(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料に集光する対物レンズと、
該対物レンズの光軸に直交する方向にレーザ光を走査させる走査部と、
該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、
前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記レーザ光源からのレーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部と、
これらを制御する制御部とを備え、
前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像の同一断面内におけるレーザ光の強度分布を調節するレーザ顕微鏡。
【請求項２】
試料の表面からの深さに応じたレーザ光の強度分布を格納するレーザ光強度記憶部を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記制御部が、前記光軸に直交する前記試料の断面内の領域毎に、該試料の表面からの距離に応じてレーザ光の強度を調節する請求項１または２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記レーザ光強度調節部により調節されたレーザ光の強度と、前記走査部によるレーザ光の走査位置および前記集光深さ調節部により調節されるレーザ光の集光位置とを対応付けて記憶するレーザ光強度記憶部を備える請求項１から３いずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度に基づいて、レーザ光の集光位置における試料の有無を判定する請求項１から４いずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記制御部が、同一断面においてレーザ光の強度を調節して前記試料に複数回レーザ光を照射し、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度の変動値に基づいて、レーザ光の集光位置における試料の有無を判定する請求項１から５いずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記レーザ光強度調節部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度が所定値以上の領域に対して、同一断面においてレーザ光の強度を低下させる請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項８】
前記レーザ光源が、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源である請求項１から７いずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項９】
試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における試料の断面画像を取得する観察方法であって、
レーザ光の集光位置から発生した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像の同一断面内におけるレーザ光の強度分布を調節し、
蛍光の強度とレーザ光の集光位置とに基づいて試料の２次元的な蛍光画像を取得する観察方法。
【請求項１０】
前記次に取得する試料の断面画像の同一断面内において、領域毎に前記試料の表面からの深さに応じてレーザ光の強度を調節する請求項９に記載の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、多光子励起現象を利用して試料内部にレーザ光を集光させ、試料内部の蛍光画像を取得するレーザ顕微鏡が知られている。試料内部から発生する蛍光は、試料内を通過する過程において散乱されるため、試料の深い位置で発生した蛍光に基づく蛍光画像は、試料の浅い位置で発生した蛍光に基づく蛍光画像よりも暗くなるという問題がある。
【０００３】
この問題に対して、従来、試料の深さ方向にレーザ光の強度を強く調節することで、試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得するレーザ顕微鏡が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２６１７６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に開示されているレーザ顕微鏡では、ある基準位置から試料の深さ方向に一定の割合でレーザ強度を変化させるため、試料の深さ方向の各スライス面に対して、それぞれ同一強度のレーザ光を照射することとなる。
【０００６】
しかしながら、実際の試料は、平坦な表面形状ではなく、凹凸のある表面形状を有しているため、試料の深さ方向の各断面において、実際に照射されるレーザ光の強度は、試料の位置（深さ方向に直交する方向）によって異なることとなる。そのため、同一断面内においても、試料の厚い領域では散乱の影響が大きいために弱いレーザ光が照射される一方、試料の薄い領域では散乱の影響が小さいために強いレーザ光が照射される。このように、同一断面内において実際に照射されるレーザ光の強度が不均一となり、試料の位置によっては、不必要に強いレーザ光が照射されてしまい、試料にダメージを与えてしまったり、取得した画像の輝度が飽和してしまうことがあった。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、凹凸のある表面形状を有する試料に対しても、試料へのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができるレーザ顕微鏡および観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料に集光する対物レンズと、該対物レンズの光軸に直交する方向にレーザ光を走査させる走査部と、該走査部により走査されるレーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、前記試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、前記レーザ光源からのレーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部と、これらを制御する制御部とを備え、前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像の同一断面内におけるレーザ光の強度分布を調節するレーザ顕微鏡である。
