(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物または植物組織を作出するための方法であって、
宿主植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域と、少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位とからなるポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する工程であって、前記ポリヌクレオチドが配列番号１５または配列番号１６を含む、工程、
前記植物細胞または前記植物細胞を含む植物組織を前記核酸分子で形質転換する工程であって、前記ポリヌクレオチドが前記植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、工程、および
前記核酸分子で形質転換した前記植物細胞から植物組織を作製するか、または植物を再生する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸分子が非同一制限部位をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非同一制限部位が、複数のＥＬＰのコンカテマー化を可能にする適合一本鎖末端を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、前記植物細胞のゲノム中にランダムに安定的に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、前記植物細胞のゲノム中の１つまたは複数の既知の標的部位に安定的に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、染色体または微小染色体の増幅領域に安定的に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物組織または植物。
【請求項８】
請求項７に記載のトランスジェニック植物によって作出される種子。
【請求項９】
トランスジェニック植物を作出するための方法であって、
請求項７に記載のトランスジェニック植物組織または植物から単離した細胞または組織を提供する工程、
少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む第一の核酸分子を提供する工程であって、前記少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼが前記トランスジェニック植物のゲノム中に導入された少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する、工程、
対象の核酸配列、および対象の核酸配列に隣接する２つのさらなる核酸配列を含む第二の核酸分子を提供する工程であって、前記２つのさらなる核酸配列のそれぞれが、ゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の２つの領域のうちの１つと相同性がある、工程、
（ｉ）前記少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼまたは前記第一の核酸分子および（ｉｉ）前記第二の核酸分子を前記植物細胞または組織に導入する工程であって、前記対象の核酸配列が前記植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる工程、および
前記第一および第二の核酸分子で形質転換した前記植物細胞または組織から植物を再生する工程を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項１０に記載のトランスジェニック植物によって作出される種子。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドの各末端に、１つまたは複数のさらなるターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位が隣接する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のさらなるターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する１つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼを植物組織または植物に導入する工程であって、前記核酸分子が前記植物組織または植物のゲノムから切除される工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ターゲティングエンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、「ENGINEERED LANDING PADS FOR GENE TARGETING IN PLANTS」に関する２０１０年１月２２日付で出願された米国仮特許出願第６１／２９７，６４１号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は概して、トランスジェニック生物、例えば植物を作製するための組成物および方法に関する。特定の実施形態では、本発明の方法は、ゲノム部位への操作されたランディングパッド（engineered landing pad）（ＥＬＰ）の取り込みを可能にし、それによって１つまたは複数のＥＬＰを含有する定義したゲノム部位への対象のさらなる核酸分子の導入を容易にする。いくつかの実施形態では、ＥＬＰは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）結合部位に隣接する本質的にランダムな配列を含むヌクレオチド配列の領域を含むことができる。
【背景技術】
【０００３】
多くの植物は、他種由来の遺伝子で遺伝的に形質転換して、望ましい形質を導入する。例えば栄養価の質の改善、収量の増大、病虫害抵抗性または疾患抵抗性の付与、干ばつ耐性およびストレス耐性の増大、色素沈着および成長などの園芸的質の改善、および／または除草剤抵抗性の付与によって、農業的価値を改善するなどして、植物からの産業上有用な化合物および／または物質の生産を可能にし、および／または医薬品の生産を可能にする。植物細胞へのクローニング遺伝子の導入および安定した多産のトランスジェニック植物の回収を使用して、このような植物の変形を作製することができ、（例えば、作物改良のための）植物の遺伝子改変を可能にしている。これらの方法では、外来ＤＮＡは典型的には真核植物細胞の核またはプラスチドＤＮＡ中にランダムに導入され、次に細胞のＤＮＡ中に組み込まれた外来ＤＮＡを含有する細胞を単離して、安定的に形質転換された植物細胞を作出する。
【０００４】
第一世代のトランスジェニック植物は、典型的にはアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換技術によって作製された。これらの技法を用いた成功は、プロトプラストにおけるＰＥＧ媒介のＤＮＡ取り込み、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、およびシリコンウィスカー媒介形質転換などの、植物のゲノムに対象の核酸分子を導入するための他の方法の開発を刺激した。
【０００５】
しかしながら、これらの植物形質転換法の全てにおいて、植物ゲノム中に取り込まれる導入遺伝子は、ランダムな形式および予想外のコピー数で組み込まれる。しばしば導入遺伝子は、導入遺伝子またはその一部分のいずれかの、反復型で組み込まれ得る。このような複雑な組み込みパターンは、（例えば、転写後遺伝子サイレンシング機構を介した転写ＲＮＡの破壊によって、または導入ＤＮＡのメチル化の誘導によって）導入遺伝子の発現レベルに影響を与え、それによって導入遺伝子の転写を下方制御する可能性がある。さらに、組み込み部位自体が、導入遺伝子の発現レベルに影響を与える可能性がある。これらの要因の組合せは、異なるトランスジェニック植物細胞および植物系間の対象の導入遺伝子または外来ＤＮＡの、発現レベルの広い変動をもたらす。さらに、対象の外来ＤＮＡの組み込みは、組み込みが起こるゲノムの領域に対して破断効果を有する可能性があり、その標的領域の正常機能に影響を与えるかまたはそれを妨害し、しばしば望ましくない副作用をもたらす可能性がある。
【０００６】
前述の事項によって、植物への特定外来ＤＮＡの導入の影響を調べると常に、多数のトランスジェニック植物系が作製され、分析されて有意な結果を得ることになる。同様に、トランスジェニック作物植物の作製では、対象の特定ＤＮＡを植物中に導入して望ましい表現型を有するトランスジェニック植物を提供する場合、独立に作製したトランスジェニック植物系の大集団を作製して、トランスジェニック植物の全体的表現型に対する副作用がほとんどまたは全くない、導入遺伝子の発現が最適である植物系の選択を可能にする。特にこの分野では、例えば、望ましくないトランスジェニックイベントの排除に必要な反復実地試験に関する厄介な制御要件および高コストの観点で、より誘導型のトランスジェニック手法が望まれる。さらに、標的ＤＮＡ挿入の可能性は導入遺伝子スタッキングのプロセスにおいても有用であり得ることは明らかである。
【０００７】
いくつかの方法が、植物中の導入遺伝子挿入を制御するための努力において開発されている。例えば、Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci. 6:155-9を参照されたい。これらの方法は、相同的組換えに基づく導入遺伝子組み込みを利用するものである。この戦略は原核生物および下等な真核生物に適用するのに成功している。Paszkowski et al. (1988) EMBO J. 7:4021-6。しかしながら、植物に関しては近年まで、導入遺伝子組み込みに関する主な機構は、組換えＤＮＡ鎖間の相同性がほとんど関与しない非正統的組換えに基づくものである。したがって、この分野における主たる課題は、非正統的組換えを介した導入外来ＤＮＡのより一層効率的な組み込みにより遮断される、稀な相同的組換えイベントの検出である。
【０００８】
注文設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ中の標的部位特異的二本鎖破壊への送達、および切断末端の後の組換えのために設計されたタンパク質である。ＺＦＮは、例えばＦｏｋＩなどの制限エンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメインと、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質を組み合わせる。例えば、Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9、Kim et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20、Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60、Kim et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7、Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9、Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9、Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95、Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9、Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81を参照されたい。個々のジンクフィンガーモチーフは、広範囲のＤＮＡ部位を標的としそれらと結合するように設計しうる。標準（canonical）Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２および非標準（non-canonical）Ｃｙｓ３Ｈｉｓジンクフィンガータンパク質は、二重らせんの主溝にα−らせんを挿入することによりＤＮＡと結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュラーであり、それぞれのフィンガーは標的中の主に３個の連続塩基対、およびタンパク質媒介認識中に数個の重要残基と接触する。ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼはヌクレアーゼドメインを介して二量体化しＤＮＡを切断し、二本鎖破壊を誘導するに違いないことが示されている。同様にＺＦＮも、ＤＮＡを切断するためにヌクレアーゼドメインの二量体化を必要とする。Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7、Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接し反対を向く結合部位によって助長される。同文献。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
［１］トランスジェニック植物または植物組織を作出するための方法であって、
植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を実質的に欠く核酸配列の少なくとも２つの領域と、少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位とを含む核酸分子を提供する工程であって、上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの実質的配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域が、上記少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する、工程、
上記植物細胞または上記植物細胞を含む植物組織を上記核酸分子で形質転換する工程であって、上記核酸分子が植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる工程、および
上記核酸分子で形質転換した上記植物細胞から植物組織を作製するか、または植物を再生する工程
を含む方法。
［２］上記核酸分子が非同一制限部位をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記非同一制限部位が、複数のＥＬＰのコンカテマー化を可能にする適合一本鎖末端を含む、上記［２］に記載の方法。
［４］上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域がオープンリーディングフレームを含まない、上記［１］に記載の方法。
［５］上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも１つの領域がオープンリーディングフレームを含まない、上記［１］に記載の方法。
［６］上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域が約５０ｂｐ〜約３ｋｂである、上記［１］に記載の方法。
［７］上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域が配列番号１〜１０からなる群の１つまたは複数から選択される、上記［１］に記載の方法。
［８］上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域およびターゲティングエンドヌクレアーゼが配列番号１５および１６を含む、上記［１］に記載の方法。
［９］上記植物細胞のゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも２つの領域およびターゲティングエンドヌクレアーゼが、単子葉植物、キャノーラを含めた双子葉植物の形質転換に使用される植物形質転換用ベクター、ｐＤＡＢ１０４１３７、ｐＤＡＢ１０４１３９、ｐＤＡＢ１０４１４１、またはｐＤＡＢ１０４１４３に取り込まれた配列番号１５および１６を含む、上記［１］に記載の方法。
［１０］上記ターゲティングエンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記［１］に記載の方法。
［１１］上記核酸分子が、上記植物細胞のゲノム中にランダムに安定的に組み込まれる、上記［１］に記載の方法。
［１２］上記核酸分子が、上記植物細胞のゲノム中の１つまたは複数の既知の標的部位に安定的に組み込まれる、上記［１］に記載の方法。
