(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン組成物を保存および／または投与するための容器であって、オキシ水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着したB型肝炎表面抗原を含むワクチン組成物を含み、ストッパーとして作用する装置により閉じられる、該組成物と接触可能な該装置の表面がフルオロポリマーでコートされている、容器。
【請求項２】
該ワクチン組成物が液体または凍結乾燥の形である請求項１記載の容器。
【請求項３】
該フルオロポリマーが以下からなる群から選ばれる請求項１または２記載の容器：ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリテトラフルオロプロピレン(PTFP)、フッ素化エチレンプロピレン(FEP、ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンのコポリマー)、ポリクロロトリフルオロエチレン(PCTFE)、パーフルオロアルコキシコポリマー(PFA)、ポリ(エチレン-コ-テトラフルオロエチレン)(ETFE)、ポリ(エチレンクロロトリフルオロエチレン)(ECTFE)、ポリビニルフロリド(PVF)、およびポリビニリデンフロリド(PVPF)。
【請求項４】
該容器の内側表面が重合シリコーンでコートされている、請求項１〜３のいずれかに記載の容器。
【請求項５】
プランジャーによって閉じるシリンジのリザーバーである、請求項１〜４のいずれかに記載の容器。
【請求項６】
該ワクチン組成物が、さらにジフテリアバレンス、破傷風バレンス、百日咳バレンス、ポリオバレンス、およびHibバレンスの１またはそれ以上を含む請求項１〜５のいずれかに記載の容器。
【請求項７】
オキシ水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着したB型肝炎表面抗原を含むワクチン組成物を保存するための、ストッパーとして作用する装置により閉じる、該組成物と接触可能な該装置の表面がフルオロポリマーでコートされている、容器の使用。
【請求項８】
該容器の内側表面が重合シリコーンでコートされている、請求項７記載の使用。
【請求項９】
該ワクチン組成物が、さらにジフテリアバレンス、破傷風バレンス、百日咳バレンス、ポリオバレンス、およびHibバレンスの１またはそれ以上を含む請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルミニウムアジュバント上に吸着している抗原の脱離を減少および/または減速させる方法、およびその生成物、すなわち、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物と該組成物のための特定の特性を有する容器の組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの抗原が、特に、ヒトを含む哺乳動物に投与すべき組成物に当然に求められるｐHである、中性ｐHまたは中性に近いｐHで、アルミニウムアジュバントに吸着することができる。
【０００３】
アジュバントの量が、２つの化合物を混合した時に抗原が最適な量で実際にアジュバントに吸着することができる量であれば、最大の吸着度が達成されることが非常に多い。しかしながら、環境条件に応じて、次第に、吸着した抗原の割合（吸着度）は低下し、この脱離が不安定因子を構成するかもしれない。
【０００４】
吸着した抗原の割合（吸着度）に影響を及ぼしうる既知の環境条件には、例えば、ｐHの変動（わずかな変動でも）、および１またはそれ以上の媒質成分または１またはそれ以上の、アジュバント上の吸着部位が最初の抗原と競合しうるさらなる抗原の添加が含まれる。
【０００５】
通常、そのまますぐに使用できる多用量ワクチン組成物は、バイアル、例えばプラスチックストッパーで閉じられたガラスバイアル中に充填される。同様に、単用量のワクチン組成物は、単用量バイアル、または標準的方法で、ワクチンを含むリザーバー、リザーバーをその遠位端で閉じるプランジャー、および投与用の装置、例えばその近位端についている針からなるそのまますぐに注射できるシリンジ中に充填することができる。別の標準的充填方法によれば、ワクチン用量を、医師が注射時に別に包装された針をつける針なしシリンジ中に充填することもできる。該シリンジのリザーバーは、一般的に、ガラスかプラスチックでできており、プランジャーやストッパーは、単純にプラスチック、例えばクロロブチルやブロモブチルポリマー（特に制限はない）でできている。