(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を含む，疾患又は障害の治療剤又は予防剤であって，前記疾患又は障害は，前記疾患又は障害の発生又は成長にＮＦ−κＢが関与するヒトの癌であり，
前記化合物は，
アセチル−（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）−ＮＨ２，その塩，又はその溶媒和物である，剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に至る研究は，国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＲ０１グラント，ＣＡ８４０４０及びＣＡ０９８５８３により，部分的に支援を受けた。
【０００２】
本発明は，癌，他の疾患や障害，例えば炎症性疾患や障害，及びそれらの治療的調節に関する。特に，本発明は，プログラム細胞死（ＰＣＤ）と癌細胞及び炎症誘発性細胞／自己免疫性細胞の増殖の調節を可能にする短ペプチドに基づく化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
アポトーシスの誘導は，長い間，癌細胞と共に炎症誘発性細胞，免疫細胞，及び他の病気の細胞を標的とする方法と考えられている。ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ，ＪＮＫ経路など，細胞誘導死に関与する多数の細胞経路が存在している。ＪＮＫｓはサイトカインや紫外線照射，熱ショック，及び浸透圧ショックなどのストレス刺激に応答する。また，サイトカインや細胞ストレスに応答して活性化するものとして，ＮＦ−κΒ経路がある。ＮＦ−κΒ経路は，Ｇａｄｄ４５β及びＪＮＫキナーゼ，つまりマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７／ＪＮＫＫ２）によって仲介されるクロストークによりＪＮＫ経路を阻害することができる。ＭＫＫ７の活性はＧａｄｄ４５βにより阻害される。Ｇａｄｄ４５βは，誘導因子のＧａｄｄ４５ファミリーのメンバーであり，ＮＦ−κＢの直接転写標的である。これは，Ｇａｄｄ４５βが，ＭＫＫ７に結合し，その活性を阻害することによって，ＪＮＫシグナル伝達のＮＦ−κΒによる抑制を仲介していることを意味する（Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（２）：  １４６２１５３参照）。
【０００４】
ＮＦ−κΒ阻害剤の使用は，癌や炎症性疾患の治療に使用するのに提案されている。しかし，ＮＦ−κΒは，ＰＣＤ，免疫，炎症や組織発達の役割を含む多数の活性を有しているため，ＮＦ−κΒ自体よりもＮＦ−κΒの特定の機能を阻害することが好ましい。
【０００５】
本発明は，多数の癌だけでなく，慢性炎症性及び遺伝性疾患においてもアップレギュレートすることが知られているＧａｄｄ４５βの阻害に関する。
【０００６】
プラズマ細胞骨髄腫やケーラー病として知られている多発性骨髄腫（ＭＭ）は，形質細胞の癌である。ステロイド，化学療法，サリドマイド，ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤（ＰＩｓ），メルファラン及び幹細胞移植により一時的な寛解が起こり得るが，現在，多発性骨髄腫は完治できていない。米国癌協会によると，米国では，多発性骨髄腫の患者数は約４５，０００人おり，毎年約１５，０００人が新たに診断されている。診断からの平均生存期間は，約３年である。多発性骨髄腫は，非ホジキンリンパ腫に次ぐ２番目に多い一般的な血液の癌であり，すべての癌の約１％を示し，すべての癌による死亡の約２％を示している。多発性骨髄腫の発生率は増加している傾向にあり，病気の発症年齢が低下しているという証拠もある。したがって，多発性骨髄腫の治療法を改善する必要性は明確である。
【０００７】
ほぼすべての多発性原発性腫瘍細胞株（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｕｒ）及び多発性骨髄腫細胞株は，恒常的ＮＦ−κΒ活性を示している。ＮＦ−κΒ活性をブロックすると多発性骨髄腫の細胞死を引き起こす。ＮＦ−κＢの標的戦略により長期的な癌治療の成果を達成するための主要な障壁は，特異性の欠如であるため，治療許容性は乏しい。これは，ＮＦ−κΒとプロテアソームの多面的機能によるものである。したがって，より特異的，より安全で，より効果的な，根本的に新しい治療アプローチが必要である。
【０００８】
多発性骨髄腫におけるＮＦ−κＢの主要機能の一つは，生存を促進することである。ＮＦ−κＢは，誘導因子のＧａｄｄ４５ファミリーのメンバーであるＧａｄｄ４５βを用いてＪＮＫ型ＭＡＰＫカスケードを抑制することにより細胞保護作用を提供することが知られている（Ｄｅ  Ｓｍａｅｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３０６−３１３参照）。Ｇａｄｄ４５βは，様々な刺激に応答してＮＦ−κΒによりアップレギュレートされ，直接的にＪＮＫキナーゼＭＫＫ７を標的とすることで生存を促進する（Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１４６−１５３；Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８２：１９０２９−１９０４１；Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．Ｃｌｉｒｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：１９１−１９２３参照）。
【０００９】
プロテアソーム阻害剤（ＰＩｓ）及び直接的なＮＦ−κＢ阻害剤は，ＪＮＫ経路を活性化することにより，多発性骨髄腫細胞を殺傷するが，ＮＦ−κＢへの無差別的な作用及び／又はプロテアソームの無差別的な作用が，完全に阻害する治癒量で使用することを妨げることから，多発性骨髄腫の治療には不適当である。
【００１０】
多発性骨髄腫に加えて，Ｇａｄｄ４５βは，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，バーキットリンパ腫，前単球性白血病及び他の白血病を含む他の腫瘍と同様に，肝細胞癌，膀胱癌，脳や中枢神経系癌，乳癌，頭頸部癌，肺癌，及び前立腺癌を含むいくつかの固形腫瘍においても高レベルで発現する。したがって，これらの腫瘍においてＧａｄｄ４５βを阻害することは，癌細胞死を誘導し，有益な治療効果を得る可能性がある。また，多くの血液悪性腫瘍（多発性骨髄腫，マントル細胞リンパ腫，ＭＡＬＴリンパ腫，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，ホジキンリンパ腫，骨髄異形成症候群，成人Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１），慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，急性骨髄性白血病，及び急性リンパ性白血病を含む）や，固形腫瘍（乳癌，子宮頚癌，腎癌，肺癌，大腸癌，肝臓癌，食道癌，胃癌，喉頭癌，甲状腺癌，副甲状腺癌，膀胱癌，卵巣癌，前立腺癌，膵臓癌及び他の多くの癌を含む）も，増加した腫瘍細胞死を導くＰＣＤを犠牲にして生存促進性シグナルを細胞に提供する恒常的ＮＦ−κＢ活性を示すことが知られている。（Ｖ．  Ｂａｕｄ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋａｒｉｎ  ２００９，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  ８：  ３３−４０参照）。さらに恒常的ＮＦ−κΒ活性は，悪性黒色腫，円柱腫，扁平上皮癌（皮膚，及び頭頸部），口腔癌，子宮内膜癌，網膜芽細胞腫，星状細胞腫及び膠芽腫においても見られる（Ｖ．  Ｂａｕｄ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋａｒｉｎ  ２００９，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  ８：  ３３−４０参照）。そして，異常に高い恒常的ＮＦ−κＢ活性を特徴とするこれらの腫瘍において，Ｇａｄｄ４５βを阻害し，癌細胞にプログラム細胞死を誘導することによって，有益な治療効果を作り出すことができる。本発明は，Ｇａｄｄ４５βを介して細胞生存におけるＮＦ−κＢの個別の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）生存促進性の機能を標的にすることが，癌及び異常な細胞生存に特徴付けられる他の疾患又はＰＣＤの誘導を増加させることにより治療可能な疾患（例えば，自己免疫疾患，慢性炎症性疾患，変性疾患や虚血性血管疾患など）を含む様々な疾患や障害に，直接的にＮＦ−κＢを標的にする投与よりも，安全で効果的な治療を提供するという認識に基づいている。
【００１１】
様々な疾患及び障害は，ＮＦ−κＢの活性に依存している。実際に，事実上あらゆる既知の人間の疾患又は障害の病因は，現在，炎症に依存すると考えられており，したがって，ＮＦ−κＢが関与している。これは炎症反応のマスタースイッチとして機能し，サイトカイン，受容体，転写因子，ケモカイン，炎症性酵素，及び生存促進性存因子を含む他の因子をコード化する２００以上の遺伝子配列の発現を調整して，炎症を開始し，維持する。本発明の化合物は炎症におけるＮＦ−κＢの個別の（ｄｉｓｃｒｅｔ）生存促進性の活性を阻害する。したがって，これらの化合物による治療を受け入れる疾患や障害は，従来の慢性炎症性疾患（例えば，炎症性腸疾患，関節リウマチや乾癬など）の他にも重要な炎症性成分に依存する他の疾患及び障害を含む。抗炎症剤又はＮＦ−κＢ阻害剤で治療し，又はＮＦ−κＢ阻害剤による治療が適するとして提案されている。そのような疾患及び障害の例は，以下の通りである。
【００１２】
１，呼吸器：
気管支喘息，アレルギー性喘息，内因性喘息，外因性喘息，運動誘発性喘息，薬剤誘発性（アスピリン及びＮＳＡＩＤ誘発性を含む）喘息，粉塵誘発性喘息，間欠性喘息，持続性喘息やそれらの重大な症状，及び気道過敏性の他の原因を含む，気道の閉塞性疾患；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；感染症及び好酸球性気管支炎を含む，気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；農夫肺及び関連疾患；過敏性肺炎；特発性線維化性肺胞炎，特発性間質性肺炎，抗腫瘍治療を複雑にする線維症，結核などの慢性感染症，アスペルギルス症，及び他の真菌症を含む，肺線維症；肺移植の合併症；肺血管系の血管炎，血栓症及び肺高血圧症；気道の炎症や分泌状態に伴う慢性咳嗽，及び医原性の咳の治療を含む，鎮咳作用；薬物性鼻炎や血管運動性鼻炎を含む急性及び慢性鼻炎；神経性鼻炎（花粉症）を含む通年性及び季節性アレルギー性鼻炎；鼻ポリープ；一般的な風邪及び呼吸器合胞体ウイルス，インフルエンザ，コロナウイルス（ＳＡＲＳを含む）又はアデノウイルスによる感染症を含む，急性ウイルス感染症；又は好酸球性食道炎；
【００１３】
２，骨及び関節：
例えば先天性の股関節形成不全などの原発性骨関節症及び続発性骨関節症に関連する，又は含む関節炎；頸部脊椎炎，腰部脊椎炎，及び首や腰の痛み；骨粗しょう症；関節リウマチ及びスチル病；強直性脊椎炎，乾癬性関節炎，反応性関節炎，及び未分化型脊椎関節炎を含む，血清反応陰性脊椎関節症；敗血症性関節炎，及び結核などの他の感染症による関節症や骨障害，ポット病やポンセット症候群（Ｐｏｎｃｅｔ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）など；尿酸痛風，ピロリン酸カルシウム沈着症，カルシウムアパタイトによる腱炎，滑液包炎や滑膜炎症を含む，急性及び慢性結晶誘発性滑膜炎；ベーチェット病；一次性及び二次性シェーグレン症候群；全身性強皮症及び限局型全身性強皮症；全身性エリテマトーデス，混合性結合組織病，未分化結合組織疾患；皮膚筋炎及び多発性筋炎を含む，炎症性ミオパシー；リウマチ性多発筋痛症；すべての関節分布での特発性炎症性関節炎を含む若年性関節炎，及び症候群，リウマチ熱やその全身性合併症に関連する若年性関節炎；巨細胞性動脈炎，高安動脈炎，チャーグ・ストラウス症候群，結節性多発動脈炎，顕微鏡的多発動脈炎を含む血管炎，及びウイルス感染，過敏症反応クリオグロブリンやパラプロテインに関連する血管炎；腰痛；家族性地中海熱，マックル−ウェルズ症候群，及び家族ハイバーニアンフィーバー，菊池病；薬剤誘発性の関節痛，腱炎，及びミオパシー；
【００１４】
３，傷害（例えば，運動傷害）又は疾患に起因する筋骨格系障害の痛み及び結合組織のリモデリング：関節炎（例えば，関節リウマチ，変形性関節症，痛風又は結晶性関節症），その他の関節疾患（例えば，椎間板変性や顎関節の変性など），骨リモデリング疾患（例えば骨粗鬆症，パジェット病又は骨壊死など），多発性軟骨炎，強皮症，混合性結合組織障害，脊椎関節症又は歯周疾患（例えば，歯周炎など）；
【００１５】
４，皮膚：
乾癬，アトピー性皮膚炎，接触性皮膚炎又はその他の湿疹皮膚病，及び遅延型過敏反応；植物及び光線皮膚炎；脂漏性皮膚炎，疱疹状皮膚炎，扁平苔癬，硬化性萎縮性苔癬，壊疽性膿皮症，皮膚サルコイド，円板状エリテマトーデス，天疱瘡，類天疱瘡，表皮水疱症，蕁麻疹，血管浮腫，血管炎，毒性紅斑，皮膚好酸球増加症，円形脱毛症，男性型脱毛症，スウィート症候群，ウェーバー・クリスチャン症候群，多形性紅斑；感染性，非感染性の蜂巣炎；脂肪織炎；皮膚リンパ腫，非黒色腫皮膚癌や他の異形成病変；固定薬疹を含む薬剤誘発性障害；
【００１６】
５，眼：
眼瞼炎；通年性又は春季アレルギー性結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部及び後部ぶどう膜炎；脈絡膜炎；自己免疫性；網膜に影響を与える変性又は炎症性障害；交感神経眼炎を含む眼炎；サルコイドーシス；ウイルス，真菌，及び細菌を含む感染；
【００１７】
６，消化管：
舌炎，歯肉炎，歯周炎，逆流性を含む食道炎；好酸球性胃腸炎，肥満細胞症，クローン病，潰瘍性大腸炎を含む大腸炎，直腸炎，肛門掻痒症；セリアック病，過敏性腸症候群，及び腸から離れて作用し得る食品関連アレルギー（例えば偏頭痛，鼻炎又はアトピー性皮膚炎）；
【００１８】
７腹部：
自己免疫性，アルコール性及びウイルス性を含む肝炎；肝臓の線維症及び肝硬変；胆嚢炎；急性及び慢性の膵炎；
【００１９】
８，泌尿生殖器：
間質性及び糸球体腎炎を含む腎炎；ネフローゼ症候群；急性及び慢性（間質性）膀胱炎，及びハンナー潰瘍を含む膀胱炎；急性及び慢性尿道炎，前立腺炎，精巣上体炎，卵巣炎及び卵管炎；外陰膣炎；ペイロニー病；勃起不全（男女とも）；
【００２０】
９，同種移植片拒絶反応：
例えば，腎臓，心臓，肝臓，肺，骨髄，皮膚又は角膜の移植後又は輸血後の急性および慢性のもの；又は慢性移植片対宿主病；
【００２１】
１０，ＣＮＳ：
アルツハイマー病及びＣＪＤやｎｖＣＪＤを含む他の痴呆障害；アミロイド症；多発性硬化症及び他の脱髄症候群；脳動脈硬化及び血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；内臓痛，頭痛，片頭痛，三叉神経痛，非定型顔面痛，関節や骨の痛み，癌や腫瘍浸潤に起因する痛み，及び糖尿病性，ヘルペス後，及びＨＲＶ関連ニューロパシーなどの神経障害性疼痛症候群を含む急性及び慢性疼痛（中枢起源であれ末梢起源であれ，急性，間欠性又は持続性の）；神経サルコイドーシス；悪性，感染性又は自己免疫過程の中枢及び末梢神経系の合併症；
【００２２】
１１，橋本甲状腺炎，グレーブス病，アジソン病，真性糖尿病，特発性血小板減少性紫斑病，好酸球性筋膜炎，高ＩｇＥ症候群，抗リン脂質抗体症候群を含む，その他の自己免疫性及びアレルギー性障害；
【００２３】
１２，後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ），ハンセン病，セザリー症候群，腫瘍随伴性症候群を含む，炎症性又は免疫学的要因に伴うその他の障害；
【００２４】
１３，心血管：
冠状動脈及び末梢循環に影響を与えるアテローム性動脈硬化症；心膜炎；心筋炎，心筋サルコイドを含む炎症性疾患及び自己免疫心筋症；虚血再潅流傷害；感染症（例えば梅毒性）を含む心内膜炎，弁膜炎，及び大動脈炎；血管炎，深部静脈血栓症及び静脈瘤の合併症を含む静脈炎及び血栓症などの近位及び末梢静脈の障害；
【００２５】
１４，消化管：
セリアック病，直腸炎，好酸球性胃腸炎，肥満細胞症，クローン病，潰瘍性大腸炎，顕微鏡的大腸炎，判定不能大腸炎，過敏性腸障害，過敏性腸症候群，非炎症性の下痢，腸から離れた部位に作用する食品関連アレルギー，例えば偏頭痛，鼻炎及び湿疹。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許第６４１０７０７号
【特許文献２】米国特許第５９３６０９２号
【特許文献３】米国特許第６０９３６９２号
【特許文献４】米国特許第６２２５４４５号
【特許文献５】米国特許第４１７９３３７号
【特許文献６】米国特許第６４４７７４３号
【特許文献７】米国特許第５７００４８６号
【特許文献８】米国特許第６４３６０９１号
【特許文献９】米国特許第５９３９３８０号
【特許文献１０】米国特許第５９９３４１４号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（２）：  １４６２１５３
【非特許文献２】Ｄｅ  Ｓｍａｅｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３０６−３１３
【非特許文献１】Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１４６−１５３
【非特許文献３】Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８２：１９０２９−１９０４１
【非特許文献４】Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．Ｃｌｉｒｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：１９１−１９２３
【非特許文献５】Ｖ．  Ｂａｕｄ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋａｒｉｎ  ２００９，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  ８：  ３３−４０
【非特許文献１】Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  ９：４４７−６７
【非特許文献６】Ｎｇｏ  ＶＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０８９）：  １０６−１０
【非特許文献７】Ｇｅｅｓｏｎ  ＭＰ．  ２００８  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ５１  ：８１７−８３４
【非特許文献８】Ｙａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６  Ｊｕｌ  ５；  １０３（２７）：  １０３９７−４０２
【非特許文献９】Ｗａｇｓｔａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １３：  １７１−１３８７
【非特許文献１０】Ｃｈｉｔｈｒａｎｉ  ＤＢ，Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ  ７，（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）
【非特許文献１１】Ｓｃｈｒａｎｄ  ＡＭ，  Ｌｉｎ  ＪＢ，  Ｈｅｎｓ  ＳＣ，  Ｈｕｓｓａｉｎ  ＳＭ．，  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．  ２０１０  Ｓｅｐ  ２７，  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ
【非特許文献１２】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ．
【非特許文献１３】Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０，  Ｓｕｐｐ．  ４２：２Ｓ，  １９８８．
【非特許文献１４】Ｙ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０，  Ｓｕｐｐ．  ４２：２Ｓ，  １９８８
【非特許文献１５】，Ｌａｎｇｅｒ，  ｓｕｐｒａ；  Ｓｅｆｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１，  １９８７
【非特許文献１６】Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７，  １９８０
【非特許文献１７】Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４，  １９８９
【非特許文献１８】Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）
【非特許文献１９】Ｆｉｅｌｄｓ  Ｇ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ  Ｒ．Ｌ．  １９９０  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉ  Ｒｅｓ；  ３５：  １６１−２１４
【非特許文献２０】Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ａ．  １９９５  Ｔｈｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ
【非特許文献２１】Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１
【非特許文献２２】Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｂ，  Ｃｈａｆｆｏｔｔｅ  ＡＦ，  Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ  Ｌ，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＭＥ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９８５  Ｍａｒ  １８；７７（２）：３０５−１９
【非特許文献２３】Ｚａｚｚｅｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３，  Ｂｌｏｏｄ  １０２：  ３２７０−３２７９
【非特許文献２４】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２
【非特許文献２５】Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００４  Ｃｅｌｌ  １１６，  ５２９−５４２
【非特許文献２６】Ｒｉｃｃａｒｄｉ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ  Ｉ  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，  １４５８  −  １４６１
【非特許文献２７】Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６，  Ｂｌｏｏｄ  １０７：  ４０５３−４０６２
【非特許文献２８】Ｐｉｖａ  Ｒ  ．  ｅｔ  ａｌｌ  ２００８  Ｂｌｏｏｄ  １  １１：  ２７６５−２７７５
【非特許文献２９】Ｓｈｉｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １−１２
【非特許文献３０】Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００８  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，  １９１１−１９２３
【非特許文献３１】Ｌａｕｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２３，  ２２２２−２２３２
【非特許文献３２】Ｌｕｄｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １５，  ６−２５
【非特許文献３３】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｃａｒｅ．ｏｎ．ｃａ／
【非特許文献３４】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｓｉｇｈｔ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ
【非特許文献３５】Ｇｒｏｕｌｘ  Ａ．  ２００６  ＳｃｉａｎＮｅｗ  ９：  １−５
【非特許文献３６】ＤｉＳｔｅｆａｎｏ  ３ｒｄ  １９８２  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２４３：  １−６
【非特許文献３７】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｓ．ｃｏｒｎ／ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｉｄａｍｙｃｉｎ／ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ．ｈｔｍｌ
【非特許文献３８】Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０  １９７０−１９８０
【発明の概要】
【００２８】
本発明の第１の側面は，
式（Ｉ）：
Ｘ１−Ａ−Ｘ２  （Ｉ）
（式（Ｉ）中：
Ａは，Ａ’’’’又はＡ’’−［Ｍ−Ａ’−］ｎＭ−Ａ’’’であり；
Ａ’’’’はＡ’’，Ａ’’’又はＺ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ４であり，ここで，Ｙ２−Ｙ３は，オリゴペプチド部分又は前記Ｙ２−Ｙ３の残基を有するオリゴペプトイド部分であり，Ｚ１は，前記Ｙ２−Ｙ３のＮ末端窒素に結合し，Ｚ４は，前記Ｙ２−Ｙ３のＣ末端炭素に結合し；
Ａ’’はＡ’又はＹ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ４であり，ここで，Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３は，オリゴペプトイド部分又は前記Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３の残基を含むオリゴペプトイド部分であり，Ｚ４は，前記Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３のＣ末端炭素に結合し；
Ａ’’’はＡ’又はＺ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４であり，ここで，Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４は，オリゴペプトイド部分又は前記Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４の残基を含むオリゴペプトイド部分であり，Ｚ１は，前記Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４のＮ末端窒素に結合し；
それぞれのＡ’は，独立してオリゴペプチド部分又はＹ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４の残基を含むオリゴペプトイド部分であり；
ｎは０から１８の整数であり；
Ｙ１及びＹ４は，独立してアミノ酸残基又は芳香族側鎖を有するアミノ酸誘導体の残基であり；
Ｙ２は，アミノ酸残基もしくはアミノ酸誘導体の残基であるか，又は存在せず；
Ｙ３は，アミノ酸残基もしくはアミノ酸誘導体の残基であるか，又は存在せず；
前記Ｚ１は，前記Ｙ２のＮ末端窒素に結合する，式（ＩＩ）の基である。
【００２９】
【化１】
0005961113.tif 000002
【００３０】
式（ＩＩ）中：
Ｗは，存在しないか又は酸素，窒素，もしくは１個から３個の炭素を有するアルキレン基であり，ここで前記１個から３個の炭素を有するアルキレン基は，必要に応じて１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は５員から１０員の炭素環式又は複素環式芳香族基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
Ｊは，５員から１０員の炭素環式又は複素環式芳香族基であり，ここで前記芳香族基は，必要に応じて，水酸基，ハロゲン基，１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は１個から４個の炭素を有するアルコキシ基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
前記Ｚ４は，前記Ｙ３のＣ末端炭素に結合する，式（ＩＩＩ）の基である。
【００３１】
【化２】
0005961113.tif 000003
【００３２】
式（ＩＩＩ）中：
Ｒは，水素又は１個から４個の炭素を有するアルキルであり；
Ｗ’は，存在しないか又は１個から３個の炭素を有するアルキレン基であり，ここで前記１個から３個の炭素を有するアルキレン基は，必要に応じて，１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は５員から１０員の炭素環基又は複素環式芳香族基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
Ｊ’は，３員から１０員の脂肪族炭素環基又は５員から１０員の炭素環式もしくは複素環式芳香族基であり，ここで前記脂肪族基又は芳香族基は，必要に応じて，ヒドロキシル基，ハロゲン基，１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は１個から４個の炭素を有するアルコキシ基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
Ｍは，先のオリゴペプチド又はオリゴペプトイド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）と次のオリゴペプチド又はオリゴペプチド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）との間のペプチド結合であるか，又はアミド結合，エステル結合，エーテル結合もしくはチオエーテル結合により先のオリゴペプチド又はオリゴペプトイド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）の末端カルボン酸基に結合したリンカー部分と，アミド結合，エステル結合，エーテル結合又はチオエーテル結合により次のオリゴペプトイド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）の末端カルボン酸基に結合したリンカー部分との間のペプチド結合であり；
Ｘ１は存在しないか，又は遊離アミノ基をブロックするために，Ａのアミノ末端に付加される部分であり；
Ｘ２は存在しないか，又は遊離カルボキシル基をブロックするために，Ａのカルボキシル末端に付加される部分である；
ＡがＺ１を含む場合，Ｘ１は存在せず，ＡがＺ４を含む場合，Ｘ２は存在しないことを条件とする；）
で表わされる化合物，又は
ａ）前記式（Ｉ）の化合物の分子のオリゴマー又はマルチマーであって，
前記オリゴマー又はマルチマーは，前記式（Ｉ）の化合物の分子中に存在するアミノ酸基又はカルボン酸基と，向かい合う足場部分（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｍｏｅｉｔｙ）のアミノ酸基又はカルボン酸基との間に形成されるアミド結合を介して共通の足場部分にそれぞれ結合する前記式（Ｉ）の化合物の２つ以上の分子を含み，前記足場部分は少なくとも２つのアミド結合に関与しているものと，
ｂ）アミド結合，エステル結合，エーテル結合又はチオエーテル結合を介して
ＰＥＧ，
ＰＥＧ系化合物，
細胞浸透性ペプチド，
蛍光色素，
ビオチンもしくはその他のタグ部分，
脂肪酸，
離散サイズ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｓｉｚｅ）のナノ粒子，
又は金属イオンもしくは放射性イオンとのキレート配位子錯体，
に結合した，前記化学式（Ｉ）の化合物の分子又は上記ａ）で定義されるオリゴマー又はマルチマーを含む誘導体と，
ｃ）アミド化，グリコシル化，カルバミル化，アシル化，硫酸化，リン酸化，環化，脂質化，ペグ化，又はペプチドもしくはペプトイド融合するためのペプチドもしくはペプトイド融合パートナーへの結合によって修飾された，
式（Ｉ）の化合物の分子又は上記ａ）で定義されるそれらのオリゴマー又はマルチマーを含む誘導体と，
ｄ）前記化学式（Ｉ）の化合物の分子，又は上記ａ）又はｂ）で定義される誘導体の塩及び溶媒和化合物と，
から成る群から選択される化合物を提供する。
【００３３】
本発明の第２の側面では，本発明の第１の側面の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の第３の側面では，本発明の第１の側面の化合物又は本発明の第２の側面の医薬組成物の治療有効量を必要とする対象に投与することを含む，ＮＦ−κＢ活性及び／又は発現，及び／又はＧａｄｄ４５活性及び／又は発現を増加させることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法を提供する。
【００３５】
本発明の第４の側面では，医薬として使用する，本発明の第１の側面の化合物，又は本発明の第２の側面の組成物を提供する。
【００３６】
本発明の第５の側面では，ＮＦ−κＢ活性及び／又は発現，及び／又はＧａｄｄ４５活性及び／又は発現を増加させることを特徴とする疾患又は障害を治療するための医薬の製造に関する，本発明の第１の側面の化合物，又は本発明の第２の側面の医薬組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は，ＴＮＦ−Ｒ１のシグナル伝達における，ＮＦ−κＢ経路とＪＮＫ経路の間の保護的クロストークの模式図である。Ｇａｄｄ４５βが，ＮＦ−κＢによって誘導される生存経路とＭＫＫ７及びＪＮＫによって誘導される死滅経路との間のクロストークを仲介していることを見ることができる。Ｇａｄｄ４５βをブロックすることによってクロストークを阻害することは，ＭＫＫ７によりＪＮＫを活性化させ，腫瘍細胞の死滅経路をもたらすことになる。
【図２】図２は，Ｇａｄｄ４５β−ＭＫＫ７複合体のモデルである。このモデルは，“Ｐａｐａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：  １９０２９−１９０４１”の文献で報告されているように作成した。さらにこのモデルは，ＭＫＫ７の結晶構造（ｐｄｂ：２ＤＹＬ）及びＧａｄｄ４５γの結晶構造（ｐｄｂ：３ＦＦＭ）をモデルにしたＧａｄｄ４５βの構造を用いて精密化した。Ｇａｄｄ４５βの構造はブルー（リボン）であるのに対し，ＭＫＫ７の構造は黄色である（ファンデルワールス面のリボンで表される）。Ｇａｄｄ４５βの阻害性の酸性ループ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｌｏｏｐｓ）６０−７１及び１０４−１１８（Ｐａｐａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：  １９０２９−１９０４１）が強調表示されている。
【図３】図３（Ａ）は，リードＤ−テトラペプチド（ＤＴＰｓ）１及び２を単離するのに使用したＥＬＩＳＡスクリーニングを示している。Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用のアンタゴニストは，Ｘ１からＸ４までの各位置の１２個のアミノ酸のいずれかを使用して調製した一般式Ｆｍｏｃ−（βＡｌａ）２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＣＯＮＨ２の簡略化されたコンビナトリアルペプチドライブラリー（Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  ９：４４７−６７参照）をスクリーニングすることによって選択した。総数１２４＝２０，７３６の異なるペプチド含む，このライブラリーは，コーティングされたヒトのＭＫＫ７（４２ｎＭ），可溶性ヒトビオチン標識（ｈ）Ｇａｄｄ４５β（２１ｎＭ）及び４２ｎＭの名目上の濃度における各々の１２のサブライブラリー（示されていない）を用いて，ＥＬＩＳＡ競合アッセイによって４つのステップで反復的にデコンボリューションした。図３（Ｂ）は，最も活性した初代のペプチドを，その後第２世代のライブラリーの合成に使用したことを示している。このライブラリーのスクリーニングは，２つの非常に活性したペプチドを提供した（図３Ｂの１と８参照）。図３（Ｃ）は，最適化したペプチドを，その後Ｆｍｏｃ−（βＡｌａ）２−ｔａｇから解放し，Ｄ−異性体として合成し，得られたＤＴＰ１とＤＴＰ２が，それぞれ０．２２ｎＭ及び０．１９ｎＭのＩＣ５０で，相互作用するＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７を阻害したことを示している。また，これらのペプチドのＬ−異性体（すなわちＬＴＰ１とＬＴＰ２）がＥＬＩＳＡ競合アッセイでＤＴＰｓと同様のＩＣ５０ｓを示したのに対して，ネガティブコントロールのペプチド，ＬＮＣとＤＮＣは，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体の形成に与える検出可能な阻害効果を示さなかったことを見ることができる。ここで，ＬＮＣはＬ−異性体ネガティブコントロールであり，ＬＴＰ１はＬ−異性体テトラペプチド１であり，ＬＴＰ２は，Ｌ−異性体テトラペプチド２であり，ＤＮＣは，Ｄ−異性体のネガティブコントロールである。
【図４】図４は，生体液中でのＺ−ＤＴＰｓの安定性を示している。ＥＬＩＳＡ競合アッセイは，ヒト血清において３７℃で４８時間インキュベーションした後（ＩＣ５０＝０．１９ｎＭ，Ｚ−ＤＴＰ１；ＩＣ５０＝０．１８ｎＭ，Ｚ−ＤＴＰ２），Ｚ−保護ＤＴＰｓ（Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２）が完全な阻害活性を保持していることを示したのに対して，Ｚ−保護ＬＴＰｓ（Ｚ−ＬＴＰ１，Ｚ−ＬＴＰ２）がこの処理後（ＩＣ５０ｓ＞１０μΜ）にほぼ完全に不活性化したことを示している。アッセイは，図３Ｃのように行い，コーティングされたＭＫＫ７，可溶性ビオチンｈＧａｄｄ４５β，及び示される濃度のテトラペプチドを使用した。Ｚ−ＬＮＣとＺ−ＤＮＣはそれぞれ，Ｌ−及びＤ−異性体ネガティブコントロールである。
【図５】図５は，ネガティブコントロール（ＮＣ）Ｄ−テトラペプチド（ＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３とＮＣ４）には見られないが，Ｄ−テトラペプチド１及び２（ＤＴＰ１とＤＴＰ２）によって，Ｇａｄｄ４５β／ＭＭＫ７の相互作用が効果的かつ特異的に阻害することを示す，共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイである。Ｃｏ−ＩＰは，抗ＦＬＡＧ（ＭＫＫ７）抗体を用いて行い，ウェスタンブロット像を，抗ＨＡ（ＨＡ−Ｇａｄｄ４５βを検出）（上部）又は抗ＭＫＫ７（下部）抗体を用いて現像した。
【図６】図６は，ネガティブコントロール（ＮＣ）Ｄ−テトラペプチド（ＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３及びＮＣ４）には見られないが，Ｄ−テトラペプチド１及び２（ＤＴＰ１とＤＴＰ２）によって，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７の相互作用が効果的かつ特異的に阻害され，ＭＫＫ７触媒活性を回復させることを示す，ＭＫＫ７キナーゼアッセイである。活性化したＭＫＫ７を，ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（Ｐ／Ｉ）で処理したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から，抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し，組換えヒト（ｈ）Ｇａｄｄ４５βの存在下（上パネル）又は非存在下（下パネル）においてＤ−テトラペプチドとインキュベートした。示されるように，Ｇａｄｄ４５βの非存在下（下パネル）においてキナーゼでインキュベートしたとき，活性リードＤ−テトラペプチドもコントロールＮＣテトラペプチドも，ＭＫＫ７触媒活性を阻害しなかった。
【図７】図７（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，ＤＴＰ２のアセチル誘導体（ＡＣ−ＤＴＰ２）又はＺ−保護ＤＴＰ２のＬ異性体の誘導体（Ｚ−ＬＴＰ２）では見られないが，Ｚ−保護ＤＴＰ２の誘導体（Ｚ−ＤＴＰ２）が腫瘍細胞株に有意な殺腫瘍活性を有していることを示す，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイである。データは，未処理細胞の生存率／増殖率に対する，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２（Ａ），Ａｃ−ＤＴＰ２（Ｂ）もしくはＺ−ＬＴＰ２（Ｃ）（黒カラム），又はＺ−ＤＮＣ（Ａ），Ａｃ−ＤＮＣ（Ｂ）及びＺ−ＬＮＣ（Ｃ）（白カラム）のいずれかで処理した後の腫瘍細胞の生存率／増殖率の割合を表している。図には時刻が示されている。テストした８つの感受性多発性骨髄腫細胞株の内の３つの細胞株（すなわちＵ２６６，ＫＭＳ−１１，ＮＣＩ−Ｈ９２９），バーキットリンパ腫（ＢＪＡＢ）及び前単球性白血病（Ｕ９３７）細胞株が示されている。これらのデータは，Ａｃ−ＤＴＰ２の非活性化（Ｂ）及びＺ−ＬＴＰ２の低い活性化（Ｃ）に対して，Ｚ−ＤＴＰ２（Ａ）の高い細胞傷害活性を証明している（図８，図８Ｂ，及び図８Ｃ，表４；別の多発性骨髄腫株参照）。図７（Ｂ）は，ＣａＣＯ２アッセイ（データは示されていない）で証明されるように，多発性骨髄腫細胞株におけるＡｃ−ＤＴＰ２の殺腫瘍活性の欠如が，この化合物の低い細胞透過性と相関することを示している。メチル（Ｍｅ）基，アセチル（Ａｃ）基，ミリスチル（Ｍｙｒ）基，３−メトキシ基，４−ヒドロキシベンゾイル基，ベンゾイル基，６Ｃｌ−ベンジルオキシカルボニル（６Ｃｌ−Ｚ）基，及び／又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を含む，他の効果の低いＤＴＰｓ誘導体（ＤＴＰｓの細胞取り込みを改善するように設計されている）で処理した後の多発性骨髄腫細胞株の生存率は示されていない。図７（Ｃ）は，Ｚ−ＬＴＰＳのインビトロでの効力及び細胞取り込みがＺ−ＤＴＰｓのものと同等であったが（図３Ｃ参照；データは示されていない），Ｚ−ＬＴＰ２は生体液中における低安定性により，多発性骨髄腫細胞では低活性であることを示している（図４参照）。
