(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８のアミノ酸配列を含むＦｃ含有ポリペプチドであって、Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３位および２６４位に突然変異を含み、該Ｆｃ含有ポリペプチドが、Ｆｃ領域内に、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり、そして、突然変異が、Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａであり、ここで、該番号付けがＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠しており、
ここで、シアル酸化Ｎ−グリカンのシアル酸残基がα−２，６結合により結合している、Ｆｃ含有ポリペプチド。
【請求項２】
該Ｆｃ含有ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも４７モル％が、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する、請求項１に記載のＦｃ含有ポリペプチド。
【請求項３】
該Ｆｃ含有ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも６６モル％が、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する、請求項１に記載のＦｃ含有ポリペプチド。
【請求項４】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に、以下の特性、すなわち、
ａ）低下したエフェクター機能、
ｂ）増強した抗炎症特性、
ｃ）増加したシアル酸化、
ｄ）非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
ｅ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下
の１以上を有する、請求項１〜３のいずれかの請求項に記載のＦｃ含有ポリペプチド。
【請求項５】
宿主細胞におけるＦｃ含有ポリペプチドの製造方法であって、
ａ）Ｆｃ含有ポリペプチドを産生するように遺伝的に操作された細胞を準備し、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そして、Ｆｃ領域内に、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり、該宿主細胞は、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域のアミノ酸位置２４３位および２６４位に突然変異をコードする核酸を含み、該突然変異がＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａであり、ここで、該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠しており、ここで、シアル酸化Ｎ−グリカンのシアル酸残基がα−２，６結合により結合しており、
ｂ）該Ｆｃ含有ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で該宿主細胞を培養し、
ｃ）該宿主細胞から該Ｆｃ含有ポリペプチドを単離することを含む、製造方法。
【請求項６】
全シアル酸化Ｎ−グリカンの量および比率が親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増加しているＮ−グリカン組成を該Ｆｃ含有ポリペプチドが有する、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
該Ｆｃ含有ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも４７モル％が、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
該Ｆｃ含有ポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも６６モル％が、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に、以下の特性、すなわち、
ａ）低下したエフェクター機能、
ｂ）増強した抗炎症特性、
ｃ）増加したシアル酸化、
ｄ）非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
ｅ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下
の１以上を有する、請求項６または７記載の製造方法。
【請求項１０】
Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する又は細胞傷害性を低下させる方法であって、ここで、Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そして、Ｆｃ領域内に、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するシアル酸化Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり、そしてここで、シアル酸化Ｎ−グリカンのシアル酸残基がα−２，６結合により結合しており、
該方法は、Ｆｃ領域の２４３位および２６４位に突然変異を導入することを含み、ここで、突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａであり、該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠しており、
そして、該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性または低下した細胞傷害性を有する、方法。
【請求項１１】
炎症状態の治療用医薬の製造における、請求項１に記載のＦｃ含有ポリペプチドの使用であって、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシル化タンパク質（糖タンパク質）、特に、ヒトまたは動物用治療剤として有用であるＦｃ含有ポリペプチドの製造のための製造方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、しばしば、２つの結合事象によりその治療利益をもたらす。第１に、抗体の可変ドメインが標的細胞上の特異的タンパク質、例えば癌細胞の表面上のＣＤ２０に結合する。抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合し、該抗体が結合した細胞を破壊するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のようなエフェクター細胞のリクルートメントが、これに続いて生じる。抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）として公知のこの過程は、ＩｇＧ１の重鎖のＦｃドメイン内のＡｓｎ２９７における特異的Ｎ−グリコシル化事象に依存している（Ｒｏｔｈｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３−１１２３（１９８９））。このＮ−グリコシル化構造を欠く抗体は抗体に尚も結合するが、ＡＤＣＣを引き起こすことができない。これは、ＮＫ細胞の表面上のＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａに対する抗体のＦｃドメインのアフィニティの低下の結果として生じるらしい。
【０００３】
Ｎ−グリコシル化の存在が抗体のエフェクター機能における役割を果たしているだけでなく、Ｎ結合オリゴ糖の個々の組成もその最終的な機能に重要である。フコースの欠如または二分岐Ｎ−アセチルグルコサミンの存在はＡＤＣＣの強度に正に相関されている（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），Ｕｍａｎａら，Ｎａｔ−Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０（１９９９），Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０（２００２）およびＳｈｉｎｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３））。Ｆｃ領域におけるシアル酸化が静脈内用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の抗炎症特性に対して正に相関するという証拠も存在する。例えば、Ｋａｎｅｋｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：６７０−６７３，２００６；ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎおよびＲａｖｅｔｃｈ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０４：１１−１５，２００７を参照されたい。
【０００４】
抗体の機能および効力における特異的Ｎ−グリコシル化の効用を考慮すると、Ｎ結合オリゴ糖の組成を修飾し、抗体のエフェクター機能を修飾するための方法が望ましいであろう。
【０００５】
酵母および他の真菌宿主は組換えタンパク質の製造のための重要な製造媒体である。酵母は真核生物であり、したがって、分泌経路内で生じる翻訳後修飾の多くを含む、高等真核生物と共通の進化的過程を有する。糖操作における最近の進歩は、ヒトにおけるグリコシル化の過程を模倣した一連の酵素反応を行うことを可能にする遺伝的に修飾されたグリコシル化経路を有する酵母株ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞系をもたらしている。例えば、ヒト対応物と実質的に同一である下等真核宿主細胞における組換え糖タンパク質の製造方法を記載している米国特許第７，０２９，８７２号、第７，３２６，６８１号および第７，４４９，３０８号を参照されたい。前記方法によりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されるものと同様のヒト様シアル酸化二分岐複合体Ｎ結合グリカンは治療用糖タンパク質の製造に関する有用性を示している。したがって、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母における抗体の製造を更に修飾または改善するための方法が望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概括
本発明は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３位および２６４位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドに関するものであり、ここで、２４３位の突然変異は、Ｆ２４３Ａ、Ｆ２４３Ｇ、Ｆ２４３Ｓ、Ｆ２４３Ｔ、Ｆ２４３Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｉ、Ｆ２４３Ｄ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３ＷおよびＦ２４３Ｋからなる群から選択され、２６４位の突然変異は、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４ＱおよびＶ２６４Ｌからなる群から選択され、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＴおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。
【０００７】
１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号９の重鎖アミノ酸配列またはその変異体を含む抗体である。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号９に挙げられている最後のリシン（Ｋ）残基を欠く配列番号９の重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。
【０００８】
１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１２の重鎖アミノ酸配列またはその変異体と配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列またはその変異体とを含む抗体である。
【０００９】
１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１５の重鎖アミノ酸配列またはその変異体と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列またはその変異体とを含む抗体である。
【００１０】
幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡならびにそれらの類似体および誘導体を含む）を含むＮ−グリカンを含む。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸のみを含む。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）もしくはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、シアル酸の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。
【００１１】
本発明のＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンは、所望により、フコースを含みうる。１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコシル化Ｎ−グリカンと非フコシル化Ｎ−グリカンとの混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコースを欠く。
【００１２】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性の１以上を有する：（ｉ）低下したエフェクター機能、（ｉｉ）増強した抗炎症特性、（ｉｉｉ）増加したシアル酸化、（ｉｖ）増強したバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）、ならびに（ｖ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８またはＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８）およびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較してエフェクター機能における少なくとも７、１０、１５、３０、５０、１００、５００または１０００倍の低下を伴う。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。
【００１３】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＡＤＣＣ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも７、１０、１５、３０、５０、１００、５００または１０００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも５００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも１０００倍の低下を伴う。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＣＤＣ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＣＤＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。
【００１５】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したアフィニティでＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８またはＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８）およびＦｃγＲＩＩＩｂに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも５０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩａに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも２０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩｂに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも１０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＦに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも１、２または１０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＶに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＶに結合する。
【００１６】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性を有する。
【００１７】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、非経口的に注入された場合に、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強したバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）を有する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、皮下に注入された場合に、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強したバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）を有する。
【００１８】
１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。
【００１９】
本発明はまた、（ｉ）Ｆｃ含有ポリペプチドを産生するように遺伝的に操作された宿主細胞を準備し（ここで、該宿主細胞は、アミノ酸位置２４３位および２６４位に突然変異をコードする核酸を含み、２４３位の突然変異は、Ｆ２４３Ａ、Ｆ２４３Ｇ、Ｆ２４３Ｓ、Ｆ２４３Ｔ、Ｆ２４３Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｉ、Ｆ２４３Ｄ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３ＷおよびＦ２４３Ｋからなる群から選択され、２６４位の突然変異は、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４ＱおよびＶ２６４Ｌからなる群から選択され、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）、（ｉｉ）該Ｆｃ含有ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で該宿主細胞を培養し、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該Ｆｃ含有ポリペプチドを単離することを含む、宿主細胞におけるＦｃ含有ポリペプチドの製造方法を含む。１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸はＦ２４３ＬおよびＶ２６４Ａをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇをコードしている。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。
【００２０】
１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を哺乳類細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を植物細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を細菌において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を昆虫細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を下等真核細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法を酵母細胞において実施する。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの製造方法をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において実施する。
【００２１】
１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡならびにそれらの類似体および誘導体を含む）を含むＮ−グリカンを含む。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも４０モル％、７０モル％または９０モル％がシアル酸化されている（ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から選択される構造を有する）、Ｎ−グリカン組成を有する。１つの実施形態においては、該抗体上のＮ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。もう１つの実施形態においては、該抗体上のＮ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。もう１つの実施形態においては、該抗体上のＮ−グリカンの少なくとも６６モル％が構造ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。もう１つの実施形態においては、該抗体上のＮ−グリカンの少なくとも６６モル％が構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸のみを含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、該シアル酸上の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。
【００２２】
特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンは、所望により、フコースを含みうる。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコシル化Ｎ−グリカンと非フコシル化Ｎ−グリカンとの混合物を含む。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはフコースを欠く。
【００２３】
１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、全シアル酸化Ｎ−グリカンの量および比率が親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増加している、Ｎ−グリカン組成を有する。
【００２４】
幾つかの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性の１以上を有する：（ｉ）低下したエフェクター機能、（ｉｉ）増強した抗炎症特性、（ｉｉｉ）増加したシアル酸化、（ｉｖ）増強したバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）、ならびに（ｖ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較してエフェクター機能における少なくとも７、１０、１５、３０、５０、１００、５００または１０００倍の低下を伴う。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。
【００２５】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＡＤＣＣ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも７、１０、１５、３０、５０、１００、５００または１０００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも５００倍の低下を伴う。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＡＤＣＣ活性における少なくとも１０００倍の低下を伴う。
【００２６】
もう１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したＣＤＣ活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＣＤＣ活性における少なくとも１００倍の低下を伴う。
【００２７】
１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したアフィニティでＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８またはＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８）およびＦｃγＲＩＩＩｂに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも５０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩａに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも２０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩｂに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも１０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＦに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して少なくとも１、２または１０倍低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＶに結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したアフィニティでＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＶに結合する。
【００２８】
１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性を有する。
【００２９】
１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、非経口的に注入された場合に、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強したバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）を有する。１つの実施形態においては、特許請求している方法により製造されるＦｃ含有ポリペプチドは、皮下に注入された場合に、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強したバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）を有する。
【００３０】
１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。
【００３１】
本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドのエフェクター機能を低下させる方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇをコードしている。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。
【００３２】
本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｆａｃｔ  ＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣまたは前記分子のいずれかに対する受容体からなる群から選択される抗原に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。
【００３３】
本発明はまた、炎症の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、該Ｆｃ領域の２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｆａｃｔ  ＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣまたは前記分子のいずれかに対する受容体からなる群から選択される抗原に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＦ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドはＶ２６４Ａ突然変異を含む。
【００３４】
本発明はまた、炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法を含み、該方法は、２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＰ、ＡＴＰ６ｖ０ｄ２、ＭＤＬ−１、ＤＡＰ１２、ＣＤ１１ｂ、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ９、ＣＴＳＫ、ＰＵ−１、ＭＣＰ１，ＭＩＰ１α、Ｃｘｃｌ１−Ｇｒｏａ、ＣＸｃｌ２−Ｇｒｏｂ、ＣＤ１８、ＴＮＦ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶからなる群から選択される遺伝子の発現を低下させる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎをコードしている。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇをコードしている。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは非経口投与される。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは皮下投与される。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、炎症状態の治療に有用な抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｆａｃｔ  ＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣまたは前記分子のいずれかに対する受容体からなる群から選択される抗原に結合する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。
【００３５】
本明細書に開示するもう１つの発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関するものであり、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも７０％は、ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるオリゴ糖構造を含み、該Ｆｃ含有ポリペプチドは該Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含む。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇである。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＬおよびＶ２６４Ａである。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎである。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇである。１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。もう１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸のみを含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、該シアル酸上の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。
【００３６】
本明細書に開示するもう１つの発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関するものであり、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも７０％は、ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるオリゴ糖構造を含み、ここで、該シアル酸残基は専らα−２，６結合により結合しており、該Ｎ−グリカンはフコースを欠き、該Ｆｃ含有ポリペプチドは該Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含む。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇである。もう１つの実施形態においては、該核酸は突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇをコードしている。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＬおよびＶ２６４Ａである。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎである。もう１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇである。１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。もう１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，３およびα−２，６結合シアル酸の混合物を含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸のみを含む。もう１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはα−２，６結合シアル酸を含み、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸を含まない。１つの実施形態においては、該シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）またはそれらの混合物である。もう１つの実施形態においては、該シアル酸は、該シアル酸上の９位にアセチル化を含有するＮＡＮＡまたはＮＧＮＡの類似体または誘導体である。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンはＮＡＮＡを含み、ＮＧＮＡを含まない。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１９を含む抗体フラグメントである。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９からなる（または実質的になる）抗体フラグメントである。
