(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属からなる群から選択される少なくとも2種の細菌株と、1種または複数のプレバイオティクス物質とを含むシンバイオティクス組成物において、
-  前記細菌株の少なくとも1種が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種のBif LU10 (寄託番号LMG P-26117)であって、デンプンを分解することができ、
-  少なくとも1種のプレバイオティクス物質が、デンプンである
ことを特徴とするシンバイオティクス組成物。
【請求項２】
デンプンが、難消化性デンプン(RS)および/または可溶性デンプン(SS)である、請求項1に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項３】
前記細菌株の1種が、非デンプン分解株である、請求項1または2に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項４】
非デンプン分解細菌株が、ラクトバチルス・パラカゼイ種のものである、請求項3に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項５】
非デンプン分解細菌株が、LAB LU33(寄託番号LMG P-26118)である、請求項3に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項６】
株LAB LU23(寄託番号LMG P-26119)、LAB LU28(寄託番号LMG P-26120)、BIF LU29(寄託番号LMG P-26115)、および/またはBIF LU30(寄託番号LMG P-26116)のうち1種または複数をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項７】
少なくともLAB LU33(寄託番号LMG P-26118)、およびBIF LU30(寄託番号LMG P-26116)を含む、請求項6に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項８】
少なくともLAB LU33(寄託番号LMG P-26118)、BIF LU30(寄託番号LMG P-26116)、およびLAB LU28(寄託番号LMG P-26120)を含む、請求項6に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項９】
前記細菌株のうち1種または複数が、その生産の間に酸、胆汁および/またはムチンに曝露されている、請求項1から8のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１０】
二糖、オリゴ糖、および/または多糖からなる群のプレバイオティクス物質をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１１】
対象の腸粘膜のコロニー形成において使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１２】
対象における抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症の予防、治療、症状の寛解、および/またはその再発の予防において使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１３】
抗生物質関連下痢(AAD)が、クロストリジウム・ディフィシルにより誘発される、請求項12に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１４】
胃腸病原体による感染症が、サルモネラ属、カンピロバクター・ジェジュニ、広域スペクトルベータラクタマーゼ産生(ESBL)大腸菌に起因する、請求項12に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１５】
対象が哺乳動物である、請求項11から14のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１６】
対象の腸粘膜のコロニー形成のための、請求項1から10のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物を含む薬物。
【請求項１７】
抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を治療するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のシンバイオティクス組成物を含む薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み合わせると相乗的挙動を示す、プロバイオティクス細菌株およびプレバイオティクス物質を含むシンバイオティクス組成物に関する。相乗作用組成物は、常在性細菌叢を刺激して、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する他の腸管感染症ならびにそれらの再発の後にin vivoで腸管様条件を回復および再構成し、加えて、前記障害を予防するであろう。
【背景技術】
【０００２】
腸内微生物叢は、身体の内在的な代謝および様々な免疫機能に重要な役割を有する真性の「体外器官」を構成する。この「器官」は、無菌動物の胃腸(GI)管ではどうしても達成できない独自の消化機能を行う。しかし、GIおよび微生物叢は一体的に、細菌種と宿主との間に複雑な代謝のクロストークを形成する。
【０００３】
通常、腸粘液層は、病原体の侵入およびコロニー形成から上皮を保護し、上皮により産生される抗菌因子と正常腸管内微生物叢の株が共在するマトリクスとして機能する。この粘液層は、微生物叢の管腔区画化を達成する緩衝帯(buffer zone)を構成し、細菌株と腸上皮との間のクロストークによる分子の交換のための通信回線(communication line)を確立する(Sansonetti、Mucosal Immunol、2011、4:8〜14)。
【０００４】
今日、人間医学および獣医学における抗生物質使用の増加は、メチシリン抵抗性ブドウ球菌(Staphylococci)(MRSAおよびMRSE)、広域スペクトルβ-ラクタマーゼ産生腸内細菌科(Enterobacteriaceae)(ESBL)、バンコマイシン抵抗性腸球菌属の種(Enterococcus spp)(VRE)、クラリスロマイシン抵抗性ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、バンコマイシン抵抗性クロストリジウム・ディフィシル(Clostridum difficile)(CD)、キノロン抵抗性カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)およびカンジダ属(Candida)の種の様々な株等、腸管における抗生物質抵抗性株の重大な増幅をもたらす。
【０００５】
CDは、常在性正常腸管内菌叢の一部に少量存在するが、常在性ヒト腸管内細菌叢を破壊するクリンダマイシン、セファロスポリン、およびフルオロキノロン等の広域性抗生物質は、毒素を産生するCDの腸管内異常増殖の原因となり粘膜における腸細胞を死滅させ、重度の症例においては高い死亡率の偽膜性大腸炎をもたらす下痢を誘発するであろう。伝染性CD株NAP1/027は、今までに単離されたことのある院内分離株よりも実質的に多量の毒素Aおよび毒素Bを産生し、高い病原性を有する。
【０００６】
腸管内微生物叢は、宿主と共生的に作用する複雑な生態系である。腸内ビフィズス菌(bifidobacteria)(Bif)の種は、結腸における炭水化物代謝のための非常に多数の遺伝子を保有し、一方、乳酸桿菌(lactobacilli)は、小腸における優勢な乳酸菌(LAB)である。
【０００７】
プレバイオティクス発酵は、結腸の局所的pHを低下させる酢酸、酪酸および乳酸等の短鎖脂肪酸(SCFA)を産生する。さらに、プレバイオティクスおよび食物繊維は、LABおよびビフィズス菌の高い細胞密度への繁殖に役立ち、殺菌物質、抗酸化因子を産生し、粘膜炎症を低下させ、結腸粘膜統合性を維持し、強力な宿主抗炎症性応答を促進することにより、上述の前記腸管病原体の増殖を抑制する。競合的排除は、侵入病原体に対する抗菌防御の別の機序である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sansonetti、Mucosal Immunol、2011、4:8〜14
【非特許文献２】http://bccm.belspo.be
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
プロバイオティクスおよびプレバイオティクスの用語の現在の使用は通常、宿主に望ましい特定の有益な効果に基づきプロバイオティクスが選択され、常在性細菌叢の増殖を刺激するようプレバイオティクスが選択される、相補的シンバイオティクス概念に関連する。しかし、本発明は、宿主における特定の有益な効果を有するプロバイオティクス株の増殖を刺激するようプレバイオティクスが選択される、新規相乗的概念のアプローチを用いる。これは、有益な宿主GI微生物叢のレベルを増加させることもできるが、主要標的は、摂取したプロバイオティクス株の増殖を刺激することである。共培養は、ヒト腸管におけるプレバイオティクスオリゴ糖および他の非消化性炭水化物の利用が乏しい組成物における他のパートナーを刺激する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の態様は、ラクトバチルス属(Lactobacillus)およびビフィドバクテリウム属からなる群から選択される少なくとも2種の細菌株と、1種または複数のプレバイオティクス物質とを含むシンバイオティクス組成物において、
-  細菌株の少なくとも1種が、デンプンを分解することができ、
-  少なくとも1種のプレバイオティクス物質が、デンプンである
ことを特徴とするシンバイオティクス組成物に関する。
【００１１】
有利には、デンプンを分解することのできる細菌株は、ビフィドバクテリウム属、またはBif LU10等、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)種のものである。
【００１２】
有利には、デンプンは、難消化性デンプン(RS)および/または可溶性デンプン(SS)である。
【００１３】
有利には、前記細菌株の1種は、非デンプン分解株、またはLAB LU33等、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)種のものである。
【００１４】
