(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス抗体８３−１４に由来し、ヒトインスリン受容体に結合し、
重鎖可変領域が配列番号５または配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる、ヒト化抗体。
【請求項２】
イヅロニダーゼ酵素に結合されたものである、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
リソソーム酵素、および
前記リソソーム酵素に結合された、ヒトインスリン受容体に結合するモノクローナル抗体である、請求項１または請求項２に記載のヒト化抗体
を含む、インビボで血液脳関門を越えてリソソーム酵素を送達可能な組成物。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、リソソーム酵素と遺伝的に融合されたヒト化抗体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記重鎖可変領域が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
ヒトインスリン受容体に結合可能な医薬組成物であって、前記医薬組成物は：
医薬品；および
請求項５に記載のヒト化抗体からなるヒトインスリン受容体ターゲティング物質であって、前記ヒトインスリン受容体ターゲティング物質が前記医薬品に結合している当該物質、
を含む医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬品はビオチン化されており、前記ヒトインスリン受容体ターゲティング物質はアビジンもしくはストレプトアビジンを含み、前記医薬品は少なくとも１つのアビジン−ビオチン結合を介して前記ヒトインスリン受容体ターゲティング物質に結合されている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬品はモノビオチン化されている、請求項６又は請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬品は神経医薬品である、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ヒト化抗体は前記ヒト化抗体および前記医薬品を含む融合タンパク質を形成するための遺伝子融合法によって前記医薬品へ結合されている、請求項６又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヒトへ静脈内投与するための医薬製剤であって、前記医薬製剤は請求項６〜請求項１０のいずれか１項に記載の医薬組成物と、前記医薬製剤を静脈内投与するための前記医薬組成物に容認可能な担体と、を含む医薬製剤。
【請求項１２】
前記医薬品は神経医薬品である、請求項１１記載の医薬製剤。
【請求項１３】
神経医薬品がヒト血液脳関門を越える能力を強化する方法であって、前記神経医薬品を請求項５に記載のヒト化抗体へ結合させる工程を含む方法。
【請求項１４】
前記神経医薬品はアビジン−ビオチン結合を介して前記ヒト化抗体へ結合されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経医薬品は遺伝子融合法によって前記ヒト化抗体へ結合されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
インビボで医薬品をヒトインスリン受容体にターゲティングさせるための医薬組成物の製造方法であって、前記医薬品を請求項５に記載のヒト化抗体へ結合させる工程を含む方法。
【請求項１７】
前記医薬品はアビジン−ビオチン結合を介して前記ヒト化抗体へ結合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬品は遺伝子融合法によって前記ヒト化抗体へ結合される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に血流からヒト脳およびその他のヒトインスリン受容体を発現する器官もしくは組織への医薬品（pharmaceutical agents）の送達に関する。より詳細には、本発明は、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に容易に結合できる化合物を形成するために医薬品に付着させることのできる「ヒト化」モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の開発に関する。この化合物は、脳毛細血管内皮上に位置するインスリン受容体によってヒト血液脳関門（ＢＢＢ）を越えることができる。ＢＢＢを越えると、ヒト化モノクローナル抗体／医薬品化合物は、さらにまた脳細胞上に位置するインスリン受容体を介して脳細胞内への受容体媒介性エンドサイトーシスを受けることができる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書で言及した出版物およびその他の参考文献は、本発明の背景およびその実践に関する追加される詳細を提供するために、参考文献として組み込まれる。便宜上、参考文書は添付の文献目録に著者名および発行日によって分類されている。
【０００３】
ＢＢＢは、循環中の薬物、タンパク質治療薬、アンチセンス薬物、および遺伝子薬品の脳内取り込みを防止する組織全体に及ぶ障壁膜である。重篤な脳疾患を治療するための薬物もしくは遺伝子は、（ａ）その薬物もしくは遺伝子を脳内に直接注射する、したがってＢＢＢを迂回する工程によって、または（ｂ）その薬物もしくは遺伝子がＢＢＢを越える経血管的経路を介して脳内に入るようにその薬物もしくは遺伝子を血流内に注射する工程のどちらかによってヒト脳へ送達することができる。薬物の脳内投与を用いる場合は、頭部に穴を穿孔して開頭術を実施する必要がある。この開頭術に基づく脳アプローチによる薬物送達は、高額な費用がかかり高度に侵襲性であることに加えて、その薬物もしくは遺伝子が注射針の先端で脳のほんのわずかな容積にしか送達されないために有効ではない。その薬物もしくは遺伝子を脳内に広く分布させることのできる唯一の方法は、血流への注入後の経血管的経路である。しかしこの後者のアプローチは、ＢＢＢを越えて輸送される能力を必要とする。ＢＢＢは、安全に越えるのが極めて困難であり、かつ頑強であることが証明されている。
【０００４】
以前の研究は、ＢＢＢ受容体／輸送系に結合する分子版トロイの木馬を使用することでＢＢＢを越えて薬物もしくは遺伝子を運び込めることを証明している。これらのトロイの木馬は、修飾されたタンパク質、内因性ペプチド、またはペプチド模倣（peptidomimetic）モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であってよい。例えば、ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４はヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に結合するマウスＭＡｂである。この結合はＭＡｂ  ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  １９９５）の、およびＭＡｂに付着したいずれかの薬物もしくは遺伝子ペイロード（Ｗｕら，  １９９７）のＢＢＢを越える輸送を誘発する。
【０００５】
ＢＢＢを越えて薬物もしくは遺伝子を運び込むための分子版トロイの木馬の使用は米国特許第４，８０１，５７５号および第６，３７２，２５０号に記載されている。ＭＡｂ輸送ベクターへの薬物の結合は、アビジン−ビオチンテクノロジーの使用により容易になる。このアプローチでは、薬物もしくはタンパク質治療薬がモノビオチン化されて抗体ベクターとアビジンもしくはストレプトアビジンとの共役結合体に結合される。抗体主体（based)輸送ベクターへの薬物の結合を促進するためのアビジン−ビオチンテクノロジーは、米国特許第６，２８７，７９２号に記載されている。薬物が遺伝子組換えによりＭＡｂ輸送ベクターに融合されている融合タンパク質もまた使用されている。
【０００６】
ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４は、生きているアカゲザルのＢＢＢを越えて迅速に輸送されることが、ヒトＢＢＢの解剖学的基質である単離ヒト脳毛細血管に強度に結合することが証明されている（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  １９９５を参照）。どちらの場合も、霊長類もしくはヒトＢＢＢでの結合および輸送に関するＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４の活性は、トランスフェリン受容体のような他のＢＢＢ受容体をターゲットとしうる他のペプチド模倣ＭＡｂの結合または輸送より１０倍高い（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，  １９９７）。現在のところ、ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４は既知の最も活性なＢＢＢ輸送ベクターである（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，  １９９７）。これに基づくと、ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４は薬物をインビボで霊長類の脳へ送達するために極めて有用な物質であることが証明されており、さらにヒト脳への脳薬物もしくは遺伝子送達にとって高度に活性であろう。
【０００７】
ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４は、このマウスタンパク質が免疫原性であるためにヒトにおいて使用することができない。ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４の遺伝子組換え形は、キメラ抗体または遺伝子組換え「ヒト化」ＨＩＲＭＡｂのどちらかの形態でヒトにおいて使用できよう。しかしキメラ抗体またはヒト化抗体いずれかの遺伝子組換えおよび産生を実施するためには、最初に抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）をクローニングする必要がある。ＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニングに続いて、遺伝子をシーケンシングし、ヌクレオチド配列からアミノ酸配列を推定しなければならない。このアミノ酸配列と共に、当業者に知られている工学技術（Ｆｏｏｔｅら，  １９９２）を使用すると、マウスＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４のヒト化を実施することが可能になる。しかしＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４は、ヒト化した後には生物活性を損失する可能性がある（Ｐｉｃｈｌａら，  １９９７）。このため、生物活性を維持しながらマウスＨＩＲＭＡｂをヒト化できるかどうかは不確実である。
【０００８】
ＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４のキメラ形は遺伝子組換えされており、このキメラ抗体はＨＩＲに結合し、霊長類の脳内へ輸送される（Ｃｏｌｏｍａら，  ２０００）。しかしキメラ抗体はＶＨおよびＶＬのどちらについても全マウスＦＲを保持しており、このため、キメラ抗体は依然としてヒトにおいては免疫原性である（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，  １９８９）。キメラ抗体とは対照的に、ヒト化抗体はＶＨおよびＶＬのどちらについてもヒトＦＲアミノ酸配列を使用し、ＨＶの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＶＬの３つのＣＤＲしか保持していないであろう。全部のマウスＭＡｂをヒト化することはできないが、これはマウスＦＲがヒトＦＲ配列によって置換されると生物活性の損失が発生するためである（Ｐｉｃｈｌａら，  １９９７）。抗体の生物活性は一定のマウスＦＲアミノ酸を逆置換することによって復元できる（米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。それでも、ＦＲアミノ酸逆置換を用いた場合でさえ、一定の抗体は生物活性を保持しながらヒト化することができない（Ｐｉｃｈｌａら，  １９９７）。このため、主要なマウスＣＤＲおよびＦＲアミノ酸配列が分かっている場合でさえ、マウスＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４をヒト化できるかどうかは不確実である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、マウスＨＩＲＭＡｂ  ８３−１４抗体をヒト化して、ヒトをインビボで治療するための薬物および診断薬と組み合わせて使用できる生物活性のヒト化インスリン受容体（ＨＩＲ）抗体を提供できることが見いだされた。ＨＩＲ抗体は、アビジン−ビオチン共役法を使用して薬物または診断薬に共役させることができ、または遺伝子組換え技術を使用して融合タンパク質としてＨＩＲ抗体／薬物の組み合わせを調製することができる。ＨＩＲ抗体は、ＢＢＢを越えてヒト脳へ神経薬理学的物質を送達するために特に良好に適している。ＨＩＲ抗体のヒト化特性は、ヒトにおける免疫学的反応を顕著に低下させる。
【００１０】
本発明のヒト化マウス抗体はＨＩＲに結合することができ、どちらも可変領域および定常領域を含むアミノ酸の重鎖（ＨＣ）およびアミノ酸の軽鎖（ＬＣ）を含有している。ＨＣおよびＬＣの可変領域には、フレームワーク領域（ＦＲ）間に挿入されている相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００１１】
ＨＣは可変領域のアミノ末端に位置する第１ＣＤＲ、ＨＣ可変領域のカルボキシル末端に位置する第３ＣＤＲならびに前記第１および第３ＣＤＲの間に位置する第２ＣＤＲを含有している。第１ＣＤＲ、第２ＣＤＲ、および第３ＣＤＲのアミノ酸配列は各々配列番号３１、３３および３５、ならびにそれらの組み合わせ同等物である。ＨＣフレームワーク領域には、第１ＣＤＲのアミノ末端に隣接する第１ＦＲ、前記第１および第２ＣＤＲの間に位置する第２ＦＲ、前記第２および第３ＣＤＲの間に位置する第３ＦＲ、ならびに前記第３ＣＤＲのカルボキシル末端に隣接する第４ＦＲが含まれる。本発明によると、ＨＣの４つのＦＲは、全抗体がＨＩＲに関して生物活性を維持していて、ヒトにおいて免疫原性ではないようにヒト化される。
【００１２】
ＬＣは可変領域のアミノ末端に位置する第１ＣＤＲ、可変領域のカルボキシル末端に位置する第３ＣＤＲ、ならびに前記第１および第３ＣＤＲの間に位置する第２ＣＤＲを含有している。第１ＣＤＲ、第２ＣＤＲ、および第３ＣＤＲのアミノ酸配列は各々配列番号３８、４０および４２、ならびにそれらの組み合わせ同等物である。ＬＣフレームワーク領域には、前記第１ＣＤＲのアミノ末端に隣接する第１ＦＲ、前記第１および第２ＣＤＲの間に位置する第２ＦＲ、前記第２および第３ＣＤＲの間に位置する第３ＦＲ、ならびに前記第３ＣＤＲのカルボキシル末端に隣接て位置する第４ＦＲが含まれる。本発明によると、ＬＣの４つのＦＲは、全抗体がＨＩＲに関して生物活性を維持していて、ヒトにおいて最小の免疫原性を有するようにヒト化される。
【００１３】
マウス抗体の定常領域は、またヒトにおける免疫原性を最小限に抑えるために修飾される。マウスＨＣ定常領域は、ＩｇＧ１などのヒト免疫グロブリンからのＨＣ定常領域と置換される。マウスＬＣ定常領域は、カッパ（κ）ＬＣ定常領域のようなヒト免疫グロブリンのＬＣからの定常領域と置換される。マウスＨＣおよびＬＣ定常領域とヒト定常領域との置換は、ＨＩＲ結合に関してヒト化抗体の生物活性に有害な影響を及ぼさないことが見いだされた。
【００１４】
本発明は、ヒト化マウス抗体自体を含むだけではなく、薬物または診断薬に結合したヒト化抗体から構成される医薬組成物も含んでいる。ヒト化抗体は、ＨＩＲを介してＢＢＢを越える輸送および／または細胞内へのエンドサイトーシスを提供するために薬物または診断薬をインビボでＨＩＲへ送達する際に有効である。これらの組成物は、神経医薬品を脳へ送達するためにヒトへ静脈内（ｉｖ）注入するために特に良好に適している。
【００１５】
本発明の上記で考察した、およびその他の多数の特徴および付随する利点は、添付の図面を結び付けて詳細な説明を参照することにより、明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、マウスＶＨ（配列番号１）およびマウスＶＬ（配列番号２）のヌクレオチド配列ならびにマウスＶＨ（配列番号３）およびマウスＶＬ（配列番号４）の推定アミノ酸配列を示し、これらは、８３−１４マウスＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）双方の３つのフレームワーク（ＦＲ）領域および４つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を示している。アスタリスク（*）が付けられたアミノ酸は、無傷マウスＬＣまたは無傷マウスＨＣのトリプシン消化ペプチドのいずれかのアミノ酸シーケンシングによって確認された；アミノ酸シーケンシングのために、ハイブリドーマ順化培地から無傷マウスＩｇＧを精製した後に無傷マウスＨＣまたはＬＣをゲル精製した。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ヒト剖検脳から機械的均質化法を用いて得られた単離ヒト脳毛細血管について実施した放射性受容体アッセイの結果を示したグラフである。これらの毛細血管は［125Ｉ］−標識キメラＨＩＲＭＡｂ（Ｃｏｌｏｍａら，  ２０００）（図２Ａ）または［125Ｉ］−バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂ（図２Ｂ）と一緒にインキュベートした。これらのデータは、どちらの抗体も同等に、ヒトにおけるＢＢＢの解剖学的基礎を形成するヒト脳毛細血管に良好に結合することを示す。
【図３】図３は、本発明によるヒト化モノクローナル抗体を用いて治療されたアカゲザルの脳スキャンを示した図である。［125Ｉ］−標識バージョン５  ＨＩＲＭＡｂを麻酔したアカゲザルに静脈内注射し、１２０分後に動物を安楽死させた。迅速に脳を切除し、冠状半球形スラブに切り分け、これらを直ちに冷凍した。クリオスタット切片（２０μｍ）を作製し、Ｘ線フィルムに露光させた。このフィルムを走査すると、図３に示した画像が得られた。この画像は霊長類の脳の灰白質と白質との間の明白な境界を示す。灰白質中の方が血管密度が高いために、白質より多くのヒト化ＨＩＲＭＡｂの取り込みが見られる。
【図４】図４は、以下の重鎖および軽鎖両方の３ＦＲおよび３ＣＤＲのアミノ酸配列比較を示す：（ａ）バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂ、（ｖ）オリジナルのマウス８３−１４  ＨＩＲＭＡｂ、および（ｃ）Ｂ４３ヒトＩｇＧのＶＨまたはＲＥＩヒトＩｇＧのＶＬ。
