(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託されたハイブリドーマから生産される、単クローン抗体ＭＤ−３。
【請求項２】
重鎖および軽鎖を含む、ヒトＩＣＡＭ−１に結合する単クローン抗体であって、
前記重鎖は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の重鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
前記軽鎖は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の軽鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体。
【請求項３】
受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託されたハイブリドーマから生産されるＭＤ−３抗体由来のキメラ形態またはヒト化形態である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託された、ハイブリドーマ細胞。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単クローン抗体を含む、薬学組成物。
【請求項６】
前記単クローン抗体は、単離された形態である、請求項５に記載の薬学組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単クローン抗体を有効成分として含む薬学組成物であって、ＩＣＡＭ−１ドメイン２への結合および抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導により樹状細胞の分化および機能を調節するための薬学組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単クローン抗体を有効成分として含む、Ｔ細胞媒介免疫疾患を予防または治療するための薬学組成物。
【請求項９】
前記Ｔ細胞媒介免疫疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患または自己免疫疾患である、請求項８に記載の薬学組成物。
【請求項１０】
ＩＣＡＭ−１ドメイン２への結合および抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導により樹状細胞の分化および機能を調節することに用いるための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単クローン抗体。
【請求項１１】
Ｔ細胞媒介免疫疾患を予防または治療することに用いるための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単クローン抗体。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞媒介免疫疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患または自己免疫疾患である、請求項１１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の機能および分化を調節し、移植片生存を延長させることができる、ヒト細胞間接着分子−１（ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ−１、ＩＣＡＭ−１）に結合する抗体に関するものである。また、本発明は、前記抗体を含む薬学組成物、および免疫疾患を治療するためにこれらを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ、ＤＣ）は、多様な免疫反応を統合させる高度に特性化された抗原提示細胞であり（Ｎａｔｕｒｅ．１９９８、３８２：２４５−２５２）、免疫の開始および免疫寛容に関連する専門的な抗原提示細胞の異種ファミリーを含む。現在まで、未成熟樹状細胞はＴ細胞をアナジー（ａｎｅｒｇｙ）に誘導することが知られているのに対し、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のような活性刺激剤によって成熟樹状細胞に転換された樹状細胞は一次Ｔ細胞反応を誘導すると考えられてきた（Ｂｌｏｏｄ．２００６、１０８：１４３５−１４４０）。また、独特のサイトカイン生産プロファイルを有する準成熟樹状細胞は免疫寛容性機能を付与されうる（Ｂｌｏｏｄ．２００６、１０８：１４３５−１４４０）。
【０００３】
ＩＣＡＭ−１は、５つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインで構成された、９０ｋＤａのタイプＩ細胞表面糖蛋白質である（Ｃｅｌｌ．１９９０、６１：２４３−５４）。ＩＣＡＭ−１はＴ細胞と抗原提示細胞との間の相互作用のような、白血球／白血球の相互作用を媒介する。また、炎症過程中に組織への白血球の流出を媒介する（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９９、６７：７２９−７３６）。インビトロ研究は、ＩＣＡＭ−１／白血球機能関連抗原−１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−１、ＬＦＡ−１）の相互作用を妨げる抗体がＴ細胞の内皮細胞への接着を妨げることができ、これら抗体によって混合リンパ球反応内でＴ細胞の活性化も有意に減少できることを示した（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８８、８５：３０９５−３０９９）。ヒトＩＣＡＭ−１のドメインに結合するマウスの単クローン抗体であるＲ６−５−Ｄ６（エンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ））を用いた猿の研究では、腎臓同種移植片生存期間が延長し、移植片内へのＴ細胞の浸透が対照群と比較して減少した（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、１４４：４６０４−４６１２）。また、エンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）は、リウマチ性関節炎患者において疾患活性を抑制させる効果があることが裏付けられた（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９４、３７：９９２−９９９；Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９６、２３：１３３８−１３４４）。