(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵媒体中で、微生物菌株の発酵によりＬ−シスチンを製造する方法であって、Ｌ−システインを製造する際の細胞の培養が、好気性成長条件下で行われ、かつ前記Ｌ−シスチンが、総システインに対して少なくとも７０％の量で沈殿し、使用される前記微生物菌株が、腸内細菌科の代表であり、前記Ｌ−シスチンを形成する際の前記発酵媒体のＯ２飽和が、少なくとも１％、最大４０±３％に維持される、方法。
【請求項２】
前記Ｌ−シスチンを形成する際の前記Ｏ２飽和が、３０±３％未満に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｌ−シスチンを形成する際の前記Ｏ２飽和が、１０±３％未満に維持される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物菌株が、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを有するか、又は、前記微生物菌株が、野生型菌株と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により少なくとも２のファクターで、システイン搬出が増加している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物菌株が、さらに、対応する野生型酵素と比較して少なくとも２のファクターで、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低下している３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酸素が、前記発酵媒体中に、振とう装置で培養基容器を振とうすることにより、あるいは空気又は純粋酸素もしくはこれらのガスの混合物を吹き込むことにより、導入される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
炭素源は、前記システイン製造段階における前記発酵槽中の炭素源レベルが１０ｇ／ｌを超えないように、発酵媒体に加えられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培養温度が１５〜４５℃であり、前記発酵の際の前記発酵媒体のｐＨがｐＨ５．０〜８．５である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
硫黄源が前記発酵の際に供給される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によりＬ−シスチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−シスチンは、Ｌ−システイン２分子の酸化により形成されるジスルフィドである。この反応は可逆的であり、つまり、Ｌ−シスチンを還元によりＬ−システインに再転化することができる。
【０００３】
アミノ酸Ｌ−システインは、経済的に重要である。例えば、Ｌ−システインは、食品添加物（特に製パン工業において）として、化粧品の原料として、及び活性製薬成分（特にＮ−アセチルシステイン及びＳ−カルボキシメチルシステイン）を製造するための出発物質としても使用される。
【０００４】
Ｌ−システインは、全ての生物における硫黄代謝で重要な役割を果たし、タンパク質、グルタチオン、ビオチン、リポ酸、メチオニン及び他の硫黄含有代謝生成物の合成に使用される。さらに、Ｌ−システインは、補酵素Ａを生合成するための前駆物質として役立つ。Ｌ−システインの生合成は、細菌、特に腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）で詳細に研究されており、Ｋｒｅｄｉｃｈ（１９９６、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ、ｐｐ．５１４−５２７．Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｅ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｌｏｗ，Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｍ．Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．）に詳細に記載されている。
【０００５】
ケラチン含有材料、例えば毛髪、剛毛、角、ひずめ及び羽、から抽出による、又は前駆物質の酵素転化を利用した生体内変化による、Ｌ−システインの古典的な製造に加えて、発酵によるＬ−システインの製造方法も数年前に開発された。微生物を使用する発酵によるＬ−システインの製造に関する先行技術は、例えば米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、米国特許出願公開第２００４／００３８３５２Ａ１号、加国特許第２３８６５３９Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／００５３７７８Ａ１号及び米国特許出願公開第２００９／０２２６９８４Ａ１号に記載されている。ここで使用されている細菌性ホスト生物は、とりわけ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ又はＰａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ、からの代表である。