［１３］上記核酸分子が、染色体または微小染色体の増幅領域に安定的に組み込まれる、上記［１］に記載の方法。
［１４］上記［１］に記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物組織または植物。
［１５］上記［１４］に記載のトランスジェニック植物によって作出される種子。
［１６］トランスジェニック植物を作出するための方法であって、
上記［８］に記載のトランスジェニック植物組織または植物から単離した細胞または組織を提供する工程、
少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む第一の核酸分子を提供する工程であって、上記少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼが上記トランスジェニック植物のゲノム中に導入された少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する、工程、
対象の核酸配列、および対象の核酸配列に隣接する２つの他の核酸配列を含む第二の核酸分子を提供する工程であって、上記２つの他の核酸配列のそれぞれが、ゲノムＤＮＡとの配列相同性を欠く核酸配列の２つの領域のうちの１つと相同性がある、工程、
（ｉ）上記少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼまたは上記第一の核酸分子および（ｉｉ）上記第二の核酸分子を上記植物細胞または組織に導入する工程であって、上記対象の核酸配列が上記植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる工程、および
上記第一および第二の核酸分子で形質転換した上記植物細胞または組織から植物を再生する工程を含む方法。
［１７］上記［１６］に記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物。
［１８］上記［１７］に記載のトランスジェニック植物によって作出される種子。
［１９］上記核酸分子の各末端上に、１つまたは複数の他のターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位が隣接する、上記［１］に記載の方法。
［２０］上記１つまたは複数の他のターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する１つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼを植物組織または植物に導入する工程であって、上記核酸分子が上記植物組織または植物のゲノムから切除される工程をさらに含む、上記［１９］に記載の方法。
［２１］上記ターゲティングエンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記［１６］に記載の方法。
本明細書では、低い割合の相同的組換えを示す宿主生物、例えば植物または動物種のゲノムに核酸分子を導入する方法を開示する。特定の例において、「操作されたランディングパッド」（ＥＬＰ）を使用し、ＥＬＰは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー）の結合部位に隣接した、宿主生物のゲノムとの相同性を実質的に欠くヌクレオチド配列（例えば、ランダムに生じる配列）を含むヌクレオチド配列領域を含むことができる。ＥＬＰの結合部位を標的とするＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ切断機能ドメインを本来含むことができ、または機能ドメイン、例えばエンドヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断半ドメイン（例えば、ＺＦＮ、リコンビナーゼ、トランスポアーゼ、または修飾ＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼを含むホーミングエンドヌクレアーゼ）をさらに含む融合タンパク質の一部であってもよい。このクラスのＤＮＡ結合性切断タンパク質は、本明細書では一括して「ターゲティングエンドヌクレアーゼ」と呼ぶ。特定の例において、宿主生物以外の生物源由来の非ランダムのヌクレオチド配列も使用することができ、標的生物のゲノムとの非相同性が適切である。したがって、いくつかの例において、任意の配列決定した標的植物ゲノムの領域と相同性が実質的にないことを確実にするように、ヌクレオチド配列を設計しうる。
【００１０】
いくつかの例において、ＥＬＰは、相同性指向型（homology-directed）遺伝子ターゲティングのためのターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）に対して高活性の相同性領域および結合部位を提供しうる。したがってＥＬＰは、外部または内部、核酸挿入体で他のヌクレオチド配列を使用する必要性を低減または排除しうる。いかなる擬似オープンリーディングフレームも欠如し、好ましくはベクターの構築または対象の核酸分子で形質転換した植物の分析のため、制限酵素部位を含有または欠如するように、ＥＬＰを設計しうる。いくつかの例において、ＥＬＰは制限酵素の消化の際に適合末端を生成する非同一制限部位に隣接する可能性はあるが、ハイブリッド結合部位は制限酵素の一方によって切断されない。これらおよび他の例において、これは、独自の相同性領域およびターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位（例えば、ＺＦＮ結合部位）をそれぞれが有する大規模アレイへの、ＥＬＰのコンカテマー化を可能にする。
【００１１】
いくつかの例において、ＥＬＰを標的ゲノムにランダムに取り込ませることが可能であり、または生じるトランスジェニック植物に対して許容範囲の有害な影響ありで、もしくは有害な影響なしで、トランスジェニック挿入体を収容することが示されているゲノム部位にターゲティングしうる。ゲノム標的部位中の相同性領域は、標的ドナー核酸分子中の相同性領域と同一である可能性があり、それによってターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）による二本鎖切断後の相同性指向型組換えが容易になる可能性がある。
【００１２】
したがって、ＥＬＰを設計および作製する方法、およびＥＬＰを使用して対象の核酸分子で植物を形質転換する方法を開示する。本発明中で有用な核酸分子、および本発明による方法によって作出される遺伝子組換え植物も開示する。
【００１３】
前述および他の特徴は、添付の図面の参照に続くいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１００６１０を含む代表的なベクターを示す図である。
【図２】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１００６１１を含む代表的なベクターを示す図である。
【図３】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１００６４０を含む代表的なベクターを示す図である。
【図４】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１００６４１を含む代表的なベクターを示す図である。
【図５】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１０５９５５に組み込まれたドナー断片を含む代表的なベクターを示す図である。
【図６】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１０５９５６に組み込まれたドナー断片を含む代表的なベクターを示す図である。
【図７】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１０５９７９に組み込まれたドナー断片を含む代表的なベクターを示す図である。
【図８】ＥＬＰ、ｐＤＡＢ１０５９８０に組み込まれたドナー断片を含む代表的なベクターを示す図である。
【図９】ａ）メイズにおけるＥＬＰ１、ｂ）ＥＬＰ１再ターゲティングのドナー構築物、ｃ）再ターゲティングされたＥＬＰ１遺伝子座の概略図である。
【図１０】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３２の描写を含む図である。
【図１１】改変ジンクフィンガー結合部位およびバッファー配列に隣接したマルチクローニングサイトの代表的なＤＮＡ断片を示す図である。
【図１２】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１２６を示す図である。
【図１３】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３６を示す図である。
【図１４】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３８を示す図である。
【図１５】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１４０を示す図である。
【図１６】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１４２を示す図である。
【図１７】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３３を示す図である。
【図１８】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３４を示す図である。
【図１９】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３５を示す図である。
【図２０】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３７を示す図である。
【図２１】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１３９を示す図である。
【図２２】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１４１を示す図である。
【図２３】代表的なベクターｐＤＡＢ１０４１４３を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
いくつかの実施形態において、宿主生物中へのさらなる対象の核酸分子の組み込みが容易になるように、宿主生物中に「操作されたランディングパッド」（ＥＬＰ）を含む核酸分子を導入する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＥＬＰは、ターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、ＺＦＮ認識部位）に隣接した、宿主生物の天然配列（例えば、本質的にランダムに生じる核酸配列、本明細書に開示する特定の望ましい基準に基づき挿入用に次いで選択され得る）と相同性がない核酸配列の領域を含み得る。ＥＬＰを組み込むための部位はランダムであってよく、例えばＥＬＰの部位に対象の核酸分子を導入するのに望ましい発現レベルを有する宿主ゲノム内の構造遺伝子を同定することにより決定することができ、またはＥＬＰをその部位に導入したとき形質転換宿主生物に代謝的、機能的、農学的（植物の場合）または他の制約を与えない宿主ゲノム内の位置を同定することにより決定しうる。例えば本発明の方法に従って作出される生物中にコンカテマーとしてＥＬＰが存在するように、ゲノム中にＥＬＰをタンデムで導入しうる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、対象の核酸分子の組み込みはＥＬＰ部位に実施する。いくつかの実施形態において、ＥＬＰ部位に導入される対象の核酸分子は、１つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼと結合し、ポリペプチドとして与えられまたは導入ＲＮＡもしくはＤＮＡから発現される。さらに、導入核酸分子は、宿主ゲノム中に既に取り込まれたＥＬＰと異なるＥＬＰを含み得る。当業者は、野生型生物において宿主ゲノム中の天然核酸配列が発現される部位に導入される核酸配列は、天然核酸配列と類似した形式で発現されると予想されることを理解している。例えば、野生型生物において制御エレメントの調節下で（例えば、核酸配列が例えば組織特異的または発生特異的な形式で発現されるように）天然核酸配列が発現される場合、導入核酸配列は同一または類似の制御調節を受けると予想される。したがってＥＬＰは、ＥＬＰ部位に導入された対象の核酸分子の所望の時間的および／または空間的発現を容易にしうる。
【００１７】
ＩＩ．略語
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＬＰ  操作されたランディングパッド
ＺＦＮ  ジンクフィンガーヌクレアーゼ
【００１８】
ＩＩＩ．用語
遺伝子発現：それによって核酸転写ユニット（例えばゲノムＤＮＡを含む）のコード情報が、細胞の作動的、非作動的、または構造的な部分に変換されるプロセス（タンパク質の合成を含むことが多い）である。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増大または低下させる物質への細胞、組織、または生物の曝露によって影響を受ける可能性がある。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡそしてタンパク質への経路中の任意の場所で制御することもできる。遺伝子発現の制御は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に作用する調節によって、またはそれらが生成した後の特定タンパク質分子の活性化、不活性化、区画化、もしくは分解によって、またはこれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、またはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（１つまたは複数）を非制限的に含む当技術分野で知られている任意の方法により、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定しうる。
【００１９】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドとそれらのアナログは、相補的塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によってハイブリダイズする。一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基はピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンの結合は「塩基対形成」と呼ばれる。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的な」は、２つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対形成を指す。
【００２０】
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」は、安定的および特異的結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間で起こるような十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能に干渉し、特異的結合が望ましい条件下、例えばｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは系の場合生理的条件下でのオリゴヌクレオチドと非標的配列の非特異的結合を回避するほど十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
【００２１】
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変わる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに貢献するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。特定の程度のストリンジェンシーを得るのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11中で論じられている。
【００２２】