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、レーザ光源から出射されたレーザ光が、走査部により走査されるとともに、集光深さ調節部により試料内の深さ位置が調節されて、対物レンズにより、調節された試料内の集光位置に集光される。試料内の集光位置では、試料内の蛍光物質が励起されて蛍光が発せられ、試料内において発生した蛍光は、蛍光検出部により検出される。そして、走査部による走査位置と蛍光検出部により検出された蛍光の強度情報とに基づいて、試料の断面画像（蛍光画像）が取得される。
【００１０】
この場合において、制御部により、試料の断面画像が試料の表面から深さ方向に順次取得されるとともに、レーザ光強度調節部により、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像におけるレーザ光の強度分布が調節される。
【００１１】
具体的には、例えば、過去に取得した試料の断面画像において、蛍光が検出された領域を「第１領域」、蛍光が検出されなかった領域を「第２領域」とした場合に、次に取得する試料の断面（過去よりも深い断面）において、「第１領域」および「第２領域」の両方で蛍光が検出されたとする。この場合、試料の表面からの距離は、「第１領域」の方が「第２領域」よりも大きいこととなる。この場合には、次に取得する試料の断面において、「第１領域」に照射するレーザ光の強度を、「第２領域」に照射するレーザ光の強度よりも大きくする。これにより、同一断面において、試料の厚さに基づく散乱等の影響を排除して、均一な明るさの蛍光画像を取得することができる。
【００１２】
このようにすることで、試料の薄い領域に対して不必要に強いレーザ光が照射することを防止することができ、試料にダメージを与えてしまうことや、取得した画像の輝度を飽和させてしまうことを防止することができる。すなわち、本発明の第１の態様によれば、凹凸のある表面形状を有する試料に対しても、試料へのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
上記の態様において、試料の表面からの深さに応じたレーザ光の強度分布を格納するレーザ光強度記憶部を備えることとしてもよい。
上記の態様において、前記制御部が、前記光軸に直交する前記試料の断面内の領域毎に、該試料の表面からの距離に応じてレーザ光の強度を調節することとしてもよい。
【００１３】
上記の態様において、前記レーザ光強度調節部により調節されたレーザ光の強度と、前記走査部によるレーザ光の走査位置および前記集光深さ調節部により調節されるレーザ光の集光位置とを対応付けて記憶するレーザ光強度記憶部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、試料の深さ方向の各断面において、試料の表面からの距離に応じてレーザ光の強度が調節されたテーブル（レーザ光の集光位置とレーザ光の強度とが対応づけられたテーブル）を作成して、レーザ光強度記憶部に記憶することができる。そして、このテーブルに基づいて試料の各断面画像を取得することで、試料の厚さに基づく散乱等の影響を排除して、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００１４】
上記の態様において、前記制御部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度に基づいて、レーザ光の集光位置における試料の有無を判定することとしてもよい。
このようにすることで、蛍光検出部により検出した蛍光の強度が、所定の閾値以上の場合にその際のレーザ光の集光位置に試料が存在するものと判定し、所定の閾値未満の場合にその際のレーザ光の集光位置に試料が存在しないものと判定することができる。これにより、試料の存在する位置にのみレーザ光を集光させることができ、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
【００１５】
上記の態様において、前記制御部が、同一断面においてレーザ光の強度を調節して前記試料に複数回レーザ光を照射し、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度の変動値に基づいて、レーザ光の集光位置における試料の有無を判定することとしてもよい。
このようにすることで、蛍光の強度が変動した領域を標本の存在する領域として判定することができる。これにより、試料の有無判定において蛍光の強度に関する閾値を設定する必要を排除することができ、標本Ａの有無判定の精度を向上することができる。そして、標本Ａの有る位置にのみレーザ光を集光させることで、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
【００１６】
上記の態様において、前記レーザ光強度調節部が、前記蛍光検出部により検出した蛍光の強度が所定値以上の領域に対して、同一断面においてレーザ光の強度を低下させることとしてもよい。
このようにすることで、蛍光検出部により検出した蛍光の強度が所定値以上の領域（例えば輝度が飽和した領域）に対して、同一断面においてレーザ光の強度を低下させて、試料の各断面画像を取得することができる。これにより、各断面画像における輝度の飽和を防止することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００１７】
上記の態様において、前記レーザ光源が、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源であることとしてもよい。
このようにすることで、各集光位置のみから発生した蛍光を容易に検出して鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１８】
