(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にキメラポリペプチドの複数のコピーを提示する組換え型バクテリオファージであって、前記ポリペプチドが少なくとも以下：
a) 繊維状バクテリオファージのコートタンパク質または前記バクテリオファージの表面発現されることが可能なその機能性断片および
ｂ）配列番号２から成る細菌性接着タンパク質ＦｉｍＨの免疫原性ドメイン
を含む組み換え型バクテリオファージであって、
前記コートタンパク質が、コートタンパク質ｐＶＩＩＩであり、
細菌性接着タンパク質ＦｉｍＨの免疫原性ドメインが、レクチン結合ドメインである、
組み換え型バクテリオファージ。
【請求項２】
前記繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１の群に属する、請求項１に記載の組換え型バクテリオファージ。
【請求項３】
前記ドメインが、配列番号２の２４〜１７９位のアミノ酸断片である、請求項１または２に記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
前記ドメインが、配列番号２の６６〜１８０位のアミノ酸断片である、請求項１または２に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記キメラポリペプチドが、そのコートタンパク質またはその断片と細菌性接着タンパク質ＦｉｍＨの免疫原性ドメインとの間にリンカーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。
【請求項６】
前記キメラポリペプチドが、アフィニティータグを含む、請求項1から５のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。
【請求項７】
組換え型バクテリオファージの核酸配列が配列番号３からなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。
【請求項８】
医薬として使用されるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え型バクテリオファージ。
【請求項９】
尿路感染症（ＵＴＩ）に対する免疫原として使用されるための、請求項８に記載の組換え型バクテリオファージ。
【請求項１０】
生理学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせた、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え型バクテリオファージを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
体液性および／または細胞性免疫応答を誘発できる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
尿路感染症（ＵＴＩ）に対するワクチン接種に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組換え型バクテリオファージが、ビヒクルと組み合わされる、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の尿路感染症（ＵＴＩ）の予防および、または治療に使用されるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージを含むワクチンに関しており、このファージは、その表面に、外因性のポリペプチドを、コートタンパク質ｐＶＩＩＩとの融合体として提示するように操作されている。このような外因性のポリペプチドは、特に、細菌性接着タンパク質ＦｉｍＨのドメインである。
【背景技術】
【０００２】
尿路感染症は、広く蔓延している、ヒトに発生する細菌性疾患に属する（Ｈｏｏｔｏｎら、１９９７年）。これらの感染の主要な原因物質は、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である（Ｓｔａｍｍ、２００４年）。最近の研究で、再発性感染は、糞便細菌叢および膣内細菌叢からのみでなく、膀胱上皮細胞内の細胞内細菌集団（ＩＢＣ）からも発生しうることが明らかとなった（Ｍｙｓｏｒｅｋａｒら、２００６年；Ｇａｒｏｆａｌｏら、２００７年；Ｒｅｉｇｓｔａｄら、２００７年）。ＩＢＣによるバイオフィルム形成により、細菌は、宿主免疫応答および抗生物質処理に対して生存することが可能になる。
【０００３】
再発性ＵＴＩに利用可能なワクチンは、完全不活化細菌細胞で処方され、経口投与（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９９３年）、または腟内投与（Ｐａｍ、２００２年；Ｈｏｐｋｉｎｓら、２００７年）される。このタイプのワクチンは、成果に限界があり（Ｎａｂｅｒら、２００８年）、改善の必要があると考えられる。不活化ワクチンＵｒｏ−Ｖａｘｏｍ（登録商標）（ＯＭ−Ｐｈａｒｍａ（コピーライト））およびＳｏｌｃｏ−Ｕｒｏｖａｃ（登録商標）（ＳｏｌｃｏＢａｓｌｅ（コピーライト））は、ＦＤＡ（食品医薬品局）による承認が得られていない。１９９７年に、Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎは、細菌性接着タンパク質ＦｉｍＨをベースとした組換え型ワクチンが、疾患マウスモデルの感染症を効果的に遮断することを示した（Ｌａｎｇｅｔｍａｎｎ  Ｓら、１９９７年）。また、組換え型ＦｉｍＨの使用は、ＣｐＧをアジュバントとして含む合成オリゴヌクレオチドと一緒に使用する場合に、鼻腔内ワクチン接種により、高レベルのＩｇＡを誘導する効率的な方法でもある（Ｐｏｇｇｉｏ  ＴＶ  ら、２００６年）。
【０００４】
著者らは、接着タンパク質ＦｉｍＨのマンノース結合レクチンドメインを提示する繊維状ファージベースワクチンを開発した。短ペプチドを提示する繊維状ファージの良好な免疫原性特性は、よく知られている（Ｍｉｎｅｎｋｏｖａ  ＯＯら、１９９３年；Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＥら、１９９３年；Ｌｉｄｇｖｉｓｔら、２００８年；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｍら、２００８年）。さらに、抗原性ポリペプチドの非常に多くのコピーを提示している繊維状ファージは、ポリマー型ウイルス様ファージ粒子構造のために、特定のアジュバントの添加がなくても、免疫応答を誘発することができる（Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＥら．、１９９３年）。
【０００５】
バクテリオファージは、細菌細胞中でのみ増殖し、ヒト生物体中には利用可能な宿主細胞がない（Ｃｌａｒｋ  ら、２００４年）。ファージワクチン接種の安全性は、先天性および２次性の両方の免疫不全疾患のモニタリングのための、大腸菌ファージφＸ１７４の長期間適用により、確認できる（Ｏｃｈｓら、１９７１年；Ｗｅｄｇｗｏｏｄら、１９７５年；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９８５年）。事実、３０年以上の間、φＸ１７４は、臨床的医学における体液性免疫評価のための標準的抗原の１つと考えられている（Ｂｅａｒｄｅｎら、２００５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｙｓｏｒｅｋａｒら、２００６年
【非特許文献２】Ｇａｒｏｆａｌｏら、２００７年
【非特許文献３】Ｒｅｉｇｓｔａｄら、２２０７年
【非特許文献４】Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９９３年
