(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエリン関連ニューロパシーの検出方法に用いられるイメージング剤であって、当該イメージング剤が、次の式Ｉの化合物、次の式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、次の式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は次の式Ｉの放射性同位体誘導体を含んでおり、前記検出方法が、
ミエリン関連ニューロパシーのリスクがある被験体又はミエリン関連ニューロパシーに罹患していると診断された被験体を同定する段階、
イメージング剤を被験体に投与する段階、
被験体内に存在するイメージング剤を検出することで被験体内のミエリン化を測定する段階、及び
被験体内のミエリン化を対照試料と比較する段階であって、被験体内のイメージング剤レベルの方が低いことがミエリン関連ニューロパシーを表す段階
を含んでいる、イメージング剤。
【化１】
0005897461.tif 000016
（式中、Ｒ1はアルキル基であり、
Ｒ2が電子供与基でありかつＲ3が電子求引基であるか、或いは
Ｒ2が電子求引基でありかつＲ3が電子供与基である。）
【請求項２】
当該イメージング剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で測定して、１００ｎｍ以上のストークスシフトを示す、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
Ｒ1が炭素原子数１〜６の低級アルキル基であり、電子供与基が第一アミノ、第二アミン、第三アミン又はアルコキシであり、電子求引基がニトリル基又はエステルである、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
Ｒ1がアルキル基であり、Ｒ2が電子供与基であり、Ｒ3が−ＳＯ2Ｒ4（式中、Ｒ4はアルキル、置換アルキル、アミン又は置換アミンである。）である、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項５】
投与が、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、鞘内注射、大脳内注射、脳室内注射、脊髄内注射又はこれらの組合せからなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項６】
検出が、γ線イメージング、ＭＲＩ、ＭＲＳ、ＣＥＳＴ、ＰＡＲＡＣＥＳＴ又はこれらの組合せによって実施される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項７】
さらに、被験体内のイメージング剤の量を定量化する段階を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項８】
ミエリン関連疾患が、多発性硬化症、ギヤン−バレー症候群、白質萎縮症、異染性白質萎縮症、レフスム病、腺白質萎縮症、クラッベ病、フェニルケトン尿症、カナバン病、ペリツェウス−メルツバッハー病、アレグザンダー病、糖尿病性ニューロパシー、化学療法誘発ニューロパシー又はこれらの組合せからなる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項９】
手術領域におけるミエリン塩基性タンパク質のイメージング方法に用いられるイメージング剤であって、当該イメージング剤が、次の式Ｉの化合物、次の式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、次の式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は次の式Ｉの放射性同位体誘導体を含んでおり、前記イメージング方法が、
手術部位をイメージング剤に接触させる段階、及び
イメージング剤を検出する段階
を含んでいる、イメージング剤。
【化２】
0005897461.tif 000017
（式中、Ｒ1はアルキル基であり、
Ｒ2が電子供与基でありかつＲ3が電子求引基であるか、或いは
Ｒ2が電子求引基でありかつＲ3が電子供与基である。）
【請求項１０】
当該イメージング剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で測定して、１００ｎｍ以上のストークスシフトを示す、請求項９記載のイメージング剤。
【請求項１１】
Ｒ1が炭素原子数１〜６の低級アルキル基であり、電子供与基が第一アミノ、第二アミン、第三アミン又はアルコキシであり、電子求引基がニトリル基又はエステルである、請求項９又は請求項１０記載のイメージング剤。
【請求項１２】
Ｒ1がアルキル基であり、Ｒ2が電子供与基であり、Ｒ3が−ＳＯ2Ｒ4（式中、Ｒ4はアルキル、置換アルキル、アミン又は置換アミンである。）である、請求項９又は請求項１０記載のイメージング剤。
【請求項１３】
検出段階が、
式Ｉの化合物の分光励起特性に合わせた光源を手術領域に照射すること、及び
式Ｉの化合物の分光発光特性に合わせた光学フィルターを通して手術領域を観察すること
を含む、請求項９乃至請求項１２のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項１４】
検出段階が手術部位のγ線イメージングを含む、請求項１３記載のイメージング剤。
【請求項１５】
被験体におけるミエリン関連ニューロパシーを検出するためのキットであって、
キットは薬学的キャリヤー及びミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤を含んでなり、
薬剤は次の式Ｉの化合物、次の式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、次の式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は次の式Ｉの放射性同位体誘導体を含む、キット。
【化３】
0005897461.tif 000018
（式中、Ｒ1はアルキル基であり、
Ｒ2が電子供与基でありかつＲ3が電子求引基であるか、或いは
Ｒ2が電子求引基でありかつＲ3が電子供与基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミエリン塩基性タンパク質のイメージングに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経系中における情報の流れは、ニューロンに沿ったイオン勾配の永続化を要求する。多くのニューロンでは、軸索に沿ったかかる勾配の効果的で効率的な永続化のために電気的絶縁が必要である。軸索を覆う脂質に富む誘電性物質であるミエリンは、このような絶縁機能を果たす。神経系は高いレベルのミエリンを含んでいて、特に多くのミエリン化軸索が束になっている場所に濃縮されている。かかる場所としては、例えば、脊髄路及び脊髄神経根、末梢神経系中の神経、並びに「灰白質」に対して総称的に「白質」といわれる脳内の線維路がある。非神経系組織にはミエリンが存在しないので、ミエリンの存在は神経組織を他のタイプの組織から識別することができる。即ち、脊髄及び脊髄神経根を脊柱の非神経要素から識別でき、また脳中の白質を灰白質から識別できる。
【０００３】
インビボ又はインビトロでミエリンを定性的又は定量的に可視化できることは、研究者達及び臨床医達に重要な診断及び治療ツールを与える。例えば、手術中に末梢神経を目視で同定できれば、外科医が神経の切断又は損傷を避けることが容易になる。神経の画像誘導手術における従前の努力は、造影剤又は逆行性輸送による軸索の蛍光標識を必要としないモダリティーを利用していた。第１のアプローチの問題点は、信号が通例あいまいなことである。
【０００４】
動物モデルにおける神経の逆行性標識は、文献中に広く報告されている。この方法は有効であり得るが、多くの固有の問題が存在している。標識は、造影剤をどこに注射するかに完全に依存する。神経が造影剤を取り込むことができなければ、神経は可視化されないであろう。場合によっては、逆行性輸送を容易にするために神経刺激が必要となる。逆行性輸送のために必要な長い時間は、臨床的には適さないかもしれない。
【０００５】
ミエリン化神経及び線維路は、前臨床的及び基礎的な神経科学研究者達によって実施される解剖学的研究において有用なランドマークとして役立つ。さらに、ミエリン鞘の形成は新しいニューロンの生成及び機能安定性における重要な段階であるので、ミエリンマーカーの利用可能性はかかる過程の研究に当たって研究者達を支援し得る。ミエリン標識方法はまた、数多くの治療法の開発、神経幹細胞の研究、及びミエリン関連ニューロパシーの推定動物モデルにおいても有用である。脊髄のインビボミエリンイメージングは、神経圧迫又は椎間板ヘルニアのような脊髄疾患並びに中枢又は末梢神経系中にミエリン損傷をもたらす多発性硬化症のようなミエリン関連ニューロパシーの診断及び治療に際して臨床医達を支援する。かかる病態を有する患者におけるミエリン化の量をインビボで測定できれば、ミエリン関連ニューロパシーの診断及び予後診断に際して臨床医達及び研究者達を支援することになろう。
【０００６】
脊髄神経根は脊柱管を横切るので損傷を受けることがあるが、特に脊髄神経根が結合して脊髄神経を形成する椎間孔内において傷つきやすい。頸部神経根障害、坐骨神経痛、椎間板ヘルニア及び神経根圧迫のような症候群は、主として腫瘍又は他の病変に由来する圧迫によって引き起こされるが、これらは通常背痛又は頸痛を伴って現れる。背痛又は頸痛は各種の筋骨格的機序によって引き起こされることがあり、医師は神経系を検査して神経根又は脊髄の圧迫が存在するか否かを判定することが可能でなければならない。慢性の頸痛又は背痛の原因をイメージングによって同定できれば、外科医はこれらの症候群を効果的に治療することが可能であろう。
【０００７】
高ミエリン含有量組織の同定のために市販のＦｌｕｏｒｏＭｙｅｌｉｎ色素を使用することを始めとするミエリン標識方法が存在している。しかし、１，４−ビス（ｐ−アミノスチリル）−２−メトキシベンゼン（ＢＭＢ）及び（Ｅ，Ｅ）−１，４−ビス（４’−アミノスチリル）−２−ジメトキシ−ベンゼン（ＢＤＢ）のような若干の色素を除き、公表された色素の大部分は血液神経関門又は血液脳関門を通過することができない。
【０００８】
ミエリンは、中枢神経系（ＣＮＳ）における乏突起膠細胞及び末梢神経系（ＰＮＳ）におけるシュワン細胞によって生成されるタンパク質及び脂質に富む基質である。ＣＮＳ及びＰＮＳにおける２つの異なる細胞タイプ（即ち、それぞれ乏突起膠細胞及びシュワン細胞）がミエリンを生成するので、タンパク質及び脂質組成にはミエリンの出所に応じて類似点及び相違点が存在している。いずれの場合にも、ミエリンは約８０％の脂質画分及び約２０％のタンパク質画分から構成されている。多くの研究により、両画分の分子成分が調査されている。
【０００９】
ミエリン中の脂質画分は、コレステロール、コレステロールエステル、セレブロシド、スルファチド、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、トリアシルグリセロール及びジアシルグリセロールを含んでいる。タンパク質画分は複数のタンパク質から構成され、ＰＮＳ及びＣＮＳ細胞の両方によって生成されるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、コネキシン３２及びミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ＰＮＳのみによって生成されるミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、並びにＣＮＳ細胞のみによって生成されるプロテオリピドタンパク質を含んでいる。
【００１０】
ＭＢＰは５〜１５％を占めるミエリンの主タンパク質成分であって、これは約５ｍＭのＭＢＰ濃度に相当する。円偏光二色性、ＮＭＲ及びＥＰＲ分光法、原子間力顕微鏡検査などの技法は、ＭＢＰがβシート構造のコア要素を含むコンパクトなＣ形の形態を有し得るが、これは脂質と結合した場合のみであることを示唆している。ミエリン塩基性タンパク質と脂質との相互作用はコンホメーションの可変性を引き起こすことができ、機能にとって重要であり得る。
【００１１】
ＭＢＰと選択的に結合する薬剤は、ミエリン染色の向上をもたらし、それによって神経の可視化を助けることができる。神経の可視化は、未結合色素及び非特異的結合色素の最適排除並びに光学的性質の改善によってミエリンと周囲組織との間のコントラストの増強を可能にすることでさらに向上させることができる。７００〜９００ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）域における光学的性質は、インビボでのミエリンの可視化のために理想的である。ＮＩＲ域では、水、ヘモグロビン及び脂質の吸収は最小であり、分散は減少して光子の透過が向上する。また、自己蛍光は低く、ＮＩＲ光は組織中に深く浸透すると共に、分散による影響が少ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
国際公開第２００９／０２９９３６号パンフレット
【発明の概要】
【００１３】
本明細書中には、ミエリン関連ニューロパシーの検出方法であって、ミエリン関連ニューロパシーのリスクがある被験体又はミエリン関連ニューロパシーに罹患していると診断された被験体を同定する段階、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤を被験体に投与する段階、及び被験体内に存在する薬剤を検出することで被験体内のミエリン化を測定する段階を含んでなる方法が提供される。
【００１４】
一実施形態では、薬剤は次の式Ｉの化合物、次の式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、次の式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は次の式Ｉの放射性同位体誘導体を含んでいる。
【００１５】
【化１】
0005897461.tif 000002
式中、Ｒ1はアルキル基であり、Ｒ2が電子供与基でありかつＲ3が電子求引基であるか、或いはＲ2が電子求引基でありかつＲ3が電子供与基である。
【００１６】
一実施形態では、薬剤は式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は式Ｉの放射性同位体誘導体を含んでいて、式中のＲ1はアルキル基であり、Ｒ2は電子供与基であり、Ｒ3は−ＳＯ2Ｒ4（式中、Ｒ4はアルキル、置換アルキル、アミン又は置換アミンである。）である。
【００１７】
別の実施形態では、被験体におけるミエリン関連ニューロパシーを検出するためのキットであって、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤及び薬学的に許容されるキャリヤーを含んでなるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。
【図１】図１は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体（図１Ａ）及びＢＭＢ（図１Ｂ）で染色したラットの三叉神経組織切片の蛍光顕微鏡検査から得られた結果を示している。倍率は１０００×である。
【図２】図２は、式Ｉａ、式Ｉｂ、式ＩＩ及び式ＩＩＩの薬剤によるラットの坐骨神経切片（上部パネル）及び三叉神経切片（下部パネル）のエクスビボ染色から得られた結果を示している。
【図３】図３は、式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）で処理されたマウスの三叉神経及び視神経の蛍光インビボイメージングから得られた結果を示している。
【図４】図４は、マウスの三叉神経上におけるＭＢＰ信号の位置と発蛍光団ＢＭＢ及び式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）の位置との間の相関関係を示している。ＢＭＢ又は式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）を生きているマウスに投与し、クリアランス及び生体分布のために十分な時間後に神経を切除し、切片化し、次いでＭＢＰ抗体で染色した。
【図５】図５は、精製された天然様ＭＢＰの存在下及び不存在下でのＢＭＢ及び式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）に関するＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５アッセイを示している。
