(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）。
【請求項２】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤。
【請求項３】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）を有効成分とするＩｇＥ産生抑制用飲食品組成物。
【請求項４】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）を有効成分とするＩｇＥ産生抑制による免疫調節剤。
【請求項５】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）を有効成分とするＩｇＥ産生抑制による免疫調節用飲食品組成物。
【請求項６】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）を有効成分とするＩｇＥ産生抑制による抗アレルギー剤。
【請求項７】
サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）を有効成分とするＩｇＥ産生抑制による抗アレルギー用飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酵母及びこれを含む医薬及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーとは、免疫反応が、特定の抗原に対して過剰に起こることであり、免疫反応は外来の異物（抗原）を排除するために働く、生体防御反応である。アレルギー反応は、発生機序により大きくＩ型からIV型に分類されている（クームス分類）。Ｉ型アレルギーは、ＩｇＥが肥満細胞や好塩基球に結合し、そこに抗原が結合することにより、これらの細胞がヒスタミン、セロトニンなどのメディエータを放出する。このメディエータの作用により種々の症状が現われる。アレルギー性鼻炎や気管支喘息、じんましん等が含まれる。II型アレルギーは、ＩｇＧが抗原を有する自己の細胞に結合し、それを認識した白血球が細胞を破壊する反応である。III型アレルギーは、免疫反応により形成された免疫複合体が、血流に乗って流れた先で、周囲の組織を傷害する反応である。IV型アレルギーは、抗原と反応した感作Ｔ細胞から、マクロファージを活性化する因子などの様々なサイトカインが遊離し、周囲の組織障害を起こす反応である。
【０００３】
これらのアレルギー疾患に対しては、抗ヒスタミン剤、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制剤、各種サイトカイン抑制剤等の合成医薬品が開発されている。しかし、これらの医薬品には、多くの副作用が生じることから、天然物由来の抗アレルギー剤が注目されている。
【０００４】
そのような天然物由来の生理活性成分としては、酵母由来成分ＮＢＧ（特許文献１）、サッカロマイセス属に属する酵母の水溶性画分を除去して免疫調節剤を製造する方法（特許文献２）、酵母や乳酸菌による大豆発酵物（特許文献３）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００３／０３９５６７号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−２９１００６号公報
【特許文献３】特開２００７−１９７３３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これらの酵母由来成分や大豆発酵物の薬理作用は十分なものではなく、さらに新たな素材及びその利用が望まれていた。
従って、本発明の課題は、アレルギー症状の原因となるＩｇＥの産生を抑制したり、有用なサイトカインの産生を促進することにより種々の免疫疾患の予防及び治療に有用な天然素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、木曽町に存在する種々の天然物から新規な酵母を単離し、その薬理作用を検討してきたところ、サッカロマイセス属に属する７種の酵母が、ＩＬ−１２産生促進作用、ＩＦＮ−γ産生促進作用及びＩｇＥ産生抑制作用を有し、免疫調節作用に基づき、種々の免疫疾患、特に種々のアレルギー疾患の予防、治療用の医薬又は飲食品として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する木曽酵母Ｓ０３（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｐ０２（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０１（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２）、サッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０４（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５）又はサッカロマイセス・パラドクサスに属する木曽酵母Ｓ０５（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９６）。
〔２〕〔１〕記載の酵母を含有する医薬又は飲食品。
〔３〕〔１〕記載の酵母を含有する免疫調節剤。
〔４〕〔１〕記載の酵母を含有する抗アレルギー剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の酵母を用いれば、ＩＬ−１２やＩＦＮ−γが関与するか、ＩｇＥが関与する種々の免疫疾患の予防又は治療が可能である。また本発明の酵母は、天然由来であり、医薬だけでなく、各種の食品及び飲料に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウス脾臓細胞のＩｇＥ産生に及ぼす木曽酵母添加の影響を示す。**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図２】マウス脾臓細胞のＩＬ−１２産生に及ぼす木曽酵母添加の影響を示す。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図３】マウス脾臓細胞のＩＦＮ−γ産生に及ぼす木曽酵母添加の影響を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の酵母（木曽酵母）は、いずれもサッカロマイセス属に属するが、Ｓ０２及びＳ０３はサッカロマイセス・セレビシエに属し、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｓ０１、Ｓ０４及びＳ０５はサッカロマイセス・パラドクサスに属する。これらの木曽酵母は、長野県木曽町内より収集した花、果実、葉又は土壌から採取したものである。
