(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着細胞を成長させるための担体であって、当該担体が、
２つの外表面と、それら２つの外表面に設けられた１以上の構造的くぼみを含んでおり、担体が０．２ｍｍ以上の長さ、０．２ｍｍ以上の幅、０．０５ｍｍ〜１．２ｍｍの範囲の高さを有しており、構造的くぼみの各々が０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲の長軸、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲の短軸及び０．０２５ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲の深さを有する、担体。
【請求項２】
少なくとも１つの表面に設けられた単一の構造的くぼみを含んでいて、前記単一の構造的くぼみが１ｍｍ以上の長さ、１ｍｍ以上の幅、１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲の高さを有しており、担体の壁厚が０．０５ｍｍ〜２ｍｍの範囲にある、請求項１記載の担体。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の担体を１以上含む細胞培養システムであって、細胞培養システムがバイオリアクタである、細胞培養システム。
【請求項４】
請求項１又は請求項２記載の担体が予め装填された使い捨て筐体を含む細胞培養用キット。
【請求項５】
付着細胞を培養する方法であって、
請求項１又は請求項２記載の担体を用意する段階と、
担体上で細胞を成長させる段階と
を含む方法。
【請求項６】
請求項１又は請求項２記載の担体の製造方法であって、
ａ）２枚の平坦なポリマー薄膜を用意する段階と、
ｂ）前記２枚の平坦なポリマー薄膜に、前記２枚の薄膜の各々の少なくとも１つの表面に複数の構造的くぼみを形成する段階と、
ｃ）少なくとも２つの外側を向いた表面が前記複数の構造的くぼみを含むように、前記２枚のポリマー薄膜を貼り合わせる段階と、
ｄ）貼り合わせたポリマー薄膜を複数の部分に切断する段階と、
ｅ）コロナ放電処理、気体プラズマ処理、化学的官能化又はコーティングのうちの１以上を含む処理を前記部分に施す段階と
を含む方法。
【請求項７】
担体が細胞親和性である、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞担体、及び細胞担体を作製し使用するための関連方法に関する。より具体的には、本発明は、細胞成長用のポリマー系細胞担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
付着細胞は、従来ガラス表面上又はポリマー基材上で成長させてきた。細胞培養用の表面は、細胞の付着及び増殖を増強するためにしばしば前処理されている。様々な静置培養容器が、実験室における付着細胞の培養に利用可能である。Ｔ型フラスコ、Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）又はＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））ユニットなどの静置培養容器は付着細胞の培養をいくらかスケールアップできるが、それは労働力を要し、手作業に起因する変動を生じ、容積生産性（例えばインキュベータ空間の体積当たりの細胞収量）に制限があるので、より大規模化するには制限がある。
【０００３】
細胞培養をスケールアップする好ましい方法として、バイオリアクタを使用する細胞培養が長く実践されてきた。バイオ処理など産業的実践においては、付着細胞培養用のマイクロキャリアを使用することが一般的である。マイクロキャリアビーズが開発されて、細胞が付着するための表面領域が増加し、産業規模での高密度付着細胞培養が可能になった。典型的なバイオリアクタ容器は、内部回転翼、揺動又は振盪機構など、なんらかの撹拌手段を利用して細胞を懸濁し、栄養分、酸素及び代謝老廃物の物質移動を可能にしている。しかし、撹拌は、細胞を流れ誘発ストレスに曝す場合があり、そのストレスは細胞、特に感受性が高い細胞、例えば特定の哺乳動物細胞系及び初代細胞を損傷する可能性がある。バイオリアクタ内の流れ誘発ストレスは、容器壁、回転翼又は他の容器構成部品に対する液体培地の相対運動によって、及び培地に対する担体の相対運動によって起こり得る。細胞を保持するマイクロキャリアが互いに、又は容器構成部品若しくは撹拌器構成部品と衝突する場合、細胞はバイオリアクタ容器内にある内部の可動部品で損傷される場合がある。従って、撹拌誘発損傷から細胞を保護する担体が求められている。特定の担体デザイン（例えばマクロ多孔質ビーズ、不織繊維マット）は細胞の保護を可能にするが、細胞の可視化及びそのような担体からの細胞の回収は困難である。
【０００４】
従って、撹拌又は剪断ストレスの影響から細胞を保護し、さらに細胞の増殖培養、可視化及び遊離を容易にする付着細胞成長用の担体の必要性がある。現在は静置培養容器で増殖培養されている間葉系間質細胞（ＭＳＣ）のような剪断感受性細胞を含めた付着細胞用の、高収量で産業規模の細胞培養工程には、効果的に細胞を増殖培養させることが特に重要である。従って、細胞の付着、増殖及び遊離を容易にし、細胞に対する剪断力を減少させる細胞培養担体の開発が、大いに求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】SARA LINDSTROEM ET AL: "High-Density Microwell Chip for Culture and Analysis of Stem Cells", PLOS ONE, vol. 4, no. 9, E6997, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 1-9, XP055022128, ISSN:1932-6203, DOI:10.1371/journal.pone.0006997 figure2 Materials and Methods: Microwell chip design Materials and Methods: Pre-coating of the microwell chip
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細胞培養用の担体及びその担体を作製し、使用する方法に関する。細胞培養用の担体の１以上の実施形態は、１以上のくぼみを含む。
【０００７】
付着細胞を成長させるための担体の一実施形態は、１以上の外表面、及び外表面のうちの１以上にある１以上の構造的なくぼみを含み、担体が長さ約０．２ｍｍ以上、幅約０．２ｍｍ以上、高さ約０．０５ｍｍ〜１．２ｍｍの範囲にあり、構造的なくぼみのそれぞれが長軸約０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲、短軸約０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲及び深さ約０．０２５ｍｍ〜約０．５ｍｍの範囲にある。
【０００８】
付着細胞を成長させるための担体は、１以上の外表面、及び少なくとも１つの表面にある単一の構造的なくぼみを含み、１つの構造的なくぼみは長さ約１ｍｍ以上、幅約１ｍｍ以上、高さ約１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲、及び担体の壁厚約０．０５ｍｍ〜２ｍｍの範囲にある。
【０００９】
付着細胞を培養する方法は、１以上の外表面、及び外表面のうちの１以上にある１以上の構造的なくぼみを含む担体を提供する段階であって、担体が長さ約０．２ｍｍ以上、幅約０．２ｍｍ以上、高さ約０．０５ｍｍ〜１．２ｍｍの範囲にあり、構造的なくぼみのそれぞれが長軸約０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲、短軸約０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲及び深さ約０．０２５ｍｍ〜約０．５ｍｍの範囲にある段階と、担体上で細胞を成長させる段階とを含む。
【００１０】
