(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に、イタコン酸高生産能を与えるプラスミドベクターが導入された形質転換体を培養する工程と、
前記形質転換体が生成したイタコン酸を回収する工程と、を備えるイタコン酸の製造方法であって、
前記プラスミドベクターは、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡと、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプロモーターＤＮＡと、
配列番号５に記載の塩基配列からなるターミネーターＤＮＡと、を含有しており、
前記形質転換体を培養する工程において、培地のｐＨが４以下であることを特徴とするイタコン酸の製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
前記形質転換体を培養する工程において、前記培地の炭素源として、硝酸による酸分解物を用いる請求項１に記載のイタコン酸の製造方法。
【請求項３】
前記形質転換体を培養する工程において、培養温度が１５〜３８℃である請求項１又は２に記載のイタコン酸の製造方法。
【請求項４】
前記宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌である請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載のイタコン酸の製造方法。
【請求項５】
前記宿主がアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）である請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載のイタコン酸の製造方法。
【請求項６】
前記形質転換体を培養する工程において、前記培地には、ビオチン、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸、ピリドキシン塩酸塩、パントテン酸、リボフラビン、及び塩化コリンが配合されている請求項１乃至５のうちのいずれか一項に記載のイタコン酸の製造方法。
【請求項７】
宿主に、イタコン酸高生産能を与えるプラスミドベクターが導入された形質転換体を培養する培養方法であって、
前記プラスミドベクターは、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡと、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプロモーターＤＮＡと、
配列番号５に記載の塩基配列からなるターミネーターＤＮＡと、を含有しており、
培地のｐＨが４以下であることを特徴とする培養方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項８】
前記培地の炭素源として、硝酸による酸分解物を用いる請求項７に記載の培養方法。
【請求項９】
培養温度が１５〜３８℃である請求項７又は８に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌である請求項７乃至９のうちのいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記宿主がアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）である請求項７乃至９のうちのいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記培地には、ビオチン、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸、ピリドキシン塩酸塩、パントテン酸、リボフラビン、及び塩化コリンが配合されている請求項７乃至１１のうちのいずれか一項に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体の培養方法及びイタコン酸の製造方法に関する。更に詳しくは、本発明は、特定のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドベクターが導入された形質転換体の培養方法、及びイタコン酸を効率的に製造することができるイタコン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イタコン酸は不飽和基を有する二価の水溶性有機酸であり、その構造から重合や共重合によって線状高分子を形成できる特性がある。また、その安全性も高いことから、合成樹脂や合成繊維、接着剤や印刷用インキ等、工業製品の原料や添加剤として幅広く利用されている。イタコン酸は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓのようなアスペルギルス属等の糸状菌や、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓのような酵母において生産できることが知られている。イタコン酸の工業生産においてはもっぱら生育速度の観点からＡ．ｔｅｒｒｅｕｓが使用されている。より効率的なイタコン酸製造のため、イタコン酸高性生産菌の開発が求められているが、イタコン酸高生産菌の育種は、変異原性物質による処理や紫外線照射等の古典的なランダム変異導入法に頼っているのが現状である（特許文献１参照）。
【０００３】
Ｂｅｎｔｌｅｙらは、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓにおいて、クエン酸回路で生成するシス−アコニット酸からシス−アコニット酸デカルボキシラーゼによりイタコン酸が生合成されるという説を提唱した（非特許文献１参照）。また、その後、岡部らにより、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼタンパク質が単離精製されている（非特許文献２参照）。更に、その後、本願発明者らにより、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡについて単離同定がなされており、このＤＮＡを含むプラスミドを酵母細胞に導入した微生物を用いたイタコン酸の製造方法が提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−３８７７４号公報
