(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系バイオマスを、加水分解酵素と発酵微生物である酵母とにより同時に反応させる同時糖化発酵反応によりエタノールを製造する方法において、
該セルロース系バイオマスを、厨芥、食品廃棄物、農産廃棄物、畜産廃棄物、下水汚泥、有機性汚泥のうちの１種以上から構成される有機性廃棄物とともに同時糖化発酵反応に付し、
該有機性廃棄物は、同時糖化発酵反応に付す前に細分化の処理のみが施されたものであり、
同時糖化発酵反応期間が２日以上を要するものであり、
反応槽当たりの酵母の初期添加乾燥重量を０．１２５〜０．００２５ｇ／ｋｇとすることを特徴とする、方法。
【請求項２】
同時糖化発酵反応時の前記セルロース系バイオマスの濃度が、総反応量に対して１０〜２５％である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスを原料とした同時糖化発酵によるエタノール製造方法のうち、原料の混合使用による発酵用微生物の初期使用量低減技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料代替として温暖化ガスの発生抑制に寄与すると言われているバイオ燃料が注目されている。そのうち、バイオエタノールはカーボンニュートラルの思想の下、ブラジルやアメリカなど世界中で生産量が増加している。一方で、食物由来のバイオエタノールは、原料生産時に多くのエネルギーを使用していることから温暖化ガス低減への疑問や、食料との競合から食料価格の高騰問題、新規農地開墾に伴う更なる環境悪化などが懸念されており、食料と競合しない既存のバイオマスの利活用として、林地残材や農作物の非可食部、稲わらなどの農業残渣といったセルロース系バイオマスの利活用が望まれている。
【０００３】
このようなセルロース系バイオマスは、ホロセルロースがその有機物組成の半分以上を占めており、その構成単位が単糖であることから、分解し、エネルギー転換を行うことが検討されている。
【０００４】
このようなセルロース系バイオマスは、酸やアルカリを用いた化学的処理や、熱や圧力をかける物理的な処理、酵素による加水分解が試みられ、またこれらの併用も検討されている。特に環境負荷が少なく、副産物の生成がほとんどない酵素糖化法は有用な方法の１つである。
【０００５】
セルロース系バイオマスの酵素糖化を行い、エタノール製造原料とする場合、糖化後に糖化液を発酵させるという糖化後発酵方法、および糖化と発酵を同時に行う同時糖化発酵（simultaneous saccharification and fermentation以下、SSF）の２つの方法に大別される。糖化後発酵を選択した場合、エタノール発酵後に蒸留を行うことを考えれば蒸留時のエネルギー損失を考慮して、高原料濃度由来の糖化液を作製するか、低原料濃度由来の糖化液を濃縮するかの２つが考えられる。前者は酵素の競争阻害（生成物阻害）により酵素活性が徐々に低下し、後者は糖液の濃縮に多くのエネルギーが必要である。このような高濃度原料に対する問題を解決できる方法として近年特にSSFが有用な方法の１つとして認識されてきている。
【０００６】
SSF反応は原料以外に少なくとも発酵用微生物と加水分解酵素が必要であり、その量のバランスにより効率的な反応を実現できる。セルロース系バイオマスを原料としてSSF反応を行う際にはセルロースを加水分解する酵素であるセルラーゼを加え、発酵用微生物には酵母やザイモモナスなどを用いて、加水分解により得られた糖からエタノールへの変換が行われる。現在セルラーゼの値段が高く、コストの低下が必要であると言われているが、一方で酵母などの微生物も反応に多くの量が必要となる。例えば、非特許文献１には、100mLのSSF反応において、8gのコーンストーバーを原料に用い、各種栄養塩を添加後、1gの乾燥酵母を使用して反応を行い、最大27.8g/Lのエタノール濃度が得られているが、このときに使用する1g の乾燥酵母を生産するためには、一般的にはプラトーに達した酵母培養液が少なくとも25mL程度以上必要となり、SSF反応の少なくとも１／４以上の規模で前培養を行わなければならなくなる。一方、非特許文献２には乾燥重量当たり0.5g/Lの酵母使用の報告がある。
【０００７】
また、特許文献１で検討されているSSF（並行複発酵）の開始時の酵母使用量はOD600nm＝２の濁度に調製しており、0.5〜2g/L程度の使用量と考えられる。
【０００８】
SSF反応時に必要な酵母量は、少なくとも競争阻害により活性が低下するほど糖が生成してしまうとSSF反応の利点が抑制されてしまうため、使用する酵素の活性である加水分解能の維持のために、多めに添加する必要があると考えられる。