有利には、シンバイオティクス組成物は、少なくともBif LU10と、株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29および/またはBIF LU30のうち1種または複数とを含み、あるいは少なくともBif LU10およびLAB LU33、あるいは少なくともBIF LU10、LAB LU33およびBIF LU30、あるいは少なくともBIF LU10、LAB LU33、BIF LU30およびLAB LU28を含む。
【００１５】
有利には、酸への曝露が、細菌株の増殖の間の15〜150分間、好ましくは20〜140分間、より好ましくは30〜130分間、より好ましくは40〜120分間、pH2〜5、好ましくはpH2.5〜4.5、より好ましくはpH3〜4へ培養ブロスのpHを低下させることを伴い、胆汁への曝露が、0.1〜2.5%(wt/vol)、好ましくは0.5〜2%、より好ましくは1.0〜1.5%タウロコール酸ナトリウム、または1〜10%(vol/vol)、好ましくは2〜7%、より好ましくは3〜5%ブタ胆汁の存在下で、2〜8時間、好ましくは2.5〜7時間、より好ましくは3〜6時間、細菌株を増殖させることを伴い、ムチンへの曝露が、0.01〜1%(vol/vol)、好ましくは0.03〜0.7%、より好ましくは0.05〜0.5%ムチンの存在下で、2〜8時間、好ましくは2.5〜7時間、より好ましくは3〜6時間、細菌株を増殖させることを伴うように、細菌株のうち1種または複数は、その生産の間に酸、胆汁および/またはムチンに曝露されている。
【００１６】
有利には、シンバイオティクス組成物は、二糖、オリゴ糖および/または多糖からなる群のプレバイオティクス物質をさらに含み、二糖は、ラクツロースであり、オリゴ糖は、フルクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、キトサンオリゴ糖(キオース(chiose))、イソマルトースオリゴ糖(IMOS)、アラビアゴム、ダイズおよびペクチンオリゴ糖からなる群のものであり、多糖は、ペクチン、キシラン、イヌリン、キトサンおよび/またはβ-グルカンからなる群のものである。
【００１７】
有利には、シンバイオティクス組成物は、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、イソマルトースオリゴ糖(IMOS)、フルクトオリゴ糖(FOS)および/またはラクツロースからなる群のプレバイオティクス物質をさらに含む。
【００１８】
有利には、シンバイオティクス組成物は、ガラクトオリゴ糖(GOS)および/またはイソマルトオリゴ糖(Isomaltooligosaccharide)(IMOS)をさらに含む。
【００１９】
上述のシンバイオティクス組成物は、対象の腸粘膜のコロニー形成において、ならびに対象における抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症の予防、治療、症状の寛解、および/またはその再発の予防において有利に使用される。
【００２０】
抗生物質関連下痢(AAD)は、クロストリジウム・ディフィシルにより誘発される。
【００２１】
胃腸病原体による感染症は、サルモネラ属(Salmonella)、カンピロバクター・ジェジュニ、広域スペクトルベータラクタマーゼ産生(ESBL)大腸菌(E. coli)に起因する。
【００２２】
有利には、対象は、ヒト、非ヒト霊長類動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ、イヌ、ネコ、齧歯動物ならびにモルモットからなる群の哺乳動物等の、哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。
【００２３】
上述のシンバイオティクス組成物は、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を予防する、治療する、その症状を寛解する、およびその再発を予防するために、対象の腸粘膜のコロニー形成において使用するための薬物の製造において使用することができる。
【００２４】
上述のシンバイオティクス組成物は、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を患う対象の治療において使用するための薬物の製造のために使用することができる。
【００２５】
上述のシンバイオティクス組成物は、有効用量のシンバイオティクス組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、対象の腸粘膜のコロニー形成のための方法において使用することができる。
【００２６】
上述のシンバイオティクス組成物は、有効用量のシンバイオティクス組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症に関して対象を治療するための方法において使用することができる。
【００２７】
定義
本発明において用いられている用語は、一般に、微生物学および生化学の技術分野の業者に受け入れられている標準定義に忠実であると予想される。下に挙げる数例の例外は、本発明の範囲内でさらに定義されてきた。
【００２８】
本明細書において、用語「二糖」は、2個の単糖が、官能基から水等の小分子のみの脱離に関与する縮合反応を行う際に形成される炭水化物である。
【００２９】
本明細書において、用語「オリゴ糖」は、通常2から10個の少数の糖(単糖)を含有する糖類ポリマーを意味する。
【００３０】
本明細書において、用語「多糖」は、グリコシド結合により一体に連結された反復単位(単糖または二糖)から形成されるポリマー型炭水化物構造である。これらの構造は、多くの場合直鎖状であるが、様々な程度の分枝を含有していてもよい。
【００３１】
本明細書において、用語「デンプン」は、グリコシド結合により一体に連結された多数のグルコース単位からなる炭水化物である。この多糖は、あらゆる緑色植物によりエネルギー貯蔵体として産生される。これは、2種類の分子、直鎖状で螺旋状のアミロースと、分枝状のアミロペクチンからなる。デンプンは一般に、植物によって20から25%アミロースおよび75から80%アミロペクチンを含有する。用語、デンプンは、穀類(コメ、コムギおよびトウモロコシ)、根菜(ジャガイモおよびキャッサバ)、ドングリ、アロールート、アラカチャ、バナナ、オオムギ、パンノキ、ソバ、カンナ、サトイモ(colacasia)、カタクリ(katakuri)、クズ(kudzu)、マランガ、アワ、オートムギ、オカイモ(oca)、ポリネシアン・アロールート、サゴ(sago)、ソルガム、サツマイモ、ライムギ、タロイモ、クリ、ヒシおよびヤムイモ、ソラマメ、レンズマメ、リョクトウ、エンドウマメおよびヒヨコマメ等のマメ由来の可溶性デンプン(SS)、難消化性デンプン(RS)を包含するが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、用語「プロバイオティクス」は、十分な量で消費されると健康に利益を与える細菌を意味する。
【００３３】
本明細書において、用語「プレバイオティクス」は、消化器系における細菌の増殖および/または活性を健康に有益とされる方法で刺激する、非消化性食物成分である物質を意味する。
【００３４】
本明細書において、用語「シンバイオティクス」は、プロバイオティクスおよびプレバイオティクスを相乗作用形式で組み合わせるための栄養補助食品または薬物を意味する。シンバイオティクス組成物は、組成物および常在性細菌叢に存在するプロバイオティクス株の増殖を刺激して、in vivoで相乗的効果を示すであろう。
【００３５】
本明細書において、用語「対象」は、望まれないまたは望ましくない微生物に関与する状態のための治療、例えば、下に定義する望まれない胃腸病原体のための特定の治療を必要とするまたはそれに対し感受性の動物またはヒト等、任意の生きた生物を意味する。用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類動物およびサルの種や、ブタ、ヤギおよびウマ等の家畜、イヌおよびネコ等の飼育(domestic)哺乳動物、マウス、ラットおよびモルモット等の齧歯動物を包含する実験動物を包含するが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を表さない。よって、雄であれ雌であれ、成体および新生仔対象を網羅することを目的とする。好ましい実施形態において、対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する哺乳動物である。最も好ましい実施形態において、対象はヒトである。本明細書において、用語「病原性」は、疾患の原因となる能力を有する物質または条件を意味する。
【００３６】
本明細書において、用語「胃腸病原体」または「腸管病原体」は、胃腸管(食道から直腸まで)に対し病原性を有する微生物を包含する。これは、腸内細菌、腸球菌、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)亜種パラ結核症、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア(Brachyspira hyodysenteriae)、ローソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)、カンピロバクター属(campylobacter)、クロストリジウムを包含する。胃腸病原性細菌は、サルモネラ属、赤痢菌属(Shigella)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、カンピロバクター・ジェジュニ、クロストリジウム属(Clostridium)、大腸菌(Escherichia coli)、エルシニア属(Yersinia)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、他の細菌を包含し得る。
【００３７】
本明細書において、用語「バクテリオシン」または「バクテリオシン様物質」は、細菌によって産生されて、類似のまたは密接に関連する細菌株の増殖を阻害するタンパク質性(proteinasceous)毒素である。
【００３８】
本明細書において、用語「治療」は、通常は診断の後に行われる、対象における健康問題の予防の試み、矯正、寛解および再発予防を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】胃腸管様通過シミュレーター(gastrointestinal-like transit simulator)(GITS)のアルゴリズムの図である。
【図２】qPCRにより決定された、胃腸管通過様シミュレーション(Gastro Intestinal transit like simulation)(GITS)における細菌数の図である。
【図３】シンバイオティクス、プロバイオティクスおよびプレバイオティクスミックスによる、ネズミモデルにおけるCDI予防の実験計画の図である。
【図４】1群内の全ての動物からプールされた盲腸の内容物から得られる盲腸内菌数の図である。
