(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記３種のポリペプチド（ｉ）〜（ｉｉｉ）のすべてを含む組合せ、または、下記３種のポリペプチド（ｉ）〜（ｉｉｉ）をコードする核酸分子のすべてを含む組合せを含んでなる免疫原性組成物：
（ｉ）第１のＨＢＶウイルスに由来するポリメラーゼタンパク質の少なくとも４５０個のアミノ酸残基を含んでなるポリメラーゼ部分；
（ｉｉ）第２のＨＢＶウイルスに由来するコアタンパク質の少なくとも１００個のアミノ酸残基を含んでなるコア部分；および
（ｉｉｉ）第３のＨＢＶウイルスに由来するＨＢｓＡｇタンパク質の連続した２０〜１００個のアミノ酸残基の１以上の免疫原性ドメインを含んでなるｅｎｖ部分であって、前記１以上の免疫原性ドメインが、配列番号１２〜１５に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。
【請求項２】
前記第１、第２、および第３のＨＢＶウイルスが、異なる遺伝子型に由来する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記第１、第２、および第３のＨＢＶウイルスの少なくとも２つが、同じＨＢＶ遺伝子型に由来する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記第１、第２、および第３のＨＢＶウイルスが、同じ遺伝子型に由来する、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記第１、第２、および第３のＨＢＶウイルスが、遺伝子型Ｄに由来する、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記第１、第２、および第３のＨＢＶウイルスが、ＨＢＶ分離株Ｙ０７５８７に由来する、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記第１、第２、および第３のＨＢＶウイルスが、遺伝子型ＢまたはＣに由来する、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ポリメラーゼ部分が、天然ＨＢＶポリメラーゼのＮ末端に通常存在する少なくとも２０個のアミノ酸残基、多くとも３３５個のアミノ酸残基の末端切断によって改変される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ部分が、天然ＨＢＶポリメラーゼのＮ末端に位置する開始Ｍｅｔ残基に続く最初の４７または４６個のアミノ酸残基の末端切断によって改変される、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ部分が、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼ部分が、天然ＨＢＶポリメラーゼよりも低い逆転写酵素（ＲＴアーゼ）活性を示すように改変される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼ部分が、配列番号１の５４０番および配列番号７の４９４番に相当するＡｓｐ残基の、Ａｓｐ以外の任意のアミノ酸残基への置換を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記Ａｓｐ以外の任意のアミノ酸残基がＨｉｓ残基である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼ部分が、天然ＨＢＶポリメラーゼよりも低いＲＮアーゼＨ酵素活性を示すように改変される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼ部分が、配列番号１の７１８番および配列番号７の６７２番に相当するＧｌｕ残基の、Ｇｌｕ以外の任意のアミノ酸残基への置換を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記Ｇｌｕ以外の任意のアミノ酸残基がＨｉｓ残基である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ部分が、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼ部分が、異種の疎水性配列とインフレームで融合される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ部分が、狂犬病糖タンパク質のシグナルおよびトランスメンブランペプチドとインフレームで融合され、該狂犬病トランスメンブラン配列が該ポリメラーゼ部分のＮ末端においてインフレームで融合され、該狂犬病トランスメンブラン配列がＣ末端においてインフレームで融合される、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ部分が、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１８または１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記コア部分が、天然ＨＢＶコアのＣ末端に通常存在する、少なくとも１０個のアミノ酸残基、多くとも４０個のアミノ酸残基の末端切断によって改変される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記コア部分が、天然ＨＢＶコアの最後の３５個のアミノ酸残基の末端切断によって改変される、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記コア部分が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記コア部分が、天然ＨＢＶコアに対して、ＨＢＶエンベロープタンパク質について低下した認識および／または相互作用を示すように改変される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記コア部分が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２４に記載の免疫原組成物。
【請求項２６】
前記ｅｎｖ部分が、配列番号１６または配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記ポリメラーゼ、コアおよび／またはｅｎｖ部分が、ペアでまたはすべて一緒に単一ポリペプチド鎖においてインフレームで融合される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
ｅｎｖ部分が、前記コア部分のＣ末端とインフレームで融合される、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
前記コア部分とｅｎｖ部分の融合ポリペプチドが、
・配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
・配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；および
・配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、または残基１で始まり、残基２５１で終わる配列番号２０に示されるアミノ酸配列の一部と、あるいはまた残基１で始まり、残基２２１で終わる配列番号２０に示されるアミノ酸配列の一部と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または配列番号２０における残基７７〜８４を欠くその欠失型
からなる群から選択される、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
請求項１および８〜２０のいずれか一項に定義されるポリメラーゼ部分、
請求項１および２１〜２５のいずれか一項に定義されるコア部分、ならびに
請求項１および２６〜２９のいずれか一項に定義されるｅｎｖ部分
のすべてを含む組合せをコードする核酸分子。
【請求項３１】
・配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・１４８０番のＧヌクレオチドのＣへの置換、２０１４番のＧヌクレオチドのＣへの置換、および２０１６番のＡヌクレオチドのＴへの置換を含む、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・配列番号２３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・配列番号２４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・配列番号２５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；および
・配列番号２６に示されるヌクレオチド配列と、またはヌクレオチド１で始まりヌクレオチド７５３で終わる配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の部分と、またはヌクレオチド１で始まりヌクレオチド６６３で終わる配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の部分と、少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；または配列番号２６の２２９番のＧから２５２番のＡまでに及ぶ部分を欠失しているそれらの欠失型
からなる群から選択される核酸分子を含んでなる、請求項３０に記載の核酸分子。
【請求項３２】
請求項３０または３１に定義される１種以上の核酸分子を含んでなる、プラスミドまたはウイルスベクター。
【請求項３３】
ウイルスベクターが、複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
ウイルスベクターが、Ｅ１領域の代わりに挿入された前記核酸分子を含んでなるアデノウイルスベクターである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
ウイルスベクターが、ポックスウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ポックスウイルスベクターが、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、またはワクシニアウイルスから得られる、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記ワクシニアウイルスが、改変アンカラ（ＭＶＡ）株に由来する、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分、および前記ｅｎｖ部分をコードする核酸分子を担持する、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３９】
前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分、および前記ｅｎｖ部分をコードする核酸分子の１つだけまたは２つを担持する、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４０】
（ｉ）７．５Ｋプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれた、配列番号７、８もしくは９に、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分をコードする、核酸分子を含んでなるＭＶＡベクター；
（ｉｉ）ｐＨ５ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれた、配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を含んでなるコア部分およびｅｎｖ部分をコードする核酸分子を含んでなるＭＶＡベクター；
（ｉｉｉ）Ｅ１領域の代わり挿入された、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれた核酸分子であり、配列番号７、８もしくは９に、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分をコードする核酸分子を含んでなるＥ１欠損型Ａｄベクター；および
（ｉｖ）Ｅ１領域の代わり挿入された、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれた、配列番号１８、１９もしくは２０に、または残基１で始まり残基２５１で終わる配列番号２０の部分に、または残基１で始まり残基２２１で終わる配列番号２０の部分に示されるアミノ酸配列を含んでなるコア部分およびｅｎｖ部分をコードする核酸分子を含んでなるＥ１欠損型Ａｄベクター
からなる群から選択される、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子または請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、感染性ウイルス粒子。
【請求項４２】
以下の工程：
（ａ）請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のウイルスベクターを好適な細胞系統に導入する工程、
（ｂ）該感染性ウイルス粒子の産生を可能にする好適な条件下で該細胞系統を培養する工程、
（ｃ）産生された感染性ウイルス粒子を該細胞系統の培養物から回収する工程、および
（ｄ）所望により、回収された該感染性ウイルス粒子を精製する工程
を含んでなる、請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子の製造方法。
【請求項４３】
請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子を含んでなる、宿主細胞。
【請求項４４】
請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子、または請求項４３に記載の宿主細胞と、薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる、組成物。
【請求項４５】
ヒトにおける全身適用または粘膜適用に好適な１種以上のアジュバントをさらに含んでなる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
筋肉内投与または皮下投与用に処方される、請求項４４または４５に記載の組成物。
【請求項４７】
約１０５〜約１０１３感染単位のウイルスベクターまたは感染性ウイルス粒子を含んでなる、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患もしくは病的状態の治療または予防のための薬物の製造のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクター、請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子、請求項４３に記載の宿主細胞、または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１つの使用。
【請求項４９】
慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する患者の治療を意図した薬物の製造のための、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクター、請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子、請求項４３に記載の宿主細胞、または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１つを含んでなる、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患もしくは病的状態の治療または予防に用いるための、医薬組成物。
【請求項５１】
慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療に用いるための、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
標準治療と併用される、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５３】
標準治療と併用される、請求項５０または５１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記標準治療が、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、アデホビル、ジピボキシル、およびテノホビルからなる群から選択される、サイトカインおよび／またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体を含んでなる、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
前記標準治療が、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、アデホビル、ジピボキシル、およびテノホビルからなる群から選択される、サイトカインおよび／またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体を含んでなる、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクター、請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子、請求項４３に記載の宿主細胞、または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１つを含んでなる、宿主生物においてＨＢＶに対する免疫応答を誘導または刺激するために用いるための、医薬組成物。
【請求項５７】
前記免疫応答が、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋に媒介される細胞性応答である、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ＨＢＶ感染の治療に使用するためのパーツキットであって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物、請求項３０もしくは３１に記載の核酸分子、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のベクター、請求項４１に記載の感染性ウイルス粒子、請求項４３に記載の宿主細胞、または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の組成物からなる群から選択される複数の活性物質を含んでなる、パーツキット。
【請求項５９】
請求項１および８〜２０のいずれか一項に定義されるポリメラーゼ部分をコードする核酸分子を含んでなる第１のベクターと、請求項１および２１〜２９のいずれか一項に定義されるコア部分およびｅｎｖ部分をコードする核酸分子を含んでなる第２のベクターとを含んでなる、請求項５８に記載のパーツキット。
【請求項６０】
前記第１のベクターが、請求項４０（ｉ）に定義されるＭＶＡベクターであり、前記第２のベクターが、請求項４０（ｉｉ）に定義されるＭＶＡベクターである、請求項５９に記載のパーツキット。
【請求項６１】
前記第１のベクターが、請求項４０（ｉｉｉ）に定義されるＡｄベクターであり、前記第２のベクターが、請求項４０（ｉｖ）に定義されるＡｄベクターである、請求項５９に記載のパーツキット。
【請求項６２】
免疫調節剤を発現する第３のベクターをさらに含んでなる、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載のパーツキット。
【請求項６３】
請求項１および８〜２９のいずれか一項に定義されるポリメラーゼ部分、コア部分、およびｅｎｖ部分をコードする、少なくとも２つの独立したベクターの組合せを含んでなる、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、核酸に基づくかまたはポリペプチドに基づくＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）成分を含む免疫原性組成物に関する。該免疫原性組成物は、ＨＢＶ感染およびＨＢＶ感染によって引き起こされるかまたはそれに関連する任意の病態または疾患に対する防御的または治療的効果を提供する目的で、ＨＢＶに対する免疫応答を刺激するまたは増強するために使用することができる。本発明はまた、そのようなＨＢＶ成分を発現するための発現ベクターおよびそれらの治療的または予防的使用に関する。本発明は、免疫療法の分野において、より特には、ＨＢＶに感染した患者、特に、慢性的に感染した患者の治療に極めて特に興味深い。
【発明の背景】
【０００２】
Ｂ型肝炎は重大な公衆衛生問題であり、世界では慢性的に感染している人が３５０百万人を超えており、その感染者の２０〜４０％は慢性肝疾患、肝硬変および肝細胞癌を発症する危険性がある。有効な予防ワクチンがあるにもかかわらず、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は多くの国で、先進国でもまだ蔓延しており、世界では毎年推計４．５百万の新たな感染症例が報告されている。ＷＨＯでは皆接種制度の実施を推奨しているが、予防接種フルコースの普及率は、アジアでの２５％から欧州での７５〜９０％まで様々である。現在、Ｂ型肝炎は、死因の第１０位であり（およそ１百万人死亡／年）、ＨＢＶは５番目に罹患率の高い癌である肝臓癌と関係している。ＨＢＶ感染の地理的分布は一様ではなく、西洋諸国では有病率は１％より低く、東南諸国、アフリカの大部分および南アメリカ赤道付近では１０％を上回っている。ＨＢＶ慢性保菌者高蔓延地域では、感染母体から新生児への垂直伝播が最も頻発する感染様式であり、ほとんどの場合、結果として慢性肝炎となる（症例の９０％）。この割合は、出生直後に感染乳児に予防接種することによって１５％に下げることができる。西洋諸国では、感染は、血液、精液、唾液などの体液を介して、成人期に水平伝播によって起こる可能性が最も高く、結果として、患者の８５％は急性の自己回復する感染であるが、症例の１５％は慢性感染となる。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)のメンバーであり、主に肝臓に感染し、肝細胞で複製する。感染粒子は、３種の異なる表面タンパク質（ＨＢｓ）を含む外側リポタンパク質エンベロープと、その主要な構造タンパク質がコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）である内部ヌクレオカプシドで構成されるいわゆる４２〜４５ｎｍの「デーン粒子」である。ヌクレオカプシド内部にはウイルスポリメラーゼタンパク質（Ｐ）に関連したＨＢＶゲノムの単一コピーが存在する。ＨＢＶ感染患者の血液には、４２〜４５ｎｍのビリオンの他に、感染細胞から放出されたＨＢｓＡｇおよび宿主由来の脂質からできた２０ｎｍの球状物が含まれる。これらの球状物の数はビリオンの１０４〜１０６倍である。
【０００４】
ＨＢＶゲノムは、全長マイナス鎖とより短いプラス鎖からなるおよそ３，２００ヌクレオチドの弛緩型開環状の部分的に二本鎖のＤＮＡである。ＨＢＶゲノムは、４種のオーバーラップオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、Ｃ、Ｓ、ＰおよびＸを含む。Ｃ  ＯＲＦは、コアタンパク質（またはＨＢｃＡｇ）（ＨＢＶヌクレオカプシドを構成する１８３アミノ酸長のタンパク質）と、プレコアＮ末端伸長部およびＨＢｃＡｇの一部を含むＨＢｅＡｇとして知られる、ウイルス複製中に患者の血清で見られる第２のタンパク質をコードする。コアタンパク質のＣ末端は、非常に塩基性が高く、核酸だけでなく数多くのリン酸化部位とも結合すると予測される４つのＡｒｇに富んだドメインを含む（Yu and Sommers, 1994, J. Virol. 68:2965に記載のとおり、コアのリン酸化状態は、カプシド粒子におけるコンフォメーション変化に関連している）。Ｓ  ＯＲＦは、３種の表面タンパク質をコードし、それらのタンパク質は総て同じＣ末端を有するがそれらのＮ末端では３つのインフレームＡＴＧ開始コドンが存在することによって異なっており、Ｓ  ＯＲＦはそれらの開始コドンによって３つの領域、それぞれ、Ｓ（２２６個のアミノ酸）、ｐｒｅ−Ｓ２（５５個のアミノ酸）およびｐｒｅ−Ｓ１（１０８個のアミノ酸）に分かれている。Ｌａｒｇｅ型表面抗原タンパク質（Ｌ）は、第１のＡＴＧ開始コドンでの翻訳開始後に産生され、３８９個のアミノ酸残基（ｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−Ｓ）を含む。ｍｉｄｄｌｅ型表面抗原タンパク質（Ｍ）は、第２の開始ＡＴＧから始まるＳ領域およびｐｒｅ−Ｓ２領域の翻訳から生じるのに対して、２２６個のアミノ酸からなるｓｍａｌｌ型表面抗原タンパク質（Ｓ、ＨＢｓＡｇとも呼ばれる）は、第３の開始ＡＴＧコドンから開始するＳ領域の翻訳から生じる。それらのＨＢＶ表面タンパク質は、炭水化物側鎖（グリカン）がＮ−グリコシド結合によって結合されている糖タンパク質である。Ｐ  ＯＲＦは、ウイルスポリメラーゼをコードし、Ｘ  ＯＲＦは、転写活性化因子であると考えられている、Ｘタンパク質として知られるタンパク質を含む。
【０００５】
未知の受容体によって、ビリオンが肝細胞に入ると、ヌクレオカプシドによってゲノムＨＢＶ  ＤＮＡが核に移行し、そこで、弛緩型開環状ＤＮＡが共有結合性閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変わる。ｃｃｃＤＮＡは、４種のウイルスＲＮＡの転写のための鋳型として働き、それらのウイルスＲＮＡは細胞質に輸送され、ＨＢＶタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡとして用いられる。最も長い（プレゲノム）ＲＮＡは、ＨＢＶ複製のための鋳型としても働き、細胞質においてヌクレオカプシド内で生じる。次いで、ＨＢＶ  ＤＮＡとポリメラーゼを含むカプシドのいくつかは核に再び運ばれ、そこで、カプシドは新たに作り出された弛緩型開環状ＤＮＡを放出してさらなるｃｃｃＤＮＡを形成する。半減期が肝細胞より長いことから、ｃｃｃＤＮＡは、ＨＢＶの持続に関与する。他のカプシドは、小胞体への出芽によってエンベロープに覆われ、ゴルジ複合体の通過後に分泌される。
【０００６】
効果的な抗ウイルス応答を得るためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の重要性を強調した前臨床および臨床研究は複数ある(Ferrari et al, 1990, J Immul 145:3442; Penna et al, 1996, J Clin Invest, 98:1185; Penna et al, 1997, Hepatology, 25:1022)。つまり、Ｂ型肝炎から自然に回復した患者は、Ｔヘルパー（ＴＨ）リンパ球および細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）リンパ球（末梢血で容易に検出可能である）によって媒介される多特異的で持続する応答が高かった。ウイルスペプチドを認識することによって、ＣＴＬは、ＨＢＶ複製の非細胞変性的、サイトカイン媒介性阻害を介してＨＢＶ感染細胞を治癒する能力および／またはパーフォリン−ＦａｓリガンドおよびＴＮＦαを媒介する死経路を介してそれらの細胞を死滅させる能力のいずれかを獲得する。どちらのエフェクター機能も急性Ｂ型肝炎の回復中に観察されており、この１型Ｔ細胞（Ｔｈ１）応答は臨床的回復後も持続する。その応答は、血清アラニン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの上昇やＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＭおよびＩｇＧの出現と同時に起こる場合が多い。抗ＨＢｅ抗体および抗ＨＢｓ抗体は後に現れ、良好な感染転帰を示す。ＨＢｓＡｇ特異的抗体は、中和抗体であり、感染防御免疫を媒介し、臨床的回復後も生涯続く。しかしながら、慢性ＨＢＶ感染は、免疫系ではまれにしか回復しない。これが起こった場合、ウイルスクリアランスは、免疫系による感染肝細胞の破壊によって引き起こされるＣＴＬ活性の増加とＡＬＴレベルの上昇を伴う。しかしながら、肝臓生検材料から個々のＨＢＶ特異的Ｔ細胞クローンが単離され増殖されたが、慢性的に感染した患者の大部分は、抗原に拘束された、ウイルス感染を除去するのに効果がない、弱く一時的なＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を示す。慢性Ｂ型肝炎における細胞性免疫応答のエフェクター機能のこの変化の理由は現在分かっていない。しかしながら、ウイルス量が閾値１０６ＩＵ／ｍＬより低い場合には、一部の患者において機能的Ｔ細胞応答を部分的に回復させることができることが示された(Webster et al 2004, J. Virol. 78:5707)。これらのデータは、明らかに有望であり、効果的なＴ細胞応答を誘導することが可能な免疫調節戦略の必要性を強調している。
【０００７】
理想的には、慢性ウイルス性Ｂ型肝炎の治療は、そのウイルスを除去し、肝硬変または肝臓癌への疾患進行を予防し、患者の生存を改善するために、まず、回復不能な肝臓損傷の前にＨＢＶ複製を抑制することを可能にすることであろう。慢性Ｂ型肝炎の従来の治療には、ペグ化インターフェロンα（ＩＦＮａ）およびヌクレオシド／ヌクレオチド類似体（ＮＵＣ）（ラミブジンなど）があり、ごく最近では、エンテカビル、テルビブジン、アデホビルおよびテノホビルがある（ＥＡＳＬ診療ガイドライン：慢性Ｂ型肝炎管理、２００９年(EASL Clinical Practice Guidelines: management of chronic hepatitis B, 2009)）。ＩＦ  Ｎａは、ウイルスの複製を阻害する強力な抗ウイルス分子であるが、しかしながら、重篤な副作用を引き起こすのは患者の２５〜３０％にすぎない。ＮＵＣは、プレゲノムＲＮＡのマイナス鎖ＤＮＡへ、さらに二本鎖ウイルスＤＮＡへの逆転写を阻害することを目的とするＨＢＶポリメラーゼの競合的阻害剤として作用する。ＮＵＣは、新たなビリオンの形成を制限するが、新たな子孫ウイルスの源である感染肝細胞の核内に潜在するスーパーコイルｃｃｃＤＮＡの除去には効果がない。これにより、ＮＵＣの有効性が一時的であり、治療中止直後にウイルスリバウンドが起こり、患者は生涯にわたって治療を受ける必要がある理由を説明することができる。加えて、長期有効性も、耐性のあるＨＢＶ変異株の出現(Leung et al., 2001, Hepatology 33:1527において議論されているように、ラミブジン治療については１年経過すると２４％を上回り、４年経過するとおよそ６６％）により制限されるが、最新のＮＵＣ（エンテカビル、テルビブジンおよびテノホビル）では、薬物耐性のあるＨＢＶ変異株の発生はずっと少なく、ＨＢＶ  ＤＮＡの抑制は増大した。しかしながら、これらの新薬に関する長期治療データはわずかであり、このように有効性がより高いことは、ＨＢｓ−セロコンバージョン率が有意に高いこととは相関していなかった。