本開示の目的で、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間に２５％未満のミスマッチが存在する場合、その下でハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、特定のレベルのストリンジェンシーにさらに定義しうる。したがって、本明細書で使用する「適度なストリンジェンシー」条件は、その下で２５％を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件である。「中間ストリンジェンシー」の条件は、その下で１５％を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」の条件は、その下で１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、その下で６％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
【００２３】
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション、次に４０分間の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での連続洗浄を含み得る。
【００２４】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質など）は、その構成成分が本来存在する生物の細胞内の他の生物学的構成成分、すなわち他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびタンパク質から実質的に分離、生成、または精製されている。「単離された」状態である核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、および化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。
【００２５】
核酸分子：ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得るポリマー型のヌクレオチド、ならびに前述の合成型および混合ポリマー。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、または一方の型のヌクレオチドの修飾型を指す。本明細書で使用する「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。この用語は、一本鎖および二本鎖型のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または非天然ヌクレオチド結合により１つに結合した、天然に存在するヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの一方または両方を含み得る。
【００２６】
当業者によって容易に理解されるように、核酸分子は化学的または生化学的に修飾することができ、または非天然または誘導体ヌクレオチド塩基を含有しうる。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、および１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログの置換がある。他の修飾には、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント成分（例えば、ペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）がある。用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖、部分的デュプレックス、トリプレックス、ヘアピン、環状、およびパドロック形状を含めた任意の位相幾何学的形状も含む。
【００２７】
作動可能に連結した：第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係があるとき、第一の核酸配列は第二の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるとき、プロモーターはコード配列と作動可能に連結している。組換えにより生成するとき、および同一リーディングフレームで２つのタンパク質コード領域を接合することが必要である場合、作動可能に連結した核酸配列は一般に隣接している。しかしながら、エレメントは、作動可能に連結するように互いに隣接している必要はない。
【００２８】
プロモーター：転写に必要とされる（遺伝子の５’領域に向かって）一般に上流に位置するＤＮＡの領域。プロモーターは、それらが制御する遺伝子の正確な活性化または抑制を可能にする。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含有する。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列と結合し、ＲＮＡポリメラーゼ（遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素）の動員をもたらす。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターを使用する。組織特異的プロモーターは、生物の他の組織と比較してプロモーターが特異的である組織中の、関連遺伝子の高レベルの転写を誘導するＤＮＡ配列である。組織特異的プロモーターの例には、タペート組織特異的プロモーター、葯特異的プロモーター、花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号、および国際ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／０４２５８７参照）、胚珠特異的プロモーター（例えば、米国特許出願Ｎｏ．２００１／０４７５２５Ａ１参照）、果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号、および同第５，７５３，４７５号参照）、および種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号、および同第５，６０８，１５２号参照）がある。いくつかの実施形態において、発生段階特異的プロモーター、例えば発生中の後期段階で活性があるプロモーターも使用する。
【００２９】
形質転換：ウイルスまたはベクターは、それが細胞に核酸分子を移すとき、細胞を「形質転換」または「形質導入」する。細胞ゲノム中への核酸分子の取り込み、またはエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞により安定的に複製された状態になるとき、細胞に形質導入された核酸分子によって細胞は「形質転換」される。本明細書で使用する用語「形質転換」は、それによって核酸分子をこのような細胞中に導入しうる、全ての技法を包含する。例には、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）、リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）、マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）、直接的なＤＮＡの取り込み、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント（Klein et al. (1987) Nature 327:70）があるが、これらに限定されない。
【００３０】
導入遺伝子：外来核酸配列。一例では、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、産業上もしくは薬学上有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業的形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子はアンチセンス核酸配列であり、アンチセンス核酸配列の発現は標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子と作動可能に連結した制御配列（例えば、プロモーター）を含有しうる。いくつかの実施形態において、ＥＬＰ標的組換えにより導入される対象の核酸分子は導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態において、対象の核酸分子は、その内因性核酸配列の追加的ゲノムコピーが望ましい内因性核酸配列、または宿主生物中の標的核酸分子に対してアンチセンス方向に存在する核酸分子である。
【００３１】
ベクター：細胞中に導入し、それによって形質転換細胞を生成する核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞中でのその複製を可能にする核酸配列を含むことができる。例には、細胞中に外来ＤＮＡを運ぶ、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスがあるが、これらに限定されない。ベクターは、当技術分野で知られている、１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含むことができる。ベクターは細胞に形質導入、形質転換、または感染し、それによってベクターによってコードされる核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させうる。ベクターは、細胞中への核酸分子の進入の実施を容易にする物質（例えば、リポソーム、コードタンパク質など）を場合によっては含むことができる。
【００３２】
ＩＶ．植物における遺伝子ターゲティング用の操作されたランディングパッド
Ａ．概要
いくつかの実施形態において、ＥＬＰを植物に導入して、例えば１つまたは複数の対象のさらなる核酸分子の導入を容易にする。対象のさらなる核酸分子は、例えば、宿主生物中で発現されるタンパク質をコードする任意の核酸配列を含むことができる。他の実施形態において、ＥＬＰを使用して未知の機能の核酸分子の導入を容易にし、異所遺伝子発現に基づいてそれらの機能を識別する。（１つまたは複数の）ＥＬＰに隣接する領域は、（１つまたは複数の）ＥＬＰが部位特異的に宿主植物ゲノム中に組み込まれるように、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的であってもよい。ＥＬＰを使用して様々な長さの核酸分子を取り込むことができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、トランスジェニックＥＬＰ標的にターゲティングされる核酸分子は、標的部位における連続遺伝子付加を可能にするために第二のＥＬＰを含有しうる。１つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）をこのプロセス中連続的または同時に使用しうる。望む場合、２つ以上のターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位（例えば、ＺＦＮ結合部位）を、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的な（１つまたは複数の）ＥＬＰ領域内に追加的に取り込ませうる。いくつかの実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位は、それらがＥＬＰに隣接するように加えることができる。この後者およびさらなる実施形態において、植物中の加えた結合部位で切断するターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）の発現はＥＬＰの切除をもたらす。
【００３４】
いくつかの実施形態において、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的な領域を、他の隣接ＤＮＡと組み合わせて使用して、ＥＬＰ標的に導入される対象の核酸分子、例えば、遺伝子発現エレメントまたは対象の遺伝子などに隣接した核酸分子を挿入させることもできる。ＤＮＡ切断を使用して、この部位における相同的組換えを高めることができる。いくつかの実施形態において、ゲノム核酸配列と相同的なＥＬＰ中の相同性領域は、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼまたは他のターゲティングエンドヌクレアーゼなどのＤＮＡを切断する酵素によって容易になる、核酸分子の標的挿入に使用することもできる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ増幅プロセスによりまたは微小染色体において生成しうる修飾染色体領域中に、ＥＬＰを取り込ませうる。いくつかの実施形態において、相同性領域および適切に配置されたターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を使用して、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的な隣接領域内の配列の修飾を容易にする。
【００３６】
Ｂ．ＥＬＰの設計
いくつかの実施形態において、植物染色体の位置における相同的組換えを容易にするように、ＥＬＰを設計しうる。ＥＬＰは周辺遺伝子またはＤＮＡ配列に対して中立的影響を有し得る。ＥＬＰは植物ゲノム内の独自の、標的可能配列を示し得る。特定の実施形態において、所望の染色体位置に対する各５’および３’相同性領域の大きさ（例えば、１ｋｂ）を、相同性指向型組換えを容易にするのに望ましいと考えられる最小の大きさに見合うよう選択する。具体的な実施形態において、各５’および３’相同性領域の大きさは、約５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、４００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．４ｋｂ、１．６ｋｂ、１．８ｋｂ、２ｋｂ、または３ｋｂである。特定の実施形態において、５’および３’相同性領域は同じ大きさである必要はない。例えば乱数発生用のコンピュータープログラムを使用して、ＥＬＰ配列を生成しうる。例えば乱数発生により生成したＥＬＰ配列は次いで、望ましい特徴（標的生物の天然ゲノム配列に対する相同性を実質的または完全に欠く配列を含むがこれらに限定されない）に基づいてＥＬＰとして使用するために選択しうる。選択したＥＬＰは、以下でさらに詳述するように修飾することもできる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＥＬＰの設計および／または選択したＥＬＰの修飾に関する基準は、以下の１つまたは複数を含み得る：クローニングに通常使用する制限部位の除去、潜在的メチル化部位（例えば、ＣＧおよびＣＮＧ）の数の減少、および３００ｂｐを超える任意のオープンリーディングフレームの不在。さらに、ＥＬＰの設計中、例えば、エクソン：イントロン接合部（５’または３’）；ポリＡ付加シグナル；ＲＮＡポリメラーゼ終了シグナル；および非常に安定した鎖内二次構造を含む、核酸配列中の他の部位を除去しうる。配列を分析し、修飾してＴＡまたはＣＧダブレットの頻度を低下させることも可能である。［Ｇ＋Ｃ］または［Ａ＋Ｔ］の約６を超える連続残基を有する配列ブロックを、ＥＬＰの設計中に配列から除去することもできる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＥＬＰは例えば、Ｘ１−Ｙ−Ｘ２であって、前式でＹが少なくとも１つのターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位（例えば、ＺＦＮ結合部位）であり、Ｘ１が宿主生物のゲノムとの相同性を欠く選択したヌクレオチド配列でありＹの５’に位置し、Ｘ２が、Ｘ１とは異なる宿主生物のゲノムとの相同性を欠く選択したヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含み得る。
【００３９】
例示的なＸ１およびＸ２ヌクレオチド配列は、以下の配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０から独立に選択しうる。いくつかの実施形態において、これらの配列に対するさらなる修飾、欠失、または付加（例えば、制限部位の除去または付加）を施して、付加または異なる機能を与えることができる。例えば、特定の実施形態において、配列番号１を修飾して配列番号１１を生成することができ、配列番号３を修飾して配列番号１２を生成することができ、配列番号２を修飾して配列番号１３を生成することができ、配列番号４を修飾して配列番号１４を生成することができ、配列番号５を修飾して配列番号１７を生成することができ、配列番号６を修飾して配列番号１８を生成しうる。
