(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するための植込可能でない支持体であって、非接着性のディボットされた表面を有し、
前記表面は、実質的に平坦な上面、
前記支持体の表面は、実質的に平坦な上面がエッチングされた複数のディボットを含み、
各ディボットは、内部底面および内部側壁面を含み、
底面は、丸みを帯ており、
各ディボットは、直径１００〜２００μｍ、深さ５０〜１５０μｍであり、少なくとも膵臓由来の島細胞を直径１５０μｍより大きいネイティブ大型島および直径が１２５μｍ未満であるネイティブ小型島から分離して、細胞培養液中の前記ディボット中で培養し、各ディボット内に再凝集島を形成でき、
細胞は個々のディボット中に分布され、細胞はディボット表面に接着せずそこから移動可能である支持体。
【請求項２】
請求項１記載の支持体を含む、細胞を培養するためのデバイスであって、
前記平坦支持体を保持するための系をさらに含み、
前記系が底面および内部側壁面および内部容積を形成し、前記底および側壁が実質的に液密性であり、細胞および培地が内部容積中に分布される、デバイス。
【請求項３】
前記細胞が島細胞である請求項１記載の支持体。
【請求項４】
前記ディボットが直径１００μｍおよび深さ６０μｍである請求項１記載の支持体。
【請求項５】
前記平坦上面がガラス製である請求項１記載の支持体。
【請求項６】
滅菌性である請求項１記載の支持体。
【請求項７】
細胞の培養方法であって、
請求項１に記載の支持体に細胞を導入すること、
を含み、
前記支持体を細胞培養条件に曝露する、細胞の培養方法。
【請求項８】
前記細胞が島細胞であり、そしてデバイスおよび支持培養条件に曝露後に、前記細胞が小型島に再凝集する請求項７記載の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記細胞が２０〜１５０細胞／１ディボットの比率でディボット中に沈下する請求項７記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記ディボットが直径１００μｍおよび深さ６０μｍである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
導入化学物質に対する応答に関して複数の細胞試料を試験するための方法であって、
（ａ）請求項２に記載のデバイス中で細胞を培養するステップと、
（ｂ）各ディボットに試験化学物質を導入するステップと、
（ｃ）試験化学物質に対する細胞の応答を分析するステップと、
を包含する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の支持体中の細胞培養液中に保持される島の単離集団であって、
すべての島の少なくとも８０％は、直径９０μｍより小さく、前記島が同一細胞培養液中のネイティブの大型島に比して生存するための多くの栄養および酸素を受け取ることができ、
前記島は、同一細胞培養液中のネイティブの小型および大型島に比して高い細胞生存度を有し、
島インスリン産生は、ネイティブ単離島より１０倍以上大きいレベルにより特性化される、島の単離集団。
【請求項１３】
球形である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１４】
前記島が膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞および膵臓デルタ細胞である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１５】
前記島の少なくとも８５％が生存可能である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１６】
全島の少なくとも８０％が直径５０μｍ未満である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１７】
前記島の少なくとも５０％が直径３７μｍ未満である請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１８】
前記島ベータ細胞が、ネイティブ小型島またはネイティブ大型島から単離されるベータ細胞と比較してより多量にインスリンを産生する請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項１９】
前記島がネイティブ大型島に比して低拡散バリアを有する請求項１２記載の島の単離集団。
【請求項２０】
前記細胞が、前記ディボットされた表面および支持培養条件に暴露した後３次元細胞凝集体に凝集する請求項７に記載の細胞の培養方法。
【請求項２１】
前記ディボット間の平均距離が３０μｍ未満である請求項１に記載の支持体。
【請求項２２】
前記支持体表面は個々の細胞を前記表面に接着できる細胞接着分子が存在しない請求項１に記載の支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引照）
本出願は、米国特許出願第１１／５８９，０６３号（２００６年１０月３０日出願）の一部継続である。上記出願は、参照により本明細書中で援用される。
（連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する陳述）
【０００２】
Ｎ／Ａ
【０００３】
本発明は、一般的に、生存可能島細胞、島および小型島細胞クラスターを作製するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
米国における真性糖尿病の症例の増加は、流行病と呼ばれている。糖尿病は、疾患による死因の第３位であり、米国民の主要死因としての心臓疾患および癌に匹敵する。説明不可能な理由のため、１型糖尿病の発生は世界的に増大しつつあり、開始年齢は過去１０年に３〜５歳低下しており、したがって、多数の小児が目下、就学前に糖尿病を発症している。その結果は、糖尿病を有するより多くの人々が、１型糖尿病に関連した慢性合併症を発症する危険に直面しながらその人生の大半を過ごすことになる、というものである。糖尿病に関連した慢性合併症のほとんどの発症の危険性は、血糖制御に関連しているため、血糖制御を改善するための新規の療法、例えば島移植に有意の注意が向けられる。
【０００５】
島移植片は、１９８０年代に最初に試みられた。ヒトにおける島移植に関する初期成功率は期待はずれで、移植片を受けている患者の５％だけが部分的機能を獲得した（Sutherland et al., Evolution of kidney, pancreas, and islet transplantation for patients with diabetes at the University of Minnesota, Am. J. Surg. 166: 456-491 (1993)参照）。失敗に囲まれて、１〜２年の期間、その糖尿病の長期逆転を達成している個体の成功物語は孤立したが、これは、糖尿病の治療へのこのアプローチを研究者が継続する励みとなった。２０００年に、今日、エドモントン・プロトコールと呼ばれる糖質コルチコイドを省略する抑制レジメンを用いて、数名の糖尿病患者で島移植が首尾よく実施された（Ridgway et al., Pancreatic islet cell transplantation: progress in the clinical setting, Treat. Endocrinol. 2(3):173-189 (2003).参照）。したがって、島移植結果は、著しく改善された（Shapiro et al., Clinical results after islet transplantation, J. Investig. Med. 49(6): 559-562 (2001)；Balamurugan et al., Prospective and challenges of islet transplantation for the therapy of autoimmune diabetes, Pancreas 32(3): 231-243 (2006)参照）。未だ、これらの結果により生じた楽観論にかかわらず、糖尿病に関する実際的治療としての島移植の使用に対するバリアが依然として存在しており、バリアの１つは、ほとんどの個体がインスリン非依存性を達成するのに多数の移植片を必要とすることを考慮した場合にドナー器官の数が限られていることである。
【０００６】
例えば島の物理的特質を含めて、多数の因子が移植成功に影響を及ぼす。約２０年前、研究者等は、島のサイズおよび形状を詳細に記載して、島容積を概算するための方法を決定した（Bonnevie-Nielsen et al., Pancreatic islet volume distribution: direct measurement in preparations stained by perfusion in situ, Acta Endocrinol. (Copenh) 105(3): 379-84 (1984)参照）。長年、以下のいくつかの理由のために、移植片部位により、大型の島が伝統的に望ましいと考えられてきた：（１）島は過剰消化により断片化され得るため、大型島の存在は良好な膵臓消化の品質証明とみなされる、ならびに（２）容積は、移植に必要とされる島の最小数を決定するために用いられ、そして島の直径の２倍がその容積の８倍と等価であるため、大型島が調製における島等価物の数に大きく寄与する。
【０００７】
近年、研究者等は、島による酸素、グルコースおよびインスリンの運搬をモデル化した（Dulong et al., Contributions of a finite element model for the geometric optimization of an implantable bioartificial pancreas, Artif. Organs 26(7): 583-9 (2002)参照）。末梢細胞による酸素消費速度が島への酸素拡散速度を超えた場合、酸素運搬制限が、島の中心部における細胞死を増加させる。例えば、大型島は低酸素条件に曝露されると、壊死増大を示す、ということを近年の研究は示している。実際、島直径が１００〜１５０μｍを超えると、ほぼすべてのベータ細胞が死亡した（Giuliana et al., Central necrosis in isolated hypoxic human pancreatic islets; evidence for postisolation ischemia, Cell Transplantation 147 67-76 (2005)；MacGregor et al., Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290(5): E771-779 (2006)参照）。その結果生じる酸化ストレスは、移植時にアポトーシスおよび免疫応答を増悪し得る（Bottino et al., Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment, Diabetes 53(10): 2559-68 (2004)参照）。細胞死が起きなかった場合でさえ、島中心部の代謝率低減が起こり得る。
【０００８】
グルコースおよびインスリンの運搬遅延も、膵島の機能を減少させる。島内のグルコース勾配は、末梢細胞を、島中心部に含有されるものよりはるかに高濃度のグルコースと接触させる（Kauri et al., Direct measurement of glucose gradients and mass transport within islets of Langerhans, Biochem. Biophys. Res. Commun. 304(2): 371-7 (2003)参照）。この勾配の形状は、島の直径ならびにグルコース代謝速度と直接的に関連する。島直径の増大は、島内のすべての平面におけるこの拡散および消耗バリアを増大する。
【０００９】
インスリン産生ベータ細胞の別の供給源を見出すために、in vitroでベータ細胞を培養する努力もなされてきた。これらの方法は、胎仔組織からベータ細胞を培養するか、あるいは島産生幹細胞または先祖細胞からこのような細胞を得ることに集中してきた（例えば、Peck et al., U.S. Patent No. 6,703,017；Brothers, WO 93/00411 (1993)；Neilsen, WO 86/01530 (1986)；Zayas, EP 0363125 (1990)；Bone et al., Microcarriers; A New Approach to Pancreatic Islet Cell Culture, In Vitro Vol. 18, No.2 Feb. (1982)参照）。残念ながら、このような技法は、一般的に、時間が掛かり、そしてそれらの供給源としての胎仔組織または幹細胞の利用可能性を必要として、培養ベータ細胞の集密的単層を生じる。したがって、より効率的な、利用可能な、そして信頼性の高い技法を用いて生存可能な島細胞を作製する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
大型無傷島の建造に際して出くわす拡散バリアを克服するための試みの１つにおいて、移植のためのポリマー微小球上に多層の島細胞を増殖するために、本発明人等により種々の試みがなされた。図１Ａに示した微小球は、無傷島のサイズ範囲内であるよう工学処理された。微小球の外面にベータ細胞を付着することにより、拡散バリアのための細胞死はほとんどまたは全く存在しないはずである、ということが理論化された。懸濁液中の非常に高密度の細胞の使用を含めて、微小球への細胞の付着を最適化するために異なる培養環境を用いて、多数の試みがなされた。しかしながら、この方法は、栄養素の媒質を急速に枯渇させて、細胞生存が乏しくなる。他の技法は、微小球上に徐々に「滴下されて」、細胞と微小球との物理的相互作用を増大するか、あるいは数日間、極微重力小室中で細胞および微小球を同時培養する細胞を包含した。いくつかのベータ細胞はポリマー微小球に付着するが、一方、それらの分布は不均一であり、多層の付着細胞は一貫して達成されなかった（図１Ｂ）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態では、本発明は、大表面を有する生体物質で構成される実質的に平坦な足場；ならびに生体物質足場の表面に多層で付着される個々の島細胞または小型島細胞クラスターを含む移植可能デバイスに関する。個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、好ましくは、成体無傷島に由来する。細胞接着分子（例えば、インテグリン、カドヘリン、セレクチンおよび免疫グロブリン）は、個々の細胞または小型島細胞クラスターの足場への付着を促すために足場に付着され得る。さらに、１つ以上の血管形成因子、免疫抑制剤（例えば、自己免疫抑圧因子）、抗生物質、酸化防止剤、抗サイトカインまたは抗内毒素は、足場から制御可能的に放出されて、島細胞および小型島細胞クラスターの生存度を改善し得る。
【００１２】
別の態様では、生体物質足場は柔軟性生体物質であり、生体適合性および／または生分解性ポリマー、例えばポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）で構成され得る。
【００１３】
さらに別の態様では、多層は、インスリン産生ベータ細胞および他の島細胞型の組合せを含む。多層は、好ましくは、約１〜５細胞の厚みであり、約１０〜５０μｍの厚みの多層を形成する。多層は、好ましくは、細胞厚が生体物質足場の表面を横断して１〜２細胞以下だけ変化するよう、実質的に均一な厚みを有する。
【００１４】
さらに別の態様では、個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、酵素消化を用いて、および／またはカルシウム枯渇培地中で培養して、無傷成体島から獲得される。
【００１５】
本発明は、移植可能デバイスを形成する方法も提供する。特に、無傷島から個々の島細胞または小型島細胞クラスターを得るための技術が提供される（例えば、酵素消化、カルシウム枯渇またはその組合せ）。さらに、個々の島細胞および／または小型島細胞クラスターを付着するための方法、例えば細胞の懸濁液から遠心分離すること、ならびに足場表面への付着を改善するための細胞接着分子の使用を含めた方法が提供される。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、糖尿病の治療として本発明の移植可能デバイスを用いる方法を提供する。デバイスを移植するための方法、ならびに糖尿病の治療のための技法が記載される。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、実質的に平坦な上面を含む支持体を含む細胞を培養するための表面であって、この場合、その表面は複数のディボットを含む。各ディボットは、内部底面および内部側壁面を含む。底面は丸みを帯ており、各ディボットは直径１００〜２００μｍ（±２０％）、深さ５０〜１５０μｍ（±２０％）である。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、上記表面を含み、平坦表面を保持するための系をさらに含む細胞を培養するためのデバイスである。系は、底面および内部側壁面および内部容積を形成し、底および側壁は実質的に液密性である。当該デバイスが用いられる場合、細胞および培地は内部容積中に分布される。好ましい一実施形態では、細胞は島細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は、幹細胞、細胞培養株、新たに分散された細胞または初代細胞からなる群から選択される非島細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は島細胞であり、ディボットは直径１００μｍ（±２０％）および深さ６０μｍ（±２０％）である。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、細胞の培養方法であって、複数のディボットを含む表面に細胞を導入すること（各ディボットは、直径１００〜２００μｍ（±２０％）および深さ５０〜１５０μｍ（±２０％）である）、そして前記デバイスを細胞培養条件に曝露することを包含する方法である。好ましい一実施形態では、細胞は島細胞であり、そしてデバイスおよび支持培養条件に曝露後に、前記細胞は小型島に再凝集する。好ましい一実施形態では、細胞は約２０〜１５０細胞／１ディボットの比率でディボット中に沈下する。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、細胞は島培養から分散され、そして非ネイティブ分子が結果的生じる小型島に工学処理される。別の好ましい実施形態では、非島細胞は、幹細胞、細胞培養株、新たに分散された細胞または初代細胞からなる群から選択される。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、導入化学物質に対する応答に関して複数の細胞試料を試験するための方法であって、（ａ）複数のディボット（各ディボットは、直径１００〜２００μｍ（±１０％）および深さ５０〜１５０μｍ（±１０％）である）を含むデバイス中で細胞を培養するステップ、（ｂ）各ディボットに試験化学物質を導入するステップ、ならびに（ｃ）試験化学物質に対する細胞の応答を分析するステップを包含する方法である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、すべての島の少なくとも８０％が直径９０μｍより小さい島の単離集団であって、この場合、島はネイティブの大型島に比して低い拡散バリアを有する。好ましくは、島は、ネイティブの小型および大型島に比して高い細胞生存度を有し、そして島インスリン産生は、ネイティブ単離島より１０倍以上大きいレベルにより特性化される。好ましい一実施形態では、島の大多数は球形である。好ましい一実施形態では、島は、膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞および膵臓デルタ細胞を含む。好ましい一実施形態では、島の少なくとも８５％は生存可能である。好ましい一実施形態では、全島の少なくとも８０％は直径５０μｍ未満である。好ましい一実施形態では、島の少なくとも５０％は直径３７μｍ未満である。好ましい一実施形態では、島ベータ細胞は、ネイティブ小型島またはネイティブ大型島から単離されるベータ細胞と比較してより多量にインスリンを産生する。
