(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者から採取した生体試料から、ＣＤＫ１の活性値及び発現量と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とを取得するステップと、
取得したＣＤＫ１の活性値及び発現量と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量とに基づいて再発リスクスコアを取得し、取得した再発リスクスコアと、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定するステップと
を含み、
前記再発リスクスコアが、下記の式（１）：
（再発リスクスコア）＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）    ・・・（１）
［式中、
ｘはＣＤＫ１の比活性を表し、このＣＤＫ１の比活性は、（ＣＤＫ１の活性値）／（ＣＤＫ１の発現量）で示され；
ｙは比活性の比を表し、この比活性の比は、（ＣＤＫ２の比活性）／（ＣＤＫ１の比活性）で示され、ＣＤＫ２の比活性は、（ＣＤＫ２の活性値）／（ＣＤＫ２の発現量）で示される］
に基づいて取得される値であり、
前記Ｆ（ｘ）及びＧ（ｙ）が、それぞれ下記の式（２）及び（３）：
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ））    ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ））    ・・・（３）
［式中、
ａ、ｂ及びｃは、ｘと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり；
ｄ、ｅ及びｆは、ｙと癌の再発率との相関関係から定められた定数である］
であり、
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第１の閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２の閾値未満であり、且つＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定する、
乳癌の再発リスクの判定方法。
【請求項２】
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第１の閾値以上であるか、ｕＰＡの発現量が第２の閾値以上であるか又はＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値以上であるとき、乳癌の再発リスクが高いと判定する請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記判定ステップにおいて、さらに、（ＣＤＫ１の活性値）／（ＣＤＫ１の発現量）で示されるＣＤＫ１の比活性を取得し、
取得したＣＤＫ１の比活性と、再発リスクスコアと、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定する請求項１に記載の判定方法。
【請求項４】
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第１の閾値未満であり、ＣＤＫ１の比活性が第４の閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２の閾値未満であり、且つＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定する請求項３に記載の判定方法。
【請求項５】
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第１の閾値以上であるか、ｕＰＡの発現量が第２の閾値以上であるか、ＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値以上であるか又はＣＤＫ１の比活性が第４の閾値以上であるとき、乳癌の再発リスクが高いと判定する請求項３または４に記載の判定方法。
【請求項６】
乳癌患者から採取した生体試料が、乳腺組織である請求項１〜５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項７】
乳癌患者から採取した生体試料から取得したＣＤＫ１の活性値及び発現量と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とを受信するステップと、
受信したＣＤＫ１の活性値及び発現量と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量とに基づいて再発リスクスコアを算出し、算出した再発リスクスコアと、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定するステップと、
得られた判定結果を出力するステップと
をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、
前記再発リスクスコアが、下記の式（１）：
（再発リスクスコア）＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）    ・・・（１）
［式中、
ｘはＣＤＫ１の比活性を表し、このＣＤＫ１の比活性は、（ＣＤＫ１の活性値）／（ＣＤＫ１の発現量）で示され；
ｙは比活性の比を表し、この比活性の比は、（ＣＤＫ２の比活性）／（ＣＤＫ１の比活性）で示され、ＣＤＫ２の比活性は、（ＣＤＫ２の活性値）／（ＣＤＫ２の発現量）で示される］
に基づいて算出される値であり、
前記Ｆ（ｘ）及びＧ（ｙ）が、それぞれ下記の式（２）及び（３）：
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ））    ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ））    ・・・（３）
［式中、
ａ、ｂ及びｃは、ｘと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり；
ｄ、ｅ及びｆは、ｙと癌の再発率との相関関係から定められた定数である］
であり、
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第１の閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２の閾値未満であり、且つＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定する、
前記コンピュータプログラム。
【請求項８】
前記判定ステップが、
さらに、（ＣＤＫ１の活性値）／（ＣＤＫ１の発現量）で示されるＣＤＫ１の比活性を算出し、
算出したＣＤＫ１の比活性と、再発リスクスコアと、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定するステップである請求項７に記載のコンピュータプログラム。
【請求項９】
前記判定ステップが、
再発リスクスコアが第１の閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２の閾値未満であり、ＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値未満であり、且つＣＤＫ１の比活性が第４の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定するステップである請求項８に記載のコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の再発リスクの判定方法及びその方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の分野においては、外科的切除、放射線療法、化学療法などによって原発癌を治療しても、ある程度の割合で癌が再発することが知られている。さらに、再発した癌は、悪性度の高い症例が多いことも知られている。実際、原発癌によって死亡する患者よりも、癌の再発によって死亡する患者の方が多い。すなわち、癌の再発は、患者の予後を決定する重要な問題である。それゆえ、手術などにより原発癌を治療した患者について、癌の再発リスクを判定することは、補助化学療法の要否といった治療後の方針を決定する上で極めて有用である。
【０００３】
癌の再発リスクを判定するための因子は、当該技術においていくつか知られている。そのような因子として、例えば患者の年齢、腫瘍の大きさ、進行度、腫瘍の組織及び核のグレード分類、リンパ節転移の有無などが挙げられる。また、近年では、癌の種類に応じたバイオマーカーが多数同定されており、これらは癌の発見及び予後の予測に利用されている。例えば、乳癌では、エストロゲン受容体などのホルモン受容体、及びＨｅｒ２などの受容体型チロシンキナーゼがバイオマーカーとして注目されている。また、Harbeck N.らは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）及びプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）の発現量に基づいて、乳癌の再発リスクを判定できることを報告している（非特許文献１参照）。
【０００４】
本発明者らは、２種類のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値に基づいて、癌細胞の悪性度及び癌の再発リスクを判定する方法をこれまでに開発している（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１６２４１号
