(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGF-18、pHを7.0〜7.5に維持するリン酸緩衝液、ポロクサマー188、及びスクロースを含んでなる、安定な凍結乾燥製剤。
【請求項２】
前記リン酸緩衝液が、pHを7.2に維持する、請求項１に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項３】
前記リン酸緩衝液の濃度が、5〜100 mMである、請求項１又は２に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項４】
前記ポロクサマー188の濃度が、0.1〜0.4 mg/バイアルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項５】
前記スクロースの濃度が、10〜60 mg/バイアルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項６】
FGF-18の濃度が、20〜300 mcg/バイアルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項７】
前記製剤が、20、30、60、100、200又は300 mcg/バイアルのFGF-18、pHを7.2に維持する10 mMリン酸緩衝液、30 mg/バイアルのスクロース、及び0.2 mg/バイアルのポロクサマー188を含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項８】
前記製剤が、FGF-18を5%以上含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項９】
FGF-18が、
a. 配列番号1のアミノ酸残基28〜207を含んでなる又はから成るポリペプチド、
b. 配列番号1のアミノ酸残基28〜196を含んでなる又はから成るポリペプチド、及び
c. 配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチド、
から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤の製造方法であって、
a. FGF-18と、リン酸緩衝液、ポロクサマー188及びスクロースとの混合物を形成する工程、及び
b. 前記混合物を凍結乾燥に供する工程、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤を含んでなる第一の容器、及び再構成用の溶剤を含んでなる第二の容器、を含んでなる製品。
【請求項１２】
前記安定な凍結乾燥製剤を含んでなる容器及び再構成用の溶剤を含んでなる容器が、デュアルチャンバーシステムの２つのコンパートメントである、請求項１１に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製剤の分野に関する。詳細には、線維芽細胞増殖因子18（FGF-18）タンパク質の凍結乾燥製剤、及び斯かる製剤の製造方法を目的とする。本発明の凍結乾燥製剤は、適切な期間の室温での貯蔵において安定である。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子18（FGF-18）は、FGF-8及びFGF-17と密接に関係したタンパク質の線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーのメンバーである。FGFファミリーのメンバーは、ヘパリン結合ドメインによって特徴づけられる。斯かる推定ヘパリン結合ドメインは、FGF-18に関して特定されている。細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンと複合体を形成したFGFリガンドが結合されると、受容体介在性情報伝達が惹起されると推定されている。
【０００３】
FGF-18は、軟骨細胞及び骨芽細胞のための増殖性薬剤であることが示されている（Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320; Shimoaka et al., 2002, J.Bio. Chem. 277（9）:7493-7500）。FGF-18は、軟骨疾患、例えば、変形性関節症及び軟骨損傷等のFGF-18単独での治療（国際公開第2008/023063号）、又はヒアルロン酸と組み合わせた治療に提案されている（国際公開第2004/032849号）。
【０００４】
FGFポリペプチドを含んでなる医薬組成物は、当技術分野で周知である。国際公開第00/21548号は、医薬的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせた、組み換えFGFを含んでなる医薬組成物を開示する。注射可能溶液に適した担体又は希釈剤の例には、水又は等張生理食塩水が含まれる。
【０００５】
国際公開第2008/121563号は、医薬的に許容される担体と共に、単位用量の注射可能形態に調製された、FGF-21化合物を含んでなる医薬製剤に関する。適した担体は、中でも、糖、緩衝液及び／又は界面活性物質のようである。
【０００６】
国際公開第92/01442号は、FGF、医薬的に許容される充填剤と、i）セルロースのアルカリ金属塩、又はii）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとシステインとの組合わせを含んでなる凍結乾燥組成物を開示する。i）及びii）の成分により、FGF組成物を安定化させることができる。
【０００７】
国際公開第01/39788号は、医薬的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝食塩水との混合で、細胞毒と共にFGF-18化合物を含んでなる医薬組成物を記載する。
【０００８】
国際公開第2008/023063号は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、賦形剤等と共に、FGF-18化合物を含んでなる製剤を開示する。一例として、ビヒクル、例えば、生理食塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミン及びリンゲル液等の中にFGF-18を含んでなる注射のための製剤が開示されている。