【図５】動物の盲腸組織の病理組織診断の図である。
【図６】シンバイオティクス群および対照群における盲腸の(caceal)LABおよびビフィズス菌のqPCR結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、ラクトバチラス属(LAB)および/またはビフィドバクテリウム(Bif)属の少なくとも2種のプロバイオティクス株と、1種または複数のプレバイオティクス物質とを含むシンバイオティクス(symbiotic)組成物に関する。細菌株の少なくとも1種は、デンプンを分解する能力を有するべきであり、組成物中に存在するプレバイオティクス物質の少なくとも1種は、デンプンであるべきである。細菌株は、腸に接着し、クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)により産生される毒素AおよびBを阻害する能力を有するべきであるが、互いの増殖を阻害しない。さらに、組成物中に存在する少なくとも1種または複数のプレバイオティクス物質は、プロバイオティクス株の増殖を増強するべきであるが、胃腸病原体の増殖を増強するべきではない。本発明のシンバイオティクス(symbiotic)組成物は、対象の腸粘膜のコロニー形成に有利に用いられて、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を予防、治療、症状を寛解し、その再発を予防する。
【００４１】
本研究において、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の75種を超える異なるプロバイオティクス株をスクリーニングし、腸粘液層への接着、クロストリジウム・ディフィシル(CD)および/または他の腸管病原体に対する抗菌活性、プレバイオティクス物質の分解ならびに抗酸化因子の産生等、有益な特性に関して特徴付けた。驚くべきことに、これらの特性は非常に株特異的であり、属内の全ての株に一般的ではないことが判明した。
【００４２】
乳酸桿菌は、増殖の際に乳酸を産生する、100種を超える異なるラクトバチルス属の種を含む(微好気性)細菌群に属する。これらは、正常膣菌叢および新生児腸の優勢的な一部を構成するが、成体の正常菌叢の一部も形成する。乳酸桿菌は、低pHで増殖することができ、増殖培地における>20%胆汁に耐容性を示す。乳酸の産生は、その環境を酸性にし、これにより一部の有害細菌の増殖を阻害する。ラクトバチルス・アシドフィルス菌(L. acidophilus)、ラクトバチルス・プランタラム(L. plantarium)、ラクトバチルス・カゼイ菌(L. casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(L. paracasei)、ラクトバチルス・ロイテリ菌(L. reuteri)、ラクトバチルス・ラムノサス(L. rhamnosus)、ラクトバチルス・ビフィダス(L. bifidus)、およびラクトバチルス・ブルガリクス(L. bulgaricus)は、本発明の組成物において用いることのできるラクトバチルス属の数種の重要な種である。
【００４３】
ビフィズス菌は、新生児腸管にコロニー形成し、年齢と共に徐々に減少する嫌気性群の細菌に属する。これらは増殖の際に、腸内微生物恒常性の制御、腸管粘膜にコロニー形成および/または感染する病原体および有害細菌の阻害、局所的および全身性免疫応答の調節、微生物叢内の発癌促進性(pro-carcinogenic)酵素活性の抑圧、ビタミンの産生、ならびに多数の食物由来化合物の生理活性分子への生物変換等、有益な効果を発揮する。ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(B. animalis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B. infantis)は、本発明の組成物において用いることのできるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属の種の例である。
【００４４】
初期スクリーニング後に、75種を超えるプロバイオティクス株の群から6株(即ち、LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10、Bif LU29およびBif LU30)を、それらの上記の有益な特性に基づき最終的に選択した。その後、選択された株は、互いの存在下での増殖の間の、即ち共培養の間のその生存および繁殖能力、ならびに抗菌活性(AMA)を示す能力に関して試験した。選択された乳酸桿菌およびビフィズス菌の株は全て、共培養において十分に生存し、互いに対するバクテリオシン様物質を産生しなかった。
【００４５】
選択された株は、互いを共培養したときの、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、イソマルトースオリゴ糖(IMOS)、フルクトオリゴ糖(FOS)、ラクツロース、アラビアゴム、ベータグルカン、キシラン、ペクチン、イヌリンおよび/または可溶性および難消化性デンプン等、それらのプレバイオティクス利用に関しても調査した。選択されたプロバイオティクス株の共培養は、異なる組み合わせのプレバイオティクスにおけるそれらのプレバイオティクス分解能力に依存して、特異的細菌株の増殖を刺激した。驚くべきことに、唯一の利用できるプレバイオティクス物質としてのデンプンの存在下における非デンプン分解株およびデンプン分解株の共培養は、非デンプン分解株の増殖を刺激した。このような組成物のAMAは、CDおよび他の腸管病原体に対し保持された。この結果は、栄養共生(cross-feeding)の新規概念を示したし、本発明の組成物の株間で示される相乗作用を実証する。抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を予防、治療、症状を寛解し、その再発を予防するために、対象の腸粘膜のコロニー形成における使用に最適な組成物を開発する際に、この概念が用いられる。
【００４６】
異なる組み合わせのプレバイオティクスによる2種以上の選択された株の共培養物から得られた無細胞上清(CFS)は、病原体ESBL大腸菌、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、クロストリジウム・ディフィシル2167およびNAP1/027に対するAMAを示した。驚くべきことに、CFS抽出物を一部の病原体に対し最大1:500、その他に対し1:10に希釈した場合、AMAは保持され、その活性は、単独培養物(mono-culture)として増殖した株よりも有意に高かった。この結果は、選択された株が互いに相乗作用を示し、病原体に対し高AMAをもたらすことを明らかに示す。さらに、選択された株ミックスとCDの共培養は、CDの増殖を低下させ、CDによる毒素AおよびBの産生は、選択されたプロバイオティクス株の存在により強く阻害された。
【００４７】
前記組成物において、細菌株の1種または複数が、細菌株の生産の間に酸、胆汁および/またはムチンに曝露されていることは有利ではあるが、必ずしも必要ではない。酸および/または胆汁曝露は、細菌におけるストレス応答を誘導し、これは、その胃腸管を通した輸送における生存および腸粘液層におけるコロニー形成能力を増強し、そこで抗菌活性(AMA)が生じて、株に有益な効果を発揮させることができる。
【００４８】
酸への曝露は、培養ブロスのpHを低下させることを伴うことができ、細菌株の1種または複数は、pH2〜5、好ましくはpH2.5〜4.5、より好ましくはpH3〜4のMRS培地において、15〜150分間、好ましくは20〜140分間、より好ましくは30〜130分間、より好ましくは40〜120分間増殖される。胆汁への曝露は、細菌株の生産の間の培養ブロスへの、0.1〜2.5%(wt/vol)、好ましくは0.5〜2%、より好ましくは1.0〜1.5%タウロコール酸ナトリウム、あるいは1〜10%(vol/vol)、好ましくは2〜7%、より好ましくは3〜10%ブタ胆汁の、2〜8時間、好ましくは2.5〜7時間、より好ましくは3〜6時間の添加を伴うことができる。ムチンへの曝露は、細菌株の生産の間の2〜8時間、好ましくは2.5〜7時間、より好ましくは3〜6時間、0.01〜1%(vol/vol)、好ましくは0.03〜0.7%、より好ましくは0.05〜0.5%ムチンの存在下で、細菌株を増殖させることを伴う。
【００４９】
通常、細菌は、増殖に「正に」最適な培地において培養される。増殖の間の酸、胆汁またはムチンへの曝露は、細菌にとってストレスである。防御としてストレス遺伝子が誘導され、次にこれは、熱ショックタンパク質(HSP)および他のストレスタンパク質の産生を誘導し、これにより細菌はより頑強になる。酸および胆汁ストレスへの曝露は、胃腸管の条件を模倣する。選択された株とプレバイオティクスの組成物の安定性、頑強さおよび相乗作用は、胃腸管シミュレーター(GITS)モデルと共にin vivoマウスモデルにおいて確認した。
【００５０】
共培養、同時供給(co-feeding)、CDおよび腸管病原体に対するAMA、毒素阻害活性、酸、胆汁および/またはムチンへの曝露に耐容性を示す能力と共に、in vitroシミュレーション(GITSモデル)およびin vivoマウスモデルに関する研究に基づき、本発明の組成物の最適成分を選択した。本発明の組成物は、ラクトバチルス属(LAB)および/またはビフィドバクテリウム(Bif)属の少なくとも2種のプロバイオティクス株と、1種または複数のプレバイオティクス物質とを含む。さらに、細菌株の少なくとも1種は、デンプンを分解する能力を有し、組成物中に存在するプレバイオティクス物質の少なくとも1種は、デンプンである。
【００５１】
有利には、デンプンを分解することができる細菌株は、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種またはより具体的にはBif LU10株等、ビフィドバクテリウム属のものである。本発明のデンプン分解細菌株は、可溶性デンプン(即ち、腸管において分解できるデンプン)および/または難消化性デンプン(即ち、腸管において分解できないデンプン)等のデンプンを分解することができる。有利には、本発明のシンバイオティクス(symbiotic)組成物は、LAB LU33等、ラクトバチルス・パラカゼイ種のものである非デンプン分解株をさらに含む。
【００５２】
よって、本発明の有利な組成物は、少なくともBif LU10と、株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29、および/またはBIF LU30のうち1種または複数とを含む。さらに有利な組成物は、少なくともBif LU10、およびLAB LU33、または少なくともBIF LU10、LAB LU33、およびBIF LU30を含む。さらになお有利な組成物は、少なくともBIF LU10、LAB LU33、BIF LU30、およびLAB LU28を含む。記載されている組成物の利点を下に開示する。
