(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子に結合し、生体試料から標的核酸を増幅して増幅産物（複数可）を生成することができる、少なくとも１対のプライマーであって、前記少なくとも１対のプライマーは、配列番号１６の配列から成るプライマー及び配列番号１９の配列から成るプライマーを含む、少なくとも１対のプライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ、及び
複数のｄＮＴＰｓ
を含む、生体試料中のＣ．ディフィシレの毒素原性菌株の存在を決定するためのアッセイ混合物。
【請求項２】
さらに、生体試料由来の核酸を含む、請求項１に記載のアッセイ混合物。
【請求項３】
核酸がＣ．ディフィシレＤＮＡを含む、請求項２に記載のアッセイ混合物。
【請求項４】
生体試料が、糞便、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、呼吸組織、および滲出液からなる群から選択される、請求項２に記載のアッセイ混合物。
【請求項５】
生体試料が糞便試料である、請求項４に記載のアッセイ混合物。
【請求項６】
さらに、増幅産物（複数可）にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、５’末端に蛍光体、３’末端に蛍光消光体を含む、請求項６に記載のアッセイ混合物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３０または配列番号３１の配列を含む、請求項６に記載のアッセイ混合物。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３０の配列を含む、請求項６に記載のアッセイ混合物。
【請求項１０】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【請求項１１】
さらに緩衝液を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【請求項１２】
さらにＭｇＣｌ２を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒素を産生する（毒素原性）クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌株を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびにこれらのプライマーおよびプローブを使用して毒素原性菌株を検出する方法に関する。より具体的には、本発明は、毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子に結合する特定のプライマーおよびプローブを使用した核酸に基づく増幅法によるＣ．ディフィシレの検出に関する。これらのプライマーおよびプローブを使用して臨床試料中のＣ．ディフィシレ核酸を増幅することによりこれらの毒素原性菌株の存在を決定する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシレは、ヒトに対して病原性である菌体外毒素を産生する芽胞形成グラム陽性バチルスである。Ｃ．ディフィシレ関連疾患（ＣＤＡＤ）は、重症度が、軽度の下痢から劇症大腸炎および死亡にまで及ぶ。Ｃ．ディフィシレは、典型的には、病院入院患者または長期療養施設の居住者である高齢または重病の患者に影響を及ぼしていた。Ｃ．ディフィシレは、偽膜性大腸炎および抗生物質関連下痢の主要な原因である。Ｃ．ディフィシレ関連疾患は、正常な腸内細菌叢が変化して、Ｃ．ディフィシレが腸管で繁殖し、水性下痢を引き起こす毒素の産生が可能になる場合に生じる。腸内細菌叢が変化する１つの主要な原因は、抗生物質の乱用である。浣腸の繰り返し、長期にわたる経鼻胃管挿入、および消化管手術も、人がこの疾患を発症するリスクを増加させる。抗生物質、特にペニシリン（アンピシリン）、クリンダマイシン、およびセファロスポリンの乱用も、正常な腸内細菌叢を変化させ、Ｃ．ディフィシレ下痢の発症リスクを増加させる場合がある。
【０００３】
Ｃ．ディフィシレの毒素原性菌株は、一般的に２つの大型毒素、腸毒素；毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および細胞毒素；毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）を産生し、病患の症状はそれらに起因する。それらは、環境刺激に応じて、Ｃ．ディフィシレの増殖中に効率的に発現される。それらの活性は、細胞の様々な生理学的事象を調節し、疾患に直接寄与する。ヒトにおいて、この２つの毒素は、偽膜性大腸炎および抗生物質関連下痢と呼ばれる疾患を引き起こす。伝染は、主として医療施設で生じ、そこでは抗菌薬への曝露およびＣ．ディフィシレ芽胞による環境汚染が一般的に起こっている（２、３、および４）。
【０００４】
毒素Ａおよび毒素Ｂは、遺伝子ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢによってコードされている。両者は配列決定がなされており、単一のオープンリーディングフレームに見出されている。それらは、３つの追加の遺伝子（ｔｃｄＣ、ｔｄｃＤ、ｔｃｄＥ）と共に、１９．６ｋｂの染色体病原性遺伝子座（Ｐａｌｏｃ）を形成する（８）。オープンリーディングフレームは両方とも大型であり、ｔｃｄＡは８，１３３個のヌクレオチドにわたり、ｔｃｄＢは長さが７，０９８個のヌクレオチドである。図１は、Ｃ．ディフィシレＰａｌｏｃの遺伝子配置を示している。ｔｃｄＲと呼び名が変更されたｔｃｄＤは（Ｒｕｐｎｉｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００５年、５４巻：１１３〜１１７頁）は、正の調節因子であると提唱されており、ｔｃｄＥは、推定上のｈｏｌｉｎタンパク質であり、ｔｃｄＣは、毒素遺伝子発現の負の調節因子であると提唱されている（Ｖｏｔｈ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、１８巻：２４７〜２６３頁）。
【０００５】
ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、報告されている最も大型の細菌毒素に属しており、Ｃ．ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）の致死性毒素（ＴｃｓＬ）および出血性毒素（ＴｃｓＨ）ならびにＣ．ノービー（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）のアルファ毒素（Ｔｃｎｓ）のサイズに匹敵する（Ｖｏｔｈ、上記参照）。ＴｃｄＡ（３０８ｋＤａ）およびＴｃｄＢ（２７０ｋＤａ）は、標的細胞内のＲｈｏ、Ｒａｃ、およびＣｄｃ−４２などの小型ＧＴＰアーゼを不活性化するグルコシルトランスフェラーゼである（Ｖｏｔｈ、上記参照）。この不活性化は、細胞の細胞骨格の分離、および最終的に細胞死に結びつく他の細胞プロセスの変化を引き起こす（Ｖｏｔｈ、上記参照）。両毒素は、高度に保存されているＮ末端ドメイン（ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢとの間で７４％の相同性）を使用して、同一の基質を修飾する。Ｖｏｎ  Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒは、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ遺伝子が近位に位置していること、およびこの２つのタンパク質間で配列相同性および機能的相同性が高いことに触発され、この２つの遺伝子が遺伝子重複の結果として生じた可能性があると提唱した（Ｋｎｏｏｐ  Ｆ．Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ  ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９３年７月、２５１〜２６５頁）。
【０００６】
