(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍を治療するための医薬組成物であって、
（ａ）１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、または
（ｂ）分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１（ＢＣＡＴ１）をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡ、を活性成分として含み、
前記脳腫瘍が、ＩＤＨｗｔ星状細胞系脳腫瘍、ＩＤＨｗｔ神経膠腫またはＩＤＨｗｔ神経膠芽腫である、医薬組成物。
【請求項２】
脳腫瘍を治療するための医薬組成物を調製するための（ａ）１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、または（ｂ）分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１（ＢＣＡＴ１）をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡ、の使用であって、
前記脳腫瘍が、ＩＤＨｗｔ星状細胞系脳腫瘍、ＩＤＨｗｔ神経膠腫またはＩＤＨｗｔ神経膠芽腫である、使用。
【請求項３】
治療対象の脳腫瘍がＢＣＡＴ１過剰発現を示す請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
治療対象の脳腫瘍がＢＣＡＴ１過剰発現を示す請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記脳腫瘍は、ＩＤＨｗｔ神経膠芽腫である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記脳腫瘍は、ＩＤＨｗｔ神経膠芽腫である請求項２に記載の使用。
【請求項７】
脳腫瘍の治療剤を同定する方法であって、
前記脳腫瘍が、ＩＤＨｗｔ星状細胞系脳腫瘍、ＩＤＨｗｔ神経膠腫またはＩＤＨｗｔ神経膠芽腫であり、 
（ａ）候補化合物を分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１（ＢＣＡＴ１）もしくはＢＣＡＴ１をコードする遺伝子を含む試験系とともにインキュベートする工程と、
（ｂ）ＢＣＡＴ１の生物学的活性をアッセイする工程を含み、
このときＢＣＡＴ１の前記生物学的活性の阻害もしくは消失が、脳腫瘍細胞の増殖を抑制するとの所望の特性を有する候補化合物の存在を示す、方法。
【請求項８】
ＢＣＡＴ１の前記生物学的活性の阻害もしくは消失は、試験化合物の非存在によって特徴付けられる試験系との比較によって決定される請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳腫瘍を治療する方法において使用するための（ａ）分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１（ＢＣＡＴ１）の生物学的活性または（ｂ）ＢＣＡＴ１をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできる化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト悪性神経膠芽腫は、ヒトの悪性脳腫瘍の最多数を占めている。これまで、神経膠腫の治療には、神経外科技術（切除または定位固定法）、放射線療法および化学療法が含まれる。例えば星状細胞腫瘍のための現在の医療基準は、外科的腫瘍切除術を含んでおり、その後に経口アルキル化剤であるテモゾラミド（ＴＭＺ）による化学療法および放射線療法を行うことができる。しかし、神経膠芽腫は、電離放射線、化学療法および外科的切除には応答できないので治療不能であると考えられている。言い換えると、これらの療法を使用しても、患者の延命は極めて短い。これは、これらの療法を実施しても癌診断後の平均寿命が１２〜１６カ月間に過ぎないことを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明の基礎にある技術的課題は、現行療法の欠点を克服して患者の生存率を改善する、脳腫瘍、好ましくは神経膠芽腫または星状細胞系脳腫瘍の療法のための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けた実施形態を提供することによって達成される。
【０００５】
本発明に至った実験において、これまでに例えば抗けいれん薬として使用されてきたガバペンチンのような公知のＢＡＣＴ１阻害剤が、癌療法、つまり一般的には新生物に対する、特に星状細胞系脳腫瘍のような脳腫瘍を治療するための効果的な療法における新規な治療選択肢を表すことが見いだされた。ＢＡＣＴ１阻害剤は、いずれかの確立された化学療法の標的とはされていない分子経路を標的とすることによって作用する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＩＤＨｗｔ神経膠星状細胞腫は高ＢＣＡＴ１発現を特徴とする。（ａ）ＢＣＡＡ異化作用の略図による表示。ＢＣＡＡ、分枝鎖アミノ酸。ＢＣＫＡ、分枝鎖ケト酸。（ｂ、ｃ）正常脳における発現（点線）に対して正規化された７０例の神経膠星状細胞腫（４１例のＩＤＨｗｔおよび２９例のＩＤＨｍｕｔ）におけるＢＣＡＴ１（ｂ）およびＢＣＡＴ２（ｃ）のＲＮＡ発現。データは、平均値±ｓ．ｄ．（標準偏差）として表示されている（スチューデントの両側ｔ検定）。＊  Ｐ＜０．０５。＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（ｄ）ＩＤＨ１およびＩＤＨ２野生型遺伝子（レーン１〜５）、ＩＤＨ２（レーン６〜７）またはＩＤＨ１（レーン８〜１２）遺伝子における様々な突然変異を備える神経膠星状細胞腫および正常脳（レーン１３）におけるＢＣＡＴ１タンパク質の発現を示しているウェスタンブロット。ＡＩＩ、瀰漫性星状細胞腫ＷＨＯグレードＩＩ。ＡＡＩＩＩ、退形成性星状細胞腫ＷＨＯグレードＩＩＩ。ｓＧＢＩＶ、二次性神経膠芽腫ＷＨＯグレードＩＶ。ｐＧＢＩＶ、原発性神経膠芽腫ＷＨＯグレードＩＶ。ＡＯＩＩＩ、退形成性乏突起神経膠腫ＷＨＯグレードＩＩＩ。（ｅ〜ｈ）ＩＤＨｗｔ原発性神経膠芽腫。（ｅ）、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ突然変異を備える原発性神経膠芽腫（ｆ）、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｃ突然変異を備える瀰漫性星状細胞腫（ｇ）、およびＩＤＨ２−Ｒ１７２Ｋ突然変異を備える退形成性乏突起神経膠腫におけるＢＣＡＴ１の免疫組織化学的染色（ｈ）。（ｉ、ｊ）ＢＣＡＴ１およびＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ染色の相補性を示している、パネルｂおよびｃ各々と同一腫瘍におけるＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈの免疫組織化学的染色。スケールバー、５０μｍ。（ｋ）８１例の神経膠腫におけるＩＤＨ１およびＩＤＨ２遺伝子のＢＣＡＴ１タンパク質発現および突然変異状態の有意な相関を示している２×２分割表（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）。
【図２】ＢＣＡＴ１は神経膠芽腫細胞系における基質依存性発現を示す。（ａ）ＩＤＨｗｔ神経膠腫細胞系におけるＢＣＡＴ１タンパク質発現を示しているウェスタンブロット。（ｂ〜ｄ）低酸素およびα−ＫＧがＢＣＡＴ１発現に及ぼす作用。ＲＮＡおよびタンパク質発現は、各パネルの底部および上部に示されている。ウェスタンブロットの上方の数は、コントロール細胞と比較した発現の倍率を示している。ｍＲＮＡ発現値は、サンプル３例ずつの平均値±ｓ．ｄ．で表している。（ｂ）ＢＣＡＴ１は、低酸素（１％Ｏ２）条件下でアップレギュレートされる。（ｃ）ＢＣＡＴ１発現は、培養培地への細胞透過性のジメチル−αＫＧの補給によって誘導される。（ｄ）α−ＫＧ産生性細胞質ＩＤＨ１の２つの異なるｓｈＲＮＡによるノックダウンは、ＢＣＡＴ１発現のダウンレギュレーションをもたらす。
【図３】３種のＢＣＡＴ１転写産物の発現レベルは２種の選択的プロモーターの差次的メチル化と関連している。（ａ）３種の転写産物Ｔ１、Ｔ４およびＴ６のエクソン構造を示している、ＢＣＡＴ１のエクソン１〜４の略図である。２種の選択的プロモーター１および２は、各々左下および右下の拡大図に示されている。（ｂ）星状細胞神経膠腫ならびに正常脳組織由来のＲＮＡプール（ｎ＝２３）における転写産物Ｔ１、Ｔ４およびＴ６のＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ定量化。数値は、サンプル３例ずつの平均値±ｓ．ｄ．を表している。（ｃ）正常脳および星状細胞神経膠腫ＷＨＯグレードＩＩ〜ＩＶにおける亜硫酸水素塩−ＰＣＲアンプリコンＡ１〜Ａ８の質量アレイ分析によってプロモーター１（左）および２（右）において検出されたＤＮＡメチル化パターン。＊、ＩＤＨｗｔ退形成性星状細胞腫。（ｄ〜ｆ）（ｄ）プロモーター２における全ＣｐＧの平均値（スチューデントの両側ｔ検定、Ｐ＜０．０００１）、（ｅ）ＣｐＧ４、５（Ｐ＝０．０００３）および（ｆ）プロモーター１におけるＣｐＧ６（Ｐ＜０．０００１）で表した、正常脳（Ｎｂｒ）、ＩＤＨｗｔおよびＩＤＨｍｕｔ腫瘍におけるＤＮＡメチル化の程度。（ｇ）ＣｐＧ６メチル化グレードとＢＣＡＴ１  Ｔ１発現との相関。（ｈ、ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＨＥＹ１のノックダウン（ｈ）は、ＢＣＡＴ１発現のアップレギュレーション（ｉ）を生じさせる。数値は、平均値±ｓ．ｄを表す（ｎ＝３）。（ｊ、ｋ）ＢＣＡＴ１の約５ｋｂ上流にあるプロモーター１におけるコントロールアンプリコン（ｃ２）、ならびに非関連性の陽性（ＢＨＬＨ１５）および陰性（ＰＴＰＲＤ）コントロールと比較したＨＥＹ１のＤＭＲ（アンプリコンｃ１）への好ましい結合を示しているＣｈＩＰアッセイ。（ｊ）ＨＥＹ１−Ｆｌａｇ構築物。（ｋ）ＨＥＹ１−フラグ構築物。ｑＲＴ−ＰＣＲは３回ずつ実施され、インプットへの結合率は、平均値±ｓ．ｄとして示されている。
【図４】ＢＣＡＴ１抑制は神経膠腫細胞によるグルタミン酸遊離を減少させ、膜脂肪酸の濃度に影響を及ぼす。（ａ、ｂ）コントロール（−）または２０ｍＭガバペンチン（＋）を用いた２０時間にわたる処理後のＵ−８７ＭＧ（ａ）およびＵ−３７３ＭＧ（ｂ）細胞のＮＭＲスペクトル。差スペクトルは、パネルの上部近くに示されている。阻害剤処理後、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）のレベルは、Ｕ−８７ＭＧ細胞中では各々１．０９、１．３８、および１．１９倍、ならびにＵ−３７３ＭＧ細胞中では各々１．８３、２．１８％および２．３２倍増加した。（ｃ）コントロール（−）または２０ｍＭガバペンチンによるＢＣＡＴ１阻害（＋）を用いた処理開始６および１２時間後の神経膠腫細胞によるグルタミン酸遊離（ｎ＝３）。（ｄ）レンチウイルス形質導入８日後のＢＣＡＴ１ノックダウンおよびコントロ−ルＵ−８７ＭＧ細胞の培養培地中のアミノ酸濃度についてのタンデム−ＭＳ分析。数値は培地開始濃度との差として示されている。プラスおよびマイナスの数値は、各々アミノ酸の遊離および取り込みを示している（ｎ＝６）。（ｅ）（ｄ）と同一細胞の細胞内アミノ酸濃度（ｎ＝６）。（ｆ）ＢＣＡＴ１ノックダウン後のＨＡＤＨのダウンレギュレーションを示しているウェスタンブロット。（ｇ）ＢＣＡＴ１ノックダウン対コントロールＵ−８７ＭＧ細胞（ｎ＝３）におけるコレステロールおよび超長鎖脂肪酸の相対枯渇。データは、平均値±ｓ．ｄ．として示されている。＊  Ｐ＜０．０５。＊＊  Ｐ＜０．０１。＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図５】ＢＣＡＴ１ノックダウンは神経膠芽腫細胞浸潤能力を制限する。（ａ、ｂ）コントロール（ａ）およびＢＣＡＴ１ノックダウン（ｂ）Ｕ−８７ＭＧ細胞におけるα−チューブリンの免疫蛍光標識化。青色、ＤＡＰＩ。スケールバー、５０μｍ。（ｃ）９時間にわたる５×１１×３００μｍマイクロチャネルを通るＵ−８７ＭＧ細胞の透過を示している連続画像。スケールバー、５０μｍ。（ｄ）ＢＣＡＴ１ノックダウンは、非標的ｓｈＲＮＡ形質導入細胞と比較してＵ−８７ＭＧ細胞の浸潤能力を有意に阻害する。結果は、３回の独立実験の平均値±ｓ．ｄ．を示している。Ｐ＝０．０１４６。
【図６】ＢＣＡＴ１は神経膠芽腫進行に不可欠である。（ａ〜ｄ）ＢＣＡＴ１抑制後の神経膠腫細胞の細胞増殖および細胞周期分析。細胞の増殖は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ細胞増殖アッセイを使用して試験された。細胞周期分析は、ヨウ化プロピジウムを用いたＤＮＡ染色後に実施された。ＤＮＡ分布は、生細胞について示されている。グラフ上の数値は、ｎ＝３についての平均値±ｓ．ｄ．を表している。ｎｔ、非標的ｓｈＲＮＡ。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．０１。＊＊＊Ｐ＜０．００１。各コントロールとの比較。（ａ）２０時間にわたるＢＣＡＴ１阻害剤であるガバペンチンによる処理は、溶媒単独で処理されたコントロール細胞と比較して濃度に依存して神経膠腫細胞の増殖を抑制した。（ｂ）ガバペンチン処理神経膠腫細胞の細胞周期分析は、Ｇ１期における細胞蓄積を示した。（ｃ）ＢＣＡＴ１のノックダウンは、全３種の神経膠腫細胞系内で非標的ｓｈＲＮＡ（ｎｔ）を用いて処理されたサンプルと比較して細胞増殖の有意な減少を誘導し、（ｄ）Ｇ１期停止マーカーＣＤＫＮｌＢ／ｐ２７ＫＩＰ１の蓄積を生じさせた。細胞周期分析は、Ｇ１期における細胞比率の有意な増加を示した。（ｅ）ＢＣＡＴ１ノックダウンはＡＫＴのリン酸化減少を生じさせる。（ｆ〜ｉ）Ｕ−８７ＭＧ神経膠芽腫細胞のＣＤ−１ヌードマウス内への頭蓋内注射によって誘導された腫瘍の断面図。（ｆ）コントロール非標的−ｓｈＲＮＡまたは（ｇ）ＢＣＡＴ１−ｓｈＲＮＡを注射されたマウスでのヘマトキシリン−エオシン染色が示されている。（ｈ）腫瘍容積の定量（各群について、ｎ＝５（マウス）、Ｐ＝０．００９１）。
