(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を同定するための方法であって、
ａ）配列番号：１６４、１６８、２３０、２３２、２９８、３１０、３４４、および３４６のタンパク質を使用して作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを用いて１つまたは複数のアミノ酸配列を問い合わせるステップであって、Ｅ値が１０-5未満である一致により第１サブセットの配列が提供され、また前記第１サブセットの配列が１種または複数種のＤＨＡＤ関連タンパク質に対応する、問い合わせステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の１種または複数種のＤＨＡＤ関連タンパク質に対応する前記第１サブセットの配列を、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼのアミノ酸配列（配列番号：１６８）内の位置５６、１２９、および２０１に対応する３個の保存システインが存在するかどうかについて分析するステップであって、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素をコード化する第２サブセットの配列が同定される、分析ステップと；
ｃ）ステップ（ｂ）の前記第２サブセットの配列を、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのアミノ酸配列（配列番号：１６８）内の各位置に対応する位置にサイン保存アミノ酸（位置８８のアスパラギン酸、位置１４２のアルギニンまたはアスパラギン、位置２０８のアスパラギン、および位置４５４のロイシン）が存在するかどうかについて分析するステップであって、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素をコード化する第３サブセットの配列がさらに同定される、分析ステップと
を含む、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を同定するための方法。
【請求項２】
ｄ）ステップａ）、ｂ）、およびｃ）によって同定できる配列を有するポリペプチドを細胞内で発現させるステップと、
ｅ）前記ポリペプチドが前記細胞内でＤＨＡＤ活性を有することを確認するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄ）ステップａ）、ｂ）、およびｃ）によって同定できる配列でコード化されたタンパク質を精製するステップと、
ｅ）紫外・可視およびＥＰＲスペクトロスコピーによって前記タンパク質が［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素であることを確認するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）、ｂ）、およびｃ）によって同定された［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素の配列に対応する１つまたは複数の配列を選択することをさらに含み、ここで、１つまたは複数の配列が細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素の配列に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞には内生ＤＨＡＤ活性がない、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ｄ）細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素の配列に対応する前記選択された１つまたは複数の配列を細胞内で発現させるステップと、
ｅ）前記酵素の配列が細胞内でＤＨＡＤ活性を有することを確認するステップと
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ｄ）細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素の配列に対応する前記選択された１つまたは複数の配列でコード化されたタンパク質を精製するステップであって、精製タンパク質が製造される、精製ステップと、
ｅ）前記タンパク質が［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素であることを紫外・可視およびＥＰＲスペクトロスコピーによって確認するステップと
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって同定できる少なくとも１種の異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を含む微生物宿主細胞であって、前記少なくとも１種の異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素が、ニトロソモナス・ユーロピア、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストニア・メタリデュランス、ラルストニア・ユートロファ又はラクトコッカス・ラクティスに由来し、さらに微生物宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、微生物宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞がバクテリア細胞または酵母菌細胞である、請求項８に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１０】
前記バクテリア宿主細胞が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択されるバクテリア属のメンバーである、請求項９に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１１】
前記酵母菌細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロ
ミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）よりなる群から選択される酵母菌属のメンバーである、請求項９に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）請求項８に記載の微生物宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）イソブタノールが産生される条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を成長させるステップと
を含む、イソブタノールの産生方法。
【請求項１３】
ａ）請求項８に記載の微生物宿主および２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸を用意するステップと、
ｂ）前記２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸がα−ケトイソ吉草酸に変換される条件下で（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと
を含む、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸をα−ケトイソ吉草酸に変換する方法。
【請求項１４】
異種ＤＨＡＤが、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）またはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）から由来する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１５】
異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素が、配列番号：１６８もしくは配列番号：２３２のアミノ酸配列、またはそれらの配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の微生物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年９月２９日出願の米国仮特許出願第６１／１００，７９２号明細書に関連し、その優先権を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、工業微生物学の分野およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性の発現に関する。さらに具体的には、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有する細菌性ジヒドロキシ酸デヒドラターゼが同定され、細菌性宿主および酵母菌宿主内で異種タンパク質として発現される。
【背景技術】
【０００３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）（アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼとも呼ばれる）は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換および２，３−ジヒドロキシメチル吉草酸（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒａｔｅ）からα−ケトメチル吉草酸（α−ｋｅｔｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒａｔｅ）への変換を触媒する。Ｅ．Ｃ．４．２．１．９として分類されるＤＨＡＤ酵素は、バリン、イソロイシン、ロイシンおよびパントテン酸（ビタミンＢ５）を作り出す天然生合成経路の一部である。ＤＨＡＤ活性の発現を増大させることは、分枝鎖アミノ酸またはパントテン酸の微生物生産を増大させる上で望ましい。
【０００４】
２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へのＤＨＡＤ触媒変換は、共同所有で同時係属中の特許文献１に開示されている複数のイソブタノール生合成経路における共通ステップでもある。その中には、イソブタノール産生用の組換え微生物の工学が開示されている。イソブタノールは燃料添加物として有用であり、それが入手しやすくなれば石油燃料の需要を減らすことができる。
【０００５】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを含む経路で合成される化合物の産生を向上させるために、関心のある産生宿主（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ）内でこの酵素活性をもたらす異種酵素を発現させるのが望ましい。異種宿主内でのジヒドロキシ酸デヒドラターゼの機能発現を高めることは、Ｆｅ−Ｓクラスターに関する酵素の要件に、クラスターの入手のしやすさおよびＤＨＡＤアポタンパク質へのクラスターの適切な導入が関係しており、複雑である。
【０００６】
Ｆｅ−Ｓクラスターを必要とするＤＨＡＤ酵素は、当該技術分野において知られており、［４Ｆｅ−４Ｓ］または［２Ｆｅ−２Ｓ］のいずれかの形態で見出される。幾種類かの細菌性酵素が知られており、その特徴を有する最たるものが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものである（非特許文献１）。しかしながら、そうした細菌性酵素はすべて［４Ｆｅ−４Ｓ］形態のものである。これまでに報告されている唯一の［２Ｆｅ−２Ｓ］形態のものは、ホウレンソウ酵素である（非特許文献２）。
【０００７】
導入された生合成経路の生産量を向上させるために、宿主細胞内で［２Ｆｅ−２Ｓ］形態の酵素を使用することが望ましい。というのは、［２Ｆｅ−２Ｓ］形態を使用すると、Ｆｅ−Ｓクラスター合成及び／または構築に加わる負荷が少なくなるからである。残念ながら、知られているのは、この酵素の１種類の［２Ｆｅ−２Ｓ］形態のみである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｌｉｎｔ，ＤＨ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４７３２−１４７４２
【非特許文献２】Ｆｌｉｎｔ  ａｎｄ  Ｅｍｐｔａｇｅ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５５８−３５６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえに、組換え宿主細胞で用いるためのＤＨＡＤの新規の［２Ｆｅ−２Ｓ］形態を同定することが必要とされている。ただし、組換え宿主細胞は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換が、望ましい生合成経路における代謝経路ステップであるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書では、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を同定するための方法であって、
ａ）配列番号：１６４、１６８、２３０、２３２、２９８、３１０、３４４、および３４６のタンパク質を使用して作成されたプロファイル隠れＭａｒｋｏｖモデル（Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ）を用いて１つまたは複数のアミノ酸配列を問い合わせるステップであって、Ｅ値が１０−５未満である一致により第１サブセットの配列が提供され、また前記第１サブセットの配列が１種または複数種のＤＨＡＤ関連タンパク質に対応する、問い合わせステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の１種または複数種のＤＨＡＤ関連タンパク質に対応する前記第１サブセットの配列を、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼのアミノ酸配列（配列番号：１６８）内の位置５６、１２９、および２０１に対応する３個の保存システインが存在するかどうかについて分析するステップであって、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素をコード化する第２サブセットの配列が同定される、分析ステップと；
ｃ）ステップ（ｂ）の前記第２サブセットの配列を、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのアミノ酸配列（配列番号：１６８）内の各位置に対応する位置にサイン保存アミノ酸（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）（位置８８のアスパラギン酸、位置１４２のアルギニンまたはアスパラギン、位置２０８のアスパラギン、および位置４５４のロイシン）が存在するかどうかについて分析するステップであって、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素をコード化する第３サブセットの配列がさらに同定される、分析ステップと
を含む、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を同定するための方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様では、上記の方法は、
ｄ）ステップａ）、ｂ）、およびｃ）のいずれか１つまたは全部によって同定できる配列を有するポリペプチドを細胞内で発現させるステップと、
ｅ）前記ポリペプチドが細胞内でＤＨＡＤ活性を有することを確認するステップと
をさらに含む。
【００１３】
本発明の別の態様では、上記の方法は、
ｄ）ステップａ）、ｂ）、およびｃ）のいずれか１つまたは全部よって同定できる配列でコード化されたタンパク質を精製するステップと、
ｅ）紫外・可視（ＵＶ−ｖｉｓ）およびＥＰＲスペクトロスコピーによって前記タンパク質が［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素であることを確認するステップと
をさらに含む。
【００１４】
本発明の別の態様では、上記の方法は、ステップａ）、ｂ）、およびｃ）のいずれか１つまたは全部によって同定された細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素配列に対応する１つまたは複数の配列を選択することをさらに含む。前記選択された配列は細胞内で発現させることができ、また細胞内でのＤＨＡＤ活性を確認できる。前記選択された配列は、精製タンパク質が得られるようにさらに精製することができ、前記精製タンパク質の［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素活性は、紫外・可視およびＥＰＲスペクトロスコピーで確認できる。
【００１５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって同定できる少なくとも１種の異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を含む微生物宿主細胞に関する。前記細胞は、バクテリア細胞または酵母菌細胞であってよい。細胞は、イソブタノール産生する組換え細胞であってもよい。
【００１６】
本発明の別の態様は、
ａ）本明細書に記載の方法によって同定できる少なくとも１種の異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素を含む微生物宿主細胞を用意するステップであって、前記宿主細胞がイソブタノール生合成経路をさらに含む、微生物宿主細胞を用意するステップと；
ｂ）イソブタノールが産生される条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を成長させるステップと
を含む、イソブタノールを産生する方法である。
【００１７】
本発明の別の態様は、
ａ）本明細書に記載の方法によって同定できる少なくとも１種の異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素と２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸の供給源とを含む微生物宿主細胞を用意するステップと；
ｂ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸がα−ケトイソ吉草酸に変換される条件下で（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと
を含む、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸をα−ケトイソ吉草酸へ変換する方法である。
【００１８】
本発明は、本出願の一部を構成する以下の詳細な説明、図、および添付の配列記述からより詳しく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】代表的な細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤおよび［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤにおける保存システイン領域（システインを表すＣは太字である）を示す。１文字のアミノ酸略号を使用している。
【図２】ＤＨＡＤ関連タンパク質の系統樹を示す。［４Ｆｅ−４Ｓ］および［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤならびにＥＤＤ、アルドン酸デヒドラターゼおよび未定義群（Ｕｎｄ）の枝に印を付けてある。個々の選択ＤＨＡＤに名前を付けてある。
【図３】イソブタノール産生の生合成経路を示す。
【図４Ａ】Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの空気中における活性の安定性のグラフを示す。
【図４Ｂ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡＤの空気中における活性の安定性のグラフを示す。
【図５】Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの紫外・可視スペクトルの図を示す。
【図６】２０°Ｋから９０°Ｋの間の種々の温度でのＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルの図を示す。
【図７】アセト乳酸合成酵素、ＫＡＲＩ、およびＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ遺伝子を発現する酵母菌細胞の抽出物のＨＰＬＣ分析を示す（イソブタノールのピークが４７．５３３分にある）。
【図８】空気中のＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤの安定性のグラフを示す。
【図９】精製Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤの紫外・可視スペクトルの図を示す。
【００２０】
表１は、試験された機能を有する酵素に基づく、実施例１に記載されたようにして作成されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼに関するプロファイルＨＭＭの表である。表１はここに電子的手段で提出し、参照により本明細書に援用する。
【００２１】
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ））を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに用いられている記号および形式は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定された規則に従っている。
【００２２】
【表１】
0005846912.tif 000002
【００２３】
【表２】
0005846912.tif 000003
【００２４】
【表３】
0005846912.tif 000004
【００２５】
【表４】
0005846912.tif 000005
【００２６】
【表５】
0005846912.tif 000006
【００２７】
【表６】
0005846912.tif 000007
【００２８】
【表７】
0005846912.tif 000008
【００２９】
【表８】
0005846912.tif 000009
【００３０】
【表９】
0005846912.tif 000010
【００３１】
【表１０】
0005846912.tif 000011
【００３２】
【表１１】
0005846912.tif 000012
【００３３】
【表１２】
0005846912.tif 000013
【００３４】
【表１３】
0005846912.tif 000014
【００３５】
配列番号：３９５−４０９、４１２−４２１、４２４、および４３１−４３６は、本明細書中の実施例に記載のように使用した、ＰＣＲ、クローニングまたはシークエンシング分析用のプライマーである。
配列番号：４１０は、ｐＤＭ１ベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号：４１１は、ｐＬＨ５３２ベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号：４２５は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡプロモーターである。
配列番号：４３０は、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）ベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号：４３７は、ｐＮＹ１３ベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号：４３８は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｌｓＳコード領域である。
配列番号：４３９は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤプロモーターである。
