(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階を含む、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法：
（ａ）培養液のｐＨを７．０ないし９．４の範囲に維持しながら、肺炎球菌血清型を生成する菌株を培養する段階と、
（ｂ）培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階（ａ）の培養を終了する段階と、
（ｃ）ｐＨ調節なしに、段階（ｂ）から得られた培養液を、培養液のｐＨが５．５以下になるまで追加して培養する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）から得られた溶液から、莢膜多糖類を単離及び精製する段階とである。
【請求項２】
前記肺炎球菌血清型が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
段階（ａ）の前記培養が、３４〜３８℃で、５０〜１５０ｒｐｍで撹拌しながら行われることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
段階（ｂ）が、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から１ないし３時間以内に、段階（ａ）の培養を終了することよって遂行されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
段階（ｃ）の追加培養が、ｐＨ調節なしに３４〜３８℃で、５０〜１５０ｒｐｍで撹拌しながら行われることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
段階（ｄ）で使用される溶解剤が、デオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
段階（ｄ）が、段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、得られた溶液を、１０〜２０℃で３〜２４時間、撹拌なしに維持してタンパク質を沈澱させ、遠心分離によって沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去することよって遂行されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
段階（ｅ）の単離及び精製が、下記段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法：
（ｉ）段階（ｄ）から得られた溶液を深層濾過器で濾過する段階と、
（ｉｉ）段階（ｉ）から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行う段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）から得られた上澄み液に、陽イオン性界面活性剤を加えて反応させた後、遠心分離して莢膜多糖類を含むペレットまたは上澄み液を得る段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）から得られた莢膜多糖類をヨード化ナトリウムと反応させ、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
（ｖ）段階（ｉｖ）から得られた溶液に活性炭を加えて濾過する段階と、
（ｖｉ）段階（ｖ）から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行って莢膜多糖類を得る段階とである。
【請求項９】
段階（ｉｉ）の濃縮が、１００ｋＤａメンブレンを使用して遂行されることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
段階（ｖｉ）の濃縮が、３０ｋＤａメンブレンを使用して遂行されることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
段階（ｉｉｉ）で使用される陽イオン性界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記臭化セチルトリメチルアンモニウムが、０．５〜３．０％の濃度で使用されることを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
段階（ｖ）で使用される活性炭が、１〜５％（ｗ／ｖ）の含量で使用されることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法に係り、さらに詳細には、肺炎球菌血清型を生成する菌株の培養液から、タンパク質、核酸などの不純物を除去し、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）は、ラクトバシラス目連鎖状球菌科に属するグラム陽性菌であり、ヒトに肺炎、菌血症、中耳炎、脳膜炎などの疾病を起こす。肺炎球菌の血清型細胞は、各細胞の周辺を覆い包む多糖類コーティングである莢膜を有する。該莢膜は、抗体がバクテリア細胞に結合することを阻むことにより、食菌作用を邪魔する。免疫学的特性により、約９０種以上の血清型に区分されているが、このうち一部の血清型が浸襲性疾患を誘発すると報告されている。１９９６〜２００８年の間に収集された浸襲性肺炎球菌において、総３７種の血清型が確認され、１９Ｆ＞２３Ｆ＞１９Ａ＞６Ａ＞３＞９Ｖ＞６Ｂの血清型順序で表されたこれら主要血清型が、５３．４％と過半数以上を占めた。このような血清型肺炎球菌の莢膜多糖類を利用して、多糖類ワクチン、多糖類・タンパク質接合ワクチンなどのワクチンが製造されている。
