(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショウガオールとカプリン酸を含む抗カンジダ活性組成物であって、ショウガオールの濃度が3.13μｇ/ｍＬであり、かつ、カプリン酸の濃度が1.56μｇ/ｍＬであることを特徴とする抗カンジダ活性組成物。
【請求項２】
口腔カンジダ症用であることを特徴とする請求項１の抗カンジダ活性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ショウガオールとカプリン酸とを併用することによって抗カンジダ活性を高めた組成物およびその用途に関する。本発明の組成物の利用は、発症頻度が高く、かつ再発しやすい皮膚、粘膜のカンジダ症、とくに口腔カンジダ症に対し、効果的かつ簡便で、副作用や耐性菌出現の危険がない、新たな治療法および予防法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】  ショウガオールは、ショウガやそれから造られるショウガエキスに含まれる低分子の生理活性成分である。ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｔｅ  Ｒｏｓｃ．）は、熱帯アジア原産のショウガ科の多年草で、日本各地で広く栽培され、ないしは自生している。利用部位は秋期に収穫される根茎であり、用途としては、香辛料としての食用の他、漢方などの医療用としても用いられる。ショウガの薬理作用としては、消化促進、緩下、鎮咳、血行促進、健胃、解熱、抗菌といった作用が知られている。ショウガをエタノールなどの有機溶媒で抽出・濃縮すると粘稠な樹脂状のジンジャーオレオレジンが得られる。その中には、ジンゲロン、ジンゲロール、ショウガオールなどの有用な低分子成分が含まれている。また、ショウガの水蒸気蒸溜によって得られるジンジャー精油には、主成分として、ジンギベレンやファルネセンなどのセスキテルペン類、シトラール、１，８−シネオールなどのモノテルペン類が含まれており、血液循環の促進、抗ウイルス、鎮痛といった効果を示すことが報告されている。セスキテルペンおよびモノテルペンとは、それぞれ炭素数が１５個、１０個から成るテルペン類を指す。
ショウガに含まれる成分が抗真菌作用を発揮することは公知の事実であって、例えば、ショウガオール関連化合物の［６］−デヒドロショウガオールは、ＩＣ５０（５０％発育阻止濃度）３．５５ｍｇ／ｍＬで、植物病原真菌のＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉに対して抗真菌作用を発揮する。ショウガオールの抗カンジダ作用については、すでに本発明者によって公表されている。具体的には、カンジダに対するＩＣ５０（５０％発育阻止濃度）が３．１３μｇ／ｍＬと極めて低く、前述の植物病原真菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉに対する有効濃度の１，０００分の１以下の濃度で効果を発揮する。
ショウガオールを産業的に利用する場合には、精製された純品ではなく、それを一成分として含むショウガまたはショウガエキスを用いるのが一般的である。前述のジンジャーオレオレジンは、ショウガエキスの一例である。
カンジダは、健常人にも見出せる常在性真菌であるが、ときによって病原性を示し、口腔や腟、皮膚のカンジダ症の原因となる。口腔カンジダ症は、舌の疼痛や味覚異常などの症状を呈してＱＯＬの低下をもたらす感染症で、とくに高齢者に発症頻度が高く、老人ホームにおいてはその治療や予防が重要な課題となっている。口腔カンジダ症の原因菌は、その大半がカンジダ・アルビカンスＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである。女性の腟カンジダ症も発症頻度が大変高く、局所の痒み、発赤、帯下といった症状を呈し、ＱＯＬが低下する。膣カンジダ症の原因菌は、主にカンジダ・アルビカンスであるが、カンジダ・トロピカリスＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、カンジダ・グラブラタＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａなどの菌種も比較的高い頻度で検出される。後の２菌種は通常の抗真菌剤には抵抗性であり、それらを原因菌とするカンジダ症は、難治性で再発を繰り返しやすいとされている。
カンジダは、酵母形と菌糸形の２形性を示し、このうち菌糸形が病原性に直接関わっている。したがって菌糸形発育の阻害は、カンジダ感染症の予防に結びつくとされている。カンジダの酵母形および菌糸形発育それぞれに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害試験の方法は確立されており、それによって、様々な材料のＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定することができる。菌糸形発育に対する［６］−ショウガオールのＩＣ５０（５０％発育阻止濃度）およびＩＣ９５（９５％発育阻止濃度）は、それぞれ３．１３、２５μｇ／ｍＬであった。
