(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む、生物学的に活性な網膜グアニル酸シクラーゼタンパク質における欠損症を発症する危険性があるか、または該欠損症を有すると診断された哺乳動物を処置するための組成物であって、
該ｒＡＡＶベクターは、
配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第１の生物学的に活性なヒトグアニル酸シクラーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメント、および、
該第１の核酸セグメントに作動可能に連結された光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターを含む少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド
を含む、
組成物であって、ここで、該ｒＡＡＶベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス血清型５（ｒＡＡＶ５）ベクター、または、組換えアデノ随伴ウイルス血清型８（ｒＡＡＶ８）ベクターである、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第１のヒトグアニル酸シクラーゼタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記ｒＡＡＶベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス血清型５（ｒＡＡＶ５）ベクターである、組成物。
【請求項４】
前記ｒＡＡＶベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス血清型８（ｒＡＡＶ８）ベクターである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｒＡＡＶベクターがｒＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ベクターが、自己相補的ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号１２からの少なくとも４０の連続した塩基対配列からなる核酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも１つの第１のエンハンサーをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも１つの第１の哺乳動物のイントロン配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｒＡＡＶベクターが感染性アデノ随伴ウイルス粒子、ビリオン、または複数の感染性ＡＡＶ粒子内に含まれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｒＡＡＶベクターが、ビリオンまたは感染性ウイルス粒子内に含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
脂質、リポソーム、脂質複合体、エトソーム、ニオソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポスフィア、ナノカプセル、またはその任意の組み合わせをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒトの眼への投与のために処方される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
療法または予防における使用のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒト網膜ジストロフィー、疾患、または障害の療法または予防における使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ１）の療法または予防における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、ヒト新生児、新産児、幼児、または年少者であって、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）などの先天性網膜ジストロフィーを発症する危険性があるか、またはレーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）などの先天性網膜ジストロフィーを有すると診断された、ヒト新生児、新産児、幼児、または年少者である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記哺乳動物が、該哺乳動物の少なくとも１つの第１の組織において、正常な哺乳動物における生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルと比較した場合に、生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質の欠陥、または、欠損を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ｒＡＡＶベクターの導入によって、前記哺乳動物の眼において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記哺乳動物の眼の中への前記ｒＡＡＶベクターの１回の導入によって、少なくとも３か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記哺乳動物の眼の中への前記ｒＡＡＶベクターの１回の導入によって、少なくとも６か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記哺乳動物の眼の中への前記ｒＡＡＶベクターの１回の導入によって、少なくとも１０か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記哺乳動物が、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）と診断された、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
（１）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、ならびに
（２）該組成物を、ヒトにおける網膜ジストロフィー、疾患、障害、または異常状態の１つまたは複数の症状の診断、予防、処置、または改善において使用するための説明書を含む、キット。
【請求項２５】
前記網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）と診断されている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
哺乳動物の眼の疾患、障害、機能不全、もしくは異常状態またはその１つもしくは複数の症状を診断するか、予防するか、処置するか、または改善させるための医薬の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
ヒトにおけるレーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）の１つまたは複数の症状を処置するか、または改善させるための医薬の製造における、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１０年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２７，５２１号（現在係属中）への優先権を主張し、上記米国仮特許出願の全容は、明示的に参考としてその全体が本明細書に具体的に援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発についての陳述
米国政府は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの助成金番号ＥＹ１３７２９、ＥＹ１１１２３、およびＥＹ０８５７１によって、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
共同研究契約の当事者の名称
該当なし。
【０００４】
発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学およびウイルス学の分野ならびに特に、少なくとも１つの第１の処置用遺伝子産物をコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）組成物を使用するための方法、特に、哺乳動物の眼の疾患、障害、傷害、外傷、または機能不全の１つまたは複数の症状の予防、処置、または改善において有用なそれらの産物に関する。特定の実施形態では、本発明は、たとえば、哺乳動物の眼の１つまたは複数の障害または疾患の処置を含む、１つまたは複数の治験用の、診断上の、および／または処置用のレジメンにおける使用のための、特に、ヒトにおける、レーバー先天性黒内障、１型（ＬＣＡ１）などのような網膜ジストロフィーを含む、先天性の網膜の失明を処置するための、生物学的に機能的なグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。ヒトにおけるグアニル酸シクラーゼ欠損の１つまたは複数の症状を処置するまたは改善させるためのｒＡＡＶ−ＬＣＡ１ベクターを含む、ウイルスベクターベースの遺伝子療法における使用のための、ｒＡＡＶベクターベースのグアニル酸シクラーゼ医薬を調製するための方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００５】
１８６９年にドイツの眼科医Ｄｒ．Ｔｈｅｏｄｏｒ  Ｌｅｂｅｒによって先天性のタイプの色素性網膜炎（ＲＰ）として最初に記載されたレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）（以前は「レーバー先天性黒内障（ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ  ｏｆ  Ｌｅｂｅｒ）」）は、遺伝性の網膜症の最も初期の、最も重症の形態であり、すべての遺伝性網膜ジストロフィーの約６％を占める。ＬＣＡは、網膜の変性疾患の１つのグループであり、子供における先天性失明の最も一般的な原因である。この常染色体劣性状態は、全盲または非常に損なわれた視力、正常な眼底、および網膜電位図（ＥＲＧ）の消滅により、誕生時にまたは幼児における出生後１か月の間に通常、認識される（たとえば非特許文献１を参照されたい）。これらの機能的な欠乏にもかかわらず、ＬＣＡ１患者は、黄斑および周辺部網膜の両方においていくつかの杆体および錐体光受容体を何年間も保持する。疾患の症状は、網膜の機能不全、不安定な眼球運動（眼振）、損なわれた視力、遅い瞳孔反応、および最終的に、失明を含む。
【０００６】
遺伝子分析を通して、ＬＣＡ１座に割り当てられたグアニル酸シクラーゼ−１（Ｇｕｃｙ２ｄ）における変異は、ＬＣＡについて報告されたすべての症例の２０％を占めることが示された（たとえば非特許文献２；非特許文献１；非特許文献３を参照されたい）。ＬＣＡ１によって冒された患者の数は、疾患の網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）における欠陥のバージョン（ＬＣＡ２）によって冒された患者のおよそ２倍であり、これは、近年、遺伝子療法コミュニティーにおいて多くの注目を集めてきた。
【０００７】
２００，０００人の米国人が１型レーバーを有すると推測される。Ｇｕｃｙ２ｄは、光受容体外節膜において発現されるグアニル酸シクラーゼ（ｒｅｔＧＣ１）をコードし（たとえば非特許文献４；非特許文献５を参照されたい）、光伝達の回復フェーズにおいて役割を果たす。この酵素の活性を低下させるまたは消滅させる変異は、杆体および錐体光受容体において慢性の光暴露と生化学的に等価な状態を引き起こすと考えられる。ＬＣＡは、光受容体の発達障害または正常に発達した細胞の非常に初期の変性の結果として通常、見なされる。ＬＣＡ１座（ＧＵＣＹ２Ｄ）は、ホモ接合性マッピングによってヒト染色体１７ｐ１３．１（ＬＣＡ１）にマッピングされた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ，  「Ｒｅｔｉｎａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ」，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９９６．  １４（４）：４６１−４
【非特許文献２】Ｍｉｌａｍ，  Ａ．  Ｈ．；  Ｂａｒａｋａｔ，  Ｍ．  Ｒ．；  Ｇｕｐｔａ，  Ｎ．；  Ｒｏｓｅ，  Ｌ．；  Ａｌｅｍａｎ，  Ｔ．  Ｓ．；  Ｐｉａｎｔａ，  Ｍ．  Ｊ．；  Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ，  Ａ．  Ｖ．；  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，  Ｖ．  Ｃ；  Ｓｔｏｎｅ，  Ｅ．  Ｍ．；  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｓ．Ｇ．，  「Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＧＵＣＹ２Ｄ  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ」，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，  ２００３．  １１０：５４９−５５８
【非特許文献３】Ｐｅｒｒａｕｌｔ  Ｉ，  Ｒｏｚｅｔ  ＪＭ，  Ｇｅｒｂｅｒ  Ｓ，  Ｇｈａｚｉ  Ｉ，  Ｄｕｃｒｏｑ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，  「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｒｅｔＧＣ  ｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ」，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０００．  ８：５７８−８２
【非特許文献４】Ｄｉｚｈｏｏｒ  ＡＭ，  Ｌｏｗｅ  ＤＧ，  Ｏｌｓｈｅｖｓｋａｙａ  ＥＶ，  Ｌａｕｒａ  ＲＰ  ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ  ＪＢ，  「Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ，  ＲｅｔＧＣ，  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ」，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９４．  １２：  １３４５−５２
【非特許文献５】Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｓｅｎｏ  Ｋ，  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  Ｙ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，  「Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙ  ｒｅｔｉｎａｓ」，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，  １９９４．  ５９：７６１−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
先行技術における不備
現在、ヒトにおいてＬＣＡ１を予防するまたは処置することができる有効な予防薬も治療薬もない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、１つまたは複数の処置用哺乳動物ポリペプチド、特に、生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼポリペプチド活性の欠乏またはその欠損から結果として生じるまたはそれによって悪化する、１つもしくは複数の哺乳動物の疾患、障害、もしくは機能不全またはその１つもしくは複数の症状の処置および／または改善のための、グアニル酸シクラーゼファミリーのそれらのタンパク質、ペプチド、ポリペプチドをコードする、新規の、自明でない、有用な、ｒＡＡＶベースの遺伝子構築物を提供することによって、先行技術における本質的な限界を克服する。特に、本発明は、ＬＣＡ１のような状態ならびに生理学的に正常なレベルのグアニル酸シクラーゼポリペプチドの欠損または欠如から現れる、錐体杆体ジストロフィーの劣性および優性形態などのような眼の他の状態の処置における使用のための、１つまたは複数の哺乳動物網膜特異的グアニル酸シクラーゼ（ｒｅｔＧＣ１）ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供する。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。好ましくは、プロモーターは、光受容体特異的プロモーター（たとえばヒトロドプシンキナーゼプロモーターなど）またはユビキタスプロモーター（たとえば切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターなど）である。好ましくは、第１の核酸セグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において示される、任意の１つまたは複数の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質において記載される配列の少なくとも約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００以上の連続したアミノ酸の少なくとも１つの第１の配列領域との同一性が少なくとも約８０％、約８５％、または約９０％以上である少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域を含む、それから本質的になる、またはその代わりにそれからなる、少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする。
【００１２】
ある実施形態では、少なくとも１つの第１の核酸セグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１において列挙される任意の１つまたは複数の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質配列において記載される配列の少なくとも約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、または約１５０以上の連続したアミノ酸の少なくとも１つの第１の配列領域との一次アミノ酸配列同一性が少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、または約９５％以上である少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域を含む、少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを好ましくはコードする。
【００１３】
好ましくは、少なくとも１つの第１の核酸セグメントは、１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１において示される少なくとも１つの第１のグアニル酸シクラーゼタンパク質の少なくとも約９０、約１１０、約１３０、約１５０、または約１７０以上の連続したアミノ酸を含む少なくとも１つの第１の配列領域と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の少なくとも１つの第１の連続した一次アミノ酸配列をそれぞれ好ましくは含む少なくとも１つまたは複数の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードするであろう。
【００１４】
好ましくは、本発明のｒＡＡＶベクターは、任意の１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、もしくはその代わりにそれからなる少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントまたは１つもしくは複数のそのような配列に相補的なもしくはストリンジェント〜高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、形質転換哺乳動物細胞において、好ましくは、形質転換ヒト宿主細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいておよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてグアニル酸シクラーゼ活性を有するであろう。特定の態様では、グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、ペプチド、タンパク質、またはポリペプチドをコードする核酸セグメントが、哺乳動物、好ましくは、ヒト宿主細胞において配列を発現することができる少なくとも１つの第１のプロモーターに作動可能に連結される場合、形質転換哺乳動物細胞において、好ましくは、形質転換ヒト宿主細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいておよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有意な生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼ活性を有するであろう。
【００１５】
本発明のｒＡＡＶベクターは、特定の血清型に必ずしも限定されないが、ある実施形態では、発明者らは、１つまたは複数の以下の公知の血清型であるｒＡＡＶベクターを利用することによって有益な結果を達成することができることを企図する：組換えアデノ随伴ウイルス血清型１（ｒＡＡＶ１）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型２（ｒＡＡＶ２）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型３（ｒＡＡＶ３）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型４（ｒＡＡＶ４）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型５（ｒＡＡＶ５）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型６（ｒＡＡＶ６）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型７（ｒＡＡＶ７）、組換えアデノ随伴ウイルス血清型８（ｒＡＡＶ８）、または組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ）ベクター。ある適用では、本発明のｒＡＡＶベクターは、自己相補的ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターであってもよい。
【００１６】
光受容体特異的プロモーターが所望される実施形態では、本明細書において開示されるｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの第１の光受容体特異的ロドプシンキナーゼプロモーターを含んでいてもよい。例示的なそのようなプロモーターは、配列番号１２において示されるヒトロドプシンキナーゼプロモーターを含む。本発明のある態様では、配列番号１２からの少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、または少なくとも約５０以上の連続したヌクレオチドを含むプロモーター配列の使用は、処置用構築物の組織特異的（特に、光受容体特異的）発現が所望される場合、特に好ましい。
【００１７】
同様に、ユビキタスプロモーターが所望される実施形態では、本明細書において開示されるｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの第１の切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターを含んでいてもよい。例示的なそのようなプロモーターは、配列番号１３において示される切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターを含む。本発明のある態様では、配列番号１３からの少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、または少なくとも約５０以上の連続したヌクレオチドを含むプロモーター配列の使用は、処置用遺伝子の非組織特異的発現が所望される場合、特に好ましい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、開示される処置用遺伝子構築物において用いられるプロモーター配列は、配列番号１２または配列番号１３において記載されるプロモーター配列からの少なくとも５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、または約１２０以上の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を含んでいてもよい、それから本質的に成ってもよい、または代わりにそれから成ってもよい。
【００１９】
本明細書において開示される遺伝子療法ベクターはまた、任意選択で、少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結された第１のエンハンサーまたはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節性エレメントなどのような転写調節性領域などのような、１つまたは複数の「上流」または「下流」調節性配列をさらに含んでいてもよい。本発明の構築物はまた、任意選択で、処置剤をコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結された１つまたは複数のイントロン配列をさらに含んでいてもよい。
【００２０】
本発明の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、およびポリペプチドをコードする核酸セグメントは、天然、半合成、または完全に合成の配列に由来してもよいが、好ましくは、哺乳動物起源のものであろう。例示的な哺乳動物の供給源は、限定を伴うことなく、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ヤギ、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）、およびその他同種のものを含む。
【００２１】
本明細書において開示されるｒＡＡＶベクターは、任意選択で、感染アデノ随伴ウイルス粒子、ビリオン内に、または１つもしくは複数の複数の感染ＡＡＶ粒子内に含まれていてもよい。そのため、本発明はまた、１つまたは複数の開示されるｒＡＡＶ遺伝子構築物を含有するビリオン、ウイルス粒子、および単離組換え宿主細胞を包含する。本発明の実施のための特に好ましい宿主細胞は、限定を伴うことなく、１つまたは複数のｒＡＡＶベクター、ＡＡＶビリオン、または複数の感染性ウイルス粒子を含む単離哺乳動物宿主細胞を含む。
【００２２】
他の態様では、本発明は、１つまたは複数の（ａ）ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶ感染性ウイルス粒子、複数のそのようなビリオンもしくは感染性粒子、またはベクター、ビリオン、感染性粒子、もしくはその複数を含む単離哺乳動物宿主細胞を含む、新規で有用な組成物を提供する。好ましくは、そのような組成物は、任意選択で、１つまたは複数の薬学的に許容される緩衝剤、キャリア、ビヒクル、希釈剤などをさらに含むであろう、また、さらに任意選択で１つまたは複数の脂質、リポソーム、脂質複合体、エトソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅ）、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポスフィア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、ナノカプセル、またはその任意の組み合わせを含んでいてもよい。好ましくは、そのような組成物は、好ましくは、ヒトの眼への投与のために処方され、療法または予防および特に、ヒト網膜ジストロフィー、疾患、または障害（ＬＣＡ１など）の療法または予防において使用されてもよい。
【００２３】
下記に述べられるように、本発明はまた、本明細書において開示される１つまたは複数のｒＡＡＶベクター構築物を含む診断上の、処置用の、および予防用のキットをも含む。そのようなキットは、任意選択で、ヒトにおける網膜ジストロフィー、疾患、障害、または異常状態の１つまたは複数の症状の診断、予防、処置、または改善において構成要素を使用するための１つまたは複数のプロトコール、投薬レジメン、または説明書をさらに含んでいてもよい。ある態様では、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）と診断されたヒト患者の処置のための処置用のキットが、特に企図される。
【００２４】
本発明はまた、哺乳動物の疾患または障害の療法におけるまたは予防における１つまたは複数の開示されるｒＡＡＶベースの組成物の使用をも包含する。同様に、本発明は、哺乳動物の眼の疾患、障害、機能不全、または異常状態の１つまたは複数の症状を診断する、予防する、処置する、または改善させるための、特に、ヒトにおけるレーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）の１つまたは複数の症状を処置するまたは改善させるための医薬の製造における開示される組成物の使用を含む。
【００２５】
本発明はまた、哺乳動物における疾患、機能不全、障害、欠損、または異常状態の１つまたは複数の症状を予防する、処置する、または改善させるための方法を提供する。そのような方法は、一般に、哺乳動物における疾患、機能不全、障害、欠損、または異常状態の１つまたは複数の症状を予防する、処置する、および／または改善させるのに十分な時間、有効量の本明細書において開示されるｒＡＡＶ組成物をその必要性のある哺乳動物に投与するステップを含む。そのような哺乳動物は、好ましくは、たとえばレーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）を含む、少なくとも１つの第１の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有する、それを有することが疑われている、それを発症する危険性がある、もしくはそれを有すると診断されているまたは哺乳動物は、生物学的に活性で機能的なグアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドの１つもしくは複数の欠損、欠陥、もしくは欠如を発症する危険性があるもしくは欠損、欠陥、もしくは欠如を有すると診断されている。哺乳動物は、任意の年齢であってもよいが、より好ましくは、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）などのような先天性網膜ジストロフィーを発症する危険性があるまたはそれを有すると診断されている新生児、新産児、幼児、または年少者であろう。
【００２６】
本発明はまた、その必要性のある哺乳動物に、治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を哺乳動物に提供するための方法をもさらに含む。そのような方法は、一般に、少なくとも、有効量の１つまたは複数の本明細書において開示されるｒＡＡＶベクターを、その必要性のある哺乳動物の適した細胞の中に、ｒＡＡＶベクターが導入された哺乳動物の細胞の少なくとも１つの第１の集団または少なくとも１つの第１の組織において生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をそれから産生するのに十分な時間、導入するステップを含む。方法の実施において、その必要性のある哺乳動物は、好ましくは、正常な哺乳動物における生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルと比較した場合、哺乳動物の身体内のまたはその身体に関する１つまたは複数の組織において、機能的で、生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質の１つまたは複数の欠陥、欠損、または実質的な欠如もしくは完全な欠如を有するであろう。方法のある適用では、哺乳動物からの複数の細胞に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｒＡＡＶベクターが提供され、方法は、続いて、哺乳動物の身体内のまたはその身体に関する少なくとも１つの第１の組織部位の中に、複数の提供された細胞を導入するさらなるステップをさらに含む。たとえば、複数の得られた細胞は、たとえば、網膜、網膜下スペースの中へのまたは網膜を囲む１つもしくは複数の組織へのまたは眼全体へのまたは眼を囲む組織への直接的な注射によるものを含めて、哺乳動物の一方または両方の眼内の少なくとも１つの第１の部位の中に導入されてもよい。
【００２７】
特定の態様では、細胞の中へのｒＡＡＶベクターグアニル酸シクラーゼ遺伝子構築物の導入およびその続く発現は、機能的なグアニル酸シクラーゼペプチド、タンパク質、またはポリペプチドの翻訳を可能にし、その結果、錐体光受容体は、保持され、錐体媒介性の機能が修復される。重要なことには、そのような方法は、哺乳動物の眼における正常な視覚的な行動の復帰および好ましくは、視力の復帰を提供する。
【００２８】
本発明のｒＡＡＶベクターの投与は、１回限りの療法の一部であってもよいまたは処置されている対象の生涯の間に２回以上繰り返される、進行中の療法レジメンの一部であってもよい。ある態様では、ｒＡＡＶ構築物の１回の投与は、投与の後の少なくとも１か月、少なくとも２か月、または少なくとも３か月以上の期間にわたり、錐体光受容体の保持ならびに錐体媒介性の機能および視覚的な行動の回復と共に、グアニル酸シクラーゼタンパク質形成の持続をもたらす。より好ましくは、長期療法または予防は、数か月〜数年間の期間、哺乳動物の眼への処置用構築物の１つまたは複数の続く投与を使用して達成される。好ましくは、錐体光受容体は、保持され、錐体媒介性の機能および視覚的な行動は、投与の後の少なくとも４か月、少なくとも５か月、または少なくとも６か月以上の期間、哺乳動物において修復される。ある態様では、光受容体の保持、錐体媒介性の機能、および視覚的な行動は、本明細書において開示される組成物を含む処置レジメンの終了の後の少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、または少なくとも４年間以上の期間、哺乳動物において修復される。本発明は、ＬＣＡ１を有する、それを有することが疑われている、それを有すると診断される、またはそれを発症する危険性がある哺乳動物の１つまたは複数の網膜細胞において、生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルを増加させるための方法をさらに提供する。そのような方法は、一般に、哺乳動物の１つまたは複数の網膜細胞において生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルを増加させるのに有効な量および時間で、１つまたは複数の開示されるｒＡＡＶグアニル酸シクラーゼウイルスベクター構築物を、その必要性がある哺乳動物の網膜細胞の少なくとも１つの第１の集団の中に導入するステップを含む。そのような方法は、哺乳動物における網膜ジストロフィーの１つまたは複数の症状を予防する、処置する、または改善させるために特に企図され、好ましくは、哺乳動物における網膜ジストロフィーの１つまたは複数の症状を処置するまたは改善させるのに十分な量および時間で、１つまたは複数の開示される処置用構築物を、哺乳動物の網膜、網膜下スペース、または眼に直接または間接的に投与するステップを含んでいてもよい。
【００２９】
本発明はまた、哺乳動物におけるグアニル酸シクラーゼタンパク質欠損の症状を予防する、処置する、または改善させるための、特に、生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼポリペプチドの欠損に関係する１つまたは複数の障害を示すヒトにおける欠損の重症度または程度を処置するまたは低下させるための組成物および方法を提供する。一般的な意味で、方法は、そのような障害または１つもしくは複数のその症状に罹患していることが疑われている動物における欠損を処置するまたは改善させるのに十分な量でのおよびその期間の、動物への、薬学的に許容されるビヒクル中の１つまたは複数のグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする、少なくとも１つの第１のｒＡＡＶベースの遺伝子構築物の投与を含む。本発明の実施において有用な例示的なグアニル酸シクラーゼポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において開示される配列およびその生物学的に機能的な等価物または誘導体のいずれか１つに一次アミノ酸配列が実質的に同一であるグアニル酸シクラーゼ活性を有するペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含むが、これらに限定されない。実施において有用なさらなる例示的なグアニル酸シクラーゼペプチド、タンパク質、およびポリペプチドは、哺乳動物グアニル酸シクラーゼをコードするアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるもの、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において開示されるそれらの配列ならびにその生物学的に機能的な等価物または誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
