(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸を含み、前記式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸が、配列番号１〜１７のいずれかの配列からなることを特徴とするウサギ由来ＩｇＧに結合するＲＮＡ分子。
【化１】
0005846623.tif 000005
前記式（Ｉ）において、前記Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７は、ヌクレオチド残基を示し、各ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、それぞれ前記ヌクレオチド残基Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７の数を示し、
前記Ｎ１およびＮ７は、相互に水素結合してステム構造形成可能であり、前記Ｎ３およびＮ５は、相互に水素結合してステム構造を形成可能であり、前記Ｎ２およびＮ６は、インターナルループ構造を形成可能であり、前記Ｎ４は、ヘアピンループ構造を形成可能である。
ｍｉｎｉ３（配列番号１）
GGGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUCCC
ｍｉｎｉ３ｍ（配列番号２）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＣ（配列番号３）
GGGA[fC][fC]AGAAGUUUUUAAA[fC][fC]G[fC]G[fC][fC]UUGGAAG[fC]GUA[fC]GU[fC][fC][fC]
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＵ（配列番号４）
GGGACCAGAAG[fU][fU][fU][fU][fU]AAACCGCGCC[fU][fU]GGAAGCG[fU]ACG[fU]CCC
ｒｍ０１（配列番号５）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGG[mC]
ｒｍ０２（配列番号６）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]GCCUUGGAAG[mC]GUA[mC]GUGG[mC]
ｒｍ０３（配列番号７）
GCCAC[mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGGC
ｒｍ０４（配列番号８）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｄ０３（配列番号９）
GCCAC[dC]AGAAGUUUUUAAA[dC][dC]G[dC]G[dC][dC]UUGGAAGCGUA[dC]GUGGC
ｒｄ０６（配列番号１０）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCGAACGUGGC
ｒｍｄ０２（配列番号１１）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[mU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０３（配列番号１２）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０４（配列番号１３）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[dU]ACGUGGC
ｒｍｄ０５（配列番号１４）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]ACGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０６（配列番号１５）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]CCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄｅ０１（配列番号１６）
[lG][lC]CAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUG[lG][lC]
ｒｍｅ０１（配列番号１７）
[lG][lC]C[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACG[lG][lC]
配列番号３〜１７の配列において、[dC]または[dU]は、それぞれ、塩基がCまたはUであるデオキシリボヌクレオチド残基を示し、[lG]または[lC]は、それぞれ、塩基がGまたはCであるＬＮＡ残基を示し、[mC]または [mU]は、それぞれ、塩基がCまたはUであるメチル化リボヌクレオチド残基を示し、[fC]または[fU]は、それぞれ、塩基がCまたはUであるフルオロ化リボヌクレオチドを示す。
【請求項２】
前記式（Ｉ）において、前記ヌクレオチド残基の一部が、修飾化ヌクレオチド残基である、請求項１記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、メチル化ヌクレオチド残基、フルオロ化ヌクレオチド残基、アミノ化ヌクレオチド残基およびチオ化ヌクレオチド残基からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記式（Ｉ）において、前記ヌクレオチド残基の一部が、ＬＮＡおよびＤＮＡの少なくとも一方である、請求項１または２記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする、ウサギ由来ＩｇＧに対する結合剤。
【請求項６】
請求項５記載の結合剤を含むことを特徴とする、ウサギ由来ＩｇＧの検出試薬。
【請求項７】
請求項６記載の検出試薬を含むことを特徴とする、ウサギ由来ＩｇＧの検出キット。
【請求項８】
ウサギ由来ＩｇＧと請求項５記載の結合剤とを反応させる反応工程、および、
前記ウサギ由来ＩｇＧに結合した前記結合剤を検出する検出工程を含むことを特徴とするウサギＩｇＧの検出方法。
【請求項９】
試料中のターゲットと、前記ターゲットに対する抗体とを反応させる第１の反応工程、
前記ターゲットと前記抗体との複合体に、前記抗体に結合する結合剤とを反応させる第２の反応工程、および、
前記複合体に結合した前記結合剤を検出する検出工程を含み、
前記ターゲットに対する抗体として、ウサギ由来ＩｇＧを使用し、
前記結合剤として、請求項５記載の結合剤を使用することを特徴とする、ターゲットの検出方法。
【請求項１０】
前記第１の反応工程と前記第２の反応工程との間に、さらに、前記第１の反応の反応液から、前記ターゲットに未結合の前記抗体を除去する除去工程を含む、請求項９記載の検出方法。
【請求項１１】
前記第１の反応工程に先立って、前記試料中の前記ターゲットと前記試料中の他の成分とを分離する分離工程を含む、請求項９または１０記載の検出方法。
【請求項１２】
前記分離工程において、前記ターゲットを変性させる、請求項１１記載の検出方法。
【請求項１３】
前記分離工程が、試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥである、請求項１１または１２記載の検出方法。
【請求項１４】
