(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンとして有用な多糖及び無毒化大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）の共有結合体であって、
可溶型であり、
前記ＬＴが、野生型ＬＴＡのアミノ酸配列の６１位に対応する位置にリシン置換を有するＬＴＳ６１Ｋホロ毒素であり、３次構造を維持している、共有結合体。
【請求項２】
感染性細菌の影響に対して防御又は免疫感作するための、請求項１に記載の共有結合体。
【請求項３】
感染性細菌がインフルエンザ菌又は肺炎連鎖球菌である、請求項２に記載の共有結合体。
【請求項４】
多糖がポリリボシルリビトールリン酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の共有結合体。
【請求項５】
精製された請求項１〜４のいずれか一項に記載の共有結合体を含む、哺乳動物に投与するためのワクチン。
【請求項６】
感染性細菌の影響から哺乳動物を防御又は免疫感作するための医薬の製造における精製された請求項１〜４のいずれか一項に記載の共有結合体の使用。
【請求項７】
（ａ）多糖を過ヨウ素酸塩によって酸化する工程と、
（ｂ）得られた多糖を還元アミノ化によってＬＴに結合させる工程と、
（ｃ）得られた共有結合体を単離する工程と、
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の共有結合体を調製する方法。
【請求項８】
前記多糖がポリリボシルリビトールリン酸であり、ポリリボシルリビトールリン酸：ＬＴのモル比の範囲が３：１〜６０：１の間である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
旅行者下痢の影響から哺乳動物を防御又は免疫感作するための医薬の製造における精製された請求項１〜４のいずれか一項に記載の共有結合体の使用。
【請求項１０】
腸管毒素原性大腸菌由来の下痢の影響から哺乳動物を防御又は免疫感作するための医薬の製造における精製された請求項１〜４のいずれか一項に記載の共有結合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
[0002]多糖ワクチンは、担体タンパク質なしで調製される場合、免疫記憶応答が欠如する。現在知られている結合ワクチンには、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃ群、及び肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ｆ、２３Ｆなどの細菌莢膜多糖が含まれる。これらのワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７（変異体無毒性ジフテリア毒素）、又は髄膜炎菌外膜タンパク質などの担体タンパク質に共有結合させる。これらの多糖結合体ワクチン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）は、特に２歳未満の乳幼児においてＴ細胞依存性応答を誘導し得、長期の免疫記憶を刺激し、高親和性抗体を産生し得、鼻咽頭コロニー形成及び感染の割合を低下させ得る。
【０００２】
しかし、現在市販されている細菌多糖結合体ワクチンの大多数は、担体タンパク質として破傷風トキソイド（ＴＴ）又はジフテリアトキソイド（ＤＴ）を適用した。これら２つのトキソイドタンパク質、ＴＴ及びＤＴは、乳幼児／小児用の通常のワクチンであり、短期間でのＴＴ及びＤＴの高頻度ワクチン接種は、免疫原性及び安全性に影響を与える可能性がある。（「乳幼児に同時に投与される、共通のタンパク質エピトープを共有する複数のワクチンに対する反応の低下（Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｓｈａｒｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｔｏ  ｉｎｆａｎｔｓ）」  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  １９９８年；  ６６（５）：  ２０９３〜８頁；「乳幼児における肺炎球菌−髄膜炎菌混合ワクチンの免疫原性及び安全性：無作為化対照試験（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ）」  ＪＡＭＡ  ２００５年；  ２９３（１４）：  １７５１〜８頁）。したがって、本発明は、結合体ワクチンで使用するための新たなタイプの担体タンパク質ＬＴＳ６１Ｋを提供する。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]本発明は、インフルエンザ菌及び肺炎連鎖球菌などの感染性細菌の影響に対して防御又は免疫感作し、腸管毒素原性大腸菌によって引き起こされる旅行者下痢を軽減するワクチンとして有用な無毒化大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）との多糖結合（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を含む。
