(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記 (1)-(6)の工程を含む、核酸の増幅方法。
(1)所望の細胞由来のクロマチン免疫沈降産物から得られた２本鎖DNA断片に対して、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ、ddNTP、及びクロマチン免疫沈降産物のDNAよりも短く、3’末端にジデオキシヌクレオチドが付加されたＤＮＡ（以下、「decoy DNA1」）を添加し、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼによる酵素反応を行う工程、
(2)上記(1)の工程により増幅されたDNAを精製して、decoy DNA1を除去する工程、
(3)上記(2)で精製されたDNAを変性した後、ポリA-T7オリゴDNAプライマーと、3’末端にジデオキシチミジントリホスフェートが付加され、かつポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数よりも少ない数のポリT塩基が3’末端のジデオキシチミジントリホスフェートに隣接して付加されているＤＮＡ（以下、「decoy DNA2」）を添加し、クレノウ酵素による酵素反応を行う工程、
(4)上記(3)の工程により増幅されたDNAを精製して、decoy DNA2を除去する工程、
(5)上記(4)で精製されたDNAを、in vitroで転写後、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行う工程、
(6)上記(5)の工程により得られたDNAに対して、DNAリガーゼ反応、RNaseH反応、DNAポリメラーゼ伸長反応を行い増幅された２本鎖cDNAを得る工程
【請求項２】
さらにT7 RNAポリメラーゼの酵素反応を行う工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
decoy DNA1の長さが1〜60 bpである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数が5〜50であり、decoy DNA2のポリT塩基の数が3〜48である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
decoy DNA2の長さが1〜60 bpである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
decoy DNA1とdecoy DNA2が同一のＤＮＡである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ1 Uに対して、decoy DNA1が0.01〜10000 ngの量で存在する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
クレノウ酵素1 Uに対して、decoy DNA2が0.01〜10000 ngの量で存在する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
3’末端にジデオキシチミジントリホスフェートが付加され、かつポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数よりも少ない数のポリT塩基が3’末端のジデオキシチミジントリホスフェートに隣接して付加されているＤＮＡの存在下で、クレノウ酵素の酵素反応を行う方法。
【請求項１０】
3’末端にジデオキシチミジントリホスフェートが付加され、かつポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数よりも少ない数のポリT塩基が3’末端のジデオキシチミジントリホスフェートに隣接して付加されているＤＮＡを含む、クレノウ酵素の酵素反応を行うためのキット。
【請求項１１】
3’末端にジデオキシチミジントリホスフェートが付加され、かつポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数よりも少ない数のポリT塩基が3’末端のジデオキシチミジントリホスフェートに隣接して付加されているＤＮＡを含む、クレノウ酵素の酵素反応促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は高等動物の多くの組織において、組織の発生や新陳代謝、損傷部分の修復に中心的な役割を果たしている。幹細胞が適切に機能するためには、幹細胞の重要な形質である自己複製能と多分化能が適切に制御される必要があり、これらに関わる複数の遺伝子の発現が統合的に制御されることが重要と考えられている。遺伝子の発現制御に関わる因子としては、古典的に転写因子やそのコファクターが重要な機能を持つことが知られているが、近年、これらの因子に加えてDNAで形成されるメチル化、あるいは、ヒストンタンパク質上で形成されるメチル化・アセチル化・リン酸化等の化学修飾が遺伝子の発現制御で重要な機能を持つことが明らかになっている1,2（非特許文献１、２）。これらの修飾は、DNA配列の変化を伴わずに遺伝子発現の制御に関わるだけでなく、細胞分裂を介して娘細胞に維持されることから、個々の細胞の形質を細胞分裂の前後で一定の範囲に留める働き、すなわち「細胞記憶」に深く関与しているものと考えられている。そのため、DNAやヒストンタンパク質におけるこれらの化学修飾は、幹細胞のエピジェネティクス(後生的修飾)の中で最も重要な役割を担っていると考えられている。その一方で、胃癌、大腸癌、肝癌、肺癌など様々な癌においてDNAやヒストンタンパク質の化学修飾の異常が明らかにされている。これらのエピジェネティクス異常は発癌プロセスの初期段階から関わると考えられており、癌の分子治療の標的や発癌リスク評価のためのバイオマーカーとして有用と考えられる3（非特許文献３）。【０００３】
各細胞におけるエピジェネティクス修飾の実態を明らかにするためには、各細胞の核に存在するDNA-タンパク質複合体であるクロマチンを対象とし、個々の遺伝子領域において形成されているDNAのメチル化修飾やこれら遺伝子領域に接するヒストンタンパク質の化学修飾を特定する必要がある。現在、汎用性と精度が高い手法として、クロマチン沈降(ChIP; Chromatin immunoprecipitation)を利用した解析系が確立している。この手法では、はじめに目的細胞のクロマチンを断片化しておき、特異抗体を用いて特定の化学修飾を持つDNA断片のみを免疫沈降させた後、得られた免疫沈降産物中のDNA配列を特定する。DNA配列の特定方法としては、特異的Primerを用いたPCR(polymerase chain reaction)反応による検出法、DNAマイクロアレイ(例えばプロモーターアレイ等)を用いた検出法、次世代シークエンサーを用いた直接的な配列解析等が挙げられる4（非特許文献４）。これらは、ChIP-PCR解析法、ChIP on chip(ChIP-chip)解析法、ChIP-sequence法と呼ばれている。これらの解析法の中で、広範囲なDNA領域の解析が出来るのは、ChIP-chip解析とChIP-sequence解析の二つである5（非特許文献５）。【０００４】
ChIP-chip解析あるいはChIP-sequence解析は、広範囲なDNA領域を対象とした網羅的な解析ができるものの、各細胞から抽出したChIP産物を大量に必要とする。これらの解析を行うために必要なChIP産物量は、解析手法の違いにより異なるものの、広く普及しているChIP-chip解析ではChIP産物から抽出した数〜数十μg程度の二本鎖DNA断片を必要とする6（非特許文献６）。これらのChIP産物(二本鎖の短いDNA断片)を得るために必要な細胞数については、対象とする細胞における各修飾の形成頻度によって異なるが、一般的には106〜107個程度の数の細胞サンプルを必要とする7（非特許文献７）。しかしながら、生体中に存在する幹細胞の数は極度に少なく、例えば造血幹細胞集団であるCD34-/low c-Kit+ Sca-1+ Lin-細胞はマウス骨髄細胞の0.005％を占めるにしかすぎない8（非特許文献８）。また、肝幹細胞集団であるc-Met+ c-Kit- CD49f+/low CD29+ CD45- Ter119-細胞はマウス胎仔肝臓中の0.3%〜0.4%を占めるにしかすぎないことが明らかとなっている9（非特許文献９）。そのため、従来、このような幹細胞を対象として、これらの細胞のDNA上で形成されているDNAやヒストンの化学修飾を網羅的に解析することは困難であった。【０００５】
このような問題点を克服する唯一の手法は、解析対象とする細胞から得たChIP産物(二本鎖の短いDNA断片)を増幅して解析に用いることである。これまでに、PCR反応を利用してChIP産物の増幅を行うLM-PCR(Ligation-mediated PCR)法、また、in vitro RNA転写(in vitro transcription; T7-IVT)法が報告されている10（非特許文献１０）。これまでの報告において、LM-PCR法を用いたDNA増幅法ではPCRのサイクル増加に伴って増幅に偏りが生じることが知られている11（非特許文献１１）。一方、in vitro transcription(T7-IVT)法についても複数の報告がある11, 12, 13, 14（非特許文献１１、１２、１３、１４）。このT7-IVT法はPCR反応を介さずに線形的な増幅が出来るため有用と考えられているが、増幅の過程で少なくとも3つの酵素反応ステップが必要となる15, 16（非特許文献１５、１６）。T7-IVT法における第一のステップでは、ChIP産物の末端に短いプロモーター配列を有した人工的なDNA配列を付加する必要があり、このときTerminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)等の酵素を用いる15。更に、増幅の第二ステップではTdTによって付加された塩基配列に、人工的に合成された短いプロモーター配列(例えばT7プロモーターを入れる)を持つ別のオリゴDNAを結合させ、クレノウ酵素等を用いて二本鎖DNA断片を生成する必要がある。また、第三のステップではT7 RNAポリメラーゼを用いてプロモーター配列を持つDNA断片からcRNAを転写させる必要があり、T7 RNA polymerase等の酵素の利用が必須である16。また、増幅の最終段階では、cRNAからcDNAを得るために逆転写酵素、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ等を用いる。しかしながら、T7-IVT増幅法で用いられるKlenow fragmentやT7-RNA polymeraseなどの酵素はKm値が高く、基質DNA量が微少なときには反応が殆ど進まなくなるとされる17, 18, 19（非特許文献１７、１８、１９）。そのため、基質となるDNA量が非常に少ない場合は酵素反応が殆ど進行せず、極微量のChIP産物を対象として安定的にT7-IVT増幅を行う事が困難であった。すなわち、LM-PCR法による増幅では増幅の感度は高いものの増幅の精度が不足する問題があり、T7-IVT法による増幅では増幅の精度は高いものの増幅の感度が不足する問題が生じる。このような問題に対する解決法の一つとして、解析対象となる動物種以外のクロマチンを人為的に添加し、見た目上の基質DNA量を増加させることにより、酵素反応の効率化を促す方法がある。例えば、O’Neillらは微量なマウス細胞サンプルの解析を行うために、断片化したサケDNAをキャリアDNAとして添加し、みかけ上の基質DNA量を増加させることで、酵素反応の効率化を図っている20（非特許文献２０）。しかしながら、酵素反応後に解析対象となるマウス由来のDNA断片とサケ由来のDNA断片を分離することができないため、双方を正確に区別することが困難であり、このような手法では原理的に解析の精度が確保できない。他方、RNAの増幅に関して有用な報告がある。野島らは、増幅対象とするmRNA集団にChum-RNAと名付けた短い人工的なRNA分子を添加することにより、見かけ上のRNA基質量を増加させ、RNAから効率良くcDNAを生成するための方法を報告している21（非特許文献２１、特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat Rev Genet. 2007 8(4):263-71.