【図７】ＢＣＡＴ１転写産物。（ａ）１１個のエクソンならびに２種の異なるプロモーターを起源とする３種の転写産物Ｔ１（ＥＮＳＴ０００００２６１１９２）、Ｔ４（ＥＮＳＴ０００００５３９２８２）およびＴ６（ＥＮＳＴ０００００５３８１１８）を示しているＢＣＡＴ１の遺伝子構造。転写開始部位（ＴＳＳ）およびエクソン５の周囲の領域は、プライマーの場所を示すために拡大されている。（ｂ）リバースプライマーおよび転写産物特異的エクソン１プライマーを用いてＩＤＨｗｔ神経膠芽腫（左）および２３個体由来の正常脳ＲＮＡのプール（右）から増幅させたＰＣＲ産物のアガロースゲル画像。バンドサイズは、スプライスされたｍＲＮＡ各々の予測サイズと適合する。
【図８】ウェスタンブロット分析  細胞系Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧおよびＨｓ６８３における（ａ）ガバペンチン処理および（ｂ）ＢＣＡＴ１ノックダウン後のｍＴＯＲ標的ＲＰＳ６Ｋの全およびリン酸化タンパク質のウェスタンブロット分析。
【図９】ＢＣＡＴ１ノックダウン  ＢＣＡＴ１ノックダウンは、神経膠芽腫球状一次培養においてアポトーシスを誘発する。（ａ）２つのｓｈＲＮＡ構築物のレンチウイルス形質導入によって誘導された増殖の減少（ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。（ｂ）ＢＣＡＴ１ノックダウン後のｓｕｂ−Ｇ１分画の強度の増加を示している細胞周期分析（ｎ＝３）。上部のウェスタンブロットは、ノックダウン細胞内でのＧ１停止マーカーＣＤＫＮ１Ｂの存在の増加を示している。（ｃ）ＢＣＡＴ１ノックダウンを用いた球状細胞のアポトーシス死を確証しているアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ／７ＡＡＤアッセイ。
【図１０】２３時間にわたる５ｍＭガバペンチン処理後のＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵアッセイ  実験の詳細については、実施例２を参照されたい。
【図１１】ｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウン後のＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵアッセイ  実験の詳細については、実施例３を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
そこで、本発明は、新生物形成を治療する方法において使用するための（ａ）分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１（ＢＣＡＴ１）の生物学的活性または（ｂ）ＢＣＡＴ１をコードする遺伝子の発現、を低減もしくは阻害することのできる化合物に関する。
【０００８】
「新生物」は、新生物形成の結果としての異常な組織の塊である。「新生物形成」は、細胞の異常な増殖である。細胞の増殖は卓越し、その周囲の正常組織に対して調和しない。この増殖は、刺激の停止後でさえ同一の過剰方法で持続する。この増殖は、通常は腫物または腫瘍を誘発する。新生物は良性、前癌状態（細胞腫−原位置）または悪性（癌）の場合がある。本発明による治療対象新生物は、ＢＣＡＴ１を（過剰）発現する新生物である。そこで、新生物中のＢＣＡＴ１の判定は、ＢＣＡＴ阻害療法を開始すべき兆候である。治療対象の新生物は、脳腫瘍、特にＩＤＨ１野生型を発現する星状細胞系脳腫瘍、神経膠腫もしくは神経膠芽腫である。
【０００９】
分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）であるバリン、ロイシンおよびイソロイシンは、肝異化作用を免れる必須アミノ酸であり、全身循環で入手することができる。ＢＣＡＡ代謝は、中枢神経系における神経伝達物質であるグルタミン酸を含む非必須アミノ酸の合成のために身体全体を通して窒素を移動させる重要な輸送システムを提供する。ＢＣＡＡ異化経路の脱制御は、頻回に神経機能障害を生じさせる。ＢＣＡＡ異化作用の最初の工程は、細胞質分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ１（ＢＣＡＴ１）またはミトコンドリアＢＣＡＴ２アイソザイムによるα−アミノ基のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）への転移を含み、産物としてグルタミン酸および各分枝鎖ケト酸（ＢＣＫＡ）が得られる（Ｉｃｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  ｐｐ．１６０−１６９，  （１９６６）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４１，  ｐｐ．４３９６−４４０５，  （１９６６））。ＢＣＡＴ２の発現は遍在性であるが、ＢＣＡＴ１の発現は、ＢＣＡＡが神経伝達物質であるグルタミン酸の合成のための窒素の主要起源である脳を含む少数の組織に限定されている。アミノ基転移後、ＢＣＫＡはさらにトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路に侵入するアセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡへ異化される（図１ａ）。ＢＣＫＡ異化作用の副産物として生成されるＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２は、ＡＴＰ産生のための呼吸鎖の複合体ＩＩＩへ還元当量を運搬するために使用される。
【００１０】
最初に神経膠芽腫の分画内で検出されたＩＤＨ１（イソクエン酸脱水素酵素１）内の突然変異は、世界保健機関（ＷＨＯ）グレードＩＩおよびＩＩＩ神経膠腫および二次性神経膠芽腫の大半に存在するが、原発性神経膠芽腫内では希である（Ｂａｌｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  １１６，  ｐｐ．５９７−６０２（２００８））。ＩＤＨ２における突然変異もまた、５〜１０％という低頻度ではあったが検出された（Ｂａｌｓｓ，  Ｂａｌｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  １１６，  ｐｐ．５９７−６０２（２００８）、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６０，  ｐｐ．７６５−７７３（２００９））。ＩＤＨ突然変異は神経膠腫の病因において中心的役割を果たし（Ｐａｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，  ｐｐ．１８０７−１８１２（２００８））、最初にＲＮＡ発現およびＤＮＡメチル化パターンに基づいて同定された２つの主要神経膠腫サブグループを識別する重要な分類指標を構成することが証明されている。ＩＤＨ１変異型（ＩＤＨｍｕｔ）を示す脳腫瘍はＩＤＨ１が変異していない（ＩＤＨｗｔ）脳腫瘍よりも良好な予後を有することが解明されている（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  １２０，  ｐｐ．７０７−７１８（２０１０））。
【００１１】
本発明者らは、ＩＤＨｍｕｔ（ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ突然変異を有する）とＩＤＨｗｔ脳腫瘍との１つの相違は、ＢＣＡＴ１過剰発現が最も一般的で最も攻撃的な成人脳腫瘍であるＩＤＨｗｔ神経膠芽腫の高度に特異的な特徴であることを見いだした。ＩＤＨｍｕｔ腫瘍では観察されたがＩＤＨｗｔ腫瘍および正常脳では観察されなかったＢＣＡＴ１プロモーター２の特異的メチル化は、ＩＤＨｍｕｔ腫瘍における低ＢＣＡＴ１発現が、腫瘍代謝産物の２−ヒドロキシグルタレートである変異型ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素の産物によるヒストンデメチラーゼおよび５−メチルシトシンヒドロキシラーゼのＴＥＴファミリーの阻害を通して媒介されると考えられるＩＤＨ１突然変異関連性ＤＮＡメチル化の結果であることを証明している。興味深いことに、プロモーター１を起源とするＢＣＡＴ１  ｍＲＮＡ発現の制御は、ＩＤＨｗｔ腫瘍においてはＨＥＹ１転写レプレッサーのための結合部位のメチル化を通してＩＤＨ非依存性エピジェネティック機序によって達成されるが、ＩＤＨｍｕｔ腫瘍においては達成されないようである。２つのプロモーターにおけるＤＮＡメチル化のこれらの全く逆のパターンは、ＢＣＡＴ１抑制が「パッセンジャー」メチル化を通してのＩＤＨ１突然変異の単なる副産物として発生するのではなくむしろ、ＩＤＨｗｔおよびＩＤＨｍｕｔ腫瘍における細胞代謝の差次的制御には各群におけるＢＣＡＴ１発現の厳密な制御を必要とすることを明らかにしている。
【００１２】
一般に使用される診断用ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ染色に類似して、ＢＣＡＴ１染色はＩＤＨｗｔをＩＤＨｍｕｔ神経膠腫から識別するために役立つ可能性があり、ＢＣＡＴ１染色はＩＤＨｗｔ原発性神経膠芽腫を非ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ突然変異を備える１０％近いＩＤＨｍｕｔ星状細胞腫から識別するという追加の利点も提供する。最も重要なことに、本発明は、ＢＣＡＴ１およびＢＣＡＡ代謝が神経膠腫療法における新規な代謝に基づくアプローチを開発するための基礎を提供することを示している。
【００１３】
これは、ＩＤＨｗｔ神経膠芽腫におけるＢＣＡＴ１の抑制が腫瘍細胞増殖ならびに、周囲脳組織への神経毒性を頻回に誘発して脳腫瘍患者における腫瘍関連性てんかんを引き起こす腫瘍細胞によるグルタミン酸の排出を有意に妨害する能力を有することを意味する。
【００１４】
さらに、本発明のデータは、悪性細胞増殖を支持するために最も重要であると考えられる２つの栄養素であるグルコースおよびグルタミンの大量の利用可能性がＩＤＨｗｔ神経膠芽腫の持続性の高速増殖を支持するためには不十分であることを証明している。
【００１５】
これを言い換えると、本発明では、ＢＣＡＴ１過剰発現が神経膠芽腫、特にＩＤＨｗｔ神経膠芽腫の高度に特徴的な特性であり、それらの攻撃的な臨床挙動に必須であることが証明されている。そこで、ＢＣＡＴ１発現およびＢＣＡＡ異化作用は、神経膠腫の診断的および予後的評価の有望なマーカーであり、新規治療標的として機能する。さらに、本発明は、神経膠腫の病理学的機序の中核を成す代謝遺伝子のＩＤＨ１突然変異関連性異常ＤＮＡメチル化によるサイレンシングによる最初の例を提示する。腫瘍成長の初期におけるＢＣＡＴ１のサイレンシングは、ＩＤＨｍｕｔ神経膠腫が代謝供給源としてＢＣＡＡを利用することを防止し、ＢＣＡＴ１−依存性ＩＤＨｗｔ神経膠芽腫に比してＩＤＨｍｕｔ神経膠腫の悪性増殖挙動が小さいことを説明する。
【００１６】
生物学的活性の低減、サイレンシングまたは阻害は、ある化合物のＢＣＡＴ１との直接的な相互作用もしくは結合によって、または間接的相互作用、例えばＢＣＡＴ１の生物学的活性と関連する化合物との相互作用によって実行することができる。生物学的活性の低減もしくは阻害は、さらにまた変化した、例えばＢＣＡＴ１の不活性形の、好ましくは過剰の適用によって達成することもできる。
治療作用を得る目的でＢＣＡＴ１の生物学的活性またはＢＣＡＴ１をコードする遺伝子の発現を低減、サイレンシングもしくは阻害する適切な化合物の例として以下のものが挙げられる。
【００１７】
（ａ）様々なタイプのプラスミド、ベクターもしくは天然／合成／突然変異ウイルス、改変オリゴヌクレオチド、例えば、ＰＴＯ、ＬＮＡ、２’Ｆ−ＡＮＡ、タンパク質−ヌクレオチド複合体、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡもしくはミクロｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、メチルメトキシ−、ホスホロアミド酸、ＰＮＡ、モルホリノ、ホスホルアミデート、シクロヘキセン（ＣｅＮＡ）、ギャップ−ｍｅｒｅ、リボザイム、アプタマー、ＣｐＧ−オリゴ、ＤＮＡ−ザイム、リボスイッチ、または脂質もしくは脂質含有分子、
（ｂ）ペプチド、ペプチド複合体、全てのタイプのリンカーを含む、
（ｃ）小分子、
（ｄ）抗体およびそれらの誘導体、特に、キメラ、Ｆａｂ−フラグメント、Ｆｃ−フラグメント、または、
（ｅ）担体、リポソーム、ナノ粒子、複合体または上記に挙げた構築物を含有する任意の他の送達系、
（ｆ）酸化剤またはスルフヒドリル（ＳＨ基）改変剤。
【００１８】