【００２３】
この特許および出願ファイルは、着色して作成された少なくとも１つの図面を含有する。着色図面（単数または複数）を伴うこの特許または特許出願公告のコピーは、必要手数料の要求および支払い時に、オフィス（Office）により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ，Ｂは、患者への移植のために微小球ポリマー上でベータ細胞を増殖するための従来の試みを示す。画像では、キトサンポリマーで被覆されたＰＬＧＡ微小球に付着された細胞の不均一分布が示されている。細胞の部分的単層は、ベータ細胞を用いた長期インキュベーション後に得られ得るすべてであった。
【図２】時間の一関数としての、培養大型ラット島（１２５μｍ以上）、小型島（１２５μｍ未満）および分散ベータ細胞に関する細胞生存度を比較するグラフである。大型島の生存度低減は、第３日目を過ぎると統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【図３Ａ】糖尿病ラットへの小型島（１２５μｍ未満）または大型島（１２５μｍ以上）の移植の結果を要約する。小型島を用いた場合、時間の約８０％で正常血糖に首尾よく戻ったが、しかし、大型島を移植した場合、移植片は正常血漿グルコースレベルを首尾よく回復できなかった。これは、移植６０日後に各軍における動物の血漿グルコースレベルを示すことにより、最良に例証され得る。大型島を受容している動物は、移植後も依然として高血糖であったが、一方、小型島を受容しているラットは正常血糖であった。＊印は、０．０１の有意差を示す。
【図３Ｂ】糖尿病ラットへの小型島（１２５μｍ未満）または大型島（１２５μｍ以上）の移植の結果を要約する。小型島を用いた場合、時間の約８０％で正常血糖に首尾よく戻ったが、しかし、大型島を移植した場合、移植片は正常血漿グルコースレベルを首尾よく回復できなかった。これは、移植６０日後に各軍における動物の血漿グルコースレベルを示すことにより、最良に例証され得る。大型島を受容している動物は、移植後も依然として高血糖であったが、一方、小型島を受容しているラットは正常血糖であった。＊印は、０．０１の有意差を示す。
【図４】移植の約８週間後に腎臓被膜から取り出され、インスリンに関して免疫標識された島移植片である。左パネルの画像は、小型島（１２５μｍ未満）を用いた移植片における相対的に多くのインスリン免疫標識（赤）および確立された毛管網状構造を示す。これに対比して、大型島（１２５μｍ以上）の移植片は、インスリン免疫標識および有意の繊維症をほとんど示さなかった（右パネル）。画像は、４つの異なる動物を代表するものである。
【図５】ベータ細胞を同定するためにジチゾンで染色されたラット小型島細胞クラスターを示す。共焦点口径は超薄Ｚ切片用に設定されたため、サブユニット内の（しかし焦点平面より低い）細胞はぼやけており、赤色を生じない。しかしながら、それらの細胞に対する共焦点平面での調整は、それらもジチゾンで明確に染色される、ということを示した。
【図６】（パネルＡ）は、酵素的分散を用いて無傷成体島から作製された小型島細胞クラスターの生／死染色を示す。この小型島細胞クラスターは、直径約４０μｍである。図６の上右パネル（パネルＢ）では、カルシウム枯渇培地で無傷島を培養することにより得られる小型島細胞クラスターが示されている。小型島細胞クラスターは、解かれるかまたは開かれ、したがって、培地はクラスター中の細胞を取り囲み得る。図６の（パネルＣ）では、カルシウム枯渇および酵素分散液の両方を用いて得られる小型島細胞クラスターが示されている。断片の直径は、約１５μｍであった。図６（パネルＤ）は、カルシウム枯渇および酵素消化の組合せと、その後の手動ピペット分取から得られる個々の島細胞を示す。赤色は死細胞を示し、緑色細胞は生きている。パネルＢのスケールバーは、パネルＡ〜Ｃに当てはまる。
【図７】本発明に従ってそこに付着される多層の島細胞を有するパッチの産生の模式図である。
【図８】（Ａ）キトサン（Ｍｗ＝１００ｋＤａ）および（Ｂ）ラミニンへのベータ細胞付着の光学顕微鏡写真である。差込図は、アクチンに関するシトクロムＢ（緑色）染色によるラミニン上のベータ細胞の光学および蛍光顕微鏡写真を示す。
【図９】５０：５０  ＡＬＧＡ−カルボキシル（５．５ｋＤａ）から製造されたポリマーパッチ上に島細胞を層化した場合の結果を実証する。パッチを、共焦点顕微鏡を用いて光学的に切片にした。示されたＺ切片を得るために、画像を得た。上パネルは、１または２層の細胞を有するパッチを例証しており、次いで示されているような付加的細胞層を有するパッチが付加された。約３５００ｒｐｍで約１０分間、プレート用遠心分離機でそれらを回転させることにより、足場上に細胞を層化した。層は、繰り返しすすいだ後も、ポリマー足場に付着されたままであった。
【図１０】ディボットを有する微小鋳型の一般的デザインを示す模式図である。この例では、ＰＤＭＳは微小鋳型のハウジングを構成する物質であり、蝕刻ガラスはディボットが蝕刻される支持体である。
【図１１】微小鋳型中の空ディボットのトップダウン図を示す顕微鏡写真である；ここに示したディボットのパターンは、微小鋳型デザインＢを代表するものである。
【図１２】単一ディボットの深さおよびディボットの丸底形状を示す粗面計により作成されたグラフである。
【図１３】微小鋳型産生のために利用される足場を示す模式図である。微小鋳型の構成成分および微小鋳型を建造するための足場は、以下の：［１］大型銅管；［２］小型銅管；［３］ＰＤＭＳポリマー（ディボット化表面を収容する系を含む）；［４］平坦面、例えばアルミ箔で包まれた大型四角形ガラス（その上に微小鋳型を建造するための基部として用いられる）；［５］微小鋳型ハウジングの垂直壁；［６］微小鋳型の基部；ならびに［７］ディボット化支持体である蝕刻ガラスである。
【図１４】２および５日目の微小鋳型のディボット内の島細胞再凝集を示す顕微鏡写真である。
【図１５】ディボットの領域に隣接するディボット化支持体の非ディボット化縁を示す顕微鏡写真；ディボットは、小型再凝集島細胞を含有するが、しかし非ディボット化面に位置したそれらの細胞は大型巨大島に再凝集した。
【図１６】市販のプレート中のウェルの縁に集合した生島細胞を示す顕微鏡写真である；島細胞の再凝集は微小鋳型の場合のように球形であるわけではなく、島細胞の再凝集群は微小鋳型中で形成される９０μｍ島よりはるかに大きい。
【図１７】図１７Ａ，Ｂは、微小鋳型用の２つの考え得るディボットパターンを示す１組の模式図である；図１７Ａは、ディボットが互いに密接しているデザインであり、これは、単一微小鋳型中で形成される再凝集体の数を最大にしようとする場合に有用である；図１７Ｂは、さらに互いに離れて間隔を置いたデザインであり、これは、個々のディボットにおける細胞の処理を操作する場合に有用である。
【図１８】単一ディボット内に含有される２つの再凝集島を示す顕微鏡写真である。
【図１９】図１９Ａ，Ｂは、再凝集島における生存度染色を示す１組の顕微鏡写真である；赤色は死細胞を示す。図１９Ａは、微小鋳型内に再凝集された島が極少数の死細胞を含有し、１つの死細胞は上部島中で染色されているが、一方、下部の島における細胞死の証拠は認めされない、ということを示す。図１９Ｂは、微小鋳型の非ディボット化面上に形成される巨大島を示し、この場合、図の共焦点面に少なくとも２３個の死島細胞が認められる。
【図２０】ネイティブ小型およびネイティブ大型島と再凝集島との生存度を比較するグラフである。島はすべて、同一ラットから取り出され、単離島の一部分は再凝集のために島細胞に分散された。５日目に、再凝集島が微小鋳型から取り出されて、すべての島が生／死生存度染色に曝露された。再凝集島中の生細胞のパーセンテージは、ネイティブ大型または小型島に関するものより高かった。
【図２１】ベータ細胞（緑色）、アルファ細胞（赤色）およびデルタ細胞（青色）を同定するために三重染色された微小鋳型ディボットにおける再凝集の６日後の２つの代表的島を示す。上部島は、直径４３×５５μｍ（ＸおよびＹ方向で測定）、底部島は直径４８×６５μｍである。
【図２２】インスリン（緑色）およびプロインスリン（赤色）に関して染色された微小鋳型ディボット中に形成された６日再凝集島を示す。この島は、直径４５かける５４μｍ（ＸおよびＹ方向で測定）である。
【図２３】異なるグルコース条件に曝露された３つの島型におけるインスリン分泌を示すグラフである。ネイティブ小型島および微小鋳型ディボット中で再凝集された島を、低グルコース条件（３ｍＭ）に曝露した；培地中に分泌されるインスリンを収集し、Ｙ軸で示されるように定量した。ネイティブ小型島、ネイティブ大型島および微小鋳型ディボット中に再凝集された島を、高グルコース条件（２０ｍＭ）に曝露した；培地中に分泌されるインスリンを収集し、Ｙ軸で示されるように定量した。
【図２４】最適サイズ化島を再凝集するために即製微小鋳型を用いるための一般的方法を示す模式的流れ図である。
【図２５】高処理量薬剤試験のための即製微小鋳型の一例示的使用を示す模式的流れ図である。
【図２６】２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄグルコース（２−ＮＢＤＧ；２０ｍＭ）を含有する培地中の再凝集島を示す。円形は、島の位置を示す。２−ＮＢＤＧ（蛍光グルコース類似体）は、各再凝集島中に完全に組み込まれる。
【図２７】生体ポリマー鋳型を作製するために用いられ得る逆押し型（金属またはＳＵ−８から作られる）のためのデザインを示す。最終生成物は、ガラス鋳型で作られるものと同様のディボットを有する。
【図２８】図２８Ａ，Ｂは、各微小鋳型におけるディボットの領域内の各ディボットの位置を同定するための標識を含めた逆押し型デザインを示す。図２８Ａで示すように、異なる形状が、ガラス蝕刻法より精確さを有するディボット底のために設計され得る。図２８Ｂは、識別標識を有するディボットを含有する最終生体ポリマー鋳型の一部分を実証する。
【図２９】図２９Ａ，Ｂは、ほぼ同一サイズの２つの島を比較する。図２９Ａは、球形再凝集島の一例である。図２９Ｂは、ネイティブ小型島を示す。形状、サイズおよび平滑カプセル様外縁は、両島に関して同様である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ａ．  概要
この明細書中で引用される特許出願、特許および出版物はすべて、これらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。矛盾する場合は、本発明の開示（定義を含む）が優先される。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「ランゲルハンス島」または「島」という用語は、ホルモンを製造し、分泌する膵臓中の特殊化細胞の一群を指す。島は、一般的に、以下の細胞型のうちの１つ以上を含有する：（１）血中のグルコース（糖）のレベルを上昇させるグルカゴンを製造するアルファ細胞；（２）インスリンを製造するベータ細胞；（３）身体中の多数の他のホルモンの放出を抑制するソマトスタチンを製造するデルタ細胞；（４）ＰＰ細胞を産生する膵臓ペプチド；（５）血管作用性腸ペプチドを分泌するＤ１細胞；あるいは（６）セレクチン、モチリンおよびサブスタンスＰを分泌するＥＣ細胞。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「島細胞」という用語は、島中に見出される細胞のうちのいずれかを指す。本発明で用いられる島細胞は、好ましくは、インスリン産生ベータ細胞と他の島細胞型の組合せである。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「小型島細胞クラスター」または「島断片」という用語は、クラスターでの通常は約２５島細胞未満の、一緒に結合される島細胞の集合体を指す。小型島細胞クラスターは、好ましくは、クラスター内の任意の細胞に関する（例えば栄養素、酸素、グルコース等に関する）拡散バリアが約７細胞以下であるような形態を有する。典型的には、拡散バリアは約５細胞未満であり、４、３または２細胞と低いこともある。「小型島細胞クラスター」は、好ましくは、優勢細胞型としてベータ細胞を含み、任意に１つ以上の他の島細胞型を含み得る。小型島細胞クラスターは、種々の形状（例えば、一般的には球形か、細長いか、そうでなければ非対称形である）を有し得る。小型島細胞クラスターの例は、図５、ならびに６（Ａ）、６（Ｂ）および６（Ｃ）に示されている。「小型島細胞クラスター」は、好ましくは、ドナー膵臓から単離される無傷大型島を分散することにより得られる。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「ネイティブ島」は、動物膵臓由来の島を指す。ネイティブ島は、１２５μｍより大きい、好ましくは１５０μｍより大きい直径を有する「ネイティブ大型島」、あるいは１２５μ未満の直径を有する「ネイティブ小型島」として特性化され得る。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「巨大島」という用語は、約３００μｍより大きい直径を有する再凝集島を指す。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「成体無傷島」という用語は、成体哺乳動物膵臓由来のネイティブ大型島またはネイティブ小型島を指し、この場合、島はばらばらに壊されていない。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「分散化島細胞」という用語は、好ましくは、島細胞が懸濁液中に均一に分布されるよう大型島を崩壊することにより得られる細胞の懸濁液を指す。好ましくは、懸濁液中の島細胞の９０％以上が単一細胞であり、残りは二連（一緒に結合された２個の細胞）および三連（一緒に結合された３個の細胞）、ならびに互いに結合された細胞の非常に少数の大型群を含む。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「再凝集島」という用語は、好ましくは、大型島を単一島細胞に壊して、それらの単一島細胞を一緒に群で培養して島を形成することにより得られる、一緒に結合された島細胞の収集物を指す。好ましくは、島への単一島細胞の再凝集は、微小鋳型中のディボットの物理的寸法により影響を及ぼされる。再凝集島を形成するために用いられる個々の島細胞の数は、島生成物の所望のサイズによって決まる。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、「拡散バリア」という用語は、高濃度の領域（例えば細胞の外側の酸素またはグルコース濃度）から低濃度の領域（例えば、細胞の内側の酸素またはグルコース濃度）への分子移動の抑制を指す。大型島は、酸素に対する相対的に高い拡散バリアを示し、これが、移植に関するそれらの生存度および有用性を制限する。微小鋳型中に再凝集される島はネイティブ大型島に比して小さく、そして相対的に低い拡散バリアを示し、これが、再凝集島内の細胞生存度に寄与する。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、「細胞生存度」という用語は、総細胞試料を基礎にして、生きているかまたは死んでいる細胞の量の測定値を指す。高細胞生存度は、本明細書中で定義される場合、全細胞の８５％より多くが、好ましくは９０〜９５％より多くが生存可能である細胞集団を指し、さらに好ましくは、高細胞生存度により特性化される集団は９９％より多くの生存可能細胞を含有する。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、（例えば、被験体への植込みまたは移植により）生物学的流体または組織と接触するようになるよう意図される物質は、「生体物質」と呼ばれる。生体物質は物質と生理学的環境との間の最小反応を誘導する、というのが望ましい。生理学的環境に置かれた後、最小の炎症反応、アナフィラキシー反応の証拠なし、ならびに生体物質上での最小度の細胞増殖が認められる場合、生体物質は「生体適合性」であるとみなされる。宿主哺乳動物における植込み時に、生体適合性生体物質はマイクロカプセルの機能に有害な影響を及ぼすのに十分な宿主応答を引き出さない；このような宿主応答としては、生体物質の上または周囲の繊維性構造の形成、生体物質の免疫学的拒絶、あるいは生体物質から周囲宿主組織への毒性または発熱性化合物の放出が挙げられる。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「蝕刻」という用語は、支持体にディボットを作成するために酸を用いる化学的工程を指す。
【００３８】
本明細書中で用いる場合、「ディボット」という用語は、底および側壁からなる支持体中の局在化ウェルまたは小室（すなわち、幅および深さを有する窪みをつけた間隙）を意味する。一実施形態では、島の再凝集のために、ディボットは直径１００μｍ未満、深さ６０μｍである。例えば、ディボットは直径８０μｍ、深さ４８μｍであり得る。再凝集島を所望する他の実施形態では、ディボットは直径８０〜１２０μｍ、深さ４８〜７２μｍである。例えば薬剤試験のために小型の腫瘍を増殖させるといったような他の目的に関しては、最適ディボット直径は１００〜２００μｍ、深さは６０〜１００μｍである。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「ディボット化支持体」という用語は、異なる個々のディボットを含有するよう改質されている固体支持体または任意の物質を指す。
