(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞由来でない１つ以上のペントース代謝経路の１つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞であって、前記酵母細胞由来のｈｘｋ１、ｈｘｋ２、ｇｌｋ１およびｇａｌ１の破壊を有する酵母細胞。
【請求項２】
前記酵母細胞は、グルコース消費能を回復するために、再導入されたｈｘｋ１、ｈｘｋ２、ｇｌｋ１およびｇａｌ１遺伝子の１つ以上を含む、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
ペントース発酵酵母細胞を調製する方法であって、ペントース代謝経路の１つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞を、前記酵母細胞由来の遺伝子ｈｘｋ２の破壊に供し、得られた破壊体株を、前記酵母細胞が単独の炭素源としてのペントース上で０．０５ｈ−１以上の生育速度を有するまで進化工学に供してペントース消費を改善し、得られたペントース発酵酵母細胞を単離し、得られた酵母細胞において、ｈｘｋ１、ｈｘｋ２、ｇｌｋ１およびｇａｌ１遺伝子の１つ以上を導入してそのグルコース消費能を回復する方法。
【請求項４】
破壊体株は請求項１に記載の酵母細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法により得られる、嫌気的同時ペントースおよびグルコース消費をし得る、ペントースおよびグルコース発酵サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞。
【請求項６】
請求項５に記載のペントースおよびグルコース発酵酵母細胞をペントースおよびグルコース含有材料中で、好適な発酵条件下でペントースおよびグルコースの発酵生成物への発酵を可能とするために十分な期間培養する工程を含む、ペントースの発酵から発酵生成物を生成する方法であって、前記酵母細胞は、ペントースを発酵して発酵生成物を対応する野性型酵母と比べて高いレベルにおいて生成する方法。
【請求項７】
発酵時間は、対応する野性型酵母の発酵と比べて低減される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
発酵時間は、４０％以上低減される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ペントースおよびグルコースを同時に発酵する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
全体エタノール生成速度は、対応する野生型酵母を用いる方法のそれよりも少なくとも２０％高い、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペントース含有材料は、リグノセルロース材料の加水分解物を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記加水分解物は、リグノセルロース材料の酵素加水分解物である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、Ｃ５およびＣ６糖を含む糖組成物（そのような組成物は、本明細書において混合糖組成物と命名される）の発酵に好適なペントースおよびグルコース発酵酵母細胞に関する。混合糖組成物は、リグノセルロース材料に由来し得る。本発明はまた、ペントースおよびグルコース発酵酵母細胞を使用して混合糖組成物から発酵生成物を生成する方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
化石燃料の代替物として生成されるエタノールのほとんどが、現在、トウモロコシデンプンおよびサトウキビベースのスクロースの発酵からのものである。再生燃料を生成する意欲的目的に到達するため、非食材バイオマスを発酵組成物、例えばエタノールに変換する新規技術が開発されている。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、エタノール工業において厳選された生物であるが、それはバイオマス原料のヘミセルロース構成成分中に含有される五炭糖を利用し得ない。ヘミセルロースは、バイオマスの２０〜３０％を構成し得、キシロースおよびアラビノースが最も豊富なＣ５糖である。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）の異種性発現は、酵母細胞のキシロースの代謝および発酵を可能とする任意選択である。同様に、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における細菌性遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤの発現は、アラビノースの利用および効率的なアルコール発酵をもたらす。
【０００３】
公知のペントース発酵酵母種によるペントースのエタノールへの発酵は、ゆっくりと生じ、グルコース発酵において慣用の酵母を用いて得られる発酵速度およびエタノール収率と比べて低い収率をもたらす。ペントース発酵のコスト効率を改善するため、得られる発酵の速度およびエタノール収率を増加させることが必要である。
【０００４】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、グルコースを先天的に好む。結果として、全ての現在のペントース発酵株は、グルコースおよびペントースの混合物の連続的利用を実証し、またはせいぜいペントース発酵は低いグルコース濃度において開始する。
【０００５】
国際公開第２００８０４１８４０号パンフレットは、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素をコードするヌクレオチド配列を発現し、それによりそれらのヌクレオチド配列の発現がＬ−アラビノースを使用する能力ならびに｜またはＬ−アラビノースをＬ−リブロース、および／もしくはキシルロース５−リン酸および｜もしくは所望の発酵生成物、例えばエタノールに変換する能力を細胞に付与する真核細胞を記載している。場合により、真核細胞はまた、キシロースをエタノールに変換し得る。株ＩＭＳ０００３（４６頁）は、図７に示されるとおりグルコース、キシロースおよびアラビノースを７０時間内に完全に消費し得る。図７は、キシロースおよびアラビノースのみの実質的な消費が２０時間後、すなわち、グルコースが既に完全に変換された場合に開始することを示す。グルコースおよびペントースの消費は連続的である。
【０００６】
Ｒａａｍｓｄｏｎｋ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ２００１；１８；１０２３−１００３は、ＨＸＫ２遺伝子が欠失されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における糖またはエタノールおよびグルコースの同時消費を記載している。しかしながら、この株は、エタノールをほとんど生成せず、豊富なグルコースの存在下でほぼ酸化的にのみ生育する。
【０００７】
ペントースをグルコースと同時に（ペントースおよびグルコースの同時発酵）および／または公知のものよりも迅速に嫌気的に発酵し得る酵母株を提供することが望ましい。
【０００８】
［発明の概要］
本発明の目的は、ペントースおよびグルコースを嫌気的に同時発酵し得る酵母株を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、ペントースの発酵によりエタノールを生成する、コスト効率的な方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ペントースを、当該技術分野において現在公知の株を使用して達成することができるものよりも高い速度で発酵し得る酵母細胞を提供することである。
【００１１】
Ｃ５／Ｃ６発酵の発酵時間を低減させることが別の目的である。
【００１２】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、本明細書および特許請求の範囲の精査から明らかである。
【００１３】
これらの目的の１つ以上が、本発明により得られる。本発明の一実施形態は、酵母細胞由来でない１つ以上のペントース代謝経路の１つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞であって、酵母細胞由来のｈｘｋ１、ｈｘｋ２  ｇｌｋ１およびｇａｌ１の破壊を有する酵母細胞である。
【００１４】
１つ以上の破壊を有するそのような細胞は、本明細書において、破壊体酵母細胞と命名される。ｈｘｋ１、ｈｘｋ２、ｇｌｋ１およびｇａｌ１の破壊を有する細胞は、本明細書において、四重破壊体とも呼ばれる。
【００１５】
本発明はさらに、ペントース発酵酵母細胞を調製する方法であって、ペントース経路の１つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞を、酵母細胞由来の遺伝子ｈｘｋ２の破壊に供し、得られた破壊体酵母細胞を、酵母細胞が単独の炭素源としてのペントース上で０．０５ｈ−１以上の生育速度を有するまで進化工学に供してペントース消費を改善し、得られたペントース発酵酵母細胞を単離する方法に関する。一実施形態において、ペントース発酵酵母細胞は、グルコースを消費し得ない。進化工学の生成物である細胞は、本明細書において、ペントース発酵酵母細胞と命名される。
【００１６】
この方法の好ましい実施形態において、破壊体細胞は、細胞のペントースの発酵を可能とする１つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞であって、酵母細胞由来ｈｘｋ１、ｈｘｋ２  ｇｌｋ１およびｇａｌ１の破壊を有する細胞、すなわち、四重破壊体である細胞である。
【００１７】
一実施形態において、ペントース発酵酵母細胞は、１つ以上の外因性ヘキソキナーゼを含む。外因性ヘキソキナーゼを介するヘキソキナーゼ活性の再導入により、ペントース発酵酵母細胞によるグルコース消費を回復させることができる。好ましくは、外因性ヘキソキナーゼは、酵母細胞由来のヘキソキナーゼと同一の活性を有する。ヘキソキナーゼが再導入されたそのような酵母細胞は、本明細書において、ペントースおよびグルコース発酵酵母細胞または酵母細胞と命名される。本発明はさらに、嫌気的同時ペントースおよびグルコース消費をし得るペントースおよびグルコース発酵サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】株ＤＳ６２５０４（図１（ａ））、ＩＭＫ３０７（図１（ｂ））およびＩＭＫ３１１（図１（ｃ））の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）を示す。
【図２】株ＤＳ６２５０４（図２（ａ））、ＩＭＫ３０７（図２（ｂ））およびＩＭＫ３１１（図２（ｃ））の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに排ガス中のＣＯ２百分率（黒色実線）を示す。発酵物にグルコースにより生育させた振とうフラスコ培養物を植菌した。
【図３】２％のアラビノースおよび種々の濃度のグルコース（０、０．１１、０．２３、０．６５、１．３および２．５％）を含有するＭＹ尿素中の株ＩＭＫ３１８の振とうフラスコ培養物についての６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０）を計測することにより決定された生育プロファイルを示す。
【図４】表３に従って継代された株ＩＭＫ３１８（系列Ａ：ＳＦ１、ＳＦ２およびＳＦ５）；この系列の振とうフラスコから選択された単一コロニー単離物ＩＭＷ０１８の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）。
【図５】表３に従って継代された株ＩＭＫ３１８（系列Ｂ：ＳＦ１、ＳＦ２およびＳＦ３）；この系列の振とうフラスコから選択された単一コロニー単離物ＩＭＷ０１７の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）を示す。
【図６】株ＩＭＷ０１７の連続嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）を示す。
【図７】株ＩＭＷ０１７の連続嫌気的培養の間の排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）および生育速度を示す。比生育速度は、グルコースおよびアラビノースの混合物（●）またはアラビノース単独（◆）のいずれかに対するバッチ培養の間のＣＯ２生成プロファイルから導かれる。
【図８】株ＩＭＷ０１７の嫌気的連続バッチ培養の間の、アラビノース（Ａ）ならびにグルコースおよびアラビノースの混合物（Ｂ）を補給した培地における個々のバッチのＣＯ２生成プロファイルを示す。ＣＯ２生成プロファイルは、等しい初期ＣＯ２生成レベルを想定してアラインされる。説明文中の数字は、連続バッチ数を示す。
【図９】株ＩＭＷ０１７の連続嫌気的バッチ培養のバッチ２４および２５の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）を示す。
【図１０】株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１１、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のヘキソキナーゼ酵素活性を示す。
【図１１】２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ培地中での株ＩＭＷ０２３の振とうフラスコ培養の間のＯＤ６６０（●）、アラビノース濃度（▲）、およびグルコース濃度（◆）を示す。
【図１２】２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の継代された培養物の１代目（ＳＦ１）および２４代目（ＳＦ２４）の振とうフラスコ培養の間のＯＤ６６０（●）、アラビノース濃度（▲）、およびグルコース濃度（◆）を示す。
【図１３】２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の継代された培養物の個々の振とうフラスコ培養において決定された推定比生育速度を示す。
【図１４】２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の連続嫌気バッチ培養の間の排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）および比生育速度、ならびに個々のバッチ培養の比生育速度（●）を示す。灰色陰影は、窒素の代わりに空気を補給した箇所を示す。矢印は、新たな連続バッチの開始を示す。
【図１５】２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の連続的嫌気バッチ培養の間の排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）、アラビノース濃度（▲）およびグルコース濃度（◆）を示す。
【図１６】２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の嫌気的連続バッチ培養の間の個々のバッチのアラインされたＣＯ２生成プロファイルを示す。ＣＯ２生成プロファイルは、等しい初期ＣＯ２生成レベルを想定してアラインされる。説明文中の数字は、連続バッチ数を示す。
【図１７】株ＤＳ６２５０４（図１７（ａ））、ＩＭＫ３０７（図１７（ｂ）、ＩＭＫ３１１（図１７（ｃ））、ＩＭＷ０１７（図１７（ｄ））、ＩＭＷ０１８（図１７（ｅ））およびＩＭＷ０５８（図１７（ｆ））、ＩＭＷ０２４（図１７（ｇ））、ＩＭＷ０２５（図１７（ｈ））、ＩＭＷ０４７（図１７（ｉ））、ＩＭＷ０５９（図１７（ｊ））、ＩＭＷ０６０（図１７（ｋ））、ＩＭＷ０６１（ｌ））の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）を示す。
【図１８】株ＩＭＷ０４７の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）およびアラビノース（▲）濃度を示す。