マウスを用いた口腔カンジダ症の病態モデルも作成されており、それを用いて候補となる材料の治療効果、予防効果を評価することができる。［６］−ショウガオールの適用は、重症度の指標である舌スコアを有意に改善した。
カプリン酸は、炭素数１０の中鎖脂肪酸である。カプリン酸は、民間生薬である乾燥ドクダミに含まれていて、抗カンジダ活性を担う主成分の一つとみなされている。ドクダミは、全国いたる所に野生しているドクダミ科の多年生草本で、花期に地上部を採取して水洗し、天日乾燥して後、保存、利用する。興味深いことに、採取した直後の生の植物体からは、カプリン酸は検出されなかった。またココナッツ油、ヤシ油、パーム油といった食用油に多く含まれているが、精製油の場合は、ほとんどがトリグリセリド分子の構成脂肪酸として結合型で存在している。しかしながら、それら食用油の原油には、非結合型のカプリン酸が少なくない量含まれていることが知られている。カプリン酸は、香料、染料、医薬品などの各種化学工業において有機合成の原料として用いられる一方、食品添加物としての使用も認可されている。一般に、カプリン酸、カプロン酸（炭素数６）、カプリル酸（炭素数８）などの中鎖脂肪酸は、非結合型で抗真菌作用を発揮することが知られている。
以上述べてきたようにショウガオールとカプリン酸は、それぞれ単独で抗カンジダ作用を発揮し、皮膚あるいは粘膜のカンジダ症に適用すると、実用的な治療効果を発揮することがすでに知られている。しかしながら、ショウガオールとカプリン酸とを併せて使用すると、それによって抗真菌作用が相乗的に高まるという知見は、これまで報告されたことはなく公知ではない。
一般に、微生物に対して抗菌物質を併用した場合の相乗的効果の定義は、２剤の個別的効果の和よりも有意に大きい効果を示した場合を指す。また相乗効果に対する評価は、以下の通り、チェッカーボード法によって２剤のＭＩＣの値から求めたＦＩＣ係数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）によっておこなうことができる。すなわちＦＩＣ係数が０．５未満の場合、相乗効果があると判定される。本発明のショウガオールとカプリン酸とを併用した場合は、カンジダの菌糸形発育に対するＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数の求め方
ＦＩＣ係数＝Ａ１／Ａ０＋Ｂ１／Ｂ０
Ａ０：Ａ剤単独のＭＩＣ。  Ａ１：Ａ剤、Ｂ剤併用時のＡ剤のＭＩＣ
Ｂ０：Ｂ剤単独のＭＩＣ。  Ｂ１：Ａ剤、Ｂ剤併用時のＢ剤のＭＩＣ
ＦＩＣ係数による併用効果の評価
ＦＩＣ＜０．５              相乗効果
０．５＜ＦＩＣ＜１．０    超相加効果
ＦＩＣ＝１．０              相加効果
１．０＜ＦＩＣ＝２．０    不関
ＦＩＣ＞２．０              拮抗作用
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  皮膚や粘膜におけるカンジダ症、とくに高齢者における口腔カンジダ症、および女性における腟カンジダ症は、それぞれ発症頻度が大変高く、かつ再発を繰り返しやすい。これらのカンジダ症の治療には、アゾール系やキャンディン系といった抗真菌剤が用いられるが、使用終了後の再発を抑えることは困難である。再発を抑えるために薬剤を長期間使用した場合、肝機能障害などの副作用や耐性菌の出現といったリスクが高まる。
ショウガオールやカプリン酸といった植物成分を活用した方法は、副作用や耐性菌出現の危険がほとんどなく、かつ効果的な治療法であって、食品にも応用可能であるところから、患者自身が安心して手軽に実行できるという特長がある。また本発明の組成物は、両成分の相乗効果を利用しているため、各成分の単独使用の濃度レベルで比較すれば効果が著しく高く、同等の効果レベルで比較すれば添加量が大幅に少なくてすむ。とくに風味を重視する食品においては、添加量を下げることができれば配合の自由度が増し、応用商品の拡大に結びつく。したがって本発明の実用的な意味は大きい。