【０００８】
抗ウイルス療法の他にも、現在、宿主の免疫応答の改善を目的とする補助療法、具体的には、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球によって媒介されるものを開発するために努力がなされている。既存の免疫療法アプローチの大部分は、ＨＢＶ表面タンパク質、Ｓ  ｐｒｅＳ１および／またはｐｒｅＳ２の使用に集中していた(Smith et al., 1983, Nature 302:490; Lubeck et al., 1989, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 :6763 ; Adkins et al., 1998, BioDrugs 10:137; Loirat et al., 2000, J. Immunol. 165:4748; Funuy-Ren et al. 2003, J. Med. Virol, 71:376; Kasaks et al., 2004, J. Gen. Virol. 85:2665; Xiangming Li et al., 2005, Intern. Immunol. 17:1293; Mancini-Bourguine et al., 2006, Vaccine 24:4482; Vandepapeliere et al., 2007, Vaccine 25:8585)。少なくとも免疫応答の刺激に関連して有望な結果が得られた。例えば、Mancini-Bourguine et al. (2006, Vaccine 24:4482)には、ｐｒｅＳ２−ＳコードＤＮＡワクチンを注射したＨＢＶ慢性感染患者におけるＴ細胞応答の誘導および／または再現が報告されており、このことは、免疫系がこれらの患者においてまだ効力を発揮しているということを十分に示している。
【０００９】
ＨＢｃＡｇはまた、免疫原(Yi-Ping Xing et al., 2005, World J, Gastro. 11:4583)としてだけでなく表面上に外来エピトープを担持しているキメラＨＢｃＡｇカプシド（ＷＯ９２／１１３６８；ＷＯ００／３２６２５；Koletzki et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:2049）としても使用された。免疫原性の観点からエピトープを挿入するために最も有望な位置は、８０番付近のＨＢｃＡｇの表面上の存在すると予測される外側ループ部位であると思われる(Argos et al. 1988, EMBO J. 7:819)。Schodel et al. (1992, J. Virol. 66:106)、Borisova et al. (1993, J. Virol. 67:3696)は、ｐｒｅＳ１およびＨＢｓＡｇエピトープをこの領域に挿入することができ、キメラ粒子により成功した免疫誘導を報告した。
【００１０】
複数のＨＢＶ抗原を同時に標的とすることを目的とした多価ワクチン候補もまた、調査されてきた。特に、エンベロープタンパク質、コアタンパク質およびポリメラーゼタンパク質に存在する複数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープおよびヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープの融合ポリペプチドをコードするポリエピトープＤＮＡワクチンは、前臨床マウスモデルにおいて複数のＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答を引き出すことが示されている(Depla et al., 2008, J. Virol. 82:435)。ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＨＢＶポリメラーゼをコードするＤＮＡプラスミドの混合物の基づくワクチン処方物がいくつか開発され（ＷＯ２００５／０５６０５１；ＷＯ２００８／０２０６５６）、それらの処方物は、慢性Ｂ型肝炎のトランスジェニックマウスモデルにおいて特異的な抗ＨＢＶ細胞性応答および体液性応答を明らかに示した(Chae Young Kim et al., 2008, Exp. Mol. Medicine 40:669)。第１相臨床試験は、韓国においてＨＢＶ保菌者でラミブジン治療との併用で開始された(Yang et al., 2006, Gene Ther. 13:1110)。
【００１１】
従って、より強くかつ効果的に免疫応答、特に、細胞性免疫応答をＨＢＶ慢性感染患者などのそれを必要とする個体において誘導するための代替免疫治療アプローチの必要性がなお存在する。さらに、安定かつ持続的にＨＢＶ抗原を発現することが可能なベクターに基づく組成物を提供する必要性がある。
【００１２】
この技術的問題は、特許請求の範囲に定義される実施形態が提供されることによって解決される。
本発明の他の態様、特徴および利点ならびにさらなる態様、特徴および利点は、本発明の現在の好ましい実施形態についての次の説明から明らかとなる。これらの実施形態は開示を目的として示している。
【発明の概要】
【００１３】
従って、第１の態様において、本発明は、少なくとも１つのポリペプチドまたは該少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を含んでなる免疫原性組成物であって、前記少なくとも１つのポリペプチドが、
（ｉ）第１のＨＢＶウイルスに由来するポリメラーゼタンパク質の少なくとも４５０個のアミノ酸残基を含んでなるポリメラーゼ部分；
（ｉｉ）第２のＨＢＶウイルスに由来するコアタンパク質の少なくとも１００個のアミノ酸残基を含んでなるコア部分；および
（ｉｉｉ）第３のＨＢＶウイルスに由来するＨＢｓＡｇタンパク質の連続した１５〜１００個のアミノ酸残基の１以上の免疫原性ドメインを含んでなるｅｎｖ分；または
該ポリメラーゼ部分、該コア部分、該ｅｎｖ部分、該ポリメラーゼ部分をコードする該核酸分子、該コア部分をコードする該核酸分子および／または該ｅｎｖ部分をコードする該核酸分子の任意の組合せ
からなる群から選択される、免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
定義
本出願全体を通じて本明細書において用いられるように、「１つの(a)」および「１つの(an)」とは、特に断りがない限り、それらの用語が「少なくとも１つ」、「少なくとも最初」、「１つ以上」または「複数」の参照される化合物または工程を意味するという意味で用いられる。例えば、「１つの細胞(a cell)」という用語は、複数の細胞を含み、その混合物を含む。
【００１５】
「および／または」とは、本明細書において用いられる場合には必ず、「および」、「または」および「該用語によってつながれる要素の総てまたは任意の他の組合せ」の意味を含む。
【００１６】
本明細書において用いられる「約」または「およそ」とは、所定の値または範囲の１０％以内、好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００１７】
本明細書において、生成物、組成物および方法を定義するために用いられる場合には、「含んでなる(comprising)」（および含んでなる(comprising)の任意の形態、「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprises)」など）、「有する(having)」（および有する(having)の任意の形態、「有する(have)」および「有する(has)」など）、「含む(including)」（および含む(including)の任意の形態、「含む（includes）」および「含む(include)」など）または「含む(containing)」（および含む(containing)の任意の形態、「含む(contains)」および「含む(contain)」など）とは、オープンエンドであり、追加の、記載されていない要素または方法工程を排除しない。「から本質的になる」は、本質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味する。よって、記載された成分から本質的になる組成物は、微量の汚染物および薬学上許容されるビヒクルを排除するものでない。「からなる」は、他の成分または工程の微量とはいえない量の要素を排除することを意味する。例えば、ポリペプチドが記載されたアミノ酸配列の他にアミノ酸を含まない場合には、該ポリペプチドは該アミノ酸配列「からなる」。そのようなアミノ酸配列が最終的にほんの数個の追加アミノ酸残基とともに存在する場合には、該ポリペプチドは該アミノ酸配列「から本質的になる」。アミノ酸配列がポリペプチドの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合には、該ポリペプチドは該アミノ酸配列を「含んでなる」。そのようなポリペプチドは、数個〜数百個までの追加アミノ酸残基を有していてよい。
【００１８】
「アミノ酸」、「残基」および「アミノ酸残基」という用語は、同義語であり、天然アミノ酸だけでなくアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、合成アミノ酸および改変アミノ酸、Ｄ型またはＬ型光学異性体を含む）も包含する。
【００１９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、ペプチド結合によって結合された９個以上のアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基のポリマーを言及するために本明細書において互換的に用いられる。そのポリマーは、線状、分岐状または環状であり、天然に存在するものおよび／またはアミノ酸類似体を含んでなってよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。一般的には、そのアミノ酸ポリマーが長い（例えば、５０個より多いアミノ酸残基）場合には、好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれ、一方、５０個のアミノ酸より多いまたは少ない場合には、「ペプチド」と呼ばれる。
【００２０】
本発明に関連して、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」とは、互換的に用いられ、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離ＤＮＡ、プローブ、プライマーおよびそれらの任意の混合物）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）分子（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）またはポリリボヌクレオチド・ポリデオキシリボヌクレオチド混合物のいずれかの任意の長さのポリマーを定義する。それらは、一本鎖または二本鎖、線状または環状、天然または合成のポリヌクレオチドを包含する。さらに、ポリヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含んでなってよく（改変の例としては、米国特許第５，５２５，７１１号、同第４，７１１，９５５号またはＥＰＡ３０２１７５参照）、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。存在する場合には、ヌクレオチドに対する改変は、重合の前または後に行われ得る。
【００２１】
本明細書において、「免疫原性組成物」とは、下に記載される１種、２種、３種、４種またはそれ以上の成分（例えば、前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分、前記ｅｎｖ部分、前記ポリメラーゼ部分をコードする核酸分子、前記コア部分をコードする核酸分子および／または前記ｅｎｖ部分をコードする核酸分子）と、所望により、他の成分（例えば、アジュバント、担体、希釈剤など）を含んでなる処方物を意味する。本発明の免疫原性組成物は、一般には、宿主生物に投与することが可能な形態のものであり、抗ＨＢＶ免疫を誘導するまたは刺激するのに十分な防御的または治療的免疫応答を誘導し、結果として、治療上の利益をもたらす（例えば、ＨＢＶ感染を予防する、ＨＢＶ感染によって引き起こされるかまたはそれに関連する少なくとも１つの病態を軽減するおよび／または改善する（例えば、ウイルス量を減らす、肝硬変または肝臓癌などの肝臓病変の危険性を減らすまたは遅らせる、肝臓病歴を改善するなど）、および／または血清ＨＢｅＡｇレベルまたはＨＢｓＡｇレベルまたは両方を下げる、および／またはＨＢｅ血清変換、ＨＢｓ血清変換または両方を誘導するおよび／または別の抗ＨＢＶ療法または予防の有効性を高めるなど）。宿主生物に導入することによって、本発明の免疫原性組成物は、限定されるものではないが、抗体および／またはサイトカインの産生および／または細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞の活性化を含む免疫応答を引き起こすことが可能であり、少なくとも１つのＨＢＶ抗原／エピトープに対する先天性免疫応答および／または特異的体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の産生に至る。
【００２２】
「免疫原性ドメイン」とは、抗体またはＴ細胞受容体が結合可能なＨＢＶタンパク質構造部分を意味する。一般には、そのような免疫原性ドメインは、１以上のＢエピトープおよび／またはＴエピトープ、特に、ＣＴＬエピトープまたはＴＨエピトープまたは両方を含み、特定の抗体による認識、またはＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）に関しては、Ｔ細胞受容体による認識に関与する。「エピトープ」は、全体として、抗体、Ｔ細胞受容体またはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する最小のペプチドモチーフ（通常、９〜１１個のアミノ酸残基のセット）に相当する。それらの残基は、連続したものであってよく（線状エピトープ）またはそうでなくてもよい（互いに直接隣接しない残基を含む立体構造エピトープ）。Ｔ細胞によるＴ細胞エピトープの認識は、一般的に、抗原提示細胞で発現されるクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子と結合された抗原のペプチドフラグメントをＴ細胞が認識する機構によると考えられている。
【００２３】
本明細書において、「ＨＢＶ」および「Ｂ型肝炎ウイルス」は互換的に用いられ、ヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す（例えば、Ganem and Schneider in Hepadnaviridae (2001) "The viruses and their replication" (pp2923-2969), Knipe DM et al.編 Fields Virology, 第４版. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkinsまたは後続の版参照）。広範囲にわたる系統発生解析によって、Ｂ型肝炎ウイルスは８種の主要遺伝子型（Ａ〜Ｈ）に分類されており、それらの遺伝子型は少なくとも８％まで配列分岐を示す。それぞれのＨＢＶ遺伝子型は特異な地理的分布を示し、異質の病徴および／または臨床転帰を示し得る。それぞれのＨＢＶは、ＨＢｓＡｇ関連血清学に関連して９種の異なるサブタイプ（ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ＋およびａｄｑｒ−）に分類された（Mamum-Al Mahtab et al., 2008, Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5:457; Schaeffer, 2007, World Gastroenterol. 7:14; Norder et al., 1993, J. Gen Virol. 74:1341による総説参照）。各遺伝子型および血清型は、異なるＨＢＶ系統および分離株を包含している。分離株は、特定ＨＢＶ源(例えば、患者サンプルまたは他の生物学的ＨＢＶリザーバー)から単離された特異的なウイルスに相当するが、系統は、ゲノム配列に関して互いに非常に近い種々の分離株を包含している。
【００２４】
本発明に関連しての使用に適した複数のＨＢＶは、当技術分野において記載されており、特に、Ｇｅｎｂａｎｋに存在する。遺伝子型Ａの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＨＢ−ＪＩ４４４ＡＦおよび系統ＨＢ−ＪＩ４４４Ａ（受託番号ＡＰ００７２６３）が挙げられる。遺伝子型Ｂの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、クローンｐＪＤＷ２３３（受託番号Ｄ００３２９）、分離株ＨＢＶ／１４６１１（受託番号ＡＦ１２１２４３）、２００１年にHou, et al. によって同定されたＨＢＶ−Ｂ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２８２９１７．１）、Zhang et al.によって同定されたＨＢＶ系統Ｗｈｕｔｊ−３７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９３３３０９．１）(2005, Arch, Virol. 150, 721-741)、He et al.によって同定されたＣｈｉｎｅｓｅ  ＨＢＶ系統ＧＤＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７６６４６３．１）およびJiang et al.によって同定されたＨＢＶ分離株５７−１サブタイプａｄｗ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５１８５５６．１）が挙げられる。遺伝子型Ｃの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＡＨ−１−ＯＮ９８０４２４（受託番号ＡＢ１１３８７９）、系統ＨＣＣ−３−ＴＴ（受託番号ＡＢ１１３８７７）、Fang et al.によって同定されたＨＢＶ分離株ＳＷＴ３．３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ９１６２４１．１）、Zhu et al.によって同定されたＨＢＶ分離株Ｈ８５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３０６１３６．１）、Tu et al.によって同定されたＨＢＶ系統Ｃ１２４８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ９７５２７２．１）、Wang et al.によって同定されたＨＢＶ分離株ＣＨＮ−Ｈ１５５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４７８９０１．１）(2007, J. Viral Hepat 14, 426-434)およびZhou et al.によって同定されたＨＢＶ分離株ＧＺ２８−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ６８８０６２）が挙げられる。遺伝子型Ｄの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＫＡＭＣＨＡＴＫＡ２７（受託番号ＡＢ１８８２４３）、ＡＬＴＡＹ１３６（受託番号ＡＢ１８８２４５）およびStoll-Becker et al. (1997, J. Virol 71:5399)に記載されている、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受託番号Ｙ０７５８７で入手可能なＹ０７５８７ならびに受託番号ＡＢ２６７０９０で記載されているＨＢＶ分離株が挙げられる。遺伝子型Ｅの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＨＢ−ＪＩ４１１Ｆおよび系統ＨＢ−ＪＩ４１１（受託番号ＡＰ００７２６２）が挙げられる。遺伝子型Ｆの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＨＢＶ−ＢＬ５９７（受託番号ＡＢ２１４５１６）およびＨＢＶ−ＢＬ５９２（受託番号ＡＢ１６６８５０）が挙げられる。遺伝子型Ｇの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＨＢ−ＪＩ４４４ＧＦおよび系統ＨＢ−ＪＩ４４４Ｇ（受託番号ＡＰ００７２６４）が挙げられる。遺伝子型Ｈの典型的なＨＢＶとしては、限定されるものではないが、分離株ＨＢＶ  ＳＴ０４０４（受託番号ＡＢ２９８３６２）および分離株ＨＢ−ＪＴ２６０Ｆおよび系統ＨＢ−ＪＩ２６０（受託番号ＡＰ００７２６１）が挙げられる。しかしながら、本発明はこれらの典型的なＨＢＶに限定されない。実際には、ヌクレオチド配列および���ミノ酸配列は、異なるＨＢＶ分離株および遺伝子型の間で様々であり、この自然遺伝的変異だけでなく非自然改変（下に記載されるものなど）も本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
本明細書において、「天然ＨＢＶタンパク質」とは、自然界においてＨＢＶ源から見出され、単離され、得られ得る、研究室で人によって人工的に改変されたまたは改変されたものとは異なる、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、前記ポリメラーゼタンパク質、前記コアタンパク質または前記ＨＢｓＡｇなど）を意味する。よって、この用語は、特に断りのない限り、天然に存在するＨＢＶタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。自然界におけるそのようなＨＢＶ源としては、感染したまたはＨＢＶに曝されたことのある対象から採取された生体サンプル（例えば、血液、血漿、血清、精液、唾液、組織切片、生検材料など）、培養細胞（例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｕＨ６−Ｃ１５(Sureau et al., 1986, Cell 47:37; Sells et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84(4):1005)；ＨｕＨ７．ＴＡ６１またはＨｕＨ７．ＴＡ６２(Sun et al., 2006, J Hepatol. 45(5):636)、組織培養物ならびに組換え材料が挙げられる。組換え材料としては、限定されるものではないが、ＨＢＶ分離株（例えば、寄託機関で入手可能）、ＨＢＶゲノム、ゲノムＲＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、ＨＢＶゲノムまたはそのフラグメントを含むプラスミドまたはそのような要素を含むことが知られている任意の従来技術のベクターが挙げられる。
【００２６】
様々なＨＢＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、専門データバンク(例えば、上述のもの)や文献（例えば、Valenzuela et al, 1980, The nucleotide sequence of the hepatitis B viral genome and the identification of the major viral genes (pp57-70) in "Animal Virus Genetics"; B. Fields, et al. 編; Academic Press Inc., New York and Vaudin et al., 1988, J. Gen. Virol. 69: 1383参照）に見出すことができる。天然のポリメラーゼポリペプチド、コアポリペプチドおよびＨＢｓＡｇポリペプチドの代表例は、それぞれ、配列番号１〜３に示される（配列番号１は、ＨＢＶ分離株Ｙ０７５８７の天然ポリメラーゼタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号２は、ＨＢＶ分離株Ｙ０７５８７の天然コアタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号３は、ＨＢＶ分離株Ｙ０７５８７の天然ｅｎｖ（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸配列を示す）。Ｙ０７５８７  ＨＢＶの天然のポリメラーゼ、コアおよびＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列は、例示を目的として、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される。しかしながら、上述のように、ＨＢＶタンパク質はこれらの典型的な配列に限定されず、遺伝的変異は本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
本明細書において、「部分」（例えば、ポリメラーゼ部分、コア部分および／またはｅｎｖ部分）とは、本明細書において記載されるように研究室で人によって人工的に改変されたまたは変更された後、天然のＨＢＶタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドから生じるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを意味する。「改変された」という用語は、１個以上のヌクレオチド／アミノ酸残基の欠失、置換または付加、これらの可能性の任意の組合せ（例えば、本発明の組成物によってコードされるＨＢＶ配列間の相同性を下げるための天然ヌクレオチド配列の変性、適当な制限部位の導入）ならびに非自然配置（例えば、２種以上のＨＢＶタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたは部分／部分群の間の融合）を包含する。いくつかの改変が考えられる場合には、それらの改変は連続した残基および／または連続していない残基に関係し得る。改変は、当業者に公知の複数の方法（例えば、部位特異的突然変異誘発（例えば、Amersham (Les Ullis, France)のＳｃｕｌｐｔｏｒ（商標）in vitro突然変異誘発システムを使用する）、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングなど）によっておよび化学合成技術（例えば、結果として合成核酸分子が得られる）によって起こすことができる。本発明によって考えられる改変は、コードされるＨＢＶポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないサイレント改変、ならびにコードされたポリペプチドに翻訳され、結果として、対応する天然配列と比べて改変されたアミノ酸配列をもたらす改変を包含する。「由来する」とは、分子の起源を特定するために用いられるが、分子を得る方法を限定するものではなく、例えば、化学合成手段または組換え手段でもよい。
【００２８】
好ましくは、本発明において使用されるＨＢＶ部分は各々、全長タンパク質またはその部分のいずれかと比べて、対応する天然ＨＢＶタンパク質と高度のアミノ酸配列同一性を保持する。２つのポリペプチド間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数であり、最適アライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。アミノ酸配列間の同一性の割合を決定するために、当技術分野では、様々なコンピュータープログラムおよび数学アルゴリズムが利用可能であり、例えば、ＮＣＢＩで利用可能なＢｌａｓｔプログラム（例えば、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389; Altschul et al., 2005, FEBS J. 272:5101）などがある。同じことがヌクレオチド配列にも当てはまる。ヌクレオチド配列相同性を決定するためのプログラムも、専門データベース（ＧｅｎｂａｎｋまたはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）において利用可能であり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＧＡＰプログラムがある。
【００２９】
例えば、下に記載される改変（例えば、酵素活性の低下など）に加えて、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされるＨＢＶ部分のいずれかまたは総ては、特定の遺伝子型の代表であるように改変することができ、その結果、コンセンサスまたはニアコンセンサス配列(near consensus sequence)に相当するアミノ酸配列を含んでなる。コンセンサスまたはニアコンセンサス配列は、特定の遺伝子型の様々なＨＢＶポリペプチドの配列アラインメント後に一般に決定される。
【００３０】
本明細書において「組合せ」とは、本発明の免疫原性組成物に含まれるまたは本発明の免疫原性組成物によってコードされる成分の少なくとも２種と、様々な成分の起こり得るあらゆる配置とのあらゆる種類の組合せを指し、前記成分の２種または３種の場合が特に好ましい。これは、２つ以上のポリペプチドの混合物、２つ以上の核酸分子／ベクターの混合物、１つ以上のポリペプチドと１つ以上の核酸分子／ベクターの混合物、ならびに２つ以上の核酸分子の融合物を包含し、２以上のＨＢＶ部分を担持する単一ポリペプチド鎖を提供する（例えば、非自然配置）。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分、前記ｅｎｖ部分の少なくとも２つの組合せ、または前記ポリメラーゼ部分をコードする前記核酸分子、前記コア部分をコードする前記核酸分子および／または前記ｅｎｖ部分をコードする前記核酸分子の少なくとも２つの組合せを含んでなる。本発明の特に好ましい組成物は、（ｉ）本明細書において定義されるポリメラーゼ部分およびコア部分の組合せ、または前記ポリメラーゼ部分および前記コア部分をコードする核酸分子の組合せを含んでなる組成物；（ｉｉ）本明細書において定義されるコア部分およびｅｎｖ部分の組合せまたは前記コア部分および前記ｅｎｖ部分をコードする核酸分子の組合せを含んでなる組成物；および（ｉｉｉ）本明細書において定義されるポリメラーゼ部分、コア部分およびｅｎｖ部分の組合せ、または前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分および前記エンベロープ部分をコードする核酸分子の組合せを含んでなる組成物からなる群から選択される。