【００４０】
特定の実施形態において、例示的なＥＬＰには、以下の配列、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１９があるが、これらに限定されない。
【００４１】
制限酵素部位（例えば、ＦｓｅＩ制限酵素部位）をＥＬＰの隣に導入して、適切なベクターへのＥＬＰのクローニングを可能にしうる。制限酵素の消化によって適合末端を生成する制限酵素部位（例えば、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ部位）をＥＬＰの隣に導入して、宿主植物ゲノムにおいて、例えばコンカテマーとしてのＥＬＰの同時の鎖形成を可能にすることもできる。制限酵素部位を導入して、組換えによりＥＬＰに後にターゲティングされる対象の核酸配列の宿主植物における分析を可能にすることもできる。２つ以上の制限酵素部位を１つのＥＬＰの隣に導入しうる。例えば、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ部位をＦｓｅＩ部位の内部に含めることができる。制限酵素部位を導入して、組換えによる挿入用にＥＬＰにターゲティングされる対象の核酸配列の宿主植物における分析を可能にすることもできる。例えば、ＰｍｅＩ部位を挿入部位の隣に導入しうる。
【００４２】
Ｃ．ＥＬＰを含有する植物細胞への核酸分子の送達
標的組み込みによる植物ゲノムへの、対象の核酸分子（例えば、事前に組み込まれたＥＬＰにターゲティングされる（１つまたは複数の）ＥＬＰおよび／または外来核酸分子）のターゲティングエンドヌクレアーゼ媒介の組み込みを可能にするため、ターゲティングエンドヌクレアーゼまたはターゲティングエンドヌクレアーゼコード核酸分子の送達、次に植物細胞中での機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質の発現が必要とされる。ターゲティングエンドヌクレアーゼがその中で送達または発現されるのと同時に、対象の核酸分子も植物細胞中に存在するはずであり、したがって機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質は（１つまたは複数の）標的部位で二本鎖破壊を誘導する可能性があり、それらは次いで標的遺伝子座への対象の核酸分子の相同性指向型組み込みにより修復される。当業者は、機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質の発現は、ターゲティングエンドヌクレアーゼコード構築物のトランスジェネシス、またはターゲティングエンドヌクレアーゼコード構築物の一過性発現に限定されないが、これらを含むいくつかの方法により実施しうることを想定しうる。この両方の場合において、植物細胞中での機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質の発現およびドナーＤＮＡの送達を同時に実施して、標的組み込みを誘導しうる。
【００４３】
したがって、特定の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を形質転換植物中で核酸分子から発現させて、形質転換植物のゲノム中、例えば植物に事前に導入した１つまたは複数のＥＬＰ中に二本鎖破壊を導入する。ＥＬＰ中に存在するように設計された１つまたは複数の認識配列を標的とする、ターゲティングエンドヌクレアーゼを使用しうる。したがって、本発明のＥＬＰを構築するための設計および選択手法は、ＥＬＰに対象の核酸分子を導入するために後に使用されるターゲティングエンドヌクレアーゼ（１つまたは複数）によって認識される、１つまたは複数の特異的核酸配列を決定することにより始めることができる。ＺＦＮ系の柔軟性および特異性は、知られているリコンビナーゼ媒介遺伝子切除戦略により以前は実施不能であった一定レベルの制御をもたらす。
【００４４】
一例として、ＺＦＮを容易に操作して、例えば特異的核酸配列（例えば、ＥＬＰ）を認識しうる。Wu et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44。ジンクフィンガー認識残基に関するコドンのランダム化は、任意で選択したＤＮＡ配列に対して高い親和性を有する新たなフィンガーの選択を可能にする。さらに、ジンクフィンガーは天然ＤＮＡ結合分子であり、改変ジンクフィンガーは生きた細胞中でそれらの設計標的に作用することが示されている。したがって、ジンクフィンガーベースのヌクレアーゼは、特異的であるが任意の認識部位にターゲティングしうる。
【００４５】
キメラジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインの二量体化に関する要件は、高レベルの配列特異性をもたらす。３フィンガーの各組は９連続塩基対と結合するので、それぞれのジンクフィンガードメインが完全な特異性を有する場合、２キメラヌクレアーゼは１８ｂｐの標的を効果的に必要とする。この長さの任意の所与の配列は１ゲノム内に特有であると予想される（約１０９ｂｐと仮定）。Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(1):289-97、Wu et al. (2007)、上記。さらに、他のフィンガーは高い特異性をもたらし、Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:14628-33、Kim and Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7、Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5525-30、したがって各ＤＮＡ結合ドメイン中のジンクフィンガーの数が増大して一層高い特異性をもたらす可能性がある。例えば、２４ｂｐの配列を認識する一対の４フィンガーＺＦＮを使用することによって、特異性はさらに増大し得る。Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51。したがって、宿主植物ゲノム中に導入されるＥＬＰ中の認識配列がゲノム内に特有であるように、ＺＦＮを使用しうる。
【００４６】
ＥＬＰにおける標的組換えによって導入される対象の核酸分子は、望ましい形質または表現型を与えるのに十分な量の遺伝子の発現を誘導する、１つまたは複数の植物プロモーター（１つまたは複数）と作動可能に連結しうる。この使用および他の使用に適したプロモーターは当技術分野でよく知られている。このようなプロモーターを記載する非制限的な例には、米国特許第６，４３７，２１７号（メイズＲＳ８１プロモーター）、同第５，６４１，８７６号（イネアクチンプロモーター）、同第６，４２６，４４６号（メイズＲＳ３２４プロモーター）、同第６，４２９，３６２号（メイズＰＲ−１プロモーター）、同第６，２３２，５２６号（メイズＡ３プロモーター）、同第６，１７７，６１１号（構成的メイズプロモーター）、同第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、および同第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）、同第６，４３３，２５２号（メイズＬ３オレオシンプロモーター）、同第６，４２９，３５７号（イネアクチン２プロモーター、およびイネアクチン２イントロン）、同第５，８３７，８４８号（根特異的プロモーター）、同第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）、同第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）、同第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）、同第６，１７５，０６０号（リン欠乏誘導性プロモーター）、同第６，３８８，１７０号（双方向性プロモーター）、同第６，６３５，８０６号（γ−コイキシンプロモーター）、および米国特許出願第０９／７５７，０８９号（メイズ葉緑体アルドラーゼプロモーター）がある。他のプロモーターには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）、オクトパインシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（これはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発プラスミドで実施される）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）、スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、および同第５，５３０，１９６号）、ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号、および同第５，３７８，６１９号）、ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）、ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７、Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73、Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）などがある。
【００４７】
対象の核酸分子と場合によっては作動可能に連結しうる他の遺伝子エレメントには、輸送ペプチドをコードする配列がある。例えば、Ａ．タリアナ（A.thaliana）のＥＰＳＰＳＣＴＰ（Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42）、およびペチュニアハイブリダ（Petunia hybrida）のＥＰＳＰＳＣＴＰ（della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7）などの適切な葉緑体輸送ペプチドの取り込みは、異種のＥＰＳＰＳタンパク質配列をトランスジェニック植物中の葉緑体にターゲティングすることが示されている。国際ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００８／１０５８９０中に記載されたように、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）も葉緑体にターゲティングしうる。
【００４８】
対象の核酸分子と場合によっては作動可能に連結しうる他の遺伝子エレメントは、翻訳リーダー配列として機能するプロモーター配列とコード配列の間に位置する５’ＵＴＲも含む。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性、および／または翻訳効率に影響を与えることができる。翻訳リーダー配列の例には、メイズおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、およびその他がある。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照。５’ＵＴＲの非制限的な例には、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）、ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号）、ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）、およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７、およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）がある。
【００４９】
対象の核酸分子と場合によっては作動可能に連結しうる他の遺伝子エレメントは、３’非翻訳配列、３’転写終結領域、またはポリアデニル化領域も含む。これらはポリヌクレオチド分子の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および／または転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を与えることができる他の制御シグナルを与えるポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは植物中で機能して、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニレートヌクレオチドの付加を引き起こす。ポリアデニル化配列は、天然遺伝子、様々な植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来してよい。３’転写終結領域の非制限的な一例は、ノパリンシンターゼ３’領域である（ｎｏｓ３’、Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）。異なる３’非翻訳領域の使用の一例はIngelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80中に与えられる。ポリアデニル化シグナルの非制限的な例には、ピスム・サティブム（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子からのポリアデニル化シグナル（Ps.RbcS2-E9、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）、およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０１３１２）がある。
【００５０】
Ｄ．核酸分子を用いた宿主細胞の形質転換
植物に核酸分子を導入するための当技術分野で知られている任意の技法を使用して、本発明による形質転換植物を作出する、例えば、宿主植物ゲノムに１つまたは複数のＥＬＰを導入する、および／または対象の核酸分子をさらに導入しうる。植物の形質転換に適した方法には、米国特許第５，３８４，２５３号中に例示されたエレクトロポレーションによる方法、米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、および同第６，４０３，８６５号中に例示されたマイクロプロジェクタイルボンバードメントによる方法、米国特許第５，６３５，０５５号、同第５，８２４，８７７号、同第５，５９１，６１６号、同第５，９８１，８４０号、および同第６，３８４，３０１号中に例示されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による方法、および米国特許第５，５０８，１８４号中に述べられたプロトプラスト形質転換による方法などの、それによってＤＮＡを細胞中に導入しうる任意の方法がある。これらの技法などの技法の施用によって、ほぼ任意の植物種の細胞を安定的に形質転換することができ、当業者に知られている技法によって、これらの細胞をトランスジェニック植物に成長させうる。例えば、綿花形質転換の状況で特に有用でありうる技法は米国特許第５，８４６，７９７号、同第５，１５９，１３５号、同第５，００４，８６３号、および同第６，６２４，３４４号中に開示され、特にアブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技法は例えば米国特許第５，７５０，８７１号中に開示され、ダイズを形質転換するための技法は例えば米国特許第６，３８４，３０１号中に開示され、コーンを形質転換するための技法は例えば米国特許第７，０６０，８７６号、米国特許第５，５９１，６１６号、および国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６７２２中に開示される。
【００５１】
レシピエント細胞への外来ＤＮＡの送達の実施後、さらなる培養および植物再生用の形質転換細胞が一般に確認される。形質転換体を同定する能力を向上させるために、形質転換体を作製するために使用する、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子および形質転換用ベクターを利用することが望ましい可能性がある。この場合、おそらく形質転換された細胞集団は、１つまたは複数の選択剤に細胞を曝すことによりアッセイすることができ、または望ましいマーカー遺伝子形質に関して細胞をスクリーニングしうる。
【００５２】