【０００９】
生理活性タンパク質を含んでなる医薬組成物を調製する場合、斯かる組成物はタンパク質の活性が適切な期間維持される方法で製剤化しなければならない。タンパク質の活性／安定性の損失は、タンパク質の化学的又は物理的不安定性、特に変性、凝集又は酸化に起因し得る。よって、生じる生成物は、医薬的に容認できないものとなり得る。賦形剤の使用は所定のタンパク質の安定性を増加することが知られているが、これらの賦形剤の安定化効果は非常に賦形剤の性質及び生理活性タンパク質それ自体に依存的である。
【００１０】
活性成分としてFGF-18を含むさらなる製剤であって、製剤が適切な期間安定であり、注射における使用、好ましくは、関節内注射に適した製剤が必要なままである。斯かる製剤は、患者における軟骨疾患、例えば、変形性関節症又は軟骨損傷等の治療での投与に有効となり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、FGF-18タンパク質を含む新規製剤を供することである。好ましくは、製剤はFGF-18を含む安定な凍結乾燥（又は凍結乾燥された）製剤である。本発明はまた、本発明の凍結乾燥製剤を調製するための方法を供する。本明細書に記載される凍結乾燥製剤は、再構成後に、軟骨疾患の治療での投与に有用となり得る。
【００１２】
第一の態様において、本発明は、FGF-18、緩衝液、ポロクサマー界面活性物質及び安定化剤としての糖を含んでなる又はから成る安定な凍結乾燥製剤を供する。好ましい実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝液であり、ポロクサマー界面活性物質はポロクサマー188であり、安定化剤はスクロースである。さらに好ましい実施形態において、緩衝液は、pHをちょうど又は約6〜8に維持し、好ましくは、ちょうど又は約7.2である。さらに好ましい実施形態において、ポロクサマー界面活性物質の濃度は、ちょうど又は約0.1〜0.4 mg/バイアルである。好ましくは、FGF-18は、1）配列番号1の残基28（Glu）〜残基207（Ala）を含んでなる又はから成る配列に相当する、ヒトFGF-18の成熟形態を含んでなる又はから成るポリペプチド、2）配列番号1の残基28（Glu）〜残基196（Lys）を含んでなる又はから成るヒトFGF-18の切断型を含んでなる又はから成るポリペプチド、並びに3）配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチド、から成る群から選択される。より好ましくは、FGF-18は、本明細書中に定義される、trFGF-18である。
【００１３】
第二の態様において、本発明は、FGF-18の安定な凍結乾燥製剤を製造するための方法を供し、斯かる方法は、
1）緩衝液、界面活性物質及び安定化剤と共に、FGF-18の混合物を形成する工程、並びに
2）斯かる混合物を凍結乾燥（lyophilisation）｛凍結乾燥（freeze-drying）｝に供する工程、
を含んでなり、緩衝液がリン酸緩衝液であり、安定化剤が糖、例えば、スクロース等であり、界面活性物質がポロクサマー界面活性物質、例えば、ポロクサマー188等である。好ましい実施形態において、緩衝液はpHをちょうど又は約6〜8に維持し、好ましくは、ちょうど又は約7.2に維持する。
【００１４】
好ましくは、FGF-18は、1）配列番号1の残基28（Glu）〜残基207（Ala）を含んでなる又はから成る配列に相当する、ヒトFGF-18の成熟形態を含んでなる又はから成るポリペプチド、2）配列番号1の残基28（Glu）〜残基196（Lys）を含んでなる又はから成るヒトFGF-18の切断型を含んでなる又はから成るポリペプチド、及び3）配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチド、から成る群から選択される。より好ましくは、FGF-18は本明細書中に定義されるtrFGF-18である。
【００１５】
第三の態様において、本発明は、
1）安定な凍結乾燥製剤であって、凍結乾燥製剤がFGF-18、緩衝液、界面活性物質及び安定化剤、を含んでなる第一の容器、並びに
2）再構成のための溶剤を含んでなる第二の容器、
を含んでなる医薬又は獣医的使用の製品であって、
緩衝液がリン酸緩衝液であり、安定化剤が糖、例えば、スクロース等であり、界面活性物質がポロクサマー界面活性物質、例えば、ポロクサマー188等であり、再構成用溶剤が水又は生理食塩水（例えば、注射用の0.9% w/v塩化ナトリウム）である、製品を供する。
【００１６】
好ましくは、FGF-18は、1）配列番号1の残基28（Glu）〜残基207（Ala）を含んでなる又はから成る配列に相当する、ヒトFGF-18の成熟形態を含んでなる又はから成るポリペプチド、2）配列番号1の残基28（Glu）〜残基196（Lys）を含んでなる又はから成る、ヒトFGF-18の切断型を含んでなる又はから成るポリペプチド、並びに3）配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチドから成る群から選択される。より好ましくは、FGF-18は本明細書中に定義されるtrFGF-18である。
【００１７】
定義
本明細書中の用語「FGF-18タンパク質」又は「FGF-18」は、少なくとも１つのヒトFGF-18タンパク質の生物学的活性を維持するタンパク質であることを意図する。FGF-18は、天然の、その成熟形態、又は切断型とすることができる。ヒトFGF-18タンパク質の生物学的活性には、特に骨芽細胞活性の増加（国際公開第98/16644号）又は軟骨形成の増大（国際公開第2008/023063号）が含まれる。
【００１８】
