(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり：
R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１〜３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列番号４〜７のいずれかの配列からなるStaphylococcus aureus由来のプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質である配列、又は配列番号４〜７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列を１〜３個連結した配列であり；
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり；
R4部分の配列はシステイン−Ｘ（Ｘは、アラニンであるか、もしくはアラニンとシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり；
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり；
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である］
からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体（但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く）。
【請求項２】
プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、請求項１記載の固定化担体。
【請求項３】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させるための、請求項１又は２に記載の固定化担体。
【請求項４】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R3部分の配列が、１〜１０個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の固定化担体。
【請求項５】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数１〜１０個の配列であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固定化担体。
【請求項６】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、１〜１０個のアスパラギン酸からなる配列であることを特徴とする、請求項５記載の固定化担体。
【請求項７】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R6部分の配列が、４個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の固定化担体。
【請求項８】
担体がシリカ担体、ガラスビーズ、及びポリマーからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の固定化担体。
【請求項９】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を担体に静電相互作用により吸着させることを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の固定化担体を作製する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させて製造された、プロテインＡの変異体が固定化された固定化担体。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させることを含む、請求項９に記載の固定化担体を作製する方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の固定化担体が充填された、抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラム。
【請求項１３】
請求項１２記載の抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラムに抗体を含む溶液をアプライし、抗体をプロテインＡ変異体に結合させ、次いで溶出緩衝液により抗体を解離溶出させることを含む、抗体の精製方法。
【請求項１４】
固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化するために用いる一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を設計する方法であって、R1、R2、R3、R4、R5及びR6部分のアミノ酸配列を以下の条件に適合するように選択することを含む方法：
(a) R1部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列を選択し;
(b) R2部分の配列として、プロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１〜３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列番号４〜７のいずれかの配列からなるStaphylococcus aureus由来のプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質である配列、又は配列番号４〜７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列を１〜３個連結した配列を選択し；
(c) R3部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列を選択し；
(d) R4部分の配列として、システイン−Ｘ（Ｘは、アラニンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列を選択し；
(e) R5部分の配列は存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列を選択し；そして
(f) R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列を選択する。
【請求項１５】
プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体精製用担体及びその製造方法に関する。本発明は、さらに抗体精製用担体が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた抗体の精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体を基にした副作用の少ない抗体医薬に対する需要が年々高まっている。抗体を精製する手段として、プロテインＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーが広く使用されている。ここでいうプロテインＡとは、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)又はそれを構成する抗体結合機能を発揮できる一部のドメイン配列を指している。
【０００３】
プロテインＡを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用する一般的な抗体の精製方法は以下のとおりである。すなわち、（１）抗体を含む原料粗液を、プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムに通液し、担体に目的とする抗体を吸着させる。（２）抗体を吸着させた担体を中性の緩衝液で洗浄し、不純物を取り除いた後、（３）酸性の緩衝液（具体的には、ｐＨ２．５〜３．０）を用いて、担体に吸着した抗体を溶出させる、というものである。
【０００４】
本発明者らは、担体あたりの抗体の結合容量を増大させることにより、抗体を効率よく精製する手段として、配向を制御しながら抗体のＦｃドメインと特異的に結合するタンパク質であるプロテインＡ由来のタンパク質を不溶性担体に配向を制御して導入する技術を開発している(特許文献１〜１６を参照)。
【０００５】
本発明者らが開発した配向制御固定化法は、より一般化した形態で表すと、以下のとおりである。
【０００６】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジンおよびシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり：
R2部分の配列は、プロテインＡ由来の固定化対象タンパク質の配列であり、抗体との結合特性を保持するようにリジン残基とシステイン残基を全く含まないようにした配列であり：
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり；
R4部分の配列はシステイン−Ｘ（Ｘは、リジンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり：
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり；
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である］
からなるタンパク質を用いて、R4部分に唯一存在するシステイン残基のSH基をシアノ化し、シアノシステイン化したタンパク質を、アミノ基を官能基として導入された不溶性担体と反応させることにより、R1-R2-R3で表される部分が、そのカルボキシ末端が担体のアミノ基とアミド結合により固定化するという特徴を有する配向制御固定化法である。
【０００７】
これまでに本発明者らが開発してきたプロテインＡを配向制御して固定化した担体を用いた抗体の精製においても、（１）抗体を含む原料粗液を、プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムに通液し、担体に目的とする抗体を吸着させる。（２）抗体を吸着させた担体を中性の緩衝液で洗浄し、不純物を取り除いた後、（３）酸性の緩衝液（具体的には、ｐＨ２．５〜３．０）を用いて、担体に吸着した抗体を溶出させるという精製手段が適用され、担体あたりの抗体の結合容量の増大により、効率の良い抗体の精製手段を提供してきた。