標準的ガラスまたはプラスチックシリンジは、Becton-Dickinson；Gerresheimer AG、Schott AG、Germany ；Nuova Ompi srl、Italy；およびWest Pharma/Daykioなどが販売している。滑りをよくするために、プランジャーやストッパーを水中シリコーンエマルジョンに浸漬してその表面にシリコーンフィルムを形成させることができる。標準的プランジャー/ストッパーは、Helvoet、Stelmi、およびWest Pharmaなどが販売しており、そのいくつかはシリコーンフィルムでコートされたものがすでに販売されている(West Pharmaのref.B2)。
【０００６】
どんな容器を保存に用い、どんな装置を容器を閉じるのに用いるにせよ、注射時の投与は、シリンジを用い、ワクチンを送達するためにプランジャーまたはストッパー/プランジャーの組み合わせをスライドさせることからなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の要約）
今回、容器自体の材料、および容器を閉じるための装置の材料は吸着率に影響を与えうることがわかった。
【０００８】
アルミニウムアジュバントでアジュバント化し（adjuvanted）、標準的ストッパーで閉じた標準的シリンジ中に単用量として充填したＢ型肝炎表面抗原(HBsAg)を含むワクチン組成物を、同じ条件で同じ時間（数日〜数ヶ月間）保存すると、シリンジを垂直位置で保存するか、または水平位置で保存するかに応じて、吸着率が異なることがわかった。同じ現象がバイアルでもみられた。保存位置の違いによる実際の結果は、垂直に保存したリザーバー中に含まれるワクチンは、ストッパーと接触しなかったが、水平に保存したリザーバーでは該組成物とストッパーが接触した。
【０００９】
一定時間後にHBsAgの吸着レベルを測定し、水平に保存したリザーバー中に含まれるHBsAgでは吸着レベルがはるかに低いことがわかった。これは、標準的ストッパーの材料（クロロブチルまたはブロモブチルポリマー)が吸着の減少に関与することを示唆した。
【００１０】
この問題の解決は、アジュバント化ワクチン組成物と吸着減少に寄与する材料でできたストッパーの接触を防ぐか、または吸着減少に寄与しない材料でできたストッパーを用いることである。ある態様において、本発明は、ストッパーによって生じる脱離を減少させるかまたは排除するフルオロポリマー、例えばTeflon（登録商標）またはTeflon（登録商標）様物質(例えば、Omniflex（登録商標）(Helvoet Pharma)またはFluorotec（登録商標）(West Pharma))のフィルムでコートされたストッパーを用いる方法および装置を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
(発明の詳細な説明)
ある局面において、本発明は、保存中のアルミニウムアジュバント上に最初に吸着した抗原の脱離を減少させ、および/または遅らせるための最初の方法であって、(i)容器に、アルミニウムアジュバント上に最初に吸着した抗原を含むワクチン組成物を充填し、(ii)ストッパーとして作用する装置で容器を閉じる（ここで、該組成物と接触可能な該装置の表面はフルオロポリマーでコートされている）ことを含む方法を含む。
【００１２】
すなわち、本発明は、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含む組成物を充填および保存するための最初の方法であって、(i)容器に該ワクチン組成物を充填し、(ii)ストッパーとして作用する装置で容器を閉じる（ここで、該組成物と接触可能な該装置の表面はフルオロポリマーでコートされている）ことを含む方法に関する。
【００１３】
同様に、本発明は、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を含む容器を閉じるためのストッパーとして作用する装置(ここで、該組成物と接触可能な該装置の表面はフルオロポリマーでコートされている）の使用にも関する。
【００１４】
該容器は、例えばバイアルまたはシリンジのリザーバーでありうる。これも下記の本発明のその他のすべての局面に適用される。
【００１５】
該ワクチン組成物は、液体または固体、例えば凍結乾燥したものでありうる。凍結乾燥組成物は、粉末の外観をしていることがある。患者に注射する際に、凍結乾燥組成物を適切な医薬的溶液で再構成する。これも下記の本発明の他のすべての局面に適用される。