【特許文献２】特開２００９−２７９９９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｉｅｓｓｅｎ  Ｃ．Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：７０３−７２０（１９５７）
【非特許文献２】Ｄｗｉａｒｔｉ  Ｌ．，Ｙａｍａｎｅ  Ｋ．，Ｙａｍａｔａｎｉ  Ｈ．，Ｋａｈａｒ  Ｐ．，Ｏｋａｂｅ  Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：２９−３３（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の微生物を用いたイタコン酸の製造方法では、イタコン酸の生産効率が未だ十分とはいえず、更なる効率の向上が求められているのが現状である。
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、特定のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドベクターが導入された形質転換体の培養方法、及びイタコン酸を効率的に製造することができるイタコン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
［１］宿主に、イタコン酸高生産能を与えるプラスミドベクターが導入された形質転換体を培養する工程と、
前記形質転換体が生成したイタコン酸を回収する工程と、を備えるイタコン酸の製造方法であって、
前記プラスミドベクターは、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡと、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプロモーターＤＮＡと、
配列番号５に記載の塩基配列からなるターミネーターＤＮＡと、を含有しており、
前記形質転換体を培養する工程において、培地のｐＨが４以下であることを特徴とするイタコン酸の製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［２］前記形質転換体を培養する工程において、前記培地の炭素源として、硝酸による酸分解物を用いる上記［１］に記載のイタコン酸の製造方法。
［３］前記形質転換体を培養する工程において、培養温度が１５〜３８℃である上記［１］又は［２］に記載のイタコン酸の製造方法。
［４］前記宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌である上記［１］乃至［３］のうちのいずれか一項に記載のイタコン酸の製造方法。
［５］前記宿主がアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）である上記［１］乃至［３］のうちのいずれか一項に記載のイタコン酸の製造方法。
［６］前記形質転換体を培養する工程において、前記培地には、ビオチン、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸、ピリドキシン塩酸塩、パントテン酸、リボフラビン、及び塩化コリンが配合されている上記［１］乃至［５］のうちのいずれか一項に記載のイタコン酸の製造方法。
［７］宿主に、イタコン酸高生産能を与えるプラスミドベクターが導入された形質転換体を培養する培養方法であって、
前記プラスミドベクターは、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡと、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプロモーターＤＮＡと、
配列番号５に記載の塩基配列からなるターミネーターＤＮＡと、を含有しており、
培地のｐＨが４以下であることを特徴とする培養方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［８］前記培地の炭素源として、硝酸による酸分解物を用いる上記［７］に記載の培養方法。
［９］培養温度が１５〜３８℃である上記［７］又は［８］に記載の培養方法。
［１０］前記宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌である上記［７］乃至［９］のうちのいずれか一項に記載の培養方法。
［１１］前記宿主がアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）である上記［７］乃至［９］のうちのいずれか一項に記載の培養方法。
［１２］前記培地には、ビオチン、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸、ピリドキシン塩酸塩、パントテン酸、リボフラビン、及び塩化コリンが配合されている上記［７］乃至［１１］のうちのいずれか一項に記載の培養方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のイタコン酸の製造方法によれば、イタコン酸を従来よりも効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１において作製したプラスミドベクターを示す。
【図２】イタコン酸生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主に、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（以下、「ＣＡＤ」ともいう。）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドベクターが導入されたものであって、上記宿主が糸状菌であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の形質転換体における宿主細胞である上記「糸状菌」としては、例えば、アスペルギルス属、ウスチラゴ属等のイタコン酸生産菌が挙げられる。これらのなかでも、アスペルギルス属の糸状菌が好ましい。