【図１９】株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のＧＡＬ１アミノ酸アラインメントを示す。
【図２０】株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のＧＡＬ２アミノ酸アラインメントを示す。
【図２１】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０５９の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）、エタノール（□）濃度、バイオマス乾燥重量（●）およびＣＯ２生成（灰色実線）を示す。
【図２２】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０６０の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）、エタノール（□）濃度、バイオマス乾燥重量（●）およびＣＯ２生成（灰色実線）を示す。
【図２３】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０６１の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）、エタノール（□）濃度、バイオマス乾燥重量（●）およびＣＯ２生成（灰色実線）を示す。
【図２４】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースの混合物中の嫌気的培養の間の株ＤＳ６２５０４のＣＯ２生成プロファイル（黒色点線）、ＩＭＷ０５９（黒色実線）、ＩＭＷ０６０（黒色実線）およびＩＭＷ０６１（黒色ストライプ線）を示す。
【図２５】培地ＣＦＭＭ２Ｍ上での株ＤＳ６２５０４の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２６】培地ＣＦＭＭ２Ｍ上での株ＩＭＷ０６０の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２７】培地ＣＦＭＭ２Ｍ上での株ＩＭＷ０６１の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２８】培地ＣＦＭＭ１Ｍ上での株ＤＳ６２５０４の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２９】培地ＣＦＭＭ１Ｍ上での株ＩＭＷ０６０の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図３０】培地ＣＦＭＭ１Ｍ上での株ＩＭＷ０６１の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【００１９】
［配列表の簡単な説明］
遺伝子破壊カセットの構築に使用されるオリゴヌクレオチド：
配列番号１は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ｄｉｓＡの配列を説明する
配列番号２は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ｄｉｓＢの配列を説明する
配列番号３は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ｄｉｓＡの配列を説明する
配列番号４は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ｄｉｓＢの配列を説明する
配列番号５は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ｄｉｓＡの配列を説明する
配列番号６は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ｄｉｓＢの配列を説明する
診断目的に使用されるオリゴヌクレオチド：
配列番号７は、オリゴヌクレオチドＫａｎＡの配列を説明する
配列番号８は、オリゴヌクレオチドＫａｎＢの配列を説明する
配列番号９は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＦＷの配列を説明する
配列番号１０は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＲＶの配列を説明する
配列番号１１は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＦＷの配列を説明する
配列番号１２は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＲＶの配列を説明する
配列番号１３は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＦＷの配列を説明する
配列番号１４は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＲＶの配列を説明する
配列番号１５は、ＨＸＫ１のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１６は、ＨＸＫ２のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１７は、ＧＬＫ１のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１８は、ＧＡＬ１のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１９は、ＹＤＲ５１６ＣのＤＮＡ配列を説明する
配列番号２０は、ＹＬＲ４４６ＷのＤＮＡ配列を説明する
配列番号２１は、ＨＸＫ１のアミノ酸配列を説明する
配列番号２２は、ＨＸＫ２のアミノ酸配列を説明する
配列番号２３は、ＧＬＫ１のアミノ酸配列を説明する
配列番号２４は、ＧＡＬ１のアミノ酸配列を説明する
配列番号２５は、ＹＤＲ５１６Ｃのアミノ酸配列を説明する
配列番号２６は、ＹＬＲ４４６Ｗのアミノ酸配列を説明する
配列番号２７は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＤｉｓＡの配列を説明する
配列番号２８は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＤｉｓＢの配列を説明する
配列番号２９は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＦＷ２の配列を説明する
配列番号３０は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＲＶ２の配列を説明する
配列番号３１は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＦＷ２の配列を説明する
配列番号３２は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＲＶ２の配列を説明する
配列番号３３は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＦＷ３の配列を説明する
配列番号３４は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＲＶ３の配列を説明する
配列番号３５は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＦＷ２の配列を説明する
配列番号３６は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＲＶ２の配列を説明する
配列番号３７は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＦＷ３の配列を説明する
配列番号３８は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＲＶ３の配列を説明する
配列番号３９は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＦＷ４の配列を説明する
配列番号４０は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＲＶ４の配列を説明する
配列番号４１は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＦＷ５の配列を説明する
配列番号４２は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＲＶ５の配列を説明する
配列番号４３は、ＧＡＬ１（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４４は、ＧＡＬ１（ＩＭＫ３１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４５は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１７）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４６は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４７は、ＧＡＬ２（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４８は、ＧＡＬ２（ＩＭＫ３１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４９は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１７）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号５０は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号５１は、ＧＡＬ１（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５２は、ＧＡＬ１（ＩＭＫ３１８）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５３は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１７）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５４は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１８）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５５は、ＧＡＬ２（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５６は、ＧＡＬ２（ＩＭＫ３１８）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５７は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１７）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５８は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１８）のアミノ酸配列を説明する
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲全体にわたり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびに変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、包括的なものと解釈すべきである。すなわち、これらの語は、文脈が許容すれば具体的に引用されていない他の要素または整数の考えられる包含を伝えるものとする。
【００２１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、１つまたは少なくとも１つ）を指すものとして使用される。例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味し得る。例として、細胞は、本明細書において、１つの細胞であり得るが、細胞の集団または株も指す。
【００２２】
本明細書に記載の本発明の種々の実施形態は、相互に組み合わせることができる。
【００２３】
破壊は、本明細書において、活性の任意の破壊を意味するものと理解され、それには、限定されるものではないが、欠失、突然変異、破壊される遺伝子の親和性の低減およびヘキソキナーゼｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現が含まれる。遺伝子破壊体は、それぞれの遺伝子の１つ以上の破壊を有する細胞である。酵母由来は、本明細書において、遺伝子が破壊前に酵母細胞中に存在することとして理解される。それには、酵母由来の遺伝子が野性型酵母細胞、実験室酵母細胞または工業酵母細胞中に存在する状況が含まれる。酵母細胞は、本明細書において、酵母株または酵母株の一部とも命名することもできる。
【００２４】
一実施形態において、エタノールを対応する野生型株よりも高い全体速度において生成し、より短い発酵時間を有し、ならびに／またはペントースおよびグルコースを同時消費し、好ましくは、それらを、ペントースを嫌気的に連続的ではなく同時に同時消費するペントースおよびグルコース発酵酵母細胞。
【００２５】
一実施形態において、酵母は、外因性ヘキソキナーゼを含む。好ましくは、外因性ヘキソキナーゼは、細胞中にヘキソキナーゼ活性を導入する。
【００２６】
外因性は、本明細書において、ヘキソキナーゼの導入前に酵母細胞中に存在しないものと理解される。外因性ヘキソキナーゼには、限定されるものではないが、酵母由来の遺伝子または破壊されたヘキソキナーゼと同一の配列を有する遺伝子が含まれ得る。
【００２７】
本発明の一実施形態において、酵母細胞は、酵母変異体におけるヘキソキナーゼ発現の低減が、ヘキソキナーゼ遺伝子の破壊およびヘキソキナーゼｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現からなる群から選択される手段により行われる株である。
【００２８】
本発明の一実施形態において、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のヘキソキナーゼ破壊体である。
【００２９】
別の実施形態において、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＭＷ０１７、ＩＭＷ０１８、ＩＭＫ３０６、ＩＭＫ３０７および／またはＩＭＫ３１８である。
【００３０】
一実施形態において、酵母細胞は、対応する野生型酵母よりも少なくとも約２０％高い、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％高い全体エタノール生成速度を有する。
【００３１】
本発明はさらに、本発明による酵母細胞をペントース含有糖組成物中で、好適な発酵条件下でペントースのエタノールへの発酵を可能とするために十分な期間培養する工程を含む、ペントースの発酵からエタノールを生成する方法であって、酵母細胞は、ペントースを発酵してエタノールを対応する野性型酵母と比べて高いレベルにおいて生成し、酵母細胞は、対応する野生型酵母と比べて機能性ヘキソキナーゼの低減された発現を有する方法に関する。
【００３２】
本方法の一実施形態において、発酵時間は、対応する野性型酵母の発酵と比べて低減され、好ましくは、発酵時間は４０％以上低減される。
【００３３】
本方法の一実施形態において、ペントースおよびグルコースを同時発酵する。本方法の別の実施形態において、全体エタノール生成速度は、対応する野生型酵母を用いる方法のそれよりも少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または約１００％高い。
【００３４】
本方法の一実施形態において、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＭＷ０１７、ＩＭＷ０１８、ＩＭＫ３０６、ＩＭＫ３０７および／またはＩＭＫ３１８である。
