(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカー結合物質固定針状物により、マーカー物質発現細胞を釣り上げ、分離する装置に用いる細胞分離用接着基板の製造方法であって、キレート剤を含み、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体を混合した被膜形成剤を用いて、細胞分離用接着基板材料表面に被膜を形成することにより、細胞と該基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、上記細胞分離用接着基板の製造方法。 
【請求項２】
被膜形成剤中のＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合割合を調整することにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、請求項１に記載の細胞分離用接着基板の製造方法。 
【請求項３】
細胞分離用接着基板が、複数の種類の細胞を培養するものである請求項１又は２に記載の細胞分離用接着基板の製造方法。 
【請求項４】
細胞分離用接着基板が、細胞アレイ基板として用いられることを特徴とする請求項３に記載の細胞分離用接着基板の製造方法。 
【請求項５】
被膜形成剤により被膜を形成される細胞分離用接着基板材料が、コロナ放電またはプラズマ処理により酸化加工されたポリスチレン基板であることを特徴とする、請求項１〜４に記載の培養基板の製造方法。 
【請求項６】
マーカー結合物質固定針状物により、マーカー物質発現細胞を釣り上げ、分離する装置に用いる細胞分離用接着基板であって、キレート剤を含み、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体を混合したコーティング剤を用いて、細胞分離用接着基板材料をコーティングすることにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節されていることを特徴とする、上記細胞分離用接着基板。 
【請求項７】
ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合割合を調整することにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、請求項６に記載の細胞分離用接着基板。 
【請求項８】
細胞分離用接着基板が、複数の種類の細胞を培養するものである請求項６又は７に記載の細胞分離用接着基板。 
【請求項９】
細胞分離用接着基板が、細胞アレイ基板として用いられることを特徴とする請求項８に記載の細胞分離用接着基板。 
【請求項１０】
被膜形成剤により被膜を形成される細胞分離用接着基板材料が、コロナ放電またはプラズマ処理により加工されたポリスチレン基板であることを特徴とする、請求項６〜９に記載の細胞分離用接着基板。 
【請求項１１】
マーカー結合物質固定針状物により、マーカー物質発現細胞を釣り上げ、分離する装置に用いる細胞分離用接着基板の接着力の調節方法であって、細胞分離用接着基板材料表面に、キレート剤を含み、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体を混合した被膜形成剤により被膜を形成するとともに、該被膜形成剤におけるＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合割合を調整することにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、上記細胞分離用接着基板の接着力の調整方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞を釣り上げて分離する細胞分離法に使用する、細胞分離用接着基板あるいは該基板を用いた細胞アレイに関する。 
【背景技術】
【０００２】
細胞の分離技術としては、最近利用されている手段として、FACS(fluoresence activated cell sorting）がある。この手段は、蛍光標識抗体を用いて、細胞試料中の標的細胞のみを標識するものであり、細胞試料を液流として流しつつレーザー光を照射して、細胞試料中の個々の細胞が発生する蛍光を測定して、上記標的細胞を識別し、該標的細胞のみをソーテイングするものである。しかし、この手段は、細胞表面の抗原を標的とするものであり、細胞内部に産生するタンパク質等の細胞内物質を指標に細胞を識別分離するものではない。 
【０００３】
