(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物体に由来し、粘度平均分子量が１×１０3〜９×１０5の範囲にあり、該分子中の遊離アミノ基の量が、全アミノ基に対して５０％〜１００％の範囲にある天然高分子のアミノ多糖類からなる腫瘍治療用ナノ粒子の製造方法であって、
以下の手順を含むことを特徴とする、腫瘍治療用ナノ粒子の製造方法：
（１）単一の分子量を示す天然高分子のアミノ多糖類または異なる分子量を示す分子からなる天然高分子のアミノ多糖類を、希釈した２０〜６０℃の酸溶液に添加し、多糖[saccharan]溶液を作り、ただし該溶液中の多糖[saccharan]の含有量が、０．１重量％〜５重量％の範囲にあり；
（２）微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを６〜９に調整し；
（３）該乳濁液から該微粒子を単離し、低温で乾燥し、天然高分子のアミノ多糖類からなる腫瘍治療用ナノ粒子を得る。
【請求項２】
上記ナノ粒子の粒子直径が、５〜５００ｎｍの範囲にある請求項１に記載の腫瘍治療用ナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記腫瘍治療用ナノ粒子が、金属イオンを取り込んだ天然高分子のアミノ多糖類からなるナノ粒子であり、該アミノ多糖類の粘度平均分子量が１×１０3〜９×１０5の範囲にあり、該分子中の遊離アミノ基の量が、全アミノ基に対して５０％〜１００％の範囲にあり、該金属イオンの含有量が、１〜２０重量％の範囲にあり、
上記の金属イオンを取り込んだ天然高分子のアミノ多糖類からなるナノ粒子を調製する方法が以下の手順を含む請求項１に記載の腫瘍治療用ナノ粒子の製造方法：
（１）天然高分子のアミノ多糖類を、希釈した２０〜６０℃の酸溶液に添加し、多糖[saccharan]溶液を作り、ただし、該アミノ多糖類の粘度平均分子量が１×１０3〜９×１０5の範囲にあり、該溶液中の多糖[saccharan]の含有量が０．１重量％〜５重量％の範囲にあり；
（２）微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを３〜８に調整し；
（３）該乳濁液から該微粒子を単離し、洗浄して中性のｐＨにし、該微粒子を金属イオンの溶液に添加し、ただし該溶液の濃度が１００〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲にある；その後、該微粒子中に該イオンが取り込まれるようにこの系を振動させ、乾燥し、金属イオンを取り込んだ天然高分子のアミノ多糖類からなるナノ粒子を得る。
【請求項４】
上記の希釈した酸溶液が、酢酸または塩酸である請求項３に記載の腫瘍治療用ナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
上記の金属イオンの溶液が、該金属イオンの硫酸塩、塩酸塩または硝酸塩の少なくとも１種の溶液である請求項３に記載の腫瘍治療用ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療用ナノ粒子に関し、さらに詳しくは、グルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子およびその調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルシダミン[glucidamin]（アミノ多糖類）は天然の高分子であり、その分解産物はアミノ単糖類である。グルシダミンは、ヒト組織に対して無毒または無害であり、そして抗腫瘍活性および静菌作用を有する。グルシダミンのミクロスフェア［微粒子］は、薬剤の放出制御システムに使用されてきた。このグルシダミンのミクロスフェアを調製する方法としては、水油二相プロセス，乳剤技術および噴霧乾燥法などが挙げられる。一般的に、これらの方法は複雑で、有機溶媒および界面活性剤を必要とする。したがって、製造された多糖[saccharan]のミクロスフェアが安全であるか否かが考慮される。
【０００３】
一部の研究者は、このグルシダミンが、ある種の腫瘍細胞に直接作用すること、この腫瘍細胞の代謝を妨害すること、この細胞の増殖を阻害すること、そして解明されていないある経路を介して腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができることを実証している。さらに、このグルシダミンは、血管内皮細胞の増殖を阻害すること、腫瘍の成長を制限すること、腫瘍細胞の転移を阻止するために血管内皮細胞接着分子の接着を妨害することができることが報告されている。さらに、一部の研究者は、このグルシダミンが、抗腫瘍活性を発揮するために、マクロファージ、リンパ球、ＮＫ細胞などの免疫細胞および補体系を活性化すること、種々のサイトカインの産生を誘導すること、生物体の免疫を強化することができることを見出した。
