(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
振動反応を利用した測定を用いる高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法であって、
前記振動反応は、過酸化水素、前記ＨＤＬ及び前記ＬＤＬが混合された第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応であり、
前記ＨＤＬと前記ＬＤＬが混合された状態で濃度を変えて前記振動反応を利用した測定を複数回行い、各々において振動周期を求め、求めた振動周期の変化に基づき高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比を決定する、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法。
【請求項２】
前記第一の溶液は、前記過酸化水素水を０．５重量％以上１．０重量％以下の範囲で含む請求項１記載の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法。
【請求項３】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項１記載の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法。
【請求項４】
前記第二の溶液は、前記コレステロールオキシダーゼを０．００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項１記載の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法。
【請求項５】
前記第一の溶液において、前記リポタンパク質は、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれる請求項１記載の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法。
【請求項６】
過酸化水素、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が混合された第一の溶液を保持する第一の容器と、
カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を保持する第二の容器と、
前記第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、
前記第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、
前記酸素電極に接続される溶存酸素計と、
前記溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有し、
前記情報処理装置は、前記ＨＤＬと前記ＬＤＬが混合された状態で濃度を変えて前記振動反応を利用した測定を複数回行い、溶存酸素濃度を当該濃度を示した時刻データとともに順次記録していく溶存酸素データ取得手段と、
前記測定の各々において前記振動周期を求める周期判断手段と、
前記ＨＤＬと前記ＬＤＬの混合液の濃度と前記振動周期との関係を予め記憶してある周期−コレステロール濃度関係記録手段と、
求めた前記振動周期の変化に基づき高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比を決定するコレステロール定量手段と、を有する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比を決定する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポタンパク中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法及びそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、血清中ではアポタンパク質と結合し、リポタンパク質として存在している。リポタンパク質は物理的な形状の違いなどにより、カイロミクロン、低密度リポタンパク質（以下「ＬＤＬ」という。）、高密度リポタンパク質（以下「ＨＤＬ」という。）などに分類されている。ＬＤＬは動脈硬化を引き起こす物質の一つとして、一方ＨＤＬは抗動脈硬化作用を示す物質として注目されている。
【０００３】
これまでの各リポタンパク質中のコレステロールの定量としては、超遠心法、電気泳動法、換算法、分画沈殿法などがある。しかしながらこれらは簡便な方法としては適当ではない。
【０００４】
一方、コレステロールオキシダーゼ等の酵素を用いたコレステロールの定量法もあり、例えば、コレステロールオキシダーゼを用いてコレステロールを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それに基づいてコレステロールを定量する方法が下記特許文献１、２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２４３９７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１１８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記いずれの技術においても、コレステロールを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それからコレステロールを定量するという２段階以上の操作が必要となる。
【０００７】
以上本発明は、上記を鑑みコレステロールの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うこと、更には、リポタンパク質中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の重量濃度比を決定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は具体的に以下の手段を採用する。
