(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コケモモ由来物、マンゴスチン由来物、オウゴン由来物、イノシトール及びイノシトールリン酸からなる群より選択される１又は２以上を有効成分として含んでなる血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）産生亢進剤。
【請求項２】
イノシトール又はイノシトールリン酸を含むとともに、酵母エキスをさらに含んでなる、請求項１に記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤。
【請求項３】
イノシトール又はイノシトールリン酸がコメヌカ由来である、請求項１又は２に記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）産生亢進剤、並びに、当該ＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤を含んでなる間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤、及び真皮再生化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、複数の細胞に分化した細胞を産生する多分化能と、細胞分裂によりその細胞と同じ細胞を産生する自己複製能という２つの性質を併せ持つ細胞である。受精卵の初期の発生段階である胚に由来する幹細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と称される。ヒトＥＳ細胞は再生医療に使用することが期待されているものの、受精卵を利用するという倫理上の問題から、新たなヒトＥＳ細胞の作成は認められていない。【０００３】
近年、ＥＳ細胞類似の性質を持つ細胞として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）にも注目が集まっている。しかしながら、ｉＰＳ細胞の作成には細胞の癌化、作成効率等の観点で多くの問題がある。一方、特定の組織に分化する能力を有する体性幹細胞は、患者自身の身体の組織、例えば骨髄から得られるため、胚性幹細胞のような倫理上の問題はない。【０００４】
皮膚では表皮基底層に表皮幹細胞（非特許文献１）が存在することが良く知られており、また毛包のバルジ領域と呼ばれる領域には、毛包上皮幹細胞（非特許文献２）や皮膚色素幹細胞（非特許文献３）が存在することが報告されている。一方、真皮にはコラーゲンを主体とする繊維成分の中に、細長い紡錘形をした線維芽細胞が存在しているが、真皮の線維芽細胞に幹細胞が存在するかは明らかにされていない。また、真皮には脂肪、グリア、軟骨、筋肉など複数の細胞系列に分化する皮膚由来前駆細胞（skin-derived precursors：ＳＫＰ）が存在すること（非特許文献４）は知られているものの、真皮線維芽細胞とＳＫＰの関連は明らかではない。【０００５】
線維芽細胞の前駆細胞として骨髄から分離された間葉系幹細胞（非特許文献５）は、間葉系に属するさまざまな細胞（骨細胞、筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）に分化することから、骨や血管、筋の再構築など再生医療への応用が期待されている。最近では、間葉系組織を持つ組織の多くに存在する可能性が明らかになってきており、脂肪や臍帯血、胎盤等からも間葉系幹細胞が単離されている（非特許文献６〜８）。【０００６】
近年の知見によれば、間葉系幹細胞は、血管周皮細胞（ぺリサイト）として全身の血管に存在し、血管安定化や組織恒常性維持に働くことが知られている（非特許文献９及び１０）。
また、組織損傷部位又はその近傍において血管が破壊されると、血管周皮細胞（ぺリサイト）である間葉系幹細胞は血管から離れて増殖し、失われた細胞を供給するとともに（非特許文献１１〜１４）、生物活性を持つ因子を放出して組織を保護し（非特許文献１５〜１９）、損傷した組織の修復・再生に作用する。これらの分泌因子は、血管形成や抗アポトーシスの作用のほか、免疫を強力に抑制する作用も有し（非特許文献２１及び２２）、Ｔ細胞やＢ細胞を介した損傷組織の破壊を抑える（非特許文献９及び２２）ことも報告されている。
更に、間葉系幹細胞は、抗線維化の作用（非特許文献２３及び２４）や、多発性硬化症や糖尿病に対する効果（非特許文献９）も示すことが知られている。【０００７】
一方で、慢性炎症が、各種疾患（例えばメタボリックシンドローム、動脈硬化性疾患、癌、神経変性疾患、自己免疫疾患等）に共通する基盤病態であることが明らかになりつつある（非特許文献２５）。例えば、慢性炎症によって内皮細胞機能障害やインスリン抵抗性が誘導され、糖尿病や動脈硬化性疾患等の種々の疾患の原因となることが報告されている（非特許文献２６）。更には、肥満の脂肪組織そのものが、炎症性へと変化をきたすことも明らかになってきた（非特許文献２７〜２９）。慢性炎症は血管周囲に生じるため、慢性炎症においても、血管周皮細胞（ぺリサイト）である間葉系幹細胞と血管との相互作用の破綻が生じていると考えられる。【０００８】
以上の知見から、間葉系幹細胞の産生促進や安定化を図ることができれば、血管安定化、組織恒常性維持、損傷組織の修復・再生、抗線維化、多発性硬化症や糖尿病等の各種疾患の予防・治療、メタボリックシンドローム等の慢性炎症に基づく各種状態の予防・改善等、各種の用途に極めて有効であると考えられる。【０００９】
