(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はその医薬的に許容可能な塩を含むメトトレキサート抵抗性疾患用医薬組成物であって、
前記メトトレキサート抵抗性疾患を有する個体において使用し、前記メトトレキサート抵抗性疾患は、メトトレキサートに対する獲得抵抗性を有する疾患である、医薬組成物。
【請求項２】
前記疾患が癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
治療しようとする癌が、前立腺癌、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、血液悪性腫瘍、頭頸部癌、消化管の癌、卵巣癌及び骨肉種である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記疾患が炎症性疾患である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炎症性疾患が関節リウマチである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記疾患がメトトレキサート抵抗性新生物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記メトトレキサート抵抗性新生物は、前立腺癌、Ｔ細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、血液悪性腫瘍、頭頸部癌、消化管の癌、卵巣癌及び骨肉種である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物が経口投与用に製剤化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が静脈内投与用に製剤化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
メトトレキサート（「ＭＴＸ」とも呼ばれる。）は、多くの種類の癌を治療するための併用化学療法レジメンの一部として使用される。これは、急性リンパ芽球性白血病を含む多くの腫瘍性疾患の治療法である。メトトレキサートは、重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、ヴェーゲナー肉芽腫及び強皮症を含む一部の自己免疫疾患に対する治療としても使用される。
【背景技術】
【０００２】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン（「１０−プロパルギル−１０−ｄＡＭ」、「プララトレキサート」、「ラセミＰＤＸ」、「（２Ｓ）−２−［［４−［（１ＲＳ）−１−［（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル］ブト−３−イニル］ベンゾイル］アミノ］ペンタン二酸」、「（２ＲＳ）−２−［［４−［（１ＲＳ）−１−［（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル］ブト−３−イニル］ベンゾイル］アミノ］ペンタン二酸」及び「ＰＤＸ」を包含する。）は、試験を経て、癌の治療において有用であることが分かっている化合物である。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から、再発治療抵抗性末梢Ｔ細胞リンパ腫に対する治療薬として承認を得ている。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンはまた、リンパ腫、肺癌、膀胱癌及び乳癌での使用についても研究中である。
【０００３】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、ＤｅＧｒａｗら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  １０−Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ−１０−ｄｅａｚａａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２２２８−２２３１（１９９３）により最初に開示され、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）の阻害剤として及びマウスＬ１２１０リンパ性白血病細胞株における増殖阻害剤として作用することが示された。さらに、マウスＥ０７７１乳房腫瘍モデルを用いて、本化合物の抗腫瘍特性に関する結果がいくつか発表された。
【０００４】
米国特許第６，０２８，０７１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ１９９８／０２１６３号は、異種移植モデルで試験した場合、高純度１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン組成物がヒト腫瘍に対して有効性があることを開示している。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを用いたその後の研究から、これが、単独で及び他の治療薬と併用して有用であることが示されている。例えば、Ｓｉｒｏｔｎａｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．６，３７０５−３７１２（２０００）は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及び、ｃＭＯＡＴ／ＭＲＰ−様形質膜ＡＴＰａｓｅの阻害剤であるプロベネシドの同時投与によって、ヒト固形腫瘍に対して１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの効果が大きく促進されることを報告している。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンならびに１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンとプラチナ系化学療法剤との併用は、中皮腫に対して有効であることが示されている。（Ｋｈｏｋａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：３１９９−３２０５（２００１））。ＷＯ／２００５／１１７８９２ではリンパ腫の治療のための、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）との同時投与が開示されている。米国特許第６，３２３，２０５号では、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンとタキソールとの併用が有効であることが開示されている。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンはまた、Ｔ細胞リンパ腫の治療に対して有効であることも示されており、これについては米国特許第７，６２２，４７０号を参照のこと。その他の研究から、試料により発現される還元型葉酸担体−１タンパク質（ＲＦＣ−１）の量を測定することによる、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンによる治療に対するリンパ腫の感受性を評価するための方法が示されており、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１１７８９２号で開示されており、この方法では、発現されるＲＦＣ−１レベルが高いほど、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する感受性が高いことを示す。
【０００５】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは葉酸拮抗剤／代謝拮抗剤として知られている。葉酸経路は、細胞成長及び増殖においてキーとなる役割を果たす（Ａｐｐｌｉｎｇ、１９９１；Ｏｄｉｎら、２００３）。葉酸（ｆｏｌａｔｅ）は、還元型葉酸担体１（ＲＦＣ−１）を介して細胞に入り、ホリルポリグルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）によりポリグルタミン酸化され、ジヒドロ葉酸へと還元され、これがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）によってテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）に変換される。この経路に関与する様々な酵素及び輸送体は、重要なクラスの細胞毒性薬である葉酸拮抗剤のための標的である。メトトレキサートは、このクラスの最初の薬剤の１つであり、小児急性リンパ芽球性白血病の治療において最初に使用された（Ｆａｒｂｅｒら、１９４８）。その後、メトトレキサートは血液及び固形癌において幅広く使用され、葉酸経路の複数の局面を利用するように新世代の葉酸拮抗剤が合理的に設計されてきた（例えば、結直腸癌におけるラルチトレキセド（Ｃｏｃｃｏｎｉら、１９９８）及び悪性胸膜中皮腫（Ｖｏｇｅｌｚａｎｇら、２００３）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（Ｈａｎｎａら、２００４）におけるペメトレキセド））。殆どの腫瘍細胞において、ＲＦＣ−１は葉酸類似体の内部移行に介在する。細胞の内部に移行したら、これらの類似体はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に結合し、それによってプリン及びチミジン生合成に必要な細胞内還元型葉酸プールを枯渇させるか又はＤＨＦＲに結合する前にポリグルタミン酸に代謝されるかの何れかである。ホリルポリグルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）によりポリグルタミン酸化が触媒される。ホリル−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼ（ＦＰＧＨ、γ−グルタミルヒドロラーゼ［ＧＧＨ］としても知られる。）は開裂に介在し、従って続いてこれらの細胞内のポリグルタミン酸化葉酸拮抗剤のクリアランスが起こる。チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ（ＧＡＲＦＴ）も、「リサイクリング」酵素として葉酸代謝に関与する（従って、ＤＮＡ合成に利用可能なヌクレオチドのプールに直接影響を与える。）。
【０００６】
メトトレキサートは葉酸拮抗剤である。細胞株の試験に基づき、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサートは、同様なパターンの細胞毒性を有すると考えられており、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンはメトトレキサートよりも３倍から１９倍強力であることが多い。