しかし、多機関のランダム研究によれば、腎臓移植後のエンリモマブ誘導治療は、急性拒絶反応の割合または移植片機能遅延の危険性を低減させることができなかった（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９９、６７：７２９−７３６）。また、急性虚血性脳卒中の患者における臨床試験は、エンリモマブによる抗ＩＣＡＭ−１療法が効果的でなく、脳卒中の経過を実際に有意に悪化させ、プラシーボ（ｐｌａｃｅｂｏ）と比較した時、より多くの副作用、一次感染および熱を誘導することを示した（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００１、５７：１４２８−１４３４）。エンリモマブはＴ細胞だけでなく、好中球の血管内皮細胞への接着を遮断する機能を果たし、このため、好中球の移動を妨げることは、潜在的に感染に対する感受性を増加させることが報告された（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９、１６２：２３５２−２３５７）。
【０００４】
他の抗ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）であるＭＤ−２は、組織移植拒絶反応を抑制することが知られている（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１０−０１６８３９４−Ａ１）。Ｒ６−５−Ｄ６とは異なり、前記抗体は、ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）のドメインに結合し、ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）とＬＦＡ−１との間の結合を妨げない。その代わりに、前記抗体は、樹状細胞の発達および機能を調節することによりＴ細胞の機能を抑制する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一実施形態は、樹状細胞の機能および分化を調節し、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することにより、Ｔ細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療に効果的な、ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）のドメイン２に結合する抗体に関するものである。また、本発明は、前記抗体を含む薬学組成物を提供する。また、本発明は、Ｔ細胞媒介性免疫疾患を治療するための抗体を含む薬学組成物、Ｔ細胞媒介性免疫疾患の治療に用いるための抗体、および前記抗体を用いてＴ細胞媒介性免疫疾患を治療する方法に関するものである。
【０００６】
より具体的には、本発明は、ヒトＩＣＡＭ−１のドメイン２に結合し、免疫機能の一般的な抑制よりむしろ抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することにより、樹状細胞の分化および機能を調節する抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体に関するものである。そのため、前記抗体の投与は、免疫抑制に伴う副作用、例えば、感染および癌の発達を最少化する一方でＴ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療に効果的であり得る。
【０００７】
また、本発明は、抗体を生産する方法、および抗体またはその断片を生産する細胞に関するものである。また、本発明は、抗体を生産するハイブリドーマ細胞および前記ハイブリドーマ細胞によって生産される抗体を含む。
【０００８】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療のための薬学組成物に関するものである。薬学組成物は、次の群より選択される免疫抑制剤を含む：ＩＣＡＭ−１のドメイン２に結合することができ、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することができ、好ましくは、ハイブリドーマによって生産された抗体；およびＩＣＡＭ−１のドメイン２に結合することができ、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することができる抗体の断片。
【０００９】
さらに、本発明はＴ細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などを予防および／または治療するための方法であって、必要とする患者に対して抗体または抗体の断片からなる群より選択される１つ以上を投与することを含む方法に関するものである。前記抗体または抗体の断片は、好ましくは、単クローン抗体からなる群より選択され、より好ましくは、ヒトまたは動物由来の抗体である。
【００１０】
なおさらに、本発明は、Ｔ細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療に用いられる、ＩＣＡＭ−１のドメイン２に結合することができ、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することができ、好ましくは、ハイブリドーマによって生産された抗体、およびＩＣＡＭ−１のドメイン２に結合することができ、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することができる抗体の断片に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明を、以下の実施例を参考にしてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、いずれの形態であれ本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【００１２】