前記第１の反応工程、前記第２の反応工程および前記検出工程が、ウエスタンブロット法である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウサギ由来ＩｇＧに結合するＲＮＡ分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応は、特異性の高い反応であることから、タンパク質等のターゲットの検出において、広く利用されている。例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）は、抗原抗体反応を利用して、以下のように行われる。まず、ターゲットを抗原とする抗体を、固相に固定化する。そして、前記固相に試料を接触させ、前記試料中のターゲットと前記固定化抗体とを、抗原抗体反応により結合させる。つぎに、前記固相に、ターゲットに結合する一次抗体を接触させる。前記一次抗体は、前記固定化抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を使用する。これによって、前記固相上に、前記固定化抗体と前記ターゲットと前記一次抗体との複合体が形成される。つぎに、前記固相から、未反応の試料および前記一次抗体を除去した後、前記固相に、前記一次抗体に結合する二次抗体を接触させる。前記二次抗体は、例えば、酵素等の標識物質で標識した標識化二次抗体を使用する。これによって、前記複合体に、さらに、前記標識化二次抗体が結合する。そして、前記固相から、未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記複合体に結合した前記標識化二次抗体の前記標識物質を検出する。前記標識物質が酵素の場合、例えば、発色試薬等を添加し、酵素反応による生成物を検出することで、前記標識物質を検出でき、間接的に、前記複合体における前記ターゲットを検出できる。
【０００３】
しかしながら、抗体は、以下のような問題が指摘されている。すなわち、抗体は、例えば、ウサギ等の被免疫動物に抗原を注入し、血清等から結合性を有する画分を分離することによって調製されるため、作業が煩雑であり、コストもかかる。また、抗体は、例えば、タンパク質等の抗原以外に、例えば、ポリプロピレン等のポリマー製容器にも非特異的に結合するため、検出精度の問題がある。また、前記標識化二次抗体の調製においては、酵素等の標識物質と前記抗体とのコンジュゲートを形成する必要があるが、その操作も煩雑である。
【０００４】
このような問題から、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。例えば、一次抗体であるウサギ由来ＩｇＧに結合可能な核酸分子として、抗体よりも高い結合力を示すＲＮＡ分子が報告されている（特許文献１参照）。前記二次抗体に代えて、このようなＲＮＡ分子を使用した場合、例えば、抗体における、ウサギ以外の動物由来ＩｇＧに対する結合、変性ＩｇＧへの結合等を防止できるため、抗体よりも優れた結合力および特異性を実現できる。
【０００５】
そして、このようなＲＮＡ分子を用いたターゲット検出の実用化においては、さらに優れた精度で簡易な検出を可能とすることが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１２５４８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、結合性、特異性および取り扱い性に優れる、ウサギ由来ＩｇＧに結合するＲＮＡ分子、ならびにその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のＲＮＡ分子は、下記一般式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸を含むことを特徴とするウサギ由来ＩｇＧに結合するＲＮＡ分子である。
【化１】
0005846623.tif 000002
前記式（Ｉ）において、前記Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７は、ヌクレオチド残基を示し、各ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、それぞれ前記ヌクレオチド残基Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７の数を示し、
前記Ｎ１およびＮ７は、相互に水素結合してステム構造形成可能であり、前記Ｎ３およびＮ５は、相互に水素結合してステム構造を形成可能であり、前記Ｎ２およびＮ６は、インターナルループ構造を形成可能であり、前記Ｎ４は、ヘアピンループ構造を形成可能である。
【０００９】
本発明の結合剤は、前記本発明のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする、ウサギ由来ＩｇＧに対する結合剤である。
【００１０】
本発明の検出試薬は、前記本発明の結合剤を含むことを特徴とする、ウサギ由来ＩｇＧの検出試薬である。
【００１１】
本発明の検出キットは、前記本発明の検出試薬を含むことを特徴とする、ウサギ由来ＩｇＧの検出キットである。
【００１２】
本発明のウサギＩｇＧの検出方法は、ウサギ由来ＩｇＧと前記本発明の結合剤とを反応させる反応工程、および、前記ウサギ由来ＩｇＧに結合した前記結合剤を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のターゲットの検出方法は、試料中のターゲットと、前記ターゲットに対する抗体とを反応させる第１の反応工程、前記ターゲットと前記抗体との複合体に、前記抗体に結合する結合剤とを反応させる第２の反応工程、および、前記複合体に結合した前記結合剤を検出する検出工程を含み、
前記ターゲットに対する抗体として、ウサギ由来ＩｇＧを使用し、
前記結合剤として、前記本発明の結合剤を使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＲＮＡ分子によれば、ウサギ由来ＩｇＧと優れた特異性で結合可能である。このため、例えば、前述のような二次抗体に代えて、本発明のＲＮＡ分子を使用することによって、より精度よくターゲットを検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜ＲＮＡ分子＞
本発明のＲＮＡ分子は、前述のように、下記一般式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸を含むことを特徴とするウサギ由来ＩｇＧに結合するＲＮＡ分子である。
【化１】
0005846623.tif 000003
前記式（Ｉ）において、前記Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７は、ヌクレオチド残基を示し、各ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、それぞれ前記ヌクレオチド残基Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７の数を示し、
前記Ｎ１およびＮ７は、相互に水素結合してステム構造形成可能であり、前記Ｎ３およびＮ５は、相互に水素結合してステム構造を形成可能であり、前記Ｎ２およびＮ６は、インターナルループ構造を形成可能であり、前記Ｎ４は、ヘアピンループ構造を形成可能である。
【００１６】
本発明において、「ウサギ由来ＩｇＧに結合する」とは、例えば、前記ウサギ由来ＩｇＧに対する結合能を有している、または、前記ウサギ由来ＩｇＧに対する結合活性を有しているともいう。本発明のＲＮＡ分子と前記ウサギ由来ＩｇＧとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ビアコアＸ（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。本発明のＲＮＡ分子は、ＲＮＡアプタマーともいう。
【００１７】
本発明のＲＮＡ分子は、前記ウサギ由来ＩｇＧとの解離定数が、例えば、５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは２５ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは１０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは７ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、特に好ましくは５ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１８】