【非特許文献２】Nature. 2009 459(7243):108-12.
【非特許文献３】Mol Cell. 2007 12;25(1):1-14.
【非特許文献４】Curr Opin Genet Dev. 2004 14(6):697-705.
【非特許文献５】Trends Genet. 2011 27(4):141-8.
【非特許文献６】[URL]http://www.chem.agilent.com/en-US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx?whid=42637
【非特許文献７】Biotechniques. 2007 43(6):791-7.
【非特許文献８】Nat Protoc. 2006;1(6):2979-87.
【非特許文献９】J Cell Biol. 2002 7;156(1):173-84.
【非特許文献１０】Genome Res. 2008:18(3):393-403.
【非特許文献１１】BMC Genomics. 2003:4(1):19. (PMID: 12740028)
【非特許文献１２】Nucleic Acids Res. 2008 36(4):e21. (PMID: 18180247)
【非特許文献１３】Katou Y, Methods Enzymol. 2006: 409:389-410. (PMID: 16793414)
【非特許文献１４】CSH Protoc. (2008) 2008:pdb.top42. doi: 10.1101/pdb.top42. (PMID: 21356838)
【非特許文献１５】CSH Protoc. 2008 1;2008:pdb.prot5002. doi: 10.1101/pdb.prot5002. (PMID: 21356834)
【非特許文献１６】CSH Protoc. 2008 1;2008: pdb.prot5003. doi: 10.1101/pdb.prot5003. (PMID: 21356835)
【非特許文献１７】J Biol Chem. 1990 Aug 25;265(24):14579-91.
【非特許文献１８】J Biol Chem. 1975 Jun 10;250(11):4073-80.
【非特許文献１９】Biochemistry. 1983 Jul 19;22(15):3537-46.
【非特許文献２０】Nat Genet. 2006 Jul;38(7): 835-41.s
【非特許文献２１】Methods Mol Biol. (2011) 729:15-35.
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０３２５７４パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
LM-PCR法による増幅では増幅の感度は高いものの増幅の精度が不足する問題があり、T7-IVT法による増幅では増幅の精度は高いものの増幅の感度が不足する問題がある。テンプレートDNAの完全長を線形的に増幅することが可能な技術は唯一T7- IVT 増幅法であるが、この方法は酵素反応等によりテンプレートDNAの末端にT7プロモーター配列を付加することが必須となる。具体的に(i)Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)酵素を用いたテンプレートDNA3’末端へのポリT配列の付加、(ii)T7配列を有したポリA配列塩基のハイブリダイズと二本鎖形成、(iii)Klenow酵素による突出末端の平滑化の操作が必要であり、これらを順次行う必要がある。このとき操作(ii)はDNAの二本鎖形成であるため、比較的効率良く反応が進行するが、操作(i)、(iii)は酵素反応に基づくため、基質量が少ないときには酵素反応が殆ど進まないといった問題点を持つ。例えば、TdT酵素やKlenow酵素の至適基質濃度(Km値)は1μM〜1mMと高く、基質濃度が極めて少ない場合は酵素反応が殆ど進まないといった問題点を持つ。そのため、少数の細胞サンプルから得られる極微量の短鎖DNA(微量かつ短い長さのDNA断片)を線形的に増幅することが困難であった。【０００９】
本発明は、これらの従来技術が抱える問題を解決する核酸増幅法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ChIP産物等として得られる短い二本鎖DNA分子に対して、DNA基質量を人為的にコントロールし、短い二本鎖DNA分子に対して酵素反応処理を実施できる基盤要素を開発した。具体的には、T7-IVT反応により増幅を受けず、かつ、T7-IVT処理後に完全除去が可能な低分子DNAを添加することにより、微量ChIP産物を円滑に増幅することに成功した。【００１１】
本発明では、DNA T7-IVT 増幅法の初期ステップである(i)Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)反応によるテンプレートDNA3’末端へのポリT配列の付加、(iii)Klenow酵素による突出末端の平滑化など、酵素反応に依存したステップの反応効率を大幅に効率良く進めることが可能である。具体的には、DNA T7- IVT 増幅法の初期ステップで微量テンプレートDNA(100-500塩基程度の長さを持つ)に人工的に合成した20-60塩基程度の一本鎖もしくは二本鎖DNA断片(decoy DNA)を添加しておき、上記酵素反応を行った後、最後にdecoy DNAのみを分子量の差異に基づいて完全に除去することにより、見かけ上のDNA基質濃度を増加させて酵素反応を効率良く行う。この操作を行う際には、decoy DNA自体の増幅を抑制する必要があるため、本発明ではdecoy DNAに下記性状を付加する。具体的には、(a)TdT反応の際に使用するdecoy DNAは3’末端にジデオキシヌクレオチド(ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP)を持つ。(b)Klenow酵素による突出末端の平滑化の際に使用するdecoy DNAは末端にddTTPを付加しておき、テンプレートDNAの3’側の修飾部位(poly T部分)と完全に結合できるようにする。これにより、(a) TdT反応の際、decoy DNAに余分なT付加反応が生じず、decoy DNAの塩基長が不要に増加することを阻害可能である。また、(b)により3’側に修飾部位(poly T)を持つテンプレートDNAに対してdecoy DNAの末端部分が完全に結合することが出来るようになる。decoy DNAに(b)の性状を付加することにより、Klenow酵素反応を行う際にdecoy DNA末端のddTTPが削除されることを阻害する。これにより、3’側に修飾部位(poly T)を持つテンプレートDNAとdecoy DNAを二本鎖形成させた後においても、decoy DNAのT7プロモーター配列を1本鎖の状態に留めておくことが出来、decoy DNAからのcRNAの生成を完全に阻害することが可能である。本発明では、DNA T7-IVT増幅法の初期ステップの酵素反応を効率化することが可能であるため、微量なクロマチン免疫沈降産物(微量短鎖DNA断片)を対象としてDNA T7- IVT増幅法を実施することが可能となる。【００１２】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記(a)及び／又は(b)の工程を含む、核酸の増幅方法。
(a) ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡの存在下で、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応を行う工程
(b) ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡの存在下で、クレノウ酵素の酵素反応を行う工程
（２）さらにT7 RNAポリメラーゼの酵素反応を行う工程を含む（１）記載の方法。
（３）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡが、3’末端にジデオキシヌクレオチドが付加されたＤＮＡである（１）又は（２）記載の方法。
（４）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡの長さが1〜60 bpである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡが、3’末端にジデオキシチミジントリホスフェートが付加され、かつポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数よりも少ない数のポリT塩基が3’末端のジデオキシチミジントリホスフェートに隣接して付加されているＤＮＡである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数が5〜50であり、ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡのポリT塩基の数が1〜60である（５）記載の方法。
