(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる物質を同定するための方法であって、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程、及び、
ｂ．前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して決定する工程を含み、
ここで、前記ＣＳＣは、以下の特性、ＣＤ２４−、ＣＤ１３３−、Ｎｏｔｃｈ＋、Ｇｌｉ１＋、Ｇｌｉ２＋、及びサイトケラチン−をさらに有し、
前記−はドセタキセル感受性癌細胞に対してその発現がダウンレギュレーションされていることを示し、前記＋はドセタキセル感受性癌細胞に対してその発現がアップレギュレーションされていることを示す、方法。
【請求項２】
前記ＣＳＣは、更に、以下の特性、自己再生能力を有する、非対称性細胞分裂を受ける、腫瘍化能を有する、転移能を有する、遺伝子表現型を変化させる特性を有する、癌療法に使用される化学物質に対する耐性を有する、並びにＮｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子に対する感受性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＳＣは、標準化学療法に対して難治性である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記候補物質は、化学剤、生物剤及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記決定する工程は、前記候補物質で処理された細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程をさらに含み、このとき未処理細胞内のＣＳＣの割合と比較した処理細胞の集団内のＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、前記ＣＳＣの数を選択的に減少させる物質である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記決定する工程は、フローサイトメトリー分析、細胞生存性アッセイ、細胞分化アッセイ、細胞分裂アッセイ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される手順を実施する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞集団はＣＳＣ及び成体幹細胞を含み、前記物質は成体幹細胞の数を実質的に減少させることなく前記細胞集団内のＣＳＣの数を減少させる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
高スループットスクリーンである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記決定する工程は、工程ｉならびに工程ｉｉ、ｉｉｉ、及びｉｖの少なくとも一つを更に有する、
ｉ．前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない前記細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程、
このとき、（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、候補物質はＣＳＣの数を選択的に減少させる物質であると決定する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記決定する工程は、フローサイトメトリー分析、細胞生存性アッセイ、細胞分化アッセイ、細胞分裂アッセイ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される手順を実施する工程を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞集団内において癌幹細胞（ＣＳＣ）の割合を選択的に減少させる物質を同定するための高スループットスクリーニング法であって、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程、
ｂ．前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して、前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを、
ｉ．前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない前記細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程によって、決定する工程を含み、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの割合を選択的に減少させる物質であると決定するものであり、
ここで、前記ＣＳＣは、以下の特性、ＣＤ２４−、ＣＤ１３３−、Ｎｏｔｃｈ＋、Ｇｌｉ１＋、Ｇｌｉ２＋、及びサイトケラチン−をさらに有し、
前記−はドセタキセル感受性癌細胞に対してその発現がダウンレギュレーションされていることを示し、前記＋はドセタキセル感受性癌細胞に対してその発現がアップレギュレーションされていることを示す、高スループットスクリーニング法。
【請求項１２】
前記ＣＳＣは、更に、以下の特性、自己再生能を有する、非対称性細胞分裂を受ける、腫瘍化能を有する、転移可能性を有する、遺伝子表現型を変化させる特性を有する、癌療法に使用される化学物質に対する耐性を有する、ならびにＮｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子に対する感受性を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）は、フローサイトメトリー分析によって実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）は、細胞生存性アッセイによって実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉｉ）は、細胞分化アッセイによって実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｖ）は、細胞分裂アッセイによって実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記候補物質は、化学剤、生物剤及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＳＣは、標準化学療法に対して難治性である請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞集団内において癌幹細胞（ＣＳＣ）の割合を選択的に減少させる物質を同定するための高スループットスクリーニング法であって、前記ＣＳＣは標準化学療法に対して難治性であり、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程であって、前記ＣＳＣは、以下の特性、ＨＬＡ  Ｉ−及びＨＬＡ  ＩＩ−を有し、さらに、以下の特性、ＣＤ２４−、ＣＤ１３３−、Ｎｏｔｃｈ＋、Ｇｌｉ１＋、Ｇｌｉ２＋、及びサイトケラチン−をさらに有し、
前記−はドセタキセル感受性癌細胞に対してその発現がダウンレギュレーションされていることを示し、前記＋はドセタキセル感受性癌細胞に対してその発現がアップレギュレーションされていることを示す、工程、
ｂ．前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して、前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを、
ｉ．フローサイトメトリーを使用して、前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない前記細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．細胞生存性アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．細胞分化アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．細胞分裂アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程によって、決定する工程を含み、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの割合を選択的に減少させる物質であると決定する高スループットスクリーニング法。
【請求項２０】
前記候補物質は、化学剤、生物剤及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、例えば細胞集団内の癌幹細胞の数を選択的に減少させる物質を同定するのに有用な方法に関する。
【０００２】
参照による配列表の組み込み
本出願は、２０１０年３月２１日に作成されたファイルサイズ１．１２ＫＢの配列表テキストファイル「ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ０３１１１９２．ｔｘｔ」として本出願と同時に提出されているアミノ酸及び／又は核酸配列に関する参考文献を含む。前述の配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）を遵守し、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【背景技術】
【０００３】
癌は、脱調節細胞増殖、異常分化及び欠損性アポトーシスを特徴とする１群の疾患を規定するために使用される用語である。これらの新生物疾患は、全部が一般に、本質的に多様性（例、ウイルス感染、化学的発癌物質）であり、固有の組織細胞、いわゆる「成体幹細胞」に影響を及ぼす初期形質転換事象を有する可能性がある。これらの形質転換事象は、腫瘍開始及び癌の階層的組織化の原因となる「腫瘍／癌幹細胞（ＣＳＣ）」を生成すると考えられている。しかし、そのような細胞は、これまで明確には同定されておらず、続く特性解析もなされていない。
【０００４】
腫瘍は、増殖能力、形態及びマーカー発現が相違する細胞の不均一な集団から成る。癌幹細胞仮説は、ＣＳＣに加えて、腫瘍が小集団の過渡増殖性クローン源（transit amplifying clonogen）及び大集団の分化悪性腫瘍細胞を含んでいると仮定している（Ｒｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。癌幹細胞は、それらの正常幹細胞対応物と同様に、未分化で非対称性細胞分裂を提示するはずであり、自己再生及び分化クローン原の産生を生じさせるので、腫瘍不均一性の一因となる。さらに、ＣＳＣは標準化学療法による治療に難治性であると主張されており、そのような治療は極めて迅速な分裂細胞の撲滅を生じさせることが多く、腫瘍応答を生じさせるが、ＣＳＣ枯渇は生じさせない（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｔｒｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。このモデルは、標準ヒト癌化学療法がなぜ頻回に初期腫瘍収縮を生じさせるかについて説明するが、大多数の癌は生残ＣＳＣによる再生のために最終的には再発する。そこで、臨床的観点から、ＣＳＣの同定及び分子学的特性解析は、癌の診断、予後及び標的治療を含む新規な治療アプローチにとっての基本的な意味を有する。
【０００５】
充実性腫瘍では、ＣＳＣは、以前には細胞表面免疫表現型検査及び腫瘍開始能力によって同定すべきであると主張されていた。これらの推定ＣＳＣ部分集団は、特に、乳癌におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ及びα６−インテグリン表現型（Ａｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；Ｃａｒｉａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｆｉｌｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｐｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、脳腫瘍におけるＣＤ１３３＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋表現型（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、ならびに結腸癌におけるＣＤ１３３＋表現型（Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）を提示することが証明された。前立腺癌では、高レベルのＣＤ４４を発現する推定ＣＳＣの類似の部分集団についても報告されている（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；Ｐａｔｒａｗａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｐａｔｒａｗａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。おそらく、本分野が直面している課題の最も大きな問題は、報告されたＣＳＣ部分集団が、「幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」を規定する伝統的特性、主として非対称性細胞分裂によって分化された子孫を生成する能力を必ずしも満たさない点である。さらに、上述の表面表現型部分集団の存在は、同一の組織病理学的診断を備える患者由来の腫瘍組織サンプル中おいて劇的に異なる。一部の症例では、これらの部分集団は相当に希であるが、他の集団では大きな分画の腫瘤を構成する（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；Ｓｈｍｅｌｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。これらの観察所見は、ＣＳＣの一貫した同定の複雑さを強調している。
【０００６】
ＣＳＣを幹細胞性などの特性によって同定する際の一貫性の欠如により、ＣＳＣを標的とする物質について信頼性ある探索が難しい。特に、細胞集団内でのＣＳＣの割合に影響を及ぼす分化又は他のプロセスを調節可能な物質の同定は、これまで実現することができなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一実施形態は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる物質を同定するための方法である。本方法は、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程、及び
ｂ．前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して決定する工程を含んでいる。
【０００８】
本発明のまた別の実施形態は、細胞集団内において癌幹細胞（ＣＳＣ）の割合を選択的に減少させる物質を同定するための高スループットスクリーニング法である。本スクリーニング法は、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程、
ｂ．前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して、前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを、
ｉ．前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程によって、決定する工程を含み、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの割合を選択的に減少させる物質である。
【０００９】
本発明のまた別の実施形態は、細胞集団内において癌幹細胞（ＣＳＣ）の割合を選択的に減少させる物質を同定するための高スループットスクリーニング法であって、前記ＣＳＣは標準化学療法に対して難治性であるスクリーニング法である。本スクリーニング法は、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程であって、前記ＣＳＣは、以下の特性、ＨＬＡ  Ｉ−及びＨＬＡ  ＩＩ−を有する工程、
ｂ．前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して、前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを
ｉ．フローサイトメトリーを使用して、前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．細胞生存性アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．細胞分化アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．細胞分裂アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程によって、決定する工程を含み、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの割合を選択的に減少させる物質である。
【００１０】
本発明のまた別の実施形態は、本発明のいずれかの方法によって同定されたＣＳＣを選択的に殺滅するための物質である。
【００１１】
本発明の追加の実施形態は、医薬組成物である。本医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び本発明の物質を含んでいる。
【００１２】
本発明もしくは出願は、少なくとも１枚の色付けした図面を含有している。色付き図面を備える本特許もしくは特許出願公報の写しは、要請して必要な手数料を支払うことで、特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ホルモン非依存性前立腺癌細胞におけるドセタキセル獲得耐性の特性解析を示す図である。図１ａは、親細胞（２２ＲＶ１（左のパネル）及びＤＵ１４５（右のパネル））ならびに用量を増加させながらドセタキセルで処理したドセタキセル獲得耐性細胞（２２ＲＶ１−ＤＲ及びＤＵ１４５−ＤＲ）における細胞生存性アッセイ（ＭＴｓ）の結果を示している。赤線は、感受性及び耐性細胞についての薬物（ドセタキセル）のＩＣ５０濃度を示している。２２ＲＶ１−ＤＲドセタキセルＩＣ５０は、２５ｎＭから１０μＭ（４００倍の増加）及びＤＵ１４５−ＤＲドセタキセルＩＣ５０は５ｎＭから１μＭ（２００倍の増加）へ増加した。図１ｂの左のパネルは、親細胞及び２４時間にわたり用量を増加させながらドセタキセルで処理したドセタキセル耐性細胞におけるコロニー形成アッセイの定量的分析を示している。図１ｂの右のパネルは、ドセタキセル（２２ＲＶ１細胞では２５ｎＭ及びＤＵ１４５細胞では５ｎＭ）を用いて２１日間持続的に処理した細胞の代表的なコロニー形成アッセイを示している。感受性細胞中ではドセタキセルの持続的投与後にコロニーは全く観察されなかったが、耐性細胞中ではコロニーが観察された。この薬物への２４時間曝露後には類似の作用が観察された。図１ｃは、ＤＭＳＯ（コントロール）及びドセタキセルに曝露させた細胞のアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム染色によるアポトーシスのフローサイトメトリー評価の結果を示している。図１ｄは、様々な細胞タイプのＰＡＲＰ開裂についてのウエスタンブロット分析を示している。図１ｃ及びｄに示した結果は、獲得したドセタキセル耐性表現型がドセタキセルアポトーシス応答の欠如と結び付いていることを証明している。
【図２】図２は、ドセタキセル耐性細胞の表現型特性解析及び腫瘍開始能力を示す図である。図２ａ左は、ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞におけるドセタキセル耐性を獲得するプロセスでの転写産物発現における少なくとも２倍の増加（↑）又は減少（↓）を伴う遺伝子のＶｅｎｎ図を示している。重複遺伝子＝２４７個。図２ａ右は、２４７個の重複遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）を示しているヒストグラムである。統計的有意性（ｐ≦０．０１）を伴うカテゴリーが表示されている。黒色星印（＊）が付けられたＧＯカテゴリーは、細胞増殖、細胞死及び薬物への応答に関連している。赤色星印（＊）が付けられたＧＯカテゴリーは、発生プロセスに関連する。図２ｂは、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用した階層的クラスタリングによって組織化された、発生遺伝子のヒートマップを示している。赤色カラーコーディングは高い発現レベルを示し、緑色カラーコーディングは低い発現レベルを示している。信号値は、ｌｏｇ２変換されている。図２ｃは、上皮分化マーカー、前立腺関連マーカー、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＷＮＴ／β−カテニン経路タンパク質、ＮＯＴＣＨシグナリングタンパク質及びヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナリング経路タンパク質について対応する、親及びドセタキセル耐性細胞の細胞溶解液の免疫ブロッティング及びタンパク質定量を示している。図２ｄは、ＤＵ１４５（２ｄ）及び２２ＲＶ１（２ｄの続き）親及びドセタキセル耐性細胞におけるＣＫ及びＨＬＡクラスＩ抗原、ならびに様々な転写因子（脱リン酸化β−カテニン、開裂ＮＯＴＣＨ２、Ｇｌｉ１及びＧｌｉ２）の発現及び細胞内局在性についての免疫蛍光分析を示している。ドセタキセル耐性細胞内の発生転写因子の核局在化は、それらの親細胞と比較することで見られる。ＣＫの発現の欠如が示されている。図２ｅは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍開始能力を示しているヒストグラム及び親及びドセタキセル耐性細胞の注射後の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間を要約している表を提供している。＊はｐ＜０．００１に対応し、＊＊はｐ＜０．０５に対応する。図２ｆは、ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１親及びドセタキセル耐性細胞におけるＣＫ及びＨＬＡクラスＩ抗原の発現及び細胞内局在についての免疫蛍光分析を示している。
【図３】図３は、親ドセタキセル感受性細胞内でのサイトケラチン陰性の亜集団の同定を示す図である。図３ａ及び３ｂは、親細胞（２２ＲＶ１及びＤＵ１４５）内でのＣＫ（１８及び１９）発現についてのフローサイトメトリー及び免疫蛍光分析を示している。コントロール（未染色）、ＣＫ１８、ＣＫ１９及びＣＫ１８＋１９染色細胞についての列（１）に示したフローサイトメトリー分析のプロットは、この集団の代表である。列（２）は、３回の独立実験におけるＣＫ細胞の定量を示している。列（３）は、ＣＫ１８（赤色）、ＣＫ１９（緑色）及びＣＫ１８＋１９についての免疫蛍光染色を示している。白色矢印は、両方の親細胞系におけるＣＫ陰性細胞を示している。図３ｃは、２つの初期作業仮説、ドセタキセルによる転移対癌幹細胞富化の略図表示である。