【００５３】
本発明のシンバイオティクス(symbiotic)組成物は、デンプン以外にも、二糖、オリゴ糖、および/または多糖からなる群のさらに別のプレバイオティクス物質を含むことができる。二糖は、ラクツロースとすることができる。オリゴ糖は、フルクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、キトサンオリゴ糖(キオース)、イソマルトースオリゴ糖(IMOS)、アラビアゴム、ダイズおよびペクチンオリゴ糖からなる群から得ることができる。多糖は、ペクチン、キシラン、イヌリン、キトサン、アラビノキシラン、および/またはβ-グルカンからなる群から得ることができる。
【００５４】
好ましくは、デンプン以外のさらに別のプレバイオティクス物質の少なくとも1種または複数は、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、イソマルトースオリゴ糖(IMOS)、フルクトオリゴ糖(FOS)および/またはラクツロースからなる群のものである。
【００５５】
よって、本発明の組成物は、例えば、上述の細菌株のうち2種以上と、デンプンと、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、イソマルトースオリゴ糖(IMOS)、フルクトオリゴ糖(FOS)および/またはラクツロースからなる群の1種または複数のさらに別のプレバイオティクス物質とを含むことができる。
【００５６】
本発明の組成物は、対象の腸粘膜のコロニー形成に有利に用いることができる。本明細書において、用語「対象」は、望まれないまたは望ましくない胃腸微生物に関与する状態の治療、例えば、上に定義する望まれない病原性胃腸感染症の特定の治療を必要とする、あるいはそれに対し感受性の、任意の生きた動物またはヒトを意味する。好ましい実施形態において、対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する哺乳動物である。その使用は、対象がヒトである場合、特に有利である。
【００５７】
本発明の一実施形態において、本発明の組成物は、クロストリジウム・ディフィシル関連下痢(CDAD)および/または胃腸(GI)病原体に起因する感染症の予防、治療、その症状の寛解、および/またはその再発の予防に用いられる。本明細書において、用語「胃腸病原体」は、例えば対象が、ヒト等、哺乳動物である場合、対象における感染症の原因となり得るウイルス、寄生生物および細菌を意味する。胃腸病原性細菌は、サルモネラ属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、カンピロバクター・ジェジュニ、クロストリジウム属、大腸菌、エルシニア属、コレラ菌、他の細菌を包含し得る。
【００５８】
有利には、組成物は、様々なビルレンスおよびリボタイプのクロストリジウム・ディフィシルの株により誘発される抗生物質関連下痢(AAD)の予防、治療、その症状の寛解、および/またはその再発の予防に用いることができる。クロストリジウム・ディフィシルは、正常腸菌叢の少数一部を形成するクロストリジウム属の嫌気性種である。クロストリジウム・ディフィシルは、抗生物質関連下痢(AAD)の最も重大な原因であり、多くの場合、抗生物質による正常腸管内菌叢の根絶に起因する結腸の重度の感染症である偽膜性大腸炎を生じ得る。増殖において、クロストリジウム・ディフィシルは、ビルレンス因子、例えば毒素AおよびBを産生および分泌する。毒素Aは、あらゆる細胞に対し毒性を有するが、毒素Bは、細胞を損傷し、分泌(下痢)を誘導するため、腸細胞に対し毒性を有する。本発明の組成物は、リボタイプCD NAP1/027、CD1939、CD2167、CD1958、CD2165、CD2166、CD2168、CD027およびCD1551からなる群のクロストリジウム・ディフィシルの株により誘導される抗生物質関連下痢(AAD)の予防、治療、その症状の寛解、およびその再発を予防するために用いることができる。
【００５９】
本発明のさらに別の態様は、対象の腸粘膜のコロニー形成において使用するための薬物を製造するための、ならびに前記対象における抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を予防する、治療する、その症状を寛解する、およびその再発を予防するための、上述の組成物の使用を提供する。
【００６０】
本発明のさらに別の態様は、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症を患う対象の治療において使用するための薬物を製造するための、上述の組成物の使用を提供する。
【００６１】
本発明のさらに別の態様は、対象における抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症の再発の予防において使用するための薬物を製造するための、上述の組成物の使用を提供する。
【００６２】
本発明における組成物のプレバイオティクス物質およびプロバイオティクス株は、標準方法により任意のレベルの純度で単離してもよく、精製は、蒸留、再結晶化およびクロマトグラフィー等、当業者にとって公知の従来手段により達成することができる。
【００６３】
組成物において用いられる培養細菌細胞は、遠心分離、濾過またはデカンテーション等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの方法によりブロスから分離される。発酵ブロスから分離された細胞は、水、生理食塩水(0.9%NaCl)または任意の適切な緩衝液で場合により洗浄される。得られた湿った細胞塊は、任意の適切な方法、好ましくは凍結乾燥により乾燥させることができる。
【００６４】
本発明における組成物のプレバイオティクス物質およびプロバイオティクス株は、単独でまたは薬学的に許容される担体もしくは希釈液と組み合わせて投与することができ、このような投与は、単一または複数用量で行うことができる。
【００６５】
本発明の組成物において、プレバイオティクス成分は、組成物の総重量に基づいて5から99重量%、好ましくは30%から95%、より好ましくは50から90重量%を占める量で存在する。次に、プロバイオティクス成分は、組成物の総重量に基づいて1から15重量%、好ましくは5から10%を占める量で存在する。シンバイオティクス組成物の100重量%に足りない部分があるとすれば、アジュバントおよび/または賦形剤または妥当な添加物/担体等、追加的な物質からなる。
【００６６】
医薬組成物(例えば、錠剤)において、本発明の組成物は、医薬組成物の総重量に基づいて40から70重量%を占め、残りの部分は、薬学的に許容されるアジュバントおよび/または賦形剤でできている。食品組成物(例えば、ヨーグルトまたはチョコレート)において、シンバイオティクス組成物は、食品組成物の総重量に基づいて1から15重量%を占める。
【００６７】
好ましい実施形態において、シンバイオティクス(symbiotic)組成物は、シンバイオティクス(symbiotic)組成物の重量に対して1×108から1×1013CFU/g、好ましくは1×109から1×1011CFU/gを占める量の細菌株を含有する。
【００６８】
組成物は、例えば、錠剤、丸剤、小袋、バイアル、硬もしくは軟カプセル、水性もしくは油性懸濁液、水性もしくは油性溶液、エマルジョン、粉末、顆粒、シロップ、エリキシル、ロゼンジ、再構成可能な粉末、液体調製物、クリーム、トローチ、ハードキャンディー、スプレー、クリーム、軟膏、ゼリー、ゲル、ペースト、注射用溶液、液体エアロゾル、乾燥粉末製剤、HFAエアロゾルまたは有機もしくは無機酸付加塩の形態とすることができる。
【００６９】
本発明の組成物は、経口または吸入もしくはガス注入(例えば、経鼻、気管、気管支)経路による投与に適切な形態とすることができる。
【００７０】
経口、頬側または舌下投与のため、本発明のプレバイオティクス物質およびプロバイオティクス株は、様々な賦形剤と組み合わせることができる。経口投与のための液体組成物は、例えば、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態とすることができる、あるいは、使用前に水または他の適切な媒体により再構成するための乾燥製品として提示することができる。他の適切なフィラー、バインダー、崩壊剤、潤滑剤および追加的な賦形剤は、当業者によく知られている。
【００７１】
本発明は、上に定義する組成物であって、食品組成物、食品サプリメント、栄養補助食品組成物、医薬組成物および動物飼料の少なくとも1種または一部である組成物にも属す。
【００７２】
本発明のさらに別の態様は、有効用量の上述の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、腸粘膜のコロニー形成、ならびに対象における抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症の予防、治療、その症状の寛解、およびその再発の予防のための方法を提供する。治療される障害および患者ならびに投与経路に応じて、組成物は、変動用量で投与することができる。好ましい実施形態において、組成物は、1×107から1×1013CFU/用量、好ましくは1×109から1×1011CFU/用量を占める量の細菌株を含有する。
【００７３】
次に、実験により本発明の利点を例示する。しかし、下に記す実験は、ほんの例として示すものであり、本発明を限定してはならない。特許請求の範囲としての本発明の範囲内に収まる他の解決法、使用、目的、および機能は、当業者にとって明らかとなるであろう。
【００７４】
本発明の組成物のための株の選択の根拠(Rational)
用いた株バンクから最も有望な株の主な選択判断基準は、コンゴーレッド結合(CRB)および塩凝集試験(Salt aggregation test)(SAT)により測定される、クロストリジウム・ディフィシル等、腸管病原体に対する抗菌活性(AMA)および腸壁に接着する能力であった。その次の判断基準は、少なくとも1種または複数のプレバイオティクス物質の発酵であった。被験株のスクリーニング結果をTable 1(表1)に提示する。
【００７５】
細胞表面疎水性(CSH)は、腸において結合および相互作用し、粘液層において病原体と競合する微生物の重要な特性である。次の通りCRBおよびSATアッセイに基づいてCSHを決定した。洗浄した細胞を、コンゴーレッド(PBS中に100マイクログラム/ml)と10分間インキュベートし、続いて遠心分離(9,000g×30分間)することによりCRBを行った。480nmにおける吸光度を測定することにより、上清における残留コンゴーレッドを決定した。リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.2、0.015M)におけるコンゴーレッドを対照として用いた。CRBは、結合したコンゴーレッドのパーセンテージとして表す。従って、結果が100に近いほど、細胞表面疎水性は高い。塩凝集試験(SAT)によりCSHを決定した。PBSにおける洗浄済細胞懸濁液10マイクロリットルを、0.02Mから4Mにわたる様々なモル濃度の硫酸アンモニウム(pH6.8)10マイクロリットルとスライドグラス上で混合した。1分後、凝集が観察された。SATの結果は、株が凝集する最低濃度の塩(M)として表す。凝集により低い塩濃度が必要とされるということは、より高い細胞表面疎水性を意味する。
