載されているものと類似した。１Ｈ化学シフトのいくつかは、顕著に異なっていた。これは、分析で用いた溶媒によって説明される（ＣＤ3ＯＤ対ＤＭＳＯ−ｄ６）。
【００６０】
ＨＭＢＣスペクトルは、Ｈ１’とＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ２’、Ｃ３’およびＣ５’との間の結合性を示す。Ｈ１’とＣ５’との間の相関関係は、２つの原子が２〜３結合の長さの範囲内にあることを示す。Ｃ１’〜Ｃ６’の化学シフトは、それぞれの炭素の単一の酸素結合と一致しているので、Ｃ１’およびＣ５’は、エーテル結合によって結合している可能性が高い。これらの観察により、ピラノシド残基が、Ｏ−ピラノシド結合よりもむしろＣ−ピラノシド結合により、ピロン環上のＣ２に結合していることが示された。
【００６１】
９〜１０Ｈｚのオーダーの大きなＨ１’−Ｈ２’およびＨ２’−Ｈ３’結合定数は、提唱するピラノシド構造と一致する。１Ｄ−選択的ＲＯＥＳＹ実験は、Ｈ１’とＨ３’との間、Ｈ１’とＨ５’との間、およびＨ３’とＨ５’との間の相関関係を示す。異なる混合時間による１Ｄ−ＳＥＬＴＯＣＳＹ実験を用いて、Ｈ１’〜Ｈ６’までの化学シフトおよび相関経路を確認した。これらの実験を組み合わせることにより、ピラノース環が好ましいいす型配座にあり、４’−ＯＨは軸配向されることが示されたが、Ｈ１’−Ｈ２’結合（Ｊ＝９．７Ｈｚ）は、Ｃ−ピラノース単位がピロンにβ結合していることを示す。これらの発見により、エピピロンＡの構造がβ−Ｃ−Ｄ−ガラクトピラノシドと同定された。
【００６２】
同じ試料中に存在する２つのマイナーな異性体エピピロンＢおよびエピピロンＣにも、構造を割り当てることができた。ＨＭＢＣ相関およびＲＯＥＳＹ相関に基づいて、それらは、ピラノシド化合物エピピロンＡよりもむしろＣ−Ｄ−ガラクトフラノシドのα−アノマーおよびβ−アノマーであることが判明した（表２参照）。
【００６３】
【表２】
0005956439.tif 000008
【００６４】
質量分析
負のイオンモードにおいて、ＣＯ２のわずかな損失（４４ａｍｕ）ｍ／ｚ５６７．３ピークと共に、強い[Ｍ−Ｈ]−ｍ／ｚ６１１．３分子イオンが観察された（図３Ａ）。陽イオンモードにおいて、[Ｍ＋Ｈ]＋ｍ／ｚ６１３．３および［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ６３５．３は、観察される主たる分子イオンであった（図３Ｂ）。
【００６５】
負のイオンモードの衝突誘起解離（ＣＩＤ）実験は、顕著なフラグメントｍ／ｚ４０３、４４７、４９１および５２１を明らかにし（図４Ａ）、陽イオンモードにおいては、一連の水損失およびｍ／ｚ５６９、５４５、５３９、５１５および４８５を明らかにした（図４Ｂ）。陽イオンおよび陰イオンの両方のモードにおける、提唱するエピピロンＡのフラグメンテーション経路を図５に示す。提唱するフラグメンテーション経路は、ピロン環が未変化であり、提唱するエピピロンＡの構造と一致することを示す。
【００６６】
マイクロスケールの反応化学
アセチル化実験
化合物エピピロンＡのサブ試料を、乾燥ジクロロメタン９００μＬ、無水酢酸５０μＬおよびピリジン５０μＬの混合物に溶解した。この反応を、ＬＣ−ＭＳ陽イオンスキャニングによって監視した。この試料の分析は、２〜５つの酢酸塩の添加によりアセチル化化合物の混合物を示し、少なくとも５つの水酸基の存在を示した。これは、提唱するエピピロンＡの構造と一致する（図５）。
【００６７】
メチル化実験
化合物エピピロンＡのサブ試料を、ＭｅＯＨ２００μＬ＋Ｈ2ＳＯ4５μＬに溶解した。この反応を、ＬＣ−ＭＳ陽イオンスキャニングによって監視した。室温でのエステル化は遅いので、この試料を２時間、５０℃まで加熱し、単一のメチルエステルへの６０％変換をもたらした。これは、１つのカルボキシル基が存在することを示し、提唱するエピピロンＡの構造と一致する（図６）。
【００６８】
本明細書の目的のために、化合物エピピロンＡ  ４−ヒドロキシ−６−（１１’,１５’,１７’−トリメチル−１３’−カルボキシ−ノナデカ−１’，３’，５’,７’，９’,１１’,１３’−ヘプテン）−２−ピロン−１−Ｃ−ガラクトピラノシドの構造のより好ましい実施形態を、エピピロンＡと呼んだ。
【００６９】
生物活性の実証：Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｎｉｇｒｕｍ抽出物の負荷試験
材料
Ｅｐｉｃｃｏｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ（同義語：ｎｉｇｒｕｍ株ＳＦ７４８９）の試料を、エタノール１Ｌで培養物１Ｌを抽出することにより調製し、次いで、固体を濾過により除去し、液体を回転蒸発により除去した。残留物を水２５ｍＬに再懸濁した。サブ試料を希釈し、ＨＰＬＣにより分析し、エピピロンの濃度を測定した。このエピピロン濃度は、３．４ｍｇ／ｍＬであった。
【００７０】
溶液２５ｍＬを５バイアルに分注し、凍結させた。
【００７１】
方法
灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）株ＩＣＭＰ１６２２１を、ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）上で増殖させ、胞子を得た。
【００７２】
レカニシリウム・マスカリウム（Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｓｃａｒｉｕｍ）Ｋ４Ｖ１をＳＡ（サブロー寒天）上で増殖させ、胞子を得た。エピピロンを、以下の濃度で、滅菌試験管内の灰色カビ病菌およびレカニシリウム・マスカリウムの胞子溶液２ｍＬに導入し、次いで、２６℃で４８時間インキュベートした。次いで、胞子発芽の徴候について、溶液を顕微鏡で調べた。
【００７３】
１．対照：エピピロンを含まない胞子溶液；
２．正味：希釈していない抽出濃度のエピピロン（３．４ｍｇ／ｍＬ＝３４００ｍｇ／Ｌ）を混合した胞子溶液；
３．エピピロン濃度を１０００ｍｇ／Ｌまで希釈した胞子溶液；
４．エピピロン濃度を５００ｍｇ／Ｌまで希釈した胞子溶液；
５．エピピロン濃度を２５０ｍｇ／Ｌまで希釈した胞子溶液；および
６．エピピロン濃度を１２５ｍｇ／Ｌまで希釈した胞子溶液；
【００７４】
結果
６つの試験管のそれぞれの中の胞子増殖の程度を以下の表に示す。
【００７５】
【表３】
0005956439.tif 000009
【００７６】
結論
胞子増殖の阻害は、２５０ｍｇ／Ｌを超えるエピピロン濃度で実証された。
【００７７】
実施例のみによって本発明の態様を記載してきたが、添付の特許請求の範囲で定義されるとおり、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明に変更および追加を行うことができることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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