本発明の第２の態様は、試料に集光させたレーザ光を、その集光位置を深さ方向に変化させつつ、深さ方向に交差する方向に走査させて、各深さ位置における試料の断面画像を取得する観察方法であって、レーザ光の集光位置から発生した蛍光から、試料の断面画像を試料の表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した試料の断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する試料の断面画像の同一断面内におけるレーザ光の強度分布を調節し、蛍光の強度とレーザ光の集光位置とに基づいて試料の２次元的な蛍光画像を取得する観察方法である。
上記の態様において、前記次に取得する試料の断面画像の同一断面内で、領域毎に前記試料の表面からの深さに応じてレーザ光の強度を調節することとしてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、凹凸のある表面形状を有する試料に対しても、試料へのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の各実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡におけるレーザ光の調節方法を説明する図である。
【図３】図２のレーザ顕微鏡により取得される標本の各断面画像を示す図である。
【図４】標本が球体形状である場合において、図１のレーザ顕微鏡により取得される標本の各断面画像を示す図である。
【図５】標本の形状が経時変化する場合において、図１のレーザ顕微鏡により取得される標本の各断面画像を示す図である。
【図６】第２の変形例に係るレーザ顕微鏡において、標本の有無についての判定方法を説明する図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡により取得される標本の各断面画像を示す図である。
【図８】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡におけるレーザ光の調節方法を説明する図である。
【図９】本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡におけるレーザ光の調節方法を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、例えば、多光子励起現象を利用するレーザ顕微鏡であって、図１に示されるように、超短パルスレーザ光を出射するレーザ装置１０と、超短パルスレーザ光を２次元的に走査させるスキャナ（走査部）１４と、走査された超短パルスレーザ光を標本（試料）Ａに集光させる一方、標本Ａにおいて発生した蛍光を集める対物レンズ１５と、対物レンズ１５により集められた蛍光を超短パルスレーザ光から分岐するダイクロイックミラー１３と、分岐された蛍光を検出する検出器（蛍光検出部）１７とを備えている。
【００２２】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、レーザ装置１０（後述するＡＯＴＦ１２）、スキャナ１４および検出器１７を制御するコントロールユニット（制御部）１９と、コントロールユニット１９を介して各種の情報を記憶するメモリ（レーザ光強度記憶部）１８と、コントロールユニット１９により構築された多光子蛍光画像を表示するモニタ２０とを備えている。また、対物レンズ１５には、対物レンズ１５を光軸方向に沿って移動させるＺコントローラ（集光深さ調節部）１６が備えられている。Ｚコントローラ１６は、コントロールユニット１９により制御されるようになっている。
【００２３】
レーザ装置１０は、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源１１と、該レーザ光源１１から出射された超短パルスレーザ光の強度を調節するＡＯＴＦ（レーザ光強度調節部）１２とを備えている。
【００２４】
レーザ光源１１は、所定の強度の超短パルスレーザ光（以降では「レーザ光」という。）を出射するようになっている。ＡＯＴＦ１２は、例えば、音響光学素子により構成され、コントロールユニット１９からの指令により、スキャナ１４に入射させる超短パルスレーザ光の強度を調節するようになっている。
【００２５】
コントロールユニット１９は、各部を制御して、検出器１７により検出された標本Ａからの蛍光から標本Ａの断面画像を生成するとともに、生成した断面画像をモニタ２０に表示させるようになっている。また、コントロールユニット１９は、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得し、これらの断面画像の蛍光分布に基づいてＡＯＴＦ１２を制御して、レーザ光の強度を調節するようになっている。
【００２６】
具体的には、コントロールユニット１９は、検出器１７により検出した蛍光から、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得するとともに、過去に取得した標本Ａの断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する標本Ａの断面画像におけるレーザ光の強度分布を同一断面内で調節するように、ＡＯＴＦ１２を制御する。
【００２７】
上記のコントロールユニット１９による具体的な制御について、図２（ａ）から図２（ｈ）に示す具体例を参照して以下に説明する。
図２（ａ）から図２（ｈ）に示すように、コントロールユニット１９は、Ｚコントローラ１６を制御して、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得する。具体的には、図２（ｈ）に示すように、コントロールユニット１９は、標本Ａの表面に近い順、すなわち、第１面、第２面、第３面の順に標本Ａの断面画像を取得する。
【００２８】
まず、第１面の断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第１面の位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図２（ｂ）に示すように、標本Ａの全体に弱いレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図２（ａ）に示されている。図２（ａ）に示される画像において、標本Ａの第１面における断面画像が蛍光画像３１，３２として表わされている。
