(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のエリスロポエチン(ＥＰＯ)接合体分子であって、前記ＥＰＯの各々が、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と共有結合しており、前記共有結合の５０％超が前記ＥＰＯタンパク質のＮ末端のα‐アミノ基でのカルバメート結合を介し、５０％未満の共有結合は、前記ＥＰＯタンパク質のリシン１１６、リシン５２、もしくはリシン１５４で又はこれらの組合せでの結合である、複数のＥＰＯ接合体分子。
【請求項２】
前記ＥＰＯタンパク質が、１つ又は２つのＰＥＧ分子と共有結合している、請求項１記載の複数のＥＰＯ接合体分子。
【請求項３】
前記ＰＥＧ分子がＳＣ‐ＰＥＧである、請求項1又は２記載の複数のＥＰＯ分子接合体分子。
【請求項４】
（a）複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）接合体分子であって、前記ＥＰＯの各々が、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と共有結合しており、前記共有結合の５０％超が、前記ＥＰＯタンパク質のＮ末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、５０％未満の共有結合は、前記ＥＰＯタンパク質のリシン１１６、リシン５２、もしくはリシン１５４で又はこれらの組合せでの結合である、複数のＥＰＯ接合体分子と、
（b）薬学的に許容される担体
とを含む、医薬組成物。
【請求項５】
前記ＥＰＯタンパク質が、１つ又は２つのＰＥＧ分子と共有結合している、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ分子がＳＣ‐ＰＥＧである、請求項４又は５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧ分子が、１０ｋＤ〜４０ｋＤの分子量を有し、かつ直鎖状または分枝鎖状のいずれかである、請求項４〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記薬学的に許容される担体がタンパク質を含まない、請求項４〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
（ａ）複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）接合体分子であって、それぞれのＥＰＯが少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と共有結合しており、前記共有結合の５０％超が、前記ＥＰＯタンパク質のＮ末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、５０％未満の共有結合は、前記ＥＰＯタンパク質のリシン１１６、リシン５２、もしくはリシン１５４で又はこれらの組合せでの結合である、複数のＥＰＯ接合体分子と、
（ｂ）薬学的に許容される担体
とを含む治療有効量の組成物の、赤血球欠乏の治療を必要とする患者用の薬剤の調製における使用。
【請求項１０】
前記ＥＰＯタンパク質が、１つ又は２つのＰＥＧ分子と共有結合している、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記薬学的に許容される担体がタンパク質を含まない、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
（a）複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）接合体分子であって、それぞれのＥＰＯが少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と共有結合しており、前記共有結合の５０％超が、前記ＥＰＯタンパク質のＮ末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、５０％未満の共有結合は、前記ＥＰＯタンパク質のリシン１１６、リシン５２、もしくはリシン１５４で又はこれらの組合せでの結合である、複数のＥＰＯ接合体分子と、
（b）薬学的に許容される担体
とを含む、赤血球欠乏の治療のための医薬組成物。
【請求項１３】
前記共有結合の７９％超が、前記ＥＰＯタンパク質のＮ末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、２１％未満の共有結合は、前記ＥＰＯタンパク質のリシン１１６、リシン５２、もしくはリシン１５４で又はこれらの組合せでの結合である、請求項４又は１２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年８月４日に出願された米国仮特許出願第６０／８３５，４２９号明細書の利益を主張し、上記特許出願の全内容はあらゆる目的のために参照して本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、新規タンパク質接合体（コンジュゲート）、詳細には、新規ペグ化タンパク質、ならびにそれらの製造方法および使用方法に関する。本発明の１つの態様は、現行エリスロポエチン製剤より大きな臨床有効性ならびに輸送および保管中の安定性を有するペグ化エリスロポエチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、例えばポリエチレングリコールなどの（「ＰＥＧ」）非抗原性水溶性ポリマーが、治療上および診断上重要なポリペプチドを共有結合修飾するために使用されてきた。ＰＥＧは、非毒性、非免疫原性、高度に水溶性であり、身体から容易に排出されるポリマーである。ＰＥＧには多数の用途があり、一般に食品、化粧品、飲料、および処方箋薬に使用されている。医薬品グレードのＰＥＧは、ＦＤＡによって米合衆国内での使用について承認されており、高度の生体適合性を前提に、生物薬剤学的担体として広汎に使用されている。ペグ化は、生物医薬品の機能を変化させずに所定の特性を修飾することができ、それによって治療効果を増強する。
【０００４】
一般に、ポリエチレングリコール分子は、タンパク質上で見いだされる反応性基を介してタンパク質に結合する。例えばリシン残基上もしくはＮ末端にあるアミノ基は、そのような結合のために都合がよい。ＰＥＧは、様々な化学的方法を用いることによって、鎖の末端のヒドロキシル基を通して活性生物医薬品に結合させることができる。例えば、例えばインターロイキン（非特許文献１；非特許文献２）、インターフェロン（非特許文献３）、カタラーゼ（非特許文献４）、スーパーオキシドジムスターゼ（非特許文献５）、およびアデノシンデアミナーゼ（非特許文献６）などの治療用ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合は、それらのインビボ半減期を延長させる、および／またはそれらの免疫原性および抗原性を減少させると報告されている。
【０００５】
ＰＥＧ分子は、様々な反応性部分を有するメトキシ化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を用いて、ポリペプチド上のアミノ基を通して結合されている。このようなポリマーには、ｍＰＥＧ−サクシニミジルスクシネート、ｍＰＥＧ−サクシニミジルカーボネート、ｍＰＥＧ−イミデート、およびｍＰＥＧ−塩化シアヌルが含まれる。もう一つの方法として、成長ホルモン放出因子の強力なアナログのＮ末端、側鎖およびＣ末端における部位特異的ペグ化は、固相合成を通して実施されてきた（非特許文献７）。Ｎ末端での部位特異的ペグ化は、さらにアルデヒド活性化ＰＥＧを用いても実施されているが、このような反応は長い反応時間を必要とし、ｐＨ依存度が高い。例えば、反応には１８〜３６時間を必要とし、一般には酸性ｐＨでのみ特異的であり、中性もしくはより高いｐＨではランダムとなる（例えば、これらの各々がこれにより全体として参照して本明細書に組み込まれる特許文献１および特許文献２を参照されたい）。これは、利用できるペプチドを長期間の酸性条件に抵抗できるペプチドに限定する。
【０００６】
使用される追加の方法は、Ｎ末端トレオニンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化によって生成されたＮ末端において、反応性アルデヒド基を通して部位特異的にリポソーム表面グラフト化ＰＥＧ鎖の先端にペプチドを結合させる工程を含んでいた（非特許文献８）。しかし、この方法は、Ｎ末端セリンもしくはトレオニン残基を備えるポリペプチドに限定される。
【０００７】
ポリペプチドのＣ末端で活性基を特異的に導入するための酵素援用法についてもまた報告されている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。一般的には、これらの活性基は、後の工程で機能的プローブをポリペプチドへ結合させるために、ヒドラジド、アルデヒド、および芳香族アミノ基であってもよい。
【０００８】
部位特異的突然変異は、部位特異的ポリマー結合用のポリペプチドを調製するために使用されているさらに別の手法である。特許文献３は、システイン残基の挿入または他の残基とシステイン残基との置換によって修飾された、タンパク質の部位特異的ペグ化について記載している。特許文献３は、さらにシステイン特異的ｍＰＥＧ誘導体を、ＥＰＯ上の組換えにより導入されたシステイン残基と反応させることによる、ｍＰＥＧ−エリスロポエチン（「ｍＰＥＧ−ＥＰＯ」）の調製について記載している。同様に、インターロイキン−２は、部位特異的突然変異後に、そのグリコシル化部位でペグ化された（非特許文献１２）。
【０００９】
糖タンパク質は、修飾のための追加の標的部位としての炭水化物を提供する。酵素ペルオキシダーゼは、その炭水化物部分を通してＰＥＧ−ジアミンを用いて修飾されている（非特許文献１３）。特許文献４は、過ヨウ素酸塩酸化炭水化物を通してｍＰＥＧ−ＥＰＯを調製する方法について記載している。関係する化学反応は、ｍＰＥＧ−ヒドラジドとＥＰＯ上の炭水化物部分のアルデヒド基とを反応させることによるヒドラゾン形成であった。このタイプの修飾は、潜在的に炭水化物部分における様々なタイプの糖残基およびポリペプチド内の一部のアミノ酸残基、例えばメチオニンなどを酸化できる酸化工程を通して、反応性アルデヒド基を生成する。
【００１０】
エリスロポエチン
改良されたペグ化法の必要性を実証する代表的なタンパク質は、エリスロポエチンである。赤血球生成は、赤血球の産生であり、細胞破壊を相殺するために発生する。赤血球生成は、適正な組織酸化のために十分な赤血球を利用できるようにする、制御された生理学的機序である。天然型ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）は、腎臓で生成されるポリペプチドであり、赤血球産生を刺激する体液血漿因子である（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。天然型ＥＰＯは、骨髄内での前駆赤血球始原細胞の分割および分化を刺激し、赤血球前駆細胞上の受容体に結合することによってその生物学的活性を発揮する（非特許文献１８）。
【００１１】
エリスロポエチンは、組換えＤＮＡ技術を用いて生合成的に製造されており（非特許文献１９）、およびチャイニーズハムスターの卵巣組織細胞（ＣＨＯ細胞）内に挿入されて発現したクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。ｈＥＰＯの主な完全プロセシング型の一次構造は、配列番号１に示されている。Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ１６１およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ３３の間には２つのジスルフィド架橋が存在する。糖部分を除いたＥＰＯのポリペプチド鎖の分子量は、１８，２３６Ｄａである。完全ＥＰＯ分子（約３３ｋＤａの分子量）では、分子量のおよそ４０％は、タンパク質上のグリコシル化部位でそのタンパク質をグリコシル化する炭水化物基によって占められている（非特許文献２０）。
【００１２】
ヒトエリスロポエチンは赤血球形成において必須であるので、このホルモンは低赤血球生成または異常赤血球生成を特徴とする血液障害、および患者にとって赤血球産生の拡大が有益である他の疾患の治療において有用である。例えば、ＥＰＯは、慢性腎不全患者（ＣＲＦ）（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）およびＡＩＤＳならびに化学療法を受けている癌患者（非特許文献２５）における貧血の治療に使用されてきた。
【００１３】
しかし、市販されているタンパク質治療薬、例えばＥＰＯの生体利用効率は、タンパク質治療薬の短い血漿中半減期およびプロテアーゼ分解に対する感受性によって制限される。これらの欠点は、タンパク質治療薬が最高の臨床効力を達成することを妨害し、一般にはより治療頻度の増大またはより大量の薬物の投与を必要とし、結果として副作用の頻度や重症度の増加および治療スケジュールへの患者コンプライアンスの不足を生じさせる。天然型ＥＰＯならびにその誘導体化された形態および修飾された形態を含むタンパク質は、さらに一般にはアルブミン（ＨＳＡもしくは血清）を含めて調製され、使用を通して生成物の安定性を維持するのに役立つように、低温で保管および輸送される。ＨＳＡ血清含有製剤は、ヒト感染因子による汚染のリスクならびに医薬品グレードのＨＳＡおよび関連バイオアッセイに関連するコスト高のために、望ましくない。
【００１４】
ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ダルベポエチンα）は、市販されているＥＰＯ誘導体である。これは５本のＮ結合オリゴ糖鎖を含むという点でヒト組換えエリスロポエチンとは相違する１６５アミノ酸タンパク質であるが、一方ヒト組換えエリスロポエチンは３本のオリゴ糖鎖を含む。追加した２箇所のＮ−グリコシル化部位は、エリスロポエチンペプチド主鎖内でのアミノ酸置換の結果として生じる。追加の炭水化物鎖は、糖タンパク質の近似分子量を３０，０００から３７，０００ダルトンへ増加させる。ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）は、相違する賦形剤を備える２種の製剤で供給されており、１つはポリソルベート８０を含み、もう１つはヒト血液の派生物であるアルブミン（ＨＳＡ）を含む。
【００１５】
ペグ化タンパク質、例えばＥＰＯ誘導体は、開示されている（特許文献５、特許文献６および特許文献７）。しかし、これらの組成物を作製するために使用される工程は、実行および制御するのが困難であり、費用がかさみ、合成において毒性化合物を使用するか、または他の品質管理問題を有する。さらに、これらが未修飾ポリペプチドの自然的機能より大きな生物活性を有するポリペプチド接合体を生成することは公知ではない。
【００１６】
したがって、依然としてペグ化組成物に対する、および／または実行するのがより容易で余り費用のかからない、そして最も重要なことは、予測可能で一貫性のある生成物を製造するために、より容易に制御できるペグ化組成物の製造方法に対する深刻な必要性がある。
【００１７】
特にＥＰＯに関しては、現在利用できる製剤と比較して、血漿中半減期の改善、活性の増加、およびプロテアーゼ分解に対する感受性の減少の性質を有する製剤が必要とされる。さらに、このような製剤は最適には、無タンパク質製剤で包装され、輸送され、および／または標準条件下で保管されなければならない。
【００１８】
