(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジルサルタンの有機アミンに対するモル比が２：1であり、有機アミンが、エタノールアミン及びコリンからなる群より選ばれる、アジルサルタン有機アミン塩。
【請求項２】
アジルサルタン有機アミンが錯体の形態で存在する、請求項１に記載のアジルサルタン有機アミン塩。
【請求項３】
構造が式（I）で表され、
0005981940.tif 000014
が、コリンのカチオンまたはH+と形成したエタノールアミンのカチオンである、請求項２に記載のアジルサルタン有機アミン塩。
【化７】
0005981940.tif 000015
【請求項４】
構造が式（III）で表される、請求項３に記載のアジルサルタン有機アミン塩。
【化９】
0005981940.tif 000016
【請求項５】
アジルサルタンの酸と有機アミンとをそれぞれアルコール有機溶媒に添加し、室温又は加熱下、無水条件下で反応させて、対応する塩を得ることを含み、アジルサルタンの酸の有機アミンに対するモル比が２：1である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジルサルタン有機アミン塩の製造方法。
【請求項６】
アジルサルタンの酸と有機アミンとをそれぞれアルコール有機溶媒に添加し、室温又は加熱下で対応する塩を得ることを含み、アジルサルタンの酸の有機アミンに対するモル比が２：1である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジルサルタン有機アミン塩の製造方法。
【請求項７】
アジルサルタンの酸とコリンアルコール溶液とをアルコールに添加することを含み、前記コリンアルコール溶液は45％濃度のコリンメタノール溶液であり、アジルサルタンのコリンに対するモル比は２：１である、請求項４に記載の式（III）で表されるアジルサルタン有機アミン塩の製造方法。
【請求項８】
アルコール有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールからなる群より選ばれる、請求項５又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
有効成分として、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジルサルタン有機アミン塩の治療的有効量及び製薬学的に許容される担体を含有する、高血圧症の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項１０】
抗高血圧症薬の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジルサルタン有機アミン塩又は請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジルサルタン有機アミン塩、その製造方法及びその治療的有効量を含有する医薬組成物、並びに抗高血圧症薬の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は一般的な循環器疾患であり、その主要な臨床的症状は動脈圧が持続性に上昇することであり、その動脈圧上昇は心臓、脳、腎臓やその他の重要臓器の病変部分で生じ、対応する結果を招く。中国は世界で高血圧症に悩まされる国のひとつである。過去数十年間に成人における高血圧症の推定症例数は、１９６０年の３０００万人から１９８０年の５９００万人に増加し、１９９１年には９４００万人に達した。現在ではこの数は２億人以上である。毎年死亡する３００万人の循環器疾患患者のうち、５０％は高血圧症と関連している。米国では成人の３分の１は高血圧症を患っている。有害反応の少ない効果的な抗高血圧症薬の開発は非常に急がれる。
【０００３】
薬物の作用機序によれば、従来の抗高血圧症薬は、中枢性抗高血圧症薬、自律神経節遮断薬、交感神経終末阻害薬、アドレナリン遮断薬、血管拡張薬、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ACEI）及びアンジオテンシン受容体遮断薬に分類することができる。レニン−アンジオテンシン系（RAS）は腎臓及び肝臓により分泌され、相互作用又は相互調節するホルモン又は前駆体の一群であり、レニン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンI（Ang
I）、アンジオテンシンII（Ang
II）、アンジオテンシン変換酵素（ACE）及びアンジオテンシン受容体などが含まれる。この中でAng IIは最も強い血管収縮物質のひとつであり、多くの生物活性を有している。
【０００４】
アジルサルタンメドキソミル（式Ａの構造）は武田薬品工業株式会社により開発された高血圧症治療用のアンジオテンシンII受容体遮断薬であり、アンジオテンシンII受容体遮断薬（サルタン）に属する。アジルサルタンメドキソミルカリウム塩（商品名Edarbi）はFDAに認可された。この薬物は経口薬であり、単独で使用することができ、又は高血圧症及び関連する合併症を治療するための他の抗高血圧症薬と併用することができる。アジルサルタンメドキソミルは血圧を低下させることにおいてより有意な効果を有する。ロサルタン及びオルメサルタンメドキソミルと比較して、アジルサルタンメドキソミルは血圧低下作用がより効率的である（非特許文献１）。アジルサルタンメドキソミルはプロドラッグであり、速やかにアジルサルタンに加水分解され、消化管において吸収される間に作用し始める。アジルサルタン（式Ｂの構造）は、化学名が1−［［2’−（4,5−ジヒドロ−5−オキソ−1,2,4−オキサジアゾール−3−イル）［1,1’−ビフェニル］−4−イル］メチル］−2−エトキシ−1H−ベンズイミダゾール−7−カルボン酸であり、血管平滑筋AT1受容体へのアンジオテンシンIIの結合を選択的に遮断し、生体内でアンジオテンシンIIの血管収縮作用を阻害することにより血圧を低下させる。
【０００５】