【００３５】
本方法の一実施形態において、ペントース含有材料は、リグノセルロース材料の加水分解物を含む。
【００３６】
本方法の一実施形態において、加水分解物は、リグノセルロース材料の酵素加水分解物である。
【００３７】
本発明はさらに、進化工学の方法および／または酵母の株改善の方法における酵母における１つ以上のヘキソキナーゼの破壊の使用に関する。これらは公知の方法である。進化工学は、微生物、本明細書においては酵母の工業関連の表現型を、比生育速度および／または栄養素についての親和性に、合理的に設定された自然淘汰の方法により結びつけ得る方法である。進化工学は、例えば、Ｋｕｉｊｐｅｒ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５（２００５）９２５−９３４，国際公開第２００８０４１８４０号パンフレットおよび国際公開第２００９１１２４７２号パンフレットに詳細に記載されている。進化工学の後、得られたペントース発酵酵母細胞を単離する。単離は、任意の公知の様式で、例えば、例えば細胞試料の採取または濾過もしくは遠心分離による、進化工学において使用された酵母細胞ブロスからの細胞の分離により行うことができる。
【００３８】
本発明は、グルコースも含有する糖混合物中のペントースを対応する野性型酵母よりも高い速度において発酵する酵母細胞であり、この酵母細胞は、１つ以上の天然ヘキソキナーゼ遺伝子の発現の低減を特徴とする。
【００３９】
本発明の範囲を限定するものではなく、理論に拘束されるものではないが、この現象は、グルコースによるペントース輸送の競合阻害の結果である可能性が最も高く、またはペントース発酵に重要な遺伝子のグルコース抑制に起因し、もしくは関与するタンパク質の不活性化もしくは分解もしくはグルコースの存在下での親和性の低減に起因する。グルコースの存在下、グルコースをもはや利用し（得）ない株のペントース上での生育についての進化工学は、グルコース非感受性表現型をもたらすはずである。グルコースをもはや消費し得ないそのような株は、例えば、全ての３つのヘキソ／グルコキナーゼの欠失（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ）により得ることができる。本明細書において、三重破壊体においてグルコース消費をさらに減少させるためにｇａｌ１の欠失（ｇａｌ１Δ）も有利であることが示され、こうして四重破壊体が作出される。
【００４０】
本発明はまた、酵母細胞をペントース含有材料中で、好適な発酵条件下でペントースのエタノールへの発酵を可能とするために十分な期間培養する工程を含む、ペントースの発酵からエタノールを生成する方法であって、酵母変異体は、ペントースを対応する野性型酵母と比べて高い速度において発酵し得、機能性ヘキソキナーゼの低減された発現を有する方法である。
【００４１】
本発明の酵母細胞は、ヘキソキナーゼ破壊体である。ヘキソキナーゼ破壊体は、天然遺伝子の一部もしくは全部が除去されており、または発現が天然ヘキソキナーゼの任意の機能を有する発現生成物をもたらさないＤＮＡにより置き換えられている変異体を意味する。
【００４２】
破壊体の代替的実施形態において、ヘキソキナーゼの発現は、ヘキソキナーゼをコードするアンチセンス鎖の一部または全部が酸素の低下に応答するプロモーターの調節下で発現されるアンチセンス構築物の使用を介して下方調節することができる。この実施形態において、ヘキソキナーゼについてのアンチセンスｍＲＮＡは、酸素制限条件下で発現され、それにより機能性ヘキソキナーゼを不活性化する。
【００４３】
破壊体の別の代替的実施形態において、機能性ヘキソキナーゼについてのプロモーター領域は、ヘキソキナーゼ遺伝子の発現を下方調節することにより酸素の低下に応答するプロモーターにより置き換えられている。
【００４４】
「野性型」酵母は、本発明の酵母細胞が由来する、通常レベルの機能性ヘキソキナーゼを有するペントース発酵酵母株を意味する。ある場合において、本特許出願において定義される「野性型酵母」には、突然変異酵母が含まれ得る。例えば、ＩＭＷ０１７、ＩＭＷ０１８、ＩＭＫ３０６、ＩＭＫ３０７およびＩＭＫ３１８が開発されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＤＳ６２５０４は、それ自体、突然変異酵母株である。しかしながら、ＤＳ６２５０４は、本明細書において定義される野性型酵母でもある。それというのも、それは本発明の酵母細胞を開発するために使用された、通常レベルの機能性ヘキソキナーゼを有するペントース発酵酵母であるためである。
【００４５】
ヘキソキナーゼ（ｈｘｋ）は、本明細書において、六炭糖のヘキソースをヘキソースリン酸にリン酸化する任意の酵素である。ほとんどの組織および生物において、グルコースはヘキソキナーゼの最も重要な基質であり、グルコース−６−リン酸は最も重要な生成物である。
【００４６】
ヘキソキナーゼは、細菌、酵母、ならびに植物からヒトおよび他の脊椎動物に及ぶ確認されたほとんどの生物に見出されている。これらは、基質親和性および他の特性を決定するより可変性の配列により包囲される共通のＡＴＰ結合部位コアを共有するアクチン折り畳みタンパク質としてカテゴリー化される。異なる機能を提供するいくつかのヘキソキナーゼアイソフォームまたはアイソザイムが、単一種において生じ得る。
【００４７】
［ヘキソキナーゼの反応：］
ヘキソキナーゼにより介在される細胞内反応は、以下のとおり類型化することができる：
ヘキソース＋ＡＴＰ→ヘキソース−Ｐ＋ＡＤＰ
【００４８】
［酵母細胞］
本発明によれば、天然ヘキソキナーゼ活性の破壊は、Ｃ５／Ｃ６発酵におけるより短い発酵時間および／またはペントースおよびグルコースの酵母細胞による同時消費をもたらす。
【００４９】
得られた酵母細胞は、ＩＭＷ０１７、ＩＭＷ０１８、ＩＭＫ３０６、ＩＭＫ３０７および／またはＩＭＫ３１８と命名され、以下に詳細に記載のとおり得、特性決定した。機能性ヘキソキナーゼ遺伝子の発現の低減および全体エタノール収率の増加を特徴とするＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母細胞は、破壊カセットを使用する１工程部位特異的統合によりヘキソキナーゼ遺伝子を排除する以外の手段により得ることができることが予想される。例えば、機能性ヘキソキナーゼを欠き、またはヘキソキナーゼを低減されたレベルにおいて発現する変異体は、当該技術分野において公知のいくつかの手段のいずれか、例えば、酵母細胞をＤＮＡインターカレート剤に曝露することまたは酵母細胞に紫外線光を照射することにより得ることができる。ヘキソキナーゼ欠損細胞は、コロニーサイズおよび他の形態学的パターン（すなわち、小サイズ、皺外観を有する黄色のコロニー）に基づき野性型細胞から区別することができる可能性が高い。この特有の表現型に基づき仮同定された推定ヘキソキナーゼ欠損コロニーのヘキソキナーゼ状態は、例えば単独の炭素源としてのグルコースを含有する培地上での生育不能により、またはヘキソキナーゼ活性測定により確認することができる。
【００５０】
酵母細胞は、典型的には、酵母由来でないペントース代謝経路の遺伝子および／または酵母細胞のペントースの変換を可能とする遺伝子を含有する。一実施形態において、酵母細胞は、酵母細胞のキシロースの変換を可能とする、１つ以上のキシロースイソメラーゼの１または２つ以上のコピーならびに／または１つ以上のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の１または２つ以上のコピーを含み得る。この一実施形態において、これらの遺伝子は、酵母細胞ゲノム中に統合することができる。別の実施形態において、酵母細胞は、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを含む。その場合、それはアラビノースを発酵し得る。本発明の一実施形態において、酵母細胞は、酵母細胞のキシロースの発酵を可能とするためにｘｙｌＡ遺伝子、ＸＹＬ１遺伝子およびＸＹＬ２遺伝子ならびに／またはＸＫＳ１遺伝子；アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞中のペントースリン酸経路を経る流束の増加を可能とするためにＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１の過剰発現、ならびに／またはＧＡＬ２の過剰発現および／またはＧＡＬ８０の欠失を含む。したがって、上記遺伝子の包含にかかわらず、（野性型）酵母細胞由来でない好適なペントースまたは他の代謝経路を酵母細胞中に導入することができる。
【００５１】
一実施形態において、酵母細胞は、工業酵母からヘキソキナーゼの破壊により誘導する。工業細胞および工業酵母細胞は、以下のとおり定義することができる。工業プロセスにおける（酵母）細胞の生存環境は、実験室のそれとは顕著に異なる。工業酵母細胞は、プロセスの間に変動し得る複数の環境条件下で十分に機能し得なければならない。そのような変動には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞生育およびエタノール生成に対する潜在的影響を一緒に及ぼす栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度などの変化が含まれる。有害な工業条件下で、環境耐性株は堅牢な生育および生成を可能とすべきである。工業酵母株は、一般に、それらが使用される用途において、例えば製パン工業、醸造工業、ワイン生産およびエタノール工業において生じ得るそれらの環境条件の変化に対してより堅牢である。一実施形態において、工業酵母細胞は、工業宿主細胞を基礎として構築され、その構築は、以下に記載のとおり実施される。工業酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【００５２】
一実施形態において、酵母細胞は阻害剤耐性である。阻害剤耐性は、阻害化合物に抵抗性である。リグノセルロース中の阻害化合物の存在およびレベルは、原料、前処理方法加水分解プロセスの変動により広範に変動し得る。阻害剤のカテゴリーの例は、カルボン酸、フランおよび／またはフェノール化合物である。カルボン酸の例は、乳酸、酢酸またはギ酸である。フランの例は、フルフラールおよびヒドロキシ−メチルフルフラールである。例またはフェノール化合物は、バニリン、シリンガ酸、フェルラ酸およびクマル酸である。阻害剤の典型的な量は、カルボン酸については、原料、前処理および加水分解条件に応じて１リットル当たり数グラム、最大で１リットル当たり２０グラム以上である。フランについては、原料、前処理および加水分解条件に応じて１リットル当たり数百ミリグラム、最大で１リットル当たり数グラムである。フェノール化合物については、原料、前処理および加水分解条件に応じて１リットル当たり数十ミリグラム、最大で１リットル当たり１グラムである。
【００５３】
本発明による酵母細胞は、好ましくは阻害剤耐性であり、すなわち、それらは、酵母細胞を幅広く適用することができ、すなわち、それが異なる原料、異なる前処理方法および異なる加水分解条件についての高い適用性を有するように、それらが一般的な前処理および加水分解条件について典型的に有するレベルの一般的な阻害剤に耐え得る。
【００５４】
一実施形態において、工業酵母細胞は、阻害剤耐性宿主細胞を基礎として構築され、その構築は以下の記載のとおり実施される。阻害剤耐性宿主細胞は、阻害剤耐性Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ２６６０２が選択された、Ｋａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８に説明されるような阻害剤含有材料上での生育について株をスクリーニングすることにより選択することができる。
【００５５】
一実施形態において、酵母細胞はマーカーフリーである。本明細書において使用される用語「マーカー」は、マーカーを含有する宿主細胞の選択、またはスクリーニングを可能とする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカーフリーは、マーカーが酵母細胞中に本質的に不存在であることを意味する。マーカーフリーであることは、抗生物質マーカーが酵母細胞の構築に使用され、その後に除去される場合に特に有利である。マーカーの除去は、任意の好適な先行技術、例えば分子内組換えを使用して行うことができる。マーカー除去の好適な方法は、実施例に説明する。
【００５６】
酵母細胞は、ピルビン酸の所望の発酵生成物、例えばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム、抗生物質またはセファロスポリンへの変換に要求されるそれらの酵素活性をさらに含み得る。
【００５７】
一実施形態において、酵母細胞は、天然にアルコール発酵、好ましくは、嫌気的アルコール発酵し得る細胞である。酵母細胞は、好ましくは、エタノールに対する高い耐性、低ｐＨに対する高い耐性（すなわち、約５、約４、約３、または約２．５よりも低いｐＨにおいて生育し得る）および有機物に対する高い耐性ならびに／または高温に対する高い耐性を有する。
【００５８】
酵母細胞の上記の特徴または活性のいずれかは、細胞において天然に存在し得、または遺伝子改変により導入もしくは改変することができる。
【００５９】
［酵母細胞の構築］
一実施形態によれば、
ａ）場合により強力な構成性プロモーターの制御下のＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１からなるクラスター；
ｂ）強力な構成性プロモーターの制御下下のｘｙｌＡ遺伝子からなるクラスター；
ｃ）強力な構成性プロモーターの制御下のＸＫＳ１遺伝子を含むクラスター；
ｄ）強力な構成性プロモーターの制御下の遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤからなるクラスター
ｅ）アルドースレダクターゼ遺伝子の欠失；
ｆ）酵母由来の１つ以上のヘキソキナーゼ遺伝子の破壊；
ｇ）ａ）からｅ）から得られた株の進化工学；
ならびに場合により
ｈ）１つ以上の外因性ヘキソキナーゼ遺伝子の、進化工学から得られた細胞中への導入
を宿主細胞中に導入することにより遺伝子を酵母細胞に導入して酵母細胞を生成することができる。
【００６０】
上記の細胞は、公知の組換え発現技術を使用して構築することができる。
【００６１】
［組換え発現］
酵母細胞は、組換え細胞である。すなわち、酵母細胞は、当該細胞中で天然に生じないヌクレオチド配列を含み、またはその配列により形質転換もしくは遺伝子改変されている。
【００６２】
細胞中の酵素の組換え発現のための技術、および酵母細胞の付加的遺伝子改変のための技術は、当業者に周知である。典型的には、そのような技術は、関連配列を含む核酸構築物による細胞の形質転換を含む。そのような方法は、例えば、標準的な教本、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）から公知である。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変の方法は、例えば欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書から公知である。
【００６３】
［配列同一性］
アミノ酸またはヌクレオチド配列は、あるレベルの類似性を示す場合に相同性であると考えられる。相同性である２つの配列は、共通の進化的起源を示す。２つの相同配列が近縁であるかより遠縁であるかは、それぞれ高いかまたは低い「同一性パーセント」または「類似性パーセント」により示される。議論されているが、「同一性パーセント」または「類似性パーセント」を示すため、「相同性のレベル」または「相同性パーセント」が互換的に使用されることが多い。
【００６４】