細胞を成長させるための担体を作製する方法の１例は、ａ）平らなポリマー薄膜を提供する段階と、ｂ）１以上の側面において、平らなポリマー薄膜上に１以上の構造的なくぼみを形成する段階と、ｃ）コロナ放電処理、気体プラズマ処理、化学的官能化若しくはコーティングのうちの１以上を含む表面処理を薄膜に施す段階と、ｄ）処理したポリマー薄膜を複数の部分に切断する段階とを含む。
【００１１】
細胞を成長させるための担体を作製する方法の別の例は、ａ）１以上の平らなポリマー薄膜を提供する段階と、ｂ）１以上の側面において、平らなポリマー薄膜上に１以上の構造的なくぼみを形成する段階と、ｃ）ポリマー薄膜を複数の部分に切断する段階と、ｄ）コロナ放電処理、気体プラズマ処理、化学的官能化若しくはコーティングのうちの１以上を含む処理を部分に施す段階とを含む。
【００１２】
細胞を成長させるための担体を作製する方法の別の例は、ａ）２枚の平らなポリマー薄膜を提供する段階と、ｂ）２枚の平らなポリマー薄膜に、２枚の薄膜のそれぞれにおける少なくとも１つの表面に複数の構造的なくぼみを形成する段階と、ｃ）２つの外側を向いている表面が複数の構造的なくぼみを含むように、２枚のポリマー薄膜を貼り合わせる（平らな面を互いに合わせる）段階と、ｄ）貼り合わせたポリマー薄膜を複数の部分に切断する段階と、ｅ）コロナ放電処理、気体プラズマ処理、化学的官能化若しくはコーティングのうちの１以上を含む処理を部分に施す段階とを含む。
【００１３】
図面全体を通して同じ文字が同じ部分を表している添付図面を参照して下記の詳細な説明を読めば、本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点がよりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】担体の寸法を示している、複数のくぼみを含む本発明の担体の図である。
【図１Ｂ】各くぼみの寸法を示している、同担体の図である。
【図２Ａ】基板の一方の側面に１つのくぼみを含む本発明の担体の図である。
【図２Ｂ】基板の対向する２つの側面のそれぞれに１つのくぼみを含む本発明の担体の図である。
【図２Ｃ】基板の一方の側面に複数のくぼみを含む本発明の担体の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
【図２Ｄ】基板の両側面に複数のくぼみを含む、本発明の担体のＳＥＭ画像である。
【図３】バッチモードで小規模に本発明の担体を作製する方法の例のプロセスフロー図である。
【図４Ａ】おおよそ長方形の壁の横断面を持つ本発明の担体のＳＥＭ画像である。
【図４Ｂ】別の壁形状（壁の横断面がおおよそ三角形）を有する本発明の担体の画像である。
【図５Ａ】１日目、４日目、７日目及び９日目の担体表面の上部及び底部における細胞成長を例示している、本発明の担体上で成長したｈＭＳＣの１００ｘ蛍光顕微鏡画像である。
【図５Ｂ】スピナーフラスコ又はＳＴＲ内にある本発明の担体上でのｈＭＳＣの成長と、静置条件のＴＣＰＳにおけるその成長との比較を示すグラフである。
【図６】スピナーフラスコ内の本発明の担体上、及び比較として静置条件にある組織培養処理したプレート表面（ＴＣＰＳ）上での様々な供給元から調達したｈＭＳＣの成長を例示するグラフである。
【図７】スピナーフラスコにおけるｈＭＳＣのより大規模な培養を例示するグラフである。
【図８Ａ】２４時間、９６時間及び１６８時間における担体のくぼみの上部及び底部における細胞成長を例示している、本発明の担体上で成長したＭＤＣＫ細胞の１００ｘ光学顕微鏡の連続画像である。
【図８Ｂ】本発明の担体上及び平らな担体上で成長した培養ＭＤＣＫ細胞に対する発光信号を時間の関数として描いているグラフである。
【図９Ａ】２４時間、９６時間及び１６８時間における担体のくぼみの上部及び底部における細胞成長を例示している、本発明の担体上で成長したＭＲＣ−５細胞の１００ｘ光学顕微鏡の連続画像である。
【図９Ｂ】本発明の担体上及び平らな担体上で成長した培養ＭＲＣ−５細胞の発光信号を時間の関数として描いているグラフである。
【図１０Ａ】１日、４日、８日後及びトリプシン処理後に画像化した本発明の担体上で成長したＣＨＯ細胞の連続画像である。
【図１０Ｂ】静置条件下にある、及びスピナーフラスコ内にある本発明の担体上で成長したＣＨＯ細胞を示しているグラフである。
【図１１Ａ】回収及び脂肪生成の後に、スピナーフラスコ内の本発明の担体上で培養したｈＭＳＣの蛍光顕微鏡画像である。
【図１１Ｂ】対照として使用したｈＭＳＣの蛍光顕微鏡画像である。
【図１２】骨形成後のｈＭＳＣのカルシウム含量を対照細胞と比較して示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の１以上の実施形態は、付着細胞を成長させるための担体に関し、担体はバイオリアクタに懸濁されており、担体は効果的な細胞付着、細胞成長及び細胞遊離に有用である。細胞培養を含めた様々な適用には高収量の細胞が必要であり、この担体はその要件を満たすことができる。
【００１６】
より明確に及び簡潔に特許請求される発明の内容を記述するために、以下の定義が特定の用語に提供され、その用語は以下の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。明細書の全体を通して、特定の用語の実例は、非限定的な例と見なすべきである。
【００１７】
文脈による別段の明確な指図がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。本明細書では明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、近似的な語法は、関連する基本的な機能に変化を生じることのない許容範囲内で変えることができるあらゆる量的表現の修飾に適用できる。従って、「約」などの用語によって修飾される値は、特定の厳密な値に限定されるべきでない。いくつかの実例では、近似的な語法は、値を測定する機器の精度に対応することができる。必要な場合には、範囲が与えられ、これらの範囲はその間にある全ての部分的範囲を含む。
【００１８】
本明細書において意味するように、「担体」又は「細胞を成長させるための担体」は、細胞を付着させ、培養するための支持体である。担体は、その上にくぼみを有することができる。担体の適切な材料には、ポリマー、コポリマー又はポリマーのブレンドがあるが、これに限定されない。細胞の付着及び増殖に有効な適切なコーティング材料を用いて、担体をさらにコートすることができる。
【００１９】
本明細書において意味するように、「長軸」は担体表面上に存在している各くぼみの最長寸法である。例えば、長方形のくぼみの場合、くぼみの長さを「長軸」と呼ぶ。本明細書において意味するように、「短軸」は、担体表面上に存在している各くぼみのうち最長寸法ではない寸法を意味している。例えば、長方形のくぼみの場合、くぼみの幅を「短軸」と呼ぶ。例えば、図１Ｂの１４及び１６にそれぞれ示すように、正方形のくぼみの場合長さと幅は同じなので、長軸は同じであり、図２Ｂの１４に示すように、円形のくぼみの場合長軸は直径であり、長方形のくぼみの場合長軸は長さであり、長軸は楕円形くぼみの長軸である。
【００２０】
本明細書において意味するように、「アスペクト比」は構造的なくぼみのそれぞれの深さと長軸の比である。例えば、円形のくぼみのアスペクト比は、深さと直径の比である。
【００２１】
浮遊状態の担体の実施形態は、１以上の外表面を含み、担体の外表面のうちの１以上は１以上の構造的なくぼみを含む。本発明は、担体を作製する方法並びに細胞成長用担体を使用する細胞を培養するための方法及びキットも含む。
【００２２】
付着細胞を成長させるための担体は１以上の外表面、及び外表面のうちの１以上にある１以上の構造的なくぼみを含み、図１Ａに示すように、担体２は、長さ４約０．２ｍｍ以上、幅６約０．２ｍｍ以上及び高さ８約０．０５ｍｍ〜１．２ｍｍの範囲にある。いくつかの実施形態において、担体は、長さ４約０．２ｍｍ〜５ｍｍの範囲、幅６約０．２ｍｍ〜５ｍｍの範囲、及び高さ８約０．０５ｍｍ〜１．２ｍｍの範囲にある。いくつかの実施形態において、担体は、約０．２〜２５ｍｍの幅及び長さを有する。いくつかの実施形態において、担体の壁厚１０は、約０．０５ｍｍ〜２ｍｍの範囲にある。
【００２３】