FACSでは、遺伝子組み換えにより蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させる方法により細胞内部のタンパク質を指標にすることも可能であるが、移植治療に用いる等の目的で天然の細胞の分離を目的とする場合には遺伝子組み換え細胞は適用できない。また、FACSでは、個々の細胞の蛍光測定結果とソーテイングとを連動させるための極めて精密な制御機構を必要とし、極めて高価なものとならざるを得ないほか、蛍光標識抗体を用いなければならない問題点も有していた。 
【０００４】
一方、本発明者は、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する、例えば抗体等の物質を固定化した針状物を、基板上の各細胞に挿入して、上記マーカー物質と選択的に結合する物質を介して細胞内のマーカー物質を針状物に結合させた後、該針状物を引き上げて、上記マーカー物質を含有する細胞のみを選択して釣り上げ分離する手段を開発している（特許文献１参照）。 
【０００５】
この方法によれば、細胞中のマーカー物質と該マーカー結合物質と選択的に結合する物質との結合に基づく細胞と針状物との結合力が、細胞の基板に対する接着力よりも大きく、かつ、抗体固定化針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的な吸着力が、細胞の基板に対する接着力より小さい場合には、標的タンパク質を含む特定の細胞のみを識別すると同時に、上記針状物により標的細胞を釣り上げることが可能となる。 
【０００６】
個々の細胞と針状物との結合力は、様々ではあるが、２ｎＮ以上、最大５ｎＮ程度の結合力にすることが可能であり、一方、細胞と基板との接着力は、通常２０〜４０ｎＮであり、また、上記針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的吸着力は、通常２００ｐＮ程度であるので、細胞と基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満、好ましくは３ｎＮ、さらに好ましくは２ｎＮ以下にすれば、多くの細胞から、目的のマーカー物質を発現する標的細胞のみを選択的に釣り上げ分離することが可能となる。 
しかし、細胞と基板の接着力は、細胞の種類によって異なるため、ある細胞と針状物の結合力に対応して細胞と基板の接着力を調整しても、その調整条件は他の細胞に対しては分離可能な接着力にはならず、このため細胞種毎に、細胞と針状物の結合力及び細胞と基板の接着力を各々設定する必要があった。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１８２７６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を精密に調整する手段を提供し、異なる細胞種であっても、細胞と細胞分離用接着基板の接着力を同様の接着力に調整することを可能とし、これにより、固定化針状物の細胞に対する結合力及び細胞と細胞分離用接着基板の接着力を逐一新たに調整する必要がなく、同一のマーカー結合物質固定化針状物で、様々な細胞種に関わらず、標的のマーカー物質発現細胞を極めて能率的に、釣り上げ分離可能とする手段を提供しようとするものである。 
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究の結果、キレート剤を含有するＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)及びＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合物からなる被膜形成剤を作成した。この被膜形成剤は、ＢＳＡとＢＡＭ-ＢＳＡ複合体の混合割合を変更することにより、細胞分離用接着基板材料上に被膜を形成した場合、細胞種によらず、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を任意に調整でき、上記マーカー物質固定化針状物による細胞の選択的釣り上げ分離に必要な、５ｎＮ未満の所望の接着力に調整できることを見いだした。この手段によれば、同一のマーカー結合物質固定化針状物で、様々な種類の細胞から標的のマーカー物質発現細胞を極めて能率的に、釣り上げ分離可能とすることが可能となる。 
すなわち、本発明は以下のとおりである。 
【００１０】
（１）マーカー結合物質固定針状物により、マーカー物質発現細胞を釣り上げ、分離する装置に用いる細胞分離用接着基板の製造方法であって、キレート剤を含み、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体を混合した被膜形成剤を用いて、細胞分離用接着基板材料表面に被膜を形成することにより、細胞と該基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、上記細胞分離用接着基板の製造方法。 