【００１６】
当該分野の通常の実務および本明細書の目的において、「吸着した抗原」または「最初に吸着した」は、抗原量の100％が実際に吸着していることを意味するものではない。これら用語は、単に、かなりの量の抗原が吸着していることを意味する。これも下記の本発明のその他のすべての局面に適用される。
【００１７】
上記のごとく該装置は、例えばクロロブチルまたはブロモブチルポリマーでできたプラスチック装置でありうる。この標準的装置は、フルオロポリマーで処理され、特に、フルオロポリマーによる層流処理にかけられる（ここで、この層流処理は、装置全体に、または希に、該組成物と接触可能な該装置の表面に施される）。該層流処理は、フルオロポリマーの非常に薄い層（例えばフィルム）が沈着するのを可能にする。理解されるであろうように、コートした表面の面積は、該組成物と接触可能な表面を超えることがある。特に、ある態様において、該装置の全表面がフルオロポリマーでコートされる。
【００１８】
本発明で用いるフルオロポリマーは、例えば、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリテトラフルオロプロピレン(PTFP)、フッ素化エチレンプロピレン(FEP、ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンのコポリマー)、ポリクロロトリフルオロエチレン(PCTFE)、パーフルオロアルコキシコポリマー(PFA)、ポリ(エチレン-コ-テトラフルオロエチレン)(ETFE)、ポリ(エチレンクロロトリフルオロエチレン)(ECTFE)、ポリビニルフロリド(PVF)、またはポリビニリデンフロリド(PVPF)でありうる。
【００１９】
本明細書に記載の方法/使用は、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原の脱離速度、および/または一定温度で所定の保存時間後の脱離パーセンテージ（すなわち脱離率）を低下させるのを可能にする。脱離率は以下のように表すことができる：（非吸着抗原の量）/（該組成物中に存在する総抗原量）。典型的には、脱離速度は、ワクチン組成物を遠心分離し(T(時間)＝0および実験終了時の試料)；脱離抗原を含む上清を回収し、次いで、抗原の性質に応じて選んだ適切な方法を用いて上清および全ワクチン中の抗原をアッセイすることにより脱離分画を定量することにより評価することができる。脱離パーセンテージ（すなわち脱離率）は、抗原とアジュバントの相互作用の強さ/弱さに応じて抗原ごとにことなり得る。それにも関わらず、脱離パーセンテージ（すなわち脱離率）は、標準的ストッパーを用いる標準的充填方法に比べて10〜15、または20％減少しうる（該減少は充填日の１または２ヶ月後に測定する）。この期間中の保存は、＋5〜25℃の温度で行われる。容易に理解されるであろうように、吸着パーセンテージ（または吸着率）は、脱離パーセンテージ（または脱離率）から容易に推定することができる。
【００２０】
該装置を該容器を閉じるためだけでなく、例えばシリンジのプランジャーをスライドさせることにより該容器中に含まれる該組成物を供給するためにも用いる場合は、該容器の内側表面をシリコーン処理することが推奨される。
【００２１】
しかしながら、シリコーンは場合により吸着にとって有害なことがあることがわかった。実際に、水中シリコーンエマルジョンによる単なる表面処理により常套的にシリコーン処理したシリンジ中に保存した組成物で観察された脱離率は、非シリコーン処理容器に保存した組成物で観察された脱離率より高いことがある。シリコーンは容器の内側表面に付着するが、遊離型のままであり、振盪または攪拌すると該内側表面から流出し、容器の内容物（ワクチン組成物）内に移行しうる。
【００２２】
今回、この後者の問題を、内側表面を重合シリコーンでコートした容器を用いることにより解決することができることがわかった。そのような容器は容器の内側表面を水中シリコーンエマルジョンで処理し、次いで該容器を、例えば270〜330℃の温度で30分間加熱することにより得ることができる。加熱すると、シリコーンは容器の内側表面で重合し、もはや該組成物とは混合しえない。シリコーンの重合は、ワクチン組成物が感受性でありうるシリコーンの表面エネルギーを減少させるのを可能にする。
【００２３】