【化１】
0005981940.tif 000002
（式Ａ）
【０００６】
【化２】
0005981940.tif 000003
（式Ｂ）
【０００７】
EP1992110668（特許文献１）、US5243054A（特許文献２）及びUS20050187269（特許文献３）にはアジルサルタンとその類縁体の製造方法が開示されている。中国特許CN100503605C（特許文献４）にはアジルサルタンメドキソミルカリウム塩並びにその製造及び薬力学的効果が開示されている。WO2010075347（特許文献５）にはアジルサルタンメドキソミル及びアジルサルタンメドキソミルカリウム塩の薬学的応用及び薬理学的活性が開示されている。CN101381366B（特許文献６）にはアジルサルタン及びアジルサルタンメドキソミルカリウム塩が開示されている。
【０００８】
しかしながらその後の研究により、直接的な有効成分であるアジルサルタンの分子構造中にはカルボキシル基が存在することにより生体内での吸収性が低く、このことがこの薬物の有効性に影響を及ぼし、医薬剤形へと調製することが容易ではないことが示されている。アジルサルタンの生物学的利用率を改善するため、化学修飾によりアジルサルタンをエステル、例えばアジルサルタンメドキソミルへと調製するが、生物学的利用率は依然として満足できるものではない。また係る修飾によりアジルサルタンのエステルの分子構造は複雑となり、合成上の困難性や製造コストが増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】EP1992110668
【特許文献２】US5243054A
【特許文献３】US20050187269
【特許文献４】CN100503605C
【特許文献５】WO2010075347
【特許文献６】CN101381366B
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】White WB. Effects of the angiotensin receptor blocker azilsartan medoxomilversus olmesartan and valsartan on ambulatory and clinic blood pressure inpatients with stages 1 and hypertension [J]. Hypertension, 2011, 57(3):413-420.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
研究によると、本発明はアジルサルタンと有機アミンとにより形成される塩がより良好な薬物動態特性、より高い生物学的利用率及びより低い薬物毒性を有し、またこの塩が通常の製造プロセスにより適していることが示される。
【００１２】
本発明の目的は、アジルサルタンの有機アミンに対する比がm：1であり、mは2〜10から選ばれる整数であり、好ましくは、mは2であるアジルサルタン有機アミン塩の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
好ましくは、ジルサルタン有機アミン塩は単一分子又は錯体の形態で存在する。当該錯体の形態は当業者に周知の分子状態であり、例えば水素結合型、イオン結合型、電荷移動型及びファンデルワールス型を含む分子間力により形成される錯体（複合体）；非共有結合により形成される錯体状態；及び共有結合により形成される共有結合性抱合体などの分子間相互作用力により形成される結合状態を一般に指すが、これらに限定されない。
【００１４】
好ましくは、前記有機アミンは、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ピペラジン、ジベンジルエチレンジアミン、メグルミン、トロメタミン、テトラメチル第４級アンモニウム、テトラエチル第４級アンモニウム及びコリンからなる群より選ばれる。
【００１５】
好ましくは、前記アジルサルタン有機アミン塩は式（I）又は（II）で表される構造を有し、ここでMは、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ピペラジン、ジベンジルエチレンジアミン、メグルミン、トロメタミン、テトラメチル第４級アンモニウム、テトラエチル第４級アンモニウム及びコリンからなる群より選ばれる有機アミンである。
【００１６】
【化３】
0005981940.tif 000004
【００１７】
【化４】
0005981940.tif 000005
【００１８】
（nは1より大きい整数である。）
【００１９】
好ましくは、前記アジルサルタン有機アミン塩の構造は、式（III）又は（IV）として表される：
【００２０】
【化５】
0005981940.tif 000006
【００２１】
【化６】
0005981940.tif 000007
【００２２】
（nは1より大きい整数である。）
【００２３】
また本発明は上記化合物の製造方法を提供する。当該方法はアジルサルタンの酸性型と有機アミンとをそれぞれアルコール有機溶媒に添加し、室温又は加熱下で対応する塩を得ることを含み、好ましくは、前記方法は無水条件下で反応させる。
【００２４】
有機アミンがコリンである場合、コリンアルコール溶液は、好ましくは、対応するアジルサルタンコリン塩を製造するときに添加し、より好ましくは、当該コリンアルコール溶液濃度は45％であり、さらに好ましくは、当該アジルサルタンのコリンに対するモル比は1：1〜2：1である。
【００２５】
有機アミンがメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ピペラジン、ジベンジルエチレンジアミン、メグルミン、トロメタミン、テトラメチル第４級アンモニウム及びテトラエチル第４級アンモニウムからなる群より選ばれる場合、好ましくは、対応するアジルサルタン有機アミン塩を製造する場合、アルコール有機溶媒中におけるアジルサルタンの有機アミンに対するモル比は2：1である。
【００２６】