【００３２】
本明細書において「融合物」または「融合タンパク質」とは、単一ポリペプチド鎖での少なくとも２つのポリペプチド（またはそれらのフラグメント）の相互の組合せを意味する。好ましくは、様々なポリペプチド間の融合は、遺伝学的手段によって、すなわち、前記ポリペプチド各々をコードするヌクレオチド配列をインフレームで融合することによって行われる。「インフレームで融合される」とは、融合されたコード配列の発現によって、融合されたポリペプチドの各々の間に翻訳ターミネーターが存在しない単一タンパク質が生じるということを意味する。融合は、直接であっても（すなわち、間に追加のアミノ酸残基が存在しない）またはリンカーを通じてでもよい。リンカーが存在することによって、融合タンパク質の正確な形成、折りたたみおよび／または機能を容易にすることができる。本発明は、使用されるリンカー配列の形態、サイズまたは数によって制限されず、融合されるポリペプチド間の接合部にリンカー配列の複数のコピーを挿入することができる。本発明に従って好適なリンカーは、３〜３０個のアミノ酸長であり、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アラニンおよび／またはプロリンなどのアミノ酸残基の反復から構成され（例えば、Wiederrecht et al., 1988, Cell 54, 841; Aumailly et al., 1990 FEBS Lett. 262, 82; およびDekker et al., 1993, Nature 362, 852参照）、例えば、Ser-Gly-SerまたはGly-Ser-Gly-Ser-Glyリンカーである。
【００３３】
本明細書において、「異種の疎水性配列」とは、疎水性のペプチド（Ｖａｌ残基、Ｌｅｕ残基、Ｉｌｅ残基、Ｍｅｔ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基およびＴｒｐ残基などの多数の疎水性アミノ酸残基を含むペプチド）を意味する。「異種の」とは、選択されるＨＢＶ部分の起源である天然のＨＢＶタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドにとって異質である配列を意味する。それは、ＨＢＶウイルスにとって異質であるペプチド（例えば、麻疹ウイルスまたは狂犬病ウイルスのペプチド）またはウイルスゲノム内では通常見られない位置にあるＨＢＶウイルスのペプチドとすることができる。異種疎水性配列は、Ｎ末端において、Ｃ末端においてまたはＨＢＶ部分内でインフレームで融合することができ、その配列によって、特に、ポリペプチド輸送に影響を与えたり、ポリペプチド生産または精製を容易にしたり、半減期を延長したりする場合がある。本発明による好適な異種疎水性配列は、１５〜１００個のアミノ酸長であり、高疎水性ドメインを含む。
【００３４】
本明細書において「ベクター」とは、発現ベクターおよび非発現ベクターの両方を意味し、ウイルスベクターならびに非ウイルスベクターを含む（染色体外ベクター（例えば、多コピープラスミド）および宿主染色体中に組み込まれるように設計された組込みベクター）を含む）。本発明に関連して特に重要なのは、核酸分子をウイルスゲノム中に移入するためのベクター（いわゆるトランスファーベクター）、免疫療法で使用するベクター（すなわち、核酸分子を宿主生物に送達することが可能なベクター）ならびに様々な発現系または宿主生物において使用する発現ベクターである。
【００３５】
本明細書において、「ウイルスベクター」とは、ベクターＤＮＡならびにそれから生成されたウイルス粒子を包含する。ウイルスベクターは、複製能を有するものであってよく、または複製欠損もしくは複製障害であるように遺伝的に障害があってもよい。本明細書において用いられる「複製能を有する」とは、特定の宿主細胞（例えば、腫瘍細胞）においてより良好にまたは選択的に複製するように操作された複製選択的ウイルスベクターおよび制限増殖型ウイルスベクターを包含する。
【００３６】
本明細書において、「調節配列」とは、所定の宿主細胞または生物体における核酸分子の発現（複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または核酸またはその誘導体の１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の宿主細胞または生物体への輸送を含む）を可能にする、寄与するまたは調整する任意の配列を意味する。
【００３７】
本明細書において、「宿主細胞」とは、組織、器官または単離細胞における特定の組織化に関して何ら制限されることなく広く理解すべきである。そのような細胞は、独特の細胞型のものまたは異なる細胞型の一群のものであってよく、細菌、下等真核細胞および高等真核細胞ならびに培養細胞株、初代細胞および増殖細胞を包含する。この用語は、本発明の組成物、核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子のレシピエントであり得るまたはそのようなレシピエントであったことがある細胞およびそのような細胞の子孫を含む。
【００３８】
「宿主生物」とは、脊椎動物、特に、哺乳類種のメンバー、特に、家畜、農用動物、競技用動物、および霊長類（ヒトを含む）を意味する。好ましくは、宿主生物は、慢性ＨＢＶ感染を患っている患者である。感染ＨＢＶは、本発明において使用される、第１のＨＢＶ、第２のＨＢＶまたは第３のＨＢＶの少なくとも１つと同じ遺伝子型または血清型のものであってよい。
【００３９】
本明細書において、「単離された」とは、自然環境から取り出された（すなわち、本来会合している少なくとも１つの他の成分から分離された）、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、宿主細胞またはウイルスを意味する。
【００４０】
本明細書において、「治療上有効な量」とは、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染によって引き起こされるかまたはそれに関連する任意の疾患または病態に通常伴う１以上の症状の緩和に十分な用量である。予防的使用に関する場合には、この用語は、ＨＢＶ感染の確立を妨げるまたは遅らせるのに十分な用量を意味する。「治療」組成物は、前記ＨＢＶ感染によって引き起こされるかまたはそれに関連する少なくとも１つの疾患または状態を軽減するまたは改善することを目的として、最終的には、本明細書において記載されるように１以上の従来の治療法（例えば、ヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体での処置）と組み合わせて、設計され、ＨＢＶにすでに感染している宿主生物に投与される。例えば、免疫応答を誘導するために治療上有効な量は、免疫系の活性化を引き起こす（例えば、結果として抗ＨＢＶ応答を進行させる）ために必要な量であり得る。「癌」とは、びまん性または限局性腫瘍、転移、癌性ポリープならびに前癌病変（例えば、肝硬変）を含む任意の癌性状態を包含する。
【００４１】
本明細書において、「薬学上許容されるビヒクル」とは、医薬投与に適合する、あらゆる担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、および吸収遅延剤などを含むものとする。
【００４２】
本発明に従って、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされる、前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分および／または前記ｅｎｖ部分は、独立に、現在のところ確認されている任意のＨＢＶ遺伝子型、系統または分離株（用語「ＨＢＶ」に関連して上に記載されたものなど）から生じ得るものである。さらに、そのポリメラーゼ部分、コア部分およびｅｎｖ部分の各々は、天然の対応するＨＢＶタンパク質からまたは改変ＨＢＶポリペプチド（例えば、特定の遺伝子型の代表であるように改変されたもの）から生じ得るものである。よって、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされる、ポリメラーゼ部分、コア部分およびｅｎｖ部分の起源である第１のＨＢＶウイルス、第２のＨＢＶウイルスおよび第３のＨＢＶウイルスは、独立に、同じまたは異なる遺伝子型、血清型および／または分離株のものであってよい。例えば、２つまたは３つの異なるＨＢＶ遺伝子型由来のＨＢＶ部分を使用することによって広範囲のＨＢＶ遺伝子型に対して防御を提供することが可能である。
【００４３】
一実施形態では、この地域に固有のＨＢＶ遺伝子型の少なくとも１つのＨＢＶ部分を使用することによって、本発明の免疫原性組成物を特定の地理的領域に適合させることにも注目することができる。例示を目的として、米国では遺伝子型ＡおよびＣが最も多いが、一方で、西欧諸国の患者は遺伝子型ＡおよびＤに大半が感染し、地中海沿岸の患者は遺伝子型Ｄに感染する。インドの限られたデータからは、インドでは遺伝子型ＡおよびＤが最も一般的であることが示唆される。もう一方で、中国では遺伝子型ＢおよびＣが最も多い。例えば、欧州諸国に向けられる本発明の組成物は、遺伝子型Ａ由来のポリメラーゼ部分と遺伝子型Ｄ由来のコア部分およびｅｎｖ部分を含んでなることができ、逆もまた同じである。あるいは、そのポリメラーゼ部分およびコア部分は遺伝子型Ａのものであってよく、ｅｎｖ部分は遺伝子型Ｄのものであってよい。別の例として、欧州諸国およびＵＳＡに向けられる本発明の組成物は、独立に、遺伝子型Ａ、ＣおよびＤを由来とする、ポリメラーゼ部分、コア部分およびｅｎｖ部分を含んでなることができる。もう一方で、中国に向けられる本発明の組成物は、独立に、遺伝子型Ｂおよび／またはＣを由来とする、ポリメラーゼ部分、コア部分およびｅｎｖ部分を含んでなることができる、またはコードすることができる。
【００４４】
また、本発明の免疫原性組成物は、治療しようとする患者の集団に適合させることもできる。例えば、アメリカ系白人およびアフリカ系アメリカ人および性行為ＨＢＶ感染を有する人の間では遺伝子型Ａがより一般的であるが、もう一方で、アジア系アメリカ人、アジアで生まれた患者およびＨＢＶ感染母系新生児伝播を受けた人の間では遺伝子型ＢおよびＣが一般的である。ＨＢＶ遺伝子型はまた、異なる臨床転帰にも関連しており(Schaeffer et al., 2005, J. Viral. Hepatitis 12:111)、遺伝子型ＤおよびＦは遺伝子型Ａよりも重篤な疾患進行および不良な予後に関連している(Sanchez-Tapias et al., 2002, Gastroenterology 123:1848)。適当なＨＢＶ遺伝子型、血清型、系統および／または分離株を選択することによって、治療しようとする集団および／または地理的領域に応じて本発明の組成物を適合させることは、当業者の能力の範囲内である。
【００４５】
有利な実施形態によれば、第１のＨＢＶウイルス、第２のＨＢＶウイルスおよび第３のＨＢＶウイルスの少なくとも２つ、好ましくは総てが、同じＨＢＶ遺伝子型、特に遺伝子型Ｄのものである。独立して、それらは同じ分離株を起源とするものであってよく、第１のＨＢＶウイルス、第２のＨＢＶウイルスおよび第３のＨＢＶウイルスがＨＢＶ分離株Ｙ０７５８７のものであることが特に好ましい。好ましくは、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、配列番号１に示されるアミノ酸配列または少なくとも４５０個のアミノ酸残基を含んでなるその部分と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。あるいはまたは組み合わせて、本発明において使用されるコア部分は、配列番号２に示されるアミノ酸配列または少なくとも１００個のアミノ酸残基を含んでなるその部分と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。あるいはまたは組み合わせて、本発明において使用されるｅｎｖ部分の１以上の免疫原性ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列内の１５〜１００個のアミノ酸残基からなる部分と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。
【００４６】
ポリメラーゼ部分
一実施形態によれば、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされるポリメラーゼ部分は、対応する天然ＨＢＶポリメラーゼと比べて改変されている。
【００４７】
適当な改変は、天然ＨＢＶポリメラーゼのＮ末端に通常存在する、少なくとも２０個のアミノ酸残基、多くとも３３５個のアミノ酸残基の末端切断である。この改変は、ポリメラーゼ部分とコア部分の間のオーバーラップ部分を減少させるまたは欠失させるために第２のポリペプチドも含んでなる本発明の組成物に特に関連する。本発明の組成物への末端切断を記載された範囲内、少なくとも２０個のアミノ酸残基、多くとも３３５個のアミノ酸残基に適合させることは、当業者の能力の範囲内である。天然ＨＢＶポリメラーゼに対して、本発明に関連して使用されるポリメラーゼ部分は、有利には、少なくとも３０個のアミノ酸残基、多くとも２００個のアミノ酸残基だけ、望ましくは少なくとも３５個のアミノ酸残基、多くとも１００個のアミノ酸残基だけ、好ましくは少なくとも４０個のアミノ酸残基、多くとも６０個のアミノ酸残基だけ、より好ましくは少なくとも４５個、多くとも５０個のアミノ酸残基だけ末端切断されており、末端切断部が、天然ＨＢＶポリメラーゼのＮ末端に位置する開始Ｍｅｔ残基に続いて、最初の４７個または４６個のアミノ酸残基を含むことが特に好ましい。好ましくは、末端切断部は、配列番号１の１番（Ｍｅｔ開始部）または２番〜４７番まで及ぶ。
【００４８】
好ましい実施形態は、およそ４８番〜およそ８３２番まで及ぶ配列番号１に示されるアミノ酸配列の部分と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分；さらに好ましくは、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分に関する。
【００４９】
あるいはまたは組み合わせて、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、天然ＨＢＶポリメラーゼに対して、低下した逆転写酵素（ＲＴアーゼ）活性を示すように改変されている。有利には、前記ＲＴアーゼ活性低下は、ＲＴアーゼ酵素活性に関与するドメイン中に１つ以上の突然変異が存在することによってもたらされる。
【００５０】
ＨＢＶポリメラーゼの構造的および機能的組織化は、２０年ほど前に調査された（例えば、Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613参照）。ＨＢＶポリメラーゼは、ＨＢＶ複製の主要工程（プライミング、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ鋳型の除去）を触媒する３つの機能ドメインと、非必須スペーサーを有する多機能タンパク質であり、機能ドメインと非必須スペーサーは次の順序で配置されている。
・第１のドメインは、１番〜およそ１７７番まで及んでおり、ＨＢＶ末端タンパク質の活性に関与しており、
・スペーサーは、およそ１７８番〜およそ３３５番に位置しており、
・ＤＮＡポリメラーゼドメインは、およそ３３６番〜およそ６７９番に及んでおり、ＲＴアーゼ活性に関与しており、および
・ＲＮアーゼＨドメインは、およそ６８０番〜Ｃ末端（およそ８３２番）であり、ＲＮアーゼＨ活性に関連している。
【００５１】
４つの残基は、モチーフ「ＹＭＤＤ」（Ｔｙｒ残基、Ｍｅｔ残基、Ａｓｐ残基およびＡｓｐ残基の場合）を形成し、ＲＴアーゼ活性に関連していた。そのモチーフは、天然ＨＢＶポリメラーゼのおよそ５３８番〜およそ５４１番に一般的に存在している（例えば、配列番号１の５３８番、５３９番、５４０番および５４１番に、および配列番号７の４９２番、４９３番、４９４番および４９５番に相当する）。本発明は、免疫原性を保持しながら、ＲＴアーゼ活性の大幅な低下（すなわち、少なくとも１０倍の低下）または除去と相関する、ＲＴアーゼドメイン中のこのモチーフまたはその他の場所における任意の突然変異を包含する。好適なＲＴアーゼ欠損ポリメラーゼ変異株の代表例は、文献に、例えば、Radziwill et al. (1990, J. Virol. 64:613)、Bartenschlager et al. (1990, J. Virol. 64:5324)およびJeong et al. (1996, Biochem Bioph Res Commun. 223(2):264)に記載されている。好ましくは、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、ＹＭＤＤモチーフの最初のＡｓｐ残基（配列番号１の５４０番に、および配列番号７の４９４番に相当する）の、または天然ＨＢＶポリメラーゼの相当位置に位置するアミノ酸残基の、Ａｓｐ以外の任意のアミノ酸残基への置換を含んでなり、Ｈｉｓ残基への置換（Ｄ５４０Ｈ突然変異）が特に好ましい。ＲＴアーゼ活性の低下または除去は、当技術分野で周知のアッセイ（例えば、Radziwill et al., 1990, J Virol. 64:613に記載されている内因性ポリメラーゼアッセイ）を用いて行うことができる。
【００５２】
あるいはまたは組み合わせて、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、天然ＨＢＶポリメラーゼよりも低いＲＮアーゼＨ酵素活性を示すように改変されている。有利には、前記ＲＮアーゼＨ活性低下は、ＲＮアーゼＨ酵素活性に関与するドメイン中に１つ以上の突然変異が存在することによってもたらされる。上述のように、ＲＮアーゼＨ活性に関連している機能ドメインは、ＨＢＶポリメラーゼのＣ末端部分内に、より詳しくは、６８０番〜Ｃ末端の８３２番までマッピングされた。本発明は、ＲＮアーゼＨ活性の大幅な低下（すなわち、少なくとも１０倍の低下）または除去と相関する、免疫原性に有害ではない、このドメイン中にある任意の突然変異を包含する。好適なＲＮアーゼＨ欠損ポリメラーゼ変異株の代表例は、文献に、例えば、Radziwill et al. (1990, J. Virol. 64:613)、Bartenschlager et al. (1990, J. Virol. 64:5324)に記載されている。好ましくは、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、配列番号１の７１８番に、および配列番号７の６７２番に相当するＧｌｕ残基の、または天然ＨＢＶポリメラーゼの相当位置に位置するアミノ酸残基の、Ｇｌｕ以外の任意のアミノ酸残基への置換を含んでなり、Ｈｉｓ残基への置換（Ｅ７１８Ｈ突然変異）が特に好ましい。ＲＮアーゼＨ活性の低下または除去は、当技術分野で周知のアッセイ（例えば、Radziwill et al., 1990, J Virol. 64:613またはLee et al., 1997, Biochem. Bioph. Res, Commun. 233(2):401に記載されているin vitro  ＲＮアーゼＨ活性アッセイまたはＤＮＡ−ＲＮＡタンデム分子分析）を用いて行うことができる。
【００５３】
好ましくは、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、ＲＴアーゼおよびＲＮアーゼの両方の活性を低下させるまたは除去するために突然変異されており、これらの酵素機能に関連して上述の改変を含んでなり、突然変異Ｄ５４０ＨおよびＥ７１８Ｈが特に好ましい。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるポリメラーゼ部分に関する。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、合成および／または安定性および／または発現宿主細胞の表面での提示および／または宿主のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原への提示を改善するために異種の疎水性配列とインフレームで融合されている。好適な異種の疎水性配列としては、分泌経路のポリメラーゼ部分の標的化を可能にするシグナルおよび／またはトランスメンブランペプチドなどの配列が挙げられる。そのようなペプチドは当技術分野で公知である。簡潔には、シグナルペプチドは、膜提示されたまたは分泌されたポリペプチドのＮ末端に一般的に存在し、それらは小胞体（ＥＲ）の通過を開始する。シグナルペプチドは、１５〜３５個の本質的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、シグナルペプチドは、その後、成熟ポリペプチドを与えるために特異的なＥＲ局在性エンドペプチダーゼによって取り除かれる。トランスメンブランペプチドは、通常高疎水性の性質であり、ポリペプチドを細胞膜につなぎ留める働きをする（例えば、Branden and Tooze, 1991, Introduction to Protein Structureの２０２−２１４頁, NY Garland；ＷＯ９９／０３８８５参照）。本発明に関連して使用することができるトランスメンブランおよび／またはシグナルペプチドの選択は広い。それらのペプチドは、任意の膜係留型および／または分泌型ポリペプチド（例えば、細胞ポリペプチドまたはウイルスポリペプチド）、例えば、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tissue plasminigen activator)、インスリン、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質または麻疹ウイルスＦタンパク質のものなどから得ることができ、または合成したものでもよい。シグナルペプチドの好ましい挿入部位は、翻訳開始のためのコドンのＮ末端下流であり、トランスメンブランペプチドの好ましい挿入部位は、Ｃ末端、例えば、停止コドンのすぐ上流である。さらに、リンカーペプチドを使用して、シグナルおよび／またはトランスメンブランペプチドをポリメラーゼ部分と連結することもできる。
【００５６】
他の疎水性配列も本発明に関連して使用することができ、例えば、ＨＢｓＡｇを含む、エンベロープタンパク質または膜結合タンパク質中に一般的に存在するものである。本発明に関連して特に興味深いのは、ポリメラーゼ部分と、本明細書において記載される免疫原性ドメイン（ｅｎｖ１、ｅｎｖ２、ｅｎｖ３および／またはｅｎｖ４）の１以上との融合物であり、それらの免疫原性ドメインは疎水性を有するものである。１以上の疎水性ドメインを、Ｎ末端において、Ｃ末端においてまたはポリメラーゼ部分内でインフレームで融合することができる。
【００５７】
好ましくは、本発明に関連して、本発明において使用されるポリメラーゼ部分は、狂犬病糖タンパク質のシグナルおよびトランスメンブランペプチドとインフレームで融合されている。添付の実施例の節において例示するように、前記狂犬病シグナル配列は、Ｎ末端においてインフレームで融合され、前記狂犬病トランスメンブラン配列は、前記ポリメラーゼ部分のＣ末端においてインフレームで融合される。最も好ましい実施形態は、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、特に少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるポリメラーゼ部分に関する。
【００５８】
コア部分
あるいはまた、上記の組成物と組み合わせて、本発明はまた、第２のＨＢＶに由来するコア部分を含んでなる組成物を提供する。ＨＢＶウイルスに関連して本明細書において記載されるように、本発明において使用されるコア部分は、ポリメラーゼ部分の起源であるＨＢＶウイルスと同じまたは異なるＨＢＶを起源とする。好ましくは、コア部分およびポリメラーゼ部分は両方とも遺伝子型Ｄ  ＨＢＶを起源とし、Ｙ０７５８７  ＨＢＶ分離株あるいは、中国で多いＨＢＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型ＢまたはＣ）のものが特に好ましい。
【００５９】
一実施形態によれば、本発明において使用されるコア部分は、天然ＨＢＶコア（例えば、配列番号２に示されるもの）または対応する天然ＨＢＶコアと比べて改変されたコアであってよく、そのコア部分は、コアタンパク質の少なくとも１００個のアミノ酸残基を保持し、コア部分が、１２０〜１８０個のアミノ酸残基、望ましくは１２５〜１４８個のアミノ酸残基、好ましくは１３０〜１４３個のアミノ酸残基（例えば、およそ１４０個のアミノ酸残基）を含んでなることが特に好ましい。
【００６０】
適当な改変は末端切断である。望ましくは、その末端切断は、天然ＨＢＶコアのＣ末端にまたはＣ末端部分（すなわち、最後の４０個のアミノ酸残基を包含する部分）内に通常存在する、少なくとも１０個のアミノ酸残基、多くとも４０個のアミノ酸残基を包含する。この改変は、ポリメラーゼ部分とコア部分の間のオーバーラップ部分を減少させるまたは欠失させるためにポリメラーゼ部分も含んでなる本発明の組成物に特に関連する。この改変は、コアのこの領域内のＮＬＳ（核局在化シグナル）の欠失および／またはＨＢＶポリメラーゼとの相互作用の阻害にも関連し得る。本発明の組成物の末端切断を記載された範囲内、少なくとも１０個のアミノ酸残基、多くとも４０個のアミノ酸残基に適合させることは、当業者の能力の範囲内である。適当な末端切断部には、天然ＨＢＶコアのＣ末端にまたはそのＣ末端部分内に通常存在する、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個の連続したアミノ酸残基が含まれる。天然ＨＢＶコアに対して、本発明に関連して使用されるコア部分は、有利には、天然ＨＢＶのＣ末端にまたはＣ末端部分内に位置する、少なくとも２０個のアミノ酸残基、多くとも４０個のアミノ酸残基が、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基、多くとも３８個のアミノ酸残基が、より好ましくは少なくとも３４個のアミノ酸残基、多くとも３７個のアミノ酸残基が末端切断され、末端切断部が、天然ＨＢＶコアの最後の３５個のアミノ酸残基を含むことが特に好ましい（言い換えれば、その末端切断部はコアポリペプチドのおよそ１４９番〜Ｃ末端まで及ぶ）。
【００６１】
特に興味深いのは、１番〜およそ１４８番まで及ぶ配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるコア部分、さらに好ましくは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるコア部分である。
【００６２】
あるいはまたは組み合わせて、コア部分は、天然ＨＢＶコアに対して、ＨＢＶエンベロープタンパク質について低下した認識および／または相互作用を示すように改変されている。有利には、前記認識／相互作用低下は、コア粒子の表面上に露出した外側ループを形成すると予測される残基８０付近の、内部に位置する領域中に１つ以上の突然変異が存在することによってもたらされる(Argos et al., 1988, EMBO J. 7:819)。エンベロープタンパク質についての認識または相互作用の低下または除去は、当技術分野で周知のアッセイ（Seitz et al., 2007, EMBO J., 26:416またはPonsel et al., 2003, J. Virol. 77(1):416に記載のとおり、電子顕微鏡、細胞におけるヌクレオカプシド形成の解析、ＨｕＨ７における一過性トランスフェクション後のビリオン分泌など）を用いて行うことができる。
【００６３】
好ましい改変は、およそ７５番からおよそ８５番までに及ぶ（配列番号２および配列番号１０の残基７５〜８５に相当する）、コアの領域中の１個以上のアミノ酸残基の欠失を含んでなり、およそ７７番からおよそ８４番までに及ぶ（配列番号２および配列番号１０の残基７７〜８４に相当する）、コア部分の部分の欠失が特に好ましい。好ましいコア部分は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、または配列番号２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなり、残基７７〜８４を欠失している。
【００６４】
Ｅｎｖ部分
あるいはまたは上記の組成物と組み合わせて、本発明はまた、ｅｎｖ部分を含んでなる組成物を提供する。前記ｅｎｖ部分は、第３のＨＢＶウイルス由来のＨＢｓタンパク質中に存在する少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基の１つ以上の免疫原性ドメインを含んでなる。好ましくは、前記免疫原性ドメインの各々は、ＨＢｓＡｇタンパク質（天然のものまたは改変されたもの（例えば、特定の遺伝子型の代表であるであるように改変されたもの）のいずれか）中に存在する少なくとも２０個のアミノ酸、多くとも１００個のアミノ酸の一部に相当する。免疫原性ドメインの各々は、コア部分およびポリメラーゼ部分の起源であるＨＢＶウイルスと同じであってもまたは異なっていてもよい同じまたは異なるＨＢＶウイルスを起源とするものであってよい。好ましくは、ｅｎｖ免疫原性ドメインは各々、遺伝子型Ｄ  ＨＢＶ、特に、Ｙ０７５８７  ＨＢＶ分離株、あるいは、中国で多いＨＢＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型ＢまたはＣ）を起源とするものである。
【００６５】