【０００４】
[0004]本発明の１つの態様は、精製型で単離される共有結合させた多糖−ＬＴＳ６１Ｋワクチンに関する。これらの結合生成物は、哺乳動物において予想外に優れた免疫原性特性及び殺菌特性を有する。別の態様は、インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）からの防御を必要としている哺乳動物に、結合させた多糖−ＬＴＳ６１Ｋワクチンの有効量を投与する方法に関する。本発明のワクチンは、ヘルパーＴ細胞応答を刺激し、再曝露すると強いブースター応答を示し、高い抗体力価を有する。
【０００５】
[0005]本発明のさらに別の態様は、結合させた多糖−ＬＴＳ６１Ｋを還元アミノ化により生成し、精製結合生成物を単離する方法に関する。本発明に従って、本発明のワクチンを作製するために多糖及びＬＴＳ６１Ｋを結合させる好ましい方法は、天然ＰＳの過ヨウ素酸酸化と、それに続く還元アミノ化であることが発見された。
【０００６】
[0006]本発明の結合体に使用されるＬＴＳ６１Ｋは、２００７年８月１３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５８０１；２００７年７月１８日に出願された米国特許出願第ＵＳ１１／７７９４１９号、２００８年５月１５日に出願されたＵＳ１２／１２０，９５３号、及び２０１０年３月２３日に出願されたＵＳ１２／７２９，６４９号；並びに２００６年１０月２７日に出願され、２００９年１月に発行された台湾特許出願第９５１３９７０７号に記載されている。これらの各出願に記載されている主題は、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】[0007]  ＬＴ担体タンパク質の一般的描写を示す図である。
【図２】[0008]  Ｈｉｂ  ＰＲＰサッカライドの構造表示を示す図である。
【図３】[0009]  いくつかの結合方法を示す図である。
【図４】[0010]  本発明による還元アミノ化方法を示す図である。
【図５】[0011]  還元アミノ化によるＰＲＰ及びＬＴＳ６１Ｋ結合を描く図である。
【図６】[0012]  ＮａＩＯ４処理後の酸化ＰＲＰのＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ溶出プロファイルを示す図である。
【図７】[0013]  酸化ＰＲＰのＮＭＲスペクトルを示す図である。これは、過ヨウ素酸酸化後のＰＲＰでのアルデヒド基の形成を裏付けている。
【図８】[0014]  ＬＴＳ６１Ｋ試料とＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合試料の間に２次構造の違いがないことを裏付けるＦａｒ−ＵＶ  ＣＤスペクトル、及び同様にＬＴＳ６１Ｋ試料とＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合試料の間にλ最大３次構造の違いがないことを裏付ける蛍光スペクトルを示す図である。
【図９】[0015]  ＬＴＳ６１ＫへのＰＲＰの結合の成功及び共有結合の形成を確認するアミノ酸分析を示す図である。
【図１０】[0016]  ＰＲＰとＬＴＳ６１Ｋの間の共有結合を確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロッティング分析を示す図である。
【図１１】[0017]  ＩＥＦ  ＰＡＧＥにより分析された精製ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体を示す図である。
【図１２】[0018]  ＰＲＰとＬＴＳ６１Ｋの間の共有結合を確認するためのＩＥＦウェスタンブロッティングを示す図である。
【図１３】[0019]  ＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＵＶ−ＭＡＬＬＳ−ＲＩを介した精製結合体ワクチンの純度を確認する図である。
【図１４】[0020]  精製結合体ワクチンの純度を確認するためのＩＥＦ  ＰＡＧＥにより分析された精製ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体を示す図である。
【図１５】[0021]  本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のラット免疫原性試験をまとめた図である。
【図１６】[0022]  本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のウサギ免疫原性試験をまとめた図である。
【図１７】[0023]  本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のウサギ免疫原性試験の結果、ウサギ血清殺菌力価アッセイ及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ力価の結果を図示する図である。
【図１８】[0024]  ウサギ免疫原性試験についての追加情報を図示する図である。