【特許文献２】特開２００９−２３２８１５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Harbeck N.ら, J. Clin. Oncol., vol. 20, No. 4, pp. 1000-1007 (2002) "Clinical Relevance of Invasion Factors Urokinase-Type Plasminogen Activator and Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 for Individualized Therapy Decisions in Primary Breast Cancer Is Greatest When Used in Combination"
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌の再発を予防するために施される補助化学療法は、患者にとって身体的、精神的及び経済的な負担となることから、不要であるならばそのような治療を避けたいという要望があった。このような要望をふまえ、原発癌の治療後の補助化学療法などを施さないことを決定する指標を医師などに提供するためには、再発リスクの判定方法は非常に高い精度が求められる。
そこで、本発明は、癌の再発リスクをより正確に判定可能な方法を提供することを目的とする。また、本発明は、そのような判定方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、癌患者から採取した検体について、２種類のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現量及び活性値、並びにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）及びプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）の発現量に基づいて癌の再発リスクを判定すると、その判定精度が従来の方法に比べて顕著に高くなることを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、
癌患者から採取した生体試料から、第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とを取得するステップと、
取得した第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定するステップとを含む、癌の再発リスクの判定方法が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、
癌患者から採取した生体試料から取得した第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とを受信するステップと、
受信した第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定するステップと、
得られた判定結果を出力するステップとをコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の癌の再発リスクの判定方法及びコンピュータプログラムによれば、癌患者について、癌が再発するリスクをより正確に判定することができる。したがって、本発明によって、原発癌の治療後の方針を決定するための指標が医師などに提供されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の癌の再発リスクの判定方法を実現するシステムのハードウエア構成を示すブロック図である。
【図２−１】コンピュータによる癌の再発リスクの判定処理を示すフローチャートである。
【図２−２】コンピュータによる癌の再発リスクの判定処理を示すフローチャートである。
【図３】乳癌患者から採取した検体について、従来の癌の再発リスクの判定方法及び本発明の判定方法によって高リスク群と低リスク群とに分類し、各群について生存時間分析した結果を示すグラフである。
【図４】２種類のＣＤＫの発現量及び活性値と、種々の病理学的診断項目との各組み合わせによって再発リスクを検討した場合の判定精度を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「再発」とは、原発癌を治療した後に、原発巣であった部位及び／又はその付近に同じ癌が発生する場合（局所再発）と、癌細胞が原発巣から分離して遠隔組織（遠隔臓器）に転移し、そこで癌が発生する場合（転移再発）の両方を意味する。
本明細書において、「再発リスク」とは、原発癌を治療した患者の身体に癌が再発する危険と、癌が再発することによって患者が死亡する危険の両方を意味する。
本明細書において、「再発リスクスコア」とは、癌の再発リスクを再発確率として数値的に評価するための指標である。
【００１４】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）とは、サイクリンとの結合により活性化されるキナーゼの総称であり、細胞周期の進行の調節に関与することが知られている。
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）とは、セリンプロテアーゼの一種であり、プラスミノーゲンを基質とする。ｕＰＡは、細胞表面に存在するウロキナーゼ受容体と結合して、腫瘍の増殖及び転移に関与するシグナル伝達を誘発することが知られている。
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）とは、血中の組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の活性を消失させて、線溶系を抑制する分子である。ＰＡＩ−１は、血管内皮細胞より放出されると速やかにｔＰＡと結合し、その活性を阻害するので、血中の線溶活性を規定する因子として知られている。
【００１５】
本明細書において、「ＣＤＫの活性値」とは、活性化されたＣＤＫによってリン酸化された基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で表す）を意味する。
本明細書において、「発現量」とは、生体試料（測定用試料）に含まれる目的のタンパク質又はｍＲＮＡの量を反映する値を意味する。発現量は、測定値自体又はその値に基づいて算出された値であってもよい。また、発現量は、質量（重量）、濃度、比、強度、レベルなどのいずれの形式又は単位で表されてもよい。
【００１６】
［１］癌の再発リスクの判定方法
（1-1）生体試料
本発明の癌の再発リスクの判定方法（以下、単に「判定方法」ともいう）では、まず、癌患者から採取した生体試料から、第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とを取得する。
【００１７】
本発明の実施形態において、生体試料は、癌患者から採取され、該患者の細胞を含む試料であれば特に限定されないが、好ましくは腫瘍組織など、癌細胞を含む試料である。そのような生体試料としては、例えば、胃、肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、大腸、子宮、卵巣などの各種臓器の組織、乳腺組織、前立腺組織、甲状腺組織、リンパ節組織、筋組織、神経組織、軟骨組織、骨組織、皮膚組織、血液、骨髄、体液、体腔洗浄液などが挙げられる。それらの中でも、乳腺組織及び大腸組織が好ましく、乳腺組織がより好ましい。
【００１８】
本発明の実施形態において、癌患者の癌の種類は特に限定されず、例えば胃癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、リンパ腫、口腔癌、皮膚癌、脳腫瘍、白血病、骨髄腫などが挙げられる。それらの中でも、乳癌及び大腸癌が好ましく、乳癌がより好ましい。
【００１９】
（1-2）ＣＤＫの活性値の取得
本発明の実施形態においては、第１ＣＤＫの活性値及び発現量、第２ＣＤＫの活性値及び発現量、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量を取得するために、上記の生体試料から測定用試料を調製することが望ましい。そのような測定用試料は、後述するように当該技術において公知の方法により調製できる。
【００２０】
本発明の実施形態において、第１及び第２ＣＤＫの活性値は、上記の生体試料から調製した測定用試料におけるＣＤＫのキナーゼ活性を測定することにより取得することができる。なお、第１及び第２ＣＤＫは、当該技術において公知のＣＤＫから適宜選択できるが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＤ依存性キナーゼからなる群より選択されることが好ましい。より好ましい実施形態においては、第１ＣＤＫがＣＤＫ１であり、第２ＣＤＫがＣＤＫ２である。
【００２１】
ＣＤＫ活性の測定用試料は、例えば、生体試料を適切な緩衝液中で破砕することにより調製することができる。試料の破砕方法は特に限定されず、例えばピペットによる吸引排出、凍結融解による細胞破砕、ボルテックスミキサーによる撹拌、ブレンダーによる破砕、ペッスルによる加圧、超音波処理装置による超音波処理など、当該技術において公知の方法から適宜選択できる。あるいは、ＣＤＫ活性の測定用試料は、生体試料と、適切な界面活性剤を含む可溶化液とを混合して、該試料中の細胞を溶解することにより調製してもよい。
【００２２】