【０００８】
しかし、ｐＨ２．５〜３．０の酸性の緩衝液を用いて抗体を溶出させるという上記方法には重大な問題点がある。すなわち、抗体が強酸性（例えば、ｐＨ３.０以下）の緩衝液に接触することで、抗体が酸変性を起こし、抗体の高次構造が変化し、その結果、凝集を引き起こし、抗体が医薬品としての活性を失ってしまうという問題である。この課題を解決するため、より安定な抗体分子の開発が試みられているが、このような解決策は、プロテインＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製に付随する問題に対しての一般的な解決策とはなりえないことは明らかであり、多くの抗体分子の調製に幅広く適用できる方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１-１３２１４０号公報
【特許文献２】特開２０１１-１３２１４５号公報
【特許文献３】特開２０１１-１３２１４１号公報
【特許文献４】特許２９９０２７１号公報
【特許文献５】特許３０４７０２０号公報
【特許文献６】特許３７４０５２９号公報
【特許文献７】特開２００５-１１２８２７号公報
【特許文献８】特許４５２８９５１号公報
【特許文献９】特開２００８−１１５１５１号公報
【特許文献１０】特開２００８-１１５１５２号公報
【特許文献１１】特開２００８-１１５１５３号公報
【特許文献１２】特開２００８-２６６２１９号公報
【特許文献１３】特開２００８-２６６２２１号公報
【特許文献１４】特開２００９-１５６７６７号公報
【特許文献１５】特開２０１０-１２７８５６号公報
【特許文献１６】特許４０００６５２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、プロテインＡを含むタンパク質を固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製に付随する上記の問題に対しての一般的な解決策を提供するために、多くの抗体が酸変性を引き起こさない温和なpH条件（具体的には、ｐＨ４.０〜５．５）で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つプロテインＡを固定化した担体、及びその製造方法を提供するものである。さらには、上記プロテインＡを含むタンパク質を固定化した担体を充填した抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用カラム、及び前記カラムを用いた抗体の精製方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、プロテインＡの固定化における上記の解消すべき問題点を解決すべく鋭意検討を行なった。
【００１２】
本発明者らは、タンパク質の配向制御固定化に利用される、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる配列部分の内、抗体との結合機能を担うR2部分に用いるプロテインＡとして、抗体の精製過程の、抗体を含む原料粗液を、プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムに通液し、担体に目的とする抗体を吸着させ、溶出する工程において、抗体を吸着させた担体を中性の緩衝液で洗浄し、不純物を取り除くという操作には影響を与えず、かつ酸性の緩衝液を用いて、担体に吸着した抗体を溶出させる際に温和なｐＨ条件として、ｐＨ４.０〜５．５の範囲で、抗体の脱離を行わせることができる、という特性を有するプロテインＡ変異体を開発できれば、上記問題を解決できるとの着想を得た。
【００１３】
本発明がなされるより前の時点で、本発明者らは、配列番号１で示されるプロテインＡのＡドメイン由来の配列中の全てのリジン残基をアルギニン又はグリシンに置換することによりR2部分にリジン及びシステインを全く含まないようにしたプロテインＡが、抗体と強い結合反応を示すことを明らかにした（特開２０１１-１３２１４０号公報、特開２０１１-１３２１４５号公報、特開２０１１-１３２１４１号公報）。そこで、該プロテインＡのアミノ酸配列を含む、上記の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6に適合させた配列からなるタンパク質を作製し(これを、ＡＤ-１と称する。配列番号２)、さらに、この配列を元に、網羅的に１アミノ酸置換を行わせ、上記のＡＤ-１について、約800個の変異体を作製した。本発明者らが開発したタンパク質の改良方法（特許４５３４０３０号公報、特許再公表０１/０００７９７号公報、M.Iwakura et al. J.Biol.Chem. 281, 13234-13246(2006)、特開２００５-０５８０５９号公報）に従うことにより、これら約800個の変異体全てについて、酸性条件での抗体の溶出特性を明らかにできれば、本発明が目的とする変異体にたどりつけるものと考えられた。
【００１４】
プロテインＡのＡドメイン由来の配列(配列番号１)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
【００１５】
ＡＤ-１の配列（プロテインＡのＡドメイン配列を元に、R1-R2-R3-R4-R5-R6の形式に適合させて作製した配列)(配列番号２)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly 
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp 
His-His-His-His-His-His
【００１６】
ここで、配列番号２に示される配列（ＡＤ-１）の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6における、R1、R2、R3、R4、R5及びR6は以下の配列である。
R1（大腸菌での発現開始コドン由来のメチオニン、発現とともにほとんど除去されるため、通常は存在しない）：
Met
R2（プロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列を、システイン及びリジンを全く含まないように改変した配列）(配列番号３)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
R3（リンカー配列、システイン及びリジンを全く含まない）：
Gly-Gly-Gly-Gly
R4(シアノシステインを介した固定化反応を起こさせる配列)：
Cys-Ala
R5（等電点を負にするための配列）：
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R6（精製用タグ配列）：
His-His-His-His-His-His
【００１７】
本発明者らは、上記ＡＤ-１と名づけたアミノ酸配列を元に、R2を構成するアミノ酸残基全てについて１アミノ酸置換を行った変異体タンパク質を網羅的に作製してきた。
【００１８】
しかしながら、これまでの知見では、本発明が目的とする、多くの抗体が酸変性を引き起こさない温和なｐＨ条件（４.０〜５．５）で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つ変異体タンパク質を、800種もの１アミノ酸置換変異体の中から効率よく選別することが困難であった。このため、上記の変異体タンパク質を得るという目的を達成することができなかった。これは、変異体が目的とする特性を有するか否かを判定するためには、候補となる変異体のすべてを担体に固定化し、アフィニティカラムを作製し、作製したカラムを用いて精製実験を行う必要があったためである。このため、一つの変異体について、目的とする特性を明らかにするだけで、数日から２週間を必要とし、これを約800種の１アミノ酸置換体に対して適用することは、時間と費用の観点で、事実上困難であった。
【００１９】
本発明者らは、このような状況において、鋭意研究を行った結果、本発明者らが既に開発しているアレイ解析装置(特許４５２８９５１号公報、特開２０１０-１２７８５６号公報、特許４００６５２３号公報)を活用することを着想した。
【００２０】
本発明で用いたアレイ解析装置において、アレイ基板には、シリカモノリス多孔質体の薄層を支持層に用いている。該シリカモノリス多孔質体表面にポリＬリジンを導入し、この薄層に変異体をスポッターによりスポットすることにより変異体タンパク質をイオン相互作用により吸着させた後、シアノ化試薬によりスポット吸着したタンパク中のシステイン残基のＳＨ基をシアノ化し、シアノシステインを介した配向制御固定化反応を行わせる。その後、高塩濃度の緩衝液で洗浄することにより、変異体タンパク中のR4-R5-R6由来部分を除去し、R1-R2-R3部分がそのカルボキシ末端でシリカモノリス多孔質体に配向制御した形で、スポット状に固定化したアレイ基板を作製した。変異体タンパク質を固定化したアレイ基板に、（１）抗体溶液を通液し、（２）中性の緩衝液で洗浄して、（３）抗体溶出用の緩衝液としてｐＨ５．０の緩衝液を通液し、その後、（４）再生用として、ｐＨ２．５の緩衝液を通液した。この過程において、アレイ解析装置を用いて各スポットの２８０ｎｍの透過光量の変化を経時的に測定した。各変異体スポットに抗体が結合した場合は、結合した抗体の２８０ｎｍの吸収に伴い、２８０ｎｍの透過光量が減少する。
【００２１】
一方、抗体溶出に伴い、各変異体スポットから抗体が解離した場合は、２８０ｎｍの透過光量が増大する。この測定の際に、抗体溶出用の緩衝液としてｐＨ５．０の緩衝液を通液した時（上記の（３）の工程）の、２８０ｎｍの透過光の対数をとり（吸光度の変化量に対応する量）、これを経過時間に対してプロットした。ｐＨ５．０の緩衝液を通液した時の２８０ｎｍの透過光の対数の値が、再生用として、ｐＨ２．５の緩衝液を通液した（上記の（４）の工程）後に、２８０ｎｍの透過光の対数の値との差の半分になるまでの経過時間、Ｔ0.5の値を求めた。この値を指標にして、できるだけ小さい値を与える変異体を選びだした。次に、小さいＴ0.5を与える変異を組み合わせた変異体を作製し、同様の測定を行い、組み合わせ変異体を作製し、Ｔ0.5の値を測定した。そのような組み合わせ変異体の中に、目的とする変異体を見出すことができた。見出した変異体配列をいくつか繰り返し連結した変異体を作製し、これを担体に配向制御固定化した担体を作製した。この担体を用いてアフィニティカラムを作製し、溶出条件として各種ｐＨでの溶出を行い、クロマトグラムを解析した結果、温和なpH条件で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つプロテインＡを含む担体を得るという本発明の課題が達成できていることを確認し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり：