【図５】図５は、ヒトα−Ｌ−イヅロニダーゼ（ＩＤＵＡ）（配列番号４８）の融合タンパク質のアミノ酸配列であり、これは、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲＭＡｂ）に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）のカルボキシル末端に融合している。ＨＣは可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）から構成されている；ＣＨはさらに３つのサブ領域、ＣＨ１（配列番号４４）、ＣＨ２（配列番号４５）、およびＣＨ３（配列番号４６）から構成される；ＣＨ１およびＣＨ２領域は１２アミノ酸ヒンジ領域（配列番号４７）によって結合されている。ＶＨは４つのフレームワーク領域（ＦＲ１＝配列番号３０；ＦＲ２＝配列番号３２；ＦＲ３＝配列番号３４；およびＦＲ４＝配列番号３６）ならびに３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＣＤＲ１＝配列番号３１；ＣＤＲ２＝配列番号３３；およびＣＤＲ３＝配列番号３５）から構成される。ＣＨについて示されたアミノ酸配列は現行データベース内でよく知られており、ヒトＩｇＧ１のＣＨ配列に一致する。ＣＨのＣＨ２領域内のアスパラギン（Ｎ）残基上には単一Ｎ結合グリコシル化部位が存在し、下線によって示したようにＩＤＵＡ配列内には６つの潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位が存在する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＭＡｂ−８３−１４として同定されたマウスモノクローナル抗体をヒトにおいてインビボで使用できるようにする前記抗体のヒト化を含んでいる。以前に言及されたように（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ら  １９９５）、ＭＡｂ  ８３−１４はヒトまたはアカゲザル血液脳関門でヒトインスリン受容体に対する高親和性を有しており、ＢＢＢを越えて神経医薬品を輸送するためにトロイの木馬として使用するための候補物質である。本明細書で使用する用語「医薬品」は、ヒトにおける疾患を治療または診断するために使用される薬物、遺伝子または化学物質を含むことが意図されている。用語「神経医薬品」には、脳疾患を治療するために使用される医薬品が含まれる。本発明のヒト化抗体のトロイの木馬は、神経医薬品を血流からＢＢＢを越えて脳へ輸送するために特に良好に適している。
【００１８】
マウスＭＡｂ−８３−１４のＨＣおよびＬＣの可変領域の完全アミノ酸配列は、実施例１に記載したとおりに決定された。マウスＶＨ（配列番号１）およびマウスＶＬ（配列番号２）を発現する遺伝子のヌクレオチド配列は、図１に表示されている。マウスＶＨ（配列番号３）およびマウスＶＬ（配列番号４）を発現する遺伝子のアミノ酸配列もまた、図１に表示されている。マウスＭＡｂ  ８３−１４  ＶＨおよびＶＬの可変領域のアミノ酸配列（各々、配列番号３および４）もまた、図４に示されている。本発明のヒト化マウス抗体は、ＨＩＲに強力に結合する抗体の能力を破壊せずにヒト抗体により密接に類似するようにマウス抗体の可変領域のアミノ酸配列を修飾することによって調製される。さらに、ヒト化抗体には、ヒト抗体にも一致する定常領域が含まれる。
【００１９】
ヒト化マウス抗体には、定常領域（ＣＨ）および可変領域（ＶＨ）から構成されるアミノ酸の重鎖（ＨＣ）が含まれる。ＨＣの可変領域はアミノ末端およびカルボキシル末端を有しており、さらに４つのＦＲの間に挿入された３つのＣＤＲを含んでいる。第１ＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、ＶＨのアミノ末端の近くに位置しており、第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３）はＨＣのカルボキシル末端の近くに位置している。マウスＭＡｂ  ８３−１４  ＨＣ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、各々配列番号３１、３３、および３５に表示されている。ＨＣ  ＣＤＲは抗体がＨＩＲへ結合するために不可欠であるので、ヒト化抗体が配列番号３１、３３および３５に一致するアミノ酸配列を備えるＨＣ  ＣＤＲを有するのが好ましい。しかし、ヒト化抗体には、ＨＣ内に配列番号３１、３３および３５に「個別に同等」であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含まれることがある。「個別に同等」なアミノ酸配列は、少なくとも７５％の配列同一性を有しており、抗体のＨＩＲへの結合に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。好ましくは、個別に同等のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３および３５との少なくとも８５％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、少なくとも９５％の配列同一性を有する個別に同等のアミノ酸配列である。
【００２０】
３つのＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列は、さらにまたアミノ酸配列（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３）の１つの組み合わせ群と見なすことができる。本発明は、さらにまたＶＨ  ＣＤＲ配列の組み合わせ群の同等物も含んでいる。そのような「組み合わせ同等物」は、アミノ酸配列３１、３２および３５を組み合わせたものと少なくとも７５％の配列同一性を有しており、その抗体のＨＩＲへの結合に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。好ましくは、組み合わせ同等アミノ酸配列は、配列番号３１、３３および３５において見いだされる組み合わせ配列との少なくとも８５％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、組み合わせアミノ酸配列（配列番号３１、３３および３５）との少なくとも９５％の配列同一性を有する組み合わせ同等アミノ酸配列である。
【００２１】
ＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列が上記に規定した個別の同等性および組み合わせ同等性の要件をどちらも満たすことが好ましい。しかし、特により短いＣＤＲについて、組み合わせ同等性の基準が満たされる場合でさえ１つ以上のＣＤＲが個別同等性の基準を満たさないことがあるという一定の状況が存在する。そのような状況では、個別同等性の要件は、組み合わせ同等性の要件が満たされることを前提に適用されない。例えば、ＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号３５）はわずか４アミノ酸長である。２つのアミノ酸が変化される場合は、次に個別配列同一性はわずか５０％であり、これは上記に規定の個別同等性に対する７５％下限の下方にある。しかし、この特定配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を組み合わせた配列の配列同一性が群同等性要件を満たすことを前提に、組み合わせ同等ＶＨ  ＣＤＲ群の一部として使用するためにさらに適している。  
【００２２】
ヒト化マウス抗体には、さらにまた定常領域（ＣＬ）および可変領域（ＶＬ）から構成されるアミノ酸の軽鎖（ＬＣ）が含まれる。ＬＣの可変領域はアミノ末端およびカルボキシル末端を有しており、さらに４つのＦＲの間に挿入された３つのＣＤＲを含んでいる。第１ＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、ＶＬのアミノ末端の近くに位置しており、第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３）はＶＬのカルボキシル末端の近くに位置している。マウスＭＡｂ  ８３−１４  ＬＣ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、各々配列番号３８、４０および４２に表示されている。ＶＬ  ＣＤＲは抗体がＨＩＲに結合するためにも重要であるので、ヒト化抗体が配列番号３８、４０および４２と同一であるアミノ酸配列を備えるＬＣ  ＣＤＲを有するのが好ましい。しかし、ヒト化抗体には、ＶＬ内に配列番号３８、４０および４２と「個別に同等」であるアミノ酸配列を有するＣＤＲが含まれることがある。「個別に同等」なアミノ酸配列は、少なくとも７５％配列同一性を有しており、抗体のＨＩＲへの結合に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。好ましくは、個別に同等のアミノ酸配列は、配列番号３８、４０または４２との少なくとも８５％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、少なくとも９５％の配列同一性を有する個別に同等のアミノ酸配列である。
【００２３】
３つのＶＬ  ＣＤＲアミノ酸配列は、さらにまたアミノ酸配列（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３）の１つの組み合わせ群と見なすことができる。本発明は、さらにまたＶＬ  ＣＤＲ配列の組み合わせ群の同等物も含んでいる。そのような「組み合わせ同等物」は、アミノ酸配列３８、４０および４２を組み合わせたものと少なくとも７５％の配列同一性を有しており、その抗体のＨＩＲへの結合に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。好ましくは、組み合わせ同等アミノ酸配列は、配列番号３８、４０および４２において見いだされる組み合わせ配列との少なくとも８５％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、組み合わせアミノ酸配列（配列番号３８、４０および４２）との少なくとも９５％の配列同一性を有する組み合わせ同等アミノ酸配列である。