【００４０】
本明細書中で用いる場合、「微小鋳型」という用語は、複数のディボットで構成される表面を含有するデバイスを指し、この場合、ディボットは直径１００〜２００μｍを示す。微小鋳型中のディボットの物理的パターンは、微小鋳型の製造により具体的に示され得る。微小鋳型は、好ましくは２つの主要部を含む：ｉ)ディボット化支持体；ならびにｉｉ）ディボット化支持体を収容し、その中に細胞および培地を含有するための系。微小鋳型は、その中に配置される細胞の増殖または再凝集を導くかまたは決定するために用いられる。
【００４１】
本明細書中で用いる場合、「鋳型ハウジング」という用語は、ディボット化支持体とそこに付加される液体および細胞物質の両方を保持するための構造を指す。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、「ハウジング足場」という用語は、微小鋳型の構築中に物質の形態を支持し、影響を及ぼすために用いられる一時的骨組みを指す。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「スパッタリング」という用語は、支持体上に薄い皮膜コーティングを沈着するために用いられる蒸気沈着の方法を意味する。
Ｂ．  多層として付着される島細胞
【００４４】
一実施形態では、本発明は、植込みのための生存可能な個々の島細胞または小型島細胞クラスターを産生するための方法に関する。一態様では、非胎仔ドナー膵臓から単離される個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、多層で適切な生体物質足場の表面に付着される。
【００４５】
一態様では、個々の島細胞、好ましくはベータ細胞は、生体物質足場に付着される。別の態様では、種々の島細胞型の組合せが生体物質足場に付着される。さらに別の態様では、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞で構成される小型島細胞クラスターが生体物質足場に付着される。
【００４６】
さらに別の実施形態では、島細胞の１〜２、３、４または５層の多層が生体物質足場に付着される。生体物質足場上の島細胞および小型島細胞クラスターは、約１０〜５０μｍ厚の、最も好ましくは約２０〜４０μｍ厚の細胞の多層を形成する。
【００４７】
一態様では、多層の島細胞は、好ましくは実質的に均一の厚みを有し、したがって生体物質足場の表面を横断する細胞厚の変化は１〜２細胞以下だけである。
【００４８】
一態様では、個々の島細胞および／または小型島細胞クラスターは、ドナー成体被験体の膵臓から直接単離され、そして無傷島から分離される。島を個々の細胞および／または小型島細胞クラスターに分けるための適切な方法としては、酵素消化および金属ベースの分散（カルシウム枯渇）またはその組合せが挙げられる。
【００４９】
別の態様では、生体物質足場は、足場との適切な個々の島細胞または小型島細胞クラスター接着を提供する物質で構成される。種々の型の物質、例えば無機および有機物質が、本発明の生体物質足場として用いられ得る、と意図される。これらの物質の非限定例としては、多糖、ポリエステル（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸））、ポリ（乳酸−コ−リシン）、ポリ（乳酸−グラフト−リシン）、ポリ無水物（例えば、ポリ（脂肪酸二量体）、ポリ（フマル酸）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（カルボキシフェノキシプロパン）、ポリ（カルボキシフェノキシヘキサン）、これらの単量体のコポリマー等）、ポリ（無水物−コ−イミド）、ポリ（アミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（イミノカルボネート）、ポリ（ウレタン）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（ホスフェート）、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ならびにその他のアシル置換セルロースアセテートおよびその誘導体、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カルボネート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アクリレート）、ポリアセタル、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（スチレン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（フッ化ビニル）、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、コポリマー、ポリスチレン、およびその配合物またはコポリマー）が挙げられる。ある好ましい態様では、生体物質としては、多糖、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、Ｎイソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡ）、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンイミン、キトサン（ＣＳ）、キチン、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ゼラチン等、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよびその混合物が挙げられる。他の適切な生体物質としては、Vats et al., Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications, Clin. Otolaryngol. Allied Sci. 28(3): 165-72 (2003)；Wang et al., An encapsulation system for the immunoisolation of pancreatic islets, Nat. Biotechnol. 15(4): 358-62 (1997)；Orive et al., Cell encapsulation: promise and progress, Nat. Med. 9(1): 104-7 (2003)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたナイロン、ヒアルロナン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルホルムアミド等が挙げられる。
【００５０】
好ましい態様では、生体物質足場は生分解性物質で構成される。適切な生分解性生体物質としては、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＯ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。ＰＬＧは、薬剤送達に関して十分に研究されており、多数のin vivo用途に関してＦＤＡ認可されている（Berkland et al., Fabrication of PLG microspheres with precisely controlled and monodisperse size distributions, J. Control. Release May 18, 73(l):59-74 (2001)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照）。
【００５１】
別の態様では、生体物質足場は、島およびベータ細胞接着を増大するコーティングで、全部または一部が、被覆される。コーティングの例としては、フィブロネクチン、ポリエチレングリコールアセテート、ラミニン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレン−アルト−マレイン酸（ＰＥＭＡ）、およびキトサン（ＣＳ）が挙げられる。
【００５２】
足場は、足場への個々の細胞付着および／または小型島細胞クラスター付着を助長するためにそれに付着される１つ以上の島細胞接着分子（「ＣＡＭ」）も有し得る。他の用途では、ＣＡＭは、組織工学処理のためにポリマーとの細胞付着を助長することが示されている（Dunehoo et al., Cell adhesion molecules for targeted drug delivery, J. Pharm. Sci. 95: 1856-1872 (2006)）。細胞接着分子（ＣＡＭ）としては、インテグリン（例えば、ａｖｂ３、ａｖｂ５、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４）、カドヘリン（例えば、Ｅ−、Ｐ−およびＮ−カドヘリン）、セレクチン（例えば、Ｅ−、Ｌ−およびＰ−セレクチン）、免疫グロブリン・スーパーファミリー（例えば、ＩＣＡＭ−１、１ＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１）、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、ラミニンおよびフォン・ビレブランド因子）、線状および環状細胞接着ペプチドおよびＲＧＤペプチド由来のペプチド模倣物、ＩＣＡＭ−１ペプチド、ＶＣＡＭ−１ペプチド、カドヘリンペプチド、およびＬＦＡ−１ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＭは、組織再生、細胞形態、移動、有糸分裂、細胞質分裂、食作用、ならびに細胞極性の維持のための必須分子である。ＣＡＭは、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）接着のための受容体として作用する細胞表面に見出される糖タンパク質である。細胞接着分子、例えばＲＧＤペプチドは、組織工学処理、組織再生、創傷治癒、再建手術、神経再生、骨移植および臓器移植のプロセスを手助けし得る、ということが従来示されてきた。さらに、Ｅ−カドヘリンは、β細胞接着において重要であることが示されている（Hauge-Evans et al., Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MINE pseudoislets, Diabetes, 48: 1402-1408 (1999)）。一態様では、細胞接着分子は、共有結合（単数または複数）、例えばペプチド、チオエーテル、ジスルフィドまたはエステル結合（これらに限定されない）を用いてポリマー上に固定される。スペーサー分子は、細胞接着分子とポリマーとの間に付加されて、ポリマー上の接着分子と細胞表面の細胞接着受容体との間の自由相互作用を可能にし得る。ＲＧＤペプチドをちりばめられたポリマーに異なる細胞を付着するための試験はポリマー間の最適スペーサーを示し、そしてＲＧＤポリペプチドは、細胞表面受容体によるＲＧＤペプチドの最適認識のためには、約１１〜４６オングストロームである。スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧＳ）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｇｌｙ、ポリ−Ｌｙｓ、ポリ−Ａｌａ）、ポリアミノカプロン酸（ポリ−Ａｃａ）および２または３つのアミノ酸反復（例えば、ポリ−Ａｃａ−Ｇｌｙ）の組合せから作られ得るが、これらに限定されない。共有結合のほかに、細胞接着分子は、島細胞を付着する前に、ポリマー上のパッチのポリマー網状構造に吸着され得る細胞接着分子を先ず付着することにより（例えば、静電的に、疎水的に、または他の非共有的相互作用により）、吸着され得る。
【００５３】
別の態様では、生体物質足場は、その表面への個々の島細胞または小型島細胞クラスターの付着を助長する形状を有する。足場は、典型的には、例えばパッチまたは机の上のような実質的に平坦な表面を有する。好ましい実施形態では、生体物質足場は実質的に平坦な柔軟性パッチ物質を含む。
【００５４】
生体物質足場は、個々の島細胞または小型島細胞クラスターの付着に適したサイズを有する。例えば、一態様では、平坦なパッチは、典型的には、約０．２〜３センチメートルのオーダーの寸法を有する。パッチの厚みは、典型的には、約５０μｍ〜１センチメートルのオーダーである。
【００５５】
さらに別の態様では、生体物質足場は、１つ以上の成長因子、免疫抑制剤、抗生物質、酸化防止剤、抗サイトカイン、抗内毒素、Ｔ細胞接着遮断剤、血管新生因子、栄養素またはその組合せを制御可能的に放出し得る。
【００５６】
成長因子の例としては、エピレグリン、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、内皮細胞成長因子（「ＥＣＧＦ」）、繊維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）、神経成長因子（「ＮＧＦ」）、白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）および骨形態形成タンパク質−４（「ＢＭＰ−４」）、肝細胞成長因子（「ＨＧＦ」）、血管内皮細胞成長因子−Ａ（「ＶＥＧＦ−Ａ」）、コレシストキニン・オクタペプチド、インスリン様成長因子が、そしてインスリンそれ自体でさえ挙げられる（一般的には、Miao et al., In vitro and in vivo improvement of islet survival following treatment with nerve growth factor, Transplantation Feb 27;81(4):519-24 (2006)；Ta et al., The defined combination of growth factors controls generation of long-term replicating islet progenitor-like cells from cultures of adult mouse pancreas, Stem Cells, Mar 23 (2006)；Johannson, Islet endothelial cells and pancreatic beta-cell proliferation: studies in vitro and during pregnancy in adult rats, Endocrinology May;147(5):2315-24 (2006), Epub Jan 26 (2006)；Kuntz et al., Effect of epiregulin on pancreatic beta cell growth and insulin secretion, Growth Factors Dec 23(4):285-93 (2005)；Vasadava, Growth factors and beta cell replication, Int. J. Biochem. Cell Biol. 38(5- 6):931-50 (2006), Epub Aug 31 Review (2005)；Kuntz et al., Cholecystokinin octapeptide: a potential growth factor for pancreatic beta cells in diabetic rats, JOP, Nov 10;5(6):464-75 (2004)参照）。
【００５７】
免疫抑制剤の例はよく知られており、ステロイド系または非ステロイド系であり得る。好ましいステロイド系剤は、プレドニソンである。好ましい非ステロイド系剤としては、いわゆるエドモントン・プロトコールにおけるものが挙げられる：シロリムス（ラパムン、Wyeth-Ayerst Canada）、タクロリムス（プログラフ、Fujisawa Canada)および抗ＩＬ２Ｒダクリズマブ(ゼナパックス、Roche Canada)。他の免疫抑制剤としては、１５−デオキシスペルグアリン、シクロスポリン、ラパマイシン、ラパムン(シロリムス/ラパマイシン)、ＦＫ５０６またはリソフィリン（ＬＳＦ）が挙げられる。
【００５８】
本発明の実行のために有用な抗生物質の例としては、アモキシシリン、ペニシリン、サルファ剤、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クラリスロマイシン、シプロフロザシン、テルコナゾール、アジスロマイシン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
種々の酸化防止剤が、当業者に既知である。特に好ましいのは、チオール基を含む分子、例えば還元グルタチオン（ＧＳＨ）またはその前駆体、グルタチオンまたはグルタチオン類似体、グルタチオンモノエステルおよびＮ−アセチルシステインである。他の適切な酸化防止剤としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ビタミンＥ、トロロックス、リポ酸、ラザロイド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ビタミンＫなどが挙げられる。グルタチオンは、例えば、約２〜約１０ｍＭの濃度範囲で用いられ得る（例えば米国特許第５，７１０，１７２号；第５，６９６，１０９号および第５，６７０，５４５号参照）。
【００６０】
適切な抗サイトカインは当該技術分野でよく知られており、例としては、ジメチルチオ尿素（約１０ｍＭ）、シチオロン（約５ｍＭ）、プラバスタチンナトリウム（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ、約２０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ、２ｍＭ）、ラクトフェリン（約１００μｇ／ｍ１）、４−メチルプレドニソロン（約２０μｇ／ｍ１）等が挙げられる。
【００６１】
抗内毒素も当該技術分野で既知であり、例としては、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ、約２ｍＭ）、ラクトフェリン（約１００ｕｇ／ｍ１）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ、約１ｍＭ）、アデノシン受容体アンタゴニスト、例えばバミフィリン（テオフィリン）および抗リポ多糖化合物、例えばエキノマイシン（約１０ｎＭ）等が挙げられる。