天然又は野生型の、ヒトFGF-18は、関節軟骨の軟骨細胞によって発現されたタンパク質である。ヒトFGF-18は、最初にzFGF-5と命名され、国際公開第98/16644号に十分に記載されています。配列番号1は、天然のヒトFGF-18のアミノ酸配列に相当し、アミノ酸残基1（Met）〜27（AIa）から成るシグナルペプチドを有する。ヒトFGF-18の成熟形態は、配列番号1の残基28（Glu）〜残基207（Ala）のアミノ酸配列に相当する（180個のアミノ酸）。FGF-18は、FGFR4及びFGFR3及びFGFR2の「IIIc」スプライスバリアントへの特異性を有する（Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilag, 10: 308-320）。FGF-18の成熟形態は、21.04 kDaの平均質量を有する。
【００１９】
本発明においてFGF-18は、例えば、国際出願第2006/063362号に記載の組み換え方法等によって産生することができる。発現系及び条件に従って、本発明のFGF-18は、開始メチオニン（Met残基）又は分泌のためのシグナル配列と共に、組み換え宿主細胞において発現される。原核生物宿主、例えば、大腸菌（E. coli）等において発現される場合、FGF-18はその配列のN末端においてさらなるMet残基を含む。例えば、ヒトFGF-18のアミノ酸配列は、大腸菌（E.coli）で発現される場合、N末端（位置1）のMet残基で開始し、配列番号1の残基28（Glu）〜残基207（Ala）が続く。
【００２０】
本明細書中の用語FGF-18の「切断型」は、配列番号1の残基28（Glu）〜196（Lys）を含んでなる又はから成るタンパク質を意味する。好ましくは、FGF-18タンパク質の切断型は、「trFGF-18」と命名されたポリペプチド（170アミノ酸）であり、Met残基（N末端）で開始し、野生型ヒトFGF-18のアミノ酸残基28（Glu）〜196（Lys）が続く。trFGF-18のアミノ酸配列は、配列番号2（配列番号2のアミノ酸残基2〜170は、配列番号1のアミノ酸残基28〜196に相当する）に示される。trFGF-18は、ヒトFGF-18の組み換え切断型であり、大腸菌（E.coli）で産生される（国際公開第2006/063362号）。trFGF-18は、成熟ヒトFGF-18と同様の活性を示し、例えば、様々な軟骨組織の修復及び再構築につながる軟骨細胞増殖及び軟骨沈着を増加することが示されている（国際公開第2008/023063号）。trFGF-18は、平均質量19.83 kDaを有する。
【００２１】
本明細書中の用語「安定性」は、本発明の製剤における、FGF-18の物理的、化学的、及び立体構造的安定性を意味する（また、生物学的効力の保持も含む）。タンパク質製剤の不安定性は、高次ポリマーを形成するタンパク質分子の化学的分解又は凝集、脱グリコシル、糖鎖付加の修飾、酸化又は本発明のFGF-18タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を低下する任意の他の構造修飾により生じ得る。
【００２２】
本明細書中の用語「安定」溶液又は製剤は、タンパク質の分解、修飾、凝集の程度、生物学的活性の損失等がその中で許容できるほど制御され、経時的に許容できないほど増加しない溶液又は製剤である。好ましくは、製剤は室温で、少なくとも12月の期間に亘って少なくとも80%以上のFGF-18活性を有する。本発明の安定化製剤は、FGF-18を含んでなり、好ましくは、少なくとも約12月、18月、より好ましくは、室温で貯蔵される場合に、少なくとも20月、さらにより好ましくは、約24月の有効期間を有する。本発明のFGF-18製剤の安定性のモニタリング方法は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に開示される実施例に記載される方法が含まれる。
【００２３】
本明細書中の用語「緩衝液」は、医薬又は獣医的使用のための製剤中で安全であり且つ製剤に望まれるpH範囲における製剤のpHを維持する又は制御する効果を有することが知られる化合物の溶液を意味する。中程度の酸性pH〜中程度塩基性pHのpH制御に許容される緩衝液は、リン酸塩、酢酸、クエン酸、アルギニン、TRIS、及びヒスチジン緩衝液を含むが、それらに限定されない。「TRIS」は、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3,-プロパンジオール、及び任意の薬理学的に許容されるその塩を意味する。本発明によれば、好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液である。
【００２４】
本明細書中の用語「界面活性物質」は、特に疎水性、油性物質の水溶性を増加する、あるいは、異なる疎水を有する２つの性物質の混和性を増加するために使用できる可溶性化合物を意味する。この理由のため、これらのポリマーは、産業上の利用、化粧品、及び医薬において一般的に使用される。それらはまた、薬物送達適用のためのモデルシステムとして、特に薬物の吸収又は標的組織へのその送達を変更するために使用される。周知の界面活性物質には、ポリソルベート（ポリオキシエチレン誘導体; ツイーン）及びポロクサマー（すなわち、エチレンオキシド及び酸化プロピレンに基づくコポリマー、プルロニック（登録商標）としても知られる）が含まれる。本発明によれば、好ましい界面活性物質はポロクサマー界面活性物質であり、より好ましくは、ポロクサマー188（プルロニック（登録商標）F68）である。
【００２５】
本明細書中の用語「安定化剤」、「安定剤」又は「等張剤」とは、生理的に許容され、製剤に適した安定性／浸透圧を与える化合物である。それは特に、製剤と接触している細胞膜を越えた水の流入を阻害する。凍結乾燥（凍結乾燥）工程の間、安定剤はまた抗凍結剤として効果的である。化合物、例えば、グリセリン等は、斯かる目的に一般的に使用される。他の適した安定化剤は、アミノ酸又はタンパク質（例えば、グリシン又はアルブミン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）、及び糖（例えば、ブドウ糖、マンニトール、スクロース及びラクトース）を含むが、これらに限定されない。本発明によれば、好ましい安定化剤は、糖、より好ましくは、スクロースである。
【００２６】