本発明において、「ループ構造形成可能」とは、例えば、実際にループ構造を形成すること、およびループ構造が形成されていなくても、条件によってループ構造形成可能なことも含む。「ループ構造形成可能」であることは、例えば、実験的に確認した場合、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。本発明において、「ステム構造形成可能」とは、例えば、実際にステム構造を形成すること、およびステム構造が形成されていなくても、条件によってステム構造形成可能なことも含む。「ステム構造形成可能」であることは、例えば、実験的に確認した場合、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００１９】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前者の前記一本鎖核酸の場合、前記一本鎖核酸は、前記式（Ｉ）で表わされる構造を含む一本鎖核酸でもよいし、前記構造からなる一本鎖核酸でもよい。後者の二本鎖核酸の場合、一方の一本鎖核酸は、前記式（Ｉ）で表わされる構造を含む一本鎖核酸でもよいし、前記構造からなる一本鎖核酸でもよく、他方の一本鎖核酸は、特に制限されない。前記二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖核酸にすることが好ましい。また、前記式（Ｉ）で表わされる構造は、例えば、使用時において、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００２０】
本発明のＲＮＡ分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明のＲＮＡ分子は、例えば、リボヌクレオチド残基のみから構成されるＲＮＡでもよいし、１〜数個のデオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
【００２１】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、１〜数個の修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよく、前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化リボヌクレオチド残基および修飾化デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されたものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基またはデオキシリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００２２】
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２−チオウラシル、２−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００２３】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、１〜数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００２４】
前記式（Ｉ）において、例えば、前記デオキシリボヌクレオチド残基、前記修飾化ヌクレオチド残基および前記人工核酸モノマー残基の部位は、特に制限されない。
【００２５】
前記式（Ｉ）において、前記デオキシリボヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、１〜７７残基の範囲であり、１〜７６残基の範囲であり、好ましくは１〜２５残基の範囲であり、より好ましくは１〜５残基の範囲である。前記式（Ｉ）において、前記修飾化ヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、１〜７７残基の範囲であり、１〜７６残基の範囲であり、好ましくは１〜２５残基の範囲であり、より好ましくは１〜５残基の範囲である。前記式（Ｉ）において、前記人工核酸モノマー残基の数は、特に制限されず、例えば、１〜７７残基の範囲であり、１〜７６残基の範囲であり、好ましくは１〜２５残基の範囲であり、より好ましくは１〜５残基の範囲である。これらの残基は、例えば、前記式（Ｉ）において、連続してもよいし、非連続でもよい。
【００２６】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性であることが好ましい。本発明のＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性のため、前記デオキシリボヌクレオチド残基、前記修飾化ヌクレオチド残基および前記人工核酸モノマー残基の少なくともいずれかを有することが好ましい。また、本発明ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００２７】
前記式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、３９〜７７残基の範囲であり、３９〜７６残基の範囲であり、好ましくは３９〜７０残基の範囲であり、より好ましくは３９〜６０残基の範囲であり、特に好ましくは３９〜５０残基の範囲である。
前記Ｎ１のヌクレオチド残基数ｎ１は、特に制限されず、例えば、４〜１５残基の範囲であり、好ましくは４〜１０残基の範囲であり、より好ましくは４〜７残基の範囲であり、特に好ましくは４〜５残基の範囲である。
前記Ｎ２のヌクレオチド残基数ｎ２は、特に制限されず、例えば、４〜１５残基の範囲であり、好ましくは４〜１０残基の範囲であり、より好ましくは４〜７残基の範囲であり、特に好ましくは４〜５残基の範囲である。
前記Ｎ３のヌクレオチド残基数ｎ３は、特に制限されず、例えば、７〜１５残基の範囲であり、好ましくは７〜１２残基の範囲であり、より好ましくは７〜１０残基の範囲であり、特に好ましくは７〜８残基の範囲である。
前記Ｎ４のヌクレオチド残基数ｎ４は、特に制限されず、例えば、８〜１５残基の範囲であり、９〜１５残基の範囲であり、好ましくは９〜１３残基の範囲であり、より好ましくは９〜１１残基の範囲であり、特に好ましくは９〜１０残基の範囲である。
前記Ｎ５のヌクレオチド残基数ｎ５は、特に制限されず、例えば、７〜１５残基の範囲であり、好ましくは７〜１２残基の範囲であり、より好ましくは７〜１０残基の範囲であり、特に好ましくは７〜８残基の範囲である。
前記Ｎ６のヌクレオチド残基数ｎ６は、特に制限されず、例えば、４〜１５残基の範囲であり、好ましくは４〜１０残基の範囲であり、より好ましくは４〜７残基の範囲であり、特に好ましくは４〜５残基の範囲である。
前記Ｎ７のヌクレオチド残基数ｎ７は、特に制限されず、例えば、４〜１５残基の範囲であり、好ましくは４〜１０残基の範囲であり、より好ましくは４〜５残基の範囲であり、特に好ましくは４残基である。
前記各ヌクレオチド残基数ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、例えば、以下の等式および不等式を満たすことが好ましい。
ｎ１＝ｎ７、ｎ３＝ｎ５、（ｎ２＋ｎ６）＞ｎ４
【００２８】
前記一本鎖核酸の全長が前述のような範囲の場合、従来のウサギＩｇＧに結合するＲＮＡ分子と比較して、小型化されているといえる。このように小型化した一本鎖核酸を有するＲＮＡ分子は、例えば、合成が容易であり、コストの低減、標識物質およびリンカーの結合等の修飾も容易である。このため、本発明のＲＮＡ分子は、例えば、検出用試薬としての使用、検出用デバイスへの適用等に適しているといえる。
【００２９】
前記式（Ｉ）の具体例として、例えば、前記式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、４３残基であり、前記Ｎ１のヌクレオチド残基数ｎ１は、５残基であり、前記Ｎ２のヌクレオチド残基数ｎ２は、５残基であり、前記Ｎ３のヌクレオチド残基数ｎ３は、８残基であり、前記Ｎ４のヌクレオチド残基数ｎ４は、８残基であり、前記Ｎ５のヌクレオチド残基数ｎ５は、８残基であり、前記Ｎ６のヌクレオチド残基数ｎ６は、４残基であり、前記Ｎ７のヌクレオチド残基数ｎ７は、５残基である。このような一本鎖核酸を含むＲＮＡ分子は、例えば、下記配列からなるＲＮＡ分子または前記下記配列を含むＲＮＡ分子があげられる。