【００６２】
さらに別の態様では、Ｔ細胞接着遮断剤が、島細胞を含有する植込み生体ポリマーに提供されて、免疫反応を抑圧する。これらの遮断剤の付加は、島移植の拒絶を防止する。Ｔ細胞接着遮断剤は、臓器移植および自己免疫疾患におけるＴ細胞活性化および免疫応答を抑圧することが示されている（Yusuf-Makagiansar et al., inhibition of LFA-1/ICAM-1 and VLA-4/VCAM-I as a therapeutic approach to inflammation and autoimmune diseases, Medicinal Chemistry Reviews 22, 146-167 (2002); Anderson and Siahaan, Targeting 1CAM-1/LFA-1 interaction for controlling autoimmune diseases: Designing peptide and small molecule inhibitors, Peptides 24, 487-501 (2003)参照）。Ｔ細胞接着遮断剤としては、（ａ）ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｂ７、ＣＤ２８、ＣＤ２およびＶＬＡ−４に対するモノクローナル抗体、（ｂ）可溶性タンパク質およびその断片、例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、（ｃ）ＲＧＤペプチドおよびペプチド模倣物、（ｄ）ＶＣＡＭ−１ペプチドおよびペプチド模倣物、（ｅ）ＩＣＡＭ−１ペプチドおよびペプチド模倣物、ならびに（ｆ）ＬＦＡ−１ペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）に由来するペプチド（例えば、ＧＡＤ２０８−２１７）およびＧＡＤ二機能性ペプチド阻害剤（ＧＡＤ−ＢＰＩ）は、免疫寛容を誘導し、そしてＴ細胞による島浸潤（膵島炎）を抑圧することが示されている。ＧＡＤ２０８−２１７は、Ｔ細胞：ＡＰＣ相互作用中のＴＣＲ−ＭＨＣ−Ａｇ複合体形成（シグナル−１）を調整することにより、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおけるベータ細胞を攻撃するＴ細胞の活性化を遮断することが示されている（Tisch et al., Induction of GAD65-specific regulatory T-cells inhibits ongoing autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice, Diabetes 47: 894-899 (1998)）。好ましいＧＡＤ−ＢＰＩは、ＬＦＡ−１ペプチド（配列ＥＩＡＰＶＦＶＬＬＥ−［Ａｃ−Ｇ−Ａｃ−Ｇ−Ａｃ］−ＩＴＤＧＥＡＴＤＳＧ）の一部分と連結されたＧＡＤ２０８−２１７を含み、そしてMurray et al., 公開米国特許第２００５／０１０７５８５（表題：Signal-1/signal-2 bifunctional peptide inhibitors）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記述されているように、ＮＯＤにおけるＴ細胞活性化および膵島炎を遮断することが示されている。したがって、これらの分子は、島移植片の拒絶を防止するために同時投与され得る。これらの分子は、制御放出機序によっても送達されて、島移植片の拒絶を防止し得る。したがって、当該分子が生体物質足場の内側に閉じ込められた後、ベータ細胞が足場に付着される。
【００６３】
このような作用物質の制御放出は、Raman et al., Modeling small-molecule release from PLG microspheres: effects of polymer degradation and nonuniform drug distribution, J. Control. Release. Mar 2;103(1):149-58 (2005)；Berkland et al., Precise control of PLG microsphere size provides enhanced control of drug release rate, J. Control. Release. Jul 18;82(1):137-47 (2002)；Schwendeman, Recent advances in the stabilization of proteins encapsulated in injectable PLGA delivery systems, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 19(1):73-98 (2002)；Sershen et al., Implantable, polymeric systems for modulated drug delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 5;54(9):1225-1235 (2002)（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される）に記述されたプロトコールを用いることにより、実施され得る。
Ｃ．  ディボット化微小鋳型上の島の産生
【００６４】
本発明は、生存可能な小型島のin vitro産生のための方法にも関する。一態様では、非胎仔ドナー膵臓から単離された分散化島細胞は、群で、微小鋳型の個々のディボットに配置され、培養されて再凝集島を形成するが、その形状およびサイズはディボット寸法の影響を受ける。
【００６５】
微小鋳型のディボットは、小型島の形成に適したサイズを有する。例えば、一態様では、微小鋳型は典型的には直径約３０〜３５ｍｍのオーダーの寸法を有するが、しかしこのサイズは産生方法により限定されるものではなく、３０×３０ｃｍまで勾配をなし得る。ディボットは、典型的には、直径約１００〜２００μｍ（±２０％）および深さ６０〜１００μｍ（±２０％）のオーダーの寸法を有する。好ましくは、島の産生のために、ディボットは、直径１００μｍ（±２０％）および深さ６０μｍ（±２０％）である。
【００６６】
別の態様では、微小鋳型は、移植またはin vitro試験に適した、最適に造形され、サイズ化された島の集団を生成するために用いられ得る。例えば、一態様では、微小鋳型で生成される島の集団は、５０μｍ以下の平均直径を有する。他の態様では、集団は、少なくとも８５％の生存可能細胞、好ましくは９０％または９５％より多い生存可能細胞により特性化され、さらに好ましくは、集団は９９％より多い生存可能細胞により特性化される。
【００６７】
さらに別の態様では、微小鋳型で生成される島の集団は、高レベルのインスリン分泌により特性化され得る。例えば、微小鋳型中で再凝集される小型島は、ネイティブ小型島に比してより高いレベルのインスリン分泌、好ましくは２０倍より多いインスリン分泌、さらに好ましくは１００倍より多いインスリン分泌により特性化される。例えば、再凝集島は、図２３で示されている約１０ｎｇ／ＩＥという分泌が測定された。これは、Crim et al., 2010からの最良算定値の４１倍である。実験室間でインスリン分泌データを比較するに際して難しいことの１つは、多くの研究者が島容積当たりのそのインスリン分泌を報告できない、という点である。Crim等の場合、彼等は５０個の島当たりのインスリン分泌を報告したが、しかし島の平均サイズを示さなかった。したがって、その５０個の島が各々、１島当量（ＩＥ）という前に明示された島容積と等価であった、と推定し得るだけである。ＩＥで割ることにより、島および細胞の総容積に関して正規化されるインスリン分泌を、われわれの実験室は常に報告している。Crim論文に関してなされる推測によれば、本明細書中に記載される再凝集島は、Crim等が報告した最良条件の４０倍を超える高グルコースに応答したインスリンを放出する。
【００６８】
本発明の一実施形態では、微小鋳型は、in vitro試験ならびに他のin vitro用途のために有用な細胞を作製するために用いられる。その実施形態では、微小鋳型表面は、好ましくは、ＰＤＭＳから作られる鋳型側面（ハウジング系）を有するガラス製である。
【００６９】
別の実施形態では、微小鋳型は植え込み可能であるよう作製され、生体適合性物質から作られる。その実施形態では、好ましい物質は、前に記載された任意数の生体ポリマーである。
【００７０】
別の態様では、微小鋳型ディボットは、非島細胞に最適物理的再形成条件を提供する。種々の型の細胞が本発明のディボット中に形成され得る、ということが意図される。非限定例としては、長いニューロン経路、糸球体様フィルター、血管、置換肺胞等が挙げられる。微小鋳型のような小型の良好に限定された形状の幹細胞または再プログラム化細胞の凝集も、本発明の適切な用途である。好ましい細胞型としては、三次元構造が細胞機能に重要であるものが挙げられる。
【００７１】
概して、図２４は、本発明の方法を示す模式図である。膵臓または他の島供給源から採取されたネイティブ大型島クラスターは、単一島細胞にばらばらにされて、ディボットを有する微小鋳型上に載せられる。「分散細胞」とは、大多数（典型的には少なくとも９０％）の細胞が単一細胞であり、二連物または三連物として一緒に結合される細胞の割合は低い、ということを意味する。分散細胞は、分散細胞の群を各ディボット中に沈積させるように微小鋳型に入れられる。好ましくは、３０〜１５０個の細胞が各ディボットに沈積する。
【００７２】
実施例５は、島を単一細胞に分散する好ましい方法、ならびに微小鋳型中での細胞のインキュベーションを開示する。好ましくは、解離は、KU Diabetes Research Laboratoryで処方された培地配合物中である。この配合物は、９部のカルシウム−マグネシウム無含有ハンクス平衡塩溶液と１部のパパイン（５０単位／ｍｌ）を含む。これに対比して、ほとんどの島解離は、トリプシンかまたはパパイン以外の酵素を用いて達成される。解離は、撹拌しながら３７℃で実行される。最後に、島を手動でピペット分取して、細胞の少なくとも９０％が単一細胞に分離されるまで血球計で観察することにより、島は単一細胞に分散される。実施例５は、微小鋳型内での島細胞の再凝集のための好ましい条件も開示する。概して、細胞は、図１４で特筆されるように、２日目を終えて、単一細胞として、または細胞の緩く付着された群として残存する。しかしながら、５または６日までに、ディボット中のその同一細胞は、しばしば球形である三次元構造に再編成した（例えば、図１８〜１９Ａおよび２１参照）。典型的には、５日目までに、再凝集島は鋳型からの除去に耐えて、独立した島として機能し得る。
【００７３】
この期間中に、細胞はネイティブ島の三次元形状をとる。ディボット中に形成される島の平均直径は、５０μｍ未満である。実施例５は、微小鋳型中で形成される小型島の形態学的性質を記載する。
【００７４】
本発明の一実施形態では、２または３個という少数の細胞が各ディボット中に在るよう、そしてディボット内の細胞が成長し、分裂し得るよう、低濃度で分散される細胞は微小鋳型に付加され得る。このようにしてディボット中で増殖される細胞化塊の形状およびサイズは、ディボットの物理的寸法により影響を及ぼされる。好ましくは、微小鋳型は島細胞を投入され、２または３個という少数の細胞が各ディボットを占有するよう濃縮されるが、この場合、島細胞は一緒に成長し、凝集して、好ましくは直径３０〜４０μｍの小型島を形成する。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、再凝集の時点で、化学物質または生物学的分子を工学処理島に組入れたい。これらの分子としては、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、抗炎症薬および抗生物質が挙げられる。特に、植込み型微小鋳型支持体が用いられた場合、移植部位での酸素張力を増大するための分子または小型デバイスが、再凝集島中に組み入れられ得た。再凝集の時点で付加され得る分子の他のクラスとしては、インスリン放出を誘導するための薬剤、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ,ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８に対する）、および核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
このような分子は、典型的には、微小鋳型への投入の時点で島に組み入れられ得る。分子は、それらが凝集中に細胞に取り込まれるかまたは細胞に接着するよう、分散細胞を有する培地に付加される。代替的には、細胞は、ユーザーの標的タンパク質の産生の増大または低減を生じる標準トランスフェクション法による再凝集前に修飾され得る。再凝集物の形成後、新規に形成された島は、免疫抑制因子または他の当該分子、例えば成長因子のような化学物質を保有する生体ポリマーで封入され得る。代替的には、植込み可能微小鋳型に関しては、鋳型は選り抜きの分子で充満され得る。
【００７７】
本発明の方法は、その後の移植のための、あるいは薬剤またはデバイス試験のための細胞凝集物を形成するよう意図され得る。実施例５は、移植片または薬剤スクリーニングのために細胞を再凝集するための好ましい方法、好ましくはそれを実行するための好ましい方法を記載する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、薬剤、化学物質または他の小分子の高処理量スクリーニングのための方法にも関する。本発明の微小鋳型の形状と寸法は、各ディボットにおける個々の相互作用に適応するように設計されることができると予期される。他の態様では、ディボット化された微小鋳型は、動物宿主に移植のために適したバイオポリマーから生産される。植込み可能な微小鋳型中に再凝集される細胞は、ディボット化支持体に接着し得るし、そうでないこともある、とわれわれは予見する。in vitro研究に関しては、非接着性支持体表面、例えばガラスが好ましい。しかしながら、植込み可能鋳型または生体ポリマーパッチに関しては、接着支持体は、移植プロセスの効率を増強し、移植中および移植後の島の損失を低減する。生体ポリマーへの細胞の接着は、試験され、表１および図８に記載されている。
【００７９】
本発明の付加的態様は、それに付随する利点および新規の特徴と一緒に、一部は以下の説明および実施例に記述され、そして一部は以下の検査時に当業者に明らかになるか、あるいは本発明の実行から習得され得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段および組合せにより実現され且つ獲得され得る。
【００８０】
本実施例は、ラットにおける移植成功に島サイズが如何に作用するかを調べた。この実施例では、島を単離するための技法が記載されており、細胞生存度が測定された。移植成功に及ぼす島サイズの作用を査定するために、大型島（１２５μｍより大きい）および小型島（１２５μ未満）の両方を移植した。以下で考察するように、小型ラット島は、in vitro機能およびin vivo移植結果において、大型島より優れている。これらの実験は、MacGregor et al.にも記載されている。小型ラット島は、in vitro機能および移植結果において、大型島より優れている（Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. May;290(5):E771-9 (2006)）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
ラット島単離
【００８１】
大型および小型島を単離するために、ケタミンおよびキシラジンの混合物の腹腔内注射により、成体雄ＤＡラットを麻酔した。腹膜腔を露呈し、小腸との膵管連結をクランプした。総胆管を介してin situで膵臓にカニューレ挿入し、胆管中にコラゲナーゼの冷却溶液をポンプ注入することにより拡張させた。コラゲナーゼ（ＣＬＳ−１、Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ）を、４５０Ｕ／ｍｌで２０ｍｌのレイボビッツＬ１５中に溶解した。その後、拡張膵臓を切り出して、５０ｍｌ遠心分離管に移し、３７℃インキュベーター中で静かに回転させながら、約２０〜３０分間インキュベートした。インキュベーション後、遠心管を静かに振盪して、島を追出した。管の内容物を、１０％の新生仔ウシ血清を含有する希釈氷冷ハンクス平衡塩溶液（「ＨＢＳＳ」）中に入れた。消化物を１×ｇで沈澱させて、上清を取り出した。さらに多くのＨＢＳＳ／血清を付加し、工程を反復した。洗浄消化物を５００ミクロンのステンレススチールスクリーンに通して、冷却遠心分離器で３００×ｇで約１分間沈澱させた。ペレットを１０ｍＬの１．１１０ｇｍ／ｍＬヒストパック（密度＝１．１０８５、Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, Missouri）と混合して、８００×ｇで１０分間遠心分離した。勾配上に浮遊する島を収集し、別個に沈澱させて、１０％の胎仔ウシ血清を含有するハムＦ１２培地中に入れて、５％ＣＯ２を含有する３７℃培養小室中に置いた。
収率
【００８２】
収率測定のために、島の各バッチの三重反復実験試料を検査した。各々は、約２％の島分画を含む。個々の島を計数し、それらの直径を測定した。不規則形状島に関しては、島上の異なる位置で３〜４つの直径測定値を取って、平均を用いた。島容積を算定し、島および全島分画に関する島等価値に変換した。約１２５μｍ以上の直径を有する大型島と比較して、小型島を約１２５μｍ未満の直径を有するものと定義した。
【００８３】
大型島から小型島を分離するために、新鮮な島または一晩培養した島を沈澱させて、次に、１〜２ｍｌのＬ１５培地中に入れた。次いで、Ｌ１５中の５％ＢＳＡの一段階勾配上で、島を迅速に層化させた。大型島が管の底に観察されるまで、経験的設定時間の間に１×ｇで沈澱が起きた。その時点で、勾配の上部２ミリリットル（ＢＳＡ含有せず）を捨て、全部ではあるが底の２ｍｌを注意深く取り出して、小島集団を限定した。沈澱島および底２ミリリットル中のものを、大型島分画として併合した。大型および小型島の分離を最適化する必要がある場合には、勾配を反復した。最終島分画を沈澱させて、グルコース感受性実験が実施されるまで、ハムＦ１２およびグルコース無含有ＲＰＭＩ  １６４０の１：１混合物（グルコース＝５ｍＭ）中の培養中に入れた。
生存度
【００８４】
