(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５〜１１、及び１５〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
腫瘍を治療するための医薬組成物であって、請求項１に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項６】
前記腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、及び白血病からなる群から選択される請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、ＶＰ１６、５−ＦＵからなる群から選択される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍を治療するためのキットであって、請求項１に記載の融合タンパク質を含むキット。
【請求項１０】
腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
腫瘍を治療するための前記融合タンパク質および前記追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、ＶＰ１６、および５−ＦＵからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アポトーシスの概念は、１９７２年にＫｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．によって初めて提案され、同義遺伝子によって制御される細胞壊死とは相違する明確に組織化された自発死を意味する。アポトーシスは、生物の多数の系の進化、ホメオスタシス・プロセスおよび発達において不可欠な役割を果たす（Ｒｅｎｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；Ｎｉｊｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｏｐｆｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，  ２００３；Ｏｓｂｏｒｎｅ，  １９９６）。アポトーシスの機序は高度に複雑であり、一連のエネルギー依存性カスケード反応の密接な関係を含んでいる。現在までに、２つの主要なアポトーシス経路である外因経路もしくはデスレセプター経路、および内因経路もしくはミトコンドリア経路が見いだされており、これら２つの経路間は結び付けられている（Ｉｇｎｅｙ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｍｅｒ，  ２００２）。パーフォリン／グランザイム経路として公知であるまた別の経路があり、それによってグランザイムＡもしくはグランザイムＢは、Ｔ細胞媒介性細胞毒性およびパーフォリン−グランザイム依存性細胞殺滅に関係している。最後に、外因経路、内因経路およびグランザイムＢ経路は、同一実行経路、つまりカスパーゼ−３切断、ＤＮＡ破損、細胞骨格および核タンパク質変性、タンパク質架橋、アポトーシス小体の形成、食細胞受容体のリガンドの発現に収束し、最終的には飲み込まれる。外因経路によって誘導されるアポトーシスにはリガンドと膜貫通デスレセプターとの相互作用が必要とされるが、これらのデスレセプターは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーは、類似のシステインリッチ細胞外結合ドメインおよびおよそ８０アミノ酸を備える細胞内デスドメインを共有している（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，  １９９８）。デスドメインは、細胞表面から細胞の内部への死シグナルの伝達において重要な役割を果たし、現時点で確立されたリガンド／デスレセプター経路には、ＦａｓＬ／ＦａｓＲ、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＲ１、Ａｐｏ３Ｌ／ＤＲ３、Ａｐｏ２Ｌ／ＤＲ４およびＡｐｏ２Ｌ／ＤＲ５が含まれる（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ.，  １９９７；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｐｅｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，  １９９８；Ｓｕｌｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；Ｒｕｂｉｏ−Ｍｏｓｃａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【０００２】
アポトーシスは、多数の生理学的条件、例えば胚発生、および免疫系におけるクローン選択下で発生する（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。生理学的条件下でのアポトーシスは、精密な調節によって制御され、アポトーシスの過度のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションは、生理学的変化、例えば発生欠損、自己免疫疾患、神経変性疾患、または悪性腫瘍などを生じさせる。悪性腫瘍は、現在では、正常細胞周期の制御機序の機能不全に起因する過度の細胞増殖および／または細胞除去の減少の結果であると見なされている（Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｉｄｌｏｗｓｋｉ，  １９９８）。アポトーシスの阻害は、一部の腫瘍の発病および進行において重要な役割を果たす（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。
【０００３】
腫瘍細胞内では、そのアポトーシスは様々な分子機序、例えば抗アポトーシスタンパク質の発現、プロアポトーシスタンパク質の発現のダウンレギュレーションまたはプロアポトーシスタンパク質の突然変異の不活性化を通して阻害できる。腫瘍の発病および進行ならびにアポトーシスのシグナル伝達経路においてアポトーシスが果たす役割に関する理解に基づいて、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する薬物が開発されてきた、または開発される。デスレセプターの細胞外アポトーシス経路、特にＤＲ４／ＤＲ５を標的とする新規薬物の開発は、近年の研究の１つの焦点である。ＤＲ４／ＤＲ５を標的とする数種の候補薬物は、現在臨床試験中である。
【０００４】
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）遺伝子は、１９９５年に初めてＷｉｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．によってクローン化および命名された。１９９６年には、同一遺伝子がＰｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によってクローン化され、Ａｐｏ２Ｌと命名された。ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、健常者の様々な組織（肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、末梢リンパ球、心臓、胎盤、骨格筋など）において広範囲に発現する（Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、２つの形態、つまりどちらも安定性ホモ三量体を形成して、受容体と結合して生物学的に作用する膜結合および可溶性ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌとしてｉｎ  ｖｉｖｏに存在する。多数のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌが数種の腫瘍細胞および形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導できることを証明している。担癌動物における組み換えＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌタンパク質の投与は、腫瘍細胞増殖を有意に阻害することができ、宿主に対する明白な損傷を伴わずに腫瘍退縮を生じさせることさえできる。腫瘍細胞を致死させるＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌの特異性、効率性および非毒性は、同一ファミリー内のＣＤ９５ＬおよびＴＮＦαより有意に有益であるが、それは後者が全身性および制御困難な炎症ならびに重度の毒性、例えば変性、壊死、肝組織への出血、および死亡さえ引き起こす可能性があるからである（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  Ｌ，  １９９２）。ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌの抗腫瘍活性および安全性は、臨床的に使用される放射線療法および化学療法などに比較して有意に有益である。動物実験は、放射線療法および化学療法と併用したＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、相乗作用をうみだすことができ、それにより後者の用量および副作用を減少させることを確証した。このため、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、現在は最も前途有望な抗癌剤と見なされている。Ｉｍｍｕｎｅｘ社（米国）は、野生型ＴＲＡＩＬの遺伝子配列、発現ベクター、および宿主細胞、ならびに抗ＴＲＡＩＬ抗体を開示している（特許文献１（米国特許第６２８４２３６号明細書））。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（米国）は、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌および神経膠腫癌を治療するために野生型ＡＰＯ２Ｌを使用する方法を開示している（特許文献２（米国特許第６０３０９４５号明細書）、特許文献３（米国特許第６７４６６６８号明細書）、特許文献４（米国特許第６９９８１１６号明細書））。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社の他の２つの特許出願は、ＡＰ０２Ｌポリペプチド内の所定のアミノ酸位置が置換されていることを開示している（特許文献５（米国特許第６７４０７３９号明細書）、特許文献６（国際公開第２００３／０２９４２０（Ａ２）号パンフレット））。組み換え技術により製造された可溶性野生型ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌの活性が低いために工業および臨床用途に適用することはできない。このため、高活性の変異ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌを獲得するために野生型ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌの構造を再構築して改変することは、これらの薬物を開発する主要な方法である。
【０００５】
特許文献７（国際公開第２００５／０４２７４４号パンフレット）は、腫瘍に対する有意な選択的阻害作用を有する、ＴＲＡＩＬの円順列変異形を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６２８４２３６号明細書
【特許文献２】米国特許第６０３０９４５号明細書
【特許文献３】米国特許第６７４６６６８号明細書
【特許文献４】米国特許第６９９８１１６号明細書
【特許文献５】米国特許第６７４０７３９号明細書
【特許文献６】国際公開第２００３／０２９４２０号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００５／０４２７４４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
高活性の変異ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌを獲得するために野生型ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌの構造を再構築して改変する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、