【図６】図６は、精製された天然ＭＢＰ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は天然ＭＢＰの脂質画分の存在下での式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）に関するＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５アッセイから得られたデータを示している。
【図７】図７は、式Ｉａの化合物によるラットの大腿神経切片（上部パネル）、坐骨神経切片（中央パネル）及び三叉神経切片（下部パネル）のエクスビボ染色から得られた結果を示している。
【図８】図８は、式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3）で処理されたマウスの腕神経叢中の神経の蛍光インビボイメージングから得られた結果を示している。
【図９】図９は、精製された天然様ＭＢＰ又は変性ＭＢＰの存在下及び不存在下での式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝−ＣＨ3）及び式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＦ3）に関するＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５アッセイを示している。式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3）は４００ｎｍで励起し、蛍光発光強度を６１０ｎｍで読み取った。式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＦ3）は４３０ｎｍで励起し、蛍光発光強度を６３０ｎｍで読み取った。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本願の発明及び該発明の用途を限定する意図はない。さらに、先行する発明の背景又は図面の説明中に示されるいかなる理論によっても限定する意図は存在しない。
【００２０】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。
【００２１】
「ミエリン関連ニューロパシー」とは、一般的には、神経細胞の一部を覆う絶縁体が症候群、疾患又は他の病態の一構成要素として損傷を受け又は機能不全に陥っている任意の状態をいう。ミエリン関連ニューロパシーには、特に限定されないが、多発性硬化症、ギヤン−バレー症候群、白質萎縮症、異染性白質萎縮症、レフスム病、腺白質萎縮症、クラッベ病、フェニルケトン尿症、カナバン病、ペリツェウス−メルツバッハー病、アレグザンダー病、糖尿病性ニューロパシー、化学療法誘発ニューロパシー及びこれらの組合せがある。
【００２２】
「薬剤」とは、化合物が所望の濃度及び効力で投与されるようにして化合物を被験体内に導入するための溶液又はキャリヤーをいう。薬剤は、特に限定されないが、溶媒、安定化助剤、緩衝剤及びフィラーを含み得る。
【００２３】
薬剤がミエリンを含まない組織より高い頻度で、より迅速に、より長い持続時間で、又はより高い親和性をもってミエリンと結合すれば、薬剤はミエリンに対して「特異的結合」を示す。「非特異的結合」とは、非ミエリン含有組織に対する薬剤の結合をいう。特異的結合又は非特異的結合のような相対結合値に関しては、各試料は同様な物理的条件（即ち、温度、ｐＨ、処方及び投与モード）下で測定すべきである。一般に、特異的結合は、標的に対する薬剤の相対的に高い親和性及び相対的に低度乃至中等度の受容能力によって特徴づけられる。通例、親和性定数Ｋaが１０6Ｍ-1以上である場合に結合は特異的と見なされる。親和性定数が高くなるほど親和性が高いことを表し、したがって通例は特異性が高いことを表す。例えば、抗体は通例１０6Ｍ-1〜１０9Ｍ-1以上の範囲内の親和性定数で抗原と結合する。「非特異的結合」は、通常、中等度乃至高度の受容能力と共に低い親和性を有する。非特異的結合は、通常は親和性定数が１０6Ｍ-1未満である場合に起こる。薬剤を組織に接触させるために使用する時間及び方法を制御することで、非特異的結合は低減される。
【００２４】
「洗浄」とは、一般的には、特に限定されないが、ミエリンとの特異的結合を排除することなしに組織又は組織試料の非ミエリン化構成要素から非結合又は非特異的結合標識化合物を解離、分散又は除去するための媒質を提供するため、非標識溶液又は他の物質（例えば、特に限定されないが、水、食塩水、緩衝食塩水又はエタノール）中への浸漬或いはそれの反復適用によるフラッシングを行うような任意の方法をいう。
【００２５】
「基線蛍光」とは、何らかの蛍光発生化合物の投与又は結合及び外部電磁放射源への暴露後に放出される放射とは異なり、かかる蛍光発生化合物の投与又は結合の不存在下で外部電磁放射源に暴露した際に組織又は組織試料から放出される電磁放射の周波数及び強度（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）をいう。
【００２６】
「組織切片を代表する対照試料」とは、分析すべき組織試料と同様なサイズ、形態又は構造の組織試料であって、他の試料のミエリンレベルを比較するための基準として役立つミエリンレベルを有する組織試料をいう。
【００２７】
「非経口投与」とは、被験体内に物質又は化合物を導入するための任意の手段であって、経口摂取又は胃腸管への直接導入を伴わないものをいう。非経口投与には、特に限定されないが、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、静脈内注射、鞘内注射、大脳内注射、脳室内注射又は脊髄内注射或いはこれらの任意の組合せがある。
【００２８】
「薬学的キャリヤー」とは、適用部位、周囲組織又は作製された組織切片への薬剤物質の適用を可能にする組成物であって、標的への特異的結合のために有効な滞留時間を薬剤に付与し、或いは簡便な遊離方法を提供する組成物をいう。可溶化方法は、特に限定されないが、ｐＨ調整、塩形成、イオン化可能な化合物の生成、共溶媒の使用、錯体形成、界面活性剤、ミセル、エマルジョン及びマイクロエマルジョンを含み得る。これらの例には、特に限定されないが、ＨＣｌ、クエン酸、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、エタノール、ＰＥＧ３００、シクロデキストラン、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンがある。
【００２９】
「脱ミエリン化モデル」とは、神経細胞の一部を覆う絶縁体の実験的に誘発された任意の損傷又は機能不全であって、特に限定されないが、実験的アレルギー性脳脊髄炎を始めとするニューロパシー性脱ミエリン化の実験的研究において利用できるものをいう。
【００３０】
「再ミエリン化」とは、ニューロンの軸索を覆う絶縁体の自発的な、治療的な、又は実験的に誘発される修復、再生或いはその他の方法による構造又は機能性の強化をいう。
【００３１】
「アルキル」とは、線状、枝分れ又は環状炭化水素構造体及びこれらの組合せを含むものであり、低級アルキル及び高級アルキルを包含する。アルキル基はＣ２０以下のものである。「低級アルキル」とは、炭素原子数１〜６、好ましくは炭素原子数１〜４のアルキル基をいい、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル並びにｎ−、ｓ−及びｔ−ブチルを含む。高級アルキルとは、炭素原子数７以上、好ましくは炭素原子数７〜２０のアルキル基をいい、ｎ−、ｓ−及びｔ−ヘプチル、オクチル並びにドデシルを含む。シクロアルキルはアルキルの部分集合であり、炭素原子数３〜８の環状炭化水素基を包含する。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びノルボルニルがある。アルケニル及びアルキニルとは、２以上の水素原子がそれぞれ二重結合又は三重結合によって置き換えられたアルキル基をいう。
【００３２】
「置換される」とは、特に限定されないが、アルキル、アルキルアリール、アリール、アリールアルキル及びヘテロアリールを含む残基において、残基の３以下のＨ原子が低級アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロアルキル、アルコキシ、カルボニル、カルボキシ、カルボキシアルコキシ、カルボキサミド、アシルオキシ、アミジノ、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、ＯＣＨ(ＣＯＯＨ)2、シアノ、第一アミノ、第二アミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン、フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリール又はヘテロアリールオキシで置き換えられていることをいう。
【００３３】
「電子供与基」とは、共役π系に電子密度を追加してそれの求核性を高める化化学基をいう。電子供与基は、π系に隣接した原子上の孤立電子対によって認識できる。電子供与基の例には、特に限定されないが、−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＨＲ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＯＣＯＲ、−Ｒ、−Ｃ6Ｈ5及び−ＣＨ＝ＣＲ2がある。
【００３４】
「電子求引基」とは、共役π系から電子密度を除去して該構造の求核性を低下させる化化学基をいう。電子求引基は、π系に隣接した原子がより電気陰性の原子に対する複数の結合を有するか、或いは形式的な陽電荷を有することによって認識できる。電子求引基の例には、特に限定されないが、−ＣＯＨ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ2、−ＣＯＯＮＨＲ、−ＣＯＯＮＲ2、−ＣＯＣｌ、−ＣＦ3、−ＣＮ、−Ｃ＝Ｃ(ＣＮ)2、−ＳＯ3Ｈ、−ＮＨ3+、−ＮＲ3+、−ＮＯ2、−ＳＯ2Ｒ、−ＳＯ2ＮＨ2、−ＳＯ2ＮＨＲ及び−ＳＯ2ＮＲ2がある。
【００３５】
薬剤が非ミエリン化組織より高い頻度で、より迅速に、より長い持続時間で、又はより高い親和性をもってミエリン化組織と結合するか、或いはミエリン化組織中により多く吸収され又はより多く蓄積されれば、薬剤はミエリン化組織に対して「特異的結合」を示す。一般に、特異的な取込みは標的に対する薬剤の相対的に高い親和性によって特徴づけられる。
【００３６】
特記しない限り、明細書及び特許請求の範囲中で使用される、成分の量、性質（例えば分子量）、反応条件などを表すすべての数は、あらゆる場合に「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。したがって、そうではないと表記されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲中に示される数値パラメーターは、本発明によって得ることが求められる所望の性質に応じて変動し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲の技術的範囲への等価物の原則の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも報告された有効数字の桁数を考慮しつつ通常の丸め技法を適用して解釈すべきである。
【００３７】
本明細書中に記載される化合物の多くは、１以上の非対称中心を含むことがあり、したがって鏡像異性体、ジアステレオマー及び他の立体異性体を生じることがある。これらは絶対立体配置の観点から(Ｒ)−又は(Ｓ)−として定義できる。薬剤の化学構造は、例えば、特に限定されないが、すべてのかかる可能な異性体並びにこれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を包含する。光学的に活性の(Ｒ)−及び(Ｓ)−異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を用いて製造でき、或いは通常の技法を用いて分割できる。本明細書中に記載される化合物がオレフィン性二重結合又は他の幾何学的非対称中心を含む場合には、特記しない限り、かかる化合物はＥ及びＺ幾何異性体の両方を包含するものと想定されている。同様に、すべての互変異性体も包含される。
【００３８】
特定の実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質に対する薬剤の特異的結合を利用してインビトロ又はインビボ試料中のミエリン塩基性タンパク質を定性的又は定量的に測定する方法が提供される。ミエリン塩基性タンパク質への特異的結合は、次の式Ｉの化合物、次の式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、次の式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は次の式Ｉの放射性同位体誘導体を含む薬剤によって達成できる。
【００３９】
【化２】
0005897461.tif 000003
式中、Ｒ1はアルキル基であり、Ｒ2が電子供与基でありかつＲ3が電子求引基であるか、或いはＲ2が電子求引基でありかつＲ3が電子供与基である。
【００４０】
特定の実施形態では、Ｒ1は炭素原子数１〜６、好ましくは炭素原子数１〜４の低級アルキル基であってよく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル並びにｎ−、ｓ−及びｔ−ブチルを含む。電子供与基は、第一、第二又は第三アミン（−ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ’Ｒ”）或いはアルコキシ基（−ＯＲ）を含み得る。電子求引基は、ニトリル基（−ＣＮ）、エステル（−ＣＯＯＲ）又はスルホン（−ＳＯ2Ｒ）を含み得る。
【００４１】
各実施形態において、Ｒ2及びＲ3はベンゼン環のπ二重結合軌道及びオレフィン性置換基を介して共役しており、それによって電子が電子供与基から電子求引基に流れるための明確な経路を提供する。電子供与基は、他方の位置に電子求引基があることを条件にして、Ｒ2又はＲ3の位置にあり得る。
【００４２】
特定の実施形態では、Ｒ1はアルキル基であり、Ｒ2は電子供与基であり、Ｒ3は−ＳＯ2Ｒ4基（式中、Ｒ4はアルキル、置換アルキル、アミン又は置換アミン基である。）である。特定の実施形態では、Ｒ1は炭素原子数１〜６、好ましくは炭素原子数１〜４の低級アルキル基であってよく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル並びにｎ−、ｓ−及びｔ−ブチルを含む。電子供与基は、第一、第二又は第三アミン或いはアルコキシ基を含み得る。Ｒ4は炭素原子数１〜６、好ましくは炭素原子数１〜４の低級アルキル基であってよく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル並びにｎ−、ｓ−及びｔ−ブチルを含む。
【００４３】
他の実施形態では、Ｒ4は得られるスルホンの水溶性を向上させかつそのｌｏｇＰを低下させるために使用できる。Ｒ4は、特に限定されないが、アルコキシ又はアルコールのような置換アルキル基であり得る。特定の実施形態では、アルコキシ基はエチレングリコール単位又はエチルグリコール末端停止アルコールを含み得る。例えば、Ｒ4は(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＸ又はＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2(ＯＣＨ2ＣＨ2)nＯＸ（式中、ｎは１〜６の整数であり、Ｘは水素、メチル又はエチルである。）であり得る。プロピル基の導入もまた、β排出の可能性を排除できる。
【００４４】
特定の他の実施形態では、Ｒ4はスルホンアミドを形成するための第一、第二又は第三アミンであり得る。アミン基には、特に限定されないが、ＮＨ2、ＮＨＲ5及びＮＲ5Ｒ6（式中、Ｒ5及びＲ6はアルキル又は置換アルキル基である。）がある。Ｒ5及びＲ6は同等のものであってもなくてもよく、また環構造を形成してもよい。例えば、Ｒ5及びＲ6は(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＸ、ＣＨ(ＣＨ2ＯＸ)2又はＣ(ＣＨ2ＯＸ)3（式中、ｎは１〜６の整数であり、Ｘは水素、メチル又はエチルである。）であり得る。他の例では、Ｒ5及びＲ6は置換ピペリジン、ピペラジン又はモルホリンのような環構造を形成し得る。