【図１９】[0025]  本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のウサギ免疫原性試験の結果、ウサギ血清殺菌力価（ＢＡ）及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ力価（ＯＤ）の結果を図示する図である。
【図２０】[0026]  抗ＰＲＰ及び抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体反応試験の追加のウサギ免疫原性ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２１】[0027]  追加のウサギ血清殺菌アッセイ及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂの結果を示す図である。
【図２２】[0028]  ４回目の免疫感作後の、追加のウサギ血清殺菌アッセイ及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂの結果を示す図である。
【図２３】[0029]  肺炎球菌ＰＳ血清型１４−ＬＴＳ６１Ｋ結合体についてのマウスにおける免疫原性を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
[0030]本発明者らは、このたび、本発明に従って作製された結合させた多糖−ＬＴＳ６１Ｋワクチンが、驚くべきことに、多糖又はＬＴＳ６１Ｋと混合された多糖よりも血清中で高い多糖特異的ＩｇＧ抗体力価及び大きい殺菌活性を誘導することを発見した。
【０００９】
[0031]本明細書で使用される略語のリストは次の通りである。
ＣＦＵ：コロニー形成単位
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
Ｈｉｂ：インフルエンザ菌ｂ型
ＩＥＦ：等電点電気泳動
ＬＴ：易熱性エンテロトキシン
ＭＡＬＬＳ：多角度レーザー光散乱
ＯＤ：光学密度
ＰＮＰＳ：肺炎球菌多糖
ＰＲＰ：ポリリボシルリビトールリン酸
ＰＳ：多糖
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法
ＳＥＣ＿ＨＰＬＣ：サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー
ＲＩ：反射率（ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）
【００１０】
[0032]本発明の結合体において使用される新たな担体タンパク質は、無毒化組換え大腸菌易熱性エンテロトキシン変異体、ＬＴ、より具体的にはＬＴＳ６１Ｋである。ＬＴ変異体では、Ａ及びＢサブユニットは典型的なＡＢ５ホロ毒素構造を形成する。無毒化ＬＴ変異体（ＬＴＳ６１Ｋ）は、アミノ酸６１位にＫを含む変異成熟サブユニットＡ（ＬＴＡ）及び野生型成熟サブユニットＢ（ＬＴＢ）を含有する。ＬＴＳ６１Ｋは、生成物を野生型ＬＴより著しく低い毒性にする。担体タンパク質は、図面の図１に描かれている。
【００１１】
[0033]本発明のための開始材料の１つとして選択されたＬＴＳ６１Ｋの発明は、変異ＬＴＡを含有するＬＴは野生型対応物と比較して減少した毒性を示す一方で、免疫原性を保持するという予想外の発見に基づく。この変異ＬＴＡは、野生型ＬＴＡの６１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する。野生型ＬＴＡのアミノ酸配列、配列番号５は、本明細書に参照により組み込まれている引用された特許出願に示されている。したがって、ＬＴＳ６１Ｋは、配列番号５の６１位に対応する位置に、Ｓ、Ｔ、及びＦ以外のアミノ酸残基を含有する変異ＬＴＡを含む単離されたポリペプチドを特徴とする。置換アミノ酸残基は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、又はＷであってもよい。置換アミノ酸残基は、天然発生アミノ酸、又は非天然発生アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸若しくはβ−アミノ酸であってもよい。一例では、ＬＴＡは、配列番号２、４、８、又は１０のアミノ酸配列を有する。この変異ＬＴＡを含有するＬＴは、減少した毒性、すなわち、本明細書に組み込まれている、上記に特定された特許出願において配列番号５を含有する野生型ＬＴの＜１０−５倍の毒性を示す。
【００１２】
[0034]本発明に従って、インフルエンザ菌Ｂ型が培養され、この莢膜多糖抗原、ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）が精製された。ＰＲＰは線状であり、負電荷を有し、親水性である。分子量３４５及び分子式１０Ｃ，１８Ｈ，１１Ｏ，１Ｐを有するＨｉｂ  ＰＲＰサッカライドは、図面の図２に描かれている。
【００１３】
[0035]ＰＲＰは、結合体ワクチンを生成する、多糖ＰＲＰ対タンパク質（ＬＴＳ６１Ｋ）の適切なモル比を使用して、化学的還元アミノ化反応によりＬＴＳ６１Ｋに結合させる。ＰＲＰ：ＬＴＳ６１Ｋのモル比の範囲は、下の表１に示されている。好ましくは、ＰＲＰ：ＬＴＳ６１Ｋのモル比の範囲は約３：１〜約６０：１の間であり、モル／モルＩＯ４−／ＰＲＰは約０．１〜約０．４の間である。
