(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、神経幹細胞（NSC）を産生するインビトロの方法：
a）  繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、および脂肪細胞の群より選択される哺乳動物体細胞を提供する段階、ならびに
b）  Bmi1およびSox2の群より選択される少なくとも2種の遺伝子を該体細胞に導入し、FGF2、EGF、およびBDNFならびに低分子のROCK阻害剤を含む培地中で該体細胞を培養することにより、該体細胞をNSCへリプログラミングする段階。
【請求項２】
c）  NSCの増殖に適する条件下で、段階b）の産物をインキュベーションする段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階a）の哺乳動物体細胞が、ヒト細胞である、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
段階b）の増殖因子および低分子が、化学的に定義された培地の補給物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
化学的に定義された培地が、インスリン、トランスフェリン、およびプロゲステロンを補給した無血清培地である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
段階b）の少なくとも2種の遺伝子が、Mash1、Sox11、Emx2、Foxg1、およびPax6の群より選択される少なくとも1種の遺伝子をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
段階b）の少なくとも1種のさらなる遺伝子がMash1である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ROCK阻害剤が、1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン、N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド、(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロ-ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、およびN-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドの群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
体細胞が、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤で前処理される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
Bmi1およびSox2を含む該少なくとも2種の遺伝子が、レンチウイルスによって該体細胞に送達される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法により取得された、患者特異的な神経幹細胞。
【請求項１２】
CNS疾患用のインビトロのモデルとしての、請求項11記載の神経幹細胞の使用。
【請求項１３】
請求項11記載の神経幹細胞を含む、治療用組成物。
【請求項１４】
神経幹細胞が、ニューロンまたはグリア細胞に分化する、請求項13記載の治療用組成物。
【請求項１５】
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法により、患者またはいくつかのHLA型を有する健康な個体から取得された、患者特異的な神経幹細胞を含む、バイオバンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、体細胞を神経幹細胞（NSC）へ変換するための方法に関連する。さらに、本出願は、遺伝子導入および化学的に定義された培地誘導の連結された段階に基づいて、ヒト繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、または脂肪細胞を、神経幹細胞へ変換するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
完全に分化した体細胞は絶対的に不可逆性の特性を有するという定説が、長期にわたって一般に受け入れられていた。一連の先駆的な実験が、異なるペアの細胞タイプの融合によりサイレント遺伝子の発現プロファイルが完全に再活性化され得ることを示した時に、これが変化し始めた（Blau, H. M. How fixed is the differentiated state? Lessons from heterokaryons. Trends Genet. 5, 268-272 (1989)（非特許文献1））。より最近には、体細胞タイプ由来の核の、脱核した卵細胞中への移入が、体細胞の遺伝子発現プロファイルの完全な先祖返りをもたらし、かつ、新たな動物全体を生むことができる多能性細胞状態の形成をもたらし得ることが示された（例えば、Gurdon, J. B. & Melton, D. A. Nuclear reprogramming in cells. Science 322, 1811-1815 (2008)（非特許文献2）を参照されたい）。山中と同僚（Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006)（非特許文献3））は、4種の定義された因子（Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc）の導入により、体細胞が人工多能性幹細胞（iPSC）へリプログラミングされ得ることを実証した。繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、および脂肪細胞を含む様々なタイプの体細胞が、iPSC多能性状態へリプログラミングされている。過去数年の間に、特定の体細胞タイプが、ニューロンなどの完全に異なる体細胞タイプに分化形質転換され得るか否かの疑問が生じた。Wernigと同僚は、この疑問に取り組み、3種の非常に重要な遺伝子：Mash1、Brn2、およびMyt1lの導入による、マウス繊維芽細胞の機能的ニューロンへの直接変換を示した（Wernig at al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 25;463(7284):1035-41 (2010)（非特許文献4））。しかしながら、取得されたニューロンは、本質的に増殖できず、かつ凍結融解手順に耐えられない有糸分裂後細胞である。US2010/0021437（特許文献1）は、繊維芽細胞から人工多能性幹細胞を生成するための方法、および神経表現型に分化するようにそれらの細胞を誘導するための方法を開示している。
【０００３】
しかしながら、分化した体細胞の神経幹細胞への直接変換は、これまで記載されていない。神経幹細胞は、多分化能幹細胞であり、特定の条件下で増殖することが報告されている。それらは、化学的に定義された培地、例えば、FGF（繊維芽細胞増殖因子2）およびEGF（上皮成長因子）を補給したN2B27培地（N2B27は、N2およびB27（両方ともGibco由来）を補給したDMEM/F12（Gibco, Paisley, UK）の1:1混合物である）を必要とする。それらは、例えば、ポリオルニチン/ラミンコーティングされたプレート上で単層接着培養として、または、非接着性細胞培養プレートにおいて浮遊性ニューロスフェアとして、増殖することができる。2種のタイプの神経幹細胞培養（ニューロスフェア、接着培養）は、完全に互換性であることが報告されている。神経幹細胞は、無限に増殖することができ、かつ依然として真に多分化能のままである。それらは、特別な条件上で、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトを含む、成体脳を構成する細胞タイプに分化する。神経幹細胞は、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、および脊髄損傷などの神経変性疾患を有する患者を処置するための可能性のある治療剤であると考えられている。
【０００４】