前記アルコール有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールからなる群より選ばれる。
【００２７】
また本発明は、有効成分としてアジルサルタン有機アミン塩の治療的有効量及び製薬学的に許容される担体を含有する、高血圧症の治療に使用するための医薬組成物を提供する。
【００２８】
さらに本発明は、抗高血圧症薬の製造におけるアジルサルタン有機アミン塩及びその医薬組成物の使用を提供する。
【００２９】
医薬組成物の製造プロセスにおいて、商業化が可能な製造方法の観点のみならず、有効成分を含有する医薬品剤形の製造の観点においても、薬物を適切な使いやすい剤形に調製することは重要である。
【００３０】
さらに、患者に投与した後、信頼性があり、再現性があり、かつ一定の薬物血漿濃度曲線を提供することは重要である。
【００３１】
他の重要な要素としては、有効成分の化学的耐久性、固体安定性及び保管寿命がある。薬物及び薬物を含む組成物は、それらの有効成分の化学組成、密度、吸湿性及び溶解性などの物理的及び化学的性質に明らかな変化がなく、比較的長期にわたり保存できることが望ましい。
【００３２】
さらに、薬物をできるだけ純粋に提供することも重要である。
【００３３】
一般的に、薬物が安定型で得られる場合、当該薬物は下記の利点を提供する：すなわち、簡便な取り扱い、適切な薬物剤形への製造の容易さ及び信頼できる溶解性を有することであり、当業者はこれらを理解する。
【００３４】
有効成分の有効量は有効無毒性投与量を意味し、好ましくは総重量について0.001〜100
mg/kgの範囲から選ばれ、より好ましくは0.001〜50
mg/kgの範囲から選ばれる。アジルサルタン有機アミン塩を必要とする患者を治療する場合、投与経路は、好ましくは経口又は局所投与型、直腸投与型、経皮投与型、注射剤及び連続点滴を含む非経口である。ヒトへの投与のための経口投与単位は、好ましくは0.05〜3500
mgの有効成分を含有し、最も好ましくは0.5〜1000
mgの有効成分を含有する。より低用量での経口投与がより好ましい。しかしながら、患者にとって安全であり、かつ簡便であれば、高用量での非経口投与も用いることができる。上記の投与量は、遊離酸として計算される有効成分の好ましい量と関連する。
【００３５】
当業者であれば、個々の患者に対する有効成分の投与単位の最適量及び最適期は、疾患の性質や程度、投与型、投与経路及び投与部位並びに治療する個々の患者の状態に依存し、係る最適量や最適期は通常の技術により決定することができるということを理解する。また当業者であれば、最適の治療過程、すなわち規定された日数に対する有効成分の１日当たりの投与回数は、通常の検査により当業者によって確定することができるということを理解する。
【００３６】
本発明の化合物は経口又は非経口で投与することができ、異なる投与経路で使用するために錠剤、丸薬、粉剤及び顆粒剤に調製することができる。これらの固形製剤において、有効成分は少なくとも１種類の不活性希釈剤と混合される。通常の操作によれば、経口製剤は不活性希釈剤に加えて潤滑剤、流動促進剤及び抗酸化剤などの他の物質も含有する。カプセル剤、錠剤及び丸薬の場合、製剤は緩衝剤を含有する。また錠剤及び丸薬は、徐放投与型とすることもできる。
【００３７】
非水乳剤を用いることができるが、本発明の非経口製剤は無菌水溶液を含む。またこれらの製剤は、防腐剤、湿潤剤、浸透剤、緩衝剤、乳化剤及び分散剤である補助剤を含有する。組成物は、細菌保持フィルター、滅菌剤、放射線又は加熱により滅菌される。
【発明の効果】
【００３８】
アジルサルタンとそのエステルを比較すると、本発明のアジルサルタン有機アミン塩は主に下記の利点を有する：
（１）通常の溶媒における本発明の塩の溶解性は著しく増大し、通常の製剤への調製に適している。
（２）本発明の塩は優れた製剤適用有用性を有する。
（３）本発明の塩は優れた生物学的利用率及び優れた治療効果を有する。
（４）本発明の塩は低毒性である。
（５）発明の塩の製造方法は、高収率、高純度、迅速性、簡便性及び低価格という利点を有する。ここで、エタノールアミン塩及びコリン塩は工程経路においてより有利であり、結晶形に直接沈澱させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例２で調製された化合物（Ａ）3.0 mg/kg及びアジルサルタンメドキソミル（Ｂ）3.58 mg/kgを投与後のラットにおけるアジルサルタンの曝露量を示す図である。
【図２】実施例２で調製された化合物（Ａ）3.0 mg/kg及びアジルサルタンメドキソミル（Ｂ）3.58 mg/kgを投与後のラットにおけるM1の曝露量を示す図である。
【図３】実施例２で調製された化合物（Ａ）3.0 mg/kg及びアジルサルタンメドキソミル（Ｂ）3.58 mg/kgを投与後のラットにおけるM2の曝露量を示す図である。
【図４】実施例２で調製された化合物を２週間連続して投与した後の、SHRラットの血圧への影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４０】
アジルサルタンとコリンとをモル比1：1で塩化した。
アジルサルタン（20.00 g、0.0439 mol）をメタノール（600.0 mL）に添加した。この溶液に46％のコリン水溶液（11.80 g、0.0439 mol）を加え、澄明になるまで撹拌した。この反応混合物を減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテル（100.0
mL）を加え、混合物を撹拌し結晶化させた。真空下での濾過及び乾燥後、白色固体18 gを得た。
1H
NMR (DMSO-d6) δ: 1.32 (t, 3H, CH3), 3.30 (s, 9H), 3.43 (t, 2H, CH2),
3.97 (t, 2H, CH2), 4.29 (q, 2H, CH2), 5.46 (s, 2H, CH2),
7.29~7.87 (m, 11H), 11.21(br, 2H, NH, OH).