R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１〜３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する；
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり；
R4部分の配列はシステイン−Ｘ（Ｘは、アラニンであるか、もしくはアラニンとシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり：
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり；
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である］
からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体（但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く）。
【００２３】
[２]  プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、[１]の固定化担体。
【００２４】
[３]  プロテインＡ変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、[１]又は[２]の固定化担体。
【００２５】
[４]  プロテインA変異体が、プロテインＡのＡドメインの変異体である、[１]〜[３]のいずれかの固定化担体。
【００２６】
[５]  R2部分の配列が、配列番号４〜７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列、又は配列番号４〜７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列を１〜３個連結した配列である、[１]〜[４]のいずれかの固定化担体。
【００２７】
[６]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させるための、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の固定化担体。
【００２８】
[７]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R3部分の配列が、１〜10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、[１]〜[６]のいずれかの固定化担体。
【００２９】
[８]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数１〜10個の配列であることを特徴とする、[１]〜[７]のいずれかの固定化担体。
【００３０】
[９]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、１〜10個のアスパラギン酸からなる配列であることを特徴とする、[８]の固定化担体。
【００３１】
[１０]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R6部分の配列が、４個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、[１]〜[９]のいずれかの固定化担体。
【００３２】
[１１]  担体がシリカ担体、ガラスビーズ、及びポリマーからなる群から選択される、[１]〜[１０]のいずれかの固定化担体。
【００３３】
[１２]  一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を担体に静電相互作用により吸着させることを含む、[１]〜[１１]のいずれかの固定化担体を作製する方法。
【００３４】
[１３]  [１]〜[１１]のいずれかの一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させて製造された、プロテインＡの変異体が固定化された固定化担体。
【００３５】
[１４]  [１]〜[１１]のいずれかの一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させることを含む、[１２]の固定化担体を作製する方法。
【００３６】
[１５]  [１３]の固定化担体が充填された、抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラム。
【００３７】
[１６]  [１５]の抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラムに抗体を含む溶液をアプライし、抗体をプロテインＡ変異体に結合させ、次いで溶出緩衝液により抗体を解離溶出させることを含む、抗体の精製方法。
【００３８】
[１７]  固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化するために用いる一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を設計する方法であって、R1、R2、R3、R4、R5及びR6部分のアミノ酸配列を以下の条件に適合するように選択することを含む方法：
(a) R1部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列を選択し;
(b) R2部分の配列として、プロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１〜３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列を選択し；
(c) R3部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列を選択し；
(d) R4部分の配列として、システイン−Ｘ（Ｘは、アラニンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列を選択し；
(e) R5部分の配列は存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列を選択し；そして
(f) R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列を選択する。
【００３９】
[１８]  プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、[１７]の方法。
【００４０】
[１９]  プロテインＡ変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、[１７]又は[１８]の方法。
【００４１】
[２０]  プロテインＡ変異体が、プロテインＡのＡドメインの変異体である、[１７]〜[１９]のいずれかの方法。
【００４２】
[２１]  R2部分の配列が、配列番号４〜７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質、又は配列番号４〜７のいずれかの配列を１〜３個連結した配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列である、[１７]〜[２０]のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の方法により、R2としてプロテインＡ変異体を含む一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列からなるタンパク質を作製し、該タンパク質を用いてプロテインＡ変異体を担体に固定化することにより、抗体精製の際に、プロテインＡに結合した抗体をより温和なｐＨ条件（ｐＨ４.０〜５．５）で行うことができるという溶出性能に優れた固定化担体を得ることができる。また、上記固定化担体を用いることにより、温和なｐＨ条件（ｐＨ４.０〜５．５）で抗体を溶出することが可能となり、得られる抗体の回収率も向上する。さらに、上記固定化担体を充填剤として用いることにより、精製能力に優れるアフィニティークロマトグラフィー用カラムを得ることができ、該カラムを用いて効率的な抗体の精製方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ｐＨ５．０におけるＡＤ-１の溶出パラメータ及びＴ0.5の値のプロットの結果を示す図である。
【図２】プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける、抗体の溶出・回収量のｐＨ依存性を示す図である。図２のＡからＦの図においては、横軸は、溶出に用いた緩衝液のｐＨを表し、縦軸は、各ｐＨにおける溶出を行った時に溶出された抗体の回収率（％）を黒丸で示している。
【図３】プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。図３Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれｐＨ３．０、４．０及び５．０の溶出液を用いた場合のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中のR2部分の配列は、固定化しようとする固定化対象プロテインＡであり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることにより、R2部分が固定化された固定化タンパク質を得ることができる。上記一般式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かうアミノ酸配列を示す。
【００４６】
R1部分の配列は、存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列である。具体的には、例えば、大腸菌での発現開始コドン由来のメチオニンが挙げられる。但し、該メチオニンは発現とともにほとんど除去されるため、通常は存在しない
【００４７】