（７）ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡの長さが1〜60 bpである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）(a)のターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡと(b)のポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡが同一のＤＮＡである（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ1 Uに対して、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡが0.01〜10000 ngの量で存在する（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）クレノウ酵素1 Uに対して、ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡが0.01〜10000 ngの量で存在する（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡ及び／又はポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡを含む、核酸を増幅するためのキット。
（１２）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡ及び／又はポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡを含む、核酸増幅促進剤。
（１３）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡの存在下で、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応を行う方法。
（１４）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡを含む、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応を行うためのキット。
（１５）ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡを含む、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応促進剤。
（１６）ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡの存在下で、クレノウ酵素の酵素反応を行う方法。
（１７）ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡを含む、クレノウ酵素の酵素反応を行うためのキット。
（１８）ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡを含む、クレノウ酵素の酵素反応促進剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、従来のdecoy DNAを用いずに行うDNA T7- IVT増幅方法に比べて、より微量なDNAテンプレートを増幅することが出来るようになる。従来、微量なDNAテンプレートを増幅する際には、感度は高いものの正確性に欠けるLM-PCR法が用いられてきた。本発明では、正確性の面では有利であるが、感度面で劣っていたDNA T7- IVT増幅方法を大幅に改善し、微量なDNAテンプレートを対象とした線形的増幅方法を開発した。これにより、微量DNAテンプレートを線形性良く増幅することが出来るようになり、微量DNAテンプレートを用いた塩基配列情報解析 (プロモーターアレイあるいは次世代シークエンサー解析等) を精度良く実施することが可能となった。これまで、DNAとタンパク質との相互作用（結合）を同定する一つの手法として、クロマチン免疫沈降(ChIP)法と塩基配列情報解析(プロモーターアレイあるいは次世代シークエンサー解析等)を組み合わせた解析手法が有用とされてきたが、生体中に極僅かにしか存在しない微少な細胞 (例えば組織幹細胞や癌幹細胞など) を対象としてこのような解析を精度高く実施することは困難であった。本発明は微量DNAテンプレートを線形性良く増幅することを可能とすることにより、微少な細胞等におけるDNAとタンパク質との相互作用を精度良く解析するための基盤を提供する。上記技術を用いて得られる情報は、病態の解明や創薬の開発、あるいは疾患のリスク評価のためのバイオマーカーの同定を行う上で非常に価値が高い。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2011‐215318の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】(A)マウス肝臓細胞から調製した断片化ゲノムDNA、および、LM-PCR法もしくはT7-IVT法で増幅後に得られたDNAの電気泳動結果。テンプレートDNAは100-500bp程度の長さで断片化されている。これらの一部(10ng)を各方法で増幅したところ、IVT法では100-500bp程度のDNAが均一に増幅されているが、T7-IVT法では250bp程度の部分が選択的に増幅されている。また、テンプレートDNAを加えずに同様の方法で増幅処理を行ったところ、IVT法ではバンドが認められないが、T7-IVT法ではバックグランドと考えられるバンドが検出された。増幅の精度において、T7-IVT法はLM-PCR法に勝ると考えられた。  (B)IVT増幅におけるTdT反応について検証した。TdT反応度に20bp程度の塩基付加が確認された。ポリA-T7オリゴDNAプライマー 付加反応後には更にDNAの長さが増大しており、各反応が進行していることが確認された。  (C)マウス肝臓細胞から調製した断片化ゲノムを抗トリメチル化ヒストンH3K27抗体で免疫沈降し、免疫沈降産物中に含まれる各遺伝子の転写開始地点近傍の遺伝子配列の有無をPCR法により確認した。100pgの免疫沈降産物をテンプレートとしてLM-PCR法あるいはT7-IVT法で増幅を行った場合、どちらの方法を用いた場合でも1000pgの免疫沈降産物をテンプレートとした場合と同一の結果が得られた。10pgの免疫沈降産物をテンプレートとして増幅を行った場合、T7-IVT法を利用すると1000pg群に類似したバンドが検出されたが、LM-PCR法を利用するとバンドは検出されなかった。増幅の感度において、T7-IVT法はLM-PCR法に勝ると考えられた。
【図２】Decoy DNAの添加による極微量な免疫沈降産物の高感度かつ高精度な増幅法の概略。T7-IVT法は一般的に増幅の精度や感度に優れるが、基質となるDNA量が極端に少ない場合、酵素反応が効率良く行われないといった欠点を持つ。DNA基質量が不足するT7-IVT法の初期ステップにおいて、Decoy DNAを添加することにより酵素反応が効率良く進む。
【図３】Decoy DNAの添加は各酵素反応の効率化において有用であるが、増幅後には効率良く除去されなければならない。Decoy DNAの長さ(概ね70bp程度)は免疫沈降産物(概ね100-500bp 程度)よりも有意に短いことから、100bp以下の塩基を選択的に除去することが可能なDNA精製システムを利用することで、殆ど除去することが出来る。上図はDecoy DNA除去前、下図は除去後のクロマトグラムを示す。
【図４】(A)Decoy DNAの添加がクロマチン免疫沈降産物の増幅結果に悪影響を及ぼさないことは必須である。テンプレートDNAを加えずにDecoy DNAのみを添加して増幅を行った結果、バンドは検出されず、Decoy DNAは増幅されないことが確認された。(B)Decoy DNA添加が増幅の感度に及ぼす影響の検討。各量の断片化ゲノムDNAをテンプレートとして、同じ条件でT7-IVT増幅を行った。Decoy DNAを加えることで、0.08ng(80pg)のDNA断片の増幅が可能であることが確認された。(C) 各量の断片化ゲノムDNAをテンプレートとしてDecoy DNA存在下あるいは非存在下でT7-IVT増幅を行った。テンプレートDNA量が少ない(80pg)場合、Decoy／ＤＮＡ存在下の方がより高い確率でDNA配列が増幅されていた。(D)各細胞数のマウス肝細胞を断片化後、抗トリメチル化ヒストンH3K27抗体を用いて免疫沈降を行い、各免疫沈降産物をDecoy存在下でT7-IVT増幅した。ChIP-PCR法による確認の結果、僅か1x103細胞(1000細胞)より調製したクロマチン免疫沈降産物に対して、T7-IVT法による増幅が安定して可能であることが明らかとなった。
【図５】(A)Decoy DNAを用いたT7-IVT増幅によって得られる増幅産物を用いたChIP-chip解析結果。未処理の断片化ゲノムDNA、および、IVT増幅後に得られた断片化ゲノムDNAに由来する増幅産物(DNA)にそれぞれ異なる蛍光色素を取り込ませ、双方をプロモーターアレイ上で競合的にハイブリダイズし、アレイデーターを解析した。T7-IVT法による増幅では、増幅の前後で各蛍光強度のDNAの存在頻度はほぼ同じパターンを維持していた。一方、LM-PCR法による増幅では、増幅の前後で各蛍光強度のDNAの存在頻度はほぼ同じパターンを維持しておらず、増幅のバイアスが生じていた。(B)プロモーターアレイ上の各遺伝子領域における増幅前サンプルと増幅後サンプルの存在量の推移。T7-IVT法ではシグナルがほぼ横這いとなっており、増幅前後でのDNA量の偏りが殆ど生じていないことが分かる。LM-PCR法では遺伝子領域毎に増幅前サンプルと増幅後サンプルの存在量が異なっており、様々なピークが検出される。