生存度を試験するために、生／死蛍光体、Ｓｙｔｏｘ(Molecular Probes、１μＭ)およびカルセイン(Molecular Probes、０．５μＭ)を有するＬ−１５培地  ５００μｌ中に島を入れて、３７℃で約１５〜３０分間インキュベートした。島を、以下の：１３７  ＮａＣｌ、２．７  ＫＣｌ、４．３  Ｎａ２ＨＰＯ４および１．４  ＫＨ２ＰＯ４（ｍＭ）、ｐＨ７．４からなるリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、Diabetes Research Laboratoryに収容されたオリンパスＦｌｕｏｖｉｅｗ  ３００共焦点顕微鏡上のAttofluor Chamber (Molecular Probes)に入れた。４０×または６０×対物レンズを用いて、像を得た。培地から島を取り出して２０分以内に、全画像を収集した。Ｈｅ：Ｎｅおよびアルゴンレーザーならびに第三明視野像を用いて、各島に関して３つの同時画像を収集した。
【００８５】
図２に示したように、培養中に保持された大型無傷島（１２５μｍより大きい）は、ヒトでもラットでも、わずか４日後に、有意パーセンテージの壊死（１２．６％）およびアポトーシス（６．３％）細胞を示し、細胞死は経時的に増大する。小型島（１２５μｍ未満）は、生存可能性延長を示したが、しかし依然として、その後の時点で（１週間を超えると）急勾配の細胞死を示した。これらの小型島の生存度を、１週間までの間、追跡調査したが、それらは９９〜８６％の高生存度パーセンテージを維持する、ということが判明した。これは、１０個の無傷大型島と比較した場合で、大型島の生存度レベルは、培養中で数日後、５０％より低くなった。図２に示したように、ここの分散島細胞は、小型無傷島と同様に培養中で高い生存度プロフィールを維持する。
【００８６】
視野中の島を同定し、当該領域を丸く囲むことにより、生／死分析を完了した。バックグラウンド蛍光を、全画像から差し引いた。当該視野からフォトショップ（Adobe）を用いて色相ヒストグラムを展開して、緑色相（生）および赤（死）における総ピクセルを算定することにより、生存度パーセンテージを算定した。生細胞を総島面積で割って得られる比率を生値％として算定した。サイオン（Scion）ソフトウェアを用いて、島直径および周囲の長さを算定して、生存度値を島のサイズに従って類別した。
移植試験
【００８７】
移植成功に及ぼす島サイズの作用も調べた。実験では、ストレプトゾトシン（６５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射（１回）することにより、レシピエント動物に糖尿病を誘導した。血糖値が３連続日間に２５０ｍｇ／ｄｌより高くなったら、ラットは糖尿病とみなされた。
【００８８】
ラットを、ペントバルビタール  ４５ｍｇ／ｋｇで麻酔した。ラットを剃毛し、ベタジン・スクラブで清浄化して、左脇腹の体壁を切開した。腎臓を傷口に取り出して、腎臓被膜を小さく切開した。小穴ピペットを用いて、大型または小型島をその被膜下に置いた。腎臓を元の位置に戻して、切開部を創傷クリップで閉じた。食肉用ウシ／ブタ亜鉛−インスリン（ＮＰＩ−１  イレチンＩ）注射（２回／日）を島移植後３日間、レシピエントに投与して、新規移植島における高血糖のストレスを低減した。
【００８９】
大型または小型ラット島の移植を完了した（ｎ＝１０移植／群）。ストレプトゾトシン誘導性糖尿病ＤＡラットは、限界質量（１０００  ＩＥ）の大型（１５０μｍより大きい）または小型（１２５μｍより小さい）同系島を腎臓被膜下に受容した。血糖レベルを、８週間モニタリングした。図３（Ａ）および３（Ｂ）は、各群に関する最初の５つの移植片からの結果を示す。大型島のレシピエントはすべて、移植後に高血糖のままであった（１０匹中１０匹）。これに対比して、小型島の１０匹のレシピエントのうちの８匹は、移植の７〜１０日後に、正常レベルに近いかまたは正常レベルの血糖レベルを有し、これは全８週間中、正常のままであった。
【００９０】
腎臓被膜からの島移植片を、移植の８週間後に取り出した。組織を固定し、インスリンに関して免疫標識した。図４（左パネル）は、小型島移植を受けて、８週間正常血糖であった動物からの移植片を示す。移植片中のインスリンに関する実質的染色が認められた。これに対比して、図４（右パネル）では、大型島の移植を受けた動物は、８週間高血糖を継続し、移植片中のインスリンに関する免疫標識をほとんど示さなかった。
【００９１】
同時に前記の実験は、小型島（１２５μｍ未満）が、生存度、in vivo機能検定において、ならびに移植片結果において、大型島（１２５μｍより大きい）より優れている、ということを示す。さらに、平均的膵臓は大型島より約３倍多い小型島を産生し、小型島は約２０％以上生存可能であった。最も重要なのは、糖尿病動物に移植された場合、小型島が大型島よりはるかに優れていたことである。
実施例２：個々の島細胞または小型島細胞クラスターへの大型島の変換
【００９２】
この実施例は、無傷島を小型島細胞クラスター（例えば、図５に示したクラスター）および個々の島細胞に断片化するかまたは分散するための方法を例証する。慣用的酵素消化を用いて図６（Ａ）における小型島細胞クラスターを作製したが、一方、図６（Ｂ）における小型島細胞クラスターは段階的カルシウム枯渇により形成した。図６（Ａ）の画像が示すように、酵素的分散は島を小型島細胞クラスターに壊すが、しかし、それはクラスターを「散開」せず、したがってクラスター内部の細胞は数細胞厚みである拡散バリアを有する。これに対比して、カルシウム枯渇を用いて形成された小型島細胞クラスター（図６（Ｂ））に関しては、小型島細胞クラスターの各細胞に対する小型拡散バリアが存在するよう、クラスターは「散開」形態を有する。酵素消化とカルシウム枯渇の組合せを用いても、無傷島を小型島細胞クラスターに変換し得る（図６（Ｃ））、と予測される。
ａ．  酵素消化
【００９３】
異なる酵素カクテルを用いて、無傷島を小型島細胞クラスターおよび個々の島細胞に断片化し得る。例示的酵素消化方法は、米国特許第６，７８３，９５４号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されている。この実施例では、１２の酵素カクテル、例えばパパインを含む一カクテルを用いて、種々の程度に成功した。
【００９４】
膵島を単離するために、Sprague-Dawleyラットをケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射により麻酔した。腹膜腔を露呈し、小腸との膵管連結をクランプした。総胆管を介してin situで膵臓にカニューレ挿入し、胆管中にコラゲナーゼの冷却溶液をポンプ注入することにより拡張させた。その後、拡張膵臓を切り出して、遠心分離管に移し、３７℃で静かに回転させながら、約３０分間インキュベートした。洗浄消化物をスクリーンに通して、冷却遠心分離器中で沈澱させた。ペレットをヒストパック（密度＝１．１０８５、Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO）と混合して、遠心分離した。次いで、１０％の胎仔ウシ血清を含有するハムＦ１２培地中に入れて、５％ＣＯ２を含有する３７℃培養小室中に置いた。
【００９５】
ベータ細胞単離のための標準プロトコールは、４．８ｍＭのＨｅｐｅｓを有するハンクス平衡塩溶液（「ＨＢＳＳ」）中で無傷島（本明細書中に記載の技法を用いて単離）をインキュベートすることを包含した（Balamurugan et al., Flexible management of enzymatic digestion improves human islet isolation outcome from sub-optimal donor pancreata. Am. J. Transplant 3(9): 1135-42 (2003)参照）。酵素消化のために、最終９ｍｌのハンクス平衡塩溶液（１ｍｌのパパイン（５０単位／ｍｌ）を含有）を島に付加した。島を最初にピペットで静かに上下させて、完全なすすぎを確保した。島を管の底に沈澱させて、上清のほとんどを除去した。酵素中の島を、３７℃で約３０分間、ゆっくり回転した。この時点で、小型島クラスターが多少の単一分散細胞を伴って形成されたので、溶液から取り出した。典型的には、細胞を、最終培地としてのＣＭＲＬ  １０６６またはMemphis ＳＭＦに移した。
【００９６】
図５および６（Ａ）（酵素）で一般的に示したように、細胞をジチゾンで染色して、クラスター内のベータ細胞を同定した。
ｂ．  金属ベースの断片化
【００９７】
金属ベースの断片化アプローチを用いても、無傷島を小型島細胞クラスターおよび個々の島細胞に断片化し得る。金属ベースの断片化の興味深い知見は、結果的に生じる小型島細胞クラスターがあまり密でなく、「散開」形態を有する、という点である。細胞接着分子、例えばＥ−カドヘリンは、島を一緒に保持するが、しかし機能するために二価金属を要する（Hauge-Evans et al., Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets, Diabetes 48(7): 1402-8 (1999)参照）。したがって、カルシウム無含有培地中で約１時間、島を培養すると、酵素単独（密な島構造を生じる（図６（Ａ）参照））を利用する場合と比較して、島構造は「弛緩し」ならびに破砕する（図６（Ｂ）参照）。さらに、カルシウム枯渇を用いて島を「弛緩」した後、ベータ細胞の残りの集塊は、伝統的酵素によってより容易に分散される（図６（Ｃ）参照）。
【００９８】
金属ベースの断片化の詳細を、以下に示す。個々の島細胞および小型島細胞クラスターを得るために、島は、カルシウム−マグネシウム無含有ハンクス平衡塩溶液＋４．８ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ中に存在した。約３７℃で約３０分間インキュベーション後、細胞をピペット分取して、それらを小型島細胞クラスターまたは単一細胞中に分散した。細胞を、最終培地としてのＣＭＲＬ  １０６６に移した。必要な場合、小型島細胞クラスターまたはベータ細胞をジチゾンで同定した（Mythili et al., Culture prior to transplantation preserves the ultrastructural integrity of monkey pancreatic islets, J. Electron Microsc. (Tokyo) 52(4): 399-405 (2003)参照）。
【００９９】
図６（Ｂ）に示すように、カルシウム枯渇単独により得られる小型島細胞クラスターは不規則な管状配置を有し、これがクラスターのコアの還流のために最適であり得る。さらに、金属ベースの分散から得られるクラスターは、産生するのに約１時間掛かるだけであるが、一方、断片化への酵素アプローチは４８時間までを要し得る。
ｃ．  酵素消化および金属分散液の組合せ
【０１００】
分散技法として酵素消化および金属枯渇の組合せを用いる実験も実施した。無傷島を、４．８ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを伴うハンクス平衡塩溶液（カルシウムまたはマグネシウムを含有しない）９ｍｌですすいだ。島を最初にピペットで静かに上下させて、完全なすすぎを確保した。島を管の底に沈澱させて、上清のほとんどを除去した。島を繰り返し洗浄して、すべてのカルシウムおよびマグネシウムを除去し得た。
【０１０１】
最終９ｍｌのカルシウムおよびマグネシウム無含有ハンクス平衡塩溶液（１ｍｌのパパイン（５０単位／ｍｌ）を含有）を島に付加した。酵素中の島を、約３０分間ゆっくり（１０ｒｐｍ）回転した。この時点で、小型島クラスターを溶液から取り出した。中等度の速度で２〜３回、強くピペッティングすると、単一細胞を生じた。
【０１０２】
細胞を、２５℃で１５００ｒｃｆで５分間、遠心分離した。適切な培地（その後の検定によって）を用いて、単一細胞を再懸濁した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター中に保存した。図６（Ｃ）に示したように、酵素およびカルシウム枯渇法の組合せは、小型島細胞クラスターまたは単一細胞を生じる。さらに、組合せは、全体的により迅速な分散プロトコールであったが、しかし、細胞を過剰に消化および損傷しないよう、用心しなければならない。
【０１０３】
これらの実験において、ＹＯ−ＰＲＯ−１およびヨウ化プロピジウム（Vibrant Apoptotic Assays, Molecular Probes）を用いて、壊死およびアポトーシス細胞を確定した。検定のために、細胞を、オリンパスＦｌｕｏｖｉｅｗ  ３００レーザー共焦点顕微鏡上のAttofluor Chamber (Molecular Probes)中にＰＢＳとともに入れた。培地から島を取り出して２０分以内に、全画像を収集した。Ｈｅ：Ｎｅおよびアルゴンレーザーならびに第三明視野像を用いて、各島に関して３つの同時画像を収集した。透過光を用いて視野中の細胞を同定することにより、生／死分析を完了した。緑色細胞はアポトーシスを示し、一方、黄色／赤色は壊死細胞死を示す。蛍光発光を欠く細胞は、生きていた。蛍光画像に、透過光画像を被せた（灰色）。
実施例３：パッチ生体物質足場上での個々の島細胞および小型島クラスターの調製
【０１０４】
前記の実施例は、小型島細胞クラスターが、そして個々のベータ細胞でさえ、酸素、グルコース等を運搬するための最高に達成可能な自由表面積を表すはずであることを示している。したがって、この実施例では、個々の島細胞または小型島細胞クラスターを、生体物質足場物質、例えば図７に一般的に示したようなパッチ上に鋳型化して、多層の島細胞を形成した。
足場物質のスクリーニング
【０１０５】
この実施例では、生体物質への島細胞の相対的接着を測定することにより、本発明の足場を調製するために有用な種々の生体物質の最適化を調べた。足場物質が、組織および生体物質を解離し戻すことなく取扱い易く、容易な植込みを可能にする、というのが好ましい。表１は、ベータ細胞との相互作用に関して選択された広範な種々の生体物質を示す。これらの物質のいくつかは、植込物としての使用の歴史を保有する。
【０１０６】
典型的一実験では、列挙生体物質の１％ストック溶液を先ず調製した。ほとんどの物質が、中性ｐＨで脱イオン水中に溶解した。キトサンは、溶解する（塩酸を用いた）ために約５．５という低ｐＨを要し、そして他の物質は、有機溶媒を要した；例えば、エタノール中のセルフォーム（商標）、およびジクロロメタン中のポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）。常態で水に溶解するポリマー（例えば、硫酸デキストラン、ある儀ネート等）は、架橋して、皮膜マトリックスを形成し得る。約２５μＬの各ストック溶液を９６ウェルプレート中の３つの個々のウェルに付加して、放置蒸発させるか、または真空乾燥し、したがって、各ウェルの底に薄い生体物質皮膜を沈澱した。残留溶媒内容物は微量で、細胞中で毒性を誘導しなかった。ウェルプレート（例えば、フィブロネクチン、ラミニン等）上の細胞接着を促進するために商業的に提供されるいくつかのタンパク質を、同様に細胞接着のために予備スクリーニングした。
【０１０７】
ベータ細胞の希釈懸濁液を、９６ウェルプレート中で一晩インキュベートし、３回洗浄して、非結合ベータ細胞を除去した。ベータ細胞懸濁液は均質であった。等アリコート／ウェルは、同様の量のベータ細胞を含有すると推定された。全細胞数を、生体物質皮膜を含まないウェルからの細胞数に正規化した。概して、軽度疎水性ポリマーは、ベータ細胞を接着するために良好に働いた（表１）。
【表１】
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【０１０８】
生体物質上にプレート化し、その後、３回洗浄した後、付着細胞の数を計数することにより、細胞接着を確定した。以下のケイ酸を用いて、生体物質を欠いているウェル底（空ウェル、対照を参照）に付着する細胞の数に、計数を正規化した：当該ウェルに付着した細胞数／空ウェル中の細胞数。各実験を、三重反復実験で反復した。
【０１０９】
概して、軽度疎水性ポリマーは、ベータ細胞を接着するために良好に働いた。光学顕微鏡写真は、細胞形態が生体物質によっても影響される、ということを示した。キトサン（ＭＷ＝１００ｋＤａ）上のベータ細胞は、平滑な丸みのある表面を示したが、一方、ラミニン上のベータ細胞は、広がった、しわくちゃの形態を実証した（図８参照）。ラミニン支持体上のベータ細胞中のアクチンの蛍光染色は、強固な細胞接着を示唆する強蛍光性細胞骨格焦点を明示した。
島細胞パッチの調製
【０１１０】
この実施例では、ＰＬＧＡを含む島細胞を生体物質足場パッチに結合した。血管新生化ランゲルハンス島では、ベータ細胞の血管からの距離は２５μｍ以下である（Wayland, Microcirculation in pancreatic function, Microsc. Res. Tech. 37(5-6): 418-33 (1997)参照）。ベータ細胞は直径約１０μｍであるため、約３つの細胞の細胞層厚はネイティブベータ細胞環境をほとんど正確に模倣する、と予測される。
【０１１１】
概して、島は、前記のように、ラット膵臓から単離され、単一細胞または小型細胞クラスターに分散された。ＨＢＳＳ培地（０．５ｍｌ）中の島細胞および小型島細胞クラスターを各ウェルに付加し、３〜４時間、生体物質上で培養させた。ウェル中の生体ポリマーを有するプレートを、室温で３５００ｒｐｍで約１０分間、遠心分離管中で回転して、細胞が生体ポリマーに付着するのを手助けした。培地の半分を各ウェルから除去して、新鮮な島細胞または小型島細胞クラスター懸濁液を含有する培地に取り替えて、付着させた（重力により、または遠心分離により）。これを３回反復した。これらの実験の結果を、図９に示す。遠心分離せずにポリマー上で培養される細胞と比較して、遠心分離法を用いた場合、反復洗浄後に、島細胞のさらなる層をポリマーのパッチに付着し得る。約３〜４層の細胞が、繰り返し培地を変えながら、０．５８ｄＬ／ｇ（ＨＦＩＰ中）または０．９ｄＬ／ｇポリマーで、５０：５０ＰＬＧＡに一貫して付着されたままである。ベータ細胞層の厚みを制御するために、反復沈着サイクル中の各ウェルに付加される細胞培養の容積および／または各ウェルに付加されるアリコートの数を制御し得る。
実施例４：生体物質足場上の島細胞の予測試験
【０１１２】
この実施例では、それに付着される多層の島細胞を有する生体物質パッチをさらに調べる。生存度測定およびインスリン産生検定を実施する。さらに、糖尿病の治療のための植込み可能なデバイスとしてのデバイスを調べる。
【０１１３】
生存度測定値    前記のように、アポトーシス対壊死実験を完成する。３つの試料に関して、０、１、３、７、１４および３０日目に、ネイティブ島との比較のために、ベータ細胞層の横断面積当たりで、生細胞パーセンテージを算定する。生存可能細胞パーセント対時間としてデータをプロットして、ｔ検定を用いて、異なる数のベータ細胞層に関する生存度傾向間に統計学的有意差が存在するか否かを確定する。さらに、壊死またはアポトーシスに起因すると考えられる細胞死のパーセンテージを記録する。