本明細書中の用語「バイアル」又は「容器」は広く、凍結乾燥形態でFGF-18製剤を保持することに適した容器を意味する。同様に、それは再構成用の溶剤を保持するであろう。本発明に使用できるバイアルの例は、シリンジ、アンプル、薬包、又は注射を介した、好ましくは、関節内注射を介した患者へのFGF-18製剤の送達に適した他の容器を含む。あるいは、FGF-18製剤を保持するバイアル、及び再構成用の溶剤を保持するバイアルは、デュアルチャンバーのシステム（例えばシリンジ又は薬包）の２つのコンパートメントとして提示することができる。関節内投与のための生成物のパッケージングに適するバイアルは、当技術分野で周知であり、且つ認められている。
【００２７】
本明細書中の用語「溶剤」は、水性又は非水性の液体溶剤を意味する。溶剤の選択は、特に薬剤化合物の溶剤への溶解性及び投与方法次第である。水性溶剤は、単に水から構成されても、或いは水及び１又は２以上の混和性溶剤から構成されてもよく、溶解された溶質、例えば、糖、緩衝液、塩又は他の賦形剤等を含んでもよい。より一般的に使用される非水性溶剤は、短鎖有機アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等、短鎖ケトン、例えば、アセトン等、並びにポリアルコール、例えば、グリセロール等である。本発明によれば、好ましい溶剤は、水性溶剤、例えば、水又は生理食塩水溶剤等である。
【００２８】
本明細書中の用語「軟骨疾患」は、外傷に起因する損傷から生じる疾患又は軟骨疾患を含む。本明細書に記載されるFGF-18製剤の投与によって治療できる軟骨疾患の例は、関節炎、例えば、変形性関節症等又は関節リウマチ、及び軟骨損傷が含まれるがそれらに限定されない。
【００２９】
用語「変形性関節症」は、関節炎の最も一般的な形態を意図するために使用される。それは、軟骨の崩壊によって生じ得る。少量の軟骨が破損し、痛みを生じ、骨間の関節中で腫れが生じ得る。時間と共に、軟骨は完全にすり減り、骨は互いにこすり合うこととなる。変形性関節症は、任意の関節に影響し得るが、通常手及び体重を支える関節、例えば、腰、膝、脚、及び脊椎等に関係する。好ましい例では、変形性関節症は、膝変形性関節症又は腰変形性関節症とすることができる。当業者は、当技術分野、特にOARSI評価システムで使用される変形性関節症の分類を十分に認識している（例えば、Custers et aI.、2007）。変形性関節症は、本発明のFGF-18製剤の投与により治療され得る好ましい軟骨疾患の１つである。
【００３０】
本明細書中の用語「軟骨損傷」とは、特に外傷から生じる、軟骨疾患又は軟骨損傷である。軟骨傷害は、外傷機械的破壊の結果として、特にアクシデント又は手術に生じ得る。スポーツによる傷害又はスポーツによる関節組織の摩耗もまた定義内と考えられる。
【００３１】
本発明の詳細な説明
本発明の主な目的は、FGF-18タンパク質、緩衝液、ポロクサマー界面活性物質及び安定化剤としての糖を含んでなる又はから成る安定な凍結乾燥製剤である。好ましい実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝液であり、ポロクサマー界面活性物質はポロクサマー188であり、安定化剤はスクロースである。好ましくは、FGF-18タンパク質は、1）配列番号1の残基28（Glu）〜残基207（Ala）を含んでなる又はから成る配列に相当する、ヒトFGF-18の成熟形態を含んでなる又はから成るポリペプチド、2）配列番号1の残基28（Glu）〜残基196（Lys）を含んでなる又はから成るヒトFGF-18の切断型を含んでなる又はから成るポリペプチド、及び3）配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチド、から成る群から選択される。より好ましくは、FGF-18は、trFGF-18である。
【００３２】
本発明におけるFGF-18の濃度は、好ましくは、ちょうど又は約20〜300 mcg/バイアル、好ましくは、ちょうど又は約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250又は300 mcg/バイアル、より好ましくは、ちょうど又は約20、30、60、100、200又は300 mcg/バイアルである。FGF-18は、製剤化の間に生じ得るタンパク質損失を阻害するために、5%を超えて添加できる。例えば、30 mcg/バイアルのFGF-18濃度に関して、31.5 mcg／バイアルの濃度で化合物を添加できる。
【００３３】
好ましくは、本発明の製剤は、（最初の使用までの）少なくとも12月の期間に亘る凍結乾燥及び／又はパッケージング時に少なくとも80%のFGF-18生物学的活性を有する。FGF-18活性は、以下の「実施例」部分に記載されるように測定することができる。
【００３４】
本発明の好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液であり、pHを6〜8、好ましくは、7〜7.5、及びさらに好ましくは、ちょうど又は約7.2に維持する。
【００３５】
総溶液の緩衝液濃度は、好ましくは、ちょうど又は約5〜500 mMである。好ましい実施形態において、緩衝液の濃度はちょうど又は約10〜100 mMである。好ましくは、緩衝液の濃度はちょうど又は約10 mMである。
【００３６】
本発明の安定化剤は、好ましくは糖である。好ましい糖は、スクロースである。好ましくは、安定化剤の濃度は、ちょうど又は約0.5〜250mg/バイアルであり、より好ましくは、ちょうど又は約1〜100 mg/バイアルであり、好ましくは、ちょうど又は約15〜60mg/バイアルであり、最も好ましくは、ちょうど又は約30 mg/バイアルである。
【００３７】