【００１４】
【表１】
0005967585.tif 000002
【００１５】
[0036]さらに本発明に従って、インフルエンザ菌ｂ型及び肺炎連鎖球菌由来のさまざまな種々のタイプの細菌莢膜多糖抗原を、還元アミノ化反応によりＬＴＳ６１Ｋタンパク質と化学的に結合させる。上の表１に示されているようなＮａＩＯ４：ＰＲＰのさまざまな種々のモル比が、多糖を酸化して種々の反復単位を有する短い長さの多糖を生成するのに使用された。適切なモル比の多糖をＬＴＳ６１Ｋと反応させた後、結合及び精製に成功した多糖−ＬＴＳ６１Ｋ結合体生成物が得られた。生成物は可溶型であり、多糖抗原及びＬＴＳ６１Ｋ担体タンパク質の成功した化学結合を同定するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、オルシノール、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＩＥＦ、ＧＭ１結合活性、円二色性、及び蛍光アッセイにより物理的及び化学的に評価された。
【００１６】
多糖をＬＴＳ６１Ｋと結合させる手順の例：
[0037]さまざまな可能性のある結合プロセスが、図面の図３に図示されている。本発明に従って選択された還元アミノ化プロセスの一般化されたフローチャートは、Ｇｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．  １９８９年、６：４８９頁に見出され、図面の図４として再現されている。
【００１７】
[0038]本発明に従って、多糖は過ヨウ素酸酸化により、より小さい断片に切断してアルデヒド末端基を生成する。その後、ＬＴＳ６１Ｋタンパク質への酸化多糖の結合を、還元アミノ化により行う。より具体的には、該プロセスの例は次の通りである。
【００１８】
[0039]Ａ．多糖活性化（過ヨウ素酸酸化）：５ｍｇ／ｍＬの量の、インフルエンザ菌ｂ型の精製莢膜多糖である天然ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）を、過ヨウ素酸（ＩＯ４−）０．３又は０．６又は１．２ｍｇ／ｍＬと混合する（ＩＯ４−対ＰＲＰのモル比（ｍ／ｍ）＝０．１、０．２、０．４）。この混合物を、４℃、暗所で２４時間放置した。次いでグリセロールを添加して反応を終了させた。得られた酸化ＰＲＰは、不純物を除去するため３．５Ｋ膜を用いてｄｄＨ２Ｏに対して透析を受けた。得られた生成物は、０．２２μｍフィルターで滅菌濾過した。過ヨウ素酸酸化手順は、種々の鎖長への多糖ＰＲＰの断片化をもたらした。ＰＲＰの反復単位の平均数の範囲は、約４０〜１０であった。
【００１９】
[0040]Ｂ．多糖−ＬＴＳ６１Ｋ結合：ＰＲＰ及びＬＴＳ６１Ｋ結合体の調製、上記から得られた酸化ＰＲＰの混合物、（以前に取得／出願された特許に開示された）精製ＬＴＳ６１Ｋ、及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ、反応は暗所で４℃、２週間行われた。水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ４を添加してＰＲＰの未反応アルデヒドをクエンチすることにより反応を終了させ、調製物を次いで１０Ｋ膜を用いてｄｄＨ２Ｏに対して透析した。
【００２０】
[0041]Ｃ．多糖結合ＬＴＳ６１Ｋ生成物の特徴付け：適切なモル比の多糖をＬＴＳ６１Ｋと反応させた後、結合及び精製に成功した多糖−ＬＴＳ６１Ｋ結合体生成物が得られた。可溶型を有する生成物を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、オルシノール、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＩＥＦ、ＧＭ１結合活性、円二色性、及び蛍光アッセイにより物理的、化学的、及び生物学的に評価して、多糖抗原及びＬＴＳ６１Ｋ担体タンパク質の化学結合の成功、多糖対ＬＴＳ６１Ｋタンパク質の比、並びにこの免疫原性を確認した。図面の図５は、本発明の特定の例示に従って使用された反応条件及びアッセイをまとめている。
【００２１】
[0042]結合体及びワクチンの構造及び純度の確認に関する図面の図についてこれより言及する。
【００２２】
[0043]図６は、ＮａＩＯ４処理後の酸化ＰＲＰのＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ溶出プロファイルを示す。本図は、本発明のプロセスを図示し、結果は容易に再現可能である。
【００２３】
[0044]図７は、酸化ＰＲＰのＮＭＲスペクトルである。これは、過ヨウ素酸酸化後のＰＲＰでのアルデヒド基の形成を裏付けている。
【００２４】
[0045]図８は、ＬＴＳ６１Ｋ試料とＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合試料の間に２次構造の違いがないことを裏付けるＦａｒ−ＵＶ  ＣＤスペクトル、及び同様にＬＴＳ６１Ｋ試料とＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合試料の間にλ最大３次構造の違いがないことを裏付ける蛍光スペクトルを示す。