【０００３】
多糖類ワクチン及び多糖類・タンパク質接合ワクチンの生産のために利用される莢膜多糖類は、各血清型を生成する菌株の培養液から得られる。各菌株は、最適化された温度、ｐＨ条件及び撹拌条件の下で、最大増殖量に逹するまで培養される。細胞質外に分泌されない肺炎球菌の莢膜多糖類を得るため、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）などを利用した細胞溶解過程が遂行される。このとき、莢膜多糖類以外に、菌株が有する多様なタンパク質と核酸とが共に放出され、これは、培養後、精製工程で除去されなければならない。ワクチン接種後、抗原以外の物質による副作用を最小化するためには、厳格なタンパク質及び核酸含量の基準を満足することが要求される。例えば、プレブナール７（登録商標）（Prevnar ７TM）の場合、血清型により、乾燥重量基準のタンパク質は、２〜５％以下、核酸は、１〜２％以下の基準を満足しなければならない。
【０００４】
国際特許公開第ＷＯ２００６／１１０３５２号は、肺炎球菌の培養、細胞溶解、ｐＨ５．５未満による酸性化によるタンパク質沈澱、振盪なしの放置、遠心分離及び／または濾過などの段階を遂行し、莢膜多糖類を得る方法を開示している。また、国際特許公開第ＷＯ２００８／１１８７５２号は、細胞溶解物を限外濾過及び定容濾過した後、酸性化によるタンパク質沈澱工程を遂行し、莢膜多糖類を得る方法を開示している。しかし、従来の製造方法は、いずれもｐＨ調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を必須に遂行しなければならないが、それは、全体工程を複雑にするだけではなく、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を引き起こすことにもなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法を改善するために、多様な研究を行った。本発明者らは、驚くべきことに、ｐＨ調節なしに、同一条件で追加培養を行う場合、培養産物（特に、乳酸など）によって、ｐＨをタンパク質沈澱に適する範囲、すなわち、ｐＨ５．５以下に低くすることができるということを発見した。すなわち、本発明者らは、ｐＨ調節なしに追加培養を行った後、細胞溶解工程及びタンパク質沈澱工程を遂行することにより、ｐＨ調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を除去することができるということを発見した。
従って、本発明は、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の改善された製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一様態により、下記段階を含む、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法が提供される：
（ａ）培養液のｐＨを、７．０ないし９．４の範囲に維持しながら、肺炎球菌血清型を生成する菌株を培養する段階と、
（ｂ）培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階（ａ）の培養を終了する段階と、
（ｃ）ｐＨ調節なしに、段階（ｂ）から得られた培養液を、培養液のｐＨが５．５以下になるまで追加して培養する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）から得られた溶液から、莢膜多糖類を単離及び精製する段階とである。
本発明の製造方法において、前記肺炎球菌血清型は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆでもある。
段階（ａ）の前記培養は、３４〜３８℃で、５０〜１５０ｒｐｍで撹拌しながら行われてもよい。
【０００７】
本発明の一具現例において、段階（ｂ）は、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から１ないし３時間以内に、段階（ａ）の培養を終了することよって遂行される。
段階（ｃ）の追加培養は、ｐＨ調節なしに３４〜３８℃で、５０〜１５０ｒｐｍで撹拌しながら行われてもよい。
段階（ｄ）で使用される溶解剤は、デオキシコール酸ナトリウムでもある。
本発明の他の具現例において、段階（ｄ）は、段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、得られた溶液を、１０〜２０℃で３〜２４時間、撹拌なしに維持してタンパク質を沈澱させ、遠心分離によって沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去することよって遂行される。
本発明の他の具現例において、段階（ｅ）の単離及び精製は、下記段階を含んでもよい：
（ｉ）段階（ｄ）から得られた溶液を、深層濾過器（depth filter）で濾過する段階と、