【図８】Ｚ−ＤＴＰｓのアポトーシス促進活性は，恒常的ＮＦ−κＢ活性を有する腫瘍細胞に対して選択的である。図８（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，図７で記載したように実施した［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイである。これは，示されるように（Ａ）では１４４時間後；（Ｂ，Ｃ）では２４時間，７２時間又は１４４時間，１０μΜのＺ−ＤＴＰｓ又はＺ−ＤＮＣで処理した後の腫瘍細胞株パネルにおける細胞生存を示している。図８（Ａ）は，テストした９つの多発性骨髄腫細胞株の内の８つの細胞株と，２つのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ；ＬＹ３）細胞株の内の１つの細胞株と，１つの前単球性白血病細胞株（Ｕ９３７）と，６つのバーキットリンパ腫細胞株（ＢＪＡＢ）の内の１つの細胞株で（図９参照），強力な殺腫瘍活性を有することを示している。興味深いことにＺ−ＤＴＰ２は，活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）様サブタイプ（すなわちＬＹ３）のＤＬＢＣＬ細胞株においてのみ細胞傷害活性を示すが，胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）様サブタイプ（すなわちＳＵＤＨＬ６）では，恒常的なＮＦ−κＢ活性を特徴とせず，細胞傷害活性を示さなかった（Ｎｇｏ  ＶＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０８９）：  １０６−  １０；図１２，Ｇａｄｄ４５β発現のレベル参照）。またそれらは，多発性骨髄腫細胞株においても活性を示し，実質的にそのすべてが恒常的なＮＦ−κＢ活性の特徴を有していることを示している。１０μΜのＺ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２及びＺ−ＤＮＣによって示される時間（つまり２４時間，７２時間又は１４４時間）処理した後の多発性骨髄腫及びＤＬＢＣＬ細胞株におけるＺ−ＤＴＰ２の殺腫瘍活性が図８（Ｂ）に，Ｚ−ＤＴＰ１の殺腫瘍活性が図８（Ｃ）に示されている。結果はトリパンブルー排除アッセイ（データは示されていない）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイで確認された（図１０参照；データは示されていない）。
【図９】図９は，この化合物が非常に高い濃度の１００μＭのＺ−保護Ｄ−ネガティブコントロール，Ｚ−ＤＮＣで使用された場合でも，Ｚ−ＤＴＰ２で１４４時間処理した後，２２個の耐性腫瘍細胞株パネルにおけるＺ−ＤＴＰ２細胞傷害性の欠如を示す，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイである。また，感受性細胞株ＢＪＡＢ（バーキットリンパ腫），ＫＭＳ−１１及びＫＭＳ−１２（多発性骨髄腫）も示されている。特に，これらの細胞株において，Ｚ−ＤＴＰ２誘導死滅に対する感受性と内因性Ｇａｄｄ４５β発現レベルとの間で強い相関関係があった（図１２Ａ及び図１２Ｂ参照）。
【図１０】多発性骨髄腫細胞株におけるＺ−ＤＴＰ２誘導死滅はアポトーシスによるものである。図１０は，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２又はＺ−ＤＮＣ１で７２時間又は１４４時間処理した後の代表的な多発性骨髄腫細胞株，ＮＣＩ−Ｈ９２９，ＫＭＳ−１１，ＡＲＨ−７７，ＪＪＮ−３，及びＵ２６６における，アポトーシスの誘導を示す（すなわち，サブＧ１ＤＮＡ含量，ＦＬ２−Ａ参照），ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）核染色アッセイである。また，同じ条件下で培養した未処理細胞のＤＮＡ含有量も示されている。アポトーシス細胞の割合は，ヒストグラムで示されている。
【図１１】Ｚ−ＤＴＰ２処理は多発性骨髄腫細胞株において強力なＪＮＫ活性化を引き起こす。図１１は，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２又はＺ−ＤＮＣで処理したＫＭＳ１１とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を示しており，抗リン（Ｐ）ＪＮＫ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより，ＪＮＫの活性化を示される時間でモニタリングした。ＪＮＫのリン酸化（ＪＮＫ活性化のマーカー）の増加は，Ｚ−ＤＴＰ２による処理後にのみ見られ，Ｚ−保護ネガティブコントロールペプチド（Ｚ−ＤＮＣ）による処理後には見られなかった。ＴＮＦα刺激（２，０００Ｕ／ｍｌ）をＪＮＫ活性化のポジティブコントロールとして使用した。重要なことに，Ｚ−ＤＴＰ２の同様の効果はＭＫＫ７活性化にも見られた（データは示されていない）。また，Ｇａｄｄ４５βの生物学的活性で見られるように（参考文献：Ｄｅ  Ｓｍａｅｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３０６−３１３；及び  Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３；及び  Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８２：  １９０２９−１９０４１  ；及び  Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：  １９１−１９２３参照），多発性骨髄腫におけるＺ−ＤＴＰｓの効果はＭＫＫ７／ＪＮＫ経路に特異的であり，これらの細胞株におけるＩＫＫ／ＮＦ−κＢ，ＥＲＫ及びｐ３８経路の活性化に対する効果は，これらの化合物では観察されなかった（データは図示されていない）。
【図１２】図１２は，腫瘍細胞株における，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に対して感受性を有する細胞と，Ｇａｄｄ４５βの発現レベルとの強い相関関係を示している。図１２（Ａ）において，上部パネルは，２９個の癌細胞株パネルでのＧａｄｄ４５β発現（ｑＲＴ−ＰＣＲ；赤色カラム）を示し，下部パネルは，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２で１４４時間処理した後の同様の細胞株における細胞死（［３Ｈ］チミジン取り込み；黒色カラム）の割合を示している。図１２（Ｂ）は，図１２（Ａ）と同様の実験でＺ−ＤＴＰ２で処理した後の，Ｇａｄｄ４５β発現対細胞生存の割合の相関プロットを示している。２つのパラメータ領域間の相関係数の有意性は，非常に高い（Ｐ＜０．０１）（グラフパッドソフトウェアにより計算した，２変数間の関連を定量化したピアソン相関）。これらのデータは，細胞におけるＺ−ＤＴＰｓの高い標的特異性を証明している。図１２（Ａ）の上部パネルの値は，β−アクチンに対して正規化した。
【図１３】図１３は，本発明に開示の関連化合物の化学構造と可能なファーマコフォア及び評価戦略の説明を示している。図１３（Ａ）は，親化合物Ｚ−ＤＴＰ２（Ｚ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）［配列番号１］と，Ｚ−ＤＴＰ２誘導体である，ｍＤＴＰ１（ｐ−ヒドロキシ安息香酸−Ｄ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ａｒｇ−フェネチルアミン），ｍＤＴＰ２（Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｎ３／４），及びｍＤＴＰ３（Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）の化学構造を示している。これらの修飾されたＺ−ＤＴＰ２化合物（以下，ｍＤＴＰｓと呼ぶ）を，インビトロ（ＥＬＩＳＡ）及び細胞内（死滅アッセイ）の両方における活性について試験した。分子量（ＭＷ）と，インビトロ及び細胞内のＩＣ５０ｓ，及びＺ−ＤＰＴ２及びこれらの代表的な修飾化合物のリガンド効率も，報告されている（表５参照）。図１３（Ｂ）は，生理活性化合物の可能なファーマコフォアを同定するために達成した戦略の主な手順の概要を示している（Ｇｅｅｓｏｎ  ＭＰ．  ２００８  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ５１  ：８１７−８３４参照）。提案した変更のほとんどは，以下のように既に検討されている：Ｎ−末端基（表３参照）；Ｔｙｒとシクロヘキシルアラニンの交換，Ｐｈｅとシクロヘキシルアラニンの交換，内部Ｇｌｕ及び／又はＡｒｇの除去（ｒｅｍｏｖｅ），ＧｌｕとＡｓｐの交換，ＡＳＰ側鎖へのエステルプロドラッグ（表５参照）；ＴｙｒとＰｈｅの交換，ＡｒｇとＨｉｓ，Ｌｙｓ又はＰｒｏの変換（表６参照）。このデータを合わせると，生理活性ファーマコフォアを次のように記述できることを示している。位置Ｙ１では，チロシン又は類似の芳香環とＨ−結合ドナー／アクセプターが必要とされる。位置Ｙ２，及び／又はＹ３では，少なくとも１種のα−アミノ酸と，好ましくは細胞への取り込みを向上させる塩基性基が必要とされる。位置Ｙ３のアルギニンの有無にかかわらず，位置Ｙ２でのプロリン，アスパラギン，又ロイシンは，生理活性の保持を可能する。２つの芳香環の間の約７オングストロームよりも大きい距離（つまり，１つのα−アミノ酸によって課せられているもの（ｉｍｐｏｓｅ）より大きい距離）は，生理活性の減少を引き起こす。位置Ｙ４では，生理活性を保持するＨ−結合ドナー／アクセプター基の有無にかかわらず，芳香族環が必要とされる（表６参照）。
【図１４】図１４の（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）は，５人の典型的な患者から単離した原発性多発性骨髄腫細胞におけるＺ−ＤＴＰｓの細胞傷害活性を示している。各パネルは，患者１（ａ），患者２（Ｂ），患者３（Ｃ），患者４（Ｄ），及び患者の５（Ｅ）の異なる患者由来の細胞で得られたデータを示している。図１４（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）において，Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＮＣの処理は，４８時間，示された濃度で行われた。また，各患者由来の未処理細胞（−）も示している。アッセイはトリパンブルー色素排除法，及び細胞数計測により行った。値は，未処理のコントロール細胞の生存率に対する，Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１又はＺ−ＤＮＣでの処理後に観察された細胞の生存率を表している。
【図１５】図１５は，多発性骨髄腫でない個人由来の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）（図１５Ａ），末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）（図１５Ａ），及びｍｅｓｅｎｋｙｍａｌ幹細胞（ＭＳＣｓ）（図１５Ｂ）を含む初代非形質転換細胞，又はマウスから精製した一次Ｂ及びＴリンパ球における，Ｚ−ＤＴＰｓの細胞傷害活性の欠如を示している。図に示される濃度で，それぞれ（ＢＭＳＣｓ，ＰＢＭＮＣｓでは）４８時間（図１５Ａ），（マウスＢ及びＴ細胞では）７２時間（図１５Ｂ），又は（ＭＳＣｓでは）１４４時間（図１５Ｂ），Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＮＣにより処理した。アッセイはトリパンブルー色素排除法及び細胞数計測（Ａ）又は［３Ｈ］チミジンの取り込み（Ｂ）を用いて行った。
【図１６】図１６は，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５β発現のサイレンシング後の典型的な多発性骨髄腫細胞株における細胞死の誘導を示している。図１６（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，Ｚ−ＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株，ＡＲＨ−７７（図１６Ａ）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（図１６Ｂ）と，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株，ＲＰＭＩ−８２２６（図１６Ｃ）を，Ｇａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡｓ（すなわち，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，又はｓｈ−Ｇａｄｄ４５−３），ＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡ（すなわち，ｓｈ−ＭＫＫ７−１又はｓｈ−ＭＫＫ７−２），か又は非特異的ｓｈ−ＲＮＡ（すなわち，ｓｈ−ＮＳ−１やｓｈ−ＮＳ−２）のいずれかを発現するレンチウイルスに感染させ，感染した細胞の生存率を，高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現する細胞，つまり感染した細胞を明らかにするフローサイトメトリー及び細胞数計測により，８日間にわたってモニタリングした。図１６（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，同様の培養における０日間でのｅＧＦＰ＋多発性骨髄腫細胞の生存率に対する，図示された期間でのｅＧＦＰ＋（つまり感染した）多発性骨髄腫細胞の生存率を示している。細胞は，標準的な方法により，示されるｓｈ−ＲＮＡと共にｅＧＦＰも発現するｐＬｅｎｔｉＬｏｘ．３．７レンチウイルスに感染させた（Ｙａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６  Ｊｕｌ  ５；  １０３（２７）：  １０３９７−４０２参照）。５日後，ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用してｅＧＦＰ＋細胞を選別し，細胞生存率の分析を開始する前に２日間放置した。この時間（つまり生存分析の開始日）が０日目としてグラフに示されている。データは，Ｇａｄｄ４５β発現の阻害が，Ｚ−ＤＴＰ誘導傷害性に感受性を有する多発性骨髄腫細胞株（つまり，ＡＲＨ−７７，ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株）（図１６Ａ，Ｂ）において急速な細胞死を引き起こすことを示しているが，ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞株（図１６Ｃ）では起こらず，この傷害性に耐性があることを示している。これらのデータはさらに，多発性骨髄腫細胞におけるＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−ＤＴＰｓの標的特異性を確証している（図７，図８，図９，及び図１２；死滅アッセイ及びｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ参照）。またそれらは，Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫細胞で果たす重要な役割を示していることから，多発性骨髄腫の治療標的としてもＧａｄｄ４５βが有効であることを証明している。
【図１７】図１７は，ＭＫＫ７のサイレンシングでは見られないが，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのサイレンシングが，Ｚ−ＤＴＰｓの誘導死滅に感受性を有する多発性骨髄腫細胞株（つまりＡＲＨ−７７及びＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株）（図７Ａ，図７Ｂ，図７Ｃ及び８；Ｚ−ＤＴＰ誘発死滅に対する感受性参照）における強力な殺腫瘍活性を有することを示す，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイである。一方で，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株，ＲＰＭＩ−８２２６の生存率は，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５β阻害による影響を受けない。図１７（Ａ）は，Ｇａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のサイレンシング後の３つの典型的な多発性骨髄腫細胞株，ＲＰＭＩ−８２２６，ＮＣＩ−Ｈ９２９及びＡＲＨ−７７の生存率を示している。図１７（Ｂ）は，３つの異なるＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡｓ（すなわち，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，又はｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−３）と，２つの異なるＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡｓ（すなわち，ｓｈ−ＭＫＫ７−１又はｓｈ−ＭＫＫ７−２）と，２つの異なる非特異的ｓｈ−ＲＮＡ（すなわち，ｓｈ−ＮＳ−１又はｓｈ−ＮＳ−２）によるＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のサイレンシング後の多発性骨髄腫細胞株のＡＲＨ−７７の生存率を示している。図１７（Ａ，Ｂ）において，多発性骨髄腫細胞株は，示されるｓｈ−ＲＮＡを発現するｐＬｅｎｔｉＬｏｘ．３．７レンチウイルスに感染させ，その後，ｅＧＦＰ＋多発性骨髄腫細胞（つまりレンチウイルスに感染した細胞）を，図１６のようにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して選別した。［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイは，細胞選別から１０日後に行った。これは，図１６の８日目に相当する。０日目（つまり細胞選別後２日目）の同様の細胞で発生する［３Ｈ］チミジン取り込みに対する，８日目（つまり細胞選別後１０日目）の［３Ｈ］チミジンの取り込みの割合（ｃ．ｐ．ｍ），つまり細胞増殖の測定値を示している。これらのデータはさらに，多発性骨髄腫細胞におけるＧａｄｄ４Ｓｐ／ＭＫＫ７複合体に対する標的特異性を証明しており（図７，図８，図９及び図１２，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅及びＧａｄｄ４５β発現参照；図１６，Ｇａｄｄ４５β及びＭＫＫ７遺伝子サイレンシング参照），Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫細胞の生存中に果たす重要な役割を確証している。さらに，これらを合わせると，多発性骨髄腫の治療標的としてＧａｄｄ４５βが有効であることを証明している。
【図１８】図１８（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのサイレンシングが，Ｚ−ＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株，ＡＲＨ−７７（Ａ）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（Ｂ）においてアポトーシスを誘導するが，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株，ＲＰＭＩ−８２２６（Ｃ）では誘導しないことを示す，ＣＰＩ核染色アッセイである（以下参照：図１６及び図１７，ｓｈ−ＲＮＡによるサイレンシング；図７，図８及び図１２，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に対する感受性を有する多発性骨髄腫細胞株，及びＧａｄｄ４５β発現）。図１８（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，レンチウイルス感染の欠乏（非感染）中，又はＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡ（すなわち，ｓｈ−ＭＫＫ７−ｌ及びｓｈ−ＭＫＫ７−２）もしくは非特異的なｓｈ−ＲＮＡ（すなわち，ｓｈ−ＮＳ−１又はｓｈ−ＮＳ−２）の発現後，同様の多発性骨髄腫細胞株において，アポトーシスの有意な誘導は観察されなかったことを示している。多発性骨髄腫細胞株は，ｓｈ−ＲＮＡを発現するｐＬｅｎｔｉＬｏｘ．３．７レンチウイルスに感染させ，ＥＧＦＰ＋多発性骨髄腫細胞（つまりレンチウイルスに感染した細胞）を，図１６のようにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して選別した。ＰＩ核染色アッセイは細胞選別から１０日後に行った。これは，図１６の８日目に相当する。アポトーシス細胞（つまりｓｕｂＧＴ１ＤＮＡ含量を示す細胞）の割合はヒストグラムで示されている。重要なことに，図１８（Ａ）は，異なるＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡ（つまり，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−３）によって誘導されるアポトーシスのレベルが，これらのＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡのそれぞれによって誘導されるＧａｄｄ４５βダウンレギュレーションのレベルと相関していることを示している（データは示されていない）。図１８（Ａ，Ｂ，Ｃ）のデータはさらに，多発性骨髄腫細胞におけるＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−ＤＴＰｓの標的特異性を証明し（以下参照：図７，図８，及び図９，Ｚ−ＤＴＰｓによる死滅アッセイ；図１２，Ｇａｄｄ４５β発現及びＺ−ＤＴＰ誘導死滅に対する癌細胞の感受性；図１６及び図１７，ＭＫＫ７に見られないＧａｄｄ４５βのダウンレギュレーションによる多発性骨髄腫細胞誘導死），Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫細胞生存中に果たす重要な役割を確証している。さらにこれらを合わせると，多発性骨髄腫の治療標的としてＧａｄｄ４５βが有効であることを証明している。
【図１９】図１９（Ａ，Ｂ，Ｃ）は，ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７又はＧａｄｄ４５βのいずれかのサイレンシングが，多発性骨髄腫細胞株における細胞周期の分布に影響を与えないことを示す，ＰＩ核染色アッセイである。レンチウイルスに感染した典型的な多発性骨髄腫細胞株，ＡＲＨ−７７（Ａ），ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ｂ），及びＲＰＭＩ−８２２６（Ｃ）は，図１８で示されるのと同様の実験に由来する。図１８のデータ（ＰＩ染色プロファイルは対数スケールで表わされ，アポトーシスを強調している）とは違って，この図のＰＩ染色（つまりＦＬ２−Ａ）は，細胞周期の分布を強調するリニアスケールで表わされている。細胞周期の異なる段階（つまりＧ１，Ｓ，及びＧ２／Ｍ）での多発性骨髄腫細胞の割合はヒストグラムで示されている。図１８（Ａ，Ｂ）は，大規模なアポトーシスの誘導により，多発性骨髄腫細胞株，ＡＲＨ−７７（Ａ）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（Ｂ）において，Ｇａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡで細胞周期分析を行うことができなかったことを示している。
【図２０】図２０（Ａ，Ｂ，Ｃ）では，ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７のサイレンシングが，典型的なＺ−ＤＴＰ−感受性細胞株，ＡＲＨ−７７に，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して耐性を持たせていることを示している。図２０は，ＭＫＫ７特異体（ｓｈ−ＭＫＫ７）又は非特異体ｓｈ−ＲＮＡは（ｓｈ−ＮＳ）のいずれかを発現する多発性骨髄腫細胞株，ＡＲＨ−７７における，Ｄ−異性体のネガティブコントロールテトラペプチド（Ｚ−ＤＮＣ）（図２０Ａ，Ｂ，Ｃ），Ｚ−ＤＴＰ１（図２０Ａ），Ｚ−ＤＴＰ２（図２０Ｂ），又はｍＤＴＰ３（図２０Ｃ）のＩＣ５０ｓを示す，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイである。Ｚ−ＤＮＣ，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，又はｍＤＴＰ３によってＡＲＨ−７７細胞を３日間処理した。１．４μΜ（Ｚ−ＤＴＰ１；Ａ），３０２ｎＭ（Ｚ−ＤＴＰ２；Ｂ），及び３０３ｎＭ（ｍＤＴＰ３；Ｃ）のＩＣ５０値が示すように，ｓｈ−ＮＳを発現するＡＲＨ−７７細胞がＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して非常に高い感受性を有していることが分かり，これは非感染の親のＡＲＨ−７７細胞に見られるのと同様である（表４参照）。これとは対照的に，ＩＣ５０値＞１０μΜが示すように，ｓｈ−ＭＫＫ７を発現するＡＲＨ−７７細胞は，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して完全に耐性を有しており，これはＺ−ＤＮＣで処理したＡＲＨ−７７細胞に見られるのと同様である。ＩＣ５０ｓは，Ｚ−ＤＮＣ（図２０Ａ，Ｂ，Ｃ），Ｚ−ＤＴＰ１（図２０Ａ），Ｚ−ＤＴＰ２（図２０Ｂ），及びｍＤＴＰ３（図２０Ｃ）の０．０１〜１０μΜの範囲での増加濃度を用いて，実施例で記載されているように算出した。グラフは，未処理細胞により得られるｃ．ｐ．ｍ．値に対する，ペプチド処理した細胞により得られるカウント毎分（ｃ．ｐ．ｍ．）の割合，つまり細胞増殖の測定値を示している。同様のデータは，Ｕ２６６，ＫＭＳ−１，及びＫＭＳ−１２細胞株を含む，別のＺ−／ｍＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞でも得られた（データは示されていない）。図２０（Ａ，Ｂ，Ｃ）のこれらのデータは，多発性骨髄腫細胞におけるＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対する非常に高い標的特異性を証明している（図１２，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に感受性を有する癌細胞とＧａｄｄ４５β発現との相関関係参照）。
【図２１】図２１（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）は，本発明の化合物が，分離しているＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のいずれにも結合せず，むしろビアコアアッセイ（ｂｉａｃｏｒｅ  ａｓｓａｙｓ）で測定されるように，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体の結合生成を必要とすることを示している。図２１（Ａ）は，チップ上に固定化されたＭＫＫ７のキナーゼドメイン（ＭＫＫ７ＫＤ）へのＧａｄｄ４５βの結合を示している。Ｇａｄｄ４５βの様々な濃度（２０〜２００ｎｍの範囲）を，ＭＫＫ７ＫＤが固定化されているチップに注入した。ＭＫＫ７ＫＤとＧａｄｄ４５βの用量依存的な結合，及びＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７ＫＤ複合体の解離曲線が記録されており，個々の曲線の速度論的パラメータによって測定した値を平均して，４．０±０．７ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）の値を決定した。簡単に言えば，平衡定数解離（ＫＤ）の熱力学パラメータ（ｔｅｒｍｏｄｉｎａｍｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）は，ＳＰＲシグナル（反応単位，ＲＵとして表される）の増加又は減少にそれぞれ対応する結合段階（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）（Ｋａ）と解離段階（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）（ＫＤ）を考慮して算出した。図２１（Ｂ）は，Ｇａｄｄ４５βをチップ上に固定化させた時のＧａｄｄ４５βとＭＫＫ７ＫＤの結合性を示している。ＫＤ値は，固定化したＧａｄｄ４５βのチップ上に様々な濃度（１〜２５ｎＭの範囲）をＭＫＫ７ＫＤに注入することによって決定した。図２１（Ａ）のように，用量反応曲線はテストしたＭＫＫ７ＫＤの濃度のすべてを示している。これらの分析から３．４±０．６ｎｍのＫＤ値が得られ，これは図２１（Ａ）で得られたＫＤ値と非常によく似ている。図２１（Ｃ）では，Ｇａｄｄ４５β又はＭＫＫ７ＫＤのいずれかを含むチップ上へのｍＤＴＰ３の注入が示されている（ｍＤＴＰ３の注入を示す図である）。ｍＤＴＰ３がＧａｄｄ４５β及び／又はＭＫＫ７に結合するかどうかを判断するために，１ｎＭから１０μＭの範囲の濃度で，ｍＤＴＰ３を含む溶液を，どちらか一方のタンパク質で誘導体化したチップに注入した。図から分かるように，ｍＤＴＰ３の最高濃度（すなわち，１０μΜ）でさえ，ｍＤＴＰ３はＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のいずれにも結合しないことが示された。図２１（Ｄ）は，予備成形したＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体とｍＤＴＰ３の結合を示している。濃度１００ｎＭのＧａｄｄ４５βをＭＫＫ７ＫＤで誘導体化したチップ上に注入した（６０μＬ；接触時間３分）。Ｇａｄｄ４５βタンパク質は約１０分間で解離し，Ｇａｄｄ４５βの約５０％がまだＭＫＫ７ＫＤに結合しているときに，ｍＤＴＰ３を１０ｎＭ，１００ｎＭ，又は１μΜのいずれかの濃度で注入した。図からわかるように，１００ｎＭと同等又は１００ｎＭより低い濃度で使用したときに，ｍＤＴＰ３はＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７ＫＤ複合体の急速な解離を誘導した。また，ｍＤＴＰ３を洗い流した後，Ｇａｄｄ４５／ＭＫＫ７ＫＤ複合体形成が急速に回復したことも見ることができる。しかし，高濃度（例えば１μΜ）では，ｍＤＴＰ３は，Ｇａｄｄ４５β及び／又はＭＫＫ７ＫＤ，か又は２つのタンパク質の複合体のいずれかに結合したことを示す，用量反応結合及び解離曲線を得た。��れらのデータは，ＤＴＰｓが分離しているＧａｄｄ４５β又はΜΚΚ７タンパク質に結合しないという見解を支持し，むしろ２つのタンパク質が相互に接触する時にのみ，一方のタンパク質及び／又は他方のタンパク質，又は２つのタンパク質の複合体に結合することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書中で使用される命名法についての留意
本明細書の様々な部分で，化合物をＬＴＰ，ＤＴＰ，ＬＮＣ，ＤＴＰ１等の記号で表している。“ＮＣ”を含むコードは，本発明の範囲内に包含されないネガティブコントロールである化合物を表している。“ＴＰ”（これはテトラ又はトリペプチド／ペプトイドの略称であるが，化合物のいくつかはジペプチド／ペプトイドモチーフに基づいていることに留意されたい）を含むコードは，本発明の範囲内である。“Ｌ”又は“Ｄ”という接頭辞は，Ｌ又はＤの光学配置の残基を表す。数値の接尾辞は，別の場所で説明している特定の番号の化合物を意味する。“Ｚ−ＤＴＰ”の接頭語“Ｚ”は，ベンジルオキシカルボニル，Ｎ−末端基を表す。“ｍＤＴＰ”の接頭辞“ｍ”は，細胞取り込みの向上，細胞活性，及び／又はＰＫプロファイルを目的としたＤＴＰの任意の修飾を表している。例えば，ｍＤＴＰ１として，Ｎ及び／又はＣ末端の除去（ｒｅｍｏｖｅ），ｍＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３として，それぞれＺ−ＤＴＰ２のＺ基の除去（ｒｅｍｏｖｅ），及びＡｒｇ又はＧｌｕ残基の除去（ｒｅｍｏｖｅ）などである（さらなる例は，図１３に提供されている）。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明を強調する戦略は，ＮＦ−κＢ−ＪＮＫクロスト−クが，細胞の生存か，癌細胞の死滅を含むプログラム死かを制御することを理解することから生じる。意義深いことに，Ｇａｄｄ４５βは，ＮＦ−κＢ活性化に応じて癌細胞でアップレギュレートされ，肝細胞癌，膀胱癌，脳や中枢神経系癌，乳癌，頭頸部癌，肺癌，前立腺癌を含むいくつかの固形腫瘍だけでなく，多発性骨髄腫細胞，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，バ−キットリンパ腫，前単球性白血病や他の白血病などを含む他の腫瘍において，高レベルで恒常的に発現する。本発明は，ＮＦ−κＢ−ＪＮＫのクロスト−クを防ぐことで，細胞内でのＪＮＫ細胞傷害性シグナル伝達を増強するＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７標的化合物を送達することにより，プログラム細胞死を促進する戦略に基づいている。本発明の生成物及び方法は，特にＧａｄｄ４５βの異常なアップレギュレートを特徴とする疾患の治療に関連してもよい。また，Ｇａｄｄ４５βが必ずしも異常にアップレギュレートされないが，ＮＦ−κΒが異常にアップレギュレートされ又は活性化される場合，及びＧａｄｄ４５β−ＭＫＫ７シグナル伝達を介したプログラム細胞死の誘導因子（ｉｎｄｕｃｔｏｒ）が治療を提供する場合の疾患及び障害にも関連している。
【００４０】
ＮＦ−κΒの異常なアップレギュレート又は活性化を特徴とし，Ｇａｄｄ４５β−ＭＫＫ７シグナル伝達を介するプログラム細胞死の誘導因子（ｉｎｄｕｃｔｏｒ）が治療を提供することが可能な疾患の例は，血液悪性腫瘍（例えば，多発性骨髄腫，マントル細胞リンパ腫，ＭＡＬＴリンパ腫，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，ホジキンリンパ腫，骨髄異形成症候群，成人Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１），慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，急性骨髄性白血病，及び急性リンパ性白血病）と，固形腫瘍（例えば，乳癌，子宮頸癌，腎癌，肺癌，大腸癌，肝臓癌，食道癌，胃癌，喉頭癌，甲状腺癌，甲状腺癌，膀胱癌，卵巣癌，前立腺癌，膵臓癌及び他の多くの癌）と，その他の癌（例えば，黒色腫，円柱腫，扁平上皮癌［皮膚，及び頭頸部］，口腔癌，子宮内膜癌，網膜芽細胞腫，星状細胞腫，及び神経膠芽腫）と，自己免疫疾患，慢性炎症性疾患，変性疾患，虚血性疾患及び血管疾患などの他の疾患及び障害などがある。
【００４１】
様々な疾患及び障害は，ＮＦ−κＢの活性に依存している。実際に，事実上あらゆる既知の人間の疾患又は障害の病因は，現在，炎症に依存すると考えられており，したがって，ＮＦ−κＢが関与している。これは炎症反応のマスタースイッチとして機能し，サイトカイン，受容体，転写因子，ケモカイン，炎症性酵素，及び生存促進性存因子を含む他の因子をコード化する２００以上の遺伝子配列の発現を調整して，炎症を開始し，維持する。本発明の化合物は炎症におけるＮＦ−κＢの個別の（ｄｉｓｃｒｅｔ）生存促進性の活性を阻害する。したがって，これらの化合物による治療を受け入れる疾患や障害は，従来の慢性炎症性疾患（例えば，炎症性腸疾患，関節リウマチや乾癬など）の他にも重要な炎症性成分に依存する他の疾患及び障害を含む。抗炎症剤又はＮＦ−κＢ阻害剤で治療し，又はＮＦ−κＢ阻害剤による治療が適するとして提案されているそのような疾患及び障害の例は，以下の通りである。
【００４２】
１，呼吸器：
気管支喘息，アレルギー性喘息，内因性喘息，外因性喘息，運動誘発性喘息，薬剤誘発性（アスピリン及びＮＳＡＩＤ誘発性を含む）喘息，粉塵誘発性喘息，間欠性喘息，持続性喘息やそれらの重大な症状，及び気道過敏性の他の原因を含む，気道の閉塞性疾患；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；感染症及び好酸球性気管支炎を含む，気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；農夫肺及び関連疾患；過敏性肺炎；特発性線維化性肺胞炎，特発性間質性肺炎，抗腫瘍治療を複雑にする線維症，結核などの慢性感染症，アスペルギルス症，及び他の真菌症を含む，肺線維症；肺移植の合併症；肺血管系の血管炎，血栓症及び肺高血圧症；気道の炎症や分泌状態に伴う慢性咳嗽，及び医原性の咳の治療を含む，鎮咳作用；薬物性鼻炎や血管運動性鼻炎を含む急性及び慢性鼻炎；神経性鼻炎（花粉症）を含む通年性及び季節性アレルギー性鼻炎；鼻ポリープ；一般的な風邪及び呼吸器合胞体ウイルス，インフルエンザ，コロナウイルス（ＳＡＲＳを含む）又はアデノウイルスによる感染症を含む，急性ウイルス感染症；又は好酸球性食道炎；
【００４３】
２，骨及び関節：
例えば先天性の股関節形成不全などの原発性骨関節症及び続発性骨関節症に関連する，又は含む関節炎；頸部脊椎炎，腰部脊椎炎，及び首や腰の痛み；骨粗しょう症；関節リウマチ及びスチル病；強直性脊椎炎，乾癬性関節炎，反応性関節炎，及び未分化型脊椎関節炎を含む，血清反応陰性脊椎関節症；敗血症性関節炎，及び結核などの他の感染症による関節症や骨障害，ポット病やポンセット症候群（Ｐｏｎｃｅｔ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）など；尿酸痛風，ピロリン酸カルシウム沈着症，カルシウムアパタイトによる腱炎，滑液包炎や滑膜炎症を含む，急性及び慢性結晶誘発性滑膜炎；ベーチェット病；一次性及び二次性シェーグレン症候群；全身性強皮症及び限局型全身性強皮症；全身性エリテマトーデス，混合性結合組織病，未分化結合組織疾患；皮膚筋炎及び多発性筋炎を含む，炎症性ミオパシー；リウマチ性多発筋痛症；すべての関節分布での特発性炎症性関節炎を含む若年性関節炎，及び症候群，リウマチ熱やその全身性合併症に関連する若年性関節炎；巨細胞性動脈炎，高安動脈炎，チャーグ・ストラウス症候群，結節性多発動脈炎，顕微鏡的多発動脈炎を含む血管炎，及びウイルス感染，過敏症反応クリオグロブリンやパラプロテインに関連する血管炎；腰痛；家族性地中海熱，マックル−ウェルズ症候群，及び家族ハイバーニアンフィーバー，菊池病；薬剤誘発性の関節痛，腱炎，及びミオパシー；
【００４４】
３，傷害（例えば，運動傷害）又は疾患に起因する筋骨格系障害の痛み及び結合組織のリモデリング：関節炎（例えば，関節リウマチ，変形性関節症，痛風又は結晶性関節症），
その他の関節疾患（例えば，椎間板変性や顎関節の変性など），骨リモデリング疾患（例えば骨粗鬆症，パジェット病又は骨壊死など），多発性軟骨炎，強皮症，混合性結合組織障害，脊椎関節症又は歯周疾患（例えば，歯周炎など）；
【００４５】
４，皮膚：
乾癬，アトピー性皮膚炎，接触性皮膚炎又はその他の湿疹皮膚病，及び遅延型過敏反応；植物及び光線皮膚炎；脂漏性皮膚炎，疱疹状皮膚炎，扁平苔癬，硬化性萎縮性苔癬，壊疽性膿皮症，皮膚サルコイド，円板状エリテマトーデス，天疱瘡，類天疱瘡，表皮水疱症，蕁麻疹，血管浮腫，血管炎，毒性紅斑，皮膚好酸球増加症，円形脱毛症，男性型脱毛症，スウィート症候群，ウェーバー・クリスチャン症候群，多形性紅斑；感染性，非感染性の蜂巣炎；脂肪織炎；皮膚リンパ腫，非黒色腫皮膚癌や他の異形成病変；固定薬疹を含む薬剤誘発性障害；
【００４６】
５，眼：
眼瞼炎；通年性又は春季アレルギー性結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部及び後部ぶどう膜炎；脈絡膜炎；自己免疫性；網膜に影響を与える変性又は炎症性障害；交感神経眼炎を含む眼炎；サルコイドーシス；ウイルス，真菌，及び細菌を含む感染；
【００４７】
６，消化管：
舌炎，歯肉炎，歯周炎，逆流性を含む食道炎；好酸球性胃腸炎，肥満細胞症，クローン病，潰瘍性大腸炎を含む大腸炎，直腸炎，肛門掻痒症；セリアック病，過敏性腸症候群，及び腸から離れて作用し得る食品関連アレルギー（例えば偏頭痛，鼻炎又はアトピー性皮膚炎）；
【００４８】
７腹部：
自己免疫性，アルコール性及びウイルス性を含む肝炎；肝臓の線維症及び肝硬変；胆嚢炎；急性及び慢性の膵炎；
【００４９】
８，泌尿生殖器：
間質性及び糸球体腎炎を含む腎炎；ネフローゼ症候群；急性及び慢性（間質性）膀胱炎，及びハンナー潰瘍を含む膀胱炎；急性及び慢性尿道炎，前立腺炎，精巣上体炎，卵巣炎及び卵管炎；外陰膣炎；ペイロニー病；勃起不全（男女とも）；
【００５０】
９，同種移植片拒絶反応：
例えば，腎臓，心臓，肝臓，肺，骨髄，皮膚又は角膜の移植後又は輸血後の急性および慢性のもの；又は慢性移植片対宿主病；
【００５１】
１０，ＣＮＳ：
アルツハイマー病及びＣＪＤやｎｖＣＪＤを含む他の痴呆障害；アミロイド症；多発性硬化症及び他の脱髄症候群；脳動脈硬化及び血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；内臓痛，頭痛，片頭痛，三叉神経痛，非定型顔面痛，関節や骨の痛み，癌や腫瘍浸潤に起因する痛み，及び糖尿病性，ヘルペス後，及びＨＲＶ関連ニューロパシーなどの神経障害性疼痛症候群を含む急性及び慢性疼痛（中枢起源であれ末梢起源であれ，急性，間欠性又は持続性の）；神経サルコイドーシス；悪性，感染性又は自己免疫過程の中枢及び末梢神経系の合併症；
【００５２】
橋本甲状腺炎，グレーブス病，アジソン病，真性糖尿病，特発性血小板減少性紫斑病，好酸球性筋膜炎，高ＩｇＥ症候群，抗リン脂質抗体症候群を含む，その他の自己免疫性及びアレルギー性障害；
【００５３】
１２，
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ），ハンセン病，セザリー症候群，腫瘍随伴性症候群を含む，炎症性又は免疫学的要因に伴うその他の障害；
【００５４】
１３，心血管：
冠状動脈及び末梢循環に影響を与えるアテローム性動脈硬化症；心膜炎；心筋炎，心筋サルコイドを含む炎症性疾患及び自己免疫心筋症；虚血再潅流傷害；感染症（例えば梅毒性）を含む心内膜炎，弁膜炎，及び大動脈炎；血管炎，深部静脈血栓症及び静脈瘤の合併症を含む静脈炎及び血栓症などの近位及び末梢静脈の障害；
【００５５】
１４，消化管：
セリアック病，直腸炎，好酸球性胃腸炎，肥満細胞症，クローン病，潰瘍性大腸炎，顕微鏡的大腸炎，判定不能大腸炎，過敏性腸障害，過敏性腸症候群，非炎症性の下痢，腸から離れた部位に作用する食品関連アレルギー，例えば偏頭痛，鼻炎及び湿疹。
【００５６】
この目的のために本発明者らは，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用を阻害するＤ−鏡像異性体のペプトイド部分を含むテトラペプチド，トリペプチド，ジペプチド，及び同様のペプチド類似体に基づく複数の合成分子を開発してきた。重要なことに，これらの化合物はＭＫＫ７キナ−ゼの機能を抑制することなくＧａｄｄ４５β阻害活性を示している。本発明の化合物は，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体の阻害を介してＪＮＫ細胞傷害性シグナル伝達を誘導することができることを証明しているため，その価値は大きい。
【００５７】
この合成分子は分離してＧａｄｄ４５βにもＭＫＫ７にも結合しないが，タンパク質が結合状態又は非結合状態で互いに接触している時，どちらかのタンパク質に結合する。これはおそらく，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７が互いに接触している時にのみ，Ｇａｄｄ４５β，ＭＫＫ７及び／又は２つのタンパク質の複合体で利用できる表面を認識することによるものである。これにより，全体的に複合体の分離をもたらすように，２つのタンパク質のいずれか又は複合体の構造変化を誘導する。これは，本化合物がターゲット（すなわちＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体）に対して非常に高い特異性があり，本発明の化合物が相互作用によりＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のそれと同様の構造を有するタンパク質に影響を与える確率を減少させることを保証するため，これは特に重要な特性である。また，本発明の化合物の治療標的が２つのタンパク質（すなわちＧａｄｄ４５βとＭＫＫ７）のインターフェースであることを確立するこの特性は，本発明の化合物がインビボでのＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のグローバルな生物学的活性をブロックせず，むしろＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体の一部として，Ｇａｄｄ４５β又はＭＫＫ７が有する生物学的機能を選択的に干渉することを保証する。