【０００６】
突然変異及び選択による改良されたＬ−システイン生産菌を得る古典的な手順に加えて、菌株に対する特異的な遺伝子修飾も、効果的なＬ−システイン過生産を達成するために行われている。
【０００７】
Ｌ−システインによるフィードバック阻害を低減させたセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコード化するｃｙｓＥ対立遺伝子の挿入により、システイン生産を増加している（米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、Ｎａｋａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１６０７−１６１１；Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：３２３−３２７）。フィードバック耐性のＣｙｓＥ酵素により、Ｌ−システインの直接前駆物質であるＯ−アセチル−Ｌ−セリンの形成が、細胞内でＬ−システインレベルから大部分はデカップリングされる。
【０００８】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは、Ｌ−セリン及びアセチル−ＣｏＡから形成される。従って、Ｌ−システイン製造のために十分な量でＬ−セリンを提供することが非常に重要である。これは、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害能力を下げた３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素をコード化するｓｅｒＡ対立遺伝子の挿入により達成される。Ｌ−セリンの前駆物質である３−ヒドロキシピルビン酸の形成は、細胞内でＬ−セリンレベルから大部分はデカップリングされる。そのようなＳｅｒＡ酵素の例は、欧州特許第０６２０８５３号、米国特許出願公開第２００５／０００９１６２Ａ１号、米国特許出願公開第２００５００９１６２Ａ２号及び欧州特許第０９３１８３３号に記載されている。
【０００９】
発酵におけるＬ−システイン収率は、Ｌ−システイン−分解酵素、例えばトリプトファナーゼＴｎａＡ又はシスタチオニン−β−リアーゼＭａｌＹ又はＭｅｔＣ、をコード化する弱体化又は破壊遺伝子により増加させることができる（欧州特許第１５７１２２３号）。
【００１０】
細胞から外へのＬ−システインの搬送を増加することも、媒体中における生成物の収率を増加させるさらなる可能性である。これは、いわゆるエフラックス遺伝子の過発現により達成される。これらの遺伝子は、細胞からのＬ−システインの搬送を仲介する膜結合型タンパク質をコード化する。Ｌ−システイン搬送用の様々なエフラックス遺伝子が記載されている（米国特許第５９７２６６３Ａ号、米国特許出願公開第２００４／００３８３５２Ａ１号、米国特許第２００５２２１４５３号、国際公開第２００４１１３３７３号パンフレット）。
【００１１】
Ｌ−システインを細胞から発酵媒体へ搬送することには、幾つかの利点がある、すなわち
１）Ｌ−システインは、細胞内反応平衡から連続的に抽出され、その結果、このアミノ酸が、細胞中で低レベルに維持され、従って、Ｌ−システインによる酵素に感受性のあるフィードバック阻害が無い、すなわち
（１）Ｌ−システイン（細胞内）←→Ｌ−システイン（媒体）
２）媒体中に放出されたＬ−システインは、酸素の存在下でジスルフィドＬ−シスチンに酸化され、培養の際に媒体中に導入される（米国特許第５９７２６６３Ａ号）、すなわち
（２）２Ｌ−システイン＋１／２Ｏ２←→Ｌ−シスチン＋Ｈ２Ｏ
水溶液中の中性ｐＨにおけるＬ−シスチンの溶解度は、Ｌ−システインと比較して非常に低いので、ジスルフィドは、低濃度でも沈殿し、白色沈殿を形成する、すなわち
（３）Ｌ−シスチン（溶解したもの）←→Ｌ−シスチン（沈殿）
Ｌ−シスチンの沈殿により、媒体中に溶解した生成物のレベルは低下し、それによって（１）及び（２）の反応平衡は、それぞれの場合に生成物側に引き寄せられる。
３）アミノ酸が発酵媒体から直接得られるなら、生成物が細胞内に蓄積し、初期細胞溶解を行わなければならない場合よりも、生成物の精製に関わる技術的な労力は著しく低い。
【００１２】
通性の嫌気細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ又はＰ．ａｎａｎａｔｉｓ、は、炭水化物、例えばグルコース、から好気性代謝により、それぞれのエネルギー源からの発酵（嫌気性代謝）によるよりも、より多くのエネルギーを得ることができるので、好気性条件下、すなわち酸素の存在下で、成長が速い。
【００１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ又はＰ．ａｎａｎａｔｉｓを使用するＬ−システインの生産は、好気性条件下でも行われる（米国特許出願公開第２００４／００３８３５２Ａ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、加国特許第２３８６５３９Ａ１号、欧州特許第１３８９４２７号、欧州特許第２１３８５８５号）。記載されている方法では、培養基に入る酸素が、発酵の際に培養基ブロスが５０％の酸素含有量を有するように調節されることがより詳細に開示されている。