ＴｃｄＢは、Ｒａｓ、Ｒａｃ、ＲａｐおよびＲａｌをグリコシル化するＣ．ソルデリイの致死性毒素（ＴｓｃＬ）とも相同性を示している（８５％の相同性および７４％の同一性）。主要な違いはＮ末端に見出される。これらにより、基質特異性の違いが説明される。ＴｃｄＡは、Ｃ．ソルデリイの出血性毒素（ＴｃｓＨ）と、機能がより類似していると思われる（Ｖｏｔｈ、上記参照）。
【０００７】
初期の研究では、Ｃ．ディフィシレ毒素原性菌株は、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方を産生する一方で、非毒素原性菌株は両毒素を欠如していることが、一般的に受入れられていた（Ｒｕｐｎｉｋら、上記参照；Ｌｙｅｒｌｙら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．、１９９８年、１月、１〜１８頁）。その後、検出可能な毒素Ａを産生できないが、毒素Ｂを産生する（ＴｃｄＡ−／ＴｃｄＢ＋）毒素変異株が発見された。３番目の毒素（二元毒素ＣＤＴ）も、いくつかのＣ．ディフィシレ菌株に見出されている。大多数の二元毒素陽性菌株は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを産生する（ＴｃｄＡ＋ＴｃｄＢ＋ＣＤＴ＋）が、いくつかは、ＴｃｄＡもＴｃｄＢも産生しない（ＴｃｄＡ−ＴｃｄＢ−ＣＤＴ＋）。利用可能なデータに照らして、Ｃ．ディフィシレ菌株の毒素原性菌株への分類は、それらが３つの公知の毒素のうち少なくとも１つを産生する場合は毒素原性、これらの３つの毒素のうちのいずれも産生しなかった場合は非毒素原性菌株と分類された（Ｒｕｐｎｉｋら、上記参照）。
【０００８】
ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに関する主要な研究は、毒素原性基準菌株ＶＰ１  １０４６３に由来する毒素について行われたが、これらの毒素のいくつかの遺伝子変異体は、今では臨床分離株に存在する（Ｖｏｔｈら、上記参照）。毒素Ａを発現しない（ＴｃｄＡ−／ＴｃｄＢ＋）詳しく特徴づけられている２つの菌株、１４７０および８８６４は、ＶＰ１  １０４６３と比較して修飾されている毒素Ｂを産生する。菌株１４７０は、毒素ＴｃｄＢおよびＴｃｓＬのハイブリッドを産生する。この菌株は、ＴｃｄＢ様細胞接着ドメインおよびＴｃｓＬ様酵素ドメイン（形態変化および細胞死様ＴｃｓＬ）を産生する（Ｖｏｔｈ、上記参照；Ｃｈａｖｅｓ−Ｏｌａｒｔｅ  Ｅ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、２７４巻、第１６号、１１０４６〜１１０５２頁）。上記で言及したように、基準菌株１０４６３に由来する毒素Ｂは、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、およびＣｄｃ−４２のような小型ＧＴＰアーゼを不活性化した。細胞的機構が修飾される影響は、電子顕微鏡で可視化できる。２つのタイプの細胞変性効果が記載されている。Ｄタイプは、細胞の外観が樹状であることによって特徴づけられるが、紡錘体様の外観は、第２のタイプの細胞変性効果、Ｓタイプに典型的である（Ｍｅｈｌｉｇら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、１９８巻：１７１〜１７６頁）。基準菌株の毒素Ｂならびに毒素Ａは、Ｄタイプの細胞変性効果を示す。菌株１４７０および菌株８８６４などの毒素Ａ産生を欠如している菌株は、Ｓタイプの細胞変性効果を有する毒素Ｂを産生する。これらの毒素Ｂの基質は、小型ＧＴＰアーゼＲａｓ、Ｒａｃ、Ｒａｐ，Ｒａｌ、およびＣｄｃ−４２である。両菌株は、ＶＰ１  １４０６３  ｔｃｄＢ遺伝子と比較して、それらの毒素Ｂ遺伝子（ｔｃｄＢ）に変異を示している。これらの変異により、基質特異性の違いが説明される。１４７０菌株およびＶＰ１  １０４６３のｔｃｄＢのＮ末端領域の違いは、詳しく文書化されている（Ｖｏｎ  Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９５年、１７巻：３１３〜３２１頁）。
【０００９】
機能的な毒素Ａを産生する別の毒素Ｂ変異株が発見された。したがって、菌株Ｃ３４は、１４７０および８８６４のように変異体毒素Ｂを発現し、基準型菌株１４０６３のように機能的な毒素Ａを発現する最初のＣ．ディフィシレ菌株である（Ｍｅｈｌｉｇら、上記参照）。この菌株は、菌株１４７０および菌株８８６４のようにＳタイプの細胞変性効果を有する毒素Ｂを産生する。Ｃ３４は、Ｄタイプ誘導性ＴｃｄＡとＳタイプ誘導性ＴｃｄＢ分子とを共発現する最初のＣ．ディフィシレ単離株である。ＴｃｄＡ−Ｃ３４および基準菌株ＴｃｄＡ−１０４６３の基質は同一であり（Ｒｈｏ、Ｒａｃ、およびＣｄｃ−４２）、ＴｃｄＢ−Ｃ３４およびＴｃｄＡ−１４７０または８８６４の基質は同一である（Ｒａｓ、Ｒａｃ、Ｒａｐ、Ｒａｌ、およびＣｄｃ−４２）。Ｃ３４に由来するｔｃｄＢ配列は、ｔｃｄＢ−１４７０または８８６４とヌクレオチドが異なるのみである。菌株１４７０および８８６４のように毒素Ａ産生を防止するｔｃｄＡにおける欠失を有する代りに、ｔｃｄＡ−Ｃ３４には配列の挿入がある。この小さな挿入は、毒素Ａ産生に負の効果を有していない。それでも、この菌株では、細胞に対するＳタイプの細胞変性効果は、Ｄタイプの細胞変性効果より優勢である（Ｍｅｈｌｉｇら、上記参照）。
【００１０】
現在まで、一般的に完全なｔｃｄＢを産生するが、細胞毒性効果を欠如している非機能的な毒素Ｂ、および細胞毒性効果を有する機能的な毒素Ａを産生する１つの変異株が記載されている。この変異体の毒素遺伝子変異型判定データにより、Ｐａｌｏｃにおける突然変異が限定的であることが示され、この菌株は毒素遺伝子変異型ＩＸ（ＴｃｄＡ＋／ＴｃｄＢ＋／ＣＤＴ＋）に分類された（抄録、Ｍａｃｃａｎｎｅｌｌら、２００６年）。最近、高毒素原性Ｃ．ディフィシレ菌株の流行が、カナダおよび合衆国で報告されている。これらの単離株は、ＣＤＴ二元毒素に陽性であり、ｔｃｄＣ遺伝子中に欠失を有し、より大量の毒素ＡおよびＢを産生した（ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００５年１２月、３５３巻、２３号）。類似したＣ．ディフィシレ単離株の出現は、英国、ベルギー、およびオランダでも記載されている。それらの国々で単離された伝染性菌株は、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、北アメリカＰＧＥＦ１（ＮＡＰ１）、制限エンドヌクレアーゼ解析群Ｂ１型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｒｏｕｐ  ｔｙｐｅ  Ｂ１）、およびＰＣＲリボタイプ０２７として特徴づけられた（Ｋｕｉｊｐｅｒ  Ｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌの文書、Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃａｎａｄａ，ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅ）。
【００１１】
Ｃ．ディフィシレ毒素原性菌株の場合、Ｐａｌｏｃ（ｔｃｄＢおよびｔｃｄＡ領域）におけるヌクレオチド配列の変異、欠失、および重複が、種々の遺伝子型の原因である。種々の遺伝子型を識別し、毒素遺伝子変異型（１、８、９、１０、１１、１２、１３、１９）としてそれらを分類する遺伝子型決定方式が開発されている。毒素遺伝子変異型決定には、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ遺伝子における病原性遺伝子座（Ｐａｌｏｃ）の多型性を正確に検出する必要がある。今のところ、少なくとも２４種の毒素遺伝子変異型がある（表１を参照）。Ｐａｌｏｃが基準菌株ＶＰ１  １０４６３と同一である菌株は、毒素遺伝子変異型０と呼ばれる。毒素遺伝子の変異がすべて毒素原性に影響するとは限らない。毒素遺伝子変異型がＩ〜ＶＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩ〜ＸＶ、およびＸＶＩＩＩ〜ＸＸＩＶの菌株は、それらの毒素遺伝子（８、１１、１３、１９）における変異にもかかわらず、毒素ＡおよびＢの両方を産生する。毒素遺伝子変異型ＸＩの菌株は、毒素ＡまたはＢ（１３）を産生しないが、その一方で毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＶＩ、およびＸＶＩＩの菌株は、機能的な毒素Ｂを産生するが、毒素Ａは産生しない（１３）。図２には、毒素遺伝子変異型と毒素発現との関係が詳しく記載されている。菌株１４７０は、毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩに属し、菌株８８６４は、毒素遺伝子変異型Ｘに属している。ほとんどのＴｃｄＡ−／ＴｃｄＢ＋菌株は、毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩに属しており、菌株１４７０のように変異体毒素Ｂを産生することが知られており、毒素遺伝子変異型Ｘには菌株８８６４のみが含まれている（１１）。