本発明は、マウス抗ヒトＩＣＡＭ−１単クローン抗体ＭＤ−３（例えば、登録番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託されたハイブリドーマ細胞によって生産されたＭＤ−３）、ＭＤ−３の断片、およびＴ細胞寛容を誘導することができるＭＤ−３のキメラまたはヒト化された形態に関するものである。より具体的には、本発明は、ヒトＩＣＡＭ−１のドメイン２に結合することにより樹状細胞の分化および機能を調節し、免疫機能の一般的な抑制よりもむしろ抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導する、登録番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４で寄託されたハイブリドーマ細胞によって生産された抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体に関するものである。そのため、前記抗体の投与は、免疫抑制に伴う副作用、例えば、感染および癌の発達を最少化するのに対しＴ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療に効果的であり得る。
【００１３】
また、本発明は、抗体またはその断片を生産する方法に関するものである。
抗体またはその断片を生産する方法は、（ａ）ヒトＩＣＡＭ−１蛋白質（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１９２）または蛋白質の断片、あるいはヒトＩＣＡＭ−１を発現する細胞（例えば、活性化されたヒト末梢血液単核球および／またはＤｕ１４５（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８１））で動物を免疫化する段階と、（ｂ）免疫化された動物から脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を抽出する段階と、（ｃ）動物の脾臓細胞を骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞株と融合させる段階と、（ｄ）ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との間の相互作用を妨げないものの、移植された器官の拒絶反応を抑制することだけでなく、樹状細胞の機能および分化を調節することも可能な、好適なハイブリドーマ細胞を選別する段階とを含む。
前記抗体またはその断片は、インビトロ培養によるか、あるいは前記抗体またはその断片を生産する細胞を動物に投与することによって得られる。前記抗体またはその断片は、前記抗体またはその断片を生産する細胞が腹膜内に投与された動物の腹水から得られる。前記抗体またはその断片は、イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性カラムクロマトグラフィーによって培養上澄液または腹水から精製することができる。
【００１４】
また、本発明は、ＭＤ−３抗体を生産するハイブリドーマ細胞を提供し、具体的な一例として、前記ハイブリドーマ細胞は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４の細胞である。
【００１５】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療のための薬学組成物に関するものである。前記薬学組成物は、マウス抗ヒトＩＣＡＭ−１単クローン抗体ＭＤ−３（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４のハイブリドーマ細胞から生産される）、ＭＤ−３の断片、あるいはＭＤ−３のキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）またはヒト化形態からなる群より選択される免疫抑制剤を含む。本発明にかかる抗体またはその断片の投与は、薬学組成物の投与において許容されているあらゆる方式を用いて行われうる。
【００１６】
さらに、本発明は、必要とする患者に対して抗体（例えば、ＭＤ−３）またはその断片からなる群より選択される１つ以上を投与する段階を含む、Ｔ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および／または治療方法に関するものである。好ましくは、前記抗体または抗体の断片は、単クローン抗体からなる群より選択されたものであり、より好ましくは、ヒトまたは動物由来のものである。前記方法は、投与する段階に先立ち、Ｔ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの治療および／または予防を必要とする患者を同定する段階を追加的に含むことができる。
【００１７】
他の実施形態として、本発明は、Ｔ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの治療および／または予防に用いるか、あるいはＴ細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの治療および／または予防のための薬学組成物を調製するために用いられる抗体（例えば、ＭＤ−３）またはその断片を提供する。
【００１８】
ヒト化抗体は、供与抗体由来の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）、およびヒト抗体由来の可変領域フレームワークと不変領域とを有する抗体である。したがって、一般に、ヒト化抗体は、（ｉ）マウス抗体、例えば、ＭＤ−３由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト不変領域と、（ｉｉ）マウス抗体、例えば、ＭＤ−３由来の３つのＣＤＲを含む重鎖、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト不変領域とを含む。
【００１９】
キメラ抗体は、マウス（または他の齧歯類）抗体の可変領域がヒト抗体の不変領域と組み合わされた抗体であって、遺伝工学的手段によるこれらの構築はよく知られている。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を保有するものの、約２／３程度がヒト由来である。マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体内の非ヒト配列の存在割合は、キメラ抗体の免疫原性がマウス抗体とヒト化抗体の中間程度であることを示す。
【００２０】
単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）は、動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターまたは鶏）起源であってもよく、または遺伝子工学的に製作されてもよい。齧歯類の単クローン抗体は、当業界でよく知られている標準的方法によって製造され、その方法は、適切な免疫増強剤と共に、腹腔内、静脈内、または足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）内にＩＣＡＭ−１を複数回免疫化した後、脾臓またはリンパ節細胞を抽出し、適切な不死化細胞株と融合した後、ＩＣＡＭ−１と結合する抗体を生産するハイブリドーマを選別することを含む（例えば下記の実施例を参照のこと）。キメラおよびヒト化単クローン抗体が本発明の具体例として好ましい。
