(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の遺伝要素を単離するための方法であって、
マイクロ流体チャンネルを含むマイクロ流体デバイスにおいて水性液滴を形成することにより１つ以上の遺伝要素を複数の水性液滴に区画化する工程、ここに、それぞれの液滴は少なくとも１つの遺伝要素および１つ以上の遺伝産物を発現するために必要な構成要素を含む；
マイクロ流体チャンネル内の液滴の速度と比較して液滴の速度を少なくとも遅延させるべく、前記チャンネルよりも大きな断面積を有する１つ以上の共通の区画へマイクロ流体チャンネルからの液滴をプールすることにより遺伝要素を選別する工程、ここに、前記液滴は、１つ以上の共通の区画内で融合しない、マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝産物を生成するべく遺伝要素を発現させる工程、および遺伝産物の発現によってひき起こされる修飾された光学特性についてマイクロカプセルを監視する工程
を含む方法。
【請求項２】
遺伝要素が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝要素が核酸であって、遺伝産物を発現するために必要な構成要素がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝要素が標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
遺伝要素が光学的に標識されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
液滴が界面活性剤の存在により融合を阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤がフッ素化界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
液滴が担体流体により分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
担体流体が油を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
油がフッ素化またはペルフルオロ油である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
液滴が互いに単分散である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
液滴が互いにサイズにおいて均質である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ライブラリのインビトロ進化において使用するための方法に関する。特に、本発明は、核酸およびコードされた遺伝子産物の活性が、区画を作成しかつ／またはそれを処理するためにマイクロ流体システムを用いる区画化によって連結されている、遺伝子産物をコードする核酸の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
進化には、遺伝的多様性（核酸の多様性）の生成とそれに続く有益な特性を結果としてもたらす核酸の選択が必要となる。１つの生体のコードされた遺伝子産物の活性と核酸は物理的に連結されている（核酸はそれらがコードする細胞内部に閉じ込められている）ことから、多数回の突然変異と選択ラウンドは、適合性の増大に伴って、結果として生体の進歩的な存続をもたらし得る。インビトロでの核酸またはタンパク質の高速進化用のシステムは、コードされた遺伝子産物の活性と核酸が連結され、遺伝子産物の活性が選択可能であるという点において、このプロセスを分子レベルで有利に模倣する。
【０００３】
分子生物学における近年の進歩は、一部の分子を、それらをコードする核酸と共にそれらの特性に従って同時選択できるようにした。選択された核酸はその後さらなる分析または使用のためにクローニングするか、そうでなければ付加的な突然変異および選択ラウンドに付すことができる。
【０００４】
これらの方法に共通であるのは、核酸の大きなライブラリの確立である。所望の特徴（活性）をもつ分子は、例えば結合活性などの所望の生化学または生物学的活性といったようなコードされた遺伝子産物の所望の活性について選択する選択形態を通して単離可能である。
【０００５】
ファージディスプレイ法は、コードされた遺伝子産物の活性と核酸の間に不可欠な連結を提供することにより、提示されたタンパク質の選択を可能にするビヒクルを提供するものとして大きな成功をおさめてきた（スミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９８５年；バス（Ｂａｓｓ）ら、１９９０年；マカフェティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、１９９０年；再考のためにはクラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）およびウエルズ（Ｗｅｌｌｓ）、１９９４年を参照のこと）。線状ファージ粒子は、外側のタンパク質およびそれらをコードする内側の遺伝要素を伴う遺伝的提示パッケージとして作用する。コードされた遺伝子産物の活性と核酸の間の密な連関は、細菌内部のファージの集合の結果である。個々の細菌は多重感染を受けることが稀であることから、大部分の場合、個々の細菌から生成された全てのファージは、同じ遺伝要素を担持し同じタンパク質を提示することになる。
【０００６】
しかしながら、ファージディスプレイ法は、細菌内のインビトロでの核酸ライブラリの創出に依存している。かくして、ファージディスプレイ技術が可能にするライブラリサイズについての実際的制限は、切除可能な線状ファージレプリコンを伴う□ファージベクターを利用しても、およそ１０７〜１０１１である。この技術は主として、結合活性をもつ分子の選択に応用されてきた。触媒活性をもつ少数のタンパク質も同様にこの技術を用いて単離されてきたが、選択は所望の触媒活性について直接的にではなく、遷移状態類似体に対する結合（Ｗｉｄｅｒｓｔｅｎ（ヴィデルステン）およびマンネルヴィク（Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ）、１９９５年）または自殺阻害物質との反応（スミヨン（Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎ）ら、１９９４年；ヤンダ（Ｊａｎｄａ）ら、１９９７年）のいずれかについてのものであった。より最近では、生成物形成によるファージ提示を用いて選択された酵素のいくつかの例が存在している（アトウェル（Ａｔｗｅｌｌ）およびウエルズ、１９９９年；デマーティス（Ｄｅｍａｒｔｉｓ）ら、１９９９年；ジェスティン（Ｊｅｓｔｉｎ）ら、１９９９年；ペダーソン（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）ら、１９９８年）。
【０００７】
ｌａｃリプレッサーＬａｃＩのＣ末端に連結されたペプチドの大きなライブラリを用いて親和性選択により、レセプターに対する結合について特異的ペプチドリガンドが選択されてきた（カル（Ｃｕｌｌ）ら、１９９２年）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された時点で、リプレッサータンパク質は、プラスミド上のｌａｃオペレータ配列に対する結合により、コードプラスミドに対しリガンドを物理的に連結する。
【０００８】
完全にインビトロのポリソームディスプレイシステムも同様に報告されており（マテアキス（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ）ら、１９９４年；ヘインズ（Ｈａｎｅｓ）およびプラックタン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、１９９７年）、ここでは、新生ペプチドが、それらをコードするＲＮＡに対してリボソームを介して物理的に付着されている。ＲＮＡ−ペプチド融合を行なうことにより遺伝子型を表現型に連関させるための代替的な完全インビトロシステムも同様に記述されてきた（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）、１９９７年；ネモト（Ｎｅｍｏｔｏ）ら、１９９７年）。
【０００９】
しかしながら、上述のシステムの範囲はタンパク質の選択に制限されており、その上例えば触媒または調節活性といった、結合以外の活性についての直接的選択を可能にしていない。
【００１０】
ＳＥＬＥＸ（指数富化によるリガンドの系統的進化）（チュルク（Ｔｕｅｒｋ）およびゴルド（Ｇｏｌｄ）、１９９０年）と呼ばれることもあるインビトロＲＮＡ選択および進化（エリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）およびショスタック、１９９０年）は、結合および化学活性の両方についての選択を可能にするが、核酸についてのみである。選択が結合についてのものである場合、固定化された基質と共に核酸プールがインキュベートされる。非結合剤は洗い流され、次に結合剤は放出され、増幅され、より優れた結合配列について富化するべくプロセス全体を反復的工程で繰り返し行なう。この方法は同様に、触媒ＲＮＡおよびＤＮＡの単離を可能にするように適合させることもできる（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）およびショスタック、１９９２年；レビューのためにはチャプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）およびショスタック、１９９４年；ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、１９９４年；ゴルドら、１９９５年；ムーア（Ｍｏｏｒｅ）、１９９５年を参照のこと）。