【００４５】
各実施形態において、Ｒ2及び−ＳＯ2Ｒ4はベンゼン環のπ二重結合軌道及びオレフィン性置換基を介して共役しており、それによって電子が電子供与基から電子求引基に流れるための明確な経路を提供する。
【００４６】
このような共役及びＲ2からＲ3への（並びにＲ2から−ＳＯ2Ｒ4への）「プッシュプル」式電子の流れは、ＢＭＢ及びＢＤＢに比べて蛍光発生時により長波長のストークスシフトが起こる原因となり得る。実用に際しては、これは式Ｉの薬剤を用いた場合にミエリンと周囲組織との間のコントラスト増強を可能にし得る。
【００４７】
若干の実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤は放射性同位体、13Ｃ濃縮化合物又は19Ｆ標識誘導体であり得る。若干の実施形態では、式Ｉの化合物の放射性同位体誘導体を製造し、放射性イメージングによってイメージングを行うことができる。別法として、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を製造することができる。
【００４８】
式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は式Ｉの放射性同位体誘導体を含む薬剤は、その放出信号（例えば、式Ｉの放射性同位体誘導体からの磁気共鳴信号又は放出放射、自己蛍光放出、或いは薬剤の光学的性質）によって検出できる。式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は式Ｉの放射性同位体誘導体を含む薬剤の検出方法としては、所期の用途及び医療職員又は研究職員に利用できるイメージング方法に応じ、蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査、交差偏光顕微鏡検査、核シンチグラフィー、陽電子放出断層撮影法（「ＰＥＴ」）、単光子放出コンピューター断層撮影法（「ＳＰＥＣＴ」）磁気共鳴イメージング（「ＭＲＩ」）、磁気共鳴分光法（「ＭＲＳ」）、コンピューター断層撮影法（「ＣＴ」）又はこれらの組合せが挙げられる。
【００４９】
例えば、Ｒ3が−ＳＯ2Ｒ4に等しい式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ4はＭＲＩイメージングのためのフルオロアルキル（例えば、−ＣＦ3、−ＣＨ2ＣＦ3又は−ＯＣ(ＣＦ3)3）であり得る。他の例では、Ｒ4は−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＱ又はＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)mＱ（式中、ｎは１〜５の整数であり、ｍは０〜４の整数であり、ＱはＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ(ＣＦ3)2又はＣ(ＣＦ3)3である。
【００５０】
同様に、Ｒ4がスルホンアミドを形成するための第二又は第三アミンであり得る場合、アミン基をフルオロアルキルで置換することができる。特定の実施形態では、Ｒ4はＮＨＲ5及びＮＲ5Ｒ6（式中、Ｒ5及びＲ6は同等のものであってもなくてもよく、−ＣＨ2ＣＦ3又は−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＱ（式中、ｎは１〜６の整数であり、ＱはＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ(ＣＦ3)2又はＣ(ＣＦ3)3に等しい。）であり得る。ＮＲ5Ｒ6はまた、フルオロアルキル又はフルオロアルコキシル置換ピペリジン、ピペラジン又はモルホリンのような環構造を形成し得る。
【００５１】
ＰＥＴイメージングを用いるイメージング方法のためには、そのＲ1、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4置換基を介して18Ｆ放射性同位体を式Ｉ中に組み込むことができる。特定の実施形態では、ＭＲＩイメージングで使用する19Ｆ標識誘導体に関して上記の例に記載したように、18Ｆ放射性同位体をＲ4置換基中に組み込むことができる。
【００５２】
記載されたイメージング方法は、ミエリン塩基性タンパク質の検出に関係する分析用途、診断用途又は予後診断用途に適用できる。かかる用途は、特に、手術中神経標識、脊髄イメージング、脳組織イメージング、ミエリン化レベルの非侵襲的インビボ測定、並びにミエリン化の機能やプロセス及びミエリンの機能不全や修復の調査を目的とする前臨床的及び基礎的な神経科学ベンチ研究において適用できる。
【００５３】
一実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤を手術前に外科被験体に対して非経口的に投与し、薬剤をミエリン塩基性タンパク質に結合させると共に、ミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から排除させることができる。別の実施形態では、手術中に手術領域への塗布、噴霧又は局所注射によって直接適用し、存在するミエリン塩基性タンパク質に結合させ、洗浄液で手術部位を洗浄して該部位から未結合組成物を排除させることができる。手術中は、薬剤の分光励起特性に合わせた光源を手術領域に照射すればよい。薬剤は、その分光発光特性に合わせた光学フィルターを通して観察できる。蛍光剤への特異的結合のため、神経及び他のミエリン含有組織はミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から識別できる。これにより、外科医は蛍光組織を避けることでミエリン化組織を誤って切断又は損傷することを回避でき、或いは所期のミエリン化組織に対して正確に治療を施すことが容易になる。特定の実施形態では、薬剤は式Ｉの化合物を含んでいる。
【００５４】
ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤は、神経又は他のミエリン含有組織を標的とする手術又は治療（例えば、薬学的又は外科的神経ブロック）に先立ち、被験体に対して非経口的に投与できる。特定の実施形態では、ミエリン化組織は脊柱管及び椎孔の一部であり得る。他の実施形態では、ミエリン化組織は脳の一部であり得る。特定の実施形態では、薬剤は式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物、式Ｉの19Ｆ標識誘導体又は式Ｉの放射性同位体誘導体を含んでいる。
【００５５】
一実施形態では、式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を含むもののような薬剤を手術前に外科被験体に対して非経口的に投与して、ミエリン塩基性タンパク質に結合させると共に、特異的なミエリン塩基性タンパク質結合を排除することなくミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から排除させることができる。
【００５６】
別の実施形態では、放射性同位体であってミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤を治療前に被験体に対して非経口的に投与して、結合させると共に、ミエリンを含まない組織から排除させることができる。次いで、核シンチグラフィー、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、ＭＲＳ又はこれらの任意の組合せのようなイメージング技法を用いてミエリン含有組織と非ミエリン含有組織との識別を助けることができ、またγ線カメラ、スキャナー又はプローブを使用することができる。かかる薬剤は、式Ｉの化合物の放射性同位体誘導体であり得る。
【００５７】
別の実施形態では、式Ｉの放射性同位体誘導体を含むもののような薬剤を、脊髄疾患（例えば、特に限定されないが、脊髄圧迫、脊髄神経根圧迫又は膨張椎間板）を有すると疑われ、又はそれを有すると判定され、又はそれに罹患している患者に対して非経口的に投与することができる。脊髄のミエリン塩基性タンパク質に結合させると共に、特異的なミエリン塩基性タンパク質結合を排除することなくミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から排除させた後、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又はこれらの任意の組合せのような放射性同位体イメージングを用いてインビボで脊椎のイメージングを行うことができる。
【００５８】
診断画像を検査することで、臨床医は、脊髄又は関連する神経根が例えば脊柱又は異物によって侵害されているかどうか、そしてその場所はどこかを判定することができる。脊柱の構成要素の構造及び相対位置のような追加の情報を得るため、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャンと共にＣＴ又はＭＲＩのような追加のスキャンを行うこともできる。一実施形態では、この方法を外科的処置に適用することで、手術中に脊髄領域のイメージングを行うことができる。
【００５９】
別の実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤の放射性同位体誘導体のイメージングを行うことで、ミエリン化レベルがインビボで入手できる。ミエリン関連ニューロパシーに罹患していると診断されたか、又はそれを有すると疑われる被験体に対して薬剤を非経口的に投与する。ミエリン塩基性タンパク質に結合させると共に、特異的なミエリン塩基性タンパク質結合を排除することなくミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から排除させた後、放射性同位体のインビボイメージングに適した方法によって中枢又は末梢神経系の構成要素のイメージングを行えばよい。かかる方法にはＰＥＴ及びＳＰＥＣＴがある。イメージング結果を検査することで、臨床医は、薬剤の放射性同位体誘導体から放出されかつ適当なイメージング方法で検出されるシグナルのレベル及び解剖学的局在によって表されるミエリン化の量を決定できる。特定の実施形態では、薬剤は式Ｉの化合物の放射性同位体誘導体である。
【００６０】
患者におけるミエリン化が不十分であり得るかどうかを判定するため、ミエリン化レベルを、ミエリン関連ニューロパシーに罹患していないと考えられ又は知られている単数又は複数の被験体が示すミエリン化レベルと比較することができる。別の実施形態では、脱ミエリン化又は再ミエリン化の速度を測定することができる。脱ミエリン化を防止又は減速するか、或いはミエリン関連ニューロパシーに罹患している患者において再ミエリン化を促進すると考えられ又は予想される公知の又は提唱された治療剤で処置した後、治療剤で処置された患者において経時的にイメージングを行うことでミエリン化レベルを評価できる。イメージングは様々な時点で行い、ある時点でのミエリン化レベルを別の時点でのミエリン化レベルと比較することができる。
【００６１】
ミエリン関連ニューロパシーを示唆する陽性の結果は、対照試料におけるミエリン塩基性タンパク質の基線測定値に比べて、被験体のミエリン塩基性タンパク質の減少が統計的に有意であるようなものである。対照試料は、ミエリン関連ニューロパシーを伴わない類似の試料に由来するもの、又は経時的に測定された同じ被験体に由来するものであり得る。
【００６２】
さらに別の実施形態では、生検で採取された哺乳動物組織試料又はインビトロで培養された組織試料を、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤に接触させることができる。薬剤は、式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を含み得る。薬剤との接触を用いて、組織試料中におけるミエリン塩基性タンパク質の位置、存在又は量を決定できる。組織試料は、ミエリン関連ニューロパシーの立証又は意図されたモデルとして役立つように実験的に操作された被験体、或いはミエリン関連ニューロパシーの治療法として立証され又はかかる治療法である意図される１種以上の治療剤を投与された被験体から採取できる。かかる治療剤は、ミエリン化の機能及び過程並びにミエリンの機能不全及び修復を調べることを目的とする前臨床的評価又は基礎的神経科学研究に関連し得る。
【００６３】
生検又は培養組織の新鮮な凍結クリオスタット切片或いは固定若しくは包埋切片又は組織を、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤と接触させることができる。試料は、ミクロトーム、ビブラトーム又はクリオスタット調製のような各種の切片化技法を用いて調製できる。薬剤は、式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を含み得る。
【００６４】
ミエリン塩基性タンパク質に結合させた後、ミエリン塩基性タンパク質への特異的結合を排除することなく未結合ラベル及び非特異的結合ラベルを試料から除去するのに適した方法及び媒質で試料を洗浄することができる。
【００６５】
次いで、特に限定されないが、
蛍光顕微鏡検査、レーザー共焦点顕微鏡検査、交差偏光顕微鏡検査、オートラジオグラフィー、ＭＲＩ、ＭＲＳ又は他の適当可能な方法或いはこれらの任意の組合せを含む複数の検出、可視化又は定量化技法のいずれかを用いて、組織試料中のミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合した薬剤の存在又は量を評価し、そしてミエリン塩基性タンパク質の存在又は量を表すことができる。特定の実施形態では、薬剤は式Ｉの化合物、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を含み得る。薬剤による標識並びにその検出、可視化又は定量化はまた、ミエリン塩基性タンパク質以外の物質と特異的に結合する１種以上の他の化合物による標識並びにその検出、可視化又は定量化と共に実施することができる。
【実施例】
【００６６】
以下に示す非限定的な実施例により、本発明の様々な実施形態を記載する。
【００６７】
実施例１：神経組織切片の作製
坐骨神経、大腿神経、腕神経叢、三叉神経、視神経及び陰茎神経を含む各種の神経を雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット又は雄ＣＤ−１マウスから採取した。ホルマリンによる灌流及び／又は後固定によって組織を固定した。後固定に続いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製した２０％スクロース溶液を用いて組織を凍結保護した。次いで、ＯＣＴ媒体中でメタノール及びドライアイスを用いて神経をフラッシュ凍結した。場合によっては、ＰＶＤＦ膜を用いてＯＣＴ媒体中に神経を垂直に保った。Ｌｅｉｃａミクロトーム上で薄切片（５〜１０μｍ）をスライスし、−８０℃のフリーザー内に貯蔵し、次いで抗体又は小分子化合物で染色した。
【００６８】
実施例２：抗体による神経組織切片の組織学的評価
基礎的な神経形態を確認するため、若干の神経をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。神経の連続切片を、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）及び末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）並びにシュワン細胞タンパク質である２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）及びＳ１００を含む一連のミエリンタンパク質に関して染色した。抗体販売者、カタログ番号及び希釈度を表Ｉに示す。神経は、自動Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ免疫染色機（Ｒｏｃｈｅ社）上で染色した。非パラフィン包埋組織をセル・コンディショニング・ソリューションＣＣ１（Ｖｅｎｔａｎａ社）中で予備処理した。次いで、スライドを１０％血清（二次抗体のホストによって決定された種）中でブロックした。一次及び二次抗体を手作業で適用し、免疫染色機上で加熱（３７℃）し、途中ですすぎ洗いしながら１時間インキュベートした。次いで、スライドを免疫染色機から取り出し、Ｄａｗｎ皿洗い洗剤溶液ですすいでスライドから鉱油を除去した。次いで、スライドをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（商標）マウンティング媒質によりカバースリップで覆った。すべての二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入し、Ｃｙ３又はＣｙ５とコンジュゲートし、１：２００の希釈度で使用した。カバースリップで覆った後、各二次抗体にとって適したフィルターセットを使用しながら、２０×のＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ顕微鏡上でスライドのイメージングを行った。