【０００４】
ある研究者は、亜鉛、コバルト、銅などのいくつかの金属イオンが優れた抗腫瘍活性を有することを発見した。分解可能な生体適合性多糖類の微粒子（またはナノ粒子）がこのような金属イオンを取り込むことによって産生された複合材料は、優れた抗腫瘍活性を有する点のみならず、徐放できる点、持続性作用を有する点および残留物が残らない点など、いくつかの利点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の主な目的は、先行技術が抱える問題を克服するために、グルシダミンからなるナノ粒子およびその調製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、上記技術的課題は下記技術的解決法によって解決される。
グルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子であって、それは生物体のグルシダミンに由来し、該グルシダミンの粘度平均分子量が１×１０3〜９×１０5の範囲にあり、該グルシダミン中の遊離アミノ基の量が、全アミノ基に対して５０％〜１００％の範囲にある。
【０００７】
好ましくは、上記のグルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子の粒子直径は、５〜５００ｎｍの範囲にある。
好ましくは、上記のグルシダミンの腫瘍治療用ナノ粒子は、金属イオンを取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子であり、グルシダミンの粘度平均分子量は、１×１０3〜９×１０5の範囲にあり、該分子中の遊離アミノ基の量は、全アミノ基に対して５０％〜１００％の範囲にあり、該金属イオンの含有量は、１〜２０重量％の範囲にある。
【０００８】
上記のグルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子を調製する方法は、以下の手順を含む：
（１）単一の分子量を示すグルシダミンまたは異なる分子量を示す分子からなるグルシダミンを、希釈した２０〜６０℃の酸溶液に添加し、多糖[saccharan]溶液を作り、ただし該溶液中の多糖の含有量は０．１重量％〜５重量％の範囲にあり；
（２）微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを６〜９に調整し；
（３）該乳濁液から該微粒子を単離し、低温で乾燥し、グルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子を得る。
【０００９】
好ましくは、上記の金属イオンを取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を調製する方法は、以下の手順を含む：
（１）グルシダミンを、希釈した２０〜６０℃の酸溶液に添加し、多糖溶液を作り、ただし該グルシダミンの粘度平均分子量が１×１０3〜９×１０5の範囲にあり、該溶液中の多糖の含有量が０．１重量％〜５重量％の範囲にあり；
（２）微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを３〜８に調整し；
（３）該乳濁液から該微粒子を単離し、洗浄して中性のｐＨにし、該微粒子を金属イオンの溶液に添加し、ただし該溶液の濃度は１００〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲にある；その後、該微粒子中に該イオンが吸着されるようにこの系を振動させ、乾燥し、金属イオンを取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を得る。
【００１０】
好ましくは、上記の希釈した酸溶液は、酢酸または塩酸である。
好ましくは、上記の金属イオンの溶液は、該金属イオンの硫酸塩、塩酸塩または硝酸塩の少なくとも１種の溶液である。
【発明の効果】
【００１１】
先行技術と比較した場合、本発明の効果として（１），（２）が挙げられる：
（１）グルシダミンからナノ粒子または金属イオンを取り込んだナノ粒子を調製することによって、グルシダミンの抗腫瘍活性を著しく向上させることができ、このようなナノ粒子を抗腫瘍薬剤として広く用いることができる。
【００１２】