【００１２】
【表１】
0005981979.tif 000002
【００１３】
ｔｃｄＢ遺伝子のコンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な６つの配列を使用して決定した（配列表を参照）。ｔｃｄＢアラインメントにおける第１の配列（配列番号１）は、基準菌株ＶＰ１  １４０６３  ＴｃｄＡ＋／ＴｃｄＢ＋である。配列表の第２および第３の配列（それぞれ、配列番号２および３）は、詳しく特徴づけられている２つのＴｃｄＡ−／ＴｃｄＢ＋菌株（１４７０、２行目、および菌株８８６４、３行目）である。４つ目は別のＴｃｄＡ−／ＴｃｄＢ＋菌株である（５３４０）（配列番号４）。変異体ｔｏｘＢおよび機能的ｔｏｘＡ菌株Ｃ３４クラスター１〜２配列（配列番号５）は、５つ目に示されており、Ｃ．ソルデリイ致死性毒素（ＴｃｓＬ）配列（配列番号６）は、特異性対照として６つ目に示されている。ｔｃｄＢ遺伝子の特定の領域は、これらの異なる菌株中で保存されている。
【００１４】
毒素アッセイをしないＣ．ディフィシレの陽性培養は、Ｃ．ディフィシレ関連疾患の診断を行うには十分でない。したがって、組織培養細胞毒素アッセイによる毒素原性Ｃ．ディフィシレの検出は、多くの場合「究極の標準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」であると考えられる。しかしながら、このアッセイは、少なくとも２４時間のインキュベーション期間を含むことになるため、時間がかかる。本発明は、迅速、高感度、および特異的であり、糞便試料などの臨床試料から直接的にＣ．ディフィシレを検出することを可能にする、Ｃ．ディフィシレ毒素遺伝子ｔｃｄＢを標的とするリアルタイムＰＣＲアッセイを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、毒素を産生する（毒素原性）Ｃ．ディフィシレ菌株を検出するためのプライマーおよびプローブを提供する。これらのプライマーおよびプローブは、表２〜４に示されており、Ｃ．ディフィシレの毒素原性菌株を検出する方法は、これらのプローブおよびプライマーを使用する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施形態は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子にハイブリダイズすることが可能である長さが最大で約１００核酸塩基のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーであり、前記プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列、または配列番号１〜３３からなる群から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列を含む。一実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列、または配列番号１〜３３からなる群から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列を有する。別の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列を有する。本発明は、生体試料中のＣ．ディフィシレの毒素原性菌株の存在を検出する方法も提供し、この方法は、試料を、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子に結合することが可能である少なくとも１対のプライマーと接触させるステップであって、少なくとも１対のプライマーの各プライマーが、長さが最大で約１００核酸塩基であり、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子に結合することが可能であり、少なくとも１対のプライマーの各プライマーが、配列番号１〜３３に示されている配列、または配列番号１〜３３に示されている配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列を含んでいるステップと、試料から標的核酸を増幅するステップと、前記試料中のＣ．ディフィシレの毒素原性菌株の存在の指標として、増幅産物（複数可）の存在または量を検出するステップとを含む。
【００１７】
一実施形態では、試料は、糞便、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、呼吸組織、または滲出液試料である。別の実施形態では、試料を、１対のプライマーと接触させる。さらに別の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、レプリカーゼ媒介増幅、または転写媒介増幅を用いて実行される。好ましくは、増幅はＰＣＲを使用して実施される。ＰＣＲのタイプには、ＡＦＬＰ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ＤＤ−ＰＣＲ、デジェネレートＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−一本鎖高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）、定量的競合ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端迅速増幅−ＰＣＲ（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）、多型ＤＮＡランダム増幅−ＰＣＲ（ＲＡＰＤ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、反復遺伝子外パリンドロームＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、およびベクトレット（Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲが含まれる。一実施形態では、ＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）である。別の実施形態では、各プライマーは、増幅自体に対して著しい影響を与えずに増幅産物の増幅後操作を可能にする外来性ヌクレオチド配列を導入する。特定の実施形態では、プライマー対は、配列番号３０および３１または３１および３２を含む。一実施形態では、プライマー対の各プライマーに、５’末端に蛍光体、３’末端に蛍光消光体を含む相補的配列が隣接している。
【００１８】