【００６９】
【表１】
0005897461.tif 000004
実施例３：小分子発蛍光団の光学的性質の測定
発蛍光団薬剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍＭの原液を作製した。アリコートを取り、メタノール、水又はＤＭＳＯ中で１０ｎＭ〜１μＭの発蛍光団溶液を調製した。３種の溶媒からの光学的測定値を求めた。吸光度スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２０  ＵＶ／ＶＩＳ分光計を用いて測定した。発光スペクトルは、ＰＴＩ定常状態蛍光計を用いて生成した。
【００７０】
実施例４：発蛍光団による神経のエクスビボ染色
発蛍光団をＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭの原液を作製した。神経組織切片を含むスライドをＰＢＳで３回すすいだ。組織切片を、ＰＢＳ又は９９μＬのＤＭＳＯ、１００μＬのクレマフォア（ｃｒｅｍａｐｈｏｒ）、６００μＬのラット血清及び２００μＬのＰＢＳで希釈した各発蛍光団の１０μＭ溶液と共に２０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてカバースリップで覆い、倍率２０×のＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ顕微鏡上でイメージングを行った。特注フィルターキューブ（励起フィルター：１１ｎｍ帯域幅の３８７ｎｍ、４０９ｎｍ二色ミラー；発光フィルター：４０９ｎｍングパス）を用いて、形態検査用及び画像解析用の画像を収集した。
【００７１】
発蛍光団及び各種のミエリン抗体による神経の共染色も実施した。これらのスライドは、多少の修正を加えた上記と同じプロトコルを用いて、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ上で染色した。発蛍光団を一次抗体溶液に直接添加することで、１０μＭの最終発蛍光団濃度及び表Ｉ記載の最終抗体希釈度を得た。２０×のＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ顕微鏡を用いてスライドのイメージングを行い、以下のようにして解析した。すべての場合に、生のタグド・イメージ・フォーマット（ｔａｇｇｅｄ  ｉｍａｇｅ  ｆｏｒｍａｔ）画像を使用した。発蛍光団チャンネルを表す各画像内に、神経含有組織、隣接組織及び組織なしの領域を含む複数の円形の検査対象区域を描画した。すべての検査対象区域は同一サイズであり、画像の全領域が表示された。二次抗体チャンネルにも、同一の共局在化した検査対象区域を描画した。各検査対象区域からの平均チャンネルシグナル強度を相互にプロットした。二次抗体チャンネルをＸ軸上にプロットし、薬剤チャンネルをＹ軸上にプロットした。次いで、回帰係数を計算した。
【００７２】
実施例５：ラット脳からの天然ミエリン塩基性タンパク質の単離
発蛍光団結合度のさらなる評価のためにラット脳からの精製ミエリン塩基性タンパク質を使用した。Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）３．２５．１−３．２５．１９中のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓからの変法を用いて粗ミエリンを単離した。粗ミエリンからの天然ミエリン塩基性タンパク質の単離は、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  ５（９９４）６８９−６９２からのプロトコルに従って実施した。簡単に述べれば、雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから３つのラット脳を切除し、７２ｍｌの冷０．３０Ｍスクロース溶液中に入れ、さいの目に切り、ホモジナイズした。ホモジネートを等容の０．８３Ｍスクロース溶液上に重ね、４℃で７５０００ｇの超遠心に３０分間かけ、２種のスクロース溶液の界面から粗ミエリンを回収した。
【００７３】
回収したミエリン画分を（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４５、２ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、１ｍＭジチオトレイトール及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中でホモジナイズすることで、それに浸透圧ショックを加えた。追加のＴｒｉｓ−Ｃｌを添加して最終容量を２２８ｍｌにした。懸濁液を４℃で７５０００ｇの遠心に１５分間かけた。ペレットをさらに２回ホモジナイズし、そのたびに４℃で１２０００ｇの超遠心に１５分間かけた。ペレットを７２ｍｌの０．３Ｍスクロース溶液中に再懸濁した。再懸濁したペレット上に等容の０．８３Ｍスクロース溶液を重ね、試料全体を４℃で７５０００ｇの超遠心に３０分間かけた。精製ミエリンを界面から回収し、２２８ｍｌのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中に再懸濁した。上記にようにしてＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中での追加のホモジネーション及び遠心を行うことで過剰のスクロースを洗い流した。
【００７４】
ミエリンペレットを５容の（冷５００ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ８．５を含む）緩衝液１中に３０分間再懸濁し、次いでＪＡ２０上において１５０００ｒｐｍ２０分間遠心した。これを２回繰り返した。ペレットを２％ＣＨＡＰＳ溶液中に可溶化し、氷上で３０分間インキュベートし、次いでＢｅｃｋｍａｎ  ４２．１ローター上において４００００ｒｐｍで４５分間遠心した。ＣＨＡＰＳ抽出物を、１％ＣＨＡＰＳ溶液で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（１．６×５ｃｍ）上に装填した。脂質結合ＭＢＰを非吸着通過画分中に溶出させた。ＡｍｉｃｏｎフィルターＹＭ３を用いて通過画分を濃縮した。濃縮物を、（１％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  １，１０−フェナントロリン、１ｍＭ酢酸亜鉛を含む）緩衝液２で予め平衡化したスペクトラゲルＡｃＡ  ４４ゲル濾過カラム上に装填した。脂質結合ＭＢＰを濃縮し、５０％硫酸アンモニウムを用いて塩析し、凍結乾燥し、窒素下４℃で貯蔵した。試料は、標準の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロット法で試験した。ゲル電気泳動用の試薬及び標準品はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手した。商業的に入手できるマウスＭＢＰ（Ｓｉｇｍａ社）を対照として使用した。
【００７５】
実施例６：単離した天然ミエリン塩基性タンパク質への発蛍光団結合
Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ蛍光アッセイ：０．５ｎｍｏｌの発蛍光団を低蛍光９６ウェルプレート中にピペットで注入した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マルチモダリティープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、吸光度並びにピーク吸光度波長で励起した場合の発光特性を走査した。それぞれ０．５ｎｍｏｌ（１当量）及び２ｎｍｏｌ（４当量）のウシ血清アルブミン及び天然ＭＢＰを発蛍光団に添加し、発蛍光団の吸光度及び発光特性を再測定した。
【００７６】
Ｂｌｉｇｈｔ−Ｄｙｅｒ抽出：天然ＭＢＰの凍結乾燥試料を、２０ｍＭ  ＨｅｐｅｓでｐＨ７．４に緩衝された０．５％ＣＨＡＰＳ中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成した。このタンパク質の４００μＬ試料から、Ｂｌｉｇｈｔ−Ｄｙｅｒ抽出法を用いて脂質を抽出した。簡単に述べれば、各２００μＬのタンパク質試料に７５０μＬのクロロホルム：メタノール（１：２、ｖ：ｖ）を添加し、試料をよく渦動させた。次いで、２５０μＬのクロロホルムを添加し、試料を渦動させた。次に、２５０μＬの蒸留水を添加し、試料を再び渦動させ、次いで１０００ｇで５分間遠心した。下方画分（脂質画分）を回収し、窒素下で乾燥した後、実験のために適した緩衝液中に再構成した。脂質画分を上記のＳｐｅｃｔｒａｍａｘ蛍光アッセイで試験することで、ＭＢＰの脂質成分に対する薬剤の特異的結合を排除した。
【００７７】
実施例７：インビボイメージング
ＡＡＡＬＡＣ公認施設で飼育されたＣＤ−１マウス（２５〜４０ｇ）を秤量し、２．５％イソフロランでの導入及び維持によって麻酔した。動物を加温パッド上に仰向けに置いた。片手で皮膚をぴんと張りながら、３０ゲージ注射針を備えた３００μｌ注射器を用いて、配合物１（１００％ＤＭＳＯ、１００００ｇで２０分間遠心）又は配合物２（リン酸緩衝食塩水中の１０％ＤＭＳＯ、５％Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）、７５％マウス血清、１００００ｇで２０分間遠心）中の薬剤を５０μモル／ｋｇの量で腹腔内又は静脈内（配合物ＩＩのみ）に注射した。動物を麻酔から回復させ、４時間にわたり正常に活動させた。その時点で、２．５％イソフロランでの導入及び維持によって動物を麻酔した。上記にようにして、１００μｌのＦａｔａｌ  Ｐｌｕｓ（ペントバルビタール）を注射した。胸腔及び腹部を開いた。下大静脈を切断し、１２ｍｌのリン酸緩衝食塩水を心臓穿刺を通して約１ｍｌ／秒で注入し、次いでリン酸緩衝ホルマリンを注入した。主要神経を露出させ、発蛍光団にとって適するフィルターセットを備えたＺｅｉｓｓ  Ｌｕｍａｒ  Ｖ．１２外科顕微鏡を用いてイメージングを行った。
【００７８】
若干の場合には、インビボイメージング後に神経組織切片のエクスビボ組織学的評価を実施した。主要神経を切除し、ホルマリンによる後固定を４℃で一晩行い、次いでリン酸緩衝食塩水中に調製した２０％スクロース溶液を用いて凍結保護した。次いで、ＯＣＴ媒体中でメタノール及びドライアイスを用いて神経をフラッシュ凍結した。Ｌｅｉｃａミクロトーム上で薄切片（５〜１０μｍ）をスライスし、−８０℃のフリーザー内に貯蔵し、次いで抗体で染色した。抗体による染色方法は上記に記載した通りであった。
【００７９】
実施例８：式Ｉ〜式ＩＩＩに対する中間体の合成
各種の化合物を合成し、ミエリンを含むインビトロ又はインビボ試料への特異的結合に関して試験した。かかる化合物は、表ＩＩに示す置換基パターンに基づいて類別された。ＢＭＢ及びＢＤＢは、結合度及び光学的性質を比較するために使用した。
【００８０】
【表２】
0005897461.tif 000005
上記の通り、式Ｉａ及び式Ｉｂは好ましい構造を有している。式Ｉａは、Ｒ2がＯＲ1基に対してオルト位にある完全に共役した置換基上の電子供与基である構造を表している。Ｒ3は、ＯＲ1基に対してメタ位にありかつＲ2で置換された基に対してパラ位にある完全に共役した置換基上の電子求引基である。
【００８１】
式Ｉｂは電子供与基及び電子求引基の位置が逆転した化合物であって、Ｒ2がＯＲ1基に対してメタ位にある完全に共役した置換基上の電子求引基である。Ｒ3は、ＯＲ1基に対してオルト位にありかつＲ2で置換された基に対してパラ位にある完全に共役した置換基上の電子供与基である。
【００８２】
式ＩＩＩは、２つの電子供与基を有する化合物を表している。式ＩＶは、２つの電子求引基を有する化合物を表している。
【００８３】
末端アミノ部分の導入は、下記のスキームに従って製造した新しい構成単位４−ｔ−ブトキシカルバモイルベンジルホスホネートの使用で行った。
【００８４】
【化３】
0005897461.tif 000006
ホーナー・ウィティッヒオレフィン化のための一般手順：アルデヒド及びホスホネート（それぞれ１当量の官能基）を含む乾燥バイアルに、乾燥テトラヒドロフラン（０．２Ｍ反応体濃度に相当する５ｍｌ／ｍｍｏｌ、二官能性に関しては生じたジエチルリン酸カリウムを可溶化するため後に反応の過程で追加のＴＨＦが必要となることがある）を添加した。次いで、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．２当量／ホスホネート基）を添加し、混合物をＮ2下で６０℃に加熱し、ＧＣ−ＭＳ又はＬＣ−ＭＳでモニターした。大抵の反応は、これらの条件下では１．５時間以内に完全に進行した。次いで、ロトエバポレーターを用いて反応混合物を濃縮し、ブラインで希釈し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥した抽出液を濃縮し、粗生成物をシリカゲル上に吸着させ、ヘキサン−酢酸エチル、ヘキサン−ジクロロメタン又はジクロロメタン−メタノールの勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。
【００８５】
ジエチル−４−アミノベンジルホスホネート：ジエチル−４−ニトロベンジルホスホネート（２８３ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）をアセトン−水（２．９ｍｌ／０．６ｍｌ）に溶解した溶液にＺｎ粉末（２７０ｍｇ、４ｅｑ．）を添加し、次いで塩化アンモニウム（３３０ｍｇ、６ｅｑ．）を添加した。反応物を約４５℃まで加温し、次いで１５分以内に室温に戻した。ＧＣ−ＭＳは、３０分までに完全な転化が起こったことを示した。水酸化アンモニウム（２ｍｌ、２５％）及び酢酸エチル（３ｍｌ）を添加し、混合物をブライン（３ｍｌ）で洗浄し、有機層を分離した。水性層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、有機層を合わせて乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。橙色の油状物を２０ｍｔｏｒｒ及び３０℃で１時間乾燥した後、次の段階に供した。
【００８６】
ジエチル−４−ｔ−ブトキシカルバモイルベンジルホスホネート：ジエチル−４−アミノベンジルホスホネート（０．４９９ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を水性ＴＨＦ（６．５ｍｌ  ＴＨＦ／１．６ｍｌ水、８０／２０  ｖ／ｖ）に溶解した溶液に、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル無水物（４９５ｍｇ、１．１ｅｑ．）及び重炭酸ナトリウム（２５８ｍｇ、１．５ｅｑ．）を添加した。混合物を室温で２０時間撹拌した。ブライン（５ｍｌ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し、ＭＰＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル  ４５〜１００％）で精製した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ+）：３６６（Ｍ＋Ｎａ+）；３８５（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．２３（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，６Ｈ）；１．５２（ｓ，１０Ｈ）；３．１２（ｄ，Ｊ＝７５Ｈｚ，２Ｈ）；４．０４（ｔｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，０．８Ｈｚ，４Ｈ）；６．５８（ｂｒｓ，０．８５Ｈ）；７．２２（ｄｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，０．８Ｈ，２Ｈ）；７．３６（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）。
