(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘプタメトキシフラボンを有効成分として含む骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記ヘプタメトキシフラボンと、ノビレチン、タンゲレチン及びテトラメトキシフラボンからなる群より選択された少なくとも１種とを含むポリメトキシフラボン配合物を含む請求項１記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリメトキシフラボン配合物が、ヘプタメトキシフラボン及びノビレチンを含み、ヘプタメトキシフラボンのノビレチンに対する質量比が０．８〜１．５である請求項２記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリメトキシフラボン配合物は、前記ヘプタメトキシフラボンを少なくとも１５質量％含有する請求項２又は請求項３記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
【請求項５】
前記ヘプタメトキシフラボン又は前記ポリメトキシフラボン配合物が、柑橘類の果皮油、精油エキス及び搾汁粕の少なくとも１種を、有機酸水溶液により抽出することにより得られたものである請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨疾患予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎えた今日、わが国の骨粗鬆症患者数は1000万人を超え、更年期女性の３人に１人、また高齢者の大部分が骨粗鬆症に罹患しているといわれており、骨粗鬆症患者の増大は社会的・経済的に深刻な問題となっている。骨粗鬆症では、古い骨が新しい骨に置き換わる骨リモデリングの過程において、骨吸収量が骨形成量を上回る結果、骨量が減少する。骨粗鬆症では、骨塩量の減少に加えて、骨の微細構造が崩壊するため、骨が脆弱化し、骨折により寝たきり状態となる高齢患者も多い。
従来、骨粗鬆症の治療は骨吸収の抑制あるいは骨形成の促進を促す内服薬が主流であった。現在最も普及している治療方法は、ビスホスホネート製剤、ホルモン剤（エストロゲン）、カルシウム製剤、ビタミンＤやその誘導体等を服用し、全身性に骨代謝の改善を試みるものである（例えば、特許文献１）。
【０００３】
一方、天然由来のフラボノイドには種々の機能があることが知られている。例えば、特許文献２には、シークワーサーエキスなどに含まれるポリメトキシフラボノイドは歯周病の予防・治療に有効であることが開示されている。また、特許文献３には、血圧の上昇又は血糖値の上昇を抑制するフラボノイドとして、タンゲレチン、ノビレチン等が開示されている。非特許文献１には、柑橘由来フラボノイドであるナリンジンが破骨細胞形成を抑制して骨量を増加することが開示されている。特許文献４には、ヘプタメトキシフラボ
ン、ヘキサメトキシフラボン、又はペンタメトキシフラボン等に脂肪蓄積阻害効果があることが開示されている。
【０００４】
特に、ノビレチンについては、ＰＧＥ産生とＮＦ−κＢの活性化を抑制して炎症性骨吸収を改善すると共に、卵巣摘出マウスの骨量減少を阻止すること(非特許文献２）、及び骨粗鬆症モデルの骨破壊を部分的に改善すること（非特許文献３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１０６０４２号公報
【特許文献２】特開２００６−１０５９６９号公報
【特許文献３】特開２００１−２４０５３９号公報
【特許文献４】特開２００８−２７３９３５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Health Sci., (2009) Vol.55, pp.463-467
【非特許文献２】J. Pharmacol. Sci., (2011) Vol.115, pp.89-93
【非特許文献３】BioFactors, (2007) Vol.30, pp.179-192
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、骨疾患の予防又は治療の効果は個人差があり、より確実な予防又は治療効果を得るために依然として改善の余地がある。
【０００８】
従って、本発明は、高い予防又は治療効果を有する骨疾患予防又は治療用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
［１］  ヘプタメトキシフラボンを有効成分として含む骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