本発明者等は、真皮にも間葉系幹細胞が存在することを報告し、真皮から効率よく間葉系幹細胞を単離する方法を確立した（特願２００９−２１３２９１）。上述の間葉系幹細胞の作用を考慮すれば、真皮における間葉系幹細胞の安定化や産生亢進を図ることにより、真皮の状態改善や再生等にも有効であると考えられる。【００１０】
更に、本発明者等は、真皮や皮下脂肪において間葉系幹細胞の存在する部位をより詳細に明らかにするとともに、間葉系幹細胞の局在化に血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）が関与していることを見出し、更には、血管内皮細胞でのＰＤＧＦ−ＢＢの産生亢進が間葉系幹細胞の産生亢進及び安定化に寄与することを明らかにした（特願２０１０−２０９７０５）。【００１１】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等といった間葉系幹細胞の遊走及び増殖等の調節に関与する増殖因子であり、上皮細胞や内皮細胞等の様々な細胞によって産生される。ＰＤＧＦにはＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも４種類が存在するが、Ａ鎖及びＢ鎖はジスルフィド結合を形成することによりホモあるいはヘテロ２量体構造をとり３種類のアイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）を有している。ＰＤＧＦはチロシンキナーゼ関連型であるＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）を介してその生理作用を発現することが知られている。ＰＤＧＦ−Ｂの遺伝子は公知であり、遺伝子クローニングされている（非特許文献３０）。【００１２】
斯かるＰＤＧＦ−ＢＢの産生亢進に有効な成分を見出すことができれば、これを用いて間葉系幹細胞の産生促進や幹細胞の安定化を図ることができ、ひいては上記の各種用途等に有効に使用できるものと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Watt FM, J Dermatol Sci, 28:173-180, 2002
【非特許文献２】Cotsarelis G et al., Cell, 57:201-209, 1989
【非特許文献３】Nishimura EK et al., Nature, 416:854-860, 2002
【非特許文献４】Wong CE al., J Cell Biol, 175:1005-1015, 2006
【非特許文献５】Pittenger MF et al., Science, 284:143-147, 1999
【非特許文献６】Park KW et al., Cell Metab, 8:454-457, 2008
【非特許文献７】Flynn A et al., Cytotherapy, 9:717-726, 2007
【非特許文献８】Igura K et al., Cytotherapy, 6:543-553, 2004
【非特許文献９】da Silva Meirelles L et al., Stem Cells, 2008 Sep;26(9):2287-2299
【非特許文献１０】da Silva Meirelles L et al., J Cell Sci, 2006;119:2204-2213
【非特許文献１１】Dai WD et al., Circulation, 2005;112:214-223
【非特許文献１２】Fazel S et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2005;130:1310-1318
【非特許文献１３】Noiseux N et al., Mol Ther, 2006;14:840-850
【非特許文献１４】Zhao LR et al., Exp Neurol, 2002;174:11-20
【非特許文献１５】Gnecchi M et al., Nat Med, 2005; 11:367-368
【非特許文献１６】Kinnaird T et al., Circ Res, 2004;94:678-685
【非特許文献１７】Kinnaird T et al., Circulation, 2004;109:1543-1549
【非特許文献１８】Tang YL et al., Ann Thorac Surg, 2005;80:229-237
【非特許文献１９】Zhang M et al., FASEB J, 2007;21:3197-3207
【非特許文献２０】Le Blanc K et al., J Intern Med, 2007;262:509-525
【非特許文献２１】Uccelli A et al., Trends Immunol, 2007;28:219-226
【非特許文献２２】Caplan AI et al., J Cell Biochem, 2006;98:1076-1084
【非特許文献２３】Fang BJ et al., Transplantation, 2004;78:83-88
【非特許文献２４】Ortiz LA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2003;100:8407-841
【非特許文献２５】小川佳宏, 実験医学, 28:1680-1687, 2010