元素分析（％）：C, 64.30；H, 6.02；N,
12.49.
【実施例２】
【００４１】
アジルサルタンとコリンとをモル比2：1で塩化した。
アジルサルタン（10.00 g、0.022 mol）とエタノール（100.0 mL）とを反応フラスコに加え、加熱還流した。この混合物に45％コリン−メタノール溶液（5.90
g、0.022 mol）を添加し、溶液が澄明な溶液になった後、同一温度で3時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、撹拌して結晶化させた。真空下での濾過及び乾燥後、白色固体6.80 gを得た。
1H
NMR (DMSO-d6) δ: 1.38 (t, 6H, CH3), 3.09 (s, 9H), 3.39 (t, 2H, CH2),
3.82 (t, 2H, CH2), 4.58 (q, 4H, CH2)，5.69 (s, 4H, CH2), 7.05~7.61 (m, 22H),
11.07(br, 4H, NH, OH, CO2H).
元素分析（％）：C, 65.22；H, 5.42；N,
12.23.
【実施例３】
【００４２】
アジルサルタンとエタノールアミンとをモル比1：1で塩化した。
アジルサルタン（10.00 g、0.0219 mol）をメタノール（300.0 mL）に添加した。この溶液にエタノールアミン（1.34 g、0.0219 mol）を加え、澄明になるまで撹拌した。この反応混合物を減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテル（100 mL）を加え、混合物を撹拌し結晶化させた。真空下での濾過及び乾燥後、白色固体10.30 gを得た。
1H
NMR (DMSO-d6) δ: 1.30 (t, 3H, CH3), 3.52 (t, 2H, CH2),
4.27 (t, 2H, CH2), 4.29 (q, 2H, CH2), 5.52 (s, 2H, CH2),
7.26〜7.89 (m, 11H), 11.32 (br, 5H, NH, OH, NH3).
元素分析（％）：C, 62.59；H,
5.32；N, 13.54.
【実施例４】
【００４３】
アジルサルタンとエタノールアミンとをモル比2：1で塩化した。
アジルサルタン（10.00 g、0.0219 mol）をメタノール（300.0 mL）に添加した。この溶液にエタノールアミン（0.67g、0.0110mol）を加え、澄明になるまで撹拌した。この反応混合物を減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテル（100 mL）を加え、混合物を撹拌し結晶化させた。真空下での濾過及び乾燥後、白色固体8.93 gを得た。
1H
NMR (DMSO-d6) δ: 1.33 (t, 6H, CH3), 3.09 (t, 2H, CH2),
3.60 (t, 2H, CH2), 4.30 (q, 4H, CH2), 5.46 (s, 4H, CH2),
7.28~7.93 (m, 22H), 11.0~13.0 (br, 7H, NH, CO2H, OH).
元素分析（％）：C, 64.07；H,
4.79；N, 13.12.
【実施例５】
【００４４】
アジルサルタンとピペラジンとをモル比2：1で塩化した。
アジルサルタン（10.00 g、0.0219 mol）をメタノール（300.0 mL）に添加した。この溶液にピペラジン（0.94g、0.0109 mol）を加え、澄明になるまで撹拌した。この反応混合物を減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテル（100 mL）を加え、混合物を撹拌し結晶化させた。真空下での濾過及び乾燥後、白色固体9.45 gを得た。
1H
NMR (DMSO-d6) δ: 1.34 (t, 6H, CH3), 2.68 (s, 8H, CH2),
4.31 (q, 4H, CH2), 5.47 (s, 4H, CH2), 7.27~7.92 (m, 22H),
11.20 (br, 6H, NH, CO2H).
元素分析（％）：C, 64.79；H,
5.12；N, 14.15.