［２］  前記ヘプタメトキシフラボンと、ノビレチン、タンゲレチン及びテトラメトキシフラボンからなる群より選択された少なくとも１種とを含むポリメトキシフラボン配合物を含む［１］に記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
［３］  前記ポリメトキシフラボン配合物が、ヘプタメトキシフラボン及びノビレチンを含み、ヘプタメトキシフラボンのノビレチンに対する質量比が０．８〜１．５である［２］に記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
［４］  前記ポリメトキシフラボン配合物は、前記ヘプタメトキシフラボンを少なくとも１５質量％含有する［２］又は［３］記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
［５］  前記ヘプタメトキシフラボン又は前記ポリメトキシフラボン配合物が、柑橘類の果皮油、精油エキス及び搾汁粕の少なくとも１種を、有機酸水溶液により抽出することにより得られたものである［１］〜［４］のいずれかに記載の骨疾患予防又は治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高い予防又は治療効果を有する骨疾患予防又は治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例１にかかる各ポリメトキシフラボンの破骨細胞形成抑制率を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２にかかるヘプタメトキシフラボンの骨吸収活性抑制効果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２にかかるＰＭＦ配合物の骨吸収活性抑制効果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例３にかかるＰＭＦ配合物摂取による大腿骨遠位の骨密度の変化を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例３にかかるＰＭＦ配合物摂取による大腿骨遠位海綿骨量の変化を示すマイクロＣＴ写真像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の骨疾患予防又は治療用組成物は、ヘプタメトキシフラボンを有効成分として含む。
本発明によれば、ヘプタメトキシフラボンを有効成分として含むので、高い骨疾患予防又は治療効果を有する骨疾患予防又は治療用組成物を提供することができる。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１３】
本発明の骨疾患予防又は治療用組成物は、ヘプタメトキシフラボンを有効成分として含む。ヘプタメトキシフラボンは、フラボン骨格にメトキシ基を７つ有する化合物であり、メトキシ基の位置については特に制限はない。本発明におけるヘプタメトキシフラボンとしては、例えば、以下の構造を有するものを挙げることができる。本発明におけるヘプタメトキシフラボンは、同一の構造のヘプタメトキシフラボン単独で構成してもよく、メトキシ基の位置が異なる複数種のヘプタメトキシフラボンとの組み合わせであってもよい。
【００１４】
【化１】
0005846350.tif 000002
【００１５】
また、本発明にかかる骨疾患予防又は治療用組成物は、ヘプタメトキシフラボンを単独で使用してもよく、ヘプタメトキシフラボンと他のメトキシフラボンを含有するポリメトキシフラボン配合物を含むものであってもよい。このようなポリメトキシフラボン配合物としては、ヘプタメトキシフラボンと、ノビレチン、タンゲレチン及びテトラメトキシフラボンからなる群より選択された少なくとも１種とを含むポリメトキシフラボン配合物であることが、骨疾患予防又は治療効果の観点から好ましい。なお、テトラメトキシフラボンは、メトキシ基が４つ有するフラボン誘導体であり、例えば、下記に示す構造のものを挙げることができるが、メトキシ基の位置は下記のものに限定されない。また。テトラメトキシフラボンは、単独で用いてもよく、メトキシ基の位置が異なる複数種のテトラメトキシフラボンの組み合わせを用いてもよい。
【００１６】
【化２】
0005846350.tif 000003
【００１７】
ヘプタメトキシフラボンの前記ポリメトキシフラボン配合物における含有量としては特に制限はないが、例えば、少なくとも１５質量％含むものであり、骨疾患予防又は治療効果の観点から１５質量％〜６０質量％であることが好ましく、２５質量％〜４５質量％であることがより好ましい。