【非特許文献２６】Medzhitov R, Nature, 454:428-35, 2008
【非特許文献２７】Hotamisligil GS, Nature, 444(7121):860-7, 2006
【非特許文献２８】Wellen KE et al., J Clin Invest, 115(5):1111-9, 2005
【非特許文献２９】菅波孝祥他, 実験医学, 28:1717-1723, 2010
【非特許文献３０】Dalla-Favera R et al., Nature, 292:31-35, 1981
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記背景に鑑みてなされたもので、その課題は、ＰＤＧＦ−ＢＢの産生亢進に有効な剤を提供すると共に、これを用いて、間葉系幹細胞の産生促進及び／又はその安定化に有効な剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、多種多様な素材について検討を重ね、ＰＤＧＦ−ＢＢの産生を亢進させる薬剤をスクリーニングした結果、コケモモ、マンゴスチン、及びオウゴンの各植物由来物、並びにイノシトール及びイノシトールリン酸が、各々顕著なＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進作用を示すことを見出し、本発明を為すに至った。【００１６】
したがって、本願は下記の発明を包含する：
［１］コケモモ由来物、マンゴスチン由来物、オウゴン由来物、イノシトール及びイノシトールリン酸から選択される１又は２以上の成分を有効成分として含んでなる血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）産生亢進剤。
［２］イノシトールを含むとともに、酵母エキスをさらに含んでなる、［１］に記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤。
［３］イノシトールがコメヌカ由来のイノシトールリン酸である、［１］又は［２］に記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤。
［４］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤を含んでなる、間葉系幹細胞産生促進剤。
［５］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤を含んでなる、幹細胞安定化剤。
［６］［１］〜［３］のいずれか１つに記載のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤を含んでなる、真皮再生化剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＰＤＧＦ−ＢＢの産生亢進に有効な剤が提供されるとともに、これを用いることにより、間葉系幹細胞の産生促進や安定化等に有効な剤も提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［コケモモ由来物］
コケモモ（学名：Vaccinium vitis-idaea L.）はツツジ科スノキ属の植物である。本発明ではコケモモ由来物として、コケモモの花、花穂、果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を粉砕後搾取したもの、又は粉砕後に溶媒等で抽出したもの、又は粉砕後に酵素処理や機械的処理等の処理により分解したものを用いることができる。
【００１９】
コケモモを抽出する場合、抽出溶媒としては抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。
抽出は常温で行ってもよいが、加熱下で（例えば温水や熱水等の加熱した溶媒を用いて）行ってもよい。
上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また、公知の分配法（例えば水／酢酸エチル等を用いた分配法）により抽出した抽出物等も用いられる。
【００２０】
コケモモを分解する場合、細胞間質が選択的に分解され、且つ細胞形態は維持されるような「単細胞化処理」を行ってもよい。例えば特開２００２−１９３７３４に記載の方法を参考にすることができる。具体的には、植物を、酵素分解や機械的分解等により、細胞壁をほとんど分解せずに細胞間質を選択的に分解又は破壊して、対象物を、細胞形態が維持されたままの状態で細胞単位に分解し、粥状、液体組成物又は凍結乾燥品とする処理をいう。かかる選択的な分解を行うために、酵素処理を用いることができる。例えば、Rizopus属やAspergillus属等の酵素原料から、通常公知の方法により単離又は単離・精製したものを用いることができ、また市販品を用いることもできる。これらの単細胞化酵素を、コケモモに作用させる場合には、用いる酵素の至適温度及び至適ｐＨ等の至適条件で作用させ、かつ必要最少量を用いることが好ましい。ここで、単細胞化酵素の至適温度は３０〜４５℃であり、至適ｐＨは４〜６である。また、酵素反応後に残渣となる部分は、例えば、２０メッシュ程度の篩を用いて除去することにより、本外用組成物に含有させ得るコケモモ由来物とすることができる。
【００２１】
さらに、上記の単細胞化植物の懸濁液の他に、この懸濁液を、遠心分離等の方法により脱水して得られる単細胞ペースト又はその乾燥品を本発明に用いることができる。
【００２２】
