(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてペニシリウム・ラピドサム（Penicillium lapidosum）の検出を行う工程、及び下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてペニシリウム・ブレフェルディアナム（Penicillium brefeldianum）の検出を行う工程から選択される少なくとも１つの工程を含む、耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記検出工程が、前記オリゴヌクレオチド対をプライマー対として用いて核酸増幅を行う工程、及び増幅産物を検出する工程を含む、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行われる、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記増幅産物を検出する工程において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いて増幅産物が確認されたときはペニシリウム・ラピドサムと同定し、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いて増幅産物が確認されたときはペニシリウム・ブレフェルディアナムと同定し、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対及び前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いて増幅産物が確認されたときはペニシリウム・ラピドサム又はペニシリウム・ブレフェルディアナムと同定する、請求項２又は３記載の検出方法。
【請求項５】
前記核酸増幅により増幅される領域が、ＲＰＢ２遺伝子領域の一部である、請求項２〜４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
前記ペニシリウム・ラピドサムのＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列が下記（Ａ）の塩基配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の検出方法。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列又はその相補配列
【請求項７】
前記ペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列が、下記（Ｃ）の塩基配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の検出方法。
（Ｃ）配列番号６に示す塩基配列又はその相補配列
【請求項８】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、又は下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【請求項９】
前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドが核酸プライマーである、請求項８記載のオリゴヌクレオチド対。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のオリゴヌクレオチド対から選択される少なくとも１種を含む耐熱性ペニシリウム属真菌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、７５℃で３０分間の加熱処理を経ても生残しうる真菌を耐熱性真菌といい、これらの多くは飲食品事故を引き起こす危害菌とされている。耐熱性真菌は、土壌等に広く生息しており、食品原料との接触により飲食品内に混入する。混入した耐熱性真菌は、通常の加熱殺菌処理では完全には殺滅できず、製品内で増殖し、製品の腐敗や変敗を引き起こす。飲食品からの耐熱性真菌検出事例としては、穀物、香辛料、果実、果汁、茶葉、野菜の水煮、果実飲料、茶系飲料、スポーツドリンク、トマトジュース、ジャム、マーマレードなどが知られている。
【０００３】
飲食品の安全性確保のためには、危害菌が混入しないよう予防策を講ずることはもちろん、原料や製品検査等で真菌が検出された際には、検出菌の耐熱性の有無や菌種を識別することが重要となる。
これまで耐熱性真菌の検出方法は、真菌を培地で培養した後、顕微鏡でその形態を観察し同定することにより行われてきた。しかし、この方法は、判定の指標となる各菌種の特徴的な形態形成までに２週間程度の期間が必要であり、また、正確な判定には熟練を要する。そのため、迅速かつ正確な検出を行うことが難しかった。
従来の形態観察にかわる方法として、検出プライマーを用いた核酸増幅反応により目的の真菌を検出、同定する方法が提案されている。例えば、耐熱性真菌であるビソクラミス(Byssochlamys)属真菌やそのアナモルフであるパエシロマイセス（Paecilomyces）属真菌を、核酸増幅法により特異的に検出する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
耐熱性真菌の１つとして、耐熱性ペニシリウム属真菌が報告されている。なかでも、ペニシリウム・ラピドサム（Penicillium lapidosum）及びペニシリウム・ブレフェルディアナム（Penicillium brefeldianum）の２菌種は、加工食品から複数の検出事例があり、事故原因菌として報告されている。ペニシリウム・ラピドサムはブルーベリー缶詰、冷凍ブルーベリーケーキから、ペニシリウム・ブレフェルディアナムはマーマレード、クリームチーズ、リンゴジュースからそれぞれ分離されている。
このため、耐熱性ペニシリウム属真菌のなかでも、特にペニシリウム・ラピドサムとペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出、同定が重要となるが、これらの菌についての迅速かつ正確な検出方法は、これまでのところ確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−００４８８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムの迅速かつ正確な検出が困難であった一因として、遺伝子情報が脆弱であり特異性の高いプライマーの設計が困難であったことが挙げられる。また、真菌に広く保存されている遺伝子領域を基に、ユニバーサルプライマーを設計して、核酸増幅反応を行った後、得られた増幅産物の塩基配列を解析し、既知の配列情報と比較することで菌種を決定する手法も存在する。しかし、この手法では塩基配列の解析や比較に一定の時間を要するため、迅速性の観点から十分であるとはいえない。
【０００７】
本発明は、耐熱性のペニシリウム属真菌であるペニシリウム・ラピドサム、ペニシリウム・ブレフェルディアナムを迅速かつ正確に種レベルで検出し、同定する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者等は、ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムを、種レベルで、迅速かつ正確に検出する方法について鋭意検討を行った。
ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムの遺伝子配列上で、これらを特異的に検出しうるプライマーの設計に有用なＤＮＡ領域を探索した。ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２（RNA  polymerase  II）遺伝子の塩基配列情報と既知のペニシリウム属真菌等のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列情報をもとに、分子系統学的解析を行った結果、ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子領域中に、他の菌種と区別しうる特異的な塩基配列を見出した。そして、当該塩基配列を検出ターゲットとすることで、ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムを迅速かつ正確に検出できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてペニシリウム・ラピドサム（Penicillium lapidosum）の検出を行う工程、及び下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてペニシリウム・ブレフェルディアナム（Penicillium brefeldianum）の検出を行う工程から選択される少なくとも１つの工程を含む、耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法、に関する。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００１０】