【００２５】
[0046]図９は、ＬＴＳ６１ＫへのＰＲＰの結合の成功及び共有結合の形成を確認するアミノ酸分析を示す。
【００２６】
[0047]図１０は、ＰＲＰとＬＴＳ６１Ｋの間の共有結合を確認するためのＳＤＳ  ＰＡＧＥウェスタンブロッティング分析を示す。
【００２７】
[0048]図１１は、ＩＥＦ  ＰＡＧＥにより分析された精製ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体を示す。
【００２８】
[0049]図１２は、ＰＲＰとＬＴＳ６１Ｋの間の共有結合を確認するためのＩＥＦウェスタンブロッティングを示す。
【００２９】
[0050]図１３は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＵＶ−ＭＡＬＬＳ−ＲＩを介した精製結合体ワクチンの純度を裏付けている。
【００３０】
[0051]図１４は、精製結合体ワクチンの純度を確認するためのＩＥＦ  ＰＡＧＥにより分析された精製ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体を示す。
【００３１】
[0052]下の表２は、ＬＴＳ６１Ｋタンパク質が結合後に結合活性を保持することを裏付けるＧＭ１結合アッセイの結果である。
【００３２】
【表２】
0005967585.tif 000003
【００３３】
多糖−ＬＴＳ６１Ｋ結合体の有効性を示す哺乳動物前臨床試験：
[0053]ニュージーランドシロウサギを、意図されたヒト用量の多糖、ＬＴＳ６１Ｋと混合した多糖、又は多糖−ＬＴＳ６１Ｋ結合体を用いて、２週間間隔で３回、筋肉内免疫感作して結合体ワクチンの効力を評価した。全てのワクチン調製物は、ＡｌＰＯ４又は他の関連アジュバントを含有しなかった。全てのワクチンの免疫応答は、抗多糖抗原特異的ＩｇＧ力価を検出するためのＥＬＩＳＡ、及び抗体の機能的活性を検出するための血清殺菌アッセイにより決定した。試験結果は、結合に成功した多糖−ＬＴＳ６１Ｋワクチンのみが、多糖単独又はＬＴＳ６１Ｋと混合された多糖のみよりも、血清中で高い多糖特異的ＩｇＧ抗体力価及び大きい殺菌活性を誘導できることを示した。動物免疫原性試験は、ＬＴＳ６１Ｋタンパク質を含む無毒化大腸菌易熱性エンテロトキシンホロ毒素が、多糖抗原の特異的免疫応答を著しく刺激するのに多糖の担体タンパク質として有用であることを示唆している。
【００３４】
[0054]初期哺乳動物試験の結果に関する図面のさらなる図についてこれより言及する。
【００３５】
[0055]図１５は、本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のラット免疫原性試験をまとめている。
【００３６】
[0056]図１６は、本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のウサギ免疫原性試験をまとめている。
【００３７】
[0057]図１７は、本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のウサギ免疫原性試験の結果、ウサギ血清殺菌力価アッセイ及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ力価の結果を図示する。ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のみが、抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ力価を誘導することができた。ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体に追加添加したＬＴＳ６１Ｋは、抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂを増強しなかった。
【００３８】
[0058]図１８は、ウサギ免疫原性試験についての追加情報を図示する。
【００３９】
[0059]図１９は、本発明のＨｉｂ  ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のウサギ免疫原性試験の結果、ウサギ血清殺菌力価（ＢＡ）及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ力価（ＯＤ）の結果を図示する。
【００４０】
[0060]追加の試験は、以下に記載された手順を使用し、以下に記載された結果を観察して行った。
【００４１】