【００１４】
発酵によるＬ−システインの製造に関して記載されている方法の欠点は、アミノ酸が、培養基ブロス中に様々な形態で存在することである。沈殿物中に沈殿したＬ−シスチンに加えて、溶解した形態のＬ−シスチン及びＬ−システイン及びチアゾリジンも、培養基上澄み液中にみられる（米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、加国特許第２３８６５３９Ａ１号）。このチアゾリジン（２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸）は、Ｌ−システイン及びピルベートの縮合生成物であり、純粋な化学反応で形成される。
【００１５】
本発明の文脈における用語「総システイン」は、Ｌ−システイン及びＬ−シスチン及びそこから形成されるチアゾリジンを組み合せ、発酵の際に形成され、培養基上澄み液及び沈殿物中に蓄積する。
【００１６】
公地の方法では、沈殿したＬ−シスチンの割合が、発酵の最後で異なっている。沈殿したＬ−シスチンの割合は、総システインの４０〜６６％（米国特許第５，９７２，６６３Ａ号、加国特許第２３８６５３９Ａ１号）であり、つまり総システインの残りの３４〜６０％は、培養基上澄み液中に存在する、すなわち主としてＬ−システインとチアゾリジンの形態にある。この生成物の不均質性が、培養基ブロスから生成物を回収し、精製することを妨げている。
【００１７】
従って、最終生成物が大部分ただ一つの形態でのみ生じる方法が望ましい。Ｌ−シスチンが生成物として主に形成される方法が特に好ましいが、これは、Ｌ−シスチンは、ｐＨが中性の水性媒体中における溶解度が低いために低濃度でも沈殿し、それによって反応平衡が生成物側にシフトし、比較的高い生成物収率につながるためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、本発明の目的は、発酵媒体中で、微生物菌株の発酵によりＬ−シスチンを製造する方法であって、Ｌ−シスチンが、形成された総システインに対して少なくとも７０％の量で沈殿する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この目的は、Ｌ−シスチンを形成する際の発酵媒体のＯ２飽和が、少なくとも１％、最大４０±３％に維持される方法により達成される。
【００２０】
媒体のＯ２飽和は、溶解酸素量の、記載されている条件下で溶解可能な最大酸素量の百分率として定義される。
【００２１】
驚くべきことに、Ｏ２飽和をこの低レベルに維持した場合、発酵の最後で、沈殿したＬ−シスチンが、培養基ブロス中の総システインの比率として少なくとも７０％（総システインの１リッターあたりの重量に対する、沈殿したＬ−シスチンの１リッターあたりの重量）である。この知見は、特に欧州特許第１３８９４２７号が、高Ｌ−シスチン比率が、実際に、例えば酸素又は過酸化水素の形態にある酸化剤を培養基中に大量に導入することにより達成されることを開示しているので、驚くべきことである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明による方法は、沈殿物として存在するＬ−シスチンが、簡単なデカンテーション工程により細胞から分離でき、生成物の精製が容易に達成できるので、非常に有利である。
【００２３】
本発明による発酵方法のシスチン形成段階は、培養基ブロス中で沈殿物として最初に検出される時点から出発し、培養の最後まで続行する。典型的には、この段階は、製造発酵槽の接種後約８〜１０時間で開始される。
【００２４】
本発明による方法で使用できる微生物は、先行技術で記載されている全てのシステイン生産菌株である。そのような菌株は、例えば米国特許第６２１８１６８Ｂ１号、米国特許第５９７２６６３Ａ号、米国特許出願公開第２００４／００３８３５２Ａ１号、加国特許第２３８６５３９Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／００５３７７８号又は欧州特許第２１３８５８５号に開始されている。
【００２５】
好ましい微生物は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の代表、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＰａｎｔｏｅａ属の代表、特に好ましくはＥ．ｃｏｌｉ及びＰ．ａｎａｎａｔｉｓ種の菌株である。
【００２６】