本発明の目的に適したまた別の化合物およびそのような化合物を同定／選択する方法については以下でより詳細に記載する。
【００１９】
好ましくは、医薬組成物中では、上述したそのような化合物は薬学的に許容される担体と結合されている。「薬学的に許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主にとって毒性ではないあらゆる担体を含むことが意図されている。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、慣習方法によって調製することができ、活性化合物を有効量で被験者に投与することができる。
【００２０】
「有効量」は、新生物の経過および重症度に影響を及ぼしてそのような病理の低減または寛解をもたらすのに十分である有効成分の量を意味する。新生物の治療および／または防止に有用な「有効量」は、当業者であれば公知の方法を使用して決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  ｅｄｓ．  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．１−４６（１９７５）を参照されたい）。
【００２１】
適切な組成物の投与は、様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって実行することができる。投与経路は、当然ながら、療法の種類および該医薬組成物中に含有された化合物の種類に左右される。投与レジメンは、主治医および他の臨床因子によって決定されることになる。医療分野において周知であるように、任意の１人の患者のための用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与すべき特定化合物、投与の時間および経路、療法の種類、全身健康状態および同時に投与される他の薬物を含む多数の因子に左右される。
【００２２】
当業者であれば、本発明の治療のために有用な化合物を、ＢＣＡＴ１のアミノ酸配列、およびこのタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列に関する知見に基づいて容易に同定または生成することができる。各配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（Ｐ５４６８７、ＢＣＡＴ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５５０４）およびヒト遺伝子解析機構の遺伝子命名法委員会（ＨＧＮＣ）データベース（ＨＧＮＣ  ＩＤ：９７６）に見いだされる。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＢＣＡＴ１をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害するのに有用な化合物は、ＢＣＡＴ１に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。好ましくは、ＢＣＡＴ１発現をサイレンシングするのに有用な化合物は、ヒトＢＣＡＴ１（ＢＣＡＴ１  ｓｈＲＮＡＩ  ＮＭ＿００５５０４．３−１０６４ｓ１ｃ１およびＢＣＡＴ１  ｓｈＲＮＡＩＩ  ＮＭ＿００５５０４．３−７５１ｓ１ｃ１）ならびにヒトＩＤＨ１（ＩＤＨ１  ｓｈＲＮＡＩ  ＮＭ＿００５８９６．２−１３６３ｓ１ｃ１およびＩＤＨ１  ｓｈＲＮＡＩＩ  ＮＭ＿００５８９６．２−２９２ｓ１ｃ１）ｍＲＮＡ転写産物の様々な領域を標的とする非依存性のＭｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ｓｈＲＮＡ構築物である。
【００２４】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成には、所望の作用、例えば該タンパク質の発現の阻害が生じるようにアンチセンス相互作用のためのＢＣＡＴ１コーディング遺伝子内の１つ以上の部位が発生するとの決定が含まれる。好ましい遺伝子内部位は、（ａ）該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始もしくは停止コドンを含む領域、または（ｂ）「ループ」もしくは「バルジ」である、つまり二次構造の一部ではないｍＲＮＡの１領域である。１つ以上の標的部位が同定されている場合は、該標的と十分に相補的である、つまり十分良好に、および十分な特異性でハイブリダイズして所望の作用を生じさせるオリゴヌクレオチドが選択される。本発明の状況では、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であってよい、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合を意味する。本明細書で使用する「相補的」は、２つのヌクレオチド間の厳密な対合の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの所定の位置にあるヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一位置にあるヌクレオチドと水素結合可能な場合は、該オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡもしくはＲＮＡは、その位置で相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡもしくはＲＮＡは、各分子内の十分な数の対応する位置が相互に水素結合を生成可能なヌクレオチドによって占有される場合に相補的である。そこで、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、該オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡもしくはＲＮＡ標的間で安定性および特異的結合が発生するように十分な程度の相補的もしくは厳密な対合を示すために使用される用語である。当該技術分野では、アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないと理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子への該化合物の結合が該標的ＤＮＡもしくはＲＮＡの正常機能を妨害して有用性の消失を誘発し、特異的結合が所望である条件下で、つまり治療の場合、該アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２５】
当業者であれば、本発明にしたがってＢＣＡＴ１についての公知のＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス化合物およびｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを生成することができる。
【００２６】
「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーもしくはポリマーまたはそれらのミメティックを意味する。この用語には、天然型核酸塩基、糖および共有結合インターヌクレオシド（バックボーン）結合から成るオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する非天然成分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変もしくは置換オリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性およびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性のために天然型より好ましいことが多い。アンチセンスオリゴヌクレオチドは該アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、例えば以下に記載するようなオリゴヌクレオチドミメティックを含むがそれらに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は、約８〜約５０個の核酸塩基（つまり、約８〜約５０個の連結ヌクレオシド）を含んでいる。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、いっそうより好ましくは約１５〜約２０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物には、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、ならびに標的核酸にハイブリダイズしてその発現を阻害する他の短鎖触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２７】
または、本発明の化合物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば哺乳動物宿主内で転写することを可能にするベクターである。好ましくは、そのようなベクターは、遺伝子治療に有用なベクターである。遺伝子治療に有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはより好ましくはＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスである。いっそうより好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。本発明において使用可能なそのようなレトロウイルスベクターの例として：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。最も好ましくは、例えば、マウスベクターに比較してより広い宿主範囲を提供するテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）などの非ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組換え型レトロウイルスは不完全であるので、感染粒子を生成するためには支援が必要とされる。そのような支援は、例えばＬＴＲ内の制御配列の制御下で該レトロウイルスの構造遺伝子全部をコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を使用することによって提供することができる。適切なヘルパー細胞系は、当業者に周知である。前記ベクターは、形質導入細胞を同定することができるように選択可能なマーカーをコードする遺伝子を追加して含有することができる。さらに、レトロウイルスベクターは、それらが標的に特異的になるような方法で改変できる。これは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成することができる。当業者に、標的特異的ベクターを生成する追加の方法は公知である。さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法に適したベクターおよび方法は文献に記載されており、当業者に公知である。例えば国際公開第９４／２９４６９号または同第９７／００９５７号を参照されたい。
【００２８】
標的器官、例えば脳腫瘍においてのみ発現を達成するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写するためのＤＮＡ配列を組織特異的プロモーターに結合させて遺伝子療法に使用することができる。そのようなプロモーターは、当業者に周知である（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ  １２，  １１−２４、Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９，  ８３３−  ８４０、Ｍａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），  Ｃｅｌｌ  ８１，  ８９１−９０４、Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １，  ２６８−７６を参照されたい）。
オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、一般に該オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシドバックボーンを形成すると言われている。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常結合またはバックボーンは、３’〜５’ホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、改変バックボーンまたは非天然インターヌクレオシド結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。改変バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、該バックボーン内のリン原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび該バックボーン内にリン原子を有していないオリゴヌクレオチドが含まれる。安定性を増すことのできる改変オリゴヌクレオチドバックボーンは当業者に公知であり、好ましくは、そのような改変はホスホロチオエート結合である。
