(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生トリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）の細胞毒性量と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、イヌ種の哺乳動物における癌治療用の医薬組成物。
【請求項２】
免疫抑制物質を更に含むことを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該哺乳動物を免疫抑制物質での治療に付すことを特徴とする、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
静細胞化合物を更に含むことを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
該哺乳動物を静細胞化合物での治療に付すことを特徴とする、請求項１または４記載の医薬組成物。
【請求項６】
ウイルス運搬を増強する化合物を更に含むことを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
該哺乳動物を、ウイルス運搬を増強する化合物および／または方法での治療に付すことを特徴とする、請求項１または６記載の医薬組成物。
【請求項８】
該癌治療が、生ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程、およびそれに続く、前記のＡＭＰＶの細胞毒性量の投与から２〜５６週間のうちに生非ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
該癌治療が、非ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程の後の２〜５６週間のうちに生ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該医薬組成物の投与部位が腫瘍内であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該医薬組成物の投与部位が腫瘍周辺であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該医薬組成物の投与部位が静脈内であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該医薬組成物の投与経路が吸入によるものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療に使用されるトリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）、および治療に使用されるトリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのウイルスは腫瘍を消失させる能力を有しうることが公知である。そのようなウイルスは腫瘍崩壊性ウイルスとして一般に公知である。とりわけ、以下の属の腫瘍崩壊性メンバーが公知である：アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルスおよびレトロウイルス。Ｖａｈａ−Ｋｏｓｋｅｌａ，Ｍ．らによる最近の概説は癌治療における腫瘍崩壊性ウイルスの概観を示している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５４：１７８−２１６（２００７））。
【０００３】
全ての腫瘍崩壊性ウイルスが直面する問題は、最初の用量の投与後に、使用されたウイルスに対する免疫が生じ始めることである。また、腫瘍細胞における予測不可能な分化および脱分化経路を考慮すると、ある腫瘍塊の個々の腫瘍細胞の幾つかが、癌治療に使用される腫瘍崩壊性ウイルスに対して耐性になるのももっともである。これは、例えば、そのような腫瘍細胞がその腫瘍崩壊性ウイルスに対する受容体を喪失することによるものでありうる。これらの理由からだけでも、癌治療を開始する際に使用されうる、あるいは他の腫瘍崩壊性ウイルスが癌治療において有効でない場合の代替手段としての新規腫瘍崩壊性ウイルスが必要とされている。
【０００４】
驚くべきことに、生きたトリウイルスであるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（現在はトリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）としても公知である）が意外にも哺乳類細胞に対する腫瘍崩壊作用を有することが、本発明において見出された。
【０００５】
シチメンチョウ鼻気管炎（ＴＲＴ）ウイルスまたはトリメタニューモウイルスはパラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属のメンバーである。メタニューモウイルスはアンチセンス極性の一本鎖非セグメント化ＲＮＡゲノムを有する。パラミクソウイルス科内には、現在までに、４つのウイルス属が腫瘍崩壊性メンバーを含むことが公知である。１つのメンバーはアブラウイルス属内（ニューカッスル病ウイルス）、１つはモルビリウイルス属内（特異的麻疹ウイルス株）、１つはレスピロウイルス属内（センダイウイルス）、そして１つはルブラウイルス属内（ムンプスウイルス）である。