選択剤への曝露に対して生存する細胞、またはスクリーニングアッセイ中で陽性と記録された細胞は、植物の再生を促進する培地中で培養しうる。いくつかの実施形態において、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節物質などのさらなる物質を含めることによって改変しうる。植物再生作業を始めるのに十分な組織が得られるまで、または、反復した数ラウンドの手作業による選択後、組織の形態が再生に適した状態になり（例えば、少なくとも２週間）、次いで苗条形成を促進する培地に移すまで、成長調節物質を含む基本培地上に組織を維持しうる。十分な苗条形成が起こるまで、培養物は定期的に移動させる。苗条が形成された後、それらは苗条形成を促進する培地に移す。十分な根が形成された後、さらなる増殖および成熟のため植物を土壌に移すことができる。
【００５３】
再生植物中の対象の核酸分子の存在を確認するために、様々なアッセイを実施しうる。このようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティングおよびＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット）または酵素機能による、タンパク質産物の存在の検出などの生化学的アッセイ、葉または根のアッセイなどの植物部分アッセイ、および再生植物全体の表現型の分析がある。
【００５４】
標的組み込みイベントは、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを例えば使用して、例えばＰＣＲ増幅によってスクリーニングしうる。ＰＣＲによる遺伝子型決定は、ゲノム中に組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予想される単離宿主植物カルス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、次にＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列分析に限定されないが、これらを含むと理解される。ＰＣＲによる遺伝子型決定の方法は十分記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2002)Plant J.32:243-53）、細胞培養物を含めた任意の植物種または組織型由来のゲノムＤＮＡに適用しうる。標的配列と導入配列の両方と結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、ＰＣＲ増幅反応において連続的に使用または多重化しうる。標的部位、導入核酸配列、および／またはこの２つの組合せとアニーリングするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーが考えられる。したがって、ＰＣＲによる遺伝子型決定戦略は、植物ゲノム中の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の多重特異的配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的配列の増幅、またはこれらの組合せ（に限定されないが）これらを含むことができる。当業者は、ゲノムを調べるためのプライマーと増幅反応混合物の他の組合せを考案しうる。例えば、一組のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを、導入核酸配列境界外の標的に特異的な（１つまたは複数の）核酸配列とアニーリングするように設計しうる。
【００５５】
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、対象の核酸分子内のコード領域、または対象の核酸分子の他の部分に相当する配列で、対象の導入核酸分子と特異的にアニーリングするように設計しうる。これらのプライマーは、前に記載したプライマーと共に使用しうる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成することができ、（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡから）市販されている。増幅にクローニングおよび配列決定、または増幅産物の直接的配列分析を続けることができる。当業者は、ＰＣＲによる遺伝子型決定中に生成した増幅産物を分析するための他の方法を想定しうる。一実施形態において、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅中に利用する。
【００５６】
Ｅ．トランスジェニック植物の栽培および使用
本発明に従いＥＬＰ部位に標的組み込みにより挿入した１つまたは複数のＥＬＰおよび／または対象の核酸分子を含むトランスジェニック植物は、１つまたは複数の望ましい形質を有する可能性がある。このような形質は、例えば、昆虫、他の病虫害、および病原因子に対する抵抗性、除草剤に対する耐性、高い安定性、収率、または貯蔵寿命、環境耐性、医薬品生産、工業製品生産、および栄養価向上を含むことができる。望ましい形質は、望ましい形質を示す植物中で発現されるＥＬＰ部位に標的組み込みにより挿入される１つまたは複数の核酸分子によって与えられる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、望ましい形質は、植物のゲノムＥＬＰ部位に導入される植物中の（１つまたは複数の）導入遺伝子の存在に原因がある可能性がある。他の実施形態において、望ましい形質は従来の品種改良によって得ることができ、その形質はＥＬＰ部位に標的組み込みにより挿入される１つまたは複数の核酸分子によって与えられる可能性がある。
【００５７】
本発明によるトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子で形質転換しうる任意の植物であってよい。したがって、植物は双子葉植物または単子葉植物であってよい。本発明の方法中で有用な双子葉植物の非制限的な例には、アルファルファ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、綿花、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、パンプキン、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、およびスイカがある。本発明の方法中で有用な単子葉植物の非制限的な例には、コーン、タマネギ、イネ、モロコシ、コムギ、ライムギ、キビ、サトウキビ、オートムギ、ライコムギ、スイッチグラス、およびターフグラスがある。
【００５８】
本発明によるトランスジェニック植物は任意の形式で使用または栽培することができ、（１つまたは複数の）ＥＬＰおよび／または対象の核酸分子の存在が望ましい。したがって、本発明による核酸分子で形質転換することによって、特に１つまたは複数の望ましい形質を有するように操作することができ、当業者に知られている任意の方法によって収穫および栽培しうる。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例証するために含まれる。実施例中に開示する技法は、本発明の実施において十分機能することが本発明者らにより発見された技法を表すことは、当業者によって理解される。しかしながら当業者は、本開示に照らして、開示する具体的な実施形態において多くの変形を作製することができ、本発明の範囲から逸脱せずに同様または類似の結果をさらに得ることができることを理解する。より具体的には、同様または類似の結果を得ながら、化学的かつ生理的に関係がある特定の作用物質を、本明細書に記載する作用物質に置換しうることは明らかである。当業者には明らかである全てのこのような類似の代替および変更形態は、添付の特許請求の範囲によって定義する本発明の範囲内にあると考えられる。
【実施例１】
【００６０】
ベクター構築
１ｋｂｐの５’相同性領域（ｐＤＡＢ１００６１０／ｐＤＡＢ１００６４０中の「操作されたランディングパッド領域１」（配列番号１１）およびｐＤＡＢ１００６１１／ｐＤＡＢ１００６４１中の「改変合成相同性領域３」（配列番号１２））、および１ｋｂｐの３’相同性領域（ｐＤＡＢ１００６１０中の「操作されたランディングパッド領域２」（配列番号１３）およびｐＤＡＢ１００６１１／ｐＤＡＢ１００６４１中の「改変合成相同性領域４」（配列番号１４））からなる、２つの異なるＥＬＰを合成した。これらの相同性領域は２つの異なるＥＸＺＡＣＴジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｅＺＦＮ）結合部位によって分けた。
【００６１】
それぞれＥＬＰ１（配列番号１５）およびＥＬＰ２（配列番号１６）で表すｐＤＡＢ１００６１０およびｐＤＡＢ１００６１１に使用した２つのＥＬＰを、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｐＤＡＢ１００７０４、ｐＳＢ１１由来のデスティネーションスーパーバイナリーベクターに移した（ＷＯ９４／００９７７およびＷＯ９５／０６７２２）。ｐＤＡＢ１００７０４は、ＺｍＵｂｉ１プロモーター（プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology, 18(4);675-89）由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびイントロン）、アリルオキシフェノオキシプロピオネート除草剤に対する耐性を与えるαケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードするＡＡＤ−１選択マーカー遺伝子（スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobium herbicidovorans）由来の、合成、植物最適型のアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ遺伝子（ＡＴＣＣ（登録商標）７００２９１）（ＷＯ２００５／１０７４３７、ＷＯ２００８／１４１１５４Ａ２、およびＵＳ２００９／００９３３６６、その各々は参照により本明細書に組み込まれる）、およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ（トウモロコシ（Zea mays）ＬＩＰ遺伝子の転写終結およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３５９１３）を含有する。
【００６２】
それぞれＥＬＰ１（配列番号１５）およびＥＬＰ２（配列番号１６）で表すｐＤＡＢ１００６４０およびｐＤＡＢ１００６４１に使用した２つのＥＬＰを、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｐＤＡＢ１０１８４９、バイナリーベクターに移した。ｐＤＡＢ１０１８４９は、ＯｓＡｃｔ１プロモーター（プロモーター、およびイネアクチンプロモーター由来のイントロン（米国特許第５６４１８７６号））、ｐａｔ選択マーカー遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、Wohlleben et al., (1988) Gene 70:25-37）、およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ（トウモロコシ（Zea mays）ＬＩＰ遺伝子の転写終結およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３５９１３）を含有する。
【００６３】
生成したクローン、ｐＤＡＢ１００６１０（図１）、ｐＤＡＢ１００６１１（図２）、ｐＤＡＢ１００６４０（図３）、およびｐＤＡＢ１００６４１（図４）の配列を確認した。ｐＤＡＢ１００６１０およびｐＤＡＢ１００６１１ベクターは、ｐＳＢ１バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４に移し、Ｔ鎖領域は相同的組換えによってｐＳＢ１に組み込んだ。ｐＤＡＢ１００６４０およびｐＤＡＢ１００６４１ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４に移した。それぞれのプラスミドの構造は制限酵素の消化によって確認した。
【００６４】
対象の核酸分子（ドナーＤＮＡ）を含有するベクターを、ＥＬＰ１およびＥＬＰ２の（型２（ｖ２）として示す）切断型の５’および３’相同性領域の間にＹＦＰ発現カセットおよびＰＡＴもしくはＡＡＤ−１発現カセットを挿入することによって構築した。ＰＡＴ発現カセットは、ＺｍＬｉｐ３’非翻訳領域に隣接したｐａｔ遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、Wohlleben et al., (1988) Gene 70:25-37）を発現させるために使用したＯｓＡｃｔ１プロモーター（イネアクチン１プロモーター、McElroy et al., (1990) Plant Cell 2:163-171）を含有する。ＡＡＤ−１発現カセットは、ａａｄ−１遺伝子およびＺｍＰｅｒ５３’ＵＴＲを誘導するためのＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有する（米国特許第６３８４２０７号）。ＹＦＰ発現カセットは、ＰｈｉＹＦＰ遺伝子（黄色蛍光タンパク質（米国特許出願ＵＳ２００７／０２９８４１２））の発現を誘導するために使用しＺｍＰｅｒ５３’ＵＴＲに隣接するＺｍＵｂｉ１プロモーターからなる（米国特許第６３８４２０７号）。
【００６５】
ＰＡＴおよびＹＦＰ発現カセットは、ＥＬＰ１中の切断型の「操作されたランディングパッド領域１」と「操作されたランディングパッド領域２」の間にクローニングした（ｐＤＡＢ１０５９５５、図５）。あるいは、ＰＡＴおよびＹＦＰ発現カセットを、ＥＬＰ２中の切断型の「改変相同性領域３」と「改変相同性領域４」の間にクローニングした（ｐＤＡＢ１０５９５６、図６）。同様に、ＡＡＤ−１およびＹＦＰ発現カセットを、ＥＬＰ１中の切断型の「操作されたランディングパッド領域１」と切断型の「操作されたランディングパッド領域２」の間にクローニングした（ｐＤＡＢ１０５９７９、図７）。あるいは、ＡＡＤ−１およびＹＦＰ発現カセットを、ＥＬＰ２中の切断型の「改変相同性領域３」と切断型の「改変相同性領域４」の間にクローニングした（ｐＤＡＢ１０５９８０、図８）。ドナーＤＮＡ構築物をバイオリスティック、ウィスカーまたはアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換用にバイナリーベクターにクローニングした。さらに、ＤＮＡ構築物は、直接ＤＮＡ送達形質転換に使用するプラスミドＤＮＡの作製用に高コピー数プラスミド（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点を有するｐＢＲ３２２誘導体）にクローニングしうる。
【実施例２】
【００６６】
ウィスカー媒介のＤＮＡ送達
メイズの胚Ｈｉ−ＩＩ細胞培養物を米国特許第７，１７９，９０２号中に記載されたように生成し、その標的組み込みを例示した生存する植物細胞の供給源として使用した。
【００６７】
ＡＡＤ−１植物選択マーカーカセット、およびそれぞれｐＤＡＢ１００６１０ならびにｐＤＡＢ１００６１１由来のＥＬＰ１ならびにＥＬＰ２を含有する断片、およびＰＡＴ植物選択マーカーカセット、およびそれぞれｐＤＡＢ１００６４０ならびにｐＤＡＢ１００６４１由来のＥＬＰ１ならびにＥＬＰ２を含有する断片を使用してトランスジェニックイベントを作製した。トランスジェニックイベントは単離し特徴付けした。次いで相同性指向型相同的組換えを使用してこれらのイベントをターゲティングし、対象の核酸分子は操作されたランディングパッド内に組み込むことができる。
【００６８】
１２ｍＬのヘマトクリット値（ＰＣＶ）の予め凍結保存した細胞系および２８ｍＬの条件培地を、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Chu et al., (1975) Sci Sin. 18:659-668）、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ５．８）に二次培養し、２８℃において１２５ｒｐｍでシェーカー上に置いた。合計３６ｍＬのＰＣＶが３フラスコ中に分配されるように、このステップは同じ細胞系を使用して２回繰り返した。２４時間後、ＧＮ６液体培地を除去し、７２ｍＬのＧＮ６Ｓ／Ｍ浸透圧培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、４５．５ｇ／Ｌのソルビトール、４５．５ｇ／Ｌのマンニトール、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、ｐＨ６．０）と交換した。適度な攪拌で（１２５ｒｐｍ）２８℃において３０〜３５分間、暗所中でフラスコをインキュベートした。インキュベーション時間中、炭化ケイ素ウィスカーの５０ｍｇ／ｍＬ縣濁液（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ＬＬＣ、Ｇｒｅｅｒ、ＳＣ）を、８．１ｍＬのＧＮ６Ｓ／Ｍ液体培地に４０５ｍｇの滅菌、炭化ケイ素ウィスカーを加えることにより調製した。