【０００７】
メトトレキサート抵抗性は通常、ＤＨＦＲ遺伝子の突然変異又は増幅の結果として生じる。この葉酸アンタゴニスの効果に対して細胞が免疫性を獲得し得る３種類の既知の方式がある。細胞中のメトトレキサート濃度は、薬物を細胞へ及び細胞から移動させる輸送系での変化によって低下し得る。例えば、メトトレキサートを細胞に取り込む輸送体数が減少する場合、細胞内で見られるメトトレキサートはより少なくなる。また、細胞における薬物濃度は、ポリグルタミン酸化及び代謝速度を変化させることにより制御することができる。薬物がよりゆっくりとポリグルタミン酸化されるか又はより急激に代謝される場合、薬物はより簡単に細胞から除去され、細胞内でのその濃度及び活性が低下する。ＤＨＦＲ遺伝子の増幅により、存在するＤＨＦＲ量が増加し、これがメトトレキサート治療に対する反応低下と相関することが示された。メトトレキサートは、ＤＨＦＲの活性を妨害するためにＤＨＦＲに結合しなければならない。遺伝子の変化により、メトトレキサート結合を低減させるようにＤＨＦＲの結合領域が変化する場合、ＤＨＦＲは、葉酸を活性化し続け得、治療の有効性が低下する。これらの結果は全て、メトトレキサートに対する抵抗性の上昇と関連付けられている。メトトレキサートに対する抵抗性が急激に獲得され得、治療は失敗に終わり得る。
【０００８】
従って、メトトレキサート獲得抵抗性を克服するための方法は有用である。
【発明の概要】
【０００９】
ある実施態様において、本発明は、個体においてメトトレキサート抵抗性疾患を治療する方法を含む。この方法は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はその医薬的に許容可能な塩を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み得る。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、メトトレキサート抵抗性新生物治療を必要とする個体を治療する方法を含み、この方法は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はその医薬的に許容可能な塩の有効量を個体に投与することを含む。
【００１１】
いくつかの実施態様において、疾患は癌である。他の実施態様において、疾患は炎症性疾患である。ある実施態様において、本組成物は静脈内投与用に製剤化される。別の実施態様において、本組成物は経口投与用に製剤化される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを調製する際に有用な合成スキームを示す。
【図２】図２は、１５種類の被験癌細胞株に対する１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及び他の葉酸阻害剤の感受性を示す。
【図３】図３は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はメトトレキサートで処理した場合の、ナイーブＤＵ−１４５細胞、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン順応（ＤＵ−ＰＤＸ）及びメトトレキサート順応（ＤＵ−ＭＴＸ）ＤＵ−１４５細胞に対するＩＣ５０を示す。
【図４】図４は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はメトトレキサートで処理した場合の、ナイーブＨＥＰ２細胞、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン順応（ＨＥＰ−ＰＤＸ）及びメトトレキサート順応（ＨＥＰ−ＭＴＸ）ＨＥＰ２細胞に対するＩＣ５０を示す。
【図５】図５は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−抵抗性細胞株における葉酸遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
【図６】図６は、ＤＵ１４５及びＨＥＰ２感受性細胞株ならびにＤＵ−ＰＤＸ、ＤＵ−ＭＴＸ、ＨＥＰ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＭＴＸといった１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサート抵抗性細胞株における、ＤＨＦＲタンパク質のウエスタンブロットを示す。
【図７】図７は、ＤＵ１４５及びＨＥＰ２感受性細胞株ならびにＤＵ−ＰＤＸ、ＤＵ−ＭＴＸ、ＨＥＰ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＭＴＸといった１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサート抵抗性細胞株における、ＤＨＦＲに対するｍＲＮＡ発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
癌患者における治療に伴う今も変わらぬ問題の１つは、治療薬に対する反応の個人差及び、化学療法に対する抵抗性をもたらす腫瘍内の遺伝子変化である。化学療法には、急速に分裂している細胞を標的とすることが多い薬物の投与が含まれる。葉酸拮抗剤を含め、多くの化学療法剤は、細胞分裂前のＤＮＡ複製を妨害する。化学療法剤には多くの長所があるものの、癌細胞、特に進行癌の遺伝的不安定性により、薬物抵抗性癌の出現率が高い。
【００１４】
本発明において、ＤＵ１４５（前立腺）及びＨＥＰ２（頭頸部）癌細胞株から、メトトレキサート及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する獲得抵抗性を有する細胞株を作製した。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対して獲得抵抗性があるＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対して親細胞よりも２００倍超高い抵抗性を有しながら、メトトレキサートに対する交差抵抗性を示し；ＤＵ−ＭＴＸ及びＨＥＰ−ＭＴＸ細胞は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対して顕著な感受性をなお示す。
【００１５】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサートに対する獲得抵抗性の様々なメカニズムが認められた。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する獲得抵抗性は、ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞株の両方においてＲＦＣ１  ｍＲＮＡ発現の顕著な低下と関連があり、さらにＭＤＲ１  ｍＲＮＡ発現の小幅な上昇も認められた。本発明はまた、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−抵抗性細胞においてＦＰＧＳ  ｍＲＮＡ発現が僅かに減少することも示し、これにより１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する抵抗性におけるポリグルタミン酸化の役割が示唆される。３０年前に行われた研究から、メトトレキサート獲得抵抗性のよくあるメカニズムは、ＤＨＦＲ遺伝子増幅及び結果として起こる酵素過剰発現であることが分かった（Ａｓｓａｒａｆにより概説、２００７；Ｃｈｅｎら、１９９５）。故に、メトトレキサート濃度漸増による培養腫瘍細胞株の選択において、葉酸拮抗剤に対する獲得抵抗性はＤＨＦＲ遺伝子増幅によることが多い。実際に、本発明において、メトトレキサートに対する獲得抵抗性を有する細胞株ＨＥＰ−ＭＴＸは、その親細胞株と比較したとき、ＤＨＦＲタンパク質の発現が劇的に上昇しており、このことから、このモデルにおけるＤＨＦＲ遺伝子増幅の可能性が示唆される。このようなタンパク質増加は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−抵抗性細胞株では認められなかった。これらの知見から、これらの細胞株におけるメトトレキサート及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する抵抗性の様々な分子メカニズムが示唆される。
【００１６】
癌は、治療剤と接触させない場合のその成長と比較して、治療剤との接触の結果としてその成長速度が抑制される場合、治療剤に「反応性」があるか又は、治療に対する「良好な反応」がある。様々な方法で癌の成長を測定することができ、例えば、腫瘍の大きさ又はその腫瘍タイプに適切な腫瘍マーカーの発現を測定し得る。これらの基準は、測定される反応のタイプ及び、また治療剤に対する腫瘍の感受性の別の重要な尺度である疾患進行停止時間の特徴も規定する。様々な条件下で、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対して反応性があるという性質は変動するものであり、ある種の治療剤に対する「反応性」レベルは癌によって異なる。またさらに、患者のクオリティーオブライフ、転移度などを含む、腫瘍の成長サイズ以外のさらなる基準を用いて、反応性の程度を評価することができる。さらに、適切な状況において、臨床予後マーカー及び可変要素を評価することができる。
【００１７】
癌は、治療剤と接触させない場合のその成長と比較したとき、治療剤との接触の結果として、その成長速度が抑制されないか又は抑制が非常に小さい場合、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンなどの治療剤に対して「無反応性」であるかもしくは「反応不良」であるか又は治療に対して反応が乏しい。上述のように、様々な方法で癌の成長を測定することができ、例えば、腫瘍の大きさ又はその腫瘍タイプに適切な腫瘍マーカーの発現を測定し得る。様々な条件下で、治療剤に対して無反応性であるという性質は大きく変動するものであり、ある種の治療剤に対する「無反応性」レベルは癌によって異なる。またさらに、患者のクオリティーオブライフ、転移度などを含む、腫瘍の成長サイズ以外のさらなる基準を用いて、無反応性の程度を評価することができる。さらに、適切な状況において、臨床予後マーカー及び可変要素を評価することができる。このような無反応性又は反応不良の癌は、無反応性であり得るか又は最初に反応性であったが、抵抗性を獲得している。抵抗性又は無反応性は、他のより感受性が高い癌又は腫瘍細胞株に対して又は同じタイプの癌又は腫瘍細胞株に対して測定し得る。これらのタイプの癌はまた、特定の化学療法剤に対して「抵抗性」癌ともみなされ得、例えばメトトレキサート抵抗性癌は、最初からメトトレキサートに抵抗性である場合もあれば、メトトレキサートもしくは別の化学療法剤での一連の治療中にメトトレキサートに対して抵抗性を獲得したものである場合もある。抵抗性は、葉酸経路タンパク質、葉酸輸入経路の１つにおけるタンパク質中の突然変異によるか又はメトトレキサートに対する反応に関連する何らかの他のタンパク質によるものであり得る。
