(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）レーザー式光散乱法による測定方法において、平均粒子径が３０μｍ〜４０μｍであり、
（ｂ）コールターカウンター法による測定方法において、粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから９０％の粒子径（Ｄ９０）と１０％の粒子径（Ｄ１０）の比（Ｄ９０／Ｄ１０）が１．５０以下であり、
（ｃ）水銀圧入法による測定方法において、平均細孔径が８５ｎｍ〜１１５ｎｍの範囲であり、細孔容積が１．５ｍＬ／ｇ以上である、
ことを特徴とするシリカ球状体。
【請求項２】
前記粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから９０％の粒子径（Ｄ９０）と１０％の粒子径（Ｄ１０）の比（Ｄ９０／Ｄ１０）が１．３５以下である、請求項１に記載のシリカ球状体。
【請求項３】
前記平均粒子径が３３μｍ〜３７μｍである、請求項１または２に記載のシリカ球状体。
【請求項４】
比表面積として、５５ｍ２／ｇ〜７５ｍ２／ｇを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシリカ球状体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のシリカ球状体を含み、前記シリカ球状体にリガンドが固定された、アフィニティ担体。
【請求項６】
リガンドがプロテインＡであり、該プロテインＡの固定量が、１０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である、請求項５に記載のアフィニティ担体。
【請求項７】
動的結合容量として、５０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上を有する、請求項５に記載のアフィニティ担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ球状体及びアフィニティ担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定のタンパク質を高精度に精製又は除去することが、医薬分野及び医療分野において重要視されている。例えば、特定の機能を有する薬品を精製する場合には、特定のタンパク質を高精度に精製することが必要とされる。
【０００３】
アフィニティクロマトグラフィでは、リガンドとして特異的な結合性を有するプロテインＡが広く利用されている。プロテインＡは、グラム陽性球菌である真正細菌のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するタンパク質であり、様々な動物由来のＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合する性質を有し、ＩｇＧ精製に広く利用されている。プロテインＡを不溶性担体に固定化させ、この不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィによりＩｇＧを特異的に分離精製する手法が広く知られている。
【０００４】
アフィニティクロマトグラフィに用いられるアフィニティ担体においては、一般に、リンカーと称される構造を不溶性担体とリガンドの間に介在させ、リンカーの一端を担体に結合させ、且つリンカーの他端をリガンドに結合させることにより、リガンドを不溶性担体に固定化している（特許文献１）。
【０００５】
特許文献２には、６３０Åより大きく１０００Åより小さい細孔径および５５μｍより大きく７０μｍより小さい平均粒径を有するシリカ粒子を含む、アフィニティクロマトグラフィの実施に適した固相担体によって、改善された動的容量、より短い滞留時間での大きい流量を有するクロマトグラフィを提供することが提案されている。しかしながら、特許文献２では、シリカ粒子の充填量を多くするために平均シリカ粒径を小さくすると圧力損失が上昇するという問題があり、圧力損失が高いと線流速の上限が制限されることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本特開２０１１−１３３６号公報
【特許文献２】日本特開２００９−３１２７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、流通させる溶液の線流速が速い場合であっても圧力損失が小さく、結合容量の大きいアフィニティ担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一側面としては、（ａ）レーザー式光散乱法による測定方法において、平均粒子径が３０μｍ〜４０μｍであり、（ｂ）コールターカウンター法による測定方法において、粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから９０％の粒子径（Ｄ９０）と１０％の粒子径（Ｄ１０）の比（Ｄ９０／Ｄ１０）が１．５０以下であり、（ｃ）水銀圧入法による測定方法において、平均細孔径が８５ｎｍ〜１１５ｎｍの範囲であり、細孔容積が１．５ｍＬ／ｇ以上であることを特徴とするシリカ球状体である。
【０００９】
本発明の他の側面としては、上記シリカ球状体を含み、前記シリカ球状体にリガンドが固定された、アフィニティ担体である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、流通させる溶液の線流速が速い場合であっても圧力損失が小さく、結合容量の大きいアフィニティ担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は本発明の一実施形態による乳化装置の概略断面図である。
【図２】図２は実施例及び比較例によるカラムの線流速と圧力損失の関係を表すグラフである。
【図３】図３は実施例及び比較例によるカラムの滞留時間と動的結合容量の関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係る実施形態について説明するが、本実施形態における例示が本発明を限定することはない。
【００１３】
本発明の一実施形態によるシリカ球状体は、（ａ）レーザー式光散乱法による測定方法において、平均粒子径が３０μｍ〜４０μｍであり、（ｂ）コールターカウンター法による測定方法において、粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから９０％の粒子径（Ｄ９０）と１０％の粒子径（Ｄ１０）の比（Ｄ９０／Ｄ１０）が１．５０以下であり、（ｃ）水銀圧入法による測定方法において、平均細孔径が８５ｎｍ〜１１５ｎｍの範囲であり、細孔容積が１．５ｍＬ／ｇ以上であることを特徴とする。このようなシリカ球状体によれば、流通させる溶液の線流速が速い場合であっても圧力損失が小さく、結合容量の大きいアフィニティ担体を提供することができる。
【００１４】