上記アスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｅｕｓ）、アスペルギルス・イタコニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）等が挙げられる。これらのなかでも、アスペルギルス・テレウスが好ましく、アスペルギルス・テレウスＩＦＯ６３６５株が特に好ましい。
【００１２】
また、上記「プラスミドベクター」が含有しているＣＡＤをコードするＤＮＡは下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる。
（ａ）配列番号１（表１参照）に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２（表２参照）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３（表３参照）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２（表２参照）又は配列番号３（表３参照）に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１３】
【表１】
0005846417.tif 000002
【００１４】
【表２】
0005846417.tif 000003
【００１５】
【表３】
0005846417.tif 000004
【００１６】
本発明において、上記（ａ）に記載のＤＮＡには、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＡＤ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００１７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の具体例としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１６番目のＳｅｒの他のアミノ酸（例えばＡｌａ）への置換、２３６番目のＨｉｓの他のアミノ酸（例えばＴｙｒ）への置換、２８９番目のＬｅｕの他のアミノ酸（例えばＴｙｒ）への置換、２９０番目のＴｙｒの他のアミノ酸（例えばＬｅｕ）への置換、３０５番目のＡｓｎの他のアミノ酸（例えばＬｙｓ）への置換、３０８番目のＧｌｙの他のアミノ酸（例えばＡｒｇ）への置換、３２６番目のＨｉｓの他のアミノ酸（例えばＴｙｒ）への置換、３７１番目のＳｅｒの他のアミノ酸（例えばＡｌａ）への置換、３９４番目のＳｅｒの他のアミノ酸（例えばＰｒｏ）への置換、３９６番目のＧｌｎの他のアミノ酸（例えばＨｉｓ）への置換、４２２番目のＩｌｅの他のアミノ酸（例えばＶａｌ）への置換、４２５番目のＳｅｒの他のアミノ酸（例えばＴｈｒ）への置換、４６７番目のＧｌｙの他のアミノ酸（例えばＳｅｒ）への置換、４７５番目のＳｅｒの他のアミノ酸（例えばＴｈｒ）への置換等を挙げることができる。
【００１８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡは、既知のアミノ酸配列からそれをコードするＤＮＡを得る従来の方法をそのまま用いて得ることができる。例えば、上記アミノ酸配列からＤＮＡの塩基配列を決定して得ることができる。また、上記アミノ酸配列に対応する部分塩基配列に基づき、ＰＣＲにより全塩基配列を得ることができる。
【００１９】
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＣＡＤをコードするゲノム配列であることから、アミノ酸配列に翻訳されないイントロン領域を含んでいる。
配列番号３に記載の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列からイントロン領域を除外した塩基配列である。配列番号３に記載の塩基配列は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のｃＤＮＡ塩基配列である。
【００２０】
また、上記（ｄ）に記載のＤＮＡにおける、ストリンジェントな条件としては、例えば、６５℃で４×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション、次いで６５℃で１時間０．１×ＳＳＣでの洗浄という条件を挙げることができる。
【００２１】
配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、上記の配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列をもとにＰＣＲプライマーを設計し、種々のイタコン酸生産菌に由来する染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことで得ることができる。
適用可能なイタコン酸生産菌については特に制限はなく、種々のアスペルギルス属糸状菌や酵母を用いることができる。具体的には種々のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ、及び、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ等のイタコン酸生産菌を挙げることができる。
【００２２】
上記プラスミドベクターは、ＣＡＤをコードするＤＮＡを公知の方法で糸状菌用ベクター等に挿入することで得ることができる。
また、このプラスミドベクターは、後段で説明する特定のプロモーターＤＮＡとＣＡＤをコードするＤＮＡとを含有するプラスミドベクターである。
【００２３】
本発明の形質転換体は、宿主（糸状菌）に適した方法で、糸状菌細胞にプラスミドベクターを導入することで得ることができる。例えば、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、電気穿孔法、アグロバクテリウム法、パーティクル・ガン法等の導入方法を用いることができる。
【００２４】
［２］プラスミドベクター
本発明のプラスミドベクターは、宿主にイタコン酸高生産能を与えるものであって、ＣＡＤをコードするＤＮＡと、配列番号４に記載の塩基配列からなるプロモーターＤＮＡと、を含有することを特徴とする。