さらに、重合工程を含むシリコーン処理操作は、(i)単純な標準的シリコーン処理操作より正確で均質であり、(ii)潤滑効果を失うことなく用いる（すなわち、容器の内側表面に適用する）シリコーンの量を約10倍減少させることを可能にする。例えば、標準的シリコーン処理プロセスでは、400〜1000μgのシリコーンを用量0.5〜1mlを含むことを意図するシリンジ中に沈着させる（0.5〜1mlシリンジリザーバーの総内側表面は約８cm２であり、この実施例ではこの表面は、約50〜125μg/cm２のシリコーン量に対応する）が、シリコーンを該容器の内側表面に沈着させ、次いで例えば加熱により重合させる場合は、同じシリンジについて40〜100μｇのシリコーンで充分である（約5〜12μg/cm２)。シリンジの内側表面が、低量の遊離シリコーンより均質に低量の重合シリコーンでコートされることで、非シリコーン処理プランジャーがスムーズにスライドするのを可能にするが、該プランジャーは低量の遊離シリコーンでコートしたシリンジでは作動不能である。
【００２４】
これが、本発明が、容器に、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を充填する（ここで、該容器の内側表面は重合シリコーンでコートされている）ことを含む、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原の脱離を減少させ、および/または遅くらせるための第2の方法を包含する理由である。
【００２５】
すなわち、本発明は、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を充填および保存するための第2の方法であって、容器に該組成物を充填することを含む（ここで、該容器の内側表面は重合シリコーンでコートされている）方法も包含する。
【００２６】
同様に、本発明は、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を保存するための重合シリコーンでコートした内側表面を有する容器の使用も包含する。
【００２７】
好都合には、重合シリコーンでコートした内側表面を有する容器はプラスチックかガラスでできている。好都合には、重合シリコーンでコートした内側表面を有する容器はシリンジのリザーバーである。
【００２８】
容器の内側表面をコートする重合シリコーンの量は、3〜25μg/cm２、好都合には5〜20μg/cm２、好ましくは5〜15μg/cm２である。
【００２９】
容易に理解できるあろうが、本発明の第1の方法に用いる容器は、好都合には、上記のごとく重合シリコーンでコートされることがある。
【００３０】
別の局面において、本発明は以下のものを含む：
Ａ−(i)アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を含み、(ii)ストッパーとして作用する装置により閉じる（ここで、該組成物と接触可能な該装置の表面はフルオロポリマーでコートされている）容器；
Ｂ−(i)重合シリコーンでコートされた内側表面を有し、(ii)アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を含む容器；および
Ｃ−(i)重合シリコーンでコートされた内側表面を有し、(ii)アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物を含み、(iii)ストッパーとして作用する装置により閉じられる（ここで、該組成物と接触可能な該装置の表面はフルオロポリマーでコートされている）容器。
【００３１】
すなわち、本発明は、(i)重合シリコーンでコートされた内側表面を有し、および/または(ii)ストッパーとして作用する装置により閉じられる（ここで、該組成物と接触可能な該装置の表面はフルオロポリマーでコートされている）容器に充填され、保存されるアルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物に関する。
【００３２】
本発明の容器に保存されるワクチン組成物には以下のものが含まれる：
− 目的とする用途に必要な最小抗原量（例えばヒトに投与するための用量として）がアルミニウムアジュバント上に吸着している、抗原を含むワクチン組成物；
− 本発明に用いるための容器に充填した時にワクチン組成物が少なくとも以下の吸着率を示す、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原を含むワクチン組成物：