（１）ＴＲＡＩＬの円順列変異形および前記変異形のＮ末端および／またはＣ末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは３〜１０個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含み、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形のＮ末端からＣ末端までの成分は、（ａ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５もしくはＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４〜１３５もしくはＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５、もしくはＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５を含有するＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５の任意のフラグメントである、または
（２）（１）と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％アミノ酸配列同一性を有するＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号５に規定した前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも２０％、例えば９０〜１１０％、８０〜１２０％、７０〜１３０％、６０〜１４０％、５０〜１５０％、４０〜１６０％、３０〜１７０％、２０〜１８０％、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する。同一性は、当該技術分野において周知の方法、例えばＢＬＡＳＴ、デフォルトパラメータを用いて計算する。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０；２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７；２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形の（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形内ならびに前記ＴＲＡＩＬの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。
【０００９】
（３）１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加による（１）のアミノ酸配列に由来するＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号５に規定した前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも２０％、例えば９０〜１１０％、８０〜１２０％、７０〜１３０％、６０〜１４０％、５０〜１５０％、４０〜１６０％、３０〜１７０％、２０〜１８０％、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形の（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形内ならびに前記ＴＲＡＩＬの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。一部の実施形態では、置換、欠失もしくは付加を受けたアミノ酸残基の数は、１〜２０個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個である。
【００１０】
前記「腫瘍阻害活性」は、腫瘍細胞系、例えば肺癌、多発性骨髄腫および／または結腸腫瘍細胞系などに対する阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該腫瘍阻害活性は、腫瘍細胞系への死滅活性ＩＣ５０によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該「腫瘍阻害活性」は、肺癌細胞系に対するその阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、腫瘍阻害活性は、肺癌細胞系への死滅活性ＩＣ５０によって特徴付けることができ、例えば本明細書の実施例６に記載した方法によって測定されるＩＣ５０によって特徴付けることができる。
【００１１】
前記「ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５を含有するＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５の任意のフラグメント」は、そのＮ末端がＴＲＡＩＬの９５〜１２１位のいずれかの位置にあり、Ｃ末端がＴＲＡＩＬの１３５位にあるＴＲＡＩＬのアミノ酸フラグメントを意味する。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のＮ末端および／またはＣ末端での該オリゴペプチド内のヒスチジン残基の数は、３〜９個、好ましくは６〜９個である。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のＮ末端にあるオリゴペプチドは、構造ＭＧａ−ＨｉＳｂ（式中、ａは０もしくは１である、およびｂは３〜９の整数、好ましくは６〜９の整数である）を含んでいる。
【００１４】
本明細書に記載したリンカーは、融合タンパク質分野において一般に使用されるリンカーであり、当業者であればそのようなリンカーを容易に設計および製造することができる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のリンカーは、長さが３〜１５アミノ酸、好ましくは３〜１０アミノ酸、より好ましくは５〜７アミノ酸であり、好ましくは、該リンカーのアミノ酸配列は、数個のＧからなる、または１つのＳが組み入れられた数個の連続するＧからなる、およびより好ましくは該リンカーのアミノ酸配列は、配列番号４１、４２および４３からなる群から選択される。
【００１５】
本明細書に記載したＴＲＡＩＬには、天然ＴＲＡＩＬおよび非天然ＴＲＡＩＬ、好ましくは先行技術において開示された野生型ヒトＴＲＡＩＬを含む様々なＴＲＡＩＬが含まれる（Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内では、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１は配列番号３７であり、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５は配列番号３８であり、ＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５は配列番号３９であり、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４〜１３５は配列番号４０である。
【００１６】
本明細書に記載したＴＲＡＩＬのアミノ酸位置は、上記の野生型ＴＲＡＩＬ内の位置である、または上記の野生型ＴＲＡＩＬと最適にアライメントさせたときに対応する位置である。アライメントは、当該技術分野において周知の方法、例えばＢＬＡＳＴ、デフォルトパラメータを用いて実施する。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０；２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７；２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質の配列は、配列番号５〜１１および１５〜１６からなる群から選択される。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸に関する。本発明はまた、ベクター、好ましくは発現ベクター、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むに関する。本発明はまた、上記ベクターを含む宿主細胞に関し、該宿主細胞は、細菌、真菌、植物、動物、ヒト由来など、例えば大腸菌由来である。
【００１９】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、任意に、腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するための医薬組成物に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、および任意に腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するためのキットに関する。該キット内では、該融合タンパク質および腫瘍を治療するための追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される。
【００２１】
本発明はまた、被験者に本発明の融合タンパク質を投与する工程を含む、任意に該被験者に腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物を投与する工程をさらに含む腫瘍を治療するための方法であって、該融合タンパク質は該追加の薬物と同時に、または連続的に投与されてよい、方法に関する。
【００２２】
本発明はまた、腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む組成物の使用であって、このとき前記医薬品は腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む使用に関する。
【００２３】
本発明の一部の実施形態では、本明細書で使用する用語「含む／含んでいる」、「包含する／包含している」、「有する／有している」は、全て「〜からなる」を含んでいる。
【００２４】
本明細書で記載した腫瘍には、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、白血病などが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍は、肺癌、多発性骨髄腫、および結腸癌から選択される。
【００２５】
本明細書に記載した腫瘍を治療するための追加の薬物には、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、ＶＰ１６、５−ＦＵなどが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍を治療するための追加の薬物は、メルファラン、プレドニゾン、パクリタキセル、およびカルボプラチンからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１がＨ４６０細胞へ及ぼす死滅効果についての位相差顕微鏡下での観察を示す図である。
【図２】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１によるＲＰＭＩ８２２６細胞死滅の時間効果関係を示す図である。様々な濃度のＮＣＰＴ−１．Ｍ１とヒト多発性骨髄腫ＲＰＭＩ８２２６細胞との６時間にわたるインキュベーションは、最大死滅を生じさせることができ８時間、２４時間、および４８時間の最大死滅との有意差を示さなかった。
【図３】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１によって誘導されたヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６のアポトーシスの形態学的変化を示す図である。細胞は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（２００ｎｇ／ｍＬ）とともに３時間インキュベートし、次にＭＧＧ染色の前にスメアとして調製した。Ａ（１，０００×）、Ｃ（２００×）は、細胞質が好塩基性であって青色染色され、核が好酸性であって明確な核を含む均質な赤色として染色されるコントロール群を表す；Ｂ（１，０００×）、Ｄ（２００×）は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１群を表し、膜は無傷で大きな気泡を含み、クロマチンはより暗色の染色を伴って辺縁での凝集、核凝縮および核崩壊を示している。
【図４】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１によって誘導されたヒト肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０のアポトーシスについてのＴＵＮＥＬアッセイを示す図である。ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｎｇ／ｍＬ）とともに４時間インキュベートし、次にＴＵＮＥＬ染色の前にスメアとして調製した。ほぼ全ての腫瘍細胞が、顕微鏡下で核凝縮、核崩壊、および破砕したクロマチンの褐色染色等のアポトーシスの特徴を示している（Ｂ）。コントロール群では、核は無傷のままであり、特徴的な褐色染色クロマチンは見られない（Ａ）。