同じ体積のカラムであれば、平均粒子径がより小さいシリカ球状体を用いた方がシリカ球状体あたりの有効容積が増えるため、担体あたりの抗体分子（タンパク質など）の結合能力である結合容量が多くなると考えられるが、一方で圧力損失が高くなるという問題もある。本発明によれば特定の小さな平均粒子径を有するとともに、上記（Ｄ９０／Ｄ１０）の比率が小さいシリカ球状体、すなわち粒子径分布がシャープなシリカ球状体を用いることで、低圧力損失で高容量のアフィニティ担体を提供することができる。
【００１５】
一方、アフィニティ担体の基材として、アガロースやポリメタクリレート等の樹脂系充填剤を用いると、その柔軟性から、圧力損失が高くなりやすく、特に高線流速で圧力損失が高くなりやすい。また、アフィニティ担体の基材として、破砕状のガラスやセラミックを用いると、その形状ゆえに、圧力損失が高くなりやすい。
【００１６】
さらに、本実施形態によるシリカ球状体によれば、平均粒子径及び（Ｄ９０／Ｄ１０）の比率が小さく、平均細孔径が適切な範囲であり、細孔容積が大きいため、結合容量が大きいアフィニティ担体を提供することができる。一般に、結合容量は線流速が高くなるほど低下すると考えられるが、本実施形態によるシリカ球状体によれば、高線流速においても大きい結合容量を得ることができる。すなわち、本実施形態によるシリカ球状体は動的結合容量に優れる。さらに、本実施形態によるシリカ球状体は高線流速においても圧力損失が低いため、より動的結合容量を大きくすることができる。
【００１７】
ここで、結合容量には、静的結合容量（Ｓｔａｔｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＳＢＣ）と動的結合容量（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）がある。静的結合容量は、担体が抗体分子を吸着できる上限の量を表し、動的結合容量は、カラムに抗体分子を含む溶液を流している状態で、抗体分子を回収できる程度を表す。動的結合容量が大きい担体では、高線流速においても抗体分子を効率よく吸着でき、短時間で抗体分子を精製することができる。
【００１８】
好ましくは、本実施形態によるシリカ球状体によれば、滞留時間１分の高流速域下（２０ｃｍカラムで１２００ｃｍ／ｈｒに相当）において、抗体分子の動的結合容量が５０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上、より好ましくは６０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上であり、かつ、圧力損失が５ｂａｒ以下、より好ましくは３ｂａｒ以下であるアフィニティ担体を提供することができる。
【００１９】
シリカ球状体の形状としては、球状であれば特に限定されず、真球体及び楕円体を含めた球状とすることができ、カラムへの充填性、使用時の圧力損失の抑制の観点から、真球体に近い形状であることが好ましい。
【００２０】
シリカ球状体の平均粒子径としては、３０μｍ〜４０μｍであり、好ましくは３２μｍ〜３８μｍであり、さらに好ましくは３３μｍ〜３７μｍである。平均粒子径が３０μｍ以上であることで、結合容量を大きく保ちながら圧力損失の上昇を防ぐことができる。また、平均粒子径が４０μｍ以下であることで、各粒子あたりの有効容積を増やして結合容量を大きくすることができる。ここで、シリカ球状体の平均粒子径はレーザー式光散乱法による測定方法での体積換算の平均粒子径である。具体的には、シリカ球状体の平均粒子径としては、堀場製作所社製「ＬＡ−９５０Ｖ２」等を用いて測定することができ
る。
【００２１】
粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから９０％の粒子径（Ｄ９０）と、粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから１０％の粒子径（Ｄ１０）と、の比（Ｄ９０／Ｄ１０）（以下、「均等係数」と称することがある。）としては、コールターカウンター法において、１．５０以下であり、好ましくは１．４０以下であり、さらに好ましくは１．３５以下である。均等係数が１．５０以下であることで、平均粒子径が小さなシリカ球状体であっても圧力損失の増大を防ぐことができる。また、均等係数は、１に近いほど粒子径分布が均等であり好ましい。
【００２２】
ここで、シリカ球状体の均等係数はコールターカウンター法による測定方法によって測定される。Ｄ１０は、コールターカウンター法による粒子径分布において、粒子径の体積を粒子径の小さな側から積算していった場合に合計体積の１０％となるときの粒子径であり、Ｄ９０は同様に積算体積が９０％となる粒子径である。均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）はこれらの粒子径の比であることから、シリカ球状体をベックマン・コールター社製「Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ」等にて測定して得られたＤ１０及びＤ９０から求めることができる。
【００２３】
シリカ球状体の平均細孔径としては、水銀圧入法において、８５ｎｍ〜１１５ｎｍであり、好ましくは９０ｎｍ〜１１０ｎｍであり、より好ましくは９５ｎｍ〜１０５ｎｍである。平均細孔径が８５ｎｍ以上であることで、抗体分子を吸着する能力が向上し大容量の担体を提供することができる。また、平均細孔径が１１５ｎｍ以下であることで、抗体分子の吸着量を大きく保ちながらシリカ球状体の強度の低下を防ぐことができる。
【００２４】
シリカ球状体の細孔容積としては、水銀圧入法において、１．５ｍＬ／ｇ以上であり、好ましくは１．５５ｍＬ／ｇ以上であり、より好ましくは１．６ｍＬ／ｇ以上である。細孔容積が１．５ｍＬ／ｇ以上であることで、抗体分子を吸着する能力が向上し大容量の担体を提供することができる。また、細孔容積は、シリカ球状体の強度の観点から、１．８ｍＬ／ｇ以下であることが好ましい。
【００２５】
シリカ球状体の比表面積としては、水銀圧入法において、好ましくは５５ｍ２／ｇ〜７５ｍ２／ｇであり、より好ましくは６０ｍ２／ｇ〜７５ｍ２／ｇである。比表面積としては、上記した平均細孔径及び細孔容積とともに目的に合わせて適正化することができる。比表面積が大きいことで抗体分子を吸着する能力が向上するため好ましいが、大きくなるとシリカ球状体の強度が低下するため、上記範囲内で設定するとよい。
【００２６】
これらの水銀圧入法による細孔物性は、島津製作所社製「水銀ポロシメーター  オートポアＩＶ９５１０」等を用いて測定することができる。
【００２７】
上記したシリカ球状体としては、アフィニティ担体として用いることができる。アフィニティ担体としては、上記したシリカ球状体を基材として含み、このシリカ球状体にリガンドが固定されえたものを用いることができる。リガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、コンカナバリンＡ、抗原、抗体等を用いることができる。
【００２８】
リガンドとしてプロテインＡを用いる場合、アフィニティ担体は、上記したシリカ球状体を基材として用いることで、プロテインＡの固定化量が１０．０ｇ／Ｌ−ｂｅｄ以上とすることができ、より好ましくは１１．０ｇ／Ｌ−ｂｅｄ以上であり、さらに好ましくは１１．５ｇ／Ｌ−ｂｅｄ以上である。
【００２９】
ここで、プロテインＡの固定化量の測定方法としては、プロテインＡを固定化した担体を乾燥して、この担体を元素分析して求めることができる。