【００５８】
注目すべきことに，本発明の化合物は，多発性骨髄腫細胞株，原発性腫瘍細胞株，及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫やバーキットリンパ腫細胞株を含む他の腫瘍Ｂ細胞株と同様に，前単球性白血病のようなその他の悪性腫瘍のアポトーシスを低いナノモル範囲のＩＣ５０ｓで，誘導するが，非常に高濃度（つまり１００μΜ）で使用した時でさえ，腫瘍Ｔ細胞株，又は非形質転換線維芽細胞，骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ），末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ），及び間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ），もしくはマウスから精製した一次Ｂ及びＴリンパ球などの正常細胞で，活性化しないことを示している。これは，異常な恒常的活性型ＮＦ−κΒを持つ細胞に対する傷害活性の特異性を有する証拠になる。さらに重要な事に，本発明の化合物は，タンパク質分解に耐性があり，水溶性で，ヒト血清を長期間インキュベーションした後に完全な阻害活性を保持する生体液中で安定しているため，全身の使用として適する候補に挙げられる。
【００５９】
本発明の化合物はＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対して，細胞内で高い標的特異性を示している。これは，以下の調査結果によって示されている。１）腫瘍細胞株の大パネルにおいて，Ｇａｄｄ４５β発現とＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して感受性を有する癌細胞のレベルの間に統計的に有意な相関化関係が存在する，２）ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのダウンレギュレーションは，Ｚ−／ｍＤＴＰ感受性癌細胞株ではアポトーシスを誘導するが，Ｚ−／ｍＤＴＰ耐性癌細胞株では誘導せず，これらの細胞株におけるＧａｄｄ４５特異性ｓｈ−ＲＮＡｓによるアポトーシス誘導の動態は，Ｚ−／ｍＤＴＰｓで観察されたものと同様である，３）ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７のダウンレギュレーションは，Ｚ−／ｍＤＴＰ感受性癌細胞株に，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対する完全な耐性を持たせる，４）本発明の治療標的は，２つのタンパク質，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７との間のインターフェースであり，これはさらに高度な標的選択性の可能性を提供し，既存の治療に対して重要な利点となる。これらのデータと共に，正常細胞に対するＺ−／ｍＤＴＰｓの低傷害性と，Ｇａｄｄ４５βのノックアウトアブレーション（ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ａｂｌａｔｉｏｎ）がマウスにおいて良好な耐容性を示す調査結果を合わせると，Ｚ−／ｍＤＴＰｓによるＧａｄｄ４５／ＭＫＫ７の阻害を介して細胞生存内のＮＦ−κΒの個別の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）生存促進性機能を標的にすることが，より特異的で低毒性であり，ＮＦ−κΒ経路を標的にする治療及び／又はプロテアソームを標的にする治療よりもより効果的な治療を提供できることを示している。
【００６０】
さらに本発明の化合物は，Ｇａｄｄ４５βノックアウトマウスが生存可能で明らかに健康であるため，正常細胞への毒性を有さず，Ｇａｄｄ４５βの阻害は副作用が無いか，又はわずかであり，完全なＧａｄｄ４５βの不活化がインビボで良好な耐容性を有することを示している。本発明の化合物はまた，安定性，水溶性，及び細胞透過性を有するため，多発性骨髄腫，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，及び生存に関しＮＦ−κΒに依存する他の癌の治療に適している。それらはまた，慢性炎症性疾患及び自己免疫疾患，特にＮＦ−κΒを媒介にする疾患の治療に有用である。さらに本発明の化合物は，治療的使用に魅力的なＰＫプロファイルを有している
【００６１】
本発明はまた，患者のＺ−／ｍＤＴＰ治療反応性を予測するために臨床的に有用なアッセイの開発にも関する。腫瘍細胞株の大パネルのデータは，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対する感受性とＧａｄｄ４５β発現レベルが，高度な有意性で相関していることを示し（Ｐ＜０．０１），これによりＧａｄｄ４５βに対するＺ−／ｍＤＴＰｓの細胞傷害作用の高い特異性を確証している。さらに，ノックダウンＧａｄｄ４５βは多発性骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導するのに対して，ノックダウンＭＫＫ７はＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に完全な耐性を有する細胞を提供する。これらのデータを合わせると，Ｚ−／ｍＤＴＰ治療が臨床で取り入れられると，簡便で費用対効果の高いｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって，患者の応答者集団（ｐａｔｉｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）を予測できるようになることを示している。
【００６２】
本発明の第１の側面は，
式（Ｉ）：
Ｘ１−Ａ−Ｘ２  （Ｉ）
（式（Ｉ）中：
ＡはＡ’’’’又はＡ’’−［Ｍ−Ａ’−］ｎＭ−Ａ’’’であり；
Ａ’’’’はＡ’’，Ａ’’’又はＺ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ４であり，ここで，Ｙ２−Ｙ３は，オリゴペプチド部分又は前記Ｙ２−Ｙ３の残基を有するオリゴペプトイド部分であり，Ｚ１は，前記Ｙ２−Ｙ３のＮ末端窒素に結合し，Ｚ４は，前記Ｙ２−Ｙ３のＣ末端炭素に結合し；
Ａ’’はＡ’又はＹ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ４であり，ここで，Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３は，オリゴペプトイド部分又は前記Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３の残基を含むオリゴペプトイド部分であり，Ｚ４は，前記Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３のＣ末端炭素に結合し；
Ａ’’’はＡ’又はＺ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４であり，ここで，Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４は，オリゴペプトイド部分又は前記Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４の残基を含むオリゴペプトイド部分であり，Ｚ１は，前記Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４のＮ末端窒素に結合し；
それぞれのＡ’は，独立してオリゴペプチド部分又はＹ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４の残基を含むオリゴペプトイド部分であり；
ｎは０〜１８の整数であり，
Ｙ１及びＹ４は，独立したアミノ酸残基又は芳香族側鎖を有するアミノ酸誘導体の残基であり；
ある態様において，各側鎖は，５員から１０員の炭素環式又は複素環式芳香族基で数回置換され，かつ必要に応じてさらに１個から４個の炭素原子を有するアルキル基で置換された１個から３個の炭素を有するアルキレン基を含み；
前記芳香族基は必要に応じて，ヒドロキシル，ハロゲン，又はＣ１からＣ４のアルキルもしくはＣ１からＣ４のアルコキシから選択される少なくとも一つの置換基で置換されており；
Ｙ２は存在しないか，又は好ましくは，Ｌ又はＤ配置の２０個の天然アミノ酸のいずれかのアミノ酸残基もしくはアミノ酸誘導体の残基，及び／又は好ましくはｐＨ７の水性溶液中で負電荷を有する側鎖を持つ，アミノ残基もしくはアミノ酸誘導体の残基であり，
Ｙ３は，好ましくは，ＬもしくはＤ配置の２０個の天然アミノ酸のいずれかのアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体の残基，及び／又は好ましくはｐＨ７の水性溶液中で正電荷を保有する側鎖を持つ，アミノ酸残基もしくはアミノ酸誘導体の残基であり；
ある態様においてＹ２とＹ３が共に存在している場合，それらは，好ましくは塩橋が側鎖のそれぞれの正電荷と負電荷の間に形成できるようなもの，及び／又はＹ１とＹ４，又はＸ１とＸ４，又はＸ１とＹ４，又はＹ１とＸ４の芳香族の中心間の距離が１０又は２０オングストローム以下で３オングストローム以上のものであり；
好ましくはＹ２及びＹ３の側鎖は３０原子以下から成り，Ｙ２及びＹ３は，天然に存在するアミノ酸又はＬもしくはＤ配置のＮ−メチルアミノ酸でもよく；
前記Ｚ１は，前記Ｙ２のＮ末端窒素に結合する，式（ＩＩ）の基である。
【００６３】
【化３】
0005961113.tif 000004
【００６４】
式（ＩＩ）中：
Ｗは，存在しないか又は酸素，窒素，もしくは１個から３個の炭素を有するアルキレン基であり，ここで前記１個から３個の炭素を有するアルキレン基は，必要に応じて１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は５員から１０員の炭素環式又は複素環式芳香族基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
Ｊは，５員から１０員の炭素環式又は複素環式芳香族基であり，ここで前記芳香族基は，必要に応じて，水酸基，ハロゲン基，１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は１個から４個の炭素を有するアルコキシ基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
前記Ｚ４は，前記Ｙ３のＣ末端炭素に結合する，式（ＩＩＩ）の基である。
【００６５】
【化４】
0005961113.tif 000005
【００６６】
式（ＩＩＩ）中：
Ｒは，水素又は１から４個の炭素を有するアルキルであり；
Ｗ’は，存在しないか又は１個から３個の炭素を有するアルキレン基であり，ここで前記１個から３個の炭素を有するアルキレン基は，必要に応じて，１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は５員から１０員の炭素環式もしくは複素環式芳香族基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
Ｊ’は，３員から１０員の脂肪族炭素環基又は５員から１０員の炭素環式もしくは複素環式芳香族基であり，ここで前記脂肪族基又は芳香族基は，必要に応じて，ヒドロキシル基，ハロゲン基，１個から４個の炭素を有するアルキル基，又は１個から４個の炭素を有するアルコキシ基から選択される少なくとも一つの置換基で置換され；
Ｍは，先のオリゴペプチド又はオリゴペプトイド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）と次のオリゴペプチド又はオリゴペプチド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）との間のペプチド結合であるか，又はアミド結合，エステル結合，エーテル結合もしくはチオエーテル結合により先のオリゴペプチド又はオリゴペプトイド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）の末端カルボン酸基に結合したリンカー部分と，アミド結合，エステル結合，エーテル結合又はチオエーテル結合により次のオリゴペプトイド部分（Ａ’Ａ’’又はＡ’’’）の末端カルボン酸基に結合したリンカー部分との間のペプチド結合であり；
Ｘ１は存在しないか，又は遊離アミノ基をブロックするために，Ａのアミノ末端に付加される部分であり；
Ｘ２は存在しないか，又は遊離カルボキシル基をブロックするために，Ａのカルボキシル末端に付加される部分であり；
ある態様において，Ｗは存在しないか，又は１個から３個の炭素を有するアルキレン基であり；
好ましくはＸ１とＸ２は，わずか３０分子（より好ましくは２０又は１０分子）の部分であり；
ＡがＺ１を含む場合，Ｘ１は存在せず，ＡがＺ４を含む場合，Ｘ２は存在しないことを条件とする（すなわち，分子の末端に遊離アミノ基又はカルボキシル基が存在しない場合，Ｘ１とＸ２は必須ではない）；）
で表わされる化合物，又は
ａ）前記式（Ｉ）の化合物の分子のオリゴマー又はマルチマーであって，
前記オリゴマー又はマルチマーは，前記式（Ｉ）の化合物の分子中に存在するアミノ酸基又はカルボン酸基と，向かい合う足場部分（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｍｏｅｉｔｙ）のアミノ酸基又はカルボン酸基との間に形成されるアミド結合を介して共通の足場部分にそれぞれ結合する前記式（Ｉ）の化合物の２つ以上の分子を含み，前記足場部分は少なくとも２つのアミド結合に関与しているものと，
ｂ）アミド結合，エステル結合，エーテル結合又はチオエーテル結合を介して
ＰＥＧ，
ＰＥＧ系化合物，
細胞浸透性ペプチド，
蛍光色素，
ビオチンもしくはその他のタグ部分，
脂肪酸，
離散サイズ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｓｉｚｅ）のナノ粒子，
又は金属イオンもしくは放射性イオンとのキレート配位子錯体
に結合した，前記化学式（Ｉ）の化合物の分子又は上記ａ）で定義されるオリゴマー又はマルチマーを含む誘導体と，
ｃ）アミド化，グリコシル化，カルバミル化，アシル化，硫酸化，リン酸化，環化，脂質化，ペグ化，又はペプチドもしくはペプトイド融合するためのペプチドもしくはペプトイド融合パートナーへの結合によって修飾された，
式（Ｉ）の化合物の分子又は上記ａ）で定義されるそれらのオリゴマー又はマルチマーを含む誘導体と，
ｄ）前記化学式（Ｉ）の化合物の分子，又は上記ａ）又はｂ）で定義される誘導体の塩及び溶媒和化合物と，
から成る群から選択される化合物を提供する。
【００６７】
ある態様において：
Ｙ１は，
Ｄ−トリプトファン，
Ｌ−トリプトファン，
Ｄ−チロシン，
Ｌ−チロシン，
Ｄ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｌ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｄ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｄ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｌ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｄ−３−（２−フリル）−アラニン，
Ｌ−３−（２−フリル）−アラニン，
Ｌ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｌ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｄ−ナフチルアラニン，
Ｌ−ナフチルアラニン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸，
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸，
３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸，
又は上記いずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体である。
【００６８】
あるいはＹ１は，
Ｄ−フェニルアラニン，
Ｌ−フェニルアラニン，
Ｄ−トリプトファン，
Ｌ−トリプトファン，
Ｄ−チロシン，
Ｌ−チロシン，
Ｄ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｌ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｄ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｄ−フェニルグリシン，
Ｌ−フェニルグリシン，
ＤＨ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
ＬＨ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｄ−３−（２−フリル）−アラニン，
Ｌ−３−（２−フリル）−アラニン，
Ｌ−シクロヘキシルアラニン，
Ｄ−シクロヘキシルアラニン，
Ｌ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｌ−３−（４−キノリル）−アラニン；
Ｄ−ナフチルアラニン
又はＬ−ナフチルアラニン
であってもよい。
【００６９】
ある態様において：
Ｙ２は，存在しないか，
Ｄ−グルタミン酸，
Ｌ−グルタミン酸，
Ｄ−アスパラギン酸，
Ｌ−アスパラギン酸，
Ｌ−ロイシン，
Ｄ−ロイシン，
Ｌ−グルタミン，
Ｄ−グルタミン，
Ｌ−メチオニン，
Ｄ−メチオニン，
Ｄ−２−アミノヘプタン酸，
Ｌ−２−アミノヘプタン酸，
それらのいずれかのメチル又はエチルエステル，
Ｌ−ホモセリン，
Ｄ−ホモセリン，
又は上記いずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体である。
【００７０】
あるいはＹ２は，
Ｄ−グルタミン酸，
Ｌ−グルタミン酸，
Ｄ−アスパラギン酸，
Ｌ−アスパラギン酸，
Ｄ−２−アミノヘプタン酸，
Ｌ−２−アミノヘプタン酸，
それらのいずれかのメチル又はエチルエステル
Ｌ−ホモセリン，
又はＤ−ホモセリンであってもよい。
【００７１】
ある態様において：
Ｙ３は，
Ｄ−アルギニン，
Ｌ−アルギニン，
Ｌ−プロリン，
Ｄ−プロリン，
Ｄ−ヒスチジン，
Ｌ−ヒスチジン，
Ｄ−リジン，
Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ｄａｐ），
Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｌ−Ｄａｐ），
Ｌ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ），
Ｄ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｄ−Ｄａｂ），
Ｌ−オルニチン，
Ｄ−オルニチン，
Ｌ−リジン，
又は上記いずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体である。
【００７２】
あるいはＹ３は，
Ｄ−アルギニン，
Ｌ−アルギニン，
Ｄ−ヒスチジン，
Ｌ−ヒスチジン，
Ｄ−リジン，
Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ｄａｐ），
Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｌ−Ｄａｐ），
Ｄ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｄ−Ｄａｂ），
Ｌ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ），
Ｌ−オルニチン，
Ｄ−オルニチン，
又はＬ−リジンであってもよい。
【００７３】
ある態様において：
Ｙ４は，
Ｄ−フェニルアラニン，
Ｌ−フェニルアラニン，
Ｄ−トリプトファン，
Ｌ−トリプトファン，
Ｄ−チロシン，
Ｌ−チロシン，
Ｄ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｌ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｄ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｄ−フェニルグリシン，
Ｌ−フェニルグリシン，
Ｄ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｌ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｄ−３−（２−フリル）アラニン，
Ｌ−３−（２−フリル）アラニン，
Ｌ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｌ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｄ−ナフチル−アラニン，
Ｌ−ナフチル−アラニン，
それらのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体，
アニリン，
ベンジルアミン，
又は２−フェニルエチルアミンである。
【００７４】
あるいはＹ４は，
Ｄ−フェニルアラニン，
Ｌ−フェニルアラニン，
Ｄ−トリプトファン，
Ｌ−トリプトファン，
Ｄ−チロシン，
Ｌ−チロシン，
Ｄ−３，３−ジフェニル−アラニン，
Ｌ−３，３−ジフェニル−アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｄ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｄ−フェニルグリシン，
Ｌ−フェニルグリシン，
Ｄ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｌ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｄ−３−（２−フリル）アラニン，
Ｌ−３−（２−フリル）アラニン，
Ｌ−シクロヘキシルアラニン，
Ｄ−シクロヘキシルアラニン，
Ｌ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｌ−３−（４−キノリル）−アラニン；
Ｄ−ナフチル−アラニン
又はＬ−ナフチル−アラニン，であってもよい。
【００７５】
ある好ましい態様において，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３及びＹ４は上記のすべてである。ある態様において，Ｙ２及びＹ３が以下であるという条件で，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３及びＹ４は上記のすべてである。
Ｙ２が，
Ｄ−グルタミン酸，
Ｌ−グルタミン酸，
Ｄ−アスパラギン酸，
Ｌ−アスパラギン酸，
Ｄ−２−アミノヘプタン酸，
Ｌ−２−アミノヘプタン酸，
それらのいずれかのメチル又はエチルエステル；
Ｌ−ホモセリン，
Ｌ−ロイシン
Ｄ−ロイシン
Ｌ−グルタミン
Ｄ−グルタミン
Ｌ−メチオニン
Ｄ−メチオニン
Ｄ−ホモセリン，
又は上記いずれかのＬ又Ｄ配置のＮ−メチル誘導体であり，
Ｙ３が，
Ｄ−アルギニン，
Ｌ−アルギニン，
Ｄ−ヒスチジン，
Ｌ−ヒスチジン，
Ｄ−リジン，
Ｌ−リジン；
Ｌ−プロリン
Ｄ−プロリン
Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ｄａｐ），
Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｌ−Ｄａｐ），
Ｄ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｄ−Ｄａｂ），
Ｌ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ），
Ｄ−オルニチン
Ｌ−オルニチン
，又は上記のいずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体である。
【００７６】
ある態様において，Ｙ１とＹ２は共に上記のようであるが，Ｙ２とＹ３のいずれか又は両方は存在しない。ある態様において，Ｍはペプチド結合である。
【００７７】
ある態様において，Ｘ１は水素か，又はアミド結合を形成するために，オリゴペプチド配列のアミノ末端に付加されるアセチル基，ベンジルオキシカルボニル基，２−クロロベンジルオキシカルボニル基，３−メトキシ−３，４−ヒドロキシベンゾイル基，３−ヒドロキシ−３，４−メトキシ−ベンゾイル基，ベンゾイル基，又はフルオレニル基，のいずれかである。
【００７８】
Ｘ２はヒドロキシル基であるか，又はアミド結合を形成するためにオリゴペプチド配列のカルボニル酸末端に付加される以下の基のいずれかである。
アミン，
Ｄ−フェニルアラニン，
Ｌ−フェニルアラニン，
Ｄ−トリプトファン，
Ｌ−トリプトファン，
Ｄ−チロシン，
Ｌ−チロシン，
Ｄ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｌ−３，３−ジフェニルアラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（４−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（３−ピリジル）アラニン，
Ｄ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｌ−Ｈ−３−（２−ピリジル）アラニン，
Ｄ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
Ｄ−フェニルグリシン，
Ｌ−フェニルグリシン，
Ｄ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｌ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
Ｄ−３−（２−フリル）アラニン，
Ｌ−３−（２−フリル）アラニン，
Ｌ−シクロヘキシルアラニン，
Ｄ−シクロヘキシルアラニン，
Ｌ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−ホモフェニルアラニン，
Ｄ−３−（４−キノリル）−アラニン，
Ｌ−３−（４−キノリル）−アラニン；
Ｄ−ナフチルアラニン
Ｌ−ナフチルアラニン
又は上記いずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体。
【００７９】
ある態様において，
Ｚ１は，
４−ヒドロキシベンゾイル，
（４−ヒドロキシ−フェニル）−アセチル，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピオニル，
ベンゾイル，
ベンジルオキシカルボニル，
２−フェニル−アセチル，
３−フェニル−プロピオニル，
３，３−ジフェニル−プロピオニル，
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−プロピオニル，
（１Ｈ−インドール−３−イル）−アセチル，
フラン−２−イル−アセチル，
フラン−３−イル−アセチル，
３−ピリジン−４−イル−プロピオニル，
３−ピリジン−３−イル−プロピオニル，
３−ピリジン−２−イル−プロピオニル，
３−ピリミジン−４−イル−プロピオニル，
３−ピリダジン−４−プロピオニル，
３−［１，３，５］トリアジン−２−イル−プロピオニル，
２−ピリジン−４−イル−アセチル，
２−ピリジン−３−イル−アセチル，
２−ピリジン−２−イル−アセチル，
２−ピリミジン−４−イル−アセチル，
２−ピリダジン−４−イル−アセチル，
２−［１，３，５］トリアジン−２−イル−アセチル，
ナフタレン−１−イル−アセチル，
ナフタレン−２−イル−アセチル，
２−ナフタレン−１−イル−プロピオニル，
又は２−ナフタレン−２−イル−プロピオニルであり，
Ｙ２は，
Ｄ−グルタミン酸，
Ｌ−グルタミン酸，
Ｄ−アスパラギン酸，
Ｌ−アスパラギン酸，
Ｌ−ロイシン，
Ｄ−ロイシン，
Ｌ−グルタミン，
Ｄ−グルタミン，
Ｌ−メチオニン，
Ｄ−メチオニン，
Ｄ−２−アミノヘプタン酸，
Ｌ−２−アミノヘプタン酸，
これらのいずれかのメチル又はエチルエステル，
Ｌ−ホモセリン，
Ｄ−ホモセリン；
又は上記のいずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体であり，
Ｙ３は，
Ｄ−アルギニン，
Ｌ−アルギニン，
Ｄ−ヒスチジン，
Ｌ−ヒスチジン，
Ｌ−プロリン，
Ｄ−プロリン，
Ｄ−リジン，
Ｌ−リジン，
Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ｄａｐ），
Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｌ−Ｄａｐ），
Ｄ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｄ−Ｄａｂ），
Ｌ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ），
Ｄ−オルニチン，
Ｌ−オルチニン，
又は上記のいずれかのＬ又はＤ配置のＮ−メチル誘導体であり，
Ｚ４は，
フェニルアミン，
ベンジルアミン，
フェネチルアミン，
シクロヘキシルアミン，
２−シクロヘキシルエチルアミン，
３−シクロヘキシルプロピルアミン，
４−（２−アミノエチル）−フェノール，
４−アミノ−フェノール，
４−アミノメチル−フェノール，
１Ｈ−インドール−３−イル−アミン，
２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチルアミン，
Ｃ−（１Ｈ−インドール−３−イル）−メチルアミン，
２，２−ジフェニル−エチルアミン，
２，２−ジピリジン−４−イル−エチルアミン，
２−ピリジン−４−イル−エチルアミン，
２−ピリジン−３−イル−エチルアミン，
２−ピリジン−２−イル−エチルアミン，
２−ピリミジン−４−イル−エチルアミン，
２−［１，３，５］トリアジン−２−イル−エチルアミン，
Ｃ−フラン−２−イル−メチルアミン，
Ｃ−フラン−３−イル−メチルアミン，
又はＣ−ナフタレン−２−イル−メチルアミンである。
【００８０】
慣例に従って，すべてのペプチド及びペプトイドとそれらの領域は，Ｎ末端からＣ末端へと記載している。
【００８１】
ｎは０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７又は１８でもよい。ある好ましい態様において，ｎ＝０である。
【００８２】
ある好ましい態様においてＡはＡ’である。このような態様において，化合物は本質的に，１つ以上の末端で任意のブロック基Ｘ１とＸ２を有するテトラペプチド，トリペプチド，又はジペプチド（又は対応するペプトイド）である。
【００８３】
オリゴペプチド
オリゴペプチドは，αアミノ酸（本明細書では単に“アミノ酸”と称する）の縮合によって形成された短ポリマーである。１つの残基と次のそれとの結合は，ペプチド結合又はアミド結合として知られている。
【００８４】
アミノ酸
本明細書中で使用される用語“アミノ酸”は，Ｄ型，Ｌ型の光学配置の両方における，２０個の標準的なアミノ酸（イソロイシン，アラニン，ロイシン，アスパラギン，リジン，アスパラギン酸，メチオニン，システイン，フェニルアラニン，グルタミン酸，スレオニン，グルタミン，トリプトファン，グリシン，バリン，プロリン，セリン，チロシン，アルギニン，及びヒスチジン）である。また，Ｄ型とＬ型の両方の合成αアミノ酸も含む。ある態様において，Ｄ配置が好ましい。
【００８５】
アミノ酸誘導体
本明細書中で使用されるこの用語は，側鎖が，（アミノ酸におけるような）α炭素ではなく，分子の主鎖に沿って窒素原子に結合するという点でαアミノ酸とは異なるＮ−置換グリシンを含む。またこの用語は，αアミノ酸のメチル及びエチルエステルと，β−アミノ酸と，Ｎ−メチル化αアミノ酸も含む。
【００８６】
オリゴペプトイド
厳密に言えば，用語“オリゴペプチド”はαアミノ酸のオリゴマーにのみ関連する。アミノ酸誘導体（例えば，Ｎ−置換グリシン）を取り込んだ（すべての又はいくつかの残基位置で）類似オリゴマーは，オリゴペプトイドとして知られている。
【００８７】
誘導体
好ましくは，本発明の第一の側面における化合物の誘導体は，機能的な誘導体である。本明細書において用語“機能的な誘導体”は，未修飾の式（Ｉ）の化合物と同様の生理学的機能，又は機能アッセイ（例えば，本明細書に開示される実施例に記載のアッセイのいずれか）と同様のインビトロ生理学的機能を有する，式（Ｉ）の化合物の化学的誘導体を示すのに用いられる。
【００８８】
本発明の化合物の誘導体は，アミド化，グリコシル化，カルバミル化，アセチル化などのアシル化，硫酸化，リン酸化，環化，脂質化及びペグ化などを含む周知のプロセスによって修飾された式（Ｉ）の構造を含んでもよい。式（Ｉ）の構造は，分子内のランダムな位置，又は分子内の所定の位置で修飾されてもよく，１つ，２つ，３つ，又はそれ以上で結合した化学的部分を含んでもよい。誘導体は，Ｎ末端のＮＨ２基が別の基，例えばメトキシ基で置換された化合物を含む。本発明の化合物は，式（Ｉ）の構造が当該技術分野で公知の方法により，別のタンパク質又はポリペプチド（融合パートナー）に融合された，融合タンパク質であってもよい。任意の適当なペプチド又はタンパク質は，融合パートナー（例えば，血清アルブミン，炭酸脱水酵素，グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ又はチオレドキシンなど）として使用することができる。好ましい融合パートナーは，インビボで有害な生物学的活性を有していない。このような融合タンパク質は，式（Ｉ）の構造の又はその逆の構造のアミノ末端に融合パートナーのカルボキシ末端を結合することにより生成してもよい。必要に応じて，融合パートナーに式（Ｉ）の構造を結合するのに分割可能な（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを使用してもよい。得られる分割可能な（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）融合タンパク質は，本発明の化合物の活性体が遊離するようにインビボで分割（ｃｌｅａｖｅｄ）されてもよい。そのような分割可能な（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーの例としては，リンカーＤ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｙ［配列番号：２２７］，Ｇ−Ｐ−Ｒ，Ａ−Ｇ−Ｇ及びＨ−Ｐ−Ｆ−Ｈ−Ｌ［配列番号：２２８］を含むが，これらに限定されない。これらはそれぞれ，エンテロキナーゼ，トロンビン，ユビキチン分割酵素，及びレニンによって分割（ｃｌｅａｖｅｄ）することができる（例えば，米国特許第６４１０７０７号参照）。
【００８９】
本発明の化合物は，式（Ｉ）の構造の生理学的に機能的な誘導体であってもよい。本明細書において，用語“生理学的に機能的な誘導体”は，未修飾の式（Ｉ）の化合物と同様の生理学的機能を有する式（Ｉ）の化合物の化学的誘導体を示すのに用いられる。例えば，生理学的に機能的な誘導体は，生体内で式（Ｉ）の化合物に転換されてもよい。本発明において，生理学的に機能的な誘導体の例は，エステル類，アミド類，及びカルバメート類，好ましくはエステル類及びアミド類を含む。
【００９０】
本発明の化合物の薬学的に許容されるエステル類及びアミド類はＣ１−２０アルキル−，Ｃ２−２０アルケニル−，Ｃ５−１０アリール−，Ｃ５−１０もしくはＣ１−２０アルキル−，又は適切な部分，例えば酸基で結合した酸エステルもしくは酸アミドを含んでもよい。適当な部分の例は，４個から２６個の炭素原子，好ましくは５個から１９個の炭素原子を有する疎水性の置換基である。適当な脂質基としては，ラウロイル（Ｃ１２Ｈ２３），パルミチル（Ｃ１５Ｈ３１），オレイル（Ｃ１５Ｈ２９），ステアリル（Ｃ１７Ｈ３５），コール酸，及びデオキシコール酸を含むが，これらに限定されるものではない。
【００９１】
脂肪酸誘導体とスルフヒドリル基含有化合物を脂質化する方法は，米国特許第５９３６０９２号，米国特許第６０９３６９２号及び米国特許第６２２５４４５号に開示されている。ジスルフィド結合により脂肪酸に結合した本発明の化学式（Ｉ）の化合物を含む本発明の化合物の脂肪酸誘導体は，本発明の化合物を神経細胞や組織へ送達するのに使用してもよい。脂質化は，対応する非脂質化の化合物の吸収率に対して化合物の吸収率を著しく増加させると共に，化合物の血液や組織滞留を長くする。さらに，脂質化誘導体のジスルフィド結合は，細胞内では比較的不安定であるため，脂肪酸部分から分子の細胞内遊離を容易にする。適当な脂質含有部分は，４個から２６個の炭素原子，好ましくは５個から１９個の炭素原子を有する疎水性の置換基である。適当な脂質基は，パルミチル（Ｃ１５Ｈ３１），オレイル（Ｃ１５Ｈ２９），ステアリル（Ｃ１７Ｈ３５），コール酸及びデオキシコール酸が含まれるが，これらに限定されるものではない。
【００９２】
環化方法は，ジスルフィドブリッジの形成を介する環化，及び環化樹脂を用いるヘッド・トゥ・テールの環化（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）を含む。環状ペプチドは，それらの構造制約の結果として，酵素分解に対する耐性の増加など，安定性が強化されていてもよい。環化は，非環化ペプチドがＮ末端システイン基を含む場合には，特に都合がよい可能性がある。適当な環状ペプチドは，モノマー及び二量体のヘッド・トゥ・テールの環構造（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ｃｙｃｌｉｚｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を含む。環状ペプチドは，１つ以上の付加残基，特にジスルフィド結合の形成のために取り込まれた付加システイン又は樹脂ベースの環化のために組み込まれた側鎖を含んでもよい。
【００９３】
本発明の化合物は，式（Ｉ）のペグ化構造であってもよい。本発明のペグ化化合物は，溶解度の増加，安定性，及びポリペプチドの循環時間，又は免疫原性を減少させるなどの付加的利点を提供することができる（米国特許第４１７９３３７号参照）
【００９４】
本発明の化合物を誘導体化する化学的部分は，ポリエチレングリコール，エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体，カルボキシメチルセルロース，デキストラン，ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択されてもよい。本発明の化合物を誘導体化するポリマー部分は，どのような分子量でもよく，分枝又は非分枝であってもよい。他の分子量のポリマーは，所望の治療プロファイル，例えば，所望の徐放期間，生物学的活性があるならばその効果，取り扱いの容易さ，抗原性の程度又は不足，及び治療用タンパク質又は類似物質に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果，に応じて使用されてもよい。例えば，ポリエチレングリコールは，約２００，５００，１０００，１５００，２０００，２５００，３０００，３５００，４０００，４５００，５０００，５５００，６０００，６５００，７０００，７５００，８０００，８５００，９０００，９５００，１００００，１０５００，１１０００，１１５００，１２０００，１２５００，１３０００，１３５００，１４０００，１４５００，１５０００，１５５００，１６０００，１６５００，１７０００，１７５００，１８０００，１８５００，１９０００，１９５００，２００００，２５０００，３００００，３５０００，４００００，５００００，５５０００，６００００，６５０００，７００００，７５０００，８００００，８５０００，９００００，９５０００，又は１０００００ｋＤａの平均分子量を有してもよい。
【００９５】
薬剤の使用に適している本発明の化合物の塩及び溶媒和化合物は，対イオン又は関連する溶剤が薬学的に許容されるものである。ただし，薬学的に許容されない対イオン又は関連する溶剤を有する塩及び溶媒和化合物も本発明の範囲内であり，例えばそれは，式（Ｉ）の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和化合物の調製における中間体として使用される。
【００９６】
本発明における適当な塩は，有機酸もしくは無機酸又は塩基で形成されるものを含む。薬学的に許容される酸付加塩は，塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，クエン酸，酒石酸，酢酸，リン酸，乳酸，ピルビン酸，酢酸，トリフルオロ酢酸，コハク酸，過塩素酸，フマル酸，マレイン酸，グリコール酸，乳酸，サリチル酸，オキサロ酢酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，ギ酸，安息香酸，マロン酸，ナフタレン−２−スルホン酸，ベンゼンスルホン酸，及びイセチオ酸で形成されるものを含む。シュウ酸などのその他の酸はそれ自体では薬学的に許容されないが，本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩を得る際の中間体として有用である可能性がある。塩基性の薬学的に許容される塩は，アンモニウム塩，カリウム塩やナトリウム塩などのアルカリ金属塩，カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩，及びジシクロヘキシルアミンやＮ−メチル−Ｄ−グルコサミンなどの有機塩基性塩を含む。
【００９７】
有機化学の当業者は，多くの有機化合物が反応している溶媒，又は沈殿又は結晶化している溶媒で錯体を形成できることを理解しているであろう。このような錯体は“溶媒和化合物”として知られている。例えば，水との錯体は“水和物”として知られている。本発明は，本発明の化合物の溶媒和化合物を提供する。
【００９８】
ある好ましい態様において，本化合物のヒト循環半減期は，少なくとも０．１，０．２，０．５，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１時間，又は最も好ましくは少なくとも１２時間である。
【００９９】
好ましくは，化合物は，インビトロ結合アッセイで評価されるように，Ｇａｄｄ４５β及び／又はＭＫＫ７（及び／又は２つの複合体）に結合する能力を，少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０％，最も好ましくは９９％保持するか，又は摂氏３７℃で２４時間，正常なヒト血清のインキュベーションした後のインビトロ競合的結合アッセイで評価されるように，ＭＫＫ７とＧａｄｄ４５βの相互作用をブロックする能力を，少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０％か又は最も好ましくは９９％保持する。
【０１００】
