(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、並びにそれらの溶媒和物、水和物、互変異性体、又は製薬上許容され得る塩、からなる群から選択される化学物質を含む、プロマトリックスメタロプロテアーゼ（プロＭＭＰ）の活性化を阻害するための医薬組成物であって、
前記前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、以下からなる群から選択される医薬組成物。
【化１】
0006002764.tif 000273
【請求項２】
アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子及び製薬上許容され得る担体を含む、プロＭＭＰの活性化を阻害するための医薬組成物であって、
前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、以下からなる群から選択される医薬組成物。
【化２】
0006002764.tif 000274
【請求項３】
前記プロＭＭＰがプロＭＭＰ９であり、かつ前記化学物質が、アポ形態のプロＭＭＰ９においてフェニルアラニン（Ｐｈｅ）１０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合し、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記プロＭＭＰがプロＭＭＰ９であり、前記アロステリックな結合部位が、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記プロＭＭＰが、次の：プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記化学物質が、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で含む、哺乳類においてＭＭＰ活性を阻害するための医薬組成物であって、
前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、以下からなる群から選択される医薬組成物。
【化３】
0006002764.tif 000275
【請求項７】
前記ＭＭＰがＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記プロＭＭＰがプロＭＭＰ９であり、前記アロステリックな結合部位が、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＭＭＰが、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための医薬組成物であって、前記ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む組成物又は薬剤の有効量を含む、医薬組成物であって、
前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、以下からなる群から選択される医薬組成物。
【化４】
0006002764.tif 000276
【請求項１１】
ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための医薬組成物であって、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む組成物又は薬剤の有効量を含み、前記症候群、疾患又は疾病は、ＭＭＰの高発現すなわちＭＭＰの過剰発現と関連付けられ、あるいはＭＭＰの高発現又はＭＭＰの過剰発現と関連付けられる症候群、疾患又は疾病に伴う状態である、医薬組成物であって、
前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、以下からなる群から選択される医薬組成物。
【化５】
0006002764.tif 000277
【請求項１２】
症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための医薬組成物であって、下記構造式で表されるＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む組成物又は薬剤の有効量を含み、前記症候群、疾患又は疾病は、変形性関節症または関節リウマチである、医薬組成物。
【化６】
0006002764.tif 000278
【請求項１３】
前記ＭＭＰがＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＭＭＰが、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記症候群、疾患又は疾病が、関節リウマチである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記症候群、疾患又は疾病が、変形性関節症である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年６月２９日に出願された特許仮出願番号第６１／５０２，５１０号の利益を請求するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、ハイスループットスクリーニング、タンパク質結晶化、Ｘ線回折解析、３次元構造体決定、分子モデリング及び構造に基づく合理的薬物設計の分野に関係する。より詳細には、本発明は、アロステリックなプロセシング阻害因子でありプロ形態のマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏＭＭＰ）の活性化を阻害するリガンドの選択方法に関係し、並びに選択されたリガンドの治療用途及び予防用途での使用に関係する。関連する治療領域の例としては、一般的に、炎症、腫瘍、循環器疾患及び神経疾患が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
本明細書を通して、特許、公開された出願、技術論文、及び学術論文を包含し得る種々の出版物は括弧内に引用され、各々の完全な引用は本明細書の末尾に見出され得る。それらの引用された各出版物はその全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００４】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、構造的に、コラーゲン、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質を消化する亜鉛依存性タンパク質分解酵素と関連性のあるファミリーである。現在までに、少なくとも２８種の異なる哺乳類のＭＭＰタンパク質が同定されており、基質特異性及びドメイン構造に基づきグループ分けされている。ＭＭＰの酵素活性は各種細胞型における遺伝子の発現による調節以外にも、不活性な酵素前駆体（ｐｒｏＭＭＰ）の活性化により、並びに内在性阻害因子及び組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）による阻害により正確に調節されている。酵素は、正常な恒常性の組織再構築イベントにおいて重要な役割を果たすだけでなく、関節炎、歯周炎及び組織潰瘍形成などの数多くの結合組織疾患、並びにがん細胞の浸潤及び転移におけるマトリックスの病理学的な破壊においても重要な役割を果たすものと考えられる。
【０００５】
様々なＭＭＰが上方調節され、悪性腫瘍細胞が結合組織のバリアを破壊し転移するようになる機序など、ＭＭＰの機能は腫瘍学においてよく証明されている（Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ａｌａ−ａｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５年）。ＭＭＰが、脈管形成において直接的な役割を果たすことも明らかであるという点からも、腫瘍学的な徴候に関係する重要な標的となっている（Ｈａｎｄｓｌｅｙ及びＥｄｗａｒｄｓ（２００５年）、Ｒｕｎｄｈａｕｇ（２００５年））。これらのプロセスには、例えば、ＭＭＰ９、ＭＭＰ２及びＭＴ１−ＭＭＰなどのいくつかの異なる種類のＭＭＰが関与する。
【０００６】
他のＭＭＰ介在性の徴候としては、変形性関節症及び関節リウマチを引き起こす軟骨及び骨の変性が挙げられる。変性は、主に、骨及び関節において、ＭＭＰにより細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が消化されることに起因する（Ｉａｎｎｏｎｅ及びＬａｐａｄｕｌａ、２００３年）。ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１３は、全て、損傷を受けた領域周辺の組織及び体液において濃度が上昇していることが判明している。
【０００７】
ＭＭＰは、アテローム性動脈硬化巣の破裂、動脈瘤、並びに血管及び心筋組織の形態形成に関与するものと考えられる心血管系疾患においても機能する場合がある（Ｇｅｏｒｇｅ  ２０００，Ｔａｙｅｂｊｅｅ，Ｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１３の濃度の上昇は、多くの場合、これらの状態と関連付けられてきた。また、胃潰瘍、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、歯周病、皮膚潰瘍、肺線維症、気腫、及びマルファン症候群などのいくつかの他の病態は、全てＭＭＰ成分を有しているようである（Ｓｈａｈ，Ｗｉｌｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【０００８】
中枢神経系の内部でのＭＭＰの発現変化は、神経変性疾患の状態に関連付けら（Ｙｏｎｇ  １９９９）、多くの場合、脳卒中において顕著に関連付けられている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｗｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。詳細には、虚血性又は出血性の障害後に生じる脳組織の損傷の伝播に、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９が顕著に影響することは明らかである。ヒト脳卒中患者及び動物脳卒中モデルにおける試験により、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９の発現レベル並びに活性が、いずれも虚血性イベント後に２４時間にわたって急増していることが示されている。脳の内部では、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９の活性化により、微小血管内皮細胞の密着結合が破壊され、これにより血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性が上昇する。ＢＢＢの一体性にこの破壊が生じることで、炎症性因子に関係する浮腫及び湿潤が生じ、これらの両方の現象により、梗塞コア周辺（半影帯）の細胞死が増加し、かつ出血性形質転換の生じる可能性が上昇する。これまでに、ＭＭＰ阻害因子の投与が、脳卒中の動物モデルにおいて保護作用を示すことが明らかになっている（Ｙｏｎｇ  １９９９，Ｇｕ，Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。更に、ＭＭＰ９ノックアウト動物は、同様の脳卒中モデルにおいて、顕著な神経保護を示すことも明らかになっている（Ａｓａｈｉ，Ａｓａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。米国では、脳卒中は死亡率第３位の疾患であり、かつ身体障害を引き起こすものである。したがって、この領域では、ＭＭＰ阻害因子により解決される可能性のある即時的な治療介入法の大部分が未達成であり、このような介入法が医療上必要とされている。
【０００９】
ＭＭＰ９が、多発性硬化症（ＭＳ）の進行に機能し得ることも示唆されている。試験により、症状の活発な患者ではＭＭＰ９の血清濃度が上昇しており、かつＭＳ病変部位周辺では濃縮されていることが示された（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｎｅｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。血清ＭＭＰ９活性の上昇によりＣＮＳへの白血球の湿潤が促進されることが原因因子であり、疾患の特徴の１つとされる。ＭＭＰは、片頭痛の重症度及び長期化に関与する場合もある。片頭痛（皮質拡延性抑制）の動物モデルでは、ＭＭＰ９は急速に上方調節され、活性化されてＢＢＢを破壊し、軽度〜中度の浮腫を生じる（Ｇｕｒｓｏｙ−Ｏｚｄｅｍｉｒ，Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。この脳腫脹後の血管収縮により、頭痛及び片頭痛に関連する他の症状は弱まる。皮質拡延性抑制モデルにおいて、ＭＭＰ阻害因子によりＢＢＢの開口が予防されることが示されている（Ｇｕｒｓｏｙ−Ｏｚｄｅｍｉｒ，Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。関連する研究により、ＭＭＰ９は、外傷性脳損傷後に、損傷を受けた脳組織において特異的に上方調節されていることが示されており（Ｗａｎｇ，Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、浮腫及び免疫細胞の湿潤に起因して脳の損傷が更に進行するものと予測される。ＭＭＰは、その他の慢性ＣＮＳ疾患においても、更なる機能を示す場合がある。パーキンソン病の動物モデルにおいては、ＭＭＰ９は、ドーパミン作動性ニューロン毒（ＭＰＴＰ）を線条体に注入した後に急速に上方調節されることが判明しており（Ｌｏｒｅｎｚｌ，Ｃａｌｉｎｇａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００４）、かつＭＭＰ３は、集積する傾向のある形態にα−シヌクレインをプロセシングすることが判明している（Ｓｕｎｇ，Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。これにより、ＭＭＰは、細胞損傷時の神経系の再構築に関与すること、及び疾患の潜在的な原因因子にもなることが示唆される。アルツハイマー病の患者では、死後血漿試料を正常な対照と比較したときにＭＭＰ９が上方調節されていることが判明している（Ｙｏｎｇ  １９９９，Ｌｏｒｅｎｚｌ，Ａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。更に、アミロイドβペプチドの病的な発現により、アルツハイマー病に関係する主要な病理学的特徴である大脳のアミロイド血管症に関与する、ＭＭＰ２の発現及び活性化が誘導される（Ｊｕｎｇ，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。認知症患者から採取した脳脊髄液ではＭＭＰ９の濃度が上昇していることが判明しており、ＭＭＰは血管性認知症にも関与する可能性がある（Ａｄａｉｒ，Ｃｈａｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００１０】
不活性な前駆体の構造及び活性化を考慮すると、プロトタイプとなるＭＭＰはマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）である。ＭＭＰ９は、マクロファージゼラチナーゼ、ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａのゼラチナーゼ、９２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ及びＶ型コラゲナーゼとしても知られる。不活性な形態のＭＭＰ９、すなわちプロＭＭＰ９は、分泌に関係するシグナル配列、プロＭＭＰ９の活性を阻害するプロペプチドドメイン、タンパク質切断に関係する触媒ドメイン、３つのＩＩ型フィブロネクチンリピートからなるＩＩ型フィブロネクチン（ＦｎＩＩ）ドメイン、及び基質との結合を補助するものと考えられるヘモペキシン様ドメインなどの、数種類の異なるドメインにより表される。ヘモペキシン様ドメインは、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）との相互作用に関係する結合ドメインとしても機能する。ＭＭＰ９の不活性な前駆体、すなわちプロＭＭＰ９は、システインスイッチ機序により維持される。この機序では、プロペプチド形態中のＣｙｓが触媒ドメイン中の亜鉛触媒と複合体を形成し、活性部位を閉鎖する（Ｖａｎ  Ｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ  １９９０）。プロＭＭＰ９の活性化は２段階の工程により生じる。Ｍｅｔ  ６０の後にあり、亜鉛の配位を妨害し、かつプロペプチドと触媒ドメインとの相互作用を不安定化させる第１切断部位を、プロテアーゼが切断する。この第１の切断により、第２の切断部位Ｐｈｅ  １０７に接近することができるようになり、その後プロペプチドが除去され、成熟型の活性な形態の酵素が放出される（Ｎａｇａｓｅ  １９９７年）。生体内でＭＭＰ９を活性化するプロテアーゼはまだ特定されていないものの、活性化は、ＭＭＰ３、キマーゼ及びトリプシンの活性を通じて生じ得るというエビデンスがある（Ｏｇａｔａ，Ｅｎｇｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９２年、Ｆａｎｇ，Ｒａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９７年、Ｔｃｈｏｕｇｏｕｎｏｖａ，Ｌｕｎｄｅｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５年）。
【００１１】
ＭＭＰ９及びプロＭＭＰ９の結晶構造は報告されている。Ｃ末端の切断されたプロＭＭＰ９の構造は、解像度２．５Åで報告されている（Ｅｌｋｉｎｓ，Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２年）。この構造はプロドメイン、触媒ドメイン及びフィブロネクチンのＩＩ型（ＦｎＩＩ）リピートを含有していたものの、構造は活性部位阻害因子又はアロステリックなプロセシング阻害因子を含有していなかった。その他の２報では、ＦｎＩＩリピート以外のＭＭＰ９の触媒ドメインの構造が報告されている（Ｒｏｗｓｅｌｌ，Ｈａｗｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２年）、Ｔｏｃｈｏｗｉｃｚ，Ｍａｓｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７年））。ＭＭＰ９の触媒ドメインの構造は、タンパク質のアポ部位及び活性部位の両方が阻害されている形態を示した。構造が解明されたデータによると、高度に構造ホモロジーであることが示された。構造には、ＦｎＩＩリピートの存在又は非存在による大きな違いはなかったことが報告された。これまでに、残基Ｐｈｅ  １０７付近の領域に結合する化合物を特定する構造データは報告されていない。プロＭＭＰ９の構造に加え、プロＭＭＰ１（Ｊｏｚｉｃ，Ｂｏｕｒｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、プロＭＭＰ２（Ｍｏｒｇｕｎｏｖａ，Ｔｕｕｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、及びプロＭＭＰ３（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍａｒｃｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）の構造も報告されている。
【００１２】
数多くの病態への関与が実証されたことに基づき、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害因子は、幅広い疾患状態の治療に可能性があるものと広く考えられてきた。しかしながら、臨床試験においては、活性部位が非選択的なＭＭＰ阻害因子の性能は乏しいものであった。このような乏しさは、多くの場合、用量規制毒性、並びに骨格筋症候群（ＭＳＳ）の発生など顕著な副作用が発現することによりもたらされる。より選択性の高いＭＭＰ阻害因子を開発することで、従来、臨床上の成功を妨げていた一部の課題を解決する助けとなることが示唆されているが、より選択性の高いＭＭＰ活性部位阻害因子を開発するにあたって、数多くの障害が存在する。ＭＭＰは、触媒作用に重要なＺｎ２＋イオンを活性部位に共有しており、かつ非常に保存されている亜鉛結合モチーフを共有する。加えて、ＭＭＰファミリーのメンバーでは、触媒ドメインの全長にわたってかなりの配列が保存されている。
【００１３】
本明細書には、不活性なプロ形態のタンパク質に結合し、かつ安定化させて、活性型酵素のプロセシングを阻害する、小分子型のアロステリックなプロセシング阻害因子により、不活性な酵素前駆体、すなわち、プロＭＭＰのプロドメインを標的として、より選択性の高いＭＭＰ阻害因子を開発するための、新規のアプローチ法を記載する。ＭＭＰタンパク質のプロドメイン内部の配列同一性は著しく低く、触媒作用に重要なＺｎ２＋イオンはなく、かつ高度に保存された亜鉛結合モチーフもない。したがって、プロＭＭＰのプロドメインを標的とするのは、ＭＭＰタンパク質の活性を阻害する際に魅力的な作用機序である。プロＭＭＰ９の活性化の阻害は、特異的なモノクローナル抗体により観察されている（Ｒａｍｏｓ−ＤｅＳｉｍｏｎｅ，Ｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。トリプシンによるプロＭＭＰ９の活性化が、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害タンパク質及び由来するペプチド阻害因子により阻害されることも示されている（Ｌｏｓｓｏ，Ｍｕｎｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。しかしながら、プロＭＭＰ９又は任意の他のプロＭＭＰのタンパク質分解活性を阻害する、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子に関する報告は存在しない。本発明は、このようなアロステリックな小分子プロセシング阻害因子、並びにこのような阻害因子を使用する処置法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一実施形態では、本発明は、プロ形態のマトリックスメタロプロテイナーゼ（プロＭＭＰ）、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰの、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子である。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９の、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子である。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９のアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、該アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）１０７により占有される空間領域を含むアロステリック結合部位において結合する（付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用している）。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９のアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、該アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含むアロステリック結合部位において結合する（付番は完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用している）。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のホモログ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、該アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域と相同である空間領域を含むアロステリック結合部位において結合する。
【００１９】
他の実施形態では、本発明はプロＭＭＰ９、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びにプロＭＭＰ９のアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子の結晶を含み、該それらの断片又はそれらの誘導体は、配列番号１２を含むペプチドであるか、又は配列番号１２に対して少なくとも９５％配列同一性を有するペプチドである。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰの、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、前記結晶はＣ２の空間群を有する。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰの、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、かつ前記化学物質は、次の構造からなる群から選択される：
実施例１：
【００２２】
【化１】
0006002764.tif 000002
実施例２：
【００２３】
【化２】
0006002764.tif 000003
実施例３：
【００２４】
【化３】
0006002764.tif 000004
実施例４：
【００２５】
【化４】
0006002764.tif 000005
【００２６】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、かつ前記結晶は、次のものからなる群から選択される寸法を有する単位胞を含む：単位胞寸法、ａ＝９１．７（Å）、ｂ＝７３．７（Å）、ｃ＝７９．４（Å）、単位胞寸法、ａ＝９０．７（Å）、ｂ＝７３．０（Å）、ｃ＝７８．２（Å）、単位胞寸法、ａ＝９１．０（Å）、ｂ＝７３．６（Å）、ｃ＝７８．０（Å）、及び単位胞寸法、ａ＝９０．０（Å）、ｂ＝７７．１（Å）、ｃ＝７５．０（Å）。
【００２７】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質の原子構造を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、前記原子構造は、次のものからなる群から選択される座標を含む：表１１に記載の座標、表１２に記載の座標、表１３に記載の座標、及び表１４に記載の座標。
【００２８】
他の実施形態では、本発明は、本発明は、プロＭＭＰ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質の原子構造を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、かつ前記プロＭＭＰはプロＭＭＰ９である。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９の原子構造、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質を含む結晶を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９のアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、該アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリック結合部位において結合する。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質の原子構造を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９のアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、該アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含むアロステリック結合部位において結合する（付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用している）。
【００３１】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質の原子構造を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰの、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、かつ前記プロＭＭＰは、次の：プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３、及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択された、プロＭＭＰ９のホモログである。
【００３２】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のホモログ、又はそれらの断片、又はそれらの標的とする構造モチーフ、又はそれらの誘導体、並びに化学物質の原子構造を含み、前記化学物質は、プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子であり、該アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域と相同である空間領域を含むアロステリック結合部位において結合する。
【００３３】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位に結合する化学物質を設計、選別及び／又は最適化するための方法を含み、方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記アロステリックな結合ポケットの３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれかに従うプロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記アロステリックな結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）１０７により占有される空間領域を含み、付番は完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、段階と、（ｃ．）前記物質と、前記アロステリックな結合部位の全ての又は一部の前記３次元構造情報との間で当てはめ演算を実行することにより、前記化学物質を設計、選択及び／又は最適化するために、（ｂ）において特定された残基を使用する段階と、を含む。
【００３４】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位に結合する化学物質を設計、選別及び／又は最適化するための方法を含み、方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれかに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記アロステリックな結合部位は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、段階と、（ｃ．）前記物質と、前記アロステリックな結合部位の全ての又は一部の前記３次元構造情報との間で当てはめ演算を実行することにより、前記化学物質を設計、選択及び／又は最適化するために、（ｂ）において特定された残基を使用する段階と、を含む。