【００２９】
好ましいオリゴヌクレオチドミメティックは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが証明されており、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれているオリゴヌクレオチドミメティックである。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンと置換されている。核酸塩基は保持され、該バックボーンのアミド成分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４（１９９１），  １４９７−１５００を参照されたい）。
【００３０】
改変オリゴヌクレオチドは、さらに１つ以上の置換もしくは改変糖成分を含有することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位置で以下の内の１つを含んでいる。ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルもしくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい）。特に好ましい改変糖成分は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖成分である。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基の改変または置換をさらに含むことができる。改変核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシンなどが含まれ、核酸二本鎖安定性を増すことが証明されているため、５−メチルシトシン置換が好ましい。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドのまた別の改変は、該オリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１つ以上の成分もしくはコンジュゲートと化学結合させる工程を含んでいる。そのような成分には、脂質成分、例えばコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分が含まれる。
【００３３】
本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物をさらに含んでいる。本発明との関連における「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物、特に各々が少なくとも１つのモノマー単位、つまりオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから作られている、２つ以上の化学的に別個の領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１つの領域を含有し、該オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与することができるように改変される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂させることのできる酵素のための基質として機能することができる。一例として、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。このためＲＮａｓｅ  Ｈの活性化は、結果としてＲＮＡ標的の開裂を生じさせ、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大幅に高める。結果として、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用された場合にはより短いオリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果を得られることが多い。本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述した２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチドミメティックの複合構造として形成することができる。そのような化合物は、当該技術分野においてはハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれてきた。
【００３４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、新生物を治療する方法において使用するための化合物は、ＢＣＡＴ１の生物学的活性を低減もしくは阻害する化合物である。
【００３５】
そのような化合物は本発明の適応とは異なる医学的適応の分野で記載があり、好ましくは例えば１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸（ガバペンチン）またはＧｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８０（４４）（２００５），  ３７２４６−５６、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６（２００６），  ２３３７−４０、Ｃａｂａｌｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １３（２００９），  ４９３−５００、米国特許第６，６３２，８３１号明細書、同第６，８０９，１１９号明細書および欧州特許第１１１５７０００（Ｂ）号明細書に記載された化合物を含んでいる。
【００３６】
ＢＣＡＴ１の生物学的活性を低減もしくは阻害することのできる化合物また別の例として、ＢＣＡＴ１に対して向けられた（中和）抗体または実質的に同一の結合特異性を有するそれらのフラグメントが挙げられる。用語「抗体」は、好ましくは様々なエピトープ特異性を備えるプールされたモノクローナル抗体から実質的に成る抗体ならびに別個のモノクローナル抗体調製物を意味する。モノクローナル抗体は、例えば、当業者には周知の方法によってＢＣＡＴ１のフラグメントを含有する抗原から作成される（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），  ４９５を参照されたい）。本明細書で使用する用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、タンパク質に特異的に結合可能な完全な分子ならびに抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図されている。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントには完全な抗体のＦｃフラグメントが欠けており、循環からより迅速に排出され、完全な抗体より非特異的組織結合が少ない可能性がある（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２４：３１６−３２５（１９８３））。そこで、これらのフラグメント、ならびにＦＡＢまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明のために有用な抗体には、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体が含まれる。
【００３７】
または、本発明のために好ましい化合物は、ＢＣＡＴ１の不活性種または上述したアプローチ／ベクターにしたがって導入可能なＢＣＡＴ１の不活性種をコードする核酸配列である。そのような不活性種は、突然変異生成の周知の方法にしたがって生成することができる。そのような化合物は、ヒト身体においてそれらの機能的に活性の対応物と置き換えることによって、特に過剰に適用された場合に治療作用を有することができる。ＢＣＡＴ１の潜在的不活性種の分析は、分枝鎖Ｌ−アミノ酸から分枝鎖α−ケト酸への（可逆性）アミノ基転移をアッセイすることによって、例えばグルタミン酸の産生を決定することによって実施することができる。適切なアッセイは、文献ならびに米国特許第６，８０９，１１９号明細書の実施例３９、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、および欧州特許第１１１５７０００（Ｂ）号明細書に記載されている。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、上記で詳細に記載した化合物は、星状細胞系脳腫瘍または神経膠芽腫を治療する方法において使用される。
【００３９】
本発明は、ＢＣＡＴ１の生物学的活性および／またはその発現を低減もしくは阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物をＢＣＡＴ１もしくはその遺伝子を含む試験系とともにインキュベートする工程と、
（ｂ）ＢＣＡＴ１の生物学的活性をアッセイする工程を含む方法であって、
好ましくは前記試験化合物の非存在下における試験系と比較したＢＣＡＴ１の生物学的活性の阻害もしくは消失が、所望の特性を有する候補化合物の存在を表示する方法にさらに関する。
【００４０】
工程（ｂ）は、上述したアッセイを使用して分枝鎖Ｌ−アミノ酸から分枝鎖α−ケト酸への（可逆性）アミノ基転移をアッセイすることによって実施することができる。
【００４１】
そのような候補分子の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または小分子が含まれる。そのような分子は、公知の技術を使用して合理的に設計することができる。
【００４２】
好ましくは、スクリーニングに使用される前記試験系は、類似の化学的および／または物理的特性の物質を含んでおり、最も好ましくは、前記物質はほぼ同一である。本発明の使用にしたがって調製および同定可能な化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、リガンド、ホルモン、ペプチドミメティック、ＰＮＡなどであってよい。
【００４３】
国際公開第９８／２５１４６号パンフレットは、所望の特性、特にポリペプチドまたはその細胞受容体を作動、結合、または拮抗する能力を有する化合物について複合体のライブラリーをスクリーニングする方法をさらに記載している。そのようなライブラリー内の複合体は、試験下の化合物、該化合物の合成における少なくとも１つの工程を記録しているタグ、およびレポーター分子による改変を受けやすいテザーを含んでいる。テザーの改変は、複合体が所望の特性を有する化合物を含有することを明示するために使用される。タグは、そのような化合物の合成における少なくとも１つの工程を解明するために解読することができる。ＢＣＡＴ１またはそのような分子をコードする核酸分子と相互作用する化合物を同定する他の方法は、例えば、ファージディスプレイシステムを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングならびにフィルター結合アッセイまたは相互作用の「リアルタイム」測定である。
【００４４】
当業者には、例えばＢＣＡＴ１にとっての基質またはリガンドとして作用することができる低分子有機化合物のミメティックを設計、合成および評価可能であることも周知である。例えば、ハパロシンのＤ−グルコースミメティックが細胞毒性における多剤耐性支援関連タンパク質に拮抗する際、ハパロシンと類似の有効性を示すことが記載されている。Ｄｉｎｈ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４１（１９９８），  ９８１−９８７を参照されたい。
【００４５】
これらの方法は全て、本発明にしたがって、ＢＣＡＴ１の生物学的活性またはその発現を低減もしくは阻害する化合物を同定するために使用することができる。
【００４６】
ＢＣＡＴ１をコードする遺伝子もまた、阻害剤をスクリーニングするための標的として機能することができる。阻害剤は、例えば、ＢＣＡＴ１をコードする遺伝子のｍＲＮＡに結合することにより該ｍＲＮＡの未変性コンフォメーションを不安定化させ、転写および／または翻訳を妨害するタンパク質を含むことができる。さらに、文献は核酸分子、例えば結果として細胞増殖もしくは細胞死の遅延を生じさせる細胞内部でそれに化合物が結合する規定もしくは未規定標的ＲＮＡ分子の構造を模擬するＲＮＡフラグメントを同定する方法が記載されている。例えば国際公開第９８／１８９４７号パンフレットおよびそこで言及された参考文献を参照されたい。これらの核酸分子は、興味深い未知の医薬化合物を同定するため、および疾患を治療する際に使用する未知のＲＮＡ標的を同定するために使用することができる。これらの方法および組成物は、ＢＣＡＴ１の発現レベルを低下させるのに有用な化合物を同定するために使用することができる。
【００４７】