また本発明によってショウガおよびドクダミの新たな用途が実用化されると、国内産業の育成に結びつく期待がある。本発明の中のショウガオールは、実用的にはショウガエキスの形で利用されるが、ショウガエキスは、日本各地で栽培されているショウガを原料として生産される。特定の植物精油も抗カンジダ作用を発揮することが知られているが、それらの植物精油の入手は専ら輸入に頼っている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  本発明者は、市販のショウガにエタノールを加えて抽出し、抽出物を濃縮してオレオレジンを調製した。得られたオレオレジンを液体クロマトグラフィーにより分析した結果、［６］−ジンゲロール、［６］−ショウガオール、ジンギベレン、β−セスキフェランドレンといった成分の含有量が高いことが分かった。［６］−ショウガオールの含有量は、［６］−ジンゲロールに次いで２番目に高く１４％であった。また本発明者は、野生のドクダミの地上部を採取して乾燥ドクダミを調製し、熱水によって抽出して、その中に含まれるカプリン酸をガスクロマトグラフィーによって定量した。その結果、乾燥ドクダミ１ｇ当り０．４５ｍｇのカプリン酸が含まれていることが分かった。しかしながら採取直後の生のドクダミからは、カプリン酸は検出されなかった。
カンジダは、酵母形と菌糸形の２形性を示し、このうち菌糸形が病原性に直接関わっている。したがって菌糸形発育の阻害は、カンジダ感染症の予防や治療に結びつくとされている。カンジダの酵母形および菌糸形発育それぞれに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害試験の方法は確立されており、それによって、様々な材料のＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定することができる。
カンジダの菌糸形発育に対する阻害試験は、帝京大学医真菌研究センター保存の菌株Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＴＩＭＭ１７６８株を用いておこなった。カンジダは、子牛血清を含む培地では専ら菌糸形をとり、培養器の表面に付着して発育する。９６穴マイクロプレートの各ウェルの中に、２％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０を基本培地にして、カンジダを菌数５×１０２になるよう接種し、さらに予め各濃度を設定してＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド。培地中の最終濃度０．２５％）に溶解した［６］−ショウガオールまたはカプリン酸を加えて最終液量を２００μＬとした。それを５％炭酸ガス存在下、３７℃、１６時間培養した。培養終了後、各ウェルの培養物を吸引除去し、生理食塩水１８０μＬを入れて洗浄除去し、７０％エタノール２００μＬを入れて残存しているカンジダを殺菌した。ウェルのエタノールを除去して水道水で洗浄した後、染色液（０．１Ｍリン酸バッファーに溶解した０．０１％クリスタルバイオレット液）１００μＬを入れてウェルの表面に付着したカンジダ菌を染色した。水道水で洗浄して余分な染色液を除去した後、０．０４ＮＨＣｌを含む３−イソプロパノール１５０μＬおよび０．２５％ＳＤＳ溶液５０μＬを入れて菌体に付着した色素を遊離させた。色素を遊離させた後、プレートをマルチスキャンフォトメーターにかけて、各ウェルのＯＤ６２０ｎｍを測定した。増殖阻害率は、以下の式により求めた。
増殖阻害率（％）＝（１−サンプルＯＤ／対照ＯＤ）×１００
［６］−ショウガオールおよびカプリン酸の各ＩＣ９５（９５％増殖阻害濃度）は、それぞれ２５．０、６．２５μｇ／ｍＬであった。
ショウガオールとカプリン酸との併用によって発揮される抗カンジダ活性の相乗効果については、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、ショウガオールおよびカプリン酸それぞれの濃度系列を各ウェルに交差させた。実験条件および測定方法などは、菌糸形発育に対する試験と同様とした。ショウガオールとカプリン酸をそれぞれ単独に使用した場合の各ＩＣ９５は、２５．０、および６．２５μｇ／ｍＬであったが、併用時の各ＩＣ９５は、それぞれ３．１３、１．５６μｇ／ｍＬとなり、大幅に減少した。それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝３．１３／２５＋１．５６／６．２５＝０．３７５＜０．５
【発明の効果】
【０００５】  本発明の抗カンジダ活性組成物は、ショウガオールとカプリン酸との相乗効果を利用しているため、各成分の単独使用に比較し、同じ濃度であればカンジダ感染をより強く抑えるという利点がある。したがって発明の効果としては第一に、皮膚や粘膜のカンジダ症、とくに患者数の多い口腔カンジダ症や膣カンジダ症へのより効果的な適用と、それによる症状の改善、病気の治癒、および感染の予防があげられる。またショウガオールやカプリン酸は、高純度の製品を得ることが容易であり、かつ食品への利用も認められているところから、医薬品から食品まで幅広い製品に応用することが可能であり、患者にとっても入手しやすく使いやすいというメリットがある。同じ効果のレベルで比較した場合は、ショウガオールやカプリン酸の添加量を少なくすることが可能であり、風味が重視される食品産業においては、配合の自由度が増して応用製品の拡大に結びつく。