コケモモは、これまで、単細胞化処理したコケモモを含有する外用剤（特開２００２−１９３７３４）、殺菌、抗菌及びふけ防止用化粧料（特開昭６１−２３８７１９）、エラスターゼ活性阻害剤（特開２００２−３６３０８８）、活性酵素消去剤（特開２００２−３６３０２７）、メラニン生成抑制剤（特開２００２−３６３０５７）、過酸化脂質生成抑制剤（特開２００２−３６３０８９）、コラゲナーゼ活性阻害剤（特開２００３−１２５３１）、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤（特開２００３−７３２８７）、メタロプロテアーゼ発現阻害剤（特開２００２-１９３７３８）、抗グリゲーション剤（特表２００４−５０５００７）、及び皮膚肥厚、皮膚硬化等の皮膚障害に対する抗皮膚障害剤（特開２００５−３０６８５０）として用いられた例があるが、コケモモ由来物にＰＤＧＦ−ＢＢ産生促進作用、間葉系幹細胞産生促進作用、幹細胞安定化作用、及び真皮安定化作用があることはこれまで全く知られておらず、これらの作用は本発明者らによって今回初めて見出された。
【００２３】
［マンゴスチン由来物］
マンゴスチン（学名：Garcinia mangostana）はオトギリソウ科フクギ属の植物である。本発明ではマンゴスチン由来物として、マンゴスチンの果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を粉砕後搾取したもの、又は粉砕後に溶媒等で抽出したものを用いることができる。
【００２４】
マンゴスチンを抽出する場合、抽出溶媒としては抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチルエステル等の各種有機溶媒により抽出し、溶媒を留去することにより得ることができる。
抽出は常温で行ってもよいが、加熱下で（例えば温水や熱水等の加熱した溶媒を用いて）行ってもよい。
また、溶媒に酵素を加えて抽出処理を行ってもよい。酵素を加えることによって、果実の細胞組織を崩壊させることができ、これにより抽出効率をより高めることができる。酵素としては、細胞組織崩壊酵素を用いることが好ましい。このような酵素としては、例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、α−アミラーゼ、フィターゼが挙げられる。これらの酵素は１種類を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
上記抽出溶媒を用いて得られる抽出液をそのまま使用することができるが、抽出溶媒を留去し、必要により乾燥した後に含有させてもよい。
【００２５】
マンゴスチンは、これまで、紫外線吸収剤（特開平９−８７１５５）、ＭＭＰｓ阻害剤（特開２００３−２５２７４５）、線維芽細胞賦活剤（特開２００６−２４９０５１）として用いられた例があり、またキサントン誘導体の製造及びコラーゲン産生作用を有する（特開２００９−８４１６９）ことが知られているが、マンゴスチン由来物にＰＤＧＦ−ＢＢ産生促進作用、間葉系幹細胞産生促進作用、幹細胞安定化作用、及び真皮安定化作用があることはこれまで全く知られておらず、これらの作用は本発明者らによって今回初めて見出された。
【００２６】
［オウゴン由来物］
オウゴン（学名：Scutellaria baicalensis Georgi, Labiatae）はシソ科タツナミソウ属の植物である。本発明ではオウゴン由来物として、オウゴンの果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を粉砕後搾取したもの、又は粉砕後に溶媒等で抽出したものを用いることができる。
【００２７】
オウゴンを抽出する場合、抽出溶媒としては、通常植物抽出等に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、あるいはこれらアルコール類の含水物、ｎ−ヘキサン、トルエン等の炭化水素系溶媒等が挙げられる。これらはそれぞれ単独で用いてもよく、あるいは任意の二種以上を組み合わせて用いてもよい。中でもメタノールやエタノール等の低級アルコールが好ましく用いられる。
抽出は常温で行ってもよいが、加熱下で（例えば温水や熱水等の加熱した溶媒を用いて）行ってもよい。
また、溶媒に酵素を加えて抽出処理を行ってもよい。酵素を加えることによって、果実の細胞組織を崩壊させることができ、これにより抽出効率をより高めることができる。酵素としては、細胞組織崩壊酵素を用いることが好ましい。このような酵素としては、例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、α−アミラーゼ、フィターゼが挙げられる。これらの酵素は１種類を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
上記抽出溶媒を用いて得られる抽出液をそのまま使用することができるが、抽出溶媒を留去し、必要により乾燥した後に含有させてもよい。
【００２８】
オウゴンは、これまで、毛乳頭活性化剤（特開平１１−２４０８２３）、ヒアルロン酸産生能増強剤（特開平１０−９５７３５）、紫外線皮膚免疫機能低下防止用免疫賦活剤（特開平１１−７１２９５）、抗炎症剤（特開２００６−８５３６）、及び抗酸化剤（特開平５−２３８９２５）として用いられた例があるが、オウゴン由来物にＰＤＧＦ−ＢＢ産生促進作用、間葉系幹細胞産生促進作用、幹細胞安定化作用、及び真皮安定化作用があることはこれまで全く知られておらず、これらの作用は本発明者らによって今回初めて見出された。