【００１８】
従って、ある実施態様において、本発明は、個体においてメトトレキサート抵抗性疾患を治療する方法を含み、この方法は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びその医薬的に許容可能な塩の有効量を個体に投与することを含む。
【００１９】
以前にはある腫瘍に対して毒性であった薬物の効果に対してその腫瘍が抵抗性を獲得することができると、その結果、抵抗性が生じ得る。このような獲得抵抗性は、染色体破壊によるものであり得る。透過性低下は初期抵抗性の一般的な形態である。薬物の変質又は不活性化はおそらく薬物抵抗性の最も一般的なメカニズムである。薬物抵抗性は、薬物が作用する標的部位の変化によるものでもあり得る。主治医又は当技術分野の他の熟練者の評価により、癌などの疾患がメトトレキサートに対する抵抗性を獲得した状況を調べることができ、これには、治療時の疾患の退縮又は静止状態と、それに続くある一定の治療期間後の疾患の進行が含まれる。癌を含む多くの疾患において、多くの疾患が治療に対する獲得抵抗性を現すことが認められている。
【００２０】
従って、別の実施態様において、本発明は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はその医薬的に許容可能な塩を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、メトトレキサートでの治療中にメトトレキサートに対する抵抗性を獲得した葉酸経路依存性疾患又は悪性腫瘍を治療する方法に関する。
【００２１】
「治療」は、さらなる腫瘍成長を阻止又は抑制するための、ならびに腫瘍の縮小を引き起こすための、及び生存期間を延長させるための療法の使用を意味し得る。治療はまた、腫瘍の転移の予防も含むものとする。（反応性／無反応性、疾患進行停止時間又は当技術分野で公知及び本明細書中に記載の指標により判定するとき）癌又は腫瘍の少なくとも１つの症状が改善されるか、停止するか、減速するか、最小化されるか又は阻止される場合、腫瘍は「抑制される」か又は「治療される」。本明細書中にさらに記載のような治療レジメン（例えば１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン）を用いた治療に従う、腫瘍の何らかの症状、身体（ｐｈｙｓｉｃａｌ）他の何らかの改善は、本発明の範囲内である。次に、一般に、「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療すること（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」という用語は、本明細書中で使用される場合、症状を改善するか、一時的又は永久的の何れかで癌又は炎症性疾患の原因を排除するか、症状の発現及び／又は疾患の進行を遅延させるか又は疾病を予防する（即ち予防的に治療する）ことを意味する。予防的治療を受ける対象は、一般に例えば遺伝的素因、食餌、病原体への曝露、病原因子への曝露などにより癌又は炎症状態のリスクがある哺乳動物である。
【００２２】
本発明のある実施態様において、本発明の方法に使用される組成物は、「高純度」の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンのジアステレオマーを含む、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを含み得る。本明細書及び本明細書中の特許請求の範囲で使用される場合、「高純度」の組成物は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの抗腫瘍活性を妨害し得る他の葉酸誘導体、特に１０−デアザアミノプテリンを実質的に含まない、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン含有する。本発明の範囲内の組成物は、治療上の使用に適切な投与単位形態に１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを製剤化する担体又は賦形剤ならびにさらなる非葉酸治療剤を含み得る。
【００２３】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、炭素１０（Ｃ１０）及び炭素１９（Ｃ１９）位に不斉中心を含有する。ある実施態様において、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、Ｃ１０キラル中心でＲ−及びＳ−配置のおよそ１：１のラセミ混合物及びＣ１９キラル中心で≧９８．０％のＳ−ジアステレオマーを含む。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、Ｃ１０ジアステレオマーＰＤＸ−１０ａ［Ｓ−配置］化学名：（２Ｓ）−２−［［４−［（１Ｓ）−１−［（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル］ブト−３−イニル］ベンゾイル］アミノ］ペンタン二酸及びＰＤＸ−１０ｂ［Ｒ−配置］化学名：（２Ｓ）−２−［［４−［（１Ｒ）−１−［（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル］ブト−３−イニル］ベンゾイル］アミノ］ペンタン二酸を含む。
【００２４】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを製造することに関し、その全体において本明細書中に参照により組み込まれる、ＤｅＧｒａｗら、米国特許第５，３５４，７５１号の実施例７で開示される方法を用いて、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを合成し得る。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第６，０２８，０７１号の特に実施例１で与えられる方法によって合成することもできる。
【００２５】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンのジアステレオマーを生成させるために、本明細書中で教示されるように及びその他により１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを合成し得、続いて最終生成物又は早期の中間生成物の何れかを出発物質としてして、Ｃ１０ジアステレオマーを分離し得る。あるいは、キラル合成を使用し得、実質的に純粋なＰＤＸ−１０ａ及び／又はＰＤＸ−１０ｂが多くの出発物質の何れかから直接生成される。光学異性体又はジアステレオマーを分離するための当技術分野で公知のキラルカラムを使用して、最終的な１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又は早期の中間体のジアステレオマーを分離し得る。ジアステレオマーを分離するための適切なキラルカラムとしては、移動相としてエタノールを用いる、日本のダイセル化学工業から入手可能なキラルカラムＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤが挙げられる。
【００２６】
いくつかの実施態様において、葉酸経路依存性疾病又は疾患は癌である。その他の実施態様において、葉酸経路依存性疾病又は疾患は炎症性疾患である。いくつかの実施態様において、癌又は炎症性疾患は、最初に少なくともある程度はメトトレキサートに感受性があり、その後メトトレキサートに対する抵抗性を獲得した疾患である。固有のものであれ獲得性であれ、葉酸経路疾病又は疾患がメトトレキサートに対して抵抗性を有するか否かを判定するための方法は、当業者により決定され得、患者由来の腫瘍細胞などの関連細胞を培養又は入手し、メトトレキサートに対する抵抗性及び／又は感受性に関与する様々な葉酸経路酵素の発現レベルを調べることなどの方法を含み得る。別のこのような方法は、固有のものであれ獲得性であれ、抵抗性を明らかにするためにメトトレキサート治療に対する患者の反応を調べ及び／又は監視することによる。メトトレキサートに対する抵抗性を示すマーカーの相対的発現を調べるために、関連細胞を遺伝子型又は表現型の何れかで分類し得る。
【００２７】
ある実施態様において、本発明での使用のための表現型アッセイには、患者から腫瘍外植片を入手し、その外植片の一部を培養し、外植片からの関連細胞の単層を成長させ、候補薬物にその単層を曝露し、候補薬物が腫瘍細胞表現型を変化させる能力を評価することが含まれる。
【００２８】
本発明に従う遺伝子型分析は何らかの公知の方法により遂行される。好ましい方法には、一般的に又は評価を行っている候補治療剤に関して特異的に、薬物抵抗性と関連することが知られている遺伝子型を有する患者から入手した細胞の遺伝子型もしくはその一部を比較することが含まれる。例えば、候補治療剤に対する抵抗性を与えることが知られているか又はそれが疑われる多型変異体が患者細胞中に存在する場合、その候補薬剤はそれらの細胞に対する有望な治療剤としては選抜されずに除外される。患者細胞の遺伝学的特性は下記のように当技術分野で公知の方法により決定される（例えば配列決定、遺伝子多型）。薬物抵抗性における患者の遺伝子型の影響は、抵抗性に関連する既知の突然変異又は遺伝子多型を分類する遺伝子データベース又はライブラリを参照することにより調べ得る。
【００２９】
何らかのメカニズムに縛られるものではないが、メトトレキサートに対する抵抗性又は獲得抵抗性に関連する細胞における突然変異の例としては、感受性細胞に対するか又は抵抗性獲得前の細胞に対する、ＤＨＦＲ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現の増加が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
いくつかの実施態様において、癌又は炎症性疾患は、メトトレキサートに対する獲得抵抗性を有する。治療する癌としては、例えば、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、肺癌及びＴ細胞リンパ腫が挙げられる。Ｔ細胞リンパ腫の場合、本発明のジアステレオマーによる治療の対象となる様々な状態があり、これには、（ａ）胸腺由来の原始リンパ球前駆細胞において悪性腫瘍が生じるリンパ芽球性リンパ腫；（ｂ）Ｔ細胞前リンパ球白血病、Ｔ細胞顆粒リンパ球白血病、アグレッシブＮＫ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫／セザリー症候群）、未分化大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞型、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、ＨＴＬＶ−１が関与するものを含む成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫及び皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫を含む、成熟又は末梢Ｔ細胞新生物；及び（ｃ）病初はリンパ節皮質傍野を含み、真の濾胞型に成長することはない末梢Ｔ細胞リンパ腫が含まれる。治療するための他の癌としては、血液悪性腫瘍、頭頸部癌癌、消化管の癌、卵巣癌及び骨肉種が含まれる。
