(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-アミノ酸を生産する能力を有する腸内細菌科の細菌を培地中で培養すること、および
L-アミノ酸を培地から回収すること
を含む、L-アミノ酸を製造する方法であって、
前記細菌は、pepA、pepB、及びpepD遺伝子からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して弱化されるように改変されている、方法。
【請求項２】
前記遺伝子の発現が、遺伝子の不活化により非改変株と比較して弱化されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、パントエア（Pantoea）属に属する細菌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記L-アミノ酸が、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
pepA、pepB、及びpepD遺伝子の発現が非改変株と比較して弱化されるように改変され、且つ、前記L-アミノ酸がL-リジンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物工業に関し、特に、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジン等のL-アミノ酸を製造する方法に関する。この方法は、ペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が弱化されるよう改変された腸内細菌科（Enterobacteriaceae family）の細菌を使用する。
【背景技術】
【０００２】
従来、L-アミノ酸は、自然源（natural sources）由来の微生物の株、又はその変異体を利用する発酵法によって工業的に製造されている。典型的には、微生物は、L-アミノ酸の生産収量を増強するよう改変されている。
【０００３】
L-アミノ酸の生産収量を増強するための多数の技術が報告されており、これには組換えDNAにより微生物を形質転換することによるものが含まれる（例えば、特許文献１を参照のこと）。生産収量を増強するための他の技術には、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は、生産されたL-アミノ酸によって引き起こされるフィードバック阻害の標的酵素を脱感作することが含まれる（例えば、特許文献２〜５を参照のこと）。
【０００４】
L-アミノ酸の生産収量を増強させる他の方策は、標的L-アミノ酸の分解に関与する１又は幾つかの遺伝子、標的L-アミノ酸の前駆体を標的L-アミノ酸の生合成経路から逸らす（分岐させる）遺伝子、炭素フラックス、窒素フラックス、及びリン酸フラックスの再分配に関与する遺伝子、ならびに毒素をコードする遺伝子等、の発現を弱化させることである。
【０００５】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のpepA遺伝子（carPと同義）は、多機能酵素であるアミノペプチダーゼＡ（PepA）をコードし、アミノペプチダーゼＡは、触媒機能と調節機能を兼ね備える。アミノペプチダーゼＡは、タンパク質のN-末端アミノ酸残基の加水分解以外にも、部位特異的DNA組換え及び多量体プラスミドの単量体化のために必要であることが示されている（非特許文献１、２）。アミノペプチダーゼＡの他の機能は、転写の調節である。PepAは、DNA結合タンパク質であり、carABオペロンの転写の抑圧に関与し、これによりカルバモイルリン酸合成酵素の合成を制御する（非特許文献３）。カルバモイルリン酸は、L-アルギニン生合成経路及びピリミジン生合成経路の中間体である。カルバモイルリン酸とL-オルニチンとの相互作用によりL-シトルリンが形成され、L-シトルリンはL-アルギノコハク酸を経てL-アルギニンへと変換される。
【０００６】
Escherichia coli由来のpepB遺伝子（yhfI, b2523, ECK2520と同義）は、アミノペプチダーゼＢ（PepB）をコードし、アミノペプチダーゼＢは、E. coliにおける４つのシステイニルグリシナーゼの１つである。アミノペプチダーゼＢは、in vitroで、Leu-Gly、Leu-Gly-Gly、Cys-Gly、及びLeu-Glyを開裂させる（非特許文献４〜６）。生体内（in vivo）では、アミノペプチダーゼＢは、アミノペプチダーゼＡ及びＮ、並びにジペプチダーゼＤと共に、４つのシステイニルグリシナーゼの１つである（非特許文献７）。２価陽イオンは、有効な活性促進因子ではないものも含んではいるが、熱による不活化に対してアミノペプチダーゼＢを安定化させる（非特許文献６）。
【０００７】
Escherichia coli由来のpepD遺伝子（pepHと同義、カルノシナーゼ）は、ペプチダーゼＤをコードし、ペプチダーゼＤは、ブロックされていないＮ末端を有する多数のジペプチ
ド、例えばシステイニルグリシン、を分解することのできるジペプチダーゼである（非特許文献７、８）。ペプチダーゼＤは、PepD単量体による二量体として機能する（非特許文献９）。pepDの転写は、リン酸飢餓の際に５倍に増加する（非特許文献１０）。
【０００８】
しかしながら、現在のところ、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジン等のL-アミノ酸の生産のためにペプチダーゼをコードする遺伝子の発現を弱化させることについての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第4,278,765号
【特許文献２】国際公開第95/16042号
【特許文献３】米国特許第4,346,170号
【特許文献４】米国特許第5,661,012号
【特許文献５】米国特許第6,040,160号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Stirlingら, (1989) EMBO J., 8, 1623-1627
【非特許文献２】Charlierら, (1995) J. Mol. Biol., 250, 392-406
【非特許文献３】Rooversら, (1988) J. Mol. Biol., 204, 857-865
【非特許文献４】Millerら, (1994) Journal of Bacteriology, 176, 610-619
【非特許文献５】Hermsdorfら, (1979) International Journal of Peptide and Protein Research, 13, 146-151
【非特許文献６】Suzukiら, (2001) Bioscience. Biotechnology. Biochemistry., 5, 1549-1558
【非特許文献７】Suzukiら, (2001) Journal of Bacteriology 2001; 183(4) 1489-1490
【非特許文献８】Schroederら, (1994) FEMS Microbiology Letters, 123, 153-159
【非特許文献９】Kleinら, (1986) Journal of General Microbiology, 132, 2337-2343
【非特許文献１０】Henrichら, (1992) Molecular General Genetics, 232, 117-125