【００７６】
潜在的プロバイオティクス株のAMAは、次の通りマイクロタイタープレート(MTP)アッセイを用いて、腸管病原体ESBL大腸菌、黄色ブドウ球菌、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)および4種の異なるクロストリジウム・ディフィシル株に対し決定した。MRS(De Man Rogosa Sharpe)およびMRSC(0.05%(w/v)L-塩酸システイン含MRS)ブロスにおいて増殖させた、乳酸桿菌およびビフィズス菌の24時間経過した培養物から、遠心分離(3,200g、20分間、4℃)により無細胞上清培養(CFS)濾液を収集し、0.2マイクロメータフィルターを用いて上清をフィルター滅菌した。AMAを決定するため、MTPにCFSを添加した。滅菌ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスにおいて異なる希釈物(1:1、1:10、1:100および1:500)を調製した。100マイクロリットルの上清をマイクロタイターウェルに添加し、Anoxomat(登録商標)培養システム(MART、オランダ)を用いて37℃で一晩嫌気的にインキュベートして平衡化した。フルクトース偏好性寒天プレートにおいて24時間、嫌気的に腸管病原体細胞を増殖させた。細胞をPBSで2回洗浄し、無菌PBSに再懸濁した。10マイクロリットルのA620=0.02の腸管病原体細胞をBHIブロスに調製し、予備還元(pre-reduced)MTPに一晩添加した。48時間(CD病原体)/24時間(他の病原体)後に、プレートリーダーを用いてOD620で増殖を測定し、結果を、CFSなしの対照ウェルにおける増殖と比べて計算したパーセント腸管病原体増殖阻害として表した。
【００７７】
【数１】
0005905032.tif 000002
【００７８】
ODtおよびODcは、LABまたはビフィズス菌のCFS存在下および非存在下における、CDの増殖を表す。同様に、乳酸桿菌およびビフィズス菌の共培養抽出物のCDに対するAMAを決定した。全ての腸管病原体に対し同じ式を用いた。
【００７９】
潜在的プロバイオティクス株のプレバイオティクス分解能力の予備スクリーニングを次の通りに行った。最初に、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の株を、MRS/MRSC寒天において微好気性および嫌気性条件下で37℃にて増殖させた。次に、各株の単一コロニーを、1リットル当たり30mgのブロモクレゾールパープル(bromocresol purple)を含有する、ラクトバチルス属に対しては1%(wt/vol)プレバイオティクス(フルクト(Fruto-)オリゴ糖(FOS)、キシロオリゴ糖(Xylooligosacharides)(XOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、イヌリン、可溶性デンプン(SS)、難消化性デンプン(RS)、ペクチン、イソマルトオリゴ糖(IMOS)、ラクツロース)を含有するグルコースなしの基本MRS寒天上に、あるいはビフィズス菌に対しては主要炭素源として1%(wt/vol)プレバイオティクス(FOS、FOS(Orafti)、XOS、GOS、イヌリン、SS、RS、ペクチン、IMOS、ラクツロース)を含有する0.05%(w/v)L-塩酸システイン寒天を補充したプロテオースペプトン酵母抽出物(PY)寒天上に小パッチとして広げ、微好気性(乳酸桿菌のため)または嫌気性(ビフィズス菌のため)条件下で37℃、48時間インキュベートした。様々なLABおよびビフィズス菌によるFOS、FOS(Orafti)、XOS、GOS、イヌリン、SS、RSおよびペクチンの分解能力は、Table 1(表1)(脚注を参照)に見出すことができる。
【００８０】
【表１Ａ】
0005905032.tif 000003
【００８１】
【表１Ｂ】
0005905032.tif 000004
【００８２】
【表１Ｃ】
0005905032.tif 000005
【００８３】
Table 1(表1)に提示する実験結果に基づき、Table 2(表2)に提示するプロバイオティクス株をさらなる実験のために選択した。
【００８４】
【表２】
0005905032.tif 000006
【００８５】
選択されたプロバイオティクス株を、2010年11月24日に、ベルギー微生物保存機関(Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms)(BCCM)、Laboratorium voor Microbiologie Bacterienverzameling(LMG)、Universiteit Gent, K.L. Ledenganckstraat 35、9000 Gent、Belgium(ウェブサイト: http://bccm.belspo.be)に、次の株寄託番号(deposit nos):LAB LU33:LMG P-26118、LAB LU28:LMG P-26120、BIF LU10:LMG P-26117、BIF LU30:LMG P-26116、BIF LU29:LMG P-26115、LAB LU23:LMG-P-26119で寄託した。
【００８６】
プロバイオティクス株の共培養
選択されたビフィズス菌およびLAB株の異なる組み合わせ(Table 2(表2))を試験して、これらの株相互の可能な相乗作用および適合性を決定した。特定の株によりバクテリオシン様物質が産生されるか決定するため、各株から得られる中和された抽出物の他の株に対するAMAを、MTPアッセイを用いて決定した。上に記す実験手順の通りにAMA抽出物を得た。
【００８７】
上述の実験手順の通りに得たCFSを、5N NaOHを用いてpH7となるよう中和した。選択されたビフィズス菌および乳酸桿菌の中和CFSの互いに対するAMAを、MTPアッセイを用いて決定した。試験に用いた乳酸桿菌またはビフィズス菌の選択された株の中和抽出物は、互いに対しAMAを示さなかった(乳酸桿菌、またはビフィズス菌のいずれも)。さらに、これらは、参照株として用いた他の乳酸桿菌およびビフィズス菌を阻害せず、選択された乳酸桿菌およびビフィズス菌の株が、互いに対するバクテリオシン様物質を産生しないことを示した。株のこの特性は、腸管病原体およびクロストリジウム・ディフィシルに起因する感染症を予防および治療するための「シンバイオティクス製剤」における適切な株ミックスの開発に有用であった。
【００８８】
多くの胃腸感染症は、サルモネラ属、カンピロバクター・ジェジュニおよびESBL大腸菌が原因であるが、AADは、主にCDおよびMRSAが原因である。従って、Table 2(表2)から選択されたLABおよびビフィズス菌の株が互いを阻害しないことを確認した後、これらをMRSCブロスにおいて共培養し、高病原性(hypervirulent)CD027 /NAP1等のCD、ESBL大腸菌、黄色ブドウ球菌、およびネズミチフス菌に対するそれらの潜在的なAMAを、MTPアッセイを用いて決定した。
【００８９】
5mlの予備還元MRSCブロスにおいて異なるLABおよび/またはビフィズス菌の株の10%接種材料(全ての株の合計)を接種することにより、Table 2(表2)から選択されたLABおよびビフィズス菌の株の活性化培養物を共培養して、anoxomateジャーを用いて嫌気性条件下で37℃、24時間増殖させた。24時間後、遠心分離により培養物を収集し、0.22マイクロメータフィルターを用いて上清をフィルター滅菌した。CFSを用いて、CDおよび他の病原体に対するAMAを、上述の通りまたは以前に記載した通りにMPTアッセイを用いて決定した。48時間(CD病原体)/24時間(他の病原体)後に、プレートリーダーを用いてOD620にて増殖を測定し、結果を、CFSなしの対照ウェルにおける増殖と比べて計算されるパーセント病原体増殖阻害として表した。
【００９０】
LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30の異なる組み合わせの共培養は、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurim)、大腸菌、クロストリジウム・ディフィシルCD NAP1/027および黄色ブドウ球菌に対し高AMAを示した。驚くべきことに、CFS抽出物を、病原体(CD027および黄色ブドウ球菌)に対し最大1:500、ネズミチフス菌(S. typhimurim)およびESBL大腸菌に対し1:10希釈した場合、AMAは保持され、この結果は、株を単独培養として試験した場合には見出されなかった(Table 3(表3)&Table 4(表4))。LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30を含有する組成物は、ネズミチフス菌(Sal. typhimurim)およびESBL大腸菌に対する1:10希釈において、他の組み合わせのものよりも高いAMAを示した(Table 4(表4))。これは、選択された株が、病原体に対し高AMAをもたらす株間の相乗作用を示すことを明示する。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
【表４】
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【００９３】
さらに、選択された株により生じた、クロストリジウム・ディフィシルに対するAMAは、高病原性株CD NAP1/027により生じた毒素量の低下と十分に相関した。共培養した選択された株の最大1:10希釈したCFS抽出物の存在下で増殖させた場合、CD NAP1/027株から毒素は検出されなかった。多量の毒素Aおよび毒素Bを含有するNAP1/027の抽出物を、生きたLABおよびビフィズス菌とインキュベートした場合、毒性は阻害され、これはLABおよびビフィズス菌の選択された株が、抗毒素活性を示すことを示唆する。LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30の異なる組み合わせにより産生されたCFSのAMAは、酸のみならず、熱安定性細胞外抗菌タンパク質/ペプチドも原因である。株LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30を含む組成物は、高病原性CD株NAP1/027、黄色ブドウ球菌、ネズミチフス菌(Sal. typhimurim)およびESBL大腸菌に対しAMAを示した(Table 3(表3)&Table 4(表4))。
【００９４】