【０００９】
上記課題を解決する第一の観点に係る本発明のリポタンパク質中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法は、振動反応を利用した測定を用いることを特徴の一つとする。これまでのコレステロールオキシダーゼを利用した方法では、生成した過酸化水素をカタラーゼで分解させ生成した酸素量を測定するなど最低２段階の操作を必要とした。しかし振動反応を利用したこの方法では酸素量の振動を測定するだけで定量化が可能となるだけでなく、リポタンパク質中における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比を決定することが出来るようになる。また少量の試料で測定が可能であるという利点もある。
【００１０】
また本観点において、限定されるわけではないが、振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応であることが好ましい。
【００１１】
また本観点において、限定されるわけではないが、振動反応を利用した測定を複数回行い、各々において振動周期を求め、求めた振動周期の変化に基づき高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比を決定することが好ましい。このようにすることで、振動周期の変化、具体的には傾きを求めることで、予め求めた変化−ＨＤＬとＬＤＬの濃度比に基づき、濃度比を決定することができる。
【００１２】
また本観点において、限定されるわけではないが、半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターであることが好ましい。
【００１３】
また本観点において、限定されるわけではないが、第一の溶液が過酸化水素水を０．５重量％以上１．０重量％以下の範囲で含むこと、第二の溶液がカタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むこと、コレステロールオキシダーゼを０．００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むことが好ましい。このような範囲とすることで、通常は非線形的な反応である振動反応が直線的な反応となり、しかもリポタンパク質の濃度比を定めることができるようになる。
【００１４】
また本観点において、限定されるわけではないが、第一の溶液において、リポタンパク質は、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。
【００１５】
また、本発明の第二の観点に係る高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比を決定する装置は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、第一の容器と第二の容器との間に配置され、第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、酸素電極に接続される溶存酸素計と、溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有する。
【発明の効果】
【００１６】
以上本発明によると、振動反応を用いて、その溶存酸素濃度を測ることで簡単にコレステロールの定量を行うことができるため、その他途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことができる。このコレステロールの定量法を利用して、ＨＤＬとＬＤＬの重量濃度比を決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施形態に係る振動反応の反応機構を示す図である。
【図２】実施形態に係る装置の概略図である。
【図３】実施形態に係る装置の他の一例の概略図である。
【図４】実施形態に係る装置における情報処理装置の機能ブロック図である。
【図５】実験例１における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図である。
【図６】実験例１におけるＨＤＬ、ＬＤＬ混合液の量と振動の周期の関係を示す図である。
【図７】実験例１におけるＨＤＬの重量比と振動の周期と希釈率の直線関係から求めた傾きとの関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について図面を用いて説明するが、本発明は多くの異なる態様による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例に限定されるものではない。
【００１９】
本実施形態に係るリポタンパク質中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度比の決定方法は（以下「本定量方法」ともいう。）は、振動反応を利用してなることを特徴の一つとする。具体的に説明すると、本定量方法は、過酸化水素水及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して浸透、混合させる方法であることが好ましい。リポタンパク質には上記のＨＤＬとＬＤＬが双方含まれる。
【００２０】