有利には、１つ以上の免疫原性ドメインの各々は、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞および／または細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞に特異的なＴ細胞エピトープを含んでなり、それらは様々なＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原（例えば、Ａ２、Ａ２４、ＤＲ、ＤＰなど）に拘束され得る。そのようなエピトープは当技術分野で記載されており（ＷＯ９３／０３７６４; ＷＯ９４／１９０１１; Desombere et al., 2000, Clin, Exp. Immunol 122:390; Loirat et al., 2000, J. Immunol, 165:4748; Schirmbeck et al., 2002, J. Immunol 168:6253; Depla et al., 2008, J. Virol 82 :435）、本明細書において記載される好適な免疫原性ドメインを、１５〜１００個のアミノ酸残基の記載された範囲内で設計することは、当業者の能力の範囲内であり、そのような免疫原性ドメインには、天然ｅｎｖタンパク質（例えば、配列番号３に示されるもの）のＢエピトープ、ＴＨエピトープおよび／またはＣＴＬエピトープが含まれる。好ましくは、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされるｅｎｖ部分は、ｐｒｅＳ１領域およびｐｒｅＳ２領域由来の免疫原性ドメインを含まない。
【００６６】
本発明は、１つの免疫原性ドメインを含んでなるｅｎｖ部分だけでなく、２つ、３つまたはそれ以上を含んでなるものも包含する。
【００６７】
望ましくは、本発明において用いられる１つ以上の免疫原性ドメインは、
・１４〜５１番に及ぶｅｎｖタンパク質（ＨＢｓＡｇ）の一部（ｅｎｖ１ドメイン）；
・１６５〜１９４番に及ぶｅｎｖタンパク質（ＨＢｓＡｇ）の一部（ｅｎｖ２ドメイン）；
・８１〜１０６番に及ぶｅｎｖタンパク質（ＨＢｓＡｇ）の一部（ｅｎｖ３ドメイン）；
・２０２〜２２６番に及ぶｅｎｖタンパク質（ＨＢｓＡｇ）の一部（ｅｎｖ４ドメイン）；および
・それらの任意の組合せ
からなる群から選択される。
【００６８】
本発明における使用に特に好適な免疫原性ドメインは、配列番号１２〜１５に示されるアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなる。
【００６９】
本発明に関連して、免疫原性ドメインの組合せは、本発明の組成物中の個々の免疫原性ドメインの混合物としてであってもまたは可能なあらゆる配置での２つ以上の免疫原性ドメイン間のインフレームでの融合物としてであってもよい（例えば、ｅｎｖ１−ｅｎｖ２、ｅｎｖ２−ｅｎｖ１、ｅｎｖ１−ｅｎｖ３、ｅｎｖ３−ｅｎｖ１、ｅｎｖ１−ｅｎｖ４、ｅｎｖ４−ｅｎｖ１、ｅｎｖ２−ｅｎｖ３、ｅｎｖ３−ｅｎｖ２、ｅｎｖ２−ｅｎｖ４、ｅｎｖ４−ｅｎｖ２、ｅｎｖ３−ｅｎｖ４、ｅｎｖ４−ｅｎｖ３、ｅｎｖ１−ｅｎｖ２−ｅｎｖ３、ｅｎｖ２−ｅｎｖ１−ｅｎｖ３、ｅｎｖ１−ｅｎｖ２−ｅｎｖ４などの融合物または混合物）。さらに、その組合せは、その単一コピーまたはいくつかのコピー（例えば、ｅｎｖ１−ｅｎｖ−２−ｅｎｖ１、ｅｎｖ１−ｅｎｖ−４、ｅｎｖ１など）を含んでなってもよい。各免疫原性ドメイン間の融合は、直接であってもまたはリンカーを通じてでもよい。
【００７０】
本発明に関連して特に興味深いｅｎｖ部分は、配列番号１２〜１５に示される２つまたは３つの免疫原性ドメインの融合物を含んでなり、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるｅｎｖ１−ｅｎｖ２融合物、または配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるｅｎｖ１−ｅｎｖ２−ｅｎｖ４融合物が特に好ましい。
【００７１】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされる、ポリメラーゼ部分、コア部分および／またはｅｎｖ部分は、２つ１組でまたは全体として、インフレームで融合されていてよい。例えば、単一ポリペプチド鎖でのポリメラーゼ部分とｅｎｖ部分の融合物を想定することができる。あるいは、コア部分とｅｎｖ部分が、単一ポリペプチド鎖でインフレームで融合されていてもよい。この場合もまた、コード核酸配列は、直接またはリンカーを通じて融合されていてよい。有利には、ｅｎｖ部分は、コア部分またはポリメラーゼ部分のＣ末端とインフレームで融合される。
【００７２】
コア部分とｅｎｖ部分との融合ポリペプチドの好ましい例は、
・配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１）；
・配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２）；および
・配列番号２０に示されるアミノ酸配列と（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２−ｅｎｖ４）、または残基１で始まり残基２５１で終わる配列番号２０に示されるアミノ酸配列の部分と（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２）、または残基１で始まり残基２２１で終わる配列番号２０に示されるアミノ酸配列の部分と（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１）、少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
またはコア部分において残基７７〜８４を欠失しているそれらの欠失型
：からなる群から選択される。
【００７３】
本発明に関連して、本発明の組成物に含まれるまたは本発明の組成物によってコードされる、ポリメラーゼ部分、コア部分および／またはｅｎｖ部分は、さらなる改変をさらに含んでなってよい。好適な改変は、結果として生じるポリペプチドの合成、プロセシング、安定性および溶解度に有益であるもの（例えば、本明細書において記載される、潜在的切断部位、潜在的グリコシル化部位および／または膜係留を改変することを目的としたもの）ならびに結果として生じる組成物の免疫原性に有益であるもの（例えば、免疫原性を増強することが可能な１種以上の化合物の組込みまたはそれらとの融合）である。免疫原性を増強することが可能なそのような化合物は文献に記載されており、それらの化合物には、限定されるものではないが、カルレティキュリン(Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108:669)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）(Chen et al., 2000, Cancer Res. 60:1035)、ユビキチン(Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71:8497)、細菌毒素、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素Ａの転移ドメイン（ＥＴＡ（ｄＩＩＩ））(Hung et al., 2001 Cancer Res. 61:3698)ならびにＴヘルパーエピトープ、例えば、Ｐａｎ−Ｄｒペプチド(Sidney et al., 1994, Immunity 1:751)、ｐｓｔＳ１  ＧＣＧエピトープ(Vordermeier et al., 1992, Eur, J. Immunol. 22:2631)、破傷風トキソイドペプチドＰ２ＴＴ(Panina-Bordignon et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19:2237)およびＰ３０ＴＴ(Demotz et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23:425)、インフルエンザエピトープ(Lamb et al., 1982, Nature 300:66)およびヘマグルチニンエピトープ(hemaglutinin epitope)(Rothbard et al., 1989, Int. Immunol. 1:479)がある。
【００７４】
核酸分子
本発明はまた、本発明において使用される、ポリメラーゼ部分、コア部分およびｅｎｖ部分を、独立にまたは組み合わせて、コードする単離核酸分子、ならびにそのような核酸分子を含んでなる組成物を提供する。
【００７５】
特に興味深いのは、
・本明細書において記載されるポリメラーゼ部分をコードする核酸分子（配列番号７、８、９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるものが特に好ましい）；
・本明細書において記載されるコア部分をコードする核酸分子（配列番号１０または１１に示されるアミノ酸配列を含んでなるものが特に好ましい）；
・本明細書において記載されるｅｎｖ部分をコードする核酸分子（配列番号１２〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含んでなるものが特に好ましい）；および
・本明細書において記載される融合されたコア部分・ｅｎｖ部分をコードする核酸分子（配列番号１８、１９またはまたは２０のいずれかに示されるアミノ酸配列、または残基１で始まり残基２５１で終わる配列番号２０に示されるアミノ酸配列の部分（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２）、または残基１で始まり残基２２１で終わる配列番号２０に示されるアミノ酸配列の部分（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１）；または配列番号２０のコア残基７７〜８４を欠失しているそれらの欠失型を含んでなるものが特に好ましい）
：である。
【００７６】
望ましくは、本発明の核酸分子を、特定の宿主細胞または生物体、例えば、哺乳類、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)）または細菌（例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)またはリステリア菌(Listeria)）において高レベル発現を提供するために最適化してもよい。所定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが利用可能な場合には、生物体のコドン使用パターンは高度に非ランダムであることが実際に観察されており（例えば、Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111参照）、コドンの使用は、宿主によって著しく異なっている可能性がある（例えば、Nakamura et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:214参照）。本発明において使用されるヌクレオチド配列は主にウイルス起源（ＨＢＶ）のものであるため、それらの配列は、細菌、下等真核細胞または高等真核細胞などの宿主細胞において効率的発現には不適当なコドン使用パターンを示す可能性がある。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞において使用頻度の低いコドンに相当する１つ以上の「天然の」（例えば、ＨＢＶ）コドンを、使用頻度のより高い、同じアミノ酸をコードする１つ以上のコドンによって置き換えることによって行われる。発現の増加は部分的な置き換えでも成し遂げることができるため、使用頻度の低いコドンに相当する総ての天然コドンを置き換える必要はない。さらに、結果として生じる核酸分子への制限部位の導入に適合させるために、最適コドン使用頻度から多少逸脱してもよい。
【００７７】
コドン使用頻度の最適化に加え、宿主細胞または生物体における発現は、ヌクレオチド配列のさらなる改変を通じてさらに改善することができる。例えば、レアな非最適コドンのクラスターが集中した領域に存在しないようにおよび／または発現レベルに悪い影響を及ぼすと予想される少なくとも部分的に負の配列エレメントを抑制または改変するように、本発明の核酸分子を改変することができる。そのような負の配列エレメントとしては、限定されるものではないが、ＧＣ含量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域；ＡＴリッチ配列ストレッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチ；不安定な直接反復配列または逆方向反復配列；ＲＮＡ二次構造；および／または内部暗号調節エレメント、例えば、内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム侵入部位および／またはスプライシングドナー部位／スプライシングアクセプター部位などが挙げられる。本発明の別の実施形態は、本発明の核酸分子のフラグメント、例えば、制限エンドヌクレアーゼおよびＰＣＲで生成されたフラグメントに関するものである。そのようなフラグメントは、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドの免疫原性部分をコードする、プローブ、プライマーまたはフラグメントとして使用することができる。
【００７８】
本発明による好ましい核酸分子は、
・（配列番号７の末端切断型Ｐｏｌをコードする）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・（配列番号８の突然変異型Ｐｏｌをコードする）配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・（Ｄ５４０Ｈ突然変異およびＥ７１８Ｈ突然変異の置換を含む、配列番号７の末端切断型Ｐｏｌをコードする）１４８０番のＧヌクレオチドのＣへの置換、２０１４番のＧヌクレオチドのＣへの置換、および２０１６番のＡヌクレオチドのＴへの置換を含む、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・（配列番号９の末端切断型Ｐｏｌ−ＴＭＲおよび突然変異型Ｐｏｌ−ＴＭＲをコードする）配列番号２３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・（配列番号１８のｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１をコードする）配列番号２４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
・（配列番号１９のｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２をコードする）配列番号２５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；および
・（配列番号２０のｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２−ｅｎｖ４をコードする）配列番号２６に示されるヌクレオチド配列と、または（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２をコードする）ヌクレオチド１で始まりヌクレオチド７５３で終わる配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の部分と、または（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１をコードする）ヌクレオチド１で始まりヌクレオチド６６３で終わる配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の部分と、少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；または配列番号２６の２２９番のＧから２５２番のＡまでに及ぶ部分（コア部分における残基７７〜８４の欠失に相当する）を欠失しているそれらの欠失型
：からなる群から選択される。
【００７９】
本発明の核酸分子は、当技術分野で利用可能な配列データおよび本明細書において提供される配列情報を用いて作製することができる。各ＨＢＶポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、従来の分子生物学またはＰＣＲ技術によって、ＨＢＶを含む細胞、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー、ウイルスゲノムまたはそれを含むことが知られている任意の従来技術ベクターから直接単離することができ、（例えば、本明細書において記載されるように）改変することができる。また、本発明の核酸分子は、自動化プロセスで化学合成によっても作製することができる（例えば、Edge, 1981, Nature 292, 756; Nambair el al., 1984, Science 223:1299; Jay et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:6311に記載されているように、例えば、オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドから構成される）。
【００８０】
また、本発明の１種以上の核酸分子を含んでなるベクター、ならびにそのようなベクターを含んでなる組成物も本発明によって提供される。
【００８１】
本発明に関連して様々な宿主・ベクター系を使用することができ、それらには、原核宿主生物、例えば、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌またはリステリア菌）などにおいて発現するように適合された、バクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドベクター；酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス）において発現するように適合されたベクター；昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）において発現するように適合されたウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）；植物細胞系において発現するように適合されたウイルスまたはプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス  ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス  ＴＭＶ）；ならびに高等真核細胞または生物において発現するように適合されたプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。そのようなベクターは、文献に広く記載されており、市販されている（例えば、Stratagene、Amersham Biosciences、Promegaなど）。好適なプラスミドベクターの代表例としては、限定されるものではないが、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)、ｐＣＩ(Promega)、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987, Nature 329, 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187)、ｐＶＡＸおよびｐｇＷｉｚ(Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735)が挙げられる。本発明に関連して、種々の異なるウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、フォーミーウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスなど）に由来する複数のウイルスベクターを利用することもできる。
【００８２】
特に興味深いのは、遺伝子導入または組換え産生について複数の十分に裏付けされた利点を有するアデノウイルスベクターである（概説については、"Adenovirus vectors for gene therapy", 2002, D. Curiel and J. Douglas編, Academic Press参照）。本発明に従って使用するアデノウイルスベクターは、種々のヒト源または動物源（例えば、イヌ、ヒツジ、サルアデノウイルスなど）から得ることができる。任意の血清型を使用することができ、ヒトアデノウイルスが特に好ましく、Ｃ亜属、例えば、Ａｄ２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、６（Ａｄ６）など、Ｂ亜属、例えば、１１（Ａｄ１１）、３４（Ａｄ３４）および３５（Ａｄ３５）などおよびＤ亜属、例えば、１９（Ａｄ１９）、２４（Ａｄ２４）、４８（Ａｄ４８）および４９（Ａｄ４９）などが特に好ましい。また、動物のＡｄを使用することが有利であることもあり、チンパンジーＡｄ、例えば、チンパンジーＡｄ３(Peruzzi et al., 2009, Vaccine 27:1293)およびチンパンジーＡｄ６３(Dudareva et al., 2009, vaccine 27:3501)などが特に好ましい。記載したアデノウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ATCC, Rockville, Md.)から入手可能であり、またはそれらの配列、組織化および生産方法を記載している多数の刊行物の主題となっており、それによって、当業者はそれらを適用可能となった(例えば、米国特許第６，１３３，０２８号;同第６，１１０，７３５号; ＷＯ０２／４０６６５; ＷＯ００／５０５７３; ＥＰ１０１６７１１; Vogels et al., 2003, J. Virol. 77:8263; ＷＯ００／７００７１; ＷＯ０２／４０６６５; ＷＯ２００４／００１０３２; ＷＯ２００４／０８３４１８; ＷＯ２００４／０９７０１６; ＷＯ２００５／０１０１４９参照)。
【００８３】
一実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは複製欠損である。好ましい複製欠損型アデノウイルスベクターは、およそ４５９番から３３２８番までまたはおよそ４５９番から３５１０番までに及ぶＥ１欠失を有するＥ１欠損である（例えば、米国特許第６，１３６，５９４号および同第６，０１３，６３８号参照）（ＧｅｎｅＢａｎｋにおいて受託番号Ｍ７３２６０として、さらにChroboczek et al., 1992, Virol. 186:280において開示されているヒトアデノウイルス５型の配列を参照）。クローニング能力は、アデノウイルスゲノムのさらなる部分（ＷＯ９４／２８１５２; Lusky et al., 1998, J. Virol 72:2022に記載されているように、非必須Ｅ３領域または他の必須Ｅ２領域、Ｅ４領域の総てまたは一部）を欠失させることによってさらに向上させることができる。
【００８４】
本発明の核酸分子は、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができ、Ｅ１領域の代わりに挿入することことが特に好ましい。本発明の核酸分子は、問題の領域の自然転写方向に対してセンス配向またはアンチセンス配向に配置し得る。
【００８５】
本発明に関連する他の好適なウイルスベクターは、ポックスウイルスから得られる（例えば、Cox et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" J. M. Hos編, Carolina Academic Press参照）。本発明に関連し、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科(Poxviridae)の任意のメンバー、特に、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルスから得ることができ、ワクシニアウイルスが好ましい。好適なワクシニアウイルスとしては、限定されるものではないが、コペンハーゲン系統(Goebel et al., 1990, Virol. 179:247および517; Johnson et al., 1993, Virol. 196:381)、および改変アンカラ（Ｗｙｅｔｈ系統およびｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）系統(Antoine et al, 1998, Virol. 244:365)が挙げられる。組換えポックスウイルス構築のための一般条件は当技術分野で周知である（例えば、ＥＰ２０６９２０; Mayr et al., 1975, Infection 3:6; Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847;米国特許第６，４４０，４２２号参照）。本発明の核酸分子は、好ましくは、ポックスウイルスゲノム内の非必須遺伝子座に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、コペンハーゲンワクシニアベクターへの挿入に(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad, Sci USA 80:3411; Weir et al., 1983, J. Virol. 46:530)、欠失ＩＩまたはＩＩＩは、ＭＶＡベクターへの挿入に(Meyer et al., 1991, J. Gen, Virol. 72:1031; Sutter et al., 1994, Vaccine 12:1032)特に適当である。
【００８６】
本発明はまた、脂質またはポリマーと複合体を形成して、リポソーム、リポプレックス(lipoplexes)またはナノ粒子などの微粒子構造を形成しているベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ）を包含する。そのような技術は当技術分野で利用可能である（例えば、Arangoa et al., 2003, Gene Ther. 10:5; Eliaz et al., 2002, Gene Ther. 9:1230およびBetageri et al., 1993, "Liposome drug delivery systems”, Technomic Publishing Company, Inc参照）。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、本発明のベクターは、本発明の核酸分子を宿主細胞または生物体における発現に好適な形態で含んでなり、それは、核酸分子が、ベクターおよび／または宿主細胞に適当な１以上の調節配列の制御下に置かれるということを意味している。調節配列の選択が、宿主細胞、所望の発現レベルなどのような因子に依存することは当業者であれば理解することができる。
【００８８】
プロモーターは特に重要であり、本発明に関連して有用な好適なプロモーターとしては、多くの種類の宿主細胞において核酸分子の発現を導く構成プロモーターおよびある特定の宿主細胞においてのみ（例えば、肝臓特異的調節配列）または特定の事象または外因性因子に応じて（例えば、温度、栄養添加物、ホルモンまたは他のリガンドにより）核酸分子の発現を導くものが挙げられる。
【００８９】
哺乳類細胞における構成的発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター(Boshart et al., 1985, Cell 41:521)、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター(Adra et al., 1987, Gene 60:65)および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。ワクシニアウイルスプロモーターは、特に、ポックスウイルスベクターでの発現用に適合される。代表例としては、限定されるものではないが、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５(Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther, 15:18)、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌプロモーター、ならびに合成プロモーター、例えば、Chakrabarti et al. (ｐＳＥ／Ｌプロモーターに関する、1997, Biotechniques 23:1094)、Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66:135)およびKumar and Boyle (1990, Virology 179:151)に記載されているものなど、ならびに初期／後期キメラプロモーターが挙げられる。肝臓特異的プロモーターとしては、限定されるものではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ(Luskey, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1881)；ステロール調節エレメント１(SRE-1; Smith et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2306)；アルブミン(Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268)；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）(Eisenberger et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:1396)；ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）(Li et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:4136)；ヒトグルコキナーゼ(Tanizawa et al., 1992, Mol. Endocrinology 6:1070)；コレステロール７−αヒドロキシラーゼ(cholesterol 7-alpha hydroylase)（ＣＹＰ−７）(Lee et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:14681)；α−１アンチトリプシン(Ciliberto et al., 1985, Cell. 41:531)；インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１）(Babajko et al., 1993, Biochem Biophys. Res, Comm. 196:480)；ヒトトランスフェリン(Mendelzon et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18:5717)；Ｉ型コラーゲン(Houglum et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:808)およびＦＩＸ（米国特許第５，８１４，７１６号）の遺伝子のものが挙げられる。
