(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養した後、微生物菌体を高圧式ホモジナイザーで破砕し、光を遮断して保存する、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項２】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
破砕した菌液を４〜３７℃で保存する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含むニトリルヒドラターゼの保存方法。
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
（２）培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
（３）得られた菌体破砕物を遮光下で４〜２４時間、４〜３７℃で保存する工程。
【請求項５】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含むニトリルヒドラターゼの活性化方法。
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
（２）培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
（３）得られた菌体破砕物を遮光下で４〜２４時間、４〜３７℃で保存する工程。
【請求項７】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法。
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を遮光下で培養する工程。
（２）培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕する工程。
（３）得られた菌体破砕物を遮光下で４〜２４時間、４〜３７℃で保存する工程。
【請求項９】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が、Rhodococcus属又はPseudonocardia属に
属する微生物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の酵素を保存する方法、活性化する方法、及び活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の産生する酵素は、化学変換反応の触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニトリル基の水和又は加水分解能を有するニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ等を利用することにより、化学工業上重要なアミド、カルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸等を安価に製造することが可能になる。更に、光学特異的水和能又は光学特異的加水分解能を持つ上記酵素を利用することにより、医薬、農薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ酸、α-ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能になる。【０００３】
微生物由来の酵素を触媒とする化学変換反応においては、培養及び集菌した微生物を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、雑菌が混入して、腐敗し、あるいは溶菌することで、酵素の触媒能が失われたり、低下したりしないように保存しておかなければならない。そこで、一般的には、安定剤、代謝阻害剤、高濃度塩類の存在下で保存することにより微生物菌体保存時の微生物酵素の失活や腐敗、溶菌を抑制し、化学変換反応に使用している。上記安定剤等を添加しない場合には、凍結や冷蔵、或いは通気撹拌により酵素の活性を維持しながら保存することが知られている。【０００４】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の場合、例えば、高濃度の無機塩類を含む水溶液中で保存する方法（特許文献１）、凍結により保存する方法（特許文献２）、pH制御の下で通気攪拌を行う方法（特許文献３）等が知られている。【０００５】
一方、菌体触媒ユーザーの利便性を向上させることを目的として、菌体を破砕して固形物を分離し、菌体酵素を精製する方法（特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３１６３２２４号
【特許文献２】特開２００３-２１９８７０号公報
【特許文献３】特開２００３-１４４１４４号公報
【特許文献４】国際公開第２０１１／００７７２５号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
ところが、上記の様な公知の保存方法は、工程が複雑であり、経済性に優れない。さらに、酵素の活性が低下するといったことから、未だ満足すべき方法とはいえない。例えば、特許文献１に記載されている、高濃度の無機塩類を含む水溶液を使用する方法は、後の工程で洗浄等を行う必要があるため、製品の品質に影響を与える恐れがあるだけでなく、製造工程が複雑になる。また、特許文献２に記載されている、凍結により保存する方法では、凍結、融解操作が煩雑であり、またその操作に伴い酵素活性が失われたり、低下する問題があった。特許文献３に記載されている、pH制御下で通気攪拌して保存する方法は、酸・アルカリ薬品や通気攪拌を行う設備・動力が必要となる。特許文献４には、菌体を破砕し、酸・加熱処理後に遠心分離を行う方法が記載されているが、工程を経るに連れて酵素活性が低下することから改善の余地があった。
本発明は、培養して得られた微生物菌体の酵素を、従来法と比較して安価・簡便に保存する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することにより、微生物菌体の酵素が安価・簡便に保存され、且つ保存中に酵素活性が向上することを知見した。すなわち、上記課題に合致した微生物菌体の酵素の保存方法が達成されることを知見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、培養して得られた微生物菌体の酵素を、従来法と比較して安価・簡便に保存し、且つ保存中に酵素活性を向上させる方法に係わり、その要旨は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の保存方法に存する。
【０００９】