【００２１】
本発明の本来の（ｎａｔｉｖｅ）単クローン抗体は、これらのハイブリドーマから生産することができる。遺伝子工学的に製作された単クローン抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体は、当業界で知られている多様な方法によって発現することができる。例えば、これらの軽鎖および重鎖Ｖ領域をコーディングする遺伝子を、オーバーラップするオリゴヌクレオチドから合成し、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ領域などの必須調節領域を提供する発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているもの）内に、利用可能なＣ領域と共に挿入することができる。ＣＭＶプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。次に、発現ベクターは、リポフェクションまたは電気穿孔法のような、当業界で知られている多様な方法を用いて、ＣＨＯまたはＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非生産性骨髄腫細胞のような多様な哺乳動物細胞株に形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することができ、抗体を発現する細胞は、適切な抗生物質による選別によって選別される。
【００２２】
本発明の単クローン抗体その他の抗体が発現されると、精密ろ過、限外ろ過、蛋白質ＡもしくはＧ親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および／または有機染料に基づいた他の形態の親和性クロマトグラフィーなどのような、当業界の標準的技術により精製することができる。薬学的用途のためには、少なくとも約９０％または９５％の均質性を有する実質的に純粋な抗体が好ましく、９８％または９９％、あるいはそれ以上の均質性のあるものがより好ましい。
【００２３】
好ましい具体例として、本発明は、本願に開示された抗体を含む薬学製剤を提供する。つまり、前記抗体は、疾患を治療するための医薬の製造に使用できる。前記抗体の薬学製剤（つまり、医薬）は、凍結乾燥または水性溶液の形態で、生理学的に許容される担体中において、任意で添加剤または安定化剤を伴って、単クローン抗体を含む。許容可能な担体、添加剤または安定化剤は、使用される用量および濃度において受容者に毒性がなく、一般に、ｐＨ５．０〜８．０、より一般には、ｐＨ６．０〜７．０におけるリン酸、クエン酸、または酢酸のような緩衝液；等張性を作るための塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのような塩；抗酸化剤、保存剤、低分子量ポリペプチド、蛋白質、ポリソルベート８０のような親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、および当業者に知られているその他の標準的成分を含む。
【００２４】
単クローン抗体は、一般に、１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度、例えば、１０ｍｇ／ｍｌで存在する。
【００２５】
本発明の抗体は、一般に、望ましくない混入物を排して実質的に純粋である。これは、その抗体は、干渉する蛋白質または混入物が実質的にないことだけでなく、少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）以上の純度であることを意味する。好ましくは、前記抗体は、少なくとも９０％、９５％または９９％以上の純度である。
【００２６】
他の好ましい具体例として、本発明は、薬学製剤中の抗ＩＣＡＭ−１単クローン抗体を用いて、疾患を有する患者を治療する方法を提供する。薬学製剤中に調製された単クローン抗体は、任意の適切な経路、特に、静脈注入もしくはボーラス注射による非経口投与、筋肉内投与または皮下投与により、患者に投与することができる。静脈注入は、１５分間程度の短時間行うこともできるが、より一般的には、３０分間、または１時間、２時間、もしくは３時間以上に渡って行われうる。単クローン抗体は、疾患（例えば、腫瘍）部位に直接注射されてもよいし、リポソームのような運搬体内にカプセル化されてもよい。投与量は、治療対象の状態を緩和させるのに十分な量とし（「治療的有効量」）、体重ｋｇあたり０．１〜５ｍｇ、例えば、１、２、３または４ｍｇ／ｋｇであると思われるが、１０ｍｇ／ｋｇ、あるいは１５または２０ｍｇ／ｋｇほどまで高くなることもありうる。固定単位投与量、例えば５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇで投与されてもよく、または、前記投与量は、患者の表面積に基づいていてもよい（例えば１００ｍｇ／ｍ２）。
【００２７】
単クローン抗体は、毎日、週ごとに、週２回ずつ、隔週ごとに、月ごとに、あるいは、例えば単クローン抗体の半減期に依存してその他の間隔で、１週間、２週間、４週間、８週間、３〜６ヶ月間またはそれ以上の期間に渡って投与されうる。慢性投与のように反復的な治療も可能である。合併症、および疾患の発達過程における中間的病理表現型を含む、疾患の症状（生化学的、組織学的および／または臨床学的）を緩和させ、あるいは少なくとも部分的に中断させる投与量および投与間隔の投与療法を、治療学的に有効な投与療法という。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明に対するより完全な理解と、本発明に伴う多くの有利な効果は、添付の図面と共に結び付けて考慮しながら下記の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されるにつれ、ただちに明確になるであろう。図面の説明は以下の通りである。
【００２９】
【図１】ヒトＩＣＡＭ−１、マウスＩＣＡＭ−１、ならびにヒトおよびマウスのＩＣＡＭ−１由来の各ドメインで構成された、２つの形態のキメラ変異（ｈ１ｍ２３４５およびｈ１２ｍ３４５）遺伝子で形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＭＤ−３単クローン抗体の反応性を示した写真である。