【００３７】
本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含むＦｃ含有ポリペプチドを含み、ここで、該重鎖は配列番号９のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体を含み、ここで、該変異体は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に以下の特性の１以上を有する：低下したエフェクター機能、増強した抗炎症特性、増加したシアル酸化、非経口投与された場合のバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）の増強、ならびにＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下。本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含むＦｃ含有ポリペプチドを含み、ここで、該重鎖は配列番号１２のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖は配列番号１１のアミノ酸配列またはその変異体を含み、ここで、該変異体は、配列番号１０の重鎖アミノ酸配列と配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に以下の特性の１以上を有する：低下したエフェクター機能、増強した抗炎症特性、増加したシアル酸化、非経口投与された場合のバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）の増強、ならびにＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含むＦｃ含有ポリペプチドを含み、ここで、該重鎖は配列番号１５のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖は配列番号１４のアミノ酸配列またはその変異体を含み、ここで、該変異体は、配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に以下の特性の１以上を有する：低下したエフェクター機能、増強した抗炎症特性、増加したシアル酸化、非経口投与された場合のバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）の増強、ならびにＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の低下。１つの実施形態においては、該変異体は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個まで又はそれ以上の連続的または非連続的アミノ酸置換を含む。１つの実施形態においては、該変異体は、特許請求している配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む。
【００３８】
本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位の突然変異または２６４位の突然変異（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。本発明はまた、炎症の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位の突然変異または２６４位の突然変異（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｖ２６４Ａを含む。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。
【００３９】
本発明はまた、炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法を含み、該方法は、２４３位の突然変異または２６４位の突然変異（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドを非経口投与する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドを皮下投与する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｖ２６４Ａを含む。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。
【００４０】
前記実施形態のいずれにおいても、抗炎症活性の増強は、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて検出されうる。１つの実施形態においては、抗炎症活性の増強は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＰ、ＡＴＰ６ｖ０ｄ２、ＭＤＬ−１、ＤＡＰ１２、ＣＤ１１ｂ、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ９、ＣＴＳＫ、ＰＵ−１、ＭＣＰ１，ＭＩＰ１α、Ｃｘｃｌ１−Ｇｒｏａ、ＣＸｃｌ２−Ｇｒｏｂ、ＣＤ１８、ＴＮＦ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶからなる群から選択される遺伝子の発現の低下を測定することにより検出される。
【００４１】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる「Ｇ０」なる語は、ガラクトースもフコースも含有しない複合二分岐オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。
【００４２】
本明細書中で用いる「Ｇ１」なる語は、フコースを含有せず１個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。
【００４３】
本明細書中で用いる「Ｇ２」なる語は、フコースを含有せず２個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。
【００４４】
本明細書中で用いる「Ｇ０Ｆ」なる語は、コアフコースを含有しガラクトースを含有しない複合二分岐オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆを意味する。
【００４５】
本明細書中で用いる「Ｇ１Ｆ」なる語は、コアフコースおよび1個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆを意味する。
【００４６】
本明細書中で用いる「Ｇ２Ｆ」なる語は、コアフコースおよび２個のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆを意味する。
【００４７】
本明細書中で用いる「Ｍａｎ５」なる語は、以下に示すオリゴ糖構造を意味する。
【００４８】
【化１】
0005956982.tif 000002
本明細書中で用いる「ＧＦＩ５．０」なる語は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。
【００４９】
本明細書中で用いる「ＧＦＩ６．０」なる語は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。
【００５０】
本明細書中で用いる「ＧＳ５．０」なる語はＮ−グリコシル化構造Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味する。
【００５１】
本明細書中で用いる「ＧＳ５．５」なる語は、Ｎ−グリコシル化構造ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味し、これは、α２，６シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，６結合シアル酸を与え、α２，３シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，３結合シアル酸を与える。
【００５２】
本明細書中で用いる「ＧＳ６．０」なる語は、Ｎ−グリコシル化構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を意味し、これは、α２，６シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，６結合シアル酸を与え、α２，３シアリルトランスフェラーゼが糖操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された場合にはα２，３結合シアル酸を与える。
【００５３】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株に関して本明細書中で用いる「野生型」または「ｗｔ」なる語は、グリコシル化を制御するための遺伝的修飾に付されていない天然ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。
【００５４】
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的抗原に結合しうる免疫グロブリン分子を意味する。本明細書中で用いる該用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの同一ペアのポリペプチド鎖［各ペアは１つの「軽」鎖（ＬＣ）（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（ＨＣ）（約５０〜７０ｋＤａ）を有する］からなる完全ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および免疫グロブリン分子のいずれかの他の修飾形態（ＣＨ２ドメインのＮ結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの少なくとも一部と抗原認識部位とを含むもの）、またはそれらの変異体をも含む。本明細書中で用いる該用語は、それぞれＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのようないずれかのクラスの抗体を含む。
【００５５】
本明細書中で用いる「ＣＨ２のコンセンサス配列」なる語は、種々の抗体のＣＨ２ドメインにおいて見出される最も共通しているアミノ酸配列に由来するＮ結合グリコシル化部位を含有する重鎖定常領域のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を意味する。
【００５６】
「Ｆｃ領域」なる語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を示すために用いられる。「Ｆｃ領域」は天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々でありうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端に伸長すると定められる。免疫グロブリンのＦｃ領域は２つの定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含み、所望により、ヒンジ領域を含みうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ領域は配列番号１９のアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ領域は、５’末端におけるリシン（Ｋ）残基の付加を伴う配列番号１８のアミノ酸配列を含む。該Ｆｃ領域は、抗体の完全長重鎖のＡｓｎ２９７部位に対応するＣｈドメインにおける単一のＮ結合グリコシル化部位を含有する。
【００５７】
「Ｆｃ含有ポリペプチド」なる語は、Ｆｃ領域を含む、例えば抗体またはイムノアドヘシンのようなポリぺプチドを意味する。この用語は、Ｆｃ領域を含む又はＦｃ領域からなる（または実質的になる）ポリペプチドを含む。Ｆｃ領域を含むポリペプチドは抗体のパパイン消化または組換えＤＮＡ技術により製造されうる。
【００５８】
本明細書中で用いる「親抗体」、「親免疫グロブリン」または「親Ｆｃ含有ポリペプチド」なる語は、本明細書に開示されているＦｃ領域突然変異を欠く抗体またはＦｃ含有ポリペプチドを意味する。親Ｆｃ含有ポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域、または既存アミノ酸配列修飾を含有するＦｃ領域を含みうる。天然配列Ｆｃ領域は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列Ｆｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびに天然で見出されるそれらの変異体を含む。親抗体または親Ｆｃ含有ポリペプチドは、比較手段として使用される場合、いずれかの細胞内で発現されうる。１つの実施形態においては、親抗体または親Ｆｃ含有ポリペプチドは本発明のＦｃ含有ポリペプチドと同じ細胞内で発現される。
【００５９】
本明細書中で用いる「イムノアドヘシン」なる語は、免疫グロブリン定常ドメインと異種「アドヘシン」タンパク質（例えば、受容体、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」とを併せ持つ抗体様分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（抗原合体部位）以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。本明細書中で用いる「リガンド結合ドメイン」なる語は、いずれかの天然細胞表面受容体、または対応天然受容体の少なくとも定性的リガンド結合能を保有するそのいずれかの領域もしくは誘導体を意味する。特定の実施形態においては、該受容体は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドからのものである。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、この定義に尚も明確に含まれる他の受容体としては、サイトカインに対する受容体、特に、チロシンキナーゼ活性を有する受容体（受容体チロシンキナーゼ）、ヘマトポエチンおよび神経成長因子のメンバー（問題の障害に哺乳動物が罹患する素因を与えるもの）が挙げられる。１つの実施形態においては、該障害は癌である。イムノアドヘシンの製造方法は当技術分野でよく知られている。例えば、ＷＯ００／４２０７２を参照されたい。
【００６０】
本明細書中で用いる「Ｈｅｒ２」または「Ｈｅｒ２抗体」なる語は、哺乳類細胞（すなわち、ＣＨＯ細胞）において製造されたトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）として公知の商業的に入手可能なＨｅｒ２抗体のものに類似したアミノ酸配列を有する抗体を意味する。
【００６１】
本明細書中で用いる「ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）Ｈｅｒ２抗体」または「ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）抗Ｈｅｒ２抗体」なる語は、糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造された商業的に入手可能なＨｅｒ２抗体（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））のものに類似したアミノ酸配列を有する抗体を意味する。
【００６２】
本明細書中で用いる「Ｆｃ突然変異タンパク質抗体」なる語は、本明細書に記載されている単一Ｆｃ突然変異タンパク質または二重Ｆｃ突然変異タンパク質の１つを含む抗体を意味する。
【００６３】
本明細書中で用いる「Ｆｃ突然変異タンパク質」なる語は、Ｆｃ領域に１以上の点突然変異が施されているＦｃ含有ポリペプチドを意味する。
【００６４】
本明細書中で用いる「Ｆｃ突然変異」なる語は、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域に施された突然変異を意味する。そのような突然変異の例には、本明細書に記載されているＦ２４３ＡまたはＶ２６４Ａ突然変異が含まれる。
【００６５】
本明細書中で用いる「単一Ｆｃ突然変異タンパク質」なる語は、Ｆｃ領域の２４３位または２６４位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドを意味する。「Ｆ２４３Ａ」なる語はＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域の２４３位におけるＦ（野生型）からＡへの突然変異を意味する。「Ｖ２６４Ａ」はＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域の２６４位におけるＶ（野生型）からＡへの突然変異を意味する。２４３位および２６４位はＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域のＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸位置を表す。
【００６６】
本明細書中で用いる「二重Ｆｃ突然変異タンパク質」なる語は、Ｆｃ領域の２４３位および２６４位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドを意味する。「Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ」なる語は、２つの特定されている突然変異を含む二重Ｆｃ突然変異タンパク質を意味する。
【００６７】
本明細書および特許請求の範囲の全体において、免疫グロブリン重鎖またはＦｃ含有ポリペプチドにおける残基の番号は、Ｋａｂａｔｉら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）（これを参照により明示的に本明細書に組み入れることとする）におけるものと同様のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
【００６８】
本明細書中で用いる「エフェクター機能」なる語は、Ｆｃ受容体またはリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用から生じる生化学的事象を意味する。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、当技術分野で公知の種々のアッセイを用いて評価されうる。
【００６９】
本明細書中で用いる「糖操作（された）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）」なる語は、ヒト様Ｎ−グリカンを発現するように遺伝的に改変されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株、例えば前記のＧＦＩ５．０、ＧＦＩ５．５およびＧＦＩ６．０株を意味する。
【００７０】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」、「糖タンパク質」および「グリコフォーム（糖形態）」なる語は、Ｎ結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ結合オリゴ糖を意味する。糖タンパク質上に見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（ＳＡ、例えばＮＡＮＡ、ＮＧＮＡならびにそれらの誘導体および類似体、例えばアセチル化ＮＡＮＡまたはアセチル化ＮＧＮＡ）が挙げられる。糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においては、シアル酸は専らＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６））。Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有し、ここで、「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小（ｐａｕｃｉ）マンノースコア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の株において異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐（分枝）構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。
【００７１】
本明細書中で用いる「シアル酸」または「ＳＡ」なる語は、限定的ではないが以下のものを含むシアル酸ファミリーのいずれかのメンバーを意味する：Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）およびそれらのいずれかの類似体または誘導体（該シアル酸分子上のいずれかの位置におけるアセチル化により生じるものを含む）。シアル酸は、多数の複合糖質の必須成分である約３０個の天然に存在する酸性炭水化物のグループに関する一般名である。Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１１，２７０−２７１（１９８３）。シアル酸は、通常、オリゴ糖の末端残基である。Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）は最も一般的なシアル酸形態であり、Ｎ−グリコノイラミン酸（ＮＧＮＡ）はそれに続く第２の一般的な形態である。Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１，４４９−４５２（１９９１）。ＮＧＮＡは動物界全体に広範囲に広まっており、種および組織に応じて、しばしば、複合糖質結合シアル酸の相当な割合を占める。ある種、例えばニワトリおよびヒトは例外的である。なぜなら、それらは正常組織においてＮＧＮＡを欠くからである。Ｃｏｒｆｉｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１０，５−５０（１９８２）。ヒト血清サンプルにおいては、ＮＧＮＡの形態のシアル酸の割合は全シアル酸の０．０１％であると報告されている。Ｓｃｈａｕｅｒ，“Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ”［Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）中に見出される］。
【００７２】
本明細書中で用いる「ヒト様Ｎ−グリカン」なる語は、未操作野生型ヒト細胞により産生されるオリゴ糖に酷似しているＮ結合オリゴ糖を意味する。例えば、野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の下等真核細胞は、典型的に、Ｎ−グリコシル化部位における高マンノシル化タンパク質を産生する。本明細書に記載されている宿主細胞は、高マンノシル化されていないヒト様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質（例えば、抗体）を産生する。幾つかの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、ハイブリッドおよび／または複合Ｎ−グリカンを伴うヒト様Ｎ−グリカンを産生しうる。本発明の宿主細胞から産生される個々の糖タンパク質上に存在する個々のタイプの「ヒト様」グリカンは、該宿主細胞において行われる個々の糖操作工程に左右されるであろう。
【００７３】
本明細書中で用いる「高マンノース」型Ｎ−グリカンなる語は、５個以上のマンノース残基を有するＮ−グリカンを意味する。
【００７４】
本明細書中で用いる「複合」型Ｎ−グリカンなる語は、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有するＮ−グリカンを意味する。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」が挙げられ、ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されることがあるガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をも有しうる。複合Ｎ−グリカンは、コアフコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換をも有しうる。一例として、Ｎ−グリカンがトリマンノースコア上に二分岐ＧｌｃＮＡｃを含む場合、該構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｌｃＮＡｃ）またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３と表されうる。Ｎ−グリカンが、トリマンノースコアに結合したコアフコースを含む場合、該構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）と表されうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。
【００７５】
本明細書中で用いる「ハイブリッド」Ｎ−グリカンなる語は、「トリマンノース」コアの１，３マンノースアームの末端における少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上の０個以上のマンノースとを有するＮ−グリカンを意味する。
【００７６】
糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モル％（モル百分率）」に言及する場合、この用語は、該タンパク質調製物をＰＮＧアーゼで処理し、ついで、グリコフォーム組成物により影響されない方法（例えば、ＰＮＧアーゼにより遊離したグリカンプールを２−アミノベンズアミドのような蛍光タグで標識し、ついで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離し、ついで蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量した場合に遊離したＮ結合オリゴ糖のプール内に存在する特定のグリカンのモル％を意味する。例えば、５０モル％のＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、遊離したグリカンの５０％がＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であり、残りの５０％が他のＮ結合オリゴ糖から構成されることを意味する。
【００７７】
本明細書中で用いる「抗炎症抗体」なる語は、炎症を治療するために使用されることが意図される抗体を意味する。Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて測定されうる。１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、動物モデル、例えば、Ｋａｎｅｋｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０−６７３（２００６），Ａｎｔｈｏｎｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７３−３７６（２００８）および本明細書中の実施例２０〜２１に記載されているモデルを使用して測定される。もう１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、炎症に関連した生物マーカー（限定的なものではないが以下のものを含む：ＣＲＰ、炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−アルファ）、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン６（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ケモカイン、凝血マーカーＤ−二量体、ｓＣＤ１４、腸脂肪酸結合ペプチド（ＩＦＡＢＰ）およびヒアルロン酸）のレベルを決定することにより測定される。１つの実施形態においては、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性は、当技術分野で公知の方法を用いてＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを決定することにより測定される。Ｃ−反応性タンパク質のレベルの減少は、該Ｆｃ含有ポリペプチドが抗炎症特性を有することを示している。
【００７８】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸と置換されることを意味し、この場合、該変化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させずに施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照されたい）。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を以下に列挙する。
【００７９】
【表１】
0005956982.tif 000003
Ｆｃ領域Ａｓｎ２９７（ＥＵ付番系に準拠）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のグリコシル化は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含むエフェクター経路の最適な認識および活性化に必要であることが示されている。Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：２６−３１（１９９７），Ｔａｏ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３（８）：２５９５−２６０１（１９８９）。したがって、ＩｇＧの定常領域におけるグリコシル化操作は治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発のための活発な研究の領域になっている。Ａｓｎ２９７におけるＮ結合グリコシル化の存在は、ＡＤＣＣ（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），Ｌｉｆｅｌｙら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５：８１３−８２２（１９９５），Ｕｍａｎａ（１９９９），Ｓｈｉｅｌｄｓ（２００２）およびＳｈｉｎｋａｗａ（２００３））および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，２１（６）：１６４４−１６５２（２００５）およびＪｅｆｆｅｒｉｓら，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６５：１１１−１２８（１９９７））を含む免疫エフェクター機能アッセイにおけるｍＡｂ活性に決定的に重要であることが確認されている。機能に対するこの効果は、グリコシル化Ｆｃドメインがとる特異的コンホメーションによるものであると考えられており、これは、グリコシル化が存在しない場合には欠如しているようである。より詳しくは、Ｆｃ  ＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化を欠くＩｇＧは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含むＦｃγＲに結合しない（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９））。
【００８０】
抗体のエフェクター機能においてはグリコシル化の存在が何らかの役割を果たしているようであるが、それだけではなく、Ｎ結合オリゴ糖の個々の組成も重要である。例えば、フコースの存在はインビトロＦｃγＲＩＩＩａ結合およびインビトロＡＤＣＣに対して顕著な効果を示す（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９）およびＬｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１００−２１５（２００６））。哺乳類細胞培養、例えばＣＨＯまたはＮＳ０により産生される組換え抗体は、主にフコシル化されているＮ結合オリゴ糖を含有する（Ｈｏｓｓｌｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５（５）：９４６−９６０（２００６），Ｕｍａｎａ（１９９９）およびＪｅｆｆｅｒｉｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１１−１６（２００５））。また、Ｆｃ領域におけるシアル酸化が抗体に抗炎症特性を付与しうるという証拠が存在する。シアル酸化形態を富化するためにレクチンカラムで精製された静脈内用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、シアル酸化Ｆｃフラグメントに限定された顕著な抗炎症効果を示し、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂの発現の増強に関連づけられた（ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎおよびＲａｖｅｔｃｈ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１１−１５（２００７））。
【００８１】
哺乳類細胞系に由来する抗体のＦｃ領域におけるグリコシル化は、典型的に、グリコフォームの異種混合物からなり、主要形態は、典型的に、複合フコシル化グリコフォーム、すなわち、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆおよびそれらより低い割合ではあるがＧ２Ｆから構成される。Ｇ０Ｆ構造への不完全なガラクトース転移を引き起こす考えられうる状態には、限定的なものではないが、非最適化ガラクトース転移装置（例えば、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ）、およびゴルジ装置内への劣悪なＵＤＰ−ガラクトース輸送、最適未満の細胞培養およびタンパク質発現条件、ならびに該オリゴ糖に隣接するアミノ酸残基による立体障害が含まれる。これらの状態のそれぞれは末端ガラクトースの最終的な度合を調節しうるが、Ｆｃオリゴ糖への後続のシアル酸転移は、ＣＨ２ドメインの、閉じたポケット立体配置により抑制されると考えられている。例えば、図１、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４（１０）：１２３０−１２３１，２００６を参照されたい。適正な末端単糖、特にガラクトースの非存在下または不十分な末端ガラクトシル化形態の存在下では、治療用タンパク質として作用しうるシアル酸化形態を産生する可能性は、シアリルトランスフェラーゼの存在下で産生された場合であっても、ほとんどない。ヒトＩｇＧ−Ｆｃグリコフォームのタンパク質工学および構造分析は、グリコシル化プロファイルがＦｃコンホメーションにより影響されることを示している。例えば、ＣＨＯ産生ＩｇＧ３由来のオリゴ糖上のガラクトースおよびシアル酸のレベルの増加は、Ｆｃポケットからの特定のアミノ酸が、Ｆ２４１、Ｆ２４３、Ｖ２６４、Ｄ２６５およびＲ３０１を含むアラニンに突然変異した場合に生じうることが見出された（Ｌｕｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（１１）；４９６３−４９６９（１９９６））。或る突然変異は細胞媒介性スーパーオキシド生成および補体媒介性赤血球溶解（これらは、それぞれ、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑ結合に関する代替マーカーとして用いられる）に何らかの影響を及ぼすことが更に示された。