【００３５】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９ホモログのアロステリックな結合部位に結合する化学物質を設計、選別及び／又は最適化するための方法を含み、方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか又はいずれか１つに従うプロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記アロステリックな結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域と相同である領域を含む、段階と、（ｃ．）前記物質と、前記アロステリックな結合部位の全ての又は一部の前記３次元構造情報との間で当てはめ演算を実行することにより、前記化学物質を設計、選択及び／又は最適化するために、（ｂ）において特定された残基を使用する段階と、を含む。
【００３６】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９ホモログのアロステリックな結合部位に結合する化学物質を設計、選別及び／又は最適化するための方法を含み、方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか又はいずれか１つに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記アロステリックな結合部位は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、付番は完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、段階と、（ｃ．）前記物質と、前記アロステリックな結合部位の全ての又は一部の前記３次元構造情報との間で当てはめ演算を実行することにより、前記化学物質を設計、選択及び／又は最適化するために、（ｂ）において特定された残基を使用する段階と、を含む。
【００３７】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位に結合する化学物質を設計、選別及び／又は最適化するための方法を含み、ここで、前記プロＭＭＰ９のホモログは、プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択され、前記方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか又はいずれか１つに従うプロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記アロステリックな結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域と相同である領域を含む、段階と、（ｃ．）前記物質と、前記アロステリックな結合部位の全ての又は一部の前記３次元構造情報との間で当てはめ演算を実行することにより、前記化学物質を設計、選択及び／又は最適化するために、（ｂ）において特定された残基を使用する段階と、を含む。
【００３８】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の全ての又は一部と会合する化学物質の性能を評価するための方法を含み、方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか又はいずれか１つに従うプロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記化学物質の結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、を含む。
【００３９】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の全ての又は一部と会合する化学物質の性能を評価するための方法を含み、方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従う前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階と、（ｂ．）前記化学物質の結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、を含む。
【００４０】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の全ての又は一部と会合する化学物質の性能を評価するための方法を含み、方法は、（ａ．）コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか又はいずれか１つに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階であって、前記コンピュータは、前記３次元モデルの生成手段を含む、段階と、（ｂ．）前記化学物質の結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログの領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、を含む、方法。
【００４１】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の全ての又は一部と会合する化学物質の性能を評価するために、コンピュータを使用する方法を含み、ここで、前記コンピュータは、表１１〜１４のいずれか１つに従うアロステリックな結合部位の構造座標によりコードされたデータ格納素材を含む、機械可読なデータ記憶媒体と、アロステリックな結合部位の３次元グラフィック表示を生成するための手段と、を含み、前記方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従う前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階と、（ｂ．）前記化学物質のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、を含む。
【００４２】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の全て又は一部と会合する化学物質の性能を評価するために、コンピュータを使用する方法を含み、ここで、前記コンピュータは表１１〜１４のいずれか１つに従ってアロステリックな結合部位の構造座標によりコードされたデータ格納素材を含む、機械可読なデータ記憶媒体と、アロステリックな結合部位の３次元グラフィック表示を生成するための手段と、を含み、前記方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従う前記プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の構造座標を使用する段階と、（ｂ．）前記化学物質のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、（ｅ）第２の化学物質を用い、段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階と、（ｆ）前記第１又は第２の化学物質について前記定量された会合度に基づき、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部と会合する前記第１又は第２の化学物質の少なくとも一部を選択する段階と、を含む。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の全ての又は一部と会合する化学物質の性能を評価するために、コンピュータを使用する方法を含み、前記コンピュータは、表１１〜１４のいずれか従うアロステリックな結合部位の構造座標によりコードされたデータ格納素材を含む、機械可読なデータ記憶媒体と、アロステリックな結合部位の３次元グラフィック表示を生成する手段と、を含み、前記方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階と（ｂ．）前記化学物質のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログの領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、を含む。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位の全て又は一部と会合する化学物質の性能を評価するために、コンピュータを使用する方法を含み、ここで、前記コンピュータは、表１１〜１４のいずれかに従うアロステリックな結合部位の構造座標によりコードされたデータ格納素材を含む、機械可読なデータ記憶媒体と、アロステリックな結合部位の３次元グラフィック表示を生成するための手段と、を含み、前記方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階と、（ｂ）前記化学物質のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログの領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、（ｅ）第２の化学物質を用い、段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階と、（ｆ）前記第１又は第２の化学物質について前記定量された会合度に基づき、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部と会合する前記第１又は第２の化学物質の少なくとも一部を選択する段階と、を含む。
【００４５】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の全ての又は一部と会合する化学物質の性能を評価するために、コンピュータを使用する方法を含み、ここで、前記ＭＭＰ９のホモログは、プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択され、前記コンピュータは、表１１〜１４のいずれか従うアロステリックな結合部位の構造座標によりコードされたデータ格納素材を含む、機械可読なデータ記憶媒体と、アロステリックな結合部位の３次元グラフィック表示を生成する手段と、を含み、前記方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階と（ｂ．）前記化学物質のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログの領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、を含む。
【００４６】
他の実施形態では、本発明は、プロＭＭＰ９ホモログのアロステリックな結合部位の全て又は一部と会合する化学物質の性能を評価するために、コンピュータを使用する方法を含み、ここで、前記ＭＭＰ９のホモログは、プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３、及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択され、ここで、前記コンピュータは表１１〜１４のいずれかに従うアロステリックな結合部位の構造座標によりコードされた記録されたデータ記憶素材を含む機械可読なデータ格納素材を含む、機械可読なデータ記憶媒体と、アロステリックな結合部位の３次元グラフィック表示を生成するための手段と、を含み、前記方法は、（ａ．）前記コンピュータ上で前記プロＭＭＰ９のホモログのアロステリックな結合部位の３次元モデルを生成するために、表１１〜１４のいずれか１つに従うプロＭＭＰ９の構造座標を使用する段階と、（ｂ．）前記化学物質のアロステリックな結合部位を特定する段階であって、前記結合部位は、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログの領域を含む、段階と、（ｃ．）前記化学物質と、前記（ｂ）で特定されたアロステリックな結合部位の全て又は一部との間で当てはめ演算を実行するために計算手段を使用する段階と、（ｄ．）前記化学物質と、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部との間の会合度を定量するために、前記当てはめ演算の結果を解析する段階と、（ｅ）第２の化学物質を用い、段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階と、（ｆ）前記第１又は第２の化学物質について前記定量された会合度に基づき、前記アロステリックな結合部位の全て又は一部と会合する前記第１又は第２の化学物質の少なくとも一部を選択する段階と、を含む。
【００４７】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、並びにそれらの溶媒和物、水和物、互変異性体、又は製薬上許容され得る塩、からなる群から選択される化学物質を使用して、プロマトリックスメタロプロテアーゼ（プロＭＭＰ）の活性化を阻害する方法を含む。
【００４８】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子及び製薬上許容され得る担体を含む医薬組成物を使用して、プロＭＭＰの活性化を阻害する方法を含む。
【００４９】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、並びにそれらの溶媒和物、水和物、互変異性体、又は製薬上許容され得る塩、からなる群から選択される化学物質を使用して、プロＭＭＰの活性化を阻害する方法を含み、ここで、前記プロＭＭＰはプロＭＭＰ９であり、かつ前記化学物質は、アポ形態のプロＭＭＰ９のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）１０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合し、付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわち、プロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである。
【００５０】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、並びにそれらの溶媒和物、水和物、互変異性体、又は製薬上許容され得る塩、からなる群から選択される化学物質を使用して、プロＭＭＰの活性化を阻害する方法を含み、ここで、前記プロＭＭＰはプロＭＭＰ９であり、かつ前記化学物質は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含むアロステリックな結合部位に結合し、付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわち、プロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである。
【００５１】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子及び製薬上許容され得る担体を含む医薬組成物を使用して、プロＭＭＰの活性化を阻害する方法を含み、ここで、前記プロＭＭＰはプロＭＭＰ９であり、かつ前記化学物質は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００５２】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、並びにそれらの溶媒和物、水和物、互変異性体、又は製薬上許容され得る塩、からなる群から選択される化学物質を使用して、プロマトリックスメタロプロテアーゼ（プロＭＭＰ）の活性化を阻害する方法を含み、前記プロＭＭＰは、次の：プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記化学物質は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００５３】
他の実施形態では、本発明は、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子及び製薬上許容され得る担体を含む医薬組成物を使用して、プロＭＭＰの活性化を阻害する方法を含み、ここで、前記プロＭＭＰは、次の：プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記化学物質は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰの活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で投与することにより、哺乳類においてマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性を阻害する方法を含む。
【００５５】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰの活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で投与することにより、哺乳類においてマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性を阻害する方法を含み、ここで、前記ＭＭＰはＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子はアポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００５６】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰの活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で投与することにより、哺乳類においてマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性を阻害する方法を含み、ここで、前記ＭＭＰはＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含むアロステリックな結合部位に結合し、付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである。
【００５７】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰの活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で投与することにより、哺乳類においてマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性を阻害する方法を含み、前記ＭＭＰは、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９のホモログであり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域と相同な領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００５８】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含む。
【００５９】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、前記症候群、疾患又は疾病は、ＭＭＰの高発現すなわちＭＭＰの過剰発現と関連付けられ、あるいはＭＭＰの高発現又はＭＭＰの過剰発現と関連付けられる症候群、疾患又は疾病に伴う状態である。
【００６０】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、前記症候群、疾患又は疾病は、次の：腫瘍性疾患、変形性関節症、リウマチ様関節炎、循環器疾患、胃潰瘍、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸症候群、歯周病、皮膚潰瘍、肝線維症、気腫、マルファン症候群、脳卒中、多発性硬化症、喘息、腹部大動脈瘤、冠動脈疾患、特発性肺線維症、腎線維症、及び片頭痛からなる群から選択される。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰの活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で投与することにより、哺乳類においてマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性を阻害する方法を含み、前記ＭＭＰは、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９のホモログであり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域と相同な領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００６２】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記ＭＭＰはＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００６３】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は、ＭＭＰの高発現すなわちＭＭＰの過剰発現と関連付けられ、あるいはＭＭＰの高発現又はＭＭＰの過剰発現と関連付けられる症候群、疾患又は疾病に伴う状態であり、前記ＭＭＰはＭＭＰ９であり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００６４】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は、次の：腫瘍性疾患、変形性関節症、リウマチ様関節炎、循環器疾患、胃潰瘍、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸症候群、歯周病、皮膚潰瘍、肝線維症、気腫、マルファン症候群、脳卒中、多発性硬化症、喘息、腹部大動脈瘤、冠動脈疾患、特発性肺線維症、腎線維症、及び片頭痛からなる群から選択され、前記ＭＭＰはＭＭＰ９であり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００６５】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記ＭＭＰは次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択される、ＭＭＰ９のホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである領域を含むアロステリックな結合部位に結合する。
【００６６】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は、ＭＭＰの高発現すなわちＭＭＰの過剰発現と関連付けられ、あるいはＭＭＰの高発現又はＭＭＰの過剰発現と関連付けられる症候群、疾患又は疾病に伴う状態であり、前記ＭＭＰは、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択される、ＭＭＰ９のホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである領域を含むアロステリックな結合部位を含む。
【００６７】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は、次の：腫瘍性疾患、変形性関節症、リウマチ様関節炎、循環器疾患、胃潰瘍、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸症候群、歯周病、皮膚潰瘍、肝線維症、気腫、マルファン症候群、脳卒中、多発性硬化症、喘息、腹部大動脈瘤、冠動脈疾患、特発性肺線維症、腎線維症、及び片頭痛からなる群から選択され、前記ＭＭＰは、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択される、ＭＭＰ９のホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子は、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである領域を含むアロステリックな結合部位と結合する。
【００６８】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は腫瘍性疾患であり、卵巣がんである。
【００６９】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は循環器疾患であり、かつ前記循環器疾患は、次の：アテローム性動脈硬化プラークの破裂、動脈瘤、血管組織の形態形成、冠動脈疾患及び心筋組織の形態形成からなる群から選択される。
【００７０】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記症候群、疾患又は疾病は循環器疾患であり、かつ該循環器疾患はアテローム性動脈硬化巣の破裂である。
【００７１】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、かつ前記症候群、疾患又は疾病は、関節リウマチである。
【００７２】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、かつ前記症候群、疾患又は疾病は喘息である。
【００７３】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、かつ前記症候群、疾患又は疾病は、慢性閉塞性肺疾患である。
【００７４】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、かつ前記症候群、疾患又は疾病は、炎症性腸症候群である。
【００７５】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、かつ前記症候群、疾患又は疾病は、腹部大動脈瘤である。
【００７６】
他の実施形態では、本発明は、症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法を含み、前記方法は、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、かつ前記症候群、疾患又は疾病は、変形性関節症である。
【００７７】
本発明の追加の実施形態及び利点は、本開示に包含される発明の詳細、スキーム、実施例及び請求項から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
ここで本発明の実施形態を、添付の図面を参照し、例示のみの目的で説明する。
【図１】連鎖球菌細胞壁のペプチドグリカン多糖類の腹腔内投与により関節炎を誘導した後に雌性Ｌｅｗｉｓラットから採取した滑膜細胞におけるプロＭＭＰ９の活性化に対する、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、すなわち実施例２の効果を実証する、２種類の酵素を用いたウェスタンブロット。マウスモノクローナル抗体、ｍＡｂ  Ｌ５１／８２により、プロ形態及びプロセシングを受けた形態のＭＭＰ９が検出された。マウスモノクローナル抗体により、実施例２が、８０ｋＤ活性形態のＭＭＰ９の出現並びに８６ｋＤ形態のタンパク質の出現を用量依存的に減少させたことが示された（図１Ａ、レーン３〜６）。ウサギポリクローナル抗体ｐＡｂ−１２４６により８０ｋＤ活性形態のＭＭＰ９が検出されたものの、１００ｋＤ形態のプロＭＭＰ９は認識されなかった。ウサギポリクローナル抗体により、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、８０ｋＤ活性形態のＭＭＰ９の出現を用量依存的に減少させたことが示された（図１Ｂ、レーン２〜６）。
【図２】連鎖球菌細胞壁のペプチドグリカン多糖類（ＳＣＷ）の腹腔内投与により関節炎を誘導した後に、雌性Ｌｅｗｉｓラットから採取した脛骨−足根骨関節（足首）においてプロＭＭＰ９が増加していたこと及び活性型ＭＭＰ９画像化していたことを実証する、ウェスタンブロット。生理食塩水を投与したラットの健常な足首では、ｍＡｂ−Ｌ５１／８２により約１００ｋＤプロＭＭＰ９及び約８０ｋＤ形態の活性型ＭＭＰ９が少量検出された（図２Ａ、レーン１及び２）。ＳＣＷ投与から５日及び１８日後の足首破砕液では、プロＭＭＰ９の量は著しく増加していた（図２Ａ、それぞれレーン３〜５、及び６〜８）。８０ｋＤの活性型ＭＭＰ９の量は、ＳＣＷ投与の５日後に中程度に増加しており（図２Ａ、レーン３〜５）、ＳＣＷ投与の１８日後には顕著に増加していた（図２Ａ、レーン６〜８）。生理食塩水を投与したラットの健常な足首では、ｍＡｂ−１２４６により８０ｋＤの活性型ＭＭＰ９が少量検出された（図２Ｂ、レーン１及び２）。８０ｋＤ活性型ＭＭＰ９は、ＳＣＷ投与の５日後に中程度に増加しており（図２Ａ、レーン３〜５）、ＳＣＷ投与の１８日後には顕著に増加していた（図２Ａ、レーン６〜８）。
【図３】連鎖球菌細胞壁のペプチドグリカン多糖類（ＳＣＷ）の腹腔内投与により関節炎を誘導した後に雌性Ｌｅｗｉｓラットから採取した脛骨−足根骨関節（足首）におけるプロＭＭＰ９の活性化に対する、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、すなわち実施例２の効果を実証する、２種類の酵素を用いたウェスタンブロット。ＳＣＷにより誘導し賦形剤処理したラットの足首には、プロＭＭＰ９及び活性型ＭＭＰ９の両方が豊富に存在していた（図３Ａ及び３Ｂ、レーン１〜３）。実施例２によるラットの処置では、プロＭＭＰ−９の存在量は減少していなかった（図３Ａ、レーン４〜９）。しかしながら、実施例２によりラットを処置した場合、ｐＡｂ−１２４６（図３Ｂ、レーン４〜９）及び同様にｍＡｂ−Ｌ５１／８２（図３Ａ、レーン４〜９）により検出された活性型の８０ｋＤの形態のＭＭＰ９が著しく減少した。
【図４Ａ】阻害されたプロＭＭＰ９（暗色構造）とアポプロＭＭＰ９（明色構造）とを重ね合わせた図。位置を置き換えたループの正確な配置は異なる阻害因子により変化し得る一方で、全ての阻害因子は同様のポケットに結合し、結合が切断されて活性型酵素が形成されないよう阻害する。ＡはプロＭＭＰ９と実施例２との複合体であり、ＢはプロＭＭＰ９と実施例３との複合体であり、ＣはプロＭＭＰ９と実施例４との複合体である。
【図４Ｂ】阻害されたプロＭＭＰ９（暗色構造）とアポプロＭＭＰ９（明色構造）とを重ね合わせた図。位置を置き換えたループの正確な配置は異なる阻害因子により変化し得る一方で、全ての阻害因子は同様のポケットに結合し、結合が切断されて活性型酵素が形成されることを予防する。ＡはプロＭＭＰ９と実施例２との複合体であり、ＢはプロＭＭＰ９と実施例３との複合体であり、ＣはプロＭＭＰ９と実施例４との複合体である。
【図４Ｃ】阻害されたプロＭＭＰ９（暗色構造）とアポプロＭＭＰ９（明色構造）とを重ね合わせた図。位置を置き換えたループの正確な配置は異なる阻害因子により変化し得る一方で、全ての阻害因子は同様のポケットに結合し、結合が切断されて活性型酵素が形成されることを予防する。ＡはプロＭＭＰ９と実施例２との複合体であり、ＢはプロＭＭＰ９と実施例３との複合体であり、ＣはプロＭＭＰ９と実施例４との複合体である。
【図５】アポプロＭＭＰ９（印を付した構造）により阻害されたプロＭＭＰ９の構造を重ねあわせて示す。阻害因子をボール及び棒様に示し、構造をリボン様に示す。位置を置き換えたループの正確な配置は異なる阻害因子により変化し得る一方で、全ての阻害因子は同様のポケットに結合し、結合が切断されて活性型酵素が形成されることを予防する。実施例２、実施例３及び実施例４を阻害因子として示す。
【図６】プロＭＭＰ９構造の露出表面。触媒ドメインにおける残基の接触表面は暗灰色に着色し、プロドメインの残基に由来する接触表面は中間の濃さの灰色で着色してある。
【図７】これまでに決定されているプロＭＭＰ構造のオーバーラップ構造。このオーバーラップにより、類似する三次構造が、触媒ドメインとの接触により活性化される最終的な切断部位を有するその他のＭＭＰプロドメインにも存在することが示される。
【図８−１】ヒトＭＭＰファミリーのプロドメインの配列アラインメント。これらのドメインの三次構造は、構造が決定され、残りのＭＭＰの配列から同様の折りたたみを有することが予想される４本のヘリックス束からなる。触媒ドメインのキャビティを充填する多様な残基が存在するものの、一般的な様式の安定化は同様のままである。