【００１１】
しかしながら、ＳＥＬＥＸを用いた「触媒」または結合活性についての選択が唯一可能であり、これは、同じ分子が遺伝子情報を担持することと触媒または結合分子（アダプタマー）であることの２重の役割を果たすからである。選択が「自己触媒作用」についてのものである場合、同じ分子は同様に、基質であることという第３の役割を果たさなくてはならない。遺伝要素は基質と触媒という両方の役割を果たさなくてはならないことから、単一の代謝回転事象についてのみ選択が可能である。「触媒」は、このプロセスにおいてそれ自体修飾されることから、それは本質的に真の触媒ではない。さらに、ＳＥＬＥＸ手順を用いてタンパク質を選択することはできない。従って、選択可能な触媒、基質および反応の範囲は、大幅に制限されている。
【００１２】
上述の方法のうち反復的な突然変異および選択ラウンドを可能にするものは、反復的変動、所望の活性に対する進歩的選択および複製という通常進化プロセスに原因があるとされるインビトロ機序を模倣している。しかしながら、これまで開発されてきた方法のいずれも、天然に見出されるものに匹敵する多様性および機能的有効性をもつ分子を提供していない。さらに、（例えば結合、触媒および調節活性といった）生化学および生物学的活性の全範囲をもたらすべく核酸とタンパク質の両方を進化させることができかつ所望の生成物または活性を導く複数のプロセスを組合せることのできる人工の「進化」システムは全く存在していない。
【００１３】
かくして、以上で論述した制限を克服するインビトロシステムに対する高いニーズが存在する。
【００１４】
タウフィーク（Ｔａｗｆｉｋ）およびグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、（１９９８年）および特許文献１では、出願人は、分子レベルで遺伝子型および表現型を連結するためマイクロカプセル内の区画化を用いることによって上述の多くの制限を克服するインビトロ進化用システムについて記述している。
【００１５】
タウフィークおよびグリフィス（１９９８年）内および特許文献２内では、遺伝子産物の所望の活性は、結果として、それをコード化した（そして同じマイクロカプセル内に存在する）遺伝要素の修飾をもたらす。修飾された遺伝要素は、このとき、後続工程において選択され得る。
【００１６】
我々のその後の特許文献３は、遺伝要素の修飾が要素自体の光学特性の変化を起こす、前述の方法に比べ数多くの利点をもつこの技術の変形形態について記述している。
【００１７】
流体の送達、製品製造、分析などを目的とした所望の構成の流体流、不連続流体流、液滴、粒子、分散などを形成するための流体の操作は、相対的に充分研究されている技術である。例えば、毛細管フロー集束と呼ばれる技術を用いて、直径１００マイクロン未満のきわめて単分散の気泡が生成されてきた。この技術においては、気体は強制的に毛細管から液体浴内に出され、この管は小さいオリフィスの上に位置づけされ、このオリフィスを通した外部液体の縮流は、気体を薄い噴流の形に集束させ、この噴流はその後、毛細管不安定性を介して急激に等サイズの気泡になる。関連技術では、空気中で液滴を生成するために類似の配置が使用された。
【００１８】
非特許文献１は、細かいスプレーを発生させる層状加速気体流による微細液体スレッドの形成について記述している。
【００１９】
非特許文献２は、特定的には２つのマイクロ流体チャンネルの間の「Ｔ字形」接合部において流動する油の中に水を導入することによる、マイクロ流体交差フローを介した連続油相中の不連続水相の形成について記述している。
【００２０】
２０００年９月１９日に発行された特許文献４は、例えば生体液分析において流体媒質内の微細粒子を分析するため第１および第２の試料流体流を空間的に封じ込めるための流体集束用チャンバを有するマイクロ加工装置について記述している。
【００２１】
２０００年９月１２日に発行された特許文献５は、毛細管マイクロ噴流の形成およびマイクロ噴流の解離を介した単分散エアロゾルの形成について記述している。
【００２２】
２００１年２月１３日に発行された特許文献６は、２つの不混和流体の相互作用によって生成される約１〜約５マイクロンのサイズ範囲内の霧化粒子について記述している。
【００２３】
２００１年６月１９日に発行された特許文献７は、マイクロ噴流を用いて食物の中に導入するための粒子の生産およびマイクロ噴流が解離したときに形成される単分散エアロゾルについて記述している。
【００２４】
標準的には、小型化された実験室（例えば臨床的）分析の状況下で、マイクロ流体システムがさまざまな状況下で記述されてきた。その他の用途も同様に記述されてきた。例えば、特許文献８は、表面上の生体材料および細胞といったような材料パターンを提供するために使用可能なマルチレベルマイクロ流体システムについて記述している。その他の刊行物は、バルブ、スイッチおよびその他のコンポーネントを含めたマイクロ流体システムについて記述している。
【特許文献１】国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０１８８９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９０２６７１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第００４０７１２号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，１２０，６６６号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１１６，５１６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１８７，２１４号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２４８，３７８号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／８９７８９号パンフレット
【非特許文献１】「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅａｄｙ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｍｉｃｒｏｔｈｒｅａｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｎ−Ｓｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｐｒａｙｓ  および  Ｇａｓ  Ｓｔｒｅａｍｓ」と言う表題の論文、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．、第８０：２号、１９９８年１月１２日、２８５〜２８８頁（Ｇａｎａｎ−Ｃａｌｖｏ）
【非特許文献２】「Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｖｅｓｉｃｌｅ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ」と言う表題の論文、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．、第８６：１８号、２００１年４月３０日（トールセン（Ｔｈｏｒｓｅｎ）、ら）
【発明の概要】
【００２５】
本発明の第１の態様に従うと、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする１つ以上の遺伝要素を単離するための方法であって、
（ａ）  遺伝要素をマイクロカプセルに区画化する工程；
（ｂ）  所望の活性をもつ遺伝産物を発現する遺伝要素を選別する工程、
を含む方法であって、少なくとも１つの工程がマイクロ流体制御下にある方法が提供されている。
【００２６】
本発明の方法であって、は、区画化の前または後にその遺伝子生成物を形成させるために遺伝要素を発現させることが可能である。遺伝子産物が区画化の前に発現される場合、それは、それらが一緒に区画化されるように遺伝要素に連結される。
【００２７】
好ましくは、少なくとも１つの工程は、流体種の電子制御を用いて実施される。
【００２８】
有利には、少なくとも１つの工程に、マイクロカプセルの融合または分割が関与する。
【００２９】
流体種の電子制御ならびにマイクロ流体制御下でのマイクロカプセルの分割（および融合）のための方法が、本書で記述されている。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法は、
（ａ）  遺伝要素をマイクロカプセルに区画化する工程；
（ｂ）  マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝子産物を生成するべく遺伝要素を発現させる工程；および