（２）被膜形成剤中のＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合割合を調整することにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、上記(１)に記載の細胞分離用接着基板の製造方法。 
（３）細胞分離用接着基板が、複数の種類の細胞を培養するものである上記(１)又は(２)に記載の細胞分離用接着基板の製造方法。 
（４）細胞分離用接着基板が、細胞アレイ基板として用いられることを特徴とする上記(３)に記載の細胞分離用接着基板の製造方法。 
（５）被膜形成剤により被膜を形成される細胞分離用接着基板材料が、コロナ放電またはプラズマ処理により酸化加工されたポリスチレン基板であることを特徴とする、上記(１)〜（４）に記載の培養基板の製造方法。 
（６）マーカー結合物質固定針状物により、マーカー物質発現細胞を釣り上げ、分離する装置に用いる細胞分離用接着基板であって、キレート剤を含み、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体を混合した被膜形成剤を用いて、細胞分離用接着基板材料をコーティングすることにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節されていることを特徴とする、上記細胞分離用接着基板。 
（７）ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合割合を調整することにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、上記(６)に記載の細胞分離用接着基板。 
（８）細胞分離用接着基板が、複数の種類の細胞を培養するものである上記(６)又は(７)に記載の細胞分離用接着基板。 
（９）細胞分離用接着基板が、細胞アレイ基板として用いられることを特徴とする上記(８)に記載の細胞分離用接着基板。 
（１０）  被膜形成剤により被膜を形成される細胞分離用接着基板材料が、コロナ放電またはプラズマ処理により加工されたポリスチレン基板であることを特徴とする、上記(６)〜(９)に記載の細胞分離用接着基板。 
（１１）  マーカー結合物質固定針状物により、マーカー物質発現細胞を釣り上げ、分離する装置に用いる細胞分離用接着基板の接着力の調節方法であって、細胞分離用接着基板材料表面に、キレート剤を含み、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体を混合した被膜形成剤により被膜を形成するとともに、該被膜形成剤におけるＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)とＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合割合を調整することにより、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を、２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節することを特徴とする、上記細胞分離用接着基板の接着力の調整方法。 
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞と細胞分離用接着基板との接着力を精密かつ簡便に調整することができ、マーカー結合物質固定化針状物による標的細胞の釣り上げ分離を正確に行うことが可能となる。基板に対する接着力が各々異なる細胞種であっても、細胞分離用接着基板に対する接着力を同様の接着力に調整することを可能とし、これにより、固定化針状物の細胞に対する結合力及び細胞と細胞分離用接着基板の接着力を逐一新たに調整する必要がなく、同一のマーカー結合物質固定化針状物で、細胞の種類に関わらず、標的のマーカー結合物質発現細胞を極めて能率的に、釣り上げ分離を行うことを可能とする。特に本発明の細胞分離用接着基板は、細胞アレイ基板として有用である。すなわち、このような細胞アレイ基板を用いれば、例えば、支持体に針状物として多数のナノスケールの針状物を配置した細胞分離部材との組み合わせにより、細胞の種類によらず、アレイ基板上に多数配置された細胞の中から、標的細胞を一度に選択して釣り上げ分離を行うことが可能となる。 
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の細胞分離用接着基板を用いた標的細胞の釣り上げ、分離の態様を表す概念図
【図２】ガラス基板に形成したＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜の接着力を試験した結果を示す図