【発明の概要】
【００１１】
本発明の態様には、L-アルギニン、L-シトルリン、又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産することのできる株の生産性を増強すること、および、これらの株を使用するこのようなL-アミノ酸を製造する方法を提供することが含まれる。
【００１２】
上記態様は、ペプチダーゼをコードする遺伝子、すなわちpepA、pepB、及び／又はpepD、の不活化により、L-アルギニン及びL-リジン等のL-アミノ酸の生産を増強することができることを見出したことにより達成された。更に、L-シトルリンはL-アルギニン生合成経路の中間体であるため、このL-アミノ酸の生産も増強することができる。
【００１３】
本発明は、L-アルギニン及びL-シトルリン等のL-アミノ酸を生産する増大した能力を有する腸内細菌科の細菌を提供する。
【００１４】
本発明の一態様は、L-アミノ酸を生産する能力を有する腸内細菌科の細菌であって、pepA、pepB、及びpepD遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の発現が弱化されるように改変された細菌を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる態様は、前記遺伝子の発現が、前記遺伝子の不活化により弱化された前記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明の更なる態様は、細菌が、Escherichia属に属する前記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる態様は、前記細菌が、Escherichia coliである請求項３記載の細菌を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる態様は、細菌が、Pantoea属に属する前記細菌を提供することである。
【００１９】
本発明の更なる態様は、前記L-アミノ酸が、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンからなる群より選択される前記細菌を提供することである。
【００２０】
本発明の更なる態様は、pepA、pepB、及びpepD遺伝子の発現が弱化されるように改変され、且つ前記L-アミノ酸がL-リジンである前記細菌を提供することである。
【００２１】
本発明の更なる態様は、L-アミノ酸を製造する方法であって、前記細菌を培地中で培養すること、およびL-アミノ酸を培地から回収することを含む方法を提供することである。
【００２２】
本発明の更なる態様は、前記L-アミノ酸が、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンからなる群より選択される前記方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、プライマーペアP1及びP2の、プラスミドpMW118-attL-Cm-attR上での相対的な位置を示す図である。
【図２】図２は、不活化されたpepA遺伝子を含む染色体DNA断片の構築を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明を以下に詳細に説明する。
【００２５】
１．細菌
ここに開示する主題に基づく細菌は、L-アルギニン、L-シトルリン、又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産する能力を有する腸内細菌科の細菌であって、アミノペプチダーゼをコードするpepA、pepB、及びpepD遺伝子からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が弱化されるように改変された細菌である。
【００２６】
「L-アミノ酸を生産する能力を有する細菌」という用語は、培地中で培養した場合に、L-アミノ酸を生産して培地中に分泌することのできる細菌を意味してよい。
【００２７】
「L-アミノ酸を生産する能力を有する細菌」という用語は、E. coli K-12等のE. coliの野生株又は親株よりも多い量で、L-アルギニン、L-シトルリン、又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産して培地中への蓄積を引き起こすことのできる細菌を意味してもよく、微生物が、0.5 g/L以上、他の例では1.0 g/L以上の量で、培地中へのL-アミノ酸の蓄積を引き起こすことができることを意味してもよい。「L-アミノ酸」という用語は、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンを包含してよい。
【００２８】
腸内細菌科は、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）
属、エルビニア（Erwinia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、パントエア（Pantoea）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、セラチア（Serratia）属、シゲラ（Shigella）属、モルガネラ（Morganella）属、エルシニア（Yersinia）属等に属する細菌を包含する。特に、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で使用される分類により腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に分類されるものを使用することができる。特定の例は、Escherichia属又はPantoea属に属する細菌である。
【００２９】
「Escherichia属に属する細菌」という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従って、Escherichia属に分類されることを意味してよい。Escherichia属に属する細菌としては、限定されるものではないが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））が挙げられる。Escherichia属に属する細菌は特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F. C.らによって記載された細菌（Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1）が包含される。
【００３０】
「Pantoea属に属する細菌」という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従って、Pantoea属に分類されることを意味してよい。エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）の幾つかの種は、最近では、16S rRNAの塩基配列解析等に基いて、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチュアールティ（Pantoea stewartii）等に再分類されている。
【００３１】
