(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍標的細胞であって、導入遺伝子を含有する組換えウイルスベクター産生能を有し、ここで当該腫瘍標的細胞は間葉系幹細胞であり、そしてここで当該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、前記細胞。
【請求項２】
哺乳動物由来である、請求項1に記載の細胞。
【請求項３】
動物または動物細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、請求項1または2に記載の細胞。
【請求項４】
腫瘍性疾患、炎症性疾患、または、それらの近縁疾患であって神経変性疾患、動脈硬化症、粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患、および高血圧症からなる群より選択される疾患、の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、請求項1または2に記載の細胞。
【請求項５】
ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が、検出可能なマーカー遺伝子であり、そして、当該マーカー遺伝子の発現を検出することにより腫瘍病巣の検出に使用するための、請求項1または2に記載の細胞。
【請求項６】
哺乳動物由来の間葉系幹細胞であって、ウイルスベクター産生能を有し、当該ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼであり、ガンシクロビルとの併用により腫瘍性疾患、炎症性疾患、または、それらの近縁疾患であって神経変性疾患、動脈硬化症、粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患、および高血圧症からなる群より選択される疾患、の治療に用いる、ここで当該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、前記細胞。
【請求項７】
ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を調製する方法であって、腫瘍標的細胞に（1）所望の導入遺伝子を含有するプラスミド；および（2）ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上のプラスミド；を遺伝子導入する工程を含む、ここで、上記（1）および（2）のプラスミドは、それらが遺伝子導入された腫瘍標的細胞において、（２）のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現するが（2）のプラスミドに含まれるウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子はウイルス粒子にパッケージングされず、（1）のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされるように設計されている、ここで当該腫瘍標的細胞は間葉系幹細胞であり、そしてここで当該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、前記方法。
【請求項８】
プラスミドの導入をヌクレオフェクション法またはリポフェクション法により行う、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項1ないし4のいずれか1項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
腫瘍性疾患、炎症性疾患、または、それらの近縁疾患であって神経変性疾患、動脈硬化症、粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患、および高血圧症からなる群より選択される疾患、の治療のための、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項5に記載の細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣の検出のための、診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞に関する。本発明はまた、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞の調製方法に関する。また、本発明の腫瘍標的細胞は、腫瘍性疾患、炎症性疾患もしくはそれらの近縁疾患の治療に用いることができる。よって本発明は、本発明の腫瘍標的細胞を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明の腫瘍標的細胞は、腫瘍病巣または炎症病巣の検出に用いることができる。よって本発明は、本発明の腫瘍標的細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣を検出するための診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物における遺伝子治療では、様々な遺伝子導入法が開発されてきており、大きく分けて体内法（In vivo法）と体外法（Ex vivo法）に分けられる。体内法は、治療遺伝子を含有するベクターを直接体内に注入する方法である。体外法は、患者から採取した標的の細胞に対して遺伝子導入し、遺伝子導入細胞の選択と増幅を行った後、遺伝子導入細胞を移植・注射等により再び体内に戻す方法である。
【０００３】
癌を含む腫瘍の遺伝子治療における主要な戦略の１つとして、腫瘍細胞に治療遺伝子を導入することにより、正常細胞と腫瘍細胞との薬剤感受性の差を拡大させる戦略がある。腫瘍細胞に治療遺伝子を導入することにより、細胞内での発現による作用や、治療タンパク質の長期にわたる安定な発現が期待できる。また、細胞間のギャップジャンクションの存在により、導入された治療遺伝子の発現産物である治療タンパク質による代謝物が隣接する細胞にも伝播するバイスタンダー効果により、薬剤が到達できない細胞にも効果を及ぼすことが期待できる。
【０００４】
上記の戦略による療法の１つとして、ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶ療法がある（Ram, Z.ら、Nat. Med., (1997) 3:1354-1361）。ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶ療法においては、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子の細胞への導入、およびガンシクロビル（ＧＣＶ）の投与を組み合わせることにより、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が導入された細胞をアポトーシスに導く治療法である。ＨＳＶ−ｔｋは、それ自体が細胞内で発現することにより細胞を細胞死に導くことはない。しかし、ガンシクロビル（ＧＣＶ）が投与され細胞に取り込まれると、ＨＳＶ−ｔｋがＧＣＶをリン酸化してＧＣＶ−ＭＰ（一リン酸）に変換し、その後細胞内代謝により最終的に細胞のＤＮＡ合成を阻害するＧＣＶ−ＴＰ（三リン酸）へと変換される。このＧＣＶ−ＴＰの作用により細胞をアポトーシスへと導く。
【０００５】
GLI328 International Study Groupは、患者の神経膠腫細胞を、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有するウイルスベクターを産生するよう遺伝子工学的に操作し、そして当該細胞を腫瘍内に移植し、その後ＧＣＶを投与することによる体外法での遺伝子治療を試みた（例えば、Rainov NG on behalf of the GLI328 International Study Group, Hum. Gene Ther.,Vol.11,p.2389-2401,2000、を参照）。しかしながら、この方法は、腫瘍組織内でのベクターの拡散能に制限があり、ベクターの遺伝子導入効率が０．００２−２．６％と極めて低かった。
【０００６】
また、本発明者らの研究グループは以前に、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを産生させるよう設計されたプラスミドを、アデノウイルスベクターに封入したハイブリッドベクターを作成した。そして当該アデノウイルスベクターを腫瘍組織に注入することにより腫瘍細胞に遺伝子導入して、腫瘍細胞を当該レトロウイルスベクターを産生するように修飾し、体内法での遺伝子治療を試みた（Okada, T.ら，J. Gene. Med., Vol.6, p.288-299, 2004）。この方法では、向上した遺伝子導入効率および腫瘍組織内でのベクターの拡散が認められた。