【０００６】
パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属が、腫瘍崩壊特性を示すメンバーを有することは、従前公知ではなく、また、そのように推測されることもなかった。メタニューモウイルス属は２つのメンバーを有し、そのうちの１つは前記のＡＭＰＶであり、もう１つのメンバーはヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）である。どちらのウイルスも、ＨＭＰＶはヒトにおいて、ＡＭＰＶは家禽において、気道疾患を引き起こす。向性における相違をもたらすのはメタニューモウイルスの融合タンパク質（Ｆ）である。ＨＭＰＶは家禽に感染し得ないことが、Ｄｅ  Ｇｒａａｆらにより、説得力を伴って示されている。同様に、ＡＭＰＶが哺乳類において疾患を引き起こすことや、いずれかの臨床症状を引き起こすことさえも全く報告されていない（Ｄｅ  Ｇｒａａｆ  Ｍ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９０：１４０８−１４１６（２００９））。更に、ＨＭＰＶに関してもＡＭＰＶに関しても、抗腫瘍作用は何ら記載されていない。
【０００７】
生ＡＭＰＶは哺乳類腫瘍細胞を選択的に殺すが、同じ用量で哺乳類正常分化細胞および哺乳類正常増殖細胞を殺さない。哺乳類腫瘍細胞を選択的に殺すというこの特性を更に、抗腫瘍作用と称することとする。
【０００８】
抗腫瘍作用は、腫瘍の個々の細胞が、どのような作用様態であろうと、該ウイルスにより殺されることを意味する。ウイルスが例えば細胞に抗腫瘍作用を及ぼすのは、それがこれらの細胞に対して細胞溶解性であるからであり、細胞溶解性ウイルス株は感染細胞の細胞膜を損傷すると考えられている。もう１つの形態の抗腫瘍作用は、例えば、非細胞溶解性ウイルスで見られ、それは細胞の代謝を妨げ、この作用様態により細胞死を招くらしい。ＡＭＰＶの抗腫瘍作用は該ウイルスを癌治療における使用に好適なものにする。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明の第１の実施形態は、哺乳動物における癌治療に使用される生トリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）に関する。
【００１０】
好ましくは、ＡＭＰＶは、乳癌、肺癌、前立腺癌、神経膠芽細胞腫、線維肉腫、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌もしくは結腸癌に対する又はメラノーマに対する癌治療に使用される。
【００１１】
より好ましくは、ＡＭＰＶは結腸癌に対する癌治療に使用される。
【００１２】
抗腫瘍作用を得るためには、ＡＭＰウイルスは、腫瘍細胞に対して細胞毒性である量で投与される必要がある。この量は細胞毒性量と称される。したがって、ＡＭＰＶの細胞毒性量は、腫瘍細胞死の誘導に必要なウイルスの量である。
【００１３】
理論的に言うと、１個のＡＭＰＶは１個の腫瘍細胞に感染し、それを殺す。したがって、腫瘍細胞死に必要なＡＭＰＶの細胞毒性量は細胞当たりウイルス１個であろう。しかし、実際の状況においては、感染されるべき腫瘍細胞の数の何倍もの量を投与することになろう。それでも、抗腫瘍作用を誘導するために非常に少量のウイルスが必要とされるに過ぎないであろう。少量の腫瘍細胞を攻撃するためには、用量当たり１０３プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス数で、もはや十分であろう。したがって、多数の実際の目的には、もはや僅か１０３  ｐｆｕのウイルス数で細胞毒性量だとみなされうるであろう。しかし、投与されるウイルス量が非常に少なくて少数の腫瘍細胞だけしか感染しない場合には、他の腫瘍細胞に感染しうる新たな後代ウイルスが第１段階の感染から生じるまでに或る程度の時間がかかることは明らかであろう。後続の複製段階にも同じことが言え、そのうちに該ウイルスに対する免疫応答が生じ、該ウイルスを阻害するであろう。したがって、好ましくは、より多数のウイルスを一度に投与することになろう。その場合、多数の腫瘍細胞が一度に感染し、したがって、該ウイルスに対する免疫が生じる前に、多数の腫瘍細胞が感染するであろう。該ウイルスが哺乳類における非腫瘍細胞に対して非常に軽度な作用を及ぼし又は更には全く作用を及ぼさないことは、そのような比較的高い用量の投与を可能にする。したがって、１０３〜１０１２  ｐｆｕの広い範囲内の用量が許容用量となるが、１０６〜１０１２  ｐｆｕの範囲の用量が、高用量のウイルスから利益を受ける大部分の用途に好ましい用量となろう。１０９〜１０１２  ｐｆｕの範囲の用量がより好ましいであろう。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態は、生トリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）の細胞毒性量と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、哺乳動物における癌治療に使用される医薬組成物に関する。
【００１５】