【図５】様々な時間にわたりＮＣＰＴ−１．Ｍ１とともにインキュベートした後のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞のヌクレオソーム間ＤＮＡフラグメント化についてのアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。  マーカー：間隔が２００ｂｐの２００ｂｐ〜２０００ｂｐのＤＮＡマーカー；  コントロール：溶媒コントロール；  ２時間、４時間、６時間：各々２時間、４時間、６時間にわたる１５ｎｇ／ｍＬのＮＣＰＴ−１．Ｍ１とのインキュベーションを表す。
【図６】カスパーゼ−８阻害剤（ｚＩＥＴＤ−ｆｍｋ）は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１がＨ４６０細胞に及ぼすプロアポトーシス活性を阻害できる。  Ｈ４６０細胞は、カスパーゼ−８阻害剤であるｚＩＥＴＤ−ｆｍｋ（濃度３０μｍｏｌ／Ｌ、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１より１時間早く加えた）の存在下もしくは非存在下で２４時間にわたりＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１．２または１０ｎｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、その後ＭＴＴアッセイによって細胞生存率を測定した。
【図７】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１は腫瘍組織内の多数の腫瘍細胞のアポトーシスを生じさせることができる。  無胸腺ヌードマウスにヒトＭＭ  ＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞を皮下接種し、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１を用いて処置し、次に腫瘍組織を切除し、アポトーシス細胞の様式化されたＨＥ染色（Ａ、Ｂ）およびＴＵＮＥＬ染色（Ｃ、Ｄ）にかけた。多数の細胞が核凝縮、核崩壊（Ｂ）、核の褐色染色（Ｄ）およびアポトーシスの他の特徴を示すが、コントロール群にはアポトーシス細胞が少数しか存在しない（Ａ、Ｃ）。
【図８】マウスにおけるヒトＰＲＭＩ８２２６異種移植片腫瘍の増殖はＮＣＰＴ−１．Ｍ１によって有意に阻害される。無胸腺ヌードマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｈｕａｆｕｋａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞（５×１０６／マウス）を皮下接種した。腫瘍が約５００ｍｍ３まで増殖した時点で、マウスを幾つかの群に分け、生理食塩液（コントロール群）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｍｇ／ｋｇ）および野生型ＴＲＡＩＬ（ｗｔＴＲＡＩＬ、１５ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇ）を各々１日１回、連続８日間にわたり腹腔内注射した。腫瘍容積は、２日毎にノギスを用いて測定した。用量１５ｍｇ／ｋｇでのＮＣＰＴ−１．Ｍ１群の腫瘍増殖率は４５ｍｇ／ｋｇのｗｔＴＲＡＩＬ群の腫瘍増殖率に比較して有意に低く、これはＮＣＰＴ−１．Ｍ１の阻害活性がＲＰＭＩ８２２６異種移植片腫瘍にｗｔＴＲＡＩＬが及ぼす阻害活性より強力なことを示唆している。
【図９】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１はメルファランと併用するとヒト多発性骨髄腫細胞系Ｕ２６６に及ぼす死滅効果を改善することができる。Ｕ２６６細胞は、ＣＰＴに対して非感受性である。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１単独は、１μｇ／ｍＬの濃度ではＵ２６６に軽度の死滅効果（＜２０％）しか有していないが、メルファラン（１２．５〜５０μｇ／ｍＬ）の存在下では、どちらの薬剤も増強された死滅効果を誘導することができる。細胞生存率はＡＴＰｌｉｔｅ発光システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いてアッセイし、この図に示したデータは全て平均値±標準偏差（ｎ＝４）として提示した。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、メルファラン群に対して；＊Ｐ＜０．０５、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１群に対して。
【図１０】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１はメルファランと併用するとヒトＭＭ細胞系Ｈ９２９に対して相乗的な死滅効果を有する。様々な濃度のＮＣＰＴ−１．Ｍ１（３１〜１，０００ｎｇ／ｍＬ）と併用したメルファラン（１２．５ｎｇ／ｍＬ）をＨ９２９細胞とともにインキュベートした。細胞生存率は、ＡＴＰｌｉｔｅ発光システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いてアッセイした。併用指数（ＣＩ、ヒストグラム上にマーキングした）は、２種の薬物間の相互作用の性質を表す：ＣＩ＜０．９は相乗作用を表し、ＣＩ＞１．１は拮抗作用を表し、０．９〜１．１のＣＩは相加効果を表す。
【図１１】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１はメルファランと併用するとヒトＭＭ細胞系ＲＰＭＩ８２２６に対して相乗的な死滅効果を有する。様々な濃度のＮＣＰＴ−１．Ｍ１（２〜５００ｎｇ／ｍＬ）と併用したメルファラン（２５μｇ／ｍＬ）をＲＰＭＩ８２２６細胞とともにインキュベートした。細胞生存率は、ＡＴＰｌｉｔｅ発光システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いてアッセイした。併用指数（ＣＩ、ヒストグラム上にマーキングした）は、２種の薬物間の相互作用の性質を表す。ＣＩ＜０．９は相乗作用を表し、ＣＩ＞１．１は拮抗作用を表し、０．９〜１．１のＣＩは相加効果を表す。
【図１２】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１がマウスにおけるヒトＰＲＭＩ８２２６異種移植片腫瘍の増殖に及ぼす阻害作用は、メルファランおよびプレドニゾンと併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１によって有意に増強される。
【図１３】ＮＣＰＴ−１．Ｍ１がマウスにおけるヒトＰＲＭＩ８２２６異種移植片腫瘍の増殖に及ぼす阻害作用は、化学療法（ＰＣレジメン：パクリタキセル＋カルボプラチン）と併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１によって有意に増強される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、
（１）ＴＲＡＩＬの円順列変異形および前記変異形のＮ末端および／またはＣ末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは３〜１０個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含み、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形のＮ末端からＣ末端までの成分は、（ａ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５もしくはＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４〜１３５もしくはＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５、もしくはＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５を含有するＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５の任意のフラグメントである、または
（２）（１）と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％アミノ酸配列同一性を有するＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号５に規定した前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも２０％、例えば９０〜１１０％、８０〜１２０％、７０〜１３０％、６０〜１４０％、５０〜１５０％、４０〜１６０％、３０〜１７０％、２０〜１８０％、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する。同一性は、当該技術分野において周知の方法、例えばＢＬＡＳＴ、デフォルトパラメータを用いて計算する。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０；２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７；２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形の（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形内ならびに前記ＴＲＡＩＬの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。
【００２８】
（３）１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加による（１）のアミノ酸配列に由来するＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号５に規定した前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも２０％、例えば９０〜１１０％、８０〜１２０％、７０〜１３０％、６０〜１４０％、５０〜１５０％、４０〜１６０％、３０〜１７０％、２０〜１８０％、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形の（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと（１）との差は、前記ＴＲＡＩＬの円順列変異形内ならびに前記ＴＲＡＩＬの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。一部の実施形態では、置換、欠失もしくは付加を受けたアミノ酸残基の数は、１〜２０個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個である。
【００２９】
前記「腫瘍阻害活性」は、腫瘍細胞系、例えば肺癌、多発性骨髄腫および／または結腸腫瘍細胞系などに対する阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該腫瘍阻害活性は、腫瘍細胞系への死滅活性ＩＣ５０によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該「腫瘍阻害活性」は、肺癌細胞系に対するその阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、腫瘍阻害活性は、肺癌細胞系への死滅活性ＩＣ５０によって特徴付けることができ、例えば本明細書の実施例６に記載した方法によって測定されるＩＣ５０によって特徴付けることができる。
【００３０】
前記「ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５を含有するＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５の任意のフラグメント」は、そのＮ末端がＴＲＡＩＬの９５〜１２１位のいずれかの位置にあり、Ｃ末端がＴＲＡＩＬの１３５位にあるＴＲＡＩＬのアミノ酸フラグメントを意味する。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のＮ末端および／またはＣ末端での該オリゴペプチド内のヒスチジン残基の数は、３〜９個、好ましくは６〜９個である。
【００３２】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のＮ末端にあるオリゴペプチドは、構造ＭＧａ−ＨｉＳｂ（式中、ａは０もしくは１である、およびｂは３〜９の整数、好ましくは６〜９の整数である）を含んでいる。
【００３３】
本明細書に記載したリンカーは、融合タンパク質分野において一般に使用されるリンカーであり、当業者であればそのようなリンカーを容易に設計および製造することができる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のリンカーは、長さが３〜１５アミノ酸、好ましくは３〜１０アミノ酸、より好ましくは５〜７アミノ酸であり、好ましくは、該リンカーのアミノ酸配列は、数個のＧからなる、または１つのＳが組み入れられた数個の連続するＧからなる、およびより好ましくは該リンカーのアミノ酸配列は、配列番号４１、４２および４３からなる群から選択される。