【図４】図４は、ＧＦＰ発現を駆動するＣＫ１９のプロモーターを含有するプラスミドの生成及び妥当性確認ならびに化学療法がＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性表現型を備える癌幹細胞を富化させることを示す図である。図４ａは、生成されたＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ受容体構築物の略図表示である。ヒトサイトケラチン１９プロモーターに対応する１，７６８ｂｐの領域は、ＤＵ１４５細胞由来のゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲによって増幅させた。プロモーター領域は、５’ＵＴＲ領域の１，１４２ｂｐ、エクソン１に属する４８０ｂｐ及びイントロン１に属する１４６ｂｐを含んでいる。ＰＣＲ産物はｐＥＧＦＰＮ１にクローン化した。生じた構築物は、ＧＦＰタンパク質コーディング領域の上流にＣＫ１９プロモーターを有しており、その発現を調節する。図４ｂは、ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１親細胞のＣＫ（赤色）及びＨＬＡクラスＩ（緑色）についての免疫蛍光共染色を示している。統合パネル内の白色矢印は、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性表現型を備える細胞を指示している。代表的なフローサイトメトリー分析は、２つの別個の細胞集団、ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞の大集団及びＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性表現型を備える小さな細胞集団をしている。図４ｃは、前記プラスミドを用いて安定的に形質転換させた選別ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞のＰＣＲの結果を示している。ＰＣＲは、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ＤＵ１４５選別細胞内のＣＫ１９レポーター構築物の安定的な組み込みを確証している。ＧＦＰ配列のフラグメントは、レポータープラスミドを用いて安定的に形質転換された選別ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ＤＵ１４５細胞由来のテンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅させた。陰性ＰＣＲコントロールとして、未形質転換親ＤＵ１４５細胞を使用した。
【図５】図５は、化学療法がＣＫ１９陰性、ＧＦＰ陰性表現型を備える癌幹細胞を富化させることを示している。図５ａは、作業仮説の略図表示を示している。図５ｂは、指示した様々な時点でのドセタキセル（１０ｎＭ）を用いて処理された安定的に形質転換された細胞の代表的な連続画像を示している。未選別ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定生細胞をドセタキセル（１０ｎＭ）で４８時間処理し、それらの挙動を試験するために経時的顕微鏡検査法で撮影した。黒色矢印が細胞分裂を受けて化学療法下で生残しているＧＦＰ−細胞を指示しているが、他方ＧＦＰ発現細胞は核分裂停止後に死滅し始めている代表的な実験の連続画像が含まれている。図５ｃは、ドセタキセル処理４８時間後に生存しているＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び定量割合を示している。パネルｃの細胞は、１０ｎＭドセタキセル処理４８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析された。３回の独立実験の代表的プロット及び定量は、未処理細胞（コントロール）と比較して、処理で生存しているＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞集団の割合において変化があることを示している。図５ｄは、ドセタキセル（１０ｎＭ）で継続的に処理された選別ＧＦＰ−／ＨＬＡ−及びＧＦＰ＋／ＨＬＡ＋細胞の代表的なコロニー形成アッセイ及び定量を示している。１０ｎＭドセタキセルとともに継続的に培養した、又は薬物の非存在下（コントロール）でのＧＦＰ／ＨＬＡ選別ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞（ＧＦＰ＋／ＨＬＡ＋及びＧＦＰ−／ＨＬＡ−）の３回の独立実験を実施した。＊はｐ＜０．００１に対応する。
【図６】癌幹細胞の特徴、非対称性細胞分裂、腫瘍開始及び分化の特性解析を示す図である。図６ａは、非対称性分割を受けているＧＦＰ−（ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性）細胞を示している安定性に形質転換された細胞の代表的な連続画像を示している。未選別及び未処理ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞を経時的顕微鏡検査法により２４時間中に撮影した。代表的な実験の連続画像は、ＧＦＰ−（ＣＫ陰性）細胞が非対称性で分割してＧＦＰ＋娘細胞を産生することを示している。図６ｂは、様々な時点でのＧＦＰ陰性及びＧＦＰ陽性選別細胞由来のＧＦＰ細胞集団の代表的なフローサイトメトリー分析及び定量を示している。ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞をＧＦＰ選別し、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞を別個にプレーティングして様々な期間にわたり増殖させた。様々な時点（第１日、２週間後、４週間後）のＧＦＰ−及びＧＦＰ＋選別細胞に由来する培養細胞を対象とする３回の独立実験の代表的なフローサイトメトリー分析のプロット及び定量。図６ｃは、ＧＦＰ陰性／ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性細胞から生成した腫瘍異種移植片内の分化マーカー（ＧＦＰ、ＣＫ及びＨＬＡクラスＩ）の実験設計及び結果ならびに免疫蛍光分析の略図表示を示している。実験設計の略図表示は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内へのＧＦＰ／ＨＬＡ選別ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞の注射及び結果として得られた腫瘍を示している。各選別細胞集団（例、ＧＦＰ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性）及び細胞希釈（細胞１０、１００及び１，０００個）に対してマウス８匹を含む３回の独立実験を実施した。ＧＦＰ陰性／ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性細胞から生成した異種移植腫瘍内の分化マーカー（ＧＦＰ、ＣＫ及びＨＬＡクラスＩ）の代表的な免疫蛍光分析を示した。図６ｄは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＧＦＰ＋／ＨＬＡ＋及びＧＦＰ−／ＨＬＡ−選別細胞の注射後の腫瘍潜伏期間及び腫瘍開始能力の定量を示している。＊はｐ＜０．００１に対応し、＊＊はｐ＜０．０５に対応する。バーは、１００μｍに対応する。
【図７】ヒト原発性及び転移性前立腺癌組織内の癌幹細胞の同定を示す図である。図７ａは、患者２例（対応する原発性及び転移性腫瘍を備える患者１）由来の代表的組織サンプル中のＣＫ１８及びＣＫ１９免疫組織化学的発現を示す図である。ヒストグラムは、独立した患者由来の原発性（ｎ＝６）及び転移性（ｎ＝２０）組織サンプル中のＣＫ陰性及び陽性細胞の割合を示している。図７ｂ〜７ｄは、分析された組織サンプル中のＣＫ陰性及び陽性細胞の定量、ならびにＣＫ（ＣＫ１８＋１９）及びＨＬＡクラスＩ抗原（図７ｂ）、転写因子（開裂Ｎｏｔｃｈ−２、活性β−カテニン、Ｇｌｉ１及びＧｌｉ２）（図７ｃ）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）（図７ｄ）の共発現分析に基づく代表的な免疫蛍光を示している。転写因子の核染色は、同定されたＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性腫瘍細胞内で示されている。バーは、１００μｍに対応する。
【図８】ＨＬＡクラスＩ選別細胞のクローン形成能力を示す図である。ＤＵ１４５  ＨＬＡクラスＩ選別細胞の代表的な希釈（細胞１０、１００及び１，０００個）コロニー形成アッセイ及び３回の独立実験の定量を実施した。ＨＬＡクラスＩ陰性選別細胞は、ＨＬＡ−クラスＩ陽性選別細胞と比較した場合に統計的に有意に高いコロニー形成率を示した。＊はｐ＜０．０５に対応する。
【図９】様々な新鮮ヒト癌タイプ由来のＨＬＡクラスＩ陰性上皮腫瘍細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍開始能力を有することを示す図である。図９ａは、ＨＬＡクラスＩ陰性及び陽性腫瘍細胞の代表的な選別図である。図９ｂは、ヒト前立腺癌ＨＬＡ選別細胞の希釈アッセイ後の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間を示している。グラフ及び対応する表は、新鮮ヒトサンプルに直接由来する（初回注射）及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける異種移植片に由来する（二次注射）様々な希釈液（１０、１００及び１，０００個の注射細胞）のヒト前立腺癌ＨＬＡ選別細胞（ＨＬＡ−及びＨＬＡ＋）の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間を要約している。各選別細胞集団及び細胞希釈液に対してマウス４匹の上側腹部（ＨＬＡ陰性）及び下側腹部（ＨＬＡ陽性）に２回ずつ注射した。図９ｃは、１０２個のＨＬＡクラスＩ陰性（上）及びＨＬＡクラスＩ陽性（下）細胞が注射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける代表的な腫瘍異種移植片形成を示している。注射から生じた腫瘍は、ヒト原発性腫瘍ならびに初回及び二次注射から生じた異種移植片腫瘍において実施した組織学的（Ｈ＆Ｅ）及び免疫蛍光（ＣＫ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ））試験によって前立腺癌であると確証された。図９ｄは、他のヒト癌（結腸、肺、乳房及び膀胱）ＨＬＡ選別細胞の希釈アッセイ後の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間を表すヒストグラムを示している。他のヒト癌タイプ由来の１００個のＨＬＡ選別細胞の初回及び二次注射を実施した。各選別細胞集団及び細胞希釈液に対してマウス４匹の上側腹部（ＨＬＡ陰性）及び下側腹部（ＨＬＡ陽性）に２回ずつ注射した。図９ｅは、ヒト原発性及び対応する由来異種移植片の組織学的（Ｈ＆Ｅ）特性解析を示している。＊はｐ＜０．００１に対応し、＊＊はｐ＜０．０５に対応し、＊＊＊はｐ＞０．０５に対応する。バーは、１００μｍに対応する。
【図１０】同定された癌幹細胞におけるＮＯＴＣＨ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ作用を示している。図１０ａは、７２時間にわたりシクロパミン（Ｃ）、化合物−Ｅ（ＣＥ）単独又はそれらの組み合わせ（Ｃ＋ＣＥ）に曝露させた場合の親（ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１）ＨＬＡ陰性及び陽性選別腫瘍細胞において観察されたサブ−Ｇ１作用についての代表的な細胞周期分析及び定量を示している。図１０ｂは、デキサメタゾン（Ｄ）及び図１０ａと同一薬物の組み合わせに持続的に曝露させた場合の親（ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１）選別ＨＬＡ陰性及び陽性腫瘍細胞についての代表的なコロニー形成アッセイ及び定量を示している。図１０ｃは、ビヒクル溶液（コントロール）、デキサメタゾン（Ｄ）、シクロパミン＋デキサメタゾン（Ｄ＋Ｃ）、ＤＢＺ＋デキサメタゾン（Ｄ＋ＤＢＺ）又は三剤組み合わせ（Ｄ＋Ｃ＋ＤＢＺ）に曝露させたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける１０３個の２２ＲＶ１及びＤＵ１４５  ＨＬＡ陰性選別細胞の注射後の腫瘍開始能力及び潜伏期間を示している。各ＨＬＡ選別細胞系及び処理（例、シクロパミン）に対してマウス８匹を含む３回の独立実験を実施した。図１０ｄは、図１０ｃと同一薬物及び濃度に曝露させたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺癌異種移植片＃５、＃９及び＃１２由来の１０３個のＨＬＡ陰性選別細胞の注射後の腫瘍開始能力及び潜伏期間を示している。この実験は、各前立腺癌症例及び処理に対してマウス８匹を含めた。＊はｐ＜０．０５に対応する。
【図１１】サイトケラチンが欠如する腫瘍細胞が陰性ＡＲ表現型を提示することを示す図である。
【図１２】前立腺癌細胞における獲得ドセタキセル耐性の可逆性を示す図である。図１２ａは、様々な期間（４、８及び１２週間）にわたり、薬物とともに培養されたドセタキセル耐性細胞（２２ＲＶ１−ＤＲ及びＤＵ−１４５−ＤＲ）及び薬物を伴わずに培養されたドセタキセル耐性細胞における細胞生存性アッセイ（ＭＴｓ）からの細胞生存率の定量を示している。赤線は、獲得耐性及び逆耐性細胞についての薬物（ドセタキセル）のＩＣ５０濃度を示している。薬物を伴わずに培養された獲得ドセタキセル耐性細胞は、時間依存法でドセタキセルに対して漸進的により感受性となる。投薬中止１２週間後には、２２ＲＶ１−ＤＲドセタキセルＩＣ５０は１０μＭから５０ｎＭへ減少し、ＤＵ１４５−ＤＲドセタキセルＩＣ５０は１μＭから２５ｎＭへ減少した。図１２ｂの右のパネルは、２４時間にわたり用量を増加させながら処理したドセタキセル耐性細胞及び薬物を伴わずに培養したドセタキセル耐性細胞におけるコロニー形成アッセイの定量的分析を示している。図１２ｂの左のパネルは、ドセタキセルを用いて持続的に処理した細胞の代表的なコロニー形成アッセイを示している。結果は、逆耐性細胞がドセタキセルを用いて処理した場合にほとんどコロニーを形成しないことから、ドセタキセル獲得耐性の可逆性を確証している。
【図１３】ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞における分化細胞表現型の回復に結合したドセタキセル耐性可逆性を示す図である。図１３の左パネルは、親感受性細胞、ドセタキセル獲得耐性細胞及びドセタキセル逆耐性細における上皮分化マーカー（ＣＫ１８及びＣＫ１９）ならびにＨＬＡクラスＩ抗原の発現についてのウエスタンブロット分析、図１３の右パネルはヒストグラムによるタンパク質定量を示している。逆耐性細胞は、ドセタキセル獲得耐性細胞より高いタンパク質発現レベルを提示し、親感受性細胞において観察されたレベルと類似のレベルを達成する。
【図１４】ＧＦＰ発現を駆動するＣＫ１９のプロモーターを含有するプラスミドの生成及び妥当性確認を示している。図１４ａは、ｐＣＫ１９−ＧＦＰプラスミドを用いて安定性で形質転換されたＤＵ１４５親細胞のＣＫ１９（赤色）及びＧＦＰ（緑色）についての免疫蛍光染色を示している。統合パネル内の白色矢印は、ＣＫ１９及びＧＦＰの発現が欠如する細胞を指している。フローサイトメトリー定量は、内因性ＣＫ及びＧＦＰの共発現が存在することを確証しており、この安定性細胞系におけるＣＫ発現の読み出しとしてのＧＦＰ発現の使用の妥当性を確認している。図１４ｂは、ｐＣＫ１９−ＧＦＰプラスミドを用いて安定性で形質転換されたＤＵ１４５親細胞のＨＬＡクラスＩ（赤色）及びＧＦＰ（緑色）についての免疫蛍光染色を示している。統合パネル内の白色矢印は、ＨＬＡクラスＩ及びＧＦＰの発現が欠如する細胞を指している。フローサイトメトリー定量は、ＧＦＰ及びＨＬＡ−クラスＩ抗原の共発現を確証している。ＧＦＰを発現する細胞はＨＬＡクラスＩ陽性であり、他方ＧＦＰを発現しない細胞もＨＬＡクラスＩ陰性である。
【図１５】ＨＬＡクラスＩ選別細胞の腫瘍開始能力を示す図である。親ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞は、ＨＬＡマーカー発現によって選別した。ＨＬＡ陰性及びＨＬＡ陽性集団の２種の細胞希釈液（細胞１０及び１００個）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。各ＨＬＡ選別細胞系及び細胞希釈液に対してマウス８匹を含む３回の独立実験を実施した。上方パネルのグラフ及び下方パネルの対応する表は、これら３回の独立実験の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間各々を要約している。どちらの細胞系においても、１０個のＨＬＡ陰性選別細胞だけが腫瘍化能を示し、１０個のＨＬＡ陽性細胞は腫瘍を形成しない。＊はｐ＜０．０００１に対応する。
【図１６】ＧＦＰ陰性／ＨＬＡ陰性選別細胞の注射から生成された腫瘍異種移植片内のＧＦＰ／ＨＬＡ部分集団の定量を示す図である。腫瘍異種移植片内のＧＦＰ／ＨＬＡ細胞部分集団の代表的なフローサイトメトリー分析プロット及び定量は、２つの別個の細胞集団、大集団のＧＦＰ陽性／ＨＬＡ陽性細胞及び小集団のＧＦＰ陰性／ＨＬＡ陰性表現型を備える細胞を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
標準化学療法に対して難治性であるＣＳＣが見いだされている。化学療法は分裂細胞を含む所定の腫瘍細胞部分集団を絶滅させるが、化学療法は同定されたＣＳＣ集団を枯渇させない。これは、標準ヒト癌化学療法がなぜ初期腫瘍収縮を頻回に生じさせるか説明するが、今も大多数の癌は生残するＣＳＣが再生するために最終的には再発する。本明細書で規定したＣＳＣの数を減少させる、又は根絶する物質を同定することは、癌療法の分野を前進させることになる。
【００１５】
本発明による方法は、本明細書で同定される癌幹細胞（「ＣＳＣ」）表現型の特徴及び機能的化学耐性を有するＣＳＣの数を選択的に減少させる物質を同定するために開発されてきた。本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーンは、前記ＣＳＣの生残もしくは増殖を減少させる、又は前記ＣＳＣの分化を増加させることができる物質を同定するために候補物質を試験するアッセイを提供する。前記アッセイの実行は、極めて広範囲の候補物質の試験及び推定ＣＳＣ阻害作用を備える物質の同定を促進する。
【００１６】
したがって、本発明の一実施形態は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる物質を同定するための方法である。本方法は、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程、及び
ｂ．前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して決定する工程を含んでいる。
【００１７】
癌幹細胞（「ＣＳＣ」）は、ＨＬＡ−である癌細胞である。そのような細胞は、ＣＤ２４−、ＣＤ１３３−、Ｎｏｔｃｈ＋、Ｇｌｉ１＋、Ｇｌｉ２＋、グリア線維性酸性タンパク質−（ＧＦＡＰ−）、ニューロフィル−、及びサイトケラチン−の内の少なくとも１つであることによってさらに規定される。さらに、上記の一部又は全部の組み合わせも企図されている。そのようなＣＳＣは、以下の追加の特性、自己再生する、非対称性細胞分裂を受ける、腫瘍化能を有する、転移能を有する、多分化特性を有する、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子に感受性である、及び広範囲の化学耐性を有する能力の内の少なくとも１つを有することによってさらに規定される。さらに、上記の一部又は全部の組み合わせも企図されている。ＣＳＣのまた別の特性は、例えば、表１に列挙されている。ＨＬＡ−とともに表１に同定されたいずれかの特性の組み合わせは、ＣＳＣ細胞を同定するのに十分である可能性がある。
【００１８】
表１は、癌幹細胞表現型をさらに規定する多数のバイオマーカーを要約している。この表現型は、「胚幹細胞」及び「組織／成体幹細胞」の発生経路及びバイオマーカー、例えば所定のホメオボックス調節因子（例、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ４）、幹細胞マーカー（例、Ｓｃａｌ、Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３、Ｎｅｓｔｉｎ）、転写因子（例、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、核β−カテニン）、非対称性細胞分裂（例、ＲＭＮＤ５Ａ）、及び多剤耐性と関連する膜トランスポーター（例、ＭＤＲ１／Ｐ−糖タンパク質、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＡＢＣ３）の発現を含むことができる。極めて重要なことに、これらのＣＳＣは共通して、宿主免疫監視機構の回避に寄与するすべてのＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ分子を含む組織適合性タンパク質の発現の欠如を有しており、転移拡散にとって極めて重要である。
【００１９】
本明細書で使用する「ＨＬＡ  Ｉ−」は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を有していないことを意味する。前記ＭＨＣは、リンパ球認識及び抗原提示の原因となる細胞表面上で提示された１組の分子である。前記ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞毒性Ｔ細胞に対する抗原を表す。ＭＨＣＩ分子は、ほぼ全てのタイプの体細胞上で見いだされる。
【００２０】
本明細書で使用する「ＨＬＡ  ＩＩ−」は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を有していないことを意味する。前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞に対する抗原を提示する。ＭＨＣＩＩ分子は、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞上でのみ見いだされる。「ＨＬＡ−」は、好ましくはＨＬＡ  Ｉ−及びＨＬＡ  ＩＩ−を意味する。
【００２１】
癌細胞集団由来のＨＬＡ−細胞を同定する工程は、例えば、特定の細胞表面マーカーの発現もしくは非発現に基づいて細胞を同定する、及び前記細胞の生存性を維持する任意の従来型もしくは公知の技術を使用して実施することができる。好ましくは、同定は、実施例の項でより詳細に開示する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって実施される。
【００２２】