ｒＡＡＶグアニル酸シクラーゼベクター組成物
第１の実施形態では、本発明は、そのようなベクターを用いて形質転換された適した宿主細胞において核酸セグメントを発現することができる、少なくとも１つの第１のプロモーターに作動可能に連結された、グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド、特に、哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片もしくは誘導体）をコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントを含むポリペプチドを含むｒＡＡＶベクターを提供する。好ましい実施形態では、核酸セグメントは、哺乳動物、特に、ヒトグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、もしくは配列番号１１において開示される１つもしくは複数のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体からの少なくとも１つの第１の３０の連続したアミノ酸配列と少なくとも９０％相同である少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。
【００３１】
好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１からの少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、または少なくとも８０の連続したアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％相同である少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１からの少なくとも９０の連続したアミノ酸配列と少なくとも９９％相同である少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列を含む。
【００３２】
その代わりに、本発明の処置用構築物は、たとえば、マウス、霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、エピン、ヤギ、イヌ、ネコ、および／もしくはオオカミ起源の核酸、ペプチド、およびポリペプチドなどのような、任意の哺乳動物の起源のグアニル酸シクラーゼポリペプチドをコードする核酸セグメントを包含してもよいまたは１つもしくは複数の哺乳動物の種から最初に得られ、それらのグアニル酸シクラーゼ活性が保持されるようにヒト細胞において発現されるように遺伝子修飾された修飾核酸セグメントもしくは部位特異的変異誘発核酸セグメントを包含してもよい。
【００３３】
他の好ましい実施形態では、本発明の実施における使用のための好ましい核酸セグメントは、哺乳動物、特にヒトグアニル酸シクラーゼポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする。
【００３４】
本発明のベクターおよびウイルス粒子において含まれるポリヌクレオチドは、好ましくは、本明細書において記載されるグアニル酸シクラーゼコード核酸セグメントに作動可能に連結された、少なくとも１つの第１の恒常的または誘発性プロモーターを含む。そのようなプロモーターは、同種または異種プロモーターであってもよく、グアニル酸シクラーゼコードセグメントの発現がプロモーターの制御下となるように、グアニル酸シクラーゼポリペプチドをコードする核酸セグメントの上流に、適切に作用するように位置づけられてもよい。構築物は、単一のプロモーターを含んでもよいまたはその代わりに、２つ以上のプロモーターが、グアニル酸シクラーゼコードＤＮＡ配列の発現を促進するために使用されてもよい。
【００３５】
本発明の実施において有用な例示的なプロモーターは、たとえば、ＣＭＶプロモーター、プロモーター、β−アクチンプロモーター、ハイブリッドＣＭＶプロモーター、ハイブリッドＣＭＶ−βアクチンプロモーター、切断型ＣＭＶプロモーター、切断型β−アクチンプロモーター、切断型ハイブリッドＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、ＥＦ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、もしくはＵ１ｂプロモーターなどのようなユビキタスプロモーター；または１つもしくは複数の細胞もしくは組織特異的プロモーター（たとえば、ロドプシンキナーゼプロモーター［ｈＧＲＫ１］などのような光受容体特異的プロモーターを含む）またはＴｅｔ誘発性プロモーターもしくはＶＰ１６−ＬｅｘＡプロモーターなどのような誘発性プロモーターなどのような、哺乳動物、特にヒト宿主細胞、組織、および器官において作動可能なそれらのプロモーター配列を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
例証となる実施形態では、処置用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ユビキタス切断型ハイブリッドニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下にまたは光受容体細胞特異的ｈＧＲＫ１プロモーターの制御下に配置され、適した宿主細胞が遺伝子構築物を用いて形質転換され、かつグアニル酸シクラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡが、そのような細胞において発現される場合、処置的に有効なレベルのコードグアニル酸シクラーゼポリペプチドを産生するために使用された。適したｈＧＲＫ１プロモーターの例は、配列番号１２において示されるが、切断型ハイブリッドニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターなどのような適したユビキタスプロモーターは、配列番号１３において示される。
【００３７】
本発明のベクターおよびウイルス粒子において含まれるポリヌクレオチドはまた、任意選択で、１つまたは複数の天然、合成、同種、異種、もしくはハイブリッドエンハンサーまたは５’調節性エレメント、たとえば、ＣＭＶエンハンサーなどのような天然エンハンサーまたはその代わりに、合成エンハンサーをさらに含んでいてもよい。たとえば、作動可能に連結された遺伝子配列の発現を増加させるものを含む細胞または組織特異的エンハンサーもまた、本発明の実施において特に有用であることが企図される。そのようなエンハンサーは、網膜特異的エンハンサー、杆体特異的エンハンサー、および錐体特異的エンハンサーなどを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のベクターおよびウイルス粒子内に含まれるポリヌクレオチドおよび核酸セグメントはまた、任意選択で、１つまたは複数のイントロン配列をさらに含んでいてもよい。そのような実例では、イントロン配列（複数可）は、好ましくは起源が哺乳動物であろう、より好ましくは起源がヒトであろう。
【００３９】
本発明のベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、または組成物内に含まれるＤＮＡ配列、核酸セグメント、およびポリヌクレオチドはまた、任意選択で、コードされたポリペプチドのより優れた発現、より優れた安定性、および／または翻訳の増強をもたらすように本明細書において開示されるグアニル酸シクラーゼコード核酸セグメントに関して作動可能に位置づけられた、１つまたは複数の天然、合成、同種、異種、またはハイブリッド転写後もしくは３’調節性エレメントをさらに含んでいてもよい。そのような１つの例は、グアニル酸シクラーゼ遺伝子の下流に作動可能に位置づけられたウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節性エレメント（ＷＰＲＥ）である。そのような状況におけるこれらなどのようなエレメントの使用は、分子生物学の技術分野における当業者らに周知である。
【００４０】
例証となる実施形態では、本発明は、以下に開示されるポリペプチドおよびペプチド配列からの少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００以上の連続したアミノ酸配列、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のいずれか１つにおいて列挙されるそれらのポリペプチドを含む、１つまたは複数の生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの投与に関する。
【００４１】
同様に、さらなる例証となる実施形態では、本発明は、以下に開示される核酸セグメントからの少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、もしくは少なくとも約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、またはさらに約８００以上の連続した核酸残基、特に、たとえば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において列挙されるものを含む、任意の１つまたは複数の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸セグメントによってコードされる、１つまたは複数の生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの投与に関する。
【００４２】
本発明の例示的なアデノ随伴ウイルスベクター構築物およびポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものを含み、ペプチドまたはポリペプチドは、選択された哺乳動物の細胞および／または組織において発現される場合、グアニル酸シクラーゼ活性を有する。
【００４３】
ある実施形態では、本発明のウイルスベクター構築物およびポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において開示される１つまたは複数の配列と少なくとも約８２％、少なくとも約８４％、少なくとも約８６％、少なくとも約８８％、少なくとも約９２％、または少なくとも約９４％同一であるペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメントを含む、それから本質的になる、またはそれからなるそれらのベクターおよびポリヌクレオチドを含むであろう。そのような構築物は、選択された哺乳動物細胞および／または組織において、特にヒト細胞および／または組織において発現される場合、グアニル酸シクラーゼ活性を有する１つまたは複数の生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを好ましくはコードするであろう。
【００４４】
本発明の例示的なポリヌクレオチドはまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のいずれか１つをコードする核酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である少なくとも１つの第１の核酸セグメントを含む、それから本質的になる、またはそれからなる配列をも含み、核酸セグメントによってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、選択された哺乳動物細胞および／または組織において発現される場合、グアニル酸シクラーゼ活性を有する。
【００４５】
ｒＡＡＶウイルス粒子およびビリオンならびにそれらを含む宿主細胞
本発明の他の態様は、本発明のｒＡＡＶグアニル酸シクラーゼベクターを含むｒＡＡＶ粒子およびビリオン、複数のそのような粒子およびビリオンならびに哺乳動物の選択された細胞、組織、または器官、たとえば、選択された哺乳動物の眼の１つまたは複数の領域への、筋肉内、静脈内、または直接的な注射によってなどのような、適した手段を通しての哺乳動物への投与が意図される、たとえば、ｒＡＡＶグアニル酸シクラーゼベクターまたはビリオンの医薬処方物などのような、本明細書において開示される１つまたは複数のｒＡＡＶグアニル酸シクラーゼベクターを含む医薬組成物および宿主細胞に関する。典型的に、そのような組成物は、以下に記載されるように、薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、希釈剤、アジュバント、またはキャリアと共に処方されるであろう、また、処置効果が所望される、選択された器官、組織、および細胞への投与を促進するために、１つまたは複数のリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子処方物をさらに含んでいてもよい。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本明細書において開示される１つまたは複数のｒＡＡＶベクター、ビリオン、または感染性ウイルス粒子を含む哺乳動物宿主細胞およびその複数を含む。特に好ましい細胞は、たとえば網膜細胞を含むヒト宿主細胞、特にヒトの眼組織である。
【００４７】
処置用のキットおよび医薬組成物
哺乳動物におけるグアニル酸シクラーゼ欠損から結果として生じる状態の症状を処置するまたは改善させるための処置用のキットもまた、本発明の一部である。例示的なキットは、好ましくは、本明細書において記載される１つまたは複数の開示されるＡＡＶグアニル酸シクラーゼベクター構築物、ビリオン、または医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含むものである。グアニル酸シクラーゼ、特に、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ−１欠損の処置の方法におけるそのようなキットの使用は、ｒｅｔＧＣ１欠陥または欠損の処置においておよび罹患哺乳動物におけるＬＣＡ−１などのような網膜ジストロフィーの処置において好ましい。
【００４８】
本発明の他の重要な態様は、哺乳動物、特にヒトにおけるグアニル酸シクラーゼ欠損の症状を処置するまたは改善させるための医薬の調製における、本明細書において記載される、開示のベクター、ビリオン、組成物、および宿主細胞の使用に関する。医薬の調製におけるならびに、たとえば、ＬＣＡ−１などのような網膜ジストロフィーにおけるなどのような、たとえば、網膜ＧＣ１における欠損または欠陥から結果として生じる状態を含む神経学的および／または中枢神経系欠陥の処置のための方法におけるそのような組成物の使用は、一般に、罹患哺乳動物においてそのような欠損の症状を処置するまたは改善させるのに十分な量でのおよびその時間の、１つまたは複数の開示されるウイルスベクター、ビリオン、宿主細胞、またはそれらの１つもしくは複数を含む組成物の、その必要性がある哺乳動物、特にヒトへの投与を含む。方法はまた、診断の後のまたは症状の発症前の、そのような状態を有することが疑われている動物の予防療法またはそのような状態を発症する危険性があるそれらの動物へのそのような組成物の投与を包含してもよい。
【００４９】
本発明の他の態様は、本明細書において記載される、１つまたは複数の開示されるアデノ随伴ウイルスベクター、ビリオン、ウイルス粒子、および宿主細胞を含む組成物に関する。そのようなものを含む医薬組成物は、罹患哺乳動物、特にヒトを処置するための療法において、特に、医薬の調製において有用であることが特に企図される。
【００５０】
処置方法
本発明はまた、その必要性がある哺乳動物に治療有効量のグアニル酸シクラーゼポリペプチドを送達するための方法を提供する。そのような方法は、一般に、本明細書において開示される１つまたは複数のグアニル酸シクラーゼ組成物をそのような哺乳動物に提供するまたは投与するステップを少なくとも含む。たとえば、方法は、本明細書において記載される１つまたは複数のｒＡＡＶベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物をそのような哺乳動物に提供するステップを含んでいてもよい。好ましくは、そのような提供またはそのような投与は、本明細書において開示される、治療有効量の１つまたは複数のグアニル酸シクラーゼポリペプチドを哺乳動物の選択された細胞、組織、または器官に、特に、処置的に有効なレベルを哺乳動物の眼の細胞に提供するのに有効な量およびその時間となるであろう。そのような方法は、薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｕｍ）の全身性の注射（複数可）を含んでいてもよいまたは哺乳動物の特定の細胞、組織、もしくは器官への処置用組成物の直接的なもしくは間接的な投与、注射、もしくは導入をさらに含んでいてもよい。
【００５１】
たとえば、処置用組成物は、眼の組織へのもしくは網膜へのまたは網膜下スペースへのまたは哺乳動物の眼内の１つもしくは複数の特定の細胞型への直接的な注射によって哺乳動物に提供されてもよい。
【００５２】
本発明はまた、動物におけるグアニル酸シクラーゼ欠損の症状を処置する、改善させる、およびその重症度を低下させるための方法を提供する。これらの方法は、一般に、ｒｅｔＧＣ１ポリペプチド欠陥もしくは欠損を処置するのにまたはそのような蓄積から結果として生じるまたはＬＣＡ１およびその他同種のものなどのような網膜ジストロフィーを含む、動物における十分な生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼポリペプチドの過小発現もしくは欠如から結果として生じる機能不全を処置するのに有効な量および時間で、本明細書において開示される１つまたは複数のｒＡＡＶグアニル酸シクラーゼベクター組成物をその必要性がある動物に提供するステップを少なくとも含む。上記に記載されるように、そのような方法は、薬の全身性の注射（複数可）を含んでいてもよいまたは動物の特定の細胞、組織、もしくは器官への処置用組成物の直接的なもしくは間接的な投与、注射、もしくは導入をさらに含んでいてもよい。
【００５３】
本発明は、哺乳動物におけるグアニル酸シクラーゼ欠陥もしくは欠損、網膜ジストロフィー、もしくはＬＣＡ１または他のＧＣ１関連眼疾患、障害、もしくは機能不全を処置するための医薬の製造における、本明細書において開示されるアデノ随伴ウイルスベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、および／または医薬組成物の使用にさらに関する。この使用は、哺乳動物の１つまたは複数の細胞、組織、または器官への全身性のまたは局所的な注射、感染、または投与を含んでいてもよい。そのような使用は、ＬＣＡ−１などのような１つまたは複数の網膜ジストロフィーを有する、それを有することが疑われている、またはそれを発症する危険性があるヒトにおいて特に企図される。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、
少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の核酸セグメント、および、
該第１の核酸セグメントに作動可能に連結された光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターまたはユビキタス切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターを含む少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド
を含む、ｒＡＡＶベクター。
（項目２）
上記少なくとも１つの第１の核酸セグメントが、少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードし、該少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において記載される配列の少なくとも８０の連続したアミノ酸の少なくとも１つの第１の配列領域と少なくとも約９０％同一である、項目１に記載のｒＡＡＶベクター。
（項目３）
上記少なくとも１つの第１の核酸セグメントが、少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードし、該少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において記載される配列の少なくとも１００の連続したアミノ酸の少なくとも１つの第１の配列領域と少なくとも約９２％同一である、項目１または項目２に記載のｒＡＡＶベクター。
（項目４）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域を含み、該少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において記載される配列の少なくとも１２０の連続したアミノ酸の少なくとも１つの第１の配列領域と少なくとも約９５％同一である、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目５）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域を含み、該少なくとも１つの第１の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において記載される配列の少なくとも１４０の連続したアミノ酸の少なくとも１つの第１の配列領域と少なくとも約９８％同一である、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目６）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、該少なくとも１つのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一である、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目７）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目８）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列から本質的になる、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目９）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１からの少なくとも５０のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１０）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１からの少なくとも７５のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１１）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１からの少なくとも１００のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１２）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１からの少なくとも１２５のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１３）
上記哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の１つまたは複数からの一次アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である一次アミノ酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１４）
上記哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の１つまたは複数からの一次アミノ酸配列と少なくとも９９％同一である一次アミノ酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１５）
前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクターであって、該ｒＡＡＶベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス血清型１（ｒＡＡＶ１）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型２（ｒＡＡＶ２）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型３（ｒＡＡＶ３）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型４（ｒＡＡＶ４）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型５（ｒＡＡＶ５）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型６（ｒＡＡＶ６）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型７（ｒＡＡＶ７）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型８（ｒＡＡＶ８）ベクター、または組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ）ベクターである、ｒＡＡＶベクター。
（項目１６）
自己相補的ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１７）
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号１２からの少なくとも３０の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号１３からの少なくとも７０の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１８）
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号１２からの少なくとも４０の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号１３からの少なくとも９０の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目１９）
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号１２からの少なくとも６０の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号１３からの少なくとも１２０の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２０）
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号１２の核酸配列を含むか、または上記切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号１３の核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２１）
上記少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも１つの第１のエンハンサーをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２２）
上記少なくとも１つの第１の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも１つの第１の哺乳動物のイントロン配列をさらに含む、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２３）
上記少なくとも１つの第１の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、エピン、ヤギ、またはオオカミ起源のものである、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２４）
上記少なくとも１つの第１の核酸セグメントが、ヒト起源の生物学的に活性なヒトグアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２５）
上記切断型キメラＣＭＶ−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号１２の配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記少なくとも１つの第１の核酸セグメントが、配列番号１からの少なくとも１００の連続したアミノ酸配列を含む哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドをコードする、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２６）
感染性アデノ随伴ウイルス粒子、ビリオン、または複数の感染性ＡＡＶ粒子内に含まれる、前述の項目のいずれかに記載のｒＡＡＶベクター。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクターを含む、ビリオンまたは感染性ウイルス粒子。
（項目２８）
項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクターから調製される、複数の感染性ウイルス粒子。
（項目２９）
（ａ）項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクター、
（ｂ）項目２７に記載のビリオンもしくは感染性ウイルス粒子、または
（ｃ）項目２８に記載の複数の感染性ウイルス粒子
を含む、単離哺乳動物宿主細胞。
（項目３０）
ヒト宿主細胞である、項目２７に記載の単離哺乳動物宿主細胞。
（項目３１）
（１）
（ａ）項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクター、
（ｂ）項目２７に記載のビリオンもしくは感染性ウイルス粒子、
（ｃ）項目２８に記載の複数の感染性ウイルス粒子、または
（ｄ）該ベクター、該ビリオン、もしくは該感染性粒子を含む単離哺乳動物宿主細胞
および
（２）薬学的に許容される緩衝剤、キャリア、ビヒクル、または希釈剤
を含む、組成物。
（項目３２）
脂質、リポソーム、脂質複合体、エトソーム、ニオソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポスフィア、ナノカプセル、またはその任意の組み合わせをさらに含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
ヒトの眼への投与のために処方される、項目３１または項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
療法または予防における使用のための、項目３１〜３３のいずれか一項目に記載の組成物。
（項目３５）
ヒト網膜ジストロフィー、疾患、または障害の療法または予防における使用のための、項目３１〜３４のいずれか一項目に記載の組成物。
（項目３６）
レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ１）の療法または予防における使用のための、項目３１〜５４のいずれか一項目に記載の組成物。
（項目３７）
（１）
（ａ）項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクター、
（ｂ）項目２７に記載のビリオンもしくは感染性ウイルス粒子、
（ｃ）項目２８に記載の複数の感染性ウイルス粒子、
（ｄ）項目２９もしくは項目３０に記載の単離哺乳動物宿主細胞、または
（ｅ）項目３１〜３６のいずれか一項目に記載の組成物
からなる群より選択される構成要素、および
（２）該構成要素を、ヒトにおける網膜ジストロフィー、疾患、障害、または異常状態の１つまたは複数の症状の診断、予防、処置、または改善において使用するための説明書
を含む、キット。
（項目３８）
上記網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）と診断されている、項目３５に記載のキット。
（項目３９）
哺乳動物の眼の疾患、障害、機能不全、もしくは異常状態またはその１つもしくは複数の症状を診断するか、予防するか、処置するか、または改善させるための医薬の製造における、項目３１に記載の組成物の使用。
（項目４０）
ヒトにおけるレーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）の１つまたは複数の症状を処置するか、または改善させるための医薬の製造における、項目３９に記載の使用。
（項目４１）
哺乳動物における疾患、機能不全、障害、欠損、もしくは異常状態、またはその１つもしくは複数の症状を予防するか、処置するか、または改善させるための方法であって、該方法は、該哺乳動物における該疾患、機能不全、障害、欠損、もしくは異常状態、またはその１つもしくは複数の症状を予防するか、処置するか、または改善させるのに十分な量および時間で、項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクターを含む組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目４２）
上記哺乳動物が、少なくとも１つの第１の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有するか、少なくとも１つの第１の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有することが疑われているか、少なくとも１つの第１の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを発症する危険性があるか、または少なくとも１つの第１の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有すると診断された、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
上記哺乳動物が、生物学的に活性な網膜グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドにおける欠損症を発症する危険性があるか、または該欠損症を有すると診断された、項目４１または項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記哺乳動物が、ヒト新生児、新産児、幼児、または年少者であって、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）などの先天性網膜ジストロフィーを発症する危険性があるか、またはレーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）などの先天性網膜ジストロフィーを有すると診断された、ヒト新生児、新産児、幼児、または年少者である、項目４１〜４３のいずれか一項目に記載の方法。
（項目４５）
治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を必要とする哺乳動物に、治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を提供するための方法であって、項目１〜２６のいずれか一項目に記載の有効量のｒＡＡＶベクターを、十分な時間、治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を必要とする哺乳動物の適した細胞に導入して、該ｒＡＡＶベクターが導入された該哺乳動物の細胞の少なくとも１つの第１の集団または少なくとも１つの第１の組織において、該ｒＡＡＶベクターから生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生するステップを含む、方法。
（項目４６）
上記治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を必要とする哺乳動物が、該哺乳動物の少なくとも１つの第１の組織において、正常な哺乳動物における生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルと比較した場合に、生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質の欠陥、欠損、または実質的な欠如を有する、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
項目４５または項目４６に記載の方法であって、ここで、上記哺乳動物からの複数の細胞には、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて上記ｒＡＡＶベクターが提供され、該方法は、該哺乳動物の身体内のまたは身体に関する少なくとも１つの第１の組織部位の中に、該複数の提供を受けた細胞を導入するステップをさらに含む、方法。
（項目４８）
上記複数の得られた細胞が、上記哺乳動物の一方または両方の眼内の少なくとも１つの第１の部位の中に導入される、項目４５〜４７のいずれか一項目に記載の方法。
（項目４９）
上記複数の得られた細胞が、網膜または周囲の組織の中への直接的な注射によって、上記哺乳動物の一方または両方の眼内の少なくとも１つの第１の部位の中に導入される、項目４５〜４８のいずれか一項目に記載の方法。
（項目５０）
上記ｒＡＡＶベクターの導入によって、上記哺乳動物の眼において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目４５〜４９のいずれか一項目に記載の方法。