【０００７】
より高い臨床的有効性を得るためには、局所で十分な量の治療タンパク質の供給を維持し、生体内で効率の高い遺伝子導入を行う技術が依然として求められている。また、通常の腫瘍の検出方法では検出できない微小な転移病巣の治療にも対応可能な技術も求められている。
【０００８】
間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells：ＭＳＣｓ）は、骨髄の土台となる細胞であり、腫瘍や炎症組織への集積性、多分化能や幹細胞分化生着促進効果を有する。このことから、ＭＳＣｓは治療タンパク質を産生する担体として、細胞治療への応用が期待されている。サイトカインなどの治療タンパク質を発現するようにＭＳＣｓに遺伝子修飾を施すことにより、当該治療タンパク質を標的細胞に送達するための担体としてＭＳＣｓを用いる試みが報告されている（Studeny, M.ら，Journal of the National Cancer Institute, Vol.96, p.1593-1603, 2004；H. Hamadaら，Cancer Sci., Vol.96, p.149-156,2005；および、Nakamizo, A.ら，Cancer Res., Vol.65, p.3307-3318, 2005を参照）。しかしながら、移植した遺伝子修飾ＭＳＣｓから産生される治療タンパク質の量は集積したＭＳＣｓの状態に依存するため、長期間の発現は困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ram, Z.ら、Nat. Med., Vol.3, p.1354-1361, 1997
【非特許文献２】Rainov NG on behalf of the GLI328 International Study Group, Hum. Gene Ther.,Vol.11,p.2389-2401,2000
【非特許文献３】Okada, T.ら，J. Gene. Med., Vol.6, p.288-299, 2004
【非特許文献４】Studeny, M.ら，Journal of the National Cancer Institute, Vol.96, p.1593-1603, 2004
【非特許文献５】Hamada, H.ら，Cancer Sci., Vol.96, p.149-156, 2005
【非特許文献６】Nakamizo, A.ら，Cancer Res., Vol.65, p.3307-3318, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供することにある。本発明はまた、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞の調製方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、本発明の腫瘍標的細胞を含む医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、本発明の腫瘍標的細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣を検出するための診断用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意研究の結果、腫瘍組織および炎症組織等への集積性を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を遺伝子工学的に操作してウイルスベクター産生能を有するＭＳＣｓを作成し、当該ＭＳＣｓを担癌動物モデルに投与したところ、当該ＭＳＣｓは癌病巣に集積し、そこでウイルスベクターが産生された結果、癌病巣において高効率の遺伝子導入および遺伝子発現が起こることを見いだした。このことから本発明者らは、腫瘍組織および炎症組織等への集積性を有する腫瘍標的細胞を遺伝子工学的に操作することにより作成したウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、腫瘍性疾患や炎症性疾患等の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療に有用であるという技術的思想に想到し、本発明を完成させた。
【００１２】
したがって、本発明はウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
本発明はまた、動物または動物細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するためのウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
【００１３】
また、ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が治療遺伝子である場合、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療のために使用することができる。従って本発明は、腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するためのウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
【００１４】
また、ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が検出可能なマーカー遺伝子である場合、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、腫瘍病巣または炎症病巣の検出に使用することができる。よって、一態様において本発明は、ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が検出可能なマーカー遺伝子であり、そして、マーカー遺伝子の発現を検出することにより腫瘍病巣または炎症病巣の検出に使用するための、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を調製する方法を提供する。
また別の態様において、本発明は、本発明の腫瘍標的細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、本発明の腫瘍標的細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣を検出するための診断用組成物を提供する。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
【００１７】
本明細書において、腫瘍標的細胞とは、生体内において腫瘍組織または炎症組織に集積する性質を有する細胞である。腫瘍標的細胞の具体的なものには、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、血管内皮前駆細胞、神経幹細胞などを含む組織幹細胞、腫瘍細胞などがあるがこれらに限定されない。腫瘍標的細胞として好ましいのはＭＳＣｓである。ＭＳＣｓが好ましいのは、腫瘍組織や炎症組織への集積性を有することに加え、移植時の拒絶反応の可能性が低く、患者本人や親族の他にも多数の患者にユニバーサルに使用可能であるためである。
【００１８】
また、本発明の腫瘍標的細胞は、動物由来であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来である。
本明細書において、ウイルスベクターとは、ウイルスが本来細胞へ感染・維持される仕組みを応用した細胞への外来遺伝子の導入のためのベクターをいう。また、本明細書においてベクターとは、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の宿主細胞への導入を可能にする媒介物を意味する。
【００１９】
本発明の腫瘍標的細胞が産生するウイルスベクターは、ウイルスベクターであれば特に限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、センダイウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである。好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである。特に好ましいウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは血液中で補体によって失活しやすいが、本発明のウイルスベクターを産生する腫瘍標的細胞を用いることにより標的組織内でレトロウイルスベクターを産生させることが可能となるため、安定な遺伝子発現が期待できる。
【００２０】