【００２９】
次に、第２面の断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第２面の位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図２（ｄ）に示すように、標本Ａの蛍光画像３１，３２に対応する領域に中程度の強度のレーザ光を照射するとともに、その他の領域に弱いレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図２（ｃ）に示されている。図２（ｃ）に示される画像において、標本Ａの第２面における断面画像が蛍光画像３３として表わされている。
【００３０】
次に、第３面の断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第３面の位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図２（ｆ）に示すように、標本Ａの蛍光画像３１，３２に対応する領域に強いレーザ光を照射するとともに、標本Ａの蛍光画像３３に対応する領域に中程度の強度のレーザ光を照射し、その他の領域に弱いレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図２（ｅ）に示されている。図２（ｅ）に示される画像において、標本Ａの第３面における断面画像が蛍光画像３４として表わされている。
【００３１】
上記のようにすることで、標本Ａの第１面、第２面、第３面の各断面において、レーザ光の強度分布が調節された断面画像がそれぞれ取得される。これにより、標本Ａの表面からの深さに応じて、レーザ光の強度分布が調節された標本Ａの断面画像が複数取得される。具体的には、各断面において、標本Ａの厚い部分は強く、標本Ａの薄い部分は弱くレーザ光を照射する。これにより、標本Ａが凹凸のある形状であったり、立体形状（例えば球体形状）である場合にも、各断面において一定輝度の蛍光画像が得られる。さらに、標本Ａの薄い部分に過度に強度の高いレーザ光を照射することを防止することができ、標本Ａへのダメージを抑えることができる。
【００３２】
なお、上記の例において、Ｚスライスのステップ（第１面、第２面、第３面の間隔）を５ｕｍとした場合における、第３面までのデータから計算した標本Ａの厚さの分布が図２（ｇ）に示されている。図２（ｇ）に示す例において、標本Ａは、蛍光画像３１，３２に対応する領域の厚さが１５ｕｍ、蛍光画像３３に対応する領域の厚さが１０ｕｍ、蛍光画像３４に対応する領域の厚さが５ｕｍとして示されている。
【００３３】
このように本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、標本Ａが立体的であり、組織の全体を観察したい場合に好適である。具体的な標本Ａとして、例えば、ＥＳ細胞、またはＩＰＳ細胞からの脳等、組織の発現段階、マウスの脳、ゼブラフィシュ等が想定される。
【００３４】
上記のように標本Ａの表面からの深さに応じたレーザ光の強度分布は、テーブルとしてメモリ１８に格納される。具体的には、メモリ１８は、各断面における、ＡＯＴＦ１２により調節されたレーザ光の強度と、レーザ光の焦点位置とを対応付けて記憶する。すなわち、メモリ１８は、ＡＯＴＦ１２により調節されたレーザ光の強度と、スキャナ１４によるレーザ光の走査位置およびＺコントローラ１６により調節されるレーザ光の集光位置とを対応付けて記憶する。
【００３５】
上記構成を有する本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いた観察方法について、以下に説明する。
大まかな流れとしては、まず、標本Ａのテスト測定を実施し、標本Ａの各断面にレーザ光を照射する。そして、このテスト測定において、前述のように、レーザ光の強度と標本Ａの表面からの距離とが対応付けられたテーブルを作成し、該テーブルをメモリ１８に記憶する。基本的にテーブルの作成方法は従来技術、特許文献１などに従うが、標本Ａの各断面にレーザ光を照射し、断面画像を確認する際、各断面の明るさが適性となるように表面からの距離に対応するレーザ強度のテーブルのパラメータを調節する。この作業を繰り返し、表面からの距離に対応するレーザ強度の適切なテーブルを作成する。その後、テスト測定により作成されてメモリ１８に記憶されたテーブルを用いて標本Ａの本測定を実施する。
【００３６】
上記の本測定の詳細について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて標本Ａの深さ方向に複数の蛍光画像を取得して行くには、まず、図３に示されるように、コントロールユニット１９によりＺコントローラ１６を制御して、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向、すなわち、断面Ｚ１からＺ５の順にその断面画像を順次取得する。そして、標本の断面Ｚ１からＺ５のそれぞれにおいて、レーザ光の強度分布が調節された標本Ａの断面画像をそれぞれ取得する。
【００３７】
具体的には、図２（ａ）から図２（ｈ）に示す例において、図２（ａ）に示す標本Ａの断面画像において、蛍光が検出された領域が符号３１，３２、蛍光が検出されなかった領域が符号３６で示されている。この場合、標本Ａの表面からの距離は、符号３１，３２で示す領域の方が、符号３６で示す領域よりも大きいこととなる。
【００３８】
この場合には、図２（ｃ）に示す次に取得する標本Ａの断面において、符号３１，３２で示す領域に照射するレーザ光の強度を、符号３６で示す領域に照射するレーザ光の強度よりも大きくする。これにより、同一断面（図２（ｃ）に示す断面画像）において、標本Ａの厚さに基づく散乱等の影響を排除して、均一な明るさの蛍光画像を取得することができる。
【００３９】
また、図２（ｃ）に示す標本Ａの断面画像において、蛍光が検出された領域が符号３１，３２，３３、蛍光が検出されなかった領域が符号３７で示されている。この場合、標本Ａの表面からの距離は、符号３１，３２で示す領域の方が、符号３３で示す領域よりも大きいこととなる。また、標本Ａの表面からの距離は、符号３３で示す領域の方が、符号３７で示す領域よりも大きいこととなる。
【００４０】