（２）本発明は、グルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子を穏和な条件（すなわち、常温・常圧）下で調製する方法を提供する。本発明の方法に従い調製したグルシダミンのナノ粒子および金属イオンを取り込んだグルシダミンのナノ粒子の粒子直径は、一様に分布している。その一方で、該ナノ粒子は容易に単離・精製でき、そして安全性の問題を招くことがないため、該ナノ粒子を抗腫瘍薬剤へ発展させる際の安全管理および品質管理に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１で調製した上記のグルシダミンからなるナノ粒子の、原子間力顕微鏡により観察された画像である。
【図２】図２は、実施例２で調製した上記のグルシダミンからなるナノ粒子の、原子間力顕微鏡により観察された画像である。
【図３】図３は、実施例３で調製した上記のコバルトを取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子の、原子間力顕微鏡により観察された画像である。
【図４】図４は、実施例４で調製した上記の銅を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子の、原子間力顕微鏡により観察された画像である。
【図５】図５は、実施例５で調製した上記の亜鉛を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子の、原子間力顕微鏡により観察された画像である。
【図６】図６は、実施例６において、上記のグルシダミンからなるナノ粒子を用いて２４時間処理した胃癌細胞の、透過型電子顕微鏡により観察された画像である。
【図７】図７は、実施例７において、上記のグルシダミンからなるナノ粒子を用いて２４時間処理した肝癌細胞の、透過型電子顕微鏡により観察された画像である。
【図８】図８は、実施例８において、上記の銅を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を用いて２時間処理した肝癌細胞の、透過型電子顕微鏡により観察された画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、具体例を参照することによって、本発明を説明する。下記実施例において、特に明記しない限り、溶液のすべてのパーセンテージは、重量／体積に基づく。
【実施例】
【００１５】
実施例１：
２０℃の０．５％酢酸溶液にグルシダミンを添加し、０．１％の多糖溶液を作る。該グルシダミンの粘度平均分子量（Ｍｒ）は１．８×１０4である。微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを４．０に調整する。該乳濁液を３０００ｒｐｍ／分で遠心分離する。得られた沈殿物を蒸留水で洗浄し中性ｐＨとした後、凍結乾燥しグルシダミンからなるナノ粒子を得る。原子間力顕微鏡で観察されるように、上記方法で調製した該ナノ粒子は、均一な球状構造を有し（図１を参照のこと）、ｐＨ３〜８で安定に保存することができる。
【００１６】
実施例２：
３０℃の１％塩酸溶液にグルシダミンを添加し、２％の多糖溶液を作る。該グルシダミンの粘度平均分子量（Ｍｒ）は４．７×１０3である。微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを６．０に調整する。該乳濁液を沈殿させ、得られた沈殿物を蒸留水で洗浄し中性ｐＨとする。その後、該沈殿物を凍結乾燥させ、グルシダミンからなるナノ粒子を得る。
【００１７】
原子間力顕微鏡で観察されるように、上記方法で調製した該ナノ粒子は球状構造を有し（図２を参照のこと）、ｐＨ３〜８で安定に保存することができる。
実施例３：
６０℃の０．５％酢酸溶液にグルシダミンを添加し、５％の多糖溶液を作る。該グルシダミンの粘度平均分子量（Ｍｒ）は５．２×１０4である。微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを６．５に調整する。沈殿および単離のために、該乳濁液を４０００ｒｐｍ／分で遠心分離する。得られた沈殿物を蒸留水で洗浄して中性ｐＨとし、乾燥させ多糖からなる微粒子を得る。得られた多糖の乾燥粉末を５００ｍｇ／Ｌコバルトイオン溶液に添加する。該イオンが該粉末に吸着されるよう、この系を３００ｒｐｍ／分で振る（３０分間〜２４時間）。吸着が完了した後、グルシダミンからなる微粒子を乾燥させ、コバルトを取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を得る。
【００１８】
上記方法に従い調製された、該コバルトを取り込んだナノ粒子中のコバルトの含有量は約１０％である。原子間力顕微鏡で観察されるように、該ナノ粒子は、均一な球状構造を有し（図３を参照のこと）、ｐＨ３〜８で安定に保存することができる。