口腔カンジダ症や膣カンジダ症は再発を繰り返しやすく、しかも副作用や耐性菌出現といったリスクのために抗真菌剤の長期の適用には限界がある。植物成分であり食品としての摂取も可能なショウガオールやカプリン酸といった成分は、これらのリスクを心配する必要がなく、そのため患者は安心して利用することができる。
ショウガオールの原材料としては、日本各地で栽培されているショウガを用いることができる。従って、ショウガの新たな用途が開発されれば、国内産業の育成に結びつく期待もある。
【発明を実施するための形態】
【０００６】  本発明の抗カンジダ活性組成物の必須成分であるショウガオールやカプリン酸は、高純度の製品を得ることが容易であり、かつ食品への利用も可能である。したがって、医薬品から食品まで幅広い範囲の製品に応用することができる。医薬品的な形態としては、例えば液剤や軟膏として、口腔や膣などの患部に直接塗布または噴霧することがあげられる。食品的な形態としては、例えばキャンディやグミ、ガム、錠菓といった製品や、成分の保存性がよい容器を使用した飲料などがあげられる。いずれの製品であっても、使用に際して、ショウガオールやカプリン酸の有効必要量の投与を可能とする形態であり、かつ保証期間内にそれらの保存に問題を生じないことが肝要である。
【実施例】
【０００７】  本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ショウガオールおよびカプリン酸のカンジダ菌糸形発育に対する阻害活性【０００８】  カンジダは帝京大学医真菌研究センター保存の臨床分離株、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＴＩＭＭ１７６８を用い、サブロー・デキストロース寒天培地平板で３７℃、２０時間培養した。増殖した菌体を回収して２％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、菌数５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整してカンジダ菌液とした。ショウガオールおよびカプリン酸は、予め最終濃度に合わせて、それぞれＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に溶解し、この溶液を２％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に加えてサンプル液とした（培地中のＤＭＳＯ濃度０．５％）。サンプル液およびカンジダ菌液各１００μＬを、それぞれ９６穴マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ、住友ベークライト、東京）各ウェルに入れて、５％炭酸ガス存在下、３７℃、１６時間培養した。培養終了後、各ウェル中の培養物を吸引除去し、生理食塩水１８０μＬを入れて洗浄回収し、７０％エタノール２００μＬを入れてカンジダを殺菌した。エタノールを除去して水道水で洗浄した後、染色液（０．１Ｍリン酸バッファーに溶解した０．０１％クリスタルバイオレット液）１００μＬを入れて１５分間静置し、ウェルの表面に付着したカンジダ菌を染色した。
水道水で洗浄して余分な染色液を除去した後、０．０４ＮＨＣｌを含む３−イソプロパノール１５０μＬおよび０．２５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液５０μＬを入れて菌体に付着した色素を遊離させた。色素を遊離させた後、プレートをマルチスキャンフォトメーター（Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、大日本製薬、大阪）にかけて、各ウェルのＯＤ６２０ｎｍを測定した。増殖阻害率は、以下の式により求めた。
増殖阻害率（％）＝（１−サンプルＯＤ／対照ＯＤ）×１００
市販ショウガオールおよびカプリン酸の各ＩＣ９５（９５％増殖阻害濃度）は、それぞれ２５．０および６．２５μｇ／ｍＬであった。
実施例２．カンジダ菌糸形発育に対する、ショウガオールとカプリン酸との併用による抗カンジダ活性の相乗効果【０００９】  併用による抗カンジダ活性の相乗効果については、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、各ウェルに、ショウガオールとカプリン酸それぞれの濃度系列を交差させた。実験条件および測定方法などは実施例１の試験と同様とした。
ショウガオールとカプリン酸単独使用時の各ＩＣ９５は、それぞれ２５および６．２５μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ９５は、それぞれ３．１３および１．５６μｇ／ｍＬであった。それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝３．１３／２５＋１．５６／６．２５＝０．３７５＜０．５