【００１８】
前記ポリメトキシフラボン配合物にノビレチンが含まれる場合、ノビレチンは、ポリメトキシフラボン配合物の全質量の、例えば２０質量％〜５０質量％であってもよく、３０質量％〜４０質量％であることが好ましい。
前記ポリメトキシフラボン配合物にタンゲレチンが含まれる場合、タンゲレチンは、ポリメトキシフラボン配合物の全質量の、例えば５質量％〜２５質量％であってもよく、８質量％〜１８質量％であることが好ましい。
前記ポリメトキシフラボン配合物にテトラメトキシフラボンが含まれる場合、テトラメトキシフラボンは、ポリメトキシフラボン配合物の全質量の、例えば１質量％〜１７質量％であってもよく、２質量％〜１３質量％であることが好ましい。
【００１９】
前記ポリメトキシフラボン配合物の例としては、ヘプタメトキシフラボン及びノビレチンを含むものであることが、骨疾患予防又は治療効果の観点から好ましく、ヘプタメトキシフラボンとノビレチンとタンゲレチンとを含むポリメトキシフラボン配合物であることがより好ましい。
【００２０】
ヘプタメトキシフラボン及びノビレチンを含有するポリメトキシフラボン配合物の場合、前記ポリメトキシフラボン配合物におけるヘプタメトキシフラボンとノビレチンとの配合量は特に制限はないが、骨疾患予防又は治療効果の観点から、ヘプタメトキシフラボン１５質量％〜６０質量％及びノビレチン２０質量％〜５０質量％を含有するポリメトキシフラボン配合物であることが好ましく、ヘプタメトキシフラボン２５質量％〜４５質量％及びノビレチン３０質量％〜４０質量％を含有するポリメトキシフラボン配合物であることがより好ましい。
【００２１】
ポリメトキシフラボン配合物がヘプタメトキシフラボン及びノビレチンを含む場合、ヘプタメトキシフラボンとノビレチンとの混合比には特に制限はないが、骨疾患予防又は治療効果の観点から、ヘプタメトキシフラボンのノビレチンの対する質量比として、例えば０．８〜１．５とすることができ、０．９〜１．５であることが好ましく、１．０〜１．３であることがより好ましい。
【００２２】
ヘプタメトキシフラボンは、合成したものであってもよく、市販品であってもよいが、天然物からの抽出物の成分として得ることが入手容易性及び骨疾患予防又は治療効果の観点から好ましい。ヘプタメトキシフラボンの供給源となる天然物としては、例えば、オレンジ、グループフルーツ、レモン、温州みかん、夏みかん、八朔、伊予柑、冬橙、シークワーサー、ネーブル、ユズ等の柑橘類から得ることができ、純度及び入手容易性の観点からオレンジ、グレープフルーツ、シークワーサー、レモン、温州みかん等であることが特に好ましい。また、抽出部位としては、果皮油、精油エキス又は搾汁粕等を挙げることができ、ヘプタメトキシフラボンの含有率の観点から果皮油又は精油エキスであることが好ましい。
【００２３】
また、ヘプタメトキシフラボン又はヘプタメトキシフラボンを含有する前記ポリメトキシフラボン配合物は、柑橘類の抽出物又は当該抽出物からの精製物として入手することができる。
柑橘類の抽出物としてポリメトキシフラボン配合物は、特に制限はないが、生産性及びヘプタメトキシフラボンの純度の観点から、柑橘類の果皮油、精油エキス及び搾汁粕の少なくとも１種を、有機酸水溶液により抽出することにより得られた有機酸水溶液抽出物であることが好ましい。前記有機酸水溶液抽出物は、ヘプタメトキシフラボンを前述した所定の割合で含有し、且つ、ヘプタメトキシフラボンに加えて、ノビレチン、タンゲレチン及びテトラメトキシフラボンを所定の割合で含むものであり、高い骨疾患予防又は治療効果を有するため、好ましい。
【００２４】
前記有機酸水溶液抽出物は、例えば、特開２００９−５１７３８号に記載された製造方法により得ることが好ましい。前記製造方法は、柑橘類の果皮油、精油エキス及び搾汁粕の少なくとも１種類を、抽出溶媒として有機酸水溶液を使用してポリメトキシフラボン類を抽出すること（以下、抽出工程という）を含む。
供給源となる柑橘類としては、ヘプタメトキシフラボンの場合と同様に、例えば、オレンジ、グループフルーツ、レモン、温州みかん、夏みかん、八朔、伊予柑、冬橙、シークワーサー、ネーブル、ユズ等の柑橘類から得ることができ、各ポリメトキシフラボンの配合比、純度及び入手容易性の観点からオレンジ、グレープフルーツ、シークワーサー、レモン、温州みかん等であることが特に好ましい。また抽出部位としては、ヘプタメトキシフラボンの場合と同様に、ヘプタメトキシフラボンの含有率の観点から果皮油又は精油エキスであることが好ましい。
【００２５】
抽出工程で用いられる有機酸水溶液の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、ピルビン酸、クエン酸等が挙げられる。