【０１１４】
インスリン産生検定    低グルコース（３ｍＭ）、高グルコース（３０ｍＭ）および高グルコース／減極（２５ｍＭ  Ｋ＋）（Dean 1989）の条件下で、静的インキュベーション（ＥＬＩＳＡ）を用いて、インスリン産生を測定する。１２ウェルプレート中の各ウェルを、３７℃および５％ＣＯ２で、新鮮な培地を用いて予備インキュベートする。実験的測定のために、３または３０ｍＭグルコースを含有する新鮮な培地中で２時間、種々のベータ細胞パッチをインキュベートする。ＮａＣｌを適切に減少させ、２５ｍＭのＫＣｌを含有する３０ｍＭグルコース中で、ウェルの付加的一群をインキュベートする。各パッチ型を、試験される各条件に関して、三重反復実験で評価する。ＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて、インスリン含量に関して培地試料を検定する。標準偏差を用いた三重反復実験資料の平均として結果を表し、統計学的有意に関してｔ検定を用いて比較する（MacGregor et al., Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290(5); E771-779 (2006)）。
【０１１５】
パッチおよび島の植込み    糖尿病を、成体レシピエントにおいて誘導する。糖尿病耐性BioBreeding（ＤＲＢＢ）Worcesterラットは、ヒトにおけるＩ型糖尿病に対応する自己免疫性糖尿病の一モデルである。４週齢ラットを、Biomedical Research Models, Inc.から購入する。動物を無作為に２つの群に分ける：パッチ・レシピエントと島レシピエント（６匹／群）。糖尿病の誘導のために、ＤＲＢＢラットを、抗ＲＴ６モノクローナル抗体（Dale L. Greiner博士（マサチューセッツ大学医療センター：University of Massachusetts Medical Center）の御厚意により提供された）および非特異的免疫系活性剤ポリＩ：Ｃ（Sigma；５ｕｇ／体重１ｇ、週３回注射）の組合せで処置する。３週間に亘って注射を施す。反復高血糖（血糖レベル＞２５０ｍｇ／ｄｌ；３連続日間）の日に、糖尿病とみなされ、処置は終わる（Semis 2004）。この方法を用いて、ラットの９５％が第３週の終わりまでに糖尿病になる。ベータ細胞パッチおよび島の植込みを、腎臓被膜下で実行する。ＤＡ（Dark Agouti）ラットは、ベータ細胞ドナーとして役立てる。ラットをペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、左脇腹の体壁に作った傷口に腎臓を取り出した。中等度の切開を腎臓被膜に作って、ベータ細胞パッチを被膜下に置いた。可変性生体物質および／または細胞層厚を有する最低４つのパッチを植込む。島移植片は典型的には、小穴ピペットを通したより小さい切開および注入を要する。レシピエント群は、移植用の１０００または２０００ＩＥの島、または等価量のパッチ支持体上ベータ細胞を施される。性能の有意の改善（パッチ型対島）は、成功のために最低限必要な島（１０００ＩＥ）が移植され、高島容積（２０００ＩＥ）と比較される場合、検出可能であるはずである。食肉用ウシ／ブタ亜鉛−インスリン（ＮＰＩ−１  イレチンＩ）注射（２回／日）を島移植後３日間、レシピエントに投与して、高血糖のストレスを低減する。
【０１１６】
糖血症のin vivo確定    ラットの血糖を４週間モニタリングして、パッチまたは島植込片が正常血糖を誘導し得るか否かを確定する。動物の糖血制御の後には、毎日血糖測定を行なう。Freestyleグルコース計（TheraSense）を用いて、最初の３週間は毎日、次いで２回／週で、尾から血液試料を得ることにより、血漿グルコースレベルをモニタリングする。一般的に、糖尿病の回復は、島移植の２４時間以内に達成され、同様の結果は、パッチを用いて達成されるはずである。
【０１１７】
外植ベータ細胞パッチの分析    パッチまたは島は、免疫染色（インスリンおよびグルカゴン）、生存度測定およびアポトーシスの検出のために、１４または３０日後に回収される。いくつかの場合、正常血糖を達成しているラットを８週間保持した後、分析する。インスリンおよびグルカゴンに関して、抗体を用いて、切片に関する免疫組織化学検定を成し遂げる。比色分析を用いて画像を処理して、染色の各々に関して陽性である横断領域を確定する。陰性対照スライドを調製し、分析する。最初に、ジチゾン染色を用いて、ベータ細胞を同定する。末端でオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）検定を用いて、細胞アポトーシスを示すＤＮＡ断片化を成し遂げる。従来実行しているように、１０％ホルマリンを用いて（パラフィン包埋）、組織学検査のためにパッチまたは島を調製する。ＴＵＮＥＬキット（in situ細胞死検出キット；Roche Diagnostics）を用いて、組織学的切片を標識する。研究者には上方を伏せて、ＴＵＮＥＬ＋細胞の数および分布に関して、パッチおよび島をともに分析する。組織学的切片の画像を、島の完全３Ｄ画像に再構築する。このようにして、単一島全体のアポトーシス細胞を同定し得る。切片をヘマトキシリンで対比染色して、光学顕微鏡下で可視化する。島内のインスリン分泌細胞を同定するために、抗インスリン抗体を用いて、試料を標識して、ローダミン二次抗体で検出する。アポトーシス分析のために移植後に最低で１０島／ラットを収集すると予測する。陰性対照スライドを、必要な場合は調製する。ＴＵＮＥＬ分析のほかに、コア顕微鏡設備を用いたその後の電子顕微鏡検査のために、パッチを固定する。ベータ細胞層の、ならびに浸潤細胞の同定を、このようにして実施する。
実施例５：微小鋳型を用いた最適サイズ化細胞の調製
【０１１８】
この実施例では、細胞を再凝集するための付加的デバイスを開発し、設計した。そして支持体の表面に蝕刻された多数の個々のディボットを有する微小鋳型を生成するための方法を記載する。
【０１１９】
概して、膵臓をネイティブ大型島（１５０μｍより大きい）およびネイティブ小型島（１２５μｍ未満）にばらばらにする。大型および小型島を分離し、小型島を培養中に入れる（いくつかの実施形態では、小型島クラスターは、後に、新規再凝集島に付加し戻される）。大型ネイティブ島は、単一細胞懸濁液に分散されて、微小鋳型中に沈澱させられる。微小鋳型中に投入した細胞の数により、生成される島のサイズを操作し得る。細胞懸濁液によって、典型的には２０〜１００（＋／−２０％）細胞が各ディボット中に落ちて、互いに結合して、新規の再凝集小型島を形成する。個々のディボット中の単一細胞を、ネイティブ小型島に似た３Ｄ構造の形成を促すための条件下で培養するが、この場合、再凝集島のサイズおよび形状は、ディボットのサイズおよび形状により影響を及ぼされる。濃縮（懸濁液中の細胞密度を測定することによる）によりディボット中の細胞の数を変える能力は、非常に小型（３０μｍ以下）の、または中サイズ（５０〜９０μｍ）の再凝集島を生成させる。この制御は、化学療法試験のためのミニ腫瘍のような他の３Ｄ細胞構造を形成する場合に、重要であることが分かる。
【０１２０】
上記実施例３の生体物質足場パッチと違って、この実施例で記載されるディボット化微小鋳型は、支持体表面に付着するために細胞を必要としない。以下で考察するように、微小鋳型中に再凝集される島細胞は、最適にサイズ化され、生存可能であり、微小鋳型由来の細胞集団は、高生存度パーセンテージおよび高レベルのインスリン分泌により特性化される。
微小鋳型の開発
【０１２１】
物理的再凝集環境としてのディボット    最適サイズ化小型島に単一細胞を再凝集しようと努力して、物理的に制約された環境における島の形成が再凝集中の島塊の形状を誘導する、と仮定した。この終わりまで、最適物理的再凝集環境は、所望の細胞最終生成物の形状およびサイズの両方に類似する、と確定した。われわれの最初の実験に用いた寸法範囲（直径１００μｍ、深さ６０μｍ）は、直径５０μｍ以下（平均）の再凝集島の生成のために最適である。深さ６０μｍは、それらをより小さい片に壊すことなく、再凝集島を容易に回復させる。各再凝集環境における丸底は、ほぼ球形への細胞塊の再凝集を誘導した。「ディボット」としての丸底を含めた特定寸法を有するこれらの物理的再凝集環境に言及する。ディボットの寸法および配置は、ユーザーの要求に従って変更し得る。
【０１２２】
微小鋳型設計    最適サイズ化小型島の集団を生成しようと努力して、多数のディボットを含む表面を含有する微小鋳型を設計した。この微小鋳型中のディボットの寸法、ならびに微小鋳型内のそれらの互いの空間的関係は、ユーザーにより特定された。オートキャド・ソフトウェアを用いて、微小鋳型の電子テンプレートを作成した。テンプレートは、鋳型表面のディボットのサイズ、形状および分布を正確に叙述する。ディボット化支持体は、鋳型ハウジングとして本明細書中でも言及される漏出を伴わずに液体を含有し得る大型ハウジング内に設定される（図１０）。微小鋳型および微小鋳型内のディボットの両方の寸法は、ユーザーの要求に従って変更され得る。例えば、目標が薬剤試験のために鋳型を用いることである場合、ディボット当たり大容量の試験化合物を保持するために、より大型のまたはより深いディボットが試験され得る。当該細胞が島でない場合、ディボットの寸法は、当該細胞型に関する最適再凝集または成長判定基準を満たすよう、別の方法で特定され得る。
【０１２３】
ディボット化表面のための支持体    支持体を選択する場合に重要であるいくつかの物理的特性が存在する。二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）ベースの支持体の使用は、緩衝化フッ化水素（ＨＦ）酸溶液での湿式蝕刻のために好ましい。ＨＦ酸は、ＳｉＯ２分子を反応させることにより、支持体を蝕刻する。さらに、微小鋳型のin vitro使用に関しては、細胞が接着せず、ディボットから再凝集島を容易に除去し得る支持体を選択するのが好ましい。透明支持体は、別のプレートに移さずに、顕微鏡下でディボット内の内容物を見ることを可能にする。滅菌可能な支持体は、再利用可能な鋳型を提供する。ガラスは、これらの特質のすべてを示すので、非植込み式微小鋳型のための理想的支持体として選択された。さらに、ユーザーは、製造中のガラスの厚みおよび寸法を特定して、微小鋳型をさらにカスタマイズし得る。ガラスは、低経費溶液も提供するが、しかしこの物質は植込み可能でない。
【０１２４】
鋳型ハウジングを開発するために、支持体におけるいくつかの特性が必要である。鋳型ハウジングを造るために選択される物質は、ユーザー明細事項に従って成形される能力を有するべきである。これは、それが、鋳型に注ぎ入れ得る液体として出発し、時間および温度に伴って固まって、蝕刻支持体周囲に固体特徴を形成する、ということを意味する。ポリマーは、好ましくは、滅菌可能である。それは、典型的には、鋳型から液体が漏出するのを防止するために、疎水性である。Sylgard１８４ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、これらの鋳型のために理想的である。それは、滅菌され得るし、疎水性であり、鋳型に容易に注入され得て、固体生成物に硬化し得る。さらに、それは、長時間に亘って、−４５〜２００℃の範囲の温度で用いられて、凍結および蒸気滅菌の両方を可能にする。ＰＤＭＳは、約２時間の作用時間を有し、次いで、室温で硬化されるかまたは熱硬化（約２００℃まで）され得る。明細事項を製造するために混合されるＰＤＭＳは、ガラス支持体に張り付く能力を有して、さらに鋳型中から液体が漏出するのを防ぐ（Mata et al., 2005）。ガラスおよびＰＤＭＳを用いて設計される微小鋳型は、具体的には、in vitro実験のために設計され、in vivo使用には適していない。光蝕刻法を用いないが、しかしむしろ先ず陰型スタンプを製造することにより作られる、in vivo目的のために用いられる植込み可能鋳型を、以下に記載する。
【０１２５】
ここまで生成された微小鋳型フォトタイプは、ディボットが蝕刻されたガラス支持体で構成された。ディボット支持体は、ユーザーの要求を満たすよう切断され得る。例えば、支持体は、標準顕微鏡スライドのサイズに切断され得た。ここまで作製された一原型では、ソーダ石灰ガラス支持体が、直径３３ｍｍおよび厚み３ｍｍの円形に切断された。
【０１２６】
支持体表面の調製    ディボット処理されるべき支持体の表面を、窒素ガスで清浄にして、大型粒子を除去した。酸および塩基ピランハ溶液を用いて、支持体を深いところまで清浄にして、有機化合物ならびに金属沈着および光蝕刻を妨害し得る物質を除去した。その後、支持体を３０〜６０分間、焼き固めた。大型粒子および有機化合物を表面支持体から除去するための他の方法が、当業者により用いられ得る。一旦支持体表面が清浄にされたら、金属の層（３００ｎｍクロム）を、Lesker薄皮膜沈着系を用いて、支持体にスパッタリングした。支持体に薄い金属層を適用するための代替的技法は、当該技術分野で既知であり、利用され得る。
【０１２７】
光蝕刻法    ＡＺ１５１８ポジティブ・フォトレジスト（１ｍｌ）の被膜を、スピンコーター（Brewer CEE100 Programmable Spin Coater）を用いて、沈着金属の上部に適用した。スピンコーターを、フォトレジストの１．８ミクロン層を生じるよう設定し、その後、１００℃で２分間、穏やかに焼き固めた。冷却後、フォトマスクを有するガラスを紫外線（ABM UV Flood & Mask Alignment System）に４秒間曝露した後、ＡＺ  ３００ＭＩＦ現像液中に３０秒間浸漬した。支持体を軽く掻き混ぜた。次いで、支持体を１００℃で８〜１０分間焼き固めた。その後、蝕刻工程を手助けするために掻き混ぜながら、ＣＲ７Ｓクロム蝕刻液中に浸漬することにより、フォトレジストにおける展開パターンをクロム層に蝕刻した。画像を出現させるためには、３０〜４５秒の浸漬を要する。支持体を水で軽く洗浄し、窒素で乾燥して、湿式蝕刻法の準備をした。これにより、クロムおよびフォトレジストで層化されたガラス片が生じたが、クロムまたはフォトレジストが存在しない場合には、表面に開口スポットを含入する。これらの非被覆スポットはガラス表面を湿式蝕刻工程に曝露するが、一方、クロムおよびフォトレジストで覆われた領域は蝕刻溶液からガラス表面を防護する。これにより、非被覆領域のディボットが蝕刻される。それぞれ２０：１４：６６の比のＨＦ：ＨＮＯ３：Ｈ２Ｏの溶液中で、湿式蝕刻を成し遂げた。オービタル・シェーカーで低速で振盪しながら、支持体を溶液中に１８分間浸漬した。この浸漬中、ＳｉＯ２と反応することにより酸がガラスを攻撃し、したがってクロムおよびフォトレジストマスクで覆われていないガラスの可視部分を溶解して、表面上に均一ディボットを作製した（図１１）。この溶液は、４〜５μｍの深さ／分（溶液の鮮度によって）というおよその蝕刻率を生じる。オービタル・シェーカーでの撹拌は、表面の均一蝕刻を保証する。
【０１２８】
その後、支持体を炭酸カルシウムで、次いで水で洗浄して中和し、余分量の酸を除去して、最後に窒素で乾燥した。余分量のクロムが支持体上に残存した場合、クロム蝕刻液中にさらに浸漬し、アセトンおよび水で洗浄して、あらゆる残存物を除去することが必要である。最後に、支持体を窒素で乾燥した。粗面計を用いて、ディボット深度および直径を測定した（図１２）。これまで作製されたフォトタイプでは、ディボットサイズの可変性は問題ではなかった；原型ディボットは、特定寸法の＋／−１０％を示した。
【０１２９】
鋳型を作製するために用いられ得る２つの他の予測的方法を考えてみる：
【０１３０】
ＳＵ−８陰型鋳型：  この実施形態では、ガラスを再び支持体として用いる。ガラスは前記と同様の光蝕刻工程を受けるが、しかし元の設計を変更して、陰テンプレート鋳型を作製し、これは次に微小鋳型に変換され得るが、しかし、列挙された生体ポリマーのうちの１つをスタンプ上に注いで、それを硬化させる。要するに、ＳＵ−８フォトレジストを、厚い層で回転被覆する（層の厚みはディボットの所望の深さと等しいはずである）。それは次に穏やかに焼き固められ、フォトマスクで被覆されて（上記と同様）、紫外線に曝露され、曝露後再び焼き固められ、ＳＵ−８現像液中で現像されて、最後に現像後焼きされる。これにより、設計明細事項に基づいてディボットの負の突出部を有するガラス片が生じる。次にこの陰テンプレートを用いて、硬化時に鋳型印プリントを作製することにより、所定の生体ポリマーまたはＰＤＭＳで鋳型を成型する。完成ポリマーはＰＤＭＳ／ガラス微小鋳型に似ており、限定寸法のディボットを有する。この手法の一利点は、薬剤試験または他の用途のために、各ディボットは独特の識別子（例えば、字句、番号）により設計段階中に標識され、各ディボットにより可視的インプリントとして完成鋳型中に存在する、という点である（図２８参照）。さらに詳細な工程は、メーカーの加工処理ガイドライン（SU-8 2000 - Permanent Epoxy Negative Photoresist, MicroChem, Newton, MA）に記載されている。
【０１３１】
蝕刻金属鋳型陰型：    この実施形態では、金属成型鋳型を用いてポリマー鋳型を作製する。金属成型は、ＣＡＤソフトウェアで３Ｄモデルを設計することにより、製造し得る。考え得る一デザインを、図２７に示す。金属をレーザー蝕刻して、上記のＳＵ−８鋳型と同様の成型鋳型を作製する。ポリマーを金属成型鋳型上に注いで、硬化させて、新規の微小鋳型を作製する。さらにまた、必要な場合は、字句または番号を３Ｄモデルに組入れて、上記のように各ディボットを標識して、可視的インプリントをあとに残す。
【０１３２】
ＳＵ−８および蝕刻金属テンプレートを開発して、in vitroおよびin vivo使用の両方のために所定の物質から鋳型を製造する方法を可能にする。さらに具体的には、これらの方法は、植込み得る鋳型を作製するために生体ポリマーを利用し得る。これらの方法は、より詳細なデザイン（例えばディボット標識）およびディボット作製、形状およびサイズにおけるより多くの制御（ディボット測定の可変性は特定寸法の＋／−１％未満であるべきである）も可能にする。
【０１３３】
ディボット化支持体に関するハウジングの構築    微小鋳型を構築する場合の次の段階は、ディボット化表面を配置し、固定する系を、そして培養のための大型容器として役立つ系を開発することである（図１０のＰＤＭＳ「ハウジング」参照）。
【０１３４】
鋳型ハウジングの基部［６］および垂直壁［５］を、Dow Corning Sylgard 184 ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて造った（図１３）。ＰＤＭＳを１０部塩基対１部硬化剤の比率で、５０ｍｌ遠心分離管中で混合した（〜２時間の稼動時間）。その管を十分に混合して、塩基および硬化剤を完全に分散した。渦巻き撹拌を用いて、この工程中の混合を手助けした。ＰＤＭＳを、１０００〜１５００ｒｐｍで１分間遠心分離して、空気泡を除去した。ＰＤＭＳ以外の物質を用いて、微小鋳型のための適切なハウジングを構築し得る。例えば、多用途in vitro適用を意図される微小鋳型に適した物質としては、が挙げられるが、これらに限定されない。植え込まれる（in vivo使用）微小鋳型は、生体ポリマーから鋳型のディボット化表面および側面の両方を有して形成される。しかしながら、側面の高さは最低限で、移植物質の総容積を低減するために移植前に除去され得る。