（ｃ）  所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素を選別する工程、を含む。
【００３１】
代替的には、本発明の方法は、
（ａ）  遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子に連結されるような形でそのそれぞれの遺伝子産物を生成するべく遺伝要素を発現させる工程；
（ｂ）  遺伝要素をマイクロカプセルに区画化する工程；および
（ｃ）  所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする前記遺伝要素を選別する工程、を含む。
【００３２】
本発明に従ったマイクロカプセルは、遺伝要素と遺伝子産物を区画化し、それらが物理的に共に連結された状態にとどまるようにする。
【００３３】
本書で使用されている通り、遺伝要素は、核酸を含む分子または分子構成体である。本発明の遺伝要素は、あらゆる核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはその天然のまたは人工のあらゆる類似体）を含み得る。遺伝要素の核酸構成要素は、タンパク質、化学物質および基を含めた１つ以上の分子または構造および（非磁性、磁性および常磁性ビーズを含めた）ビーズなどの固相支持体に対し共有結合または非共有結合により連結され得る。本発明の方法であって、は、これらの構造または分子は、所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素の選別および／または単離を補助するように設計可能である。
【００３４】
本書で使用される発現というのは、遺伝要素内に含有される核酸がその遺伝子産物へと転換されることを意味するためにその最も広い意味で使用されている。かくして、核酸がＤＮＡである場合、発現はＤＮＡからＲＮＡへの転写を意味する。このＲＮＡがタンパク質についてコードする場合、発現は同様に、ＲＮＡからタンパク質への翻訳をも意味し得る。核酸がＲＮＡである場合、発現は、このＲＮＡからさらなるＲＮＡコピーへの複製、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写および任意にはこのＤＮＡからさらなるＲＮＡ分子への転写、ならびに任意には生成されたＲＮＡ種のいずれかからタンパク質への翻訳を意味し得る。従って、好ましくは、発現は、転写、逆転写、複製および翻訳からなる群の中から選択された１つ以上のプロセスによって実施される。
【００３５】
かくして、遺伝要素の発現は、遺伝子産物が遺伝要素と同じマイクロカプセル内部に閉じ込められるように、本発明のマイクロカプセルの内部に天然でない塩基またはアミノ酸（遺伝子産物）を含む核酸またはタンパク質か、またはＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかの中に導かれ得る。
【００３６】
遺伝要素およびこれによりコードされる遺伝子産物は、同じマイクロカプセルの内部に各々の遺伝要素およびそれによりコードされるそれぞれの遺伝子産物を閉じ込めることによって連結される。このようにして、１つのマイクロカプセル内の遺伝子産物は、その他のあらゆるマイクロカプセル内の変化を起こすことができない。さらに、以下で記すように、遺伝子産物をそれらをコードする遺伝要素に連結するために、さらなる連結手段を利用することが可能である。
【００３７】
「マイクロカプセル」という用語は、本書では、当該技術分野において通常それに割当てられかつ以下でさらに詳述される意味に従って使用されている。しかしながら、基本的には、マイクロカプセルは、遺伝要素がコードする遺伝子産物の機能に応じた遺伝要素の選別を可能にする、本書で記述されている分子機序の構成要素の交換を制限する画定境界線をもつ人工的区画である。好ましくは、本発明の方法において使用されるマイクロカプセルは、極めて大量に生産されかくして遺伝子産物レパートリをコードする遺伝要素ライブラリを区画化する能力をもつことになる。
【００３８】
本書で使用される光学特性の変化というのは、吸光、発光、リン光または蛍光の変化を含めて、電磁放射線の吸収または発出のあらゆる変化を意味する。かかる特性は全て「光学」という用語の中に含まれる。マイクロカプセルおよび／または遺伝要素は、例えば発光、蛍光またはリン光活性化選別によって選別可能である。好ましい実施形態においては、マイクロカプセルおよび／または遺伝要素を選別するのにフローサイトメトリーが利用され、例えば、フロー選別を始動させるためには、光散乱（ケルカー（Ｋｅｒｋｅｒ）、１９８３年）および蛍光偏光（Ｒｏｌｌａｎｄら、１９８５年）を使用できる。きわめて好ましい実施形態においては、遺伝要素は蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて選別される（ノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）、１９８０年；マッケンジー（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）およびピンダー（Ｐｉｎｄｅｒ）、１９８６年）。かかる選別デバイスは、マイクロ流体デバイス上に直接統合され得、マイクロカプセルおよび／または遺伝要素を選別するためには電子手段を使用できる。同様にマイクロ流体デバイス上に直接統合される光検出を用いて、マイクロカプセルおよび／または遺伝要素をスクリーニングして選別を始動させることができる。電荷に加えて、その他のマイクロカプセルおよび／または遺伝要素制御手段も、マイクロ流体デバイスに内蔵可能である。
【００３９】
光学特性の変化は直接的または間接的であり得る。かくして、変化は、結果としてマイクロカプセルまたは遺伝要素自体の中の光学特性の改変をもたらす可能性があり、そうでなければ、かかる変化を間接的に導くこともできる。例えば、遺伝要素の修飾は、光学活性リガンドを結合させるその能力を改変させ得、かくしてその光学特性を間接的に改変させる。
【００４０】
代替的には、例えば望ましい特性をもつ遺伝要素が位置づけされている領域の物理的隔離、または望まれない遺伝要素のアブレーションなどにより、望ましい特性をもつ遺伝要素についての富化を可能にするべく遺伝要素の薄いフィルムをスクリーニングするために、画像形成技術を使用することができる。遺伝要素は、発光、リン光または蛍光により検出可能である。
【００４１】
遺伝要素の選別は、基本的に７つの技術のうちの１つにおいて実施可能である。
【００４２】
（Ｉ）  第１の実施形態では、マイクロカプセルは、そのマイクロカプセルを全体として検出可能にする遺伝子産物またはその誘導体の活性に従って選別される。従って、所望の活性をもつ遺伝子産物がマイクロカプセル内の変化またはマイクロカプセル内部の１つ以上の分子の修飾を誘発し、これにより遺伝子産物およびそれをコードする遺伝要素を含むマイクロカプセルの選別を可能にする。この実施形態においては、マイクロカプセルは、中に含まれた遺伝要素から発現された遺伝子産物の活性に従って互いから物理的に選別され、こうして、所望の活性の遺伝子産物を含むマイクロカプセルについて富化することが選択的に可能となる。
【００４３】
（ＩＩ）  第２の実施形態においては、遺伝要素は、１つ以上の共通の区画内へマイクロカプセルをプールした後に選別される。この実施形態では、所望の活性をもつ遺伝子産物は、その後の工程でそれを選択可能なものにするような形で、それをコードした（そして同じマイクロカプセル内に常駐する）遺伝要素を修飾する。反応は停止され、その後マイクロカプセルは、個々のマイクロカプセルの中味が全てプールされるような形で破壊される。修飾された遺伝要素についての選択は、所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素の富化を可能にする。従って、所望の活性を有する遺伝子産物は、遺伝要素の単離を可能にするべく、それをコードする遺伝要素を修飾する。当然のことながら、修飾は、遺伝要素に対する遺伝子産物の直接的作用によってひき起こされるという点で直接的であってもよいし、または、所望の活性を有する遺伝子産物が関与するものが1つ以上含まれる一連の反応が遺伝要素の修飾を導く間接的なものであってもよい、ということを理解すべきである。
【００４４】
（ＩＩＩ）  第３の実施形態においては、遺伝要素は、１つ以上の共通の区画内へマイクロカプセルをプールした後に選別される。この実施形態においては、所望の活性をもつ遺伝子が、遺伝子産物およびそれをコードする遺伝要素を含むマイクロカプセル内の変化を誘発する。この変化は、検出された時点で、区画内部の遺伝子の修飾を始動させる。反応は停止され、その後マイクロカプセルは、個々のマイクロカプセルの中味が全てプールされるような形で破壊される。修飾された遺伝要素についての選択は、所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素の富化を可能にする。従って、所望の活性を有する遺伝子産物は、検出され区画内部の遺伝要素の修飾を始動させてその単離を可能にする区画内の変化を誘発する。区画化の検出された変化は、遺伝子産物の直接的作用によってひき起こされてもよいし、または、所望の活性を有する遺伝子産物が関与するものが1つ以上含まれる一連の反応が遺伝要素の修飾を導く間接的な作用によりひき起こされてもよい、ということを理解すべきである。
【００４５】