【００８２】
高度に均一なグリコシル化を伴う糖タンパク質を分泌しうる宿主株を得るために酵母を遺伝的に操作することが報告されている。Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  １００（９）：５０２２−５０２７（２００３）は、α１，２マンノシダーゼ触媒ドメインおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインのライブラリーを、触媒ドメインを分泌経路に局在化する真菌ＩＩ型膜タンパク質リーダー配列のライブラリーと組合せて使用することを記載している。このようにして、均一なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造を有するインビボ糖タンパク質を産生する株が単離された。Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６）は、主としてビシアル酸化グリカン構造体ＧＳ６．０，ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（９０．５％）およびモノシアル酸化体ＧＳ５．５，ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（７．９％）からなるグリカン組成を有するものとしてピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された糖タンパク質エリスロポエチンの製造を記載している。しかし、類似株において産生される抗体は、それより著しく低いシアル酸化Ｎ−グリカン含量を有するであろう。なぜなら、図４において見られるとおり、該抗体においては末端ガラクトース基質のレベルが相対的に低いからである。また、Ｆｃオリゴ糖のシアル酸化は治療用静脈内用ガンマグロブリンおよびそのＦｃフラグメントに抗炎症特性を付与することＫａｎｅｋｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７８７）：６７０−６７３（２００６））、ならびに該抗炎症活性はシアル酸のα２，６−結合形態には依存するが、α２，３形態には依存しないこと（Ａｎｔｈｏｎｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７３−３７６（２００８））が最近示されている。
【００８３】
宿主生物および細胞系
本発明のＦｃ含有ポリペプチドはいずれかの宿主生物または細胞系において製造されうる。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生しうる宿主細胞において製造される。
【００８４】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは哺乳類細胞において製造されることが可能であり、この場合、該細胞は、内因的に又は遺伝的もしくはプロセス操作により、末端α２−６およびα２−３シアル酸の混合物または末端α２−６シアル酸のみを含有する糖タンパク質を産生する。培養（組織培養）における哺乳利細胞の増殖は常套手段となっている。有用な哺乳類宿主細胞系の具体例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎系（懸濁培養内での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）；乳児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ハイブリドーマ細胞系；ＮＳ０；ＳＰ２／０；およびヒト肝癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【００８５】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように操作された植物細胞において製造されうる。例えば、Ｃｏｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）２４，１５９１−１５９７（２００６）およびＣａｓｔｉｌｈｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２１）：１５９２３−１５９３０（２０１０）を参照されたい。
【００８６】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように操作された昆虫細胞において製造されうる。例えば、ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＪａｒｖｉｓ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６８：１５９−９１（２００６）を参照されたい。
【００８７】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ−グリカンを産生するように操作された細菌細胞において製造されうる。例えば、Ｌｉｚａｋら，Ｂｉｏｃｏｎｉｕｅａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２２：４８８−４９６（２０１１）を参照されたい。
【００８８】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは下等真核宿主細胞または生物において製造されうる。最近の進歩は、下等真核宿主生物、酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における完全ヒト化治療用物質の製造を可能にしている（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする））。Ｊａｃｏｂｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４（１）：５８−７０（２００９）も参照されたい。本出願人は、本発明において、重鎖のＦｃ領域内の２４３位および２６４位のアミノ酸に対する２つの突然変異を含む抗体を発現しうる修飾ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主生物および細胞系を更に開発した。これらの突然変異を有する抗体は、親抗体と比較した場合に、α２，６結合シアル酸化Ｎ−グリカンのレベルの上昇およびより均一な組成を有していた。本出願人はまた、驚くべきことに、重鎖のＦｃ領域内のアミノ酸２４３位および２６４位における突然変異が、全てのＦｃγ受容体への結合の低下およびＣ１ｑ結合の低下を伴う抗体を与えることを見出した。その前者はＡＤＣＣの代替物であり、これはα２，６−結合シアル酸のレベルの減少には左右されなかった。したがって、末端α２，６結合シアル酸Ｎ−グリカンのレベルの増加およびより高い均一性に基づけば、親抗体と比較して増強した抗炎症特性を有する組換えグリコシル化抗体を下等真核細胞、例えば酵母および糸状菌、特にピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造するために本明細書に記載の材料および方法が使用可能である、と当業者は認識し理解するであろう。
【００８９】
ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合の低下に基づけば、親抗体と比較して低下したエフェクター機能を有する組換えグリコシル化抗体を製造するために本明細書に記載の材料および方法が使用可能である。このようにして本発明の方法によりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造される抗体は、特異的Ｆｃ突然変異を欠く糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞において又は自らの内在性グリコシル化装置を保有するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞において製造された抗体と比較して、エフェクター機能の低下を伴って高収率で製造され、末端α２，６結合シアル酸残基を有する糖タンパク質の主要種を有していた。
【００９０】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、末端シアル酸を含む主要Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作された宿主細胞、特に酵母または糸状菌宿主細胞において製造される。本発明の１つの実施形態においては、該主要Ｎ−グリカンは、いずれのα２，３結合シアル酸をも産生しない、α２，６シアリルトランスフェラーゼで糖操作された株において産生されるＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のα２，６結合形態である。他の実施形態においては、該株は、α２，３シアリルトランスフェラーゼを単独で又はα２，６シアリルトランスフェラーゼと共に発現してα２，３結合シアル酸またはα２，６結合シアル酸とα２，３結合シアル酸との組合せ体を主要Ｎ−グリカンとして産生するように操作される。
【００９１】
本発明のＦｃ含有ポリペプチドを製造するために使用される細胞系は、いずれかの細胞系、例えば、１以上のシアル酸化糖タンパク質を産生する能力を有する細胞系でありうる。本明細書に記載の材料および方法は、本明細書中に一例として記載されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の特定の株には限定されず、例えばＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３のような１以上の末端ガラクトースを有するＮ−グリカンを産生するあらゆるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株または他の酵母もしくは糸状菌株を含む、と当業者は認識し理解するであろう。該末端ガラクトースはα２，６結合シアル酸の産生のための基質として作用して、Ｎ−グリカン構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を与える。適当な株の例は米国特許第７，０２９，８７２号、ＵＳ  ２００６−０２８６６３７およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６）（それらの記載を、該記載が完全に記載されているのと同様に、本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００９２】
一般に、タンパク質、特に糖タンパク質の発現には、下等真核生物、例えば酵母が使用される。なぜなら、それらは経済的に培養可能であり、高い収率を与えることが可能であり、適当に修飾された場合には適当なグリコシル化が可能だからである。酵母は特に、迅速な形質転換、試験されたタンパク質局在化方法および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝学を提供する。適当なベクターは、発現制御配列、例えばプロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含む）、および複製起点、終結配列などを、所望により有する。
【００９３】
本明細書においてはメチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用して本発明が実証されているが、他の有用な下等真核宿主細胞には以下のものが含まれる：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は細胞培養に特に適している。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。同様に、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などは、本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために使用されうる。
【００９４】
下等真核生物、特に酵母および糸状菌は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように遺伝的に修飾されうる。前記のとおり、本明細書中で用いる「ヒト様Ｎ−グリカン」なる語は、未操作野生型ヒト細胞により産生されるオリゴ糖に酷似しているＮ結合オリゴ糖を意味する。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の宿主細胞は、ハイブリッドおよび／または複合Ｎ−グリカン、すなわち、「ヒト様Ｎ−グリコシル化」を伴うヒト様糖タンパク質を産生しうる。本発明の宿主細胞から産生される糖タンパク質上に主に存在する個々の「ヒト様」グリカンは、行われる個々の操作工程に左右されるであろう。このように、特定の所望のグリコフォームが組成物において優勢である糖タンパク質組成物が製造されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または宿主細胞を遺伝的に操作し、および／または外因性酵素を供給して、哺乳類グリコシル化経路の全部または一部を模擬することにより（米国特許第７，４４９，３０８号に記載されているとおり）、これは達成されうる。所望により、該糖タンパク質がコアフコシル化を伴って又は伴わずに産生されるように、該グリコシル化の追加的な遺伝的操作が行われうる。下等真核宿主細胞の使用は更に有利である。なぜなら、これらの細胞は高度に均一な糖タンパク質組成物を産生して、該糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％以上で存在しうるようにするからである。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％以上、最も好ましくは、８０モル％以上で存在しうる。
【００９５】
下等真核生物、特に酵母は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように遺伝的に修飾されうる。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または外因性酵素を供給することにより（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，４４９，３０８号に記載されているとおり）、これは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が激減するように選択または操作されうる。
【００９６】
１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。
【００９７】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００９８】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００９９】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【０１００】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生させることが可能である。
【０１０１】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。好ましい実施形態においては、該シアリルトランスフェラーゼはアルファ２，６−シアリルトランスフェラーゼである。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生する。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌の場合、該宿主細胞が、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。シアル酸の量を増加させるためには、ＣＭＰ−シアル酸合成経路の２以上のコピーまたはシアリルトランスフェラーゼの２以上のコピーを含むように宿主細胞を構築することが有利でありうる。前記細胞において産生された糖タンパク質をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【０１０２】
前記宿主細胞はいずれも、米国公開特許出願第２００５／０２０８６１７号および２００７／００３７２４８号に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ  ＩＩＩ）および／または多分岐（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩおよびＧｎＴ  ＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。更に、前記宿主細胞は、ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＧＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＮＡＮＡ（ｌ−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２とＮＧＮＡ（ｌ−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２との組合せを含む抗体を産生しうる。１つの実施形態においては、該組換え糖タンパク質は、ＳＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される構造を含みいずれのα２−３結合ＳＡをも欠くＮ−グリカンを含む。
【０１０３】
更に詳細な実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生する。
【０１０４】
更に詳細な実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＮＧＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはそれらの混合物）を含む組換え糖タンパク質を産生する。
【０１０５】
前記宿主細胞はいずれも、更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体［例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体］、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体［例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体］およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含みうる。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。
【０１０６】
更に、前記宿主細胞はいずれも、更に、Ｎ−グリカン占拠を増加させるために操作されうる。例えば、Ｇａｕｌｉｔｚｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）；Ｊｏｎｅｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｓｐｙｈｓ．Ａｃｔａ  １７２６：１２１−１３７（２００５）；ＷＯ２００６／１０７９９０を参照されたい。１つの実施形態においては、前記宿主細胞はいずれも、更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せ）をコードする少なくとも１つの核酸分子、および該異種糖タンパク質をコードする核酸分子を含むように操作されることが可能であり、ここで、該宿主細胞は、内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する。１つの実施形態においては、前記宿主細胞はいずれも、更に、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ｄタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子、および該異種糖タンパク質をコードする核酸分子を含むように操作されることが可能であり、ここで、該宿主細胞は、内在性ＯＴａｓｅ複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する。
【０１０７】
宿主細胞には更に、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有しない糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された下等真核細胞（例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））が含まれる。これは、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）の一方または両方を欠失または破壊することによりホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を、ならびにβ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）（米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）の１以上を欠失または破壊することにより達成されることが可能であり、更に詳細な態様においては、それはまた、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失または破壊することを含みうる。破壊は、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊すること、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。更に、細胞は、化学的インヒビターの添加または細胞培養条件の修飾によりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。これらの宿主細胞は、特定のＮ−グリカン構造を産生するように前記のとおりに更に修飾されうる。
【０１０８】
宿主細胞には更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ［Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）］の１以上を欠失または破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ  ２００７／０６１６３１に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはα−マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞［例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）］が含まれる。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊すること、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞には更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかが含まれうる。
【０１０９】
Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用されうるベンジリデンチアゾリジンジオンの例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。
【０１１０】
特定の実施形態においては、少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失される。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失され、あるいは該宿主細胞は１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養される。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞は１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性α−１，２−マンノシダーゼをも発現する。
【０１１１】
ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占拠を低減することにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるα−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性α−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占拠および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、個々の異種糖タンパク質（例えば、Ｆａｂおよび抗体）は種々の度合の効率で発現されゴルジ装置から輸送される可能性があり、したがって、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せを要しうるため、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。もう１つの態様においては、１以上の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与と組合されることが可能であり、あるいは分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与の代わりに行われうる。
【０１１２】
したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、より良好な通算収率または適切に構築された糖タンパク質の収率で、本明細書に開示されている宿主細胞において特定の糖タンパク質を製造するのに有用でありうる。Ｏ−グリコシル化の低減または排除は全抗体およびＦａｂフラグメントの構築および輸送に有益な効果をもたらすらしい。なぜなら、それらは分泌経路を横断し、細胞表面へ輸送されるからである。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御された細胞においては、適切に構築された抗体またはＦａｂフラグメントの収率が、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる収率と比較して増加する。
【０１１３】
α−マンノシダーゼに耐性である、β−結合マンノース残基を有するＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの可能性を減少させ又は排除するために、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）の１以上を欠失または破壊することにより、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を除去するために、組換え糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を遺伝的に操作する（米国特許第７，４６５，５７７号および米国特許第７，７１３，７１９号を参照されたい）。また、ＢＭＴ２とＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の１以上との欠失または破壊は、宿主細胞タンパク質に対する抗体に対する検出可能な交差反応性を低減または排除する。
【０１１４】
糖タンパク質の収率は、幾つかの場合には、哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、あるいは１以上の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換することにより改善されうる。また、宿主細胞における哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質の発現も該細胞におけるＯ−グリコシル化を制御するらしい。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能が低減または排除されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類またはヒトホモログの少なくとも１つをコードするベクターが細胞内で発現される、本発明における宿主細胞が更に含まれる。また、該内在性宿主細胞シャペロンおよび該哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質が発現される宿主細胞も含まれる。更に詳細な態様においては、下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。組換えタンパク質の収率の改善およびＯ−グリコシル化の低減または制御のためにヒトシャペロンタンパク質が導入される、宿主細胞のシャペロンの使用の具体例は、公開国際出願番号ＷＯ  ２００９１０５３５７およびＷＯ  ２０１００１９４８７（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。前記と同様に、該内在性シャペロンタンパク質の１以上をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換すること、あるいは前記のとおりに１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質を過剰発現させることに加えて、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失されている、下等真核宿主細胞が更に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能が低減、破壊または欠失されている。
【０１１５】
また、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアフィニティおよび／またはアビディティに影響を及ぼしうる。抗体またはＦａｂの製造のための最終的な宿主細胞が、該抗体の選択に使用された宿主細胞と同じでない場合に、これは特に重要でありうる。例えば、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアフィニティを阻害し、したがって、該阻害が無ければ抗原に対する高いアフィニティを有しうる抗体またはＦａｂフラグメントは特定されない可能性があるであろう。なぜなら、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントが抗原に結合する能力を阻害しうるからである。他の場合には、Ｏ−グリコシル化は、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアビディティを阻害するため、抗原に対する高いアビディティを有する抗体またはＦａｂフラグメントは特定されない可能性があるであろう。前記の２つの場合においては、該抗体またはＦａｂフラグメントを特定し選択するための宿主細胞が、別の細胞型のもの、例えば酵母または真菌細胞（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））であったため、哺乳類細胞系において産生された場合に特に有効でありうる抗体またはＦａｂフラグメントは特定されない可能性があるであろう。酵母におけるＯ−グリコシル化は哺乳類細胞におけるＯ−グリコシル化と有意に異なりうることがよく知られている。これは、野生型酵母Ｏ−グリコシル化を哺乳類におけるムチン型またはジストログリカン型Ｏ−グリコシル化と比較した場合に特に顕著である。特定の場合には、Ｏ−グリコシル化は、抗原結合を妨げるのではなく、抗体またはＦａｂフラグメントの、抗原に対するアフィニティまたはアビディティを増強しうるであろう。この効果は、抗体またはＦａｂフラグメントを特定し選択するために使用される宿主細胞と製造用宿主細胞が異なることになる（例えば、特定および選択は酵母において行われ、該製造用宿主は哺乳類細胞である）場合には望ましくない。なぜなら、該製造用宿主においては、該Ｏ−グリコシル化は、もはや、該抗原に対するアフィニティまたはアビディティの増強を引き起こしたタイプのものではないからである。したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、特定の抗原に対する特異性を有する抗体またはＦａｂフラグメントを、該抗体またはＦａｂフラグメントの特定および選択が宿主細胞のＯ−グリコシル化系により影響されることなく、該抗体またはＦａｂフラグメントの該抗原に対するアフィニティまたはアビディティに基づいて特定し選択するための、本明細書における材料および方法の使用を可能にしうる。したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は更に、哺乳類細胞系において最終的に産生された抗体またはＦａｂフラグメントを特定し選択するための、酵母または真菌宿主細胞の有用性を増大させる。
【０１１６】
本明細書に記載されている方法および材料を、特定のＮ−グリカンまたはシアル酸化糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された他のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）および酵母細胞系、例えば、特定のガラクトシル化またはシアル酸化形態を産生するように遺伝的に操作された前記の宿主生物および細胞系（これらに限定されるものではない）と共に利用する方法を当業者は更に認識し理解するであろう。例えば、ＵＳ  ２００６−０２８６６３７（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  Ｌｏｗｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）（その記載を、それが完全に記載されている場合と同様に本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。それにおいては、炭素源としてのガラクトースの取り込み及び利用のための経路が遺伝的に修飾されている。
【０１１７】
また、本明細書における方法は、α２，６シアリルトランスフェラーゼ活性を有さないヒト様およびヒト糖タンパク質を産生するように操作された他の下等真核細胞系において前記の組換えＦｃ含有ポリペプチドを製造するために使用されうる。該方法は、シアル酸化Ｎ−グリカンの産生が固有の特徴である真核細胞系において前記の組換えＦｃ含有ポリペプチドを製造するためにも使用されうる。