【０００９】
現在工業化されている回分発酵によるエタノール発酵反応では、反応容量当たり、時間当たりに生成するエタノール量は、1.3〜1.5g/L/h（非特許文献３）であり、２日間あれば60−70g/Lのエタノールが製造できるが、この場合発酵槽の数分の１の容量の前培養槽が必要となり、前培養に必要な培地や栄養分などが大量に必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−００４７３０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Fuel Processing Technology, Volume 90, Issue 10, October 2009, Pages 1193-1197
【非特許文献２】Bioresource Technology, Volume 101, Issue 9, May 2010, Pages 3126-3131
【非特許文献３】アルコールハンドブック第9版(1997)、発酵ハンドブック2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
SSF反応により、セルロース系バイオマスを用いたエタノール製造において、酵母の使用量は高コストの原因となりうるが、使用量を低減することは安定的な反応が実現できず、酵素の使用量も増大する原因となる。実際に検討されている酵母使用量では、SSF反応槽の数分の１という容量での前培養が必要となり、前培養コストおよび設備負担の点で問題であり、ひいては発酵によるバイオエタノールの普及の障害となる可能性が高い。
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、発酵用微生物の初期使用量を低減させることができ、なおかつ、安定的な反応を実現することができる、エタノール製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らが鋭意検討した結果、セルロース系バイオマスを有機性廃棄物とともに同時糖化発酵反応に付すことにより上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）セルロース系バイオマスを、加水分解酵素と発酵微生物である酵母とにより同時に反応させる同時糖化発酵反応によりエタノールを製造する方法において、
該セルロース系バイオマスを、厨芥、食品廃棄物、農産廃棄物、畜産廃棄物、下水汚泥、有機性汚泥のうちの１種以上から構成される有機性廃棄物とともに同時糖化発酵反応に付し、
反応槽当たりの酵母の初期添加乾燥重量を０．１２５〜０．００２５ｇ／ｋｇとすることを特徴とする、方法；および
（２）同時糖化発酵反応時の前記セルロース系バイオマスの濃度が、総反応量に対して１０〜２５％である、上記（１）に記載の方法；
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、セルロース系バイオマスを、厨芥、食品廃棄物、農産廃棄物、畜産廃棄物、下水汚泥、有機性汚泥のうちの１種以上から構成される有機性廃棄物とともに同時糖化発酵反応に付し、反応槽当たりの酵母の初期添加乾燥重量を０．１２５〜０．００２５ｇ／ｋｇとした。これにより、本発明では、発酵用微生物の初期使用量を低減させることができ、なおかつ、安定的な反応を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】比較例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例１の結果を示すグラフである。
【図３】実施例２において、SSF反応により得られたエタノール濃度の結果を示すグラフである。
【図４】実施例２において、反応中のCFUの推移を示すグラフである。
【図５】本発明により得られる効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明にいう、セルロース系バイオマスとは、そのバイオマスの構成成分中のホロセルロース含量が最も主要であるものであれば特に限定されないが例えば、廃材、おがくず、剪定枝、紙、紙くず、製紙スラッジ、藻類、草本類、綿類、布類などや、それらの混合物が考えられる。
【００２０】
また、セルロース系バイオマスとともに同時糖化発酵原料とする有機性廃棄物は、食料と競合せず、酵母の増殖に必要な成分を含んでいるものであれば限定されるものではないが、例えば厨芥、食品廃棄物、農産廃棄物、畜産廃棄物、下水汚泥、有機性汚泥のうちの１種以上から構成され得る。セルロース系バイオマスに対する有機性廃棄物の比率は、乾燥重量比で１０〜６０％が好ましい。