【００７９】
【図８−２】ヒトＭＭＰファミリーのプロドメインの配列アラインメント。これらのドメインの三次構造は、構造が決定され、残りのＭＭＰの配列から同様の折りたたみを有することが予想される４本のヘリックス束からなる。触媒ドメインのキャビティを充填する多様な残基が存在するものの、一般的な様式の安定化は同様のままである。
【００８０】
定義
一般に、生物工学及び化学と同様に、本発明の説明は、多くの技術用語の使用を必要とする。あまり徹底的に行うのは実用的ではないが、これらの用語の幾つかの定義は、容易に参照できるように、本明細書に提供される。別段の規定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。他の用語に対する定義もまた、本明細書の他の場所で出現し得る。しかしながら、本明細書に提供される定義は、常に、定義された用語の意図した範囲及び意味を考慮しなければならない。本願に記載されているものと類似した又は等価な任意の方法及び部材を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び部材を記載する。
【００８１】
用語「具備する（comprising）」は「主として備えるが、必ずしも単独で備えるのではない」ことを意味する。更に、「含む（comprise及びcomprises）」等の、単語「具備する（comprising）」の変化形はそれに応じて変化した意味を有する。
【００８２】
本明細書で使用するとき、用語「含有する（containing）」、「有する（having）」及び「包含する（including）」は、幅広い非限定的な意味で用いる。
【００８３】
本明細書で使用するとき、「配列」とは、例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の順序又はポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序のような、モノマーがポリマー中に生じる線形順序（linear order）を意味する。
【００８４】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基がペプチド結合又は修飾ペプチド結合により結合したアミノ酸鎖を指す。アミノ酸鎖は、２アミノ酸を超える任意の長さのものであってもよい。特に指定のない限り、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、その種々の修飾形態をも包含する。このような修飾形態は、自然発生的に修飾された形態であっても化学的に修飾された形態であってもよい。修飾された形態の例としては、限定するものではないが、グリコシル化形態、リン酸化形態、ミリストイル化形態、パルミトイル化形態、リボシル化形態、アセチル化形態、ユビキチン化形態などが挙げられる。修飾には、分子内架橋、並びに脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコール又はそれらの誘導体などの各種基との共有結合も包含される。更に、修飾には、環化、分岐及び架橋も包含することができる。更に、遺伝子のコドンによりコードされた従来の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸もまた、ポリペプチドに含まれることができる。
【００８５】
本明細書で使用するとき、タンパク質又は核酸分子は、タンパク質又は核酸分子が、実質的に、タンパク質又は核酸の源からの汚染物質から分離される場合、「単離された」と考えられる。
【００８６】
本明細書で使用するとき、「天然タンパク質」という用語は、その天然源又は有機体から単離されたタンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。
【００８７】
本明細書で使用するとき、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸のＬ異性体を指す。天然に存在するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシルグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、及びリシンである。具体的に指示されない限り、全てのアミノ酸は、本願において、Ｌ型であるものを指す。
【００８８】
本明細書で使用するとき、「非天然アミノ酸」という用語は、タンパク質に天然に見出されないアミノ酸を指す。例えば、セレノメチオニンである。
【００８９】
本明細書で使用するとき、「正電荷を持つアミノ酸」という用語は、正常な生理学的条件下で、正電荷を持つ側鎖を有するあらゆるアミノ酸を包含する。正電荷を持つ天然に存在するアミノ酸の例は、アルギニン、リシン、及びヒスチジンである。
【００９０】
本明細書で使用するとき、「負電荷を持つアミノ酸」という用語は、正常な生理学的条件下で、負電荷を持つ側鎖を有するあらゆるアミノ酸を包含する。負電荷を持つ天然に存在するアミノ酸の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００９１】
本明細書で使用するとき、「疎水性アミノ酸」という用語は、水中で相対的に不溶性である、非荷電の非極性の側鎖を有するあらゆるアミノ酸を包含する。天然に存在する疎水性アミノ酸の例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンである。
【００９２】
本明細書で使用するとき、「親水性アミノ酸」という用語は、水中で相対的に可溶性である、非荷電の極性の側鎖を有するあらゆるアミノ酸を包含する。天然に存在する親水性アミノ酸の例は、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、及びシステインである。
【００９３】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、本明細書で定義されるように、タンパク質又はペプチドをコードするか、又はこのようなペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、又は適切な厳密性条件下で、このような核酸にハイブリダイズし、それに安定的に結合した状態である、ＲＮＡ又はＤＮＡとして定義される。核酸配列は、それぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵと略される、チミジン、アデニン、シトシン、グアニン、及びウラシルの塩基の天然ヌクレオチド、並びに／又は天然ヌクレオチドの合成類似体から構成されてよい。
【００９４】
用語「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」は、比較的短鎖の、例えば１００残基長未満の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。多くの手法に関し、約１６〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが有用であるものの、場合により約２５ヌクレオチド長超のオリゴヌクレオチドを使用することもできる。幾つかのオリゴヌクレオチドは、核酸の相補鎖を合成するための「プライマー」として使用してよい。例えば、ＤＮＡプライマーは、相補的核酸配列とハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼを用いた反応における相補的ＤＮＡ鎖の合成の準備をすることができる。オリゴヌクレオチドはまた、幾つかの核酸検出方法におけるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロッティング又は原位置ハイブリダイゼーションにも有用である。
【００９５】
「組み換え体」とは、分子生物学技術を用いてその自然状態以外の何かに修飾されている、核酸、核酸にコードされたタンパク質、細胞、又はウイルス粒子を指す。例えば、組み換え細胞は、細胞の自然（非組み換え）形態には見出されないヌクレオチド配列を含有してよく、又は、別の方法では異常に低発現した、若しくは全く発現しない自然遺伝子を発現してよい。組み換え細胞は細胞の自然形態に見出される遺伝子を含有してもよく、遺伝子は人工的手段によって修飾され細胞に再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を取り除くことなく修飾されている内因性核酸を含有する細胞も包含し、このような修飾としては、例えば、遺伝子置換及び部位特異的変異により得られるものが挙げられる。
【００９６】
本明細書で使用するとき、「高い厳密性」という用語は、２つの核酸がハイブリダイズされ得、かつ、例えば、２つの核酸のハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの期間中、使用される、溶液中の塩及び／又は洗剤の濃度、溶液の温度を包含し得る、条件を指す。したがって、本明細書で使用するとき、「高い厳密性」という用語は、このような核酸が、高度の相補性を共有する場合のみ、２つの核酸のハイブリダイゼーションを助長する溶液中の条件を指す。相補性度は、約９０％〜１００％の範囲が包含され得るが、これらに限定されない。したがって、「高い厳密性」条件は、異なる温度、並びに洗剤、塩、及び二価カチオンの種々の濃度を含む、緩衝液の使用が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００９７】
本明細書で使用するとき、「ベクトル」とは、異種核酸が挿入され得る又は挿入される核酸分子を指す。幾つかのベクトルが宿主細胞に導入されて、ベクトルの複製、又はベクトル若しくは作成物によってコードされるタンパク質の発現が可能になり得る。ベクトルは、典型的には、選択マーカー、例えば、薬剤耐性を可能にするタンパク質をコードする遺伝子、複製配列の開始点、及び異種配列の挿入を可能にする多重クローニング部位を有する。ベクトルは、典型的には、プラスミドベースであり、小文字の「ｐ」に続く文字及び／又は数の組み合わせにより指定される。本明細書で開示された出発プラスミドは、市販のもの若しくは無制限に公的に入手可能なもののいずれか、又は当該技術分野において公知の手順を適用することにより、入手可能なプラスミドから構築されてもよい。本発明に従って使用され得る多くのプラスミド並びに他のクローニング及び発現ベクトルは周知であり、当業者に容易に入手可能である。更に、当業者は、本発明における使用に好適な任意の数の他のプラスミドを容易に構築できる。本発明における、このようなプラスミド並びに他のベクトルの性質、構築及び使用は、本開示から当業者に容易に明らかとなる。
【００９８】
本明細書で使用するとき、「プロＭＭＰ」は、プロ形態のマトリックスメタロプロテイナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼとしても既知）を発現させた結果として得られるタンパク質を指すために使用される。この用語の意味する範囲内では、プロＭＭＰには、プロＭＭＰ遺伝子又はｃＤＮＡ、欠失、置換及び短縮化、並びにこれらの修飾形態を含むこれらの変異体によりコードされる全てのタンパク質が包含されるものと理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「プロＭＭＰ」には、活性型へのプロセシングを完全には受けていない、一部プロセシングを受けた状態のプロＭＭＰも包含される。
【００９９】
本明細書で使用するとき、用語「ＭＭＰ９のホモログ」又は「ＭＭＰ９ホモログ」は、ヒトプロＭＭＰ９と構造又は配列がホモログであり、かつ活性型へとプロセシングを受けた場合にマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）タンパク質の活性を有する、分子を指す。ヒトＭＭＰ９ホモログの例としては、限定するものではないが、ヒトプロＭＭＰ１、ヒトプロＭＭＰ２、ヒトプロＭＭＰ３、ヒトプロＭＭＰ９、ヒトプロＭＭＰ１３、並びに保存的置換、付加、欠失又はこれらの組み合わせを含むプロＭＭＰを包含するその他の種由来のプロＭＭＰが挙げられる。非限定例として、ヒトプロＭＭＰ９には、配列番号１２、並びに配列番号１２と少なくとも約７０％アミノ酸配列同一性を有するそれらの変異体、又は好ましくは配列番号１２と８０％、８５％、９０％及び９５％配列同一性を有するそれらの変異体、あるいは好ましくは、配列番号１２と少なくとも約９５％以上配列同一性を有するそれらの変異体が含まれる。
【０１００】
本明細書で使用するとき、用語「ホモログな領域」及び「〜とホモログな領域」は、異なる一次アミノ酸配列を有するものの、最終的な二次及び三次構造が類似するタンパク質の領域を指す。本発明での使用が企図されるホモログ領域としては、限定するものではないが、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される領域を包含し、かつプロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位とホモログな領域が挙げられる。
【０１０１】
本明細書で使用するとき、用語「活性化」は、不活性なプロ型のマトリックスメタロプロテイナーゼ（プロＭＭＰ）から活性型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）への変化を生じさせるプロセシングを指す。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、用語「活性」又は「活性型」は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により発揮され、標準的な手法により生体内又は生体外で測定される活性を指す。このような活性の例としては、限定するものではないが、触媒活性又はリガンド若しくはそれらの類似体に対する結合能などの直接的な活性、転写活性の変化又はＭＭＰ活性により直接的に若しくは間接的に調節される遺伝子若しくは遺伝子産物のレベルの変更、ＭＭＰ活性により発現が直接的に若しくは間接的に影響を受ける場合のある他のタンパク質に対する酵素活性の変更、又はＭＭＰ活性の変更により得られる細胞生理の機能的な変更が挙げられる。
【０１０３】
本明細書で使用するとき、用語「アロステリックな」は、活性部位以外の結合部位に結合することを指す。
【０１０４】
本明細書で使用するとき、用語「活性部位」は、活性型ＭＭＰ上の領域、あるいはヒトＭＭＰ若しくはホモログの触媒活性に直接関与する活性型ＭＭＰの構造モチーフ上の領域を指す。
【０１０５】
本明細書で使用するとき、用語「プロセシング阻害因子」、「活性阻害因子」及び「活性化阻害因子」は、全て、活性型形態へのプロＭＭＰのプロセシングを阻害し、ひいては生体外又は生体内において測定され得るＭＭＰ活性を調節する能力を有するリガンドを指す。プロセシング阻害因子としては、小分子（好ましくは約１，０００ダルトン未満）が好ましい。
【０１０６】
本明細書で使用するとき、用語「小分子」は、分子量が約１，０００未満の任意の分子又は化合物質を指す。
【０１０７】
本明細書で使用するとき、用語「化合物質」は、化合物、少なくとも２つの化合物の複合体、及びこのような化合物又は複合体の断片を指す。例えば、化学改質は、リガンド、基質、ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチド二リン酸、リン酸塩、ヌクレオチド、アゴニスト、作動剤、拮抗剤、阻害因子、抗体、薬剤、ペプチド、タンパク質又は化合物であり得る。
【０１０８】
本明細書で使用するとき、用語「リガンド」は、ヒトＭＭＰ又はプロＭＭＰ、ＭＭＰ又はプロＭＭＰのサブユニット、ＭＭＰ又はプロＭＭＰのドメイン、ＭＭＰ又はプロＭＭＰの標的構造モチーフ、ＭＭＰ又はプロＭＭＰの断片、と結合する又はこれらに結合する任意の分子又は化学改質を指す。したがって、リガンドとしては、限定するものではないが、プロＭＭＰに結合してプロＭＭＰの活性型ＭＭＰへのプロセシングを阻害するプロセシング阻害因子が挙げられる。リガンドとしては、小分子（好ましくは約１，０００ダルトン未満）が好ましい。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、プロＭＭＰタンパク質に関し使用する場合、用語「アポ」及び「アポ型」は、アロステリックな結合部位に、アロステリックなプロセシング阻害因子を結合していないプロＭＭＰタンパク質を指す。
【０１１０】
本明細書で使用するとき、原子、分子、又は化学基の会合に関連して使用された場合の「結合する」、「結合すること」、「結合」、又は「結合された」という用語は、２個以上の原子、分子、又は化学基のいずれかの物理的接触又は会合を指す。
【０１１１】
本明細書で使用するとき、用語「結合部位」又は「結合ポケット」は、ＭＭＰ又はプロＭＭＰ、並びにリガンドと、ＭＭＰ又はプロＭＭＰとを含む複合体分子の領域を指し、結果として、ＭＭＰ又はプロＭＭＰの一次アミノ酸配列及び／又はその立体構造、望ましくは、他の化学物質又はリガンド、補因子、阻害因子若しくは他の種類の修飾因子を指す。
【０１１２】
本明細書で使用するとき、「標的構造モチーフ」、「標的モチーフ」又は「ドメイン」とは、任意の合理的に選択された配列若しくは配列の組み合わせを指し、この配列は、プロＭＭＰ又はＭＭＰの折り畳み時に形成される３次元配置若しくは電子密度マップに基づいて選択される。当該技術分野において既知の種々の標的モチーフがある。タンパク質の標的モチーフには、酵素活性部位、阻害因子結合部位、アロステリック結合部位、構造サブドメイン、エピトープ、機能ドメイン、及びシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。入力及び出力手段の種々の構造形式が、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて、情報を入力及び出力するために使用され得る。
【０１１３】
化合物を「選択すること」、「選択する」、「選択された」、「特定する」、「特定」若しくは「特定された」という用語により、（ａ）タンパク質錯体若しくはその相互作用するタンパク質メンバーの調節物質であることが以前に未知の群から化合物を選ぶこと、並びに（ｂ）タンパク質錯体若しくはその相互作用するタンパク質メンバーを結合する若しくはその機能及び活性を調節することが可能であることが既知である化合物を試験することの双方を包含することを意図している。化合物は、限定するものではないが、小分子有機又は無機化合物及び天然又は合成分子などの数多くの化学的分類を包含する。好ましくは、それらは小有機化合物、即ち、１，０００ダルトン未満の分子量を有するものである。
【０１１４】
「高スループットアッセイ」又は「高スループットスクリーニング」という用語は、複数のサンプルの容易なスクリーニングを同時に、かつ／若しくは迅速な連続で可能にするアッセイ設計を指し、ロボット操作の能力を包含し得る。高スループットアッセイの別の所望の特性は、試薬の使用を低減する、又は所望の分析を成し遂げるための操作の数を最低限に抑えるように最適化したアッセイ設計である。高スループットアッセイ形式の例は、液体を取り扱う実験に使用される９６ウェル、３８４ウェル、及び１５３６ウェルプレート、若しくは「ラボチップ（lab on a chip）」マイクロチャンネルチップが挙げられるが、これらに限定されない。プラスチック型及び液体取扱装置の小型化が進行すると、又は改良型アッセイ装置が設計されると、本発明の型を用いてより多くの試料を処理できることは、当業者に周知である。本発明は、プロＭＭＰと相互作用するよう意図され又は設計された新規化合物を試験するために利用することのできる、任意のハイスループットなスクリーニング法を包含する。高スループットスクリーニングにおける一般情報に関しては、例えば、（Ｄｅｖｌｉｎ（編集者）１９９８）、及び米国特許番号（ＵＳ５７６３２６３）を参照のこと。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、「原子座標」又は「構造座標」という用語は、各原子に対して、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＢを包含する、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式において、プロＭＭＰ又はＭＭＰの結晶における原子の位置を説明する、数学的座標を指す。結晶から得られた回折データを使用して、結晶の反復単位の電子密度マップを計算する。電子密度マップは、結晶内の個々の原子の位置（即ち、Ｘ、Ｙ、及びＺ座標）を構築するために使用され得る。当業者は、Ｘ線結晶学によって決定される一組の構造座標が、標準誤差が伴うことを理解している。
【０１１６】
「原子型」という用語は、座標が測定された化学元素を指す。
【０１１７】
「Ｘ」、「Ｙ」、及び「Ｚ」という用語は、選択された結晶学的原点に関して測定された元素の結晶学的に決定された原子位置を指す。「Ｂ」という用語は、その平均位置に関して原子位置の平均偏差を測定する熱因子を指す。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、「結晶」という用語は、Ｘ線を回折する分子のいずれかの３次元配列アレイを指す。
【０１１９】
本明細書で使用するとき、組成物内の「担体」という用語は、製品を混合する希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。
【０１２０】
本明細書で使用するとき、構造−活性相関の省略である「ＳＡＲ」という用語は、化合物の活性／性質とその化学構造との間の相関に関する構造−活性／構造的性質関係を集合的に指す。
【０１２１】
本明細書で使用するとき、「分子構造」という用語は、特定の化合物の分子又は分子の錯体の３次元配列を指す（例えば、プロＭＭＰ及びアロステリックなプロセシング阻害因子の複合体の３次元構造）。
【０１２２】
本明細書で使用するとき、「分子モデル化」という用語は、分子の外観の現実的モデルを作成し、リガンドの構造活性相関に関する予測を立てるために、計算方法、好ましくはコンピュータ支援方法の使用を指す。分子モデル化に使用される方法は、分子グラフィックスから計算化学に及ぶ。
【０１２３】
本明細書で使用するとき、「分子モデル」という用語は、共有結合により連結された分子の原子の３次元配列、又は１個以上の分子を含む錯体、例えばタンパク質−リガンド複合体の原子の３次元配列を指す。
【０１２４】
本明細書で使用するとき、「分子グラフィックス」という用語は、分子の３次元（３Ｄ）表示、例えば、コンピュータ支援の計算方法を用いて作成された３Ｄ表示を指す。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、「コンピュータ読み取り可能な媒体」とは、コンピュータによって読み取り、かつ直接アクセスすることができる、任意の媒体を指す。このような媒体は、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープ等の磁気的記憶媒体、光ディスク若しくはＣＤ−ＲＯＭ等の光学的記憶媒体、ＲＡＭ及びＲＯＭ等の電気的記憶媒体、並びに、磁気／光学的記憶媒体等のこれらのカテゴリーのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本明細書で使用するとき、「記録される」とは、コンピュータ読み取り可能な媒体における記憶情報のための方法を指す。当業者は、コンピュータ読み取り可能な媒体における情報を記録するために、現在公知の方法のいずれかを容易に採用し、本発明のアミノ酸配列及び／又は原子座標／Ｘ線回折データ情報を含む製品を生産することができる。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、「コンピュータベースのシステム」とは、本発明の配列及び／又はＸ線回折データを分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、及びデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースのシステムの最小ハードウェア手段には、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、及びデータ記憶手段が包含される。当業者には、本発明で用いるのに、現在利用可能なコンピュータベースのシステムのどれが適しているかが容易に理解されよう。モニター等の可視化デバイスは、構造データを視覚化するために任意に提供される。
【０１２８】
上記のように、本発明のコンピュータベースのシステムは、本発明の配列及び／若しくは原子座標／Ｘ線回折データをその中に記憶するデータ記憶手段、並びに分析手段を支援し、かつ実施するために必要なハードウェア手段及びソフトウェア手段を含む。本明細書で使用するとき、「データ記憶手段」とは、本発明の配列若しくは原子座標／Ｘ線回折データを記憶することができるメモリ、又は本発明の配列若しくはＸ線データをそこに記録する製品にアクセスすることができるメモリアクセス手段を指す。
【０１２９】
本明細書で使用するとき、「検索手段」又は「分析手段」とは、標的配列若しくは標的構造モチーフをデータ記憶手段内に記憶された配列若しくはＸ線データと比較するためにコンピュータベースのシステムにおいて実施される、１つ以上のプログラムを指す。検索手段は、特定の標的配列若しくは標的モチーフを適合させるタンパク質の断片若しくは領域を同定するために使用される。種々の既知のアルゴリズムは、公的に開示され、検索手段を実行するための種々の市販のソフトウェアが、本発明のコンピュータベースのシステムに使用され得る。当業者は、コンピュータ分析を実行するために、利用可能なアルゴリズムのうちのいずれか１つ又は実装するソフトウェアパッケージが、現行のコンピュータベースのシステムで用いるのに、適用され得ることを容易に理解されよう。
【０１３０】
本明細書で使用するとき、「計算化学」という用語は、分子の物理的かつ化学的性質の計算を指す。
【０１３１】
本明細書で使用するとき、「分子置換」という用語は、未知結晶の観察された回折パターンを説明するために最善であるように、本発明に記載の前記原子座標を配置及び位置決定することによる、座標が未知のプロＭＭＰとアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体の結晶の予備的モデルを生成することを含む方法を指す。次いで、このモデルから位相を算出し、観察された振幅と組み合わせて、座標が未知の構造の近似的フーリエ合成を与えることができる（Ｒｏｓｓｍａｎｎ  １９７２）。
【０１３２】
本明細書で使用するとき、「ホモログ」という用語は、第２の供給源からのタンパク質、コード核酸分子、若しくはそれらのいずれの機能性ドメインと、少なくとも約７０％若しくは７５％の配列同一性、又は少なくとも約８０％の配列同一性、又は更に好ましくは、少なくとも約８５％の配列同一性、又はなお更に好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、及び最も好ましくは、少なくとも約９５％、９７％若しくは９９％のアミノ酸若しくは核酸配列同一性を有する第１の供給源からの前記タンパク質からの、タンパク質、若しくは機能性ドメインをコードする、プロＭＭＰ分子又は核酸分子を指す。第２の供給源は、一次アミノ酸若しくはヌクレオチド配列を変化させるいずれかの利用可能な手段により遺伝子的に改変された第１の供給源からの分子の１つの変形であってもよく、又は第１の供給源のものと同一若しくは異なる種からであってもよい。
【０１３３】
「二乗平均平方根」という用語は、平均値からの偏差の二乗の相加平均の平方根を意味する。
【０１３４】
本明細書で使用するとき、「水素結合」という用語は、ただ１個の原子に共有結合する水素を共有し、一方で他と相互作用する２個の親水性原子（ＯあるいはＮのいずれか）を指す。
【０１３５】
本明細書で使用するとき、「疎水性相互作用」という用語は、２個の疎水性残基又は原子（例えば、炭素）により行われる相互作用を指す。
【０１３６】
本明細書で使用するとき、「共役系」という用語は、電子が全系内で完全に非局在化されている、互いに隣接する２個以上の二重結合を指す。これは、芳香族残基も包含する。
【０１３７】
本明細書で使用するとき、「芳香族残基」という用語は、非局在化共役系を有する側鎖を有するアミノ酸を指す。芳香族残基の例は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである。
【０１３８】
本明細書で使用するとき、「Ｒ又はＳ−異性体」という用語は、国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）により採択されたカーン−インゴルド−プレログ系（Cahn-Ingold-Prelog System）に従ってキラル炭素の２種の可能な立体異性体を指す。キラル炭素に付着する各基は、第１に、キラル炭素に直接付着する原子の原子番号に基づいて順位又は優先ａ、ｂ、ｃ、若しくはｄに割り当てられる。最高の原子番号を有する基が最高の順位ａを与えられ、次に高い原子番号を有する基が次の順位ｂを与えられ、以下同様である。次いで、最低の順位（ｄ）の基を観点から外す。ａからｂ次いでｃへの経路のトレースが反時計廻りの場合には、異性体は（Ｓ）と命名され、反対方向の時計廻りの場合に、異性体は（Ｒ）と命名される。
【０１３９】
本明細書で使用するとき、「立体異性体」という用語は、空間におけるそれらの原子の配向においてのみ異なる個別の分子の全ての異性体に対する一般的用語である。それは、エナンチオマー及び互いの鏡像ではない１個以上のキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を包含する。
【０１４０】
本明細書で使用するとき、「キラル中心」という用語は、４個の異なる基が付着している炭素原子を指す。
【０１４１】
本明細書で使用するとき、「エナンチオマー」又は「エナンチオマー的」という用語は、その鏡像に重ね合わせることができず、したがって光学的に活性である分子を指し、エナンチオマーは、偏光面を１つの方向で回転させ、その鏡像は、偏光面を反対の方向で回転させる。
【０１４２】
本明細書で使用するとき、「ラセミ」という用語は、エナンチオマーの等量部の混合物を指し、これは光学的に活性である。
【０１４３】
本明細書で使用するとき、「分解能」という用語は、分子の２つのエナンチオマー形態の１つの分離又は濃縮又は枯渇を指す。本願の文脈において、「分解能」という用語はまた、回折実験によって分解され得る、細部の量も指す。言い換えると、タンパク質結晶回折パターンの本来的な不規則性は、いくらかの回折角θmaxで消失するため、逆格子の相当する距離ｄminは、ブラッグの法則によって決定される。タンパク質結晶学の実際では、タンパク質電子密度の見かけ分解能は、ｄminの、データがマップの計算に含有される最小格子距離において、通常引用される。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、「共有結合」又は「原子価結合」という用語は、結合分子により、通常は対で、電子を共有して創成される分子内の２個の原子間の化学結合を指す。
【０１４５】
本明細書で使用するとき、「非共有結合」という用語は、原子及び／又は分子の間の共有結合の形成に関与しない原子及び／又は分子の間の相互作用を指す。
【０１４６】
用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む製品、及び特定の量の特定の成分の組み合わせから直接的又は間接的に得られる任意の製品を包含することを意図する。本発明の目的上、組成物は、担体をしばしば含むが、常にというわけではない。
【０１４７】
本明細書で使用される際、用語「対象」は、治療、観察、又は実験の対象である、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【０１４８】