本明細書において言及した特許文献を含むすべての科学的刊行物は、あらゆる目的のために全体として参照して組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第６，０７７，９３９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２６５号明細書
【特許文献３】国際公開第９０／１２８７４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９４／２８０２４号パンフレット
【特許文献５】米国特許公開第２００２／０１１５８３３号明細書
【特許文献６】米国特許公開第２００３／０１２００４５号明細書
【特許文献７】米国特許公開第２００３／０１６６５６６号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３，１５，０６４
【非特許文献２】Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９５，３３，４４７
【非特許文献３】Ｋｉｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  １９９０，６，１５７
【非特許文献４】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２，３，５８２
【非特許文献５】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｃ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３１，２５
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  １９８１，６６０，２９３
【非特許文献７】Ｆｅｌｉｘ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９５，４６，２５３
【非特許文献８】Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６，７０５
【非特許文献９】Ｓｃｈｗａｒｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８４，１６０
【非特許文献１０】Ｒｏｓｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９１，２，１５４
【非特許文献１１】Ｇａｅｒｔｎｅｒ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９，７２２４
【非特許文献１２】Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９０，８，３４３
【非特許文献１３】Ｕｒｒｕｔｉｏｇｏｉｔｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  １９８９，２，１４５
【非特許文献１４】Ｃａｒｎｏｔ，Ｐ  ａｎｄ  Ｄｅｆｌａｎｄｒｅ，Ｃ（１９０６）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１４３：４３２
【非特許文献１５】Ｅｒｓｌｅｖ，ＡＪ（１９５３）  Ｂｌｏｏｄ  ８：３４９
【非特許文献１６】Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ，ＫＲ（１９５０）Ｂｌｏｏｄ  ５：３７２
【非特許文献１７】Ｊａｃｏｂｓｏｎ，ＬＯ，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ，Ｆｒｅｉｄ，Ｗ  ａｎｄ  Ｐｌｚａｋ，ＬＦ（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ  １７９：６３３１−４
【非特許文献１８】Ｋｒａｎｔｚ，ＢＳ（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７７：４１９
【非特許文献１９】Ｅｇｒｉｅ，ＪＣ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，ＴＷ，Ｌａｎｅ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．７２：２１３−２２４
【非特許文献２０】Ｓａｓａｋｉ，Ｈ，Ｂｏｔｈｎｅｒ，Ｂ，Ｄｅｌｌ，Ａ  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２０５９
【非特許文献２１】Ｅｓｃｈｂａｃｈ，ＪＷ，Ｅｇｒｉ，ＪＣ，Ｄｏｗｎｉｎｇ，ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＮＥＪＭ  ３１６：７３−７８
【非特許文献２２】Ｅｓｃｈｂａｃｈ，ＪＷ，Ａｂｄｕｌｈａｄｉ，ＭＨ，Ｂｒｏｗｎｅ，ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１１：９９２
【非特許文献２３】Ｅｇｒｉｅ，ＪＣ，Ｅｓｃｈｂａｃｈ，ＪＷ，ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｔ，Ａｄａｍｓｏｎ，ＪＷ（１９８８）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ．３３：２６２
【非特許文献２４】Ｌｉｍ，ＶＳ，Ｄｅｇｏｗｉｎ，ＲＬ，Ｚａｖａｌａ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１０：１０８−１１４
【非特許文献２５】Ｄａｎｎａ，ＲＰ，Ｒｕｄｎｉｃｋ，ＳＡ，Ａｂｅｌｓ，ＲＩ  Ｉｎ：ＭＢ，Ｇａｒｎｉｃｋ，ｅｄ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；１９９０：ｐ．３０１−３２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、新規な形態のモノ−およびジ−ペグ化タンパク質、例えばエリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、およびそれらの混合物の予期し得なかった発見に基づいている。ＥＰＯを用いて証明されたように、本発明の製剤は、ヒト組換えＥＰＯおよび／または他の市販されているＥＰＯ治療薬と比較して、改善された血漿中半減期および安定性を含む、改善されたインビボ活性を示す。本発明のＥＰＯ分子および組成物は、さらに無タンパク質製剤中で長期安定性を示す、および／または標準保管条件下、即ち、例えば約２５℃の標準温度で保管された場合に安定である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
所定の実施形態では、本発明は、各エリスロポエチンタンパク質が少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に共有結合している少なくとも１つの群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のエリスロポエチンタンパク質、およびタンパク質を含まない医薬担体とを含む医薬製剤に関する。特定の実施形態では、各エリスロポエチンタンパク質は、１つのポリエチレングリコール分子に共有結合している。また別の実施形態では、各エリスロポエチンタンパク質は、２つのポリエチレングリコール分子に結合している。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの群のエリスロポエチンタンパク質は第１および第２群であり、第１群のエリスロポエチンタンパク質は１つのポリエチレングリコール分子に結合し、第２群は２つのポリエチレングリコール分子に結合している。さらにまた別の実施形態では、第１群対第２群の比率は、約１未満：約１００、約１０：約９０、約２０：約８０、約３０：約７０、約４０：約６０、約５０：約５０、約６０：約４０、約７０：約３０、約８０：約２０、約９０：約１０、または約１００：約１未満の範囲に及んでいてもよく、約１未満は当分野において公知である標準方法を用いて検出できない量を含む。
【００２３】
さらにまた別の実施形態では、各エリスロポエチンタンパク質は、特定のリシン残基を経由して少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に共有結合している。所定の実施形態では、本発明は、エリスロポエチンタンパク質のアミノ末端を介して少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に共有結合している少なくとも１つのエリスロポエチン分子を有する組成物を含むが、この共有結合はアルデヒド結合を経由していない。他の実施形態では、本発明は、特定リシン残基を経由して少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に共有結合している少なくとも１つのエリスロポエチン分子を有する組成物を含み、その残基はリシン１１６である。さらにまた別の実施形態では、本製剤は、担体タンパク質を含まない製剤中にエリスロポエチンの実質的分解を伴わずに長期間にわたって保管することができる。
【００２４】
本発明は、特に医薬製剤中で使用するための、ペグ化タンパク質、例えばＥＰＯの新規形態の製造方法および使用方法にさらに関する。本明細書に提供した製造方法を用いると、本発明のペグ化タンパク質は接合体であり、このタンパク質は少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に共有結合している。特定の実施形態では、本発明のペグ化タンパク質は、１つまたは２つのＰＥＧ分子に共有結合しているＥＰＯ分子である。本発明のこの態様の１つの実施形態では、共有結合は、タンパク質のアミノ末端を経由する。本発明のこの態様のまた別の実施形態では、共有結合は、ＥＰＯタンパク質のリシン残基、例えばリシン１１６を介する。したがって、本発明のペグ化タンパク質は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に共有結合しているタンパク質を包含する。特定の実施形態では、本発明は、１つまたは２つのポリエチレングリコール分子に共有結合しているＥＰＯタンパク質（即ち、各々モノ−もしくはジ−ペグ化ＥＰＯ）、および／またはそれらの混合物を包含する。所定の実施形態では、本発明のペグ化タンパク質接合体は、モノ−ペグ化タンパク質を包含する。本発明のモノ−ペグ化タンパク質は、各接合体について、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）分子が同一アミノ酸残基を介してタンパク質に共有結合していると言う点で一様であり得る。他の実施形態では、本発明のモノ−ペグ化タンパク質は、各接合体について、単一ＰＥＧ分子がタンパク質の相違するアミノ酸残基もしくはＮ末端（即ち、タンパク質のα−アミノ基）を介してＥＰＯタンパク質に共有結合していると言う点で複数の接合体を含むが、このアミノ酸残基は、本明細書に記載したＰＥＧに共有結合するために適合するアミノ酸残基の１つである。さらにまた別の実施形態では、本発明のペグ化タンパク質接合体は、複数部位でのペグ化を有するタンパク質、例えばジ−ペグ化タンパク質を包含する。本発明の複数のペグ化タンパク質は、各接合体について、２つ以上のＰＥＧ分子が同一部位で各タンパク質に共有結合していると言う点で一様であり得る。他の実施形態では、本発明の複数のペグ化タンパク質は、各接合体について、２つ以上のＰＥＧ分子が本明細書に記載したＰＥＧへの共有結合のために適合する、利用できる任意の２つ以上のアミノ酸残基および／またはタンパク質のアミノ末端においてタンパク質に結合しているという点で、複数の接合体を含む。例えば、特定の実施形態では、本発明のＥＰＯ接合体は、複数のモノ−およびジ−ペグ化ＥＰＯを含むが、ＥＰＯタンパク質とＰＥＧ分子との間の共有結合の部位は一様ではない。
【００２５】
したがって、特定の実施形態では、本明細書に提示した製造方法は、複数のＥＰＯ接合体を包含する組成物を製造するが、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、タンパク質のアミノ末端において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体を含み、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない。また別の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を含み、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、タンパク質のアミノ末端における上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体であって、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない接合体と、ならびにリシン１１６において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体と、ＥＰＯタンパク質のリシン５２において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体と、および／またはＥＰＯタンパク質のリシン１５４において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体のうちの１つもしくは複数または全部を含む。他の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を含み、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、タンパク質のアミノ末端において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体であって、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない接合体、および本明細書に記載した、または当分野において公知であるこのような結合のために適合する任意の部位で上記１つまたは２つの共有結合を有する接合体とを含む。
【００２６】