ｍｉｎｉ３（配列番号１）
GGGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUCCC
ｍｉｎｉ３ｍ（配列番号２）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
ｒｄ０６−未修飾（配列番号１８）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGAACGUGGC
ｒｍｄ０６−未修飾（配列番号１９）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCCCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
【００３０】
前記式（Ｉ）の具体例として、前記ｍｉｎｉ３（配列番号１）の二次構造を下記式（ＩＩ）に示す。
【化２】
0005846623.tif 000004
【００３１】
これらの配列番号の配列は、例えば、前記デオキシリボヌクレオチド残基、前記修飾化ヌクレオチド残基および前記人工核酸モノマー残基で置換されてもよい。置換された配列の具体例を以下に示す。下記配列において、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびｄＴ等の「ｄＮ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を示し、ｌＧおよびｌＣ等の「ｌＮ」は、ＬＮＡ残基を示し、ｍＣおよびｍＵ等の「ｍＮ」は、メチル化リボヌクレオチド残基を示し、ｆＣおよびｆＵ等の「ｆＮ」は、フルオロ化リボヌクレオチドを示す（以下、同様）。
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＣ（配列番号３）
GGGA[fC][fC]AGAAGUUUUUAAA[fC][fC]G[fC]G[fC][fC]UUGGAAG[fC]GUA[fC]GU[fC][fC][fC]
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＵ（配列番号４）
GGGACCAGAAG[fU][fU][fU][fU][fU]AAACCGCGCC[fU][fU]GGAAGCG[fU]ACG[fU]CCC
ｒｍ０１（配列番号５）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGG[mC]
ｒｍ０２（配列番号６）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]GCCUUGGAAG[mC]GUA[mC]GUGG[mC]
ｒｍ０３（配列番号７）
GCCAC[mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGGC
ｒｍ０４（配列番号８）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｄ０３（配列番号９）
GCCAC[dC]AGAAGUUUUUAAA[dC][dC]G[dC]G[dC][dC]UUGGAAGCGUA[dC]GUGGC
ｒｄ０６（配列番号１０）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCGAACGUGGC
ｒｍｄ０２（配列番号１１）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[mU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０３（配列番号１２）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０４（配列番号１３）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[dU]ACGUGGC
ｒｍｄ０５（配列番号１４）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]ACGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０６（配列番号１５）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]CCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄｅ０１（配列番号１６）
[lG][lC]CAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUG[lG][lC]
【００３２】
また、前記式（Ｉ）の具体例として、これらの他に、例えば、前記式（Ｉ）で表わされる一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、３９残基であり、前記Ｎ１のヌクレオチド残基数ｎ１は、３残基であり、前記Ｎ２のヌクレオチド残基数ｎ２は、５残基であり、前記Ｎ３のヌクレオチド残基数ｎ３は、８残基であり、前記Ｎ４のヌクレオチド残基数ｎ４は、８残基であり、前記Ｎ５のヌクレオチド残基数ｎ５は、８残基であり、前記Ｎ６のヌクレオチド残基数ｎ６は、４残基であり、前記Ｎ７のヌクレオチド残基数ｎ７は、３残基である。このような一本鎖核酸を含むＲＮＡ分子は、例えば、下記配列からなるＲＮＡ分子または前記下記配列を含むＲＮＡ分子があげられる。
ｒｍｅ０１−未修飾（配列番号２０）
[lG][lC]C[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACG[lG][lC]
【００３３】
前記配列番号の配列は、例えば、前記デオキシリボヌクレオチド残基、前記修飾化ヌクレオチド残基および前記人工核酸モノマー残基で置換されてもよい。置換された配列の具体例を以下に示す。下記配列において、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびｄＴ等の「ｄＮ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を示し、ｌＧおよびｌＣ等の「ｌＮ」は、ＬＮＡ残基を示し、ｍＣおよびｍＵ等の「ｍＮ」は、メチル化リボヌクレオチド残基を示す。
ｒｍｅ０１（配列番号１７）
[lG][lC]C[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACG[lG][lC]
【００３４】
本発明のＲＮＡ分子は、前記式（Ｉ）において、（Ｎ４）ｎ４から（Ｎ５）ｎ５にかけて、配列番号２１で表わされるモチーフを有することが好ましい。下記モチーフは、下記小文字の配列を、（Ｎ４）ｎ４の３’末端に有し、下記大文字の配列を（Ｎ５）ｎ５の５’末端に有することが好ましい。このようなモチーフを有するＲＮＡ分子は、例えば、前記配列番号１〜２０の塩基配列を含むＲＮＡ分子があげられる。
モチーフ（配列番号２１）
ｃｃＵＵＧＧＡＡ
【００３５】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、下記配列における下線を付した塩基が保存されていることが好ましい。
ｍｉｎｉ３（配列番号１）
GGGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUCCC
ｍｉｎｉ３ｍ（配列番号２）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
ｒｄ０６−未修飾（配列番号１８）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGAACGUGGC
ｒｍｄ０６−未修飾（配列番号１９）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCCCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