R2部分の配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる天然のプロテインＡの変異体のアミノ酸配列である。また、プロテインＡの変異体のアミノ酸配列を配列単位として該配列単位の繰り返しよりなるアミノ酸配列を用いてもよい。この場合繰り返し数は１〜３である。ここで、繰り返しよりなるアミノ酸配列を、プロテインＡの変異体のアミノ酸配列を１〜３個連結した配列ともいう。R2部分に用いるプロテインＡの変異体のアミノ酸配列中には、リジン残基及びシステイン残基は全く含まれない。また、用いるプロテインＡの変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特徴を有する。
【００４８】
R2部分のプロテインＡの一例として、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)を通常の遺伝子改変技術を用いて設計することにより、アミノ酸配列を改変したプロテインＡ変異体をあげることができる。また、R2部分のタンパク質として、プロテインＡの抗体のＦｃ領域と結合し得るドメインの変異体を用いてもよい。このようなドメインとして、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン及びＣドメインが挙げられる。この中でもＡドメインの変異体が好ましい。本発明において、プロテインＡという場合、これらのドメインも含む。
【００４９】
プロテインＡのアミノ酸配列中にε-アミノ基を有するリジン又はスルフヒドリル基を有するシステイン残基が含まれる場合、プロテインＡの抗体との結合活性が低下しないように、リジン及びシステインを他のアミノ酸で置換し、プロテインＡのアミノ酸配列中にリジン及びシステインが含まれないようにする。既に、本発明者らは、リジン及びシステインを全く含まないタンパク質を作製する方法を確立している（特開２００８-２６６２１９号公報）。該方法に従って、天然由来のプロテインＡのアミノ酸配列を基に、アミノ酸配列を改変し、リジン及びシステイン残基を含まない18種のアミノ酸より構成されるアミノ酸配列からなるプロテインＡであって、抗体との結合特性において天然のプロテインＡと同等の性能を発揮するタンパク質を作製することができる。
【００５０】
Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列は以下の配列番号１で示される。
【００５１】
プロテインＡのＡドメイン由来の配列(配列番号１)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
【００５２】
このプロテインＡは４残基のリジン（３５番目、４９番目、５０番目及び５８番目のアミノ酸位置）を有しており、上記の方法により、リジン残基をアルギニン残基又はグリシン残基で置換したプロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列を以下の配列番号３で示す。
【００５３】
プロテインＡのＡドメインをシステイン及びリジンを全く含まないように改変した配列(配列番号３)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
【００５４】
配列番号３に示すアミノ酸配列をベースに改変した、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡのＡドメインとして、以下の変異体が挙げられる。それぞれの変異体のアミノ酸配列をR2部分として含む、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１及びＡＤ-６-２と呼ぶ。
【００５５】
ＡＤ-３のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号４)からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＡ（アラニン）に置換されている。
【００５６】
ＡＤ-３のアミノ酸配列（配列番号４）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln 
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
【００５７】
ＡＤ-４のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号５）からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、１９番目のＭ（メチオニン）がＶ（バリン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＡ（アラニン）に置換されている。
【００５８】
ＡＤ-４のアミノ酸配列（配列番号５）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
【００５９】
ＡＤ-６-１のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号６）からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、１９番目のＭ（メチオニン）がＶ（バリン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＥ（グルタミン酸）に置換されている。
ＡＤ-６-１のアミノ酸配列（配列番号６）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Glu-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
【００６０】
ＡＤ-６-２のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号７）からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、１９番目のＭ（メチオニン）がＶ（バリン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＤ（アスパラギン酸）に置換されている。
ＡＤ-６-２のアミノ酸配列（配列番号７）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Asp-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
【００６１】
R3部分の配列は、リジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される任意のスペーサー配列である。R3部分は存在しなくてもよい。R3部分の配列は、固定化担体にR2部分と共に固定化される。R3部分は固定化に際して固定化担体との結合によりR2部分が有する機能が阻害されないようにする適切なリンカーとしての役割を担っている。リンカーとしての役割は、R2部分の特定の機能を有するタンパク質と固定化担体との間に適切な距離を保つことである。従って、R3部分は一定の長さを有する任意のアミノ酸配列で且つ不活性であることが求められる。R3部分のアミノ酸の数は限定されないが、０、すなわち存在しないか、１〜１０アミノ酸、好ましくは２〜５アミノ酸である。R3部分の配列として、例えば、０〜１０個、又は２〜５個のグリシンからなるポリグリシン等が挙げられ、具体的には、例えば、Gly-Gly-Gly-Glyで表される配列が挙げられる。
【００６２】
R4部分の配列は、システイン−Ｘ（Ｘは、リジン及びシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり、例えばCys-Alaが挙げられる。一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質においてR4配列部分にのみ、唯一のシステイン残基を有する。従って、この唯一のシステイン残基の側鎖の官能基であるSH基をシアノ化することによりシアノシステイン残基に変化させ、該シアノシステイン残基と固定化担体上の１級アミンとの反応により、上記の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列のR1-R2-R3で表される部分のみを固定化担体上に配向制御して固定化させることができる。
【００６３】
R5部分の配列は、リジン残基及びシステイン残基を全く含まない任意の配列で且つ一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列である。ここで、「タンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含む配列」とは、酸性アミノ酸の種類及び数がタンパク質全体の等電点を酸性にするだけ含まれている配列をいう。R5部分としては、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。タンパク質の等電点は、構成するアミノ酸の種類と数に依存する。例えば、リジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含む場合は、塩基性アミノ酸の総数を超える数のアスパラギン酸やグルタミン酸が必要である。タンパク質の等電点の計算は、当業者であれば容易に計算により推定できる。好ましくは、上記一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の等電点を４〜５の間の値になるように、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列を設計すればよい。R5部分の配列のアミノ酸の数は限定されないが、０すなわち存在しないか、又は１〜２０個、好ましくは１〜１０個、あるいは０〜２０個、好ましくは０〜１０個である。例えば、アスパラギン酸２〜１０個からなるポリアスパラギン酸を挙げることができ、具体的にはAsp-Asp-Asp-Asp-Aspが挙げられる。R5部分を含まない部分の等電点が最初から酸性の場合は、R5部分は存在しなくてもよい。
【００６４】