【００３０】
このようなアフィニティ担体によれば、滞留時間１分の高線流速域下（２０ｃｍカラムで１２００ｃｍ／ｈｒに相当）における抗体分子の動的結合容量を５０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上、さらには６０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上とすることができ、また、圧力損失を５ｂａｒ以下、さらには３ｂａｒ以下とすることができる。また、このようなアフィニティ担体の静的結合容量としては、８０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上、さらには８５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上とすることができる。
【００３１】
圧力損失の測定方法としては、アフィニティ担体をカラムに充填し、このカラムをクロマトグラフィ装置に装填して、種々の線流速で蒸留水を通液し、運転圧力を求める。次いで、空のカラムをクロマトグラフィ装置に装填して、同様に種々の線流速で蒸留水を通液し、求めた運転圧力を先のアフィニティ担体を充填したカラムの運転圧力から差し引くことで圧力損失を測定することができる。
【００３２】
動的結合容量としては、アフィニティ担体をカラムに充填し、このカラムをクロマトグラフィ装置に装填して、カラムに抗体分子を含むサンプル溶液を所定の線流速で通液し、溶出液の吸光度を測定し、添加したサンプル溶液の吸光度の所定の割合（例えば１０％）のブレイクスルーが測定された時点の添加抗体分子の質量から求めることができる。吸光度は、島津製作所社製「ＵＶ−１８００」等を用いて測定することができる。
【００３３】
また、静的結合容量としては、アフィニティ担体に所定の濃度の抗体分子を含む溶液を加え、適宜混合及び攪拌した後に、遠心分離して、上澄み液の抗体分子の量を吸光度測定によって低量化し、ラングミュアプロット法を用いて求めることができる。吸光度は、島津製作所社製「ＵＶ−１８００」等を用いて測定することができる。
【００３４】
次に、シリカ球状体及びアフィニティ担体の製造方法について説明する。以下、一例として、上記した物性のシリカ球状体を作製し、このシリカ球状体にプロテインＡを固定する方法を説明する。
【００３５】
上記した物性のシリカ球状体の製造方法としては、特に限定されないが、一例として、シリカ前駆体を含む分散相と連続相とを乳化し、得られたエマルションをゲル化してシリカ球状体を得ることができる。必要であれば、シリカ球状体の平均細孔径及び細孔容積を大きくするための処理を適宜行ってもよい。
【００３６】
乳化工程としては、シリカ前駆体を含む分散相を連続相に微小孔部または多孔質膜を介して供給し、エマルションを作製する方法が好ましい。これによって、均一な液滴径のエマルションを作製して、結果として均等係数が１．５以下の均一な粒子径のシリカ球状体を得ることができる。このような乳化工程としては、一例としてマイクロミキサー法や膜乳化法を用いることができる。
【００３７】
以下、シリカ前駆体を含む分散相としてシリカ前駆体を含む水性液体を用い、連続相として有機液体を用いて、Ｗ／Ｏ型エマルションを作製する例について説明する。なお、シリカ前駆体を含む分散相を有機液体とし、連続相を水性液体とし、Ｏ／Ｗ型エマルションを作製することも可能である。
【００３８】
シリカ前駆体を含む水性液体としては、固形化によって沈殿物を形成することができるものであれば、いずれも適用可能である。具体的には、水溶性シリカが溶解した水溶液、有機ケイ素化合物を加水分解して得られたシリカゾル及び市販のシリカゾルなどの固体シリカが分散した水性分散液が挙げられる。特に、アルカリ金属ケイ酸塩の水溶液が好ましく使用される。アルカリ金属としてはリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウムなどが挙げられ、中でも入手の容易さ、経済的理由によりナトリウムが最も好ましい。ナトリウムとケイ酸の割合は、ＳｉＯ２／Ｎａ２Ｏ（モル比）で２．０〜３．８が好ましく、さらには２．０〜３．５が好ましい。また、アルカリ金属ケイ酸塩水溶液の濃度は、ＳｉＯ２濃度として５〜３０質量％が好ましく、さらには５〜２５質量％が好ましい。
【００３９】
有機液体としては、特に限定されず、水性液体に不溶性のものを使用することができ、例えば、以下に挙げるもののうち１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００４０】
ｎ−ヘキサン、イソヘキサン、ｎ−ヘプタン、イソヘプタン、ｎ−オクテン、イソオクテン、ノナン、デカン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセン等の脂環式炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、スチレン等の芳香族炭化水素類、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル、酢酸−ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸−ｎ−プチル、酢酸イソプチル、酢酸−ｎ−アミル、酢酸イソアミル、乳酸ブチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸ブチル等のエステル類等である。
【００４１】
有機液体としては、炭素数９〜１２の飽和炭化水素が好ましく、操作性、火気への安全性、固形化した粒子と有機液体との分離性、シリカ球状体の形状特性、水への有機液体の溶解性などを総合的に考慮して選定される。炭素数が９〜１２の飽和炭化水素は、単独で使用してもよいし、このうちの二種以上を混合して使用してもよい。また、炭素数が９〜１２の飽和炭化水素は、その化学的安定性が良好であれば、直鎖状炭化水素であってもよいし、側鎖を有する炭化水素であってもよい。
【００４２】
炭素数９〜１２の飽和炭化水素の引火点としては、２０〜８０℃のものが好ましく、より好ましくは３０〜６０℃のものが好ましい。引火点が２０℃未満の飽和炭化水素を有機液体とした場合、引火点が低すぎるため、防火上、作業環境上の対策が必要である。また、引火点が８０℃を超えるものは、揮発性が小さいことから、得られるシリカ球状体に付着する炭化水素の量が多くなるおそれがある。
【００４３】
本実施形態では、エマルションを固形化した後のシリカ球状体と有機液体とは通常固液分離される。分離後のシリカ球状体に付着又は吸着している有機液体は、濾過操作、洗浄操作、乾燥操作などにより分離するのが好ましい。
【００４４】
本実施形態では、Ｗ／Ｏ型エマルションの形成にあたり、界面活性剤を使用するのが好ましい。界面活性剤としては、例えば、以下に挙げるもののうち１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００４５】
ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル系、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル等のポリオキシエチレン高級アルコールエーテル系、
ポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレート等のポリオキシエチレン脂肪族エステル系、
ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル系等を挙げることができる。
さらに、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル系、ショ糖脂肪酸エステル系、ポリグリセリン脂肪酸エステル系ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系等を用いてもよい。
【００４６】
界面活性剤の使用量は、界面活性剤の種類、界面活性剤の親水性あるいは疎水性の程度を表す指標であるＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）、目的とするシリカ球状体の粒子径などの条件により異なるが、上記有機液体中に５００〜２００００ｐｐｍ、好ましくは１０００〜１００００ｐｐｍ含有させるのが好ましい。５００ｐｐｍ未満であると、エマルションが不安定になるおそれがある。また、２００００ｐｐｍを超えると、製品であるシリカ球状体に付着する界面活性剤の量が多くなり好ましくない。
【００４７】
シリカ前駆体を含む水性液体と有機液体との室温（２０〜２３℃）における体積比は、得られるエマルション中のＷ／Ｏ比として１〜１００程度とすることが望ましい。
【００４８】
乳化工程の一実施形態としては、シリカ前駆体を含む水性液体を、層流で流れる有機液体に、微小孔部を通して押し出すことにより、有機液体が連続相となり、この中にシリカ前駆体を含む水性液体の液滴が分散相となったエマルション、すなわちＷ／Ｏ型エマルションを形成することができる（例えば特許第４１９３６２６号公報記載の方法を用いることができる）。
【００４９】
本実施形態では、有機液体の流速を０．００１〜５ｍ／ｓとすることにより、液滴径分布の狭いエマルション液滴が形成され、得られるシリカ球状体の液滴径分布も狭くできる。有機液体の流速が０．１〜４ｍ／ｓである場合はさらに好ましい。
【００５０】
流路中を流れる有機液体のレイノルズ数は２１００以下とすることが好ましい。ここで、流路の断面が円形である場合のレイノルズ数は式２で計算され、流路の内径Ｄは流路の断面における最小径を使用する。ここで、Ｄ（流路の内径：ｍ）、ｕ（平均流速：ｍ／ｓ）、ρ（流体密度：ｋｇ／ｍ３）、μ（流体粘度：Ｐａ・ｓ）である。
【００５１】
レイノルズ数（−）＝Ｄ・ｕ・ρ／μ  ・・・式２
【００５２】
また、流路の断面が円形でない場合のレイノルズ数は式３で計算される。ここで、ｒは流路動水半径（ｍ）＝流路の断面積（ｍ２）／流路断面の流体に接する周長（ｍ）であり、ｕ、ρ、μは式２と同様である。
【００５３】
レイノルズ数（−）＝４×ｒ・ｕ・ρ／μ  ・・・式３
【００５４】
レイノルズ数が２１００以下の場合、有機液体の流れは層流状態であるため、有機液体の流れは安定したものとなる。その結果、微小孔部を通して供給されるシリカ前駆体を含む水性液体が、常に一定の液滴径を有するＷ／Ｏ型エマルションとなるため、実質的に液滴径が均一なシリカ球状体が製造されやすい。逆に、レイノルズ数が２１００を超える場合、有機液体の流れが乱流となるため、従来と同様に液滴径が不揃いなＷ／Ｏ型エマルションとなり、その結果、シリカ球状体の粒子径も不揃いになることがある。なお、この有機液体の流路の形状については、特に限定されない。
【００５５】
図１は、乳化工程を行うための乳化装置の一例を示す概略断面図である。図１において、１及び２はアクリル樹脂製部品、３はエッチング処理にて流路３ａを形成したステンレス鋼板、４は複数の微小孔部４ａが形成された表面を疎水化処理してあるステンレス鋼板である。そして、有機液体が連続相供給部５から供給され連続層排出部６から排出されるように流路３ａを層流状態で流れ、シリカ前駆体を含む水性液体が分散相供給部７から供給され微小孔部４ａを介して有機液体中に圧入される。ステンレス鋼板３の流路３ａは、複数本の流路３ａが液体の流れ方向に沿って形成されていてもよい。
【００５６】
図１に示す例では、有機液体の流路を隔壁で区画して形成し、隔壁の厚さ方向に貫通した微小孔部を通して水性液体を圧入する。これにより、水性液体と有機液体とが直交流で混合するため、有機液体の流れによりエマルション液滴が切り離される効果が得られやすくなるため、粒子径の小さいシリカ球状体が安定して得られやすくなる。
【００５７】
また、微小孔部は１流路あたりに複数設けた方が好ましい。この場合、微小孔部は、有機液体の流路上に、微小孔部の断面形状に外接する円の直径の１／２以上の間隔を設けて複数個設置するのが好ましい。さらに好ましくは微小孔部の断面形状に外接する円の直径以上の間隔を設ける。外接する円の直径の１／２より短い間隔しか設けずに微小孔部を設置すると、エマルションの液滴が合一し、その結果、液滴径が不均一になる可能性があるため好ましくない。ただし、合一しない範囲でなるべく密接して設置したほうが、生産性を向上できるので好ましい。
【００５８】
本実施形態において、微小孔部が設けられる隔壁の材料としては、シリカ前駆体を含む水性液体及び有機液体に対する耐性を有するものを使用することが好ましい。金属を主体とするものであると加工性及び強度に優れるため好ましいが、その他、樹脂を主体とするものも好適に用いられる。樹脂としては、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、芳香族ポリエステル及びフッ素樹脂からなる１種以上を用いると加工性、寸法安定性に優れるため好ましい。
【００５９】
また、微小孔部が設けられる隔壁の材料としては、親連続相（この場合、親有機液体）性であることが好ましい。したがって、金属材質の場合は、油を焼き付ける、あるいは疎水化処理剤との反応、疎水性ポリマーでのコートなどの方法で親有機液体性をもたせる処理を施すことが望ましい。これは、シリカ前駆体を含む水性液体が微小孔部を通過した後の隔壁からの液離れを促すためであり、隔壁が親水性の場合、微小孔部を通過後、隔壁に沿って水性液体が流れてしまい、大きなエマルションを生成しやすいことが、高速度カメラでの観察により明らかになっている。
【００６０】
乳化工程の他の実施形態として、上記した微小孔部に代えて、多孔質膜を用いてもよい。シリカ前駆体を含む水性液体を多孔質膜を介して有機液体に供給することで、微小孔部と同様に、均一な液滴径のエマルションを作製することができる。多孔質膜は、表面が疎分散相（この場合、疎水性）としてあることが好ましい。これによって、シリカ前駆体を含む水性液体が均一な液滴となって有機液体中に分散される。
【００６１】
多孔質膜の一例としては、多孔質ガラス、高分子材料のフィルター、金属焼結フィルター等が挙げられる。
【００６２】
エマルションにゲル化剤を添加しシリカ球状体を得る工程としては、エマルションの分散相１滴からシリカ球状体１粒を製造する方法がある。
【００６３】