本発明の界面活性物質は、好ましくは、ポロクサマー界面活性物質であり、特にポロクサマー188（すなわち、プルロニック（登録商標）F68）である。好ましくは、界面活性物質の濃度は、ちょうど又は約0.01〜10 mg/バイアルであり、より好ましくは、ちょうど又は約0.05〜約5 mg/バイアルであり、好ましくは、ちょうど又は約0.1〜約1 mg/バイアルであり、最も好ましくは、ちょうど又は約0.1、0.2又は0.4 mg/バイアルであり、特にちょうど又は約0.2 mg/バイアルである。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明の安定な凍結乾燥製剤は、FGF-18をちょうど又は約20、30、60、100、200又は300 mcg/バイアル、pH 7.2の10 mMリン酸緩衝液、30 mg/バイアルのスクロース、並びに0.2 mg/バイアルのポロクサマー188を含んでなる又はから成る。5%以上が含まれる場合、本発明の凍結乾燥製剤は、FGF-18をちょうど又は約21、31.5、63、105、210又は315 mcg/バイアル含んでなる。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、
1）濃度比1:95000〜1:6000又は約1:95000〜約1:6000、好ましくは、ちょうど又は約1:92000、1:61000、1:31000、1:18450、1:9200又は1:6100のFGF-18:スクロース、
2）濃度比1:25〜6:10又は約1:25〜6:10、好ましくは、ちょうど又は約1:25、5:83、5:42、1:5、2:5又は6:10のFGF-18:ポロクサマー188、
3）モル比1:10500〜1:700又は約1:10500〜約〜1:700、好ましくは、ちょうど又は約1:10500、1:7000、1:3500、1:2100、1:1050又は1:700、のpH 7.2のFGF-18:リン酸緩衝液、を含んでなる安定な凍結乾燥製剤を目的とし、
FGF-18タンパク質は好ましくは、
1）配列番号1のアミノ酸残基28（Glu）〜207（Ala）を含んでなる又はから成るポリペプチド、2）配列番号1のアミノ酸残基28（Glu）〜196（Lys）を含んでなる又はから成るポリペプチド、又は3）配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチド、から成る群から選択される。より好ましくは、FGF-18タンパク質は、配列番号1のアミノ酸残基28（Glu）〜207（AIa）を含んでなる又はから成る。
【００４０】
さらに他の実施形態において、本発明は、
1）モル比1:90000〜1:5000又は約1:90000〜1:5000、好ましくは、ちょうど又は約1:87000、1:58000、1:29000、1:17400、1:8700又は1:5800のFGF-18:スクロース、
2）モル比5:120〜5:8又は約5:120〜5:8、好ましくは、ちょうど又は約5:118、5:79、10:79、10:47、5:12又は5:8のFGF-18:ポロクサマー188、
3）モル比1:10000〜1:700又は約1:10000〜1:700、好ましくは、ちょうど又は約1:10000、1:6600、1:3300、1:2000、1:1000又は1:700のpH 7.2のFGF-18:リン酸緩衝液、
を含んでなる安定な凍結乾燥製剤を目的とし、FGF-18タンパク質は、好ましくは、
1）配列番号1のアミノ酸残基28（Glu）-207（Ala）を含んでなる又はから成るポリペプチド、2）配列番号1のアミノ酸残基28（Glu）-196（Lys）を含んでなる又はから成るポリペプチド、又は3）配列番号2を含んでなる又はから成るポリペプチド、から成る群から選択される。より好ましくは、FGF-18タンパク質は、配列番号1のアミノ酸残基28（Glu）-196（Lys）を含んでなる又はから成る。さらに好ましくは、FGF-18タンパク質は、配列番号2を含んでなる又はから成る。特に実施形態において、FGF-18タンパク質はtrFGF-18である。
【００４１】
本発明はさらに、FGF-18の上記の安定な凍結乾燥製剤のいずれかを製造するための方法を供し、当該方法は、
1）緩衝液、ポロクサマー界面活性物質及び安定化剤としての糖と、FGF-18の混合物を形成する工程、及び
2）混合物を凍結乾燥へ供する工程、
を含んでなる。
【００４２】
工程1及び2は、通常の方法を使用して行われる。一例としては、適した安定な製剤を調製するために、所定の量のFGF-18、例えば、trFGF-18等を、pHをちょうど又は約7.2に維持するリン酸緩衝液、ポロクサマー188及びスクロースと混合する。これらの化合物（すなわち、FGF-18、緩衝液、界面活性物質及び安定化剤）のそれぞれは、上記濃度、pH、及び／又は比に従って使用できる。生じる混合物は凍結乾燥され、続いてバイアルに分注される。当業者はこの方法のバリエーションを認識できるであろう。
【００４３】
本発明はまた、医薬又は獣医的使用のための製品であって、
1）上記の安定な凍結乾燥製剤のいずれかを含んでなる第一の容器であって、製剤がFGF-18、緩衝液、ポロクサマー界面活性物質、安定化剤としての糖を含んでなる又はから成る、第一の容器、及び
2）再構成のための溶剤を含んでなる第二の容器、
を含んでなる製品を供する。
【００４４】
一例として、第一の容器が、所定量のFGF-18、例えば、trFGF-18等、pHをちょうど又は約7.2に維持するリン酸緩衝液、ポロクサマー188及びスクロースを含んでなる又はから成る安定な凍結乾燥製剤を含んでなり、第二の容器が生理食塩水（注射のための0.9% w/v 塩化ナトリウム）を含んでなる。これらの化合物（すなわち、FGF-18、緩衝液、界面活性物質及び安定化剤）のそれぞれは、上記の濃度、pH、及び／又は比に従って使用できる。好ましくは、FGF-18製剤を保持する容器及び再構成用の溶剤を保持する容器は、デュアルチャンバーのシステムの２つのコンパートメント（例えば、シリンジ又は薬包）に相当する。
【００４５】
FGF-18（第一の容器）の凍結乾燥製剤を溶剤（第二の容器）に再構成するための説明書が供され、パッケージング原料が記載される。
【００４６】
本発明の凍結乾燥製剤は、少なくとも約12〜約24月間保存することができる。好ましい貯蔵条件下で、最初の使用まで、室温で（25℃又は約25℃）製剤を明るい光から隔離する（好ましくは、暗室で）。
【００４７】
本発明の安定な凍結乾燥製剤は、好ましくは、無菌条件下で、使用前に、すなわち、注射前に、溶剤、例えば、水又は生理食塩水（例えば、注射用の0.9% w/v塩化ナトリウム）等で再構成する必要がある。再構成後に、注入される体積は、好ましくは、0.5 mL〜5 mL、より好ましくは、0.5、1又は2 mLである。FGF-18製剤は、好ましくは、再構成の１時間内に投与されるべきである。