R6部分の配列は、特定の化合物と結合し得る任意のアフィニティータグ配列である。R6部分の配列は、合成した一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を精製するために利用される配列部分である。R6部分の配列として、特定の化合物と結合し得る配列、すなわちアフィニティータグ配列が挙げられる。該タグに特異的な抗体を用いて該タグを含むタンパク質の精製を行なう場合、エピトープタグという場合もある。アフィニティータグ配列として例えば、２〜１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン配列が挙げられ、具体的にはHis-His-His-His-His-Hisが挙げられる。この場合、ニッケルをリガンドとしたニッケルキレートカラムクロマトグラフィーを利用することにより上記ポリペプチドを精製することができる。また、ポリヒスチジンに対する抗体をリガンドとして固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによっても精製することができる。その他、ヒスチジンを含む配列からなるHATタグ、HNタグ等も用いることができる。
【００６５】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質の具体的な例を配列番号２に示す。
【００６６】
ＡＤ-１の配列（プロテインＡのＡドメイン配列を元に、R1-R2-R3-R4-R5-R6の形式に適合させて作製した配列)(配列番号２)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly 
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp 
His-His-His-His-His-His
【００６７】
配列番号２に示す配列において、R1部分は存在せず、R2部分は上記のリジン及びシステインを含まないプロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列（配列番号３）であり、R3部分はGly-Gly-Gly-Glyで表される配列であり、R4部分はCys-Alaで表される配列であり、R5部分はAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Aspで表される配列であり、R6部分はHis-His-His-His-His-Hisで表される配列である。
【００６８】
また、ＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１及びＡＤ-６-２のR1部分、R3部分、R4部分、R5部分及びR6部分は、上記のＡＤ-１と同じである。
【００６９】
本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質を用いた、固定化対象タンパク質の担体への固定化は、特許第３７８８８２８号公報、特許第２９９０２７１号公報、特許第３０４７０２０号公報、特開２００３-３４４３９６号公報、特開２００８-１１５１５１号公報、特開２００８-１１５１５２号公報、特開２００８-１１５１５３号公報、特開２００８-２６６２２１号公報等に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７０】
具体的には、本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のR4部分のシステイン残基をシアノ化によりシアノシステインとし、シアノシステインを有するタンパク質を一般式「NH2-Y」（Ｙは任意の固定化担体を表す）で示される１級アミノ基を官能基として有する固定化担体とを弱アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）で反応させることにより、R1-R2-R3部分が固定化担体に固定化される。固定化担体にR1-R2-R3部分が結合したものは、R1-R2-R3-CO-NH-Y（式中、Ｙは上記の意味を有する。）で表され、R2部分のカルボキシ末端一箇所で固定化担体に結合している。シアノ化反応は、シアノ化試薬を用いて行うことができる。シアノ化試薬としては、２-ニトロ-５-チオシアノ安息香酸(2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Biochemistry, 13,1-11 (1974)参照）又は、１−シアノ-４-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロ硼酸(1-cyano-4dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP))等を用いることができる。
【００７１】
また、特開2003-344396号公報に記載の方法においては、本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に吸着させた後に、システイン残基をシアノ化し、上記の反応を行なわせ、固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に固定化する。タンパク質を固定化担体に吸着させるには、中性から弱アルカリ条件下（ｐＨ７〜１０)で、タンパク質と固定化担体を反応させればよい。弱アルカリ反応条件化において、タンパク質は負に帯電し、一方、固定化担体は正に帯電し、静電相互作用により互いに吸着結合する。
【００７２】
本発明は、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を吸着させた固定化担体であり、システイン残基をシアノ化する前の固体化担体、及びシアノ化を行い、R1-R2-R3で表される部分が固定化された固定化担体を包含する。
【００７３】
本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて、シアノシステインを介した固定化反応により作製される、R1-R2-R3部分を固定化した固定化タンパク質においては、固定化担体部分に未反応の一級アミンが多数存在する。固定化されたタンパク質にリジン残基又はシステイン残基が存在する場合、残存の活性アミンが本発明の固定化タンパク質の利用を制限することがあり得る。しかしながら、固定化されたタンパク質部分であるR1-R2-R3部分は、全くリジン残基及びシステイン残基を含まないことから、タンパク質部分の化学的統制を変えることなく、タンパク質を固定化した担体表面に残存する１級アミンをマスク剤で処理することができる。マスク剤としては、無水酢酸、無水マレイン酸等が好適であるが、どのようなマスク剤であれ利用できる。
【００７４】
本発明は、さらに、上記方法で得られた、システイン残基及びリジン残基を含まないアミノ酸配列よりなるタンパク質を適当なリンカー配列を介して、１級アミノ基を有する固定化担体とアミド（ペプチド）結合で強固に結合した固定化タンパク質を提供する。
【００７５】
本発明において、固定化の担体としては、クロマトグラフィーに利用し得る担体を用いることができる。但し、本発明において用いる担体は、モノリス構造体を有する担体は除かれる。ここで、モノリス構造体とは、上面から下面まで貫通しているマクロ細孔を持つ多孔質体であり、多孔質体はマクロ細孔の内部にミクロ細孔を有することを特徴とし、多孔質体はマクロ細孔１〜１００μm、ミクロ細孔０〜１００nmである。モノリス構造体として、例えばケイ素を含むシリカモノリス構造体が挙げられる。モノリス構造体については、特公平０８-０２９９５２号公報、特開平０７-０４１３７４号公報、特開２０１０-１２７８５３号公報等に記載されている。
【００７６】
また、粒子状の担体、膜状の担体、繊維状の担体、ホロファイバー状の担体、板状やシート状の基板、磁気ビーズ等タンパク質を固定化し得る不溶性のものならば、いずれも含まれる。「固定化担体」は、「固定化基板」を含む。このような形状の担体を形成する素材としては、表面に介在タンパク質を配向制御固定化するための官能基が導入されているものならどのようなものでもよくポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼン、ポリメタクリエート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリアクリレートに代表される重合体や共重合体であるポリマー素材やハイドロゲル、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサンなどに代表される天然素材、シリカ、ガラス、セラミックなどに代表される無機素材、さらには、金、アルミナ、銀などに代表される金属素材など幅広く利用可能である。担体としては、Sepharose（登録商標）、Sephadex(登録商標）、Cellufine（登録商標）等の市販のものを用いることができる。さらに、ミクロ流路も担体として利用することができる。ここで、ミクロ流路とは、フローチャンネルセルやガラス基板上にミクロンオーダーの高精度の流路を形成したマイクロチップ等をいい、流路内のガラス上にタンパク質を固定化すればよい。
【００７７】
ここで、官能基を導入した市販の固定化担体としては、アミノ−セルロファイン（生化学工業で販売）、AF-アミノトヨパール（TOSOHで販売）、EAH-セファロース4B及びリジン-セファロース4B（アマシャムバイオサイエンスで販売）、ポラス20NH（ベーリンガーマンハイムで販売）、ポロス（ライフテクノロジーズで販売）、CNBr活性化セファロースFF、NHS活性化セファロースFF、などがある。また、１級アミノ基を有するシラン化合物（例えば、３−アミノプロピルメトキシシランなど）を用いて、シリカ担体、ガラスビーズ又はガラス平板などにアミノ基などの官能基を導入することは当業者であれば容易にできる。
【００７８】
本発明の、プロテインＡ変異体を含む担体を、抗体生成用のためのアフィニティークロマトグラフィーに用いる場合、粒子状の担体がクロマトグラフィー用カラムに充填されて用いられる。
【００７９】
上記の抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、プロテインＡの変異体は以下の方法で取得することができる。
【００８０】