【０１１８】
該Ｆｃ含有ポリペプチド上のα２，３およびα２，６結合シアル酸のレベルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびパルス化電流測定検出を伴う高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を含むよく知られた技術を用いて測定されうる。
【０１１９】
Ｆｃ突然変異タンパク質の生物学的特性
多数のＦｃ含有ポリペプチドに関しては、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合の低下により示される、エフェクター機能の欠如またはその有意な低下（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４（８）：４１７８−８４（２０００）およびＳｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：６５９１−６６０４（２００１））、ならびに抗炎症特性の増強は、望ましい特性であろう。本出願人は、ＩｇＧのＦｃ領域内のアミノ酸２４３位および２６４位における特定の修飾が、末端グリカン位置におけるシアル酸化の存在には無関係に、エフェクター機能の欠如またはその有意な低下をもたらしうることを、本発明において見出した。特に、本出願人は、Ｆｃ領域内の残基Ｆ２４３およびＶ２６４に対するアラニンへの修飾が、Ｆｃγ受容体およびＣ１ｑへの結合の低下を伴う抗体を与えることを見出した。これらのＦｃ領域修飾を伴って産生された抗体は、それらが末端グリカンとしてα２，６結合シアル酸形態を有することが判明しているかどうかにかかわらず、Ｆｃγ受容体への結合の低下を示したことに注目すべきである。
【０１２０】
したがって、本出願人は、前記の所望の特性を有するＦｃ含有ポリペプチドを与える二重Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａを本発明において開発した。本明細書における実施例は、Ｆｃ領域の２４３位および２６４位に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換宿主細胞を培養して、該Ｆｃ含有ポリペプチドを得ることを含む。
【０１２１】
Ｆｃ含有ポリペプチドの製造
本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの製造に適した当技術分野で公知のいずれかの方法に従い製造されうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメント（限定的なものではないが、抗体のＦｃ領域からなる又は実質的になるポリペプチドを含む）である。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドはイムノアドヘシンである。抗体および抗体フラグメントの製造方法は当技術分野でよく知られている。ポリペプチド内への点突然変異の導入方法、例えば部位特異的突然変異誘発も当技術分野でよく知られている。
【０１２２】
本明細書に開示されている実施例においては、コンセンサスＣＨ２配列を含有するＩｇＧ１重鎖および軽鎖ならびに本明細書に記載されているＦｃ二重突然変異タンパク質は２つの異なる糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において発現された。後記実施例に記載されているとおり、重鎖および軽鎖遺伝子配列はメタノール誘導プロモーター、ＡＯＸ１および組込まれたブレオマイシン（ゼオシン）選択マーカーの制御下にあった。この方法は相同ＤＮＡ組換えにより発現カセット全体をＴｒｐ２遺伝子座内に組込む。
【０１２３】
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよびそれに続くＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓカチオン交換精製工程により発酵ブロスから分泌抗体を捕捉した。精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）ならびにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および逆相ＨＰＬＣにより特徴づけして、適切な構築を評価した。図２から分かるとおり、本明細書における材料および方法により製造された抗体は、哺乳類細胞（ＣＨＯ）において製造されたＨｅｒ２抗体に関するものに類似した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の純度プロファイルを有していた。ＳＥＣおよび逆相ＨＰＬＣによるＩｇＧ分析は、Ｆｃ突然変異タンパク質糖操作株から製造された抗体が適切に構築されており、哺乳類細胞において製造された抗体に構築の点で類似していることを更に実証した（データ非表示）。本明細書における材料および方法により製造された種々の抗体に対する抗原アフィニティを、ＳＫ−ＢＲ３細胞系（これは、この場合は、Ｈｅｒ２過剰発現ヒト乳癌系であった）を使用する、細胞に基づくアッセイにより測定した。予想どおり、該Ｆｃ突然変異タンパク質を含む該抗体の全てはＳＫ−ＢＲ３細胞系に同等に良好に結合した（図３）。
【０１２４】
Ｆｃ突然変異タンパク質のＮ−グリカン分析
ある抗体を含む多数の糖タンパク質に関しては、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の末端Ｎ結合グリカンのシアル酸化は、治療活性をもたらす適正なコンホメーションを有する糖タンパク質および抗体の産生に必須である。例えば、末端シアル酸化がＩＶＩＧ調製物の抗炎症活性と相関されている、Ａｎｔｈｏｎｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７３−３７６（２００８）を参照されたい。シアル酸化は最後から２番目のガラクトースの存在を要し、それに対してシアリルトランスフェラーゼが作用してシアル酸化グリカンを形成する。したがって、１以上の末端ガラクトースグリコフォームを欠く糖タンパク質は、抗炎症活性を伴うα２，６結合シアル酸組成を有する抗体を産生し得ない。
【０１２５】
典型的に、哺乳類細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞）において製造された抗体は、Ｇ０Ｆ（３７％）、ＧＩＦ（４３％）、Ｇ２Ｆ（９％）、Ｇ０（４％）、Ｇ１（３％）およびＭａｎ５（３％）を含むグリコフォーム組成を有し、これは、シアル酸の転移のための基質として作用する末端ガラクトースをほとんど又は全く有さない。ＣＨＯ細胞製造の場合、産生される末端グリカンはα２，３結合形態であり、ＣＨＯ細胞は、抗炎症活性に関連づけられているシアル酸のα２，６結合形態を産生するのに必要なα２，６シアリルトランスフェラーゼを発現しない。しかし、ＣＨＯにおける特定のα２，６シアリルトランスフェラーゼの過剰発現はα２，３結合およびα２，６結合シアル酸の混合物を与えうる（Ｂｒａｇｏｎｚｉら，ＢＢＡ  １４７４：２７３−２８２（２０００）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８９：２４３−２４９（２００１））。糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ５．０株は高レベルのガラクトシル化非抗体タンパク質、例えばエリスロポエチンを産生することが可能であり（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６））、α２，６結合シアル酸化形態を形成するための作用対象となりうる相対的に低い量の末端ガラクトースを含有する抗体を産生する（図４）。そのようなピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された抗体は、典型的に、グリコフォームＧ０（６０％）、Ｇ１（１７％）、Ｇ２（４％）およびＭａｎ５（８％）を含む組成を有する。Ｇ０（４３．５％）、Ｇ１（２０．８％）、Ｇ２（２．７％）、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（５．５％）およびＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（４．９％）を含むグリカン組成を有する、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ６．０株において産生された抗体でさえも、相対的に低いレベルのα２，６結合シアル酸化形態を有する。したがって、ＧＦＩ５．０および６．０株において産生された抗体は、同じ株において産生された非抗体タンパク質（例えば、エリスロポエチン）と比較して遥かに低いレベルのガラクトシル化およびシアル酸化を有する。
【０１２６】
糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０株において本発明で製造されたＨｅｒ２抗体および対応Ｆｃ突然変異抗体のＮ−グリカン組成を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦでの該抗体の遊離の後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により分析した（図４〜８）。Ｈｅｒ２およびＦｃ突然変異タンパク質抗体の遊離炭水化物組成をＡｌｌｅｎｔｅｃｈ  Ｐｒｅｖａｉｌ  ｃａｒｂｏ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ  ＩＬ）カラム上のＨＰＬＣにより定量した。
【０１２７】
ＧＦＩ５．０株からのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２抗体のグリコフォームは二分岐Ｇ０、Ｇ１およびＧ２ならびに他の中性グリカンを含んでおり、Ｇ０が主要グリコフォームであった（図４）。このグリカン組成は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来抗体がフコースを本来的に欠いている点を除き、ＣＨＯ細胞において商業的に製造されたものと一致している。逆に、ＧＦＩ５．０において産生されたＦｃ突然変異タンパク質抗体からのグリコフォームは非類似グリカン組成を有する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析における最高ピークから分かるとおり、単一Ｆｃ突然変異タンパク質抗体（Ｆ２４３ＡまたはＶ２６４Ａ）は、α２，６シアリルトランスフェラーゼの基質として働きうるガラクトシル化Ｎ−グリカンにおける増加を示し（図５および６）、一方、Ｆｃ二重突然変異タンパク質抗体Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４ＡのＮ−グリカン組成はより一層大きな増加を示し、全Ｎ−グリカンの８０％以上がグリコシル化されていた（図７）。Ｆｃ二重突然変異タンパク質抗体上に存在するＧ２（ビ−ガラクトシル化Ｎ−グリカン）は、本出願人が評価したあらゆる抗体で見られたＧ２の最大比率に相当する。これらの同じＦｃ突然変異タンパク質抗体をＧＦＩ６．０株において発現させた場合、α２，６結合シアル酸がＧ１（モノ−ガラクトシル化）またはＧ２（ビ−ガラクトシル化）Ｎ−グリカンに付加された。単一Ｆｃ突然変異タンパク質抗体の場合、Ｇ２  Ｎ−グリカンのほぼ全てがシアル酸化グリカンに変換されていた（データ非表示）。単一Ｆｃ突然変異体から産生された抗体は非常に高いレベルのα２，６結合シアル酸化を示したが（４０〜５１％、表３を参照されたい）、該レベルは、Ｆｃ二重突然変異タンパク質から産生された抗体の場合より低く（図８および表３）、この場合、バイオリアクター発酵で７４％のシアル酸化が達成され、小規模発酵で９１％以上のシアル酸化が達成された。
【０１２８】
いずれの理論にも束縛されるものではないが、Ｆｃオリゴ糖へのシアル酸転移は、Ｆｃ単一突然変異タンパク質と比較して、Ｆｃ二重突然変異タンパク質によりもたらされる、より開いたＣＨ２ドメインポケット立体配置により増強される、と本出願人は考えている。ＧＦＩ６．０株から産生されるシアル酸のα２，６形態は、ヒトにおいて産生されるものと同じ形態であり、ＣＨＯ細胞系において産生される抗体上に存在するα２，３結合シアル酸形態とは異なることにも注目されるべきである（Ｊａｓｓａｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８９：２４３−２４９，２００１）。
【０１２９】
Ｆｃ突然変異タンパク質のＦｃγ結合
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて、本出願人は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ抗体、単一および二重Ｆｃ突然変異タンパク質抗体ならびにＨｅｒ２抗体へのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合を比較した。実施例１１および１５に記載されている実験において示されているとおり、Ｆｃ二重突然変異タンパク質はＦｃγＲＩに対するアフィニティの低下を示した。ＦｃγＲＩは、抗体結合に際して免疫応答を刺激することが示されている受容体であるため、これらのデータは、二重突然変異タンパク質抗体がより低い免疫応答促進能を有することを示唆しているであろう。
【０１３０】
ＦｃγＲＩより低い抗体アフィニティを有し、免疫応答を抑制することが示されている受容体であるＦｃγＲＩＩｂの場合、該二重Ｆｃ突然変異タンパク質は、低下したアフィニティで結合する。ＦｃγＲＩＩａの場合も、該二重Ｆｃ突然変異タンパク質は、低下したアフィニティで結合するらしい。これらのデータは、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂ／ｃを介して免疫応答を抑制する能力が有意に低減または排除されるように該二重突然変異タンパク質抗体のコンホメーション構造が改変されていることを示唆している。
【０１３１】
ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８およびＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８は、免疫応答を刺激することが知られている受容体の多形であるが、ＦｃγＲＩより低い抗体アフィニティを有する。該Ｆｃ二重突然変異タンパク質はＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８に対してはアフィニティをほとんど有さないが、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対しては幾らかのアフィニティを尚も保有する。総合すると、該二重Ｆｃ突然変異タンパク質は、マクロファージ、単球およびナチュラルキラー細胞のような免疫細胞を活性化しリクルートする傾向が、親抗体と比べて低いことを、これらのデータは示唆している。
【０１３２】
Ｆｃ突然変異タンパク質のＣ１ｑ結合
抗体−Ｃ１ｑ結合は補体依存性細胞傷害に関する重要なパラメーターである。Ｃ１ｑへの免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子の結合活性（アフィニティ）は、細胞に基づくアッセイ、例えば、本明細書中の実施例１３に記載されているアッセイにより測定されうる。開示されているアッセイは任意のＩｇＧ分子での使用に容易に適合化されうる、と当業者は認識し理解するであろう。
【０１３３】
Ｆｃ突然変異タンパク質に対するＡＤＣＣ効果
ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）受容体は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらすことが十分に確認されている（Ｄａｅｒｏｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４，１９９７）。本出願人は、本明細書に記載されている二重Ｆｃ突然変異タンパク質から産生された抗体がＦｃγＲＩＩＩａ結合の低下を伴い（図９ＣおよびＤ；表４および５）、したがって、ＦｃγＲＩＩＩａ媒介性ＡＤＣＣを引き起こす能力の低下を伴う可能性があることを見出した。
【０１３４】
実施例１３は、Ｂ細胞喪失および蛍光放出ＡＤＣＣを測定するためのインビトロアッセイを記載している。
【０１３５】
Ｆｃ突然変異タンパク質のバイオアベイラビリティ
バイオアベイラビリティは、活性部分が、それが薬物であるか代謝産物であるかには無関係に、ヒトの循環内に進入して作用部位に接近する度合および速度を意味する。薬物のバイオアベイラビリティは、薬物の物理化学的特性よりも剤形の特性に主に影響され、今度はこれがその吸収能を決定しうる。化学的同等性は、薬品が同一活性成分を同量で含有するが、他の不活性物は異なりうることを示唆する。同様に、生物学同等性は、２つの薬品が、同一患者に同一投与計画で投与された場合、循環および組織内で同等の薬物濃度を与えることを示唆する。逆に、同一でない２つの薬品は、同一患者に投与された場合、同一の治療効果（および副作用）を与えうるかもしれない。したがって、薬物のバイオアベイラビリティは、バイオアベイラビリティがたとえ異なる場合であっても、治療的同等性を達成する可能性がありうる点でのいずれかの同等性の決定に関連している。狭い治療係数（すなわち、５０％有効濃度に対する最小毒性濃度の比）を有する薬物の場合、バイオアベイラビリティの相違は治療的非同等性をもたらしうる。
【０１３６】
本出願人は、驚くべきことに、本明細書における材料および方法によりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造されたＦｃ二重突然変異タンパク質抗体が、皮下注射された場合、公知の商業的方法によりＣＨＯ細胞において製造された比較されうる抗体より良好なバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）を示すことを本発明において見出した。皮下用製剤は患者が自分で投与可能であるため、一般に、静脈内投与よりも皮下投与が好ましい。図１２に示されているとおり、Ｆｃ二重突然変異タンパク質抗体で（実施例１４に記載されているとおりに）処理されたマウスからの血清濃度は、ＣＨＯにおいて製造された対応物の血清濃度と比較して約３０％増加し、α２，６結合シアル酸化形態の増加を欠くピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造された抗体の場合より大きかった。
【０１３７】
シアル酸化のレベルの増加を伴うヒトグリコシル化抗体の製造
本明細書における知見の結果として、本出願人は、Ａｓｎ２９７位のシアル酸化およびガラクトシル化の増加を伴う抗体をインビボで産生しうる株が作製されるように、抗体のＦｃ領域の修飾により、α２，６結合シアル酸の増加を伴う抗体の製造方法を開発した。いずれの理論にも束縛されるものではないが、抗体のＡｓｎ２９７位にＮ−グリカン上に存在する低レベルのガラクトースおよびシアル酸の欠如は、それぞれのグリコシルトランスフェラーゼの低い効率によるものではなく、むしろ、Ｆｃ領域の構造に固有の立体障害によるものである、と本出願人は提示している。Ｆｃ領域の構造は、抗体が分泌経路を通過する短時間の間にガラクトースおよびシアル酸の付加を妨げる、と本出願人は考えている。これまでの報告は、インビボで典型的に用いられるものより長いインキュベーション時間がガラクトシルトランスフェラーゼと共に用いられた場合、ＣＤ２０  ｍＡｂの高レベルのガラクトシル化がインビトロで可能であったことを示唆している（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−２１５（２００６））。より少ない立体障害を伴って抗体が開いた立体配置で存在する場合、ガラクトース転移が生じると考えられた。二重突然変異（すなわち、二重Ｆｃ突然変異タンパク質）から生じる構造変化またはコンホメーション変化は永久的な開いたコンホメーションをもたらして、ガラクトースおよびシアル酸転移の著しい増強を可能にする。
【０１３８】
本明細書における本出願人の研究から、アミノ酸Ｆ２４３またはＶ２６４の個々の突然変異はＩｇＧ１分子のＦｃ領域のガラクトシル化およびシアル酸の増強に同様の影響を及ぼしたようである。Ｌｕｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７（１１）：４９６３−４９６９（１９９６）は、Ｆｃ領域内の単一アミノ酸（Ｐｈｅ２４１、Ｐｈｅ２４３、Ｖａｌ２６４、Ａｐｓ２６５またはＴｙｒ２９６）を変化させて１２〜４２％のレベルのモノシアル酸化および４〜３１％のレベルのビシアル酸化形態を得ることによる、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系において産生されたシアル酸化ＩｇＧ３の中等度の増加を報告している。ここにおいて報告されているとおり、本明細書における材料および方法により製造された抗体は、特定の部位（Ｆ２４３またはＶ２６４）がアラニンに変化した場合に、シアル酸化における有意な増強を示した。更に、両方の部位が同時に突然変異した場合、９１％を超えるα２，６−シアル酸化種のレベルが得られた（表３）。
【０１３９】
生物学的標的
後記実施例においては、商業的に入手可能な抗Ｈｅｒ２および抗ＴＮＦ抗体の配列に類似した配列を有するＩｇＧ１抗体を使用する本発明の材料および方法を本出願人は例示しているが、本発明は、開示されている抗体に限定されないことに注目すべきである。本明細書における材料および方法は、抗炎症活性の増強またはエフェクター機能の低下の特性が望ましい任意のＦｃ含有ポリペプチドを製造するために使用されうる、と当業者は認識し理解するであろう。更に、本発明によりこのようにして製造されるＦｃ含有ポリペプチドまたは抗体のタイプ（型）には何ら制限がないことに注目すべきである。該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭからのものでありうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含むＩｇＧからのものである。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域はＩｇＧ１からのものである。特定の実施形態においては、本明細書における材料および方法により製造される抗体または抗体フラグメントはヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体でありうる。
【０１４０】
幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、炎症に関与する生物学的標的に結合する。
【０１４１】
幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは炎症性サイトカインに結合する。幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される分子に結合する：ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＶＬＡ−４、ＶＥＧＦ、ＰＣＳＫ９、α４β７−インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｆａｃｔ  ＩＩ、ＩＣＡＭ−３、ベータ２−インテグリン、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＣＢＬ、ＬＣＡＴ、ＣＲ３、ＭＤＬ−１、ＧＩＴＲ、ＡＤＤＬ、ＣＧＲＰ、ＴＲＫＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＧＴＣ、αＢＬｙｓまたは前記分子のいずれかに対する受容体。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＴＮＦ−αに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＨｅｒ２に結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＰＣＳＫ９に結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＴＮＦＲに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＬＣＡＴに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＴＳＬＰに結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＰＤ−１に結合する。もう１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはＩＬ−２３に結合する。
【０１４２】
幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、自己免疫抗原、アレルゲン、ＭＨＣ分子またはリーザス因子Ｄ抗原から選択される抗原に特異的である。例えば、ＷＯ２０１０／１０９１０（これを参照により本明細書に組み入れることとする）の表１に挙げられている抗原を参照されたい。
【０１４３】
抗炎症特性を増強させる又はエフェクター機能／細胞傷害性を低下させる方法
本発明はまた、炎症の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、該Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異２４３ＴおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇを含む。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、炎症に関与する抗原に結合する抗体、抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、炎症状態の治療のために既に市販されている又は開発中である抗体、抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される抗体である：ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体抗体）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４１  ７Ｅ３抗体）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０抗体）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２５抗体）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（抗ＲＳＶ（呼吸器性シンシチウムウイルス）抗体）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（抗Ｈｅｒ２抗体）、ゲムツズマブ  オゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（抗ＣＤ３３抗体）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ５２抗体）、イブリツモマブチウキセテン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔｅｎ）（抗ＣＤ２０抗体）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩｇＥ抗体）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）−１３１Ｉ（抗ＣＤ２０抗体のヨウ素化誘導体）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１ａ抗体）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦ受容体抗体）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦα抗体）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（抗α４インテグリン）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１ａ）、セトリズマブ（Ｃｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ��（抗ＴＮＦα抗体）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−６Ｒ）、ウステンキヌマブ（Ｕｓｔｅｎｋｉｎｕｍａｂ）（抗ＩＬ−１２／２３）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ５２）およびナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（抗α４インテグリン）ならびにそれらの変異体。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるＦｃ融合タンパク質である：アルカリスト／リロナセプト（Ａｒｃａｌｙｓｔ／ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）（ＩＬ１Ｒ−Ｆｃ融合体）、オレニシア／アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ／ａｂａｔａｃｅｐｔ）（ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合体）、アメビベ／アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ／ａｌｅｆａｃｅｐｔ）（ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合体）、アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）−Ｆｃ融合体（ＩＬ−１Ｒａ−Ｆｃ融合タンパク質）、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質）、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、グルカゴン−Ｆｃ融合タンパク質、オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）−Ｆｃ−融合タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｃ融合タンパク質、ＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質、プロインスリン−Ｆｃ融合タンパク質およびインスリン前駆体−Ｆｃ融合タンパク質ならびにそれらの類似体および変異体。
【０１４４】
本発明はまた、親Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドのエフェクター機能を低下させる方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＡＤＣＣである。もう１つの実施形態においては、該エフェクター機能はＣＤＣである。
【０１４５】
本発明はまた、炎症状態の治療に有用な親Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン）を選択し、該Ｆｃ含有ポリペプチドの２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を導入することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの細胞傷害性を低下させる方法を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して低下した細胞傷害性を有する。
【０１４６】
１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは天然Ｆｃ領域を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３Ａ突然変異を含む。もう１つの実施形態においては、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｖ２６４Ａ突然変異を含む。
【０１４７】
治療方法
本発明はまた、炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法を含み、該方法は、２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＴおよびＶ２６４Ｇを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎを含む。もう１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは突然変異Ｆ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇを含む。本発明のＦｃ含有ポリペプチドは任意の経路により投与されうる。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは非経口投与される。１つの実施形態においては、該Ｆｃ含有ポリペプチドは皮下投与される。
【０１４８】
１つの実施形態においては、該炎症状態は望ましくない炎症免疫反応である。
【０１４９】
１つの実施形態においては、該炎症状態は自己免疫疾患である。１つの実施形態においては、該炎症状態は多発性硬化症である。１つの実施形態においては、該炎症状態は全身性エリテマトーデスである。１つの実施形態においては、該炎症状態はＩ型糖尿病である。
【０１５０】
１つの実施形態においては、該炎症状態は、先天性ガンマグロブリン欠乏血症および低ガンマグロブリン血症、尋常性多様性免疫不全、重症複合性免疫不全またはウィスコット・アルドリッチ症候群を含む原発性免疫不全症候群である。
【０１５１】
１つの実施形態においては、該炎症状態は、Ｂ細胞リンパ球性白血病、ＨＩＶ感染または同種骨髄移植を含む続発性免疫不全症候群である。
【０１５２】
１つの実施形態においては、該炎症状態は特発性血小板減少性紫斑病である。
【０１５３】
１つの実施形態においては、該炎症状態は多発性骨髄腫である。
【０１５４】
１つの実施形態においては、該炎症状態はギラン−バレー症候群である。
【０１５５】
１つの実施形態においては、該炎症状態は川崎病である。
【０１５６】
１つの実施形態においては、該炎症状態は慢性脱髄性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）である。
【０１５７】
１つの実施形態においては、該炎症状態は自己免疫性好中球減少症である。
【０１５８】
１つの実施形態においては、該炎症状態は溶血性貧血である。
【０１５９】
１つの実施形態においては、該炎症状態は抗因子ＶＩＩＩ自己免疫疾患である。
【０１６０】
１つの実施形態においては、該炎症状態は多巣性ニューロパチーである。
【０１６１】
１つの実施形態においては、該炎症状態は全身性脈管炎（ＡＮＣＡ陽性）である。
【０１６２】
１つの実施形態においては、該炎症状態は多発性筋炎である。
【０１６３】
１つの実施形態においては、該炎症状態は皮膚筋炎である。
【０１６４】
１つの実施形態においては、該炎症状態は抗リン脂質症候群である。
【０１６５】
１つの実施形態においては、該炎症状態は敗血症症候群である。
【０１６６】
１つの実施形態においては、該炎症状態は移植片対宿主疾患である。
【０１６７】
１つの実施形態においては、該炎症状態はアレルギーである。
【０１６８】
１つの実施形態においては、該炎症状態は抗リーザス因子Ｄ反応である。
【０１６９】