「医薬上許容される担体」の概念は別の箇所において説明されている（後記を参照されたい）。
【００１６】
腫瘍が、数層の細胞層の厚さに達している巨大腫瘍である場合には特に、内層はウイルス攻撃に直接的にさらされない可能性がある。これは、低レベルの血管形成を伴う腫瘍に特に当てはまる。したがって、死んだ腫瘍細胞から生じた後代ウイルスまたは新たに投与されたウイルスが、上層細胞層が死んだ後で腫瘍内の更に深い細胞層の感染に利用可能であることが重要である。この理由により、そして遅かれ早かれＡＭＰＶに対する免疫応答が生じることを考慮すると、ＡＭＰＶでの治療の前および／または途中に免疫抑制物質を患者に投与することが有益であろう。これは、全ての感受性腫瘍細胞が死ぬまで後続段階の感染が生じうるように、該ウイルスに対する免疫応答を遅らせ又は抑制するであろう。免疫抑制物質は当技術分野で詳細に公知である。そのような免疫抑制剤の例としては、とりわけ、インターロイキンおよびＴＮＦ−γをコードする遺伝子を抑制するグルココルチコイド；静細胞物質、例えばメトトレキセートおよびアザスリオピン（ａｚａｔｈｒｉｏｐｉｎｅ）；ＣＤ２５およびＣＤ３に対する抗生物質、例えばダクチノマイシン（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）；イムノフィリンに作用する薬物、例えばシクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）およびタクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）；ならびに他の薬物、例えばインターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質、ミコフェノラートおよび小型生物学的物質、例えばフィンゴリモド（Ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ）およびミリオシン（Ｍｙｒｉｏｃｉｎ）が挙げられる。そのような免疫抑制物質の用法はこれらの物質の販売業者により示されるであろう。
【００１７】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、免疫抑制物質を更に含むことを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。
【００１８】
免疫抑制物質は一度に投与されうるが、例えば免疫抑制作用を経時的に維持するために、それらは、より長期にわたって反復用量で投与されることも可能である。したがって、本発明の医薬組成物は、それが免疫抑制物質を含むかどうかに無関係に、好ましくは、免疫抑制物質での治療を受ける哺乳動物に投与される。
【００１９】
前記のとおり、免疫抑制物質の投与を行わないと、遅かれ早かれ、ＡＭＰＶに対する免疫応答が生じ、これは、感染の第１段階において該ウイルスに感染しなかった細胞が感染する可能性に対して負の影響を及ぼす。この問題は、抗腫瘍作用（例えば、前記を参照されたい）を有する別の（今度は非ＡＭＰ）ウイルスの投与による代替方法により回避されうる。そのようなウイルスはＡＭＰＶに対する免疫応答により阻害されないであろう。
【００２０】
好ましくは、ＡＭＰＶおよび非ＡＭＰＶ（または非ＡＭＰＶおよびＡＭＰＶ；後記を参照されたい）の投与の時間的間隔は２〜５６週間である。第１ウイルスの投与と第２ウイルスの投与との間の２〜５６週間の期間は以下の論理的根拠を有する。幾つかの腫瘍は成長が速く、一方、他の腫瘍または更には転移腫瘍細胞は成長が遅く、または更にはかなりの時間にわたって「休眠」していることがある。したがって、腫瘍の特性に応じて、時間的に、より早く又はより遅く、第２のウイルスを投与することが有益でありうるであろう。多くの場合、第１ウイルスの投与と第２ウイルスの投与との間の期間はより短いであろう。なぜなら、「休眠」期間は５６週未満だからである。そして更に、より早い細胞成長のリスクを回避することを望むこともあるであろう。したがって、好ましい期間は２〜２８週間であり、より好ましいのは２〜２０週間、２〜１６週間、２〜１２週間または更には２〜８週間であり、その順序でより好ましくなる。
【００２１】
したがって、この実施形態のもう１つの形態は、哺乳動物における癌治療に使用される本発明の医薬組成物に関するものであり、該癌治療は、生ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程、およびそれに続く、前記の生ＡＭＰＶの細胞毒性量の投与から２〜５６週間のうちに非ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
癌治療におけるこの使用は、必要に応じて変更を加えて、より早期に非ＡＭＰＶで治療された動物にも適用されうることは明らかである。そのような使用は、非ＡＭＰＶの細胞毒性量の投与後の２〜５６週間のうちに生ＡＭＰＶの細胞毒性量を投与する工程を含む治療に適用されるであろう。したがって、また、この実施形態のもう１つの形態は、哺乳動物における癌治療に使用される本発明の医薬組成物に関するものであり、該癌治療は、非ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程の後の２〜５６週間のうちに生ＡＭＰＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程を含むことを特徴とする。
