(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アンドロゲン剤を製造するためのラクトフェリンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アンドロゲン剤、及びこの抗アンドロゲン剤を有効成分として含有する皮脂分泌抑制剤、養毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのステロイドホルモンは産生臓器から分泌された分子型で受容体と結合してその作用を発現するが、アンドロゲンと総称される男性ホルモンの場合、たとえばテストステロンは脳下垂体、副腎、睾丸等で生成され、標的臓器の細胞内に入ってテストステロン５α−リダクターゼにより５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に還元されてから受容体と結合し、アンドロゲンとしての作用を発現する。
【０００３】
アンドロゲンは重要なホルモンではあるが、それが過度に作用すると男性型禿頭、多毛症、脂漏症、ざ瘡、前立腺肥大症、前立腺腫瘍、男児性早熟等、様々な好ましくない症状を誘発する。そこで、過剰のアンドロゲンの作用を抑制することによりこれら好ましくない症状を改善することが考えられるが、その手段としては、テストステロンを活性型のＤＨＴに還元するテストステロン５α−リダクターゼの作用を阻害することにより活性なＤＨＴを生じるのを抑制する方法と、テストステロンから生じたＤＨＴが受容体と結合するのを阻害することにより作用を発現させない方法とが有り得る。
【０００４】
そこで、今回、テストステロン５α−リダクターゼ阻害試験、アンドロゲン受容体結合阻害試験、更には培養ハムスター皮脂腺細胞を用いた皮脂腺機能抑制評価法により、幾つかの天然素材についてスクリーニングを行った結果、哺乳動物の乳・涙・唾液・胆汁などの分泌物中に存在するラクトフェリンが高い抗アンドロゲン作用を有し、皮脂分泌を抑制する可能性が見い出された。
【０００５】
従来から、ラクトフェリンに関しては、種々の研究がなされている。それらの結果から、ラクトフェリンには、ブドウ球菌・大腸菌からキレート作用により鉄分を奪い、菌やウイルスの繁殖を抑制する；乳酸菌やビフィズス菌などの善玉菌を増やす；鉄分の吸収を高め貧血を防ぐ；ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞を活性化させ、免疫力を高める；生理痛を軽減し、骨粗鬆症を防ぎ、気分を落ち着かせる；T細胞に働きかけてIgE抗体を低下させ、肥満細胞からのヒスタミン産生を減らし、花粉症などのアレルギー症状を緩和する；口内炎、口臭や水虫などを改善する；C型肝炎に対する血清「インターロイキン-18」を上昇させる；粘膜を保護し、ドライアイやドライマウスなどの症状を緩和する；発がん性物質の生成を抑え、肝臓がんや大腸がんなどのがんを防ぐ；トキソプラズマなどの原虫の繁殖抑制；内臓脂肪を減らすなどの様々な作用が知られている。  
【０００６】
このラクトフェリンの安全性に関しては、現状では充分なデータがないが、一部では妊産婦の過剰摂取は避けるべきとの意見もあるが、母乳や牛乳に多く含まれる成分であり、人体に悪影響を及ぼす可能性は少ないと考えられている。
【０００７】
さらに、このラクトフェリンの種類に関しては、牛乳に含まれるのは牛ラクトフェリンであり、人の体内にあるのは人ラクトフェリンであり、別種であるが、牛ラクトフェリンを人が摂取するとその人の血液中の人ラクトフェリンが増加する。この機序はいまだ不明である。ラクトフェリンは消化酵素に比較的耐性があり分解されにくいが、消化酵素により大きな塊に分解されたラクトフェリンから抗菌作用の強いラクトフェリシンが生成されるのでこれとこの機序は関係があると考えられている。
【０００８】
これらのラクトフェリンの研究の中で、具体的には以下のような文献が挙げられる。
特許文献１は、ざ瘡治療に関する文献で、請求項に「ざ瘡の治療に対する経口的な組成物を調製するための、ラクトフェリンを含んでなる乳漿タンパク質画分の使用」と記載されている。しかしその作用メカニズムに関しての詳細な記載はない。
特許文献２、３、４、５は、抗炎症、皮脂調節、抗菌活性およびβディフェンシン（抗菌ペプチド）産生促進に起因するざ瘡治療に関する文献である。特許文献３には、「加水分解乳タンパク質はこれまで毛髪および皮膚の状態を改善する際の使用が知られていた。この物質は乾燥肌での皮脂の流れを改善し、脂性肌での過剰な皮脂産生を低減させる皮脂調節剤として使用できる。」と記載されている。しかしながらラクトフェリンに関する記載は無い。特許文献６はラクトフェリンの抗酸化活性に起因する抗脱毛効果に関する文献であり、頭皮表面で生じた酸化ストレスが毛包に与える悪影響を軽減するという内容であるが、ラクトフェリンの抗アンドロゲン作用に関する記載はない。特許文献７はラクトフェリンの抗炎症活性に起因する頻尿および前立腺肥大の改善に関する文献であり、尿路を圧迫する炎症を鎮静化し、排尿を容易にするという内容であり、抗アンドロゲン作用に関する記載は無い。非特許文献１は、ラクトフェリンの皮脂に対する効果に言及しているが、その詳細な内容については具体的な開示がない。
【０００９】
このように、従来技術では、ラクトフェリンのざ瘡治療（経口）、皮脂漏症（塗布）、抗脱毛（塗布）、頻尿改善効果（経口）、または加水分解乳タンパク質の皮脂調節によるざ瘡治療という内容が開示されているが、ラクトフェリンの作用機序という観点からはラクトフェリンの抗アンドロゲン作用に言及した文献は存在してない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００８−５３３１３４号公報
【特許文献２】特表２００８−５０１７７２号公報
【特許文献３】特表２００７−５２３１３７号公報
【特許文献４】特表２００３−８９６２９号公報
【特許文献５】ＷＯ２００５−０７７３４９
【特許文献６】特開２００７−２２９２３号公報