配列番号：４４０は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１ターミネーターである。
配列番号：４４２は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＬＶ５遺伝子である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書に開示されているように、出願人らは［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの同定方法を発見することにより既述の問題を解決した。この発見により、こうした酵素および組換え宿主におけるそれらの使用、ＤＨＡＤを用いた経路技術においてこれまで真価が認められていなかった活性上の利点が明らかになった。
【００３７】
本発明は、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）の異種発現を生じさせるように操作された組換え酵母菌またはバクテリア細胞に関する。発現されたＤＨＡＤは、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、またはイソブタノールなどの化合物を産生するための生合成経路の１成分として機能する。こうしたアミノ酸およびパントテン酸は栄養補助品として使用でき、またイソブタノールは石油化学製品の需要を減らすための燃料添加物として使用できる。
【００３８】
以下の略号および定義が、本明細書および請求項を解釈する際に使用される。
【００３９】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」またはそれらの他のいずれの変化形も、非排他的な包含を表すことを意図している。例えば、列挙された要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、かならずしもそうした要素に限定されるわけではなく、明確に列挙されていない他の要素またはそうした組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の要素も含みうる。さらに、逆のことを特に述べていない限り、「または」は、包含的な「または」であり、排他的な「または」ではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが正しく（または存在し）かつＢが誤りである（または存在しない）、Ａが誤りであり（または存在せず）かつＢが正しい（または存在する）、さらにＡおよびＢの両方が正しい（または存在する）。
【００４０】
また、本発明の要素または成分の前に付いている不定冠詞の「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非制限的であることを意図している。したがって「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むと理解すべきであり、さらに要素または成分の単数形も、数が明らかに単数を意味するのでない限り、複数を含む。
【００４１】
本明細書で使用される「発明」または「本発明」という用語は、非制限的用語であり、特定の発明のいずれかの１つの実施態様を指すことを意図するものではなく、本明細書および請求項に記載された可能な実施態様すべてを包含する。
【００４２】
使用される本発明の成分または反応物の量を修飾する、本明細書で使用される「約」という用語は、起こりうる数値的量の変動を指し、そうした変動は、例えば、現実の世界で濃縮物または使用溶液を作るために使用する典型的な測定および液体処理手順によって；そうした手順における不注意による間違いによって；組成物を作るかまたは方法を実施するために用いる成分の製造、源、または純度の違いなどによって起こりうる。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物の種々の平衡状態のせいで違ってくる量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわりなく、請求項は量に相当するようなものを含む。１つの実施態様では、「約」という用語は、報告されている数値の１０％以内、好ましくは報告されている数値の５％以内を意味する。
【００４３】
「［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ」という用語は、結合した［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するＤＨＡＤ酵素を指す。
【００４４】
「［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤ」という用語は、結合した［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを有するＤＨＡＤ酵素を指す。
【００４５】
ここで、「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語がＤＨＡＤと略され、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸をα−ケトイソ吉草酸に変換する酵素を指すことになる。
【００４６】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルベートからイソブタノールを作り出す酵素経路を指す。
【００４７】
「通性嫌気性菌」という用語は、有酸素環境および無酸素性環境のどちらでも成長できる微生物を指す。
【００４８】
「炭素物質」または「発酵性炭素物質」という用語は、本発明の宿主生物が代謝できる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および炭素１つの物質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。炭素物質としては、Ｃ６およびＣ５の糖およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４９】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現可能な核酸フラグメントを指し、これは任意選択でコード配列の前にくる制御配列（５’非コード配列）および後にくる制御配列（３’非コード配列）を含む。「ネイティブ遺伝子（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）」は、独自の制御配列を有する自然に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然には一緒に見出されない制御配列およびコード配列を含む、ネイティブ遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる源から誘導される制御配列およびコード配列、または同じ源から誘導されるが、自然に見出されるものとは違った仕方で配置されている制御配列およびコード配列を含みうる。「内在性遺伝子」は、生物体のゲノム内で自然の位置にあるネイティブ遺伝子を指す。「外来遺伝子」または「異種遺伝子」は、通常は宿主生物に存在しないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、天然でない生物体に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子を含みうる。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００５０】
本明細書で使用される「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な制御配列」は、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、コード配列の内部に位置するヌクレオチド配列、または下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード配列）を指し、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を及ぼすものである。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造体を挙げることができる。
【００５１】
「プロモーター」という用語は、コード配列の発現または機能ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体がネイティブ遺伝子から誘導されうるか、または自然に見出される種々のプロモーターから誘導される種々の要素から構成されうるか、または合成ＤＮＡ断片を含むことさえできる。種々のプロモーターは、種々の組織または細胞型内で、または発育の種々の段階で、または種々の環境条件または生理学的条件に応じて遺伝子の発現を指示できる、と当業者は理解している。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般的に、「常時発現プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」と呼ばれる。さらに、大抵の場合、制御配列の正確な境界が完全には定まっていないので、様々な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有しているであろうと理解される。
【００５２】
「作動的に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の結合であって、一方の機能が他方によって影響されるようなものを指す。例えば、プロモーターが、あるコード配列の発現に影響を与えることができる場合、プロモーターはそのコード配列と作動的に連結されている（すなわち、そのコード配列はそのプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向に向かって制御配列に作動的に連結できる。
【００５３】
本明細書で使用される「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメントから誘導されるセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを指す場合もある。
【００５４】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、宿主生物への核酸フラグメントの導入を指し、その結果として遺伝的に安定した遺伝形質が生じる。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」生物または「組換え」生物または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００５５】
本明細書で使用される「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子（普通は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形である）を持っていることが多い余分の染色体要素を指す。そのような要素は、任意の源から誘導される自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、それらにおいては、幾つかのヌクレオチド配列が固有の構成体に結合されるかまたは再結合されており、その構成体は、選択された遺伝子産物のプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を、適切な３’未翻訳配列と一緒に細胞に導入することができる。
【００５６】
本明細書で使用される「コドン縮重」という用語は、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列が変化するのを許すという遺伝暗号の性質を指す。当業者は、ある特定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用の際に特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」についてよく知っている。それゆえに、宿主細胞内での発現を向上させるために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように遺伝子を設計するのが望ましい。
【００５７】
「コドン最適化」という用語は、様々な宿主の形質転換を行うための核酸分子の遺伝子またはコード領域と関係している場合、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変化させることなく、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンを変更して宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映させることを指す。
【００５８】
本明細書で使用される「単離された核酸フラグメント」または「単離された核酸分子」は、同義語として用いられ、１本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味し、任意選択で、合成された、自然のものでない、または変更されたヌクレオチド塩基を含んでいる。ＤＮＡポリマーの形の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の断片から作成されうる。
【００５９】
温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、一本鎖の形の核酸フラグメントが他の核酸フラグメントにアニールしうる場合、核酸フラグメントは、別の核酸フラグメント（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子）と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリッド形成および洗浄の条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（全体を参照により本明細書に援用する）に例示されている。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリッド形成の「緊縮性」が決まる。緊縮性の条件は、類似性が中程度のフラグメント（遠縁関係にある生物からの相同配列など）を探すため、また類似性の高いフラグメント（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子など）を探すために調整できる。ハイブリッド形成後の洗浄により、緊縮性条件が決まる。好ましい一式の条件では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５ｍｉｎから開始し、次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０ｍｉｎを繰り返し、その後、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０ｍｉｎを２回繰り返すという一連の洗浄を使用する。より好ましい一式の緊縮条件では、もっと高い温度を使用し、その場合、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０ｍｉｎの洗浄の温度を６０℃まで増大させたこと以外は洗浄が上記と同じである。別の好ましい一式の高緊縮条件では、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での２回の最終洗浄を使用する。更なる一式の緊縮条件は、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリッド形成、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄、その後に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【００６０】
ハイブリッド形成では、２個の核酸が相補的配列を含んでいることが必要であるが、ハイブリッド形成の緊縮性によっては、塩基間のミスマッチも可能である。核酸のハイブリッド形成のための適切な緊縮性は、核酸の長さおよび相補性の度合い、当該技術分野において周知である変数によって異なる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きいほど、そうした配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリッド形成の相対的安定性（Ｔｍが大きくなることに対応する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順序で減少する。長さが１００個より長いヌクレオチドのハイブリッドの場合、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照），９．５０−９．５１を参照）。短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリッド形成では、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによってその特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照），１１．７−１１．８を参照）。１つの実施態様では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小長さは少なくとも約１５個のヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、もっとも好ましくはその長さは少なくとも約３０個のヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、プローブの長さなどの因子に応じて、必要な場合に温度および洗浄溶液の塩濃度を調節できることを認めるであろう。
【００６１】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的部分」とは、当業者による配列の手作業での評価か、またはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３  ４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータによる自動化配列比較および同定のいずれかによって、推定的にそのポリペプチドまたは遺伝子を同定するための、十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでいる部分である。一般に、ポリペプチド配列または核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子と類似のものであると推定的に同定するためには、１０個以上の連続アミノ酸の配列または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の連続ヌクレオチドを含んでいる遺伝子特有のオリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および分離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークのインサイツハイブリダイゼーション）の配列依存法で使用できる。加えて、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、１２から１５個の塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲでの増幅プライマーとして使用できる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、その配列を含む核酸フラグメントを明確に同定し、かつ／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコード化する完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示するものである。本明細書で報告している配列の恩恵を受ける当業者は、開示されている配列の全部または実質的部分を、当業者に知られている目的のために今や使用することができるであろう。したがって本発明は、添付の配列リストで報告されている完全な配列、ならびに上に記載した配列の実質的部分を含む。
【００６２】
「相補的」という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
【００６３】
当該技術分野において知られている「同一性パーセント」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係であり、それらの配列を比較することによって求められる。当技術分野においては、「同一性」または「配列同一性」は、場合によっては、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列の類似度をも意味し、そのような配列の糸と糸との間での突き合わせによって求められる。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されている方法（これらに限定されない）を含む周知の方法で容易に計算できる：
１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）。
【００６４】
同一性を求める好ましい方法は、試験する配列間で最高の一致をもたらすように設計される。同一性および類似性を求める方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで分類される。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スーツ（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実施できる。多重配列アラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を用いて実施されるが、その方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと名付けられたアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）に記載）に対応する「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法」を含め、アルゴリズムの幾つかの種類を包含する。またそれはＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スーツのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）の中に見出される。多重アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の同一性パーセントの計算でのデフォルト・パラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いて配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見て「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」が入手可能であり、これはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗと名付けられたアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．、およびＧｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３  ４６８０に記載）に対応しており、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スーツのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）の中に見出される。多重アラインメントのデフォルト・パラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ  ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を見て「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００６５】