神経幹細胞は、胚性幹細胞（ESC）からインビトロで生成することができる（Chambers et al. Nature 27;3 (2009)（非特許文献5））か、または、脳試料から直接単離することができる（Reynolds BA, Rietze RL (2005) Nat Methods 2:333-336（非特許文献6））かのいずれかであることが公知である。しかしながら、これまで公知であるこれらの方法は、多数の高度に敏感な倫理的配慮を引き起こすか、および／または再現性に関する重大な問題点に苦しむ複雑かつ困難な技術を必要とするかのいずれかであるため、多くの主要な欠点を有する。これまで、分化した体細胞から神経幹細胞を直接導き出すことができる方法は記載されていない。原理的には、神経幹細胞を、分化した細胞から導き出したiPSCより取得することができる。しかしながら、これは、iPSCの培養を意味すると考えられる。iPSCは、無限に拡大することが報告されているが、培養条件が複雑であり、かつ莫大な労力を必要とする。さらに、多能性幹細胞からの神経幹細胞の派生は、確率論的機構のために変動することが報告されている。iPSCおよびESCの共通の障害は、少数の未分化細胞でさえ奇形腫（いくつかの細胞タイプを含む胚細胞腫瘍）の形成をもたらし得、無視されてはいけない重大な混入を呈することである。神経幹細胞などの体性幹細胞は、奇形腫を形成しない。従って、神経幹細胞の生成のために、容易に利用可能なかつ再現可能な技術が相変わらず必要である。本発明は、体細胞を神経幹細胞へ直接変換するための方法を提供する。新たな方法は、iPS細胞を取得する必要性を軽減し、かつ従って、奇形腫形成のリスクを除去する。奇形腫を形成する能力の無いそのような細胞は、再生医療応用のために有用かつ安全である。好ましくは、該体細胞は、哺乳動物体細胞であり、最も好ましくはヒト体細胞である。該ヒト体細胞は、健康な個体から、または患者から取得することができる。好ましくは、該体細胞は、繊維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチン生成細胞であり、最も好ましくは繊維芽細胞である。該繊維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチン生成細胞は、例えば、皮膚生検などの非侵襲的な方法により、または引き抜いた毛髪から、患者または健康な個体から容易にかつ安全に導き出すことができる。本発明の方法は、健康なまたは疾患を有する個体由来の、繊維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチン生成細胞などの体細胞を、神経幹細胞へ直接変換することを可能にする。これらの健康な個体または患者特異的な神経幹細胞は、無限に拡大することができる。培養は、容易であり、かつ十分に特徴決定されている。健康な個体および患者特異的な神経幹細胞のアリコートを、再現性良く凍結融解することが可能である。特に、患者由来の神経幹細胞は、CNS疾患の病態生理学を研究するための、疾患に関連したインビトロのモデルに相当する。患者特異的な体細胞の神経幹細胞への直接の変換は、患者特異的な神経幹細胞のバイオバンクを作製するための、容易に利用可能なかつ再現可能な技術に相当する。神経幹細胞から生成した3種の細胞タイプ：ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトの少なくとも1種において明らかな病変が記載されているため、そのようなバイオバンクは、CNS関連疾患について大きな妥当性を有する。従って、本明細書において記載される方法で取得された神経幹細胞は、有効かつ安全な薬物をスクリーニングするための価値ある疾患モデルである。
【０００５】
様々な神経変性疾患が、神経細胞の損失を特徴としている。脳の損傷および神経変性疾患に応答する成体脳の再生能力は、かなり限定されている。さらに、影響されやすい神経集団は進行的に失われるため、薬理学的介入は、多くの場合、次第に効果が低くなる。本明細書において記載される方法で取得された神経幹細胞はまた、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS／ルー・ゲーリッグ病）、または脊髄損傷のような神経変性疾患を処置するための再生医療において使用することができる。本明細書において記載される革新的な方法で、細胞移植療法における使用のために十分な量の神経前駆細胞を提供することが、現在可能である。神経幹細胞は、健康な個体または患者のいずれかより単離された体細胞から取得することができる。本明細書において記載される方法により取得された患者特異的な神経幹細胞は、自家細胞移植療法のための魅力的な新たなドナー源であり、それにより、患者とドナーとの間の免疫学的不適合性によるいかなる免疫拒絶も排除する。この戦略は、細胞移植療法における免疫抑制剤の必要を解消すると考えられる。さらに、種々のHLAホモ接合対立遺伝子を有する健康な個体に由来する神経幹細胞のバイオバンクの創設は、必要とする個体の処置のためのドナーバンクとして使用することができる。適合性のHLAタイプを有する神経幹細胞の異種移植は、移植された細胞の拒絶をもたらし得る望ましくない免疫応答のリスクを低減させる。
【０００６】
本明細書において記載される本発明の飛躍的進歩を達成するために、存在するリプログラミングの制限のいくつかを回避すること、および、遺伝子導入を特定の培地での誘導の段階の使用と組み合わせることが、必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US2010/0021437
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Blau, H. M. How fixed is the differentiated state? Lessons from heterokaryons. Trends Genet. 5, 268-272 (1989)
【非特許文献２】Gurdon, J. B. & Melton, D. A. Nuclear reprogramming in cells. Science 322, 1811-1815 (2008)
【非特許文献３】Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006)
【非特許文献４】Wernig at al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 25;463(7284):1035-41 (2010)
【非特許文献５】Chambers et al. Nature 27;3 (2009)
【非特許文献６】Reynolds BA, Rietze RL (2005) Nat Methods 2:333-336
【発明の概要】
【０００９】
体細胞を神経幹細胞（NSC）へ変換するための方法であって、以下の段階を含む方法が、本明細書において提供される：
a）体細胞を提供する段階、
b）少なくとも2種の遺伝子を導入することにより、該体細胞を神経幹細胞へリプログラミングする段階、ならびに
c）増殖因子および低分子で、リプログラミングのために誘導する段階。
【００１０】
さらなる態様において、該方法は、
d）神経幹細胞の増殖に適する条件下で、段階b）およびc）の産物をインキュベーションする段階
をさらに含む。典型的に、段階b）およびc）の産物は、ニューロスフェアとして細胞培養において容易に同定することができる。好ましくは、神経幹細胞の増殖に適する該条件は、該ニューロスフェアの収集、および化学的に定義された培地におけるそれらの拡大を含む。好ましくは、該培地は拡大培地であり、かつ、ニューロスフェアを非接着性培養条件において培養する。拡大培地の非限定的な例を、下記にさらに記載する。
【００１１】
本明細書において使用される「体細胞」という用語は、生殖系列細胞（例えば、精子および卵子、それらが作製される由来の細胞（生殖母細胞））および未分化幹細胞ではない、生物の身体を形成する任意の細胞を指す。内部器官、皮膚、骨、血液、および結合組織は、すべて体細胞で作られている。本明細書において記載される方法において使用される好ましい体細胞は、繊維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチン生成細胞であり、かつ、好ましくは皮膚生検から取得される。
【００１２】