本発明は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子にハイブリダイズすることが可能である少なくとも１対のプライマーの使用も提供し、前記プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列、または配列番号１〜３３からなる群から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列を含む。一実施形態では、核酸に基づく増幅によって生体試料中のＣ．ディフィシレの毒素原性菌株の存在を検出するために、プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列、または配列番号１〜３３からなる群から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列を有する。一実施形態では、試料は、糞便、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、呼吸組織、または滲出液試料である。別の実施形態では、試料を、１対のプライマーと接触させる。さらに別の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、レプリカーゼ媒介増幅、または転写媒介増幅を用いて実行される。好ましくは、増幅はＰＣＲを使用して実行される。ＰＣＲのタイプには、ＡＦＬＰ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ＤＤ−ＰＣＲ、デジェネレートＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−一本鎖高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）、定量的競合ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端迅速増幅−ＰＣＲ（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）、多型ＤＮＡランダム増幅−ＰＣＲ（ＲＡＰＤ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、反復遺伝子外パリンドロームＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、およびベクトレットＰＣＲが含まれる。一実施形態では、ＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｃ．ディフィシレ病原性遺伝子座の遺伝子配置、ならびにＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ遺伝子の提唱されているタンパク質ドメイン構造を示す図である。
【図２ａ】ＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０標的プローブが形成するヘアピン構造を示す模式図である。
【図２ｂ】Ｓｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０内部対照プローブが形成するヘアピン構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、Ｃ．ディフィシレの毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）遺伝子に結合する特定のプライマーおよびプローブを使用した、クロストリジウム・ディフィシレの毒素原性菌株の検出に関する。これらのプライマーおよびプローブを使用して臨床試料中のＣ．ディフィシレ核酸を増幅することにより毒素原性菌株の存在を決定する。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「鋳型」は、少なくとも１つの標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの全部または一部を指す。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「標的ヌクレオチド配列」は、定義された配列および長さ有する最終産物のヌクレオチド配列を含み、増幅産物の増幅後処理中に取り除かれる他のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。標的ヌクレオチド配列中に見出され、その後取り除かれるヌクレオチド配列は、プライマーもしくはプローブの結合部位（アニーリング部位）、二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの変換に関与するヌクレオチド、または制限エンドヌクレアーゼの認識部位および／または切断部位として有用な配列を含んでいてもよい。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「外来性ヌクレオチド配列」は、増幅に使用されたプライマーまたはプローブにより導入された配列を指し、増幅産物は、標的ヌクレオチド配列がそこからコピーされた元々の鋳型には見出されない配置で、外来性ヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含有するであろう。
【００２４】
鋳型は、増幅に好適な任意のポリヌクレオチドであってよく、鋳型は、増幅される少なくとも１つの標的ヌクレオチド配列を含有している。好適な鋳型には、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子が含まれ、修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、鋳型は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ分子である。別の好ましい実施形態では、本明細書中で開示された方法を使用して、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写せずに、ＲＮＡ鋳型を直接増幅することができる。
【００２５】
「臨床試料」とは、例えば、糞便（液状または軟質）、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、呼吸組織、もしくは滲出液を含む生検組織、または他の体液、組織、物質を含む、Ｃ．ディフィシレ核酸を含有する可能性のある任意の由来組織または材料を意味する。試料を処理して、物理的、化学的、および／または機械的に組織または細胞構造を破壊し、したがって細胞内成分を放出させてもよい。試料調製には、分析用試料を調製するために使用される緩衝液、塩、および界面活性剤などを含有する溶液を使用してもよい。
【００２６】
「核酸」とは、核酸骨格結合（例えば、ホスホジエステル結合）によって共に結合されてポリヌクレオチドを形成する窒素性ヘテロ環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含むポリマー化合物を意味する。従来のＲＮＡおよびＤＮＡが「核酸」という用語に含まれるように、それらの類似体も「核酸」という用語に含まれる。核酸骨格は、多様な結合、例えば、１つまたは複数の糖ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート結合、または単一のオリゴヌクレオチドにおけるそのような結合の混合を含んでいてもよい。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または公知の置換を有する類似化合物のいずれであってもよい。従来の窒素性塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、公知の塩基類似体（例えば、イノシン）、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体、および「脱塩基」残基（つまり、１つまたは複数の骨格位置に窒素性塩基がない）は、核酸という用語に含まれる。すなわち、核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見出される従来の糖、塩基、および結合のみを含んでいてもよく、または従来の構成要素および置換（例えば、メトキシ骨格によって結合された従来の塩基および類似体、またはＲＮＡまたはＤＮＡ骨格によって結合された従来の塩基および１つまたは複数の塩基類似体）の両方を含んでいてもよい。
【００２７】
