(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。
【請求項２】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の、細胞ストレスを検出するための使用。
【請求項３】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を培養することと、
前記細胞の培養液に、物質を滴下することと、
前記培養液に前記物質を滴下した後、前記細胞の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度が上昇した場合、前記物質は細胞のストレス要因であると判定することと、
を含む、細胞ストレス物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞の蛍光強度を、前記細胞の核内で観察する、請求項３に記載の細胞ストレス物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用意することと、
前記細胞に、細胞質を導入することと、
前記細胞の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度が上昇した場合、前記導入された細胞質がストレスを受けていたと判定することと、
を含む、細胞ストレスの判定方法。
【請求項６】
前記細胞に前記細胞質を導入する前に、前記細胞をストレプトリシンで処理し、前記細胞の形質膜を透過性にすることを更に含む、請求項５に記載の細胞ストレスの判定方法。
【請求項７】
前記細胞の蛍光強度を、前記細胞の核内で観察する、請求項５又は６に記載の細胞ストレスの判定方法。
【請求項８】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に、小胞体ストレスを与えることと、
前記細胞の核内の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度を低下させる化合物を探索することと、
を含む、
小胞体ストレスを軽減する化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用意することと、
前記細胞に、小胞体ストレスを与えられた細胞質を導入することと、
前記細胞の核内の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度を低下させる化合物を探索することと、
を含む、
小胞体ストレスを軽減する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記小胞体ストレスがタプシガルジンによって与えられる、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に、酸化ストレスを与えることと、
前記細胞の核内の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度を低下させる化合物を探索することと、
を含む、
酸化ストレスを軽減する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用意することと、
前記細胞に、酸化ストレスを与えられた細胞質を導入することと、
前記細胞の核内の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度を低下させる化合物を探索することと、
を含む、
酸化ストレスを軽減する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記酸化ストレスが砒素によって与えられる、請求項１１又は１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に、紫外線ストレスを与えることと、
前記細胞の核内の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度を低下させる化合物を探索することと、
を含む、
紫外線ストレスを軽減する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用意することと、
前記細胞に、紫外線ストレスを与えられた細胞質を導入することと、
前記細胞の核内の蛍光強度を観察することと、
前記蛍光強度を低下させる化合物を探索することと、
を含む、
紫外線ストレスを軽減する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記紫外線ストレスが紫外線照射によって与えられる、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５'末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させた、配列番号１で表されるコンストラクトがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用意することと、
前記細胞に、糖尿病細胞質を導入することと、
前記細胞の蛍光強度を観察することと、
を含み、
キナーゼの阻害剤を前記細胞に導入し、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行を抑制するキナーゼの阻害剤を特定することを含む、
糖尿病細胞質のストレス要因の特定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞生物学に係り、細胞、細胞の使用、スクリーニング方法、及び細胞ストレスの判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞ストレスの一つである小胞体ストレスが生じると、小胞体内で合成中の不安定なタンパク質が正常な折りたたみ構造の形成に失敗し、異常タンパク質となって小胞体内に蓄積される。近年、異常タンパク質の蓄積と、神経疾患等の各種疾病との関係を示唆する研究結果が発表されるにつれ、細胞に加えられたストレスを容易に検出可能な技術の提案が望まれるようになった（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１３１８９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、細胞に加えられたストレスを容易に検出可能な細胞、細胞の使用、スクリーニング方法、及び細胞ストレスの判定方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一の態様は、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させたｍＲＮＡを有する細胞であることを要旨とする。