あるいは又はさらに，この化合物は以下の活性の少なくとも１つを有する：ａ）実施例に記載のアッセイ条件下で，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７の相互作用を，少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０％か又は最も好ましくは９９％阻害する能力；ｂ）Ｔ細胞株ＪＵＲＫＡＴの少なくとも９０％が殺傷されていない条件下での，Ｕ２６６，ＫＭＳ−１１，ＮＣＩ−Ｈ９２９，ＡＲＨ−７７，ＪＪＮ−３，ＫＭＳ−１２，ＫＭＳ−１８，及びＫＭＳ−２７から成る群から選択される培養したヒト骨髄腫細胞株培養液中の細胞，ＤＬＢＣＬ細胞株ＬＹ−３培養物，前単球性細胞株Ｕ９３７培養物，バーキットリンパ腫細胞株ＢＪＡＢ培養物，又は原発性腫瘍細胞（例えば原発性多発性骨髄腫細胞）の培養物の少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０％か又は最も好ましくは９９％をインビトロで死滅させる能力。
【０１０１】
ある好ましい態様において，式（Ｉ）のＡとして同定された化合物のオリゴペプチドのコア部分は，下記から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する：
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：２］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：３］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：４］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：５］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：６］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：７］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：８］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：９］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：１０］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：１１］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：１２］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｐｈｅ）［配列番号：１３］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：１４］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：１５］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：１６］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：１７］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：１８］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：１９］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：２０］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：２３］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：２４］，
（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）［配列番号：２５］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ｔｙｒ）［配列番号：２６］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２７］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２８］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２９］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：３０］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：３１］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｔｙｒ）［配列番号：３２］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｙｒ）［配列番号：３３］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｔｙｐ）［配列番号：３４］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｙｐ）［配列番号：３５］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：３６］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２０８］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２０９］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２１０］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２１１］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２１２］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）［配列番号：２１３］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１４］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１５］，
（Ｔ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１６］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１７］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１８］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２１９］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２０］，
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２１］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２２］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２３］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２４］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｇｌｎ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２５］，
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ａｓｎ）−（Ｄ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）［配列番号：２２６］，
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｐｈｅ），
（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｐｈｅ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｔｙｒ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｐｒｏ）−（Ｄ−Ｔｒｐ），及び
（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｌｅｕ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）。
【０１０２】
他の態様において，Ａ部分は下記から成る群から選択される：
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル，酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−ＧＩｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−アニリン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−ベンジルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−２−フェニルエチルアミン，
ｐ−ヒドロキシ安息香酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−アニリン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−ベンジルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−２−フェニルエチルアミン，
２−（４−ヒドロキシ−フェニル）酢酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−アニリン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−ベンジルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ａｒｇ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｌ−Ｇｌｕ）−２−フェニルエチルアミン，
３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロオピオン酸−（Ｄ−Ｇｌｕ）−２−フェニルエチルアミン。
【０１０３】
あるいは，式（Ｉ）でＡ’と示した部分は，上記に直接記載された群から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドでもよい。
【０１０４】
ある態様では，Ａ’の部分は残基Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４を有するペプチド又はペプトイド部分である。ここで，Ｘａａ１は，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｄ−Ｔｙｒ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｔｙｒ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ，ｐ−ヒドロキシ安息香酸，２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸，３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸，又はアセチルであり，Ｘａａ２は，Ｌ−Ｇｌｕ，Ｄ−Ｇｌｕ，Ｌ−Ａｓｐ，Ｄ−Ａｓｐ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｇｌｕ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｇｌｕ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ａｓｐ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｓｐ，Ｌ−Ｐｒｏ，Ｄ−Ｐｒｏ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｐｒｏ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｐｒｏ，Ｌ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｌｅｕ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｌｅｕ，又は存在せず，Ｘａａ３は，Ｌ−Ａｒｇ，Ｄ−Ａｒｇ，Ｌ−Ｈｉｓ，Ｄ−Ｈｉｓ，Ｌ−Ｌｙｓ，Ｄ−Ｌｙｓ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ａｒｇ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｒｇ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｈｉｓ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｈｉｓ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｌｙｓ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｌｙｓ，又は存在せず，Ｘａａ４は，アニリン，ベンジルアミン，２−フェニルエチルアミン，Ｌ−Ｐｈｅ，Ｄ−Ｐｈｅ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｐｈｅ，Ｎ−メチル−Ｄ−Ｐｈｅ，Ｌ−Ｔｒｐ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｎ−メチル−Ｌ−Ｔｒｐ，又はＮ−メチル−Ｄ−Ｔｒｐである。
【０１０５】
ある態様において，Ｘａａ２又はＸａａ３のいずれかは存在しないが，Ｘａａ２及びＸａａ３が共に存在しないことはない。他の態様において，Ｘａａ２とＸａａ３は共に存在しない。
【０１０６】
Ｍは，隣接するペプチド又はペプトイド部分との間の単純なアミド結合である。あるいは，スペーサーとして導入され，アミド結合によって隣接するペプチド又はペプトイド部分に結合される分子部分であってもよい。
【０１０７】
Ｍは，付加的なアミノ酸であってもよい。好ましくは，例えば，グリシン，アラニン又はセリン又はそれらの誘導体などの嵩高くない側鎖を持つ付加的なアミノ酸である。あるいは，Ｍは非アミノ酸部分，例えばε−アミノカプロン酸，３−アミノプロピオン酸，４−アミノ酪酸でもよい。他の部分は，メチルアミン，エチルアミン，プロピルアミン，ブチルアミン，メチレン，ジメチレン，トリメチレン又はテトラメチレンとなり得る。すべての場合でＭは，その存在が実質的にＡ’部分とＧａｄｄ４５β及び／又はＭＫＫ７との間の結合を干渉しないようにする必要がある。潜在的な干渉の程度は，本明細書に開示されるようにインビトロ結合アッセイを用いることによって評価することができる。
【０１０８】
オリゴマー及びマルチマー
本発明の第１の側面は，式（Ｉ）の化合物の分子のオリゴマー又はマルチマーを包含する。
前記オリゴマー又はマルチマーは，前記式（Ｉ）の化合物の分子中に存在するアミノ酸基又はカルボン酸基と，向かい合う足場部分（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｍｏｅｉｔｙ）のアミノ酸基又はカルボン酸基との間に形成されるアミド結合を介して共通の足場部分にそれぞれ結合する前記式（Ｉ）の化合物の２つ以上の分子を含み，前記足場部分は少なくとも２つのアミド結合に関与している。
【０１０９】
ある態様において，共通の足場部分は，アミノ酸リジンでもよい。リジンは，アミノ酸として定義する官能基に加えて，側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｌａｉｍ）にアミノ基を有する三官能性アミノ酸である。この三官能性の性質は，ペプチド，ペプトイド又は同様の分子と３つのアミド結合を形成することができる。共通の足場部分として使用できる他の３官能性アミノ酸は，Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ｄａｐ），Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｌ−Ｄａｐ），Ｌ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ），Ｌ−α，δ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ），及びＬ−オルニチン，Ｄ−オルニチンを含む。また他の三官能性の非標準アミノ酸が本発明に従って使用されてもよい。共通の足場部分は，配列内に三官能性アミノ酸を取り込み，アミド結合を形成することができる少なくとも３つの官能性の活性末端基を有する分枝鎖状ペプチド，ペプトイド，又は類似分子を含んでもよい。
【０１１０】
細胞浸透性ペプチド
ある態様において，式（Ｉ）の化合物は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に結合している。
【０１１１】
このようなペプチドは，１つ以上の共有結合，又は非共有結合（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のいずれかによって，式（Ｉ）の化合物に結合してもよい。
【０１１２】
あるいは，ＣＰＰはエンドサイトーシス又は一過性の細胞膜貫通構造の形成により細胞に浸透してもよい。細胞透過性ペプチドの議論については，“Ｗａｇｓｔａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １３：  １７１−１３８７”及びそれらの参考文献を参照されたい。
【０１１３】
ある態様において，本発明の化合物は細胞への取り込みを促進するためにナノ粒子（例えばナノゴ−ルド）に結合させてもよい。
【０１１４】
蛍光試薬，タグ部分，及び脂質化誘導体
式（Ｉ）の化合物は，標的組織や細胞への透過をモニタリングできるように，蛍光試薬に結合させてもよい。蛍光試薬は，アミノ基（すなわち，コハク酸，イソチオシアネート，ヒドラジン），カルボキシル基（すなわち，カルボジイミド），チオール基（すなわち，マレイミド及びアセチルブロミド），及びアジド基で得られる。これらは式（Ｉ）の化合物のペプチド部分と選択的に反応するように使用されてもよい。蛍光試薬の例はフルオレセイン及びその誘導体，又はローダミン及びその誘導体を含む。
【０１１５】
式（Ｉ）の化合物は，離散サイズ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｓｉｚｅ）のナノ粒子，例えば“Ｃｈｉｔｈｒａｎｉ  ＤＢ，Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ  ７，（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）”に記載の最大１００ｎｍの離散サイズ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｓｉｚｅ）のナノ粒子に結合させてもよい。したがって，細胞質ゾルの還元性環境内で特異的に遊離できるように，ペプチド又はそれらの誘導体をジスルフィド架橋によって結合させることができる。またアミド，エーテル，エステル，チオエーテル結合により結合したペプチドナノ粒子も，これらの化合物が低傷害性を示すという同じ目的で使用することができる。ナノ粒子は細胞取り込みを支持すると共に，蛍光技術により細胞取り込みを可視化し，定量化する方法を提供する（Ｓｃｈｒａｎｄ  ＡＭ，  Ｌｉｎ  ＪＢ，  Ｈｅｎｓ  ＳＣ，  Ｈｕｓｓａｉｎ  ＳＭ．，  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．  ２０１０  Ｓｅｐ  ２７，  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。
【０１１６】
タグ部分は，同様の手段によって結合させることができ，同様に組織や細胞への標的の成果をモニタリングすることができる。
【０１１７】
ジスルフィド結合により脂肪酸に結合した式（Ｉ）の化合物を含む本発明の化合物の脂肪酸誘導体は，本発明の化合物を細胞や組織へ送達するのに使用してもよい。脂質化は，対応する非脂質化の化合物の吸収率に対して化合物の吸収率を著しく増加させると共に，化合物の血液や組織滞留を長くする。さらに，脂質化誘導体のジスルフィド結合は，細胞内では比較的不安定であるため，脂肪酸部分から分子の細胞内遊離を容易にする。適当な脂質含有部分は，４個から２６個の炭素原子，好ましくは５個から１９個の炭素原子を有する疎水性の置換基である。適当な脂質基は，パルミチル（Ｃ１５Ｈ３１），オレイル（Ｃ１５Ｈ２９），ステアリル（Ｃ１７Ｈ３５），コール酸及びデオキシコール酸が含まれるが，これらに限定されるものではない。
【０１１８】
イオン複合体（ｉｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
本発明はまた，金属イオンや放射性イオンに機能的に結合した式（Ｉ）の化合物を包含する。この結合は通常，イオンとキレート化するイオンキレート化剤（例えば，ＥＤＴＡ）の結合により達成される。このような手段によって，放射線治療として放射性イオン（例えば，９９ｍＴｃ，１１１Ｉｎ，６４Ｃｕ，６７Ｃｕ，８９Ｓｒ，９０Ｙ，１１７ｍＳｎ，１５３Ｓｍ，１８６Ｒｅ，１８８Ｒｅ，又は１７７Ｌｕ）を標的細胞に送達してもよい。非放射性の金属イオン（例えばガドリニウムのイオン）は，ＮＭＲで検出可能なマーカーとして使用してもよい。
【０１１９】
塩及び溶媒和化合物
薬剤の使用に適している本発明の化合物の塩及び溶媒和化合物は，対イオン又は関連する溶剤が薬学的に許容されるものである。ただし，薬学的に許容されない対イオン又は関連する溶剤を有する塩及び溶媒和化合物も本発明の範囲内であり，例えばそれは，式（Ｉ）の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和化合物の調製における中間体として使用される。
【０１２０】
本発明における適当な塩は，有機酸もしくは無機酸又は塩基で形成されるものを含む。薬学的に許容される酸付加塩は，塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，クエン酸，酒石酸，酢酸，リン酸，乳酸，ピルビン酸，酢酸，トリフルオロ酢酸，コハク酸，過塩素酸，フマル酸，マレイン酸，グリコール酸，乳酸，サリチル酸，オキサロ酢酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，ギ酸，安息香酸，マロン酸，ナフタレン−２−スルホン酸，ベンゼンスルホン酸，及びイセチオ酸で形成されるものを含む。シュウ酸などのその他の酸はそれ自体では薬学的に許容されないが，本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩を得る際の中間体として有用である可能性がある。塩基性の薬学的に許容される塩は，アンモニウム塩，カリウム塩やナトリウム塩などのアルカリ金属塩，カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩，及びジシクロヘキシルアミンやＮ−メチル−Ｄ−グルコサミンなどの有機塩基性塩を含む。
【０１２１】
有機化学の当業者は，多くの有機化合物が反応している溶媒，又は沈殿又は結晶化している溶媒で錯体を形成できることを理解しているであろう。このような錯体は“溶媒和化合物”として知られている。例えば，水との錯体は“水和物”として知られている。本発明は，本発明の化合物の溶媒和化合物を提供する。
【０１２２】
式（Ｉ）の好ましい分子の例を以下に示す。アミノ酸残基のＬ／Ｄ配置が指定されていない場合は，両方の構成が包含される。
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：３７］，
パラヒドロキシ安息香酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−アニリン
パラヒドロキシ安息香酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ベンジルアミン
パラヒドロキシ安息香酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−２−フェニルエチルアミン
２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−アニリン
２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ベンジルアミン
２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−２−フェニルエチルアミン
３−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−３−アニリン
３−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ベンジルアミン
３−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−２−フェニルエチルアミン
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：３８］，
パラヒドロキシ安息香酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−アニリン
パラヒドロキシ安息香酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−ベンジルアミン
パラヒドロキシ安息香酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−３−Ｐｈｅ−プロピルアミン２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−アニリン
２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−ベンジルアミン
２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−２−フェニルエチルアミン
３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−アニリン
３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−ベンジルアミン
３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−２−フェニルエチルアミン
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：３９］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４０］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４１］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４２］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４３］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４４］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４５］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：４６］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：４７］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：４８］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：４９］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：５０］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：５１］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：５２］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：５３］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：５４］，
アセチル−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２［配列番号：５５］，
内部ラクタム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌａｃｔａｍ）の，アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：５６］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：５７］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：５８］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：５９］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６０］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６１］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６２］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｎ−メチル）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−（Ｎ−メチル）Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−（Ｎ−メチル）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（β−ホモ）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−（β−ホモ）Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−（β−ホモ）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
アセチル−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ベンジルオキシカルボニル−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
Ｈ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
（３−メトキシ，４−ヒドロキシベンゾイル）−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６３］，
（３−メトキシ，４−ヒドロキシベンゾイル）−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６４］，
（３−メトキシ，４−ヒドロキシベンゾイル）−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号６５］，
（３−メトキシ，４−ヒドロキシベンゾイル）−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
（３−メトキシ，４−ヒドロキシベンゾイル）−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６６］，
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６７］，
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６８］，
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：６９］，
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ミリスチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７０］，
ミリスチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７１］，
ミリスチル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ミリスチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
ミリスチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７２］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７３］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７４］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７５］，
アセチル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｈ２［配列番号：７６］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７７］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７８］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：７９］，
ベンジルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−のＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２［配列番号：８０］
【０１２３】
本発明の化合物のさらなる例を以下に示す。
【０１２４】
【化５】
0005961113.tif 000006
化合物Ａ１
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１２５】
【化６】
0005961113.tif 000007
化合物Ａ３
Ａｃ−Ｔｙｒ−ｂＡｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１２６】
【化７】
0005961113.tif 000008
化合物Ａ６
Ａｃ−Ｔｙｒ−（６−アミノ−カプロン酸）−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
化合物Ａ７
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
化合物Ａ８
Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
化合物Ａ９
Ａｃ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１２７】
【化８】
0005961113.tif 000009
化合物Ｂ２
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１２８】
【化９】
0005961113.tif 000010
化合物Ｂ１３
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１２９】
【化１０】
0005961113.tif 000011
化合物Ｂ１６
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
化合物Ｈ１
Ｌ−３，３−ジフェニル−アラニン，
化合物Ｈ２
Ｌ−Ｈ−３（４−ピリジル）アラニン，
化合物Ｈ３
Ｌ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
化合物Ｈ４
Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸，
化合物Ｈ５
Ｌ−フェニルグリシン，
化合物Ｈ６
Ｌ−Ｈ−４−ヒドロキシフェニルグリシン，
化合物Ｈ７
Ｌ−ホモフェニルアラニン，
化合物Ｈ８
Ｌ−３−（２−フリル）−アラニン，
化合物Ｈ９
Ｌ−３−（４−キノリル）−アラニン，
化合物Ｈ１０
Ｌ−ナフチル−アラニン，
【０１３０】
【化１１】
0005961113.tif 000012
化合物Ｉ１
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１３１】
【化１２】
0005961113.tif 000013
化合物Ｉ２
Ａｃ−Ｔｙｒ−（Ｎ−Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１３２】
【化１３】
0005961113.tif 000014
化合物Ｉ３
Ａｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１３３】
【化１４】
0005961113.tif 000015
化合物Ｉ４
Ａｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｔｙｒ−（Ｎ−Ｍｅ）Ａｒｇ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１３４】
【化１５】
0005961113.tif 000016
化合物Ｉ５
Ａｃ−（Ｎ−ＭＥ）Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１３５】
【化１６】
0005961113.tif 000017
化合物Ｏ１
Ａｃ−Ｐｈｅ−ＡｒｇＴｙｒ−ＮＨ２，
【０１３６】
【化１７】
0005961113.tif 000018
化合物Ｏ２
Ａｃ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
【０１３７】
【化１８】
0005961113.tif 000019
化合物Ｏ３
Ａｃ−Ｔｙｒ−ＡｒｇＴｙｒ−ＮＨ２，
【０１３８】
【化１９】
0005961113.tif 000020
化合物Ｏ５
Ｈ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
【０１３９】
【化２０】
0005961113.tif 000021
化合物Ｏ７
Ｈ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
化合物Ｏ８
Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
化合物Ｏ９
Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２，
化合物Ｏ１０
Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２，
化合物のＰ１
４−（ヒドロキシ）−フェニル−酢酸−Ａｒｇ−３−フェニル−エチルアミン，
化合物のＰ２
４−（ヒドロキシ）−フェニル−酢酸−Ｈｉｓ−３−フェニルエチルアミン，
化合物のＰ３
４−（ヒドロキシ）−フェニル−酢酸−Ｇｌｕ−３−フェニル−エチルアミン，
【０１４０】
【化２１】
0005961113.tif 000022
化合物Ｇ１
シクロ（Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ），
化合物Ｇ２
シクロ（Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ），
【０１４１】
【化２２】
0005961113.tif 000023
化合物Ｇ３
シクロ（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ），
化合物Ｎ１
ナノゴールド−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
【０１４２】
ある態様において，実施例を含めて本明細書で具体的に開示されている化合物は，好ましい化合物，又は式（Ｉ）のＡ’部分の好ましい態様である。本発明は，本明細書に明示的に開示されたマルチマーバージョン又は具体的な化合物を検討している。例えば本発明は，式（Ｉ）の化合物のＡ，Ａ’，Ａ’’，Ａ’’’，又はＡ’’’’部分に相当する，本明細書で開示された具体的な化合物の３つ又は４つの残基のペプチド又はペプトイド部分を検討している。
【０１４３】
医薬組成物
本発明の第２の側面では，本発明の第１の側面に係る化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【０１４４】
活性成分は単独で投与させることができるが，医薬製剤又は組成物中に存在することが好ましい。したがって本発明は，上記で定義したような式（Ｉ）の化合物又はそれらの誘導体，塩もしくは溶媒和物を含む医薬製剤，及び薬学的に許容される担体を提供する。本発明の医薬組成物は，後述するような医薬製剤の形態をとってもよい。
【０１４５】
本発明の医薬製剤は，経口投与，非経口投与（皮下，皮内，筋肉内，静脈内，及び関節を含む），吸入投与（様々なタイプの加圧式定量エアロゾル，ネブライザー又はインサフレーターにより生成される微粒子ダストまたはミストを含む）直腸投与，及び局所投与（皮膚，経皮，経粘膜，口腔，舌下，及び眼内投与を含む）に適するものを含むが，最も適した経路は，例えば受容者の状態や障害に依存してもよい。
【０１４６】
製剤は単位剤形で便利に提供することができ，製薬分野で周知のいずれかの方法によって調製することができる。すべての方法は，活性成分と１つ以上の副成分を構成する担体を混合するステップを含む。通常，製剤は活性成分と液体担体もしくは超微粒子状固体担体とを，又はその両方とを均一かつ密に混合し，必要に応じ，所望の製剤に生成物を成形することによって調製する。
【０１４７】
経口投与に適する本発明の製剤は，それぞれ所定量の活性成分を含むカプセル剤，カシェ剤又は錠剤などの個別単位や，粉末又は顆粒や，溶液又は水性液体もしくは非水性液体の懸濁液や，水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンなどのように提供されてもよい。また活性成分は，巨丸剤（ボーラス），舐剤又はパスタ剤のように提供されてもよい。様々な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は，標準製剤に関する論文，例えばＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。また，“Ｙ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０，  Ｓｕｐｐ．  ４２：２Ｓ，  １９８８”も参照されたい。
【０１４８】