「細菌が、アミノペプチダーゼＡをコードするpepA遺伝子の発現が弱化されるように改変された」という記載は、細菌が減少した量のアミノペプチダーゼＡを含有するように改変されたことを意味してもよく、細菌がアミノペプチダーゼＡを合成することができないことを意味してもよい。
【００３２】
「細菌が、アミノペプチダーゼＢをコードするpepB遺伝子の発現が弱化されるように改変された」という記載は、改変された細菌が減少した量のアミノペプチダーゼＢを含有するように細菌が改変されたことを意味してもよく、細菌がアミノペプチダーゼＢを合成することができないことを意味してもよい。
【００３３】
「細菌が、ジペプチダーゼＤをコードするpepD遺伝子の発現が弱化されるよう改変にされた」という記載は、改変された細菌が減少した量のジペプチダーゼＤを含有するように細菌が改変されたことを意味してもよく、細菌がジペプチダーゼＤを合成することができないことを意味してもよい。
【００３４】
「遺伝子の不活化」という記載は、改変された遺伝子が、完全に非機能的なタンパク質をコードすることを意味してよい。また、遺伝子の一部の欠失、遺伝子のリーディングフレームのシフト、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、又は遺伝子の隣接領域（プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等の遺伝子の発現を制御する配列を含む）の改変により、改変されたDNA領域が遺伝子を本来の形で発現できないことも可能である。
【００３５】
細菌の染色体上の遺伝子の有無は、PCRやサザンブロッティング等を含む周知の方法によって検出することができる。また、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することによって見積もることができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は
、SDS-PAGEとそれに続けてイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング分析）を行うこと等を含む周知の方法によって測定することができる。
【００３６】
Escherichia coli由来のアミノペプチダーゼＡをコードするpepA遺伝子（carP, b4260,
ECK4253と同義）は既に明らかになっている（GenBank Accession NC_000913.2の配列中のヌクレオチド4482463〜4483974に相補的なヌクレオチド）。E. coli由来のpepA遺伝子は、染色体上のholC遺伝子とlptF遺伝子との間に位置する。pepA遺伝子の塩基配列及びpepA遺伝子によってコードされるPepAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。
【００３７】
Escherichia coli由来のアミノペプチダーゼＢをコードするpepB遺伝子（yfhI, b2523,
ECK2520と同義）は既に明らかになっている（GenBank Accession EG12310の配列中のヌクレオチド2653097〜2654380に相補的なヌクレオチド）。E. coli由来のpepB遺伝子は、染色体上のiscX遺伝子とsseB遺伝子との間に位置する。pepB遺伝子の塩基配列及びpepB遺伝子によってコードされるPepBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び配列番号８に示す。
【００３８】
Escherichia coli由来のアミノペプチダーゼＤをコードするpepD遺伝子（pepH, b0237,
ECK0238と同義）は既に明らかになっている（GenBank Accession 10695の配列中のヌクレオチド254259〜255716に相補的なヌクレオチド）。E. coli由来のpepD遺伝子は、染色体上のgpt遺伝子とprfH遺伝子との間に位置する。pepD遺伝子の塩基配列及びpepD遺伝子によってコードされるPepＤタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９及び配列番号１０に示す。
【００３９】
腸内細菌科の属又は株の間でDNA配列に幾分かの差異があり得るため、染色体上の不活化される遺伝子は、配列番号１、７、又は９に示す遺伝子には限定されず、配列番号１、７、又は９に相同な遺伝子を含んでいてよい。これら相同な遺伝子は、バリアントタンパク質（variant protein）をコードする。「バリアントタンパク質」という記載は、アミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであるかにかかわらず配列中に変異を有するが、タンパク質の活性を依然として維持しているタンパク質を意味してよい。バリアントタンパク質における変異の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。バリアントタンパク質における変異の数は、１〜３０、他の例では１〜１５、更に他の例では１〜５であってよい。バリアントにおけるこのような変異は、タンパク質の機能に重要ではないタンパク質の領域において生じうる。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有しているため、そのような変異によっては三次元構造又は活性は影響を受けないからである。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質のバリアントは、不活化される前のタンパク質がアミノペプチダーゼ又はジペプチダーゼとして機能することができる限り、配列番号２、８、又は１０に示すアミノ酸配列全体に対して、80％以上、他の例では90％以上、他の例では95％以上、他の例では98％以上、更に他の例では99％以上の相同性を有し得る。この明細書では、「相同性」という用語は、「同一性」を意味してよい。
【００４０】
２つのアミノ酸配列の間の相同性は、周知の方法、例えば、３つのパラメータ（スコア、同一性、及び類似性）を計算するコンピュータプログラムBLAST 2.0、を使用して決定することができる。
【００４１】
更に、pepA、pepB、又はpepD遺伝子は、不活化前に機能的なタンパク質をコードする限り、配列番号１、７、又は９に示す塩基配列又はこの塩基配列から調製することのできるプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントであってよい。「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッド、例えば、60％以上、他の例では
70％以上、他の例では80％以上、他の例では90％以上、他の例では95％以上、他の例では98％以上、更に他の例では99％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件としては、１×SSC、0.1％SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1％SDSに相当する塩濃度で、60℃で、１回、他の例では2回又は3回、洗浄することが挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用する膜の種類に依存し、原則として、製造業者によって推奨されているものとすべきである。例えば、ストリンジェントな条件下でHybond（商標名）N+ナイロン膜（アマシャム）について推奨される洗浄時間は15分である。洗浄は、2〜3回行うことができる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーション条件に応じて適宜選択することができ、通常は100 bp〜１kbpである。