【非特許文献５】Ｐａｍ、２００２年
【非特許文献６】Ｈｏｐｋｉｎｓら、２００７年
【非特許文献７】Ｎａｂｅｒら、２００８年
【非特許文献８】Ｌａｎｇｅｔｍａｎｎ  Ｓら、１９９７年
【非特許文献９】Ｐｏｇｇｉｏ  ＴＶら、２００６年
【非特許文献１０】Ｍｉｎｅｎｋｏｖａ  ＯＯ  ら、１９９３年
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＥら、１９９３年
【非特許文献１２】Ｌｉｄｇｖｉｓｔ  Ｍら、２００８年
【非特許文献１３】Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｍ  ら、２００８年
【非特許文献１４】Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＥ  ら、１９９３年
【非特許文献１５】Ｃｌａｒｋ  ら、２００４年
【非特許文献１６】Ｏｃｈｓ  ら、１９７１年
【非特許文献１７】Ｗｅｄｇｗｏｏｄ  ら、１９７５年
【非特許文献１８】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ら、１９８５年
【非特許文献１９】Ｂｅａｒｄｅｎら、２００５年
【発明の概要】
【０００７】
本出願で、発明者は、ＦｉｍＨドメインが、主要コートタンパク質ＶＩＩＩとの融合体として、繊維状ファージの表面上に効率的に提示されることを示している。好ましくは、提示効率を改善するためおよび組換え型ファージの収率を向上させるために、発明者は、１１４アミノ酸のＦｉｍＨドメインをクローニングし、本発明の態様のファージを得て、ｐＳＴＭ２７と命名した。前記ＦｉｍＨドメインは、依然として、膀胱上皮細胞に接着するために結合部位を形成するほぼ全てのアミノ酸残基を含んでいた。発明者は、前記ｐＳＴＭ２７型ファージ粒子が長期保存に対し安定（４℃で１年以上）で、提示ポリペプチドの分解または抗ＦｉｍＨ血清との特異的反応性の低下もなく、ＣｓＣｌ勾配による精製に耐えることを発見した。
【０００８】
得られたファージｐＳＴＭ２７を、マウス免疫化に使用した。鼻腔内および筋肉内免疫化経路を使用して、げっ歯類にｐＳＴＭ２７ファージをワクチン接種した。鼻腔内ワクチン接種は、バクテリオファージ単独で、筋肉内接種はフロイントアジュバント、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび対照の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドと組み合わせて、実施した。
【０００９】
その結果、鼻腔内ワクチン接種した動物中の高い血清レベルの抗ＦｉｍＨ  ＩｇＧが、ならびに、筋肉内および鼻腔内の免疫化後、マウスの腟洗浄物中のＦｉｍＨタンパク質に対する特異的ＩｇＡの存在が示された。さらに、組換え型ワクチンは、臨床的ＵＰＥＣ株(すなわち、鼻腔内免疫化マウスにおけるＰＴ２７の実験室採集に由来する)による膀胱のインビボコロニー形成を１０倍低減させた。
【００１０】
さらに、バクテリオファージベースワクチンは、下記のいくつかの重要な利点があると考えられる：
１．安価な生産、
２．成長培地に動物由来物質が不要であること、
３．ファージ調製物は、４℃で長時間安定である、
４．ファージは、ヒトウイルスとは生物学的に異なり、哺乳動物に感染できないこと、
５．ファージの物理的構造は、ウイルスと類似であり、アジュバントとして機能し、ワクチン成分に対する応答が増加すること、
６．ポリクローナルワクチンは、容易に調製可能であること。
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の１つの重要な目的は、その表面に複数のキメラポリペプチドのコピーを提示し、前記キメラポリペプチドが少なくとも以下を含む組み換え型バクテリオファージである：
a) 繊維状バクテリオファージのコートタンパク質または前記バクテリオファージの表面発現されることが可能なその機能性断片および
b)前記繊維状バクテリオファージが好ましくはＭ１３、ｆｄおよびｆ１の群に属する、配列番号２から成る細菌接着タンパク質ＦｉｍＨの免疫原性ドメイン。
【００１２】
好ましくは、コートタンパク質はコートタンパク質pＶＩＩＩである。
【００１３】
好ましくは、バリテリア接着タンパク質ＦｉｍＨの免疫原性ドメインは、レクチン結合ドメイン、さらに好ましくは前記ドメインは、配列番号２の２４〜１７９位のアミノ酸断片または配列番号２の６６〜１８０位のアミノ酸断片である。
【００１４】
前記キメラポリペプチドは、好ましくは、コートタンパク質またはその断片と細菌接着タンパク質ＦｉｍＨの免疫原性ドメイン間のリンカーを含む。
【００１５】
前記キメラポリペプチドは、好ましくはアフィニティータグを含む。
【００１６】
好ましくは、本発明の前記組み換え型バクテリオファージは、配列番号３に必須に存在する核酸配列を有する。
【００１７】
従って、本発明の目的は、新規に操作された本発明のバクテリオファージであり、これは外来ポリペプチドを含み：前記ポリペプチドは抗原性、例えば、所望の免疫学的な応答を高めるポリペプチドであり、（特に、尿路病原性大腸菌（Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｅ．  ｃｏｌｉ：ＵＰＥＣ）としてのＵＴＩ病原体に対して）抗原性であるべきである。その長さは、応答を高めるのに充分であるが、バクテリオファージの特性を望ましくないように改変するには不十分であるか、または、その組み込みを妨げるには不十分であるべきである。本発明のバクテリオファージは、免疫原性であり、ワクチンとして、および、通常、治療／診断用製品としての使用に適するのが好ましい。従って、本発明の製品は、いずれかの生理学的に許容可能な適切な希釈剤または担体を用いて処方され、ワクチン組成物を調製し得る。
【００１８】
本発明の複合型ファージは、好ましくは各ウイルス粒子上に提示される外因性のポリペプチドのコピーの数を広い範囲内で制御可能にし、非常に高い感受性を付与することができる。
【００１９】
周知のように、繊維状バクテリオファージの主要コートタンパク質、好ましくは、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１は、遺伝子ＶＩＩＩによりコードされている。前記タンパク質は、成熟タンパク質のＮ末端に結合した２３アミノ酸のリーダーペプチドを含むプロコートとして合成される。合成後、プロコートタンパク質は、大腸菌の内膜に迅速に挿入され、そこでプロセッシングされて、膜貫通する５０アミノ酸の成熟コートタンパク質となる。このタンパク質は、３つのドメイン、すなわち、疎水性の膜貫通のドメイン、細胞の細胞質側に面する正に帯電したＣ末端ドメイン、および周辺質に伸びる負に帯電したＮ末端ドメイン、を有する。ウイルス粒子のアッセンブリーの間、コートタンパク質サブユニットは、細胞膜から突き出て、ウイルスＤＮＡの周りでらせん状配列に整列する。ウイルス粒子中では、タンパク質サブユニットのＣ末端領域は、ＤＮＡに向かって内側を向き、それにより、正に帯電した残基は、糖リン酸塩骨格の負の電荷を中和し得る。対称的に、Ｎ末端ドメインは、粒子の外表面上にあり、そこで、環境に曝される。核磁気共鳴調査により、この領域は、膜結合型のタンパク質中でも、ファージ粒子の外側に存在する場合でも、柔軟性があることが明らかになった。本発明では、外因性のポリペプチドが主要ファージコートタンパク質のアミノ末端に融合され、ウイルス粒子中に首尾よく組み込まれる伸長コートタンパク質を生成し、顕著な免疫応答を誘発する。この結合は、直接的または一つもしくは複数の適するリンカーを介する。
【００２０】