本開示の医薬組成物又は本開示の複合薬の、治療的及び予防的目的に対する有効量を判定するための方法は、同一組成物において製剤化されるかどうかに関わらず、当該技術分野で既知である。治療的目的で、本明細書に使用される際、用語「治療的有効量」は、研究者、獣医、医師、若しくは他の臨床医によって探求される、組織系、動物、又はヒトにおいて、治療される疾患又は障害の症状の緩和を含む、単独又は組み合わせで、生物学的応答又は薬効的応答を引き出す、それぞれの活性化合物あるいは医薬品の量を意味する。予防的目的（すなわち、障害の発症又は進行の阻害）について、用語「治療的有効量」は、研究者、獣医、医師、若しくは他の臨床医によって探求されるような、対象において、単独又は組み合わせで、障害を治療するか、又はその発症若しくは進行を阻害する、それぞれの活性化合物あるいは医薬品の量を指す。したがって、本発明は、例えば、（ａ）それぞれの薬物が、独立して治療的有効量又は予防的有効量で投与される、（ｂ）組み合わせのうちの少なくとも１つの薬物が、単独で投与される場合に、治療量以下又は予防量以下の量で投与されるが、本発明による第２又は追加の薬物との組み合わせで投与される場合に、治療的又は予防的な量で投与される、あるいは（ｃ）両方（又はそれ以上）の薬物が、単独で投与される場合に、治療量以下又は予防量以下の量で投与されるが、共に投与される場合には治療的又は予防的な量で投与される、２つ以上の薬物の組み合わせを提供する。
【０１４９】
用語「製薬上許容され得る塩」は、非毒性の製薬上許容され得る塩を意味する（Ｂｅｒｇｅ，Ｂｉｇｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９７７，Ｇｏｕｌｄ  １９８６）。しかしながら、当業者に周知の他の塩も、本発明による化合物又は製薬上許容できる塩の調製に有用であり得る。代表的な有機又は無機酸としては、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸又はトリフルオロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な有機又は無機塩基としては、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛などの塩基性又はカチオン性塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【０１５０】
本明細書において与えられる図及び実施例は例示のためのものであり、本発明及びその種々の実施形態を限定しないものであるということが最初に理解されるべきである。
【０１５１】
本発明は、プロＭＭＰと、プロＭＭＰの活性化を阻害するアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体を含む結晶、並びにプロＭＭＰの活性化を阻害するアロステリックなプロセシング阻害因子を特定するための方法、並びにアロステリックなプロセシング阻害因子によりプロＭＭＰの活性化を阻害する方法、を包含する。非限定例では、プロＭＭＰはヒトプロＭＭＰ９であり、アロステリックなプロセシング阻害因子は分子量が約１，０００ダルトンを超えない小分子である。
【０１５２】
遺伝子操作を受けた形態及び断片
遺伝子操作を受けたプロＭＭＰ又はそれらの断片、例えば、２つ以上のアミノ酸によ規定されるプロドメインを含む遺伝子操作型又は断片は、合成法又は組み換え法など、何らかの利用可能な手法により製造することができる。次に、このような断片を本明細書に記載される通りのアッセイに使用して、例えば、限定するものではないが、ハイスループットアッセイに使用して、予期されるリガンド及び断片内のプロドメインとの相互作用を検出することができる。
【０１５３】
本発明の形態及び断片の組み換え発現又は産生のために、形態又は断片をコードする核酸分子が、調製され得る。本発明の改変形態又は断片をコードする核酸分子は、遺伝子コードの縮退のため、配列が異なってもよく、又はアミノ酸配列が異なるタンパク質若しくはタンパク質断片をコードするため、配列が異なってもよい。２個以上のかかる核酸分子間のホモのロジー又は配列同一性は、配列類似検索のために適応されているプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  １９９０）及び（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９３）によって採用されるアルゴリズムを用いて、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）解析によって決定される。
【０１５４】
ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、クエリー配列とデータベース配列との間の類似セグメントを最初に考慮し、次いで、同定された全てのマッチの統計的有意性を評価し、最後に事前に選択された有意性の閾値を満足するマッチを総合するものである。配列データベースの同様の探索における基本的な課題に関係する議論については、（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｂｏｇｕｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）を参照されたい。ヒストグラム、記述、アラインメント、エクスペクト（即ち、データベース配列に対するマッチを報告する統計的有意閾値）、カットオフ、マトリックス、及びフィルタの検索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルト評点マトリックスの考察に関しては、（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  １９９２）を参照のこと。
【０１５５】
本発明のコード核酸分子又はその断片（即ち、合成オリゴヌクレオチド）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプローブ又は特異性プライマーとして、又は本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために使用されるものは、化学技術、例えば、（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ  １９８１）のホスホトリエステル法によって、又は自動化合成方法を用いて容易に合成することができる。加えて、より大きいＤＮＡセグメントは、周知の方法、例えば、遺伝子の種々の調節セグメントを画定するオリゴヌクレオチドの群の合成、次いで、完全な改変された遺伝子を構築するためのオリゴヌクレオチドの連結によって容易に調製することができる。
【０１５６】
本発明のコード核酸分子は、診断及びプローブの目的のための検出可能な標識を含有するように、更に改変され得る。種々のかかる標識は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載のコード分子と共に容易に採用することができる。好適な標識には、ビオチン、放射能標識ヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、標識されたコード核酸分子を得るために、いずれかの当該技術分野で既知の標識を採用することができる。
【０１５７】
本発明は、本明細書に記載される、タンパク質又はタンパク質断片に対するコード配列を含有する組み換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を更に提供する。本明細書で使用するとき、ｒＤＮＡ分子は、分子操作されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）を参照されたい。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列及び／又はベクトル配列に操作可能に連結されている。
【０１５８】
本発明のタンパク質コード配列の１つが操作可能に連結されているベクトル及び発現制御配列の選択は、当該技術分野において周知のように、所望の機能的性質（例えば、タンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞）に直接に依存する。本発明のベクトルは、宿主染色体内への複製又は挿入、及び好ましくは、ｒＤＮＡ分子中に包含される構造遺伝子の発現も指令することができる。
【０１５９】
操作可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を制御するために使用される発現制御因子は、当該技術分野において既知であり、誘導可能なプロモータ、構成的プロモータ、分泌シグナル、及び他の制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、誘導可能なプロモータは、例えば、宿主細胞の媒体内の栄養物に応答するように容易に制御される。
【０１６０】
本発明は、本発明のタンパク質又はタンパク質断片をコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞も更に提供する。宿主細胞は、原核性又は真核性のいずれであってもよい。細胞株が細胞培養方法に適合し、発現ベクトルの増殖及び遺伝子産物の発現に適合する限り、本発明のタンパク質の発現のために有用な真核細胞は限定されない。好ましい真核宿主細胞には、昆虫、酵母、及び哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、ヨウトガ（Ｓｆ９又はＳｆ２１）昆虫細胞及びヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）が挙げられる。
【０１６１】
本発明の形質転換された宿主細胞は、組み換えタンパク質の産生を可能とする条件下で培養されてもよい。任意に、組み換えタンパク質は、媒体から又は細胞から単離され、タンパク質の回収及び精製は、ある不純物が容認できるような場合によっては、必要ではない場合がある。
【０１６２】
特定のアッセイ、例えば、アッセイに必要な試薬と共に任意に包装した上記の核酸分子、タンパク質、タンパク質断片、ベクトル及び／又は宿主細胞のいずれかを用いてキットを調製してもよい。このようなキットにおいて、タンパク質、タンパク質断片又は他の試薬は、固体支持体、例えば、ガラス又はプラスチックビーズに付着させてもよい。
【０１６３】
高スループットアッセイ
化合物同定方法は、以下に記載のものを含むが、これらに限定されない、従来の実験アッセイ形式を用いて、又は高スループットアッセイにおいて、実施することができる。
【０１６４】
イムノアッセイ
イムノアッセイは、例えば、生物学的液体のような錯体混合物中で、通常は低濃度で特定の生物化学物質の測定のために使用される技術の一群である。アッセイは、それらの相補性抗原に対して特異性及び高い親和性を有する、適切に調製され、選択された抗体に依存する。測定される物質は、必要な場合には、免疫原性巨大分子あるいはハプテン性小分子のいずれかの抗原性でなければならない。各試料に、既知で限定された量の特異性抗体を添加し、多くの場合に、結合：遊離比として表される、それと混合する抗原の割合を、抗体からのシグナルを定量化することによって推定する。定量化は、多くの容易に識別可能な標識を用いて達成され得、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の放射性同位体、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）の蛍光性分子、スピンイムノアッセイの安定な遊離基、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）の化学発光分子、免疫金アッセイのコロイド状金粒子、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の酵素が挙げられるが、これらに限定されない、種々の型のアッセイに使用することができる。
【０１６５】
通常のイムノアッセイ形式は、ＥＬＩＳＡであり、これは、放射能化学の危険及び蛍光検出系の経費を回避する。代わりに、ＥＬＩＳＡは、不溶性担持面上に連結され得る抗体（又は抗原）を使用し、次いで、試験溶液中の関連する抗原（又は抗体）を「捕捉」するために使用することに基づく、定量的イムノアッセイの１つの形態である。次いで、抗原−抗体錯体は、捕捉抗原（又は抗体）、又はその後の「検出」抗体（又は抗原）に共有結合され得る適切な酵素の活性を測定することによって検出される。ＥＬＩＳＡ技術における更なる情報に関しては、例えば、（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  １９９５）、（Ｋｅｍｅｎｙ（編集者）及びＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅ（編集者）１９８８）、（Ｋｅｍｅｎｙ  １９９１）、並びに（Ｉｓｈｉｋａｗａ  １９９９）を参照のこと。
【０１６６】
比色分析
酵素の比色分析アッセイは、多くの場合、比色計を用いて、化合物の標準及び試験量の双方と試薬との反応により発生する色を比較することによって、化合物の濃度又は量を決定する、定量的化学分析方法である。比色計は、目視に又は光電的に色強度又は色強度の差異を測定する装置である。例えば、βガラクトシダーゼ酵素活性による標準的な比色分析は、当業者によく知られており、例えば、（Ｎｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｉｎ  １９８５）を参照されたい。比色分析は、例えば、標準的な比色βガラクトシダーゼアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）において、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド（ＯＮＰＧ，シグマ）を基質として使用して、細胞可溶化物の精製画分又は未精製画分に実施することができる。米国特許番号（ＵＳ５７３３７２０）に記載されるように、自動化された比色分析アッセイも、β−ガラクトシダーゼ活性の検出に利用可能である。
【０１６７】
蛍光アッセイ
酵素によって作用した後、蛍光を発する酵素基質は、一般的に、周知である。このような蛍光基質は、典型的には、例えば、共有化学結合を通して互いに結合する、２つの構成要素を有する。１つの構成要素は、まず光エネルギーを受け入れ、次いで、光エネルギーを発光することによって、蛍光を発することが可能な蛍光分子である。他の構成要素は、２つの構成要素が互いに共有結合する場合、蛍光分子が光エネルギーを受け入れる、又は発光するのを防ぐ実体である。適切な酵素の存在下で、酵素は、２つの構成要素間で共有結合を切断し、蛍光分子が、光エネルギーを受け入れ、発光することを可能にするために、１つの構成要素を他の構成要素から分離する。換言すれば、酵素は、蛍光分子を遊離し、それが蛍光を発するようにする。理想的には、蛍光基質は、水性緩衝液中で可溶性かつ安定性があり、それらに作用する酵素に対して高親和性があり、かつ、酵素作用に強いシグナルを産出すべきである（ＵＳ５９９８５９３Ａ）。
【０１６８】
蛍光酵素基質の蛍光構成要素から発光された蛍光を検出する工程は、一般的には、２つの工程において達成される。蛍光分子は、第１に、光エネルギーを励起し、次いで、蛍光構成要素から発光した蛍光を検出する。概して、蛍光分子は、例えば、レーザー又は別の好適な光源からの光エネルギーを用いて励起することができる。蛍光は、蛍光分子によって発光される波長の光エネルギーを検出するように設計される装置を用いて検出される。このような励起及び発光検出システムは、概して、特定の波長範囲で動作するように設計される（ＵＳ５９９８５９３Ａ）。
【０１６９】
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）は、ＴＲＦ（時間分解蛍光法）及びＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の原理を合わせたものである。この組み合わせは、ＴＲＦのもつ、低バックグラウンドであるという利点と、ＦＲＥＴのもつ、アッセイフォーマットが均一であるという利点とを兼ね備える。時間分解蛍光法（ＴＲＦ）には、ランタニドと呼ばれる希土類金属に特有の性質に関係する利点がある。具体的には、ランタニドは、従来のフルオロフォアと比較してストークシフトが大きく、放出半減期が非常に長い。ＴＲＦアッセイで一般的に使用されるランタニドは、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）及びジスプロシウム（Ｄｙ）である。ランタニドは、光を吸収しかつ分子内のプロセスを介してランタニドへと放出する有機基と複合体形成する。ＦＲＥＴは２通りのフルオロフォア、すなわちドナー及びアクセプターを使用する。所定の距離内に互いに近接しているならば、エネルギー源によるドナーの励起（例えば、閃光灯又はレーザー蛍光光度計）により、アクセプターへのエネルギー遷移が引き起こされる。次に、アクセプターが所定の波長の光を放出する。このエネルギー遷移をもとに、蛍光標識を有する各パートナーとカップリングさせ、エネルギーの遷移度を検出することにより、生体分子間の分子間相互作用を評価することができる。エネルギー遷移の指標としてより重要なアクセプター放射は、未結合のアッセイ成分から結合成分を分離せずとも検出することができる（Ｋｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌａｒ  ２００１）。
【０１７０】
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（登録商標）アッセイ
ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）アッセイは、リガンドの結合親和性を評価する古典的な手法（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ，Ｐｅｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）に基づくものである。この手法は一般的なものであり、広範な系に適用することができ、かつ平衡結合定数（すなわち、真のＫD値）を介する理論的な解釈に基づく厳密なものである。当該技術は、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）等の染料の蛍光強度の変化をモニタリングする。蛍光染料は、水性環境下でクエンチされるが、変性タンパク質の疎水性コアに結合すると直ぐに蛍光性を増加する。
【０１７１】
この実験では、安定度は温度の着実な上昇としてモニターされ、動力学又は平衡理論のいずれかにより、高温下で、全体の半分がアンフォールディングなものに遷移するようになる結合リガンドの平衡値を決定し、ΔＴmとして記載する。リガンド結合及びタンパク質安定性の両方に関し、平衡定数の関数は、添加したリガンドのΔＴmに依存する。更に、タンパク質安定性に対する結合エネルギーの寄与率は、生成物の結合定数及びリガンド濃度により求めることができることから、化合物の結合により生じる結果は、一定の単一濃度のリガンド下でのΔＴmの大きさを基に比較することができる。したがって、化合物の力価は、ΔＴm値（「スクリーニング」モード）又はＫD値（完全な用量反応曲線）のいずれかの順位序列として比較することができる。測定可能なＫD値のダイナミックレンジは約２００ｕＭ〜１０ｐＭであり、解像度は、リガンド溶解度に応じた上限のみに制限される。
【０１７２】
３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発されたＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（登録商標）装置で、同種の３８４ウェルプレート系アッセイを実施する（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ，Ｐｅｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｍａｔｕｌｉｓ，Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。アッセイ成分は、典型的には、緩衝液中に、リガンドと共に又はリガンドは含有せずに、染料（２５〜１００μＭ、典型的には１，８−ＡＮＳ又はダポキシルスルホンアミド）を添加したタンパク質（１〜５μＭ）を含有する。アッセイ容量は典型的には２〜４ｕＬであり、適切な３８４ウェル熱サイクラーアッセイプレートに分注し、蒸発を防ぐため１ｕＬのシリコーンオイルを積層した。アッセイは、３８４ウェルプレートの温度に周囲温度から高温へと勾配をつけ、温度の漸増に応じた色素蛍光の変化をイメージ化し、ＣＣＤカメラによりプレートベースで色素の蛍光を測定するというものである。タンパク質アンフォールディングエネルギー及びリガンド結合エネルギーは、立証されている生物物理学的指針に基づき定量化される。
【０１７３】
３次元構造のモデリング
本明細書で提供される原子座標データ、又はホモログなタンパク質に由来する座標データを使用して、プロＭＭＰと、プロＭＭＰの活性化を阻害するアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体の３次元モデルを構築することができる。いずれかの利用可能な計算方法を使用して、３次元モデルを構築してもよい。出発点として、プロＭＭＰ又はプロＭＭＰホモログの結晶性バージョンにおける分子又は原子の集合体（assemblage）から得たＸ線回折パターンが、結晶学及びＸ線回折技術の当業者には周知のツールを用いて、電子密度マップを構築するために使用することができる。次いで、公開された出版物中の回折データ及び／又は補足実験からのいずれかから取り出した追加の位相情報を再構築を完成するために使用してもよい。
【０１７４】
電子密度の構築のためのＸ線回折データを収集、解析、及び利用する基本概念及び手順に関しては、例えば、（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  １９８４）、（Ｃａｎｔｏ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ  １９８０）、（Ｂｒｕｎｇｅｒ  １９９３）、（Ｗｏｏｌｆｓｏｎ  １９９７）、（Ｄｒｅｎｔｈ  １９９９）、（Ｔｓｉｒｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｚｅｒｏｖ  １９９６）、並びに米国特許第５９４２４２８Ａ号、同第６０３７１１７Ａ号、同第５２００９１０Ａ号、及び同第５３６５４５６Ａ号を参照されたい。
【０１７５】
分子モデル化の基本情報に関しては、例えば、（Ｓｃｈｌｅｃｈｔ  １９９８）、（Ｇａｎｓ，Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、（Ｃｏｈｅｎ（編集者）１９９６）、及び（Ｓｍｉｔｈ  １９９６）を参照のこと。分子モデル化の詳細な情報を提供する米国特許には、米国特許（ＵＳ４９０６１２２Ａ号、ＵＳ５０３０１０３Ａ号、ＵＳ５５８３９７３Ａ号、ＵＳ５６１２８９４Ａ号、ＵＳ５９９４５０３Ａ号、ＵＳ６０７１７００Ａ号、ＵＳ６０７５０１４Ａ号、ＵＳ６０７５１２３Ａ号、ＵＳ６０８０５７６Ａ号、ＵＳ６０９３５７３Ａ号）を参照されたい。
【０１７６】
リガンドを同定及び設計するために原子座標を使用する方法
本明細書に記載の原子座標、又は本明細書に記載のこれらの座標と実質的に同一である若しくはホモログである座標を、任意の利用可能な手法とともに使用して、プロＭＭＰと、プロＭＭＰの活性化を阻害するアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体の３次元モデルを構築することができ、並びにプロＭＭＰの活性化を阻害するアロステリックなプロセシング阻害因子の同定及び設計することができる。このような方法により、当業者による、プロＭＭＰと、プロＭＭＰの活性化を阻害するアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体又はそれらのサブドメインを含む関連する分子の３次元構造の解析及び分子モデリングを可能にする形態で、アミノ酸配列及び／又はＸ線回折データが提供される。
【０１７７】
例えば、３次元モデリングは、本明細書に記載のものなどのＸ線回折パターンをもとに実験的に求められた座標を使用して実施することもできる。例えば、このようなモデリングとしては、限定するものではないが、実際の構造の描図、実際の構造の物理モデルの構築、並びに座標を用いた関係するサブユニット及びプロＭＭＰ：リガンド及びプロＭＭＰサブユニット：リガンド複合体の決定が挙げられる。このような分子モデリングでは、既知のＸ線回折分子モデリングアルゴリズム又は分子モデリングソフトウェアを利用して、プロＭＭＰとプロＭＭＰの活性化を阻害するリガンドとの複合体の３次元構造に対応する原子座標を生成することができる。
【０１７８】
上記のように、分子モデリングは、既知の結晶構造に配列として同定できるように、関連する分子の実際的なモデルを構築するために、計算方法、好ましくはコンピュータ支援方法の使用を含む。分子モデリングは、プロＭＭＰの構造、及び又は既知のリガンド若しくは他の分子と複合体形成したプロＭＭＰの構造から開始して、プロＭＭＰに結合する新規分子をモデリングすることも包含する。リガンドモデル化に利用される方法は、分子グラフィックス（即ち、３Ｄ表示）からリガンドの結合若しくはリガンドの活性に関する予測を立てるための計算化学（即ち、物理的及び化学的性質の計算）に、新規のリガンドの設計に、及び化学合成のための薬物のようなリガンドを包含する新規分子の予測に、集合的に合理的薬物設計と呼ばれる方法にまで及ぶ。
【０１７９】
理論的薬物設計の１つのアプローチは、活性部位又はアロステリックな結合部位に結合し得る既知の分子構造について探索するというものである。分子モデル化を用いて、合理的薬物設計プログラムは、ある部位内に適合し得る薬物の一連の異なる分子構造を調査でき、どの構造か部位に実際に良く適合するかを決定することができる３次元環境内で移動させることによって、決定することができる。
【０１８０】
代替的ではあるが、関連する合理的薬物設計アプローチは、プロＭＭＰと追加的に有利な相互作用を行うために、小分子リガンドとの錯体の既知の構造から出発し、小分子の改変物をモデル化する。
【０１８１】
本発明は、プロＭＭＰのアロステリックなプロセシング阻害因子として機能する、小分子リガンドなどのリガンドを、設計及び選別するための分子及びコンピュータモデリング技術を包含する。例えば、本明細書に記載する通り、本発明は、プロＭＭＰに結合し、プロＭＭＰの触媒活性型タンパク質へのプロセシングを阻害するリガンドの設計を包含する。好ましくは、但し、非限定例ではあるが、リガンドはプロＭＭＰ９に結合し、プロＭＭＰ９の触媒活性型ＭＭＰ９へのプロセシングを阻害する。他の非限定的な実施例では、本発明は、プロＭＭＰ９と本発明のアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体の原子座標を使用して、アロステリックなプロセシング阻害因子を設計する方法を提供する。
【０１８２】
本発明の原子座標は、プロＭＭＰに対し相互作用をするのに最適の部位を決定して、プロＭＭＰに関係する有望なアロステリックなプロセシング阻害因子を同定するために、各種異なる化学的特徴から構成される異なる分子を有するプロＭＭＰの結晶を探索するのに必要とされる情報も提供する。例えば、溶媒で飽和した結晶から収集した高分解能Ｘ線回折データは、溶媒分子の各タイプが粘着する場所の決定を可能にする。次いで、それらの部位に結合する小分子を設計及び合成して、活性を調節する能力に関して試験できる（Ｔｒａｖｉｓ  １９９３）。
【０１８３】
本発明はまた、プロＭＭＰに全体として又は部分的に結合することができる化学的実体、薬剤、リガンド、又は化合物の小分子データベース及びライブラリをコンピュータ的にスクリーニングするための方法も包含する。このスクリーニングにおいて、結合部位又は部位へのかかる実体又は化合物の適合の質は、形状相補性により、又は推定された相互作用エネルギーのいずれかにより判定され得る（Ｍｅｎｇ，Ｓｈｏｉｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。
【０１８４】
本発明に従ってプロＭＭＰに結合する、又はプロＭＭＰの活性化を阻害するリガンドの設計には、２つの因子を検討することが包含される。まず、化合物は物理的及び構造的にプロＭＭＰと会合し得るものでなくてはならない。本明細書に記載の共有相互作用に加え、水素結合、ファンデルワールス及び疎水性相互作用などの非共有分子相互作用は、プロＭＭＰとリガンドとの会合に重要である。第２に、リガンドは、プロＭＭＰとの会合を可能にさせる立体構造を想定することのできるものでなくてはならない。リガンドのある部分は、プロＭＭＰとの会合に直接的に関与し得ないが、これらの部分は、それでも、分子の全体的立体配座に影響することもある。同様に、これは、リガンドの結合親和性、治療効力、薬剤類似品質、及び効力に著しく影響することもある。かかる立体配座の必要条件は、プロＭＭＰの活性部位又は他の領域の全て若しくは一部分と関連するリガンドの全体的３次元構造及び配向、又はプロＭＭＰと直接的に相互作用する数種の化学実体を含む化合物の機能性基の間の間隔を包含する。
【０１８５】
プロＭＭＰに結合し、プロＭＭＰの活性化を阻害するリガンドの可能性又は予測される能力は、実際に合成する前に解析し、コンピュータモデリング技術を使用して試験することができる。与えられたリガンドの理論的構造が、それとプロＭＭＰとの間の不十分な相互作用及び会合を示唆する場合には、リガンドの合成及び試験を避けてもよい。しかしながら、コンピュータモデル化が、強い相互作用を示す場合には、分子を合成し、プロＭＭＰと相互作用するその能力に関して試験してもよい。この様式で、作用がないリガンドの合成を避けることができる。他の場合では、モデリングを基に不活性型のリガンドを合成し、プロＭＭＰの特定の領域と相互作用するその他の化合物を設計するのに使用することのできるＳＡＲ（構造活性相関）の開発を補助するために試験することができる。
【０１８６】
当業者であれば、プロＭＭＰと会合する能力、及びより好ましくは本発明に記載の通りのプロＭＭＰの個々の結合ポケットと会合し得る能力をもとに、リガンドとして使用するための化学物質、断片、化合物、又はその他の剤を選別するためのいくつかの方法のうちのいずれかを使用することができる。非限定例では、プロＭＭＰは、ヒトプロＭＭＰ９である。本手法では、例えば、プロＭＭＰ又はリガンドと複合体形成しているプロＭＭＰの原子座標をもとにコンピュータスクリーン上でアロステリックな結合部位を確認するなど、目視観察により開始することもできる。選択された化学的実体、化合物、又は剤は、種々の配向で位置決めされるか、又はプロＭＭＰの個別の結合ポケット内にドッキングされてもよい。ドッキングは、限定するものではないが、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．から入手可能なＱＵＡＮＴＡ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手可能なＳＹＢＹＬ；次いで、標準分子機構力場を用いるエネルギー最小化及び分子力学、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なＣＨＡＲＭｍ；及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＡＭＢＥＲのようなソフトウェアを用いて、実施することができる。
【０１８７】
専門のコンピュータプログラムが、化学的実体を選択するプロセス中で支援してもよい。これらには、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能なＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  １９８５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．から入手可能なＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ  １９９１）、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能なＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ  １９９０）、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能なＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｂｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