【００９０】
当業者であれば、本発明の核酸分子の発現を制御する調節エレメントが、宿主細胞または生物体での、転写の適切な開始、調節および／または終結（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送（例えば、核局在化シグナル配列）、プロセシング（例えば、スプライシングシグナル）、および安定性（例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列）、翻訳（例えば、イニシエーターＭｅｔ、トリパルタイトリーダー配列(tripartite leader sequences)、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ配列など）および精製プロセス（例えば、タグ）のためのさらなるエレメントをさらに含んでなり得ることは理解することができる。
【００９１】
本発明に従って、前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分および／または前記ｅｎｖ部分をコードする本発明の核酸分子は、同じベクターまたは少なくとも２つのベクター（例えば、２つまたは３つの独立したベクター）に担持することができる。よって、本発明は、前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分および前記ｅｎｖ部分をコードする核酸分子を担持するベクターと、独立ベクターを包含し、それらの独立ベクターはそれぞれ、前記ポリメラーゼ部分、前記コア部分および前記ｅｎｖ部分をコードする核酸分子の１種だけまたは２種を担持する。そのようなベクターは、本発明によって提供されるものであり、そのようなベクターを含んでなる組成物も同様である。異なるベクターを使用する場合には、それらは異なる起源のものであってもまたは同じ起源ものであってもよい。例えば、欠損型ポックスウイルス（例えば、ＭＶＡ）からの１つのＨＢＶ部分の発現と、別のポックスウイルスベクター（例えば、コペンハーゲンベクター）からの他の２つの部分の発現を想定することができる。別の例として、ポリメラーゼ部分をコードするアデノウイルスベクターと、コア部分およびｅｎｖ部分をコードするアデノウイルスベクターを含んでなる組成物を想定することができる。あるいは、異なるウイルスベクターからの発現（例えば、アデノウイルスベクターからのポリメラーゼ部分の発現と、ＭＶＡからのコア部分および／またはエンベロープ部分の発現、逆もまた同じ）もまた、本発明に関連して好適であり、プラスミドおよびウイルスベクターからのＨＢＶ部分の発現も同様である。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態は、以下からなる群から選択されるベクターに関するものである：
（ｉ）７．５Ｋプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれた、配列番号７、８もしくは９に、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分をコードする、核酸分子を含んでなるＭＶＡベクター。好ましくは、前記核酸分子はＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入される。
（ｉｉ）ｐＨ５ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれた、配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を含んでなるコア部分およびｅｎｖ部分をコードする核酸分子を含んでなるＭＶＡベクター。好ましくは、前記核酸分子はＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入される。
（ｉｉｉ）Ｅ１領域の代わり挿入された、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれた核酸分子であり、配列番号７、８もしくは９に、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分をコードする核酸分子を含んでなるＥ１欠損型Ａｄベクター。
（ｉｖ）Ｅ１領域の代わり挿入された、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれた、配列番号１８、１９もしくは２０に、または残基１からはじまり残基２５１で終わる配列番号２０の部分（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２）に、または残基１で始まり残基２２１で終わる配列番号２０の部分（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１）に示されるアミノ酸配列を含んでなるコア部分およびｅｎｖ部分をコードする核酸分子を含んでなるＥ１欠損型Ａｄベクター。
【００９３】
同様に、ベクター（ｉ）および（ｉｉ）または（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含んでなる組成物にも関する。
【００９４】
必要に応じて、本発明のベクターまたは組成物は、１種以上の導入遺伝子、例えば、宿主細胞または生物体において本発明の核酸分子とともに発現させるべき目的遺伝子をさらに含んでなってよい。望ましくは、導入遺伝子の発現は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染により引き起こされるかまたはそれに関連する任意の疾患または状態に対する治療活性または防御活性を有し、または本発明の組成物の免疫原性を増強することが可能である。好適な導入遺伝子としては、限定されるものではないが、１つ以上の追加ＨＢＶポリペプチド／ペプチドまたはコード核酸分子、例えば、Ｘタンパク質またはそのフラグメントなど、免疫調節剤、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＦＮｇ）、サイトカインの融合物（ＷＯ２００５／１４６４２に記載されているものなど）またはそれらのコード核酸分子など、ならびに肝臓癌の治療に関して特に有用な自殺遺伝子産物またはコード核酸分子（例えば、シトシンデアミナーゼ（ＣＤａｓｅ）、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）、ＦＣＵ−１遺伝子産物（ＷＯ９９／５４４８１に記載されている）およびそれらの誘導体（ＷＯ２００６／０４８７６８に記載されている）など（これらはプロドラッグである５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）とともに使用される）が挙げられる。導入遺伝子を使用する場合には、導入遺伝子は、本発明の核酸分子のいずれかとの融合物の形で発現させることができ、または適当な調節エレメントの制御下で独立に発現させることができる。さらに、導入遺伝子は、本発明のベクターの任意の位置に、または本発明のベクターまたは組成物と組み合わせて使用される独立ベクターに挿入することができる。
【００９５】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子またはベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子、ならびにそのような感染性ウイルス粒子を含んでなる組成物を提供する。
【００９６】
一般には、そのようなウイルス粒子は、以下の工程を含む方法によって産生される：
（ａ）本発明のウイルスベクターを好適な細胞系統に導入する工程、
（ｂ）該感染性ウイルス粒子の産生を可能にする好適な条件下で該細胞系統を培養する工程、
（ｃ）産生された感染性ウイルス粒子を該細胞系統の培養物から回収する工程、および
（ｄ）所望により、該感染性ウイルス粒子回収物を精製する工程。
【００９７】
ウイルスベクターが欠損型である場合には、感染粒子は、通常、補完細胞系統において、または非機能的ウイルス遺伝子をトランスで供給するヘルパーウイルスの使用によって産生される。例えば、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの補完に好適な細胞系統としては、２９３細胞(Graham et al., 1997, J. Gen, Virol. 36, 59-72)ならびにＨＥＲ−９６細胞およびＰＥＲ−Ｃ６細胞（例えば、Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917;ＷＯ９７／００３２６）が挙げられる。ポックスウイルスベクターの増殖に適当な細胞は、鳥類細胞であり、最も好ましくは、受精卵から得られるニワトリ胚から調製された初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）である。
【００９８】
感染性ウイルス粒子は、培養上清からまたは溶解後の細胞から回収することができる。感染性ウイルス粒子は、標準的な技術（例えば、ＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９８／２２５８８、ＷＯ９８／２６０４８、ＷＯ００／４０７０２、ＥＰ１０１６７００およびＷＯ００／５０５７３に記載されているように、クロマトグラフィー、塩化セシウム勾配での超遠心分離）によってさらに精製することができる。
【００９９】
本発明はまた、特定の標的細胞への優先的ターゲッティングを可能にするように改変されているベクターまたはウイルス粒子を包含する（例えば、Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg et al., 1997, Virol. 227, 239-244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668; ＷＯ９４／１０３２３；ＷＯ０２／９６９３９およびＥＰ１１４６  １２５参照）。本発明のターゲッティングベクターおよびウイルス粒子の特徴は、それらの表面に、細胞成分および表面露出成分を認識しその成分に結合することが可能なリガンド、例えば、細胞特異的マーカー（例えば、ＨＢＶ感染細胞）、組織特異的マーカー（例えば、肝臓特異的マーカー）、ならびにウイルス（例えば、ＨＢＶ）抗原などが存在することである。好適なリガンドの例としては、ＨＢＶ抗原ドメインに対する抗体またはそのフラグメントが挙げられる。細胞ターゲッティングは、ウイルスの表面に存在するポリペプチド（例えば、アデノウイルス繊維、ペントン、ｐＩＸまたはワクシニアｐ１４遺伝子産物）にリガンドを遺伝学的に挿入することによって行うことができる。
【０１００】
本発明はまた、本発明の核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を含んでなる宿主細胞、ならびにそのような宿主細胞を含んでなる組成物に関する。本発明に関連して、宿主細胞には、原核細胞、下等真核細胞（酵母など）および他の真核細胞（昆虫細胞、植物細胞および哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞など）ならびに本発明の複製欠損型ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の少なくとも１つの欠陥機能を補完することが可能な補完細胞（２９３細胞およびＰＥＲＣ．６細胞など）が含まれる。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態によれば、宿主細胞はさらにカプセル封入することができる。細胞カプセル封入技術はこれまでに記載されている(Tresco et al., 1992, ASAIO J. 38. 17-23; Aebischer et al., 1996, Human Gene Ther. 7, 851-860)。
【０１０２】
本発明のさらなる態様は、本発明のベクター、感染性ウイルス粒子および／または宿主細胞を使用して組換え型のポリメラーゼ部分、コア部分および／またはｅｎｖ部分を作出するための方法である。本発明の方法は、（ａ）トランスフェクトまたは感染した宿主細胞を作出するために本発明のベクターまたは感染性ウイルス粒子を好適な宿主細胞へ導入すること、（ｂ）宿主細胞の増殖に好適な条件下で該トランスフェクトまたは感染宿主細胞をin-vitro培養すること、（ｅ）ポリメラーゼ部分、コア部分および／またはエンベロープ部分を細胞培養物から回収すること、および（ｄ）所望により、回収したポリペプチドを精製することを含む。
【０１０３】
当業者は、適当な宿主細胞におけるＨＢＶ部分の産生に利用可能な数多くの発現系についておよびベクターまたは感染性ウイルス粒子を宿主細胞へ導入するための方法について熟知していると思われる。そのような方法としては、限定されるものではないが、マイクロインジェクション(Capechi et al., 1980, Cell 22:479)、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション(Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7:2745)、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション(Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15:1311)、リポフェクション／リポソーム融合(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :7413)、粒子衝撃(particle bombardement)(Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568)、遺伝子銃、形質導入、ウイルス感染ならびに様々な手段による宿主生物への直接投与が挙げられる。
【０１０４】
本発明のベクターは、宿主細胞へのベクターの導入を容易にするために、トランスフェクション試薬、例えば、ポリカチオン性ポリマー（例えば、キトサン、メタクリレート、ＰＥＩなど）および陽イオン性脂質（例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、Promegaから現在入手可能なトランスフェクタムリポフェクチン）などとともに使用することができる。さらに、上述のように、組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、高コピー数ベクターの使用、１以上の転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）の置換または改変、核酸分子コドン使用頻度の宿主細胞への最適化、および転写物を不安定にする可能性がある負の配列の抑制によって、宿主細胞または生物体における核酸分子の発現を改善することができる。
【０１０５】
本発明の宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコおよびペトリ皿で培養することができる。培養は、所定の宿主細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で行うことができる。本明細書では、原核生物細胞および真核生物細胞におけるタンパク質の産生について知られている様々な方法を詳細に記載することはしない。
【０１０６】
ＨＢＶ部分は、次いで、周知の精製方法によって精製することができ、それらの方法には、硫安沈殿、酸抽出、ゲル電気泳動；濾過およびクロマトグラフィー法（例えば、逆相、サイズ排除、イオン交換、アフィニティー、ホスホセルロース、疎水性相互作用、ヒドロキシルアパタイトまたは高速液体クロマトグラフィー）が含まれる。使用する条件および技術は、正味電荷、分子量、疎水性、親水性のような因子に依存し、当業者には明らかであろう。さらに、精製のレベルは目的の用途にもよる。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、本発明の、ポリメラーゼ部分、コア部分および／またはｅｎｖ部分の少なくとも１つ、コード核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子または宿主細胞（本明細書では「活性物質」とも呼ばれる）またはそれらの任意の組合せ（例えば、本明細書に記載される種々のＨＢＶ部分をコードする、ポリペプチドまたはベクター／ウイルス粒子の組合せ、または異なる遺伝子型の組合せ）を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、該組成物は、治療上有効な量の活性剤にさらに薬学上許容されるビヒクルを含んでなる医薬組成物である。
【０１０８】
好適には、本発明の組成物は、ヒトまたは動物用途に適当な希釈剤を含んでなる。それは好ましくは、等張、低張または弱高張であり、比較的低いイオン強度を有する。代表例としては、無菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス液、および他の水性の生理学的平衡塩溶液が挙げられる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins参照）。本発明の組成物は、ヒト用途に好適とするために、生理学的ｐＨまたはやや塩基性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７〜およそｐＨ９）に適宜緩衝される。好適なバッファーとしては、限定されるものではないが、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはＴｒｉｓバッファーが挙げられる。
【０１０９】
該組成物はまた、例えばｐＨの改変および維持、浸透圧、粘度、明澄性、色、無菌性、安定性、処方物の溶解速度、ヒトもしくは動物生物体での放出または吸収の改変または維持、血液関門を通過する輸送の促進、または特定の器官（例えば、肝臓）での浸透を含む、望ましい薬学的または薬力学的特性を提供するために、他の薬学上許容される賦形剤を含むことができる。好適な賦形剤としては、アミノ酸を含む。
【０１１０】
本発明の組成物に含まれる薬学上許容されるビヒクルはまた、製造、および冷凍庫（例えば、−７０℃、−２０℃）、冷蔵庫（例えば、４℃）または周囲温度での長期保存（すなわち、少なくとも１か月）の条件下でその安定性の保持を可能としなければならない。この点に関して、本発明の組成物に特に適合された処方物は、
・１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５４ｍｇ／ｌ  Ｔｗｅｅｔ  ８０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５（特に活性剤がアデノウイルスベクターである場合）、および
・１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
・生理食塩水
を含む。
【０１１１】
さらに、本発明の組成物は、ヒトにおける全身または粘膜適用に好適な１以上のアジュバントを含んでなり得る。好ましくは、アジュバントは、本発明の組成物に対する免疫、特に、例えば、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介した細胞性免疫を刺激することができる。有用なアジュバントの代表例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、フロイントの完全および不完全アジュバント（ＩＦＡ）などの鉱油エマルション、リポ多糖類またはその誘導体(Ribi et al., 1986, Immunology and lmniunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)、ＱＳ２１などのサポニン(Sumino et al., 1998, J. Virol. 72:4931；ＷＯ９８／５６４１５）、イミキモドなどのイミダゾ−キノリン化合物(Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol, 43:S6)、Ｓ−２７６０９(Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324)およびＷＯ２００７／１４７５２９に記載されているものなどの関連化合物、ＣｐＧなどのシトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド(Chu et al., 1997, J. Exp, Med. 186:1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171:2358)およびＩＣ−３１などの陽イオンペプチド(Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822:263)が挙げられる。
【０１１２】
本発明の組成物は、全身、局所および限局投与を含む、種々の投与様式に好適である。注射は、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、血管内、動脈内注射、または動脈への直接注射（例えば、肝動脈注入による）または肝臓栄養静脈（例えば、門脈への注射）によるなどの任意の手段によって行うことができる。注射は従来のシリンジと針、または当技術分野で利用可能な他の適当な任意の装置によって行うことができる。あるいは、本発明の組成物は、経口／食事性、鼻腔内、気管内、肺内、膣内または直腸内経路などの粘膜経路によって投与してもよい。気道内投与は、液滴、スプレーまたは乾燥粉末組成物を加圧容器（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの好適な噴射剤を伴う）または非加圧式ディスペンサーで噴霧化またはエアゾール化することによって行うことができる。
【０１１３】
局所投与はまた、経皮的手段（例えば、パッチなど）を用いて行うこともできる。本発明に関して、好ましい組成物は筋肉内および皮下経路向けに処方される。
【０１１４】
本発明の組成物は、例えば、固体、液体または凍結品などの種々の形態であってよい。固体（例えば、乾燥粉末または凍結乾燥）組成物は、真空乾燥および凍結乾燥を含むプロセスによって得ることができる。粘膜投与では、組成物は経口投与用の胃耐性カプセル剤および顆粒剤、直腸または膣投与用坐剤として、最終的には、粘膜の孔径を増すのに有用な吸収促進剤と組み合わせて処方することができる。このような吸収促進剤は一般に、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル−β−シクロデキストリン、ラウリル−１−リソホスファチジルコリンなど、粘膜のリン脂質ドメインに類似する構造を有する物質である。
【０１１５】
適当な用量は、種々のパラメーター、特に、投与様式；用いる組成物；宿主生物の齢、健康状態および体重；症状の特徴および程度；併用処置の種類；処置の頻度；および／または予防もしくは治療の必要の関数として適合させることができる。処置に適当な用量を決定するために必要な、計算のさらなる精密化は、慣例的に、関連のある状況に照らして医師により行われる。一般的な指針としては、ウイルスを含んでなる組成物に好適な用量は、用いるベクターおよび定量技術によって、約１０５〜約１０１３ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）で様々である。サンプル中に存在するｖｐ、ｉｕおよびｐｆｕの量を評価するために利用可能な技術は、当技術分野では常法である。例えば、アデノウイルス粒子の数（ｖｐ）は、通常、Ａ２６０における吸光度を測定することによって求められ、ｉｕ力価は定量的ＤＢＰ免疫蛍光法によって、ｐｆｕは許容細胞の感染後にプラーク数を数えることによって求められる。好ましくは、ｖｐ／ｉｕ比は、ＦＤＡ指針によれば１００未満である。ＭＶＡに基づく組成物では、約５×１０５〜約１０９ｐｆｕの用量が好ましく、約１０７、約５×１０７、約１０８または約５×１０８ｐｆｕの用量が特に好ましい。Ａｄに基づく組成物に関して、好ましい用量は、約１０６〜約１０１２ｖｐを含み、約１０９、約５×１０９、約１０１０、約５×１０１０Ｖｐまたは約１０１１ｖｐの用量が特に好ましい。ベクタープラスミドに基づく組成物は、１０μｇ〜２０ｍｇの間、有利には１００μｇ〜２ｍｇの間の用量で投与すればよい。タンパク質組成物は、体重１ｋｇ当たり１０ｎｇ〜２０ｍｇの間の用量の治療タンパク質を１回以上投与すればよく、約０．１μｇ〜約２ｍｇの用量が特に好ましい。投与は、一回用量で、または一定の時間間隔の後に１回または数回の繰り返し用量で行うことができる。
【０１１６】
本発明の組成物は、種々の疾患および病的状態、特に、ＨＢＶ感染のよって引き起こされるかまたはそれに関連するものを処置するための方法に用いることができる。本明細書において「処置する」とは、予防および／または治療を包含する。それは特に、肝硬変および肝臓癌を含む、ＨＢＶ感染患者におけるＨＢＶ慢性感染および／または肝臓病変を処置するのに有用である。好ましくは、本明細書に記載の治療法に従って宿主生物に導入した際に、本発明の組成物は、処置前に比べて、処置された宿主に治療上の利益を与える。治療上の利益は、例えば、感染被験体における血液、血漿、血清または肝臓において検出されるＨＢＶウイルス量の低下、および／または抗ＨＢＶ免疫応答の検出（例えば、抗ＨＢＶ抗体の生産および／またはＴ細胞性免疫）またはＨＢＶ感染に関連する症状の遅延（例えば、肝硬変または癌の発症の遅延）、または一般にＨＢＶ感染に関連する肝臓炎症／脂肪症／繊維症の軽減、または従来の療法に対する個々の応答の改善などのいくつかの方法で証明することができる。
【０１１７】
よって、本発明はまた、本明細書に記載の治療法に従ってＨＢＶ感染、ＨＢＶ関連疾患および病的状態の治療または予防を意図した薬剤を製造するための、本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物の少なくとも１つの使用を包含する。
【０１１８】
本発明はまた、ＨＢＶ感染、特に、慢性ＨＢＶ感染、ＨＢＶ関連疾患および病的状態を治療または予防する方法であって、それを必要とするヒトまたは動物生物体に、治療上有効な量の、本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物の少なくとも１つを投与することを含んでなる方法を提供する。
【０１１９】
本発明の方法または使用は、治療上有効な量の該活性剤の１回以上の投与（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）を含んでなり、該投与は互いに適当な時間をおき、同じ投与経路または異なる投与経路（例えば、筋肉内経路と皮下経路）で、同じ部位にまたは異なる部位に行われる。ＭＶＡに基づく組成物およびベクターの場合、３〜１０日おいた３回の投与（例えば、毎週３回の投与）が特に好適である。この第１クールの投与の後に、前記３連続投与によってプライムされた抗ＨＢＶ免疫応答を想起させるために、同じ活性物質を用いて１回以上の後続投与を行うことができる（１または数ヶ月行うことができる）。Ａｄに基づく組成物およびベクターに関して、好ましい方法または使用は、１回の投与と、最終的に、１か月後および６か月後の１回または２回の後続投与を含む。
【０１２０】
所望により、本発明の方法または使用は、１以上の従来の治療法（例えば、放射線、化学療法および／または手術）と組み合わせて行うことができる。複数の治療アプローチの使用は、患者に、よりすそ野の広い介入を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、外科的介入の前または後に行うことができる。別の実施形態では、本発明の方法は、放射線療法（例えば、γ線）の前または後に行うことができる。当業者ならば、当業者に容易に明らかになる適当な適合および改変を用い、適当な放射線療法プロトコールおよび使用可能なパラメーターを容易に設定することができる（例えば、Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed, JB Lippincott Co参照）。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、本発明の方法または使用は、ＨＢＶ感染、ＨＢＶ関連疾患および病的状態を治療または予防するために従来から使用されている１以上のＨＢＶ薬による化学療法と組み合わせる。それらの投与は本発明において使用される活性物質の投与の前、または投与と並行して、または投与の後に行うことができる。ＨＢＶ薬の代表例としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ阻害剤、ＲＮアーゼＨ阻害剤、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、ＴＬＲアゴニスト、Ｎ−グリコシル化阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＨＢＶ抗体、免疫調節剤、治療用ワクチンおよびＨＢＶ関連肝臓癌の処置に通常用いられる抗腫瘍剤（例えば、アドリアマイシン、アドリアマイシンとリピオドールまたはソラセニブ(sorasenib)の組合せ）が挙げられる。好適な治療用ワクチンの例としては、限定されるものではないが、抗ＨＢＶ体液性応答の誘発に特に適した、ＨＢＶタンパク質（Ｃｏｒｅ、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、Ｓおよび／またはポリメラーゼ）に基づくか、またはそれをコードする組換え抗原、ＶＬＰ、ベクターまたは合成ペプチドが挙げられる。このようなＨＢＶ薬は一回用量で、あるいはまた、数時間、数日および／または数週間にわたる、標準的なプロトコール、用量およびレジメンに従った複数用量で提供することができる。本発明による特に好適な方法または使用は標準治療と併用され、標準治療は本発明の方法または使用の前、または並行して、または後に行うことができる。このような標準治療は患者よって異なり得るが、一般に、サイトカイン（例えば、ＩＦＮａ、ｐｅｇ化ＩＦＮａ２）および／またはヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体、例えば、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、アデホビル、ジピボキシルまたはテノホビルンによる処置を含んでなる。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明の方法または使用は、１以上のプライム組成物と１以上のブースト組成物の連続投与を含んでなるプライムブースト治療法に従って行う。一般に、プライム組成物およびブースト組成物は、通常、少なくとも抗原ドメインを含んでなるか、またはコードする異なるビヒクル使用する。さらに、プライム組成物およびブースト組成物は同じ部位または別の部位に、同じ投与経路または異なる投与経路によって投与することができる。例えば、ポリペプチドに基づく組成物は粘膜経路によって投与することができ、ベクターに基づく組成物は好ましくは注射され、例えば、ＭＶＡベクターの場合は皮下注射され、ＤＮＡプラスミドの場合は筋肉内注射され、アデノウイルスベクターの場合は皮下または筋肉内注射される。