【図３】ガラス基板およびポリスチレン基板にＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜を形成し、洗浄による耐久性を試験した結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の培養基板は、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する物質(マーカー結合物質という場合がある。）を固定化した針状物を有する細胞分離部材とセットで用いられるものである。これを用いる細胞分離の概要は図１に示される。 
この針状物には、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する、例えば抗体等が固定化され、本発明の細胞分離用接着基板上の各細胞に挿入して、上記マーカー物質と選択的に結合する物質を介して細胞内のマーカー物質を針状物に結合させた後、該針状物を引き上げて、上記マーカー物質を含有する細胞のみを選択して釣り上げ分離する(特許文献１参照。) 
【００１４】
この針状物は、細胞挿入部分の直径が１００〜３００ｎｍで、好ましくは２００ｎｍあるいはそれ以下であり、長さは５〜１００μｍ、好ましくは１０〜２０μｍである(以下、この針状物をナノニードルということがある）。 
細胞中にマーカー物質が存在している場合、ナノニードルに固定化された抗体等のマーカー結合物質とマーカー物質(例えば、抗体の標的タンパク質)が結合し、ナノニードルを引き上げる際、細胞が釣り上げられ、マーカー物質が発現している細胞のみが選択的に分離される。釣り上げられた細胞は、例えば、ＢＡＭ等の細胞接着材料が固定化され、細胞との接着力が３０ｎＮ程度に調整された細胞回収用基板に接触させることにより回収される。これらの分離、回収操作は全て培養液等の液中で行われる。 
【００１５】
このマーカー物質固定化ナノニードルと個々の細胞との結合力の分布は、広い範囲に亘るが、２ｎＮ以上、最大５ｎＮ程度までの結合力を有する細胞も存在する。一方、細胞と基板との接着力は、通常２０〜４０ｎＮであり、また、上記針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的吸着力は、通常２００ｐＮ程度であるので、細胞と細胞分離用接着基板との接着力は、下限は２００ｐＮを超え、好ましくは５００ｐＮ以上であり、上限は少なくとも５ｎN未満、好ましくは３ｎＮ以下、さらに好ましくは２ｎＮ以下にすれば、マーカー物質を発現していない細胞とナノニードルの非特異的吸着に基づく分離を排して、標的の細胞のみを釣り上げ、分離できる。なお、マーカー物質結合物質固定化ナノニードルと細胞の結合力は、個々の細胞の中には非常に低いものもあるので、マーカー物質を発現している細胞であっても、釣り上げ分離できない場合もあり得るが、上記マーカー物質固定化ナノニードルで釣り上げられ分離された細胞は必ずマーカー物質を発現している細胞である。 
【００１６】
以下、本発明の細胞分離用接着基板について詳述する。 
本発明の細胞分離用接着基板は、キレート剤を含有する、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)及びＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)-ＢＳＡ複合体の混合物からなる被膜形成により、細胞と該基板との接着力が２００ｐＮを超え、５ｎＮ未満に調節される。 
上記ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)は、細胞の接着を抑制するタンパク質であり、ＢＡＭ(Biocompatible Anchor for Membrane)は、該分子が有する脂肪鎖が細胞の脂質膜に挿入されることにより、細胞を強く保持する性質を持つ化合物である。 
【００１７】
ＢＡＭ-ＢＳＡ複合体におけるＢＡＭは、市販されており、例えば、SUNBRIGHT OE-020CS(日油)を用いることができる。ＢＡＭ-ＢＳＡ複合体は、ＢＡＭとＢＳＡとを室温で反応させ、透析により、未反応のＢＡＭを除去することにより得られる。上記複合体中のＢＡＭ分子の割合は、上記反応持の、ＢＡＭとＢＳＡの使用割合を種々変更することにより調節設定できる。本発明においては、このＢＡＭ-ＢＳＡとＢＳＡを種々混合割合で溶液を調製し、基板上に混合液を接触させ、被膜を形成させる。 
【００１８】