１つの実施形態においては、該炎症状態は心血管系の炎症状態である。本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠状動脈高血圧、急性冠状動脈症候群および心不全（これらの全ては炎症に関連している）を治療するために使用されうる。
【０１７０】
１つの実施形態においては、該炎症状態は中枢神経系の炎症状態である。もう１つの実施形態においては、該炎症状態は末梢神経系の炎症状態である。例えば、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（別名ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、虚血性脳損傷、プリオン病およびＨＩＶ関連痴呆の治療に使用されうる。
【０１７１】
１つの実施形態においては、該炎症状態は胃腸管の炎症状態である。例えば、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、炎症性腸障害、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病および過敏性腸症候群を治療するために使用されうる。
【０１７２】
１つの実施形態においては、該炎症状態は乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎、例えば慢性関節リウマチ、変形性関節症および乾癬性関節炎である。
【０１７３】
１つの実施形態においては、該炎症状態はステロイド依存性アトピー性皮膚炎である。
【０１７４】
１つの実施形態においては、該炎症状態は悪液質である。
【０１７５】
本発明のＦｃ含有ポリペプチドを使用して治療されうる炎症障害の例には以下のものも含まれる：尋常性ざ瘡、喘息、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再灌流損傷、サルコイドーシス、移植拒絶、脈管炎、間質性膀胱炎およびミオパチー。
【０１７６】
１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは１〜１００ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは０．００１〜１０ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは０．００１〜０．１ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは０．００１〜０．０１ミリグラム／ｋｇ体重の用量で投与される。
【０１７７】
医薬製剤
本発明はまた、本発明のＦｃ含有ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む医薬製剤を含む。
【０１７８】
１つの実施形態においては、本発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関するものであり、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ−グリカンの少なくとも７０％は、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるオリゴ糖構造を含み、該Ｆｃ含有ポリペプチドは該Ｆｃ領域のアミノ酸位置２４３位および２６４位（該番号付けはＫａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスに準拠している）に突然変異を含む。１つの実施形態においては、該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンの少なくとも４７モル％が構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはにおけるシアル酸残基はα−２，６結合により結合している。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンにおけるシアル酸残基はα−２，６結合により結合しており、検出可能なレベルのα−２，３結合シアル酸は存在しない。１つの実施形態においては、該シアル酸化Ｎ−グリカンはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含まない。
【０１７９】
本明細書中で用いる「医薬上許容される」なる語は、動物、より詳しくはヒトにおける使用に関して連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている又は米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に収載されている、有効成分の生物活性の有効性を妨げない無毒性物質に関するものである。「担体」なる語は、治療用物質と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味し、水および油のような無菌液を包含するが、これらに限定されるものではない。該担体の特性は投与経路に左右される。
【０１８０】
治療用物質および診断用物質の医薬製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液または懸濁液の形態で、許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造されうる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【０１８１】
投与方法は様々でありうる。適当な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、脊髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、通気、局所、皮膚、経皮または動脈内が含まれる。
【０１８２】
ある実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、侵襲的経路、例えば注射（前記を参照されたい）により投与されうる。本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドまたはその医薬組成物は静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節内（例えば、関節炎関節）、腫瘍内に、または吸入、エアゾール運搬により投与される。非侵襲的経路（例えば経口、例えば丸剤、カプセル剤または錠剤によるもの）による投与も本発明の範囲内である。
【０１８３】
ある実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、侵襲的経路、例えば注射（前記を参照されたい）により投与されうる。本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドまたはその医薬組成物は静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節内（例えば、関節炎関節）、腫瘍内に、または吸入、エアゾール運搬により投与される。非侵襲的経路（例えば経口、例えば丸剤、カプセル剤または錠剤によるもの）による投与も本発明の範囲内である。
【０１８４】
組成物は、当技術分野で公知の医学的装置を使用して投与されうる。例えば、本発明の医薬組成物は、例えば予め充填されたシリンジまたは自動注射装置を含む皮下針を使用する注射により投与されうる。
【０１８５】
本発明の医薬組成物はまた、無針皮下注射装置、例えば、米国特許第６，６２０，１３５号、、第６，０９６，００２号、第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されている装置を使用して投与されうる。
【０１８６】
本発明の医薬組成物はまた、注入により投与されうる。医薬組成物を投与する良く知られたインプラントおよびモジュール形態の例には以下のものが含まれる：米国特許第４，４８７，６０３号に開示されている、制御された速度で薬物を投薬するための移植可能な微量注入ポンプ；米国特許第４，４４７，２３３号に開示されている、正確な注入速度で薬物を運搬するための薬物注入ポンプ；米国特許第４，４４７，２２４号に開示されている、連続的薬物運搬のための種々の流動移植可能注入装置；米国特許第４，４３９，１９６号に開示されている、多室コンパートメントを有する浸透薬物運搬系。多数の他のそのようなインプラント、運搬系およびモジュールは当業者に良く知られている。
【０１８７】
あるいは、全身的ではなく局所的に、例えば、多くの場合にはデポー剤または徐放製剤で、関節炎関節内にの直接的に該抗体を注射することにより、該抗体を投与することが可能である。更に、例えば、免疫病理により特徴づけられる病原体誘発病変または関節炎関節を標的化する標的化薬物運搬系で、例えば、組織特異的抗体で被覆されたリポソームで、該抗体を投与することが可能である。該リポソームは罹患組織に標的化され、罹患組織により、選択的に取り込まれる。
【０１８８】
投与計画は、該治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状の程度、該治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の利用可能性を含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、投与計画は、標的病態における改善をもたらすと同時に望ましくない副作用を最小にするのに十分な治療用抗体を運搬する。したがって、運搬される生物学的物質の量は、１つには、個々の治療用抗体、および治療される状態の重症度に左右される。治療用抗体の適当な用量を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら，（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら，（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３：Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照されたい）。
【０１８９】
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野において知られている又は疑われているパラメータまたは因子を用いて、臨床家により行われる。一般に、投与は、最適用量より幾分少ない量から開始し、ついで、いずれかの負の副作用との比較において所望の又は最適な効果が得られるまで、小さな増加量でそれを増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。好ましくは、使用される生物学的物質は、治療の標的となる動物と同じ種から誘導され、それにより、該物質に対する免疫応答を最小に抑える。ヒト対象の場合、例えば、キメラ、ヒト化および完全ヒトＦｃ含有ポリペプチドが好ましい。
【０１９０】
Ｆｃ含有ポリペプチドは、連続的注入により、または例えば毎日、週１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、毎年などで投与される複数の用量により供与されうる。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔内、直腸内、筋肉内、大脳内、髄腔内に、または吸入により投与されうる。毎週の合計用量は、一般には少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（例えば、Ｙａｎｇら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８（２００２）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４（２００３）を参照されたい）。他の実施形態においては、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、毎週、隔週、「４週ごとに」、毎月、隔月または年４回、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で、皮下または静脈内投与される。
【０１９１】
本明細書中で用いる「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」なる語は、単独で又は追加的な治療用物質と共に細胞、組織または対象に投与された場合に、疾患もしくは状態の症状の１以上またはそのような疾患もしくは状態の進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効である、本発明のＦｃ含有ポリペプチドの量を意味する。治療的有効量は更に、症状の少なくとも部分的な改善、例えば、関連医学的状態の治療、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは改善の率における増加をもたらすのに十分なＦｃ含有ポリペプチドの量を意味する。治療的有効量は、単独で投与される個々の有効成分に適用される場合には、その成分のみに関するものである。治療的有効量は、組合せ体に適用される場合には、連続投与または同時投与のいずれで組合せ投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、有効成分の組合された量を意味する。治療用物質の有効量は、少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の、診断尺度またはパラメータの改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するために主観的尺度が用いられる場合には、主観的尺度における改善をもたらしうる。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａ二重突然変異タンパク質発現プラスミドｐＧＬＹ３４８３を図示する。重鎖および軽鎖は共にメタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１の制御下であった。ＰｐＴｒｐ２遺伝子は、該カセット全体を組込むために適用された遺伝子座であった。重鎖上の突然変異を除き、発現プラスミド構造は野生型（親）、単一Ｆ２４３Ａ突然変異タンパク質、単一Ｖ２６４Ａ突然変異タンパク質および該二重突然変異タンパク質発現プラスミドと同一であった。
【図２】図２は、本明細書における材料および方法により産生された非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）抗体を特徴づけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からのゲルを示す。レーン１は抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体Ｈｅｒ２を含有し、レーン２は単一Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａを含有し、レーン３は単一Ｆｃ突然変異タンパク質Ｖ２６４Ａを含有し、レーン４は二重Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａを含有する。
【図３】図３は、Ｈｅｒ２過剰発現ヒト乳癌系であるＳＫ−ＢＲ３細胞系を使用する細胞に基づくアッセイにより測定した場合の、本明細書における材料および方法により産生された種々の抗体に対する抗原アフィニティを示す。■−Ｈｅｒ２；◆−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ  ＧＳ６．０グリコシル化；▲−ＧＳ６．０グリコシル化を伴うＦ２４３Ａ；▼−ＧＳ６．０グリコシル化を伴うＶ２６４Ａ；◇−対照ＩｇＧ：×−ＧＦＩ５．０グリコシル化を伴って産生されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２。
【図４】図４は、ＧＦＩ５．０株ＹＤＸ４７７において産生されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。ピークはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２，１２６１．２４（ＧＳ２．０）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１３４３．５０（Ｇ０）（優勢）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１５０５．９７（Ｇ１）およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１６６８．４７（Ｇ２）である。
【図５】図５は、ＧＦＩ５．０株ＹＤＸ５５１において産生された単一Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａ抗体のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。ピークはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２，１２６１．０５、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１３４３．７１、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１５０６．６２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１６６８．４７（優勢）である。
【図６】図６は、ＧＦＩ５．０株ＹＤＸ５５１において産生された単一Ｆｃ突然変異タンパク質Ｖ２６４Ａ抗体のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。ピークはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２，１２６１．９８、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１５０５．４５およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１６６８．８５（優勢）である。
【図７】図７は、ＧＦＩ５．０株ＹＤＸ５５７において産生された二重Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ抗体のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。主要ピークはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，１６６８．３９（優勢）に対応する。
【図８】図８は、ＧＦＩ６．０株ＹＧＬＹ４５６３において産生された二重Ｆｃ突然変異タンパク質Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ抗体のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。２２２４．２８および２２４５．８３（優勢）における二重ピークはそれぞれＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２および  ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、実施例１１に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する：ＦｃγＲＩＩＩａＬＦ（図９Ａ）、ＦｃγＲＩ（図９Ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（図９Ｃ）およびＦｃγＲＩＩＩａＬＶ（図９Ｄ）。図９Ａ〜９Ｄに関しては、■−Ｈｅｒ２；▲−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ；▼−ＧＦＩ６．０において産生されたＶ２６４Ａ；◆−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；●−ＧＦＩ６．０において産生されＰＮＧアーゼで処理されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、実施例１１に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する：ＦｃγＲＩＩＩａＬＦ（図９Ａ）、ＦｃγＲＩ（図９Ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（図９Ｃ）およびＦｃγＲＩＩＩａＬＶ（図９Ｄ）。図９Ａ〜９Ｄに関しては、■−Ｈｅｒ２；▲−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ；▼−ＧＦＩ６．０において産生されたＶ２６４Ａ；◆−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；●−ＧＦＩ６．０において産生されＰＮＧアーゼで処理されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、実施例１１に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する：ＦｃγＲＩＩＩａＬＦ（図９Ａ）、ＦｃγＲＩ（図９Ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（図９Ｃ）およびＦｃγＲＩＩＩａＬＶ（図９Ｄ）。図９Ａ〜９Ｄに関しては、■−Ｈｅｒ２；▲−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ；▼−ＧＦＩ６．０において産生されたＶ２６４Ａ；◆−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；●−ＧＦＩ６．０において産生されＰＮＧアーゼで処理されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、実施例１１に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する：ＦｃγＲＩＩＩａＬＦ（図９Ａ）、ＦｃγＲＩ（図９Ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（図９Ｃ）およびＦｃγＲＩＩＩａＬＶ（図９Ｄ）。図９Ａ〜９Ｄに関しては、■−Ｈｅｒ２；▲−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ；▼−ＧＦＩ６．０において産生されたＶ２６４Ａ；◆−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；●−ＧＦＩ６．０において産生されＰＮＧアーゼで処理されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ。
【図１０】図１０は、実施例１２に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＣ１ｑ結合を図示する。◇−抗ＣＤ２０抗体、陽性対照；■−Ｈｅｒ２；▲−ＧＳ６．０グリコシル化を伴って産生されたＦ２４３Ａ；▼−ＧＳ６．０グリコシル化を伴って産生されたＶ２６４Ａ；◆−ＧＳ６．０グリコシル化を伴って産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；●−ＧＳ６．０グリコシル化およびＰＮＧアーゼを伴うＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ。
【図１１】図１１は、実施例１３に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。■−Ｈｅｒ２；▲−ＧＳ６．０グリコシル化を伴って産生されたＦ２４３Ａ；▼−ＧＳ６．０グリコシル化を伴って産生されたＶ２６４Ａ；◆−ＧＳ６．０グリコシル化を伴って産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；◇−抗体の非存在下で殺傷するＮＫ細胞；×−ＧＦＩ２．０において産生されたＨｅｒ２。
【図１２】図１２は、実施例１４に記載されているとおり、■−Ｈｅｒ２；×−ＧＦＩ５．０において産生されたＨｅｒ２；◆−ＧＦＩ６．０において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａが注射されたマウスに関する経時的な血清モノクローナル抗体濃度を図示する。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｅは、実施例１５に記載されている種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｅは、実施例１５に記載されている種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｅは、実施例１５に記載されている種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｅは、実施例１５に記載されている種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜１３Ｅは、実施例１５に記載されている種々の抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図１４Ａ】図１４は、実施例１６に記載されている材料および方法により製造された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。図１４Ａおよび１４Ｂにおける結果は、ヘテロ接合性Ｆ／Ｖエフェクター細胞を使用した実験からのものである。
【図１４Ｂ】図１４は、実施例１６に記載されている材料および方法により製造された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。図１４Ａおよび１４Ｂにおける結果は、ヘテロ接合性Ｆ／Ｖエフェクター細胞を使用した実験からのものである。
【図１４Ｃ】図１４は、実施例１６に記載されている材料および方法により製造された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。図１４Ｃおよび１４Ｄにおける結果は、Ｆ／Ｆエフェクター細胞を使用した実験からのものである。
【図１４Ｄ】図１４は、実施例１６に記載されている材料および方法により製造された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。図１４Ｃおよび１４Ｄにおける結果は、Ｆ／Ｆエフェクター細胞を使用した実験からのものである。
【図１４Ｅ】図１４は、実施例１６に記載されている材料および方法により製造された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。図１４Ｅからの結果は、Ｖ／Ｖエフェクター細胞を使用した実験からのものである。
【図１５】図１５は、実施例１７に記載されている単一突然変異体のそれぞれの推定相加的参照曲線と比較した場合の抗Ｈｅｒ２  Ｆｃ二重突然変異体のＡＤＣＣ活性を図示する。
【図１６Ａ】図１６は、実施例１８に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。
【図１６Ｂ】図１６は、実施例１８に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。
【図１６Ｃ】図１６は、実施例１８に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。
【図１６Ｄ】図１６は、実施例１８に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＡＤＣＣ応答を図示する。
【図１７】図１７は、実施例１９に記載されている材料および方法により産生された種々の抗体に対するＣＤＣ応答を図示する。
【図１８Ａ】図１８は、実施例２０に記載されているＡＩＡモデルにおける本発明のＦｃ突然変異タンパク質の効果を図示する。
【図１８Ｂ】図１８は、実施例２０に記載されているＡＩＡモデルにおける本発明のＦｃ突然変異タンパク質の効果を図示する。
【図１９Ａ】図１９は、実施例２１に記載されているＡＩＡモデルにおける本発明のＦｃ突然変異タンパク質の効果を図示する。
【図１９Ｂ】図１９は、実施例２１に記載されているＡＩＡモデルにおける本発明のＦｃ突然変異タンパク質の効果を図示する。
【図２０−１】図２０は、実施例２２に記載されている抗ＴＮＦα抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図２０−２】図２０は、実施例２２に記載されている抗ＴＮＦα抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図２１Ａ】図２１は、実施例２３に記載されている抗ＴＮＦα抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図２１Ｂ】図２１は、実施例２３に記載されている抗ＴＮＦα抗体に対するＦｃγＲ結合を図示する。
【図２２】図２２は、実施例２４に記載されているＡＩＡモデルにおける本発明のＦｃ突然変異タンパク質の効果を図示する。  実施例１  株および試薬  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０またはＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を組換えＤＮＡ研究に使用した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素およびＰＮＧアーゼＦをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから入手した。オリゴヌクレオチドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから取り寄せた。
【０１９３】
実施例２
抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１  Ｆｃ突然変異タンパク質およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）組換え発現ベクターの構築
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＨｅｒ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体の単一および二重Ｆｃ突然変異タンパク質の製造を、後記に挙げる配列およびプロトコールを用いて行った。
【０１９４】
Ａ．重鎖および軽鎖
Ｈｅｒ２モノクローナルＩｇＧ１抗体の製造に使用した重鎖および軽鎖配列（それぞれ、配列番号１および２）は後記に記載されている。重鎖抗Ｈｅｒ２二重突然変異タンパク質抗体のアミノ酸配列は配列番号９に示されている。該重鎖および軽鎖はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）コドン使用頻度に従い最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．１１，Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成され、ｐＵＣ１９内にクローニングされた。
【０１９５】
フォワードおよびリバースプライマーとしてそれぞれＦｃＦ２４３Ａ−Ｆ（配列番号３）およびＦｃＦ２４３Ａ−Ｒ（配列番号４）を使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＣＡ）を使用して、アミノ酸位置Ｆ２４３におけるアラニンＦｃ突然変異を行った。同様に、フォワードおよびリバースプライマーとしてそれぞれＶ２５４Ａ−Ｆ（配列番号５）およびＶ２６４Ａ−Ｒ（配列番号６）を使用して、アミノ酸位置Ｖ２６４における突然変異を行った。該単一突然変異タンパク質プラスミドのそれぞれからのＦ２４３Ａ部位とＶ２６４Ａ部位との間の酵素消化およびそれに続く連結を用いて、二重突然変異を行った。
【０１９６】
Ｂ．シグナル配列
α−接合因子プレドメインのシグナル配列を、ＰＣＲ融合により、軽鎖または重鎖の５’末端にインフレームで融合させた。該配列を前記のとおりにコドン最適化した。コザック配列ＡＡＡＣＧをメチオニンの５’末端に付加し、クローニング目的のためにＥｃｏＲＩ部位を該コザック配列の前に付加した。ＤＮＡ配列（配列番号７）およびアミノ酸（配列番号８）の翻訳は後記に示されているとおりである。
【０１９７】
Ｃ．ＩｇＧ１およびＩｇＧ１  Ｆｃ突然変異タンパク質の発現のための組換えプラスミド
ＩｇＧ１およびその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する重鎖および軽鎖を、それぞれ、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター下およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｃｙｃターミネーターの前にクローニングした。その完成した重鎖および軽鎖の発現カセットを最終的な発現ベクターへと合体させた。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）内へのゲノム挿入を、Ｓｐｅ１での該ベクターの線状化およびＴｒｐ２部位内への標的化組込みにより行った。
【０１９８】
本明細書中で使用されているプラスミドの要約を以下の表１に示す。Ｈｅｒ２二重Ｆｃ突然変異タンパク質のための最終的な発現プラスミドの図示を図１に示す。
【０１９９】
【表２】
0005956982.tif 000004
実施例３
抗Ｈｅｒ２およびそのＦｃ突然変異タンパク質を製造するための糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０宿主
２つの異なる糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主、すなわち、ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０を、本発明において適用した。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＵＳ  ７，０２９，８７２およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＵＳ  ７，４４９，３０８に開示されている方法に従い、所望のＮ−グリコフォームを主要種として有する所望のポリペプチドを発現しうるように下等真核宿主細胞を遺伝的に操作するのに有用であるベクターを構築することが可能である。Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６）およびＨａｍｉｌｔｏｎ  ＵＳ  ２００６／０２８６６３７に記載されている方法に従い、ＮＲＲＬ１１４３０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡ）からＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０株を操作した。操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＦＩ５．０は、末端ガラクトースを伴う二分岐Ｎ−グリカン構造を有するタンパク質を産生しうる。本明細書において使用されているＧＦＩ５．０株ＲＤＰ６９７の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１Δ：：ｌａｃＺ  ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＦＢ８／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｈｉｓ１：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＸＢ３３／ＳｐＧＡＬＥ／ＤｍＵＧＴ  ａｒｇ１：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４。操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＦＩ６．０であるＹＧＬＹ３５８２の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ，ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３，ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ  ｍｅｔ１６Δ：：ｌａｃＺ，ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ，ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４，ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８，ＰＲＯ１：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１，ＴＲＰ２：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３Ｙ。ＧＦＩ６．０株は、末端α２，６結合シアル酸がガラクトースに結合した二分岐Ｎ−グリカン構造を有するタンパク質を産生しうる。