【００４２】
遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞内の活性が非改変株と比較して減少するよう、染色体上の遺伝子に変異を導入することにより、弱化させることができる。遺伝子の発現の弱化をもたらす変異には、遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸の置換を引き起こす１以上の塩基の置換（ミスセンス変異）、終止コドンの導入（ノンセンス変異）、フレームシフトを引き起こす１又は2塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子の挿入、又は遺伝子の一部若しくは遺伝子の全体の欠失が含まれる（Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)）。pepA遺伝子の発現は、プロモーターやシャイン-ダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することによっても弱化させることができる（WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)）。
【００４３】
例えば、遺伝子組換えによって変異を導入するために、以下の方法を用いることができる。活性の低下した変異型タンパク質をコードする変異型遺伝子を調製することができ、その変異型遺伝子を含むDNA断片を用いて、改変すべき細菌を形質転換することができる。その後、相同組換えによって、染色体上の本来の（native）遺伝子を変異型遺伝子で置換し、この結果得られる株を選択することができる。相同組換えを使用する遺伝子置換は、直鎖DNAを用いて行うことができ、これは「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」として知られている（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)）。または、相同組換えを使用する遺伝子置換は、温度感受性複製開始点を有するプラスミドを用いて行うことができる（米国特許第6,303,383号又はJP 05-007491A）。更に、宿主中で複製できないプラスミドを使用する上記したような相同組換えを使用して、遺伝子置換による部位特異的変異を組込むこともできる。
【００４４】
遺伝子の発現は、遺伝子のコード領域にトランスポゾン又はIS因子（IS factor）を挿入することによっても弱化させることができ（米国特許第5,175,107号）、又は、従来の方法、例えば、UV照射又はニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を用いる変異誘発、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子破壊、及び／又は「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」とも呼ばれる挿入−欠失変異誘発（Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45）によっても弱化させることができる。
【００４５】
プラスミドDNAの調製、DNAの消化及び連結、形質転換、オリゴヌクレオチドのプライマーとしての選択等のための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。これらの方法は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００４６】
L-アミノ酸生産細菌
L-アルギニン、L-シトルリン、又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産することのできる細菌を用いることができる。
【００４７】
ここに開示する主題に基づく細菌は、L-アミノ酸を生産する生来の（native or inherent）能力を有する細菌において、ペプチダーゼをコードする１またはそれ以上の遺伝子を不活化することにより得られる。あるいは、ここに開示する主題に基づく細菌は、ペプチダーゼをコードする不活化された遺伝子を既に有する細菌に対して、L-アミノ酸を生産する能力を付与することにより得られる。
【００４８】
L-アルギニン生産細菌
L-アルギニン生産細菌、又はL-アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、E. coli 237株 (VKPM B-7925)（米国特許出願第2002/058315A1号）及び変異型N-アセチルグルタミン酸合成酵素を保有するその誘導体株（ロシア連邦特許出願第2001112869号）、E. coli 382株 (VKPM B-7926)（EP1170358A1）、ならびにN-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株（EP1170361A1）等のEscherichia属に属する株が挙げられる。
【００４９】
L-アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-アルギニンの生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。このような遺伝子としては、N-アセチルグルタミン酸合成酵素（argA）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、N-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、アルギノコハク酸合成酵素（argG）、アルギノコハク酸リアーゼ（argH）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）をコードする遺伝子が挙げられる。酵素名の後の括弧内の省略形は、遺伝子名を表す。
【００５０】
L-シトルリン生産細菌
L-シトルリン生産細菌、又はEscherichia属に属するL-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、E. coli 333株 (VKPM B-8084）及び374株 (VKPM B-8086)（両者は、フィードバック耐性の変異型カルバモイルリン酸合成酵素を保有する）（ロシア連邦特許第RU2264459 C2号）、α‐ケトグルタル酸合成酵素の活性が増加し、さらにフェレドキシンNADP+レダクターゼ、ピルビン酸合成酵素、又はα‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が改変されたE. coli株（EP 2133417 A1号）、ならびに、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びα‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が減少したP. ananatis NA1sucAsdhA株（米国特許出願第2009286290号）等が挙げられる。