好ましくは、神経幹細胞への変換のために使用される体細胞は、哺乳動物起源であり、最も好ましくはヒト起源である。該ヒト体細胞は、健康な個体または患者から取得することができる。好ましくは、該体細胞は、繊維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチン生成細胞の群より選択される。これらのドナー細胞は、任意の適当な供給源から容易に取得することができる。ヒト身体に対する侵襲的な手順無しでドナー細胞の単離を可能にする供給源が、本明細書において好ましい。繊維芽細胞を単離するための方法は、当技術分野において周知である。繊維芽細胞は、任意の適当な供給源から、例えば、種々の器官組織または皮膚組織から取得されてもよい。好ましい繊維芽細胞は、肺繊維芽細胞、包皮繊維芽細胞、および成体皮膚繊維芽細胞である。本発明の特別な態様において、該ヒト繊維芽細胞は、患者から、例えば皮膚生検により取得される（例えば、Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. George Q. Daley et al. Nature 2008；A method for the isolation and serial propagation of keratinocytes, endothelial cells, and fibroblasts from a single punch biopsy of human skin, Normand et al. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 1995）。脂肪細胞およびケラチン生成細胞もまた、皮膚生検または引き抜いた毛髪より容易に導き出すことができ（Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells, Belmonte et al. Nature Protocols 2010）、かつまた、本発明の方法のための好ましいドナー細胞である。
【００１３】
本発明の一つの好ましい局面は、患者特異的な神経幹細胞を生成するための方法である。本発明の別の局面は、健康な個体より取得された体細胞から神経幹細胞を生成するための方法である。
【００１４】
本明細書において使用される際、「神経幹細胞」とは、例えばネスチンを含むいくつかの神経マーカーを発現する、多能性細胞のサブセットを指す。本明細書において記載される方法により取得された神経幹細胞はまた、「irNSC」：人工リプログラミング神経幹細胞（induced reprogrammed neural stem cell）とも呼ばれる。神経幹細胞は、無限に拡大することができ、かつ、ニューロンまたはグリア細胞（例えば、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）に分化し得る。「患者特異的な神経幹細胞」という用語は、患者の体細胞から取得された神経幹細胞を指し、かつまた、自家神経幹細胞とも呼ばれる。本明細書において使用される「健康な個体から取得された神経幹細胞」とは、いかなる障害または疾患も患っていることが疑われない個体の体細胞から取得された神経幹細胞を指す。
【００１５】
本明細書において使用される際、「リプログラミング」という用語は、体細胞をより分化していない細胞へ変換するため、例えば、繊維芽細胞、脂肪細胞、またはケラチン生成細胞を神経幹細胞へ変換するために必要とされる、一つまたは複数の段階を指す。体細胞の神経幹細胞へのリプログラミングは、神経幹細胞特性の維持に関与する少なくとも2種の遺伝子を導入することにより、達成される。体細胞の神経幹細胞へのリプログラミングに適する遺伝子は、Sox2（SEQ ID NO：1）、Brn2（SEQ ID NO：2）、Bmi1（SEQ ID NO：3）、Mash1（SEQ ID NO：4）、Sox11（SEQ ID NO：5）、NCam（SEQ ID NO：6）、Kpna1（SEQ ID NO：7）、Foxg1（SEQ ID NO：8）、Emx2（SEQ ID NO：9）、およびPax6（SEQ ID NO：10）を含むが、それらに限定されない。好ましい態様において、少なくとも2種の遺伝子が導入され、別の好ましい態様において、3種の遺伝子が導入される。体細胞中に導入される遺伝子の好ましい組み合わせは、Bmi1およびSox2を含む。さらに好ましい態様において、少なくとも2種の遺伝子のこの組み合わせは、Mash1を追加的に含む。別の態様において、少なくとも2種の遺伝子のこの組み合わせは、Mash1、Emx2、Foxg1、Pax6、およびSox11の群より選択される1種の遺伝子を追加的に含む。さらなる態様において、少なくとも2種の遺伝子の組み合わせは、Bmi1およびSox2およびMash1を含む。
【００１６】
本明細書において使用される「遺伝子の導入」という用語は、体細胞における該遺伝子の安定発現をもたらす任意の方法を指す。該遺伝子は、リプログラミングベクターを介した細胞中への送達、または低分子を介した該遺伝子の活性化のいずれかにより、当技術分野において公知である方法により体細胞中に導入される。リプログラミングベクターの例は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、プラスミド、およびトランスポゾンである。該遺伝子の送達のためのレンチウイルスの使用が、本明細書において好ましい。該遺伝子の堅牢な活性化に適する低分子の例は、DNAメチル化阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、エルゴリン（例えばリセルグ酸エチルアミド）、フラボン（例えば7'ヒドロキシフラボン）、パウロン（paullone）（例えばケンパウロン（Kenpaullone））（Reprogramming of murine fibroblasts to induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4 PNAS 2009 106 (22) 8912-8917）、L型チャンネルアゴニスト（例えばBIX01294）、BayK8644、および5'アザシチジン（Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds Yan Shi et al. Cell Stem Cell - 6 November 2008 (Vol. 3, Issue 5, pp. 568-574)）である。リプログラミングを成功裏に誘導するために、体細胞を、増殖因子および低分子を補給した適当な培地において増殖させる。本明細書において使用される際、「増殖因子」という用語は、細胞増殖を引き起こす生物学的活性ポリペプチドを意味し、かつ、増殖因子およびその類似体の両方を含む。これらは、非限定的に、上皮成長因子、トランスフォーミング増殖因子、神経成長因子、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、ならびに血管新生因子、血小板由来増殖因子、インスリン、およびソマトメジンを含むインスリン様増殖因子、粘液腫およびワクシニアウイルス由来増殖因子を含む。本明細書において使用される好ましい増殖因子は、BDNF（脳由来神経栄養因子）、FGF2（繊維芽細胞増殖因子2）、およびEGF（上皮成長因子）である。増殖因子は、単独でもしくはペアの組み合わせにおいて使用されてもよく、または最も好ましくは、3種の因子すべてが一緒に使用される。さらに、繊維芽細胞は、少なくとも1種の低分子の存在下で培養される。本明細書において使用される「低分子」、または「小化合物」という用語は、一般に、1モル当たり10,000グラム未満、任意で1モル当たり5,000グラム未満、および任意で1モル当たり2,000グラム未満の分子量を有する、合成されるかまたは天然に見出されるかいずれかの、有機または無機分子を指す。一つの好ましい態様において、該低分子は、タンパク質キナーゼの、Rho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（ROCK）ファミリーの阻害剤を含む。ROCK阻害剤の非限定的な例は、ファスジル（1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン）、チアゾビビン（N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド）、Y27632（(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロ-ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド）、およびバラノール様324化合物（N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミド）を含む。別の態様において、該低分��は、1種または複数のキナーゼ、AMPK（AMP活性化タンパク質キナーゼ、β1非触媒サブユニット；公式の記号：PRKAB1）、CHK2（CHK2チェックポイントホモログ（S.ポンべ（S. pombe））、公式の記号：CHEK2）、MSK1（リボゾームタンパク質S6キナーゼ、90kDa、ポリペプチド 5；公式の記号：RPS6KA5）、PKA（タンパク質キナーゼ、cAMP依存性、触媒性、α；公式の記号：PRKACA）、PKGa（タンパク質キナーゼ、cGMP依存性、I型；公式の記号：PRKG1）、およびSGK1（血清／グルココルチコイド調節キナーゼ1、公式の記号：SGK1）の阻害剤より選択される。