【００８７】
４−ブロモ−２−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール：４−ブロモ−２−メトキシベンズアルデヒド（５．２ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）及びトリメチルオルトホルメート（１４ｍｌ、５．５ｅｑ．）に溶解した溶液にｐ−トルエンスルホン酸（４６ｍｇ、０．０１ｅｑ．）を添加し、混合物を３時間還流した。炭酸カリウム（１２５ｍｇ、０．０３ｅｑ．）及びシリカゲルを添加し、溶媒を減圧下で除去し、固体残留物を装填カラムに充填し、ＭＰＬＣ（ヘキサン−酢酸エチルの４０〜８０％勾配）で精製した。ＭＳ（ＥＩ+）：２６２，２６０（１／１，Ｍ+，１０％）；２３１，２２９（１／１，９０％）；２１５，２１３（１／１，１０％）；１９９，１７０，１５０，１１８，９２，７５，４５（１００％）。
【００８８】
４−ホルミル−２−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール：上記の臭化アリール（５．９９ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）を−３０℃の乾燥エーテル（６５ｍｌ）に溶解した溶液に微量の１，１０−フェナントロリンを添加し、次いでｎ−ＢｕＬｉの２．６Ｍヘキサン溶液を添加した。１．２ｍｌの添加後、橙色〜桃色の着色によって示されるようにすべての水分が消費された。この時点で、１０ｍｌのｎ−ＢｕＬｉ溶液を添加し（１．０９ｅｑ．）、混合物を０℃まで加温し、この温度で４５分間撹拌した。淡い桃色〜橙色の懸濁液を−７８℃に冷却し、Ｎ−ホルミルピペリジン（５ｍｌ、１．９５ｅｑ．）を滴下して処理した。混合物を室温まで放温し、２０℃で１時間撹拌した。水を添加し、有機層を水で３回及びブラインで１回洗浄した。水性排液をエーテルで抽出し、有機層を合わせて乾燥し、減圧下で濃縮することで、ＧＣ−ＭＳによれば純度９９％の所望生成物をほぼ定量的な収量で得た。ＭＳ（ＥＩ+）：２１０（１０％，Ｍ+）；１７９（１００％）；１６３，１３５，１１９，９１，７５，４５（９０％）。
【００８９】
（Ｅ）−４−（４−（ジメトキシメチル）−３−メトキシスチリル）ベンゾニトリル：ＴＨＦ（１２ｍｌ）中の４−ホルミル−２−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール（４５２ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）及び４−シアノベンジルジエチルホスホネート（５４５ｍｇ、１ｅｑ．）を含む乾燥バイアルに、カリウムｔ−ブトキシド（２９０ｍｇ、１．２ｅｑ．）を添加した。混合物は緑色に変わり、室温で１０分以内にゲル状になった。混合物を穏やかに１０分間還流し、ブラインで希釈し、酢酸エチルで抽出した。溶液を乾燥し、粗生成物をＥｔＯＡｃを用いてシリカゲルＳＰＥカートリッジでフラッシュした。ＭＳ（ＥＩ+）：３０９（１２％，Ｍ＋）；２７８（１００％）；２６２，２３４，２１９，２０４（１５％），１９０（２０％），１６５，１３９，７５，４５（９５％）。
【００９０】
（Ｅ）−４−（４−ホルミル−３−メトキシスチリル）ベンゾニトリル：（Ｅ）−４−（４−（ジメトキシメチル）−３−メトキシスチリル）ベンゾニトリル（７０ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）を水性ＴＨＦ（５ｍｌ水／２５ｍｌ  ＴＨＦ）に溶解した溶液にｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．０２ｅｑ．）を添加し、混合物を３時間還流した。混合物を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、乾燥し、溶媒を真空中で除去することで、ＧＣ−ＭＳによれば純度９９％の所望生成物を得た。ＭＳ（ＥＩ+）：２６３（１００％，Ｍ＋）；２４６（４０％），２３２，２１６，２０３（６０％），１９０（６５％），１７６，１４０，８８。
【００９１】
式Ｉａの化合物の合成
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（４−シアノスチリル）−２−メトキシスチリル）フェニルカルバメート：（Ｅ）−４−（４−ホルミル−３−メトキシスチリル）ベンゾニトリル（１４２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、ジエチル−ｔ−ブトキシカルバモイルベンジルホスホネート（２２３ｍｇ、１．２ｅｑ．）及び乾燥テトラヒドロフラン（３ｍｌ）を含む乾燥バイアルに、グローブボックス内でカリウムｔ−ブトキシド（９１ｍｇ、１．５ｅｑ．）を添加し、混合物をフードに戻し、６０℃で９０分間加熱した。混合物をブラインで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し、ＭＰＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル）で精製した。収量：２２４ｍｇ（９２％）。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４５２（Ｍ+）；４７５（Ｍ＋Ｎａ+）；４９５（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。
【００９２】
４−（４−（４−アミノスチリル）−３−メトキシスチリル）ベンゾニトリル（式Ｉａ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2、Ｒ3＝ＣＮ）：ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（４−シアノスチリル）−２−メトキシスチリル）フェニルカルバメート（２７．４ｍｇ、６０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４．８ｍｌ）に溶解した溶液にトリフルオロ酢酸（１．２ｍｌ）を添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、重炭酸ナトリウムの溶液で中和し、ＥｔＯＡｃで抽出した。粗生成物をＭＰＬＣ（ジクロロメタン中１％トリエチルアミン、０〜２．５％メタノール勾配）で精製することで、ＬＣ−ＭＳによれば純度＞９８％の所望色素を得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：３５２（Ｍ+）；３５３（Ｍ＋Ｈ+）；３９４（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−Ｄ６）：３．９７（ｓ，３Ｈ）；４．８−４．９５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）；５．６７（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ，１Ｈ）；６．７０（ｄｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，０．４Ｈｚ，２Ｈ）；７．１４−７．４０（ｍ，８Ｈ）；７．７６−７．８３（ｍ−ｑ−ｌｉｋｅ，４Ｈ）。
【００９３】
メチル４−（４−（４−アミノスチリル）−３−メトキシスチリル）ベンゾエート（式Ｉａ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2、Ｒ3＝ＣＯ2Ｍｅ）の合成
ジメチル−４−カルボメトキシベンジルホスホネート：４−ブロモメチルメチルベンゾエート（２．２９ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びトリメチルホスフィット（５．９ｍｌ、５ｅｑ．）の混合物を、撹拌しながら１００℃で１．５時間加熱した。過剰のホスフィットを減圧下で除去し、残留油状物（ＧＣ−ＭＳによれば純度９９％）をそれ以上精製せずに次の段階で使用した。ＭＳ，ｍ／ｅ：２５８（Ｍ+，５０％）；２２７（６０％）；１９８（９０％）；１６２（３５％）；１４９（１００％）；１２１（４２％）；１１８（４０％）；１０９（５８％）；９０（５０％）。
【００９４】
メチル（Ｅ）−４−（４−（ジメトキシメチル）−３−メトキシスチリル）ベンゾエート：この化合物は、一般的なホーナー・ウィティッヒ方法に従い、無水ＴＨＦ（１５ｍｌ  ）中においてｔ−ＢｕＯＫ（４０４ｍｇ、１．２ｅｑ．）を塩基として使用しながら４−ホルミル−２−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール（６３０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）及びジメチル−４−カルボメトキシベンジルホスホネート（７７５ｍｇ、１ｅｑ．）から製造した。混合物を７０℃で９０分間加熱し、次いで前述のように処理し、ヘキサン／酢酸エチルの０〜３０％勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。収量：７９５ｍｇ（７６％）。ＭＳ，ｍ／ｅ：３４２（Ｍ+）１５％；３１１（Ｍ+−ＭｅＯ，１００％）；２９４（５％）；２３４（４％）；１６４（１２％）；１３９（１０％）。
【００９５】
メチル（Ｅ）−４−（４−ホルミル−３−メトキシスチリル）ベンゾエート：この化合物は、（Ｅ）−４−（４−ホルミル−３−メトキシスチリル）ベンゾニトリルの合成に関して記載した方法に従い、メチル（Ｅ）−４−（４−（ジメトキシメチル）−３−メトキシスチリル）ベンゾエートの酸加水分解によって製造した。即ち、２５８ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のアセタールから、６ｍｌ  ＴＨＦ／１．５ｍｌ水溶液中の１．７ｍｇピリジニウムトリフレートの存在下で、３０分間の還流及び冷却後にほぼ定量的収量（２２０ｍｇ）の所望生成物を綿毛状針状結晶の塊として得た。ＭＳ，ｍ／ｅ：２９６（Ｍ＋，１００％）；２６４（１５％）；２３４（３５％）；１６４（４５％）；１３８，１１４，８２（６％）。
【００９６】
ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−（４−カルボメトキシスチリル）−２−メトキシスチリル）フェニルカルバメート：乾燥バイアルに、メチル（Ｅ）−４−（４−ホルミル−３−メトキシスチリル）ベンゾエート（２２２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ジエチル−４−ｔ−ブトキシカルバモイルベンジルホスホネート（２６２ｍｇ、１．０２ｅｑ．）及び乾燥テトラヒドロフラン（４ｍｌ）を添加した。グローブボックス内で固体カリウムｔ−ブトキシド（１０１ｍｇ、１．２ｅｑ．）を添加し、混合物をフードに戻し、７０℃で９０分間加熱した。混合物をブラインで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し、ＭＰＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル−１０％ジクロロメタン、５〜８０％勾配）で精製した。収量：３００ｍｇ（８２％）。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４８５（Ｍ+）；５０８（Ｍ＋Ｎａ+）；５４９（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｎａ+）。
【００９７】
メチル４−（４−（４−アミノスチリル）−３−メトキシスチリル）ベンゾエート（式Ｉ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2、Ｒ3＝ＣＯ2ＣＨ3）：ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−（４−カルボメトキシスチリル）−２−メトキシスチリル）フェニルカルバメート（３００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を４２ｐｐｍのアミレンで安定化したジクロロメタン（４８ｍｌ）に溶解した溶液にトリフルオロ酢酸（１２ｍｌ）を添加し、混合物を室温で４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン中に取り、重炭酸ナトリウム溶液で中和し、水性相をジクロロメタンで抽出した。有機相を合わせてＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去することで、ＬＣ−ＭＳによれば純度＞９８％の所望色素を得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：３８６（Ｍ＋Ｈ+）；４２７（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。
【００９８】
式Ｉｂの化合物の合成
（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ジメトキシメチル）−３−メトキシスチリル）フェニルカルバメート：ＴＨＦ（１０ｍｌ）中の４−ホルミル−２−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール（４０８ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）及びジエチル−４−ｔ−ブトキシカルバモイルベンジルホスホネート（６６８ｍｇ、１ｅｑ．）を含む乾燥バイアルに、グローブボックス内でカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２６５ｍｇ、１．２ｅｑ．）を添加した。混合物をＮ2下に密封し、７０℃に加熱し、この温度で１時間撹拌した。冷却した混合物にトリエチルアミン（０．５ｍｌ）を添加し、粗生成物を酢酸エチルで希釈し、シリカゲル上に吸着させた。生成物アセタールを、ヘキサン／酢酸エチルの１０〜６０％勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４２２（Ｍ＋２３，Ｍ＋Ｎａ+）。収量：４５１．４ｍｇ（６６％）。
【００９９】
（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ホルミル−３−メトキシスチリル）フェニルカルバメート：アセタール（４５１．４ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ2Ｏ（６．６ｍｌの８０／２０（ｖ／ｖ）、５．３ｍｌ  ＴＨＦ／１．３ｍｌ  Ｈ2Ｏ）に溶解した溶液に触媒量のピリジニウムトリフレート（２．６ｍｇ、０．０１ｅｑ．）を添加し、混合物を６０℃に３時間加熱した。この時点でのＬＣ−ＭＳ（水／アセトニトリル、０．１％ギ酸アンモニウム）は、Ｂｏｃ基の喪失なしに完全な転化が起こったことを示した。粗混合物を減圧下でシリカゲル上に吸着させ、２０〜６０％Ｂ勾配を用いるＭＰＬＣ（シリカ）で精製した。この場合、溶媒Ａはヘキサンであり、溶媒Ｂは酢酸エチル中１０％ＣＨ2Ｃｌ2であった。収量：３１９．１ｍｇ（４６．８％）。Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−Ｄ６）：１．５２，（ｓ，９Ｈ）；４．０６（ｓ，３Ｈ）；７．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ）；７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ）；７．４２−７．４８（ｍ，２Ｈ）；７．６２（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５，６Ｈｚ）；７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ）；８．５８（ｓ，１Ｈ）；１０．４２（ｓ，１Ｈ）。