（ｉｉ）段階（ｉ）から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行う段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）から得られた上澄み液に、陽イオン性界面活性剤を加えて反応させた後、遠心分離して莢膜多糖類を含むペレットまたは上澄み液を得る段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）から得られた莢膜多糖類をヨード化ナトリウムと反応させ、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
（ｖ）段階（ｉｖ）から得られた溶液に活性炭を加えて濾過する段階と、
（ｖｉ）段階（ｖ）から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行って莢膜多糖類を得る段階とである。
【０００８】
前記具現例において、段階（ｉｉ）の濃縮は、１００ｋＤａメンブレンを使用して行われ、段階（ｖｉ）の濃縮は、３０ｋＤａメンブレンを使用して行われる。また、段階（ｉｉｉ）で使用される陽イオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、前記臭化セチルトリメチルアンモニウムは、０．５〜３．０％の濃度で使用されもする。また、段階（ｖ）で使用される活性炭は、１〜５％（ｗ／ｖ）の含量で使用されもする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明による製造方法は、タンパク質沈澱のためのｐＨ調節剤を使用しない。すなわち、本発明によって、ｐＨ調節なしに、同一条件で、肺炎球菌血清型を生成する菌株を追加して培養する場合、培養産物（特に、乳酸など）によって、ｐＨを、タンパク質沈澱に適する範囲、すなわち、ｐＨ５．５以下に低くすることができるということが明らかにされた。従って、本発明の製造方法は、タンパク質沈澱のためのｐＨ調節剤の使用が要求されないので、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を最小化することができ、製造工程を単純化することができる。本発明の製造方法によって得られた肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類は、多糖類ワクチン及び多糖類・タンパク質接合ワクチンに有用に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】肺炎球菌血清型３を生成する菌株の培養ｐＨ変化推移及びその条件を示すグラフである。
【図２】肺炎球菌血清型６Ｂを生成する菌株の培養ｐＨ変化推移及びその条件を示すグラフである。
【図３】肺炎球菌血清型７Ｆを生成する菌株の培養ｐＨ変化推移及びその条件を示すグラフである。
【図４】肺炎球菌血清型１４を生成する菌株の培養ｐＨ変化推移及びその条件を示すグラフである。
【図５】肺炎球菌血清型１９Ａを生成する菌株の培養ｐＨ変化推移及びその条件を示すグラフである。
【図６】肺炎球菌血清型２３Ｆを生成する菌株の培養ｐＨ変化推移及びその条件を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、下記段階を含む、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型を有する莢膜多糖類の製造方法を提供する：
（ａ）培養液のｐＨを７．０ないし９．４の範囲に維持しながら、肺炎球菌血清型を生成する菌株を培養する段階と、
（ｂ）培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階（ａ）の培養を終了する段階と、
（ｃ）ｐＨ調節なしに、段階（ｂ）から得られた培養液を、培養液のｐＨが５．５以下になるまで追加して培養する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）から得られた溶液から、莢膜多糖類を単離及び精製する段階とである。
本発明による製造方法の段階（ａ）において、前記肺炎球菌血清型は、肺炎球菌ワクチン製造に使用される全ての形態の血清型であり、例えば、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，７Ｆ，９Ｎ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ，２２Ｆ，２３Ｆ，３３Ｆなどを含むが、それらに制限されるものではない。前記肺炎球菌血清型を生成する菌株は、本技術分野に公知されており、公知の菌株を制限なしに使用することができる（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１号参照）。本発明による製造方法の段階（ａ）の培養は、例えば、水酸化ナトリウムなどを使用して、培養液のｐＨを７．０ないし９．４、望ましくは、７．２ないし８．２の範囲に維持しながら、大豆基剤培地などの通常の培地内で行われる。前記培養は、公知の培養条件、例えば、３４〜３８℃で、５０〜１５０ｒｐｍで撹拌しながら行われてもよい。肺炎球菌の代表的な血清型による種培養、及び本培養に適して使用されるｐＨ条件は、下記表１の通りである。
【００１２】
【表１】
0005905649.tif 000002
【００１３】