本発明方法のより好ましい方法として以下の態様、即ち、破砕した菌液を所定の方法で保存すること；ニトリルヒドラターゼ活性を有する所定の微生物を用いることが挙げられる。
【００１０】
更に他の好ましい態様として、破砕した菌液を４〜３７℃で保存すること；破砕した菌液を４〜２４時間保存すること；Rhodococcus属又はPseudonocardia属に属する微生物を用いることが挙げられる。
【００１１】
本発明の要旨は、更に、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の遮光下培養後の菌体を、高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することを特徴とするニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の活性化方法；及び活性化ニトリルヒドラターゼの製造方法に存する。
【００１２】
本発明によれば、分散媒に懸濁させた遮光下培養した微生物菌体を高圧式ホモジナイザーを用いて破砕し、光を遮断して保存することにより、通気や撹拌を行わず、pH調整や加熱処理なしでも腐敗や酵素の劣化なしにニトリルヒドラターゼ等の酵素活性を維持した状態を保つこと、すなわち、保存することが可能となる。また、本発明によれば、保存中に酵素活性を向上することが可能である。すなわち、従来の保存方法で必要とされてきた労力やコストを大幅に削減することができ、工業的に満足し得る菌体酵素の保存方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１４】
本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物は、目的とする酵素触媒を生産し菌体内に蓄積又は菌体外に分泌する性質を有するものである。この微生物には自然界より単離された微生物及び遺伝子組換え微生物が含まれる。このような微生物の代表例としては、例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を持つロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物が挙げられる。更に、これらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物が挙げられる。中でも工業的には、ロドコッカス属、シュードノカルディア属及びこれらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌及び組換えロドコッカス属細菌が好ましい。例えば、ロドコッカス属の微生物の具体例としては、特公平６-５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）および国際公開パンフレットＷＯ２００５／０５４４５６号に記載されるロドコッカス・ロドクロウスNCIMB41164株が挙げられる。ロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。また、NCIMB41164株は、２００３年３月５日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB)（NCIMB Ltd Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen AB21 9YA）に受託番号NCIMB41164として寄託されている。シュードノカルディア属の具体例としては、特開平０９-２７５９７８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila JCM3095）が挙げられる。当該株は、「ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５」として同特許生物寄託センターに寄託されている。
本発明においては、上記微生物から選択される１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の培養は、遮光下で培養をすること以外は、微生物の培養に適した通常の条件で、培養すればよい。
【００１５】
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して、対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素をいうものである。ニトリルヒドラターゼをコードする核酸及びその配列の例としては、前記特許文献２に記載されるものが挙げられる。このような核酸は、通常の分子生物学的手法によって微生物細胞内に導入及び発現可能である（これらの分子学的手法については、以下を参照：Sambrook,Fritsch and Maniatis,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press）。すなわち、本発明においては、天然のニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物から得られる酵素を用いることもでき、ニトリルヒドラターゼをコードする核酸を微生物細胞内で発現させて得られる酵素を用いることもできる。本発明においては、上記酵素から選択される１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明において「保存」とは、タンクや容器中に菌体破砕物を保管することを意味する。この際、タンクや容器内の濃度が偏らないように攪拌や通気をしてもよいが、本発明では、攪拌や通気を行わず静置してもかまわない。本発明において「静置」とは、撹拌や通気をせずタンクや容器中に菌体破砕物を保管することを意味する。本発明において、光を遮断する方法としては、遮光性のタンクや暗室にて密閉容器中に菌体破砕物を保存すればよい。
【００１７】
本発明において、保存温度は、酵素を生産する微生物、酵素の種類等によって変化するが、酵素活性化を指標に、適切な保存温度を設定することが可能である。
本発明において、保存は通常室温で可能であるが、酵素活性化の観点から好ましくは４〜３７℃、より好ましくは４〜２５℃、さらに好ましくは４〜１５℃で行われる。保存温度が４℃よりも低いと菌体懸濁液が凝固する可能性があるだけでなく、冷却のための費用が高くなる恐れがある。また、３７℃よりも高くなると菌体酵素によってはニトリルヒドラターゼ活性が低下する恐れがある。
【００１８】
本発明において、保存期間は、酵素を生産する微生物、酵素の種類、保存温度等によって変化するが、酵素活性化を指標に、適切な保存期間を設定することが可能である。保存期間は、通常４〜２４時間であればよいが、６〜２４時間がより好ましい。保存期間が４時間よりも短いと、ニトリルヒドラターゼ活性が十分に向上しない恐れがある。また、２４時間よりも長いと、温度や菌体酵素によっては菌体懸濁液が腐敗しニトリルヒドラターゼ活性が低下する恐れがある。