【０１００】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（４−シアノスチリル）−３−メトキシスチリル）フェニルカルバメート：乾燥バイアルに、（３１９．１ｍｇ、０．９０３ｍｍｏｌ）、ジエチル−４−シアノベンジルホスホネート（２３３ｍｇ、１．０２ｅｑ．）及び乾燥テトラヒドロフラン（４．７ｍｌ）を加えた。グローブボックス内で固体カリウムｔ−ブトキシド（１２１．５ｍｇ、１．２ｅｑ．）を添加し、混合物をフードに戻し、６０℃で７５分間加熱した。粗混合物を酢酸エチルで希釈し、シリカゲル上に吸着させ、ヘキサン（Ａ）／酢酸エチル−１０％ジクロロメタン（Ｂ）の２０〜８５％（Ｂ）勾配を用いるＭＰＬＣで精製することで、標記化合物をレモン色の固体（３８４ｍｇ、９４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４５２（Ｍ+）；４７５（Ｍ＋Ｎａ+）；４９５（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−Ｄ６）：１．５１（ｓ，９Ｈ）；４．０１（ｓ，３Ｈ）；７．１５−７．２８（ｍ，２Ｈ）；７．３−７．４２（ｍ，２Ｈ）；７．５４−７．６５９ｍ，４Ｈ）；７．６８−７．８４（ｍ，７Ｈ）；８．５３，（ｓ，１Ｈ）；Ｃ−ＮＭＲ（アセトン−Ｄ６）：５５．１４，７９．２６，１００．８１，１１８．２６，１２４．３７，１２７．１２，１２８．９６，１３２．４５，１３９．６４，１４２．８２，１５２．７３，１５７．７０。
【０１０１】
４−（４−（４−アミノスチリル）−２−メトキシスチリル）ベンゾニトリル（式Ｉｂ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2、Ｒ3＝ＣＮ）：上記のカルバメート（２００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を４２ｐｐｍのアミレンで安定化した３５ｍｌのジクロロメタンに溶解した溶液にトリフルオロ酢酸（８．８ｍｌ）を添加し、混合物を室温で４５分間撹拌した。アリコートの分析は完全な転化を示した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、残留物をジクロロメタン中に取り、ＮａＨＣＯ3水溶液で洗浄し、有機相を分離し、粗生成物をシリカゲル上に吸着させ、ヘキサン（Ａ）／ジクロロメタン＋１％トリエチルアミン＋１％ＭｅＯＨ（Ｂ）の１０〜５０％（Ｂ）勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。ＭＳ（ＥＳＩ+）：３５２（Ｍ+）；３５３（Ｍ＋Ｈ+）；３９４（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。
【０１０２】
式ＩＩの化合物の合成
メチル４−（４−（４−ジメチルアミノスチリル）−３−メトキシスチリル）ベンゾエート（式Ｉ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2、Ｒ3＝ＣＯ2ＣＨ3）：アミノエステル（式Ｉ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2、Ｒ3＝ＣＯ2ＣＨ3）（２３１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（６．１ｍｌ）に溶解した溶液に、ホルムアルデヒド（１．４４ｍｌ、３７％、３ｅｑ．）、氷酢酸（０．３４ｍｌ、１０ｅｑ．）及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３８５ｍｇ、３ｅｑ．）の水溶液を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。水（１２ｍｌ）を添加した。有機相を分離し、水性相をジクロロメタンで抽出し、有機相を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。収量：２４０ｍｇ（９８％）。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４１４（Ｍ＋Ｈ+）；４５５（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。
【０１０３】
メチル４−（４−（４−ジメチルアミノスチリル）−３−メトキシスチリル）安息香酸（式ＩＩ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2、Ｒ3＝ＣＯ2ＯＨ）：上記のメチル４−（４−（４−ジメチルアミノスチリル）−３−メトキシスチリル）ベンゾエート（２４０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を０℃の無水ＴＨＦ（６ｍｌ）に溶解した溶液にＬｉＡｌＨ4（３５ｍｇ、９５％、１．５ｅｑ．）を添加し、混合物を３５分間撹拌した。アリコートの分析は、所望生成物（式ＩＩＩ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2、Ｒ3＝ＣＯ2ＯＨ）への完全でクリーンな転化を示した。次いで、０℃で激しく撹拌しながら、ロッシェル塩の水溶液（１０ｍｌ）を注意深く添加し、混合物を酢酸エチルで抽出し、乾燥し、減圧下で蒸発させた。残留物をシリカゲル上に吸着させ、ヘキサン／酢酸エチルの３０〜６０％勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。収量：２０４ｍｇ（９２％）。ＭＳ（ＥＳＩ+）：３８６（Ｍ＋Ｈ+）；４２７（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。
【０１０４】
【化４】
0005897461.tif 000007
式ＩＩＩの化合物の合成
１，４−ビス（ブロモメチル）−２−メトキシベンゼン）の合成：ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）（３４．５ｇ、１９０ｍｍｏｌ）を無水ＣＣｌ4中に懸濁した懸濁液に過酸化ベンゾイル（５０ｍｇ）を添加した。反応懸濁液を窒素雰囲気下において還流ＣＣｌ4で加熱し、一晩撹拌した。ＧＣＭＳ（２ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中１００μｌ）によって反応を追跡した。１時間の加熱後、反応混合物は透明であったが、ＧＣＭＳはほんのわずかな転化しか示さなかった。過酸化ベンゾイル（１００ｍｇ）を再び添加し、さらに１３時間還流した。次いで、反応物をＧＣＭＳで分析した。得られた反応物をブフナー漏斗で濾過することで、スクシンイミド並びに未反応のＮＢＳを除去した。溶媒の除去によって淡褐色のケークが得られた。次いで、ケークをヘキサン（３×２００ｍｌ）で洗浄した。洗液を合わせて蒸発させることで、白色の非晶質固体（６．８３ｇ、２６％）を得た。ＧＣＭＳ（ｍ／ｚ）：２９３（Ｍ+），２１３（分子イオン），１３３。（短い１５分法、７５−３００oＣ、２０oＣ／分で１０分間昇温、３００oＣに５分間保持）。
【０１０５】
テトラエチル（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（メチレン）ジホスホネートの合成：反応物を７ｍｌバイアル内に構成し、過圧を避けるためにゆるく栓をした。７ｍｌバイアル内に、臭化ジベンジルを１２ｍｌのＰ(ＯＥｔ)3（３当量）と共に導入した。次いで、それを１３５℃の加熱ブロック中で一晩加熱した。ＧＣＭＳは出発原料の完全な転化を示した。ＧＣＭＳ（ｍ／ｚ）：４０８（Ｍ＋），２７１，２１５，１０４。（保持時間：８．９分）。
【０１０６】
４，４’−（１Ｅ，１’Ｅ）−２，２’−（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（エテン−２，１−ジイル）ビス（ニトロベンゼン）（式ＩＩＩ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｒ3＝ＮＯ2）の合成：ＮａＨ（１５０ｍｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を仕込んだオーブン乾燥済みの三つ口丸底フラスコに、ジホスホネート（１．０ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。まず、加熱ブロック及びＧＥ  Ｓｕｎｌａｍｐ  ２７５Ｗを用いて反応混合物を窒素下で加熱した。可変変圧器を用いて温度を７０℃に調整した。１６時間の還流後、氷水を注意深く添加することで反応物を急冷した。真空下での蒸発及び得られた暗色の油状物の再結晶により、化合物を赤色の結晶質固体（４０％、４１０ｍｇ）として得た。（出発ビスホスホネートが０．５ｍｍｏｌのスケールでは、８４％の収率が得られた。）ＧＣＭＳ及び1Ｈ  ＮＭＲによって生成物の正体が確認された。
【０１０７】
ＢＭＢの合成：４，４’−（１Ｅ，１’Ｅ）−２，２’−（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（エテン−２，１−ジイル）ビス（ニトロベンゼン）（１．０ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）、亜鉛粉末（２．８７ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）及びＮＨ4Ｃｌ（１．７ｇ）をアセトン及び水の混合物（１．５Ｌ）（４：１）中に懸濁し、激しく撹拌しながら窒素雰囲気下で１．５時間還流した。次いで、反応混合物を冷却し、濾過し、真空中で減量した。ＮａＯＨペレットを添加することでｐＨを１２〜１３（ｐＨ紙）に調整し、次いでＥｔＯＡｃ（２×３００ｍｌ）及びＣＨ2Ｃｌ2（２×３００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、蒸発させることで、赤色の粘稠な油状物（２．０８ｇ）を得た。次いで、ＳｉＯ2上でヘキサン、酢酸エチル及びＤＩＰＥＡ（勾配：２０〜１００％のＥｔＯＡｃ）を用いるＭＰＬＣでＢＭＢを精製した。主ピークに対応する画分を集め、合わせて蒸発させることで、赤橙色の固体（６５０ｍｇ、７２％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲによってＢＭＢの正体が確認された。
【０１０８】
式Ｉの化合物の放射性同位体誘導体を製造し、放射性イメージングによってイメージングを行うことができる。別法として、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を製造することができる。特定の実施形態では、Ｒ1＝ＣＨ2ＣＨ2ＯＴｓ（式中、Ｔｓはトシレートである）を有する式Ｉの化合物を、18Ｆ（ＰＥＴ）又は124Ｉ（ＳＰＥＣＴ）による放射性標識のための前駆体として使用できる。トシレート脱離基に対する他の選択肢は、放射性標識分野で一般に知られているようにして選択できる。さらに、Ｒ1＝ＣＦ3又はＣ1〜Ｃ4ペルフルオロアルキルである式Ｉの化合物を19Ｆに基づくＭＲＩのために使用でき、またＲ1＝13Ｃメチル又は13Ｃ濃縮Ｃ1〜Ｃ4アルキルである式Ｉの化合物を13Ｃに基づくＭＲＩのために使用できる。これらの化合物は、本明細書中に記載した一般的方法に従って製造できるか、或いはＲ1＝Ｈである式Ｉの前駆体を介して求核性アルキル化で得ることができる。
【０１０９】
別法として、式Ｉの化合物の13Ｃ標識誘導体は、式Ｉの化合物のアミノ官能基を13Ｃ濃縮ヨウ化メチル又は同様なＣ1〜Ｃ4アルキル化剤でアルキル化することで製造できる。式Ｉの化合物の19Ｆ誘導体は、式Ｉの化合物のアミノ官能基をＣ1〜Ｃ4フルオロ若しくはペルフルオロアルキルハライド、メシレート又はトシレートでアルキル化するか、ペンタフルオロフェニルベンゾイルクロリドのようなフルオロアシルハライドと反応させて対応するアミドを得るか、或いはカルボニル成分が13Ｃ又は19Ｆ部分を有する場合には還元アミノ化することで製造できる。他の実施形態では、式Ｉのアミン部分をアルキル化して２−ヒドロキシエチル誘導体を製造し、そのトシレート又はメシレートを18Ｆ（ＰＥＴ）及び124Ｉ（ＳＰＥＣＴ）による放射性標識のための前駆体として使用できる。
【０１１０】
結果及び観測値
【０１１１】
【表３】
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各種化合物の蛍光励起及び発光ピーク並びに相対結合度を表ＩＩＩに示す。
【０１１２】
神経組織切片のヘマトキシリン及びエオシン染色の検査により、特徴的な神経形態を同定できることが明らかになった。各神経又は神経束は大きい円又は１群の大きい円として現れ、その内部に小さいドーナツ形のミエリン化軸索が確認できる。神経の連続切片を様々なミエリンタンパク質抗体で染色し、染色パターン及び形態をＢＭＢの場合と比較した。
【０１１３】
表ＩＶには、免疫組織化学及びＢＭＢ染色が要約されている。単一の「＋」は、陽性の染色シグナルが存在するが、抗体染色とＢＭＢ染色との間でパターンが異なることを示している。「＋＋＋」は、陽性のシグナル及び類似の形態を示している。「−」は、染色シグナルが存在しないことを示している。表ＩＶに示される通り、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は試験した様々な神経のすべてを通じてＢＭＢの染色パターン及び形態と最もよく相関していた。
【０１１４】
【表４】
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図１ＡはＭＢＰ抗体による三叉神経の切片の染色を示している一方、図１ＢはＢＭＢによる三叉神経染色を示している。ＢＭＢによる結果は、ＭＢＰ抗体の場合と同じである。ドーナツ形の構造はミエリン化神経線維である。図２は、坐骨神経及び三叉神経組織切片を式Ｉａ、式Ｉｂ、式ＩＩ及び式ＩＩＩからの薬剤例で染色した場合に得られた代表的な画像を示している。薬剤を用いない神経を含む対照スライド（図示せず）は、同じイメージング条件下で陰性であった。図示の通り、式Ｉａ及び式Ｉｂの薬剤による染色は、式ＩＩ及び式ＩＩＩの薬剤に比べてミエリン塩基性タンパク質の可視化を増加させた。
【０１１５】
薬剤を前臨床動物モデルに全身注射した場合、インビボイメージングは、前臨床動物モデルに全身注射された薬剤の一部が腕神経叢、顔面神経、三叉神経、横隔神経、迷走神経及び視神経を含む複数の組織中の神経に局在化することを明らかにした。隣接する筋肉組織は、非常に低いバックグラウンド結合度を有していた。発蛍光団を投与しない陰性対照動物の神経は、蛍光シグナルを有していなかった。図３は、式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）によるマウス外科モデルの三叉神経及び視神経の蛍光インビボイメージングを示している。薬剤のインビボ性能は、特に限定されないが、薬剤のミエリン結合性、血液神経関門透過性、代謝、血漿結合性、半減期、溶解度及びクリアランス速度を含む複数の因子の組合せである。エクスビボアッセイで神経組織切片を染色しなかった薬剤は、通例はインビボで試験しなかった。式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＯ2ＣＨ3）及び（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2及びＲ3＝ＣＮ）の化合物は、インビボで神経を染色しなかった。式Ｉｂ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＣＮ及びＲ3＝ＮＨ2）はインビボで神経を染色した。ＢＭＢはインビボで神経を染色した。式ＩＩ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2及びＲ3＝Ｎ(ＣＨ3)2）、（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＯＣＨ3及びＲ3＝ＯＣＨ3）及び（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ2)2ＣＨ3及びＲ3＝Ｎ(ＣＨ2)2ＣＨ3）は、インビボで神経を染色しなかった。式ＩＩ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＳＣＨ3及びＲ3＝ＳＣＨ3）は注射時に沈殿した。式ＩＩ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2及びＲ3＝ＣＨ2ＯＨ）は、インビボで弱い神経シグナルを示した。
【０１１６】