図１Ｂに示すように、構造的なくぼみの実施形態は、深さ１２、長軸１４及び短軸１６を含み、くぼみの長軸１４は約０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲にあり、短軸１６は約０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲にあり、深さ１２は約０．０２５ｍｍ〜約０．５ｍｍの範囲にある。壁厚１０は、約０．０５ｍｍ〜２ｍｍの範囲にある。本明細書ではくぼみの「深さ」という用語は、各くぼみの内壁の深さを意味している。本明細書では、「壁厚」という用語は、図１Ｂで示すように、１つのくぼみを持つ担体では１つの壁の厚さ、又は複数の構造的なくぼみを持つ担体では複数の壁のそれぞれの厚さを意味している。各構造的なくぼみは、約０．１〜約１．５の範囲のアスペクト比を有する。
【００２４】
一実施形態において、担体は、図２Ａに示すように担体の少なくとも１つの表面に１つのくぼみを含むことができる。この実施形態において、担体は、基板の１つの外表面上にある、担体の基板を囲む連続した壁を持つ「カップ」様構造をしている。代わりの実施形態において、担体は、図２Ｂに示すように担体の表面のそれぞれに１つのくぼみを含むことができる。この実施形態において、担体は、基板の対向する外表面にある、カップを囲む連続した壁を持つ２つの「カップ」様構造を有する。この担体は、特定の細胞培養条件又は特定の細胞型に有用となる可能性がある。単一の担体（図２Ａ及び２Ｂ）は、長さ約０．１ｍｍ〜５ｍｍの範囲、幅約０．１〜５ｍｍの範囲、高さ８約１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲、及び担体の壁厚１０約０．０５ｍｍ〜２ｍｍの範囲である。図２Ａ及び２Ｂに示すように、単一の「カップ」（図２Ａ）又は基部の対向する側面にある２つの「カップ」（図２Ｂ）の場合、長さは長軸１４と同じであり、図２Ａに示すように、幅は短軸１６と同じでありカップは深さ１２である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、担体は、付着細胞を成長させるための少なくとも１つの表面を含み、１以上の構造的なくぼみが表面上に存在しており、例えば、図２ＣのＳＥＭ画像に示すように、担体は基板の１つの外表面に複数の構造的なくぼみを有する。一実施形態において、担体は少なくとも２つの外表面を含む。この実施形態において、図２Ｄに示すように、１８及び２０がそれぞれ上下の表面にある構造的なくぼみであるように、１以上の構造的なくぼみが外表面のそれぞれに形成されている。この実施形態において、担体は基板の反対の外表面に複数のくぼみを有する（図２Ｄ）。
【００２６】
いくつかの実施形態において、担体は、実質的に平面な円盤様構造を有する。本明細書では、「実質的に平面な円盤」は、円盤を意味し、その円盤は成長細胞用の平面領域を提供する。担体の形状は、多角形でもよい。１以上の実施形態において、担体の形状は変わることができ、例えば、担体は円形、楕円形、三角形、長方形、正方形、五角形又は六角形である全周を有することができる。
【００２７】
担体の円盤様構造は、例えば球面構造と比較して、細胞培養のための単位体積当たりより高い表面領域を得ることができる。その担体サイズ（長さ及び幅の両方が０．２〜５ｍｍ）は、継代当たり約１０〜１００倍のｈＭＳＣを増殖させることができる。担体と遊離した（例えばトリプシン処理した）細胞の効果的な分離は、細胞（１５ミクロン未満）と担体（０．２ｍｍより大きい）との著しいサイズ差により促進される。単純な濾過又は担体を沈殿させた後に上清を分離することにより、遊離した細胞を担体と分離できる。
【００２８】
図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、及び２Ｂに示すように、構造的なくぼみは、担体の外表面に垂直に突き出す壁を有する。壁の高さは担体の様々な要件のバランスを満たすように選択され、例えば、低い壁（すなわち浅いくぼみ）により単位体積当たりより高密度に担体を詰めることが可能になり、従って反応装置の単位体積当たりより高い細胞収量を得ることができる。さらに、壁の高さがさらに低いと（すなわちより浅いくぼみ）、細胞に出入りする酸素、栄養分及び代謝廃棄物の輸送が促進される。しかし、高い壁（すなわちより深いくぼみ）は、バイオリアクタ内部の撹拌により起こる流体力からの高い保護を提供できる。さらに、高い壁又は深いくぼみは、あらゆる細胞分泌分子の希釈も防ぐ微環境を形成できる。細胞−細胞情報伝達又は自己分泌因子が細胞培養又は処理操作の求める部分である場合、これが有利になり得る。担体の平面上に突き出た壁の望ましい高さ範囲は従ってこれらの因子を考慮して０．０５ｍｍ〜１．２ｍｍの範囲、いくつかの実施形態において約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、又はいくつかの実施形態において約０．０８ｍｍ〜約０．２ｍｍに最適化されている。
【００２９】
担体は、細胞へ養分及び酸素を十分に輸送する対流運動がある液体を含むバイオリアクタ内部で浮遊状態である。細胞に対する流体誘発流体力学的ストレスの影響を最小化するような、十分な高さの平らな又は湾曲した壁を有する構造的なくぼみの表面に細胞は付着している。担体は、栄養分及び代謝物への接近を可能にする一方で液体運動によって生成する流体力学的剪断への曝露から細胞を保護するという、細胞に必要なバランスをとっている最適なくぼみの深さから成る。
【００３０】
構造的なくぼみは、担体表面に凸型の特徴も形成する。凸型の特徴は担体の１以上の表面上に存在でき、その特徴は担体が互いに張り付くことを防いでいる。張り付き又は凝集している担体は、平らな又は平滑な担体の特定の型で問題となり得る。担体上の凸型の特徴は、担体が反応装置又は培養容器の内壁に張り付くことを防ぐのにも役立ち、これは細胞培養のバッチ間の反応装置／培養容器の清掃を容易にする。
【００３１】
各くぼみの断面側面図は、非限定的な例として、多角形、円形又は楕円形をとることができる。多角形のくぼみのそれぞれは、非限定的な例として、三角形、長方形、正方形、五角計又は六角形をとることができる。くぼみの長軸及び短軸の寸法は、同じ又は異なることができる。
【００３２】
担体は、ガラス、ポリマー、セラミック、金属又はその組合せで作製することができる。一実施形態において、担体は、ポリマー又はコポリマー又はポリマーのブレンドで作製されている。ポリマーには、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリウレタン、オレフィンポリマー、デキストラン、シリコーン若しくはポリアクリレートを含めたポリエステルなどの合成及び天然ポリマー、又はそのポリマーのコポリマー若しくはブレンドがあるが、これに限定されない。１つの特定の実施形態において、担体はポリスチレン製である。
【００３３】
ポリマーは透明であることができ、それにより光学顕微鏡下で細胞を観察できる。特定の実施形態において、担体は実質的に平面な円盤形状をとり、この形状はレンズ化の影響を防ぐことにより細胞の可視化を容易にする。光の屈折は、特定の屈折率の球状担体において細胞の可視化の障害になり得る。細胞の可視化は、例えばワクチン製造又は幹細胞増殖の間に細胞を培養及びモニタリングするのに有用である。いくつかの実施形態において、ポリマー及び表面処理は、動物由来の構成要素を実質的に含まない。これは、治療適用において、例えば細胞療法用の細胞の製造において特に有益である。ポリマーは、室温／細胞培養温度で硬く、無孔であることができ、水、ＰＢＳ又は成長培地中で非膨張特性を有することができる。ポリマーの硬く、非膨張であり、無孔の特性は、例えば標準的なトリプシン処理手順を使用するときに細胞の遊離を容易にできる。
【００３４】
場合によっては、ポリマー系担体表面を官能基又はコーティングで修飾して、細胞の付着及び成長をより良くできる。いくつかの実施形態において、エンボス加工したポリマー薄膜に、コロナ放電処理、気体プラズマ処理、化学的官能化又はコーティングのうちの１以上を含む表面処理が施される。様々な生体分子を使用して担体表面を修飾し、細胞の付着を高めることもできる。生体分子の非限定的な例には、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンがある。一実施形態において、表面を組換え型フィブロネクチンを用いて修飾して、表面細胞親和性を高め、細胞をより良く付着させる。表面修飾により、例えば、疎水性又は親水性が変化する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、表面をコロナ放電で処理して、担体の１以上の表面特性を修飾する。コロナ放電処理では、高電位を持つ電極から中性ガス（空気など）の中に電流が発生する。気体のイオン化により電極の周囲にプラズマの層が生成する。生成したイオンは最終的に、より低電位の周辺領域に電荷を渡す又は再結合して、中性ガス分子を形成する。コロナ放電表面処理によって反応性空気プラズマに短時間曝露すると、有機薄膜、例えばポリスチレン、ポリエステルなどの表面を酸化することができる。コロナ放電処理によって、ポリマー表面上の酸素含有量を高めることができ、水による薄膜ぬれ性が改善される。