また、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対から選択される少なくとも１種を含む耐熱性ペニシリウム属真菌の検出キットに関する。
なお、本発明における「検出」とは、分類学的に使用される「同定」も含む概念である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の検出方法は、飲食品汚染事故の原因菌である耐熱性真菌のペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムを迅速かつ正確に検出し、同定することができる。当該方法によれば、従来の形態観察法と比べて、上記真菌の検出し、同定するまでに要する時間を大幅に短縮することができる。
また、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、当該方法に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ペニシリウム属真菌のＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列に基づいて作成した、ペニシリウム属真菌の分子系統樹を示す図である。
【図２】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図３】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図４】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図６】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図７】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図８】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図９】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法は、耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法であり、検出対象となる耐熱性ペニシリウム真菌は、ペニシリウム・ラピドサム（Penicillium lapidosum）及びペニシリウム・ブレフェルディアナム（Penicillium brefeldianum）である。この２菌種は、ペニシリウム属に属する真菌のなかでも、子のう胞子の耐熱性が高く、飲食品事故の報告例がある。これらの真菌は、生活環の中に有性世代を有し、有性世代は耐熱性を有する子のう胞子を形成する。本発明の方法では、上記真菌の有性世代、無性世代のいずれも検出することができる。
なお、2011年4月に、International  Commission  of  Penicillium  and  Aspergillus（ICPA）で、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属真菌と関連するペニシリウム属真菌とをペニシリウムの名称で統一することが提案された（http://www.aspergilluspenicillium.org/index.php/penicillium-names参照）。本発明ではこれに則り、名称としてペニシリウムを使用している。
【００１４】
本発明の方法では、ＲＰＢ２遺伝子領域中の、ペニシリウム・ラピドサム又はペニシリウム・ブレフェルディアナムに特異的な塩基配列を用いて、ペニシリウム・ラピドサム又はペニシリウム・ブレフェルディアナムを、種特異的に検出することができる。
本発明者等は、ペニシリウム・ラピドサム及びペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子の塩基配列と他の真菌のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列との間でアライメント解析を行った。その結果、ペニシリウム・ラピドサムのＲＰＢ２遺伝子の塩基配列中に、他のペニシリウム属真菌とは保存性が低く、同一種内では保存性の高い領域が見出され、当該領域はペニシリウム・ラピドサムを種特異的に検出し、同定するための指標（標的）として有用であった。さらに、ペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子の塩基配列中にも、他のペニシリウム属真菌とは保存性が低く、同一種内では保存性が高い領域が見出され、当該領域は、ペニシリウム・ブレフェルディアナムを種特異的に検出し、同定するための指標（標的）として有用であった。以下、これらの領域を「検出対象領域」ともいう。
この検出対象領域を用いたペニシリウム・ラピドサムの検出及びペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出について、以下順に説明する。本発明の検出方法では、ペニシリウム・ラピドサムの検出とペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出をそれぞれ単独で行ってもよいし、併せて行ってもよい。
【００１５】
１．ペニシリウム・ラピドサムの検出
本発明の方法では、ペニシリウム・ラピドサム検出に、上述した検出対象領域として、下記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸を用いる。好ましくは下記（Ａ）の塩基配列で表される核酸を用いる。配列番号５に示す塩基配列は、ペニシリウム・ラピドサムのＲＰＢ２遺伝子の部分塩基配列である。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列又はその相補配列
（Ｂ）配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はその相補配列
【００１６】
前記（Ｂ）において、１若しくは数個の塩基は、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【００１７】
また、前記（Ｂ）の塩基配列として、下記（Ｂ１）の塩基配列も好ましい。
（Ｂ１）配列番号５に示す塩基配列と８５％以上の同一性（相同性）を有する塩基配列、又はその相補配列
前記（Ｂ１）において、塩基配列の同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがよりさらに好ましい。
本発明において、塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００１８】
前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を用いてペニシリウム・ラピドサムを検出する方法として具体的には、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて核酸増幅法により検出する方法（以下、「核酸増幅法」）、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法（以下、「ハイブリダイゼーション法」）、被検体のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列を決定し、該配列中に前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列が含まれることを確認する方法（以下、「シークエンシング法」）、が挙げられる。なかでも、迅速性の点から、好ましくは核酸増幅法又はハイブリダイゼーション法であり、より好ましくは核酸増幅法である。
以下、それぞれの方法について説明する。
【００１９】
［核酸増幅法］
核酸増幅法による検出は、検体試料から調製した核酸を鋳型とし、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて、核酸増幅反応により前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列の一部又は全部からなる核酸を増幅し、増幅産物の有無を確認することにより行う。増幅産物が確認された場合、ペニシリウム・ラピドサムと同定される。
【００２０】