【００２９】
［イノシトール・イノシトールリン酸］
イノシトールはビタミンＢの一種と言われ、生体内でもグルコースから生合成されることが知られている。イノシトールは穀物、糠、マメ、果物等の植物にも含有されている。イノシトールはしばしば、そのヒドロキシ基がリン酸化された形態（イノシトールリン酸）で存在する。本発明では斯かるイノシトールリン酸も使用することができる。本発明に用いられるイノシトールには、イノシトールの各種の立体異性体が含まれる。イノシトールの立体異性体としては、cis-イノシトール（1,2,3,4,5,6/0-イノシトール）、epi-イノシトール（1,2,3,4,5/6-イノシトール）、allo-イノシトール（1,2,3,4/5,6-イノシトール）、myo-イノシトール（1,2,3,5/4,6-イノシトール、muco-イノシトール（1,2,4,5/3,6-イノシトール）、neo-イノシトール（1,2,3/4,5,6-イノシトール）、chiro-イノシトール（1,2,4/3,5,6-イノシトール）、及びscyllo-イノシトール（1,3,5/2,4,6-イノシトール）がある。イノシトールリン酸としては、イノシトールの６個のヒドロキシ基のうち任意の１又は２以上がリン酸化された化合物が挙げられる。中でも、イノシトールの６個のヒドロキシ基が全てリン酸化された化合物であるフィチン酸が好ましい。本発明で用いられるイノシトール又はイノシトールリン酸は、コメヌカ由来であることが好ましい。また、イノシトールリン酸の任意の塩も、本発明に使用できる。
【００３０】
本発明のある実施態様によれば、イノシトール及びイノシトールリン酸は、単体の粉末を培地に溶解して適宜希釈して使用することができる。
【００３１】
イノシトール及びイノシトールリン酸は、他の物質との組み合わせることによりＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進作用を向上させることもできる。かかる他の物質としては、酵母エキスが挙げられ、例えば、バイオダイン（登録商標）EMPP（Arch Personal Care Products L.P.社製）を使用することができる。当該エキスを用いる場合は、エキスの乾燥残分から濃度変換することにより、培地に０．１％前後になるようエキスを添加して使用することができる。
【００３２】
イノシトール及びイノシトールリン酸はこれまで、イノシトールを含有する老化皮膚及び／又はストレスを受けた皮膚用の美容組成物（特表２０４−５０１０６９）、イノシトールリン酸（特にフィチン酸とその塩）を含有する脂肪性浮腫の兆候を低減又は予防するための化粧品組成物（特開平８−２５３４０６）、並びに皮膚保湿及び／又は皮膚保護及び／又は皮膚抗老化用の組成物（特開２０１０−１５０２５８）として用いられた例がある。また、ビタミンＢ類としては、ビタミンＢ２及びＢ６含有の細胞賦活用皮膚外用剤（特開平９−２４１１４６）、ビタミンＢ含有の抗酸化剤（特開平７−２７７９３９及び特開２０５３０６８３１など）として用いられた例がある。しかしながら、ビタミンＢ類又はイノシトール若しくはイノシトールリン酸が、ＰＤＧＦ−ＢＢ産生促進作用、間葉系幹細胞産生促進作用、幹細胞安定化作用、及び真皮安定化作用を有することはこれまで全く知られておらず、これらの作用は本発明者らによって今回初めて見出された。
【００３３】
［ＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤、間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤及び真皮再生化剤］
本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤は、コケモモ由来物、マンゴスチン由来物、オウゴン由来物、イノシトール及びイノシトールリン酸から選択される１又は２以上を有効成分として含有する。また、本発明の間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤及び真皮再生化剤は、上記の有効成分を含む本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤を含有する。本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤、間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤及び真皮再生化剤（以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある。）は、上記の有効成分の何れか１種を単独で含有してもよく、２種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。
【００３４】
上述のように、本発明者等の知見によれば、ＰＤＧＦ−ＢＢは間葉系幹細胞の局在化に関与しており、血管内皮細胞でのＰＤＧＦ−ＢＢの産生を亢進することによって、間葉系幹細胞の産生亢進及び安定化を図ることができる（特願２０１０−２０９７０５）。すなわち、本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤は、間葉系幹細胞の産生亢進及び安定化の目的に極めて有効に用いることが可能である。