種々の官能基特性を有するプローブと巨大分子表面との間の可能性がある相互作用部位を決定するプログラムであるＧＲＩＤのようなソフトウェアの使用は、類似の阻害性タンパク質又は化合物の構造を決定するために表面部位を解析するために使用される。プローブとして分子上の適当な阻害剤の基（例えば、プロトン化一級アミン）を使用するＧＲＩＤ計算は、好適なエネルギー等高線レベルで接近可能な位置の周囲の電位ホットスポットを同定するために使用される。プログラムＤＯＣＫは、活性部位又はリガンド結合部位を解析し、相補的立体性質を有するリガンドを示唆するために使用され得る。
【０１８９】
好適な化学物質、化合物、又は剤を有望なリガンドとして選別したならば、これらを単一のリガンド、化合物、アンタゴニスト（阻害因子）アゴニスト（活性化因子）、又はインバースアゴニストへと組み立てることができる。アセンブリは、３次元イメージ上で互いに断片の関係を目視検査して進めてもよい。これは、ＱＵＡＮＴＡ又はＳＹＢＹＬのようなソフトウェアを用いて手作業のモデル構築により続けてもよい。
【０１９０】
個別の化学的実体、化合物、又は薬剤の接続を支援するために有用なプログラムとしては、ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）；ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡから入手可能なＭＡＣＣＳ−３Ｄ等の３Ｄデータベースシステム（Ｍａｒｔｉｎ  １９９２）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＨＯＯＫが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９１】
ファーマコフォア（pharmacophore）仮説を試験し、スクリーニングのための化合物を選択する３次元データベースを検索する数種の方法が利用可能である。これらには、プログラムＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｃｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｔ  １９９２）が包含される。例えば、ＣＡＶＥＡＴは、すでに活性部位に位置付けられるいずれかの数の化学的断片を接続するための「スペーサー」として機能し得る環状化合物のデータベースを使用する。これにより、当業者は、緊密な結合に必要と既知又は予想される断片を接続する数百の可能な方法を迅速に生み出すことが可能である。
【０１９２】
上記のように、プロＭＭＰのアロステリックなプロセシング阻害因子を１回の１つの化学的実体という段階方法により構築を行なう代わりに、このようなリガンドは、空いた結合部位を用いて、あるいは所望により既知の分子のある部分を含むかのいずれかで、全体として、又は「新規に」設計され得る。これらの方法は、Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ  １９９２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．から入手可能なＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ  ａｎｄ  Ｉｔａｉ  １９９１）、及びＴｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，．ＵＳＡから入手可能なＬｅａｐＦｒｏｇを包含する。
【０１９３】
例えば、プログラムＬＵＤＩは、その中に水素結合及び疎水性断片の両方が位置する相互作用部位の表を決定することができる。次いで、ＬＵＤＩは、４つの異なる相互作用部位を断片に接続するリンカーのライブラリを使用する。次いで、より小さい「架橋」基、例えば、−ＣＨ２−及び−ＣＯＯ−がこれらの断片を接続するために使用される。例えば、酵素ＤＨＦＲに対して、周知の阻害剤メトトレキセート（methotrexate）内の鍵となる官能基の配置がＬＵＤＩにより再作成された。例えば、（Ｒｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｃｋｏ  １９９３）も参照のこと。
【０１９４】
他の分子モデル化技術も本発明に従って使用してもよい。例えば、（Ｃｏｈｅｎ，Ｂｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）を参照されたい。例えば、（Ｎａｖｉａ  ａｎｄ  Ｍｕｒｃｋｏ  １９９２）も参照のこと。
【０１９５】
上記の方法により、リガンドが設計されるか又は選択されると、リガンドがプロＭＭＰと結合又は会合し得る親和性は、計算的評価により、及び／又は化合物を合成した後の生物学的活性の試験により試験及び最適化され得る。リガンドは、全体的結合エネルギーが類似する１つ以上の立体配座でプロＭＭＰと相互作用し得る。そのような場合、結合の変形エネルギーは、遊離リガンドのエネルギーと、リガンドがプロＭＭＰに結合した場合に観察される立体配座の平均エネルギーとの差であると考えられる。
【０１９６】
プロＭＭＰを結合又は会合するように設計又は選択されたリガンドは、その結合状態において、好ましくはプロＭＭＰとの反発静電相互作用が失われるように計算により更に最適化され得る。このような非相補性（例えば、静電性）相互作用は、反発性電荷−電荷、双極子−双極子、及び電荷−双極子相互作用を包含する。具体的には、リガンドが結合する場合の化合物とプロＭＭＰとの間の全ての静電気相互作用の和は、好ましくは、結合エンタルピーに対して中立又は有利な寄与となる。弱い結合性化合物はまた、ＳＡＲを決定するためにこれらの方法によっても設計され得る。
【０１９７】
特定のコンピュータソフトウェアが、化合物変形エネルギー及び静電相互作用を評価するめに当該技術分野において利用可能である。かかる使用のために設計されたプログラムの例には、Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９２、改訂Ｃ（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔｒｕｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）、ＡＭＢＥＲ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なＱＵＡＮＴＡ及びＣＨＡＲＭｍ、並びにＢｉｏｓｙｓｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒを包含される。他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケージは、当業者には公知であろう。
【０１９８】
上記のように、プロＭＭＰと会合するリガンドが最適に選択又は設計されると、その結合特性を改善又は変更するために、その原子又は側基の幾つかで置換を行い得る。一般的に、最初の置換は、保存的、即ち、置換基が当初の基とほぼ同じ大きさ、形状、疎水性、及び電荷を有する。当然ながら、立体配座を改変すると、当該技術分野において既知の構成成分は、回避されることが理解されるべきである。このような置換されたリガンドは、上記に詳述した同一の計算機的方法によりプロＭＭＰへの適合の効率を解析され得る。
【０１９９】
リガンドを設計する際の構造ホモロジーモデリングの使用
本発明は、アロステリックなプロセシング阻害因子を設計するために、原子座標並びにプロＭＭＰ及びアロステリックなプロセシング阻害因子と複合体形成しているプロＭＭＰの構造を使用して、プロＭＭＰと又はプロＭＭＰに関係する他のタンパク質とより緊密に結合する又はより特異的に相互作用するリガンド及びそれらの誘導体が得られるような改変の設計を開始することを包含する。プロＭＭＰと出発リガンドとの錯体の構造は、適用できる工業界及び他の使用物（例えば、医薬品）のための他の所望の性質、例えば、化学的安定性、溶解度、又は膜透過性を有する新規リガンドを作製するために、そのリガンドの改変を誘導するために使用することができる（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，Ｌｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。
【０２００】
Ｘ線回折データを収集するために、プロＭＭＰの安定的な結晶に当該技術分野で既知及び未知のリガンドを拡散させて、又は浸漬して、複合体を形成させることもできる。あるいは、当該技術分野で既知及び未知のリガンドは、結晶化の前にリガンドとプロＭＭＰを混合することにより、プロＭＭＰと共結晶化させることもできる。非限定例では、プロＭＭＰは、ヒトプロＭＭＰ９である。
【０２０１】
親和性が高く非常に特異的な化合物をあつらえて製造するにあたって、アロステリックなプロセシング阻害因子と複合体形成させた本発明のヒトプロＭＭＰ９の構造を、対象とするものとは異なる選別されたプロＭＭＰ分子の構造と比較することができ、並びに対象とするものとは異なるプロＭＭＰ分子の構造を変更させて、本発明において提供されるアロステリックな結合部位に記載される構造上の特徴をもたせることにより、ハイブリッド構造を構築することができる。このモデル化が達成されるプロセスは、ホモロジー構造モデル化と称される。このモデル化は、本発明の既知の構造から側鎖を除去し、それらを、側鎖が立体的に妥当な位置に配置されるよう対象とするものとは異なるプロＭＭＰ分子の側鎖により体系的に置換することにより、計算的に行うことができる。このように、標的及び非標的分子の結合部位の空隙の形状がいかに異なるかを理解することができる。したがって、このプロセスは、所望の標的分子に緊密に、かつ特異的に結合し得るが、同時に非標的分子への結合が立体的に阻止され得る化合物を作製するために、結合リガンドをいかに化学的に改変することができるかに関する情報を提供する。同様に、溶媒に面する結合リガンドの部分の知識は、追加の製薬学的目的のための他の官能基の導入を可能とするであろう。非標的酵素に対するよりも更に緊密に標的酵素に緊密に結合するリガンドを設計するためのホモロジー構造モデル化の使用は、広範な適用性を有する。詳細には、非限定例では、ホモロジー構造モデリングは、ヒトプロＭＭＰ９などの対象とするプロＭＭＰに対し高親和性を有する化合物の設計に適用することができる。
【０２０２】
データベース及びコンピュータシステム
プロＭＭＰ又はその一部分のコンピュータの分子モデル化に有用なプロＭＭＰのアミノ酸配列若しくはヌクレオチド配列及び／又はＸ線回折データは、その使用を容易にするために種々の媒体中で提供され得る。本実施形態の一適用法では、プロＭＭＰとアロステリックなプロセシング阻害因子との複合体、あるいはそれらの少なくとも１つのプロＭＭＰサブドメインのＸ線回折データに属するデータを含むデータベースは、コンピュータ可読の媒体に記録される。当業者は、いずれかの現在公知のコンピュータ読み取り可能な媒体が、本発明のアミノ酸配列及び／又はＸ線回折データをその上に記録しているコンピュータ読み取り可能な媒体を含む製品を創成するために、どのようにして使用することができるかを容易に理解することができる。
【０２０３】
種々のデータ記憶構造は、本発明のアミノ酸配列及び／又は原子座標／Ｘ線回折データをその上に記録しているコンピュータ読み取り可能な媒体を創成するために、当業者により利用可能である。データ記憶構造の選択は、概して、記憶された情報へのアクセスに選択される手段に基づくであろう。加えて、種々のデータ処理プログラム及びフォーマットを使用して、コンピュータ読み取り可能な媒体上の本発明の配列及びＸ線回折データ情報を記憶することができる。配列情報は、市販のソフトウェア、例えば、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ及びＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  Ｗｏｒｄ中にフォーマットされたワード処理テキストファイルで表されるか、又はＡＳＣＩＩファイルの形態で表され、データベースアプリケーション、例えば、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅ等内に記憶することができる。本発明の情報をその上に記録しているコンピュータ読み取り可能な媒体を取得するために、当業者は、容易にデータ処理構造フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）の幾つかを適合させることができる。
【０２０４】
Ｘ線回折データに基づく配列及び／又は原子座標を有するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供することにより、当業者は、関連する分子、サブドメイン、擬似体、又はそのリガンドをモデル化するために配列及び原子座標又はＸ線回折データに日常的にアクセスすることができる。コンピュータアルゴリズムは、公的かつ商業的に利用可能であり、当業者が、コンピュータ読み取り可能な媒体中に提供されるこのデータにアクセスし、分子モデル化及び／又はＲＤＤ（合理的薬物設計）のためにそれを解析することを可能にする。例えば、（Ｍａｒｙ  Ａｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）１９９５）を参照のこと。
【０２０５】
本発明は、本明細書中に記載の配列及び／又は回折データを含む、システム、具体的には、コンピュータベースのシステムを更に提供する。このようなシステムを設計して、プロＭＭＰの活性化を阻害するリガンドとプロＭＭＰとの複合体、又はそれらの少なくとも１つのサブドメインなどの情報を利用し、構造決定及び理論的薬物設計（ＲＤＤ）を行う。限定されない例は、ＵＮＩＸ系ソフトウェア、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ又はＩＢＭ  ＯＳ／２オペレーティングシステムで機能するＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ及びＳｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマイクロコンピュータワークステーションである。
【０２０６】
種々の比較手段がまた、原子座標／Ｘ線回折データから一部誘導された構造モチーフ又は電子密度マップを同定するために、標的配列若しくは標的モチーフとデータ記憶手段とを比較するために使用することができる。当業者は、公的に利用可能なコンピュータモデル化プログラムのいずれか１つが、本発明のコンピュータベースのシステムのための検索手段として使用することができることを容易に認めることができる。
【０２０７】
本発明を利用する総合手順
本発明により、プロＭＭＰの活性化を阻害するリガンドの、合理的薬物設計（ＲＤＤ）用分子モデリングが提供される。上記のように、薬物設計パラダイムでは、コンピュータモデリングプログラムを使用して、タンパク質上の部位と相互作用することが期待される有望なリガンドを決定する。次いで、有望なリガンドを、活性及び／又は結合及び／又は相互作用に関してスクリーニングする。プロＭＭＰに関係するリガンドのスクリーニング方法は、ＭＭＰの少なくとも１つの生物活性に関係するアッセイから選択することができる。
【０２０８】
したがって、本発明により提供されるツール及び方法論は、所望の様式において、標的と結合するリガンドを同定及び設計するための手順中に使用され得る。このような手順は、反復プロセスを利用し、これによって、リガンドが合成、試験、及び特徴付けられる。新規のリガンドは、最初のリガンドの試験及び特性付けで得られた情報に基づいて設計でき、次いで、このような新規に同定されたリガンドは、それ自体を試験及び特徴付けすることができる。この一連のプロセスは、所望の結合性質を有するリガンドが得られるまで、必要に応じて何回も反復され得る。
【０２０９】
本発明は、本発明の選択された化合物中の構造非対称の結果として生じる、立体異性体、並びに光学異性体、例えば、鏡像異性体の混合物並びに個別の鏡像異性体及びジアステレオマーを包含することを企画すると理解されるべきである。
【０２１０】
本明細書中の方法によって開示又は発見されたリガンドの幾つかは、１個以上の不斉中心を含有してもよく、それ故に、鏡像異性体、ジアステレオマー、及び他の立体異性体形態を生じる。本発明はまた、全てのこのような可能な形態、並びにそれらのラセミ及び分割された形態及びこれらの混合物を包含することを意味する。本明細書中に記載又は発見されたリガンドが、オレフィン性二重結合又は他の幾何学的不斉中心を含有する場合、別途に特定しない限り、それはＥ及びＺ幾何異性体を包含することを意図する。全ての互変異性体も同様に本発明に包含されることを意図する。
【実施例】
【０２１１】
更に説明しなくても、当業者は、上記の記述及び下記の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製及び使用し、特許請求する方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を特異的に指摘するものであって、本開示の残部をいかようにも限定するものと解釈されない。
【０２１２】
化合物例
実施例１：Ｎ−［２−（２−メトキシ−フェニルアミノ）−４’−メチル−［４，５’］ビチアゾリル−２’−イル］−アセトアミド）
【０２１３】
【化５】
0006002764.tif 000006
【０２１４】
実施例１は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅにより市販の化合物である。
【０２１５】
実施例２：３−（２’，４’−ジメチル−［４，５’］ビチアゾリル−２−イルアミノ）−４−イソプロポキシ−ベンゼンスルホンアミド・ＨＢｒ
【０２１６】
【化６】
0006002764.tif 000007
【０２１７】
実施例２：工程ａ
２−ブロモ−１−（２，４−ジメチル−チアゾール−５−イル）−エタノン・ＨＢｒ
【０２１８】
【化７】
0006002764.tif 000008
【０２１９】
臭素（１１．９ｍＬ、２３１．５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２００ｍＬ）懸濁液を、１−（２，４−ジメチル−チアゾール−５−イル）−エタノン（２８．７５ｇ、１８５．２ｍｍｏｌ、Ａｌｆａ）の１，４−ジオキサン（２００ｍＬ）撹拌溶液に加えた。混合物を５０℃で２５時間撹拌し、得られたクリーム色の懸濁液を室温に冷却し、濾過し、２：１ヘプタン：ＥｔＯＡｃ（体積／体積）により洗浄した。ＥｔＯＨから再結晶化させて、白色粉末として表題化合物を得た。
【０２２０】
実施例２：工程ｂ
４−フルオロ−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド
【０２２１】
【化８】
0006002764.tif 000009
【０２２２】
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，４９，１１７３に記載の手順に従い、市販の２−フルオロニトロベンゼン（１０．００ｇ、７０．８７ｍｍｏｌ）及びクロロスルホン酸（２１ｍＬ）を加熱して、９５℃で１８時間還流した後、室温に冷却した。次に、この溶液を、ｉＰｒＯＨ（２２５ｍＬ）と濃ＮＨ4ＯＨ（５４ｍＬ）水溶液とからなる溶液に−３５℃にて１時間かけて滴加し、０．５時間撹拌した。溶液を−３５℃に維持しつつ、ｐＨが酸性になるまで濃ＨＣｌ水溶液を添加した。次に溶液を蒸発させてｉＰｒＯＨをある程度除去し、水を加え、溶液を再度蒸発させてほとんどのｉＰｒＯＨを除去した。更に水を加えて溶液を濾過し、固体を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液及び水で洗浄し、表題化合物を得た。
【０２２３】
実施例２：工程ｃ
４−イソプロポキシ−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド
【０２２４】
【化９】
0006002764.tif 000010
【０２２５】
イソプロパノール（２２５ｍＬ）及びナトリウム金属（１．９２ｇ，８３．６ｍｍｏｌ）小片を加熱して２．５時間還流し、ナトリウムを消費させた。得られた溶液には、加熱を続けたまま４−フルオロ−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（８．３７ｇ、３８．０ｍｍｏｌ、実施例２、工程ｂ）のＴＨＦ／ｉＰｒＯＨ（１／１、体積／体積、１５０ｍＬ）溶液を１０分かけて加え、室温で３．５時間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ及びブライン及び１Ｎ  ＨＣｌ水溶液に分配した。次に有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発させて、表題化合物を得た。
【０２２６】
実施例２：工程ｄ
３−アミノ−４−イソプロポキシ−ベンゼンスルホンアミド
【０２２７】
【化１０】
0006002764.tif 000011
【０２２８】
水素化ホウ素ナトリウム（１．８８ｇ、４９．６ｍｍｏｌ）を、０℃にて塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物（３．９３ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（６０ｍＬ）にゆっくりと加え、得られた黒色懸濁液を２３℃で３０分撹拌した。混合物を０℃に冷却し、４−イソプロポキシ−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（８．６ｇ、３３．０ｍｍｏｌ、実施例２、工程ｃ）と、続いて水素化ホウ素ナトリウム（４．３８ｇ、１１５．６ｍｍｏｌ）とを加えた。得られた黒色懸濁液を２３℃で３０分撹拌した。反応混合物に水を加えて過剰なＮａＢＨ4をクエンチした後、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液を添加した。生成物をジクロロメタンで抽出し、有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、蒸発させて、表題化合物を得た。
【０２２９】
実施例２：工程ｅ
４−イソプロポキシ−３−イソチオシアナト−ベンゼンスルホンアミド
【０２３０】
【化１１】
0006002764.tif 000012
【０２３１】
重炭酸ナトリウム（１６．８ｇ、１９９．５ｍｍｏｌ）の水溶液（４００ｍＬ）を、３−アミノ−４−イソプロポキシ−ベンゼンスルホンアミド（１５．３ｇ、６６．５ｍｍｏｌ、実施例２、工程ｄ）のクロロホルム水溶液（クロロホルム及び水各２００ｍＬ）に加えた。次にチオホスゲン（６．３７ｍＬ、８３．１ｍｍｏｌ）を加えた。二相溶液を室温で１．５時間撹拌した。相を分離させ、水相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。有機相を水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、濃縮して、黄褐色の固体として表題の粗生成物を得た。
【０２３２】
実施例２：工程ｆ
４−イソプロポキシ−３−チオウレイド−ベンゼンスルホンアミド
【０２３３】
【化１２】
0006002764.tif 000013
【０２３４】
４−イソプロポキシ−３−イソチオシアナト−ベンゼンスルホンアミド（１７．８ｇ、６５．２ｍｍｏｌ、実施例２、工程ｅ）の粗生成物を、２ＭアンモニアＭｅＯＨ溶液（２５０ｍＬ）で処理し、得られた溶液を室温で１８時間撹拌した。次に、反応混合物を約半量に濃縮させて、黄褐色の固体が大量に沈殿させた。懸濁液を０℃で３０分冷却し、濾過した。固体をメタノール及びエーテルで洗浄し、クリーム色の固体として表題化合物を得た。
【０２３５】
実施例２
３−（２’，４’−ジメチル−［４，５’］ビチアゾリル−２−イルアミノ）−４−イソプロポキシ−ベンゼンスルホンアミド・ＨＢｒ
【０２３６】
【化１３】
0006002764.tif 000014
【０２３７】
２−ブロモ−１−（２，４−ジメチル−チアゾール−５−イル）−エタノン・ＨＢｒ（１．０７ｇ、３．３９ｍｍｏｌ、実施例２、工程ａ）及び４−イソプロポキシ−３−チオウレイド−ベンゼンスルホンアミド（０．９８ｇ、３．３９ｍｍｏｌ、実施例２、工程ｆ）のエタノール（１５ｍＬ）混合物を室温で２日間撹拌した。混合物を濾過し、冷ＥｔＯＨで洗浄し、風乾させて、白色粉末として表題化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ９．６７（ｓ，１Ｈ），９．００（ｄ，Ｊ＝２．２６Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄｄ，Ｊ＝２．０７，８．４８Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝８．６７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），４．８０（ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．０３Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｄ，Ｊ＝６．０３Ｈｚ，６Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｅ  ４２５．１（Ｍ＋Ｈ）。
【０２３８】
実施例３：３−（２’−アミノ−４’−メチル−［４，５’］ビチアゾリル−２−イルアミノ）−４−メトキシ−ベンズアミド・ＨＢｒ
【０２３９】
【化１４】
0006002764.tif 000015
【０２４０】
実施例３：工程ａ
１−（２−アミノ−４−メチル−チアゾール−５−イル）２−ブロモ−エタノン
【０２４１】
【化１５】
0006002764.tif 000016
【０２４２】
国際公開第２００５／０６８４４４号に記載の通りに１−（２−アミノ−４−メチル−チアゾール−５−イル）−２−ブロモ−エタノン・ＨＢｒを調製した。対応する遊離塩基を変換させるために、粗反応混合物を氷冷飽和ＮａＨＣＯ3水溶液にゆっくりと加えた。真空濾過により沈殿を回収し、Ｅｔ2Ｏで洗浄した。ＥｔＯＨから粗生成物を再結晶化し、オレンジ色の粉末として表題化合物を得た。
【０２４３】
実施例３：工程ｂ
４−メトキシ−３−チオウレイド−ベンズアミド
【０２４４】
【化１６】
0006002764.tif 000017
【０２４５】
還流下で３−アミノ−４−メトキシベンズアミド（２．４９ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、Ａｌｆａ）のアセトン（３０ｍＬ）溶液にベンゾイルイソイオシアナート（２．２２ｍＬ、１６．５ｍｍｏｌ）を加え、還流下で混合物を３０分撹拌した後、水に注いだ。真空濾過により沈殿を回収し、１０％  ＮａＯＨ水溶液（１５ｍＬ）で処理した。混合物を加熱して４０分還流し、室温に冷却し、氷を加えた６Ｎ  ＨＣｌ水溶液に注ぎ入れた。濃ＮＨ4ＯＨ水溶液により、混合物をｐＨ  １０へと塩基性化し、得られる白色固体沈殿物を真空濾過により回収し、粗表題化合物を得て、これを更に精製することなく使用した。
【０２４６】
実施例３
３−（２’−アミノ−４’−メチル−［４，５’］ビチアゾリル−２−イルアミノ）−４−メトキシ−ベンズアミド・ＨＢｒ
【０２４７】
【化１７】
0006002764.tif 000018
【０２４８】
１−（２−アミノ−４−メチル−チアゾール−５−イル）−２−ブロモ−エタノン（２７０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ、実施例３、工程ａ）及び４−メトキシ−３−チオウレイド−ベンズアミド（２５９ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ、実施例３、工程ｂ）と、エタノール（５ｍＬ）との混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物を濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、風乾した。ＥｔＯＨ水溶液から粗生成物を再結晶化させた。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ｐｐｍ  ９．８２（ｓ，１Ｈ），９．２５（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），８．７９（ｓ，１Ｈ），７．８０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．００〜７．１７（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ  ｍ／ｅ  ３６２．１（Ｍ＋Ｈ）。
【０２４９】
実施例４：（４−メトキシ−ピリジン−３−イル）−（６−メチル−６Ｈ−イミダゾ［４’，５’：３，４］ベンゾ［２，１−ｄ］チアゾール−２−イル）−アミン・ＴＦＡ
【０２５０】
【化１８】
0006002764.tif 000019
【０２５１】
実施例４：工程ａ
３−イソチオシアナト−４−メトキシ−ピリジン
【０２５２】
【化１９】
0006002764.tif 000020
【０２５３】
４℃で撹拌しながら、３−アミノ−４−メトキシピリジン（２．０１ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ3（４．０８ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）と、ＣＨＣｌ3水溶液（１：１，５０ｍＬ）とからなる混合物に、チオホスゲン（１．５ｍＬ、１９．６ｍｍｏｌ）を滴加した。添加終了後、アイスバスを取り外した。混合物を４時間撹拌し、有機層を分離させ、水相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、茶色固体として表題化合物を得た。
【０２５４】
実施例４：工程ｂ
１−（４−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−チオ尿素
【０２５５】
【化２０】
0006002764.tif 000021
【０２５６】
４−アミノ−１−メチルベンゾイミダゾール（０．１００ｇ、０．６７９ｍｍｏｌ）及び３−イソチオシアナト−４−メトキシ−ピリジン（０．１１３ｍｇ、０．６８０ｍｍｏｌ、実施例４、工程ａ）とＤＭＦの混合物を室温で６４時間撹拌した。ＤＭＦを真空下で除去後、残渣を水で処理した。沈殿した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させて表題化合物を表題化合物の第一画分を得た。ろ液を濃縮し、油性の茶色残渣を真空下で乾燥し、表題化合物の第二画分を得た。
【０２５７】
実施例４
（４−メトキシ−ピリジン−３−イル）−（６−メチル−６Ｈ−イミダゾ［４’，５’：３，４］ベンゾ［２，１−ｄ］チアゾール−２−イル）−アミン・ＴＦＡ
【０２５８】
【化２１】
0006002764.tif 000022
【０２５９】
１−（４−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−（１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）−チオ尿素（２１３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、実施例４、工程ｂ）の酢酸（１ｍＬ）溶液を、０．５０Ｍ  Ｂｒ2（１．０９ｍＬ、０．５４４ｍｍｏｌ）の酢酸溶液により一晩処理する。真空下でＨＯＡｃを蒸発させた後、ＣＦ3ＣＯ2Ｈを加え、次に真空下で除去した。残渣を少量のＤＭＳＯに溶解させ、水／アセトニトリル／０．２％トリフルオロ酢酸により溶出を行ってＨＰＬＣを実施し、茶色固体として表題化合物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ4）δ＝１０．４７（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），９．４１（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｄｄ，Ｊ＝１．２，６．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｓ，３Ｈ），４．１９（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｅ  ３１２（Ｍ＋Ｈ）。
【０２６０】
クローン化、発現及び精製
ヒトプロＭＭＰ９のクローン化