【００２４】
ＶＬ  ＣＤＲアミノ酸配列が上記に規定した個別の同等性および組み合わせ同等性の要件をどちらも満たすことが好ましい。しかし、特により短いＣＤＲについて、組み合わせ同等性の基準が満たされる場合でさえ１つ以上のＣＤＲが個別同等性の基準を満たさないという一定の状況が存在する。そのような状況では、個別同等性の要件は、組み合わせ同等性の要件が満たされることを前提に適用されない。例えば、ＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号４２）は９アミノ酸長である。３つのアミノ酸が変化される場合は、次に個別配列同一性はわずか６６％であり、これは上記に規定の個別同等性に対して７５％下限の下方にある。しかし、この特定配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を組み合わせた配列の配列同一性が群同等性要件を満たすことを前提に、組み合わせ同等ＶＬ  ＣＤＲ群の一部として使用するためにさらに適する。
【００２５】
ＶＨの第１フレームワーク領域（ＦＲ１）はヒト化抗体のアミノ末端に位置する。第４フレームワーク領域（ＦＲ４）は、ヒト化抗体のカルボキシル末端の近くに位置する。ヒト化ＶＨ  ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の代表的な好ましいアミノ酸配列は各々配列番号３０、３２、３４および３６に表示されており、これらの好ましい配列はバージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂに一致する（表３）。ＦＲ２のアミノ酸配列（配列番号３２）は、マウスＭＡｂ  ８３−１４  ＶＨ  ＦＲ２またはヒトＩｇＧ、Ｂ４３のアミノ酸配列（図４を参照）と同一である。ＶＨ  ＦＲ１およびＦＲ４のアミノ酸配列（配列番号３０および３６）は、マウスＭＡｂ  ８３−１４とは相違するアミノ酸配列を有するＢ４３ヒト抗体フレームワーク領域に一致する（図４）。バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂのＶＨ
ＦＲ３のアミノ酸配列（配列番号３４）は、マウス８３−１４抗体のＶＨ  ＦＲ３に一致する（表３）。好ましいＶＨ  ＦＲ配列は抗体の生物活性を破壊せずに修飾することができる。適切なまた別の、または同等のＦＲには、配列番号３０、３２、３４または３６と少なくとも７０％の個別配列同一性を有し、結果として生じる抗体がＨＩＲに結合する能力を破壊しないＦＲが含まれる。好ましくは、また別のＦＲは、置換される好ましいＶＨ  ＦＲとの少なくとも８０％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、置換される好ましいＶＨ  ＦＲとの少なくとも９０％の配列同一性を有するまた別のＦＲである。
【００２６】
４つのＶＨ  ＦＲアミノ酸配列は、さらにまたアミノ酸配列（ＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２およびＶＨ  ＦＲ３）の１つの組み合わせ群と見なすことができる。本発明は、さらにまたＶＨ  ＦＲ配列の組み合わせ群の代替物または同等物も含んでいる。そのような「組み合わせ同等物」は、アミノ酸配列３０、３２、３４および３６を組み合わせたものと少なくとも７０％の配列同一性を有しており、その抗体のＨＩＲへの結合に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。好ましくは、組み合わせ同等アミノ酸配列は、配列番号３０、３２、３４および３６において見いだされる組み合わせ配列との少なくとも８０％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、組み合わせアミノ酸配列（配列番号３０、３２、３４および３６）との少なくとも９０％の配列同一性を有する組み合わせ同等アミノ酸配列である。
【００２７】
また別のＶＨ  ＦＲアミノ酸配列が上記に規定した個別同等性および組み合わせ同等性の要件をどちらも満たすことが好ましい。しかし、特により短いＦＲについて、組み合わせ同等性の基準が満たされる場合でさえ１つ以上のＦＲが個別同等性の基準を満たさないという一定の状況が存在する。そのような状況では、個別同等性の要件は、組み合わせ同等性の要件が満たされることを前提に適用されない。
【００２８】
ＬＣの第１フレームワーク領域（ＦＲ１）はヒト化抗体のＶＬのアミノ末端に位置する。第４フレームワーク領域（ＦＲ４）は、ヒト化抗体のＶＬのカルボキシル末端の近くに位置する。ヒト化ＶＬ  ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の代表的な好ましいアミノ酸配列は、各々配列番号３７、３９、４１および４３に表示されている。ＶＨ  ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列（配列番号３７、３９、４１および４３）は、マウスＭＡｂ  ８３−１４とは相違するアミノ酸配列を有するＲＥＩヒト抗体フレームワーク領域に一致する（図４を参照）。好ましいＶＬ  ＦＲ配列は抗体の生物活性を破壊せずに修飾することができる。適切なまた別の、または同等のＦＲには、配列番号３７、３９、４１および４３と少なくとも７０％の個別配列同一性を有し、結果として生じる抗体がＨＩＲに結合する能力を破壊しないＦＲが含まれる。好ましくは、同等またはまた別のＦＲは、置換される好ましいＶＬ  ＦＲとの少なくとも８０％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、置換される好ましいＶＬ  ＦＲとの少なくとも９０％の配列同一性を有するまた別のＦＲである。
【００２９】
４つのＶＬ  ＦＲアミノ酸配列は、さらにまたアミノ酸配列（ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、ＶＬ  ＦＲ３およびＶＬ  ＦＲ４）の１つの組み合わせ群と見なすことができる。本発明は、さらにまたＶＬ  ＦＲ配列の組み合わせ群の代替物または同等物も含んでいる。そのような「組み合わせ同等物」は、アミノ酸配列３７、３９、４１および４３を組み合わせたものと少なくとも７０％の配列同一性を有しており、その抗体のＨＩＲへの結合に有害な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。好ましくは、組み合わせ同等アミノ酸配列は、配列番号３７、３９、４１および４３において見いだされる組み合わせ配列との少なくとも８０％の配列同一性を有するであろう。よりいっそう好ましいのは、組み合わせアミノ酸配列（配列番号３７、３９、４１および４３）との少なくとも９０％の配列同一性を有する組み合わせ同等アミノ酸配列である。
【００３０】
また別のＶＬ  ＦＲアミノ酸配列が上記に規定した個別同等性および組み合わせ同等性の要件をどちらも満たすことが好ましい。しかし、特により短いＦＲについて、組み合わせ同等性の基準が満たされる場合でさえ１つ以上のＦＲが個別同等性の基準を満たさないという一定の状況が存在する。そのような状況では、個別同等性の要件は、組み合わせ同等性の要件が満たされることを前提に適用されない。
【００３１】
バージョン５は、本発明による好ましいヒト化抗体である。バージョン５のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列は、各々配列番号５および６に表示されている。バージョン５の調製および同定については、実施例２、表３および図４により詳細に記載されている。バージョン５のＶＨ  ＦＲのアミノ酸配列は、上記に記載の好ましいＶＨ  ＦＲ配列（配列番号３０、３２、３４および３６）と一致する。さらに、バージョン５のＶＬ  ＦＲのアミノ酸配列は、上記に記載の好ましいＶＬ  ＦＲ配列（配列番号３７、３９、４１および４３）と一致する。バージョン５のＶＨおよびＶＬ  ＦＲは、「ヒト化」されているＶＨおよびＶＬ  ＬＣ  ＦＲの好ましい例である。「ヒト化」とは、ＨＣまたはＬＣいずれかにおける４つのフレームワーク領域が、結果として生じる抗体がＨＩＲに結合する能力を破壊せずにヒト抗体（ＨＡｂ）からのＦＲとできる限り緊密に適合されていることを意味する。ＨＣのために使用されるヒト抗体モデルはＢ４３抗体であり、ＬＣのために使用されるヒト抗体モデルはＲＥＩ抗体であり、Ｂ４３およびＲＥＩ抗体配列はどちらもよく知られており、公共データベースから入手可能である。ＨＣまたはＬＣ  ＦＲがヒト化された場合、１つ以上のＦＲが選択されたＨＡｂテンプレートと完全には一致せず、マウス抗体との同一性または類似性を保持していることがあり得る。マウスアミノ酸配列がヒト化ＦＲ内に残されている程度は、ヒトにおける免疫原性反応の可能性を減少させるためにできる限り低く維持されなければならない。
【００３２】
ヒト化されているＦＲの例は、実施例２および表３で説明されている。マウスＭＡｂ  ８４−１３のＦＲに密接に一致するヒト抗体からのフレームワーク領域が選択される。次にヒトＦＲはマウスＦＲに代えてＭＡｂ−８３−１４内に置換される。次に結果として生じる抗体が試験される。１群としてのＦＲは、修飾された抗体がまだＨＩＲ受容体に強力に結合し、ヒトにおける免疫原性を減少させている場合にのみヒト化されていると見なされる。最初の試験が成功しない場合は、ヒトＦＲがわずかに修飾され、結果として生じる抗体が試験される。ＭＡｂ  ８４−１３のＨＣ  ＦＲをヒト化するために使用できるＨＣ