錠剤は，必要に応じて１つ以上の副成分と共に圧縮又は成形することによって製造してもよい。圧縮錠剤は，必要に応じて結合剤，滑沢剤，不活性希釈剤，潤滑剤，界面活性剤又は分散剤と混合した粉末又は顆粒などの自由流動形態に活性成分を，適当な機械で圧縮することにより調製してもよい。成形錠剤は，不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適当な機械で成形することにより製造してもよい。錠剤は必要に応じてコーティング又は刻み目をいれてもよく，その中の活性成分の持続放出又は制御放出を提供するように製剤化してもよい。本発明の化合物は例えば，即時放出又は持続放出に適した形態で投与することができる。即時放出又は持続放出は，本発明の化合物を含む適切な医薬組成物の使用によって達成することができ，特に持続放出の場合には，皮下埋め込み型ポンプ又は浸透圧ポンプなどの器具によって達成させることができる。また本発明の化合物はリポソームを投与することもできる。
【０１４９】
好ましくは，本発明に係る組成物は，例えば注射による，皮下投与に適している。
【０１５０】
経口投与用の典型的な組成物は，懸濁液及び即時放出錠剤を含み，懸濁液は例えば，当該技術分野で知られているような，バルク性を持たせる微結晶性セルロース，懸濁剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム，粘度増強剤としてのメチルセルロ−ス，及び甘味料又は香料などを含めることができ，即時放出錠剤は例えば，当該技術分野で知られているような，微結晶性セルロース，リン酸二カルシウム，デンプン，ステアリン酸マグネシウム，及び／又はラクトース，及び／又は他の賦形剤，結合剤，増量剤，崩壊剤，希釈剤および潤滑剤を含めることができる。また，式（Ｉ）の化合物又はその変異体，誘導体，塩もしくは溶媒和化合物は舌下投与及び／又は口腔投与により口腔を介して送達することができる。成形錠剤，圧縮錠剤又は凍結乾燥錠剤は使用可能な典型的な形態である。典型的な組成物はマンニトール，ラクトース，スクロース及び／又はシクロデキストリンなどの高速溶解希釈剤と共に，本発明の化合物を製剤化するものを含む。またこのような製剤は，セルロース（アビセル）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子量の賦形剤を含んでもよい。さらにこのような製剤は，粘膜付着を補助する賦形剤，例えばヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＳＣＭＣ），無水マレイン酸共重合体（例えば，Ｇａｎｔｒｅｚ）など，及び放出を制御するための薬剤，例えばアクリル共重合体（例えば，Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４）などを含めることができる。製造と使用を容易にするために，潤滑剤，滑沢剤，香料，着色剤及び安定剤を添加してもよい。
【０１５１】
非経口投与用の製剤は，水性及び非水性の無菌注射液，及び水性及び非水性滅菌懸濁液を含み，水性及び非水性の無菌注射液は抗酸化剤，緩衝剤，静菌薬，及び対象となる受容者の血液と製剤を等張させる溶質を含んでもよく，水性及び非水性滅菌懸濁液は懸濁剤及び増粘剤を含んでもよい。製剤は単位用量又は複数回用量容器，例えば密封アンプル及びバイアル中に存在してもよく，使用の直前に無菌液体担体，例えば生理食塩水又は注射用蒸留水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存してもよい。即時調合注射液（Ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）及び懸濁液は，前述した種類の無菌粉末，顆粒及び錠剤から調製することができる。非経口投与用の典型的な組成物は，注射液又は懸濁液を含み，これらは例えば，マンニトール，１，３−ブタンジオール，水，リンゲル液，等張塩化ナトリウム溶液などの適当な非毒性で非経口的に許容され得る希釈剤もしくは溶剤，又は他の適当な分散剤，湿潤剤，及びクレモホール（Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ）もしくはオレイン酸を含む脂肪酸と合成モノ又はジグリセリドを含む懸濁剤を含むことができる。水性担体は，例えば約３．０〜約８．０のｐＨ，好ましくは約３．５〜約７．４のｐＨ，例えば３．５〜６．０，３．５〜約５．０のｐＨの等張緩衝液であってもよい。有用な緩衝剤は，クエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ−ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ），リン酸ナトリウム−リン酸緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ），酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒｓ）を含む。組成物は，式（Ｉ）及び関連分子の化合物に有害であることが知られている酸化剤及び他の化合物を含まないことが好ましい。含めることができる賦形剤は，例えばヒト血清アルブミン又は血漿製剤などの他のタンパク質である。必要に応じて，医薬組成物は湿潤剤又は乳化剤，防腐剤及びｐＨ緩衝剤等の非毒性の補助物質，例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを少量含んでもよい
【０１５２】
鼻エアロゾル又は吸入投与用の典型的な組成物は，例えばベンジルアルコールやその他の適当な防腐剤，バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤，及び／又は当該技術分野で知られているような可溶化剤もしくは分散剤を含有し得る生理食塩水を含む。好都合なことに，鼻エアロゾル又は吸入投与用の組成物における本発明の化合物は，適当な噴射剤，例えばジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素又は他の適当なガスを用いて加圧パック又はネブライザーからエアゾールスプレーの形態で供給することができる。加圧エアロゾルの場合，単位投与量は計量された量を送達するためにバルブを設けて測定することができる。吸入器又は吹入器などに使用するためのゼラチンなどのカプセル及びカートリッジは，化合物と適当な粉末基剤，例えば乳糖又はでんぷんとの粉末混合物を含むように製剤化することができる。ある具体的で非限定的な例では，本発明の化合物は，アクチュエータとしても知られるエアロゾルアダプタを介して，定量投与バルブからエアロゾルとして投与する。必要に応じて安定剤，及び／又は深肺送達のための多孔質粒子も含まれる（例えば米国特許第６４４７７４３号参照）。
【０１５３】
直腸投与用の製剤は，例えばカカオバター，合成グリセライドエステル又はポリエチレングリコールなどの通常の担体と共に，停留浣腸剤又は座薬として提供することができる。このような担体は通常，常温で固体であるが，直腸腔内では液化及び／又は溶解して薬物を放出する。
【０１５４】
口腔内，例えば口腔又は舌下の局所投与用の製剤は，スクロース及びアカシア又はトラガカントなどの香料基剤に活性成分を含むトローチ剤と，ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの基剤に活性成分を含むパステル剤を含む。局所投与用の典型的な組成物は，プラスチベース（ポリエチレンによるゲル化鉱物油）などの局所用担体を含む。
【０１５５】
好ましい単位投与量の製剤は，本明細書に記載の有効量又はそれらの適当な割合の活性成分を含むものである。
【０１５６】
特に上記した成分に加えて，本発明の製剤は当該製剤の種類に関係を有する分野で常用の他の薬剤を含んでもよく，例えば経口投与に適するものは香味剤を含んでもよいことを理解できるだろう。
【０１５７】
また本発明の化合物は，徐放性製剤として適切に投与される。本発明の徐放性製剤の適切な例として，例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの成型品の形態の半透性ポリマーマトリックスを含む適当な高分子材料，許容される油の乳剤としての疎水性材料，又はイオン交換樹脂，及び本発明の化合物の難溶性誘導体，例えば難溶性塩を含む。徐放性製剤は，例えば経口投与，直腸投与，非経口投与，膣内投与，腹腔内投与，粉末，軟膏，ゲル，ドロップ又は経皮パッチなどの局所投与，又は経口もしくは鼻腔スプレーなどの口腔投与でもよい。
【０１５８】
投与用の調製は，本発明の化合物が制御放出をもたらすように適切に製剤化することができる。例えば，医薬組成物は，１つ以上の生分解性ポリマー，多糖ゼリー状，及び又は生体接着性ポリマー，両親媒性ポリマー，式（Ｉ）の化合物の粒子の界面特性を変えることができる作用物質を含む粒子形態であってもよい。これらの組成物は，活性物質の制御放出を可能にする特定の生体適合性の特徴を示している。米国特許第５７００４８６号参照。
【０１５９】
本発明の化合物はポンプ法（Ｌａｎｇｅｒ，  ｓｕｐｒａ；  Ｓｅｆｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１，  １９８７；  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７，  １９８０；  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４，  １９８９を参照）又はミニポンプなどを用いる持続的皮下注入法により送達されてもよい。静脈内注射溶液のバッグも利用することができる。他の制御放出系は，Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）による総説で論じられている。開示している他の側面として，本発明の化合物は，例えば米国特許第６４３６０９１号，米国特許第５９３９３８０号，米国特許第５９９３４１４号に記載の埋め込み型ポンプ（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｐｕｍｐ）により送達される。
【０１６０】
埋め込み型薬剤注入装置は，患者に持続的な長期投薬又は薬剤もしくは他の治療薬の注入をするのに使用される。本質的にそのような装置は，能動型（ａｃｔｉｖｅ）又は受動型（ｐａｓｓｉｖｅ）のいずれかに分類される。本発明の化合物はデポー製剤として製剤化してもよい。そのような長時間作用型デポー製剤は，皮下もしくは筋肉内などへの埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ），又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって例えば，化合物は，許容される油中の乳剤などとして適当なポリマー材料もしくは疎水性材料，又はイオン交換樹脂で製剤化することができるか，又は難溶性塩などの難溶性誘導体として製剤化することができる。
【０１６１】
本発明の化合物の治療有効量は，単回パルスの投与として，ボーラス投与として，経時的に投与するパルス投与として，投与してもよい。したがって，パルス投与において，本発明の化合物をボーラス投与し，続いて本発明の化合物を対象に投与しない期間の後，第２のボーラス投与を行う。具体的な非限定的な例では，本発明の化合物のパルス投与は，１日の内に，週の内に，又は月の内に投与する。
【０１６２】
一態様において，本発明の化合物の治療有効量は，他の薬剤，例えばさらに抗腫瘍化学療法剤（例えば，サリドマイド，デキサメタゾン，ボルテゾミブ，レナリドマイド，メルファラン，シスプラチン，ドキソルビシン，５−ＦＵなど），貧血治療剤（例えばエリスロポエチン），又は骨折防止薬剤（例えば，パミドロネート又はゾレドロン酸などのビスフォスフォネート）の治療有効量と共に投与してもよい。
【０１６３】
本発明の化合物の治療有効量は，使用する分子，治療する対象，苦痛の重症度やタイプ，及び投与の形式や経路に依存することになる。
【０１６４】
本発明の第３の側面では，本発明の第１の側面及び第２の側面の化合物，又は本発明の第２の側面の医薬組成物を，本発明の第１の側面の化合物の治療有効量もしくは本発明の第２の側面の医薬組成物の治療有効量を必要とする対象に投与することを含む，障害又は疾患を治療する方法が提供される。
【０１６５】
障害と疾患
本発明の化合物，組成物及び方法は，Ｇａｄｄ４５βの異常な発現増加もしくは活性化，又はＮＦ−κΒ経路の異常な活性化のいずれかによって特徴づけられる疾患及び障害の治療又は予防に適しており，Ｇａｄｄ４５β活性を阻害することによりプログラム細胞死を誘導させる治療に適している。
【０１６６】
治療又は予防に適した疾患は癌を含む。好ましくは，癌は，対応する正常な健康な細胞や組織と比較して，Ｇａｄｄ４５βを高レベルで発現する癌である。異常に高いレベルのＧａｄｄ４５βを発現することが知られている癌，つまり本発明の化合物で治療することが適切な癌は，多発性骨髄腫，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，バーキットリンパ腫，前単球性白血病，及び他の白血病と共に，肝細胞癌，膀胱癌，脳や中枢神経系癌，乳癌，頭頸部癌，肺癌，前立腺などの癌固形腫瘍も含む。ある態様において，癌は，生存に関してＮＦ−κΒに依存する癌である。生存に関してＮＦ−κΒに依存し，治療又は予防に適する具体的な癌は，多発性骨髄腫，マントル細胞リンパ腫，ＭＡＬＴリンパ腫，ホジキンリンパ腫，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，バーキットリンパ腫，前単球性白血病，骨髄異形成症候群，成人Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１），慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，急性骨髄性白血病，急性リンパ芽球性白血病，大腸炎関連癌，大腸癌，肝臓癌（例えば肝細胞癌），子宮頸癌，腎癌，肺癌，食道癌，胃癌，喉頭癌，前立腺癌，膵臓癌，甲状腺癌，甲状腺癌，膀胱癌，卵巣癌，乳癌，黒色腫，円柱腫，扁平上皮癌（皮膚，及び頭頸部），口腔癌，子宮内膜癌，網膜芽細胞腫，星状細胞腫，及び神経膠芽腫を含む。ある好ましい態様において，癌は多発性骨髄腫である。ある態様において，対象者から採取した細胞（例えば，対象者の癌からの生検，又は癌によってそれらが放出され得る対象者の血液もしくは他の体液からの抽出など）を，本発明の方法，化合物及び組成物による治療に対する癌の適合性を判断するために，ＮＦ−κΒ活性化のテスト及び／又はＧａｄｄ４５β活性化のレベルを評価してもよい。
【０１６７】
治療又は予防に適した他の疾患及び障害は，自己免疫疾患（例えば，多発性硬化症，狼瘡，Ｉ型糖尿病），アレルギー性疾患（例えば喘息），慢性炎症性疾患（例えば炎症性腸疾患，関節リウマチ，乾癬，潰瘍性大腸炎），遺伝性疾患（例えば，色素失調症，免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成異常症，円柱腫症），虚血性血管疾患（例えば，アテローム性動脈硬化症，狭心症，脳卒中，心筋梗塞），変性疾患（例えばアルツハイマー病やパーキンソン病），及び肝線維症及び肝硬変などの肝疾患を含む。
【０１６８】
様々な疾患及び障害は，ＮＦ−κΒの活性に依存している。実際に，事実上あらゆる既知の人間の疾患又は障害の病因は現在，炎症に依存すると考えられており，したがって，ＮＦ−κΒが関与している。これは炎症反応のマスタースイッチとして機能し，サイトカイン，受容体，転写因子，ケモカイン，炎症性酵素，及び生存促進性存因子を含む他の因子をコード化する２００以上の遺伝子配列の発現を調整して，炎症を開始し，維持する。本発明の化合物は，炎症におけるＮＦ−κΒの個別の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）生存促進活性を阻害する。したがって，これらの化合物による治療に適する病気や障害は，従来の慢性炎症性疾患（例えば，炎症性腸疾患，関節リウマチや乾癬など）の他にも重要な炎症性成分に依存する他の疾患及び障害を含む。抗炎症剤又はＮＦ−κＢ阻害剤で治療し，又はＮＦ−κΒ阻害剤による治療が適するとして提案されているそのような疾患及び障害の例は，以下の通りである。
【０１６９】
１，呼吸器：
気管支喘息，アレルギー性喘息，内因性喘息，外因性喘息，運動誘発性喘息，薬剤誘発性（アスピリン及びＮＳＡＩＤ誘発性を含む）喘息，粉塵誘発性喘息，間欠性喘息，持続性喘息やそれらの重大な症状，及び気道過敏性の他の原因を含む，気道の閉塞性疾患；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；感染症及び好酸球性気管支炎を含む，気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；農夫肺及び関連疾患；過敏性肺炎；特発性線維化性肺胞炎，特発性間質性肺炎，抗腫瘍治療を複雑にする線維症，結核などの慢性感染症，アスペルギルス症，及び他の真菌症を含む，肺線維症；肺移植の合併症；肺血管系の血管炎，血栓症及び肺高血圧症；気道の炎症や分泌状態に伴う慢性咳嗽，及び医原性の咳の治療を含む，鎮咳作用；薬物性鼻炎や血管運動性鼻炎を含む急性及び慢性鼻炎；神経性鼻炎（花粉症）を含む通年性及び季節性アレルギー性鼻炎；鼻ポリープ；一般的な風邪及び呼吸器合胞体ウイルス，インフルエンザ，コロナウイルス（ＳＡＲＳを含む）又はアデノウイルスによる感染症を含む，急性ウイルス感染症；又は好酸球性食道炎；
【０１７０】
２，骨及び関節：
例えば先天性の股関節形成不全などの原発性骨関節症及び続発性骨関節症に関連する，又は含む関節炎；頸部脊椎炎，腰部脊椎炎，及び首や腰の痛み；骨粗しょう症；関節リウマチ及びスチル病；強直性脊椎炎，乾癬性関節炎，反応性関節炎，及び未分化型脊椎関節炎を含む，血清反応陰性脊椎関節症；敗血症性関節炎，及び結核などの他の感染症による関節症や骨障害，ポット病やポンセット症候群（Ｐｏｎｃｅｔ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）など；尿酸痛風，ピロリン酸カルシウム沈着症，カルシウムアパタイトによる腱炎，滑液包炎や滑膜炎症を含む，急性及び慢性結晶誘発性滑膜炎；ベーチェット病；一次性及び二次性シェーグレン症候群；全身性強皮症及び限局型全身性強皮症；全身性エリテマトーデス，混合性結合組織病，未分化結合組織疾患；皮膚筋炎及び多発性筋炎を含む，炎症性ミオパシー；リウマチ性多発筋痛症；すべての関節分布での特発性炎症性関節炎を含む若年性関節炎，及び症候群，リウマチ熱やその全身性合併症に関連する若年性関節炎；巨細胞性動脈炎，高安動脈炎，チャーグ・ストラウス症候群，結節性多発動脈炎，顕微鏡的多発動脈炎を含む血管炎，及びウイルス感染，過敏症反応クリオグロブリンやパラプロテインに関連する血管炎；腰痛；家族性地中海熱，マックル−ウェルズ症候群，及び家族ハイバーニアンフィーバー，菊池病；薬剤誘発性の関節痛，腱炎，及びミオパシー；
【０１７１】
３，傷害（例えば，運動傷害）又は疾患に起因する筋骨格系障害の痛み及び結合組織のリモデリング：関節炎（例えば，関節リウマチ，変形性関節症，痛風又は結晶性関節症），その他の関節疾患（例えば，椎間板変性や顎関節の変性など），骨リモデリング疾患（例えば骨粗鬆症，パジェット病又は骨壊死など），多発性軟骨炎，強皮症，混合性結合組織障害，脊椎関節症又は歯周疾患（例えば，歯周炎など）；
【０１７２】
４，皮膚：
乾癬，アトピー性皮膚炎，接触性皮膚炎又はその他の湿疹皮膚病，及び遅延型過敏反応；植物及び光線皮膚炎；脂漏性皮膚炎，疱疹状皮膚炎，扁平苔癬，硬化性萎縮性苔癬，壊疽性膿皮症，皮膚サルコイド，円板状エリテマトーデス，天疱瘡，類天疱瘡，表皮水疱症，蕁麻疹，血管浮腫，血管炎，毒性紅斑，皮膚好酸球増加症，円形脱毛症，男性型脱毛症，スウィート症候群，ウェーバー・クリスチャン症候群，多形性紅斑；感染性，非感染性の蜂巣炎；脂肪織炎；皮膚リンパ腫，非黒色腫皮膚癌や他の異形成病変；固定薬疹を含む薬剤誘発性障害；
【０１７３】
５，眼：
眼瞼炎；通年性又は春季アレルギー性結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部及び後部ぶどう膜炎；脈絡膜炎；自己免疫性；網膜に影響を与える変性又は炎症性障害；交感神経眼炎を含む眼炎；サルコイドーシス；ウイルス，真菌，及び細菌を含む感染；
【０１７４】
６，消化管：
舌炎，歯肉炎，歯周炎，逆流性を含む食道炎；好酸球性胃腸炎，肥満細胞症，クローン病，潰瘍性大腸炎を含む大腸炎，直腸炎，肛門掻痒症；セリアック病，過敏性腸症候群，及び腸から離れて作用し得る食品関連アレルギー（例えば偏頭痛，鼻炎又はアトピー性皮膚炎）；
【０１７５】
７腹部：
自己免疫性，アルコール性及びウイルス性を含む肝炎；肝臓の線維症及び肝硬変；胆嚢炎；急性及び慢性の膵炎；
【０１７６】
８，泌尿生殖器：
間質性及び糸球体腎炎を含む腎炎；ネフローゼ症候群；急性及び慢性（間質性）膀胱炎，及びハンナー潰瘍を含む膀胱炎；急性及び慢性尿道炎，前立腺炎，精巣上体炎，卵巣炎及び卵管炎；外陰膣炎；ペイロニー病；勃起不全（男女とも）；
【０１７７】
９，同種移植片拒絶反応：
例えば，腎臓，心臓，肝臓，肺，骨髄，皮膚又は角膜の移植後又は輸血後の急性および慢性のもの；
又は慢性移植片対宿主病；
【０１７８】
１０，ＣＮＳ：
アルツハイマー病及びＣＪＤやｎｖＣＪＤを含む他の痴呆障害；アミロイド症；多発性硬化症及び他の脱髄症候群；脳動脈硬化及び血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；内臓痛，頭痛，片頭痛，三叉神経痛，非定型顔面痛，関節や骨の痛み，癌や腫瘍浸潤に起因する痛み，及び糖尿病性，ヘルペス後，及びＨＲＶ関連ニューロパシーなどの神経障害性疼痛症候群を含む急性及び慢性疼痛（中枢起源であれ末梢起源であれ，急性，間欠性又は持続性の）；神経サルコイドーシス；悪性，感染性又は自己免疫過程の中枢及び末梢神経系の合併症；
【０１７９】
橋本甲状腺炎，グレーブス病，アジソン病，真性糖尿病，特発性血小板減少性紫斑病，好酸球性筋膜炎，高ＩｇＥ症候群，抗リン脂質抗体症候群を含む，その他の自己免疫性及びアレルギー性障害；
【０１８０】
１２，
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ），ハンセン病，セザリー症候群，腫瘍随伴性症候群を含む，炎症性又は免疫学的要因に伴うその他の障害；
【０１８１】
１３，心血管：
冠状動脈及び末梢循環に影響を与えるアテローム性動脈硬化症；心膜炎；心筋炎，心筋サルコイドを含む炎症性疾患及び自己免疫心筋症；虚血再潅流傷害；感染症（例えば梅毒性）を含む心内膜炎，弁膜炎，及び大動脈炎；血管炎，深部静脈血栓症及び静脈瘤の合併症を含む静脈炎及び血栓症などの近位及び末梢静脈の障害；
【０１８２】
１４，消化管：
セリアック病，直腸炎，好酸球性胃腸炎，肥満細胞症，クローン病，潰瘍性大腸炎，顕微鏡的大腸炎，判定不能大腸炎，過敏性腸障害，過敏性腸症候群，非炎症性の下痢，腸から離れた部位に作用する食品関連アレルギー，例えば偏頭痛，鼻炎及び湿疹。
【０１８３】
本発明の第４の側面では医薬として使用する，本発明の第１の側面の化合物又は本発明の第２の側面の組成物が提供される。
【０１８４】
本発明の第５の側面では，疾患又は障害の治療用薬剤の製造に関する，本発明の第１の側面の化合物又は本発明の第２の側面の医薬組成物の使用が提供される。ある好ましい態様として，前記疾患又は障害及び対象は，本発明の第３の側面に関連する上記のように定義される。
【０１８５】
好ましくは，本発明の生成物及び方法は人間の疾患及び障害を治療するためのものである。
【０１８６】
本発明のセラノスティック（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）な側面
本発明は様々な態様の治療方法，医薬の製造における本発明の化合物又は組成物の使用，治療に使用される本発明の化合物又は組成物を包含する。
【０１８７】
ある態様において，本発明は以下を包含してもよい。
ａ）上記のような疾患又は障害を治療又は予防する方法。ここで疾患又は障害は，対象者別の癌であり，その対象者の疑いのある癌はあらかじめ試料が採取され（例えば，組織生検又は血液や痰などの体液を採取することにより），Ｇａｄｄ４５βの発現及び／又は活性，及び／又はＮＦ−κΒの発現及び／又は活性の上昇値を示すことが測定されている。ｂ）Ｇａｄｄ４５βの発現及び／又は活性，及び／又はＮＦ−κΒの発現及び／又は活性の上昇値を示すことがあらかじめ測定された個人の組織を治療する医薬として使用する本発明の化合物又は組成物。ｃ）Ｇａｄｄ４５βの発現及び／又は活性化の異常な増加，又はＮＦ−κΒ経路の異常な活性化のいずれかによって特徴付けられる疾患又は障害，及びＧａｄｄ４５βの阻害によるプログラム細胞死の誘導による治療に適した疾患又は障害を治療する医薬として製造する本発明の化合物又は組成物の使用。ここで疾患又は障害は癌であり，癌細胞はＧａｄｄ４５βの発現及び／又は活性の上昇値を示すことが測定されている。
【０１８８】
“上昇値”は，同一の起源でかつ必要に応じて同一の対象者から又は正常な対象者から得られた正常な組織のコントロ−ル値と比較して，少なくとも１０％，少なくとも２０％，少なくとも３０％，少なくとも５０％，少なくとも７５％，少なくとも１００％，少なくとも２００％，少なくとも３００％，少なくとも４００％，少なくとも５００％，少なくとも６００％，少なくとも７００％，少なくとも８００％，少なくとも９００％，又は少なくとも１０００％の上昇を意味してもよい。発現及び活性のレベルは，ＲＴ−ＰＣＲ，サザンブロッティング，ノーザンブロッティング，ウェスタンブロット法，ＥＬＩＳＡ，ラジオ免疫アッセイ，キナーゼアッセイ及び他の結合，機能，及び／又は発現アッセイを含む，当該技術分野で公知のいずれかの方法によって測定してもよい。
【０１８９】
本発明のこのセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）な側面は，主に図１２Ａ及び１２Ｂに示される結果によって説明されている。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによる評価として，２９個の異なる原発組織の癌細胞株のパネルで示されるここでの結果は，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に感受性を有する癌細胞が，内因性Ｇａｄｄ４５β発現レベルと相関することを，非常に高度な統計的有意性で証明している。実際に，Ｚ−ＤＴＰ２で治療した後のＧａｄｄ４５β発現と細胞生存／細胞増殖の割合の相関プロットは，２つのパラメ−タドメイン間の相関係数の有意性が非常に高いことを示している（ｐ＜０．０１）。驚くべきことに，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅と共にｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのサイレンシングにより誘導される細胞死にも耐性がある多発性骨髄腫細胞株（テストした９つの多発性骨髄腫細胞株の内）は，ＲＰＭＩ−８２２６細胞株のみであり（図１６，１７，及び１８），ほとんど検出できないくらいの最も低いレベルのＧａｄｄ４５βを発現している（図１２Ａ）。これらのデータは，仮にＤＴＰに基づく治療が臨床で行われれば，簡易で費用対効果の高いｑＲＴ−ＰＣＲ解析を介して患者のレスポンダー集団を予測することができるようになることを示している。例えば，多発性骨髄腫患者からの初代細胞のＧａｄｄ４５βの発現レベルを分析して，この発現が高レベルの患者は，本発明の化合物を用いた治療から最も恩恵を受ける人とみなすことができる。したがって，本発明の重要な側面は，セラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）な側面であり，つまりＤＴＰｓ治療に応答する患者を予測する臨床的に有用なアッセイを適用する。
【０１９０】
また本発明のこのセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）な側面は，細胞内でのＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対する本発明の化合物の非常に高い標的特異性によって支持されている。これは，細胞内の標的（すなわちＧａｄｄ４５β）の発現レベルが高いほど，そのような細胞の生存がＧａｄｄ４５βに依存する確率が高くなる，つまりこのような細胞がＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に感受性を有する確率が高くなることを示している。このＺ−／ｍＤＴＰの高い特異性は，以下の調査結果によって証明されている。１）腫瘍細胞株の大パネルにおいて，Ｇａｄｄ４５β発現レベルとＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に感受性を有する癌細胞との間に統計的に非常に有意な相関関係がある（図１２）；２）ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのダウンレギュレ−ションが，Ｚ−／ｍＤＴＰ感受性癌細胞株においては急速にアポトーシスを誘導するが，Ｚ−／ｍＤＴＰ耐性癌細胞株では誘導せず（図１６，１７，１８），これらの細胞株でのＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡによるアポト−シス誘導のキネティクスは，Ｚ−／ｍＤＴＰｓで観察されたものに類似している（図７Ａ，８Ｂ，及び８Ｃ）；３）ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７のダウンレギュレ−ションは，Ｚ−／ｍＤＴＰ感受性細胞株に，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して完全な耐性を持たせる（図２０Ａ，２０Ｂ，及び２０Ｃ）；４）本発明の治療標的が，２つのタンパク質，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７とのインターフェースである（図２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃ及び２１Ｄ）。これは，さらに高い標的選択性の可能性を提供し，既存の治療に対して重要な利点となる。正常細胞に対するＺ−／ｍＤＴＰｓの低毒性，及びマウスにおいてＧａｄｄ４５βのノックアウトアブレーションが良好な耐用性を示す調査結果（Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：  １９１−１９２３参照）と共にこれらのデータは，Ｚ−／ｍＤＴＰによるＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７の阻害を介して細胞生存内の個別の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）生存促進性機能を標的にすることが，ＮＦ−κΒ経路及び／又はプロテアソーム標的療法よりも，特異的，低毒性で，効果的な治療法を提供できることを示している。
【実施例】
【０１９１】
以下の非限定的な実施例により本発明を説明する。
【実施例１】
【０１９２】
Ｚ−ＤＴＰ２の合成
実施例によって，Ｚ−ＤＴＰ２の合成を説明する。Ｚ−ＤＴＰ２は，アミド結合によりＮ−末端に結合したベンジルオキシカルボニル基（つまりＺ基）及びアミド結合によりＣ末端に結合したアミノ基を有するＤ−チロシン，Ｄ−グルタミン，Ｄ−アルギニン，Ｄ−フェニルアラニンで構成されるコアテトラペプチドを含む。
【０１９３】
材料と方法
Ｚ−ＤＴＰ２は，Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ固相法（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｇ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ  Ｒ．Ｌ．  １９９０  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉ  Ｒｅｓ；  ３５：  １６１−２１４；  ；Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ａ．  １９９５  Ｔｈｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ参照）に従って，５００μｍｏｌ（１０００ｍｇ）のＲｉｎｋアミドポリスチレン樹脂（Ｆｍｏｃ−ＲＩＮＫ−ＡＭ−ｒｅｓｉｎ，ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社，上海，中国，カタログ番号４９００１）から手作業で調製し，０．５０ｍｍｏｌｅｓ／ｇを置換した。樹脂は，２０μｍのフッ素樹脂膜，ポリプロピレン製の上部キャップ及びポリプロピレン製の底部ルアーロックキャップを備えた３０ｍＬのポリプロピレン容器に入れた。樹脂は，１０．０ｍＬの５０：５０のジクロロメタン（ＤＣＭ）：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物（共にＬａｂＳｃａｎ社，スティローガン，アイルランド；ＤＣＭ，カタログ番号Ｈ６５０８Ｌ；ＤＭＦ，カタログ番号Ｈ３３Ｈ１１Ｘ）で２０分間膨潤させた。その後，減圧下で溶媒を除去（ｒｅｍｏｖｅｄ）した後，５．０ｍＬの８：２のＤＭＦ：ピペリジン混合物（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ，Ｐｉｐ，カタログ番号８０６４１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，ミラン，イタリア）で，室温（ＲＴ）で２０分間処理することによりＦｍｏｃ基を除去（ｃｌｅａｖｅｄ）した。反応物を減圧下で分解（ｃｌｅａｖｅｄ）し，樹脂を５．０ｍＬのＤＭＦで３回洗浄した。次に，２．５ｍｍｏｌ，０．９７ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社，上海，カタログ番号３５７０２）を，５．０ｍＬのＤＭＦに溶解し（終濃度０．５Ｍ），ＤＣＭ中で，５．０ｍＬ，０．５Ｍのベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート溶液（ＰｙＢＯＰ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社，カタログ番号０１−６２−００１６），及び，０．９０ｍＬのジ−イソ−プロピル−エチルアミン（５．０ｍｍｏｌ；ＤＩＥＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，カタログ番号Ｄ−３８８７）で活性化させた。活性化させたアミノ酸の溶液を樹脂に注ぎ，激しく撹拌しながら３０分間放置した。減圧下で溶液をドレーンし，樹脂を５．０ｍＬのＤＭＦで３回洗浄した。α−ＮＨ２のＦｍｏｃ基を，前述のように８：２のＤＭＦ−Ｐｉｐ溶液（５．０ｍＬ）で２０分間処理して除去（ｒｅｍｏｖｅｄ）し，さらに５．０ｍＬのＤＭＦで（３回）洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ溶液（５．０ｍＬのＤＭＦ中で２．５ｍｍｏｌ，１．６グラム；ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社，上海，カタログ番号３６４０４）を，２．５ｍｍｏｌのＰｙＢＯＰ及び５．０ｍｍｏｌの純粋なＤＩＥＡのを用いて活性化させた。溶液を樹脂に移し，撹拌しながら３０分間放置した。Ｆｍｏｃ基を５．０ｍＬの８：２ＤＭＦ−Ｐｉｐ溶液で分解（ｃｌｅａｖｅｄ）し，ＤＭＦで洗浄（３回，５．０ｍＬ）した後，上記のようにＰｙＢＯＰとＤＩＥＡであらかじめ活性化させた（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＤＭＦ中の０．５ＭのＦｍｏｃ−（Ｄ）−Ｇｌｕ（ｔＢＵ）���ＯＨ溶液（５．０ｍＬのＤＭＦ中で２．５ｍｍｏｌ，１．１グラム；ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社，上海，カタログ番号３６６０５）を樹脂に加え，反応を室温で３０分間進行させた。アミノ酸溶液のドレーンに続いて，Ｆｍｏｃ基を前述のように除去し（８：２のＤＭＦ：Ｐｉｐ５．０ｍＬで２０分間の処理），樹脂を５．０ｍＬのＤＭＦで３回洗浄した。上記のようにＰｙＢＯＰとＤＩＥＡで予め活性化させ，５．０ｍＬのＤＭＦに溶解した２．５ｍｏｌのＦｍｏｃ−（Ｄ）−Ｔｙｒ（ｔＢＵ）−ＯＨ（１．２ｇ，ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社，上海，カタログ番号３６９０６）を樹脂上に移し，攪拌しながら４５分間放置した。減圧ドレーンによりアミノ酸溶液を除去（ｒｅｍｏｖｅｄ）した後，樹脂を５．０ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した。５ｍｍｏｌのＺ−ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社，上海，カタログ番号１０５０２）を１０ｍｌのＤＭＦに溶解し，樹脂に加えた。２．４ｍＬのＤＩＥＡを加え，攪拌しながら一晩反応させた。溶液をドレーンした後，樹脂をＤＭＦ，ＤＣＭ，メチルアルコール（ＭｅＯＨ，ＬａｂＳｃａｎ社，カタログ番号Ｃ２５１７），及びエチルエーテル（ＥＴ２Ｏ，ＬａｂＳｃａｎ社，カタログ番号Ａ３５０９Ｅ）で広範に洗浄し，減圧下で乾燥させ，加重した。重量は１．１ｇであった。ペプチドを除去（ｃｌｅａｖｅｄ）するために，９０：５：５（ｖ／ｖ／ｖ）のＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳから成る１０．０ｍＬの混合物（ＴＦＡ，トリフルオロ酢酸，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，イタリア，カタログ番号９１７００；ＴＩＳ，トリイソプロピルシラン，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，カタログ番号２３，３７８−１）で，樹脂を室温で３時間処理した。樹脂を濾過により除去（ｒｅｍｏｖｅｄ）し，２０ｍＬの低温ＥＴ２Ｏをトリフルオロ酢酸溶液に加え，結果として白色沈殿物を形成した。遠心分離により溶媒を除去（ｒｅｍｏｖｅｄ）した後，沈降物を１０．０ｍＬの低温ＥＴ２Ｏで洗浄し，１０．０ｍＬの５０：５０（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮに溶解し，凍結乾燥した。ペプチドは，内径５０×２ｍｍで狭口径のＯＮＹＸ  Ｃ１８カラム（ａ  ｎａｒｒｏｗ  ｂｏｒｅ  ５０ｘ２  ｍｍ  ＩＤ  ＯＮＹＸ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社，トーランス，カリフォルニア，米国）を用いて毎分６００μＬで５％のＣＨ３ＣＮ，０．０５％のＴＦＡと平衡化し，ＬＣ−ＭＳによって特徴を明らかにした。この分析は，３分で５％から７０％のＣＨ３ＣＮ，（０．０５％の）ＴＦＡの濃度勾配を適用して行った。ペプチドは，１０×１ｃｍのＣ１８  ＯＮＹＸカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社，トーランス，カリフォルニア，米国）を用いたセミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し，毎分２０ｍＬで平衡化し，各実行ごとに２０ｍｇを注入した。８分で５％から６５％の濃度勾配を適用し，ペプチドを溶出した。純粋な画分をプールし，ＬＣ−ＭＳで特徴を明らかにした。測定されたペプチドＡのＭＷは７４６．８ａｍｕ（ｔｈｅｏｒ．７４６．８３ａｍｕ）であり，生成物は９５％以上純粋であった（ＨＰＬＣ）。約６０％の収率が，すべての粗生成物の精製後に達成された。
【実施例２】
【０１９４】
Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７との間の相互作用の用量依存的な阻害と一般式（Ｉ）の化合物の選択性
ペプチドの阻害特性を評価するために，ＥＬＩＳＡベースのアッセイを行った。これらのアッセイにおいて，ビオチン化ｈＧａｄｄ４５βを溶液として使用し，グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の融合タンパク質を９６ウェルプレートのウェルにコーティングした。ｈＧａｄｄ４５βは，Ｔｏｒｎａｔｏｒｅらによる，ＥＺ  Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社，ロックフォード，アイルランド）を用いてビオチン化した（Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１）。
【０１９５】
材料と方法
まず，Ｔｏｒｎａｔｏｒｅらも報告しているように，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７との関係をＥＬＩＳＡアッセイによって調べた（Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１）。９６ウェルマイクロプレート中において，ＧＳＴ融合完全長キナーゼ（ＧＳＴ−ｆｕｓｅｄ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｋｉｎａｓｅ）を，緩衝液Ａ（２５ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＤＴＴ，及び１ｍＭのＥＤＴＡ）によって，４２ｎＭの濃度で，４℃で１６時間コーティングした。いくつかのウェルは緩衝液だけで満たし，ブランクとして使用した。４°Ｃで１６時間のインキュベーション後，溶液を除去（ｒｅｍｏｖｅ）し，ウェルをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中１％（ｗ／ｖ）の３５０μＬのＮＦＤＭ（脱脂粉乳）溶液で満たした。プレートを暗所で３７℃，１時間インキュベートした。緩衝液Ｔ−ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ洗浄剤を０．００４％（ｖ／ｖ）含むＰＢＳ）で洗浄後，８．４ｎＭから１６８ｎＭの範囲の濃度の１００μＬのビオチン化ｈＧａｄｄ４５βで，ウェルを満たした。各データポイントは３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行った。暗所で３７℃，１時間インキュベートした後，溶液を除去し，ウェルを再びＴ−ＰＢＳで洗浄した。その後，緩衝液中に溶解した希釈度１：１０，０００のＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を，各ウェルに加え，プレートを暗所で３７℃，１時間インキュベートした。酵素溶液を除去（ｒｅｍｏｖｅ）し，洗浄した後，１００μＬの発色基質ｏ−フェニレンジアミン（過酸化水素中０．４ｍｇ／ｍＬの尿素を含む，５０ｍＭのリン酸ナトリウムクエン酸緩衝液中０．４ｍｇ／ｍＬ）を加え，暗所で５分間現像し，発色させた。２．５ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加え，反応を停止させた。４９０ｎｍの吸光度をすべてのウェルで測定し，値を，対応するブランクを差し引いて平均化した。その後上記のように結合したタンパク質を検出した。半最大値のＥＬＩＳＡシグナルが検出されるビオチン化ｈＧａｄｄ４５βのモル濃度は，解離定数（ＫＤ）に一致する（Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｂ，  Ｃｈａｆｆｏｔｔｅ  ＡＦ，  Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ  Ｌ，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＭＥ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９８５  Ｍａｒ  １８；７７（２）：３０５−１９）。上記のように４２ｎＭでのＧＳＴ−ＭＫＫ７のコーティング，２１ｎＭの濃度のビオチン化ｈＧａｄｄ４５β（事前飽和条件（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）１：０．５，モル／モル比）により結合競合アッセイを行い，最初のテストで，２１ｎＭの競合体（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を用いた。ＧＳＴ−ＭＫＫ７に対するビオチン化ｈＧａｄｄ４５βの結合を，競合ペプチド（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（０．０１ｎＭから１００ｎＭの範囲の濃度）の増加量の存在下で分析し，この競合体により得られた値を競合体が無い場合に検出された結合の割合として表した。アッセイ条件下で２１ｎＭでの阻害能力の割合として表現される活性化のデータは，本発明の化合物から選択された組み合わせに関して，以下の表１に報告されている。この表に用いられる規則に従って，“Ｌ−Ｘａａ”と“Ｄ−Ｘａａ”はアミノ酸ＸａａのＬ型とＤ型を示している。選択された化合物のＩＣ５０のデータ（すなわち，ＭＫＫ７に結合するＧａｄｄ４５βの５０％を減少させるために必要な化合物用量）は，図３Ｃに表わされている。