本発明の方法にしたがって試験および同定可能な化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、ホルモン、ペプチドミメティック、ＰＮＡなどであってよい（Ｍｉｌｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １（１９９５），  ８７９−８８０、Ｈｕｐｐ，  Ｃｅｌｌ  ８３（１９９５），  ２３７−２４５、Ｇｉｂｂｓ，  Ｃｅｌｌ  ７９（１９９４），  １９３−１９８および上記で言及した参考文献）。さらに、ＢＣＡＴ１の推定制御因子をコードする、および／またはＢＣＡＴ１の上流または下流でそれらの作用を発揮する遺伝子は、例えば、当該技術分野において公知の遺伝子ターゲティングベクターを使用する挿入突然変異生成を使用して同定することができる。前記化合物は、さらにまた公知の阻害剤の機能的誘導体またはアナログであってよい。そのような有用な化合物は、例えば、ＢＣＡＴ１に結合するトランス作用因子またはそれをコードする遺伝子の制御配列であってよい。トランス作用因子の同定は、当該技術分野における標準方法を使用して実施することができる。タンパク質がタンパク質自体または制御配列に結合するかどうかを決定するためには、標準天然ゲルシフト分析を実施することができる。タンパク質もしくは制御配列に結合するトランス作用因子を同定するために、該タンパク質もしくは制御配列は、標準タンパク質精製法における親和性試薬として、または発現ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。ＢＣＡＴ１と相互作用するポリペプチドをコードする核酸分子の同定は、例えばＳｃｏｆｉｅｌｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４（１９９６），  ２０６３−２０６５）に記載されているように、いわゆる酵母「ツーハイブリッドシステム」の使用によっても達成することができる。このシステムでは、ＢＣＡＴ１は、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合している。この融合ポリペプチドを発現する、およびＧＡＬ４転写因子によって認識される適切なプロモーターによって駆動されるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母菌株は、活性化ドメインに融合した植物タンパク質またはそのペプチドを発現するｃＤＮＡのライブラリーを用いて形質転換される。そこで、ｃＤＮＡの１つによってコードされるペプチドがＢＣＡＴ１のペプチドを含む融合ペプチドと相互作用可能な場合、該複合体はレポーター遺伝子の発現を指令することができる。この方法で、ＢＣＡＴ１およびＢＣＡＴ１をコードする遺伝子は、ＢＣＡＴ１と相互作用するペプチドおよびタンパク質を同定するために使用することができる。当業者には、次に阻害剤を同定するためにこれや類似のシステムを利用可能なことが明白である。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するが、本発明を制限するものとは見なされない。
【００４９】
（実施例１）
一般的方法
（ａ）ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の指示にしたがって使用し、全ＲＮＡを抽出した。Ａｍｂｉｏｎ社製ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ヒト脳参照全ＲＮＡが正常脳ＲＮＡプールとして機能した（ｎ＝ドナー２３例）。製造業者の指示にしたがってランダムプライマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（独国カールスルーエ））を使用し、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写させた。贈呈された各ＤＮＡサンプルはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスターシティ））を用いてＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＯＸ  Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ社（英国エプソム））を使用して３回ずつ分析した。特異的ｍＲＮＡの相対量をＡＲＦ、Ｂ２ＭおよびＴＢＰへ基準化した。プライマー配列は、以下の表１Ａに表示した。
【００５０】
【表１Ａ】
0006002152.tif 000002
【００５１】
（ｂ）ウェスタンブロット分析
ヒト組織の使用を含む全実験は、ハインリッヒ・ハイネ大学デュッセルドルフの医学部治験審査委員会のガイドラインを遵守して実施した。新鮮な冷凍ヒト腫瘍組織サンプルおよび非新生物脳組織サンプルは、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（ＩＫＡ社（独国シュタウフェン））を用いてグアニジンイソチオシアネート溶液（４Ｍ）中に溶解させ、ＣｓＣｌ−超遠心分離にかけた。得られたタンパク質分画の透析濾過は、基本的には記載されたように４５Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（独国シュヴァルバッハ）、３ｋＤａカットオフ）を使用して実施した。細胞系の全タンパク質は、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して抽出した。１０μｇのタンパク質を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へ移した。膜をブロッキング溶液（ＴＢＳ中５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中でブロックし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体は室温で１時間インキュベートし、その後タンパク質の化学発光検出を実施した（ＥＣＬキット、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国リトルチャルフォント））。
【００５２】
以下の抗体を使用した。α−チューブリンに対するマウスモノクローナル抗体（１：２０００、＃Ｔ９０２６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州６３１７８セントルイス））、ＢＣＡＴ１に対するマウスモノクローナル抗体（１：２０００、ＥＣＡ３９、クローン５１、＃６１１２７０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国カリフォルニア州サンノゼ））、ＩＤＨ１に対するラットモノクローナル抗血清（１：１、Ａ．  ｖｏｎ  Ｄｅｉｍｌｉｎｇ、ＤＫＦＺ（ドイツ癌研究センター）より提供（独国ハイデルベルク）、Ｄｉａｎｏｖａ社（独国ハンブルク）より市販）、ＨＡＤＨＳＣに対するマウスモノクローナル抗体（１：５００、＃Ｈ００００３０３３−Ｍ０１、Ａｂｎｏｖａ社）、ＣＤＫＮ１Ｂに対するウサギモノクローナル抗体（１：１０００、ｐ２７  Ｋｉｐｌ、＃３６８６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ａｋｔに対するウサギモノクローナル抗体（１：１０００、＃９２７２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ホスホ−Ａｋｔに対するウサギモノクローナル抗体（Ｓｅｒ４７３）（１：１０００、＃１９３Ｈ１２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ｐ７０  Ｓ６キナーゼに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００、＃９２０２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ホスホ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼに対するウサギポリクローナル抗体（Ｔｈｒ３８９）（１：１０００、＃９２０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＨＲＰ結合抗ラットＩｇＧ（１：１００００、Ａ．  ｖｏｎ  Ｄｅｉｍｌｉｎｇ、ＤＫＦＺより提供（独国ハイデルベルク））、ＨＲＰ結合ウマ抗マウスＩｇＧ（１：５０００、＃７０７６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２０００、＃７０７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。
【００５３】
（ｃ）免疫組織化学的染色
腫瘍切片はキシロールを用いて脱パラフィンし、エタノールの濃度を低下させながら再水和させた。抗原性賦活化処理は、スチーマー内の１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で４０分間加熱することによって実施した。内因性ペルオキシダーゼは、３％過酸化水素中で該腫瘍切片をインキュベートすることによって不活性化した。切片は、一次抗ＢＣＡＴ１（ＥＣＡ３９）マウスモノクローナル抗体、１：５００に希釈したクローン５１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンノゼ））またはＤａｋｏ  ＲＥＡＬ（商標）抗体希釈液（Ｄａｋｏ社（デンマーク国グロストルップ））中に１：２０で希釈したマウス抗ヒトＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社（独国ハンブルク））とともに一晩インキュベートした。結合抗体を検出するための染色は、標準プロトコールにしたがってＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）検出システム（ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ＋、ウサギ／マウス）（Ｄａｋｏ社（デンマーク国グロストルップ））を使用して実施し、その後の対比染色はヘマトキシリンを使用して実施した。
【００５４】
（ｄ）ＤＮＡメチル化分析
ＤＮＡメチル化は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術によって分析した。つまり、５００ｎｇのゲノムＤＮＡは、製造業者の指示にしたがってＥＺメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して亜硫酸水素ナトリウムを用いて化学的に改変した。亜硫酸水素処理したＤＮＡは、ＢＣＡＴ１転写産物１（Ｔ１、ＥＮＳＴ０００００２６１１９２）のＴＳＳの周囲で−９９０ｂｐ〜＋６１２ｂｐの４つのアンプリコン（Ａ１〜Ａ４）およびＢＣＡＴ１転写産物４（Ｔ４、ＥＮＳＴ０００００５３９２８２）および６（Ｔ６、ＥＮＳＴ０００００５３８１１８）のプロモーターの−１９８ｂｐ〜＋６３ｂｐの３つのアンプリコン（Ａ５〜Ａ７）を生成するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。これらのアンプリコンは、Ｔ７ポリメラーゼにより転写させ、その後、Ｔ特異的−ＲＮＡａｓｅＡ切断を実施した。消化したフラグメントは、質量分析法により定量した。プライマー配列は、以下の表１Ｂに表示した。ＤＮＡメチル化標準物質（０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％メチル化ゲノムＤＮＡ）を使用して、該アンプリコンの不偏の増幅を確証した。
【００５５】
【表１Ｂ】
0006002152.tif 000003
【００５６】
（ｅ）細胞培養
ヒト神経膠腫細胞系Ｕ−８７ＭＧ（ＨＴＢ−１４）、ＬＮ−２２９（ＣＲＬ−２６１１）、Ｈｓ６８３（ＨＴＢ−１３８）およびＵ−３７３ＭＧ（ＨＴＢ−１７）は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンミックスを補給したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞系は、ショート・タンデム・リピート（ＳＴＲ）分析によって真正であることが証明された。脳腫瘍幹様細胞ＮＣＨ４２１ｋはハイデルベルク大学医学部で施設内審査委員会によって承認された研究提案書にしたがって外科的切除を受けた患者の原発性神経膠芽腫から樹立された。これらは、以前の試験において遺伝子型および表現型にしたがって特徴付けられた（Ｃａｍｐｏｓ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｅｘｅｒｔｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６，  ２７１５−２７２８（２０１０））。ＮＣＨ４２１ｋ細胞は、各々２０ｎｇ／ｍＬの濃度で２０％  ＢＩＴ無血清補給液、塩基性線維芽細胞増殖因子および上皮成長因子（全てＰｒｏｖｉｔｒｏ社（独国ベルリン））を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中の未被覆の組織培養皿上の浮遊凝集体（ニューロスフェア）として増殖させた。ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＫ２９３細胞は、抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中の単層培養として維持した。
【００５７】
全細胞系は、５％  ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。低酸素実験のために、細胞は窒素供給Ｃ１６低酸素インキュベーター（Ｌａｂｏｔｅｃｔ社（独国ゲッティンゲン））内の１％  Ｏ２で培養した。