全てのヒトプロＭＭＰ９コンストラクトのアミノ酸付番は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ１４７８０の、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）に基づくものであった。１つのコンストラクト、プロＭＭＰ９（２０〜４４５）（配列番号２）は、既に公開されている結晶構造に基づくものである（Ｅｌｋｉｎｓ，Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。コンストラクトは、Ｎ末端のシグナルペプチドを欠損しており、かつＣ末端のヘモペキシン様ドメインも欠損している。Ｎ端末の短縮されたコンストラクトは、既に報告されているプロＭＭＰ９構造において最初に観察され得る電子密度及び単一のアミノ酸をＣ末端から除去して、プロＭＭＰ９（２９〜４４４）（配列番号３）を精製した後でＮ末端が短縮されるようにも設計した。３つのフィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ΔＦｎＩＩ）、すなわちアミノ酸２１６〜３９０を除いた、他の短縮型コンストラクトも合成した。ΔＦｎＩＩコンストラクトはプロＭＭＰ９（２９〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号４）、プロＭＭＰ９（６７〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）及びプロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）であった。ＦｎＩＩドメインをもたないプロＭＭＰ９タンパク質による結合試験により、化合物が、野生型タンパク質と比較して類似する親和性で結合することが示された（データ不掲載）。
【０２６１】
ＦｎＩＩドメインを欠失したプロＭＭＰ９（２９〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号４）、プロＭＭＰ９（６７〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）及びプロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）のコンストラクトを作製するために、異なる短縮型プロＭＭＰ９をコードしているプラスミドをテンプレートとして使用してＰＣＲを行い、それぞれ第２９〜２１５／３９１〜４４４、６７〜２１５／３９１〜４４４、及び２０〜２１５／３９１〜４４５番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸対に対応するＤＮＡ断片を２つ作製した。オーバーラッピングＰＣＲを使用して、断片を連結させた。５’プライマーはＮｄｅ１部位及び開始メチオニンを有し、３’プライマーは終止コドン及びＢｇｌ２部位を有した。最終的なＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン）にクローン化し、配列を確認した。続いて、Ｎｄｅ１及びＢｇｌ２によりベクターを消化し、配列をＴ７発現ベクターｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅ１及びＢａｍＨ１部位にサブクローニングした。
【０２６２】
短縮型ヒトプロＭＭＰ９の発現
大腸菌での発現に際し、全ての短縮型プロＭＭＰ９コンストラクトをＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた。グリセロールストックから起こした細胞を、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃下でＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）により一晩培養した。一晩培養物をＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）で１：１００継代し、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃下で維持した。ＯＤが０．６に到達するまで、サンプルを回収し、Ａ６００測定値をモニターした。１ｍＭ  ＩＰＴＧにより培養物に発現誘導を行い、記載の増殖条件下で維持した。発現誘導から３時間後に６０００×ｇで１０分遠心し、培養物を回収した。プロテアーゼ阻害因子を添加した１×ＰＢＳでペレットを洗浄し、−８０℃で保管した。
【０２６３】
短縮型ヒトプロＭＭＰ９の精製
大腸菌から短縮型プロＭＭＰ９タンパク質を精製するため、細胞ペレットを、２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ  ７）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＬ／ｇ細胞ペレットに懸濁した。細胞をダウンス型ホモジナイザーで均質化し、次にマイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍ−１１０Ｙ型）により２回処理した。可溶化液を４℃下で、３２，０００×ｇで４５分遠心分離した。上清を廃棄した。ペレットを２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ  ７）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＬ／ｇ細胞ペレットに懸濁した。ペレットをダウンス型ホモジナイザーで均質化し、次に３２，０００×ｇで４℃で４５分遠心分離した。上清を廃棄した。ペレットを７Ｍ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．５ｍＬ／ｇ細胞ペレットに懸濁し、次にダウンス型ホモジナイザーで可溶化し、周囲温度で約１６時間撹拌した。可溶化したタンパク質溶液をｐＨ７．５に調整し、４５，０００×ｇで４℃で４５分遠心分離し、変性したプロＭＭＰ９を含有している上清を０．８マイクロメートルに濾過した。製造元の指示に従い、緩衝液Ａ（７Ｍ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））、及び緩衝液Ｂ（７Ｍ尿素、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ  ＮａＣｌ）を使用し、５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用意した。流速２．５ｍＬ／分でタンパク質溶液をＨｉＴｒａｐにかけた。ベースライン吸光度が約３．５ＣＶになるまで緩衝液Ａでカラムを洗浄した。プロＭＭＰ９は、０％緩衝液Ｂ〜１２％緩衝液Ｂの直線勾配で溶出させた（１２ＣＶ）。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）で解析し、純度に基づいてプールした。プールしたタンパク質を、溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＺｎＣｌ2、０．７Ｍ  Ｌ−アルギニン、１０ｍＭ還元型及び１ｍＭ酸化型グルタチオン）に滴加し、周囲温度で撹拌して再生し、４℃で約１６時間撹拌した。リフォールディングさせたタンパク質を、１０，０００ＭＷＣＯメンブレンを取り付けたＪｕｍｂｏ  Ｓｅｐ遠心濃縮機（Ｐａｌｌ）により約２．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮したタンパク質溶液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して４℃で約１６時間透析した。透析したタンパク質溶液を前述同様に０．８マイクロメートルに濾過して清澄化し、４℃で４５，０００×ｇで１５分遠心分離し、０．２マイクロメートルに濾過し、２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮したタンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／２００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、純度に基づいてプールした。プールしたタンパク質を前述同様にＪｕｍｂｏ  Ｓｅｐ濃縮器で濃縮し、４℃で１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。バイオラッド・プロテインアッセイ（バイオラッドラボラトリーズ，Ｉｎｃ．）を使用し、標準としてウシ血清アルブミンを用いタ��パク質濃度を測定した。上清を小分けし、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２６４】
完全長ヒトプロＭＭＰ９
ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを使用して、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ−１細胞において、完全長プロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）を分泌タンパク質として発現させた。ＨＥＫ２９３細胞又はＣＯＳ−１細胞において分泌タンパク質として発現させた場合、シグナルペプチド、すなわち完全長プロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）のアミノ酸１〜１９は同時翻訳により除去する。最終的に精製されるプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）タンパク質はシグナルペプチドを欠損している。
【０２６５】
プロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）コンストラクトにより形質転換を行う前に、ＨＥＫ２９３細胞は最終濃度０．１％でｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｆ−６８）を添加した無血清培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３）による懸濁培養に順応させた（振盪フラスコ）。細胞密度が１．２×１０6個／ｍＬに達したならば、細胞には、標準法を用い一過性形質転換を行った。接着細胞培養物及び無血清培地を入れたフラスコで、ＣＯＳ−１細胞の一過性トランスフェクトを行った。ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ−１細胞の両方で、プロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）タンパク質を精製するために馴化培地を回収した。最終濃度が５０ｍＭになるよう、１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を９Ｌ馴化培地に加えた。１０，０００ＭＷＣＯ（ＧＥヘルスケア）中空繊維カートリッジを取り付けたＫｖｉｃｋｌａｂ濃縮器により、培地を６００ｍＬに濃縮させた。この濃縮液を、４℃にて６，０００×ｇで１５分間遠心分離して清澄化し、次に１０，０００ＭＷＣＯ膜を用いＪｕｍｂｏ  Ｓｅｐ延伸濃縮器（Ｐａｌｌ）により更に４００ｍＬに濃縮した。濃縮したタンパク質を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３５に対し４℃で一晩透析した後、新しい透析緩衝液で更に数時間４℃にて透析を続けた。透析したタンパク質を、４℃にて６，０００×ｇで１５分間遠心分離し、０．４５マイクロメートルで濾過した。直径２．５ｃｍのＥｃｏｎｏカラム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）中で、１２ｍＬゼラチンセファロース４Ｂ樹脂（ＧＥヘルスケア）を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３５で平衡化した。平衡化したゼラチンセファロース樹脂上に、重力流が約３ｍＬ／分になるよう、濾過したタンパク質溶液を充填した。樹脂を１０ＣＶ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３５で洗浄し、３０ｍＬ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３５、１０％  ＤＭＳＯで溶出し、５ｍＬ画分で回収した。Ａ２８０吸光度によりタンパク質を含有していることが確認された画分を、４℃にて一晩、画分の体積の５００倍量の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３５に対して透析した。２回新しい緩衝液と交換しつつ、更に２４時間透析を続けた。透析した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、純度に基づきプールした。プールしたタンパク質を、１０，０００ＭＷＣＯメンブレンを取り付けたＪｕｍｂｏ  Ｓｅｐ遠心濃縮機（Ｐａｌｌ）により約１．２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質濃度は、ＤＣ（商標）タンパク質アッセイ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ．）により測定した。タンパク質を小分けし、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２６６】
完全長ラットプロＭＭＰ９
完全長ラットプロＭＭＰ９コンストラクトのアミノ酸付番は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ５０２８２の、完全長のラットマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０８）（配列番号１１）に基づくものであった。完全長ラットプロＭＭＰ９は、完全長ヒトプロＭＭＰ９についての記載と同様の方法により産生した。手短に述べると、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを使用して、ＨＥＫ２９３細胞において、完全長ラットプロＭＭＰ９（１〜７０８）（配列番号１１）を分泌タンパク質として発現させた。ＨＥＫ２９３細胞において発現させて培地に分泌させた場合、シグナルペプチドは同時翻訳により除去し、よって最終的な完全長ラットプロＭＭＰ９（１〜７０８）（配列番号１１）タンパク質の精製品は、シグナルペプチドを欠損している。
【０２６７】
ヒトプロＭＭＰ１３
プロＭＭＰ１３配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ４５４５２、すなわちプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）のアミノ酸１〜２６８であった。発現コンストラクトには、インビトロジェンＧａｔｅｗａｙシステムで使用するための、Ｃ末端Ｔｅｖ切断配列に隣接する組み換え配列を含有させた。インビトロジェンＧａｔｅｗａｙ組み換え試薬を用い、エントリーベクターにコンストラクトを組み込んだ。得られたコンストラクトを、Ｃ末端６×ヒスチジンタグを含有させたＨＥＫ２９３発現ベクターに移入させた。ＨＥＫ２９３細胞を利用し、一過性トランスフェクトによりタンパク質を発現させ、培地に分泌させた。ＨＥＫ２９３細胞において発現させ、培地に分泌させた場合、シグナルペプチド、すなわちプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）のアミノ酸１〜１９は同時翻訳により除去する。最終的に精製されるプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）タンパク質はシグナルペプチドを欠損している。ＨＥＫ２９３培地を回収し、遠心分離した。培地をＧＥヘルスケアのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラムに充填し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭイミダゾール）で洗浄し、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2  ２００ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出したタンパク質を、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに充填した。プロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）を含有している画分をプールし、２ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。
【０２６８】
ヒト触媒型ＭＭＰ３
触媒型ＭＭＰ３は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０８２５４の、ヒトＭＭＰ３の第１００番目〜第２６５番目のアミノ酸である（ＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８））。対応するヌクレオチド配列をｐＥＴ２８ｂベクターにサブクローン化してＣ末端６×ヒスチジンタグを付加し、大腸菌による発現にこのコンストラクトを使用した。標準的手法により、４．５Ｍ尿素により可溶化した封入体から純度９５％超でタンパク質を精製した。精製タンパク質のアリコートを−７０℃で保存した。組み換え型ヒト触媒型ＭＭＰ３の精製品は、市販品を利用することもできる（例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標），４４４２１７）。
【０２６９】
生物学的アッセイ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（登録商標）アッセイ
一般化されたＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）法
ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）（ＴＦ）アッセイは、タンパク質の熱安定性を測定する、３８４ウェルプレート系結合アッセイである（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ，Ｐｅｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｍａｔｕｌｉｓ，Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。この実験は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣから販売されている機器を使用して実施した。全ての実験において、１，８−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）（インビトロジェン：Ａ−４７）をＴＦ色素として使用した。
【０２７０】
予め分注したプレートにおいて、化合物を１００％  ＤＭＳＯで段階希釈して、一連の１１本のカラムに配置した（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ：７８１２８０）。カラム１２及び２４は、ＤＭＳＯ参照として使用し、化合物は含有させなかった。複数の化合物濃度反応試験の際には、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄリキッドハンドラー（ＤｉｇｉＬａｂ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用し、化合物のアリコート（５０ｎＬ）をロボット制御により黒色３８４ウェルポリプロピレンＰＣＲマイクロプレート（Ａｂｇｅｎｅ：ＴＦ−０３８４／ｋ）に予め直接分注した。化合物を分配した後、タンパク質及び染料溶液を加えて、最終測定容積を３μＬとした。測定溶液の上に１μＬのシリコーンオイル（Ｆｌｕｋａ、タイプＤＣ  ２００：８５４１１）を載せて、蒸発を防いだ。
【０２７１】
ロボットにより、測定プレートを、温度制御されたＰＣＲタイプのサーマルブロックに搭載し、全ての実験について傾斜速度１℃／分で４０〜９０℃に加熱した。蛍光は、光ファイバーを介して供給し、バンドパスフィルター（３８０〜４００ｎｍ；＞６ＯＤカットオフ）でフィルターされた紫外線（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＬＣ６）を連続照射し測定した。全３８４ウェルプレートの蛍光発光は、５００±２５ｎｍで検出するために、濾過されたＣＣＤカメラ（Ｓｅｎｓｙｓ、Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて光強度を測定することによって検出し、これにより、全ての３８４ウェルの同時に、かつ独立した読み込みを得た。各温度にて、曝露時間２０秒で単一像を回収し、アッセイプレートの所定の面積におけるピクセル強度の合計を温度に対して記録し、標準方程式に代入してＴm（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ，Ｐｅｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）を得た。
【０２７２】
示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用し、及びＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）データをもとに、各プロＭＭＰに結合する化合物を一致させるのに必要な熱力学的パラメーターを推定した。分子量と、ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）の添加データをもとに、アンフォールディングな各タンパク質の熱容量を推定した。アンフォールディング曲線を単独で割り当てたた後、１２種のリガンド濃度群のデータを各化合物の単一のＫDに割り当てた。
【０２７３】
ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）を取り付けたプロＭＭＰ９（６７〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）
タンパク質試料の調製時には、必ずＰＤ−１０自然落下型カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、脱塩緩衝液による交換工程を行った。脱塩緩衝液の交換を行った後、タンパク質を最終アッセイ濃度の３．５μＭ  プロＭＭＰ９（６７〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）に希釈した。算出吸光係数ε280＝３３９００Ｍ-1ｃｍ-1、算出分子量２２．６ｋＤａ及び算出ｐＩ  ５．２０をもとに、分光光度測定によりプロＭＭＰ９（６７〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）の濃度を測定した。ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）の参照条件は次の通りに定義した：８０μｇ／ｍＬ（３．５μＭ）プロＭＭＰ９（６７〜４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）、５０μＭ  １，８−ＡＮＳ、ｐＨ  ７．０緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３００μＭ  ＣａＣｌ2）。プロＭＭＰ９（６７−４４４；ΔＦｎＩＩ）（配列番号５）の熱力学的パラメータは次の通りである：Ｔm（℃）＝６３（＋／−０．１）、ΔUＨ(Tm)（ｃａｌ  ｍｏｌ-1）＝１０５０００（＋／−５０００）、ΔUＳ(Tm)（ｃａｌ  ｍｏｌ-1  Ｋ-1）＝４５０、ΔUＣp（ｃａｌ  ｍｏｌ-1  Ｋ-1）＝２０００。
【０２７４】
ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）を取り付けたプロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）
タンパク質試料の調製時には、ＰＤ−１０自然落下型カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、脱塩緩衝液による交換工程を行った。脱塩緩衝液の交換を行った後、タンパク質を最終アッセイ濃度の２．８μＭプロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）に希釈した。算出吸光係数ε280＝３９８８０Ｍ-1ｃｍ-1、算出分子量２８．２ｋＤａ及び算出ｐＩ  ５．５をもとに、分光光度測定によりプロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）の濃度を測定した。ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）の参照条件は次の通りに定義した：８０μｇ／ｍＬ（２．８μＭ）プロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）、５０μＭ  １，８−ＡＮＳ、ｐＨ  ７．０緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３００μＭ  ＣａＣｌ2）。プロＭＭＰ９（２０〜４４５；ΔＦｎＩＩ）（配列番号６）の熱力学的パラメータは次の通りである：Ｔm（℃）＝７２（＋／−０．１）、ΔUＨ(Tm)（ｃａｌ  ｍｏｌ-1）＝１６００００（＋／−５０００）、ΔUＳ(Tm)（ｃａｌ  ｍｏｌ-1  Ｋ-1）＝４３４、ΔUＣp（ｃａｌ  ｍｏｌ-1  Ｋ-1）＝２４００。
【０２７５】
ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）を取り付けたプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）
プロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）タンパク質試料の調製時には、ＰＤ−１０自然落下型カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、脱塩緩衝液による交換工程を行った。脱塩緩衝液の交換を行った後、タンパク質を最終アッセイ濃度の３．５μＭに希釈した。算出吸光係数ε280＝３７０００Ｍ-1ｃｍ-1、算出分子量３０．８ｋＤａ及び算出ｐＩ  ５．３３をもとに、分光光度測定によりプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）の濃度を測定した。ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）の参照条件は次の通りに定義した：１００μｇ／ｍＬプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）、２５μＭ  １，８−ＡＮＳ、ｐＨ  ７．０緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３００μＭ  ＣａＣｌ2）。プロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）の熱力学的パラメータは次の通りである：Ｔm（℃）＝６７（＋／−０．１）、ΔUＨ(Tm)（ｃａｌ  ｍｏｌ-1）＝１０７０００（＋／−５０００）、ΔUＳ(Tm)（ｃａｌ  ｍｏｌ-1  Ｋ-1）＝３１８、ΔUＣp（ｃａｌ  ｍｏｌ-1  Ｋ-1）＝２６００。
【０２７６】
【表１】
0006002764.tif 000023
【０２７７】
酵素アッセイ
プロＭＭＰ９／ＭＭＰ３  Ｐ１２６活性化アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞から精製した完全長のプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）と、触媒型ＭＭＰ９による切断に応じ蛍光を発するペプチド（Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ2、ＢｉｏＭｏｌ  Ｐ−１２６）を使用し、触媒型ＭＭＰ３、ＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）によるプロＭＭＰ９活性化阻害について化合物を評価した。使用したアッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５からなる。ＤＭＳＯは試験化合物の添加により最終濃度が２％となるように含有させた。アッセイ日に、ＨＥＫ２９３細胞から精製したプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）と、ＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）とをアッセイ緩衝液により４００ｎＭに希釈した。反応用量は５０μＬであった。９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１５）中で、アッセイ緩衝液４４μＬを、試験化合物１．０μＬ、ＨＥＫ２９３細胞から精製した４００ｎＭプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）２．５μＬと混合し、４００ｎＭ  ＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）２．５μＬにより反応を開始した。プレートをシーリングし、３７℃で８０分インキュベートした。最終濃度は、ＨＥＫ２９３細胞から精製したプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）が２０ｎＭ、及びＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）が２０ｎＭであり、試験化合物の濃度はＩＣ50について角括弧で記載する通りに変化させた。８０分インキュベートした直後に、５０μＬ  ４０μＭ  Ｐ−１２６基質（新しくアッセイ緩衝液に希釈したもの）を加え、それにより生じる、ＭＭＰ９の触媒性と関連付けられる活性の動態を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、３７℃で１０〜１５分間、３２８ｎｍにおける励起、３９３ｎｍにおける放出によりモニターした。これらの条件下では、残留ＭＭＰ３によるＰ−１２６に対する反応は最小限のものであった。ＩＣ50を決定するにあたり、４パラメータロジスティック曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア）を使用して初期速度をプロットした。
【０２７８】
プロＭＭＰ１３／プラスミンＰ１２６活性化アッセイ
触媒型ＭＭＰ１３による切断に応じ蛍光を発するペプチド（Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ2、ＢｉｏＭｏｌ  Ｐ−１２６）を使用して、プラスミンによるプロＭＭＰ１３の活性化の阻害について化合物を評価した。使用したアッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５からなる。ＤＭＳＯは試験化合物の添加により最終濃度が２％となるように含有させた。アッセイ日に、ＨＥＫ２９３細胞から精製したプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）と、プラスミンとを、それぞれアッセイ緩衝液により１６０ｎＭ及び３２０ｎＭに希釈した。反応用量は５０μＬであった。９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１５）中で、アッセイ緩衝液４４μＬを試験化合物１．０μＬ、１６０ｎＭプロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）２．５μＬと混合し、３２０ｎＭプラスミン２．５μＬにより反応を開始した。プレートをシーリングし、３７℃で４０分インキュベートした。最終濃度は、プロＭＭＰ１３（１〜２６８）（配列番号７）が８ｎＭ、及びプラスミンが１６ｎＭであり、試験化合物の濃度はＩＣ50について角括弧で記載する通りに変化させた。４０分インキュベートした直後に、４０μＭ  Ｐ−１２６基質（新しくアッセイ緩衝液に希釈したもの）５０μＬを加え、それにより生じる、ＭＭＰ１３の触媒性と関連付けられる活性の動態を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、３７℃で１０〜１５分間、３２８ｎｍにおける励起、３９３ｎｍにおける放出によりモニターした。プラスミンは、これらの条件下ではＰ−１２６基質に対し反応しなかった。ＩＣ50を決定するにあたり、４パラメータロジスティック曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア）を使用して初期速度をプロットした。