【００１７】
本明細書において使用される、「誘導培地」とも示される「リプログラミングの誘導に適する培地」とは、体細胞のリプログラミングの誘導に有用な、任意の化学的に定義された培地を指す。インスリン、トランスフェリン、およびプロゲステロンを補給した無血清培地が、本明細書において好ましい。本明細書において使用される好ましい培地は、10〜50μg/ mlインスリン、10〜100μg/ mlトランスフェリン、および10〜50 nMプロゲステロンを含有する。リプログラミングの誘導に適する無血清培地の例は、N2B27培地（N2B27は、N2およびB27（両方ともGibco由来）を補給したDMEM/F12（Gibco, Paisley, UK）の1:1混合物である）、N3培地（DMEM/F12（Gibco, Paisley, UK）、25μg/ mlインスリン、50μg/ mlトランスフェリン、30 nM亜セレン酸ナトリウム、20 nMプロゲステロン（Sigma）、100 nMプトレッシン（Sigma）から構成される）、またはNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation培地（Stemcell Technologies）である。FGF2、EGF、BDNF、およびROCK阻害剤を追加的に補給した上述のような無血清培地が、本明細書において最も好ましい。好ましくは、該ROCK阻害剤は、ファスジルまたはバラノール様324化合物を含む。好ましい態様において、培地に、10〜50 ng/ml FGF2、10〜50 ng/ml EGF、1〜20 ng/ml BDNF、および1〜50μMファスジルまたは1〜10μMバラノール様324化合物を補給する。少なくとも2種の遺伝子の導入後、リプログラミングされるべき体細胞を、好ましくは、該誘導培地において、少なくとも1日間、好ましくは1〜7日間、最も好ましくは2〜3日間増殖させる。
【００１８】
一つの態様において、段階a）の体細胞は、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤で前処理される。本明細書において使用される「前処理する段階」または「前処理」は、該HDAC阻害剤を補給した適当な培地における、4〜60時間、好ましくは48時間の体細胞のインキュベーションを意味する。本明細書において有用なHDAC阻害剤は、酪酸ナトリウム（ブタン酸、ナトリウム塩）、トリコスタチンA（TSA、7-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-N-ヒドロキシ-4,6-ジメチル-7-オキソヘプタ-2,4-ジエンアミド）、およびバルプロ酸（2-プロピル-ペンタン酸）を含む群より選択される。一つの態様において、段階a）の体細胞は、バルプロ酸で前処理される。別の態様において、段階a）の体細胞は、バルプロ酸で48時間、前処理される。
【００１９】
ニューロスフェア培養として神経幹細胞の増殖を広げるために、人工神経幹細胞を、インスリン、トランスフェリン、およびプロゲステロン、ならびに上述のような増殖因子を補給した無血清培地から構成される拡大培地において増殖させる。好ましくは、該増殖因子は、FGF2、BDNF、およびEGFを含む。別の態様において、該拡大培地は、ヘパリン、アスコルビン酸、SHH（組み換えヒトソニック・ヘッジホッグ（Sonic Hedgehog））、FGF8（組み換えヒトFGF8aアイソフォーム）、DLL4（組み換えヒトDLL4）、Jagged1（組み換えヒトJagged 1 Fcキメラ）、ファスジル、およびバラノール様324化合物の群より選択される1種または複数の補給物を、追加的に含む。
【００２０】
本発明の別の態様において、本明細書において記載される方法により取得された神経幹細胞を、次の段階で、リプログラミング培地の増殖因子の少なくとも1種の除外により、分化のために刺激する。好ましくは、中止されるべき該増殖因子は、EGFおよびFGFを含む。
【００２１】
本発明の別の好ましい態様において、リプログラミングに成功した神経幹細胞のスクリーニングおよび定量化を促進するために、マーカー遺伝子を使用する。例えば、蛍光マーカータンパク質をコードする遺伝子を、レンチウイルス導入により標的体細胞中に導入する。蛍光マーカータンパク質の例は、GFP、YFP、EGFP、またはDsRedである。好ましくは、該マーカー遺伝子は、ネスチンプロモーターに機能的に連結される。ネスチンは、神経幹細胞において特異的に発現され、従って、ネスチンプロモーターの制御下のマーカー遺伝子は、人工リプログラミング神経幹細胞の迅速なスクリーニングおよび同定を可能にする。その後、それらの細胞をスクリーニングして、所望の表現型、すなわちニューロスフェアを呈する細胞を同定する。20μmより大きい、好ましくは50μmより大きいニューロスフェアを選択し、さらなる拡大のために収集する。
【００２２】
本発明の別の局面において、前述の方法のいずれかにより産生された神経幹細胞の集団が提供される。好ましくは、神経幹細胞の集団は、患者特異的であり、すなわち、疾患を有する個体から取得された体細胞に由来する。別の態様において、幹細胞の該集団は、健康な個体から取得される。神経幹細胞は、無限に拡大することができる。培養は、容易であり、かつ十分に特徴決定されている。神経幹細胞のアリコートを、再現性良く凍結融解することが可能である。患者由来の神経幹細胞は、CNS疾患の病態生理学を研究するための、疾患に関連したインビトロのモデルに相当する。患者特異的な体細胞の神経幹細胞への直接の変換は、患者特異的な神経幹細胞のバイオバンクを作製するための、容易に利用可能なかつ再現可能な技術に相当する。従って、本発明のさらなる好ましい局面において、患者特異的な神経幹細胞を含むバイオバンクが、構想される。別の態様において、健康な個体から取得された神経幹細胞の様々な集団を含むバイオバンクが、作製される。本明細書において使用される「バイオバンク」という用語は、様々な個体または種から採取された生物学的試料のライブラリーを意味する。検体および関連データの保管された収集物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS／ルー・ゲーリッグ病）、卒中、および脊髄損傷などの神経変性疾患のような神経疾患に取り組むことを目指した研究目的、または該神経学的疾患の治療を意図したものである。
【００２３】
本発明の別の局面は、本方法により取得された神経幹細胞の使用である。好ましい態様において、本方法により取得された神経幹細胞は、CNS疾患の病態生理学を研究するためのインビトロのモデルとして使用される。例えば、本発明の方法により取得された神経幹細胞は、神経学的疾患を逆転、阻害、または予防する化合物のスクリーニングのために使用することができる。さらに、それらを、薬剤、例えば糖尿病の薬剤の神経性副作用を逆転、阻害、または予防する化合物のスクリーニングのために使用することができる。好ましくは、本明細書において記載される発明の方法により取得された該神経幹細胞は、疾患を有する対象に由来する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、前述の方法のいずれかにより産生された細胞を含有する、または前述の細胞集団のいずれかを含有する治療用組成物を提供する。好ましくは、治療用組成物は、例えば、人工脳脊髄液またはリン酸緩衝生理食塩水を含む、生理学的に適合性の溶液をさらに含む。該治療用組成物は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、またはALS、リソソーム蓄積疾患、多発性硬化症、または脊髄損傷などの神経学的疾患を処置、予防、または安定化するために使用することができる。例えば、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、または脂肪細胞を、皮膚生検により、処置を必要とする個体からまたは健康な個体から取得し、かつ、本発明の方法により神経幹細胞へリプログラミングしてもよい。本発明の一つの態様において、状態を処置するために、神経幹細胞を収集し、かつ個体中へ導入する。別の態様において、該神経幹細胞を、個体中への導入の前に、ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはアストロサイトへの分化に適する状態の下で培養し、かつ、疾患を有するかまたは損傷を受けた組織を置換するため、またはその正常な機能を補助するために使用してもよい。本発明の大きな利点は、患者特異的なヒト神経細胞、または移植に適する同一のHLA型を有する健康な個体由来の適合性の神経幹細胞の、本質的に無制限の供給を提供することである。細胞療法における自家および／または適合性の細胞の使用は、免疫学的拒絶を受ける可能性が高い非自家細胞の使用を上回る主要な利点をもたらす。対照的に、自家細胞は、有意な免疫学的応答を誘発する可能性が低い。