【００３４】
本明細書に記載したＴＲＡＩＬには、天然ＴＲＡＩＬおよび非天然ＴＲＡＩＬ、好ましくは先行技術において開示された野生型ヒトＴＲＡＩＬを含む様々なＴＲＡＩＬが含まれる（Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内では、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１は配列番号３７であり、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５は配列番号３８であり、ＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５は配列番号３９であり、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４〜１３５は配列番号４０である。
【００３５】
本明細書に記載したＴＲＡＩＬのアミノ酸位置は、上記の野生型ＴＲＡＩＬ内の位置である、または上記の野生型ＴＲＡＩＬと最適にアライメントさせたときに対応する位置である。アライメントは、当該技術分野において周知の方法、例えばＢＬＡＳＴ、デフォルトパラメータを用いて実施する。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０；２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７；２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質の配列は、配列番号５〜１１および１５〜１６からなる群から選択される。
【００３７】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸に関する。本発明はまた、ベクター、好ましくは発現ベクター、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むに関する。本発明はまた、上記ベクターを含む宿主細胞に関し、該宿主細胞は、細菌、真菌、植物、動物、ヒト由来など、例えば大腸菌由来である。
【００３８】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、任意に、腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するための医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、および任意に腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するためのキットに関する。該キット内では、該融合タンパク質および腫瘍を治療するための追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される。
【００４０】
本発明はまた、被験者に本発明の融合タンパク質を投与する工程を含む、任意に該被験者に腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物を投与する工程をさらに含む腫瘍を治療するための方法であって、該融合タンパク質は該追加の薬物と同時に、または連続的に投与されてよい、方法に関する。
【００４１】
本発明はまた、腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む組成物の使用であって、このとき前記医薬品は腫瘍を治療するための１つ以上の追加の薬物をさらに含む使用に関する。
【００４２】
本発明の一部の実施形態では、本明細書で使用する用語「含む／含んでいる」、「包含する／包含している」、「有する／有している」は、全て「〜からなる」を含んでいる。
【００４３】
本明細書で記載した腫瘍には、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、白血病などが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍は、肺癌、多発性骨髄腫、および結腸癌から選択される。
【００４４】
本明細書に記載した腫瘍を治療するための追加の薬物には、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、ＶＰ１６、５−ＦＵなどが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍を治療するための追加の薬物は、メルファラン、プレドニゾン、パクリタキセル、およびカルボプラチンからなる群から選択される。
【実施例】
【００４５】
実施例１
野生型ヒトＴＲＡＩＬコーディング遺伝子の構築
野生型ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４〜２８１の配列を発現する遺伝子を含有するプラスミドを構築した。
【００４６】
（１）第１工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）ならびに、添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ１、Ｐ２を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００４７】
Ｐ１：ｃｇｔｔｃａｔａｔｇ  ｇｔｇａｇａｇａａａｇａｇｇｔｃｃｔｃａｇａｇａｇ（配列番号１７）
Ｐ２：ｃｔｔａ  ｇｇａｔｃｃ  ｔｔａｇｃｃａａｃｔａａａａａｇｇｃｃｃｃｇａａａａａａｃ（配列番号１８）
【００４８】
（２）ＴＲＡＩＬプラスミドの構築
先行工程の結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ４２ａ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒトＴＲＡＩＬ遺伝子の発現プラスミドはＤＮＡシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＴＲＡＩＬ  １１４−２８１と命名した。
【００４９】
実施例２
組み換えヒト円順列変異ＴＲＡＩＬを発現する遺伝子の構築
組み換えヒト円順列変異ＴＲＡＩＬ（円順列変異ＴＲＡＩＬ、ＣＰＴと称する）をコードする遺伝子を構築した。Ｎ末端からＣ末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、（ａ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２２〜１３５である。
【００５０】
【表１】
0005956580.tif 000002
【００５１】
（１）第１工程ＰＣＲ増幅
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＴＲＡＩＬ  １１４−２８１ならびに、添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ３、Ｐ４を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００５２】
Ｐ３：ｃａｔｇｃａｔａｔｇａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｔｃｔｃｃａａ  ａｃｔｃ（配列番号１９）
Ｐ４：ａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｃｃａａｃｔａａａａａｇｇｃｃｃｃａａａａａａａｃｔｇ（配列番号２０）
【００５３】
（２）第２工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第１工程のＰＣＲ産物、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ３、Ｐ５を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００５４】
Ｐ５：ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃａｃｃａｃｃ（ＢａｍＨＩ制限部位）（配列番号２１）
【００５５】
（３）ＣＰＴプラスミドの構築
第２工程のＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ４２ａ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異ＴＲＡＩＬの発現プラスミドはＤＮＡシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＣＰＴと命名した。
【００５６】
実施例３
様々な組み換えヒト円順列変異ＴＲＡＩＬをコードする新規遺伝子の構築
１．組み換えヒト新規円順列変異ＴＲＡＩＬ−１（新規円順列変異ＴＲＡＩＬ−１、ＮＣＰＴ−１と称する）をコードする遺伝子の構築。
Ｎ末端からＣ末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、（ａ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１２１〜１３５である。
【００５７】
【表２】
0005956580.tif 000003
【００５８】
（１）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ７を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００５９】
Ｐ６：ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇａｃａｔｔｇｔｃｔｔｃｔｃｃａａａｃｔｃｃａａｇ（ＮｄｅＩ制限部位）（配列番号２２）
Ｐ７：ｃｇｇｇａｔｃｃｇｃｃａａｃｔａａａａａｇｇｃｃｃｃａａａａａａａｃｔｇｇｃｔｔｃ（ＢａｍＨＩ制限部位）（配列番号２３）
【００６０】
ＰＣＲ産物およびプラスミドｐＥＴ４２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）は、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによってライゲーションした。ライゲーション産物は、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）細菌内に形質転換させた。形質転換された細菌をプレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。陽性クローンをその後にＤＮＡシーケンシングによって確証した。構築したプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＴＲＡＩＬ  １３５−２８１と命名した。
【００６１】
（２）第２工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＴＲＡＩＬ  １３５−２８１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ８を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００６２】
Ｐ８：ａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃｔｃｔａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｃｃａａｃｔａａａａａｇｇｃｃｃｃａａａａａａａｃｔｇ（配列番号２４）
【００６３】
（３）第３工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第２工程のＰＣＲ産物、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ９を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００６４】
Ｐ９：ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃｔｃｔａｃｃａｃｃ（ＢａｍＨＩ制限部位）（配列番号２５）
【００６５】
（４）ＮＣＰＴ−１プラスミドの構築
第３工程のＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ４２ａ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒトＮＣＰＴ−１遺伝子の発現プラスミドはＤＮＡシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−１と命名した。
【００６６】
２．組み換えヒト新規円順列変異ＴＲＡＩＬ−２（新規円順列変異ＴＲＡＩＬ−２、ＮＣＰＴ−２と称する）をコードする遺伝子の構築。
Ｎ末端からＣ末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、（ａ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜１３５である。
【００６７】
【表３】
0005956580.tif 000004
【００６８】