本発明による製造方法は、タンパク質沈澱のためのｐＨ調節剤を使用しない。すなわち、本発明者らは、驚くべきことに、ｐＨ調節なしに、同一条件で追加培養を行う場合、培養産物（特に、乳酸など）によって、ｐＨをタンパク質沈澱に適する範囲、すなわち、ｐＨ５．５以下に低くすることができるということを発見した。従って、本発明の製造方法は、肺炎球菌血清型を生成する菌株の培養後、望ましくは、最大増殖に到達された時点において、ｐＨ調節なしに追加培養を行った後、細胞溶解工程及びタンパク質沈澱工程を遂行することを含む。それにより、本発明の製造方法は、タンパク質沈澱のためのｐＨ調節剤の使用が要求されないので、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を最小化することができ、製造工程を単純化することができる。
従って、本発明の製造方法は、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階（ａ）の培養を終了する段階［すなわち、段階（ｂ）］、及びｐＨ調節なしに、段階（ｂ）から得られた培養液を、培養液のｐＨが５．５以下になるまで追加して培養する段階［すなわち、段階（ｃ）］を含む。
【００１４】
本発明の製造方法の段階（ａ）によって培養を行えば、菌株が増殖することよって、培養液の吸光度［例えば、５９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ５９０）］が徐々に上昇し、最大増殖に達した時点（培養開始後、約７〜２４時間）での吸光度が、一定値に維持される。その後、前記吸光度は、１ないし３時間以内に低下する。従って、本発明の一具現例において、段階（ｂ）は、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から１ないし３時間以内に、段階（ａ）の培養を終了することによって遂行される。段階（ｃ）の追加培養は、ｐＨ調節なしに、段階（ａ）と同一条件、すなわち、３４〜３８℃で、５０〜１５０ｒｐｍで撹拌しながら行われてもよい。このように追加培養を行う場合、培養液のｐＨは、５．５以下に自然に低下し、従って、タンパク質凝集に必要な適正ｐＨを提供する。
【００１５】
本発明の製造方法は、段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加え、細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階［すなわち、段階（ｄ）］を含む。
前記細胞の溶解は、公知の方法、例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１号、ＷＯ２００８／１１８７５２号などに開示された方法によって行われる。例えば、前記細胞の溶解は、溶解剤として、デオキシコール酸ナトリウムを使用して行われる。デオキシコール酸ナトリウムは０．１０〜０．１５％の濃度（デオキシコール酸ナトリウムを加えたときの濃度）で使用されるが、それに制限されるものではない。前記細胞の溶解によって、肺炎球菌血清型の莢膜多糖類が細胞質外に放出される。また、タンパク質沈澱は、例えば、１０〜２０℃で静置することよって行われ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸の除去は、通常の方法（例えば、遠心分離など）によって行われる。本発明の一具現例において、段階（ｄ）は、段階（ｃ）から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、得られた溶液を、１０〜２０℃で３〜２４時間、撹拌なしに維持してタンパク質を沈澱させ、遠心分離によって沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去することよって遂行される。
【００１６】
本発明の製造方法は、段階（ｄ）から得られた溶液から、不純物（例えば、細胞内部に含まれていたタンパク質、核酸など）を除去し、莢膜多糖類を単離及び精製する段階［すなわち、段階（ｅ）］を含む。前記莢膜多糖類の単離及び精製は、公知の精製方法、例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１号、ＷＯ２００８／１１８７５２号などに開示された方法によって行われる。一具現例において、段階（ｅ）の単離及び精製は、下記段階を含んでもよい：
（ｉ）段階（ｄ）から得られた溶液を深層濾過器（depth filter）で濾過する段階と、
（ｉｉ）段階（ｉ）から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行う段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）から得られた上澄み液に、陽イオン性界面活性剤を加えて反応させた後、遠心分離して莢膜多糖類を含むペレットまたは上澄み液を得る段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）から得られた莢膜多糖類をヨード化ナトリウムと反応させ、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
（ｖ）段階（ｉｖ）から得られた溶液に活性炭を加えて濾過する段階と、
（ｖｉ）段階（ｖ）から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行って莢膜多糖類を得る段階とである。
【００１７】
前記具現例において、深層濾過器を使用した濾過によって、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸の除去のための遠心分離後にも残っている溶解物が除去される。