さらに、上述の選択されたプロバイオティクス株組み合わせを、0.05%(w/v)L-塩酸システイン含有プロテアーゼペプトン酵母抽出物グルコース培地(pH7.2)においてCD NAP1/027と共培養した。PYGにおいて単独で増殖したCDと比較して、CD NAP1/027は、増殖の2log cfu低下を示し、CD毒素Aおよび毒素B産生は24時間の増殖の後に強く阻害された。従って、株LAB LU28、LAB LU33、Bif 10およびBif 30のうち2種以上を包含する組成物は、腸管病原体に対するAMAの増強をもたらす相乗作用を示すと結論することができる。
【００９５】
同時供給:プロバイオティクス+プレバイオティクス
多株(multi-strain)プロバイオティクスまたはシンバイオティクスを開発するため、対象の腸管における有益微生物の腸管内微生物叢を回復させるための、高いプレバイオティクススコアおよび/またはプレバイオティクス指数を備える効率的な株を選択することが重要である。
【００９６】
初期スクリーニングは、FOS、GOS、XOS;IMOSおよびラクツロースを包含した(Table 5(表5))。また、コムギ由来の難消化性デンプン(RS)、アラビアゴム、ベータグルカン、キシラン、ペクチンおよびイヌリン等、他の天然多糖を、そのプレバイオティクス潜在力に関して評価した。
【００９７】
FOSは、そのビフィズス菌増殖促進(bifidogenic)および乳酸菌増殖促進(lactogenic)効果のためによく知られているが、ヒトにおける粘膜刺激作用を生じ、抗生物質で治療したマウスにおけるサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)の転位を増強することがあり、この不利益のため、本発明者らは、FOSの代わりにGOS、IMOS、XOSおよびラクツロースをプレバイオティクスとしてスクリーニングすることにした。
【００９８】
選択されたプロバイオティクス株の大部分(Table 2(表2))は、複数のプレバイオティクス成分(Table 5(表5))を分解した。個々のプレバイオティクスにおける各株の相対増殖をグルコースと比較して決定することにより、選択された株それぞれのプレバイオティクススコア(PS)を開発した。
【００９９】
【表５】
0005905032.tif 000009
【０１００】
プレバイオティクスの異なる組み合わせによる、混合したプロバイオティクスの共培養
上述の共培養実験において、選択された株は、互いに対してAMAを示さなかったため、互いに適合性であることが示された。同じ選択された株を、単一プレバイオティクス、プレバイオティクス組み合わせおよびプレバイオティクス組み合わせとSSの存在下で、pH制御されない条件下で共培養して、プロバイオティクス株間の相乗作用の可能性をさらに調査した。
【０１０１】
株LAB LU28、LAB LU33、BIF LU10およびBIF LU30を混合し、MRSC寒天において37℃で48時間継代培養した。単一コロニーを5mlの予備還元MRSCブロスに接種し、3回継代培養した。各培養物を収集し、上述の通りに洗浄し、PBSに再懸濁した。4種の選択されたプロバイオティクス株をミックスとして接種して、1%(w/v)の(a)GOS、IMOSおよび可溶性デンプン(SS)の混合物(1:1:1)、(b)IMOSおよびGOS(1:1)、(c)GOSおよびSS(1:1)、(d)GOSならびに(e)SSを含有する予備還元MRSCブロス5mlにおいて、最終吸光度0.5ユニット(即ち、1株当たり0.125)を得た。チューブを嫌気性条件下で24時間インキュベートした。0および24時間後に試料を収集し、100マイクロリットルの培養ブロスを系列希釈し、50マイクロリットルをMRS寒天(LABのため)およびBereens寒天(ビフィドバクテリウム属のため)上に広げて、CFU/ml単位で生存数を決定した。
【０１０２】
単一および混合プレバイオティクスの異なる組み合わせにおける、ラクトバチルス属およびビフィズス菌の総数を、Table 6(表6)に示す。グルコース(GLU)、GOSおよびIMOS/GOSにより、総ビフィズス菌の数は、総LABよりも多かった。SSにより、LABおよびビフィズス菌数の増加は等しかった。SS/GOSおよびSS/IMOS/GOSにより、総LAB数は、ビフィズス菌の数よりも多かった。LABのlog CFU/mlが増加する順に、SS/IMOS/GOS>SS/GOS>GOS>SS>IMOS/GOS>GLUであり、ビフィズス菌の場合は、IMOS/GOS>GOS>GLU>SS/IMOS/GOS>SS>SS/GOSである(Table 6(表6))。
【０１０３】
【表６】
0005905032.tif 000010
【０１０４】
同時供給のための可溶性デンプンにおけるLAB LU33およびBif LU10の共培養
非デンプン分解株LAB LU33とデンプン分解株Bif LU10の可能な同時供給および増殖増強を解明するため、1%(w/v)のSSを唯一の炭素源として含有するMRSCブロスにおいてこれらの株を共培養した。Bif LU10およびLAB LU33の共培養は、LAB LU33の増殖を増強した。デンプン分解の間に産生された中間代謝産物は、LAB LU33の増殖を支持した(Table 7(表7))。デンプン分解は、正常結腸環境の維持と、腸管内細菌叢を回復させるための他の有益微生物の増殖の増強に重要である。デンプン代謝におけるpHの減少は、LAB LU33を阻害しなかった。これらの株は両者共に互いに適合性であり、相乗的活性を示す。LAB 33およびBif LU10により示される相乗作用は、驚くべきことに、株特異的であることが判明した。同様に非デンプン分解株であるLAB LU28と、Bif LU10とをRSの存在下で増殖させた場合、LAB LU28の増殖は刺激されなかった。周知のプロバイオティクス株ラクトバチルス・ラムノサスGG非デンプン分解株を、SSの存在下でデンプン分解株Bif LU10と共培養した場合、同様の観察がなされた。ラクトバチルス・ラムノサスGG増殖は刺激されなかった。これらの2例は、栄養共生が、互いに組み合わせて用いた選択された株に特異的であることを示す。栄養共生は、明らかに同じ属の株間であっても明らかな特性ではない。
【０１０５】
【表７】
0005905032.tif 000011
【０１０６】
共培養した抽出物のヒト病原体に対するAMA
プレバイオティクスの異なる組み合わせと共培養した、選択された株(Table 2(表2))のうち2種以上の抽出物の、腸管病原体に対するAMAを決定した。プレバイオティクスの異なる組み合わせにより増殖した全てのCFSが、病原体ESBL大腸菌、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・ディフィシル2167およびNAP1/027に対しAMAを示したことが判明した(Table 8(表8))。共培養した抽出物のCFSを、毒素を含有するCD抽出物とインキュベートした場合、毒性効果の>70%が阻害され、これはCFSにおいて産生された酸が、抗毒素活性を示すことを示した。
【０１０７】
【表８】
0005905032.tif 000012
【０１０８】
本組成物における選択された株が、プレバイオティクスを分解する高い能力を保有していると結論付けることができる。異なる組み合わせのプレバイオティクスによる選択された株の共培養は、株のプレバイオティクス分解能力に応じて異なるLAB/bif比を生じた。また、デンプン分解株Bif LU10による代謝が、非デンプン分解株LAB LU33の増殖を刺激することが判明した。選択された株が、培養において利用される異なるプレバイオティクスの組み合わせに応じて、腸管病原体に対し高AMAを示すことにも留意されたい(Table 8(表8)を参照)。
【０１０９】
同時供給:病原体+プレバイオティクス
上述の通り、クロストリジウム・ディフィシル、ESBL大腸菌、黄色ブドウ球菌、ネズミチフス菌は、ヒト病原体である。従って、このような病原体が、シンバイオティクス混合物に存在するプレバイオティクスを分解・利用することができるかスクリーニングすることが必須である。試験は、ヒト病原体;LUHospitalから入手した高病原性株NAP1/027等のクロストリジウム・ディフィシルの5種の臨床分離株、黄色ブドウ球菌、ESBL大腸菌、およびネズミチフス菌のいずれも、FOS、GOS、IMOS、XOS、イヌリン、RS、SS、ペクチンまたはキシランを利用できなかったことを示した。従って、ヒト病原体は、プレバイオティクス分解能力を示さなかった。この結果は、腸管感染症と闘うためのプロバイオティクスおよびプレバイオティクスのカクテルの開発を大いに促すものである。
【０１１０】
選択された株の評価のためのストレスパルス負荷およびIn vitro胃腸管(GIT)シミュレーション
単純かつ信頼できるin vitro方法を開発して、in vivoの胃の通過条件をシミュレートした。これは、選択されたプロバイオティクス株を、組み合わせた酸(30分間)および胆汁ストレスパルスに4時間曝露し、in vivoの胃腸通過(GITS)を37℃で好気的(LAB)および嫌気的(ビフィズス菌)に模倣することにより行った。先ず、細胞を、pH2.5のMRSC/MRS培地において酸ストレスに付した。30分後、細胞をPBSで洗浄し、ブタ胆汁5%(v/v)を含むMRSC/MRSにより4時間ストレスを加えた。30分および4時間後に株の生存率を決定した。酸または胆汁ストレスなしのMRSCブロスを対照として用いた。ストレスパルスを与えた細胞のプレバイオティクス分解能力を試験するため、同様にこの細胞を洗浄し、異なるプレバイオティクスまたはグルコースを含有するMRSCブロスに接種した。ストレス無負荷細胞を対照として用いた。
【０１１１】
3株、LAB LU28、LAB LU33およびLGGは、ストレスパルス負荷における100%生存率を示した。BIF LU30およびBif LU10は、GI通過モデルにおける胆汁相の終わりにそれぞれ100および40%生存率を示した。参照株、ビフィドバクテリウム・ラクティスJCM 10602(Bb12)は、GI通過後に85%生存率を示した。GI様通過シミュレーションにおける頑強さ、即ち、耐性の順を次に示す。Bif LU30>ビフィドバクテリウム・ラクティスJCM 10602>Bif LU10。
【０１１２】
理想的にはin vivoにおいて、選択された株はそのプロバイオティクス機能を発揮するために、生存可能な形態で腸管の様々な部分に到達し、食糧としてプレバイオティクスを用いて十分に繁殖する。プロバイオティクスミックスにおける株の、GI様通過における、即ちストレスパルス負荷後のプレバイオティクスサプリメント代謝能力を解析した。LAB LU28のストレスパルス負荷およびストレス無負荷細胞は、GOSおよびグルコースにより同様の増殖を示した。Bif LU10のストレスパルス負荷細胞は、より長い遅滞期を示したが、その24時間後の増殖パターンは、IMOS、GOSおよびFOSの存在下におけるストレス無負荷細胞の増殖パターンに類似していた。さらに、ストレスパルス負荷Bif LU10の増殖は、グルコースと比較して、GOS、IMOS、FOSにおいてより高かった。Bif LU30株は、GOS、XOSおよびグルコースにより増殖した場合、ストレス無負荷細胞と同じ増殖動態を示した。