【特許文献７】特開２００６−２０６５４７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】“Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｒａｖｅｎｔｉｎ”  ＤＭＶ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、高い抗アンドロゲン作用を有し、副作用が無く安全性にも優れる抗アンドロゲン剤を提供すること、及びこの抗アンドロゲン剤を有効成分として含有する皮脂分泌抑制剤、養毛剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するためにいくつかの天然素材についてスクリーニングを行った結果、哺乳動物の乳・涙・唾液・胆汁などの分泌物中に存在するラクトフェリンが高い抗アンドロゲン作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、ラクトフェリンを含有することを特徴とする抗アンドロゲン剤、に関する。
本発明は、上記の抗アンドロゲン剤を有効成分として配合することを特徴とする皮脂分泌抑制剤、に関する。
本発明は、上記の抗アンドロゲン剤を有効成分として配合することを特徴とする養毛剤、に関する。
本発明は、ラクトフェリンを有効成分とする抗アンドロゲン剤を含有する飲食品に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、含そう剤、吸入剤、トローチ剤などの製剤として、また、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミ・ゼリー、ビスケット、チョコレート等の菓子、シャーベット、飲料等の食品として日常的に利用、摂取することが可能であり、男性型脱毛症・粗毛などの毛髪疾患、前立腺肥大・前立腺腫瘍等の疾患、過剰な皮脂分泌が原因とされる尋常性ざ瘡・脂漏等の皮膚疾患の予防ないし治療に有効である。さらに、本発明の抗アンドロゲン剤は、その効力が極めて高く、かつ副作用が無く安全性にも極めて優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】テストステロン５α−リダクターゼ阻害活性を示すグラフである。
【図２】アンドロゲン受容体結合阻害率を示すグラフである。
【図３】皮脂腺細胞における皮脂合成量を示すグラフである。
【図４】皮脂腺細胞におけるオイルレッドO染色（脂腺細胞培養試験結果）の顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（実施例１）
テストステロン５α−リダクターゼ阻害試験
＜試験方法＞
１．3.0mMテストステロン溶液（プロピレングリコールで溶解）0.1mlに、5mM Tris-HCｌ緩衝液(pH7.2)を0.5ml加えた。
２．更に、6.7mM NADPH溶液（5mM Tris-HCｌ緩衝液(pH7.2)に溶解）0.1mlならびにサンプル溶液（50%エタノールに溶解）0.05mlを加え、37℃で予備加熱後、酵素液(S-9、オリエンタル酵母)0.1mlを加えて1時間インキュベートを行った。
本試験において、ラクトフェリンは牛由来のラクトフェリンを調製して使用し、対照として、ノコギリヤシを使用した。
３．その後、3mlジクロロメタンを加えて反応を停止させ、0.5mlの内部標準溶液（0.1mg/mlのp-ヒドロキシ安息香酸n-ヘキシルエステル）を加え、10分間振とうし、3000rpmで10分間遠心分離した。
４．ジクロロメタン層を分取して、減圧乾燥を行った。乾燥物にメタノール5mlを加えて溶かし、試料溶液とした。得られた試料溶液からHPLCにより残存するテストステロンを定量した。
測定条件は、YMC A-302（内径4.6×150mm）カラムを使用し、カラム温度40℃、流速1ml／分の条件でメタノール／水（65／35）で溶離し、254nmで検出した。また、測定は内部標準物質法を用いて行い、阻害率(%)を次式から求めた。
阻害率(%)=（A−B）／（C−B）×100
A：試験液を加えたときのテストステロン量
B：コントロール30分のテストステロン量（試験液の代わりに、50%エタノール溶液を用いて、反応を行ったときのテストステロン量）
C：コントロール0分のテストステロン量（トリス−塩酸緩衝液、テストステロン、試験液および酵素液を混和した後に、NADPHを加える前に、ジクロロメタンを加えて反応を起こさないようにしたときのテストステロン量）
＜試験結果＞
得られた結果を図１に示す。図１から明らかなように、ポジティブコントロールであるノコギリヤシは1000ppmの濃度で約35%の阻害活性を示したが、ラクトフェリンについてはテストステロン5α−リダクターゼ阻害活性は認められなかった。
【００１７】
（実施例２）
アンドロゲン受容体結合阻害試験
＜試験方法＞
１．アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞SC−3細胞を、2% DCC処理ＦCＳ含有MEM培地を用いて、1.0×104 cells/well/100μlの細胞密度にて96穴マイクロプレートに播種、37℃、5%CO2−95% airの下で培養した。
２．24時間後に、試験試料および10−8MのDHTを添加したHMB培地(0.1% BSA含有Ham F12＋MEM培地）に培地を交換して48時間培養する。
本試験において、ラクトフェリンは牛由来のラクトフェリンを調製して使用し、ポジティブコントロールとして、スピロノラクトンを使用した。
３．その後、MTT還元法により、ブルーホルマザンの吸収極大点である570nmの吸光度を測定し、細胞増殖を評価した。
なお、付着細胞の影響を補正するため、同時に６５０nmの吸光度も測定し、両吸光度の差をもってブルーホルマザンの生成量とする。上記と並行して、試料単独でＳＣ−３細胞に及ぼす影響をみるため、ＨＭＢ培地にＤＨＴを添加せず試料のみを添加して、同様の培養と測定を行なう。さらに、コントロールとして、試料およびＤＨＴを添加しないＨＭＢ培地で培養した場合、および試料を添加せずＤＨＴのみを添加したＨＭＢ培地で培養した場合についても同様の測定を行う。測定結果より、抗アンドロゲン作用を示す結合阻害率を次式により算出する。
結合阻害率（％）＝〔{（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）}／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：ＤＨＴ添加、試料無添加の場合の吸光度
Ｂ：ＤＨＴ無添加、試料無添加の場合の吸光度
Ｃ：ＤＨＴ添加、試料添加の場合の吸光度
Ｄ：ＤＨＴ無添加、試料添加の場合の吸光度
＜試験結果＞