所定の実施形態では、本発明は複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、リシン１１６において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体を含む。また別の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、リシン１１６において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体、ならびにタンパク質のアミノ末端において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体であって、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない接合体と、ＥＰＯタンパク質のリシン５２において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体と、ＥＰＯタンパク質のリシン１５４において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体のうちの１つもしくは複数または全部を含む。別の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のエリスロポエチン接合体は、リシン１１６において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体および本明細書に記載した、または当分野において公知であるこのような結合のために適合する任意の部位で上記１つまたは２つの共有結合を有する接合体を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、リシン１１６を介してＥＰＯタンパク質へ共有結合しているＥＰＯ分子を有するモノ−ペグ化ＥＰＯタンパク質を含む。また別の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、リシン１１６を介してＥＰＯタンパク質へ共有結合しているＰＥＧ分子を有するモノ−ペグ化ＥＰＯ、ならびにＥＰＯタンパク質のアミノ末端において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体であって、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない接合体、ＥＰＯタンパク質のリシン５２において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体、およびＥＰＯタンパク質のリシン１５４において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体とのうちの１つまたは複数または全部を含む。他の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、タンパク質のアミノ末端を介してＥＰＯタンパク質へ共有結合しているＰＥＧ分子を有するモノ−ペグ化ＥＰＯタンパク質であって、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していないＥＰＯタンパク質を含む。また別の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、タンパク質のアミノ末端を介してＥＰＯタンパク質へ共有結合しているＰＥＧ分子を有するモノ−ペグ化ＥＰＯタンパク質であって、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していないＥＰＯタンパク質、ならびにＥＰＯタンパク質のリシン１１６において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体、ＥＰＯタンパク質のリシン５２において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体、およびＥＰＯタンパク質のリシン１５４において上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有する接合体とのうちの１つまたは複数または全部を含む。所定の他の実施形態では、本発明は、上記の複数のＥＰＯ接合体のいずれかを包含し、本明細書に記載した、または当分野において公知であるこのような結合のために適切な任意の部位で上記１つまたは２つの共有結合を有する接合体をさらに含む。
【００２８】
所定の実施形態では、本発明の複数のタンパク質接合体は、少なくとも１つの群の接合体を含み、上記少なくとも１つの群は少なくとも１つのＰＥＧ分子に共有結合しているタンパク質を含む。他の実施形態では、少なくとも１つの群のタンパク質接合体は第１および第２群であり、上記第１群は１つのＰＥＧ分子に結合し、第２群は２つ以上のＰＥＧ分子に結合している。所定の実施形態では、上記共有結合には、タンパク質のアミノ末端における非アルデヒド結合が含まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つの群のタンパク質接合体は第１および第２群である少なくとも１つの群のＥＰＯ接合体であり、上記第１群は１つのＰＥＧ分子に共有結合しているＥＰＯ−ＰＥＧであり、第２群のＥＰＯ−ＰＥＧは２つのＰＥＧ分子に共有結合しているＥＰＯタンパク質である。所定の実施形態では、第１群対第２群の比率は、約１未満：約１００、約１０：約９０、約２０：約８０、約３０：約７０、約４０：約６０、約５０：約５０、約６０：約４０、約７０：約３０、約８０：約２０、約９０：約１０、または約１００：約１未満の範囲に及んでよいが、約１未満は当分野において公知である標準方法を用いて検出できない量を含む。
【００２９】
本発明は、複数のタンパク質接合体をさらに包含し、各接合体は少なくとも１つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、被験者への上記複数のタンパク質接合体の投与は、注射の約２４、３６もしくは４８時間後に同等量（例えば、タンパク質濃度または活性単位、例えばＥＰＯ単位に基づく）の対照製剤の投与によって得られるものより少なくとも約１０％〜７００％高い、上記複数のタンパク質接合体の血清濃度、もしくは上記複数のタンパク質接合体の１つまたは複数の成分の血清濃度を生じさせる。本発明の複数のＥＰＯ接合体に関する特定の実施形態では、対照製剤は、例えば、ヒト組換えＥＰＯ（ｒｈｕＥＰＯ）、天然型ＥＰＯもしくは市販のＥＰＯ製剤、例えばＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）であってもよい。特定の実施形態では、本発明の複数のＥＰＯ接合体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットへの投与（例、皮下、静脈内）は、投与約１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８もしくは７２時間後に対照ＥＰＯ製剤の投与によって得られるものより少なくとも約５％〜７００％高い血清濃度を生じさせる。本発明は、治療用タンパク質、例えば治療用ペグ化タンパク質を被験者に送達するために適合する、本明細書に記載した、および／または当分野において公知である任意の投与方法を包含する；このような方法には、筋内、非経口、肺内、経鼻および経口が含まれるがこれらに限定されない。本発明の複数のタンパク質接合体は、特に、被験者に投与するための本明細書に記載した、および／または当分野において公知である任意の適切な薬学的に許容される担体を含む、様々な追加の物質もまた含むことができる。
【００３０】
また別の特定の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は、１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、被験者への上記複数のＥＰＯ接合体の投与は、投与の約５、７、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２１日後に同等量（例えば、ＥＰＯ単位に基づく）の対照ＥＰＯ製剤（例、ヒト組換えＥＰＯ（ｒｈｕＥＰＯ）、天然型ＥＰＯもしくは市販ＥＰＯ製剤、例えばＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）の投与によって得られる、ヘマトクリットにおける少なくとも約５％〜２５０％高い増加を生じさせる。特定の実施形態では、本発明の複数のＥＰＯ接合体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットへの投与（例、皮下）は、投与約５、７、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２１日後に同等量（例えば、ＥＰＯ単位に基づく）の対照ＥＰＯ製剤（例、ヒト組換えＥＰＯ（ｒｈｕＥＰＯ）、天然型ＥＰＯもしくは市販ＥＰＯ製剤、例えばＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）の投与によって得られる、ヘマトクリットにおけるより約５％〜約２５０％高い増加を生じさせる。
【００３１】
本発明は、本明細書に記載した複数のタンパク質接合体を含む、および／または上記複数のＥＰＯ接合体（例えば、１つのＰＥＧ分子へ共有結合している１つの群のＥＰＯ接合体および／または２つのＰＥＧ分子へ共有結合している１つの群のＥＰＯ接合体および／または１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合している１つの群のＥＰＯ接合体であって、上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つはタンパク質のアミノ末端にあり、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない１つの群のＥＰＯ接合体）の１つまたは複数の成分、および、薬学的に許容される無タンパク質（例、無血清、無アルブミン、無ヒト血清アルブミン（「無ＨＳＡ」））の担体を含む医薬製剤をさらに包含する。所定の実施形態では、無タンパク質の薬学的に許容される担体を含む本発明の医薬製剤は、本明細書に記載した、および／または当技術分野において公知である方法によって決定されるようなエリスロポエチンの実質的および／または検出可能な分解を伴わずに長期間にわたり保管することができる。所定の実施形態では、本発明の医薬製剤は、少なくとも１５カ月の約−２０℃または４℃での保管後に決定される、このような無タンパク質製剤中で安定（即ち、検出可能な分解を示さない、および／または実質的分解を示さない）である。他の実施形態では、本発明の医薬製剤は、少なくとも１０カ月の約２５℃または約３７℃での保管後に決定される、このような無タンパク質製剤中で安定（即ち、検出可能な分解を示さない、および／または実質的分解を示さない）である。本発明の医薬製剤の安定性は、当分野において公知である、および／または本明細書に記載した任意の方法によって評価できる。所定の実施形態では、本発明の医薬製剤の安定性は、ビシンコニン酸（「ＢＣＡ」）タンパク質アッセイによって決定されるように、タンパク質濃度中の変化を経時的に測定（ｍｏｎｉｔｏｒ）することによって評価される。他の実施形態では、本発明の医薬製剤の安定性は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって決定されるように、経時的なタンパク質分解（即ち、ＥＰＯ接合体の分解）の指標によって評価される。さらに他の実施形態では、本発明の医薬製剤の安定性は、上記製剤の活性を経時的に測定することによって評価され、上記活性は、上記製剤（例、ＥＰＯ製剤）の活性を決定するために、当分野において公知の任意のインビトロ法またはインビボ法によって決定される。この実施形態にしたがった特定の実施例では、複数のＥＰＯ接合体を含む本発明の医薬製剤の活性は、上記医薬製剤がインビトロで赤血球系細胞への幹細胞分化を誘導する能力によって評価される。
【００３２】
本発明のまた別の態様は、タンパク質を反応緩衝液中の活性化水溶性ポリマーと共有結合させるために上記タンパク質を上記活性化水溶性ポリマーと反応させる工程、および上記ＥＰＯ接合体を得るために実質的に全部の未結合水溶性ポリマーを除去する工程を含む方法によって作製されたタンパク質接合体に関する。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、活性化水溶性ポリマーはＳＣ−ＰＥＧである。また別の実施形態では、活性化水溶性ポリマーは、ＮＨＳ−ＰＥＧである。好ましい実施形態では、反応緩衝液はアルデヒド−ＰＥＧを含んでいない、および／または活性化水溶性ポリマーはアルデヒド−ＰＥＧではない。所定の実施形態では、反応緩衝液は約６．５〜約８．５のｐＨを有する。他の実施形態では、反応緩衝液は、約６．５〜約７．５、約６．６〜約７．３、または約６．７〜約７．１のｐＨを有する。好ましい実施形態では、反応緩衝液は約７．０の中性ｐＨを有する。所定の実施形態では、反応緩衝液は、５（ｖ／ｖ）％〜８０％のＤＭＳＯ、および好ましくは１０（ｖ／ｖ）％〜４０％のＤＭＳＯをさらに含んでもよい。本発明の方法は、当分野において公知の標準方法に比較して反応緩衝液中においてより少ない量の、即ちより低濃度のＰＥＧを使用することを可能にし、他方ではペグ化効率（即ち、非ペグ化生成物に比較したペグ化生成物の量として評価して）を改良する、もしくは上記公知方法と同様に維持する。本発明の方法は、当分野において公知の他の方法より高いｐＨでの反応の使用もまた許容できる（例えば、アルデヒドＰＥＧを用いるタンパク質のペグ化（例えば、その各々が全体として参照して本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０７７，９３９号明細書および米国特許第５，９８５，２６５号明細書を参照されたい））。当分野において公知である方法と比較して、このような修飾は、費用、製造効率、および／または工程の容易さに関して製造上の利点を提供できる。さらに別の実施形態では、反応緩衝液は、約１：約３から約１：約６０のタンパク質対活性化水溶性ポリマーのモル比を含む。他の実施形態では、反応緩衝液は、約１：約４、約１：約５、約１：約６、約１：約７、約１：約８、約１：約９、約１：約１０、約１：約１５、約１：約２０、約１：約２５、約１：約３０、約１：約３５、約１：約４０、約１：約４５、約１：約５０、約１：約５５、約１：約６０のタンパク質対活性化水溶性ポリマーのモル比を含む。所定の実施形態では、反応緩衝液は、約１：約７のタンパク質対活性化水溶性ポリマーのモル比を含む。さらにまた別の実施形態では、実質的に全部の未反応水溶性ポリマーの除去は、当分野において公知である方法（例、透析、クロマトグラフィー）によってルーチン的に実行できる。
【００３３】
本発明のまた別の態様は、これを必要とする患者を治療有効量の上述の製剤または接合体を用いて治療する工程に関する。１つの実施形態では、本発明は、これを必要とする被験者における赤血球産生を増加させるための治療有効濃度で、組成物、特に複数の本発明のＥＰＯ接合体、または上記複数の１つまたは複数の成分を含む薬学的組成物の使用を包含する。所定の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、上記被験者において、異常な赤血球産生または不十分な赤血球産生に関連する、疾患または障害を治療もしくは管理するため、もしくはその症状を緩和するために投与される。所定の実施形態では、治療対象の被験者は、異常な赤血球産生または不十分な赤血球産生に関連する、疾患または障害を有するとは診断されていないが、上記疾患または障害を発生する素因を有すると決定されている。さらに他の実施形態では、治療対象の被験者は、異常な赤血球産生または不十分な赤血球産生に関連する、疾患または障害を有するとは診断されていないが、上記治療から利益を得られると当分野の標準によって評価されている。所定の実施形態では、患者は、少なくとも１週間に約１回、任意の用量を摂取する。他の実施形態では、患者は２週間毎に少なくとも約１回、３週間毎に少なくとも約１回、または１カ月毎に少なくとも約１回任意の用量を摂取する。
【００３４】
本発明の追加の利点は、以下に詳述する、本発明の好ましい実施形態だけが明示かつ記載されている明細書から当業者には容易に明白になる。明確に理解されるように、本発明は他の相違する実施形態が可能であり、その幾つかの詳細は、すべてが本発明から逸脱せずに、様々な観点においてルーチン的な修飾が可能である。本発明は、これらの特定の詳細の一部または全部を伴わずに実行できる。したがって、図面および説明は、事実上例示であり、限定的であると見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】完全にプロセシングされた主要なヒトエリスロポエチン（「ｈＥＰＯ」）のアミノ酸配列（配列番号１）。