前記製造方法により得られた有機酸水溶液抽出物におけるポリメトキシフラボンの含有率は、例えば０．３質量％〜３．５質量％である。
また、ヘプタメトキシフラボンのみを得る場合には、前記製造方法での抽出工程の後に、ヘプタメトキシフラボンを精製する工程を付加すればよい。精製工程に用いられる精製手段については、特に制限はなく、ヘプタメトキシフラボンの構造に基づいて精製可能な周知の精製手段を用いることができる。
【００２６】
前記骨疾患予防又は治療用組成物は、液体、固体、粉末又はゲル状等のいずれの形態であってもよく、適用される形態に基づき使用可能な周知の溶剤又は賦形剤等の医薬として許容可能な添加成分又は担体を更に含むものであってもよい。
本発明の骨疾患予防又は治療用組成物は、年齢、体重、症状に応じて適切な投与量で投与することができる。例えば静脈内投与の場合には、前記骨疾患予防又は治療用組成物を、成人１日あたり有効成分量として、例えば、１から１００ｍｇ／ｋｇで投与することができ、また、経口投与の場合には、前記骨疾患予防又は治療用組成物を、成人１日あたり有効成分量として、例えば２から２００ｍｇ／ｋｇで投与とすることができる。前記骨疾患予防又は治療用組成物の投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【００２７】
本発明において、骨疾患としては、骨代謝の不全や、骨破壊の亢進等に関連して発症する疾患であればよく、骨粗鬆症、歯周病、がんの骨転移、慢性関節リウマチ、変形性関節症、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、ペジェット病等を挙げることができる。
本発明における「予防又は治療」は、骨代謝の不全や骨破壊の亢進等に関連した症状の発生を抑制する又は進行を維持又は抑止できればよく、また、予防と治療とを明確に区別されなくてもよい。
【００２８】
本発明の骨疾患予防又は治療用組成物は、上記成分を含むものであれば、組成物としての用途は限定されず、例えば、食品添加物、栄養補助食品、オーラルケア用の健康補助食品、オーラルケア用の添加物、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品等の任意の種類及び形態の機能性食品又はその素材として用いてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００３０】
［実施例１］
（１）ヘプタメトキシフラボン及びポリメトキシフラボン配合物の調製
ヘプタメトキシフラボン及びノビレチンは、和光純薬より入手した。
ポリメトキシフラボン配合物は、特開２００９−５１７３８号に記載された方法に従って、オレンジ果皮油から調製した。得られたポリメトキシフラボン配合物（ＰＭＦ１：純度８７．８％、）の組成は、以下のとおりである。また、抽出溶媒を、４０％酢酸に代えて、４０％ギ酸、４０％プロピオン酸、又は４０％酪酸を用いることによって、ヘプタメトキシフラボンの含有率が異なる複数のＰＭＦ配合物を得ることができる（それぞれ、ＰＭＦ２〜ＰＭＦ５）。
以下、ポリメトキシフラボン配合物の評価にはＰＭＦ１を用いた。以下、ＰＭＦ１を「ＰＭＦ配合物」又は単に「ＰＭＦ」と称する。
【００３１】
【表１】
0005846350.tif 000004
【００３２】
（２）破骨細胞形成分化に対する抑制評価
６週齢ｄｄｙマウスより骨髄細胞を常法により採取し、２４ウェルプレートに骨髄細胞を２×１０６個／ｗｅｌｌ及び初代骨芽細胞を１×１０４個／ｗｅｌｌの細胞濃度で播種し、終濃度２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１を含む０．５ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＰＲ（−）αＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２−９５％Ａｉｒ気相下、３７℃にて７日間共存培養した。３日ごとに０．４ｍｌの培養液交換を行った。ヘプタメトキシフラボン、ノビレチン及び上記で得られたＰＭＦ配合物を、培養開始時及び培養液交換時に表２に示す各濃度となるように添加した。
培養後、細胞は破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（以下、ＴＲＡＰ）液にて染色後、室温で乾燥させた。３核以上のＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞として計測し、破骨細胞形成率として評価した。結果を表２及び図１に示す。なお、図１において、黒菱形はＰＭＦ配合物、黒四角はヘプタメトキシフラボン単独、黒三角はノビレチン単独の場合をそれぞれ示す。表２中の数値は、ＩＬ−１（２ｎｇ／ｍＬ）により誘導される破骨細胞数を１００％としたときの、各成分を添加して培養した場合の破骨細胞の数を％（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示したものである。