【０００６】
また、本発明の他の態様は、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させたｍＲＮＡを有する細胞の、細胞ストレスを検出するための使用であることを要旨とする。
【０００７】
また、本発明の別の態様は、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させたｍＲＮＡを有する細胞を培養することと、細胞の培養液に、物質を滴下することと、培養液に物質を滴下した後、細胞の蛍光強度を観察することと、蛍光強度が上昇した場合、物質は細胞のストレス要因であると判定することと、を含む、細胞ストレス物質のスクリーニング方法であることを要旨とする。当該スクリーニング方法において、細胞の蛍光強度を、細胞の核内で観察してもよい。
【０００８】
また、本発明のさらに別の態様は、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域とを融合させたｍＲＮＡを有する細胞を用意することと、細胞に、細胞質を導入することと、細胞の蛍光強度を観察することと、蛍光強度が上昇した場合、導入された細胞質がストレスを受けていたと判定することと、を含む、細胞ストレスの判定方法であることを要旨とする。当該判定方法において、細胞に細胞質を導入する前に、細胞をストレプトリシンで処理し、細胞の形質膜を透過性にしてもよい。また、細胞の蛍光強度を、細胞の核内で観察してもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞に加えられたストレスを容易に検出可能な細胞、細胞の使用、スクリーニング方法、及び細胞ストレスの判定方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＡＴＦ４タンパク質の翻訳制御機構の概念図である。
【図２】本発明の第１の実施例に係るコンストラクトの模式図である。
【図３】本発明の第１の実施例に係るコンストラクトの発現量を示す逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の結果である。
【図４】本発明の第１の実施例に係るコンストラクトを有する細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図５】本発明の第１の実施例に係る小胞体ストレスを与えられた細胞の蛍光強度を示すグラフである。
【図６】本発明の第１の実施例に係る酸化ストレスを与えられた細胞の蛍光強度を示す第１のグラフである。
【図７】本発明の第１の実施例に係る紫外線ストレスを与えられた細胞の蛍光強度を示すグラフである。
【図８】本発明の第１の実施例に係る酸化ストレスを与えられた細胞の蛍光強度を示す第２のグラフである。
【図９】本発明の第１の実施例に係るウェスタン・ブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０】本発明の第２の実施例に係るセミインタクト処理を示す模式図である。
【図１１】本発明の第２の実施例に係るストレス細胞質を導入された細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１２】本発明の第２の実施例に係る正常細胞質を導入されたコントロール細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】本発明の第２の実施例に係るＴＢバッファを導入されたコントロール細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】本発明の第２の実施例に係るＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳等に関わる因子をアッセイした結果を示すグラフである。
【図１５】本発明の第３の実施例に係る糖尿病細胞質を導入された細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】本発明の第３の実施例に係る糖尿病細胞質を導入された細胞の蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
細胞は、ストレス環境下で、ほとんどのタンパク質の合成を停止する。しかし、細胞は、ストレス環境下においても、シャペロンやある種の転写因子群の翻訳を活性化する。ＡＴＦ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）４タンパク質は、ストレス負荷時に翻訳が活性化される転写因子である。ストレスのない平常時においては、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡは細胞質内に存在するが、ＡＴＦ４タンパク質は翻訳されない。しかし、図１に示すように、酸化ストレス、小胞体ストレス、飢餓ストレス、及びウイルス感染ストレス等のストレスが細胞に加えられると、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡが活性化され、ＡＴＦ４タンパク質が翻訳される。このように、ＡＴＦ４タンパク質は、ストレスにより翻訳が制御されるタンパク質である。
【００１２】
ＡＴＦ４タンパク質の翻訳制御は、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）が担っている。ＡＴＦ４タンパク質の翻訳制御は、ストレス刺激に対して細胞内で活性化されるストレス依存的なキナーゼが、転写制御因子ｅＩＦ２をリン酸化することから始まる。リン酸化されたｅＩＦ２は、ＡＴＦ４タンパク質の翻訳を活性化し、翻訳されたＡＴＦ４タンパク質は核内に移行して、ストレスに依存した様々なストレス応答タンパク質の転写を誘起する。
【００１３】