【図６】Decoy DNAを用いたT7-IVT増幅によって得られる増幅産物を用いたChIP-chip解析結果。次世代シークエンス後に得られた各増幅産物の遺伝子配列より、Ｄecoy DNAに由来する人工配列をインフォマティクスによって削除した後、ゲノム配列にマッピングしたところ、増幅前と同様なパターンで増幅されていることを確認した。各増幅産物の長さは、増幅前とほぼ一致しており、テンプレートDNAの全長を増幅できたものと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、下記(a)及び／又は(b)の工程を含む、核酸の増幅方法を提供する。
(a) ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡの存在下で、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応を行う工程
(b) ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡの存在下で、クレノウ酵素の酵素反応を行う工程
本発明の核酸増幅方法は、さらにT7 RNAポリメラーゼの酵素反応を行う工程を含んでもよい。
【００１７】
(a)のターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）により3’末端に塩基が付加されないＤＮＡは、TdTのみかけ上の基質となるDNA分子（decoy DNA）であればよい（以下、(a)のターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）により3’末端に塩基が付加されないＤＮＡを「(a)のdecoy DNA」と呼ぶこともある）。TdTにより3’末端に塩基が付加されないためには、例えば、(a)のdecoy DNAの3’末端にはターミネーターとして機能する塩基であるジデオキシヌクレオチド (ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTPのいずれか)を付加しておく。このターミネーター修飾により、(a)のdecoy DNAはTdT酵素存在下でも3'末端に塩基が付加されることが無く、(a)のdecoy DNAが増幅されることがない。
【００１８】
(a)のdecoy DNAの長さは、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応およびポリA-T7オリゴDNAプライマーとの二本鎖形成およびクレノウ酵素の酵素反応を行った時点において、TdTの基質となるDNA（例えば、解析の対象となるDNA断片）と区別できる長さであるとよく、例えば、TdTの基質となるDNAより短くなるように調整するとよく、具体的には、1〜60 bpであるとよく、好ましくは、15〜50bpであり、より好ましくは、15〜40bpである。
【００１９】
TdT 1Uに対して、(a)のdecoy DNAは0.0001〜100 ngの量で存在するとよく、好ましくは、      0.001〜100 ngの量、より好ましくは、0.01〜100 ng の量で存在する。
【００２０】
TdTの酵素反応は、状況に応じた適切な条件で行えばよく、例えば、温度37 ℃、時間0.1〜0.5 時間、pH7.0〜7.4、基質濃度0.01〜10 mM、TdT濃度0.1〜10 U/μl、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど、T7-IVT法でTdTの酵素反応を行う場合には、dTTP）濃度1〜1000 μM、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）濃度0.01〜10 mM の条件下で行うとよい。
【００２１】
(a)のdecoy DNAを添加することにより、TdTの酵素反応を促進することができるので、(a)のdecoy DNAは、TdTの酵素反応促進剤として利用することができる。従って、本発明は、 (a)のdecoy DNAを含む、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応促進剤を提供する。
【００２２】
(b)のポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素（Klenow酵素）の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡは、Klenow酵素のみかけ上の基質となるDNA分子（decoy DNA）であればよい（以下、(b)のポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡを「(b)のdecoy DNA」と呼ぶこともある）。ポリA-T7オリゴDNAプライマーとKlenow酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないためには、(b)のdecoy DNAにポリA-T7 オリゴDNAプライマー（１本鎖）が結合した際にT7プロモーター配列が１本鎖に保たれるようにするとよい。例えば、(b)のdecoy DNAとポリA-T7オリゴDNAプライマーは人為的に長さを調整するとよく、二本鎖形成を行った際に、T7プロモーター配列（T7領域）が1本鎖になるように設計しておくとよい。しかしながら、一般的な配列を持つdecoy DNAでは、以後の操作でKlenow酵素を添加した際にKlenow酵素が持つ3’→5’方向への伸長促進能によりT7プロモーター領域が二本鎖化されてしまう。そこで、(b)のdecoy DNAの末端を予めジデオキシヌクレオチドで修飾しておき、Klenow酵素存在下においても(b)のdecoy DNAの末端部分と結合したT7プロモーターで二本鎖形成が生じないようにするとよい。このとき、(b)のdecoy DNAの末端に付加するジデオキシヌクレオチドはddTTPであるとよい。(b)のdecoy DNA末端のジデオキシヌクレオチドがポリA-T7 オリゴDNAと相補鎖形成できない場合は、Klenow酵素を添加した際にKlenow酵素の3’→5’ヌクレアーゼ活性によりジデオキシヌクレオチドが削除され、Klenow酵素のfill-in反応の際にポリA-T7オリゴDNAのプロモーター領域が二本鎖化されてしまう。そこで、Klenow酵素反応時で用いる(b)のdecoy DNAは3'末端のPolyT塩基がポリA-T7 オリゴ DNAに比べて数塩基以上短く、かつ、(b)のdecoy DNAは3'末端にはddTTPを持つとよい。(b)のdecoy DNAは、例えば、3’末端にddTTPを付加し、かつポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数よりも少ない数のポリT塩基を3’末端のddTTPに隣接して付加しておく。ポリA-T7オリゴDNAプライマーのポリA塩基の数は5〜50であるとよく、好ましくは、10〜40 bpであり、より好ましくは、15〜25bpであり、(b)のdecoy DNAのポリT塩基の数は3〜48であるとよく、好ましくは、8〜38bpであり、より好ましくは、13〜23bpである。
【００２３】
(b)のdecoy DNAの長さは、ポリA-T7オリゴDNAプライマーとの二本鎖形成を行った時点において、Klenow酵素の基質となるDNA（例えば、解析の対象となるDNA断片）と区別できる長さであるとよく、例えば、Klenow酵素の基質となるDNAより短くなるように調整するとよく、具体的には、1〜60 bpであるとよく、好ましくは、15〜50bpであり、より好ましくは、15〜40bpである。
【００２４】
Klenow酵素1 Uに対して、(b)のdecoy DNAは0.01〜10000 ngの量で存在するとよく、好ましくは、2〜60 ngの量、より好ましくは、5〜15ng の量で存在する。
【００２５】
Klenow酵素の酵素反応は、状況に応じた適切な条件で行えばよく、例えば、温度37℃、時間60〜120分、pH7.4 、基質濃度0.01〜10 mM、Klenow酵素濃度0.01〜1.0 U/μl、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど、T7-IVT法でKlenow酵素の酵素反応を行う場合には、dTTP）濃度1〜1000 μM、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）濃度0.01〜10 mM の条件下で行うとよい。
【００２６】
(b)のdecoy DNAを添加することにより、Klenow酵素の酵素反応を促進することができるので、(b)のdecoy DNA はKlenow酵素の酵素反応促進剤として利用することができる。従って、本発明は、(b)のdecoy DNAを含む、Klenow酵素の酵素反応促進剤を提供する。
【００２７】
(a)のdecoy DNAと(b)のdecoy DNAは同一のＤＮＡであってもよい。
【００２８】
以上に説明したように、(a)のdecoy DNA及び／又は(b)のdecoy DNAは、核酸増幅促進剤として利用することができる。従って、本発明は、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡ（(a)のdecoy DNA）及び／又はポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡ（(b)のdecoy DNA）を含む、核酸増幅促進剤を提供する。
【００２９】