また、上述のように、間葉系幹細胞の産生亢進及び安定化が、血管の安定化、組織恒常性の維持、損傷組織の修復・再生（特に真皮の再生）、抗線維化、多発性硬化症や糖尿病等の各種疾患の予防・治療、メタボリックシンドローム等の慢性炎症に基づく各種状態の予防・改善等の用途に極めて有効であることが知られている。よって、本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ産生亢進剤を用いた本発明の間葉系幹細胞産生促進剤及び幹細胞安定化剤は、これらの用途に極めて有効に用いることが可能である。
【００３５】
本発明の剤は、上記の有効成分を、１種又は２種以上の他の成分、例えば賦形剤、担体及び／又は希釈剤等と組み合わせた組成物とすることもできる。組成物の組成や形態は任意であり、有効成分や用途等の条件に応じて適切に選択すればよい。当該組成物は、その剤形に応じ、賦形剤、担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で、常法を用いて製造することができる。
【００３６】
本発明の剤は、各種の飲食品、飼料（ペットフード等）に配合してヒト及び動物に摂取させることができる。また、化粧品等に配合してヒト及び動物に使用し、或いは医薬製剤としてヒト及び動物に投与してもよい。
【００３７】
具体的に、本発明の剤を飲食品や飼料等に配合する場合、植物体又はその抽出物の配合量（乾燥質量）は、それらの種類、目的、形態、利用方法等に応じて適宜決めることができる。例えば、成人一日当たり植物又はその抽出物の摂取量が、アムラ抽出物では０．５ｍｇ〜１ｇ（乾燥残分）、リンゴンベリー抽出物では０．５ｍｇ〜３ｇ程度になるように配合できる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分による所定の効果が十分発揮されるように、成人一日当たり、アムラ抽出物では１０ｍｇ〜５００ｍｇ（乾燥残分）、リンゴンベリー抽出物では１０ｍｇ〜１．５ｇ（乾燥残分）となるように含有させることが好ましい。
【００３８】
飲食品や飼料の形態としては、任意の形態とすることが可能であり、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、又は、液体状に成形することができる。これらの形態には、飲食品等に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤等の賦形剤を適宜含有させることができる。
【００３９】
本発明の剤を化粧品に適用する場合、植物体又はその抽出物の配合量（乾燥質量）は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、化粧料全量中に、アムラ抽出物、リンゴンベリー抽出物それぞれ０．００００１％〜５０％（乾燥質量換算）を配合でき、中でも０．０００１％〜５％（乾燥質量換算）が好ましい。
【００４０】
上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４１】
さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸及びその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体又はその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００４２】
また、この皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能である。その剤型も、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００４３】
本発明の剤を化粧品として用いる場合は、化粧水、乳液、ファンデーション、口紅、リップクリーム、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、パック、ハンドクリーム、ハンドパウダー、ボディシャンプー、ボディローション、ボディクリーム、浴用化粧品等の形態として用いるのが好ましく、この際、これらの形態とする際に通常添加・配合される成分、例えば保湿剤、香料、可溶化剤、安定化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤等の成分も適宜配合することができる。
【００４４】
本発明の剤を外用剤として適用する場合、植物体又はその抽出物の配合量（乾燥質量）は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、化粧料全量中に０．００００１％〜５０％（乾燥質量換算）が好ましく、その他の飲食品では０．０００１％〜５％（乾燥質量換算）が好ましい。
【００４５】
本発明の剤を医薬部外品として用いる場合であれば、該製剤は経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、又は、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調整剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
【００４６】
外用剤であれば、各種の軟膏剤等の形態に広く適用することが可能であるが、ローション剤、懸濁剤・乳剤、液剤、軟膏剤、貼付剤等の形体として用いるのが好ましい。なお、本発明の剤の採り得る形態が、これらの剤型及び形態に限定されるものではない。
【００４７】