核酸プライマーとして用いる前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（以下、「検出用オリゴヌクレオチド」）は、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドが好ましい。「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２１】
検出用オリゴヌクレオチドとしてより好ましくは、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列の部分配列からなり、かつ下記（１）〜（４）の条件を満たすオリゴヌクレオチドである。
（１）３’末端がペニシリウム・ラピドサムに特異的な配列である
（２）ＧＣ含量がおよそ３０〜８０％となる
（３）自己アニールの可能性が低い
（４）Ｔｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５〜６５℃程度となる
前記条件（３）において、「自己アニールの可能性が低い」とは、オリゴヌクレオチドの塩基配列からオリゴヌクレオチド同士が結合しないことが予想されることを言う。
【００２２】
検出用オリゴヌクレオチドの塩基数は特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２６塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることがさらに好ましい。
【００２３】
検出用オリゴヌクレオチドとしてさらに好ましくは、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００２４】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示す塩基配列の３５８位から３７９位まで、６１９位から６４２位までの配列にそれぞれ対応する。
前記（ａ）及び（ｂ）における、ペニシリウム・ラピドサムのＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列は、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列である。
前記（ａ）及び（ｂ）において、１若しくは数個の塩基は、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【００２５】
前記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドとして、下記（ａ１）又は（ｂ１）のオリゴヌクレオチドも好ましい。
（ａ１）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
前記（ａ１）又は（ｂ１）において、塩基配列の同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがよりさらに好ましい。なお、塩基配列の同一性の算出方法については、前述した方法を用いることができる。
【００２６】
前記（ａ）のオリゴヌクレオチドとして、下記（ａ２）又は（ｂ２）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ａ２）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ２）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２７】
前記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
前記検出用オリゴヌクレオチドは、通常の合成方法により調製することができる。例えば、検出用オリゴヌクレオチドの配列に基づいて、核酸自動合成装置等を用いて化学合成することにより調製できる。また、ペニシリウム・ラピドサムのゲノムから制限酵素等を用いて直接切り出したり、またＲＰＢ２遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００２８】
核酸増幅法による検出には、前記検出用オリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー対をもちいることが好ましい。核酸プライマー対として、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対が好ましく、前記（ａ２）及び（ｂ２）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対がより好ましい。
【００２９】
核酸を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法など、通常の核酸増幅法を用いることができる。本発明においては、迅速性の観点から、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
以下、ＰＣＲ法により増幅反応を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００３０】
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で１０秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０℃以上（好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上）７０℃以下（好ましくは６４℃以下、より好ましくは６０℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
【００３１】
本発明において、核酸増幅産物の確認は通常の方法で行うことができる。例えば、反応産物を電気泳動し、目的とする増幅産物の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられる。なかでも、核酸増幅反応後に反応物を電気泳動し、目的の増幅産物の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば、増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられる。なかでも、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
被検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にペニシリウム・ラピドサムが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約２８０ｂｐのＤＮＡ断片が確認される。当該ＤＮＡ断片が確認された場合、検体にペニシリウム・ラピドサムが含まれていると同定できる。
【００３２】
［ハイブリダイゼーション法］
ハイブリダイゼーション法による検出は、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとし、該プローブを検体試料から調製した核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした該プローブの標識を検出することにより行う。プローブがハイブリダイズした場合、ペニシリウム・ラピドサムと同定される。
【００３３】
核酸プローブには、上記「核酸増幅法」の項で述べた検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を用いることができ、好ましい範囲も同様である。なかでも、前記（ａ）、（ｂ）、（ａ１）及び（ｂ１）のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが好ましく、前記（ａ２）及び（ｂ２）のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００３４】
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検体試料から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでペニシリウム・ラピドサムを種レベルで検出することができる。ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記検出用オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
【００３５】
［シークエンシング法］
シークエンシング法による検出は、検体試料から調製した核酸中のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列を解析・決定して、該配列と前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいて、ペニシリウム・ラピドサムの同定を行う。