【実施例３】
【０１９６】
リードテトラペプチドの単離
材料と方法
本発明の好ましい化合物が得られるリードＤ−テトラペプチドを同定するためにＥＬＩＳＡスクリーニングを使用した。簡略化したコンビナトリアルペプチドライブラリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）（Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  ９：４４７−６７参照）により，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用のアンタゴニストをスクリーニングした。このライブラリーは，Ｇｉｎ（Ｑ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ａｒｇ（Ｒ），Ａｌａ（Ａ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｍｅｔ（Ｍ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｈｉｓ（Ｈ），Ａｓｐ（Ｄ）のアミノ酸残基の組み合わせにより形成される合計１２４＝２０７３６個の異なるテトラペプチドを包含しており，コーティングしたＭＫＫ７（４２ｎＭ），可溶性ビオチンｈＧａｄｄ４５（２１ｎＭ），及びそれぞれの１２個のサブライブラリー（４２ｎＭ）を用いて，ＥＬＩＳＡ競合アッセイによって，４つのステップで反復的にデコンボリューションした。このスクリーニングの結果は表１に示されている（ここでは標準的な１文字のアミノ酸残基コードを使用し，Ｘ２，Ｘ３とＸ４は上記１２個の残基の混合物を表している）（図３Ａ参照）。表１に記載された結果として生じる最も活性化したペプチド（すなわち，Ｆｍｏｃ−（βＡｌａ）２−ＹＤＨＦ−ＮＨ２，別名Ｆｍｏｃ−ＬＴＰ１）は，最適化のいくつかの段階を行い，Ｆｍｏｃ−（βＡｌａ）２−標識が除去（ｒｅｍｏｖｅ）され，ＡＣ−ＬＴＰ１及びＡＣ−ＬＴＰ２が得られた（表２参照）。その後，これらのテトラペプチドを同じアミノ酸のＤ−異性体を用いて再合成し，最終的にリードテトラペプチド１及び２（ＤＴＰ１及びＤＴＰ２）を得た（図３Ｃ）。これはそれぞれ，０．２２ｎＭ及び０．１９ｎＭのＩＣ５０ｓでＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７の相互作用を阻害する。
【０１９７】
ＤＴＰ１の配列：アセチル−（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）−ＮＨ２［配列番号３８］
ＤＴＰ２の配列：アセチル−（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ｇｌｕ）−（Ｄ−Ａｒｇ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）−ＮＨ２［配列番号：３７］
【０１９８】
また，以下の配列をネガティブコントロール（ＮＣ）として選択した。
ＮＣ１の配列：アセチル−（Ｄ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−Ａｓｐ）−（Ｄ−Ｈｉｓ）−（Ｄ−Ｇｌｎ）−ＮＨ２［配列番号：８１］
ＮＣ２の配列：アセチル−（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｈｉｓ）−（Ｌ−Ａｌａ）−ＮＨ２［配列番号：８２］
ＮＣ３の配列：アセチル−（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−ＮＨ２［配列番号：８３］
ＮＣ４の配列：アセチル−（Ｌ−Ｔｙｒ）−（Ｌ−Ａｓｐ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−ＮＨ２［配列番号：８４］
【０１９９】
図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは，ＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを示している。アセチル化ペプチド及び／又は修飾ペプチド（つまりアセチル基又は他の基のいずれかに結合したペプチド）の阻害率は，それぞれ表２及び表３に示されている（ここでは標準的な１文字のアミノ酸残基コードを使用している）。
【実施例４】
【０２００】
免疫沈降アッセイ
材料と方法
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）を，１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ），１００単位／ｍｌのペニシリン，１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン，及び１％のグルタミンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＨＥＫ−２９３細胞（２．２×１０６）を１０ｃｍ２の組織培養皿に播種し，次の日，標準Ｃａ３（ＰＯ４）２沈殿技術（Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３参照）を用いて，ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７及びｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｇａｄｄ４５βプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトから４８時間後，細胞をＰＢＳで１度洗浄し，その後再懸濁し，プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド，１０μΜのキモスタチン，２μｇ／ｍｌのアプロチニン，２μｇ／ｍｌのロイペプチン）を加えた溶解緩衝液中で（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，３５０ｍＭのＮａＣｌ，２０％のグリセロール，１ｍＭのＭｇＣｌ２，０．２ｍＭのＥＧＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，１ｍＭのＮａ３ＶＯ４，及び５０ｍＭのＮａＦ），４℃で３０分間，時折穏やかに振とうしながらインキュベートした。溶解した細胞を回収し，４０分間４５，０００ｘｇで遠心分離した。得られた透明細胞溶解液は，さらなる分析に使用した。
【０２０１】
活性化Ｄ−テトラペプチドはＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用を阻害するが，ネガティブコントロールテトラペプチドでは阻害しないことを証明するために，ネガティブコントロールのテトラペプチド（ＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３及びＮＣ４）と共に，実施例３で分離したリードテトラペプチドＤＴＰ１及びＤＴＰ２をＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７と混合培養した。本質的に“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３”及びそれらの中の参考文献に記載と同じ条件で，ＦＬＡＧ標識したＭＫＫ７を沈降させる抗ＦＬＡＧ抗体を用いて，免疫沈降を行った。ウェスタンブロット法により，抗ＭＫＫ７抗体又は抗ＨＡ抗体（ＨＡ−ｈＧａｄｄ４５βに結合している）を用いて，図５（それぞれ下部パネルと上部パネル）に示されているように現像した。
【０２０２】
結果
結果は図５に示されている。ＨＡ−Ｇａｄｄ４５β及びＦＬＡＧ−ＭＫＫ７を一時的に発現するＨＥＫ−２９３細胞からの溶解物と，抗ＦＬＡＧ抗体（ＦＬＡＧ標識ＭＫＫ７に特異的に結合する）とで共免疫沈降を行った時，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７の間に強い相互作用があったことを図５に示すウェスタンブロット像から見ることができる。テトラペプチドの非存在下，又はネガティブコントロール（ＮＣ）Ｄ−テトラペプチドＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ２もしくはＮＣ４の存在下のいずれかで共免疫沈降を行った場合，この結果が得られた。しかし，１ｎＭ又は５ｎＭのＤＴＰ１又はＤＴＰ２の存在下で，共免疫沈降を行った場合，沈降した複合体はＧａｄｄ４５βを全く又はほんの少ししか含んでおらず，ＭＫＫ７とＧａｄｄ４５β間の相互作用が活性化ＤＴＰ化合物によって阻害されていたことを示し，したがって共免疫沈降中にＧａｄｄ４５は減少した。これらのデータは，図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃ，図４に示すＥＬＩＳＡ競合アッセイで観察された結果を確証し拡張する。
【実施例５】
【０２０３】
ヒト血清中のＤＴＰｓの安定性
材料と方法
図４では，Ｚに結合したＤ−テトラペプチドのヒト血清中での安定性を測定するために，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７結合競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。この目的のために，実施例３に記載されたコンビナトリアルライブラリースクリーン（すなわち，Ｚ−ＬＴＰ１，Ｚ−ＬＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１，及びＺ−ＤＴＰ２）から選択される最も活性化されたＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７アンタゴニストの活性と共に，あるネガティブコントロールのＬ−テトラペプチド（すなわちＺ−ＬＮＣ）及び対応するＤ−鏡像異性体（すなわちＺ−ＤＮＣ）の活性を，ＥＬＩＳＡ競合アッセイにおいて，３７℃で，ヒト血清での４８時間プレインキュベートの前後で比較した。ＥＬＩＳＡは，図３に記載されているように行った。簡単に言えば，ＥＬＩＳＡ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＤＴＴ，１ｍＭのＥＤＴＡ）中４２ｎＭの組換え型ＧＳＴ−ＭＫＫ７を１００μｌ，４℃で一晩インキュベートし，９６ウェルプレートのウェル上にコーティングした。３７℃で１時間，２％のＮＦＤＭでブロッキングした後，プレートをＴＰＢＳで洗浄し，次いで，２１ｎＭの組換え型ビオチン化ヒト（ｈ）Ｇａｄｄ４５βを，上記のようにヒト血清でプレインキュベーションしたか又はしていないテトラペプチドの濃度を増加させながらウェルに加えた。アッセイの使用条件のさらなる議論については，“Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  ＪＭＢ，  ３７８：９７−１１１”及びそれらの中の参考文献を参照のこと。
【０２０４】
結果
図３Ｃは，ＥＬＩＳＡ競合アッセイでのＤＴＰｓとＬＴＰｓのＩＣ５０ｓの比較により示されるように，Ｇａｄｄ４５β／ＭＭＫＫ７複合体の形成を阻害するＤＴＰ１とＤＴＰ２の活性が，それらの対応するＬ−鏡像異性体の活性と同程度であることを示している。図４は，Ｚ−ＤＴＰ１又はＺ−ＤＴＰ２が，ヒト血清と３７℃で４８時間インキュベーションした後，活性の損失が生じていないことを示している。実際にこのデータは，このプレインキュベート後，ＥＬＩＳＡ競合アッセイにおいて，Ｚ−ＬＴＰＳでは見られないが，Ｚ−ＤＴＰｓではＧａｄｄ４５β−ＭＫＫ７の相互作用を妨害する能力を十分に保持していることを示している。血清とプレインキュベーションした後と，血清とプレインキュベーションしなかった後とのテトラペプチドのＩＣ５０ｓを比較することによって，Ｚ−ＤＴＰ１とＺ−ＤＴＰ２が，血清とプレインキュベーションした後で完全に安定しているのに対し（Ｚ−ＤＴＰ１ではＩＣ５０＝０．１９ｎＭ，Ｚ−ＤＴＰ２ではＩＣ５０＝０．１８ｎＭ），Ｚ−ＬＴＰ１とＺ−ＬＴＰ２では，テトラペプチドが血清とのプレインキュベーションの後に活性の有意な損失を示すように，安定していない（ＩＣ５０ｓ＞１０μΜ参照）ことを見ることができる。これらのアッセイにおいて，テストしたすべての濃度で，血清とプレインキュベートしたＤ−テトラペプチドの阻害活性は，このプレインキュベーションを行わなかったＤ−テトラペプチドのものと区別がつかなかった。
【０２０５】
図３Ｃ及び４に示される用量依存性のパターンの比較は，Ｚ−ＤＴＰ１とＺ−ＤＴＰ２が３７℃のヒト血清中で安定しており，全身の使用に適しているのに対しＺ−ＬＴＰ１とＺ−ＬＴＰ２では安定していないことを示している。また，ネガティブコントロールのテトラペプチド（例えば，Ｚ−ＤＮＣ及びＺ−ＬＮＣ）は，ヒト血清でプレインキュベートされたかどうかにかかわらず，前述の競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいていずれの活性も欠いていることを見ることができる（図３Ｃ及び４）。また図３Ｃ及び図４に示すデータは，ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基（アセチル基の代わりに）のＮ末端付加が，ＤＴＰ１及びＤＴＰ２又はＬＴＰ１及びＬＴＰ２のいずれかのＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体の形成を阻害する能力を損なわないことを示し，さらにＺ基の付加が，ＤＴＰｓの細胞取り込みを著しく増加させ（データは示されていない），したがって腫瘍殺傷アッセイにおけるＤＴＰｓの細胞活性を著しく増加させている（図７ａ及び図７ｂを参照）。
【実施例６】
【０２０６】
多発性骨髄腫細胞株パネルにおけるＺ−ＤＴＰｓのＩＣ５０ｓの測定
材料と方法
多発性骨髄腫細胞株の生存率／増殖率に対するＤ−テトラペプチド処理の効果をさらに調べるために，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に感受性を有する８つの多発性骨髄腫細胞株（テストした９つの多発性骨髄腫細胞株の内）からの細胞を（すなわちＵ２６６，ＫＭＳ−１１，ＮＣ１−Ｈ９２９，ＡＲＨ−７７，ＪＪＮ−３，ＫＭＳ−１２，ＫＭＳ−１８，ＫＭＳ−２７細胞；図８，図８Ｂ，図８Ｃ，及び図１２参照），表４で示すようにＺ−ＤＴＰ１又はＺ−ＤＴＰ２の濃度を増加させながら（０．０１から１０μＭ），２４，７２，１４４時間処理した。実施例８に記載のように（下記参照），多発性骨髄腫細胞の培養及びＺ−ＤＴＰｓによる処理を行った。多発性骨髄腫細胞の生存率／増殖率に対するＺ−ＤＴＰｓの効果を，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて，実施例８に記載のように行い，評価した。使用したＺ−ＤＴＰｓのそれぞれの濃度及び未処理培養物（すなわち，単独培地でインキュベートした培養物）で測定した細胞増職の量を，カウント毎分（ｃ．ｐ．ｍ．）として表した。これは細胞増殖の程度と直接的に相関する。すべての実験は３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行った。その後，未処理培養物で記録した細胞増殖に対する細胞増殖の５０％阻害（すなわち，ＩＣ５０）をもたらすＺ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２と同様に，それらの誘導体（例えばｍＤＴＰ３）の平均濃度も測定した。表４には，テストした８つの感受性多発性骨髄腫細胞株において，示される期間（すなわち１日目，３日目及び６日目）で算出したＺ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２のＩＣ５０ｓが示されている。表５には，ＫＭＳ−１及び／又はＫＭＳ−１２多発性骨髄腫細胞において，１日目，３日目及び６日目で算出したこれら２つの化合物のＩＣ５０ｓと同様に，３１個の付加化合物（例えばｍＤＴＰ３などのＺ−ＤＴＰ２誘導体のものを含む）のＩＣ５０ｓが示されている。
【０２０７】
表４を見て分かるように，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２は，テストしたすべての多発性骨髄腫細胞株における［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みを，用量依存的様式で著しく減少させた（Ｇａｄｄ４５βの非常に低いレベルを示したＲＰＭＩ−８２２６細胞株を除く；以下でさらに説明する；図８Ａ，図８Ｂ，図８Ｃ，及び図１２参照）。Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２のＩＣ５０ｓを，トリパンブルー排除アッセイ（細胞の生存率を測定する）を用いて計算した場合にも，これらの多発性骨髄腫細胞株で同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【０２０８】
結果
表４に示すように，テストしたすべての多発性骨髄腫細胞株は，細胞の生存率／増殖率の阻害をもたらすＺ−ＤＴＰに対する高い感受性を示した（図８Ａ，図８Ｂ，図８Ｃ，及び図１２参照）。しかし，さらに表４に見られるように，これらの細胞株は，Ｚ−ＤＴＰ１とＺ−ＤＴＰ２に対して可変的な感受性を示している。実際に，いくつかの細胞株は，これらの化合物で２４時間処理した後，細胞の生存率／増殖率の阻害をもたらすＺ−ＤＴＰに対してすでに高い感受性を示しており（例えば，Ｚ−ＤＴＰ２の２４時間処理でＫＭＳ−１２細胞はＩＣ５０＝１．３μΜ，及びＫＭＳ−１１細胞はＩＣ５０＝２．８８μΜ），１４４時間処理後では，それらのすべては，Ｚ−ＤＴＰ１については１０．１ｎＭから４．９μΜ，Ｚ−ＤＴＰ２については１０ｎＭから４．５μΜにわたるＩＣ５０ｓで，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２の両方に対して高い感受性を有していた（表４）。注目すべきは，ＫＭＳ−１１及びＫＭＳ−１２細胞株でテストしたＺ−ＤＴＰ２誘導体のｍＤＴＰ３（化合物１７）は，６日目において，Ｚ−ＤＴＰ１のＩＣ５０ｓ（すなわち，それぞれ３１６ｎＭ及び１０．１ｎＭ）及びＺ−ＤＴＰ２のＩＣ５０ｓ（すなわち，それぞれ６６ｎＭ及び１０ｎＭ）と比較して，それぞれ１６ｎＭ及び２５ｎＭのＩＣ５０ｓを有することから（表５参照），Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２と比較してこれらの細胞株での細胞活性を向上させることが示された（図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃ参照）。したがって，ネガティブコントロールのＺ−ＤＮＣｓでは見られないが，活性化ＤＴＰｓは，ほとんどの多発性骨髄腫細胞株で強い細胞傷害活性を有している。さらに，最新の誘導体（例えばｍＤＴＰ３）はインビトロで高い効力を保持するが，実質的にＭＷを減少させ（＞７００に対して〜５００），したがってリガンド効率を増加させていることから（図１３参照），多発性骨髄腫細胞内においても向上した細胞活性を示している（表５参照）。
【実施例７】
【０２０９】
テトラペプチドによるＧａｄｄ４５βの阻害によるＭＫＫ７触媒活性の修復
材料と方法
図６では，ＨＥＫ−２９３細胞におけるｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７の一過性トランスフェクションを，本質的に“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３”及びその中の参考文献に記載された，リン酸カルシウム沈殿法（ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｃａ３（ＰＯ４）２  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により行った。トランスフェクションから３６時間後，細胞を３７℃で３０分間，１００ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及び１μΜのイオノマイシンで処理した。実施例４に記載されているように細胞抽出液を調製し，“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３”及びその中の参考文献に記載されているように抗ＦＬＡＧ抗体（ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７に結合している）と共に免疫沈降に使用した。簡単に言うと，一時的にＦＬＡＧ−ＭＫＫ７を発現しているＨＥＫ−２９３細胞をＰＭＡ−イオノマイシン（Ｐ／Ｉ）処理又は未処理し，得られた５０μｇの細胞溶解液を１０μｌのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＧＥＬ（ＳＩＧＭＡ社）と共に，４℃で４時間，回転下でインキュベートした。その後免疫沈降物を溶解緩衝液中で３回洗浄し，かつキナーゼ緩衝液中（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，５ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍＭのＭｎＣｌ２，１２．５ｍＭのβ−グリセロホスフェート，２ｍＭのＤＴＴ，４ｍＭのＮａＦ及び０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４）で２回以上洗浄した。最終的に“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３”及びその中の参考文献に記載されているように，２μΜの組換えＧＳＴ−ＪＮＫ１及び５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（キナーゼ反応）を含む２０μｌのキナーゼ緩衝液と共に３０℃で２０分間インキュベートすることにより，ＭＫＫ７触媒活性をキナーゼアッセイで測定した。
【０２１０】
いくつかの反応では，Ｇａｄｄ４５β−ＭＫＫ７の相互作用を阻害するＤ−テトラペプチドアンタゴニストの能力，つまりＧａｄｄ４５βが有する阻害性からＭＫＫ７の触媒活性を分離する能力をテストするために，ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７免疫沈降物を，１）始めに，１ｎＭもしくは５ｎＭのＤＴＰ１，ＤＴＰ２又はネガティブコントロール（ＮＣ）のＤ−テトラペプチドであるＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３及びＮＣ４のいずれかと共に３０℃で１０分間プレインキュベートし，２）その後，図６で示されているように，それらを上記キナーゼ反応に使用する前に，５μＭの組換えヒト（ｈ）Ｇａｄｄ４５βのＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ｈＧａｄｄ４５β；Ｐａｐａ，  Ｓ．，  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２，  １９０２９−１９０４１に記載のように溶菌液から精製される）を加える場合と加えない場合とで，３０℃でさらに１０分間インキュベートした。
【０２１１】
すべての場合において，キナーゼ反応は，Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加えることにより停止させた。その後タンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し，ＭＫＫ７キナーゼ活性をオートラジオグラフィーによって明らかにした。ＭＫＫ７キナーゼアッセイ条件の詳細な説明については，“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｔ  ．，  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２，  １９０２９−１９０４１”，及び“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３”，及びその中の参考文献を参照されたい。
【０２１２】
結果
結果は図６に示されており，バンドの明暗度は，測定されたＭＫＫキナーゼ活性の程度に相当し，この明暗度はＭＫＫ７によって，基質であるＧＳＴ−ＪＮＫ１に取り込まれた［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの量に比例している。図３Ｃ，図４及び図５から分かるように，ＤＴＰ１又はＤＴＰ２とのインキュベーションは，Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７の相互作用を効果的かつ特異的に阻害し，結果として図６から分かるように，ＭＫＫ７の触媒活性を十分に回復させるのに対して，ネガティブコントロール（ＮＣ）のテトラペプチドであるＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３又はＮＣ４ではそれらは見られなかった（図６，上部パネル）。また図６から分かるように，組換えＧＳＴ−ｈＧａｄｄ４５βの非存在下でＭＫＫ７とインキュベートした時，コントロールテトラペプチドのＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３，及びＮＣ４，又は活性テトラペプチドのＤＴＰ１及びＤＴＰ２はいずれも，ＭＫＫ７触媒活性を阻害しなかった（図６，下部パネル）。これらの結果は，図３Ｃ，図４，図５，で示されているものと一致しており，ＥＬＩＳＡ又は共免疫沈降アッセイのいずれかにおいて，ＮＣ１，ＮＣ２，ＮＣ３又はＮＣ４では見られず，ＤＴＰ１及びＤＴＰ２でのみＭＫＫ７−Ｇａｄｄ４５βの相互作用を阻害することができた。
【実施例８】
【０２１３】
テトラペプチドによる，恒常的ＮＦ−κΒ活性及び／又はＧａｄｄ４５βの高レベル発現を特徴とする腫瘍細胞株の特異的死滅
材料と方法
この実施例では，ヒト及びマウスの腫瘍細胞株の様々な原発組織の大パネルの死滅に関する，コントロールのテトラペプチド（つまりＺ−ＤＮＣ，Ｚ−ＬＮＣ，及びＡＣ−ＤＮＣ）の使用と，インビトロで生理活性のリードテトラペプチド（つまり，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＬＴＰ２及びＡＣ−ＤＴＰ２）の使用を調査した。テストした腫瘍細胞株は，多発性骨髄腫細胞株のＵ２６６，ＫＭＳ−１，ＮＣＩ−Ｈ９２９，ＡＲＨ−７７，ＪＪＮ−３，ＫＭＳ−１２，ＫＭＳ−１８，ＫＭＳ−２７，及びＲＰＭＩ−８２２６；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株のＬＹ−３及びＳＵＤＨＬ６；バーキットリンパ腫細胞株のＢＪＡＢ，ＳＴ４８６，ＲＡＪＩ，ＲＡＭＯＳ，Ｎａｍａｌｗａ，及びＨＳ−ＳＵＬＴＡＮ；前単球性白血病細胞株のＵ９３７；Ｔ細胞白血病及びリンパ腫細胞株のＪＵＲＫＡＴ，ＨＵＴ−７８，ＭＴ−２，ＭＴ−４，ＭＯＬＴ４，ＭＴ２−ＨＴＬＶ−Ｉ，及びＣＥＭ；乳癌細胞株のＭＣＦ７，ＭＤ−ＭＤＡ−２３１，及びＭＤ−ＭＤＡ−４８６；プレＢ細胞リンパ腫細胞株のＮＡＬＭ−６（ヒト）及び７０Ｚ／３（マウス）；慢性骨髄性白血病細胞株のＫ６５２；Ｂ細胞リンパ腫細胞株のＫＡＲＰＡＳ（ヒト）及びＡ２０（マウス）；ヒト胎児由来腎臓細胞株のＨＥＫ−２９３Ｔを含む。腫瘍細胞株を前述のように，１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ），１％のグルタミン，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，そして１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた，ＲＰＭＩ−１６４０培地（多発性骨髄腫，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫，バーキットリンパ腫，前単球性白血病，Ｔ細胞白血病及びリンパ腫，プレＢ細胞リンパ腫，慢性骨髄性白血病，並びにＢ細胞リンパ腫の細胞株），又はＤＭＥＭ培地（乳癌及び胚腎臓細胞株）において，３７℃，ＣＯ２５％の加湿雰囲気下で，培養した（Ｚａｚｚｅｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３，  Ｂｌｏｏｄ  １０２：  ３２７０−３２７９参照）。
【０２１４】
増殖阻害アッセイ（図７，図８，及び図９）及び細胞死アッセイ（図１０）については，細胞を１．０×１０４細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートのウェルに播種するか（増殖アッセイ），又は細胞を４×１０５細胞／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートのウェルに播種し（アポトーシスアッセイ），最大６日間培養した。この間に細胞は，培地のみ（未処理培養液），又は図示されるように培養液中の最終的なテトラペプチドの濃度である１０μＭ又は１００μＭを達成させるように，コントロールテトラペプチド（例えばＺ−ＤＮＣ）もしくは活性テトラペプチド（例えばＺ−ＤＴＰ２）のいずれかを加えた培地（処理済培養液）で培養した。腫瘍細胞の生存率／増殖率に対するテトラペプチドの効果を評価することを目的とした増殖阻害アッセイにおいて，培養液を，トリパンブルー色素排除法（生細胞と死細胞とを区別する），及び細胞数計測（データは示されていない），又は図示されている［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイ（図７Ａ，図７Ｂ，図７Ｃ，図８Ａ，図８Ｂ，図８Ｃ及び図９）のいずれかにより，毎日分析した。これらの後者のアッセイでは，腫瘍細胞株の生存率／増殖率に対するＺ−ＤＴＰｓ，Ａｃ−ＤＴＰｓ及びＺ−ＬＴＰｓの効果を，標準的なトリチウム化チミジン（［３Ｈ］チミジン；［３Ｈ］−ＴｄＲ）取り込みアッセイを用いてＤＮＡ合成を測定することにより調査した。この分析において，コントロール又は生理活性テトラペプチドの存在下又は非存在下において，３７℃で２４時間，７２時間，１２０時間，又は１４４時間インキュベートし，次に［３Ｈ］−ＴｄＲで１８時間，さらなるインキュベートを行った（０．０３７ＭＢｑ／ウェル，０．５μＣｉ／ウェルに相当）。その後，シンチレーション液を加え，ベータカウンターの液体シンチレーション分光法により［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した後，セルハーベスターを自動化した９６ウェルプレートを用いて，ガラス繊維フィルターマット上で細胞を収集した。結果は，培地のみ（未処理細胞）でインキュベートした対照培養液で測定したカウント毎分（ｃ．ｐ．ｍ．）に対するテトラペプチドで処理した培養液で測定したｃ．ｐ．ｍ．（直接的に細胞増殖の程度と相関する）の割合として表わされている。すべての実験は３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行った。さらに後述するように，これらの生存率／増殖率アッセイにおいて，Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＬＴＰ２及びＡｃ−ＤＴＰ２は，それぞれ，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＬＴＰ１及びＡｃ−ＤＴＰ１と同様の結果が得られたが，Ｚ−ＤＴＰ２はＺ−ＤＴＰ１より若干高い活性を示した（データは示されていない；表４参照）。
【０２１５】
ｓｕｂ−Ｇ１のＤＮＡ量を有する細胞（すなわち，アポトーシス細胞）を同定するために，培養液中での細胞のアポトーシスを，本質的に（Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，−１４５８−１４６１参照）に記載のように，ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）核染色，及びフローサイトメトリー（ＦＣ）を行うことにより，示される時間で測定した（図１０）。これらのアッセイにおいて，図１０に示すように，細胞（４×ｌ０５細胞／ｍｌ）を２４ウェルプレートで７２時間又は１４４時間培養し，１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し，７０％氷冷エタノールで，−２０℃で１６時間固定した後，それらを遠心分離し，次いで１００μｇ．ｍＬのＲＮＡアーゼＡを含有する１×ＰＢＳで再懸濁させた。このステップの後，細胞を室温で３０分間インキュベートし，遠心分離にかけ，次に５０μｇ／ｍＬのＰＩで再懸濁し，さらに４℃で４５分，暗所でインキュベートした。フローサイトメトリー（ＦＣ）は，最終的にＦＡＣｓキャリバー自動化システムを用いて行われ，ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０２１６】
Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅への腫瘍細胞株の様々な感受性の根拠を特定するために，我々は定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＴ）を用いて，２９個の腫瘍細胞又は様々な原発組織のパネルでＧａｄｄ４５の発現レベルを測定し，これらの発現レベルと，Ｚ−ＤＴＰｓの細胞傷害活性に対するこれらの細胞株の感受性の程度との相関を求めた。図１２に示されているこれらの分析において，乳癌細胞株及びＨＥ−２９３Ｔ細胞株は，完全ＤＭＥＭ培地の５ｃｍ２フラスコ（５×ｌ０６細胞／フラスコ）で培養したのに対して，他のすべての細胞株は，上記のように完全ＲＰＭＩ−１６４０培地の６ウェルプレート（５×ｌ０５細胞／ウェルプレート）で培養した。全ＲＮＡをトリゾールで抽出し，ＰｕｒｅＬｉｋｅ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて精製した。１μｇのＲＮＡを鋳型として加え，ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社），表７に記載されているＧａｄｄ４５β特異的プライマー，及びＡＢＩ  ７９００リアルタイムＰＣＲ機を用いて，産生されたｃＤＮＡでｑＲＴ−ＰＣＲを３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行った。実験のＣｔ値をβ−アクチンに正規化し，標準試料（すなわちＨＥＫ−２９３Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ）に対して相対的なｍＲＮＡ発現を計算した。細胞を１０μΜのＺ−ＤＴＰ２で１４４時間処理した後に［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを行うことにより，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅への癌細胞株の感受性を上記のように分析した。また図１２は，Ｚ−ＤＴＰ２による処理後の細胞生存の割合に対するＧａｄｄ４５βのｍＲＮＡ発現（ｍＲＮＡ  Ｇａｄｄ４５β  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の相関プロットを示している。２つのパラメータ領域間の相関係数の有意性は，ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して，２つの変数間の関連性を定量化するピアソン相関により算出した。
【０２１７】
癌細胞株のＺ−ＤＴＰ誘導死滅が傷害ＪＮＫシグナル伝達の誘導によるものであったかどうかを判断するために，２つの代表的な感受性多発性骨髄腫細胞株（すなわちＫＭＳ１１及びＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株）をＺ−ＤＴＰ２で処理した後，ＪＮＫの活性化をモニタリングした。（図１１）この目的のために，ＪＮＫ活性化の指標となるＪＮＫのリン酸化の評価にウェスタンブロット法を使用した。ＫＭＳ１１とＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞株を，上記のように完全ＲＰＭＩ−１６４０培地において５×１０５細胞／ウェルの６ウェルプレートで培養し，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２又はネガティブコントロールテトラペプチドのＺ−ＤＮＣで，３時間，６時間，１２時間又は２４時間処理した（図１１）。テトラペプチド処理後，細胞溶解液を本質的に実施例４で説明したように調製し，抗リン（Ｐ）ＪＮＫ特異的抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロット法に使用する手法は，“Ｄｅ  Ｓｍａｅｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３０６−３１３”；“Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３”；“ＰａｐＡ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８２：１９０２９−１９０４１”；及び“Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：  １９１−１９２３”の文献に記載されている。β−アクチンのレベルは，β−アクチン特異的抗体を用いて測定し，ローディングコントロールとしての役割を果たした（図１１）。ＫＭＳ１１とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のＴＮＦα刺激（２，０００Ｕ／ｍｌ）を５分間，１０分間又は３０分間行い，ＪＮＫ活性化のポジティブコントロールとして使用した（図１１）。これらの分析は，ＪＮＫの活性化がＺ−ＤＴＰ２による処理の場合にのみ引き起こされ，Ｚ−ＤＮＣによる処理では起きなかったことを明らかにした。Ｚ−ＤＴＰ２と同様の効果はＭＫＫ７活性上にも見られた（データは図示していない）。重要なことに，Ｇａｄｄ４５βの生物学的活性で見られるように（Ｄｅ  Ｓｍａｅｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３０６−３１３；  Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３；  Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８２：  １９０２９−１９０４１；  Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １  １８：  １９１−１９２３参照），多発性骨髄腫におけるＺ−ＤＴＰ２の効果はＭＫＫ７／ＪＮＫ経路に特異的であったが，この化合物はＩＫＫ／ＮＦ−κΒ，ＥＲＫ及びｐ３８経路の活性化には影響を示さなかった（データは示していない）。
【０２１８】
結果
図７Ａ，図７Ｂ及び図７Ｃは，アセチル誘導体（Ａｃ−ＤＴＰ２）又はＬ−異性体（Ｚ−ＬＴＰ２），さらにネガティブコントロールテトラペプチドのＺ−ＤＮＣ，Ａｃ−ＤＮＣ及びＺ−ＬＮＣでは見られないが，ＤＴＰ２のＺ保護誘導体（Ｚ−ＤＴＰ２）では，テストした８つの感受性多発性骨髄腫細胞株の内，３つの代表的な多発性骨髄腫細胞株（すなわち，Ｕ２６６，ＫＭＳ−１，及びＮＣＩ−Ｈ９２９），バーキットリンパ腫細胞株，ＢＪＡＢ，及び前骨髄球白血病細胞株，Ｕ９３７の増殖を著しく阻害することを示している（図８及び図１２，表４；別の多発性骨髄腫細胞株参照）。示されているように，細胞を１０μΜのＺ−ＤＴＰ２又はＺ−ＤＮＣ（図７Ａ），Ａｃ−ＤＴＰ２又はＡｃ−ＤＮＣ（図７Ｂ），及びＺ−ＬＴＰ２又はＺ−ＬＮＣ（図７Ｃ）のいずれかで培養した。処理した細胞の［３Ｈ］−ｔＴｄＲの取り込み（ＤＮＡ合成を測定する）を測定し，培地のみで培養した細胞のそれと比較した。データは，培地のみで処理した細胞株（未処理細胞）で測定されたｃ．ｐ．ｍ．（黒カラム）に対する，Ｚ−ＤＴＰ２，Ａｃ−ＤＴＰ２もしくはＺ−ＬＴＰ２，又はＺ−ＤＮＣ，Ａｃ−ＤＮＣもしくはＺ−ＬＮＣで処理した後に腫瘍細胞で観察された細胞で観察されたｃ．ｐ．ｍ．（白カラム）の割合として表されている。細胞増殖の顕著な阻害は，Ｚ−ＤＴＰ２で処理した多発性骨髄腫や他の腫瘍細胞株で観察されたが，Ｚ−ＤＮＣで処理したものでは観察されなかった。図７Ｂにおいて，多発性骨髄腫細胞株におけるＡｃ−ＤＴＰ２の殺腫瘍活性の欠如は，ＣａＣＯ２アッセイ（データは示されていない）で証明されているように，この化合物の低い細胞透過性と相関関係を有している。メチル（Ｍｅ）基，アセチル（Ａｃ）基，ミリスチル（Ｍｙｒ）基，３−メトキシ基，４−ヒドロキシベンゾイル基，ベンゾイル基，６Ｃ１−ベンジルオキシカルボニル（６Ｃ１−Ｚ）基，及び／又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を有するものを含む，他の効果の弱いＤＴＰ誘導体（ＤＴＰの細胞取り込みを高めるように設計されている）により処理した後の多発性骨髄腫細胞株の生存率は示されていない。Ｚ−ＬＴＰＳのインビトロでの効力と細胞取り込みは，Ｚ−ＤＴＰｓのものと同等であったが（図３Ｃ参照，データは示されていない），Ｚ−ＬＴＰ２は生体液中での低安定性（図４参照）により，多発性骨髄腫細胞内では低活性を示した（図７Ｃ）。細胞増殖の同様の阻害は，Ｚ−ＤＴＰ１で処理した腫瘍細胞株では観察されたが，Ａｃ−ＤＴＰ１又はＺ−ＬＴＰ１で処理したものでは観察されなかった（データは示されていない）にもかかわらず，後者の２つの化合物は，（ＤＴＰ２誘導体でも見られるように）インビトロにおいてＺ−ＤＴＰと同程度の効力を示している（図３Ｃ及び図４参照）。これらのデータを合わせると，Ａｃ−ＤＴＰｓの不活性（図７Ｂ，データは示されていない），及びＺ−ＬＴＰｓの低活性（図７Ｃ，データは示されていない）と比較して，Ｚ−ＤＴＰｓの細胞傷害活性が高いことを証明している（図７Ａ，データは示されていない）。
【０２１９】