【００１２】
花、果実、葉又は土壌から木曽酵母を採取するには、例えば麹汁培地での集積培養を行い、発泡が認められた試料について２〜５％エタノール添加培地で嫌気培養し、さらに発泡が認められた試料を寒天培地で培養してコロニーを単離することにより行うことができる。
【００１３】
得られたコロニーの特定は、酵母様真菌判定試験（ＡＰＩ  ＩＤ  ３２Ｃによる３１種類の炭素源資化試験）により、サッカロマイセス属であることを確認することができる。
【００１４】
これらの酵母が、サッカロマイセス属のセレビシエ又はパラドクサスに属することは、２６ＳｒＤＮＡ  Ｄ１／Ｄ２領域の遺伝子解析及び国際塩基配列データベースとの相同性検索及び簡易分子系統樹解析により行った。
【００１５】
得られた７種の酵母は、木曽酵母Ｐ０１をＮＩＴＥ  Ｐ−１２９０、木曽酵母Ｐ０２をＮＩＴＥ  Ｐ−１２９１、木曽酵母Ｓ０１をＮＩＴＥ  Ｐ−１２９２、木曽酵母Ｓ０３をＮＩＴＥ  Ｐ−１２９３、木曽酵母Ｓ０４をＮＩＴＥ  Ｐ−１２９４、木曽酵母Ｓ０５をＮＩＴＥ  Ｐ−１２９５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託した。
【００１６】
本発明の酵母は、後記の実施例に示すように、優れたＩｇＥ産生抑制作用を有し、また、ＩＬ−１２産生促進作用及びＩＦＮ−γ産生促進作用を有する。
ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ誘導因子であり、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞を活性化させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導することが知られている。またナイーブヘルパーＴ細胞をＩ型ヘルパー
Ｔ細胞（Ｔｈ１）細胞に分化誘導させる。ＩＦＮ−γは、主にＣＤ４陽性のＩ型ヘルパー
Ｔ細胞（Ｔｈ１）細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞から産生される。ＩＦＮ−γは、II型のヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）を抑制することでＩｇＥの産生を抑制する
作用も有し、またマクロファージの活性化作用、マクロファージによる一酸化窒素産生向上作用などを有することが知られている。従って、本発明の酵母は、免疫調節剤として有用であり、種々の免疫疾患、特にアレルギー疾患の予防治療剤として有用である。ここで対象となる好ましいアレルギー疾患としては、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、アレルギー性下痢症、気管支喘息、じんましん、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎等のＩ型アレルギーが挙げられる。
【００１７】
本発明の酵母を免疫調節剤として使用する場合、経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が望ましい。投与に関しては、有効成分である酵母菌体を投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００１８】
本発明の免疫調節剤の有効成分である木曽酵母を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量は木曽酵母については菌体重量で１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜１ｇである。
【００１９】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２０】
また、本発明の酵母及び免疫調節剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明の酵母をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、種々の免疫疾患に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明の酵母を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物用の飼料も含まれる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【００２２】
実施例１
〔方法〕
（１）酵母の分離源として、長野県木曽町内より収集した花・果実・葉、土壌を含む環境資源を試料として用いた。
（２）酵母分離用の試料を麹汁培地（乾燥米麹に対し４倍容の蒸留水を加えたものを、５６℃で６〜７時間保温することで高温糖化処理し、遠心分離（３，０００×ｒｐｍ、１０分間）後の上清に２％乳酸、０．２％プロピオン酸ナトリウム、０．０１％クロラムフェニコールを添加してオートクレーブ滅菌処理を行ったもの）に添加し、１週間程度の好気培養を行った。
（３）発泡が認められた試料について、さらに２９℃条件下で２〜５％エタノールを添加したＹＰＳ培地（２％スクロース、１％乾燥酵母抽出物、２％ペプトン、０．２％プロピオン酸ナトリウム、０．０１％クロラムフェニコール、ｐＨ５．８）中での嫌気培養を行った。さらに発泡が認められた試料について、その培養液をＹＰＤ培地（２％Ｄ−グルコース、１％乾燥酵母抽出物、２％ペプトン、０．２％プロピオン酸ナトリウム、０．０１％クロラムフェニコール、ｐＨ５．８）に１．５％寒天を添加した寒天培地に播きこんでコロニーの単離を行った。
（４）単離した酵母によるコロニーについて、Ｋｕｒｔｚｍａｎら（２０１１）のＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ−ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ａｇａｒ（ＹＭ）寒天平板培地上で２５℃好気培養下、培養３日目のコロニーについて、周縁の形状、隆起状態、表面の形状、光沢および性状、色調の形態学的観察を行った。
（５）単離した酵母の栄養細胞について、ＹＭ寒天平板培地上で２５℃好気培養下、培養３日目の栄養細胞を光学顕微鏡観察し、形状および出芽の有無について確認を行った。また、ＹＭ寒天平板培地上で２５℃下、培養３週間目の栄養細胞における子嚢胞子の形成の有無について確認を行った。
【００２３】