用語「相同性」、「相同性パーセント」、「同一性パーセント」または「類似性パーセント」は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的のため、本明細書において、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために完全配列が最適比較目的のためにアラインされることが定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するため、ギャップを比較される２つの配列のいずれかに導入することができる。そのようなアラインメントは、比較されている配列の全長にわたり実施される。あるいは、アラインメントは、より短い長さにわたり、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／ベースまたはアミノ酸にわたり実施することができる。同一性は、報告されるアラインされた領域にわたる２つの配列間の同一合致の百分率である。
【００６５】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者は、いくつかの異なるコンピュータプログラムが２つの配列のアラインメントおよび２つの配列間の相同性の決定に利用可能である事実を認識する（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定することができる。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。このアルゴリズムは、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列をアラインする。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のため、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ  Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。他のマトリックスを規定することができる。アミノ酸配列のアラインメントに使用される任意選択のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティおよび０．５のギャップエクステンションペナルティである。当業者は、これらの全ての異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体の同一性パーセントは、異なるアルゴリズムを使用した場合に顕著には変化しないことを認識する。
【００６６】
［全体的相同性の定義］
相同性または同一性は、任意のギャップまたはエクステンションを含むアラインされた全領域にわたる２つの完全配列間の同一合致の百分率である。２つのアラインされた配列間の相同性または同一性は、以下のとおり算出される：両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数を、ギャップを含むアラインメントの全長により割る。本明細書に定義の同一性は、ＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「ＩＤＥＮＴＩＴＹ」とラベルすることができる。
【００６７】
［最長同一性の定義］
２つのアラインされた配列間の相同性または同一性は、以下のとおり算出される：両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数を、アラインメント中のギャップの総数を引いた後のアラインメントの全長により割る。本明細書に定義の同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによりＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「ｌｏｎｇｅｓｔ−ｉｄｅｎｔｉｔｙ」とラベルすることができる。本発明の目的のため、２つの配列（アミノ酸またはヌクレオチド）間の同一性（相同性）のレベルは、プログラムＮＥＥＤＬＥを使用することにより実施することができる「最長同一性」の定義に従って算出される。
【００６８】
本発明において使用されるタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として使用して、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために配列データベースの検索を実施することができる。そのような検索は、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を介して一般に入手可能である。ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列について使用される。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして以下を使用する：
−オープンギャップに対するコスト：デフォルト＝ヌクレオチドについて５／タンパク質について１１
−エクステンドギャップに対するコスト：デフォルト＝ヌクレオチドについて２／タンパク質について１
−ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティ：デフォルト＝−３
−ヌクレオチドマッチについてのリワード：デフォルト＝１
−期待値：デフォルト＝１０
−ワードサイズ：デフォルト＝ヌクレオチドについて１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔについて２８／タンパク質について３
【００６９】
さらに、アミノ酸配列クエリーまたは核酸配列クエリーおよび検索された相同性配列間の局所的な同一性（相同性）の程度が、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定される。しかしながら、ある閾値を超える合致を与えるそれらの配列セグメントのみが比較される。したがって、このプログラムは、同一性をそれらの一致セグメントについてのみ算出する。したがって、このように算出された同一性は局所同一性と称される。
【００７０】
［バイオ製品生成］
長年にわたり、作物糖からバイオエタノールを生成するために、種々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら、実際、全ての主要なバイオエタノール生成プロセスは、エタノール生成菌としてサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を使用し続けている。これは工業的プロセスのための、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の多くの魅力的な特徴、すなわち高い酸、エタノールおよび浸透圧耐性、嫌気的生育能、ならびにもちろんその高いアルコール発酵能に起因する。宿主細胞として好ましい酵母種には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。
【００７１】
酵母細胞は、エタノールの生成に好適な細胞であり得る。しかしながら、酵母細胞は、エタノール以外の発酵生成物の生成に好適であり得る。
【００７２】
そのような非エタノール発酵生成物には、原則的には、真核微生物、例えば酵母または糸状菌により生成可能な任意のバルクまたはファインケミカルが挙げられる。
【００７３】
非エタノール発酵生成物の生成に好ましい酵母細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらす遺伝子改変を含有する宿主細胞である。
【００７４】
［リグノセルロース］
潜在的な再生可能原料とみなすことができるリグノセルロースは、一般に、多糖セルロース（グルカン）およびヘミセルロース（キシラン、ヘテロキシランおよびキシログルカン）を含む。さらに、例えば木材由来原料中に、一部のヘミセルロースがグルコマンナンとして存在し得る。例えばこれらの多糖の、可溶性糖、例としてモノマーおよびマルチマーの両方、例えばグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルクロン酸ならびに他のヘキソースおよびペントースへの酵素加水分解は、協調して作用する異なる酵素の作用下で生じる。
【００７５】
さらにペクチンおよび他のペクチン物質、例えばアラビナンが、典型的には非木本組織からの細胞壁の乾燥質量のかなりの比率を構成し得る（乾燥質量の約４分の１から２分の１がペクチンであり得る）。
【００７６】
［前処理］
酵素処理前に、リグノセルロース材料を前処理することができる。前処理は、リグノセルロース材料を酸、塩基、溶媒、熱、過酸化物、オゾン、機械的破砕、研削、粉砕もしくは急速減圧、またはそれらの任意の２つ以上の組合せに曝露することを含み得る。この化学的前処理は、熱前処理、例えば１〜３０分間の１５０〜２２０℃の処理と組み合わされることが多い。
【００７７】
［酵素加水分解］
前処理された材料は、一般に、酵素加水分解に供して本発明により発酵することができる糖を放出させる。これは、慣用の方法を用いて、例えばセルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼおよび場合により他の酵素と接触させることにより行うことができる。セルラーゼによる変換は、周囲温度においてまたはより高温において、十分量の糖を放出させるための反応時間において行うことができる。酵素加水分解の結果は、本明細書において糖組成物として命名されるＣ５／Ｃ６糖を含む加水分解生成物である。
【００７８】
［糖組成物］
本発明により使用される糖組成物は、グルコース、および例えばアラビノースおよび／またはキシロースなどの１つ以上のペントースを含む。それらの基準を満たす任意の糖組成物を本発明において使用することができる。糖組成物中の任意選択の糖は、ガラクトースおよびマンノースである。好ましい実施形態において、糖組成物は、１つ以上のリグノセルロース材料の加水分解物である。本明細書におけるリグノセルロースには、ヘミセルロースおよびバイオマスのヘミセルロース部分が含まれる。リグノセルロースには、バイオマスのリグノセルロース画分も含まれる。好適なリグノセルロース材料は、以下の列記に見出すことができる：果樹園のプライミング処理物、シャパラル、ミル廃棄物、都市木材廃棄物、一般廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐材、短期輪作木質作物、工業廃棄物、コムギ藁、オートムギ藁、イネ藁、オオムギ藁、ライムギ藁、アマ藁、ダイズ殻、籾殻、イネ藁、トウモロコシグルテン飼料、オートムギ殻、サトウキビ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ茎、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ外皮、スイッチグラス、ススキ、サトウモロコシ、キャノーラ茎、ダイズ茎、プレリーグラス、ガマグラス、エノコログサ；サトウダイコンパルプ、柑橘果実パルプ、種子殻、セルロース性家畜排泄物、刈り取った芝草、ワタ、海藻、樹木、針葉樹、広葉樹、ポプラ、マツ、灌木、草、コムギ、コムギ藁、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ外皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ穀粒、穀粒からの繊維、穀物の湿式または乾式粉砕からの製品および副産物、一般固形廃棄物、古紙、庭ごみ、草質材料、農業残渣、林業残渣、一般固形廃棄物、古紙、パルプ、製紙工場残渣、枝、低木、トウ、トウモロコシ、トウモロコシ外皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀物、草、草本作物、葉、樹皮、針葉、原木、根、苗木、灌木、スイッチグラス、木、野菜、果皮、蔓植物、サトウダイコンパルプ、コムギ製粉物、オートムギ殻、広葉樹もしくは針葉樹、農業プロセスから生じる有機廃材、林業木材廃棄物、またはそれらの任意の２つ以上の組合せ。
【００７９】
リグノセルロースから誘導される一部の好適な糖組成物およびその加水分解物の糖組成物の概要を表１に挙げる。列記されるリグノセルロースには、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ繊維、籾殻、メロン皮、サトウダイコンパルプ、コムギ藁、サトウキビバガス、木材、草およびオリーブ圧搾物が含まれる。
【００８０】
【表１】
0005961886.tif 000002
【００８１】
これらのリグノセルロースに豊富な量の糖がグルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの形態で存在することは、表１から明白である。したがって、グルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの、発酵生成物への変換は非常に経済的に重要である。マンノースも一部のリグノセルロース材料中に存在し、通常、上記の糖よりも少ない量で存在する。したがって、有利には、マンノースも形質転換宿主細胞により変換される。
【００８２】
本発明の酵母細胞をさらに操作して他の所望の特徴、またはいっそうより高い全体エタノール収率を達成することができると予期される。
【００８３】
加水分解物を含有する培地上で酵母細胞をパッセージすることによる改善された酵母細胞の選択は、向上された発酵速度を有する改善された酵母をもたらした。本発明の教示を使用して、そのような改善された株を容易にすることができる。
【００８４】
ペントース含有材料は、液体か固体かにかかわらずペントースを含む任意の培地を意味する。好適なペントース含有材料には、多糖またはリグノセルロースバイオマス、例えばトウモロコシ外皮、木材、紙、農業副生物などの加水分解物が含まれる。
【００８５】
本明細書において使用される「加水分解物」は、水の添加を介して脱重合されて単糖およびオリゴ糖を形成する多糖を意味する。加水分解物は、多糖含有材料の酵素または酸加水分解により生成することができる。
【００８６】
好ましくは、酵母細胞は、ペントースの工業源に見出される条件と同様の条件下で生育し得る。本発明の方法は、ペントース含有材料に酵母変異体を過剰な操作なしで植菌することができる場合に最も経済的である。例として、パルプ化工業は、大量のセルロース廃棄物を生成する。酸加水分解によるセルロースの糖化は、発酵反応において使用することができるヘキソースおよびペントースを生じさせる。しかしながら、加水分解物または亜硫酸廃液は、ほとんどの微生物の生育を阻害または妨害する木材中に天然に存在する高濃度の亜硫酸塩およびフェノール阻害剤を含有する。以下の実施例は、本発明の酵母細胞による広葉樹および針葉樹の酸加水分解物（または亜硫酸廃液）中でのペントースの発酵を記載する。亜硫酸廃液中で生育し得る酵母株が、実質的に他のいかなるバイオマス加水分解物中でも生育し得ることが合理的に予期される。
【００８７】
［発酵］
発酵プロセスは、好気的または嫌気的発酵プロセスであり得る。嫌気的発酵プロセスは、本明細書において、酸素不存在下で実行される発酵プロセス、または実質的に酸素が消費されず、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され（すなわち酸素消費が検出可能でない）、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスと定義される。酸素の不存在下で、解糖およびバイオマス形成中に生成されたＮＡＤＨは、酸化的リン酸化により酸化され得ない。この問題を解決するため、多くの微生物は、電子および水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の１つを使用し、それによりＮＡＤ＋を再生する。
【００８８】
したがって、好ましい嫌気的発酵プロセスにおいて、ピルビン酸が電子（および水素受容体）として使用され、発酵生成物、例えばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸およびエチレンに還元される。
【００８９】
発酵プロセスは、好ましくは細胞に最適の温度において実行される。したがってほとんどの酵母または真菌宿主細胞について、発酵プロセスは、約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度において実施される。酵母または糸状菌宿主細胞について、発酵プロセスは好ましくは約３５、約３３、約３０または約２８℃よりも低い温度および約２０、約２２、または約２５℃よりも高い温度において実施される。
【００９０】