数多くの配列同一性レベルが、（他の種からの）ポリペプチドを同定するのに役立ち、そのようなポリペプチドは同一または類似の機能または活性を有していることは、当業者によく理解されている。同一性パーセントの有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％があるが、これらに限定されない。あるいは５５％から１００％の任意の整数のパーセントが本発明を記述するのに役立ちうるが、それには、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などがある。好適な核酸フラグメントは、上記の相同性を有しているだけでなく、典型的には、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコード化する。
【００６６】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に役立つ任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、独自に開発したものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては次のものがあるであろうが、それらに限定されない：１．）ＧＣＧプログラムスーツ（ＧＣＧ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。本出願との関連においては、配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に明記されていない限り、分析の結果は、参照されているプログラムの「デフォルト値」に基づくものであることが理解されるであろう。本明細書で使用される「デフォルト値」とは、最初の初期設定時に、ソフトウェアと一緒に初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【００６７】
ここで用いられる標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている。ここで用いられる更なる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．  Ｆｉｎｋ  （Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。
【００６８】
［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの発見
ＤＨＡＤタンパク質は、酵素活性に必要な結合した鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターを含んでいることが知られている。今までに報告されている［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有する唯一のＤＨＡＤは、ホウレンソウの酵素である（Ｆｌｉｎｔ  ａｎｄ  Ｅｍｐｔａｇｅ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５５８−３５６４）。幾つかの細菌性酵素も知られており、その特徴を有する最たるものが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものであり（Ｆｌｉｎｔ，ＤＨ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４７３２−１４７４２）、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを有している。
【００６９】
出願人らは、このほど［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含む細菌性ＤＨＡＤ（［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ）類があることを明らかにした。出願人らは、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの群は、タンパク質中に３個の保存システイン残基が存在する点で、［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤの群とは区別されうることを見出した。この３個の保存システインは、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含んでいると報告されたアゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネート（ａｒａｂｏｎａｔｅ）（アルドン酸）デヒドラターゼ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１：３３５２１−３３５３６）で報告されている３個の必須システインと類似している。アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼ（ａｒａｂｏｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）のタンパク質では、アミノ酸位置５６、１２４、および１９７にあるシステインは、酵素活性に必須なものであり、おそらくＦｅ−Ｓクラスターへの配位に関与しているとされた。驚くべきことに出願人らは、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼの３個の必須システインの対応位置にある３個の保存システインが、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含むＤＨＡＤに特有のものであることを見出した。出願人らは、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含んでいる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡＤが、保存システインの２個を有しているが、３番目の保存システインを有していないことを見出した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスター含有ＤＨＡＤの保存システインの配列領域と、本明細書の実施例１で同定した［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターＤＨＡＤの系統群の代表例の保存システインの配列領域を比較したものを図１に示し、以下に説明する。
【００７０】
出願人らは、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを同定するための方法を開発した。本発明では、この方法で同定できる細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを、バクテリア内での異種発現に使用できる。
【００７１】
ＤＨＡＤ酵素を構造的に特徴付けるために、本明細書の実施例２で測定された実験的に検証された機能を有するＤＨＡＤタンパク質のアミノ酸配列を用いて、実施例１に記載したようにしてプロファイル隠れＭａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）を作成した。それを表１に示す。それらのＤＨＡＤは、ニトロソモナス・ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ）（ＤＮＡ  配列番号：３０９；タンパク質  配列番号：３１０）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３（ＤＮＡ  配列：２９７；タンパク質  配列番号：２９８）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ  配列番号：１６７；タンパク質  配列番号：１６８）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤＮＡ  配列番号：１６３；配列番号：１６４）、ラルストニア・メタリデュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）（ＤＮＡ  配列番号：３４５；タンパク質  配列番号：３４６）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＤＮＡ  配列番号：３４３；タンパク質  配列番号：３４４）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ  配列番号：２３１；タンパク質  配列番号：２３２）からのものである。加えて、フラボバクテリウム・ジョンソニアエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ  配列番号：２２９；タンパク質  配列番号：２３０）からのＤＨＡＤは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された場合にジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有することが見出されたので、プロファイルの作成に用いた。ＤＨＡＤ用のこのプロファイルＨＭＭは、ＤＨＡＤ関連タンパク質を同定するのに使用できる。Ｅ値が＜１０−５でプロファイルＨＭＭと一致するタンパク質はいすれもＤＨＡＤ関連タンパク質であり、それには［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤ、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ、アルドン酸デヒドラターゼ、およびホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼがある。このプロファイルＨＭＭに一致する配列の系統樹を図２に示す。
【００７２】
その後、本明細書に示すプロファイルＨＭＭと一致する配列は、上述の３個の保存システインが存在するかどうかについて分析される。３個の保存システインの正確な位置は変わりうるものであり、それらは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：  ４６７３  ４６８０）を用いて実行される多重配列アラインメントを使用して、周囲の配列との関連で同定できる。その場合に、以下のパラメーターを使用する：１）ペアワイズアラインメントパラメーターの場合、Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０；Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ＝０．１；ｍａｔｒｉｘはＧｏｎｎｅｔ  ２５０である；モード−緩慢・正確（Ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ）、２）多重アラインメントのパラメーターの場合、Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０；Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０．２；ｍａｔｒｉｘはＧｏｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓである。例えば、３個の保存システインは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ（配列番号：１６８）内のアミノ酸位置５６、１２９、および２０１と、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤ（配列番号：２３２）内のアミノ酸位置６１、１３５、および２０７にある。他のタンパク質配列内の３個の保存システインの正確な位置は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）アミノ酸配列内のそれらの位置に対応する。当業者は、ペアワイズアラインメントまたは多重配列アラインメントを用いて、ＤＨＡＤタンパク質のアミノ酸配列内の３個の保存システインのそれぞれの有無を容易に識別することができるであろう。さらに、目視による分析など他の方法を用いて、３個の保存システインの存在を判定することもできる。
【００７３】
２個の保存システインを持つが３番目の（位置５６）保存システインは持たない、プロファイルＨＭＭと一致するＤＨＡＤタンパク質としては、［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤおよびホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ＥＤＤ）がある。３個の保存システインを持つタンパク質には、アルボネートデヒドラターゼ（ａｒａｂｏｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｓ）および［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤがあり、３個の保存システインを持つタンパク質は［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ／アルドン酸デヒドラターゼ群のメンバーである。［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、アルドン酸デヒドラターゼと区別できるが、それは、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ内またはアルドン酸デヒドラターゼ内において、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのアミノ酸配列内の以下の位置に対応する位置に存在することが見出されるサイン保存アミノ酸について分析することにより行う。こうしたサインアミノ酸はそれぞれ（９０％を超える出現率で）［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤまたはアルドン酸デヒドラターゼ内の以下の位置にある：８８においてアスパラギンであるのに対してグルタミン酸；１１３において非保存であるのに対してグルタミン酸；１４２においてアルギニンまたはアスパラギンであるのに対して非保存；１６５において非保存であるのに対してグリシン；２０８においてアスパラギンであるのに対して非保存；４５４においてロイシンであるのに対して非保存；４７７においてフェニルアラニンまたはチロシンであるのに対して非保存；さらに４８７においてでグリシンであるのに対して非保存。
【００７４】
開示されている［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素の同定方法は、単一の配列かまたは配列群に対して実施できる。好ましい実施態様では、本明細書に記載のプロファイルＨＭＭを用いて１つまたは複数の配列データベースに問い合わせる。好適な配列データベースは当業者に知られており、それには、Ｇｅｎｂａｎｋ非冗長タンパク質データベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース、またはＵｎｉＰｒｏｔデータベースあるいは他の利用可能なデータベース（ＧＱＰａｔ（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）およびＢＲＥＮＤＡ（Ｂｉｏｂａｓｅ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）など）があるが、これらに限定されない。
【００７５】
この方法によって同定できる［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの中から、バクテリアタイプである自然源の生物によって細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを容易に同定できる。この方法によって同定できる任意の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、微生物宿主細胞内での異種発現に好適でありうる。配列によって本明細書に明示的に開示されている任意の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、バクテリア細胞内での異種発現に好適でありうることも理解されるであろう。好ましい細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ酵素は、宿主細胞内で発現させることができ、ＤＨＡＤ活性をもたらすことができる。
【００７６】
最初、配列同一性が９５％未満である１９３の種々の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ（９５％より大きい同一性のタンパク質は、分析を簡単にするため排除する）を、実施例１に記載したようにして同定し、それらのタンパク質アミノ酸およびコード配列を、表２ａに示した配列番号と一緒に配列リストに示す。
【００７７】
実施例１１に記載したその後の分析では、２６８の種々の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤが戻された。最初の同定で示されなかった１９３種類の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤのいずれとも同じではないアミノ酸およびコード配列を、表２ｂに示したＳ配列番号と一緒に配列リストに含めてある。
【００７８】
本明細書に開示されている方法で同定できる配列と一致するか、または同一性が少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である本明細書に明示的に開示されている配列と一致する任意の［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤのタンパク質は、本明細書に開示されているバクテリア細胞内での異種発現に使用できる［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤである。本明細書に明示的に開示されている細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの中には、１００％保存のサインアミノ酸が次の位置にある：８８（アスパラギン酸）、１４２（アルギニンまたはアスパラギン）、２０８（アスパラギン）、および４５４（ロイシン）。
【００７９】
さらに、本発明に使用できる細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、ＤＨＡＤ関連タンパク質の系統樹（図２に示され、また実施例１に記載されているものなど）の［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ分枝の中のそれらの位置で同定可能である。さらに、使用できる細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、配列が本明細書に示されている、配列同一性が少なくとも約８０％−８５％、８５％−９０％、９０％−９５％または９５％−９９％であってよい２８１の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤのいずれかと配列を比較して同定可能である。
【００８０】
さらに、本明細書に示す［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの配列は、自然界の他の相同体を識別するのに使用できる。例えば、本明細書に記載されているＤＨＡＤをコード化する核酸フラグメントのそれぞれは、相同タンパク質をコード化する遺伝子を単離するのに使用できる。配列に依存するプロトコルを使用する相同遺伝子の単離は、当該技術分野において周知である。配列依存のプロトコルの例としては、以下のものがあるが、これらに限定されない：１．）核酸のハイブリッド形成方法；２．）核酸増幅技術の様々な使用によって例示されているＤＮＡおよびＲＮＡの増幅方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ），Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ），Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］；および３．）補完によるライブラリーの作成および選別の方法。
【００８１】
例えば、類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子および本明細書に示す［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤをコードする遺伝子は、当該核酸フラグメントの全部または一部を、当業者よく知られている方法論を用い、任意の所望の生物体からのライブラリーを選別するＤＮＡハイブリッド形成プローブとして使用することにより、直接単離できる。開示されている核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計することができ、それは当該技術分野において知られている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，（上記参照））で合成できる。さらに、配列全体を直接使用すれば、当業者に知られている方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡ標識化、ニックトランスレーンョンまたは末端標識の技術）を用いてＤＮＡプローブを合成できるか、または利用可能な試験管内転写系を用いてＲＮＡプローブを合成できる。加えて、特定のプライマーは、当該配列の一部（または全長）を増幅するよう設計して使用できる。得られた増幅産物は、増幅反応の間に直接標識できるか、または増幅反応後に標識でき、さらに、プローブとして用いて、ふさわしい緊縮性条件下でハイブリッド形成によって全長ＤＮＡフラグメントを単離することができる。
【００８２】
普通、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは種々の配列を有しており、互いに相補的ではない。望ましい試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を行えるように設計すべきである。ＰＣＲプライマー設計の方法は、ありふれたものであり、当該技術分野において周知である（Ｔｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ  Ｅｄ．，（１９８６）ｐｐ  ３３−５０，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；ａｎｄ  Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ  ３１−３９，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【００８３】
一般に、既述の配列の２つの短い断片は、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコード化するもっと長い核酸フラグメントを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルで使用できる。ポリメラーゼ連鎖反応は、クローン化核酸フラグメントのライブラリーに対して実行することもできるが、その場合、１つのプライマーの配列は、既述の核酸フラグメントから誘導され、他のプライマーの配列は、微生物遺伝子をコード化するｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸経路の存在を利用する。
【００８４】