(a) 充填直後に該組成物を(i)5±3℃で2〜3年間、または(ii)25±3℃で2〜3ヶ月間保存したときに、該組成物中に存在する総抗原量の65〜70％；または
(b) 充填直後に該組成物を5±3℃で18ヶ月間保存したときに、該組成物中に存在する総抗原量の80〜90％；ならびに
− アルミニウムアジュバントおよびアルミニウムアジュバント上に吸着することができる抗原を含むワクチン組成物（ここで、アルミニウムアジュバント上に吸着する抗原のパーセンテージは、同じワクチン組成物が非コート内側表面または非重合シリコーンでコートした内側表面を有する標準的容器に含まれる場合に観察されるパーセンテージより少なくとも5〜10％高い。なお、抗原吸着パーセンテージの比較は、ワクチン含有容器を25℃で２ヶ月間保存（容器への充填日から開始）した後に行った。
【００３３】
本発明の目的において、該容器は、あらゆる種類のリザーバー、例えばバイアルやシリンジであってよく、多用量（多用量容器）または単用量（単用量容器）を含み得る。例として、該容器は、ストッパーおよび投与時にワクチンを放出するためのシステム（例えばプランジャーを用いる）として作用する装置により閉じられたワクチンを含むリザーバーを含むシリンジまたはシリンジの部分でありうる。ストッパーとして作用する装置はプランジャーであり得る。
【００３４】
本発明に用いるためのストッパーおよび/またはプランジャーは、例えば、Helvoet Pharma(Omniflex（登録商標） technology)およびWest Pharma(Fluorotec（登録商標) technology)が販売している。本発明に用いるための重合シリコーンでコートされたガラスシリンジリザーバーは、例えばNuova Ompi srl、Becton-DickinsonおよびGerresheimer(Baked-on technology)が販売している。
【００３５】
該抗原およびアルミニウムアジュバントは、当然ながらそれらが互いに相互作用することができる限りにおいて、あらゆる抗原およびあらゆるアルミニウムアジュバントでありうる。さらに、本発明は、相互作用力（相互作用力はおそらく環境に依存する）が比較的弱い抗原-アルミニウムアジュバントペアについて特に興味がもたれる。この相互作用力は、種々の試験により評価することができる。例えば、アルミニウムアジュバントを用いて種々の抗原-アジュバントペア（抗原はペアごとに異なり、該アジュバントは同じままである）を形成することができる。次に、該アジュバントとの相互作用について該抗原と競合することができる化合物を大量に加える。種々の調製物を遠心分離にかけて、上清を回収する。最後に、吸着した抗原の量を上清を用いてアッセイすることにより、抗原のアジュバントとの相互作用を比較することができる。
【００３６】
比較的弱い相互作用力とは、抗原-アルミニウムアジュバント複合体を含む組成物で満たした標準品により悪影響があるかもしれない吸着をもたらす相互作用力である。例えばラテックス、抗酸化剤、シリコーン、および金属イオン（例えば亜鉛およびタングステン）などの容器の製造に関与する種々の要素が該抗原-アジュバント複合体を不安定化させうる。
【００３７】
「吸着」は、一般的に、とりわけ、静電気的相互作用力、疎水性相互作用、またはリガンド交換を含む、抗原-アジュバント複合体を形成することを目的としたあらゆる現象を意味する。すなわち、該抗原は該アルミニウムアジュバントのネットワークの表面に結合するか、または該アルミニウムアジュバントと共沈殿後に内側に埋め込まれうる。
【００３８】
本発明に用いるためのアルミニウムアジュバントは、オキシ水酸化アルミニウム(AlOOH)(例えばBrenntag AG(Superfos)またはReheis Corp.が販売している製品)、およびアルミニウムヒドロキシホスフェート(AlOHPO4)（例えばAlphosが販売している製品）でありうる。
【００３９】
有効なワクチン組成物について、アルミニウムアジュバント上に吸着するのに必要な最小抗原量は、本質的に抗原自身に依存し、当業者が容易に決定することができる。
【００４０】
特定の態様において、該抗原はＢ型肝炎表面抗原(HBsAg)でありうる。HBsAgは等電点が7未満(約4〜5)であり、AlOOHのゼロ荷電点(PZC)は7以上(約9〜11)であるので、HBsAgをAlOOH上に吸着するのが特に好都合である。
【００４１】
本発明に用いるためのワクチン組成物は、１またはそれ以上の抗原を含むことができ、その少なくとも１はアルミニウムアジュバント上に吸着しており、その他は吸着しても吸着しなくてもよい。