塩基配列の解析方法としては特に限定されず、通常行われている核酸シークエンシングの手法を用いることができる。具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００３６】
２．ペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出
また、本発明の方法では、ペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出のために、上述した検出対象領域として、下記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸を用いる。好ましくは下記（Ｃ）の塩基配列で表される核酸を用いる。配列番号６に示す塩基配列は、ペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子中の部分塩基配列である。
（Ｃ）配列番号６に示す塩基配列又はその相補配列
（Ｄ）配列番号６に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はその相補配列
【００３７】
前記（Ｄ）において、１若しくは数個の塩基は、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【００３８】
また、前記（Ｄ）の塩基配列として、下記（Ｄ１）の塩基配列も好ましい。
（Ｄ１）配列番号６に示す塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列、又はその相補配列
前記（Ｄ１）において、塩基配列の同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがよりさらに好ましい。なお、塩基配列の同一性の算出方法については、前述した。
【００３９】
前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列を用いてペニシリウム・ブレフェルディアナムを検出する方法として具体的には、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて核酸増幅法により検出する方法（以下、「核酸増幅法」）、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法（以下、「ハイブリダイゼーション法」）、被検体のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列を決定し、該配列中に前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列が含まれることを確認する方法（以下、「シークエンシング法」）、が挙げられる。なかでも、迅速性の点から、好ましくは核酸増幅法又はハイブリダイゼーション法であり、より好ましくは核酸増幅法である。
以下、それぞれの方法について説明する。
【００４０】
［核酸増幅法］
核酸増幅法による検出は、検体試料から調製した核酸を鋳型とし、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて、核酸増幅反応により前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の一部又は全部からなる核酸を増幅し、増幅産物の有無を確認することにより行う。増幅産物が確認された場合、ペニシリウム・ブレフェルディアナムと同定される。
【００４１】
核酸プライマーとして用いる前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（以下、「検出用オリゴヌクレオチド」）は、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドが好ましい。「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook,  David  W.  Russell.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００４２】
検出用オリゴヌクレオチドとしてより好ましくは、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列の部分配列からなり、かつ下記（１）〜（４）の条件を満たすオリゴヌクレオチドである。
（１）３’末端がペニシリウム・ブレフェルディアナム特異的な配列である
（２）ＧＣ含量がおよそ３０〜８０％となる
（３）自己アニールの可能性が低い
（４）Ｔｍ値（融解温度：melting  temperature）がおよそ５５〜６５℃程度となる
前記条件（３）において、「自己アニールの可能性が低い」とは、オリゴヌクレオチドの塩基配列からオリゴヌクレオチド同士が結合しないことが予想されることを言う。
【００４３】
検出用オリゴヌクレオチドの塩基数は特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２６塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることがさらに好ましい。
【００４４】
検出用オリゴヌクレオチドとしてさらに好ましくは、下記（ｃ）又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドである。
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００４５】
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号６に示す塩基配列の５０７位から５３１位まで、６８７位から７１０位までの配列にそれぞれ対応する。
前記（ｃ）及び（ｄ）における、ペニシリウム・ブレフェルディアナムＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列は、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列である。
前記（ｃ）及び（ｄ）において、１若しくは数個の塩基は、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【００４６】
前記（ｃ）又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドとして、下記（ｃ１）又は（ｄ１）のオリゴヌクレオチドも好ましい。
（ｃ１）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ１）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
前記（ｃ１）又は（ｄ１）において、塩基配列の同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることがよりさらに好ましい。なお、塩基配列の同一性の算出方法については、前述した方法を用いることができる。
【００４７】
前記（ｃ）又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドとして、下記（ｃ２）又は（ｄ２）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ｃ２）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ２）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００４８】
前記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
前記検出用オリゴヌクレオチドは、通常の合成方法により調製することができる。例えば、検出用オリゴヌクレオチドの配列に基づいて、核酸自動合成装置等を用いて化学合成することにより調製できる。また、ペニシリウム・ブレフェルディアナムのゲノムから制限酵素等を用いて直接切り出したり、またＲＰＢ２遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００４９】
核酸増幅法による検出には、前記検出用オリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー対をもちいることが好ましい。核酸プライマー対として、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対が好ましく、前記（ｃ２）及び（ｄ２）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対がより好ましい。
【００５０】