【０２００】
遺伝子型を示すために用いられる略語は一般に公知であり、当業者に理解されており、以下の略語を含む。
ＳｃＳＵＣ２：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ；
ＯＣＨ１：アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ；
ＫｌＭＮＮ２−２：クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体；
ＢＭＴ１：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＢＭＴ２：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＢＭＴ３：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＢＭＴ４：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）；
ＭＮＮ４Ｌ１：ＭＮＮ４様１（電荷除去）；
ＭｍＳＬＣ３５Ａ３：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ；
ＰＮＯ１：Ｎ−グリカンのホスホマンノシル化（電荷除去）；
ＭＮＮ４：マンノシルトランスフェラーゼ（電荷除去）；
ＳｃＧＡＬ１０：ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ；
ＸＢ３３：ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧａｌＴ１；
ＤｍＵＧＴ：ＵＤＰ−ガラクトース輸送体；
ＫＤ５３：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＤｍＭＮＳＩＩ；
ＴＣ５４：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＲｎＧＮＴＩＩ；
ＮＡ１０：ＰｐＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧＮＴＩ；
ＦＢ８：ＳｃＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＭｍＭＮＳ１Ａ；
ＴｒＭＤＳ１：分泌トリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＭＮＳ１；
ＡＤＥ１：Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンテターゼ；
ＭｍＣＳＴ：マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体；
ＨｓＧＮＥ：ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ；
ＨｓＣＳＳ：ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ；
ＨｓＳＰＳ：ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ；
ＭｍＳＴ６−３３：ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化マウスアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ；
ＬｍＳＴＴ３ｄ：リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）からのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ触媒サブユニット。
【０２０１】
実施例４
酵母の形質転換およびスクリーニング
糖操作ＧＦＩ５．０およびＧＳ６．０株を、ＹＰＤに富む培地（酵母エキス１％、ペプトン２％および２％デキストロース）内で増殖させ、対数増殖期に遠心分離により集め、氷冷１Ｍソルビトールで３回洗浄した。１〜５μｇのＳｐｅ１消化プラスミドをコンピテント酵母細胞と混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，２０００  Ａｌｆｒｅｄ  Ｎｏｂｅｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７）プリセット  ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）エレクトロポレーションプログラムを使用してエレクトロポレーションした。２４℃の回収用豊富（ｒｉｃｈ）培地内で１時間の後、該細胞を、３００μｇ／ｍｌ  ゼオシンを含有する最少デキストロース培地（１．３４％  ＹＮＢ、０．０００４％  ビオチン、２％  デキストロース、１．５％  寒天）上でプレーティングし、該形質転換体が出現するまで２４℃でインキュベートした。
【０２０２】
高力価株に関してスクリーニングするために、９６個の形質転換体を緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）に接種し、７２時間増殖させ、ついで緩衝化メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）内で２４時間の誘導を行った。以下のとおりにプロテインＡビーズアッセイにより抗体の分泌を評価した。９６ウェルプレート培養からの５０マイクロリットルの上清を非結合性９６ウェルアッセイプレート内で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で１：１に希釈した。各９６ウェルプレートに関して、２ｍｌの磁性ＢｉｏＭａｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ懸濁液ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を磁性ラック内に保持されたチューブ内に配置した。２〜３分後、該ビーズが該チューブの側面に集められ、該バッファーをデカントした。該ビーズを、元の容量（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に等しい容量の洗浄バッファーで３回洗浄し、同じ洗浄バッファーに再懸濁させた。２０μｌのビーズを、希釈サンプルを含有するアッセイプレートの各ウェルに加えた。該プレートを覆い、穏やかにボルテックスし、ついで、１５分ごとにボルテックスしながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、該ビーズが各ウェルの片側に集まるように誘導する磁性プレート上に該サンプルプレートを配置した。Ｂｉｏｍｅｋ  ＮＸ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で、該プレートからの上清を廃棄物容器へと除去した。ついで該サンプルプレートを該磁石から取り出し、該ビーズを１００μｌの洗浄バッファーで洗浄した。該プレートを該磁石上に再び配置した後、該洗浄バッファーを吸引により除去した。２０μｌのローディングバッファー（２５ｍＭ  ＮＥＭ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅ−ＰＡＧＥゲルローディングバッファー）を各ウェルに加え、該プレートを手短にボルテックスした。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６遠心機上の５００ｒｐｍでの遠心分離の後、該サンプルを９９℃で５分間インキュベートし、ついでＥ−ＰＡＧＥハイスループット・プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で泳動させた。ゲルをゲル染色溶液（０．５ｇクーマシーＧ２５０ブリリアントブルー、４０％  ＭｅＯＨ、７．５％  酢酸）で覆い、電子レンジ内で３５秒間加熱し、ついで室温で３０分間インキュベートした。該ゲルを蒸留水中で一晩にわたって脱染した。高力価コロニーを、実施例５に詳細に記載されている更なるＳｉｘｆｏｒｓ発酵スクリーニングのために選択した。ＩｇＧ１野生型（親）およびＦｃ突然変異タンパク質産生株の要約を以下の表２に示す。
【０２０３】
【表３】
0005956982.tif 000005
0005956982.tif 000006
実施例５
バイオリアクター（Ｓｉｘｆｏｒｓ）スクリーニング
バイオリアクター発酵スクリーニングを、以下のとおりに記載されているとおりに行った。糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のフェッドバッチ発酵を０．５リットルのバイオリアクター（Ｓｉｘｆｏｒｓマルチ・ファーメンテーション・システム（ｍｕｌｔｉ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ），ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）内で以下の条件下で行った：ｐＨ  ６．５、２４℃、３００ｍｌ  気流／分、および３５０ｍＬ（３３０ｍＬのＢＭＧＹ培地［１００ｍＭ  リン酸カリウム、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、２０ｇ／ｌ  ペプトン（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、４０ｇ／ｌ  グリセロール、１８．２ｇ／ｌ  ソルビトール、１３．４ｇ／ｌ  ＹＮＢ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、４ｍｇ／ｌ  ビオチン］および２０ｍＬの接種物）の初期実施体積での５５０ｒｐｍの初期攪拌速度。該発酵の１時間から１０時間までの間に攪拌速度を５５０ｒｐｍから１２００ｒｐｍへ直線的に増加させるために、ＩＲＩＳマルチ・ファーメンター（ｍｕｌｔｉ−ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）ソフトウェア（ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ．ＭＤ）を使用した。それにより、溶存酸素濃度が該発酵中に変動することを可能にした。初期グリセロール仕込み（４０ｇ／ｌ）が消費されるまで（典型的には１８〜２４時間）、該発酵をバッチ形態で行った。１７ｍｌのグリセロール供給溶液（５０％［ｗ／ｗ］グリセロール，５ｍｇ／ｌ  ビオチン，１２．５ｍＬ／ｌ  ＰＭＴ１塩（６５ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｇ／ｌ  ＺｎＣｌ２，９ｇｌ  Ｈ２ＳＯ４，６ｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，５ｇ／ｌ  Ｈ２ＳＯ４，３ｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５００ｍｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ，２００ｍｇ／ｌ  ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２００ｍｇ／ｌ  ビオチン，８０ｍｇ／ｌ  ＮａＩ，２０ｍｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ４）を該バイオリアクターに加えることにより、第２バッチ段階を開始した。加えたグリセロールが消費されるまで（典型的には６〜８時間）、該発酵を再びバッチ形態で行った。溶存酸素の急上昇により示される、第２バッチ段階の完了の後、メタノール溶液（１００％［ｗ／ｗ］メタノール，５ｍｇ／ｌ  ビオチンおよび１２．５ｍＬ／ｌ  ＰＭＴ１塩）を、０．６ｇ／時間で、典型的には回収前に３６時間にわたって供給することにより、誘導段階を開始した。全容量を該リアクターから取り出し、ＳＬＣ−６０００ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で８，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。細胞塊を廃棄し、上清を精製および分析のために保持した。グリカンの質をＭＡＬＤＩ飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析および２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）標識（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２）：２１０−２１５（２００６）に従って行う）により評価する。グリカンをＰＮＧアーゼ−Ｆでの処理により該抗体から遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析してグリカンの構造を確認した。存在する中性および荷電グリカンの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦにより遊離したグリカンを２−ＡＢで標識し、���ＰＬＣにより分析した。
【０２０４】
実施例６
バイオリアクター培養
３Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および１５Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ガラスバイオリアクターならびに４０Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ステンレス鋼スチーム・イン・プレイス（ｓｔｅａｍ  ｉｎ  ｐｌａｃｅ）バイオリアクターにおいて発酵を行った。凍結ストックバイアルを１％の体積比で直接的にＢＭＧＹ培地に接種することにより、シード培養を調製した。移した直後に細胞が指数関数的に増殖することが保証されるように、２０±５の光学密度（ＯＤ６００）を得るためにシードフラスコを２４℃で４８時間インキュベートする。該培地は、１リットル当たり、４０ｇ  グリセロール、１８．２ｇ  ソルビトール、２．３ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，１１．９ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，１０ｇ  酵母エキス（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ），２０ｇ  ペプトン（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ），４×１０−３ｇ  ビオチンおよび１３．４ｇ  酵母窒素ベース（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を含有していた。該バイオリアクターに初期培地に対して１０％の体積比のシードを接種する。以下の条件下、フェッドバッチ形態で培養を行った：２４±０．５℃に設定された温度、ＮＨ４ＯＨで６．５±０．１に制御されたｐＨ、Ｏ２の添加の際の段階的（ｃａｓｃａｄｉｎｇ）攪拌速度による１．７±０．１ｍｇ／Ｌに維持された溶存酸素。気流速度は０．７ｖｖｍに維持した。初期仕込みグリセロール（４０ｇ／Ｌ）が消失した後、２５０ｇ／Ｌの湿潤細胞重量に達するまで、１２．５ｍＬ／ＬのＰＴＭ１塩を含有する５０％  グリセロール溶液を、最大増殖速度の５０％で、８時間にわたって指数関数的に供給した。０．０１時間−１の比増殖速度を維持するためにメタノールを指数関数的に供給して、３０分間の飢餓段階を行った後、誘導を開始した。１５０ｍＭ／Ｌ／時間の酸素取り込み速度に達したら、酸素限界を避けるために、該メタノール供給速度を一定に維持した。
【０２０５】
実施例７
抗体の精製
分泌抗体の精製は、利用可能な公開されている方法、例えば、Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２）：２１０−２１５（２００６））の方法を用いて当業者により行われることが可能であり、この場合、抗体が発酵上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより捕捉され、フェニルセファロース高速流動樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーにより更に精製される。
【０２０６】
実施例８
グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２−５０２７（２００３）およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４−１２４６（２００３）に記載されているとおりにＮ−グリカンを分析した。糖タンパク質を還元し、カルボキシメチル化した後、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦでの処理によりＮ−グリカンを遊離させた。該タンパク質をエタノールで沈殿させた後、該遊離オリゴ糖を回収した。Ｖｏｙａｇｅｒ  ＰＲＯリニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）質量分析計を遅延抽出と共に該製造業者の説明に従い用いることにより、分子量を決定した。前記実施例に従い製造された抗Ｈｅｒ２抗体のＮ−グリカン分析の結果を図４〜８に示す。
【０２０７】
実施例９
ＨＰＬＣによるＮ結合グリカン分析
各グリコフォームの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦ遊離グリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣにより分析した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２−５０２７（２００３）およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載されているとおりに行った）。３Ｌバイオリアクターにおいて産生された単一および二重突然変異タンパク質に関する並びに小規模０．５Ｌバイオリアクターにおいて産生された野生型および二重突然変異タンパク質に関するＧＦＩ６．０株において産生されたシアル酸化抗Ｈｅｒ２抗体の量を表３に示す。
【０２０８】
【表４】
0005956982.tif 000007
実施例１０
抗原アフィニティアッセイ
抗原を発現する哺乳類細胞をトリプシン処理により集め、４０μｍ細胞濾過器で濾過し、９６深ウェルプレート内のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に懸濁させた。該精製抗体の系列希釈物を１０から０．０１μｇｍｌ−１までの範囲の最終濃度で該細胞に加えた。該抗体細胞混合物を氷上で４５分間インキュベートした。該細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の１％  ＦＢＳ中の２μｇｍｌ−１の抗ヒトＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、暗室内で氷上で４５分間染色した。該細胞を冷ＰＢＳ中で再び洗浄し、ＰＢＳ中の１％  ＦＢＳに懸濁させ、Ｕ底９６ウェルプレート（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｃａｌａ，ＦＬ）に移した。４８８ｎｍの励起波長および５２５ｎｍの発光波長を用いて、Ｇｕａｖａ  ＥｘｐｒｅｓｓＰｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出した。結果を図３に示す。
【０２０９】
実施例１１
ＦｃγＲ結合アッセイ
Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）に記載されている方法を若干変更した方法により、Ｆｃγ受容体結合アッセイを行った。高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）をＰＢＳ中の以下の濃度の１００μｌ／ウェルのＦｃγ受容体溶液でコートした：ＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＦｃγＲＩＩａ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ産生体）は１μｇ／ｍＬ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ産生体）は２μｇ／ｍＬ、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８は０．４μｇ／ｍＬならびにＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８（共にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ産生体）は０．８μｇ／ｍＬ。ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８およびＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８受容体を、Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）に記載されているとおりにピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用して発現させた。
【０２１０】
また、Ｌｉらに記載されているものに類似した方法を用いて、ＦｃγＲＩＩａを糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）において発現させた。ＦｃγＲＩＩａ細胞外ドメインをヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１  ｔｏｐｏベクター内にクローニングした。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレプロドメインを使用し、ＡＯＸ１プロモーター下、Ｆｃガンマ受容体をピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター内にクローニングした。ｐＧＬＹ３２４９をｙＧＬＹ６３８（ＧＦＩ２．０宿主）内に形質転換することにより、最終株ｙＧＬＹ４６６５を得た。
【０２１１】
糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＹＧＬＹ６３８（ＧＦＩ２．０宿主）を使用して、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃを発現させ、産生させた。Ｃ末端９Ｈｉｓタグを含有するヒトＦｃガンマ受容体ＩＩｂ／ｃ（ＮＰ ００３９９２）の細胞外ドメインのＤＮＡ配列をピチア（Ｐｉｃｈｉａ）に関してコドン最適化し、ｐＡＳ１９７（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と命名した。ＦｃγＲＩＩｂ／ｃのヒスチジンタグ付き細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１７に見られうる。ｐＧＬＹ３２４６のプラスミド構築のために、コドン最適化ｈＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（ＡｆｅＩ／ＫｐｎＩ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＦプレプロ（ＥｃｏＲＩ／平滑）をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ部位においてｐＧＬＹ２２１９内にクローニングした。得られたプラスミドｐＧＬＹ３２４６をｙＧＬＹ６３８内に形質転換して、ｙＧＬＹ４６５３を得た。ＹＧＬＹ４６５３を発酵させ、精製した（Ｌｉらに従い行った）。
【０２１２】
ＦｃγＲＩの場合には、該抗体を、アッセイ希釈剤（１％  ＢＳＡ、ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中、単量体形態でコートした。全ての他の受容体の場合には、室温で1時間、アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で二量体化した後、該抗体をコートした。また、Ｆ（ａｂ’）２を使用してＦｃγＲＩ結合抗体を検出し、ＳｕｐｅｒＰｈｏｓ（Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の存在下の１８時間のインキュベーションの後、３４０ｎｍにおける励起および４６５ｎｍにおける発光を測定することにより、全てのプレートを定量した。
【０２１３】
結果を図９に示す。図９Ａに示されているとおり、Ｆｃ単一突然変異タンパク質（▲および▼）は、Ｈｅｒ２抗体（■）（図９Ａ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２（データ非表示）の両方に類似したＦｃγＲＩ（Ｆｃ受容体ガンマ−鎖Ｉ、ＣＤ６４）結合を示し、一方、Ｆｃ二重突然変異タンパク質（◆）はＦｃγＲＩに対するアフィニティにおける約１４倍の減少を示した（図９Ａ）。
【０２１４】
ＦｃγＲＩＩｂ／ｃの場合、Ｆｃ単一突然変異タンパク質（▲および▼）は、Ｈｅｒ２抗体（■）と比較して受容体結合特性における１０倍の減少を示したが（図９Ｂ）、二重Ｆｃ突然変異タンパク質はＦｃγＲＩＩｂ／ｃに結合しないらしい。
【０２１５】
ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８およびＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８の場合、両方の単一Ｆｃ突然変異タンパク質（▲および▼）は、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８には、市販のヘルセプチン抗体（■）より２０倍良好に結合するが、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８には、市販のヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体（■）より僅かに良好に結合するに過ぎない（図９Ｄ）。Ｆｃ二重突然変異タンパク質（◆）はＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８に対してはアフィニティをほとんど示さなかったが（５０倍の減少）（図９Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対しては、市販のヘルセプチン抗体（■）およびＧＳ５．０からのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２（データ非表示）より３０倍弱いものの、幾らかのアフィニテイを尚も保有していた。
【０２１６】
更に、ＦｃγＲＩＩＩａの多形体の両方に対する二重Ｆｃ突然変異タンパク質のアフィニティはノイラミニダーゼによるシアル酸の遊離に際して変化しないらしい（データ非表示）。したがって、いずれの理論にも束縛されるものではないが、ＦｃγＲＩＩＩａの多形の両方に対するアフィニティの減少は、該二重突然変異（すなわち、二重Ｆｃ突然変異タンパク質）により生じた構造変化またはコンホメーション変化によるものであり、α２，６結合シアル酸化Ｎ−グリカンのレベルの増加によるものではない、と本出願人は考えている。
【０２１７】
実施例１２
抗Ｈｅｒ２抗体およびそのＦｃ突然変異タンパク質に関するＣ１ｑ結合アッセイ
Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：４１７８−４１８４（２０００）の方法を記載どおりに用いて、Ｃ１ｑ結合アッセイを行った。高結合性プレートを無効（ｃｌｅａｒ）にするために、系列希釈抗体を５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＣＯ３（ｐＨ９．０）中の１００μｌ／ウェルでコートした。ヒトＣ１ｑ補体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）をアッセイ希釈剤（０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｇｅｌａｔｉｎ，ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中の２μｇ／ｍＬで２時間コートした。Ｃ１ｑをＨＲＰ結合ヒツジポリクローナル抗ヒトＣ１ｑ抗体（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）で検出し、ＯＤ４５０を測定することにより定量した。
【０２１８】
結果を図１０に示す。図１０に示されているとおり、本明細書に記載されている材料および方法により産生された単一および二重Ｆｃ突然変異タンパク質抗体は、哺乳類細胞培養または非シアル酸化ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生されたものと比較して低下したＣ１ｑ結合を示した。単一Ｆｃ突然変異体（▲または▼）から産生された抗体に対するＣ１ｑ結合は、Ｈｅｒ２抗体と比較して５〜１０倍低下し、一方、二重Ｆｃ突然変異体（◆）に対するＣ１ｑ結合は実質的に消失した。
【０２１９】
ＧＦＩ５．０株において産生されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２抗体（データ非表示）および該Ｈｅｒ２抗体は共に、Ｃ１ｑに対する類似したアフィニティを示した。
【０２２０】
実施例１３
抗Ｈｅｒ２およびそのＦｃ突然変異タンパク質に関する抗体依存性細胞傷害
ユウロピウム取り込みアッセイを用いて抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定した。ヒト卵巣腺癌系ＳＫＯＶ３を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足されたＭｃＣｏｙの５Ａ培地内で培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をロイコパック（ｌｅｕｃｏｐａｋ）から得た。ＰＢＭＣをフィコール・パック密度遠心分離に付し、２％  ＦＢＳで補足されたＰＢＳ中で洗浄し、１０％  ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙの５Ａ培地に再懸濁させた。ＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｆ１５８Ｖ遺伝子型を各ドナーに関して決定した。ＳＫＯＶ３細胞をＥｕＤＴＰＡで標識した。該細胞を５０００／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに加え、エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を３００，０００／ウェル（Ｅ：Ｔ  ６０：１）で加えた。抗体を種々の濃度で加え、該プレートにわたって希釈した。対照には、バックグラウンド、標的およびエフェクターベースライン計数、ならびに１００％  細胞溶解ウェルが含まれた。抗体を含有する又は含有しない該ＰＢＭＣ混合物を３７℃で４時間インキュベートした。２０μｌの該上清をＤＥＬＰＨＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ｃａｔ＃１２４４−１０５）と混合して高蛍光キレートを形成させ、それを時間分解蛍光光度分析を用いて測定することにより、細胞溶解ＰＢＭＣからのＥｕＤＴＰＡの遊離を決定した。各抗体希釈物に関して三重ウェルを準備し、式：（（実験的遊離−バックグラウンド）／（最大遊離−バックグラウンド））−（（自然細胞傷害−バックグラウンド）／（最大遊離−バックグラウンド））に従い、細胞溶解の割合を計算した。これらの用語は以下のとおりに定義される。実験的遊離は、エフェクター細胞および抗体の存在下の標的細胞に関する平均計数を表し、バックグラウンドは、標的細胞を標識した後の最終洗浄からの上清に関する平均を表し、最大遊離は、ＤＥＬＰＨＩＡ細胞溶解バッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ｃａｔ＃４００５−００１０）と共にインキュベートされた標的細胞に関する平均を表し、自然細胞毒性はエフェクター細胞の存在下の標的細胞に関する平均計数を表す。Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを使用して、データ点を４パラメータ・ロジスティック回帰モデルに当てはめた。全ての曲線は、同じ最大値、最小値および勾配を共有するように拘束された。
【０２２１】
実施例１０〜１２におけるアッセイは、任意の免疫グロブリン分子に関する要件に容易に適合化されうる、と当業者は認識し理解するであろう。更に、動物モデルにおけるインビボＡＤＣＣアッセイは、Ｂｏｒｃｈｍａｎｎら，Ｂｌｏｏｄ，１０２：３７３７−３７４２（２００３）；Ｎｉｗａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２１２７−２１３３（２００４）の方法を用いて、任意の特異的ＩｇＧに適合化されうる。
【０２２２】
結果を図１１に示す。該単一Ｆｃ突然変異タンパク質が示したＡＤＣＣ活性プロファイルは該Ｈｅｒ２抗体のものに類似しており、ＧＦＩ５．０宿主において産生されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２抗体より約５倍低かった。図１１に示されているとおり、ＦｃγＲＩＩＩａ結合データから予想されたとおり、二重Ｆｃ突然変異タンパク質から産生された抗体にはＡＤＣＣ活性は実質的に存在しない。
【０２２３】
実施例１４
抗Ｈｅｒ２およびそのＦｃ突然変異タンパク質に関する皮下ＰＫ研究