【００４２】
ある態様において、本発明に用いるための該組成物は、AlOOH上に吸着したHBsAg(AlOOH-HbsAg複合体)、および好ましくは担体タンパク質(C)（とりわけ、DｔまたはTｔでありうる）と結合した形のHaemophilus influenzae(HiBバレンス（valence)）のポリリボシルリビトールホスフェート（PRP）である第２抗原を含む。
【００４３】
別のある態様において、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原がHBsAgである場合は、該ワクチン組成物は、さらなる抗原として以下の１またはそれ以上を含むこともできる：ジフテリアトキソイド(Dt)(ジフテリアバレンス)；破傷風トキソイド(Tt)(破傷風バレンス)；Bordetella pertussis無毒化毒素(Ptdx)、線毛、線維状赤血球凝集素(FHA)、および/またはパータクチン(69kD抗原)（百日咳バレンス）；不活化ポリオウイルス血清型１、２、または３（ポリオバレンス）；および好ましくは担体タンパク質(C)（とりわけ、DｔまたはTｔでありうる）と結合した形のHaemophilus influenzae(HiBバレンス）のポリリボシルリビトールホスフェート（PRP）。
【００４４】
例として、該組成物は、AlOOH上に吸着したHBsAg、Dt、Tt、Pt、およびFHA(AlOOH-HbsAg-Dt-Tt-Pt-FHA複合体)、ポリオバレンス、および実質的にAlOOH上に吸着していないPRP-Cを含み得る。
【００４５】
一般的に、本発明は、該ワクチン組成物がそれぞれ１またはそれ以上の抗原(2、3、4、または5)（いくつかの抗原はアルミニウムアジュバント上に吸着している）で示される種々のバレンス（例えば2、3、4、5、6、またはそれ以上）を含む場合に特に好都合である。実際に、標準的充填方法では、アルミニウムアジュバント上に吸着した抗原/バレンスの数がより高ければ、該容器による不安定化現象がより重要である。抗原-アジュバント相互作用力は、しばしば、抗原ごとに異なり、種々の抗原を含む組成物中で最も弱い相互作用力を有する抗原は悪条件下で脱離する傾向が最も高い。
【実施例】
【００４６】
（実施例および実験成績）
Ａ− それぞれオキシ水酸化アルミニウム上に吸着したＢ型肝炎表面抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳バレンス、ならびにポリオ、および非吸着Haemophilus influenzae B(HiB)バレンスを含むワクチン組成物のバルクを以下の特徴を有する単用量シリンジの３つのカテゴリーに分配した：
(1)非ラミネート加工プラスチックでできた標準的ストッパー/プランジャー付きの標準的シリコーン処理ガラスシリンジ；
(2)フルオロポリマーコートしたストッパー/プランジャー(West Pharma；Fluorotech（登録商標）technology)付きの標準的シリコーン処理ガラスシリンジ；および
(3)フルオロポリマーコートしたストッパー/プランジャー(West Pharma；Fluorotech（登録商標）technology)付きの内側表面が重合シリコーンでコートされたシリンジ(Baked-on syringe system Luercone（登録商標）(Gerresheimer))。
【００４７】
該バルクを、各用量が、10μgのHBsAg、30LfのDt、10LfのTt、25μgのPt、25μgのFHA、40DU(抗原D単位)のIPV1、8DUのIPV2、32DUのIPV3、12μgのPRP(PRP-Ttコンジュゲート型)、0.6mgのAl、55mMのリン酸イオン、20mMの炭酸イオン、およびTrisスクロース緩衝液（2.5mM、2.125％、pH6.8〜7.2）を含む0.5mL単用量に分配した。
【００４８】
３カテゴリーのすべてのシリンジを、25℃で２ヶ月間水平に保存した（促進エージング）。HBsAgの脱離を、３カテゴリーのそれぞれにつき、T＝0(シリンジを充填直後)、次いで二ヶ月後に測定した。脱離を、シリンジの内容を遠心分離し、次いでELISA(コーティングおよび捕捉のためのマウス抗HBsAgモノクローナル抗体(IgM)、第2マウス抗HBsAgモノクローナル抗体(IgG)およびパーオキシダーゼ(Sigma、Ref. A3673)と結合した第3抗マウスIgGポリクローナル抗体（テトラメチルベンジジンを加えることにより明らかになる）を含むサンドイッチELISA)により上清中に存在する脱離したHBsAgの量を測定することにより評価した。