図１は、本実施形態に決定方法（以下「本方法」という。）の振動反応について説明するための図である。本図で示すとおり、まず、半透膜により区切られた容器内の空間の一方に過酸化水素水とリポタンパク質を含む第一の溶液を入れ、他方にカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを入れた第二の溶液を入れる。すると、第一の溶液における過酸化水素水はゆっくりと半透膜を透過して第二の溶液側に移動する。第二の溶液側では過酸化水素水がカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。そして酸素が発生するとコレステロールオキシダーゼがこの酵素を用いてリポタンパク質中のコレステロールを酸化し、過酸化水素水を発生させる。すなわち、この一連の流れが循環過程となり、その過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。そしてこの場合、第二の溶液中に溶存している酸素（以下「溶存酸素」という。）の濃度を測定すると、溶存酸素の濃度が周期的な振動を示す。そして、カタラーゼ等溶液中に存在する物質の濃度が好ましい範囲にある場合、振動周期がＨＤＬとＬＤＬ合計の濃度と直線関係となっており、更に、この直線の傾きを調べることで、ＨＤＬとＬＤＬの濃度比を決定することができる。即ち、この関係を用いてＨＤＬとＬＤＬの濃度比の決定が容易に可能となる。
【００２１】
本方法は、第一の溶液と第二の溶液との反応が十分進行し、周期的な振動となった期間における周期を測定する。そして、第一の溶液におけるリポタンパク質の濃度を変化させて複数回測定し、その直線の傾きを求める。そしてこの直線の傾きと、あらかじめ求めてある傾き−ＨＤＬとＬＤＬの濃度比の関係に基づきＨＤＬとＬＤＬの濃度比を求める。
【００２２】
周期については、様々な方法で求めることができ、限定されるわけではないが、本実施形態における反応においては周期的に溶存酸素のピークが現れるため（たとえば後述する実験例の図５参照。）、このピークの間隔がほぼ一定になったと思われる期間の周期又はその近傍の期間の平均を算出することで求めることができる。また、傾き−ＨＤＬとＬＤＬの濃度比の関係は、傾きに基づきＨＤＬとＬＤＬの濃度比が分かるものであれば限定されるわけではないが、たとえば検量線であってもよく、データのテーブルであってもよい。また、限定されるわけではないが、この関係は、第一および第二の溶液におけるカタラーゼ、コレステロールオキシダーゼの濃度の少なくともいずれかに応じて複数設けられていることが精度を向上させる点においてより好ましい。
【００２３】
第一の溶液において、過酸化水素水の濃度は、０．５重量％以上１．０重量％以下の範囲で含むことが好ましい。この範囲内にすることで、振動反応の周期をより規則的にすることができるとともに、一般的な溶存酸素計の測定可能範囲に収めることができる。また、コレステロールの濃度は、測定対象であって、限定されるわけではないが、概ね、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内である。仮に、測定時において測定対象となるコレステロールの濃度測定の結果において疑問が生じる場合、第一の溶液における溶媒の増量または減量を行って希釈又は濃縮し、コレステロールの濃度を変化させ、測定後この補正を行うことが好ましい。なおここで第一の溶液における溶媒としては、限定されるわけではないが水であることが好ましい。
【００２４】
第二の溶液において、カタラーゼの濃度は、限定されるわけではないが、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ以上０．５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲である。また第二の溶液におけるコレステロールエステラーゼの濃度は、上記好ましい過酸化水素水の濃度範囲０．００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０１ｍｇ／ｍｌである。カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度を上記望ましい範囲とすると、通常非線形的な反応である振動反応がコレステロールの濃度と直線関係となるため精度が向上する。なお、第二の溶液における溶媒としては、振動反応が可能である限りにおいて限定されるわけではないが水であることが好ましい。
【００２５】
ここで図２に、本実施形態に係る高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）中と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）中の濃度比の決定方法を実現する定量装置（以下「定量装置」という。）の概略図を示す。図２で示すとおり、本定量装置は、第一の容器１と、第二の容器２と、第一および第二の容器を接続する接続管３と、第一の容器及び第二の容器を仕切る半透膜４とを有している。また、本定量装置は、第一の容器１及び第二の容器２に第一の溶液及び第二の溶液がそれぞれ充填され、振動反応が開始された場合にこの振動反応において存在する溶存酸素を測定するための酸素電極５及びこの酸素電極５に接続された溶存酸素計６と、溶存酸素計に接続された情報処理装置７と、を有して構成されている。
【００２６】
本実施形態における第一の容器１、第二の容器２としては、第一および第二の溶液それぞれとは反応せず、それぞれ安定に保持することができる限りにおいて限定されないが、たとえばガラスであることが好ましい。なお、本実施形態においては、第一の容器１と第二の容器２とを別の容器とし、接続管３で接続する構成としているが、たとえば図３で示すような構成とすることも可能である。図３では、一つの容器を穴のあいた仕切り板で仕切り、仕切り板の穴を半透膜４で覆う構成としている。この結果、図３における定量装置においても第一の容器１と、第二の容器２と、第一および第二の容器を仕切る半透膜４と、を有すると表現することができる。
【００２７】
半透膜４は、溶液における一部の成分は通すが他の成分は通さない性質を有する膜であって、限定されるわけではないが、透析膜、ミリポアフィルターの少なくともいずれかであることが好ましい。なお透析膜の場合、限定されるわけではないがセルロースが好ましい。
【００２８】