この場合には、図２（ｅ）に示す次に取得する標本Ａの断面において、符号３１，３２で示す領域に照射するレーザ光の強度を、符号３３で示す領域に照射するレーザ光の強度よりも大きくする。また、符号３３で示す領域に照射するレーザ光の強度を、符号３７で示す領域に照射するレーザ光の強度よりも大きくする。これにより、同一断面（図２（ｅ）に示す断面画像）において、標本Ａの厚さに基づく散乱等の影響を排除して、均一な明るさの蛍光画像を取得することができる。
【００４１】
本測定におけるレーザ強度は、標本Ａの表面からの距離に基づき、テスト測定により作成されてメモリ１８に記憶されたテーブルを用いて決定する。
【００４２】
具体的には、本測定において、コントロールユニット１９によりレーザ光の焦点位置（走査方向および深さ方向）に応じたレーザ光の強度がメモリ１８から読み出される。そして、読み出されたレーザ光の強度となるようにＡＯＴＦ１２が制御され、強度の調節されたレーザ光が、所望とする観察位置（焦点位置）に照射される。
【００４３】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、コントロールユニット１９により、標本Ａの断面画像が標本Ａの表面から深さ方向に順次取得されるとともに、ＡＯＴＦ１２により、過去に取得した標本Ａの断面画像における蛍光の強度分布に基づいて、次に取得する標本Ａの断面画像におけるレーザ光の強度分布が同一断面内で調節される（図２（ａ）から図２（ｈ）参照）。
【００４４】
このようにすることで、標本Ａの薄い領域に対して不必要に強いレーザ光が照射することを防止することができ、標本Ａにダメージを与えてしまうことや、取得した画像の輝度を飽和させてしまうことを防止することができる。すなわち、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、凹凸のある表面形状を有する標本Ａに対しても、標本Ａへのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、標本Ａの深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００４５】
また、レーザ光の強度とレーザ光の集光位置とを対応付けて記憶するメモリ１８を備えることで、標本Ａの深さ方向の各断面において、標本Ａの表面からの距離に応じてレーザ光の強度が調節されたテーブル（レーザ光の集光位置とレーザ光の強度とが対応づけられたテーブル）を作成して、メモリ１８に記憶することができる。そして、このテーブルに基づいて標本Ａの各断面画像を取得することで、標本Ａの厚さに基づく散乱等の影響を排除して、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００４６】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、図４に示すように、球体形状を有する標本Ａに対しても、標本Ａの表面からの深さに応じてレーザ光の強度を調節し、各断面におけるレーザ光の強度分布を調節して各断面画像を取得することができる。これにより、標本Ａへのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、標本Ａの深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００４７】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、図５に示すように、その形状が経時的に変化（形状Ｔ１から形状Ｔ２に変化）する標本Ａに対しても、それぞれの形状について標本Ａの表面からの深さに応じてレーザ光の強度を調節し、各断面におけるレーザ光の強度分布を調節して各断面画像を取得することができる。これにより、その形状が経時的に変化する標本Ａに対しても、標本Ａへのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、標本Ａの深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００４８】
［第１の変形例］
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の第１の変形例として、コントロールユニット１９が、検出器１７により検出した蛍光の強度に基づいて、レーザ光の集光位置における標本Ａの有無を判定することとしてもよい。
このようにすることで、検出器１７により検出した蛍光の強度が、所定の閾値以上の場合にその際のレーザ光の集光位置に標本Ａが存在するものと判定し、所定の閾値未満の場合にその際のレーザ光の集光位置に標本Ａが存在しないものと判定することができる。これにより、標本Ａが存在する位置にのみレーザ光を集光させることができ、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
【００４９】
［第２の変形例］
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の第２の変形例として、標本Ａの各断面において、レーザ光の強度を変えて複数回標本Ａからの蛍光強度を測定することとしてもよい。この場合において、図６に示すように、蛍光の変動量から、標本Ａの有無を認識することができる。すなわち、レーザ光の強度を変えた場合に、蛍光の強度が変動した領域には、標本Ａが存在すると判定することができる。一方、レーザ光の強度を変えた場合に、蛍光の強度が変動しない領域には、標本Ａが存在しないと判定することができる。
【００５０】
このように顕微鏡視野における標本Ａの存在する領域を判定することで、標本Ａの有無判定において所定の閾値を設定する必要を排除することができ、標本Ａの有無についての判定精度を向上することができる。これにより、標本Ａの有る位置にのみレーザ光を集光させることができ、蛍光画像の取得に要する時間および処理を軽減することができる。
【００５１】
［第２の実施形態］
以下に、第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡２について、図面を参照して説明する。以降では、本実施形態に係るレーザ顕微鏡について、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と共通する点については同一の符号を付して説明を省略し、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と異なる点について主に説明する。