【００３６】
本発明のＲＮＡ分子は、前記式（Ｉ）において、（Ｎ３）ｎ３および（Ｎ５）ｎ５のステム構造と、（Ｎ４）ｎ４のヘアピンループ構造のリン酸基が保持されていることが好ましい。
【００３７】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、下記（Ａ１）〜（Ａ３）のＲＮＡ分子があげられる。
（Ａ１）配列番号１〜２０のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ分子
（Ａ２）配列番号１〜２０のいずれかの塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、且つ、前記ウサギＩｇＧに結合可能であるＲＮＡ分子
（Ａ３）配列番号１〜２０のいずれかで表わされる塩基配列と、９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、且つ、前記ウサギＩｇＧに結合可能であるＲＮＡ分子
【００３８】
前記（Ａ２）において、「１または複数」は、特に制限されない。「１または複数」は、前記配列番号１〜２０の塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記ウサギＩｇＧ結合核酸分子（Ａ１）の全長配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、前記天然塩基でもよいし、前記非天然塩基でもよい。前記塩基の置換、付加または挿入は、例えば、前記ヌクレオチド残基を用いてもよいし、前記人工核酸モノマー残基を用いてもよい。
【００３９】
前記相同性は、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
【００４０】
本発明のＲＮＡ分子において、前記ウサギＩｇＧは、例えば、サブタイプ１、サブタイプ２ａおよびサブタイプ３のいずれでもよい。
【００４１】
本発明において、マウス由来のＩｇＧ抗体のサブタイプは、特に制約はなく、例えば、サブタイプ１、サブタイプ２ａおよびサブタイプ３並びにこれらを任意に有する異なるサブタイプを有するＩｇＧ抗体を混合したものがあげられる。
【００４２】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、ＲＮＡ分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、具体的には、前記式（Ｉ）の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは、５’末端である。
【００４３】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、ビオチンおよびその誘導体；アビジンおよびその誘導体；蛍光団；酵素；放射性同位元素；チオール基およびアミノ基等の官能基；メチレンブルー等の電子受容体；ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の電子供与体；有機化合物、無機化合物、ルテニウム等の電気化学発光物質等があげられ、中でも、ビオチンが好ましい。前記蛍光団は、特に制限されず、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルクロリドおよびその誘導体、ウンベリフェロン等があげられる。前記酵素は、特に制限されず、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ等があげられる。放射性同位元素は、特に制限されず、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、リン（３２Ｐ）、イオウ（３５Ｓ）、金属類（例えば６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、９９Ｔｃ、１３３Ｘｅ等）、トリチウム等があげられる。前記標識物質は、その他に、例えば、ＮＡＤＨ、ＦＭＮＨ２等の電子供与体、アクリジニウムエステル、ルミノール等の発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質、ＧＦＰ等の生体蛍光蛋白質等があげられる。
【００４４】
本発明のＲＮＡ分子の製造方法は、何ら制限されず、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。また、本発明のＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡプールとウサギ由来ＩｇＧを用いて、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により得ることもできる。
【００４５】
本発明のＲＮＡ分子は、前述のように、前記ウサギＩｇＧに結合性を示す。このため、本発明のＲＮＡ分子の用途は、前記ウサギＩｇＧへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明のＲＮＡ分子は、例えば、前記ウサギＩｇＧに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００４６】
本発明のＲＮＡ分子によれば、例えば、前記ウサギＩｇＧを検出できる。例えば、前記ＲＮＡ分子と前記ウサギＩｇＧとを反応させ、前記ＲＮＡ分子と前記ウサギＩｇＧとの複合体を形成させ、前記複合体における前記ＲＮＡ分子を検出することによって、行うことができる。また、ターゲットに結合する前記ウサギＩｇＧと併用することによって、前記ターゲットの検出を行うこともできる。例えば、ターゲットと前記ウサギＩｇＧとを反応させ、前記ターゲットと前記ウサギＩｇＧとを結合させ、複合体を形成する。そして、前記複合体に前記ウサギＩｇＧを介して前記ＲＮＡ分子を結合させ、前記結合したＲＮＡ分子を検出することによって、間接的に前記ターゲットを検出できる。前記ウサギＩｇＧならびに前記ターゲットの検出方法は、特に制限されない。具体例については、後述する。
【００４７】
本発明のＲＮＡ分子によれば、例えば、前記ウサギＩｇＧを精製することができる。前記ウサギＩｇＧの精製は、例えば、前記ＲＮＡ分子と前記ウサギＩｇＧの非精製画分とを接触させ、前記ＲＮＡ分子と前記ウサギＩｇＧとの複合体を形成させ、前記ＲＮＡ分子に対する非結合物質を除去し、前記複合体を回収することによって、行うことができる。
【００４８】
本発明のＲＮＡ分子をウサギ由来ＩｇＧの精製に用いる場合、例えば、前記ＲＮＡ分子を、固相に結合して使用してもよい。前記固相の形状は、例えば、ビーズがあげられ、前記固相の材質は、例えば、アガロース製、合成樹脂製等があげられる。前記ＲＮＡ分子の固相への結合方法は、特に制限されず、例えば、前記ＲＮＡ分子および前記固相のいずれか一方をビオチン化し、他方をアビジン化し、アビジン−ビオチン結合により結合させる方法等があげられる。このため、本発明のＲＮＡ分子は、例えば、ビオチン化またはアビジン化等、種々の改変を施されてもよい。
【００４９】
＜結合剤等＞
本発明の結合剤は、前述のように、前記本発明のＲＮＡ分子を含むことを特徴とするウサギ由来ＩｇＧに対する結合剤である。本発明の結合剤は、前記本発明のＲＮＡ分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の結合剤を使用すれば、前述のように、例えば、前記ウサギＩｇＧおよび前記ターゲットの検出および前記ウサギＩｇＧの精製等を行うことができる。
【００５０】
本発明の検出試薬は、前述のように、前記本発明の結合剤を含むことを特徴とするウサギ由来ＩｇＧの検出試薬である。本発明の検出試薬は、前記本発明の結合剤を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、前記ウサギＩｇＧおよび前記ターゲットの検出等を行うことができる。
【００５１】