【０１３５】
in vivo適用のために意図される微小鋳型に適した物質としては、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（ホスファゼン）等が挙げられるが、これらに限定されない。他の非限定的物質としては、例えば、多糖、ポリエステル（例えばポリ（乳酸）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸））、ポリ（乳酸−コ−リシン）、ポリ（乳酸−グラフト−リシン）、ポリ無水物（例えば、ポリ（脂肪酸二量体）、ポリ（フマル酸）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（カルボキシフェノキシプロパン）、ポリ（カルボキシフェノキシヘキサン）、これらの単量体のコポリマー等）、ポリ（無水物−コ−イミド）、ポリ（アミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（イミノカルボネート）、ポリ（ウレタン）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（ホスフェート）、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ならびにその他のアシル置換セルロースアセテートおよびその誘導体、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カルボネート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アクリレート）、ポリアセタル、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（スチレン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（フッ化ビニル）、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、コポリマー、ポリスチレン、およびその配合物またはコポリマー）が挙げられる。ある好ましい態様では、生体物質としては、多糖、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、Ｎイソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡ）、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンイミン、キトサン（ＣＳ）、キチン、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ゼラチン等、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよびその混合物が挙げられる。他の適切な生体物質としては、Vats et al., (2003)；Wang et al., (1997)；およびOrive et al., (2003)に記載されたナイロン、ヒアルロナン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルホルムアミド等が挙げられる。
【０１３６】
鋳型ハウジングの形状は、銅足場を用いて形成された（図１３）。一大型銅管（直径１．７５インチ）［１］を、平坦表面［４］（例えば、アルミ箔で包まれた大型正方形のガラス）上に開口面を下にして、配置した。２ｍｍの深さに開口して、鋳型ハウジングの基部［６］を形成する管の中心にＰＤＭＳを付加した。次に全構造を、炉中で１００℃で４５分間、焼き固めた。焼いた後、硬化ＰＤＭＳ基部［６］の上部の銅管（破線は、大型銅管に対する蝕刻ガラス［４］の位置を示す）の中心に、ディボット側を上にして、ディボット化支持体を配置した。
【０１３７】
少量のＰＤＭＳを、ディボット化支持体の縁に付加して、それを硬化ＰＤＭＳ基部［６］の中心に固定した。次にその構造物を、１００℃で３０分間焼き固めた。小型銅管［２］（直径１インチ）を蝕刻支持体の上部で中心に置いて、ＰＤＭＳを、大型［１］および小型［２］銅管間の間隙に注ぎ入れた。この段階を注意深く実行して、鋳型の中央にＰＤＭＳがこぼれないようにした。大型［１］および小型［２］銅管間の間隙に注入されるＰＤＭＳの量は、鋳型ハウジング［５］の高さを決定する。鋳型ハウジングの高さおよび幅は、ユーザーにより特定され得る。次いで、微小鋳型（銅ハウジング足場を含む）を、１００℃で一晩（少なくとも１２時間）焼き固めて、ＰＤＭＳを完全に硬化する。
【０１３８】
一晩焼いた後、銅足場枠組みを、以下のように除去した。全構造［１］〜［７］を冷却して、ＰＤＭＳを収縮して、銅管足場からの鋳型の取り出しを可能にした。冷却に要する正確な時間は、温度によって決まる；−２０℃では、３０〜６０分で十分である。底箔／ガラス層［４］および小型銅管［２］を、注意深く取り出した。次に、大型銅管［１］を、微小鋳型から分離した。
【０１３９】
微小鋳型の滅菌    好ましくは、本発明のディボット含有表面は、滅菌可能である。一実施形態では、完成微小鋳型が足場を有さない場合、それは、そして使用のために必要な場合は、洗浄され、滅菌され得る。エタノールおよび蒸気滅菌が滅菌の好ましい方法であるが、しかし、当業者に既知の他の滅菌方法は適切である。微小鋳型中にＰＤＭＳを用いる場合は、アセトンを用いるべきでない。同様に、ディボット化支持体または鋳型俳人具に用いられる物質の完全な状態を危うくする滅菌手法は、用いるべきでない。滅菌は、in vitro使用のために微小鋳型を繰り返し使用可能にする。明らかに、in vivo植込みに用いられる鋳型はこの要件を有さない。
微小鋳型内の細胞再凝集
【０１４０】
微小鋳型への細胞の送達    島を再凝集するために用いられる単一分散島細胞は、島細胞の任意の供給源から得られる。この実施例では、総胆管を介してin situで動物膵臓にカニューレ挿入し、胆管中にコラゲナーゼ（Worthington, Lakewood, NJ）の冷却溶液をポンプ注入することにより拡張させた。その後、拡張膵臓を切り出して、遠心分離管に移し、３７℃で静かに回転させながら、３０分間インキュベートした。次いで、洗浄消化物をスクリーンに通して、冷蔵遠心分離機中で沈澱させた。その結果生じたペレットをヒストパック（密度＝１．１０８５、Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO）と混合して、遠心分離した。次に、５％ウシ血清を有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を用いて４０μスクリーンを通して濾過することにより、島を清浄化して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および１％抗生物質を含有するペトリ皿中に入れた。島を、５％ＣＯ２で３７℃で一晩保持した。
【０１４１】
島を単一細胞に分散するために、単離島を、５０ｍｌ遠心分離管中に入れて、遠心分離して、ペレットを１．５ｍｌマイクロ遠心分離管に移すことにより、生存可能細胞懸濁液に消化した。カルシウム−マグネシウム無含有ＨＢＳＳで２回洗浄後、９部のカルシウム−マグネシウム無含有ＨＢＳＳおよび１部のパパインの混合物（最終濃度５Ｕｍｌ）を付加した。回転機上で３７℃で２０分間インキュベーション後、島をピペット分取して、それらを単一細胞に分散した。
【０１４２】
微小鋳型中の細胞のインキュベーション    単一分散細胞を、最終培養のために、特殊化凝集培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地：１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ（１ｇ／Ｌ）、ＢＳＡ（２ｇ／Ｌ）、ニコチンアミド（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）、エキセンジン−４（５ｎｍｏｌ／Ｌ）および１％抗生物質を含有) (Kikugawa et al. 2009)中の微小鋳型に移した。この凝集培地に、島再凝集を増強する高カルシウム条件（２〜４ｍＭ）をわれわれは付加している。分散時に、細胞のアリコートを、血球計を用いて顕微鏡検査する。単一細胞対二連または三連物のパーセンテージを確定する。上首尾の細胞分散は、最低で９０％の生存可能な単一細胞を有し、他の１０％は二連および三連物を含む、と定義される。血球計を用いて細胞数により分散液中の細胞の密度を知ることにより、ディボット当たりの細胞の数を概算し得る。しかしながら、一旦鋳型が投入されたら、細胞／ディボットも計数したが、これは、培地細胞密度に基づいて、実験によって変化したが、しかし２０〜１５０の範囲であった。細胞／ディボットの数は、鋳型中に投入される培地中の細胞の密度に基づいて操作されて、標的３Ｄ細胞構造の最終的サイズを制御するためにユーザーに利点を提供する。
【０１４３】
微小鋳型を静かに振盪し、次いで、１５分間放置すると、細胞が個々のディボットに沈澱した。培地を毎日取り替えながら、９日間まで、３７℃で５％ＣＯ２で島を保持した。微小鋳型（６０μｍ深度のディボットを有する）中の培地の取替えは、鋳型壁付近から古い培地を静かに除去し（吸引により）、そして鋳型に新鮮な培地を静かにピペット分取することにより、容易に成し遂げられた。
【０１４４】
微小鋳型内の細胞クラスターの再凝集    最初に、細胞を各ウェルの底に無作為に入れた。各ディボット中に沈澱する細胞の数を、懸濁液中の細胞の密度により設定する。微小鋳型に投入する前に細胞密度を確定するために、島細胞懸濁液のアリコートを取り出して、細胞／容積を、血球計を用いて顕微鏡下で計数する。鋳型中のディボットの数および各再凝集島の標的サイズが分かれば、出発細胞密度によって懸濁液中の細胞の数を濃縮するかまたは希釈する。鋳型が１０，０００個のディボットを含有し、所望結果が１００細胞／ディボットである場合には、微小鋳型中に投入される培地中に１，０００，０００個の細胞が存在しなければならない。図１４は、２日目に開始して５日目まで進んだ微小鋳型中に発育している細胞を示す。３日目と４日目の間に、細胞はネイティブ島の三次元構造を取り始めた。ディボット内に現れた島は、すべて直径９０μｍ（平均直径５０μｍ未満）に限定された。５０μｍは島のコア細胞への栄養を保証する臨界サイズであることを示すデータを発表済みである（Williams et al, 2010）ので、この直径は重要である。５０μｍより大きい島はコア細胞死を実証したが、一方、５０μｍ未満のものは、培養中のコア細胞死をめったに実証しなかった。各ディボットの湾曲底は、球形再凝集島の最適形成のために互いの方向に細胞を引っ張るのに役立つ。図１４は、粗面計を用いて単一ディボット深度についてなされた測定を示す。この単一ディボットの深度は６０μｍよりわずかに大きく、底は湾曲しており、これが、凝集のために細胞をディボットの中央方向に押す。
【０１４５】
最適サイズおよび形状を有する再凝集島を生成するに際しての成功は、早期原型から得られる結果により例示される。この早期原型は、ディボット領域の周囲に非ディボット化支持体表面域を含んだ（図１５）。植えつけた場合、いくつかの細胞は原型微小鋳型の非ディボット化表面に落ちた。非ディボット化表面に落ちた細胞のいくつかは単一細胞の形態で留まるか、あるいは小細胞クラスターに成長し、他のものは巨大島（ディボット明細事項により限定されなかった巨大複合体）を形成した（図１５）。この早期原型鋳型内で、同一動物から単離され、同一培地中で培養され、同一支持体物質で再凝集された細胞は、２つの異なる細胞再凝集物を生じた：ｉ）ディボット内に形成されたものは、小型の良好に造形された島を形成し；そしてｉｉ）ディボットの物理的拘束に制限されない平坦表面に形成されたものは、貧拡散特性に付される細胞の大型丸形団塊を形成した。非制限島のいくつかは、直径４００μｍのサイズに成長した。これらの結果は、細胞の再凝集を物理的に制限することが最適サイズ化島を生じるという優れた概念実証を提供する。
【０１４６】
微小鋳型中で再凝集される島は、ネイティブ小型島により示されるものと同様の拡散特性を実証するということを、実験データは示唆している。微小鋳型中で再凝集される島の拡散特性を確定するために、再凝集島を、グルコースの蛍光類似体（２−ＮＢＤＧ）を含有する培地に１０分間曝露した。蛍光グルコース類似体は再凝集島のコアに完全に浸潤したが、これは、グルコースの拡散に対するバリアが相対的に低いということを示している（図２６）。これに対比して、ネイティブ大型島は、２−ＮＢＤＧへの曝露の数時間後でさえ、島のコアへのグルコースの浸潤および細胞取込みを抑制する拡散に対する有意のバリアを有する、ということを従来の研究は示した（Williams et al., 2010）。総体的に、これらのデータは、微小鋳型中で再凝集される島細胞がネイティブ大型島に比して低い拡散バリアを有する、ということを示している。
【０１４７】
微小鋳型中で形成される細胞と市販の多重ウェルプレート中で形成されるものとの比較  鋳型中での島再凝集の結果を、市販のマイクロプレート中での島再凝集と比較した。市販のプレートは、直径５００μｍを示す正方形ウェルを含有した。分散島細胞を、市販のプレート中で培養すると、予測どおり、島様クラスターが生じた。何度か観察を実施した。第一に、市販プレート中で形成した島細胞は、ウェルの角に集合し、互いに結合したが、この場合、それらは壁と接触し得る。図１６は、市販ウェルの側面に接触する再凝集島を形成する細胞の典型例を示す。これらの細胞は、接触誘導を用いて再編制される。
【０１４８】
第二に、サイズを限定せずに、益々多くの細胞が一緒に結合して、貧生存度を有する巨大島（直径４００μｍを上回るものもある）を作った。各ウェル内の細胞の数を限定するために小型微小鋳型を用いず、そして再凝集島の形状を最適に誘導するよう意図された物理的寸法を用いない場合、結果的に生じる島は非常に大きく、且つ高パーセンテージの死細胞を含有した。市販プレート中で再凝集した島からの生存度検定では、５０％を上回る細胞死が６日の培養で認められた。これらの大型開口部では、細胞はしばしば単一体として残存し、貧細胞生存度を示した。ウェルの壁または隅に沿って群生し得た細胞は、ネイティブ島を示す球形を決して形成せず、貧生存度を有した。
【０１４９】
第三に、市販鋳型中で生じた細胞のクラスターは、微小鋳型を用いて得ることができた球形島様組織に再凝集しなかった。再凝集島の球形成能力は上首尾のin vitro機能を予測する重要な特徴であると思われる。ほとんどの多重ウェルプレートは、図１６に示すように平底ウェルおよび正方形側面を有して製造される。これらのような市販プレート中で再凝集される細胞はネイティブを連想させる球形で互いに付着せず、したがって、ネイティブ島と同じように効率的に機能するとは余り考えられない。丸底を有する１５３６ウェルプレートは市販されているが、しかし直径５００μｍの任意のウェル中で形成される島細胞は大きすぎて拡散バリアを乗り越えられない。これらの結果は、一般に市販されている鋳型が最適島形成のために不適当な支持体であるという見解を支持する。
【０１５０】
鋳型からの再凝集細胞クラスターの除去    いくつかの場合には、細胞の完全性または生存度を危うくしないようにして微小鋳型から再凝集島細胞を除去することが望ましい。これは、ディボット上に直接大型ピペットを静かに置いて、吸引を適用することにより、容易に成し遂げられ得る。再凝集島を、培地とともにディボットから取り出す。その後、新鮮な培地で微小鋳型を洗浄し、ディボット上で直接ピペッティングして、鋳型中のほとんどすべての再凝集島を取り出す。
【０１５１】
微小鋳型中で形成される細胞再凝集物の特性化    微小プレートから取り出された島を、サイズおよび生存度に関して測定した。ネイティブラット島は、直径２０〜３５０μｍの範囲である。微小鋳型のディボット（直径１００μｍ、深さ６０μｍ）内で再凝集される場合、島の１００％が９０μｍ未満の直径を有した；再凝集島当たりの平均直径は、３６．６±１．２μｍであった（５００を上回る個々の再凝集島の共焦点顕微鏡測定値）。元来、単一細胞に完全には消化されなかった、したがってディボットに落ち込まなかった代表的島とわれわれが考えた２〜３の大型構造をわれわれは見出した。それ以来、分散手順中はより以上に注意して、細胞の９０％が単一体で、残りの細胞が主に二連または三連物である島懸濁液を得た。微小鋳型パターンＡおよびＢ（図１７）を用いて、得られた全凝集物の８５〜９０％が直径９０μｍ以下であると概算している。未だ理解されない理由のために、ディボット中の細胞のいくつかは、一再凝集島／ディボットを形成するというよりむしろ、多数の島に分かれた。図１８は、１つのディボット内に２つの再凝集島の一例を示す。
【０１５２】
形態学的には、再凝集島は同一サイズのネイティブ島と同一に見える。それらは、図２９で分かるように、球形で、島周囲にカプセル様外表面を有する。これに対比して、図１５は、微小鋳型なしで凝集する細胞は球または見掛けのカプセルを形成しない、ということを示す。
【０１５３】
アポトーシス／壊死細胞染色を用いて、再凝集島に関して生存度実験を成し遂げた（Invitrogen、Ｙｏ−Ｐｒｏ−１およびヨウ化プロピジウムを含有するVybrant アポトーシス検定）。この二重標識検定は、膜完全性およびＤＮＡの断片化の両方を測定する。われわれが以前発表した方法を用いて、２つの標識で１時間、再凝集島をインキュベートした（MacGregor et al., 2006; Williams et al., 2010）。その後、島をＰＢＳですすぎ、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ３００共焦点顕微鏡上のAttofluor Chamberに入れた。再凝集島を光学的に切断して、島の中心からの画像を後の分析のために保存した。染色を含有する島内の面積を、総島面積のパーセンテージとして算定して、生存度を確定した。５日齢再凝集島の生存度測定値は、細胞内の非常に高い生存度を実証し、非常に少ない死細胞／島を明示した。再凝集島の全体的生存度は、９９．７６％であった。この値は、ネイティブ大型および小型島に関して、ならびに単一島細胞分散液に関して文献で従来報告されたものより高い（Williams et al., 2010; Song et al., 2009）。
【０１５４】