（１）第１工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＴＲＡＩＬ  １３５−２８１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ１０を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００６９】
Ｐ１０：ａｇａａａｔｇｇｔｔｔｃｃｔｃａｇａｇｇｔａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｃｃａａｃｔａａａａａｇｇｃｃｃｃａａａａａａａｃｔｇ（配列番号２６）
【００７０】
（２）第２工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第１工程のＰＣＲ産物、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ１１を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００７１】
Ｐ１１：ｔｃｔｃａｃｔａｇｇｇｇａｇａａａｔａｔｔｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔｃｔｔｇａａｃｔｇｔａｇａａａｔｇｇｔｔｔｃｃｔｃａｇａｇ（配列番号２７）
【００７２】
（３）第３工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第２工程のＰＣＲ産物、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ１２を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００７３】
Ｐ１２：ｃａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃａｃｔａｇｇｇｇａｇａａａｔａｔｔｔｔｇ（配列番号２８）
【００７４】
（４）第４工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第３工程のＰＣＲ産物、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ１３を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００７５】
Ｐ１３：ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃ（配列番号２９）
【００７６】
（５）ＮＣＰＴ−２プラスミドの構築
第４工程の結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ４２ａ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異ＴＲＡＩＬ（ＮＣＰＴ−２）の発現プラスミドはＤＮＡシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−２と命名した。
【００７７】
３．組み換えヒト新規円順列変異ＴＲＡＩＬ−３（新規円順列変異ＴＲＡＩＬ−３、ＮＣＰＴ−３と称する）をコードする遺伝子の構築。
Ｎ末端からＣ末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、（ａ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３５〜２８１、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４〜１３５である
【００７８】
【表４】
0005956580.tif 000005
【００７９】
（１）第１工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＴＲＡＩＬ  １３５−２８１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ１４を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００８０】
Ｐ１４：ｇａｇｃｔｇｃｔａｃｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃａｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｃｃａａｃｔａａａａａｇｇｃｃｃｃａａａａａａａｃｔｇ（配列番号３０）
【００８１】
（２）第２工程ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第１工程のＰＣＲ産物、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ６、Ｐ１５を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００８２】
Ｐ１５：ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａ  ｔｇｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｔｔａｔｇｔｇａｇｃｔｇｃｔａｃｔｃｔｃｔｇａｇｇ（配列番号３１）
【００８３】
（３）ＮＣＰＴ−３プラスミドの構築
第２工程のＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ４２ａ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異ＴＲＡＩＬ（ＮＣＰＴ−３）の発現プラスミドはＤＮＡシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−３と命名した。
【００８４】
（実施例４）
ＮＣＰＴ−１、ＮＣＰＴ−２、およびＮＣＰＴ−３の様々な変異体をコードする遺伝子の構築
１．ＮＣＰＴ−１．Ｍ１をコードする遺伝子の構築
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ遺伝子配列を、ＮＣＰＴ−１をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端へ融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ６＋ＮＣＰＴ−１）。
【００８５】
【表５】
0005956580.tif 000006
【００８６】
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ１６、Ｐ９を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００８７】
Ｐ１６：ｃａｔｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｔｃｔｃｃａａ  ａｃｔｃ（配列番号３２）
【００８８】
先行工程の結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ２８ｂ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをＤＮＡシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをｐＥＴ２８ｂ−ＮＣＰＴ−１．Ｍ１と命名した。
【００８９】
２．ＮＣＰＴ−１．Ｍ２をコードする遺伝子の構築
Ｍｅｔ−Ｇｌｙアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端に融合させ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＣ末端に融合させた（ＭＧ＋ＮＣＰＴ−１＋Ｈｉｓ６）。
【００９０】
【表６】
0005956580.tif 000007
【００９１】
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ１８、Ｐ１７を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００９２】
Ｐ１７：ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｔｇｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｔｔａｔｇｔｇ（配列番号３３）
Ｐ１８：ｃａｔｇｃｃａｔｇｇｇｃａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｔｃｔｃｃａａ  ａｃｔｃ（配列番号３４）
【００９３】
先行工程の結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ２８ｂ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをＤＮＡシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをｐＥＴ２８ｂ−ＮＣＰＴ−１．Ｍ２と命名した。
【００９４】
３．ＮＣＰＴ−１．Ｍ３をコードする遺伝子の構築
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチド配列のＮ末端に融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ３＋ＮＣＰＴ−１）。
【００９５】
【表７】
0005956580.tif 000008
【００９６】
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ１９、Ｐ９を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【００９７】
Ｐ１９：ｃａｔｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｃｃａｃｃａｃａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｔｃｔｃｃａａ  ａｃｔｃ（配列番号３５）
【００９８】
先行工程の結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ２８ｂ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをＤＮＡシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをｐＥＴ２８ｂ−ＮＣＰＴ−１．Ｍ３と命名した。
【００９９】
４．ＮＣＰＴ−１．Ｍ４をコードする遺伝子の構築
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ遺伝子配列を、ＮＣＰＴ−１をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端へ融合させた（Ｈｉｓ６＋ＮＣＰＴ−１）。
【０１００】
【表８】
0005956580.tif 000009
【０１０１】
ＰＣＲは、ＰＣＲ装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−１、ならびに添加したｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する下流および上流プライマーとしてのＰ２０、Ｐ９を用いて実施した。１分間の９４℃での変性、１分間の５５℃でのアニーリングおよび１分間の６８℃での伸長の３０サイクル、ならびに１０分間の６８℃での伸長の最終サイクル。
【０１０２】
Ｐ２０：ｃａｔｇｃａｔａｔｇｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｔｃｔｃｃａａ  ａｃｔｃ（配列番号３６）
【０１０３】
先行工程の結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｔ４リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターｐＥＴ４２ａ内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをＤＮＡシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをｐＥＴ４２ａ−ＮＣＰＴ−１．Ｍ４と命名した。
【０１０４】
他の変異体、つまりＮＣＰＴ−１．Ｍ５、ＮＣＰＴ−１．Ｍ６、ＮＣＰＴ−１．Ｍ７、ＮＣＰＴ−１．Ｍ８、ＮＣＰＴ−１．Ｍ９、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１０、ＮＣＰＴ−２．Ｍ１１、ＮＣＰＴ−３．Ｍ１２は、上記の方法および“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”にしたがって構築できる。
【０１０５】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ５の構築：
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を備えるリンカーを使用して融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ６＋ＮＣＰＴ−１＿ｌｉｎｋｅｒ：ＧＳＧＧＧ）。