（項目５１）
上記哺乳動物の眼の中への上記ｒＡＡＶベクターの１回の導入によって、少なくとも３か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目４５〜５０のいずれか一項目に記載の方法。
（項目５２）
上記哺乳動物の眼の中への上記ｒＡＡＶベクターの１回の導入によって、少なくとも６か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目４５〜５１のいずれか一項目に記載の方法。
（項目５３）
上記哺乳動物の眼の中への上記ｒＡＡＶベクターの１回の導入によって、少なくとも１０か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目４５〜５２のいずれか一項目に記載の方法。
（項目５４）
ＬＣＡ１を有するか、ＬＣＡ１を有することが疑われているか、ＬＣＡ１を有すると診断されているか、またはＬＣＡ１を発症する危険性がある哺乳動物の１つまたは複数の網膜細胞において、生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルを増加させるための方法であって、該哺乳動物の１つまたは複数の網膜細胞において生物学的に活性なｒｅｔＧＣ１タンパク質のレベルを増加させるのに有効な量および時間で、該哺乳動物の網膜細胞の少なくとも１つの第１の集団の中に、項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクターを導入するステップを含む、方法。
（項目５５）
哺乳動物における網膜ジストロフィーの１つまたは複数の症状を処置するかまたは改善させるための方法であって、該哺乳動物における網膜ジストロフィーの１つまたは複数の症状を処置するかまたは改善させるのに十分な量および時間で、項目１〜２６のいずれか一項目に記載のｒＡＡＶベクターを該哺乳動物の網膜または網膜下スペースに直接投与するステップを含む、方法。
（項目５６）
上記哺乳動物が、レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ−１）と診断された、項目５５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、添付の図面に関連して記載される以下の説明に対する参照によってより理解されてもよく、同様の参照数字は、同様のエレメントを識別する。
【図１】図１は、＋／＋（上位の波形）、無処置ＧＣ１ＫＯ（中央の波形）、およびＡＡＶ−ｍＧＣ１処置（最下位の波形）マウスからの代表的な錐体（左のカラム）および杆体（右のカラム）媒介性のＥＲＧ結果を示す。黒色の結果は、ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射した眼（最下位の波形）およびそれらの注射していない反対側の眼（中央の波形）に相当する。赤色の結果は、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を注射した眼（最下位の波形）および注射していない反対側の眼（中央の波形）に相当する。ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置眼における錐体の応答は、正常のおよそ４５％まで修復される。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ある期間にわたる、ＧＣ１ＫＯ、同質遺伝＋／＋対照、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置（図２Ａ）、およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置（図２Ｂ）ＧＣ１ＫＯマウスにおける平均明所視ｂ波最大振幅を示す。ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウスの両方の錐体の応答は、注射後少なくとも３か月間で、正常のおよそ４５％となる。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、視覚によって誘発された行動が、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１またはｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスにおいて修復されたことを視運動分析によって示す。Ｍ１〜Ｍ９は、試験のために使用した９匹のマウスに相当する。＋／＋対照マウス（Ｍ１、Ｍ２）、ナイーブＧＣ１ＫＯ（Ｍ３、Ｍ４）、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７）、およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置（Ｍ８、Ｍ９）マウスの明所視力およびコントラスト感度は、処置マウスが、正常の目の見えるマウスのように行動することを明らかにする（図３Ｂおよび図３Ｃ）。すべての＋／＋眼（ｎ＝４）、ＧＣ１ＫＯ眼（ｎ＝９）、およびＡＡＶ−ｍＧＣ１処置眼（ｎ＝５）の平均を示す（図３Ｃ）。それぞれのマウス（Ｍ１〜Ｍ９）からの錐体媒介性のＥＲＧ応答を電気生理学的比較のために示す（図３Ａ）。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、および図４Ｆは、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１が、ＧＣ１ＫＯマウスの光受容体外節においてＧＣ１の発現を駆動することを示す（図４Ａ）。ＧＣ１発現は、無処置の反対側の対照眼において見られない（図４Ｂ）。ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１は、光受容体外節（図４Ｃ）においておよび時々、光受容体細胞体（図４Ｆにおける白色の矢）においてＧＣ１の発現を駆動する。そのようなＧＣ１発現は、無処置の反対側の対照眼において見られない（図４Ｄ）。ＡＡＶ５−ｍＧＣ１処置眼における処置用導入遺伝子発現のレベルは、同質遺伝＋／＋対照眼において見られるものと類似する（図４Ｅ）。網膜はすべて、処置後３か月のマウスまたは年齢が一致する無処置対照から採取した。スケールバーは、図４Ａにおいて１００μｍ、図４Ｆにおいて２５μｍとする。ＯＳ＝外節、ＩＳ＝内節、ＯＮＬ＝外顆粒層。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、＋／＋、ＧＣ１ＫＯ、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置、およびＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウスの錐体光受容体における錐体アレスチン発現を示す。無処置ＧＣ１ＫＯ網膜は、特徴的な、無秩序で、剥離した錐体外節を含有する（図５Ｂ）のに対して、処置ＧＣ１ＫＯ（図５Ｃおよび図５Ｄ）ならびに＋／＋（図５Ａ）網膜切片において、錐体外節は、損なわれておらず、錐体アレスチン分布は正常に見えた。網膜はすべて、処置後３か月のマウスまたは年齢が一致する無処置対照から採取した。スケールバーは、図５Ｄにおいて１００μｍとする。ＯＳ＝外節、ＩＳ＝内節、Ｓ＝シナプス終末。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄは、ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置が、処置後少なくとも３か月間、処置眼における錐体光受容体の保持をもたらすことを示す。錐体アレスチンについて染色したｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１研究（図６Ａ：「ＴＸなし」＝無処置；図６Ｃ：「ＴＸ」＝処置）およびｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１研究（図６Ｂ：「ＴＸなし＝無処置；図６Ｄ：「ＴＸ」＝処置）および反対側の注射していない眼からの代表的な網膜ホールマウントは、錐体光受容体が、処置後少なくとも３か月間、ＡＡＶ−ｍＧＣ１を用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスにおいて保持されることを明らかにする。錐体細胞密度は、処置および無処置マウスの中央および下位の網膜においてカウントした。有意差は、各々のウイルスベクターを用いる処置の後に両方のエリアにおいて見出された。
【図７】図７は、脊椎動物光伝達カスケードを示す。光刺激に際して、ロドプシン（Ｒ）における立体構造変化は、トランスデューシン（Ｔ）およびｃＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の活性化を含む事象のカスケードを刺激し、最終的に、ｃＧＭＰの加水分解をもたらす。細胞内ｃＧＭＰの低下は、光受容体外節膜における環状ヌクレオチド感受性チャネル（ＣＮＧ）の閉鎖を引き起こす。これらのチャネルの閉鎖は、細胞の過分極およびそのため、細胞内カルシウムにおける劇的な低下を引き起こす。カルシウムレベルが下がると、非結合グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質（ＧＣＡＰ）は、自由にグアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）を刺激することができる。ＧＣは、その目的がｃＧＭＰを産生することであるという理由で光伝達の回復フェーズにおいて役割を果たす。ｃＧＭＰのレベルがＧＣによって十分に増加されたら、ｃＧＭＰ感受性チャネルは再び開き、細胞の脱分極および暗順応状態への復帰をもたらす。
【図８】図８は、ｒｅｔＧＣ１の予測される構造および形態が、１回膜貫通領域、細胞内、および細胞外ドメインを有する他のグアニル酸シクラーゼに相同性を示すことを示す。細胞内ドメインは、「キナーゼ様」領域および触媒ドメインにさらに分けられる。ｒｅｔＧＣ１のカルシウムおよびＧＣＡＰ１依存性の調節は、細胞内ドメイン（ＫＨＤ）を通して調節される。光受容体細胞におけるカルシウム濃度が高度である場合（暗／脱分極状態）、カルシウム結合ＧＣＡＰ１は、ｒｅｔＧＣ１の活性化を予防する。光刺激に際して、カルシウムレベルは減少する。カルシウムは、ＧＣＡＰ１から解離し、それによって、ＧＣＡＰ１がｒｅｔＧＣ１を活性化するのを可能にする。ｒｅｔＧＣ１の役割は、ｃＧＭＰを産生することである。
【図９】図９は、正常（ＷＴ）対ＧＣ１ＫＯマウスにおける錐体光受容体を示す。ＷＴ錐体では、ＧＣ１は、有効にＣＮＧ感受性チャネルを再び開き、かつその暗順応／脱分極状態に細胞を戻すことができるｃＧＭＰを産生するように、正常に機能する。ＧＣ１ＫＯマウスの錐体光受容体では、ＧＣ１は、ｃＧＭＰを産生しない。この不全は、ＣＮＧ感受性チャネルの再開を妨げる。これらの細胞は、本質的に、慢性的に過分極化している（明順応）。それらは、見るために光を伝達せず（ＥＲＧの欠乏によって証明されるように）、最終的に変性するであろう。
【図１０】図１０は、コンセンサス配列を含む、ウシＧＣ１（ｂｏｖ  ＧＣ１）およびマウスＧＣ１（ｍＧＣ１）のアミノ酸配列アライメントを示す。Ｎ末端エリアに位置する可変領域を赤色の長方形によって強調する。
【図１１】図１１は、２つの例証となるベクターのマップを示す。一方は、ユビキタスプロモーターｓｍＣＢＡを含有し、他方は、光受容体特異的プロモーター、ｈＧＲＫ１を利用する。
【図１２】図１２は、ＧＣ１（赤色）およびＰＮＡレクチン（緑色）について染色したＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を注射したＧＣ１ＫＯ眼からの代表的な網膜切片が錐体外節（黄色のオーバーレイ）および杆体外節（赤色のみ）においてＧＣ１発現を示すことを示す。ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射した眼は、同じパターンを示した。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃは、ＧＣ１ＫＯマウスにおける網膜機能のＡＡＶ媒介性の回復を示す。図１３Ａ：ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（赤色）、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（緑色）、もしくはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いて約Ｐ１４に処置したＧＣ１ＫＯマウスまたは年齢が一致する同質遺伝ＧＣ１＋／＋対照の眼から記録した代表的な明所視の（錐体媒介性）結果。結果は、注射後４か月（左）、７か月（中央）、および９か月（右）目に得た。図１３Ｂ：処置ＧＣ１ＫＯマウス、無処置ＧＣ１ＫＯ、および年齢が一致する同質遺伝ＧＣ１＋／＋対照マウスにおいて１２ｃｄ／ｍ２刺激を用いて毎月生成した平均錐体ｂ波振幅。図１３Ｃ：ある期間にわたる処置対無処置ＧＣ１ＫＯマウスにおける暗所視（杆体伝達）応答。値は、処置対無処置眼における５ｃｄ／ｍ２で生成された杆体ｂ波振幅の比率を示す。３つのベクターはすべて、ＧＣ１ＫＯマウスに対して安定した長期処置効果を与え、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１が最も効率的である。
【図１４】図１４は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスを注射後７か月目に安楽死させたことを示す。ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウスは注射後９か月目に安楽死させた。これらの眼および約１１月齢ＧＣ１＋／＋マウスの眼を切片化し、ＧＣ１（緑色、上位の列）および錐体アレスチン（赤色、最下位の列）に対して産生される抗体を用いて網膜を染色した。３つの処置用ベクターはすべて、もっぱら、ＧＣ１ＫＯマウスの光受容体においてＧＣ１発現を駆動した。おそらく、このベクターの高度な力価による結果である、いくらかの網膜の菲薄化が、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウスにおいて観察された。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）およびＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ処置マウスにおけるＧＣ１発現および錐体密度／形態は、年齢が一致するＧＣ１＋／＋対照において見られるものと類似していた。これに反して、年齢が一致するＧＣ１ＫＯマウスの網膜は、ＧＣ１発現の欠如および錐体細胞密度における著しい低下を示した。
【図１５】図１５は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後７．５か月目に、あるＧＣ１ＫＯマウスを安楽死させ、その網膜をウエスタンブロットに使用したことを示す。ＧＣ１に対して特異的な抗体は、処置ＧＣ１ＫＯ眼におけるＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現のレベルが、年齢が一致する同質遺伝ＧＣ１＋／＋対照眼において見られるものと類似することを示す。グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質−１（ＧＣＡＰ１）発現（グアニル酸シクラーゼの生化学的パートナー）のレベルもまた、処置および無処置ＧＣ１ＫＯならびにＧＣ１＋／＋対照眼において評価した。以前の報告と一致して、ＧＣＡＰ１タンパク質は、無処置ＧＣ１ＫＯ眼においてダウンレギュレートされた。ＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現は、同質遺伝ＧＣ１＋／＋対照において見られるレベルに類似して、ＧＣＡＰ１発現の増加をもたらす。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を用いる注射後１１か月目の結果を示し、あるＧＣ１ＫＯマウスを安楽死させ、その網膜をホールマウントし、錐体アレスチンに対して産生される抗体を用いて染色した。免疫染色は、錐体が、上部の網膜以外において無処置ＧＣ１ＫＯ眼（図１６Ａ）において不在であることを明らかにした。ＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現は、処置眼（図１６Ｂ）の網膜の全体にわたって少なくとも１１か月間（研究した最も後の時点）、錐体光受容体を保持する。
【図１７】図１７は、ＡＡＶ８（７３３）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射したＧＣ１ＫＯマウスを注射後４か月目および７か月目に安楽死させたデータを示す。ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射したＧＣ１ＫＯマウスは、注射後７か月目および１０か月目に安楽死させた。年齢が一致するナイーブＧＣ１ＫＯマウスは、対照として使用した。処置および無処置眼からの視神経ならびに視路を含有する右および左脳の一部を単離し、ベクターゲノムの回収のために使用した。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１をＧＣ１ＫＯマウスの左眼に注射したのに対して、両方のＡＡＶ５ベクターをＧＣ１ＫＯマウスの右眼に注射したことに注意されたい。ベクターゲノムは、すべての症例において処置眼の視神経のみから回収された。ＡＡＶ５ベクターの注射後１０か月目までに、ベクターゲノムは脳から回収されなかった。最も多くのベクターゲノムは、強力で速効性のＡＡＶ８（７３３）ベクターを注射したＧＣ１ＫＯマウスから回収された。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後２か月目のＧＣｄｋｏマウスからのＯＣＴおよび杆体／錐体ＥＲＧのデータを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後２か月目のＧＣｄｋｏマウスからのＯＣＴおよび杆体／錐体ＥＲＧのデータを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後１か月目のＧＣｄｋｏマウスからの代表的な杆体および錐体ＥＲＧのデータを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後１か月目のＧＣｄｋｏマウスからの代表的な杆体および錐体ＥＲＧのデータを示す。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ基準を示す。蛍光（Ｙ軸のｌｏｇ単位）を、サイクル閾値Ｃτ値（Ｘ軸）に対してプロットする。パネルはそれぞれ、野生型、ＧＣ１＋／＋マウス（ａ）、またはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスからの網膜ｃＤＮＡを使用する、ＧＣ１およびＧａｐｄｈ転写物についての標準曲線（全網膜ｃＤＮＡの希釈系列によって生成）を示す。各々の鋳型を使用するＧＣ１およびＧａｐｄｈのプライマーセットによって生成された標準曲線は、類似しており、同様の増幅反応速度を示した。Ｃτサイクル値は、鋳型の量の減少と共に増加する。
【図２１】図２１Ａおよび図２１Ｂは、処置および無処置ＧＣ１ＫＯマウスおよびＧＣ１＋／＋対照の網膜におけるＧＣ１および錐体アレスチン発現を示す。図２１Ａ：凍結網膜横断切片の免疫組織化学的検査は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（注射後７か月目）、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（注射後１０か月目）、またはＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（注射後１０か月目）ベクターを用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスならびに８月齢無処置ＧＣ１ＫＯおよびＧＣ１＋／＋対照マウスからの網膜におけるＧＣ１（緑色、上位の列）および錐体アレスチン（赤色、最下位の列）の発現の場所を突き止めるために使用した。核は、ＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。切片はすべて、２０×倍率で画像処理し、同一の設定に暴露した。図２１Ｂ：錐体アレスチンに対する抗体を用いる、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（一方の眼のみ）を用いる処置後１１か月目のあるＧＣ１ＫＯマウスからの網膜ホールマウントの免疫染色は、無処置の反対側の対照眼（最下位、左）と比較して、処置眼（最下位の右）において錐体光受容体の著しい保持を示した。網膜ホールマウントは、それらの側頭の部分を１２時の位置とし、同様に方向づけた。ホールマウントの一部を１０×倍率で画像処理し、最終的な表示のためにともにマージした。ＯＳ＝外節；ＯＮＬ＝外顆粒層；ＩＮＬ＝内顆粒層。
【図２２】図２２Ａおよび図２２Ｂは、処置および無処置ＧＣ１ＫＯならびに無処置ＧＣ１＋／＋対照眼の錐体媒介性の網膜電位図（ＥＲＧ）を示す。図２２Ａ：ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（赤色の線）、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（緑色の線）、もしくはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（黒色の線）を用いて処置したＧＣ１ＫＯ眼または無処置の年齢が一致するＧＣ１＋／＋対照眼からの１２ｃｄ／ｍ２の光刺激によって誘発された代表的な錐体媒介性の結果。処置後４か月〜１年の間に生成された代表的な結果を示す（上位のパネル）。スケール：ｙ軸＝５０μＶ、ｘ軸＝２０ｍｓ。図２２Ｂ：最大錐体ｂ波振幅（１２ｃｄ／ｍ２で生成されたもの）をそれぞれのマウスから計算し、それぞれの処置群ならびに年齢が一致する無処置ＧＣ１ＫＯおよびＧＣ１＋／＋対照において毎月平均した。比較は、ｎ＞３を有する動物の群の間で行った。ＡＡＶ処置群はすべて、処置後６か月目のものについて統計的に比較した。ＡＡＶ５ベクターで処置した眼は、処置後９か月目のものについて統計的に比較した。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、処置および無処置ＧＣ１ＫＯおよびＧＣ１＋／＋対照眼の杆体媒介性の網膜電位図（ＥＲＧ）を示す。図２３Ａ：暗所視条件下で１ｃｄ／ｍ２の刺激によって誘発された杆体ｂ波振幅（左上）およびａ波振幅（右上）は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（黒色の丸）、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（赤色の丸）、またはＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（緑色の三角形）ベクターを用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスの処置および無処置眼において決定した。処置および無処置眼のマウス内の比率は、処置眼における最大ａまたはｂ波振幅を無処置眼における最大振幅によって割ることによって生成した。これらの比率は、すべての処置群において毎月平均した。比較は、ｎ＞３を有する動物の群の間で行った。ＡＡＶ処置群はすべて、６か月間、統計的に比較した。ＡＡＶ５ベクターもまた、９か月間、統計的に比較した。ベクター媒介性の改善は、平均比率＞０．８によって定義した。図２３Ｂ：あるＧＣ１ＫＯマウスからの代表的な杆体媒介性のＥＲＧ結果は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置眼（黒色の線）からの杆体の応答が、無処置の反対側の対照眼（緑色の線）から記録されたものよりも高かったことを示す。この処置した杆体の応答は、正常なＧＣ１＋／＋杆体応答（赤色の線）の約５０％まで修復された。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、処置および無処置ＧＣ１ＫＯマウスならびにＧＣ１＋／＋対照におけるタンパク質および転写物のレベルを示す。図２４Ａ：抗ＧＣ１および抗ＧＣＡＰ１抗体を用いてプローブした、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる処置後１０か月目のあるＧＣ１ＫＯマウス眼からの網膜溶解物のイムノブロット。抗β−アクチン抗体は、内部ローディング対照として使用した。図２４Ｂ：ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を用いて処置したあるＧＣ１ＫＯ網膜、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターを用いて処置したあるＧＣ１ＫＯ網膜における、および個々の無処置ＧＣ１ＫＯまたはＧＣ１＋／＋対照網膜における、いくつかの転写物（ＧＣ１、ＧＣＡＰ１、ＧＮＡＴ２、およびＰＤＥ６α）の半定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。試料は、標準物質としてＧａｐｄｈ特異的プライマーを使用して、三通り実行した。データは、ＧＣ１＋／＋対照と比べたｍＲＮＡレベルにおける倍数変化として示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明の例証となる実施形態は、下記に記載される。明瞭にするために、実際の実施についてのすべての特徴が本明細書において記載されるわけではない。任意のそのような実際の実施形態の開発において、実施によって相互に変化するであろうシステム関連およびビジネス関連の制約とのコンプライアンスなどのような、開発者特有の目標を達成するための多数の実施に特有の決定を下さなければならないことがもちろん十分に理解されるであろう。さらに、そのような開発努力は、複雑であり、多くの時間を要し得るが、それにもかかわらず、本開示の利益を有する当業者らにとってルーチン的な仕事になるであろうということが十分に理解されるであろう。
【００５６】
アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス−２（ＡＡＶ）は、溶菌ウイルスおよびプロウイルスの両方として増やすことができるヒトパルボウイルスである（Ｃｕｋｏｒら、１９８４年；Ｈｏｇｇａｎら、１９７２年）。ウイルスゲノムは、１４５塩基の末端逆位配列が側面に位置する（Ｌｕｓｂｙら、１９８２年）、４６７９塩基長の（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９８３年）直線状一本鎖ＤＮＡ（Ｒｏｓｅら、１９６９年）からなる。溶菌成長のために、ＡＡＶは、ヘルパーウイルスとの同時感染を必要とする。アデノウイルス（Ａｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９６５年；Ｈｏｇｇａｎ、１９６５年；Ｐａｒｋｓら、１９６７年）または単純ヘルペス（Ｂｕｌｌｅｒら、１９８１年）は、ヘルパー機能を提供することができる。ヘルパーなしで、ＡＡＶ特異的な複製または遺伝子発現の証拠はない（ＲｏｓｅおよびＫｏｃｚｏｔ、１９７２年；Ｃａｒｔｅｒら、１９８３年）。ヘルパーが利用可能でない場合、ＡＡＶは、統合プロウイルスとして存続することができる（Ｈｏｇｇａｎ、１９６５年；Ｂｅｒｎｓら、１９７５年；Ｈａｎｄａら、１９７７年；Ｃｈｅｕｎｇら、１９８０年；Ｂｅｒｎｓら、１９８２年）。
【００５７】
統合は、明らかに、ＡＡＶ末端および宿主配列の間の組換えを伴い、ほとんどのＡＡＶ配列は、プロウイルスにおいて損なわれないままである。ＡＡＶが宿主ＤＮＡの中に統合する能力は、明らかに、ヘルパーウイルスの非存在下においてＡＡＶ配列の生存を確実にするための固有の戦略である。ＡＡＶプロウイルスを保持する細胞が、続いて、ヘルパーに重感染すると、統合ＡＡＶゲノムは奪回され、増殖性の溶菌サイクルが起こる（Ｈｏｇｇａｎ、１９６５年）。
【００５８】
原核生物プラスミドの中にクローニングされたＡＡＶ配列は、感染性である（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２年）。たとえば、野生型ＡＡＶ／ｐＢＲ３２２プラスミド、ｐＳＭ６２０がアデノウイルスの存在下においてヒト細胞の中にトランスフェクトされる場合、ＡＡＶ配列は、プラスミドから奪回され、正常なＡＡＶ溶菌サイクルが続いて起こる（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２年）。これは、組換えプラスミド中のＡＡＶ配列を修飾し、次いで、ヒト細胞の中にこのプラスミドをトランスフェクトすることによって変異体のウイルス株を成長させることを可能にする（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３年；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、１９８４年）。ＡＡＶは、表現型が別個の少なくとも３つの領域を含有する（Ｈｅｒｍｏｎａｔら、１９８４年）。ｒｅｐ領域は、ＤＮＡ複製および組換えプラスミドからの奪回のために必要とされる、１つまたは複数のタンパク質をコードするが、ｃａｐおよびｌｉｐ領域は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするように思われ、これらの領域内の変異体は、ＤＮＡ複製が可能である（Ｈｅｒｍｏｎａｔら、１９８４年）。ＡＡＶ末端がＤＮＡ複製に必要とされることが示されてきた（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３年）。
【００５９】
Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８３年）は、それぞれがＡＡＶの全ＤＮＡゲノムを含有する２つのＥ．ｃｏｌｉハイブリッドプラスミドの構築ならびにＡＡＶゲノムの奪回および複製に成功する、ヘルパーアデノウイルスの存在下におけるヒト細胞系の中への組換えＤＮＡのトランスフェクションについて記載している（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４年ａ；１９８４年ｂもまた、参照されたい）。
【００６０】
それがいかなる病原性の応答をも誘発せず、宿主細胞染色体の中に統合することができるので、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子移入にとって特に魅力的である（Ｋｏｔｉｎら、１９９０年）。ＡＡＶ末端リピート（ＴＲ）は、染色体統合のための最適な本質的なシス構成要素である（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｉｎ、１９８８年）。これらのＴＲは、プロモーター活性を有することが報告されている（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３年）。それらは、細胞質から核への効率的な遺伝子移入を促進し得るまたはプラスミドＤＮＡの安定性を増加させ、かつより長く続く遺伝子発現を可能にし得る（ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＳａｍｕｌｓｋｉ、１９９８年）。ＡＡＶ  ＴＲを含有する組換えプラスミドＤＮＡを使用する研究は、相当な関心を引きつけてきた。ＡＡＶベースのプラスミドは、ほとんどの細胞型においてＡＡＶのＴＲを欠く同一のプラスミドよりも高度でより長い導入遺伝子発現を駆動することが示されてきた（Ｐｈｉｌｉｐら、１９９４年；Ｓｈａｆｒｏｎら、１９９８年；Ｗａｎｇら、１９９８年）。
【００６１】
発現ベクターとしてｒＡＡＶを使用する可能性を研究するように研究者に促したいくつかの要因がある。１つは、宿主染色体の中に統合するために遺伝子を送達するための必要条件が、驚くほどわずかであるということである。１４５−ｂｐ  ＩＴＲを有することが必要であり、これらはＡＡＶゲノムのわずか６％である。これは、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入を構築するための、ベクターにおける余地を残す。この運搬能力はＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げるかもしれないが、それは、本発明のアンチセンス構築物の送達に十分に適している。
【００６２】
ＡＡＶはまた、その安全性により送達ビヒクルについて好適な選択肢となる。比較的複雑な奪回メカニズムがある：野生型アデノウイルスだけでなくＡＡＶ遺伝子もまた、ｒＡＡＶを用意するのに必要とされる。さらに、ＡＡＶは病原性でなく、いかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小限にし、そのため、ｒＡＡＶは、炎症反応を引き起こさない。ＡＡＶは、そのため、本発明のグアニル酸シクラーゼコードポリヌクレオチドの送達のための理想的な候補に相当する。
【００６３】
ｒＡＡＶベクターの産生
ｒＡＡＶベクターを産生するための従来のプロトコールは、一般に、３つの構成要素の系に基づいてきた。この系の１つの構成要素は、ｒＡＡＶとしてパッケージされることとなる組換えＤＮＡをコードするプロウイルスプラスミドである。この組換えＤＮＡは、ベクターの複製およびパッケージングを指示する最小のシス作用性ＡＡＶ−２配列である１４５塩基対（ｂｐ）ＡＡＶ−２末端逆位配列（ＩＴＲ）の間に位置する。系の第２の構成要素は、ＡＡＶ−２遺伝子、ｒｅｐ、およびｃａｐをコードするプラスミドである。ＡＡＶ−２  ｒｅｐ遺伝子は、ｒＡＡＶゲノムを複製し、複製中間体を分離し、次いで、一本鎖ｒＡＡＶゲノムをパッケージするようにトランスで作用する４つのＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ  ７８、６８、５２、および４０）をコードする。ＡＡＶ−２  ｃａｐ遺伝子は、ウイルスカプシドを含む３つの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）をコードする。ＡＡＶ−２が単独でうまく複製しないので、ｒＡＡＶパッケージング系の第３の構成要素は、他のＤＮＡウイルスからのヘルパー機能のセットとなる。これらのヘルパー機能は、ｒＡＡＶ複製およびパッケージングが効率的に起こることができる細胞環境を築く。アデノウイルス（Ａｄ）によって提供されるヘルパー機能は、ｒＡＡＶを産生するためにほとんど独占的に使用されてきており、遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡ  ＲＮＡによってコードされる。複製およびパッケージングがトランスフェクションによって起こる細胞の中に系の最初の２つの構成要素が一般に導入されるが、ａｄヘルパー機能は、野生型Ａｄウイルスによる重感染によって導入される。
【００６４】
従来のｒＡＡＶ産生技術は、トランスフェクションにおける固有の非効率のために大量のベクターを産生するそれらの能力が限られている。深刻な問題点はまた、トランスフェクションのスケールが増加する場合にも遭遇する。ウイルス複製のために必要とされるが、限られた量でのみ存在する細胞およびウイルス基質についてＡｄが競合し得るので、野生型Ａｄにとっての必要条件はまた、産生されるｒＡＡＶの量を低下させるかもしれない。従来の産生プロトコールにおいて遭遇する他の問題は、Ａｄによる重感染が、産生されるｒＡＡＶからのＡｄの精製にとって有効な手順の開発を必要とすることである。これらの精製プロセスがｒＡＡＶ調製物のＡｄコンタミネーションの排除に一般に成功するが、それらはまた、ｒＡＡＶ力価を低下させもする。ｒＡＡＶのＡｄコンタミネーションにとってストリンジェントなアッセイもまた、必要である。
【００６５】
ｒＡＡＶを産生するために、二重同時トランスフェクション手順は、１：１のモル比で、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要とされるＡｄヘルパー遺伝子を保持するｐＤＧ（Ｇｒｉｍｍら、１９９８年）ＡＡＶヘルパープラスミドと一緒にｒＡＡＶ移行ベクタープラスミドを導入するために使用する。トランスフェクションにおいて使用されるプラスミドＤＮＡは、従来のアルカリ性溶解／ＣｓＣｌ勾配プロトコールによって精製する。トランスフェクションは、以下のように実行する：２９３細胞は、実験の前の日に１：２に分離し、その結果、トランスフェクトされた場合、細胞コンフルエンスは約７５〜８０％となる。１０枚の１５ｃｍプレートを１つのバッチとしてトランスフェクトする。ＣａＰＯ４沈降物を作製するために、０．７ｍｇのｐＤＧを、０．２５ＭのＣａＣｌ２の１２．５ｍＬの全容量において１８０μｇのｒＡＡＶ移行ベクタープラスミドと混合する。古い培地を細胞から除去し、ＣａＰＯ４−沈降物の形成は、３７℃に予熱した１２．５ｍｌの２×ＨＢＳ（ｐＨ７．０５）をＤＮＡ−ＣａＣｌ２溶液に追加することによって開始する。ＤＮＡは、１分間インキュベートし、次いで、２００ｍＬの予熱したＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳの中への混合物の移入により、沈降物の形成を停止する。２２ｍＬの培地は、それぞれのプレートの中に直ちに分注し、細胞は、４８時間、３７℃でインキュベートする。細胞生存率を損なうことなく、全インキュベーション期間の間、細胞上にＣａＰＯ４−沈降物を維持させる。トランスフェクションの４８時間後に、細胞は、１０分間、１，１４０×ｇで遠心分離によって収集する。次いで、細胞は、ドライアイス−エタノールおよび３７℃のバスにおける３回の凍結／解凍サイクルによって、１５ｍｌの０．１５Ｍ  ＭｇＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中で溶解する。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ、高純度）を混合物（５０Ｕ／ｍＬ最終濃度）に追加し、溶解物を３７℃で３０分間、インキュベートする。溶解物は、２０分間、３，７００×ｇで遠心分離によって浄化し、ウイルス含有上清は、不連続濃度勾配を使用してさらに精製する。
【００６６】