また、本発明は、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡ（(a)のdecoy DNA）及び／又はポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡ（(b)のdecoy DNA）を含む、核酸を増幅するためのキットを提供する。 (a)及び(b)のdecoyについては、上述した。本発明のキットは、さらに、TdT、Klenow酵素、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど）、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）、緩衝液、取扱説明書、などを含んでもよい。
【００３０】
本発明は、(a)のdecoy DNA(ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡ)の存在下で、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応を行う方法を提供する。 (a)のdecoy DNAについては、上述した。TdTの酵素反応は、状況に応じた適切な条件で行えばよく、例えば、温度37℃、時間0.1〜0.5 時間、pH7.0〜7.4、基質濃度0.01〜10 mM、TdT濃度0.1〜10 U/μl、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど、T7-IVT法でTdTの酵素反応を行う場合には、dTTP）濃度1〜1000 μM、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）濃度濃度0.01〜10 mMの条件下で行うとよい。
【００３１】
また、本発明は、(a)のdecoy DNA(ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼにより3’末端に塩基が付加されないＤＮＡ)を含む、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼの酵素反応を行うためのキットを提供する。 (a)のdecoy DNAについては、上述した。本発明のキットは、さらに、TdT、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど）、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）、緩衝液、取扱説明書、CIAP(仔ウシ腸管粘膜由来アルカリホスファターゼ)、decoy DNA、などを含んでもよい。
【００３２】
本発明は、(b)のdecoy DNA(ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡ)の存在下で、クレノウ酵素の酵素反応を行う方法を提供する。 (b)のdecoy DNAについては、上述した。Klenow酵素の酵素反応は、状況に応じた適切な条件で行えばよく、例えば、温度37℃、時間60〜120分、pH7.4、Klenow酵素濃度0.01〜1.0 U/μl、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど、T7-IVT法でKlenow酵素の酵素反応を行う場合には、dTTP）濃度1〜1000 μM、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）濃度0.01〜10 mM、の条件下で行うとよい。
【００３３】
また、本発明は、ポリA-T7オリゴDNAプライマーとクレノウ酵素の共存在下で、ポリA-T7オリゴDNAプライマーのT7領域で二本鎖形成を受けないＤＮＡを含む、クレノウ酵素の酵素反応を行うためのキットを提供する。 (b)のdecoy DNAについては、上述した。本発明のキットは、さらに、Klenow酵素、塩基（dATP、dGTP、dCTP、dTTPなど）、補因子（Mg2+、Mn2+、Co2+などの二価イオン）、緩衝液、取扱説明書、decoy DNA、ポリA-T7オリゴDNAプライマーなどを含んでもよい。
【００３４】
本発明の手法を用いて、DNA T7 IVT 増幅法の初期ステップである(i)Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)反応によるテンプレートDNA3’末端へのポリT配列の付加、(iii)Klenow酵素による突出末端の平滑化など、酵素反応に依存したステップの反応効率を大幅に効率良く進めることが可能である。具体的には、DNA T7 IVT 増幅法の初期ステップで微量テンプレートDNA(100-500塩基程度の長さを持つ)に人工的に合成した20塩基程度の二本鎖DNA断片(decoy DNA)を添加しておき、上記酵素反応を行った後、最後にdecoy DNAのみを分子量の差異に基づいて完全に除去することにより、見かけ上のDNA基質濃度を増加させて酵素反応を効率良く行う。この操作を行う際には、decoy DNA自体の増幅を抑制する必要があるため、decoy DNAに下記性状を付加する。具体的には、(a)TdT反応の際に使用するdecoy DNAは3’末端にジデオキシヌクレオチド(ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP)を持つ。(b)Klenow酵素による突出末端の平滑化の際に使用するdecoy DNAは末端にddTTPを付加しておき、テンプレートDNAの3’側の修飾部位(poly T部分)と完全に結合できるようにする。これにより、(a) TdT反応の際、decoy DNAに余分なT付加反応が生じず、decoy DNAの塩基長が不要に増加することを阻害可能である。また、(b)により3’側に修飾部位(poly T)を持つテンプレートDNAに対してdecoy DNAの末端部分が完全に結合することが出来るようになる。decoy DNAに(b)の性状を付加することにより、Klenow酵素反応を行う際にdecoy DNA末端のddTTPが削除されることを阻害する。これにより、3’側に修飾部位(poly T)を持つテンプレートDNAとdecoy DNAを二本鎖形成させた後においても、decoy DNAのT7プロモーター配列を1本鎖の状態に留めておくことが出来、decoy DNAからのcRNAの生成を完全に阻害することが可能である。本発明では、DNA T7 IVT増幅法の初期ステップの酵素反応を効率化することが可能であるため、微量短鎖DNA断片(微量なクロマチン免疫沈降産物等)を対象としてDNA T7 IVT増幅法を実施することが可能となる。
【００３５】
本発明により、従来のdecoy DNAを用いずに行うDNA T7 IVT増幅方法に比べて、より微量なDNAテンプレートを増幅することが出来るようになる。従来、微量なDNAテンプレートを増幅する際には、感度は高いものの正確性に欠けるLM-PCR法が用いられてきた。本発明では、正確性の面では有利であるが、感度面で劣っていたDNA T7 IVT増幅方法を大幅に改善し、微量なDNAテンプレートを対象とした線形的増幅方法を開発した。これにより、微量DNAテンプレートを線形性良く増幅することが出来るようになり、微量DNAテンプレートを用いた塩基配列情報解析 (プロモーターアレイあるいは次世代シークエンサー解析等) を精度良く実施することが可能となった。これまで、DNAとタンパク質との相互作用（結合）を同定する一つの手法として、クロマチン免疫沈降(ChIP)法と塩基配列情報解析(プロモーターアレイあるいは次世代シークエンサー解析等)を組み合わせた解析手法が有用とされてきたが、生体中に極僅かにしか存在しない微少な細胞 (例えば組織幹細胞や癌幹細胞など) を対象としてこのような解析を精度高く実施することは困難であった。本発明は微量DNAテンプレートを線形性良く増幅することを可能とすることにより、微少な細胞等におけるDNAとタンパク質との相互作用を精度良く解析するための基盤を提供する。上記技術を用いて得られる情報は、病態の解明や創薬の開発、あるいは疾患のリスク評価のためのバイオマーカーの同定を行う上で非常に価値が高い。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（実験の要旨）
本実験の中心項目は下記4であるが、微少細胞サンプルを対象として網羅的解析に使用することができる増幅産物を得るためにはその他の周辺技術も重要であり、組み合わせて利用することが必要である。以下に、本実験の要素技術を挙げる。
1. 微少細胞サンプルからの安定的なクロマチン断片の作製：
ChIP解析を行うためには解析対象とする細胞の核内に存在するクロマチンを100bp-500bp程度の長さに断片化しておく必要がある。クロマチンの断片化には超音波破砕処理が有効であるが、一般的に超音波破砕装置の内部の処理容器の容量は大きく部位によって超音波の強度が大きく異なる。そのため、微少な細胞サンプルを破砕した際には破砕の程度に大きなバラツキが生じ、免疫沈降の効率が安定しない。そこで、微量の容量内で均一な超音波を発生することが可能なアコースティックソルビライザー(例えばCovaris社、S-series)を利用し、極微少細胞サンプルを対象として精度と安定性の高いクロマチン断片の作製を行う。
2. 極微少細胞サンプルからの高効率なクロマチン免疫沈降産物(二本鎖の短いDNA断片)の回収：