核酸を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法など、通常の核酸増幅法を用いることができる。本発明においては、迅速性の点からＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
以下、ＰＣＲ法により増幅反応を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００５１】
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で１０秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０℃以上（好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上）６５℃以下（好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
【００５２】
本発明において、核酸増幅産物の確認は通常の方法で行うことができる。例えば、反応産物を電気泳動し、目的とする増幅産物の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられる。なかでも、核酸増幅反応後に反応物を電気泳動し、目的の増幅産物の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば、増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられる。なかでも、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
被検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にペニシリウム・ブレフェルディアナムが含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約２００ｂｐのＤＮＡ断片が確認される。当該ＤＮＡ断片が確認された場合、検体にペニシリウム・ブレフェルディアナムが含まれていると同定できる。
【００５３】
［ハイブリダイゼーション法］
ハイブリダイゼーション法による検出は、前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとし、該プローブを検体試料から調製した核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした該プローブの標識を検出することにより行う。プローブがハイブリダイズした場合、ペニシリウム・ブレフェルディアナムと同定される。
【００５４】
核酸プローブには、上記「核酸増幅法」の項で述べた検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対を用いることができ、好ましい範囲も同様である。なかでも、前記（ｃ）、（ｄ）、（ｃ１）及び（ｄ１）のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが好ましく、前記（ｃ２）及び（ｄ２）のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００５５】
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検体試料から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでペニシリウム・ブレフェルディアナムを種レベルで検出することができる。ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記検出用オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
【００５６】
［シークエンシング法］
シークエンシング法による検出は、検体試料から調製した核酸中のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列を解析・決定して、該配列と前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいて、ペニシリウム・ブレフェルディアナムの同定を行う。
塩基配列の解析方法としては特に限定されず、通常行われている核酸シークエンシングの手法を用いることができる。具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００５７】
本発明の検出方法を適用する検体に特に制限はなく、飲食品、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体、飲食品又はその原材料の包装容器等を用いることができる。
【００５８】
検体から核酸を調製する方法としては、検出に足る量及び精製度の核酸が得られる方法のであれば特に制限されず、通常の核酸抽出方法や市販の抽出キットを用いることができる。核酸として、検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いてもよい。また、抽出した核酸に、分離、抽出、濃縮、精製等の処理をさらに施してもよい。
【００５９】
本発明の検出キットは、核酸プローブ又は核酸プライマーとして、前記検出用オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対から選ばれる少なくとも１種を含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、真菌の検出に通常用いられる物質を含有することができる。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００６０】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の検出方法、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対、検出キット、使用、並びに方法を開示する。
【００６１】
＜１＞  下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてペニシリウム・ラピドサム（Penicillium lapidosum）の検出を行う工程、及び下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてペニシリウム・ブレフェルディアナム（Penicillium brefeldianum）の検出を行う工程から選択される少なくとも１つの工程を含む、耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００６２】
＜２＞前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドが、下記（ａ１）〜（ｄ１）のオリゴヌクレオチドである、＜１＞項記載の検出方法。
（ａ１）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の同一性（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９９％以上）を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｂ１）配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の同一性（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９９％以上）を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ラピドサムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｃ１）配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に示す塩基配列と８５％以上の同一性（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９９％以上）を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（ｄ１）配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に示す塩基配列と８５％以上の同一性（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９９％以上）を有する塩基配列からなり且つペニシリウム・ブレフェルディアナムのRPB2遺伝子領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００６３】