【００５８】
（ｆ）クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）
ＣｈＩＰは、フラグでタグされたＨＥＹ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞上で実施したが、これは現在入手可能なＨＥＹ１に対する抗体がＣｈＩＰアッセイに特異的ではないためである。ＨＥＹ１過剰発現のための構築物は、ＦＬＡＧ、ｐＤｅｓｔ２６（Ｃ末端タグ）およびｐＤｅｓｔ１１（Ｎ−末端タグ）でタグされたゲートウェイ適合（gateway compatible）ベクターを用いて調製した。１μｇのコントロールベクターもしくはＨＥＹ１発現ベクターいずれかをわずかに修正を加えた製造業者の指示にしたがってＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ社（米国ワイオミング州５３７１１マディソン））を使用して１５ｃｍプレート当たり２．５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。２枚の培養皿由来の細胞は、トランスフェクション４８時間後に採取した。クロマチンは、製造業者のプロトコール（Ｃｏｖａｒｉｓ社）にしたがってＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２を含む非イオン性剪断バッファーを用いて調製した。ＣｈＩＰは、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃２３６８）を使用して実施した。ＣｈＩＰ後に回収したＤＮＡはコントロールとして機能するインプットクロマチンおよび模擬免疫沈降（抗ＩｇＧ抗体、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社、Ｋｃｈ−８０３−０１５）を用いるｑＲＴ−ＰＣＲのために使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、表２に列挙したプライマーを使用してＳＹＢＲグリーン検出法を用いて３回ずつ実施した。インプットシグナルに対する結合の比率を報告した。
【００５９】
【表２】
0006002152.tif 000004
【００６０】
（ｇ）ｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、わずかな改変を加えた製造業者の指示（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）にしたがってＤｈａｍａＦｅｃｔ１を用いて、Ａｍｂｉｏｎ社（ＨＥＹ１、ｓ２３８６８−７０）またはＤｈａｒｍａｃｏｎ社（コントロール非ターゲティング：Ｄ−００１８１０−１０）のｓｉＲＮＡ二本鎖を使用してトランスフェクトした。つまり、各ｓｉＲＮＡプールは、１×ｓｉＲＮＡバッファー（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）中に希釈し、ＲＰＭＩと混合し、９６ウエルプレートの６ウエル内に分配した。１．２×１０４個のＨＥＫ２９３または９×１０３個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ／ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ混合物の上部に播種した（最終的な容量は１５０μＬ／ウエルおよび２０ｎＭのｓｉＲＮＡであった）。３７℃での４８時間のインキュベーション後、ＲＮＡをその後の分析のためにウエルから単離した。
【００６１】
（ｈ）ウイルスの産生および形質導入
レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２６０、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏ社、パッケージングベクター）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２５９、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏ社、エンベローププラスミド）、およびｐＬＫＯ．１  ｓｈＲＮＡ構築物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）とのコトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ社）を使用して実施し、ウイルスはトランスフェクション４８および７２時間後に採取して結合させた。
【００６２】
Ｍ．Ｏ．Ｉ．が２であるウイルスを用いた神経膠腫細胞の感染は、８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社（米国マサチューセッツ州ビルリカ））の存在下で実施した。ウイルス含有上清を２４時間後に取り出し、細胞は形質導入第３日、第５日および第７日に分割した。ヒトＢＣＡＴ１（ＢＣＡＴ１  ｓｈＲＮＡＩ  ＮＭ＿００５５０４．３−１０６４ｓ１ｃ１およびＢＣＡＴ１  ｓｈＲＮＡＩＩ  ＮＭ＿００５５０４．３−７５１ｓ１ｃ１）ならびにヒトＩＤＨ１（ＩＤＨ１  ｓｈＲＮＡＩ  ＮＭ＿００５８９６．２−１３６３ｓ１ｃ１およびＩＤＨ１  ｓｈＲＮＡＩＩ  ＮＭ＿００５８９６．２−２９２ｓ１ｃ１）ｍＲＮＡ転写産物の様々な領域を標的とする２つの非依存性のＭｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ｓｈＲＮＡ構築物を使用した。非ターゲティングｓｈＲＮＡ（Ｍｉｓｓｉｏｎ  ＳＨＣ００２）をコントロールとして使用した。ＢＣＡＴ１およびＩＤＨ１ノックダウンの定量は、定量的リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロットによって評価した。
【００６３】
（ｉ）ジメチル−α−ケトグルタル酸およびガバペンチンを用いた処理
５×１０４細胞／ウエルは、総量５００μＬの細胞培養培地で２４ウエルプレート内へ播種した。培地を細胞の播種１６時間後に取り除き、５ｍＭもしくは１０ｍＭのジメチル−α−ケトグルタル酸（ジメチル２−オキソグルタレート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）または５ｍＭ、１０ｍＭもしくは２０ｍＭのガバペンチン（１−（アミノメチル）−シクロヘキサン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有する５００μＬの培地と交換した。対応する量の２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を各コントロールウエルに加えた。
【００６４】
（ｊ）細胞周期分析およびアポトーシスの検出
細胞周期分析は、ガバペンチンを用いた処理の２０時間後およびレンチウイルス形質導入の６日後に実施した。ニコレッティバッファー（０．１％のクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム）を、死細胞および生細胞両方を含有するウエルに加えた。４℃の暗所に４時間置いた後、ＤＮＡ含量をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国カリフォルニア州サンノゼ））を用いるフローサイトメトリーによって分析した。ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウエアを使用して各細胞周期段階、ｓｕｂ−Ｇ１（死細胞）、Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ期内の細胞の分布を定量した。レンチウイルスノックダウン後のアポトーシス活性を調査するために、ＮＣＨ４２１ｋ細胞をアネキシンＶ−ＰＥ（フィコエリトリン）および７−ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とともに暗所で１５分間インキュベートし、直後にフローサイトメトリーを実施した。
【００６５】
（ｋ）増殖分析
ガバペンチン処理後またはレンチウイルスノックダウン後の神経膠腫細胞の増殖を評価するために、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ細胞増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（独国カールスルーエ））を製造業者の指示にしたがって使用した。細胞は、１０μＭのヌクレオシドアナログＥｄＵ（５−エチニル−２’デオキシウリジン）とともに１６時間インキュベートした。ＥｄＵを取り込んだ細胞の定量は、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて実施した。
【００６６】
（ｌ）グルタミン酸の定量
ガバペンチンにより処理した細胞の上清中のグルタミン酸の濃度は、グルタミン／グルタミン酸測定キット（ＧＬＮ−１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を製造業者の指示にしたがって使用し測定した。反応容量は総量１００μＬに縮小し、吸光度はＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社（オーストリア国））を用いてマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウエル、クリアフラットボトムＵＶ−透過性マイクロプレート）内で３回ずつ測定した。データは、１ウエル当たりの細胞数に標準化した。
【００６７】
（ｍ）免疫蛍光染色
細胞はレンチウイルス形質導入の５日後にガラス製カバースリップ上に置いた。細胞を４％ホルムアルデヒド中で固定し、１×ＰＢＳで２回すすぎ洗いをし、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎを含有するＰＢＳ中で透過化した。１×ＰＢＳを用いてすすぎ洗いをした後、細胞は室温にて３０分間１０％ヤギ血清中でインキュベートした。サンプルは、１時間一次抗体（マウス抗α−チューブリン抗体、１：２００、＃Ｔ９０２６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および１時間室温で二次抗体（ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体、１：１００、ａｂ６７８５、Ａｂｃａｍ社）とともにインキュベートし、その後、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて封入した。蛍光イメージングのために、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡上で４０×対物レンズを用いて撮影した。
【００６８】
（ｎ）３Ｄマイクロチャネル移動アッセイ
ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）ベースのマイクロチャネルチップは、Ｄｒ．  Ｒａｌｆ  Ｋｅｍｋｅｍｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ研究所（独国））の厚意により提供された。５×１１×３００μｍ（Ｗ×Ｈ×Ｌ）の微細孔チャネル構造は、使用前に５０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液とのインキュベーションによって生物機能化した。チップをＴｅｆｌｏｎホルダー上で固定し、２×１０５個の細胞をチャネルの極めて近くにあるチップ上に播種した。細胞をチップ上に付着させた後、生細胞イメージングを２５時間実施した。実験中、化学勾配またはチャネル内の流動は適用しなかった。複数の位置の位相差時間差画像を１０分毎に、空気加湿および加熱チャンバーを装備した自動倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｃｅｌｌ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて捕捉した。画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて記録および加工処理した。細胞挙動を分析し、以前に報告されたようにカテゴリー分類した（Ｂａｉ，  Ａ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１８２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌｅｐｔｏｍｅｎｉｎｇｅａｌ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（２０１１）、Ｒｏｌｌｉ，  Ｃ．Ｇ．，  Ｓｅｕｆｆｅｒｌｅｉｎ，  Ｔ．，  Ｋｅｍｋｅｍｅｒ，  Ｒ．  ＆  Ｓｐａｔｚ，  Ｊ．Ｐ．  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ：ａ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ８７２６（２０１０））。
【００６９】
（ｏ）動物実験
動物使用研究は、政府認証機関（カールスルーエ行政管区庁（独国））により承認され、国立衛生研究所ガイドライン「実験動物の管理と使用の指針」を遵守した施設内動物保護職員により管理された。