【００３１】
「炎症性疾患」という用語は、本明細書中で使用される場合、炎症により引き起こされるか又はその症状が炎症を含むかの何れかの、何らかの疾患を指す。例として、炎症により引き起こされる炎症性疾患は敗血性ショックであり得、症状に炎症が含まれる炎症性疾患は関節リウマチであり得る。本発明の炎症性疾患としては、循環器疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、喘息、鼻炎、乾癬及び湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、治療しようとする炎症性疾患としては、関節リウマチ及び若年性関節リウマチが挙げられる。
【００３２】
「患者」又は「哺乳動物」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ及びｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ）及び動物園飼育動物又はペット、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物として分類される何らかの動物を指す。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００３３】
本発明による使用のための１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、一般的に、当技術分野で公知のように、患者が治療を受けている目的に対して最も効果的な治療（効果及び安全性の両方の面から）をもたらす投与レジメンで患者に投与される。本発明の治療法を行う際に、本発明によるメトトレキサート抵抗性疾患及び／又は１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−感受性癌における使用のための１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、治療を受けている癌のタイプ及び例えば公開されている臨床研究の結果に基づくように、処方医師の医学的判断によって、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、鼻腔内、眼内、膣内、直腸、頭蓋内又は皮内経路によるなど、当技術分野で公知の何らかの効果的な方式で投与され得る。
【００３４】
本発明によるメトトレキサート抵抗性疾患及び／又は１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−感受性癌における使用のための１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、医薬品の一部として製剤化され得る。具体的な剤形は投与方法に依存するが、これには、経口、静脈内、筋肉内、頭蓋内又は腹腔内投与などのための、錠剤、カプセル剤、経口液剤及び注射液が含まれ得る。投与量はｍｇ／ｍ２として表され得る。あるいは、投与量は、当業者にとって許容可能な何らかの方式によってｍｇ／ｋｇ体重として表され得る。ｍｇ／ｋｇ体重の単位で同等な投与量を得るためのある方法には、平均的なヒトの場合、変換係数０．０２５ｍｇ／ｋｇを１ｍｇ／ｍ２とほぼ同等として適用することが含まれる。この計算によると、１５０ｍｇ／ｍ２の投与量は約３．７５ｍｇ／ｋｇとほぼ同等である。
【００３５】
メトトレキサート抵抗性疾患及び／又は１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−感受性癌の治療のための、癌に対する適切な投与には、次の投与レジメンが含まれる。ある実施態様において、これらの投与はＩ．Ｖ．である。例えば、凡そ１０から１２０ｍｇ／ｍ２（体表面積）／日（約０．２５から３ｍｇ／ｋｇ体重／日）の用量が適切である。週に１回、３週間にわたり３０ｍｇ／ｍ２（約０．７５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、次に１週間休薬して、週に１回、６週間にわたり３０ｍｇ／ｍ２（約０．７５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、次いで１週間休薬するか又は６週間のスケジュールで週に１回の割合で１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの用量を漸増させるという投与も適切である。患者の耐容性及び悪性腫瘍のタイプに基づき、必要に応じてより少ない用量を使用し得る。より高い用量を使用することができ、この場合投与頻度は少なくなる。従って、一般的に、様々な投与スケジュールで、１０から２７５ｍｇ／ｍ２（約０．２５から約６．９ｍｇ／ｋｇ）の投与量、例えば隔週投与で約１００から２７５ｍｇ／ｍ２（約２．５から約６．８７ｍｇ／ｋｇ）の投与量及び週１回投与で約１０から１５０ｍｇ／ｍ２（約０．２５から約３．７５ｍｇ／ｋｇ）又はより具体的には約１０から６０ｍｇ／ｍ２の間の投与量が適切に使用される。
【００３６】
米国特許第６，３２３，２０５号に記載のものと同様のプロトコールを用いた適切な投与量の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。ある実施態様において、本発明に従うメトトレキサート抵抗性疾患及び／又は１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−感受性癌における使用のための１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、投与１回あたり約１０から約２７５ｍｇ／ｍ２（約０．２５から約６．８７ｍｇ／ｋｇ）の量で投与することができる。本発明の方法はまた、週に１回、約１０ｍｇ／ｍ２（０．２５ｍｇ／ｋｇ）又は約３０ｍｇ／ｍ２（０．７５ｍｇ／ｋｇ）の用量；１回あたり約１０から約１５０ｍｇ／ｍ２（約０．２５から約３．７５ｍｇ／ｋｇ）の量；隔週で；約１００から約２７５ｍｇ／ｍ２（約２．５から約６．９ｍｇ／ｋｇ）の投与量での、本発明に従うメトトレキサート抵抗性疾患及び／又は１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−感受性癌における使用のための１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの投与も含む。ある実施態様において、本発明に従うメトトレキサート抵抗性疾患及び／又は１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−感受性癌での使用のための１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、約０．２５ｍｇ／ｋｇから約４ｍｇ／ｋｇ；約０．７５ｍｇ／ｋｇから約３ｍｇ／ｋｇの量で；約１．０ｍｇ／ｋｇから約２．５ｍｇ／ｋｇの量で；約０．２５ｍｇ／ｋｇ又は約０．７５ｍｇ／ｋｇの量（又は体表面積（ＢＳＡ）での同等量）で投与することができる。
【００３７】
ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ナベルビン及びビンデシン、ヌクレオチド類似体、例えばゲムシタビン、５−フルオロウラシル及びシタラビン；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド又はイホスファミド；シスプラチン又はカルボプラチン；ロイコボリン；タキサン、例えばパクリタキセル又はドセタキセル；抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（放射性同位体あり又はなし）及び抗生物質、例えばドキソルビシン及びマイトマイシンを含む他の細胞毒性及び抗腫瘍化合物と組み合わせて、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを使用し得る。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンとこれらのその他の抗腫瘍剤の一部又は増殖因子阻害剤及び抗血管形成剤との組み合わせも使用し得る。
【００３８】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及び他の薬剤を同時に投与するか又は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びその他の薬剤を異なる時間に投与するという共通治療レジメンの一部として組み合わせてこれらを使用することができる。例えば、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン投与の、前、直後又一定時間（例えば２４時間）後に、他の薬剤を投与し得る。従って、この適用の場合、投与するという用語は、一般に、別段の断りがない限り、薬物と薬物との間に時間をあけて又はあけずに、並行治療レジメンにおいて何れかの順序で薬物を同時投与又は連続投与することを指す。
【００３９】
炎症性疾患の治療の場合、経口、筋肉内、静脈内、動脈内又は髄腔内経路によって１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを与え得る。当業者は他の経路に気付くであろう。乾癬、関節リウマチ及び／又は若年性関節リウマチを含むが限定されない炎症性疾患の治療の場合、投与には次のものが含まれ得る。成人関節リウマチ又は多関節型の若年性関節リウマチのための本発明の方法には、週に１回約１から約３０ｍｇの経口投与が含まれ、ある実施態様において、週に１回約７．５ｍｇが投与される。他の投与量には、週に１回の１０ｍｇ／ｍ２投与が含まれ得る。最適反応を得るために投与量を徐々に調節し得る。２０ｍｇ／ｍ２／ｗｋ超又は０．６５から１．０ｍｇ／ｋｇ／ｗｋなどのより高い投与量では、筋肉内又は皮下投与によって吸収がより良好になり得る。適切な投与にはまた、１週間あたり７．５ｍｇ又は約０．５から約１０ｍｇで分割して経口投与することも含まれ得；ある実施態様において、投与量は、週１回のコースとして３回に分けて１２時間間隔で２．５ｍｇに分割して経口投与し得る。それが有効である限り投与を継続し得、最長２年間及びそれより長い期間にわたる治療が含まれる。