【００５１】
L-シトルリンは、L-アルギニンの生合成経路の中間体であるため、L-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-アルギニン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。このような遺伝子としては、限定されるものではないが、N-アセチルグルタミン酸合成酵素（argA）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、N-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）をコードする遺伝子又はこれらの組合せが挙げられる。
【００５２】
本発明のL-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-
シトルリンからL-アルギニンへの変換を触媒するアルギノコハク酸合成酵素（ArgG）の活性が親株と比較して低下したL-アルギニン生産株も挙げられる。アルギノコハク酸合成酵素の活性は、上記したような従来の方法によって、対応する遺伝子であるargGを不活化することにより減少させることができる。
【００５３】
L-リジン生産細菌
Escherichia属に属するL-リジン生産細菌又は親株としては、L-リジンアナログに対する耐性を有する変異体が挙げられる。L-リジンアナログは、Escherichia属に属する細菌の生育を阻害するが、培地中にL-リジンが存在する場合、この阻害は完全に又は部分的に脱感作される。L-リジンアナログとしては、限定されるものではないが、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、S-(2-アミノエチル)-L-システイン（AEC）、γ‐メチルリジン、α‐クロロカプロラクタム等が挙げられる。これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異体は、Escherichia属に属する細菌を従来の人工的な変異誘発処理に供することによって得ることができる。L-リジンを製造するのに有用な細菌株としては、特に、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185;米国特許第4,346,170号参照）及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物においては、L-リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。
【００５４】
WC196株は、Escherichia coliのL-リジン生産細菌として使用することができる。この細菌株は、Escherichia coli K-12から誘導されたW3110株から、W3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を、352位のスレオニンがイソロイシンによって置換されたことによりL-リジンによるフィードバック阻害が脱感作された変異型アスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子で置換し、この結果得られた株にAEC耐性を与えることにより、育種された（米国特許第5,661,012号）。この結果得られた株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6 （郵便番号305-8566））に、1994年12月6日に寄託され、FERM P-14690の受託番号が付与された。その後、同株は、1995年9月29日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-5252の受託番号が付与された（米国特許第5,827,698号）。
【００５５】
L-リジンを生産することのできる細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-リジン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。このような遺伝子としては、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリネート合成酵素（dapA）、アスパルトキナーゼ（lysC）、ジヒドロジピコリネートレダクターゼ（dapB）、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（lysA）、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、及びアスパルターゼ（aspA）（EP1253195A）をコードする遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP1170376A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、又はこれらの組合せの増大した発現を有していてよい。
【００５６】
Escherichia coli由来の野生型ジヒドロジピコリネート合成酵素は、L-リジンによるフィードバック阻害を受け、一方、Escherichia coli由来の野生型アスパルトキナーゼは、L-リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA及びlysC遺伝子を使用する場合、これらの遺伝子は、L-リジンによるフィードバック阻害を受けない酵素をコードする変異型遺伝子であってよい。
【００５７】
L-リジンによるフィードバック阻害が脱感作された変異型ジヒドロジピコリネート合成酵素をコードするDNAとしては、118位のヒスチジンがチロシンで置換された酵素のアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。L-リジンによるフィードバック阻害が脱感作された変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、352位のスレオニン、323位のグリシン、及び318位のメチオニンが、それぞれイソロイシン、アパラギン、及びイソロイシンで置換されたアミノ酸配列を有するAKIIIをコードするDNAが挙げられる（これらの変異体については、米国特許第5,661,012号及び米国特許第6,040,160号を参照のこと）。このような変異型DNAは、PCR等を使用する部位特異的変異誘発によって得ることができる。
【００５８】
広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、及びpCABD2は、変異型ジヒドロジピコリネート合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysC遺伝子を含むプラスミドとして知られている（米国特許第6,040,160号）。RSFD80を用いて形質転換したEscherichia coli JM109は、AJ12396と命名され（米国特許第6,040,160号）、同株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に、1993年10月28日に寄託され、FERM P-13936の受託番号が付与され、その後、この寄託は1994年11月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号が付与された。RSFD80は、公知の方法によってAJ12396株から取得することができる。