【００３６】
表面修飾は、プラズマ処理によって達成することもできる。いくつかの実施形態において、表面をプラズマ処理して担体の表面特性を修飾する。プラズマ処理はプラズマ反応装置中で実施され、反応装置は低気圧（通常は１０〜１０００ｍＴｏｒｒ）で気体を含む真空容器である。反応装置内で高周波電界が生成されると、イオン、遊離基及び真空紫外光子のような反応種を含有するプラズマが形成される。これらの種はポリマー表面と反応し、気体の性質及びプラズマパラメータに応じて様々な特性を持つ化学修飾をもたらす。通常、酸素、アンモニア及びアルゴンなどの気体を使用して表面を修飾し、ポリマー表面の付着を改善する。一実施形態において、ポリマー表面は酸素プラズマ処理によって修飾されて、表面の細胞親和性が高められる。表面官能性は、過塩素酸若しくは過マンガン酸塩を使用する酸化処理又は強酸若しくは強塩基を使用する部分的加水分解などの湿式化学法によっても改変できる。
【００３７】
各表面にコーティングを塗布して、担体の表面特性、例えば疎水性、親水性又はぬれ性を修飾することもできる。疎水性／親水性の１つの指標は、表面上の水滴の接触角である。接触角は、当業技術分野において周知の技術によって測定できる。コートした担体表面に対する水接触角は約１０°〜約９０°の範囲にあり、いくつかの実施形態において水接触角は３０°〜７０°である。担体表面を修飾して、例えば細胞の遊離並びに細胞の付着を高めることができる。コーティングは、例えば、熱応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー又はその組合せで作製することができる。熱応答性のポリマーには、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（ジ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＤＥＧＭＡ）があるが、これに限定されない。ｐＨ応答性ポリマーには、アクリル酸、ジメチルアミノエチルアクリレート及びヒドロキシエチルアクリレートのコポリマーがあるが、これに限定されない。コーティングは、１以上の層を含むことができる。いくつかの実施形態において、コーティングが複数の層を含む場合、この層は均一又は不均一であることができる。１例として、１層を熱応答性ポリマーで作製することができ、別の層をｐＨ応答性ポリマーで作製することができる。表面の熱応答性又はｐＨ応答性ポリマーコーティングは、担体表面からの培養した細胞の簡単な遊離を容易にすることができる。
【００３８】
細胞を成長させるための担体を作製する方法の例は、複数の平らな薄膜を提供する段階と、平らな薄膜を貼り合わせて固体支持体を形成する段階とを含む。固体支持体を、エンボス加工、注型熱成形又は射出成形などの方法に供して、構造的なくぼみを形成させる。いくつかの実施形態において、固体支持体をエンボス加工して構造的なくぼみを形成し、エンボス加工した固体支持体を作製し、この支持体をさらにプラズマ処理してプラズマ処理したエンボス加工固体支持体を形成し、その後にプラズマ処理したエンボス加工固体支持体を、複数の部分若しくは断片に切断又はダイシングして複数の担体を形成する。１例では、固体支持体のエンボス加工は、型を使用して実施される。
【００３９】
１例では、細胞を成長させるための担体を作製する工程は、一般的に図３に例示される。この工程は、２つの代替的な方法、方法（１）及び方法（２）を含む。方法（１）２２は、エンボス加工の型を作る段階２４と、ロールから薄膜を切断する段階２６と、その後に薄膜をエンボス加工する段階２８とを含み。エンボス加工した薄膜をプラズマ処理３０に供して、プラズマ処理したエンボス加工薄膜を形成する。次いで場合によっては、エンボス加工した薄膜を、薄膜の反対側上でプラズマ処理３２して、処理の均一性をより良くする。次いでプラズマ処理したエンボス加工薄膜を、複数の担体へとダイシングし又は別の方法で切り離す３４。
【００４０】
方法（２）も、エンボス加工した型を作る段階３８と、ロールから薄膜を切断する段階４０と、その後に薄膜をエンボス加工する段階４２を含む方法３６を含むことができる。エンボス加工した薄膜を、切断若しくはダイシングする又は別の方法で切り離して、エンボス加工した断片を生成する４４。次いで、その断片を篩にかけてサイズ分布を狭くする４６ことができる。次いで、水又は水とイソプロピルアルコールの混合物などの洗浄液を用いて担体を洗浄して、微粒子を取り除き、その後乾燥させる４８。次いで、表面処理の均一性を確保するために混合５２しながら、担体をバルクでプラズマ処理５０に供して、プラズマ処理したエンボス加工担体を形成する。方法（１）及び（２）（上述の２２及び３６）を改変して、製造段階の一部若しくは全てに対してロールツーロール操作を使用して大規模に担体を製造することができる。例えば、エンボス加工又は構造生成段階はロールツーロール操作に拡大することができ、プラズマ処理操作は、ドラム方式処理器中で、バルクで行うことができ、切り離しは、ロールツーロール又はシート供給打抜き操作によって行うことができる。
【００４１】
担体を作製する方法の別の例は、最初に２枚の平らなポリマー薄膜を提供することを含む。本方法は、例えばエンボス加工して、２枚のエンボス加工したポリマー薄膜（それぞれ１方の側をエンボス加工した）を作製することによって、２枚の平らなポリマー薄膜上で２枚の各薄膜の少なくとも１つの表面に１以上の構造的なくぼみを別々に形成し、外側を向いている表面が１以上の構造的なくぼみを含むように２枚のエンボス加工したポリマー薄膜を背中合わせに一緒に積層して、複合積層エンボス加工ポリマー薄膜を形成することをさらに含む。次いで積層したエンボス加工ポリマー薄膜をダイシングして、複数の無処理担体を形成することができる。次いで無処理担体をプラズマ処理で処理して、複数のプラズマ処理した担体を形成する。あるいは、構造的なくぼみを作製するには、平らなポリマー薄膜を注型熱成形若しくは射出成形に供することができ、又はバルクポリマーを溶液中に作製し、型上に注型して、構造的なくぼみを持つ薄膜を形成することもできる。
【００４２】
以下の方法のうちの１以上によって、構造的なくぼみを担体に形成できる。１例として、ロールツーロール工程において、型押ししたロールを使用して、加熱したポリマー薄膜上に構造的なくぼみを作製する。別の例として、金属ブロックに所望のくぼみの雌型を切削又は機械加工することによって、平らな型を作る。次いで、金属ブロックはそのまま使用することができ、又は例えばポリマー注型工程を使用して最初に雄型として、次いで雌型として複製することもできる。次いで、バッチスタンプ又は熱エンボス加工工程において、雌型を使用してポリマー薄膜に模様をエンボス加工できる。別の例として、このように溶剤注型工程において形成した型を使用して、構造的なくぼみを持つポリマー薄膜を作製できる。ポリマー溶液を型又は型押したロールにコートし、乾燥及び／又は硬化させることができる。次いで乾燥／硬化した薄膜を剥ぎ取って、所望の構造的なくぼみを持つ薄膜を得る。熱成形又は射出成形などの代替方法も使用できる。
【００４３】
本発明の細胞培養システムは、細胞を成長させるための１以上の担体を使用する。一実施形態において、細胞培養システムはバイオリアクタであり、より具体的には撹拌されているバイオリアクタである。本明細書において言及するように、バイオリアクタは、細胞成長を補助するどんな装置又はシステムも意味することができる。一態様において、バイオリアクタは、細胞培養又は組織工学において成長細胞又は組織用の装置又はシステムを意味することができる。バイオリアクタは、内部回転翼若しくはへらによって、外部から培養容器を揺動、回転若しくは振盪することによって、又は液体の送風誘発運動によって生成する撹拌を利用できる。バイオリアクタは、例えば、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）などの揺動若しくは回転運動を備える反応装置、撹拌槽型バイオリアクタ、流動床バイオリアクタ、固定床バイオリアクタ、ローラーボトル又はエアリフトバイオリアクタであることができる。