本発明の腫瘍標的細胞は、ウイルスベクターを産生するよう遺伝子工学的に操作されている。具体的には、本発明の腫瘍標的細胞には、（１）所望の導入遺伝子を含有するプラスミド；および（２）ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミド；が遺伝子導入されている。ここで、上記（１）および（２）のプラスミドは、それらが遺伝子導入された細胞において、（２）のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現するが（２）のプラスミドに含まれるウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子はウイルス粒子にパッケージングされず、（１）のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされるように設計されている。したがって、本発明の腫瘍標的細胞が産生するウイルスベクターは、所望の導入遺伝子がウイルス粒子内にパッケージングされたウイルスベクターである。当該ウイルスベクターは所望の導入遺伝子を含むが、ウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子を含まないため、細胞に感染することにより導入遺伝子を感染した細胞に導入することはでき、そして感染した細胞においてウイルスが複製することはない。
【００２１】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである場合、本発明の腫瘍標的細胞には、（１）５’ＬＴＲ（long terminal repeat）、パッケージングシグナル（Ψ）、所望の導入遺伝子、および３’ＬＴＲを含むプラスミド；ならびに（２）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド、または、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含むプラスミドおよびｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド、が遺伝子導入されている。ここで、ｇａｇ遺伝子はウイルス粒子構成タンパク質を、ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素を、そしてｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープタンパク質をコードし、いずれもレトロウイルス由来の遺伝子である。ここで、ウイルスエンベロープタンパク質は、レトロウイルスのエンベロープとなり得るタンパク質であれば特に限定されず、例えば、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質）、アンホトロピックレトロウイルスのエンベロープタンパク質、エコートロピックレトロウイルスのエンベロープタンパク質、gibbon apeエンベロープタンパク質、feline RD114エンベロープタンパク質などを用いてよい。レトロウイルスのエンベロープが標的細胞のレセプターに結合することが感染の最初のステップとなるため、エンベロープの種類により遺伝子導入可能な細胞種が規定される。すなわち、齧歯類のみに感染する同種指向性のエコートロピックウイルス（ecotropic）と齧歯類以外にヒトを含めた様々な種の細胞にも感染する両種指向性のアンフォトロピックウイルス（amphotropic）があり、それぞれのレトロウイルスベクター作製用のパッケージング細胞株が作られている。ヒトの細胞へ遺伝子導入するベクターを作製する時はアンフォトロピックタイプのものを用いる。レトロウイルスは、５’および３’ＬＴＲに挟まれ、かつ、５’側にパッケージングシグナルを有する遺伝子をウイルスキャプシド内にパッケージングする性質がある。上記（１）および（２）のプラスミドが遺伝子導入された本発明の腫瘍標的細胞は、（２）のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現し、そして（１）のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされる。ここで、（２）のプラスミドにはＬＴＲ配列およびパッケージングシグナルが存在しないため、産生されるウイルスベクターにはパッケージングされない。したがって、本発明の腫瘍標的細胞が産生するレトロウイルスベクターは、所望の導入遺伝子をウイルス粒子内に含むレトロウイルスベクターである。
【００２２】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である場合、本発明の腫瘍標的細胞には、（１）５’ＩＴＲ（inverted terminal repeat）、パッケージングシグナル、プロモーターとｐｏｌｙ  Ａを含む当該遺伝子発現カセット、３’ＩＴＲを含むＡＡＶベクタープラスミド、（２）ＡＡＶゲノムのＩＴＲを除きｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子をクローニングしたＡＡＶヘルパープラスミド、（３）２型あるいは５型アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ−ＲＮＡ遺伝子をクローニングしたアデノウイルスヘルパープラスミド、が遺伝子導入されている。ここで、ｒｅｐ遺伝子は酵素タンパク質を、ｃａｐ遺伝子はキャプシドタンパク質をコードし、いずれもＡＡＶ由来の遺伝子である。ｃａｐ遺伝子は、様々な血清型に由来するＡＡＶのｃａｐ遺伝子、あるいは複数種類の血清型のｃａｐ遺伝子を含むものが使用可能である。ここで、野生型のＡＡＶの場合は、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子が発現してＡＡＶが増殖する。このため、アデノウイルスヘルパープラスミドの代わりに、アデノウイルス、ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスやそれらのゲノムを使用することも可能である。ＡＡＶは、パッケージングシグナルとともに両端のＩＴＲに挟まれた遺伝子をウイルスキャプシド内にパッケージングする性質がある。上記（１）、（２）および（３）のプラスミド（あるいはヘルパーウイルス）が遺伝子導入された本発明の腫瘍標的細胞は、（２）のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現し、そして（１）のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされる。ここで、（２）のプラスミドにはＩＴＲ配列およびパッケージングシグナルが存在しないため、産生されるウイルスベクターにはパッケージングされない。したがって、本発明の腫瘍標的細胞が産生するＡＡＶベクターは、所望の導入遺伝子をウイルス粒子内に含むＡＡＶベクターである。
【００２３】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである場合、本発明の腫瘍標的細胞には、（１）５’ＩＴＲ（inverted terminal repeat)、パッケージングシグナル、プロモーターとｐｏｌｙ  Ａを含む当該遺伝子発現カセット、Ｅ１遺伝子（あるいは、これに加えてＥ２、Ｅ３、Ｅ４遺伝子）以外の２型あるいは５型アデノウイルスの遺伝子、３’ＩＴＲを含むアデノウイルスベクタープラスミドあるいはウイルスベクター、（２）２型あるいは５型アデノウイルスのＥ１遺伝子（あるいは、これに加えてＥ２、Ｅ３、Ｅ４遺伝子）をクローニングしたアデノウイルスヘルパープラスミドあるいはウイルスベクター、が遺伝子導入されている。ここで、（２）としてウイルスベクターを用いる場合、そのウイルスベクターはレトロウイルスやＡＡＶなどに由来するが、必ずしもこれらに限定されない。ここで、ヒトアデノウイルス初期遺伝子のＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４遺伝子は、それぞれ、主にウイルスＤＮＡの複製に関与する。後期遺伝子はキャプシドタンパク質をコードする。通常、遺伝子治療のベクターとして用いられているアデノウイルスベクターは，アデノウイルスのプロモーターを活性化させるＥ１ＡとＥ１ＢからなるＥ１領域を、プロモーターとｐｏｌｙ  Ａを含む外来遺伝子発現カセットに置き換え、Ｅ１タンパク質を別個に供給できる細胞でのみ増殖が可能となる。したがって、Ｅ１領域を欠損したアデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子産物を発現していない通常の細胞では増殖できず、増殖不能ウイルスとなる。また、Ｅ３領域はウイルスの増殖には必須ではないため、外来遺伝子の挿入サイズの上昇を目的に除かれることが多い。アデノウイルスは、パッケージングシグナルとともに両端のＩＴＲに挟まれた遺伝子をウイルスキャプシド内にパッケージングする性質がある。上記（１）および（２）のプラスミドあるいはウイルスベクターが遺伝子導入された本発明の腫瘍標的細胞は、（２）のプラスミドあるいはウイルスベクターによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現し、そして（１）のプラスミドあるいはウイルスベクターの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされる。ここで、（２）のプラスミドあるいはウイルスベクターにはアデノウイルス由来のＩＴＲ配列およびパッケージングシグナルが存在しないため、産生されるウイルスベクターにはパッケージングされない。したがって、本発明の腫瘍標的細胞が産生するアデノウイルスベクターは、所望の導入遺伝子をウイルス粒子内に含むアデノウイルスベクターである。