（６）酵母の炭素源資化性は、ＡＰＩ  ＩＤ  ３２Ｃ酵母様真菌同定キット（シスメックス・ビオメリュー社製）を用い、３１種の炭素源（ガラクトース、シクロヘキシミド、白糖、Ｎ−アセチル−グルコサミン、乳酸、Ｌ−アラビノース、Ｄ−セロビオース、ラフィノース、Ｄ−マルトース、トレハロース、２−ケト−グルコン酸カルシウム、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、Ｄ−マンニトール、乳糖、イノシット、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、グリセロール、Ｌ−ラムノース、パラチノース、エリスリトール、Ｄ−メリビオース、グルクロン酸ナトリウム、Ｄ−メレチトース、グルコン酸カリウム、レブリン酸、ブドウ糖、Ｌ−ソルボース、Ｄ−グルコサミン塩酸塩、エスクリン）に対する４８時間後の資化性パターンをみた。得られた資化性パターンの結果に基づく菌種判定は、Ａｐｉｗｅｂ  ＩＤ  ３２Ｃ  Ｖ３．０データベースアクセスサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｉｗｅｂ．ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｌｅｔ／Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅ？ａｃｔｉｏｎ＝ｐｒｅｐａｒｅＬｏｇｉｎ）に入力して行った。
【００２４】
（７）酵母の菌種同定は、２６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｄ１／Ｄ２領域の遺伝子配列解析を行い、アポロンＤＢ−ＦＵ５．０（テクノスルガ社）ならびに国際塩基配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）との相同性検索および簡易分子系統樹解析により行った。
【００２５】
〔結果〕
（１）木曽酵母Ｐ０１はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・パラドクサスに属する菌株であることが明らかとなった。
【００２６】
（２）木曽酵母Ｐ０２はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、マルトース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・パラドクサスに属する菌株であることが明らかとなった。
【００２７】
（３）木曽酵母Ｓ０１はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・パラドクサスに属する菌株であることが明らかとなった。
【００２８】
（４）木曽酵母Ｓ０２はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・セレビシエに属する菌株であることが明らかとなった。
（５）木曽酵母Ｓ０３はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・セレビシエに属する菌株であることが明らかとなった。
【００２９】
（６）木曽酵母Ｓ０４はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、乳酸、ラフィノース、マルトース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、α−メレチトース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・パラドクサスに属する菌株であることが明らかとなった。
【００３０】
（７）木曽酵母Ｓ０５はＹＭ寒天培地上で３日間培養した際に、全縁で周縁部は扁平の形状をしたクッション型の白色からクリーム色のコロニーを形成した。また、培養３週間目の栄養細胞は亜球形から広楕円形の形状を示し、多極出芽による増殖が認められたほか、子嚢に２〜４個の亜球形の子嚢胞子の形成が認められた。本種はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｃ炭素源資化性試験において、ガラクトース、スクロース、ラフィノース、マルトース、α−メチル−α−Ｄ−グルコシド、パラチノース、α−メレチトース、グルコースを資化する特性を有し、遺伝子解析の結果サッカロマイセス・パラドクサスに属する菌株であることが明らかとなった。
【００３１】
実施例２
〔方法〕
（１）分離された菌株はＹＰＤ培地を用いて２９℃で培養した。増殖を確認後、培養液を遠心分離（３０００×ｒｐｍ、１０分間）して沈殿物を得た。得られた沈殿物から培地成分を除去するために超純水で２回遠心洗浄を行った。この沈殿物を−８０℃で保存し、凍結乾燥を行った。
【００３２】
（２）頸椎脱臼により安楽死させたＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（日本エスエルシー社）より脾臓を無菌的に摘出した後、ＲＰＭＩ  １６４０培地（日水製薬社製）中で脾臓細胞を取り出した。２０００×ｒｐｍで１０分間遠心後、赤血球溶血用緩衝液（１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１４４  Ｍ塩化アンモニウム、ｐＨ７．２）に懸濁させた。５分経過後、ＲＰＭＩ  １６４０培地を加え、２０００×ｒｐｍで１０分遠心洗浄して上清を除去した後、細胞を１０％非働化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。９６ウェル培養用マイクロプレート（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ社製）を用い、脾臓細胞浮遊液１００μｌ／ｗｅｌｌに酵母菌株を１００μｌ／ｗｅｌｌ（終濃度１０μｇ／ｍｌ（サイトカイン量測定時）および１００μｇ／ｍｌ（抗体量測定時）で添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。測定のためのサイトカイン及び抗体は、それぞれ培養３日目及び７日目の培養上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡに供した。
【００３３】