【００４４】
Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）は培養液を含有する容器を支持する揺動台を含み、培養液は培地に細胞を含む。台の搖動運動は、培養液に混合と物質輸送を誘発する。撹拌槽型バイオリアクタは一般に回転翼システム及び場合によって散布システムを含み、培養を混合し曝気する。エアリフトリアクタは上昇する気泡を利用して、培地を混合し曝気する。物質移動、混合効率及び細胞が受ける剪断ストレスなどの流体力学的な因子は、異なる型のバイオリアクタでは異なり得る。加えて、細胞成長速度及び細胞の質は、反応装置型の間の操作上の相違に左右される場合がある。
【００４５】
付着細胞を培養する方法の例は、バイオリアクタ内に成長細胞用の１以上の担体を提供し、培地を添加し、担体に細胞の接種原を添加し、担体に細胞を付着させ、担体を連続的又は断続的に培地中に懸濁し、担体上で細胞を成長させることを含む。細胞は、培養フラスコ中で成長させた後に、担体に添加することができる。細胞は、例えば、血液、骨髄又は組織切片から抽出した後に担体上で成長させることができる。いくつかの他の実施形態において、担体は、スピナーフラスコ、積み重ねた培養フラスコ、撹拌槽型反応装置、Ｗａｖｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）又は他のいずれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養システムにも導入することができる。
【００４６】
各種方法によって、培養した細胞を担体から分離又は遊離することができる。例えば、機械的方法、酵素、熱応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー又はその組合せを使用することによって、細胞を遊離させることができる。機械的方法による細胞遊離は、細胞をかき集めることを含む。トリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて処理することによって、細胞を遊離させることもできる。非酵素的な方法の１つは、ＥＤＴＡなどのカルシウムキレート剤を使用する。非酵素的な他の方法には、細胞の剥離を容易にする泡を生成する超音波を使用する物理的な方法があるが、これに限定されない。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）などの熱応答性のポリマーを含む担体から培養された細胞は、ＬＣＳＴ以下の温度に担体を冷却することによって遊離させることができる。
【００４７】
本発明の担体を使用して、初代細胞、幹細胞及び細胞系など様々な付着細胞を成長させることができる。いくつかの実施形態において、付着細胞は、ｈＭＳＣなど剪断感受性細胞である。細胞は、ヒト組織、例えば、脂肪組織、骨髄又は臍帯血から得ることができる。高純度、高効率及び高収量での複数性並びに多能性細胞の培養及び遊離は、現在研究されており臨床的必要性がある。
【００４８】
担体をバイオリアクタ又は培養容器と組み合わせて使用して、接着依存性細胞が付着し成長するための表面領域を提供し高めることができる。本発明の細胞培養用のキットのいくつかの実施形態は、１以上の担体を予め組み込んだ使い捨ての筐体又は容器を含む。一実施形態において、担体及び使い捨ての筐体又は容器を別々に提供することができる。一実施形態において、筐体は再使用することができる。筐体は、例えば、袋、フラスコ、タンク、チューブ、ペトリ皿又は瓶であることができる。キットは、細胞成長に適した培地をさらに含むことができる。キットは、凍結状態の細胞を含むことができ、担体を使用するための手順をさらに含むことができる。
【００４９】
実施例１  細胞を成長させるための担体の製作
模様原版を作製する方法−樹脂に結合させたダイヤモンドの刃を備えたダイシングソーを使用して、平らなアルミニウムブロックに溝を切削することによって、模様原版を作った。一組の平行溝（この用語は「くぼみ」と互換的に使用される）が、最初に１方向に切削され、次いで第２の一組の平行溝が最初の組の溝に対して垂直に切削された。最終的に、切削工程の間に溝の最初の組において形成されたばりを取り除く取り組みが行われた。溝が完成した後、アルミニウムブロックを清掃して、その表面上にあるあらゆるばりを取り除いた。模様原版が、エンボス加工した担体の模様幾何学的配置を決定した。
【００５０】
模様原版からの第１世代の型の形成−次いで、フルオロシリコーンゴム、ＦＳＬ７６６１（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｗａｔｅｒｆｏｒｄ、ＮＹから購入した）を使用して、模様原版から第１世代の型を作製した。第１世代の型を製造するために、製造業者の指示に従ってＨａｕｓｃｈｉｌｄ  ＳｐｅｅｄＭｉｘｅｒを使用して、２成分のフルオロシリコーンコンパウンドを１：１の比率で混合した。くぼんだテフロン(登録商標）ブロック内に模様原版を置き、模様原版の表面に過剰量の未硬化フルオロシリコーンを加えた。クロムメッキした鋼鉄製のプレートをフルオロシリコーンの上に置き、加熱した水圧プレス機で４０００ポンドの力で、１７０℃で３０分間フルオロシリコーンを硬化させた。室温に冷却後、硬化したフルオロシリコーンゴム系第１世代の型を、模様原版から取り外し空気中で、２００℃で終夜硬化させた。
【００５１】
模様原版からの第２世代の型の形成−次いで上述のように、シリコーンゴム成形コンパウンド、ＲＴＶ６６４（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｗａｔｅｒｆｏｒｄ、ＮＹから購入した）を使用して、第１世代の型から２つの第２世代の型を作った。製造業者の指示に従ってＨａｕｓｃｈｉｌｄ  ＳｐｅｅｄＭｉｘｅｒを使用して、シリコーンコンパウンドを１０：１の比率で混合した。模様表面を上にして第１世代の型を鋼鉄製のフレーム内に置き、第１世代の型の上に過剰量のシリコーンコンパウンドを分注した。平面ステンレス鋼プレートをシリコーンの上に置き、加熱した水圧プレス機で１０００ポンドの力で、１２０℃で３０分間シリコーンを硬化させた。室温に冷却後、硬化したシリコーンゴム第２世代の型を、フルオロシリコーンの第１世代の型から取り外した。
【００５２】
エンボス加工したポリスチレンシートを作製する方法−複数枚の二軸延伸ポリスチレン薄膜（Ｔｒｙｃｉｔｅ  １００３Ｕ、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、模様が内側を向いた状態にある２つの第２世代の型の間に置いた。ポリスチレンの体積が、第２世代の型の中の模様を満たし、型を隔てる少量のポリスチレンがさらに残るのに十分であるように、複数の薄膜を選択した。次いで加熱した水圧プレス機で１０００ポンドの力で、５分間で１５０℃にまで増加させる温度サイクルで薄膜をエンボス加工し（２８、図３）、次いで６０℃以下に冷却した。エンボス加工工程は、複数枚の薄膜を、型及び模様原版の押し型を両面に複製した単一の一体構造に融合した。室温に冷却後、エンボス加工したポリスチレン薄膜を型から取り外した。
【００５３】
エンボス加工した薄膜表面の化学的処理−細胞成長適合性を持つエンボス加工したポリスチレン薄膜を作製するために、図３で述べたとおりＰｌａｓｍａ  Ｔｈｅｒｍ  ＳＬＲ真空プラズマ反応装置を使用して、薄膜をＯ2プラズマ処理した（３０、図３）。１００ｓｃｃｍ（１分当たりの標準立方センチメートル）のＯ2フロー及び反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）モードで１００Ｗの表面無線周波数（ｆｏｒｗａｒｄ  ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）（ＲＦ）電力を使用して、１００ｍｔｏｒｒの圧力で１分間、エンボス加工した薄膜の両側面にプラズマ処理を実施した。
【００５４】
薄膜をダイシングして担体を生成する−薄膜を５ｍｍ×５ｍｍ片若しくは２ｍｍ×２ｍｍ片に手作業で切断することによって、又は切り離し（４４）その後に篩にかけて（４６）特定のサイズ範囲を選択することによって、又は所望のサイズの円盤を打ち抜くことによって、プラズマ処理したエンボス加工シートから細胞培養用の担体を作った。
【００５５】