＜３＞  前記検出工程が、前記オリゴヌクレオチド対をプライマー対として用いて核酸増幅を行う工程、及び増幅産物を検出する工程を含む、＜１＞又は＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞  前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行われる、＜３＞項記載の検出方法。
＜５＞  前記増幅産物を検出する工程において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いて増幅産物が確認されたときはペニシリウム・ラピドサムと同定し、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いて増幅産物が確認されたときはペニシリウム・ブレフェルディアナムと同定し、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対及び前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いて増幅産物が確認されたときはペニシリウム・ラピドサム又はペニシリウム・ブレフェルディアナムと同定する、＜２＞又は＜３＞項記載の検出方法。
＜６＞  前記核酸増幅により増幅される領域が、ＲＰＢ２遺伝子領域の一部である、＜３＞〜＜５＞のいずれか１項記載の検出方法。
【００６４】
＜７＞  前記ペニシリウム・ラピドサムのＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列が下記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の検出方法。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列又はその相補配列
（Ｂ）配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はその相補配列
＜８＞前記（Ｂ）の塩基配列が、下記（Ｂ１）の塩基配列である、＜７＞項記載の検出方法。
（Ｂ１）配列番号５に示す塩基配列と８５％以上の同一性（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９９％以上）を有する塩基配列、又はその相補配列
【００６５】
＜９＞  前記ペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子領域の塩基配列が、下記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の検出方法。
（Ｃ）配列番号６に示す塩基配列又はその相補配列
（Ｄ）配列番号６に示す塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はその相補配列
＜１０＞前記（Ｄ）の塩基配列が、下記（Ｄ１）の塩基配列である、＜９＞項記載の検出方法。
（Ｄ１）配列番号６に示す塩基配列と８５％以上の同一性（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９９％以上）を有する塩基配列、又はその相補配列
【００６６】
＜１１＞  前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
＜１２＞前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドが、前記（ａ１）〜（ｄ１）のオリゴヌクレオチドである、＜１１＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１３＞  前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、＜１１＞又は＜１２＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【００６７】
＜１４＞  ＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド対から選択される少なくとも１種を含む耐熱性ペニシリウム属真菌の検出キット。
【００６８】
＜１５＞  前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸を用いてペニシリウム・ラピドサムの同定を行う、ペニシリウム・ラピドサムの検出方法。
＜１６＞  前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを用いる、＜１５＞項記載の検出方法。
（１）３’末端がペニシリウム・ラピドサムに特異的な配列である
（２）ＧＣ含量がおよそ３０〜８０％となる
（３）自己アニールの可能性が低い
（４）Ｔｍ値がおよそ５５〜６５℃程度となる
【００６９】
＜１７＞  前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸を用いてペニシリウム・ブレフェルディアナムの同定を行う、ペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出方法。
＜１８＞  前記（Ｃ）又は（Ｄ）の塩基配列で表される核酸中の領域であって、下記の（１）〜（４）の４つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを用いる、＜１７＞項記載の検出方法。
（１）３’末端がペニシリウム・ブレフェルディアナムに特異的な配列である
（２）ＧＣ含量がおよそ３０〜８０％となる
（３）自己アニールの可能性が低い
（４）Ｔｍ値がおよそ５５〜６５℃程度となる
【００７０】
＜１９＞  ペニシリウム・ラピドサム検出用核酸プライマーとしての、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜２０＞  ペニシリウム・ラピドサム検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜２１＞  前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをペニシリウム・ラピドサム検出用核酸プライマーとして使用する方法。
【００７１】
＜２２＞  ペニシリウム・ブレフェルディアナム検出用核酸プライマーとしての、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜２３＞  ペニシリウム・ブレフェルディアナム検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜２４＞前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドをペニシリウム・ブレフェルディアナム検出用核酸プライマーとして使用する方法。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７３】
実施例
１．ペニシリウム属真菌のＲＰＢ２遺伝子解析
下記の方法により、ペニシリウム・ラピドサム、ペニシリウム・ブレフェルディアナムを含むペニシリウム属真菌及びその類縁真菌について、ＲＰＢ２遺伝子の塩基配列を決定した。
ポテトデキストロース寒天斜面培地にて２５℃で７日間、暗所培養した各真菌の菌体から、Ｇｅｎとるくん（商品名、タカラバイオ社製）を使用し、ゲノムＤＮＡを抽出した。  目的とする部位のＰＣＲ増幅は、DNAポリメラーゼとしてPuReTaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Healthcare社製）を用い、プライマーとしてRPB2  5F（5'-gaygaymgwgatcayttygg-3'：配列番号７）、RPB2  7CR（5'-cccatrgcttgyttrcccat-3'：配列番号８）を用いた。なお、配列番号７及び８の配列において、「y」は「t又はc」を、「m」は「a又はc」を、「w」は「a又はt」を、「r」は「g又はa」を、それぞれ表す。増幅は、熱変性：９４℃１分間、アニーリング：５１℃１分間、伸長反応；７２℃１分間を３５サイクル行った後、７２℃での伸長反応を１０分間実施した。ＰＣＲ産物を、BigDye  terminator  Cycle  sequencing  kit（Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetiｃ  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア  ATGC  Ver.4（Genetyx社製）を、フォワード側とリバース側塩基配列の結合には、ソフトウェア  ATSQ（Genetyx社製）を使用した。
【００７４】
２．分子系統樹作成