尚、「シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）をコードするＤＮＡ」については、上述の形質転換体における説明をそのまま適用することができる。
【００２５】
上記「プロモーターＤＮＡ」は、配列番号４（後述の表５参照）に記載の塩基配列からなる。
【００２６】
また、本発明におけるプラスミドベクターは、上記ＣＡＤをコードするＤＮＡ及び上記プロモーターＤＮＡ以外に、配列番号５（後述の表７参照）に記載の塩基配列からなるターミネーターＤＮＡを更に含有する。
【００２７】
更に、本発明におけるプラスミドベクターは、上記ＣＡＤをコードするＤＮＡ及び上記プロモーターＤＮＡ以外に、ピリチアミン耐性マーカー遺伝子を更に含有するものとすることができる。
【００２８】
上記プラスミドベクターは、ＣＡＤをコードするＤＮＡ、プロモーターＤＮＡ等のＤＮＡを公知の方法で発現ベクター等に挿入することで得ることができる。尚、用いられる発現ベクターは、シャトルベクターであってもよい。
上記発現ベクターとしては、糸状菌用ベクター等が挙げられる。具体的には、例えば、「ｐＰＴＲ  Ｉ」（タカラバイオ株式会社製）、「ｐＰＴＲ  ＩＩ」（タカラバイオ株式会社製）、「ｐＡＵＲ１２３」（タカラバイオ株式会社製）等を挙げることができる。
【００２９】
［３］イタコン酸の製造方法
本発明のイタコン酸の製造方法は、上述の形質転換体を培養する工程と、形質転換体が生成したイタコン酸を回収する工程と、を備えることを特徴とする。
【００３０】
形質転換体を培養する工程では、宿主である糸状菌に適した方法で宿主細胞を培養すればよい。
この培養工程では、培地のｐＨを４以下（特に３以下、更には２以下）とする。このように培地のｐＨが低い場合、炭素源として、従来用いられているブドウ糖よりも安価なデンプンの酸分解物をそのまま用いることができる。また、植物から抽出されたデンプンを硝酸によって酸分解すれば、糸状菌は硝酸を窒素源として利用できるため、その他の栄養となる物質を一切添加することなく培養が可能である。更には、培地が酸性であるため、培養の際に細菌や酵母が混入しても、その影響を最小限に留めることができる。
また、この培養工程では、培養温度を１５〜３８℃（特に２５〜３４℃、更には２８〜３２℃）とすることができる。培養温度が上記範囲である場合には、宿主細胞を十分に培養することができる。
【００３１】
また、形質転換体が生成したイタコン酸の回収工程では、微生物の培養によって生成する有機酸類をその培養物から分離するのに用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、遠心分離や濾過等による菌体の分離、上清の濃縮、各種のカラムクロマトグラフィー、活性炭処理、濾過、及び、再結晶等の手段を適宜組合せて用いることにより、分離、精製することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明は、これらの実施例に何ら制約されるものではない。ここで、「部」及び「％」は、特記しない限り質量基準である。
【００３３】
＜実施例１＞
［１］プラスミドベクターの構築
（１−１）糸状菌用ベクターへのプロモーターＤＮＡの挿入
糸状菌を宿主としてＣＡＤ１遺伝子を発現させるために、アスペルギルス・ニドランス由来伸長因子遺伝子プロモーターＤＮＡを用いた。
このプロモーターＤＮＡを得るために、下記表４に示すプライマーを用い、アスペルギルス・ニドランスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。これにより、配列番号４（表５参照）に記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られた。
尚、ＰＣＲの条件は、９４℃、２分の後、９４℃  ３０秒、５７℃  ３０秒、７２℃  ２分を３０サイクル行った。
【００３４】
【表４】
0005846417.tif 000005
【００３５】
【表５】
0005846417.tif 000006
【００３６】
表４における配列番号６には制限酵素ＫｐｎＩ、配列番号７にはＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩの認識配列を付加しており、増幅したプロモーターＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて消化した。
次いで、同じく制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて消化した糸状菌用ベクター（タカラバイオ株式会社製、「ｐＰＴＲ  Ｉ」）と結合した。ＤＮＡの結合にはライゲーション試薬（東洋紡績株式会社製、「Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ」）を用いた。得られたプラスミドＤＮＡをｐＰＴＲ−Ｐとする。
【００３７】
（１−２）ターミネーターＤＮＡの挿入
アスペルギルス・ニドランス由来伸長因子遺伝子ターミネーターＤＮＡを得るために、下記表６に示すプライマーを用い、アスペルギルス・ニドランスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。これにより、配列番号５（表７参照）に記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られた。
尚、ＰＣＲの条件は、９４℃、２分の後、９４℃  ３０秒、５７℃  ３０秒、７２℃  ２分を３０サイクル行った。
【００３８】
【表６】
0005846417.tif 000007
【００３９】
【表７】
0005846417.tif 000008
【００４０】
表６のプライマーには、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）の取扱説明書に従い、次に結合するベクター配列に同一性のあるＤＮＡを付加しており、取扱説明書に従いこのキットを用いて配列番号５のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＰＴＲ−Ｐと結合した。得られたプラスミドＤＮＡをｐＰＴＲ−ＰＴとする。
【００４１】
（１−３）ＣＡＤ１遺伝子の挿入