上記の緩衝液及び可溶化液は、生体試料中の細胞から抽出された測定対象のタンパク質を分解せず、且つ変性させない溶液であれば特に限定されない。緩衝液に用いられる緩衝材及び可溶化液に含まれる界面活性剤は当該技術において公知であり、生体試料の種類に応じて適宜選択できる。そのような緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、MOPS（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、HEPES（２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸）、Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、トリシン（Ｎ−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]グリシン）などが挙げられる。また、界面活性剤としては、例えばノニデットＰ−４０（NP-40）（Shell International Petroleum Company Limited社の登録商標）、Triton-X（Union Carbide Chemicals and Plastics Inc.社の登録商標）、Tween（ICI Americas Inc.社の登録商標）、Brij（ICI Americas Inc.社の登録商標）、Emulgen（花王株式会社の登録商標）などが挙げられる。
上記の可溶化液は、緩衝液と同様の緩衝剤を含むことが好ましい。また、緩衝液及び可溶化液は、必要に応じて、当該技術において公知のプロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤、還元剤などをさらに含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の実施形態においては、上記のようにして調製した測定用試料から目的のＣＤＫを特異的に回収することが好ましい。ＣＤＫの回収には、目的のＣＤＫを特異的に認識して結合する抗ＣＤＫ抗体を用いてもよいし、目的のＣＤＫと結合するサイクリンを特異的に認識して結合する抗サイクリン抗体を用いてもよい。いずれの抗体を用いる場合も、回収されたＣＤＫには、活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが含まれ得る。例えば、サイクリンとＣＤＫとの複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も、回収されたＣＤＫに含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体（不活性型ＣＤＫ）、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターとの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが、回収されたＣＤＫに含まれる。したがって、本発明の実施形態において、ＣＤＫの活性値は、活性型ＣＤＫ、不活性型ＣＤＫ及び各種の競合物質が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。
【００２４】
本発明の実施形態において、第１及び第２ＣＤＫの活性値を取得する方法は、当該技術において公知のキナーゼ活性の測定方法から適宜選択できる。例えば、ＣＤＫの活性値は、生体試料から調製した測定用試料と、ＣＤＫの基質と、リン酸基供与体とを混合し、活性型ＣＤＫによりリン酸化された基質を検出し、その基質の単位量を定量する方法により取得できる。この方法では、活性型ＣＤＫを介する反応によってリン酸基供与体のリン酸基が基質に取り込まれるので、リン酸化された基質を定量することによりＣＤＫの活性値を取得できる。
【００２５】
より具体的な測定方法の例としては、次の方法が挙げられる。まず、測定用試料と、基質タンパク質と、放射性同位元素で標識したリン酸基供与体（γ−〔32Ｐ〕−ＡＴＰ）とを反応させ、基質タンパク質に32Ｐを取り込ませることにより、基質タンパク質を標識する。そして、32Ｐ標識されたリン酸化された基質タンパク質の放射線強度を測定する。得られた測定値と、濃度既知のＣＤＫ標準品の測定から予め作成した検量線とを用いて、リン酸化された基質タンパク質の単位量を定量する。
【００２６】
また、放射性同位元素を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示される方法が挙げられる。この方法では、測定用試料と、基質タンパク質と、アデノシン５'−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）とを反応させ、基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入する。そして、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識する。そして、標識されたチオリン酸化された基質タンパク質の標識量（標識蛍光物質の蛍光強度又は標識酵素の活性）を測定する。得られた測定値と、濃度既知のＣＤＫ標準品の測定から予め作成した検量線とを用いて、リン酸化された基質タンパク質の単位量を定量する。
【００２７】
なお、活性型ＣＤＫによりリン酸化される基質は、当該技術において公知である。例えば、活性型ＣＤＫ１及び活性型ＣＤＫ２の基質としてはヒストンＨ１が挙げられ、活性型ＣＤＫ４及び活性型ＣＤＫ６の基質としてはＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）が挙げられる。
【００２８】
（1-3）発現量の取得
本発明の実施形態において、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１の各発現量は、生体試料から調製した測定用試料を、当該技術において公知の方法により測定することによって取得することができる。なお、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１の各発現量は、タンパク質及びｍＲＮＡのいずれの発現量であってもよいが、好ましくはタンパク質の発現量である。
【００２９】
本発明の実施形態においては、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１のタンパク質の各発現量を取得するための測定用試料として、ＣＤＫの活性値を取得するために調製した上記の測定用試料を用いることができる。
測定用試料に含まれる第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１のタンパク質の発現量は、例えばＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、又は特開２００３−１３０８７１号に開示されるタンパク定量方法などにより測定することができる。なお、これらの方法においては、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１の各タンパク質を捕捉するために、それぞれのタンパク質を特異的に認識して結合する抗体が用いられる。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いた場合、測定用試料に含まれる全ての形態のＣＤＫ１（ＣＤＫ１単体、ＣＤＫ１とサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫ１とその他の化合物との複合体を含む）が捕捉される。
【００３０】
ｕＰＡ及びＰＡＩ−１のタンパク質の各発現量は、ＦＥＭＴＥＬＬＥ（登録商標）（American Diagnostica Inc.社）などの市販の測定用キットを用いて取得してもよい。
【００３１】
本発明の実施形態において、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１のｍＲＮＡの各発現量を取得する場合、ＲＮＡを含む測定用試料は、当該技術において公知の方法により調製することできる。例えば、生体試料を適切な前処理液中で物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、該試料中の細胞に含まれるＲＮＡを溶液中に遊離させることにより、ＲＮＡを含む測定用試料を調製できる。
【００３２】
上記のようにして得られた測定用試料は、必要に応じて、当該技術において公知の方法、例えば遠心分離、フィルター濾過、カラムクロマトグラフィーなどにより、組織及び細胞の残渣を測定用試料から除去してもよい。また、測定用試料に含まれるＲＮＡを精製してもよい。例えば、細胞から遊離させたＲＮＡを含む測定用試料を遠心分離して上清を回収し、この上清をフェノール／クロロホルム抽出することによりＲＮＡを精製できる。また、測定用試料の調製及びＲＮＡの精製は、市販のＲＮＡ抽出・精製キットを用いて行うこともできる。
【００３３】
本発明の実施形態において、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１のｍＲＮＡの各発現量は、当該技術において公知の方法、例えば核酸増幅法などによって取得することができる。また、これらのｍＲＮＡの発現量は、マイクロアレイハイブリダイゼーション法によっても取得できる。この方法では、第１及び第２ＣＤＫ、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１の各タンパク質をそれぞれコードする遺伝子の塩基配列に相補的な核酸プローブが配置されたマイクロアレイを用いる。これらの方法の中でも、核酸増幅法によってｍＲＮＡの発現量を取得することが好ましい。
【００３４】
（1-4）癌の再発リスクの判定
本発明の判定方法では、上記のようにして取得した第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量と、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定する。