【試験例１】
【００４５】
溶解度試験
【００４６】
（表１）
0005981940.tif 000008
【００４７】
結論：実施例１の化合物の溶解度は、実施例２の化合物の溶解度に匹敵する。
【００４８】
さらに、「1：40」は1
gの試料が室温で40 mLのメタノールに溶解したことを指し、「1：80」も同様である。「1：120」は1 gの試料が室温で120 mLのメタノールに溶解したことを指し、「1：200」も同様である。
【試験例２】
【００４９】
吸湿性試験
［実験方法］
（１）乾燥させた栓付きのガラス秤量瓶（外径50 mm、高さ15 mm）を、前日に温度25℃±1℃及び相対湿度（RH）80％±2％の人口気候箱に入れた後、精秤した（m1）。
（２）試料を精秤し（m2）、秤量瓶に入れた。試料の厚さは約1 mmであった、
（３）栓のない秤量瓶とその栓とを、上記の一定の温度及び湿度条件に24時間置いた。
（４）秤量瓶に栓をし、精秤した（m3）。
計算式：重量増加率＝（m3−m2）／（m2−m1）×100％
（５）吸湿性による重量増加の定義
潮解：液体を生成するのに十分な水を吸収すること。
高吸湿性：吸湿性による重量増加が15％以上である。
吸湿性を有する：吸湿性による重量増加が2％〜15％である。
わずかに吸湿性：吸湿性による重量増加が0.2％〜2％である。
吸湿性がない又はほとんどない：吸湿性による重量増加が0.2％未満である。
（６）試験結果
【００５０】
（表２）
0005981940.tif 000009
【００５１】
結論：実施例２の化合物及び実施例４の化合物は両方とも吸湿性はなく、医薬製剤の製造に適しており、また製剤の安定性に対して好ましい。
【試験例３】
【００５２】
投与後のSDラットにおける薬物代謝試験
体重200〜250 gの12匹のSDラットを、無作為に各群6匹、雌雄半数ずつの２群に分けた。等モルである実施例２の化合物（コリンアジルサルタン）3 mg/kg又はアジルサルタンメドキソミル（Edarbiの原薬）3.58
mg/kgを成体ラットに強制経口投与した。血液0.5 mLを、投与前並びに投与後0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10、24及び48時間に眼窩より採取した。アジルサルタン（TAK-536）、M1（アジルサルタンの脱炭酸産物）及びM2（O−脱アルキル産物）の血漿中濃度を測定した。結果を下記の表３及び図１〜３に示す。
【００５３】
（表３）
0005981940.tif 000010
【００５４】
この結果より、等モルのアジルサルタンエステルを比較すると、血漿中のアジルサルタン酸のCmax及びAUCは実施例２の化合物を投与後それぞれ98％及び79％増となり、これらの差は統計学的に有意であることが示される。これより、アジルサルタン酸の暴露量は、アジルサルタンエステルをコリン塩に変更することにより大きく増大することが示される。
【試験例４】
【００５５】
SHRラットにおける降圧作用試験
38匹の25週齢SHRラットを初期血圧に従って無作為に４群に分け、対照群（溶媒）を6匹、また他の群を8匹とした。実施例２の化合物（コリンアジルサルタン）10 mg/kg、実施例４の化合物（アジルサルタンエタノールアミン塩）及び対照（アジルサルタンメドキソミルカリウム塩）をそれぞれ連続的に投与した。溶媒対照群には溶媒を投与した。投与量は5 mL/kg、また投与期間は２週間であった。
【００５６】
図４において、溶媒対照、実施例２の化合物及び実施例４の化合物は、１週間又は２週間連続的に投与後、SHRラットの血圧を有意に低下させることが示される。同一投与量で、実施例２の化合物の効果は最適であり、実施例４の化合物は効果が弱い。しかしこれら２つの化合物は、両方とも対照より抗高血圧作用が優れている。
【試験例５】
【００５７】
アンジオテンシンII誘発高血圧ラットに対する効果
［１］実験機器及びその他の材料
（１）機器
DSI遠隔検知圧力測定システム
埋込型血圧計：TA11PA-C40、データサイエンスインターナショナル
血圧データ分析ソフトウェア：ポネマ（Ponemah）ソフトウェア5.0、データサイエンスインターナショナル
アルゼット（Alzet）微小浸透圧ポンプ：アルゼット、モデル2002、米国アルゼット
（２）試験試料及び試薬
試験試料番号：HS-10149（実施例２の化合物）；バッチ：20110324；JIANGSU
HANSOH製薬株式会社から提供された。純度：99.5％；物理的状態：白色粉末；保存条件：密封、4〜8℃、乾燥、遮光
溶媒：セオラス（Ceolus）；バッチ：B063；物理的状態：白色粉末；保存条件：密封、室温、乾燥
アンジオテンシンII：バッチ：041M5062V；純度：93％以上；保存条件：−20℃、遮光；供給業者：シグマ−アルドリッチ株式会社
【００５８】
［２］化合物の調製
（１）アンジオテンシンII
アンジオテンシンIIの投与量は文献に従って決定した（当該文献：Harrison-Bernard LM, Zhuo J, Kobori H,
Ohishi M, Navar LG. Intrarenal AT (1) receptor and ACE binding in ANG
II-induced hypertensive rats. Am J Physiol Renal Physiol. 2002 Jan; 282(1): F19-25;
Diz DI, Baer PG, Nasjletti A.Angiotensin II-induced hypertension in the rat.