【００７０】
（ｐ）同所性脳腫瘍モデル
ＢＣＡＴ１  ｓｈＲＮＡＩノックダウンまたは非ターゲティングｓｈＲＮＡを備える計２×１０５個のＵ−８７ＭＧ細胞を定位固定的に６匹の７〜９週齢の無胸腺マウス（ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン））の脳内に各々移植した。移植４週間後、動物を犠死させ、脳を切除し、低温切開片を作製した。脳切開片は、ヘマトキシリン＆エオシンにより染色し、腫瘍容積はＩｍａｇｅＪを用いて計算した。
【００７１】
（ｑ）過塩素酸細胞抽出およびＮＭＲ分光法
細胞はトリプシン処理により採取し、氷温ＰＢＳを用いて１回洗浄し、細胞ペレットは−８０℃で冷凍した。典型的には１×１０８個の採取した細胞を過塩素酸抽出にかけ、その後に公表されたプロトコール５０にしたがってＫＯＨ中和を実施した。つまり、２ｍＬの氷温１Ｎ  ＨＣｌＯ４を採取した細胞の凍結ペレットに加えた。ペレットはＴｅｆｌｏｎ製乳棒およびガラス製ホモジナイザーを使用して崩壊させた。１ｍＬの氷温水をこの溶解物に加え、９０秒間ボルテックスミキサーに掛け、４℃で１０分間１０，０００×ｇで遠心した。ペレットを再抽出し、上清を結合した。この抽出物をＫＯＨで中和し、ｐＨを６．５〜７．０に調整した。沈降したＫＣｌＯ４を２０分間２５，０００×ｇでペレット化し、上清を凍結乾燥した。
【００７２】
凍結乾燥した抽出物の残留物は、３０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭアジ化ナトリウム（ｐＨ７．０２）を含有する０．５ｍＬのＤ２Ｏバッファー（９９．９％  Ｄ）中に溶解させた。定量的分析のために、参照キャピラリー（１．５ｍｍ  ＯＤ、０．９９ｍｍ  ＩＤ）に上述したＤ２Ｏバッファー中の１１ｍＭのトリメチルシリル−２，２，３，３−テトラジューテロプロパン酸（ＴＳＰ、ナトリウム塩）の溶液を充填した。続いて、このキャピラリーをＢｕｎｓｅｎバーナーの炎で密封した。キャリブレーション溶液は、１０．４９ｍＭのグルコースおよび４．９５ｍｍのグルコースの計算濃度を得るためにＤ２Ｏバッファー中の計量した量のグルコースおよびクエン酸を配置することによって調製した。キャリブレーション溶液＋キャピラリーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、６００ＭＨｚ（Ａｖａｎｃｅ  ＡＶ−６００、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ社）で標準５ｍｍ  ＮＭＲチューブおよび三重共鳴逆プローブを使用して、抽出物に対して使用する条件と同一条件（２０℃、残留ＨＤＯシグナルの前飽和、繰り返し時間ＴＲ＝７秒間、３０°のフリップ角）下で獲得した。シトレートおよびグルコースについてのシグナル積分を上記に提示した濃度に対応する数値に設定したところ、ＴＳＰメチルシグナルの積分は、４．６０±０．１０ｍＭプロトンと等価であることが見いだされた。細胞抽出物は、挿入したキャリブレーション済み参照キャピラリー（１時間に５１２のトランジェント）を用いて測定し、分枝鎖アミノ酸、様々な代謝産物、およびＴＳＰ参照物質についての１Ｈ−ＮＭＲシグナルを積分した。ＴＳＰ積分は４．６０ｍＭであると規定されたので、代謝産物シグナル積分は使用された０．５ｍＬの容量に対する代謝産物濃度（ｍＭ（μｍｏｌ／ｍＬ））で直接的に生じさせた。次に、これらのデータを抽出前に決定した細胞計数を使用してフェムトモル／細胞に転換した。
【００７３】
（ｒ）細胞ホモジネートの調製
細胞ペレットは、１００μＬの水中に希釈し、超音波処理によってホモジナイズした（超音波装置、３〜５×２０サイクル、出力８０％、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０、Ｄｉｅｔｚｅｎｂａｃｈ社（独国））。タンパク質は、Ｌｏｗｒｙ（Ｌｏｗｒｙ，  Ｏ．Ｈ．，  Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｆａｒｒ，  Ａ．Ｌ．  ＆  Ｒａｎｄａｌｌ，  Ｒ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｉｎ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９３，  ２６５−２７５（１９５１）にしたがってＨｅｌｅｎｉｕｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎｓの改変（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，  Ａ．  ＆  Ｓｉｍｏｎｓ，  Ｋ．  Ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４７，  ３６５６−３６６１（１９７２））を加えて、標準物質としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。ホモジネートの最終タンパク質濃度は、２〜４ｍｇ／ｍＬでなければならない。これらの希釈率を全分析に対して使用した。
【００７４】
（ｓ）統計的分析
ＩＤＨ１／ＩＤＨ２突然変異状態とＢＣＡＴ１タンパク質発現との関係（図１ｋ）は、両側フィッシャー直接確率検定を用いて試験した。スチューデントのｔ検定（両側、対応のない）を全ての他の統計的比較のために使用した。＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【００７５】
（実施例２）
ガバペンチンによる細胞増殖の阻害
ヒト神経膠芽腫細胞系Ｕ−８７ＭＧ（ＨＴＢ−１４）、ＨＳ６８３（ＨＴＢ−１３８）およびＵ−３７３ＭＧ（ＨＴＢ−１７、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社（英国テディントンＴＷ１１  ＯＬＹ））は、１０％ウシ胎児血清および１％のペニシリン／ストレプトマイシンミックスを補給したダルベッコの最小必須培地中で培養した。５×１０４細胞／ウエルを総量５００μＬの細胞培養培地で２４ウエルプレート内へ播種した。培地を細胞の播種４時間後に除去し、各々５ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭの最終濃度で１−（アミノメチル）−シクロヘキシル酢酸（1 - (Aminomethyl ) - cyclohexylessigsaure）（ガバペンチン、５００ｍＭの濃度で２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中に溶解させた）を含有する５００μＬの培地と置き換えた。対応する量の２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳを各コントロールウエルに加えた。培地交換の５時間後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ社（米国カリフォルニア州９２００８カールスバッド）製のＣｌｉｃｋ  ｉＴ（登録商標）増殖キットを使用して細胞増殖を測定するために５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ（米国カリフォルニア州９２００８カールスバッド））を加えた。細胞はＥｄＵ適用１６時間後に採取し、増殖は製造業者の指示にしたがってＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州０７４１７フランクリンレイクス））を使用して測定した。各処理に対して３回の反復測定値を得た。全細胞系において、疑似処理細胞と比較してガバペンチン処理細胞内では細胞増殖の約２０〜５５％の濃度依存性の有意な減少が観察された。結果は、図１０に示す。
【００７６】
（実施例３）
ＢＣＡＴ１アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害
レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２６０、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏ社、パッケージングベクター）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２５９、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏ社、エンベローププラスミド）、およびｐＬＫＯ．１  ｓｈＲＮＡ構築物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州６３１７８セントルイス））でのコトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ社（米国ワイオミング州５３７１１マディソン））を使用して実施し、ウイルスはトランスフェクションの４８および７２時間後に採取した。ＢＣＡＴ１  ｍＲＮＡ転写産物の様々な領域を標的とする２つの独立ｓｈＲＮＡ構築物を使用した。ＭＩＳＳＩＯＮ  ｓｈＲＮＡ  ＴＲＣＮ００００００５９０７  ＮＭ＿００５５０４．３−１０６４ｓ１ｃ１（ｓｈＲＮＡ１）およびＴＲＣＮ００００００５９０９  ＮＭ＿００５５０４．３−７５１ｓ１ｃ１（ｓｈＲＮＡ２）。全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（米国ミズーリ州６３１７８セントルイス）。非ターゲティングｓｈＲＮＡをコントロールとして使用した。
【００７７】
ヒト神経膠芽腫細胞系Ｕ８７−ＭＧ（ＨＴＢ−１４）、ＨＳ６８３（ＨＴＢ−１３８）およびＵ３７３−ＭＧ（ＨＴＢ−１７、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社（英国テディントンＴＷ１１  ＯＬＹ））は、総量５００μＬの細胞培養培地中で２４ウエルプレート（５×１０４細胞／ウエル）に播種した。２４時間後、細胞には８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下でウイルスを形質導入した。ウイルス含有上清を２４時間後に取り出し、細胞は形質導入の第３日および第５日に分割した。減少したＢＣＡＴ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、定量的リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロットを使用して検出した（ＥＣＡ３９抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（米国カリフォルニア州９２１２１サンディエゴ））。増殖アッセイは、細胞を１０μＭ  ＥｄＵとともに１６時間インキュベートした後にＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ細胞増殖キットを使用して第６日に実施した。ＢＣＡＴ１  ｓｈＲＮＡ形質導入細胞の全てにおいて、増殖の低下は細胞系に依存して２０〜８０％に観察された。これらの結果は、図１１に示す。
【００７８】
（実施例４）
ＩＤＨｗｔ神経膠芽腫におけるＢＣＡＴ１過剰発現の決定
ＷＨＯグレードＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの星状神経膠腫由来の遺伝子発現データ上でのマイクロアレイの予測分析は、下記の表３に明らかなように、ＢＣＡＴ１は他の星状細胞腫から原発性神経膠芽腫を識別する最良の分類指標であることを確認した。
【００７９】
【表３】
0006002152.tif 000005
【００８０】
ＩＤＨ−突然変異状態に基づいて腫瘍を分類すると、ＢＣＡＴ１  ｍＲＮＡ発現レベルはＩＤＨｍｕｔ神経膠腫との比較で、ＩＤＨｗｔ神経膠腫より有意に高かったが（図１ｂ、Ｐ＜０．０００１、両側スチューデントｔ検定）、ＢＣＡＴ２発現については匹敵する増強されたレベルは観察されなかった（図１ｃ、Ｐ＝０．０３０１）。経路分析は、ＢＣＡＴ１に加えて、ＢＣＡＡ代謝経路の数種の他の遺伝子のＲＮＡ発現はＩＤＨｍｕｔ腫瘍に比較してＩＤＨｗｔにおいてアップレギュレートされた（図７）。ＲＮＡ発現結果と一致して、ウェスタンブロット分析は、ＢＣＡＴ１タンパク質発現がＩＤＨｗｔ腫瘍では高いが、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２いずれかにおける特異的突然変異とは無関係に、本質的にＩＤＨｍｕｔ腫瘍においては存在しないことを証明した（図１ｄ）。２０例の神経膠腫についてのＢＣＡＴ１のプロモーターおよびコーディング領域両方についてのシーケンシングは、ナンセンス突然変異も推定活性化突然変異も明らかにしなかった。ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２突然変異とＢＣＡＴ１発現との間で観察された緊密な相関は、８１例の原発性ヒト神経膠腫（７７例の星状細胞腫、４例の乏突起神経膠腫）からの切片の免疫組織化学的染色を通してさらに確証されたが、特にＩＤＨｗｔ４６例中４５例の腫瘍は強度のＢＣＡＴ１染色を示し（図１ｅ）、他方ＩＤＨ１（３０例のＲ１３２Ｈ、１例のＲ１３２Ｃ、１例のＲ１３２Ｓ）もしくはＩＤＨ２（３例のＲ１７２Ｋ）における突然変異を備える３５例中３５例の腫瘍はＢＣＡＴ１陰性であった（図１ｆ〜ｈ）、（Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定、図１ｋ）。ＢＣＡＴ１染色パターンは、このためＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異タンパク質に対する広く使用される抗体を用いて得られたパターンと高度に相補性である（図１ｉ、ｊ）。しかし、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ染色とは相違して、ＢＣＡＴ１抗体は、さらに抗ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈによっては認識されない余り一般的ではないＩＤＨ１およびＩＤＨ２突然変異を備える腫瘍からＩＤＨｗｔ腫瘍（図１ｅ）も識別する（図１ｇ〜ｈ）。これらのデータは、高ＢＣＡＴ１発現が、診断状況においてこれらの腫瘍を確実に同定するために使用可能なＩＤＨｗｔ神経膠腫の特徴的特性であることを証明している。