【００２１】
SSF反応を行う際に用いる加水分解酵素は、セルロース系バイオマスを原料とすることからセルラーゼは必須であり、さらに付加的にキシラナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼといった他の糖鎖の加水分解酵素を加えてもよい。また、ともに原料として用いる厨芥、食品廃棄物、農産廃棄物、畜産廃棄物、下水汚泥、有機性汚泥を加水分解する酵素としてアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、といった加水分解酵素を少なくとも1種以上加えることで、反応の進行を促進することができると考えられる。
【００２２】
これら原料はSSF反応に用いる前に、反応をより良好に行うための前処理を行うこともできる。それら前処理としては、微細化、曝砕、加圧、加熱、薬剤処理、ｐＨ調整、濃度調整、脱水、加水、腐敗、混和、などや、これらの複合処理が考えられるが、特に限定されるものではない。
【００２３】
本発明で、混合したバイオマスを原料に用いた場合のSSF反応に必要な酵母量については、反応量当たりの酵母の乾燥重量0.125g/kg以下で反応を行うことができ、0.0025g/kg以上の量で反応を行うことができる。これは、濁度で換算すると、およそOD600nmで計測した場合には、使用する酵母の種類にもよるが、最大でも0.1以下と考えられる。一般的な回分発酵で用いられる菌体量が数g/Lであり、研究報告が行われているSSF反応に用いられる酵母量でも0.5g/kg程度が下限であることを鑑みると、酵母の使用量は数分の１から数百分の１の使用量となる。
【００２４】
SSF反応を行う時の原料濃度は特段限定されるものではないが、バイオマスを原料としているため、原料から100%エタノールに変換されることはなく、後段の蒸留におけるエネルギー損失を抑制することを考えると、セルロース系バイオマスの濃度は総反応量に対して10〜25％の濃度、すなわち含水率が75〜90％であることが望ましい。
【００２５】
酵素による競争阻害を抑制することで酵素活性の維持による酵素コストの低減がSSF反応の最も大きな利点であるが、反応時間を多くとることでも酵素コストが低減でき、また酵母の増殖期間を多くとる方が安定したSSF反応が実現する可能性が高くなることを考慮すると、SSF反応期間は特段限定されるものではないが、２日以上で行うことが望ましい。
【００２６】
一般的な回分発酵で用いられる酵母菌体量が少なくとも数g/Lであり、研究報告が行われているSSF反応に用いられる酵母量が0.5g/kg程度が下限であることを鑑みると、本発明の反応量当たりの酵母の乾燥重量が0.125g/kg以下という使用量は、酵母培地コストは数分の１から数百分の１以下となる。
【００２７】
一般的に酵母は、プレートで培養からフラスコ培養を経て、約１０倍ずつのスケールで前培養が行われていく。したがって、本発明により、最も大きな前培養槽設備の削減や、冷蔵保存する場合の保存場所および保存施設の低減が図れる。
【００２８】
このとき、本発明の要素であるセルロース系バイオマスと、ともに反応させる有機性廃棄物との混合原料、酵母及び酵素を添加することで開始されるSSF反応は、酵母の添加量を減らすことで、反応開始直後から、主に有機性廃棄物由来の栄養塩と酵素による加水分解で得られた構成糖を用いて、SSF反応に十分な量まで増殖が起こるため、酵母量が低減される。したがって、増殖に要するエネルギー、すなわち本来ならエタノールに転換されるはずの糖類が消費されることからエタノール生成量が低下するとも考えられるが、実際の効果としては増加することを確認している。増殖に適さない条件下であるセルロース系バイオマスのみを原料として用いた場合には初期に大量の酵母を用いてSSF反応を開始しなければ、酵素の競争阻害によりSSF反応の進行が抑制されてしまうが、その分大量に存在する酵母をSSF反応期間中維持するためにカロリーが消費されてしまい、エタノールへと変換されないと考えられる。このように、本発明での低減された酵母使用量は、過剰な菌体により消費されるエネルギーを回収する効果もある。図５は、このような回収されるエネルギーをグラフ中の網掛け部分で示している。
【００２９】
また、SSF反応後に多くの酵母が残存するため、反応液の再利用時には酵母の再添加量を減量もしくは割愛できる。
【００３０】
次に、本発明について実施例により具体的に説明する。
【００３１】
（実施例）