微生物菌株の中で、修正されたセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを有し、対応する野生型酵素と比較して少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているか、又は、野生型細胞と比較してエフラックス遺伝子の過発現により少なくとも２のファクターで、細胞からのシステイン搬出が増加している菌株が好ましい。特に好ましいのは、セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを有し、対応する野生型酵素と比較して少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しており、野生型細胞と比較してエフラックス遺伝子の過発現により少なくとも２のファクターで、細胞からのシステイン搬出が増加している微生物菌株である。そのような菌株は、例えば米国特許第６２１８１６８Ｂ１号及び米国特許第５９７２６６３Ａ号から公知である。特に好ましい菌株は、さらに修正された３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を有する菌株であり、対応する野生型酵素と比較して少なくとも２のファクターで、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低下しており（米国特許出願公開第２００５／０００９１６２Ａ１号、米国特許第２００５００９１６２Ａ２号）、野生型細胞と比較してこの酵素活性の最大５０％だけが細胞中に存在する限り、少なくとも一種のＬ−システイン−分解酵素が弱体化している。
【００２７】
セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの好ましい変異は、野生型細胞と比較して、少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に好ましくは少なくとも５０のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下している。
【００２８】
エフラックス遺伝子は、好ましくは、Ｅ．  ｃｏｌｉのｙｄｅＤ（米国特許第５９７２６６３Ａ号参照）、ｙｆｉｋ（米国特許出願公開第２００４／００３８３５２Ａ１号参照）、ｃｙｄＤＣ（国際公開第２００４１１３３７３号パンフレット参照）、ｂｃｒ（米国特許第２００５２２１４５３号参照）及びｅｍｒＡＢ（米国特許第２００５２２１４５３号参照）群、又は他の微生物からの対応する同族体遺伝子から生じる。同族体遺伝子は、この遺伝子の配列が、対応するＥ．  ｃｏｌｉ遺伝子のＤＮＡ配列に少なくとも８０％の程度対応することを意味する。
【００２９】
エフラックス遺伝子の過発現は、好ましくは、野生型細胞と比較して、少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に好ましくは少なくとも２０のファクターで、細胞からのシステイン搬送増加につながる。
【００３０】
３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素の好ましい変異は、対応する野生型酵素と比較して少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に好ましくは少なくとも５０のファクターで、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低下している。
【００３１】
Ｌ−システイン分解酵素は、好ましくはトリプトファナーゼ（ＴｎａＡ）及びシスタチオニン−β−リアーゼ（ＭａｌＹ、ＭｅｔＣ）の群に由来する。
【００３２】
野生型菌株と比較して、酵素活性の最大１０％だけがなお細胞中に存在する限り、これらの酵素の少なくとも一種が弱体化している、微生物菌株が特に好ましい。特に好ましいのは、これら酵素の少なくとも一種が完全に不活性化されている菌株である。
【００３３】
Ｌ−システインを製造する際の細胞の培養は、好気性成長条件下で行われる。酸素は、様々な様式で培養基に、例えば培養基容器を振とう装置で振とうすることにより、導入することができる。培養を発酵槽中で行う場合、空気又は純粋酸素又はこれらのガスの混合物を培養基に吹き込むことができる。細胞に十分な酸素を確実に供給するには、発酵を加圧下（例えば、０．５〜１．２バールの過剰圧力）で行うこともでき、その場合、媒体に対する酸素の溶解度が増加する。撹拌しているタンク発酵槽では、導入する酸素を、媒体中の攪拌機によりさらに分散させ、それによって細胞に対する酸素の利用率が増加する。
【００３４】
媒体中に溶解した酸素は、好ましくは発酵の際にプローブにより連続的に測定する。これは、例えば光学的センサー又は化学的センサー（Ｃｌａｒｋセル）で行うことができる。測定された媒体のＯ２飽和は、予め決められた公称値に合わせて連続調節する。実際の値が公称値から外れた場合、ガス供給又は撹拌速度又は両方を、自動制御回路により、Ｏ２飽和が公称値に再び回復するように調節する。このようにして、媒体中の酸素含有量を、発酵期間全体にわたって所望の値に維持することができる。
【００３５】
酸素測定プローブは、発酵の開始前に、まだ接種していない媒体中で、０％及び１００％Ｏ２飽和の制限値に校正する。これは、後に続く発酵温度で適切に行う。
【００３６】
プローブが０％Ｏ２飽和に校正される前に、なお存在する酸素全体を先ず媒体から追い出す必要がある。これは、発酵槽で発酵媒体のその場における殺菌の際に自動的に行われるか、又は可能な最大撹拌速度の２０％の撹拌速度で、媒体を純粋窒素でパージすることにより行うことができる。プローブの１００％Ｏ２飽和に対する校正は、一般的に発酵の開始（初期条件）時に、すなわち可能な最大ガス供給の４０％、及び可能な最大撹拌速度の２０％で、存在する酸素供給条件下で行われる。プローブの１００％に対する校正は、酸素含有量が、選択した条件下で一定値に達した時にのみ行う。