【００２４】
本明細書において、遺伝子導入とは遺伝子を細胞内に導入することをいう。プラスミドを用いて遺伝子を細胞内に導入する場合は、エレクトロポレーション法もしくはその改良法であるヌクレオフェクション法（Nucleofector（登録商標）技術を用いる；amaxa社）、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など当業者に公知の方法により行うことができる。ウイルスベクターを用いて遺伝子を細胞内に導入する場合は、ウイルスが本来細胞へ感染・維持される仕組みを利用しているので、ウイルスベクターを細胞に感染させることにより、遺伝子が細胞内に導入される。また、ウイルスベクターを、プラスミドと同様に、エレクトロポレーション法もしくはその改良法であるヌクレオフェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法により細胞内に導入することにより遺伝子導入を行ってもよい。このような方法は、ウイルスベクターの構造タンパク質が細胞内へのウイルスベクター取り込み後の遺伝子発現に関与するという考え方から、ウイルスベクターの感染が難しい細胞において、遺伝子をより効率よく導入するために用いられることがある。
【００２５】
本明細書において、導入遺伝子とは、遺伝子導入により細胞内に導入されることが意図されるまたは細胞内に導入された遺伝子である。
本発明の腫瘍標的細胞が産生するウイルスベクター内に含まれる導入遺伝子は特に限定されないが、好ましくは、治療遺伝子または検出可能なマーカー遺伝子である。
【００２６】
治療遺伝子として好ましいものには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、Ｂｉｍ、ＦＡＤＤ、ｐ５３、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２４（ｍｄａ−７）、Ｂ７／Ｂ７０、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｓＦｌｔ−１（遊離型ＶＥＧＦ受容体）、ＮＫ４、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ｍｄｒ−１、ＶＺＶ−ｔｋ、ＸＧＰＲＴ、または２以上のそれらの併用、などが含まれるが、これらに限定されない。治療遺伝子としてより好ましいのは、ＨＳＶ−ｔｋ、ＣＤ、ＶＺＶ−ｔｋ、ＸＧＰＲＴなどであり、これらの遺伝子は導入された細胞内で発現したときに当該細胞を細胞死に導く遺伝子である。これらの遺伝子が好ましいのは、これらの遺伝子を導入因子として使用することにより、（ｉ）感染した正常細胞が悪性化した場合に当該細胞を殺すことができ、（ｉｉ）本発明のウイルスベクターを産生する腫瘍標的細胞自身が悪性化した場合に当該細胞を殺すことができ、そして（ｉｉｉ）本発明のウイルスベクターを産生する腫瘍標的細胞が、腫瘍細胞の増殖能・転移能や、それ自身もしくは周囲の正常細胞に悪影響をもたらすタンパク質の発現が増加するなど、悪性度を促進した場合に、当該腫瘍標的細胞および腫瘍細胞を殺すことができるため、本発明の細胞を治療に用いる場合に安全性が高いからである。
【００２７】
ＨＳＶ−ｔｋは、それ自体が細胞内で発現することにより細胞を細胞死に導くことはないが、ガンシクロビル（ＧＣＶ）の投与と併用することにより細胞死に導く。詳細には、ＨＳＶ−ｔｋが導入された細胞にＧＣＶが取り込まれると、ＨＳＶ−ｔｋがＧＣＶをリン酸化してＧＣＶ−ＭＰ（一リン酸）となる。ＧＣＶ−ＭＰはその後、細胞内の酵素によりＧＣＶ−ＤＰ（二リン酸）、ＧＣＶ−ＴＰ（三リン酸）へと変換され、このＧＣＶ−ＴＰが細胞のＤＮＡ合成を阻害し、細胞死へと導く（Z. Ramら、Nat. Med., Vol.3, p.1354-1361, 1997）。ＣＤ、ＶＺＶ−ｔｋ、およびＺＧＰＲＴもまた自殺遺伝子であり、それぞれ５−ＦＣ、ＡｒａＭ、および６−ＴＸの投与と併用することにより、当該自殺遺伝子が発現する細胞を細胞死へと導く。本発明において、特に好ましい治療遺伝子は、ＨＳＶ−ｔｋである。
【００２８】
検出可能なマーカー遺伝子として好ましいものには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、動物または動物細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用することができる。動物または動物細胞は、好ましくはそれぞれ、哺乳動物または哺乳動物細胞である。
【００３０】
ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が治療遺伝子である場合、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療のために使用することができる。
【００３１】
本明細書において、腫瘍性疾患は、細胞の異常増殖を伴う疾患であれば特に限定はないが、例えば、良性上皮性腫瘍（乳頭腫、腺腫、嚢胞など）、悪性上皮性腫瘍（未分化癌、扁平上皮癌、腺癌、肝細胞癌、腎癌など）、非上皮性腫瘍（脂肪腫、骨腫、筋腫、血管腫など）、特別臓器の腫瘍（造血器腫瘍、中皮腫、神経組織の腫瘍、黒色腫など）等が挙げられる。より具体的には、脳腫瘍、甲状腺癌、咽頭・喉頭癌、卵巣癌、骨腫瘍、神経節腫瘍、肉腫、肝臓癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、消化器癌、前立腺癌、子宮癌、膀胱癌、リンパ腫、白血病、などが挙げられる。
【００３２】
本明細書において、炎症性疾患は、生体組織の障害に対する局所反応を伴う疾患であれば特に限定されないが、変質性炎（ヘルペスウイルスや肝炎ウイルスの感染、ヤコブ病）、漿液性炎（炭疽菌や溶連菌の感染、火傷や凍傷、アレルギー反応）、カタル性炎（副鼻腔炎、気管支炎、胃炎、腸炎）、化膿性炎（ブドウ球菌や緑膿菌の感染）、線維素性炎（ジフテリア、赤痢、腸チフスの感染）、出血性炎（肺ペスト、インフルエンザ肺炎、流行性出血熱）、壊疽性炎（嫌気性菌の感染）、増殖性炎（結核、梅毒、真菌症、肝硬変、腎炎、肺線維症、特発性心筋症）、感染症以外の肉芽腫性疾患（石綿症、サルコイドーシス、珪肺、ホジキン病）、などが挙げられる。より具体的には、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病などの免疫関与炎症性疾患、骨盤内炎症性疾患、卵巣炎、卵管炎、卵管−卵巣炎、卵管−腹膜炎などが含まれる。
【００３３】
本明細書において、腫瘍性疾患または炎症性疾患の近縁疾患とは、その治療に炎症制御療法が有効であることが当業者に知られる疾患をいう。例えば、神経変性疾患、動脈硬化症（粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患など）、高血圧症、などが含まれるがこれらに限定されない。
【００３４】
また、ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が検出可能なマーカー遺伝子である場合、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は腫瘍病巣または炎症病巣に集積するため、マーカー遺伝子の発現を検出することにより腫瘍病巣または炎症病巣を検出することができる。
【００３５】
ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞の調製方法
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞の調製方法を提供する。