あるいはまた、第２プライマー配列は、クローニングベクターから得られた配列に基づいたものにすることができる。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従って、ＰＣＲを用いて転写産物内の１点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅することにより、ｃＤＮＡを生成できる。３’および５’方向に配向したプライマーは、本配列から設計できる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥ系（例えば、ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離できる（Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）；Ｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【００８５】
あるいはまた、得られた［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤコード化配列は、相同体を同定するためのハイブリッド形成試薬として使用できる。核酸ハイブリッド形成試験の基本構成要素としては、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子フラグメントが含まれていると思われる試料、および特定のハイブリッド形成方法がある。プローブは、典型的には、検出する核酸配列と相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリッド形成可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基まで様々でありうる。またその長さは、実施する特定の試験によって異なるであろう。典型的には、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長さが適している。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列と相補的である必要がある。加えて、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。相補性が不完全な分子間では、ハイブリッド形成は起こらず、その結果、ハイブリッド領域内の塩基の特定部分が適切な相補的塩基と対にならない。
【００８６】
ハイブリッド形成法は詳細に明らかにされている。典型的には、プローブと試料を、核酸ハイブリッド形成が可能となるような条件下で混合しなければならない。これは、適切な濃度および温度条件において無機塩または有機塩の存在下でプローブと試料とを接触させることを含む。プローブおよび試料の核酸は、プローブの核酸と試料の核酸との間で可能などんなハイブリッド形成でも起きうる十分長い時間の間接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度により、ハイブリッド形成が起こるのに必要な時間が決まることになる。プローブまたは標的の濃度が高くなるほど、必要とされるハイブリッド形成の温置時間は短くなる。任意選択で、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤により、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの敏感かつ厳密なハイブリッド形成が可能になる（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１（１９９１））。好適なカオトロピック剤としては、とりわけ、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムおよびトリフルオロ酢酸セシウムがある。典型的には、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在することになる。所望される場合には、ホルムアミドを、典型的には３０から５０％（ｖ／ｖ）でハイブリッド形成混合物に加えることができる。
【００８７】
様々なハイブリッド形成溶液を使用できる。典型的には、それらは約２０から６０体積％（好ましくは３０％）の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリッド形成溶液では、約３０から５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、約０．１５から１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５から０．１Ｍ緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはヘペス（ｐＨの範囲は約６から９））、約０．０５から０．２％の洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５から２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００から５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０から５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを使用する。典型的なハイブリッド形成溶液には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの非標識のキャリアー核酸、フラグメント化核ＤＮＡ（例えば、子牛胸腺またはサケ精子のＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡ）、および任意選択的に、約０．５から２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグリシンも含まれるであろう。様々な極性水溶性のまたは膨潤性の試剤（例えば、ポリエチレングリコール）、陰イオンポリマー（例えば、ポリアクリレートまたはポリアクリル酸メチル）および陰イオンサッカリドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）など、他の添加剤も含めることができる。
【００８８】
核酸ハイブリッド形成は、様々なアッセイ形式（ａｓｓａｙ  ｆｏｒｍａｔｓ）に適応させることができる。もっとも好適なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリッド形成に特に適応性がある。サンドイッチ型アッセイの主要構成要素は固体支持体である。固体支持体には、配列の一部と相補的である非標識の固定化核酸プローブが吸着されているか、または共有結合している。
【００８９】
細菌性宿主および酵母菌宿主内での異種細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの発現
出願人らは、微生物細胞内で発現された場合、異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤによりＤＨＡＤ活性がもたらされることを見出した。本明細書で述べたようにして同定できる［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤはいずれも、異種微生物細胞内で発現されうる。これらのいずれのタンパク質の発現でも、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換または２，３−ジヒドロキシメチル吉草酸からα−ケトメチル吉草酸への変換を含む生合成経路のＤＨＡＤ活性がもたらされる。４Ｆｅ−４ＤＤＨＡＤとは対照的に、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの発現では、酵素活性を得るためのクラスター内のＦｅおよびＳに関する要件が緩くなる。加えて、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤの空気中での敏感性と比べて、ここでは空気中での安定性が高くなることが認められた。このことは、異種宿主細胞内での活性をより優れたものにするのに望ましい。
【００９０】
異種細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを発現する宿主になりうるバクテリア細胞としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）があるが、これらに限定されない。異種細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの工学的発現により、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤまたは［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤを自然に発現する宿主バクテリア細胞内でのＤＨＡＤ活性を増大させることができる。そのような宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を挙げることができる。さらに、異種細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの工学的発現により、内生ＤＨＡＤ活性を持たない宿主バクテリア細胞内でＤＨＡＤ活性がもたらされる。そのような宿主細胞としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）およびロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）を挙げることができる。
【００９１】
具体的な宿主としては次のものがある：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナリウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。
【００９２】
宿主バクテリア細胞は、当業者によく知られている方法で操作して、異種細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを発現させることができる。発現されるＤＨＡＤのコード領域は、当業者によく知られているように、標的宿主細胞用に最適化されたコドンであってよい。様々な宿主細胞の形質転換に役立つベクターは、ありふれたものであり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの会社から市販されている。典型的にはベクターは、選択マーカーおよび配列を含み、所望の宿主内での自律増殖または染色体の組込みが可能である。加えて、好適なベクターは、転写開始制御領域（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）および転写終結制御領域を内部に有するプロモーター領域を含み、それらの間にコード領域ＤＮＡフラグメントを挿入することができ、挿入されたコード領域の発現がもたらされる。どちらの制御領域も、形質転換宿主細胞と相同の遺伝子から誘導できるが、そのような制御領域は、産生宿主として選択された特定の種に固有でない遺伝子から誘導することもできることを理解すべきである。
【００９３】
開始制御領域またはプロモーターは、望ましい細菌性宿主細胞内で細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤコード領域の発現を駆動するのに役立つもので、数多くあり、当業者によく知られている。こうした遺伝因子を駆動することのできるプロモーターは実質的にどんなものでも本発明に適しており、それにはｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃの各プロモーター（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）での発現に有用）；ａｍｙ、ａｐｒ、およびｎｐｒの各プロモーター、および様々なｐｈａｇｅプロモーター（バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）での発現に有用）；ｎｉｓＡ（グラム陽性菌での発現に有用。Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（８）：２７６３−２７６９（１９９８））；およびＰ１１合成プロモーター（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）での発現に有用。Ｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１０１１−１０１９（２００６））があるが、それらに限定されない。
【００９４】
終結制御領域も、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導することができる。任意であるが、終結部位は不要であってもよい。しかし、含まれているのがもっとも好ましい。
【００９５】
ある特定のベクターは、広範囲の宿主バクテリア内で複製する能力があり、接合によって移すことができる。ｐＲＫ４０４および３種類の関連ベクター（ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ））の注釈付きの完全な配列が利用可能である。こうした誘導体は、グラム陰性菌における遺伝子操作のための価値あるツールであることが証明されている（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ５０（１）：７４−７９（２００３））。広宿主域のＩｎｃ  Ｐ４  プラスミド  ＲＳＦ１０１０の幾種類かのプラスミド誘導体も、ある範囲のグラム陰性菌内で機能できるプロモーターと一緒に入手可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７は、複数のクローニング部位と共に活性プロモーターを有しており、グラム陰性菌内での異種遺伝子発現が可能である。バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の形質転換に役立つベクターの中には、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８３：１７５−１８２（１９９６）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３７：２２７−２３１（１９９３））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１−１４８６（１９９６））；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００−５８０４（２００２））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１−４５８４（１９９７））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２−１２６７（２００１））；およびｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９−１９０３（１９９４））がある。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からの幾つかのプラスミドも報告されている（ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１（３）：１２２３−１２３０（２００５））。
【００９６】
染色体遺伝子の置換ツールも広く入手可能である。例えば、広宿主域レプリコンｐＷＶ１０１の温度感受性変種は、プラスミドｐＶＥ６００２を作成するように改変されたが、このプラスミドはある範囲のグラム陽性菌内での遺伝子置換を行うのに使用できる（Ｍａｇｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（１７）：５６３３−５６３８（１９９２））。さらに、様々なゲノム内にランダム突然変異を引き起こす試験管内トランスポゾンが、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給源から入手可能である。
【００９７】
異種細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを発現するための宿主となりうる酵母菌細胞は、遺伝子操作の可能な任意の酵母菌細胞であり、それには、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）があるが、これらに限定されない。好適な株としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）およびアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）があるが、これらに限定されない。もっとも好適なのは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００９８】
発現は、こうした［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤのいずれかをコード化する配列を含む遺伝子を用いた形質転換によって達成される。発現させるＤＨＡＤのコード領域は、当業者によく知られているように、標的宿主細胞用に最適化されたコドンであってよい。酵母菌内での遺伝子発現方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．  Ｆｉｎｋ  （Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照）。酵母菌内での遺伝子の発現には、典型的には、プロモーター（関心のあるコード領域へ作動的に連結されたもの）、および転写ターミネーターが必要とされる。多数の酵母菌プロモーターを、酵母菌内で遺伝子の発現カセットを作成するのに使用でき、それには以下の遺伝子から誘導されるプロモーターがあるが、それらに限定されない：ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、ＧＰＭ、およびＡＯＸ１。好適な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、およびＡＤＨ１があるが、これらに限定されない。
【００９９】
好適なプロモーター、転写ターミネーター、および［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母菌シャトルベクター内にクローン化し、また酵母菌細胞内に入れて形質転換することができる。こうしたベクターにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母菌株の両方で菌株増殖が可能になる。典型的には、使用するベクターは、望ましい宿主での自律増殖または染色体組込みを可能にする配列および選択マーカーを含む。典型的には、酵母菌内の使用プラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製オリジン（例えば、ｐＭＢ１）、酵母菌の２μ複製オリジン、および栄養選択（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）用マーカーを含む。これら４つのベクター用の選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。既述のＤＨＡＤをコード化しているキメラ遺伝子を有する発現ベクターの作成は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での標準分子クローニング技術、または酵母菌内でのギャップ修復組換え（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）法のいずれかによって実施できる。
【０１００】
ギャップ修復クローニングの取り組み方は、酵母菌内での高効率な相同組換えを利用している。典型的には、酵母菌ベクターＤＮＡは（例えば、その複数のクローニング部位で）消化されて、その配列内に「ギャップ」が作られる。５’末端と３’末端の両方に≧２１ｂｐの配列を含む、関心のある幾つかのＤＮＡが生成され、それらの末端は、互いに順次に重なり、またベクターＤＮＡの５’および３’終端と順次に重なる。例えば、「遺伝子Ｘ」用の酵母菌発現ベクターを作成するためには、酵母菌プロモーターおよび酵母菌ターミネーターを発現カセット用として選択する。プロモーターおよびターミネーターは酵母菌のゲノムＤＮＡから増幅し、遺伝子Ｘは、そのソース生物からＰＣＲ増幅するか、または遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得る。線状にしたベクターの５’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、およびターミネーターと線状にしたベクターの３’末端との間に少なくとも２１ｂｐのオーバーラップ配列がある。その後、「ギャップ」ベクターおよび挿入ＤＮＡを一緒に酵母菌株に入れて形質転換し、プラスミド上での栄養選択マーカーの相補を可能にする適切な化合物混合物を含む培地に蒔く。正しい挿入物の組み合わせが存在することは、選択した細胞から調製したプラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲマッピングにより確認できる。次いで、酵母菌から単離されたプラスミドＤＮＡ（普通は低濃度）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（例えば、ＴＯＰ１０）に入れて形質転換し、続いてミニプレップおよび制限酵素マッピングを行ってプラスミド作成物をさらに検証する。最後に、作成物は配列分析で検証できる。
【０１０１】
ギャップ修復技術のように、酵母菌ゲノムへの組み込みも酵母菌内の相同組換え系を利用する。典型的には、コード領域および調節領域（プロモーターおよびターミネーター）と栄養要求性マーカーとを含むカセットは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅するが、その際に、カセットとハイブリッド形成し、かつ挿入の望まれるゲノム領域の領域５’および３’と配列相同性のある４０から７０個の塩基対を含んでいるプライマーを用いて行う。その後、ＰＣＲ産物を酵母菌内に入れて形質転換し、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択が可能なふさわしい化合物混合物を含む培地上に蒔く。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体の位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーターとコード領域Ｘとターミネーターとの作成物をプラスミドＤＮＡ作成物からＰＣＲ増幅し、ＳＯＥ  ＰＣＲによるかまたは一般の制限消化とクローニングによるかのいずれかで独立栄養性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合させる。プロモーターとコード領域ＸとターミネーターとＵＲＡ３との領域を含む全カセットを、プライマー配列でＰＣＲ増幅するが、そのプライマー配列は、酵母菌染色体上の場所「Ｙ」の領域５’および３’との相同性のある４０から７０ｂｐを含む。ＰＣＲ産物を酵母菌に入れて形質転換し、ウラシルの欠乏した増殖培地上で選択する。形質転換体は、コロニーＰＣＲかまたは染色体ＤＮＡの直接シークエンシングのいずれかで検証できる。
【０１０２】
ＤＨＡＤ活性の確認
細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを発現するよう操作された細胞内においてＤＨＡＤ活性があることは、当該技術分野において知られている方法を用いて確認できる。一例として、また本明細書の実施例に示されているように、細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを発現するよう操作された細胞からの未精製の抽出物を、ＦｌｉｎｔおよびＥｍｐｔａｇｅが述べている、ジニトロフェニルヒドラジンを使用したＤＨＡＤ試験法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３（８）：３５５８−６４）に使用できる。別の例として、また本明細書の実施例に示すように、内生ＤＨＡＤ活性のない酵母菌株内で、本明細書に開示されている方法で同定できる細菌性ＤＨＡＤを発現させることによってＤＨＡＤ活性を検査することができる。ＤＨＡＤ活性がある場合、酵母菌株は分枝鎖アミノ酸の非存在下で成長するであろう。ＤＨＡＤ活性は、ＤＨＡＤ活性を必要とする経路の下流産物の検査など、もっと間接的な方法でも確認できる。経路中間体がα−ケトイソ吉草酸またはα−ケトメチル吉草酸である産物はいずれも、ＤＨＡＤ活性の検査として測定できる。そのような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールおよびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