【００６９】
ＧＮ６Ｓ／Ｍ浸透圧培地中でのインキュベーション後、各フラスコの内容物は２５０ｍＬ遠心分離容器にプールした。フラスコ中の全細胞が底部に沈殿した後、過剰な約１４ｍＬのＧＮ６Ｓ／Ｍ液体中の内容物体積を抜き取り、後の使用のため滅菌１リットルフラスコ中に回収した。予め湿潤させたウィスカーの縣濁液を６０秒間ボルテックスにおいて最大速度で混合し、次いで遠心分離容器に加えた。
【００７０】
ｐＤＡＢ１００６１０またはｐＤＡＢ１００６１１プラスミドＤＮＡのいずれかに由来する１７０μｇの精製断片をそれぞれの容器に加えた。ＤＮＡを加えた後、容器はすぐに市販の改良型Ｒｅｄ  Ｄｅｖｉｌ  ５４００ペイントミキサー（Ｒｅｄ  Ｄｅｖｉｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ）中に置き、１０秒間攪拌した。攪拌後、細胞、培地、ウィスカーおよびＤＮＡのカクテルを、１リットルフラスコの内容物および１２５ｍＬの新たなＧＮ６液体培地に加えて浸透圧調節物質を減らした。細胞は放置して、２時間１２５ｒｐｍに設定したシェーカーに回収した。６ミリリットルの分散懸濁液を、容器当たり６０フィルターを得るように、ハウスバキュームラインと結び付けたガラスセルコレクターユニットを使用してＷｈａｔｍａｎ＃４濾過紙（５．５ｃｍ）に濾過した。フィルターはＧＮ６固体培地（２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅゲル化剤を含むこと以外ＧＮ６液体培地と同じ）の６０×２０ｍｍプレート上に置き、１週間暗所条件下において２８℃で培養した。
【実施例３】
【００７１】
推定トランスジェニックイベントの同定および単離
ＤＮＡ送達後１週間で、濾過紙を適切な選択剤を含有するＧＮ６（１Ｈ）選択培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）の６０×２０ｍｍプレートに移した。これらの選択プレートは、暗所中で１週間２８℃においてインキュベートした。暗所中で１週間の選択後、３７〜３８℃に保った３．０ｍＬのＧＮ６アガロース培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、７ｇ／ＬのＳＥＡＰＬＡＱＵＥ（登録商標）アガロース、ｐＨ５．８、１２１℃で１０分間オートクレーブ処理）を含有する試験管に各プレート由来の細胞の半分をかき取ることによって、新たな培地に組織を包埋した。
【００７２】
アガロース／組織混合物をスパチュラで破壊し、その後３ｍＬのアガロース／組織混合物を、ＧＮ６（１Ｈ）培地を含有する１００×１５ｍｍペトリ皿の表面上に均一に注いだ。このプロセスは各プレートの両半分に繰り返した。全ての組織を包埋した後、プレートは個別にＮＥＳＣＯＦＩＬＭ（登録商標）またはＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）Ｍで密閉し、最大１０週間暗所条件下において２８℃で培養した。これらの選択条件下で増殖したおそらく形質転換された分離株は包埋プレートから除去し、６０×２０ｍｍプレート中の新たな選択培地に移した。約２週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントは施用した除草剤（選択剤）に耐性があると考え、細胞のアリコートは遺伝子型決定の分析用に後に採取した。
【実施例４】
【００７３】
イベントの分子的特性
ゲノムＤＮＡ抽出。
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離したメイズ細胞から抽出し、ＰＣＲによる遺伝子型決定実験の鋳型として利用した。ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）９６Ｐｌａｎｔキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に詳述された製造者のプロトコールに従い、単離した約１００〜３００μｌのヘマトクリット値（ＰＣＶ）のＨｉ−ＩＩカルスからｇＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは１００μｌのキット供給溶出バッファー中に溶出し、２０〜２００ｎｇ／μＬの最終濃度を得て、ＰＣＲベースの遺伝子型決定法によって後に分析した。
【００７４】
コピー数の分子学的分析
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイと類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子コピー数の決定を、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ４８０（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してリアルタイムＰＣＲにより実施した。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブ設計ソフトウエア２．０を使用して、ＡＡＤ−１およびＰＡＴ遺伝子ならびに内部標準遺伝子用に設計した。増幅用に、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積の多重反応混合物中に１×最終濃度に調製した。２ステップの増幅反応を３８秒間５８℃において延長部分で実施し蛍光を得た。全てのサンプルは三連で施用し、平均サイクル閾値（Ｃｔ）を各サンプルの分析用に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対定量モジュールを使用してＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウエアリリース１．５を使用して実施し、ΔΔＣｔ法に基づいた。このため、シングルコピーカリブレーターからのゲノムＤＮＡのサンプルおよび知られている２コピーチェックをそれぞれの施用に含めた（前述のＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイに使用したものと同一）。このデータから、それぞれのサンプルに関して見た目のＡＡＤ−１またはＰＡＴコピー数を次いで推定した。
【００７５】
ＰＣＲによる遺伝子型決定用のプライマー設計
オリゴヌクレオチドプライマーは標準的脱塩条件下で（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により）合成され、１００μＭの濃度まで水で希釈した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡ挿入体の末端領域とアニーリングするように設計した。非トランスジェニック生物から単離したＤＮＡの存在下でプラスミドＤＮＡの希釈物を使用して、プライマーを試験した。ｐＤＡＢ１００６１０、ｐＤＡＢ１００６１１  ｐＤＡＢ１００６４０およびｐＤＡＢ１００６４１の挿入体は、プライマーを使用して推定イベントのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。生成した断片はプラスミドベクターにクローニングし、配列決定し、操作されたランディングパッドが形質転換中に植物ゲノムに完全に組み込まれたことを確認した。
【００７６】
サザンブロット解析。
サザンブロット解析を実施して導入遺伝子のコピー数を確認した。この解析用に、ゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で消化しプローブ処理した。
【００７７】
遺伝子座特異的ＰＣＲにより推定ＥＬＰを含有すると確認したメイズ組織をサザンブロット解析に進めた。サザンブロット解析用に、組織サンプルを２ｍｌのエッペンドルフチューブに回収し、２日間凍結乾燥させた。組織解離を、Ｋｌｅｃｏ組織粉砕機およびタングステンビーズ（Ｋｌｅｃｏ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて実施した。組織解離後、製造者の示したプロトコールに従いＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。
【００７８】
ゲノムＤＮＡはＱｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により定量化した。定量化したＤＮＡはサザンブロット解析用に４μｇに調節し、一晩３７℃において適切な制限酵素を使用して消化した。消化したＤＮＡは、製造者の示したプロトコールに従いＱｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して精製した。沈殿したＤＮＡは１０×色素中に再縣濁し、４０ボルトで０．８％  ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロースゲル（Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上において１７時間電気泳動に施した。ＤＮＡは一晩ナイロンチャージメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移し、ＵＶ  Ｓｔｒａｔａリンカー１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してメンブレンに架橋させた。ブロットは２０ｍＬのＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ  Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とプレハイブリダイズさせ、適切な放射標識プローブで一晩プローブ処理した。ブロットは洗浄し、ホスファーイメージスクリーン上に２４時間置き、次いでＳＴＯＲＭ（商標）８６０スキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して分析した。
【実施例５】
【００７９】
挿入ＤＮＡを用いたトランスジェニックイベントの選択
ＡＡＤ−１またはＰＡＴ遺伝子カセットおよび完全ＥＬＰを含有する完全植物転写単位（ＰＴＵ）に関して、前に記載したように加水分解プローブアッセイおよびＰＣＲによってイベントをスクリーニングした。コピー数は、ＡＡＤ−１およびＰＡＴ遺伝子およびＥＬＰプローブを用いた標準的な方法を使用して、サザンブロット解析によってさらに確認した。ｐＤＡＢ１００６１０およびｐＤＡＢ１００６１１からのシングルコピー、完全挿入体を有する選択したトランスジェニックイベント由来のカルスを、ＡＡＤ−１遺伝子の発現に関する後の試験用に維持した。ＡＡＤ−１  ｑＲＴ−ＰＣＲ法およびＥＬＩＳＡ（以下）を使用したスクリーニングによって、ＡＡＤ−１を発現するイベントを同定した。
【００８０】
ＡＡＤ−１を発現するイベントのｑＲＴ−ＰＣＲ分析
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＡＡＤ−１遺伝子発現のｍＲＮＡ発現を定量化した。内部参照遺伝子からのｍＲＮＡ発現に対してこれらのレベルを標準化することによって、トランスジェニックＨｉ−ＩＩカルスのサンプルからの相対的ＡＡＤ−１ｍＲＮＡ発現を定量化するために、このアッセイを開発した。内部参照遺伝子からのｍＲＮＡに対するＡＡＤ−１ｍＲＮＡの標準化は異なるサンプル間のＡＡＤ−１発現の比較を可能にし、これを使用して高度に発現する可能性があるイベントを同定しうる。
【００８１】
全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）９６キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して新たなカルス組織から調製した。ＲＮＡはキットの説明書に従いＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理して、任意のゲノムＤＮＡ汚染物質を除去した。第一鎖合成はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の製造者の説明書に従い設定し、ランダムヘキサマーを使用してプライマー処理した。合成したｃＤＮＡ鎖は１：１０および１：５０の比で水に希釈した（これが複数の標的をＰＣＲ増幅するのに十分な鋳型を与える）。それぞれのアリコートは無期限に−２０℃で保存した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は以下のようにＡＡＤ−１ｃＤＮＡの増幅用に設定した。７．５μＬの２×ＬＣ４８０プローブマスターバッファー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１０μＭストックからの０．３μＬの遺伝子特異的フォワードプライマー、１０μＭストックからの０．３μＬの遺伝子特異的リバースプライマー、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０プローブマスターからの０．１５μＬのＵＰＬプローブ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）、および３．９μＬの水。ＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）はロックド核酸であり、したがって他で計算するより高いＴｍを有する。全ての構成成分は、標準および未知の構成成分を処理する前にフリーザー中に戻した。３８４ウエルマイクロプレートを境界画定および標識し、ウエル当たり１３．５μＬのマスター混合物を加えた。シーリングホイルをマイクロプレートに軽く取り付けた。Ｑｉａｇｅｎマイクロプレート遠心分離において３，０００ｒｐｍで１分間、プレートを遠心分離した。１．５μＬの解凍、希釈合成ｃＤＮＡ鎖を加えた。さらに、１．５μＬのプラスミドＤＮＡコピー数標準を最小〜最高濃度の希釈系で別々のウエルに加え、これらの標準は（全ｍＲＮＡから合成した）ＡＡＤ−１ｃＤＮＡと比較してコピー数を定量化した。ＡＡＤ−１ＤＮＡコピー数標準系は、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に標的アンプリコンをクローニングすること、およびコピー数を定量化するための希釈系を作製することによって作製した。ホイルシールをプレートに確実に取り付け、前に記載したのと同様に遠心分離した。ＰＣＲプログラムを実行し、ＤＮＡはリアルタイムＰＣＲ装置ＬＣ４８０（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）または相当物で増幅した。
【実施例６】
【００８２】
ＥＬＩＳＡによるメイズ組織中のＡＡＤ−１タンパク質の測定
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技法を使用して、メイズカルス中のＡＡＤ−１タンパク質を定量的に測定するための方法を開発した。本明細書に記載する方法を使用してＡＡＤ−１タンパク質を検出することができ、トランスジェニックメイズカルス由来の植物組織サンプルを分析しうる。
【００８３】
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有し、ウシ血清アルブミン、プロテアーゼ阻害剤またはアスコルビン酸をおそらく含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液ベースのカルス特異的バッファーを用いて、ＡＡＤ−１タンパク質をメイズサンプルから抽出した。抽出物を遠心分離し、水様性上清を回収し、希釈し特異的ＡＡＤ−１ＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。このアッセイでは同時サンドイッチＥＬＩＳＡ形式を施用した。希釈サンプルのアリコートおよびビオチニル化抗ＡＡＤ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ４７３Ｆ１８５）を、固定抗ＡＡＤ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ４７３Ｈ２７４）でコーティングしたマイクロタイタープレートのウエルでインキュベートした。これらの抗体はウエル中でメイズ発現ＡＡＤ−１タンパク質と結合して、可溶性抗体と固定抗体の間で結合したＡＡＤ−１タンパク質と「サンドイッチ」を形成した。次いで非結合サンプルおよびコンジュゲートを、ＰＢＳＴで洗浄することによりプレートから除去した。過剰量のストレプトアビジン−酵素（アルカリホスファターゼ）コンジュゲートを、インキュベーション用にウエルに加えた。ＡＡＤ−１の存在は、酵素コンジュゲートおよび酵素基質をインキュベートし、着色生成物を生成することによって検出した。ＡＡＤ−１は抗体サンドイッチにおいて結合したので、発色のレベルはサンプル中のＡＡＤ−１の濃度と関係がある（すなわち、低いタンパク質濃度は低い発色をもたらす）。４０５ｎｍにおける吸光度はプレートリーダーを使用して測定した。