エマルションをゲル化することにより、球状である水溶液の分散液滴は、この球状を保持したままゲル化され、球状のシリカヒドロゲルが得られる。ゲル化には、エマルション中にゲル化剤を導入するのが好ましい。ゲル化剤としては、無機酸や有機酸などの酸が用いられ、特に無機酸である硫酸、塩酸、硝酸、炭酸などが好ましい。操作の容易性などの点で、最も簡便で好ましいのは、炭酸ガスを用いる方法である。炭酸ガスは、１００％濃度の純炭酸ガスを導入してもよいし、空気や不活性ガスで希釈した炭酸ガスを導入してもよい。ゲル化に要する時間は、通常４〜３０分が好ましく、ゲル化時の温度は５〜３０℃が好ましい。
【００６４】
ゲル化終了後は、反応系を静置して、有機液体の相とシリカヒドロゲルを含む水性相に２相分離させてシリカゲルを分離するのが好ましい。有機液体として飽和炭化水素を用いた場合は、上層に有機液体の相が、下部にシリカヒドロゲルを含む水性液体相が分離するので、両者を公知の手段により分離する。
【００６５】
シリカヒドロゲルの水スラリーは、所望により硫酸などの酸を添加してｐＨを１〜５程度に調整してゲル化を完結させ、水スラリーをろ過、水洗してシリカヒドロゲルを得、これを１００〜１５０℃程度の温度で、１〜３０時間程度乾燥することにより、シリカ球状体が得られる。
【００６６】
なお、シリカ前駆体を含む水性液体としてケイ酸アルカリ水溶液を用い、ゲル化剤として酸を用いた場合、アルカリ金属塩（例えばゲル化剤が炭酸であれば炭酸ナトリウムなど）を副生するので、この塩がシリカ球状体へ混入することを防止するため、ろ過した際のシリカヒドロゲル（ウエットケーキ）は十分水洗することが好ましい。場合によっては、水洗後のウエットケーキに再度水を添加してスラリーとして、再度ろ過、水洗を繰り返してもよい。なおこの際、所望により当該スラリーのｐＨを１〜５程度に調整して再度熟成する操作を行ってもよい。
【００６７】
上記乳化工程及びゲル化工程によって得たシリカ球状体（以下、「乳化後シリカ球状体」と称することがある。）は、均一な粒子径を有し、乳化及びゲル化の条件を適宜調整することで、平均粒子径、均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）、平均細孔径及び細孔容積が上記範囲内であるシリカ球状体を提供することができる。
【００６８】
上記して得たシリカ球状体は、乳化工程及びゲル化工程の後に、必要に応じて、平均細孔径及び細孔容積を大きくするために、次の処理をさらに行ってもよい。
【００６９】
例えば、乳化後シリカ球状体を２〜５０％のリン酸に含浸し、１００〜７００℃で加熱処理する方法（リン酸浸漬−加熱処理法、例えば特開平３−２３２１１号公報記載の方法）、２７０〜３５０℃で水熱処理する方法（水熱処理法、例えば特公昭和６１−２０４８７号公報記載の方法）、シリカゲルの細孔内をＮａＣｌ等の無機塩水溶液で充填し、乾燥後、３５０〜１５００℃で焼成する方法（無機塩充填−焼成法、例えば特開昭４７−５８１７号公報記載の方法）のいずれの方法を適用することによっても、シリカ球状体の平均細孔径を大きくすることができる。
【００７０】
さらに、乳化後シリカ球状体または乳化後さらに細孔径を大きくしたシリカ球状体は、アルカリ水溶液またはフッ素水溶液に接触させることで、均等係数を維持したまま、その平均細孔径及び細孔容積を増加させることができる（例えば特開２００７−２３８４２６号記載の方法を用いることができる）。
【００７１】
アルカリ水溶液の処理では、アルカリとして、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム等のアルカリ金属の水酸化物、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム等のアルカリ土類金属の水酸化物等の強アルカリを用いることができる。好ましくは、水酸化ナトリウム及び／または水酸化カリウムである。
【００７２】
使用するアルカリのシリカゲル球状体に対する質量比（アルカリ（ＯＨ）質量／シリカゲル原体質量）は０．０２／１〜０．２／１、好ましくは０．０５／１〜０．１５／１程度である。アルカリの比率がこれ未満であるとシリカゲル原体の細孔物性を調整する反応を充分行うことができず、比率がこれを超えると細孔物性を制御しながら調整することが困難になる。
【００７３】
アルカリ水溶液の濃度は０．１〜４０質量％、好ましくは０．５〜３０質量％、さらに好ましくは１〜２０質量％である。濃度がこれ未満であるとシリカゲル原体の細孔物性を増加させるアルカリの作用が充分得られず、また濃度がこれを超えると反応が進行しすぎて細孔物性を制御することが困難になる。なお、アルカリ水溶液中のシリカゲル原体のスラリー濃度は例えば１〜６０質量％、好ましくは２〜５０質量％、さらに好ましくは３〜４０質量％である。
【００７４】
反応温度は、５〜１００℃、好ましくは１０〜８０℃、さらに好ましくは２０〜５０℃程度である。また、特に加温又は冷却を行うことなく室温で反応を行ってもよい。
【００７５】
処理時間（反応時間）はアルカリ水溶液の濃度、反応温度、アルカリ質量とシリカゲル原体質量比、スラリー濃度等の因子によって変わりうるが、通常１分〜５０時間、好ましくは１０分〜４０時間、さらに好ましくは３０分〜３０時間、最も好ましくは１〜２４時間程度である。
【００７６】
処理工程が終了後のスラリーを濾過や遠心分離により固液分離し、分離したシリカゲルのケーキを撹拌槽において、再度水に分散せしめ、硫酸、塩酸、硝酸等の適当な酸を添加してｐＨを１〜３程度とし、０．１〜２時間スラリー状態で撹拌してアルカリを充分洗浄する。所望によりさらにこれを濾過、洗浄、乾燥することにより細孔物性を調整したシリカ球状体が得られる。
【００７７】
上記したアルカリ水溶液に代えて、フッ化水素水溶液を用いてもよい。フッ化水素水溶液を用いる場合、上記したアルカリ水溶液を用いる場合と同様にして処理することができる。
【００７８】
使用するフッ化水素のシリカゲル原体に対する質量比（フッ化水素質量／シリカゲル原体質量）は、０．１／１〜１．８／１、好ましくは０．２／１〜１．６／１程度である。また、フッ化水素水溶液の濃度は０．０１〜２０質量％、好ましくは０．５〜１５質量％、さらに好ましくは１〜１０質量％である。フッ化水素水溶液の濃度が上記範囲である場合は、細孔物性を適度に制御することができる。
【００７９】
上記したシリカ球状体にプロテインＡを固定させる工程としては、リンカーと称される構造をシリカ球状体とリガンドの間に介在させ、リンカーの一端をシリカ球状体に結合させ、かつリンカーの他端をリガンドに結合させることにより、リガンドをシリカ球状体に固定させることができる。
【００８０】
以下、一例として、シリカ球状体とエポキシ基含有化合物とを反応させ、さらにプロテインＡを反応させる方法について説明する。
【００８１】
シリカ球状体とエポキシ基含有化合物とを反応させることで、シリカ球状体表面にエポキシ基含有化合物を固定化し、リンカーを形成することができる。リンカーは末端にエポキシ基を有する。
【００８２】
エポキシ基含有化合物としては、エポキシ基を有するシランカップリング剤が好ましく用いられる。エポキシ基含有シランカップリング剤としては、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、β−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン等を用いることができる。