【００２３】
前記の腫瘍崩壊性非ＡＭＰウイルスのうち、癌治療において最も頻繁に使用されるウイルスは、もう１つの細胞毒性パラミクソウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ＮＤＶの使用に関する十分な説明が後記に記載されている。したがって、好ましい実施形態においては、該非ＡＭＰＶはＮＤＶである。
【００２４】
ＡＭＰＶの使用の前または直前直後の免疫抑制物質の使用および他の細胞毒性（非ＡＭＰＶ）ウイルスの使用に加えて、腫瘍細胞へのウイルス運搬を増強するための幾つかのアプローチがある。１つのアプローチはタンパク質分解酵素、例えばヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼのような化合物での腫瘍組織の前処理である（ＭｃＫｅｅ，Ｔ．Ｄ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：２５０９−２５１３（２００６），Ｃａｉｒｎｓ，Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：６１−７０（２００６），Ｍｉｎｃｈｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｉ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：５８３−５９２（２００６））。血液−腫瘍透過性を増加させるためのもう１つのアプローチは、血管作用性または血管正常化化合物、例えばブラジキニン（ｂｒａｄｉｋｙｎｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）またはロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｎｅ）の投与によるものである。そのような化合物の用法は該化合物の販売業者により示されるであろう。そのような処理はウイルス透過、ひいては腫瘍細胞へのウイルスの運搬を促進する。そのような化合物は更に、ウイルス運搬を増強する化合物と称される。
【００２５】
したがって、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、ウイルス運搬を増強する化合物を更に含むことを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。
【００２６】
また、ウイルス運搬を増強する物理的方法に基づく方法、例えば、腫瘍の酸素化を増加させることによる方法も、血液−腫瘍透過性を増加させる方法として提示されている。そのような方法は、例えば、酸素過剰ガスの吸入に基づく。そのような方法は更に、ウイルス運搬を増強する方法と称される。
【００２７】
ウイルス運搬を増強する化合物は一度に投与されうるが、例えば該作用を経時的に維持するために、それらは、より長期にわたって反復用量で投与されることも可能である。
【００２８】
したがって、本発明の医薬組成物は、それが、ウイルス運搬を増強する化合物を含むかどうかに無関係に、好ましくは、ウイルス運搬を増強する化合物での治療を受ける哺乳動物に投与される。
【００２９】
同様に、ウイルス運搬を増強する方法は長期的に動物に適用されうる。したがって、本発明の医薬組成物は、それが、ウイルス運搬を増強する化合物を含むかどうかに無関係に、好ましくは、ウイルス運搬を増強する方法での治療を受ける哺乳動物に投与される。
【００３０】
本発明のＡＭＰＶ治療と組合せて成功裏に適用されうるもう１つのアプローチは、静細胞化合物を使用する、より古典的なアプローチである。そのような化合物は当技術分野でよく知られており、それらはアルキル化物質、例えばクロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）およびイホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、代謝拮抗物質、例えばメルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、植物アルカロイドおよびテルペノイド、例えばビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）およびタンナン（ｔａｎｎａｎｅ）、ならびにトポイソメラーゼインヒビター、例えばイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）およびアムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）を含む。そして前記の免疫抑制物質、酵素および化合物の場合と同様に、そのような酵素または化合物の用法は該静細胞化合物の販売業者により示されるであろう。
【００３１】
したがって、また、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、静細胞化合物を更に含むことを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。
【００３２】