【００８４】
高発現ＡＡＤ−１イベントは選択したトランスジェニックイベントから同定し、ドナーＤＮＡを用いた後のターゲティング用に保存した。
【実施例７】
【００８５】
ＥＬＰを含有する植物細胞へのバイオリスティック媒介のＤＮＡ送達
標的ＤＮＡを用いたトランスジェニックイベントの再生
低コピー数であり完全ＰＴＵを含有することを確認したｐＤＡＢ１００１６０およびｐＤＡＢ１００６１１由来のイベントを再生して、ターゲティング用の未分化胚ドナー材料を作出した。健常に成長した組織は最初に２８＋１００ハロキシホップ（ＭＳ培地（Murashige and Skoog (1962) Physiol Plant 15:473-497）、０．０２５ｍｇ／Ｌの２，−４Ｄ、５ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０．０３６２ｍｇ／Ｌのハロキシホップ、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．５ｇ／Ｌのゲルライト、ｐＨ５．７）に移し、弱光（１４μＥ／ｍ２・ｓｅｃ１６時間光周期）で７日間、次に強光（８９μＥ／ｍ２・ｓｅｃ１６時間光周期）でさらに７日間インキュベートした。緑化構造は３６＋１００ハロキシホップ（ＢＡＰおよび２，４−Ｄを含まない２８＋１００ハロキシホップと同じ）に移し、苗条構造が温室に移植するのに十分な根に発達するまで、強光（４０μＥ／ｍ２・ｓｅｃ１６時間光周期）でインキュベートした。９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０（登録商標）および５％粘土／ローム土壌の混合物を使用して、植物は温室内で成熟状態まで成長させ、植物の健康状態に応じて授粉した。活発に成長した植物は自家受粉または授粉させ（同じイベント由来の植物）、低活性植物はＨｉ−ＩＩ、Ａ１８８またはＢ１０４と交差させドナー材料の胚形成能力を維持した。
【実施例８】
【００８６】
ＥＬＰを含有する植物細胞へのバイオリスティック媒介のＤＮＡ送達
ｐＤＡＢ１００６１０およびｐＤＡＢ１００６１１から生じたイベントのターゲティング。
ドナー配列のターゲティングは、２つの異なる形質転換プロトコールを使用して実施した。選択マーカーとしてＡＡＤ−１を含有したトランスジェニック完全ＥＬＰイベント（ｐＤＡＢ１００６１０およびｐＤＡＢ１００６１１イベント）に関して、カルス前状態の未熟胚へのバイオリスティック媒介のＤＮＡ送達によってターゲティングを実施した。１．２〜２．０ｍｍの大きさの胚を授粉後１０〜１３日で採取し、Ｎ６Ｅ培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２．８ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、４．２５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、３０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ５．８）に平板培養し、暗所で２〜３日間２８℃においてインキュベートした。膨張した胚はＮ６ＯＳＭ（３６．４ｇ／ｌのソルビトール、３６．４ｇ／Ｌのマンニトールを加えＬ−プロリンを０．７ｇ／Ｌに低下させたＮ６Ｅと同じ）に移し、Ｗｈａｔｍａｎ＃４濾過紙上に２．５ｃｍ径の円形が広がった。１，０００μｍスクリーンを使用してブラスティング用の胚を含有し、胚はブラスティング前に４時間２８℃において暗所でインキュベートした。ＤＮＡでバイオリスティック粒子をコーティングするため、０．６０ミクロン径の金粒子３ｍｇを１００％エタノールで一回、滅菌蒸留水で２回洗浄し、シリコーンマイクロフュージチューブ内の５０μｌの水中に再縣濁した。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡ断片、ｐＤＡＢ１０５９５５またはｐＤＡＢ１０５９５６）をコードする合計５μｇのプラスミドＤＮＡセパレートベクター、２０μｌのスペルミジン（０．１Ｍ）および５０μｌの塩化カルシウム（２．５Ｍ）を金縣濁液に別々に加え、ボルテックスで混合した。混合物は室温で１０分間インキュベートし、１０秒間ベンチトップマイクロ遠心分離機で１０，０００ｒｐｍにおいてペレット状にし、６０μｌの氷冷１００％エタノール中に再縣濁し、８〜９μｌをそれぞれのマクロキャリアに分配した。
【００８７】
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／ＨＥ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して衝突を行った。胚を含有するプレートは６５０ｐｓｉおよび２７インチのＨｇ＋＋真空管の条件下で中段に置き、操作説明書に従い一回衝突させた。衝突後２４時間で、胚は回収のため（前と同じ）Ｎ６Ｅに（濾過紙なしで）直接移し、１３日間２８℃において暗所でインキュベートした。胚は選択培地Ｎ６Ｓ（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、０．８５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、２ｍｇ／Ｌのビアラホス、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．５ｇ／ＬのゲルライトおよびｐＨ５．８）に移し、２週間毎に選択培地に３回移し、最大１０週間暗所条件において２８℃でインキュベートした。これらの選択条件下で増殖したおそらく形質転換された分離株は包埋プレートから除去し、６０×２０ｍｍプレート中の新たな選択培地に移した。約２週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントは施用した除草剤（選択剤）に耐性があると考え、細胞のアリコートは遺伝子型決定の分析（以下に記載する分析）用に後に採取した。
【００８８】
ｐＤＡＢ１００６４０およびｐＤＡＢ１００６４１から生じたイベントのターゲティング。
選択マーカーとしてＰＡＴを含有したトランスジェニック完全ＥＬＰイベント（ｐＤＡＢ１００６４０およびｐＤＡＢ１００６４１）に関して、胚状メイズカルスへのバイオリスティック媒介のＤＮＡ送達によってターゲティングを実施した。二次培養後６〜８日で、胚状メイズ組織（（約０．４ｍＬＰＣＶの細胞）は、２．５ｇ／Ｌのゲルライトで凝固させたＧＮ６Ｓ／Ｍ培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、４５．５ｇ／Ｌのソルビトール、４５．５ｇ／Ｌのマンニトール、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、ｐＨ５．８）を含有する１００×１５ｍｍペトリ皿上に置いたＷｈａｔｍａｎ＃４濾過紙の上に２．５ｃｍ径の円形に薄く広がった。細胞は暗所条件下において４時間インキュベートした。ＤＮＡは前に記載したようにブラスティング用に調製し、ｐＤＡＢ１０５９７９およびｐＤＡＢ１０５９８０はターゲティング用に使用した。
【００８９】
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／ＨＥ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して衝突を行った。細胞を含有するプレートは１，１００ｐｓｉおよび２７インチのＨｇ＋＋真空管の条件下で中段に置き、操作説明書に従い一回衝突させた。衝突後２４時間で、植物細胞を含有する濾過紙は２．５ｇ／Ｌのゲルライトで凝固させたＧＮ６固形培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、３０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ５．８）に移し、暗所条件下において２８℃で２４時間インキュベートした。２４時間の回収期後、植物細胞を含有する濾過紙はＧＮ６＋１００ハロキシホップ（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．０３６２ｍｇ／Ｌのハロキシホップ、２．５ｇ／Ｌのゲルライト、ｐＨ５．８）に移し、細胞は濾過紙上で薄層に広がった。２週間毎に選択培地に３回移動を続けた。ドナーＤＮＡの組み込みから生じた可能性があるトランスジェニック分離株が現れ始めるまで、組織は最大１２週間インキュベートした。これらの選択条件下で増殖したおそらく形質転換された分離株は包埋プレートから除去し、６０×２０ｍｍプレート中の新たな選択培地に移した。約２週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントは施用した除草剤（選択剤）に耐性があると考え、細胞のアリコートは遺伝子型決定の分析（以下に記載する分析）用に後に採取した。
【実施例９】
【００９０】
ＰＣＲ遺伝子型決定による標的組み込みイベントのスクリーニング
トランスジェニックメイズにおけるＥＬＰへのドナー分子（ｐＤＡＢ１０５９７９、ｐＤＡＢ１０５９８０、ｐＤＡＢ１０５９５５、ｐＤＡＢ１０５９５６）のターゲティングを、１）遺伝子座特異的ＰＣＲ、２）ドナー特異的ＴａｑＭａｎ、および３）遺伝子座特異的サザンブロットの組合せの使用により分析して、挿入精度、完全性およびコピー数を評価する。陽性再ターゲティングイベントは、ａ）陽性アウト−アウトＰＣＲまたは重複イン−アウトＰＣＲ結果および２）ドナーの存在のサザンブロット診断画像を有すると予想される。
【００９１】
ＤＮＡ抽出
再ターゲティングトランスジェニックメイズ由来の組織（カルス組織または植物の葉）を、９６ウエル回収プレート（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）中で少なくとも２日間凍結乾燥させる。ＤＮＡは製造者の説明に従いＢｉｏＳｐｒｉｎｔ９６ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して凍結乾燥組織から抽出し、２００μｌの水中に再縣濁する。モデル２−９６ＡＫｌｅｃｏ組織粉砕機（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｖｉｓａｌｉａ  ＣＡ）を組織破壊用に使用する。
【００９２】
ＤＮＡ定量化：生成したゲノムＤＮＡは、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（登録商標）Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して定量化する。（段階希釈した）２０ｎｇ／μＬ〜１．２５ｎｇ／μＬの範囲の５つの予め定量化したＤＮＡ標準は、標準曲線作成に使用した。未知のサンプルは、アッセイの直線範囲内で１：１０または１：２０希釈に最初に希釈する。５μＬの希釈サンプルおよび標準を１００μＬの希釈Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ基質（１：２００）と混合し、暗所で１０分間インキュベートする。次いでＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して蛍光を記録する。ゲノムＤＮＡ濃度は、バックグラウンド蛍光補正後に計算した標準曲線から推定する。Ｂｉｏｒｏｂｏｔ−３０００自動液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して、ＤＮＡは後に２ｎｇ／μＬの濃度に標準化する。標準化したＤＮＡはＰＣＲ、およびコピー数分析に使用する。
【００９３】
ＰＣＲ分析
３つの型の遺伝子座特異的ＰＣＲ（アウト−アウト、５’アウト−イン、３’アウト−イン）を実施して、ドナープラスミドがＥＬＰにターゲティングされるかどうかを評価する。ＰＣＲ反応を実施してドナーＤＮＡの完全コピーの存在を調べる（アウト−アウトＰＣＲ）。他のＰＣＲ反応は、標的とドナーの間の５’境界およびドナーと標的の間の３’境界に焦点を当てる（イン−アウトＰＣＲ）。分析に使用したプライマーの位置に関する概略は図９中に例示する。それぞれのドナーおよびＥＬＰ標的に関する予想ＰＣＲ産物は表１中に概略する。分析に使用したプライマーの配列は表２中に示す。
【００９４】
【表１】
0005939989.tif 000002
【００９５】
【表２】
0005939989.tif 000003
【００９６】
ＰＣＲ増幅：
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施してＥＬＰの再ターゲティングを評価および確認する。ＰＣＲ反応混合物は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）またはＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて２５μｌ体積で調製する。ＰｈｕｓｉｏｎのＰＣＲに関して、それぞれの反応混合物は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＧＣバッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２μＭのフォワードおよびリバースオリゴ、２．５単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼおよび２０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有する。再ターゲティングイベントを模倣するために構築した１０〜２０ｎｇのプラスミドＤＮＡは陽性対照として施用する。非鋳型対照（鋳型としての水）も施用する。ＰＣＲ条件は以下の通りである。９８℃、１分間、９８℃１０秒間、６５℃、２０秒間、７２℃で２．５分間、次に７２℃で１０分間の３５サイクル。
【００９７】
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で実施した２５マイクロリットルのＰＣＲ反応混合物は、１×バッファーＩＩ、０．２ｕＭのフォワードおよびリバースオリゴ、２．５単位のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ、および２０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。陽性および陰性対照はＰｈｕｓｉｏｎに関して前に記載したように施用する。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅに関する条件は以下の通りである。９８℃、１分間、９８℃１０秒間、６５℃、２０秒間、６８℃で２．５分間、次に６８℃で１０分間の３５サイクル。
【００９８】
増幅断片はゲル切除し、製造者の指示に従い精製する。精製した断片はプラスミドベクターに後にクローニングし、大腸菌（E.coli）コンピテントセルに形質転換する。
【００９９】
個々のコロニーを選択し、増幅ＰＣＲ断片を含有することを確認する。プラスミドクローンの二本鎖配列決定反応を実施して、ＰＣＲ増幅ゲノム配列が組み込んだドナーを含有することを確認する。ドナー断片を含有することを確認したイベントは、特定遺伝子標的におけるＺＦＮ媒介二本鎖破壊の相同性駆動型修復およびドナーＤＮＡの標的組み込みが起こる標的となる。
【０１００】
加水分解プローブ／ＴａｑＭａｎアッセイ
ＴａｑＭａｎ分析を実施して、推定再ターゲティングイベントにおけるドナーのコピー数を画定する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイと類似した加水分解プローブアッセイによるコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してリアルタイムＰＣＲにより実施する。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブ設計ソフトウエア２．０を使用して、ＰＡＴおよびＡＡＤ１ならびに内部標準遺伝子ＧＬＰ１およびＩｎｖｅｒｔａｓｅ用に設計する。増幅用に、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４（９８℃、１分間、９８℃１０秒間、６５℃、２０秒間、７２℃で２．５分間、次に７２℃で１０分間の３５サイクル）Ｍの各プライマー、および０．２（９８℃、１分間、９８℃１０秒間、６５℃、２０秒間、７２℃で２．５分間、次に７２℃で１０分間の３５サイクル）Ｍの各プローブを含有する１０μＬ体積の多重反応混合物中に１×最終濃度に調製する（表３）。２ステップの増幅反応を、ＰＡＴ／ＧＬＰ１に関して３８秒間５８℃で、およびＡＡＤ−１およびＩｎｖｅｒｔａｓｅに関して４０秒間６０℃で、延長部分で実施し蛍光を得る。全てのサンプルは三連で施用し、平均サイクル閾値（Ｃｔ）を各サンプルの分析用に使用する。