従って、本発明の好ましい実施形態では、選択されたＦｉｍＨドメインは、（ＳＧＧＧＧ）３Ｓ（配列番号）１５フレキシブルリンカーを使用して繊維状バクテリオファージＭ１３（ｐＶＩＩＩ）の主要コートタンパク質のＮ末端ドメイン中に挿入され、それにより、アッセンブリーされたファージ粒子の外側を修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅ）する。
【００２１】
このファージの調製は、遺伝子ＶＩＩＩ中の制限酵素認識部位を使用する組換え型ファージを操作し、所望のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ断片を直接ファージゲノム中に挿入可能にすることを可能にすることにより、完全にＤＮＡレベルで処理され得る。しかし、制御された手順でこの結果を達成するためには、複合コートタンパク質の合成とファージ粒子のアッセンブリーが別々であり得ることが好ましい。このことは、新規コートタンパク質コンストラクトのクローニングおよび発現、ならびにファージアッセンブリーの膜への挿入およびパッケージング状態が、独立したステップとして実行されることを可能にする。
【００２２】
Ｍ１３コートタンパク質遺伝子の独立した発現を可能とするために、遺伝子ＶＩＩＩは、制御可能な発現ベクターのファージミド中にサブクローニングされ得る。しかし、野性型遺伝子ＶＩＩＩは、（エピトープをコードするために使用される）オリゴヌクレオチドカセットの挿入に適する制限酵素部位を含んでいない。従って、前記遺伝子のサブクローニングの前に、部位特異的変異誘発によって適切な部位を導入し得る。
【００２３】
本発明の複合型バクテリオファージの調製では、中間生成物は、改変をコードするプラスミドである。このようなプラスミドの損失を防ぐために、操作コートタンパク質が、パッケージングシグナルと共に、ファージ、ファージミドまたは他のレプリコン中に移入されることが好ましい。その後、組換え型遺伝子は、パッケージングされ、さらなる複製のために選択することができる。
【００２４】
好ましくは、本発明の操作ファージは、繊維状バクテリオファージであり、さらに好ましくは、Ｍ１３または関連ファージミドである。
【００２５】
Ｍ１３は、約２７００コピーの主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩ中に封入され、５コピーの４つの異なる副次的なコートタンパク質（ｐＩＸ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩ、ｐＩＩＩ）で端をキャッピングされた、６４０７ヌクレオチド長の環状１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）からなる繊維状バクテリオファージである（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｖ００６０４）。副次的なコートタンパク質ｐＩＩＩは、宿主大腸菌のＦ線毛の先端にある受容体に付着する。繊維状ファージの感染は、致死ではないが、感染により大腸菌中の濁りプラークを引き起こされる。それは非溶解性ウイルスである。しかし、細胞増殖速度の低下が、感染細胞で認められている。Ｍ１３プラスミドは、多くの組換えＤＮＡプロセスで使用されており、ウイルスもまた、ナノ構造およびナノテクノロジーでの使用のための研究が行われている。
【００２６】
ファージコートは、主に、ｐＶＩＩＩ（またはＰ８）と呼ばれる５０アミノ酸タンパク質から構築されており、これは、ファージゲノム中の遺伝子ＶＩＩＩ（またはｇ８）によりコードされている。野性型Ｍ１３粒子に対しては、約９００ｎｍ長のコート外皮を作るのに約２７００コピーのｐＶＩＩＩを要する。コート径は、柔軟性があるが、ｐＶＩＩＩのコピー数を調節して、パッケージングする単鎖ゲノムのサイズに合わせて収容する。例えば、ファージゲノムが変異してＤＮＡ塩基の数を減らした場合（６．４ｋｂから２２１ｂｐへ）、ｐＶＩＩＩコピーの数を１００より少ない数に減らしてｐＶＩＩＩコートを縮め、それにより、短くなったゲノムに適合させる。ファージは、天然ＤＮＡ含量の約２倍に制限されているようである。しかし、ファージタンパク質（ｐＩＩＩ）の欠失が、宿主大腸菌から完全に抜け出すのを防ぎ、ファージゲノムのいくつかのコピーを有する通常の１０〜２０倍の長さのファージが大腸菌宿主から排出されるのが認められる。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、医薬として使用される、特に、尿路感染に対する免疫原として使用される、本発明の組換え型バクテリオファージである。
【００２８】
本発明の他の目的は、生理学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせた、本発明の組換え型バクテリオファージを含む医薬組成物であり、前記医薬組成物は、好ましくは体液性および/または細胞性免疫応答を誘発する。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、尿路感染(utenary tract infection:UTI)に対するワクチン接種のために使用される前記医薬組成物である。
【００３０】
前記医薬組成物は、さらなるアジュバントを含み得る。
【００３１】
前記組換え型バクテリオファージは、好ましくは、前記医薬組成物中のビヒクルと組み合わせる。
【００３２】
本発明の他の目的は、ヒトまたは動物において、尿路感染症(UTI)の予防およびまたは治療のために使用される本発明の医薬組成物である。
【００３３】
本発明のさらに重要な態様では、発現でき、生物体の抗原提示細胞の表面上に提示できるポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、前記したバクテリオファージ粒子を含むワクチン製剤を提供し、それにより、前記ポリペプチドに対する生物体の免疫応答が上昇する。
【００３４】
本発明のバクテリオファージは、「外来のもの」であると認識されていると考えられ、そのために、通常の方法で宿主の免疫系により処理される。さらには、外部ポリペプチド／タンパク質、すなわち、選択した哺乳類宿主中には通常存在しないポリペプチド／タンパク質、をコードすることが可能な外因性核酸を含むようにバクテリオファージのゲノムを改変することにより、この外部タンパク質に対する免疫応答が誘発される。免疫応答は、体液性（すなわち、抗体）および／または細胞性免疫応答であり得ることは正しく理解されよう。
【００３５】
用語の「外因性」は、個々の生物体または生物学的実体（例えば、バクテリオファージ）中に存在し、活性であるが、内在性因子とは対称的に、元来は、その生物体の外部に由来する材料（例えば、ポリペプチドまたは核酸）に関する。
【００３６】
外因性のポリペプチドまたはタンパク質は、ワクチンが提示される宿主中で免疫応答を誘発するのに充分なレベルで発現する。
【００３７】
本発明は、ＵＴＩ用のワクチンの調製に適用可能であることは正しく理解されよう。
【００３８】
バクテリオファージの表面上の前記外因性のポリペプチドは、ＡＰＣ特異的な核酸の直接取込みを可能にする。理論に拘泥することなく、バクテリオファージ粒子は、「外来」抗原として認識されていることが想定される。通常、用語「ポリペプチド」は、本明細書では抗原活性を示しているアミノ酸の鎖または配列に関し、その生成物の具体的な長さそれ自体に関しない。必要に応じ、ポリペプチドをインビボでおよび／またはインビトロで、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化および／または翻訳後切断により改変でき、従って、その結果、とりわけペプチド、オリゴペプチド、タンパク質および融合タンパク質が包含される。
【００３９】
当然、当業者なら、改変ポリペプチドは、生理的機能を保持している、すなわち、免疫応答を誘発できるはずであることを正しく理解するであろう。