【００４８】
本発明は、特に頓用の、医薬又は獣医的使用に適した、FGF-18の安定な凍結乾燥製剤を供する。
【００４９】
本発明のFGF-18を含んでなる安定な凍結乾燥製剤は、軟骨修復を改善する又は軟骨疾患、例えば、変形性関節症又は軟骨傷害等の治療のために、投与用に再構成後に使用できる。
【００５０】
これらの安定な凍結乾燥製剤は、再構成後に、注射における使用に適し、代替の送達システムである。特に好ましい実施形態において、本発明の製剤は、関節内注射用である。それらは、再構成後に、関節の滑液中に又は直接異常に直接注射によって投与できる。本発明の好ましい実施形態において、関節内投与は、腰、膝、肘、手首、足首、脊椎、脚、指、つま先、手、肩、肋骨、肩甲骨、大腿、すね、かかと関節から選択される関節において、且つ脊椎の骨点（bony point）に沿って行われる。さらに他の好ましい実施形態において、関節内投与は、腰又は膝の関節において行われる。
【００５１】
本発明のFGF-18製剤は、安定性を改善し、室温（ちょうど又は約25℃）又は2-8 ℃（以下の実施例を参照）、好ましくは、室温で容易に貯蔵できる。実際、発明者は、FGF-18（例えば、trFGF-18）、pH 7.2の10 mMリン酸緩衝液、30mg/バイアルのスクロース及び0.2 mg/バイアルのポロクサマー188を含んでなる凍結乾燥製剤が、特に室温で貯蔵される場合に、経時で安定であることを今回発見した。斯かる製剤は、活性成分、すなわち、FGF-18の喪失を最少化する。製剤が酸化及びタンパク質凝集の形成により耐性を示すこともまた分かった。
【００５２】
以下の実施例は、製剤の調製及び本発明の組成をさらに説明するために供する。本発明の範囲は、以下の実施例からのみ成ると理解すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、凍結乾燥工程前の、界面活性物質（ポロクサマー188）のFGF-18回収への効果を示す。リン酸緩衝液pH 7.2中の10 mg／ml（+ 5%超過）FGF-18を含むプレ製剤を使用し、界面活性物質の濃度を変えた（0〜0.2 %）。タンパク質含有量を、濾過前（BF）及び濾過後（T=0）にプレ製剤のそれぞれに関して評価した。
【００５４】
配列の記載
配列番号1: 天然のヒトFGF-18のアミノ酸配列。
配列番号2: 組み換え切断FGF-18（trFGF-18）のアミノ酸配列。
【実施例】
【００５５】
材料
本実施例の組み換え切断FGF-18（trFGF-18）は、国際出願第2006/063362号に記載される技術に従って、大腸菌における発現によって調製した。以下の実施例において、trFGF-18及びFGF-18は、互換的に使用する。
【００５６】
実施例で使用した他の物質は、次の通りである。
- スクロース（1.07653、Merck; 分子量: 342.30 g/Mol）
-リン酸二水素ナトリウム一水和物（1.06345、Merck）
- リン酸二水和物二ナトリウム水素（1.06586、Merck）
- ポロクサマー188（Lutrol F 68 DAC、USP/NF、Basf; 分子量: 8400 g/Mol）
- 注射用の水、
- 生理食塩水（注射用0.9% w/v 塩化ナトリウム）
- タンパク質含有量のためのモノクローナル抗体抗FGF-18クローン#F5A2（RBMから供給）
- BAF3-FGFR3c細胞（ワシントン大学）
- Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640ベースの選択培地（Invitrogen）
- ATPlite 1 step 発光アッセイシステム（Perkin Elmer）
- ヘパリンH3149（Sigma）
【００５７】
装置
- AMICON ULTRA-4 10,000カットオフ（UFC 8012024、Amicon）
- ビアコア 2000（ビアコア）
- CO2 インキュベーター（Heraeus）
- カラムTSK2000SWxI、7.8 x 300 mm、5μ（TosoHaas、code 08540）
- Guard column TSKG2000（Hichrom、code 8543）
- HPLCシステム（水）
- ルミノメーター（Perkin Elmer）
- メンブランフィルター0.22 pm（Durapore type GWVP、Millipore）
- Stabileoソフトウェア（ver. 1.1; Microsoft（登録商標）Excel Visual Basic（登録商標）のパッケージ）
- GraphPadソフトウェア（Prism）
- ステンレス鋼ホルダー22 mL及び220 mLの容量（Sartorius）
- Zorbax 300SB-C18（150X4.6cm）カラム
- DIN2R（3 ml）ガラスバイアル（Nuova OMPI）
- コーティングゴム製ストッパー（S2F452、D777-1、B2-40、West Pharmaceutical）
- ゴム製ストッパー（コード1779、W1816 grey、Pharma-Gummi）
【００５８】
方法
製剤への異なるアッセイ
標準方法を、以下に関して使用した。
- SE-HPLC、
- RP-HPLC、
- 残留水分、
- pH、
- 浸透圧（時間0、のみ）、
- SDS-PAGE/SS、及び
- ペプチドマッピング／UPLC（酸化型）。
【００５９】
タンパク質含有量
異なる製剤中のタンパク質、すなわち、trFGF-18の定量化を、ビアコアによって行った。trFGF-18を含む試料（25pL）を（10 mg/mLのBSAの存在下で適切に希釈）、続いて25℃、5pL/minで、予めモノクローナル抗体抗FGF-18クローンF5A2でコーティングしたセンサー表面上で、続いて再生緩衝液としての5pLの10mMグリシンpH 2.0で試験した。125〜2,000 ng/mLの範囲の標準試料（IRS FGF-18 No. 051230）を、各分析セッションに流した。結果を共鳴単位（RU）として収集し、対数変換後のデータで、二次アルゴリズムを使用してあてはめた標準曲線から、各試料のFGF-18レベルを推定した。