担体製作工程の変法−いくつかの実例では、アルミニウムブロックの代わりにセラミックブロックを使用して模様原版を作製した。樹脂に結合させたダイヤモンドの刃を備えたダイシングソーを使用して、平らなアルミナブロックに溝を切削することによって、模様原版を作った（９９．６％アルミナ、焼き入れされ、Ａｃｕｍｅｔにより２０〜２５μｍに研磨した）。一組の平行溝が、最初に１方向に切削され、次いで第２の一組の平行溝が最初の組の溝に対して垂直に切削された。模様原版の幾何学的配置が、最終的にエンボス加工した担体の模様幾何学的配置を決定した。セラミックブロックが使用される場合、第１世代の型は少し違えて作られた。テフロン(登録商標）ブロックの代わりに、鋼鉄製のフレームを使用してセラミック模様原版を保持した。より高い温度１７０℃で１５分間、次いで２００℃で１５分間、硬化を実施した。残りの手順は、上記と同じままだった。
【００５６】
いくつかの例では、フルオロシリコーン第１世代の型を、ＲＴＶシリコーン第１世代の型と置きかえた。後述するように手順を修正した。そして、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ製のシリコーンゴム成形コンパウンド、ＲＴＶ６６４を使用して、模様原版から第１世代の型を作製した。第１世代の型を製造するために、製造業者の指示に従ってＨａｕｓｃｈｉｌｄ  ＳｐｅｅｄＭｉｘｅｒを使用して、シリコーンコンパウンドを１０：１の比率で混合した。くぼんだテフロン(登録商標）ブロック内に模様原版を置き、模様原版の表面の全体に、過剰量の未硬化シリコーンコンパウンドを加えた。クロムメッキした鋼鉄製のプレートをシリコーンの上に置き、加熱した水圧プレス機で１０００ポンドの力で、１２０℃で３０分間シリコーンを硬化させた。室温に冷却後、硬化したシリコーンゴム第１世代の型を、模様原版から取り外した。第１世代の型を、（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシランを用いて、７５０ｍｔｏｒｒで４５分間真空蒸着することによってコートした後に、任意の第２世代の型を作製する。上記の製作手順を使用して異なるデザインの細胞担体を作製した。本発明のエンボス加工した細胞担体は、代わりの壁形状を持つ担体を含むことができる。例えば、長方形の壁を持つ担体は図４Ａに示すように作製され、断面が三角形の壁を持つ担体は図４Ｂに示すように作製された。
【００５７】
実施例２  担体上での細胞培養及びその後の細胞の遊離
細胞担体−以下の実施例において使用した担体は、長さ及び幅５ｍｍ、並びに高さ約０．５ｍｍを有した。担体は、２つの外表面のそれぞれに複数の構造的なくぼみを含んだ。構造的なくぼみのそれぞれは、長軸及び短軸各０．４５ｍｍ並びに深さ０．２ｍｍを有した。
【００５８】
細胞培養−細胞培養用の担体を使用して、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、ＡＴＣＣ）、ＭＤＣＫ（メイディンダービーイヌ腎臓細胞、ＡＴＣＣ）、ＭＲＣ−５（ヒト肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ）及びｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）細胞を培養及び遊離させた。これらの細胞は、以下の培地を使用してポリスチレン表面上で日常的に培養された。Ｆ−１２Ｋ（ＥＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％ＦＢＳ。培養方法は、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中、３７℃で実施された。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を用いて細胞層を軽くゆすぐ段階と、その後に培養フラスコに０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン３．０ｍＬ及び０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加する段階と、細胞層が分散するまで倒立顕微鏡で細胞を観察する段階とを実施することにより、細胞を継代した。その後、完全成長培地７ｍＬを細胞及び培地に添加し、穏やかに数回ピペット操作して細胞を混合した。細胞懸濁液の適切なアリコートを、新鮮な培地を含む新しい培養容器に移した。
【００５９】
以下の実験に使用した細胞は、加湿した５％ＣＯ2雰囲気のインキュベータ内で、３７℃で成長させた後に、細胞培養フラスコから新たに前培養され回収された。静置細胞培養試験の場合、ウェル当たり１ｍＬの成長培地を含む２４穴プレートに、２０００細胞／ｃｍ2となるように、前培養した細胞を播種した。組織培養処理したプレート（ＴＣＰＳ表面、Ｎｕｎｃ）及び／又は非接着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）製）を対照として使用し、非付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））に、本発明のエンボス加工した円盤形ポリスチレン担体を、ウェルにぴったりと収まるように嵌入させた。撹拌槽型反応器（ＳＴＲ）内の担体上の動的条件下で成長させた細胞の場合、１２５ｍＬの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））内の担体に、２０００細胞／ｃｍ2となるように、前培養した細胞をまた播種した。細胞及び担体を、撹拌サイクルを調節するためにタイマーに接続したスピナー底部で６０回転数／分で攪拌した。連続的に又は断続的に細胞を撹拌した。断続的条件では、例えば、撹拌機は１サイクルにつき１分間スイッチを入れ、４５分間スイッチを切った。
【００６０】
トリプシンによる細胞の遊離−細胞が約８０〜９０％コンフルエントのとき、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０分未満）によって回収した。細胞を成長表面から遊離させた後、１０％血清を含有する培地を少なくとも同量添加することによってトリプシンを中和した。細胞を回収した後に、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）自動細胞計数器（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ製）を使用して、細胞数及び細胞生存率を測定した。
【００６１】
細胞成長の質的な及び定量的な評価
細胞染色及び画像化−画像化用のサンプルを、室温で４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定し、パラホルムアルデヒドは琥珀色のガラス瓶中にアルゴン存在下で保管されている１６％ストックから新たにＰＢＳに希釈した。一旦固定したら、染色し、画像化するまで４℃でサンプルを保管した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤（シグマ）を用いて透過化処理した後に、固定化細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて染色して核を強調し、ファロイジン−Ａｌｅｘａ−５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて細胞骨格（アクチン）を可視化した。染色した細胞を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ倒立蛍光顕微鏡で画像化し、顕微鏡には使用する蛍光団に適切なフィルターキューブ及び光源を取り付けた。