Effects on the plasma concentration, renal excretion, and tissue release of
prostaglandins. J Clin Invest. 1983 Aug; 72(2): 466-77.）。アンジオテンシンIIは精秤し、滅菌生理食塩水に加えて14.4 mg/mLとした後、清澄になるまで軽く混合し、−20℃、暗所で保存した。
（２）試験試料
HS-10149懸濁液：化合物を精秤し、2％セオラス懸濁液で希釈して0.20
mg/mL, 0.06 mg/mL及び0.02 mg/mLの勾配とした後、溶解するまで撹拌し、−4℃、暗所で保存した。試料は投与前に予め室温まで暖め、均一に混合した。
【００５９】
［３］実験動物
Sprague-Dawley系ラット37匹（上海SLAC実験動物株式会社）（雌性ラット17匹、雄性ラット20匹）、動物証明書番号：2007000524884、2007000525715、2007000526632。
【００６０】
［４］試験方法
（１）高血圧の誘導と埋込型血圧計の埋め込み
所要の重量（雌：230〜250 g、雄：200〜220 g）がある動物（ラット）を１週間の馴化後選別した。雄性ラットは、ケタミン（44 mg/kg、筋肉内投与）と2％ペントバルビタールナトリウム溶液（30 mg/kg、腹腔内投与）の併用麻酔を行ない、雌性ラットは2％ペントバルビタールナトリウム溶液（40 mg/kg、腹腔内投与）で麻酔した。埋込血圧計は第0日に埋め込み、微小浸透圧ポンプの埋め込み後第7日から血圧を24時間連続的に測定した。24時間中の平均収縮期血圧が140 mmHgになる動物を標準スクリーニング動物と見なした。条件を満たした動物を試験に使用し、条件を満たさない動物は除外した。
（２）群
条件を満たした動物を24時間中の平均収縮期血圧に基づいて、各群8匹、雌雄同数で群分けした。各群8匹の動物は統計的検定要件及び薬力学指針を満たしている。
（３）投与
群分け後、溶媒対照、低用量、中用量及び高用量投与群の動物に、2％セオラス、HS-10149の0.1 mg/kg、0.3 mg/kg及び1.0 mg/kgをそれぞれ投与した。投与時間は午前10時及び10時30分であり、投与体積は5 mL/kgであった。
【００６１】
（表４）
試験デザイン
0005981940.tif 000011
溶媒対照は2％セオラス懸濁液である。
【００６２】
（４）実験方法
第0日に健常動物に埋込血圧計を埋め込み、第８日に微小浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだ。血圧は第15日より24時間測定し、血圧条件を満たす動物を選別し試験に供した。比較対照薬又は試験試料は第16日の10時に単回投与し、血圧を投与後24時間測定した。動物は、試験終了時に過剰の二酸化炭素で殺処分した。
【００６３】
［５］データ処理と分析
データはDSI遠隔検知圧力測定システムにより５秒毎に自動的に記録した。ソフトウェアにより単位として１時間以内に計算された平均値を初期データと見なした。P<0.05は投薬群と溶媒対照群との間に有意差があることを示す。**P<0.05は投薬群と溶媒対照群との間に大きな有意差があることを示す。
【００６４】
［６］結果
（１）血圧上昇効果
アンジオテンシンIIを満たした微小浸透圧ポンプの埋め込み後第6日で、動物の自由行動下血圧を24時間測定した。平均収縮期血圧が24時間を通して140 mmHgになることが成功するモデルの標準である。条件を満たした動物を試験に使用し、条件を満たさない動物は除外した。5匹の動物（雄4匹と雌1匹）が本試験で除外された。条件を満たした動物の24時間中の平均収縮期血圧の平均値は167 mmHgであった。
【００６５】
（２）モデル動物の血圧に対するHS-10149の効果
データから、溶媒は動物の血圧レベルに影響しないことが示された。HS-10149の３投与群（0.1 mg/kg、0.3 mg/kg及び1.0 mg/kg）における動物の平均血圧（投与後23時間中の平均値）は、溶媒対照群の平均血圧に比較して著しく低下した（p<0.01）。平均低下率はそれぞれ24.7％、39.3％及び44.9％であった。HS-10149は投与量の範囲内で投与量と効果が正の相関関係を示した。投与前23、13及び3時間並びに投与後1時間では、試験群のすべての平均血圧は、群間で有意差を示さなかった（p>0.05）。溶媒群と比較すると、HS-10149の３投与量群（低用量、中用量及び高用量群）は投与後2、7、13、18及び23時間で高い有意差を示し（P<0.01）、HS-10149の３投与量群（低用量、中用量及び高用量群）の平均血圧は投与後23時間で大きく低下した。したがってHS-10149の効果は、投与後約23時間持続する