前記１．のシークエンシング解析により決定した各真菌のＲＰＢ２遺伝子配列、及びDNA  data  bank  of  Japan（DDBJ）から入手したペニシリウム属真菌及び類縁真菌のＲＰＢ２遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal  X（http://www.clustal.org/）を用いて系統解析を実施した。系統解析結果をもとに、NJ-plotを用いて分子系統樹を作成した。
作成した分子系統樹を図１に示す。
【００７５】
図１に示すように、ペニシリウム・ラピドサム、ペニシリウム・ブレフェルディアナムは、それぞれ独立した分岐鎖に分けられることが明らかとなった。
【００７６】
３．ペニシリウム・ラピドサムの検出
（１）プライマーの設計
上記１．で得られたペニシリウム・ラピドサムのＲＰＢ２遺伝子の塩基配列領域のうち、１）３’末端がペニシリウム・ラピドサムに特異的な配列であり、２）ＧＣ含量が概ね３０〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。
上記条件に該当する部分塩基配列情報をもとにして、フォワードプライマー（配列番号１）とリバースプライマー（配列番号２）からなる１組のプライマー対を設計した。当該プライマーは、北海道システムサイエンス社に合成依頼し（脱塩精製品、0.2μmolスケール）購入した。
続いて、設計したプライマーのペニシリウム・ラピドサム検出の有効性を、検証した。
【００７７】
（２）検体の調製
プライマー評価には、表１−１及び１−２に記載のペニシリウム・ラピドサムを含むペニシリウム属真菌及びその類縁真菌、表２に記載のペニシリウム・ラピドサム、耐熱性真菌、他の一般的な真菌を用いた。これらの真菌は、千葉大学真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌株を生育至適条件下で培養した。培養は、ポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて、Byssochlamys属、Talaromyces属、Hamigera属、Neosartorya属以外は生育至適温度である２５℃で、Byssochlamys属、Talaromyces属、Hamigera属、Neosartorya属は生育至適温度である３０℃で７日間培養した。
【００７８】
【表１−１】
0005956389.tif 000002
【００７９】
【表１−２】
0005956389.tif 000003
【００８０】
【表２】
0005956389.tif 000004
【００８１】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
培養した各菌体を、寒天培地から白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名：Ｇｅｎとるくん、タカラバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調整した。
【００８２】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応キットの試薬１反応分に（商品名：illustra  PuRe  Taq  PCRキット、GEヘルスケア社製）、無菌蒸留水２３μｌを混合し、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー（5’-gcctagcgagcctatcattgac-3’、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー（5’-gggtcgttgtcaatagtgaaaaga-3’、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ溶液を調製した。
このＰＣＲ溶液を、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて、遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９７℃、１分間の熱変性反応、（ｉｉ）６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００８３】
（５）増幅ＤＮＡ産物の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から５μｌを分取して、２％アガロースゲルにて電気泳動を行った。また、分子量マーカーとして、ＥＺ  Ｌｏａｄ  １００  ｂｐ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いた。泳動後、SYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン社製）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片（ＲＰＢ２遺伝子断片）の有無を確認した。
アガロースゲルの電気泳動図を図２、図３に示す。図２は表１−１及び１−２の各真菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ反応産物の電気泳動結果を、図３は表２の各真菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ反応産物の電気泳動結果を、それぞれ示す。なお、各図中のレーン番号は、各表に記載された試料番号に対応する。
【００８４】
その結果、ペニシリウム・ラピドサムのゲノムＤＮＡを鋳型とした試料（図２の１レーンから３レーン、図３の１レーン及び２レーン）からは、約２８０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。一方、ペニシリウム・ラピドサム以外のペニシリウム属及びその他の真菌のゲノムＤＮＡを鋳型とした試料では、ＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった。
以上の結果から、配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対により、ペニシリウム・ラピドサムのみを特異的に検出できることがわかった。
【００８５】
４．ペニシリウム・ブレフェルディアナムの検出
（１）プライマーの設計
上記１．で得られたペニシリウム・ブレフェルディアナムのＲＰＢ２遺伝子の塩基配列領域のうち、１）３’末端がペニシリウム・ブレフェルディアナムに特異的な配列であり、２）ＧＣ含量が概ね３０〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。
上記条件に該当する部分塩基配列情報をもとにして、フォワードプライマー（配列番号３）とリバースプライマー（配列番号４）からなる１組のプライマー対を設計した。当該プライマーは、北海道システムサイエンス社に合成依頼し（脱塩精製品、0.2μmolスケール）購入した。
続いて、設計したプライマーのペニシリウム・ブレフェルディアナム検出の有効性を、検証した。
【００８６】
（２）検体の調製
プライマー評価には、表３−１及び３−２に記載のペニシリウム・ブレフェルディアナムを含むペニシリウム属真菌及びその類縁真菌、前記表２に記載のペニシリウム・ブレフェルディアナム、耐熱性真菌、他の一般的な真菌を用いた。これらの真菌は、千葉大学真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌株を生育至適条件下で培養した。培養は、ポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて、生育至適温度である２５℃で７日間培養した。
【００８７】
【表３−１】
0005956389.tif 000005
【００８８】
【表３−２】
0005956389.tif 000006
【００８９】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
培養した各菌体を、寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名：Ｇｅｎとるくん、タカラバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は２ｎｇ/μｌに調整した。
【００９０】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応キットの試薬１反応分に（商品名：illustra  PuRe  Taq  PCRキット、GEヘルスケア社製）、無菌蒸留水２３μｌを混合し、配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー：Ebre_F3（5’-tgaccccacccatctagtgaacaca-3’、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー：Ebre_R3（5’-atgtgctccttgttgaggacgaga-3’、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ溶液を調製した。