【図２】対照抗体、遮断（ブロッキング）抗体、およびＭＤ−３抗体処理後の、樹状細胞の表面における多様な分子の発現水準、および樹状細胞培養培地でのサイトカインの濃度を示した図である。
【図３】末梢血液でのヒトＴ細胞（図３Ａ）、およびヒト化マウスの膵臓での各ヒト白血球サブセット（図３Ｂ）の再増殖の動態を示した図である。
【図４】膵島移植前に、対照抗体、遮断（ブロッキング）抗体、またはＭＤ−３抗体を受けたヒト化マウスの、腎臓被膜下に移植されたブタ膵島の生存曲線を示した図である。
【図５】ヒト化マウスから抽出した、膵島移植された腎臓において、インスリン、ヒトＣＤ３およびヒトＣＤ６８に対する免疫組織化学的染色結果を示した写真である。
【図６】移植されたブタ膵島、ヒト同種血液単核球（ａｌｌｏ−ＰＢＭＣｓ）、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ、ＫＬＨ）に対するＴ細胞の反応を評価するＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果の要約を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、下記の実施例を参照してより詳細に説明される。しかし、このような実施例は、いずれの形態であれ本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【実施例】
【００３１】
［実施例１．抗ヒトＩＣＡＭ−１単クローン抗体を生産可能なハイブリドーマ細胞の分離］
ヒト末梢血液単核細胞を、フィコール−パック（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心法によって健康な供与者から分離した。ＩＣＡＭ−１／Ｆｃ蛋白質を製造するために、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）活性化されたヒト末梢血液単核細胞からｍＲＮＡを抽出し、ヒトＩＣＡＭ−１の細胞外ドメインに相応するｃＤＮＡ断片の５’および３’末端にそれぞれＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩサイトを導入し、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。次のプライマーを用いて重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
５’プライマー：ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ（配列番号１）
３’プライマー：ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣ（配列番号２）
ＩＣＡＭ−１およびヒトＩｇＧ  Ｆｃの融合構造体を製造するために、上記断片を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ−制限酵素処理されたｐＳｅｃＴａｇプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に連結させた。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）に前記プラスミドを一時的に形質移入させ、蛋白質Ｇカラムを用いてＩＣＡＭ−１／Ｆｃ蛋白質を培養上澄液から精製した。
【００３２】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６〜８週、１７〜２５ｇ；ＫＯＡＴＥＣＨ、韓国）に対し、完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）免疫増強剤で乳化されたＩＣＡＭ−１／Ｆｃ蛋白質１００μｇを用いて腹腔内免疫し、次に、ＩＣＡＭ−１／Ｆｃ蛋白質１００μｇを不完全フロイント免疫増強剤と共に用いて、２週間隔で２回免疫化した。２週間後、免疫化されたマウスにＩＣＡＭ−１／Ｆｃ蛋白質１００μｇを追加接種した。脾臓細胞懸濁液を製造するために、最終投与から３日後にＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓を摘出した。単クローン抗体は、９−アザグアニンに抵抗性のあるＳＰ２／０−Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）と、ヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃで免疫化されたＢａｌｂ／ｃの脾臓細胞とを融合することによって製造した。細胞融合方法は、ＫｏｅｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に従った（Ｋｏｅｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５−４９７）。１０８の脾臓細胞を、５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて１０７の骨髄腫細胞と融合した。細胞を洗浄し、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００μＭヒポキサンチン、０．４４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジン（ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）に再懸濁させた。前記細胞を４つの９６ウェルプレートに導入し、３７℃、５％ＣＯ２培養器内で培養した。
【００３３】
２週間後コロニーが形成された時、ヒトＩＣＡＭ−１形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて上澄液をスクリーニングした。ＩＣＡＭ−１形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞および野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を両方とも培養上澄液で染色し、ＩＣＡＭ−１形質移入した２９３Ｔ細胞に反応するものの、野生型２９３Ｔ細胞には反応しない上澄液を生産する細胞を選別した。高反応性抗体を生産する安定したハイブリドーマクローンを製造するために、陽性ウェルから取った細胞を、限界稀釈法（抗体：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  ＥＤ  ＨＡＲＬＯＷ  ａｎｄ  ＤＡＶＩＤ  ＬＡＮＥ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８８）によってウェルあたり０．５細胞にサブクローニングした。