【００６２】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）による細胞生存率の測定−担体のサンプルを採取し、総ＡＴＰ含有量を測定する又は蛍光顕微鏡用に固定及び染色することによって、間隔をおいて細胞の成長及び形態を評価した。Ｐｒｏｍｅｇａ製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ試薬によって、細胞成長をアッセイした。この試薬は、代謝的に活性な細胞の存在を表すＡＴＰの存在の定量に基づいて培養液中の生細胞数を決定する。その工程は、血清を補充した培地中で培養した細胞に単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標））を直接添加することを含む。均一な試薬は、細胞を溶解し、存在するＡＴＰ量に比例した発光信号を生成する。ＡＴＰの量は、培養液中に存在する細胞数に正比例する。アッセイには耐熱性ルシフェラーゼを利用し、この酵素はＭｇ+2、ＡＴＰ及び分子酸素の存在下にルシフェラーゼによって触媒されたオキシルシフェリンから発生する安定した「グロー型（ｇｌｏｗ  ｔｙｐｅ）」発光信号を生成する。細胞を溶解させた１０分後に、細胞可溶化物２００μＬアリコートを不透明な９６穴プレートに移し、穏やかに混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）発光マイクロプレートリーダーに読み込んで、細胞生存率の測定値を生成した。このアッセイの発光測定値は、サンプル中に存在する生細胞数に比例しており、そのため細胞成長の進展をモニタリングするために使用することができる。
【００６３】
実施例３−ヒト間充織間質細胞（ｈＭＳＣ）成長の特徴づけ
ｈＭＳＣ−この実験で使用するｈＭＳＣは、Ｌｏｎｚａ（品番ＰＴ−２５０１）（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ｈＭＳＣを、撹拌槽型反応器（ＳＴＲ）内の担体（本明細書において「エンボス加工した担体」と互換的に使用される）上で成長させた。図５Ａは１日目（５６、５８）、４日目（６０、６２）、７日目（６４、６６）及び９日目（６８、７０）における細胞の成長を示しており、培養液中の細胞数の経時的な増加を明確に表している。細胞は、エンボス加工した担体のくぼみの上部及び底部両方で成長することが観察された。図５Ａは、くぼみの上部より底部において高い細胞成長をさらに例示している。２つの異なる型のスピナーフラスコ、１つはＣｏｒｎｉｎｇ製及びもう１つはＷｈｅａｔｏｎ製（Ｍａｇｎａ−Ｆｌｅｘ（登録商標））中のエンボス加工した細胞担体上で細胞を成長させた。陽性対照として、静置培地で組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上に細胞を成長させた。
【００６４】
実施例４−ｈＭＳＣ成長の定量的推定
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）測定値によって及び質的には画像化によって、細胞成長をモニタリングした。図５Ｂに示すように、ＳＴＲ内の担体上でのｈＭＳＣの成長速度は、ＴＣＰＳ上と同等である。細胞の発光は細胞数を表し、発光は経時的な細胞数の増加に伴って増加している（図５Ｂ）。従って図５Ｂにおいて、５０時間未満の倍加時間で１１日間、本発明の担体上でのｈＭＳＣの強い成長が実証されている。
【００６５】
実施例５−様々な供給元からのｈＭＳＣの成長の特徴づけ
担体が、様々な供給元／ドナーに由来するｈＭＳＣの成長を支持することを実証するために、さらに２社からｈＭＳＣを調達した−（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（登録商標）  Ｌｏｎｚａ細胞は実施例３及び４に参照されている、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（品番Ｃ−１２９７４）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（品番ＳＣＲ１０８））。図６はｈＭＳＣの強い細胞成長を実証しており、細胞はＰｒｏｍｏｃｅｌｌ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し、ＳＴＲ内で培養させた。成長は静置条件で、ＴＣＰＳ上で成長させた細胞と同等である。
【００６６】
実施例６−大規模培養におけるｈＭＳＣ成長の特徴づけ
ｈＭＳＣ培養を、５００ｍＬの培地を含む１Ｌスピナーフラスコに拡大した。図７は、約８５時間の倍加時間で１２日間、ｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ、品番ＰＴ−２５０１）の強い成長を示している。
【００６７】
実施例８−メイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞成長の特徴づけ
メイディンダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）−複数のくぼみ（又は「エンボス加工した担体」）を含む担体上でのＭＤＣＫ細胞の成長が図８Ａ及び８Ｂに示されている。図８Ａは、担体のくぼみの上部（７２、７４、７６）及び底部（７８、８０、８２）で成長しているＭＤＣＫ細胞を示している。細胞数は、２４時間〜１６８時間まで経時的に増加している。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）発光アッセイによるＭＤＣＫ成長の定量的測定が、図８Ｂに提示されている。比較例として、ＭＤＣＫ細胞を、断続的に撹拌するＳＴＲ内の平らなポリスチレン担体（くぼみなし）上で成長させた。対照として、静置ウェルプレート（ＴＣＰＳ）内の、及び静置条件で平らな担体上での細胞数も、図８Ｂに示されている。図８Ｂに示すように、エンボス加工した担体（図８Ｂにおいて「エンボス加工した−ＳＴＲ」と示した）上でのＭＤＣＫ細胞成長は、平らなポリスチレン担体（図８Ｂにおいて「平らな担体−ＳＴＲ」と示した）上の成長より、著しく高かった。
【００６８】
実施例９−ヒト肺線維芽細胞の細胞成長の特徴づけ
ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５）−上述のとおり類似の実験を、ＭＲＣ−５細胞を用いて実施した（図９Ａ）。図９Ａにおいて、担体のくぼみの上部（８４、８６、８８）及び底部（９０、９２、９４）におけるＭＲＣ−５細胞成長の質的な測定が提示されている。細胞数は、２４時間（８４及び９０）〜１６８時間（８８及び９４）まで経時的に増加している。細胞成長の定量的測定は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）発光（上記実施例にて説明したとおり）として図９Ｂに提示されている。比較例として、ＭＲＣ−５細胞を、断続的に撹拌するＳＴＲ内の平らなポリスチレン担体（くぼみなし）上で成長させた。対照として、静置ウェルプレート（ＴＣＰＳ）内の、及び静置条件で平らな担体上での細胞数も、図９Ｂに示されている。図９Ｂに示すように、本発明のエンボス加工した細胞担体上の細胞成長は、平らなポリスチレン細胞担体上より大きい。
【００６９】
実施例１０−チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞成長の特徴づけ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−類似の細胞成長実験を、本発明の担体上でＣＨＯ細胞を使用して実施した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。図１０Ａに示すように、細胞を、１日（９６）、４日（９８）、８日（１００）後及びトリプシン処理後（１０２）に画像化した。０．２×１０6個の細胞を、０日目（ゼロ）に播種した。図１０Ａに示すように、細胞数は経時的に増加し、トリプシン処理後の細胞回収は約１３×１０6個であった。標準的な方法であるトリプシン処理によるエンボス加工した担体からのＣＨＯ細胞の効果的な遊離も、図１０Ａに示されている。本発明のエンボス加工した担体は、他の市販の担体と比較して、より良好な細胞遊離を示した（データ不掲載）。スピナーフラスコ内のエンボス加工した細胞担体上、静置ウェルプレート内、及び静置ウェルプレート内でのＴＣＰＳ上のＣＨＯ細胞成長も、図１０Ｂに量的に示されている。これら異なる３条件における細胞成長はそれぞれ同等であり（図１０Ｂ）、図１０Ｂに示すとおり、ＣＨＯ細胞は約２１時間の倍加時間で８日間に約６７倍の増殖を伴う強い細胞成長を示した。
【００７０】
表現型及び機能的アッセイ
本発明の担体上で成長したｈＭＳＣがバイオリアクタ中で増殖した後もその表現型を維持していることを実証するために、脂肪細胞及び骨形成分化アッセイによって表現型の特徴づけを行った。フローサイトメトリーによって表面マーカープロファイルも特徴づけられた。
【００７１】
実施例１１−脂肪細胞分化アッセイ