「プライマー」とは、標的配列、プローブ、またはライゲーション産物の相補性部分とハイブリダイズし、プライマー伸長を起こすように設計されたオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、ヌクレオチドの重合の出発点として機能する（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９６年）  ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ニューベリー、英国）。プライマーは、一般的に、約１６〜２４個のヌクレオチドを含有するが、最大で約５０、７５、または１００個のヌクレオチドを含有していてもよい。プライマーは、標的配列のコード配列を有するＤＮＡ鎖にハイブリダイズすることができ、センスプライマーと呼ばれる。プライマーは、標的配列のコード配列の相補体であるＤＮＡ鎖にハイブリダイズすることもでき、このようなプライマーはアンチセンスプライマーと呼ばれる。同じ位置でＤＮＡの各鎖にハイブリダイズするプライマー、または互いにハイブリダイズするプライマーは、互いの相補体として知られている。プライマーは、標的ＤＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズするように設計することもでき、逆転写ＰＣＲに有用である。
【００２８】
「プライマー伸長」という用語は、鋳型依存性ポリメラーゼを使用して、標的とアニーリングしているプライマーを５’から３’方向に伸長させる過程を意味する。特定の実施形態によると、鋳型依存性ポリメラーゼは、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、ならびにその類似体および誘導体を含むヌクレオチド三リン酸を用いて、アニーリングしたプライマーの３’末端から開始して、相補的なヌクレオチドを鋳型鎖に組み込み、相補鎖を生成する。
【００２９】
「プローブ」とは、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で核酸の標的配列に特異的にハイブリダイズし、それによって標的または増幅核酸の検出を可能にする核酸オリゴマーを意味する。プローブの「標的」とは、一般的に、標準的な水素結合（つまり、塩基対合）によってプローブオリゴマーの少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズする増幅核酸配列内の配列またはサブセットを指す。プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元高次構造に寄与する他の配列を含んでいてもよい。配列は、プローブの標的特異的配列に完全には相補的でない標的配列に対するプローブオリゴマーの適切なハイブリダイゼーション条件下で、安定したハイブリダイゼーションが可能である場合、「十分に相補的である。」
【００３０】
「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基間の水素結合によって、別の塩基配列にハイブリダイズすることが可能な近接する核酸塩基配列を意味する。相補的塩基配列は、標準的な塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）の使用により、オリゴマー配列の各位置で相補的であってもよく、または相補的でない（脱塩基位置を含む）１つまたは複数の残基を含有していてもよいが、相補的塩基配列全体が、適切なハイブリダイゼーション条件下で別の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能である。近接する塩基は、オリゴマーがハイブリダイズするように意図されている配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは１００％相補的である。当業者であれば、塩基配列組成に基づいて予測できるか、または日常的な試験で決定することができる適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、米国ニューヨーク州、１９８９年）。
【００３１】
「二重鎖」という用語は、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または核酸塩基の他の配列特異的相互作用により塩基対合している核酸の分子間または分子内二本鎖部分を意味する。二重鎖は、プライマーおよび鋳型鎖で構成されていてもよく、またはプローブおよび標的鎖で構成されていてもよい。「ハイブリッド」とは、塩基特異的相互作用、例えば水素結合によって相互作用する核酸の二重鎖複合体、三重鎖複合体、または他の塩基対複合体を意味する。
【００３２】
「アニーリングする」という用語は、本明細書中で使用される場合、二重鎖または他のより高次な構造を形成する、１つのポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとの塩基対合相互作用を指す。主な相互作用は、塩基特異的であり、つまりワトソン／クリックによるＡ／ＴおよびＧ／Ｃ、ならびにフーグスティーン型水素結合である。
【００３３】
本発明の一態様によると、プライマーおよび／またはプローブを使用して、ｔｃｄＢ由来の標的ヌクレオチド配列を含有するＣ．ディフィシレ核酸鋳型の増幅を可能にし、任意選択で追加の特徴を増幅産物に導入する。各プライマーおよび／またはプローブは、各プライマーが鋳型に結合（アニーリング）するために、鋳型の標的ヌクレオチド配列領域に相補的なヌクレオチド配列を含有する。一実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、プライマー結合標的ヌクレオチド配列に相補的なプライマー配列の５’（上流）にある外来性ヌクレオチド配列を含有しており、各増幅産物は、プライマーにより導入された外来性ヌクレオチド配列を含有する結果となる。
【００３４】
本明細書中に記載されているプライマーおよび／またはプローブ配列のいずれかを含有する最大で約１００個のヌクレオチドを有するプライマーおよび／またはプローブ、ならびに核酸増幅に基づく方法（例えばＰＣＲ）を使用して、臨床試料中のＣ．ディフィシレＴｃｄＢ遺伝子の存在を検出するためのこれらのプライマーの使用も、本発明の範囲内である。加えて、本明細書中に記載されている特定のプライマーおよび／またはプローブのいずれかに対して、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の核酸同一性を示すプライマーおよび／またはプローブ、ならびに核酸増幅に基づく方法を使用して、臨床試料中のＣ．ディフィシレＴｃｄＢ遺伝子の存在を検出するためのこれらのプライマーの使用も企図され、これらの相同性配列のいずれかを含む最大で約１００個のヌクレオチドを有するプライマーおよび／またはプローブも同様である。
【００３５】
別の実施形態では、２つのプライマーが使用され、各プライマーは、増幅自体に対して著しい影響を与えずに増幅産物の増幅後操作を可能にする外来性ヌクレオチド配列を導入する。あるいは、２つを超えるプライマーが使用され、各プライマーは、増幅自体に対して著しい影響を与えずに増幅産物の増幅後操作を可能にする外来性ヌクレオチド配列を導入する。特定の実施形態のためのプライマーは、当業者であれば、例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、編の「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」）に開示されるような周知の原理に従って設計することができる。
【００３６】
核酸増幅とは、配列特異的な方法を使用して、標的核酸配列もしくはその相補体またはその断片のコピーを複数得るための任意の公知な手順を指す。公知の増幅方法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、レプリカーゼ媒介増幅、および転写媒介増幅が含まれる。
【００３７】