【００３４】
前記実験によって得られた１つのハイブリドーマ細胞株は、ヒトおよびサル抗原ともに結合するＩｇＧ１抗体を生産し、これをＭＤ−３と名づけた。ＭＤ−３と名づけられたハイブリドーマは、大韓民国、ソウル、鍾路区、蓮建洞２８番地所在のソウル大学医科大学（郵便番号１１０−７４４）に位置する韓国細胞株研究財団（ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＫＣＬＲＦ）に２０１１年５月４日付で寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２６４を受けた。
【００３５】
［実施例２．ヒトＩＣＡＭ−１のＭＤ−３結合ドメインのマッピング］
ＩＣＡＭ−１は、５つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインで構成された構造を有する（Ｃｅｌｌ．１９９２、６８：７１−８１）。具体的なＩＣＡＭ−１  Ｉｇ様ドメインへのＭＤ−３の結合サイトの位置を知るために、ヒトおよびマウスＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローンを用いて、ヒトドメイン１／マウスの膜貫通および細胞質ドメインを含むマウスドメイン２〜５をコーディングするｃＤＮＡ（ｈ１ｍ２３４５）、ならびに、ヒトドメイン１〜２／マウスドメイン３〜５をコーディングするｃＤＮＡ（ｈ１２ｍ３４５）の２種類のキメラｃＤＮＡを製造した。これらのキメラ突然変異体を製作するためにオーバーラッピングＰＣＲ技術を用いた。まず、次のプライマーを用いてヒトドメイン１（ｈ１）を含むｃＤＮＡを増幅した：５’プライマーＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴ（配列番号３）；３’プライマーＡＧＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号４）。マウスドメイン２−５、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ｍ２３４５）の製造のためのプライマーは次の通りである：５’プライマーＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＡＣＧ  Ｇ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ（配列番号５）；３’プライマーＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ（配列番号６）。これら２種類のｃＤＮＡを混合し、配列番号３および配列番号６のプライマーを用いて再増幅し、最終産物（ｈ１ｍ２３４５）をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。ｈ１２ｍ３４５をコーディングする変異体は、次のプライマーを用いて、ｈ１ｍ２３４５に対するものと類似の方式でクローニングした：ｈ１２に対する５’プライマーＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴ（配列番号７）；ｈ１２に対する３’プライマーＧＧＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＧＧＴ（配列番号８）；ｍ３４５に対する５’プライマーＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ（配列番号９）；ｍ３４５に対する３’プライマーＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ（配列番号１０）。
【００３６】
修正された連結部が得られたかを確認するために構造体全体を配列分析し、次に、プラスミドＤＮＡを、カルシウムホスフェート沈殿法を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入させた。カルシウムホスフェートおよびプラスミドＤＮＡの共沈物とともにＨＥＫ２９３Ｔを１６〜２０時間インキュベートした後に、培地を１０ｍｌの新たな溶液に代替し、さらに２４時間細胞をインキュベートした。次に、形質移入体を氷中でＭＤ−３で染色した。３０分間のインキュベーション後に、細胞を５％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）および０．１％アジドを有するリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ結合されたヤギ抗マウスＩｇ抗体（二次抗体）と３０分間インキュベートした。３回さらに洗浄した後に、各抗体と反応する能力をテストするためにフローサイトメトリー分析を行った（図１）。陰性対照として、ベクターでのみ形質移入された細胞を用いた。図１に示されているように、全長ヒトＩＣＡＭ−１形質移入体は、ＭＤ−３抗体で陽性的に染色されたのに対し、その抗体は全長マウスＩＣＡＭ−１形質移入体には反応せず、これは、ＭＤ−３抗体がマウスＩＣＡＭ−１と交差反応しないことを示す。キメラ変異体の場合、ＭＤ−３抗体は、ヒトＩＣＡＭ−１のドメイン２を含む変異体（ｈ１２ｍ３４５）にのみ反応し、これは、ＭＤ−３抗体がドメイン２上のエピトープに特異的であることを示す。
【００３７】
［実施例３．単核球由来の樹状細胞の分化過程におけるＭＤ−３抗体の阻害効果］
末梢血液単核細胞を、フィコール−ハイパック密度勾配遠心法によって健康な供与者の血液から分離した。ＰＢＳで２回洗浄した後に、細胞を１ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に再懸濁させ、次に、氷中で１５分間、抗ＣＤ１４マグネチックビーズ（２０μｌ／１０７ｃｅｌｌｓ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートし、次に、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて磁性分離した。精製されたＣＤ１４＋単核球を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に再懸濁し、大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に６日間培養した。培養０日目および３日目に培地にＭＤ−３または同アイソタイプの対照抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を追加し、６日目にＬＰＳを培養培地に追加した。