（ＩＶ）  第４の実施形態においては、例えば、少なくとも２つの別々の作用が発生できるようにする条件に対する遺伝要素の曝露を可能にするべく、少なくとも２つの工程が関与する多重工程手順によって遺伝要素を選別することができる。当業者には明らかとなるように、本発明の第１のマイクロカプセル化工程は、転写、転写および／または翻訳、複製などのいずれであれ、遺伝要素の発現を可能にする条件を結果としてもたらさなくてはならない。これらの条件下では、例えば、遺伝子産物がこれらの条件で活性でないかもしれないことまたは発現システムが干渉性の活性を含むことを理由として、特定の遺伝子産物活性について選択することが可能でないかもしれない。従って、本方法は、マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝子産物を生成するべく遺伝要素を発現させる工程、遺伝子産物とそれらをコードする遺伝要素を連結する工程およびかくして形成された複合体を単離する工程を含む。こうして、遺伝要素およびその関連遺伝子産物を遺伝子産物活性に従った選別が起こる前に、カプセルから単離させることが可能となる。好ましい実施形態においては、複合体は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝要素を単離する前にさらなる区画化に付される。有利にはマイクロカプセル内で行なわれるこのさらなる区画化工程は、遺伝要素とそのそれぞれの遺伝子産物が物理的に連結されている環境の中で異なる条件下でのさらなる反応の実施を可能にする。最終的な遺伝要素選別は、上述の実施形態（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）に従って実施することができる。
【００４６】
選択が遺伝要素内の光学的変化についてのものである場合、選択は以下のとおりに実施可能である。
【００４７】
（Ｖ）  第５の実施形態においては、遺伝要素は、１つ以上の共通の区画内へマイクロカプセルをプールした後に選別される。この実施形態では、所望の活性をもつ遺伝子産物は、その後の工程でその修飾された光学特性の結果としてそれを選択可能なものにするべく、それをコードした（そして同じマイクロカプセル内に存在する）遺伝要素を修飾する。反応は停止され、その後マイクロカプセルは、個々のマイクロカプセルの中味が全てプールされるような形で破壊される。マイクロカプセル内の遺伝要素の修飾は、直接的遺伝要素の光学特性の修飾を結果としてもたらし得る。代替的には、修飾は、マイクロカプセルの外側で遺伝要素をさらに修飾できるようにして、それらの光学特性の変化を誘発することができる。修飾された光学特性をもつ遺伝要素についての選択により、所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素の富化が可能となる。従って、所望の活性を有する遺伝子産物は、遺伝要素の光学特性の変化の結果として遺伝要素の単離を可能にするべく、それをコードする遺伝要素を修飾する。当然のことながら、修飾は、遺伝要素に対する遺伝子産物の直接的作用によってひき起こされるという点で直接的であってもよいし、または、所望の活性を有する遺伝子産物が関与するものが1つ以上含まれる一連の反応が遺伝要素の修飾を導く間接的なものであってもよい、ということを理解すべきである。
【００４８】
（ＶＩ）  第６の実施形態においては、例えば、少なくとも２つの別々の作用が発生できるようにする条件に対する遺伝要素の曝露を可能にするべく、少なくとも２つの工程が関与する多重工程手順によって遺伝要素を選別することができる。当業者には明らかとなるように、本発明の第１のマイクロカプセル化工程は有利にも、転写、転写および／または翻訳、複製などのいずれであれ、遺伝要素の発現を可能にする条件を結果としてもたらさなくてはならない。これらの条件下では、例えば、遺伝子産物がこれらの条件で活性でないかもしれないことまたは発現システムが干渉性の活性を含むことを理由として、特定の遺伝子産物活性について選択することが可能でないかもしれない。従って、本方法は、マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝子産物を生成するべく遺伝要素を発現させる工程、遺伝子産物とそれらをコードする遺伝要素を連結する工程およびかくして形成された複合体を単離する工程を含む。こうして、遺伝要素およびその関連遺伝子産物を遺伝子産物活性に従った選別が起こる前に、カプセルから単離させることが可能となる。好ましい実施形態においては、複合体は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝要素を単離する前にさらなる区画化に付される。有利にはマイクロカプセル内で行なわれるこのさらなる区画化工程は、遺伝要素とそのそれぞれの遺伝子産物が物理的に連結されている環境の中で異なる条件下でのさらなる反応の実施を可能にする。最終的な遺伝要素選別は、上述の実施形態（Ｖ）に従って実施することができる。
【００４９】
「二次カプセル化」は、同様に、発現がカプセル化に先立って起こる場合任意に、ファージディスプレイ法、ポリソームディスプレイ法、ＲＮＡ−ペプチド融合またはｌａｃリプレッサーペプチド融合、さらには所望の遺伝要素を含有する全細胞のカプセル化などといったその他の手段により遺伝子産物に対して連結された遺伝要素で実施することもできる。
【００５０】
選択された遺伝要素は同様に、上述の方法の全体または選択された工程のみ再度応用することで、反復的に繰り返される工程の形で、場合によってはよりストリンジェントな後続選択ラウンドにも付され得る。適切に条件を調整することにより、より良く最適化された活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素を各選択ラウンドの後に単離することが可能である。
【００５１】
さらに、第１の選別ラウンド後に単離された遺伝要素は、上述の通りの本発明の方法の工程の反復的繰り返しにより選別を反復する前に、突然変異誘発に付すことができる。突然変異誘発の各ラウンドの後、一部の遺伝要素は、遺伝子産物の活性が増強されるような形で修飾を受けていることになる。
【００５２】
その上、遺伝要素およびその生成物のさらなる特徴づけを可能にするため、選択された遺伝要素を発現ベクター内にクローニングさせることができる。
【００５３】
（ＶＩＩ）  第７の実施形態においては、マイクロ流体アプローチを用いて、マイクロカプセルを選別することができる。マイクロカプセルは、本書に記述されているものといったようなマイクロ流体液滴形成技術を用いて、または、２つの流体相を合わせて強制することによる従来の乳化などのその他の技術によって、生産することができる。マイクロ流体工学を用いた選別は、以上の実施形態Ｉ〜ＶＩに適用可能であり、改良型選別を導くマイクロカプセルの増強された処理を提供する。マイクロカプセルを、本書で記述されている方法に従って分割または融合でき、そうでなければ、その中味を混合することもできる。その上、マイクロカプセルの中味を分析し、マイクロ流体システム内で検出器を用いてマイクロカプセルを選別することができる。
【００５４】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従って選択された場合の生成物を提供している。これに関連して使用される「生成物」というのは、本発明に従って選択可能な遺伝子産物または遺伝要素（またはその中に含まれた遺伝情報）を意味する。
【００５５】
第３の態様では、本発明は、その発現が結果として、それをコードする遺伝要素の光学特性の修飾を直接的または間接的にもたらす遺伝子産物を調製するための方法であって、、
（ａ）遺伝子産物をコードする遺伝要素を調製する工程；
（ｂ）遺伝要素をマイクロカプセルに区画化する工程；
（ｃ）遺伝要素を発現させて前記マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝子産物を生成する工程；
（ｄ）遺伝要素の変化した光学特性を用いて所望の活性を有する遺伝子産物を生成する遺伝要素を選別する工程；および
（ｅ）所望の活性を有する前記遺伝子産物を発現させる工程；を含み、
工程（ｂ）および（ｄ）の一方または両方の工程がマイクロ流体制御下にある方法を提供している。
【００５６】
第３の態様に従うと、工程（ａ）は好ましくは、遺伝要素のレパートリを調製する工程を含んでなり、ここで各々の遺伝要素は潜在的に異なる遺伝子産物をコードする。レパートリは、ファージディスプレイ法といったような方法による選択用に意図されたライブラリの生成のために利用されるものといった従来の技術によって生成可能である。本発明に従って、所望の活性をもつ遺伝子を、その他の遺伝子産物のものと異なる要領で遺伝要素の光学特性を修飾するその能力に応じて選択することが可能である。例えば、所望の遺伝子産物は、その他の遺伝子産物よりも高いレベルで、または皆無を含めより低いレベルで光学特性を修飾することができる。
【００５７】
第４の態様では、本発明は、その発現が結果として、それをコードする遺伝要素の光学特性の修飾を直接的または間接的にもたらす、遺伝子産物の活性の修飾能力をもつ１つ以上の化合物をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）遺伝子産物をコードする遺伝要素のレパートリを調製する工程；
（ｂ）遺伝要素をマイクロカプセルに区画化する工程；
（ｃ）前記遺伝要素を発現させて前記マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝子産物を生成する工程；