本発明の一つの実施形態では、第１ＣＤＫの活性値及び発現量と、第２ＣＤＫの活性値及び発現量とに基づいて再発リスクスコアを取得し、取得した再発リスクスコアと、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定する。
【００３５】
上記の再発リスクスコアは、次の式（１）に基づいて取得することができる。
（再発リスクスコア）＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）    ・・・（１）
［式中、
ｘは第１ＣＤＫの比活性を表し、この第１ＣＤＫの比活性は、（第１ＣＤＫの活性値）／（第１ＣＤＫの発現量）で示され；
ｙは比活性の比を表し、この比活性の比は、（第２ＣＤＫの比活性）／（第１ＣＤＫの比活性）で示され、第２ＣＤＫの比活性は、（第２ＣＤＫの活性値）／（第２ＣＤＫの発現量）で示される］
【００３６】
上記のＦ（ｘ）及びＧ（ｙ）は、それぞれｘ及びｙについての関数であり、それぞれ次の式（２）及び式（３）で表される。
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ1−ｂ）×ｃ））    ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ1−ｅ）×ｆ））    ・・・（３）
［式中、
ａ、ｂ及びｃは、ｘと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり；
ｄ、ｅ及びｆは、ｙと癌の再発率との相関関係から定められた定数である］
【００３７】
式（２）は、ＣＤＫ１比活性値に対する再発率の変化をロジスティックカーブによりフィッティングさせた際に得られる式である。定数ａ（例えば、０．１５）は、ＣＤＫ１比活性値が与えうる最大の再発率（例えば、１５％）を意味している。定数ｂおよびｃは、上記のカーブの形を規定する。
式（３）は、ＣＤＫ２比活性値とＣＤＫ１比活性値との比に対する再発率の変化をロジスティックカーブによりフィッティングさせた際に得られる式である。定数ｄ（例えば、０．２５）は、比活性の比が与えうる最大の再発率（例えば、２５％）を意味している。定数ｅおよびｆは、上記のカーブの形を規定する。
【００３８】
本発明の実施形態において、再発リスクスコアは、上記の式（１）で示されるように、第１ＣＤＫ比活性及び比活性の比の２つの因子によって規定される値である。ここで、ＣＤＫ比活性及び比活性の比について説明する。
ＣＤＫの比活性は、（ＣＤＫ活性値）／（ＣＤＫ発現量）で示されることから理解できるように、ＣＤＫの発現量に対する活性値の比である。すなわち、ＣＤＫ比活性は、生体試料中の細胞に存在するＣＤＫのうち、キナーゼ活性を示したＣＤＫの割合に相当する。したがって、ＣＤＫ比活性は、癌細胞の増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルを反映する。
【００３９】
比活性の比は、（第２ＣＤＫの比活性）／（第１ＣＤＫの比活性）によって示されることから理解できるように、第１ＣＤＫの比活性に対する第２ＣＤＫの比活性の比である。細胞周期においてＣＤＫが活性を示す時期はそのＣＤＫの種類によって異なることから、比活性の比は、細胞周期の所定の時期においてそれぞれ活性を示す２種類のＣＤＫの活性レベルの比を示している。したがって、比活性の比は、癌患者の細胞においていずれのＣＤＫの活性が優位であるか、すなわち細胞周期の中でいずれの時期にある細胞がどの程度の割合で存在するかを反映する。
【００４０】
一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して活発に増殖していることから、ＤＮＡの複製期であるＳ期と、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間であるＧ２期にある細胞の割合が多い場合に、その細胞は癌化していると考えられる。また、癌細胞に見られる異数性及び倍数性は、細胞分裂期であるＭ期を異常な状態で経過した場合、又はＭ期を経ずにＧ１期に進み、そのままＳ期に移行した場合に発生すると考えられる。すなわち、Ｍ期にある細胞の割合が少ない場合も、その細胞が癌化していると考えられる。
したがって、例えば、Ｇ２期からＭ期に移行する際に活性を示すＣＤＫ１を第１ＣＤＫとし、Ｇ１期からＳ期に移行する際に活性を示すＣＤＫ２を第２ＣＤＫとして用いて、これらの活性値及び発現量に基づいてＣＤＫの比活性の比を算出した場合、得られた比活性の比は、Ｓ期又はＧ２期にある細胞が、Ｍ期にある細胞に比べてどれだけ多く存在するかを反映する数値である。よって、比活性の比は、細胞の増殖能を正確に反映する指標として用いることができる。
【００４１】
また、本発明者らはこれまでに、癌の再発の確率が、第１ＣＤＫの比活性、又は第１ＣＤＫと第２ＣＤＫの比活性の比に比例して増加することを見出している。そして、本発明者らは、再発の確率をロジスティック関数によって近似することにより、第１ＣＤＫの比活性、及び第１ＣＤＫと第２ＣＤＫの比活性の比についての関数として、上記の式（２）及び式（３）を得た（特許文献２参照）。
上述したように、ＣＤＫ比活性及び比活性の比は、癌細胞の増殖状態及び増殖能を反映する指標であるので、本発明の実施形態においては、再発リスクスコアを、第１ＣＤＫの比活性についての式（２）と、第１ＣＤＫと第２ＣＤＫの比活性の比についての式（３）との積から取得できる値として規定される。
【００４２】
本発明の実施形態において、癌の再発リスクは、上記のようにして取得した各値と、予め設定された閾値とを比較することにより判定される。具体的には、再発リスクスコアが第１閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２閾値未満であり、且つＰＡＩ−１の発現量が第３閾値未満であるとき、癌の再発リスクが低いと判定される。また、再発リスクスコアが第１閾値以上であるか、ｕＰＡの発現量が第２閾値以上であるか又はＰＡＩ−１の発現量が第３閾値以上であるとき、癌の再発リスクが高いと判定される。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、癌の再発リスクの判定のために、第１のＣＤＫ比活性をさらに用いる。すなわち、判定ステップにおいて、（第１ＣＤＫの活性値）／（第１ＣＤＫの発現量）で示される第１ＣＤＫの比活性を取得し、取得した第１ＣＤＫの比活性と、再発リスクスコアと、ｕＰＡの発現量と、ＰＡＩ−１の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定する。
この実施形態では、再発リスクスコアが第１閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２閾値未満であり、ＰＡＩ−１の発現量が第３閾値未満であり、且つ第１ＣＤＫの比活性が第４閾値未満であるとき、癌の再発リスクが低いと判定される。また、再発リスクスコアが第１閾値以上であるか、ｕＰＡの発現量が第２閾値以上であるか、ＰＡＩ−１の発現量が第３閾値以上であるか又は第１ＣＤＫの比活性が第４閾値以上であるとき、癌の再発リスクが高いと判定される。
【００４４】
上記の第１、第２、第３及び第４の閾値は、判定対象の患者の癌の種類に応じて適宜設定できる値である。すなわち、閾値は、癌の再発が認められた患者群と再発が認められない患者群とを明確に区別できる所定の値として経験的に設定することができる。例えば、生体試料の採取から一定期間後に癌の再発が認められた患者及び再発が認められなかった患者のそれぞれから採取した生体試料について、第１ＣＤＫの活性値及び発現量、第２ＣＤＫの活性値及び発現量、ｕＰＡの発現量、並びにＰＡＩ−１の発現量を取得する。これらの値から、再発リスクスコア、ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量、並びに第１ＣＤＫの比活性を取得する。そして、癌が再発した患者と再発しなかった患者とを区別できる再発リスクスコア、ｕＰＡの発現量、ＰＡＩ−１の発現量及び第１ＣＤＫの比活性の各値を、それぞれ第１、第２、第３及び第４閾値として設定することができる。
【００４５】
本発明の実施形態においては、閾値として、当該技術において公知の値を用いてもよい。例えば、乳癌の再発リスクの判定においては、第１及び第２ＣＤＫがそれぞれＣＤＫ１及びＣＤＫ２である場合、再発リスクスコアの閾値は0.45であり、第１ＣＤＫの比活性の閾値は70（maU/eU）である。また、乳癌の再発リスクの判定において、ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量の閾値は、ELISA法による測定の場合、それぞれ３（ng/mg総タンパク量）及び14（ng/mg総タンパク量）である。なお、乳癌についてのｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量の閾値は、国際基準として確立されている。
【００４６】
［２］癌の再発リスクの判定用コンピュータプログラム
以下に、癌の再発リスクの判定方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム（以下、単に「プログラム」ともいう）について説明する。
【００４７】
本発明の一つの実施形態として、プログラムを実行する判定装置１００と測定用試料の測定装置２００とを含む、癌の再発リスク判定用システムのハードウエア構成を、図１に示す。
この癌の再発リスク判定用システムは、判定装置１００と測定用試料の測定装置２００とを備え、これらの装置はケーブル３００で接続されている。判定装置１００は、測定装置２００により測定された第１ＣＤＫの活性値及び発現量、第２ＣＤＫの活性値及び発現量、ｕＰＡの発現量、並びにＰＡＩ−１の発現量のデータ（以下、「癌患者のデータ」ともいう）を、ケーブル３００を介して受信する。そして、判定装置１００は、測定装置２００から出力されたデータを解析して、癌患者の癌の再発リスクの感受性を判定し、判定結果を出力する。