この時転写されるストレス応答タンパク質の一つに、ＧＡＤＤ３４がある。ＧＡＤＤ３４は、ＰＰ１という脱リン酸化複合体を形成することで、ｅＩＦ２の脱リン酸化を行う。その結果、ＡＴＦ４タンパク質の翻訳が抑制される。つまり、ＡＴＦ４とＧＡＤＤ３４は、ネガティブ・フィードバック・ループを形成し、ＧＡＤＤ３４は、ストレス負荷時における細胞のストレス応答を、ネガティブに制御している。
【００１４】
ここで、本発明の発明者らは、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させたｍＲＮＡを有する細胞の培地中にサンプル物質を添加し、細胞の核内の蛍光強度を観察することにより、サンプル物質が細胞のストレス要因であるか否かを、高い感度でスクリーニング可能であることを見出した。また、当該細胞の核内の蛍光強度を低下させる化合物を探索することにより、細胞ストレスを軽減する化合物をスクリーニングすることも可能となる。
【００１５】
例えば、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域にルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）等のレポータ遺伝子のみを融合させたコンストラクトは、ＡＴＦ４タンパク質の翻訳領域を含まないため、ＧＡＤＤ３４によるネガティブ・フィードバック・ループ機構の影響を受けない。これに対し、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させたｍＲＮＡを含む細胞は、与えられたストレスに応じて、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質を生成する。  さらに、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質は正常に核内に移行するため、ＧＡＤＤ３４とともに、ネガティブ・フィードバック・ループを形成すると考えられる。そのため、細胞の本来の姿に近い状態で、細胞ストレスをモニターすることが可能となる。
【００１６】
さらに発明者らは、形質膜に孔が設けられたセミインタクト細胞においても、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させたｍＲＮＡからストレスに応じてＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質が翻訳され、核内に移行することを見出した。セミインタクト細胞には、他の細胞から抽出した細胞質を導入することが可能である。そのため、様々な病態細胞から抽出した細胞質を、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’末端の非翻訳領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、ＧＦＰタンパク質コーディング領域と、を融合させたｍＲＮＡを有するセミインタクト細胞に注入することにより、細胞質を抽出された病態細胞のストレス状態を検出することが可能となる。また、ストレス要因の阻害剤を添加することにより、細胞質を抽出された病態細胞のストレス要因を特定することも可能となる。
【００１７】
（第１の実施例：生細胞を用いた細胞ストレスの検出アッセイ）
ＡＴＦ４タンパク質の翻訳を可視化するために、図２に示すように、ＡＴＦ４タンパク質のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域と、ＡＴＦ４タンパク質コーディング領域と、半減期が約１時間の短寿命緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）コーディング領域とを融合させたコンストラクト（ｍＲＮＡ）を作製した。作製したコンストラクトｍＡＴＦ４  ５’ＵＴＲ＋ＣＤＳ／ｐｄ１ＥＧＦＰ−Ｎ１の配列は、配列表の配列番号１に示す。ここで、５’ＵＴＲ領域は、ストレス時にＡＴＦ４タンパク質が翻訳され、ストレスのない平常時にＡＴＦ４タンパク質が翻訳されないよう、ＡＴＦ４タンパク質の翻訳を制御する。
【００１８】
次に、作製したｍＲＮＡを安定に発現する細胞株ＣＨＯ−ＡＴＦ４を得た。具体的には、Ｍｏｕｓｅ  ＡＴＦ４  ５’ＵＴＲ−ＣＤＳ／ｐｄ１ＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドをＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用い、メーカーのマニュアルに基づいて行った。トランスフェクションの翌日に細胞をトリプシン溶液により培養皿より剥がし、３００  ｎｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＨａｍＦ１２−５％  ＦＣＳ培地中にまきこみ培養した。その後、３日ごとにＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む培地を交換した。７〜１０日後にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性の細胞（つまり当該プラスミドが染色体内に組み込まれた細胞）コロニーが出現するため、これらを２４ｗｅｌｌ  プレートに単離した。次に小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルジンを単離した細胞に作用させたときにのみ、ＡＴＦ４−ＧＦＰが翻訳され核にＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質が蓄積する細胞株を、蛍光顕微鏡観察により選別した。
【００１９】
図３に示すように、得られたＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞において、タプシガルジン（Ｔｇ）によって小胞体ストレスが与えられた時（Ｔｇ＋）のＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量と、小胞体ストレスを与えなかった時（Ｔｇ−）のＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量は同等であることが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確認された。
【００２０】