酸素電極５は、溶存酸素を測定するために用いられるものであり、第二の溶液側に配置される。酸素電極５は、この電極上で溶存酸素が還元されて水になるときに発生する電子の量に応じ電位を発生させる。酸素電極５の構成は特に限定されず、一般に市販されている周知の酸素電極を用いることができる。
【００２９】
溶存酸素計６は、酸素電極５からの電位の発生を受け、溶存酸素の量を算出するものであり、この機能を有する限りにおいて限定はなく、一般に市販されている周知のものを採用することができる。
【００３０】
情報処理装置７は、溶存酸素計６からの出力を受け、その出力から振動反応の周期を求め、この周期とあらかじめ求めてある周期−コレステロール濃度の関係とを参照し、コレステロールの濃度を算出（定量）する。
【００３１】
情報処理装置７としては、上記機能を奏する限りにおいて限定されるわけではないが、コンピュータのハードディスクなどの記録媒体に記録されたプログラムを実行することで実現できる。図４に、プログラムが実行された場合における情報処理装置７の機能ブロック図を示す。
【００３２】
図４で示すとおり、本情報処理装置７は、プログラムの実行により、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を、その濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに順次記録していく溶存酸素データ取得手段７０１と、時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、コレステロールの濃度と振動反応の周期との関係をあらかじめ記憶してある周期−コレステロール濃度関係記憶手段７０３と、振動反応の周期とコレステロールの濃度と振動反応の周期との関係に基づいてコレステロールの定量を行うコレステロール定量手段７０４と、して機能する。なおこの場合において、上述のように、コレステロールの濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやコレステロールオキシダーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なってくるため、周期−コレステロール濃度関係記憶手段７０３は、測定における条件の入力を受付、記憶する機能も有すること、更には、その入力に対応する条件に合致した振動の周期とコレステロールの濃度との関係を読み出せるようにすることが望ましい（もちろん、予め当該条件における関係を記憶しておくことが必要である）。これにより、情報処理装置７は、コレステロール定量装置となる。
【００３３】
（実験例１）
ここで、実際に検量線の作成を行い、上記実施形態に係る方法の有用性について確認した。以下、詳細に説明する。
【００３４】
まず、図２で示す装置を用いた。第一の容器１、第二の容器２及び接続管３はいずれもガラス製の円筒状のものを用い、第一の容器１及び第二の容器２の内径は３ｃｍ、接続管３の内径は１ｃｍとした。半透膜４としては、αセルロース（分画分子量１２，０００〜１４，０００）の透析膜を用いた。
【００３５】
そして、上記第一の容器１には、０．６重量％の過酸化水素水を２０ｍｌ、ＨＤＬとＬＤＬを１：９の重量比で混合した溶液を０．０２〜０．１ｍｌを入れ最終的に２０．１ｍｌになるように水を加えた。第二の容器には、カタラーゼ２．０ｍｇ、コレステロールオキシダーゼ０．１ｍｇを含む水溶液２５ｍｌを入れた。なお、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表１に示す５種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。
【表１】
0005846625.tif 000002
【００３６】
この結果の振動反応の周期を表１の右列に、図５に、表１における試料溶液番号４の溶存酸素量の時間変化を、図６に、加えたＨＤＬ、ＬＤＬ混合液の量に対する周期の関係を示す。なお図５中、横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示している。図６は、ＨＤＬ、ＬＤＬ混合液の量と振動の周期の関係を示しておく。
【００３７】
この結果、振動の周期と加えたＨＤＬ、ＬＤＬ混合液の量との関係が直線によって非常によく説明できることが確認できた。
【００３８】
次に、ＨＤＬとＬＤＬの混合液におけるＨＤＬの重量比（ＬＤＬの重量比）を変化させるとともに、上記のようにＨＤＬ、ＬＤＬの混合液の合計量も異ならせてそれぞれの直線の傾きについて確認した。このＨＤＬの重量％と直線の傾きについて下記表２に示す。なお図６は、下記表２の結果を図にしたものである。
【表２】
0005846625.tif 000003
【００３９】
本図において、横軸はＨＤＬ、ＬＤＬ混合液における重量％（ＨＤＬ、ＬＤＬ全体の重量を１とした）、縦軸は直線から求めた傾きの値である。両者の間に直線関係があることがわかる。これを検量線としてＨＤＬ、ＬＤＬ両方を含むいろいろな量の試料溶液の振動反応の周期を測定し、混合液の量と周期の関係をプロットし、その直線の傾きを求めて、検量線から相当するＨＤＬ／ＬＤＬの重量濃度比を求めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、リポタンパク質の重量比の決定方法、及びその装置として産業上の利用可能性がある。
【符号の説明】
【００４１】
１…第一の容器、２…第二の容器、３…連絡管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置
【図１】
0005846625.tif 000004
【図２】
0005846625.tif 000005
【図３】
0005846625.tif 000006
【図４】
0005846625.tif 000007
【図５】
0005846625.tif 000008
【図６】
0005846625.tif 000009
【図７】
0005846625.tif 000010