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を調製する方法であって、腫瘍標的細胞に（１）所望の導入遺伝子を含有するプラスミド；および（２）ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミド；を遺伝子導入する工程を含む、ここで、上記（１）および（２）のプラスミドは、それらが遺伝子導入された腫瘍標的細胞において、（２）のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現するが（２）のプラスミドに含まれるウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子はウイルス粒子にパッケージングされず、（１）のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされるように設計されている、前記方法を提供する。本発明の方法においては、通常は（１）と（２）のプラスミドは同時に導入するが（１）のプラスミドを先に遺伝子導入してもよく、あるいは（２）のプラスミドを先に遺伝子導入してもよい。
【００３６】
本発明の方法において、腫瘍標的細胞、ウイルスベクター、導入遺伝子、上記に定義したとおりである。
本発明の方法の好ましい態様において、腫瘍標的細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）であり、そして産生されるウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。したがって、本発明は、レトロウイルスベクター産生能を有する間葉系幹細胞を調製する方法であって、間葉系幹細胞に（１）５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル（Ψ）、導入遺伝子、および３’ＬＴＲを含むプラスミド；および（２）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド、または、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含むプラスミドおよびｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド；を遺伝子導入する工程を含む、前記方法を提供する。本発明の方法においては、通常は（１）と（２）のプラスミドは同時に導入するが、（１）のプラスミドを先に遺伝子導入してもよく、あるいは（２）のプラスミドを先に遺伝子導入してもよい。
【００３７】
本発明の方法において、プラスミドの腫瘍標的細胞への遺伝子導入は、エレクトロポレーション法もしくはその改良法であるヌクレオフェクション法（Nucleofector（登録商標）技術を用いる；amaxa社）、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など当業者に公知の方法により行ってよい。好ましい遺伝子導入法は、ヌクレオフェクション法またはリポフェクション法である。
【００３８】
医薬組成物／診断用組成物
本発明は、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に含まれるウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、産生されるウイルスベクターが含む導入遺伝子が治療遺伝子である他は上記したとおりである。
【００３９】
本発明はまた、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣の検出のための診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物に含まれるウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、産生されるウイルスベクターが含む導入遺伝子が、検出可能なマーカー遺伝子である他は上記したとおりである。
【００４０】
本明細書において、本発明の医薬組成物および本発明の診断用組成物を総称して本発明の組成物ということがある。本発明の医薬組成物および診断用組成物の違いは、導入遺伝子が治療遺伝子であるか、検出可能なマーカー遺伝子であるかの違いがあるのみであり、その結果、生体に対する作用が異なるが、物としての本質的な性質は同じである。
【００４１】
本発明の組成物は、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞の他、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤などを含んでいて良い。医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。本発明の組成物はさらに、医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）；グリセリン；アルブミン、デキストランなどの乳化補助剤；コレステロール、ホスファチジン酸などの安定化剤；塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースなどの等張化剤；塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンなどのｐＨ調製剤；などを挙げることができる。
【００４２】
本発明の組成物は、治療または診断に有効量の本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の組成物は、例えば注射剤、点滴剤など液剤の形態に調製してもよい。
【００４３】
本発明の組成物は、ヒトを含む動物に対し、左心室腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、組織内投与、腫瘍栄養血管内投与または脳室などへの髄腔内投与することができ、患者の症状に合わせた適切な投与経路により投与してよい。特にカテーテル操作による左心室腔内投与あるいは腫瘍栄養血管内投与が好ましい。本発明の医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与される。
【００４４】
本発明の組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましい。好ましい用量範囲は、本発明の細胞が１ｘ１０６ないし１ｘ１０１０個／ｋｇ体重の範囲で存在しているものである。より好ましい用量範囲は、本発明の細胞が１ｘ１０６ないし１ｘ１０９個／ｋｇ体重、１ｘ１０６ないし１ｘ１０８個／ｋｇ体重、１ｘ１０６ないし１ｘ１０７個／ｋｇ体重、または１ｘ１０６ないし３ｘ１０６個／ｋｇ体重、の範囲で存在しているものである。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。投与は１回のみ行ってもよく、または複数回行ってもよい。複数回投与を行う場合は、１日１〜数回、１〜数日に１回、１から数週間に１回、または１〜数ヶ月に１回の間隔で投与してもよい。
【発明の効果】
【００４５】
本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、生体内に注入したときに生体内の腫瘍や炎症組織に集積する。そのため、本発明の腫瘍標的細胞を生体内に注入することにより、標的組織内でウイルスベクターを産生させ、そして標的組織への感染を持続させることが可能であり、その結果高い効率で遺伝子導入を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ベクター産生型のＭＳＣｓのレトロウイルス分泌能、および、分泌したレトロウイルスによるマウス９Ｌ細胞への感染の度合いを示すグラフである。横軸の、ＮＣは対照（ネガティブコントロール）を示し、日数は、プラスミド導入後の培養日数を示す。右側の縦軸はＭＳＣｓが分泌したウイルスの力価を示す。左側の縦軸は、分泌されたウイルスを感染させたマウス９Ｌ細胞が産生するルシフェラーゼの量を示し、これは、ウイルスの感染能および遺伝子導入能による生物学的力価を評価するものである。
【図２−１】図２−１は、ウイルスベクター産生型ＭＳＣｓ（ＶＳＶ−Ｇ群：ＶＳＶ−Ｇをエンベロープとするウイルスベクターを産生する）の担癌動物モデルにおける遺伝子発現を示すグラフ（ａ）および生体イメージング画像（ｂ）である。グラフにおいて、横軸はＭＳＣｓ投与後の日数を示す；左縦軸はルシフェラーゼの蛍光の全光束を示し、丸で示すプロット（腫瘍におけるルシフェラーゼ蛍光）および四角で示すプロット（バックグラウンド：ＢＧ）についての縦軸である；右縦軸は、腫瘍体積を示し、ひし形で示すプロットについての縦軸である。
【図２−２】図２−２は、ウイルスベクター産生型ＭＳＣｓ（ｅｎｖ群：アンホトロピックレトロウイルスのエンベロープを有するウイルスベクターを産生する）の担癌動物モデルにおける遺伝子発現を示すグラフ（ａ）および生体イメージング画像（ｂ）である。グラフにおいて、横軸はＭＳＣｓ投与後の日数を示す；左縦軸はルシフェラーゼの蛍光の全光束を示し、丸で示すプロット（腫瘍におけるルシフェラーゼ蛍光）および四角で示すプロット（バックグラウンド：ＢＧ）についての縦軸である；右縦軸は、腫瘍体積を示し、ひし形で示すプロットについての縦軸である。