若干の場合には、インビボ蛍光イメージング後に神経を切除した。神経を免疫組織化学的分析のために切片化した。図４は、マウスの三叉神経上におけるＭＢＰシグナルの位置と発蛍光団ＢＭＢ及び式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）の位置との相関関係を示している。ＢＭＢ又は式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）を生きているマウスに投与し、クリアランス及び生体分布のために十分な時間の後、神経を切除し、切片化し、次いでＭＢＰ抗体で染色した。図４は、動物に全身投与された発蛍光団と、神経切片上にエクスビボで投与されたＭＢＰ抗体との強い共局在を示している。式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）に関しては、発蛍光団染色とＭＢＰ抗体染色との間の相関係数は０．９５３であり、薬剤がミエリン塩基性タンパク質を標的としていることを強く支持している。
【０１１７】
ラット脳から天然のミエリン塩基性タンパク質を精製し、生化学的アッセイで使用した。天然ＭＢＰはＢＭＢ及び式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）の蛍光特性を変化させ、発蛍光団とＭＢＰとの緊密な相互作用を示唆していた。図５は、ＢＭＢ及び式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）の励起及び発光特性が天然ＭＢＰとの結合で増強されたことを示している。その増強は、ＢＭＢよりも式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）においてはるかに顕著であった。
【０１１８】
ベンゼン環のπ二重結合軌道及びオレフィン性置換基を介しての共役は、電子が式Ｉを横切って電子供与基Ｒ2から電子供与基Ｒ3に流れるための経路を提供し得る。このような電子の流れは、蛍光シグナルの一層顕著な増強に寄与し得る。
【０１１９】
発蛍光団が天然ＭＢＰと結合した脂質と相互作用していた可能性を排除するため、クロロホルム：メタノール抽出を用いるＢｌｉｇｈｔ−Ｄｙｅｒ法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９７７，５９，４８７−９６）に従って天然ＭＢＰから脂質を抽出した。次いで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーを用いる生化学的アッセイで抽出した脂質を使用することで、式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）の蛍光特性の同様な増強が観測されるかどうかを判定した。図６は、式Ｉａ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＣＮ）の蛍光発光が天然ＭＢＰの存在下でのみ増強し、抽出した脂質又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の存在下では増強しなかったことを示している。結果は、薬剤がミエリン塩基性タンパク質成分と特異的に結合し、脂質成分とは結合しないことを示唆している。
【０１２０】
式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3）の合成
スキーム２に略示した変換方法に従って式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3）を製造した。アルデヒド３及びホスホネート５の製法は、米国特許出願第１２／４７８３００号に記載されている。
【０１２１】
【化５】
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ジエチル４−メチルスルホニルベンジルホスホネート２ｂ：
４−メチルスルホニルベンジルブロミド２ａ（１ｇ、４ｍｍｏｌ）をトリエチルホスフィット（２．８ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）に溶解した溶液を２時間かけて１００℃まで加温した。ＧＣ−ＭＳは完全な転化が起こったことを示した。混合物を真空下で揮発分除去することで、所望生成物を淡黄色の油状物（１．２２ｇ、９９％）として得た。ＧＣ−ＭＳ（ＥＩ+）：３０６（Ｍ+），２７８，２６３，２５０，２２７，１９９，１８３，１７０，１２４，１０９，１０７（１００％），１０４，９７，９０。
【０１２２】
（Ｅ）−２−メトキシ−４−（４−（メチルスルホニル）スチリル）ベンズアルデヒド４：
Ｎ2下でホスホネート２（５７９ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を含む乾燥バイアルに乾燥ＴＨＦ（４ｍｌ）を添加し、次いでｔ−ＢｕＯＫ（２５０ｍｇ、２．２６８ｍｍｏｌ）を３ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した溶液を添加した。室温で５分間撹拌した後、アルデヒド３を３ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した溶液を滴下し、混合物を６０℃の浴温で２時間撹拌した。Ｎ2流下で反応物の体積を減少させ、酢酸エチル及びブラインを添加し、水性相のｐＨを希（０．１Ｎ）ＨＣｌで３に調整した。混合物を振盪し、相を分離し、水性相を酢酸エチル（２×）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。乾燥剤を濾別し、シリカゲル６０を添加し、化合物をシリカゲル上に吸着させ、ジクロロメタン−酢酸エチルの５〜３０％（ｖ／ｖ）勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。黄色固体、５０４ｍｇ（７４％）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ+）：３１７（Ｍ＋Ｈ+），３５８（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）．ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：１０．４６（ｓ，１Ｈ），７．９７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，０．８Ｈｚ），７．８５（１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．７８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，０．８Ｈｚ），７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ），４．０４（３Ｈ，ｓ），３．０９（３Ｈ，ｓ）。
【０１２３】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−メトキシ−４−（４−（メチルスルホニル）スチリル）スチリル）フェニルカルバメート６：
ＴＨＦに対するアルデヒド４の溶解性が悪いので、次のように改変したオレフィン化方法を使用した。Ｎ2下で乾燥ＴＨＦ（１ｍｌ）中にホスホネート５（１０５ｍｇ、０．３０７５ｍｍｏｌ）を含む乾燥バイアルに、ｔ−ＢｕＯＫ（４０．３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を０．２５ｍｌのＴＨＦに溶解した溶液を添加し、次いでｔ−ＢｕＯＫをすすいだ０．２５ｍｌのＴＨＦ洗液を添加した。青色の混合物をＮ2下で室温で５分間撹拌し、次いで乾燥ＴＨＦ（１ｍｌ）中におけるアルデヒド４の溶液−懸濁液にカニューレを通して添加した。添加の完了後、赤れんが色の溶液を６２℃の浴温で１時間撹拌した。この時点でのＬＣ−ＭＳは、所望生成物への非常にクリーンで完全な転化を示した。生成物は、ＴＨＦを除き、大抵の常用溶媒に対する溶解性が悪い。反応混合物を回転蒸発で乾燥し、過剰の塩基をドライアイスの小片で中和し、固体をＣＯ2ブランケット下に一晩放置した。次いで、それをＴＨＦに溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ヘキサン−ＴＨＦの４０〜８０％勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。化合物は６０％（ｖ／ｖ）ＴＨＦで淡橙色の固体（１２４ｍｇ（８３％））として溶出する。ＭＳ（ＥＳＩ+）：５０５（Ｍ+），５２８（Ｍ＋Ｎａ+）。Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−Ｄ６）：８．４７（１Ｈ，ｓ），７．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．４７（１Ｈ，ｓ），７．４２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２，３．２Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｓ），７．２８−７．２３（２Ｈ，ｍ），３．９８（３Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ），１．４９（９Ｈ，ｓ）。Ｃ−ＮＭＲ（アセトン−Ｄ６）：１５８．２１，１５３．８１，１４３．８２，１４０．３９，１３８．１６，１３３．２７，１３０．０２，１２８．８３，１２８．０１，１２７．５９，１２７．３２，１２２．０３，１２１．０１，１１９．３５，８０．２６，５６．２０，４４．５６，２８．６９。
【０１２４】
４−（２−メトキシ−４−（４−（メチルスルホニル）スチリル）スチリル）アニリン（式Ｉ、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3）：
４０ｐｐｍのアミレンを含むジクロロメタン（０．８ｍｌ）にＢｏｃ−３１１１（６、１６．４ｍｇ、３２．４μｍｏｌ）を溶解した溶液にＴＦＡ（０．２ｍｌ）を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、非常にクリーンで完全な脱保護を示した。溶媒をＮ2流でストリッピングし、化合物を０．２ｍｌのＴＨＦに溶解し、シリカＳＰＥカートリッジ上に吸着させた。ヘキサンによる初期溶出の後、５０μｌのトリエチルアミンを添加してＴＨＦで溶出することで、１０．５ｍｇ（８１％）の所望色素を暗赤色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４０６（Ｍ＋Ｈ+），４４７（Ｍ＋ＣＨ3ＣＮ＋Ｈ+）。
【０１２５】
スキーム３に略示した合成変換方法に従って、ホスホネート８及び（アルデヒド３の異性体である）アルデヒド９を含む数種の他の中間体を製造した。
【０１２６】
【化６】
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２−（トリメチルシリル）エチル４−（（ジエトキシホスホリル）メチル）フェニルカルバメート８：
ジエチル４−アミノベンジルホスホネート（９２２ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１２．６ｍｌ）に溶解した溶液にトリエチルアミン（２．６０ｍｌ、１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌し、次いでスクシンイミジルＴＥＯＣ（９８５ｍｇ、３．８７６ｍｍｏｌ）を一度に添加し、混合物を室温で４０時間撹拌した。溶液をブライン（３×）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、シリカゲル上に吸着させ、ヘキサン−酢酸エチルの５０〜１００％勾配を用いるＭＰＬＣで精製した。低温でろう状に凝固する無色油状物。収量：８２２ｍｇ（５６％）。注記：後続の画分は純度９９％未満の追加生成物５２２ｍｇを与えた。ＭＳ（ＥＳＩ+）：３８８（Ｍ＋Ｈ+），４１０（Ｍ＋Ｎａ+）。ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：７．３９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．４，２．２Ｈｚ），４．２４−４．２８（２Ｈ，ｍ），４．０２−４．０６（２Ｈ，ｍ），３．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２３．２Ｈｚ），１．２８（６Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．０６（２Ｈ，ｍ），０．１（９Ｈ，ｓ）。Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：１５３．７６，１３７．５１（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），１３０．１６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１２６．１２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），１１８．６１，６３．１８，６２．０３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３３．４７，３２．１０，１７．６８，１６．１９（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），−１．８６。
【０１２７】
４−ブロモ−３−メトキシベンズアルデヒド：
２−ブロモ−５−ヨードアニソール（５ｇ、１６ｍｍｏｌ）及び１，１０−フェナントロリンの結晶（指示薬）を乾燥Ｅｔ2Ｏ（４５ｍｌ）に溶解した溶液をドライアイス−アセトン浴中で−７８℃に冷却した。ｎ−ＢｕＬｉの溶液（ヘキサン中２．５Ｍ）を、終点に達するまで滴下した（７．８ｍｌ）。混合物をこの温度で撹拌し、その間に濃厚なスラリーが生じた。懸濁液に乾燥Ｎ−ホルミルピペリジン（３．４６ｍｌ、３１．２ｍｍｏｌ）を注射器で添加し、混合物を３０分かけてゆっくりと室温まで放温した。この時点でのＧＣ−ＭＳはヨウ化アリールの不存在を示した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（２回）及びブライン（１回）で洗浄し、水性相をエーテルで抽出し、有機相を合わせてＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、溶媒をロトバップ上で除去して淡黄色の油状物を得、これをそのまま次の段階に供した。注記：アリコートを少量の冷メタノールで洗浄したところ、白色の結晶質生成物が得られた。ＭＳ（ＥＩ+）：２１６（Ｍ+，１００％），２１４（Ｍ+，１００％），２１５，２１３，２０１，１９９，１８７，１８５，１７２，１７０，１５７，１５５，１４５，１４３，１１９，１０５，９２，７７，６３。
【０１２８】
４−（ジメトキシメチル）−２−メトキシメトキシベンズアルデヒド９：
上記の粗アルデヒド（３．４ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）をメタノール（６２ｍｌ）及びトリメチルオルトホルメート（１７ｍｌ、１５８ｍｍｏｌ）に溶解した。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（３００ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３時間還流した。室温に冷却した後、１さじの固体ＮａＨＣＯ3を添加し、混合物を１０分間撹拌し、シリカゲル上に吸着させ、ヘキサン−酢酸エチル（２０〜６０％ＥｔＯＡｃ）で溶出するＭＰＬＣで精製した。収量：３．８１ｇ（９２％）の淡黄色油状物であって、これを次の段階に供した。ＭＳ（ＥＩ+）：２６２（Ｍ+），２６０（Ｍ+），２３１（１００％），２２９（１００％），２１６，２１５，２１４，２１３，１２２，７５。
【０１２９】
上記の臭化アリール−アセタール（３．８１２ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）及び１，１０−フェナントロリンの結晶（指示薬）を−７８℃（アセトン−ドライアイス浴）の乾燥エーテル（４１ｍｌ）に溶解した溶液に、ｎ−ＢｕＬｉのヘキサン溶液（２．５Ｍ）を当量（６．３ｍｌ）までゆっくりと添加した。５分後、ドライアイス−アセトン浴をアセトニトリル−ドライアイス浴と交換し、混合物を−４０℃の内温で４５分間撹拌した。この時点で、Ｎ−ホルミルピペリジン（３．１６ｍｌ、２８．４７ｍｍｏｌ）を注射器で添加し、混合物を１時間かけて室温まで放温した。次いで、水を注意深く添加し、有機層を水（３×）及びブライン（１回）で洗浄し、水性相をエーテルで抽出し、有機相を合わせて乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、粗生成物を