【０１０６】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ６の構築：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を備えるリンカーを使用して融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ６＋ＮＣＰＴ−１＿ｌｉｎｋｅｒ：ＧＧＳＧＧＧＧ）。
【０１０７】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ７の構築：
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ遺伝子配列をＮＣＰＴ−１をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端へ融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ９＋ＮＣＰＴ−１）。
【０１０８】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ８の構築：
Ｍｅｔ−ＧｌｙおよびＴＲＡＩＬのアミノ酸１２９−１３４をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端に融合させた（ＭＧ＋１２９−１３４＋ＮＣＰＴ−１）。
【０１０９】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ９の構築：
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ遺伝子配列を、ＮＣＰＴ−１をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端へ融合させた（ＭＧ＋Ａｓｎ６＋ＮＣＰＴ−１）。
【０１１０】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１０の構築：
Ｍｅｔ−Ｇｌｙアミノ酸配列をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＮ末端に融合させ、ＴＲＡＩＬのアミノ酸１３６−１４１をＮＣＰＴ−１ポリペプチドのＣ末端に融合させた（ＭＧ＋ＮＣＰＴ−１＋ａａ１３６−１４１）。
【０１１１】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１１の構築：
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ遺伝子配列を、ＮＣＰＴ−２をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−２ポリペプチドのＮ末端へ融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ６＋ＮＣＰＴ−２）。
【０１１２】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１２の構築：
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ遺伝子配列を、ＮＣＰＴ−３をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列をＮＣＰＴ−３ポリペプチドのＮ末端へ融合させた（ＭＧ＋Ｈｉｓ６＋ＮＣＰＴ−３）。
【０１１３】
【表９−１】
0005956580.tif 000010
【表９−２】
0005956580.tif 000011
【０１１４】
（実施例５）
ＴＲＡＩＬの組み換えヒト円順列変異形およびその変異体の発現および精製
発現プラスミドを大腸菌の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換させ、形質転換大腸菌を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１０ｍＬのＬＢ液体培地中に植菌し、３７℃で１２時間にわたり振盪台上で培養した。次に１０ｍＬの培養を２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１ＬのＬＢ液体培地中に植菌して培養し、ＯＤ６００値が０．６に達した時点に、タンパク質発現を誘導するために０．２ｍＬの１ＭのＩＰＴＧを１Ｌの培養に加えた。３時間の誘導後、細胞を遠心により収集し、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１００ｍＬのバッファ中にペレットを懸濁させた。
【０１１５】
細胞を４℃での超音波処理によって溶解させた後、溶解液はＢｅｃｋｍａｎ  ＪＡ２０ロータを備える遠心分離装置で１５，０００ｒｐｍで遠心した。発現したタンパク質は金属キレート樹脂に結合できるので、金属キレートクロマトグラフィによって精製できる。遠心後、上清は樹脂を含有するＮｉクロマトグラフィカラム内にポンプで供給し、その中の夾雑タンパク質は５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、０．５ＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファを用いてすすぎ、除去した。次に結合したタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２００ｍＭのイミダゾールを含有するバッファを用いて溶出させ、溶出したタンパク質はＰＢＳバッファに対して透析した。
【０１１６】
最後に、タンパク質はＡＫＴＡ  ＨＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上に取り付けたイオン交換カラムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）ゲルクロマトグラフィによって精製した。当該精製タンパク質を−８０℃で貯蔵し、その後の使用のために分子量およびアミノ酸配列を決定した。
【０１１７】
（実施例６）
肺癌細胞系へのＮＣＰＴ−１、ＮＣＰＴ−２、およびＮＣＰＴ−３の様々な変異体の死滅活性についてのアッセイ
ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（ＡＴＣＣ）を対数増殖期までフラスコ内で培養し、０．２５％トリプシン（Ａｍｒｅｓｃｏ社）を用いて消化し、遠心によって収集し（１，０００ｒｐｍ、５分間）、３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に再懸濁させ、計数して１．５×１０５／ｍＬの細胞懸濁液に調製し、９６ウエル培養プレート（Ｎｕｎｃ社）内に１００μＬ／ウエルで添加し、３７℃で５％のＣＯ２インキュベータ内で一晩インキュベートした。試験対象のサンプルは、３％のＦＢＳを含有する１６４０培地を用いて所定の濃度へ希釈し、さらに４倍希釈液（８倍希釈液）へ希釈した。培養プレート内の上清を廃棄し、試験対象のサンプルの連続希釈液をプレートに陰性コントロールおよび取り置いたブランクコントロールとともに１００μＬ／ウエルで添加し、３７℃の５％のＣＯ２下で２０〜２４時間インキュベートした。顕微鏡下の検査の後、上清を廃棄し、各ウエルに５０μＬの０．０５％クリスタルバイオレット溶液（５０ｍｇクリスタルバイオレットを２０ｍＬの無水エタノール中に溶解させ、容積が１００ｍＬとなるように水を加え、その後室温で貯蔵した）を加え、３〜５分間染色した。クリスタルバイオレットを流水で注意深く洗浄し、残留水を脱水（ｓｐｉｎ  ｄｒｙｉｎｇ）によって除去し、脱染溶液（５０ｍＬの蒸留水、５０ｍＬの無水エタノール、および０．１ｍＬの氷酢酸を完全に混合し、室温で貯蔵した）を１００μＬ／ウエルで加え、次にＯＤ５７０での示数をマイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ６８０）上で測定した（参照波長：６３０ｎｍ）。各サンプルの阻害濃度５０（ＩＣ５０）は、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  １０．０ソフトウエアを使用する４−パラメータＬｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔｔｉｎｇによって計算した。ＣＰＴならびにＮＣＰＴ−１、ＮＣＰＴ−２、およびＮＣＰＴ−３の各変異体についてのＩＣ５０を計算し、各変異体の活性変化を各変異体のＩＣ５０対ＣＰＴのＩＣ５０の比率として表示した（表１）。結果は、様々な変異体の中で、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１、ＮＣＰＴ−１．Ｍ２、ＮＣＰＴ−１．Ｍ３、ＮＣＰＴ−１．Ｍ４、ＮＣＰＴ−１．Ｍ５、ＮＣＰＴ−１．Ｍ６、ＮＣＰＴ−１．Ｍ７、ＮＣＰＴ−２．Ｍ１１、およびＮＣＰＴ−３．Ｍ１２の活性がＣＰＴの活性より有意に高く、ＮＣＰＴ−１．Ｍ８およびＮＣＰＴ−１．Ｍ９の活性はＣＰＴの活性に比較して有意に減少し、そしてＮＣＰＴ−１．Ｍ１０の活性はＣＰＴの活性に比較してわずかに減少していることを示している。
【０１１８】
【表１０】
0005956580.tif 000012
【０１１９】
（実施例７）
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞死滅における時間効果関係
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１による肺癌細胞系死滅の時間効果関係。Ｈ４６０細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃で５％のＣＯ２インキュベータ内の細胞培養フラスコ中に１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で対数増殖期へ接着培養した。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１を５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度に加え、各々１時間、２時間、４時間および６時間培養し、その後に倒立位相差顕微鏡下で細胞の形態学的変化を観察した。ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）コントロール群では、ビヒクル溶液の添加の６時間後に、細胞傷害の形態学的変化は認められなかった（図１Ａ）。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１添加の１時間後に、Ｈ４６０細胞の著明な形態学的変化は認められなかった（図１Ｂ）。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１添加の２時間後、一部の細胞上では形態学的変化、細胞収縮、細胞膜小胞形成、屈折の減少が生じたが、剥離細胞はまだ希である（図１Ｃ）。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１添加の４時間後、多数の細胞上で上記の形態学的変化が生じるが、剥離細胞は依然として希である（図１Ｄ）。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１添加の６時間後、ほぼ全部の細胞が上記の形態学的変化を示し、フラスコ底部から剥離し、浮遊してペレットに凝集し、少数の正常細胞のみが散在した（図１Ｆ）。より高い倍率では、形態学的変化を備える細胞はアポトーシスに典型的な特徴、細胞質収縮、細胞収縮、膜小胞形成、複数のアポトーシス小体を結果として生じる、を示した（図１Ｅ）。結果は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１の１〜２時間にわたるＨ４６０細胞とのインキュベーションは、形態学的アポトーシスの外観を生じさせ、６時間にわたるインキュベーションは最大数の細胞のアポトーシスを生じさせることを示している。
【０１２０】
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１による多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６の死滅における時間効果関係