しかし、図４の蛍光顕微鏡写真に示すように、小胞体ストレスを与えなかった時（Ｔｇ−）、ＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞は、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質を発現しなかった。これに対し、小胞体ストレスが与えられた時（Ｔｇ＋）、ＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞は、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質を発現し、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質は核内に移行した。さらに、０．３μｍｏｌ／Ｌのタプシガルジン（Ｔｇ）によって小胞体ストレスが与えられた細胞の時間経過を蛍光顕微鏡で確認したところ、ＡＴＦ４タンパク質とネガティブ・フィードバック・ループを形成するＧＡＤＤ３４の生成によって、図５に示すように、次第にＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳が抑制され、核内の蛍光強度は減少する傾向にあることが確認された。なお、図５においては、１０サンプルの結果が描画されている。
【００２１】
また、１００μｍｏｌ／Ｌの砒素（Ａｓ）を添加し、酸化ストレスを細胞に与えた場合も、図６に示すように、時間経過と共に、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質は核内に移行し、核内に蓄積した。その後、次第にＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳は抑制され、蛍光強度は減少した。なお、図６においても、１０サンプルの結果が描画されている。さらに、５００Ｊ／ｍ2の紫外線（ＵＶ）を照射して、細胞にストレスを与えた場合も、時間経過と共に、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質は核内に移行し、核内に蓄積したが、図７に示すように、次第にＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳は抑制され、蛍光強度は減少した。なお、図７においても、１０サンプルの結果が描画されている。
【００２２】
次に、１００μｍｏｌ／Ｌの砒素（Ａｓ）を添加し、酸化ストレスを細胞に与えた場合のＡＴＦ４タンパク質及びＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の発現量を、抗ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体及び抗ＧＦＰ抗体を用いて、ウェスタン・ブロッティングで確認し、図８に示すグラフに描画した。また、図８に示すグラフに、同様の酸化ストレスを与えられた１４個の細胞の蛍光強度を描画した。すると、ウェスタン・ブロッティングで確認されたＡＴＦ４タンパク質の発現量と、蛍光顕微鏡で確認された蛍光強度は、時間経過と共に、同様に増減した。
【００２３】
また、図９に示すように、ＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞内のＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の発現量は、細胞の内在性のＡＴＦ４タンパク質の発現量のほぼ２倍であった。以上示したように、第１の実施例に係るコンストラクトを導入されたＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞において、外来性のＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質も、内在性のＡＴＦ４タンパク質と同様に、ネガティブ・フィードバック・ループを形成し、ＧＡＤＤ３４によって、翻訳が抑制されることが示された。さらに、ＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞において、外来性のＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質は、内在性のＡＴＦ４タンパク質より多く翻訳されることが示された。したがって、ＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞は、細胞ストレスの有無の検証に有用であることが示された。
【００２４】
（第２の実施例：セミインタクト細胞を用いた細胞ストレスの検出アッセイ）
まず、セミインタクト細胞について説明する。セミインタクト細胞とは、連鎖球菌の酵素感受性毒素であるストレプトリシンＯ（ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ：ＳＬＯ）等を形質膜に作用させることにより、形質膜を部分的に透過性にした細胞のことである。セミインタクト細胞を作製することにより、オルガネラや細胞骨格そのもの、及びオルガネラや細胞骨格のトポロジーを保持させたまま、細胞から細胞質を流出させることが可能となる。
【００２５】
さらに、細胞質が流出したセミインタクト細胞に、新たに外部より分画した細胞質成分とＡＴＰ再生系を導入することにより、細胞内膜動過程、タンパク質間相互作用、及びタンパク質のターゲティング等の細胞質に依存的な細胞内のイベントを、セミインタクト細胞内に再構成可能である（例えば、村田昌之ら、セミインタクト細胞を用いた細胞内タンパク質の動態・機能の解析技術の開発、月刊バイオインダストリー、日本、シーエムシー出版、２００４年６月号参照。）。例えば、病態細胞でない正常細胞から作製したセミインタクト細胞に、病態細胞から抽出した病態細胞質を導入することにより、病態細胞の核の影響を排した細胞を作製することも可能である。
【００２６】
ここで、タプシガルジン（Ｔｇ）処理により、小胞体ストレスを与えたＬ５１７８Ｙマウス細胞から細胞質を抽出し、抽出した細胞質をストレス細胞質とした。また、ＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞をストレプトリシンＯで処理し、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞を作製した。次に、図１０に示すように、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞に、ＡＴＰ再生系と共にストレス細胞質を導入した。すると、第１の実施例と同様に、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質が発現及び核内移行し、核内に蓄積されることが、図１１に示すように観察された。