最初にリジン及びシステインを含まないように改変したプロテインＡ（例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるプロテインＡのＡドメイン）の１個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したタンパク質を作製する。このタンパク質について、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡ変異体を選択する。必要ならば、選択したプロテインＡ変異体について、さらに１個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したタンパク質、すなわち複数のアミノ酸置換を組合せた変異体を作製し、変異体の中から、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡ変異体を選択する。この操作を数回繰り返すことにより、上記の特性を強く呈するプロテインＡ変体を製造することができる。最終的には抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡ変異体として又は複数のアミノ酸が置換されたプロテインＡ変異体を得ることができる。例えば、プロテインＡとしてプロテインＡのＡドメインを用いた場合、リジン及びシステイン残基を含まないようにリジン及びシステインを他のアミノ酸に置換した変異体において、さらに１個、２個又は３個のアミノ酸が置換されたプロテインＡ変異体を得ることができる。この場合、リジン及びシステインを含む野生型のアミノ酸からは６〜９個のアミノ酸が置換される。また、プロテインＡ全体としても、リジン及びシステイン残基を含まないようにリジン及びシステインを他のアミノ酸に置換した変異体において、さらに、１〜９個のアミノ酸が置換された変異体を得ることができる。この場合、リジン及びシステインを含む野生型のアミノ酸からは７〜１５個のアミノ酸が置換される。このうちの６個がリジン及びシステインの他のアミノ酸への置換であり、残りの１〜９個が抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を付与するための置換である。具体的には、上記のＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１及びＡＤ-６-２のアミノ酸配列のR2部分で表されるアミノ酸配列からなる変異体が挙げられる。
【００８１】
プロテインＡ変異体の抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０〜pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性の検定は、例えば以下の方法で行うことができる。
【００８２】
一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質中、R2部分としてプロテインＡの変異体のアミノ酸配列を含むタンパク質を製造し、該タンパク質を用いてR1-R2-R3部分をアレイ用基板に、シアノ化を利用した上記方法により固定化する。ここで用いるアレイとしては、特許４５２８９５１号公報、特開２０１０-１２７８５６号公報、特許４００６５２３号公報等に記載されているアレイを用いればよい。
【００８３】
変異体を固定化したアレイ基板を、アレイ解析装置にセットし、装置の送液系に接続し、以下に記載する解析のための溶液を自動通液しながらアレイに２８０ｎｍの紫外光を照射し、その透過光をCCDで継時的に撮影しアレイの画像をPCに取り込む。初期化緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、抗体溶液（ヒトポリクローナル抗体を０．２ｍｇ/ｍｌになるようにランニング緩衝液で希釈した溶液）、洗浄用緩衝液（１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、溶出用緩衝液（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、再生用緩衝液（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．５）の各々を０．６ｍｌ/ｍｉｎの速さで２５分間、この順に通液し、８秒間隔でアレイの画像を継時的に撮影し、画像としてPCに取り込み保存する。データの解析においては、装置に付属した解析用ソフトフェアを用いて、アレイ画像の中にスポットを自動検出し、スポット領域のピクセルの平均輝度、及び、スポット周辺のピクセルの平均輝度を計算し、その比の対数をスポットのシグナル強度として求める。この値は、スポット上のタンパク質の量に比例することが確認されている。各スポットのシグナル強度をアレイ基板に対して通液を開始してからの経過時間に対してプロットする。経過時間に対するシグナル強度のプロットから得られる曲線を解析することにより変異体タンパク質の特性を評価することができる。このシグナル強度の時間経過を求めることにより、抗体が吸着、解離する状況を定量的に解析することができる。この溶出過程のシグナル強度変化に減衰曲線をフィッティングし、結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5を求め、アレイ近傍の上記のＡＤ-１中のプロテインＡのＡドメインのＴ0.5との比を計算することによって規格化したＴ0.5を求め、この値を酸溶出特性の指標、あるいは、酸溶出の容易さの指標として評価する。Ｔ0.5が低い方が酸溶出特性、すなわち、ｐＨ４.０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が良好であると判断することができる。さらに、Ｔ0.5に加えて、抗体との解離定数（Kd）を指標にしてもよい。
【００８４】
解離定数は、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサーであるBiacore（ビアコア社）を用いてプロテインＡ変異体と抗体との結合特性解析を行うことにより測定することができる。この際、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質中、R2部分としてプロテインＡの変異体のアミノ酸配列を含むタンパク質を用いてR1-R2-R3部分を担体に結合し、該タンパク質固定化担体を用いればよい。観測された表面プラズモン共鳴によるセンサー表面の質量変化の経時変化は、Biacoreにより定義される単位ＲＵにより測定し、結合速度定数(kass)、解離速度定数(kdis)及び解離定数(Kd =kass/kdis)を求めればよい。解離定数が小さいプロテインＡ変異体ほど、抗体と中性条件で強く結合し得る変異体であると判断することができる。
【００８５】
上記の方法で求めたＴ0.5及び解離定数を図１に示すような座標上にプロットし、Ｔ0.5及び解離定数が一定値範囲にあるもの、すなわち、座標上の特定の範囲にプロットされたプロテインＡのＡドメイン変異体を、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が優れた変異体として選択すればよい。
【００８６】
例えば、上記の配列番号２で表されるＡＤ-１を用いて作製したプロテインＡのＡドメイン固定化担体について同様の検討を行い、Ｔ0.5がＡＤ-１中のプロテインＡのＡドメインを用いて測定したＴ0.5よりも小さく、かつ解離定数がＡＤ-１中のプロテインＡのＡドメインを用いて測定した解離定数よりも小さいプロテインＡを本発明の、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が優れた変異体として選択することができる。本発明の、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が優れた変異体の、上記のアレイを用いて測定した場合のＴ0.5は１．００以下、好ましくは０．８０以下、さらに好ましくは０．６０以下、特に好ましくは０．５５以下であり、上記のビアコアにより測定した解離定数は６×１０-9以下、好ましくは８×１０-9以下、さらに好ましくは１０-10以下である。
【００８７】
本発明の、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化した固定化担体を用いることにより、R1-R2-R3で表される部分が固定化された固定化タンパク質を得ることができる。一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化した固定化担体は、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に吸着させることにより製造することができる。タンパク質の固定化担体への吸着は上記のように、中性から弱アルカリ条件下（ｐＨ７〜１０）で、タンパク質と固定化担体を反応させればよい。一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化した固定化担体において、タンパク質のR3部分に含まれるシステイン残基をシアノ化することにより、上記のように、固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を製造することができる。本発明は、R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体も包含する。
【００８８】
R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製することができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるアフィニティークロマトグラフィー用カラムは、カラムにR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を充填することにより、製造することができる。担体のカラムへの充填は公知の方法により行うことができる。本発明は、R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を含む抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用カラムも包含する。