多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ）を死滅させることにおけるＮＣＰＴ−１．Ｍ１の時間効果関係は、化学発光（ＡＴＰｌｉｔｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）法を使用して測定した。対数増殖期にある細胞を遠心によって収集し（１，０００ｒｐｍ、５分間）、３％のＦＢＳ−１６４０培地中に再懸濁させ、計数して２×１０５／ｍＬの細胞懸濁液へ調整し、５０μＬ／ウエルで９６ウエル培養プレート内へ添加した。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１サンプルは、３％のＦＢＳ−１６４０培地を用いて５００ｎｇ／ｍＬ、６３ｎｇ／ｍＬ、７．８ｎｇ／ｍＬへ希釈し、上記ＮＣＰＴ−１．Ｍ１サンプルを５０μＬ／ウエルで５０μＬの細胞を含有する培養ウエル内にＮＣＰＴ−１．Ｍ１の最終濃度が２５０ｎｇ／ｍＬ、３１．５ｎｇ／ｍＬ、３．９ｎｇ／ｍＬとなるように加え、陰性コントロールウエルにはＮＣＰＴ−１．Ｍ１を含まない同一容積の培地を加え、上記全部をさらに３７℃の５％のＣＯ２下で培養した。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１を用いた処理の１、３、６、８、２４、４８時間後に、細胞溶解バッファを３０μＬ／ウエルでプレート内に加え、３分間振盪した。細胞が完全に溶解された時点で、細胞溶解液を除去し、９０μＬ／ウエルで化学発光プレート内に加えた。化学発光基質溶液をプレート内に３０μＬ／ウエルで加え、３分間振盪し、その後、示数を測定した。細胞におけるＮＣＰＴ−１．Ｍ１の阻害率は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１処理細胞およびコントロール細胞の発光強度に基づいて計算する。結果は、ＲＰＭＩ８２２６細胞と２５０ｎｇ／ｍＬ、３１．５ｎｇ／ｍＬ、３．９ｎｇ／ｍＬのＮＣＰＴ−１．Ｍ１との１時間のインキュベーションでは、阻害作用は全く観察されない。３時間で、程度の異なる阻害が検出され、正の用量−作用関係にしたがう。６時間で、最大阻害に達し、８、２４、４８時間後の阻害強度と有意に相違しないことを示している（図２）。
【０１２１】
（実施例８）
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシス誘導活性のアッセイ
本実施例ではＮＣＰＴ−１．Ｍ１が様々なヒト腫瘍細胞系に及ぼすアポトーシス誘導活性を検出する。
【０１２２】
１．ヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６のＮＣＰＴ−１．Ｍ１誘導性アポトーシスに関する形態学的観察
ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ）を対数増殖期になるまで細胞培養フラスコ内で培養し、遠心で収集し、１×１０６／ウエルで完全培地（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０）を用いて再懸濁させ、６ウエル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）内に加えた。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１を完全培地で希釈し、２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度に加え、３７℃で５％のＣＯ２インキュベータ内で３時間インキュベートした。細胞を収集し、スメアとして調製し、メタノールを用いて固定し、その後にメイ・グリュンバルト・ギムザ（Ｍａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ：ＭＧＧ、メイ・グリュンバルト染色：Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＺｈｏｎｇＹｅＨｅｎｇＹｕａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から市販、ギムザ染色：Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から市販）染色を実施した。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１と細胞との３時間のインキュベーション後に、アポトーシスの以下の明白な特徴：細胞質凝縮、細胞収縮、クロマチンの濃染、核の周辺でのクロマチン凝集、核凝縮、核崩壊、アポトーシス小体の形成が観察された（図３）。
【０１２３】
２．ヒト肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０のアポトーシスの誘導を示しているＴＵＮＥＬ染色
アポトーシスのプロセス中、ゲノムＤＮＡは、二本鎖の低分子量ＤＮＡフラグメントおよび切断端（ギャップ）を備える高分子量一本鎖ＤＮＡフラグメントに崩壊する可能性があり、これらＤＮＡ鎖のギャップは、酵素標識ヌクレオチド３’末端標識法を用いて同定することができる。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の触媒作用の場合、ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドは、テンプレート非依存性様式でフリー３’末端ヌクレオチドに組み込むことができ、それにより標識されたＤＮＡ鎖のギャップが作成される（ＴＵＮＥＬ法）。標識ＦＩＴＣは、ヒツジ由来Ｆａｂフラグメントに共役結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）によって認識できる。ＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジン）での顕色後、アポトーシス細胞であった褐色として染色された細胞を光学顕微鏡下で検査した。ＴＵＮＥＬの技術は、アポトーシスを検出するための一般的方法である。ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞のＮＣＰＴ−１．Ｍ１とのインキュベーション後のアポトーシスは、ＴＵＮＥＬ技術を使用して検査した。対数増殖期にあるＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０）は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｎｇ／ｍＬ）とともに４時間インキュベートし、次に全部の接着性および浮遊性細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを用いて細胞懸濁液に調製し、スライドガラス上に塗布し、自然に風乾させ、室温で３０分間かけて４％パラホルムアルデヒド中で固定した。その他の手順はＴＵＮＥＬアポトーシス検出キット（ＺＫ−８００５、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の取扱説明書にしたがって実施した。これらの結果は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｎｇ／ｍＬ）との４時間にわたるインキュベーション後に、多数のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞はアポトーシスを経験し、核凝縮、多数の核フラグメントへのフラグメント化、様々なサイズの濃褐色顆粒を示すことを証明している（図４Ｂ）。陰性コントロール群ではアポトーシス細胞は全く見られない（図４Ａ）。
【０１２４】
３．アポトーシス細胞内のヌクレオソーム間ＤＮＡフラグメント化の分析
対数増殖期にあるＮＣＩ−Ｈ４６０細胞をＮＣＰＴ−１．Ｍ１（最終濃度、１５ｍｇ／ｍＬ）とともに２時間、４時間、６時間にわたりインキュベートし、培地コントロール群にはＮＣＰＴ−１．Ｍ１を加えなかった。全接着性および浮遊性細胞（およそ５×１０６）を収集し、ＤＮＡを抽出した（Ｗｅｎ  Ｊｉｎｋｕｎ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２３６−２３７（１９９９））。ＤＮＡサンプルを除去し、６×ローディングバッファと混合し、１．８％アガロースゲル（臭化エチジウムの最終濃度、０．５μｇ／ｍＬ）電気泳動にかけた。ゲルを紫外線源下で観察して撮影し、ＤＮＡフラグメント化について分析した。Ｈ４６０細胞をＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｎｇ／ｍＬ）とともに２時間インキュベートすると、そのＤＮＡ電気泳動は、アポトーシスの主要な生化学的特徴である明瞭なラダーを示した［Ｃｏｈｅｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５０：５５−８５（１９９１）］。これとは反対に、培地コントロール群のＤＮＡ電気泳動では、高分子に対応するバンドはローディングウエルに極めて近く、ＤＮＡフラグメント化ラダーは存在しない。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１とのインキュベーション時間を増加させると、ＤＮＡラダーは弱く曖昧になって判読できなくなるが（図５）、これはおそらくＤＮＡがより小さなフラグメントに分解したためと考えられる。
【０１２５】
４．カスパーゼ−８阻害剤は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１のアポトーシス誘導活性を阻害する。
Ｈ４６０細胞は、１．２ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬのＮＣＰＴ−１．Ｍｌ（培養法は上記と一緒である）とともに２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイによって測定した細胞生存率は各々６０％および１６％であった。３０μｍｏｌ／Ｌのカスパーゼ−８阻害剤であるｚＩＥＴＤ−ｆｍｋ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を加え、１時間後に、１．２ｎｇ／ｍＬもしくは１０ｎｇ／ｍＬのＮＣＰＴ−１．Ｍ１を加えて２４時間、同時インキュベートし、そうして、結果として細胞生存率は各々１００％および９０％であった。結果は、カスパーゼ−８阻害剤がＨ４６０細胞へのＮＣＰＴ−１．Ｍ１のアポトーシス活性の誘導を遮断したことを示しており、カスパーゼ−８の活性化がＨ４６０細胞上のＮＣＰＴ−１．Ｍ１によって誘導されたアポトーシスのシグナル伝達経路に関係していることを示唆している（図６）。
【０１２６】
（実施例９）
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１のｉｎ  ｖｉｖｏでのアポトーシス誘導活性のアッセイ
Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ無胸腺ヌードマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｈｕａｆｕｋａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にヒトＭＭ  ＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍が７００〜８００ｍｍ３の容積に増殖した時点で、マウスをコントロール群（ｎ＝３）およびＣＰＴ処置群（ｎ＝３）に分け、連続３日間にわたり１日１回、１５ｍｇ／ｋｇの用量でコントロールもしくはＮＣＰＴ−１．Ｍ１を腹腔内注射した。第４日に、腫瘍容積を測定し（上記と同一方法）、全動物を致死させ、腫瘍を切除して、１０％ホルムアルデヒド溶液中で固定した。腫瘍組織は、様式化された方法にしたがってパラフィン中に包埋し、切片に切断してＨＥ染色した。パラフィン包埋組織切片のアポトーシスアッセイは、ＴＵＮＥＬアポトーシス検出キット（ＺＫ−８００５、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の取扱説明書にしたがって実施した。連続３日間にわたるＮＣＰＴ−１．Ｍ１を用いた処理後に、平均腫瘍容積は投与前の７９８ｍｍ３から２８６ｍｍ３へ有意に減少した。ＨＥ染色は、凝縮および破砕した青−黒染色の核、ならびに淡赤色の細胞質を備える多数のアポトーシス細胞を示している（図７Ｂ）。これとは反対に、正常細胞の核は、淡青もしくは青色である（図７Ａ）。ＴＵＮＥＬ染色後、アポトーシス細胞の核は茶色に染色される（図７Ｄ）。結果は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１処理により迅速に多数のＭＭ腫瘍細胞のアポトーシスが生じ得ることを示している。
【０１２７】
（実施例１０）
ＮＣＰＴ−１．Ｍ１がヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性
ヒト結腸癌異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性：
４〜５週齢のＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ雄マウス（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にＣＯＬＯ２０５ヒト結腸癌組織片を皮下接種した。腫瘍が約１２０ｍｍ３の容積まで増殖した時点で、担癌マウスを４つの群（ｎ＝７／群）に分け、生理食塩液（陰性コントロール群）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、およびｗｔＴＲＡＩＬ（１５ｍｇ／ｋｇ）を各々１日１回、連続１０日間にわたり腹腔内注射した。投薬停止後、マウスを実験終了前にさらに１２日間観察した。実験中、腫瘍の長い径（ａ）および幅広の径（ｂ）を２日毎にノギスを用いて測定し、腫瘍容積（ＴＶ）を以下の式にしたがって計算した。ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ２。上記から、相対腫瘍容積（ＲＴＶ）は下記の式にしたがって計算した。ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０。式中、Ｖ０は、投与当日であるが投与前（つまりｄ０）に測定した腫瘍容積であり、Ｖｔは、各時点で測定した腫瘍容積である。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は、評価指数として使用する。評価基準：Ｔ／Ｃ（％）＞４０％は作用なしを意味する。Ｔ／Ｃ（％）≦４０％およびＰ＜０．０５の統計的有意性は、有効であることを意味する。