また、濃縮／限外濾過を二次にわたって行うことより、タンパク質及び核酸を除去することができる。一具現例において、段階（ｉｉ）の濃縮は、１００ｋＤａメンブレンを使用して行われ、段階（ｖｉ）の濃縮は、３０ｋＤａメンブレンを使用して行われる。前記限外濾過は、本工程で、「定容濾過（diafiltration）」と呼ばれもする。
【００１８】
また、段階（ｉｉｉ）で使用される陽イオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウムでもある。前記臭化セチルトリメチルアンモニウム（cetrimonium bromide、ＨＢ：hexadecyl-trimethylammonium bromide）は、０．５〜３％の濃度（臭化セチルトリメチルアンモニウムを加えたときの濃度）で使用される。使用されたＨＢなどの陽イオン性界面活性剤は、ヨード化ナトリウムを使用して沈澱及び除去される。前記段階（ｉｉｉ）で遠心分離工程を遂行する場合、莢膜多糖類は、ペレット（例えば、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，９Ｎ，９Ｖ，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ，２２Ｆ，２３Ｆなど）または上澄み液（例えば、血清型７Ｆ，１４，３３Ｆなど）に存在する。ペレット状で得られる莢膜多糖類は、適切な溶媒（例えば、塩化ナトリウム水溶液など）に溶解させ、次の段階（すなわち、ヨード化ナトリウムとの反応）を遂行することができる。上澄み液に存在する莢膜多糖類は、別途の分離なしに、そのまま上澄み液状で、次の段階（すなわち、ヨード化ナトリウムとの反応）を遂行することができる。
また、段階（ｖ）において、活性炭（activated carbon）は、１〜５％（ｗ／ｖ）の含量で、望ましく使用される。
【００１９】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明は、それら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００２０】
下記実施例で使用された大豆基剤培地の組成は、下記表２の通りである。
【００２１】
【表２】
0005905649.tif 000003
【００２２】
実施例１．肺炎球菌血清型３，６Ｂ及び１９Ａの莢膜多糖類製造
＜細胞銀行の製造＞
肺炎球菌血清型３，６Ｂ及び１９Ａをそれぞれ生産する原種菌（seed stock）を、受託機関［ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection］から収得した。種培養、及び本培養に使用された菌株は、下記表３の通りである。
【００２３】
【表３】
0005905649.tif 000004
【００２４】
前記原種菌を、何世代か培養した（Ｆ１，Ｆ２及びＦ３世代）。原種菌を、追加して２世代さらに培養した。追加された第１世代は、Ｆ３バイアルから培養し、後続世代は、追加された第１世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した（＜−７０℃）。細胞銀行製造のために、全ての培養物を大豆基剤培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤（例：合成グリセロール）を含む新たな培地に、細胞ペレットを再懸濁させた。
【００２５】
＜培養及び回収＞
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基剤培地を含むシード瓶（seed bottles）に接種して培養した。目標吸光度に逹した後、シード瓶を使用して、大豆基剤培地を含む発酵器に接種した。３Ｎ ＮａＯＨを使用して、ｐＨを約７．２以上に維持しながら、３４〜３８℃で、１２０ｒｐｍの条件下で培養を行った。２〜３時間ごとにサンプリングし、吸光度値を測定した。吸光度値が急激に上昇し始めれば、０．５〜１時間ごとにサンプリングして吸光度を測定した。吸光度値が一定値に維持され始めた後、約１時間後に培養を終了した。培養終了後、ｐＨ調節なしに、ｐＨが５．５以下になるまで、同一温度及びｒｐｍ条件で、追加培養を行った。前記追加培養終了後、０．１２％の濃度で、デオキシコール酸ナトリウムを加えて細胞を溶解（lysis）させた。得られた培養物を１０〜１５℃に冷却し、該温度で約３時間、撹拌なしに維持し、タンパク質沈澱を誘導した。その後、前記混合物を遠心分離し、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去した。
【００２６】
＜精製＞
前記遠心分離を介して得られた溶液を深層濾過器で濾過し、遠心分離時に沈んでいないタンパク質及び細胞残骸を除去した。得られた濾液を、１００ｋＤａメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、３〜４ｍＳ／ｃｍほどになるまで行い、膜差圧（ＴＭＰ）は、０．５〜１．５バー以下に設定した。得られた試料の不純物を除去した後、約１．０ｗ／ｖ％の濃度で臭化セトリモニウム（cetrimonium bromide、ＨＢ：hexadecyl-trimethylammonium bromide（ＨＢ））を加えて約１時間撹拌した後、遠心分離して多糖類を沈澱させた。得られたペレットを、約０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解させた後、約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、ヨード化ナトリウム（ＮａＩ）を添加した。前記溶液を遠心分離して上澄み液を回収し、得られた溶液を撹拌しながら、約２．０ｗ／ｖ％の濃度で、活性炭を徐々に添加した後、約１時間撹拌した後で濾過した。得られた濾液を、３０ｋＤａメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、約１０倍の三次蒸溜水を使用して限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が約１０μｓ／ｃｍほどになるまで行い、膜差圧（ＴＭＰ）は、０．５〜１．５バー以下に設定した。得られた濃縮液を無菌濾過した後、−２０℃以下で冷凍保管した。