【図２】末端Ａｒｇ残基を備える、エリスロポエチンのアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】図３Ａ：レーン１は、分子量マーカーである。レーン２は、調製用緩衝液中での４℃での５カ月間の保管後のサンプルである。レーン３は、−２０℃で５カ月間にわたり冷凍状態で保管されたサンプルの対照であり、レーン４は、未修飾ＥＰＯである。    図３Ｂ：左側から、レーン１：産生直後のサンプル、レーン２：天然型ＥＰＯ、レーン３：分子量マーカーである。
【図４Ａ】図４Ａは、天然型ＥＰＯの例示的なトリプシン消化を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例１によって調製されたＥＰＯ接合体の例示的なトリプシン消化を示す。
【図５】様々な期間に渡って高温で保管されたＥＰＥＧ接合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：標準分子量（単位、ｋＤａ）（２００、１１６．３、９７．４、６６．３、５５．４、３６．５、３１、２１．５および１４．４）；レーン２：−２０℃、１５カ月間；レーン３：４℃、１６カ月間；レーン４：２５℃、１０．５カ月間；レーン５：３７℃、１０．５カ月間。
【図６】標準（ＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα））およびＥＰＯ接合体（「ＥＰＥＧ」）がＭｅｔｈＣｕｌｔ（商標）−４２３０（無サイトカイン）における赤血球前駆細胞増殖に及ぼす活性の比較。
【図７】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットにおける静脈内注射でのＥＰＯ、ＥＰＥＧおよびＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）の薬物動態プロファイル。
【図８】本発明のＥＰＯ接合体のインビボでの活性の比較。３例のＰＥＧ−ＥＰＯサンプルの経時的なヘマトクリットレベルを、５μｇ／ラット用量での天然型ＥＰＯのヘマトクリットレベルと比較した。Ｙ５０１Ｐ：１ＰＥＧ−ＥＰＯを有する分枝鎖ＮＨＳ−ＰＥＧ（２０，０００ｋＤａ）によって修飾されたＥＰＯ。Ｙ５０２Ｐ：２ＰＥＧ−ＥＰＯを有する分枝鎖ＮＨＳ−ＰＥＧ（２０，０００ｋＤａ）によって修飾されたＥＰＯ。Ｙ５０１２：同等量の１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯを有する分枝鎖ＮＨＳ−ＰＥＧ（２０，０００ｋＤａ）によって修飾されたＥＰＯ。
【図９】ラットにおけるヘマトクリット増加の誘導における活性についての３種のＥＰＥＧ（Ｌ３３、Ｙ５０１２およびＸ６０１２）および天然型ＥＰＯの比較の時間経過プロット。
【図１０】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットにおける、ＥＰＥＧまたはｒｈｕ−ＥＰＯ（動物１匹当たり２．５μｇもしくは５μｇ）または賦形剤（ＰＢＳ）のボーラス注射後のヘマトクリット増加の時間経過。
【図１１】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットにおける、ＥＰＥＧ、ｒｈｕ−ＥＰＯ（動物１匹当たり２．５μｇもしくは５μｇ）または賦形剤（ＰＢＳ）の１または２回（各々、「非注射」もしくは「注射」）のボーラス注射後のヘマトクリット増加の時間経過。ＥＰＥＧまたは対照の第２回投与は、第１回投与の１４日後に行われた。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の目的は、野生型もしくは天然形にある非共有結合ポリペプチドに比して臨床的に優れているポリペプチド接合体（例、ＥＰＯ接合体）を提供することである。さらに、このような共有結合ポリペプチドの追加の利点は、所望の治療作用を達成するために、より低頻度の投与を含む、（野生型もしくは天然ポリペプチドと比較して）より少ないタンパク質を投与できることである。これは、同様に、より少ない原料費用および副作用を生じさせるが、それは投与１回当たりのタンパク質の量が実質的に減少するからである。所定の実施形態では、本発明は、水溶性ポリマーに共有結合しているエリスロポエチンに関する。好ましい実施形態では、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合しているポリペプチドに関する。最も好ましくは、本発明は、ＰＥＧに共有結合しているエリスロポエチン（ＥＰＥＧ）に関する。
【００３７】
特定の実施例では、天然型ＥＰＯ（即ち、結合したＰＥＧを伴わないＥＰＯ；従来型のグリコシル化エリスロポエチン）と比較して、本発明のＥＰＯ接合体、即ちＥＰＥＧは、増加した循環中半減期および血漿滞留時間、減少したクリアランス速度、および増加したインビボ臨床活性を有する。本発明の接合体は、ＥＰＯと同一の使用を有する。特に、本発明の接合体は、ＥＰＯが同一もしくは類似の被験者を治療するために使用される方法と同一方法で、骨髄中の委任赤血球前駆細胞の分割および分化を刺激することによって、ＥＰＯを必要とする被験者における赤血球産生を増加させるのに有用である。さらに、本発明者らは驚くべきことに、本発明の接合体が、保管中の安定性用に、それらの製剤中にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を必要としないことを見いだした。したがって、本発明の製剤は、現在利用できるＥＰＯをベースとする治療薬と比較してより長期の安定性、より低いコストおよび単純化された製造、輸送、保管および品質管理という利点を有する。
【００３８】
本明細書において用語「Ｎ末端」、「アミノ末端」、もしくは類似の用語は、タンパク質の他の分子への共有結合の状況において使用した場合には、タンパク質のアミノ末端αアミノ基を介しての共有結合を意味する。
【００３９】
本明細書において用語「野生型」もしくは「天然」は、好ましくはそれが身体内で自然に機能することが見いだされているので、その作動型または機能形にあるタンパク質もしくはポリペプチドを意味する。これらの用語は、人工的に修飾もしくは変更させられていない形状にあるタンパク質もさらに意味する。そこでこれらの用語は、組換えタンパク質にも関連し得る。したがって、これらの用語は、そのタンパク質の核酸および／またはアミノ酸配列が最初に引き出された動物において生成されるものと比較して、グリコシル化の欠如を含む、変更されたグリコシル化パターンを備えるタンパク質を意味することができる。
【００４０】
本明細書においてポリペプチドの「自然的機能」は、水溶性ポリマーを用いた共有修飾以前の機能を意味する。自然的機能には、例えば酵素活性、受容体結合（例、抗体）、リガンド結合、および免疫原性が含まれる。好ましくは、エリスロポエチンの自然的機能は、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させることを誘発するインビボ生物活性を意味する。
【００４１】
本明細書において用語「エリスロポエチン」もしくは「ＥＰＯ」は、配列番号１（図１）もしくは配列番号２（図２）に規定されたアミノ酸配列、またはこれらと実質的に相同であるアミノ酸配列を有する糖タンパク質を意味し、これらの生物学的特性は、赤血球産生の刺激および／または骨髄中での委任赤血球前駆細胞の分割および分化の刺激に関連する。本明細書においてこれらの用語には、例えば、天然型ＥＰＯと比較してそれらがアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を有するように、故意の特定部位突然変異誘発によって、もしくは偶発的な突然変異を通して修飾されたタンパク質が含まれる。これらの用語には、天然および組換え生成両方のヒトエリスロポエチンが含まれる。ＥＰＯは、例えば組織などの任意の従来型起源、タンパク質合成、天然もしくは組換え細胞を含む細胞培養から得られる、好ましくはヒトの天然型もしくは組換え両方のタンパク質を意味する。
【００４２】
ＥＰＯと実質的に相同であるポリペプチドは、配列番号１（図１）もしくは配列番号２（図２）のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む機能的同等物である。アミノ酸配列に関連して「実質的に同一」とは、本明細書においては、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−２４４８（１９８８）によるＦＡＳＴＡ検索法によって決定されるように、他のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、およびより好ましくは少なくとも約９０％相同である配列であると規定されている。好ましくは、ＥＰＯ相同体は、本明細書に記載した方法、および／または当分野において公知の標準方法によって評価される天然もしくは野生型ＥＰＯの活性と比較して、同等以上の活性を示す。
【００４３】
例えば突然変異タンパク質、さもなければ修飾されたタンパク質などの、ＥＰＯの活性を有する任意のタンパク質もまた包含されている。組換えＥＰＯは、組換えＤＮＡ技術または内因性遺伝子活性化によって、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨｅＬａもしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞系または動物もしくはヒト起源の他の適切な細胞系における発現を介して調製することができる。内因性遺伝子活性化によるＥＰＯを含むタンパク質の発現は、当分野において周知であり、例えば米国特許第５，７３３，７６１号明細書、米国特許第５，６４１，６７０号明細書、米国特許第５，７３３，７４６号明細書、米国特許第５，９９４，１２２号明細書、米国特許第５，７３３，７６１号明細書、米国特許第５，６４１，６７０号明細書、米国特許第５，９８１，２１４号明細書および米国特許第５，２７２，０７１号明細書、ならびに国際公開第９０／１１３５４号パンフレット（各々の内容は、参照して本明細書に組み込まれる）に開示されている。その調製および治療用途は、例えば、米国特許第５，５４７，９３３号明細書および米国特許第５，６２１，０８０号明細書、欧州特許第０１４８６０５（Ｂ）号明細書、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）２７０８−２７１２、欧州特許第０２０５５６４（Ｂ）号明細書、欧州特許第０２０９５３９（Ｂ）号明細書および欧州特許第０４１１６７８（Ｂ）号明細書、ならびにＬａｉ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１９８６）３１１６−３１２１、Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）１２０５９−１２０７６に詳細に記載されている。治療に使用するためのエリスロポエチンは、組換え手段によって生成することができ（欧州特許第０１４８６０５（Ｂ）号明細書、欧州特許第０２０９５３９（Ｂ）号明細書およびＥｇｒｉｅ，Ｊ．Ｃ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｔ．Ｗ．，Ｌａｎｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．７２：２１３−２２４）、上記の参考文献の各々の内容は参照して本明細書に組み込まれる。エリスロポエチン糖タンパク質生成物を調製するために好ましいＥＰＯ種は、ヒトＥＰＯ種である。より好ましくは、ＥＰＯ種は、配列番号１（図１）もしくは配列番号２（図２）に規定したアミノ酸配列、および最も好ましくは配列番号１（図１）に提示するアミノ酸配列を有するヒトＥＰＯである。
【００４４】
無血清培地中でエリスロポエチンを発現させて調製するための方法は、例えば１９９６年１１月１４日にＢｕｒｇへ発行された国際公開第９６／３５７１８号パンフレット、および１９９２年６月１２日にＫｏｃｈへ発行された欧州特許出願公開第５１３７３８（Ａ）号明細書に記載されている（これらの各々の内容は、全体として参照して本明細書に組み込まれる）。上記に言及した刊行物に加えて、ＥＰＯ遺伝子を含む組換えＣＨＯ細胞の無タンパク質発酵を実施できることは公知である。このような方法は、例えば、欧州特許出願公開第０５１３７３８（Ａ）号明細書、欧州特許出願公開第０２６７６７８（Ａ）号明細書、ならびに一般形では、Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０（１９８３）４４５−４５３、欧州特許出願公開第０２４８６５６（Ａ）号明細書、Ｋｏｗａｒ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４２１（１９８６）２７７−２９２、Ｂａｖｉｓｔｅｒ，Ｂ．，Ｅｘｐｃｏｌｏｇｙ  ２７１（１９８１）４５−５１、欧州特許出願公開第０４８１７９１（Ａ）号明細書、欧州特許出願公開第０３０７２４７（Ａ）号明細書、欧州特許出願公開第０３４３６３５（Ａ）号明細書、国際公開第９６／３５７１８号パンフレットおよび国際公開第８８／００９６７号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照して本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４５】
欧州特許出願公開第０２６７６７８（Ａ）号明細書（これにより全体として参照して組み込まれる）では、透析後に無タンパク質培養中で生成されたＥＰＯを精製するためのＳ−セファロースでのイオン交換クロマトグラフィー、Ｃ８カラムでの分取的逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマトグラフィーについて記載されている。これに関連して、ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、Ｓ−セファロース高流速でのイオン交換クロマトグラフィーと置換することができる。さらにまた、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌカラムでの色素クロマトグラフィーをイオン交換クロマトグラフィーの前に実施することもまた提案されている。
【００４６】
組換えＥＰＯを精製するための工程もまたＮｏｂｕｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７（１９９０）３５２−３５９（全体として参照して組み込まれる）によって記載されている。しかしこの工程では、ＥＰＯは、精製工程の前にＴｗｅｅｎ−２０、フッ化フェニルメチルスルホニル、エチルマレイミド、ペプスタチンＡ、硫酸銅およびオキサミド酸の溶液を用いて処理される。
【００４７】
本明細書においてタンパク質もしくはポリペプチドに関連する用語「接合体」は、共有結合によって結合された１つまたは複数の他の化学基と相互作用して機能する、タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの群である。好ましくは、タンパク質は、エリスロポエチンもしくはその相同体であり、および化学基は水溶性ポリマーである。最も好ましくは、タンパク質は、エリスロポエチンもしくはその相同体であり、および水溶性ポリマーはＰＥＧである。本発明の接合体は、各ＥＰＯタンパク質に結合した少なくとも１つまたは２つのＰＥＧ分子を有する。さらにより好ましくは、本発明の接合体は、本明細書に開示した方法によって作製される。
【００４８】