イソブタノールの産生
本明細書で述べるバクテリアまたは酵母菌内での細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの発現により、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換または２，３−ジヒドロキシメチル吉草酸からα−ケトメチル吉草酸への変換を行うためのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する、形質転換された組換え宿主細胞が生じる。経路中間体がα−ケトイソ吉草酸またはα−ケトメチル吉草酸である産物は、既述の異種［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを有する本明細書に開示の菌株または酵母菌株において、より効果的に産生しうる。そのような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールおよびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
例えば、酵母菌では、バリンの生合成は、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）（ＩＬＶ５）による２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートへのアセト乳酸の変換ステップ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによる２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（２−ケト−イソバレレートとも呼ばれる）への変換ステップ、および分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）によるα−ケトイソ吉草酸からバリンへの変換ステップを含む。ロイシンの生合成は、α−ケトイソ吉草酸への同じステップと、その後に、アルファ−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬＥＵ９、ＬＥＵ４）によるα−ケトイソ吉草酸からアルファ−イソプロピルリンゴ酸への変換、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬＥＵ１）によるアルファ−イソプロピルリンゴ酸からベータ−イソプロピルリンゴ酸への変換、ベータ−ＩＰＭデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）へのベータ−イソプロピルリンゴ酸からアルファ−ケトイソカプロン酸への変換、最後に分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）と分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）によるアルファ−ケトイソカプロン酸からロイシンへの変換を含む。細菌性経路は、類似しており、異なる仕方で名付けられたタンパク質および遺伝子を含む。２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートからα−ケトイソ吉草酸の変換が増大すると、こうした経路における流れが増大することになるが、特に経路の１種または複数種の更なる酵素が過剰発現された場合に増大する。したがって、バリンまたはロイシンの産生では、本明細書に開示されている菌株を使用するのが望ましい。
【０１０５】
パントテン酸の生合成は、ＤＨＡＤによって行われるステップ、ならびにケトパントエート（ｋｅｔｏｐａｎｔｏａｔｅ）ヒドロキシメチル転移酵素およびパントテナートシンターゼによって行われるステップを含む。微生物内でのパントテン酸生合成の産生を増大させるためのこうした酵素の発現の工学は、米国特許第６１７７２６４号明細書に記載されている。
【０１０６】
ＤＨＡＤのα−ケトイソ吉草酸産物は、共同所有で同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用する）に開示されている、イソブタノール生合成経路における中間体である。開示されているイソブタノール生合成経路の図を図３に示す。本明細書に開示されている菌株内でのイソブタノールの産生は、ＤＨＡＤ活性が増大することから恩恵を受ける。本明細書に開示されているように、ＤＨＡＤ活性は、細菌性細胞または酵母菌細胞内での細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの発現によって提供される。米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されているように、イソブタノール生合成経路の例の中のステップは、以下の変換を含む：
−  ピルベートからアセト乳酸への変換（図１とその中の経路のステップａを参照）（例えば、アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
−  アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換（図１とその中の経路のステップｂを参照）（例えば、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）によって触媒される）；
−  ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換（図１とその中の経路のステップｃを参照）（例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）とも呼ばれる）によって触媒される）；
−  α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換（図１とその中の経路のステップｄを参照）（例えば、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される）；および
−  イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図１とその中の経路のステップｅを参照）（例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）。
【０１０７】
代替経路のステップｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋにおける、物質から産物への変換、およびこうした反応に関与する酵素は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されている。
【０１０８】
上に名前を挙げた経路ステップの酵素（本明細書に開示されている細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを除く）および２種類の更なるイソブタノール経路用の酵素の発現に使用できる遺伝子が、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されており、また使用できる更なる遺伝子は、バイオインフォマティクスによりまたは上述のように実験により当業者が同定できる。３つの経路すべてでの、特に高い活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素の好ましい使用は、共同所有で同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２６１２３０Ａ１号明細書に開示されている。その中に開示されている高活性ＫＡＲＩの例として、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）からのもの（ＤＮＡ：配列番号：３８９；タンパク質  配列番号：３９０）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１からのもの（ＤＮＡ：配列番号：４２２；タンパク質  配列番号：４２３）、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５からのもの（ＤＮＡ：配列番号：３９１；タンパク質  配列番号：３９２）がある。
【０１０９】
さらに、キメラ遺伝子の作成および開示されている生合成経路を用いたイソブタノール産生のためのバクテリアおよび酵母菌の遺伝子工学が、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されている。
【０１１０】
産生のための成長
本明細書に開示されている組換えバクテリアまたは酵母菌宿主は、好適な炭素物質を含む発酵培地で成長する。更なる炭素物質としては、単糖類（フルクトースなど）、オリゴ糖類（乳糖  マルトース、ガラクトース、またはスクロースなど）、多糖類（デンプンまたはセルロースなど）またはそれらの混合物および再生可能な供給原料（チーズホエーの透過物、コーンスティープリカー、砂糖てん菜糖みつ、および大麦の麦芽など）からの未精製混合物があるが、これらに限定されない。他の炭素物質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールを挙げることができる。
【０１１１】
さらに、炭素物質は、重要な生化学的中間体への代謝変換が実証されている炭素１個の物質（二酸化炭素、またはメタノールなど）であってもよい。炭素１個および２個の物質に加えて、メチローフ生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび様々なアミノ酸などの他の幾つかの種類の炭素含有化合物を代謝活性に利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを生じることが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。それゆえに、本発明に利用する炭素源は多種多様な炭素含有物質を包含することができ、またそれは生物の選択によって限定されるのみであることが考えられる。
【０１１２】
本発明においては上述の炭素物質およびそれらの混合物はすべて適すると考えられるが、好ましい炭素物質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、あるいはこれらとＣ５の糖類を利用するよう改変された酵母細胞用のＣ５の糖類（キシロース及び／またはアラビノースなど）との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、カッサバ、サトウモロコシ、およびそれらの混合物などの再生可能な砂糖源から得ることができる。グルコースおよびデキストロースは、穀物（トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オートムギ、およびそれらの混合物など）を含むデンプン系の供給原料を糖化させることによって、再生可能な穀物源から得ることができる。さらに、発酵性糖類は、例えば、共同所有で同時係属中の米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書（これを参照により本明細書に援用する）に記載されている前処理および糖化の工程によって、再生可能なセルロースまたはリグノセルロースのバイオマスから誘導できる。バイオマスとは、任意のセルロース系物質またはリグノセルロース系物質を指し、それには、セルロースを含む物質、および任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類及び／または単糖類をさらに含む物質がある。バイオマスは、タンパク質及び／または脂質などの更なる成分を含んでもよい。バイオマスは単一源から得ることもできるが、バイオマスは複数の源から得られる混合物を含むこともできる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシのわらの混合物、または草と葉の混合物を含むことができる。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、固形都市廃棄物、固形産業廃棄物、紙製造のスラッジ、庭ゴミ、木屑および林業廃棄物があるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ殻粒、トウモロコシの穂軸、穀物残渣（トウモロコシの皮など）、トウモロコシのわら、草、小麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、（穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および灌木の）粉砕によって得られる成分、野菜、果物、花、家畜ふん尿、およびそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
【０１１３】
ふさわしい炭素源に加えて、発酵培地は、好適な無機質、塩類、共同因子、緩衝液および当業者に知られている他の成分（培養物を成長させ、細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを含む酵素経路を促進するのに適したもの）を含まなければならない。
【０１１４】
培養条件
典型的には、細胞は、約２０℃から約４０℃の範囲の温度においてふさわしい培地中で成長する。本発明における好適な増殖培地は、一般の商業生産された培地であり、それにはＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、サブローデキストロース（ＳＤ）培地、Ｙｅａｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）培地（つまり、酵母菌窒素塩基、硫酸アンモニウム、および（炭素／エネルギー源として）デキストロースを含む培地）あるいはＹＰＤ培地（ほとんどのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を成長させるのに最適な割合のペプトンと酵母菌抽出物とデキストロースとのブレンド）などがある。他の定められた増殖培地または合成増殖培地を使用してもよく、特定の微生物の成長に適した培地は微生物学または発酵科学の当業者に知られているであろう。カタボライトリプレッションを直接または間接的に調整することで知られている試薬を使用すること、例えば、環状アデノシン２’：３’モノホスフェートを発酵培地に含めることもできる。
【０１１５】
酵母菌の発酵に適したｐＨ範囲は、典型的にはｐＨ３．０からｐＨ９．０の間であり、初期条件としてはｐＨ５．０からｐＨ８．０が好ましい。他の微生物の発酵に適したｐＨ範囲は、ｐＨ３．０からｐＨ７．５の間であり、初期条件としてｐＨ４．５．０からｐＨ６．５が好ましい。
【０１１６】
発酵は好気条件または嫌気条件のもとで実施でき、嫌気条件または微好気的条件が好ましい。
【０１１７】
バッチ式および連続式の工業発酵
発酵は、バッチ式発酵法であってよい。古典的なバッチ発酵は、培地の組成物を発酵の開始時に設定し、発酵の間に人為的な変更を実施しない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に培地に、所望の生物体（１種または複数種）を接種し、その系に何も添加せずに発酵を行わせる。しかし、典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してはバッチ式であるが、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御する試みを行うことがよくある。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマスの組成は、発酵が停止する時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は穏やかに静的な停滞期を通過して、高度対数増殖期（ｈｉｇｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）に向かい、最後に成長速度が減少または停止する定常期になる。処置を行わなければ、定常期の細胞はやがては死滅することになる。一般に、対数期にある細胞が、最終産物または中間体の産生の大部分と関係する。
【０１１８】
標準バッチシステムの変形形態が供給バッチシステム（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｓｙｓｔｅｍ）である。供給バッチ発酵プロセスも本発明では好適であり、発酵の進行につれて物質を徐々に添加することを除いて、これは典型的なバッチシステムを含む。カタボライトリプレッションが細胞の代謝を妨げる傾向があるとき、また培地における物質の量を限定することが望ましい場合に、供給バッチシステムは有用である。供給バッチシステムにおける実際の物質濃度は、測定するのが困難であるため、ｐＨ、溶解酸素および排ガス（ＣＯ２など）の分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定する。バッチ式発酵および供給バッチ式発酵は一般的かつ当該技術分野において周知のものであり、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）（参照により本明細書に援用する）に見出すことができる。
【０１１９】
発酵培養物は、連続式発酵法に適合させることができる。連続式発酵は、定められた発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に、同量の馴化培地が処理のために除去される開放系である。連続式発酵は一般に、培養物を一定の高密度に維持する。
【０１２０】
連続式発酵では、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子を調節することが可能である。例えば、ある方法は、炭素源などの制限的栄養物質または一定速度での窒素レベルを維持し、他のすべてのパラメーターが適度になるようにすることができる。他のシステムでは、培養培地の濁り度で測定される細胞濃度を一定に保ちつつ、成長に影響する幾つかの因子を連続的に変えることができる。連続システムは、定常状態の成長条件を維持しようとし、そのようにして、培地が取り除かれることによる細胞損失と、発酵での細胞成長速度との釣り合いを保たなければならない。連続式発酵方法での栄養素および成長因子の調節方法ならびに産物形成の速度を最大にする技術は、工業微生物学の技術分野において周知であり、様々な方法がＢｒｏｃｋ（上記を参照）によって詳述されている。
【０１２１】
発酵のバッチ法、供給バッチ法、連続法、または任意の周知の方式が、既述の組換え微生物宿主細胞を成長させるのに好適であると考えられる。さらに、細胞は、全細胞触媒としての物質上に固定化し、イソブタノール産生のための発酵条件にさらしてよいと考えられる。
【０１２２】
発酵培地から産物を分離する方法
生物産生イソブタノールは、ＡＢＥ発酵の場合など、当該技術分野において知られている方法を用いて発酵培地から分離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８），Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の文献を参照）。例えば、固体は、遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去できる。その後、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液−液抽出、吸着、気体ストリッピング、膜蒸発（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）、または透析蒸発などの方法を用いて、発酵培地から分離できる。
【０１２３】
イソブタノールは、低沸点の、水との共沸混合物を生じるので、蒸留を用いて混合物をその共沸組成物まで分離することができる。蒸留は、別の分離方法と組み合わせて用いて、共沸混合物とならないようにして分離を行うことができる。蒸留と併用してブタノールを分離および精製する方法には、デカンテーション、液−液抽出、吸着、および膜に基づく技法があるが、これらに限定されない。さらに、ブタノールは共留剤を用いた共沸蒸留を使用して分離できる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照）。
【０１２４】
ブタノール−水の混合物は、不均一な共沸混合物を生じるので、蒸留をデカンテーションと併用してイソブタノールを分離および精製することができる。この方法では、発酵ブロスを含んでいるイソブタノールを蒸留して共沸組成物に近づけることができる。その後、共沸混合物を濃縮し、イソブタノールをデカンテーションで発酵培地から分離する。デカンテーションで取られた水性相は、還流液として第１蒸留カラムに戻すことができる。イソブタノールを多量に含んでいる、デカンテーションで取られた有機相は、第２蒸留カラムにおいて蒸留でさらに精製することができる。
【０１２５】
イソブタノールは、液−液抽出を蒸留と併用して発酵培地から分離することもできる。
この方法では、イソブタノールは、好適な溶媒による液−液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次いで、イソブタノールを含んでいる有機相を蒸留して、ブタノールを溶媒から分離する。
【０１２６】
吸着と組み合わせた蒸留も、イソブタノールを発酵培地から分離するのに使用できる。この方法では、イソブタノールを含んでいる発酵ブロスを蒸留して共沸組成物に近づけ、その後、残っている水を、モレキュラーシーブなどの吸着剤を使用して除去する（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０１２７】
さらに、透析蒸発と組み合わせた蒸留を用いて、イソブタノールを発酵培地から分離し、精製することができる。この方法では、イソブタノールを含んでいる発酵ブロスを蒸留して共沸組成物に近づけ、その後、残っている水を親水性膜に通して透析蒸発によって除去する（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。
【０１２８】
本発明を、以下の実施例でさらに明確に示す。そうした実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すものだが、単なる例として示すものであることを理解すべきである。上記の説明およびこうした実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を見定めることができ、本発明の精神および範囲を逸脱しない範囲で本発明に様々な変更および修正を加えて様々な用途および条件に適合させることができる。
【０１２９】
一般的方法
実施例に記載されている標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）  （Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【０１３０】
細菌性培養物の維持および成長に適した物質および方法は、当該技術分野において周知である。以下の実施例に用いるのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ
Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ
Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））ま
たはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に示されており、その中に見出すことができるであろう。バクテリア細胞の成長および維持のために使用する試薬、制限酵素および物質はすべて、特に明記されていない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１３１】
微生物株は、特に記載のない限り、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから得た。以下の実施例で使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｓｖｉｌｌｅ，ＩＡ）が合成したものである。