【００２７】
前記各段階の精製過程において、総タンパク質含量、総核酸含量、総多糖類含量及び精製収率を評価した結果は、下記表４ないし表６の通りである。
【００２８】
【表４】
0005905649.tif 000005
【００２９】
【表５】
0005905649.tif 000006
【００３０】
【表６】
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【００３１】
前記表４ないし表６の結果から、本発明による製造方法によって得られた莢膜多糖類は、別途の酸性化工程の採用なしにも、残留タンパク質含量基準値を満足し、莢膜多糖類の回収率も、それぞれ４９％以上（血清型３莢膜多糖類）、６５％以上（血清型６Ｂ莢膜多糖類）、及び６０％以上（血清型１９Ａ莢膜多糖類）であった。従って、本発明による製造方法は、単純化された工程を介して、莢膜多糖類を効果的に生産することができる。
【００３２】
実施例２．肺炎球菌血清型７Ｆ及び１４の莢膜多糖類製造
＜細胞銀行の製造＞
肺炎球菌血清型７Ｆ，１４を生産する原種菌を、受託機関［ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection］から収得した。種培養及び本培養に使用された菌株は、下記表７の通りである。
【００３３】
【表７】
0005905649.tif 000008
【００３４】
前記原種菌を何代か培養した（Ｆ１，Ｆ２及びＦ３世代）。原種菌を、追加して２世代さらに培養した。追加された第１世代は、Ｆ３バイアルから培養し、後続世代は、追加された第１世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した（＜−７０℃）。細胞銀行製造のために、全ての培養物を大豆基剤培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤（例：合成グリセロール）を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁させた。
【００３５】
＜培養及び回収＞
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基剤培地を含むシード瓶に接種して培養した。目標吸光度に逹した後、シード瓶を使用して、大豆基剤培地を含む発酵器に接種した。３Ｎ ＮａＯＨを使用して、ｐＨを約７．２以上に維持しながら、３４〜３８℃で１２０ｒｐｍの条件下で、培養を行った。２〜３時間ごとにサンプリングし、吸光度値を測定した。吸光度値が急激に上昇し始めれば、０．５〜１時間ごとにサンプリングして吸光度を測定した。吸光度値が一定値に維持され始めた後、約１時間後に培養を終了した。培養終了後、ｐＨ調節なしに、ｐＨが５．５以下になるまで、同一温度及びｒｐｍ条件で追加培養を行った。前記追加培養終了後、０．１２％の濃度でデオキシコール酸ナトリウムを加え、細胞を溶解させた。得られた培養物を１０〜１５℃に冷却し、この温度で、約３時間撹拌なしに維持し、タンパク質沈澱を誘導した。その後、前記混合物を遠心分離し、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去した。
【００３６】
＜精製＞
前記遠心分離を介して得られた溶液を深層濾過器で濾過し、遠心分離時に沈んでいないタンパク質及び細胞残骸を除去した。得られた濾液を、１００ｋＤａメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を使用して、限外濾過を遂行した。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、３〜４ｍＳ／ｃｍほどになるまで行い、膜差圧（ＴＭＰ）は、０．５〜１．５バー以下に設定した。得られた試料の不純物を除去した後、約１．０ｗ／ｖ％の濃度で、臭化セトリモニウム（cetrimonium bromide、ＨＢ：hexadecyl-trimethylammonium bromide）を加えて約１時間撹拌した後、遠心分離して上澄み液を回収した。得られた上澄み液に、約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、ヨード化ナトリウム（ＮａＩ）を添加した。前記溶液を遠心分離して上澄み液を回収し、得られた溶液を撹拌しながら、約２．０ｗ／ｖ％の濃度で活性炭を徐々に添加した後、約１時間撹拌した後で濾過した。得られた濾液を、３０ｋＤａメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、約１０倍の三次蒸溜水を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、１０μｓ／ｃｍほどになるまで行い、膜差圧（ＴＭＰ）は、０．５〜１．５バー以下に設定した。得られた濃縮液を無菌濾過した後、−２０℃以下で冷凍保管した。