【００４０】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、治療の副作用を減少させるために葉酸及びビタミンＢ１２補給と組み合わせて適切に使用される。例えば、葉酸（１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンによる治療の１週間前から開始して毎日１ｍｇ／ｍ２又はあるいは体表面積（ＢＳＡ）に基づくことなく毎日経口投与（ｐ．ｏ．）で１ｍｇ）；及びＢ１２（月に１ｍｇ／ｍ２又はあるいは筋肉内投与（Ｉ．Ｍ．）で８−１０週間ごとに１ｍｇ（ＢＳＡに基づかない。）又はあるいは毎日ｐ．ｏ．で１ｍｇ（ＢＳＡに基づかない。））で患者を処置し得る。
【００４１】
ある実施態様において、本発明による１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、経口投与用に製剤化される。別の実施態様において、本発明による１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは静脈内投与用に製剤化される。
【００４２】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、多岐にわたる様々な剤形で投与され得る。例えば、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、好ましくは経口又は非経口投与され得る。
【００４３】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンは、錠剤、カプセル剤、薬用ドロップ、トローチ剤、ハードキャンディー、粉剤、噴霧剤、クリーム剤、塗剤（ｓａｌｖｅｓ）、坐薬、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、エリキシル剤、シロップ剤などの形態で様々な医薬的に許容可能な不活性担体とともに投与し得る。単回投与又は複数回投与でこのような剤形の投与を行い得る。担体としては、固体希釈剤又は充填剤、滅菌水性溶媒及び様々な無毒性の有機溶媒などが挙げられる。経口医薬組成物は適切に甘味が付与されるか及び／又は香味が付与され得る。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの経口投与の場合、一方又は両方の活性薬物を含有する錠剤は、デンプン（及び好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、アルギン酸及びある種の複雑ケイ酸塩などの様々な崩壊剤とともに、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン及びアカシアのような顆粒結合剤と一緒に、例えば微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム及びグリシンなどの様々な賦形剤の何れかと合わせられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの滑沢剤が錠剤化に非常に有用であることが多い。同様のタイプの固形組成物もゼラチンカプセルにおける充填剤として使用され；これに関連する好ましい材料にはまた、ラクトース又は乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールも含まれる。水性縣濁液及び／又はエリキシル剤が経口投与に望ましい場合、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンなどの希釈剤及び様々なその類似の組み合わせなどと一緒に、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを様々な甘味剤又は香味剤、着色料又は色素及び望ましい場合は乳化剤及び／又は懸濁化剤とも合わせ得る。場合によっては１以上の補助的成分又はアジュバントと一緒に圧縮するか又は成形することによって、本発明の組成物を含有する錠剤を調製し得る。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤，界面活性剤又は分散剤と混合した、粉末又は顆粒などの自由流動形態の活性成分を適切な機械において圧縮することによって、調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械において成形することによって作製され得る。各錠剤は、好ましくは約０．０５ｍｇから約１０ｇの活性成分を含有し、各カシェー又はカプセルは好ましくは約０．０５ｍｇから約１０ｇの活性成分を含有し；錠剤はまた、適切に錠剤１個あたり約２．５ｍｇの活性成分又は錠剤１個あたり約７．５ｍｇを含有し得る。
【００４４】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの非経口投与の場合、溶液ならびに活性成分又は対応するその水溶性の塩を含む滅菌水溶液を使用し得る。このような滅菌水溶液は、好ましくは適切に緩衝化され、また好ましくは、例えば十分な塩又はグルコースで等張化され得る。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内注射用に特に適切である。油性溶液は、関節内、筋肉内及び皮下注射用に適切である。当業者にとって周知の標準的な製薬技術によって、滅菌状態下でのこれらの全溶液の調製を容易に遂行し得る。
【００４５】
獣医学の目的の場合、何らかの形態を使用して、及び上述の何らかの経路によって、個別に又は一緒に動物に活性成分を投与することができる。好ましい実施態様において、カプセル剤、ボーラス剤、錠剤、水薬の形態で、注射により又は移植片として、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを投与する。代替法として、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを動物飼料とともに投与することができ、この目的のために、濃厚飼料添加物又はプレミックスを通常の動物飼料用に調製し得る。標準的な獣医学的実務に従い、従来の方式でこのような処方物を調製する。
【００４６】
本発明はまた、メトトレキサート抵抗性新生物治療を必要とする個体を治療する方法も含み、この方法は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びその医薬的に許容可能な塩の有効量を個体に投与することを含む。
【００４７】
「医薬的に許容可能な塩」という用語は、医薬的に許容可能な無毒性塩基又は酸から調製される塩を指す。本発明の化合物が酸性である場合、その対応する塩は、無機塩基及び有機塩基を含む医薬的に許容可能な無毒性塩基から都合よく調製され得る。このような無機塩基由来の塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅（第二銅及び第一銅）、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、、マンガン（マンガン（ＩＩＩ）及びマンガン（ＩＩ））、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩が挙げられる。特に好ましいものは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。ある実施態様において、塩は塩酸塩である。医薬的に許容可能な有機無毒性塩基由来の塩としては、一級、二級及び三級アミンならびに環状アミン及び置換アミン、例えば天然及び合成置換アミンなどの塩も挙げられる。塩が形成され得る他の医薬的に許容可能な有機無毒性塩基としては、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン類、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのイオン交換樹脂が挙げられる。
【００４８】
上記で挙げた一般的な剤形に加えて、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン（その各成分の医薬的に許容可能な塩、エステル、溶媒和物及び多形体を含む。）は、制御放出手段及び／又は送達装置によっても投与し得る。
【００４９】
別段の断りがない限り、本明細書及び特許請求の範囲中で使用される、成分、寸法、反応条件などの量を表す数字は全て、全ての例において「約」という用語により修飾されると理解されたい。
【００５０】
本願及び特許請求の範囲において、単数の使用には、具体的に別段の断りがない限り、複数も含む。さらに、「又は」の使用は、別段の定めがない限り「及び／又は」を意味する。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびにその他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などは、限定するものではない。また、「要素」又は「構成成分」などの用語は、具体的に別段の断りがない限り、１単位を含む要素及び構成成分ならびに複数単位を含む要素及び構成成分の両方を包含する。
【００５１】
本発明は、ある一部分において、メトトレキサートに対する抵抗性を獲得した細胞がプララトレキサートに対する感受性を保持し、一方でプララトレキサートに対する抵抗性を獲得している細胞がメトトレキサートに対する獲得抵抗性も有することを示すデータに基づく。プララトレキサート感受性の予測的遺伝因子に関して、ＤＵ１４５（前立腺）及びＨＥＰ２（頭頸部）癌細胞株から、薬物に対する獲得抵抗性がある２種類の細胞株を作製した。ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸは、親細胞よりもプララトレキサートに対して２００倍超高い抵抗性を有しながら、メトトレキサートに対する部分的な交差抵抗性を示した。プララトレキサート獲得抵抗性は、ＲＦＣ−１発現低下及びＭＤＲ１発現上昇と関連していた。Ｆｏｔｏｏｈｉら（２００９）は、ＲＦＣ−１のｍＲＮＡレベルがメトトレキサート抵抗性細胞において２倍を超えて下方制御される葉酸拮抗剤−抵抗性白血病株について述べているが、このことから葉酸拮抗剤抵抗性における流入輸送の重要な役割が強調される。他のメトトレキサート抵抗性細胞モデルを用いてＪａｎｓｅｎ（１９９８）、Ｒｏｔｈｅｎ（２００４）及びＩｆｅｒｇａｎ（２００３）によって同様なデータが以前に得られた。ＭＤＲ１の阻害によってプララトレキサートに対する感受性が回復しなかったので、ＭＤＲ１発現の上昇は、プララトレキサートに対する獲得抵抗性が認められることに関与しないと思われる。ＦＰＧＳ活性の低下は、ヒト白血病ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞においてメトトレキサートに対する獲得抵抗性と関与することが示された（Ｍａｕｒｉｔｚ、２００２）。ある研究において、プララトレキサート−抵抗性細胞においてＦＰＧＳ発現の僅かな低下が認められ、これによりプララトレキサートに対する抵抗性においてポリグルタミン酸化が果たす役割が示唆される。３０年前に行われた研究から、メトトレキサート獲得抵抗性の別のよくあるメカニズムが、ＤＨＦＲ遺伝子増幅及び結果として起こる酵素過剰発現であることが分かった（Ａｓｓａｒａｆ  ２００７により概説；Ｃｈｅｎら、１９９５）。この研究において、メトトレキサートに対する獲得抵抗性がある細胞株ＨＥＰ−ＭＴＸは、その親細胞株と比較した場合にＤＨＦＲ  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の劇的な上昇を示した。プララトレキサート−抵抗性細胞株において、ＤＨＦＲ発現の上昇は認められなかった。これらの知見から、これらの細胞株におけるメトトレキサート及びプララトレキサートに対する抵抗性の様々な分子メカニズムが示唆される。