[0061]ニュージーランドシロウサギを、意図されたヒト用量の多糖、ＬＴＳ６１Ｋと混合した多糖、及び多糖−ＬＴＳ６Ｋ結合体を用いて、２週間間隔で、３回及び４回、筋肉内免疫感作して結合体ワクチンの効力を評価した。全ての調製物は、ＡｌＰＯ４又は他の関連アジュバントを含有しなかった。全てのワクチンの免疫応答は、抗多糖抗原特異的ＩｇＧ力価を検出するためのＥＬＩＳＡ、及び抗多糖抗体の機能的活性を示すための血清殺菌アッセイにより決定した。血清抗ＬＴＳ６１Ｋ  ＩｇＧ力価の応答もＥＬＩＳＡにより決定し、インビトロでのＣａｃｏ−２細胞ｃＡＭＰ誘導試験及びＹ−１副腎細胞毒性集合試験（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｕｐ  ｓｔｕｄｙ）は、野生型ＬＴによる血清抗ＬＴＳ６１Ｋ  Ａｂ中和能力を決定するのに使用した。インビボでのウサギ回腸ループチャレンジ試験は、抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体の機能を調べるために行った。動物免疫原性試験は、ＬＴＳ６１Ｋタンパク質を含む無毒化大腸菌易熱性エンテロトキシンホロ毒素が、多糖抗原の特異的応答を著しく刺激するのに多糖の担体タンパク質として有用であることを示唆している。ＬＴＳ６１Ｋ自体は、免疫原として使用することができ、野生型ＬＴに対する抗体を効果的に生成する。
【００４２】
[0062]Ａ．ウサギ免疫原性試験。ＰＲＰ、ＬＴＳ６１Ｋと結合したＰＲＰ、及びＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰ；２つ及び３つのブースターを含む被験物質による、１０μｇ用量のＰＲＰを用いたウサギ筋肉内免疫感作は、隔週間隔で与えた。血液試料を各免疫感作後１４日目に採取し、採取した血清試料は使用まで−８０℃で貯蔵した。
【００４３】
[0063]Ｂ．ＥＬＩＳＡにより決定された抗多糖及び抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体。ＰＲＰ−ＢＳＡ結合体を、抗ＰＲＰ抗体判定については１００ｎｇ／ウェルでのＰＲＰ濃度で９６ウェルプレートにおいて被覆し、抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体判定については２５０ｎｇ／ウェルでＬＴＳ６１Ｋで被覆した。被覆プレートを４℃で１６時間インキュベートし、この後３７℃で１時間、ブロッキング緩衝液として５％脱脂乳と共にインキュベートした。動物血清は、１：５０の希釈から開始してテストした。特異的抗体は、３７℃で１時間インキュベートした西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて測定し、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）ペルオキシダーゼ基質を添加して抗体を明らかにし、１０分後、１２％Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を終了させ、吸光度をＯＤ（光学密度）６５０〜４５０ｎｍ（参照波長６５０ｍｎ）で読み取った。ＥＬＩＳＡ力価は最終希釈の逆数として表し、ＯＤ４５０≧０．５を示した。
【００４４】
[0064]Ｃ．血清殺菌アッセイ。抗体依存性補体媒介殺菌活性は、インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）コロニーの５０％超を死滅させる血清希釈力価について行った。血清試料を５６℃で３０分間前処理してウサギ血清の補体を不活化した。９６ウェルＵ底プレート中１０μＬの容量による血清試料の２倍連続希釈物を調製した。この後、１０００ＣＦＵ／２０μＬに調製した２０μＬの希釈Ｈｉｂ培養物を添加した。混合物を５％ＣＯ２と共に３７℃で１５分間さらにインキュベートし、５０μＬの１：１ハンクス緩衝液希釈仔ウサギ補体を各ウェルに添加し、混合物を５％ＣＯ２と共に３７℃で６０分間インキュベートした。仔ウサギ補体添加混合物５μＬをチョコレート寒天プレートに播種し、プレートを５％ＣＯ２と共に３７℃で１６時間インキュベートした。Ｈｉｂコロニー形成単位をカウントし、５０％を超えるＨｉｂコロニーを死滅させる血清希釈力価を決定した。血清試料は全て、図で希釈力価の逆数と比較する。
【００４５】
[0065]Ｄ．ウサギ抗ＬＴＳ６１Ｋ血清抗体で中和した野生型ＬＴによるＣａｃｏ−２細胞におけるｃＡＭＰの誘導試験は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）ＥＩＡキット（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。１０ナノグラムの野生型ＬＴを、１５０μＬ抗ＬＴＳ６１Ｋウサギ血清（１：１００希釈）と共に室温でインキュベートした。１時間インキュベーション後、混合物をＣａｃｏ−２細胞プレート（５×１０４細胞／ウェル）に添加し、Ｃａｃｏ−２細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で２時間さらにインキュベートした。この後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ  ＨＣＬ（１ウェル当たり２００μＬ）で溶解し、０．１Ｍ  ＮａＯＨで中和した。細胞溶解生成物は、室温で１０分間、６６０×Ｇで遠心分離により回収した。得られた懸濁液は、市販のＥＩＡキットを利用して細胞内ｃＡＭＰレベルについてアッセイした。
【００４６】