好ましくは本明細書に記載した方法によって作製された本発明のペグ化タンパク質は、一般に「タンパク質接合体」と呼ばれる。タンパク質がエリスロポエチン（「ＥＰＯ」）である特定の実施例では、本発明の分子は、「ＥＰＯ接合体」、「ＥＰＥＧ接合体」、および／または類似の用語について言及するが、これらの用語は互換的に使用される。本発明のこれらの用語「タンパク質接合体」は、本発明の接合体化タンパク質の混合物、すなわち複数の本発明の接合体化タンパク質、例えばＥＰＯも意味している。例えば、ＥＰＥＧ接合体および／またはＥＰＯ接合体は、１つ（「１ＰＥＧ−ＥＰＯ」；モノ−ペグ化ＥＰＯ）もしくは２つ（「２ＰＥＧ−ＥＰＯ」；ジ−ペグ化ＥＰＯ）ＰＥＧ分子、および／または上記の組み合わせとそこで結合した各ＥＰＯタンパク質を備える、実質的に均質な群のＥＰＯタンパク質を意味する可能性がある。
【００４９】
大多数のポリペプチドは、複数の潜在的ＰＥＧ結合部位を有する。このため、均質群の１ＰＥＧ−タンパク質接合体は各タンパク質分子に結合した１つのＰＥＧ分子を有するが、その結合は必ずしも群内の各タンパク質上の同一場所にはない可能性がある。同様に、均質群の２ＰＥＧ−タンパク質接合体は各タンパク質分子に結合した２つのＰＥＧ分子を有するが、その結合は必ずしも群内の各タンパク質上の同一箇所にはない可能性がある。特定の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、リシン１１６を介してＰＥＧ分子への上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有するＥＰＯ接合体を含む。他の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、ＥＰＯタンパク質のアミノ末端を介してＰＥＧ分子への上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有するＥＰＯ接合体を含み、上記アミノ末端における共有結合はアルデヒド結合を経由していない。さらに他の実施形態では、本発明は、複数のＥＰＯ接合体を包含し、各接合体は１つまたは２つのＰＥＧ分子へ共有結合しているＥＰＯタンパク質を含み、上記複数のＥＰＯ接合体は、リシン５２、またはリシン１５４であるＰＥＧ分子への上記１つまたは２つの共有結合のうちの少なくとも１つを有するＥＰＯ接合体を含む。他の実施形態では、本発明は、上記の複数のＥＰＯ接合体のいずれか、およびこのような結合のために適合することが当分野において公知である任意の部位を介して、上記１つまたは２つのＰＥＧ分子に共有結合している接合体を包含する。
【００５０】
所定の実施形態では、１ＰＥＧ−タンパク質および２ＰＥＧ−タンパク質接合体を含む複数のタンパク質接合体（例、ＥＰＥＧ接合体の異質な混合物）は、２つの上記の群の混合物を意味するが、各群は均質であっても均質でなくてもよい。特定の実施形態では、混合物の１ＰＥＧ−タンパク質接合体：２ＰＥＧ−タンパク質接合体の比率は、約１未満：約１００、約１０：約９０、約２０：約８０、約３０：約７０、約４０：約６０、約５０：約５０、約６０：約４０、約７０：約３０、約８０：約２０、約９０：約１０、または約１００：約１未満であるが、約１未満は当分野において公知の標準方法を用いて検出不能な量を含む。
【００５１】
本発明に包含される「水溶性ポリマー」は、以下に限定されないＰＥＧ、メトキシ化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）、ＰＥＧホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーを含む、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体を含み、上記ホモポリマーおよびコポリマーは、未置換、またはその一端でアルキル基により置換されている。好ましい実施形態では、ポリマーは、ｍＰＥＧであり、最も好ましくはモノ−メトキシ化ＰＥＧである。水溶性ポリマーは、広範囲の分子量を備える直鎖状、分枝状、または星状であってもよい。ＰＥＧのサイズは、１０〜約１００ｋＤaの範囲に及んでよい。特定の実施形態では、ＰＥＧのサイズは、約１０〜約４０ｋＤaである。
【００５２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および類似のポリ（アルキレンオキシド）を１つの分子への、詳細には１つのタンパク質への共有結合を生じさせるためには、ポリマーのヒドロキシル末端基が最初に反応性官能基に変換させられなければならない。この工程は本明細書においては「活性化」と呼ばれ、生成物は「活性化ＰＥＧ」と呼ばれる。例えば、メトキシ化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）は、当分野において周知の方法によってその後のアミノ基への共有結合のために活性化することができる。すなわち、ｍＰＥＧは、利用できるアミノ残基、例えばリシニル残基を含むアミノ酸残基を介するその後のタンパク質への結合のために適合する様々な反応性部分を含むように修飾することができる。このような活性化ｍＰＥＧポリマーには、ｍＰＥＧ−サクシニミジルスクシネート、ｍＰＥＧ−サクシニミジルカーボネート、ｍＰＥＧ−イミデート、およびｍＰＥＧ−塩化シアヌルが含まれる。例えば、メトキシポリエチレングリコリルサクシニミジルスクシネート（「ＳＳ−ＰＥＧ」）は、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、ｍＰＥＧスクシネートからヒドロキシスクシンイミドとの反応によって生成できる（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５−１８６（全体として参照して組み込まれる）を参照されたい）。ＰＥＧは、当分野において公知および／または本明細書に記載の任意の方法によって活性化することができる。所定の実施形態では、Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミジルＰＥＧは、活性化ＰＥＧとして使用される。好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）−サクシニミジルカーボネート（「ＳＣ−ＰＥＧ」）は、活性化ＰＥＧとして使用される（例えば、全体として参照して組み込まれる米国特許第５，１２２，６１４号明細書を参照されたい）。好ましい実施形態では、ＳＣ−ＰＥＧをタンパク質へ共有結合させるための反応は、タンパク質のアミノ基を介したカルバメート結合を経由してポリペプチドに結合したＮ−ヒドロキシサクシニミジル基およびＰＥＧ鎖の遊離を生じさせる（例えば、米国特許第５，１２２，６１４号明細書を参照されたい）。しかし当分野において公知である以前の方法とは相違して、そして本発明の方法を用いて本明細書において証明したように、接合体化反応は、ペグ化の部位を優先的に選択（例、リシニル残基のアミノ末端α−アミノ基とε−アミノ基との間の優先選択）できるように制御することができる。
【００５３】
所定の実施形態では、本発明はＰＥＧを活性化する方法を包含するが、ＰＥＧクロロホルメートは、ホスゲンを用いたポリマー（ＰＥＧ）の処理によってインサイチューで生成される。次に結果として生じるクロロギ酸エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、次にトリエチルアミン（ＴＥＡ）と反応させると、ＰＥＧの所望の活性化誘導体が得られる。次に活性化ポリマー調製物は、低分子量反応物質から精製し、理論量の活性基の存在について評価することができる。
【００５４】
本明細書に記載した方法によって任意のタンパク質をペグ化することができるが、本発明は、詳細には、治療用ポリペプチドのペグ化を包含する。所定の実施形態では、本発明の方法によって使用するための治療用タンパク質は、例えば、プロテアーゼ、下垂体ホルモンプロテアーゼ阻害剤、ポエチン、コロニー刺激因子、ホルモン、凝固因子、抗凝固因子、神経向性因子、リウマチ様因子、ＣＤタンパク質、骨誘導因子、インターロイキン、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ソマトメジン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉａｎ）、ケモカイン、免疫グロブリン、ゴナドトロピン、インターロイキン、ケモタクチン、インターフェロン、脂質結合タンパク質アレルゲン、または上記の組み合わせであってもよい。このような治療用タンパク質の特定の非限定的な例には、インターフェロン−α２Ａ、インターフェロン−α２Ｂ、インターフェロンβ、インターフェロン−γ、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、毛様体神経突起トランスフォーミング因子（ＣＮＴＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、脳由来神経突起因子（ＢＤＮＦ）、ＩＬ−１、インスリントロピン、ＩＬ−２、グリア細胞由来神経突起因子（ＧＤＮＦ）、ＩＬ−１  ＲＡ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、カタラーゼ、ストレプトキナーゼ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ヘモグロビン、神経突起成長因子、アデノシンデアミダーゼ（ＮＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、カルシトニン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、殺菌作用／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、ウリカーゼ、γ−インターフェロン、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、濾胞刺激ホルモン、プロインスリン、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ、ヒトＰＴＨを含む）、骨形態形成タンパク質、造血成長因子、黄体化ホルモン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンビルブランド因子、タンパク質Ｃ、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ボンベシン、トロンビン、エンケファリナーゼ、ミュラー管阻害剤、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、ＤＮａｓｅ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、タンパク質ＡもしくはＤ、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、ＣＤ−１９、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、上記のいずれかの生物活性フラグメント、または上記の組み合わせであってもよい。好ましい実施形態では、タンパク質もしくはポリペプチドは、天然型ＥＰＯである。
【００５５】
好ましい接合体は、天然タンパク質もしくはポリペプチドを活性化水溶性ポリマーと反応させる工程によって作製される。好ましくは、水溶性ポリマーは、ＰＥＧである。いっそうより好ましくは、水溶性ＰＥＧは、ｍＰＥＧである。好ましくは、ｍＰＥＧは、約１０〜約１００ｋＤa、より好ましくは、約１０ｋＤa〜約５０ｋＤa、一層より好ましくは約１０ｋＤa〜約２５ｋＤa、および最も好ましくは約１２ｋＤaの分子量を有する。所定の実施形態では、活性化ＰＥＧは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−ＰＥＧ（「ＮＨＳ−ＰＥＧ」）である。好ましい実施形態では、活性化ＰＥＧは、スクシニミジル炭酸エステル（「ＳＣ−ＰＥＧ」）である。好ましくは、活性化ＰＥＧおよび天然型ＥＰＯは、反応緩衝液中で反応する。
【００５６】
変異体ＥＰＥＧ（すなわち、ＥＰＯ接合体）製剤は、複数種の活性化ＰＥＧを用いて生成した。４０ｋＤaの分枝状ＰＥＧを用いて製造された製剤を除く試験した全製剤は、ヘマトクリット誘導のインビボラットモデルにおいて、天然型ＥＰＯより高い活性を証明した。この結果は、ＳＣ−ＰＥＧもしくはＮＨＳ−ＰＥＧのいずれが使用されたのか、またはＰＥＧの分子量が１２ｋＤaもしくは２０ｋＤaのいずれであったのか、またはＰＥＧの形状が直鎖状もしくは分枝状のいずれであったのかに依存していなかった。
【００５７】
本明細書において「反応緩衝液」は、アミン成分を含まない標準緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）である。好ましくは、反応緩衝液は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、最も好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、および一層より好ましくは約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度の塩、例えばＮａを有する。所定の実施形態では、ポリペプチドは、攪拌下で無水活性化水溶性ポリマーと混合される。好ましくは、反応緩衝液は、約６．５〜約８．５または約６．６〜約７．５のｐＨを有する。好ましい実施形態では、反応緩衝液は、約７．０の中性ｐＨを有する。所定の実施形態では、反応緩衝液中のタンパク質（例、ＥＰＯ）対活性化水溶性ポリマーのモル比は、約１：約３〜約１：約６０である。他の実施形態では、反応緩衝液は、約１：約６〜約１：約６０のモル比のタンパク質（例、ＥＰＯ）対活性化水溶性ポリマーを含む。好ましい実施形態では、反応緩衝液は、約１：約７のモル比のエリスロポエチンタンパク質対活性化水溶性ポリマーを含む。好ましい反応条件は、約ｐＨ７．０であり、約７：約１のモル比の水溶性ポリマー：ポリペプチドを含む中性反応緩衝液である。
【００５８】
所定の他の実施形態では、反応緩衝液は、有機溶媒をさらに含んでもよい。そのような実施形態では、好ましい有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）である。ＤＭＳＯは、反応混合液中に５〜８０％、および好ましくは１０〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在してよい。ＤＭＳＯは、ペグ化反応に影響を及ぼさない、詳細には上記反応の結果として生じるペグ化の部位に優先的に影響を及ぼさない、一般的溶媒として広く使用される。本明細書に記載した反応条件は、特に活性化ＰＥＧの共有結合を特定リシン部位に向かうように駆動すると思われる。さらに、現在では、反応緩衝液へのＤＭＳＯの添加は、ペグ化の部位を変化させることが見いだされている。詳細には、本明細書に記載した反応緩衝液へのＤＭＳＯの添加は、そのアミノ末端、すなわちアミノ末端α−アミノ基でのタンパク質の優先的ペグ化に向かうように駆動する。したがって、本発明の方法は、対象となるタンパク質の特定アミノ基の選択的修飾、特にタンパク質のアミノ末端の修飾を可能にする。そのようなタンパク質のこの選択的修飾は、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧがタンパク質とアミノ基を介して結合すると活性の消失を生じさせることが一般に理解されているだけに、有益である。ペグ化と一般に関連している活性の消失は、先行技術の無作為のリシン標的化反応に起因したと考えられている。リシン残基の無作為修飾は、上記タンパク質の三次構造または形態を実質的に変化させることによってタンパク質機能を偶発的に変化させる可能性がある。決して任意の理論に限定することは望まないが、本明細書に開示した反応条件は、一般にはタンパク質の活性に寄与するとは考えられていない選択的残基またはそのアミノ末端で、タンパク質の選択的修飾を可能にすると思われる。特定の実施例では、本発明の方法は、１つから２つのＥＰＯ分子を、それらのＥＰＯリシン残基へ特異的に結合させるために使用され、それらのＰＥＧへの結合は天然型ＥＰＯに比較して生物活性の消失を生じさせず、むしろ驚くべきことに天然型ＥＰＯよりはるかに臨床的に有効であるＥＰＯ接合体を生じさせる。