脂肪生成−脂肪生成を示すために、ＭＳＣを、細胞を培養するために上で使用したのと同じ成長培地、Ｌｏｎｚａ  ＭＳＣＧＭ（品番ＰＴ−３００１）を用いて２０００〜３０００細胞／ウェルとなるようにサンプル当たり３〜６ウェルで、９６ウェルプレートに播種し、細胞が１００％コンフルエントになるまで成長させた。成長培地を、脂肪細胞誘導培地（Ｌｏｎｚａ、品番ＰＴ−３００４）と置きかえて３７℃で３〜４日間インキュベートした。その後、脂肪細胞誘導培地を、維持又は成長培地（Ｌｏｎｚａ）と置きかえて３７℃で３〜４日間インキュベートした。これらの２つの段階をさらに２回繰り返した。維持培地が添加され、３日目に培地を置きかえ、７日間インキュベートした。得られた脂肪細胞を、ナイルレッドを用いて染色した。陰性対照として、ＭＳＣを維持培地中で維持した。培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を添加して、５分間細胞を固定した。５分後にＰＦＡを取り除き、ナイルレッド及びＨｏｅｃｈｓｔ染色バッファを添加し、その後３０〜６０分間インキュベーションした。ＤＭＳＯ中に１：１０００の比（１ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液）のナイルレッドストック、１：１０００の比のＨｏｅｃｈｓｔバッファ溶液、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を使用してリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中にバッファを調製した。ウェル当たり０．２ｍＬのＰＢＳを添加することにより、細胞をＰＢＳで２回すすいだ。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ倒立蛍光顕微鏡を用いてＤＡＰＩ及びＣｙ３染色を使用して細胞を画像化した。図１１Ｂで示すように、対照ＭＳＣに対して脂質の蓄積を表している赤い液胞を図１１Ａは示している。液胞内の脂質の蓄積は、バイオリアクタ条件でこれらの担体上で成長した細胞が、ＭＳＣに求められる特性である脂肪細胞に分化する能力を保持していることを表している。Ｌｏｎｚａ製のｈＭＳＣをこの実験に使用した。実施例３に記載したとおり細胞を成長させた。
【００７２】
実施例１２  骨形成性分化アッセイ
骨形成−２０〜３０ｋ／ウェルの濃度で、３つ組で２４ウェル組織培養プレートにＭＳＣを播種し、細胞を成長培地中で、３７℃で終夜培養した。成長培地を骨形成誘導培地と置きかえ、３日毎に細胞に同じ培地を供給した。この手順を２〜３週間続けた。紡錘形から立方体形状への形態変化が注目された。カルシウム含量が、以下の方法によって測定された。細胞をＣａ２＋を含まないＰＢＳで洗浄し、０．５Ｍ  ＨＣｌ  １００μＬを添加して、細胞を均一に溶解し、７０μＬアリコートを９６−ウェルプレートに添加した。呈色試薬１００μＬ、続いて塩基性試薬１００μＬ（ＳＴＡＮＢＩＯ、Ｃａｔ＃０１５０−２５０、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｌｏｒ）を添加した。試薬を混合し、１分間インキュベートした。試薬混合後６０分以内に、５５０ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ）を測定した。図１２は、分化した骨形成細胞のカルシウム含量が対照細胞より約７倍高いことを示している。分化した細胞におけるカルシウム含量の増加は、これら担体上で成長したＭＳＣが、ＭＳＣと定義される細胞に求められる造骨細胞の表現型に分化する能力を保持していることを表している。
【００７３】
実施例１３  −フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によるＭＳＣの特徴づけ
ｈＭＳＣは、いくつかの表面タンパク質マーカーを発現しており同時にいくつかの他のマーカーを欠いていると期待される。陽性マーカーにはＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ７３を含み、陰性マーカーはＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ１９、ＣＤ４５及びＣＤ３が挙げられる。各マーカー用として、アッセイは試験管に１５０，０００個以上の細胞を含有した。ＰＢＳ及び１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で、４℃で３０分間、細胞をブロッキングした。以下の細胞表面マーカーに対する抗体を使用した。ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ１９及びＣＤ３１。実施例３に記載の条件を使用して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のｈＭＳＣ（品番ＳＣＲ１０８）を、静置Ｔ型フラスコ（対照）中で、又はスピナーフラスコ中のエンボス加工した担体上で成長させた。トリプシンを用いて回収した後、細胞を標識抗体と一緒にＰＢＳ及び１％ＮＧＳ中で、４℃で１時間インキュベートし、次いで遠心分離して細胞をペレット化することによってＰＢＳ及び１％ＮＧＳで洗浄した。ペレットを１５０μＬ  ＰＢＳ及び１％ＮＧＳバッファに再懸濁した。製造業者（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００ＭＰＬ）の指示に従って、フローサイトメーターで細胞を分析した。ｈＭＳＣ及び製造業者の成長培地がＭｉｌｌｉｐｏｒｅから供給されており、細胞を実施例５に記載のとおり成長させた。
【００７４】
ＦＡＣＳ分析の結果を下の表１に示しており、バイオリアクタ条件のエンボス加工した担体上で成長したＭＳＣが、これら細胞に求められるものと一致するマーカープロファイルを示した（Ｔ型フラスコ中の静置条件下で成長した対照細胞によっても示された）ことを表している。表の最上列は、ＦＡＣＳでアッセイした特定の標識を表している。プラス（＋）記号はそのマーカーが存在した（＞９０％）ことを表し、マイナス（−）印は検出されなかった（＜５％）マーカーを表している。細胞の＞９０％において発現が観察された場合、上記６つの陽性マーカーの発現は陽性であることを意味し、細胞の＜５％について発現が観察された場合、５つの陰性マーカーを意味した。
【００７５】
【表１】
0006002146.tif 000002
本明細書においては、本発明の特定の特徴しか例示及び記載されていないが、多くの変更及び改変が当業者に見出されることになる。従って、添付の請求の範囲が、全てのそのような変更及び改変を本発明の範囲に該当するものとして保護することを目的としていることが理解されよう。
【符号の説明】
【００７６】
２  担体
４  長さ
６  幅
８  高さ
１０  壁厚
１２  深さ
１４  長軸
１６  短軸
１８  上表面の構造的なくぼみ
２０  下表面の構造的なくぼみ
２２  方法１
２４  エンボス加工の型を作る
２６  ロールからの薄膜の切断
２８  エンボス加工
３０  プラズマ処理
３２  反対側のプラズマ処理
３４  担体の打ち抜き／切断
３６  方法２
３８  エンボス加工した型を作る
４０  ロールからの薄膜の切断
４２  エンボス加工
４４  エンボス化した担体の切り離し
４６  狭いサイズ分布に篩かけ
４８  担体の洗浄、微粒子除去、乾燥
５０  プラズマ処理
５２  混合
５４  繰り返し
５６  １日目
５８  １日目
６０  ４日目
６２  ４日目
６４  ７日目
６６  ７日目
６８  ９日目
７０  ９日目
７２  担体のくぼみの上部
７４  担体のくぼみの上部
７６  担体のくぼみの上部
７８  担体のくぼみの底部
８０  担体のくぼみの底部
８２  担体のくぼみの底部
８４  担体のくぼみの上部２４時間
８６  担体のくぼみの上部９６時間
８８  担体のくぼみの上部１６８時間
９０  担体のくぼみの底部２４時間
９２  担体のくぼみの底部９６時間
９４  担体のくぼみの底部１６８時間
９６  １日後
９８  ４日後
１００  ８日後
１０２  トリプシン処理後
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006002146.tif 000008
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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