【０１２３】
本発明はまた、宿主生物においてＨＢＶに対する免疫応答を誘導または刺激する方法であって、該免疫応答を誘導または刺激するために該生物に本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物の少なくとも１つを投与することを含んでなる方法を提供する。免疫応答は特異的および／または非特異的、体液性および／または細胞性であり得、これに関して、それはＣＤ４＋またはＣＤ８＋またはその双方に媒介されるものであり得る。免疫応答は好ましくはＨＢＶ抗原に対するＴ細胞応答である。
【０１２４】
動物またはヒト生物体に投与した際の、本発明の方法の抗ＨＢＶ免疫応答を誘導または刺激する能力は、当技術分野で標準的な多様なアッセイを用いて、in vitroまたはin vivoのいずれかで評価することができる。免疫応答の発現および活性化を評価するために利用可能な技術の全般的な説明については、例えば、Coligan et al (1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health）を参照。細胞性免疫の測定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む、活性化されたエフェクター細胞によって分泌されるサイトカインプロフィールの測定（例えば、ＥＬＩｓｐｏｔによるＩＬ−１０またはＩＦＮｇ産生細胞の定量）によって、免疫エフェクター細胞の活性化状態の決定（例えば、従来の［３Ｈ］チミジンの取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ）によって、感作された被験体における抗原特異的Ｔリンパ球についてのアッセイ（例えば、細胞傷害性アッセイにおけるペプチド特異的溶解）によって行うことができる。体液性応答を刺激する能力は、抗体結合および／または結合における競合によって決定してもよい（例えば、Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press参照）。本発明の方法はまた、適当な感染性または腫瘍誘導性物質（例えば、ＨＢＶ遺伝子産物を発現するワクシニアウイルスまたはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria Monocytogenes))で抗原投与を行った動物モデルにおいてさらにバリデートして、該感染性または腫瘍誘導性物質の中和および最終的には関連する症状に対する部分的な抵抗性（これは抗ＨＢＶ免疫応答の誘導または増強を反映する）を決定することができる。本発明の組成物の試験およびバリデーションは、添付の実施例の節でも説明される。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の治療法に従って、慢性ＨＢＶ感染、ＨＢＶ関連疾患および病的状態を含むＨＢＶ感染の治療または予防、より詳しくは、ＨＢＶに感染した被験体における免疫応答の誘導または生成に使用するためのパーツキットを提供し、該キットは、本明細書に記載のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞および組成物からなる群から選択される複数の活性物質を含んでなる。望ましくは、該複数の活性物質は、独立したポリペプチドまたは独立したベクターの形態で提供され、各活性物質の投与は同時に（同じ時点で）または別に（一方の後に一定の時間のおいて他方を）、同じ投与経路または異なる投与経路によって、同じ部位（または近接して）または異なる部位に、同じ用量または異なる用量を用いて行うことができる。
【０１２６】
本発明において特に注目されるのは、本明細書において定義されるポリメラーゼ部分をコードする核酸分子を含んでなる第１のベクターと、本明細書において定義されるコア部分および／またはｅｎｖ部分をコードする核酸分子を含んでなる第２のベクターとを含んでなるパーツキットである。
【０１２７】
好ましい実施形態によれば、該第１のベクターは、７．５Ｋプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれた、配列番号７、８もしくは９に、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分をコードする、核酸分子を含んでなるＭＶＡベクターであり；該第２のベクターは、ｐＨ５ｒプロモーターなどのワクシニアプロモーターの制御下に置かれた、配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を含んでなるコア部分およびｅｎｖ部分をコードする、核酸分子を含んでなるＭＶＡベクターである。
【０１２８】
別の好ましい実施形態によれば、該第１のベクターは、ＣＭＶプロモーターなどの好適なプロモーターの制御下に置かれた、配列番号７もしくは配列番号８に、または４９４番のＡｓｐ残基のＨｉｓ残基への置換および６７２番のＧｌｕ残基のＨｉｓ残基への置換を含む、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリメラーゼ部分をコードする、核酸分子を含んでなるアデノウイルスベクターであり；該第２のベクターは、ＣＭＶプロモーターなどの好適なプロモーターの制御下に置かれた、配列番号１８、１９もしくは２０に、または残基１で始まり残基２５１で終わる配列番号２０の部分（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２）に、または残基１で始まり残基２２１で終わる配列番号２０の部分（ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１）に示されるアミノ酸配列を含んでなるコア部分およびエンベロープ部分をコードする核酸分子を含んでなるアデノウイルスベクターである。
【０１２９】
本発明のパーツキットは、上記で定義された免疫調節剤を発現する第３のベクターをさらに含んでもよい。例示を目的として、パーツキットに含まれる各有効成分の好ましい用量は、本発明の組成物に関して上記されたものと同じ程度であるが、各ポックスウイルスまたはＭＶＡベクターでは５×１０５〜１０９ｐｆｕ、各アデノウイルスベクターでは約１０６〜約１０１２ｖｐの用量が特に好ましい。
【０１３０】
本発明はまた、本発明において使用されるＨＢＶ部分またはそのペプチドフラグメントと選択的に結合する抗体を提供する。本明細書において、抗体は、標的ペプチドと結合し、無関係のタンパク質と有意には結合しない場合、標的ペプチドと選択的に結合する。ある場合には、ペプチドと結合する抗体は、ある程度の交差反応性にもかかわらずなお選択的であると理解される。しかしながらやはり、本発明の抗体は、ＨＢＶ天然タンパク質と高い親和性または高い選択性で結合しないことが好ましい。
【０１３１】
本明細書において、抗体は、当技術分野で認識されている抗体と一致すると明確に定義される。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに限定されるものではないが、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントを含む、このような抗体のフラグメントを含む。本発明の抗体は、当技術分野で慣例の技術を用いて、例えば、有効量の本明細書に記載のＨＢＶ部分および／またはそのペプチドフラグメントを動物に投与した後に産生され得る。抗体は、好ましくは、例えば天然ＨＢＶタンパク質に導入された本明細書に記載の改変に向けられたものなどの独特な配列を含んでなる、ＨＢＶ部分の領域または不連続のフラグメントから作製される。
【０１３２】
本発明の抗体は、本発明の範囲内にある種々の潜在的用途を有している。例えば、このような抗体は、（ａ）本発明の第１または第２のポリペプチドを検出するアッセイにおける試薬として、（ｂ）生体サンプル中のＨＢＶウイルスの存在を検出するアッセイにおける試薬として、および／または（ｃ）組換え生産されたＨＢＶ部分を、タンパク質と他の夾雑物の混合物から回収するツールとして（例えば、培養宿主細胞からのアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降による精製を可能にすることによって）使用することができる。
【０１３３】
本発明はまた、本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物または抗体の少なくとも１つを用いる、ＨＢＶウイルスによる感染に感受性のある個体から採取した生体サンプル（例えば、血漿、血清、組織）中のＨＢＶウイルスまたは抗ＨＢＶ抗体の検出および／または定量のための方法に関する。
【０１３４】
一実施形態において、本方法は、生体サンプル中のＨＢＶウイルスの検出および／または定量により特に適切であり、該方法は、該生体サンプルを少なくとも１つの本発明の抗体と、ウイルスと抗体の間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程、および該複合体の形成を任意の適当な手段によって検出および／または定量する工程を少なくとも含んでなる。
【０１３５】
別の実施形態において、本方法は、生体サンプル中の抗ＨＢＶ抗体の検出および／または定量により特に適切であり、該方法は、該生体サンプルを本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物の少なくとも１つと、抗ＨＢＶ抗体と本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物の間での複合体の形成を可能にする条件下に接触させる工程、および該複合体の形成を任意の適当な手段によって検出および／または定量する工程を少なくとも含んでなる。
【０１３６】
当業者ならば、本発明の方法で使用される抗体、ＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物の量を容易に決定することができる。ウイルスの検出および／または定量の手段は慣例であり、当業者に周知である。例としては、ブロット、ＥＬＩＳＡ、いわゆるサンドイッチ技術、競合技術およびＰＣＲ技術（特に、いわゆる「リアルタイム」技術）が挙げられる。試薬としての本発明の抗体、ＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物の使用は、検出可能な物質とのカップリング（すなわち、物理的連結）により容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体）、発光物質、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはエクオリン）および放射性物質（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈ）が挙げられる。
【０１３７】
最後に、本発明は、生体サンプルにおけるＨＢＶ感染のin vitro診断のための、本発明のＨＢＶ部分、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物または抗体の少なくとも１つの使用に関する。
【０１３８】
本発明を例示の様式で記載してきたが、用いた用語は、限定ではなく説明という言葉の性質を有するものと理解すべきである。自明のこととして、上記の教示に照らして本発明の多くの改変および変形が可能である。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本明細書中に具体的に記載されるものとは異なる様式で実施可能であると理解すべきである。
【０１３９】
上記で引用した特許、刊行物およびデータベース記載事項の開示は総て、そのような特許、刊行物または記載事項の各々が具体的かつ個々に参照により組み込まれることが示されている場合と同程度に、具体的にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１４０】
１．材料および方法
下記の構築を、Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)に詳説されている一般的遺伝子操作および分子クローニング技術に従い、または市販のキットを用いる場合には製造者の推奨に従って行う。ＰＣＲ増幅技術は当業者に公知である（例えば、Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Pressにより出版されているPCR protocols -A guide to methods and applications, 1990参照）。アンピシリン耐性遺伝子を担持する組換えプラスミドを、１００μｇ／ｍｌの抗生物質を添加した寒天培地または液体培地の大腸菌Ｃ６００(Stratagene)で複製する。組換えワクシニアウイルスの構築は、上記に引用されている文献およびMackett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419)およびMackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857-864)中の当技術分野の従来技術に従って行う。組換えワクシニアウイルスの選択を容易にするために、大腸菌の選択遺伝子ｇｐｔ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）(Falkner and Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854)を用いる。
【０１４１】
１．１．ベクターの構築および生産
１．１．１．選択された抗原およびＨＢＶ配列株
以下に具体的に示すベクターは、ポリメラーゼ、コアポリペプチドおよびエンベロープタンパク質の免疫原性ドメインを発現するように操作されたものであった。このベクターはＨＢＶ株Ｙ０７５８７に由来し、その配列は国際データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｙ０７５８７）および刊行物に記載されている。このベクターは血清型ａｙｗの遺伝子型Ｄのウイルスである。コアポリペプチドは野生型（ａａ１〜１８３）またはアミノ酸７７〜８を欠くコアポリペプチド（すなわち、ｃｏｒｅ＊で示されるアミノ酸１〜７６および８５〜１８３を含むコア）またはＣ末端切断型ポリペプチド（１〜１４８）またはさらにアミノ酸７７〜８４を欠くＣ末端切断型コア（１〜１４８）（すなわち、ｃｏｒｅ＊ｔで示されるアミノ酸１〜７６および８５〜１４８を含むコア）のいずれかである。
【０１４２】
ポリメラーゼポリペプチドは、野生型または最初の４７個のアミノ酸を欠くＮ末端切断型ポリペプチド（４８〜８３２）または５４０番（ＤがＨ）および７１８番（ＥがＨ）（４５０番および７１８番は野生型ポリメラーゼに関して与えられたものである）においてさらに変異されたＮ末端ポリメラーゼ（４８〜８３２）または狂犬病ウイルス糖タンパク質のペプチドシグナルおよびトランスメンブランドメインに融合されている、末端切断され（４８〜８３２）、かつ、変異されたポリメラーゼ（Ｄ５４０ＨおよびＥ７１８Ｈ）（Ｐｏｌ＊ＴＭＲ）のいずれかである。
【０１４３】
選択されたＥｎｖドメインは、Ｓタンパク質のアミノ酸１４〜５１のドメイン（Ｅｎｖ１）およびＨＢｓタンパク質のアミノ酸１６５〜１９４のドメイン（Ｅｎｖ２）およびＨＢｓタンパク質のアミノ酸２０２〜２２６のドメイン（Ｅｎｖ４）である。
【０１４４】
１．１．２．末端切断および変異型ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｏｌ＊）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７８４２の構築および生産
改変型ＨＢＶポリメラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物を用い、Ｇｅｎｅａｒｔ社によって合成された。改変型ＨＢＶポリメラーゼは、ＨＢＶ  Ｙ０７５８７のポリメラーゼタンパク質（配列番号１）が、天然ＨＢＶポリメラーゼによって示されるＲＮアーゼ  ＨおよびＲＴアーゼ活性を排除するために５４０番（ＤがＨ）および７１８番（ＥがＨ）において変異されたものに相当する（結果として配列番号８に示されるアミノ酸配列および配列番号２２に示されるヌクレオチド配列が得られる）。次に、再構築されたＰｏｌ配列をプラスミドベクターにクローニングして、ＰＧＡ１５−ｐｏｌ（配列番号２７）を得る。天然ＨＢＶポリメラーゼのＮ末端に存在する最初の４７のアミノ酸が欠失された末端切断型を、以下のプライマーＯＴＧ１９０３７
【化１】
0005897464.tif 000002
（配列番号２８）およびＯＴＧ１９０３８
【化２】
0005897464.tif 000003
（配列番号２９）
を用いてｐＧＡ１５−ＰｏｌプラスミドからＰＣＲによって増幅した。得られたフラグメントを、ＭＶＡトランスファープラスミドの、ｐ７．５Ｋプロモーター(Cochran et al 1985, J, Virol, 54:30)の下流のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位に挿入し、ｐＴＧ１７８４２を得た。この変異および末端切断型ポリメラーゼを以下ｐｏｌ＊と呼ぶ。
【０１４５】
このＭＶＡトランスファープラスミドは、ＭＶＡゲノムの欠失部ＩＩＩにおける相同組換えにより、移入するヌクレオチド配列の挿入を可能とするように設計されている。このプラスミドはプラスミドｐＴＧ１Ｅ（Braun et al. 2000, Gene Ther. 7:1447に記載）に由来し、ＭＶＡ欠失部ＩＩＩの前後にフランキング配列（ＢＲＧ３およびＢＲＤ３）がクローニングされている(Sutter and Moss, 1992, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89:10847)。このトランスファープラスミドはまた、初期−後期ワクシニアウイルス合成プロモーターｐ１１Ｋ７．５の制御下に、オワンクラゲ(Aeqiiorea victoria)増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ遺伝子、ｐＥＧＰ−Ｃ１から単離、Clontech）と大腸菌(Escherichia coli)キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子）の融合物を含む（ローザンヌ大学のR. Wittekから厚意により提供）。キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの合成によって、ＧＰＴ＋組換えＭＶＡは、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地においてプラーク形成が可能となり(Falkner el al, 1988, J. Virol 62, 1849-54)、およびｅＧＦＰは組換えＭＶＡプラークの可視化を可能とする。選択マーカーｅＧＦＰ−ＧＰＴは、２つの相同配列の間に同じ配向で配置される。クローン選択が達成されれば、この選択マーカーは、選択を行わずに数回継代培養してｅＧＦＰ−ＧＰＴ組換えＭＶＡを増殖させることで容易に除去される。
【０１４６】
ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２ウイルスの生成は、ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）における相同組換えによって行い、ｐＴＧ１７８４２でトランスフェクトした（標準的なリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法に従う）。ウイルスの選択は、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地の存在下での３回のプラーク精製によって行った。上述のように、次に、選択マーカーを非選択培地での継代培養によって除去した。親ＭＶＡの混入がないことをＰＣＲによって確認した。
【０１４７】
ＨＢＶポリメラーゼの発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。増殖培地にプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２（１０μＭ）を添加して、または添加せずに、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）にＭＶＡ  ＴＧ１７８４２（Ｐｏｌ＊）をＭＯＩ  １で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗Ｐｏｌ抗体Ｈｅｐ  Ｂ  Ｐｏｌ(8D5, Santa Cruz, # sc-81591)を用いて行った。
【０１４８】
１．１．３．狂犬病エンベロープ糖タンパク質の膜係留ドメインと融合した末端切断および変異型ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｏｌ＊ＴＭＲ）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７８４３の構築および生産
次に、ＨＢＶ  Ｐｏｌ＊配列を、そのＮ末端においてペプチドシグナル（ＳＳ）と、また、そのＣ末端において狂犬病ウイルス（ＥＲＡ分離株；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ  Ｍ３８４５２に記載）の糖タンパク質に由来する膜係留配列（ＴＭＲ）と融合させることによって改変した。このＳＳ配列およびＴＭＲ配列を、それぞれプライマー対ＯＴＧ１９０４５（配列番号３０）
【化３】
0005897464.tif 000004
／ＯＴＧ１９０４７（配列番号３１）
【化４】
0005897464.tif 000005
およびＯＴＧ１９０４９（配列番号３２）
【化５】
0005897464.tif 000006
／ＯＴＧ１９０５０（配列番号３３）
【化６】
0005897464.tif 000007
を用い、プラスミドｐＴＧ８０４２（ＷＯ９９／０３８８５に記載）からＰＣＲによって増幅した。Ｐｏｌ＊配列は、プライマー対ＯＴＧ１９０４６（配列番号３４）
【化７】
0005897464.tif 000008
／ＯＴＧ１９０４８（配列番号３５）
【化８】
0005897464.tif 000009
を用い、プラスミドｐＧＡ１５−ＰｏｌからＰＣＲによって増幅した。次に、ＳＳ−Ｐｏｌ＊−ＴＭＲ配列を、以下のプライマーＯＴＧ１９０４５（配列番号３０）およびＯＴＧ１９０５０（配列番号３３）を用い、トリプルＰＣＲによって再構築した。得られたフラグメントをワクシニアトランスファープラスミドの、ｐ７．５Ｋプロモーターの下流のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位に挿入し(Cochran et al, 1985, J. Virol. 54:30)、ｐＴＧ１７８４３を得た。
【０１４９】
ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３ウイルスの生成は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えによって行った。
Ｐｏｌ＊−ＴＭＲ発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。増殖培地にプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２（１０μＭ）を添加して、または添加せずに、Ａ５４９細胞にＭＶＡ  ＴＧ１７８４３をＭＯＩ  １で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗Ｐｏｌ抗体Ｈｅｐ  Ｂ  Ｐｏｌ(8D5, Santa Cruz, # sc-81591)を用いて行った。
【０１５０】
１．１．４  欠失型のコアポリペプチド（Ｃｏｒｅ＊）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７９７１の構築および生産
Ｃｏｒｅ＊は、アミノ酸７７〜８４が欠失したＨＢＶ  Ｙ０７５８７（配列番号２）のコア配列に相当する。
Ｃｏｒｅ＊コード配列は、ｐＧＡ４−コアプラスミドから２重ＰＣＲによって再構成した。このプラスミドはＧｅｎｅａｒｔ社によって作製された。このプラスミドは、合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＣＲ産物から組み立てられた改変型ＨＢＶコア遺伝子の全長コード配列を含む。コード配列の最後の２つのコドンＣＡＡ  ＴＧＴは、Ｐｏｌとの配列相同性を避けるためにＣＡＧ  ＴＧＣに改変した（配列番号３６）。
【０１５１】
１〜７６番のコア配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９２９０（配列番号３７）
【化９】
0005897464.tif 000010
およびＯＴＧ１９２９２（配列番号３８）
【化１０】
0005897464.tif 000011
を用い、ＰＣＲによって増幅した。８５〜１８３番のコア配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９２９１（配列番号３９）
【化１１】
0005897464.tif 000012
およびＯＴＧ１９０８０（配列番号６１）
【化１２】
0005897464.tif 000013
を用い、ＰＣＲによって増幅した。ＯＴＧ１９２９０（配列番号３７）およびＯＴＧ１９０８０（配列番号６１）およびその生成された両アンプリコンを用いて、ダブルＰＣＲを行った。得られたフラグメントを、ワクシニアトランスファープラスミドの、ｐＨ５Ｒプロモーターの下流のＸｈｏＩおよびＨｐａＩ制限部位に挿入し(Rosel et al, 1986, J Virol. 60:436)、ｐＴＧ１７９７１を得た。
【０１５２】
ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１ウイルスの生成は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えによって行った。
Ｃｏｒｅ＊発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ニワトリ胚繊維芽細胞にＭＶＡ  ＴＧ１７９７１をＭＯＩ  ０．２で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ（１３Ａ９）(Santa Cruz, # sc-23946)を用いて行った。
【０１５３】
１．１．５  欠失および末端切断型コアポリペプチド（Ｃｏｒｅ＊ｔ）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７９７２の構築および生産
Ｃｏｒｅ＊ｔは、アミノ酸１４８の後で末端切断され、かつ、アミノ酸７７〜８４が欠失されたＨＢＶ  Ｙ０７５８７（配列番号２）のコア配列に相当する。
Ｃｏｒｅ＊ｔコード配列は、コード配列の最後の２つのコドンＣＡＡ  ＴＧＴを、Ｐｏｌ（配列番号３６）との配列相同性を避けるためにＣＡＧ  ＴＧＣに改変したこと以外は、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から組み立てられた全長ＨＢＶコア遺伝子をコードする配列を含むｐＧＡ４−コアプラスミドからダブルＰＣＲによって再構成した。
【０１５４】
１〜７６番のコア配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９２９０（配列番号３７）
【化１３】
0005897464.tif 000014
およびＧＴＧ１９２９２（配列番号３８）
【化１４】
0005897464.tif 000015
を用い、ＰＣＲによって増幅した。８５〜１４８番のコア配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９２９１（配列番号３９）
【化１５】
0005897464.tif 000016
およびＯＴＧ１９２９９（配列番号４０）
【化１６】
0005897464.tif 000017
を用い、ｐＧＡ４−コアからＰＣＲによって増幅した。ダブルＰＣＲを、ＯＴＧ１９２９０（配列番号３７）およびＯＴＧ１９２９９（配列番号４０）を用いて行った。得られたフラグメントを、ワクシニアトランスファープラスミドの、ｐＨ５Ｒプロモーターの下流のＸｈｏＩおよびＨｐａＩ制限部位に挿入し(Rosel et al, 1986, J Virol. 60:436)、ｐＴＧ１７９７２を得た。
【０１５５】
ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２ウイルスの生成は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えによって行った。
Ｃｏｒｅ＊ｔ発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ニワトリ胚繊維芽細胞にＭＶＡ  ＴＧ１７９７２をＭＯＩ  ０．２で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗コア抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ（１３Ａ９）(Santa Cruz, # sc-23946)を用いて行った。
【０１５６】
１．１．６  Ｅｎｖ１免疫原性ドメインと融合した欠失および末端切断型コアポリペプチド（Ｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７９９３の構築および生産
Ｃｏｒｅ−ｔ＊部分を、ＨＢｓタンパク質のアミノ酸１４〜５１にわたるＥｎｖ１ドメインと融合させた。
このＣｏｒｅ＊ｔ−Ｅｎｖ１配列は、ダブルＰＣＲによって再構成した。Ｃｏｒｅ＊ｔ配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９３１７（配列番号４１）
【化１７】
0005897464.tif 000018
およびＯＴＧ１９３１９（配列番号４２）
【化１８】
0005897464.tif 000019
を用い、ｐＴＧ１７９７２からＰＣＲによって増幅した。Ｅｎｖ１配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９３１８（配列番号４４）
【化１９】
0005897464.tif 000020