ＦＲを有する代表的なヒト抗体には、Ｇｅｎｂａｎｋ（受託番号Ｓ７８３２２）に預託されているＢ４３ヒトＩｇＧ（配列番号１２）が含まれており、マウス８４−１３  ＶＨとのＶＨ相同性を備えるその他のヒトＩｇＧ分子は、免疫グロブリン配列のＫａｂａｔデータベースなどの公共データベースを検索することによって見いだすことができる。ＭＡｂ  ８４−１３のＬＣ  ＦＲをヒト化するために使用できるＬＣ  ＦＲを有する代表的なヒト抗体には、Ｇｅｎｂａｎｋ（受託番号１ＷＴＬＢ）に預託されているヒトＲＥＩ抗体（配列番号１３）が含まれており、マウス８３−１４  ＶＬとのＶＬ相同性を備えるその他のヒトＩｇＧ分子は、免疫グロブリン配列のＫａｂａｔデータベースなどの公共データベースを検索することによって見いだすことができる。
【００３３】
ヒト化抗体が適正に機能するためには、ＨＣおよびＬＣは各々定常領域を含有していなければならない。抗体がＨＩＲに結合する能力を破壊しないことを前提に、あらゆる数の様々なヒト抗体定常領域をヒト化抗体内に組み込むことができる。適切なヒト抗体ＨＣ定常領域にはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４が含まれる。好ましいＨＣ定常領域はヒトＩｇＧ１である。適切なヒト抗体ＬＣ定常領域にはカッパ（κ）またはλが含まれる。ヒトκＬＣ定常領域が好ましい。
【００３４】
ヒト化抗体は、事前にＨＩＲにアクセスすることによって遺伝子、薬物および診断薬を細胞へ送達するために使用されてきた他の抗体ターゲティング剤（トロイの木馬）と同一方法で使用できる。ヒト化抗体は、典型的には薬物または診断用化合物（医薬品）に結合しており、適切な医薬担体と組み合わされて静脈内（ｉｖ）投与される。適切な担体を用いると、薬物／ヒト化抗体複合体は、皮下、筋肉内、鼻腔内、クモ膜下、または経口投与することができよう。ヒト化抗体を医薬品へ結合させることのできる多数の方法がある。ヒト化抗体はアビジンもしくはストレプトアビジンに融合させ、抗体トロイの木馬と医薬品とを一緒に結合させるためにアビジン−ビオチン結合を使用する既知の方法によって、モノビオチン化されている医薬品へ結合させることができる。あるいは、ヒト化抗体および医薬品は遺伝子組換え方法を使用して単一融合タンパク質として発現させることができる。
【００３５】
それにヒト化抗体を結合させることのできる代表的な医薬品には、遺伝子送達のための小分子、組換えタンパク質、合成ペプチド、アンチセンス物質またはナノ容器が含まれる。代表的な組換えタンパク質には、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ヒトα−Ｌ−イヅロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、脳由来神経栄養性因子などの他のニューロトロフィン、またはその他のリソソーム酵素が含まれる。本発明のヒト化抗体などの、ＢＢＢを越えてｂＦＧＦを輸送するためのトロイの木馬の使用は、本特許出願と同一譲受人によって所有されており、本特許出願と同一日に出願された同時係属の米国特許出願（ＵＣ  Ｃａｓｅ
２００２−０９４−１、代理人整理番号第０１８０−００２７号）の中に記載されている。
【００３６】
ヒト化抗体が医薬品と結合されると、患者に知られている他のコンジュゲート（結合体）または融合タンパク質と同一方法で患者に投与される。特定の用量または治療レジメンは、送達される医薬品および治療される状態に依存して広範囲に変動するであろう。好ましい投与経路は静脈内（ｉｖ）である。適切な担体には、Ｔｗｅｅｎシリーズの界面活性剤由来の１つなどの低濃度の中性洗剤を含む、または含まない酢酸塩、リン酸塩、ＴＲＩＳまたは様々な他のバッファーを用いて緩衝された生理食塩液もしくは水が含まれる。ＢＢＢを越えて神経医薬品を送達するためには、好ましくはヒト抗体／医薬品によるトロイの木馬化合物が使用される。しかし、ヒト化されたトロイの木馬は、さらにまた一般にＨＩＲを有するいずれかの器官または組織へ医薬品を送達することもできる。
【００３７】
以下の実施例では、本発明によるヒト化モノクローナル抗体が発見された方法およびそれらの作製および使用に関する更なる詳細について記載する。
【実施例１】
【００３８】
マウス８３−１４  ＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニング
ポリＡ＋ＲＮＡを８３−１４ハイブリドーマ細胞系（Ｓｏｏｓら，  １９８６）から単離し、それを使用して逆転写酵素素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成した。このｃＤＮＡを、マウス抗体遺伝子のＶＨおよびＶＬを特異的に増幅させるオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて８３−１４  ＶＨまたは８３−１４  ＶＬ遺伝子のうちのどちらかのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と一緒に使用したが、類似方法は周知である（Ｌｉら，  １９９９）。これらの遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅に適したＰＣＲ  ＯＤＮの配列は周知である（Ｌｉ．，  １９９９）。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで単離し、予想された０．４ＫｂのＶＨおよびＶＬ遺伝子産物を単離した。一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）抗体をコードできるように、ＶＨおよびＶＬ遺伝子フラグメントを連続的に細菌発現プラスミドにサブクローニングした。次にＳｃＦｖ発現プラスミドを使用して大腸菌を形質転換させた。個々のコロニーを寒天プレート上で同定し、ＬＢ培地中で液体培養物を生成した。この培地をアカゲザル脳の免疫組織化学検査に使用して、アカゲザル脳微小血管またはＢＢＢへ強力に結合する抗体を産生するクローンを同定した。この免疫組織化学検査は、それらのコロニーが機能的８３−１４ＳｃＦｖを分泌することを同定した。８３−１４  ＶＨおよびＶＬ遺伝子の同定に続いて、自動ＤＮＡシーケンシング法を使用してヌクレオチド配列を両方向で決定した。マウス８３−１４  ＶＨ（配列番号１）およびマウスＶＬ（配列番号２）のヌクレオチド配列は、マウスＶＨ（配列番号３）およびマウスＶＬ（配列番号４）の推定アミノ酸配列を生じさせる。アミノ酸配列は、ＨＣおよびＬＣのマウス８３−１４  ＨＩＲＭＡｂ両方の全３つのＣＤＲおよび全４つのＦＲについて与えられる。図１では、ＬＣの可変領域をＶＬとし、ＨＣの可変領域をＶＨとしている。
【実施例２】
【００３９】
８３−１４  ＨＩＲＭＡｂの反復ヒト化：バージョン１からバージョン５
８３−１４  ＭＡｂのヒト化は８３−１４  ＭＡｂ内のマウスＦＲはＬＣおよびＨＣの両方の可変領域内の適切なヒトＦＲ領域によって置換されるＣＤＲ／ＦＲグラフティングによって実施した。ＫａｂａｔデータベースはＭａｔｃｈプログラムを使用してスクリーニングした。マウス８３−１４  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をヒトＩｇＧ  ＶＨまたはヒトκ軽鎖データベースと比較した。できる限り最小のミスマッチを使用して、マウス８３−１４  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と高度に相同であるＦＲアミノ酸配列を含有する可能性のあるいくつかのヒトＩｇＧ分子を同定した。最後にマウス８３−１４  ＨＩＲＭＡｂのＣＤＲ／ＦＲグラフティングのために、Ｂ４３ヒトＩｇＧ１重鎖およびＲＥＩヒトκ軽鎖のフレームワーク領域を選択した。
【００４０】
合成ヒト化８３−１４  ＶＬおよびＶＨ遺伝子を増幅させるために、長さが６９−９４ヌクレオチドから構成される６種のＯＤＮプライマーのセットを設計した（表１および２）。これらのＯＤＮプライマーは５’および３’末端のどちらにもおいても２４ヌクレオチド重複しており、標準ソフトウエアを用いて二次構造を分析した。４６℃を超えるＴｍを生じる安定な二次構造は、これらの構造の融点を３２−４６℃へ低下させるために第１、第２、または第３文字のコドンの置換によって修正した。さらに５’および３’末端両方に対応するプライマーもまた設計したが、これらによって人工遺伝子のＰＣＲ増幅が可能になった。これらの新規の配列は、アスパラギン残基での如何なるコンセンサスＮ−グリコシル化部位も欠如している。
【００４１】
【表１】
0005981688.tif 000002
【００４２】
【表２】
0005981688.tif 000003
【００４３】
ＰＣＲは、各５ｐモルの６つのオーバーラッピングＯＤＮ、ヌクレオチド、ならびにＴａｑおよびＴａｑ伸長ＤＮＡポリメラーゼを含有する総量１００μＬ中で実施した。ＰＣＲ後、ヒト化ＶＨおよびＶＬ遺伝子を細菌発現プラスミド中で個別にライゲートし、大腸菌を形質転換させた。幾つかのクローンを単離し、個別にシーケンシングし、ＰＣＲ導入シーケンスエラーを含有しないクローンを引き続いて生成させた。
【００４４】