【００２５】
本発明の別の態様は、神経学的疾患の治療のための神経幹細胞のバイオバンクの使用である。バイオバンクは、好ましくは、患者またはいくつかのHLA型を有する健康な個体から取得された神経幹細胞を含む。健康なドナーから取得された細胞を、適合性のHLA型を有する処置を必要とする個体に移植することは、異種細胞移植に通常付随する拒絶反応の有意な問題を回避する。従来、拒絶は、シクロスポリンなどの免疫抑制剤または抗拒絶薬の投与により、予防または軽減される。しかしながら、そのような薬物は、有意な有害副作用、例えば、免疫抑制、発癌特性、腎毒性を有し、かつ非常に高価である。本発明は、シクロスポリン、imulan、FK-506、グルココルチコイド、およびラパマイシン、ならびにそれらの誘導体などの抗拒絶薬の必要性を除去するか、または少なくとも大幅に軽減するはずである。
【００２６】
本発明の治療法に関して、神経幹細胞の哺乳動物への投与が、特定の投与の様式、投与量、または投薬の頻度に限定されることは意図されず；本発明は、疾患を予防または処置するために適切な用量を提供するのに十分な、筋肉内、静脈内、関節内、病巣内、皮下、または任意の他の経路を含む、すべての投与の様式を企図する。神経幹細胞は、単一用量または複数用量において、哺乳動物に投与してもよい。複数用量を投与する際、用量を、例えば、1週間、1か月、1年、または10年単位で、互いに分離させてもよい。細胞の投与の前、間、または後に、それらを特定の細胞タイプへさらに偏らせるために、1種または複数の増殖因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン、低分子、または他の細胞も、投与してもよい。
[本発明1001]
以下の段階を含む、神経幹細胞（NSC）を産生する方法：
a）体細胞を提供する段階、
b）Bmi1、Sox2、Mash 1、Sox11、Emx2、Foxg1、およびPax6の群より選択される少なくとも2種の遺伝子を導入することにより、該体細胞をNSCへリプログラミングする段階；ならびに
c）増殖因子および低分子を用いてリプログラミングのために誘導する段階。
[本発明1002]
d）NSCの増殖に適する条件下で、段階b）およびc）の産物をインキュベーションする段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階a）の体細胞が、ヒト細胞である、本発明1001または1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
段階a）の体細胞が、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、および脂肪細胞の群より選択される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
段階c）の増殖因子および低分子が、化学的に定義された培地の補給物である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
化学的に定義された培地が、インスリン、トランスフェリン、およびプロゲステロンを補給した無血清培地である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
段階b）の少なくとも2種の遺伝子が、Bmi1およびSox2を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
段階b）の少なくとも2種の遺伝子が、Mash1、Sox11、Emx2、Foxg1、およびPax6の群より選択される少なくとも1種の遺伝子をさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
段階b）の少なくとも2種の遺伝子が、Bmi、Sox2、およびMash1を含む、本発明1007または1008の方法。
[本発明1010]
段階c）の増殖因子が、FGF2、EGF、およびBDNFの群より選択される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
段階c）の低分子が、ROCK阻害剤を含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
ROCK阻害剤が、1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン、N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド、(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロ-ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、およびN-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミドの群より選択される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
体細胞が、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤で前処理される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
体細胞のリプログラミングが、レンチウイルスによる少なくとも2種の遺伝子の組み合わせの送達を通して達成される、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
本発明1001〜1014のいずれかの方法により取得された、神経幹細胞。
[本発明1016]
CNS疾患用のインビトロのモデルとしての、本発明1015の神経幹細胞の使用。
[本発明1017]
本発明1015の神経幹細胞を含む、治療用組成物。
[本発明1018]
神経幹細胞が、ニューロンまたはグリア細胞に分化する、本発明1017の治療用組成物。
[本発明1019]
本発明1001〜1014のいずれかの方法により取得されたNSCの、バイオバンク。
[本発明1020]
本質的に本明細書において記載されるような、方法および使用。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒト繊維芽細胞をirNSCへ変換するための方法の模式図。0日目：ヒト繊維芽細胞をトリプシン処理し、誘導培地（FGF、EGF 30 ng/ml；BDNF 20 ng/ml；ファスジル10μM、ポリブレン4μg/mlを含むN2B27）を用いて、少容量で遺伝子の組み合わせおよびネスチンGFPレポーターをトランスフェクションした。繊維芽細胞を、10000〜30000細胞/cm2の濃度で、標準的な組織培養プレートにプレーティングした。1日目：新鮮な誘導培地での培地交換。GFP／ネスチン陽性（GFP+）irNSCが、非常に低い頻度で（100000個のうち、〜50個のirNSC GFP+）出現し始めた。2日目：GFP+ irNSCの数が増加していき、共に細胞クラスターを形成するように移動し始めた。3日目：細胞クラスターが、持ち上がって離れ、かつGFP+ニューロスフェアとして浮遊し始める、明らかな球状構造に組織化される。20μmより大きいニューロスフェアを計数し、さらなる拡大のために収集した。
【図２】ヒトネスチンGFPレポーターレンチウイルスの模式図。蛍光タンパク質copGFPおよびzeocin選択マーカーを、最小CMVプロモーターに連結した、ヒトネスチンイントロン2由来の1.8 kbエンハンサー断片の発現制御下に、クローニングした。