【００６６】
（表５）
投与前23時間中及び投与後23時間中の平均収縮期血圧の比較（平均±S.E.、N=8）
0005981940.tif 000012
*P<0.05、**P<0.01 対溶媒対照群
【００６７】
（表６）
0005981940.tif 000013
【００６８】
［７］結論
試験結果より、アンジオテンシンII誘発高血圧ラットモデルにおいてHS-10149は顕著な抗高血圧効果を示す。薬物効果と投与量は、0.1 mg/kgと1.0 mg/kgとの間で正の相関関係を示す。最小有効量は0.1 mg/kgであり、すべての投与量において投与後23時間で強い抗高血圧効果を示す。
【試験例６】
【００６９】
ビーグル犬における急性毒性試験
目的：
試験では、実施例２の化合物又はアジルサルタンメドキソミルカリウム塩をビーグル犬に胃内投与することにより動物の急性毒性反応を観察するため概算致死量法を導入し、実施例２の化合物の投与後の毒性状況を検討して、実施例２の化合物とアジルサルタンメドキソミルカリウム塩の毒性を比較した。この比較により、実施例２の化合物の毒性評価について参照位置が与えられる。
【００７０】
方法（概算致死量法）：
6匹のビーグル犬を、実施例２の化合物群とアジルサルタンメドキソミルカリウム塩群とに3匹ずつ使用した。投与量はそれぞれ0.09、0.13、0.19、0.28、0.42、0.63、0.95、1.42、2.13及び3.20 g&middot;kg-1とした。ここで3.20 g&middot;kg-1は最高投与量であり、臨床患者に対する投与量の1081倍に相当した。付随する生化学的指標を検査するため、投与前及び投与後第2、7及び24日に血液を採取した。投与前及び投与後第7及び24日に、心電図、体重及び体温を測定した。
【００７１】
結果：
（アジルサルタンメドキソミルカリウム塩群）3.20 g&middot;kg-1投与群において、動物は投与日に嘔吐、流涎、運動減少を示し、第2〜8日には運動量が低下し、第5〜8日には衰弱し、第9日に死亡した。2.13 g&middot;kg-1投与群において、動物は投与日に嘔吐、流涎、運動減少を示し、投与後第2日に運動量が低下し、第3日には運動量が回復して、第3日以降は異常は観察されなかった。1.42 g&middot;kg-1投与群において、動物は投与日に嘔吐、運動減少を示し、投与後第2日に運動量が低下し、第3日には運動量が回復して、第3日以降は異常は観察されなかった。
【００７２】
（実施例２の化合物群）3.20 g&middot;kg-1投与群において、動物は投与日から観察終了まで軟便、液状便、嘔吐を示し、投与後第2日に液状便、運動量の低下を示し、第3日には軟便を示し、第4日には運動量が回復し、また排泄物が正常に回復し、それ以降異常は観察されなかった。2.13 g&middot;kg-1投与群において、投与日には異常は観察されず、投与後第2日に動物は嘔吐、運動量の低下を示し、第3日には軟便及び運動量が回復し、第4日には排泄物が正常に回復し、第4日以降異常は観察されなかった。1.42 g&middot;kg-1投与群において、動物は投与日に液状便及び運動減少を示し、投与後第2日に運動量の低下を示し、第3日には運動量が正常に回復し、第3日以降異常は観察されなかった。
【００７３】
アジルサルタンメドキソミルカリウム塩及び実施例２の化合物を投与した群において、投与後第７日にはすべての動物の体重は投与前に比較して減少し、生存動物のすべては、投与後第14日には体重増加が始まった。
【００７４】
アジルサルタンメドキソミルカリウム塩及び実施例２の化合物の群において、投与後第７日にすべての動物の体温に異常は示されず、生存動物のすべては、投与後第14日には体温の異常を示さなかった。
【００７５】
アジルサルタンメドキソミルカリウム塩及び実施例２の化合物を投与した群において、動物のすべてが、投与後第7日で心電図及び血液学的指標に異常を示さなかった。また生存動物のすべてが、投与後第14日で異常な心電図及び血液学的指標を示さなかった。
【００７６】
アジルサルタンメドキソミルカリウム塩及び実施例２の化合物を投与した群において、5匹の動物の収縮期血圧及び拡張期血圧は、投与後第2日で程度の差はあるが低下した。また生存動物のすべてが、投与後第14日で異常な収縮期血圧及び拡張期血圧を示さなかった。
【００７７】