【００６０】
生物検定
FGF-18の生物学的活性を、FGF受容体3c（FGFR3c）を安定に遺伝子導入したBaF3細胞系統を使用して、インビトロ（in-vitro）生物検定によって増殖活性として測定する。BaF3細胞発現FGFR3cは、FGF-18刺激下で増殖する。
【００６１】
BaF3/FGFR3c細胞を、増殖因子としてのr-hIL-3の存在下でRPMI 1640ベースの選択培地に培養する。FGF-18の増殖性効果を特異的に試験するために、細胞はIL-3由来である必要がある。よって、アッセイ前に細胞を、r-hIL-3の不存在下で26時間37℃、5% CO2で培養する。
【００６２】
標準試料を、0.002 U/mL〜177.5 U/mLの濃度範囲でアッセイ媒体において5倍に連続希釈する。IL-3由来のBAF3/FGFR3c細胞（20,000細胞/ウェル）を、1μg/mLヘパリン、及び10% Newborn Calf Serumの存在下で、FGF-18と共に37℃、5% CO2でインキュベートし、細胞増殖を48時間後に、ホタルルシフェラーゼに基づく「ATPlite 1 step」発光アッセイ、ATPモニタリングシステムで評価する。
【００６３】
広域用量反応曲線モデルを適用して、試料の効力を測定する。斯かるモデルを使用して、標準と試料の全用量反応曲線を、FGF-18濃度の対数に対するcps（すなわち、カウント毎秒）値を報告する可変勾配（4PL）アルゴリズムを有するS字形用量反応曲線で合わせる。各曲線に関して、EC50は、GraphPadソフトウェアによって自動的に算出される。試料の効力を、参照製剤のEC50及び周知試料のEC50との間の比（効力比）に基づいて算出する。FGF-18の効力を、U/mLとして表す。
【００６４】
実施例1: trFGF-18の凍結乾燥製剤
FGF-18凍結乾燥製剤の組成を、以下の表1に供する。
表1: FGF-18凍結乾燥製剤に関する組成（*）
【００６５】
【表１】
0005981538.tif 000002
【００６６】
（*）1mL WFI（注射用水）での再構成。
【００６７】
凍結乾燥製剤を以下の通り製造した。スクロース及びポロクサマー188を、リン酸緩衝液中に溶解した。続いて、必要量の薬物物質（trFGF-18）を添加し、pHチェックし、溶液を最終体積とした。続いて、濾過比約20 cc/cm2又は約50 cc/cm2を維持しながら、0.22 pmの膜（Durapore（登録商標））を介して窒素圧下で溶液を濾過した。
【００６８】
続いて、最終溶液を手動で無菌条件下でガラス製バイアルに充填し（0.5 mL/バイアル）、次のサイクルで凍結乾燥した。
【００６９】
【表２】
0005981538.tif 000003
【００７０】
凍結乾燥製剤はいつでもすぐに、溶剤、例えば、注射用の水又は生理食塩水等で再構成できる。
【００７１】
実施例2: FGF-18製剤の予備安定性試験
実施例2.1: さらに試験する凍結乾燥プレ製剤を特定するために、加速安定性条件（2〜8℃、25℃及び40℃）を使用した（データの提示なし）。
【００７２】
最良の候補製剤を特定するために、様々な予備凍結乾燥製剤を調製した。斯かる予備試験の枠組みにおいて、リン酸塩及びヒスチジン緩衝液を含む様々な緩衝液を評価した。様々な濃度のスクロース及びポロクサマー188もまた、試験した。プレ候補製剤を、純度（SE-HPLC及びRP-HPLCによって）、タンパク質含有量（ビアコアによって）、生物学的活性（インビトロ（in-vitro）生物検定）、残留水分、pH及び浸透圧に関して試験した。支持的安定性データもまた、SDS-PAGElSS（純度）及びペプチドマッピング/UPLC（酸化型）によって得た。
【００７３】
実施例2.2（予備製剤に関する安定性データ; データの提示なし）: 3〜4週の保存に亘ってSE-HPLCにより予備凍結乾燥製剤に関して収集した安定性データは、pH 6のヒスチジン緩衝液と比較して非常に高純度レベル（すなわち、モノマーのより高い%）が観察されたので、リン酸緩衝液がpH 7.2で好ましいに違いない（表2）ということを示唆する。スクロースの量（15 mcg/バイアル対30 mcg/バイアル）はまた、凝集に対するFGF-18の安定化において役割を果たし、全体的に高いモノマー回収が、30 mcg/バイアルのスクロースで観察された（25℃及び5℃で貯蔵）。さらに、界面活性物質（すなわち、ポロクサマー188）が増加されるので、高タンパク質回収が濾過工程後（凍結乾燥工程前）に観察され、0.2 mg/バイアルが最も良好な結果である（図1）。
【００７４】
このプレ製剤段階からの結果に基づき、さらなる調査のために６つの凍結乾燥製剤を調製した（表1由来の製剤1〜6; 候補製剤としても言及する）。
【００７５】
実施例3: FGF-18凍結乾燥製剤の安定性試験
表1の候補凍結乾燥製剤において、２週間〜２４月間の安定性データを収集した。
【００７６】
実施例3.1（SE-HPLCによる純度）: SE-HPLCによって得た安定性データ上のStabileoにより行った統計評価に関する結果を、表3に要約する。異なる温度での貯蔵において（40℃で最長6月、及び25℃で最長24月）、いずれの凍結乾燥候補製剤に関しても、純度（モノマー含有量）における有意な喪失は検出されなかった。
【００７７】
実施例3.2（SDS-PAGE/SSによる純度）: SDS-PAGEによって得た結果から、試験した全温度における貯蔵において（40℃で少なくとも6月、及び25℃で最長18月）、いずれの凍結乾燥製剤に関しても純度レベルが全体的に99%以上であることを確認した。結果を表4に供する。
【００７８】
実施例3.3（RP-HPLCによる純度）: RP-HPLCによって得られた安定性データ上での、Stabileoによって行った統計評価に関する結果を表5に要約する: 異なる温度での貯蔵において（40℃で最長6月及び25℃で最長18月）、いずれの凍結乾燥候補製剤に関しても、純度（% メインピーク）において有意な損失は検出されなかった。よって、本発明のFGF-18を製剤化することは、出発物質（純粋）FGF-18と比較して純度の損失を生じない。出発物質（製剤前）は完全には純粋ではなかった（RP-HPLCによって不純物は完全には分離されなかった）ので、製剤前のピークは100%でなかったが、例えば、FD-30の77.5%及びFD-300の87.4%に存在し、T=0でのピークは、例えば、FD-30の76.8%及びFD-300の87.7%に存在したことに留意されたい。