なお、測定装置２００は、複数の測定装置から構成されていてもよい。例えば、測定装置２００は、ＣＤＫのキナーゼ活性を測定する装置、ＣＤＫの発現量を測定する装置、並びにｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量を測定する装置から構成され得る。また、判定装置１００及び測定装置２００は、一体の装置として構成されてもよい。
【００４８】
上記の判定装置１００の構成について説明する。判定装置１００は、本体１１０と、表示部１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成される。本体１１０において、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１１０ａと、ＲＯＭ（Read Only Memory）１１０ｂと、ＲＡＭ（Random Access Memory）１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インターフェース１１０ｆと、画像出力インターフェース１１０ｇとは、バス１１０ｈによって互いにデータ通信可能に接続されている。
【００４９】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、ＣＰＵ１１０ａにより実行されるコンピュータプログラム及び該コンピュータプログラムの実行に用いられるデータが記録されている。
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭ（Static Random Access Memory）またはＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory）などによって構成される。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０ｂおよびハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ１１０ｃは、ＣＰＵ１１０ａがこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
【００５０】
ハードディスク１１０ｄには、オペレーティングシステム及びアプリケーションシステムプログラムなどの、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及び該コンピュータプログラムの実行に用いられるデータがインストールされている。また、ハードディスク１１０ｄには、本発明の判定方法を判定装置１００に実現させるためのコンピュータプログラム１４０ａ及び判定に用いられる各閾値のデータがインストールされている。
【００５１】
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ（Compact Disc）−ＲＯＭドライブ又はＤＶＤ（Digital Versatile Disc）−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置１１０ｅは、可搬型記憶媒体１４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
可搬型記憶媒体１４０には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム１４０ａ及び各閾値のデータが格納されている。ＣＰＵ１１０ａが可搬型記憶媒体１４０から該アプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、これらのプログラム及び閾値のデータをハードディスク１１０ｄにインストールすることができる。
【００５２】
ハードディスク１１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。
以下、本発明のプログラム（コンピュータプログラム１４０ａ）は、該オペレーティングシステム上で動作するプログラムとして説明する。
【００５３】
入出力インターフェース１１０ｆは、例えばＵＳＢ（Universal Serial Bus）、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェース、及び、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェースなどから構成される。入出力インターフェース１１０ｆには、キーボード及びマウスからなる入力デバイス１３０が接続されている。ユーザは、入力デバイス１３０を使用することにより、測定用試料の測定により取得された癌患者のデータを、コンピュータ本体１１０に入力することができる。入出力インターフェース１１０ｆにはさらに、測定装置２００が接続されている。測定装置２００による測定用試料の測定により取得された癌患者のデータは、測定装置２００からコンピュータ本体１１０に直接送信される。
【００５４】
画像出力インターフェース１１０ｇは、ＬＣＤ又はＣＲＴなどで構成される表示部１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから入力される画像データに応じて映像信号を表示部１２０に出力する。表示部１２０は、入力された映像信号に基づいて、画像データを出力する。表示部１２０はさらに、ＣＰＵ１１０ａから入力された判定結果を出力する。
【００５５】
以下、本発明の一実施形態として、上記の判定装置１００において実行されるコンピュータプログラム１４０ａの処理フローを、図２を参照して説明する。
測定装置２００は、測定用試料の測定により取得された癌患者のデータを、コンピュータ本体１１０に直接送信する。
【００５６】
判定装置１００のＣＰＵ１１０ａは、第１ＣＤＫの活性値及び発現量、第２ＣＤＫの活性値及び発現量、ｕＰＡの発現量、並びにＰＡＩ−１の発現量のデータを、入出力インターフェース１１０ｆを介して測定装置２００から受信する（ステップＳ１）。ＣＰＵ１１０ａは、取得したデータをＲＡＭ１１０ｃに記憶させる。
【００５７】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させた上記のデータを読み出し、再発リスクスコアを算出する（ステップＳ２）。ＣＰＵ１１０ａは、算出した再発リスクスコアをＲＡＭ１１０ｃに記憶させる。なお、このステップＳ２では、ＣＰＵ１１０ａは、第１ＣＤＫの比活性をさらに算出することが好ましい。
【００５８】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶させていた第１、第２及び第３の閾値を読み出す。そして、ＣＰＵ１１０ａは、第１閾値と再発リスクスコアの値とを比較する（ステップ３−１）。再発リスクスコアの値が第１閾値よりも小さい場合（Ｙｅｓ）、処理をステップＳ３−２に進める。反対に、再発リスクスコアの値が第１閾値よりも小さくない場合（Ｎｏ）、処理をステップＳ４−２に進める。
ステップ３−２では、ＣＰＵ１１０ａは、第２閾値とｕＰＡの発現量の値とを比較する。ｕＰＡの発現量の値が第２閾値よりも小さい場合（Ｙｅｓ）、処理をステップＳ３−３に進める。反対に、ｕＰＡの発現量の値が第２閾値よりも小さくない場合（Ｎｏ）、処理をステップＳ４−２に進める。
ステップ３−３では、ＣＰＵ１１０ａは、第３閾値とＰＡＩ−１の発現量の値とを比較する。ＰＡＩ−１の発現量の値が第３閾値よりも小さい場合（Ｙｅｓ）、処理をステップＳ４−１に進める。反対に、ＰＡＩ−１の発現量の値が第３閾値よりも小さくない場合（Ｎｏ）、処理をステップＳ４−２に進める。
【００５９】
上記のステップ２において第１ＣＤＫの比活性を算出している場合、ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶させていた第４閾値を読み出し、第４閾値と第１ＣＤＫの比活性の値とを比較することが好ましい（図２−２のステップ３−４）。第１ＣＤＫの比活性の値が第４閾値よりも小さい場合（Ｙｅｓ）、処理をステップＳ４−１に進める。反対に、第１ＣＤＫの比活性の値が第１閾値よりも小さくない場合（Ｎｏ）、処理をステップＳ４−２に進める。
なお、図２−１及び図２−２から理解できるように、処理フローにおいて、ステップ３−１、３−２、３−３及び３−４の順序は入れ替えることができる。また、上記の説明では、癌患者のデータは、測定装置２００からコンピュータ本体１１０に直接送信されたが、本発明はそのような実施の形態に限定されない。例えば、癌患者のデータは、ユーザによる入力デバイス１３０に対する入力操作により、入出力インターフェース１１０ｆを介してコンピュータ本体１１０に入力されてもよい。
【００６０】
上記の各閾値は、癌患者の癌の種類に応じて設定可能である。この実施形態において設定した各閾値を以下の表１に示すが、各閾値は、これらの値に限定されない。
【００６１】
【表１】
0006002379.tif 000002
【００６２】
本実施形態では、各閾値はハードディスク１１０ｄに予め記憶されていたが、本発明はこのような実施の形態に限定されない。例えば、ＣＰＵ１１０ａは、入力デバイスから入力された各閾値のデータを、入出力インターフェース１１０ｆを介して受信することができる。ＣＰＵ１１０ａはまた、外部記憶装置に記憶された各閾値のデータを、インターネットに接続された入出力インターフェース１１０ｆを介して受信することができる。ＣＰＵ１１０ａはさらに、可搬型記憶媒体１４０に記録された各閾値のデータを読出装置で読み出すことにより、これらを受信することができる。
【００６３】