【００３７】
前記各段階の精製過程において、総タンパク質含量、総核酸含量、総多糖類含量、及び精製収率を評価した結果は、下記表８及び表９の通りである。
【００３８】
【表８】
0005905649.tif 000009
【００３９】
【表９】
0005905649.tif 000010
【００４０】
前記表８及び表９の結果から、本発明による製造方法によって得られた莢膜多糖類は、別途の酸性化工程の採用なしにも、残留タンパク質含量基準値を満足し、莢膜多糖類の回収率も、それぞれ６０％以上（血清型７Ｆ莢膜多糖類）及び５５％以上（血清型１４莢膜多糖類）であった。従って、本発明による製造方法は、単純化された工程を介して、莢膜多糖類を効果的に生産することができる。
【００４１】
実施例３．肺炎球菌血清型２３Ｆの莢膜多糖類製造
＜細胞銀行の製造＞
肺炎球菌血清型２３Ｆを生産する原種菌を受託機関［ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection，Ｎｏ．６３２３］から収得した。前記原種菌を何世代か培養した（Ｆ１，Ｆ２及びＦ３世代）。原種菌を、追加して２世代さらに培養した。追加された第１世代は、Ｆ３バイアルから培養し、後続世代は、追加された第１世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した（＜−７０℃）。細胞銀行製造のために、全ての培養物を、大豆基剤培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤（例：合成グリセロール）を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁させた。
【００４２】
＜培養及び回収＞
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基剤培地を含むシード瓶に接種して培養した。目標吸光度に逹した後、シード瓶を使用して、大豆基剤培地を含む発酵器に接種した。３Ｎ ＮａＯＨを使用して、ｐＨを約７．２以上に維持しながら、３４〜３８℃で１２０ｒｐｍの条件下で、培養を行った。２〜３時間ごとにサンプリングし、吸光度値を測定した。吸光度値が急激に上昇し始めれば、０．５〜１時間ごとにサンプリングし、吸光度を測定した。吸光度値が一定値に維持され始めた後、約１時間後に培養を終了した。培養終了後、ｐＨ調節なしに、ｐＨが５．５以下になるまで、同一温度及びｒｐｍ条件で追加培養を行った。前記追加培養終了後、０．１２％の濃度で、デオキシコール酸ナトリウムを加え、細胞を溶解させた。得られた培養物を１０〜１５℃に冷却し、この温度で、約３時間撹拌なしに維持し、タンパク質沈澱を誘導した。その後、前記混合物を遠心分離し、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去した。
【００４３】
＜精製＞
前記遠心分離を介して得られた溶液を深層濾過器で濾過し、遠心分離時に沈んでいないタンパク質及び細胞残骸を除去した。得られた濾液を、１００ｋＤａメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、３〜４ｍＳ／ｃｍほどになるまで行い、膜差圧（ＴＭＰ）は、０．５〜１．５バー以下に設定した。得られた試料の不純物を除去した後、約２．５ｗ／ｖ％の濃度、で臭化セトリモニウム（cetrimonium bromide、ＨＢ：hexadecyl-trimethylammonium bromide）を加えて約１時間撹拌した後、遠心分離して多糖類を沈澱させた。得られたペレットを、約０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解させた後、約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、ヨード化ナトリウム（ＮａＩ）を添加した。前記溶液を遠心分離して上澄み液を回収し、得られた溶液を撹拌しながら、約２．０ｗ／ｖ％の濃度で、活性炭を徐々に添加した後、約１時間撹拌した後で過した。得られた濾液を、３０ｋＤａメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、約１０倍の三次蒸溜水を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、１０μｓ／ｃｍほどになるまで行い、膜差圧（ＴＭＰ）は、０．５〜１．５バー以下に設定した。得られた濃縮液を無菌濾過した後、−２０℃以下で冷凍保管した。
【００４４】
前記各段階の精製過程において、総タンパク質含量、総核酸含量、総多糖類含量、及び精製収率を評価した結果は、下記表１０の通りである。
【００４５】
【表１０】
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【００４６】
前記表１０の結果から、本発明による製造方法によって得られた血清型２３Ｆ莢膜多糖類は、別途の酸性化工程の採用なしにも、残留タンパク質含量基準値を満足し、莢膜多糖類の回収率も、６０％以上であった。従って、本発明による製造方法は、単純化された工程を介して、莢膜多糖類を効果的に生産することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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