図８Ａ，図８Ｂ及び図８Ｃでは，多発性骨髄腫細胞株（すなわち，Ｕ２６６，ＫＭＳ−１１，ＪＪＮ−３，ＮＣＩ−Ｈ９２９，ＡＲＨ−７７，ＫＭＳ−２７，ＫＭＳ−１８，ＫＭＳ−１２，及びＲＰＭＩ−８２２６）の大パネルの増殖に対するＤ型テトラペプチド処理の効果を調べた。テストした他の腫瘍細胞株は，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株のＬＹ−３，ＳＵＤＨＬ６と，バーキットリンパ腫細胞株のＢＪＡＢ，ＳＴ４８６，ＲＡＪＩと，前単球性白血病細胞株Ｕ９３７である。示されるように，細胞を，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１又はＺ−ＤＮＣのいずれかで，図示された時間（すなわち２４，７２，又は１４４時間）処理した。処理した細胞の［３Ｈ］チミジン取り込みを図７に示すように測定し，培地のみで培養した細胞のそれと比較した。データは，未処理細胞で測定されたｃ．ｐ．ｍ．に対する，Ｚ−ＤＴＰ２もしくはＺ−ＤＴＰ１（黒カラム）又はＺ−ＤＮＣ（白カラム）で処理した腫瘍細胞で観察されたｃ．ｐ．ｍ．の割合として表されている。図８Ａは，Ｚ−ＤＮＣでは見られないが，Ｚ−ＤＴＰ２では，テストした９つの内の８つの多発性骨髄腫細胞株（すなわちＵ２６６，ＫＭＳ−１１，ＪＪＮ−３，及びＮＣＩ−Ｈ９２９，ＡＲＨ−７７，ＫＭＳ−２７，ＫＭＳ−１８，ＫＭＳ−１２），バーキットリンパ腫細胞株ＢＪＡＢ，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株（ＤＬＢＣＬ），ＬＹ−３，及び前骨髄球球性白血病細胞株Ｕ９３７の生存率／増殖率を顕著に阻害することを示している（図１２参照）。特にＺ−ＤＴＰ２は，ＤＬＢＣＬ細胞株において，生存に関してＮＦ−κＢに依存する活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）サブタイプ（すなわちＬＹ３）にのみ細胞傷害活性を示し，恒常的ＮＦ−κΒ活性の特性を有さない胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）サブタイプ（すなわちＳＵＤＨＬ６）では示されなかった（Ｎｇｏ  ＶＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０８９）：  １０６−  １０；図１２参照）。またＺ−ＤＴＰｓは，すべてが生存に関してＮＦ−κΒに依存するテストした複数の細胞株の大半で，強力な細胞傷害活性を示した。図８Ｂ及び図８Ｃに示すように，腫瘍細胞の増殖に対するＺ−ＤＰＴ１とＺ−ＤＴＰ２の阻害効果は，経時的に増加した。つまり，これらの効果は２４時間の処理後にはすでに明らかであったが，増殖の最大の阻害は，テトラペプチドを１４４時間処理した後に観察された。これらのデータは，ＤＮＡ量に関するトリパンブルー排除アッセイ（データは示されていない），及びＰＩ核染色アッセイ（図１０参照，データは示されていない）における細胞数測定により得られたものと一致する。これらのデータ及びその他のデータを合わせると，Ｚ−ＤＴＰｓの細胞傷害活性が恒常的ＮＦ−κΒ活性を示す腫瘍細胞に対して選択的であることを示している（図１２参照；データは示されていない）。
【０２２０】
Ｚ−ＤＴＰｓの細胞傷害活性の特異性は，図９に示される［３Ｈ］チミジン増殖アッセイによってさらに確証された。この図は，この化合物が非常に高い濃度，つまり１００μＭで使用している場合でも，１４４時間処理後の２２個の耐性腫瘍細胞株パネルにおいてＺ−ＤＴＰ２誘導細胞傷害が欠如していることを示している。図９に示す［３Ｈ］チミジン増殖アッセイは，図８で説明したように行った。
【０２２１】
図９に見られるように，Ｚ−ＤＴＰ２は，Ｔ細胞白血病細胞株及びリンパ腫細胞株であるＪＵＲＫＡＴ，ＨＵＴ−７８，ＭＴ−２，ＭＴ−４，ＭＯＬＴ４，ＭＴ２−ＨＴＬＶ−Ｉ，及びＣＥＭと，バーキットリンパ腫細胞株であるＢＪＡＢ，ＳＴ４８６，ＲＡＪＩ，ＲＡＭＯＳ，Ｎａｍａｌｗａ，及びＨＳ−ＳＵＬＴＡＮと，乳癌細胞株であるＭＣＦ７，ＭＤ−ＭＤＡ−２３１，及びＭＤ−ＭＤＡ−４８６と，プレＢ細胞リンパ腫細胞株であるＮＡＬＭ−６及び７０Ｚ／３と，Ｂ細胞リンパ腫細胞株のＫＡＲＰＡＳ及びＡ２０と，慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ６５２，ヒト胚腎臓細胞株であるＨＥＫ−２９３Ｔと，多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ−８２２６では細胞傷害性を示さなかった。（図１２参照）。また図９に示すように，細胞株ＢＪＡＢ（バーキットリンパ腫），ＫＭＳ−１１，及びＫＭＳ−１２（多発性骨髄腫）では感受性がある。特に，これらの細胞株において，Ｚ−ＤＴＰ２誘導死滅に対する感受性と内因性Ｇａｄｄ４５β発現レベルとの間に強い相関関係があった（図１２参照）。注目すべきは，テストした多発性骨髄腫細胞株で唯一，Ｚ−／ｍＤＴＰ−誘導死滅に耐性があるＲＰＭＩ−８２２６細胞株（図８Ａ及び図９参照）は，非常に低レベルのＧａｄｄ４５βを示し（図１２参照），癌に対するＤＴＰｓの細胞傷害活性が，恒常的Ｇａｄｄ４５β発現レベルに依存していることをさらに裏付けている。
【０２２２】
図１０の埋没パネル（ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｐａｎｅｌ）は，培地のみ，又はＺ−ＤＴＰ２もしくはＺ−ＮＣ１の終末濃度１０μＭを注入する培地のいずれかで，示される時間（すなわち７２又は１４４時間）処理した後のｓｕｂ−Ｇ１のＤＮＡ量（すなわち，アポトーシスにより死んでいるか死にかけている量）を示すヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を表わす細胞の割合を示しているアポトーシス細胞の割合は，ヒストグラムで示されている。５つの代表的な感受性多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９，ＫＭＳ−１１，ＡＲＨ−７７，ＪＪＮ−３，Ｕ２６６が示されている。見られるように，多発性骨髄腫細胞のＺ−ＤＴＰ２誘導死滅は，アポトーシスを引き起こすことによるものであり，細胞をこの化合物に暴露した後に見られるアポトーシス細胞の量は，処理時間と共に増加している。
【０２２３】
図１１は，Ｚ−ＤＴＰ２処理が多発性骨髄腫細胞株においてＪＮＫの強力な活性化を引き起こすことを示している。２つの代表的な感受性多発性骨髄腫細胞株のＫＭＳ１１及びＮＣＩ−Ｈ９２９を，図に示すように，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２又はＺ−ＤＮＣで処理した。ＪＮＫの活性化を，抗リン（Ｐ）ＪＮＫ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって，示される時間で観察した。Ｚ保護したネガティブコントロールペプチド（Ｚ−ＤＮＣ）で処理した後では見られないが，Ｚ−ＤＴＰ２で処理した後では，ＪＮＫのリン酸化（ＪＮＫ活性化の指標）が増加することが分かる。実際，ポジティブコントロールであるＺ−ＤＴＰ２は，ＴＮＦα刺激（２，０００Ｕ／ｍｌ）よりもさらに強力なＪＮＫ活性を引き起こした。Ｚ−ＤＴＰ２の同様の効果はＭＫＫ７活性化にも見られ，キナーゼアッセイを使用してＪＮＫ及びＭＫＫ７の活性化をモニタリングした（データは示されていない）。特に，Ｇａｄｄ４５βの生物学的活性に見られるように（参考文献参照：Ｄｅ  Ｓｍａｅｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３０６−３１３；  Ｐａｐａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６，  １４６−１５３；  Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８２：  １９０２９−１９０４１；  Ｐａｐａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：１９１−１９２３），多発性骨髄腫細胞におけるＺ−ＤＴＰ２の効果と同様にＺ−ＤＴＰ１とｍＤＴＰ３の効果（データは示されていない）は，ＭＫＫ７／ＪＮＫ経路に特異的であったが，ＩＫＫ／ＮＦ−κＢ，ＥＲＫ及びｐ３８経路ではこの効果は観察されなかった（データは示されていない）。重要なのことに，Ｚ−ＤＴＰｓによる処理は，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に耐性を有する多発性骨髄腫細胞株のＲＰＭＩ−８２２６においては，ＪＮＫを活性化しなかった（図８Ａ及び図９参照）。これらのデータ及び他のデータ（図２０参照）は，Ｚ−ＤＴＰｓが，ＪＮＫ細胞傷害性シグナル伝達を活性化することによって腫瘍細胞株におけるアポトーシスを誘導するという見解を支持している。
【０２２４】
重要なことに，図１２Ａ及び図１２Ｂで表わされるデータは，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に対する癌細胞株の感受性が内因性Ｇａｄｄ４５β発現レベル（ｐ＜０．０１）と非常に高い統計的有意性で相関関係を有していることを示している。Ｇａｄｄ４５βのｍＲＮＡ発現を，ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して，２９個の癌細胞株のパネルで評価した（図１２Ａ，上部パネル，赤カラム）。値は，β−アクチンに正規化している。同じ癌細胞株における生存率／増殖率を，１０μΜのＺ−ＤＴＰ２で１４４時間処理した後，［３Ｈ］チミジン取り込みを行うことによって測定した。これらの結果は，図１２の下部パネルに表示されている（黒カラム）。ここで報告された値は，未処理細胞で測定したｃ．ｐ．ｍ．に対するＺ−ＤＴＰ２で処理した細胞を測定したｃ．ｐ．ｍ．の割合を表している。図１２Ｂは，図１２Ａに示されるのと同じ実験のＺ−ＤＴＰ２による処理後に観察された細胞の生存率／増殖率の割合に対するＧａｄｄ４５β発言の相関プロットを示している。見られるように，２つのパラメータドメイン間の相関係数の有意性は，非常に高い（ｐ＜０．０１）（ピアソン相関，これはグラフパッドソフトウェアにより計算した２つの変数間の関連性を定量化している）。これは人間に有効な治療の開発にとって重要な事項である。これらのデータは，細胞中でのＧａｄｄ４５βに対するＺ−ＤＴＰｓの高い標的特異性を示している。この結論をさらに支持するように，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのサイレンシングは，多発性骨髄腫細胞でアポトーシスを誘導するのに対して，ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７ＭＫＫ７のサイレンシングは，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に完全に耐性を有する細胞を提供する（図１６，図１７，図１８，及び図２０参照）。また，これらのデータを合わせると，ＤＴＰベースの治療を臨床で採用すれば，簡単で，費用対効果の高いｑＲＴ−ＰＣＲ解析を介して患者のレスポンダー集団を予測することが可能になることを示している。したがって，多発性骨髄腫患者由来の初代細胞のＧａｄｄ４５βの発現レベルを分析して，この発現レベルが高い患者は，本発明の化合物による治療から最も恩恵を受ける人とみなすことができる。したがって，本発明の重要な側面は，治療的側面である。それは臨床的に有用なアッセイを適用して，ＤＴＰｓの治療に応答する患者を予測する。
【実施例９】
【０２２５】
インビトロ及び細胞内におけるＺ−ＤＴＰｓ誘導体のパネルのＩＣ５０ｓ
出発点として現在の優位性を利用して，癌や他の疾患及び障害を治療するための安全かつ効果的な新しい治療法を提供するための，最新で広範なプランを考案した。Ｚ−ＤＴＰ２はすでに，高安定，高溶解性，インビトロでのｎＭ以下の活性，及び多発性骨髄腫細胞（原発性及び細胞株）やその他の癌細胞での良好な活性を示しており，それと共に標的特異性及び正常細胞での無毒性を有している。（図３Ｃ，図４，図８，図９，図１２，図１４及び図１５参照；表４参照。データは示されていない）。また，インビボにおいて（マウスにおける単回静脈内ボーラス投与），優れた初期（良好に開始する）のＤＭＰＫ及び安全性プロファイル（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ＤＭＰＫ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）を示している（表８及び表９参照）。高い生理活性を維持しながら向上したＡＤＭＥＴ特性を有するＤＴＰ誘導体を産生するために，合理的な分子設計を適用している（Ｇｅｅｓｏｎ  ＭＰ．  ２００８  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ５１  ：８１７−８３４）。このアプローチでは，インビトロでの生理活性に関与する構造要素を保持するように，モデルファーマコフォアを使用して（図１３参照），ＡＤＭＥＴ特性に影響を与える分子のバルク特性である，大きさ（ＭＷ），脂溶性（ＬｏｇＰ），及び電離状態（分子電荷）を変更した。この実施例で記載したように，最新の誘導体（例えばｍＤＴＰ３及びｍＤＴＰ４）はインビトロで高い効力を保持するが，実質的にＭＷを減少させ（＞７００に対して〜５００），したがってリガンド効率を増加させていることから（図１３参照），多発性骨髄腫細胞内においても向上した殺傷活性を示している（図１３）。また，環化，脆弱なアミド類を内部化する保護基の付加，及び／又は非アミド結合の置換を含む，ペプチドの細胞活性及びＰＫ値を向上させる付加的な手段も適用した。
【０２２６】
材料と方法
３３個の化合物をリードテトラペプチド配列，ライブラリースクリーニング由来のＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅに基づいて設計した（図３参照）。化合物２，３，４，５，６，７，１０，１，１２，１３，１４，１５，及び１６（表５参照）を除く，すべての化合物を，以下の古典的なＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学反応による固相法（Ｆｉｅｌｄｓ  ＧＢ，  Ｎｏｂｌｅ  ＲＬ．  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｉｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  １９９０；３５：１６１−２１４の文献において説明されている）により調製した。Ｄ配置のアミノ酸のみを表５に示されるペプチドを構築するのに使用した。Ｎ末端アセチル化を，５％のＤＩＥＡ（ジ−イソプロピル−エチルアミン）を含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中において，１０％の無水酢酸で処理することによって行った。必要に応じてＺ基を，５％のＤＩＥＡを含むＤＭＦ中において，０．５ＭのＺ−ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）による樹脂処理により導入した。化合物をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）及びスカベンジャー処理により樹脂から分割（ｃｌｅａｖｅｄ）し，その後，分取逆相（ＲＰ）−ＰＬＣにより均一に精製した。化合物２，３，４，５，６，７，１０，１１，１２，１３，１４，１５，及び１６（表５）の合成は委託した。化合物の同定及び純度は，ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分析を用いて評価した。Ｘ１は安息香酸であり，Ｘ２はベンジル酸であり，Ｙ１はアニリンであり，Ｙ２はベンジルアミンであり，Ｙ３はフェネチルアミンであった。化合物は，５ｍＭのストック濃度でＤＭＳＯに溶解し，その後アリコートを連続して緩衝液で希釈し，ＥＬＩＳＡ競合アッセイで必要な濃度を達成した。タンパク質を，“Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１”で報告されているように調製した。
【０２２７】
０．０１ｎＭから１０ｎＭの範囲で濃度を増加させたペプチドを用いて，“Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１”の文献で報告されているように，ＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを行った。簡単に述べると，ＧＳＴ−ＭＫＫ７を，９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル上に４２ｎＭで固定化した。競合化合物を，ビオチン化ｈＧａｄｄ４５β（２１ｎＭ）と共にプレインキュベートし，その後コーティングしたキナーゼと共にインキュベートした。それぞれの化合物について，インビトロでのＩＣ５０を，競合物の非存在下で観察したＭＫＫ７とＧａｄｄ４５βの結合率に対して，その結合率を５０％減少させることになる濃度として算出した。
【０２２８】
２つの代表的な感受性多発性骨髄腫細胞株のＫＭＳ１２及びＫＭＳ−１１において，ＤＴＰ誘導体の生存率／増殖率に対するそれぞれの化合物の効果を検討した。実施例６及び８で説明したように，多発性骨髄腫細胞株のＫＭＳ１２及びＫＭＳ−１１において［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを行った。（図７Ａ，図７Ｃ，図７Ｂ，図８Ａ，図８Ｂ，及び図８Ｃ，表４参照）簡単に述べると，９６ウェルプレート中の細胞を培養し，０．１ｎＭから１０μΜの範囲で化合物の濃度を増加させながら，９６ウェルプレートのウェルにおいて示される化合物で別々に処理した。また，図７Ａ，図７Ｂ，図７Ｃ，図８Ａ，図８Ｂ，及び図８Ｃ，表４で示されるように，細胞の培養と化合物による処理も行った。示されるように化合物で１日，３日，又は６日間処理した後に，細胞の生存率／増殖率を測定する［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した。これらの期間で，未処理細胞で観察された生存率／増殖率に対して細胞の生存率／増殖率を５０％阻害する濃度を測定することにより，それぞれの化合物のＩＣ５０ｓを実施例６に説明されているように算出した。
【０２２９】
この実施例で説明した３３個の化合物のインビトロ（ＥＬＩＳＡ）及び細胞内（ＫＭＳ−１１細胞及びＫＭＳ−１２細胞）でのＩＣ５０ｓは，表５に報告されている。
【０２３０】
結果
表５は，ライブラリースクリーニング及びリード最適化ケミストリー（ｌｅａｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）由来のコンセンサス配列であるＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅを基に設計したテトラペプチド及びトリペプチドパネルのインビトロ及び細胞内でのＩＣ５０値を示している。
【０２３１】
これらの化合物を，ＥＬＩＳＡ競合アッセイを用いてインビトロでスクリーニングした。ここでコーティングしたＧＳＴ−ＭＫＫ７とビオチン化Ｇａｄｄ４５βの結合の変位は，異なる濃度で化合物の活性をテストすることによって測定した。選択した化合物群のインビトロでのＩＣ５０ｓを，多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１及びＫＭＳ−１２において［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて測定し，化合物の殺腫瘍活性を評価した。示される化合物の細胞内でのＩＣ５０ｓを，１日，３日，又は６日間の処理後に測定した。Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す。表５に見られるように，細胞内で最も活性のある化合物は，Ｚ−ＤＴＰで表される化合物９（ＫＭＳ−１１ではＩＣ５０＝１０ｎＭ；ＫＭＳ−１２ではＩＣ５０＝６６ｎＭ）と，ｍＤＴＰ３で表される化合物１７（ＫＭＳ−１１ではＩＣ５０＝２５ｎＭ；ＫＭＳ−１２ではＩＣ５０＝１６ｎＭ）であった。
【０２３２】
この実施例で記載した３３個の化合物を，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用を阻害する能力について，ＥＬＩＳＡの競合アッセイによりインビトロですべてスクリーニングした（表５）。また，化合物１８，２０，２１，２２，３２，及び３３を除く，これらの化合物のほとんどを，多発性骨髄腫細胞株であるＫＭＳ−１１及び／又はＫＭＳ−１２において，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて細胞内でスクリーニングし，これらの細胞内のＩＣ５０Ｓを１日，３日及び６日目で測定した。表５に見られるように，化合物１，２，３，４，５，６，７，９，１５及び１７を両方の細胞株でテストした。化合物１５及び１９をＫＭＳ−１２細胞でのみテストした。化合物１０，１１，１２，１３，１４，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，及び３１をＫＭＳ−１１細胞株でのみテストした。化合物１８，２０，２１，２２，３２，及び３３は，インビトロで比較的低活性であったため，細胞内ではテストしなかった。
【０２３３】
表５は，テストした化合物のインビトロでのＩＣ５０ｓが，１００ｐＭ（化合物７，Ｘ２−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｙ３；化合物１５，Ｘ２−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｙ３；及び化合物１９，Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ参照）と＞１０ｎＭ（化合物２４，２７，３０，３１，３２，及び３３参照）との間の範囲に及ぶことを示している。例えば化合物１５（インビトロではＩＣ５０＝１００ｐＭ，ＫＭＳ−１１細胞ではＩＣ５０＝２６３ｎＭ）と化合物９（Ｚ−ＤＴＰ；インビトロではＩＣ５０＝１９０ｐＭ，ＫＭＳ−１１細胞ではＩＣ５０＝１０ｎＭ）を比較して見られるように，インビトロにある活性化合物は，細胞内活性に大抵反映しているが，いくつかの活性化合物は，細胞取り込みが乏しいことから，細胞内で比較的低い活性であった。また細胞内でのデータは，Ｎ末端でのＺ基の存在及び／又は塩基性側鎖の存在が，細胞取り込みを増加させることから，細胞内で高い活性をもたらすことを示している。塩基性側鎖との関連性の例については，化合物１９の細胞内ＩＣ５０ｓ（Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；３日目のＫＭＳ−１２細胞でＩＣ５０＝８１ｎＭ）と，化合物８のそれ（Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；３日目のＫＭＳ−１２細胞でＩＣ５０＞１０μΜ）（すなわちＡｒｇとＡｒｐの変換），又は化合物１６のそれ（Ｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；３日目のＫＭＳ−１２細胞でＩＣ５０＝３．０μＭ）（すなわちＡｒｇとＧｌｕの変換）とを比較でき，同等にこれらの３つの化合物のインビトロでのＩＣ５０ｓは低く，すべてｎＭ以下の範囲であることにも留意されたい。Ｚ基との関連性の例については，Ｚ−ＤＴＰのＵ２６６，ＫＭＳ−１１，及びＮＣＩ−Ｈ９２９でのＩＣ５０ｓと（図７Ａ），Ａｃ−ＤＴＰ２のそれ（図７Ｂ）とで比較でき，同様にインビトロでのこれら２つの化合物のＩＣ５０ｓでも見られる（図３Ｃ及び図４；データは示されていない）。データはまた，両端に芳香環を持たない化合物（例えば，化合物２０及び２１）が，インビトロ及び細胞の両方で不活性であることを示しており（表５），そのような芳香族環が生理活性に絶対的に必要であることを示している。興味深いことに，Ｎ末端での２チロシンの存在は，活性の損失をもたらした（表５）。
【実施例１０】
【０２３４】
付加的Ｚ−ＤＴＰｓ誘導体のパネルのインビトロでのＩＣ５０ｓ
材料と方法
１）２つの芳香環の間の距離，２）中央に位置するアミノ酸の特性，３）Ｎ末端でのアセチル基の存在，及び４）芳香環の置換基の存在，と生理活性との関連性を調べるために，１８個の付加化合物のパネルをリードトリペプチド配列であるＴｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（すなわちｍＤＴＰ３）に基づいて設計した（図６参照）。すべての化合物を，以下の古典的なＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学反応による固相法（Ｆｉｅｌｄｓ  ＧＢ，  Ｎｏｂｌｅ  ＲＬ．  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｉｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  １９９０；３５：１６１−２１４の文献において説明されている）により調製した。Ｎ末端アセチル化を，５％のＤＩＥＡ（ジ−イソプロピル−エチルアミン）を含む（ＤＭＦ）ジメチルホルムアミド中の１０％の無水酢酸で処理することによって行った。化合物をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）及びスカベンジャー処理により樹脂から分割（ｃｌｅａｖｅｄ）し，その後，分取逆相（ＲＰ）−ＰＬＣにより均一に精製した。化合物の同定及び純度をＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分析により評価した。化合物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し，その後すべてを５ｍＭのストック濃度でＤＭＳＯに溶解し，それらが使用されるまで保存した。その後アリコートを連続して緩衝液で希釈し，ＥＬＩＳＡ競合アッセイで必要な濃度を達成した。０．０１ｎＭから１０ｎＭの範囲で濃度を増加させたペプチドを用いて，“Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  ＪＭｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１”の文献で報告されているように（実施例２及び３の方法参照），ＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを行った。簡単に述べると，ＧＳＴ−ＭＫＫ７を，９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル上に４２ｎＭで固定化した。競合化合物を，ビオチンｈＧａｄｄ４５β（２１ｎＭ）と共にプレインキュベートし，その後コーティングされたキナーゼと共にインキュベートした。それぞれの化合物について，インビトロでのＩＣ５０を，競合物の非存在下で観察したＭＫＫ７とＧａｄｄ４５βの結合率に対して，その結合率を５０％減少させることになる濃度として算出した。
【０２３５】
表６は，ｍＤＴＰ３（Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｈｅ）に基づいて設計された１８個のトリペプチド及びジペプチドパネルのＩＣ５０値を示している。化合物は，以下のパラメータの生理活性に及ぼす影響を調査するために設計した。
１）Ｎ−及びＣ−末端での２つの芳香環の間の距離（化合物Ａ１，Ａ１ｂｉｓ，Ａ３，Ａ６，Ａ７，及びＡ８参照），
２）中央に位置するアミノ酸の特性（化合物Ｂ２，Ｂ１３，Ｂ１６，Ｂ１６ｂｉｓ，Ｏ５，及びＯ５ｂｉｓ参照），
３）位置１及び３での芳香環残基でのヒドロキシル基の有無（化合物Ａ９，Ｏ１，Ｏ３，Ｏ５，Ｏ５ｂｉｓ，Ｏ６，Ｏ７，及びＯ８参照），
４）Ｎ末端でのアセチル基の存在（化合物Ａ９とＯ７；Ｂ１６とＢ１６ｂｉｓ；Ｏ１とＯ８；Ｏ３とＯ６；Ｏ５とＯ５ｂｉｓ）。
【０２３６】
１８個の付加化合物を，ＥＬＩＳＡ競合アッセイを用いて，０．０１ｎＭから１００ｎＭの範囲で化合物濃度を増加させながらインビトロの活性についてテストした。表６に見られるように，テストしたすべてのジペプチドは，Ｎ末端又はＣ末端のいずれかでＰｈｅ又はＴｙｒのアミノ酸の存在にかかわらず不活性であった（化合物Ａ１，Ａ１ｂｉｓ，Ａ７，及びＡ８参照）。また，トリペプチドの中央に位置するαアミノ酸より長いスペーサーの導入も，インビトロで活性の損失をもたらした（化合物Ａ３及びＡ６参照，中央の位置でそれぞれβ−アラニン及びε−カプロン酸を保有している）。これは，化合物９（すなわち，Ｚ−ＤＴＰ２）のインビトロでのＩＣ５０ｓと化合物１６（すなわちｍＤＴＰ２）のそれの比較，及び化合物１（Ｚ−ＤＴＰ１）のそれと化合物８（すなわち，Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）のそれの比較のように，位置Ｙ２及びＹ３がＡｓｐ／Ｇｌｕ又はＨｉｓ／Ａｒｇによって占有されたテトラペプチドには当てはまらなかった。これは，２つの活性芳香族基の間に余分なアミノ酸（ｅｘｔａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）が含まれているＺ−ＤＰＴ２及びＺ−ＤＴＰ１が，インビトロで高い効力を保持しているためである（表５のＩＣ５０ｓ参照）。驚くべきことに，表６に示すように，Ｎ末端チロシンのヒドロキシル基の除去もまた，アセチル基の存在にかかわらず，インビトロでの生理活性の完全な損失をもたらした（化合物Ａ９，Ｏ１，Ｏ５，Ｏ５ｂｉｓ，Ｏ７，及びＯ８参照）。意義深いことに，この観察は，標的タンパク質と活性化合物の相互作用にヒドロキシル基が大きく寄与することを示している。実際にこの基は，おそらくＨ結合又は極性相互作用の形成に関与している。対照的に，Ｃ末端の芳香環でのヒドロキシル基の存在は化合物の活性に影響を及ぼさなかった（化合物Ａ９，Ｏ１，Ｏ３，Ｏ５，Ｏ５ｂｉｓ，Ｏ６，Ｏ７及びＯ８参照）。同様に，アルギニンをヒスチジンやリジンなどの別の塩基性アミノ酸，又はプロリンに置換しても，インビトロでの生理活性を変化させなかった（化合物Ｂ２，Ｂ１３，Ｂ１６，Ｂ１６ｂｉｓ，Ｏ５，Ｏ５ｂｉｓ参照）。これはＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７相互作用を阻害する化合物の能力において，この残基の側鎖が大した役割を果たしていないことを示唆している。
【実施例１１】
【０２３７】
レンチウイルス感染症が確証する，多発性骨髄腫細胞の生存に対するＧａｄｄ４５βの重要な役割
材料と方法
多発性骨髄腫細胞株の生存におけるＧａｄｄ４５β及びＭＫＫ７の役割を特定するために，これらの細胞でＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７の発現をダウンレギュレートする効果を調査した（図１６Ａ，図１６Ｂ，図１６Ｃ，図１７Ａ，図１７Ｂ，図１８Ａ，図１８Ｂ，図１８Ｃ，図１９Ａ，図１９Ｂ，及び図１９Ｃ参照）。この目的のために，Ｇａｄｄ４５β及びＭＫＫ７標的ｓｈ−ＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させた。これはそれぞれ，Ｇａｄｄ４５β及びＭＫＫ７遺伝子のサイレンシングをもたらす。標的小ヘアピン（Ｓｈ）−ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は，表７に記載されている。標的ｓｈ−ＲＮＡ配列（すなわち，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−３，ｓｈ−ＭＫＫ７−１，及びｓｈ−ＭＫＫ７−２）と，非特異的なコントロール配列のｓｈ−ＮＳ−１及びｓｈ−ＮＳ−２を，レンチウイルスベクター，ＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７の制限部位であるＢａｍＨＩとＨｐａｌ間に導入した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２参照）。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における高力価レンチウイルス製剤の産生は，本質的に“Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００４  Ｃｅｌｌ  １１６，  ５２９−５４２”及び“Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２”の文献に記載されているのと同一の条件により行った。Ｇａｄｄ４５β及びＭＫＫ７標的ｓｈ−ＲＮＡ配列と非特異的コントロールｓｈ−ＲＮＡ配列の導入するために，５つの代表的なＺ−ＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株のＡＲＨ−７７，ＮＣＩ−Ｈ９２９，Ｕ２６６，ＫＭＳ１１及びＫＭＳ１２と，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６を，本質的に“Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２”の文献に記載され公開されたプロトコルで報告されているように，レンチウイルスに感染させた。感染から５日後，ｅＧＦＰ多発性骨髄腫細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して選別し，その後，細胞生存及び細胞増殖の分析を開始する前に，２日間放置した。高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）（感染した細胞が標識される）を測定し，細胞数を計測するフローサイトメトリーを行うことによって，感染した多発性骨髄腫細胞の生存率を，８日間にわたってモニタリングした（図１６Ａ，図１６Ｂ，図１６Ｃ，図１７Ａ，及び図１７Ｂ参照）。アポトーシス（図１８Ａ，図１８Ｂ，及び図１８Ｃ）及び細胞周期分布（図１９Ａ，図１９Ｂ，及び図１９Ｃ）を，“Ｒｉｃｃａｒｄｉ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ  Ｉ  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，  １４５８  −  １４６１”に記載されているように，ＰＩ核染色アッセイを行うことにより測定した（実施例８に記載の方法参照）。
【０２３８】
結果
図１６Ａ，図１６Ｂ，及び図１６Ｃは，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５β発現のサイレンシングが，代表的なＺ−ＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７（図１６Ａ）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（図１６Ｂ）において，急速な細胞死誘導をもたらし，細胞増殖を減少させるが，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ−８２２６（図１６Ｃ）ではそれらが行われないことを示している。図１６Ａ，図１６Ｂ，及び図１６Ｃに示される実験では，多発性骨髄腫細胞株を，Ｇａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，又はｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−３），ＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡｓ（ｓｈ−ＭＫＫ７−１又はｓｈ−ＭＫＫ７−２），又は非特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−ＮＳ−１やｓｈ−ＮＳ−２）のいずれかを発現するレンチウイルスで感染させ，高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現する細胞，つまり感染した細胞を明らかにするフローサイトメトリー及び細胞数計測により，感染した細胞の生存率を８日間モニタリングした。ｅＧＦＰ＋（つまりレンチウイルスに感染した）多発性骨髄腫細胞の生存率が，同一の培養液中のｅＧＦＰ＋多発性骨髄腫細胞の０日目の生存率に対する割合として，示される時間で表わされている。標準的な方法（Ｙａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６  Ｊｕｌ  ５；１０３（２７）：  １０３９７−４０２で報告されているような）を使用して，細胞をｐＬｅｎｔｉＬｏｘ．３．７レンチウイルスに感染させ，示されるｓｈ−ＲＮＡ及びｅＧＦＰを発現させた。５日後，ｅＧＦＰ＋細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して選別し，細胞生存率の分析を開始する前に，２日間放置した。図１６Ａ，図１６Ｂ，及び図１６Ｃで示される日数は生存分析の開始を０日目としている。データは，ＭＫＫ７発現の阻害には見られないが，Ｇａｄｄ４５β発現の阻害では，Ｚ−ＤＴＰ誘導傷害性に対する感受性を有する多発性骨髄腫細胞株（つまりＡＲＨ−７７とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株）での細胞死を急速に引き起こし（図１６Ａ及び図１６Ｂ），この傷害性に耐性を有するＲＰＭＩ−８２２６ではそれらは起きない（図１６Ｃ）ことを示している。さらにこれらのデータは，多発性骨髄腫細胞のＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−ＤＴＰｓの標的特異性を確証している（図７，図８，及び図９の死滅アッセイ（ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）及びｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ参照）。さらにこの結論と一致するように，実際に，Ｇａｄｄ４５βのサイレンシング後に観察された多発性骨髄腫細胞の増殖の阻害の動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は，Ｚ−ＤＴＰｓでこれらの細胞を処理した後に観察されたものと非常に類似していた（図７Ａ，図８Ｂ，及び図８Ｃ参照）。データはまた，Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫細胞の生存に重要な役割を果たすことを示しており，したがってＧａｄｄ４５βが多発性骨髄腫の治療標的として有効であることを証明している。
【０２３９】
図１７Ａ及び図１７Ｂは，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５のサイレンシングが，Ｚ−ＤＴＰｓの誘導死滅に感受性を有する多発性骨髄腫細胞株（例えばＡＲＨ−７７及びＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株，図７及び図８のＺ−ＤＴＰ誘導死滅に対する感受性参照）の生存率／増殖率に対してのみ強力な阻害活性を有し，ＭＫＫ７のそれでは有さないことを示している。対照的に，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ−８２２６の生存率は，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５β阻害の影響を全く受けなかった。図１７Ａ及び図１７Ｂでは，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを実施例６及び８に記載のように行い，細胞増殖／生存を測定した。図１７Ａは，Ｇａｄｄ４５β又はＭＫＫ７のサイレンシング後の代表的な３つの多発性骨髄腫細胞株のＲＰＭＩ−８２２６，ＮＣＩ−Ｈ９２９，及びＡＲＨ−７７の生存率を示している。図１７Ｂは，３つの異なるＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，又はｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−３），２つの異なるＭＫＫ特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−ＭＫＫ７−１又はｓｈ−ＭＫＫ７−２），及び２つの異なる非特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−ＮＳ−１又はｓｈ−ＮＳ−２）によってＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７をサイレンシングした後の，多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７の生存率／増殖率を示している。多発性骨髄腫細胞株を，示されるｓｈ−ＲＮＡを発現するｐＬｅｎｔｉＬｏｘ．３．７レンチウイルスに感染させ，ｅＧＦＰ＋多発性骨髄腫細胞（つまりレンチウイルスに感染した細胞）をＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して，図１６のように選別した。図１７Ａ及び図１７Ｂに示される［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを，図１６の８日目に相当する，細胞選別から１０日後に行った。８日目（細胞選別後から１０日目）の［３Ｈ］チミジン取り込みの割合（ｃ．ｐ．ｍ．），つまり細胞増殖の測定値が，同様の細胞で発生した０日目（細胞選別後から２日目）の［３Ｈ］チミジン取り込みに対する割合として表わされている。さらにこれらのデータは，多発性骨髄腫細胞におけるＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−ＤＴＰｓの標的特異性を確証し（図７，図８，図９，図１２，及び図１６参照），Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫細胞に対する重要な役割を果たすことを裏付けている。またこれらを合わせると，Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫の治療標的として有効であることを証明している。
【０２４０】
図１８Ａ，図１８Ｂ，及び図１８Ｃは，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのサイレンシングが，Ｚ−ＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ−８２２６（図１８Ｃ）においては見られないが，Ｚ−ＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７（図１８Ａ）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（図１８Ｂ）においては，効果的にアポトーシスを誘導することを示している（図１６及び図１７，ｓｈ−ＲＮＡによるサイレンシング参照，図７，図８及び図１２，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に対して感受性を有する多発性骨髄腫細胞株とＧａｄｄ４５βの発現レベル参照，）。図１８Ａ，図１８Ｂ，及び図１８Ｃでは，ＰＩ核染色アッセイを実施例８に記載のように行い，アポトーシス誘導を測定した。これらのデータは，図１６及び図１７で観察されたＧａｄｄ４５β発現のダウンレギュレーションによって引き起こされる多発性骨髄腫細胞の生存率／増殖率の阻害が，アポトーシス経路によって媒介されるプログラム細胞死の誘導によるものであったことを示している。特に，レンチウイルス感染の非存在下（非感染）又はＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡｓの発現後（ｓｈ−ＭＫＫ７−１及びｓｈ−ＭＫＫ７−２），又は非特異的ｓｈ−ＲＮＡｓの発現後（ｓｈ−ＮＳ−１やｓｈ−ＮＳ−２），同一の多発性骨髄腫細胞では，アポトーシスの有意な誘導は観察されなかった。（図１８Ａ，図１８Ｂ，及び図１８Ｃ参照）。多発性骨髄腫細胞株を，ｓｈ−ＲＮＡを発現するｐＬｅｎｔｉＬｏｘ．３．７レンチウイルスに感染させ，図１６に示すように，ｅＧＦＰ＋多発性骨髄腫細胞（つまりレンチウイルスに感染した細胞）をＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して選別した。図１７Ａ及び図１７Ｂでは，図１６の８日目に対応する細胞選別後１０日目にＰＩ核染色アッセイを行った。アポトーシス細胞（つまりｓｕｂＧ１のＤＮＡ量を示す細胞）の割合は，ヒストグラムで示されている。重要なことに，異なるＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−１，ｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−２，及びｓｈ−Ｇａｄｄ４５β−３）によって誘導されるアポトーシスのレベルは，これら各々のＧａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡによって誘導されるＧａｄｄ４５βダウンレギュレーションのレベルと相関した（図１８Ａ，データは示されていない）。さらに図１８Ａ，図１８Ｂ，及び図１８Ｃにおけるデータは，多発性骨髄腫細胞においてＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−ＤＴＰｓのの標的特異性を確証し（図７，図８，及び図９，Ｚ−ＤＴＰｓによる死滅アッセイ（ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）参照；図１２，Ｇａｄｄ４５β発現とＺ−ＤＴＰ誘導死滅に対して感受性を有する癌細胞との統計的に有意な相関関係参照；図１６及び図１７，ＭＫＫ７では見られない，Ｇａｄｄ４５βのダウンレギュレーションによる多発性骨髄腫細胞株の誘導死滅参照），Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫細胞で果たす重要な役割を裏付けている。さらにこれらを合わせると，Ｇａｄｄ４５βが多発性骨髄腫の治療標的として有効であることを証明している。