（比較例１）
一般廃棄物から手選別により紙類を抽出し、パルピング（離解）処理を行った。得られたパルプをスクリーンにより異物を除去後、スクリュープレスにて脱水した紙パルプをセルロース系バイオマスとした。得られた紙パルプのホロセルロース含量は約85%であった。
【００３２】
調製した紙パルプを重量濃度10%に調製したスラリーに、加水分解酵素と酵母を同時に作用させ、同時糖化発酵反応を行った。加水分解酵素はジェネンコア社製アクセルレースを用い、酵母使用量は0.125−2.5g-dry/kg-反応量の範囲で行ない、38℃でSSF反応を行った。エタノール濃度はサンプリング後、沸騰水中にて失活処理を行い、遠心後の上清をバイオセンサー（王子計測機製BF-5）により分析を行った。
【００３３】
その結果を図1に示す。紙パルプのみを原料として用いた場合には、酵母使用量依存的に生成エタノール量が増加し、安定的および効率的なSSF反応のためにはおよそ1g-dry/kg程度以上の酵母使用量が必要であった。
【００３４】
（実施例１）
前記紙パルプに、一般廃棄物より手選別後ミキサーにて細分化した厨芥を混合してSSF反応を行った。
【００３５】
紙パルプおよび厨芥をそれぞれ15%および10%の重量比率で混合して、これを混合原料として用いて、加水分解酵素と酵母を同時に作用させ、同時糖化発酵反応を38℃で行った。加水分解酵素はジェネンコア社製アクセルレースとともに、ノヴォザイム社製スピリザイムを用い、酵母使用量は0.0025-2.5g-dry/kg-反応量の範囲で行った。エタノール濃度はサンプリング後、沸騰水中にて処理を行い、遠心後の上清についてバイオセンサー（王子計測機製BF-5）により分析を行った。
【００３６】
その結果を図２に示す。比較例１で示した紙パルプのみの原料で必要と考えられる酵母使用量である1g-dry/kgよりも百分の１量の使用量でも反応が進行しており、さらに酵母使用量が少ない方が得られるエタノール量が多い結果であった。
【００３７】
したがって、セルロース系バイオマスである紙類に厨芥を混合して得られる混合原料のSSF反応により、酵母使用量を軽減することができ、その減少率は最大数百分の１以下であることが確認できた。
【００３８】
また、軽減した酵母使用量での反応により、エタノール生成量が増加することも示された。
【００３９】
（実施例２）
紙パルプのみの原料において十分な酵母量（1.25g/kg）を用いた場合、紙パルプのみの原料において少ない酵母使用量（0.025g/kg）を用いた場合、厨芥を1割含む混合原料において十分な酵母使用量（0.025g/kg）を用いた場合、および厨芥を2割含む混合原料において十分な酵母使用量（0.025g/kg）を用いた場合の４通りについて、実施例1と同様の条件にてSSF反応を行った。
【００４０】
エタノール濃度はサンプリング後、沸騰水中にて処理を行い、遠心後の上清についてバイオセンサー（王子計測機製BF-5）により分析を行った。また、別途サンプリングを行い、１０２〜１０４に希釈後YPD(2%グルコース)プレートにまき、30℃で培養後、酵母のコロニーを計数することでCFU(コロニーフォーミングユニット)を調べた。
【００４１】
SSF反応により得られたエタノール濃度の結果を図３に、反応中のCFUの推移を図４に示す。
【００４２】
紙パルプのみを原料とした場合では、十分な酵母量（1.25g/kg）を用いたSSF反応に比べて、1/50だけ少ない酵母使用量（0.025g/kg）を用いたSSF反応では明らかにエタノール生成量が少なかった。
【００４３】
一方、厨芥を１割もしくは２割混合した原料を用いたSSF反応では、１日後のエタノール量が若干少ないものの、２日目以降においては紙パルプ単独で酵母を50倍加えた場合と同等のエタノール量が生成した。
【００４４】
CFUの結果では、紙パルプのみを原料とした場合に、十分な酵母量を加えた場合、減少するのみであったが、1/50量では１日後以降に増殖していた。しかし、その増殖量は等量の酵母を用いた厨芥混合原料に比べると少なかった。
【００４５】
SSF反応では、エタノールの含有量が多くなるにつれて酵母へのストレスが増加し、さらに反応中の酵素活性の低下や基質の減少により、単位時間当たりに加水分解され生成する糖量は減少する。したがって、反応時間が進行するほど酵母の生育可能数は減少すると考えられるが、図４において、混合原料では生菌数が維持されていることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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