【００５９】
タンパク質のアミノ末端特異的ペグ化は、以前にアルデヒド活性化ＰＥＧを用いて報告されている。しかし、この反応は低ｐＨでのみ特異的であり、７以上のｐＨでは特異性を消失する（例えば、全体として参照して組み込まれる米国特許第６，０７７，９３９号明細書および米国特許第５，９８５，２６５号明細書を参照されたい）。したがって、本発明の方法は、ｐＨ感受性タンパク質のペグ化および／または接合体化において特に有用であり得る。
【００６０】
好ましい反応では、活性化水溶性ポリマーは、モル過剰で存在し、したがって未反応の過剰な活性化水溶性ポリマーは、新しく生成されたタンパク質接合体から除去される必要がある。本明細書において、「実質的に全部の未結合水溶性ポリマーを除去する工程」は、例えば透析を通しての分離を実施するための一般に公知の方法を意味する。一般に、約８０％の未結合水溶性ポリマーが除去され、好ましくは約９０％が除去され、より好ましくは約９５％が除去され、最も好ましくは約９９％が除去される。
【００６１】
本発明は、タンパク質接合体、特にＥＰＯ接合体を提供するが、上記接合体は、それに結合した少なくとも１つの水溶性ポリマーを有し、および骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させることを誘発するインビボ生物活性を有するエリスロポエチン糖タンパク質を含む。好ましい実施形態では、ＥＰＯ糖タンパク質は、ヒトエリスロポエチンおよび／またはヒトエリスロポエチンの配列（例、配列番号１（図１）；配列番号２（図２））もしくは実質的にそれと同一のアミノ酸配列を有するこれらのアナログである。
【００６２】
ＥＰＯもしくはＥＰＥＧ接合体の特異的活性は、本明細書に記載した方法または当分野において公知である標準的アッセイによって決定できる。本発明の精製されたＥＰＯ接合体の生物活性は、本発明の製剤（例、複数の本発明のＥＰＯ接合体、またはそれらの１つまたは複数の成分、および薬学的に許容される担体）のヒト患者への投与が、未注射群もしくは対照群の被験者に比較して網状赤血球および赤血球の産生を増加させる骨髄細胞を生じさせるような生物活性である。本発明の方法によって入手かつ精製されるＥＰＯ接合体、またはそれらのフラグメントの生物活性は、例えばＡｎｎａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｗｌｄ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．（１９７２）４７：９９−１１２およびＰｈａｒｍ．Ｅｕｒｏｐａ  Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＢＲＰ  Ｂｉｏ  １９９７（２）による方法によって試験することができる。
【００６３】
本明細書において「Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットへの注射の約３６時間後に天然エリスロポエチンより少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％もしくは５０％以上高い血清レベルを達成することができる」は、本発明のＥＰＥＧ接合体がＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットを用いたインビボアッセイにおいて天然型ＥＰＯもしくは市販されているグリコシル化ＥＰＯより実質的に緩徐な速度で被験者から排出され、対照化合物と比較してより高く広範囲のＰＫプロファイルを生じさせるという事実を意味する。本発明のＥＰＥＧ接合体の血清レベルは、当業者であれば、例えば放射性標識およびイムノアッセイなどであるがそれらに限定されない、当分野におけるルーチン法を用いて容易に決定することができる。好ましくは、血清中レベルは、下記の実施例４に記載した方法によって決定される。
【００６４】
実施例４は、天然型ＥＰＯが注射後まもなく最大血清濃度に到達し（すなわち、放射標識ＥＰＯ接合体の最高血行性活性を達成する）、その後１３時間以内に排出されることを証明している。現在利用できるグリコシル化ＥＰＯ治療薬であるＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）（Ａｍｇｅｎ社、カリフォルニア州サウザンドオークス）は、注射１２〜１８時間後にピーク血行性放射能を有し、天然型ＥＰＯに比して長い半減期を示す。しかし、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）は、天然型ＥＰＯより有意に高い血中濃度を達成することができない。これとは対照的に、本発明のＥＰＥＧ接合体の血液由来活性の濃度は、初期約１２時間にわたってＥＰＯおよびＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）の両方に類似している；しかし、約１２時間後に、血清中のＥＰＥＧ接合体の活性の濃度は増加し続け、注射３６時間後にＥＰＯまたはＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）のいずれよりも約５０％高い最高レベルに到達した。ＥＰＥＧは、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）より約２６％〜約３８％緩徐に身体から排出される。結果として、ＥＰＥＧ接合体は、曲線下面積に関して、対照ＥＰＯもしくはＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）のいずれよりも増加した全薬物曝露を提供する。実際に、ＥＰＥＧは、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）に比して約２５％〜約４５％大きな曲線下面積（ＡＵＣ）；および天然型ＥＰＯより４倍高いＡＵＣを有する（例えば、実施例４を参照されたい）。結果として、ＥＰＥＧは、それでもまだより高レベルの生物活性を達成しながら、天然型ＥＰＯもしくは他のグリコシル化−エリスロポエチン製剤、例えばＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）より低頻度で投与することができる。
【００６５】
本明細書に提供した実施例は、本発明の接合体を未修飾ポリペプチドと同一方法で使用できることをさらに証明する。詳細には、本明細書に開示したＥＰＥＧ接合体は、天然型ＥＰＯと同一方法で使用できる。しかし、本発明の接合体は、少なくとも２つの予想外の、当分野において公知である先行ペグ化ポリペプチドに比較して優れた特性を有する。詳細には、本発明のＥＰＥＧ接合体は、予想外にも対照製剤と比較して予想外に高い効力を有し、長期間にわたって無タンパク質製剤中で保管することができる（すなわち、無タンパク質の薬学的に許容される担体中に保管することができる）。本明細書に開示した実験結果は、本発明の接合体が対照製剤と比較して、増加した循環中半減期および血漿中滞留時間、減少したクリアランス率および増加したインビボ臨床活性を有することを証明している。
【００６６】
決して任意の特定の理論に縛られる、または限定されることは望まないが、対照製剤と比較した本発明のＥＰＥＧ製剤のインビボ活性における増加は、増加した血漿中半減期に起因する可能性があると理論付けられている。受容体が結合すると、天然型ＥＰＯおよびその受容体は細胞によって処理されて内在化されることが公知である。全ＥＰＯ受容体が結合して内在化されると、ＥＰＯシグナリングは最大化され、細胞は身体内に依然として存在する任意の過剰な天然型ＥＰＯに対して非感受性にさせられる。本明細書の実施例において証明されるように、過剰な天然型ＥＰＯは次に身体によって急速に排出される。本発明の複数のＥＰＯ接合体、またはそれらの１つまたは複数の成分の増加した生物活性は、受容体回転時間と比較して増加した生体利用効率および増加した半減期（すなわち、増加した循環時間）の関数である可能性があると考えられている。ＥＰＯ−受容体が内在化されると、新規な受容体を発生させるための期間が必要になる。本発明の複数のＥＰＯ接合体、またはそれらの１つまたは複数の成分の循環寿命は、排出前に複数の世代の受容体に結合できるように十分に長い可能性がある。これにより本発明のＥＰＯ接合体は、天然型ＥＰＯまたは現在入手できるグリコシル化ＥＰＯ製剤と比較して、インビボ活性を増加させる、例えばヘマトクリット誘導を増加させる。
【００６７】
これらの改善された特性のため、本発明の接合体は、未修飾ＥＰＯまたは現在利用できるＥＰＯをベースとする製剤と比較して、減少した用量および／または減少したスケジュール、例えば各々週３回の代わりに週１回で投与することができる。本発明のＥＰＯ接合体は、必要とする被験者に、少なくとも１日１回、少なくとも１日おきに１回または少なくとも３日毎に１回投与することもできる。しかし、本発明のＥＰＯ接合体製剤は、必要とする患者に、少なくとも週１回投与できるのが好ましい。より好ましくは、本発明のＥＰＯ接合体製剤は、患者に少なくとも２週間毎に１回投与することができる。より好ましくは、本発明のＥＰＯ接合体製剤は、患者に少なくとも月１回または少なくとも６週間〜２カ月間に１回投与することができる。
【００６８】
投与頻度の減少は、患者コンプライアンスの改善を生じさせて、治療転帰ならびに患者のクオリティ・オブ・ライフの改善を導くと予想される。従来型のグリコシル化ＥＰＯと比較して、本発明の接合体の分子量およびリンカー構造を有する接合体は、改善された効力、安定性、循環中ＡＵＣ、循環中半減期、および商品原価プロファイルを有することが見いだされている。
【００６９】
予防法および治療法
本発明のタンパク質接合体は、天然タンパク質の使用と同様に使用できる。例えば、ＥＰＥＧ製剤は、例えばＥＰＯの腎臓疾患、癌合併症、化学療法、またはＨＩＶ療法に起因する貧血の治療における使用と同様に使用できる。本発明のこの態様によるその他の特定の潜在的な用途には、赤血球の増大が患者にとって有益であるすべての疾患（例、貧血）が含まれる。接合体の正確な量は、治療される状態の正確なタイプ、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの因子に支配される、優先的な問題である。
【００７０】
治療有効量とは、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生の増加を惹起するインビボ生物活性のために必要な接合体の量である。接合体の正確な量は、治療される状態の正確なタイプ、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの因子に支配される、優先的な問題である。本接合体を含む薬学的組成物は、低い赤血球産生または欠陥のある赤血球産生を特徴とする血液疾患を経験しているヒト患者へ、様々な手段によって投与するために有効な強度で調製することができる。本接合体の平均治療有効量は変動する可能性があり、詳細には、資格を有する医師の推奨および処方に基づかなければならない。例えば、０．０１〜１０μｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．１〜３μｇ／ｋｇ（体重）を例えば週１回投与することができる。または、本発明の薬学的組成物は、様々な量のＥＰＥＧ、例えば、約１０〜約１，０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０μｇ／ｍＬ〜約４００μｇ／ｍＬを含んでもよい。
【００７１】
しかし、当業者であれば、本発明の接合体を含む薬学的組成物は、低い赤血球産生または欠陥のある赤血球産生を特徴とする血液疾患を経験しているヒト患者へ様々な手段によって投与するために有効な強度で調製できることを認識する。本接合体の平均治療有効量は変動する可能性があり、資格を有する医師の推奨および処方に基づかなければならない。
【００７２】
薬学的組成物
本発明の組成物、例えば、本発明によって調製された複数のタンパク質またはエリスロポエチン糖タンパク質接合体、もしくはこれらの１つまたは複数の成分は、当分野において公知の方法によって追加の薬学的に許容される担体または賦形剤との混合物もしくは組み合わせによって注射するために、さらに適合させることができる。本発明の生成物を調製するための特に薬学的に許容される担体は、食塩液、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などである。本発明は、上記に記載した接合体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含む薬学的組成物にさらに関する。このような薬学的に許容される担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、食塩液および緩衝液を含む水、アルコール／水溶液、エマルジョンもしくは懸濁液が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液もしくは固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、水分および栄養素補充液、例えばリンゲルデキストロースなどに基づく電解質補充液などが含まれる。保存料およびその他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性気体などもまた存在してもよい。
【００７３】
本発明によって調製されるタンパク質接合体は、当分野において公知の方法によって薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を用いて、注射のために適合する薬学的組成物中で調製することができる。例えば、国際公開第９７／０９９９６号パンフレット、国際公開第９７／４０８５０号パンフレット、国際公開第９８／５８６６０号パンフレット、および国際公開第９９／０７４０１号パンフレット（これらの各々は全体として参照して組み込まれる）を参照されたい。本発明の化合物は、例えば、１３２ｍＭ塩化ナトリウムなどの等張化剤を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で調製することができる。任意で、本薬学的組成物は、保存料を含むことができる。
【００７４】
好ましくは、本薬学的組成物は、上記に規定したＥＰＯ接合体と、約５．５〜約７．０の範囲内の溶液ｐＨを維持するために適合する薬学的に許容される緩衝液中の多価無機アニオンと、ならびに任意で１つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を含む。例えば、本発明の組成物は、約１０μｇ〜約１，０００μｇ／ｍＬのエリスロポエチン接合体、１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸塩、約１０〜約５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩（ｐＨ６．０〜６．５）、任意で約１ｍＭまでのＣａＣｌ２、および任意で約１〜５％のポリオールを含んでもよい。