（ｄ）遺伝要素の変化した光学特性を用いて所望の活性を有する前記遺伝子産物を生成する前記遺伝要素を選別する工程；および
（ｅ）前記１つ以上の化合物と前記所望の活性をもつ遺伝子産物を接触させ、前記化合物による前記遺伝子産物の活性の変調を監視する工程；を含み、
工程（ｂ）および（ｄ）の一方または両方の工程がマイクロ流体制御下にある方法を提供している。
【００５８】
有利には、本方法はさらに、
（ｆ）  遺伝子産物の活性を変調し前記１つ以上の化合物を合成する能力をもつ１つ以上の化合物を同定する工程、を含む。
【００５９】
この選択システムを、触媒、調節または結合活性をもつＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質分子について選択するように構成することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に従った液滴の分割を例示する。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に従った液滴の分割を例示する。
【図２Ａ】電場を印加する前の、本発明の一実施形態に従った器具を例示している。
【図２Ｂ】電場を印加する前の、本発明の一実施形態に従った器具を例示している。
【図３Ａ】電場を印加した後の、図２Ａの器具を例示する。
【図３Ｂ】電場を印加した後の、図２Ｂの器具を例示する。
【図４Ａ】逆電場の印加後の図２Ａの器具を例示する。
【図４Ｂ】逆電場の印加後の図２Ｂの器具を例示する。
【図５】本発明の一実施形態に従った液滴分割の概略図である。
【図６Ａ】本発明の付加的な実施形態の概略図である。
【図６Ｂ】本発明の付加的な実施形態の概略図である。
【図７ａ】本発明に従ったマイクロ流体液滴の形成の概略図である。
【図７ｂ】本発明に従ったマイクロ流体液滴の形成の概略図である。
【図８ａ】本発明に従った液滴の分割を例示する。
【図８ｂ】本発明に従った液滴の分割を例示する。
【図８ｃ】本発明に従った液滴の分割を例示する。
【図８ｄ】本発明に従った液滴の分割を例示する。
【図８ｅ】本発明に従った液滴の分割を例示する。
【図８ｆ】本発明に従った液滴の分割を例示する。
【図９ａ】本発明に従った液滴内への双極子の誘導を例示する。
【図９ｂ】本発明に従った液滴内への双極子の誘導を例示する。
【図９ｃ】本発明に従った液滴内への双極子の誘導を例示する。
【図９ｄ】本発明に従った液滴内への双極子の誘導を例示する。
【図１０ａ】マイクロ流体システム内の担体流体のフローを改変することによるマイクロカプセルの選別を例示する。
【図１０ｂ】マイクロ流体システム内の担体流体のフローを改変することによるマイクロカプセルの選別を例示する。
【図１０ｃ】マイクロ流体システム内の担体流体のフローを改変することによるマイクロカプセルの選別を例示する。
【図１０ｄ】マイクロ流体システム内の担体流体のフローを改変することによるマイクロカプセルの選別を例示する。
【図１１ａ】液滴フローの方向を制御するためのマイクロ流体システム内の圧力変化の使用を例示している。
【図１１ｂ】液滴フローの方向を制御するためのマイクロ流体システム内の圧力変化の使用を例示している。
【図１１ｃ】液滴フローの方向を制御するためのマイクロ流体システム内の圧力変化の使用を例示している。
【図１２ａ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｂ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｃ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｄ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｅ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｆ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｇ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｈ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｉ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１２ｊ】本発明に従ったマイクロ流体システム内の液滴についてのフローパターンを例示する。
【図１３ａ】本発明における反対に荷電された液滴の使用を例示する。
【図１３ｂ】本発明における反対に荷電された液滴の使用を例示する。
【図１３ｃ】本発明における反対に荷電された液滴の使用を例示する。
【図１３ｄ】本発明における反対に荷電された液滴の使用を例示する。
【図１４ａ】非混和性液体を用いたマイクロ流体液体の形成および維持の例示である。
【図１４ｂ】非混和性液体を用いたマイクロ流体液体の形成および維持の例示である。
【図１５】マイクロ流体システム内でマイクロ液滴を用いた酵素の方向付けられた進化。図版Ａ：コアシステムの概略図。図版Ｂ：コアシステム内のモジュールを示すプロセスブロック図。統計学的に液滴の大部分が液滴１個あたり１個以下の遺伝子を含むような形でマイクロ水滴（図１６Ａ）の中に、突然変異を受けた酵素遺伝子のライブラリがカプセル化される。これらのマイクロ液滴の各々が、インビトロ翻訳システムを含む第２のマイクロ液滴（図１６Ｃ）と融合される。遺伝子がタンパク質へと翻訳される時間を置いてから、各々のマイクロ液滴が、翻訳阻害物質（ピュロマイシン）および蛍光発生酵素基質を含むもう１つのマイクロ液滴と融合させられる。酵素反応の速度は、理想的には（異なる時間に対応する）多数の点において、各々のマイクロ液滴の蛍光を測定することによって決定される。所望の閾値を上回る触媒速度をもつマイクロ液滴（例えば最速の１％）が選別され（図１６Ｄ）、収集され、その中に含まれている遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅されることになる。選択された遺伝子は、このとき特徴づけされるか、直接再選択されるか、またはまず再度ランダム突然変異を受けるかまたは組換えされてから再選択される。
【図１６】マイクロ流体を用いたマイクロ液滴の形成および操作の例。図版Ａ：流体力学的集束（上部の２つの図版）により最高１０４ｓｅｃ−１でマイクロ液滴を作り出すことができ、それらは１．５％未満の多分散性（下図版）を示す。図版Ｂ：マイクロ液滴は対称または非対称に分割可能である。図版Ｃ：正（＋ｑ）および負（−ｑ）の電荷を担持するマイクロ液滴が自然発生的に融合する。図版Ｄ：荷電マイクロ液滴は同様に、印加された電場（Ｅ）を用いても操縦可能である。
【図１７】荷電液滴の生成。（Ａ）、油および水の流れが、３０マイクロンのオリフィスで収束する。ガラス上のインジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）電極に印加された電圧Ｖが、電場Ｅを生成して、水−油界面を容量荷電する。滴径は低い電場強度では電荷と無関係であるが、高電場での顕微鏡写真［（Ｂ）Ｖ＝０、（Ｃ）Ｖ＝４００、（Ｄ）Ｖ＝６００および（Ｅ）Ｖ＝８００］の中で示されている通り、より高い電場では減少する。（Ｆ）連続相油の３つの異なる流速（Ｑｃ＝８０ｎＬ／秒、１１０ｎＬ／秒および１４０ｎＬ／秒）についてのフロー優位および電場優位のスナップオフの間の交差を示す電圧の関数としての液滴サイズ。水の注水速度は恒常である。Ｑｄ＝２０ｎＬ／秒｝
【図１８】合体する滴。（Ａ）２つの水流を横断して１つの電圧を印加することにより、静電電荷の相対する正負符号をもつ滴を生成することができる。（Ｂ）電場が無い場合、２つのノズルにおける滴形成の頻度およびタイミングは独立しており、各ノズルは異なる頻度で異なるサイズの滴を生産する；注入速度は両方のノズルにおいて同じである。２つの流れの合流の後、上部および下部ノズルからの滴は、流れのそれぞれの半分の中にとどまり、界面活性剤に起因して、チャンネル幅を満たす大きなスラグがある場合でさえ、いかなる合流事象も存在しない。（Ｃ）ノズルの５００マイクロンの離隔距離を横断して２００Ｖという電圧が印加される場合、滴は、２本のノズルから同時に中断し、同一である。同時滴形成は、体積差の２倍という水流の不等な注入速度についてさえ達成可能である。（Ｄ）互いに遭遇し合流する滴の画分は、界面活性剤ソルビトンモノオレアート３％が存在する場合、臨界電場より上で線形的に増大する。
【図１９】ｐＨ感応性染料を担持する液滴は、異なるｐＨの流体の液滴と合流する。液滴がコーナーのまわりを透過するにつれて、並進運動と回転の組合せを通し、カオス的移流が２つの流体を急速に混合する。
【図２０】拡散制限および急速混合戦略。（Ａ）滴はＥの方向に沿って遭遇し合流し、次に、垂直方向に運び去られる。素描されているとおり、各渦流は単一の材料を含むため、対抗回転する渦流は、合流点の後２つの流体部分を混合させない。（Ｂ）滴が互いに接近するにつれて、増大する電場がその界面を変形させ、（Ｃ）ブリッジが飛び出て滴を連結させて、（Ｄ）２０ｎｍのシリカ粒子およびＭｇＣｌ＿２の場合、粒子がゲル化し始める鮮明な界面を作り出す。（Ｅ）１半球内に粒子を伴う標準的な未混合液滴。（Ｆ）高速混合を達成するためには、液滴は、電場に対して垂直方向に集められ、それらが併合した方向に対し平行な方向に運び去られる。このとき、対抗回転する渦流が作り出され、ここで各々の渦流は併合前の滴の各々に由来する中味の半分で構成されている。（Ｇ）下部滴中のｐＨ感応性染料および上部液滴中の異なるｐＨの流体を示す。（Ｈ）併合の後、液滴は鮮明な線により分割される。（Ｉ）混合が発生したことを表わす均等な強度が、液滴中で、それが１直径分並進運動した後に達成され、標準的にこれには１〜２ｍｓかかる。