【００４０】
本発明のバクテリオファージは、好ましくは、適切な転写／翻訳制御因子、例えば、プロモーター、ターミネーター等を含む。
【００４１】
便宜的には、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
【００４２】
しかし、当業者に既知の制御可能プロモーターもまた、使用可能である。例えば、構成的プロモーターおよび制御可能なプロモーターの制御下で、外因性の核酸を含むコンストラクトが設計され得る。この方法では、最初に構成的プロモーターにより、第２の時点で制御可能プロモーター由来の発現により、外因性の核酸の発現をさせることが可能となり得る。この方法は、結果としてより高い免疫原性のファージ粒子の合成をもたらし得る。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、前記ファージは、ファージ粒子の表面上に抗原性のタンパク質を発現するように改変できる。例えば、無傷のバクテリオファージＭ１３粒子をベクタービヒクルとして使用可能である。Ｍ１３へのインサートの大きさは、比較的小さいが、「ファージディスプレイ」技術（Ｈａｗｋｉｎｓ、ＲＥら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９）の使用は、ファージ粒子が、そのコートタンパク質に融合した外部抗原の一部を保持することを意味する。従って、コンストラクトを、外因性の遺伝子が原核生物のプロモーター（例えば、ＬａｃＺプロモーター）の制御下にある状態で作ることができ、大腸菌宿主中で増殖する場合は、原核生物プロモーターは、ワクチン抗原の発現を指示し、融合タンパク質としてＭ１３コート中へのその組み込みを可能とし、これにより、ワクチン接種後の強力な１次応答を誘発することになる。
【００４４】
好ましくは、本発明による外因性の核酸は、ＦｉｍＨのマンノース結合レクチンドメインをコードするＤＮＡ、さらに好ましくは、成熟ＦｉｍＨタンパク質の４４〜１５８位のアミノ酸をコードするドメイン（本明細書では、ΔＦｉｍＨとも命名される）を含むか、もしくは、これから構成される。
【００４５】
さらに好ましくは、外因性の核酸は、アフィニティータグをコードする配列を含み得る。このようなアフィニティータグの例は、ＦＬＡＧタグ、またはＦＬＡＧオクタペプチド、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＨＡタグもしくはｍｙｃタグである。ＦＬＡＧタグは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して組換え型バクテリオファージを精製するために、または融合タンパク質発現の品質管理のために、組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質に付加できるポリペプチドタンパク質タグである。好ましいＦＬＡＧタグのペプチド配列は以下の通り、Ｎ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−Ｃ（配列番号）１４（１０１２Ｄａ）である。これは、他のアフィニティータグと連結して使用できる。また、タンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合できる。さらに、融合タンパク質の構築は、通常、ペプチドリンカーによる２つのタンパク質またはタンパク質のドメインの連結を伴う。リンカー配列の選択は、機能性融合タンパク質の構築には、特に重要である。リンカーの柔軟性および親水性は、通常、ドメイン（我々のケースでは、外因性のポリペプチドおよびタンパク質コートｐＶＩＩＩ）の機能を妨害しないために重要である。バクテリオファージ上に提示された組換え型抗体を操作するために文献中で首尾よく使用されている好ましいリンカーは、（ＳＧＧＧ）３Ｓ（配列番号１５）である。
【００４６】
従って、本発明の具体的な目的は、例えば、図９に示すような、本発明に従って操作されたバクテリオファージの核酸配列、および実質的に同じ全てのヌクレオチド配列である。「実質的に同じヌクレオチド配列」は、遺伝暗号の縮退のために、所与のアミノ酸配列をコードする全ての他の核酸配列を含む。
【００４７】
前記バクテリオファージは、任意の適切な経路、例えば、注射により投与され得て、単位剤形、例えば、アンプル、または複数回投与容器中に調製され得る。前記バクテリオファージは、油性のまたは好ましくは水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態で存在し得る。あるいは、前記バクテリオファージは、適切なビヒクル例えば無菌の発熱性物質を含まない水による、送達時の再構成のために凍結乾燥した形態であり得る。この方法では、ファージ粒子を凍結乾燥する際に、安定化剤、例えば、タンパク質、糖等を添加し得る。液体ならびに再構成される凍結乾燥した形の両方が、注射溶液のｐＨを適切に調節するのに必要な量の剤、好ましくは緩衝液を含む。任意の非経口の使用、特に製剤を静脈内に投与する場合は、合計溶質濃度を制御して、等張性、低張性または弱高張性の調製物を作らなければならない。
【００４８】
糖などの非イオン性材料は、浸透圧を調整するのに好ましく、ショ糖は、特に好ましい。
【００４９】
これらの形態のいずれかは、適切な製剤化薬剤、例えば、デンプンまたは糖、グリセリンまたは生理食塩水をさらに含む。単位投与量当たりの組成物は、液体または固体であり得て、バクテリオファージ材料の０．１％〜９９％を含み得る。
【００５０】
好ましい形態では、ワクチンはアジュバントを含むこともできる。アジュバントは、通常、非特異的な方法で宿主の免疫応答を促進させる物質を含む。いくつかのアジュバントが当技術分野で既知である。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、リポソーム、および例えば、国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号に記載のニオソーム、ミネラルおよび非ミネラルオイルベース油中水型エマルジョンアジュバント、サイトカイン、例えば、ＣｐＧジヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡ中の短い免疫賦活性ポリヌクレオチド配列、例えば、Ｓａｔｏ  Ｙら．（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２７３号、第３５２〜３５４頁；Ｋｒｉｅｇ  Ａ．Ｍ．（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４号、第７３〜７７頁、に記載されたものが含まれる。
【００５１】
バクテリオファージは、いわゆる「ビヒクル」とも組み合わせ得る。ビヒクルは、これに共有結合しないでバクテリオファージが接着できる化合物、または基質である。典型的「ビヒクル」化合物には、金粒子、シリカ粒子、例えば、ガラス等が含まれる。従って、本発明のバクテリオファージは、遺伝子銃法、例えば当業界で記載されている、被覆金粒子を使用する高速打ち込み法（ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）、を使用して生物体中に導入され得る（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ．Ｓ．ら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８８号、第２７２６〜２７３０頁；Ｆｙｎａｎ  Ｅ．Ｆ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９０号  第１１４７８−１１４８２頁）。
【００５２】