本明細書で使用する「自己再生する能力」は、例えば、ＣＳＣがその未分化状態を維持しながら極めて多数の細胞分裂周期を経験する能力を有することを意味する。
【００２３】
本明細書で使用する「非対称性細胞分裂」は、例えば異なる特性を備える２つの細胞、例えば前記ＣＳＣ表現型を維持する細胞と例えば分化するようにプログラムされたもう１つの細胞とを生じさせる細胞分裂を有し得ることを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する「腫瘍化能」は、例えば、宿主動物に移植されると腫瘍を生成する能力を有するＣＳＣなどの細胞を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する「転移能」は、例えば、体内の第２位置へ移動、つまり転移して腫瘍を生成するＣＳＣなどの細胞の能力を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する「多分化特性」は、例えば、２つ以上の細胞タイプへ細胞が分化する能力を意味する。
【００２７】
本明細書で使用する「Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子に対する感受性」は、前記Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路の阻害剤によって調節される、例えばＣＳＣなどの細胞を意味する。そのような阻害剤は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｋ．  Ｇａｒｂｅｒ，ＪＮＣＩ，９９（１７）：１２８４−１２８５（２００７）（Ｎｏｔｃｈ阻害剤）及びＭａｒｔｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第７６９５９６５号明細書（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子）を参照されたい。
【００２８】
本明細書で使用する「広範囲の化学耐性」は、ある範囲の化学物質、例えば癌治療に使用される物質に耐性であるＣＳＣなどの細胞を意味する。本明細書で使用する癌治療に使用される物質は、広範囲に解釈すべきであり、任意の公知の化学療法化合物、組成物又はそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、前記物質は、ＤＮＡ損傷薬及び／又は抗有糸分裂剤であってよい。前記物質のまた別の非限定的例には、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ミトキサントロン、シスプラチン、ドセタキセル、コルチシン類アナログ、ハリントニン、ホモハリントニン、カンプトテシン、カンプトテシンアナログ、ポドフィロトキシン、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００２９】
本明細書で使用する「細胞集団」は、様々な細胞の混合物を意味する。例えば、前記ＣＳＣは、残りの細胞タイプ、例えば癌細胞の集団から単離される必要はない。
【００３０】
本明細書で使用する「癌細胞の集団」もしくは「癌／腫瘍細胞の集団」は、癌／腫瘍細胞系、例えばＡＴＣＣを通して容易に入手可能な細胞系を含んで構築され、不死（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無制限に増殖させることができる）であってよく、被験者、例えばヒト、家畜動物、又は研究用動物、例えばマウス、ラットから得られる非不死癌性材料のサンプル（「非不死サンプル」）であってよい。癌性材料は、例えば生検又は他の外科手技から、例えば充実性腫瘍、血液に基づく腫瘍、又は神経系腫瘍から得られる細胞及び／又は組織及び／又は液体であってよい。癌性材料の起源の非限定的例には、さらに血液、血漿、尿、脳脊髄液、腹水、腫瘍性腹水、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３１】
そこで、癌細胞の集団は、下記の実施例に開示した技術を含む周知の技術を使用して、細胞培養から癌細胞を採取することによって得られる。さらに、癌細胞の集団は、癌患者からの腫瘍サンプルの獲得を通して入手することができる。癌細胞の集団は、原発性癌細胞又は転移性癌細胞であってよい。癌細胞は、様々な組織源、例えば前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、結腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、黒色腫もしくは肉腫に由来してよい。本発明の範囲内に含まれる他のそのような癌のまた別の非限定的例には、白血病、リンパ腫及び神経膠腫が含まれる。
【００３２】
本発明による細胞集団は、さらにＨＬＡ  Ｉ−及びＨＬＡ  ＩＩ−である細胞が富化している哺乳動物ＣＳＣ細胞系であってよい。「哺乳動物」は、好ましくは、ヒト、マウス、又は他の研究用動物、例えばラットを意味する。本明細書で使用する「富化（された）」は、例えば癌治療に使用される物質を用いて処理されていないコントロール細胞系に比較して増加した数のＣＳＣを有する癌細胞系を意味する。ＣＳＣ数の増加は一過性であってよく、例えば一部のＣＳＣは分化してよい、又はより長く継続してよい。さらに、そのような細胞系は純粋であっても純粋でなくてもよく、例えば、実質的にＨＬＡ＋細胞を含んでいなくてよい。
【００３３】
上述したように、ＣＳＣは、以下の特性、ＣＤ２４−、ＣＤ１３３−、Ｎｏｔｃｈ＋、Ｇｌｉ１＋、Ｇｌｉ２＋、ＧＦＡＰ−、ニューロフィル−、及びサイトケラチン−の内の少なくとも１つを有する場合がある。さらに、上記の一部又は全部の組み合わせも企図されている。ＣＳＣは、以下の特性、自己再生する、非対称性細胞分裂を受ける、腫瘍化能を有する、転移能を有する、多分化特性を有する、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子に感受性である、及び広範囲の化学耐性を有する能力の内の少なくとも１つを有する場合がある。さらに、上記の一部又は全部の組み合わせも企図されている。
【００３４】
本実施形態の一態様では、ＣＳＣは、標準化学療法に対して難治性であってよい。本明細書で使用する「難治性」は、耐性を意味する。例えば、癌／腫瘍細胞のサンプルは、化学療法に耐性である被験者の癌性物質のサンプル由来であってよい、又は前記ＣＳＣは、化学療法に耐性である癌細胞系から入手することができる。そのような耐性癌細胞系を生成するための方法は、当該技術分野において公知であり、実施例の項により詳細に開示される。
【００３５】
本実施形態のまた別の態様では、候補物質は、化学剤、生物剤及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。本明細書で使用する「生物剤」は、生体から引き出される、もしくは生成される、又はｉｎ  ｖｉｖｏ由来物質又はその誘導体もしくは生成物を模倣するために合成された物質を意味する。生物剤は、例えば、核酸、ポリペプチド、又は多糖であってよい。「化学剤」は、明確な化学組成及び特徴的な特性を有し、生物剤ではない物質を意味する。化学剤の非限定的例には、小有機化合物及び小無機化合物が含まれる。候補物質の非限定的例には、本明細書の実施例の項に開示されるＨｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ阻害剤が含まれる。
【００３６】
本実施形態の追加の態様では、前記決定する工程は、前記候補物質で処理される細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程をさらに含み、未処理細胞内のＣＳＣの割合に比較した処理細胞の集団内のＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの数を選択的に減少させる物質である。
【００３７】
本実施形態のまた別の態様では、前記決定する工程は、フローサイトメトリー分析、細胞生存性アッセイ、細胞分化アッセイ、細胞分裂アッセイ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される手順を実施する工程を含んでいる。
【００３８】
上記に規定したように、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳは、ＣＳＣを非ＣＳＣから分離及び／又は同定するために使用することができる。フローサイトメトリーは、さらに細胞生存率、分化、又は分割を評価するために使用することができる。
【００３９】
本明細書で使用する「細胞生存率」アッセイは、生細胞を死細胞から同定及び／又は分離するアッセイである。細胞生存性アッセイの非限定的例は、実施例の項に開示されている。
【００４０】
本明細書で使用する「細胞分化」アッセイは、分化細胞又は非分化細胞を、実施例の項に開示したように、例えば細胞分化マーカー、例えばサイトケラチン発現に基づいて同定及び／又は分離するアッセイである。
【００４１】
本明細書で使用する「細胞分裂」アッセイは、分裂細胞を非分裂細胞から、実施例の項に開示したように、例えば細胞周期分析を実施することによって同定及び／又は分離するアッセイである。
【００４２】
本実施形態のまた別の態様では、前記細胞集団はＣＳＣ及び成体幹細胞を含み、前記物質は成体幹細胞の数を実質的に減少させることなく細胞集団内のＣＳＣの数を減少させる。本明細書で使用する「成体幹細胞」は、胚発生後に身体全体、例えば成人の身体で見いだされる、細胞分裂により増殖して死細胞を補充し損傷組織を再生させる未分化細胞を意味する。成体幹細胞は、身体の修復系として機能する。そこで、成体幹細胞の数を実質的に減少させない物質は、身体の正常修復系に実質的な影響を及ぼさない。
【００４３】
本発明の方法は、高スループットスクリーンを使用して実施することができる。高スループットスクリーンは、ＣＳＣの数を減少させる潜在的化合物もしくは生物剤についてスクリーニングする能力を最大化するために好ましい。
【００４４】
本明細書で使用する語句「高スループットスクリーン」又は「高スループットスクリーニング法」は、多数の物質、例えば化合物が標的分子もしくは標的細胞、例えばＣＳＣに対する生物学的活性について迅速に並行して試験されるプロセスを規定している。所定の実施形態では、「多数の物質、例えば化合物」は、例えば、１００種以上又は３００種以上又は５００種以上又は１，０００種以上の化合物であってよい。好ましくは、前記プロセスは、自動化プロセスである。
【００４５】
本実施形態のまた別の態様では、前記決定する工程は、以下のような工程ｉならびに工程ｉｉ、ｉｉｉ、及びｉｖの少なくとも１つを含むことができ、
ｉ．前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない前記細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの数を選択的に減少させる物質である。
【００４６】
好ましくは、前記決定する工程は、フローサイトメトリー分析、細胞生存性アッセイ、細胞分化アッセイ、細胞分裂アッセイ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される手順を実施する工程を含んでいる。
【００４７】
本発明のまた別の実施形態は、細胞集団内において癌幹細胞（ＣＳＣ）の割合を選択的に減少させる物質を同定するための高スループットスクリーニング法である。本スクリーニング法は、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程、
ｂ．前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して、前記候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうかを、
ｉ．前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない前記細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程によって、決定する工程を含み、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの割合を選択的に減少させる物質である。ＣＳＣの特性は、上記に開示した通りである。
【００４８】
本実施形態の工程（ｉ）は、好ましくはフローサイトメトリー分析によって実施される。
【００４９】
本実施形態の工程（ｉｉ）は、好ましくは細胞生存性アッセイによって実施される。
【００５０】
本実施形態の工程（ｉｉｉ）は、好ましくは細胞分化アッセイによって実施される。
【００５１】
本実施形態の工程（ｉｖ）は、好ましくは細胞分裂アッセイによって実施される。
【００５２】
本実施形態のまた別の態様では、候補物質は、化学剤、生物剤及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００５３】
本実施形態の追加の態様では、ＣＳＣは、標準化学療法に対して難治性である。
【００５４】
本発明のまた別の実施形態は、細胞集団内において癌幹細胞（ＣＳＣ）の割合を選択的に減少させる物質を同定するための高スループットスクリーニング法であって、前記ＣＳＣは標準化学療法に対して難治性であるスクリーニング法である。本方法は、
ａ．細胞集団由来のＣＳＣを候補物質と接触させる工程であって、前記ＣＳＣは、以下の特性、ＨＬＡ  Ｉ−及びＨＬＡ  ＩＩ−を有する工程、
ｂ．候補物質が前記ＣＳＣの生存もしくは増殖を減少させるかどうか、又は前記ＣＳＣの分化を増加させるかどうか前記候補物質と接触させられていないＣＳＣと比較して、
ｉ．フローサイトメトリーを使用して、前記候補物質で処理された前記細胞集団内のＣＳＣの割合を前記候補物質で処理されていない前記細胞集団内のＣＳＣの割合と比較する工程、
ｉｉ．細胞生存性アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の生存細胞の割合を決定する工程、
ｉｉｉ．細胞分化アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の非ＣＳＣ細胞の割合を決定する工程、及び
ｉｖ．細胞分裂アッセイを使用して、前記処理及び未処理細胞集団内の分裂細胞の割合を決定する工程によって、決定する工程を含み、
このとき（１）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞生存率を低下させる、（２）細胞生存率の低下を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる、（３）ＣＳＣの割合を減少させ、非ＣＳＣの割合を増加させる、（４）ＣＳＣの割合を減少させ、細胞分裂を減少させる、又は（５）細胞分裂の減少を伴わずにＣＳＣの割合を減少させる候補物質は、ＣＳＣの割合を選択的に減少させる物質である。ＣＳＣの特性は、上記に開示したように、詳細に規定することができる。
【００５５】
本実施形態の一態様では、候補物質は、化学剤、生物剤及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００５６】
本発明のまた別の実施形態は、本明細書に開示した方法によって同定されたＣＳＣを選択的に殺滅するための物質である。
【００５７】
本発明のまた別の実施形態は、薬学的に許容される担体及び上記で同定したＣＳＣを選択的に殺滅するための物質もしくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。
【００５８】
本明細書で使用する薬学的に許容される塩は、ＣＳＣを選択的に殺滅するための物質と生理学的に適合する無機酸（mineral acids）、例えば塩酸、硫酸、亜硫酸もしくはリン酸、又は有機酸、例えばメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、乳酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸もしくはサリチル酸との塩である。用語「薬学的に許容される塩」は、そのような塩を意味する。その中に酸性基が存在する物質は、塩基と塩をさらに形成することができる。そのような塩の例として、アルカリ、アルカリ土類及びアンモニウム塩、例えばＮａ−−、Ｋ−−、Ｃａ−−及びトリメチルアンモニウム塩が挙げられる。用語「薬学的に許容される塩」は、さらにそのような塩を意味する。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、任意の所望の効果的方法、経口摂取のため、又は眼への局所投与のための軟膏もしくは液滴として、又は非経口もしくは他の投与のために任意の適切な方法、例えば腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣内、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管内、又はリンパ管内投与することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、他の治療と併せて投与することができる。本発明の医薬組成物は、カプセル封入することができる、さもなければ所望であれば胃液もしくは他の分泌液から保護することができる。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の有効成分、例えば本発明の方法によって同定された１つ以上の物質を１つ以上の薬学的に許容される担体、及び場合により、１つ以上の他の化合物、薬物、成分及び／又は材料と混合物中に含んでいる。選択された投与経路とは無関係に、本発明の物質／化合物は、当業者には公知の従来方法によって薬学的に許容される剤形に調製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．）を参照されたい。
【００６１】
薬学的に許容される担体は当該技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．）及びＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい）、糖類（例、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム類（例、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム及びリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例、食塩液、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンガー液）、アルコール類（例、エチルアルコール、プロピルアルコール、及びベンジルアルコール）、ポリオール類（例、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール）、ポリオール（例、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール）、有機エステル類（オレイン酸エチル及びトリグリセリド類）、生分解性ポリマー（例、ポリラクチド−ポリグリコライド、ポリ（オルトエステル類）、及びポリ（無水物類））、エラストマーマトリックス類、リポソーム類、ミクロスフェア類、油類（コーン油、麦芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、綿実油、及び落花生油）、カカオ脂、ワックス類（例、坐剤ワックス）、パラフィン類、シリコーン類、タルク、ケイ酸塩などが含まれる。本発明の医薬組成物において使用される各薬学的に許容される担体は、前記調製物の他の成分と適合性であって被験者にとって有害ではないという意味において「許容可能」でなければならない。選択された剤形及び意図された投与経路に適切な担体は当該技術分野において周知であり、選択された剤形及び投与方法のために許容される担体は、当該技術分野における通常の技術を使用して決定することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、任意で、そのような医薬組成物において一般に使用される追加の成分及び／又は材料を含有することができる。これらの成分及び材料は、当該技術分野において周知であり、（１）充填剤もしくは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース及びアカシア、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば寒天（agar-agar）、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、所定のケイ酸塩、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第４級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土、（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール類、及びラウリル硫酸ナトリウム、（１０）懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、メタヒドロキシドアルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム、（１１）緩衝剤、（１２）賦形剤、例えばラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動物及び植物脂肪、油類、ワックス類、パラフィン類、カカオ脂、デンプン類、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン類、ベントナイト類、ケイ酸、タルク、サリチル酸塩、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、（１３）不活性希釈剤、例えば水もしくは他の溶媒、（１４）保存料、（１５）界面活性剤、（１６）分散剤、（１７）徐放性剤もしくは吸収遅延剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、又は他のポリマーマトリックス、生分解性ポリマー、リポソーム類、ミクロスフェア類、アルミニウムモノステアレート、ゼラチン、及びワックス類、（１８）乳白剤、（１９）アジュバント、（２０）湿潤剤、（２１）乳化剤及び懸濁化剤、（２２）溶解補助剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、落花生油、コーン油、麦芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール類、ポリエチレングリコール類及びソルビタンの脂肪酸エステル類、（２３）噴霧剤（propellants）、例えばクロロフルオロ炭化水素類及び揮発性未置換炭化水素類、例えばブタン及びプロパン、（２４）酸化防止剤類、（２５）意図されたレシピエントの血液と等張性の調製物にさせる物質、例えば糖類及び塩化ナトリウム、（２６）増粘剤、（２７）コーティング材料、例えばレシチン、及び（２８）甘味料、フレーバー剤、着色剤、香料及び保存料を含んでいる。そのような各成分もしくは材料は���前記調製物の他の成分と適合性であって被験者にとって有害ではないという意味において「許容可能」でなければならない。選択された剤形及び意図された投与経路に適切な成分及び材料は当該技術分野において周知であり、選択された剤形及び投与方法のために許容される成分及び材料は、当該技術分野における通常の技術を使用して決定することができる。