【００３３】
【表２】
0005846350.tif 000005
【００３４】
表２及び図１に示されるように、ノビレチンのみを添加した場合よりも、ヘプタメトキシフラボン単独及びヘプタメトキシフラボンを含有するＰＭＦ配合物を添加した場合において、破骨細胞の形成が低濃度で強く抑制された。また、ヘプタメトキシフラボンを所定量で含むＰＭＦ配合物は特に強く破骨細胞の形成を抑制することが分かった。
【００３５】
［実施例２］
（骨吸収活性亢進に対する抑制評価）
生後５日齢のｄｄｙ系マウスより頭頂骨を採取し、２４ウェルプレートを用い、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／ＢＧＪｂ培地（ペニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）含有）にて３７℃、２４時間培養した。その後、同培地にＩＬ−１を添加した培地（終濃度４ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１）に変え、ヘプタメトキシフラボン又はＰＭＦ配合物を１３μｇ／ｍＬ又は２６μｇ／ｍＬ添加して５日間培養した。培養後、培養上清中のカルシウム濃度を測定した。培養液のみの場合のカルシウム濃度を差引き、カルシウム濃度の上昇分を頭頂骨から遊出したカルシウムと判定し、骨吸収活性の指標とした。結果を図２及び図３に示す。
【００３６】
図２及び図３に示されるように、処理後５日目、ＩＬ−１の添加によって頭頂骨の破壊が進み骨吸収活性の上昇が認められたが、ヘプタメトキシフラボンにより有意に抑制された（図２）。また、ＰＭＦ配合物を用いた場合でも、ＩＬ−１による骨吸収活性が顕著に抑制された（図３）。すなわち、ヘプタメトキシフラボン及びＰＭＦ配合物は炎症性骨吸収因子による骨吸収活性亢進に対する抑制効果を有し、骨破壊を予防し得ることがわかった。
【００３７】
［実施例３］
５週齢雌性マウスに卵巣摘出（ＯＶＸ）あるいは偽手術（Ｓｈａｍ）を常法により施した。ＰＭＦ配合物を、ＯＶＸの翌日より、１日１回１匹当たり５ｍｇの量でゾンデにて連日経口投与した。術後４週にて、体重及び子宮質量を計測すると共に、大腿骨を摘出し、骨密度を、二重エネルギーＸ線吸収測定器（ＤＣＳ−６００Ｒ；アロカ社）により測定した。コントロール群には、ＰＭＦ配合物の代わりに溶媒（アラビアゴム）をゾンデにて連日経口投与した。結果を図４に示す。また、マイクロＣＴ（ｉｎｓｐｅＸｉｏ ＳＭＸ−９０ＣＴ、島津製作所）を用いて、大腿骨遠位の海綿骨量を３次元観察した。結果を図５に示す。
【００３８】
図４に示すように、偽手術（Ｓｈａｍ）群に比してＯＶＸ群では、大腿骨の遠位骨密度が減少するが、ＯＶＸ群がＰＭＦ配合物を摂取することにより、大腿骨の遠位骨密度が有意に増加した（図４、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１）。一方、Ｓｈａｍマウスでは、ＰＭＦ配合物の摂取により、大腿骨の骨密度は変化しなかった。また、図５に示されるように、マイクロＣＴにより大腿骨遠位の海綿骨量を３次元観察したところ、ＯＶＸにより顕著に低下した海綿骨がＰＭＦ配合物の経口摂取によりに改善した。なお、ＰＭＦ配合物の摂取によって、Ｓｈａｍ群及びＯＶＸ群共に体重の変化は認められなかった。また、ＯＶＸ群の子宮質量はＳｈａｍ群に比して顕著に低下するが、ＰＭＦ配合物の摂取によって、Ｓｈａｍ群及びＯＶＸ群共に子宮質量は変化しなかった。
このことは、閉経後骨粗鬆症モデルにおいて、ＰＭＦ配合物が女性ホルモンに類似した作用ではない機序によって、骨破壊を改善できることを示している。
【００３９】
このように、ヘプタメトキシフラボン及び、ヘプタメトキシフラボンを含むＰＭＦ配合物を摂取することにより、骨粗鬆症に予防・治療効果を発揮することが分かった。
従って、ヘプタメトキシフラボンを含む本発明の組成物は、骨の健康維持に有効であり、骨疾患の予防・治療効果を有する。
【図１】
0005846350.tif 000006
【図２】
0005846350.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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