プロセスにおけるキシロースおよび／またはグルコースに対するエタノール収率は、好ましくは少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５または約９８％である。エタノール収率は、本明細書で理論的最大収率の百分率と定義される。
【００９１】
本発明はまた、発酵生成物を生成する方法にも関する。
【００９２】
本発明による発酵プロセスは、好気的および嫌気的条件下で実行することができる。一実施形態において、このプロセスは微好気的または酸素制限条件下で実施される。
【００９３】
嫌気的発酵プロセスは、本明細書において、酸素不存在下で進行し、または実質的に酸素が消費されず、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスと定義される。
【００９４】
酸素制限発酵プロセスは、気体から液体への酸素移動により、酸素消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入ガス流の量および組成ならびに使用される発酵装置の実際の混合／質量移動特性により決定される。好ましくは、酸素制限条件下のプロセスにおいて、酸素消費速度は、少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、例えば少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。本発明の方法は、発酵生成物の回収を含み得る。
【００９５】
好ましい方法において、細胞はキシロースおよびグルコースの両方を好ましくは同時に発酵し、その場合、好ましくはジオーキシー生育を妨害するグルコース抑制に非感受性の細胞が使用される。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）の源に加えて、発酵培地は、細胞の生育に要求される適切な成分をさらに含む。微生物、例えば酵母の生育のための発酵培地の組成物は、当該技術分野において周知である。
【００９６】
発酵プロセスは、バッチ、流加または連続様式で実施することができる。加水分解・発酵分離（ＳＨＦ）プロセスまたは並行復発酵（ＳＳＦ）プロセスを適用することもできる。最適生産性のために、これらの発酵プロセス様式の組合せも可能であり得る。これらのプロセスを以下により詳細に記載する。
【００９７】
［ＳＳＦ様式］
並行復発酵（ＳＳＦ）様式について、液化／加水分解または前糖化工程のための反応時間は、所望の収率、すなわちセルロースからグルコースへの変換収率を実現する時間に依存する。そのような収率は、好ましくは可能な限り高く、好ましくは６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、さらには９９．５％以上または９９．９％以上である。
【００９８】
本発明によれば、ＳＨＦ様式における極めて高い糖濃度、およびＳＳＦ様式における極めて高い生成物濃度（例えばエタノール）が実現される。ＳＨＦ操作では、グルコース濃度は、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上、３５ｇ／Ｌ以上、４０ｇ／Ｌ以上、４５ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、５５ｇ／Ｌ以上、６０ｇ／Ｌ以上、６５ｇ／Ｌ以上、７０ｇ／Ｌ以上、７５ｇ／Ｌ以上、８０ｇ／Ｌ以上、８５ｇ／Ｌ以上、９０ｇ／Ｌ以上、９５ｇ／Ｌ以上、１００ｇ／Ｌ以上、１１０ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ以上であり、または例えば２５ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、３０ｇｌ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであり得る。
【００９９】
［ＳＳＦ様式における生成物濃度］
ＳＳＦ操作において、生成物濃度（ｇ／Ｌ）は生成されるグルコースの量に依存するが、糖はＳＳＦにおいて生成物に変換され、生成物濃度は、基礎グルコース濃度に理論的最大収率（Ｙｐｓ  ｍａｘは、１グラムのグルコース当たりの生成物のグラムである）を掛けたものに関連し得るため、これは可視的でない。
【０１００】
発酵生成物の理論的最大収率（Ｙｐｓ  ｍａｘは、１グラムのグルコース当たりの生成物のグラムである）は、教本による生化学から導くことができる。エタノールについて、１モルのグルコース（１８０グラム）は、酵母中の通常解糖発酵経路に従って、２モルのエタノール（＝２×４６＝９２グラムのエタノール）を生じる。したがってグルコースに対するエタノールの理論的最大収率は、９２／１８０＝０．５１１グラムのエタノール／１グラムのグルコースである。
【０１０１】
ブタノール（ＭＷ７４グラム／モル）またはイソブタノールについて、理論的最大収率は１モルのグルコース当たり１モルのブタノールである。したがって（イソ−）ブタノールのＹｐｓ  ｍａｘ＝７４／１８０＝０．４１１グラムの（イソ−）ブタノール／１グラムのグルコースである。
【０１０２】
乳酸について、ホモ乳酸発酵の発酵収率は、１モルのグルコース当たり２モルの乳酸（ＭＷ＝９０グラム／モル）である。この化学量論によれば、Ｙｐｓ  ｍａｘ＝１グラムの乳酸／１グラムのグルコースである。
【０１０３】
他の発酵生成物について、同様の計算を行うことができる。
【０１０４】
［ＳＳＦ様式］
ＳＳＦ操作において、生成物濃度は、２５ｇ＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ／Ｌ以上、３０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、３５ｇ＊Ｙｐｓ／Ｌ以上、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、４５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１１０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ＊Ｙｐｓ以上であり、または例えば２５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、３０＊Ｙｐｓ  ｇｌ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌであり得る。
【０１０５】
したがって、本発明は発酵生成物を調製する方法であって、
ａ．本明細書に記載の方法を使用してリグノセルロースを分解すること；および
ｂ．得られた材料を発酵すること
を含み、それにより発酵生成物を調製する方法を提供する。
【０１０６】
［発酵生成物］
本発明の発酵生成物は、任意の有用な生成物であり得る。一実施形態において、これは、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物飼料補助剤、特殊化学薬品、化学原料、プラスチック、溶媒、燃料、例としてバイオ燃料およびバイオガスまたは有機ポリマー、ならびに工業酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼからなる群から選択される生成物である。
【０１０７】
［発酵生成物の回収］
発酵生成物の回収のため、既存の技術が使用される。異なる発酵生成物について、異なる回収プロセスが適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に分留および吸着技術を使用する。例えばビール蒸留器を使用して、エタノールを水性混合物中に含有する発酵生成物を処理して濃縮エタノール含有混合物を生成し、次いで分留（例えば分別蒸留または他の同様の技術）に供することができる。次に最高濃度のエタノールを含有する留分を吸収材に導通させ、エタノールから残りの水の全部ではないが大部分を除去することができる。
【０１０８】
以下の非限定的な実施例は、単なる説明的なものを意図する。
【０１０９】
［実施例］
［株および維持］
本試験において使用される株（表１）の貯蔵のため、振とうフラスコ培養を１０ｇ  ｌ−１の酵母抽出物（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）および２０ｇ  ｌ−１のペプトン（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）からなり、２％のグルコース（ＹＰＤ）、２％のエタノール＋１．５％のグリセロール（ＹＰ−ＥｔＯＨ／Ｇｌｙｃ）または２％のアラビノース（ＹＰ−Ａｒａ）のいずれかを補給した複合培地（ＹＰ）中で実施した。培養物を、静止生育期までオービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）中で３０℃においてインキュベートした。３０％（ｖ／ｖ）のグリセロールの添加後、振とうフラスコ培養物からの試料を２ｍｌのアリコートで−８０℃において貯蔵した。
【０１１０】
［振とうフラスコ培養］
振とうフラスコ中での培養を、２．３ｇ  ｌ−１の尿素、６．６ｇ  ｌ−１のＫ２ＳＯ４、３ｇ  ｌ−１のＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ｌ−１のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、および微量元素を含有する合成培地（ＭＹ尿素）［７］中で３０℃において実施した。振とうフラスコ培養のため、培地ｐＨを滅菌前に２ＭのＫＯＨにより４．７に調整した。加熱滅菌（１２１℃、２０分）後、フィルター滅菌ビタミン溶液［７］および糖を添加した。振とうフラスコ培養物は、５００ｍｌの振とうフラスコ中の適切な糖を含有する１００ｍｌの培地に凍結ストック培養物を植菌することにより調製し、オービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）中で３０℃においてインキュベートした。
【０１１１】
［嫌気的バッチ培養］
嫌気的バッチ培養は、１ｌの作業容積を有する２リットルの発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｓｃｈｉｅｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で３０℃において実施した。培養は、５ｇ  ｌ−１の（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ  ｌ−１のＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ｌ−１のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏおよび微量元素を含有する合成培地［７］中で実施した。加熱滅菌（１２１℃、２０分）後、培地にエタノール中に溶解した０．０１ｇ−１のエルゴステロールおよび０．４２ｇ−１のＴｗｅｅｎ８０［１，２］、ケイ素消泡剤、微量元素、フィルター滅菌ビタミン溶液［７］、ならびに適切な炭素源を補給した。培養物を８００ｒｐｍにおいて撹拌し、０．５ｌ  ｍｉｎ−１の窒素ガス（＜１０ｐｐｍの酸素）によりスパージし、２ＭのＫＯＨの自動添加によりｐＨ５．０において維持した。酸素拡散を最小化するため、発酵槽にＮｏｒｐｒｅｎｅチューブ（Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＵＳＡ）を備えた。酸素の不存在は、酸素電極（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ，Ｓｃｈｉｅｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により確認した。バッチ培養は、１００ｍｌのグルコースにより生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により開始した。
【０１１２】
［生育速度決定］
振とうフラスコ培養物について、６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０）を経時的に計測することにより生育プロファイルを作製した。発酵槽中の嫌気的培養について、比生育速度を排ガス中のＣＯ２濃度に基づき決定した。比生育速度は、データ点を指数曲線にフィットすることにより決定した。
【０１１３】
［二酸化炭素および細胞外代謝産物分析］
嫌気的発酵槽からの排ガスを、凝縮器（２℃）中で冷却し、Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ乾燥器型ＭＤ−１１０−４８Ｐ−４（Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ，Ｔｏｍｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＳＡ）により乾燥させた。二酸化炭素濃度は、ＮＧＡ２０００分析器（Ｒｏｓｅｍｏｕｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｏｒｒｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）により測定した。排ガス流速および比二酸化炭素生成速度は、上記のとおり測定した［６，８］。
【０１１４】
グルコース、アラビノース、酢酸、乳酸、コハク酸、グリセロールおよびエタノールを、ＢｉｏＲａｄ  ＨＰＸ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率検出器およびＷａｔｅｒｓ２４８７ＵＶ検出器を搭載したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９０ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用するＨＰＬＣにより分析した。カラムは、６０℃において０．５ｇ  ｌ−１の硫酸により０．６ｍｌ  ｍｉｎ−１の流速において溶出させた。
【０１１５】
［ヘキソキナーゼ活性測定］
本試験において使用された株の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、グルコースのグルコース−６−リン酸（反応１）への変換率を、形成されたグルコース−６−リン酸を酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより６−ホスホグルコン酸に変換する連結酵素反応（反応２）を使用して計測することにより測定した。この連結反応において形成されるＮＡＤＰＨの速度は、ヘキソキナーゼ活性と等しく、３４０ｎｍにおける吸光度を計測することにより測定する。
【数１】
0005961886.tif 000003
【０１１６】
［実施例１］
［遺伝子欠失］
本実施例において、遺伝子欠失は、標的遺伝子を置き換えるＧ４１８耐性カセットの統合により達成した。ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１の欠失のため、ｐＵＧ６からのＫａｎＭＸカセットを、表２に示されるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅した［４］。
【０１１７】
【表２】
0005961886.tif 000004
【０１１８】
ＰＣＲ生成物の精製後（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、一晩培養物を遺伝子破壊カセットにより形質転換［３］した。形質転換細胞は、１００μｇ  ｍｌ−のＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を含有するＹＰＤ寒天上で選択した。ＫａｎＭＸカセットの正確な統合は、ＫａｎＭＸカセットならびに標的遺伝子の上流および下流領域に結合する診断オリゴヌクレオチドを使用して単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した（表１）。
【０１１９】