【図２１】時間的遅延反応モジュール。（Ａ）ペルフルオロデカリンの液滴が、ヘキサデカン担体流体内で水滴と交番する。液滴の「一列縦隊」順序づけは、水滴の精確な間隔どりまたは液滴順序に基本的に全く逸脱がない状態で長い遅延を提供する。（Ｂ）「広い断面積」のチャンネルを作り出すためにチャンネルの幅および高さを増大させることにより、分単位乃至時間単位のきわめて長い時間的遅延が提供される。液滴間の正確な順序づけおよび間隔どりは、このタイプの遅延ラインにおいては維持されない。
【図２２】中性滴の再荷電。（Ａ）電場の存在下で破壊することにより中性滴を再荷電するための概略図。未荷電滴（ｑ＝０）が電場内で分極され（Ｅｓ≠０）、Ｅｓが（Ｂ）の顕微鏡写真内で示されている通り、充分大きいことを条件として、これらの滴は、分岐点での伸長流内で２つの反対に荷電された娘滴へと分かれる。（Ｃ）に示されている破線矩形の拡大は、荷電滴が電場Ｅｓ内で引き延ばされるが、破線垂直線によって表わされた電極との接触時点で球形に戻る、ということを明らかにしている。
【図２３】検出モジュール。各液滴がファイバ上を通過するにつれてその中の蛍光を励起させるために使用される光ファイバに対し、１つ以上のレーザーが結合される。蛍光は同じファイバにより収集され、２色性ビームスプリッタが蛍光の特異的波長を分離し、蛍光の強度は、光が帯域通過フィルターを通過した後、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて測定される。
【図２４】荷電滴の操作。（Ａ）では、全く電場が印加されない場合（Ｅｓ＝０）、荷電滴は左右のチャンネルに交互に入る。（Ｂ）の素描は、荷電滴が分岐点で進入することになるチャンネルを選択するために電場Ｅｓを使用するためのレイアウトを示す。右に電場が印加された時点で（Ｃ）、滴は、分岐点で右の分岐に入る；電場が逆転した時点で、これらは左の分岐に入る（Ｄ）。分岐点の後、滴間の距離は、油流が均等に分けられていることを標示する前の距離の半分まで削減される。（Ｄ）の差し込み図は、電場内のきわめて高い荷電を受けた滴の形状の変形を示している。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
定義
本書で使用される「または」という用語は、「包含的にまたは」、すなわち、多くの要素の２つ以上または要素のリストの２つ以上を含めた少なくとも１つの包含を意味するものとして理解されるべきである。これとは対照的に、「排他的にまたは」という用語は、多くの要素の正確に１つの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を意味する。
【００６２】
本明細書およびクレーム内で使用されている「ａ」および「ａｎ」という不定冠詞は、「少なくとも１つ」を意味するものとして理解すべきである。
【００６３】
数値的パラメータ（例えば物理的、化学的、電気的または生物学的特性）に関連して本書で使用されている「約」という用語は、当業者には、１つの数値の近似であり、その正確な値はその数値パラメータの測定誤差の結果としてのものといったような誤差、数値パラメータの可変性および／または再現性（例えば別の実験における）の結果としての不正確さなどの対象となり得るものとして理解されることになる。
【００６４】
「マイクロカプセル」という用語は、本書では、当該技術分野において通常割当てられ以下で詳述される意味に従って使用されている。しかしながら、基本的には、マイクロカプセルというのは、所望の活性を有する分子の同定を可能にする、本書で記述されている分子機序のコンポーネントの交換を制限する画定境界線をもつ人工的区画である。画定環境線は好ましくは、マイクロカプセルの中味を完全に封じ込めている。好ましくは、本発明の方法において使用されるマイクロカプセルは、極めて大量に生産され、かくして遺伝要素のライブラリを区画化する能力をもつことになる。任意には、遺伝要素はマイクロビーズに付着される遺伝子を含み得る。本書で用いられるマイクロカプセルは、本発明の方法の高速処理能力を容易にするべく、カプセル上で行われる混合および選別を可能にする。マイクロカプセルは、異なる流体の中の１つの流体の液滴であり得、ここで閉込められたコンポーネントは液滴内で可溶であるが担体流体中では可溶でない。もう１つの実施形態においては、膜といったような壁を構成する第３の材料または、剛性の非透過性膜または半透過性膜を伴うものが存在する。
【００６５】
固体表面、マルチウェル平板およびマイクロ流体システム内の「プラグ」上の液滴すなわち本書で定義されている通りの第２の流体によって完全に取り囲まれていない流体液滴のアレイは、本書で定義づけされる通りのマイクロカプセルではない。
【００６６】
「マイクロビーズ」という用語は、ここでは、当該技術分野で通常それに割当てられる意味および以下でさらに詳述される意味に従って使用されている。マイクロビーズは当業者にマイクロスフェア、ラテックス粒子、ビーズまたはミニビーズとしても知られており、２０ｎｍ〜１ｍｍの直径で入手可能であり、シリカおよびさまざまな重合体、共重合体および３元重合体を含めたさまざまな材料から作ることができる。数多くの供給源（例えば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、バングス・ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）およびモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））（フォルヌセック（Ｆｏｒｎｕｓｅｋ）およびヴェトヴィツカ（Ｖｅｔｖｉｃｋａ）、１９８６年）から、高均質性の誘導体化および非誘導体化非磁性および常磁性微小粒子（ビーズ）が市販されている。
【００６７】
マイクロビーズは、マイクロカプセル内への分布により本発明に従って「区画化」され得る。例えば、好ましい一態様においては、マイクロビーズは水／油混合物内に入れられ乳化されて、本発明に従ったマイクロカプセルを含む油中水型エマルジョン形成することができる。マイクロビーズの濃度は、各マイクロカプセル内に単一のマイクロビーズが平均して現われるように調整可能である。
【００６８】
本書で使用される「標的」というのは、任意の化合物、分子および超分子複合体である。標準的な標的には、レセプター例えばＧタンパク質カップリング型レセプターおよびホルモンレセプターといったような薬物標的を含めた医学的意義のある標的；シグナリング経路に関与する転写因子、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼ；細胞壁コンポーネント、レプリカーゼおよびその他の酵素といったような微生物に特異的な遺伝子産物；食品業界で用いられている酵素、研究または生産目的で意図された試薬などといったような工業的に関連性ある標的が含まれる。
【００６９】
本書で言及されている「所望の活性」というのは、本書で検定される通り１つ以上の遺伝要素によって直接的または間接的に変調可能である、標的の任意の活性または標的により影響される分子の活性の変調である。標的の活性は、結合活性、酵素活性、第３の酵素またはその他の分子に対する活性化または阻害活性、疾病を起こすまたは代謝またはその他の機能に影響を及ぼす能力などを含めた、任意の測定可能な生物学的または化学的活性であり得る。本書で言及されている活性化および阻害というのは、所望の活性の１．５、２、３、４、５、１０、１００倍以上の増加または減少を意味する。変調が不活性化である場合、不活性化は実質的に完全な不活性化であり得る。所望の活性はさらに、純粋に、結合された標的の活性の変調が関与してもしなくてもよい１つの結合活性でもあり得る。
【００７０】
本書で「低分子量」または「小分子」として定義されている化合物は、薬学技術において「小分子」として一般に言及されている分子である。かかる化合物はポリペプチドおよびその他の大きい分子複合体より小さく、患者およびその他の対象に対し容易に投与されこれらにより同化され得る。小分子薬物は有利にも、経口投与または筋肉注射用に処方可能である。例えば、小分子は、最高２０００ダルトン、好ましくは最高１０００ダルトン、有利には２５０〜７５０ダルトンそしてより好ましくは５００ダルトン未満の分子量を有し得る。
【００７１】
「選択可能な変化」というのは、それをひき起こす遺伝要素を同定または単離するべく測定しかつ作用を及ぼすことのできるあらゆる変化のことである。選択は、マイクロカプセル、マイクロビーズまたは遺伝要素自体のレベルで、任意にはもう１つの試薬と複合体化された時点で行なわれる。特に有利な実施形態は、選択可能な変化が、所望の変化を示しているマイクロカプセルまたはマイクロビーズを分離するべくフロー選別デバイス内などで検出し作用を及ぼすことのできる光学特性の変化である、光学的検出である。
【００７２】