【００６３】
経口投与に適切な医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤、ピル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、水性液もしくは非水性液中の液剤もしくは懸濁剤、水中油型もしくは油中水型液体エマルジョン、エリキシル剤もしくはシロップ剤、トローチ剤、ボーラス剤、舐剤もしくはペースト剤の形態にあってよい。これらの製剤は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば従来型パン・コーティング、混合、造粒又は凍結乾燥プロセスによって調製することができる。
【００６４】
経口投与の固体剤形（カプセル剤、錠剤、ピル剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）は、例えば有効成分を１つ以上の薬学的に許容される担体、ならびに任意で、１つ以上の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、潤滑剤、及び／又は着色剤と混合する工程によって調製することができる。類似タイプの固体組成物は、適切な賦形剤を使用して軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤は、任意で１つ以上の補助成分とともに圧縮もしくは成形することによって製造することができる。圧縮錠は、適切な結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤、界面活性剤もしくは分散剤を用いて調製することができる。成形錠剤は、適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤、及び他の固体剤形、例えば糖衣錠、カプセル剤、ピル剤及び顆粒剤は、任意で、コーティング剤及びシェル剤、例えば腸溶コーティング及びその他の医薬品製造分野において周知の他のコーティング剤を用いて割線付けする、又は調製することができる。さらにまたその中の有効成分の徐放もしくは制御放出を提供できるように調製することもできる。例えば、細菌保持フィルターを通すろ過によって殺菌することができる。これらの組成物は、さらに任意で乳白剤を含有することができ、それらが有効成分だけを、又は任意で遅延方法で優先的に消化管の所定部分内に放出するような組成物であってよい。有効成分は、さらにまたマイクロカプセル形にあってよい。
【００６５】
経口投与の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、当該技術分野において一般に使用される適切な不活性希釈剤を含有することができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、フレーバー剤、着色剤、香料及び保存料をさらに含むことができる。懸濁剤は、懸濁化剤を含有することができる。
【００６６】
直腸もしくは膣投与の医薬組成物は、１つ以上の有効成分を１つ以上の、室温では固体であるが体温では液体であり、直腸もしくは膣腔内では融解して前記有効化合物を放出する適切な非刺激性担体と混合する工程によって調製可能な坐剤として提示することができる。膣投与に適切な医薬組成物には、当該技術分野において公知であるような薬学的に許容される担体を含有するペッサリー剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤もしくはスプレー製剤がさらに含まれる。
【００６７】
局所もしくは経皮投与の剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、滴剤及び吸入剤が含まれる。本活性物質／化合物は、無菌条件下で適切な薬学的に許容される担体と混合することができる。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤及びゲル剤は、賦形剤を含有することができる。散剤及びスプレー剤は、賦形剤及び推進剤を含有することができる。
【００６８】
非経口投与に適切な医薬組成物は、１つ以上の物質／化合物を１つ以上の薬学的に許容される無菌等張性水性もしくは非水性液剤、分散剤、懸濁剤もしくはエマルジョン、又は使用直前に無菌注射用液剤もしくは分散液に再構成可能な無菌散剤と組み合わせて含んでおり、これらは適切な酸化防止剤、緩衝剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にさせる溶質、又は懸濁化剤もしくは増粘剤を含有していてよい。適正な流動性は、例えば、分散剤の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。これらの組成物は、適切なアジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤及び分散剤をさらに含有することができる。等張剤を含めることが望ましい場合もある。さらに、本注射用医薬剤形の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質を含めることによって引き起こすことができる。
【００６９】
時には、薬物（例、医薬製剤）の作用を延長させるために、皮下もしくは筋肉内注射からの吸収を緩徐化することが望ましい。これは、水溶性の良くない結晶質もしくは非晶質材料の液体懸濁液の使用によって実施することができる。
【００７０】
活性物質／薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは順に、結晶サイズ及び結晶形に依存する可能性がある。又は、非経口投与された物質／薬物の遅延性吸収は、油ビヒクル中に活性物質／薬物を溶解又は懸濁させる工程によって実施することができる。注射用デポ剤は、生分解性ポリマー中で有効成分のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって製造することができる。有効成分対ポリマーの比率、及び使用された特定ポリマーの性質に依存して、有効成分の放出速度を制御することができる。注射用デポ製剤は、また身体組織と適合性であるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。注射用材料は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって殺菌することができる。
【００７１】
製剤は、単位用量もしくは複数回用量密閉容器、例えばアンプル及びバイアル中で提示することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加しか必要としない凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、上記に記載したタイプの無菌散剤、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【００７２】
追加の用語の定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定を意図していない。本明細書及び添付の特許請求項において使用される単数形「１つの」及び「その」には、状況が他のことを明示しない限り、複数の指示対象を含んでいる。
【００７３】
本明細書での数値範囲の言及については、それらの間に同一精度で存在する数は明示的に企図されている。例えば、６〜９の範囲については、数６及び９に加えて、７及び８が企図されており、６．０〜７．０の範囲については、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図されている。
【００７４】
核酸
本明細書で使用する「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述は、相補鎖の配列も規定する。そこで、核酸は、記述した一本鎖の相補鎖も含んでいる。核酸の多数の変異体は、所定の核酸と同一目的のために使用することができる。そこで、核酸は、実質的に同一の核酸及びそれらの相補体も含んでいる。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列へハイブリダイズすることができるプローブを提供する。そこで、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含んでいる。
【００７５】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってよい、又は二本鎖及び一本鎖配列の両方の部分を含有していてよい。核酸は、ゲノム及びｃＤＮＡ両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、又はハイブリッドであってよく、前記核酸はデオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、合成遺伝子を使用して一本鎖分子として合成することができる、又は細胞内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現させることができる。核酸は、化学合成法又は組み換え法によって得られる。
【００７６】
核酸は、米国特許出願第１１／４２９，７２０号明細書、同第１１／３８４，０４９号明細書、同第１１／４１８，８７０号明細書及び同第１１／４２９，７２０号明細書ならびに国際公開第２００５／１１６２５０号パンフレット及び同第２００６／１２６０４０号パンフレットに記載されたように、さらにまたＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗ｍｉＲＮＡであってよい。
【００７７】
ｓｉＲＮＡ遺伝子標的化は、脂質媒介性形質転換（例えば、リポソーム内のカプセル封入、カチオン性脂質、コレステロール、及び／又は凝縮ポリマーとの錯体形成、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクション）などの伝統的方法によって達成される、細胞内への一過性ｓｉＲＮＡ転移によって実施することができる。ｓｉＲＮＡ遺伝子標的化は、さらにまた抗体とコンジュゲートしたｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡに結合する二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ結合ドメイン（ＤＲＢＤ）にコンジュゲートした細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質と錯体形成されたｓｉＲＮＡの投与によって実施することができる（例えば、米国特許出願第２００９／００９３０２６号明細書を参照されたい）。
【００７８】
核酸は、さらにまたアプタマー、イントラマー、又はスピーゲルマーであってよい。用語「アプタマー」は、特異的分子標的に結合する核酸もしくはオリゴヌクレオチド分子を意味する。アプタマーは、大きなコンビナトリアルライブラリーから標的特異的アプタマー配列を選択する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化プロセス（例、米国特許第５２７０１６３号明細書に開示されたＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）））から引き出される。アプタマー組成物は二本鎖もしくは一本鎖であってよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、又は他のヌクレオチド様分子を含むことができる。アプタマーのヌクレオチド成分は、所望の特性、例えば血液中のヌクレアーゼ耐性又はより長い寿命などを改善可能な修飾糖基（例、リボヌクレオチドの２’−ＯＨ基は２’−Ｆ又は２’−ＮＨ２で置換されてよい）を有することができる。アプタマーは、循環系からの前記アプタマーのクリアランスを緩徐化するために他の分子、例えば高分子量担体とコンジュゲート化されてよい。アプタマーは、例えば架橋結合剤の光活性化によってそれらの同種リガンドに特異的に架橋結合させることができる（Ｂｒｏｄｙ，Ｅ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｌ．  Ｇｏｌｄ（２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４：５−１３）。
【００７９】
用語「イントラマー」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現するアプタマーを意味する。例えば、ワクシニアウイルスベースのＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質内で特異的ＲＮＡアプタマーを高レベルで発現させるために使用されてきた（Ｂｌｉｎｄ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：３６０６−３６１０）。
【００８０】
用語「スピーゲルマー」は、Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡ、又は他の左側のヌクレオチド誘導体もしくはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを意味する。左旋性ヌクレオチドを含有するアプタマーは、通常は右旋性ヌクレオチドを含有する基質に作用する天然型酵素による分解に耐性である。
【００８１】
核酸は、一般にはホスホジエステル結合を含有するが、少なくとも１つの異なる結合、例えばホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくはＯ−メチルホスホロアミダイト結合及びペプチド核酸骨格及び結合を有していてよい核酸アナログが含まれてよい。他のアナログ核酸には、米国特許第５２３５０３３号明細書及び同第５０３４５０６号明細書に開示されているものを含む陽性骨格、非イオン性骨格、及び非リボース骨格が含まれる。１つ以上の非天然型もしくは修飾ヌクレオチドを含有する核酸もまた、核酸の定義内に含まれる。修飾ヌクレオチドアナログは、例えば核酸分子の５’末端及び／又は３’末端に所在してよい。ヌクレオチドアナログの代表的な例は、糖修飾又は骨格修飾リボヌクレオチドから選択することができる。なお、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、つまり天然型核酸塩基に代えて非天然型核酸塩基を含有するリボヌクレオチド、例えば５位で修飾されたウリジン類もしくはシチジン類、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、８位で修飾されたアデノシン類及びグアノシン類、例えば８−ブロモグアノシン、デアザヌクレオチド類、例えば７−デアザ−アデノシン、Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンが適切である。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２もしくはＣＮから選択される基によって置換されてよいが、このときＲは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩである。修飾ヌクレオチドには、また例えばＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（Ｏｃｔ．  ３０，２００５），Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８（２００４）及び米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号明細書に開示されているヒドロキシプロリノール結合を通してコレステロールとコンジュゲート化されたヌクレオチドが含まれる。修飾ヌクレオチド及び核酸は、米国特許出願公開第２００２０１１５０８０号明細書に開示されているように、ＬＮＡ（ロックド核酸）も含むことができる。追加の修飾ヌクレオチド及び核酸は、米国特許出願公開第２００５０１８２００５号明細書に開示されている。リボース−リン酸塩骨格の修飾は、様々な理由のために、例えば生理学的環境内での分子の安定性及び半減期を増加させるため、細胞膜を横断する拡散を強化するため、又はバイオチップ上のプローブとして実施することができる。天然型核酸及びアナログの混合物を生成することができる、又は、異なる核酸アナログの混合物、ならびに天然型核酸及びアナログの混合物を生成することができる。
【００８２】
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用される。本発明では、これらの用語は、天然型、合成、もしくは修飾、又は天然型及び合成の組み合わせであってよいアミノ酸の連結配列を意味する。この用語には、抗体、抗体ミメティック、ドメイン抗体、リポカリン類、標的化プロテアーゼ類、及びポリペプチドミメティックが含まれる。この用語には、さらにペプチドもしくはペプチドフラグメントに対して抗体を立てるために企図されたペプチドもしくはペプチドフラグメントを含有するワクチン類が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用する用語「抗体」には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥのクラスの抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含むそれらのフラグメントもしくは誘導体、ならびに一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、及び二機能性抗体が含まれる。抗体は、所望のエピトープ又はそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、又はそれらの混合物であってよい。抗体は、さらにキメラ抗体であってよい。抗体は、当該技術分野において公知の１つ以上の化学剤、ペプチド、又はポリペプチド部分の付着によって誘導体化することができる。抗体は、化学的部分とコンジュゲート化することができる。抗体は、ヒト又はヒト化抗体であってよい。これらやその他の抗体は、米国特許出願公開第２００７００６５４４７号明細書に開示されている。
【００８４】
その他の抗体様分子もまた本発明の範囲内に含まれる。そのような抗体様分子には、例えば、受容体トラップ（例えばエンタネルセプト）、抗体ミメティック（例えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のアドネクチン類、例えばフィブロネクチンをベースとする「アドレス可能な」治療用結合分子）、ドメイン抗体（天然型単一ドメイン抗体の最小機能性フラグメント（例えば、ナノボディ、例えばＣｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ａｐｒ  １５；６４（８）：２８５３−７）を参照されたい）が含まれる。
【００８５】
適切な抗体ミメティックは、一般に本明細書に記載した抗体及び抗体フラグメントに対する代用物として使用することができる。そのような抗体ミメティックは、有益な特性と結び付けることができる（例えば、それらは水溶性、タンパク質分解抵抗性、及び／又は非免疫原性であってよい）。例えば、モノクローナル抗体の第２相補性決定領域（ＣＤＲ）を模倣する合成β−ループ構造を含むペプチドが提案及び生成されてきた。例えば、Ｓａｒａｇｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  Ａｕｇ．  １６，１９９１；２５３（５０２１）：７９２−５を参照されたい。ペプチド抗体ミメティックも、多重ＣＤＲから抗原接触残基を含有するペプチドミミックを設計することができるよう、「活性」抗原認識残基、分子モデリング、及び分子動力学軌道分析を決定するためにペプチドマッピングの使用によって生成されてきた。例えば、Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｊｕｌ．  １８，２００３；３０７（１）：１９８−２０５を参照されたい。本発明の状況において適用可能であり得る関連原理、方法などについての追加の考察は、例えばＦａｓｓｉｎａ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９４；５（２）：１２１−９に提供されている。
【００８６】
本明細書で使用する用語「ペプチド」には、例えば米国特許出願公開第２００６０２７５８２３号明細書に開示されている翻訳後修飾の基質標的阻害が可能である標的プロテアーゼが含まれる。
【００８７】
本発明では、「ペプチド」はさらにアンチカリン類を含んでいる。アンチカリン類は、癌幹細胞の数を減少させる物質についてスクリーニングすることができる。アンチカリン類は、リポカリンスカフォールドに基づいて構築されているリガンド結合タンパク質である（Ｗｅｉｓｓ，Ｇ．Ａ．  ａｎｄ  Ｈ．Ｂ．  Ｌｏｗｍａｎ（２０００）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ７：Ｒ１７７−Ｒ１８４；Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４：２５７−２７５）。リポカリン類のタンパク質構造は、その開放端で４つのループを支持する８本の逆平行β鎖を有するβ−バレルを含むことができる。これらのループは、新規な結合特異性を付与するアミノ酸置換によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子組み換え可能な部位であるリポカリン類の天然リガンド結合部位を形成する。アミノ酸置換は、当該技術分野において公知の方法を使用して生成することができ、保存的置換（例えば、結合特異性を変化させない置換）又は結合特異性を控えめに、軽度に、又は有意に変化させる置換を含むことができる。
【００８８】
一般に、ポリペプチドミメティック（「ペプチドミメティック」）は、ポリペプチドの生物学的活性を模倣するが、化学的性質ではペプチド性ではない分子である。所定の実施形態においてペプチドミメティックはペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）を含有していない分子であるが、用語「ペプチドミミック」は、完全には性質がペプチド性ではない分子、例えば疑似ペプチド、半ペプチド、及びペプトイドを含むことができる。より広範囲の定義（例えば、ポリペプチドの一部がペプチド結合が欠如する構造によって置換されている場合）による一部のペプチドミミックの例については、以下に記載する。性質が完全又は部分的に非ペプチであるかどうかにかかわらず、本発明によるペプチドミメティックは、ポリペプチド内の活性基の三次元配置に非常に似た反応性化学的部分の立体配置を提供することができる。この同様の活性部位形状の結果として、本ペプチドミメティックは、ポリペプチドの生物学的活性に類似する生物学的作用を示すことができる。
【００８９】
前記ポリペプチド自体ではなく所定のポリペプチドのミメティックを使用することについては幾つかの潜在的利点がある。例えば、ポリペプチドは、２つの望ましくない属性、つまり不良な生体内利用率及び短い作用期間を示す場合がある。ペプチドミメティックは、経口活性であって長い作用持続期間を有するために十分小さいことが多い。さらにまたポリペプチドについてはペプチドミメティックを用いると低下する可能性がある安定性、保管及び免疫反応性に関する問題もある。