【０１２８】
Ｔ／Ｃ％＝ＲＴＶＴ／ＲＴＶＣ＊１００％（ＲＴＶＴ：治療群のＲＴＶ、ＲＴＶｃ：陰性コントロール群のＲＴＶ）。
【０１２９】
表１１から明らかなように、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１およびｗｔＴＲＡＩＬ群の両方の２つの用量群のＴ／Ｃ（％）は、全部が＜４０％、コントロール群と比較した場合にＰ＜０．０５であり、これはＮＣＰＴ−１．Ｍ１およびｗｔＴＲＡＩＬの両方の２つの用量群がこの腫瘍モデルにおいて有効であることを証明している。１５ｍｇ／ｋｇの用量を用いた場合のｗｔＴＲＡＩＬの有効性は、同一用量を用いたＮＣＰＴ−１．Ｍ１の有効性より有意に弱く（Ｐ＜０．０５）、５ｍｇ／ｋｇの用量を用いたＮＣＰＴ−１．Ｍ１の有効性に匹敵している。
【０１３０】
【表１１】
0005956580.tif 000013
【０１３１】
ヒト多発性骨髄腫の異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性：
無胸腺ヌードマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｈｕａｆｕｋａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に５×１０６のＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞／マウスを皮下接種した。腫瘍が５００ｍｍ３の容積まで増殖した時点で、マウスを幾つかの群に分け、生理食塩液（陰性コントロール群）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、およびｗｔＴＲＡＩＬ（１５ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇ）を各々１日１回、連続８日間にわたり腹腔内注射した。腫瘍容積は、２日毎にノギスを用いて測定した。用量１５ｍｇ／ｋｇを用いたＮＣＰＴ−１．Ｍ１群の腫瘍増殖率は４５ｍｇ／ｋｇを用いたｗｔＴＲＡＩＬ群の腫瘍増殖率に比較して有意に低く、これはＮＣＰＴ−１．Ｍ１の主要素外活性がＲＰＭＩ８２２６に野生型ＴＲＡＩＬが及ぼす阻害活性より強力なことを示唆している（図８）。
【０１３２】
（実施例１１）
化学療法薬と併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１がヒト多発性骨髄腫細胞系に及ぼす阻害活性
本実施例では、化学療法薬メルファラン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）と併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１がヒト多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６、Ｈ９２９、Ｕ２６６Ｂ１（全てＡＴＣＣ由来）に及ぼす腫瘍死滅効果を化学発光（ＡＴＰｌｉｔｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）法を用いて測定したが、このときＲＰＭＩ８２２６およびＨ９２９はどちらもＮＣＰＴ−１．Ｍ１に対して感受性であり、Ｕ２６６Ｂ１はＮＣＰＴ−１．Ｍ１に対して非感受性である。対数増殖期にある細胞を遠心によって収集し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０５〜３×１０５／ｍＬの密度で細胞懸濁液に調製し、１×１０４〜１．５×１０４／ウエルで９６ウエル培養プレート（ＮＵＮＣ）内へ加えた。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１およびメルファランは上記の培地を用いて２倍（または３倍もしくは４倍）連続希釈し、メルファラン（またはＮＣＰＴ−１．Ｍ１）は所定の濃度のＮＣＰＴ−１．Ｍ１溶液（もしくはメルファラン溶液）を用いて希釈し、上記の培養プレート内に添加し、３７℃の５％のＣＯ２インキュベータ内で反応を停止させる前に４８時間インキュベートし、その後に化学発光を検出した。細胞生存率を実験ウエルおよびコントロールウエルの発光強度に基づいて計算し、併用治療の結果は、メジアン有効分析ソフトウエアＣａｌｃｕＳｙｎ  Ｖ２（ＢＩＯＳＯＦＴ社）を使用して分析し、そしてＣＩは併用係数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）を意味する。０．９〜１．１のＣＩは、２種の薬物の相加作用の指標である。ＣＩ＜０．９は２種の薬物の相乗作用の指標であり、そしてＣＩ＞１．１は２種の薬物の拮抗作用の指標である。
【０１３３】
Ｕ２６６Ｂ１は、１μｇ／ｍＬのＮＣＰＴ−１．Ｍ１との４８時間のインキュベーション後にＮＣＰＴ−１．Ｍ１に対して非感受性であり、８０％の細胞が生存していた。しかし、メルファラン（１２．５〜５０μｇ／ｍＬ）の共存在下における細胞生存率（７．０〜６２．４％）はＮＣＰＴ−１．Ｍ１単独（８５．０％）またはメルファラン単独（１１．９〜１００．９％）の細胞生存率より有意に低く、それらの併用が増強された死滅活性を有することを示唆した（図９）。メルファラン（１２．５μｇ／ｍＬ）および様々な濃度のＮＣＰＴ−１．Ｍ１（６３〜１，０００ｎｇ／ｍＬ）をＮＣＰＴ−１．Ｍ１に感受性であるＨ９２９細胞に加えたが、その生存率はメルファラン単独およびＮＣＰＴ−１．Ｍ１単独の生存率より有意に低かった。相乗作用が存在した（０．５６３〜０．８３５のＣＩ指数）（図１０）。同様に、メルファラン（２５ｎｇ／ｍＬ）と様々な濃度のＮＣＰＴ−１．Ｍ１（２〜５００ｎｇ／ｍＬ）との併用を、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１に対して感受性であるＲＰＭＩ８２２６細胞に加えると、相乗作用が観察された（０．０３９〜０．３６８のＣＩ指数）（図１１）。
【０１３４】
（実施例１２）
化学療法薬と併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１がヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性
【０１３５】
メルファランおよびプレドニゾンと併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１がヒト多発性骨髄腫異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性
雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ無胸腺ヌードマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｈｕａｆｕｋａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に５×１０６個のＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞／マウスを皮下接種した。腫瘍が約５００ｍｍ３〜６００ｍｍ３に増殖した時点で、マウスを生理食塩液コントロール群（ｉｐ）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１群（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、連続１０日間にわたり１日１回）、プレドニゾン（１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、連続１０日間にわたり１日１回）と併用したメルファラン群（０．７５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、連続５日間にわたり１日１回）、メルファランおよびプレドニゾンと併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１群に分けた（各薬物の用量、投与方法および投与頻度は上記と同一であった）。腫瘍容積は、２日毎にノギスを用いて測定した。実験終了時に、メルファランおよびプレドニゾンと併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１群の腫瘍容積は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１単剤療法群およびプレドニゾンと併用したメルファラン群の腫瘍容積より有意に少なかった（Ｐ＜０．０５）。これら３種の薬物を併用した場合、腫瘍は５７％のマウスにおいて完全に消失し、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１単剤療法群では、腫瘍は１６％のマウスにおいてのみ完全に消失したが、プレドニゾンと併用したメルファラン群では腫瘍は完全には消失しなかった。結果は、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１、メルファランおよびプレドニゾンの３剤併用がＲＰＭＩ８２２６腫瘍に及ぼす腫瘍阻害作用が有意に増強されることを示唆している（図１２）。
【０１３６】
パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用したＮＣＰＴ−１．Ｍ１がヒト肺癌異種移植片腫瘍に及ぼす阻害作用。
５〜６週齢のＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ無胸腺雄マウス（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌を皮下接種した。腫瘍が約１５０ｍｍ３のサイズに増殖したら、マウスを以下に示す、生理食塩液コントロール群（ｉｐ）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１単剤療法群（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、連続９日間にわたり１日１回）、化学療法群（ＰＣレジメン：パクリタキセル３０ｍｇ／ｋｇ（ｉｐ）およびカルボプラチン６０ｍｇ／ｋｇ（ｉｐ）、第１日に１回投与）、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１併用化学療法群（各薬物の投与様式および用量は上記と同一である）に分けて投与した。実験中、腫瘍の長径（ａ）および幅広の径（ｂ）を２日毎にノギスを用いて測定し、腫瘍容積（ＴＶ）を以下の式にしたがって計算した。ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ２。上記から、相対腫瘍容積（ＲＴＶ）を下記の式にしたがって計算した。ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０。式中、Ｖ０は、投与当日だが投与前（つまりｄ０）に測定した腫瘍容積であり、Ｖｔは、各時点に測定した腫瘍容積である。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は、評価指数として使用する。
【０１３７】
Ｔ／Ｃ％＝ＲＴＶＴ／ＲＴＶＣ＊１００％（ＲＴＶＴ：治療群のＲＴＶ、ＲＴＶｃ：陰性コントロール群のＲＴＶ）。
【０１３８】
表１２から明らかなように、ＮＣＰＴ−１．Ｍ１単剤療法群および化学療法群のＴ／Ｃ（％）は各々４３．９％および３９．８％であり、それらの腫瘍阻害作用はコントロール群と比較して有意に改善される（Ｐ＜０．０５）。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１併用化学療法群のＴ／Ｃ（％）は０．８％であり、これはＮＣＰＴ−１．Ｍ１単剤療法群および化学療法群のＴ／Ｃ（％）より有意に良好である（Ｐ＜０．００１）。ＮＣＰＴ−１．Ｍ１併用化学療法を用いると、腫瘍はマウスの６６．７％において完全に消失するが、他の群では腫瘍は完全には消失せず、これはＮＣＰＴ−１．Ｍ１と化学療法薬との併用が臨床的肺癌を患う患者により強力な作用を有することを示唆している（図１３）。
【０１３９】
【表１２】
0005956580.tif 000014
【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
0005956580.tif 000023
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
0005956580.tif 000027
【配列表】
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