【００２７】
これに対し、ストレスを与えなかったＬ５１７８Ｙマウス細胞から細胞質を抽出し、抽出した細胞質を正常細胞質とした。次に、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞に、ＡＴＰ再生系と共に正常細胞質を導入したところ、図１２に示すように、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の発現は観察されなかった。また、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞に、ＡＴＰ再生系と共にＴＢバッファを導入した場合も、図１３に示すように、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の発現は観察されなかった。したがって、ストレス細胞質を導入されたセミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞においては、ストレス細胞質依存的に、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質が発現したことが示された。
【００２８】
図１４に、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞を用いて、ストレス細胞質に依存的なＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行に関わる因子をアッセイした結果を示す。なお、図１４のグラフの横軸においては、ストレス細胞質を導入した場合の核の蛍光強度を１００％に、ＴＢバッファを導入した場合の核の蛍光強度を０％に換算している。図１４に示すように、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行は、ＡＴＰ及びＧＴＰに依存していることが明らかになった。
【００２９】
また、細胞質に存在する翻訳制御領域を含むＡＴＦ４−ＧＦＰの遺伝子に対応するｍＲＮＡをＲＮＡａｓｅ処理によって分解した後では、ストレス負荷細胞質をセミインタクト細胞内に添加してもＡＴＦ４−ＧＦＰの発現は起こらなかった。さらに、ＧＴＰγＳ存在下でＡＴＦ４−ＧＦＰの核内移行が阻害された。したがって、ＡＴＰ及びＧＴＰは、この翻訳制御機構の制御因子として必要なことがわかった。
【００３０】
また、キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ）を導入した結果から、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行は、キナーゼに依存していることが明らかになった。さらに、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を導入した結果から、細胞内のタンパク質合成を止めると、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行は生じないことが明らかになった。
【００３１】
以上の結果より、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞に導入されたストレス細胞質によって、新たなＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳が行われることが示された。また、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞内のｍＲＮＡをＲＮＡａｓｅによって予め分解した後、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞にストレス細胞質を導入した場合、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行は起きなかった。これらの結果より、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞においても、ストレス細胞質依存的にＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳制御機構が機能していることが示された。
【００３２】
（第３の実施例：セミインタクト細胞を用いた糖尿病による細胞ストレスの検出アッセイ）
糖尿病態マウス（過脂肪食供与マウス）の副睾丸脂肪細胞から細胞質を抽出し、抽出した細胞を糖尿病細胞質とした。次に、セミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞に、ＡＴＰ再生系と共に糖尿病細胞質を導入した。すると、第２の実施例と同様に、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質が発現及び核内移行し、核内に蓄積されることが、図１５に示すように観察された。また、図１６に示すように、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳は、細胞質濃度に依存することも示された。
【００３３】
よって、糖尿病細胞質は、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行を活性化することが明らかになった。また、この結果は、糖尿病細胞質は「ストレス」性の細胞質であることを示している。したがって、ストレス依存的な各種キナーゼの阻害剤を、糖尿病細胞質を導入されたセミインタクトＣＨＯ−ＡＴＦ４細胞に導入し、ＡＴＦ４−ＧＦＰタンパク質の翻訳及び核内移行を抑制するキナーゼの阻害剤を特定することにより、糖尿病細胞質のストレス要因を特定することが可能となることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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