皮下ＰＫ研究をＣ５７Ｂ６マウスにおいて行った。抗体サンプルを１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した（ｎ＝３）。１０μｌの血液を１、６、２４、５３、７７、１２０、１９２、２４０、２８８および３６０時間の採集時点において毛管で集め、９０μｌのカルシウムおよびマグネシウム非含有ＰＢＳならびに１．８ｍｇ／ｍｌ  Ｋ２ＥＤＴＡを含有するミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）チューブに移した。サンドイッチイムノアッセイを用いて、Ｇｙｒｏｓ（登録商標）Ｂｉｏａｆｆｙ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ワークステーションでヒトＩｇＧレベルを決定した。１００μｇ／ｍｌ  ビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトカッパ鎖（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を捕捉抗体として使用し、１２．５ｎＭ  ＡＬＥＸＡ−６４標識マウスモノクローナル抗ヒトＦｃ  Ｐａｎ  ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を検出抗体として使用した。捕捉抗体の固定化およびアナライトの添加から、検出抗体の添加および洗浄工程まで、全イムノアッセイを自動化した。標準物およびＱＣを５％  マウス対照血漿（ＥＤＴＡ）中で２０×ストックとして調製し、分析前にアッセイバッファー（ＰＢＳ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ）中の５％  マウス血漿中に１：２０希釈した。正確なＩｇＧ濃度の決定のための直線範囲を添加ＱＣで確定し、それが５〜５０００ｎｇ／ｍｌであることが判明した。正確さ及び精度の許容性限界は、＋／−２５％の定量下限（ＬＬＯＱ）を伴う＋／−２０％であった。標準物およびＱＣは、シグナルの有意な喪失を伴うことなく、３回、凍結および解凍することが可能であった。標準物、ＱＣおよび研究サンプルは−７０℃で貯蔵した。研究サンプルを解凍し、アッセイバッファー中の５％  マウス血漿中に１：２０希釈し、レベルが直線アッセイ範囲外である場合には更に１：１０希釈した。全ての標準物、ＱＣおよび研究サンプルを二重にアッセイし、平均結果を示した。第５パラメータ・ロジスティック曲線フィットを用いて、濃度を決定した。血清ｍＡｂ濃度−時間データ（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の非コンパートメント分析を用いて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎで、薬物動態学的パラメータを各動物に関して計算した。
【０２２４】
図１２に示されているとおり、ＧＦＩ５．０グリコシル化を伴うピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｈｅｒ２およびＨｅｒ２で処理されたマウスは、類似したｔ  １／２および血清濃度を有し、一方、ＧＦＩ６．０グリコシル化を伴って産生されたＦｃ二重突然変異タンパク質Ｈｅｒ２で処理されたマウスは、ＣＨＯ細胞において産生されたＨｅｒ２で処理されたマウスと比較して、より高いＣｍａｘ（最大濃度）、および血清濃度における約３０％の増加を示した。したがって、皮下注射された３つのサンプルのうち、Ｆｃ二重突然変異タンパク質抗体が、より高いＣｍａｘおよび血清濃度に基づいて、より良好なバイオアベイラビリティ（吸収または曝露）を示した。
【０２２５】
実施例１５
本発明の抗Ｈｅｒ２抗体およびそのＦｃ突然変異タンパク質に関するもう１つの一連のＦｃγ受容体結合アッセイを、実施例１１に記載されているとおりに行い、結果を図１３ならびに表４および５に示す。
【０２２６】
【表５】
0005956982.tif 000008
【０２２７】
【表６】
0005956982.tif 000009
実施例６
抗ＨＥＲ２抗体およびＦｃ突然変異タンパク質のＡＤＣＣの評価
ＳＫＯＶ３標的細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ＃ＨＴＢ−７７）を使用してＡＤＣＣ分析を行った。該アッセイの前日に、初代ＮＫエフェクター細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ，Ｃａｔ＃２１５−１１−１０）を１０００ｒｐｍで１５分間にわたりペレット化し、１０％  ＦＢＳ（Ｃｅｉｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃３５−０１６−ＣＶ）で補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ＃１１８３５−０３０）に１×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁させた。該再懸濁ＮＫ細胞を５％  ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２２８】
アッセイ当日、付着ＳＫＯＶ３標的細胞のフラスコをＰＢＳで洗浄し、該細胞を、３ｍｌのトリプシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃２５−０５３−ＣＩ）および３７℃で２〜５分間のインキュベーションを用いて脱離させた。該細胞を２３ｍｌのＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％  ＦＢＳで集め、上下にピペッティングして塊をばらばらにした。集めた細胞を１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１×１０７細胞／ｍｌの濃度までＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％ＦＢＳで再懸濁させた。該標的細胞（１×１０７細胞）を１００μＣｉのクロム−５１（正常食塩水中の５ｍＣｉ  クロム酸ナトリウム；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃ＮＥＺ０３００５ＭＣ）で標識した。標的細胞を、１５分ごとに振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を１８００ｒｐｍで２分間遠心分離し、１ｍｌのＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％  ＦＢＳに再懸濁させた。細胞を１ｍｌのＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％ＦＢＳで更に２回洗浄した。そのそれぞれの洗浄と洗浄との間に、１８００ｐｍで２分間の遠心分離を行った。最終洗浄後、該標識標的細胞を２．５×１０５細胞／ｍｌの最終濃度までＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％  ＦＢＳに再懸濁させた。
【０２２９】
これらのアッセイにおいて使用した試験抗体は、ＧＦＩ５．０において産生された抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、ＧＦＩ６．０において産生された抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  Ｆ２４３Ａ（ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ）、ＧＦＩ６．０において産生された抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  Ｖ２６４Ａ（ＧＳ６．０／Ｖ２６４Ａ）、およびＧＦＩ６．０において産生された抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ（ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）であった。ＳＫＯＶ３標的細胞を標識している間に、ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ＃３５３０７７）内で、ＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％  ＦＢＳにおいて、３倍系列滴定（１μｇ／ｍｌから開始）を用いて試験抗体を希釈した。別の９６ウェルアッセイプレートのウェルに、１００μｌのＣｒ−５１標識ＳＫＯＶ３標的細胞（＝２５，０００細胞）を移した。該抗体希釈プレートを調製した後、１０μｌの各希釈物を、該標識標的細胞を含有する９６ウェルアッセイプレートに移した。対照として、１０μｌのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（１０％  ストック，Ｆｌｕｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｃａｔ＃９３４４３）または１０μｌの培地をそれぞれ「最大細胞溶解」または「自然遊離」対照ウェルに加えた。各抗体希釈物は、二重に（２回重複試験で）試験し、一方、各対照は、６回重複試験で試験した。
【０２３０】
初代ＮＫ細胞を１２００ｒｐｍで５分間にわたってペレット化し、２．５×１０６細胞／ｍｌまでＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地、１０％  ＦＢＳに穏やかに再懸濁させた。全てのサンプルウェルおよび「無抗体」対照ウェル（すなわち、「自然遊離」および「最大細胞溶解」対照を除外）に、１００μｌのＮＫ細胞（＝２５０，０００細胞）を１０：１のエフェクター：標的比で加えた。該アッセイプレートを５％  ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。該インキュベーションの後、該アッセイプレートを３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。３０μｌの該上清を９６ウェルＰｉｃｏｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃６００５１８５）内の２５０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃６０１３６２１）に加えた。該Ｃｒ−５１遊離をＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターにおいて測定した。
【０２３１】
細胞溶解率（％）を（（ＡＤＣＣ実験的遊離−自然遊離）／（最大遊離−自然遊離））＊１００として計算した。
【０２３２】
これらのアッセイの結果を図１４に示す。図１４に示されているとおり、Ｆ２４３Ａ単一突然変異タンパク質抗体およびＶ２６４Ａ単一突然変異タンパク質抗体は、親（野生型）抗体と比較してＡＤＣＣ活性における５〜１０倍の低下を示し、一方、Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ二重突然変異タンパク質抗体は、親（野生型）抗体と比較してＡＤＣＣ活性における１００倍を超える低下を示した。
【０２３３】
実施例１７
抗ＨＥＲ２抗体およびその突然変異タンパク質のＡＤＣＣデータの統計分析
本研究の目的は、該二重突然変異体の細胞溶解率が、それらの２つの単一突然変異体と比較して相乗的であるかどうかを判定することであった。該決定は、該二重突然変異体（群４）と推定相加的参照曲線（図１５および表６に示されている）との間でＥＤ５０（５０％細胞溶解に対応する抗体レベル）を比較することによりなされる。該二重突然変異体曲線のＥＤ５０の下限は、アッセイされた最高抗体レベルより高く、相加的参照曲線のＥＤ５０の上限よりも十分に高いため、本発明者らは、該二重突然変異の効果は相加的効果より遥かに大きいと結論づけている。
【０２３４】
統計的方法および結果
該目的は、ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体の二重突然変異体（ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）が、２つの単一突然変異変異体（ＧＳ６．０／Ｆ２４３ＡおよびＧＳ６．０／Ｖ２６４Ａ）と比較して相乗効果を示すかどうかを判定することであった。以下の４つの抗体群を用いた：群１（ＧＳ５．０）、群２（ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ）、群３（ＧＳ６．０／Ｖ２６４Ａ）および群４（ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）。
【０２３５】
３つのドナーからのデータを別々の９６ウェルプレートに関して処理する。各プレートからの観察を、以下のとおりに値を細胞溶解率に変換することにより正規化する。
【０２３６】
【数１】
0005956982.tif 000010
（式中、Ｏｒｃは、各プレートの第ｒ行第ｃ列において観察された応答である；
ＯＮは、各プレートに関する陰性対照の平均応答である；
Ｏｐは、各プレートに関する陽性対照の平均応答である）。
【０２３７】
ついで、各抗体−レベルおよび群に関する二重（２回重複試験）の％細胞溶解を平均する。
【０２３８】
全４群および全３ドナーからのデータを一緒にモデル化する。本発明者らは、「抗体レベル−応答」関係がＳ字形のヒルの式（式１）に従うと考えている。本発明者らは、本発明者らの応答変数（Ｙ）として（１００％−％細胞溶解）を、そして実験的変数（Ｘ）としてｌｏｇ抗体−レベルを用いる。種々の突然変異の効力に関する比較を行い、該モデルを当てはめるために、各群に関する該モデルパラメータについての幾つかの仮定を行う。
【０２３９】
用いるモデルの形態は以下のことを仮定する。
【０２４０】
１．全ての４つの処理群に関して、範囲（ａ）およびプラトー（ｄ）は同じである。
【０２４１】
２．異なる勾配を有することが可能なＧＳ５．０群を除く全ての処理群に関する同じ勾配。
【０２４２】
３．ＥＣ５０パラメータは群によって異なる。
【０２４３】
ヒルの式：
【０２４４】
【数２】
0005956982.tif 000011
以下の制約を伴う：γ１＝０，β１＝０およびβ２＝β３＝β４＝β
ここで、
Ｙｉｊは第ｊの処理に関する第ｉの応答（１００−％細胞溶解）である。
Ｘｉｊは、Ｙｉｊに対応する抗体レベル（対数表示）である。
ｊ＝ＧＳ５．０に関しては１、ｊ＝ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａに関しては２、ｊ＝ＧＳ６．０／Ｖ２６４Ａに関しては３、ｊ＝ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａに関しては４。
【０２４５】
更に、２つの単一突然変異体（ＧＳ６．０／Ｆ２４３ＡおよびＧＳ６．０／Ｖ２６４Ａ）が相加的であれば、合わさった効果に関する式は以下のようになると仮定される。
【０２４６】
【数３】
0005956982.tif 000012
（式中、パラメーターａ、ｄ、γ、γ２、γ３、βおよびβ０は式１の場合と同じである）。
【０２４７】
ＳＡＳ  ｖ９．２におけるＰＲＯＣ  ＮＬＩＮを用いて、モデル（式１および式２）を当てはめる。４つの群に関する観察データ値および当てはめられた曲線ならびに合わされた２つの単一突然変異群に関する推定相加的参照曲線を図１５に示す。ＥＤ５０およびその信頼区間（元の尺度で表示）を表６に示す。
【０２４８】
【表７】
0005956982.tif 000013
２つの単一突然変異ＧＳ６．０／Ｆ２４３ＡおよびＧＳ６．０／Ｖ２６４Ａと比較してＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａの効果を評価するために、群４のＥＤ５０を相加的参照曲線のＥＤ５０と比較する。信頼区間が重複していない場合には、それらの２つの量は統計的に異なると結論づけることが可能である。
【０２４９】
相加的参照曲線のＥＤ５０の９５％信頼区間は（０．３０３１，０．５４５５）であり、一方、群４のＥＤ５０に関する推定値および信頼区間は全て１より大きい（該推定値は抗体−レベルの観察範囲外である）。該二重突然変異のＥＤ５０の９５％信頼下限は＞１であり、これは参照相加的曲線（群２および３を合わせたもの）のＥＤ５０の９５％信頼上限より遥かに高い。したがって、それらの２つの量は有意に異なると結論づけることが可能である。
【０２５０】
ＥＤ５０の信頼区間の前記比較はγ４と和（γ２＋γ３）との比較、すなわち、Ｈｏ：γ４＝（γ２＋γ３）という仮説を、Ｈａ：γ４＞（γ２＋γ３）という対立仮説に対して検定することと同等である。
【０２５１】
ＳＳＥｒｅｄｕｃｅｄおよびＳＳＥｆｕｌｌがそれぞれ低減（ｒｅｄｕｃｅｄ）モデルおよび完全（ｆｕｌｌ）モデルからの残差平方和であるとする。完全モデルは、式１を該データに当てはめることにより得られ、低減モデルは、式１におけるγ４を（γ２＋γ３）で置換することにより得られる。
【０２５２】
仮説：
Ｈｏ：γ４＝（γ２＋γ３）    対    Ｈａ：γ４＞（γ２＋γ３）
検定統計量：
【０２５３】
【数４】
0005956982.tif 000014
ｐ値：
【０２５４】
【数５】
0005956982.tif 000015
ｐ値が＜０．０００１であるため、Ｈｏを棄却し、γ４＞（γ２＋γ３）であると結論づけることが可能である。
【０２５５】
データおよびモデルに基づく該比較は、二重突然変異ＧＳ６．０／Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａが、２つの単一突然変異の合された仮説効果より有意に低い細胞溶解率を有することを示している。該二重突然変異の効果は該単一突然変異の相加効果より遥かに大きい。
【０２５６】
本実施例に関する参考文献：
［１］ＳＡＳ（ｒ）Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ９．２（ＴＳ２Ｍ２），ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ。
［２］‘Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｕｒ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｌｏｐｅ  Ｒａｔｉｏ  ａｎｄ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｌｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌｓ’；Ａａｇｅ  Ｖｏｌｕｎｄ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．３（Ｓｅｐ．１９７８），ｐｐ．３５７−３６５。
【０２５７】
実施例１８
抗ＴＮＦα  Ｆｃ突然変異タンパク質の構築およびＡＤＣＣ評価
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における抗ＴＮＦモノクローナル抗体の二重Ｆｃ突然変異タンパク質（Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）の製造を、後記に挙げる配列およびプロトコールを用いて行った。親（野生型）抗ＴＮＦα抗体の重鎖および軽鎖配列は配列番号１０および１１に記載されている。該二重突然変異タンパク質抗ＴＮＦα抗体の重鎖の配列は配列番号１２に記載されている。ｗｔおよび二重突然変異タンパク質抗ＴＮＦα抗体の軽鎖配列は同一である。
【０２５８】
アルファ−接合因子プレドメインのシグナル配列（配列番号８）を、ＰＣＲ融合により、軽鎖または重鎖の末端にインフレームで融合させた。該配列はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，８６０  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ０８８５４，ＵＳＡ）によりコドン最適化され、合成された。重鎖および軽鎖の両方を、抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１およびそのＦｃ突然変異体の構築に類似した方法により、抗体発現ベクター内にクローニングした。
【０２５９】
ＩｇＧ１およびその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する重鎖および軽鎖を、それぞれ、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター下およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｃｙｃターミネーターの前にクローニングした。その完成した重鎖および軽鎖の発現カセットを最終的な発現ベクターへと合体させた。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）内へのゲノム挿入を、Ｓｐｅ１での該ベクターの線状化およびＴｒｐ２部位内への標的化組込みにより行った。プラスミドｐＧＬＹ６９６４は野生型抗ＴＮＦα  ＩｇＧ１抗体をコードしている。プラスミドｐＧＬＹ７７１５は抗ＴＮＦアルファＩｇＧ１  Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ二重突然変異タンパク質をコードしている。
【０２６０】
抗ＴＮＦアルファおよびそのＦｃ突然変異タンパク質を製造するための糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＦＩ５．０  ＹＧＬＹ８３１６およびＧＦＩ６．０  ＹＧＬＹ２２８３４宿主
抗ＴＮＦα抗体およびそのＦｃ突然変異タンパク質の発現のために使用されるＧＦＩ５．０株ＹＧＬＹ１６７８６の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１Δ：：ｌａｃＺ  ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＦＢ８／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｈｉｓ１：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＸＢ３３／ＳｐＧＡＬＥ／ＤｍＵＧＴ  ａｒｇ１：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４  ＰＲＯ１：：ＡＲＧ１／ＡＯＸ１−ＳｃＭＦｐｒｅＴｒＭＮＳ１ＰＲＯ１：：ＡＲＧ１／ＡＯＸ１−ＳｃＭＦｐｒｅＴｒＭＮＳ１。
【０２６１】
抗ＴＮＦα  Ｆｃ  ＤＭ突然変異タンパク質の発現のために使用されるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ６．０株ＹＧＬＹ２３４２３の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１Δ  ｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ  ＡＤＥ１：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ  ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ  ＴＲＰ２：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３ｓｔｅ１３Δ：：ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１  ｄａｐ２Δ：：ＮａｔＲ  ＴＲＰ５：ＨｙｇＲＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３  Ｖｐｓ１０−１Δ：：ＡＯＸ１ｐ ＬｍＳＴＴ３ｄ。
【０２６２】
実施例４〜７に示されているとおりに、該細胞を形質転換し、スクリーニングし、精製した。
【０２６３】
抗ＴＮＦα  Ｆｃ突然変異タンパク質の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の評価
最初の１２アミノ酸が除去されたＴＮＦαの非切断可能変異体を安定に発現するＪｕｒｋａｔ  ＦｌｐＩｎ標的細胞、すなわち、Ｊｕｒｋａｔ  ＦｌｐＩｎ  ＴＮＦα（Δ１−１２）標的細胞を使用して、ＡＤＣＣ分析を行った。Ｊｕｒｋａｔ  ＦｌｐＩｎヒトＴ細胞白血病細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＴＮＦαの非分泌性細胞表面突然変異体（Δ１−１２  ＴＮＦα）（Ｐｅｒｅｚら，Ｃｅｌｌ  ６３；２５１−２５８（１９９０））でトランスフェクトすることにより、これらの細胞を調製した。Δ１−１２  ＴＮＦα  ＤＮＡを、トランスフェクションに使用するためにｐｃＤＮＡ５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。細胞表面ＴＮＦαの発現をフローサイトメトリーにより確認した。
【０２６４】
アッセイの前日に、初代ＮＫエフェクター細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ，Ｃａｔ＃２１５−１１−１０）を１２００ｒｐｍで１２分間ペレット化し、１０％  熱不活性化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｆ４１３５）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１５６３０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃２５−００５−ＣＩ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃３０−００２−ＣＩ）で補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ＃１１８３５−０３０）に約１〜１．５×１０６細胞／ｍｌまで穏やかに再懸濁させた。該再懸濁ＮＫ細胞を５％  ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２６５】
アッセイの当日に、Ｊｕｒｋａｔ  Ｆｌｐｉｎ  ＴＮＦα（Δ１−１２）標的細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを、５％  熱不活性化ＦＢＳで補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁させた。該細胞を２５μｌのＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ標識試薬（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキット，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃ＡＤ０１１６）で標識した。細胞を穏やかに混合し、１０分ごとに穏やかに混合しながら３７℃で２０分間インキュベートした。細胞容量を、１．５ｍＭ  プロベニシド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃Ｐ３６４００）を含有するＤＰＢＳで３０ｍｌに調節し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１．５ｍＭ  プロベニシドを含有する３０ｍｌのＤＰＢＳで細胞を３回洗浄し、それぞれの洗浄と洗浄との間に、１２００ｐｍで５分間の遠心分離を行った。最終洗浄後、５％  熱不活性化ＦＢＳおよび１．５ｍＭ  プロベニシドで補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地に２．５×１０５細胞／ｍｌの最終濃度まで該標識標的細胞を再懸濁させた。
【０２６６】
該アッセイにおいて使用した試験抗体は、ＧＦＩ５．０において産生された抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１野生型抗体（「ＧＦＩ７７４」と称される）、ＧＦＩ５．０において産生された非シアル酸化抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体（ＧＦＩ７７４）Ｆ２３４Ａ／Ｖ２６４Ａ、およびＧＦＩ６．０において産生されたシアル酸化抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体（ＧＦＩ７７４）Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａであった。ＧＦＩ５．０において産生された非シアル酸化抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａは以下のグリコフォームを含む：８４％  Ｇ２、２％  Ｇ１および１４％  ハイブリッドＮ−グリカン。ＧＦＩ６．０において産生されたシアル酸化抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａは以下のグリコフォームを含む：２７％  Ａ１、５０．６％  Ａ２および５．７％  Ａ１ハイブリッド（合計で、該Ｎ−グリカンの８３％以上がシアル酸化されている）。
【０２６７】
Ｊｕｒｋａｔ  ＦｌｐＩｎ  ＴＮＦα（Δ１−１２）標的細胞を標識している間に、丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ＃５６９９；蓋−Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔ＃３９３１）内で、５％  熱不活性化ＦＢＳおよび１．５ｍＭ  プロベニシドで補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地において、３倍系列（４０μｇ／ｍｌから開始）を用いて、２×濃度の抗体を希釈した。該希釈プレートを調製した後、１００μｌの各２×希釈物を新たな９６ウェル丸底ポリプロピレンプレート（「無抗体」対照として１００μｌの培地のみを移した）に移した。また、「自然遊離」および「混合細胞溶解」対照（１５０μｌ／ウェル）ならびに「バックグラウンド」対照（２００μｌ／ウェル）として、５％  熱不活性化ＦＢＳおよび１．５ｍＭ  プロベニシドで補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地を該９６ウェルプレートに移した。各抗体希釈物は二重に試験し、各対照は四重に試験した。
【０２６８】
「バックグラウンド」対照を除く全てのウェルに、５０μｌのユウロピウム標識標識Ｊｕｒｋａｔ  ＦｌｐＩｎ  ＴＮＦα（Δ１−１２）細胞（＝１２，５００細胞）を加え、穏やかに混合した。初代ＮＫ細胞を１２００ｒｐｍで１２分間ペレット化し、５％  熱不活性化ＦＢＳおよび１．５ｍＭ  プロベニシドで補足されたＲＰＭＩマイナス  フェノールレッド培地に２．５×１０６細胞／ｍｌまで穏やかに再懸濁させた。全てのサンプルウェル（すなわち、「自然遊離」、「混合細胞溶解」および「バックグラウンド」対照を除く）に、５０μｌのＮＫ細胞（＝１２５，０００細胞）を１０：１のエフェクター：標的比で加えた。サンプルを穏やかに混合し、該アッセイプレートを３７℃で２時間インキュベートした。１時間１５分後、１０μｌの２０％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ  Ｘ−１００，Ｃａｔ＃２８３１４）または１０μｌの培地をそれぞれ「混合細胞溶解」または「自然遊離」対照に加えた。該プレートを３７℃で更に４５分間（合計インキュベーション時間は２時間であった）インキュベートした。プレートをインキュベートしている間に、ＤＥＬＦＩＡ  Ｅｕｒｏｐｉｕｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキットのもの）を室温で平衡化した。２時間の該インキュベーションの後、該アッセイプレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。泡が入らないように注意しながら、２０μｌの上清を白色平底透明プレート（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキットからのもの、またはＣｏｓｔａｒ，Ｃａｔ＃３６３２）に移した。各ウェルに、２００μｌのＤＥＬＦＩＡ  Ｅｕｒｏｐｉｕｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、該プレートをアルミホイルシールで覆った。穏やかに振とうしながら、該アッセイプレートを室温で１５分間インキュベートした。ユウロピウムを読取るためにＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ装置を使用して、蛍光を測定した。以下のとおりに細胞溶解率を計算した。
１）バックグラウンド対照の平均を全ての生（ｒａｗ）の値から差し引いた。
２）ＡＤＣＣ活性の割合（％）を、（（ＡＤＣＣ実験値−自然遊離）／（最大細胞溶解−自然遊離））＊１００として計算した。そして、
３）最終細胞溶解率（％）を、工程２からの％ＡＤＣＣ活性から「無抗体」対照を差し引いたものとして示した。
【０２６９】
これらのアッセイの結果を図１６に示す。図１６に示されているとおり、非シアル酸化およびシアル酸化抗ＴＮＦα  ＩｇＧ１−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ二重突然変異タンパク質は、ＧＳ５．０において産生された親（野生型）ポリペプチドと比較してＡＤＣＣにおける１０００倍を超える減少を示した。
【０２７０】
実施例１９
抗ＴＮＦα二重Ｆｃ突然変異タンパク質の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の評価
最初の１２アミノ酸が除去されたＴＮＦαの非切断可能変異体を安定に発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞を使用して、ＣＤＣ分析を行った。１０％  熱不活性化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｆ４１３５）、１００μｇ／ｍｌ  ヒグロマイシンＢ（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃３０−２４０−ＣＲ）およびＬ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃２５−００５−ＣＩ）で補足されたダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）マイナス  フェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃２１０６３）内で組織培養フラスコにおいて７０％コンフルエンスまでＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＮＦα（Δ１−１２）を増殖させた。細胞を２ｍｌのトリプシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ＃ＭＴ２５−０５３−ＣＩ）で処理し、８ｍｌの  ＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地、１０％  熱不活性化ＦＢＳを使用して集め、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地、熱不活性化１０％  ＦＢＳに４×１０５細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁させた。該細胞を９６ウェル黒色透明底プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ＃３６０３）内で１００μｌ（４０，０００細胞）／ウェルでプレーティングし、５％  ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２７１】