（３）脾臓細胞培養上清中のＩｇＥ量測定は、固層抗体としてＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ（Ｂｅｔｈｙｌ社製）、検出用抗体としてＧｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。それぞれ１次抗体は０．１  Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解させ、９６−ｗｅｌｌ  Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌで添加して３７℃で９０分間静置した。その後Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、１％スキムミルクを添加した炭酸緩衝液を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で一晩静置した。その後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄し、各サンプル液ならびにスタンダードとして抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）マウスＩｇＥ抗体（Ｓｉｇｍａ）をＴ−ＰＢＳで段階希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で６０分間反応させた。その後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、遮光下で検出用抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄し、遮光下でＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）により発色させた。発色後、１００μｌのリン酸を加えて反応を停止させ、Ｍｏｄｅｌ  ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３４】
（４）脾臓細胞培養上清中のＩＬ−１２の測定は、固層抗体としてＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ７０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、検出用抗体としてＢｉｏｔｉｎ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ７０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。またＩＦＮ−γの測定には、固層抗体としてＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、検出用抗体としてＢｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰと組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。それぞれ１次抗体は０．１  Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解させ、９６−ｗｅｌｌ  Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  ＭａｘｉＳｏｒｐに１００μｌ／ｗｅｌｌで添加して３７℃で９０分間静置した。その後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、１％スキムミルクを添加した炭酸緩衝液を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で一晩静置した。その後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄し、各サンプル液ならびにスタンダードとしてＩＬ−１２にはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＬ−１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を、ＩＦＮ−γにはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＦＮ−γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をＴ−ＰＢＳで希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で６０分間反応させた。その後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、遮光下で２次抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰを１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、３０分間反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄し、遮光下でＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍより発色させた。発色後、１００μｌのリン酸を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ  ５５０を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３５】
〔結果〕
（１）抗体産生量に関して、木曽酵母Ｐ０１、Ｐ０２および木曽酵母Ｓ０１、Ｓ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ｓ０５のすべてについて、添加時のＩｇＥ産生量の有意な減少が確認された（図１）。このことは本発明酵母の作用により、ＩｇＥとマスト細胞との相互作用によって誘導される脱顆粒反応が抑制されることを意味する。
【００３６】
（２）サイトカイン産生量に関して、木曽酵母Ｐ０１、Ｐ０２および木曽酵母Ｓ０１、Ｓ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ｓ０５のすべてについて、添加時のＩＬ−１２産生量の有意な増加が確認された（図２）。また木曽酵母Ｓ０３について、添加時のＩＦＮ−γ産生量の有意な増加が確認された（図３）。
【００３７】
ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）１型とＴｈ２型の免疫応答は、お互いが相手を抑制する拮抗状態を保つことで、生体での免疫応答のバランスを形成していることが知られており、Ｔｈ１型免疫応答を誘導するＩＬ−１２やＩＦＮ−γは、Ｔｈ２型の免疫応答を抑制して生体の免疫応答をＴｈ１型に誘導する。近年先進国で増加している即時型（その中でもＩ型）アレルギー増加の一因には、Ｔｈ２型免疫応答の有意な免疫応答で、ＩｇＥ抗体が多く産生されることが関係しているとされている。本発明酵母はＴｈ１型のサイトカインが誘導し、ＩｇＥ抗体産生を含むＴｈ２型の免疫応答の抑制が抑制することで抗アレルギー作用を発揮することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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