【００７９】
実施例3.4（タンパク質含有量アッセイ）: ビアコアにより測定したタンパク質濃度の結果を、表6及び7に要約する。主たる損失は0.22 pm膜の濾過で検出されず、すなわち、ほぼ完全なタンパク質回収が観察された（表6の「AF」カラム参照）。1 mL WFIでの凍結乾燥生成物の再構成において（表6の「T0」カラム参照）、低い回収が得られ、これはガラス製バイアル上へのタンパク質の吸着を説明できる（再構成において、続いてタンパク質溶液を、より大きな表面へ曝露する）。
【００８０】
安定性の観点から、表7に示すように、試験した全温度、全強度に関して、ビアコアによってタンパク質含有量における損失は検出されなかった（40℃で最長6月及び25℃で最長24月）。
【００８１】
実施例3.5（生物学的活性）: 貯蔵における凍結乾燥候補のすべてに関する生物学的活性の結果（単位：U/容器）を、表8に供する。例えば、貯蔵において、最も高い強度（trFGF-18の300 mcg/バイアル）に関して観察された生物学的活性は、25℃及び40℃双方で経時で安定であった。最も低い強度FD-20ではより可変であることが観察された。他の試験のいずれによっても生成物安定性において変化が検出されなかったので、この観察されたFD-20での減少は、25℃での貯蔵の39、52、78及び104週間後に確認しなければならない。
【００８２】
実施例3.6（酸化型）: 貯蔵において全強度に関して検出された酸化型のレベルを、表9に要約する: 酸化を受け得るMet残基において、結果は、全強度及び評価したいずれの温度においても、Met 1が酸化の影響をより受けやすいことを示唆する。
【００８３】
実施例3.7（残留水分）: 全強度に関して、貯蔵において残留水分において有意な増加は生じなかった; 約1% 以下の残留水分値を、安定性試験を介して全体的に測定した（表10）（40℃で最長6月及び25℃で最長24月）。
【００８４】
実施例3.8（pHバリエーション）: 全強度に関して試験したいずれの温度でも貯蔵において、有意なpH変動は観察されなかった（表11）（40℃で最長6月及び25℃で最長24月）。
【００８５】
実施例3.9（浸透圧バリエーション）: 全強度に関するいずれの試験温度でも貯蔵において、有意な浸透圧変動は観察されなかった（表12）（40℃で最長6月及び25℃で最長24月）。
【００８６】
表
表2: SE-HPLCにより分析した、貯蔵での凍結乾燥プレ製剤（FGF-18の10 mcg/バイアル及びF68の0.2 mg/バイアル）におけるFGF-18モノマーのパーセンテージ（%）。
【００８７】
【表３】
0005981538.tif 000004
【００８８】
表3: SE-HPLCにより分析した、貯蔵における凍結乾燥候補製剤中のFGF-18モノマーのパーセンテージ（%）。
【００８９】
【表４】
0005981538.tif 000005
【００９０】
表4: SDS-Pageによって分析した、貯蔵におけるFGF-18凍結乾燥候補製剤の純度（%）。
【００９１】
【表５】
0005981538.tif 000006
【００９２】
表5: RP-HPLCによって分析した、貯蔵におけるFGF-18凍結乾燥候補製剤の純度
【００９３】
【表６】
0005981538.tif 000007
【００９４】
（ａ）製剤化前のピークは、87.4%に存在した。
（ｂ）製剤化前のピークは、77.5%に存在した。
【００９５】
表6: ビアコアにより分析した、濾過／充填におけるFGF-18回収。
【００９６】
【表７】
0005981538.tif 000008
【００９７】
BF=濾過前、AF=濾過後、T0=バイアル中
* 1mL WFIでの再構成後、元のバッチは0.5mLであった。
** 回収の%; 製剤BF中のFGF-18タンパク質の量と比較。
【００９８】
表7: ビアコアによるアッセイに基づく、貯蔵におけるFGF-18回収（凍結乾燥候補製剤中）。
【００９９】
【表８】
0005981538.tif 000009
【０１００】
表8: 貯蔵における、生物検定（U/容器）での、凍結乾燥候補製剤中のtrFGF-18の生物学的活性
【０１０１】
【表９】
0005981538.tif 000010
【０１０２】
表9: 貯蔵における、凍結乾燥候補製剤中のFGF-18の酸化形態（%）
【０１０３】
【表１０】
0005981538.tif 000011
【０１０４】
表10: 貯蔵における、FGF-18凍結乾燥候補製剤中の残留水分（%）
【０１０５】
【表１１】
0005981538.tif 000012
【０１０６】
表11: 貯蔵における、FGF-18凍結乾燥候補製剤のpH値
【０１０７】
【表１２】
0005981538.tif 000013
【０１０８】
表12: 貯蔵における、FGF-18凍結乾燥候補製剤の浸透圧
【０１０９】
【表１３】
0005981538.tif 000014
【０１１０】
参考文献
1. Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320
2. Shimoaka et al., 2002, JBC 277（9）7493-7500
3. 国際公開第2008023063号
4. 国際公開第2004032849号
5. 国際公開第00/21548号
6. 国際公開第2008/121563号
7. 国際公開第92/01442号
8. 国際公開第01/39788号
9. 国際公開第98/16644号
10. 国際公開第2006/063362号
11. Custers et al., 2007, Osteoarthritis and Cartilage, 15:1241-1248
【図１】
0005981538.tif 000015
【配列表】
0005981538000001.app