ChIP解析では、クロマチン断片にDNA・ヒストンタンパク質の各々の化学修飾を認識する特異抗体を反応させ、遠心操作などを行うことで特定の化学修飾を持つクロマチン断片の濃縮を行う。一般的に、免疫沈降の効率を向上させるために、Protein A/Gセファロースビーズ等を担体として用いて遠心操作により抗体-クロマチン断片の複合体を濃縮するが、洗浄操作などにおいてロスが大きく微少サンプルの解析が困難であった。そこで、遠心操作に依存しない抗体-クロマチン複合体の回収を行う。具体的には、磁気ビーズ担体(例えばＩnvitrogen社、Dynabeads（登録商標）Protein A/G)と結合させた抗体を利用し、磁気を用いて極微少細胞サンプルから迅速かつ高精度に抗体-クロマチン複合体の単離を行う。
3. 極微量な抗体-クロマチン複合体を対象とした高効率な二本鎖DNA断片の回収：
ChIP解析では、ChIP処理によって得られた抗体-クロマチン複合体からタンパク質成分等を除去し、DNA成分を高純度に抽出する必要がある。一般的にはプロテアーゼ処理とタンパク質変性処理によってDNAを分離した後、エタノール存在下でDNAを沈殿させることが多い。しかし、この手法では極微量の抗体-クロマチン複合体中に存在する極微量のDNAを効率良く回収することは困難であり、また得られるDNAの純度も低い。そこで、高い親和力で核酸を可逆的に結合させることが可能な磁気ビーズ(例えばBeckmancoulter社、AMPure)および磁気を用いて強い条件で洗浄を行い、高純度なDNAを効率良く回収する。
4. クロマチン免疫沈降産物から回収した二本鎖DNA断片末端への高効率なプロモーター配列付加：
T7-IVT法によるChIP産物の増幅の第一ステップでは、クロマチン免疫沈降産物から回収した二本鎖DNA断片の末端に短いプロモーター配列を有した人工的なDNA配列を付加する必要がある。そこで、微量な二本鎖DNA分子の末端に効率良く塩基を付加することができるTerminal Transferaseおよび特定のヌクレオチド(微量にddNTPを含む)を用いて20bp程度の均一な塩基を付加した後、この塩基と相補的な配列を持つ別のDNA断片(T7プロモーター配列も持つ)を反応させ、Klenow酵素を用いてFill-inを行うことで、二本鎖DNAを得る。この操作では2つの酵素反応が必要となるが、前述したように酵素反応は基質量が極度に少ない時には殆ど進行しない。そこで、クロマチン免疫沈降産物から回収した二本鎖DNA断片に対して、後のcRNA増幅時に増幅を受けない人工的なDNA分子(decoy DNA)を大量に添加し、DNA基質量を増加させる。【００３７】
これらを組み合わせて用いる事により、我々はChIP産物を低いバイアスで約3000倍に増幅することに成功した。増幅されたChIP産物を用いてプロモーターアレイを行ったところ、既存の方法(LM-PCR法)に比べて増幅前後のバイアスが有意に低いことが明らかとなった。また、ChIP-sequence解析を実施したところ、増幅前と同様なパターンのシグナルが得られた。これらのことから、網羅的解析への使用に十分耐えうる事が明らかとなった。【００３８】
（実験方法）
生体マウス肝細胞の調製と断片化クロマチン産物の回収
胎仔マウスより肝臓を採取し、1mM EDTA を含む0.1%trypsin中で37℃・10分間のトリプシン消化を行った後、径40μmのメッシュを通すことで細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液に、biotin標識抗マウスTER119抗体 (PharMingen社)、biotin標識抗マウスCD45抗体(PharMingen社)を添加し、30分間反応させた後、PBSを用いて洗浄を行った。その後、二次抗体として、Streptavidin-Magnetic beads(PharMingen社)を添加し、30分間、氷上にて反応させた。反応後、BSAおよびEDTAを加えて終濃度を0.5% BSA、2mM EDTAとなるように調製し、8分間磁気にさらして磁気ビーズの凝集を促した後、上清を回収して非血球細胞を分離した。【００３９】
得られた胎児肝細胞の懸濁液に、終濃度で1%となるようにホルムアルデヒド溶液を添加して室温で20 分間静地後、遠心操作 (1600×g, 5分) により洗浄を行った。上清を廃棄した後、Cell Lysis Buffer中で処理し、1900×g・5分間の遠心操作後に得られる沈査を回収した。Nuclei lysis bufferを加えて氷上で10分間反応させた後、Covaris社アコースティックソルビライザーを用いて超音波破砕を行った。15000×g・5分間の遠心後の上清画分を電気泳動したところ、100-500bp程度のバンドが確認されている。【００４０】
クロマチン免疫沈降
断片化クロマチンは、抗トリメチル化ヒストンＨ3K27抗体 (ミリポア社) と16時間・4℃で反応後、磁気ビーズProtein A/G担体を用いて免疫沈降を行い、PBS洗浄を行うことにより免疫沈降産物を回収した。免疫沈降産物はその後、RNaseA処理(37℃30分間)、Proteinase K 処理(37℃2時間)、フェノール・クロロホルム精製、イソプロパノール沈殿を行うことにより純化を行い、風乾処理後、TEバッファー中に溶解した。【００４１】
T7-IVT・LM-PCR増幅
100-500bpの二本鎖DNAを含むクロマチン免疫沈降産物についてCIAP処理を行い、DNA末端を脱リン酸化(37℃・60分間)させた後、DNA精製試薬キット(例えばベックマン・コールター社AMpureXP)を使いてDNA断片の精製を行った。次に、DNA断片(各濃度)、TdT(40U)、4.6μM dTTP、0.4μM ddCTP、0.075mM CoCl2、TdTバッファーおよびDecoy DNA(各濃度)を含む20μlの反応液中で37℃20分間反応させ、T付加反応を誘導した。0.5M EDTA(pH8.0)を加えて反応を停止させた後、DNA精製試薬キットを用いてTdT反応後のDNA断片の精製を行った。さらに、TdT反応後のDNA断片、ポリA-T7オリゴDNAプライマー(0.3μM)、dNTP(0.2mM)、クレノウ酵素用バッファーを含む24μlの反応液を94℃に加温して25℃まで-1℃/秒程度の速度で徐々に温度を降下させた後、1uL (5U) のクレノウ酵素を添加し、37℃・90分間反応させた。0.5M EDTA(pH8.0)を加えて反応停止後、DNA精製試薬キットを用いて100bp程度以下のDNA断片を除去した。DNA精製前後でのDNA断片の除去効果については、バイオアナライザー2100(Agilent社)を使い測定した。次に、IVT増幅を行った。T7付加されたDNA断片、dNTP混合液(dATP,dGTP,dCTP,＆ dUTP)(28.5mM)、T7 RNAポリメラーゼ(200U)、IVT用バッファー中で37℃16時間反応させた。反応後すぐにDNA精製試薬キットを用いて精製を行った。最後に、IVTにより得られたcRNAをランダムプライマー、dNTP混合液(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、逆転写酵素(例えばInvitrogen社 SuperscriptIII)、逆転写酵素用バッファー、DTTの存在下で逆転写を行い鋳型cRNA上でcDNA化させてcRNA-cDNAハイブリッド形成を促した。さらに、このcRNA-cDNAハイブリッドに対してDNAリガーゼ、DNAポリメラーゼI、RNaseH、dNTP混合液、Second Strand Buffer存在下で16℃・120分間のライゲーション反応を行うことにより二本鎖DNAの形成を誘導した。回収した二本鎖DNA断片は70℃・15分間の失活処理後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿操作を行い純化した。なお、LM-PCR法は文献11に基づいて行った。【００４２】
ChIP-PCR解析
DNAをテンプレートとして、目的遺伝子の転写開始地点近傍を認識するプライマーを用いてChIP-PCRを行った。各遺伝子の転写開始地点は理化学研究所により提供されているデータベース（CAGE Analysis Viewer）を利用し、転写開始点近傍を認識するようにPrimerを設計した。【００４３】
ChIP-chip解析
増幅を行っていないマウスゲノムDNA断片、T7-IVT法あるいはLM-PCR法で増幅したマウスゲノムDNA断片にそれぞれ異なる蛍光標識を行い、mouse 1Mプロモーターアレイ(Agilent社)上で未増幅サンプルと増幅サンプルを競合的にハイブリダイズし、蛍光シグナルを計測した。マイクロアレイデーターの解析はAgilent Genomic Workbench (Agilent社) を利用した。【００４４】
ChIP-sequence解析
マウス胎仔肝臓のCD45- Ter1190-画分中に含まれる肝幹/前駆細胞より断片化クロマチンを回収した後、抗トリメチル化ヒストンＨ3K27抗体 (ミリポア社)を用いたクロマチン免疫沈降を実施し、ゲノムDNA断片を得た。得られたゲノム断片をT7-IVT法により増幅した。増幅を行っていないマウスゲノムDNA断片、T7-IVT法で増幅したマウスゲノムDNA断片をテンプレートとして、次世代シークエンサーHiseq2000 (イルミナ社) を用いて塩基配列解析を行い、マウスゲノム配列へマッピングを行った。【００４５】
（実験結果）