本発明の剤を投与した際の間葉系幹細胞中のＰＤＧＦ−ＢＢ遺伝子の発現は、例えばＰＤＧＦ−ＢＢの量を測定することにより発現量を決定し、評価することができる。好ましくは、この測定は、ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等、様々な方法により実施できる。また、例えば、間葉系幹細胞中の総ＲＮＡを抽出し、ＰＤＧＦ−ＢをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定して評価することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる。ＲＴ−ＰＣＲに適切なプライマーの選定は、当業者に周知の方法により実施することができる。
【実施例】
【００４８】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。【００４９】
［評価対象サンプル］
ＰＤＧＦ−ＢＢの産生亢進作用の評価対象サンプルとして以下を用いた。【００５０】
・イノシトール：
市販のイノシトール粉末（和光純薬工業社製：ミオ-イノシトール）をＰＢＳに溶解後、後述の培地に対して１０ｐｐｍとなるように使用した。【００５１】
・フィチン酸：
市販のフィチン酸（ナカライテスク社製：５０％水溶液）を、後述の培地に対して１０ｐｐｍとなるように使用した。【００５２】
・オウゴンエキス：
オウゴンの周皮を除いた根を、７０体積％エタノール（水とエタノールとの体積割合３：７の混合液）で抽出して得られた抽出物を用いた。抽出物は乾燥して保存し、使用直前に７０体積％エタノールを加えて溶解させた上で、後述の培地に対して（抽出物の乾燥重量換算で）１５ｐｐｍとなるように使用した。【００５３】
・コケモモＣＲＳ（cell release system）：
コケモモの葉を細胞分解酵素（マセロチームＡ）で処理した細胞懸濁液に、１，３−ＢＧを４０体積％になるよう加えた懸濁液を用いた。懸濁液は液体として保存し、後述の培地に対して（抽出物の乾燥重量換算で）３０ｐｐｍとなるように使用した。【００５４】
・マンゴスチン樹皮エキス：
マンゴスチンの樹皮を、７０体積％１，３−ＢＧ（水と１，３−ＢＧとの体積割合３：７の混合液）で抽出して得られた抽出物を用いた。抽出物は乾燥して保存し、使用直前に７０体積％１，３−ＢＧを加えて溶解させた上で、後述の培地に対して（抽出物の乾燥重量換算で）１０ｐｐｍとなるように使用した。【００５５】
［血管内皮細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢの産生亢進作用の評価］
ヒト血管内皮細胞HUVECをEGM-2培地（三光純薬）で継代培養し、継代４代目の細胞を、ＶＥＧＦ−Ａを含まないHumedia-EG2培地（クラボウ）に懸濁して、コラーゲンコート２４穴マルチプレート（旭硝子）に２０，０００個の割合で播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が集密に達するまで３〜５日間の培養を行った。上記の各サンプルを上記濃度となるように添加、又は各評価対象サンプルが溶解している溶媒を添加したHumedia-EG2培地（クラボウ）に交換した後、さらに２日間培養を行った。培養後の細胞からＲＮＡ抽出試薬MagNA Pure LC mRNA HSキット（Roche）と自動核酸抽出装置MagNA Pure LC 1.0 インスツルメント（Roche）を用いて、提供されたプロトコールに従ってｍＲＮＡの抽出・精製を行った。各サンプルについて、同容量のｍＲＮＡを鋳型に、後述の配列番号１及び２のプライマーペア、反応試薬QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit（Qiagen）と反応装置LightCycler（Roche）を用いて、ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子のワンステップ定量リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲを行った。組成条件はQiagenのプロトコールに従った。また、ＲＴ−ＰＣＲの条件は、ＲＴ反応５０℃で２０分、初期変性９５℃で１５分、変性９４℃で１５秒、アニール６０℃で２０秒、伸長７２℃で３０秒とした。なお、Ｇ３ＰＤＨは内部標準として用い（配列番号３及び４のプライマーペア）、これを用いて対照群のｍＲＮＡ量を補正した。【００５６】
ＰＤＧＦ−Ｂ：
フォワードプライマー：5'-CCTGGCATGCAAGTGTGA-3'（配列番号１）
リバースプライマー：5'-CCAATGGTCACCCGATTT-3'（配列番号２）
Ｇ３ＰＤＨ：
フォワードプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号３）
リバースプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'（配列番号４）【００５７】
［評価結果］
上記評価手順に従い、上記各サンプルについて得られたＰＤＧＦ−ＢＢのｍＲＮＡの発現量の、対照（各評価対象サンプルが溶解している溶媒）について得られた発現量に対する比を、以下の表に示す。以下の結果から、これらの成分はＰＤＧＦ−ＢＢ発現を亢進させる活性を有することが分かる。【００５８】
【表１】
0005905258.tif 000002
【配列表】
0005905258000001.app