【００５９】
L-リジンを生産することのできる細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-リジンの生合成経路から分岐してL-リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が減少したか、この活性を有さない株が挙げられる。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（米国特許第5,827,698号）、及びリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005/010175）が挙げられる。リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または消失させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子及びldcC遺伝子の両者の発現を低減させることができる（国際公開WO2006/038695）。
【００６０】
cadA遺伝子及びldcC遺伝子の破壊株としては、Escherichia coli WC196LC株（WC196ΔcadAΔldc）が挙げられる。WC196LC株は、AJ110692と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6 （郵便番号305-8566））に、2008年10月７日に国際寄託され、FERM BP-11027の受託番号が付与された。
【００６１】
２．本発明の方法
例示的な方法には、ここに記載した細菌を培地中で培養して、L-アルギニン、L-シトルリン、及び／又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産して培地中に分泌し、培地からL-アミノ酸を回収することによりL-アミノ酸を製造することが含まれる。
【００６２】
培養、ならびに培地からのL-アミノ酸の回収及び精製は、細菌を使用してアミノ酸を製造する従来の発酵法によって行うことができる。
【００６３】
培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて、選択された細菌が生育のために要求する適量の栄養素を含む限り、合成培地であってもよく、天然培地であってもよい。炭素源には、グルコースおよびスクロース等の種々の炭水化物および種々の有機酸が含まれ得る。選択された微生物の同化の様式によっては、エタノール及びグリセリンを含むアルコールを使用してよい。窒素源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウム等の種々のアンモニウム塩、アミン等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、モノリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母
エキス等を使用することができる。
【００６４】
好ましくは、培養は、20〜40℃の温度で、好ましくは30〜38℃の温度で、振盪培養または通気攪拌培養によるような好気的な条件下で、行うことができる。培養のpHは、通常は5〜9、好ましくは6.5〜7.2である。培養のpHは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液を用いて調整することができる。通常は、１〜５日間の培養により、液体培地中にL-アミノ酸が蓄積する。
【００６５】
培養後、細胞等の固形分は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、L-アミノ酸は、イオン交換、濃縮、及び／又は結晶化の方法によって回収および精製することができる。
【実施例】
【００６６】
以下の非限定的な実施例を参照し、以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００６７】
実施例１．不活化されたpepA遺伝子を有する株の構築
１．pepA遺伝子の欠失
細菌株のpepA遺伝子は、Datsenko, K. A.とWanner, B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって最初に開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法により欠失させた。この手順に従い、pepA遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子の両者に相同のPCRプライマーP1（配列番号３）及びP2（配列番号４）を構築した。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO05/010175）をPCR反応におけるテンプレートとして使用した。PCRの条件は次の通りである：94℃で30秒の最初のDNA変性の後；94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、および72℃で１分30秒の伸長反応、を25サイクル；ならびに72℃で2分の最後の伸長反応。
【００６８】
1.7 kbのPCR産物（図１）をアガロースゲルから精製し、プラスミドpKD46を有するE. coli MG1655株（ATCC700926）のエレクトロポーレーションに使用した。pKD46プラスミド（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45）は、温度感受性の複製開始点、λファージの2,154塩基のDNA断片（ヌクレオチド位置31088〜33241, GenBank accession no. J02459）、並びにアラビノース誘導性ParaBプロモーターの制御下にあるλRed相同組換え系の遺伝子（γ、β、およびエキソ（exo）遺伝子）を含む。pKD46プラスミドは、MG1655株の染色体へのPCR産物の組込みに必要である。MG1655株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P. O. Box 1549 Manassas, VA 20108, U.S.A.）から入手することができる。
【００６９】
エレクトロコンピテント細胞は次のようにして調製した。E. coli MG1655/pKD46細胞を、アンピシリン（100 mg/l）を含有するLB培地中で30℃で一夜生育させ、培養液を、アンピシリン及びL-アラビノース（１mM）を含有する５mlのSOB培地（Sambrookら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）で100倍に希釈した。細胞を、OD600が約0.6になるまで30℃で通気しながら生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水を用いて３回洗浄することによりエレクトロコンピテント化させた。エレクトロポーレーションは、70μlの細胞及び約100 ngのPCR産物を使用して行った。エレクトロポーレーション後の細胞を、１mlのSOC培地（Sambrookら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて37℃で2.5時間インキュベートした後、クロラムフェニコール（30μg/ml）を含有するL-寒天上にプレーティングし、37℃で生育させてCmR組換え体を選択した。その後、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを有するL-寒天上で42℃で2回継代（passages）を行い、コロニーのアンピシリン感受性を試験した。