およびＯＴＧ１９３２０（配列番号４５）
【化２０】
0005897464.tif 000021
を用い、プラスミドｐＭＫ−Ｃ／Ｅ（配列番号４３）からＰＣＲによって増幅した。ダブルＰＣＲは、ＯＴＧ１９３１７（配列番号４１）およびＯＴＧ１９３２０  配列番号４５）を用いて行った。得られたフラグメントを、ワクシニアトランスファープラスミドの、ｐＨ５Ｒプロモーターの下流のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入し(Rosel et al, 1986, J Virol. 60:436)、ｐＴＧ１７９９３を得た。
【０１５７】
例示を目的として、プラスミドｐＭＫ−Ｃ／Ｅは、Ｇｅｎｅａｒｔ社によって作製されたものであり、コア配列（配列番号４３）への３つのＨＢＶ  ｅｎｖドメイン配列の挿入からなるキメラ配列を含む。天然コアおよびｅｎｖヌクレオチド配列は、ＨＢＶ  Ｐｏｌ配列との配列相同性およびまたポリＴまたはポリＧＣストレッチによる配列の不安定性を避けるために変性させた。さらに、コア配列は、アミノ酸７７〜８４を欠失させ、ａａ１４８において末端切断した。選択されたＥｎｖドメインは、Ｓタンパク質のアミノ酸１４〜５１のドメイン（Ｅｎｖ１）およびＳタンパク質のアミノ酸１６５〜１９４のドメイン（Ｅｎｖ２）およびＳタンパク質のアミノ酸２０２〜２２６のドメイン（Ｅｎｖ４）である。これら３つのドメインをそれぞれコア配列のｎｔ１２７、ｎｔ２２２およびｎｔ４１６の位置に挿入した。この配列をＭＶＡベクターに挿入すると発現細胞で細胞傷害性が生じ、ｅｎｖ−ｃｏｒｅ融合のデザインは簡単ではないことが強調されるということを述べておかなければならない。
【０１５８】
ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３ウイルスの生成は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えによって行った。
Ｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ニワトリ胚繊維芽細胞にＭＶＡ  ＴＧ１７９９３をＭＯＩ  ０．２で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗コア抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ（１３Ａ９）(Santa Cruz, # sc-23946)を用いて行った。
【０１５９】
１．１．７  Ｅｎｖ１およびＥｎｖ２免疫原性ドメインと融合した欠失および末端切断型コアポリペプチド（Ｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７９９４の構築および生産
１．１．５に記載されているＣｏｒｅ＊ｔポリペプチドを、次に、ＨＢｓタンパク質のアミノ酸１４〜５１（Ｅｎｖ１）およびアミノ酸１６５〜１９４（Ｅｎｖ２）にわたる２つの免疫原性ドメインと融合させた。
Ｃｏｒｅ＊ｔ−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２をコードするヌクレオチド配列をトリプルＰＣＲによって再構築した。Ｃｏｒｅ＊ｔ配列は、以下のプライマーＯＴＧ１９３１７（配列番号４１）およびＯＴＧ１９３１９（配列番号４２）を用い、ｐＴＧ１７９７２からＰＣＲによって増幅した。Ｅｎｖ１は、以下のプライマーＯＴＧ１９３１８（配列番号４４）およびＯＴＧ１９３２２（配列番号４６）
【化２１】
0005897464.tif 000022
を用い、ｐＭＫ−Ｃ／Ｅプラスミドから増幅した。Ｅｎｖ２は、以下のプライマーＯＴＧ１９３２１（配列番号４７）
【化２２】
0005897464.tif 000023
およびＯＴＧ１９３２３（配列番号４８）
【化２３】
0005897464.tif 000024
を用い、ｐＭＫ−Ｃ／Ｅプラスミドから増幅した。トリプルＰＣＲは、ＯＴＧ１９３１７（配列番号４１）およびＯＴＧ１９３２３（配列番号４８）を用いて行った。得られたフラグメントを、ワクシニアトランスファープラスミドの、ｐＨ５Ｒプロモーターの下流のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入し(Rosel et al, 1986, J Virol. 60:436)、ｐＴＧ１７９９４を得た。
【０１６０】
ＭＶＡ  ＴＧ１７９９４ウイルスの生成は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えによって行った。
Ｃｏｒｅ＊ｔ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ニワトリ胚繊維芽細胞にＭＶＡ  ＴＧ１７９９４をＭＯＩ  ０．２で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗コア抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ（１３Ａ９, Santa Cruz, # sc-23946)を用いて行った。
【０１６１】
１．１．８．ＣＯＲＥ−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２−Ｅｎｖ４を発現するアデノウイルスベクターＡｄＴＧ１７９０９の構築および生産
ＣＯＲＥ−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２−Ｅｎｖ４融合物をコードする合成遺伝子（８３１ヌクレオチド）は、ダブルＰＣＲによって再構成した。ＣＯＲＥは、以下のプライマーＯＴＧ１９１５２（配列番号４９）
【化２４】
0005897464.tif 000025
およびＯＴＧ１９１５４（配列番号５０）
【化２５】
0005897464.tif 000026
を用い、ｐＧＡ４−Ｃｏｒｅ（１．１．４．に記載）からＰＣＲによって増幅した。Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２−Ｅｎｖ４は、以下のプライマーＯＴＧ１９１５３（配列番号５１）
【化２６】
0005897464.tif 000027
およびＯＴＧ１９１５９（配列番号５２）
【化２７】
0005897464.tif 000028
を用い、ＧＡ４−ＥｎｖからＰＣＲによって増幅した。ダブルＰＣＲは、ＯＴＧ１９１５２（配列番号４９）およびＯＴＧ１９１５９（配列番号５２）を用いて行った。得られたフラグメントを、相同組換えによるベクターゲノムの生成を可能とするために(Chartier et al, 1996, J. Virol 70:4805)、アデノウイルス配列（それぞれアデノウイルスヌクレオチド１〜４５４およびヌクレオチド３５１３〜５７８１）によって挟まれたＣＭＶ駆動発現カセットを含むアデノウイルスシャトルプラスミドのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入した。得られたアデノウイルスベクターｐＴＧ１７９０９は、Ｅ３（ヌクレオチド２８５９３〜３０４６４）およびＥ１（ヌクレオチド４５５〜３５１２）が欠失し、このＥ１領域が、５’から３’方向に、ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター、キメラヒトβ−グロビン／ＩｇＧイントロン（Promegaにおいて入手可能なｐＣＩベクターに見られるものなど）、ＣＯＲＥ−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２−Ｅｎｖ４をコードする配列およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含む発現カセットに置換されている。組換えアデノウイルスは、ＰａｃＩで線状化したウイルスゲノムをＥ１相補細胞系統にトランスフェクトすることによって作出した。ウイルスの増殖、精製および力価測定は従前に記載されているように行った(Erbs el al., 2000, Cancer Res. 60:3813)。
【０１６２】
融合タンパク質の発現は、ウエスタンブロットによって評価した。１０６個のＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）に、ＡｄＴＧ１７９０９または陰性対照としてのエンプティーアデノウイルスを４８時間、ＭＯＩ  １０または５０で感染させた。細胞ペレットを回収し、抗ＣＯＲＥマウスモノクローナル抗体（Ｃ１−５，ｓｃ−２３９４５，Santa Cruz）でプローブした。
【０１６３】
１．１．９．Ｐｏｌ＊を発現するアデノウイルスベクターＡｄＴＧ１７９１０の構築および生産：
Ｍｅｔ開始部（４８〜８３２）を除く最初の４７のアミノ酸が末端切断され、かつ、５４０番（ＤがＨ）および７１８番（ＥがＨ）において変異された（野生型ポリメラーゼに対して）ポリメラーゼタンパク質であるＰｏｌ＊をコードする遺伝子をアデノウイルスベクターに挿入した。Ｐｏｌ遺伝子（２３６４ヌクレオチド）は、プライマーＯＴＧ１９１５５（配列番号５３）
【化２８】
0005897464.tif 000029
およびＯＴＧ１９１５６（配列番号５４）
【化２９】
0005897464.tif 000030
を用い、ｐＧＡ１５−Ｐｏｌ（１．１．２に記載）からＰＣＲによって増幅した。得られたフラグメントを、相同組換えによるベクターゲノムの生成を可能とするために(Chartier et al, 1996, J. Virol 70:4805)、アデノウイルス配列（それぞれアデノウイルスヌクレオチド１〜４５４およびヌクレオチド３５１３〜５７８１）によって挟まれたＣＭＶ駆動発現カセットを含むアデノウイルスシャトルプラスミドのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入した。得られたアデノウイルスベクターｐＴＧ１７９１０は、Ｅ３（ヌクレオチド２８５９３〜３０４６４）およびＥ１（ヌクレオチド４５５〜３５１２）が欠失し、このＥ１領域が、５’から３’方向に、ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター、キメラヒトβ−グロビン／ＩｇＧイントロン（Promegaにおいて入手可能なｐＣＩベクターに見られるものなど）、末端切断および変異型Ｐｏｌをコードする配列およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含む発現カセットに置換されている。組換えアデノウイルスは、ＰａｃＩで線状化したウイルスゲノムをＥ１相補細胞系統にトランスフェクトすることによって作出した。ウイルスの増殖、精製および力価測定は従前に記載されているように行った(Erbs el al., 2000, Cancer Res. 60:3813)。
【０１６４】
融合タンパク質の発現は、アデノウイルス感染細胞においてウエスタンブロットによって評価した。Ａ５４９細胞（１０６個）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）に、アデノウイルスＡｄＴＧ１７９１０または陰性対照としてのエンプティーアデノウイルスを４８時間、ＭＯＩ  １０または５０で感染させた。細胞ペレットを回収し、抗Ｐｏｌマウスモノクローナル抗体（８Ｄ５，ｓｃ−８１５９１，Santa Cruz）でプローブした。
【０１６５】
１．２．抗原の免疫原性の評価
抗原の免疫原性は、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫誘導の後に、Ｅｌｉｓｐｏｔ  ＩＦＮγおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによってin vivoで評価した。
【０１６６】
１．２．１  マウスモデル
試験に用いたＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスは、Pascolo et al. (1997, J, Exp. Med. 185:2043)によって記載されている。これらのマウスはＨ−２Ｄｂおよびネズミβ２−ミクログロブリン遺伝子ノックアウトを有し、ヒトβ２ｍのＣ末端がキメラ重鎖に共有結合されているトランスジェニック単鎖組織適合性クラスＩ分子（ＨＨＤ分子）（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α１−α２，Ｈ−２Ｄｂ  α３トランスメンブランおよび細胞室内ドメイン）を発現する。７〜１０週齢のマウス（雄および雌）に免疫誘導を行った。マウスの平均体重は２５〜３０ｇ前後であった。
【０１６７】
１．２．２．免疫誘導プロトコール
マウスを、群１  ＡｄＴＧ１７９０９（ｅｎｖ１、ｅｎｖ２およびｅｎｖ４免疫原性ドメインと融合したＨＢＶ  Ｃｏｒｅをコードする）による免疫誘導、群２  ＡｄＴＧ１７９１０（末端切断および変異型Ｐｏｌ＊をコードする）による免疫誘導、群３  両ベクターによる免疫誘導および群４  陰性対照としてのエンプティーアデノウイルス（ＡｄＴＧ１５１４９）による免疫誘導、の４群に分けた。総ての動物を、尾の基部に皮下注射を行うことによって免疫誘導し、群１および２の動物には、１０８ＩＵの各アデノウイルス（ＴＧ１７９０９またはＴＧ１７９１０）の皮下注射を１回施し、群３には、１０８ＩＵの各アデノウイルスを含む混合物（計２．１０８ＩＵ：１０８ＩＵのＡｄＴＧ１７９０９＋１０８ＩＵのＡｄＴＧ１７９１０）の皮下注射を１回施し、陰性対照には、２．１０８ＩＵのＡｄＴＧ１５１４９の皮下注射を１回施した。細胞性免疫応答は、免疫誘導２週間後にＩＦＮｇ  Ｅｌｉｓｐｏｔおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによって評価した。
【０１６８】
１．２．３  ペプチド
in vitro細胞刺激に用いたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープであると記載されているまたは推定される９〜１０アミノ酸の短鎖ペプチドか、または総ての対象抗原をカバーするペプチドライブラリーに含まれる１５アミノ酸の長鎖ペプチドのいずれかであった。
ポリメラーゼタンパク質の記載されているまたは推定されるＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ、コアタンパク質またはＥｎｖドメインに相当する短鎖ペプチドは、Eurogentec (Belgium)によって合成され、１００％ＤＭＳＯ(sigma, D2650)に１０ｍＭ濃度で溶かした。
【０１６９】
全ポリメラーゼ、コアおよびエンベロープタンパク質をカバーするペプチドライブラリーはProImmune (Oxford, United Kingdom)によって合成された。このＰｏｌ、ＣｏｒｅおよびＥｎｖライブラリーは１１アミノ酸がオーバーラップする１５マーペプチドから構成された。各未精製ペプチドを１００％ＤＭＳＯ(sigma, D2650)に５０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かした。各ライブラリーについて、各ペプチド２ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにペプチドをプールした。
【０１７０】
ＨＢＶ  Ｐｏｌタンパク質は、Ｐｏｌライブラリーに由来する８プールの２４〜２５ペプチド、（プール１：残基４５〜１５１をカバーする２４ペプチド；プール２：残基１４０〜２５１をカバーする２４ペプチド；プール３：残基２４１〜３４７をカバーする２４ペプチド；プール４：残基３３７〜４４７をカバーする２４ペプチド；プール５：残基４３７〜５４３をカバーする２４ペプチド；プール６：残基５３３〜６３９をカバーする２４ペプチド；プール７：残基６２９〜７３５をカバーする２４ペプチド；プール８：残基７２５〜８３２をカバーする２５ペプチド）によってカバーされ、
ＨＢＶコアタンパク質は、コアライブラリーに由来する２プールの２１〜２２ペプチド（プール１：残基１〜１００をカバーする２２ペプチド；プール２：残基８９〜１８３をカバーする２１ペプチド）によってカバーされ；
ＨＢＶ  Ｅｎｖタンパク質は、Ｅｎｖライブラリーに由来する３プールの６〜１０ペプチド（プール１：ＨＢｓ残基９〜５９をカバーする１０ペプチド；プール２：ＨＢｓ残基１５７〜１９４をカバーする９ペプチド；プール４：ＨＢｓ残基１９３〜２２６をカバーする６ペプチド）によってカバーされる。
【０１７１】
１．２．４．ＩＦＮｇ  ＥＨｓｐｏｔアッセイ
免疫マウスからの脾細胞を回収し、赤血球を溶解させた(Sigma, R7757)。２．１０５細胞ウェルを、抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（BD Biosciences；１０μｇ／ｍｌ，５５１２１６）でコーティングしたＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート(Millipore, MSHA S4510)にて、１０％ＦＣＳ(Sigma, F7524またはJRH, 12003-100M)、８０Ｕ／ｍＬペニシリン／８０μｇ／ｍＬストレプトマイシン(PAN, P06-Q7-100)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco, 25030)、１×非必須アミノ酸(Gibco, 11140)、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco, 15630)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco, 31350)および５０μＭ  β−メルカプトエタノール(Gibco, 31350)を添加したＭＥＭ培養培地(Gibco, 22571)中、陰性対照としての１０単位／ｍｌの組換えネズミＩＬ２(Peprotech, 212-12)単独の存在下、または
・ＡｄベクターによってコードされるＨＢＶ抗原中に存在する１つのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＰｏｌではＳＬＹ、ＣｏｒｅではＦＬＰ、ＩＬＣ、ＥｎｖではＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）または無関連のもの１０μＭ、
・各ペプチド終濃度５μｇ／ｍｌのペプチドプール、
・陽性対照としてのコンカナバリンＡ(Sigma, C5275)５μｇ／ｍｌ
とともに、３反復で４０時間培養した。
【０１７２】
ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞を、従前に記載されているように(Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76:12735)、Ｅｌｉｓｐｏｔ（サイトカイン特異的酵素結合免疫スポット）アッセイによって定量した。陰性対照ウェルにおけるスポットの数（ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞に相当する）を、ＨＢＶペプチドを含む試験ウェルにおいて検出されたスポットの数から差し引いた。結果は３反復のウェルで得られた平均値として示す。見られた応答の確実な試験閾値（すなわちカットオフ）は、１０６細胞に対して報告された、媒体単独＋２標準偏差で見られたスポットの平均値に相当する閾値を計算することによって求める。また、ＣＴＬ  Ｅｌｉｓｐｏｔリーダーに関連するテクニカルカットオフは、５０スポット／１０細胞（リーダーのＣＶが体系的に２０％未満であった場合を超える値である）として定義した。テクニカルカットオフと、各試験で計算された試験閾値の間の最高値を考慮して、各試験のカットオフ値を定義する。Ｅｌｉｓｐｏｔ応答の統計分析は、マン・ホイットニー検定を用いて行った。０．０５以上のＰ値を有意と見なした。
【０１７３】
１．２．５．細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
各群の各動物からの脾細胞に対してＩＣＳを行った。溶解バッファー(Sigma, R7757)で赤血球を溶解させた後、ウェル当たり２×１０６個の細胞を平底９６ウェルプレートにて、完全α（ＭＥＭ培養培地(Gibco BRL, 22571)中、陰性対照として１０単位／ｍｌのネズミ組換えＩＬ−２(Peprotech, 212-12)単独の存在下、または１０μＭの特異的ＨＢＶペプチドまたは各ペプチド終濃度５μｇ／ｍｌのペプチドプールまたは１０μＭの無関連のペプチドとともにインキュベートした。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ(BD Biosciences, 555029)を終濃度１μｌ／ｍｌですぐに５時間加えた。次に、細胞をＶ底９６ウェルプレートに回収し、１％ＦＣＳ−ＰＢＳで洗浄した。染色は、５０μｌの１％ＦＣＳ−ＰＢＳ中、ＣＤ３（ハムスターＭＡｂ抗ＣＤ３ｅ−ＰＥ、１／２００希釈）、ＣＤ８（ラットＭＡｂ抗ＣＤ８ａ−ＡＰＣ、１／６００希釈）およびＣＤ４（ラットＭＡｂ抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、１／６００希釈）（総てBD Biosciencesから、それぞれ553063、553035および553052）に対するモノクローナル抗体を用いて室温で１５分間行った。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで透過処理を施し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液(BD Biosciences, 554714)で洗浄した。その後、抗マウスＩＦＮｇ−ＰＥ抗体(BD Biosciences, 554412557724)および抗マウスＴＮＦａ−Ａｌｅｘａ４８８抗体(BD Biosciences, 557719)または抗マウスＩＦＮｇ−ＰＥ抗体(BD Biosciences, 554412557724)および抗マウス１Ｌ２−Ａｌｅｘａ４８８抗体(BD Biosciences, 557719)を室温で１５分間加え、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈで洗浄した後、細胞を１％ＦＣＳ−ＰＢＳに再懸濁させ、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ(Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ３ｅ＋、ＣＤ８ａ＋細胞またはＣＤ３ｅ＋、ＣＤ４＋細胞にゲートをかけ、ＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋またはＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋ＴまたはＴＮＦａ＋ＣＤ８＋またはＴＮＦａ＋ＣＤ４＋ＴまたはＩＬ２＋ＣＤ８＋またはＩＬ２  ＣＤ４＋ＴまたはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ＋ＣＤ８＋またはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ＋ＣＤ４＋またはＩＦＮｇ＋ＩＬ２＋ＣＤ８＋またはＩＦＮｇ＋ＩＬ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の割合％を求めた。媒体単独で得られた割合％をバックグラウンドとみなした。
【０１７４】
１．２．６．in vivo ＣＴＬアッセイ
in vivo ＣＴＬアッセイは、記載されているように行った(Fournillier et al., 2007)。脾細胞懸濁液を同系マウスの脾臓から得、赤血球を溶解させた後に２０×１０６細胞／ｍｌに調整した。３分の１の細胞をＨＢＶ特異的ペプチドの１つともにインキュベートし、別の３分の１の細胞を別のＨＢＶペプチドとともにインキュベートし（総て終濃度１０μＭにて３７℃で１時間）、最後の３分の１はパルスを行わずにおいた。５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）(Molecular probes, C1157)を、ｕｎパルスを行わなかった細胞には１６μＭ（ＣＦＳＥ−高）で、ＩＬＣまたはＶＬＱペプチドでパルスした細胞には４μＭ（ＣＦＳＥ−中）で、また、ＳＬＹまたはＦＬＰペプチドでパルスした細胞には１μＭ（ＣＦＳＥ−低）で１０分間加えた。ＰＢＳで洗浄した後、これらの３つの集団（非パルス、ＩＬＣおよびＳＬＹペプチドでパルスした細胞、または非パルス、ＦＬＰおよびＩＬＣペプチドでパルスした細胞）を混合し、計３０．１０６個の細胞を、麻酔したマウスに後眼窩静脈から注射した（ケタミン−キシラジン−ＰＢＳ混合物（Ketamine Virbac, Centravet KET204,終濃度２５ｍｇ／ｍｌ；塩酸キシラジン（Rompun Bayer, Centravet，終濃度５ｍｇ／ｍｌを使用）。従って、ＣＦＳＥ−低および中集団は、細胞傷害性Ｔ細胞によって溶解されると思われる特異的標的に相当し、ＣＦＳＥ−高集団アッセイのノーマライゼーションを可能とする内部参照であった。２４時間後、レシピエントマウスからの脾細胞をフローサイトメトリーにより分析して、ＣＦＳＥ標識細胞を検出した。リンパ球（ＳＳＣ／ＦＳＣ）にゲートをかけた後、次のゲートを事象数／ＣＦＳＥ蛍光（ＦＬ１）に基づいて設定したところ３つのピークが明らかになり、すなわち、１つ目はＣＦＳＥ−低細胞に相当し、２つ目はＣＦＳＥ−中細胞に相当し、３つ目はＣＦＳＥ−高細胞に相当する。動物ごとに、ＣＦＳＥ＋ペプチドでパルスされた標的とＣＦＳＥ＋でパルスされていない標的との比を計算した（Ｒ＝ＣＦＳＥ−低細胞の数／ＣＦＳＥ−高細胞の数）。２匹のナイーブマウスを用いてＲ参照値を求めた。各動物の特異的溶解の割合％を下式：溶解率％＝（１−Ｒマウス／Ｒ参照）×１００によって求めた。応答は、特異的溶解の割合％が１０％（カットオフ）より大きければ陽性と見なした。
【０１７５】
２．結果
２．１  ウイルスベクターによる抗原の発現
２．１．１  アデノウイルス構築物ＡｄＴＧ１７９０９およびＡｄＴＧ１７９１０からの抗原の発現
ｃｏｒｅ−ｅｎｖ１−ｅｎｖ２−ｅｎｖ４融合タンパク質の発現は、ウエスタンブロットによって評価した。Ａ５４９細胞（１０６細胞）に、ＡｄＴＧ１７９０９または陰性対照としてのエンプティーアデノウイルスを４８時間、ＭＯＩ  １０または５０で感染させた。細胞ペレットを回収し、抗コアマウスモノクローナル抗体（Ｃ１−５，ｓｃ−２３９４５，Santa Cruz）でプローブした。図１Ａに示されるように、ＡｄＴＧ１７９０９感染細胞から回収されたサンプルにおいて、予測分子量（３１．６ｋＤａ）を有する主要バンドが現れた。
【０１７６】
Ａ５４９細胞のＡｄＴＧ１７９１０感染後のＰｏｌ＊ポリペプチドの発現は、ウエスタンブロットによって評価した。次に、細胞ペレットを回収し、抗Ｐｏｌマウスモノクローナル抗体（８Ｄ５，ｓｃ−８１５９１，Santa Cruz）でプローブした。図１Ａに示されるように、ＡｄＴＧ１７９１０感染細胞から回収されたサンプルにおいて、予測分子量（８８．５ｋＤａ）を有するバンドが、いくらかの副産物（部分的ポリメラーゼタンパク質）とともに現れた。
【０１７７】
２．１．２  ＭＶＡ構築物からの抗原の発現
Ｐｏｌ＊、Ｐｏｌ＊ＴＭＲ、Ｃｏｒｅ＊ｔ、Ｃｏｒｅ＊ｔＥｎｖ１、Ｃｏｒｅ＊ｔ−Ｅｎｖ１−Ｅｎｖ２の発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２およびＭＶＡ  ＴＧ１７８４３では増殖培地にプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２（１０μＭ）を加えて、または加えずに、Ａ５４９細胞またはＣＥＦに、それぞれＭＶＡ  ＴＧ１７８４２、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２、ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３およびＭＶＡ  ＴＧ１７９９４をそれぞれＭＯＩ  １または０．２で感染させた。２４時間後、細胞を回収した。
【０１７８】
ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２では、市販のモノクローナル抗Ｐｏｌ抗体Ｈｅｐ  Ｂ  Ｐｏｌ(8D5,Santa Cruz, #sc-81591)を用いてウエスタンブロット分析を行った。図１Ｂに示されるように、見掛けの分子量が８８．５ｋＤａのタンパク質の発現が唯一ＭＧ−１３２の存在下で検出された。このバンドはＰｏｌ＊タンパク質の予測分子量を有する。
【０１７９】
ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３では、市販のモノクローナル抗Ｐｏｌ抗体Ｈｅｐ  Ｂ  Ｐｏｌ(8D5,Santa Cruz,#sc-81591)を用いてウエスタンブロット分析を行った。図１Ｂに示されるように、見掛けの分子量が９８．２ｋＤａのタンパク質の発現がＭＧ−１３２の存在下または不在下で検出された。このバンドはＰｏｌ＊−ＴＭＲタンパク質の予測分子量を有する。ＭＧ１３２の存在下ではより多くの産物、また、２００ＫＤａを超える高分子量の付加的産物が検出された。
【０１８０】
ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１では、市販のモノクローナル抗コア抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ（１３Ａ９）（Santa Cruz，＃ｓｃ−２３９４６）を用いてウエスタンブロット分析を行った。図１Ｂに示されるように、予測分子量に相当する見掛けの分子量が２１ｋＤａのＣｏｒｅ＊の発現が検出された。
【０１８１】
ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２では、市販のモノクローナル抗コア抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ（１３Ａ９）(Santa Cruz,#sc-23946)を用いてウエスタンブロット分析を行った。図１Ｂに示されるように、見掛けの分子量が予測分子量に相当する１５．８ｋＤａのＣｏｒｅ＊ｔの発現が検出された。
ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３およびＭＶＡ  ＴＧ１７９９４では、ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗コア抗体Ｈｅｐ  Ｂ  ｃＡｇ(13A9,Santa Cruz,#sc-23946)を用いて行った。図１Ｂに示されるように、見掛けの分子量がそれぞれ１９．９および２３．４ｋＤａのタンパク質の発現が検出された。このバンドはＣｏｒｅ＊ｔ−Ｅｎｖ１タンパク質およびＣｏｒｅ＊ｔ−Ｅｎｖ１−Ｆｎｖ２の予測分子量を有する。
【０１８２】