ＰＣＲは、核酸を増幅するための当技術分野で周知の方法を指す。ＰＣＲでは、標的配列に隣接する２つ以上の伸長可能な配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的配列を増幅する。目的の標的配列を含有する核酸は、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、および４種のｄＮＴＰの存在下で、複数ラウンドの熱サイクル（変性、アニーリング、および伸長）の正確なプログラムにかけられ、その結果、標的配列が増幅する。ＰＣＲでは、複数ラウンドのプライマー伸長反応が使用され、ＤＮＡ分子の定義された領域の相補鎖が、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって同時に合成される。各サイクルの終わりでは、新たに合成された各ＤＮＡ分子が、次のサイクルの鋳型として機能する。これらの反応の反復ラウンド中に、新たに合成されたＤＮＡ鎖の数は指数関数的に増加し、２０〜３０回の反応サイクル後には、最初の鋳型ＤＮＡは数千倍または数百万倍に複製される。様々なタイプおよび様式のＰＣＲを実行するための方法は、文献、例えば「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、編  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年、およびＭｕｌｌｉｓらによる特許（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号）、および科学出版物（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５５巻：３３５〜３５０頁）に詳細に既述されており、各参考文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００３８】
ＰＣＲでは、増幅後処理に好適な二本鎖増幅産物が生成される。必要に応じて、増幅産物は、アガロースゲル電気泳動法を用いた可視化により、プローブに基づく比色検出を使用した酵素イムノアッセイ形式により、蛍光発光技術により、または当業者に公知な他の検出手段により、検出することができる。
【００３９】
多種多様なＰＣＲ応用法が当技術分野で広く知られており、多数の出典、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、セクション１５、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４年）に記載されている。ＰＣＲのバリエーションには、ＡＦＬＰ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ＤＤ−ＰＣＲ、デジェネレートＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−一本鎖高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）、定量的競合ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端迅速増幅−ＰＣＲ（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）、多型ＤＮＡランダム増幅−ＰＣＲ（ＲＡＰＤ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、反復遺伝子外パリンドロームＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、およびベクトレットＰＣＲが含まれる。例えば、これらの技術は、ｗｗｗ．ｐｃｒｌｉｎｋｓ．ｃｏｍに記載されている。
【００４０】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）とも呼ばれ、所与のＤＮＡ分子の特定部分を同時に定量および増幅するために使用される。それは、特定の配列が試料中に存在するかどうか、もし存在する場合は、存在する配列のコピー数を決定するために使用される。「リアルタイム」という用語は、ＰＣＲ中の定期的モニタリングを指す。ＡＢＩ７７００および７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、米国カリフォルニア州）などの特定のシステムでは、所定のまたはユーザ定義のポイントで各熱サイクル中にモニタリングが実施される。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブを用いたＰＣＲのリアルタイム解析では、好ましくは任意の内部対照シグナルを差し引いた、サイクル間の蛍光染料シグナル変化が測定される。リアルタイム手順は、一般的なパターンのＰＣＲに従うが、ＤＮＡが各ラウンドの増幅後に定量される。定量化の一般的な２つの方法は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光染料（例えば、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ）の使用、および相補的ＤＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの使用である。
【００４１】
ＬＣＲ増幅法では、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することにより標的およびその相補鎖を増幅するために、少なくとも４つの別々のオリゴヌクレオチドが使用される（欧州特許第０  ３２０  ３０８号）。ＳＤＡ法は、標的配列を含む半修飾された（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖をニックする制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用することにより増幅し、その後一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅する（Ｗａｌｋｅｒらに対する米国特許第５，４２２，２５２号）。
【００４２】
鎖置換増幅法では、二本鎖ＤＮＡ標的は、２つのプライマーと共に変性およびハイブリダイズされ、またはプライマーはＤＮＡヘリックスに入り込む。２つのプライマーは、新たに形成されるＤＮＡヘリックスに配置される酵素ニックの内部配列を含有する。５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより、両プライマーが伸長される。一本鎖ニックの生成により、新しいＤＮＡ伸長部位が生成され、最初のプライマーのハイブリダイゼーションにより、指数関数的なＤＮＡ増幅のための追加のＤＮＡ伸長部位が生成される。
【００４３】
本発明の特定の実施形態には、Ｃ．ディフィシレのＴｃｄＢ遺伝子に結合する以下のプライマーおよびプローブ（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）が含まれる。
【００４４】
プローブおよびプライマーの設計および分子的特徴づけ
任意のＰＣＲ診断アッセイにおけるプライマーおよびプローブの設計は、常に感度と特異性との妥協であり、迅速性およびハイブリダイゼーション温度が考慮される必要がある。その蓄積を最大限にし、サイクル時間を低減するために、一般的には最も短いアンプリコンを設計する。プライマーと分子標識プローブ（下記で定義）との間の融解温度の温度差は、一般的に可能な限り大きい。これは、標識基部の長さおよびＧＣ含量を変えることにより達成することができる。プライマーおよびプローブのそのような最適化には、核酸配列のデータベース解析および計算から得られる特定量の理論データが必要とされる。関連データの概要を下記に提供する。
【００４５】
プライマーを、配列データベースおよびソフトウェアＯｌｉｇｏ（商標）（バージョン６．０；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して設計した。プライマー設計は、融解温度、ＧＣ含量、アンプリコンの長さ、ヘアピン構造をできるだけ少ししか形成しない能力、同一配列の別のプライマー分子との相互二次構造（ホモダイマー）をできるだけ少ししか形成しないそれらの能力、他のプライマーおよびプローブとの相互二次構造（ヘテロダイマー）をできるだけ少ししか形成しないそれらの能力、およびｔｏｘＢ  ＤＮＡ遺伝子配列に対するそれらの特異性に基づいていた。ＴｍおよびＧＣ％計算は、ＩＤＴのウェブサイト（ｈｔｔｐ／／ｓｃｉｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐ）で利用可能な、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＤＴ）社製ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０プログラムを使用して行った。使用したパラメーターは、すべてのプライマーが０．２５μＭ、１００ｍＭ  Ｎａ＋、および標的はＤＮＡだった。ＢＤ社製ＧｅｎｅＯｈｍ（商標）Ｃｄｉｆｆアッセイのプライマーの概観を可能にするために、標的を増幅するために使用されたプライマーを表２に記載する。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