さらに、ワクチンは、１つまたは複数の適する表面活性化合物または乳化剤、例えば、ＳｐａｎまたはＴｗｅｅｎを含み得る。
【００５３】
本発明のワクチンの投与モードは、免疫防御量の本発明のウイルスを対象に送達する、任意の適する経路によるものであり得る。しかし、ワクチンは、筋肉内または深部皮下経路経由で非経口的に投与されるのが好ましい。他の投与モード、例えば、粘膜経路（例えば、直腸、経口、鼻または腟投与）経由、または他の非経口の経路経由、すなわち、皮内、鼻腔内、もしくは静脈内も、目的に応じ採用し得る。経鼻投与用の製剤も開発可能で、例えば、アジュバントとしてキトサンを含み得る（Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（４）第３８７−９２頁、１９９９年）。
【００５４】
しかし、任意の特定のレシピエント生物体に対する具体的な用量レベルは、年齢、総体的な健康、および性別；投与の時間；投与経路；投与される他の薬剤との相乗効果；ならびに求められる防御度合い、等の様々な因子に依存することは理解されよう。もちろん、必要に応じ適切な間隔で投与を繰り返すことができる。通常、毎日投与量のワクチンには、体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇが含まれる。
【００５５】
従って、さらなる態様では、本発明は、ヒトおよび／または動物に有効量の本明細書に記載のワクチン製剤を投与することを含む、予防的におよび／または治療的にヒトまたは動物を免役する方法を提供する。有効量は、ヒトおよび／または動物で免疫応答を誘発することができる量であることは理解されよう。
【００５６】
本明細書で引用された全ての文献は、引用文献で提示された全てのデータ、表、図、およびテキストを含むその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で引用された文献の中の引用文献の全含有内容もまた、全体が参照によって組み込まれる。既知の方法のステップ、従来の方法のステップ、既知の方法または従来の方法に対する参照は、関連技術において、本発明のいずれかの態様、説明または実施形態が開示、教示、または示唆されていることを何ら承認するものではない。
【００５７】
本出願で開示されている方法および生成物の特徴が理解されると、先行技術、非制限的な以下の図および本発明の基礎的な詳細といくつかの適用を記述した実施例を考察することにより、追加のステップの必要性と性質を容易に導き出すことが可能である。
【００５８】
本発明は、以降で、実施例と以下の図を参照しながらさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】は、抗ＦＬＡＧ抗体に対するファージの反応性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを抗ｐＩＩＩモノクローナル抗体でコートし、ファージ結合後、抗ＦＬＡＧ  ＨＲＰコンジュゲート二次抗体で発色させた。野性型ファージＭ１３ＫＯ７を陰性対照として含めた（Ｖｉｅｉｒａ およびＭｅｓｓｉｎｇ、１９８７年）。ｐＳＴＭ２３は、ＦＬＡＧペプチドでタグを付加したｐＶＩＩＩタンパク質と融合したＦｉｍＨタンパク質を提示する。
【図２】は、抗ＦｉｍＨ血清に対するファージの反応性を示す。抗ＦｉｍＨ血清は、ファージ粒子の表面にＦｉｍＨドメインを提示しているｐＳＴＮ２３ファージを特異的に認識する。プレートを抗ｐＩＩＩモノクローナル抗体でコートし、ファージ結合後、異なる稀釈度の抗ＦｉｍＨ血清および抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体で発色させた。
【図３】は、細菌ＦｉｍＨ接着タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ  ００７９４６）の核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＦｉｎＨのアミノ酸配列を示す：リーダーペプチドのアミノ酸配列は、太字（１〜２１位のアミノ酸）、マンノース結合レクチンドメインは、下線（２２〜１７９位のアミノ酸）で示される。ファージｐＳＴＭ２３は、ＦｉｍＨの成熟タンパク質の３〜１５８位のアミノ酸に対応する２４〜１７９位のアミノ酸断片を提示し、太字及び下線で示される。一方、ｐＳＴＭ２７は、ＦｉｍＨの４５〜１５９位のアミノ酸（ΔＦｉｍＨと命名された）に対応する、６６〜１８０位のアミノ酸を提示し、太字と斜体で示される。マンノース結合レクチンドメインのシステイン残基は、大きなフォントで示され；マンノース結合に寄与しているアミノ酸残基（Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２００８年）は、＊で示される。
【図４】は、ＦｉｍＨタンパク質との競合を示す。プレートを抗ｐＩＩＩモノクローナル抗体でコートした。約３ｘ１０９ＣＦＵのファージをウェルに添加した。抗ＦｉｍＨ血清の１：１００の希釈物を、単独または５ｍｇのＦｉｍＨタンパク質もしくは関連のないタンパク質であるＧＳＴと組み合わせてウェルに添加し、最終的に抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体で発色させた。ＦｉｍＨタンパク質は、抗ＦｉｍＨ血清への結合において、結合用のレクチンドメインを提示したファージと効果的に競合する。
【図５】は、ＣｓＣｌ勾配で精製されたｐＳＴＭ２７ファージの反応性の分析を報告する。ＰＥＧ／ＮａＣｌ析出により濃縮したｐＳＴＭ２７ファージを、ＣｓＣｌ勾配により追加精製されたファージと比較して分析した。プレートを抗ｐＩＩＩモノクローナル抗体でコートし、最終的に、１：５０に希釈した抗ＦｉｍＨ血清および抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体で発色させた。
【図６】は、バクテリオファージｐＳＴＭ２７で免疫したマウス群における抗ＦｉｍＨ免疫グロブリンＧ血清力価の平均を示す。個別マウス由来の血清試料を、ワクチン接種の４５日後の細菌抗原投与の直前に採取した。個別の抗体力価は、結果として非免疫動物に対する値の２倍よりさらに高い吸光度値を生ずる最大血清希釈因子として計算された。図中のバーは、免疫群の抗体力価の中間値を示す。
【図７】は、バクテリオファージｐＳＴＭ２７免疫マウスの腟洗浄物中の抗ＦｉｍＨ免疫グロブリンＡ特異的抗体レベルを示す。個別マウス由来の腟洗浄物を、ワクチン接種の４５日後の細菌抗原投与の直前に採取した。
【図８】は、バクテリオファージｐＳＴＭ２７ワクチン接種マウスにおける尿路病原性大腸菌ＰＴ２７（ＵＰＥＣ）のインビボ細菌抗原投与の結果を示す。全マウスに対し、４５日目に１０８ＣＦＵのＵＰＥＣ株ＰＴ２７を抗原投与した。
【図９】は、ｐＳＴＭ２７（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。融合ｐＶＩＩＩ−ＦｉｍＨタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を次のように表される：融合ｐＶＩＩＩタンパク質のリーダーペプチドのアミノ酸および開始ＡＴＧコドンは、太字で示される；ｐＶＩＩＩのアミノ酸配列は、下線で示される；ＦｉｍＨのアミノ酸配列は、斜体で示される；ＦＬＡＧペプチドのアミノ酸配列は、太字および下線で示される。フレキシブルリンカー（ＳＧＧＧＧ）３Ｓのアミノ酸配列（配列番号１５）は太字および斜体で示される。