該アッセイにおいて使用した試験抗体は、ＧＦＩ５．０において産生された抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体（「ＧＦＩ７７４」と称される）、ＧＦＩ５．０において産生された抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体（ＧＦＩ７７４）Ｆ２３４Ａ／Ｖ２６４Ａ、およびＧＦＩ６．０において産生された抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体（ＧＦＩ７７４）Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａであった（これらの抗体は実施例１８に記載されている）。該アッセイの当日、該培地をマルチチャネルピペッターで該９６ウェルプレートのウェルから吸引し、５０μｌのＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地、１×ペニシリン／ストレプトマイシンと交換した。１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌ  抗ヒトＣＤ５５マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＩＢＧＲＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｌｏｎｅ  ＢＲＩＣ２１６，Ｃａｔ＃９４０４Ｐ）および１０μｇ／ｍｌ  抗ヒトＣＤ５９マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体（ＩＢＧＲＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｌｏｎｅ  ＢＲＩＣ  ２２９，Ｃａｔ＃９４０９Ｐ）を含有するＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地内で試験抗体の２倍系列滴定物（３０μｇ／ｍｌから開始）を調製した。適当なアッセイプレートウェルに、５０μｌの該希釈抗体を加えた。アッセイ陰性対照はアッセイ培地の単体、およびアッセイＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地（ＣＤ５５およびＣＤ５９抗体を含有する）中で希釈されたヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃００９−０００−００３）であった。該アッセイ細胞溶解対照は、アッセイＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地（ＣＤ５５およびＣＤ５９抗体を含有する）中で希釈された０．２５％  Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ１００（１０％  ストック，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ＃９３４４３）であった。各試験抗体は二重に試験し、該アッセイ対照は三重に試験した。試験サンプルを含有するアッセイプレートを、軽く叩くことにより混合し、該プレートを３７℃で約１０分間インキュベートし、その間にヒト補体血清を調製した。３ｍｌのヒト補体（ＱＵＩＤＥＬ，Ｃａｔ＃Ａ１１３）を、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する３ｍｌのＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地で１：２希釈し、５０μｌの該希釈補体を該アッセイプレートウェルに加えた。該アッセイプレートを、軽く叩くことにより混合し、該プレートを５％  ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭマイナス  フェノールレッド培地で１００％  ストックを希釈することにより、４０％  アラマー（ａｌａｍａｒ）ブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｔ＃ＤＡＬ１１００）の溶液を調製し、５０μｌの該希釈アラマーブルー溶液を該アッセイプレートウェルに加えた（＝１０％最終）。該アッセイプレートを、軽く叩くことにより混合し、該プレートを５％  ＣＯ２下、３７℃で一晩（１５〜２０時間）インキュベートした。翌日、該アッセイプレートをシェーカー上で室温で１０分間インキュベートし、励起５４４ｎｍ、発光５９０ｎｍで蛍光を読取った。ＣＤＣ率（％）を（１−（サンプル生蛍光単位（ＲＦＵ）−Ｔｒｉｔｏｎ  ＲＦＵ）／（ＲＦＵ中央値−Ｔｒｉｔｏｎ  ＲＦＵ））＊１００として計算した。
【０２７２】
これらのアッセイの結果を図１７に示す。図１７に示されているとおり、非シアル酸化およびシアル酸化抗ＴＮＦα  ＩｇＧ−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ二重突然変異タンパク質は、親（野生型）抗体と比較してＣＤＣ活性における約１０倍の減少を示した。
【０２７３】
実施例２０
コラーゲン−抗体誘発性関節炎（ＡＩＡ）モデルにおける抗ＴＮＦα抗体およびそのＦｃ突然変異タンパク質の効果
モデル誘発：ＩＩ型コラーゲンの種々の種における保存されたエピトープを認識する５つのモノクローナル抗体、すなわち、クローンＡ２−１０（ＩｇＧ２ａ）、Ｆ１０−２１（ＩｇＧ２ａ）、Ｄ８−６（ＩｇＧ２ａ）、Ｄ１−２Ｇ（ＩｇＧ２ｂ）およびＤ２−１１２（ＩｇＧ２ｂ）の混合物からなる市販のＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）関節炎生成性モノクローナル抗体（Ｃｈｏｎｄｒｅｘから購入）で、ＡＩＡ（抗体誘発性関節炎）を誘発させる。
【０２７４】
動物：共刺激因子の添加を伴うことなく関節炎誘発に対して感受性である１０週齢のＢ１０．ＲＩＩＩ雄マウスを使用した。これらの動物はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
【０２７５】
臨床スコア化：関節炎の誘発後に毎日、脚の腫張を測定した。該疾患の重症度を以下のとおりに脚ごとに０〜３の尺度で等級化した：０，正常；１，１つの指の腫脹；２，２以上の指の腫脹；３，脚全体の腫脹。マウス当たりの最大臨床スコアは１２である。
【０２７６】
研究設計：第０日に、３ｍｇの抗ＣＩＩ  ｍＡｂ病原体混合物ＩＶの受動移入により関節炎を誘発させた。マウスの群を以下の試薬で皮下処理した。
【０２７７】
【表８】
0005956982.tif 000016
イソタイプＩｇＧ１抗体を対照として使用した。該抗体はマウス抗ヘキソンに結合し、「２７Ｆ１１」なる名称を有していた。
【０２７８】
「非シアル酸化抗ＴＮＦ」として特定されているサンプルは、Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ突然変異を含むＧＦＩ５．０において産生された実施例１８に記載されている抗ＴＮＦ抗体に対応する。「α２，６シアル酸化抗ＴＮＦ」として特定されている抗体は、Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ突然変異を含むＧＦＩ６．０において産生された実施例１８に記載されている抗ＴＮＦ抗体に対応する。ＧＦＩ５．０において産生された非シアル酸化抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａは以下のグリコフォームを含む：８４％  Ｇ２、２％  Ｇ１および１４％  ハイブリッドＮ−グリカン。ＧＦＩ６．０において産生されたシアル酸化抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１抗体−Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａは以下のグリコフォームを含む：２７％  Ａ１、５０．６％  Ａ２および５．７％  Ａ１ハイブリッド（合計で、該Ｎ−グリカンの８３％以上がシアル酸化されている）。
【０２７９】
ｍＴＮＦＲ−Ｉｇは、ヒンジから始まりＣＨ２およびＣＨ３領域に広がるｍＩｇＧ１  Ｆｃに連結されたｍＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを含む、ならびにＣＨＯ細胞において産生された配列番号１６のアミノ酸配列を含むイムノアドヘシン（抗ＴＮＦ受容体Ｉｇ−融合タンパク質）である。
【０２８０】
ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ液はＢａｘｔｅｒ  Ｃｏｒｐから購入した。
【０２８１】
ＨＵＭＩＲＡはＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓから購入した。ＨＵＭＩＲＡは、非常に僅かな末端ガラクトースを有する非シアル酸化Ｎ−グリカンを含む。
【０２８２】
ｍＴＮＦＲ−Ｉｇ以外は第−１日および第７日に全てのマウス群に投与し、ｍＴＮＦＲ−Ｉｇは第−１日、＋３日および＋７日に合計３用量を投与した。該臨床スコアを１４日間モニターした。
【０２８３】
これらの実験の結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。本研究においては、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤは臨床効力を示さなかった。Ｍｕ−ＴＮＦ−Ｉｇは５匹中４匹のマウスにおいて疾患からの良好な防御を示した。ＨＵＭＩＲＡは対照ＩｇＧ１に非常に類似した疾患動態を示した。非シアル酸化抗ＴＮＦは或る程度の疾患抑制を示した。α２，６シアル酸化抗ＴＮＦは５匹中５匹のマウスにおいて良好な疾患防御を示し、スコアは抗ＴＮＦ療法に匹敵するものであった。
【０２８４】
遺伝子発現分析：炎症および骨リモデリング遺伝子の発現を、イソタイプ、α２，６シアル酸化ｍＡｂまたはｍＴＮＦＲ−Ｉｇ処理マウス（ｎ＝４／群）からの後脚のＲＴ／ＰＣＲ分析により測定した。定量的ＰＣＲを行うために、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して、後脚から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（５μｇ）をＤＮアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）での処理に付した。ＤＮアーゼ処理全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して逆転写した。プライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計し、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから商業的に入手した。
【０２８５】
各サンプルからの１０ｎｇのｃＤＮＡに関するリアルタイム定量的ＰＣＲを、２つの方法のうちの１つを用いて行った。第１の方法においては、ＡＢＩ  ５７００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＹＢＲグリーン・リアルタイム定量的ＰＣＲアッセイにおいて、２つの遺伝子特異的非標識プライマーを４００ｎＭで使用した。第２の方法においては、ＡＢＩ７７００配列検出系でのＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイム定量的ＰＣＲ反応において、それぞれ９００ｎＭの２つの非標識プライマーを２５０ｎＭのＦＡＭ標識プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用した。ＣＤ４プロモーターのゲノム領域を認識するプライマーを使用してゲノムＤＮＡ汚染の非存在を確認し、リアルタイムＰＣＲによる検出可能なＤＮＡ汚染を有するサンプルを該研究から除外した。ユビキチンレベルを別の反応において測定し、各サンプルに関する関心遺伝子およびユビキチンに関する平均サイクル閾値（ｃｔ）値を用いるΔ−ΔＣｔ法によりデータを正規化するために使用した。正規化値を得るために、式：１．８ｅ（Ｃｔユビキチン−Ｃｔ関心遺伝子）×１０４を用いた。結果を表７に示す。示されているデータは、ナイーブ対照マウスの後脚における遺伝子発現と比較された場合の炎症／骨リモデリング遺伝子発現の増加倍率である。
【０２８６】
【表９】
0005956982.tif 000017
実施例２１
コラーゲン−抗体誘発性関節炎（ＡＩＡ）モデルにおける抗ＴＮＦα抗体またはその突然変異タンパク質の効果
実施例２０に記載されている実験を、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤを静脈内投与した（一方、全ての他の試薬は皮下投与した）こと以外は、それにおいて記載されているとおりに反復した。
【０２８７】
研究設計：実施例２０に記載されているとおりに、関節炎を誘発させた。
【０２８８】
ｍＴＮＦＲ−Ｉｇ以外は第−１日に全てのマウス群に投与し、ｍＴＮＦＲ−Ｉｇは第−１日および＋３日に合計２用量を投与した。該臨床スコアを７日間モニターした。
【０２８９】
マウスの群を以下の試薬で処理した。
【０２９０】
【表１０】
0005956982.tif 000018
試薬：「イソタイプＩｇＧ１」、「非シアル酸化抗ＴＮＦ」、「α２，６シアル酸化抗ＴＮＦ、ｍＴＮＦＲ−Ｉｇ、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤおよびＨＵＭＩＲＡは実施例２０に記載されている。
【０２９１】
「α２，３シアル酸化抗ＴＮＦ」として特定されている試薬は、α２，６結合シアル酸を除去するためにノイラミニダーゼでインビトロで処理されα２，３シアリルトランスフェラーゼで更にインビトロで処理された、Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａを含むＧＦＩ６．０において産生された実施例１８に記載されている抗ＴＮＦ抗体に対応する。簡潔に説明すると、該精製抗体（４〜５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ５．２に調節された、１ｍｌ当たり６．１６ｍｇの塩化ナトリウム、０．９６ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム脱水物、１．５３ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム脱水物、０．３０ｍｇのクエン酸ナトリウム、１．３０ｍｇのクエン酸ナトリウム一水和物、１２ｍｇのマンニトール、１．０ｍｇのポリソルベート８０を含む製剤化バッファー中に存在した。ノイラミニダーゼ（１０ｍＵ／ｍｌ）を抗体混合物に加え、少なくとも５時間または脱シアル酸化が完了に達するまで、３７℃でインキュベートした。該脱シアル酸化物質を、ノイラミニダーゼを除去するためにＣａｐｔｏＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム精製に適用し、シアリルトランスフェラーゼバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＣａＣ１２，２．５ｍＭ  ＭｇＣ１２，２．５ｍＭ  ＭｎＣ１２）中に４ｍｇ／ｍｌで再配合した。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）において発現されｈｉｓタグにより精製されたマウスα２，３シアリルトランスフェラーゼ組換え酵素をα２，３シアル酸の伸長のために使用した。該混合物を１．２ｍｇ／ｍｌでプロテアーゼインヒビター混合物（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ（商標），ｃａｔ＃１１８７３５８０００１）の存在下のＰＢＳ中に配合した。該シアル酸化反応の前に、ペプスタチン（５０μｇ／ｍｌ）、キモスタチン（２ｍｇ／ｍｌ）および１０ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸を該酵素混合物に加え、ついで０．２μｍフィルターで滅菌した。１ｍｌの酵素混合物を１０ｍｌの脱シアル酸化物質に加えた。該反応を３７℃で８時間行った。シアル酸化収率をＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる質量測定により確認した。該最終物質を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、前記のバッファー中に配合し、滅菌濾過（０．２μｍ膜）した。
【０２９２】
「１８  ＡＤＸ  ＰＮＧ  Ｈｕｍｉｒａ」として特定されている試薬は、全てのＮ−グリカンを除去するためにＰＮＧアーゼでインビトロで処理された、Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａを含むＧＦＩ６．０において産生された実施例１８に記載されている抗ＴＮＦ抗体に対応する。ＰＮＧアーゼＦ酵素をＰｒｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．から入手し、ｐＨ７．４において４ｍｇのＩｇＧ１に対して化学量論量の２μｌの市販酵素と共に使用した。消化された該物質を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。該最終物質を配合し、滅菌濾過（０．２μｍ膜）した。
【０２９３】
「２０  ＡＤＸ  Ｎｏ  Ｇｌｙｃｏ」として特定されている試薬は、ＧＦＩ５．０  ＹＧＬＹ８３１６において産生された、グリコシル化を引き起こさない２９７位の単一突然変異を含む実施例１８に記載されている野生型抗ＴＮＦ抗体に対応する。この抗体を産生する株を、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ（ｋｅｎｄｏ，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ）中、１３，０００ｇで１５分間の遠心分離により清澄化した。該捕捉工程を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行い、ついで、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製工程を行った。該最終物質を配合し、滅菌濾過（０．２μｍ膜）した。
【０２９４】
これらの実験の結果を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。
【０２９５】
遺伝子発現分析：炎症および骨リモデリング遺伝子の発現をＲＴ／ＰＣＲ分析により測定した。定量的ＰＣＲを行うために、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して、後脚から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（５μｇ）をＤＮアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）での処理に付した。ＤＮアーゼ処理全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して逆転写した。プライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計し、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから商業的に入手した。
【０２９６】
各サンプルからの１０ｎｇのｃＤＮＡに関するリアルタイム定量的ＰＣＲを、２つの方法のうちの１つを用いて行った。第１の方法においては、ＡＢＩ  ５７００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＹＢＲグリーン・リアルタイム定量的ＰＣＲアッセイにおいて、２つの遺伝子特異的非標識プライマーを４００ｎＭで使用した。第２の方法においては、ＡＢＩ７７００配列検出系でのＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイム定量的ＰＣＲ反応において、それぞれ９００ｎＭの２つの非標識プライマーを２５０ｎＭのＦＡＭ標識プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用した。ＣＤ４プロモーターのゲノム領域を認識するプライマーを使用してゲノムＤＮＡ汚染の非存在を確認し、リアルタイムＰＣＲによる検出可能なＤＮＡ汚染を有するサンプルを該研究から除外した。ユビキチンレベルを別の反応において測定し、各サンプルに関する関心遺伝子およびユビキチンに関する平均サイクル閾値（ｃｔ）値を用いるΔ−ΔＣｔ法によりデータを正規化するために使用した。正規化値を得るために、式：１．８ｅ（Ｃｔユビキチン−Ｃｔ関心遺伝子）×１０４を用いた。結果を表８に示す。示されているデータは、ナイーブ対照マウスの後脚における遺伝子発現と比較された場合の炎症／骨リモデリング遺伝子発現の増加倍率である。
【０２９７】
【表１１】
0005956982.tif 000019
実施例２２
抗ＴＮＦ抗体および突然変異タンパク質のＦｃγＲ結合アッセイ
Ｆｃγ受容体結合アッセイを、実施例１８に記載されている抗ＴＮＦ抗体を使用して、実施例１に記載されているとおりに行った。結果を図２０および表９〜１０に示す。
【０２９８】
【表１２】
0005956982.tif 000020
【０２９９】
【表１３】
0005956982.tif 000021
実施例２３
追加的な抗Ｈｅｒ２  Ｆｃ二重突然変異タンパク質（２４３／２６４位におけるもの）およびそれらのＮ−グリカン組成物の構築
縮重プライマーを使用して飽和突然変異誘発を行うために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃２００５１８（３０反応）を、それが提供しているプロトコールに従い使用して、実施例２に記載されているＨｅｒ２  ＩｇＧ１抗体の追加的なＦｃ二重突然変異タンパク質を構築した。アルファ−接合因子プレドメインのシグナル配列を軽鎖および重鎖の５’末端にインフレームで融合した。ＩｇＧ１およびその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する得られた重鎖および軽鎖をそれぞれピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター下およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｃｙｃターミネーターの前にクローニングした。完成した重鎖および軽鎖の発現カセットを最終的な発現ベクターへと合体させた。
【０３００】
該ベクターを糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＦＩ６．０宿主細胞ＹＧＬＹ３５８２およびＹＧＬＹ２２８１２において発現させた。
【０３０１】
【表１４】
0005956982.tif 000022
ＧＦＩ６．０  ＹＧＬＹ３５８２株の遺伝子型は実施例４に記載されている（ＹＧＬＹ４５６３と同じ）。
【０３０２】
抗ＴＮＦα  Ｆｃ  ＤＭ突然変異タンパク質の発現のために使用されるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ６．０株ＹＧＬＹ２２８１２の遺伝子型は以下のとおりである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１Δ  ｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ  ＡＤＥ１：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ  ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ  ＴＲＰ２：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３ｓｔｅ１３Δ：：ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１  ｄａｐ２Δ：：ＮａｔＲ  ＴＲＰ５：ＨｙｇＲＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３  Ｖｐｓ１０−１Δ：：ＡＯＸ１ｐ ＬｍＳＴＴ３ｄ。ＹＧＬＹ２３２９４、ＹＧＬＹ２３２８０、ＹＧＬＹ２３３０１、ＹＧＬＹ２５２５９およびＹＧＬＹ２３３０５は、表１１に挙げられている異なる突然変異タンパク質をそれらが発現すること以外は同じ遺伝子型を有する。
【０３０３】
該株を、２４℃で３日間振とうされる３００ｍｌの２％  ＢＭＧＹ培地を含有する５００ｍｌの振とうフラスコ内で培養した。
【０３０４】
振とうフラスコの誘導のためのプロトコール：各培養の全容量（３００ｍｌ）をファルコンチューブ内に集め、２５００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を移し、細胞ペレットを１５０ｍｌの２％  ＢＭＭＹおよび３６０μｌのＰＭＴｉ４（ストック濃度０．６５ｍｇ／ｍｌ）の最終容量に再懸濁させる。新鮮な５００ｍｌ振とうフラスコに移し、２４℃で２日間振とうする。該誘導培養物を遠心沈降させ、上清を新鮮なファルコンチューブ内に集める。
【０３０５】
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（カタログ番号１７−１２８１−０１）およびＢｉｏＲａｄポリ−プレップ（ｐｏｌｙ  ｐｒｅｐ）クロマトグラフィーカラム（１０ｍｌ）（カタログ番号７３１−１５５０）プロテインＡカラムにより、該分泌抗体を精製した。以下のバッファーを使用した。
・洗浄バッファー＃１：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０，１Ｍ  ＮａＣｌ
・洗浄バッファー＃２：２０ｍＭ  ｔりｓ  ｐＨ７．０
・中和バッファー：１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０
・溶出バッファー：１００ｍＭまたは５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ３．０
・クリーニング溶液：水中の６Ｍ  尿素
精製プロトコールは以下のとおりである。
・５００μｌのＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズを各ＢｉｏＲａカラムに加える。該ビーズは２０％エタノール中に存在するべきである。該ビーズスラリーの組成は５０％  ビーズ、５０％  液体であるべきである。
・該プロテインＡビーズが該カラム内に入ったら、それらを５ｍｌの洗浄バッファー＃２で洗浄すべきである（フロースルーは廃棄する）。
・１０ｍｌの上清をＢｉｏＲａｄカラムに加える。この工程中に、該抗体はプロテインＡビーズに結合するであろう（フロースルーは廃棄する）。
・５ｍｌの洗浄バッファー＃１を該カラムに加えることにより、望ましくない過剰のタンパク質を洗い落とす（フロースルーは廃棄する）。
・５ｍｌの洗浄バッファー＃２を加えることにより、該カラムを再び洗浄する（フロースルーは廃棄する）。
・１ｍｌの中和バッファーを１５ｍｌタンパク質収集チューブに加える。
・ＢｉｏＲａｄカラムを該１５ｍｌ収集チューブ内に配置する。
・３ｍｌの溶出バッファーをＢｉｏＲａｄカラムに加える。これは所望の抗体をプロテインＡビーズから除去するであろう。
・溶出タンパク質を該１５ｍｌタンパク質収集チューブ内に集める。
・ブラッドフォードアッセイ（１０μｌのタンパク質をブラッドフォードアッセイに使用する）により該溶出タンパク質の濃度を決定する。
【０３０６】
各グリコフォームの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦ遊離グリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣにより分析した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２−５０２７（２００３）およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載されているとおりに行った）。表１２は、産生された抗体のグリカンプロファイルを示す（ＮＱＰ＝定量不可能）。
【０３０７】
【表１５】
0005956982.tif 000023
種々のＦｃγ受容体への前記突然変異体の結合を、実施例１１に記載されている方法を用いて測定した。結果を図２１ならびに表１３および１４に示す。
【０３０８】
【表１６】
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【０３０９】
【表１７】
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実施例２３
抗ＰＣＫＳ９親抗体およびＦｃ突然変異タンパク質
配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗ＰＣＳＫ９抗体も構築し、重鎖の突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを導入した（実施例２に記載されているとおりに行った）。該抗ＰＣＳＫ９二重突然変異タンパク質の重鎖アミノ酸配列を配列番号１５に示す。該抗体の野生型および二重突然変異形態を糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０において発現させ、精製し（実施例３〜７に記載されている方法に従い行った）、種々のＦｃγ受容体へのそれらの結合能を、実施例１１に記載されている方法を用いて測定した。該抗ＰＣＳＫ９二重突然変異タンパク質抗体（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とを含む、ＧＦＩ６．０において産生されたもの）は、親抗体（ＧＦＩ５．０において産生されたもの）と比較された場合、ＦｃγＲＩへの結合における約４倍の低下、ＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＦへの結合における８〜６０倍の低下、ＦｃγＲＩＩＩａ  ＬＶへの結合における２〜６倍の低下を示し、また、ＦｃγＲＩＩａまたはＦｃγＲＩＩｂ／ｃへの検出可能な結合を示さなかった。
【０３１０】
実施例２４
コラーゲン−抗体誘発性関節炎（ＡＩＡ）モデルにおける抗Ｈｅｒ２抗体およびそのＦｃ突然変異タンパク質の効果
モデル誘発：ＩＩ型コラーゲンの種々の種における保存されたエピトープを認識する５つのモノクローナル抗体、すなわち、クローンＡ２−１０（ＩｇＧ２ａ）、Ｆ１０−２１（ＩｇＧ２ａ）、Ｄ８−６（ＩｇＧ２ａ）、Ｄ１−２Ｇ（ＩｇＧ２ｂ）およびＤ２−１１２（ＩｇＧ２ｂ）の混合物からなる市販のＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）関節炎生成性モノクローナル抗体（Ｃｈｏｎｄｒｅｘから購入）で、ＡＩＡ（抗体誘発性関節炎）を誘発させる。
【０３１１】
動物：共刺激因子の添加を伴うことなく関節炎誘発に対して感受性である１０週齢のＢ１０．ＲＩＩＩ雄マウスを使用した。これらの動物はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
【０３１２】
臨床スコア化：関節炎の誘発後に毎日、脚の腫張を測定した。該疾患の重症度を以下のとおりに脚ごとに０〜３の尺度で等級化した：０，正常；１，１つの指の腫脹；２，２以上の指の腫脹；３，脚全体の腫脹。マウス当たりの最大臨床スコアは１２である。
【０３１３】
研究設計：第０日に、３ｍｇの抗ＣＩＩ  ｍＡｂ病原体混合物ＩＶの受動移入により関節炎を誘発させた。
【０３１４】
全ての群のマウスに第−１日に投与した。臨床スコアを７日間モニターした。
【０３１５】
マウスの群を以下の試薬で皮下処理した。
【０３１６】
【表１８】
0005956982.tif 000026
イソタイプＩｇＧ１抗体を対照として使用した。該抗体はマウス抗ヘキソンに結合し、「２７Ｆ１１」なる名称を有していた。
【０３１７】
「非シアル酸化抗Ｈｅｒ２」として特定されているサンプルは、ＧＦＩ５．０株ＹＧＬＹ１９７０９において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ突然変異を含む抗Ｈｅｒ２抗体に対応する。該ＹＧＬＹ１９７０９株は、ＬｓＳＴＴ３ｄを発現させるためにプラスミドｐＧＬＹ６３０１で形質転換された抗Ｈｅｒ２抗体産生株ＹＧＬＹ１３９７９から誘導された。株ＹＧＬＹ１３９７９およびプラスミドｐＧＬＹ６３０１は特許出願ＷＯ  ２０１０／０９９１８６に記載されている。
【０３１８】
「α２，６シアル酸化抗Ｈｅｒ２」として特定されているサンプルは、ＧＦＩ６．０株ＹＧＬＹ４５６３（実施例４を参照されたい）において産生されたＦ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ突然変異を含む抗Ｈｅｒ２抗体に対応する。
【０３１９】
ｍＴＮＦＲ−Ｉｇは、ヒンジから始まりＣＨ２およびＣＨ３領域に広がるｍＩｇＧ１  Ｆｃに連結されたｍＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを含む、ならびにＣＨＯ細胞において産生された配列番号１６のアミノ酸配列を含むイムノアドヘシン（抗ＴＮＦ受容体Ｉｇ−融合タンパク質）である。
【０３２０】
これらの実験の結果を図２２に示す。
【０３２１】
【表１９】
0005956982.tif 000027
0005956982.tif 000028
0005956982.tif 000029
0005956982.tif 000030
本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。当業者および本明細書における教示の読者は本発明の範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。
【図１】
0005956982.tif 000031
【図２】
0005956982.tif 000032
【図３】
0005956982.tif 000033
【図４】
0005956982.tif 000034
【図５】
0005956982.tif 000035
【図６】
0005956982.tif 000036
【図７】
0005956982.tif 000037
【図８】
0005956982.tif 000038
【図９Ａ】
0005956982.tif 000039
【図９Ｂ】
0005956982.tif 000040
【図９Ｃ】
0005956982.tif 000041
【図９Ｄ】
0005956982.tif 000042
【図１０】
0005956982.tif 000043
【図１１】
0005956982.tif 000044
【図１２】
0005956982.tif 000045
【図１３Ａ】
0005956982.tif 000046
【図１３Ｂ】
0005956982.tif 000047
【図１３Ｃ】
0005956982.tif 000048
【図１３Ｄ】
0005956982.tif 000049
【図１３Ｅ】
0005956982.tif 000050
【図１４Ａ】
0005956982.tif 000051
【図１４Ｂ】
0005956982.tif 000052
【図１４Ｃ】
0005956982.tif 000053
【図１４Ｄ】
0005956982.tif 000054
【図１４Ｅ】
0005956982.tif 000055
【図１５】
0005956982.tif 000056
【図１６Ａ】
0005956982.tif 000057
【図１６Ｂ】
0005956982.tif 000058
【図１６Ｃ】
0005956982.tif 000059
【図１６Ｄ】
0005956982.tif 000060
【図１７】
0005956982.tif 000061
【図１８Ａ】
0005956982.tif 000062
【図１８Ｂ】
0005956982.tif 000063
【図１９Ａ】
0005956982.tif 000064
【図１９Ｂ】
0005956982.tif 000065
【図２０−１】
0005956982.tif 000066
【図２０−２】
0005956982.tif 000067
【図２１Ａ】
0005956982.tif 000068
【図２１Ｂ】
0005956982.tif 000069
【図２２】
0005956982.tif 000070
【配列表】
0005956982000001.app