複数の遺伝子欠失のため、隣接遺伝子の欠失前にＫａｎＭＸマーカーをレスキューした。この目的のため、細胞を、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し、フレオマイシン耐性遺伝子ｂｌｅｒを有するｐＳＨ６５により形質転換した［５］。形質転換細胞を、フレオマイシンを含有するＹＰＤプレート上にスプレッドし、コロニーが現れるまで３０℃においてインキュベートした。７．５μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含有する液体ＹＰ−ガラクトース（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に、いくつかのフレオマイシン耐性コロニーを植菌し、Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導のために３０℃において一晩インキュベートし、フレオマイシンを有する固体ＹＰＤに植継ぎした。ＣｒｅリコンビナーゼによるＫａｎＭＸカセットの除去は、ＹＰＤおよびＹＰＤ−Ｇ４１８上のフレオマイシン耐性酵母コロニーのレプリカプレーティングにより、およびＧ４１８耐性を失った単一コロニーに対する診断ＰＣＲにより確認した。続いて、ｐＳＨ６５の損失を、細胞をフレオマイシンを有さないＹＰＤ中で非選択的に５〜１０世代生育させることにより達成し、その後、フレオマイシン耐性の損失を、フレオマイシンを有し、または有さない固体ＹＰＤ上の単一コロニーのレプリカプレーティングにより確認した。ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１の後続の欠失、ならびにそれぞれの欠失後のＫａｎＭＸ遺伝子の除去は、株ＩＭＫ３０６、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１１、ＩＭＫ３１２およびＩＭＫ３１８をもたらした（表３）。
【０１２０】
【表３】
0005961886.tif 000005
【０１２１】
グルコースおよびアラビノース消費に対するｈｘｋ２およびｈｘｋ２  ｈｘｋ１欠失の効果。グルコースおよびアラビノース消費に対するＨＸＫ２およびＨＸＫ１欠失の効果を決定するため、株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）およびＩＭＫ３１１／ＩＭＫ３１２（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ）を振とうフラスコ（図１）および嫌気的発酵槽（図２）の両方の中で３０℃において２％のアラビノースおよび２％のグルコースの混合物を補給したＭＹ中で培養した。
【０１２２】
振とうフラスコ培養は、ＭＹ−ｇｌｃ中で生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により約０．０５の初期ＯＤ６６０において開始した。株ＤＳ６２５０４（図１）は、グルコースを２１時間内に消費し、グルコース枯渇時、アラビノース消費が開始した。両方の糖は、５０時間超の合計時間内に消費された。株ＩＭＫ３０７（図１）の培養物において、グルコースは、２５時間で全部消費され、アラビノースはその後１５時間未満で枯渇した。全ＩＭＫ３０７は、ＤＳ６２５０４と比較して合計発酵時間の少なくとも２０％の低減を実証した。株ＩＭＫ３１１（図１）は、２％のグルコースを約３０時間内で消費した。培養物中に依然として約１０ｍＭのグルコースが残り、アラビノース消費が観察された。アラビノースは、４８時間内に消費が完了した。ＩＭＫ３０７よりも緩慢であったが、ＩＭＫ３１１の全発酵時間はＤＳ６２５０４のそれよりも依然として短かった。
【０１２３】
嫌気的培養（図２）は、ＭＹ−ｇｌｃ中で生育させた振とうフラスコ培養物による植菌により約１の初期ＯＤ６６０において開始した。ＣＯ２生成プロファイルに基づき、株ＤＳ６４２０５がグルコースを１５時間未満内で完全に消費したことが推定することができた。グルコース消費の間の比生育速度は、０．２９ｈ−１であった。しかしながら、アラビノースは、かなり低い速度において消費された。８０時間後、アラビノースの約９０％が発酵ブロス中に依然として存在する。株ＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）についてのグルコース消費はより緩慢であった。ＣＯ２生成プロファイルおよびグルコース計測の両方は、全てのグルコースが２０時間内に消費されることを示した。グルコース消費の間の比生育速度は、０．２０ｈ−１であった。アラビノース消費はグルコース枯渇時に開始し、アラビノースの９２％が６６時間内に消費され、それは株ＤＳ６２５０４と比較した場合に明白な改善である。ＨＸＫ２に加えてＨＸＫ１の欠失（株ＩＭＫ３１２）は、グルコース上での比生育速度に対して甚大な効果を有した。株ＩＭＫ３１２についての生育速度０．０５ｈ−１は、株ＩＭＫ３０７のそれよりも７５％低かった。グルコースは４６時間内に枯渇した。これらの４６時間内で、１３２ｍＭのアラビノースの合計の約１０％が消費された。アラビノースは、１１２時間未満内で完全に消費された。
【０１２４】
［実施例２］
［グルコースの存在下でアラビノース上で生育するＩＭＫ３１８の選択］
グルコース上での振とうフラスコ中の４５０時間の培養により、ヘキソキナーゼ／グルコキナーゼ欠失株ＩＭＫ３１８（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ）がグルコース単独上で生育し得ないことを確認した。したがって、この株をＹＰ−ＥｔＯＨ／Ｇｌｙｃ中で培養し、続いてグリセロールの添加後に−８０℃において貯蔵した。続いてＩＭＫ３１８を、２％のアラビノースを含有する１００ｍｌのＭＹ中で培養した。３日後、約１のＯＤ６６０において、２ｍｌの培養物を、２％のアラビノースを含有する１００ｍｌの新たなＭＹに植継ぎした。約１２日後、培養物のＯＤ６６０は＞５であり、試料を−８０℃においてグリセロールストックとして貯蔵した。株ＩＭＫ３１８は、３０℃においてＭＹ−ａｒａ中で数日間培養した。約５のＯＤ６６０において、２ｍｌの培養物を、２％のアラビノースを補給し、グルコース濃度が０、０．１１、０．２３、０．６５、１．３および２．５（ｗ／ｖ）％で変動する１００ｍｌのＭＹ尿素を含有する６つの別個の振とうフラスコに植継ぎした。これら６つの並行培養物の生育を、ＯＤ６６０計測により記録した（図３）。グルコースの存在下、生育が遅延することが観察された。グルコースの量の増加は、アラビノース上での次第に遅延する生育をもたらした。これらの並行培養物の２つ（系統Ａ、０．６５ｗ／ｖ％のグルコースにおいて開始；系統Ｂ、２．５ｗ／ｖ％のグルコースにおいて開始）を、表４に示される植継ぎスキームに従ってアラビノースおよびグルコースを補給した１００ｍｌのＭＹに継代した。
【０１２５】
【表４】
0005961886.tif 000006
【０１２６】
培養物を、増加濃度のグルコースを有する培地に植継ぎした系列Ａにおいて（表３）、アラビノースは完全に消費された一方、グルコースの１０％未満が消費された（図４）。ＳＦ７から、試料を、１００μｇ  ｍｌ−１のＧ４１８を補給した固体ＹＰ−ａｒａ上にスプレッドし、コロニーが現れるまで３０℃においてインキュベートした。別々のコロニーを固体ＹＰ−ａｒａに植継ぎした。単一コロニー単離物をＹＰ−ａｒａ中で培養し、−８０℃において貯蔵した。継代された振とうフラスコのこの系列の２つの単一コロニー単離物を試験し、混合培養物と質的に類似することが見出された。これらの単離物の１つを株ＩＭＷ０１８と命名した。
【０１２７】
系列Ｂ（表３）において、振とうフラスコ培養物を、２％のアラビノースおよび２％のグルコースの固定濃度を有するＭＹ培地中に植継ぎした（図５）。驚くべきことに、アラビノースおよびグルコースの同時消費は、第１の植継ぎ（ＳＦ１→ＳＦ２）後に観察された。ＳＦ３から、試料を、１００μｇ  ｍｌ−１のＧ４１８を補給した固体ＹＰ−ａｒａ上にスプレッドし、コロニーが現れるまで３０℃においてインキュベートした。別々のコロニーを固体ＹＰ−ａｒａに植継ぎした。単一コロニー単離物をＹＰ−ａｒａ中で培養し、グリセロールストックとして−８０℃において貯蔵した。継代された振とうフラスコのこの系列の２つの単一コロニー単離物を試験し、混合培養物と質的に類似することが見出された。これらの単離物の１つを株ＩＭＷ０１７と命名した。
【０１２８】
単一コロニー単離物株ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８の両方のグルコースおよびアラビノース消費を、振とうフラスコ培養物中で試験した（図４および５）。単一コロニー単離物は、それらが由来する継代された振とうフラスコ培養物に類似するグルコースおよびアラビノース濃度プロファイルを示した。興味深いことに、ヘキソキナーゼ／グルコキナーゼ欠失株ＩＭＫ３１８（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ）に基づくこの進化工学戦略において適用されたグルコース濃度レジームは、２つの異なる表現型をもたらした：（ｉ）株ＩＭＷ０１８によるグルコース非感受性アラビノース消費、および（ｉｉ）株ＩＭＷ０１７によるアラビノースおよびグルコースの同時消費。
【０１２９】
［実施例３］
［アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵］
株ＩＭＷ０１７を、連続バッチ発酵槽設定を使用してグルコースおよびアラビノースの混合物中で嫌気的に培養した。グルコース／アラビノース混合物中の３つの連続バッチを実施した（図６）。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された。ＣＯ２生成プロファイルから推定すると、グルコース／アラビノース混合物上での比生育速度が、第１のバッチにおける０．０５ｈ−１から第３のバッチにおける０．０７ｈ−１に増加することが観察された。
【０１３０】
さらなる連続バッチ発酵の間、生育速度はいっそうさらに増加する。最終バッチから採取された単一コロニー単離物株は、グルコースおよびアラビノース同時消費をＩＭＷ０１７と比較して増加した比消費速度において示す。
【０１３１】
［実施例４］
［ヘキソキナーゼ活性］
株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１２、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性を測定する。ＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、株ＤＳ６２５０４のそれよりも低い。ＩＭＫ３１２（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ）のヘキソキナーゼ活性はＩＭＫ３０７のそれよりも低い一方、ＩＭＫ３１８（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ  ｇｌｋ１Δ）は、ヘキソキナーゼ活性を示さず／最低のヘキソキナーゼ活性を示す。株ＩＭＷ０１８中のヘキソキナーゼ活性はＩＭＫ３１８について観察されるヘキソキナーゼ活性と類似する一方、ＩＭＷ０１７はＩＭＫ３１８よりも高いヘキソキナーゼ活性を有する。
【０１３２】
［実施例５］
［ＩＭＷ０１７における未知ヘキソキナーゼの同定］
進化させたｈｘｋｌ  ｈｘｋ２  ｇｌｋｌ株における計測されたヘキソキナーゼ活性に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期される。この活性をコードする遺伝子をゲノム分析により同定する。この遺伝子の付加的欠失は、ヘキソキナーゼ活性の減少をもたらす。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０１３３】
［実施例６］
［ＩＭＫ３１８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
グルコース上での生育を回復させるため、ＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかをＩＭＫ３１８中に再導入する。活性計測は、ＩＭＫ３１８におけるこれらの遺伝子の１つの再導入がヘキソ／グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。
【０１３４】
［実施例７］
［ＩＭＷ０１８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
活性計測は、ＩＭＷ０１８におけるＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入が株ＩＭＷ０１８と比較してヘキソ／グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。ＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入は、単独の炭素源としてのグルコースおよびアラビノースの両方の上での生育をもたらす。得られた株は、グルコースおよびアラビノースの混合物中で生育し、グルコースおよびアラビノースの同時消費を示す。
【０１３５】
［実施例８］
［ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のグルコース非感受性表現型の基礎をなす突然変異の同定］
株ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のグルコース非感受性表現型は、グルコースおよびアラビノースを含有する培地中の株ＩＭＫ３１８の選択的生育の間に蓄積した突然変異により説明することができることが予測される。これらの突然変異を同定するため、株ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のゲノムをシーケンシングする。ＩＭＷ０１７とＩＭＫ３１８およびＩＭＷ０１８とＩＭＫ３１８のゲノム配列を比較することにより、例えば単一ヌクレオチド多型などのゲノム改変を同定する。ＤＳ６２５０４におけるこれらの単一ヌクレオチド多型の導入は、アラビノース上での生育がグルコースに対して非感受性である表現型をもたらす。
【０１３６】
［実施例９］
［ＧＡＬ１の欠失］
ヘキソキナーゼ活性の維持を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、ＧＡＬ１遺伝子をｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株において欠失させる。得られた株は、親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０１３７】
［実施例１０］
［ＹＤＲ５１６ｃの欠失］
ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、ＹＤＲ５１６ｃ遺伝子をｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株において欠失させる。得られた株は、親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０１３８】
［実施例１１］
［ＹＬＲ４４６ｗの欠失］
ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、ＹＬＲ４４６ｗ遺伝子をｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株において欠失させる。得られた株は、親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０１３９】
［実施例１２］
［アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵］