【図１０】（Ａ）Ｍ１３ファージの主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００６０４．２）。繊維状ファージＭ１３ｍｐ主要コートタンパク質（ｐＶＩＩＩ）の核酸配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）。ｐＶＩＩＩタンパク質のリーダーペプチドは太字で示される。（Ｂ）ｐｃ８９主要コートタンパク質（Ｆｅｌｉｃｉら、１９９１年）。ｐｃ８９（Ｆｅｌｉｃｉら、１９９１年）にコードされる主要コートタンパク質（ｐＶＩＩＩ）の核酸配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）。ｐＶＩＩＩのリーダーペプチドは太字、クローニング部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩは太字および下線で、終始コドンは斜体で示される。
【実施例】
【００６０】
材料および方法
＜細菌株＞
ＵＰＥＣＰＴ２７の臨床分離菌を選択し、膀胱炎マウスモデル動物に感染させた。この株は、元々、再発性ＵＴＩ患者の尿から、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＤｉＦｉ（Ｐｏｍｅｚｉａ（ＲＭ）、Ｉｔａｌｙ）で得た。マンノース感受性赤血球凝集反応アッセイおよびマンノースによる赤血球凝集阻害を使用して、ＰＴ２７株の１型線毛発現を試験した。
【００６１】
実験大腸菌株  ＤＨ５αＦ’（ｓｕｐＥ４４  ΔｌａｃＵ１６９  （Φ８０  ｌａｃＺΔＭ１５）ｈｓｄＲ１７  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｒｅｌＡ１  Ｆ’  ［ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ＋  ｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］）をファージ増殖に使用した。
【００６２】
＜クローニングおよび発現ＦｉｍＨレクチンドメイン＞
ＦｉｍＨレクチンドメインをコードするＤＮＡ断片を、それぞれ、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位（下線）を含むプライマーＳＭ１２４  ＦＯＲ  （５’−ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴ−３’（配列番号９））およびＳＭ１２５  ＲＥＶ（５’−ＧＴＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号１０））で、ＤＨ５αＦ’ゲノムから増幅した。結果として得られたＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＫＭ１６プラスミド（Ｐａｖｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）に連結し、次いで、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩでも消化した。結果として得られたプラスミドｐＳＴＭ２１をＦｉｍＨ発現に使用した。
【００６３】
＜抗ＦｉｍＨポリクローナルウサギ血清の産生＞
大腸菌ＤＨ５αＦ’中でＦｉｍＨドメインを発現させ、以下のプロトコルに従って精製した。ｐＳＴＭ２１で形質転換した細菌細胞を１００μｇ／ｍＬのＡｐを含有するＬＢ中で一晩（ＯＮ）振盪培養した。翌朝、１ｍＬのＯＮ培養液を１００ｍＬの新鮮培地中に植菌した。培養液をＯＤ＝０．８まで増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加してＦｉｍＨ発現を誘導した。３７℃で一晩インキュベーション後、細胞を回収し、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含有する１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁して、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）の存在下、氷上で３０分間インキュベートした。１．５％Ｎ−ラウリルサルコシンを添加してタンパク質の溶解度を増大させた後、細胞懸濁液を超音波処理によりホモジナイズした。細胞組織片を遠心沈殿し、Ｈｉｓ−ｔａｉｌを伴って発現したＦｉｍＨタンパク質を、Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＦ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、メーカーの使用説明書従って精製した。精製タンパク質を１２％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＦＬＡＧ二次抗体で免疫染色した。
【００６４】
精製ＦｉｍＨタンパク質をウサギのワクチン接種に使用し、ポリクローナルウサギ抗ＦｉｍＨ血清を得た。
【００６５】
＜繊維状ファージ上のＦｉｍＨおよびΔＦｉｍＨドメインの提示＞
ＦｉｍＨレクチンドメイン（成熟タンパク質の３〜１５８アミノ酸）をコードするＤＮＡ断片を、それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線）を含むプライマーＳＭ１２６  ＦＯＲ（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴ−３’（配列番号１１））およびＳＭ１２７  ＲＥＶ（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号１２））で、ＤＨ５αＦ’ゲノムから増幅した。リバースプライマーＳＭ１２７は、ＦｉｍＨ配列に提示される組換え型タンパク質のモニタリングを促進するＦＬＡＧペプチドおよび、ファージ表面上でのアッセンブリーを向上させる（ＳＧＧＧ）３Ｓフレキシブルリンカーを付加した。結果として得られたＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐｃ８９（Ｆｅｌｉｃｉら、１９９１年）に連結して、次にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでも消化した。結果として得られたプラスミドｐＳＴＭ２３を使ってＤＨ５αＦ’エレクトロコンピテント細胞を形質転換した。
【００６６】
より短いドメインΔＦｉｍＨ（成熟タンパク質の４４〜１５８位のアミノ酸）をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ部位を含むプライマーＳＭ１５０ＦＯＲ（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＣ−３’）およびプライマーＳＭ１２７ＲＥＶで、ＰＣＲで増幅した。結果として得られた、ΔＦｉｍＨドメインをコードするＰＣＲ断片、ＦＬＡＧペプチド、フレキシブルリンカー（ＳＧＧＧ）３Ｓ（配列番号１５）を上述のようにプラスミドｐｃ８９中にクローン化し、新規ファージミドｐＳＴＭ２７を得た。ｐＳＴＭ２７を使用してＤＨ５αＦ’エレクトロコンピテント細胞を形質転換した。
【００６７】
＜ファージＥＬＩＳＡ＞