本発明においては、細胞分離用接着基板と細胞との接着力を、ＢＳＡに対するＢＡＭ-ＢＳＡ複合体の混合割合のみに依存させることができ、これにより、細胞の種類にかかわらず、ＢＳＡに対するＢＡＭ-ＢＳＡ複合体の混合割合の調整のみで、細胞分離用接着基板と細胞との接着力を調節することが可能となる。しかし、ＢＳＡは細胞と細胞分離用接着基板との接着作用を抑制させるが、完全ではない。そこで、本発明はキレート剤をさらに含有させることにより、細胞分離用接着基板と細胞との接着力を完全に抑制し、細胞分離用接着基板と細胞の接着力はＢＳＡに対するＢＡＭ-ＢＳＡ複合体の混合割合にのみ依存するようにしたものである。キレート剤の作用は、細胞の接着因子を阻害することによる効果であるので、上記したＢＡＭの細胞保持の作用機構とは無縁であり、この点でＢＡＭの細胞接着保持力に影響を与えない点で都合がよい。キレート剤は液(培養液中)に溶出し、上記作用を発揮する。 
【００１９】
例えば、マウス胚性癌細胞であるＰ１９とマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、通常培養時、それぞれ２５ｎＮおよび６０ｎＮで、大きく異なるが、例えば、キレート剤の存在下、ＢＳＡに対するＢＡＭ-ＢＳＡ複合体の混合割合が、１：１００（１％）のとき、いずれの細胞も、１.５ｎＮ程度を示し、細胞の種類が異なり、細胞分離用接着基板に対する接着力が異なるものであっても同等の接着力に調節することができる。 
【００２０】
使用するキレート剤としては、カルシウムイオンと錯形成する効果が大きいものが望ましい。例えばアミノカルボン酸系キレート剤EDTA、NTA、EGTA、DTPA、HEDTA、TTHA、PDTA等が挙げられる。ホスホン酸系キレート剤HEDP、NTMP、PBTC、EDTMP等が挙げられる。その使用量は、例えばEDTAの場合、１０ｍＭで被膜に対して作用させる。 
【００２１】
本発明の上記した被膜形成剤で被膜形成される細胞分離用接着基板材料としては、表面がコロナ放電あるいはプラズマ処理により処理されたポリスチレン基板が好ましい。ガラス基板、無処理のポリスチレン基板では、ＢＳＡの吸着安定性が悪く、被膜形成剤による被膜形成性が各段に劣る。 
【００２２】
本発明の細胞分離用接着基板とセットで用いられる細胞分離部材は、ナノニードルを支持体上に一本あるいは複数本設けたものであるが、多数のナノニードルが配置されたものを用いれば、能率よく標的細胞を分離できるため、好ましい。 
【００２３】
このような多数のナノニードルが配置されたものとしては、例えば、シリコンウエハをエッチング加工することにより、ナノニードルと支持体とが一体成形されたものが挙げられ、この部材は、シリコンウエハにフォトレジストをコーティングし、直径２〜３μｍ程度の円形のマスク剤(クロム)が２０〜１００μｍ間隔に配列されたフォトマスクを用いて、マスクアライナーにより光照射、現像液による処理でレジストにパターンを作製した後、ドライエッチング加工により、フォトマスクが除去された部分を掘り下げることによって、直径２〜３ミクロンのピラーが配列された基板(マイクロピラーアレイ)を作製する。ついで、フォトレジストをアッシャーで除去した後に、１１００℃、１０〜２０時間の湿潤条件で熱酸化し、酸化層を作製し、２０％緩衝フッ酸によるウェットエッチングを行い、酸化層を除去することにより得られる。このような方法によれば、直径２００ｎｍ以下、長さ１０μｍ以上のナノニードルが、支持体１０ｍｍ角に１万本以上配列された部材を作成することが可能である。 
【００２４】
複数本のナノニードル有する細胞分離部材とセットで用いられる本発明の細胞分離用接着基板においては、上記各ナノニードルに対応する位置に細胞が配置され、配置される細胞の種類は、同一種のものでも異なる複数の種類のものであってもよく、細胞アレイとしても用いることができる。異なる複数の種類の細胞を配置する場合には、細胞の種類毎に例えば疎水性の樹脂等で区画しておくことが好ましい。 
【００２５】
本発明においては、細胞の種類が異なる場合であっても、細胞分離用接着基板と細胞との接着力は同様で、マーカー物質固定化ナノニードルで釣り上げ可能な力に調節されているから、配置した細胞に対応するナノニードルを有する一つの細胞分離部材で、標的細胞を分離することが可能である。 
【実施例】
【００２６】
実施例１ 
まず、ＢＡＭ-ＢＳＡ複合体を作製した。ＢＡＭは、SUNBRIGHT OE-020CS(日油)を用いた。終濃度１４μＭ ＢＳＡと５.３ｍＭ ＢＡＭを室温で１時間反応させた。透析により、未反応のＢＡＭを除去し、ＢＡＭ-ＢＡＭ複合体溶液を得た。このＢＡＭ-ＢＳＡ複合体を分析した結果、１分子のＢＳＡに対してＢＡＭ分子を９分子導入されていた。 
終濃度３μＭに調整したＢＡＭ-ＢＳＡ溶液とＢＳＡ溶液を１％、１０％、１００％のＢＡＭ-ＢＳＡ混合割合になるように混合溶液を調製した。ガラス基板として用いたカバーガラスをＳＰＭ、ＡＰＭ溶液で室温で１０分間処理し、超純水５ｍＬで３回洗浄した。洗浄したガラス基板にＢＡＭ-ＢＳＡ溶液を１０μＬ滴下し、室温で３時間反応させ、ＢＳＡ/ＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜形成基板を作製した。 