株ＩＭＷ０１７のグルコースおよびアラビノースの同時消費を改善するため、株ＩＭＷ０１７を、２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースの混合物を補給したＭＹ中で、連続バッチ発酵槽設定を使用して嫌気的に培養した。最初に、グルコース／アラビノース混合物中の４つの連続バッチを実施した。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された（図６、実施例３）。ＣＯ２生成プロファイルから推定すると、グルコース／アラビノース混合物上の比生育速度が、第１のバッチにおける０．０５ｈ−１から第４のバッチにおける０．０６ｈ−１に増加することが観察された。第４のバッチ後、連続バッチ培養をグルコースおよびアラビノースの混合物（バッチ番号６、７、９、１１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９）またはアラビノース単独（バッチ番号５、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０）の中で実施した。ＭＹ−アラビノースおよびＭＹ−グルコース／アラビノースそれぞれにおける１９および２１のバッチ後、嫌気的生育速度は単独の炭素源としてのアラビノース上で０．０９ｈ−１に増加し、グルコース／アラビノース混合物上で０．１０ｈ−１に増加した（図７）。個々のバッチ培養のＣＯ２生成プロファイルの比較は、反復バッチレジームがアラビノース単独またはグルコース／アラビノース混合物のいずれについても約１２０時間から約８０時間に発酵時間の減少をもたらしたことを示し、それぞれのバッチについて等しい初期植菌材料サイズが想定される（図８）。グルコース／アラビノース混合物中のバッチ培養について観察されたＣＯ２生成の単一ピークは、グルコースおよびアラビノースが連続的にではなく同時に消費されることを示す（図８および９）。
【０１４０】
［実施例１３］
［ヘキソキナーゼ活性］
株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１２、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のヘキソキナーゼ活性を、アラビノースを補給したＹＰ中で生育させた振とうフラスコ培養物の細胞抽出物において測定した。ヘキソキナーゼ反応混合物は、５０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＮＡＤＰ＋、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２Ｕのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１０ｍｍのＤ−グルコースおよび細胞抽出物からなるものであった。反応は１ｍＭのＡＴＰの添加により開始し、ＮＡＤＰＨの形成は３４０ｎｍにおける反応混合物の吸光度を計測することにより測定した。株ＤＳ６２５０４およびＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）の細胞抽出物におけるヘキソキナーゼ活性は、それぞれ１．２および１．３μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質であった（図１０）。ＩＭＫ３１２（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ）の細胞抽出物における０．４μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質のヘキソキナーゼ活性は、ＩＭＫ３０７のそれよりも低かった。株ＩＭＫ３１８およびＩＭＷ０１８（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ  ｇｌｋ１Δ）は、０．２μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質未満のヘキソキナーゼ活性を示した。三重のｈｘｋ２  ｈｘｋ１およびｇｌｋ１の欠失にかかわらずグルコースを消費し得る株ＩＭＷ０１７は、両方ともグルコースを消費し得ない株ＩＭＫ３１８およびＩＭＷ０１８と比較してより高いヘキソキナーゼ活性を有することが予期された。株ＩＭＷ０１７についてのヘキソキナーゼ活性は、アッセイ条件下で０．０２μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質未満でもあった。
【０１４１】
［実施例１４］
［ＩＭＷ０１７におけるヘキソキナーゼとしてのＧＡＬ１の同定］
グルコースおよびアラビノースの混合物上での進化させたｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ株ＩＭＷ０１７の生育実験に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期された。未知のヘキソキナーゼ活性がＧＡＬ１によりコードされるか調査するため、ＧＡＬ１遺伝子をＩＭＷ０１７において欠失させた。ｐＳＨ６５（実施例１参照）を使用してｇｌｋ１遺伝子座からＫａｎＭＸカセットを除去した後、ＧＡＬ１欠失を、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＤｉｓＡおよびＧＡＬ１−ＤｉｓＢ（表５）を使用するＰＣＲにより増幅させたＧ４１８耐性カセットの統合により達成した。形質転換細胞は、１００μｇ  ｍｌ−のＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）ならびに炭素源としての１．５％（ｗ／ｖ）のエタノールおよび１．５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含有するＹＰ寒天上で選択した。ＫａｎＭＸカセットの正確な統合は、診断オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＦＷ２／ＫａｎＡおよびＧＡＬ１−ＲＶ２／ＫａｎＢ（表４）の組合せを使用する単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した。得られた株ＩＭＷ０２３におけるＧＡＬ１の欠失は、単独の炭素源としてのガラクトース上での生育不能により確認した。
【０１４２】
興味深いことに、ＩＭＷ０２３は、グルコースを炭素源として使用し得ず、それは、ＧＡＬ１がその親ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ株ＩＭＷ０１７における未知のヘキソキナーゼ活性を担ったことを示す。グルコースおよびアラビノースの混合物中での振とうフラスコ培養の間、ＩＭＷ０２３はグルコースを消費しなかった一方、アラビノースは消費された（図１１）。
【０１４３】
【表５】
0005961886.tif 000007
【０１４４】
［実施例１５］
［グルコースの存在下でのアラビノースの嫌気的発酵について］
ＩＭＷ０１７におけるＧＡＬ１ｐもヘキソキナーゼ活性を示すことが見出されたため、ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ  ｇａｌ１Δ株ＩＭＷ０２３は、進化工学によりグルコースを消費させずにグルコースの存在下でのアラビノース消費を改善するためのより堅実なプラットフォームを提供する。培地中のグルコースの存在下での改善されたアラビノース消費を選択するため、株ＩＭＷ０２３を、振とうフラスコ培養物中で、２％のアラビノースおよび２％のグルコースを補給したＭＹ培地中での継代により培養した。生育はＯＤ６６０計測によりモニタリングし、比生育速度は培養物当たり２または３つのいずれかのＯＤ６６０計測から推定した。グルコースおよびアラビノース濃度は、ＨＰＬＣ分析により測定した。６３日間におけるアラビノース／グルコース混合物上での２４代の継代後、株ＩＭＷ０２３の植継ぎされた培養物は、依然としてグルコースを消費せずに２％のグルコースの存在下でアラビノース上で生育し得た（図１２）。アラビノース上での比生育速度は、約０．０６ｈ−１から約０．１１ｈ−１に増加した（図１３）。
【０１４５】
嫌気的条件下でグルコースの存在下でアラビノースを消費し得る細胞を選択するため、およびグルコースの存在下でアラビノース消費をさらに改善するため、２％のアラビノースおよび２％のグルコースを補給したＭＹ培地中での株ＩＭＷ０２３の連続的植継ぎを嫌気的連続バッチ発酵設定中で継続した。このため、株ＩＭＷ０２３の継代された培養物の最終振とうフラスコ培養物（ＳＦ２４）を植菌材料として使用した。培養の最初の１０００時間において、発酵槽のヘッドスペースに窒素に代えて空気を補給した場合にＣＯ２生成の増加が観察されるにすぎなかった（図１４）。第４のバッチの間の培養の約１０００時間後、排ガス中のＣＯ２濃度の増加が観察された。ＣＯ２生成プロファイルから推定すると、嫌気的生育のこの第１のバッチは、約０．０３ｈ−１の比生育速度を示した。さらなる１０代の植継ぎ後、比生育速度は約０．０６ｈ−１に増加した（図１４）。連続的に植継ぎされたバッチ培養の間、アラビノースは消費された一方、グルコースは消費されなかった（図１５）。個々のバッチ培養のＣＯ２生成プロファイルは、ＣＯ２生成の速度、ひいてはアラビノース消費速度が連続的植継ぎの間に増加し、それはアラビノースを完全に消費するために必要とされる発酵時間の減少をもたらしたことを示す（図１６）。
【０１４６】
最終バッチから採取された単一コロニー単離物は、株ＩＭＷ０５８と命名し、ＩＭＷ０２３と比較してグルコースの存在下でアラビノース消費速度の増加を示した。
【０１４７】
［実施例１６］
［ＩＭＷ０１８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
株ＩＭＷ０１８におけるＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１を、オリゴヌクレオチド組合せＨＸＫ２ＦＷ／ＨＸＫ２ＲＶ、ＨＸＫ１ＦＷ／ＨＸＫ１ＲＶおよびＧＬＫ１ＦＷ／ＧＬＫ１ＲＶを使用し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮＰＫ１１３−７ＤのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物の精製後（（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＩＭＷ０１８の一晩培養物をこのＰＣＲ生成物により形質転換した（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  ２００２）。形質転換細胞は、２％のグルコースを含有するＭＹ寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断プライマーペア（表６）を使用する単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した。
【０１４８】
得られた株ＩＭＷ０２４（ＨＸＫ２）、ＩＭＷ０２５（ＨＸＫ１）およびＩＭＷ０４７（ＧＬＫ１）を、振とうフラスコ中で３０℃において２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ−尿素培地（ｐＨ４．７）中で０．０５±０．０１の初期ＯＤ６６０で、グルコース上で生育させた予備培養物を使用して培養した。比較のため、株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７およびＩＭＫ３１１を同一条件下で培養した。生育および糖消費は、６９時間モニタリングした。株ＩＭＷ０２４、ＩＭＷ０２５およびＩＭＷ０４７は、全てグルコースおよびアラビノースの両方を利用し得た（図１７）。ＩＭＷ０１８におけるＧＬＫ１の再導入（ＩＭＷ０４７）は、迅速なグルコースおよびアラビノース消費をもたらした。アラビノースおよびグルコースは、培養の４３時間内に消費が完了し、それはＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）およびＩＭＫ３１１（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ）について観察されたものと類似する。ＩＭＷ０２４（ＨＸＫ２）およびＩＭＷ０２５（ＨＸＫ１）について観察されたアラビノース消費は、両方ともＩＭＫ３０７およびＩＭＫ３１１について観察されたものよりも緩慢であるが、いかなるＨＸＫ／ＧＬＫ欠失も有さない親株ＤＳ６２５０４について観察されたものよりも迅速であった（図１７（ａ））。アラビノースおよびグルコースの同時消費は、株ＩＭＷ０４７についてのみ観察された（図１８）。グルコースが２２時間において枯渇される前、アラビノースの約７％が消費された。２５時間において、グルコースが完全に消費されたとき、アラビノースの１９％が利用された。
【０１４９】
【表６】
0005961886.tif 000008
【０１５０】
［実施例１７］
［ＩＭＷ０５８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
株ＩＭＷ０５８におけるＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１を、オリゴヌクレオチド組合せＸＫ２ＦＷ／ＨＸＫ２ＲＶ、ＨＸＫ１ＦＷ／ＨＸＫ１ＲＶおよびＧＬＫ１ＦＷ／ＧＬＫ１ＲＶを使用し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＥＮＰＫ１１３−７ＤのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ生成物の精製後（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＩＭＷ０５８の一晩培養物をこのＰＣＲ生成物により形質転換した（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  ２００２）。形質転換細胞は、２％のグルコースを含有するＭＹ寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断オリゴヌクレオチド（表５）を使用する単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した。
【０１５１】
得られた株ＩＭＷ０５９（ＨＸＫ２）、ＩＭＷ０６０（ＨＸＫ１）およびＩＭＷ０６１（ＧＬＫ１）を、振とうフラスコ中で３０℃において２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ−尿素培地（ｐＨ４．７）中で０．０５±０．０１の初期ＯＤ６６０で、グルコース上で生育させた予備培養物を使用して培養した。生育および糖消費は、７２時間モニタリングした。株ＩＭＷ０５９、ＩＭＷ０６０およびＩＭＷ０６１は、全てグルコースおよびアラビノースの両方を利用し得た（図１７）。ＩＭＷ０５８におけるＨＸＫ２の再導入は、アラビノースおよびグルコースの迅速な連続的消費をもたらした。参照株ＤＳ６２５０４は６９時間内にアラビノースを完全に消費しなかった一方（図１７（ａ））、株ＩＭＷ０５９はアラビノースの９９％超を約４６時間内に消費した（図１７（ｊ））。
【０１５２】
株ＩＭＷ０６０（ＨＸＫ１）およびＩＭＷ０６１（ＧＬＫ１）について、グルコースおよびアラビノースの同時消費が観察された（図１７（ｋ）および（ｌ））。培養の最初の２２時間において、アラビノースの約１８％がグルコースの約４８％と一緒に同時消費された。培養の５０時間内に、アラビノースの９９％が消費された。
【０１５３】
［実施例１８］
［株ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８の比較全ゲノムシーケンシング］
株ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８についての全ゲノムＤＮＡシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘ技術（７５ｂｐのリード、ペアエンド）を使用して実施した。シーケンスリードは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン４．５を使用してＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの参照ゲノム配列にアラインした。ＳＮＰ分析は、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン４．５を使用して実施した。
【０１５４】
全体で、ＳＮＰ分析は、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの参照配列と比較した場合にアミノ酸変化をもたらすコード領域中の４つの突然変異を生じた。
【０１５５】