【００８９】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カラムを用いた抗体精製は公知のアフィニティークロマトグラフィーの方法により行うことができるが、プロテインＡ変異体に結合させた抗体を温和なpH条件で溶出することができるという特徴を有する。抗体精製は、最初に、精製しようとする抗体を含む溶液（原料粗液）を、R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を充填したアフィニティークロマトグラフィー用カラムに通液し、担体上のプロテインＡ変異体に抗体を吸着させる。この際、原料粗液はｐＨ６．０〜８．５に調整しておく。ｐＨの調整に用いる緩衝液は限定されないが、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ; 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid、 ＭＥＳ; 2-Morpholinoethanesulfonic acid等を用いればよい。また、アフィニティークロマトグラフィー用カラムは、あらかじめ上記のｐＨ６．０〜８.５の緩衝液を用いて平衡化しておくのが好ましい。次いで、抗体を吸着させた担体をリン酸ナトリウム緩衝液やTris-HCl緩衝液等の中性緩衝液で洗浄し、不純物を除去する。その後、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の緩衝液を用いて結合した抗体を溶出させ回収すればよい。ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液やクエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液あるいはMES；2-Morpholinoethanesulfonic acid等を用いればよい。用いる緩衝液の濃度は限定されないが、例えば、１０〜５０ｍＭの濃度で用いればよい。カラムサイズはサンプルとして用いる抗体含有原料粗液の容積にもよるが、例えば長さ２．５〜３０cmのものを用いればよい。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【００９１】
以下の実施例においては、下記の実験方法が共通的に用いられている。
（実施例１）
遺伝子合成
実施例に記載されている遺伝子の合成は、合成遺伝子受託製造業者にて合成を行った。以下に示した塩基配列（配列番号８）にもとづき、ｄｓＤＮＡを合成しpUC18vectorのBamHI-EcoRI siteへの挿入、取得されたクローンについて片鎖解析による配列を確認、塩基配列情報の照合、ミスマッチが確認された部位についてはSite directed mutagenesis等の手法により変異修正を実施、得られた取得したプラスミドDNA（約１μg）が納入された。納入されたプラスミド中の目的部分に関しては、再度シーケンシングにより配列確認を行った。
【００９２】
配列番号８の塩基配列
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCGGATAACAACTTTAACCGCGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAATTCTGAACATGCCGAACCTGAACGAAGAACAGCGCAACGGCTTTATTCAGAGCCTGCGCGATGATCCGAGCCAGAGCGCGAATCTGCTGAGCGAAGCGCGTCGTCTGAATGAAAGCCAGGCGCCGGGCTGTGCGGATGACGACGACGATGATCACCACCATCACCATCATTAAGAATTC
【００９３】
１アミノ酸置換変異体作製
ＡＤ-１（アミノ酸配列を配列番号２に示す）を元にしたプロテインＡのＡドメインのアミノ酸置換は、置換部位のアミノ酸をコードするDNA配列を目的のコドン配列に転換して両方に24塩基ずつ元の配列を持つＤＮＡプライマーとその相補ＤＮＡプライマーを用いて、クイックチャンジ法（Stratagene社のQuickChang Site-directed Mutagenesis kitに記載に記載されている方法）に従って行った。
【００９４】
タンパク質精製
組換えプラスミドを形質転換した大腸菌JM109株を、２Lの培地（２０ｇの塩化ナトリウム、２０ｇ酵母エキス、３２ｇのトリプトン、１００ｍｇのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で、３５℃で一晩培養した。その後、培養液を２０分間低速遠心（毎分５，０００回転）することにより、湿重量３〜５gの菌体を得た。これを２０mLの１０ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレス装置により菌体を破砕した後、２０分間高速遠心（毎分２０，０００回転）することにより、上清を分離した。得られた上清にストレプトマイシン硫酸を最終濃度が２％になるように加え２０分間撹拌後、２０分間高速遠心（毎分２０，０００回転）することにより、上清を分離した。この後、硫酸アンモニウム処理を行い、得られた上清をニッケルキレートカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社より購入）にアプライし、洗浄用緩衝液（５ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を２０ｍｌ以上用いて、カラムを十分洗浄し、洗浄後、溶出用緩衝液（０．５Ｍイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を２０ｍｌアプライすることにより、目的のタンパク質を溶出した。その後、このタンパク質溶液からイミダゾールを除去するため、５Ｌの１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析膜にはMWCO3500（Spectrum Laboratories社より購入）を用いた。透析後、遠心真空乾燥機を用いて目的のタンパク質を乾燥させた。
【００９５】
ヒト抗体ＩｇＧ分子との結合特性解析
目的タンパク質の結合特性解析には、表面プラズモン共鳴バイオセンサーであるBiacore（ビアコア社）を用い、ビアコア社の提供するプロトコールに従って解析を行った。
【００９６】
ランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ (pH７．４)、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５μM EDTA、0.005％ Surfactant P20（ビアコア社）の組成のものを用い、あらかじめ脱気したものを用いた。
【００９７】
センサーチップとしては、SensorChip NTA（ビアコア社）を用いた。センサーチップをランニング緩衝液にて十分平衡化した後、５ｍＭ塩化ニッケル溶液を注入することにより、ニッケルイオンの配位を完成させた。その後、センサーチップを、組み換えタンパク質溶液（ランニング緩衝液中、濃度１００μg/mL）を注入することにより、組み換えタンパク質の固定化を行った。
【００９８】
固定化組換えタンパク質とヒトＩｇＧとの結合反応は、ランニング緩衝液を用いて０．２５〜２０μg/ｍｌの範囲で７種類の濃度になるように希釈・調製したヒトＩｇＧ（シグマ−アルドリッチ社)溶液を逐次注入し、引き続きランニング緩衝液に切り替えて送液を保持することにより、抗体の結合・解離現象を定量的に観測した。なお、送液流量は２０μＬ/ｍｉｎ、結合観測時間（抗体溶液注入時間）は４分間、解離観測時間は４分間とした。各濃度の抗体溶液を注入し、結合・解離現象を観測した後には、引き続き６Ｍ塩酸グアニジン溶液を３分間注入し、固定化されている組換えタンパク質に結合しているヒトＩｇＧをすべて解離させ、ランニング緩衝液で再生し、その後の測定に使用した。
【００９９】
観測された表面プラズモン共鳴によるセンサー表面の質量変化の経時変化は、Biacoreにより定義される単位RUにより測定し、結合速度定数(kass)、解離速度定数(kdis)及び解離定数(Kd =kass/kdis)を求めた。
【０１００】
ＡＤ-１のプロテインＡのＡドメインの網羅的１アミノ酸置換変異体のビアコア測定による抗体との結合の強さを示す解離定数に対する、アレイ解析装置を用いた測定から得られたｐＨ５．０における溶出から求めた溶出パラメータ、Ｔ0.5の値のプロット結果を図１に示す。
【０１０１】
アレイ解析装置を用いた抗体の酸溶出特性の解析
アレイ解析装置を用いた測定は以下のように行った。
【０１０２】
タンパク質のアレイ基板への固定化
各変異型タンパク質をｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、BCA法で濃度を測定し、最終濃度が２ｍｇ/ｍｌになるように調整した。約２ｍｇ/ｍｌの各タンパク質溶液をアレイ用基板（シリカモノリス多孔質体の薄層）に対して、８行１２列の９６箇所に１．２ｍｍ間隔で０．２μＬずつスポットした。その際、１枚のアレイ上に同じ変異型タンパク質を二箇所にスポットし、データの再現性を確認できるようにした。また、比較用タンパク質としてＡＤ-１タンパク質を各行の中２か所にスポットし、変異型タンパク質のデータとＡＤ-１のデータとを比較できるようにした。スポットした後、タンパク質の還元反応、シアノ化反応、シアノシステインを介した配向制御固定化反応、高塩濃度の緩衝液による洗浄、及び残存アミノ基のマスク反応を逐次行うことにより、タンパク質をアレイ用基板に固定化した。
【０１０３】
測定
各変異体をスポット固定化したアレイ基板を、アレイ解析装置にセットし、装置の送液系に接続し、以下に記載する解析のための溶液を自動通液しながらアレイに２８０ｎｍの紫外光を照射し、その透過光をCCDで継時的に撮影しアレイの画像をPCに取り込んでいった。初期化緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、抗体溶液（ヒトポリクローナル抗体を０．２ｍｇ/ｍｌになるようにランニング緩衝液で希釈した溶液）、洗浄用緩衝液（１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、溶出用緩衝液（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、再生用緩衝液（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．５）、各々を０．６ｍｌ/ｍｉｎの速さで２５分間、この順に通液し、８秒間隔でアレイの画像を継時的に撮影し、画像としてPCに取り込み保存した。
【０１０４】
データ解析
データの解析においては、装置に付属した解析用ソフトフェアを用いて、アレイ画像の中にスポットを自動検出し、スポット領域のピクセルの平均輝度、及び、スポット周辺のピクセルの平均輝度を計算し、その比の対数をスポットのシグナル強度として求めた。この値は、スポット上のタンパク質の量に比例することが確認されている。各スポットのシグナル強度をアレイ基板に対して通液を開始してからの経過時間に対してプロットした。経過時間に対するシグナル強度のプロットから得られる曲線を解析することにより変異体タンパク質の特性を評価した。このシグナル強度の時間経過を求めることにより、抗体が吸着、解離する状況を定量的に解析することができる。
【０１０５】