【００１９】
実施例４：
２５℃の０．５％酢酸溶液にグルシダミンを添加し、１％の多糖溶液を作る。該グルシダミンの粘度平均分子量（Ｍｒ）は１．１×１０4である。微粒子の乳濁液を作るため該溶液のｐＨを６．５に調整する。沈殿および単離のために、該乳濁液を４０００ｒｐｍ／分で遠心分離する。得られた沈殿物を蒸留水で洗浄して中性ｐＨとし、乾燥させ多糖からなる微粒子を得る。得られた多糖の乾燥粉末を６００ｍｇ／Ｌ銅イオン溶液に添加する。該イオンが該粉末に吸着されるよう、この系を３００ｒｐｍ／分で振る（３０分間〜２４時間）。吸着が完了した後、グルシダミンからなる微粒子を乾燥させ、銅を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を得る。
【００２０】
上記方法に従い調製された、該銅を取り込んだナノ粒子中の銅の含有量は約２０％である。原子間力顕微鏡で観察されるように、該ナノ粒子は、均一な球状構造を有し（図４を参照のこと）、ｐＨ３〜８で安定に保存することができる。
【００２１】
実施例５：
３０℃の０．５％酢酸溶液にグルシダミンを添加し、２％の多糖溶液を作る。該グルシダミンの粘度平均分子量（Ｍｒ）は８．３×１０3である。微粒子の乳濁液を作るために、該溶液のｐＨを７に調整する。沈殿および単離のために、該乳濁液を６０００ｒｐｍ／分で遠心分離する。得られた沈殿物を蒸留水で洗浄して中性ｐＨとし、乾燥させ多糖からなる微粒子を得る。得られた多糖の乾燥粉末を８００ｍｇ／Ｌ亜鉛イオン溶液に添加する。該イオンが該粉末に吸着されるよう、この系を４００ｒｐｍ／分で振る（３０分間〜２４時間）。吸着が完了した後、グルシダミンからなる微粒子を乾燥させ、亜鉛を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を得る。
【００２２】
上記方法に従い調製された、亜鉛を取り込んだ該ナノ粒子中の亜鉛の含有量は約８％である。原子間力顕微鏡で観察されるように、該ナノ粒子は、均一な球状構造を有し（図５を参照のこと）、ｐＨ３〜８で安定に保存することができる。
【００２３】
実施例６：
胃癌細胞を、上記のグルシダミンからなるナノ粒子で２４時間処理し、１０％グルタルアルデヒドで固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄する。１％オスミウム酸を添加する。２時間後、Ｅｐｏｎ８１２を加えたアセトンを用いて勾配浸透[gradient infiltration]を行う。該細胞を、エポキシ樹脂であるＥｐｏｎ８１２中にインサイツで包埋し、ＬＫＢウルトラミクロトームでスライスし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で二重染色し、透過型電子顕微鏡（型  ＪＥＭ−１２００ＥＸ）で観察する。図６によれば、対照群の細胞（図６ａ）は、その細胞膜の表面が微繊毛に覆われ、その細胞膜の構造がコンパクトであり、その細胞小器官が小さく、そのミトコンドリアが円形または楕円形であり、クリステが明瞭であり、その核膜がすべてあり、そのクロマチンが均一に分布している。上記のグルシダミンからなるナノ粒子を２４時間処理した後、細胞の形状から細胞壊死していることを示し、該細胞は壊れ細胞残屑になっている。
【００２４】
実施例７：
肝癌細胞であるＢＥＬ７４０２を、細胞培養フラスコに播種する。接着培養の２４時間後、グルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子の乳濁液を加えた。２４時間処理した後、培養液を捨てる。培養フラスコ中の該細胞を、トリプシンにより消化し、回収し、１０％グルタルアルデヒドで固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄する。１％オスミウム酸を添加する。２時間後、Ｅｐｏｎ８１２を加えたアセトンを用いて勾配浸透を行う。該細胞を、エポキシ樹脂であるＥｐｏｎ８１２中にインサイツで包埋し、ＬＫＢウルトラミクロトームでスライスし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で二重染色し、透過型電子顕微鏡（型  ＪＥＭ−１２００ＥＸ）で観察する。得られた結果を図７に示す。
【００２５】
図７によれば、対照群の細胞（図７ｃ）は、その細胞体が滑らかであり、その細胞膜の表面が微繊毛に覆われ、その細胞小器官が正常であり、そのミトコンドリアが円形または楕円形であり、クリステが明瞭であり、その核膜がすべてあり、そのクロマチンが均一に分布している。上記のグルシダミンからなるナノ粒子を２４時間処理した後（図７ｄを参照のこと）、多くの液胞が該細胞に含まれ、該細胞の細胞膜が壊され、核膜が消失し、細胞小器官の多くが壊れ、そのミトコンドリアが肥大しつつあり、その細胞核が凝縮し、その核小体の構造が網目状から環状に変形する。