ガラクトキナーゼをコードするＧＡＬ１中のＡｓｐ３７６Ｖａｌアミノ酸変化をもたらす１つの突然変異。この突然変異は、参照配列と比較した場合にＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８に見出された（図１９）。
【０１５６】
驚くべきことに、ＩＭＷ０１７について２つの特有の突然変異のみが見出された。それらの一方は、ＧＡＬ１中のＴｙｒ２７４Ｐｈｅ突然変異であり、Ｔｈｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）により記載されたガラクトキナーゼのガラクトース結合部位中に局在する。ＩＭＷ０１７におけるＧＡＬ１の欠失がグルコース上での生育を排除する観察と組み合わせると、この突然変異はＩＭＷ０１７におけるグルコース消費を可能とするＧＡＬ１のヘキソキナーゼ活性を担った可能性が高いと考えられる。第２の突然変異は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるガラクトースパーミアーゼをコードするＧＡＬ２の膜貫通モチーフ５に見出された（Ｔｈｒ２１９Ａｓｎ）。ＧＡＬ２ｐは、アラビノースを輸送し得ることが公知である（Ｋｏｕ  ｅｔ．ａｌ  １９７０；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。アラビノースについての親和性を増加させ、またはグルコースについての親和性を減少させるＧＡＬ２における突然変異は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の改善をもたらす。
【０１５７】
驚くべきことに、１つの特有の突然変異のみがＩＭＷ０１８のコード領域に見出された。この突然変異は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるガラクトースパーミアーゼをコードするＧＡＬ２の膜貫通モチーフ８中に局在した（Ａｓｎ３７６Ｓｅｒ）。ＧＡＬ２ｐは、アラビノースを輸送し得ることが公知である（Ｋｏｕ  ｅｔ．  ａｌ  １９７０；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。アラビノースについての親和性を増加させ、またはグルコースについての親和性を減少させるＧＡＬ２における突然変異は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の改善をもたらす。
【０１５８】
［実施例１９］
［ＩＭＷ０５９によるグルコースおよびアラビノースの迅速な嫌気的発酵］
株ＩＭＷ０５９を、２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを有するＭＹ培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、ＨＰＬＣ計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびＯＤ６６０のモニタリングにより測定した。ＣＯ２生成は、排ガス中のＣＯ２濃度の計測により測定した。エタノール生成は、ＣＯ２生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、ＣＯ２の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたＣＯ２生成（１グラムのバイオマス当たり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２）および酢酸形成に伴うＣＯ２を差し引いたものに等しいと想定した。
【０１５９】
１９時間内に、グルコースは枯渇した。ＣＯ２生成プロファイルおよびアラビノース濃度（図２１）に基づくと、アラビノース消費はグルコースが完全に消費された後に開始した。グルコースおよびアラビノースの同時消費は観察されなかった。嫌気的培養の７４時間後、アラビノースの９９％が消費された。エタノールは、全糖１グラム当たり０．４３ｇの全体収率で生成された。このＣＯ２生成プロファイルとＤＳ６２５０４株のそれとの比較（図２４）は、グルコース／アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第１のＣＯ２生成ピークに基づき、グルコース消費が株ＩＭＷ０５９について緩慢であることを示す。しかしながら、アラビノースは、ＩＭＷ０５９によりかなり迅速に消費され、それは第２のＣＯ２生成ピークの間のより高いＣＯ２生成レベルおよびより短い合計発酵時間により反映される。
【０１６０】
［実施例２０］
［ＩＭＷ０６０によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費］
株ＩＭＷ０６０を、２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを有するＭＹ培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、ＨＰＬＣ計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびＯＤ６６０のモニタリングにより測定した。ＣＯ２生成は、排ガス中のＣＯ２濃度の計測により測定した。エタノール生成は、ＣＯ２生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、ＣＯ２の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたＣＯ２生成（１グラムのバイオマス当たり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２）および酢酸形成に伴うＣＯ２を差し引いたものに等しいと想定した。
【０１６１】
ＣＯ２生成プロファイルならびにグルコースおよびアラビノース濃度（図２２）に基づくと、アラビノースは最初の約４０時間内にグルコースと同時に消費された。最初の４３時間内に、グルコースは完全に消費される一方、アラビノースの４１％が消費された。嫌気的培養の７４時間後、アラビノースの８９％が消費された。嫌気的培養の１４０時間後、アラビノースの９８％が消費された。エタノールは、全糖１グラム当たり０．４３ｇの全体収率で生成された。このＣＯ２生成プロファイルとＤＳ６２５０４株のそれとの比較（図２４）は、グルコース／アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第１のＣＯ２生成ピークに基づき、グルコース消費が株ＩＭＷ０６０について緩慢であることを示す。しかしながら、グルコース／アラビノース混合物を発酵させるための合計時間は、ＤＳ６２５０４のそれよりも短い。
【０１６２】
［実施例２１］
［ＩＭＷ０６１によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費］
株ＩＭＷ０６１を、２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを有するＭＹ培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、ＨＰＬＣ計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびＯＤ６６０のモニタリングにより測定した。ＣＯ２生成は、排ガス中のＣＯ２濃度の計測により測定した。エタノール生成は、ＣＯ２生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、ＣＯ２の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたＣＯ２生成（１グラムのバイオマス当たり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２）および酢酸形成に伴うＣＯ２を差し引いたものに等しいと想定した。
【０１６３】
ＣＯ２生成プロファイルならびにグルコースおよびアラビノース濃度（図２３）に基づくと、アラビノースは最初の４３時間内にグルコースと同時に消費された。最初の４９時間内に、グルコースは完全に消費される一方、アラビノースの７３％が消費された。嫌気的培養の７４時間後、アラビノースの９５％が消費された。嫌気的培養の１４０時間後、アラビノースの９９％が消費された。エタノールは、全糖１グラム当たり０．４４ｇの全体収率で生成された。このＣＯ２生成プロファイルとＤＳ６２５０４株のそれとの比較（図２４）は、グルコース／アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第１のＣＯ２生成ピークに基づき、グルコース消費が株ＩＭＷ０６１について緩慢であることを示す。しかしながら、グルコース／アラビノース混合物を発酵させるための合計時間は、ＤＳ６２５０４のそれよりも短い。
【０１６４】
［実施例２２］
［ＢＡＭにおける性能試験］
株ＩＭＷ０６０およびＩＭＷ０６１の性能を試験するため、株を、２％のグルコースを補給したＶｅｒｄｕｙｎ培地において植菌した。対照として、株ＤＳ６２５０４を含めた。
【０１６５】
ロータリーシェーカー中で３０℃および２８０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集し、ＣＯ２生成のための培養をＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）中で３３℃において、表７に示される糖を補給した１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地中で実施した。細胞を、糖ならびに阻害剤の酢酸、クマル酸、フェルラ酸、フルフラール、ＨＭＦおよびギ酸を示された濃度において補給した１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地に添加した。第２の実験において、糖を補給したが阻害剤を使用しない１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地を使用した。ＣＯ２生成は常にモニタリングし、試料は分析（６００ｎｍにおける光学密度、エタノール、および残留糖）のために周期的に採取した。
【０１６６】
ＢＡＭ実験の結果を、阻害剤を有する培地については図２５、２６、および２７に示し、阻害剤を有さない培地については図２８、２９および３０に示す。ＩＭＷ０６０およびＩＭＷ０６１は両方とも、糖グルコースおよびアラビノースを迅速に同時にエタノールに変換し得る一方、株ＤＳ６２５０４は変換し得ず、すなわちＤＳ６２５０４は、グルコースが培地から排出された後にアラビノースを消費すると結論づけることができる。同一の結果、すなわちアラビノースおよびグルコースの同時消費は、阻害剤の存在下で得られるが、文献から公知のとおり全ての糖を消費させるためにかかる時間が阻害剤の存在下においてより緩慢である。
【０１６７】
【表７】
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【０１６８】
［１］    Ａ．Ａ．  Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｓｔｉｅｒ，  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｉ．  Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４１  （１９５３）  ２３−３６．
［２］    Ａ．Ａ．  Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｓｔｉｅｒ，  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  ＩＩ．  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４３  （１９５４）  ２７１−２８１．
［３］    Ｒ．Ｄ．  Ｇｉｅｔｚ，  Ｒ．Ａ．  Ｗｏｏｄｓ，  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３５０  （２００２）  ８７−９６．
［４］    Ｕ．  Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，  Ｓ．  Ｈｅｃｋ，  Ｔ．  Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｅｉｎｈａｕｅｒ，  Ｊ．Ｈ．  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ａ  ｎｅｗ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４  （１９９６）  ２５１９−２５２４．
［５］    Ｕ．  Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，  Ｊ．  Ｈｅｉｎｉｓｃｈ，  Ｇ．Ｊ．  Ｋｏｅｈｌｅｒ，  Ｄ．  Ｖｏｓｓ，  Ｊ．Ｈ．  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｌｏｘＰ  ｍａｒｋｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（６）  （２００２）  ｅ２３．
［６］    Ｈ．  Ｖａｎ  Ｕｒｋ，  Ｐ．Ｒ．  Ｍａｋ，  Ｗ．Ａ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，  Ｊ．Ｐ．  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＢＳ  ８０６６  ａｎｄ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ  ＣＢＳ  ６２１  ｕｐｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｅｘｃｅｓｓ，  Ｙｅａｓｔ  ４  （１９８８）  ２８３−２９１．
［７］    Ｃ．  Ｖｅｒｄｕｙｎ，  Ｅ．  Ｐｏｓｔｍａ，  Ｗ．Ａ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，  Ｊ．Ｐ．  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ：  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｙｅａｓｔ  ８  （１９９２）  ５０１−５１７．
［８］    Ｒ．Ａ．  Ｗｅｕｓｔｈｕｉｓ，  Ｗ．  Ｖｉｓｓｅｒ，  Ｊ．Ｔ．  Ｐｒｏｎｋ，  Ｗ．Ａ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，  Ｊ．Ｐ．  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｕｇａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ  −  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｌｕｙｖｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０  （１９９４）  ７０３−７１５．
［９］    Ｓ．Ｃ．  Ｋｏｕ，    ｅｔ  ａｌ．  （１９７０）．  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １０２，  ６７１−６７８．
［１０］    Ｊ．  Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６９，  ４１４４−４１５０．
［１１］    Ｊ．Ｂ．  Ｔｈｏｄｅｎｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ３６９０５−３６９１１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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