【００９０】
所望の生物学的活性を有するポリペプチドは、類似の生物学的活性を備えるペプチドミメティックの開発に使用することができる。ポリペプチドからペプチドミメティックを開発する技術は公知である。ペプチド結合は、ペプチドミメティックがオリジナルのポリペプチドに類似の構造、及びこのため生物学的活性を採用することを可能にする非ペプチド結合によって置換することができる。また別の修飾は、アミノ酸の化学基を類似の構造、形状又は反応性の他の化学性基と置換することによっても生成することができる。ペプチドミメティックの開発は、遊離している、又はリガンドに結合しているオリジナルのポリペプチドの三次構造をＮＭＲ分光法、結晶学及び／又はコンピュータ支援分子モデリングによって決定する工程によって支援することができる。これらの技術は、オリジナルのポリペプチドより高い効力及び／又は高い生体内利用率及び／又は大きな安定性を備える新規な組成物の開発に役立つ（Ｄｅａｎ（１９９４），ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１６：６８３−６８７；Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｔｚｍｉｌｌｅｒ（１９９３），Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．，１１：１６６−１７３；Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ（１９９３），Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，１３：３２７−３８４；Ｍｏｏｒｅ（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．，１５：１２４−１２９；Ｈｒｕｂｙ（１９９３），Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３３：１０７３−１０８２；Ｂｕｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉ．  Ａｍ．，２６９：９２−９８）。
【００９１】
多糖類
用語「多糖類」は、グリコシド結合によって一緒に結合された繰り返し単位（単糖類もしくは二糖類のいずれか）から形成された高分子炭水化物構造を意味する。単糖類もしくは二糖類の単位は、同一であっても相違していてもよい。多糖類の非限定的例には、デンプン、グリコーゲン、セルロース、及びキチンが含まれる。
小有機もしくは無機分子
【００９２】
語句「小有機」もしくは「小無機」分子には、多糖類、ポリペプチド及び核酸以外の、作用して生物学的プロセスに影響を及ぼし得るあらゆる化学的もしくは他の部分が含まれる。小分子は、現在公知で使用されている任意の数の治療用物質を含むことができ、生物学的機能についてスクリーニングするための当該分子のライブラリー内で合成することができる。小分子は、サイズによって大分子から識別される。本発明の小分子は、通常は、約５，０００Ｄａ（ダルトン）未満、好ましくは２，５００Ｄａ未満、より好ましくは１，０００Ｄａ未満、最も好ましくは約５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００９３】
本明細書で使用する用語「有機化合物」は、大分子以外の任意の炭素ベースの化合物、例えば核酸及びポリペプチドを意味する。炭素に加えて、有機化合物は、カルシウム、塩素、フッ素、銅、水素、鉄、カリウム、窒素、酸素、硫黄及び他の元素を含有することができる。有機化合物は、芳香族もしくは脂肪族形にあってよい。有機化合物の非限定的例には、アセトン類、アルコール類、アニリン類、炭水化物類、単糖類、二糖類、アミノ酸類、ヌクレオシド類、ヌクレオチド類、脂質類、レチノイド類、ステロイド類、プロテオグリカン類、ケトン類、アルデヒド類、飽和、不飽和及び多飽和脂肪類、油類及びワックス類、アルケン類、エステル類、エーテル類、チオール類、硫化物類、環式化合物、複素環式化合物、イミダゾール類及びフェノール類が含まれる。本明細書で使用する有機化合物には、ニトロ化有機化合物及びハロゲン化（例、塩素化）有機化合物もまた含まれる。本発明によって同定された小分子の集合体及び小分子は、例えば加速器質量分析（ＡＭＳ；Ｔｕｒｔｅｌｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ２０００  ６：９９１−１００７，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、及びＥｎｊａｌｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ  ２０００  １９：１３９−６１，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照されたい）などの技術によって特徴付けられる。
【００９４】
好ましい小分子は、比較的容易及び安価で製造、処方される、又はさもなければ調製される。好ましい小分子は、様々な貯蔵条件下で安定性である。好ましい小分子は、生物学的に活性であり、改良された医薬特性を有する分子を形成するために大分子と密接に関連させて配置することができる。改良された医薬特性には、所望の生物学的活性に好都合である循環時間、分布、代謝、修飾、排泄、分泌、排出、及び安定性における変化が含まれる。改良された医薬特性には、化学実体の毒物学的及び有効性特性における変化が含まれる。
【実施例】
【００９５】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を詳細に例示するために提供される。これらの実施例は、例示に過ぎず、決して本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００９６】
実施例１
ドセタキセル耐性の前立腺癌細胞は細胞の幹細胞性と一致する発生分子指標を提示する
ドセタキセルは、ホルモン難治性前立腺癌を備える患者における標準療法として現在使用されている抗有糸分裂薬である（Ｐｅｔｒｙｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｔａｎｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４。しかし、全ての患者は、最終的には疾患進行を経験し、この状況で疾患を制御可能な他の治療は存在しない。この耐性現象の臨床的関連のために、明確に樹立された前立腺癌ホルモン非依存性細胞系ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１を使用するドセタキセル耐性のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを生成してそのような事象の原因となる分子改変を特性解析した（図１ａ〜ｄ）。
【００９７】
ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞は、用量を増加させながらドセタキセルに曝露させ、獲得化学耐性を特性解析し、細胞生存率、コロニー形成、アネキシンＶ、及びポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂アッセイによって確証した（図１ａ〜ｄ）。生成されたドセタキセル耐性（ＤＲ）細胞は、多剤耐性表現型と一致して、ＤＮＡ損傷薬（ミトキサントロン、ドキソルビシン及びシスプラチン）、ならびに他の抗有糸分裂薬（ビノレルビン及びパクリタキセル）に対する交差耐性を示した（データは示していない）。
【００９８】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングは、感受性（ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１−親細胞）ならびに獲得耐性（ＤＵ１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲ）前立腺癌細胞を比較するために実施した。その後の分析のために、転写産物発現における少なくとも２倍の増加もしくは減少を示す遺伝子を選択した。この分析は、２４７個の遺伝子が重複したＤＵ１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲ細胞各々において１，２４５個及び９９０個の脱調節遺伝子を開示した（図２ａ左側）。これらの重複遺伝子中、２９．５％はアップレギュレートされ、７０．５％はダウンレギュレートされた。驚くべきことに、一般に脱調節した２４７個の転写産物の生物学的プロセスについての遺伝子オントロジーカテゴリー評価は、細胞増殖についての予想富化の他に、細胞死、及び薬物応答生物学的プロセス、発生及び免疫監視カテゴリーが有意に提示されることを明らかにした（図２ａ右）。アップレギュレートもしくはダウンレギュレートされることが見いだされた前立腺癌の生物学及び幹細胞性に重要である遺伝子は、ａ）上皮分化バイオマーカー−サイトケラチン類（ＣＫ１８及び１９）、ならびに前立腺特異マーカー、例えばアンドロゲン受容体（ＡＲ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｂ）免疫監視抗原  −  主要組織適合複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）、及びｃ）幹細胞性シグナリング経路  −  Ｗｎｔ／β−カテニン、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇを含んでいた。選択された重要な遺伝子は、以下の表１及び２に示した。所定の細胞構造遺伝子及びシグナリング経路の転写産物レベルならびに２０例の転移性前立腺癌患者の組織サンプルの臨床病理的及び表現型的特性は、以下の表３に要約されている。
【００９９】
【表１−１】
0006002748.tif 000002
【表１−２】
0006002748.tif 000003
【表１−３】
0006002748.tif 000004
【表１−４】
0006002748.tif 000005
【０１００】
【表２】
0006002748.tif 000006
【０１０１】
ドセタキセル耐性細胞（ＤＵ１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲ）においてそれらの親感受性細胞（ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１）と比較してアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされることが見いだされた遺伝子は、表２にまとめた。対数正規化に基づいて２倍以上の変化を示す遺伝子の平均発現平均差についての統計的分析は、対応する感受性及び耐性細胞間でｔ検定を使用して実施した。上皮分化、前立腺特異的マーカー及び免疫監視マーカーに含まれた遺伝子の転写レベルの減少が生じた。他方では、発生転写因子の遺伝子転写産物がアップレギュレートされた。
【０１０２】
【表３】
0006002748.tif 000007
【０１０３】
ウエスタンブロット（図２ｃ）及び免疫蛍光アッセイ（図２ｄ及び２ｆ）によるこれらの遺伝子のタンパク質バリデーションは、獲得耐性細胞が上皮分化タンパク質、前立腺特異的バイオマーカー及び免疫監視抗原における減少を有し、発生シグナリング経路の活性化（核発現）を示すこと（図２ｄ）を確証した。活性化β−カテニン、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及び開裂ＮＯＴＣＨ−２は、タンパク質発現ならびに核免疫局在化において、ドセタキセル耐性細胞を主として細胞形質／膜発現を提示した親感受性細胞と比較した場合に有意な増加を示した。さらに、これらの表現型は、化学耐性現象に結合していることが見いだされたが、これは逆獲得耐性細胞が分化表現型を回復したからである（図１３）。
【０１０４】
分化の試験に関して、上皮マーカーならびにＡＲ、ＰＳＡ及びＰＳＭＡを含む前立腺関連バイオマーカーとしてのサイトケラチン類（ＣＫ）の発現を評価した。ＣＫは以前にヒト分化上皮細胞に対して特異的であり、シグナルトランスダクション及び細胞分化プロセスにおいても機能しながら細胞完全性の維持において役割を果たすと報告されている（Ｂｒｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０；Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１；Ｔｅｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。低分子量ＣＫ（例、ＣＫ１８及びＣＫ１９）は管腔正常ヒト前立腺細胞及び前立腺癌において特異的に発現するが、他方高分子量ＣＫ（例、ＣＫ５及びＣＫ１０）は基底正常前立腺細胞において同定され、まれに癌細胞集団において観察されている（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。ドセタキセル耐性細胞は、低分子量ＣＫの遺伝子転写及びタンパク質発現の両方において有意な減少を示した。ＤＵ１４５−ＤＲ細胞は、ＣＫ１９及び１８各々のタンパク質発現における６．２５及び１６．６倍の減少を示した。同様に、２２ＲＶ１−ＤＲは、定量して感受性親細胞と比較した場合に、そのようなＣＫにおける１４．３及び６．７倍の減少を示した。ＣＫ１９及びＣＫ１８の免疫蛍光染色は、ドセタキセル耐性細胞における減少した発現を確証した（図２）。さらに、高分子量ＣＫはドセタキセル耐性細胞中において対応する親細胞中と同様に検出不能のままであったが（データは示していない）、これはドセタキセル耐性を獲得するプロセスにおいて細胞が上皮分化マーカーを消失し、管腔（低分子量ＣＫ）から基底様（高分子量ＣＫ）表現型への変化を受けないことを示している。さらに、ＡＲ、ＰＳＭＡ及びＰＳＡを含む前立腺関連分化マーカーを発現する２２ＲＶ１細胞は、ドセタキセルに曝露させた場合にそのようなマーカーの遺伝子及びタンパク質発現レベルの劇的な減少を示した（図２）。２２ＲＶ１−ＤＲ細胞は、ＡＲ、ＰＳＭＡ及びＰＳＡ各々のタンパク質発現における１６．６、２０．０及び１１．１倍の減少を示した。これらの結果は、免疫蛍光分析によってさらに確証された（データは示していない）。
【０１０５】
免疫回避の機序に関して、ドセタキセル耐性細胞がＭＨＣクラスＩ分子の脱調節を示すことが見いだされた。細胞毒性Ｔリンパ球への効率的な抗原提示及びその後の腫瘍細胞溶解に極めて重要なＭＨＣクラスＩ抗原は、遺伝子転写及びタンパク質レベルの両方でダウンレギュレートされることが観察された（図２）。遺伝子発現プロファイリングは、ＭＨＣクラスＩ抗原Ａ、Ｂ、Ｃの免疫ブロッティング及び免疫蛍光染色によってタンパク質レベルで確証された（図２）事実である全ＭＨＣクラスＩ抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）における有意なダウンレギュレーションを明らかにした。そこで、これらの細胞は、それらを宿主免疫系によって検出することができないようにさせる免疫回避に好都合な表現型を示す。
【０１０６】
幹細胞表現型を対象とする試験に関して、ＷＮＴ／β−カテニン、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇの同定された脱調節発現を特性解析した。これらの経路は、自己再生及び前駆細胞の分化に関連付けられてきた（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｒａｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；及びＧｒｉｇｏｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。前立腺では、これらのシグナリング経路は、発生パターニング、上皮再生、及び前立腺癌腫瘍原性において極めて重要な役割を果たす（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，Ｋａｒｈａｄｋａｒ  ｅｔ  ａＬ，２００４）。ドセタキセル耐性細胞は、ＷＮＴ／β−カテニンシグナリングネットワークの周知の阻害剤であるＷＮＴ阻害剤Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）の遺伝子転写産物及びタンパク質レベルにおける有意な減少を示した（Ｆｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＤＫＫ１発現におけるこの減少は、ＷＮＴシグナリングの主要な重要エフェクターである脱リン酸化（活性）β−カテニンの発現の増加と結び付いていた。免疫蛍光分析は、親ドセタキセル感受性細胞が、接着分子としてのその機能に関連するβ−カテニンの膜発現を提示することを証明したが、他方ドセタキセル耐性細胞は正準相関ＷＮＴシグナリング経路を活性化するために必要である（Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）と報告されたこのタンパク質の顕著な核局在化を示した（図２）。さらに、ドセタキセル耐性細胞は、ＮＯＴＣＨシグナリングネットワークの増加も示した。ＮＯＴＣＨ２遺伝子転写産物レベルは、耐性細胞内では有意に増加し、それが転写活性を発揮する前記タンパク質の核転移と関連している開裂Ｎｏｔｃｈ２タンパク質発現の増加と結合していた（図２）。最後に、ドセタキセル耐性細胞では、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体Ｐａｔｃｈｅｄ及びグリオーマ関連癌遺伝子ホモログ転写因子であるＧｌｉｌ及びＧｌｉ２の発現が増加した。これらの所見は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路活性化に関連付けられている状態である、上述した転写因子の増加したタンパク質発現及び核転移（図２）と関連していた。驚くべきことに、他の報告された幹細胞表面マーカー、例えばＣＤ４４及びＣＤ１３３は、遺伝子転写産物及びタンパク質レベルの両方で分析されたように、本試験でアップレギュレートされるとは見いだされなかった（データは示していない）。
【０１０７】
ドセタキセル耐性細胞が幹細胞性に一致する表現型を示したという事実に基づいて、これらの細胞が親細胞より高い腫瘍開始能力を示すかどうかを試験した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける１０２及び１０３個のドセタキセル耐性細胞（２２ＲＶ１−ＤＲ及びＤＵ１４５−ＤＲ）の皮下注射は、それらの親感受性細胞より有意に多い腫瘍を生じさせた（図２ｅ）。１０２個のＤＵ１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲ細胞の注射はレシピエントの各々８３．３±７．８％及び７９．０±１０．４％において腫瘍形成を誘導した。他方親ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞の注射は各々３８．８±１５．２％及び４６．０±９．３％でしか腫瘍形成を誘導しなかった（ｐ＜０．０００１）。さらに、１０４個の親及び耐性細胞が注射された場合に腫瘍形成において差はなかったが、腫瘍潜伏期間は耐性細胞の方が有意に短かった。ＤＵ１４５親細胞の腫瘍潜伏期間は、耐性細胞に対して５９．２±４．９日間対４３．２±２．６日間であった（ｐ＜０．０００１）。同様に、腫瘍潜伏期間は、耐性細胞（３５．３±１．９日間）と比較して、２２ＲＶ１細胞（５４．９±１．５日間）の方が有意に長かった（ｐ＜０．０００１）。そこで、ドセタキセル耐性細胞の幹細胞性分子指標は、それらの高い腫瘍開始能力によって機能的に強化された。
【０１０８】
（実施例２）
前立腺癌幹細胞の同定及び特性解析
生成されたドセタキセル耐性細胞の幹細胞性指標及びより高い腫瘍開始能力を考察して、化学耐性現象が幹細胞性特性を備える耐性細胞に感受性の移行に起因するのかどうか、又は化学療法が先在する前立腺癌幹細胞を選択するかどうか調査した（図３ｃ）。ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１ドセタキセル耐性細胞は一般にＣＫ１９及びＣＫ１８、ならびにＭＨＣクラスＩ抗原のダウンレギュレーションを提示したので、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性表現型を備える細胞が既に親細胞系中に存在したかどうかを決定した。免疫蛍光染色は、両方の細胞系における小さなＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性部分集団の存在を明らかにしたが、これは各々フローサイトメトリーによって定量した場合に、ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１親細胞の全集団の２．１９±０．９５％及び３．５８±０．７９％を表した（図４ｂ）。
【０１０９】
次に、同定されたＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性腫瘍細胞がドセタキセル曝露から生残したかどうか、そこで獲得化学耐性現象の原因であるかどうかについて試験した。このために、ＤＵ１４５親細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動するＣＫ１９のプロモーターを含有するプラスミドを用いて安定性に形質転換させた。（図１４ａ及び１４ｂ）。ＤＵ１４５親細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動するＣＫ１９のプロモーターを含有するプラスミドを用いて安定性に形質転換させた（図６ａ）。ＣＫ１９及びＧＦＰの共発現は、フローサイトメトリー及び免疫蛍光によって確証した（図６ｂ）。ＣＫ１９を発現する細胞はＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）であったが、ＣＫ１９を発現しなかった細胞はＧＦＰ陰性（ＧＦＰ−）であった。さらに、ＣＫ１９／ＧＦＰ陰性細胞へのプロモーター構築物の安定性挿入はＰＣＲによって確証された（図６Ｃ）。さらに、これらのＣＫ１９／ＧＦＰ陰性細胞は、フローサイトメトリー及び免疫蛍光の両方によってＨＬＡ陰性であると確証された（図６ｄ）。
【０１１０】