【０２７９】
プロＭＭＰ９／ＭＭＰ３  ＤＱゼラチン活性化アッセイ
活性型ＭＭＰ９による切断に応じて蛍光を発する、クエンチしたフルオレセインゼラチン基質（ＤＱゼラチン、インビトロジェンＤ１２０５４）を使用して、ＭＭＰ３の触媒によるプロＭＭＰ９の活性化の阻害について化合物を評価した。使用したアッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５からなる。ＤＭＳＯは試験化合物の添加により最終濃度が０．２％となるように含有させた。アッセイ当日に、ＣＯＳ−１細胞由来の完全長のプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）及び触媒型ＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）を、それぞれアッセイ緩衝液により６０ｎＭ及び３０ｎＭに希釈した。試験化合物のＤＭＳＯ溶液を、４×最終濃度のアッセイ緩衝液により２５０倍希釈した。反応容量は１２μＬであり、全ての反応は３重に実施した。３８４ウェルの半量プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ  ３８４  Ｆ  Ｐｌｕｓ，６００８２６０）中で、試験化合物のアッセイ緩衝液溶液４μＬを、ＣＯＳ−１細胞由来の６０ｎＭ完全長のプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）４μＬと混合した。プレートをシーリングし、３７℃で３０分インキュベートした。最終濃度は、ＣＯＳ−１細胞から精製したプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）が２０ｎＭ、及びＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）が１０ｎＭであり、試験化合物の濃度はＩＣ50について角括弧で記載する通りに変化させた。３０分インキュベートした直後に、４０μｇ／ｍＬ  ＤＱゼラチン基質（新しくアッセイ緩衝液に希釈したもの）を４μＬ加え、室温で１０分間インキュベートした。５０ｍＭ  ＥＤＴＡを４μＬ加えて反応を停止させ、それにより生じた、ＭＭＰ９の触媒性と関連付けられる活性を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ蛍光リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、４８５ｎｍにおける励起、５３５ｎｍにおける放出により測定した。これらの条件下では、残留ＭＭＰ３によるＤＱゼラチンに対する反応は最小限のものであった。適切な陽性対照（ＤＭＳＯのみを含有させたアッセイ緩衝液）及び陰性対照（反応開始前にＥＤＴＡを添加したもの）により試験化合物の阻害率を評価した。ＩＣ50を決定するにあたり、阻害率（％）対試験化合物濃度のプロットを、４パラメータロジスティック曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア）に代入した。
【０２８０】
触媒酵素アッセイ
プロＭＭＰ９の活性化アッセイにおいて活性を示した化合物を選択し、続いて、触媒型ＭＭＰ３及び触媒型ＭＭＰ９アッセイにおいて試験した。触媒型ＭＭＰ３又は触媒型ＭＭＰ９を阻害した化合物は、プロＭＭＰ９活性化アッセイにおいて偽陽性を示すものと考えられた。
【０２８１】
触媒型ＭＭＰ３
触媒型ＭＭＰ３による切断に応じて蛍光を発するペプチド（Ｍｃａ−ＲＰＫＰＶＥ−Ｎｖａ−ＷＲＫ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2，Ｂａｃｈｅｍ  Ｍ２１１０）を使用し、ヒト触媒型ＭＭＰ３、ＭＭＰ３（１００〜２６５）（配列番号８）、の阻害について化合物を評価した。使用したアッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５からなる。ＤＭＳＯは試験化合物の添加により最終濃度が２％となるように含有させた。反応用量は１００μＬであった。９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１５）中で、アッセイ緩衝液４４μＬを、試験化合物１．０μＬ及び４００ｎＭ触媒型ヒトＭＭＰ３  ５μＬと混合し、混合物を３７℃で１０分間プレインキュベートした４０μＭ  Ｍ−２１１０基質（新しくアッセイ緩衝液に希釈したもの）５０μＬにより反応を開始し、それにより生じた、触媒型ＭＭＰ３と関連付けられる活性の動態を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、３７℃で５〜１５分間、３２８ｎｍにおける励起、３９３ｎｍにおける放出によりモニターした。必要があれば、ＩＣ５０を決定するにあたり、４パラメータロジスティック曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア）を使用して初期速度をプロットした。使用した最終濃度は、２０ｎＭ触媒型ＭＭＰ３及び２０μＭ  Ｍ２１１０基質であった。
【０２８２】
触媒型ＭＭＰ９
触媒型ＭＭＰ９による切断に応じ蛍光を発するペプチド（Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ2、ＢｉｏＭｏｌ  Ｐ−１２６）を使用して、ヒト触媒型ＭＭＰ９（ＢｉｏＭｏｌ  ＳＥ−２４４）の阻害について化合物を評価した。使用したアッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５からなる。ＤＭＳＯは試験化合物の添加により最終濃度が２％となるように含有させた。反応用量は１００μＬであった。９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１５）中で、アッセイ緩衝液４４μＬを、試験化合物１．０μＬ及び１００ｎＭ触媒型ヒトＭＭＰ９  ５μＬと混合し、混合物を３７℃で１０分間プレインキュベートした。４０μＭ  Ｐ−１２６基質（新しくアッセイ緩衝液に希釈したもの）５０μＬにより反応を開始し、それにより生じた、触媒型ＭＭＰ９と関連付けられる活性の動態を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、３７℃で５〜１５分間、３２８ｎｍにおける励起、３９３ｎｍにおける放出によりモニターした。必要があれば、ＩＣ５０を決定するにあたり、４パラメータロジスティック曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア）を使用して初期速度をプロットした。使用した最終濃度は、５ｎＭ触媒型ＭＭＰ９及び２０μＭ  Ｐ−１２６基質であった。
【０２８３】
【表２】
0006002764.tif 000024
【０２８４】
細胞系アッセイ
ラット滑膜細胞培養物におけるプロＭＭＰ９の活性化
滑膜細胞の初代培養株は、関節炎ラットの関節周囲の組織に由来するものであった。関節炎は、レンサ球菌細胞壁のペプチドグリカン多糖類の腹腔内投与により雌性Ｌｅｗｉｓラットに誘導した（Ｃｒｏｍａｒｔｉｅ，Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９７７）。関節炎を発症したラットを屠殺し、後肢を切断し、７０％エタノールに簡単に浸した後、滅菌フードに配置した。皮膚を除去し、メスを使用して、頚骨−足根関節周囲の炎症を起こしている組織を回収した。ラット６匹分をプールし、約８ｍｍ3片に刻み、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。翌週には、細胞は組織片から遊走し、増殖し、接着細胞の単層を形成した。毎週、０．０５％トリプシンにより培養プレートから滑膜細胞を剥離させ、１０％  ＦＣＳを添加したＤＭＥＭにより１：４比で継代した。９回継代した滑膜細胞を使用して、実施例２が、ＭＭＰ９の活性化を阻害する能力について研究した。
【０２８５】
コラーゲンゲル中で培養し、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）により刺激を行い、ラット滑膜細胞にＭＭＰ９を自然に発現させ、ＭＭＰ９を活性化させた（図１及び表３）。８倍量の氷冷３．８ｍｇ／ｍＬラット尾コラーゲン（シグマカタログ番号Ｃ３８６７−１ＶＬ）溶液を、１倍量の１Ｍ重炭酸ナトリウム及び１倍量の１０×ロズウェルパーク記念研究所培地と混合した。１Ｎ水酸化ナトリウムにより混合物のｐＨをｐＨ  ７に調整し、ｐＨを調製した当量のコラーゲン溶液を、０．８×１０６個／ｍＬの滑膜細胞を含有しているＤＭＥＭと混合した。０．５ｍＬ容量をＣｏｓｔａｒ  ２４ウェル培養皿に分注し、３７℃かつ５％  ＣＯ2下に１時間置き、この間にコラーゲン溶液にゲルを形成させた。各ゲルを取り外して、０．０５％  ＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍＬ  マウスＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４１０−ＭＴ−０１０）を含有するよう調節した１ｍＬ／ウェルＤＭＥＭを含有させた１２ウェルＣｏｓｔａｒプレートに入れた。プレートを１０秒間撹拌して、コラーゲンゲルをウェルの底部に付着させないようにした。３７℃かつ５％  ＣＯ2下で一晩培養した後、更に０．０５％  ＢＳＡ及び所望される最終濃度の４倍濃度の実施例２を含有させた０．５ｍＬ  ＤＭＥＭを含有するようウェルを調節した（最終的な培地容量は２ｍＬであった）。プレートを更に４８時間培養し、このとき、ゼラチン−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−０９５６−０１）の５０％スラリー４０μＬ／ｍＬを含有させた新しいエッペンドルフチューブに馴化培地を１ｍＬ回収した。試料を４℃で２時間回転させ、１分×２００ｇで遠心分離した。上清を廃棄した。ゼラチン−セファロースペレットを氷冷ＤＭＥＭ  １ｍＬで洗浄し、２×還元レムリ緩衝液５０μＬに再懸濁し、９５℃で５分加熱した。１５μＬの溶出タンパク質を４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲルで分離し、０．４５μＭ孔径のニトロセルロースにブロットを転写した。次に、ブロットをブロッキング緩衝液（５％ミルクを添加したＴｒｉｓ緩衝食塩水（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有））中で室温で１時間インキュベートし、１μｇ／ｍＬ一次抗体を含有させたブロッキング緩衝液により一晩標識し（４℃）した。次に、ブロッキング緩衝液に１／１０，０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）により、ブロットを室温で１時間標識し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｐｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質を使用して検出した。ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）イメージソフトウェアを使用して、化学発光シグナルを解析した。電気泳動の移動度は、標準（Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｐ／Ｎ  ５７３１８）の移動度をもとに評価した。
【０２８６】
マウスｍＡｂ−Ｌ５１／８２（ＵＣ  Ｄａｖｉｓ／ＮＩＨ  ＮｅｕｒｏＭａｂ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を使用して、プロＭＭＰ９及び加工型ＭＭＰ９を検出した。滑膜細胞馴化培地は、約８０ｋＤ形態のＭＭＰ９を含有していた（図１Ａ、レーン２）。０．３７〜１０μＭ実施例２（図１Ａ、レーン３〜６）の存在下では、８０ｋＤの活性型ＭＭＰ９は添加量に応じて減少し、約８６ｋＤの形態が出現した。１０μＭ実施例２の存在下では、８６ｋＤの形態が主となった（図１Ａ、レーン６）。レーン１には、完全長のラットプロＭＭＰ９（１〜７０８）（配列番号１１）３ｎｇと、完全長のラットプロＭＭＰ９（１〜７０８）（配列番号１１）をＭＭＰ３の触媒作用により触媒型ラットＭＭＰ９へと変換させたもの３ｎｇとを含有させた標準を充填した。滑膜細胞馴化培地中に存在する８０ｋＤ形態の電気泳動による移動度は、活性型ＭＭＰ９標準によるものと同様であった。実施例２の存在下で滑膜細胞により産生された８６ｋＤ形態は、約１００ｋＤの移動度で泳動される完全長のラットプロＭＭＰ９（１〜７０８）（配列番号１１）標準よりも移動度が大きいことが実証された。８６ｋＤの形態は、これまでに報告されている、システインスイッチを保持しかつ触媒活性を欠いている、不完全にプロセシングを受けた中間形態のものと移動度が類似していることが実証された（Ｏｇａｔａ，Ｅｎｇｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。
【０２８７】
プロＭＭＰ９は、Ｒ１０６及びＦ１０７間が切断されたときに活性化される（Ｏｇａｔａ，Ｅｎｇｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。既に報告されているのと同様の手法を用い（Ｄｕｎｃａｎ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、ウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ−１２４６）により、活性型ＭＭＰ９のＮ端末の新しいエピトープを生成した。ウサギを、ペプチド、すなわちヒトＭＭＰ９（１０７〜１１３）（配列番号９）とキーホールリンペットヘモシアニンとの複合体により免疫及び追加免疫し、並びにＦＱＴＦＥＧＤ複合アガロースアフィニティ樹脂を使用して１００ｍＭグリシン（ｐＨ  ２．５）により溶出を行い、血清から抗体を親和性精製した。Ｎ端末に新しいエピトープをもつ抗体を、配列中の他のエピトープを認識する抗体から分離するため、溶出した抗体をＰＢＳで透析し、アガロースとペプチド、すなわちヒトプロＭＭＰ９（９９〜１１３）（配列番号１０）との複合体と混合して交差吸着させた。Ｎ端末に新しいエピトープをもつ抗体を含有している未結合画分を回収し、ｐＡｂ−１２４６と命名した。
【０２８８】
図１Ｂでは、レーン１は、ｐＡｂ−１２４６は８０ｋＤの活性型ＭＭＰ９標準に結合したものの、１００ｋＤプロＭＭＰ９標準は認識しなかったことを実証する。ｐＡｂ−１２４６は滑膜細胞馴化培地において８０ｋＤの活性型ＭＭＰ９を検出し、実施例２は添加量に応じて活性型ＭＭＰ９を減少させた（図１Ｂ、レーン２〜６）。バンドの化学発光強度を直接測定した。これを表３に掲載する。活性型ＭＭＰ９の産生は、ＩＣ50約１．１μＭで実施例２により阻害された。ｐＡｂ−１２４６は８６ｋＤ形態を認識せず、それ以上の成熟が実施例２により阻害されているおそらくは中間体形態を表しているという更なるエビデンスが提供された。
【０２８９】
【表３】
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【０２９０】
ヒト胎性肺線維芽細胞培養物によるプロＭＭＰ９の活性化
胎性肺線維芽細胞の培養において、プロＭＭＰ９の活性化型ＭＭＰ９への成熟を阻害する能力について、実施例２を更に評価した（ＨＦＬ−１、アメリカ培養細胞系統保存機関番号ＣＣＬ−１５３）。ラット滑膜細胞とは異なり、ＨＦＬ−１細胞は、好中球エラスターゼを添加しない場合にはプロＭＭＰ９を活性型へとプロセシングすることができない。エラスターゼが組み換え型プロＭＭＰ９のプロセシングを直接引き起こすことはなかった（データ不掲載）。むしろ、本アッセイにおいて、エラスターゼ機能は、内因性のＭＭＰ９活性化経路を抑制する組織性メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）を不活性化させるものであり得る（Ｓｋｏｌｄ，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【０２９１】
１０％  ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で、単層培養によりＨＬＦ−１を維持し、継代数５〜１５のものを使用した。ラットＳＣＷ滑膜細胞（上記ｖｉｄａ）について記載した通り、コラーゲンゲルにＨＬＦ−１を包埋した。０．４×１０6個の細胞を含有させた０．５ｍＬのゲルを取り外して、０．０５％  ＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍＬヒトＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２１０−ＴＡ／ＣＦ）を含有するよう調節した１ｍＬ／ウェルＤＭＥＭを含有させた１２ウェルのＣｏｓｔａｒプレートに入れた。一晩培養後（３７℃かつ５％  ＣＯ2）、０．０５％  ＢＳＡを含有しかつ１３．２μＭ実施例２を含有している又は不含有である（実施例２の最終濃度は３．３μＭ）追加の０．５ｍＬ  ＤＭＥＭを含有するよう、ウェルを調節した。次に、培養物を調節して３０ｎＭヒトエラスターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有させた。ラット滑膜細胞培養物（上記ｖｉｄａ）について記載した通り、プレートを更に７２時間培養し、このときＭＭＰ９を馴化培地に分泌させ、ゼラチン−セファロースに結合させ、ウェスタンブロット解析により評価した。ｍＡｂ−５１／８２により、ＨＦＬ−１培養物中に３種類の形態のＭＭＰ９が検出された。
【０２９２】
これらは、ラット組み換え型プロＭＭＰ９と移動度が同様である約１００ｋＤの形態と、ラット活性型ＭＭＰ９と移動度が同様である約８０ｋＤの形態と、約８６ｋＤの中間体の形態と、を包含した。バンド強度を表４に提供する。実施例２の非存在下では、ＭＭＰ９のほとんどは８０ｋＤ形態として存在した。実施例２の存在下では、８０ｋＤ形態は微小画分であり、かつシグナルのほぼ半分は、各１００ｋＤ及び８６ｋＤ形態により示された。３つのバンドの合計シグナルは、実施例２の存在時又は非存在時と同様であった。これらのデータにより、１００ｋＤ及び８６ｋＤ形態のＭＭＰ９は、実施例２により効果的に安定化され、かつ８０ｋＤ形態の形成が抑制されることが示される。
【０２９３】
【表４】
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【０２９４】
８０ｋＤ形態が成熟な活性型ＭＭＰ９であるのか判断し、かつ本アッセイにおいてＭＭＰ９成熟阻害因子としての実施例２の力価を求めるために、第２の実験を実施した。コラーゲンゲルに包埋したＨＦＬ−１細胞を、上記の通りにＴＮＦαの存在下で一晩培養し、次に３０ｎＭエラスターゼを含有するよう培養物を調整し、更に７２時間、実施例２の濃度をもとに類別した。７２時間で、馴化培地に分泌されたＭＭＰ９をゼラチン−セファロースに結合させ、活性型ＭＭＰ９のＮ端末の新しいエピトープに対して産生させたｐＡｂ−１２４６を使用して、活性型ＭＭＰ９について、ウエスタンブロット解析により評価した（表５）。実施例２の非存在下では、ｐＡｂ−１２４６は、電気泳動移動度が約８０ｋＤであるＭＭＰ９を容易に検出した。実施例２は、ＨＦＬ−１培養物がプロＭＭＰ９を活性型ＭＭＰ９へとプロセシングする能力を効果的に阻害した。約０．３μＭの実施例２のＩＣ50を以って投与範囲にわたって阻害が生じた。
【０２９５】
【表５】
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【０２９６】
生体内試験
生体内におけるプロＭＭＰ９の発現及び活性化は、ラットＳＣＷの関節炎と関係がある。
報告によれば、ＭＭＰ９タンパク質の発現は、関節リウマチ患者の滑液において上昇している（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｓｏｒｂｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。予備研究を実施して、関節炎モデルのラットにおいてＭＭＰ９の発現及び活性化を評価した。
【０２９７】
連鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ）プロテオグリカン−多糖類（ＰＧ−ＰＳ）を腹腔内投与することにより、雌性Ｌｅｗｉｓラットにおいて多発性関節炎を誘導することができる（Ｃｒｏｍａｒｔｉｅ，Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９７７）。このモデルは、急性期（第３〜７日）のものであり、すなわち、補体及び好中球依存性であり、回復する。ＰＧ−ＧＳに対するＴ細胞特異的な免疫の発生により、慢性びらん相が第１０日目に始まる。ＰＧ−ＧＳは消化耐性を示し、滑膜マクロファージに１ヶ月も存在する。関節リウマチ同様、ＳＣＷにより誘導される関節炎もＴＮＦ阻害因子により減少するものであり、かつＳＣＷにより誘導される関節炎がマクロファージに依存すること（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、並びに滑膜組織マクロファージ数が関節リウマチの重症度に関係付けられる（Ｈａｒｉｎｇｍａｎ，Ｇｅｒｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５）ことから、ＳＣＷ関節炎は、有望な治療薬を試験する際に魅力的なモデルとなる。
【０２９８】
ＳＣＷ  ＰＧ−ＰＳ  １０Ｓ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号２１０８６６）の生理食塩水懸濁液を３０秒間ボルテックスにかけ、注射前にプローブ型の超音波処理器より３分間超音波処理した。２３ゲージの針を取り付けた１ｍＬシリンジを使用し、５〜６週齢の雌性Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ／Ｎ）ラット（８０〜１００ｇ）の腹部の左側下部にＳＣＷ  ＰＧ−ＰＳ（ラムノース１５μｇ／体重１ｇ）を腹腔内投与した。同様の手法により対照（無疾患）ラットを生理食塩水で処理した。対照群のラットは５日目に屠殺し、並びにＳＣＷ投与群のラットは急性の炎症が最大に示された場合には５日目、あるいは慢性の炎症が示された場合には１８日目に屠殺した。
【０２９９】
後肢の皮膚を剥ぎ、脛骨−足根骨関節部のすぐ上及び中足骨の下で切断し、脛骨−足根骨関節部（足首）を計量し、ドライアイス上で瞬間凍結し、ハンマー及びアンビルを使用して粉砕した。粉砕した組織を３倍量（重量：体積）の氷冷均質化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３０、１０％ジメチルスルホキシド、及びコンプリート、ＥＤＴＡ−フリープロテアーゼインヒビターカクテル錠（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含有）に懸濁した。懸濁した組織を、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ及びダウンス型ホモジナイザーにより順に破砕した。破砕液を１６，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離し、可溶性画分を保存した。ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐＴＭ  Ｇ−２５脱塩カラム（ＧＥヘルスケア）を使用して、各可溶性画分からジメチルスルホキシドを除去した。ＤＭＳＯを非添加の破砕液（０．２５ｍＬ）を、等量の結合緩衝液（すなわち、ジメチルスルホキシドを不含有の均質化緩衝液）により希釈し、ゼラチン複合セファロースの５０％スラリーを５０μＬ含有するよう調節した。４℃で２時間回転させた後、ビーズを結合緩衝液により２回洗浄し、９５℃で５分間、加熱しながら２×還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液１００μＬに溶出した。溶出液（２０μＬ）を４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲルで分離し、０．４５μＭ孔径ニトロセルロースに転写し、滑膜細胞及びＨＦＬ−１細胞の馴化培地中のＭＭＰ９の形態の検出に関し上記した通りにｍＡｂ−Ｌ５１／８２及びｐＡｂ−１２４６を使用してプロＭＭＰ９、活性型ＭＭＰ９、並びにその他のプロセシングを受けたＭＭＰ９を検出するために、免疫ブロットした。
【０３００】
生理食塩水を投与したラットの健常な足首では、ｍＡｂ−Ｌ５１／８２により約１００ｋＤ（プロＭＭＰ９）及び約８０ｋＤ形態のＭＭＰ９が少量検出された（図２Ａ、レーン１及び２）。ＳＣＷ投与から５日及び１８日後の足首破砕液では、プロＭＭＰ９は著しく増加していた（図２Ａ、それぞれレーン３〜５、及び６〜８）。８０ｋＤ  ＭＭＰ９は、ＳＣＷ投与の５日後には穏やかに増加しており（図２Ａ、レーン３〜５）、ＳＣＷ投与の１８日後には顕著に増加していた（図２Ａ、レーン６〜８）。生理食塩水を投与したラットの健常な足首では、ｍＡｂ−１２４６により８０ｋＤに活性型ＭＭＰ９が少量検出された（図２Ｂ、レーン１及び２）。８０ｋＤ活性型ＭＭＰ９は、ＳＣＷ投与の５日後に穏やかに増加しており（図２Ａ、レーン３〜５）、ＳＣＷ投与の１８日後には顕著に増加していた（図２Ａ、レーン６〜８）。
【０３０１】
ＳＣＷ関節炎を有するラットにおける実施例２の有効性
ＳＣＷにより誘導した関節炎を有するラットにおいて活性型ＭＭＰ９の増加が観察されたため、我々は、次に実施例２が疾患の重症度を減少させる能力、及び活性型ＭＭＰ９を減少させる能力を測定することにした。
【０３０２】
実施例２は、ＳＣＷにより誘導した関節炎を有するラットの足首の膨張を減少させた。
関節炎を誘導するため、５〜６週齢の雌性Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ／Ｎ）ラット（８０〜１００ｇ）に、上記の通りにＳＣＷ  ＰＧ−ＰＳを腹腔内投与した。１８日後には関節炎が十分に発症していた。キャリパーを使用して、各ラットの左及び右後足首の幅（前側表面から後ろ側表面まで）を測定した。各足首３回ずつ測定して平均し、足首の厚みに基づきランダムに処理群に割りつけた（表６）。開始から１８日目に、ランダム化したラット関節炎群（ｎ＝５匹／群）には、賦形剤又は５、２０若しくは５０ｍｇ／ｋｇ実施例２  ＢＩＤを蛍光投与した。賦形剤は、２％（体積：体積）Ｎ−メチルピロリドン、５％（体積：体積）グリセリン、及び２０％（重量：体積）ｃａｐｔｉｓｏｌを含有している水性混合物から構成した。処置は２６日の朝まで毎日連続的に行った。
【０３０３】
１８日目には、足首の平均厚は、無疾患ラットと比較して平均して４．４ｍＭ超増加していた。８日間の処置期間にわたる足首厚の測定値によると、賦形剤のみで処理したラットは、次第に、より深刻な関節炎を示すようになった（表６）。実施例２により処置した場合、足首厚の測定値は用量依存的に減少した。２６日目には、足首厚の増加と関係する疾患は、５、２０及び５０ｍｇ／ｋｇの実施例２の投与により、それぞれ２７、３７及び４６％減少していた。
【０３０４】
【表６】
0006002764.tif 000028
【０３０５】
膨張及び紅斑に基づき、後肢の炎症に臨床スコアを割り当てた。１８日目には、ＳＣＷ  ＰＧ−ＰＳにより誘導したほとんど全てのラットが、８点スケール中８点の臨床スコアを有していた（表７）。実施例２による処置により、臨床スコア測定値の用量依存的な減少が誘導され、特に２０ｍｇ／ｋｇでの投与により顕著な効果が観察された（表７）。
【０３０６】
【表７】
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【０３０７】
実施例２は、ＳＣＷにより関節炎を誘導したラットの足首において活性型ＭＭＰ９を減少させたことがウェスタンブロット解析により実証された。
表６及び７で報告した試験では、ラットは、２６日目に、ＡＭ投与から４時間後に屠殺した。右後肢から回収した足首は、上記の通りの手順で加工した。プロ及び活性型ＭＭＰ９は、ＳＣＷにより誘導し賦形剤処理したラットの足首に豊富に存在していた（図３Ａ及び３Ｂ、レーン１〜３）。実施例２によるラットの処置では、プロＭＭＰ９の存在量は減少していなかった（図３Ａ、レーン４〜９）。しかしながら、実施例２によりラットを処置した場合、ｐＡｂ−１２４６（図３Ｂ、レーン４〜９対１〜３）及びｍＡｂ−Ｌ５１／８２（図３Ａ、レーン４〜９対１〜３）により検出された活性型の８０ｋＤの形態のＭＭＰ９が著しく減少した。
【０３０８】
実施例２は、ＳＣＷ関節炎を有するラットの肝臓においてＭＭＰ９の介在するゼラチナーゼ活性を減少させた。
Ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーにより、組織において活性型のＭＭＰ９を評価するための代替的なアプローチが提供される（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓ及びＭｏｏｋ、２００４年）。組織切片を、フルオレセインにより標識したゼラチンに重ねあわせる。この際、標識は、フルオレセインの発色をクエンチさせる（ＤＱ）のに十分な密度である。ＤＱ−ゼラチンのタンパク質分解により、分解部位において、フルオレセインがクエンチ効果から開放されて、明るい緑色の蛍光が生じる。Ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーは凍結切片を使用する必要があることから、石灰化した組織では問題が生じる。しかしながら、ＳＣＷ関節炎モデルのその他の特徴としては、肝肉芽腫性疾患の発症が挙げられ（Ｗａｈｌ，Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）、報告によれば、ＭＭＰ９は、マイコバクテリアに応答した肉芽腫におけるマクロファージの補充に役割を果たす（Ｔａｌｙｌｏｒ，Ｈａｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。これらを踏まえ、ＳＣＷ処置ラットに生じる肝肉芽腫を、Ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーにより活性型ＭＭＰ９について評価した。
【０３０９】
上記の通り、５〜６週齢の雌性Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ／Ｎ）ラット（８０〜１００ｇ）に、生理食塩水又はＳＣＷ  ＰＧ−ＰＳを腹腔内投与した。２８日目に肉芽腫性の応答が良好に得られたところで、ラットを屠殺し、肝臓をＯＣＴクライオセクショニング培地中で凍結させ、Ｃｒｙｏｍｅ  ＨＭ  ５００Ｍクライオトームにより１０μＭの切片を切り出し、ガラス製顕微鏡スライドに載せた。切片を簡単に風乾した。２つの主要なゼラチナーゼＭＭＰ９及びＭＭＰ２の活性部位を直接認識するモノクローナル抗体により肝臓切片を処置し、ＭＭＰ９を、肝臓におけるゼラチナーゼ活性源として確認した。ＭＭＰ９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、クローン６−６Ｂ）又はＭＭＰ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローンＣＡ−４００１）を直接認識する１００μｇ／ｍＬマウスモノクローナル中和抗体５０μＬ、又はＰＢＳにより、肝臓切片を室温で１時間覆った。組織を一度ＰＢＳですすぎ洗いし、ブロットし、簡単に風乾し、次に脱イオン水に１ｍｇ／ｍＬで溶解した後１％（重量／体積）ｌｏｗ  ｇｅｌｌｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ａｇａｒｏｓｅ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ（シグマ）のＰＢＳ溶液に１：１０希釈したＤＱ−ゼラチン（インビトロジェン）で覆った。切片をカバーガラスで覆い、室温で暗所で２０分間インキュベートし、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ（商標）イメージングソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）を使用し、蛍光検出器（fluorescence optics）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８０倒立顕微鏡で撮像した。蛍光強度を測定した（表８）。ゼラチナーゼ活性は、生理食塩水で処置したラットと比較して、ＳＣＷ関節炎を有するラットから得られた肝肉芽種切片で豊富に発現していた。肝肉芽種切片における活性は、抗ＭＭＰ９モノクローナル抗体による処置ではほぼ完全に阻害されていたが、抗ＭＭＰ２モノクローナル抗体による処置では阻害されていなかった。