[0066]Ｅ．ウサギ抗ＬＴＳ６１Ｋ血清の段階希釈による野生型ＬＴの中和試験は、Ｙ−１マウス副腎腫瘍細胞について調べた。Ｙ−１細胞アッセイのため、ウサギ血清５０×、１００×から１０２、４００×の連続２倍希釈物を、野生型ＬＴ  １０−５μｇ（ＥＣ５０、すなわち、Ｙ−１副腎細胞について５０％を超える細胞の集合を生じさせる野生型ＬＴの毒素濃度である）と予め混合し、この後、混合物をＹ−１副腎細胞、５×１０４細胞／ウェルに添加した。細胞は、２４時間インキュベーション後に形態学的変化（細胞の集合）について観察した。
【００４７】
[0067]Ｆ．ウサギ回腸ループ液体蓄積試験：野生型ＬＴに対するウサギ抗ＬＴＳ６１Ｋ血清抗体の中和は、ウサギ回腸ループアッセイにおいて行った。５．５ｃｍセグメントのウサギ回腸ループは、ＰＲＰ又はＬＴＳ６１Ｋと結合したＰＲＰ又はＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰで免疫感作した後のウサギで作製した。濃度範囲０．０１〜１μｇの野生型ＬＴを各試験動物に投与し、各セグメントに蓄積した液体の量を１８時間後に測定した。
【００４８】
ＬＴＳ６１Ｋと結合した多糖の免疫原性効果の結果：多糖−ＬＴＳ６１Ｋ結合体の有効性を示す哺乳動物前臨床試験
[0068]試験結果を、図面の図２０〜２３及び表３〜５を参照して以下に記載する。
【００４９】
[0069]ＰＲＰ及びＬＴＳ６１Ｋに対する抗体は、ＥＬＩＳＡにより決定した。ウサギにおける免疫原性の結果は図２０に示した。ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体３回注射を与えたウサギのみが、高い抗ＰＲＰ  ＩｇＧ抗体力価を誘発し、ＰＲＰ又はＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰよりも１０００倍大きかった。ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体ワクチンにより誘導された主要な免疫グロブリンは、ＩｇＧであった。高力価の抗ＬＴＳ６１Ｋ  ＩｇＧ抗体の存在は、抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂの免疫応答を妨げなかった。
【００５０】
[0070]抗ＰＲＰ及び抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体反応結果のウサギ免疫原性ＥＬＩＳＡを示す図２０では、全ての動物は、各々１０μｇ結合ＰＲＰの合計３回筋肉内投与を２週間間隔で受けた。血清を採取し、図２０に描かれているように、投与１後１週間（１ＷＰＤ１）、投与２後１週間（１ＷＰＤ２）、投与３後２週間（２ＷＰＤ３）でアッセイした。
【００５１】
[0071]結合体により誘導された抗ＰＲＰ抗体の防御可能性は、ウサギ血清の殺菌活性をテストして評価した。殺菌力価は、インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）イーガン（Ｅａｇｅｎ）株に対して決定し、データを、５０％を超えるＨｉｂコロニーを死滅させる逆数血清希釈として表した。図２１は、１回ＰＲＰ  １０μｇ、２週間間隔、３回筋肉内免疫感作後のウサギ、抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ及び殺菌力価は、結合ＰＲＰ平均反復単位が４０又は１０、及びＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体用量が１回１０μｇ／４８μｇ〜１０μｇ／３０μｇの、実験室内（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）調製したＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体の３つのバッチ全てにおいて類似していたことを示す。一方、ＰＲＰ及びＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰ免疫感作ウサギ血清は、Ｈｉｂ細菌を死滅させることができず（逆数力価＜２）、抗ＰＲＰ  ＩｇＧ抗体も誘発することができなかった。成功したＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体のみが、高力価の抗ＰＲＰ抗体による殺菌効果を有する。
【００５２】
[0072]図２１は、ウサギが、各々１０μｇ結合ＰＲＰの３回筋肉内投与を２週間間隔で受けた後の、ウサギ血清殺菌アッセイ及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ抗体反応を示す。テスト血清は、４３日目（投与３後２週間）に採取した。
【００５３】
[0073]再ブースト試験を、ウサギがＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体の最初の３回免疫感作を受けた後、そのウサギで行った。結果は、図２２にまとめられ、殺菌力価及び抗ＰＲＰ  ＩｇＧ抗体力価は時間と共に徐々に低下するが、６ＷＰＤ３（投与３後６週間）ウサギ血清殺菌力価はウサギ血清２ＷＰＤ３よりも低く、ウサギ血清抗ＰＲＰ  ＩｇＧ抗体及び殺菌力価はＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体の後続投与後に効果的に増強することができることを示した。しかし、これらの現象は、ＰＲＰ又はＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰを免疫感作したウサギでは観察することができなかった。