微少細胞サンプルに対して安定的なクロマチン免疫沈降を行うため、クロマチンの断片化処理の方法を最適化した。極わずかな容積内で安定的に超音波照射が可能な機器(アコースティックソルビライザー、Covaris社S-series)を用いることにより、極微量なマウス胎仔肝臓細胞サンプルを対象として100bp-500bpの均一なゲノム断片を得ることが出来た（図１Ａ）(“no amplification”レーン)。この断片化処理によって得られたサンプルを用いて、次に、既存LM-PCR法とT7-IVT法の比較を行った。10ngの断片化DNAテンプレートからLM-PCR法あるいはT7-IVT法で増幅を行ったところ、いずれの方法においてもテンプレートDNAを増幅すること確認することができた(図１Ａ)。しかしながら、T7-IVT法で得た産物は断片化DNAテンプレートと近似した泳動パターン（すなわち100bp-500bpのレンジを維持している）を示したが、LM-PCR法で得た産物は200-300bpに限局して増幅されており、増幅の際にバイアスが生じているものと考えられた。また、各増幅法における非特異的な増幅(増幅のバックグランド)レベルを検討するため、DNAテンプレートなしのサンプルを用いて増幅を行った。その結果、T7-IVT法で得た産物からはバンドが確認されなかったが、LM-PCR法で増幅した産物からは200-300bp程度のバックグランドノイズが確認された。これらのことから、増幅の正確性とバックグランドノイズの低さにおいてT7-IVT法が有利であることが明らかとなった。【００４６】
次に、T7-IVT増幅効率を更に向上させるための改善点について検討した。T7-IVT増幅では特に増幅の初期ステップの反応効率が重要である。まず、T7-IVT増幅の第一段階となるテンプレートDNA(二本鎖DNA)の3’末端へのPoly T付加反応について作動性を検証した。230bpのテンプレートDNAを用いてTerminal Deoxynucleotidyl Transferase（TdT）によるpoly T付加反応を行ったところ、poly T付加に伴うバンドシフトが確認された（図１B）。12.5ngのテンプレートDNAを用いた場合においても、Poly T付加は高効率に行われていることが明らかとなった。次に、増幅の第二段階となるPoly T付加産物へのポリA-T7オリゴDNAプライマーの付加効率について評価した。その結果、テンプレートDNAサンプルの殆どにおいてT7付加が確認された（図１B）。これらのことから、T7-IVT法の初期ステップは効率良く進行していることが明らかとなった。また、T7-IVT法の増幅感度について検討を行ったところ、テンプレートDNAに対してcRNA量が線形的に増加していることが確認された(r2=0.9891 (n=4))。また、8w mouse liverサンプルのH3K27me3 ChIP産物(10pgから1000pg)をテンプレートDNAとして同一の方法でT7-IVT増幅を行い、得られた増幅産物についてChIP-PCR解析した。その結果、LM-PCR法では1ng(1000pg)のテンプレートDNAの増幅は精度良くかかるものの、100pg以下のテンプレートDNAからはPCR検出が困難であった（（図１C）。一方で、T7-IVT法により増幅したサンプルは増幅のスタート量が10pgであっても比較的高率に増幅がかかることが明らかとなった。【００４７】
T7-IVT法の有用性が確認できたことから、次に、T7-IVT増幅の更なる効率化を試みた（図２）。T7-IVT増幅法は複数の酵素反応を必要とするため、各酵素反応を効率化することが鍵となる。一般にT7-IVT増幅法で用いられるKlenow fragmentやT7-RNA polymeraseなどの酵素はKm値が高く、基質DNA量が微少なときには反応が殆ど進まなくなるとされる。そこで、微少サンプルを用いたT7-IVT増幅においては基質となるDNA量を人為的に増やしておき、増幅が行われた後に除去する手法が有効と考えられる。我々は、ChIP産物である100-500bp程度の長さの二本鎖DNAを用いたT7-IVT増幅の効率化を図るため、ChIP産物よりも有意に短く、後から分子量の差異により除去することが可能な人工合成DNA (decoy DNA, 配列; 5’-AATTCGTCTGGACACBTTTTTTTTTTTTTTT(T*)-3’)（配列番号１）を作製し、T7-IVT増幅系に添加しその効果を検討した。我々が作製したdecoy DNAは32bpと短く、IVT操作においてT7プロモーター配列を付加するために使用するポリA-T7オリゴDNAプライマー(T7-polyA(18)-B oligo DNAと呼ぶこともある) (DNA配列: 
5’-GCATTAGCGGCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAB-3’)（配列番号２） とハイブリダイズした際にも約80bp程度の塩基長しか持たない。このため、急激なカットオフ値を持つDNA精製器具 (例えば、100bp以下の塩基を選択的に除去できるBeckmancoulter社 AMpureXP) を用いて増幅後に除去することが可能となる。また、我々が作製したdecoy DNAは3’末端に2',3'-Dideoxythymidine- 5'-Triphosphate(ddTTP)を有する。そのため、decoy DNAの3’末端まで完全にポリA-T7オリゴDNAプライマーとハイブリダイズさせることが可能であり、Klenow酵素添加時にKlenow酵素の3’-5’エクソヌクレアーゼ活性によりddTTPが削除されることは無い。このことから、decoy DNA- ポリA-T7オリゴDNAプライマーの会合により二本鎖化されたDNAにおいては、Klenow酵素存在時にT7領域が二本鎖化されることは無く、decoy DNA自体がT7-IVT増幅されることが避けられるといった特性を持つ。【００４８】
実際にdecoy DNAを除去することが出来るか否かを検討したところ過剰量添加したdecoy DNA- ポリA-T7オリゴDNAプライマー ハイブリットDNA (約50bp程度) はカラム精製により殆ど除去できることが明らかとなった（図３上段(730FU)から下段(19FU)の変化）。次にT7-IVT法を用いた断片化ゲノムDNAの増幅におけるdecoy DNAの添加の効果を検討した。10ngの断片化ゲノムDNAをテンプレートにしてdecoy DNA存在下あるいはdecoy DNA非存在下でT7-IVT増幅を行ったところ、decoy DNA添加群の方が非添加群に比べて電気泳動のバンドが明瞭であった(図4Ａ)。また、断片化ゲノムDNAを加えない状態でdecoy DNAのみを添加して同一の手法によりT7-IVTを行ったところバンドは検出されなかったことが明らかとなった。このことから、人為的に添加したdecoy DNAは、後から完全に除去を行う事が可能で、テンプレートDNAの増幅に悪影響をもたらすことはないことが判明した。さらに、2ngの断片化ゲノムDNAをテンプレートにしてdecoy DNA存在下でT7-IVT増幅を行ったところ、decoy DNA非添加群では5.951±0.582μgの増幅産物 (増幅倍率2975±291.4倍 (±S.D., N=3))が回収され、decoy DNA添加群では11.088±0.848μg (増幅倍率5544±424倍)の産物が得られた。すなわち、decoy DNA非添加群に比べてT7-IVT増幅産物量が1.86倍に増大した（現在追加実験中）。さらに、微少断片化ゲノムDNAサンプルを対象としたT7-IVT増幅におけるdecoy DNA添加の効果を検討した。電気泳動の結果、2ng以下のテンプレートDNAの増幅は、decoy DNAを添加することで向上していた（図４B）。なお、400pgのテンプレートDNAの増幅においてdecoy DNAを加えた場合と加えない場合の産物量は各々1280ng, 733ngであった。各遺伝子のプロモーター領域における目的DNA配列の存在をChIP-PCRにより検討したところ、decoy DNA添加群の方がPCRの検出限界は低く、増幅の感度が増加しているものと考えられた（図４C）。そこで、各細胞数の胎児肝臓細胞からトリメチル化されたヒストンH3K27修飾(H3K27me3)を持つクロマチン断片を免疫沈降し、本増幅法で増幅を行った後にChIP-PCR解析を行った。その結果、本増幅法を用いることで、僅か1x103細胞に対してChIP-PCR解析が可能であることが明らかとなった（図４D）。【００４９】
本発明によるクロマチン免疫沈降(ChIP)産物の増幅方法が、網羅的解析系で有用な否かを検証するため、プロモーターアレイを用いて解析を行った。一般的にプロモーターアレイ解析ではChIP産物をLM-PCR法で増幅するが、高いサイクル(一般的には約30サイクル程度を行う)のPCRを実施するため、増幅の際に増幅の偏りあるいは増幅のエラーが生じるとされている。一方、我々が開発したdecoy DNAを用いるT7-IVT法はLM-PCRで問題となっていたこれらの問題を回避できるため、優位性を持つと考えられる。そこで、Agilent社のmouse 1M Promoter Arrayを用いて、各増幅方法の検証を行った。0.1ngのDNA断片をテンプレートとして各増幅方法で2μgの増幅産物を得た後、増幅前後のサンプルを異なる蛍光分子で標識し、プロモーターアレイ上で競合ハイブリダイズを行い、蛍光シグナルを計測した。Probeの蛍光強度のパターンについて検討したところ、T7-IVT増幅を行った群では増幅前後でProbeの蛍光強度のパターンが維持されていた（図５Ａ上段）。一方、LM-PCRを行った群では増幅時に著しい変化が認められた（図５Ａ下段）。増幅前後における蛍光シグナルの相関値を検討したところ、T7-IVT増幅群は、LM-PCR増幅群よりも高い相関係数を持つ(1に近いこと)が確認された。各遺伝子領域における競合ハイブリの結果を検討したところ、T7-IVT増幅を行った群ではゲノム全域において競合ハイブリによるシグナル値が0に近い(すなわち、当該遺伝子領域におけるDNA量が増幅前後で等しい)ことが明らかとなった。一方、LM-PCR増幅を行った群では競合ハイブリによるシグナル値はゲノム全域において0からかけ離れていることが明らかとなった。このことから、T7-IVT法は増幅のバイアスおよびエラーが極めて低く、プロモーターアレイ解析の前処理で極めて有用であることが明らかとなった。さらに、本発明によるクロマチン免疫沈降(ChIP)産物の増幅方法が次世代シークエンサーを用いたChIP-sequenceにおいても有用か否かを検証したところ、増幅前サンプルのシークエンス結果と増幅後のシークエンス結果で近似した集積パターンが得られた。【００５０】