静細胞物質は一度に投与されうるが、例えば静細胞作用を経時的に維持するために、それらは、より長期にわたって反復用量で投与されることも可能である。したがって、本発明の医薬組成物は、それが静細胞物質を含むかどうかに無関係に、好ましくは、静細胞化合物での治療を受ける哺乳動物に投与される。
【００３３】
該哺乳動物に関しては、以下のことが言われうる。言うまでもなく、癌治療のための本発明の使用はヒトに非常に適している。非ヒト哺乳動物における使用、すなわち、獣医用途のための使用は、とりわけ経済的な理由により、ウマ、イヌまたはネコ種のような随伴動物において特に適用可能であろう。
【００３４】
したがって、もう１つの好ましい実施形態は、哺乳動物がヒト、ウマ、イヌまたはネコ種に属することを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。
【００３５】
投与経路に関しては、原則として、該ウイルスは経口的に、吸入により、および全身適用により投与されうる。全身適用は、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および腫瘍内または腫瘍周辺投与を含む。気道内の腫瘍に関しては、静脈内経路および吸入経路が好ましい経路であろう。ほとんどの他の腫瘍に関しては、静脈内ならびに／または腫瘍内および／もしくは周辺投与が、選ばれる好ましい方法であろう。したがって、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、医薬組成物の投与部位が腫瘍内であることを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。腫瘍内投与は腫瘍塊内への投与である。また、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、医薬組成物の投与部位が腫瘍周辺であることを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。腫瘍周辺投与は腫瘍塊の周辺への投与である。また、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、医薬組成物の投与部位が静脈内であることを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。この実施形態の更にもう１つの好ましい形態は、医薬組成物の投与経路が吸入によるものであることを特徴とする、本発明の医薬組成物に関する。
【００３６】
また、もう１つの細胞毒性パラミクソウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の投与に関して当技術分野で得られている十分な知見は、十分な指針を当業者に与えるはずである。該技術の単なる具体例として、以下に概観を示す。動物研究に関しては、Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  Ｖ．，Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ  Ａ．，Ａｈｌｅｒｔ  Ｔ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１８：９４５−５２，２００１に概説されているとおり、とりわけ腫瘍内、腹腔内および静脈内経路により、ＮＤＶ感染が達成されている。筋肉内または皮下経路によるＮＤＶ感染は、とりわけ、Ｈｅｉｃａｐｐｅｌｌ  Ｒ．，Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  Ｖ．，ｖｏｎ  Ｈｏｅｇｅｎ  Ｐ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３７：５６９−５７７（１９８６）に概説されている。ＮＤＶの細胞溶解性株を患者に感染させた場合のヒト研究においては、腫瘍内、静脈内または筋肉内注射が用いられている（Ｃａｓｓｅｌ  Ｗ．Ａ．，Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｒ．Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ  １８：８６３−８６８（１９６５），Ｃｓａｔａｒｙ  Ｌ．Ｋ．，Ｍｏｓｓ  Ｒ．Ｗ．，Ｂｅｕｔｈ  Ｊ．ら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６３５−６３８（１９９９），Ｐｅｃｏｒａ  Ａ．Ｌ．，Ｒｉｚｖｉ  Ｎ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｇ．Ｉ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：２２５１−２２６６（２００２），Ｃｓａｔａｒｙ  Ｌ．Ｋ．，Ｂａｋａｃｓ  Ｔ．，ＪＡＭＡ  ２８１：１５８８−１５８９（１９９９），Ｗｈｅｅｌｏｃｋ  Ｅ．Ｆ．，Ｄｉｎｇｌｅ  Ｊ．Ｈ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２７１：６４５−６５１（１９６４），Ｃｓａｔａｒｙ  Ｌ．