【０１０１】
リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対定量モジュールを使用してＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウエアリリース１．５を使用して実施し、ΔΔＣｔ法に基づく。このため、シングルコピーカリブレーターからのゲノムＤＮＡのサンプルおよび知られている２コピーチェックをそれぞれの施用に含めた。
【０１０２】
【表３】
0005939989.tif 000004
【０１０３】
サザンブロット解析
サザンブロット解析を実施して、ＥＬＰ遺伝子座におけるドナーＤＮＡのターゲティングを確認する。この解析用に、ゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、（ドナー中に存在しない）遺伝子座特異的放射標識断片でプローブ処理する。
【０１０４】
メイズカルス（ｐＤＡＢ１００６４０およびｐＤＡＢ１００６４１標的実験）またはＴ０メイズ植物（ｐＤＡＢ１００６１０およびｐＤＡＢ１００６１１標的実験）を使用する。組織サンプルを２ｍｌの微量遠心分離チューブに回収し、２日間凍結乾燥する。組織解離は、Ｋｌｅｃｏ組織粉砕機およびタングステンビーズを用いて前述のように実施する。組織解離後、製造者の示したプロトコールに従いＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離する。
【０１０５】
ゲノムＤＮＡはＱｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により定量化する。それぞれのサンプルに関する４マイクログラムのＤＮＡを、一晩３７℃において適切な制限酵素を使用して消化する。消化したＤＮＡは、製造者の示したプロトコールに従いＱｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して精製する。０．８％のＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロースゲル（Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上での電気泳動後、ＤＮＡは一晩ナイロンチャージメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移し、ＵＶ  Ｓｔｒａｔａリンカー１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してメンブレンに架橋させる。ブロットは２０ｍｌのＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ  Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とプレハイブリダイズさせ、適切な放射標識プローブで一晩プローブ処理する。ブロットは洗浄し、ホスファーイメージスクリーン上に２４時間置き、次いでＳｔｏｒｍ８６０スキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して分析する。
【実施例１０】
【０１０６】
ＥＬＰ、選択マーカーを許容し植物中での独立した構築物エレメントの切除を可能にする中間植物形質転換用ベクターの構築
改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｅＺＦＮ）結合部位およびＥＬＰエレメントは、生成する形質転換植物細胞、組織または植物が以下の性質１）元のトランスジェニック挿入部位においてＥＬＰ内で、正確な標的形式で他の導入遺伝子により再形質転換され得る能力、および２）予想可能および有効な形式で、導入遺伝子、特に植物選択マーカー遺伝子を除去することにより、トランスジェニック遺伝子座を修飾する能力を有するように、植物形質転換用ベクターに個別または一緒に取り込ませうる。一連のベクターは一定範囲の植物種を形質転換するために構築した。これは、（以下に記載する）「中間植物形質転換用ベクター」、一次形質転換用ベクターとして知られるベースベクターへの全ての選択マーカーおよびＥＬＰに隣接するｅＺＦＮの取り込みに影響を与えるためのベクターを使用することによって実施した。
【０１０７】
右のＴ−ＤＮＡ境界と左のＴ−ＤＮＡ境界の間に位置する特有のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）バイナリー形質転換用ベクターの骨格を含む、中間植物形質転換用ベクターを構築した。この中間ベクターはｐＤＡＢ１０４１３２である（図１０）。ｐＤＡＢ１０４１３２において使用したＭＣＳは、ＡｇｅＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、ＡｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、およびＮｓｉＩに特有の制限酵素部位を含有する。この実施例では、これらの部位を使用して、最終一次形質転換用ベクターに重要な機能エレメントを取り込む。特有のＮｏｔＩ部位を使用してＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクターカセットを有するＮｏｔＩ断片を導入することができ、次いでこれらを後に使用して、形質転換用ベクターに複数の導入遺伝子をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（商標）システムを使用して積み重ねることができる。特有のＦｓｅＩ部位を使用して、それらの末端にＦｓｅＩ部位を有するＥＬＰを導入しうる。これらの実施例において前に記載したように、トランスジェニック植物中に存在するとき、ＥＬＰを標的部位として使用して、ｅＺＦＮを使用して他の遺伝子を挿入しうる。ＭＣＳ中の他の部位を使用して、選択マーカー遺伝子を含めた対象の他の遺伝子を挿入しうる。前に記載した特有の制限部位を使用して、ｐＤＡＢ１０４１３２などの中間植物形質転換用ベクターを使用して、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクターカセット、ＥＬＰ、選択マーカー−ＺＦＮモジュール、およびｅＺＦＮ切除を可能にし得るまたはし得ない任意の他の導入遺伝子を含めた機能エレメントの任意および全ての組合せを、１つの植物形質転換用ベクターに一緒に運ぶことができる。
【実施例１１】
【０１０８】
ジンクフィンガーヌクレアーゼモジュールを使用した切除可能植物選択マーカーカセットの構築。
この実施例では、ｅＺＦＮ結合部位を使用して、形質転換植物からの、植物中の選択マーカー遺伝子を含めた任意の導入遺伝子の欠失を可能にする。参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願Ｎｏ．＿６１／２９７，６２８を参照。この能力は、導入遺伝子を１つまたは複数のｅＺＦＮ結合部位に隣接させ、トランスジェニック植物細胞を作出するために次いで使用する植物形質転換用ベクターに、これらの切除可能遺伝子モジュールを次いで取り込ませることによって得られる。このようなモジュールおよびベクターの構築は、標準的な分子生物学の技法を使用して当業者により実施しうる。
【０１０９】
ＺＦＮ結合部位モジュールを有する中間体プラスミドは、切除可能遺伝子カセットの構築に向かう有用な第一ステップである。ｅＺＦＮ結合部位モジュールは、導入遺伝子をクローニングしうる１つまたは複数の制限酵素部位に隣接する少なくとも２つのｅＺＦＮ結合部位を含有するＤＮＡのセグメントである。一例は、配列番号２０および図１１によって表されるＺＦＮモジュール２：４−ＭＣＳ−２：４である。このモジュールは、ｅＺＦＮ２およびｅＺＦＮ４に関する結合部位の対に隣接する制限部位ＡｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＳｂｆＩ、ＳｐｈＩおよびＳａｌＩからなるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。このＺＦＮモジュール内には、ｅＺＦＮ結合部位に隣接する１００ｂｐのランダムな配列からなる配列の２つの同一コピーもある。さらに、制限酵素部位ＳｐｅＩとＸｈｏＩの対は機能モジュール全体に隣接し、植物形質転換用ベクターへのそのクローニングを可能にする。ｐＤＡＢ１０４１２６、ＺＦＮモジュール２：４−ＭＣＳ−２：４を有するプラスミドは図１２中に示す。
【０１１０】
４つの異なる植物選択マーカー遺伝子を、標準的な分子クローニング技法を使用してｐＤＡＢ１０４１２６中のＺＦＮモジュール２：４−ＭＣＳ−２：４に個別に挿入した。１つの選択マーカー遺伝子は、双子葉植物においてグルホシネート耐性を与えるように設計した機能ＰＡＴ遺伝子であった。このＰＡＴ遺伝子は、ＣｓＶＭＶプロモーター（キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Cassava Vein Mosaic virus）由来のプロモーターおよび５’非翻訳領域、Verdaguer et al. (1996) Plant Molecular Biology 31(6):1129-1139）およびＡｔｕＯＲＦ１の３’ＵＴＲと作動可能に連結したＰＡＴコード配列で構成されていた。ＰＡＴ遺伝子カセットは、ＺＦＮモジュールのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位中にＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片として挿入し、プラスミドｐＤＡＢ１０４１３６を生成した（図１３）。
【０１１１】
第二の選択マーカー遺伝子は、単子葉植物においてグルホシネート耐性を与えるように設計したＰＡＴ遺伝子であった。このＰＡＴ遺伝子は、ＯｓＡｃｔ１プロモーターおよびＺｍＬｉｐの３’ＵＴＲと作動可能に連結したＰＡＴコード配列を含んでいた。この単子葉植物のＰＡＴ遺伝子は、ＺＦＮモジュールのＰａｃＩ−ＳｐｈＩ部位中にＰａｃＩ−ＳｐｈＩ断片として挿入し、プラスミドｐＤＡＢ１０４１３８を生成した（図１４）。
【０１１２】
第三の選択マーカー遺伝子は、単子葉植物においてハロキシホップまたは２，４−Ｄ耐性を与えるように設計したＡＡＤ−１遺伝子を含んでいた。このＡＡＤ−１遺伝子は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターおよびＺｍＬｉｐの３’ＵＴＲと作動可能に連結したＡＡＤ−１コード配列を含んでいた。この単子葉植物のＡＡＤ−１遺伝子は、ＺＦＮモジュールのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｂｆＩ部位中にＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｂｆＩ断片として挿入し、プラスミドｐＤＡＢ１０４１４０を生成した（図１５）。
【０１１３】
第四の選択マーカー遺伝子は、キャノーラ植物においてグルホシネート耐性を与えるように設計したＰＡＴ遺伝子を含んでいた。このＰＡＴ遺伝子は、ＣｓＶＭＶプロモーターおよびＡｔｕＯＲＦ１の３’ＵＴＲと作動可能に連結し破壊されたイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子内に位置するＰＡＴコード配列を含んでいた。ＰＡＴ遺伝子は、ＺＦＮモジュールのＡｓｅ−ＸｈｏＩ部位中にＡｓｅＩ−ＳａｌＩ断片として挿入し、プラスミドｐＤＡＢ１０４１４２を生成した（図１６）。
【０１１４】
したがって、ｐＤＡＢ１０４１３６、ｐＤＡＢ１０４１３８、ｐＤＡＢ１０４１４０およびｐＤＡＢ１０４１４２は、植物形質転換用ベクター中に取り込むことが可能である異なるＺＦＮ切除可能選択マーカー遺伝子を有する中間体プラスミドである。形質転換により植物ゲノム中に最終的に取り込むとき、選択マーカーＺＦＮモジュールは選択マーカー遺伝子の後の除去を可能にする。植物細胞中でｅＺＦＮ２またはｅＺＦＮ４タンパク質を、それらをコードする遺伝子の一過的発現または安定的発現のいずれかにより生成することによって、これを実施しうる。例えばｅＺＦＮ２、または代替的にｅＺＦＮ４を、ｅＺＦＮ２またはｅＺＦＮ４遺伝子の一方からのｅＺＦＮの一過的発現によって、事前に形質転換した植物細胞において発現させうる。ｅＺＦＮ酵素は特異的ｅＺＦＮ結合部位を認識しそれらと結合し、これらの位置におけるゲノム中の二本鎖破壊を引き起こす。モジュール内の選択マーカー遺伝子の両側における二本鎖破壊は、ゲノムＤＮＡからの選択マーカー遺伝子の切除をもたらす。後に二本鎖破壊は、ＺＦＮモジュール中に含まれた反復１００ｂｐ配列間の非相同的末端接合または相同的一本鎖修復のいずれかによって修復される。このプロセスは、その元のゲノム位置に関する選択マーカー遺伝子の永続的欠失をもたらす。
【実施例１２】
【０１１５】
植物一次形質転換用ベクターの構築。
当業者は、段階的に組合せで前に記載したエレメントを構築して、異なる作物において使用するための一次形質転換用ベクターを生成しうる。ＥＬＰ１をｐＤＡＢ１０４１３２のＦｓｅＩ部位中に挿入してｐＤＡＢ１０４１３３を生成した（図１７）。次に、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクターカセットをｐＤＡＢ１０４１３３のＮｏｔＩ部位中に挿入して、ＥＬＰ配列に対するＧａｔｅｗａｙカセットのそれらの方向のみが異なるｐＤＡＢ１０４１３４（図１８）およびｐＤＡＢ１０４１３５（図１９）を生成した。次いで、前に記載した４個の選択マーカーＺＦＮモジュールをｐＤＡＢ１０４１３５にクローニングして、４個の新規な植物形質転換用ベクター（ＰＴＶ）を生成した。この構築は、以下に記載する標準的なＤＮＡクローニング法を使用して、当業者により実施しうる。
【０１１６】
双子葉植物のＰＡＴ  ＺＦＮモジュールはＳｐｅＩを使用してｐＤＡＢ１０４１３６から切除し、ｐＤＡＢ１０４１３５のＸｂａＩ部位にクローニングしてＰＴＶ  ｐＤＡＢ１０４１３７を生成した（図２０）。ｐＤＡＢ１０４１３７はＥＬＰ１およびＺＦＮ切除可能双子葉植物ＰＡＴ選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、他の導入遺伝子のＧＡＴＥＷＡＹ（商標）クローニングを可能にするＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクターでもある。
【０１１７】
単子葉植物のＰＡＴ  ＺＦＮモジュールはＳｐｅＩを使用してｐＤＡＢ１０４１３８から切除し、ｐＤＡＢ１０４１３５のＸｂａＩ部位にクローニングしてＰＴＶ  ｐＤＡＢ１０４１３９を生成した（図２１）。ｐＤＡＢ１０４１３９はＥＬＰ１およびＺＦＮ切除可能単子葉植物ＰＡＴ選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクターでもある。
【０１１８】
単子葉植物のＡＡＤ１  ＺＦＮモジュールはＳｐｅＩを使用してｐＤＡＢ１０４１４０から切除し、ｐＤＡＢ１０４１３５のＸｂａＩ部位にクローニングしてＰＴＶ  ｐＤＡＢ１０４１４１を生成した（図２２）。ｐＤＡＢ１０４１４１はＥＬＰ１およびＺＦＮ切除可能単子葉植物ＡＡＤ１選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）デスティネーションベクターでもある。
【０１１９】
キャノーラのＰＡＴ  ＺＦＮモジュールはＸｈｏＩを使用してｐＤＡＢ１０４１４２から切除し、ｐＤＡＢ１０４１３５のＸｈｏＩ部位にクローニングしてＰＴＶ  ｐＤＡＢ１０４１４３を生成した（図２３）。ｐＤＡＢ１０４１４３はＥＬＰ１およびＺＦＮ切除可能キャノーラＰＡＴ選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクターでもある。
【０１２０】
植物形質転換法を使用して、これらの構築物を使用して作物を形質転換しうる。生じたトランスジェニックイベントは、他の新たな導入遺伝子で後にターゲティングしうる。この場合、新たな導入遺伝子はＥＬＰとの相同的組換えによってターゲティングされる。さらに、選択マーカー発現カセットは除去または切除しうる。選択マーカーカセットの切除から生成した生成ＥＬＰは、前に記載した技法を使用して相同的組換えにより、新たな導入遺伝子で後に再ターゲティングしうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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