未選別ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞を播種してドセタキセル（１０ｎＭ）に曝露させ、４８時間ライブイメージングを実施した。結果として生じた動画は、ＧＦＰ陰性表現型を備える細胞について選択されたドセタキセル曝露は療法下で有糸分裂を分割及び終了することができるが、ＧＦＰ陽性細胞は有糸分裂停止後に死滅することを示した（図５ｂ）。フローサイトメトリー分析は、ドセタキセル処理がそれらの各表現型に基づいて生残細胞の比率に有意な変化を生じさせることを明らかにした（図５ｃ）。最初はＧＦＰ陽性表現型を提示する細胞は全集団の８７．５±１０．４％を表していたが、処理後にはこの表現型は減少し、全細胞集団中２８．３±１０．６％しか構成しないことが観察された（ｐ＜０．００１）。これとは対照的に、ＧＦＰ陰性表現型を備える細胞は処理後には全集団の６．４±４．３％から７３．１±１０．２％へ比例的に増加した（ｐ＜０．００１）。ＧＦＰ／ＨＬＡクラスＩ発現によって選別されたＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞のコロニー形成アッセイは、ドセタキセルに継続的に曝露させた場合にＧＦＰ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性表現型を備える腫瘍細胞しかクローンを形成することができなかったことから、これらの結果を確証した（図５ｄ）。コロニー形成アッセイは、ＧＦＰ陰性表現型を備える腫瘍細胞しかドセタキセルに継続的に曝露させた場合にクローンを形成することができなかったことから、これらの結果を確証した（図５ｄ）。そこで、これらの結果は、標準化学療法によって見逃され、腫瘍再発の原因となる可能性がある未分化表現型（ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性）を備える細胞集団の存在を強調している。
【０１１１】
さらに、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性／ＧＦＰ陰性表現型を備える腫瘍細胞の部分集団は、非対称性細胞分裂を通して分化する固有の幹細胞特性を有することも証明された。未選別ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞を播種した場合に、そのようなプロセスを通してＧＦＰ陰性細胞はその元来の同一性を保持するが、分化のプログラムに進行する（ＧＦＰ陽性になる）娘細胞を生じさせることが観察された（図６ａ）。これとは対照的に、ＧＦＰ陽性表現型を提示する細胞は対称性に分割したが、これは全娘細胞が同一特性を有し続けることを意味している。４週間にわたって培養されたＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性ＧＦＰ選別細胞のフローサイトメトリー分析は、この期間後に、ＧＦＰ陰性選別細胞に由来する細胞が主として分化（ＧＦＰ＋）細胞によって構成されるが、他方ＧＦＰ陽性選別細胞から成長した細胞は分化された表現型を維持することを明らかにした（図６ｂ）。そこでこの結果は、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性細胞が親細胞系の内部の小数の腫瘍細胞集団を表すが、他方大集団の分化悪性腫瘍細胞はこの全細胞集団の主要部分を構成するという事実を説明している。
【０１１２】
最後に、同定された細胞の部分集団における腫瘍開始の機能的な癌幹細胞特性を取り扱った。ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞をＧＦＰ／ＨＬＡクラスＩ発現によって選別し、得られた細胞のＧＦＰ選別部分集団を免疫欠損性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射すると、ＧＦＰ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性細胞だけが腫瘍開始能力を示した（図６ｃ）。ＧＦＰ陰性表現型を備える細胞１０個の注射は、レシピエントの６３．０±１４．６％において腫瘍を生成したが、同一量のＧＦＰ陽性細胞の注射後に腫瘍形成は観察されなかった（図６ｄ）。
【０１１３】
ＤＵ１４５−ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性／ＧＦＰ陰性表現型細胞だけが腫瘍開始能力を示すという観察所見をさらに確証するために、親細胞系（ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１）を表面マーカーＨＬＡクラスＩ抗原の発現に基づいて選別し、それらの腫瘍開始能力について試験した（図１３及び１５）。ＧＦＰ陰性細胞を用いて得られた結果と同様に、希釈アッセイ後にもＨＬＡクラスＩ陰性細胞だけが腫瘍開始能力を示した。１０個のＨＬＡクラスＩ陰性ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞の注射はレシピエントの各々８３．３±１９．１％及び１００％において腫瘍を生成したが、ＨＬＡクラスＩ陽性表現型を示す細胞１０個を用いた注射の１９８日後に腫瘍形成は観察されなかった。同様の結果は、ＨＬＡクラスＩ陰性生成腫瘍異種移植片からの連続移植後に得られた（データは示していない）。
【０１１４】
そこで、腫瘍開始の機能的な癌幹細胞の特性は、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性表現型を備える細胞の部分集団に固有であった。さらに、腫瘍開始能力が与えられた唯一の細胞であることに加えて、ＨＬＡクラスＩ陰性細胞はさらに、ＨＬＡクラスＩ陽性細胞と比較した場合に統計的に有意に高いクローン形成能力も示した（図８）。最も重要なことに、しかし驚くことではないが、異種移植ＧＦＰ陰性細胞から生成された腫瘍は分化（ＧＦＰ陽性／ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性）表現型を示し（図６ｃ）、全腫瘍集団の３．９３±０．８５％を占めるＧＦＰ陰性／ＨＬＡ陰性細胞の小集団を保持した（図１６）。
【０１１５】
これらをまとめると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験結果は、非対称性細胞分裂を通して分化細胞とともに発生する腫瘍を徹底的に生息させる過渡増殖期クローン原を生成する、腫瘍開始能力を備えるＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性表現型を備える細胞集団を同定している。そこで、前立腺癌幹細胞の発見を確証する。新規に生成されたドセタキセル耐性細胞の幹細胞性指標及び腫瘍開始能力を含む上述した結果を考察して、化学療法が前立腺癌幹細胞の富化を誘導するという仮説を立てた（図９ａ）。ドセタキセル耐性細胞はＣＫ１９及びＣＫ１８を含む上皮分化マーカーのダウンレギュレーションを提示したため、ＣＫ陰性細胞集団を親細胞系において最初に定量した。フローサイトメトリー分析は、両方の親細胞が散在性ＣＫ１９及びＣＫ１８陰性部分集団を有することを明らかにした（図６ａ）。２２ＲＶ１細胞は、３．４％のＣＫ１９及び４．７％のＣＫ１８陰性細胞を示した。同様に、ＤＵ１４５細胞は、２．１％のＣＫ１９及び２．３％のＣＫ１８陰性細胞を示した。さらに、２２ＲＶ１は、両方のＣＫを用いて共染色した場合に２．６％、ＤＵ１４５は１．３％のＣＫ陰性細胞を有していた。そこで免疫蛍光染色は、希少なＣＫ陰性部分集団及び両方のＣＫを共発現する優勢な部分集団の両方の存在を確証した。
【０１１６】
（実施例３）
ヒト転移性前立腺腫瘍サンプル中の癌幹細胞の同定
上記の結果を考慮して、同定された前立腺癌幹細胞集団がヒト前立腺癌組織サンプル中に存在するかどうかを調査した。転移性（ｎ＝２０）及び対応する原発性（ｎ＝６）ヒト前立腺癌組織についての免疫組織化学的試験は、ＣＫ陰性腫瘍細胞の散在性部分集団を明らかにした（図７ａ）。これらの細胞はＨＬＡクラスＩ抗原に対しても陰性であり（図７ｂ）、重要な発生転写因子の活性化を示し（図７ｃ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において以前に観察された幹細胞性指標に対応する前立腺関連性分化マーカーの発現が欠如した（図７ｄ）。
【０１１７】
分析した全ヒト前立腺癌試験片は、原発性及び転移性病変各々において全腫瘍細胞の０．０５％〜０．３％及び０．４％〜１．８％を占めるＣＫ陰性（ＣＫ１８及びＣＫ１９）腫瘍細胞の散在性部分集団を含有していた（図７ａ）。次に、ＣＫ発現と当該のマーカーとの関連を評価するために、免疫蛍光に基づく二重染色を実施した。この分析では、ＣＫ発現がＨＬＡクラスＩ発現と有意に関連することが一貫して観察された（ｐ＜０．０００１）。より詳細には、ＣＫ陰性腫瘍集団は細胞の９７．８±０．７％においてＨＬＡクラスＩ抗原を発現しないことが観察された。いずれにせよＣＫ陽性細胞の全部（１００％）が陽性ＨＬＡクラスＩ抗原表現型を示した（図７ｂ）。さらに、ＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性腫瘍細胞が、分化ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞と比較した場合に発生転写因子の核発現（活性化）の有意な（ｐ＜０．０００１）増加を有することが持続的に見られた。ＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性細胞は細胞の６３．９±２２．６％において脱リン酸化β−カテニン、７２．８±１５．１％において開裂Ｎｏｔｃｈ２、６７．５±１７．３％においてＧｌｉ１、６７±１７．３％においてＧｌｉ２の核発現を示したが、他方ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞は細胞の５．８±１１．９％において核脱リン酸化β−カテニン、６．７±７．９％において開裂Ｎｏｔｃｈ２、１．２±７．９％においてＧｌｉ１、及び１．５±１０．６％においてＧｌｉ２を発現した（図７ｃ）。さらに、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性腫瘍細胞は核ＡＲの発現を示さないが、他方ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞は細胞の７１．８±１４．３％において核ＡＲを示す（図７ｄ）ことも観察された。そこで前立腺癌幹細胞が陽性ＡＲ表現型を提示しないという事実は、これらの細胞が機能的ＡＲシグナリングに依存しない可能性があることを示唆しており、これは将来の試験において追跡すべき問題である、どのようにこれらの細胞がホルモン療法後に観察される再発の原因となるのかを説明するであろう。まとめると、これらの結果は、ヒト前立腺癌組織サンプル中の前立腺癌幹細胞の部分集団の存在及びそれを同定する能力を確証している。
【０１１８】
癌幹細胞集団が原発性及び転移性両方の前立腺癌で同定されることを前提にして、新鮮ヒト腫瘍サンプル由来のそのような細胞集団の腫瘍化能を調査することを目的とした一連の実験を設計した。そのような表現型を備える前立腺癌細胞が腫瘍開始の原因であったかどうかを評価するために、原発性前立腺癌に対する前立腺全摘出術を受けた患者４８例由来の腫瘍を入手した（表４）。細胞は、細胞表面マーカーＨＬＡクラスＩの発現に基づいてフローサイトメトリーによって単離した（図９ａ）。この分析は、全部の原発性前立腺癌サンプルが主として全集団の９８．９±０．３５％（範囲９８．７％〜９９．５％）のメジアン値を占めるＨＬＡクラスＩ陽性細胞によって構成され、他方メジアン１．２±０．６５％（範囲０．５％〜１．５％）の低い割合の細胞だけがＨＬＡクラスＩ陰性表現型を示すことを証明したが、この結果は上記に報告した免疫組織学的所見と一致している。次に、同一数（１０、１０２及び１０３個）のＨＬＡクラスＩ陰性、ＨＬＡクラスＩ陽性及びマトリゲルと混合した未選別細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。概して、４８中４例（８．３％）の異種移植片腫瘍が、原発性前立腺癌細胞の注射から３４．５（範囲２１．０〜４５．３）週間のメジアンフォローアップ期間後に発生した。２０．８（範囲９．３〜３９．６）週間、及びＨＬＡ陰性細胞だけが、ＨＬＡ陽性細胞と比較した場合に連続移植後にそれらの腫瘍化能を維持することができた（図９ｂ及び以下の表５）。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
表５は、原発性前立腺癌組織由来の１０、１００及び１，０００個のＨＬＡクラスＩ選別及び未選別細胞が注射された場合に、腫瘍発生率（腫瘍個数／注射回数）によって測定された腫瘍開始能力及び週数での腫瘍潜伏期間（平均値±ＳＤ）をまとめている。各選別細胞集団及び細胞希釈液についてマウス４匹の上側腹部（ＨＬＡ陰性）及び下側腹部（ＨＬＡ陽性）に２回ずつ注射した。各腫瘍試験片由来の未選別細胞も注射した。
【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
１０３個の細胞の初回注射後、ＨＬＡ陽性細胞（１２．５±１７．６％）と比較して有意に高い腫瘍開始能力がＨＬＡ陰性選別細胞（８７．５±１７．６％）由来であることが観察されたが、これはＨＬＡ陰性異種移植片における短い腫瘍潜伏期間と関連のある事実である（１４．２±４．５対２４．６±３．１週間）。さらに、細胞１０２及び１０３個へのさらなる希釈は、ＨＬＡ陰性細胞だけに腫瘍開始能力が付与されていることを明らかにした。これらの観察所見は、１０２及び１０３個の選別細胞の注射が、腫瘍発生がＨＬＡ陰性の部分細胞集団に限定されることを証明し続けた第２回移植実験によって確証された（図９ｂ）。ＨＬＡ陽性細胞から希に生成された異種移植片由来のＨＬＡ選別細胞の二次注射は、ＨＬＡ陽性細胞が腫瘍開始能力を有していなかったことから、この結果を確証した。組織学的及び免疫組織化学的分析は、ＨＬＡ陰性選別細胞由来の腫瘍が最初の原発性ヒト腫瘍の表現型を忠実に再現する（図９ｃ）ことを明らかにしたが、これはそれらの腫瘍細胞の大多数におけるＨＬＡクラスＩ抗原ならびに上皮及び前立腺癌関連マーカー（ＣＫ及びＡＲ）の発現を示している。そこでこれらの結果は、ＨＬＡ陰性集団がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの前立腺癌異種移植片を開始することができ、大多数のヒト癌に独特の分子及び表現型不均一性を再現することのできる細胞中で富化されることを証明している。
【０１２３】
さらに、これは普遍的現象であると思われるが、それはＨＬＡ陰性腫瘍細胞はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに連続的に注射された場合に腫瘍開始の原因となる結腸、乳房、肺及び膀胱癌を含む様々な新鮮ヒト充実性新生物から単離されたからである（図９ｄ、及び以下の表６）。概して、結腸１０例中４例（４０％）、肺１０例中２例（２０％）、乳房１２例中２例（１６．６％）及び膀胱１８例中２例（１１．１％）の異種移植片腫瘍が新鮮ヒト腫瘍サンプルの注射から発生した。他の原発性充実性腫瘍タイプの特性は、以下の表７に示した。他の充実性癌組織タイプ由来のＨＬＡ選別細胞の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間は、以下の表８に示した。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
表８は、他の原発性腫瘍組織タイプ由来の１００個のＨＬＡクラスＩ選別細胞が注射された場合に、腫瘍発生率（腫瘍個数／注射回数）によって測定された腫瘍開始能力及び週数での腫瘍潜伏期間（平均値±ＳＤ）をまとめている。各選別細胞集団及び細胞希釈液についてマウス４匹の上側腹部（ＨＬＡ陰性）及び下側腹部（ＨＬＡ陽性）に２回ずつ注射した。
【０１２８】
初回注射後、１０２個のＨＬＡ陰性細胞の腫瘍開始能力は、ＨＬＡ陽性選別細胞と比較した場合に有意に高かった。より重要なことは、連続移植後、ＨＬＡ陰性胞だけが腫瘍化能を保持していたが、他方ＨＬＡクラスＩ陽性細胞は保持していなかった。さらに、ＨＬＡ陽性細胞から生成された異種移植片から選別されたＨＬＡ陽性細胞の二次注射は腫瘍開始能力を有していなかった。ＨＬＡクラスＩ陽性細胞から腫瘍は生成したが、これはおそらく細胞選別中のＨＬＡクラスＩ陰性細胞が汚染しているためであり、ＨＬＡクラスＩ陽性細胞が連続移植後には維持できない低い腫瘍開始能力を有する可能性も排除することはできない。発生した異種移植片腫瘍の組織学的分析は、それらの対応するヒト原発性癌に類似する形態学的特性を示した（図９ｅ）。そこで、腫瘍開始能力を備えるＨＬＡ陰性集団は、前立腺癌に加えてヒト上皮腫瘍タイプにおいて同定されている。
【０１２９】
最後に、新鮮ヒト組織サンプル由来の細胞の腫瘍開始能力は、分析された癌患者の臨床病理学的特性のいずれにも関連しておらず、ＨＬＡ陰性細胞の割合とも関連していなかった。進行性臨床病理学的特性（例、高度、高腫瘍病期）又は高い数／割合のＨＬＡ陰性細胞（例、１．５％）を備える腫瘍は、有意に高い腫瘍開始能力を有していなかった。さらに、ＨＬＡ陰性細胞の割合と腫瘍病期もしくは腫瘍悪性度との関連は全く観察されなかった。
【０１３０】
（実施例４）
ヒト癌幹細胞を標的とする
同定された癌幹細胞はＨｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ経路活性化を示すという事実に基づいて、そのような経路の阻害が癌幹細胞ホメオスタシスを損傷させ得るかどうか試験を実施した。このために、Ｓｍｏのレベルで作用するＨｅｄｇｅｈｏｇ経路アンタゴニストに由来する植物であるシクロパミン（Ｔａｉｐａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｋａｒｈａｄｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）を利用した。化合物Ｅは、Ｎｏｔｃｈ受容体のタンパク質分解性処理を遮断する高度に活性のγ−セクレターゼ阻害剤である（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために、樹立されたｉｎ  ｖｉｖｏ活性を備える高度に活性のγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＢＺを以下に略述したｉｎ  ｖｉｖｏ実験における化合物Ｅの代替物として使用した（ｖａｎ  Ｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【０１３１】
ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１由来のＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性癌幹細胞集団の各個別阻害剤への曝露は主要な作用を全く誘導しなかった。しかし両方の物質が一緒に投与された場合はサブ−Ｇ１における細胞の蓄積を伴う細胞周期進行における強力な阻害が観察されたが、他方この作用は分化（ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性）細胞においてはわずかであった（図１０ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験におけるγ−セクレターゼ阻害剤の腸毒性を減少させるためにはデキサメタゾンが使用されるために（Ｒｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、上述した阻害剤と組み合わせたデキサメタゾンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用を分析した。この分析は、デキサメタゾンがＨｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ阻害剤の細胞周期作用を変化させないことを証明した（データは示していない）。さらに、これらの薬物の結合作用はコロニー形成アッセイによって、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ阻害剤が結合された場合、２１日後にコロニーは形成されなかったことから、さらに確証された（図１０ｂ）。次に、これらの経路の阻害がｉｎ  ｖｉｖｏの癌幹細胞の腫瘍開始能力に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、１０３個のＤＵ１４５及び２２ＲＶ１  ＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射し、ビヒクル液（コントロール）、デキサメタゾン単独、薬物の二剤組み合わせ（例、デキサメタゾン＋シクロパミン）又は三剤組み合わせ（デキサメタゾン＋シクロパミン＋ＤＢＺ）を用いて処理した。三剤組み合わせを用いて処理したマウスは、ＤＵ１４５異種移植片における５．１週間及び２２ＲＶ１異種移植片における３．８週間の腫瘍初期触知可能性における有意な（ｐ＜０．０５）遅延を示したが、この腫瘍遅延はＨｅｄｇｅｈｏｇもしくはＮｏｔｃｈ阻害剤単独を用いて処理されたマウスにおいては有意でなかった（図１０ｃ）。
【０１３２】
最後に、これらの化合物の腫瘍開始阻害作用を新鮮ヒト前立腺癌組織に由来する異種移植片において試験した。異種移植片＃５、＃９及び＃１２由来の１０３個のＨＬＡ陰性選別細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射し、上述したような同一スケジュールならびにＨｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ阻害剤の組み合わせを用いて処理した。以前に前記細胞系において観察されたように、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ阻害剤を用いた結合処理だけが腫瘍開始を有意に（ｐ＜０．０５）遅延させた（図１０ｄ）。薬物の三剤組み合わせを用いて処理されたマウスにおける腫瘍異種移植片は、対応するコントロールにおける１３．８±２．５、１０．３±１．５及び１６．６±２．５週間と比較して、１８．３±３．１、１３．８±２．５及び２０．１±３．３週間後に最初に触知可能であった。
【０１３３】
これらをまとめると、これらの試験結果は、これらの発生経路の発生が腫瘍開始を遅延させる癌幹細胞集団を標的化することを証明している。
【０１３４】
腫瘍開始に関する２つの主要な仮説が主張されてきた。すべての新生細胞が完全に新規な腫瘍を生成することができると予測している「確率論的モデル」、及び腫瘍細胞が階層的状態で存在する、及び少数の幹細胞しか腫瘍開始能力を有していないと提案している「癌幹細胞モデル」。以下の幹細胞性基準、１）非対称性細胞分裂を通しての自己再生及び分化、２）腫瘍開始能力、３）陰性組織適合性指標、及び４）多剤耐性表現型を満たすヒト癌幹細胞の同定及び機能的特性解析が開示されている。
【０１３５】
ＨＬＡ陰性表現型は、胚幹細胞によっても共有されている。ヒトの移植前胚はＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ陰性であると報告されている（Ｄｅｓｏｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）。この現象は、この状況においては胎盤である血液−組織関門が発生するまで、親抗原の発現に基づく拒絶を排除する。癌幹細胞の状況では、そのような組織適合性陰性表現型は、癌幹細胞が免疫監視から免れるために、宿主突然変異寛容性ならびに腫瘍の拡がり及び転移原性能力を説明することから、臨床上の重要な意義を有している。
【０１３６】
腫瘍開始能力に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏでは同定されたＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性癌幹細胞しか腫瘍を生成しないが、分化ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性子孫にはそのような特性が欠如することが開示されている。しかし、これらの癌幹細胞は、詳細に調査する必要のある現象である、同所移植の必要を伴わずに皮下注射が起源組織表現型を付与するので、所定の間質相互作用とは無関係に遺伝記憶を示すと思われる。さらに、その同種表現型に起因して、これらの細胞は遺伝的に安定性であると仮説が立てられたが、これはそれらの静止状態及び非対称的分割によって促進される特性である。この遺伝的安定性は、分子多様性が本質的に腫瘍拡大及び分化癌細胞集団の産物であり、おそらく腫瘍形成にとってそれほど重要ではないであろうから、「ドライバー」変異の同定を可能にするであろう。ヒト腫瘍の新規な分子レベルの分類は、これらの癌幹細胞集団におけるそのような「ドライバー」突然変異の分析から高い確率で引き出すことができた。