【図２−３】図２−３は、ウイルスベクターを産生しないＭＳＣｓ（ＮＣ群）の担癌動物モデルにおける遺伝子発現を示すグラフ（ａ）および生体イメージング画像（ｂ）である。これらは、図２−１および図２−２の実験に対する対照実験の結果である。グラフにおいて、横軸はＭＳＣｓ投与後の日数を示す；左縦軸はルシフェラーゼの蛍光の全光束を示し、丸で示すプロット（腫瘍におけるルシフェラーゼ蛍光）および四角で示すプロット（バックグラウンド：ＢＧ）についての縦軸である；右縦軸は、腫瘍体積を示し、ひし形で示すプロットについての縦軸である。
【図３】図３は、担癌動物モデルにおけるベクター産生型間葉系幹細胞の投与による遺伝子増幅効果を示すグラフである。横軸：９Ｌ／ＬＮＣＮは、ＭＳＣｓを投与していない担癌動物モデル；ＭＳＣは、遺伝子導入していないＭＳＣｓを投与した担癌動物モデル；ＴＫは、チミジンキナーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド（ＬＴＲ−ＴＫ）を導入したＭＳＣｓを投与した担癌動物モデル；ＴＫ  ＶＳＶ−Ｇは、ＬＴＲ−ＴＫおよびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入したＭＳＣｓを投与した担癌動物モデル；そして、ＴＫ  ＶＳＶ−Ｇ  ｇａｇ−ｐｏｌは、ＬＴＲ−ＴＫ、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド、およびｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドを導入したＭＳＣｓを投与した担癌動物モデル；をそれぞれ意味する。縦軸は、ＬＴＲ−ＴＫを導入したＭＳＣｓを投与した担癌動物モデルの皮下腫瘍におけるチミジンキナーゼ遺伝子の量を１とした場合のチミジンキナーゼの遺伝子の量である。
【図４−１】図４−１は、担癌動物モデルにおける治療遺伝子導入およびＧＣＶによる治療効果の実験手順を示す模式図である。
【図４−２】図４−２は、担癌動物モデルにおける治療遺伝子導入およびＧＣＶによる治療効果の実験結果を示す（ａ）グラフ、および（ｂ）生体イメージング写真である。（ａ）のグラフにおいて、「９Ｌ／ＬＮＣＬ」（□）は未処置群；「ＭＳＣ」（◇）は遺伝子非導入ＭＳＣ投与群；「ｔｋ」（○）はｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋ導入ＭＳＣ投与群；「ｔｋ／ＶＳＶ−Ｇ」（△）はｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋおよびｐＶＳＶ−Ｇ導入ＭＳＣ投与群；そして、「ｔｋ／ｇａｇ−ｐｏｌ／ＶＳＶ−Ｇ」（○）はｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋ、ｐＧａｇ−ｐｏｌおよびｐＶＳＶ−Ｇ導入ＭＳＣ投与群；をそれぞれ意味する。「ｔｋ」と「ｔｋ／ｇａｇ−ｐｏｌ／ＶＳＶ−Ｇ」の両群間での腫瘍部発光量はｎ＝４で、危険率５％未満、有意差あり、であった。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４８】
実施例１：間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）への遺伝子導入法の選択
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドを、Sprague-Dawley（ＳＤ）ラット骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）に導入した。遺伝子導入には、ヌクレオフェクション法、リン酸カルシウム法、または、リポフェクション法を用いた。対照として、ＧＦＰ発現プラスミドを導入しなかったＭＳＣｓを用いた。
【００４９】
ヌクレオフェクション法は、amaxa社の遺伝子導入システムNucleofector（登録商標）を用いて、同社のNucleofector（登録商標）技術を用いて行った。ヌクレオフェクション法は、エレクトロポレーション法の改良型で、細胞の核へ直接遺伝子を導入する技術である。遺伝子導入はamaxa社の製品マニュアルに従って
１穴あたり１ｘ１０６個の細胞を６穴プレートに撒き、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で２４時間培養した。Nucleofector Solutionにて再懸濁した細胞およびｅＧＦＰ発現プラスミド４μｇに、総量が１００μｌとなる様に、ＭＳＣ用のNucleofector Solutionを適当量加えた。これを電極付きの専用キュベットに移し、専用の遺伝子導入装置Nucleofector（Amaxa社）を用いて製品マニュアルに従い遺伝子導入を行った。あらかじめ加温しておいた５００  μｌの培地をキュベットに加え、加温済み培地が入った６穴プレートに移し、２４時間、培養を行った。
【００５０】
リン酸カルシウム法による遺伝子導入は、１穴あたり１ｘ１０６個の細胞を６穴プレートに撒き、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で２４時間培養した。４μｇのプラスミドを１００μｌの３００ｍＭ  ＣａＣｌ２に加え、さらに、１００μｌの２ｘＨＢＳ  （２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）を加えて混合し、直ちに１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液２ｍｌに混和して均一にした。これを、６穴プレートにて培養していた細胞の上清と置換し、培養を行った。６時間後、培養液を除去し、３７℃にて加温済みの２％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液を２ｍｌ加え、２４時間、培養を行った。
【００５１】
リポフェクション法による遺伝子導入は、リポソームとしてリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用い、１穴あたり１ｘ１０６個の細胞を６穴プレートに撒き、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で２４時間培養した。Opti-MEM（登録商標）に培地交換した後、リポフェクトアミン２０００（１５μｌ、Invitrogen社）を用いて、製品マニュアルに従い推奨条件にてプラスミド（４μｇ）を遺伝子導入した。６時間後、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液へ培地交換を行い、２４時間、培養を行った。
【００５２】
遺伝子導入した後、細胞を終濃度１０％ウシ胎仔血清（Sigma、Ｆ−２４４２）入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Invitrogen、１１３２０−０３３）中、３７℃、２４時間培養した。
【００５３】
間葉系幹細胞への遺伝子導入の割合を、細胞内で発現したＧＦＰの蛍光についてフローサイトメトリー法で評価した。ヌクレオフェクション法では６０．１１％、リン酸カルシウム法では３．１３％、リポフェクション法では１２．２６％の細胞で遺伝子導入が認められた。なお、対照の細胞では、０．０１％の細胞について蛍光が認められ、この値がバックグラウンドである。したがって、間葉系幹細胞への遺伝子導入には、ヌクレオフェクション法またはリポフェクション法が好ましいことが明らかになった。
【００５４】
実施例２：間葉系幹細胞の腫瘍親和性
ルシフェラーゼ発現プラスミド  ４μｇを、２ｘ１０６個のＳＤラット骨髄由来のＭＳＣｓに、ヌクレオフェクションにより導入した。導入後終濃度１０％ウシ胎仔血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中、３７℃、２４時間培養し、５ｘ１０５個のＭＳＣｓをマウスに投与するのに用いた。
【００５５】
ヌードマウスの背中に、３ｘ１０６個のマウス神経膠腫９Ｌ細胞を皮下注射し、担癌動物モデルを作成した。また、比較のために３ｘ１０６個のマウス神経芽細胞Ｒａｔ−１をヌードマウスの背中に皮下注射したものも作成した。
【００５６】
担癌動物モデルに、５ｘ１０５個のルシフェラーゼ発現プラスミドを導入したＭＳＣｓ（ＭＳＣ／ｐＬｕｃ）を左心室腔内に投与した（９Ｌ群）。陽性対照（ＰＣ）として、腫瘍細胞のかわりに、ヌードマウスの背中に５ｘ１０５個のＭＳＣ／ｐＬｕｃを皮下注射した。陰性対照（ＮＣ）として、腫瘍細胞を皮下注射せずに、ヌードマウスの左心室腔内に５ｘ１０５個のＭＳＣ／ｐＬｕｃを投与した。また、比較のためにＲａｔ−１細胞を背中に皮下注射したヌードマウスの左心室腔内に、５ｘ１０５個のＭＳＣ／ｐＬｕｃを投与した（Ｒａｔ−１群）。