【００７５】
本発明のＥＰＥＧ接合体は、無タンパク質溶液中において低温（例、−２０℃、４℃）での少なくとも１５カ月間の保管後、または高温（例、２５℃、３７℃）での少なくとも１０カ月間の保管後にＥＰＥＧ活性の分解もしくは消失に抵抗性であることが証明されており、長期間にわたりそのような安定性を保持すると予想されている。このような無タンパク質製剤中の本発明のＥＰＥＧ接合体は、例えば室温などの通常の条件下で輸送および保管するために十分に安定である可能性がある。相対的に、市販されているＥＰＯ、例えばＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）は、保護のために０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を必要とし、低温で輸送および保管される。例えばＨＳＡなどのヒト生物学的もしくは血清由来成分を含む医薬製剤は、より厳密な製造要件および規制コンプライアンスに制約される：および、結果として実質的に多大な経費に関連している。しかし、無タンパク質塩緩衝液中では、薬学的の有効成分の消失を伴わずに本発明のタンパク質接合体、例えばＥＰＯ接合体を調製することが可能である。そこで、無タンパク質の薬学的に許容される担体中で薬物（例、ＥＰＥＧ）を送達する能力は、重要な経済的利点を備える。
【００７６】
このために、最も好ましい実施形態では、本薬学的組成物は、ＥＰＥＧ接合体および無タンパク質の薬学的に許容される担体から製造される。任意で、無タンパク質の薬学的に許容される担体は、本ＥＰＥＧ接合体の薬理学的特性をさらに増強するために非タンパク質賦形剤を含むことができる。これらには、マンニトールなどの糖、ヒスチジンなどのアミノ酸、または低レベルの例えばＴｗｅｅｎ−８０などの従来型の界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明は、本明細書に記載した本発明を具体的に説明するが限定しない、以下の実施例を参照することによってより明確に理解される。
【実施例１】
【００７８】
ＳＣ−ＰＥＧ−１２ＫによるＥＰＯのペグ化
サクシニミジル炭酸エステル（ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ）として活性化されたモノ−メトキシ化ＰＥＧ（分子量、１２，０００ｋＤａ）をペグ化試薬として使用した。ＣＨＯ細胞中で生成されたＥＰＯをポリペプチドとして使用した。ＥＰＯ−タンパク質（５０ｍｇ）は、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）を含む反応緩衝液中において０．６１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。所定の実験のために、反応緩衝液は、１５％のＤＭＳＯをさらに含んでいた。
【００７９】
ポリペプチド溶液は、７：１の最終ＰＥＧ／ＥＰＯモル比に到達させるために、攪拌しながら無水ＰＥＧ試薬と混合した。ＤＭＳＯを含む反応生成物、および未反応ＰＥＧ分子は、２５，０００ｋＤaの分子量カットオフ値を有する膜を用いた透析によって分離した。反応緩衝液の組成、すなわちＤＭＳＯを含むか含まないかとは無関係に、最終生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって決定され、適切な同等比率のモノ−ペグ化ＥＰＯおよびジ−ペグ化ＥＰＯの混合物を含んでいた（例えば、図３Ｂを参照されたい）。この様式で調製された生成物は、ＥＰＥＧと指名された。
【実施例２】
【００８０】
ペグ化の部位
ＳＣ−ＰＥＧ（１２ｋＤa）を使用して、実施例１のプロトコールによってＥＰＯをペグ化し、生じたＥＰＥＧ製剤もしくはＥＰＯ（対照）を当分野における標準としてトリプシン消化にかけた。１００ピコモルのタンパク質を、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）中において４％の基質重量で、３７℃で１８時間にわたりＴＰＣＫ−処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州）で消化した。消化物は、Ｃ１８逆相カラム（Ａｐｏｌｌｏ  Ｃ−１８、粒径５μ、４．６×１００ｍｍ）上で分析した。画分は、１００％の０．１２５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）から７５％のアセトニトリル／０．１２５％のＴＦＡまでの、５０分間にわたる線形勾配を用いて溶出させた。溶出させた画分は、２３０ｎｍのＵＶ波長で分析した。実施例のクロマトグラムは、ＥＰＯおよびＰＥＧ−ＥＰＯについて各々図３Ａおよび３Ｂに示されている。ピークがＥＰＯクロマトグラムには存在したがＰＥＧ−ＥＰＯ溶出プロファイル中では減少もしくは存在しなかったことは、ＰＥＧ修飾を示しているので、それらのペグ化部位について特性解析した。
【００８１】
ＰＥＧを含む画分は、ＡＢＩ  Ｐｒｏｃｉｓｅシステム（ＡＢＩ社、カリフォルニア州）を用いて、標準方法に従ったタンパク質シーケンシングによって分析した。ペグ化部位は、検出された配列をＥＰＯのアミノ配列とマッチさせることによって決定した。結果は、表１に提示した。
【００８２】
【表１】
0005961730.tif 000002
【００８３】
驚くべきことに、反応緩衝液中のＤＭＳＯの存在がペグ化反応を優先的にシフトさせ、および主としてタンパク質のＮ末端（即ち、α−アミノ基）をペグ化することが見いだされた。詳細には、ＤＭＳＯの存在は、リシン１１６のペグ化から反応をシフトさせた。以前の報告は、アルデヒド活性化ＰＥＧおよび酸性ｐＨだけを使用してタンパク質のＮ末端のペグ化を証明していた（例えば、その各々が全体として参照して組み込まれる米国特許第６，０７７，９３９号明細書および米国特許第５，９８５，２６５明細書を参照されたい）。
【００８４】
反応緩衝液へのＤＭＳＯ添加によって可能にされた優先的ペグ化は、Ｎ末端シーケンシングを用いて確証された。実施例１によって（ＤＭＳＯを含む）調製された未消化ＥＰＯもしくはその対応物であるＥＰＥＧを標準方法によって、Ｎ末端シーケンシングにかけた。比較すると、Ｎ末端アラニンの予想量の５０％超をＥＰＥＧサンプル中では検出することができず、これは上記の結果を確証した。類似の結果は、ｓｔａｐｈｏｌｏｃｃｕｓプロテアーゼＶ８、キモトリプシン、もしくはトリプシンなどのプロテアーゼを用いたタンパク質分解保護分析を用いた場合にも達成された。
【００８５】
予備試験データは、さらにまた、本発明のペグ化法が、タンパク質の選択的Ｎ末端ペグ化を含む他のタンパク質の選択的ペグ化をさらに可能にすることも示している。例えば、タンパク質顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を実施例１の方法によって、ＳＣ−ＰＥＧおよびＤＭＳＯを用いてペグ化し、続いてＳＰカラム上で精製すると、同時にＰＥＧ−ＧＣＳＦが本発明のＮ末端修飾種の画分と同一画分中に溶出した；ＤＭＳＯの非存在下では、溶出時間が変化した。結果は、本発明の方法がおそらくタンパク質の選択的ペグ化、および詳細には、α−アミノ基の標的ペグ化を可能にすると思われることを示唆している。
【実施例３】
【００８６】
ＰＥＧ−ＥＰＯの調製および安定性
ＥＰＥＧは、ＤＭＳＯを含む反応緩衝液を用いて、実施例１の方法によって調製した。生成物を０．２μＭ膜に通して濾過してバイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を除去し、次にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液、ｐＨ６．９）を用いて、下記に説明するＢＣＡタンパク質アッセイによって決定されるように、最終濃度５０μｇ／ｍＬに希釈した。生成物は、保管のために除菌濾過して１ｍＬバイアル中へ入れた。最終生成物はＬＡＬ試験（リムルス・アメーバ様細胞溶解質発熱性物質アッセイ、Ｃａｍｂｒｅｘ社、メリーランド州）によって試験し、０．１ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンレベルを有していた。これらのバイアルは、その後の安定性および／または活性試験のために、３７℃、２５℃、４℃または−２０℃で保管した。定期的に、サンプルは、ＰＡＧＥによる物理的保全、ＢＣＡタンパク質アッセイによるタンパク質含量、ならびに幹細胞の増殖およびヘマトクリット産生の刺激によるＥＰＯ活性について試験した（例えば、活性アッセイについては実施例３を参照されたい）。
【００８７】
−２０℃もしくは４℃での１５カ月間の保管後に、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによるＥＰＥＧの分解もしくは消失の証拠は得られなかった（例えば、図５の各々レーン２および３を参照されたい）。驚くべきことに、ＳＤＳ  ＰＡＧＥはさらに、薬物を保護するための賦形剤としてＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などの担体タンパク質が存在しなかったにもかかわらず、２５℃または３７℃のいずれかでの少なくとも１０カ月間にわたる保管後に、検出可能な物理的保全の消失を示さなかった（図５の各々レーン４および５）。相対的に、市販のＥＰＯであるＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）は、保護のために０．２％のＨＳＡを必要とする。このため、薬学的の有効成分であるＥＰＥＧの消失を伴わずに無タンパク質塩緩衝液中で本発明のタンパク質接合体を調製することが可能である。サンプルの安定性は、ＢＣＡタンパク質含量アッセイによっても評価した。
【００８８】
サンプルの安定性は、ＢＣＡタンパク質含量アッセイによっても評価した。３７℃、２５℃、４℃もしくは−２０℃で保管された代表的サンプルは、全タンパク質濃度を定量するために、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミネソタ州）を選択した。５０μＬのサンプルもしくは対照を３７℃で２時間にわたり１７５μＬの作業試薬溶液中でインキュベートし、６５０ｎｍで吸光度を決定した。タンパク質濃度を決定するために、４パラメータ回帰を実施した。標準曲線はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて作成したが、０．９９９の相関係数を有していた。１２週間の保管後に、本アッセイは３７℃で保管されたサンプルについては５０．５μｇ／ｍＬ、および２５℃で保管されたサンプルについては５１．３μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を測定した。４７週間の保管後に、本アッセイは−２０℃で保管されたサンプルについては５１．４μｇ／ｍＬ、および４℃で保管されたサンプルについては４９．５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を測定した。実験の開始時には、サンプルはＢＣＡで測定されたおよそ５０μｇ／ｍＬの濃度を有していた。このため、経時的にタンパク質の消失は生じなかった。ＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）は、０．２％のＨＳＡを含むためにＢＣＡアッセイにおける標準物質としては使用できない。
【００８９】
サンプルの安定性についてのさらに別の証拠は、加速試験においてそれらが幹細胞分化（実施例４において記載した）を誘導する効力についてサンプルが評価された場合に観察された。活性は３単位／ｍＬ（生成物）で評価され、同一用量のＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）によって誘導されたコロニー形成の割合として表示される。３７℃で１２週間にわたり保管されたサンプルは対照活性の７６．３％、２５℃で１７週間にわたり保管されたサンプルは７６．５％、４℃で５４週間にわたり保管されたサンプルは８５．３％、および−２０℃で４７週間にわたり保管されたサンプルは７７．９％を有していた。時点０でのサンプルは対照活性の７６．５％を有していた；これは、オリジナル活性のおよそ１００％が担体タンパク質を含まない製剤中での保管中に保存されたことを示す。
【実施例４】
【００９０】
メチルセルロースに基づくインビトロコロニーアッセイを用いた、赤血球前駆細胞増殖にＰＥＧ−ＥＰＯが及ぼす機能的作用の評価
ＥＰＥＧは、ＤＭＳＯを含まない反応緩衝液を用いて、実施例１の方法によって調製した。ＥＰＥＧの有効性は、赤血球系細胞への幹細胞分化を刺激する能力によって評価した。正常ヒト骨髄を幹細胞の起源として使用した。光密度細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社製のキット）後に入手した。細胞は、２％のＦＢＳを含む１０ｍＬのＩｓｃｏｖｅ培養液中に再懸濁させ、トリパンブルーを用いて生存能力についてチェックした。５０μｇ／ｍＬでのＥＰＥＧ試験サンプルおよび対照サンプルは、実施例２に記載したＢＣＡタンパク質アッセイによるタンパク質濃度の決定に続く標準１２５，０００単位／ｍｇのＥＰＯを前提とする比較のために、単位／ｍＬに変換した。コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイのためには、３００単位／ｍＬのストック液を作製し、２％のＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅ培養液中で連続希釈液を調製した。対照として、ＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）（２０，０００ＩＵ／ｍＬ、ロット番号５８Ｂ０９７）の類似のストック液もまたプレーティングのために調製した。標準ＥＰＯ（ＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）およびＥＰＥＧは、最終濃度３、１、０．３、０．１および０．０３単位／ｍＬになるように加えた。造血コロニーアッセイは、２０，０００個／培養の骨髄細胞を用いて開始した。全培養は３つずつ準備し、１４日間にわたりインキュベートした。第１４日に、コロニー数をスコア付けした。コロニーは、当分野においてルーチンであるように、形態に基づいて、以下のカテゴリーのＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭに分類した。ＣＦＵ−Ｅは、より成熟した前駆細胞に由来する赤芽球コロニーであり、２００個未満の赤芽細胞を含む。ＢＦＵ−Ｅは、原始細胞に由来する赤芽球コロニーであり、２００個超の赤芽細胞を含む。ＣＦＵ−ＧＭは、４０個以上の顆粒球および／またはマクロファージ細胞を備えるコロニーを産生できるコロニー形成細胞（ＣＦＣ）に由来するコロニーである。全赤血球（ＣＦＵ−Ｅ＋ＢＦＵ−Ｅ）ならびに全ＣＦＣ（全赤血球＋ＣＦＵ−ＧＭ）について定量した。培養液を用いるアッセイは、検出不可能な赤芽球コロニーしか生成しなかった。これは、観察されたコロニーが試験サンプルに起因することを確証している。この結果は、前駆細胞アッセイにおいて添加されたサイトカインの非存在下で、対照ＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）および試験ＥＰＥＧの両方について赤芽球前駆細胞増殖に及ぼす用量依存性作用を証明している。３μ／ｍＬの飽和濃度では、ＥＰＥＧ  Ａ、Ｂ、およびＣは、７８〜８２％のＥＰＲＥＸ（登録商標）（エポエチンα）コントロール増殖を誘導する。これらのレベルは、図６に示したように、サブ飽和濃度（１および３単位／ｍＬ）ではより低い。このグラフは、３回の示度の平均数を示している。平均変動係数は、３単位／ｍＬについては１１％、１単位／ｍＬについては２５％、０．３単位／ｍＬについては３０％、および０．１単位／ｍＬについては５０％である。信頼性のレベルについてのｐ値は、Ｐ＜０．０１であった。無タンパク質培養液中への数カ月間の保管後、ＥＰＥＧサンプルは完全な活性を維持した。アッセイ結果は、統計的分析にかけた。同等濃���でＥＰＯおよびＰＥＧ−ＥＰＯを用いて試験した培養間で生成されたコロニー数における相違を評価するためには、標準ｔ−検定を実施した。０．０１未満のｐ値は有意と見なされる。観察されたデータは、結果がこの有意性レベル内に含まれることを示している。同様の結果が、ＤＭＳＯを含む反応緩衝液中で調製されたＥＰＥＧを用いて得られた。