組換え型ファージで、ファージＥＬＩＳＡを行い、ファージ表面上のＦｉｍＨドメインまたはＦＬＡＧペプチドの存在を確認した。ファージ上清で以下のようにＥＬＩＳＡを行った。マルチウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中濃度１μｇ／ｍＬの２００μＬのｐＩＩＩ（５７Ｄ１）（Ｄｅｎｔｅら、１９９４年）に対するモノクローナル抗体で、４℃で一晩コートした。コーティング溶液を廃棄後、前記プレートをブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした。ブロッキング緩衝液で希釈したファージ上清を各ウェルに添加し、３７℃で１時間結合させた。ブロッキング緩衝液で１：５０に希釈し、５ｘ１０１０ＰＦＵ／ｍＬファージｆ１を含むウサギ抗ＦｉｍＨ血清および１００μＬ／ｍＬのＨＢ１０１細菌抽出物の混合物を３７℃で３０分間、ゆっくり振盪しながらプレインキュベートした。前記ファージ溶液を廃棄し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、２００μＬの血清混合物を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。前記プレートを洗浄し、１：５０００希釈の抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ａ１９４９、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、２００μＬのＴＭＢ液体基質システム（Ｓｉｇｍａ）でのインキュベーションにより、ペルオキシダーゼ活性を検出した。１５分間発色させた後、２５μＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止させた。プレートを自動化ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）により読み取り、結果をＡ＝Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍとして表した。
【００６８】
＜ファージ増殖およびＣｓＣｌ勾配による精製＞
ｐＳＴＭ２７ファージに感染したＤＨ５αＦ’の単一コロニーを、４０ｍＬの１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１％グルコースを含むＬＢ中で、ＯＤ＝０．２になるまでインキュベートした。細菌を遠心処理により集め、アンピシリンを含み、グルコースを含まない４０ｍＬのＬＢ中に再懸濁した。約６ｘ１０９ＰＦＵ（プラーク形成単位）/ｍＬのヘルパーＭ１３Ｋ０７を細胞懸濁液に添加し、振盪せずに３７℃で１０分間、振盪機でさらに２時間インキュベートした。カナマイシンを添加して２０μｇ／ｍＬの最終濃度とし、細胞を３２℃で、一晩インキュベートした。ファージを標準的ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿により精製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）、さらに、１９６６年のＭａｒｖｉｎによる記載のようにＣｓＣｌ勾配で精製した。
【００６９】
＜赤血球凝集アッセイ＞
赤血球凝集アッセイは、以前記載された（ＣｌａｒｋおよびＢａｖｏｉｌ、１９９４年）ように実施した。簡単に説明すると、細菌性培養液をＬＢ中３７℃で４８時間、振盪せずに増殖させた。細菌細胞を遠心沈殿し、１ｘＰＢＳで１回洗浄し、次に、ＰＢＳに再懸濁し、密度約１ｘ１０１０細菌／ｍＬを得た（細胞を７〜１０倍に濃縮した）。モルモットを、Ｏｈｍｅｄａ  Ｉｓｏｔｅｃ  ５（ＢＯＣ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してイソフルランで麻酔した。モルモットの血液を心臓穿刺により集めた。モルモット血液に１／５の２０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加し、前記血液をＰＢＳまたは１％Ｄ−マンノースのＰＢＳ溶液で１：４に希釈することにより、ＲＢＣ（赤血球）懸濁液を得た。１滴の細菌懸濁液（４０μＬ）とＲＢＣ懸濁液（４０μＬ）をＥＬＩＳＡプレート中で混合し、１〜２分回転後、プレートを室温で１０分間インキュベートした。ＨＡの程度をマンノースの存在または非存在下について推定した。
【００７０】
＜免疫化＞
マウス免疫化を２００６年にＰｏｇｇｉｏらによってに記載されたように行った。筋肉内免疫化は、１０１０ＰＦＵ（ファージ形成単位）の投与量の組換え型バクテリオファージｐＳＴＭ２７単独で、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）と組み合わせて（比率１：１で）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１６））と組み合わせて、または、非ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１７））と組み合わせて、６週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの群を免疫した。以前に記載されたＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＤａｖｉｓ、１９９８年）を、１０μｇ／投与量で使用した。１次免疫後のマウスをワクチン接種後２８日目に追加免疫した。抗原を各マウスに１００μＬ／投与量の最終容量で送達した。
【００７１】
粘膜ｉ．ｎ（鼻腔内）免疫化は、組換え型バクテリオファージｐＳＴＭ２７で、マウス群を全身麻酔下で免疫した。ファージ懸濁液の鼻への接触により各マウスに滴下した。マウスを１０１０ＰＦＵ／投与量のｐＳＴＭ２７で免疫した。１次免疫化後、ワクチン接種後７、１４、および２８日目に、マウスを追加免疫した。鼻腔内ワクチン接種の場合には、抗原を各外鼻孔に７μＬの容量で送達した。
【００７２】
＜免疫化マウスへのＵＰＥＣ株ＰＴ２７による抗原投与＞
マウスへの大腸菌株の抗原投与を、基本的に、１９９５年のＨｏｐｋｉｎｓらによる記載のように行った。１型線毛細菌株（大腸菌ＵＰＥＣ  ＰＴ２７）を静的ブイヨン培地（ｓｔａｔｉｃ  ｂｒｏｔｈ）中で培養し、１型線毛発現を４８時間誘導した。ＦｉｍＨタンパク質の発現をインビトロＨＡ試験により確認した。手術の１〜２日前に、腹部の穏やかなマッサージの後で全てのマウスから尿を集め、ＬＡ（ルリアブイヨン寒天培地）プレート上で無菌試験した。雌６〜８週齢マウス（Ｈａｒｌａｎ）を０．２５ｍＬ／マウスの生理的溶液中の２．５％の２，２，２−トリブロモエタノール、２．５％の２−メチル−２−ブタノールで、麻酔した。各マウスの膀胱を穏やかな腹部マッサージで空にした。１０μＬ中に１０８ＣＦＵを含有するように調節した細菌懸濁液を、外径０．６１ｍｍシリコンカテーテル（ＳＩＬ−Ｃ２０、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）に適合するシリンジを使用して、尿道を通って１ｃｍの深さで膀胱に注入した。細菌感染後５日目に、マウスを屠殺し、膀胱を摘出して洗浄し、１ｍＬの無菌ＰＢＳ中でホモジナイズした。異なる稀釈度のこのホモジネートを培養し、ＬＡプレート上でカウントした。
【００７３】
＜試料採取＞
４５日目に、伏在静脈穿刺によりマウスから血液を採取した。腟分泌物を以前記載（Ｐａｒｒら、１９９８年）のように集めた。マウス膣を各５０μｌのＰＢＳで３回洗浄した。収集後ただちに洗浄物を遠心分離し、−２０℃で保存した。腟洗浄物をブロッキング緩衝液で１：１に希釈し、試験した。
【００７４】
＜ＥＬＩＳＡ＞
免疫動物の血清中および腟洗浄物中のＦｉｍＨ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の検出を下記のように実施した。重炭酸塩緩衝液中の５μｇ／ｍＬのＦｉｍＨで各ウェルを一晩コートし、ブロッキングした。マウス血清の１／２００から始まる２倍希釈系列、または１／１希釈した腟洗浄物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間結合させた。前記プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ＦｉｍＨ特異的マウスＩｇＧおよびＩｇＡを、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ａ９３０９、Ｓｉｇｍａ）２次抗体および抗マウスＩｇＡ（Ａ４７８９、Ｓｉｇｍａ）２次抗体で検出した。プレートを発色させ、上記のように読み取った。