【０１３２】
合成完全培地については、Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【０１３３】
ＨＰＬＣ
発酵の副産物組成物の分析は、当業者よく知られている。例えば、ある高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法では、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１  カラムとＳｈｏｄｅｘ  ＳＨ−Ｇガードカラム（どちらもＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）を一緒に使用し、屈折率（ＲＩ）検出を用いる。クロマトグラフ分離は、０．０１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として用い、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量および５０℃のカラム温度で実施する。イソブタノールの保持時間は約４７．６分である。
【０１３４】
略号の意味は以下のとおりである：「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定した光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「〜」は約を意味し、「％  ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％  ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。
【実施例】
【０１３５】
実施例１
［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有する細菌性ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの同定
系統発生分析
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）および関連タンパク質に関して、系統発生的関係を求めた。関連タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡＤ（配列番号：３８２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ＥＤＤ；配列番号：３８４；コード領域  配列番号：３８３）、およびアゾスピリルム・ブラシリエンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼ（配列番号：３８６；コード領域  配列番号：３８５）のアミノ酸配列を用いて、公的に入手可能なデータベースのＢｌａｓｔＰ検索によって同定した。検索パラメーターは以下のものを用いた：Ｅ  ｖａｌｕｅ＝１０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝３、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、およびＧＡＰ  ｏｐｅｎｉｎｇ＝１１およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１。３種類の異なるタンパク質配列を用いたＢｌａｓｔ検索では、オーバーラップする配列一致のセットが生成された。９５％同一性配列のものを排除し、１０−５のＥ値カットオフに基づいて検索結果から配列を選択した。３５０個のアミノ酸よりも短かった配列および６５０個のアミノ酸よりも長かった配列も排除した。得られた９７６個のアミノ酸配列セットには、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、およびアルドン酸デヒドラターゼが含まれていた。
【０１３６】
プロファイルＨＭＭは、実施例２に記載されている実験的に検証されたＤＨＡＤから生成させた。作成、較正およびこのプロファイルＨＭＭを用いた検索に関しては、以下の詳細を参照されたい。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）としてこのプロファイルＨＭＭを使用して、この９７６個の配列に対してｈｍｍｅｒ検索を行うと、Ｅ値が＜１０−５ですべての配列と一致した。アミノ酸配列の多重配列アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：  ４６７３  ４６８０）を用いて実施したが、その際に以下のパラメーターを使用した：  １）ペアワイズアラインメントパラメーターの場合、Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０；Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ＝０．１；ｍａｔｒｉｘはＧｏｎｎｅｔ  ２５０である；モード−緩慢・正確（Ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ）、２）多重アラインメントパラメーターの場合、Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０；Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０．２；ｍａｔｒｉｘはＧｏｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓである。系統樹は、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ法に基づいて配列アラインメントから生成させた。９７６個の配列間の系統発生的関連を表す樹木を図２に示す。４つの主要な分枝がこの分析から出現した。それらは、以下に詳述する基準に基づいて、「４Ｆｅ−４Ｓ  ＤＨＡＤ」、「２Ｆｅ−２Ｓ  ＤＨＡＤ」、「アルドン酸デヒドラターゼ」、および「ＥＤＤ」と名付けてある。５番目の小さい分枝の１７の配列には、未定義を表す「Ｕｎｄ」の印を付けてある。
【０１３７】
アラインメントされた配列は、最初に、酵素活性にとって必須と判断された３つのシステインがあるかどうか分析した。３つのシステインは、アゾスピリルム・ブラシリエンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼ内のＦｅ−Ｓの配位に関与していると思われ、そのアラボネートデヒドラターゼは、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタータンパク質として報告されたものである（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１：３３５２１−３３５３６）。９７６の配列のそれぞれは、アゾスピリルム・ブラシリエンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼの（位置１２４および１９７の）必須システインの２つに対応するシステインを有する。系統樹の中に、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の［４Ｆｅ−４Ｓ］ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．３８：７８３−７８９）を含んでいる１６８個の配列の分枝がある。アラニン、バリンまたはセリンまたはグリシンの４個のアミノ酸のみが、Ａ．ブラシリエンセ（Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼの３番目の必須システインの位置（位置５６）に見出されたが、システインは見出されなかった。この１６８個の配列の分枝は、図２では「ＥＤＤ」と名付けられている。
【０１３８】
この樹木の別の分枝は、３２２個の配列を含み、その中には知られている大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）の［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターＤＨＡＤが含まれている。この３２２個の配列の分枝は図２内で「４Ｆｅ−４ＳＤＨＡＤ」と名付けられている。この分枝内、および１７個の配列の分枝（「Ｕｎｄ」）内のすべての配列は、３番目のシステインに対応する位置にグリシンを含む。残りの４６９個の配列は、２つの分枝にクラスター化されていて、アルドン酸を認識するＡ．ブラシリエンセ（Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼと１組のＤＨＡＤの両方を含み、３つのシステインすべてを有している。これらのシステインは、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ（配列番号：１６８）内の位置５６、１２９、および２０１、およびＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤ（配列番号：２３２）内の位置６１、１３５、および２０７にある。保存システインを含んでいる多重配列アラインメントからの領域の例を図１に示す。
【０１３９】
多重配列アラインメントおよび系統樹の更なる分析を行って、ＤＨＡＤ固有の残基（サイン）を同定して、ＤＨＡＤをアラボネートデヒドラターゼおよび他のアルドン酸デヒドラターゼと区別した。３つの特定の保存システインを含む配列の中において、２７４個の配列のクレイドが、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤを含んでいることが見出された。Ａ．ブラシリエンセ（Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼは、１９５個の配列の別個のクレイド中に見出された。２７４個からなるＤＨＡＤ群、アルドン酸デヒドラターゼ群、および「［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤ」分枝からの配列を含む多重配列アラインメントを分析して、各位置に保存残基があるかどうか調べた。両方のＤＨＡＤ群の大多数に保存されているが、アルドン酸デヒドラターゼの群にはない１組の残基が、検出された。それを表４に示す。さらに、アルドン酸デヒドラターゼに保存されているが、この２つのＤＨＡＤ群のどちらにも含まれていない残基も見出された。そのように異なった仕方で保存されている残基は、それぞれの酵素の基質特異性決定因子としての機能を果たすことができる。
【０１４０】
【表１４】
0005846912.tif 000015
【０１４１】
［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡＤ、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、また伝えられたところによる［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターのＡ．ブラシリエンセ（Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）アラボネートデヒドラターゼのいずれも含まない、２７４個の配列のクレイドを形成するＤＨＡＤの群は、系統発生学によって、また上述の多重配列アラインメント中に見出される保存残基によって他の群とは異なるものとして識別された。その群が［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターＤＨＡＤを含むという提案と一致して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＨＡＤおよびＳ．ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＨＡＤは、この群に含まれる。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）はホウレンソウように植物であり、ホウレンソウＤＨＡＤは［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターＤＨＡＤと同定されているので（Ｆｌｉｎｔ  ａｎｄ  Ｅｍｐｔａｇｅ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５５８−３５６４）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＨＡＤは、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターＤＨＡＤでありうる。Ｓ．ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＨＡＤは、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターホウレンソウＤＨＡＤのように酸素耐性であることが報告されており（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９，５９１−５９６）、このことは、Ｓ．ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＨＡＤが［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターＤＨＡＤでありうることを示している。
【０１４２】
２７４個の配列のクレイドは、図４では「２Ｆｅ−２ＳＤＨＡＤ」と名付けられている。こうした配列の１９３個は細菌源からのものである。３個の保存システインおよび表４に明記した保存残基は、上述のアラインメント手順を用いて、１９３個の細菌性ＤＨＡＤの多重配列アラインメントで同定できる。１９３個の細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤの配列が配列リストに示されており、配列番号が表２ａに列挙されている。
【０１４３】
［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ群における幾種類かの細菌性タンパク質の同一性は、本明細書の他の実施例に記載されているＤＨＡＤとしての機能分析で確認した。本明細書の他の実施例は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤおよびＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤなどのこの群の中のタンパク質が、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含むことを示している。
【０１４４】
プロファイルＨＭＭの作成
以下の実施例２に記載されているようにして、［２Ｆｅ−２Ｓ］系統発生群のメンバーとして同定された７種類の細菌性ＤＨＡＤを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を見出した。これらのＤＨＡＤは、ニトロソモナス・ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ）（配列番号Ｏ：３１０）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３（配列番号：２９８）、連鎖球菌属ミュータンス（配列番号：１６８）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号：１６４）、ラルストニア・メタリデュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）（配列番号：３４６）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（配列番号：３４４）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号：２３２）からのものである。さらに、フラボバクテリウム・ジョンソニアエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）（配列番号：２３０）からのＤＨＡＤも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたときにジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有していることが見出された。実験的に決定されたこれらの機能細菌性ＤＨＡＤのアミノ酸配列は、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用い（プロファイルＨＭＭを支持する理論は、Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，ａｎｄ  Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１-１５３１に記載されている）、ＨＭＭＥＲ（Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）から入手可能なユーザーガイドに従って分析した。ＨＭＭＥＲソフトウェアプログラムの出力は、入力配列を特徴付けるプロファイル隠れＭａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）である。ユーザーガイドに述べられているように、プロファイルＨＭＭは多重配列アラインメントの統計モデルである。それは、アラインメントの各カラムがどのように保存されているか、また各位置にくるもっとも可能性の高いアミノ酸残基はどれかに関する、位置固有の情報を取得する。したがって、ＨＭＭには正式な確率論的な基盤がある。多数のタンパク質ファミリー用のプロファイルＨＭＭは、ＰＦＡＭデータベース（Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）で公的に入手可能である。
【０１４５】
プロファイルＨＭＭは以下のようにして作成した。
【０１４６】
ステップ１．配列アラインメントを作成する
デフォルト・パラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して、上に挙げた機能の検証されたＤＨＡＤの８個の配列をアラインメントさせた。
【０１４７】
ステップ２．プロファイルＨＭＭを作成する
アラインメントさせた配列のセットに対して、デフォルト・パラメーターを用いたｈｍｍｂｕｉｌｄプログラムを実行した。ｈｍｍｂｕｉｌｄは、多重配列アラインメントファイルを読み取り、新しいプロファイルＨＭＭを作成し、そのプロファイルＨＭＭをファイルに保管する。このプログラムを用いて、上述のサブユニット配列のそれぞれのセットについて多重アラインメントから未較正のプロファイルを生成させた。
【０１４８】
ＨＭＭＥＲソフトウェアのユーザーガイドに基づく以下の情報は、ｈｍｍｂｕｉｌｄプログラムがプロファイルＨＭＭを作成する仕方に関する幾らかの説明となるものである。プロファイルＨＭＭは、ギャップアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）（例えば、挿入および削除を含む）をモデル化することができ、それにより、ソフトウェアは（単なる小さなギャップなしのモチーフではなく）完全な保存ドメインを記述することになる。挿入および削除は、挿入（Ｉ）状態および削除（Ｄ）状態を用いてモデル化される。間隙文字の特定小数部ｘより多くを含むカラムはすべて、挿入カラムとして割り当てられることになる。デフォルトでは、ｘは０．５に設定される。それぞれの一致状態は、それに関連づけられたＩ状態とＤ状態を有する。ＨＭＭＥＲは、アラインメント「ノード」内の同じコンセンサス位置で３つの状態（Ｍ／Ｄ／Ｉ）のグループを呼び出す。これらの状態は、状態遷移確率と呼ばれる矢印で互いに連結される。ＭおよびＩの状態はエミッター（ｅｍｉｔｔｅｒ）であり、Ｄ状態はサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）である。遷移は、各ノードにおいて、Ｍ状態を使用する（また残基がアラインメントされ、点数が入る）か、またはＤ状態を使用する（また残基はアラインメントされず、削除間隙文字「−」が入る）かのいずれかとなるように配列される。ノード間で挿入が発生し、Ｉ状態が自己遷移を持つと、コンセンサスカラム間に１個または複数個の挿入残基が入るのが許される。
【０１４９】
一致状態の残基の点数（すなわち、一致状態エミッション点数（ｍａｔｃｈ  ｓｔａｔｅ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅｓ））、または挿入状態の残基の点数（すなわち、挿入状態エミッション点数）は、Ｌｏｇ＿２（ｐ＿ｘ）／（ｎｕｌｌ＿ｘ）に比例する。ここで、ｐ＿ｘは、プロファイルＨＭＭに従ったアラインメント内の特定位置でのアミノ酸残基の確率であり、ｎｕｌｌ＿ｘは、ヌルモデル（Ｎｕｌｌ  ｍｏｄｅｌ）に従った確率である。ヌルモデルは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴリリース２４でのアミノ酸分布から得られる２０個のアミノ酸のそれぞれについて事前に計算されたエミッション確率を有する、単純な１つの状態の確率論的モデルである。
【０１５０】
状態遷移点数もｌｏｇ  ｏｄｄｓパラメーターとして計算され、これはＬｏｇ＿２（ｔ＿ｘ）に比例する。ここで、ｔ＿ｘはエミッターまたは非エミッター状態に遷移する確率である。
【０１５１】
ステップ３．プロファイルＨＭＭの較正
ｈｍｍｃａｌｓｉｂｒａｔｅを用いて、プロファイルＨＭＭを読み取ったが、ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅは、そのプロファイルを用いて多数の合成ランダム配列に点数を付け（使用される合成配列の、デフォルトの数は５，０００である）、極値分布（ＥＶＤ）をそれらの点数のヒストグラムに当てはめ、こうしてＥＶＤパラメーターが入れられたＨＭＭファイルを再び保管するものである。タンパク質配列データベースに対してプロファイルの検索を実行する時に、こうしたＥＶＤパラメーター（μおよびλ）を用いてビット点数（ｂｉｔ  ｓｃｏｒｅｓ）のＥ値を計算する。ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅは、２つのパラメーターをＨＭＭファイルの「ＥＶＤ」のラベルの付けられた行に書き込む：これらのパラメーターは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴとほぼ同じ長さおよび残基組成のランダム生成配列に関して計算された点数のヒストグラムにもっともうまく当てはまる極値分布（ＥＶＤ）のμ（場所）およびλ（スケール）パラメーターである。この較正は、プロファイルＨＭＭに関して一度行った。
【０１５２】
ＤＨＡＤの配列セットに関する較正プロファイルＨＭＭを、表１に示す。プロファイルＨＭＭを、アミノ酸配列内の各位置にくる各アミノ酸の確率を示す図表で示す。最高確率は、位置ごとに強調表示してある。それぞれの位置の最初の行は、一致エミッション点数（各アミノ酸がその状態にある確率（最高点数は強調表示されている））を示している。第２行は挿入エミッション点数を示し、第３行は状態遷移点数を示している（Ｍ→Ｍ、Ｍ→Ｉ、Ｍ→Ｄ；Ｉ→Ｍ、Ｉ→Ｉ；Ｄ→Ｍ、Ｄ→Ｄ；Ｂ→Ｍ；Ｍ→Ｅ）。
【０１５３】
例えば、ＤＨＡＤのプロファイルＨＭＭは、メチオニンが第１位置にある確率が１７５７（強調表示されている最大確率）であることを示す。第２位置では、グルタミン酸が最大確率を持ち、それは１３５６である。第３位置では、リジンが最大確率を持ち、それは１５６９である。
【０１５４】
ステップ４．作成したプロファイルＨＭＭの特異性および敏感度の試験
プロファイルＨＭＭは、ｈｍｍｓｅａｒｃｈを用いて評価したが、ｈｍｍｓｅａｒｃｈは、プロファイルＨＭＭをｈｍｍｆｉｌｅから読み取って著しく類似した配列の一致がないか配列ファイルを探すものである。検索した配列ファイルには９７６個の配列が含まれていた（上記を参照）。この検索の間、データベースのサイズ（Ｚパラメーター）は１０億に設定されていた。このサイズ設定により、現行データベースに対する有意のＥ値は、当面の間は有意のままとなることが確実にされる。Ｅ値カットオフを１０に設定した。
【０１５５】