【００８３】
シリカ球状体とエポキシ基含有化合物とを反応させる方法としては、特に限定されないが、例えば、シリカ球状体とエポキシ基含有化合物とを溶媒中で加温する方法を用いることができる。反応温度は例えば３０〜４００℃程度であり、１００〜３００℃が好ましい。反応時間は例えば０．５〜４０時間程度であり、３〜２０時間が好ましい。
【００８４】
溶媒としては、エポキシ基含有化合物と反応せず、かつ、反応温度下で安定なものであれば、特に限定されない。エポキシ基本含有化合物の溶解性、沸点、さらには他の溶媒との親和性（すなわち洗浄時における除去性）などの観点から、通常、ベンゼン、トルエン、キシレン、オクタン、イソオクタン、テトラクロロエチレン、クロロベンゼン、ブロモベンゼン等を用いることができる。また、反応操作は溶媒の還流下で行ってもよい。
【００８５】
エポキシ基含有化合物の固定化量は、一般的には多いほど、つまり、シリカ球状体表面全体を緻密に覆う量であることが、シリカ球状体の耐アルカリ性を向上させる観点から好ましい。具体的には、シリカ球状体の１ｇあたりのエポキシ基含有化合物の量（エポキシ基含有化合物の固定化量をシリカ球状体の質量で除した値）が２２０μｍｏｌ／ｇ以上となるように反応させることが好ましい。エポキシ基含有化合物の固定化量は、２２０〜３２０μｍｏｌ／ｇがより好ましく、２４０〜３００μｍｏｌ／ｇが特に好ましい。
【００８６】
なお、エポキシ基含有化合物の固定化量は公知の方法に基づいて求められる。例えば、エポキシ基含有化合物を固定化した後のシリカゲルについて元素分析法により測定した炭素含有率をもとに、エポキシ基含有化合物１分子に含まれる炭素量、および、シリカ球状体の質量を用いて、エポキシ基含有化合物の固定化量を算出できる。
【００８７】
シリカ球状体とエポキシ基含有化合物との反応系には、さらに、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等のアミン化合物を混合してもよい。これによって、アミンの触媒作用により、シリカ球状体とエポキシ基含有化合物との反応が促進される。
【００８８】
次に、リンカーが導入されたシリカ球状体にプロテインＡを固定させる。プロテインＡとしては、リジンアミノ基を有するものを用いることができる。中でも、リコンビナントプロテインＡを好ましく用いることができる。
【００８９】
上記したシリカ球状体のリンカー構造にリガンドを結合させる方法としては、これに限定されないが、シリカ球状体とプロテインＡを含む溶液とを混合し、適宜触媒や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行うことができる。リンカー構造とリガンドとの反応においては、例えば、反応温度を２０〜３０℃とすることができ、反応時間を１〜２４時間とすることができる。反応系のｐＨは８〜９．５であることが好ましく、緩衝液によって調整することができる。
【００９０】
プロテインＡの配合量としては、充填容積あたり１０．０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上に相当する量であることが好ましく、より好ましくは１１．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である。
【００９１】
また、リンカー構造に残存するエポキシ基を失活するために、シリカ球状体にリガンドを結合した後に、エタノールアミンやトリスを用いて反応させる、もしくは酸性水溶液で処理することが好ましい。
【００９２】
反応後の後処理としては、特に制限されることなく、ろ過及び洗浄等の通常採用される方法で行うことができる。
【００９３】
また、リガンドが固定化された担体は、ｐＨ５〜６で４〜８℃で冷蔵保存することが好ましく、さらに防腐剤としてベンジルアルコール等を添加してもよい。
【００９４】
プロテインＡの固定化量としては、充填容量あたりのプロテインＡの量（プロテインＡの固定化量を充填容量で除した値）が１０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上となるように反応させることが好ましい。より好ましくは、プロテインＡの固定化量は、１１．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である。
【００９５】
プロテインＡの固定化量は公知の方法に基づいて求められる。例えば、配合したプロテインＡ溶液の濃度と、この溶液とシリカ球状体を混合してプロテインＡを結合させた後、シリカ球状体を分離して得られるプロテインＡ溶液の濃度との差分から、シリカ球状体に固定化された量を計算できる。溶液濃度は光学的に測定できる。
【００９６】
上記したアフィニティ担体を用いてクロマトグラフィを行う場合は、アフィニティ担体をカラムに充填して使用する。カラムとしては、ガラス製、ステンレス製、樹脂製等のカラムを適宜用いることができる。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の説明において、共通する成分は同じものを用いている。また、特に記述のない成分については、関東化学社製のものを用いている。
【００９８】
（製造例１）実施例のアフィニティ担体の作製
（１）分散相及び連続相の調製
分散相として、３号ケイ酸ソーダ（ＡＧＣエスアイテック社製）を水で希釈し、ＳｉＯ２濃度１６．９質量％、Ｎａ２Ｏ濃度６．１３質量％（ＳｉＯ２／Ｎａ２Ｏモル比＝２．８５）、比重１．２２２のケイ酸ナトリウム溶液を調製した。
【００９９】
連続相として、比重０．７３の直鎖飽和炭化水素デカン（Ｃ１０Ｈ２２、東ソー社製）に界面活性剤として１．０質量％のソルビタンモノオレイン酸エステル（三洋化成工業社製）を溶解したものを調製した。
【０１００】
（２）乳化装置の作製
分散相と連続相とを乳化するために用いた乳化装置を図１に示す。
【０１０１】
図１に示す乳化装置では、１及び２はアクリル樹脂製部品、３はエッチング処理にて流路（マイクロチャネル）３ａを形成したステンレス鋼板、４は複数の微小孔部４ａが形成されたステンレス鋼板である。そして、連続相が連続相供給部５から供給され連続相排出部６から排出されるように流路３ａを層流状態で流れ、ケイ酸ナトリウム溶液からなる分散相が分散相供給部７から供給され微小孔部４ａを介して連続相中に圧入される。
【０１０２】
ステンレス鋼板３は、エッチングにて流路３ａが２本並列で配置されるように加工した。２本の流路３ａは、それぞれ３．０ｍｍ（幅）×０．１５ｍｍ（厚さ）×６３ｍｍ（長）である。
【０１０３】
ステンレス鋼板４は、レーザー加工により、排出口側の面から見える孔の直径で１４μｍの微小孔部４ａを１流路３ａあたり、横２６個×縦５１０個＝合計１３２６０個で加工した。ステンレス鋼板４には、表面に撥水性を持たせるため、溶剤可溶型フッ素樹脂（旭硝子社製：サイトップＣＴＬ−１０２ＡＥ）を用いて表面をコートした。
【０１０４】
（３）乳化後シリカ球状体の作製