（考察）
クロマチン免疫沈降の解析法のうち、ChIP-PCRは最も感度が高いと考えられている。本実験では、クロマチン免疫沈降の様々なステップの改良と  Decoy DNAを用いたT7-IVT増幅法の利用により、1x103個の胎児肝臓細胞サンプルから調製したH3K27me3修飾を持つクロマチン断片に対して安定したChIP-PCR解析を行うことに成功した。微量細胞サンプルを対象としたChIP-PCR解析に関しては、これまでに、他の研究グループから前段階の増幅を行わずに、30-40サイクルといった高いサイクル数によるChIP-PCR解析が報告されているが、増幅のバイアス・増幅のバックグラウンドについては十分な解析がなされていなかった22。我々のT7-IVT増幅はバックグランドノイズが極めて低いことから、微少細胞サンプルを対象としたChIP-PCR解析の増幅時に用いることで、擬陽性を生じることなく安定したPCR解析を実施することが可能である。他方、ChIP-PCRよりも大量のテンプレートDNAを必要とするプロモーターアレイ解析(ChIP-chip解析)においても、本増幅方法は極めて有用と言える。ChIP-chip解析では蛍光ラベル標識する際に最低2μg(2000ng)程度のテンプレートDNAが必要である。そのため、最適化された免疫沈降条件を用いた場合においても増幅方法を用いない場合、8x106細胞数 (胎仔マウス肝臓細胞のH3K27me3 ChIP実験の場合) が必要となる。我々は本研究においてdecoy DNA存在下における1roundのIVT反応によりテンプレートDNAを約5544倍に増幅することに成功した。我々の増幅方法を用いることで約1x103個の細胞からPCR増幅を介さずにプロモーターアレイ解析を実施することが可能と考えられる。我々の検討によると、1匹の胎仔マウス肝臓細胞中には約2.5x103個の肝幹細胞が存在することが明らかとなっている。我々が開発した手法を用いることで、1匹の胎仔からフローサイトメトリーによって得られる肝幹細胞を対象としてChIP-chip解析を実施することができる可能性が示され、組織幹細胞を対処としたプロモーターアレイ解析が実施可能である可能性が示された。本手法を利用することで今後、生体中での存在頻度が極めて低い幹細胞や癌幹細胞を対象としたChIP-chip解析、あるいは、採血などで得られる少数の血液細胞を対象としたChIP-chip解析が可能になるものと考えられる。また、本研究では正確性の高い増幅産物を得るため、1roundのIVTでのみ得られる増幅産物を用いて解析を行っている。今後2nd round IVTを行うことにより、更なる高感度化が期待される。【００５１】
我々は今回、二種類の増幅方法を用いて免疫沈降産物の増幅を行い比較した。LM-PCR法により増幅したサンプルに対してChIP-PCR解析を行ったところ、予想に反して検出感度が低いことが明らかとなった。我々はその理由として下記2点を考えている。一つ目としては、LM-PCRはバックグラウンドが高いことから一見高効率に増幅されているようでも実はジャンクな産物(バックグランドノイズ)が相当量増幅されていることである。もう一つの理由としては、PCR増幅の際に大きな増幅バイアスが生じている可能性が挙げられる。実際、15サイクル以上のPCRでは原理上線形的な増幅が困難とされる。LM-PCR法では2段階のPCR増幅(15サイクル+25サイクル=計40サイクル)を行うため、この間に大きな増幅バイアスが生じるものと考えられる。プロモーター領域などGCリッチなDNA配列をLM-PCR法で増幅すると大きなバイアスが生じる可能性がある。【００５２】
一方、T7-IVT法による増幅では線形的な増幅が確認できた。最適化された条件では、decoy DNAが無い場合でも約3000倍の増幅感度を有することが明らかとなった。また、decoy DNA添加時には、増幅感度は更に向上することが確認され、decoy DNA添加の有用性が確認された。decoy DNAの添加は反応液における基質DNA量を増加させることができ、Km値が低い酵素 (T7 RNA polymerase等) の反応を促進すると考えられる。【００５３】
我々が確立した改良型T7-IVT増幅手法はDNA polymeraseを用いるLM-PCR法と比べて増幅の正確性が高いことから、ChIP-chipだけでなく、次世代シークエンサー解析(ChIP-sequence)など、シークエンスベースの包括的解析においても有用な手法となる。また、微少細胞サンプル(理想としては単一細胞など)を対象とした全ゲノム増幅による遺伝子変異検査への応用も期待される。これらの解析によって組織幹細胞や癌幹細胞で形成されているクロマチン情報を取得することにより、今後、これらの細胞における疾患のメカニズム解析やバイオマーカーの探索が可能になるものと考えられ、病態の解明や診断法の開発において重要な技術基盤となることが期待される。【００５４】
（参考文献）
1. Nat Rev Genet. 2007 8(4):263-71.
2. Nature. 2009 459(7243):108-12.
3. Mol Cell. 2007 12;25(1):1-14.
4. Curr Opin Genet Dev. 2004 14(6):697-705.
5. Trends Genet. 2011 27(4):141-8.
6.[URL]http://www.chem.agilent.com/en-US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx?whid=42637
7. Biotechniques. 2007 43(6):791-7.
8. Nat Protoc. 2006;1(6):2979-87.
9. J Cell Biol. 2002 7;156(1):173-84.
10. Genome Res. 2008:18(3):393-403.
11. BMC Genomics. 2003:4(1):19. (PMID: 12740028)
12. Nucleic Acids Res. 2008 36(4):e21. (PMID: 18180247)
13. Katou Y, Methods Enzymol. 2006: 409:389-410. (PMID: 16793414)
14. CSH Protoc. (2008) 2008:pdb.top42. doi: 10.1101/pdb.top42. (PMID: 21356838)
15. CSH Protoc. 2008 1;2008:pdb.prot5002. doi: 10.1101/pdb.prot5002. (PMID: 21356834) 
16. CSH Protoc. 2008 1;2008: pdb.prot5003. doi: 10.1101/pdb.prot5003. (PMID: 21356835)
17. J Biol Chem. 1990 Aug 25;265(24):14579-91.
18. J Biol Chem. 1975 Jun 10;250(11):4073-80.
19. Biochemistry. 1983 Jul 19;22(15):3537-46.
20. Nat Genet. 2006 Jul;38(7): 835-41.s
21. Methods Mol Biol. (2011) 729:15-35.
22. Nat Protoc. 2008;3(6):1032-45.
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によって、微量短鎖二本鎖DNA断片の線形的な増幅が可能な手法が開発されたことにより、生体中に極わずかにしか存在しない組織幹細胞や癌幹細胞の遺伝子配列解析の情報、あるいはこれらの細胞で形成されているクロマチンの情報を精度良く取得することが可能となる。ゲノムの遺伝子配列やクロマチンの状態を明らかにすることは、疾患関連遺伝子の同定、遺伝子発現制御機構の解明、あるいはバイオマーカーの同定に結びつくため、病態解明、創薬開発、あるいは診断法開発など医学・薬学・生物学領域において大いに貢献できるものである。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
＜配列番号１＞
配列番号１は、decoy DNAの配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ポリA-T7オリゴDNAプライマーの配列を示す。
【図１】
0005967550.tif 000002
【図２】
0005967550.tif 000003
【図３】
0005967550.tif 000004
【図４】
0005967550.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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