【００５７】
ＭＳＣ／ｐＬｕｃの投与２４時間後に、生体イメージング装置（IVIS Imaging System；Xenogen）を用いてルシフェラーゼの発現部位を評価した。担癌動物モデルである９Ｌ群では、ルシフェラーゼは、９Ｌ細胞を皮下注射した背中で強く発現していた。このことは、ＭＳＣ／ｐＬｕｃが腫瘍細胞に集積し、そこでルシフェラーゼ遺伝子が発現したことを示すものである。一方、Ｒａｔ−１群では、ルシフェラーゼは頭部を中心に弱く発現し、癌を有していない動物においては、血流に沿って部位非特異的にルシフェラーゼが発現したことを示す。なお、陽性対照では、ＭＳＣ／ｐＬｕｃを皮下注射した背中で強いルシフェラーゼの発現が観察された。陰性対照では、ルシフェラーゼは頭部を中心に弱く発現しており、血流に沿った部位非特異的な発現が観察された。
【００５８】
実施例３：ウイルスベクター産生能の評価
ルシフェラーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド  ４μｇ、ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド  ０．５μｇ、およびＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質）発現プラスミド  ０．５μｇを２ｘ１０６個のＳＤラット骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）にヌクレオフェクション法により導入した。上記のプラスミドを導入しない間葉系幹細胞を対照とした。導入後、終濃度１０％ウシ胎仔血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中、３７℃で培養し、経時的に、具体的には、１日目（２４時間後）、２日目（４８時間後）、３日目（７２時間後）および４日目（９６時間後）に、培養上清を回収した。この培養上清中のウイルスの力価をＲＮＡドットブロット法にて解析したところ、遺伝子導入２４時間後からウイルスの発現が確認された（図１）。
【００５９】
また、１穴あたり５ｘ１０４個のラット９Ｌ細胞を９６穴プレートに撒き、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液で２４時間培養した。この培養上清に、ＭＳＣにて産生し経時的に回収したウイルスを含む培養液を１００μｌ添加し、遺伝子導入を行った。３日間培養を行い、ルシフェラーゼアッセイを行って、感染を受けた９Ｌ細胞での遺伝子発現量を評価した（図１）。
【００６０】
実施例４：生体内における遺伝子発現増幅効果
ルシフェラーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド  ４μｇ、ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド  ０．５μｇ、およびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド  ０．５μｇを２ｘ１０６個のＳＤラット骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）に導入した（ＶＳＶ−Ｇ群）。また、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドの代わりにアンホトロピックレトロウイルスのエンベロープタンパク質発現プラスミド  ０．５μｇを導入した群（ｅｎｖ群）を調製した。ウイルス産生を行わない対照として、ルシフェラーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド  ４μｇおよびＬａｃＺ発現プラスミド  １μｇを導入して、ウイルス産生を行わない群（ＮＣ群）を調製した。遺伝子導入はいずれもヌクレオフェクション法により行った。
【００６１】
導入後、終濃度１０％ウシ胎仔血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中、３７℃で培養し、培養２４時間後に細胞を回収し、６ｘ１０５個の遺伝子導入ＭＳＣｓをヌードマウス左心室腔内に注入して全身投与を行った。当該ヌードマウスは、ＭＳＣｓ投与直前にそれらの背中にマウス神経膠腫９Ｌ細胞（以下、単に９Ｌ細胞ともいう）を皮下注射した担癌動物モデルである。生体イメージング装置（IVIS Imaging System；Xenogen）を用いて経時的に腫瘍内のルシフェラーゼの発現を評価した（図２−１、図２−２、および図２−３）。投与２１日後における遺伝子発現はウイルス産生を行わないＮＣ群と比べ、ＶＳＶ−Ｇ群では９．８倍、ｅｎｖ群では２．５倍増強された。
【００６２】
実施例５：担癌動物モデルにおける治療遺伝子増幅効果
単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド  ４μｇ、ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド  ０．５μｇ、およびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド  ０．５μｇを２ｘ１０６個のＳＤラット骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）に、ヌクレオフェクション法により導入した。
【００６３】
導入後、終濃度１０％ウシ胎仔血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中、３７℃で培養し、培養２４時間後に細胞を回収し、５ｘ１０５個の遺伝子導入ＭＳＣｓをヌードマウス左心室腔内に注入して全身投与を行った。当該ヌードマウスは、ＭＳＣｓ投与直前にそれらの背中にマウス９Ｌ細胞を皮下注射した担癌動物モデルである。投与２４日後に、皮下腫瘍を採取し、動物組織ＤＮＡ抽出用キットDNeasy Tissue Kit（QIAGEN社）を用いてＤＮＡ抽出を行った。キット標準の手順に従い，シリカゲルメンブレンへの吸着・溶出によりＤＮＡを濃縮抽出した。抽出ＤＮＡにチミジンキナーゼ遺伝子に該当するプライマーセット（５’−ＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＧＧ−３’（配列番号１）および５’−ＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＧＴＡＡ−３’（配列番号２））および対照としてラットＧＡＰＤＨ遺伝子に該当するプライマーセット（５’−ＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号３）および５’−ＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４））を適用して、チミジンキナーゼ遺伝子の量を定量的ＰＣＲにより測定した。上記３つすべてのプラスミドを導入したＭＳＣｓを投与した動物は、チミジンキナーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミドのみを導入したＭＳＣｓを投与した動物や、チミジンキナーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミドおよびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入したＭＳＣｓを投与した動物と比較して、約１２２倍の遺伝子増幅効果を示した（図３）。なお、ＭＳＣｓを投与していない担癌動物モデル、および遺伝子導入を行っていないＭＳＣｓを投与した担癌動物モデルにおいては、チミジンキナーゼ遺伝子は検出されなかった。
【００６４】
実施例６：担癌動物モデルにおける治療遺伝子導入およびＧＣＶによる治療効果
方法
２ｘ１０６個のＳＤラット由来間葉系幹細胞ＭＳＣに、（１）単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋ、（２）ｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋおよびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ、または（３）ｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋ、Ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドｐＧａｇ−ｐｏｌおよびｐＶＳＶ−Ｇを、ヌクレオフェクション法（AMAXA社、Human MSC Nucleofection Kit、パルスプログラムＵ−２３）により導入した。２４時間後に各細胞を回収してＰＢＳに懸濁し、５ｘ１０５細胞／１００μｌの最終濃度に調製した。同時に、ルシフェラーゼを恒常的に発現する標的腫瘍細胞９Ｌ／ＬＮＣＬを３ｘ１０６細胞／１００μｌの濃度で、２５％マトリゲル含有ＰＢＳ（BD Biosciences, Two Oak Park, Bedford, MA, USA）に懸濁した。