上記（２）で作製した乳化装置を水平に置いて使用し、連続相供給部５より上記（１）で調製した連続相を供給し、分散相供給部７より微小孔部４ａを通して上記（１）で調製したケイ酸ナトリウム溶液からなる分散相を供給することで、ケイ酸ナトリウム溶液が連続相中に分散したＷ／Ｏ型エマルションを連続的に製造した。このとき、連続相の供給量は１流路３ａあたり６４２ｍＬ／ｈであり、流路における流れ方向の流速は３ｍ／ｓであった。実験は常温で行い、このとき、分散相の供給量は微小孔部４ａの１個あたり１０．４μＬ／ｈであった。
【０１０５】
次に、得られたエマルションを撹拌しながら１５分間炭酸ガスを供給し、シリカ球状体を析出させた。さらに、水を加えて連続相と分離後、２０質量％の硫酸を添加し、ＣＯ２を除去した後、水洗及び乾燥し、乳化後シリカ球状体を得た。
【０１０６】
得られた乳化後シリカ球状体の物性は以下の通りであり、均質な粒子径を有する。
平均粒子径：４０．６μｍ
均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）：１．３１
平均細孔径：１５．６ｎｍ
細孔容積：１．１６ｍＬ／ｇ
比表面積：２９８ｍ２／ｇ
【０１０７】
ここで、測定方法としては、平均粒子径は、ＬＡ−９５０Ｖ２（堀場製作所社製）を用いてレーザー式光散乱法によって測定した。また、均等係数は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ（ベックマン・コールター社製）を用いてコールターカウンター法によってＤ９０粒子径及びＤ１０粒子径を測定し、その比（Ｄ９０／Ｄ１０）から求めた。
また、平均細孔径、細孔容積及び比表面積は、オートポアＩＶ９５１０（島津製作所社製）を用いて水銀圧入法によって測定した。以下同じである。
【０１０８】
（４）シリカ球状体の作製
上記した乳化工程で得られた乳化後シリカ球状体３４．５ｇに、１．５質量％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液をＳｉＯ２に対して０．７質量％になるように加え、１８０℃で一昼夜乾燥させた。それを坩堝に入れ、１８０℃で６．５時間保持した後、７３０℃で１３時間焼成を行った。過剰のナトリウム分を除去するため、１８％の塩酸水溶液で２時間還流処理を行った。ろ過・洗浄後、所定量の０．８５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液に２５℃で２４時間浸漬させた。ろ過後、ｐＨ１．５の硫酸水溶液で洗浄し、シリカ球状体の最終品を得た。
【０１０９】
得られたシリカ球状体の物性は以下の通りである。
平均粒子径：３４．４μｍ
均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）：１．３１
平均細孔径：１０５．０ｎｍ
細孔容積：１．６４ｍＬ／ｇ
比表面積：６０ｍ２／ｇ
【０１１０】
（５）リンカーの導入
得られたシリカ球状体１０ｇに８０ｍＬのトルエン、４．６２ｍＬのジイソプロピルエチルアミン、６．００ｍＬのγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて、４．５時間還流させた。放冷後、ろ過し、２００ｍＬのトルエン、１００ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１３０ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で乾燥させた。
【０１１１】
得られたシリカ球状体１ｇあたりのリンカー固定化量を全自動元素分析装置（ＣＨＮＳ／Ｏ）２４００ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて元素分析した結果、以下の通りとなった。
リンカー固定化量：２６０μｍｏｌ／ｇ
【０１１２】
（６）リガンドの導入
得られたリンカー導入シリカ球状体４ｇに０．２Ｍ炭酸水素緩衝液、ならびに充填容積あたり１２ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄに相当するリコンビナントプロテインＡ（Ｕ．Ｓ．５，０８４，５５９号公報に記載の方法によって作製したもの）を加え、室温で３時間撹拌した。ろ過・水洗した後、１６ｍＬの０．５質量％の塩酸水溶液に室温で一昼夜浸漬させ、残存するエポキシ基を失活させた。ろ過した後、１３０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、１３０ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ２．２）、再度１３０ｍＬのＰＢＳ、６０ｍＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液、１３０ｍＬの蒸留水で洗浄した。１％ベンジルアルコールを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）中で冷蔵保存した。
【０１１３】
得られたアフィニティ担体を乾燥し、プロテインＡのリガンド固定化量を全自動元素分析装置（ＣＨＮＳ／Ｏ）２４００ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて元素分析した結果、充填容積あたり以下の通りであった。
リガンド固定化量：１１．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ
【０１１４】
また、静的結合容量（ＳＢＣ）は以下の通りであった。静的結合容量としては、プロテインＡ固定化担体０．１ｍＬ−ｂｅｄに初発濃度で０〜１．８２ｍｇ／ｍＬのポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧ溶液（シグマアルドリッチ社製）を加え、室温で一昼夜ロータリーミキサーにて撹拌し、遠心分離後、上澄液の２８０ｎｍ吸光度測定（ＵＶ−１８００（島津製作所社製））により残存ＩｇＧ濃度を定量し、ラングミュアプロット法を用いて算出した。
静的結合容量（ＳＢＣ）：８８ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ
【０１１５】
（製造例２）比較例のアフィニティ担体の作製
上記した製造例１による実施例のアフィニティ担体の作製において、シリカ球状体の最終品として、ＡＧＣエスアイテック社製「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ．ＳＩＬ  Ｄ−５０−１０００ＡＷ」を用いた他は同様にして、アフィニティ担体を作製した。
【０１１６】
使用したシリカ球状体「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ．ＳＩＬ  Ｄ−５０−１０００ＡＷ」の物性は以下の通りであった。
平均粒子径：４５．７μｍ
均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）：１．９３
平均細孔径：９９．０ｎｍ
細孔容積：１．７８ｍＬ／ｇ
比表面積：７１ｍ２／ｇ
【０１１７】
また、アフィニティ担体の物性は以下の通りであった。
リガンド固定化量：１１．６ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ
静的結合容量（ＳＢＣ）：７４ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ
【０１１８】
（実施例１）
実施例１として、上記した製造例１で作製したアフィニティ担体を内径５ｍｍ×長さ２００ｍｍのガラス製カラムに充填し、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
【０１１９】
（比較例１〜３）
比較例１として、製造例２で作製した比較例のアフィニティ担体を用いた他は上記した実施例１と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例２として、市販のアガロース系担体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた他は上記した実施例１と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例３として、市販のＣＰＧ（コントロールポアーガラス）系担体（Ｐｒｏｓｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた他は上記した実施例１と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
【０１２０】
＜評価＞
実施例１及び比較例１〜３のカラムに水を通液した場合の線流速と圧力損失の関係を測定した。結果を図２に示す。
【０１２１】
アフィニティ担体を内径５ｍｍ×長さ２００ｍｍのガラス製カラムに充填し、カラムをクロマトグラフィ装置「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ」（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に装填して、各線流速にて蒸留水を通液して、運転圧力Ａを求めた。次に、アフィニティ担体をカラムに充填してない他は同様にして、運転圧力Ｂを求めた。各線流速において運転圧力Ａから運転圧力Ｂを差し引いて、圧力損失を求めた。
【０１２２】
図２に示す通り、実施例１（近似直線を実線で示す）と比較例１（近似直線を点線で示す）は同等の圧力損失を示し、滞留時間１分に相当する１２００ｃｍ／ｈｒの高線流速において３ｂａｒ以下の低圧力損失を示した。実施例１のシリカ球状体は比較例１よりも平均粒子径が小さいにも関わらず均等係数が小さいため、圧力損失を低く抑えることができた。一方、アガロース系担体の比較例２（近似直線を２点鎖線で示す）では同線流速で１０ｂａｒ以上の高圧力損失であり、ＣＰＧ系担体の比較例３（近似直線を破線で示す）では同線流速で３ｂａｒ以上の圧力損失であった。
【０１２３】
（実施例２）
実施例２として、上記した製造例１のアフィニティ担体を内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍのガラス製カラムに充填し、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
【０１２４】
（比較例４〜８）
比較例４として、製造例２で作製したアフィニティ担体を用いた他は上記した実施例２と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例５として、市販のアガロース系担体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた他は上記した実施例２と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例６として、市販のアガロース系担体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた他は上記した実施例２と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例７として、市販のアガロース系担体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＸＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた他は上記した実施例２と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例８として、市販のＣＰＧ（コントロールポアーガラス）系担体（Ｐｒｏｓｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた他は上記した実施例２と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
【０１２５】
＜評価＞
次の手順で動的結合容量（ＤＢＣ）を測定し、結果を図３に示す。実施例２及び比較例５〜８のカラムをクロマトグラフィ装置「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ」（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に装填して、各カラムに０．５ｍｇ／ｍＬのポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を種々の線流速にて通液した。通液した０．５ｍｇ／ｍＬのポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）の吸光度に対し、溶出液の吸光度が１０％ブレイクスルーした時点で、添加したポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧの質量を求め、動的結合容量を算出した。
【０１２６】
図３に示す通り、実施例２のカラムは、比較例４〜８に比べ、高い動的結合容量を示した。滞留時間１分の高線流速域において、アガロース系担体の比較例５〜７が２０〜３０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄであり、ＣＰＧ系担体の比較例８及び製造例２のカラムの比較例４が約４０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄであったのに対し、実施例２のカラムは約６０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄの高い性能を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明のシリカ球状体は、前記シリカ球状体にリガンドが固定された結合容量の大きいアフィニティ担体の製造に利用できる。
なお、２０１１年１０月２８日に出願された日本特許出願２０１１−２３７２０４号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【符号の説明】
【０１２８】
１  アクリル樹脂製板
２  アクリル樹脂製板
３  ステンレス鋼版
３ａ  流路
４  ステンレス鋼版
４ａ  微小孔部
５  連続相供給部
６  連続相排出部
７  分散相供給部
【図１】
0006002142.tif 000002
【図２】
0006002142.tif 000003
【図３】
0006002142.tif 000004