【００５２】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡２は、図７に示すように、その形状が立体的であり、さらに組織の一部が蛍光を発するような標本Ａの観察に用いる。具体的な標本Ａとして、例えば、マウスやラットの脳、網膜の神経細胞、膵臓のランゲルハンス島等の観察等が想定される。
【００５３】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡２において、コントロールユニット１９は、各部を制御して、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得し、これらの断面画像の蛍光分布に基づいてＡＯＴＦ１２を制御して、レーザ光の強度を調節するようになっている。また、コントロールユニット１９は、各断面画像を２値化して明るいエリアを切り出し、明るいエリアにおいてレーザ光の強度を弱く設定し、次の画面のレーザ光の強度調節に反映させる。
【００５４】
上記のコントロールユニット１９による具体的な制御について、図８に示す具体例を参照して以下に説明する。
図８に示すように、コントロールユニット１９は、Ｚコントローラ１６を制御して、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得する。具体的には、コントロールユニット１９は、標本Ａの表面に近い順（第１面、第２面、第３面の順）に標本Ａの断面画像を取得する。
【００５５】
まず、第１面の断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第１面の位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図８（ｂ）に示すように、標本Ａの全体に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図８（ａ）に示されている。図８（ａ）に示される画像において、標本Ａの第１面における断面画像が蛍光画像４１，４２として表わされている。
【００５６】
次に、第２面の断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第２面の位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図８（ｄ）に示すように、標本Ａの全体に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図８（ｃ）に示されている。図８（ｃ）に示される画像において、蛍光画像４１は、輝度が飽和してしまっている。
【００５７】
次に、第３面の断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第３面の位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図８（ｆ）に示すように、標本Ａの蛍光画像４１に対応する領域に弱いレーザ光を照射するとともに、その他の領域に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図８（ｅ）に示されている。このようにすることで、図８（ｅ）に示される画像において、蛍光画像４１における輝度の飽和を防止することができる。
【００５８】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡２によれば、検出器１７により検出した蛍光の強度が所定値以上の領域（例えば輝度が飽和した領域）に対して、同一断面内においてレーザ光の強度を低下させて、標本Ａの各断面画像を取得することができる。これにより、各断面画像における輝度の飽和を防止することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００５９】
［第３の実施形態］
以下に、第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡３について、図面を参照して説明する。以降では、本実施形態に係るレーザ顕微鏡について、前述の実施形態に係るレーザ顕微鏡１，２と共通する点については同一の符号を付して説明を省略し、前述の実施形態に係るレーザ顕微鏡１，２と異なる点について主に説明する。
【００６０】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡３は、観察範囲が広範囲で、場所ごとに散乱状態が異なる標本Ａの観察に用いる。具体的な標本Ａとして、例えば、マウスの脳組織等が想定される。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡３は、標本Ａを載置するとともに、対物レンズ１５の光軸に直交する方向に移動可能なＸＹステージ（図示略）を有している。
【００６１】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡３において、コントロールユニット１９は、各部を制御して、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得し、これらの断面画像の蛍光分布に基づいてＡＯＴＦ１２を制御して、レーザ光の強度を調節するようになっている。また、コントロールユニット１９は、対物レンズ１５の視野毎（ＸＹステージの位置毎）に、レーザ光の焦点位置とレーザ光の強度とが対応付けられたテーブルを作成する。
【００６２】
上記のコントロールユニット１９による具体的な制御について、図９に示す具体例を参照して以下に説明する。
図９に示すように、コントロールユニット１９は、Ｚコントローラ１６を制御して、標本Ａの断面画像を標本Ａの表面から深さ方向に順次取得する。具体的には、コントロールユニット１９は、標本Ａの表面に近い順（第１面、第２面、第３面の順）に標本Ａの断面画像を取得する。また、コントロールユニット１９は、標本Ａの各断面（第１面、第２面、第３面）のそれぞれにおいて、ＸＹステージを移動し、異なる場所（ポジション１、ポジション２）の断面画像を取得する。