【０１３７】
要するに、ヒト癌細胞系及び組織サンプル中で新規に規定された前立腺癌幹細胞が同定及び特性解析されている。さらに、この細胞集団はＨＬＡクラスＩ表面マーカーを使用して単離され、その腫瘍開始能力が証明された。その上、類似のＣＳＣ集団は、ヒトの乳房、結腸、肺及び膀胱癌にも存在し、これはこれらの所見にさらに普遍性を与える事実である。このヒト癌幹細胞の発見は、診断的及び予測的検査室アッセイにおいて、ならびに新規な治療戦略の開発のために重要な臨床的意義を有している。この状況では、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子を用いた処理は、実験動物モデルにおける腫瘍形成を軽減する。
【０１３８】
（実施例５）
材料及び方法
阻害剤及び薬物
ドセタキセル、ミトキサントロン、ドキソルビシン、シスプラチン、ビノレルビン、パクリタキセル、デキサメタゾン、シクロパミン及び化合物Ｅは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。ＤＢＺ［（２Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，−ｄ］アゼピン−７−イル）−プロピオンアミド］は、Ｓｙｎｃｏｍ社（オランダ国フローニンゲン）から入手した。
【０１３９】
獲得ドセタキセル耐性細胞の培養、生成及び特性解析
ヒトホルモン非依存性前立腺癌細胞系であるＤＵ−１４５及び２２ＲＶ１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、抗生物質を含まない１０％  ＦＢＳが補給されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）中で維持した。細胞は５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気中において３７℃で増殖させた。ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞は、前立腺癌ドセタキセル耐性モデルを生成するために選択した。この選択は、どちらの細胞系も臨床状況においてドセタキセルを用いて処理された状態であるホルモン療法難治性であり、それらがさらに明確なホルモン療法難治性表現型も示すという事実に基づいていた。２２ＲＶ１細胞は依然としてアンドロゲン受容体シグナリング依存性であって前立腺特異的マーカー（例、アンドロゲン受容体であるＰＳＭＡ）を発現するが、ＤＵ１４５は発現しない。そこで、これら２種の表現型が異なる細胞系における獲得ドセタキセル耐性の生成は、ドセタキセル耐性の獲得に関係する分子的プロセスを試験するためのアプローチを促進した。ドセタキセル耐性クローンであるＤＵ−１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲは、ドセタキセルの用量を上昇させながら用いて細胞を培養することによって選択した。初期培養は、５ｎＭのドセタキセルであった。感受性クローンがもはや存在せず、生残しているＤＵ−１４５及び２２ＲＶ１細胞がフラスコで再増殖した後、ドセタキセルの濃度を１０ｎＭ、及び続いて２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ及び２５０ｎＭへ上昇させた。２２ＲＶ１−ＤＲ細胞は、さらに５００ｎＭのドセタキセルへ曝露させた。各々の増加した用量のドセタキセルに曝露させた後、残りの生残細胞はドセタキセルの最終選択増量用量を含有している培養培地中で維持した。細胞を曝露させた最終薬物選択濃度は、獲得ドセタキセル耐性表現型の可逆性を回避するために、ＤＵ−１４５−ＤＲについては２５０ｎＭ及び２２ＲＶ１−ＤＲについては５００ｎＭであった。獲得薬物耐性のプロセスは、ＤＵ−１４５−ＤＲについては９カ月間及び２２ＲＶ１−ＤＲについては６．５カ月間を要した。これに並行して、親ＤＵ−１４５及び２２ＲＶ１細胞を同一用量増量法でＤＭＳＯ（ドセタキセルのビヒクル液）に曝露させた。
【０１４０】
細胞は、用量を増加させながらドセタキセルに曝露させ、獲得化学耐性を特性解析し、細胞生存率、コロニー形成、アネキシンＶ、及びポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂アッセイによって確証した（図１ａ〜ｄ）。生成されたドセタキセル耐性（ＤＲ）細胞は、多剤耐性表現型と一致して、ＤＮＡ損傷薬（ミトキサントロン、ドキソルビシン及びシスプラチン）、ならびに他の抗有糸分裂薬（ビノレルビン及びパクリタキセル）に対する交差耐性を示した（データは示していない）。ドセタキセル化学耐性が可逆性であることも観察された（図１２ａ及びｂ）。培養培地からの前記薬物の除去は、薬物耐性の有意な減少を誘導した。薬物を用いずにドセタキセル耐性細胞を１２週間培養した後、細胞生存率は有意に減少した。ＤＵ１４５−ＤＲ細胞についてのドセタキセルＩＣ−５０濃度は１μＭから２５ｎＭへ減少し、２２ＲＶ１−ＤＲ細胞ではＩＣ−５０薬物濃度は１０μＭから５０ｎＭへ減少した（図１２ａ）。薬物除去後のこのドセタキセル耐性の低下は、コロニー形成アッセイによって確証された（図１２ｂ）。そこで、ドセタキセル耐性表現型を維持するために、細胞を最終薬物選択濃度下で持続的に培養した。
【０１４１】
細胞生存率及びコロニー形成アッセイ
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｏｓ非反応性細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ワイオミング州マディソン）を使用して分析した。細胞は９６ウエルの培養皿内で１０４の密度で播種し、２４時間後に培地を取り除き、新規の培地単独（コントロール）又は薬物を含有する培地と取り替えた。７２時間後、色吸収度をマイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）上で４５０ｎｍ（試験波長）及び６２０ｎｍ（参照波長）で測定した。生残細胞の割合は、処理細胞のＡ  ４５０ｎｍ〜Ａ  ６２０ｎｍをコントロール細胞のＡ  ４５０ｎｍ〜Ａ  ６２０ｎｍで割り推定した。薬物処理に応答したクローン原性生存アッセイは、１０３個の細胞を３５ｍｍの培養皿中でプレーティングすることによって実施した。２４時間後、細胞は未処理のまま放置した（コントロール）、又は薬物で処理した。翌日、培地を交換し、細胞は、薬物を加えず、又は薬物への連続的曝露下で新鮮培地中で増殖させ続けた。これらの連続曝露実験のために、培地＋薬物は、薬物耐性細胞のクローンが出現するまで３日毎に交換した。細胞は次にＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、クリスタルバイオレット溶液を用いて染色し、形成されたコロニーを視覚的に計数した。
【０１４２】
フローサイトメトリーによるアポトーシスの分析
細胞（１０５個）は、未処理のまま放置した（コントロール）、又は７２時間にわたり薬物で処理した。付着性細胞及び剥離細胞をプールし、洗浄し、アネキシンＶ−ＦＬＵＯＳ染色キット（Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットレー）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用してアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムを用いて標識した。サンプルはＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて分析しアネキシンＶ染色を提示する細胞の割合を決定した。
【０１４３】
細胞周期分析
細胞は７２時間にわたり薬物を用いて処理し、採取し、７０％エタノール中で固定して４℃で保存した。分析前に、細胞はＰＢＳを用いて洗浄し、遠心し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ、０．２ｍｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ及び０．０２ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有する染色溶液中において室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ含量は、ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて分析した。
【０１４４】
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析
２２ＲＶ１、２２ＲＶ１−ＤＲ、ＤＵ−１４５及びＤＵ−１４５−ＤＲ遺伝子発現プロファイルを分析した。各サンプルからの全ＲＮＡをＴｒｙｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって単離し、ＲＮｅａｓｙミニキット及びＲＮａｓｅ無含有ＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）によって製造業者のプロトコールにしたがって精製した。全サンプルのＲＮＡの質は、ＲＮＡ完全性を保証するためにＲＮＡ電気泳動法及びＲＮＡ  ＬａｂＣｈｉｐ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州サンタクララ）によって試験した。サンプルは、製造業者の取扱説明書にしたがってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイを用いて分析のために準備した。サンプルの遺伝子発現レベルを正規化し、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ、ＭｉｃｒｏＤＢ、及びＤａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇツールソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて分析した。絶対コール（存在、境界的、又は非存在）及びサンプル中の発現の２２．２１５の平均差、ならびに絶対コール差、遺伝子発現の倍率変化、及び２例もしくは３例のサンプル間の平均差を正規化し、このソフトウエアパッケージを使用して同定した。対数正規化に基づいて２倍以上の変化を示す遺伝子の平均発現平均差についての統計的分析は、ドセタキセル感受性及び耐性サンプル間でｔ検定を使用して実施した。注釈が付けられなかった、又は容易に分類されなかった遺伝子は、機能的クラスタリング分析から除外した。
【０１４５】
遺伝子オントロジー分析
親感受性細胞に比較してドセタキセル耐性細胞内で示差的に発現した遺伝子は、共通して脱調節された一覧の転写産物を生成した。このリストは、生物学的プロセス、分子機能、及び細胞成分である遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリーの富化分析に適用されるウェブをベースとする統計学的超幾何学的試験であるＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓによって評価された。統計的有意性（ｐ＜０．０１）を備えて最高階層的レベル（≧レベル５）上で富化されたＧＯカテゴリーが考慮された。
【０１４６】
ウェスタンブロット分析
全細胞抽出物をサンプルバッファー中で調製し、免疫ブロッティング法によって分析した。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンノゼ）、開裂ＰＡＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、サイトケラチン１９（Ａｂｃａｍ社）、サイトケラチン１８（Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、アンドロゲン受容体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、前立腺特異的膜抗原（Ａｂｃａｍ社）、前立腺特異的抗原（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）、汎−ＨＬＡクラスＩ（Ａｂｃａｍ社）、ＤＫＫ１（Ｏｒｂｉｇｅｎ，ＢｉｏＣａｒｔａ  ＬＬＣ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、活性化β−カテニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ビルリカ）、β−カテニン（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社）、活性化Ｎｏｔｃｈ２（Ａｂｃａｍ社）、ＰＴＣＨ（Ａｂｃａｍ社）、Ｇｌｉ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ社、カリフォルニア州サンタクルーズ）、Ｇｌｉ２（Ａｂｃａｍ社）、及びβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）は、標準方法を使用して免疫ブロットアッセイに使用した。タンパク質発現は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用してバンド発現を比較する工程によって定量した。
【０１４７】
免疫組織化学及び免疫蛍光分析
免疫蛍光分析は前立腺癌細胞系ならびにヒト癌及び腫瘍異種移植片由来のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片上で実施した。一次抗体はサイトケラチン１９及び１８（Ａｂｃａｍ社）、汎−ＨＬＡクラスＩ（Ａｂｃａｍ社）、緑色蛍光タンパク質（Ａｂｃａｍ社）の組み合わせならびに以下の転写因子、活性β−カテニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、活性化Ｎｏｔｃｈ２（Ａｂｃａｍ社）、Ｇｌｉ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、Ｇｌｉ２（Ａｂｃａｍ社）及びアンドロゲン受容体（ＤＡＫＯ社、コロラド州フォートコリンズ）を含んでいた。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。前立腺癌細胞（１０５個）は３５ｍｍ培養皿内でプレーティングし、２４時間後に標準免疫蛍光法によって染色した。組織切片（５μｍ）を脱パラフィン化し、標準ペルオキシダーゼに基づく免疫組織化学及び免疫蛍光方法にかけた。サイトケラチン類、ＨＬＡクラスＩ抗原、転写因子及びアンドロゲン受容体の発現の定量は、腫瘍細胞を評価することによって実施した。陽性及び陰性細胞の割合は、１０高倍率視野内で決定した。
【０１４８】
サイトケラチン１９−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータープラスミドの生成
ＣＫ１９遺伝子プロモーター領域は、以前に記載されたように（Ｔｒｉｐａｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、ＤＵ１４５細胞ゲノムＤＮＡから特異的プライマーセット（Ｆｗ  ５’−ＡＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＴＧ−３’（配列番号１）及びＲｖ  ５’−ＴＣＣＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号２））を用いるＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物はＡｓｅ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて消化し、以前に同一酵素を用いて消化されたｐＥＧＦＰＮ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）にクローン化した。結果として、ＣＭＶプロモーターはオリジナルのベクターから除去され、ＧＦＰ発現はＣＫ１９プロモーターの制御下にあった。最終構築物は、消化及びシーケンシング分析によって確証された。ＤＵ１４５細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してｐＣＫ１９−ＧＦＰ構築物を用いて形質転換させた。２４時間後、培地を新鮮培地と取り替え、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の存在下で選択された細胞を安定性に発させた。陽性クローンは、直接顕微鏡検査及び免疫蛍光法さらに特異的プライマー（Ｆｗ  ５’−ＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３）及びＲｖ  ５’−ＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号４））を使用するＧＦＰコーディング領域のＰＣＲ増幅によって確証された。
【０１４９】
生細胞のイメージング
経時的ビデオ顕微鏡を使用し、ｐＣＫ１９−ＧＦＰプロモーターを用いて安定性形質転換されたＤＵ１４５細胞の非対称性細胞分裂及びドセタキセル部分集団感受性を評価した。６−ウエルプレート内で低コンフルエンスで増殖中の細胞を３７℃、湿度５０％及び５％  ＣＯ２の雰囲気下のインキュベーターチャンバー内のステージに配置した。無作為に選択されたＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ＤＵ１４５細胞の無人経時的動画は、Ｎｉｋｏｎ製Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立顕微鏡を用いて撮影した。ＮＩＳ素子ＡＲ（Ｎｉｋｏｎ社、ニューヨーク州メルビル）ソフトウェアを使用してデータを収集及び処理した。イメージングは１０×対物レンズを使用して実施し、画像はＧＦＰについては２００ｍｓ及び３０分毎の明視野については２０ｍｓの露出時間を用いて撮影した。
【０１５０】
フローサイトメトリーによる細胞部分集団の分析
前立腺癌細胞の部分集団のフローサイトメトリー分析は、標準方法に従って実施した。細胞内ＣＫ１９及びＣＫ１８発現は、７０％エタノールを用いて固定した単細胞懸濁液中で実施したが、細胞表面ＨＬＡクラスＩ及びＧＦＰの発現は新鮮細胞サンプル（固定なし）中で決定した。ＣＫ１９（Ａｂｃａｍ社）、ＣＫ１８（Ａｂｃａｍ社）、ＨＬＡクラスＩ（Ａｂｃａｍ社）、フィコエリトリン（Ａｂｃａｍ社）にコンジュゲートしたＨＬＡクラスＩ及びＧＦＰ（Ａｂｃａｍ社）に対する一次抗体を使用した。二次抗体は、使用した場合は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対応した。サンプルは、ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて分析した。サンプル毎に少なくとも１０４個の細胞を測定した。
【０１５１】
マウスの方法
動物の使用及び世話は、コロンビア大学施設内実験動物の飼養及び使用委員会によって確立された施設内ガイドラインを厳密に遵守した。異種移植片実験は、レシピエントとしてＪａＣＫｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した５〜６週齢のマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）を用いて実施した。
【０１５２】
ヒト原発性及び転移性前立腺癌組織サンプル
ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト原発性及び転移性前立腺癌組織サンプルは、コロンビア大学癌センターの腫瘍バンクによって提供された。全サンプルは、インフォームドコンセントの下及びコロンビア大学医療センター施設内試験審査委員会の監視下で収集された。癌を備える組織切片は、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドを詳細に検査することによって選択した。
【０１５３】
前立腺癌細胞系及び新鮮ヒトサンプル由来の癌細胞の腫瘍開始能力
ドセタキセル感受性親細胞及びドセタキセル耐性細胞、ＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性選別細胞、又はＨＬＡ陽性及びＨＬＡ陰性選別細胞の腫瘍開始能力を比較するために、様々な数（例、１０、１０２、１０３、１０４個）の細胞を雄性マウスに２００μＬの培地：マトリゲル（１：１）で皮下注射した。前立腺癌細胞のＧＦＰ細胞部分集団は、標準方法に従って選別した。ＨＬＡクラスＩ細胞単離のために、新鮮細胞の単一懸濁液をＰＢＳ＋ＦＢＳ  ５％を用いてブロックし、フィコエリトリン（Ａｂｃａｍ社）に直接コンジュゲートしたＨＬＡクラスＩ抗体を用いて染色した。新鮮腫瘍組織サンプル由来のヒト癌細胞の腫瘍開始能力を評価するために、腫瘍の部分はコロンビア大学医療センターで外科手技を受けた患者から施設内試験審査委員会によって承認されたプロトコールを通して得た。４８例の原発性前立腺癌、１０例の原発性結腸癌、１０例の原発性肺癌、１２例の原発性乳癌及び１８例の原発性膀胱癌を処理した。試験片は機械的に解離させ、ろ過して単細胞懸濁液を入手し、赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）に曝露させて赤血球を除去した。細胞は、ヒトＣＤ４５（Ａｂｃａｍ社）、ヒトＣＤ３１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及びヒトＨＬＡ−クラスＩ（Ａｂｃａｍ社）に対する直接的にコンジュゲートした蛍光抗体を用いて染色した。異種移植片腫瘍に対しては、マウスＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、マウスＣＤ３１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）及びヒトＨＬＡ−クラスＩ（Ａｂｃａｍ社）に対する一次蛍光コンジュゲート化抗体を使用してヒト癌生細胞を選択した。細胞は死細胞を標識するために１０μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ中に懸濁させ、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーティングシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で選別した。様々な希釈液（１０、１００及び１，０００個の注射された細胞）のヒト前立腺癌ＨＬＡ選別細胞（ＨＬＡクラスＩ陰性及びＨＬＡクラスＩ陽性）及び未選別細胞、ならびに他のヒト癌サンプル（一次注射）及び由来異種移植片（二次注射）からの１００個のＨＬＡ選別細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。各選別細胞集団及び細胞希釈液に対してマウス４匹を注射した。４回の注射は、２回はＨＬＡクラスＩ陰性細胞については上側腹部に、及び２回はＨＬＡクラスＩ陽性細胞については下側腹部に選別された細胞について各マウスで実施した。各腫瘍試験片由来の未選別細胞もＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。ＨＬＡ選別細胞の二次注射はＨＬＡクラスＩ陰性選別細胞から生成された腫瘍及び細胞のＨＬＡクラスＩ陽性分画を起源とする希に観察される腫瘍から実施した。腫瘍開始は、腫瘍発生率（腫瘍の数／注射回数）及び潜伏期間（初回注射から腫瘍触知可能になるまでの期間）によって測定した。腫瘍形成は、注射部位の触診によって定期的に評価した。腫瘍が１つの注射部位でのみ触知可能になった場合には、他の注射部位の持続的評価を可能にするために腫瘍を外科的に切除した。マウスを３６週間まで監視した。腫瘍負荷の兆候を伴わない動物についても、腫瘍発生が生じなかったことを確証するために剖検で検査した。採取した腫瘍をホルマリン中に固定し、必要な場合はＨ��Ｅ染色及び免疫蛍光試験のためにパラフィン切片を作製した。