【図３】リプログラミング誘導法の1日目のirNSC。上のパネル：形質転換されていないヒト胎児肺繊維芽細胞IMR90（位相差）。下のパネル：irNSC GFP+細胞の生成（位相差およびGFPチャンネル）。
【図４】リプログラミング誘導法の2日目のirNSC。細胞が遊走して接近する傾向にあり、irNSC GFP+のコアを有する球状構造を形成し始める（位相差およびGFPチャンネル）。
【図５】リプログラミング誘導法の3日目のirNSC。2日目に形成された球状構造が今では完全に成熟し、培地中に浮遊するニューロスフェアとして出現する。ニューロスフェアは、高密度の細胞を有し、直径が20〜100μmにわたる寸法を有する。irNSCはネスチンGFP発現により標識され、かつほぼすべてのニューロスフェアにおいて同定され得るが、すべてのニューロスフェアが同一の割合のirNSC GFP+を有するわけではない（位相差およびGFPチャンネル）。
【図６】様々な遺伝子の組み合わせで生成したニューロスフェアの数。
【図７】Sox2-Bmi1の導入後の、付着したニューロスフェア。付着したニューロスフェアは、伸長した双極細胞の特徴的な形態を示す。下のパネル：より高倍率のirNSC GFP+ニューロスフェア。
【図８】EGFおよびFGFの中止の1週間後の、分化した細胞。増殖性の増殖因子を中止したirNSCは、ニューロンマーカーtuj1で陽性に染色される非常に細い突出を有する細胞を生じる。
【図９】拡大および特徴決定のための、irNSCニューロスフェアのバッチの生成。360万個のヒト繊維芽細胞IMR90をトリプシン処理し、ファスジル10μMおよびポリブレン4μg/mlを補給した誘導培地（FGF、EGF 30 ng/ml、BDNF 20 ng/mlを含むN2B27）を用いて、少容量でSox2、Bmi1、ネスチンGFPレポーターを感染させた。4日目〜8日目：50μmより大きいGFP+ニューロスフェアを収集し、拡大のためにさらに使用した。ニューロスフェアの半分を、ファスジルを含む拡大培地（FGF、EGF 30 ng/ml、BDNF 20 ng/mlを含むN2B27）を用いて拡大し、残りの半分を、ファスジル無しで拡大した。15日目：ファスジルを含む拡大培地において増殖させたニューロスフェアは、より良好な形態、および明白かつ鮮明な境界を有し（良好に形成されたニューロスフェアの証明、パネルB）；ファスジルが無いと、ニューロスフェアは、ぼやけた境界を有する（パネルA）。
【図１０】NSCマーカーSox2およびネスチンの発現についての、irNSCニューロスフェアの免疫細胞化学特徴決定。ファスジルと共に拡大した15日目のirNSCニューロスフェアを、PO/Lamコーティングしたプレート上にプレーティングし、48時間後に、Sox2およびネスチンの発現について染色した。irNSCニューロスフェアは付着し、irNSCはスフェアから伸展する。irNSCは、典型的なNSC形態を有し、かつSox2およびネスチン陽性であった。パネルA：マージおよび単一のチャンネルDAPI、Sox2、ネスチン；20×倍率；パネルB：マージチャンネルDAPI、Sox2、ネスチン；10×倍率。
【図１１】irNSCニューロスフェアを生成するための、ファスジル対バラノール様324化合物刺激の比較。ヒト繊維芽細胞IMR90をトリプシン処理し、ファスジル10μM（斜線グラフ）またはバラノール様324化合物2μM（黒色グラフ）を補給した誘導培地（FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/ml；ポリブレン4μg/mlを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、 StemCells Technologies））を用いて、少容量でSox2、Bmi1、ネスチンGFPレポーターを感染させた。繊維芽細胞を、10000〜30000細胞/cm2の濃度で、標準的な組織培養プレートにプレーティングした。1日目：新鮮な誘導培地での培地交換。4日目：50μmより大きいGFP+ニューロスフェアを計数した。バラノール様324小化合物は、ニューロスフェア生成の効率を約2倍（1.9）増大させ、かつ、より良好な再現性を有する（STDEV, n＝3）。
【図１２】バルプロ酸（VPA）でのヒト繊維芽細胞の前処理は、GFP+ irNSCニューロスフェアの収率を改善する。ヒト繊維芽細胞IMR90を、Sox2、Bmi1、ネスチンGFPレポーターでの感染の前に、HDAC阻害剤であるバルプロ酸（2-プロピル-ペンタン酸、一ナトリウム塩）（1mM）を伴うかまたは伴わずに、48時間前処理した。誘導培地（FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/ml；バラノール様324 2μMを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies））。7日目：50μmより大きいニューロスフェアを計数し（パネルA）、ニューロスフェア当たりのGFP+ irNSCの平均数を報告する（パネルB）。VPA前処理で生成したirNSCニューロスフェアの代表的な写真（パネルC）。VPA前処理は、7日目のニューロスフェアの数に有意に影響を及ぼさなかったが；VPA処理は、GFP+ irNSCの数を増加させた（2.1倍）（STDEV, n＝3）。
【図１３】irNSCニューロスフェアの効率的な誘導のための、Sox2およびBmi1との組み合わせにおける遺伝子の最小プールの定義。ヒト繊維芽細胞IMR90を、Sox2、Bmi1、ネスチンGFPレポーター、加えて、それらの相乗作用に取り組むための様々な候補遺伝子での感染の前に、VPA（1mM）で48時間、前処理した。誘導培地：FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/ml、およびバラノール様324化合物2μMを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies）。50μmより大きいirNSCニューロスフェアの7日目の定量化。Mash1、Emx2、Foxg1、Pax6、およびSox11は、Bmi1およびSox2と相乗作用を示して、irNSCニューロスフェアを生成する。
【図１４】成体ヒト皮膚繊維芽細胞（HDFa）からのirNSCニューロスフェアの生成。成体ヒト皮膚繊維芽細胞は、GIBCO（カタログ番号：C-013-5C）より提供される。成体ヒト皮膚繊維芽細胞をトリプシン処理し、ファスジル10μMを補給した誘導培地（FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/mlを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies））を用いて、少容量でSox2、Bmi1、ネスチンGFPレポーターを感染させた。8日目：irNSCニューロスフェアが検出される（代表的な写真、2.5および10×倍率）。
【図１５】irNSC GFP+の単層培養を得るための、アスコルビン酸、ソニック・ヘッジホッグ（Shh）、Jagged1、DLL4、およびFGF8の組み合わせを用いたirNSCニューロスフェアの拡大。ヒト繊維芽細胞IMR90に、誘導培地（FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/ml；バラノール様324 2μMを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies））を用いて、Sox2、Bmi1、Mash1、およびネスチンGFPレポーターを感染させた。7日目：50μmより大きいニューロスフェアを収集し、拡大培地（FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/ml；バラノール様324 2μM；アスコルビン酸0.2mM、SHH（組み換えヒトソニック・ヘッジホッグ、カタログ番号：1845SH）500 ng/ml、FGF8（組み換えヒトFGF8aアイソフォーム、カタログ番号：4745F8）100 ng/ml、DLL4（組み換えヒトDLL4、カタログ番号：1506D4）500 ng/ml、Jagged1（組み換えヒトJagged 1 Fcキメラ、カタログ番号：1277JG）500 ng/ml、2日間、FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/mlを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies）中で培養したhESC由来のNSCからの調整培地1/10を含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies））でさらに拡大した。上記で報告した拡大培地で拡大した14日目のirNSCニューロスフェアの代表的な写真（パネルA）。ニューロスフェアは、画定された境界を有し、かつ、ニューロスフェアからのとげの突出を観察することが可能である（パネルB、ズームイン）。irNSC GFP+の同質の単層培養を得るために、21日目に、拡大したirNSCニューロスフェアを解離させ、PO/Lamコーティングしたプレート上にプレーティングした（パネルC、単層での培養における4日後の、irNSC単層の位相差およびGFPチャンネル）。