【００４９】
T(時間)＝0のHbsAg吸着レベルは３カテゴリーで同じであった（総HBsAgの98％が吸着した）。T＝2ヶ月で、すべてのカテゴリーで脱離がみられたが、脱離パーセンテージは、カテゴリーごとに異なった。最も高い脱離パーセンテージはカテゴリー(1)でみられた（T＝１および２ヶ月でそれぞれ総HBsAgの55および50％が吸着した）が、最も低いパーセンテージはカテゴリー(3)でみられた（T＝１および２ヶ月でそれぞれ総HBsAgの72および69％が吸着した）。
【００５０】
Ｂ− Ａに記載したワクチン組成物のバルクを以下の特性を単用量１mLシリンジの２カテゴリーに分配した：
(1)標準的シリコーン処理ガラスシリンジ（遊離シリコーン）；および
(2)非シリコーン処理シリンジ。
【００５１】
該バルクを、各用量が10μgのHBsAg、30LfのDt、10LfのTt、25μgのPt、25μgのFHA、40DU(抗原D単位)のIPV1、8DUのIPV2、32DUのIPV3、12μgのPRP(PRP-Ttコンジュゲート型)、0.6mgのAl、55mMのリン酸イオン、20mMの炭酸イオン、およびTrisスクロース緩衝液(2.5mM、2.125％、(pH6.8〜7.2))を含む0.5mL単用量に分配した。
【００５２】
２カテゴリーのすべてのシリンジを25℃で２ヶ月間垂直に保存した（促進エージング）。HBsAgの脱離を、上記Ａ項に記載のごとく、２カテゴリーのそれぞれにつき、T＝0(シリンジを充填直後)、次いで二ヶ月後に測定した。
【００５３】
T(時間)＝0のHbsAg吸着レベルは２カテゴリーで同じであった（総HBsAgの98％が吸着した）。T＝2ヶ月で、すべてのカテゴリーで脱離がみられたが、脱離パーセンテージは、カテゴリーごとに異なった。最も高い脱離パーセンテージはカテゴリー(1)でみられた（T＝１および２ヶ月でそれぞれ総HBsAgの69および68％が吸着した）が、最も低いパーセンテージはカテゴリー(2)でみられた（T＝１および２ヶ月で総HBsAgの73％が吸着した）。このことは、明らかに、アルミニウムアジュバント上への抗原吸着は遊離シリコーンに感受性であることを示す。
【００５４】
Ｃ− Ａ項に記載のワクチン組成物のバルクを以下の特性を有する３種類の単用量１mLシリンジに分配した：
(1)低シリコーン処理ガラスシリンジ(50〜100μg遊離シリコーン/シリンジ)；
(2)標準的高シリコーン処理ガラスシリンジ((RTFシリンジLuercone（登録商標）(Gerresheimer))：800μg〜1mg遊離シリコーン/シリンジ)；および
(3)内部表面を重合シリコーン(50〜100μg/シリンジ)でコートしたシリンジ。
【００５５】
カテゴリー(1)のシリンジは、該シリンジの内部表面をコーティングするシリコーンの量はそれ自体のスライディングを可能にするには少な過ぎるので、注射に用いるプランジャーもシリコーン処理する場合にのみ実施しうる。
【００５６】
すべてのシリンジ（タイプ１〜３）を同じタイプの非シリコーン処理ストッパーで閉じた。
【００５７】
３タイプのすべてのシリンジを、25℃で２ヶ月間垂直に保存した（促進エージング）。HBsAgの脱離を、上記Ａ項に記載のごとく、３タイプそれぞれにつき、T＝0(シリンジを充填直後)、次いで二ヶ月後に測定した。
【００５８】
T(時間)＝0のHbsAg吸着レベルは３タイプで同じであった（総HBsAgの94％が吸着した）。T＝2ヶ月で、すべてのシリンジで脱離がみられたが、脱離パーセンテージは、タイプごとに異なった。最も高い脱離パーセンテージはタイプ(2)でみられた（T＝１および２ヶ月でそれぞれ総HBsAgの60および58％が吸着した）が、タイプ(1)および(3)では脱離パーセンテージが同様であり、タイプ(2)よりはるかに低く、タイプ(1)では、T＝１および２ヶ月でそれぞれ総HBsAgの73％および68％が吸着した。タイプ(3)ではT＝１および２ヶ月でそれぞれ総HBsAgの69％および66％が吸着した。
【００５９】
さらに、このことは、明確に、(i)アルミニウムアジュバント上への抗原吸着は、スライディングに必要な量で充填される遊離シリコーンに感受性であり、(ii)シリコーンの重合は、この問題の克服を可能にすることを示す。
【００６０】
Ｄ− 安全性試験をＡ−(3)に記載の充填シリンジを用いて5±3℃で18ヶ月間実施した。総HBsAgの少なくとも80〜90％が18ヶ月間の終了時にまだ吸着していた。