【００１９】
本発明の方法によって菌体酵素を保存した場合、遮光をしない場合に比べ、酵素活性が活性化される。通常、前記のニトリルヒドラターゼ活性は保存前のニトリルヒドラターゼ活性に対し、保存後のニトリルヒドラターゼ活性が１００％を超える。好ましくは１０３％以上、より好ましくは１１０％以上、さらに好ましくは１２０％維持される。
ニトリルヒドラターゼ活性は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質（例えば、アクリロニトリル）に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
【００２０】
本発明において「分散媒」とは、破砕対象となる微生物菌体の懸濁に使用する溶液を意味する。該分散媒の種類は任意であり、菌体培養時に使用した液体培地、あるいは培養時に使用した液体培地を有機酸水溶液に置換したものでもよい。
【００２１】
有機酸水溶液の成分としては、酵素活性を阻害しないものであれば特に限定されない。例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸等のカルボン酸類が挙げられ、中でもアクリルアミドの品質を維持する点で、アクリル酸が好ましい。
【００２２】
本発明の菌体破砕液の調製は、培養を行って得た菌体について、薬剤処理（例えば特開平７−２６５０９１に開示されたグルタルアルデヒド処理）を行う前に実施することが好ましい。破砕方法は、分散媒に懸濁させた状態で菌体破砕する、高圧式ホモジナイザーを使用することができる。高圧式ホモジナイザーには、フレンチプレス、連続圧力式などがあるが、工業的に大量に且つ安定的に菌体の破砕液を得ることができる、連続圧力式が好ましい。破砕方法は、分散媒で懸濁させた状態で高圧式ホモジナイザーで破砕することが好ましい。破砕時の温度は、熱変性を回避するため０℃〜３７℃が好ましく、０℃〜２５℃がさらに好ましい。破砕時の圧力は、菌体を破砕できる圧力であれば特に制限されないが、５０〜１５０MPa、好ましくは７０〜１２０MPaに調節するのが良い。破砕する際の菌濃度は特に制限はないが、乾燥菌体換算で０．１〜３０質量％の範囲とすればよい。
【００２３】
なお、本発明において、破砕した菌液を保存した後、固形物を分離して使用してもよい。固形物を分離する方法は限定されないが、例えば遠心分離等が挙げられる。分離操作の際の温度は、０〜３７℃が好ましく、０〜２５℃がさらに好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の試験例（実施例、比較例及び参考例）において、酵素活性の評価は、培養した菌体を所定法で保存後、遠心分離した上清を後記の所定の方法でニトリルと接触させたときの水和反応速度を測定することにより行った。
以下の実施例、比較例及び参考例に於ける%表示は質量%である。
【００２５】
＜ニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するロドコッカス（Rhodococcus）属細菌形質転換体の作成＞
Rhodococcus rhodochrous J1由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体として、特開２００８-１５４５５２号公報に記載の方法で作製されたRhodococcus rhodochrous ATCC12674／pSJ042を用いた。
Pseudonocardia thermophila JCM3095由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体には、特開２０１１-２００１３２号公報に記載のプラスミドpSJ-N02Aを、記載の方法と同様にしてＡＴＣＣ１２６７４株に導入した、形質転換体Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ-N02Aを用いた。【００２６】
＜菌体の培養＞
（１）ＡＴＣＣ１２６７４株形質転換体の培養
５００ｍｌの三角フラスコに表−１の成分を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、尿素0.1g/L、カナマイシン50mg/Lとなるよう添加し、ATCC12674／pSJ042またはATCC12674/pSJ-N02Aを接種し、遮光下で３０℃、２３０ｒｐｍで７２時間培養した。試験例で使用した培地成分を以下の表−１に示す。
（２）Rhodococcus rhodochrous J-1株の培養
３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）に表−２の成分を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．０）２．５Lを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、（１）と同様の方法で培養したRhodococcus rhodochrous J-1を２０ｍL接種し、光を遮断して４２時間培養した。培養温度は３５℃であった。試験例で使用した培地成分を以下の表−２に示す。
（３）Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164株の培養
５００ｍｌの三角フラスコに表−３の成分を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。これに、尿素5.0g/Lとなるよう添加し、Rhodococcus rhodochrous NCIMB-41164を接種し、遮光下で３０℃、２３０ｒｐｍで６５時間培養した。試験例で使用した培地成分を以下の表−３に示す。【００２７】
【表１】
0005967189.tif 000002
【００２８】
【表２】
0005967189.tif 000003
【００２９】
【表３】
0005967189.tif 000004
【００３０】
＜乾燥菌体濃度の測定＞
「乾燥菌体濃度（乾燥菌体質量[％]）」とは、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣割合[％]）から、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：上清塩濃度[％]）を差引くことにより求めたものである。【００３１】
＜ニトリルヒドラターゼ活性の測定＞