制限エンドヌクレアーゼを用いてヒト化ＶＨインサートを細菌発現プラスミドから遊離させ、以前に記載されたように（Ｃｏｌｏｍａら，  １９９２；米国特許第５，６２４，６５９号）真核細胞発現ベクター内にライゲートした。ヒト化ＶＬ合成遺伝子に対して類似の方法を実施した。骨髄腫細胞にヒト化軽鎖遺伝子をトランスフェクトし、引き続き、この細胞系にバージョン１のヒト化重鎖遺伝子をトランスフェクトした（表３）。無傷ヒトＩｇＧを分泌するクローンを同定するために、トランスフェクトした骨髄腫細胞を９６ウエルＥＬＩＳＡでスクリーニングした。複数回試みたが、ヒトＩｇＧを産生する細胞系を同定することはできなかった。これとは反対に、ノーザンブロット分析はトランスフェクトした細胞系が予想されたヒト化８３−１４  ｍＲＮＡを産生することを示し、これはこの細胞系のトランスフェクションが成功したことを実証していた。これらの結果は、ＦＲアミノ酸置換を含有していないバージョン１のヒト化ＨＩＲＭＡｂがこの細胞から分泌されないことを示しており、このことは、ヒト化ＨＣがヒト化ＬＣと適正には集合しないことを示唆していた。バージョン１は、２５Ｃｌ’Ｃｌ抗体（Ｂｅｊｃｅｋら，  １９９５）に対応するＦＲアミノ酸を含有する合成ＨＣ遺伝子から誘導された。これにより、新規のＨＣ人工遺伝子が調製され、これは、Ｂ４３ヒトＩｇＧのアミノ酸配列（Ｂｅｊｃｅｋら，  １９９５）である異なるヒトＩｇＧ配列由来のＨＣ  ＦＲアミノ酸を含有しており、これはバージョン２のヒト化ＨＩＲＭＡｂを生じた（表３）。しかし、バージョン２ヒト化ＨＩＲＭＡｂはトランスフェクトした骨髄腫細胞によって分泌されなかった。バージョン１および２はどちらも、Ｒｅｃｈａｖｉら（１９８３）から誘導された同一のＨＣシグナルペプチド（表３）を含有している。シグナルペプチドがＩｇＧ分泌に及ぼす作用を評価するために、シグナルペプチド配列を、キメラＨＩＲＭＡｂを産生するために使用するシグナルペプチド配列に変更したが（Ｃｏｌｏｍａら，  ２０００）、このシグナルペプチド配列は表３に示されている。ヒト化ＨＩＲＭＡｂのバージョン２および３はそのシグナルペプチドに関してしか相違していなかった（表３）。しかし、バージョン３は骨髄腫細胞からは分泌されず、これはこのシグナルペプチドがヒト化ＨＩＲＭＡｂの分泌の欠如の原因ではないことを示している。
【００４５】
上記の所見は、ヒトＦＲ領域へのマウス８３−１４  ＣＤＲの単純なグラフティングが適正には集合および分泌できないタンパク質を産生させることを証明した。以前の研究は、ＨＩＲＭＡｂのキメラ形がトランスフェクトした骨髄腫細胞中で適切にプロセシングかつ分泌されることを証明していた（Ｃｏｌｏｍａら，  ２０００）。これは、ヒト化ＨＣまたはＬＣのＦＲ内の一定のアミノ酸配列がヒト化ＨＩＲＭＡｂの適正な集合および分泌を妨害することを示唆した。そこで、キメラ／ヒト化ハイブリッド分子を組換え作製した。バージョン４ａはマウスＦＲ１ならびにヒト化ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含有していた；バージョン４ｂはマウスＦＲ３、およびＦＲ４ならびにヒト化ＦＲ１およびＦＲ２を含有していた（表３）。バージョン４ａおよび４ｂのどちらも分泌されたが、バージョン４ｂはバージョン４ａより活性であった。これらの所見は、ＦＲ３またはＦＲ４のどちらかの中のアミノ酸がヒト化ＨＩＲＭＡｂの分泌の欠如の原因であることを示していた。ヒトおよびマウスＦＲ４は１アミノ酸しか相違しなかった（表３）；このため、ＦＲ４の配列をヒト配列に対応させるために部位特異的突然変異誘発によって変化させ、このバージョンをバージョン５とした（表３）。バージョン５  ＨＩＲＭＡｂは、ＶＨのＦＲ３内のヒト配列とＶＨ内のＦＲ３に対するオリジナルのマウス配列との置換を用いるとオリジナルのＣＤＲグラフティング抗体と一致した。全バージョンのＨＩＲＭＡｂを産生する際には、ＦＲ置換を備えていない同一ＣＤＲグラフティングＬＣを使用した。これは、ＬＣにおけるＦＲ変化を必要としない可能性があることを証明した他の研究（Ｇｒａｚｉａｎｏら，  １９９５）と一致している。
【００４６】
【表３】
0005981688.tif 000004
【００４７】
ヒト２５Ｃ１Ｃ１  ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）のＦＲを使用してバージョン１を設計した。
バージョン１は、ノーザンブロット分析によって決定されたＨＣ  ｍＲＮＡが高度に富裕であるにもかかわらず、トランスフェクトした骨髄腫細胞から分泌ｈＩｇＧを産生しなかった。
【００４８】
ヒトＢ４３  ＩｇＧ  ＨＣ可変領域のＦＲを使用してバージョン２を再設計した。バージョン１および２におけるペプチドシグナル＃１（ＭＤＷＴＷＲＶＬＣＬＬＡＶＡＰＧＡＨＳ）（配列番号４９）をバージョン３におけるシグナルペプチド＃２（ＭＧＷＳＷＶＭＬＦＬＬＳＶＴＡＧＫＧＬ）（配列番号５０）と取り替えた。バージョン２および３におけるＦＲおよびＣＤＲは同一であった。バージョン４ａ、４ｂおよび５に対してはシグナルペプチド＃２を使用した。
バージョン４ａはヒトＦＲ２、３および４、ならびにマウスＦＲ１を有している。
バージョン４ｂはヒトＦＲ１および２、ならびにマウスＦＲ３および４を有している。
バージョン５は、ヒトＦＲ１、２および４、ならびにマウスＦＲ３を使用して生成した。
バージョン４ａ、４ｂおよび５は分泌ｈＩｇＧを産生したが、他方バージョン１、２および３はＩｇＧを分泌しなかった。バージョン４ａ、４ｂ、および５の中では、含有するマウスフレームワークアミノ酸置換が少ないのでバージョン５が好ましい。
【００４９】
このタンパク質のバージョン５形は、トランスフェクトした骨髄腫細胞から無傷で分泌された。分泌されたバージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂはタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＨＩＲに対するこの抗体の親和性は、以前に記載されたように（Ｃｏｌｏｍａら，  ２０００）、リガンドとして［125Ｉ］−標識マウス８３−１４  Ｍａｂを使用した免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）を用いて試験した。これらの結果は、ＨＩＲに対するこの抗体の親和性が維持されていることを証明した。ＩＲＭＡでは、抗原はトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から産生し、ＣＨＯ細胞順化培地のレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＨＩＲの細胞外ドメインであった。マウスおよびバージョン５ヒト化８３−１４  ＨＩＲＭＡｂの解離定数（ＫＤ）は各々２．７±０．４ｎＭおよび３．７±０．４ｎＭであった。これらの結果は、８３−１４  ＨＩＲＭＡｂが、米国特許第５，５８５，０８９号に教示されているように、（ａ）種々のヒト免疫グロブリン分子由来のＨＣおよびＬＣのＦＲ領域を入手し、および（ｂ）抗体構造の分子モデリングの使用を必要としない方法を使用することによって良好にヒト化されていることを示している。他の適用（Ｇｒａｚｉａｎｏら，  １９９５）と同様に、抗体のＬＣにおけるＦＲアミノ酸変化は必要とされなかった。
【実施例３】
【００５０】
ヒト化ＨＩＲＭＡｂのヒトＢＢＢへの結合
以前の研究は、放射標識マウスＨＩＲＭＡｂが、６０〜１２０分間のインキュベーション時間でタンパク質１ｍｇにつきおよそ４００％の結合率でヒト脳毛細血管に強力に結合すると報告している（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  １９９５）。この実施例では、放射標識バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂを用いて類似の所見が記録された。ヒト脳毛細血管を放射受容体アッセイにおいて［125Ｉ］バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂと一緒にインキュベートすると、室温での６０分間のインキュベーションで結合率はほぼ４００％となり、これは［125Ｉ］−キメラＨＩＲＭＡｂのヒト脳毛細血管への結合に似ていた（図２Ａおよび２Ｂを参照）。これとは対照的に、ヒト脳毛細血管への非特異的ＩｇＧの結合は、類似のインキュベーション時間ではタンパク質１ｍｇにつき５％未満である（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  １９９５）。この実施例は、バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂがインビボでＢＢＢを形成するヒト脳毛細血管によって強力に結合かつエンドサイトーシスされたことを証明している。
【実施例４】
【００５１】
インビボの霊長類ＢＢＢを越えるヒト化ＨＩＲＭＡｂの輸送
ヒト化バージョン５ＨＩＲＭＡｂを１２５−ヨウ素により放射標識し、成体アカゲザルに静脈内注射した。２時間後に動物を致死させ、脳を切除して冷凍した。クリオスタット切片（２０ミクロン）を作製し、ｘ線フィルムに露光させた。フィルムを走査すると、ヒト化ＨＩＲＭＡｂの霊長類脳取り込みの画像が生成された（図３）。霊長類脳の白質および灰白質の区域が明瞭に描出され、取り込みは白質より灰白質内の方が多かった。白質と比較して、灰白質内のヒトＨＩＲＭＡｂの高度の取り込みは灰白質内の３倍高い血管密度と一致している。アカゲザルに３倍高い非特異的ＩｇＧが注射しても抗体の脳取り込みは生じない（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  １９９５）。これらのフィルムオートラジオグラフィー試験は、ヒト化ＨＩＲＭＡｂがインビボで霊長類ＢＢＢを越えて薬物（ヨウ素）を運べることを証明している。ヒトＢＢＢ（図２）へのヒト化ＨＩＲＭＡｂの高度の結合に基づくと、ヒトにおいてもインビボでの高い脳取り込みの類似所見が記録されるであろう。
【実施例５】
【００５２】
ＣＤＲまたはＦＲアミノ酸置換による抗体の親和性成熟法
バージョン５ヒト化ＨＩＲＭＡｂ、マウス８３−１４  ＨＩＲＭＡｂ、ならびにＢ４３