本書で使用されているように、「光学特性の変化」は、吸収度、発光、リン光または蛍光の変化を含めた電磁放射線の吸収または発出のあらゆる変化を意味する。このような特性は全て、「光学的」という用語に含まれる。マイクロカプセルまたはマイクロビーズは例えば発光、蛍光またはリン光活性化選別により同定され、任意には選別され得る。好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはマイクロビーズを同定しかつ任意には選別するためにフロー選別が利用される。分析のためそして選別を誘発するために、光散乱（ケルカー（Ｋｅｒｋｅｒ）、１９８３年）および蛍光分極（ローランド（Ｒｏｌｌａｎｄ）ら、１９８５年）を含めた、さまざまな光学特性を使用することができる。
【００７３】
マイクロカプセル内またはビーズ上の遺伝要素は、質量分析法、化学的タグ付けまたは光学的タグ付けを含めた、当業者が精通しているさまざまな技術を用いて同定可能である。
【００７４】
本書で用いられる「マイクロ流体制御」というのは、本発明の方法を実施するためにマイクロカプセル（または「液滴」）の形成および／または運動を誘導するかまたはその他の形で制御するための、本書で定義されているようなマイクロ流体チャンネルを含むマイクロ流体システムの使用を意味する。例えば、マイクロカプセル形成の「マイクロ流体チャンネル」は、第２の流体の中で流体の「液滴」を形成しかくしてマイクロカプセルを作り出すための、マイクロ流体デバイスを用いたマイクロカプセルの創出を意味する。マイクロ流体制御下で選別されるマイクロカプセルは、本書で記述されている通り、選別手順に付随する機能のうちの１つ以上のものを実施するべくマイクロ流体デバイスを使用して選別される。従って「流体種のマイクロ流体制御」というのは、本発明の方法を実施する目的での、定義されている通りのマイクロ流体システム内の流体の取扱いを意味する。
【００７５】
本書で使用される「細胞」という用語には、生物学において用いられる通りのその通常の意味が付与される。「細胞」はあらゆる細胞または細胞型であってよい。例えば、細胞は細菌またはその他の単細胞生物、植物細胞または動物細胞であり得る。細胞が単細胞生体である場合には、細胞は例えば原生動物、トリパノソーマ、アメーバ、酵母細胞、藻類などであり得る。細胞が動物細胞である場合、その細胞は例えば、無脊椎動物細胞（例えばショウジョウバエ由来の細胞）、魚類細胞（例えばゼブラダニオの細胞）、両生類細胞（例えばカエル細胞）、は虫類細胞、鳥類細胞または哺乳動物細胞例えば霊長類細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞またはラットまたはマウスといったゲッ歯類由来の細胞であり得る。細胞が多細胞生体由来のものである場合、細胞は生体のいずれの部分に由来するものであり得る。例えば、細胞が動物由来である場合、細胞は、心臓細胞、繊維芽細胞、角化細胞、肝細胞、軟骨細胞、神経系細胞、骨細胞、筋細胞、血液細胞、内皮細胞、免疫細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、肥満細胞、好酸球）、基幹細胞などであり得る。一部のケースでは、細胞は、遺伝子工学処理された細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスタ卵巣（「ＣＨＯ」）細胞または３Ｔ３細胞であり得る。
【００７６】
本書で使用されている「マイクロ流体の」という用語は、１ｍｍ未満の断面積および少なくとも３：１という長さ対最大断面寸法比を有する少なくとも１つの流体チャンネルを含むデバイス、器具またはシステムを意味する。本書で使用する「マイクロ流体チャンネル」というのは、これらの基準を満たすチャンネルである。
【００７７】
チャンネルの「断面寸法」は、流体流の方向に対し垂直に測定される。本発明のコンポーネント内の大部分の流体チャンネルは２ｍｍ未満、一部のケースでは、１ｍｍ未満の最大断面寸法を有する。１組の実施形態においては、本発明の実施形態を含む全ての流体チャンネルは、マイクロ流体チャンネルであるかまたは２ｍｍまたは１ｍｍ以下の最大断面寸法を有する。もう１つの実施形態においては、流体チャンネルは、一部分、単一のコンポーネント（例えばエッチングされた基板または成形ユニット）で形成されていてよい。当然のことながら、流体をバルクで貯蔵し、本発明のコンポーネントに流体を送達するためには、より大きなチャンネル、管、チャンバ、タンクなどを使用することができる。１組の実施形態においては、本発明の実施形態を含むチャンネルの最大断面寸法は５００マイクロン未満、２００マイクロン未満、１００マイクロン未満、５０マイクロン未満または２５マイクロン未満である。
【００７８】
本書で使用する「チャンネル」というのは、少なくとも部分的に流体の流れを方向づける製品（基質）の上または中のフィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）を意味する。チャンネルは任意の断面形状（円形、卵形、三角形、異形、正方形など）を有することができ、カバーがあってもなくてもよい。完全にカバーされている実施形態においては、チャンネルの少なくとも一部分が、完全に封じ込められた断面を有している可能性があり、そうでなければ、チャンネル全体がその入口および出口を除いてその長さ全体にわたり、完全に封じ込められていてよい。チャンネルは、少なくとも２：１、より標準的には少なくとも３：１、５：１または１０：１以上のアスペクト比（平均断面寸法に対する長さ）を有することもできる。開放チャンネルは一般に、流体輸送の制御を容易にする特徴、例えば構造的特徴（細長い欠刻）および／または物理的または化学的特徴（疎水性対親水性）または流体に力（例えば含有力）を及ぼすことのできるその他の特徴を内含することになる。チャンネル内の流体は部分的または完全にチャンネルを充てんし得る。開放チャンネルが使用される一部のケースでは、流体は、例えば表面張力（すなわち凹または凸メニスカス）を用いて、チャンネル内部に保持され得る。
【００７９】
チャンネルは例えば約５ｍｍまたは２ｍｍ未満、または約１ｍｍ未満、または約５００マイクロン未満、約２００マイクロン未満、約１００マイクロン未満、約６０マイクロン未満、約５０マイクロン未満、約４０マイクロン未満、約３０マイクロン未満、約２５マイクロン未満、約１０マイクロン未満、約３マイクロン未満、約１マイクロン未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満の流体流に対して垂直な最大寸法を有する任意のサイズのものであり得る。一部のケースでは、チャンネルの寸法は、流体が製品または基質を通して自由に流れることができるような形で選択され得る。チャンネルの寸法は同様に、その中の流体の一定の体積フローまたは線形フローを可能にするように選択することもできる。当然のことながら、チャンネルの数およびチャンネルの形状は、当業者にとって既知のあらゆる方法によって変動させることができる。一部のケースでは、２つ以上のチャンネルまたは毛細管を使用することができる。例えば、２本以上のチャンネルを使用することができ、この場合これらは互いに内側に位置づけされるか、互いに隣接して位置づけされるか、互いに交差するなどといったように位置づけされる。
【００８０】
本書で使用される「一体型（一体化した）」という語は、コンポーネントの複数の部分が、互いからコンポーネントを切断または破壊することなく互いから分離され得ないような形で接合されていることを意味する。
【００８１】
本書で使用する「液滴」という用語は、第２の流体により完全に取り囲まれている第１の流体の隔離された一部分である。ここで液滴は必ずしも球形でなく例えば外部環境などに応じてその他の形状をもとり得るという点に留意されたい。一実施形態においては、液滴は、それが内部にある流体流に対して垂直なチャンネルの最大寸法と実質的に等しい最小断面寸法を有する。
【００８２】
液滴集団の「平均直径」は液滴の直径の算術平均である。当業者であれば、例えばレーザー光散乱またはその他の既知の技術を用いて液滴集団の平均直径を判定することができるだろう。非球形液滴内の液滴の直径は、表面全体を横断して積分された液滴の数学的に定義された平均直径である。限定的意味のない例として、液滴の平均直径は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、または約５マイクロメートル未満であり得る。液滴の平均直径は同様に、一部のケースでは、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートル、または一部のケースにおいて少なくとも約２０マイクロメートルでもあり得る。
【００８３】
本書で使用する「流体」にはその通常の意味すなわち液体または気体という意味が付与される。好ましくは、流体は液体である。流体は、流動を可能にする任意の適切な粘度を有し得る。２つ以上の流体が存在する場合、各々の流体は、流体間の関係を考慮することにより当業者によって基本的にあらゆる流体（液体、気体など）の中から独立して選択され得る。流体は各々混和性または非混和性であり得る。例えば２つの流体は、流体流の形成の時間枠内または反応または相互作用の時間枠内で非混和性であるように選択可能である。これらの部分が有意な時限中液体にとどまる場合には、流体は有意に非混和性であるべきである。接触および／または形成の後、分散された部分が重合などによって急速に硬化される場合、流体はさほど非混和性である必要はない。当業者であれば、本発明の技術を実施するべく、接触角測定などを用いて、適切な混和性または不混和性流体を選択することができる。
【００８４】