【０３１０】
【表８】
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【０３１１】
次に、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーを使用し、賦形剤あるいは実施例２を投与したラットにおける活性型ＭＭＰ９の相対的な存在量について評価した。５〜６週齢の雌性Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ／Ｎ）ラット（８０〜１００ｇ）に、生理食塩水又はＳＣＷ  ＰＧ−ＰＳを腹腔内投与した。開始から２５日目に、ラットをランダムに群に割りつけ（ｎ＝３匹／群）、賦形剤又は２０若しくは５０ｍｇ／ｋｇ実施例２  ＢＩＤを経口投与した。賦形剤は、２％（体積：体積）Ｎ−メチルピロリドン、５％（体積：体積）グリセリン、及び２０％（重量：体積）ｃａｐｔｉｓｏｌを含有している水性混合物から構成した。処置は２８日の朝まで毎日連続的に行った。２８日目の午前の投与から４時間後にラットを屠殺し、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィーにより活性型ＭＭＰ９について肝臓を評価した（表９）。ゼラチナーゼ活性は、ＳＣＷ誘導ラットにおいて顕著に増加したが、この活性は、５０ｍｇ／ｋｇ実施例２で処置したラットでは約８０％減少していた。
【０３１２】
【表９】
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【０３１３】
結晶化及びデータ収集
１μＬのタンパク質を、１μＬの溶液（２５％  ＰＥＧ  ８Ｋ、１％グリセロール、０．２Ｍ硫酸アンモニウム及び１００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ  ５．５））に加え、アポプロＭＭＰ９（２９〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号４）の結晶を成長させた。安定化溶液に２０％グリセロールを加え、抗凍結剤溶液を調製した。ＭＸｐｒｅｓｓ  ｓｅｒｖｉｃｅにより、ＥＳＲＦビームラインＩＤ２３にて、アポプロＭＭＰ９（２９〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号４）結晶のＸ線データを収集した。結晶は１．７Åで回折した。結晶は、単位胞の大きさがａ＝９０．３Å  ｂ＝７３．２Å  ｃ＝７７．５Å，β＝１０６．３である空間群Ｃ２に形成された。プロＭＭＰ９（２９〜４４４  ΔＦｎＩＩ）構造についての探索分子（search molecule）として、既に報告されているプロＭＭＰ９構造を使用し、プログラムＥＰＭＲ（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ，Ｇｅｈｌｈａａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）を用い、分子置換法により構造を解析した。非対称ユニットにおいて２分子のプロＭＭＰ９（２９〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号４）が確認された。プログラムＣＮＸによりデータを精密化した。Ｒ−ｆａｃｔｏｒは２０．９  Ｒ−ｆｒｅｅ  ２３．２であった。タンパク質の全体的な折りたたみは、公開されている構造と非常に類似していた。Ｎ末端の電子密度において認識可能な最初の残基はＡｓｐ  ４１であった。プロＭＭＰ９（２９〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号４）タンパク質結晶のＮ端末配列の配列決定により、結晶化させた材料のＮ端末残基がＬｅｕ  ３５であったことが示された。すなわち、プロＭＭＰ９（２９〜４４４  ΔＦｎ）（配列番号）タンパク質は、タンパク質の発現、精製又は結晶化時に、更にＮ末端においてプロセシングを受けていたことが示唆された。精製タンパク質の質量分析により、Ｎ末端の更なるプロセシングは、発現又は精製時に生じていたことが確認された。したがって、結晶形態のプロＭＭＰ９は実際にプロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）であった。
【０３１４】
実施例１との今日結晶化試験では結晶は生成されなかった。２４時間浸漬し、アポプロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）結晶と実施例１（５％  ＤＭＳＯ中１ｍＭ）との複合体を生成することにより、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ）よりＩＭＣＡ−ＣＡＴビームラインで一連のデータを得た。結晶は解像度２．９Åで回折した。プログラムＣＮＸによりデータを精密化した。構造のＲ−ｆａｃｔｏｒは３０．０であり、Ｒ−ｆｒｅｅは３４．８であった。開始時の電子密度マップからは、阻害因子が存在し、かつ非対称ユニットの１分子において、Ｐｈｅ  １０７付近の残基の配置が変化していることが示唆された。タンパク質に生じた変化は残基１０７周辺に集中しており、分子全体（亜鉛結合部位を含む）に伝播するものではなかった。
【０３１５】
２４時間浸漬しプロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）との複合体を生成させた数多くのその他の化合物に関してもデータを収集した。データは、Ｒｉｇａｋｕ  ００７  ＨＦ発生装置及びＳａｔｕｒｎ  ９４  ＣＣＤ検出器により収集した。ｄ*ｔｒｅｋプログラム（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ  １９９９）によりデータを加工し、プログラムＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）により精密化した。選別したデータ組に関する、相関するデータ収集統計値は、表１０に見ることができる。電子密度マップの点検にはプログラムＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ  ２００４）、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＱｕａｎｔａ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ）を使用した。Ｐｙｍｏｌ及びＭｏｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）により図を作成した。
【０３１６】
【表１０】
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【０３１７】
Ｘ線構造の考察
はじめに、アポ型プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）を結晶化した。既に報告されている、ＦｎＩＩドメイン（Ｅｌｋｉｎｓ、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を含有しているプロＭＭＰ９構造のものと比較してかなり高い解像度で（１．７Å対２．５Å）アポ構造を決定したが、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）の構造は、ＦｎＩＩドメインを含有しているタンパク質の形態に存在している残基と本質的に同一であった。したがって、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）構造中のＦｎＩＩドメインを除去しても、既に報告されている完全長の構造と比較して、触媒ドメインの全体的な構造に変化は生じなかった。詳細には、切断部位の残基Ｐｈｅ  １０７周囲の残基の主鎖原子は、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）構造並びにＦｎＩＩドメインを含有している既に報告されているプロＭＭＰ９構造と類似する位置にあった。
【０３１８】
実施例１の結合
実施例１が結合するには、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）のプロ領域中のいくつかの残基が再配向する必要がある。阻害因子のフェノキシ部分は、アポタンパク質中のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域に結合する。この位置は立体構造的に亜鉛から６Å離れた位置にあたる。Ｃｙｓ  ９９は、化合物及び亜鉛間の領域をブロックし、すなわち実施例１と亜鉛が直接接近することはない。フェノキシ酸素に関し水素結合が観察されないことから、特異的な水素結合相互作用よりも、この基の方が、芳香環電子の変更において、より重要な役割を担う可能性がある。フェノキシ基付近に存在する残基には、Ｖａｌ  １０１、Ｐｒｏ  １０２、Ｔｙｒ  １７９、Ｈｉｓ  １９０（立体構造的に亜鉛と協調する）及びＰｈｅ  １９２が包含される。実施例１内部のチアゾール環は、プロドメイン及びＨｉｓ  ４０５（触媒的に亜鉛と協調する）から残基Ｐｈｅ  １１０付近に配置される。硫酸チアゾールと主鎖カルボニルのＡｌａ  １９１との間には２．８Åの距離が観察された。阻害因子の非存在下でのプロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）構造では、実施例１の構造において２つのチアゾール環により占有される空間は、５つの溶媒分子により占有される。末端メチルチアゾール環は残基Ｌｅｕ  １１４及びＡｓｐ  ４１０の付近に配置される。興味深いことに、アセトアミド基は、アポプロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）構造中のＡｒｇ  １０８のグアニジノ基と同じ位置に配置される。
【０３１９】
Ｃｙｓ  ９９（システインスイッチ）の相互作用は、阻害及び非阻害プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）間で一致したままである。触媒的又は構造的亜鉛イオンのいずれの亜鉛座標に関しても亜鉛座標に違いはなかった。実際に、再配向は残基１０３及び１０８間の領域に集中していた。
【０３２０】
実施例２の結合
実施例２が結合するには、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）のプロ領域中のいくつかの残基が再配向する必要がある。阻害因子の１−メチルエトキシ−ベンゼンスルホンアミドは、アポタンパク質中のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域に結合する。この位置は立体構造的に亜鉛から６Å離れた位置にあたる。Ｃｙｓ  ９９は、化合物及び亜鉛間の領域をブロックし、すなわち実施例２と亜鉛が直接接近することはない。タンパク質において、アニリンＮＨとＡｌａ  １９１のカルボニル酸素との間には水素結合が観察される。スルホンアミドは、タンパク質に対し水素結合も形成する。窒素はＧｌｙ  １０５のＮＨに結合し、かつ酸素はＰｈｅ  １０７及びＧｌｎ  １０８のアミド窒素と結合を形成する。１−メチルエトキシ−ベンゼンスルホンアミド基付近に存在する残基には、Ｇｌｙ  １００、Ｖａｌ  １０１、Ｐｒｏ  １０２、Ｌｅｕ  １０４、Ｇｌｙ  １０５、Ａｒｇ  １０６、Ｐｈｅ  １０７、Ｇｌｎ  １０８、Ｐｈｅ  １１０、Ｔｙｒ  １７９、Ｈｉｓ  １９０（立体構造的に亜鉛と協調する）、Ａｌａ  １９１及びＰｈｅ  １９２が包含される。実施例２内部のチアゾール環は、プロドメイン及びＰｒｏ  １９２（触媒的に亜鉛と協調する）及びＨｉｓ  ４０５付近に配置される。実施例２外部のチアゾール環は、残基Ａｒｇ  １０６、Ｌｅｕ  １１４及びＡｓｐ  ４１０付近に配置される。これらの２つのチアゾール環は、タンパク質と直接的な水素結合を形成するものではない。
【０３２１】
実施例３の結合
実施例３が結合するには、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）のプロ領域中のいくつかの残基が再配向する必要がある。阻害因子のメトキシベンゼンアミド部分は、アポタンパク質中のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域に結合する。この位置は立体構造的に亜鉛から６Å離れた位置にあたる。Ｃｙｓ  ９９は、化合物及び亜鉛間の領域をブロックし、すなわち実施例２と亜鉛が直接接近することはない。タンパク質において、アニリンＮＨとＡｌａ  １９１のカルボニル酸素との間には水素結合が観察される。アミドは、タンパク質に対し水素結合も形成する。窒素はＧｌｙ  １０５のＮＨに結合し、かつ酸素はＰｈｅ  １０７及びＧｌｎ  １０８のアミド窒素と結合を形成する。メトキシベンゼンアミド基付近に存在する残基には、Ｇｌｙ  １００、Ｖａｌ  １０１、Ｐｒｏ  １０２、Ｌｅｕ  １０４、Ｇｌｙ  １０５、Ａｒｇ  １０６、Ｐｈｅ  １０７、Ｇｌｎ  １０８、Ｐｈｅ  １１０、Ｔｙｒ  １７９、Ｈｉｓ  １９０（立体構造的に亜鉛と協調する）、Ａｌａ  １９１及びＰｈｅ  １９２が包含される。実施例３内部のチアゾール環は、プロドメイン及びＰｒｏ  １９２（触媒的に亜鉛と協調する）及びＨｉｓ  ４０５付近に配置される。実施例２外部のチアゾール環は、残基Ａｒｇ  １０６、Ｌｅｕ  １１４及びＡｓｐ  ４１０付近に配置される。これらの２つのチアゾール環は、タンパク質と直接的な水素結合を形成するものではない。
【０３２２】
実施例４の結合
実施例４が結合するには、プロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）のプロ領域中のいくつかの残基が再配向する必要がある。阻害因子のメトキシ−ピリジン部分は、アポタンパク質中のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域に結合する。この位置は立体構造的に亜鉛から６Å離れた位置にあたる。Ｃｙｓ  ９９は、化合物及び亜鉛間の領域をブロックし、すなわち実施例２と亜鉛が直接接近することはない。タンパク質において、アニリンＮＨとＡｌａ  １９１のカルボニル酸素との間には水素結合が観察される。メトキシ−ピリジン基付近に存在する残基には、Ｖａｌ  １０１、Ｐｒｏ  １０２、Ａｒｇ  １０６、Ｇｌｎ  １０８、Ｐｈｅ  １１０、Ｔｙｒ  １７９、Ｈｉｓ  １９０（立体構造的に亜鉛と協調する）、Ａｌａ  １９１及びＰｈｅ  １９２が包含される。実施例４のメチル−イミダゾ−ベンゾチアゾール環は、残基Ａｒｇ  １０６、Ｌｅｕ  １１４、Ｐｒｏ  １９２、Ｈｉｓ  ４０５（触媒的に亜鉛と協調する）及びＡｓｐ  ４１０付近に配置される。この縮合環はタンパク質と直接的な水素結合は形成しない。
【０３２３】
上記化合物のいずれかの浸漬により、化合物の結合と一致する電子密度が首尾よく示された。残基１０３〜１０８を含有するループは、適合する化合物の結合を認識する。しばしばループは化合物と直接的な水素結合を形成し、更に相互作用を安定化させる。各種化合物との複合体において、このループの正確な配向には、変化が見られる。実施例１について言えば、このループは乱れたままである。実施例２、実施例３及び実施例４の構造では、完全なループと関係する電子密度が観察された。切断しやすい結合を形成し、切断されることで活性な酵素を形成するＰｈｅ  １０７及びＡｒｇ  １０６の配置を置き換えることにより、化合物結合構造間に劇的な変化が見られる。しかしながら、一般的な効果は、これらの残基を切断から保護するというものである。
【０３２４】
上記の通り、フェノキシ基は、アポプロＭＭＰ９（３５〜４４４  ΔＦｎＩＩ）（配列番号１２）構造においてはＰｈｅ  １０７により占有されるポケットで結合する。本質的には、阻害因子の芳香環は、フェニルアラニン残基の芳香環を置き換える。成熟型酵素では、ポケットはＰｈｅ  １１０により占有される。プロＭＭＰ１の構造において、切断部位の残基は障害されているものの、ＨＥＰＥＳ分子はこれらの阻害因子と同様の領域に結合することが判明している。
【０３２５】
いくつかの異なるプロテアーゼによりプロＭＭＰ９を活性化することはできるものの、本明細書に記載の化合物は、必ずプロＭＭＰ９の最適基質性を低下させるよう機能する。データから、化合物はＭＭＰ３又はＭＭＰ９の触媒化アッセイを阻害しないことが判明している。化合物は、切断部位付近の残基の可動性を制限するよう機能する可能性がある。これらの残基が、プロＭＭＰ９を生産性のある基質にさせないような立体構造において安定化されている場合、これらの残基により活性化の阻害が導かれる。上記の通り、触媒的に活性なタンパク質において、Ｐｈｅ  １１０はこの配置を占有する。この部位に化合物が結合することで、触媒作用及び活性化に必要とされるこの位置へのＰｈｅ  １１０の移動が妨害される。Ｐｈｅ  １０７の挙動に加え、一部の構造ではＡｒｇ  １０６は異なる環境に置かれ、かつＡｓｐ  ４１０は回転して、Ａｒｇ  １０６の側鎖と二座の相互作用を形成する。塩橋により、プロＭＭＰ９を生産性のある基質として供給することのできない立体構造に留めることができる。
【０３２６】
アロステリックな結合部位
プロＭＭＰ９のアロステリックな結合部位のコアは、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０から構成され、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである。この部位は、重要な残基であるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）１０７が「ネイティブ」なプロ酵素において占有する結合表面を形成する。アロステリックなプロセシング阻害因子はこの部位に結合し、結合部位のフラップを形成する置き換えられたループ（残基１０４〜１０８）と相互作用することもできる。このループは可動性のものであり、阻害因子と接触しかつ相互作用することのできる数多くの異なる立体構造を有する。ループとのこれらの相互作用は阻害因子特異的なものである。
【０３２７】
選択性
他の全てのＭＭＰに対するこれらの化合物の選択性はまだ確認されていないものの、本化合物は、触媒機能が活性な酵素の活性部位に結合する既存のＭＭＰ阻害因子と比べて、はるかに良好な特異性を有するようである。立体構造的に、これらの化合物を結合させるは、いくつかの残基を劇的に移動させる必要があり、並びにＭＭＰプロドメインの最終的な切断部位の配列同一性を、活性部位よりも著しく劣るものにする必要がある。望ましい薬物動態特性を示す選択的なＭＭＰ阻害因子の製造が歴史的に困難であったことを考慮すると、プロＭＭＰの活性化を阻害する化合物の同定は重大な発見である。
【０３２８】
モデリング及びその他のＭＭＰ
この阻害方法は、ＭＭＰの配列アラインメントに基づきその他のＭＭＰに拡張することができることが望ましく、モデリングにより、他のプロＭＭＰは、活性化阻害因子を適切に結合させるのと同様の様式で再配向させ得ることが示唆されている。プロＭＭＰにおいて、プロ領域の全体的な二次構造は保存されている。これらのプロドメインの三次構造は構造が決定され、残りのＭＭＰの配列から同様の折りたたみを有することが予想される４本のヘリックス束からなる。更に、プロＭＭＰはシステインスイッチの結合に関係する類似するポケットを有し、かつ各種残基が触媒ドメインのキャビティを充填し、安定時の一般様式を同一に保つ。
【０３２９】
注目すべきはプロＭＭＰ１構造であり、切断部位の領域が障害されていることから、これらの残基は可動性のものであることが示唆される。更に、ＭＭＰ３により活性型へと切断を受けるＭＭＰ１及びＭＭＰ３は、いずれもＳ１親水性残基及びＳ１’Ｐｈｅ残基を含有する切断部位を有する。実際のところ、プロＭＭＰ３構造は、アポプロＭＭＰ９構造におけるＰｈｅ  １０７と非常に類似した配置でＳ１’Ｐｈｅを有する。図７は、現在の全てのプロＭＭＰ構造（ＭＭＰ９（ｐｄｂ１Ｌ６Ｊ）、ＭＭＰ１（ｐｄｂ１ＳＵ３）及びＭＭＰ２（ｐｄｂ１ＣＫ７））のオーバーラップを示す。ＭＭＰファミリーのプロドメインの配列アライメントを図８に示す。
【０３３０】
この阻害方法が、実際に、他のＭＭＰに拡張可能なものであるというエビデンスが、プロＭＭＰ９及びプロＭＭＰ１３の両方の活性化を阻害する活性を示した数多くの化合物について実証された。例えば、表２を参照すると、実施例２によりプロＭＭＰ９及びプロＭＭＰ１３の両方の活性が阻害されたことが示される。更に、ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）により、数多くの化合物がプロＭＭＰ９及びプロＭＭＰ１３の両方と結合することも実証された。例えば、プロＭＭ９及びプロＭＭＰ１３を使用し化合物を選択した際のＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）データを示す表１を参照されたい。
【０３３１】
座標
表１１、１２、１３及び１４には、異なるアロステリックなプロセシング阻害因子例と複合体形成させたプロＭＭＰ９の代表的な構造に関係する座標を掲載する。表１５には、アポ形態のプロＭＭＰ９の座標を掲載する。
【０３３２】
【表１１−１】
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【０３３３】
【表１１−２】
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【０３３４】
【表１１−３】
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【０３３５】
【表１１−４】
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【０３３６】
【表１１−５】
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【０３３７】
【表１１−６】
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【０３３８】
【表１１−７】
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【０３３９】
【表１１−８】
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【０３４０】
【表１１−９】
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【０３４１】
【表１１−１０】
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【０３４２】
【表１１−１１】
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【０３４３】
【表１１−１２】
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【０３４４】
【表１１−１３】
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【０３４５】
【表１１−１４】
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【０３４６】
【表１１−１５】
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【０３４７】
【表１１−１６】
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【０３４８】
【表１１−１７】
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【０３４９】
【表１１−１８】
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【０３５０】
【表１１−１９】
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【０３５１】
【表１１−２０】
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【０３５２】
【表１１−２１】
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【０３５３】
【表１１−２２】
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【０３５４】
【表１１−２３】
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以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、並びにそれらの溶媒和物、水和物、互変異性体、又は製薬上許容され得る塩、からなる群から選択される化学物質を使用して、プロマトリックスメタロプロテアーゼ（プロＭＭＰ）の活性化を阻害する方法。
［２］  アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子及び製薬上許容され得る担体を含む医薬組成物を使用して、プロＭＭＰの活性化を阻害する方法。
［３］  前記プロＭＭＰがプロＭＭＰ９であり、かつ前記化学物質が、アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９においてフェニルアラニン（Ｐｈｅ）１０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合し、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記プロＭＭＰがプロＭＭＰ９であり、前記アロステリックな結合部位が、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］  前記プロＭＭＰが、次の：プロＭＭＰ１、プロＭＭＰ２、プロＭＭＰ３及びプロＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記化学物質が、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、［１］又は［２］に記載の方法。
［６］  マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を阻害する少なくとも１つのアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子を有効な量で投与することにより、哺乳類においてＭＭＰ活性を阻害する方法。
［７］  前記ＭＭＰがＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、［６］に記載の方法。
［８］  前記プロＭＭＰがプロＭＭＰ９であり、前記アロステリックな結合部位が、アミノ酸残基１００〜１０２、１１０、１１４、１７７〜１７９、１９０〜１９３及び４０５〜４１０を含み、ここで付番は、完全長のヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−９前駆体、すなわちプロＭＭＰ９（１〜７０７）（配列番号１）より採用するものである、［６］に記載の方法。
［９］  前記ＭＭＰが、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、［６］に記載の方法。
［１０］  ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法であって、前記ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態（form）、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含む、方法。
［１１］  ＭＭＰにより介在される症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法であって、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、前記症候群、疾患又は疾病は、ＭＭＰの高発現すなわちＭＭＰの過剰発現と関連付けられ、あるいはＭＭＰの高発現又はＭＭＰの過剰発現と関連付けられる症候群、疾患又は疾病に伴う状態である、方法。
［１２］  症候群、疾患又は疾病を予防、処置又は寛解させるための方法であって、ＭＭＰの活性を阻害するアロステリックな小分子型プロセシング阻害因子、あるいはアロステリックなプロセシング阻害因子を含む形態、組成物又は薬剤を、これらを必要としている対象者に有効な量で投与する工程を含み、前記症候群、疾患又は疾病は、次の：腫瘍性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、循環器疾患、胃潰瘍、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸症候群、歯周病、皮膚潰瘍、肝線維症、気腫、マルファン症候群、脳卒中、多発性硬化症、喘息、腹部大動脈瘤、冠動脈疾患、特発性肺線維症、腎線維症、及び片頭痛からなる群から選択される、方法。
［１３］  前記ＭＭＰがＭＭＰ９であり、前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９においてＰｈｅ  １０７により占有される空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］  前記ＭＭＰが、次の：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３及びＭＭＰ１３からなる群から選択されるＭＭＰ９ホモログであり、かつ前記アロステリックな小分子型プロセシング阻害因子が、アポ形態のプロＭＭＰ９のＰｈｅ  １０７により占有される空間領域とホモログである空間領域を含むアロステリックな結合部位に結合する、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１５］  前記症候群、疾患又は疾病が、腫瘍性疾患であり、卵巣がんである、［１２］に記載の方法。
［１６］  前記症候群、疾患又は疾病が、循環器疾患であり、該循環器疾患が、次の：アテローム性動脈硬化巣の破裂、動脈瘤、血管組織の形態形成、冠動脈疾患、及び心筋組織形態形成からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１７］  前記循環器疾患がアテローム性動脈硬化巣の破裂である、［１４］に記載の方法。
［１８］  前記症候群、疾患又は疾病が、関節リウマチである、［１２］に記載の方法。
［１９］  前記症候群、疾患又は疾病が、喘息である、［１２］に記載の方法。
［２０］  前記症候群、疾患又は疾病が、慢性閉塞性肺疾患である、［１２］に記載の方法。
［２１］  前記が症候群、疾患又は疾病が、炎症性腸症候群である、［１２］に記載の方法。
［２２］  前記が症候群、疾患又は疾病が、腹部大動脈瘤である、［１２］に記載の方法。
［２３］  前記症候群、疾患又は疾病が、変形性関節症である、［１２］に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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