ＨＣまたはＲＥＩ  ＬＣ抗体についてのＨＣのＶＨのアミノ酸配列およびＬＣのＶＬのアミノ酸配列は図４に示されている。図４におけるＣＤＲアミノ酸を前提にすると、抗体工学術分野の当業者（Ｓｃｈｉｅｒら，  １９９６）は、いわゆる「親和性成熟法」または分子進化法と呼ばれる工程において８３−１４  ＨＣまたはＬＣ  ＣＤＲ配列内で一定のアミノ酸置換を作製することができる。これは無作為に、または抗体のＨＣもしくはＬＣのいずれかのＦＲ領域で作製した一本鎖アミノ酸変化に類似する免疫グロブリン構造のＸ線回折モデルによって誘導して実施することができる（米国特許第５，５８５，０８９号）。同様に、図４におけるＦＲアミノ酸配列が与えられると、当業者はターゲット（標的）ＨＩＲ抗原に対するＨＩＲＭＡｂの親和性をさらに最適化するために、ＨＣもしくはＬＣ  ＦＲ領域における一定のアミノ酸置換を作製することができる。これらの置換は、ＦＲおよびＣＤＲ領域両方について以前に記載された配列同一性の限界に留意しなければならない。これらの変化は、増加した結合もしくは増加したエンドサイトーシスまたはその両方のいずれかを引き起こすことができる。
【実施例６】
【００５３】
ヒト化ＨＩＲＭＡｂ／α−Ｌ−イヅロニダーゼ融合タンパク質
α−Ｌ−イヅロニダーゼ（ＩＤＵＡ）は、ハーラー症候群またはＩ型ムコ多糖体沈着症（ＭＰＳ）を有する患者において欠如している酵素であり、脳に有害な影響を及ぼす。脳病理は、最終的にはこの遺伝性疾患を有する小児の早期の死亡を生じさせる。Ｉ型ＭＰＳ患者に対するＩＤＵＡ酵素補充療法（ＥＲＴ）は脳疾患にとって有効ではないが、それはこの酵素がＢＢＢを越えないからである。これは重篤な問題であり、この疾患を有する小児がＥＲＴを受けている場合でさえ早期に死亡することを意味する。この酵素は、この酵素がヒト化ＨＩＲＭＡｂなどの分子版トロイの木馬に付着されることを前提に、末梢投与後にはヒトＢＢＢを越えて送達することができよう。ＩＤＵＡは、アビジン−ビオチン工学技術を用いてヒト化ＨＩＲＭＡｂへ付着させることができる。このアプローチでは、ＩＤＵＡ酵素はヒト化ＨＩＲＭＡｂおよびアビジンの融合タンパク質産生に平行してモノビオチン化される。さらに、ＩＤＵＡはアビジン−ビオチン工学技術ではなく、ビオチン化の必要またはアビジンなどの異種タンパク質の使用を回避する遺伝子組換え技術を用いてヒト化ＨＩＲＭＡｂへ付着させることもできよう。このアプローチでは、ＩＤＵＡをコードする遺伝子がＨＩＲＭＡｂ重鎖もしくは軽鎖タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシル末端に一致するヒト化ＨＩＲＭＡｂ重鎖もしくは軽鎖遺伝子の領域に融合される。融合遺伝子の構築および適切な原核細胞もしくは真核細胞発現ベクター内への挿入に続いて、ＨＩＲＭＡｂ／ＩＤＵＡ融合タンパク質は精製および製造のために大量生産される。典型的ＭＡｂ／ＩＤＵＡ融合タンパク質のアミノ酸配列および一般構造式は図５に示されている（配列番号４８）。この構築物中では、この酵素はヒト化ＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＨＣ）のカルボキシル末端に融合している。図５に示されているＩＤＵＡのアミノ酸配列は、成熟した、プロセシングされた酵素のアミノ酸配列である。あるいは、この酵素はＨＩＲＭＡｂ  ＨＣのアミノ末端またはヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖（ＬＣ）のアミノ末端もしくはカルボキシル末端に融合させることができよう。さらに、ＩＤＵＡ配列内の１つ以上のアミノ酸はこの酵素の生物活性を保持しながら修飾することができよう。リソソーム酵素および抗体の融合タンパク質が調製されており、これらの融合タンパク質は生物活性を保持している（Ｈａｉｓｍａら，  １９９８）。この融合タンパク質をコードする融合遺伝子はｐＣＥＰ４などの数種の市販で入手できる永続的発現ベクター内に挿入でき、細胞系を永続的にトランスフェクトしてヒグロマイシンまたはその他の選択剤を用いて選択することができる。順化培地は、組換えヒト化ＨＩＲＭＡｂ／ＩＤＵＡ融合タンパク質を精製するために濃縮することができる。
【実施例７】
【００５４】
ＨＩＲＭＡｂのヒトインスリン受容体への結合における軽鎖（ＬＣ）の役割
ヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖または、抗ダンシルＭＡｂ軽鎖であった「代替軽鎖」（Ｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９９０）をコードするプラスミドを用いて、骨髄腫細胞（ＮＳＯ）をトランスフェクトした。抗ダンシル軽鎖は、抗ダンシルＩｇＧから誘導され、この場合、ダンシルは抗体生成において使用される一般的なハプテンである。ヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖を用いてトランスフェクトした骨髄腫細胞系、および代替軽鎖を用いてトランスフェクトした骨髄腫細胞系のどちらも、引き続いて、キメラＨＩＲＭＡｂの重鎖をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。１つの細胞系は抗ＨＩＲＭＡｂキメラ重鎖および抗ＨＩＲＭＡｂヒト化軽鎖から構成されるＩｇＧを分泌し、このＩｇＧをキメラＨＩＲＭＡｂ重鎖／ヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖ＩｇＧとする。もう１つの細胞系は、キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖および抗ダンシル軽鎖から構成されるＩｇＧを分泌し、このＩｇＧをキメラＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ／ダンシルＬＣ  ＩｇＧとする。どちらの細胞系も、骨髄腫細胞上清についてのヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用いて決定されたように、ヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖または抗ダンシル軽鎖のどちらかを用いてプロセシングされたＩｇＧを分泌した。これらのデータは、キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖が非特異的もしくは代用軽鎖を産生する骨髄腫細胞によってプロセシングかつ分泌され得ることを示した。これらのキメラ抗体とＨＩＲの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との反応性はＥＬＩＳＡによって決定された。ＨＩＲ  ＥＣＤは、以前に記載されたように（Ｃｏｌｏｍａら，  ２０００）、ＨＩＲ  ＥＣＤを用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の順化培地のレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＨＩＲ  ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡでは、マウス８３−１４  ＨＩＲＭＡｂを陽性コントロールとして使用し、マウスＩｇＧ２ａを陰性コントロールとして使用した。陰性コントロールはごくわずかなＥＬＩＳＡシグナルを生じた；マウス８３−１４  ＭＡｂを用いた検量線は、１μｇ／ｍＬ（マウス８３−１４  ＭＡｂ）で飽和状態に到達した吸光度の線形増加を生じさせた。ＥＬＩＳＡにおける免疫反応を、分光光度計を用いて定量し、このアッセイにおける４０５ｎｍでの最大吸光度（Ａ４０５）は０．９であった。キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖／ヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖ＩｇＧを分泌するすべての単離骨髄腫細胞クローンは、検量線を最大化した免疫反応性レベルを示してＨＩＲ  ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡにおいて陽性であった。さらに、キメラＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ／ｄａｎｓｙｌ  ＬＣ  ＩｇＧを分泌する骨髄腫細胞クローンはさらにまたＨＩＲ  ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルを生じ、Ａ４０５レベルはキメラＨＩＲＭＡｂ重鎖／ヒト化ＨＩＲＭＡｂ軽鎖ＩｇＧを用いて得られたＡ４０５レベルの約５０％であった。これらの所見は、軽鎖がヒトインスリン受容体の細胞外ドメインであるその標的抗原へのＨＩＲＭＡｂへの結合において小さな役割しか果たさないことを示している。この解釈は、ヒト化ＨＩＲＭＡｂのＨＩＲ  ＥＣＤへの活性の結合を可能にするためにヒト化ＬＣにおけるＦＲ置換が必要とされなかったという所見によって支持される（実施例２を参照）。これらの所見は、無傷ヒト��ＨＩＲＭＡｂの標的ＨＩＲ抗原への結合の損失を最小限に抑えながらＨＩＲＭＡｂ軽鎖のアミノ酸配列における大きな変化（５０％以上）を作製できることを証明している。したがって、広範囲のＬＣを使用すると、それらがＨＣと適合性であるならば、本発明によってヒト化抗体を調製することができる。ＬＣは、ＬＣがＨＣと結合され、結果として生じる抗体がＨＩＲに結合する能力を破壊しない場合は、ＨＣと「適合性」があると見なされる。さらに、ＬＣは、ヒトにおける免疫原性反応が最小限に抑えられるようにヒトまたは十分にヒト化されなければならない。選択されたヒトまたはヒト化ＬＣ配列がＨＣと適合性であるかどうかは、日常的実験を使用して決定できる。