典型的な不連続ステップ勾配は、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ）の６０％（重量／容量）の無菌溶液を使用して調製したイオジキサノール、５，５”［（２−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｉ）−１−３−プロパンジイル）−ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’ビス（ｂｉ），（２，３ジヒドロキシプロピル−２−４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド（ｅｎｚｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）］をそれほど高密度でない細胞溶解物の下層にし（ｕｎｄｅｒｌａｙｅｒ）、細胞溶解物を移動させることによって形成される。特に、１５ｍＬの浄化溶解物を、１／２７×８９ｍｍスパイナル針を装備したシリンジを使用して、Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ  ２５×８９−ｍｍ遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ）の中に移入する。チューブの続く充填および密閉に干渉するであろう気泡を回避するように注意する。変速蠕動ポンプ、Ｍｏｄｅｌ  ＥＰ−１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）は、順番に、フェノールレッド（イオジキサノール溶液１ｍｌ当たり、２．５μＬの０．５％原液）を含有するＰＢＳ−ＭＫ緩衝剤中９ｍＬの１５％イオジキサノールおよび１Ｍ  ＮａＣｌ；ＰＢＳ−ＭＫ緩衝剤中、５ｍＬの４０％イオジキサノール；最後に、フェノールレッド（０．１μＬ／Ｌ）を含有するＰＢＳ−ＭＫ緩衝剤中、５ｍＬの６０％イオジキサノールを下に置くために使用する。チューブは、密閉し、１８℃で１時間、３５０，０００×ｇでＴｙｐｅ  ７０  Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において遠心分離する。透明な４０％の段階の４ｍｌは、最上部に斜面を有する１８ゲージ針を装備したシリンジを用いて側面でチューブを刺した後に吸引する。イオジキサノール画分は、従来のヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィーを使用して、さらに精製する。
【００６７】
クロマトグラフィーのために、典型的に、あらかじめパックされた２．５ｍＬヘパリンアガロースＩ型カラム（Ｓｉｇｍａ）を、重力下で、２０ｍＬのＰＢＳ−ＭＫを用いて平衡化する。次いで、ｒＡＡＶイオジキサノール画分を、あらかじめ平衡化したカラムにかけ、カラムを１０ｍＬのＰＢＳ−ＭＫを用いて洗浄する。ｒＡＡＶは、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝剤を用いて溶出する。溶出緩衝剤を適用した後、溶出剤の最初の２ｍｌは廃棄し、ウイルスは、溶出緩衝剤の続く３．５ｍＬ中に収集される。
【００６８】
次いで、ウイルスは、メーカーの指示に従って、ＢＩＯＭＡＸ（登録商標）１００  Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を通して遠心分離によって濃縮し、脱塩する。高塩緩衝剤は、繰り返し、乳酸加リンガー溶液を用いて濃縮ウイルスを希釈し、ゲノム含有粒子および感染性ｒＡＡＶ粒子の両方の力価を再び求めることによって変化させる。従来のドットブロットアッセイ、定量的競合的ＰＣＲ（ＱＣ  ＰＣＲ）アッセイ、またはより最近では定量的リアルタイムＰＣＲ（ａＲＴ−ＰＣＲ）が、物理的粒子力価を決定するために使用される（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、２００２年；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）。感染性力価は、感染中心アッセイ（ＩＣＡ）およびＧＦＰの発現をスコア化する蛍光細胞アッセイ（ＦＣＡ）によって決定される（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、２００２年）。
【００６９】
ＱＣ  ＰＣＲ方法は、反応チューブにおける既知濃度の内部標準プラスミドとの特異的な標的配列の競合的同時増幅に基づく。それは、ウイルス粒子の正確で急速な定量化をもたらす。内部標準は、特異的な鋳型と共にプライマー認識部位を有していなければならない。特異的な鋳型および内部標準の両方は、同じ効率でＰＣＲ増幅されなければならず、ＰＣＲ増幅産物を別々に分析することが可能でなければならない。鋳型および内部標準を区別するための最も容易な方法は、２つの産物においてサイズ差異を組み込むことである。これは、たとえば、特異的な標的と同じ配列を有するが、欠失を含有する標準物質を構築することによって達成することができる。次いで、定量化は、特異的な鋳型のＰＣＲシグナルを、既知濃度の競争者（内部標準）により得られたＰＣＲシグナルと比較することによって実行される。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、公知のＤＮＡ標準物質に対するリアルタイムにおけるＰＣＲ産物形成の比較によって未知の試料のＤＮＡ濃度を評価するための標準的な方法である。
【００７０】
精製ウイルス株は、あらゆるコンタミネーションしている、パッケージにされていないＤＮＡを消化するためにＤＮＡｓｅＩを用いて最初に処理する。１０μＬの精製ウイルス株は、３７℃で、１時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する１００μＬ反応混合物において、１０ＵのＤＮＡｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  ａｍ  Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートする。反応の終わりに、１０μＬの１０×プロテイナーゼＫ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ最終濃度）を追加し、その後に続けて１μＬのプロテイナーゼＫ（１８．６ｍｇ／ｍＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を追加した。混合物は、１時間、３７℃でインキュベートした。ウイルスＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出（２回）によって精製し、その後に、キャリアとして１０μｇのグリコーゲンを使用するクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を続けた。ＤＮＡペレットは、１００μＬの水中に溶解した。ＱＣ  ＰＣＲ反応混合物はそれぞれ、１μＬの希釈ウイルスＤＮＡおよびｐｄｌ−ＧＦＰなどのような内部標準プラスミドＤＮＡの２倍段階希釈溶液を含有した。標準ＤＮＡの最も信頼できる範囲は、１〜１００ｐｇであることが分かった。次いで、２つのＰＣＲ産物が分離するまで、それぞれの反応の一定分量を２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。臭化エチジウム染色ゲルのアナログ画像は、ＩｍａｇｅＳｔｏｒｅ  ７５００システム（ＵＶＰ；Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してデジタル化した。それぞれのレーンにおける標的および競争者のバンドの密度は、ＺＥＲＯ−Ｄｓｃａｎ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍバージョン１．０（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して測定し、それらの比率は、標準ＤＮＡ濃度の関数としてプロットする。ウイルスＤＮＡ分子の数が競争者ＤＮＡ分子の数に等しい１．０の比率は、ウイルス株のＤＮＡ濃度を決定するために使用した。
【００７１】
先に公開されたプロトコール（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年）の改良版は、ウイルスがＣ１２細胞に感染し、脱殻し（ｕｎｐａｃｋａｇｅ）、かつ複製する能力を測定するために使用した。手短かに言えば、統合ｗｔＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（Ｃｌａｒｋら、１９９５年）を含有するＣ２細胞は、約７５％のコンフルエンスで９６ウェル皿において平板培養し、次いで、２０のＭ．Ｏ．ＩでＡｄ５を感染させた。段階希釈ｒＡＡＶ−ｓＣＮＴＦのうちの１μＬを蛍光顕微鏡を使用して、視覚によってスコア化した。高感度ＣＨＲＯＭＡフィルター♯４１０１２  ＨｉｇｈＱ  ＦＩＴＣ  ＬＰ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌ、ＶＡ、ＵＳＡ）を、蛍光をモニターするために使用した。ハイブリダイゼーションによって力価を計算するために、本質的に先に記載されるように（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年）、細胞を収集し、処理した。
【００７２】
医薬組成物
ある実施形態では、本発明は、単独でまたは療法の１つまたは複数の他の様式と組み合わせて細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される溶液における、本明細書において開示される１つまたは複数のｒＡＡＶ−グアニル酸シクラーゼ組成物の処方物に関する。
【００７３】
所望される場合、本明細書において開示される処置用遺伝子産物を発現する核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡ組成物は、グアニル酸シクラーゼポリペプチドの１つまたは複数の全身性または局所的な投与を含めて、たとえばタンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な作用物質などのような他の作用物質と組み合わせて同様に投与されてもよいこともまた、理解されるであろう。実際、さらなる作用物質が標的細胞または宿主組織との接触に際して有意な副作用を引き起こさないとすれば、含まれていてもよい他の構成要素は事実上、限定されない。ｒＡＡＶベクターグアニル酸シクラーゼ組成物は、したがって、特定の実例において必要とされる様々な他の作用物質と共に送達されてもよい。そのような組成物は、宿主細胞もしくは他の生物学的供給源から精製されてもよいまたはその代わりに、本明細書において記載されるように化学的に合成されてもよい。同様に、そのような組成物は、置換または誘導体化ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡ組成物をさらに含んでいてもよい。
【００７４】
たとえば、たとえば眼、網膜、および網膜下注射などを含む、動物内の１つまたは複数の細胞または組織のタイプへの経口、非経口、静脈内、鼻腔内、筋肉内、および直接的な投与を含む、様々な処置レジメンにおいて本明細書において記載される特定の組成物を使用するのに適した投薬および処置レジメンの開発のように、薬学的に許容される賦形剤およびキャリア溶液の処方物は、当業者らに周知である。
【００７５】
典型的に、活性成分（複数可）のパーセンテージはもちろん変化してもよいが、これらの処方物は、活性化合物の少なくとも約０．１％以上を含有してもよく、好都合に、処方物の全体の重量または容量の約１または２％〜約６０％または７０％以上であってもよい。天然に、それぞれの処置的に有用な組成物における活性化合物（複数可）の量は、適した投薬量が化合物の所与のユニット用量において得られるように、調製されてもよい。溶解性、生物学的利用率、生物学的半減期、投与のルート、産物有効期間などのような要因ならびに他の薬理学的考慮は、そのような医薬処方物を調製する当業者によって企図されるであろう、また、そのため、様々な投薬量および処置レジメンは望ましくてもよい。
【００７６】
ある状況では、記載されるように、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に本明細書において開示される医薬組成物を送達することは望ましいであろう（たとえば、それぞれ、それに対する明白な参照によってその全体が本明細書において明確に組み込まれる米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号、および米国特許第５，３９９，３６３号を参照されたい）。フリーベース（ｆｒｅｅｂａｓｅ）または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどのような界面活性剤と適宜混合された水において調製されてもよい。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物においてならびに油において調製されてもよい。保存および使用の通常の状態下で、これらの調製物は、微生物の増殖を予防するために保存剤を含有する。
【００７７】
注射用の使用のために適した医薬形態は、無菌注射用溶液または分散液の即席の調製のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末を含む（たとえば、それに対する明白な参照によってその全体が本明細書において明確に組み込まれる米国特許第５，４６６，４６８号を参照されたい）。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。それは、製造および保存の状態下で安定していなければならず、細菌および菌類などのような微生物のコンタミネーション作用に対して保存されなければならない。たとえば、キャリアは、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他同種のもの）、その適した混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動度は、たとえば、レシチンなどのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されてもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびその他同種のものによってもたらすことができる。多くの場合では、等張剤、たとえば糖、塩化ナトリウムを含むことは好ましいであろう。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質の組成物、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンにおける使用によってもたらすことができる。
【００７８】
水溶液における非経口投与については、たとえば、溶液は、必要ならば、適宜緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、最初に、十分な食塩水またはグルコースと等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与にとりわけ適している。これに関連して、利用することができる無菌水性溶媒は、本発明の開示に照らして当業者らに公知であろう。たとえば、ある投薬量は、１ｍｌの等張性のＮａＣｌ溶液中に溶解され、１０００ｍＬの皮下注入液に追加されてもよいまたは注入の提唱される部位に注射されてもよい（たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。投薬量におけるいくらかの変動は、処置されている対象の状態に依存して必ず起こるであろう。投与の担当者は、少なくとも、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与のために、調製物は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ’ｓ（ＦＤＡ）Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって必要とされる無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度基準を満たさなければならない。
【００７９】
無菌注射用溶液は、必要に応じて、本明細書において列挙される様々な他の成分と共に適切な溶媒において必要とされる量で活性化合物を組み込み、その後に無菌濾過をすることによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルの中に様々な無菌活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、そのあらかじめ無菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望される成分の粉末を得る減圧乾燥および凍結乾燥技術である。
【００８０】
本明細書において開示される組成物は、中性または塩形態において処方されてもよい。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含み、これらは、たとえば塩酸もしくはリン酸などのような無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、およびその他同種のものなどの有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などのような無機塩基ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン、およびその他同種のものなどの有機塩基にも由来し得る。処方に基づいて、溶液は、投薬処方物と適合する様式でおよび処置的に有効である量で投与されるであろう。処方物は、注射用溶液、薬剤放出カプセル、およびその他同種のものなどのような様々な剤形において容易に投与される。
【００８１】
本明細書において使用されるように、「キャリア」は、任意のおよびすべての溶媒、分散培地、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、キャリア溶液、懸濁液、コロイド、ならびにその他同種のものを含む。医薬活性物質に対するそのような培地および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の培地または作用物質が活性成分と不適合性である場合を除いて、処置用組成物におけるその使用は、企図される。補足活性成分もまた、組成物の中に組み込むことができる。
【００８２】
語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応または同様の好ましくない反応をもたらさない分子要素および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。典型的に、そのような組成物は溶液か懸濁剤のいずれかとして注射液として調製される。注射前の、液体中の溶液または懸濁剤に適している固体形態もまた、調製することができる。調製物はまた、乳化することもできる。
【００８３】
配列比較、同一性、および相同性
配列比較および相同性決定のために、典型的に、一方の配列は、試験配列を比較する参照配列として果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要ならば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比べた、試験配列（複数可）についての配列同一性パーセントを計算するために使用することができる。
【００８４】
比較のための配列の最適なアライメントは、たとえば、局所性相同性アルゴリズムによって（たとえばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１年を参照されたい）、相同性アライメントアルゴリズムによって（たとえばＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年を参照されたい）、類似性検索比較法によって（たとえばＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８年を参照されたい）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのようなアルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションによって、または目視検査によって、行うことができる。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスである（たとえばＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９年を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００８５】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析をも実行する（たとえばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年を参照されたい）。有用な配列アライメントアルゴリズムの他の例は、プログレッシブペアワイズアライメントを使用して関連する配列の群から多数の配列アライメントを生成するＰＩＬＥＵＰプログラムである。それはまた、アライメントを生成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブアライメント比較法を単純化したものを使用し（たとえばＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８７年を参照されたい）、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９年）によって記載されるものに類似する一般的なアライメントマトリックスを用いる。
【００８６】
処置用のキットおよび診断キット
本発明はまた、本明細書において記載されるように、特定のｒＡＡＶ−グアニル酸シクラーゼ処方物の処方においてならびにＬＣＡ１のような網膜ジストロフィーなどのような、１つまたは複数のグアニル酸シクラーゼ欠損状態のための、哺乳動物および特にヒトへの投与のための処置剤の調製物において用いられてもよい１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、キャリア、希釈剤、アジュバント、および／または他の構成要素と一緒に１つまたは複数の組成物を包含する。特に、そのようなキットは、哺乳動物におけるそのような障害の処置においてウイルスベクターを使用するための説明書と組み合わせて１つまたは複数のｒＡＡＶベクターグアニル酸シクラーゼ組成物を含んでいてもよく、典型的に好都合な商業包装のために用意される容器をさらに含んでいてもよい。
【００８７】
そのため、本明細書において開示される医薬組成物の投与のための好ましい動物は、哺乳動物、特にヒトを含む。他の好ましい動物は、非ヒト霊長類、マウス、エピン、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ（ｈｉｒｃｉｎｅ）、オオカミ、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅ）、キツネ（ｖｕｌｐｉｎｅ）、ブタ、イヌ、ネコ、およびその他同種のものを含む。組成物は、単独でまたは１つまたは複数のさらなる活性成分と組み合わせて、部分的にまたは著しく精製されたｒＡＡＶ−グアニル酸シクラーゼ組成物を含んでいてもよく、さらなる活性成分は、天然もしくは組換え供給源から得られてもよいまたは天然に入手可能であってもよいもしくは化学的に合成されてもよいまたはその代わりに、そのようなさらなる活性成分をコードするＤＮＡセグメントを発現する組換え宿主細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて産生されてもよい。
【００８８】
本明細書において開示される少なくとも１つの組成物および処置剤として組成物を使用するための説明書を含む処置用のキットもまた、調製されてもよい。そのようなキットのための容器手段は、典型的に、開示されるｒＡＡＶ組成物（複数可）が配置され、好ましくは、適宜、小分けされてもよい少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含んでいてもよい。第２のグアニル酸シクラーゼ組成物もまた、提供される場合、キットはまた、この第２の組成物が配置されてもよい第２の別個の容器手段を含有してもよい。その代わりに、複数のグアニル酸シクラーゼ組成物は、単一の医薬組成物において調製されてもよく、バイアル、フラスコ、シリンジ、ボトル、または他の適した単一の容器手段などのような単一の容器手段においてパッケージされてもよい。本発明のキットはまた、典型的に、たとえば、所望のバイアル（複数可）が保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器などのような、商品の販売のための厳重な管理下にバイアル（複数可）を含有するための手段を含むであろう。
【００８９】
動物細胞における発現
発明者らは、本発明の処置用グアニル酸シクラーゼポリペプチドをコードする連続した核酸配列を含むポリヌクレオチドが、形質転換宿主細胞における１つまたは複数の細胞の欠陥を処置するために利用されてもよいことを企図する。そのような細胞は、好ましくは、ヒトもしくは非ヒト霊長類からまたは限定を伴うことなく、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、エピン、ネコ、ヒツジ、ヤギ、オオカミ、ウサギ、ブタ、およびその他同種のものを含む１つもしくは複数の哺乳動物種から得られるものなどのような哺乳動物細胞を含む動物細胞である。そのような障害に罹患していることが疑われているまたはそのような状態を発症する危険性があるヒト対象におけるＬＣＡ１などのような網膜ジストロフィーのまたは関連する網膜または眼疾患、障害、状態、もしくは機能不全の１つまたは複数の症状の処置および／または改善のためのそのような構築物の使用は、特に、本発明者らによって企図される。
【００９０】
細胞は、対象の１つまたは複数の処置用グアニル酸シクラーゼ遺伝子を含む１つまたは複数のｒＡＡＶベクターを用いて形質転換されてもよく、動物の宿主細胞の中に導入され、発現される遺伝子構築物は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｓｉｔｕ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有害なもしくは疾患状態（複数可）またはその１つもしくは複数の症状を改変する、低下させる、改善させる、または予防するのに十分である。
【００９１】
グアニル酸シクラーゼ
グアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）（ＥＣ  ４．６．１．２）は、３’，５’環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）およびピロリン酸へのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の変換を触媒するリアーゼである。その代わりに、文献において「グアニルシクラーゼ」または「グアニリルシクラーゼ」と呼ばれるように、ＧＣの膜結合（１型）および可溶性（２型）形態の両方が存在する。
【００９２】
レーバー先天黒内障
レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、すべての遺伝性網膜ジストロフィーのうちで最も初期の最も多い重症の形態に相当する疾患の常染色体劣性群である。この遺伝的にかつ臨床的に異質性の疾患の発病において関係し、そのため、ＬＣＡ１座に割り当てられた最初の遺伝子は、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ−１（Ｇｕｃｙ２ｄ）であった（Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９６年）。Ｇｕｃｙ２ｄは、光受容体外節膜において主に発現され、これらの細胞内のｃＧＭＰおよびＣａ２＋のレベルの調節において役割を果たす網膜特異的タンパク質グアニル酸シクラーゼ（ｒｅｔＧＣ１）をコードする。光刺激に続いて、光受容体外節内のｃＧＭＰのレベルは、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）による加水分解によって急速に下がる。ｃＧＭＰのこの低下は、ｃＧＭＰ感受性チャネルの閉鎖、Ｃａ２＋流入の低下、および細胞の過分極に至る。細胞内Ｃａ２＋におけるこの減少は、ＧＣの活性を調節するカルシウム結合タンパク質のファミリーであるグアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質（ＧＣＡＰ）とのその相互作用を介して、光に刺激された光受容体の暗状態への回復を刺激する。暗順応光受容体では、Ｃａ２＋結合ＧＣＡＰは、ＧＣの活性を阻害する。しかしながら、光刺激に際して、Ｃａ２＋なしのＧＣＡＰは、ｃＧＭＰレベルの増加、ｃＧＭＰ感受性チャネルの再開、および脱分極状態への細胞の復帰をもたらすＧＣの活性を刺激する。ＬＣＡ１における症例のように、ＧＣが細胞内ｃＧＭＰを補充し、ｃＧＭＰ感受性カチオンチャネルを再び開く能力を低下させるまたは消滅させる変異は、杆体および錐体光受容体において慢性の光暴露と生化学的に等価な状態を引き起こすと考えられる。
【００９３】
Ｇｕｃｙ２ｄにおける変異は、ＬＣＡのすべての症例の約１５％を占め、それをこの疾患の主要原因にしている。ＬＣＡ１によって冒された患者の数は、ＡＡＶ媒介性の遺伝子療法治験の成功が最近、世界的な注目を集めた形態である、その疾患の周知のＲＰＥ６５バージョン（ＬＣＡ２）によって冒された患者のおよそ２倍である。ＬＣＡ１の診断は、典型的に、全盲または著しく損なわれた視力、網膜電位図（ＥＲＧ）の消滅、および振子様眼振を有する幼児において出生後最初の数か月以内に成される（Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９９年；ＣｈｕｎｇおよびＴｒａｂｏｕｌｓｉ、２００９年）。これらの機能的な欠乏にもかかわらず、ＬＣＡ１患者は、正常な眼底を示し（Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９９年）、黄斑および周辺部網膜の両方においていくつかの杆体および錐体光受容体を何年間も保持する（Ｍｉｌａｍら、２００３年；Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉら、２００７年；Ｐａｓａｄｈｉｋａら、２００９年）。中央の黄斑および中心窩周囲エリアをスキャンするためにスペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤＯＣＴ）を使用して、最近の研究は、ＬＣＡ１患者（年齢範囲、２０〜５３歳）が、目に見える光受容体内／外節接合部と共に６つの網膜層をすべて保持することを明らかにした。ＬＣＡ１における網膜構造の維持は、年齢と共に一般に悪化する網膜菲薄化を示す著しい疾患の他の形態と異なる（Ｐａｓａｄｈｉｋａら、２００９年）。網膜構造の保持がＬＣＡ１患者におけるよりよい視覚と相応しないが、彼らが、将来の処置戦略により適していることを示唆する。
【００９４】
動物モデル
ｒｅｔＧＣ１遺伝子中にヌル変異を保持する２つの動物モデル、天然に存在するＧＵＣＹ１＊Ｂニワトリおよびグアニル酸シクラーゼ−１（ＧＣ１）ノックアウトマウスは、遺伝子置換療法を評価するために使用されてきた（たとえばＷｉｌｌｉａｍｓら、２００６年；Ｈａｉｒｅら、２００６年を参照されたい）。ＧＵＣＹ１＊Ｂニワトリは、孵化時に盲目であり、暗所視（杆体媒介性）および明所視（錐体媒介性）ＥＲＧの消滅ならびに網膜変性を示す（たとえばＵｌｓｈａｆｅｒら、１９８４年；Ｈｕａｎｇら、１９９８年；Ｓｅｍｐｌｅ−Ｒｏｗｌａｎｄら、１９９８年を参照されたい）。ＧＵＣＹ１＊Ｂ網膜へのＧｕｃｙ２ｄのレンチウイルス媒介性の移行は、行動的な試験およびＥＲＧによって証明されるようにこれらの動物の視力を修復した（たとえばＷｉｌｌｉａｍｓら、２００６年を参照されたい）。短期処置の成功にもかかわらず、この療法は、長期における網膜構造または機能の保持に至らなかった。卵内に送達された、統合ウイルスベクターにより非哺乳動物種において得られたこの結果の一時的な性質は、臨床適用の発展に向けたより適切でトランスレーショナルな研究の必要性を示唆した。
【００９５】
ＬＣＡ１の哺乳動物モデル、ＧＣ１ＫＯマウスは、錐体光受容体変性を示す（たとえばＹａｎｇら、１９９９年；Ｃｏｌｅｍａｎら、２００４年を参照されたい）。ＬＣＡ１患者のように、このマウスモデルにおける錐体機能の損失は、錐体変性に先行する（Ｙａｎｇら、１９９９年）。さらに、錐体アレスチンの光誘発性の移動は、破壊されている。このモデルにおける杆体光受容体は、変性せず、光に対する電気的な応答を生成し続け（Ｙａｎｇら、１９９９年）、これは、おそらく、これらの細胞における、ＧＣ１の密接な類縁体であるＧＣ２の存在による結果である（たとえばＬｏｗｅら、１９９５年；Ｙａｎｇら、１９９５年；ＹａｎｇおよびＧａｒｂｅｒｓ、１９９７年；Ｋａｒａｎら、２０１０年を参照されたい）。出生後のＧＣ１ＫＯ網膜へのＧｕｃｙ２ｄのＡＡＶ媒介性の移行は、形質導入された細胞において錐体アレスチンの光駆動性の移動を修復したが、錐体ＥＲＧ応答を修復せず、錐体変性を予防しなかった（Ｈａｉｒｅら、２００６年）。同じ研究者によって行われた、ニワトリおよびマウスの両方の研究において、処置用ｃＤＮＡは、ＧＣ１の機能性を評価する生化学的アッセイにおいて歴史的に使用されるタンパク質種であるウシ起源のものであった（Ｏｔｔｏ−Ｂｒｕｃら、１９９７年；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００６年）。
【００９６】
例示的な定義
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および組成物も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および組成物が、本明細書において記載される。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
【００９７】
長年の特許法条約に従って、請求項を含む本出願において使用される場合の用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、「１つまたは複数の」を意味する。
【００９８】
本明細書において使用されるように、用語「約」は、一連の数字における両方の数について言及するように一般に理解されたい。たとえば、「約１〜１０」は、「約１〜約１０」と理解されたい。さらに、本明細書における数の範囲はすべて、範囲内のそれぞれの全整数およびそれぞれの１０分の１を含むことが理解されたい。本明細書において使用される用語「約」は、「およそ」を意味するように一般に理解されたい、また、典型的に、一連の数字の範囲内に列挙された所与の数とおよそ等しい数を指す。さらに、本明細書における数の範囲はすべて、範囲内のそれぞれの全整数を含むことが理解されたい。
【００９９】
本発明に従って、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列、およびその他同種のものは、天然の供給源から得られた、化学的に合成された、修飾された、または他の場合には、人の手によって全体的にもしくは部分的に調製されたもしくは合成されたＤＮＡ（ゲノムまたはゲノム外（ｅｘｔｒａｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、ヌクレオシド、ならびに適した核酸セグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
本明細書において使用されるように、用語「核酸」は、１つまたは複数のタイプのポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプリンもしくはピリミジン塩基または修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド（脱塩基部位を含む）を含む。本明細書において使用される用語「核酸」はまた、サブユニットの間のホスホジエステル連結によってであるが、いくつかの場合にはホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびその他同種のものによって共有結合されるリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーを典型的に含む。「核酸」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。例示的な核酸は、限定を伴うことなく、ｇＤＮＡ；ｈｎＲＮＡ；ｍＲＮＡ；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体ＲＮＡ（ｓｎＯＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、ならびにその他同種のもの、ならびにその任意の組み合わせを含む。
【０１０１】
本明細書において使用されるように、用語「ＤＮＡセグメント」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡ分子を指す。そのため、本明細書において開示される組成物の１つを使用して、生物学的試料から得られるＤＮＡセグメントは、それらが得られる特定の種の全ゲノムＤＮＡから単離されたまたは精製された１つまたは複数のＤＮＡセグメントを指す。ＤＮＡセグメントおよびそのようなセグメントのより小さな断片ならびにたとえば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、およびその他同種のものを含む組換えベクターは、用語「ＤＮＡセグメント」内に含まれる。
【０１０２】
同様に、用語「ＲＮＡセグメント」は、特定の種の全細胞ＲＮＡから単離されたＲＮＡ分子を指す。そのため、ＲＮＡセグメントは、他のＲＮＡから単離されたまたは精製された１つまたは複数のＲＮＡセグメント（天然または合成起源）を指すことができる。ＲＮＡセグメントおよびそのようなセグメントのより小さな断片は、用語「ＲＮＡセグメント」内に含まれる。
【０１０３】