【００５２】
従って、本発明は、驚くべきことに、メトトレキサートに対して抵抗性になる細胞株はプララトレキサートに対して抵抗性にならず及び／又はプララトレキサートに対する最初の感受性より以上のものを保持したことを示す。
【００５３】
限定するものではない続く実施例を検討すると、本発明のさらなる目的、長所及び新規特性が当業者にとって明らかになろう。さらに、本明細書中で上記で明らかにされるような及び下記の特許請求の範囲で主張されるような本発明の様々な実施態様及び局面のそれぞれに対して、次の実施例において実験的確証が見出される。
【００５４】
実施例
続く実施例は、単に説明を目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
実施例１：
図１は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを調製する際に有用な合成スキームを示す。１８ｍＬの篩過乾燥ＴＨＦ中の油分散中６０％ＮａＨの混合物（１．０６ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）を０℃に冷却した。冷混合物を乾燥ＴＨＦ（７ｍＬ）中のホモテレフタル酸ジメチルエステル（５．０ｇ、２４ｍｍｏｌ、図１の化合物１）の溶液で処理し、この混合物を０℃で１時間撹拌した。臭化プロパルギル（２６．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を００℃でさらに１時間、次いで室温で１６時間撹拌した。得られた混合物を２．４ｍＬの５０％酢酸で処理し、次いで２４０ｍＬの水に注いだ。混合物をエーテル（２ｘ１５０ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、橙黄色の油状物質になるまで濃縮した。シリカゲル（６００ｍＬの２３０−４００メッシュ）上でクロマトグラフィーを行い、シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８：１）により溶出して、白色固体（４．６６）として生成物α−プロパルギルホモテレフタル酸ジメチルエステル（化合物２）を得たが、これはＴＬＣ（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ、３：１）により均質であることが明らかになった。しかし、この生成物における質量スペクトルデータから、これが所望の生成物２とジプロパルギル化化合物との混合物であることが示された。出発物質１は検出されなかった。ＨＰＬＣから、モノプロパルギル化生成物とジ−プロパルギル化生成物の比が約３：１であることが示される。化合物１とは異なり、ジプロパルギル化生成物は反応の次の段階で不要な副生成物を生成させ得ないので、この物質は化合物３への変換に適切であった。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンから１０−ｄＡＭから完全に除去することが非常に困難なため、本合成を進行させるのに使用される生成物中に出発化合物１がないことは、最終生成物に至る変換中の１０−ｄＡＭの逐次形成を回避するために非常に重要である。
【００５６】
０．３６ｇの油分散中６０％ＮａＨ（９ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの乾燥ＤＭＦと合わせることによって混合物を形成させ、０から５℃に冷却した。１０ｍＬ乾燥ＤＭＦ中の最初の反応生成物（化合物２）（２．９４ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して冷混合物を処理し、次に０℃で３０分間撹拌した。−２５℃に冷却した後、１０ｍＬ乾燥ＤＭＦ中の２，４，ジアミノ−６−（ブロモメチル）−プテリジン臭化水素酸塩−０．２  ２−プロパノール（１．００ｇ、２．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して添加し、その間、温度を−２５℃付近に維持した。２時間にわたり撹拌混合物の温度を−１０℃に上昇させた。−１０℃でさらに２時間経過後、温度を２０℃に上昇させ、２時間を超えて室温で撹拌し続けた。次に、固形ＣＯ２を添加することにより、反応物をｐＨ７に調整し、真空下で濃縮して溶媒を除去した後、残渣をジエチルエーテルとともに撹拌し、エーテル不溶物を回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて１．４９ｇの粗製生成物を得た。シリカゲルカラムに添加するために、この粗製生成物をＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１０：１）中で溶解した。同じ溶媒系により溶出して、４０％の収率（４８５ｍｇ）で１０−プロパルギル−１０−カルボメトキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸メチルエステル（化合物３）を得たが、これはＴＬＣに対して均一であった。
【００５７】
２−メトキシエタノール（５ｍＬ）中の化合物３（４００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の撹拌縣濁液を水（５ｍＬ）及び次いで１０％水酸化ナトリウム溶液（３．９ｍＬ）で処理した。混合物を室温で４時間撹拌したところ、その間に溶液が生じた。この溶液を酢酸でｐＨ８に調整し、高真空下で濃縮した。得られた残渣を１５ｍＬの水中で溶解し、ｐＨ５．５−５．８に酸性化したところ、沈殿物が形成された。この沈殿物を回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、３４０ｍｇの化合物４（９１％収率）を回収した。ＨＰＬＣ分析から生成物純度が９０％であることが示された。
【００５８】
１５ｍＬ  ＤＭＳＯ中で１０分間、１１５−１２０℃に加熱することによって化合物４（３３０ｍｇ）からカルボキシル基を除去した。１０分後のＨＰＬＣによる試験から、変換が基本的に完了したことが確認された。真空下で蒸留することにより（４０℃の浴槽）ＤＭＳＯを除去した。残渣を０．５Ｎ  ＮａＯＨとともに撹拌し、透明な溶液を得た。１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ５．０に酸化することにより、黄色の固体として７０％収率で１０−プロパルギル−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸（化合物５）を得た。ＨＰＬＣから、生成物の純度がこの段階で９０％であることが示された。
【００５９】
トリエチルアミン（１４８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（２８７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて、化合物５（２２５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をＬ−グルタミン酸ジメチル塩酸塩（１３７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。混合物を２０−２５℃で３時間撹拌し、次いで蒸発乾固させた。残渣を水とともに撹拌し、水に不溶の粗製生成物を回収し、真空下で乾燥させた。粗製生成物（３５０ｍｇ）をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、トリエチルアミン（０．２５％体積）を含有するＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１０：１）により溶出して精製し、１６５ｍｇの１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンジメチルエステル（化合物６、５０％収率）を回収したが、これはＴＬＣに対して均質であった（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ  ５：１）。
【００６０】
１０ｍＬの撹拌ＭｅＯＨ中で化合物６（１６５ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）を懸濁し、これに０．７２ｍＬ（０．７２ｍｅｑ）の１Ｎ  ＮａＯＨを添加した。数時間後に溶液が生じるまで室温で撹拌を継続した。この溶液を２０−２５℃に８時間維持し、次いで１０ｍＬの水で希釈した。減圧蒸発によりメタノールを除去し、濃縮された水性溶液をさらに２４時間、２０−２５℃で静置した。次いでＨＰＬＣから、エステル加水分解が完了したことが分かった。透明な水性溶液を酢酸でｐＨ４．０に酸性化したところ、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンが薄黄色の固体として沈殿した。回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた生成物の重量は１２２ｍｇ（７９％収率）であった。元素分析、プロトンＮＭＲ及び質量分析によるアッセイは、指定の構造と完全に一致していた。ＨＰＬＣ分析から、純度が９８％であることが示され、この生成物が１０−デアザアミノプテリン不含であることが確認された。
【００６１】
この場合、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの量（ＨＰＬＣピーク面積により測定した場合）は９８％に近く、この領域に小さいベースラインリップルはあるが、処理ソフトウェアにより１０−デアザアミノプテリンに対応するピークは検出されない。
【００６２】
実施例２：
様々な固形腫瘍タイプにわたり１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの活性を調べるために、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの細胞毒性活性に対する感受性について１５種類のヒト固形腫瘍細胞株を調べた。
【００６３】
材料及び方法：細胞株