【図１６】NSCマーカーであるネスチンおよび初期ニューロンマーカーであるTuj1の発現についての、irNSCニューロスフェアの免疫細胞化学特徴決定。図15に記載されるように生成した21日目のirNSCニューロスフェアを解離させ、NSC自己複製条件（FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/mlを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies））でプレーティングして、ネスチンマーカーの発現を検定した（パネルA、48時間後、すべての細胞はネスチン+およびTuj1-である）か、または、分化条件（BDNF 20 ng/mlを含むNeuroCult（登録商標）NS-A differentiation Kit（ヒト、StemCells Technologies））でプレーティングし、かつ7日目にTuj1およびネスチンについて染色した（パネルB、すべての細胞はTuj1+であり、かつ少しの細胞しかネスチン+でない）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２８】
ヒト繊維芽細胞を神経幹細胞（NSC）へ変換するために使用される本発明による方法を図示する、本明細書における図1を参照することにより、本方法を例証することができる。本方法において、ヒト繊維芽細胞を、0日目にトリプシン処理し、計数し、かつその生存度を判定した。1.0×105〜3.0×105個のトリプシン処理した繊維芽細胞を、その後、誘導培地に再懸濁し、遺伝子の組み合わせをレンチウイルスとして送達した。レンチウイルス導入の効率を増大させるために、誘導培地にポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）を添加した。感染を、15分間エッペンドルフチューブ中で行った。遺伝子との組み合わせで、ヒトネスチンGFPレポーターを使用した。ネスチンは、NSCに特異的に発現される周知のマーカーである。ネスチンレポーターにおいて、蛍光タンパク質GFPはヒトネスチンプロモーターの発現下であり（図2）、従って、人工リプログラミング神経幹細胞（irNSC）GFP+の容易なスクリーニングが可能になる。
【００２９】
感染させた細胞を、適切な容量の誘導培地において10000〜30000細胞/cm2の濃度を用いて、組織培養プレート中にプレーティングした。1日目に、全誘導培地を更新した。ヒト繊維芽細胞と比較して形態に明らかな変化を有するいくつかのirNSC GFP+（図3）を同定することが可能であった。irNSC GFP+は、NSCに典型的である、より凝縮された細胞質を有する双極性かつ伸長した形態を獲得した。さらに、irNSCは、Notch経路の増殖促進性（pro-proliferative）シグナルを活性化するために伝統的なNSC培養において獲得される典型的な細胞間相互作用に類似している、ぎっしり詰まった単層培養において増殖している。2日目、irNSC GFP+は、より成熟した状態にあり、非常にぎっしり詰まった細胞のクラスターを形成し始めた。これらのirNSCのクラスターは、irNSC GFP+を含有する緻密なコアを有する球状構造を形成し始めた（図4）。3日目、球状構造が完全に形成され、組織培養プレートから持ち上がって離れ、培地中にニューロスフェアとして浮遊し始めた。ニューロスフェアは、明白な境界を有するおよそ20〜100μmの寸法を有し、かつ、irNSC GFP+を同定することが可能である高密度の細胞を含むコアを有する（図5）。
【００３０】
本発明の飛躍的進歩を達成するために、特定の遺伝子の組み合わせを使用することが必要であった。インビボおよびインビトロでNSC特性の維持に関与する遺伝子の以下のリストを、文献の知見から検索した：Sox2（Sox転写因子で、かつNSCの重要なマーカー）、Brn2（Soxタンパク質に結合することが公知であるPOUドメインタンパク質。ネスチンプロモーター上のSox2およびBrn2の結合が報告されている。Brn2 KOマウスはCNS発生の障害を有する）、Bmi1（細胞周期の調節に関与するタンパク質であり、サイクリンE/cdk2複合体のp21およびp27阻害因子の発現を増加させることが報告されている。サイクリンE/cdk2の阻害は、細胞周期に対する網膜芽細胞腫タンパク質制御の欠失を決定し、NSCの自己複製状態の間の高速細胞周期を結果としてもたらす）、Mash1（インビボで神経前駆体の増殖のための重要な調節因子であることが記載されている）、Sox11（インビボでSGZに発現していることが報告されているSoxタンパク質）、NCam（フローサイトメトリーにおけるNSCマーカーであり、CNSの様々な領域に発現している）、Kpna1（外胚葉由来組織においてタンパク質の核移行をインポーチンβと共に担うインポーチンα5としてよりよく知られている）。
【００３１】
すべての遺伝子を、cDNAとしてレンチウイルスプラスミド中にクローニングし、続いてレンチウイルス中にパッケージングした。Sox2、Bmi1、Mash1、Sox11、NCam、Kpna1、ネスチンGFPレポーターについてのレンチウイルスのパッケージングされた粒子を、ヒト繊維芽細胞中に直接導入した。様々な遺伝子の組み合わせを、上述の方法において検定した。3日目に、生成したニューロスフェアを計数することにより、irNSCの産生の成功を評定することが可能であった。50μmより大きいニューロスフェアのみを、考慮に入れた。
【００３２】
図6に表わされるように、誘導培地へのファスジルの添加を伴わないネスチンレポーターレンチウイルスの導入は、ヒト繊維芽細胞をirNSCへリプログラミングしなかった。誘導培地へのファスジルの添加で、ニューロスフェア（約50μm）およびいくつかのより小さいもの（約20μm、計数していない）の生成が報告された。
【００３３】
遺伝子の組み合わせ：Sox2-Bmi1を用いた本発明者らの革新的な方法で生成したニューロスフェアを3日目に収集し、さらに14日間拡大した。irNSCニューロスフェアの拡大は、重大な段階であった。特別な極めて低い非接着性プレート（Corning）において、FGF、EGF、BDNFを補給したN2B27培地を用いて、ニューロスフェアを培養した。irNSC GFP+ニューロスフェアの同質の集団を達成するため、2〜3日毎に清掃手順を適用した。拡大の14日間に、低密度のirNSC GFP+を有するいくつかのニューロスフェアは、変換されていない繊維芽細胞の混入にほぼ確実に起因して、適切に増殖することができなかった。そのような種類の混入を有するニューロスフェアは、除去される必要がある単一の細胞に分解された。14日目に、ニューロスフェアを、ポリオルニチン／ラミニンコーティングされたプレートへの付着、およびニューロン様細胞の生成について検定した。付着については、細胞付着および伸展を改善するために、最初の日のみにファスジル10μMを補給した拡大培地において、ポリオルニチン／ラミニンコーティングしたプレート上に、20〜40ニューロスフェア／cm2をプレーティングした。培養の1日目に、ニューロスフェアの付着および伸展を示すことが可能であった（図7）。伸展するニューロスフェアの中心に、本発明者らは、典型的なNSC形態を有するirNSC GFP+を同定した。ニューロスフェアをさらに3日間増殖させ、かつその後、BDNFのみをN2B27に添加した(ニューロン分化条件)。EGFおよびFGFを中止すると、irNSCは形態を変化させた。それらはより伸長し、かつ神経突起様の細胞突出を形成し始めた。分化条件の7日目に、細胞を固定し、ニューロンマーカーtuj1について染色した（図8）。
【００３４】