本発明の関連において、用語「発現」は、コードペプチドまたはポリペプチドを合成するために構造遺伝子などのようなポリヌクレオチドによって行われる転写および翻訳を含む細胞内プロセスの組み合わせを含むように意図される。
【０１０４】
本明細書において使用される用語「たとえば」は、単に例として、限定を伴うことなくということを意図して使用され、本明細書において明確に列挙されるそれらのアイテムのみを表すように解釈されるべきでない。
【０１０５】
本明細書において使用されるように、用語「プロモーター」は、一般に、転写を調節する核酸配列の領域（複数可）を説明するように意図される。
【０１０６】
本明細書において使用されるように、用語「調節性エレメント」は、一般に、転写を調節する核酸配列の領域（複数可）を説明するように意図される。例示的な調節性エレメントは、エンハンサー、転写後エレメント、転写制御配列などを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書において使用されるように、用語「構造遺伝子」は、一般に、コードペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボザイム、触媒ＲＮＡ分子、またはアンチセンス分子を産生するように発現される遺伝子などのようなポリヌクレオチドを説明するように意図される。
【０１０８】
本明細書において使用されるように、用語「形質転換」は、一般に、外因性ポリヌクレオチドが少なくとも１つの第１の染色体の中に組み込まれるまたは形質転換宿主細胞内で自律複製が可能である宿主細胞またはプロトプラストの中に外因性ポリヌクレオチド配列（たとえばウイルスベクター、プラスミド、または組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）を導入するプロセスを説明するように意図される。トランスフェクション、エレクトロポレーション、および「裸の」核酸取り込みはすべて、１つまたは複数のポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換するために使用される技術の例を示す。
【０１０９】
本明細書において使用されるように、用語「形質転換細胞」は、その細胞の中への１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの導入によってその核酸相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が改変された宿主細胞を意味するように意図される。
【０１１０】
本明細書において使用されるように、用語「トランスジェニック細胞」は、形質転換細胞から誘導されるもしくは再生されるまたは他のトランスジェニック細胞からまたはそのような形質転換もしくはトランスジェニック宿主細胞の任意の世代の子孫または子から誘導される任意の細胞を意味するように一般に意図される。
【０１１１】
本明細書において使用されるように、用語「ベクター」は、宿主細胞における複製が可能なおよび／または付加されたセグメントの複製をもたらすように他の核酸セグメントが適切に作用するように連結される核酸分子（典型的にＤＮＡから構成される）を意味するように一般に意図される。プラスミド、コスミド、またはウイルスは、例示的なベクターである。
【０１１２】
本明細書において使用される用語「実質的に相当する」、「実質的に相同な」、または「実質的な同一性」は、核酸またはアミノ酸配列の特徴を意味し、選択された核酸またはアミノ酸配列は、選択された参照核酸またはアミノ酸配列と比較して、少なくとも約７０または約７５パーセントの配列同一性を有する。より典型的に、選択された配列および参照配列は、少なくとも約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、またはさらに約８５パーセントの配列同一性およびより好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、少なくとも約８７％の配列同一性、少なくとも約８８％の配列同一性、少なくとも約８９％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の配列同一性、または少なくとも約９５％パーセント以上の配列同一性を有するであろう。より好ましくは、さらに高度に相同な配列は、多くの場合、選択された配列およびそれが比較される参照配列の間で、少なくとも約９６％以上の配列同一性、少なくとも約９７％以上の配列同一性、少なくとも約９８％以上の配列同一性、または少なくとも約９９％以上の配列同一性を共有する。配列同一性のパーセンテージは、比較されることとなる配列の全長にわたり計算されてもよいまたは選ばれた参照配列の合計約２５パーセント未満程度になる小さな欠失または追加を除くことによって計算されてもよい。参照配列は、遺伝子もしくはフランキング配列の一部または染色体の反復部分などのような、より大きな配列のサブセットであってもよい。
【０１１３】
しかしながら、２つ以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合には、参照配列および標的配列は、典型的に、少なくとも約１８〜約２５の連続した同一のヌクレオチド、より典型的に、同一である少なくとも約２６〜約３５の連続したヌクレオチド、さらにより典型的には、同一である少なくとも約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、またはさらに約１００程度の連続したヌクレオチドを含むであろう。望ましいように、高度に相同な断片が所望される場合、２つの所与の配列の間の全体の配列同一性パーセントの程度は、たとえば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）によって記載されるＦＡＳＴＡプログラム解析などのような、当業者らに周知の１つまたは複数の配列比較アルゴリズムによって容易に決定されるように、少なくとも約８０％同一、好ましくは、少なくとも約８５％同一、より好ましくは、約９０％同一、約９１％同一、約９２％同一、約９３％同一、約９４％同一、またはさらに約９５％以上同一となるであろう。
【０１１４】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連における用語「同一の」または「同一性」パーセントは、下記に記載される配列比較アルゴリズム（もしくは当業者らに入手可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用してまたは目視検査によって測定されるように、最大の一致に向けて比較され、アライメントされる場合に、同じであるまたは特定されるパーセンテージの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。
【０１１５】
２つの核酸との関連における語句「実質的に同一の」は、配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視検査によって測定されるように、最大の一致に向けて比較され、アライメントされる場合に、少なくとも約９０％、好ましくは９１％、最も好ましくは約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、または約９９．９％以上のヌクレオチド残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。そのような「実質的に同一の」配列は、典型的に、実際の祖先に関係なく「相同である」と考えられる。
【０１１６】
対象に適用される、本明細書において使用される用語「天然に存在する」は、対象を自然界において見出すことができるという事実を指す。たとえば、自然界における供給源から単離することができ、研究所において人の手によって故意に修飾されていない有機体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。本明細書において使用されるように、古典的遺伝学に従って選択的に交配されてもよいげっ歯動物の実験株は、天然に存在する動物と考えられる。
【０１１７】
本明細書において使用されるように、「異種の」は、所定の参照される遺伝子配列に関して定義される。たとえば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、参照される構造遺伝子に隣接して天然に存在しないが、実験操作によって位置づけられるプロモーターとして定義される。同様に、異種遺伝子または核酸セグメントは、参照されるプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに隣接して天然に存在しない遺伝子またはセグメントとして定義される。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、用語「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の相補性の程度を指す。第１の核酸またはアミノ酸配列が第２の核酸またはアミノ酸配列と全く同じ一次配列を有する場合、単語「同一性」は、単語「相同性」と置換されてもよい。配列相同性および配列同一性は、当技術分野において公知のアルゴリズムおよびコンピュータープログラムを使用して、２つ以上の配列を分析することによって決定することができる。そのような方法は、所与の配列が、他の選択される配列と同一であるかまたは相同であるかを評価するために使用されてもよい。
【０１１９】
本明細書において使用されるように、「相同な」は、ポリヌクレオチドについて言及する場合、異なる起源から生じるにもかかわらず、同じ本質的なヌクレオチド配列を有する配列を意味する。典型的に、相同な核酸配列は、１つまたは複数の実質的に同様のゲノム配列を有する、密接に関連する遺伝子または有機体に由来する。対照的に、「類似性の」ポリヌクレオチドは、異なる種または有機体からのポリヌクレオチドと同じ機能を共有するが、類似する機能を果たすまたは類似する生物学的活性を有する、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする、著しく異なる一次ヌクレオチド配列を有していてもよいポリヌクレオチドである。類似性のポリヌクレオチドは、多くの場合、密接に関連しない（たとえば遺伝的にまたは系統発生的に）２つ以上の有機体に由来してもよい。
【０１２０】
本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含するように意図され、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を含む。したがって、本明細書において使用されるように、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」、および「連続したアミノ酸配列」を含むが、これらに限定されない用語はすべて、「ポリペプチド」の定義の範囲内に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと区別なく使用することができる。用語は、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク分解性切断、翻訳後プロセシング、または１つもしくは複数の天然に存在しないアミノ酸の包含による修飾を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数の翻訳後修飾を受けたポリペプチド（複数可）をさらに含む。従来の命名法は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造について当技術分野において存在する。たとえば、１文字および３文字の略語は、アミノ酸を記載するために広く用いられる：アラニン（Ａ；Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）、およびリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）。本明細書において記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかしながら、「Ｄ」異性体形態における残基は、任意のＬアミノ酸残基と置換されてもよい、ただし、ポリペプチドの所望の特性が保持されることを条件とする。
【０１２１】
「タンパク質」は、「ペプチド」および「ポリペプチド」と本明細書において区別なく使用され、合成的に、組換えで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて産生されるペプチドおよびポリペプチドならびに核酸配列が宿主動物またはヒト対象の中に投与された後にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現されるペプチドおよびポリペプチドの両方を含む。用語「ポリペプチド」は、好ましくは、長さが約２〜約２０のアミノ酸残基の短いペプチド、長さが約１０〜約１００のアミノ酸残基のオリゴペプチド、および長さが約１００〜約５，０００以上のアミノ酸残基のポリペプチドのものを含む、すべてのアミノ酸鎖長を指すように意図される。用語「配列」は、アミノ酸について言及する場合、所与のアミノ酸鎖、たとえばポリペプチドまたはタンパク質内の、直線状のＮ末端〜Ｃ末端の順のアミノ酸のすべてまたは一部に関し、「部分配列」は、配列内のアミノ酸の任意の連続するストレッチ、たとえば、所与のタンパク質またはポリペプチド配列内の少なくとも３つの連続するアミノ酸を意味する。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド鎖に関して、「配列」および「部分配列」は、５’〜３’の順のヌクレオチドに関する同様の意味を有する。
【０１２２】
本明細書において使用されるように、用語「実質的に相同な」は、一次ヌクレオチド配列レベルで、互いに有意に類似する、２つ以上の生体分子配列を包含する。たとえば、２つ以上の核酸配列との関連において、「実質的に相同な」は、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の同一性を指すことができ、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、より好ましくは少なくとも約９９％同一、さらにより好ましくは、完全に同一（つまり、１００％または「不変の」）である。
【０１２３】
同様に、本明細書において使用されるように、用語「実質的に同一の」は、ヌクレオチドレベルで互いに高度の同一性を示す、２つ以上の生体分子配列（特にポリヌクレオチド配列）を包含する。たとえば、２つ以上の核酸配列との関連において、「実質的に同一の」は、互いに少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、より好ましくは少なくとも約９９％同一、さらにより好ましくは、完全に同一（つまり、１００％同一または「非縮重」）である配列を指すことができる。
【０１２４】
用語「組換え体」は、物質（たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が、ヒトの介入によって人工的にまたは合成的に（非天然に）改変されたことを示す。改変は、その天然環境または状態内の物質に対して実行するまたはそれから除去することができる。特に、たとえば、プロモーター配列は、人の手によって操作された核酸セグメントの発現によって産生される場合、「組換え体」である。たとえば、「組換え核酸」は、たとえば、クローニング、ＤＮＡシャフリング、もしくは他の手順の間に核酸を組換えることによってまたは化学的なもしくは他の変異誘発によって作製される核酸であり、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は、組換え核酸の発現によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質であり、「組換えウイルス」、たとえば組換えＡＡＶウイルスは、組換え核酸の発現によって産生される。
【０１２５】
本明細書において使用されるように、用語「作動可能に連結される」は、機能的な関係における、２つ以上のポリヌクレオチドまたは２つ以上の核酸配列の連結を指す。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、「作動可能に連結される」。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。「作動可能に連結される」は、連結されている核酸配列が、典型的には、連続しているまたは実質的に連続していることを意味し、２つのタンパク質コード領域をつなぐことが必要である場合、連続し、かつリーディングフレームについてインフレームであることを意味する。エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロベース離れている場合に機能するので、イントロン配列は、多様な長さであってもよいが、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されてもよいが、連続していなくてもよい。
【０１２６】
「転写調節性エレメント」は、単独でまたは１つまたは複数の他の核酸配列と組み合わせて転写を活性化するポリヌクレオチド配列を指す。転写調節性エレメントは、たとえば、１つもしくは複数のプロモーター、１つもしくは複数の応答エレメント、１つもしくは複数のネガティブ調節性エレメント、および／または１つもしくは複数のエンハンサーを含むことができる。
【０１２７】
本明細書において使用されるように、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部位」は、直接的なタンパク質−ＤＮＡ結合の形態を頻繁に取る、１つまたは複数の転写因子の配列特異的な相互作用のための部位であるとして同定されるポリヌクレオチド配列（複数可）または配列モチーフ（複数可）を指す。典型的に、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイ、およびその他同種のものによって同定することができるならびに／または公知のコンセンサス配列モチーフに基づいてもしくは当業者らに公知の他の方法によって予測することができる。
【０１２８】
「転写ユニット」は、少なくとも１つの第１のシス作用性プロモーター配列に作動可能に連結されるおよび任意選択で、構造遺伝子配列の効率的な転写のために必要である１つまたは複数の他のシス作用性核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つの第１の構造遺伝子ならびにプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの制御下に作動可能に位置づけられた構造遺伝子配列の適切な組織特異的および発生的な転写に必要とされてもよい少なくとも１つの第１の遠位調節性エレメントならびに効率的な転写および翻訳に必要である任意のさらなるシス配列（たとえばポリアデニル化部位（複数可）、ｍＲＮＡ安定性制御配列（複数可）などを含むポリヌクレオチド配列を指す。
【０１２９】
用語「実質的に相補的な」は、アミノ酸または核酸配列を定義するために使用される場合、特定の対象配列、たとえばオリゴヌクレオチド配列が選択される配列のすべてまたは一部に実質的に相補的であり、したがって、選択される配列をコードするｍＲＮＡの一部に特異的に結合するであろうということを意味する。そのため、典型的に、配列は、ｍＲＮＡ「標的」配列に高度に相補的であろう、また、配列の相補的な部分の全体にわたって多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０程度の塩基ミスマッチを有するであろう。多くの実例では、配列が完全にマッチする、つまり、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的であり、そのため、相補的ストレッチに沿ってミスマッチがゼロであることが望ましくてもよい。そのため、高度に相補的配列は、典型的に、ｍＲＮＡの標的配列領域にかなり特異的に結合するであろう、また、そのため、ポリペプチド産物への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を低下させるおよび／またはさらに阻害するのに高度に効率的であろう。
【０１３０】
実質的に相補的な核酸配列は、核酸が特異的に結合する対応する核酸標的配列に約８０パーセント（または「％の完全なマッチ」）超相補的であろう、また、より好ましくは、核酸が特異的に結合する対応する標的配列に約８５パーセント超相補的であろう。ある態様では、上記に記載されるように、本発明の実施における使用のためのさらにより実質的に相補的な核酸配列を有することは望ましいであろう、また、そのような実例では、核酸配列は、核酸が特異的に結合する対応する標的配列に約９０パーセント超相補的であろう、また、ある実施形態では、核酸が特異的に結合する対応する標的配列に約９５パーセント超相補的であってもよく、設計される核酸が特異的に結合する標的配列のすべてまたは一部に相補的な約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、およびさらに約１００％まで完全にマッチしていてもよい。
【０１３１】
開示される核酸配列のいずれかの類似性パーセントまたは相補パーセントは、たとえば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を使用し、配列情報を比較することによって決定されてもよい。ＧＡＰのプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）のアライメント方法を利用する。手短かに言えば、ＧＡＰのプログラムは、２つの配列のうちの短い方のシンボルの総数によって割った、類似する、アライメントされたシンボル（つまりヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰのプログラムについての好ましいデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含有する）ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６年）の加重比較マトリックス、（２）それぞれのギャップについての３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれのシンボルについてのさらなる０．１０のペナルティー；ならびに（３）末端ギャップについてのペナルティーなしを含む。
【０１３２】
本明細書において使用されるように、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、区別なく使用され、２つ以上のアミノ酸残基をともに連結する少なくとも１つのアミド結合を含む分子を含む。区別なく使用されるが、一般に、ペプチドは、比較的短い（たとえば長さが２〜約１００のアミノ酸残基）分子であり、一方、タンパク質またはポリペプチドは、比較的より長いポリマー（たとえば長さが１００以上の残基）である。しかしながら、鎖長によって特に定義されない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質という用語は、区別なく使用される。
【０１３３】
本明細書において使用されるように、用語「患者」（「宿主」または「対象」と区別なく呼ばれる）は、本明細書において説明される１つまたは複数のｒＡＡＶベースのグアニル酸シクラーゼ組成物のためのレシピエントを果たすことができる任意の宿主を指す。ある態様では、レシピエントは、任意の動物種（好ましくは、人間などのような哺乳動物種）を意味するように意図される脊椎動物となるであろう。ある実施形態では、「患者」は、限定を伴うことなく、飼育された家畜、牧畜動物もしくは移住動物、外来種、または動物検体ならびにコンパニオンアニマル、ペット、および獣医のケアの下の任意の動物を含む、ヒトおよび非ヒト霊長類、ウシ、イヌ、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）、キャビン（ｃａｖｉｎｅ）、カラス（ｃｏｒｖｉｎｅ）、エピン、ウマ、ネコ、ヤギ、ラピン（ｌａｐｉｎｅ）、ウサギ、オオカミ、マウス、ヒツジ、ブタ、ラシン（ｒａｃｉｎｅ）、キツネ、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない任意の動物宿主を指す。
【０１３４】
本明細書において使用されるように、用語「キャリア」は、適宜、適切な動物への投与に薬学的に許容されるまたは診断上の目的に許容される任意の溶媒（複数可）、分散媒、コーティング（複数可）、希釈剤（複数可）、緩衝剤（複数可）、等張剤（複数可）、溶液（複数可）、懸濁剤（複数可）、コロイド（複数可）、不活性成分（複数可）など、またはその組み合わせを含むように意図される。遺伝子療法構築物、ウイルス粒子、ベクター、およびその他同種のものについての１つまたは複数の送達ビヒクルの使用は、医薬および分子の技術分野における当業者らに周知である。任意の従来の培地または作用物質が活性成分と不適合性である場合を除いて、予防用および／または処置用組成物におけるその使用が企図される。１つまたは複数の補足の活性成分（複数可）もまた、１つまたは複数の開示される組成物と関連して、組み込まれてもよいまたは投与されてもよい。
【０１３５】
本明細書において使用されるように、「有効量」は、レシピエント患者に処置、予防、または他の場合には有益な効果をもたらすことが、当業者らによって理解されるであろう。
【０１３６】
語句「単離された」または「生物学的に純粋な」は、それがその天然の状態において見出されるように物質に通常伴う構成要素が実質的にまたは本質的にない物質を指す。したがって、本発明に従う単離ポリヌクレオチドは、好ましくは、それらの天然のまたはｉｎ  ｓｉｔｕ環境においてそれらのポリヌクレオチドと通常関連する物質を含有しない。
【０１３７】
「連結する」または「つなぐ」は、限定を伴うことなく、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、静電気結合、およびその他同種のものを含む、１つまたは複数のタンパク質、ペプチド、核酸、またはポリヌクレオチドを機能的に結び付けるための当技術分野において公知の任意の方法を指す。
【０１３８】
本明細書において使用されるように、用語「プラスミド」または「ベクター」は、遺伝物質（つまり核酸）から構成される遺伝子構築物を指す。典型的に、プラスミドまたはベクターは、細菌宿主細胞、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて機能的な複製開始点およびプラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するための選択マーカーを含有する。本発明のプラスミドおよびベクターは、挿入されたコード配列が適した発現細胞において転写され、翻訳され得るように配置される、本明細書において記載される１つまたは複数の遺伝因子を含んでいてもよい。さらに、プラスミドまたはベクターは、１つまたは複数の天然のおよび／または人工の供給源から得られるまたはそれに由来するセグメントを含む、１つまたは複数の核酸セグメント、遺伝子、プロモーター、エンハンサー、活性化因子、マルチクローニング領域、またはその任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１３９】
用語「配列番号Ｘにおいて本質的に記載される配列」は、配列が、配列番号Ｘの一部に実質的に相当し、配列番号Ｘのヌクレオチド（またはアミノ酸）に同一でないまたはその生物学的に機能的な等価物である比較的少数のヌクレオチド（またはポリペプチド配列の場合にはアミノ酸）を有することを意味する。用語「生物学的に機能的な等価物」は、当技術分野において十分に理解されており、本明細書において詳細にさらに定義される。したがって、本明細書において提供される１つまたは複数のヌクレオチド配列に同一であるまたは機能的に等価である、約８５％〜約９０％またはより好ましくは約９１％〜約９５％またはさらにより好ましくは約９６％〜約９９％のヌクレオチドを有する配列は、本発明の実施において有用であることが特に企図される。
【０１４０】
本発明に適した標準的なハイブリダイゼーション条件は、たとえば、１６時間、４２℃での、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおけるハイブリダイゼーション、その後に続く、所望の量のバックグラウンドシグナルを除去するための６０℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いる１時間の連続的な洗浄を含む。本発明のための低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、たとえば、１６時間、４２℃での、３５％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡにおけるハイブリダイゼーション、その後に続く、５５℃での０．８×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる連続的な洗浄を含む。当業者らは、ストリンジェンシーの所望のレベルを得るために容易に条件を調節することができることを認識するであろう。
【０１４１】
もちろん、本発明はまた、本明細書において特に記載される少なくとも１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列に相補的な、本質的に相補的な、および／または実質的に相補的な核酸セグメントを包含する。「相補的」核酸配列は、標準的なワトソンクリック相補性ルールに従って塩基対形成が可能なものである。本明細書において使用されるように、用語「相補的配列」は、上記に記載される同じヌクレオチド比較によって評価されてもよいまたはすぐ上に記載されるものなどのような比較的ストリンジェントな条件下で本明細書において開示される１つまたは複数の特定の核酸セグメントにハイブリダイズすることができるとして定義される、実質的に相補的な核酸配列を意味する。
【０１４２】
上記に記載されるように、本発明のプローブおよびプライマーは、任意の長さであってもよい。たとえば、第１の残基は１、第２の残基は２などというように配列に数値を割り当てることによって、所与の配列内に含有されるすべてのプローブまたはプライマーを定義するアルゴリズムを提案することができる。
【０１４３】
ｎ〜ｎ＋ｙ、ｎは、１〜配列の最後の数の整数であり、ｙは、プローブまたはプライマー−１の長さであり、ｎ＋ｙは、配列の最後の数を超えない。したがって、２５塩基対プローブまたはプライマー（つまり「２５塩基長」）については、プローブまたはプライマーの集団は、配列の全長にわたり塩基１〜２５、塩基２〜２６、塩基３〜２７、塩基４〜２８などに相当する。同様に、３５塩基対プローブまたはプライマー（つまり「３５塩基長）については、例示的なプライマーまたはプローブ配列は、限定を伴うことなく、配列の全長にわたり、塩基１〜３５、塩基２〜３６、塩基３〜３７、塩基４〜３８などに対応する配列を含む。同様に、４０塩基長については、そのようなプローブまたはプライマーは、第１の塩基対〜４０ｂｐ、配列の第２のｂｐ〜４１ｂｐ、第３のｂｐ〜４２ｂｐなどのヌクレオチドに相当してもよく、一方、５０塩基長については、そのようなプローブまたはプライマーは、１ｂｐ〜５０ｂｐ、２ｂｐ〜５１ｂｐ、３ｂｐ〜５２ｂｐ、４ｂｐ〜５３ｂｐなどに及ぶヌクレオチド配列に相当してもよい。
【０１４４】
ある実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて所与の標的配列の存在を決定する際に標識ポリヌクレオチドプローブを用いる場合などのように、適切な検出可能なマーカー（つまり「標識」）と組み合わせて本発明の１つまたは複数の核酸セグメントを用いることは好都合であろう。限定を伴うことなく、適したアッセイにおいて検出することができる、アビジン／ビオチンなどのような蛍光、放射性、酵素学的、または他のリガンドなどを含む、オリゴヌクレオチドプローブを標識するための種々様々の適切な指標化合物および組成物は、当技術分野において公知である。特定の実施形態では、また、放射性または他の環境上それほど望ましくない試薬の代わりに、１つまたは複数の蛍光標識またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼなどのような酵素タグを用いてもよい。酵素タグの場合には、１つまたは複数の相補的なまたは実質的に相補的な核酸配列を含有する試料との特異的なハイブリダイゼーションを同定するために、ヒトの眼に見えるまたはシンチグラフィー、蛍光分析、分光測光、およびその他同種のものなどのような分析法によって目に見える試料を検出するための方法を提供するために用いることができる比色定量、発色性、または蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）指標基質が公知である。２つ以上の標識プローブが同時にまたは連続的に検出される、いわゆる「多重」アッセイの場合には、第１の検出特性またはパラメーター（たとえば放射および／または励起スペクトルの最大値）を有する第１の標識を用いて、第１のオリゴヌクレオチドプローブを標識することは望ましくてもよい。これはまた、異なる（つまり、第１の標識と別個のまたはそれから識別可能な）第２の検出特性またはパラメーターを有する第２の標識を用いて第２のオリゴヌクレオチドプローブをも標識する。特に遺伝子増幅／検出プロトコールとの関連における多重アッセイの使用は、分子遺伝学の技術分野における当業者らに周知である。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。続く実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者によって発見された技術を示し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えることができることが、当業者らによって十分に理解されたい。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形が、開示される特定の実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解されたい。
【０１４６】
（実施例１）
ＡＡＶ媒介性の遺伝子療法はＬＣＡ１のマウスモデルの視覚機能および行動を修復する
本実施例において、発明者らは、出生後のＧＣ１ＫＯマウスの錐体細胞へのｒｅｔＧＣ１種特異的なバージョン（つまりマウス）の送達が、これらの細胞の機能を修復することができるかどうかを評価した。血清型５ＡＡＶベクターは、出生後１４日目（Ｐ１４）のＧＣ１ＫＯマウスの光受容体にｍＧＣ１を送達するために使用した。網膜電位図（ＥＲＧ）および行動的な試験は、視覚機能を評価するために使用し、免疫細胞化学は、処置および無処置眼における、処置用導入遺伝子発現、錐体アレスチン局在化、および錐体光受容体密度を検査するために使用した。
【０１４７】
本実施例は、Ｐ１４  ＧＣ１  ＫＯマウスの一方の眼の網膜下に送達されたＡＡＶベクターが、野生型ｒｅｔＧＣ１の発現、視覚機能および行動の回復、ならびに錐体光受容体の保持を促進したことを実証する。注射の４週間後に、視覚機能（ＥＲＧ）を処置および無処置眼において分析した。ＥＲＧは、その後、注射後３か月（評価した最も後の時点）まで２週間ごとに実行した。ポジティブなＥＲＧ応答を有するマウスならびに同質遺伝野生型および非注射対照マウスは、視覚性運動反射試験を使用し、視覚的な行動の回復について評価した。注射後３か月目に、動物はすべて、安楽死させ、それらの処置および無処置網膜は、ＧＣ１の発現および錐体アレスチンの局在化について評価した。
【０１４８】
結果はまた、ＧＣ１ＫＯマウスの処置眼の錐体媒介性の機能が修復されたことを確認する（ＥＲＧ振幅は正常の約６０％であった）。さらに、処置効果は、投与後少なくとも３か月間、安定した。行動試験は、錐体媒介性の視覚的な行動における堅調な改善を示し、処置マウスの応答は、野生型マウスに類似したまたはそれと同一であった。組織学的検査は、処置マウスにおける光受容体ＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現および錐体アレスチン移動の回復を明らかにした。さらに、錐体細胞密度は、無処置の反対側の対照よりも処置眼において高度であった。この結果は、処置後少なくとも３か月間、処置が、錐体光受容体を保持することができることを示唆する。これは、出生後の遺伝子療法が、ＬＣＡ１の哺乳動物モデルにおいて視覚機能および視覚的な行動を修復し、網膜構造を保持することができるという第１の実証である。重要なことには、結果は、十分に特徴付けられた、臨床的に適切なＡＡＶベクターを使用して得られ、このように得られたｉｎ  ｖｉｖｏにおける動物モデルデータは、ＬＣＡ１に冒された子供の処置のためのＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターについての根拠を提供する。
【０１４９】
材料および方法：
実験動物：
ＧＣ１＋／−ヘテロ接合体胚は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）で凍結保存株から取り出した。ヘテロ接合体は、ＧＣ１  ＫＯ（−／−）および同質遺伝＋／＋対照子を産生するために発明者らの施設で交配した。マウスはすべて、１２時間／１２時間の光／暗サイクル下で発明者らの機関の集中施設において飼育し、維持した。飼料および水は自由に動物が利用し得る形態とした。動物研究はすべて、地域のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されており、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ＮＩＨ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓに従って行った。
【０１５０】
ＡＡＶベクターの構築：
血清型５アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５）ベクターは、それらが、堅調な形質導入効率および他のＡＡＶ血清型よりも網膜光受容体における発現のより急速な開始を示すことが示されたので、マウスＧＣ１（ｍＧＣ１）を送達するために使用した（Ｙａｎｇら、２００２年）。細胞特異的およびユビキタスプロモーターの両方は、ｍＧＣ１の発現を駆動するために選択した。ロドプシンキナーゼプロモーターとしても公知である細胞特異的Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ１（ＧＲＫ１）は、ＡＡＶと共に使用された場合に杆体および錐体光受容体において堅調な導入遺伝子発現を特異的に標的にするその能力のために選んだ（Ｋｈａｎｉら、２００７年）。網膜における完全長ＣＢＡに類似する発現パターンを示すユビキタスｓｍＣＢＡプロモーターは、神経網膜を効率的に標的にするその能力のために選んだ（Ｈａｉｒｅら、２００６年）。