図１９は、生存度に関して染色された典型的島の例を示す。これらの試験では、赤色染色は壊死による細胞死を示し、緑色細胞染色はアポトーシスによる細胞死を示す。
【０１５５】
図１９Ａは、微小鋳型中で再凝集された島で同定された極少数の死細胞の１つを示す。赤色染色細胞は、壊死のために細胞死を受けつつある。単離組織では、細胞絵師は、しばしば、最初に起きる。試験した５００の島において、アポトーシス（緑色）細胞は２つだけであった。これに対比して、同一動物からの細胞が微小鋳型の表面に大型巨体島を形成した場合、塊全体に存在する有意数の死細胞が認められた。図１９Ｂは、２３の死細胞を有する図の一平面を捉えている。顕微鏡の焦点面の調整は、塊の全平面内により多くの死島細胞が存在することを示した。したがって、正しい割合の島にディボット中で再凝集される細胞は非常に高い生存度を有したが、一方、ディボットの外側で大型塊に再凝集させられた細胞は有意の細胞死を示した。これらの結果は、微小鋳型の成功を支持するが、それは、ディボットなしの鋳型の領域上に載った細胞がディボット中で形成されたものよりはるかに乏しい生存度を有したためである。
【０１５６】
微小鋳型中で形成される全細胞の生存度は、同一動物からのネイティブ大型および小型島のものを超えた（図２０）。前記のようにInvitrogenのVybrantアポトーシス検定を用いて、生存度を、ラット大型、小型および再凝集島間で比較した。単離の６日後に、ネイティブ島の２つの群において生細胞のパーセンテージの多少の可変性が認められたが、しかしながら再凝集島における死細胞は少数で、エラーバーは図中で視覚的に表すには小さすぎた。微小鋳型中で再凝集された島は、ネイティブ小型島より約１０％高い生存度を、そしてネイティブ大型島より約４０％高い生存度を示した（図２０）。
【０１５７】
微小鋳型から生成される細胞集団    島中の総細胞の約９０％を含むネイティブ島（大型および小型の両方）中に存在する細胞には３つの主な型がある。グルカゴンを分泌するアルファ細胞は、島中の細胞の約２０％を構成する。インスリンを産生するベータ細胞は、総細胞数の６０〜６５％を構成し、ソマトスタチンを産生するデルタ細胞は島細胞組成の５〜１０％を構成する。本発明の微小鋳型中で工学処理された島は、アルファ、ベータおよびデルタ細胞を含有することを示している。例えば、図２１は、再凝集の６日後に本発明の微小鋳型中で形成された２つの代表的島を示す；ベータ細胞は緑色に染色され、アルファ細胞は赤色に染色され、そしてデルタ細胞は青色に染色されている。これらの工学処理島は、平均ネイティブ島より低いベータ細胞パーセンテージを有すると思われる。しかしながら、ネイティブ小型島と比較した場合、アルファ：ベータ：デルタ細胞の細胞相対組成、ならびにそれらの編成はネイティブ小型島と類似し得る。ネイティブラット大型および小型島は、島の外層に位置するグルカゴン陽性およびソマトスタチン陽性細胞で編成される。インスリン陽性細胞は、中心部に見出される。このようなものとして、インスリン陽性細胞（ベータ細胞）のパーセンテージは小型島中では低いが、しかし各島は多量のインスリンを含有する。決定的に結論を下すのに十分な再凝集島中のベータ／アルファ／およびデルタ細胞（インスリン／グルカゴン／ソマトスタチン陽性細胞）のパーセンテージをわれわれは算定していないが、しかし他のすべての細胞と比較してベータ細胞のパーセンテージはネイティブ小型島と類似している、と思われる。重要な差異の１つは、再凝集島中で、アルファ、ベータおよびデルタ細胞は、再凝集島全体に分散される細胞とともに無作為パターンで編成される、という点である。これは、ヒト島において認められる同一編成である（Hahn van Dorshe et al., 1988; Bosco et al., 2010）。したがって、再凝集島は、ネイティブヒト島を連想させるより無作為なパターンの細胞編成を実証する。
【０１５８】
インスリン産生    微小鋳型中で工学処理された島は新規のインスリン分子を産生し得る、ということを証明することは重要であった。インスリンは、先ず、プロインスリンと呼ばれる前駆体分子として合成される。６日齢再凝集島をプロインスリンレベルに関して染色して、それらが新規のインスリンを作っていたか否かを確定した。図２２は、成熟インスリン（緑色）およびプロインスリン分子（赤色）に関して染色された再凝集島の一例を示す。予測どおり、ベータ細胞は二重標識されている。画像は、新規インスリンは培養６日でも、再凝集島中で合成されている、ということを示す。
【０１５９】
島は、食後の高グルコース曝露に応答した血中へのインスリン放出に関与する。インスリン分泌の欠如は、正常血糖レベルを保持する能力が１型糖尿病を有する人にはないことが原因である。グルコースに対する細胞応答を確定するために、本発明の微小鋳型中で再凝集される島ならびにネイティブ小型島を、低グルコース状態（３ｍＭ）に曝露した。両島型により培地中に分泌されたインスリンを収集し、定量した（図２３）。低グルコース状態（３０分）では、再凝集島は、ネイティブ小型島の１００倍のインスリンを放出した（ネイティブ小型島はネイティブ大型島より多くのインスリンを産生する）。高グルコース（２０ｍＭ）に曝露されると、再凝集島は、ネイティブ大型または小型島より有意に多いインスリンを分泌し続けた。再凝集島がインスリンを漏出していたというよりむしろインスリンを分泌していたということを確証するために、小さな膜不透過性デキストラン（１０ｋＤ）を用いて、さらなる実験を実施した。このサイズの分子は、細胞内の核膜上の核孔複合体を通り抜けるのに十分に小さい。しかしながら、原形質膜は、このサイズの分子を通すことができるタンパク質複合体を含有しない。デキストラン（２０ｍＭ）を、再凝集島を含有する培地に付加すると、共焦点画像は、曝露の４時間後でも、デキストランは細胞に進入できないことを捉えたが、これは、細胞が漏出性でも膜が損傷しているのでもなかったことを示唆している。さらに、細胞がインスリンを分泌していたのではなく実際に漏出していた場合には、図２２に示した再凝集島における壊死／アポトーシス検定中に高レベルの赤色または緑色染色を観察したはずである。総体的に、これらのデータは、微小鋳型中で再凝集された島は、実際に、それらのネイティブ小型または大型島同等物より多量のインスリンを産生する、ということを示唆している。
【０１６０】
われわれの知る限り、ネイティブまたは変更島細胞からのこれらのレベルでのインスリン分泌は報告されておらず、われわれの結果を非常に独特なものにしている。高グルクロン酸含量でアルギン酸塩中に小型再凝集島を封入することを、Weirグループが報告した（O’Sullivan et al, 2010）。Weirは、単に島を単一細胞に分散し、次いで、制限なしにそれらを再造形させることにより、これらの島再凝集物を作製した。Weirの研究は、正常酸素レベルでは、彼等の小型島はネイティブ島と同じくらい多くのインスリンを放出したが、しかし低酸素では、Weir島はネイティブ島より多くのインスリンを放出した、ということを示した。しかしながら、Weirの最良性能の島が分泌したインスリンは、微小鋳型中で再凝集されたわれわれの島の２０分の１であった。高グルコースでのわれわれの再凝集島によるインスリン分泌の相対的減少の理由は、この時点では不明であり、工学処理島が糖尿病動物に移植され得る前に確定されなければならない重要なことである。相対的減少にもかかわらず、ネイティブ島と比較した場合の低および高グルコース状態の両方におけるインスリン分泌の劇的増加は、微小鋳型再凝集方の重要な且つ独特の特性である。
【０１６１】
島への添加物    微小鋳型中で島を再凝集すると言う方法とともに利用され得る代替的方法および物質は、ほぼ無限にある。先ず、再凝集の時点で工学処理島に組み入れられ得る多くの分子が存在する。これらの例としては、成長因子、免疫調節剤、免疫抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、抗炎症薬および抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。特に、植込み型微小鋳型支持体が用いられた場合、移植部位での酸素張力を増大するための分子または小型デバイスが、再凝集島中に組み入れられ得た。再凝集の時点で付加され得る分子の他のクラスとしては、インスリン放出を誘導するための薬剤、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ,ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８に対する）、および核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
考察    われわれのディボット化微小鋳型は、細胞を再凝集するために当該技術分野で用いられる他の足場とは異なる。以前に、他の人々が島を形成するために懸滴法の使用を試みた（例えば、Lehmann et al, 2007）。懸滴法では、細胞を溶液中に入れて、ペトリ皿の蓋の上に一滴落とし、これを次に上側を下に向けて、したがって細胞を溶液の懸滴の底に落とし、そこでそれらは島を形成し得る。しかしながら、懸滴法は時間が掛かり、そして「滴」中の培地が変えられ得ないために、汚染しがちである。
【０１６３】
in vitroでの微小鋳型の有用性    本発明の微小鋳型は、その後の移植のために、または薬剤またはデバイス試験等の他の用途のために、in vitroで細胞凝集物を形成するよう設計し得る。
【０１６４】
移植のための細胞の生成    （予測例）移植のための細胞を生成するよう設計される好ましい微小鋳型は、滅菌可能な、再利用可能な、そして充填された場合に培地または細胞を漏出しない単一デバイスである（図２４）。先ず、島は、膵臓から単離される必要がある。小型健常島が大型島から分離される。大型島は、単一細胞または二連物に分散され、これらが微小鋳型に投入される。培養中で３〜６日後、細胞を取り出して、ネイティブ小型島と混合して、糖尿病レシピエントに移植する。
【０１６５】
微小鋳型Ａ（図１７Ａ）は、直径１００μｍ、深さ６０μｍであるディボットを有して、島再凝集のために設計されている。深さ６０μｍは、ディボットから再凝集島を用意に取り出せるので、最適である、ということをわれわれは見出した。ディボットは、ディボット間の間隔が最小であるよう、交互パターンで整列される（図１７Ａ）。ディボット間の平均距離は、３０μｍ未満である。
【０１６６】
図１５で観察される非ディボット化表面は、移植のための細胞を生成するための予測微小鋳型中のディボット中で完全に覆われる。この整列は、微小鋳型上の最大間隙をディボットのために用いさせ、鋳型当たりで作製される再凝集物の数を最大にし、効率をさいだいにして、鋳型の表面に浮遊する任意の細胞がディボット中に落ちると思われ、したがって再凝集のための生存可能細胞の損失を制限する。
【０１６７】
一鋳型上に得られるディボットの数は、鋳型のサイズに伴って変わる。微小鋳型Ａ設計を用いる直径約１．５インチの鋳型（図１７Ａ）は、１０，０００〜１２，０００ディボット／鋳型を含有する。ディボットの間隔も、鋳型の必要性によって決まる。移植のための組織の再凝集に関しては、再凝集島の数に対する元の組織の効率が重要である。ディボットに落ちる細胞のパーセンテージが大きいほど、新規島を作製する効率は良好である。そこで、島移植のために設計されるわれわれの鋳型は、２０〜３０μｍの間隔のディボットを有する。
【０１６８】
薬剤スクリーニング    （予測例）微小鋳型を用いる薬剤スクリーニングは、３Ｄ構造で整列される細胞、例えばミニ腫瘍または小型島は、皿中で平坦に増殖されるかまたは再凝集される細胞とは別様にそれらの環境に応答する、という概念に基づいている。例えば、ミニ腫瘍または島は、微小鋳型のディボット中で形成され、次いで、考え得る治療薬、例えば抗癌薬が個別に各ディボットに適用されるか、または全プレートに付加され得る。次に３Ｄ構造の形成を検査し、試験化学物質の望ましくない作用を示す変化、例えば細胞生存度またはクラスターサイズの低減に注目する。第一例では、多数の異なる薬剤が、長さ約３５ｍｍのガラス片上で試験され得る。第二のアプローチでは、単一薬剤が試験されるが、しかし一鋳型では、定量され得る多数の個々の応答が認められる。
【０１６９】
癌薬試験に関して考え得る一定量は、各腫瘍に関してなされ得る生存度（生／死染色）である。微小鋳型デザインを用いて考え得る癌薬の試験が興味を引いているが、しかし当該鋳型は３Ｄ整列の細胞に関して最良に実行されるすべての薬剤試験のために有用である。
【０１７０】
微小鋳型Ｂ（図１７Ｂ）は、各ウェルへのここの介入の送達のために設計されている。したがって、薬剤試験のために適用可能である。このデザインに関しては、ディボットは直径約１８０μｍで、各ディボット間の間隔は１２０μｍである。間隔は、必要に応じて増減または低減され得る。図１１は、個々の空ディボットを有する微小鋳型Ｂの床の画像を示す。微小鋳型Ｂは、２，７００〜３，０００ディボット／鋳型を含有し、多くがデザインＡの場合より少ない。デザインＢにおけるディボット間の間隔は、唯一のディボットへの正確な薬剤送達を保証するためにより大きい。ディボットパターンおよび間隔の明細事項はユーザーにより設定され、そして用いられる薬剤送達系によって決まる。各ディボット中の細胞に関する数千の化合物をシメンするための鋳型の使用により、ユーザーは、直径２インチ未満の鋳型中で２０００〜３０００の異なる薬剤に関する薬剤スクリーニングを実行し得る（図２４）。別個の薬剤のための各鋳型を利用する高処理量薬剤スクリーニングは、数千の個々の細胞クラスターを応答させ、平均応答というよりむしろ個々の応答として測定する。各ディボットが試験のための異なる薬剤を含有し得るよう、ナノ送達系と組み合わせた高処理量薬剤スクリーニングが利用され得る。代替的には、同一処理および培養条件に曝露された数千の試料からデータポイントを収集し得る（図２４）。
【０１７１】
非島細胞の生成    （予測例）鋳型は、種々の細胞凝集形状、例えば長いニューロン経路、糸球体様フィルター、血管、置換肺胞等（これらに限定されない）のために設計され得る。小さい、輪郭のはっきりした形状、例えば微小鋳型中での幹細胞または再プログラム化細胞の凝集も本発明の適切な用途である。
【０１７２】
典型的一適用は、鋳型中での培養細胞株の拡張および凝集である。この場合、懸濁液中の細胞は、（ユーザーの要求によって）１〜５０細胞／ディボットの範囲の極低密度で鋳型中に投入される。培養細胞株は、分裂中の細胞を含有し、これは、ユーザーの要求によって決まる時間の長さの間、ディボット中で増殖させられる。他の細胞供給源としては、動物またはヒトから新たに分散された細胞が挙げられる。新たに分散された細胞を投入する工程は、島に関して記載される一般的方法と同様である。単一細胞または二連物が懸濁液中に存在するまで、選りすぐりの組織、例えば血管が、消化酵素に曝露される。細胞は、ユーザーにより選択される密度で選択される培地中で、鋳型に投入される。最後に、幹細胞は、種々の成体細胞型を産生するようプログラムされ得る。これらの細胞も微小鋳型中に投入されて、３Ｄ構造形成を増強する。
【０１７３】
in vivoでの微小鋳型の有用性    （予測例）本明細書中に記載される微小鋳型は、in vitro適用のために有用である。
【０１７４】
移植のための鋳型中での島の再凝集    （予測例）生体ポリマーから構築される微小鋳型を用いて、植込み可能な生成物を生成し得る（図２３）。このような場合、再凝集島が生体ポリマーに付着し、そして全「パッチ」がレシピエントに移植されるよう、鋳型の微小環境は変更される。上記の生体ポリマーは、このようない植込み可能な微小鋳型を生成するのに適している。鋳型中のディボットは、細胞を先ずディボット中に沈澱させ(この場合、それらの再凝集はディボットの寸法により誘導される)、次いで、生体ポリマーディボットに接着させるウェルを作製し得る。
【０１７５】
生体ポリマー中にディボットを作製するために、当該技術分野で既知のプロトコール（例えば、Dean et al. 2007）を用いて、蝋陰型が設計される。植込み可能である鋳型に関しては、島は鋳型中に残されて、外科的にレシピエントに入れられる。植込み可能鋳型は、島への神経および血管の浸潤を可能にするディボット間に開口部がある鋳型デザインを有する。さらに、植込み可能物質が、例えばニューロンおよび血管性調印しトともに植え込まれ、鋳型は免疫拒絶から島を防御するための免疫抑制剤も含有する。
【０１７６】
島を伴う鋳型の植込みは、いくつかの発表済みの方法を用いて実行され得る。微小鋳型は、Qi et al, 2010により公表されたような腹膜腔中に入れられる。腹腔が麻酔下で開けられて、鋳型が筋膜した間隙に静かに置かれる。微小鋳型の植込みのための代替的部位としては、特に、Veriter et al. 2010により記載されたような領域への血管供給を増大するための予備状態調節後の、皮下挿入が挙げられる。ヒト移植では、島は、門脈を介して肝臓中に入れられる（Koh et al, 2010）。微小鋳型を用いる場合、門脈を通しての注入は可能でないが、しかし鋳型はより侵襲性の外科手術を用いて、肝臓または腎臓被膜下に入れられ得る（MacGregor et al, 2006）。
【０１７７】
参考文献 
以下の参考文献は、それらが本明細書中に記述されるものを補足する例示的手法的またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書中で援用される。
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【０１７８】
前記から、本発明は、明白なそして本発明に固有のその他の利点とともに、本明細書中に上記したすべての目的および対象物を得るために十分に適合されるものであることが分かる。多くの考え得る実施形態はその範囲を逸脱しない限り本発明によりなされ得るため、本明細書中に記述されるすべての事柄は例証と解釈されるべきものであり、本発明を限定するものではないと理解される。具体的実施形態を示し、考察してきたが、種々の修正は、もちろん、なされ得るし、本発明は、以下の特許請求の範囲に含まれるような制限を除いて、本明細書中に記載される部分および段階の具体的形態または整列に限定されるものではない。さらに、ある種の特徴および部分的組合せは有用性を有し、他の特徴および部分的組合せと関係なく用いられ得る、と理解される。これは、特許請求の範囲により意図され、そしてその範囲内である。
【図２】
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【図２５】
0005956422.tif 000004
【図１】
0005956422.tif 000005
【図３Ａ】
0005956422.tif 000006
【図３Ｂ】
0005956422.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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