【００２６】
実施例８：
肝癌細胞であるＢＥＬ７４０２を、２４穴プレート中、マイカ細片上で２４時間培養する。銅を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子の乳濁液をその培養液に添加し、二酸化炭素を５％に保持した細胞用インキュベーター中でさらに２時間培養する。この混合物を取り出し、リン酸緩衝液で３回洗い流し、１．５％グルタルアルデヒドで５分間固定し、その塩による妨害を除くため再蒸留水で３回洗い流し、風乾し、原子間力顕微鏡で観察する。図８によると、対照群（図８ｅ）において、該腫瘍細胞は紡錘形を示し、その細胞膜の層状構造がすべてあり、その縁が滑らかであり、核の隆起、その形が細胞体に対応し、その細胞質が一様であり、該細胞が均一に並び、そして隣り合った細胞間のリンカーが明瞭である。上記の銅を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子を２時間処理した後（図８ｆを参照のこと）、該細胞の表面が粗く、崩壊し、損傷している。不規則で微小な穴が該細胞上に現れ、その縁はむらがあり、その細胞膜は溶解し、細胞残屑が細胞周辺に見られる。
【００２７】
本発明はまた腫瘍治療用薬剤として用いられる組成物にも関連し、該組成物は、上記のグルシダミンからなるナノ粒子、上記の金属イオンを取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子および薬剤として使用し得る担体からなる。必要ならば、該組成物を多種多様な剤形とすることができる。好ましい投薬量は、以下の要素、性別，年齢，体重および被験者の全身状態など、ならびに投与方法に従い医師によって決定され得る。該腫瘍は以下から選択され得る：上咽頭癌，食道癌，胃癌，腸の癌，肝細胞癌，肺癌，膀胱癌，卵巣癌，膵癌，乳癌，腎癌，前立腺癌，脳腫瘍，白血病または子宮筋腫。
【００２８】
本発明で用いられる用語「薬剤として使用し得る」とは、動物または人に好適に投与した際、悪影響、アレルギー効果もしくは他の有害作用を及ぼさない分子または組成物について言及するものである。本発明で用いられる用語「薬剤として使用し得る担体」とは、本発明に従い上記のグルシダミンからなる腫瘍治療用ナノ粒子と併用するものであり、換言すれば、該ナノ粒子と混合することができるものの医薬組成物の薬効を顕著に減少させない。薬剤として使用し得る担体または化合物として用いられ得る材料の具体例として、以下が挙げられる：糖質（乳糖，ブドウ糖およびショ糖など），デンプン（コーンスターチおよびジャガイモデンプンなど），セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム，エチルセルロースおよびメチルセルロース），トラガント末，麦芽，ゼラチン，滑石，固体潤滑剤（ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウム），硫酸カルシウム，植物油（落下生油，綿実油，ゴマ油，オリーブ油、トウモロコシ油およびヤシ油[cocoa oil]），ポリオール（プロピレングリコール，グリセロール，ソルビトール，マンニトールおよびポリエチレングリコール），アルギン酸，乳化剤（ツイーンなど），湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど），着色剤，香味料[flavorant]，錠剤用の賦形剤[tabletting agent]，安定化剤，抗酸化剤，保存剤，パイロジェン・フリー・ウォーター[no-pyrogen water]，等浸透圧の生理食塩水ならびにリン酸緩衝液など。
【００２９】
具体的な実施例の一部のみを上述したことについて気付くべきである。本発明は明らかにこのような実施例に限定されるものではなく、該実施例に対して多くの変更がなされ得る。本明細書の開示に直接由来し得るかまたは想到し得る変更のすべては、本発明の範囲内であることを意図する。
【符号の説明】
【００３０】
図中：ａ．未処理の胃癌細胞；ｂ．上記のグルシダミンからなるナノ粒子で処理した胃癌細胞；ｃ．未処理の肝癌細胞；ｄ．上記の銅を取り込んだグルシダミンからなるナノ粒子で処理した肝癌細胞；ｅ．未処理の肝癌細胞；ｆ．上記のグルシダミンからなるナノ粒子で処理した肝癌細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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