以下のフォワードプライマー：
【０１５１】
【化１】
0005897549.tif 000002
および以下のリバースプライマー：
【０１５２】
【化２】
0005897549.tif 000003
を利用するポリメラーゼ連鎖反応は、ｍＧＣ１−ｅＧＦＰ融合物を含有するプラスミドからｍＧＣ１を増幅するために使用した（Ｂｈｏｗｍｉｃｋら、２００９年）。結果として生じる断片は、ｐＣＲｂｌｕｎｔプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の中にクローニングし、配列を検証した。ｍＧＣ１の発現を駆動するｓｍＣＢＡを含有するＡＡＶベクタープラスミド（ｐＴＲ−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１）は、ＥｃｏＲＩ消化および続くライゲーションを介して、プラスミドｐＴＲ−ＣＢＳＢ−ｈＲＰＥ６５（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）においてｓｍＣＢＡと完全長ＣＢＡを交換することによって生成した。続いて、ｈＲＰＥ６５をＮｏｔＩ消化およびライゲーションを介してｍＧＣ１と交換し、ｐＴＲ−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１の生成をもたらした（図１１）。ｍＧＣ１の発現を駆動するヒトＧＲＫ１プロモーターを含有するＡＡＶベクタープラスミド、ｐＴＲ−ＧＲＫ１−ｍＧＣ１は、ＮｏｔＩ消化物およびライゲーションを介して、ｐＴＲ−ｈＧＲＫ１−ｈＧＦＰ（Ｂｅｌｔｒａｎら、２０１０年）からｈＧＦＰを除去し、それをｍＧＣ１と交換することによって生成した（図１１）。ＡＡＶベクターは、先に公開された方法（Ｈａｉｒｅら、２００６年）に従ってパッケージした。ウイルス粒子は、平衡塩類溶液（Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ、ＵＳＡ）中に再懸濁し、定量的リアルタイムＰＣＲによって力価を測定した（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）。結果として生じる力価は、それぞれ、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１について、１ｍＬ当たり４．６９×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）および４．１２×１０１３ｖｇ／ｍＬであった。
【０１５３】
網膜下注射：
１μＬのＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ｍＧＣ１（４．１２×１０１０送達ベクターゲノム）またはＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（４．６９×１０９送達ベクターゲノム）を、それぞれのＧＣ１ＫＯマウスの右眼に出生後１４日目（Ｐ１４）に網膜下に送達し、左眼は反対側の対照として残した。網膜下注射は、先に記載されるように実行した（Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年；Ｐａｎｇら、２００６年）。さらに、分析は、比較可能で好結果の注射（＞６０％の網膜剥離および最小限の合併症）を受けた動物に対してのみ実行した。網膜剥離のエリアがウイルス形質導入のエリアに相当することは十分に立証される（Ｃｉｄｅｃｉｙａｎら、２００８年；Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年）。
【０１５４】
網膜電図検査分析：
処置ＧＣ１ＫＯ（ｎ＝１４）および同質遺伝＋／＋対照（ｎ＝２）の網膜電位図（ＥＲＧ）は、わずかな改良を伴う先に記載される方法に従って（Ｈａｉｒｅら、２００６年）、ＰＣベースの制御および記録ユニット（Ｔｏｅｎｎｉｅｓ  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ；Ｊａｅｇｅｒ／Ｔｏｅｎｎｉｅｓ、Ｈｏｅｃｈｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して記録した。最初のＥＲＧ測定値は、注射後４週間目に、その後、続く２週間ごとに、注射後３か月まで（研究において評価した最も後の時点）記録した。年齢が一致する＋／＋同質遺伝対照は、すべての時点で処置動物と一緒に記録した。それぞれ、マウスは、一晩（１２時間以上）、暗順応させ、１：１：５の比の１００ｍｇ／ｋｇケタミン、２０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および生理食塩水の混合物を用いて麻酔をかけた。瞳孔は、１％トロピカミドおよび２．５％塩酸フェニレフリンを用いて散大させた。加熱した循環ウォーターバスは、３８℃に体温を維持するために使用した。ヒドロキシプロピルメチルセルロース２．５％は、角膜の脱水を予防するためにそれぞれの眼に適用した。全視野ＥＲＧは、特注のゴールドワイヤループ角膜電極を使用して記録した。基準電極および接地電極（ｇｒｏｕｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は、それぞれ、眼の間および尾中に、皮下に配置した。暗所視杆体記録は、７つの増加性の強度（０．０１ｍｃｄ／ｍ２〜５ｃｄ／ｍ２）の一連の白色の閃光を用いて誘発した。低強度刺激についての刺激間隔は、１．１秒とした。３つの最も高度な強度（１００ｍｃｄ／ｍ２、１ｃｄ／ｍ２、および５ｃｄ／ｍ２）では、刺激間隔は、それぞれ、２．５、５．０、および２０．０秒とした。１０の応答を記録し、それぞれの強度で平均した。マウスは、次いで、２分間、１００ｃｄ／ｍ２の白色のバックグラウンドに光順応させた。明所視錐体反応は、一連の５つの増加性の光強度（１００ｍｃｄ／ｍ２〜１２ｃｄ／ｍ２）を用いて誘発した。５０の応答を記録し、それぞれの強度で平均した。刺激はすべて、１００ｃｄ／ｍ２のバックグラウンドの存在下において行った。ｂ波振幅は、それぞれの波形のポジティブピークに対するａ波トラフの間の差異として定義した。
【０１５５】
すべてのｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置（ｎ＝６）およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置（ｎ＝８）ＧＣ１ＫＯ（処置および無処置眼の両方）ならびに同質遺伝＋／＋対照マウスの明所視ｂ波最大振幅（１２ｃｄ／ｍ２で生成されたもの）は、平均し、標準誤差を生成するために使用した。これらの計算は、すべての時点（注射後４週間〜１３週間）で行った。このデータは、最終的なグラフ表示のためにＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔにインポートした。対応のあるｔ検定は、ある期間にわたって（注射後４週間対注射後３か月）、それぞれのプロモーター群（ｓｍＣＢＡまたはｈＧＲＫ１）内の処置および無処置眼の間のならびにそれぞれのプロモーター群の間のＰ値を計算するために使用した。標準的なｔ検定は、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置眼対ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置眼の間のＰ値を計算するために使用した。有意差は、Ｐ値＜０．０５として定義した。それぞれの処置群からのマウスのいくつかを行動的な分析のために研究から一時的に取り出したので、図２Ａおよび図２Ｂにおける、それぞれの時点で平均し、示すマウスの総数は、異なる。ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置群からの３匹のマウスを視運動試験のために送り、８、１０、および１２週目の測定の間にＥＲＧ分析のために「ｎ」が３匹のマウスを使用した（図２Ａ）。ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置群からの２匹のマウスを視運動試験のために送り、６、８、１０、および１２週目の測定の間にＥＲＧ分析のために「ｎ」が６のものを使用した（図２Ｂ）。行動的な分析のために送ったマウスはすべて、行動的な分析の終了の後に、発明者らの研究所へのそれらの返却に際して注射後１３週間目に測定した（ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１：ｎ＝３、ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１：ｎ＝２）。
【０１５６】
視運動試験：
処置および無処置ＧＣ１ＫＯマウス眼の明所視視覚およびコントラスト感度は、先に記載されるように二者択一強制選択パラダイムを使用して測定した（たとえばＵｍｉｎｏら、２００８年；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００７年を参照されたい）。同じ動物からの個々の眼の感度を試験するために、発明者らは、マウス視力が最小限の両眼の重複を有し、左眼が時計回りにより敏感であり、右が反時計回りにより敏感であるという事実を利用した（Ｄｏｕｇｌａｓら、２００５年）。したがって、発明者らの「ランダム化した別々の」視運動のプロトコールでは、それぞれの眼の視力およびコントラスト感度の閾値は、時計回りおよび反時計回りの方向の両方における正確な応答について段階的な機能を介して別々にかつ同時に決定した。時計回りの方向に回転するパターンの正確な検出は、主として、左眼から生じる視覚的なシグナルによって行い、反時計回りの方向における正確な応答は、右眼から生じる視覚的なシグナルから導き出した。視力は、閾値応答を得る最も高度な空間周波数（１００％コントラスト）として定義し、コントラスト感度は、閾値応答を得る最低パーセントのコントラストによって割った１００として定義した。明所視力については、最初の刺激は、固定１００％コントラストと共に０．２００サイクル／度の正弦波パターンとした。明所視コントラスト感度測定については、最初のパターンは、０．１２８サイクル／度の固定空間周波数と共に１００％コントラストで行った。明所視視力は、７０ｃｄ／ｍ２の平均輝度で測定した。視覚およびコントラスト感度は、１週間の期間、それぞれのマウスの両眼について４〜６回測定した。年齢が一致する同質遺伝＋／＋対照動物（Ｍ１、Ｍ２）およびナイーブＧＣ１ＫＯマウス（Ｍ３、Ｍ４）は、図３におけるｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置（Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７）およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウス（Ｍ８、Ｍ９）と共に行った。すべてのマウス（Ｍ１〜Ｍ９）の１２ｃｄ／ｍ２の刺激から生成される錐体媒介性のＥＲＧ振幅は、行動結果と一緒に行った。対応のないｔ検定は、結果の有意性を決定するために視力およびコントラスト値パーセントに対して実行した。
【０１５７】
組織調製
注射後３か月目に、Ｐ１４処置ＧＣ１ＫＯマウスおよび年齢が一致する同質遺伝＋／＋対照を、２時間、暗順応させた。暗順応直後に、マウスは、暗赤色光（＞６５０ｎｍ）下で安楽死させた。注射および非注射眼の縁郭を、１２：００位置で熱い針を用いてマークし、方向づけを容易にした。眼球除去は、暗赤色光下で実行し、眼は、４％パラホルムアルデヒド中に直ちに配置した。凍結切片法（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）に使用されることになっていた眼は、先に記載される方法に従って調製した（Ｈａｉｒｅら、２００６年）。手短かに言えば、角膜は、それぞれの眼から除去し、残りの眼杯の内部のレンズを残した。小さな「Ｖ」字形の切り込みを、方向づけを維持するために焼いた縁郭に隣接する強膜に行った。一晩の固定後、レンズおよび硝子体を除去した。残りの網膜／ＲＰＥ含有眼杯は、４℃で少なくとも１時間、ＰＢＳ中３０％スクロース中に配置した。次いで、眼杯は、クライオスタット化合物（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ４５８３；Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に配置し、ドライアイス／エタノールのバスにおいてスナップ凍結させた。眼は、クライオスタット（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ＨＭ５５０；Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０μｍで連続的に薄片を作った。ホールマウント分析の使用されることになっていた眼は、先に記載される方法に従って調製した（Ｐａｎｇら、２０１０年）。方向づけは、先に言及されるように達成した。一晩の固定後に、網膜を動かさずに、角膜、レンズ、硝子体、および網膜色素上皮をそれぞれの眼から除去した。切り込みは、方向づけを維持するために、もとの縁郭焼け跡に隣接する網膜の上部（背側）の部分に行った。
【０１５８】
免疫組織化学的検査および顕微鏡検査法；
網膜凍結切片およびホールマウントは、１×ＰＢＳ中で３×洗浄した。これらの洗浄の後に、試料は、室温で、暗中で、１時間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）中でインキュベートした。次に、試料は、室温で、１時間、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液中でブロックした。網膜切片は、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）／１％ＢＳＡ中で希釈したウサギポリクローナルＧＣ１抗体（１：２００、ｓｃ−５０５１２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびウサギポリクローナル錐体アレスチン抗体（「Ｌｕｍｉｊ」１：１０００；Ｄｒ．Ｃｈｅｒｙｌ  Ｃｒａｆｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡによって提供）と共に３７℃で一晩、インキュベートした。網膜ホールマウントは、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）／１％ＢＳＡ中で１：１０００に希釈した同じ錐体アレスチン抗体と共に室温で一晩、インキュベートした。一次インキュベーションの後に、網膜切片およびホールマウントは、１×ＰＢＳを用いて３×洗浄した。
【０１５９】
網膜切片は、１×ＰＢＳ中で１：５００に希釈したＡｌｅｘａ−５９４またはＡｌｅｘａ−４８８蛍光団（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いてタグ付けしたＩｇＧ二次抗体と共に室温で１時間、インキュベートした。二次抗体とのインキュベーションの後に、切片およびホールマウントは、１×ＰＢＳを用いて洗浄した。網膜切片は、室温で、５分間、４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色した。１×ＰＢＳおよび水を用いる最終的なすすぎの後、切片は、水性培地（ＤＡＫＯ）中にマウントし、カバーガラスをかけた。網膜ホールマウントは、網膜の上部（背側）の部分を１２：００位置に位置づけて、スライド上に方向づけた。試料は、ＤＡＫＯ中にマウントし、カバーガラスをかけた。
【０１６０】
網膜切片は、ＬＣＳ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．６１、Ｂｕｉｌｄ  １５３７ソフトウェア（Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ、ＩＬ、ＵＳＡ）を装備した共焦点顕微鏡検査法（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて分析した。画像はすべて、２０×または６３×の倍率で同一の露光設定を用いて撮った。ＤＡＰＩ、ＧＣ１、および錐体アレスチン染色のために使用した励起波長は、それぞれ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、および５９４ｎｍとした。放射スペクトルは、それぞれ、４４０〜４７０ｎｍ、５００〜５３５ｎｍ、および６０５〜６６０ｎｍとした。網膜ホールマウントは、ＱＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ  ４０００Ｒ  ＣａｍｅｒａおよびＱＩｍａｇｉｎｇ  ＱＣａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏソフトウェア（ＱＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を装備した広視野蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２）（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて分析した。それぞれのホールマウントの四半部は、同一の露光設定下で５×で画像処理し、次いで、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）（バージョン７．０）（Ａｄｏｂｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において相互にマージした。
【０１６１】
画像分析：
錐体光受容体密度は、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、中央および下位の網膜における、錐体アレスチン抗体に対して向けられた二次蛍光団により標識された細胞をカウントすることによって網膜ホールマウントにおいて分析した。これらの値は、図６に示す５×ＴＩＦＦファイルにおいてズームすることによって得た。５つの正方形（５００μｍ２）は、処置および無処置ＧＣ１ＫＯ眼の中央および下位の網膜において同一のエリアにわたり配置した。中央の網膜については、正方形は、すべての眼において視神経乳頭のまわりに等しい偏心距離で配置した（１２５μｍ）。錐体光受容体を各それぞれの網膜エリアにおいてカウントし、値を平均し、標準偏差を計算した。標準的なｔ検定は、所望の試料の間のＰ値を計算するために使用した。有意差は、Ｐ値＜０．０５として定義した。
【０１６２】
結果
光受容体機能（ＥＲＧ）は、ＡＡＶ処置ＧＣ１ＫＯマウスにおいて修復された：
ＧＣ１ＫＯマウスにおける錐体応答が、１月齢までわずかに検出可能であることが以前に報告された。本明細書で、発明者らは、光受容体特異的（ｈＧＲＫ１）またはユビキタス（ｓｍＣＢＡ）プロモーターの制御下にマウスＧＣ１遺伝子を保持するＡＡＶベクターを用いるこのマウスのＰ１４処置が、ＥＲＧによって測定されるように、錐体光受容体機能の実質的な回復に至ったことを示した。代表的な錐体結果（図１）（ならびにｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置、ＧＣ１ＫＯ、および同質遺伝＋／＋対照からの平均明所視ｂ波振幅（図２Ａおよび図２Ｂ））は、処置眼における錐体機能が注射後４週間で正常のおよそ４５％まで修復されたことを示した。以前の報告と同様に、反対側の無処置眼における錐体応答はこの時点までに除去された。注射後４週間で、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置眼における平均錐体媒介性ｂ波振幅（６５．１μＶ）は、無処置眼（３．９μＶ）よりも有意に高度であった（Ｐ＝０．００６）。ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置眼における平均錐体媒介性ｂ波振幅（５９．１μＶ）は、無処置眼（３．２μＶ）よりも有意に高度であった（Ｐ＜０．００１）。光受容体特異的ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターの送達後４週間で達成された回復のレベルは、ユビキタスプロモーター含有ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１ベクターを用いて達成されたものと有意に異なっていなかった（Ｐ＝０．６０４）。注射後３か月で、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置眼における平均錐体媒介性ｂ波振幅（５３．３μＶ）は、無処置眼（２．８μＶ）よりも有意に高度であった（Ｐ＜０．００１）。ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置眼における平均錐体媒介性ｂ波振幅（４５．３μＶ）は、無処置眼（３．４μＶ）よりも有意に高度であった（Ｐ＜０．００１）。光受容体特異的ＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターの送達後３か月で達成された回復のレベルは、ユビキタスプロモーター含有ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１ベクターを用いて達成されたものと有意に異なっていなかった（Ｐ＝０．３３１）。両方のプロモーターは、短期で、ＧＣ１ＫＯマウスの処置眼における錐体に対して同様のレベルの機能的な回復を与えた。重要なことには、錐体光受容体機能の回復は、３か月（本研究において評価した最も後の時点（図１、図２Ａ、および図２Ｂを参照されたい））間、安定したままであった。処置後４週間〜３か月のｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置またはｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置眼の明所視ｂ波振幅において有意差はなかった（それぞれＰ＝０．１７４および０．１２５）。
【０１６３】
ＬＣＡの他の形態（Ｓｕｎら、２０１０年）を含む様々な網膜障害の診断において重要な特徴であるＥＲＧの絶対的な時間もまた、決定した。ＧＣ１ＫＯ眼（これらの眼においてＥＲＧ応答はない）からそのような測定値を得ることはできないが、ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置および同質遺伝＋／＋対照マウスにおける錐体ｂ波の絶対的な時間を比較することは可能であった。注射後４週間で、処置および＋／＋対照眼において錐体ｂ波の絶対的な時間の間で有意差はなく（Ｐ＝０．８８４）、この時点でのＡＡＶ−ｍＧＣ１処置および＋／＋眼における平均値は、それぞれ、５０．８ｍｓおよび５０．４ｍｓであった。注射後３か月で、２つの群の間の有意差もまたなく（Ｐ＝０．６９７）、処置および＋／＋対照眼におけるすべての錐体ｂ波の絶対的な時間の平均は、それぞれ、５９．７ｍｓおよび５８．３ｍｓであった。処置ＧＣ１ＫＯ網膜における錐体の応答反応速度（絶対的な時間測定によって決定される）は、短期において正常であり、かつ安定しているように思われた。
【０１６４】
ＧＣ１ＫＯマウスにおける杆体ＥＲＧが１月齢までに改変を示し、杆体ａ波およびｂ波が両方とも著しく低下していることが以前に報告された（Ｙａｎｇら、１９９９年）。この低下は、５月齢で横ばい状態になり、応答は、野生型（ＷＴ）マウスのおよそ５０〜７０％になる。ＡＡＶ−ｍＧＣ１媒介性の改善のいくつかの実例が、無処置対照と比べてＧＣ１ＫＯマウスの処置眼において観察されたが（図１において見られる例）、この結果は、錐体媒介性の応答において見られるものとそれほど一致していなかった。
【０１６５】
視覚的な行動はＡＡＶ処置ＧＣ１ＫＯマウスにおいて修復された：
視運動分析は、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７）またはｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（Ｍ８、Ｍ９）を用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスの眼が、すべての明所視錐体媒介性条件下で無処置眼よりも有意によく応答することを明らかにした。無処置ＧＣ１ＫＯ眼は、機能が不十分であり、１度当たり０．１６３±０．０４０サイクルの視覚であった（図３Ｂおよび図３Ｃ、バー、平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝９の眼）。同質遺伝ＧＣ１＋／＋対照眼（Ｍ１、Ｍ２）は、有意によりよく応答し、１度当たり０．４１８±０．０４６サイクルの平均視力を示した（ｎ＝４の眼）。ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置眼（Ｍ５〜Ｍ９）は、１度当たり０．３９２±０．０７７サイクルの平均視力を有し（ｎ＝５の眼）、対照＋／＋眼と本質的に同一であり、かつ無処置ＧＣ１ＫＯ眼よりも有意によい（Ｐ＜０．０００１）レベルである。明所視コントラスト感度（図３Ｂおよび図３Ｃ）は、明所視力結果に類似し、ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置眼（１１．９±７．３７のコントラスト感度、ｎ＝５の眼）は、＋／＋マウス（１１．９４±３．０３、ｎ＝４の眼）とほぼ同一のコントラスト閾値を示した。さらに、ＡＡＶ−ｍＧＣ１を用いてＰ１４に処置したＧＣ１ＫＯ眼は、無処置眼よりも有意によく機能し、１．２７±０．３１の平均コントラスト感度を示した（ｎ＝９、Ｐ＜０．０００１）。すべての明所視試験において、無処置ＧＣ１ＫＯ眼は、機能が非常に不十分であり、本質的に、錐体媒介性の機能がないに等しかった。これらの測定値の統計比較を表１に示す。行動分析において使用したすべてのＧＣ１＋／＋（Ｍ１、Ｍ２）、ＧＣ１ＫＯ（Ｍ３、Ｍ４）、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置（Ｍ５、Ｍ５、Ｍ７）、およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置（Ｍ８、Ｍ９）マウスの錐体媒介性のＥＲＧ結果は、視覚機能（視運動行動）を網膜機能（電気生理学）に関連づけるために、図３Ａに示す。
【０１６６】
杆体網膜機能（ＥＲＧ）は、ＧＣ１ＫＯマウスにおいて部分的に保持されている。研究は、非常に小さなＥＲＧ振幅でさえ、堅調な視覚的な行動に変わることを示した（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００６年）。実際、ＡＡＶ−ＲＰＥ６５療法を受けたＬＣＡ２患者は、ＥＲＧ応答の完全な欠乏にもかかわらず行動的な回復を示すことが分かった（Ｍａｇｕｉｒｅら、２００８年）。視運動試験は、ＧＣ１ＫＯ眼の暗所視杆体媒介性の視覚およびコントラスト感度が、＋／＋対照に非常に類似することを明らかにした。この理由のために、行動的なレベルについて処置対無処置眼の視覚的な回復を比較することは不可能であった。これらの測定値の統計比較を表１に示す。
【０１６７】
表１
視運動行動によって測定される、ＷＴ、ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置、および無処置ＧＣ１ＫＯ眼の明所視視覚機能の統計比較
【０１６８】
【表１】
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光受容体特異的およびユビキタスプロモーターは両方ともＧＣ１ＫＯマウスの杆体および錐体においてｍＧＣ１導入遺伝子発現を駆動する：
ＧＣ１欠損は、ＬＣＡ１患者において杆体および錐体光受容体の両方に影響を与える。そのため、光受容体特異的ヒトＲＫプロモーターおよびユビキタスｓｍＣＢＡプロモーターを、両方の細胞型を標的にする手段としてこの研究のために選んだ。ヒトＲＫプロモーターはその小さなサイズおよび光受容体細胞において特異的に導入遺伝子発現を効率的に駆動する能力のために選んだ。ＡＡＶ−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる処置後３か月のＧＣ１ＫＯ網膜の免疫染色は、このプロモーターが光受容体外節において堅調なＧＣ１発現を駆動することを明らかにした。この処置用ベクターを注射した眼からの網膜断面の代表的な画像（図４Ａ）は、ＯＳ層において強いＧＣ１染色を示すのに対して、同じマウスからの反対側の無処置眼は、ＧＣ１発現を欠く（図４Ｂ）。ｓｍＣＢＡプロモーターもまた、光受容体細胞においてＧＣ１発現を効率的に駆動した。光受容体ＯＳは、反対側の無処置眼（図４Ｄ）に比べて、処置眼（図４Ｃ）において堅調なｓｍＣＢＡ媒介性のＧＣ１発現を示した。ｈＧＲＫ１およびｓｍＣＢＡ媒介性のＧＣ１発現のレベルは、同質遺伝＋／＋対照眼において見られたものに近かった（図４Ｅ）。ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置眼におけるＧＣ１発現は、ＯＳに限られた。ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置眼では、ＧＣ１発現は、外顆粒層の光受容体細胞体において時々見出された（たとえば、図４Ｆの矢印を参照されたい）。しかしながら、特に、どちらのプロモーター構築物も、光受容体細胞の外側で処置用ＧＣ１の発現を駆動しなかった。オフターゲットの発現のこの欠乏は、将来の臨床の適用の発展に適切である。
【０１６９】
錐体アレスチン移動はＡＡＶ−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯマウスにおいて修復された：
ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置は、処置ＧＣ１ＫＯ網膜において錐体光受容体の、光誘発性の錐体アレスチン移動を修復した。錐体アレスチンに対して生成される抗体を用いて免疫染色した、代表的な処置、無処置、および＋／＋網膜横断切片は、錐体アレスチンが、＋／＋、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置、およびｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置錐体光受容体の外節、内節、軸索、およびシナプス末端に局在化したことを示した（それぞれ図５Ａ、図５Ｃ、および図５Ｄ）。これに反して、錐体アレスチンは、無処置ＧＣ１ＫＯ網膜において錐体の外節にほとんど局在化し続けた（図５Ｂ）。この結果は、ＧＣ１ＫＯマウス網膜における錐体が慢性的に過分極化しているという考えと一致していた。暗順応処置網膜における錐体アレスチン局在化の回復が観察されただけでなく、タンパク質の明らかなアップレギュレーションが、無処置対照と比べて処置眼において見られた。有意に、錐体細胞密度もまた、無処置対照と比べて処置眼においてより高いように思われた（たとえば図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃを参照されたい）。
【０１７０】
錐体光受容体はＡＡＶ−ｍＧＣ１−処置ＧＣ１ＫＯマウスにおいて保持された：
錐体アレスチンに対して向けられる抗体を用いて染色した、処置用ベクターを用いる注射後３か月の、ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびｈＧＲＫ−ｍＧＣ１処置ならびに非注射の反対側の網膜ホールマウントの分析は、処置用ベクターを用いる処置の結果として、錐体光受容体が保持されていることを明らかにした（図６）。処置および無処置網膜ホールマウントの両方の下位および中央の網膜における錐体光受容体のカウントは、処置対無処置眼の錐体細胞密度において統計的有意差があることを明らかにした。この結果は、堅調な電気生理学的および行動的な回復がはっきりと明白であったという観察と一致していた。各々の処置用構築物を用いるＧＣ１ＫＯマウスのＰ１４処置は、少なくとも３か月間、錐体光受容体構造を保持することができた。
【０１７１】
（実施例２）
ＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトを含有する動物モデル
ＧＣ１ＫＯマウスにおいて錐体光受容体のみが影響を与えられている（杆体は部分的な機能を失っているのみであり、それらは変性していない）が、ＬＣＡ１患者は、杆体機能損失および杆体変性を示すことに注目することは重要である。この差異についての理由は、杆体光受容体において発現されるＧＣ１の密接な類縁体であるＧＣ２に対する依存性における種特異的な差異であると推測される。推定上、ＧＣ２が活性を再構成することができるので、マウス杆体は、ＧＣ１の非存在下において機能することができるが、ヒトでは、これは当てはまらない。ＧＣ１は、杆体機能、よって杆体変性に必要とされる。ＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトマウスモデルを生成し、杆体機能損失を有することが示された（ＧＣ１  Ｋ／Ｏにおいて見られるような錐体機能損失に加えて）（Ｂａｅｈｒら、２００７年）。ＧＣ２がＧＣ１の非存在下において杆体機能を提供するものであることがこのモデルを用いる生化学的な研究を通して証明された。それでもやはり、ヒトの状態をより確実に模倣するのはＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトマウスである（錐体および杆体の両方が影響を与えられている）（Ｋａｒａｎら、２０１０年）。ＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトマウスにおいてｒＡＡＶ−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびｒＡＡＶ−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターの両方を試験するために、ｒＡＡＶベクターを、前述のＧＣ１ノックアウト研究と正確に同じ様式および時間（出生後１４日）で送達した。視力の回復の分析もまた、生理学的にまた行動的に、ＧＣ１ノックアウト研究について上記に記載されるものと同じ様式で実行する。杆体機能の測定可能な回復がＧＣ１ベクター構築物を用いて処置したＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトマウスにおいて期待されるので、暗所視（つまり杆体）応答が特に重要視される。
【０１７２】
（実施例３）
ＬＣＡ１の「ヒト化」マウス動物モデル
本実施例は、ＬＣＡ１の「ヒト化」マウス動物モデルの生成を記載する。一実施形態では、マウスモデルは、ＧＣ１／ＧＣ２／ＧＣＡＰ１ノックアウトを含有する。ＧＣＡＰ１は、ＧＣ１を活性化するタンパク質である。ヒトにおける使用のために設計した臨床グレードｒＡＡＶベクターから発現されるヒトＧＣ１を機能について評価することができるｉｎ  ｖｉｖｏ系を生成するために、ＧＣ１／ＧＣ２／ＧＣＡＰ１トリプルノックアウトｈＧＣＡＰ１トランスジェニックマウスを利用した。このマウスでは、視覚機能は、ｈＧＣＡＰ１のみと相互作用するｒＡＡＶ媒介性のｈＧＣ１に頼る（つまり、内因性マウスＧＣＡＰ１は存在しない）。この研究から、ヒトＧＣＡＰ１タンパク質がマウスモデルにおいてヒトＧＣ１活性を刺激するために必要とされるかどうかおよび２つのヒトポリペプチドが疾患の非ヒト（つまりマウス）モデルにおいて再構成され、発現される場合に、錐体および杆体の機能を修復することができるかどうかを決定することが可能である。ＧＣ１／ＧＣ２／ＧＣＡＰ１トリプルノックアウトｈＧＣＡＰ１トランスジェニックマウスを生成するために、ＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトマウス（Ｂａｅｈｒら、２００７年）をＧＣＡＰ１ノックアウトマウス（Ｍｅｎｄｅｚら、２００１年）と交雑した。次いで、ＧＣ１／ＧＣ２／ＧＣＡＰ１トリプルノックアウトｈＧＣＡＰ１トランスジェニックマウスを生成するために、ヒトＧＣＡＰ１を、動物モデルにおいて遺伝子導入発現させる。ｒＡＡＶベクターｈＧＣ１がこれらの動物に提供される研究は、ＧＣ１ノックアウト研究において使用される方法と実質的に同一の様式で行う。視力の回復の分析は、次いで、生理学的にまた行動的に、ＧＣ１ノックアウト研究において実行した同じ様式で実行する。
【０１７３】
（実施例４）
本発明の実施において有用な例示的なベクター構築物
２つの例証となるベクターのマップを図１１に示す。一方は、非特異的プロモーターｓｍＣＢＡを含有し、他方は、杆体／錐体に限られるプロモーターＧＲＫ１を有する。両方とも、血清型５  ＡＡＶの中にパッケージされている。現在まで試験したベクター用量はすべて、マウス網膜において安全である。次いで、ＧＣ１−／−マウスのコホートは、出生後の１４日目（Ｐ１４）に網膜下に注射し、次いで、ＥＲＧによっておよび明所視視動性（錐体媒介性）行動によって周期的に分析した。ＧＣ１−／−マウスが杆体媒介性のＥＲＧを維持するので、機能的な奪回のモニタリングは、主として、錐体機能の回復に集中した。ｓｍＣＢＡベクターについては、ＥＲＧは、処置後４週間およびその後、処置後１２〜１３週間まで２週間ごとに評価した。９匹のマウスにおいて処置した９つの眼はすべて、処置に応答した。下記に示す結果は、対照無処置眼における本質的に記録可能でないものからの、パートナーのベクター処置眼における正常のおよそ５０％までの明所視ＥＲＧ振幅の有意な回復を実証する。
【０１７４】
次いで、４匹のＧＣ１−／−マウスを、処置対無処置パートナー眼によって媒介される差異について暗所視視動性行動によって分析した（下記に示す）。４つの処置眼（２８９、２９０、２９４、２９５、赤色のバー）はすべて、それらの対照眼と比較して視覚における有意な改善を示し、４つのうちの３つは、有意に改善されたコントラスト感度を示した。マウス２９７および２９８は野生型対照であり、マウス２９９は無処置ＧＣ１−／−マウスであった。結果は、ＬＣＡ１の動物モデルにおいてベクターが錐体媒介性の視力の機能的および行動的な回復を達成したことを実証する。
【０１７５】