このような解析の結果、溶出用緩衝液を通液した時の抗体の解離の速さ、すなわち、抗体の酸溶出特性は、変異型タンパク質の種類によって大きく異なっていることが分かった。そこで、この溶出過程のシグナル強度変化に減衰曲線をフィッティングし、吸着していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5を求め、アレイ近傍のＡＤ-１のプロテインＡのＡドメインのＴ0.5との比を計算することによって規格化したＴ0.5を求め、この値を酸溶出特性の指標、あるいは、酸溶出の容易さの指標とした。
【０１０６】
次に、この酸溶出特性とともに、先述のヒト抗体ＩｇＧ分子との結合特性解析に記載した方法で求めた解離定数（Ｋｄ）の両方の指標を基に、変異型タンパク質の選抜を試みた。その結果、ＡＤ-１のプロテインＡのＡドメインよりも結合親和性が高く（Ｋｄの値が小さく）、且つ、酸溶出の容易な（Ｔ0.5の値が小さい）変異型タンパク質を複数選びだすことが出来た。また、それらの変異を組み合わせた変異型タンパク質を作製し、それらのアレイを作製して抗体の酸溶出特性を測定・解析することによって、さらに酸溶出の容易な変異型タンパク質を見出すことが出来た。
【０１０７】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１５番目のＥ（グルタミン酸）をＨ（ヒスチジン）に置換したもの（Ｅ１５Ｈ）の酸溶出特性が良好であった。
【０１０８】
（実施例２）
実施例１の結果を元に、さらに、Ｅ１５Ｈ変異に他の１アミノ酸置換変異を行った。付け加える変異としては、Ｍ１９（配列番号１に示すアミノ酸配列の１９番目のメチオニン）とＧ２９（配列番号１に示すアミノ酸配列の２９番目のグリシン）の部位の置換変異について検討した。Ｍ１９は、ＡＤ-１中に唯一存在する空気酸化を受けやすいメチオニン残基であり、この部位のアミノ酸置換により、化学的な性質として抗酸化性能が付加されることが期待されるからである。Ｇ２９の部位は、アレイ解析の結果、ｐＨ５．０における溶出特性が改良する変異が期待される部位の一つとして示された部位である。Ｍ１９の部位ではｐＨ５における溶出のし易さのパラメータであるＴ0.5が改良された変異として，Ｍ１９Ｖ（１９番目のメチオニンのＶ（バリン）への置換）が、Ｇ２９の部位では、Ｇ２９Ａ（２９番目のグリシンのＡ（アラニン）への置換）、Ｇ２９Ｄ（２９番目のグリシンのＤ（アスパラギン酸）への置換及びＧ２９Ｅ（２９番目のＧのＥ（グルタミン酸への置換）が選択された。結果を表１に示す。
【０１０９】
【表１】
0005963248.tif 000002
【０１１０】
これらの変異を組み合わせた組み合わせ変異体として、Ｅ１５Ｈ＋Ｇ２９Ａ（ＡＤ-３のR2部分）、Ｅ１５Ｈ＋Ｍ１９Ｖ＋Ｇ２９Ａ（ＡＤ-４のR2部分）、Ｅ１５Ｈ＋Ｍ１９Ｖ＋Ｇ２９Ｄ（ＡＤ-６-２のR2部分）、Ｅ１５Ｈ＋Ｍ１９Ｖ＋Ｇ２９Ｅ（ＡＤ-６-１のR2部分）の４種類の組み合わせ変異について、上記方法に従って発現遺伝子の作製、大腸菌での発現、発現した大腸菌からの組み換えタンパク質の分離精製を行い、それぞれのタンパク質の精製品をそれぞれ約１ｇずつ調製した。調製したそれぞれのタンパク質を用いて、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるタンパク質を作製した。R2部分がプロテインＡの上記変異体であり、R1は存在せず、R3はGly-Gly-Gly-Glyで表される配列であり、R4はCys-Alaで表される配列であり、R5はAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Aspで表される配列であり、R6はHis-His-His-His-His-Hisで表される配列であった。特許第３７８８８２８号公報、特許第２９９０２７１号公報、特許第３０４７０２０号公報、特開２００３-３４４３９６号公報、特開２００８-１１５１５１号公報、特開２００８-１１５１５２号公報、特開２００８-１１５１５３号公報、特開２００８-２６６２２１号公報等に記載の方法に従って、R4部分のシステインをシアノ化によりシアノシステインとし、R1-R2-R3部分（実際には、R2-R3部分）を担体へ固定化し、リガンドを導入したアフィニティー担体をそれぞれ作製した。作製方法は、下記の「組換えタンパク質の固定化」に示す。前記の「リガンドを導入したアフィニティー担体」と下記の「タンパク質固定化シリカゲル」は同じ物である。それぞれのアフィニティー担体を約１ｍｌ用いた分離カラムを作製した。作製したそれぞれの分離カラムについて、ポリクローナル抗体を用いたクロマトグラフィーを行い、溶出時のｐＨを変化させ、抗体の溶出・回収量のｐＨ依存性を測定した。
【０１１１】
固定化担体を用いたクロマトグラフィーは以下に記載の方法で行った。
【０１１２】
液体クロマトグラフィー装置としてＧＥヘルスケア社のアクタを用いた。
【０１１３】
上記のリガンドを固定化した担体（タンパク質固定化シリカゲル）を１ｍｌのカラム（サイズ  φ=５ｍｍ、高さ＝５０ｍｍ）に充填し、液体クロマトグラフィー装置に取り付けた。
【０１１４】
まず、（１）（初期化）１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを１０ｍｌ通液した後、
（２）（サンプルアプライ）、サンプルループを用いて、ポリクローナルＩｇＧ抗体溶液（１ｍｌ）を通液し、溶媒切り替えバルブを切り替え、
（３）（洗浄）、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを１０ｍｌ通液した後、溶媒切り替えバルブを切り替え、
（４）（溶出）、あらかじめ設定したそれぞれのｐＨのクエン酸緩衝液を１０ｍｌ通液し、溶媒切り替えバルブを切り替え、
（５）（再生）、再生用溶液(０．１Ｍクエン酸溶液)を、１０ｍｌ通液し、溶媒バルブを切り替え、
（６）(完了)、（１）の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを１０ｍｌ通液し、クロマトグラフィーの通液操作を完了した。
【０１１５】
通液中は、カラムから溶出されてくる溶液を、装置に備え付けのＵＶ検出器及び電導度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度と電導度を測定し、その値を記録した。２８０ｎｍの吸光度を用いたクロマトグラム曲線から、溶出のピークの同定とそのピーク面積を計算し、アプライした抗体がどのように回収されてくるかを計算により求めた。
【０１１６】
結果を、図２に示す。なお、図２のＡはＡＤ-２のR2部分、ＢはＡＤ-３のR2部分、ＣはＡＤ-４のR2部分、ＤはＡＤ-５のR2部分、ＥはＡＤ-６-１のR2部分、ＦはＡＤ-６-２のR2部分の結果をそれぞれ示す。
【０１１７】
図３に固体化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。
図３Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ図２のＡのｐＨ３．０、４．０及び４．５の時のクロマトグラムを示している。図３中、（１）は、ｐＨ３．０、４．０又は４．５の溶出液を流した時の溶出ピークを示し、（２）は再生溶液（ｐＨ２．５）を流した時の溶出ピークを示す。この（１）と（２）溶出ピークの面積(それぞれ、S1及びS2とする）を用いて、回収率を１００＊S1/(s1+S2)で計算し、その値を溶出溶液のｐＨに対してプロットした図が図２である。
【０１１８】
組換えタンパク質の固定化
シリカゲル（ダイソー株式会社製）５０ｇと３-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン10gを水溶媒中還流条件下（９５℃）で、４時間反応させ、エポキシ化シリカゲル５０ｇを調製した。
【０１１９】
上記のようにして得たエポキシ化シリカゲルを０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．５）中に懸濁させ、ポリ-Ｌ-リジン５ｇ（Sigma社P6516）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、５ｍＭの２-ニトロ-５-チオシアノ安息香酸溶液５００ｍｌと組み換えタンパク質（ＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１、ＡＤ-６-２共通）２ｇをそれぞれ加え、２４時間撹拌、続いて１０ｍＭホウ酸バッファー(ｐＨ９．５)にバッファーを切り替え、再び２４時間撹拌することで、最終的に各組み換えタンパク質固定化シリカゲル４７ｇを調製した。
【０１２０】
固定化担体のIgG結合容量の測定
上記で作製した固定化シリカゲルのＩｇＧ結合能を以下のようにして測定した。
ＡＤ-３のプロテインＡのＡドメイン固定化担体を５ｍｍφx２０ｍｍのガラスカラム（GEHealthcare製、０．４ｍｌ）に充填した。様々な接触時間条件下（１．０、２．４、６．０ｍｉｎ）で、ｐＨ７のリン酸ナトリウムバッファーに溶解させた既知濃度のポリクローナルヒトＩｇＧ抗体（オリエンタル酵母製、０．５ｍｇ/ｍｌ)を負荷させた。その際の破過曲線から１０％破過点を算出し、それにより各接触時間毎に以下の動的結合容量（ＤＢＣ）を得た。なお、この表から静的結合容量は約６０ｍｇ/ｍｌと推測できた。結果を表２に示す。
【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
ＡＤ-４、ＡＤ-６-１、ＡＤ-６‐２それぞれのタンパク質のプロテインＡのＡドメインの固定化担体においても同様にして、結合容量を測定し、以下の結果を得た。結果を表３に示す。
【０１２３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明が関係する技術分野としては、固定化抗体が関わる幅広い技術分野、例えば、抗体カラム、抗体アレイなどのほか、固定化抗体を用いた、成分検査、臨床検査など幅広い検査技術分野、また、抗体カラムを用いた分離精製分野などが含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２５】
配列番号１〜８  合成
【図１】
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【図２】
0005963248.tif 000006
【図３】
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【配列表】
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