【００５５】
本発明の代表的実施形態を記載してきたが、当業者には本開示は典型に過ぎないこと、様々な他の代替、適応および修飾を本発明の範囲内で実施できることに留意されたい。したがって、本発明は上記の実施形態および実施例に限定されず、添付の特許請求項によってのみ限定される。
【００５６】
参考文献
Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  Ｍ．ら（１９８９）、「キメラ抗体の免疫原性」、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７０：２１５３−２１５７．
Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．，  Ｌｅｅ  Ｈ．Ｊ．，  Ｋｕｒｉｈａｒａ  Ａ．，  Ｌａｎｄａｗ  Ｅ．Ｍ．，  Ｂｏａｄｏ  Ｒ．Ｊ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．（２０００）、「遺伝子組換えキメラモノクローナル抗体のヒトインスリン受容体への霊長類血液脳関門を越える輸送」、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．，  １７：２６６−２７４．
Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．，  Ｈａｓｔｉｎｇｓ  Ａ．，  Ｗｉｍｓ  Ｌ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．（１９９２）、「ポリメラーゼ連鎖反応によって生成した可変領域を使用して抗体分子を発現させるための新規ベクター」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １５２：８９−１０４．
Ｆｏｏｔｅ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．（１９９２）、「超可変ループの立体構造に影響を及ぼす抗体フレームワーク残基」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２４：４８７−４９９．
【００５７】
Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）、「ヒト化抗γ−Ｉｇ受容体Ｉ型（ＦｃγＲＩ）モノクローナル抗体の構築および特性解析」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５５：４９９６−５００２．
Ｈａｉｓｍａ  Ｊ．Ｊ．ら（２０００）、「抗体指向性酵素プロドラッグ療法のための一本鎖抗ＣＤ２０抗体およびヒトβ−グルクロニダーゼの融合タンパク質の構築および特性解析」、Ｂｌｏｏｄ．  ９２：１８４−１９０．
Ｌｉ  Ｊ．Ｙ．，  Ｓｕｇｉｍｕｒａ  Ｋ．，  Ｂｏａｄｏ  Ｒ．Ｊ．，  Ｌｅｅ  Ｈ．Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ  Ｃ．，  Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．（１９９９）、「遺伝子組換え脳薬物送達ベクター抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体−ストレプトアビジン融合遺伝子およびタンパク質のインビボ適用」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １２：７８７−７９６．
Ｍｉｌｌｅｒ  Ｇ．（２００２）、「障壁を破壊する」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７：１１１６−１１１８．
Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．（１９９７）、「脳への薬物送達」、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．
Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂｏｌ．，  １７：７１３−７３１．
【００５８】
Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．，  Ｂｕｃｉａｋ  Ｊ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｆｒｉｄｅｎ  Ｐ．Ｍ．（１９９１）、「インビボでの血液脳関門を通しての抗トランスフェリン受容体抗体の選択的輸送」、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２５９：６６−７０．
Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．，  Ｋａｎｇ  Ｙ．−Ｓ．，  Ｂｕｃｊａｋ  Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｙａｎｇ  Ｊ．（１９９５）、「ヒトインスリン受容体モノクローナル抗体はインビトロではヒト脳毛細血管への高度の親和性結合および霊長類におけるインビボでは血液脳関門を通る迅速なトランスサイトーシスを受ける」、  Ｐｈａｒｍ．，  Ｒｅｓ．１２：８０７−８１６．
Ｐｉｃｈｌａ  Ｗ．Ｌ．，  Ｍｕｒａｌｉ  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｅｔｔ  Ｒ．Ｍ．（１９９７）、「骨髄腫関連性ＧＤ２ガングリオシドへのＦａｂフラグメントの結晶構造」、Ｊ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  １１９：６−１６．
Ｒｅｃｈａｖｉ  Ｇ．ら（１９８３）、「免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子サブグループの進化の様相」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８０：８５５−８５９．
Ｓｃｈｉｅｒ  Ｒ．ら（１９９６）、「抗体結合部位の中心にある相補性決定領域の分子進化によるピコモル親和性抗ｃ−ｅｒｂＢ−２一本鎖Ｆｖの単離」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６３：５５１−５５７．
【００５９】
Ｓｈｉｎ  Ｓ．Ｕ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．（１９９０）、「インスリン様成長因子１へ特異的に結合した抗体結合の発現および特性解析：細胞ターゲティングの潜在的用途」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７：５３２２−５３２６．
Ｓｏｏｓ  Ｍ．Ａ．ら（１９８６）、「ヒトインスリン受容体上の多数のエピトープと反応するモノクローナル抗体」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２３５：１９９−２０８．
米国特許第５，６２４，６５９号（発行日：１９９７年４月２９日）、「テネイシンを発現する脳腫瘍を治療する方法」、（発明者：Ｄａｒｅｌｌ  Ｄ．  ＢｉｇｎｅｒおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｒ．  Ｚａｌｕｔｓｋｙ；譲受人：デューク大学）。
米国特許第６，２８７，７９２号（発行日：２００１年９月１１日）、「アビジン−ビオチン工学技術を使用したインビボ組織および細胞へのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびペプチドの薬物送達」、（発明者：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｍ．  ＰａｒｄｒｉｄｇｅおよびＲｕｂｅｎ  Ｊ．  Ｂｏａｄｏ；譲受人：カリフォルニア大学）。
【００６０】
Ｖｏｇｅｌ  Ｃ．Ｌ．ら（２００２）、「ＨＥＲ２−過剰発現性転移性乳癌の第一選択療法における単一薬剤としてのトラスツズマブの有効性および安全性」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ．，  ２０：７１９−７２６．
Ｗｕ  Ｄ．，  Ｙａｎｇ  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．（１９９７）、「ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体を用いてのインビボでの霊長類血液脳関門を越えるペプチド放射性医薬品のドラッグターゲティング」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．，  １００：１８０４−１８１２．
Ｚｈａｎｇ  Ｙ．，  Ｌｅｅ  Ｈ．Ｊ．，  Ｂｏａｄｏ  Ｒ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．（２００２）、「ヒト脳癌細胞へのアンチセンス遺伝子の受容体媒介性送達」、Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，  ４：１８３−１９４．
【図１】
0005981688.tif 000005
【図２】
0005981688.tif 000006
【図３】
0005981688.tif 000007
【図４】
0005981688.tif 000008
【図５】
0005981688.tif 000009
【配列表】
0005981688000001.app