本発明の検出キットは、前述のように、本発明の検出試薬を含むことを特徴とするウサギ由来ＩｇＧの検出キットである。本発明の検出キットは、前記本発明の検出試薬を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。前記検出キットは、さらに、前記ウサギ由来ＩｇＧの検出に使用できる他の試薬を含んでもよい。前記他の試薬は、特に制限されず、例えば、後述する本発明の検出方法において使用可能な試薬があげられる。前記本発明の検出試薬と前記他の試薬は、例えば、同じ容器に収容されてもよく、別個の容器に収容されてもよい。前記検出キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【００５２】
＜ウサギ由来ＩｇＧの検出方法＞
本発明のウサギ由来ＩｇＧの検出方法は、ウサギ由来ＩｇＧと前記本発明の結合剤とを反応させる反応工程、および、前記ウサギ由来ＩｇＧに結合した前記結合剤を検出する検出工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記ウサギ由来ＩｇＧに、前記本発明の結合剤、すなわち、本発明のＲＮＡ分子を結合させることが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００５３】
前記ウサギ由来ＩｇＧに結合した前記結合剤の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記結合剤における前記ＲＮＡ分子に標識物質を結合し、前記標識物質を検出することよって、前記結合剤を検出できる。前記標識物質は、特に制限されず、前述のような物質があげられる。前記ウサギ由来ＩｇＧに結合した前記結合剤の検出方法は、後述の本発明のターゲットの検出方法における説明を引用できる。
【００５４】
＜ターゲットの検出方法＞
本発明のターゲットの検出方法は、前述のように、試料中のターゲットと、前記ターゲットに対する抗体とを反応させる第１の反応工程、前記ターゲットと前記抗体との複合体に、前記抗体に結合する結合剤とを反応させる第２の反応工程、および、前記複合体に結合した前記結合剤を検出する検出工程を含み、
前記ターゲットに対する抗体として、ウサギ由来ＩｇＧを使用し、前記結合剤として、前記本発明の結合剤を使用することを特徴とする。
【００５５】
本発明の検出方法は、前記ターゲットと前記抗体との複合体を検出するにあたって、前記本発明の結合剤を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。前記本発明の結合剤は、例えば、公知の二次抗体に代えて使用できる。
【００５６】
本発明の検出方法は、例えば、前記第１の反応工程と前記第２の反応工程との間に、さらに、前記第１の反応の反応液から、前記ターゲットに未結合の前記抗体を除去する除去工程を含むことが好ましい。前記ターゲットに未結合の前記抗体の除去によって、例えば、前記未結合の前記抗体への前記結合剤の結合を除去できるため、さらに検出精度を向上できる。前記除去工程は、例えば、前記ターゲットを固相に固定化し、前記抗体を接触させた後、前記固相を洗浄することにより、行うことが好ましい。前記ターゲットの固定化により、例えば、前記未反応の前記抗体の他に、前記試料に含まれる他の物質も除去できる。前記ターゲットの固定化は、特に制限されず、例えば、メンブランへの固定化等があげられる。前記メンブランへの固定化は、例えば、泳動ゲルを用いて前記試料を電気泳動し、前記泳動ゲルからメンブランへのブロッティングにより行うことができる。前記電気泳動は、特に制限されず、例えば、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥがあげられ、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【００５７】
本発明の検出方法は、例えば、前記第１の反応工程に先立って、前記試料中の前記ターゲットと前記試料中の他の成分とを分離する分離工程を含むことが好ましい。前記ターゲットと前記他の成分との分離によって、例えば、さらに検出精度を向上できる。前記分離工程は、例えば、前記試料の電気泳動により行うことができる。前記試料の電気泳動は、例えば、特に制限されず、前述と同様である。前記試料を電気泳動することによって、例えば、前記試料の前記ターゲットと前記他の成分とを分離でき、さらに、前記メンブランへの固定化を行うことで、例えば、前記未反応の前記抗体を除去できる。前記分離工程において、前記ターゲットおよび前記他の成分を変性させることが好ましく、具体的には、前記試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することが好ましい。
【００５８】
本発明の検出方法は、例えば、前記第２の反応工程と前記検出工程との間に、さらに、前記第２の反応の反応液から、前記複合体における前記ウサギ由来ＩｇＧに未結合の前記結合体を除去する除去工程を含むことが好ましい。前記未結合の前記結合体の除去によって、例えば、さらに検出精度を向上できる。
【００５９】
本発明の検出方法は、例えば、ノースウェスタン法に準じて行うことができ、例えば、前記第１の反応工程、前記第２の反応工程および前記検出工程が、ウエスタンブロット法であることが好ましい。
【００６０】
本発明において、試料は、特に制限されず、例えば、溶液、懸濁液、分散液等の液体系でもよいし、細胞、組織等の固体系でもよい。
【００６１】
本発明の検出方法について、一例をあげて説明する。なお、本発明は、前記ターゲットと前記本発明のＲＮＡ分子との結合を利用すればよく、以下の例には、制限されない。
【００６２】
まず、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、メンブランにブロッティングする。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件およびブロッティングの条件、使用するメンブランは、特に制限されず、公知の方法よび材料が使用できる。
【００６３】
つぎに、前記メンブランに、前記ターゲットに結合するウサギ由来ＩｇＧを接触させる。これによって、前記メンブランに固定化された前記ターゲットと前記ウサギ由来ＩｇＧとが結合し、複合体を形成する。前記ターゲットと前記ウサギ由来ＩｇＧとの反応後、前記メンブランを洗浄し、未反応の前記ウサギ由来ＩｇＧおよび前記試料に含まれる他の成分を除去する。
【００６４】
続いて、前記メンブランに、前記本発明の結合剤を接触させる。これによって、前記メンブラン上の前記複合体における前記ウサギ由来ＩｇＧに、前記本発明の結合剤が結合する。前記ウサギ由来ＩｇＧと前記結合剤との反応後、前記メンブランを洗浄して、前記ウサギ由来ＩｇＧと未反応の前記結合剤を除去する。
【００６５】
そして、前記複合体における前記ウサギ由来ＩｇＧに結合した前記結合剤を検出する。前記結合剤の検出によって、間接的に、前記複合体における前記ターゲットを検出できる。前記結合剤の検出は、特に制限されず、前記ＲＮＡ分子に応じて適宜決定できる。前記ＲＮＡ分子は、前述のように標識物質で標識化されていることが好ましく、前記標識物質の種類に応じて適宜決定できる。前記標識物質が、例えば、酵素の場合、前記メンブランに、前記酵素に対する基質を添加し、酵素反応による生成物を検出することで、前記標識物質を検出し、間接的にターゲットを検出することができる。このような検出によって、前記ターゲットの定性および定量が可能である。
【００６６】
また、ターゲットの検出方法は、例えば、前記第１の反応工程において、前記試料中のターゲットと前記抗体とを反応させた後、前記第１の反応の反応液を電気泳動に供し、メンブランへのブロッティングを行った後、前記本発明の結合剤を前記メンブランに接触させてもよい。
【実施例】
【００６７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００６８】
［実施例１］
ＲＮＡアプタマーを作製し、ＳＰＲ解析により、ウサギＩｇＧに対する結合能を確認した。
【００６９】
（１）ＲＮＡアプタマー
下記配列番号のＲＮＡアプタマーの３’末端に、タグとして２４塩基長のポリｄＡを付加し、タグ付加ＲＮＡアプタマーを作製した。
ｍｉｎｉ３（配列番号１）
GGGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUCCC
ｍｉｎｉ３ｍ（配列番号２）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＣ（配列番号３）
GGGA[fC][fC]AGAAGUUUUUAAA[fC][fC]G[fC]G[fC][fC]UUGGAAG[fC]GUA[fC]GU[fC][fC][fC]
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＵ（配列番号４）
GGGACCAGAAG[fU][fU][fU][fU][fU]AAACCGCGCC[fU][fU]GGAAGCG[fU]ACG[fU]CCC
ｒｍ０１（配列番号５）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGG[mC]
ｒｍ０２（配列番号６）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]GCCUUGGAAG[mC]GUA[mC]GUGG[mC]
ｒｍ０３（配列番号７）
GCCAC[mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGGC
ｒｍ０４（配列番号８）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｄ０３（配列番号９）
GCCAC[dC]AGAAGUUUUUAAA[dC][dC]G[dC]G[dC][dC]UUGGAAGCGUA[dC]GUGGC
ｒｄ０６（配列番号１０）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCGAACGUGGC
ｒｍｄ０２（配列番号１１）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[mU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０３（配列番号１２）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０４（配列番号１３）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[dU]ACGUGGC
ｒｍｄ０５（配列番号１４）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]ACGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０６（配列番号１５）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]CCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄｅ０１（配列番号１６）
[lG][lC]CAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUG[lG][lC]
ｒｍｅ０１（配列番号１７）
[lG][lC]C[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACG[lG][lC]
【００７０】
また、比較例として、下記配列番号のＲＮＡアプタマーの３’末端に、タグとして２４塩基長のポリＡを付加し、タグ付加ＲＮＡアプタマーを作製した。
Ｒ１０（配列番号２２）
GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUUGGCCCUUUCCUCUCUCCUCCUUCUUCU
【００７１】
（２）ＳＰＲ解析
ＳＰＲ解析は、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００(商品名、ＢＩＡＣＯＲＥ社製)、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．１、ＢＩＯＡＣＯＲＥ社製)を用いて行った。解離定数ＫＤ値は、前記ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅのｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅｓ（１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ)で、データをフィッティングして算出した。
【００７２】
まず、チップ（商品名Ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ社製）に、５μｍｏｌ／Ｌ  ビオチン化ポリｄＴを、流速２μＬ／ｍｉｎで１０分間添加した。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のポリｄＴの５’末端をビオチン化したものを使用した。これによって、前記チップ上に、ビオチン化ポリｄＴ  約１，０００ＲＵを固定化した。前記チップに、４００ｎｍｏｌ／Ｌ  前記タグ付加ＲＮＡアプタマーを、流速２μＬ／ｍｉｎで１０分間添加した。これによって、前記チップ上の前記ビオチン化ポリｄＴに、前記タグ付加ＲＮＡアプタマー  約２，０００ＲＵをハイブリダイゼーションさせた。つぎに、前記タグ付加ＲＮＡアプタマーが固定化された前記チップに、所定濃度の抗マウスＩｇＧウサギＩｇＧ（ポリクローナル抗体、商品名ａｎｔｉ  ＧＳＴ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ：ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を、流速２０μＬ／ｍｌで２分間添加した。前記ウサギＩｇＧの所定濃度は、最終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌおよび１２．５ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、前記タグ付加ＲＮＡアプタマーと前記ウサギＩｇＧとの結合反応速度を測定した後、３分間Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ［ｐＨ７．４］、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）を流入し、前記タグ付加ＲＮＡアプタマーからの前記ウサギＩｇＧの解離を、解離反応速度として測定した。なお、解離反応速度の測定後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨの添加により、前記チップ上から前記タグ付加ＲＮＡアプタマーと前記ウサギＩｇＧの複合体を解離し、再度、前述と同様にして、前記タグ付加ＲＮＡアプタマーのハイブリダイゼーション、前記ウサギＩｇＧの結合および解離を、一連の工程として、繰り返し行った。下記表１に、これらの結果を示す。
【００７３】
（表１）
ＲＮＡアプタマー        配列番号      解離定数ＫＤ
（ｎｍｏｌ／Ｌ）  
ｍｉｎｉ３                １            ２２．４
ｍｉｎｉ３ｍ              ２            ３０．８
ｒｍ０２                  ６            ５０．７
ｒｍ０４                  ８            ３７
ｒｄ０６                １０            ４５．３
ｒｍｄ０２              １１            ３１
ｒｍｄ０３              １２            ２９
ｒｍｄ０４              １３            ４０
ｒｍｄ０５              １４            ２７．３
ｒｍｄ０６              １５            ２６．１
ｒｍｄｅ０１            １６            ２４．３
ｒｍｅ０１              １７            ２２．９    