【００６５】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Clea Japan, Inc.）の左右の背中に９Ｌ／ＬＮＣＬ細胞を１００μｌずつ皮下注し、直後に左心室腔内から遺伝子導入ＭＳＣ懸濁液１００μｌを全身的に投与した。その後、経時的に１５ｍｇ／ｍｌルシフェリン溶液（Ieda Trading Corp.，日本、東京）を腹腔内に１００μｌ投与し、生体イメージング装置（ＩＶＩＳ；Xenogen Corp., Alamada, CA, USA）を用いて腫瘍部位の発光量（Total Flux）を測定し、腫瘍細胞の生存能力を検討した。さらに、ＭＳＣ投与１０日後に、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるようにガンシクロビル（ＧＣＶ）（Denosin；F. Hoffmann‐La Roche Ltd., Basel, Switzerland）を注入した浸透圧ポンプ（MICRO-OSMOTIC PUMP MODEL 1002；DURECT Corp., Cupertino, CA, USA）をマウス腹腔内に設置した。
【００６６】
結果
腫瘍細胞をを皮下注したのみでＭＳＣを投与していない未処置群を「９Ｌ／ＬＮＣＬ」群；遺伝子非導入ＭＳＣ投与群を「ＭＳＣ」群；ｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋ導入ＭＳＣ投与群を「ｔｋ」群；ｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋおよびｐＶＳＶ−Ｇ導入ＭＳＣ投与群を「ｔｋ／ＶＳＶ−Ｇ」群；そして、ｐＬＴＲ−ＨＳＶ−ｔｋ、ｐＧａｇ−ｐｏｌおよびｐＶＳＶ−Ｇ導入ＭＳＣ投与群を「ｔｋ／ｇａｇ−ｐｏｌ／ＶＳＶ−Ｇ」群；とそれぞれ称する。
【００６７】
「ｔｋ」群、「ｔｋ／ｐＶＳＶ−Ｇ」群は、ＧＣＶ投与による抗腫瘍効果はほとんど認められなかったが、「ｔｋ／ｇａｇ−ｐｏｌ／ＶＳＶ−Ｇ」群では、腫瘍細胞の生存能が低下した（図４−２）。
【００６８】
この結果はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを産生するようにプラスミドを導入したＭＳＣを投与した場合、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子がＭＳＣの腫瘍親和性により腫瘍細胞へと運ばれた結果、腫瘍細胞におけるＨＳＶ−ｔｋとＧＣＶの組合せにより腫瘍細胞がアポトーシスへと導かれ、他の処置群と比較して腫瘍生存能が有意に低下したことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、生体内に注入したときに生体内の腫瘍や炎症組織に集積するため、標的組織内でウイルスベクターが産生し、そして標的組織への感染が持続する。したがって、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、高効率の遺伝子導入に用いることができる。
【００７０】
また、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞として間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を用いることが望ましい。ＭＳＣｓは移植時の拒絶反応の可能性が低く、患者本人や親族の他にも多数の患者にユニバーサルに使用可能である。このため、死亡胎児の細胞や受精卵を用いる再生医療に比べて倫理面の問題も少ない。腫瘍性疾患または炎症性疾患等の治療における治療用ウイルスベクター産生細胞としてのＭＳＣｓの使用は、実用化される可能性が高い。
【００７１】
本発明は、以下の態様を含む。
態様１：ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞。
【００７２】
態様２：腫瘍標的細胞が、間葉系幹細胞、血管内皮前駆細胞、および、組織幹細胞からなる群より選択される、態様１に記載の細胞。
態様３：哺乳動物由来である、態様１または２に記載の細胞。
【００７３】
態様４：ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、センダイウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、態様１ないし３のいずれか１項に記載の細胞。
【００７４】
態様５：動物または動物細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、態様１ないし４のいずれか１項に記載の細胞。
態様６：腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、態様１ないし４のいずれか１項に記載の細胞。
【００７５】
態様７：ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が、検出可能なマーカー遺伝子であり、そして、当該マーカー遺伝子の発現を検出することにより腫瘍病巣の検出に使用するための、態様１ないし４のいずれか１項に記載の細胞。
【００７６】
態様８：哺乳動物由来の間葉系幹細胞であって、レトロウイルスベクター産生能を有し、当該レトロウイルスベクターが含有する導入遺伝子が単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼであり、ガンシクロビルとの併用により腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の治療に用いる、前記細胞。
【００７７】
態様９：ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を調製する方法であって、腫瘍標的細胞に（１）所望の導入遺伝子を含有するプラスミド；および（２）ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミド；を遺伝子導入する工程を含む、ここで、上記（１）および（２）のプラスミドは、それらが遺伝子導入された腫瘍標的細胞において、（２）のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現するが（２）のプラスミドに含まれるウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子はウイルス粒子にパッケージングされず、（１）のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされるように設計されている、前記方法。
【００７８】
態様１０：レトロウイルスベクター産生能を有する間葉系幹細胞を調製する方法であって、間葉系幹細胞に（１）５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル（Ψ）、導入遺伝子、および３’ＬＴＲを含むプラスミド；および（２）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド、または、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含むプラスミドおよびｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド；を遺伝子導入する工程を含む、前記方法。
【００７９】
態様１１：プラスミドの導入をヌクレオフェクション法またはリポフェクション法により行う、態様９または１０に記載の方法。
態様１２：態様１ないし６のいずれか１項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【００８０】
態様１３：腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の治療のための、態様１２に記載の医薬組成物。
態様１４：態様７に記載の細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣の検出のための、診断用組成物。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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