【００７５】
結果
＜組換え型ＦｉｍＨドメインの発現と精製＞
ｓｃＦｖ配置の可溶性抗体の産生に通常使用されるｐＫＭ１６プラスミド（Ｐａｖｏｎｉら、２００７年）中で、ＦｉｍＨドメイン（成熟タンパク質の３〜１５８位のアミノ酸）を、クローン化した。このプラスミドは、ｌａｃＰプロモーターの制御の下でタンパク質発現を指示し、そのアミノ末端でアルカリフォスファターゼのリーダーペプチドに融合し、カルボキシ末端で６Ｈｉｓ−ｔａｉｌに融合したクローン化タンパク質の発現を可能にする。結果として得られたプラスミドｐＳＴＭ２１を使用し、ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換した。我々は、抗ＦＬＡＧ二次抗体で発色したウェスタンブロットで、凍結−解凍精製した周辺質タンパク質および細胞ペレットを分析した。予想外にも、我々は、ＦｉｍＨが細胞周辺腔に分泌されないことを発見し、また、細胞ペレット中に抗ＦＬＡＧ染色バンドを観察した（データ非公表）。細胞質からＦｉｍＨタンパク質を生成するために、材料および方法の通り、不溶性細胞質タンパク質の精製用プロトコルを使用した。タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧ二次抗体で発色したウェスタンブロットにより分析した。多くの追加のバンドが、クマシーブリリアントブルーＲ２５０による染色ゲル上で認められた。従って、ＦＬＡＧ標識ＦｉｍＨタンパク質の量は、総タンパク質のわずか約１０％であった。ＦｉｍＨタンパク質をウサギ免疫化のために使用した。抗体力価約１／７００００のポリクローナル抗ＦｉｍＨ血清を得た。
【００７６】
＜ｐＶＩＩＩタンパク質融合体としてのＦｉｍＨドメインの提示＞
我々は、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩに融合したＦｉｍＨレクチンドメイン（成熟タンパク質の３〜１５８位のアミノ酸）をコードするｐＳＴＭ２３プラスミドを構築し、これを使用してＤＨ５αＦ’細胞を形質転換した。融合ＦｉｍＨ−ｐＶＩＩＩ遺伝子は、組換え型タンパク質のアッセンブリーを促進し、提示効率をモニタリングするために、フレキシブルリンカーおよびＦＬＡＧペプチドもコードするように設計された。材料および方法のところで記載のように、形質転換細胞を培養し、ｐＳＴＭ２３ファージを増幅して、精製した。モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体で実施したＥＬＩＳＡ試験は、組換え型タンパク質がファージ表面上にアッセンブリーされ、抗ＦＬＡＧ抗体が到達可能であることを示した（図１）。
【００７７】
抗ＦｉｍＨポリクローナル血清で実施したＥＬＩＳＡ試験は、野性型ファージＭ１３Ｋ０７に比べて、ＦｉｍＨ提示ファージの特異的認識を示した（図２）。
【００７８】
ＦｉｍＨドメインのアミノ酸配列分析によって、２つのシステイン残基を含み、マンノースの結合に大きく寄与しない（Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２００８年）成熟タンパク質の２〜４３位のアミノ酸断片の欠失が、ファージ粒子生成を向上させる可能性があることが想定できる。我々は、ＦｉｍＨの欠失バリアントである、、成熟タンパク質の４４〜５８位のアミノ酸（図３）を発現させ提示させた。結果として得られたプラスミドｐＳＴＭ２７（この配列は図９に示した（配列番号３））は、ｐＶＩＩＩに融合したΔＦｉｍＨタンパク質、ＦＬＡＧペプチドおよびフレキシブルリンカーをコードした。ｐＳＴＭ２７は、ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換するのに使用された。形質転換細胞を材料および方法に記載のように増殖し、ｐＳＴＭ２７ファージを増幅して、精製した。抗ＦｉｍＨポリクローナル血清で実施したＥＬＩＳＡ試験は、ファージｐＳＴＭ２７のファージ生成の有意な向上を示した。ｐＳＴＭ２７ファージ粒子の収率は、ｐＳＴＭ２３に比べて、少なくとも５倍高い。
【００７９】
我々は、組換え型ファージｐＳＴＭ２３およびｐＳＴＭ２７（長いおよび短い形の両方のＦｉｍＨドメインを提示している）に対する抗ＦｉｍＨ血清の認識の特異性を、精製されたＦｉｍＨタンパク質との競合により、確かめた。ＦｉｍＨタンパク質の反応混合物への添加により、血清によるファージ認識が完全に遮断され、従って、ＦｉｍＨドメイン結合の特異性が確認された（図４）。
【００８０】
＜ＦｉｍＨ提示ファージの精製＞
我々は、ＰＥＧ／ＮａＣｌによる標準的な沈殿法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）、次に、Ｍａｒｖｉｎ（１９６６年）による記載の手段に従って、ＣｓＣｌ勾配でファージ粒子を精製した。我々は、ＣｓＣｌ勾配による精製の前後で、ｐＳＴＭ２７ファージの抗ＦｉｍＨ血清に対する反応性を分析し、ファージ粒子上に提示されたＦｉｍＨドメインの分解または排出の可能性を推定した（図５）。この試験は、ｐＳＴＭ２７ファージがＣｓＣｌ勾配による精製手段において安定であり、特異的反応性を何ら失うことなく、ファージ表面上のタンパク質の提示を維持することを示した。
【００８１】
＜マウスの免疫化＞
表１は、免疫化、試料採取および細菌性抗原投与の計画を示す。表２は、動物のワクチン接種群を示す。
【００８２】
【表１】
0005905457.tif 000002
【００８３】
【表２】
0005905457.tif 000003
【００８４】
ファージｐＳＴＭ２７単独、またはＣＦＡもしくはＣｐＧオリゴと組み合わせた筋肉内免疫化によってマウスに誘導されたＦｉｍＨに対するＩｇＧの血清力価は、非免疫化マウスで観察された値よりも有意に高く（図６）、また、粘膜ワクチン接種により誘導されたＩｇＧレベルよりも高かった。しかし、鼻腔内または筋肉内免疫化により誘導されたマウスの腟洗浄物中の特異的ＩｇＡのレベルは、同程度であった（図７）。
【００８５】
特異的ＩｇＡのレベルは、ＵＰＥＣ臨床株ＰＴ２７に対するインビボ保護アッセイと相関した（図８）。粘膜経路により免疫化されたマウスで認められるとおり、細菌性感染に対し、筋肉内経路による免疫化よりもより良好に保護された。膀胱のコロニー形成は、粘膜ワクチン投与の場合、筋肉内免疫化の１．５〜２．５倍と比較すると、ＵＰＥＣの尿道注入後１０倍まで低減した。
【００８６】
結論として、我々は、ＵＰＥＣ抗原投与後の細菌回復の減少における明確な陽性の効果を観察した。その減少は、ＦｉｍＨ接着ドメインに対する特異的ＩｇＡの粘膜中レベルと相関したが、血液中ＩｇＧレベルとは相関しなかった。
【００８７】
[参考文献]
0005905457.tif 000004
0005905457.tif 000005
0005905457.tif 000006
0005905457.tif 000007
【図３】
0005905457.tif 000008
【図５】
0005905457.tif 000009
【図９−１】
0005905457.tif 000010
【図９−２】
0005905457.tif 000011
【図９−３】
0005905457.tif 000012
【図１０Ａ】
0005905457.tif 000013
【図１０Ｂ】
0005905457.tif 000014
【図１】
0005905457.tif 000015
【図２】
0005905457.tif 000016
【図４】
0005905457.tif 000017
【図６】
0005905457.tif 000018
【図７】
0005905457.tif 000019
【図８】
0005905457.tif 000020
【配列表】
0005905457000001.app