【００６３】
まず、ポジション１における標本Ａの断面画像を取得する。
第１面のポジション１における断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６およびＸＹステージを制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第１面のポジション１における位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させるとともに、ＸＹステージを対物レンズ１５の光軸に直交する方向に移動させる。この状態において、図９（ｂ）に示すように、標本Ａの全体に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図９（ａ）に示されている。図９（ａ）に示される画像において、標本Ａの第１面における断面画像が蛍光画像４１，４２として表わされている。
【００６４】
第２面のポジション１における断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第２面のポジション１における位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図９（ｄ）に示すように、標本Ａの全体に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図９（ｃ）に示されている。図９（ｃ）に示される画像において、蛍光画像４１は、輝度が飽和してしまっている。
【００６５】
第３面のポジション１における断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第３面のポジション１における位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図９（ｆ）に示すように、標本Ａの蛍光画像４１に対応する領域に弱いレーザ光を照射するとともに、その他の領域に中程度の強度のレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図９（ｅ）に示されている。このようにすることで、図９（ｅ）に示される画像において、蛍光画像４１における輝度の飽和を防止することができる。
【００６６】
次に、ポジション２における標本Ａの断面画像を取得する。
まず、第１面のポジション２における断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６およびＸＹステージを制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第１面のポジション２における位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させるとともに、ＸＹステージを対物レンズ１５の光軸に直交する方向に移動させる。この状態において、図９（ｈ）に示すように、標本Ａの全体に強いレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図９（ｇ）に示されている。図９（ｇ）に示される画像において、標本Ａの第１面における断面画像が蛍光画像５１，５２として表わされている。
【００６７】
次に、第２面のポジション２における断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第２面のポジション２における位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図９（ｊ）に示すように、標本Ａの全体に強いレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図９（ｉ）に示されている。図９（ｉ）に示される画像において、蛍光画像５２は、輝度が飽和してしまっている。
【００６８】
次に、第３面のポジション２における断面画像を取得する際には、Ｚコントローラ１６を制御して、対物レンズ１５の光軸方向の焦点位置が、標本Ａの第３面のポジション２における位置となるように、対物レンズ１５を光軸方向に移動させる。この状態において、図９（ｌ）に示すように、標本Ａの蛍光画像５２に対応する領域に中程度の強度のレーザ光を照射するとともに、その他の領域に強いレーザ光を照射して標本Ａの断面画像を取得する。この場合に取得された標本Ａの断面画像が図９（ｋ）に示されている。このようにすることで、図９（ｋ）に示される画像において、蛍光画像５２における輝度の飽和を防止することができる。
【００６９】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡３によれば、標本Ａの観察範囲が広い場合にも、ＸＹステージを移動させて異なる場所（ポジション１、ポジション２）について、それぞれの輝度が飽和した領域に対してレーザ光の強度を低下させて、標本Ａの各断面画像を取得することができる。これにより、標本Ａの観察範囲全体について、各断面画像における輝度の飽和を防止することができ、全ての集光位置において適正な蛍光観察を行うことができる。
【００７０】
以上、本発明の各実施形態および各変形例について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよい。
【００７１】
また、各実施形態において、多光子励起現象を利用する多光子励起型のレーザ顕微鏡を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、本発明を共焦点型のレーザ顕微鏡に適用してもよい。
【符号の説明】
【００７２】
Ａ  標本（試料）
１，２，３  レーザ顕微鏡
１０  レーザ装置
１１  レーザ光源
１２  ＡＯＴＦ（レーザ光強度調節部）
１３  ダイクロイックミラー
１４  スキャナ（走査部）
１５  対物レンズ
１６  Ｚコントローラ（集光深さ調節部）
１７  検出器（蛍光検出部）
１８  メモリ（レーザ光強度記憶部）
１９  コントロールユニット（制御部）
２０  モニタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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