発現を杆体および錐体に限るＧＲＫ１ベクターについては、ＥＲＧは、処置後４週間およびその後、処置後１２〜１３週間まで２週間ごとに、一方の眼を処置した１４のＧＣ１−／−マウスにおいて評価した。１２の動物における１４の処置眼のうちの１２が応答した。結果（下記に示す）は、対照無処置眼における本質的に記録可能でないものからの、パートナーのベクター処置眼における正常のおよそ４０％までの明所視ＥＲＧ振幅の有意な回復を明らかにする。
【０１７６】
次いで、１匹のＧＣ１−／−マウス（♯２９３）を、処置対無処置パートナー眼における差異について暗所視視動性行動によって分析した（上記に示す）。このマウスは、その対照の左眼（青色のバー）に比べて、ベクター処置右眼（赤色のバー）において視覚およびコントラスト感度の両方における有意な改善を示した。応答は、対照野生型マウス（２９７および２９８）とほぼ等しく、無処置ＧＣ１−／−マウス（２９９）と比較して有意に改善した。そのため、ＧＲＫ１ベクターが、ＬＣＡ１のこのモデルにおいて錐体媒介性の視力の機能的および行動的な回復もまた達成することが結論付けられた。
【０１７７】
（実施例５）
ｗｔＧＣ１の特異的な錐体ターゲティングは奪回を改善する
上記に示すデータは、杆体／錐体に限られるＧＲＫ１プロモーターにより錐体機能および錐体媒介性の行動を奪回することができることをはっきりと実証する。ヒトＬＣＡ１が杆体および錐体欠乏の両方を示すので（主として錐体欠乏を示すＧＣ１−／−マウスと異なり）、発現は、純粋な錐体特異性を獲得するためにさらに限られる必要はない。しかしながら、研究するのに重要であるマウスモデルにおける１つの最終的な錐体表現型がある：暗順応条件では、錐体アレスチンは、野生型網膜でのように、錐体外節から内節、軸索、およびシナプス末端に通常移動しない。そのため、研究は、この細胞の生物学的表現型もまたベクター処置ＧＣ１−／−眼において修正されたかどうかを評価するために実行した。示す結果では、ＧＣ１−／−マウスはＧＲＫ１ベクターを用いて一方の眼を処置し、次いで、注射後７週間目にマウスを暗順応させた。次いで、処置（最下位のパネル）および対照（上位のパネル）網膜を免疫組織化学的検査によって錐体アレスチン局在化について分析した。無処置ＧＣ１−／−網膜（上位のパネル）では、錐体アレスチンは、ほとんど錐体外節（ＯＳ）およびシナプス層（ＳＬ）に残った。対照的に、反対側の処置網膜（最下位のパネル）では、実質的な画分（約５０％）が内節およびシナプス末端に移動した。そのため、ベクター処置がまた錐体アレスチンの適切な移動を修復したことが結論付けられた。
【０１７８】
（実施例６）
ｒＡＡＶベクター遺伝子構築物を使用するＬＣＡ１の長期処置効果
先の実施例は、マウスＧＣ１  ｃＤＮＡ（光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼ［ｈＧＲＫ１］またはユビキタス［ｓｍＣＢＡ］プロモーターによって駆動される）を含有するｒＡＡＶベクターの網膜下注射が、少なくとも３か月間、ＧＣ１ＫＯマウスにおいて錐体媒介性の機能および視覚的な行動を修復することができ、錐体光受容体を保持することができたことを実証した。
【０１７９】
本実施例では、発明者らは、長期処置効果もまたＬＣＡ１のげっ歯動物モデルにおいて達成可能であるかどうかを評価した。さらに、発明者らは、杆体および錐体の両方の構造および機能の損失を示し、表現型がヒトＬＣＡ１に類似するモデルであるＧＣ１／ＧＣ２ダブルノックアウトマウス（ＧＣｄｋｏ）の光受容体へのＧＣ１の送達が、これらの細胞に処置効果を与えるかどうかを検査した。
【０１８０】
方法
ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１、または高度に効率的なカプシドチロシン変異体ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１の網膜下注射を、出生後１４日（Ｐ１４）〜Ｐ２５に、ＧＣ１ＫＯまたはＧＣｄｋｏマウスの一方の眼において実行した。杆体および錐体光受容体機能を網膜電計で（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ）アッセイした。処置用ＧＣ１の発現の局在化および錐体光受容体保持の程度は、免疫組織化学的検査によって決定した。体内分布研究は、処置動物の視神経および脳におけるベクターゲノムの存在を評価するために使用した。
【０１８１】
結果
錐体光受容体機能は、すべてのベクターを用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスにおいて修復され、ＡＡＶ８（７３３）が最も効率的であった。応答は、処置後少なくとも１０か月間、安定していた。処置用ＧＣ１は、光受容体外節において見出された。注射後１０か月の間は、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（７３３）ベクターゲノムは、ＧＣ１ＫＯマウスの処置眼の視神経においてのみ検出された。ＡＡＶ８（７３３）ベクターｍＧＣ１は、処置ＧＣｄｋｏマウスにおいて杆体および錐体の両方の機能を修復した。
【０１８２】
結論
長期処置効果は、本明細書において開示されるｒＡＡＶベクター構築物を使用すると、ＧＣ１欠損の哺乳動物モデルであるＧＣ１ＫＯマウスにおいて達成可能である。重要なことには、療法はまた、ＬＣＡ１杆体／錐体表現型を模倣するＧＣｄｋｏマウスにおいても達成可能であった。これらの結果は、網膜ジストロフィー、特にＬＣＡ１の処置のためのｒＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターの使用のための証拠を提供する。
【０１８３】
（実施例７）
ＧＣ１ＫＯマウスにおける遺伝子療法による錐体光受容体の長期の保持および錐体機能の回復
先の実施例では、光受容体特異的（ｈＧＲＫ１）またはユビキタス（ｓｍＣＢＡ）プロモーターによって駆動されるマウスＧＣ１  ｃＤＮＡを含有する網膜下ＡＡＶ５ベクターが、３か月間、ＧＣ１ＫＯマウスにおいて、錐体媒介性の機能および視覚的な行動を修復することができ、錐体光受容体を保持することができることが示された。本実施例では、長期処置効果を同じマウスモデルを使用して評価する。ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１、または高度に効率的なカプシドチロシン変異体ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を、出生後１４日（Ｐ１４）〜および出生後の日（Ｐ２５）に、ＧＣ１ＫＯマウスの網膜下に送達した。網膜機能は、網膜電位図（ＥＲＧ）によってアッセイした。ＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現の局在化および錐体存続は、免疫組織化学的検査を用いてアッセイした。網膜を越えるベクターゲノムの広がりは、視神経および脳組織のＰＣＲによって定量化した。錐体機能は、試験したすべてのベクターにより修復され、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）が最も効率的であった。ＧＣ１のＡＡＶ媒介性の発現は、もっぱら光受容体において見出された。注射後１０か月の間は、ＡＡＶゲノムは、処置眼の視神経においてのみ検出された。これらの結果は、長期処置効果が、ＧＣ１欠損の哺乳動物モデルにおいて達成可能であることを初めて実証する。
【０１８４】
ＧＵＣＹ２Ｄによってコードされる網膜グアニル酸シクラーゼ−１（ＧＣ１）は、脊椎動物光伝達において重要な機能に果たす（Ｐｕｇｈら、１９９７年）。光刺激の後に、セカンドメッセンジャーサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）は、光受容体細胞内で、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ６）によって急速に加水分解され、ｃＧＭＰ感受性カチオンチャネルの閉鎖および細胞の過分極に至る。細胞質内［Ｃａ２＋］が５０ｎＭ以下に低下すると、ＧＣ１は、小さなＣａ２＋結合タンパク質、ＧＣＡＰ（グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質）によって活性化される。ＧＣ１は、ｃＧＭＰ感受性チャネルに結合し、再び開くｃＧＭＰを合成し、「暗」脱分極状態に光受容体を戻す（Ｐｕｇｈら、１９９７年；Ｐｏｌａｎｓら、１９９６年；Ｗｅｎｓｅｌ、２００８年；ＬａｍｂおよびＰｕｇｈ、２００６年；Ａｒｓｈａｖｓｋｙら、２００２年）。したがって、ＧＣ１は、光暗および回復サイクルにおいて重大な役割を果たし、ｃＧＭＰを介して、細胞内カルシウムレベルおよび光受容体の分極状態を連結するフィードバックループの中心になる。
【０１８５】
ＧＣ１は、ヒト、サル、およびマウス網膜の杆体および錐体光受容体の外節において発現される（Ｄｉｚｈｏｏｒら、１９９４年；Ｌｉｕら、１９９４年；Ｈａｉｒｅら、２００６年）。他の膜グアニル酸シクラーゼのように、それは、Ｎ’末端シグナル配列、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、１回膜貫通ドメイン、キナーゼ様相同性ドメイン（ＫＨＤ）、二量体化ドメイン（ＤＤ）、およびＣ’末端触媒ドメイン（ＣＣＤ）を含有し、おそらくホモマー二量体として存在する（ＹａｎｇおよびＧａｒｂｅｒｓ、１９９７年）。ＧＵＣＹ２Ｄにおける変異は、それぞれ、劣性レーバー先天性黒内障１（ＬＣＡ１）ならびに錐体杆体ジストロフィーの優性および劣性形態、ＣＯＲＤ６およびＣＯＲＤと関連する（Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９６年；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、２０００年；Ｋｅｌｓｅｌｌら、１９９８年；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９８年；Ｇｒｅｇｏｒｙ−Ｅｖａｎｓら、２０００年；Ｗｅｉｇｅｌｌ−Ｗｅｂｅｒら、２０００年；Ｕｇｕｒら、２０１０年）。ＬＣＡ１は、光受容体変性に先行する網膜電位図（ＥＲＧ）消滅によって特徴付けられる、重症で、初期の発病である常染色体劣性失明障害である（Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９９年；ＣｈｕｎｇおよびＴｒａｂｏｕｌｓｉ、２００９年）。ＣＯＲＤ６は、進行性の夜盲症および周辺視野損失に至る、視覚および色覚の早期喪失、その後に続く杆体の変性を引き起こす、錐体で始まる、光受容体の進行性の変性によって特徴付けられる優性障害である（Ｋｅｌｓｅｌｌら、１９９８年；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９８年）。ＣＯＲＤ６変異は、二量体化ドメイン（ＤＤ）に限られ、ＧＣ１のＧＣＡＰ媒介性の活性化の増加を一般に引き起こす（Ｐａｙｎｅら、２００１年；Ｄｏｗｎｅｓら、２００１年；Ｗｉｌｋｉｅら、２０００年）。最近発見された、劣性ＣＯＲＤを引き起こす変異は、ＧＣ１の触媒ドメイン（ＣＤ）に位置し、酵素機能を全体的に低下させると考えられる（Ｕｇｕｒら、２０１０年）。ＬＣＡ１を引き起こす変異は、ＧＣ１のＥＣＤ、ＫＨＤ、ＤＤ、およびＣＣＤドメインの全体にわたって分布する（Ｋａｒａｎら、２０１０年）。これらの変異は、酵素の構造および安定性を改変し、他の周辺膜結合タンパク質の逆行性輸送に影響を与える可能性があり、しばしばヌルである。
【０１８６】
ＧＣ１ＫＯマウスは、ＧＵＣＹ２Ｄのマウス相同体であるＧｕｃｙ２ｅにおいてヌル変異を保持する。ＬＣＡ１患者のように、このモデルにおける錐体機能の損失は、錐体変性に先行する（Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年）。杆体は、マウス光受容体における他の機能的なグアニル酸シクラーゼであるＧＣ２の存在によりそれらの機能の３０〜５０％を保持し、変性しない（ＹａｎｇおよびＧａｒｂｅｒｓ、１９９７年；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年；Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年；Ｃｉｄｅｃｉｙａｎら、２００８年；Ｓｏｎｇら、２００２年）。前の実施例では、光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）またはユビキタス（ｓｍＣＢＡ）プロモーターによって駆動されるマウスＧＣ１  ｃＤＮＡを含有する血清型５アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの網膜下注射が、３か月間、ＧＣ１ＫＯマウスにおいて、錐体媒介性の機能および視覚的な行動を修復することができ、錐体光受容体を保持することができることが示された。本研究では、ＡＡＶ媒介性の遺伝子置換療法は、長期にわたりＧＣ１ＫＯマウスに療法を提供するその能力について評価した。ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１およびＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１および高度に効率的なカプシドチロシン変異体ベクターＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を、出生後１４日（Ｐ１４）〜出生後２５日（Ｐ２５）に、ＧＣ１ＫＯマウスの網膜下に送達した。これらの発見は、長期処置効果が、ＧＣ１欠損の哺乳動物モデルにおいて達成可能であることを初めて実証する。ベクターゲノム体内分布もまた、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（７３３）ベースのベクターについて評価した。これらの発見は、ＬＣＡ１（およびおそらく錐体杆体ジストロフィー）のためのＡＡＶベースの遺伝子療法臨床試験の発展と直接的な関係があり、光受容体関連遺伝子における欠陥によって媒介される広範囲の劣性網膜変性のための標準化されたベクター設計を開発するのを支援する。
【０１８７】
材料および方法
実験動物：
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）によって提供されたＧＣ１＋／−マウスのヘテロ接合性の交配から誘導したＧＣ１ＫＯおよび類遺伝子＋／＋対照を、１２時間／１２時間の光／暗サイクル下で発明者らの施設内の動物ケア施設において飼育し、維持した。飼料および水は自由に動物が利用し得る形態とした。研究はすべて、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ＮＩＨ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓに従って行った。
【０１８８】
ＡＡＶベクターの構築：
マウスＧＣ１（ｍＧＣ１）ｃＤＮＡを駆動するユビキタス（ｓｍＣＢＡ）または光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターを含有する血清型５アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５）ベクタープラスミドを、以前に記載される方法（Ｂｏｙｅら、２０１０年）に従って生成した。ＡＡＶ２カプシド上の表面暴露チロシン残基の部位特異的変異誘発が報告されている（Ｚｈｏｎｇら、２００８年）。同様の方法を、本明細書で記載されるＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）カプシド変異体を生成するために使用した。ベクターはすべて、以前に記載される方法に従って、パッケージし、精製し、力価を測定した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、２００２年；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）。ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１、およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１についての結果として生じる力価は、それぞれ、１ｍｌ当たり４．６９×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）、４．１２×１０１３ｖｇ／ｍＬ、および１．０８×１０１３ｖｇ／ｍＬであった。
【０１８９】
網膜下注射：
ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（４．６９×１０９ベクターゲノム）、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（４．１２×１０１０ベクターゲノム）、またはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（１．０８×１０１０ベクターゲノム）のうちの１μＬを、出生後の１４日（Ｐ１４）〜出生後の２５日（Ｐ２５）に、ＧＣ１ＫＯマウスの一方の眼の網膜下に注射した。反対側の対照眼には、注射しなかった。網膜下注射は、先に記載されるように実行した（Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年）。さらに、分析は、比較可能で好結果の注射（最小限の合併症を有する＞６０％の網膜剥離）を受けた動物に対してのみ実行した。すべてのコホートのおよそ７５％は、「好結果の」注射を受けた。ベクター形質導入のエリアが少なくとも網膜剥離のエリアに相当することは十分に立証される（Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年；Ｃｉｄｅｃｉｙａｎら、２００８年）。
【０１９０】
網膜電図検査分析：
処置ＧＣ１ＫＯおよび年齢が一致する類遺伝子（＋／＋）対照のＥＲＧは、わずかな改良を伴う先に記載される方法に従って（Ｈａｉｒｅら、２００６年；Ｂｏｙｅら、２０１０年）、ＰＣベースの制御および記録ユニット（Ｔｏｅｎｎｉｅｓ  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ；Ｊａｅｇｅｒ／Ｔｏｅｎｎｉｅｓ、Ｈｏｅｃｈｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して記録した。ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯマウス（ｎ＝１０）、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯマウス（ｎ＝６）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置ＧＣ１ＫＯマウス（ｎ＝６）、および類遺伝子（＋／＋）対照（ｎ＝８）の記録は、異なる日に始め、そのため、マウスのサブセットはそれぞれ、長さがわずかに異なる時間、モニターした。処置ＧＣ１ＫＯマウスのＥＲＧは、注射後４週間、その後、注射後１年（ＡＡＶ５処置マウス）または注射後９か月（ＡＡＶ８［Ｙ７３３Ｆ］処置マウス）まで毎月記録した。年齢が一致する類遺伝子（＋／＋）対照マウスは、８か月間、続けた。マウスは、様々な死後の研究（体内分布研究、網膜免疫組織化学分析、網膜組織のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）または予期しない疾病／死亡のために、実験を通じて異なる時点で研究から取り出した。ＥＲＧデータは、ｎ＞３を有する動物のグループにのみ行った。そのため、この研究は、ＡＡＶ５処置マウスについての注射後９か月およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置マウスについての注射後６か月の発見を比較する。処置マウスは、これらの時点を過ぎてもＥＲＧ応答を示し続けたが、しかしながら、試料サイズは十分に低下し、統計分析はもはや役に立たなかった。この主張を立証するために、ＡＡＶ５ベクターを用いる処置後１年およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）を用いる処置後９か月の個々のマウスからの代表的な錐体媒介性の結果を示す。暗所視（杆体媒介性）および明所視（錐体媒介性）記録は、以前に記載される記録パラメーター（Ｂｏｙｅら、２０１０年）を使用して引き出した。ｂ波振幅は、ａ波トラフおよびそれぞれの波形の続くポジティブピークの間の差異として定義した。無処置ＧＣ１ＫＯマウスにおける杆体媒介性のＥＲＧ応答は、動物によって多様であり（Ｙａｎｇら、１９９９年）、よって、異なる動物からの暗所視ａおよびｂ波振幅を平均する場合、大きな標準偏差が観察された。杆体ＥＲＧデータは、比の形式で示す（個体内の処置対無処置杆体ａおよびｂ波振幅の平均）。そのため、１を超えるいかなる値も、ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置が杆体応答を改善したことを示す。比は、１ｃｄ／ｍ２刺激を用いて生成された振幅を使用して計算した。１２ｃｄ／ｍ２で生成された処置ＧＣ１ＫＯマウスおよび類遺伝子（＋／＋）対照マウスすべての注射および非注射眼における明所視錐体媒介性ｂ波最大振幅は、それぞれの時点で平均し、標準誤差を生成するために使用した。データはすべて、最終的なグラフ表示のためにＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔにインポートした。標準的なｔ検定は、データセットの間のＰ値を計算するために使用した。有意差は、Ｐ値＜０．０５として定義した。
【０１９１】
体内分布：
処置ＧＣ１ＫＯマウスの組織におけるベクターＤＮＡの広がりは、わずかな改良を伴う以前に記載される方法（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）に従って、安楽死時に収集した試料において決定した。ベクター処置マウスは、以下の時点で安楽死させた：ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウス（注射後４か月：ｎ＝１；注射後７か月：ｎ＝１）、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（注射後７か月：ｎ＝１；注射後１０か月：ｎ＝５）、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（注射後７か月：ｎ＝１；注射後１０か月：ｎ＝１）。注射後７か月または注射後１０か月の時点と年齢が一致するＧＣ１ＫＯマウスからの対照組織もまた、実験動物と一緒に評価した。安楽死の後に、異なる新しいピンセットを、およそ０．５ｃｍの近位視神経を保持する処置および無処置眼を摘出するために使用した。次いで、異なる新しい解剖はさみは、眼球から視神経を切り取るために使用し、この後、それらは、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃に移し、ここでそれらはＤＮＡ抽出の時間までそのままとした。眼球は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＡＦ）中に浸し、免疫組織化学的検査のために処理した（以下を参照されたい）。
【０１９２】
脳は、取り出し、ステンレス鋼マウス冠状脳マトリックス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、視覚特異的な領域を単離するために使用した。右および左の外側膝状核は、ベクターゲノムを脳から回収し、免疫組織化学的検査が必要である場合に、処置群当たり１匹のマウスから収集し（最も後の時点）、ホルマリン固定し、保存した。視路を含有する右および左の脳の別々の部分を収集し、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃に移し、ここでそれらはＤＮＡ抽出の時間までそのままとした。組織を収集する間にクロスコンタミネーションを回避するように注意した。ゲノムＤＮＡは、メーカーのプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ）に従って組織から抽出した。結果として生じるＤＮＡ濃度は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｏｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ６１３１；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定した。定量的ＰＣＲは、わずかな改良を伴う以前に記載される方法に従って実行した（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年；Ｓｏｎｇら、２００２年；Ｐｏｉｒｉｅｒら、２００４年）。
【０１９３】
プライマー対は、それぞれのベクターゲノムにおけるＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ポリＡ）領域に対して設計し、標準曲線は、同じＳＶ４０ポリＡ標的配列を含有する既知濃度のプラスミドＤＮＡを使用して確立した。ＤＮＡ試料は、三通りアッセイした。ＰＣＲの阻害による偽ネガティブを除外するために、第３の反復実験に、１００コピー／ゲノムＤＮＡ１μｇの比で標的（ＳＶ４０ポリＡ）を含有するプラスミドＤＮＡを「加えた（ｓｐｉｋｅ）」。＞４０コピーのｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ＤＮＡが検出された場合、試料は、ベクターゲノムコピーを報告するのに許容されると考えられた。いくつかの場合には、「ｓｐｉｋｅ  ｉｎ」できない試料は、ＰＣＲ反応において１μｇ未満のゲノムＤＮＡを使用して再分析し、それによって、ＰＣＲ阻害剤を希釈し、抽出した組織におけるＤＮＡと同時精製した。ｓｐｉｋｅ−ｉｎコピー数は、１００コピー／μｇ  ＤＮＡ比を維持するために比例して低下した。ベクターゲノムコピーを報告する基準は、以前に記載される方法（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）に従って確立した。手短かに言えば、１００を超えるゲノムコピー／μｇは、ポジティブであると考えられ、測定されたコピー数／μｇを報告した。１００未満のコピー／μｇは、ネガティブであると考えられた。
【０１９４】
組織調製、免疫組織化学的検査、および顕微鏡検査法：
安楽死時に、注射後７か月［ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１］ならびに１０か月（ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１およびＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１）に実行した体内分布研究と同時に、処置ＧＣ１ＫＯマウス、年齢が一致する無処置ＧＣ１ＫＯマウス、および年齢が一致する類遺伝子ＧＣ１＋／＋マウスの縁郭に、１２時の位置に熱い針を用いてマークし、方向づけを容易にした。無処置ＧＣ１ＫＯおよびＧＣ１＋／＋対照は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置マウスと年齢が一致した（安楽死時、８月齢）。凍結切片法のために指定した眼は、以前に記載される方法に従って処理し、免疫染色した（Ｈａｉｒｅら、２００６年）。手短かに言えば、１０μｍ網膜切片は、ＧＣ１（ウサギポリクローナル１：２００、ｓｃ−５０５１２  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）またはマウス錐体アレスチン（ウサギポリクローナル「ＬＵＭＩｊ」、１：１０００、Ｄｒ．Ｃｈｅｒｙｌ  Ｃｒａｆｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡによって提供）に対して向けられる抗体と共にインキュベートした。一次インキュベーションの後に、ＩｇＧ二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−５９４は、それぞれ、室温で、１時間、適用した（１×ＰＢＳ中１：５００）。切片は、室温で、５分間、４’，６’−ジアミノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色した。注射後１１か月目に、一方の眼にのみＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を用いる処置を受けたあるＧＣ１ＫＯマウスを安楽死させ、処置および無処置眼からの網膜ホールマウントを、以前に記載される方法に従って処理した（Ｐａｎｇら、２０１０年）。手短かに言えば、ホールマウントは、ＬＵＭＩｊ（１：１０００）、その後に続けてＩｇＧ二次Ａｌｅｘａ−５９４（１×ＰＢＳ中１：５００）を用いて染色し、網膜の上部（背側）の部分を１２時に方向づけてスライド上に置いた。網膜切片は、ＬＣＳ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．６１、Ｂｕｉｌｄ  １５３７ソフトウェアを装備した共焦点顕微鏡検査法（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）によって分析した。画像は、２０×の倍率で同一の露光設定で撮った。網膜ホールマウントは、ＱＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ  ４０００Ｒ  ＣａｍｅｒａおよびＱＩｍａｇｉｎｇ  ＱＣａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏソフトウェアを装備した広視野蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２）を用いて分析した。それぞれのホールマウントの四半部は、同一の露光設定下で１０×で画像処理し、次いで、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにおいて相互にマージした。
【０１９５】
イムノブロッティング：
注射後７か月目に、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射したあるマウスおよび年齢が一致する類遺伝子ＧＣ１＋／＋（対照）マウスを安楽死させ、それらの眼を摘出し、１×ＰＢＳ中に配置した。網膜は直ちに解剖し、以下のように処理した。個々の網膜は、４℃で、１時間、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）を有するＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）において可溶性にし、その後に１４０００ｒｐｍでの遠心分離を続けた。上清のタンパク質濃度は、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定し、１５μｇのそれぞれの試料を、１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、１５％メタノールを含有する移行緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン）において１時間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜上に移した。ブロットは、ブロッキング緩衝剤（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて処理し、ＧＣ１を認識するマウスモノクローナル抗体（ＩＳ４、１：３０００、Ｄｒ．Ｋｒｉｓ  Ｐａｌｃｗｅｓｋｉ、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡによって提供）ならびにＧＣＡＰ１（ｐＡｂ  ＵＷ１４、１：２５，０００、Ｄｒ．Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｂａｅｈｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈによって提供）およびβ−アクチン（１：５０００、Ａｂｃａｍ）に対して産生されるウサギポリクローナル抗体を用いて１時間、標識した。二次抗体（ＣＷ８００にコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇおよびＩＲ６８０とコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ）を１時間、適用し、ブロットは、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）を用いて画像処理した。
【０１９６】
ｒｔＰＣＲによるｍＲＮＡの定量、網膜ゲノム回収、および視神経ＩＨＣ
視神経が付属した個々の処置眼は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１またはＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１および年齢が一致する無処置ＧＣ１＋／＋マウスと共に処置後１年のＧＣ１ＫＯマウスから収集した。網膜は、直ちに眼から切り分け、液体窒素中でスナップ凍結させた。視神経は、眼から分離し、４℃で、一晩、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、４℃で、２時間、３０％スクロース中に浸し、次いで、ドライアイス／エタノールのバスにおいてクライオスタット化合物（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ  ４５８３；Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で速やかに凍結させた。視神経は、１０μｍで切片化し、以前に記載される方法に従って染色した（Ｂｏｙｅら、２０１０年）。網膜は、４５秒間、３５０ｍＬの緩衝剤ＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＢＭＥにおいてホモジナイズした。試料は、遠心分離し、溶解物は、半分に分離した（一方の半分はゲノム回収および他方の半分はＲＮＡ抽出に指定した）（ＴｒａｉｎｔおよびＷｈｉｔｅｈｅａｄ、２００９年）。ゲノム回収は、上記に記載されるように実行した。ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて実行した。ＲＮＡは、以下の網膜特異的ｍＲＮＡを測定するために、逆転写し（ｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、リアルタイムＰＣＲにおいて使用した（ｉＱ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒｍｉｘおよびｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓと接続されたＭｙｉＱ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）：グアニル酸シクラーゼ−１（ＧＣ１）、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質−１（ＧＣＡＰ１）、錐体トランスデューシンα（ＧＮＡＴ２）、杆体ｃＧＭＰ特異的３’，５’環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ（ＰＤＥ６α）、およびハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）。
【０１９７】
ＧＣＡＰ１、ＧＮＡＴ２、ＰＤＥα、およびＧＡＰＤＨについてのプライマー対は、Ｂａｅｈｒら（２００７年）によって使用されるものと同一のものとした。マウスＧＣ１についてのプライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡ−３’［配列番号１６］、リバースプライマー：５”−ＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣ−３’［配列番号１７］）は、ＧＣ１ＫＯマウスにおける遺伝子破壊の部位（Ｙａｎｇら、１９９９年）であるエクソン５の側面に位置し、かつ１５１ｂｐの増幅産物を生成するように設計した。ＰＣＲは、期待されるように、無処置ＧＣ１ＫＯ網膜ではなく、ＧＣ１＋／＋およびＡＡＶ−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯ網膜試料において適切なサイズの増幅産物を産生した。増幅産物同一性は、標的配列内で切断して、５６ｂｐおよび９５ｂｐの断片を得るＳｔｕＩ（ＮＥＢ）を用いる制限消化物によって検証した。逆転写ＤＮＡ（ＧＣ１＋／＋およびＡＡＶ−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯ網膜試料の両方からの）の希釈系列に対するＧＣ１およびＧＡＰＤＨプライマーを用いるｒｔＰＣＲは、同様の傾斜をもたらし、内因性およびベクター媒介性のＧＣ１メッセージの両方を定量化するためのＧＣ１プライマーの適合性を示した（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。
【０１９８】
結果は、３つの反復反応の平均であり、試料を標準化するためのＧＡＰＤＨシグナルおよび較正物質として役立つＧＣ１＋／＋試料を用い、２−△△Ｃτ法（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１年）を使用して計算した。標準偏差は、それぞれの試料について行った３つの反復反応から計算した。データは、ＧＣ１＋／＋試料と比べたｍＲＮＡレベルにおける倍数変化として示す。
【０１９９】
結果
長期光受容体特異的ＧＣ１発現：