比較例ＲＮＡアプタマー  ２２            ５１．５    
【００７４】
前記表１に示すように、本発明のＲＮＡアプタマーによれば、比較例のＲＮＡアプタマーよりも優れた結合力を示すことがわかった。
【００７５】
［実施例２］
（１）ＲＮＡアプタマー
下記配列番号のＲＮＡアプタマーの３’末端に、タグとして２４塩基長のポリｄＡを付加し、タグ付加ＲＮＡアプタマーを作製した。
ｍｉｎｉ３（配列番号１）
GGGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUCCC
ｍｉｎｉ３ｍ（配列番号２）
GCCACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUGGC
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＣ（配列番号３）
GGGA[fC][fC]AGAAGUUUUUAAA[fC][fC]G[fC]G[fC][fC]UUGGAAG[fC]GUA[fC]GU[fC][fC][fC]
Ｒ１０＿Ｍ３−ｆＵ（配列番号４）
GGGACCAGAAG[fU][fU][fU][fU][fU]AAACCGCGCC[fU][fU]GGAAGCG[fU]ACG[fU]CCC
ｒｍ０１（配列番号５）
G[mC][mC]A[mC][mC]AGAAGUUUUUAAA[mC][mC]G[mC]G[mC][mC]UUGGAAGCGUA[mC]GUGG[mC]
【００７６】
（２）ＳＰＲ解析
前記チップ上の前記ビオチン化ポリｄＴに、前記タグ付加ＲＮＡアプタマー  約３，０００ＲＵをハイブリダイゼーションさせ、前記タグ付加ＲＮＡアプタマーが固定化された前記チップに、アナライトとして８００ｎｍｏｌ／Ｌの抗マウスＩｇＧウサギＩｇＧ（ポリクローナル抗体、商品名ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ：ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を添加し、Ｂｕｆｆｅｒとして、異なる組成のＢｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ［ｐＨ７．４］、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、解析を行った。
【００７７】
下記表２に、前記アナライトの添加開始から１２０秒のＲＵ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｕｎｉｔｓ）を示す。
【００７８】
（表２）
ＲＮＡアプタマー        配列番号        ＲＵ        
ｍｉｎｉ３                １          １６６６
Ｒ１０                  ２２            ２８３
【００７９】
小型化アプタマーｍｉｎｉ３は、アプタマーＲ１０と比較して、非常に高い結合量を示し、具体的には、約５．８９倍に結合量が増加した 。ＳＰＲ解析では、一般に、固定化した分子の分子量に反比例して、シグナル上昇がみられる。Ｒ１０の分子量は、ｍｉｎｉ３の分子量の１．７７倍であるため、理論的には、ｍｉｎｉ１０のみかけ上のシグナルは、約１．７７倍に増加すると推測される。しかしながら、実際には、ｍｉｎｉ３のシグナルは、約５．８９倍に増加した。これは、Ｒ１０における結合に関与しない塩基配列が、ウサギＩｇＧとアプタマーの結合を阻害していたことを示唆している。そして、ｍｉｎｉ３は、不要な塩基配列が排除されたことによって、ウサギＩｇＧに対するアプタマーの結合量が増加したと考えられた。
【００８０】
［実施例３］
ＲＮＡアプタマーについて、血清中の安定性を評価した。
【００８１】
（１）ＲＮＡアプタマー
下記配列番号のＲＮＡアプタマーを作製した。これらのＲＮＡアプタマーを、それぞれ、濃度０．１５ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳに希釈し、これを以下の評価に使用した。前記ＴＢＳの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．９％  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２とした。
ｍｉｎｉ３（配列番号１）
GGGACCAGAAGUUUUUAAACCGCGCCUUGGAAGCGUACGUCCC
ｒｍｄ０２（配列番号１１）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[mU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０３（配列番号１２）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[mU]ACGUGGC
ｒｍｄ０４（配列番号１３）
GCCAC[dC]AGAAGUUUU[dU]AAAC[dC]GCGCCUUGGAAGCG[dU]ACGUGGC
【００８２】
（２）血清
ウサギ血清  （ＳＩＧＭＡ  ＃４５０５、シグマ社製）を、ＴＢＳで１／１００希釈して、希釈血清を調製した。前記ＴＢＳ（ｐＨ７．４）の組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．９％  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２とした。
【００８３】
（３）評価方法
前記ＲＮＡアプタマー０．１ｍＬを、前記希釈血清０．１ｍＬと混合して、前記混合液を室温で放置した。そして、放置開始（０分）、開始から３０分後、１時間後、２時間後、４時間後に、前記混合液のサンプリングを行い、電気泳動に供した。電気泳動の条件は、以下の通りとした。電気泳動後のゲルを、ＵＶトランスイルミネーター上で撮影し、撮影したデータを用いて前記ＲＮＡアプタマー全長（４３ｍｅｒ）のバンドを、画像解析ソフトＩｍａｇｅ−Ｊ（フリーソフトウェア、ＮＩＨ製）のデンシトメトリによりシグナル強度を数値化した。そして、０分の結果を１００％とした場合のシグナル強度の相対値を求め、前記相対値が５０％を示す時間を半減期とした。
【００８４】
（電気泳動の条件）
ゲル組成：１５％  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、７ｍｏｌ／Ｌ  Ｕｒｅａ  ｉｎ  １×ＴＢＥ
サンプルのロード量：３０ｎｇ／ｌａｎｅ
泳動条件：２００Ｖ  定電圧、８５ｍｉｎ
染色：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ染色
【００８５】
ウサギ血清中の安定性の結果を下記表３に示す。アプタマー全長のバンドを、前記画像解析ソフトで数値化した結果、下記表３に示すように、ｍｉｎｉ３は、１／１００希釈ウサギ血清中で、半減期が約１５分であった。そして、修飾アプタマーｒｍｄ０２、ｒｍｄ０３およびｒｍｄ０４は、半減期が２〜３時間であった。このように、ｍｉｎｉ３は、修飾することで、血清中における分解耐性がより一層向上していることが示唆された。
【００８６】
（表３）
アプタマー                    半減期（分）    
ｍｉｎｉ３                        １５
ｒｍｄ０２                      １８０
ｒｍｄ０３                      １３５
ｒｍｄ０４                      １５０
【００８７】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のＲＮＡ分子によれば、ウサギ由来ＩｇＧと優れた特異性で結合可能である。このため、例えば、前述のような二次抗体に代えて、本発明のＲＮＡ分子を使用することによって、より精度よくターゲットを検出することができる。このため、本発明のＲＮＡ分子は、例えば、新たな研究用ツールとしても有用である。
【配列表】
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