２．２．アデノウイルスベクターＡｄＴＧ１７９０９およびＡｄＴＧ１７９１０から発現される抗原の免疫原性
アデノウイルスベクターによって発現されるＨＢＶポリペプチドの免疫原性は、ＡｄＴＧ１  ７９０９またはＡｄＴＧ１７９１０単独か、またはこの２つのアデノウイルスの混合物のいずれかで免疫誘導したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて評価した。１回の皮下注射の後に誘導された特異的Ｔ細胞応答を、ポリメラーゼ、コアもしくはエンベロープドメイン、または／および着目するＨＢＶ抗原をカバーするオーバーラップペプチドのプールに存在する既知の（患者における特異的Ｔ細胞応答の標的であると記載されている）ＨＬＡ−Ａ２エピトープを用いた、Ｅｌｉｓｐｏｔ  ＩＦＮｇ、ＩＣＳおよびin vivo細胞溶解アッセイによって評価した。
【０１８３】
２．２．１．ＥｌｉｓｐｏｔアッセイによるＨＢＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の評価
Ｅｌｉｓｐｏｔ  ＩＦＮｇアッセイでは、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ(SLYADSPSV)（ＨＢＶポリメラーゼ内の８１６〜８２４番に位置する配列番号５５）に特異的なＩＦＮｇを産生する細胞を誘導し得ることが示された（図２Ａ）。ＡｄＴＧ１７９０９による免疫誘導もまた、２つのコアＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ（１８〜２７番のFLPSDFFPSV（配列番号５６）および９９〜１０８番のILCWGELMTL（配列番号５７）、ならびに３つのエンベロープＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ（双方ともＥｎｖ１に存在する１４〜２２番のVLQAGFFLL（配列番号５８）および４１〜４９番のFLGGTTVCL（配列番号５９）、ならびにＥｎｖ２に存在する１８５〜１９４番のGLSPTVWLSV（配列番号６０））に特異的なＩＦＮｇを産生する細胞の高頻度での誘導をもたらした（図２ＢおよびＣ）。ＡｄＴＧ１７９０９とＡｄＴＧ１７９１０の混合物による免疫誘導もまた、３つの抗原の同じエピトープ、すなわち、Ｐｏｌに存在するＳＬＹエピトープ、コアタンパク質に存在するＦＬＰおよびＩＬＣエピトープ、そしてエンベロープドメインの３つのエピトープ（ＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）を標的とする、匹敵するレベルの特異的ＩＦＮｇ産生細胞を誘導した（図２Ａ、ＢおよびＣ）。単一のＡｄまたは２つの混合物による免疫誘導後に検出されたＴ細胞応答の頻度は匹敵するものであったが、これは記載したベクターから発現した３つの抗原の間に主要な免疫優性が無いことを示す。
【０１８４】
２．２．２．細胞内染色アッセイによるＭＥＶ特異的ＩＦＮｇ／ＴＮＦａを産生する細胞の評価
ポリメラーゼドメイン（ＳＬＹ）、コアドメイン（ＦＬＰおよびＩＬＣ）およびエンベロープドメイン（ＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）に存在するＨＬＡ−Ａ２制限エピトープを標的とする、ＩＦＮｇ単独またはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａのいずれかを誘導することができるＣＤ８  Ｔ細胞の数を、ＩＣＳアッセイによって評価した。これら総てのエピトープが二重および単一分泌細胞の標的であった。結果を図３に示す。ＡｄＴＧ１７９０９単独またはＡｄＴＧ１７９１０との組合せで免疫誘導した動物では、およそ同等のＣｏｒｅ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答およびＥｎｖ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（図３Ｂおよび３Ｃに示されるように、ＦＬＰ、ＩＬＣ、ＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳペプチドで再刺激した後にＩＦＮｇまたはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａを産生する特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の割合％が同じ）が誘導された。他方、ポリメラーゼ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（ＳＬＹエピトープ）に関しては、Ｐｏｌ＊を発現するＡｄＴＧ１７１０で処置されたマウス（図３Ａ）ならびに程度は低いが、ＡｄＴＧ１７９１０とＡｄＴＧ１７９０９の混合物で免疫誘導されたマウス（図３Ｃ）において、極めて高い割合％のＩＦＮｇまたはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ産生ＣＤ８＋細胞が検出された。
【０１８５】
２．２．３．アデノウイルスベクターの混合物で免疫誘導した後のＨＥＶ特異的ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ産生ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞の、細胞内染色アッセイによる評価
ポリメラーゼドメイン（ＳＬＹ）、コアドメイン（ＦＬＰおよびＩＬＣ）およびエンベロープドメイン（ＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）またはコアタンパク質とＥｎｖドメインをカバーするオーバーラップペプチドのプールに存在するＨＬＡ−Ａ２制限エピトープを標的とする、ＩＦＮｇ単独またはＩＦＮｇ＋ＴＮＦａまたはＩＦＮｇ＋ＩＬ２のいずれかを誘導することができるＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞の割合％をＩＣＳアッセイによって評価した。供試した総てのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープが単一および二重分泌（ＩＦＮｇおよびＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ）細胞の標的であり、およびオーバーラップペプチドの一部のプールも、単一および二重産生細胞（ＩＦＮｇおよびＩＦＮｇ＋ＴＮＦおよびＩＦＮｇ＋１Ｌ２）の標的であった。結果を図４に示す。５匹のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをＡｄＴＧ１７９０９とＡｄＴＧ１７９１０の混合物で免疫誘導し、３匹のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをＡｄＴＧ１５１４９（陰性対照）で免疫誘導した。ＡｄＴＧ１５１４９で免疫誘導した動物は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を示さなかった（データは示されていない）。ＡｄＴＧ１７９０９とＡｄＴＧ１７９１０を組み合わせて免疫誘導した動物は、ＨＢＶ標的抗原に特異的な強いＣＤ８  Ｔ細胞応答を示し（図４Ａ）、ポリメラーゼドメイン、コアドメインおよびＥｎｖドメインに存在するＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的であり、かつ、ペプチドの「コア１」プールならびにＥｎｖ１およびＥｎｖ２ドメインをカバーするペプチドのプールに特異的な単一（ＩＦＮｇ）および二重（ＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ）産生細胞の割合％は高かった。図４Ｂおよび４Ｃに示されるように、これらのワクチン接種マウスはまた、ＨＢＶ抗原に特異的なＣＤ４  Ｔ細胞応答、特に、ペプチドの「コア２」プールおよびＥｎｖ２をカバーするペプチドのプールに特異的な単一（ＩＦＮｇ）および二重（ＩＦＮｇ＋ＴＮＦａおよびＩＦＮｇ＋ＩＬ２）産生細胞を示した。
【０１８６】
２．２．４．in vivo ＣＴＬアッセイによって測定されたin vivo細胞溶解の誘導
アデノウイルスベクターＡｄＴＧ１７９０９およびＡｄＴＧ１７９Ｉ０の、ＨＢＶ  ＨＬＡ−Ａ２エピトープを提示するａｇａｉｎｓＴ細胞に対してin vivo細胞溶解を誘導する能力を、in vivoＣＴＬアッセイによって評価した。４つのＨＬＡ−Ａ２エピトープ、すなわち、ＳＬＹ（Ｐｏｌ）、ＦＬＰおよびＩＬＣ（Ｃｏｒｅ）およびＶＬＱ（Ｅｎｖ１ドメイン）をそれぞれ試験した。６匹の動物をＡｄＴＧ１７９０９＋ＡｄＴＧ１７９１０で免疫誘導し、２匹の動物をＡｄＴＧ１５１４９（陰性対照）で免疫誘導した。各群の半数（ＡｄＴＧ１７９０９＋ＡｄＴＧ１７９１０免疫誘導マウスは３匹、ＡｄＴＧ１５１４９免疫誘導マウスは１匹）の、ＳＬＹペプチドでパルスされた細胞およびＩＬＣペプチドでパルスされた細胞をin vivoで溶解する能力を試験した。残りの半数で、ワクチン接種動物の、ＦＬＰペプチドでパルスされた細胞およびＶＬＱペプチドでパルスされた細胞をin vivoで溶解する能力を試験した。結果を図５に示す。予測されたように、ＡｄＴＧ１５１４９で免疫誘導したマウスでは、ＨＢＶ特異的in vivo細胞溶解は検出できなかった（データは示されていない）。ＡｄＴＧ１７９０９＋ＡｄＴＧ１７９１０で免疫誘導したマウスでは、２つのコアエピトープＦＬＰおよびＩＬＣに対するin vivo細胞溶解は弱かった。しかしながら、対照的に、ＡｄＴＧ１７９０９とＡｄＴＧ１７９１０の混合物で免疫誘導した動物は、ポリメラーゼエピトープＳＬＹ（図５Ａ）およびＥｎｖ１  エピトープＶＬＱ（図５Ｂ）に対して強いin vivo細胞溶解を示し、両場合とも５０％を超える特異的溶解に達した。
【０１８７】
興味深いことに、ｐｏｌ部分、コア部分およびｅｎｖ部分を発現するＡｄベクターの組合せは、同時注射した３つのＨＢＶ抗原を標的とする特異的Ｔ細胞応答の誘導を可能とする。誘導されたＴ細胞は、１つまたは２つのサイトカインを産生し、いくつかのＨＢＶペプチドが負荷された細胞をin vivoで溶解することができる。これらのデータを総て合わせると、記載されている組成物の免疫原活性およびＡｄをベクターとする場合の、それらのＣＤＳおよびＣＤ４  Ｔ細胞応答誘導能が証明される。
【０１８８】
２．３．ＭＶＡベクターＭＶＡ  ＴＧ１７８４２、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２、ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３およびＭＶＡ  ＴＧ１７９９４から発現される抗原の免疫原性
実施例１．１．２〜１．１．７に記載されているＭＶＡベクターの１つ（ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１またはＭＶＡ  ＴＧ１７９７２単独）で、または２つのＭＶＡの混合物（ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３＋ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３＋ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３またはＭＶＡ  ＴＧ１７８４３＋ＭＶＡ  ＴＧ１７９９４）で免疫誘導したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて、ＭＶＡに基づく組成物の免疫原活性を評価した。マウスに１週間おきに３回の皮下注射を施して免疫誘導し、特異的Ｔ細胞応答を、ポリメラーゼドメイン、コアドメインもしくはエンベロープドメインまたは／および着目するＨＢＶ抗原をカバーするオーバーラップペプチドのプールに存在する上記のＨＬＡ−Ａ２エピトープを用いたＥｌｉｓｐｏｔ  ＩＦＮｇおよびＩＣＳによって評価した。
【０１８９】
２．５．１．ポリメラーゼ発現ＭＶＡによる免疫誘導後のＥｌｉｓｐｏｔアッセイによるＨＢＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の評価
３匹のマウスを、末端切断および変異型ポリメラーゼ抗原を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７８４２または同じ末端切断および変異型ポリメラーゼの膜標的型を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７８４３またはＭＶＡ  Ｎ３３．１（陰性対照）のいずれかで免疫誘導した。ポリメラーゼ特異的Ｔ細胞応答を、ＳＬＹ  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープおよび該ポリメラーゼをカバーするペプチドのプールを用いたＩＦＮｇ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって評価した。ＭＶＡ  Ｎ３３．１およびＭＶＡ  ＴＧ１７８４２で免疫誘導されたマウスでは、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答は検出されなかった（データは示されていない）。しかしながら、図６Ａに示されるように、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３で免疫誘導した後では、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＳＬＹ、およびポリメラーゼのＣ末端部分をカバーするペプチドプール８に特異的なＩＦＮｇ産生細胞が誘導された（調べた試験条件下では、他のペプチドプール１〜７に対する特異的応答は検出できなかった）。これらのデータは、ＭＶＡに基づく組成物において膜係留抗原としてポリメラーゼを発現することの利点を強調する。
【０１９０】
２．３．２．コア発現ＭＶＡによる免疫誘導の後のＥｌｉｓｐｏｔアッセイによるＥＢＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の評価
８匹のマウスを、残基７７〜８４を欠失したコア部分を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７９７１、またはその末端切断型（残基１４９からのＣ末端切断）を発現するＭＶＡ  ＴＧ１７９７２、またはＭＶＡ  Ｎ３３．１（陰性対照）のいずれかで免疫誘導した。コア特異的Ｔ細胞応答を、ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ（ＦＬＰおよびＩＬＣペプチド）およびペプチドの上記コア１およびコア２プールを用いたＩＦＮｇ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。図６Ｂに示されるように、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１による免疫誘導により、ＨＬＡ−Ａ２制限ＦＬＰおよびＩＬＣペプチド、ならびにコア抗原をカバーする２つのペプチドプールに対して特異的な散在性Ｔ細胞応答を誘導することができる（図６Ｂ）。調べて試験条件下で供試ペプチドを用いた場合、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２で免疫誘導したマウスにおいてコア特異的Ｔ細胞応答は検出できなかった（データは示されていない）。
【０１９１】
２．３．３．ＭＶＡベクターの組合せによる免疫誘導後のＥｌｉｓｐｏｔアッセイによるＨＢＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の評価
３匹のマウスをＭＶＡ  ＴＧ１７８４３と、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２、ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３およびＭＶＡ  ＴＧ１７９９４との混合物で免疫誘導し、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を、上記のペプチドを用いたＥｌｉｓｐｏｔ  ＩＦＮｇアッセイによって評価した。
・ポリメラーゼ特異的Ｔ細胞応答は、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３＋ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２（図７Ａに示されるように２／３の動物で陽性応答）、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３＋ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３（図７Ｂに示されるように３／３の動物で陽性応答）およびＭＶＡ  ＴＧ１７８４３＋ＭＶＡ  ＴＧ１７９９４の組合せ（図７Ｃに示されるように２／３の動物で陽性応答）を接種した動物の大多数に検出された。ＩＦＮｇ産生細胞の頻度は、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３を単独で注射した場合（図６Ａ）に見られるものに匹敵すると思われ、ベクターの組合せは誘導される免疫応答に悪影響を及ぼさないことを示す。
・接種を行った動物において、調べた試験条件下では、ＨＬＡ−Ａ２またはペプチドプールを用いた場合、コア特異的応答は検出できなかった（データは示されていない）。
・ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３を含む組合せで接種を行った動物において、調べた試験条件下では、Ｅｎｖ１  ＨＬＡ−Ａ２またはペプチドプールを用いた場合、ｅｎｖ特異的応答は検出できなかった（データは示されていない）。
・図７Ｃに示されるように、ＭＶＡ  ＴＧ１７９９４を含む組合せで免疫誘導した３匹のうち２匹の動物において、ＨＬＡ−Ａ２制限ＧＬＳエピトープおよびＥｎｖ２をカバーするペプチドプールの双方に対するＥｎｖ２−特異的Ｔ細胞応答が検出された（これらの試験条件下ではＥｎｖ１ドメインに対するＴ細胞応答は検出できなかった（データは示されていない））。
【０１９２】
同じ条件でＩＣＳアッセイを行ったところ、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイで見られた結果が確認された（データは示されていない）。
興味深いことに、ｐｏｌ部分、コア部分およびｅｎｖ部分を発現するＭＶＡベクターの組合せは、同時注射したｐｏｌおよびｅｎｖ２抗原を標的とする特異的Ｔ細胞応答の誘導を可能とする。
これらのデータを考え合わせると、記載されている組成物の免疫原活性およびそれらの、主要なＨＢＶ抗原に対するＴ細胞応答誘導能が証明される。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】アデノウイルスおよびＭＶＡ感染細胞からのＨＢＶポリペプチドの発現を示す。Ａ５４９細胞またはニワトリ胚繊維芽細胞は、アデノウイルスにはＭＯＩ１０もしくは５０、ＭＶＡにはＭＯＩ０．２もしくは１で感染させ、感染４８時間後に細胞を溶解させた。次に、種々のＡｄ（図１Ａ）およびＭＶＡ（図１Ｂ）構築物に感染した細胞から得た細胞溶解液を用いてウエスタンブロットを行い、特異的ＨＢＶタンパク質を検出した。コア含有ポリペプチドを、一次抗体としての抗Ｐｏｌ抗体（８Ｄ５、１／２００希釈）とともに抗コア抗体（Ｃ１〜５または１３Ａ９、１／２００希釈）およびポリメラーゼ含有ポリペプチドを用いて検出し、二次抗体はＨＲＰと結合させた。ＡｄＴＧ１７９０９およびＡｄＴＧ１７９１０によって発現されるタンパク質の予測サイズはそれぞれ３１．６ｋＤａおよび８８．５ｋＤａである。ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２、ＭＶＡ  ＴＧ１７９９３およびＭＶＡ  ＴＧ１７９９４によって発現されるタンパク質の予測サイズはそれぞれ２０．２ｋＤａ、１５．８ｋＤａ、２０ｋＤａおよび２３．５ｋＤａである。ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２およびＭＶＡ  ＴＧ１７８４３によって発現されるタンパク質の予測サイズはそれぞれ８８．５ｋＤａおよび９８．２ｋＤａである。
【図２】Ｅｌｉｓｐｏｔｓ  ＩＦＮγアッセイにおける、アデノウイルスによってコードされるＨＢＶポリペプチドの免疫原性を示す。５匹の各マウス（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス）にＡｄＴＧ１７９０９単独（黒いバー）、ＡｄＴＧ１７９１０単独（白いバー）または組合せ（ＡｄＴＧ１７９０９＋ＡｄＴＧ１７９１０）（グレーのバー）のいずれかで１回免疫誘導を行った。図２Ａは、ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＳＬＹ（配列番号５５）または無関連のもの（示されていない）を用いた場合のポリメラーゼタンパク質を標的とする特異的Ｔ細胞応答を示す。図２Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＦＬＰ（配列番号５６）またはＩＬＣ（配列番号５７）を用いた場合のコアタンパク質を標的とする特異的Ｔ細胞応答を示す。図２Ｃは、ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＶＬＱ（配列番号５８）、ＦＬＧ（配列番号５９）またはＧＬＳ（配列番号６０）を用いた場合のＥｎｖドメインを標的とする特異的Ｔ細胞応答を示す。各バーは各ワクチン接種マウスを表し、斜線のバーは各群の中央値を表す。結果は、３反復のウェルから得られた１０６個の脾臓細胞で観察されたスポット数の平均値として示す。スポット数が１０６個の細胞当たり５０スポットより多ければ、応答を陽性とみなした（このカットオフを黒い太線で表す）。
【図３】細胞内サイトカイン染色アッセイにおける、アデノウイルスベクターによってコードされたＨＢＶポリペプチドの免疫原性を示す。５匹の各マウス（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス）にＡｄＴＧ１７９０９（図３Ｂ）、ＡｄＴＧ１７９１０（図３Ａ）またはＡｄＴＧ１７９０９とＡｄＴＧ１７９１０の組合せ（図３Ｃ）のいずれかで１回免疫誘導を行った。脾細胞を各ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＰｏｌではＳＬＹ、ＣｏｒｅではＦＬＰ、ＩＬＣ、ＥｎｖではＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）または無関連のものの存在下、Ｇｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇを用いて５時間培養した。各ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的なサイトカイン（ＩＦＮｇおよび／またはＴＮＦａ）を産生するＣＤ８＋細胞の割合％をＩＣＳアッセイによって評価した。各バーは各ワクチン接種マウスを表し、ＩＦＮｇ産生細胞を黒いバーで、ＴＮＦａ産生細胞を白いバー、ＩＦＮｇ＋ＴＮＦａ産生細胞を斜線のバーで表し、マウスごとにこれらの細胞集団を総て積み上げた。
【図４】細胞内サイトカイン染色アッセイによって検出された、アデノウイルスベクターによってコードされたＨＢＶポリペプチドのＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答誘発能を示す。５匹の各マウス（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス）にＡｄＴＧ１７９０９およびＡｄＴＧ１７９１０の混合物で１回免疫誘導を行った。脾細胞を、各ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＰｏｌではＳＬＹ、ＣｏｒｅではＦＬＰ、ＩＬＣ、ＥｎｖではＶＬＱ、ＦＬＧおよびＧＬＳ）または抗原性ドメイン全域または無関連のペプチドをカバーするオーバーラップペプチドのプール（１１のアミノ酸がオーバーラップする１５ａａ、Ｃｏｒｅで２プールのペプチド、Ｅｎｖで２プールのペプチド）の存在下、Ｇｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇを用いて５時間培養した。ＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαを産生する、誘導された特異的ＣＤ８  Ｔ細胞（図４Ａ）、ならびにＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαを産生する（図４Ｂ）またはＩＦＮγおよび／またはＳＬ２を産生する（図４Ｃ）、誘導された特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を、ＩＣＳアッセイによってモニタリングした。各バーは各ワクチン接種マウスを表し、ＩＦＮｇ産生細胞をグレーのバー、ＴＮＦａまたは１Ｌ２産生細胞を白いバーおよびＩＦＮｇ＋ＴＮＦａまたはＩＦＮｇ＋ＩＬ２産生細胞を斜線のバーで表し、マウスごとにこれらの細胞集団を総て積み上げた。各群の中央値も示す。
【図５】ＨＢＶポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターの、ＨＢＶ  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープが負荷された標的細胞に対してin vivoで機能的細胞溶解を誘導する能力を示す。３匹の各マウス（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス）に、ＡｄＴＧ１７９０９およびＡｄＴＧ１７９１０の組合せ（Ｍ１〜Ｍ３）で１回免疫誘導を行い、陰性対照（Ｍ０）として１匹のマウスに、エンプティーアデノウイルスベクターで免疫誘導を行った。ＨＢＶ  ＨＬＡ−Ａ２エピトープが負荷されたまたは負荷されない（陰性対照）同系マウスからのＣＦＳＥ染色脾細胞をワクチン接種マウスに静注した。２４時間後、各マウスに対してフローサイトメトリーにより、染色細胞のin vivo溶解を評価し、材料および方法に示されているように計算した。ＡｄＨＢＶを接種した３匹のマウスに関して、各ペプチドで見られた特異的溶解の平均値を計算し、示した（平均値Ｍ１〜Ｍ３）。
【図６】Ｅｌｉｓｐｏｔｓ  ＩＦＮγアッセイによって決定された、ＭＶＡベクターによってコードされるＨＢＶポリペプチドの免疫原性を示す。各マウス（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス）に、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２またはＭＶＡ  ＴＧ１７８４３（図６Ａ）またはＭＶＡ  ＴＧ１７９７１（図６Ｂ）またはＭＶＡ  ＴＧ１７９７２または陰性対照ＭＶＡ  ＴＧＮ３３．１（データは示されていない）のいずれかで、１週間おきに３回、免疫誘導を行った。図６Ａは、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４２（濃いグレーのバー）またはＭＶＡ  ＴＧ１７８４３（薄いグレーのバー）で免疫誘導を行った後、ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＳＬＹ（配列番号５５）、ポリメラーゼタンパク質のＣ末端部分をカバーするペプチドのプール８（１１アミノ酸／プールがオーバーラップする１５アミノ酸の２５ペプチド）、無関連のペプチドまたは媒体（陰性対照）を用いた場合の、ポリメラーゼタンパク質を標的とする特異的Ｔ細胞応答を示す。図６Ｂは、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７１で免疫誘導を行った後、ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＦＬＰ（配列番号５６）、ＩＬＣ（配列番号５７）、ペプチドプール「コア１およびコア２」（１１アミノ酸／プールがオーバーラップする１５アミノ酸の２１〜２２ペプチド）、無関連のペプチドまたは媒体（陰性対照）を用いた場合の、コアタンパク質を標的とする特異的Ｔ細胞応答を示す。各バーは各ワクチン接種マウスを表し、斜線のバーは各群の平均値を示す。結果は、３反復のウェルから得られた１０６個の脾臓細胞で観察されたスポット数の平均値として示す。スポット数が１０６個の細胞当たり５０スポットより多ければ、応答を陽性とみなした（このカットオフを黒い点線で表す）。
【図７】Ｅｌｉｓｐｏｔｓ  ＩＦＮγアッセイによって決定された、マウスに同時注射されたＭＶＡベクターによってコードされるＨＢＶポリペプチドの免疫原性を示す。各マウス（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス）に、ＭＶＡ  ＴＧ１７８４３と、ＭＶＡ  ＴＧ１７９７２（図７Ａ）もしくはＭＶＡ  ＴＧ１７９９３（図７Ｂ）もしくはＭＶＡ  ＴＧ１７９９４（図７Ｃ）いずれかとの混合物で、または陰性対照としてのＭＶＡ  ＴＧ  Ｎ３３．１単独（データは示されていない）で、１週おきに３回、免疫誘導を行った。ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＳＬＹ（配列番号５５）を用いた場合のポリメラーゼタンパク質を標的とする特異的Ｔ細胞応答、およびＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＧＬＳ（配列番号６０）またはＥｎｖ２ドメインをカバーするペプチドプール（１１アミノ酸がオーバーラップする１５アミノ酸長のペプチドのプール）を用いた場合のＥｎｖドメインを標的とする特異的Ｔ細胞応答を決定した。無関連のペプチドおよび媒体を陰性対照として用いた。各バーは各ワクチン接種マウスを表し、斜線のバーは各群の平均値を表す。結果は、３反復のウェルから得られた１０６個の脾臓細胞で観察されたスポット数の平均値として示す。スポット数が１０６個の細胞当たり９２スポットより多ければ、応答を陽性とみなした（このカットオフを黒い点線で表す）。
【図１】
0005897464.tif 000031
【図２−１】
0005897464.tif 000032
【図２−２】
0005897464.tif 000033
【図３】
0005897464.tif 000034
【図４−１】
0005897464.tif 000035
【図４−２】
0005897464.tif 000036
【図５】
0005897464.tif 000037
【図６】
0005897464.tif 000038
【図７】
0005897464.tif 000039
【配列表】
0005897464000001.app