（アジルサルタンメドキソミルカリウム塩群）3.20 g&middot;kg-1を投与した犬は、投与後第2日及び第7日にALT、AST、CK、CRE、UREA及びUAの上昇が示され、第9日に死亡した。2.13 g&middot;kg-1を投与した犬のALT、CRE、UREA及びUAは投与後第2日で著しく上昇し、またALT、CK、CRE及びUAは第7日で著しく上昇し、第14日には正常に回復した。1.42 g&middot;kg-1を投与した犬のALT、CRE及びUAは投与後第2日で著しく上昇し、またCRE及びUAは第7日で著しく上昇し、第14日には正常に回復した。他の指標は明らかな異常を示さなかった。
【００７８】
（実施例２の化合物群）実施例２の化合物を投与したすべての犬は、投与後第2日にCRE、UREA及びUAが著しく上昇し、投与後第7日ではCREおよびUAが著しく上昇した。これらは第14日には正常に回復した。3.20
g&middot;kg-1を投与した犬のALTは第2日に上昇し、第7日に正常に回復した。他の指標は明らかな異常を示さなかった。
【００７９】
アジルサルタンメドキソミルカリウム塩及び実施例２の化合物を投与したすべての動物のPT値は、投与前に比較して投与後に著しく低下した。アジルサルタンメドキソミルカリウム塩の3.20 g&middot;kg-1投与群のFibは投与後第2日及び第7日に著しく上昇し、2.13 g&middot;kg-1投与群のFibは投与後第2日に著しく上昇した。実施例２の化合物の3.20 g&middot;kg-1投与群のFibは投与後第2日に著しく上昇した。他は明らかな異常を示さなかった。
【００８０】
（アジルサルタンメドキソミルカリウム塩群）3.20 g&middot;kg-1投与群の動物は投与後第9日に死亡した。動物の解剖所見において、排泄腔周辺部の汚れと血便があり；左肺葉は黒赤色を示したが、右肺葉は明らかな異常を示さず；胃底部に灰白色のイボ状突起が示され；空腸中央から結腸までの小腸内容物は赤褐色であり、腸管を下がるに伴い色調が濃くなり、粘膜には明らかな表在性びらんが認められ、腸管粘膜上には散発性の暗赤色領域が存在し；他の内臓は異常を示さなかった。3.20 g&middot;kg-1投与群の動物を第15日に解剖すると、胃の底部及び噴門部に赤点があり、胃粘膜は赤みを帯び、胃内には乳糜状食物が存在し；他の内臓は異常を示さなかった。1.42 g&middot;kg-1投与群の動物を第15日に解剖すると、胃粘膜上に散発性の暗赤色領域が存在し、胃内には少量の乳糜状食物が存在し；他の内臓は異常を示さなかった。
【００８１】
（実施例２の化合物群）3.20 g&middot;kg-1投与群の動物を第15日に解剖し、各組織をヘマトキシリン・エオシン（HE）染色して光学顕微鏡下で観察したが、動物は明らかな異常を示さなかった。2.13 g&middot;kg-1投与群の動物を第15日に解剖したところ、胃は満たされ、粒状食物を含み；心臓粘膜は赤みを帯び、散発性の赤点が見られ；他の内臓は異常を示さなかった。1.42 g&middot;kg-1投与群の動物を解剖したところ、胃は満たされ、粒状食物を含み；心臓粘膜は赤みを帯び、散発性の赤点が見られ；他の内臓は異常を示さなかった。
【００８２】
（アジルサルタンメドキソミルカリウム塩の3.20 g&middot;kg-1投与群の解剖学的観察記録）各組織をヘマトキシリン・エオシン（HE）染色して光学顕微鏡下で観察すると、肝臓は汎発性肝血洞拡張を示し、肝組織の一部は自己融解しており；脾臓の赤色髄及び白色髄中のリンパ球は著しく減少し、赤色髄中の線維組織が増生し；広範囲の肺組織は中程度のうっ血浮腫であり；腎組織はうっ血し、自己融解しており；胃の粘膜上皮は壊死しており、粘膜下層には浮腫があり；線維芽細胞繊が増生し、毛細血管の新生が認められ；十二指腸、空腸、回腸、結腸、盲腸及び直腸の粘膜上皮には局所的な壊死又はうっ血及び出血が認められた。
【００８３】
結論
実施例２の化合物又はアジルサルタンメドキソミルカリウム塩をビーグル犬に胃内投与する本実験の条件下で、実施例２の化合物の概算致死量は3.20 g&middot;kg-1を上回り、アジルサルタンメドキソミルカリウム塩の概算致死量は2.13〜3.20 g&middot;kg-1の範囲である。したがって、実施例２の化合物の急性毒性はアジルサルタンメドキソミルカリウム塩より低い。
【図１】
0005981940.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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