【０１１３】
組成物のために、プロバイオティクス株は、頑強さ(即ち、ストレスパルス負荷)、クロストリジウム・ディフィシルおよび他の腸内病原体に対するAMA、プレバイオティクスを使用する能力、その代謝性活性を失うことなく腸に到達する能力、シンバイオティクスミックスのプレバイオティクスの存在下で繁殖してそのプロバイオティクス効果を発揮する能力に基づき選択されることになる。
【０１１４】
5%ブタ胆汁の存在下で増殖したLAB LU28およびLAB LU33のCFSは、黄色ブドウ球菌、ネズミチフス菌、クロストリジウム・ディフィシル2167およびクロストリジウム・ディフィシルNAP1/027に対し60%を超えるAMAを保持した。5%ブタ胆汁の存在下で増殖したBif LU10およびBif LU30は、クロストリジウム・ディフィシル2167およびクロストリジウム・ディフィシル027に対し60%を超えるAMAを保持した。5%ブタ胆汁の存在下で増殖した選択された株は、クロストリジウム・ディフィシルおよび他の胃腸病原体(ネズミチフス菌、ESBL大腸菌、黄色ブドウ球菌等)に対するAMAを保持した。
【０１１５】
ストレスパルス負荷後に生産される頑強な細胞は、プレバイオティクスおよびRSによるシンバイオティクス製剤のフリーズドライおよび最終パッキングにおける、より高い細胞収率の生産に有用となるであろう。
【０１１６】
混合培養における選択されたプロバイオティクス株の生存を評価するための胃腸管シミュレーター(GITS)の使用
GITSは、PCと連結し、培養プログラム「BioXpert」により制御される1L「Biobundle」発酵槽、バイオコントローラー(biocontroller)ADI 1030および天秤(balance)からなる。液体(即ち、HCl、NaHCO3、胆汁塩、栄養培地)の温度、pH、培養容量、撹拌、酸素含量および速度率は、該プログラムにより制御される。GITSは、胃腸管をシミュレートする数個の容器(P1〜P5)を備える発酵槽である(図1)。
【０１１７】
細菌懸濁液を注入し、胃(pH3.0)をシミュレートする第一の容器内に3時間留める。その後、細菌懸濁液を、胆汁、pH6.5により小腸および大腸(希釈、pH6.0)をシミュレートする第二の容器にポンプで送る。
【０１１８】
シミュレーションの開始において、100mlの0.01M HClを発酵槽に添加し、空の胃をシミュレートした。システインHClを含有するトリプトン酵母抽出物を含有する培地と、プレバイオティクスミックス:FOS、GOS、XOSを含む200mlの「モデル食糧」における、多株プロバイオティクスの選択された株(i)Bif LU10、Bif LU29、LAB LU28、(ii)Bif LU10、Bif LU29、Bif LU30、LAB LU28、(iii)Bif LU10、Bif LU30、LAB LU28、LAB LU33を、発酵槽へとポンプで送った。
【０１１９】
図1に示す通り、P1、P2、P3、P4、およびP5は、実験開始(P1)、胃相(P2)、胆汁相(P3);胆汁を除去する希釈相(P4)および実験終了時(P5)に一致する主要サンプリングポイントを示す。20mmol時間-1の速度で1M HClを添加することにより容器内のpHを滴定して3.0とし、胃条件をシミュレートした。pH3に到達した後、1M NaHCO3を添加することによりバイオリアクターの内容物をpH6.0に調整した。最大3%となるまでブタ胆汁(30ml、30%溶液)を発酵槽に添加し、30分間インキュベートした。全実験まで24時間、内容物を、システインHClを含有するトリプトン酵母抽出物と、FOS、GOS、XOS(プレバイオティクス(perbiotic)当たり3g/L)のプレバイオティクスミックスを含有する希釈培地で希釈した。共培養実験における上述の通りに、シミュレーションの異なる相におけるコロニー形成細菌を計数した。実験開始から終了までに得られる20〜40個の選択コロニーに対し、(GTG)5プライマーによるREP-PCRフィンガープリント解析を行った。qPCRを用いて、総DNAコピー数の観点から細菌細胞を定量化した。均一濃度溶出の0.005M H2SO4、流速0.6mL分-1、35℃によるBioRad HPX-87Hカラム(カリフォルニア州ハーキュリーズ)を用いた液体クロマトグラフィー(Alliance 2795システム)により、培養培地における有機酸(乳酸、酢酸、ギ酸)およびエタノールの濃度を解析した。屈折率(RI)検出器(モデル2414;Waters Corp)を物質の検出および定量化に用いた。
【０１２０】
Bif LU10、Bif LU29、およびLAB LU28ならびにプレバイオティクスミックスFOS、XOSまたはGOSを含有する組成物において、Bif LU10およびLAB LU28株は、シミュレートしたGIT条件において十分に生存した(Table 9(表9))。Bif LU10の減少は、酸および胆汁インキュベーションにおいてより顕著であり、これは希釈相において増加した。(BIF LU29の数は、実験終了時に有意に少なく、株は培養物において検出されなかった。)
【０１２１】
【表９】
0005905032.tif 000013
【０１２２】
実験開始時に等量のBif LU10、Bif LU29、Bif LU30、LAB LU28を含有する組成物により、株分布は、GITS実験終了時に約73%のLAB LU28、21%のBif LU30および6%のBif LU10となった。これらの結果は、この組み合わせにおけるBif LU10、Bif LU30およびLAB LU28の優れた生存および増殖を示す。株LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30と、FOS、XOS、GOSを含有するプレバイオティクスミックスとを含有する組成物により、LABまたはビフィズス菌の数の有意な減少は、GITS実験の終了時に検出されなかった。
【０１２３】
qPCRにより、LABおよびビフィズス菌の株の総DNAコピー数と、LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30の比率に関して各バイオマスを解析した(図2)。結果は、LAB LU28、LAB LU33、およびBif LU30のlogコピー数が、20時間後および実験終了時に同じままであったことを示した。
【０１２４】
LAB LU28およびLAB LU33株は、酸および胆汁ストレス下で十分に生存し、炭素源としてオリゴ糖により増殖することができた。ミックス中に存在する他の株と比較したLAB LU28およびLAB LU33の比率は、rep-PCRの結果によれば、シミュレーションにおいて有意に増加した。
【０１２５】
Bif LU10およびBif LU30は、実験終了時に検出されたが、プロバイオティクスミックスにおけるこれらの比率は、シミュレーションにおいて減少した。Bif LU29は、胆汁に対する寛容性が低く、計数結果は、実験開始時に他の株と比較して常により少なく、実験終了時に検出されなかった。
【０１２６】
シミュレーションの開始時に、LABコロニー数は、Bif LU10およびBif LU30と比較して常により多く、LABは、希釈相において首尾よく繁殖することができた。ビフィズス菌は、酸/胆汁処理におけるより重度の初期減退にもかかわらず、LAB株よりも良く酸/胆汁ストレスから回復した。これは、希釈相におけるLAB株と比較してオリゴ糖の選択的な消費によるものである。下のストレスパルス負荷セクションに記載の単一株試験と、これらのプロバイオティクス株の共培養物との間に優れた相関が存在し、GI様通過モデルにおけるこれらの頑強さを確認する。
【０１２７】
LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10、Bif LU30およびビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム(B. pseudocatenulatum)1200株により行われ、主要炭素源としてSS(5g/L)およびGOS(5g/L)を用いたGITS実験において、LAB LU33株は、この株がSSまたはGOSを利用しないという事実にもかかわらず、SS/GOSによるこの組み合わせにおいて最も強かったことは、注目に値する。
【０１２８】
GITS実験は、SSおよびGOSの存在下で増殖した場合、Bif LU10およびLAB LU33により示される栄養共生の新しい概念を確認した。LAB LU33は、SSまたはGOSのいずれかを用いることができない。しかし、他の選択された株、特に組成物における唯一のデンプン分解株、即ち、Bif LU10およびSS/GOSの存在下で増殖した場合、LAB LU33の計数は増加した。さらに、GIT通過における株の頑強さも観察された。LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30プロバイオティクスミックスを含有する組成物は、単一容器GITSモデルにおけるGI様通過モデルにおいて安定的であると結論付けることができる。
【０１２９】
これらの実験において、高いプレバイオティクススコアに基づき株を選択した。4種の選択された株は全て、相乗的シンバイオティクスミックスを設計するためのプレバイオティクスおよびデンプンの存在下で増殖した。シンバイオティクスミックスにおけるこれらの株は、互いに適合性であり、LAB/bif比は、株のプレバイオティクス分解能力に応じて増加または減少し(プレバイオティクススコアTable 5(表5))、これらの株がヒト病原体に対するAMAを示したことが判明した。さらに、プロバイオティクスとプレバイオティクスとの間の相乗作用は、デンプン分解プロバイオティクス株の存在下における非デンプン分解プロバイオティクス株の増殖を増強した。選択された株は頑強であり、GI様通過を耐えることができ、代謝性活性を維持することができ、プレバイオティクスを代謝することができる。
【０１３０】
マウスモデルを用いた感染症の予防
本発明の組成物は、対象の腸粘膜のコロニー形成と、(特に)対象における感染症の予防および治療、抗生物質関連下痢(AAD)および/または胃腸病原体に起因する感染症の症状の寛解および再発の予防に有利に用いることができる。
【０１３１】