１日経過後に、培養した細胞を収集し、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０の発現を、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した（図２Ａ）。培養培地内のＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αの量を測定するためにＥＬＩＳＡも行った（図２Ｂ）。ＣＤ１４＋単核球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養すると、未成熟樹状細胞に分化することができ、ＬＰＳの処理は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導して、結果的に、ＭＨＣおよび共刺激分子の表面発現の上方調節ならびにサイトカインの産生をもたらした。しかし、ＬＰＳ刺激に先立ち、ＭＤ−３抗体で前処理した場合には、遮断（ブロッキング）抗体で樹状細胞を処理した場合とは異なり、樹状細胞における表面分子発現の上方調節およびサイトカインの生成が顕著に抑制された（図５）。したがって、このような結果は、ＭＤ−３抗体が単核球由来の樹状細胞の成熟を抑制する能力を有することを示すものである。
【００３８】
［実施例４．ヒト化マウスの製造］
抗ＩＣＡＭ−１抗体のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）効果を調査するために、Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２、１００：３１７５−８２に記載の方法により、免疫欠乏マウスにヒト造血幹細胞を移植してヒト化マウスを製造した。
【００３９】
満期正常分娩の間に臍帯血細胞を収集し、フィコール−ハイパック遠心分離によって単核細胞を分離した。分離された単核細胞は、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ内で３．３ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁し、Ｆｃ遮断抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に３０分間氷中でインキュベートし、次に、抗ＣＤ３４マグネチックビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に３０分間氷中でインキュベートした。２回洗浄した後、ＭＡＣＳを用いて、ビーズが付着した細胞を磁性分離した。２回にわたる磁性分離後、フローサイトメトリーによって純度を評価した結果、収集した細胞の９５％以上がＣＤ３４＋であった。８〜１２週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｊａｐａｎ）に、コバルト放射線源を用いて２４０ｃＧｙで放射線処理し、１日後に、１ｘ１０５のＣＤ３４＋細胞を尾静脈を通して各マウスに注射した。移植後４週間から２０週間の間に、順次、眼窩静脈叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｐｌｅｘｕｓ）から末梢血液を取り、フローサイトメトリー分析のために抗ヒトＣＤ４５および抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。図３Ａは、細胞移植後の表示された週におけるマウスの末梢血液中のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞再増殖の動態を示す。ヒトＴ細胞は、臍帯血細胞移植後８週間目に現れ、その後急速に増加した。また、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１４＋単核球、ＣＤ１１ｃ＋の従来型樹状細胞、およびＣＤ１２３＋形質細胞様樹状細胞が、ヒト化マウスの膵臓から確認された（図３Ｂ）。
【００４０】
［実施例５．ブタ膵島移植モデルにおける、ＭＤ−３抗体のインビボ投与による移植拒絶反応の抑制］
移植拒絶反応を抑制するＭＤ−３抗体の効果を実証するために、膵島異種移植モデルを用いた。ブタ膵島を得るために、温虚血時間なしで膵臓全摘術を行い、先に開示された修正Ｒｉｃｏｒｄｉ方法（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１０、１９：２９９−３１１）により膵島を分離した。精製された膵島を、１０％ブタ血清、１０ｍＭニコチンアミド、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加された１９９培地（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ）で３７℃にて一晩培養し、その後、ヒト化マウスの腎臓被膜下で培養した。携帯用血糖測定器（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ソウル、韓国）を用いて血中グリコース水準を測定するために、眼窩副鼻腔（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から週ごとに末梢血液試料を得て、血清内のブタＣ−ペプチド水準は放射線免疫分析（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｌｉｎｃｏ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で測定した。ブタＣ−ペプチド＞０．５ｎｇ／ｍｌの場合、成功した移植と定義された。移植拒絶反応は、第１日目のブタＣ−ペプチド＜０．１ｎｇ／ｍｌの場合と定義し、移植片の組織学的分析（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により確認した。対照群において、組織生存期間の中央値は２１日間であり、抗ＩＣＡＭ−１遮断抗体Ｒ６−５−Ｄ６の投与は、生存期間の中央値を４０日間まで延長させた（図４）。しかし、移植された膵島は、結局、２つの群のいずれでも拒絶反応が現れた。これと対照的に、ＭＤ−３処理されたマウスは、実験期間全体を通して移植拒絶反応が現れなかった。
【００４１】