ファスジルと共に拡大したニューロスフェアは、より良好な形態、および明白かつ鮮明な境界を有し（良好に形成されたニューロスフェアの証明、図9、パネルB）；ファスジルが無いと、ニューロスフェアは、ぼやけた境界を有する（図9、パネルA）。irNSCは、典型的なNSC形態を有し、かつSox2およびネスチン陽性であった（図10）。
【００３５】
図11は、Rockキナーゼ阻害剤であるバラノール様324化合物が、GFP+ニューロスフェアの収率を増大させることを示す。
【００３６】
これらの証拠は、本方法が、遺伝子導入（最良の組み合わせ：Sox2-Bmi1、Sox2-Bmi1-Mash1、Sox2-Bmi1-Sox11、Sox2-Bmi1-Emx2、Sox2-Bmi1-Foxg1、およびSox2-Bmi1-Pax6、図13も参照されたい）ならびに化学的に定義された培地誘導の連結された段階に基づいて、ヒト繊維芽細胞をirNSCへ変換できたことを示す。
【００３７】
irNSCの収率を増大させるために、ヒト繊維芽細胞を、HDAC阻害剤であるバルプロ酸（VPA、2-プロピル-ペンタン酸、一ナトリウム塩）を伴うかまたは伴わずに前処理した。この目的に向けて、ヒト繊維芽細胞を、感染の前に、1mM VPAを補給し、FBS 10％およびL-グルタミンを補給したDMEM/F12中でインキュベーションした（図12）。
【００３８】
図14は、成体ヒト皮膚繊維芽細胞（HDFa）からのirNSCニューロスフェアの生成を示す。
【００３９】
図15は、アスコルビン酸、ソニック・ヘッジホッグ（Shh）、Jagged1、DLL4、およびFGF8の組み合わせを用いたirNSCニューロスフェアの拡大を示す。図16は、NSCマーカーであるネスチンおよび初期ニューロンマーカーであるTuj1の発現についての、irNSCニューロスフェアの免疫細胞化学特徴決定を示す。
【００４０】
材料および方法
細胞培養：
誘導培地：ヒトEGF（Peprotech）30 ng/ml、ヒトFGF2 30ng/ml（Peprotech）、ヒトBDNF（Roche）20 ng/ml、およびファスジル（Calbiochem）10μMまたはバラノール様324化合物（N-{(3R,4R)-4-[4-(2-フルオロ-6-ヒドロキシ-3-メトキシ-ベンゾイル)-ベンゾイルアミノ]-アゼパン-3-イル}-4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-ベンズアミド）2μMを補給したN2B27（N2B27は、N2およびB27（両方ともGibco由来）を補給したDMEM/F12（Gibco, Paisley, UK）の1:1混合物である）。
【００４１】
拡大培地：ヒトEGF（Peprotech）30 ng/ml、ヒトFGF2 30 ng/ml（Peprotech）、ヒトBDNF（Roche）20 ng/mlを補給したN2B27、または
FGF、EGF、BDNF 20 ng/ml；ヘパリン2μg/ml；バラノール様324 2μM；アスコルビン酸0.2mM、SHH（組み換えヒトソニック・ヘッジホッグ、カタログ番号：1845SH）500ng/ml、FGF8（組み換えヒトFGF8aアイソフォーム、カタログ番号：4745F8）100ng/ml、DLL4（組み換えヒトDLL4、カタログ番号：1506D4）500ng/ml、Jagged1（組み換えヒトJagged 1 Fcキメラ、カタログ番号：1277JG）500ng/mlを含むNeuroCult（登録商標）NS-A Proliferation Kit（ヒト、StemCells Technologies）。
【００４２】
分化培地：ヒトBDNF（Roche）20 ng/ml、ラミニン2μg/ml（Invitrogen）を補給したN2B27。
【００４３】
ヒト繊維芽細胞：IMR90胎児肺繊維芽細胞（ATCCロット番号580229699）または成体ヒト皮膚繊維芽細胞（GIBCO、カタログ番号：C-013-5C）。
【００４４】
レンチウイルス：あらかじめパッケージングされ、そのまま使用できるレンチウイルス粒子を、Sigma（Stemgent Reprogramming LentivirusヒトSox2、カタログ番号ST070012）、Genecopeia（ヒトBmi1 Lentifect Lentiviral Particles、カタログ番号LP-B0015-Lv105；Sox11 Lentifect Lentiviral Particles、カタログ番号LP-MO425-LV105；Mash1 Lentifect Lentiviral Particles、カタログ番号LP-Z0740-LV105；ヒトKpna1Lentifect Lentiviral Particles、カタログ番号LP-U1286-Lv105；NCam1 Lentifect Lentiviral Particles、カタログ番号LP-Z2645-Lv105）、およびSBI Systems Biosciences（ネスチンGFPレポーター：pGreenZeo（商標）-hNestin Transcriptional Reporter Virus、SR10035VA-1）から取得した。
【００４５】
タイター：ネスチンGFP 1.45*10 5/μl、BMI1 4.3*10 5/μl、Sox2 1.07*10 4/μl、Sox11 3.2*10 6/μl、Mash1 4.7*10 6/μl、NCam 3.3*10 4/μl、Kpna1 1.8*10 5/μl。
【００４６】
プロトコール：
1．irNSCの生成：
・200.000個のIMR90ヒト繊維芽細胞に、ポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド、Sigma）4μg/mlを含む300μl誘導培地を有するエッペンドルフにおいて、様々な遺伝子の組み合わせについてのレンチウイルス（各単一のレンチウイルスについて30の感染多重度（M.O.I）を使用する）およびレポーターネスチンGFPレンチウイルス（10のM.O.Iを使用する）を感染させる。
・室温で15分間インキュベーションする。
・組織用処理された6ウェルプレートのウェル中の1.7 ml誘導培地に、300μlをプレーティングする。
・1日目、2 mlの誘導培地／各ウェルを更新する。
・3日目、浮遊性スフェアと共に2 mlを注意深く回収し、ニューロスフェアを収集する。
・ニューロスフェアを拡大する。
【００４７】
2．ニューロスフェアの拡大：
・6ウェルプレートの3ウェルから15mlチューブに、浮遊性ニューロスフェアと共に培地を回収する。
・スフェアを10分間沈降させる。
・上清を非常に注意深く除去する（単一の細胞は沈降しないはずであり、上清と共に吸引する）。
・スフェアを4 ml最終容積の拡大培地に再懸濁する。
・超低接着性プレートのB6プレート（Corning）にプレーティングする。
・2〜3日インキュベーションする。
・irNSCの生成から14日目まで、2〜3日毎に拡大手順を反復する。
【００４８】
3．ニューロスフェアの分化：
・irNSCの生成および拡大手順後の14日目に、明白な境界を有しかつirNSC GFP+に富む丸いニューロスフェアを、実体顕微鏡の下で選択する。
・ファスジル10μMまたはバラノール様324化合物2μMを添加した拡大培地を用いて、ポリオルニチン／ラミニンであらかじめコーティングした24ウェルプレートのウェルに40個のスフェアをプレーティングする。
・翌日、ファスジル／バラノール様324化合物2μMを含まない拡大培地に更新する。
・3日間インキュベーションする。
・拡大培地を除去し、分化培地を添加する。
・3〜4日後に分化培地を更新する。
・3〜4日間インキュベーションする。
・細胞をPFA 4％で固定し、免疫染色を行う。
【００４９】
irNSCニューロスフェアを染色するプロトコール：
15日目のニューロスフェアを、以下の抗体で特徴決定のために染色した：マウスネスチンおよびウサギSox2でO/N、ならびにその後、二次抗体である抗マウス488および抗ウサギ555で1時間。
一次抗体：
ネスチンマウス、モノクローナル、1/500希釈（MAB5326 Millipore）
Sox2ウサギ、ポリクローナル、1/500希釈（AB5603MI Millipore）
二次抗体：
Alexa fluor 488、IgG、1/1000希釈、ヤギ抗マウス（A11029 Invitrogen）
Alexa fluor 555、IgG、1/1000希釈、ヤギ抗ウサギ（A21429 Invitrogen）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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