結腸（ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＣ２９９８）、乳部（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）、肺（ＨＯＰ６２、ＨＯＰ９２）、卵巣（ＯＶＣＡＲ３、ＩＧＲＯＶ１）、前立腺（ＤＵ１４５、ＰＣ３）及び頭頸部（ＳＣＣ６１、ＨＥＰ２、ＳＱ２０Ｂ）ヒト癌細胞株のパネルをＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓから購入した。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μＭ／ｍＬストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地中で細胞を単層として生育させた。
【００６４】
細胞の細胞毒性アッセイ
生成データは全て、２つ組で行った３回の個別の実験の結果であった。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存性を調べたが、このアッセイは既に記載されている通りに行った（Ｈａｎｓｅｎ、１９８９）。簡単に述べると、２ｘ１０３個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに細胞を播種した。細胞を１２０時間インキュベートし、次いで３７℃で４時間、０．４ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ色素（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを添加した。０．１ｍＬのＤＭＳＯ中で単層を懸濁し、マイクロプレートリーダーを用いて５６０ｎｍでの吸収を測定した。陽性及び陰性対照には、それぞれ未処理細胞又はＭＴＴを含有し、細胞を含まない培地が入ったウェルが含まれた。紫色の不溶性ホルマザンへの黄色の水溶性テトラゾリウムＭＴＴの変換は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼにより触媒され、生存細胞数を推定するために使用される。未処理細胞に対応する対照値を１００％とし、処理した試料の生存率を対照の％として表した。細胞生存率が５０％に低下する濃度としてＩＣ５０値を決定した。
【００６５】
単剤試験の場合、細胞を播種し、２４時間静置した後、漸増濃度の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンで７２時間処理した。インキュベート後、化合物不含培地中で４８時間、この細胞を回復させ、その後、ＭＴＴアッセイを用いて増殖抑制を調べた。
【００６６】
ウエスタンブロット分析
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＦ及び０．４ｍｇ／ｍＬフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する緩衝液中で細胞を溶解させた。等量のタンパク質（２０−５０μｇ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写した。抗切断型ＰＡＲＰ、抗切断型カスパーゼ３、抗カスパーゼ９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、抗ＤＨＦＲ（Ａｂｃａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）、抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）特異的一次抗体を用い、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体を用い、化学発光により視覚化して膜を調べた。
【００６７】
図２は、試験した１５種類のヒト癌細胞株の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する相対的感受性を示す。これらの細胞株のうち９種類は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの細胞毒性活性に対して感受性があることが分かり（ＩＣ５０＜０．１μＭ）、一方でこれらの細胞株のうち６種類が比較的抵抗性であることが分かった（ＩＣ５０＞９μＭ）。
【００６８】
単剤抗増殖効果
表１で示されるように、１５種類の癌細胞株においてプララトレキサートの抗増殖効果を調べた。経時変化実験から、細胞がプララトレキサートに７２時間曝露された場合に最適抗増殖効果が達成されたことが分かった（図１Ａ）。プララトレキサートＩＣ５０は、前立腺癌細胞株ＰＣ３の場合の０．０１±０．００２μＭから、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株の場合の＞３５０μＭの範囲にわたった。興味深いことに、ＩＣ５０が１００倍超異なる２つの群の細胞株が観察され、ＰＣ３、ＳＣＣ６１、ＤＵ１４５、ＨＴ２９、ＨＯＰ６２、ＳＱ２０Ｂ、ＨＯＰ９２、ＨＥＰ２及びＩＧＲＯＶ１細胞を含む一方の群のＩＣ５０は＜０．１μＭであり、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＣ２９９８、ＭＣＦ７、ＨＣＴ１１６、ＯＶＣＡＲ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のＩＣ５０値は≧９μＭであった。
【００６９】
プララトレキサートの抗増殖効果をメトトレキサートならびにペメトレキセド、５−ＦＵ及び、活性カペシタビン代謝物である５’−ＤＦＵＲなどの一般に使用されるいくつかの代謝拮抗剤と比較した（図１Ｂ及び表１）。プララトレキサートＩＣ５０は、メトトレキサートで見られる値よりも平均でほぼ１０倍低かった。これら２種類の葉酸拮抗剤の細胞毒性プロファイルは同様であり、感受性及び抵抗性細胞株の群が同じように区別される。プララトレキサートの細胞毒性プロファイルは、５−ＦＵ、５’−ＤＦＵＲ及びペメトレキセドとは異なっており、このことから、プララトレキサートとこれらの他の代謝拮抗剤との間の代謝、作用メカニズム及び／又は抵抗性の違いが示唆された。興味深いことに、プララトレキサートと、主にチミジル酸シンテターゼ（ＴＳ）阻害剤であると考えられる葉酸拮抗剤ペメトレキセドとの間で限定的な交差感受性が観察された。
【００７０】
葉酸輸送及び代謝に関与する遺伝子の発現
癌細胞株のパネルにおいて、葉酸拮抗剤に対する感受性に関与することが知られている遺伝子の発現を分析した。ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＴＳ／ＴＹＭＳ、（チミジル酸シンテターゼ）、ＳＣＬ１９Ａ１／ＲＦＣ−１、ＧＡＲＦＴ（グリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ）、ＳＬＣ２５Ａ３２（ミトコンドリア葉酸輸送体／担体）及びＡＢＣ輸送体Ｂ１（ＡＢＣＢ１又はＭＤＲ１）ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより調べた（図３Ａ）。これらの細胞株は、様々なレベルでこれらの葉酸経路遺伝子を発現したが、プララトレキサートに対する感受性とＴＳ、ＳＣＬ１９Ａ１／ＲＦＣ−１、ＧＡＲＦＴ、ＳＬＣ２５Ａ３２及びＭＤＲ１のｍＲＮＡ発現との間に顕著な相関は見られなかった。プララトレキサート−感受性細胞は、「抵抗性」群よりも比較的高いレベルで、プララトレキサートの標的であるＤＨＦＲを発現したが、これは統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．０８３、図３Ａ）。プララトレキサート−感受性細胞は、抵抗性細胞よりも有意に高いレベルのＦＰＧＳ  ｍＲＮＡを発現した（ｔ検定、ｐ＝０．００２）。全体として、ＦＰＧＳ  ｍＲＮＡ発現とプララトレキサート感受性（ＩＣ５０）との間で正の相関の傾向がみられ（Ｒ２＝０．４７、ｐ＜０．０１）、このことから、プララトレキサート抗増殖活性におけるポリグルタミン酸化の重要な役割が示唆される。
【００７１】
プララトレキサート活性における葉酸輸送体の潜在的な役割を調べるために、発明者らは、９種類のプララトレキサート感受性細胞株でのＳＣＬ１９Ａ１／ＲＦＣ−１及びＳＬＣ２５Ａ３２のｍＲＮＡ発現レベルと、７２時間の薬物曝露後に得られるＩＣ５０値の相互関係を示した（図３Ｂ）。ＳＣＬ１９Ａ１／ＲＦＣ−１及びＳＬＣ２５Ａ３２  ｍＲＮＡを高レベルで発現した細胞は、プララトレキサートに対する感受性がより高く、このことから、プララトレキサートの細胞取り込みにおけるＳＣＬ１９Ａ１／ＲＦＣ−１及びＳＬＣ２５Ａ３２の潜在的な役割が示唆される。
【表１】
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【００７２】
実施例３：
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサート抵抗性細胞株の生成
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン抗増殖効果の予測因子の特徴を調べるために、６ヶ月間にわたり１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに曝露し、この濃度を段階的に上昇させることによって、それぞれ親であるＤＵ１４５及びＨＥＰ２細胞から細胞株ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸを生成させた。得られたＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞は、親細胞よりも１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する感受性が少なくとも２００倍及び５００倍低かった。薬物不含培地中で５回継代した後、抵抗性細胞はそれらの薬物抵抗性を維持し、このことから、これらの細胞株の安定性が示唆される。
【００７３】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサート抵抗性のメカニズムを比較するために、メトトレキサートに曝露し、この濃度を段階的に上昇させることによって、親であるＤＵ１４５及びＨＥＰ２細胞から細胞株ＤＵ−ＭＴＸ及びＨＥＰ−ＭＴＸを生成させた。ＤＵ−ＭＴＸ及びＨＥＰ−ＭＴＸは、親細胞と比較して、メトトレキサート及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対して抵抗性を示した。しかし１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの活性は、ＤＵ−ＭＴＸ及びＨＥＰ−ＭＴＸ癌細胞においてメトトレキサートをなお上回っていた（ＩＣ５０はおよそ１０倍低い。）。
【００７４】