【０２４１】
図１９Ａ，図１９Ｂ，及び図１９Ｃは，ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７又はＧａｄｄ４５βのいずれかのサイレンシングが，多発性骨髄腫細胞株における細胞周期の分布に影響を与えないことを示している。レンチウイルスに感染した代表的な多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７（図１９Ａ），ＮＣＩ−Ｈ９２９（図１９Ｂ），及びＲＰＭＩ−８２２６（図１９Ｃ）は，図１８に示したのと同様の実験に由来する。図１９Ａ，図１９Ｂ，及び図１９Ｃに示されるように，細胞周期分析を，実施例８に記載のように実施したＰＩ核染色アッセイにより行った（図１８参照）。図１８に記載のデータ（ＰＩ染色プロファイルが対数スケールで表現され，アポトーシスを強調している）とは異なって，この図のＰＩ染色（つまりＦＬ２−Ａ）は，リニアスケールで表されており，細胞周期を強調している。細胞周期の異なる段階（つまりＧ１，Ｓ，Ｇ２／Ｍ）における，多発性骨髄腫細胞の割合はヒストグラムで示されている。細胞周期分析は，多発性骨髄腫細胞株のＡＲＨ−７７（図１９Ａ）及びＮＣＩ−Ｈ９２９（図１９Ｂ）の場合には，Ｇａｄｄ４５β特異的ｓｈ−ＲＮＡで行うことはできなかった（図１８Ａ及び図１８Ｂ参照）。これは，これらのｓｈ−ＲＮＡ発現後に大規模なアポトーシスが誘導されたことによる。それにもかかわらず，図１９Ｃに見られるように，Ｇａｄｄ４５βのダウンレギュレーションは，Ｚ−ＤＴＰ耐性細胞株であるＲＰＭＩ−８２２９，においては細胞周期の分布に影響を与えなかった。
【実施例１２】
【０２４２】
正常な感受性多発性骨髄腫細胞株に，Ｚ−ＤＴＰ誘導死滅に対する完全な抵抗性を持たせるＭＫＫ７発現のダウンレギュレーション
材料と方法
Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−／ｍＤＴＰｓの標的特異性を評価するために，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅への感受性を有する多発性骨髄腫細胞株のその感受性に及ぼす，ＭＫＫ７の発現をダウンレギュレートする効果を調査した（図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃ）。この目的のために，代表的な多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７を，ＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡ又はコントロール非特異的ｓｈ−ＲＮＡを発現させるレンチウイルスに感染させた。これは結果としてＭＫＫ７遺伝子のサイレンシングをもたらす。標的小ヘアピン（ＳＨ）−ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は表７に記載されている。ＭＫＫ７標的ｓｈ−ＲＮＡ配列及び非特異的コントロール配列を，実施例１１に記載されるように，レンチウイルスベクターであるＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７のＢａｍＨＩとＨＰＡＩの制限部位間に導入した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２参照）。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における高力価レンチウイルス製剤の産生は，本質的に“Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２”の文献に記載されているのと同一の条件により行った。ＭＫＫ７標的ｓｈ−ＲＮＡ配列及び非特異的コントロールｓｈ−ＲＮＡ配列の導入については，本質的に“Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６  ＰＮＡＳ  １０３，  １０３９７−１０４０２”の文献に記載され，公開されたプロトコルに報告されているように，代表的なＺ−ＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株のＡＲＨ−７７を，ＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−ＭＫＫ７）又は非特異的ｓｈ−ＲＮＡは（ｓｈ−ＮＳ）を発現するＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７レンチウイルスに感染させた。感染から５日後，ｅＧＦＰＤ＋ＡＲＨ−７７細胞を，ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩセルソーターを使用して選別した。次に細胞選別から１０日間後，レンチウイルスに感染した多発性骨髄腫ＡＲＨ−７７細胞を，実施例８に記載のように，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，ｍＤＴＰ３又はＺ−ＮＣのいずれかで，３７℃で７２時間処理するか，又はペプチド処理をせずに同じ条件下で培養した。Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，ｍＤＴＰ３及びＺ−ＮＣによる処理は，下記の最終ペプチド濃度で実施した：０．０１μΜ，０．０３μΜ，０．１μΜ，０．３μΜ，１μΜ，３μΜ，１０μΜ。これらの処理後，実施例６と実施例８で説明したように，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを実行することによってＡＲＨ−７７の生存率／増殖率を測定した。これらの実験から得られた結果は，ペプチド処理をしていないレンチウイルスに感染した代表的な多発性骨髄腫細胞の生存率／増殖率に対する，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，ｍＤＴＰ３又はＺ−ＮＣで処理したレンチウイルスに感染した代表的な多発性骨髄腫細胞で観察された生存率／増殖率の割合で表わされている。細胞の生存率／増殖率の５０％阻害（ＩＣ５０）をもたらすＺ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，ｍＤＴＰ３，及びＺ−ＤＮＣの平均濃度を，［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを行うことによって測定し，実施例６に記載のように算出した。これらの実験結果が図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃに示されている。
【０２４３】
結果
図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃは，ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７のサイレンシングが，代表的なＺ−／ｍＤＴＰ感受性細胞株のＡＲＨ−７７を，Ｚ−／ｍＤＴＰ−誘導死滅に対して完全な耐性を有するようにすることを示している。これらの図で表わされる［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイは，ＭＫＫ７特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−ＭＫＫ７）又は非特異的ｓｈ−ＲＮＡ（ｓｈ−ＮＳ）のいずれかを発現する多発性骨髄腫細胞ＡＲＨ−７７における，Ｄ異性体ネガティブコントロールテトラペプチド（Ｚ−ＤＮＣ）（図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃ），Ｚ−ＤＴＰ１（図２０Ａ），Ｚ−ＤＴＰ２（図２０Ｂ），及びｍＤＴＰ３（図２０Ｃ）のＩＣ５０ｓを示している。ＡＲＨ−７７細胞の処理は，これらのペプチドの異なる濃度で行い，３日後に［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイにより細胞の生存率／増殖率を分析した。１．４μＭ（Ｚ−ＤＴＰ１，図２０Ａ），３０２ｎＭ（Ｚ−ＤＴＰ２，図２０Ｂ），及び３０３ｎＭ（ｍＤＴＰ３，図２０Ｃ）のＩＣ５０値で示されるように，ｓｈ−ＮＳを発現するＡＲＨ−７７細胞は，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して高い感受性を有しており，感染していない親のＡＲＨ−７７細胞（表４参照）に見られるものと似ていることが分かる。しかしながらこれとは対照的に，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３の＞１０μＭのＩＣ５０値で示されるように，ｓｈ−ＭＫＫ７を発現するＡＲＨ−７７細胞は，Ｚ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対して完全な耐性を有しており，Ｚ−ＤＮＣ処理したＡＲＨ−７７細胞に見られるものと似ている（図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃ）。ＩＣ５０ｓは，実施例６に記載のように，Ｚ−ＤＮＣ（図２０Ａ，図２０Ｂ，及び図２０Ｃ），Ｚ−ＤＴＰ１（図２０Ａ），Ｚ−ＤＴＰ２（図２０Ｂ），及びｍＤＴＰ３（図２０Ｃ）の濃度を０．０１から１０μＭの範囲で増加させながら算出した。グラフは，未処理細胞で得られた生存率／増殖率の測定値であるカウント毎分（ｃ．ｐ．ｍ．値）に対する，処理済細胞で得られたｃ．ｐ．ｍ．の割合を示している。同様のデータが，Ｕ２６６，ＫＭＳ−１，及びＫＭＳ−１２細胞株を含む，別のＺ−／ｍＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞でも得られた（データは示されていない）。図１２に示されるデータ（すなわち，Ｇａｄｄ４５β発現とＺ−ＤＴＰ誘導死滅に対して感受性を有する癌細胞との強い相関関係）とこれらのデータ（すなわち，感受性多発性骨髄腫細胞における，ＭＫＫ７のサイレンシングによるＺ−／ｍＤＴＰ感受性の損失）を合わせると，多発性骨髄腫細胞のＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に対するＺ−／ｍＤＴＰｓの非常に高い標的特異性を決定的に示している。
【実施例１３】
【０２４４】
患者由来の原発性多発性骨髄腫細胞において強力かつ特異的に細胞傷害活性を保持するＺ−ＤＴＰｓ
材料と方法
Ｚ−／ｍＤＴＰｓが原発性多発性骨髄腫細胞で細胞傷害活性を保持することを確認するために，多発性骨髄腫の臨床診断を受けた患者から分離した多発性骨髄腫細胞の生存性に及ぼすＺ−ＤＴＰ１とＺ−ＤＴＰ２の効果を調べた。この目的のために，本質的に“Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６，  Ｂｌｏｏｄ  １０７：  ４０５３−４０６２”の文献に記載のＣＤ１３８結合磁気ビーズを用いて負の選択により，多発性骨髄腫患者の骨髄（ＢＭ）液から多発性骨髄腫細胞を精製した。多発性骨髄腫細胞の純度を，本質的に“Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌｌ  ２００６，  Ｂｌｏｏｄ  １０７：  ４０５３−４０６２”に記載されている手順に従って，ＣＤ１３８及び抗ＣＤ４５抗体を用いてフローサイトメトリーによって確認した。その後精製したＣＤ１３８＋ＢＭ細胞を，９６ウェルプレートのウェルで，４×１０５細胞／ｍｌの濃度で培養し，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２又はＺ−ＤＮＣの１μΜ又は１０μΜのいずれかで４８時間処理した。細胞生存率を，トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞数計測することにより測定した（図１４Ａ，図１４Ｂ，図１４Ｃ，図１４Ｄ，及び図１４Ｅ参照）。
【０２４５】
インビトロでのＺ−／ｍＤＴＰｓの治療指数を測定するために，Ｚ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２，及びＺ−ＤＮＣの１０μΜ又は１００μΜのいぜれかで処理した後に，ヒト及びマウス由来の両方の原発性非形質転換細胞を用いて生存及び増殖アッセイを行った。この目的のために，“Ｐｉｖａ  Ｒ  ．  ｅｔ  ａｌｌ  ２００８  Ｂｌｏｏｄ  １  １１：  ２７６５−２７７５”で報告されたプロトコルに従って，フィコール・ハイパック比重選別（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）した後，骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ），末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を健常者から精製した。次にＢＭＳＣｓ，ＰＢＭＮＣｓ，及びＭＳＣｓ細胞を，図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるペプチド濃度及び時間で処理した。さらに，癌細胞に対するＺ−／ｍＤＴＰｓの細胞傷害活性の特異性を確立するために，本質的に“Ｓｈｉｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １−１２”に記載のように，それぞれ，マウスの脾臓及びリンパ節から精製した一次Ｂ及びＴリンパ球を使用した。その後Ｂ及びＴ細胞を，１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１６時間という状況下で活性化させ，次いで図１５に示すように，１００μΜのＺ−ＤＴＰ１，Ｚ−ＤＴＰ２又はＺ−ＤＮＣで７２時間処理した。
【０２４６】
結果
図１４Ａ，図１４Ｂ，図１４Ｃ，図１４Ｄ，及び図１４Ｅは，Ｚ−ＤＮＣでは見られないが，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２では，代表的な５人の患者から分離した原発性多発性骨髄腫細胞において強い細胞傷害活性を表わしたことを示している。各パネルは，異なる患者（つまり，患者１（図１４Ａ），患者２（図１４Ｂ），患者３（図１４Ｃ），患者４（図１４Ｄ），及び患者５（図１４Ｅ）由来の多発性骨髄腫細胞で得られたデータを示している。Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＮＣの処理を，示される濃度（すなわち，１μΜ又は１０μΜ）で４８時間行った。トリパンブルー排除法を用いてアッセイを行った。値は，未処理コントロール細胞の生存率に対する，Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１又はＺ−ＤＮＣ処理後の細胞の生存率を表している。同様の実験条件下でのｍＤＴＰ３による，患者由来の原発骨髄腫細胞においても，Ｚ−ＤＴＰ２及びＺ−ＤＴＰ１のそれに匹敵する強力な細胞傷害活性が観察された（データは示されていない）。これらの知見は，Ｚ−／ｍＤＴＰｓが原発性多発性骨髄腫細胞において活性を保持することを証明し，そのＺ−／ｍＤＴＰに基づく治療を多発性骨髄腫の治療として患者に使用することができることを示している。
【０２４７】
図１５Ａ及び図１５Ｂは，非常に高濃度（つまり１００μＭ）で使用しても，Ｚ−ＤＴＰ１とＺ−ＤＴＰ２がマウス又はヒトのいずれか由来の正常な初代細胞に対して毒性がないことを示している。テストした初代細胞は，多発性骨髄腫でない個人から分離された正常な骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）（図１５Ａ），末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）（図１５Ａ），及び間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）（図１５Ｂ）と，マウスから分離し精製した一次Ｂ及びＴリンパ球（図１５Ｂ）とを含む。Ｚ−ＤＴＰ２，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＮＣによる処理を，示される濃度で，４８時間（ＢＭＳＣ，ＰＢＭＮＣｓ）（図１５Ａ），７２時間（マウスのＢ及びＴ細胞）（図１５Ｂ），又は１４４時間（ＭＳＣｓ）（図１５Ｂ）のいずれかで行った。トリパンブルー排除（図１５Ａ）又は［３Ｈ］チミジンの取り込み（図１５Ｂ）を用いて，アッセイを行った。図１４及び図１５に表わされるデータは，Ｚ−ＤＴＰｓが，高いインビトロ治療指数を有することを示している（すなわち，癌細胞には高い傷害性を有するのに対し正常細胞には傷害性がない）。実際に，Ｚ−ＤＮＣでは見られないことだが，Ｚ−ＤＴＰ１及びＺ−ＤＴＰ２は，１００μΜのように非常に高濃度で使用した場合でも（図１５Ｂ），患者由来の多発性骨髄腫細胞において強力な抗腫瘍活性を示すが（図１４），健康な個人又はマウス由来の初代正常細胞に傷害性を示していない（図１５Ｂ）。これらのデータは，Ｚ−ＤＴＰｓが細胞内で無差別の細胞傷害効果を持たないこと，むしろそれらの細胞傷害効果は，癌細胞，及び又はＧａｄｄ４５βの高レベルの発現もしくは活性を特徴とする細胞，及び／又はＮＦ−κＢの恒常的に高い発現もしくは活性を特徴とする細胞，に特異的であることを証明している。
【０２４８】
高濃度（１００μＭ）で使用した時でさえ，多発性骨髄腫細胞及びその他の癌細胞におけるＺ−／ｍＤＴＰｓの高い活性と，初代ヒトＢＭＳＣｓ，ＭＳＣｓ，ＰＢＭＮＣｓ及びマウスＢ及びＴリンパ球を含む原発正常細胞における無傷害性とを兼ね備えることは，本発明の化合物が非常に優れたインビトロ治療指数を有すること（図９，生存に関しＮＦ−κΒに依存しない細胞株における無傷害性参照；図１２，Ｇａｄｄ４５β発現とＺ−ＤＴＰｓに対して感受性を有する癌細胞との相関関係参照；図１４及び図１５，初代細胞での死滅アッセイ（ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）参照），つまり既存の治療に対する本発明の重要な利点を証明している。また，本発明の化合物は，生存に関しＮＦ−κΒに依存しない，Ｔ細胞白血病，バーキットリンパ腫などの腫瘍細胞株においても傷害性を有しておらず（たとえ１００μＭで使用しても，図９参照），これらの活性が恒常的に活性なＮＦ−κΒを持つ細胞に対して固有の特異性を有することを示している。さらに，異なる原発組織の腫瘍細胞株の大パネルにおいて，Ｇａｄｄ４５β発現レベルとＺ−／ｍＤＴＰ−誘導死滅に対する感受性との間に統計的に非常に有意な相関があり（ｐ＜０．０１，図１２），それによって，Ｇａｄｄ４５βに対する非常に特異的なＺ−／ｍＤＴＰｓの細胞傷害作用を確証している。重要なことに，ｓｈ−ＲＮＡによるＧａｄｄ４５βのダウンレギュレーションは，Ｚ−／ｍＤＴＰｓで見られるものと同様の動態でＺ−／ｍＤＴＰ感受性多発性骨髄腫細胞株（例えば，ＡＲＨ−７７及びＮＣＩＨ９２９）においてアポトーシスを引き起こすが，Ｚ−／ｍＤＴＰ耐性多発性骨髄腫細胞株（例えばＲＰＭＩ−８２２６）においては引き起こさず，ｓｈ−ＲＮＡによるＭＫＫ７のダウンレギュレーションは，感受性多発性骨髄腫細胞株（例えば，ＡＲＨ−７７）においてＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅に対する感受性の喪失をもたらす（図２０を参照）。これらのデータを合わせると，Ｚ−／ｍＤＴＰｓの細胞傷害活性が，恒常的活性ＮＦ−κΒを特徴とする腫瘍細胞，及び／又は高レベルのＧａｄｄ４５β発現又は活性を特徴とする腫瘍細胞に限定されることを示しており，つまり，Ｚ−／ｍＤＴＰｓは，１００μＭで使用したときでさえ，感受性多発性骨髄腫細胞においてはｎＭレベルで細胞傷害性を有するが，生存に関しＮＦ−κΒに依存しない，又は低レベルなＧａｄｄ４５β発現を表す耐性腫瘍細胞株においては細胞傷害性を有さないことを示している。さらに，ＩＫＫ／ＮＦ−κΒ経路のコア構成要素（ｃｏｒｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を欠如したマウスとは対照的に，ｇａｄｄ４５β−／−マウスは生存能力があり，一見健康であり（Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００８  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，  １９１１−１９２３），（完全なプロテアソーム／ＮＦ−κΒの遮断（ｂｌｏｃｋａｄｅ）とは異なり）完全なＧａｄｄ４５β不活化はインビボで十分に許容されることを示している（Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌｌ  ２００８  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，  １９１１−１９２３）。これらの知見を合わせると，Ｚ−／ｍＤＴＰベースの治療が，安全でかつ特異的であることを示している（ＮＦ−κΒ依存しない腫瘍細胞及び正常な初代細胞における細胞傷害性の欠如について図９及び図１５参照，Ｇａｄｄ４５β発現とＺ−ＤＴＰｓに対して感受性を有する癌細胞との相関関係について図１２参照，原発性多発性骨髄腫細胞のＺ−／ｍＤＴＰ誘導死滅について図１４参照）。
【０２４９】
ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤（ＰＩｓ）及び他の多発性骨髄腫の治療法もまた，ＪＮＫを活性化することにより多発性骨髄腫細胞を殺すが（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ｂｌｏｏｄ  １  １１，  １６５４−１６６４），低い治療指数により病気を治すことはできない（Ｌａｕｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２３，  ２２２２−２２３２；  Ｌｕｄｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １５，  ６−２５  ａｎｄ  ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｃａｒｅ．ｏｎ．ｃａ／）。Ｇａｄｄ４５を介して生存する多発性骨髄腫細胞生存内のＮＦ−κΒの個別の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）機能を標的とすることは，免疫，炎症や生存におけるＮＦ−κＢの機能を分離させることができるので，治療に必要な容量を許容する，より安全でより特異的な治療法を提供することができる。Ｚ−／ｍＤＴＰｓは，多発性骨髄腫や，生存に関しＮＦ−κＢに依存する潜在的な他の癌及び疾患又は障害に対して，新規な経路を標的にする全く新しいクラスの治療剤を示している。
【実施例１４】
【０２５０】
分離しているＧａｄｄ４５βとＭＫＫ７，及び複合体の一部分としてのＧａｄｄ４５／ＭＫＫ７に対するＤＴＰ３の結合特性
実施例として，表面プラズモン共鳴技術を使用して，ｍＤＴＰ３とＧａｄｄ４５β，ＭＫＫ７のキナーゼドメイン（ＭＫＫ７ＫＤ）及びＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体との結合実験を行った。
【０２５１】
材料と方法
ＤＴＰｓをＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体に結合する方法を特定するために，実験を，４チャネルのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，ミラノ，イタリア）を使用して，Ｂｉａｃｏｒｅ３０００  ＳＰＲ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，ミラノ，イタリア）で行った。完全長ヒトＧａｄｄ４５βを，“Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；３７８：９７−１１１”に記載のように，調製し，精製した。１０１残基から４０５残基にわたって，Ｓ２８７Ｄ及びＴ２９１Ｄ変異を輸送するＭＫＫ７の恒常的活性キナーゼドメイン（ＭＫＫ７ＫＤ）を，Ｈｉｓ６の融合タンパク質として大腸菌で発現させた。タンパク質を，アフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ担体）と，ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５）の２つのステップにより均一に精製し，その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，同定及び純度を確認するためのＬＣ−ＭＳ，及び折りたたみ構造を評価するための円偏光二色性によって明らかにした。
【０２５２】
ＭＫＫ７ＫＤを，古典的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学（タンパク質ｐＩ，〜９）を介して，流量５ｕＬ／ｍｉｎ，ｐＨ５でビアコアセンサーチップ上に固定化した。約８０００応答単位レベルの固定化量を達成した。約４．５のｐＩを有する本質的に酸性タンパク質であるＧａｄｄ４５βを，別のチャネルにｐＨ３．５（６０００ＲＵレベルの固定化量）で固定化した。Ｇａｄｄ４５βとＭＫＫ７ＫＤの両方のチャネル上の残留反応性基を，エタノールアミンで処理することによって最終的に不活性化した。別のチャネルも，ＥＤＣ／ＮＨＳによる活性化，及びエタノールアミンによる不活性化という同じ手順を行った。このチャネルを参考として使用し，これに由来するシグナルをブランクとした。そしてそれに応じて，チップ表面への非特異的結合を除去（ｒｅｍｏｖｅ）するために，Ｇａｄｄ４５又はＭＫＫ７ＫＤタンパク質を検出する実験的なチャネルから値を減算した。２つのタンパク質が効果的に固定化されたかどうかを判断するために，タンパク質濃度を増加させながら（３分の接触時間，６０μＬ），Ｇａｄｄ４５β（２０〜２００ｎＭ）及びＭＫＫ７ＫＤ（１〜２５ｎＭ）の反復注入を行った。１ＭのＮａＣｌ（１分，ＭＫＫ７ＫＤ誘導体化チャネル）又は２０ｍＭのＮａＯＨ（３０秒，Ｇａｄｄ４５β誘導体チャネル）の注入により再生を達成した。
【０２５３】
トリペプチドｍＤＴＰ３（Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）の濃度を増加させながら，最終的に１ｎＭから１０μΜの範囲の濃度でチップ上に注入した。別の実験では，ｍＤＴＰ３を，固定化したＭＫＫ７ＫＤからＧａｄｄ４５βの解離段階，又は固定化したＧａｄｄ４５βからＭＫＫ７ＫＤの解離段階のいずれかで注入した。これらの分析結果は，図２１Ａ，図２１Ｂ，図２１Ｃ，及び図２１Ｄで報告されている。
【０２５４】
結果
図２１Ａに見られるように，固定化したＭＫＫ７ＫＤへのＧａｄｄ４５βの結合は非常に効果的であった。用量反応結合及び解離曲線が使用したすべての濃度で観察された。Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７ＫＤ相互作用の解離定数ＫＤを，それぞれの異なる曲線上の計算値を平均化することにより評価し，４．０±０．７ｎＭであると特定した（図２１Ａ参照）。同様に，Ｇａｄｄ４５βチャネルへのＭＫＫ７ＫＤの反復注入は，用量反応結合及び解離曲線（図２１Ｂ）を提供し，ここから３．４ＫＤ±０．６ｎＭの解離定数ＫＤを得た。
【０２５５】
ｍＤＴＰ３がＭＫＫ７ＫＤ及び／又はＧａｄｄ４５βに結合するかどうかを判断するために，ペプチドのサンプル（すなわちｍＤＴＰ３）を，Ｇａｄｄ４５β及びＭＫＫ７ＫＤ誘導体化チャネルに注入した。驚くべきことに，図２１Ｃに見られるように，データは，このペプチドが分離しているＧａｄｄ４５β又はΜΚΚ７ＫＤのいずれにも結合しないことを示している。しかしこれとは対照的に，ＭＫＫ７ＫＤからＧａｄｄ４５βを解離する段階（図２１Ｄ）又はＧａｄｄ４５βからＭＫＫ７ＫＤを解離する段階（データは示されていない）で，ｍＤＴＰ３を注入した場合，結合が観察され，用量反応結合及び解離曲線を記録した。図２１Ｄは，ｍＤＴＰ３を１０ｎｍ又は１００ｎＭのいずれかの低濃度で注入した場合，このペプチドがＧａｄｄ４５β／ＭＫＫ７ＫＤ複合体の急速な解離を誘導したことを示している。また，ペプチドを洗い流した後，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７ＫＤ複合体の形成が急速に回復したことも見ることができる。図２１Ｄはまた，ｍＤＴＰ３を高濃度（例えば１μΜ）で注入した場合，用量反応結合及び解離曲線が記録されたことを示し，ｍＤＴＰ３がＧａｄｄ４５β及び又はＭＫＫ７ＫＤ又は２つのタンパク質の複合体に結合したことを表わしている。これらのデータを合わせると，高濃度で使用する場合でも，ｍＤＴＰ３は，分離しているＧａｄｄ４５β又はＭＫＫ７ＫＤのいずれにも結合することができず，Ｇａｄｄ４５β，ＭＫＫ７ＫＤ，又は２つのタンパク質の相互作用により形成された表面に結合するには，Ｇａｄｄ４５β／ＭＫＫ７複合体の形成を必要とすることを証明している。これらのデータは，治療標的が２つのタンパク質（すなわちＧａｄｄ４５βとＭＫＫ７）間のインターフェースであること，つまり，細胞内の高い標的選択性を提供し，既存の治療法に対する有意な利点を示すものとして，重要である。
【実施例１５】
【０２５６】
Ｚ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３のインビボ薬物動態（ＤＭＰＫ）プロファイル
インビボでの治療的使用に対するＺ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３の適合性を評価するために，マウスで薬物動態解析を行った。
【０２５７】
材料と方法
マウスの薬物動態試験：
プロトコルの概要：
Ｚ−ＤＴＰ２及びＺ−ｍＤＴＰ３をマウスに静脈内投与した。８時間にわたる化合物の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後，最大７回血液サンプルを採取し，血漿をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し，各時点で化合物の濃度を測定した。
【０２５８】
実験手順：
それぞれ２５〜３０グラムの３匹の雄ＣＤ１マウスに化合物ごとに，各時点ごとに，投与経路ごとに投与した。試験化合物は静脈内投与した（体重ｋｇ当たり１０ｍｇの化合物とする典型的な用量で）。動物は試験期間を通じて食物摂取を自由にした。
【０２５９】
以下の時点で，動物に麻酔し，血液をヘパリン管で採取し，動物を犠牲にした。
ｉ．ｖ．投与：投与後０．０８時間，０．２５時間，０．５時間，１時間，２時間，４時間及び８時間
【０２６０】
サンプル調製：
血液サンプルを遠心分離し，血漿を得た。これはその後別々のラベルの付いた容器に移した。３匹の動物の個々の時点からアリコートを単独で分析した。３つのメタノールの量を追加し，４℃で３０分間遠心分離することにより，タンパク質を沈殿させた。得られた上清の１００μｌのアリコートを，９６ウェルプレートのウェルにおいて，２００μｌのＨＰＬＣグレード水で希釈した。
【０２６１】
定量分析：
標準曲線をブランク血漿マトリックスで作成し，サンプルと同じ方法で処理した。血漿サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化し，血漿中の各化合物の濃度を，μｇ／ｍＬで記録した。
【０２６２】
薬物動態分析：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｓｉｇｈｔ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ．ｐｈｐウェブサイトで説明されているように，非コンパートメントモデル解析を用いて薬物動態パラメータを算出した。
【０２６３】
生物分析：
プロトコルの概要：
血漿サンプル中の試験化合物濃度を，ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。データを，３〜３０００ｎｇ／ｍＬの範囲で５点標準曲線を用いて定量化した。
【０２６４】
実験手順：
タンパク質を，１５０μＬのメタノールを追加することにより，個々の血漿サンプルの５０μＬアリコートから沈殿させた。タンパク質沈殿の後，血漿サンプルを４℃で３０分間遠心分離した。得られた上清の１００μｌのアリコートを，９６ウェルプレートにおいて２００μＬのＨＰＬＣグレードの水で希釈した。試験化合物を３〜３０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度範囲（最終ＤＭＳＯ濃度１％）にわたってＤＭＳＯに溶解し，上記のように試験サンプルと同じ方法で処理した試験化合物を，濃度を変化させながら血漿をスパイクすることによって５点標準曲線を作成し，その後これからＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化した。
【０２６５】
結果
雄ＣＤ１マウスにおける薬物動態試験は，Ｚ−ＤＴＰ２とｍＤＴＰ３両方が，マウスにおいて急性の細胞傷害性の非存在下で，静脈内（ｉｖ）注入投与に適するインビボＤＭＰＫプロファイルを有することを示している（表８，表９［Ａ］，及び表９［Ｂ］参照）。表８は，血漿中半減期（Ｔ１／２），定常状態の分布容積（Ｖｓｓ）及び消失相の分布容積（Ｖβ），総クリアランス（ｔｏｔ  ＣＬ），血漿中濃度対時間曲線（ＡＵＣ），０時点の濃度（Ｃ０）を含む，Ｚ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３から得られた最も重要なインビボ薬物動態パラメータの値を示している。値は，非コンパートメント及びコンパートメント解析法（Ｇｒｏｕｌｘ  Ａ．  ２００６  ＳｃｉａｎＮｅｗ  ９：  １−５  ａｎｄ  ＤｉＳｔｅｆａｎｏ  ３ｒｄ  １９８２  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２４３：  １−６参照）に基づく血漿中濃度対時間曲線のデータから算出した（データは示されていない）。示される各パラメータは，体重ｋｇあたり１０ｍｇの用量で化合物を単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射した後に雄ＣＤ１マウスの３つの異なるプールから得られた実験値の平均値を表している。３匹の雄ＣＤ１マウスに，（体重当たり２５〜３０グラムを）Ｚ−ＤＴＰ２又はｍＤＴＰ３のいずれかをｉ．ｖ．投与した。血液サンプルを，前述のように７時点（すなわち，注射後０．０８時間，０．２５時間，０．５時間，１時間，２時間，４時間，及び８時間）で採取し，血漿を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析し，各時点での２つの化合物の血中濃度を測定した。Ｚ−ＤＴＰ２とｍＤＴＰ３の両方について，血漿中濃度対時間プロファイルのプロットを外挿した。結果は，静脈注射後，Ｚ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３が共に多相動態（ｍｕｌｔｉｐｈａｓｉｃ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）に伴うことを示している（データは示されていない）。実際に，静脈内投与した化合物の濃度対時間曲線は，急勾配の初期分布相と長い消失相半減期Ｔ１／２の明確なバイオ指数関数プロファイルを示している（データは示していない）。
【０２６６】
血漿中濃度対時間曲線のデータから外挿した主要な薬物動態パラメータ（すなわち，Ｃ０，ＡＵＣ（ｌａｓｔまで），Ｔ１／２，Ｖβ，Ｖｓｓ，及びＣＬ）は，薬剤の所望の全身定常状態濃度（治療上の全身濃度など）を達成するために必要な投与レベル及び投与計画（ｒｅｇｉｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を算出するのに必須である。表８に見られるように，Ｚ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３の半減期は，それぞれインビトロでそれぞれ約２時間及び約１時間２０分を示している。
【０２６７】
興味深いことに，Ｚ−ＤＴＰ２とｍＤＴＰ３は共に約５分間の初期分布相半減期を示しており，迅速な組織／細胞取り込みを示唆しているが，代わりに血漿タンパクへの結合を示唆している。最も重要なのは，両化合物は，組織からの非常に遅い脱離を示し，これは約８時間の消失相半減期によって反映されている（表８，データは示されていない）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｓｉｇｈｔ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ  ａｎｄ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｓ．ｃｏｒｎ／ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｉｄａｍｙｃｉｎ／ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ．ｈｔｍｌ  ａｎｄ  Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０  １９７０−１９８０参照）。データはまた，Ｚ−ＤＴＰ２とｍＤＴＰ３は共に，それらの全体量の分布値が定常状態量の分布値よりも高いこと（すなわちＶβ＞Ｖｓｓ）の知見によって示されるように，一般的な線形薬物動態学的システム（Ｂｅｒｅｚｈｋｏｖｓｋｉｙ  （２００７）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ９６，  １６３８−５２参照）に従うことも示している。
【０２６８】
消失状態及び定常状態の分布容積と同様に２つの化合物の消失相の半減期は，定速注入での体内に必要な薬剤の量を確立するのに相乗的に関与している。
【０２６９】
重要なことに，Ｚ−ＤＴＰ２とｍＤＴＰ３はそれぞれ，６６〜９０ｍＬ／分／ｋｇの範囲と２２〜２７ｍＬ／分／ｋｇの範囲で総クリアランスの値を示し，両化合物の低代謝率と低胆汁排泄率を示唆している（表８，データは示されていない）。
【０２７０】
表９［Ａ］及び表９［Ｂ］はそれぞれ，２つの化合物の全身治療濃度を達成するのに必要な，Ｚ−ＤＴＰ２及びｍＤＴＰ３のインビボ投与における予測投与量を示している。値は，Ｚ−ＤＴＰ（表９［Ａ］）又はｍＤＴＰ３（表９［Ｂ］）のいずれかにおいて，所望の１μＭ，５μＭ又は１０μΜの定常状態の血漿中濃度を得るのに必要な，ｍｇ／ｈｒで表された投与量を示している，さらに重要なことに，ｍＤＴＰ３は，Ｚ−ＤＴＰ２と同等の消失相半減期だけでなく同等の分布相半減期も有しているが，総クリアランス値は，Ｚ−ＤＴＰ２のそれよりも３倍低いことを示している（表８，データは示されていない）。注目すべきは，Ｚ−ＤＴＰ２とｍＤＴＰ３の予測投与量の相異に見られるように（それぞれ表９［Ａ］と表９［Ｂ］），この重要な薬物動態パラメータのわずかな相違は，化合物の所望の定常状態の血漿濃度を達成するのに必要な投与量や投与計画にも著しく影響を与える可能性がある。実際に，表９［Ａ］及び表９［Ｂ］（モデリング解析）は，１μＭ，５μＭ，又は１０μΜの定常状態の血漿濃度を達成するために，ｍＤＴＰ３に必要とされる投与量がＺ−ＤＴＰ２に必要とされるものよりも著しく低くなることを示している。したがって，これらの薬物動態の結果，及び多発性骨髄腫細胞株において２つの化合物で測定されたＩＣ５０値に基づいて（表４参照），最大１０μＭの定常状態の血漿濃度を達成するためには，Ｚ−ＤＴＰでは０．９７６ｍｇ／ｈｒ，ｍＤＴＰ３では０．２１８ｍｇ／ｈｒの割合で継続的にｉ．ｖ．注入する必要がある（表９［Ａ］と表９［Ｂ］）。
【０２７１】
注目すべきことに，Ｚ−／ｍＤＴＰ合成は簡潔でかつ単純であり，さらに慢性的な使用にも費用対効果が高い。したがって，低いＴ１／２でさえ，Ｚ−／ｍＤＴＰの注入療法は，すでに化学療法を受けている入院患者にも採用できる。本発明の化合物はまた，非常に可溶性であり，高い特異性と優れた安全性プロファイルを有していることから，高用量を送達することができ，低容量で治療効果を最大化することができ，既存のペプチド療法によってうまく活用することができる。
【０２７２】
【表１】
0005961113.tif 000024
【０２７３】
【表２】
0005961113.tif 000025
【０２７４】
【表３】
0005961113.tif 000026
【０２７５】
【表４】
0005961113.tif 000027
【０２７６】
【表５】
0005961113.tif 000028
【０２７７】
【表６】
0005961113.tif 000029
【０２７８】
【表７】
0005961113.tif 000030
【０２７９】
【表８】
0005961113.tif 000031
【０２８０】
【表９】
0005961113.tif 000032
0005961113.tif 000033
【０２８１】
【図１】
0005961113.tif 000034
【図２】
0005961113.tif 000035
【図３（Ａ）】
0005961113.tif 000036
【図３（Ｂ）．（Ｃ）】
0005961113.tif 000037
【図４】
0005961113.tif 000038
【図５】
0005961113.tif 000039
【図６】
0005961113.tif 000040
【図７（Ａ）】
0005961113.tif 000041
【図７（Ｂ）．（Ｃ）】
0005961113.tif 000042
【図８（Ａ）．（Ｂ）】
0005961113.tif 000043
【図８（Ｃ）】
0005961113.tif 000044
【図９】
0005961113.tif 000045
【図１０（１）】
0005961113.tif 000046
【図１０（２）】
0005961113.tif 000047
【図１０（３）】
0005961113.tif 000048
【図１０（４）】
0005961113.tif 000049
【図１０（５）】
0005961113.tif 000050
【図１１】
0005961113.tif 000051
【図１２】
0005961113.tif 000052
【図１３（Ａ）】
0005961113.tif 000053
【図１３（Ｂ）】
0005961113.tif 000054
【図１４（Ａ）．（Ｂ）】
0005961113.tif 000055
【図１４（Ｃ）．（Ｄ）】
0005961113.tif 000056
【図１４（Ｅ）】
0005961113.tif 000057
【図１５】
0005961113.tif 000058
【図１６（Ａ）】
0005961113.tif 000059
【図１６（Ｂ）】
0005961113.tif 000060
【図１６（Ｃ）】
0005961113.tif 000061
【図１７】
0005961113.tif 000062
【図１８（Ａ）（１）】
0005961113.tif 000063
【図１８（Ａ）（２）】
0005961113.tif 000064
【図１８（Ａ）（３）】
0005961113.tif 000065
【図１８（Ａ）（４）】
0005961113.tif 000066
【図１８（Ｂ）】
0005961113.tif 000067
【図１８（Ｃ）】
0005961113.tif 000068
【図１９（Ａ）（１）】
0005961113.tif 000069
【図１９（Ａ）（２）】
0005961113.tif 000070
【図１９（Ｂ）】
0005961113.tif 000071
【図１９（Ｃ）】
0005961113.tif 000072
【図２０】
0005961113.tif 000073
【図２１（Ａ）．（Ｂ）】
0005961113.tif 000074
【図２１（Ｃ）．（Ｄ）】
0005961113.tif 000075
【配列表】
0005961113000001.app