このＰＣＲ溶液を、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（i）９７℃、１分間の熱変性反応、（ii）６１℃、１分間のアニーリング反応、及び（iii）７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００９１】
（５）増幅ＤＮＡ産物の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から５μｌを分取して、２％アガロースゲルにて電気泳動を行った。また、分子量マーカーとして、ＥＺ  Ｌｏａｄ  １００  ｂｐ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いた。泳動後、SYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン社製）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片（ＲＰＢ２遺伝子断片）の有無を確認した。
アガロースゲルの電気泳動図を図４、図５に示す。図４は表３−１及び３−２の各真菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ反応産物の電気泳動結果を、図５は表２の各真菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ反応産物の電気泳動結果を、それぞれ示す。なお、各図中のレーン番号は、各表に記載された試料番号に対応する。
【００９２】
その結果、ペニシリウム・ブレフェルディアナムのゲノムＤＮＡを鋳型とした試料（図４の１レーン及び２レーン、図５の３レーン及び４レーン）では、約２００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。一方、ペニシリウム・ブレフェルディアナム以外のペニシリウム属及びその他の真菌のゲノムＤＮＡを鋳型とした試料では、ＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった。
以上の結果から、配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対により、ペニシリウム・ブレフェルディアナムのみを特異的に検出できることがわかった。
【００９３】
５．アニーリング温度条件の検証
次に、配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドからなるペニシリウム・ラピドサム検出用プライマー対、又は配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドからなるペニシリウム・ブレフェルディアナム検出用プライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、アニーリング温度条件を変更した場合の検出特異性について検証した。
【００９４】
（１）菌体からのゲノムＤＮＡの調製
表４に示す真菌を使用した。なお、ペニシリウム・ラピドサム検出用プライマー対には表４のレーン番号１〜３の真菌を、ペニシリウム・ブレフェルディアナム検出用プライマー対には表４のレーン番号５〜７の真菌を用いた。
各菌体は上記１．と同様に培養後、白金耳を用いて回収し、Ｇｅｎとるくん（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００９５】
【表４】
0005956389.tif 000007
【００９６】
（２）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、表４のレーン番号１〜３の真菌については上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応キット（商品名：SapphireAmp  TM  Fast  PCR  Master  Mix、タカラバイオ社製）の試薬を２５μｌ、無菌蒸留水２３μｌを混合し、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、５０μｌのＰＣＲ溶液を調整した。また、表４のレーン番号５〜７の真菌については上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応キット（商品名：illustra  PuRe  Taq  PCRキット、GEヘルスケア社製）に、無菌蒸留水２３μｌを加え、さらに、配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ溶液を調製した。
このＰＣＲ溶液を、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、（ｉ）９７℃、５〜６０秒間の熱変性反応、（ｉｉ）５５℃から６４℃、５〜６０秒間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、５〜６０秒間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行ったのち、７２℃の伸長反応を５分間実施した。
【００９７】
（３）増幅ＤＮＡ産物の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から５μｌを分取して、２％アガロースゲルにて電気泳動を行った。また、分子量マーカーとして、ＥＺ  Ｌｏａｄ  １００  ｂｐ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いた。泳動後、SYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン社製）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片（ＲＰＢ２遺伝子断片）の有無を確認した。
配列番号１及び２に示すプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲルの電気泳動図を図６及び図７に、配列番号３及び４に示すプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲルの電気泳動図を図８及び図９に示す。図６は、左からアニーリング温度５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃を示す。図７は左からアニーリング温度６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃のＰＣＲ反応の電気泳動結果を示す。図８は左からアニーリング温度５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃を示す。図９は左からアニーリング温度６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃のＰＣＲ反応の電気泳動結果を示す。なお、各図中のレーン番号は、表４のレーン番号に対応する。
【００９８】
配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドからなるペニシリウム・ラピドサム検出用プライマー対を用いたＰＣＲの結果、５５℃から６４℃のアニーリング温度のすべてで、ペニシリウム・ラピドサムのゲノムＤＮＡを鋳型とした試料のみに特異的なバンドが確認された（図６、７のレーン１）。
また、配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドからなるペニシリウム・ブレフェルディアナム検出用プライマー対を用いたＰＣＲの結果、５５℃から６４℃のアニーリング温度のすべてで、ペニシリウム・ブレフェルディアナムのゲノムＤＮＡを鋳型とした試料のみに特異的なバンドが確認された（図８、９のレーン５）。
【図１】
0005956389.tif 000008
【図２】
0005956389.tif 000009
【図３】
0005956389.tif 000010
【図４】
0005956389.tif 000011
【図５】
0005956389.tif 000012
【図６】
0005956389.tif 000013
【図７】
0005956389.tif 000014
【図８】
0005956389.tif 000015
【図９】
0005956389.tif 000016
【配列表】
0005956389000001.app