【００７０】
２．PCRによるpepA遺伝子欠失の検証
pepA遺伝子を欠失した変異体は、Cm耐性遺伝子で標識されており、部位特異的（locus-specific）プライマーP3（配列番号５）及びP4（配列番号６）を使用するPCRによって検証した。この目的のために、新たに（freshly）単離したコロニーを20μlの水に懸濁した後、１μlの懸濁液をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りである：94℃で30秒の最初のDNA変性の後；94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、及び72℃で2分の伸長反応、を30サイクル；ならびに72℃で2分の最後のエ伸長反応。親のpepA+株であるMG1655の細胞をテンプレートとして用いたPCR反応で取得したPCR産物は、1.65 kbの長さであった。変異体であるMG1655ΔpepA::cat株の細胞をテンプレートとして用いたPCR反応で取得したPCR産物は、長さ1.71 kbのヌクレオチドであった（図２）。
【００７１】
３．E. coli MG1655ΔpepA::cat株の染色体からのCm耐性遺伝子（cat遺伝子）の除去
int-xis系を使用し、E. coli MG1655 pepA::cat株の染色体からCm耐性遺伝子を除去した。この目的のために、pMWts-Int/Xisプラスミド（WO05/010175）でE. coli MG1655 pepA::cat株を形質転換した。形質転換体クローンは、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地上で選択した。プレートを30℃で一夜インキュベートした。単離したコロニーを37℃（この温度では、リプレッサーCItsは部分的に不活化され、int/xis遺伝子の転写は脱抑制（derepress）される）で塗り広げ、次いでCmSApRなバリアントを選抜することにより、形質転換体クローンのcat遺伝子及びpMWst-Int/Xisプラスミドを除去した。当該株の染色体からのcat遺伝子の除去は、部位特異的プライマーP3（配列番号５）及びP4（配列番号６）を用いるPCRによって検証した。PCRの条件は次の通りである：94℃で30秒の最初のDNA変性の後；94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、及び72℃で2分の伸長反応、を30サイクル；ならびに72℃で2分の最後の伸長反応。MG1655ΔpepA::cat株の細胞をテンプレートとして用いた反応で得られたPCR産物は、1.71 kbの長さであった。cat遺伝子を有さない細胞をテンプレートとして用いた反応で得られたPCR産物は、160 bpの長さであった。こうして、pepA遺伝子が不活化され、cat遺伝子を欠失した株が得られた。
【００７２】
実施例２．E. coli 382ΔpepA株によるL-アルギニンの生産
L-アルギニン生産におけるpepA遺伝子の不活化の効果を試験するために、上記のE. coli MG1655ΔpepA株の染色体由来のDNA断片を、E. coliアルギニン生産株382にP1トランスダクション（Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によって導入し、E. coli 382ΔpepA株を得た。382株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)に2000年4月10日に受託番号VKPM B-7926の下で寄託され、その後、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。
【００７３】
E. coli 382株及び382pepA株を、それぞれ、3mlのニュートリエントブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養し、0.3 mlの培養液を20×200 mmの試験管中の２mlの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカーで32℃で48時間培養した。
【００７４】
培養後、培地中に蓄積したL-アルギニンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（v/v）を用いたペーパークロマトグラフィーにより決定した。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用した。L-アルギニンを含むスポットを切り出し、CdCl2の0.5％水溶液を用いてL-アルギニンを溶出させ、L-アルギニンの量を540 nmで分光学的に見積もった。
【００７５】
発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである。
グルコース            48.0
(NH4)2SO4            35.0
KH2PO4               2.0
MgSO4・7H2O         1.0
チアミンHCl          0.0002
酵母エキス            1.0
L-イソロイシン        0.1
CaCO3                5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO3は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。
【００７６】
試験管発酵の結果を表１に示す。表１から分かるように、不活化されたpepA遺伝子を有する株は、親のE. coliアルギニン生産株382と比較して、より高い量のL-アルギニンを生産することができた。
【００７７】
【表１】
0005846128.tif 000002
【００７８】
実施例３．E. coli 382ΔpepA株によるシトルリンの生産
L-アルギニン生産におけるpepA遺伝子の不活化の効果を試験するために、上記E. coli MG1655ΔpepA株の染色体由来のDNA断片を、E. coliシトルリン生産株382ΔargGにP1トランスダクション（Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によって導入し、E. coli 382ΔargGΔpepA株を得ることができる。382ΔargG株は、Datsenko, K. A.とWanner, B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって最初に開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法によって、382株（VKPM B-7926）の染色体上のargG遺伝子を欠失させることにより取得することができる。この手順に従い、argG遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子の両者に相同なPCRプライマーを構築することができる。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO05/010175）を、PCR反応におけるテンプレートとして使用することができる。