膵島移植の４２日後、または病的状態を示した時、マウスを犠牲にして、腎臓切除試料を移植拒絶反応に関して組織学的に分析した。各マウスから得られた腎臓切除試料は、１０％中性ホルマリン中で固定させ、パラフィン包埋後、４μｍの厚さに連続的に切片化した。免疫組織化学分析のためには、組織切片をキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で脱ワックス化し、段階化されたアルコールシリーズを用いて再水和し、内因性ペルオキシド遮断溶液（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で５分間インキュベートした。Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｍａｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、９９℃における６ｍＭクエン酸緩衝溶液中で切片を２０分間インキュベートすることにより抗原賦活化を行い、非特異的染色を防止するために組織切片をウサギ血清（ＰＢＳ中１％）で３０分間処理した。抗ヒトインスリン（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ３（Ｆ７．２．３８；ＤＡＫＯ）、ＣＤ２０（Ｌ２６；ＤＡＫＯ）、およびＣＤ６８（ＰＧ−Ｍ１；ＤＡＫＯ）抗体を３０分間反応させた後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（ＰＫ６１０１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて抗体の結合を検出した。
図５に示されているように、対照群では、インスリン陽性膵島細胞は完全に破壊され、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ６８＋大食細胞の主要な浸潤細胞により置き換えられた。しかし、ＭＤ−３処理群では、膵島近傍における無視できる程度の単核細胞の浸潤と共に、インスリン陽性膵島細胞の大きな群が明確に見られた。
【００４２】
ＭＤ−３処理したマウスにおける免疫反応欠如が、抗原特異的寛容であるか、または一般的な免疫抑制であるかを調べるために、前記マウス内で移植膵島特異的Ｔ細胞と同種（ａｌｌｏ）特異的Ｔ細胞の数を比較した。このために、ヒト化マウスの膵臓においてＩＬ−２またはＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的Ｔ細胞の頻度を、Ｍａｂｔｅｃｈから購入したＥＬＩＳＰＯＴ  ｋｉｔ（Ｎａｃｋａ  Ｓｔｒａｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。
抗ＩＬ−２または抗ＩＦＮ−γ捕獲抗体でコーティングされたプレートを、滅菌リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ；２００μｌ／ｗｅｌｌ）で４回洗い、１０％のヒト血清が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を用いて常温で３０分間ブロッキングした。前記培地を除去した後、ヒト化マウス由来の３×１０５個の脾細胞を、５×１０４個のブタ膵島細胞と共に、１０％のヒト血清が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で４０時間、５％二酸化炭素（ＣＯ２）インキュベータで培養した。
抗原特異的Ｔ細胞寛容を評価するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；０．１ｍｇ／ｍｌ）、または、３人の供与者から集めたＴ細胞枯渇化γ線照射ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ；７×１０５／ｗｅｌｌ）も刺激剤として使用した。
１つの陰性対照（ＮＣ）として、膵島移植していないヒト化マウスの脾臓細胞をブタ膵島により刺激し、抗膵島反応に使用した。これと対比させて、移植を受けたマウスの脾臓細胞を刺激抗原非存在下で培養したものを、抗同種血液単核球（ａｌｌｏ−ＰＢＭＣｓ）および抗ＫＬＨの反応に使用した。４０時間培養後、細胞を除去し、プレートをＰＢＳ溶液（２００μｌ／ｗｅｌｌ）で５回洗った。アルカリホスファターゼコンジュゲート化検出用抗体を、０．５％ウシ胎仔血清が含まれているＰＢＳ１００μｌ中で、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γについてそれぞれ１：２００または１：１０００に希釈して加え、常温で２時間インキュベートした。前記プレートをＰＢＳで５回洗い、ＢＣＩＰ／ＮＢＰ基質１００μｌを加えた。水道水で洗うことによって発色を停止させた。結果として得られたスポットを、コンピュータ支援によるＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＩＤ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で数えた。対照マウス由来の全脾臓細胞をブタ膵島で刺激した時、有意な数のＩＬ−２またはＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞が検出された（図６左段）。これと対照的に、ＭＤ−３で処理したマウスでは、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞が検出されておらず、これは、異種移植抗原に対するＴ細胞反応が完全に抑制されたことを示す。しかし、この系において、ヒト同種血液単核球（ａｌｌｏ−ＰＢＭＣｓ）に対するＴ細胞の反応は対照と同程度であった（図６中段）。このような結果は、Ｔ細胞の無反応は、ブタ膵島抗原に特異的な寛容の誘導を反映していたことを示唆する。
この抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導は、無関係な抗原によるインビボ負荷によってさらに証明された。移植後２８日目に、ＭＤ−３が完全に除去された時、マウスを溶解性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＫＬＨ抗原で免疫化した。２週間後、ＫＬＨ特異的Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。図６（右段）に示されているように、ＭＤ−３処理したマウスから得られたＴ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を生産する細胞の数という観点において、ＫＬＨに対する強い反応を示した。このような結果は、ＭＤ−３の投与が、移植膵島抗原に対して特異的なＴ細胞寛容を誘導したことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【配列表】
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