プライマーＫＥＲＬＡ−ｔｃｄＢ−２８７３およびＫＥＮＰ−ｔｃｄＢ−３１０２を、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子増幅用に設計した。それらの特徴を表３に示す。この単体は、標的の増幅を可能にする。両方が類似のＧＣ含量および融解温度（Ｔｍ）を有しているため、このプライマーセットを選択した。さらに、これらのプライマーを用いて生成されたアンプリコンは、毒素Ｂ遺伝子標的の場合、２５７ｂｐ長であり、分子標識プローブを使用したリアルタイムＰＣＲアッセイに好適である。プライマーＫＥＲＬＡ−ｔｃｄＢ−２８７３およびＫＥＮＰ−ｔｃｄＢ−３１０２は、内部対照ｐＤＩＦＦａ用のプライマーとしても機能する。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
分子標識は、ステム−アンド−ループ構造を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。ループは、標的配列に相補的なプローブ配列を含有しており、基部は、プローブ配列の一方の側に位置する相補的アーム配列のアニーリングによって形成される。蛍光体は、一方のアーム末端に共有結合で結合されており、消光体は、他方のアーム末端に共有結合で結合されている。分子標識は、溶液中で遊離している時には蛍光を発しない。しかしながら、分子標識は、標的配列を含有する核酸鎖にハイブリダイズすると、高次構造変化を起こして、明るく蛍光を発することが可能になる。
【００５１】
標的が存在しない場合、基部は、蛍光体と、それらが一時的に電子を共有する非蛍光消光体とを非常に接近して配置させることになり、蛍光体が蛍光を発する能力を消失させるため、プローブは発光しない。プローブが標的分子に遭遇すると、プローブは、基部ハイブリッドより長くてより安定するプローブ−標的ハイブリッドを形成する。プローブ−標的ハイブリッドの硬直性および長さにより、基部ハイブリッドの同時存在は排除される。したがって、分子標識は、自発的な高次構造再編成を起こして基部ハイブリッドを解離させ、蛍光体および消光体は互いに離れ、蛍光が回復する。
【００５２】
分子標識は、診断アッセイにおけるアンプリコン検出プローブとして使用することができる。非ハイブリダイズ分子標識は発光しないため、アッセイ中に合成されたアンプリコンの数を決定するために、プローブ−標的ハイブリッドを単離する必要はない。分子標識を、遺伝子増幅を実行する前にアッセイ混合物に添加し、蛍光をリアルタイムで測定する。アッセイチューブは、密閉されたままである。したがって、アンプリコンが漏れて、未検査試料を汚染することはあり得ない。さらに、分子標識の使用により、さらなるレベルの特異性が提供される。偽アンプリコンまたはプライマー−ダイマーが、分子標識の標的配列を有する可能性はほとんどないため、蛍光の発生は、もっぱら意図したアンプリコンの合成による。
【００５３】
分子標識の設計
ｔｃｄＢ配列および内部対照ｐＤＩＦＦａを標的とする分子標識を、配列データベースおよびソフトウェアＯｌｉｇｏ（商標）（バージョン６．０；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して設計した。分子標識プローブを選択する際に考慮した様々な基準を下記に要約する。
【００５４】
・検出するべき種のみに由来し（または検出すべき種特徴に由来し）、必要な特異性を示す保存配列を含有する。
【００５５】
・プローブ長が約２０〜３０個のヌクレオチド。
【００５６】
・プローブは、二次構造を示す増幅標的の部分にハイブリダイズしない。
【００５７】
・アッセイにより必要とされるＴｍ。
【００５８】
・６０％〜８０％のＧＣ含量
【００５９】
・合成温度およびアニーリング温度の両方において１つの構造のみ（ヘアピンループ）。
【００６０】
・アニーリング温度におけるデルタＧ＜０。
【００６１】
・プローブと適切な標的との間に不一致がない。
【００６２】
・プライマーと分子標識との間のＴｍの温度差が可能な限り大きい。
【００６３】
・配列アラインメントで、プローブ間の交差反応性も、プローブとプライマーとの交差反応性も示されていない。
【００６４】
それらの特徴が、確立されているすべての理論的基準間の最良の妥協案に相当するため、分子標識ＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０およびＳｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０（表４）を選択した。Ｓｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０プローブは、内部対照アンプリコンの順方向鎖とハイブリダイズし、ＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子の逆方向鎖とハイブリダイズする。毒素Ｂ遺伝子アンプリコンの検出の場合、分子標識ＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０は、その５’末端に蛍光体５’−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびその３’末端に非蛍光消光体部分塩化ダブシル（ＤＡＢＣＹＬ）を保持する。ＩＣアンプリコンの検出の場合、分子標識Ｓｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０は、その５’末端に蛍光体テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）およびその３’末端に非蛍光消光体部分ＤＡＢＣＹＬを含む。ＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０プローブは、アッセイにおいて陽性シグナルを提供し、Ｓｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０は、アッセイにおけるＰＣＲ反応の妥当性を決定する。それらの特徴を表４に示す。
【００６５】
【表５】
0005981979.tif 000006
【００６６】
ヘアピン構造の形成
アッセイの適切な設計には、増幅反応に関する潜在的な問題の検証も必要である。増幅効率は、プライマー、プローブ、およびそれぞれの標的間の二次構造および不一致によって大きく影響される場合がある。そのようなことが発生するのを防止するため、すべてのプライマーについて、ヘアピン構造を形成する能力を、ＩＤＴ社のウェブサイトで利用可能なＩＤＴ社製ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０ソフトウェアを用いて評価した。使用したパラメーターは、０．２５μＭの各プライマー、１００ｍＭ  Ｎａ＋、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、標的ＤＮＡ、５７℃のハイブリダイゼーション温度であった。ハイブリダイゼーションは、関与する分子の熱力学的特徴に依存するため、二次構造または望ましくない一致は、このようにして予測および回避することができる。加えて、溶液中で生じるＰＣＲアッセイの全反応において、ギブス自由エネルギー（ΔＧと記し、ｋｃａｌ／ｍｏｌで表す）は、一致が生じる可能性が高いかどうかを予測する。負のΔＧ値は、提唱構造または一致が形成することを示し、正のΔＧ値は、提唱構造が熱力学的に不安定であり、一致が生じない可能性が高いことを示す。プライマーＫＥＲＬＡ−ｔｃｄＢ−２８７３は、２つのヘアピン構造を形成する可能性があり（ΔＧ＝０．８６および０．８９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、プライマーＫＥＮＰ−ｔｃｄＢ−３０１２は、２つのヘアピン構造を形成する可能性がある（ΔＧ＝１．９および２．３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。これらの構造は、すべて熱力学的に不安定である（正のΔＧ）。