【００７９】
両E. coli株、すなわち382ΔargG及び382ΔargGΔpepAを、それぞれ、3mlのニュートリエントブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養することができ、0.3 mlの得られた培養液を20×200 mmの試験管中の２mlの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカーで32℃で48時間培養した。
【００８０】
培養後、培地中に蓄積するシトルリンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（v/v）を用いたペーパークロマトグラフィーにより決定することができる。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用することができる。シトルリンを含むスポットを切り出し、CdCl2の0.5％水溶液を用いてシトルリンを溶出させ、シトルリンの量を540 nmで分光学的に見積もることができる。
【００８１】
発酵培地の組成（g/l）は以下の通りであってよい。
グルコース            48.0
(NH4)2SO4            35.0
KH2PO4               2.0
MgSO4・7H2O         1.0
チアミンHCl          0.0002
酵母エキス            1.0
L-イソロイシン        0.1
L-アルギニン          0.1
CaCO3                5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO3は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。
【００８２】
実施例４：減少したアミノペプチダーゼ活性を有するL-リジン生産細菌の構築
アミノペプチダーゼＡ、Ｂ、又はＤを発現しない株（WC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km, WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km及びWC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km株）をWC196ΔcadAΔldcC株から構築した。
【００８３】
WC196ΔcadAΔldcC株は、L-リジンを生産することができ、目的のpep遺伝子の欠損株を誘導するのに使用した。WC196ΔcadAΔldcCの各pep遺伝子は、実施例１に示したものと同様のやり方で、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法によって欠失させた。
【００８４】
pepA、pepB、又はpepD遺伝子は、pepAについては配列番号１１及び１２のプライマー、pepBについては配列番号１３及び１４のプライマー、pepDについては配列番号１５及び１６のプライマーをそれぞれ使用することにより欠失させた。これにより、各アミノペプチダーゼ遺伝子が欠失したWC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km、WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km、及びWC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km株を取得した。WC196196ΔcadAΔldcC株におけるcadA遺伝子及びldcC遺伝子も、同様のやり方で欠失させることができる。
【００８５】
更に、それぞれの株を、培養液の最終OD600が約0.6になるまで、37℃でＬ培地中で培養した。その後、等容量の40％グリセリン溶液を培養液に添加し、混合物を攪拌した後、適切な容量に分けて−80℃で保存した。これらをグリセロールストックと呼ぶ。
【００８６】
実施例５：アミノペプチダーゼ活性が減少した株のL-リジン生産能の評価
各株のグリセロールストックを解凍し、それぞれ100μLをＬプレートに均等に塗布し、37℃で24時間培養した。上記グリセロールストックを解凍し、L-プレートに均一に塗布し、37℃で24時間培養を行った。得られた細胞懸濁液を101倍に希釈し、希釈した懸濁液のOD620値（n）を測定し、50/nに相当する容量の細胞懸濁液を、500 mLの坂口フラスコ中の20mLの発酵培地に接種し、往復振盪培養装置（115 rpm）で37℃で48時間培養を行った。培養後、培地中に蓄積したL-リジンの量を公知の手法で測定した（バイオテックアナライザー（Biotec Analyzer） AS210、サクラ精機）。
【００８７】
発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである。
L-リジン発酵培地の組成：
グルコース            40
(NH4)2SO4            24
K2HPO4               1.0
MgSO4・7H2O        1.0
FeSO4・7H2O         0.01
MnSO4・5H2O        0.01
酵母エキス            2.0
CaCO3（日本薬局方）  30
蒸留水                １Ｌの最終容量とする
培地は、KOHを用いてpH 7.0に調整し、115℃で10分間オートクレーブした。グルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に180℃で2時間乾熱滅菌した。
【００８８】
結果を表２に示す。収率（％）は、L-リジンの対グルコース収率を示す。表２から分かるように、WC196ΔcadAΔldcCΔpepA、WC196ΔcadAΔldcCΔpepB、WC196ΔcadAΔldcCΔpepD株は、親のE. coliL-リジン生産株WC196ΔcadAΔldcCと比較して、より高い量のL-リジンを生産することができた。
【００８９】
【表２】
0005846128.tif 000003
【００９０】
本発明をその好適な態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、また、等価物を用いることができることは、当業者に明らかであろう。ここに引用した参考文献は全て、参照によりこの出願の一部として組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によれば、腸内細菌科の細菌によるL-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンの製造を改善することができる。
【図１】
0005846128.tif 000004
【図２】
0005846128.tif 000005