【００５４】
[0074]図２２に関して、ウサギは、種々の比のＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体で免疫感作した。血清を種々の時間で得、ＥＬＩＳＡ抗ＰＲＰ  ＩｇＧ  Ａｂ及び殺菌アッセイを行った。結果は、血清抗ＰＲＰ  ＩｇＧ抗体と血清殺菌活性の相関を示し、ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体によるウサギでの第４回免疫感作が抗ＰＲＰ  Ａｂを効果的に再ブーストすることを示している。
【００５５】
[0075]表３は、高い抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体（これらは、ＰＲＰ−ＬＴＳ６１Ｋ結合体免疫感作ウサギ血清、及びＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰ免疫感作ウサギ血清であった）を有するウサギ血清の場合のみ、１０ｎｇでの野生型ＬＴ毒素がＣａｃｏ−２細胞におけるｃＡＭＰレベルの細胞内放出の増加を刺激できなかったことを示す。対照的に、ＰＲＰ免疫感作ウサギから得られたウサギ血清は、野生型ＬＴがＣａｃｏ−２細胞におけるｃＡＭＰレベルを増加させるのを妨げなかった。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
[0076]ウサギ抗ＬＴＳ６１Ｋ血清の連続希釈による野生型ＬＴの中和試験は、Ｙ−１マウス副腎腫瘍細胞で行った。表４の結果は、抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体を示すウサギの血清のみが、野生型ＬＴの毒性を効果的に中和し、これは、ＰＲＰ−ＬＴ６１Ｋ結合体免疫感作ウサギ血清、及びＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＲＰ免疫感作ウサギ血清で生じたが、ＰＲＰで免疫感作したウサギの血清では生じなかったことを示している。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
[0077]表５のデータは、５．５ｃｍセグメント当たり０．０１μｇの濃度で、野生型ＬＴ液体蓄積の回腸ループが、抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体がないウサギにおいて誘導されたこと、しかし、抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体を有するウサギでは、液体蓄積はなかったことを示している。これらの結果は、血清抗ＬＴＳ６１Ｋ抗体は野生型ＬＴを中和することができるという、インビトロＣａｃｏ−２  ｃＡＭＰ誘導試験及びＹ−１副腎細胞中和試験で以前に得られた結果を裏付けている。回腸粘膜における重度の出血性病変は、セグメント当たり０．５及び１．０μｇで野生型ＬＴを投与した抗ＬＴＳ６１Ｋ  Ａｂがないウサギで観察された。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
[0078]ＬＴＳ６１Ｋと共有結合させた肺炎球菌多糖血清型１４の例として、動物免疫原性試験の結果を図２３に示す。ＰＮＰＳ血清型１４に対する抗体力価は、ＥＬＩＳＡにより決定した。試料は、９４又は４０のＰＳ平均反復単位を有するＰＮＰＳ  １４−ＬＴＳ６１Ｋ結合体、ＰＮＰＳ  １４単独、ＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＮＰＳ  １４、及びＰＢＳであった。結合生成物のみが、高い抗ＰＮＰＳ  １４  ＩｇＧ抗体を誘導することができた。免疫感作プログラム中の化学アジュバント、水酸化アルミニウムの存在は、抗ＰＮＰＳ  １４抗体に役立つ又は該抗体を著しく増強することはなかった。
【００６２】
[0079]図２３は、肺炎球菌ＰＳ血清型１４−ＬＴＳ６１Ｋ結合体についてのマウスにおける免疫原性を示す。ＰＮＰＳ  １４−ＬＴＳ６１Ｋ結合体を与えられた動物のみが、高い抗ＰＳ  ＩｇＧ抗体力価を誘発し、ＰＮＰＳ  １４又はＬＴＳ６１Ｋと混合したＰＮＰＳ  １４よりも５００倍大きかった。
【００６３】
[0080]本発明の多くの改変及び変更は、特許請求の範囲に定義されている本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者に明らかとなろう。
【関連出願の相互作用】
【００６４】
[0001]２０１０年５月３日に出願された米国特許仮出願第６１／３３０，６５０号に対し優先権が主張され、上記出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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