【００２７】
作製した基板に対して、接着力の大きく異なる２種類の細胞を用いて試験を行った。マウス胚性腫瘍細胞P19とマウス繊維芽細胞NIH3T3である。鉤型に加工したＡＦＭ探針を用いた強制剥離実験の結果、通常培養のP19では２５ｎＮ、NIH3T3では６０ｎＮ程度の細胞接着力が観察されている。この差は細胞種の違いに依存するものであり、インテグリンなどの細胞接着分子の発現状態の違いなどに依存すると考えられる。これらの細胞を上記ＢＳＡ/ＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜形成基板に固定し、鉤型に加工したＡＦＭ探針を用いて、接着力の評価を行った。 
【００２８】
細胞を培養した容器から培地を除去後、PBS(-)で３回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でトリプシン処理を行った。１０分後、トリプシンインヒビターを添加し、５０００ｒｐｍ、５分間の遠心で溶液を除去した。その後、ｐＨ７.０に調製した無血清培地で細胞を懸濁した。その際に、終濃度１０ｍＭ ＥＤＴＡを混合し、細胞側の接着分子の活性を抑制した。ＢＳＡ/ＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜形成基板は１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有無血清培地にシャーレ内で浸漬し、上記細胞懸濁液を基板上に播種し、５分間室温で静置した。鉤型に加工したＡＦＭ探針を用い、ＡＦＭ装置を用いて細胞を強制的に剥離し、釣り上げた際にフォースカーブを得る。フォースカーブから細胞釣り上げ時の力の最大値を測定した結果が図２である。 
【００２９】
まず、ＢＳＡ/ＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜を形成していない無処理の基板では、細胞の接着力の差が反映された結果が得られ、P19の０.７ｎＮに対して、NIH3T3では１.２ｎＮ程度の値が得られた。これに対して、ＢＳＡ/ＢＡＭ-ＢＳＡ混合被膜形成基板においては、いずれの混合割合でもP19とNIH3T3で同程度の接着力に調整出来ており、細胞種によらず接着力の調整が可能であることが分かる。ＢＡＭ-ＢＳＡ混合割合１％で１.３ｎＮ、１０％で５.６ｎＮ、１００％で１８ｎＮに調節することが可能であった。 
【００３０】
実施例２ 
上記実施例１と同様の方法により、ＢＡＭ-ＢＳＡ複合体を作製した。基板としては、ガラス基板、無処理のポリスチレン基板、コロナ放電加工されたポリスチレン製の３５ｍｍ細胞培養ディッシュを用いた。被膜を形成する前に、７０％エタノールを用いて、回転式シェーカーにより５０ｒｐｍ、１０分振とうし、洗浄を行った。続いてPBS(-)を用いて同様の洗浄を行った。その後ＢＳＡを混合せずに、終濃度３μＭ ＢＡＭ-ＢＳＡ溶液を注ぎ、３７℃で３時間インキュベーションすることにより１００％ＢＡＭ-ＢＳＡ被膜を形成した。これら、ＢＡＭ-ＢＳＡ被膜形成基板の耐久性を評価するために、PBS(-)による洗浄試験を行った。ＢＳＡ/ＢＡＭ-ＢＳＡ溶液を除いた後にPBS(-)を２.０ｍｌ注ぎ、回転式シェーカーを用いて５０ｒｐｍで５分振とうした。 
【００３１】
この洗浄操作をｎ回繰り返した基板に対して、マウス胚性癌細胞P19の接着力を上記実施例１に記載された方法により測定し、比較検討した。その結果、まず無処理のポリスチレン基板では全く被膜が形成されず、細胞接着力の測定が出来なかった。ガラス基板およびコロナ放電処理ポリスチレン基板の結果を図３に示す。いずれの基板でも接着洗浄回数３回で最大となり、洗浄無し、洗浄１回と洗浄回数に従って接着力が上昇した。これはＢＡＭ-ＢＳＡ複合体が多層に積層しているためであり、播種された細胞を釣り上げる際に細胞に結合した上層のＢＡＭ-ＢＳＡ複合体が下層のＢＡＭ-ＢＳＡ複合体と解離する力が測定されていると考えられる。 
【００３２】
すなわちＢＡＭ-ＢＳＡ複合体被膜は、単分子層を形成している場合に最大の細胞接着力を示すことを示唆している。３回目以降洗浄を重ねると、ガラス基板では、接着力が２０％以下まで低下した。それに対して、コロナ放電処理ポリスチレン基板では７回の洗浄後でも最大接着力の３５％以上の接着力を維持していた。また、３回洗浄時の最大接着力は、コロナ放電処理ポリスチレン基板の方が２倍以上の値を示した。これらの結果はガラス基板と比較して、酸化処理を行ったポリスチレン基板に形成されたＢＡＭ-ＢＳＡ被膜の安定性が高いことを示している。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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