アスペルギルス・テレウス由来ＣＡＤ１遺伝子発現用ＤＮＡを得るために、下記表８に示すプライマーを用い、アスペルギルス・テレウス  ＩＦＯ６３６５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。これにより、配列番号１２（表９参照）に記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られた。このＣＡＤ１遺伝子配列は特開２００９−２７９９９や、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）８０，２２３−２２９に記述され、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ３２６１０５として登録されたものである。
尚、ＰＣＲの条件は、９８℃  １０秒、６０℃  １５秒、６８℃  ２分を３０サイクル行った。
【００４２】
【表８】
0005846417.tif 000009
【００４３】
【表９】
0005846417.tif 000010
【００４４】
表８のプライマーには、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）の取扱説明書に従い、次に結合するベクター配列に同一性のあるＤＮＡを付加しており、取扱説明書に従いこのキットを用いて配列番号１２のＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩで消化したｐＰＴＲ−ＰＴと結合した。得られたプラスミドベクター（プラスミドＤＮＡ）をｐＰＴＲ−ＣＡＤとする（図１参照）。
【００４５】
［２］宿主（アスペルギルス・テレウス）へのプラスミドベクターの導入（形質転換体の製造）
上記［１］で得られたプラスミドベクター（ｐＰＴＲ−ＣＡＤ）を、糸状菌細胞（アスペルギルス・テレウス  ＩＦＯ６３６５株）に、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法により導入した。アスペルギルス・テレウスの形質転換法についてはＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００２）６６，４０４−４０６に報告があるが、これに記載の方法をアスペルギルス・テレウス  ＩＦＯ６３６５株に適用すると、形質転換体の判別が困難であり、また菌の生育も不十分であった。そこで、形質転換体を分離するために培地に加えるピリチアミン臭化水素酸塩の濃度を０．２μｇ／ｍｌにしたところ、形質転換体を明確に判別が可能になった。菌の生育は、培地１リットルあたりにビオチン２．５ｍｇ、ニコチン酸２．５ｍｇ、パラアミノ安息香酸０．８ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩１．０ｍｇ、パントテン酸２．０ｍｇ、リボフラビン２．５ｍｇ、塩化コリン２０ｍｇを添加することにより改善した。常法であるプロトプラスト−ポリエチレングリコール法にこれらの工夫を加えることによって、ｐＰＴＲ−ＣＡＤが導入された形質転換体（アスペルギルス・テレウス  ＡｔＣＡＤ株）を得た。
【００４６】
［３］形質転換体のイタコン酸生産性評価
上記［２］で得られた形質転換体（アスペルギルス・テレウス  ＡｔＣＡＤ株）を糸状菌用最少培地にて１３日間振とう培養した。糸状菌最少培地の組成は１リットルあたり、グルコース１０ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、塩化カリウム１．３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．３ｇ、リン酸二水素カリウム３．８ｇ、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物１ｍｇ、ホウ酸１０ｍｇ、塩化コバルト六水和物２ｍｇ、硫酸銅五水和物２ｍｇ、硫酸鉄七水和物５ｍｇ、塩化マンガン四水和物５ｍｇ、硫酸亜鉛七水和物２０ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム５０ｍｇ、ピリチアミン臭化水素酸塩０．２ｍｇを基本とし、今回生育速度を改善させるためにビオチン２．５ｍｇ、ニコチン酸２．５ｍｇ、パラアミノ安息香酸０．８ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩１ｍｇ、パントテン酸２ｍｇ、リボフラビン２．５ｍｇ、塩化コリン２０ｍｇを加えた。尚、培地のｐＨは２．０、培養温度は３０℃とした。
そして、培養開始３日目から２日毎に培養液の一部を採取し、０．２０μｍの孔径を有するフィルターにてろ過することにより試料を調製した。試料に含まれるイタコン酸は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（カラム：カプセルパックＣ１８  ＭＧ（５．０×１５０ｍｍ、株式会社資生堂製）、溶媒：０．１％リン酸溶液、温度：６０℃、流速：１．５ｍｌ／分、検出波長：２１０ｎｍ）で定量した。
尚、コントロール（比較例１）には、ＣＡＤをコードするＤＮＡを挿入していないｐＰＴＲ−ＰＴが導入された形質転換体（アスペルギルス・テレウス  ＡｔＰＴ株）を用いた。そして、培養から１３日間の結果を表１０及び図２に示した。
【００４７】
【表１０】
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【００４８】
表１０及び図２によれば、実施例１の形質転換体（アスペルギルス・テレウス  ＡｔＣＡＤ株）から得られた培養液においては、ＣＡＤをコードするＤＮＡを挿入していない比較例１のコントロール（アスペルギルス・テレウス  ＡｔＰＴ株）と比較すると、培養１３日でイタコン酸濃度が約２６倍に上昇していることが確認できた。
以上より、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）をコードするＤＮＡを糸状菌（アスペルギルス・テレウス）にて高発現させることにより、イタコン酸をより効率的に製造することができることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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