【実施例５】
【００９１】
ＥＰＥＧ（ＰＥＧ−ＥＰＯ）の薬物動態学的試験
ＥＰＥＧの２つの相違するロット（ＥＰＯ−ＰＥＧ２０１およびＥＰＯ−ＰＥＧ２０２）は、ＤＭＳＯを含まない反応緩衝液を使用して実施例１の方法によって調製し（即ち、天然型ＥＰＯをリシン部位でＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋによって修飾した）、生じたサンプルのタンパク質濃度は、実施例３に記載したようにＢＣＡアッセイによって決定した。これらのＥＰＥＧ化合物を使用して、天然、未修飾、天然の機能的ＥＰＯおよび高度にグリコシル化されたＦＤＡ承認ＥＰＯ（Ａｍｇｅｎ社（カリフォルニア州サウザンドオークス）からのＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ））と薬物動態学的プロファイルを比較した。ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）は、ＦＤＡ承認製品であり、タンパク質の高グリコシル化に起因する長期半減期を有するので、基準物質として使用した。血液中のタンパク質を検出するために、４種のサンプル（ＥＰＯ−天然型ＥＰＯ−ＰＥＧ２０１、ＥＰＯ−ＰＥＧ２０２およびＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ））は、当分野において公知であるクロラミンＴ法を用いて、それらのチロシン部位を１２５Ｉにより標識した。各分子は、結合した約１〜２の１２５Ｉを有した。各サンプル（８０μｇ）を標識し、脱塩カラムを用いて残留未結合１２５Ｉを分離した。タンパク質の活性を検出し、ポリアクリルアミドゲルおよび逆相カラム上で検証した。ペグ化サンプルは、１ＰＥＧ分子に結合しているＥＰＯの下位群（１ＰＥＧ−ＥＰＯ）、または２ＰＥＧ分子に結合しているＥＰＯの下位群（２ＰＥＧ−ＥＰＯ）について評価した。１ＰＥＧ−ＥＰＯ対２ＰＥＧ−ＥＰＯ比は、ＥＰＯ−ＰＥＧ２０１においては５４：４６であり；およびＥＰＯ−ＰＥＧ２０２においては４５：５５であった。４つの放射標識タンパク質バッチの薬物動態学的プロファイルを分析するために、４Ｃｉ／ｋｇ（体重）の用量のタンパク質溶液をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットに皮下注射した。ラットは、各動物について３回より多い血液サンプリングを回避するために、動物各４匹を含む５つのサブグループに分割した。血液サンプルは、注射後の様々な時点（０、０．５、１、２、４、８、１２、１６、２４、３６、４８、７２、９６および１２０時間後）に採取した。血液サンプル中の放射標識タンパク質の量は、シンチレーションカウンタを用いて決定し、生成されたデータを統計学的に評価した。結果を、図７に示す。ＥＰＯ−ＰＥＧ２０１およびＥＰＯ−ＰＥＧ２０２は、類似の薬物動態学的プロファイルを有する。驚くべきことに、本発明者らは、どちらもＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）または天然型ＥＰＯいずれよりも、高度かつ広範囲のＰＫプロファイルを有することを見いだした。表２は、１区画モデルおよび用量累積を用いたＰＫパラメータの分析の結果を示している。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
天然型ＥＰＯは、注射後まもなく高レベルに到達し、１３時間以内に排出された。現在承認されているＥＰＯの長時間作用性形であるＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）は、１２〜１８時間後にピークに達し、ＥＰＯより長い半減期を示したが、血中では有意に高い濃度には到達できなかった。本明細書に開示した方法によって作製されたＥＰＥＧの血中レベルは、初期１２時間にわたりＥＰＯおよびＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）の両方について類似であり、その時間後に活性濃度は増加し続け、３６時間後にはＥＰＯもしくはＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）いずれよりも約５０％高い最高レベルに到達した。ＥＰＥＧは、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）より約２６％〜約３８％緩徐に身体から排出された。これは、曲線下面積に関して、対照ＥＰＯもしくはＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）のいずれよりも優れた全薬物曝露を生じさせる。実際に、ＥＰＥＧは、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｄａｒｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ）に比して約２５％〜約４５％大きな曲線下面積（ＡＵＣ）；および天然型ＥＰＯより４倍大きいＡＵＣを有する。
【実施例６】
【００９４】
様々な形状のＰＥＧ−ＥＰＯの製造
複数バッチのＥＰＥＧは、ＤＭＳＯを含まない反応緩衝液を使用し、そして種々様々な活性化ＰＥＧを用いて、実施例１の方法によって調製した。ペグ化反応において使用される活性化ＰＥＧの量は、最終生成物がほぼ同等量の１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯを含むように調整した。１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯは、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。カラムは、７５ｍＭ  ＮａＣＬ、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７５）を含む緩衝液を用いて平衡化させた。反応後、サンプルは同一緩衝液に対して透析し、次に精製のためにカラムへ装填した。小量の高度に修飾されたＰＥＧ−ＥＰＯは、カラムに結合せず、洗浄液中へ溶出した。サンプルは、９７．５ｍＭ  ＮａＣＬ−５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７５）の勾配を用いて溶出した。任意の天然型ＥＰＯは、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７５）中の１５０ｍＭ  ＮａＣＬを用いて溶出させた。溶出した画分は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって評価した。画分は、１ＰＥＧ−ＥＰＯ、２−ＰＥＧ−ＰＥＧおよびこれら２つの当量混合物の、３つの群に分離された。Ｙ５０１Ｐ、１ＰＥＧ−ＥＰＯを備える分枝鎖ＮＨＳ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）によって修飾したＥＰＯ；Ｙ５０２Ｐ、２ＰＥＧ−ＥＰＯを備える分枝鎖ＮＨＳ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）によって修飾したＥＰＯ；Ｙ５０１２、同等量の１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯを備える分枝鎖ＮＨＳ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）によって修飾したＥＰＯ；Ｌ３３、同等量の１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯを備える直鎖ＳＣ−ＰＥＧ（１２ｋＤａ）によって修飾したＥＰＯ；ならびにＸ６０１２、同等量の１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯを備える分枝状ＮＨＳ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）によって修飾したＥＰＯの、５つの代表サンプルを作成した。最終サンプルのタンパク質濃度は、実施例３に記載したように決定した。
【実施例７】
【００９５】
ＰＥＧ−ＥＰＯ変異体についての薬力学的試験
実施例６に記載の作成したＥＰＥＧサンプルをラットに投与して、活性を比較および評価した。Ｙ５０１Ｐ（１ＰＥＧ−ＥＰＯ）、Ｙ５０２Ｐ（２ＰＥＧ−ＥＰＯ）およびＹ５０１２（１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯの混合物）。
【００９６】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（特異的病原体無し、５週齢、雄）は、空調管理された動物施設内のフィルタートップケージ内に収容した。水は任意に与えた。ラットは、試験前に到着後１週間にわたり順応させる。ＥＰＥＧサンプルは、注射前にＰＢＳにより希釈した。ラット（各々およそ２５０ｇ）には１ｍＬの緩衝液（ＰＢＳ）もしくは１ｍＬ  ＰＢＳ（対照）中の５μｇの全タンパク質を皮下注射し、２５日間にわたりヘマトクリットを測定した。ヘマトクリットは、尾静脈からヘパリン化キャピラリーチューブ（Ｍａｒｉｅｎｆｌｄ社、ドイツ国）内へ血液を採取することによって決定した。密封した後、キャピラリーチューブは、ヘマトクリット遠心機（Ｈａｎｉｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ社、韓国）を用いて、最大回転速度で１０分間にわたり遠心した。ヘマトクリットのレベルは、標準方法を用いて血中血球容積率の計算によって決定した（図８）。驚くべきことに、２ＰＥＧ−ＥＰＯは、１ＰＥＧ−ＥＰＯと類似の活性を有していた。
【実施例８】
【００９７】
様々な形状のＰＥＧ−ＥＰＯのヘマトクリット誘導
実施例６に記載したように生成したＥＰＥＧ変異体を、実施例７に記載したヘマトクリット誘導のマウスモデルにおいてさらに試験した。本アッセイのために選択したＥＰＥＧ製剤は、各々ほぼ同等量の１ＰＥＧ−ＥＰＯおよび２ＰＥＧ−ＥＰＯ：Ｌ３３、Ｙ５０１２、およびＸ６０１２を含んでいた（実施例５を参照されたい）。これらのインビボ活性を、ヘマトクリット増加に関してＰＢＳおよび天然型ＥＰＯと比較した。上記に記載したように、各動物は、ほぼ５μｇの活性物質、即ち全タンパク質を摂取した。図９に示したように、Ｌ３３およびＹ５０１２は類似の作用を有するが、Ｙ５０１２はわずかにより活性である。より高分子量のＰＥＧは、この活性をそれ以上増加させなかった。試験した全ＥＰＥＧ製剤は、４０ｋの分枝状−ＰＥＧを用いて修飾したＰＥＧ−ＥＰＯ（Ｘ６０１２）を除いて、天然型ＥＰＯより高い活性を示した。天然型ＥＰＯに比較して活性において観察された増加はＳＣ−ＰＥＧもしくはＮＨＳ−ＰＥＧの使用とは無関係で、１２ｋＤａもしくは２０ｋＤａ  ＰＥＧの使用とは無関係で、もしくは直鎖状または分枝状ＰＥＧの使用とは無関係であった。
【実施例９】
【００９８】
ＰＥＧ−ＥＰＯは天然型ＥＰＯより強力である
Ｌ３３  ＥＰＥＧ（即ち、活性化ＰＥＧとしての直鎖状ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ）は、実施例６によって調製し、タンパク質濃度を実施例３に記載したように定量した。ＥＰＥＧ製剤は、実施例７および８によるラットモデルによってインビボ活性を評価した。ヘマトクリットレベルは、０、２、５、７、１０および１４日後に評価した。対照のための天然型ＥＰＯは、バキュロウイルス発現系において生成されたヒト組換えＥＰＯ（ｒｈｕ−ＥＰＯ）であった（当分野において一般に公知であるように、Ｒｈｕ−ＥＰＯはオリジナルのヒトＥＰＯと同一アミノ酸配列を有するが、グリコシル化パターンは相違する）。ＥＰＥＧもしくはｒｈｕ  ＥＰＯはラットへ動物１匹（各々およそ２５０ｇ）当たり２．５もしくは５μｇ用量で、単回注射で投与した。
【００９９】
１４日間にわたるヘマトクリットを、図１０に示す。ラット１匹当たりタンパク質２．５μｇでのＥＰＥＧの投与は、５μｇ用量の対照であるｒｈｕ−ＥＰＯと同一作用を示したが、これは本発明のＥＰＥＧが対照より２倍強力であることを証明した。５μｇ用量を用いると、ＥＰＥＧは約８０％のヘマトクリットレベルを誘導したが、これは未修飾、即ち非ペグ化ＥＰＯによって誘導可能なレベルのほぼ２倍であった。５μｇ用量での対照であるｒｈｕ−ＥＰＯは、２．５μｇ用量と類似レベルのヘマトクリット誘導を生じさせた。この結果は、対照ＥＰＯが試験した用量でのヘマトクリット誘導において既にプラトーに達したことを示唆している。これらの結果は、以前の刊行物が、ＥＰＯ製剤が試験された２．５μｇ用量より高用量では用量反応作用を示せなかったと主張していたので、驚くべきことではなかった。これとは対照的に、本発明のＥＰＥＧ製剤は、高用量では用量反応作用を示したが、これは対照化合物を用いて達成できるより実質的に高いヘマトクリット誘導を生じさせた。したがって、本発明のＥＰＥＧ製剤は、当分野において現在理解されているように薬物の薬学的特性および潜在能力の両方を供与する。
【実施例１０】
【０１００】
二重注射はＥＰＥＧの持続作用を示す
ＤＭＳＯを含む反応緩衝液を用いる実施例１によって調製したＥＰＥＧ製剤の連続投与の作用を、実施例７および８のラットモデルによってインビボ活性をアッセイした。
【０１０１】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットを１回（第０日）または一連の投与（第０日、第１４日）のＥＰＥＧ製剤を摂取する群に分けた（図１１における各々「未注射」または「注射」群）。ヘマトクリットレベルを２１日間にわたり測定した（図１１）。単回５μｇ注射を用いて得られた驚くべきヘマトクリットレベル（図９および図１０）と比較して、ＥＰＥＧ製剤の活性、即ちヘマトクリット誘導は、連続注射投与スキームを用いた場合の方がより顕著になった（図１０；ＥＰＥＧが５回注射された）。連続投与スキーム（各々用量５μｇ）を用いると、ヘマトクリットレベルは予想外の９０％のレベルへ近づき、これは対照化合物に比較して改良された活性を証明した。
【０１０２】
本開示は、本発明の好ましい実施形態およびほんの数例の多用途性についてのみ記載している。本発明は様々な他の組み合わせおよび環境において使用することができ、本明細書に明示した本発明の概念の範囲内で変更もしくは修飾が可能であることを理解されたい。そこで、例えば、当業者であれば、単なる定番の実験機器を用いて、本明細書に記載した特定の物質および方法にとっての数多くの同等物を認識する、または確認できる。そのような同等物は、本発明の範囲内に含まれると見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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