【００６７】
ＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０標的プローブおよびＳｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０内部対照プローブ分子は各々、その５’末端に蛍光体を保持し、その３’末端に蛍光消光体を保持する相補的配列（アーム）が各側に隣接しているオリゴヌクレオチドプローブ配列を有する。閉じた高次構造では、アームは基部を形成し、プローブ配列はヘアピンループに位置する（図２ａおよび２ｂ）。この高次構造では、蛍光は消光される。しかしながら、標的ＤＮＡとハイブリダイズすると、ヘアピン構造がアンフォールディングして蛍光が可能になる。各プローブについて、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｄｓｗｏｒｔｈのツール（応用セクションのＤＮＡフォールディング）を使用して、２つの温度で構造を決定した。このウエブサーバーでは、ＺｕｋｅｒおよびＴｕｒｎｅｒによるｍｆｏｌｄ（バージョン３．１）が使用されている（Ｚｕｋｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻（１３号）、３４０６〜１５頁、２００３年）。まず、合成温度および塩条件でのプローブ構造を決定し（１０ｍＭ  Ｎａ＋および２０℃、Ｍｇ２＋無し）、その後、ＰＣＲアッセイのアニーリング温度および塩条件での構造を決定した（１００ｍＭ  Ｎａ＋、５７℃、および５．５ｍＭ  Ｍｇ２＋）。１つの構造だけが、標的プローブならびにＩＣプローブについて得られた（合成条件およびＰＣＲ条件（図２ａおよび２ｂを参照））。安定したプローブダイマーは特定されなかった。
【００６８】
すべてのプライマーおよびプローブについて、セルフダイマー（ホモダイマー）またはアッセイの別のプライマーまたはプローブとの二重鎖（ヘテロダイマー）を形成する能力を、ＩＤＴ社のウェブサイトで利用可能なＩＤＴ社製ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０ソフトウェアで評価した。分析に使用したパラメーターは、０．２５μＭの各プライマー、１００ｍＭ  Ｎａ＋、および標的はＤＮＡだった。全配列（２８ｂｐ長）の２５％に相当する連続７個未満の塩基対を伴うプライマーのホモ二重鎖が形成する可能性は非常に少ない。ＫＥＲＬＡ−ｔｃｄＢ−２８７３が形成する２つの構造は、プライマーサイズの２１％に相当する連続６個の塩基を伴っている。これは、安定した二重鎖を生成するのには十分ではない（表５）。ＫＥＮＰ−ｔｃｄＢ−３１０２とのハイブリダイゼーションは、連続４個の塩基対だけ（１４％）と生じる可能性があった。プローブとは、Ｓｉｇｎ−Ｂ４−Ｂ０（７／４１ｂｐ）およびＮＫ−ｔｏｘＢ−Ｂ３４−Ａ０（７／３２ｂｐ）の全配列のそれぞれ１７％および２２％が、ホモ二重鎖の形成に利用できた。これは、安定した構造の形成には十分ではない。同様に、最も短い配列サイズの２５％未満の多数の連続ヌクレオチドを伴うヘテロ二重鎖が生じる可能性は非常に低い（表５）。したがって、形成され得る構造はすべて不安定となり、１８％が、該当する最も大きなパーセンテージである。
【００６９】
【表６】
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【００７０】
一実施形態では、必要な特異性を保証するために、アッセイプライマーは、Ｃ．ディフィシレ以外の配列とはいかなる増幅産物も生成しない。したがって、プライマーと非Ｃ．ディフィシレ配列との潜在的ハイブリダイゼーションを試験した。各アッセイプライマーに相同的な配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからＢＬＡＳＴ探索（バージョン２．２．１５）を使用して同定した。その後、非標的配列を増幅する可能性を、以下の基準に従って評価した：
【００７１】
・異なる鎖に対する各プライマー対のハイブリダイゼーション、または同一標的の２つの部位における１つの所与のプライマーのハイブリダイゼーション
【００７２】
・標的配列に相補的なヌクレオチドの数。すなわち、プライマー３’末端の最後の２個のヌクレオチドは、プライマー伸長を可能にするために標的にハイブリダイズするべきである。
【００７３】
・プライマー対によって生成されたＤＮＡ断片の長さ。３ｋｂを超える断片は、迅速ＰＣＲおよび分子標識検出技術の限界を優に超えている。
【００７４】
これらの探索の結果は、表６に要約されている。両プライマーの場合、Ｃ．ディフィシレ菌株に由来する毒素Ｂ遺伝子配列だけが、プライマー配列と１００％の同一性を示した。
【００７５】
【表７】
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【００７６】
プローブがＣ．ディフィシレアンプリコンとのみハイブリダイズし、必要な感度を有していたことを保証するため、非Ｃ．ディフィシレ配列とプローブとの潜在的なハイブリダイゼーションを試験した。アッセイプローブの各々に相同的な配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ探索（バージョン２．２．１５）を使用して同定した。これらの探索の結果は、表７に要約されている。標的プローブの場合、Ｃ．ディフィシレ菌株に由来する毒素Ｂ遺伝子配列だけが、プローブ配列との１００％同一性を示した。内部対照プローブの場合、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）配列だけが、プローブ配列との１００％同一性を示した。内部対照プローブは、キイロショウジョウバエ配列から設計した。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
特異性および感度
２２個の異なるＣ．ディフィシレ毒素遺伝子変異型を、表４に示されているプローブを用いて試験した。すべての毒素遺伝子変異型で陽性結果が得られたが、いかなる近縁種、Ｃ．ソルデリイ、Ｃ．ディフィシレＡ−／Ｂ−菌株、または非毒素原性Ｃ．ディフィシレ菌株でも陽性結果は得られなかった。したがって、プローブは、Ｃ．ディフィシレの毒素原性菌株に特異的である。
【００７９】
リアルタイムＰＣＲを、液状または軟質のヒト糞便試料から得られたＣ．ディフィシレＤＮＡを使用し、表３に示されているプライマーを使用して、標準的な条件下で実施した。下記に記載するように、リアルタイムＰＣＲアッセイを実施した。
【００８０】
リアルタイムＰＣＲアッセイ
凍結乾燥された試薬を、２２５μｌ希釈液を用いて再構成して、リアルタイムＰＣＲアッセイに使用された以下の緩衝液：１１６ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、１１．６ｍＭ  ＫＣｌ、３．４８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．８ｍＭ  ＮＨ２ＳＯ４を調製し、その後、２５μｌ等量に分割した。０．５、２．５、５、１０、または２０コピーのＣ．ディフィシレ鋳型ＤＮＡを、５つの反復反応液の各々に添加した。
【００８１】
ＰＣＲアッセイを、ＳＭＡＲＴ  ＣＹＣＬＥＲ（商標）ＰＣＲ装置を用いて以下の条件下で実行した：６０℃で６秒間、その後９５℃で９００秒間、その後９５℃で５秒間、６３℃で１０秒間、および７２℃で２０秒間を４５サイクル。得られた感度および特異性は、それぞれ９６．６％および９７．４％であった。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【配列表】
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