Ｋ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２（７７２８）：８２５（１９７１））。また、以下の経路も用いられる：吸入および結腸内への直接注射（すなわち、人工肛門形成開口を介したもの）（Ｃｓａｔａｒｙ  Ｌ．Ｋ．，Ｍｏｓｓ  Ｒ．Ｗ．，Ｂｅｕｔｈ  Ｊ．ら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６３５−６３８（１９９９），Ｃｓａｔａｒｙ  Ｌ．Ｋ．，Ｅｃｋｈａｒｄｔ  Ｓ．，Ｂｕｋｏｓｚａ  Ｉ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ．Ｐｒｅｖ．１７：６１９−２７（１９９３））。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、原則として、ＡＭＰＶの投与を可能にするための医薬上許容される担体中にＡＭＰＶを含む。
【００３８】
「医薬上許容される担体」は、それが投与される動物の健康に（重篤な）有害作用を引き起こすことなく、化合物の有効な投与を補助すると意図される。医薬上許容される担体は、例えば無菌水または無菌生理的塩溶液でありうる。より複雑な形態においては、該担体は、例えばバッファーであることが可能であり、これは、添加剤、例えば安定剤または保存剤を更に含みうる。該担体の性質は、とりわけ、投与経路に左右される。投与経路が吸入によるものである場合、該担体は無菌水、生理的塩溶液またはバッファーと同じくらい単純でありうるであろう。注射が好ましい経路である場合、該担体は、好ましくは、等張性であり、それを注射に適したものにするｐＨ制限を有するべきである。しかし、そのような担体は当技術分野で詳細に公知である。詳細および具体例は、例えば、よく知られたハンドブック、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）に記載されている。本発明で有用な医薬上許容される担体の例には、安定剤、例えばＳＰＧＡ、炭水化物、（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼイン、タンパク質含有物質、例えばウシ血清または脱脂乳およびバッファー（例えば、リン酸塩バッファー）が含まれる。好ましくは、該安定剤は動物由来の化合物を含有しないか、または更には、ＷＯ  ２００６／０９４，９７４に開示しているとおりに化学的に規定されている。そのような安定剤を医薬組成物に加える場合には特に、該医薬組成物は凍結乾燥に非常に適している。凍結乾燥は、ＡＭＰＶの不活性化を防ぐ非常に好適な方法である。したがって、より好ましい形態においては、本発明の医薬組成物は凍結乾燥形態である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＴＲＴの感染の後の細胞溶解の発現。細胞集団の代表的イメージ。写真ａ〜ｃ：ＣＩＰｐ細胞（感染後７日の時点で撮影された写真）。写真ｄ〜ｆ：ＨＭＰＯＳ細胞（感染後３日の時点で撮影された写真）。写真ｇ〜ｉ：Ｍｅｌ−Ｔ４細胞（感染後３日の時点で撮影された写真）。ａ、ｄ、ｇにおける細胞は模擬感染したものであり、ｂ、ｅ、ｈにおける細胞は０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染したものであり、ｃ、ｆ、Ｉにおける細胞は１のＭＯＩで感染したものである。  実施例  実施例１  細胞培養：  ＡＴＣＣオーダー番号ＣＬ１８８を有するヒト結腸癌細胞系ＬＳ  １７４Ｔを、ＡＴＣＣにより提供された説明に従い、半コンフルエンシーまで増殖させた。
【００４０】
ウイルスの前処理：
以下のとおりにトリプシンで前処理された細胞培養培地内のＴＲＴウイルス懸濁液で感染を行った。１０  ＵＳＰ  ＴＵ／ｍｌ  トリプシンを該ウイルス懸濁液に加え、該混合物を３０分間インキュベートした。トリプシン活性を阻害するために、１０％  ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ  ＡＧ）を該ウイルス懸濁液に加えた。
【００４１】
ヒト結腸癌細胞系ＬＳ  １７４Ｔの感染：
培地をＣＬ１８８細胞から除去し、１ｍｌのウイルス懸濁液を感染多重度（ＭＯＩ）０．１およびＭＯＩ  ０．０１で加えた。組織培養条件（３７℃、５％  ＣＯ２）で１時間のインキュベーションの後、１０％  ウシ胎児血清、細胞培養において一般に使用される標準量のネオマイシン、ピマフシン（ｐｙｍａｆｕｓｉｎ）およびチロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）ならびに２μｇ／ｍｌ  フンジゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ）を含む４ｍｌの完全組織培養培地を加え、細胞を組織培養条件で３日間維持した。ついで細胞上清を集め、−７０℃で保存した。新鮮な完全組織培養培地を該細胞に加え、感染の７日後に細胞上清を集めた。ついで１ｍｌのＰＢＳ−レッドを該細胞に加え、ついでこれをこすって該細胞を細胞培養表面から解離させた。最後に、接種物、細胞上清収集物および収集細胞の両方のウイルス力価（Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を決定した。
【００４２】
結果