ニトリルヒドラターゼ活性は、菌体を破砕して固形物を分離した上澄み液によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を上澄み液に添加することで反応を開始し、１０℃で１０分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ−１４Ｂ、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ  ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
本発明におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、1分間に菌体１ｍｇが生産するアクリルアミドの量（μｍｏｌ）として測定した。【００３２】
［試験例］
＜実施例１＞
前述の通り培養を行って得たATCC12674／pSJ042、およびATCC12674／pSJ-N02Aについて、乾燥菌体濃度を測定した。次に、高圧式ホモジナイザーである小型菌体破砕装置ＰＡＮＤＡ２Ｋ（Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）にて、培養を行って得た菌体懸濁液を用いて、菌体を破砕した。破砕圧力は１００ＭＰａ、破砕時の温度は４℃であった。
破砕液を調製した直後（０時間目）と、暗所にて４〜３７℃で静置することで４〜２４時間保存した破砕液を、４℃、１５０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離を行って上澄み液を得た。この上澄み液のニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−４に示す。【００３３】
＜参考例１＞
保存温度を５０℃にした以外は実施例１と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−４に示す。
【００３４】
【表４】
0005967189.tif 000005
【００３５】
微生物を遮光下で培養し、微生物菌体からの酵素を遮光下で酵素に応じた温度で酵素に応じた期間保存すると、酵素活性が向上することが分かる。上記実施例及び参考例で用いた微生物由来の酵素を用いた場合、保存温度が５０℃では酵素が失活し、酵素活性化効果が得られなかった。
【００３６】
＜実施例２＞
培養した菌体がRhodococcus rhodochrous J1であり、５００ｍｌの三角フラスコの代わりに３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）を用いて培養した以外は実施例１と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。なお、培養後の乾燥菌体濃度は、３９．８ｇ／Lであった。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−５に示す。【００３７】
＜参考例２＞
保存温度を５０℃にした以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−５に示す。
＜参考例３＞
保存時間を４８時間にした以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−５に示す。
＜比較例４＞
破砕装置として超音波発生機（ＴＡＩＴＥＣ製、ＶＰ−３００）を使用した以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、１５ｍｌコニカルチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ製）に培養した菌体懸濁液を１ｍｌ採取し、氷冷しながら強度２０％にて５分間適用した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−５に示す。
＜比較例５＞
遮光操作を行わなかった以外は実施例２と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−５に示す。
【００３８】
【表５】
0005967189.tif 000006
【００３９】
微生物を遮光下で培養し、微生物菌体からの酵素を遮光下で酵素に応じた温度で酵素に応じた期間静置すると、酵素活性が向上することが分かる。上記実施例、比較例及び参考例で用いた微生物由来の酵素を用いた場合、保存温度が５０℃では酵素活性化効果が得られなかった。また、保存温度３０〜３７℃、保存期間４８時間では酵素活性化効果が得られなかった。また、高圧式ホモジナイザーを用いることにより、酵素活性化効果が得られる。
【００４０】
＜実施例３＞
培養した菌体がRhodococcus rhodochrous NCIMB41164であり、菌体の破砕に高圧式ホモジナイザーである手動式フレンチプレス（大岳製作所  ５５０２型）を用いた以外は実施例１と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。なお、培養後の乾燥菌体濃度は、５.４ｇ／Lであった。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−６に示す。【００４１】
＜参考例６＞
保存温度を５０℃にした以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−６に示す。
＜参考例７＞
保存時間を４８時間にした以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−６に示す。
＜比較例８＞
破砕装置として超音波発生機（ＴＡＩＴＥＣ製、ＶＰ−３００）を使用した以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。超音波破砕操作においては、１５ｍｌコニカルチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ製）に培養した菌体懸濁液を１ｍｌ採取し、氷冷しながら強度２０％にて５分間適用した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−６に示す。
＜比較例９＞
遮光操作を行わなかった以外は実施例３と同様にし、酵素活性の向上効果を判定した。結果、０時間目の活性を１００としたときの相対値を表−６に示す。
【００４２】
【表６】
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【００４３】
微生物を遮光下で培養し、微生物菌体からの酵素を遮光下で酵素に応じた温度で酵素に応じた期間静置すると、酵素活性が向上することが分かる。上記実施例、比較例及び参考例で用いた微生物由来の酵素を用いた場合、超音波式ホモジナイザーによる菌体破壊では酵素活性化効果が得られなかった。また、保存時の遮光無しでは酵素活性化効果が得られなかった。