実験的に検証済みの機能を有する８個のＤＨＡＤのアラインメントから生成されたプロファイルＨＭＭを用いたｈｍｍｅｒ検索では、Ｅ値が＜１０−５で、９７６個の配列すべてと一致した。この結果は、デヒドラターゼのスーパーファミリーのメンバーが有意の配列類似性を共有していることを示す。１０−５のＥ値のカットオフでｈｍｍｅｒ検索を使用して、上述のようにして、ＤＨＡＤ関連デヒドラターゼを他のいっそう遠縁の（但し、関連した）タンパク質から分けた。
【０１５６】
実施例２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での細菌性［２Ｆｅ−２Ｓ］ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの発現および特性決定
種々のバクテリアのｉｌｖＤコード領域（これは、実施例１に記載した系統発生分析から、［２Ｆｅ−２Ｓ］群内にある）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＴ７プロモーターの制御下で発現した。それぞれのｉｌｖＤコード領域を、ＮｈｅＩ制限酵素部位を有する特定の順方向プライマーおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を有する特定の逆方向プライマー（表５に列挙）を用いて増幅した。
【０１５７】
【表１５】
0005846912.tif 000016
【０１５８】
それぞれの細菌性株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。ゲノムＤＮＡは、表１に列挙されているそれぞれの菌株から、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して作成した。プラスミドベクターを、プライマーｐＥＴ２８ａ−Ｆ（ＮｏｔＩ）（配列番号：３９７）およびｐＥＴ２８ａ−Ｒ（ＮｈｅＩ）（配列番号：３９８）で増幅して、ｈｉｓタグ領域を除去した。遺伝子フラグメントおよびプラスミドフラグメントの両方を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化してから連結した。連結混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｔｏｐ  １０）のコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れて形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補われたＬＢ寒天平板で成長させた。シークエンシングで確認した陽性クローンを、発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に入れて形質転換した。選択したコロニーを、カナマイシンで補われたＬＢ液体培地中で、３０℃で成長させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物が６００ｎｍで０．３から０．４のＯ．Ｄ．に達したときに、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えて誘導を実施した。５時間の誘導後に培養物を回収した。細胞のペレットをトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で洗った。
【０１５９】
未精製抽出物の酵素活性を３７℃で以下のように試験した。ＤＨＡＤに関して試験する細胞を、２から５倍の量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ｐＨ８．０）（ＴＭ８）緩衝液中に懸濁させ、その後０℃で超音波処理によって破壊した。破壊細胞からの未精製抽出物を遠心分離して、細胞の残屑をペレット状にした。上澄みを除去し、試験まで氷上に保存した（最初の試験は細胞破壊の２時間以内に行った）。ここで試験したＤＨＡＤは、氷上に保持された未精製抽出物内で数時間安定していたことが分かった。少量の試料を液体Ｎ２の中で凍らせて−８０℃で貯蔵した場合、活性も維持された。
【０１６０】
上澄みは、ＦｌｉｎｔおよびＥｍｐｔａｇｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：３５５８−６４）によって説明されているように、試薬である２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いて試験した。活性が高すぎたため、正確な試験を行うために未精製の抽出物を希釈する必要が生じた場合、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ−ＴＭ８で希釈した。
【０１６１】
ＢＳＡを標準として用い、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（カタログの２３２３８）を使用してタンパク質試験を行った。必要に応じて、タンパク質試験用の希釈液をＴＭ８緩衝液で作った。
【０１６２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された場合、ＤＨＡＤはすべて活性であった。比活性を表６に示す。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤの比活性がもっとも高かった。
【０１６３】
【表１６】
0005846912.tif 000017
【０１６４】
実施例３
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤの精製および特性決定
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤをさらに精製し、特性を決定した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを精製するために、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ｉｌｖＤを有するｐＥＴ２８ａプラスミドを内部に持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｕｎｅｒ株の培養物６リットルを成長させ、ＩＰＴＧで誘導した。細胞を（実施例２に記載されているようにして）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んでいる５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＭ８緩衝液）中で破壊し、遠心処理で細胞残屑を除去し、次いで未精製の抽出物の上澄みをＱセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに注加し、ＴＭ８緩衝液中のＮａＣｌ濃度を増大させながらＤＨＡＤを溶出させることにより、酵素を精製した。ＤＨＡＤを含む分画（外観の色に基づく）（褐色はＦｅ−Ｓクラスターが存在するせいである）をためて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに注加し、ＴＭ８緩衝液で溶出させた。ＳＤＳゲルで判定した場合、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラムから溶出したタンパク質の純度は６０から８０％であると推定された。部分的に精製された酵素の活性を、Ｆｌｉｎｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３（８）：３５５８−６４）が述べているようにして３７℃で試験した。その精製タンパク質の比活性は４０μｍｏｌ  分−１ｍｇ−１であった。精製酵素のｋｃａｔは、５０から７０秒−１であると推定された。
【０１６５】
様々な時間間隔の間、周囲空気の存在下において精製酵素を２３℃で温置し、その後、上述の活性試験を行って、空気中での精製ＤＨＡＤの安定性を詳しく調べた。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤの活性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの同様に精製されたＤＨＡＤとは対照的に、図４に示すように、７２時間温置した後であっても安定していた。図４では、（Ａ）は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの場合の結果を示し、（Ｂ）は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡＤの場合の結果を示す。
【０１６６】
精製Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の紫外・可視スペクトルを図５に示す。３００ｎｍより上のピークの数は、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するタンパク質に特有である。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを亜ジチオン酸ナトリウムで還元し、様々な温度でＥＰＲスペクトルを取った。図６は、２０°Ｋから７０°Ｋの間の温度で測定したスペクトルを示す。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のＥＰＲスペクトルが最高７０°Ｋまで測定可能であるということは、それが［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含んでいることを示している。例えば、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含んでいるタンパク質のＥＰＲスペクトルは、１０°Ｋよりかなり上の温度では観察できないことはよく知られている。（例えば、Ｒｕｐｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９７８）５３７：２５５−２６９を参照）
【０１６７】
実施例４
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）発現カセットの作成
この実施例の目的は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７７２７）内で、種々の細菌源からのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子（ｉｌｖＤ）をクローン化し発現させる方法を説明することである。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８（ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８）［Ｇｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９２）１７４：６５８０−６５８９］からのｉｌｖＤ遺伝子およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ  ７００６１０）からのｉｌｖＤ遺伝子を、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２内でクローン化し発現させるために、シャトルベクターｐＤＭ１（配列番号：４１０）を使用した。プラスミドｐＤＭ１は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１４９１７のプラスミドｐＬＦ１からの最小のｐＬＦ１レプリコン（〜０．７Ｋｂｐ）およびｐｅｍＫ−ｐｅｍＩ毒素抗毒素混合物（ＴＡ）、ｐＡＣＹＣ１８４からのＰ１５Ａレプリコン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の両方での選択用クロラムフェニコールマーカー、およびＰ３０合成プロモーター［Ｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）１５２：１０１１−１０１９］を含む。プラスミドｐＬＦ１（Ｃ．−Ｆ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５０８８０８）は、プラスミドｐ２５６［Ｓoｒｖｉｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）１５１：４２１−４３１］と密接に関連しており、そのコピー数は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣ７の染色体当たり〜５から１０コピーであると推定された。Ｐ３０合成プロモーターは、乳酸菌（ＬＡＢ）中の最強プロモーターの中の１つであることが知られているＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のｒＲＮＡプロモーター［Ｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）１５２：１０１１−１０１９］から誘導した。
【０１６８】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）のｉｌｖＤコード領域（配列番号：２３１）は、プライマー３Ｔ−ｉｌｖＤＬＩ（ＢａｍＨＩ）（配列番号：４０８）および５Ｂ−ｉｌｖＤＬＩ（ＮｏｔＩ）（配列番号：４０９）を含むラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８のゲノムＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｇｅｎｔｒａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡ）を用いて調製した。１．７ＫｂｐのＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤ  ＰＣＲ産物（ｉｌｖＤＬＩ）をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して、平滑末端を作った。得られたＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のｉｌｖＤコード領域フラグメントをＢａｍＨＩで消化し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡ）を用いてゲル精製した。プラスミドｐＤＭ１をＡｐａＬＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を作り、その後、ＢａｍＨＩで消化した。ゲル精製したＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のｉｌｖＤコード領域フラグメントを、プラスミドｐＤＭ１のＢａｍＨＩ部位およびＡｐａＬＩ（平滑末端化）部位に連結した。連結混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に入れて形質転換した。選択するために、形質転換体をＬＢクロラムフェニコール平板上に蒔いた。ＳａｌＩによる消化によって陽性クローンを選別して、期待サイズが５．３Ｋｂｐである１つのフラグメントを得た。陽性クローンはＤＮＡシークエンシングによってさらに確認した。正しいクローンにｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））という名前を付けた。
【０１６９】
プラスミドｐＥＴ２８ａからのＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ  ７００６１０）ｉｌｖＤコード領域を、プラスミドｐＤＭ１上にクローン化した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ｉｌｖＤを含むｐＥＴ２８ａの作成は、実施例２で説明した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｉｌｖＤを含むプラスミドｐＥＴ２８ａをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を作り、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｉｌｖＤコード領域を含む１，７５９ｂｐフラグメントをゲル精製した。プラスミドｐＤＭ１をＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を作り、その後、ＰｖｕＩＩで消化した。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｉｌｖＤコード領域を含むゲル精製フラグメントを、プラスミドｐＤＭ１のＢａｍＨＩ（平滑末端化）部位およびＰｖｕＩＩ部位に連結した。連結混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に入れて形質転換した。選択するために、形質転換体をＬＢクロラムフェニコール平板上に蒔いた。ＣｌａＩによる消化によって陽性クローンを選別して、期待サイズが５．５Ｋｂｐである１つのフラグメントを得た。正しいクローンに、ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））という名前を付けた。
【０１７０】
実施例５
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２内の発現されたＤＨＡＤ活性の測定
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２を、電気穿孔法によりプラスミドｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））またはｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））で形質転換した。エレクトロコンピテント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）を以下の手順で作成した。１％のグリシンを含む５ｍｌの乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地に、ＰＮ０５１２細胞を接種し、３０℃で一晩成長させた。１％のグリシンを含む１００ｍｌのＭＲＳ培地に、一晩培養物をＯＤ６００＝０．１になるまで接種し、３０℃でＯＤ６００＝０．７になるまで成長させた。細胞は、３７００  ×  ｇ、８ｍｉｎ、４℃で回収し、１００ｍｌの冷たい１ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄し、３７００  ×  ｇ、８ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、１００ｍｌの冷たい３０％ＰＥＧ−１０００（８１１８８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で洗浄し、３７００  ×  ｇ、２０ｍｉｎ、４℃で再遠心分離し、その後、１ｍｌの冷たい３０％ＰＥＧ−１０００中に再懸濁させた。６０μｌのエレクトロコンピテント細胞を、冷たい１ｍｍのギャップ電気穿孔キュベット中で〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）内において、１．７ｋＶ、２５μＦ、および４００Ωで電気穿孔した。５００ｍＭスクロースと１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２とを含む１ｍｌのＭＲＳ培地中に細胞を再懸濁させ、３０℃で２時間培養してから、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＭＲＳ培地板に蒔いた。
【０１７１】
ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））またはｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））を持っているＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２の形質転換体、ならびにｐＤＭ１ベクターのみを有する対照形質転換体を、３０℃において乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中で一晩成長させた。１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、４０μＭクエン酸第二鉄、０．５ｍＭ  Ｌ−システイン、および１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補われた１２０ｍｌのＭＲＳ培地に、それぞれの一晩試料について、１２５ｍｌのねじ蓋フラスコ中でＯＤ６００＝０．１になるまで一晩培養物を接種した。培養物は、ＯＤ６００が１から２までの間に達するまで、３７℃で嫌気的に培養した。培養物は、４℃において３７００  ×  ｇで１０分間遠心分離した。ペレットは、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）（６．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４および１．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）で洗浄し、再び遠心分離した。ＤＨＡＤ活性の試験が行われるまで、ペレットを−８０℃で凍結させ保存した。実施例２に記載されているようにジニトロフェニルヒドラジンに基づく方法を用いて、細胞抽出試料をＤＨＡＤ活性について試験した。ＤＨＡＤ活性の結果を表７に示す。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２内のＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤおよびＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの比活性は、それぞれ０．０２および０．０６μｍｏｌ  分−１  ｍｇ−１であることが示されたが、ベクターの対照試料は検出可能な活性を示さなかった。
【０１７２】
【表１７】
0005846912.tif 000018
【０１７３】
実施例６
酵母菌内でのＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのジヒドロキシ酸デヒドラターゼの発現
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤを発現させるために、シャトルベクターｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号：４３０）を用いた。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での維持のためのＦ１複製オリジン（１４２３から１８７９）および酵母菌内での複製のための２ミクロンオリジン（２  ｍｉｃｒｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）（ｎｔ  ８０８２から９４２６）を含んでいた。ベクターは、ＦＢＡプロモーター（ｎｔ  ２１１１から３１０８；配列番号：４２５）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ  ４８６１から５８６０）を有している。さらに、それは、酵母菌内での選択用のＨｉｓマーカー（ｎｔ  ５０４から１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での選択用のアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ  ７０９２から７９４９）を持っている。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ  ７００６１０）のｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ３１１６から４８２８）は、ＦＢＡプロモーターとＦＢＡターミネーターとの間にあり、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。
【０１７４】