ＧＣ１に対して向けられる抗体を用いる免疫染色は、ＡＡＶベクター処置用タンパク質発現が、かなりの割合の動物の生涯の間、処置ＧＣ１ＫＯマウスの光受容体においてもっぱら持続することを明らかにした；ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１は少なくとも７か月、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１は少なくとも１０か月、およびＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１は少なくとも１０か月（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。ＧＣ１発現は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターを用いて処置した杆体および錐体の外節に限られたのに対して、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を用いて処置した眼の外節およびよりまれに光受容体細胞体の両方において見出され、光受容体特異的ｈＧＲＫ１と比べたこのユビキタスプロモーターの強さと一致する結果であった（Ｂｅｌｔｒａｎら、２０１０年）。網膜菲薄化の２つの例が観察された。第１のものは、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（送達された４．６９×１０９の全ベクターゲノム）を用いて処置されたＧＣ１ＫＯ網膜であった。外顆粒層（ＯＮＬ）は、ナイーブＧＣ１ＫＯまたはＧＣ１＋／＋対照網膜（両方とも８月齢）において見られたものに比べてわずかに薄くなった。これは、ｓｍＣＢＡプロモーターによって媒介されたＧＣ１の過剰発現の結果であるかもしれない（Ｂｅｌｔｒａｎら、２０１０年）。
【０２００】
第２のものは、より濃度の高いＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いて処置したＧＣ１ＫＯ網膜を含み、すでに述べたように、光受容体特異的ＧＣ１発現を示したが、外顆粒層の深刻な菲薄化を伴った。このベクターは、本研究において評価した３つのうちで最も濃度の高いものであったことに注目されたい（送達した４．１２×１０１０ベクターゲノム対それぞれ、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１プレップおよびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１について４．６９×１０９および１．０８×１０１０）、また、さらに、ＧＣ１の過剰発現が、観察された菲薄化の原因であるかもしれないことを強調する。少なくとも、これらの結果は、用量制限毒性がマウスにおいて観察可能であるかもしれないことを示唆する。ＧＣ１発現は、無処置ＧＣ１ＫＯ網膜においてなかった（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
【０２０１】
長期錐体光受容体存続はＡＡＶベクターＧＣ１によって達成される
処置および無処置ＧＣ１ＫＯマウスならびにＧＣ１＋／＋対照における錐体光受容体は、マウス錐体アレスチンを染色することによって同定した。最終的な体内分布研究のために安楽死させたマウスからの網膜横断切片およびＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１（右眼のみ）を用いる処置後１１か月のＧＣ１ＫＯマウスからの網膜ホールマウントを分析した。本明細書で、錐体光受容体密度が、１０月齢までに無処置ＧＣ１ＫＯ網膜において著しく低下したことが示され、錐体が、このマウスモデルにおいて組織分布的に特異的な様式で失われているという先の報告を確認する（Ｃｏｌｅｍａｎら、２００４年）（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。ホールマウント分析は、１１月齢の無処置網膜がまばらな錐体密度を示し、残存性の錐体は、もっぱら、上部の網膜領域において見出されたことを明らかにするのに対して、パートナーのＰ１４処置網膜は、おそらく網膜下注射の間にベクターに暴露されず、そのため、導入遺伝子産物を含有しなかった側頭の網膜のわずかな部分を除いて、非常に高度な錐体密度をあらゆる部分で保持した。ＡＡＶ５処置網膜において見られたものと比較して、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置マウスの網膜横断切片における錐体密度および構造は、正常ＧＣ１＋／＋網膜において見られるものと質的に最も類似するように思われた（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。それらの密度は、無処置対照と比べて増加したが、ＡＡＶ５処置網膜における錐体は、わずかに無秩序であるように思われ、これは、おそらく、これらのマウスにおける外顆粒層のわずかな、全体的な障害／菲薄化による結果である。
【０２０２】
ＡＡＶ処置ＧＣ１ＫＯマウスにおける光受容体機能（ＥＲＧ）の長期回復
先の実施例では、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１またはＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１のＰ１４送達の後に、３か月間、ＧＣ１ＫＯマウスに錐体媒介性の機能を修復することができた（Ｂｏｙｅら、２０１０年）。処置マウスにおける平均明所視ｂ波振幅は、注射後４週間で部分的に修復され、その研究を通じて安定したままであった。本実施例では、処置後９か月までの錐体媒介性の応答は、従来の研究において使用した同一のベクターをＰ１４〜Ｐ２５に注射したＧＣ１ＫＯマウスにおいて比較した。ＡＡＶ５−ｍＧＣ１ベクターを用いて処置した残りのマウスはすべて、処置後少なくとも１年間、測定可能な錐体媒介性の機能を示し続けた。ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いて処置した個々のマウスから１２ｃｄ／ｍ２で誘発された代表的な結果を、図２２Ａおよび図２２Ｂに示す。錐体応答は、ある期間にわたって安定し、無処置の反対側の対照から生成された応答よりも有意に高度であり（ｐ＜０．００１）、錐体機能の回復が動物の生涯にわたり可能であることを示唆した（図２２Ａ）。先の実施例と一致して、光受容体特異的プロモーター（ｈＧＲＫ１）含有ベクターの送達の後に達成される回復のレベルは、あらゆる処置後の時点で、ユビキタスプロモーター（ｓｍＣＢＡ）含有ベクターを用いて達成されるものと有意に異なっていなかった。代表的な結果は、修復された錐体ＥＲＧの反応速度が、研究の経過を通じて正常であるように思われたことを明らかにする（図２２Ｂ）。さらに、本実施例において、錐体光受容体機能が、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後の少なくとも６か月間、安定して修復されたことが示された。
【０２０３】
この強力で速効性のＡＡＶ８チロシンカプシド変異体を注射したＧＣ１ＫＯマウスにおける錐体ｂ波振幅は、評価したすべての時点で各々のＡＡＶ５ベクターを注射したＧＣ１ＫＯマウスにおいて見られたものよりも高度であった。すべてのベクターを並行して比較することができた最も後の時点である処置後６か月目に、ＡＡＶ８（Ｙ７３３）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１対ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウス（ｐ＝０．０３３）およびＡＡＶ（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１対ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置マウス（ｐ＝０．０２５）における錐体ｂ波振幅の間で有意差があった。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１（ｎ＝１）を用いる注射後９か月目に記録した代表的な結果は、注射後６か月目に記録したものよりも顕著に小さかった。
【０２０４】
無処置ＧＣ１ＫＯ杆体応答（５月齢までの５０〜７０％のＷＴ）におけるマウス間の多様性により（２３）、処置対無処置眼の平均杆体応答の統計比較は、不確実である。しかしながら、動物内で、杆体ＥＲＧ振幅は、パートナーの眼の間でほぼ等しく、そのため、発明者らは、処置対無処置眼について、平均マウス内杆体ａおよびｂ波振幅比を計算し、次いで、ある期間にわたってこれらの比をプロットした（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。杆体機能のＡＡＶ媒介性の回復は、値＞１．０による比によって示す。図２３Ａおよび図２３Ｂは、ある時点（処置後４か月）を除いて、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置対無処置眼における杆体ｂ波振幅の平均比がすべて＞１．０であったことを示す。ＡＡＶ５処置対無処置眼の比は、時々＞１．０であったのみであった。同様に、杆体ａ波比は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置マウスにおいて一貫してより高度であったのに対して、それらは、多くの場合、各々のＡＡＶ５ベクターを用いる処置の後に低下した（図２３Ｂ）。これらの結果は、杆体に対する処置効果はわずかであったが、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）は、ＧＣ１ＫＯマウスに最も堅調な杆体媒介性の機能改善を与えたことを示唆する（図２３Ｂ）。１ｃｄ／ｍ２の刺激によって誘発される代表的な杆体媒介性の暗所視ＥＲＧ結果は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯマウス（処置後６か月）、無処置の反対側の対照眼、および年齢が一致するＧＣ１＋／＋対照において示す。杆体ＥＲＧ振幅におけるＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）媒介性の改善は、本実施例において明らかであり、野生型以下の振幅は別にして、処置眼応答反応速度は、ＧＣ１＋／＋対照において見られるものに類似していることを示す。
【０２０５】
ベクター体内分布：
体内分布研究は、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）送達ベクターゲノムを、数か月の期間の後に処置マウスの視神経および／または脳において検出することができたかどうかを立証するために、それぞれのベクターを用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスにおいて実行した。ＡＡＶ５ベクターを注射したマウスは、処置後７（ｎ＝２）および１０（ｎ＝５）か月目に評価し、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射したマウスは、処置後４（ｎ＝１）および７（ｎ＝１）か月目に評価した。注射および非注射眼からの視神経ならびに視路を含有した左および右脳の一部を検査した。ＡＡＶ５ベクターは、ＧＣ１ＫＯマウスの右眼に注射した。したがって、ベクターゲノムは、注射後７および１０か月目にＡＡＶ５処置マウスの右の視神経において検出された。注射後７か月目に、ベクターゲノムはまた、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射した１匹のマウスの左脳において検出された。ベクターゲノムは、その動物の右脳から検出されなかった。右の（注射した）視神経および左脳がポジティブであったという観察は、左半球が主に右眼に「つながっている」ので、解剖学的に矛盾しない。
【０２０６】
注射後１０か月までに、ＡＡＶ５送達ベクターゲノムは、右の（注射した）視神経においてなお検出されたが、両方の脳半球になかった。ＡＡＶ８（Ｙ７３３）ベクターは、ＧＣ１ＫＯマウスの左眼に注射した。したがって、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）送達ベクターゲノムは、注射後４および７か月目に左の視神経において検出された。どの時点でも、ＡＡＶ８（７３３）処置マウスにおけるベクターゲノムは、各々の脳半球において検出されなかった。ベクターゲノムのより高度な平均数は、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１と比較して、ＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射した眼の視神経において検出された。この結果は、おそらく、後者（４．６９×１０１２ｖｇ／ｍＬ）と比較した前者（４．１２×１０１３ｖｇ／ｍＬ）のより高度な力価によるものである。
【０２０７】
さらに、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１送達ゲノムのみ、本研究の経過にわたり脳組織において検出され、この違った観察は、おそらく、このベクターの比較的高度な力価によるものである。使用したＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターの力価（１．０８×１０１３ｖｇ／ｍＬ）が、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクター未満であったという事実にもかかわらず、ベクターゲノムのより高度な平均数は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置眼の視神経において検出された。ＡＡＶ５は、マウス網膜の神経節細胞の形質導入に効果がないことが公知であるが（Ｓｔｉｅｇｅｒら、２００８年）、ＡＡＶ８は、この細胞型を形質導入することが示された（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００６年）。シリンジが網膜下注射の間に内部の網膜を横断し、眼サイズ全体に対する注射容量の比がマウスにおいて高度であるので、網膜神経節細胞へのベクターのいくらかの暴露が期待される。そのため、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置眼の視神経において検出されるより多くのベクターゲノムは、網膜神経節細胞に対する、ＡＡＶ５と比べた、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）の親和性の増加によるものとすることができる。期待されるように、ＡＡＶベクターゲノムは、ナイーブＧＣ１ＫＯ対照マウスのあらゆる組織からも回収されなかった。
【０２０８】
ＡＡＶ−ｍＧＣ１処置は、処置ＧＣ１ＫＯ網膜をＧＣ１およびＧＣＡＰ１の野生型レベルに修復する
ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を用いる注射後７か月目に、１匹のＧＣ１ＫＯマウスからの処置および無処置網膜ならびに１匹の年齢が一致するＧＣ１＋／＋対照マウスは、ＧＣ１およびＧＣＡＰ１タンパク質発現のレベルをアッセイするために使用した。この実験の目標は、処置群にわたってＧＣ１レベルを比較することではなく、ベクター媒介性のＧＣ１発現のレベルを野生型動物におけるＧＣ１のレベルと比較することであった。同様に、発明者らは、ＧＣＡＰ１発現に対するＡＡＶ送達ＧＣ１の効果を評価した。期待されるように、ＧＣ１タンパク質は、ＧＣ１ＫＯマウスの無処置眼になかった。対照的に、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置眼におけるＧＣ１のレベルは、正常ＧＣ１＋／＋対照において見られたものに近かった（図４）。ＧＣＡＰ１がＧＣ１ＫＯマウスにおいて翻訳後にダウンレギュレートされるという先の報告と一致して、発明者らは、ＧＣ１＋／＋対照に比べて無処置ＧＣ１ＫＯ網膜においてＧＣＡＰ１がダウンレギュレートされたことを示す（３９）。しかしながら、ＧＣ１のＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）媒介性の送達は、処置ＧＣ１ＫＯマウス網膜におけるＧＣＡＰ１発現におけるアップレギュレーションに至る。ＧＣＡＰ１発現のレベルもまた、ＧＣ１＋／＋対照において見られるものに匹敵した。
【０２０９】
処置ＧＣ１ＫＯマウスでは、ＧＣ１  ｍＲＮＡは、存在し、ＧＮＡＴ２  ｍＲＮＡレベルは、無処置ＧＣ１ＫＯマウスに比べて増加する。ＧＣ１ＫＯマウスのエクソン５内に位置するネオマイシン遺伝子破壊の側面に位置するＧＣ１プライマー対を使用して（Ｔｉｍｍｅｒｓら、２００１年）、ＧＣ１＋／＋およびベクター処置ＧＣ１ＫＯマウスの両方においてＧＣ１  ｍＲＮＡを測定することが可能であった。興味深いことには、遺伝子破壊の十分に下流にあるＧＣ１のエクソン１８および１９を標的にする第２のＧＣ１プライマー対は、無処置ＧＣ１ＫＯマウス試料においてＰＣＲ産物を産生し、そのため、これらのプライマーは、使用しなかった。処置後１年間で、処置網膜におけるＧＣ１  ｍＲＮＡのレベルは、年齢が一致するＧＣ１＋／＋対照マウスにおいて見られものよりも、およそ７倍（ＡＡＶ５処置）および１４倍［ＡＡＶ８（ＹＹ７３３Ｆ）処置］高度であった（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。一方はＲＮＡ抽出および他方はＤＮＡ用に、２つの等しい半分量に試料の均一な分割を可能にする核酸回収技術を使用することによって（Ｐａｎｇら、２０１１年）、同じ試料内でｍＲＮＡレベルを測定し、ベクターゲノムの数を決定することができた。処置網膜における高レベルのＧＣ１  ｍＲＮＡが多くのベクターゲノムの回収率に相当したことが分かった；ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）について１．５７×１０７ベクターゲノム／ＤＮＡ１μｇおよびＡＡＶ５について４．７×１０６ベクターゲノム／μｇ。処置網膜における高レベルのＧＣ１  ｍＲＮＡにもかかわらず、ＧＣ１発現は、処置眼の視神経において検出されなかった。この結果は、この研究において評価したベクターがオフターゲットの導入遺伝子発現をもたらさなかったという考えをさらに立証する。ＧＣ１ＫＯマウスにおけるＧＣＡＰ１の低下が翻訳後である（つまり、ｍＲＮＡレベルは不変である）という先の報告と一致して、発明者らは、試料にわたるＧＣＡＰ１  ｍＲＮＡのレベルにおける実質的な変化を見出さなかった（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。
【０２１０】
他の錐体特異的ＲＮＡに対する処置の最初の判断として、他のいくつかの転写物もまた、これらの試料において評価した。錐体トランスデューシンα（ＧＮＡＴ２）のレベルについてのベースラインを確立するために、ＧＮＡＴ２  ＲＮＡを無処置ＧＣ１ＫＯ試料において評価し、ＧＣ１＋／＋対照に比べて低下していることが分かり、これは、おそらく、これらの網膜における錐体光受容体の損失による結果である（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。対照的に、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベクターを用いて処置した眼においてＧＮＡＴ２  ｍＲＮＡレベルのかなりの増加があり、これは、錐体光受容体がＡＡＶ−ｍＧＣ１処置ＧＣ１ＫＯマウスにおいて保持されているという考えをさらに立証する結果である。おそらく、杆体光受容体がＧＣ１ＫＯマウスにおいて変性しないので、杆体ＰＤＥ６αのレベルは、試料にわたって比較的不変であった（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。
【０２１１】
結論として、これらの研究は、持続性のＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現が、長期にわたって、ＧＣ１ＫＯマウスにおいて、網膜機能を修復することができ、錐体光受容体を保持することができることを実証する。ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置ＧＣ１ＫＯマウスのコホートは、それぞれ注射後９か月目および６か月目にＥＲＧ回復について評価した。錐体ＥＲＧ振幅の統計比較は、試料サイズの減少によりこれらの時点を越えて継続しなかったが、処置したマウスはすべて、機能的な（ＥＲＧ）奪回を示し続けた。これらの残りのマウスのサブセットに対して実行した様々なアッセイはすべて、療法を継続する明らかな指標を示す。この処置による寿命延長を、多くの異なるレベルで検証した：１）処置後１０か月目の処置眼におけるＧＣ１タンパク質の存在、２）処置後１２か月目にＥＲＧによって測定される錐体機能の回復、３）処置後１１か月目の処置眼における錐体存続の増加、および４）処置後１２か月の網膜におけるベクターゲノムおよびＧＣ１  ｍＲＮＡの回収。個々の別個の分析として考察された場合、これらのアッセイにおいて使用した試料サイズは、多くの場合、小さかった。しかしながら、すべてが、機能的な奪回の明らかな兆候を示すマウスにおける処置上の効能の相関現象と見なされる場合、試料サイズは、有効に、より大きなものとなる。この情況内では、そのため、処置効果は、ＥＲＧ奪回について統計的に評価される期間を越えて存続するように思われる。これは、ＧＣ１欠損の動物モデルにおける長期処置効果の第１の実証である。
【０２１２】
錐体ＥＲＧの修復は、それぞれ、処置後少なくとも９か月目および６か月目にＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３）処置ＧＣ１ＫＯマウスにおいて観察された。応答は、安定しており、研究の経過を通じて無処置ＧＣ１ＫＯ錐体応答よりも有意に高度であった。回復は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベクターを用いて処置されたマウスにおいて最も明白であった。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置マウスにおける平均錐体ｂ波振幅は、標準的なＡＡＶ５ベクターを用いて処置したＧＣ１ＫＯマウスから記録されたものよりも一貫して、約２０μＶ高度であった（それぞれ約５５μＶ対約３５μＶ）。すべてのベクターを統計的に比較した最も後の時である処置後６か月目に、この差異は有意なままであった。この結果は、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベクターが、標準的なＡＡＶベクターを用いる処置に不応性のモデルであるｒｄ１０マウスの網膜構造および機能を安定して修復したということを確認する。
【０２１３】
ＧＣ１ＫＯマウスにおける処置および無処置眼の間の杆体振幅における差異の定量化は、このモデルにおける杆体機能が、グアニル酸シクラーゼ−２（ＧＣ２）によって部分的に促進されるという事実によって複雑になる（Ｓｕｎら、２０１０年）。そのため、杆体ＥＲＧ応答は、動物によって多様である（正常の３０〜５０％）。そのため、処置および無処置錐体応答の比較と異なり、処置杆体応答は、ゼロのベースラインと比較することができない。それにもかかわらず、対のＧＣ１ＫＯ眼は、比較可能な杆体ＥＲＧ振幅を有し、一方は処置し、他方は無処置のパートナー眼における杆体ＥＲＧの動物内比は、杆体機能に対する処置効果を評価するための有効な測定基準を提供する。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）処置ＧＣ１ＫＯマウスにおける杆体媒介性の応答における改善は、処置および無処置眼からの杆体ａおよびｂ波振幅の個体内の比を比較することによって示されるように、ＡＡＶ５処置マウスから記録されたものよりも一貫して観察された。これは、ＧＣ１ＫＯ眼におけるＧＣ１の活動的な発現がマウス杆体機能に対するＧＣ２の部分的な効果を補足することができることを示唆する。
【０２１４】
長期錐体光受容体の存続（注射後１１か月）は、錐体アレスチンに対して向けられる抗体を用いる、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１を用いて処置したあるマウスからの処置および無処置網膜ホールマウントの免疫染色によって実証した。錐体は、処置ＧＣ１ＫＯ網膜の全体にわたって同定された。ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１処置網膜はまた、先の報告と一致して、その上部の半球において小さな割合の錐体しか保持しなかった無処置眼よりも多くの錐体を明らかに含有した（Ｐｒｏｖｏｓｔら、２００５年）。処置ＧＣ１ＫＯ網膜において保持された錐体は、超微細構造レベル（たとえば電子顕微鏡）で検査しなかったが、錐体がＥＲＧ分析によってある期間にわたって機能的なままであったという観察は、それらの構造が損なわれなかったことを示唆する。処置用ＡＡＶ−ＧＣ１によって媒介される錐体光受容体の長期保持は、それが、ＧＣ１欠損を有する患者に対して、黄斑錐体を保持し、かつ利用可能な昼間視力／色覚を修復する可能性を示唆するので、明白な臨床上の妥当性を有する。
【０２１５】
ＡＡＶ媒介性のＧＣ１発現は、使用した血清型または光受容体特異的（ｈＧＲＫ１）もしくはユビキタス（ｓｍＣＢＡ）プロモーターがその発現を駆動したかにかかわらず、処置後少なくとも１０か月間（ＩＨＣによって評価された最も後の時点）、存続し、もっぱら光受容体に位置した。導入遺伝子発現は、標的細胞型に限られたが、ｈＧＲＫ１プロモーターは、それが、もっぱら、標的細胞の適切なコンパートメント（光受容体外節）内の発現をもたらしたという点で、より特異的であった。この結果は、このプロモーターを利用する他の好結果の実証実験研究と共に、ｈＧＲＫ１プロモーターは、光受容体を標的にする臨床ＡＡＶベクターの設計において考慮されるべきであることを示唆する。
【０２１６】
ＡＡＶ５−ｓｍｃＢＡ−ｍＧＣ１を用いる処置後１０か月の横断ＧＣ１ＫＯ網膜切片の免疫染色は、野生型および無処置ＧＣ１ＫＯ対照に比べてＯＮＬの中程度の菲薄化を明らかにした。さらに、この網膜では、ＧＣ１は、光受容体の細胞体において時々見出された。強力なユビキタスｓｍＣＢＡプロモーターが、いくつかの光受容体の情報交換の仕組みを圧倒するレベルでＧＣ１の発現を駆動し、光受容体細胞体における導入遺伝子産物の蓄積が、これらの細胞においてストレスによって開始されるアポトーシスを構成した可能性がある。より劇的なＯＮＬ菲薄化は、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１を注射したあるマウスにおいて観察された。ｎが１である場合、網膜菲薄化がこのベクターを用いて処置したすべてのマウスにおいて存在したということを決定的に結論付けることはできない。それにもかかわらず、過剰発現毒性についての考えと一致して、ＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターの力価は、この研究において評価した３つのベクターのうちで最も高度であった。しかしながら、ＧＣ１の蓄積は、高度な力価のＡＡＶ５−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターを有する光受容体細胞体においてなかったこともまた注目されたい。
【０２１７】
ＡＡＶ媒介性ＧＣ１発現の光受容体独占的な性質にもかかわらず、発明者らは、網膜下スペースの外側の組織へのベクターゲノムの広がりを評価することに関心を持った。重要なことには、これらのデータは、「疾患」動物から収集した。これは、ベクター形質導入のパターンが疾患対健康な網膜において異なるという証拠に基づいて適切である（Ｋｏｌｓｔａｄら、２０１０年）。これは、体内分布パターンもまた異なるかもしれないことを示唆するであろう。この理由のために、奪回動物モデル自体内の（つまり明らかなＥＲＧ回復を示した対象内の）ゲノムの広がりを評価することが重要であった。試料サイズは限られたが、有用な情報は、視神経および脳におけるＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）送達ゲノムの分布に関して収集した。
【０２１８】
これは、カプシド表面暴露チロシン変異を含有するＡＡＶベクターについての体内分布の第１の評価である。ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）送達ベクターゲノムは、評価したすべての時点で注射眼の視神経において検出された。ある時点（注射後７か月）でのみ、ＡＡＶ５ベクターゲノムは、処置ＧＣ１ＫＯマウスの脳において検出された。ゲノムは、注射した眼の反対の半球においてのみ回収された。この結果は、網膜下の注射したラットおよびイヌの脳におけるＡＡＶ５送達配列の欠乏を報告したＰｒｏｖｏｓｔら、２００５年による発見と対照をなす。注射後１０か月までに、ベクターゲノムは、あらゆる時点で、ＡＡＶ５処置ＧＣ１ＫＯマウスの脳からも、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）を用いて処置したマウスの脳からも回収されなかった。しかしながら、分析した比較的少数のマウスにより、ＡＡＶ５送達ゲノムが、注射後１０か月目に脳に存在したということまたはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）送達ゲノムが、あらゆる時点で、処置ＧＣ１ＫＯマウスの脳に決して存在しないということを明確に除くことができない。
【０２１９】
処置眼の視神経からのベクターゲノムの回収にもかかわらず、免疫染色は、ＡＡＶ５−ｓｍＣＢＡ−ｍＧＣ１またはＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）−ｈＧＲＫ１−ｍＧＣ１ベクターを用いて処置した眼の視神経におけるＧＣ１発現の欠乏を明らかにした。Ｓｔｉｅｇｅｒら（２００５年）による先の研究は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するＡＡＶ８を用いる網膜下注射後の２か月と４週間目に、ラットおよびイヌの視神経および脳において導入遺伝子発現を検出した。ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベクターが光受容体特異的ｈＧＲＫ１プロモーターを含有したということおよびｓｍＣＢＡのようなユビキタスプロモーターの制御下の場合でさえ、ＧＣ１発現が光受容体に限られたという先の発見を考慮すると、視神経におけるＧＣ１発現の欠乏は意外ではない。Ｓｔｉｅｇｅｒら、（２００５年）は、強力なユビキタスＣＭＶプロモーターを、ウイルスベクターを介して送達された場合に、種々様々の組織において安定して発現することができるタンパク質であるＧＦＰを駆動するためにそれらのベクターの中に組み込んだ。
【０２２０】
ＡＡＶ５およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）ベクターの両方がＧＣ１ＫＯマウスに長期処置効果を提供することができたが、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）の使用と関連する明らかな長所がある。何よりも先に、光受容体特異的プロモーターを有するＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）は、各々のＡＡＶ５ベクターよりも処置マウスに対して有意に高度な錐体ＥＲＧ応答を与えた。これについての理由は、ＡＡＶ８ベクターがげっ歯動物網膜において注射のブレブの外側のエリアを形質導入する能力によるものかもしれないのに対して、ＡＡＶ５によって形質導入された網膜のエリアは、ほとんどブレブに限られたままである（４７）。したがって、ＡＡＶ８（７３３Ｆ）は、単純に、ＡＡＶ５ベクターに比べて、平均して、より大きなエリアの網膜を形質導入するかもしれず、次に、それぞれの形質導入した錐体における全体的な錐体存続の増加および／または光応答のレベルの増加のどちらかまたは両方を通して、より多くの錐体形質導入および堅調な全視野錐体ＥＲＧ応答をもたらすかもしれない。
【０２２１】
（実施例８）
例示的な哺乳動物ＧＣ１ポリペプチド配列
本発明の実施において有用な例示的なアミノ酸配列は、限定を伴うことなく、生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質をコードする、１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。そのような配列は、限定を伴うことなく、下記に、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１において記載されるグアニル酸シクラーゼタンパク質などのような、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、およびイヌ起源のものを含む。
【０２２２】
【化３】
0005897549.tif 000005
【０２２３】
【化４】
0005897549.tif 000006
【０２２４】
【化５】
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【０２２５】
【化６】
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【０２２６】
【化７】
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（実施例９）
公知の哺乳動物ＧＣ１ポリペプチドの配列分析
以下の種についてのアミノ酸配列を使用して生成したすべてのＧＣ１アライメントデータ：Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ；１１１０残基）、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；１１０９残基）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；１１０８残基）、およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；１１０３残基）。コンセンサスおよび可変領域の位置は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓが、最も長いＧＣ１タンパク質、１１１０残基であり、アライメントにおいてギャップを有していないので、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓに対応する数字で表した残基に基づく。
【０２２７】
Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓからのＧＣ１タンパク質のアライメントの類似性の図。
【０２２８】
【化８】
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ＧＣ１コンセンサス領域：
アミノ酸位置：４４〜４９、５５〜９０、９８〜１５５、１６４〜３２１、４６４〜５４９、５６１〜６０４、６２０〜７６１、８１３〜１０２６、１０４５〜１０５４、および１０６０〜１１１０。
【０２２９】
可変領域：
アミノ酸位置：４〜４３、５０〜５４、９１〜９７、１５６〜１６３、３２２〜４６３、５５０〜５６０、６０５〜６１９、７６２〜８１２、１０２７〜１０４４、および１０５５〜１０５９。
【０２３０】
ＧＣ１コンセンサスアライメントの他の注目すべき領域は、
（１）キナーゼ相同性ドメイン：コンセンサス配列のアミノ酸位置５３１〜５４１（光受容体における活性にとって不可欠であることが公知−たとえばＢｅｒｅｔａら、２０１０年を参照されたい）
（２）マウスＧＣ１タンパク質のキナーゼ相同性ドメイン内のリン酸化セリン残基（コンセンサス／括弧中に示すウシの位置）：５３０（５３２）、５３２（５３４）、５３３（５３５）、および５３８（５４０）を含む。
【０２３１】
（実施例１０）
ＳＭＣＢＡプロモーターのヌクレオチド配列
上記に記載する研究において使用した例証となるヒトＧＲＫ１（ｈＧＲＫ１）プロモーターの核酸配列を下記に示す。
【０２３２】
【化９】
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上記に記載する研究において使用した例証となるｓｍＣＢＡプロモーターの核酸配列を下記に示す。
【０２３３】
【化１０】
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参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書において記載されるものに対して補足的な、例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。
【０２３４】
【数１】
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【０２３５】
【数２】
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【０２３６】
【数３】
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【０２３７】
【数４】
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【０２３８】
【数５】
0005897549.tif 000017
【０２３９】
【数６】
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【０２４０】
【数７】
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【０２４１】
【数８】
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【０２４２】
【数９】
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【０２４３】
【数１０】
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本明細書において開示され、特許請求される組成物および方法はすべて、本開示を考慮して、不必要な実験作業を伴うことなく、成し、実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されるが、変形は、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載される組成物および方法にならびにステップまたは方法のステップの順序に適用されてもよいことは、当業者らに明らかであろう。特に、化学的および生理学的の両方に関連するある作用物質が、本明細書において記載される作用物質と置換されてもよく、一方、同じまたは同様の結果が達成されてもよいことは明らかであろう。当業者らに明らかなすべてのそのような同様の代用物および修飾は、添付の請求項によって定義される本発明の精神、範囲、および概念内にあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【配列表】
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