ＣＰＵ１１０ａは、再発リスクスコアが第１の閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２の閾値未満であり、且つＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値未満であるとき、癌の再発リスクが低いと判定する（ステップＳ４−１）。ＣＰＵ１１０ａはまた、再発リスクスコアが第１の閾値以上であるか、ｕＰＡの発現量が第２の閾値以上であるか又はＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値以上であるとき、癌の再発リスクが高いと判定する（ステップＳ４−２）。
【００６４】
上記のステップ２において第１ＣＤＫの比活性を算出している場合、ＣＰＵ１１０ａは、再発リスクスコアが第１の閾値未満であり、ｕＰＡの発現量が第２の閾値未満であり、ＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値未満であり、且つ第１ＣＤＫの比活性が第４の閾値未満であるとき、癌の再発リスクが低いと判定する（ステップＳ４−１）。ＣＰＵ１１０ａはまた、再発リスクスコアが第１の閾値以上であるか、ｕＰＡの発現量が第２の閾値以上であるか、ＰＡＩ−１の発現量が第３の閾値以上であるか、又は第１ＣＤＫの比活性が第４の閾値以上であるとき、癌の再発リスクが高いと判定する（ステップＳ４−２）。
【００６５】
ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果をハードディスク１１０ｄに記憶させるとともに、画像出力インターフェース１１０ｇを介して表示部１２０に出力する（ステップＳ５）。
なお、ここでは、ＣＰＵ１１０ａは判定結果のみを出力したが、生体試料を採取した癌患者に対して補助療法を行うか否かの指示をさらに出力してもよい。すなわち、ＣＰＵ１１０ａが、癌の再発リスクが低いと判定した場合には、判定結果と共に補助療法を行わない指示を表示部１２０に出力する。
【００６６】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
実施例１では、生体試料の採取後の癌の再発の有無が確認されている生体試料について、本発明の判定方法及び従来の判定方法によって癌の再発リスクを検討し、その判定精度を検討することを目的とする。
なお、この実施例では、従来の判定方法として、第１及び第２ＣＤＫの活性値及び発現量に基づく方法（以下、「従来法１」という）と、ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量に基づく方法（以下、「従来法２」という）とを用いた。
【００６８】
（１）生体試料
生体試料として、ミュンヘン工科大学医学部が管理する腫瘍バンクより、39名の乳癌患者から採取した組織片（39検体）を入手した。これら39検体については、患者に施行された治療法、検体採取後の癌の再発の有無など様々な臨床情報が得られている。また、これら39検体は、検体採取後に癌が再発した症例と再発が一定期間認められなかった症例とが、ほぼ１：１となるように選択された。すなわち、本実施例では、癌の再発率は約50％に設定されている。
【００６９】
（２）測定用試料の調製
各検体（50〜3000 mg）と破砕用ボールとをチューブに入れ、破砕機（Mikro-Dismembrator S；Sartorius社製）により検体を回転速度3000／分で30秒間粉砕した。チューブに１mLの可溶化液（トリス緩衝食塩水（TBS）、pH8.5）を添加し、チューブを４℃にて４時間回転させて検体を可溶化した。チューブを遠心分離（100,000 x g、４℃、４時間）し、得られた上清を測定用試料として回収した。得られた測定用試料は、各測定に用いられるまで凍結保存した。
【００７０】
（３）第１及び第２ＣＤＫの発現量の取得
（3-1）フィルタープレートへのタンパク質の固相化
発現量測定用フィルタープレート（Filter Plate MultiScreen HTS PSQPlate；ミリポア社製）の各ウェルに30％エタノールを100μLずつ加えた。プレートを、吸引装置（吸引／加圧両用ポンプ及びマルチスクリーンHTSバキュームマニホールド；ミリポア社製）に設置し、吸引装置の設定を「-5 in Hg」にしてウェル内の溶液を吸引した（以下、吸引は、吸引装置の設定を「-5 in Hg」にして行った）。吸引後、装置のバルブを閉じ、マニホールドからプレートを取り外した。プレートの各ウェルにメンブレン洗浄液（25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl）を200μLずつ加え、プレートを再びマニホールドに設置して、ウェル内の溶液を吸引した。そして、上記の測定用試料の希釈液を100μLずつウェルに分注した。また、検量線作成のためのＣＤＫ標準品溶液を100μLずつウェルに分注した。
なお、測定用試料の希釈液は下記のようにして調製した。また、ＣＤＫ標準品溶液として、下記の濃度のＣＤＫ１溶液及びＣＤＫ２溶液を用いた。
【００７１】
・測定用試料の希釈液（800μL）
メンブレン洗浄液（25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl）             ：475μL
検体希釈液（0.005% NP-40、25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl）     ：300μL
測定用試料                                                          ： 25μL
合計   ：800μL
・ＣＤＫ１標準品：340、170及び85 ng/mLの３点の希釈系列
・ＣＤＫ２標準品：130、65及び32.5 ng/mLの３点の希釈系列
【００７２】
なお、ＣＤＫ標準品溶液は各濃度について２ウェルずつ分注し、測定用試料の希釈液は各検体について３ウェルずつ分注した。また、対照として、検体希釈液を４つのウェルに100μLずつ分注した。
分注後、プレートをマニホールドに設置し、ウェル内の溶液を吸引することにより、溶液中のタンパク質をフィルタープレートに吸着させた。各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、再度吸引してフィルタープレートを洗浄した。
【００７３】
（3-2）フィルタープレート上での抗原抗体反応及び蛍光標識反応
上記フィルタープレートの各ウェルにブロッキング試薬（４％BSA、TBS（pH7.4））を100μLずつ分注し、溶液を吸引した。そして、各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、再度吸引してフィルタープレートを洗浄した。
ＣＤＫ１の発現量を測定するためのウェルには、抗ＣＤＫ１ポリクローナル抗体（120μg/mL）を50μLずつ分注した。また、ＣＤＫ２の発現量を測定するためのウェルには、抗ＣＤＫ２ポリクローナル抗体（75μg/mL）を50μLずつ分注した。そして、ウェル内の溶液を吸引した。再度、各抗体溶液を50μLずつ添加して、23℃に設定した恒温器内で２時間インキュベートした。プレートをマニホールドに設置し、ウェル内の溶液を吸引した。そして、各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、吸引する洗浄工程を４回繰り返した。
【００７４】
各ウェルに２次抗体試薬（ビオチン化抗ウサギIgG抗体（８μg/mL）；商品名：Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-BIOT Human/Mouse Adsorbed, Southern Biotech社製, 型番：4050-08）を50μLずつ分注し、溶液を吸引した。再度、２次抗体試薬を50μLずつ添加し、23℃に設定した恒温器内で45分間インキュベートした。プレートをマニホールドに設置し、ウェル内の溶液を吸引した。そして、各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、吸引する洗浄工程を２回繰り返した。プレートの各ウェルに蛍光標識試薬（FITC標識ストレプトアビジン（10μg/mL）；商品名：FLUORESEIN STREPTAVIDIN, VECTOR社製, 型番：SA5001）を100μLずつ添加し、ウェル内の溶液を吸引した。そして、各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、吸引する洗浄工程を４回繰り返した。洗浄後、フィルタープレートのアンダードレインを取り外し、該プレートの底をキムタオル（登録商標）（日本製紙クレシア株式会社）に押し付けて、残った溶液を吸収させた。そして、60℃に設定した恒温器内にプレートを逆さまに置いて、充分乾燥させた。
【００７５】
（3-3）蛍光検出
蛍光標識物質からの蛍光の検出にはプレートリーダー（InfiniteF200；テカン社製）を用いた。プレートリーダーの励起波長を485nm、蛍光波長を535nmに設定して、プレートの各ウェルの蛍光強度を測定した。ＣＤＫ標準品溶液を分注したウェルの測定値から、蛍光強度とＣＤＫの量との関係を示す検量線を作成した。この検量線と得られた測定値とから、各測定用試料に含まれるＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量を定量した。
【００７６】
（４）第１及び第２ＣＤＫの活性値の取得
（4-1）20%プロテインＡビーズ懸濁液の調製
プロテインＡビーズ（カタログNo. 17-5280-04；GEヘルスケア社）の試薬容器を転倒混和してビーズを懸濁させ、免疫沈降緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH7.4）、0.1 % NP-40）を加えて20％のビーズ懸濁液を調製した。
【００７７】
（4-2）免疫沈降によるＣＤＫ分子の捕捉