酵母菌株ＢＹ４７４１（当該技術分野において知られており、ＡＴＣＣから入手可能（＃２０１３８８））内でのストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤの発現を試験するために、発現ベクターｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ＩｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）を、空ベクターｐＲＳ４２６と組み合わせてＢＹ４７４１細胞（ＡＴＣＣから入手可能（＃２０１３８８））に入れて形質転換した。形質転換体を、ヒスチジンおよびウラシルの含まれていない合成培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）上で成長させた。試験のための液体培地上での成長は、５ｍｌの一晩培養物を２５０ｍｌフラスコ内の１００ｍｌ培地に加えることにより行わせた。培養物は、６００ｎｍで１から２のＯ．Ｄ．に達したときに回収した。試料を１０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄してから、１ｍｌの同じトリス緩衝液中に再懸濁させた。試料を、０．１ｍｍシリカ（Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ，ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含んでいる２．０ｍｌ管の中に移した。次いで、細胞をビーズビーター（ｂｅａｄ−ｂｅａｔｅｒ）（ＢＩＯ１０１）内で破壊した。４℃、１３，０００ｒｐｍでの３０分間の微量遠心管での遠心分離によって、上澄みを得た。典型的には、０．０６から０．１ｍｇの未精製抽出物のタンパク質を、ＦｌｉｎｔおよびＥｍｐｔａｇｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３（８）：３５５８−６４）が述べているようにして、３７℃でジニトロフェニルヒドラジンを用いたＤＨＡＤ試験法に使用した。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのデヒドラターゼは、酵母菌内で発現させた場合、比活性が０．２４μｍｏｌ  分−１ｍｇ−１であった。空ベクターｐＲＳ４２３およびｐＲＳ４２６を含んでいる対照株は、バックグラウンド活性が０．０３から０．０６μｍｏｌ  分−１ｍｇ−１であった。
【０１７５】
実施例７
酵母菌内でのＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＩｌｖＤ遺伝子の発現
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのｉｌｖＤコード領域を、順方向プライマーＩｌｖＤ（Ｌｌ）−Ｆ（配列番号：４２０）および逆方向プライマーＩｌｖＤ（Ｌｌ）−Ｒ（配列番号：４２１）で増幅した。増幅フラグメントは、ギャップ修復によってシャトルベクターｐＮＹ１３内にクローン化した。ｐＮＹ１３（配列番号：４３７）はｐＲＳ４２３から得た。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での維持用のＦ１複製オリジン（１４２３から１８７９）および酵母菌内での複製用の２ミクロンオリジン（ｎｔ  ７５３７から８８８１）を含んでいた。このベクターは、ＦＢＡプロモーター（ｎｔ  ２１１１から３１１０）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ  ４３１６から５３１５）を有している。さらに、それは、酵母菌内での選択用のＨｉｓマーカー（ｎｔ  ５０４から１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での選択用のアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ  ６５４７から７４０４）を持っている。
【０１７６】
陽性クローンは、ｉｌｖＤコード領域用の順方向および逆方向プライマーによる増幅に基づいて選択し、さらにシークエンシングによって確認した。この新しい作成物をｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））と名付けた。この作成物を、実施例６に記載した空ベクターｐＲＳ４２６と一緒に酵母菌株ＢＹ４７４３（ΔＬＥＵ１）（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ；Ｃａｔａｌｏｇ  ♯ＹＳＣ１０２１−６６６６２９）に入れて形質転換した。発現ベクターを含んでいる酵母菌株の成長および試験も、実施例６に記載した手順に従って実施した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のＩｌｖＤ遺伝子を有する酵母菌株内のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を測定すると、０．０５から０．１７μｍｏｌ分−１ｍｇ−１の範囲になった。この活性は対照よりもやや大きかった。相補性実験を実施して、このＤＨＡＤおよび他のバクテリアからのＤＨＡＤの発現を調査した（実施例８）。
【０１７７】
実施例８
細菌性ＤＨＡＤによるＩＬＶ３欠失酵母菌株の補完
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内生ＤＨＡＤ酵素は、ＩＬＶ３遺伝子によってコード化され、タンパク質はミトコンドリアを標的にする。この遺伝子の欠失の結果として、内生ＤＨＡＤ活性が失われ、またこの遺伝子の欠失により異種性細胞質ゾルＤＨＡＤ活性の発現を容易に試験できる試験株が得られる。ＩＬＶ３の欠失の結果として、分枝鎖アミノ酸の非存在下では菌株は成長できなくなる。種々の細菌性ＤＨＡＤの発現は、ＩＬＶ３欠失酵母菌株を補完してそれが分枝鎖アミノ酸の非存在下で成長するようになる能力を測定することによって試験した。
【０１７８】
表８に列挙されているバクテリアからのＤＨＡＤをコード化するｉｌｖＤ遺伝子配列を含んでいる発現シャトルベクターを作成した。こうした発現作成物の基礎要素は、実施例６に記載したｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（ｓｔｒｅｐ）ベクターと同じであった。それぞれのｉｌｖＤコード領域は、実施例２に記載したようにＰＣＲで作成し、さらにクローン化して、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）内にあるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ｉｌｖＤコード領域と置換して、表８に列挙されているプラスミドを作成した。こうした発現作成物をＩＬＶ３欠失株に入れて形質転換し、ＢＹ４７４１  ｉｌｖ３：：ＵＲＡ３を以下のようにして作成した。プライマー「ＩＬＶ３：：ＵＲＡ３  Ｆ」および「ＩＬＶ３：：ＵＲＡ３  Ｒ」（配列番号：４３１および４３２として示す）を含んでいるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーをＰＣＲ増幅して、ｉｌｖ３：：ＵＲＡ３破壊カセット（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作成した。こうしたプライマーにより、相同組換え用のＩＬＶ３染色体座の配列の上流および下流と等しい７０ｂｐの５’および３’延長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ）を含んでいる１．４ｋｂ  ＵＲＡ３  ＰＣＲ産物が作り出された。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＢＹ４７４１細胞（ＡＴＣＣ  ２０１３８８）に入れて形質転換し、得られた形質転換体を、２％グルコースで補われたウラシルを含んでいない完全な合成培地上で３０℃において維持した。形質転換体は、プライマー「ＩＬＶ３  Ｆチェック」および「ＵＲＡ３  ＲＥＶチェック」（これらを配列番号：４３３および４３４として示す）を用いてＰＣＲによって選別して、正しい部位での組込みおよび内生ＩＬＶ３座の破壊を確認した。
【０１７９】
表８の細菌性ＤＨＡＤを有する形質転換体を、ヒスチジンを含まない酵母菌合成培地を有する平板上で選択した。その後、選択したコロニーを、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含まない平板上に斑点状に付着させた。表８に列挙した発現ベクターを含んでいる菌株は、分枝鎖アミノ酸を含まないそうした平板上で成長することができたが、対照プラスミドを持つ対照菌株は成長できなかった。この結果は、こうしたバクテリアからのＤＨＡＤは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で活発に発現されたことを示した。
【０１８０】
【表１８】
0005846912.tif 000019
【０１８１】
実施例９
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤの精製および特性決定
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤを精製し、特性を決定した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＨＡＤを精製するために、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤを含んでいるｐＥＴ２８ａプラスミドを内部に持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）の培養物１４リットルを成長させ、ＩＰＴＧで誘導した。細胞を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＭ８緩衝液）１２０ｍｌ中で（実施例２に記載したようにして）破壊し、遠心処理して細胞残屑を除去し、その後、未精製の抽出物の上澄みを５×１５ｃｍのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに注加し、ＴＭ８緩衝液中のＮａＣｌの濃度を増大させながらＤＨＡＤを溶出させることにより、酵素を精製した。ＤＨＡＤを含んでいる分画をため、（ＮＨ４）２ＳＯ４が１Ｍとなるようにし、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４−ＴＭ８緩衝液で平衡化された２．６×１５ｃｍのフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに注加し、（ＮＨ４）２ＳＯ４を減少させながら溶出させた。フェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから出るＤＨＡＤを含んでいる分画をためて、濃縮して１０ｍｌにする。これを３．５×６０ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注加し、ＴＭ８を用いて溶出させた。ＤＨＡＤ活性のある分画をためて、濃縮し、Ｎ２（ｌ）中でビーズとして凍結させた。ＳＤＳゲルで判定すると、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから溶出したタンパク質の純度は＞８０％であると推定された。酵素の活性は、Ｆｌｉｎｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３（８）：３５５８−６４）が述べているようにして３７℃で試験した。精製タンパク質の比活性は、ｐＨ８および３７℃において、６４μｍｏｌ分−１ｍｇ−１であった。精製酵素のｋｃａｔは、７１秒−１であった。
【０１８２】
空気中での精製ＤＨＡＤの安定性を、様々な時間間隔の間、周囲空気の存在下において精製酵素を２３℃で温置し、その後、上述のように活性試験を行って詳しく調べた。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤは、図８に示すように、空気中に２０時間温置した後でさえほとんど完全な活性状態であった。
【０１８３】
精製Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の紫外・可視スペクトルを図９に示す。これは［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するタンパク質に特有のものである。
【０１８４】
実施例１０
酵母菌でのイソブタノール産生経路を構成するためのジヒドロキシ酸デヒドラターゼの使用
イソブタノール生合成経路の最初の３つのステップは、酵素であるアセト乳酸合成酵素、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって行われる。アセト乳酸合成酵素はａｌｓＳによってコード化されている。ＫＡＲＩ遺伝子は、酵母菌内のＩＬＶ５またはバクテリア内のｉｌｖＣとして知られている。いったんα−ケトイソ吉草酸（ＫＩＶ）がこれら３種類の酵素の反応によってピルベートから形成されると、それは酵母菌内でアルコールデヒドロゲナーゼによってイソブタノールにさらに変換することができる。
【０１８５】
ＫＡＲＩおよびａｌｓＳ遺伝子を発現するようにベクターｐＬＨ５３２（配列番号：４１１）を作成した。このベクターは、２ミクロン系のベクターｐＨＲ８１から誘導される。ｐＬＨ５３２では、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｌｓＳコード領域（ｎｔ  １４２１６から１５９３１）は、ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ．１５９３９から１６３８６）の制御下にあった。ｐＬＨ５３２には次のような２種類のＫＡＲＩ遺伝子があった：Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５からのｉｌｖＣコード領域（ｎｔ．１０１９２から１１２０８）は、酵母菌のＩＬＶ５プロモーター（ｎｔ．１１２００から１２３９０）の制御下にあり、酵母菌のＩＬＶ５コード領域（ｎｔ．８１１８から９１６７）はＦＢＡプロモーター（ｎｔ．７４５４から８１１０）の制御下にあった。選択マーカーはＵＲＡ３（ｎｔ．３３９０から４１９０）であった。
【０１８６】
イソブタノール産生用の酵母菌宿主は、ＢＹ４７４１  ｐｄｃ１：：ＦＢＡｐ−ａｌｓＳ−ＬＥＵ２であった。この菌株は次のようにして作成した。最初に、発現プラスミドｐＲＳ４２６−ＦＢＡｐ−ａｌｓＳを作成した。ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ：：ａｌｓＳ：：ＣＹＣの１．７ｋｂのａｌｓＳコード領域フラグメントを、ＢｂｖＣＩおよびＰａｃＩによる消化に続いてゲル精製を行って分離した。このプラスミドは、ＧＰＤプロモーター（配列番号：４３９）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｌｓＳコード領域（配列番号：４３８）、およびＣＹＣ１ターミネーター（配列番号：４４０）を含んでいるキメラ遺伝子を有している。これについては、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書（これを参照により本明細書に援用する）の実施例１７に記載されていた。プラスミドｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ：：ＩＬＶ５：：ＣＹＣからのＩＬＶ５フラグメント（これも、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書の実施例１７に記載）を、ＢｂｖＣＩおよびＰａｃＩによる制限消化によって除去し、残りの６．６ｋｂのベクターフラグメントをゲル精製した。このベクターは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＩＬＶ５遺伝子のコード領域の境界を示すＦＢＡプロモーター（配列番号：４２５）とＣＹＣ１ターミネーター（配列番号：４４２）とを含んでいるキメラ遺伝子を有する。これら２種類の精製フラグメントを１６℃で一晩連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れて形質転換した。形質転換体は、ＬＢ  Ａｍｐ１００培地に細胞を蒔くことによって得た。ベクターへのａｌｓＳの挿入は、制限消化パターンおよびＰＣＲによって確認した（プライマーＮ９８ＳｅｑＦ１およびＮ９９ＳｅｑＲ２、配列番号：４１２および４１３）。
【０１８７】
ｐｄｃ１：：ＦＢＡｐ−ａｌｓＳ−ＬＥＵ２破壊カセットは、ＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８に記載）によって、ｐＲＳ４２６−ＦＢＡｐ−ａｌｓＳからのＦＢＡｐ−ａｌｓＳセグメントをｐＲＳ４２５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０６）からのＬＥＵ２遺伝子に結合することによって作成した。その際に、テンプレートとしてｐＲＳ４２６−ＦＢＡｐ−ａｌｓＳおよびｐＲＳ４２５プラスミドＤＮＡを使用し、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１２５９０−４８Ａおよび１１２５９０−３０ＢからＤまで（配列番号：４１４、配列番号：４１５、４１６、および４１７として示す）を用いて行った。ＳＯＥ  ＰＣＲ用の外側プライマー（ｏｕｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ）（１１２５９０−４８Ａおよび１１２５９０−３０Ｄ）は、ＰＤＣ１のプロモーターおよびターミネーターの上流および下流にある領域と類似した５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。完成したカセットＰＣＲフラグメントをＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０１３８８）に入れて形質転換し、形質転換体を、３０℃において、ロイシンを含んでいない２％グルコースで補われた合成完全培地上に維持したが、その際に標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて行った。形質転換体は、プライマー１１２５９０−３０Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号：４１９および４１８として示される）を用いてＰＣＲで選別して、ＰＤＣ１座での組込みとＰＤＣ１コード領域の欠損を確認した。正しい形質転換体は、ＢＹ４７４１  ｐｄｃ１：：ＦＢＡｐ−ａｌｓＳ−ＬＥＵ２の遺伝子型を有している。
【０１８８】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード化ＤＨＡＤをイソブタノールの生合成に使用できるかどうかをテストするために、このｉｌｖＤを含んでいる発現ベクター（実施例６で作成されたｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（ｓｔｒｅｐ））を、ベクターｐＬＨ５３２と一緒に酵母菌株ＢＹ４７４１  ｐｄｃ１：：ＦＢＡｐ−ａｌｓＳ−ＬＥＵ２に入れて同時形質転換した。コンピテント細胞の作成、形質転換、および形質転換体選択用の増殖培地は、実施例６に記載されているのと同じであった。選択したコロニーは、酸素制限条件下で２０ｍｌの栓付き血清瓶内の１５ｍｌの培地で成長させた。瓶は、３０℃において２２５回転／ｍｉｎの一定速度のシェーカー内で温置した。４８時間温置した後、イソブタノールが存在するかどうかについて試料をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析の結果を図７に示す。イソブタノールの存在は、４７．５３３ｍｉｎの保持時間におけるピークによって示された。この結果により、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤ遺伝子の発現、ならびにａｌｓＳおよびＫＡＲＩ遺伝子の発現により、酵母菌内でイソブタノールが産生したことが分かった。
【０１８９】
実施例１１
更新されたデータベースに問い合わせて更なる［２Ｆｅ−２Ｓ］ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを同定する
更新された公共データベースへ、後ほど別の問い合わせを行って、新たに配列された［２Ｆｅ−２Ｓ］ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを見つけた。９５％同一性カットオフの場合、１４２５個の配列の最初のセットが、実施例１「系統発生分析」に記載されているようなデータベース問い合わせから生成された。その後、実施例１に記載されているように、多重配列アラインメントをＣｌｕｓｔａｌ  Ｗで実施した。その後、配列は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの中の位置に対応する位置にある以下の保存残基に関して分析を行った：位置５６、１２９、および２０１のシステイン、位置８８のアスパラギン酸、位置１４２のアルギニンまたはアスパラギン、位置２０８のアスパラギン、および位置４５４のロイシン。１９３個からなる元々のセットに加えて、バクテリアからの８８個の新規の［２Ｆｅ−２Ｓ］ジヒドロキシ酸デヒドラターゼが同定された。それらを表２ｂに列挙する。
【０１９０】
【表１９】
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【０１９１】
【表２０】
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【０１９２】
【表２１】
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【０１９３】
【表２２】
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【０１９４】
【表２３】
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【０１９５】
【表２４】
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【０１９６】
【表２５】
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【０１９７】
【表２６】
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【０１９８】
【表２７】
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【０１９９】
【表２８】
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【０２００】
【表２９】
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【０２０１】
【表３０】
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【０２０２】
【表３１】
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【０２０３】
【表３２】
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【０２０４】
【表３３】
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【０２０５】
【表３４】
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【０２０６】
【表３５】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５８】
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【０２３０】
【表５９】
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【表６４】
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【０２３６】
【表６５】
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【０２３７】
【表６６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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