表１は、接種物、接種後３日および７日の時点の細胞上清収集物ならびに収集細胞のＴＲＴ力価（Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を示す。
【００４３】
【表１】
0005897700.tif 000002
ついで該ウイルス力価を用いて、感染の経過中にウイルス複製が生じたかどうかを判定した。その目的のために、接種物、細胞上清および細胞収集物中に存在するウイルスの絶対量を計算した。該細胞上清に関しては、この量を上清の体積（５ｍｌ）について補正した。感染後３日および７日の時点の細胞上清中のウイルス量の和を感染後７日の時点の細胞におけるウイルスの量に加えた。この全ウイルス量を接種物中のウイルスの量で割り算した。１を超える複製係数は、ウイルス複製が生じたことを示している（表２）。
【００４４】
【表２】
0005897700.tif 000003
結論
ＴＲＴによる０．０１のＭＯＩでのＣＬ１８８ヒト結腸癌細胞の感染はウイルス複製を引き起こす。０．１のＭＯＩでの感染は該ウイルスの複製を引き起こさなかった。
【００４５】
実施例２
イヌ腫瘍細胞に対するシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）の細胞溶解作用を調べるために、３つの細胞系にＴＲＴを２つの感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。未感染細胞を陰性対照として用いた。細胞溶解の発生をモニターし、感染の３日後から５日間連続で顕微鏡検査により評価した。
【００４６】
材料
細胞系：
ＣＩＰｐ：１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ピルビン酸ナトリウムおよびＬ−グルタミンで補足されたＤＭＥＭ／Ｆ１２内で維持された、一次病変から誘導されたイヌ乳癌細胞。起源：Ｎｏｂｕｏ  Ｓａｓａｋｉ教授，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ。
【００４７】
ＨＭＰＯＳ：１０％  ＦＢＳおよびピルビン酸ナトリウムで補足されたＲＰＭＩ１６４０内で維持された高転移性イヌ骨肉種細胞。起源：ｄｒ．Ｊｏｌｌｅ  Ｋｉｒｐｅｎｓｔｅｉｊｎ教授，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。
【００４８】
Ｍｅｌ−Ｔ４：１０％  ＦＢＳおよびピルビン酸ナトリウムで補足されたＭ１９９／Ｆ１０内で維持されたイヌメラノーマ細胞。起源：ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。
【００４９】
ウイルス：シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、株１１９４。５．８６  １０ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／バイアル。
【００５０】
方法
細胞を９６ウェル組織培養プレート内で６０００細胞／ウェル（ＣＩＰｐ）または１５０００細胞／ウェルで播いた（ＨＭＰＯＳ、Ｍｅｌ−Ｔ４）。細胞を組織培養プレートに付着させ、ついで、ＰＢＳ中で希釈されたＴＲＴにＭＯＩ  １またはＭＯＩ  ０．１で感染させた。未感染細胞を陰性対照として使用した。３０分後、培地（４％  ＦＣＳで補足されたもの）を全ウェルに加えて、２％のＦＣＳの最終濃度を得た。該細胞を３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。感染の３日後から、５日間連続で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１倒立位相差顕微鏡を使用して、細胞溶解の発生に関して該細胞を視覚的に検査した。
【００５１】
結果
全ての感染細胞系において、様々な現れかた及び度合ではあったが、細胞溶解が観察できた。感染ＣＩＰｐ集団においては、円形細胞が観察された。感染ＨＭＰＯＳ細胞は塊状で増殖して、単層における間隙を残した。個々の細胞は円形化した。感染Ｍｅｌ−Ｔ４集団においては、単層の著しい破壊および塊状での優先的増殖も観察された（図１）。
【００５２】
細胞溶解のレベルおよびその開始時機は細胞系およびＭＯＩの両方に左右されることが認められた。細胞溶解のレベルは経時的に増加した。表１に示されているとおり、ＣＩＰｐ細胞はＴＲＴによる感染に対して最も抵抗性である。第５日（ＭＯＩ  １）または第６日（ＭＯＩ  ０．１）に、細胞溶解の最初の徴候が視認可能となった。ＨＭＰＯＳ細胞に対するＴＲＴの腫瘍崩壊作用は、ＭＯＩ  １において、感染の３日の時点で既に明らかである。これとは対照的に、ＭＯＩ  ０．１での感染は細胞溶解を引き起こさない。Ｍｅｌ−Ｔ４細胞はＴＲＴによる感染に最も感受性である。早くも感染後３日で、ＭＯＩ  １で細胞溶解が観察された。ＭＯＩ  ０．１で感染した細胞では、この作用は１日遅れた。
【００５３】
【表３】
0005897700.tif 000004
結論
ＴＲＴはイヌ腫瘍細胞系ＣＩＰｐ、ＨＭＰＯＳおよびＭｅｌ−Ｔ４に対する明らかな細胞溶解作用を有する。細胞溶解のレベルおよび時機は、問題の細胞系および用いられたＭＯＩに左右される。
【図１】
0005897700.tif 000005