上述の通り、選択された株(即ち、LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30)は全て、CD NAP1/027に対し高AMAを有し、GITSシミュレーションにおける生存の観点から頑強であり、ミックスに用いた少なくとも1種または複数のプレバイオティクスを分解する能力を保有する。選択されたプレバイオティクスの存在下で増殖した選択されたプロバイオティクス株の効果を調査するため、マウスモデルを用いて異なる組み合わせをin vivoで試験した。詳細な実験スケジュールを図3に示す。6〜7週齢のC57BL/6マウスを4つの実験群に分けた。群1(n=5)シンバイオティクス群は、RS、IMOS、GOSおよびLAB LU28、LAB LU33、BIF LU10&BIF LU30からなる「シンバイオティクスミックス」で処理し;群2(n=6)プロバイオティクス群は、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU10&BIF LU30からなる「プロバイオティクスミックス」で処理し;群3(n=6)は、RS、IMOS、GOSからなる「プレバイオティクスミックス」で処理し;群4(n=7)は、動物がCD027に感染しただけの「陽性対照」で構成された。群1および2は、各プロバイオティクス株1×1010cfu/マウスの一日量を投与した。
【０１３２】
総プレバイオティクス濃度は、マウス1匹につき5gの一日飼料消費量に基づき計算した、正常食餌の5%(w/w)であった。RSを低タンパク質齧歯動物食餌(R70、Lantmannen、スウェーデン、マルメ)と混合し、固形飼料(pellet)を調製し、毎日与えた。群4(n=7)は、NAP1/027株に感染させ、いかなるシンバイオティクス、プレバイオティクスまたはプロバイオティクスミックスも与えなかった対照群であった。常在性マウス腸管内細菌叢は、飲料水に希釈した抗生物質ミックスを5日間(-15から-11日目)与えることにより崩壊させた。カナマイシン、ゲンタマイシン、コリスチン、メトロニダゾール、およびバンコマイシンの抗生物質カクテルを飲料水において調製し、フィルター滅菌した。-9日目(-9)に、対照群を包含する全ての動物に、単一用量のクリンダマイシン(10mg/kg)を腹腔内投与した。群1〜3に、シンバイオティクス、プロバイオティクスおよびプレバイオティクスミックスを7日間与えた(図3A)。0日目に、全ての動物を、胃管により106cfuのNAP1/027(106cfu/マウス)で攻撃した。さらに5日間、それぞれの群のシンバイオティクス、プロバイオティクスまたはプレバイオティクスの給餌をさらに継続し、6日目にCO2窒息により全ての動物を屠殺した(図3A)。培養、リアルタイム定量的PCR(qPCR)、病理組織診断および毒素試験のため、新鮮な盲腸の内容物を無菌的に収集した。対照群(群4)の抗生物質処理は、クロストリジウム・ディフィシル感染症(CDI)が、群1〜3と同じ日に起こるような方法で開始した。これは、動物の感染に用いたCD用量の均一性を維持し、実験誤差を低下させるように行った(図3B)。
【０１３３】
1つの群内の全ての動物のプールした盲腸の内容物から得られる総乳酸桿菌、ビフィズス菌およびNAP1/027生存可能コロニー数を解析した(図4A)。NAP1/027のコロニー数は、嫌気性条件下で72時間、37℃にてセフォキシチンフルクトース偏好性プレートにおいて決定した。生存数は、log cfu/100mg(盲腸の内容物)として表した。さらに、総DNAコピー数は、異なる動物群の盲腸の内容物におけるBif LU10、Bif LU30、LAB LU33およびLAB LU28のqPCRにより決定された。*P値<0.05も決定した(図4B)。
【０１３４】
4種の選択されたプロバイオティクス株と、プレバイオティクスIMOS、GOSおよびRSを含むシンバイオティクス組成物による給餌が、大腸炎により動物が重度に罹患した対照群と比較してCDIを予防したことが判明した。
【０１３５】
群1〜3における全ての動物は健康であり、下痢の症状は観察(obervered)されなかった。群4における3匹のマウスは、大腸炎のためCDIの2日後に重度に罹患し、従って屠殺(sacrified)した。
【０１３６】
群1〜3における盲腸内容物のコロニー数は、群4の動物と比較して、NAP1/027(P<0.05)の有意な低下を示した。乳酸桿菌コロニー数は、他の群と比較して、群4(P<0.05)においてより多かった。ビフィズス菌コロニー数は、群3および4と比較して、群1および2において有意により多かった(図4A)。総ビフィズス菌、Bif LU10、LAB LU28およびLAB LU33コピー数のDNA logコピー数は、群3および4と比較して、群1および2においてより多かった(P<0.05)。総乳酸桿菌log DNAコピー数は、4つの群全てで同様であった(図4B)。群1において、3/5匹のマウスの盲腸内容物はNAP1/027DNAコピー数の中等度の減退を示し、2匹は陰性を示した。群2において、1/6匹のマウスは非常に低いCDコピー数を示し、5匹は陰性であった。群3において、2/6匹の動物は陰性であり、1匹は非常に低いCD DNAを示し、2匹は中等度CD DNAを示し、1匹は非常に高いNAP1/027DNAコピー数を示した。群4において、4匹のマウスの盲腸内容物は、2〜4logコピー数の間のNAP1/027 DNAを示した。
【０１３７】
図5は、実験における動物から得られた盲腸組織の病理組織診断調査の結果を示す。図5Aは、群1(シンバイオティクス群)における動物の盲腸組織の病理組織診断を示し、図5Bは群2(プロバイオティクス群)の盲腸(40×視野)を示し、これらの結果は、正常管状腺および良好に保存された表在性円柱上皮を明らかにする。図5C;群3(プレバイオティクス群)の盲腸は、不規則な表面の小さな領域を呈する。少数の多形が、粘膜固有層における陰窩間に目視できる。図5D;群4(対照群)の盲腸は、盲腸における粘膜上皮細胞裏打ちおよび陰窩の展退と、潰瘍形成を示す。粘膜および粘膜下層は出血性であり、重度の炎症性浮腫を示す。
【０１３８】
群1〜3の盲腸の試料は、炎症のいかなる徴候も示さなかったが、群4において、重度の大腸炎のため3匹の動物を屠殺した(図5)。群1における1匹および群3における1匹の動物の盲腸は、炎症のスコア3+および2+を示した。群2の動物は全て、炎症を示さなかった。群1および4において盲腸の炎症を示した全てのマウスは、毒素AまたはBに対しても陽性であり、群2において、全てのマウスが毒素陰性であった(Table 10(表10))。
【０１３９】
【表１０】
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【０１４０】
結論として、4種のプロバイオティクス株ならびにGOS、IMOSおよびRSを含有するシンバイオティクスミックスまたは多株ミックスを含有するプロバイオティクスの投与は、抗生物質処理マウスにおいて、NAP1/027株によるCDIに対する保護効果を付与した。全体的にみて、シンバイオティクスまたはプロバイオティクス混合物による給餌は、CD感染症からマウスを保護し、均等なプレバイオティクス給餌により部分的な保護がもたらされた。これは、シンバイオティクスおよびプロバイオティクス処理の新規概念を用いた、マウスモデルにおけるCDI予防に関する最初の研究である。
【０１４１】
微生物叢の回復
プロバイオティクス株LAB LU28、LAB LU30、Bif LU10およびBif LU30と、プレバイオティクスGOS、IMOSおよびRSを含有するシンバイオティクスサプリメント給餌の効果を、C57/BL/6マウスモデルにおいて調査した。給餌後の異なる時点の糞便と、実験終了時の盲腸におけるプロバイオティクスミックスの繁殖を調べた。
【０１４２】
C57BL/6マウスモデルにおいてプロバイオティクスミックスを給餌する前に、マウスを抗生物質ミックスで処理して、予防実験における上述の通り、常在性LABおよびビフィズス菌の細菌叢を崩壊させた。シンバイオティクス群および対照群の盲腸における総プロバイオティクスビフィズス菌、総乳酸桿菌、LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30のDNAコピー数を、qPCRにより決定した。有意性を*P<0.05として表す(図6)。
【０１４３】
シンバイオティクス群において、総LABおよびビフィズス菌は、対照群と比較して、抗生物質処理マウスにシンバイオティクスミックスを給餌した後に増加した。盲腸ビフィズス菌の総数は、シンバイオティクス群において対照群におけるよりも多く、培養可能なビフィズス菌は検出されなかった。総糞便ビフィズス菌およびBif LU10の数は、シンバイオティクス処理の最中および実験終了時に増加した。糞便(feceal)LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30のDNAコピーは、実験終了時により多かった。
【０１４４】
シンバイオティクス群の盲腸は、最も多いビフィズス菌およびLABを示した。対照群と比較したLAB LU28、LAB LU33およびBif LU10の数を、qPCRにより決定した(図6)。シンバイオティクス群および対照群の間にLAB DNAコピー数の有意差はなかった。BIF LU30のDNAコピー数は、対照群と比較して、シンバイオティクス(symbiotic)群においてより多かったが、有意差はなかった。従って、コロニー数およびqPCRにより決定される総LABおよびビフィズス菌数が、糞便および盲腸において有意に増加したため、プロバイオティクス株は、抗生物質処理したマウスの盲腸において、プレバイオティクスおよびRSの存在下で十分に繁殖した。LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30が、糞便および盲腸の試料から回収されたという事実から、シンバイオティクスミックスにおけるプレバイオティクスの利用が、マウス腸管における選択されたプロバイオティクス株の繁殖およびコロニー形成を促進したと結論付けることができる。4株と、GOS、IMOSおよびRSの本組成物において、盲腸における各株の繁殖が等比率であることが判明した。
【０１４５】
安全性実験
LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10およびBif LU30と、GOSおよびRSを含む組成物の安全性は、免疫無防備状態のC57/BL/6マウスモデルにおいて確立された。癌化学療法において広く用いられるジヒドロ葉酸還元酵素およびDNA合成の阻害剤であるメトトレキサートを用いて、マウスを免疫無防備状態にした。メトトレキサート(3.5mg/Kg)を、マウスに経口により3日間与えた。2日後に、シンバイオティクス群に、水における4×1010cfu/mlと5%GOSを与えた。RSを飼料と混合し、マウスに6日間毎日与えた。プレート計数方法を用いた生存率調査および肝臓の病理組織診断のため、7日目にマウスを殺傷し、肝臓、脾臓、血液および腎臓を収集した。
【０１４６】
結果は、肝臓、血液、腎臓、脾臓への細菌の転位がなく、肝臓の病理組織診断が正常であることを確認した。さらに、メトトレキサート処理後に対照群において白血球数が低下したが、7日間のシンバイオティクスサプリメント給餌が、WBC数のレベルを上昇させたことが判明した。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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