免疫沈降用フィルタープレート（製品名：MultiScreen（登録商標）HTS FilterPlate Hydrophilic, Millipore社製, 型番：MSHVN4550）の各ウェルに、上記の20%プロテインＡビーズ懸濁液を30μLずつ分注した。該プレートにおいて、ＣＤＫ１の活性値を取得するためのウェルには、抗ＣＤＫ１抗体（８μg／ウェル）を、ＣＤＫ２の活性値を取得するためのウェルには、抗ＣＤＫ２抗体（３μg／ウェル）を、バックグラウンド測定のためのウェルには、ウサギＩｇＧ（５μg／ウェル）（CALBIOCHEM社）を添加した。そして、上記（3-1）で調製した測定用試料の希釈液を90μLずつウェルに分注した。また、検量線作成のためのＣＤＫ標準品溶液を30μLずつウェルに分注した。なお、ＣＤＫ標準品溶液として、ＣＤＫ１標準品溶液（5、2.5及び1.25 ng）とＣＤＫ２標準品溶液（40、20及び10 ng）との混合液である、３点の希釈系列を用いた。
【００７８】
フィルタープレートにフタをして、４℃に設定した低温インキュベーター内のプレートシェーカーを用いて120分間撹拌して、免疫沈降反応を行った。反応終了後に、フィルタープレートを上記の吸引装置に設置し、該装置の設定を「-5 in Hg」にしてウェル内の溶液を吸引した（以下、吸引は、吸引装置の設定を「-5 in Hg」にして行った）。吸引後、プレートの各ウェルに免疫沈降用洗浄液１（50 mM Tris-HCl (pH7.4)、１% NP-40）を200μLずつ分注し、これを吸引装置で吸引した。そして、再度、免疫沈降用洗浄液を各ウェルに200μLずつ分注し、これを吸引装置で吸引した。吸引後、プレートの各ウェルに免疫沈降用洗浄液２（50 mM Tris-HCl (pH7.4)、300 mM NaCl）を200μLずつ分注し、これを吸引装置で吸引した。そして、プレートの各ウェルに免疫沈降用洗浄液３（50 mM Tris-HCl (pH7.4)）を200μLずつ分注し、これを吸引装置で吸引した。プレートをキムタオル（登録商標）（日本製紙クレシア株式会社）に押し付けて、残った溶液を吸収させた。
【００７９】
（4-3）酵素反応
上記の洗浄操作後のプレートの各ウェルに、酵素反応試薬（200μg/mLヒストンＨ１タンパク質、５mM ATP-γ-S、20 mM Tris-HCl (pH7.4)）を50μLずつ分注した。プレートにフタをして、37℃に設定した恒温振とう機を用いて、900 rpmで60分間撹拌し、酵素反応を行った。この反応により、基質タンパク質のヒストンＨ１がチオリン酸化される。プレートを恒温振とう機から取り出し、該プレートの下部に回収用プレート（Rigid Plate V Bottom Non-Sterile Clear；Sterilin社製）を重ねた。２つのプレートを重ねた状態で遠心分離（４℃、2000 rpm、５分間）して、回収用プレートに反応生成物の溶液を得た。
【００８０】
（4-4）蛍光標識反応
上記のようにして回収した反応生成物の溶液を、蛍光標識化反応用プレート（MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate；Applied Biosystems社製）の各ウェルに14μLずつ分注した。さらに、蛍光標識試薬（400 nM 5-インドアセトアミドフルオレセイン）を各ウェルに14μLずつ分注し、プレートを撹拌した。そして、プレートをアルミホイルに包んで遮光し、25℃に設定した恒温振とう機を用いて400 rpmで20分間撹拌して、蛍光標識反応を行った。反応停止液（２M MOPS、60 mM N-アセチルシステイン、pH7.4）を各ウェルに200μLずつ分注し、撹拌して蛍光標識反応を停止させた。
【００８１】
（4-5）測定用フィルタープレートへの固相化
活性測定用フィルタープレート（MultiScreen HTS FilterPlate, Hydrophobic；ミリポア社製）の裏面のアンダードレインをゆっくりと取り外し、吸引装置に設置した。活性測定用フィルタープレートの各ウェルに70%エタノールを100μLずつ加え、これを吸引装置で吸引した。吸引後、装置のバルブを閉じ、ポンプをOFFにした。プレートの各ウェルにメンブレン洗浄液（25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl）を200μLずつ加え、これを吸引装置で吸引した。そして、上記の蛍光標識化反応用プレート中の反応を停止させた溶液を、活性測定用プレートの各ウェルに100μLずつ移した。吸引装置のバルブを開いて、活性測定用プレートのウェル内の溶液を吸引した。メンブレン洗浄液を各ウェルに300μLずつ分注し、これを吸引装置で吸引した。プレートの底をキムタオル（登録商標）（日本製紙クレシア株式会社）に押し付けて、残った溶液を吸収させた。そして、60℃に設定した恒温器内にプレートを逆さまに置いて、充分乾燥させた。
【００８２】
（4-6）蛍光検出
蛍光標識物質からの蛍光の検出にはプレートリーダー（InfiniteF200；テカン社製）を用いた。プレートリーダーの励起波長を485nm、蛍光波長を535nmに設定して、活性測定用プレートの各ウェルの蛍光強度を測定した。ＣＤＫ標準品溶液を分注したウェルの測定値から、蛍光強度とＣＤＫの活性との関係を示す検量線を作成した。この検量線と得られた測定値から、各測定用試料に含まれるＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性値を定量した。
【００８３】
（５）ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量の取得
ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量は、上記（3-1）で調製した測定用試料の希釈液を、American Diagnostica社製のＥＬＩＳＡ測定キット（uPA ELISA kit（製品番号894）及びPAI-1 ELISA kit（製品番号821））を用いて測定することにより取得した。なお、測定は、キットに添付されたマニュアルの記載に従って行った。具体的には、以下のとおりである。
抗ｕＰＡ抗体が予めコートされたマイクロプレートの各ウェルに、測定用試料の希釈液及びキットに添付されたｕＰＡの標準品溶液を100μLずつ加えた。抗ＰＡＩ−１抗体が予めコートされたプレートについても同様に、測定用試料の希釈液及びキットに添付されたＰＡＩ−１の標準品溶液を100μLずつ加えた。これらのプレートを４℃で一晩インキュベートした。各プレートのウェルをキットに添付の洗浄用緩衝液で４回洗浄した。抗ｕＰＡ抗体が予めコートされたマイクロプレートの各ウェルに、検出用の抗ｕＰＡ抗体を100μLずつ加えた。抗ＰＡＩ−１抗体が予めコートされたプレートについても同様に、検出用の抗ＰＡＩ−１抗体を100μLずつ加えた。これらのプレートを室温で１時間インキュベートし、各プレートのウェルを洗浄用緩衝液で４回洗浄した。各ウェルに、キットに添付の酵素コンジュゲート希釈液を100μLずつ加えた。これらのプレートを室温で１時間インキュベートし、各プレートのウェルを洗浄用緩衝液で４回洗浄した。各ウェルに、キットに添付の基質溶液を100μLずつ加えて、室温で20分間インキュベートした。そして、各ウェルに0.5N H2SO4を50μLずつ加えて反応を停止させた。そして、各ウェルの450 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の標準品溶液を分注したウェルの測定値から、吸光度と発現量との関係を示す検量線を作成した。この検量線と得られた測定値から、各測定用試料に含まれるｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量を定量した。
【００８４】
（６）癌の再発リスクの判定
（6-1）再発リスクスコア及びＣＤＫ１の比活性の算出
上記のようにして得たＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量及び活性値を用いて、下記の式（１）〜（３）に基づいて再発リスクスコア（ＲＲＳ）を算出した。また、下記の式（４）に基づいてＣＤＫ１の比活性を算出した。
【００８５】
（ＲＲＳ）＝３０００×Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）                    ・・・（１）
Ｆ（ｘ）＝０．１５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−１．６）×７）    ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝０．２５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−１．０）×６）    ・・・（３）
［ただし、式（２）及び式（３）において、
ｘ＝（ＣＤＫ１活性値）／（ＣＤＫ１発現量）であり、
ｙ＝［（ＣＤＫ２活性値）×（ＣＤＫ１発現量）］／［（ＣＤＫ２発現量）×（ＣＤＫ１活性値）］である。］
（ＣＤＫ１比活性）＝（ＣＤＫ１活性値）／（ＣＤＫ１発現量）  ・・・（４）
【００８６】
・従来法１による再発リスクの判定
従来法１による再発リスクの判定では、各検体について算出したＲＲＳ及びＣＤＫ１の比活性の値を、それぞれの閾値と比較して、癌患者を再発リスクの高い群（Ｈｉｇｈグループ）と、再発リスクの低い群（Ｌｏｗグループ）とに分類した。すなわち、（ＲＲＳ）≧0.45であるか又は（ＣＤＫ１比活性）≧70（maU/eU）である検体の患者をＨｉｇｈグループと判定した。また、（ＲＲＳ）＜0.45であり、且つ（ＣＤＫ１比活性）＜70（maU/eU）である検体の患者をＬｏｗグループと判定した。
【００８７】
・従来法２による再発リスクの判定