図３は、ＤＵ１４５細胞及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はメトトレキサートの何れかに順応させたＤＵ１４５細胞の場合の、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はメトトレキサートに対するＩＣ５０を示す。このデータから、ＤＵ−ＭＴＸに対して、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンが顕著な効果を保持し；メトトレキサート順応ＤＵ−１４５細胞株の場合の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対するＩＣ５０が０．０２μＭであったことが示される。それに対して、ナイーブＤＵ−１４５細胞の場合の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンＩＣ５０は０．０１μＭであった。メトトレキサート順応ＤＵ−１４５細胞は、およそ１０倍、メトトレキサートに対するＩＣ５０が上昇していた。まとめると、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対して順応させたＤＵ−１４５細胞もメトトレキサートに対して不感受性となり、一方でメトトレキサート順応ＤＵ−１４５細胞は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対してＤＵ−１４５ナイーブ細胞とほぼ同じ感受性をなお示した。
【００７５】
図４は、ＨＥＰ２細胞及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はメトトレキサートの何れかに順応させたＨＥＰ２細胞の場合の、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン又はメトトレキサートに対するＩＣ５０を示す。このデータから、ＨＥＰ−ＭＴＸ（メトトレキサートに順応）の場合、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンが顕著な効果を保持し、ＩＣ５０測定によって、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンが依然として１０倍より効果的であることが示される。
【００７６】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン獲得抵抗性と関連する遺伝子変化
【００７７】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲの理論的及び実際的な局面は、当業者にとって公知である。結果は、ＴＢＰ遺伝子（内因性ＲＮＡ対照）に対する、及び標的遺伝子ｍＲＮＡの最小量を含有した試験シリーズ由来の細胞株試料からなるキャリブレーター（１ｘ試料）に対する標的遺伝子発現のｎ倍の差として表した。実験は２つ組で行った。
【００７８】
抗葉酸剤抵抗性に対する可能なメカニズムを調べるために、発明者らは、親細胞及び抵抗性細胞における、ＤＨＦＲ、ＴＳ、ＦＰＧＳ、ＲＦＣ１／ＳＣＬ１９Ａ１、ＳＬＣ２５Ａ３２及びＡＢＣＢ１／ＭＤＲ１を含む葉酸代謝に関与するいくつかの遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価した。図５で示されるように、ＤＨＦＲ、ＴＳ及びＳＬＣ２５Ａ３２のｍＲＮＡ発現は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−抵抗性細胞において顕著には変化しなかった。ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞において、それらの親細胞と比較して、ＦＰＧＳのｍＲＮＡ発現の僅かな低下が認められた。それに対して、２種類の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−抵抗性細胞株でＲＦＣ１／ＳＣＬ１９Ａ１発現が＞１０倍低下した。ＡＢＣＢ１／ＭＤＲ１のｍＲＮＡレベルは、ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸにおいてそれぞれ、ＤＵ１４５及びＨＥＰ２と比較して、４０倍及び２倍高かった。これらのデータから、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン抗増殖活性及び獲得抵抗性における輸送体の重要な役割が示唆される。カルシウムチャネルブロッカーであるベラパミルは、その固有の薬理学的機能にはかかわらず、ＭＤＲ１の競合的基質として機能することによって抵抗性を反転させる。様々な臨床研究からも、ベラパミルなどの薬物が抗癌剤に対する抵抗性を反転させ得ることが示された。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン抵抗性におけるＭＤＲ１の役割を研究するために、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンと同時に３０μＭベラパミル及び３μＭシクロスポリンＡと一緒に、ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞を７２時間インキュベートした。ベラパミル及びシクロスポリンＡの存在下及び非存在下で１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン細胞毒性の変化は認められず、これにより、これらの細胞株における獲得抵抗性においてＭＤＲ１過剰発現は顕著な役割がないことが示唆された（結果は示さず。）。
【００７９】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサートの標的であるＤＨＦＲの発現の分析から、親であるＨＥＰ２細胞と比較してＨＥＰ−ＭＴＸ細胞におけるタンパク質の顕著な増加が示され、これにより遺伝子増幅（図６）及びｍＲＮＡの顕著な増加（図７）の可能性が示唆された。ＤＨＦＲタンパク質発現は、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに短時間（２４時間）曝露した後、僅かに増加したが、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンへ長時間曝露しても（６ヶ月）増加せず、これにより、ＨＥＰ−ＰＤＸ細胞における１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する獲得抵抗性の分子メカニズムがＨＥＰ−ＭＴＸ細胞におけるメトトレキサート抵抗性とは異なることが示唆された。
【００８０】
他の薬物に対するプララトレキサート−抵抗性細胞の交差抵抗性を評価するために、ＤＵ１４５、ＤＵ−ＰＤＸ、ＨＥＰ２及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞をペメトレキセド及び５−ＦＵに７２時間曝露した。５−ＦＵ細胞毒性に関して、親細胞とＰＤＸ−抵抗性細胞との間に有意差は認められなかった。ペメトレキセドに７２時間曝露した後の細胞毒性は、ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞において、それらの親細胞と比較してごく僅かに低いだけであった（データは示さず。）。これらのデータから、おそらくこれらの化合物の作用メカニズムが異なるので、プララトレキサートに対する獲得抵抗性がペメトレキセド及び５−ＦＵへの抵抗性に転換し得ないことが示唆される。
【００８１】
プララトレキサートは、還元型葉酸担体１（ＲＦＣ−１）タンパク質及びホリルポリグルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）に対して高親和性を有し、その結果、腫瘍細胞内で大規模な内部移行及び蓄積が起こる葉酸拮抗剤である。プララトレキサートは現在、様々な悪性腫瘍において、単剤として及び併用において試験されている。さらなる臨床開発を導くために、プララトレキサートに対する感受性の分子相関及び併用治療における前臨床データが必要である。
【００８２】
プララトレキサートは、１５種類のヒト固形腫瘍細胞株のうち９種類において強力な抗増殖活性（ＩＣ５０＜０．１μＭ）を示した。２種類の別個の細胞株群は、プララトレキサートＩＣ５０値が＞１００倍異なることが確認され：感受性細胞株及び比較的抵抗性の細胞株であった。ＩＣ５０値に関するプララトレキサートのインビトロ抗増殖効果は、メトトレキサートで認められたものよりも平均でほぼ１０倍良好であった。５−ＦＵ、５’−ＤＦＵＲ及びペメトレキセドを含む他の代謝拮抗剤とこれらの２種類の同様の葉酸拮抗剤の細胞毒性活性を比較すると、プララトレキサートは、ＮＳＣＬＣ  ＨＯＰ６２及びＨＯＰ９２細胞株など、５−ＦＵ及び５’−ＤＦＵＲに対する感受性が乏しかったいくつかの細胞において活性を保持していると思われる。同様に、ペメトレキセドに対する感受性プロファイルはプララトレキサートに対するものとは異なるが、これは、これらの化合物の作用の分子メカニズムが異なることにより説明され得る。
【００８３】
まとめると、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンに対する獲得抵抗性は、ＤＵ−ＰＤＸ及びＨＥＰ−ＰＤＸ細胞株においてＲＦＣ−１発現低下及びＭＤＲ１発現上昇と関連があった。これらのモデルにおいて、ＭＤＲ１の薬理学的阻害により１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン抵抗性は変化せず、このことから、観察された抵抗性においてＭＤＲ１の役割が限定的であることが示唆された。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン−抵抗性細胞においてＤＨＦＲｍＲＮＡ発現の変化は見られなかった。それに対して、ＨＥＰ−ＭＴＸ細胞においてＤＨＦＲｍＲＮＡ及びタンパク質発現の顕著な増加が見られた。１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及びメトトレキサートに対する獲得抵抗性のメカニズムの相違が認められ、このデータから、メトトレキサート感受性癌ならびにメトトレキサート獲得抵抗性という状況における１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンのさらなる開発が示唆される。
【００８４】
本発明の前出の考察は、例示及び説明を目的として提示されている。この前出の記述は、本明細書中で開示される形態に本発明を限定するものではない。本発明の説明には１以上の実施態様の記載が含まれているが、ある一定の改変物及び変更物、他の改変物及び変更物は、本開示を理解した後、例えば当業者の技術及び知識の範囲内に包含され得るので、本発明の範囲内である。主張するものに対する代替的な、交換可能な及び／又は同等な構造、機能、範囲又は段階を含め、かかる代替的、交換可能な及び／又は同等な構造、機能、範囲又は段階が本明細書中で開示されるか否かにかかわらず、何らかの特許性のある対象物を一般に対して献納することなく、許容される程度まで代替的な実施態様を含む権利を得るものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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