【００８１】
（実施例５）
ＢＣＡＴ１の基質依存性発現の決定
ＢＣＡＴ１は、神経膠芽腫細胞系ＬＮ−２２９、Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧにおいて強度に、Ａ１７２においてはより低い程度に発現することが見いだされたが（図２ａ）、全てＩＤＨ１およびＩＤＨ２野生型遺伝子を有することが確証された。ＢＣＡＴ１発現はさらにＨｓ６８３細胞系においても上昇し、それは、元来、乏突起神経膠腫に由来したが、それでもまだＩＤＨｗｔ遺伝子型を提示する。そこで、これら全部の細胞系は、ＢＣＡＴ１機能を試験するために適切なモデルであると考察することができる。ＢＣＡＴ１  ＲＮＡおよびタンパク質発現は、神経膠芽腫において頻回に存在する、低酸素条件下ではアップレギュレートされた（図２ｂ）。ＢＣＡＴ１発現は、基質α−ＫＧの濃度と相関しており、培養培地中の細胞透過性ジメチル−α−ＫＧ基質の濃度を上げた後にはアップレギュレートされた（図２ｃ）。これとは反対に、細胞質内のα−ＫＧの主要起源であるＩＤＨ１のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンは、ＢＣＡＴ１発現の強力なダウンレギュレーションをもたらした（図２ｄ）。
【００８２】
（実施例６）
２種の選択的プロモーターにおけるＤＮＡメチル化を通して差次的制御されたＢＣＡＴ１発現
ＩＤＨｗｔおよびＩＤＨｍｕｔ神経膠腫におけるＢＣＡＴ１発現の差次的制御を詳細に解明するために、患者サンプル中の転写産物発現を定量した。ＲＴ−ＰＣＲおよびシーケンシングを使用して、ＩＤＨｗｔ星状細胞原発性腫瘍ならびに２３例の正常脳組織のプールにおける、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース内に列挙された３つのタンパク質コーディングＢＣＡＴ１転写産物の発現を確証した（図９）。これらの３種の転写産物（Ｔ１、Ｔ４およびＴ６）は、３種全てがウェスタンブロット分析によって同定された４３ｋＤの単一タンパク質バンドに対応する、３８６、３９８、および３８５アミノ酸のタンパク質をコードする。これらの転写産物は２種の選択的プロモーターを起源とし（図３ａ）、Ｔ１、Ｔ４およびＴ６内の２、１４および１個のアミノ酸各々をコードするそれらの第１エクソンだけが相違する。転写産物特異的ｑＲＴ−ＰＣＲはＴ６を原発性腫瘍内の全ＢＣＡＴ１  ｍＲＮＡの７３％を提示する主要転写産物であると同定した（図３ｂ）。明白に、全ＢＣＡＴ１転写産物の発現は、ＩＤＨｍｕｔ腫瘍に比較してＩＤＨｗｔ腫瘍において有意に高かった。
【００８３】
ＢＣＡＴ１転写制御の考えられる機序を調査するために、全グレードの星状細胞腫において、２種の選択的プロモーター（図３ｃ）をカバーする亜硫酸水素塩処理したＤＮＡから増幅させたＰＣＲ産物のＭａｓｓＡＲＲＡＹ分析を使用して定量的ＤＮＡメチル化分析を実施した。ＩＤＨｗｔおよびＩＤＨｍｕｔ腫瘍に対して明確に異なるメチル化パターンが観察された。主要プロモーター（プロモーター２）はＩＤＨｍｕｔ腫瘍内では高メチル化されたが、ＩＤＨｗｔ腫瘍および正常脳内ではほとんどメチル化されなかった（図３ｃ、右のパネル）。Ａ６およびＡ７アンプリコンのメチル化の程度の平均は、ＩＤＨ１突然変異状態と強度に関連していた（図３ｄ）。これらのデータは、ＩＤＨｍｕｔ腫瘍内でのプロモーター２メチル化による転写産物Ｔ４およびＴ６の抑制を示している。プロモーター１（図３ｃ、左のパネル）は、ＣｐＧ島のすぐ上流の高メチル化配列の伸長を除いて、全腫瘍サンプル中ならびに正常脳中でほとんどメチル化していなかった。この上流領域内では、ＩＤＨｗｔおよびＩＤＨｍｕｔ腫瘍間のアンプリコンＡ２内の位置−６９９／−６９７（ＣｐＧ４；５）および−６６０（ＣｐＧ６）で３種の差次的にメチル化されたＣｐＧ−ジヌクレオチドが同定された。プロモーター２におけるメチル化パターンとは対照的に、ＣｐＧ４；５（図３ｅ）およびＣｐＧ６（図３ｆ）は、ＩＤＨｗｔ腫瘍よりＩＤＨｍｕｔ腫瘍において有意に少ないメチル化を示した。この差次的メチル化領域（ＤＭＲ）内のメチル化の程度はＩＤＨｗｔ腫瘍内のＢＣＡＴ１転写産物Ｔ１の発現と相関しており、その機能的関連性を支持している（図３ｇ）。観察されたＣｐＧ特異的メチル化パターンは、Ｔ１のダウンレギュレーションをもたらすＤＭＲへのレプレッサー結合と一致している。レプレッサーＨＥＹ１がＢＣＡＴ１プロモーター１には結合するがプロモーター２には結合しないこと（図３ａ）は、以前にＣｈｌＰｓｅｑデータによって示唆されている。ＲＮＡ発現データの分析は、正常脳と比較して星状細胞腫瘍におけるＨＥＹ１レプレッサーの過剰発現を確証した。ＨＥＹ１レプレッサー活性と一致して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡ媒介性ＨＥＹ１ノックダウンは転写産物−Ｔ１発現を増加させた（図３ｈ、ｉ）。ＣｈＩＰ分析は、上流コントロール領域および翻訳開始部位に近い領域と比較して、２種の相違するＨＥＹ１構築物の最強の結合がＤＭＲ内で発生することを証明した（図３ｊ、ｋ）。まとめると、これらのデータは、星状細胞腫内のＢＣＡＴ１転写産物の差次的発現が、ＩＤＨｍｕｔ腫瘍内のプロモーター２の広範囲のメチル化およびＩＤＨｗｔ腫瘍内のプロモーター１のＨＥＹ１−レプレッサー結合部位におけるＣｐＧ部位特異的メチル化を含むＤＮＡメチル化によって制御されることを強力に証明している。
【００８４】
（実施例７）
ＢＣＡＴ１の抑制を通した神経膠芽腫細胞によるグルタミン酸遊離の減少
神経膠芽腫におけるＢＣＡＴ１の機能的役割に関する洞察を得るために、細胞系Ｕ−８７ＭＧおよびＵ−３７３ＭＧ細胞系を、ＢＣＡＴ１を特異的に阻害するがＢＣＡＴ２を阻害しないロイシンアナログであるガバペンチンを用いて処理した。２０ｍＭガバペンチンを用いて２０時間処理した細胞の抽出物についての１Ｈ−ＮＭＲ分光測定は、ＢＣＡＴ１阻害と一致して、ＢＣＡＡの細胞内蓄積を証明した（図４ａｂ）。神経膠芽腫は、高濃度のグルタミン酸を遊離し、興奮毒性機序によるニューロン死をもたらす。グルタミン酸遊離はガバペンチンによるＢＣＡＴ１の阻害に伴って有意に減少し（図４ｃ）、これはＢＣＡＴ１がＩＤＨｗｔ神経膠腫におけるＢＣＡＡ異化作用を通してのグルタミン酸産生にとっての主要寄与因子であることを示している。
【００８５】
これらの所見を独立して確証するために、どちらも全３種のＢＣＡＴ１転写産物を標的とする２つのｓｈＲＮＡを使用して、Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧおよびＨｓ６８３細胞におけるｓｈＲＮＡ媒介性ＢＣＡＴ１ノックダウンを実施した。２４時間のインキュベーション後のＵ−８７ＭＧ細胞培養培地のタンデム−ＭＳ分析は、グルタミン酸遊離ならびにＢＣＡＡ取り込みがコントロール細胞と比較してＢＣＡＴ１ノックダウン細胞において減少することを明らかにした（図４ｄ）。アラニン、グリシンおよびトレオニンの遊離における有意な増加も観察された。細胞内アミノ酸濃度の定量は、アスパラギン酸塩、グリシンおよびトレオニンの有意な蓄積を明らかにした（図４ｅ）。グルタミン酸の少ないが有意な蓄積もＢＣＡＴ１ノックダウン後に観察された。しかし、培地容量対細胞内容量の高い比率を考慮に入れると、グルタミン酸の総濃度は、この小さな細胞内蓄積による有意な影響は受けない。ＢＣＡＴ２ノックアウトマウスでは、ＢＣＡＡ異化作用の阻害は高濃度のＢＣＡＡならびにラパマイシン（ｍＴＯＲ）シグナリング経路および代償性の増加したタンパク質分解（増加したタンパク質の代謝回転）の機構的標的を介しての末梢組織中での高率のタンパク質合成を生じさせる。
【００８６】
ＢＣＡＴ１ノックダウンは、ＢＣＡＴ１の下流でのバリンおよびイソロイシンの異化作用において関与する酵素である３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）の強力なダウンレギュレーションをもたらした（図４ｆ、ｇ）。ＨＡＤＨは脂肪酸代謝にとって極めて重要であるので、ＢＣＡＴ１ノックダウンは膜合成に必須の脂肪酸の合成または分解も変化させるであろう。
【００８７】
（実施例８）
ＢＣＡＴ１ノックダウンによるマイクロチャネル内の神経膠芽腫遊走の制限
ＢＣＡＴ１ノックダウンは、細胞の形態に強度に影響を及ぼし、丸みを帯びた、伸長していない外観を生じさせた（図５ａ〜ｂ）。これらの形態上の変化が、腫瘍細胞が隣接組織を浸潤する能力に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験するために、三次元環境を模擬するためのマイクロチャネル移動チップを使用した（図５ｃ）。ＢＣＡＴ１ノックダウンの後に、Ｕ−８７ＭＧ細胞の大多数（５５％）はマイクロチャネル内に短距離透過したが、マイクロチャネルを完全に浸潤するために積極的に変形することはできず、ほとんどのコントロール細胞（７８％）はチャネルを完全に浸潤した（図５ｄ）。ＢＣＡＴ１ノックダウン細胞のこの低下した浸潤性は、観察された長鎖脂肪酸の低い存在度およびコレステロール代謝における相違によって誘発される変化した膜組成に起因すると思われる（図４ｇ）。そのような変化は、膜成分の一般的利用可能性ならびに細胞浸潤を妨害する膜弾性に十分に影響を及ぼす可能性がある。
【００８８】
（実施例９）
ＢＣＡＴ１は、神経膠芽腫増殖にとって必須である
ＢＣＡＴ１が腫瘍細胞増殖に及ぼす影響を評価するために、阻害およびノックダウン実験を実施した。ＥｄＵ取り込みに基づいて推定された５６％までの増殖の濃度依存性減少は、阻害剤ガバペンチンを用いた処理後に観察された（図６ａ）。細胞周期分析は、ガバペンチン処理がＧ２およびＳ分画の同時減少を伴うＧ１期における細胞の増加した分画によって指示される部分的Ｇ１停止を誘導することを示唆した（図６ｂ）。ＳｈＲＮＡ媒介性ＢＣＡＴ１ノックダウンは、類似の作用を誘発した（図６ｃ、ｄ）。ＢＣＡＴ１ノックダウンは、全３種の細胞系において増殖を２０〜７０％減少させ、Ｇ１停止および細胞ＣＤＫＮｌＢ／ｐ２７ＫＩＰ１の強度の増加をもたらした。明らかに、ＣＤＫＮｌＢ／ｐ２７ＫＩＰ１蓄積の程度は、Ｇ１分画のサイズとの正相関を示した（図６ｄ）。ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の分画によって指示される細胞死は、Ｈｓ６８３の場合を除いて５％未満のままであり、これは下記表４に示すように中等度の増加を示した。
【００８９】
【表４】
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【００９０】
細胞増殖の匹敵する減少は、これらの細胞がアネキシンＶ／７ＡＡＤ染色によって決定されるより高いアポトーシス率を示した以外は、無血清培地中の神経膠芽腫一次球状培養中でのＢＣＡＴ１ノックダウン後に観察された（図９）。観察された増殖の減少と一致して、ＢＣＡＴ１ノックダウンは、Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧおよびＨｓ６８３細胞におけるｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＡＫＴ）の減少したリン酸化をもたらした（図６ｅ）。
【００９１】
ＢＣＡＴ１ノックダウンがｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖に及ぼす作用は、Ｕ−８７ＭＧ細胞のＣＤ−１ヌードマウスへの大脳内移植によって評価した（図６ｆ〜ｈ）。同数の生細胞の移植４週間後に、全６匹のコントロールマウス、ＢＣＡＴ１−ｓｈＲＮＡ形質導入細胞が移植されたマウス６匹中１匹だけが、例えば昏睡または非協調運動活動などの神経学的症状を提示した。マウス脳切片のヘマトキシリン＆エオシン染色は、コントロール細胞が移植されたマウスにおける大きな腫瘍を明らかにしたが（図６ｆ）、ＢＣＡＴ１ノックダウン細胞が移植されたマウスにおいては有意に小さな腫瘍が見られた（図６ｇ）。定量的分析は、腫瘍容積における群間の有意差を確証した（図６ｈ、Ｐ＝０．００９１）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
0006002152.tif 000020
【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
0006002152.tif 000026
【図１１】
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【配列表】
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