ヘキサン／酢酸エチル（５〜４０％（ｖ／ｖ）、次いで６０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＡｃ）で溶出するＭＰＬＣで精製した。収量：２．６０４ｇ（８５％）の無色油状物。ＭＳ（ＥＩ+）：２１０（Ｍ+），１７９（１００％），１６３，１５１，１３５，１１９，１０８，９１，７５。
【０１３０】
スキーム４に略示した変換方法に従って式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＦ3）を製造した。Ｂｏｃ保護アミノアルデヒドが使用できるが、代わりにＴＥＯＣ保護アミノアルデヒド１０を使用した。
【０１３１】
【化７】
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所要のジエチル−４−トリフルオロメチルスルホニルベンジルホスホネートは、下記の手順に従って製造した。
【０１３２】
【化８】
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５．１１ｇの臭化ベンジルに１２ｍｌのトリエチルホスフィットを添加した。得られた溶液を８０℃で４時間加熱した。反応混合物を窒素流下で濃縮し、次いで大きいシリカゲルカラム（約２５０ｍｌのシリカ）上で精製した。かかるカラムを８０／２０ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2で溶出すると共に、ＣＨ2Ｃｌ2の比率を増加させ、最後にＭＴＢＥを加えて生成物を溶出した。収量は定量的であった。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：７．６１ｐｐｍ（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３７ｐｐｍ（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ），４．０４ｐｐｍ（４Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝１．５，７．１Ｈｚ），３．１８ｐｐｍ（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２２Ｈｚ），１．３０ｐｐｍ（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１３６．５ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），１３５．２ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），１３０．９ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１２９．５ｐｐｍ（ｄｑ，Ｊ＝２．９，３０７Ｈｚ），１２２．８ｐｐｍ（ｍ），６２．３ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３３．７ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝１３８Ｈｚ），１６．３ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。
【０１３３】
【化９】
0005897461.tif 000014
５ｍｌのＣＨＣｌ3中の０．５０ｇのスルフィドに０．２６６ｇのＭＣＰＢＡを添加し、反応混合物を室温で６０時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析したアリコートは、２つの主ピークを示した。さらに０．０６０ｇのＭＣＰＢＡを添加し、反応物を２４時間撹拌した。反応混合物を窒素下で濃縮し、１５ｍｌのＭＴＢＥで処理し、約６ｍｌの０．８Ｍ  ＮａＨＣＯ＋で、さらに約４ｍｌの０．８Ｍ  ＮａＨＣＯ＋で抽出した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルカラム及び１００％ＣＨ2Ｃｌ2で始まって１００％ＭＴＢＥで終わる勾配を用いるＩＳＣＯ分取システム上でそれを精製した。収量は定量的であった。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：７．９８ｐｐｍ（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．６１ｐｐｍ（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．５Ｈｚ），４．０６ｐｐｍ（４Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝８．１，７．１Ｈｚ），３．２８ｐｐｍ（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２２．５Ｈｚ），１．２５ｐｐｍ（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４２．２ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），１３１．３ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），１３０．９ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），１２９．６ｐｐｍ（ｍ），１１９．７ｐｐｍ（ｑ，Ｊ＝３２５．８Ｈｚ），６２．５ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３４．３ｐｐｍ（ｄ，１３７．１Ｈｚ），１６．３ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）。
【０１３４】
（Ｅ）−２−（トリメチルシリル）エチル４−（４−ホルミル−２−メトキシスチリル）フェニルカルバメート１０：
ホスホネート８（５３７．５ｍｌ、１．３４６ｍｍｏｌ）を含む乾燥バイアルに乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）を添加し、次いでｔ−ＢｕＯＫ（１８０ｍｇ、１．６０７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解した溶液を添加し、混合物を室温で５分間撹拌した。次いで、アルデヒド９（２７８ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解した溶液を滴下し、混合物をＮ2下において６４℃の浴温で２時間撹拌した。混合物を氷で冷却し、ｐＨをＮａＨＳＯ4で５．５に調整し、次いでＮａＨＣＯ3で７に調整し、飽和ブラインを添加し、混合物を酢酸エチル（４×）で抽出した。溶媒をロトバップ上で除去し、得られた油状物をＴＨＦ（９２５ｍｌ）及び水（５ｍｌ）に溶解した。触媒量のピリジニウムトリフレート（３ｍｇ）を添加し、混合物を６０℃で７５分間撹拌した。固体ＮａＨＣＯ3（５０ｍｇ）を添加して５分間撹拌した後、溶液をロトバップ（最終圧力１０ｔｏｒｒ）上で蒸発乾固し、黄色の固体をシリカゲル上に吸着させ、ＭＰＬＣ（ヘキサン−ＴＨＦ）で精製した。ＭＳ（ＥＳＩ+）：３９７（１００％，Ｍ+），３９８（２８％），２９９（６％）。Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：９．９８（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，０．９Ｈｚ），７．４４−７．４７（３Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ），６．８１（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．２７−４．３２（２Ｈ，ｍ），４．００（３Ｈ，ｓ），１．０８−１．１２（２Ｈ，ｍ），０．１１（９Ｈ，ｓ）。
【０１３５】
２−（トリメチルシリル）エチル４−（２−メトキシ−４−（４−（トリフルオロメチルペルオキシチオ）スチリル）スチリル）フェニルカルバメート：
ジエチル４−トリフルオロメチルスルホニルベンジルホスホネート（９１．３ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（０．２５ｍｌ）に溶解した溶液に、ｔ−ＢｕＯＫ（３１ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．２５ｍｌ、次いで０．２５ｍｌの洗液）に溶解した溶液を添加し、溶液を室温で５分間撹拌した。次いで、アルデヒド１０（９８．５ｍｌ、０．２４８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍｌ、次いで２×０．２５ｍｌの洗液）に溶解した溶液を添加し、溶液をＮ2下において６０℃で９０分間撹拌した。混合物をＴＨＦで希釈し、粉末ドライアイスで注意深く中和した。次いで、粗混合物をシリカゲル上に吸着させ、ヘキサン−ＴＨＦの３０〜１０％ＴＨＦ勾配を用いる１２ｇ  Ｇｏｌｄ  Ｌａｂｅｌカラムスタック上でのＭＰＬＣで精製した。収量：１０６ｍｇ（６９．５％）。ＭＳ（ＥＳＩ+）：６０４（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１３６】
４−（２−メトキシ−４−（４−（トリフルオロメチルペルオキシチオ）スチリル）スチリル）アニリン（式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3））：
４０ｐｐｍのアミレンを含むジクロロメタン（０．８ｍｌ）に上記のＴＥＯＣ−１１（１０．７ｍｇ、１７．７５μｍｏｌ）を溶解した冷（℃）溶液にＴＦＡ（０．２ｍｌ）を滴下し、混合物を約３０分かけてゆっくりと室温まで放温し、全部で９０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望生成物への完全で非常にクリーンな転化を示した。揮発分を窒素流でストリッピングし、暗色の残留物をジクロロメタンに再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で洗浄し、乾燥し、溶媒をＮ2流で再びストリッピングすることで、クリーン（９９％積分値）な生成物を暗橙色の粉末（７．５ｍｇ、９２％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：４６０（Ｍ＋Ｈ+）．Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：８．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３８−７．４２（３Ｈ，ｍ），７．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．２１−７．２５（１Ｈ，ｄｄＪ＝８．１Ｈｚ，１．５Ｈｚ，ｆｌａｎｋｅｄ  ｂｙ  １Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．１４（１Ｈ，ｍ，ｆｌａｎｋｅｄ  ｂｙ  １Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），６．７１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），５．３６（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝１Ｈｚ），３．９９（３Ｈ，ｓ）。
【０１３７】
式Ｉの化合物の放射性同位体誘導体を製造し、放射性イメージングによってイメージングを行うことができる。別法として、式Ｉの13Ｃ濃縮化合物又は式Ｉの19Ｆ標識誘導体を製造することができる。特定の実施形態では、Ｒ1＝ＣＨ2ＣＨ2ＯＴｓ（式中、Ｔｓはトシレートである）を有する式Ｉの化合物を、18Ｆ（ＰＥＴ）による放射性標識のための前駆体として使用できる。トシレート脱離基に対する他の選択肢は、放射性標識分野で一般に知られているようにして選択できる。さらに、Ｒ1又はＲ3＝ＳＯ2ＣＦ3又はＣ1〜Ｃ4ペルフルオロアルキルである式Ｉの化合物を19Ｆに基づくＭＲＩのために使用でき、またＲ1又はＲ3＝13Ｃメチル又は13Ｃ濃縮Ｃ1〜Ｃ4アルキルである式Ｉの化合物を13Ｃに基づくＭＲＩのために使用できる。
【０１３８】
別法として、式Ｉの化合物の13Ｃ標識誘導体は、式Ｉの化合物のアミノ官能基を13Ｃ濃縮ヨウ化メチル又は同様なＣ1〜Ｃ4アルキル化剤でアルキル化することで製造できる。式Ｉの化合物の19Ｆ誘導体は、式Ｉの化合物のアミノ官能基をＣ1〜Ｃ4フルオロ若しくはペルフルオロアルキルハライド、メシレート又はトシレートでアルキル化するか、ペンタフルオロフェニルベンゾイルクロリドのようなフルオロアシルハライドと反応させて対応するアミドを得るか、或いはカルボニル成分がＣ又は19Ｆ部分を有する場合には還元アミノ化することで製造できる。他の実施形態では、式Ｉのアミン部分をアルキル化して２−ヒドロキシエチル誘導体を製造し、そのトシレート又はメシレートを18Ｆ（ＰＥＴ）による放射性標識のための前駆体として使用できる。
【０１３９】
結果及び観測値
【０１４０】
【表５】
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各種化合物の蛍光励起及び発光ピーク並びに相対結合度を表Ｖに示す。「＋＋＋」は、エクスビボ組織化学的アッセイによる神経結合度を示している。
【０１４１】
神経組織切片のヘマトキシリン及びエオシン染色の検査により、特徴的な神経形態を同定できることが明らかになった。各神経又は神経束は大きい円又は１群の大きい円として現れ、その内部に小さいドーナツ形のミエリン化軸索が確認できる。神経切片を発蛍光団で染色した。図７は、発蛍光団による三叉神経、坐骨神経及び大腿神経の染色を示している。図示の通り、ドーナツ形のミエリン化構造が見られる。薬剤を用いない神経を含む対照スライド（図示せず）は、同じイメージング条件下で陰性であった。
【０１４２】
薬剤を前臨床動物モデルに全身注射した場合、インビボイメージングは、前臨床動物モデルに全身注射された薬剤の一部が腕神経叢、顔面神経、三叉神経、横隔神経、迷走神経及び視神経を含む複数の組織中の神経に局在化することを明らかにした。隣接する筋肉組織は、非常に低いバックグラウンド結合度を有していた。発蛍光団を投与しない陰性対照動物の神経は、蛍光シグナルを有していなかった。図８は、式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3）によるマウス外科モデルの腕神経叢神経の蛍光インビボイメージングを示している。薬剤のインビボ性能は、特に限定されないが、薬剤のミエリン結合性、血液神経関門透過性、代謝、血漿結合性、半減期、溶解度及びクリアランス速度を含む複数の因子の組合せである。エクスビボアッセイで神経組織切片を染色しなかった薬剤は、通例はインビボで試験しなかった。
【０１４３】
ラット脳から天然のミエリン塩基性タンパク質を精製し、生化学的アッセイで使用した。天然ＭＢＰは式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3又はＳＯ2ＣＦ3）の蛍光特性を変化させ、発蛍光団とＭＢＰとの緊密な相互作用を示唆していた。図９は、式Ｉ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＮＨ2及びＲ3＝ＳＯ2ＣＨ3又はＳＯ2ＣＦ3）の蛍光発光強度が天然ＭＢＰとの結合で増強されたことを示している。変性ＭＢＰとの結合は蛍光強度の顕著な増強をもたらさなかった。ベンゼン環のπ二重結合軌道及びオレフィン性置換基を介しての共役は、電子が式Ｉを横切って電子供与基Ｒ2から電子供与基Ｒ3に流れるための経路を提供し得る。このような電子の流れは、蛍光シグナルの一層顕著な増強に寄与し得る。
【０１４４】
本発明は、その技術思想又は本質的な特徴から逸脱することなしに他の特定の形態で実施できる。したがって、上記の実施形態はずべての点において本明細書中に記載された発明を限定するものではなく例示するものと見なすべきである。かくして、本発明の技術的範囲は上記の記載ではなく添付特許請求の範囲によって表され、したがって特許請求の範囲の意味及び同等性の範囲内にあるすべての変更はそれに包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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