得られた結果を図２に示す。図２から明らかなように、ポジティブコントロールであるスピロノラクトンは10−5Mの濃度で約70%の結合阻害活性を示した。ラクトフェリンについても、濃度依存的結合阻害活性が認められ、60ppmの濃度において約85%の阻害活性を示した。
【００１８】
（実施例３）
皮脂腺細胞培養試験
＜試験方法＞
１．本試験ではハムスター皮脂腺細胞培養キット  ＫＢ−１０００（クラボウ社製）を用いて行った。
正常ゴールデンハムスター耳介由来の皮脂腺細胞を5.0×104 cells/wellの密度で24ウェルプレートに播種した。試験期間中、テストステロンを1×10−6Mの濃度で含有させた培地で培養した。
２．コンフルエントになるまで数日培養後、試験試料を含有する培地に交換した。1日おきに試料培地で培地交換を行い、約2週間培養を続けた。
本試験において、ラクトフェリンは牛由来のラクトフェリンを調製して使用し、対照として、スピロノラクトンを使用した。
３．その後、皮脂合成測定キットＳＥ−３００１（クラボウ社製）を用いて、WST-8溶液を各ウェルに添加し、30分間37℃でインキュベートした。上清を450nmの波長で測定し、生細胞数を計測した。
４．更に、オイルレッドO染色し、顕微鏡観察をするとともに、100%イソプロパノールで抽出し、520nmの波長で測定し、脂質合成量を計測した。
次式により補正することで、細胞あたりの脂質合成量を比較した。
細胞あたりの脂質合成量の比較＝吸光度B／吸光度A
吸光度A：細胞数測定値(450nm)
吸光度B：脂質合成量測定値(520nm)
＜試験結果＞
得られた結果を図３及び図４に示す。図３及び図４から明らかなように、ポジティブコントロールであるスピロノラクトンは１×10−5Mの濃度において、顕微鏡観察および吸光度測定において、コントロールと比較して皮脂の合成量が減少していた。一方、ラクトフェリンは、顕微鏡観察および吸光度測定において、濃度依存的に皮脂合成量を抑制し、10ppm、20ppmの濃度において皮脂合成量を60%まで抑制した。
【００１９】
次に、ラクトフェリンを用いて、錠剤、チューインガム、キャンディ、チョコレート、ビスケット、グミゼリー、錠菓、アイスクリーム、シャーベット、飲料を常法にて調製した。以下にその処方を示した。なお、これらによって本発明品の範囲を制限するものではない。
【００２０】
（実施例４）
下記処方にしたがって錠剤を調製した。
Ｄ−マンニトール                                              ４２．６％
乳糖                                                          ４２．６
結晶セルロース                                                  ８．５
ヒドロキシプロピルセルロース                                    ４．３
ラクトフェリン                                                  ２．０
１００．０％
【００２１】
（実施例５）
下記処方にしたがってチューインガムを調製した。
ガムベース                                                ２０．０％
砂糖                                                      ５４．７
グルコース                                                １４．５
水飴                                                        ９．３
香料                                                        ０．５
ラクトフェリン                                              １．０
１００．０％
【００２２】
（実施例６）
下記処方にしたがってキャンディを調製した。
砂糖                                                      ５０．０％
水飴                                                      ３１．４
クエン酸                                                    １．０
香料                                                        ０．２
Ｌ−メントール                                              １．０
ラクトフェリン                                              ２．０
水                                                        １４．４
１００．０％
【００２３】
（実施例７）
下記処方にしたがってチョコレートを調製した。
カカオビター                                              ２０．０％
全脂粉乳                                                  ２０．０
カカオバター                                              １７．０
粉糖                                                      ４０．４５
レシチン                                                    ０．４５
香料                                                        ０．１
ラクトフェリン                                              ２．０
１００．０％
【００２４】
（実施例８）
下記処方にしたがってビスケットを調製した。
砂糖                                                      ３１．７％
小麦粉                                                    ２６．８