【００３７】
Ｌ−シスチン発酵の製造段階における酸素含有量は、４０±３％Ｏ２飽和未満、好ましくは３０±３％未満、特に好ましくは２０±３％未満、特に好ましくは１０±３％未満に維持しなければならない。
【００３８】
好ましい炭素源は、糖、糖アルコール、有機酸、又は糖含有植物加水分解物である。本発明による方法で使用する特に好ましい炭素源は、グルコース、フルクトース、ラクトース、グリセロール又はこれらの化合物の２種類以上を含んでなる混合物である。
【００３９】
炭素源は、Ｌ−システイン製造段階の際の発酵槽中の炭素源のレベルが１０ｇ／ｌを超えないように、好ましくは培養基に加えられる。２ｇ／ｌの最大濃度が好ましく、特に好ましくは０．５ｇ／ｌ、特に好ましくは０．１ｇ／ｌである。
【００４０】
本発明による方法で使用するＮ源は、好ましくはアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物である。ｐＨを安定化させるための補正手段としてアンモニアを使用する場合、このＮ源は、発酵の際に定期的に補充する。
【００４１】
元素リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄及び、痕跡量の（すなわちμＭ濃度）、元素モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルの塩を、さらなる媒体添加剤として加えることができる。
【００４２】
さらに、有機酸（例えば酢酸、クエン酸）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン（例えばＢ１、Ｂ６）を媒体に加えることができる。
【００４３】
使用する複雑な栄養源は、例えば酵母抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、又は麦芽エキスを含むことができる。
【００４４】
中温性微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ又はＰ．ａｎａｎａｔｉｓ、用の培養温度は、好ましくは１５〜４５℃、特に好ましくは３０〜３７℃である。
【００４５】
発酵の際における発酵媒体のｐＨは、好ましくはｐＨ５．０〜８．５、特に好ましくはｐＨ７．０である。
【００４６】
Ｌ−システイン及びＬ−システイン誘導体の製造には、発酵中に硫黄源を供給しなければならない。この場合、サルフェート又はチオサルフェートの使用が好ましい。
【００４７】
記載する方法により発酵する微生物は、Ｌ−システイン及びＬ−システインに由来する化合物を、発酵媒体中に高い効率で、成長段階に続くバッチプロセス又は流加プロセスで８〜１５０時間の期間で分泌する。
【００４８】
発酵の後、沈殿物として存在するＬ−シスチンは、培養基ブロスの残りの構成部分から公知の方法により、例えばデカンターを使用して、分離することができる。
【００４９】
下記の工程は、粗製物をさらに精製するために行うことができる。
−粗製物の鉱酸による溶解
−粗製物溶液を遠心分離又は濾過により清澄化
−溶液を無色化
−沈殿物の結晶化
【００５０】
Ｌ−シスチンのＬ−システインへの還元は、例えば欧州特許第０２３５９０８号に記載されているような電気化学的方法により行うことができる。
【実施例】
【００５１】
下記の例は、本発明をさらに説明する。
【００５２】
例１  システイン生産菌株の発生
野生型菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）及びＰ．ａｎａｎａｔｉｓ（ＡＴＣＣ  １１５３０）を、それぞれの場合、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（米国特許第５９７２６６３Ａ号の例２に開示）で、米国特許第５９７２６６３Ａ号に記載されている電気穿孔法により形質転換した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、複製開始点及びテトラサイクリン耐性遺伝子に加えて、ｃｙｓＥＸ対立遺伝子も含んでなり、これは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、及びエフラックス遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）をコード化し、その発現は、構成するＧＡＰＤＨプロモーターにより制御される。プラスミドを有する細胞の選択は、テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天プレート上で行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を使用するさらなるプラスミド単離及び制限分析の後、所望の形質転換物、すなわちプラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６を取り入れた細胞、を単離し、例２に記載する発酵に使用した。
【００５３】
例２  様々な酸素飽和におけるシステイン生産の培養
予備培養基１（振とうフラスコ）
テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含むＬＢ媒体２０ｍｌに、三角フラスコ（１００ｍｌ）中で、それぞれの菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６又はＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６）を接種し、振とう装置（１５０ｒｐｍ、３０℃）で７時間培養した。
【００５４】
予備培養基２（振とうフラスコ）
続いて、予備培養基１を、ＳＭＩ−媒体（Ｋ２ＨＰＯ４  １２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ／ｌ、（ＮＨ４）  ２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ／ｌ、Ｎａ３クエン酸塩ｘ２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ０．１ｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ２．５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ ０．７ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２ｘ４Ｈ２Ｏ １．６ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／ｌからなる痕跡量元素溶液）にグルコース５ｇ／ｌ、ビタミンＢ１５ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを捕捉したもの１００ｍｌ中に完全に移した。培養基を、三角フラスコ（１ｌ）中、３０℃、１５０ｒｐｍで１７時間振とうした。この培養に続いて、６００ｎｍ光学密度（ＯＤ６００）は、３〜５であった。
【００５５】
主培養基（発酵槽）
発酵は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍから入手したタイプＢＩＯＳＴＡＴ  Ｂの発酵槽中で行った。総容積２ｌの培養基容器を使用した。発酵媒体（９００ｍｌ）は、グルコース１５ｇ／ｌ、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）  ２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ０．０７５ｇ／ｌ、Ｎａ３クエン酸塩ｘ２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ及び痕跡量元素溶液（上記参照）、ビタミンＢ１ ０．００５ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含んでなる。発酵槽中のｐＨは、開始時に、２５％ＮＨ４ＯＨ溶液をポンプで加え、７．０に調節した。発酵の際、ｐＨは、２５％ＮＨ４ＯＨを使用して自動補正により７．０に維持した。接種のために、１００ｍｌの予備培養基２を発酵容器にポンプで供給した。従って、出発容積は、約１ｌであった。培養基は、開始時に４００ｒｐｍで撹拌し、無菌フィルターを経由して無菌の圧縮空気を２ｖｖｍで通気した。酸素プローブは、接種の前に、これらの出発条件下で１００％飽和に校正しておいた。発酵中のＯ２飽和に対する公称値は、実験バッチに応じて、５０±５％、４０±５％、３０±５％、２０±５％または１０±５％に調節した。Ｏ２飽和がそれぞれの公称値未満に低下した場合、調整カスケードを開始し、Ｏ２飽和を公称値に回復させた。最初に、ガス供給を連続的に（最大５ｖｖｍに）増加し、次いで撹拌速度を連続的に（最大１５００ｒｐｍ）増加させた。
【００５６】
発酵は、温度３０℃で行った。２時間の発酵時間の後、硫黄源の供給を、無菌６０％チオ硫酸ナトリウムｘ５Ｈ２Ｏ原液の形態で、毎時１．５ｍｌの速度で行った。発酵槽中のグルコース含有量が初期の１５ｇ／ｌから約２ｇ／ｌに低下した時、５６％グルコース溶液を連続的に加えた。供給速度は、発酵槽中のグルコース濃度がその点から２ｇ／ｌを超えないように調節した。グルコース測定は、ＹＳＩ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、オハイオ州、米国）から入手したグルコース分析装置で行った。発酵時間は４８時間であった。その後、試料を採取し、培養基上澄み液中のＬ−システイン含有量、及びそこから誘導された誘導体の含有量、（特にＬ−システイン及びチアゾリジン）、及び沈殿物中（Ｌ−シスチン）をそれぞれ独立して測定した（表１参照）。この目的には、Ｇａｉｔｏｎｄｅの熱量計試験をそれぞれの場合に使用した（Ｇａｉｔｏｎｄｅ，Ｍ．Ｋ．（１９６７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０４，６２７−６３３）。ここで、試験の強い酸性反応条件下で、遊離のＬ−システインだけではなく、チアゾリジンに結合したＬ−システインも一緒に記録され、定量されることに注意する。培養基上澄み液中に溶解したＬ−シスチンは、Ｇａｉｔｏｎｄｅ試験では、希釈溶液中で、ｐＨ８．０でジチオトレイトール（ＤＴＴ）による還元に続いて、Ｌ−システインとして検出される。沈殿物中にあるＬ−シスチンは、先ず８％塩酸中に溶解させてから、同様に定量される。
【００５７】
【表１】
0005840767.tif 000002