【０１５４】
Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用
Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子がＨＬＡ陰性及びＨＬＡ陽性選別細胞系に及ぼすｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用は、細胞周期及びコロニー形成アッセイ（上述）によって分析した。細胞は、ビヒクル液（コントロール）、デキサメタゾン（１μＭ）、シクロパミン（１μＭ）、化合物Ｅ（１μＭ）及び二剤（例、デキサメタゾン＋シクロパミン）又は三剤（デキサメタゾン＋シクロパミン＋化合物Ｅ）の組み合わせに曝露させた。
【０１５５】
腫瘍開始におけるＮｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子の作用
これらの発生経路の阻害がｉｎ  ｖｉｖｏの癌幹細胞の腫瘍開始能力に影響を及ぼすことができたかどうかを分析するために、細胞系及びヒト前立腺腫瘍異種移植片由来の１０３個のＨＬＡ陰性選別細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下接種した。マウスは、ビヒクル液（コントロール）、デキサメタゾン（１５ｍｇ／ｋｇ／腹腔内、毎日）、シクロパミン（５０μｇ／ｋｇ／皮下、毎日）＋デキサメタゾン、ＤＢＺ（１０μＭ／ｋｇ／腹腔内、毎日）＋デキサメタゾン又は三剤の組み合わせを用いて処理した。デキサメタゾン及びシクロパミンは持続的に投与した。しかし、ＤＢＺは、腸毒性を回避するために１日１回投与した（第１〜１５日、４週間毎）。ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞系試験のために、治療群（例、シクロパミン）についてはマウス８匹において３回の独立実験を実施したが、ヒト前立腺腫瘍については各治療群にマウス８匹を含めた。マウスは、腫瘍が形成されるまで毎日監視した。動物は、何らかの苦痛の証拠を示した場合、又は体重が最初の体重の２０％を超えて減少した場合には犠死させた。生成した腫瘍を採取し、組織学的に確証した。
【０１５６】
化学耐性表現型の特性解析
分化に関する試験に関して、上皮マーカーならびにＡＲ、ＰＳＡ及びＰＳＭＡを含む前立腺関連バイオマーカーとしてのサイトケラチン類（ＣＫ）の発現を評価した。ＣＫは以前にヒト分化上皮細胞に対して特異的であり、さらにシグナルトランスダクション及び細胞分化プロセスにおいても機能しながら細胞完全性の維持に関与すると報告されている。低分子量ＣＫ（例、ＣＫ１８及びＣＫ１９）は管腔正常ヒト前立腺細胞及び前立腺癌において特異的に発現するが、他方高分子量ＣＫ（例、ＣＫ５及びＣＫ１０）は基底正常前立腺細胞において同定され、癌細胞集団では希に観察されている。本発明のモデルでは、ドセタキセル耐性細胞は、低分子量ＣＫの遺伝子転写及びタンパク質発現の両方において有意な減少を示した。ＤＵ１４５−ＤＲ細胞は、ＣＫ１９及び１８各々のタンパク質発現における６．２５及び１６．６倍の減少を示した。同様に、２２ＲＶ１−ＤＲは、定量して感受性親細胞と比較した場合に、そのようなＣＫにおける１４．３及び６．７倍の減少を示した。ＣＫ１９及びＣＫ１８の免疫蛍光染色は、ドセタキセル耐性細胞におけるそれらの減少した発現を確証した（図２）。さらに、高分子量ＣＫはドセタキセル耐性細胞においてそれらの対応する親細胞中と同様に検出不能のままであったが（データは示していない）、これはドセタキセル耐性を獲得するプロセスにおいて細胞が上皮分化マーカーを消失し、管腔（低分子量ＣＫ）から基底様（高分子量ＣＫ）表現型への変化を受けないことを指示している。さらに、ＡＲ、ＰＳＭＡ及びＰＳＡを含む前立腺関連分化マーカーを発現する２２ＲＶ１細胞は、ドセタキセルに曝露させた場合にそのようなマーカーの遺伝子及びタンパク質発現レベルの劇的な減少を示した（図２）。２２ＲＶ１−ＤＲ細胞は、ＡＲ、ＰＳＭＡ及びＰＳＡ各々のタンパク質発現における１６．６、２０．０及び１１．１倍の減少を示した。これらの結果はさらに、免疫蛍光分析によって確証された（データは示していない）。
【０１５７】
免疫回避の機序に関して、ドセタキセル耐性細胞がＭＨＣクラスＩ分子の脱調節を示すことが見いだされた。この状況において、本発明者らのグループの以前の研究は、既にヒト原発性及び転移性癌におけるＭＨＣクラスＩ抗原陰性腫瘍細胞部分集団の同定を報告している（Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。本試験では、細胞毒性Ｔリンパ球への効率的な抗原提示及びその後の腫瘍細胞溶解に極めて重要であるＭＨＣクラスＩ抗原は、遺伝子転写及びタンパク質レベルの両方でダウンレギュレートされることが観察された（図２）。遺伝子発現プロファイリングは、全ＭＨＣクラスＩ抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）における有意なダウンレギュレーションを明らかにしたが、これはＭＨＣクラスＩ抗原Ａ、Ｂ、Ｃの免疫ブロッティング及び免疫蛍光染色によってタンパク質レベルで確証された（図２）。さらに、ドセタキセル耐性細胞は、表９に示したように、公知のＫＮリガンド、例えばＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＶＲ、及びＰＶＲＬ２の遺伝子転写産物レベルにおけるダウンレギュレーションを示した。そこで、これらの細胞は、それらを宿主免疫系によって検出不能にさせる免疫回避に好都合な表現型を示す。
【０１５８】
ドセタキセル耐性細胞（ＤＵ１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲ）においてそれらの親感受性細胞（ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１）と比較してダウンレギュレートされたナチュラルキラー（ＮＫ）リガンド遺伝子発現を、表９にまとめた。対数正規化に基づいて２倍以上の変化を示す遺伝子の平均発現平均差についての統計的分析は、対応する感受性及び耐性細胞間でｔ検定を使用して実施した。大多数のＮＫリガンド遺伝子の転写産物レベルにおいては減少が生じる。
【０１５９】
【表９】
0006002748.tif 000013
【０１６０】
幹細胞表現型の試験に関して、ＷＮＴ／β−カテニンの同定された脱調節発現を特性解析したところ、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇは、前駆細胞の自己再生及び分化に関係している（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｒａｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；及びＧｒｉｇｏｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。前立腺では、これらのシグナリング経路は発生パターニング、上皮再生、及び前立腺癌腫瘍形成において極めて重要な役割を果たすことが報告されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，Ｋａｒｈａｄｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ドセタキセル耐性細胞は、ＷＮＴ／β−カテニンシグナリングネットワークの周知の阻害剤であるＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）の遺伝子転写産物及びタンパク質レベルの両方における有意な減少を示した。ＤＫＫ１発現におけるこの減少は、ＷＮＴシグナリングの主要な重要エフェクターである脱リン酸化された（活性）β−カテニンの発現の増加と関連していた。免疫蛍光分析は、親ドセタキセル感受性細胞が、接着分子としてその機能に関連するβ−カテニンの膜発現を示したが、他方ドセタキセル耐性細胞は正準相関ＷＮＴシグナリング経路を活性化するために必要であると報告されたこのタンパク質の顕著な核局在化を示した（図２）。さらに、ドセタキセル耐性細胞は、ＮＯＴＣＨシグナリングネットワークの増加も示した。ＮＯＴＣＨ２遺伝子転写産物レベルは耐性細胞内では有意に増加し、転写活性を発揮する前記タンパク質の核転移と関連している開裂したＮｏｔｃｈ２タンパク質発現の増加と結合していた（図２）。最後に、ドセタキセル耐性細胞では、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体Ｐａｔｃｈｅｄ及びグリオーマ関連癌遺伝子ホモログ転写因子であるＧｌｉ１及びＧｌｉ２の発現が増加した。これらの所見は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路活性化に関連している状態である、上述した転写因子（図２）の増加したタンパク質発現及び核転移と結び付いていた。驚くべきことに、他の報告された幹細胞表面マーカー、例えばＣＤ４４及びＣＤ１３３は、遺伝子転写産物及びタンパク質レベルの両方で分析されたように、本モデルでアップレギュレートされる様子は見られなかった（データは示していない）。
【０１６１】
さらに、ＤＵ１４５−ＤＲ及び２２ＲＶ１−ＤＲ細胞両方について耐性現象の可逆性が分化マーカーの発現における増加と結び付いていることが観察された。ドセタキセル逆耐性細胞（１２週間にわたり薬物を伴わずに培養）は、親感受性細胞において観察されたレベルに類似するレベルを達成する、ドセタキセル獲得耐性細胞と比較した場合により高いタンパク質発現レベルの低分子量サイトケラチン類（ＣＫ１９及びＣＫ１８）ならびにＨＬＡクラスＩを示した（図１３）。
【０１６２】
上皮分化レポーターモデルの生成及び特性解析
ＤＵ１４５親細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動するＣＫ１９のプロモーターを含有するプラスミドを用いて安定性に形質転換させた（図１４ａ）。ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞中でのＣＫ１９及びＧＦＰの共発現は、免疫蛍光によって確証された（図１４ａ）。フローサイトメトリー定量は、２つの別個の細胞集団がＧＦＰ及びＣＫ１９の両方に対して大部分の細胞が陽性であり（９４．３±３．８％）、１つの別個の細胞集団が両方のマーカーに対して陰性である（５．６±４．１％）ことを示した。これら２つの主要集団外の小数の散在性細胞は、１つの区画から他の区画へ移動する細胞を表す可能性があることが観察された。さらに、ＣＫ１９／ＧＦＰ陰性細胞内のプロモーター構築物の安定性挿入はＰＣＲによって確証された（図４ｃ）。ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性細胞内のＨＬＡクラスＩの発現を詳細に特性解析した（図１４ｂ）。当然のことながら、ＧＦＰを発現した細胞はＨＬＡ陽性であり（９１．６±５．５％）、ＧＦＰを発現しなかった細胞はＨＬＡ陰性表現型を提示した（７．０±４．９５）。そこでこれらの結果は、上皮分化のレポーターとしてのＧＦＰの使用の妥当性を確認し、さらに図４ｂにおいて以前に示したように、分化マーカー（ＣＫ１９／ＧＦＰ）及びＨＬＡクラスＩ抗原が欠如する細胞の部分集団の存在を証明している。
【０１６３】
ＨＬＡクラスＩ選別細胞系に関する腫瘍開始試験
ＨＬＡ−クラスＩ発現を腫瘍開始の癌幹細胞の機能的特性を備える細胞を同定する細胞表面マーカーとして使用できることをさらに確証するために、親細胞系ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて試験したＨＬＡクラスＩ及びそれらの腫瘍開始能力について選別した（図１５）。ＤＵ１４５−ＣＫ１９プロモーター−ＧＦＰ安定性ＧＦＰ陰性細胞を用いて得られた結果に類似して、ＨＬＡクラスＩ陰性細胞だけが希釈アッセイ後に腫瘍開始能力を示した。１０個のＨＬＡクラスＩ陰性ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１細胞の注射はレシピエントの各々８３．３±１９．１％及び１００％において腫瘍を生成したが、ＨＬＡクラスＩ陽性表現型を示す細胞１０個を用いた注射の１９８日後には腫瘍形成は観察されなかった。注目すべきことに、２２ＲＶ１及びＤＵ１４５由来のＨＬＡクラスＩ陰性細胞の腫瘍開始能力及び腫瘍潜伏期間は相違していたが、これらの差は統計的有意性に達しなかった。腫瘍原性細胞系間の差は、他の分子経路がマウスにおけるヒト細胞の移植及び増殖に関与し得るという事実によって説明することができた。同様の結果は、ＨＬＡクラスＩ陰性生成腫瘍異種移植片からの連続移植後に得られた（データは示していない）。
【０１６４】
ＨＬＡクラスＩ選別細胞系に関するクローン形成能力試験
ＤＵ１４５及び２２ＲＶ１親細胞系由来のＨＬＡクラスＩ選別細胞のクローン形成能力を取り扱うために、希釈コロニー形成アッセイを実施した。ＨＬＡクラスＩ陰性細胞は、ＨＬＡクラスＩ陽性細胞より統計的に有意に高いクローン形成能力を示した。詳細には、ＤＵ１４５生成コロニー由来のＨＬＡクラスＩ陰性選別細胞は、１０、１００及び１，０００個の細胞がプレーティングされた場合、３１．６±７．５％、１７．１±３．６％及び２２．０±４．９％においてコロニーを形成した。これとは対照的にＨＬＡクラスＩ陽性細胞は、１０、１００及び１，０００個の細胞がプレーティングされた場合、５．０±８．３％、８．０±３．３％及び５．５±１．５％においてコロニーを形成した（図８）。同様の結果は、２２ＲＶ１  ＨＬＡクラスＩ選別親細胞を用いて観察された（データは示していない）。
【０１６５】
ヒト組織中の前立腺癌幹細胞の同定
転移性（ｎ＝２０）及び対応する原発性（ｎ＝６）ヒト前立腺癌組織の免疫組織化学試験は、全試験片が原発性及び転移性病変において各々全腫瘍細胞の０．０５％〜０．３％及び０．４％〜１．８％を占めるＣＫ陰性（ＣＫ１８及びＣＫ１９）腫瘍細胞の散在性部分集団を含有していることを明らかにした（図７ａ）。次に、ＣＫ発現と当該のマーカーとの関連を評価するために、免疫蛍光に基づく二重染色を実施した。この分析では、ＣＫ発現がＨＬＡクラスＩ発現と有意に関連することが一貫して観察された（ｐ＜０．０００１）。より詳細には、ＣＫ陰性腫瘍集団は細胞の９７．８±０．７％においてＨＬＡクラスＩ抗原を発現しないが、他方ＣＫ陽性細胞の全部（１００％）は陽性ＨＬＡクラスＩ抗原表現型を提示することが観察された（図４ｂ）。ＨＬＡクラスＩ陽性表現型を提示する小集団のＣＫ陰性細胞が同定されたが、これはＨＬＡクラスＩ陰性／ＣＫ陰性表現型から分化表現型へ移行する腫瘍細胞を提示することができた。さらに、ＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性腫瘍細胞では、分化ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞と比較して発生転写因子の活性化の核発現（活性化）の有意な（ｐ＜０．０００１）増加が一貫性で見いだされた。ＣＫ陰性／ＨＬＡ陰性細胞は細胞の６３．９±２２．６％において脱リン酸化β−カテニン、７２．８±１５．１％において開裂Ｎｏｔｃｈ２、６７．５±１７．３％においてＧｌｉ１、６７±１７．３％においてＧｌｉ２の核発現を提示したが、他方ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞は細胞の５．８±１１．９％における核脱リン酸化β−カテニン、６．７±７．９％において開裂Ｎｏｔｃｈ２、１．２±７．９％においてＧｌｉ１、及び１．５±１０．６％においてＧｌｉ２を発現した（図７ｃ）。さらに、ＣＫ陰性／ＨＬＡクラスＩ陰性腫瘍細胞は核ＡＲの発現を提示しないが、他方ＣＫ陽性／ＨＬＡ陽性細胞は細胞の７１．８±１４．３％において核ＡＲを提示することも観察された（図７ｄ）。そこで前立腺癌幹細胞が陽性ＡＲ表現型を提示しないという事実はこれらの細胞が機能的ＡＲシグナリングに依存しない可能性があることを示唆しており、これは将来の試験において追跡すべき問題である、どのようにこれらの細胞がホルモン療法後に観察された再発の原因となり得るか説明するであろう。これらをまとめると、これらの結果は、ヒト前立腺癌組織サンプル中の前立腺癌幹細胞の部分集団の存在及びそれを同定する能力を確証している。
【０１６６】
統計的分析
実験データは、平均値±ＳＤとして表示した。統計的分析は、スチューデントのｔ検定によって実施した。数値は、ｐ≦０．０５で統計的有意と見なした。
【０１６７】
（実施例６）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ高スループットアッセイ
上記に開示したＣＳＣの機能的化学耐性及び表現型特性に基づいて、このＣＳＣ集団を標的とする化合物をスクリーニングするため、及びＣＳＣが選択的に殺滅もしくは分化されるかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ高スループットアッセイを設計した。このアッセイの実行により、極めて広範囲の候補物質の試験及び推定ＣＳＣ阻害作用を備える物質の同定を可能にする。
【０１６８】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ高スループットアッセイは、上述したＣＳＣを９６ウエルプレート内に播種する工程から構成される。次に細胞を候補物質、例えば当該薬物に曝露させ、所望の時点（例、２４時間後、７２時間後）に読み出す。読み出しは、フローサイトメトリー分析によって処理対未処理集団におけるＣＳＣ表現型（例えば、ＨＬＡ、ＣＤ２４などが欠如する）を発現する細胞の割合を比較することから成る。これに並行して、生存（「生残」）細胞の割合を処理及び未処理細胞間で比較する細胞生存性アッセイも実施する。結果は次のように解釈する。候補物質、例えばＣＳＣ集団を標的とする薬物はＣＳＣが欠如する化学耐性細胞の増殖を阻害又は殺滅しなければならない。このアッセイについては４つの可能性のある結果が得られる場合がある。転帰１、細胞生存率の低下を伴うＣＳＣの割合の減少、転帰２、細胞生存率の低下を伴わないＣＳＣの減少、転帰３、細胞生存率の低下を伴うＣＳＣ集団の増加、及び転帰４、ＣＳＣの割合においても細胞生存率においても減少が生じない。転帰１は、ＣＳＣ集団が候補物質、例えば薬物の標的となると解釈することができる。転帰２は、ＣＳＣ集団が分化していると解釈することができる。転帰３は、新生物細胞が候補物質、例えば薬物の標的となるが、ＣＳＣ集団は標的でないと解釈することができる。転帰４は、候補物質、例えば薬物によってＣＳＣもしくは新生物分化細胞のいずれにおいても何の作用も生成されないと解釈することができる。
【０１６９】
ＣＳＣ欠失（転帰１）又はＣＳＣ分化（転帰２）を生成する候補物質、例えば薬物は、標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによるさらなる実験及び特性解析のために考慮される。要するに、早期スクリーニング結果を確証及び妥当性確認することを目的とするこれらのアッセイには、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−アポトーシス法（例、アネキシンＶ）、コロニー形成、及びそれらの対応する表現型に基づく分化試験（例、フローサイトメトリー及び免疫組織化学分析）、及びｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏ  −  免疫無防備状態のマウスにおける希釈腫瘍開始アッセイが含まれる。
【０１７０】
この高スループットスクリーンは、上記で開示したＮｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ阻害因子を使用して妥当性確認する。
【０１７１】
本出願で言及した全ての文献は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０１７２】
本発明の例示的実施形態を本明細書に記載してきたが、本発明は記載したことに限定されない、及び本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者によって様々な他の改変もしくは修飾を加えることができると理解すべきである。
【０１７３】
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【図１ａ】
0006002748.tif 000014
【図１ｂ】
0006002748.tif 000015
【図１ｃ】
0006002748.tif 000016
【図１ｄ】
0006002748.tif 000017
【図２ａ−１】
0006002748.tif 000018
【図２ａ−２】
0006002748.tif 000019
【図２ｂ】
0006002748.tif 000020
【図２ｃ】
0006002748.tif 000021
【図２ｄ−１】
0006002748.tif 000022
【図２ｄ−２】
0006002748.tif 000023
【図２ｅ】
0006002748.tif 000024
【図２ｆ】
0006002748.tif 000025
【図３ａ】
0006002748.tif 000026
【図３ｂ】
0006002748.tif 000027
【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
0006002748.tif 000030
【図４ｃ】
0006002748.tif 000031
【図５ａ】
0006002748.tif 000032
【図５ｂ−１】
0006002748.tif 000033
【図５ｂ−２】
0006002748.tif 000034
【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
0006002748.tif 000037
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９ａ】
0006002748.tif 000046
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
0006002748.tif 000048
【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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