片栗粉                                                    ２６．８
バター                                                      ３．２
卵                                                        １０．２
重曹                                                        ０．３
ラクトフェリン                                              １．０
１００．０％
【００２５】
（実施例９）
下記処方にしたがってグミゼリーを調製した。
ポリデキストロース水溶液                                  ３９．０％
ソルビトール水溶液                                          ８．０
パラチノース水溶液                                          ９．０
マルトース水溶液                                          ２０．０
トレハロース水溶液                                        １１．０
ゼラチン                                                  １０．０
酒石酸                                                      １．０
ラクトフェリン                                              ２．０
１００．０％
【００２６】
（実施例１０）
下記処方にしたがって錠菓を調製した。
砂糖                                                    ４６．６５％
グルコース                                              １９．０
ショ糖脂肪酸エステル                                      ０．２
香料                                                      ０．１５
ラクトフェリン                                          ３０．０
水                                                        ４．０
１００．０％
【００２７】
（実施例１１）
下記処方にしたがってタブレットを調製した。
砂糖                                                    ３５．８５％
ショ糖脂肪酸エステル                                      ０．１５
ラクトフェリン                                          ６０．０
水                                                        ４．０  
１００．０％
【００２８】
（実施例１２）
下記処方にしたがってアイスクリームを調製した。
卵黄                                                    １１．０％
砂糖                                                    １４．０
牛乳                                                    ３５．５
生クリーム                                              ３７．０
バニラビーンズ                                            ０．５
ラクトフェリン                                            ２．０
１００．０％
【００２９】
（実施例１３）
下記処方にしたがってシャーベットを調製した。
オレンジ果汁                                            １６．０％
砂糖                                                    ３１．０
ラクトフェリン                                            ３．０
水                                                      ５０．０
１００．０％
【００３０】
（実施例１４）
下記処方にしたがって飲料を調製した。
オレンジ果汁                                            ３０．０％
異性化糖                                                １３．３４
クエン酸                                                  ０．１
ビタミンＣ                                                ０．０４
香料                                                      ０．１
ラクトフェリン                                            ２．０
水                                                      ５４．４２
１００．０％
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、抗アンドロゲン作用を有するラクトフェリンを有効成分とする商品群への添加素材として有用である。また、キャンディやガム等の製品への適用、および新たな健康機能製品への適用も可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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