従来法２による再発リスクの判定では、各検体について取得したｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量の値を、それぞれの閾値と比較して、癌患者を再発リスクの高い群（Ｈｉｇｈグループ）と、再発リスクの低い群（Ｌｏｗグループ）とに分類した。すなわち、（ｕＰＡの発現量）≧３（ng/mg総タンパク量）であるか又は（ＰＡＩ−１の発現量）≧14（ng/mg総タンパク量）である検体の患者をＨｉｇｈグループと判定した。また（ｕＰＡの発現量）＜３（ng/mg総タンパク量）であり、且つ（ＰＡＩ−１の発現量）＜14（ng/mg総タンパク量）である検体の患者をＬｏｗグループと判定した。
【００８８】
・本発明の判定方法による再発リスクの判定
本発明の判定方法による再発リスクの判定では、各検体について算出したＲＲＳ及びＣＤＫ１の比活性の値、並びに取得したｕＰＡ及びＰＡＩ−１の発現量の値を、それぞれの閾値と比較して、癌患者を再発リスクの高い群（Ｈｉｇｈグループ）と、再発リスクの低い群（Ｌｏｗグループ）とに分類した。すなわち、（ＲＲＳ）≧0.45であるか、（ＣＤＫ１比活性）≧70（maU/eU）であるか、（ｕＰＡの発現量）≧３（ng/mg総タンパク量）であるか又は（ＰＡＩ−１の発現量）≧14（ng/mg総タンパク量）である検体の患者をＨｉｇｈグループと判定した。また、（ＲＲＳ）＜0.45であり、（ＣＤＫ１比活性）＜70（maU/eU）であり、（ｕＰＡの発現量）＜３（ng/mg総タンパク量）であり、且つ（ＰＡＩ−１の発現量）＜14（ng/mg総タンパク量）である検体の患者をＬｏｗグループと判定した。
【００８９】
本発明の判定方法、並びに従来法１及び従来法２のそれぞれで分類したＨｉｇｈグループ及びＬｏｗグループについて、ログランク検定による生存時間分析を行った。得られた結果を図３に示す。なお、図３のA）は従来法１について、B)は従来法２について、C)は本発明の判定方法についての結果である。
従来法１では、Ｈｉｇｈグループに分類された20例のうちの12例（60％）およびＬｏｗグループに分類された19例のうちの６例(32%)が、再発により死亡した患者の検体であった。また、従来法２では、Ｈｉｇｈグループに分類された25例のうちの14例(56%)およびＬｏｗグループに分類された14例のうちの４例(29%)が、再発により死亡した患者の検体であった。すなわち、従来法１及び２では、再発リスクが低いと判定されたＬｏｗグループの５年後の無再発生存率は、いずれも90％未満であった。さらに、従来法１及び２により分類されたＨｉｇｈグループとＬｏｗグループとの間には、統計学的有意差は認められなかった（それぞれ、P＝0.0976およびP＝0.1）。
これに対して、本発明の方法では、Ｈｉｇｈグループに分類された29例のうちの17例(59%)およびＬｏｗグループに分類された10例のうちの１例(10%)が、再発により死亡した患者の検体であった。すなわち、本発明の判定方法では、Ｌｏｗグループの５年後の無再発生存率は90％であった。また、ＨｉｇｈグループとＬｏｗグループとの間には、統計学的有意差が認められた（P＝0.0087）。
よって、本発明の判定方法は、従来法に比べて高い判定精度を有しており、この方法に用いられる判定項目の組み合わせは、強力な再発リスク予測因子となり得ることが示唆された。
【００９０】
さらに、本発明の判定方法、並びに従来法１及び従来法２のそれぞれについて、危険率（ハザード比：ＨＲ）を検討した。Ｌｏｗグループ対Ｈｉｇｈグループの危険率を、Ｃｏｘ比例ハザードモデルにより算出した。結果を下記の表２に示す。
表２より、従来法１及び２では、それぞれ危険率が2.2及び1.7であったが、本発明の判定方法では危険率が9.2と著しく高くなった。この値は、従来法１及び２の危険率の値の和（3.9）よりも高いことから、本発明の判定方法では、再発リスクの予測性能が相乗的に向上していることが示唆された。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
（参考例）
この参考例では、上記の生体試料について、従来法１又は従来法２に種々の病理学的診断項目を組み合わせた場合、癌の再発リスクの判定精度がどの程度向上するのかを検討することを目的とする。
用いられた病理学的診断項目は、患者の年齢、腫瘍径、リンパ節転移の有無、組織学的グレード分類、ホルモン受容体（プロゲステロン受容体（PR））の発現、Her2の発現である。それぞれの項目のリスク分類のための閾値は、以下の表３に示す。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
この参考例において、リンパ節転移の有無及び組織学的グレード分類は、検体の組織切片を一般的なヘマトキシリン・エオシン染色法により染色し、顕微鏡で観察することにより決定された。なお、組織学的グレード分類は、「乳癌取り扱い規約（第１６版）」（日本乳癌学会編）に記載の判定基準に従って行った。
【００９５】
Her2の発現は、一般的な免疫組織染色法により決定された。具体的な手順は次のとおりである。検体の組織切片を、アミノシランで予めコートされたスライドグラスに載せ、37℃で一晩乾燥させた。検体をPBSで再水和し、さらに２回洗浄した。そして、0.005％サポニン（Sigma社）を用いて、検体を室温で30分間前処理した。検体をPBSで洗浄して、抗Her2マウスモノクローナル抗体（0.125μg/mL；Oncogene Science社）と、４℃で一晩反応させた。検体をPBSで洗浄し、ウサギ抗マウスＩｇＧ（20μg/mL；Dianova GmbH社）と反応させた。検体をPBSで洗浄し、アルカリフォスファターゼ-抗アルカリフォスファターゼ複合体（50倍希釈；Dianova社）と、室温で30分間反応させた。検体をPBSで洗浄し、アルカリフォスファターゼの基質であるTexas Fast Red（Sigma社）と反応させ、さらにヘマトキシリンで対比染色した。染色後の組織切片を光学顕微鏡（４倍の対物レンズ）で観察した。この観察において、組織切片中にHer2陽性細胞がないか、又は該陽性細胞の数が組織切片中の腫瘍細胞全体に対し10％に満たない場合を陰性と判定し、10％以上である場合を陽性と判定した。
【００９６】
PRの発現については、Her2の場合と同様にして、PRに対する抗体を用いた免疫組織染色法により決定された。具体的な判定手順は、次のとおりである。染色した検体について、光学顕微鏡（４倍の対物レンズ）で組織切片を観察して、腫瘍細胞の核内のPRの免疫反応性を確認した。そして、免疫反応性の認められる細胞の数が組織切片中の腫瘍細胞全体に対し10％に満たない場合を陰性と判定し、10％以上である場合を陽性と判定した。
【００９７】
上記の各項目、並びに従来法１及び２のそれぞれにより癌の再発リスクを判定した場合のハザード比（Ｌｏｗグループ対Ｈｉｇｈグループ、Ｃｏｘ比例ハザードモデル）を、以下の表４に示す。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
従来法１に種々の病理学的診断項目を組み合わせた場合、患者の癌の再発リスクの判定は次のようにして行った。従来法１及び病理学的診断項目の両方で低リスクと判定された検体の患者を、Ｌｏｗグループと判定した。また、従来法１又は病理学的診断項目のいずれかで高リスクと判定された検体の患者を、Ｈｉｇｈグループと判定した。
従来法２に種々の病理学的診断項目を組み合わせた場合、患者の癌の再発リスクの判定は次のようにして行った。従来法２及び病理学的診断項目の両方で低リスクと判定された検体の患者を、Ｌｏｗグループと判定した。また、従来法２又は病理学的診断項目のいずれかで高リスクと判定された検体の患者を、Ｈｉｇｈグループと判定した。
各組み合わせのハザード比（Ｌｏｗグループ対Ｈｉｇｈグループ、Ｃｏｘ比例ハザードモデル）を、以下の表５に示す。また、各組み合わせのハザード比を、各項目のハザード比の和で除した値を、表５及び図４に示す。
【０１００】
【表５】
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【０１０１】
表５を参照して、病理学的診断項目の１つである年齢と従来法１とを組み合わせた場合、得られたハザード比は、2.653であった。この値は、表４に示されるそれぞれのハザード比を足した値「3.545」よりも低い値であった。同様に、他の各病理学的診断項目と従来法１又は従来法２とを組み合わせた場合においても、得られたハザード比は、それぞれのハザード比を足した値よりも低い値であるか、又は、同程度の値であった。
これに対し、本発明の判定方法である従来法１と従来法２とを組み合わせた場合、得られたハザード比は9.177であった。この値は、それぞれのハザード比を足した値「3.962」よりも有意に高い値であった。図４は、表５に示す各項目の組み合わせによって得られたハザード比を、各項目それぞれのハザード比の和によって除した値を、組み合わせ毎に示すグラフである。
図４を参照して、従来法１と従来法２とを組み合わせた本発明の判定方法は、他の組合せによる判定方法と比較して、判定精度が顕著に向上していることがわかる。
【符号の説明】
【０１０２】
１００    判定装置
１１０    本体
１１０ａ  ＣＰＵ
１１０ｂ  ＲＯＭ
１１０ｃ  ＲＡＭ
１１０ｄ  ハードディスク（ＨＤ）
１１０ｅ  読出装置
１１０ｆ  入出力インターフェース
１１０ｇ  画像出力インターフェース
１１０ｈ  バス
１２０    表示部
１３０    入力デバイス
１４０    可搬型記憶媒体
１４０ａ  アプリケーションプログラム
２００    測定装置
３００    ケーブル
【図１】
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【図２−１】
0006002379.tif 000008
【図２−２】
0006002379.tif 000009
【図３】
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【図４】
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