本書で使用されるように、第２のエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）のみを通って第１のエンティティの周りに閉ループを描くことができる場合、第１のエンティティは第２のエンティティによって「取り囲まれて」いる。第２のエンティティのみを通って進む閉ループが方向の如何に関わらず第１のエンティティの周りに描くことができる場合、第１のエンティティは「完全に取り囲まれている」。一態様では、第１のエンティティは細胞であり得、媒質中に懸濁している細胞が媒質により取り囲まれている。もう１つの態様においては、第１のエンティティは粒子である。本発明のさらにもう１つの態様においては、エンティティは両方共流体であり得る。例えば、親水性液体が疎水性液体内で懸濁している可能性があり、疎水性液体が親水性液体中で懸濁している可能性もあり、又、気泡が液体中で懸濁しているなどの可能性もある。標準的には、疎水性液体および親水性液体は、互いに対し実質的に非混和性であり、ここで親水性液体は、疎水性液体よりも大きい水に対する親和性を有する。親水性液体の例としては、水および水を含むその他の水溶液、例えば細胞または生物学的媒質、エタノール、塩溶液などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。疎水性液体の例には、油、例えば炭化水素、シリコン油、フッ化炭素油、有機溶媒などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００８５】
本書で使用される「判定（決定）する」という用語は、例えば定量的または定性的な、１つの種の分析または測定、または種の存在および不在の検出を一般に意味する。「判定（決定）する」という用語は同様に、例えば定量的または定性的な、または相互作用の存在または不在を検出することによる、２つ以上の種の間の相互作用の分析または測定をも意味する。技術例としては、分光学、例えば赤外光、吸光、蛍光、可視紫外光、ＦＴＩＲ（「フーリエ変換赤外分光」）、またはラマン；重量分析法；偏光解析法；圧電測定法；免疫学的検定法；電気化学測定法；光学測定、例えば光学密度測定法；円二色法；光散乱測定法、例えば、準電気（ｑｕａｓｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）光散乱；偏光分析法；屈折計法；または濁度測定法が含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００８６】
別段の定義のないかぎり、本書で使用されている全ての技術的および科学的用語は、（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学などにおいて）当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子、遺伝子および生化学的方法（一般に、本明細書に参照により援用されているサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参照のこと）および化学的方法については、標準的方法が使用される。さらに、標準的な免疫学的技術のためには、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙが参照される。
【００８７】
（Ａ）  一般的な説明
本発明のマイクロカプセルは、本発明の機能を可能にするべく適切な物理的特性を必要とする。
【００８８】
まず第１に、遺伝要素および遺伝産物がマイクロカプセル間で拡散しないようにするためには、各々のマイクロカプセルの中味を周囲のマイクロカプセルの中味から隔離するのが好ましく、かくして、実験のタイムスケール全体にわたりマイクロカプセル間で遺伝要素および遺伝産物の交換が全くまたはほとんど無いようにしなければならない。しかしながら、望まれる場合試薬がマイクロカプセルの中および／または外へ拡散できるように、マイクロカプセルの透過性を調整することができる。
【００８９】
第２に、本発明の方法は、１マイクロカプセルにつき制限された数の遺伝要素のみが存在することを必要としている。こうして、個々の遺伝要素の遺伝子産物がその他の遺伝要素から確実に単離されることになる。かくして、遺伝要素と遺伝子産物の間のカップリングはきわめて特異的なものとなる。富化係数は、平均してマイクロカプセル一個につき１個以下の遺伝要素で最大であり、核酸とコードされた遺伝子産物の活性の間の連結は、個々の遺伝要素の遺伝子産物がその他全ての遺伝要素の生成物から単離されることになるため、可能なかぎり密である。しかしながら、平均して１マイクロカプセルあたり１個以下の単一遺伝要素の理論的に最適な状況が用いられていない場合でさえ、１マイクロカプセルあたり５、１０、５０、１００または１０００以上の遺伝要素という比率は、大きいライブラリを選別する上で有益であることが判明するかもしれない。異なる遺伝要素分布を伴う刷新されたカプセル化を含めた後続する選別ラウンドは、遺伝要素のよりストリンジェントな選別を可能にすることだろう。好ましくは、１マイクロカプセルあたり１個以下の単一遺伝要素が存在する。
【００９０】
第３に、有利にも、マイクロカプセルの形成および組成が遺伝要素の発現機構の機能および遺伝子産物の活性を無にすることはない。
【００９１】
従って、使用されるあらゆるマイクロカプセル化システムが好ましくはこれら３つの必要条件を満たしている。適切なシステムは、当業者には明らかであるように、本発明の各々の利用分野における必要条件の精確な性質に応じて、変動し得る。
【００９２】
多種多様のマイクロカプセル手順が利用可能であり（ベニタ（Ｂｅｎｉｔａ）、１９９６年参照）、本発明に従って使用されるマイクロカプセルを作り出すのに使用できる。実際に、文献中で２００超のマイクロカプセル化方法が同定されている（フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）、１９９３年）。
【００９３】
さまざまなその他の方法により生成されるマイクロカプセル内で、酵素を触媒とした生化学的方法も実証されてきた。数多くの酵素が逆ミセル溶液中（ブラウ（Ｂｒｕ）およびヴァルデ（Ｗａｌｄｅ）、１９９１年；ブラウおよびヴァルデ、１９９３年；クレイ（Ｃｒｅａｇｈ）ら、１９９３年；ハーバー（Ｈａｂｅｒ）ら、１９９３年；クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９８９年；ルイジ（Ｌｕｉｓｉ）およびビー（Ｂ）、１９８７年；マオ（Ｍａｏ）およびヴァルデ、１９９１年；マオら、１９９２年；ペレス（Ｐｅｒｅｚ）ら、１９９２年；ヴァルデら、１９９４年；ヴァルデら、１９９３年；ヴァルデら、１９８８年））、例えばＡＯＴ−イソオクタン−水システム（メンゲル（Ｍｅｎｇｅｒ）および山田、１９７９年）中で活性である。
【００９４】
マイクロカプセルは同様に、界面重合および界面複合体化によっても生成可能である（ウェイトリィ（Ｗｈａｔｅｌｅｙ）、１９９６年）。この種のマイクロカプセルは、剛性で非透過性の膜または半透過性の膜を有することができる。硝酸セルロース膜、ポリアミド膜および脂質−ポリアミド膜により縁どりされた半透過性マイクロカプセル全てが、多酵素システムを含め、生化学反応を支援できる（チャン（Ｃｈａｎｇ）、１９８７年；チャン，１９９２年；リン（Ｌｉｍ）、１９８４年）。非常に穏やかな条件下で形成され得るアルギン酸塩／ポリリジンマイクロカプセル（リンおよびスン（Ｓｕｎ）、１９８０年）が非常に生体適合性の高いものであり、例えば生きた細胞および組織をカプセル化する有効な方法を提供することも証明されてきている（チャン、１９９２年；スンら、１９９２年）。
【００９５】
エマルジョンといったようなコロイドシステムの中の水性環境の相分配に基づく非膜マイクロカプセル化システムも同様に使用できる。
【００９６】
好ましくは、本発明のマイクロカプセルはエマルジョン、すなわち一方の相が微小またはコロイドサイズの液滴としてもう一方の相内に分散された状態の２つの非混和性液相の不均一システムから形成される（ベッヒャー（Ｂｅｃｈｅｒ）、１９５７年；シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）、１９６８年；リサン（Ｌｉｓｓａｎｔ）、１９７４年；リサン、１９８４年）。
【００９７】
エマルジョンは、非混和性液体の任意の適切な組合せから生成可能である。好ましくは、本発明のエマルジョンは、細分された液滴（分散、内部または不連続相）の形で存在する相としての（生化学コンポーネントを含有する水性液）「水」、およびこれらの液滴が懸濁しているマトリクス（非分散、連続または外部相）としての疎水性非混和性液（「油」）を有する。かかるエマルジョンは「油中水型」（Ｗ／Ｏ）と呼ばれる。これには、生化学コンポーネントを含有する水相全体が離散的な液滴（内部相）の中で区画化されているという利点がある。疎水性液である外部相は一般に生化学コンポーネントのいずれも含有せず、従って不活性である。
【００９８】
エマルジョンは、１つ以上の表面活性作用物質（界面活性剤）の添加により安定化され得る。これらの界面活性剤は、乳化剤と呼ばれ、相の分離を防止する（または少なくとも遅延させる）べく水／油界面で作用する。数多くの油および数多くの乳化剤を油中水エマルジョンの生成のために使用できる。最近の資料には１６，０００を超える界面活性剤が列挙されており、その多くが乳化剤として用いられている（アッシュ（Ａｓｈ）およびアッシュ（Ａｓｈ）、１９９３年）。適切な油には、軽量白色鉱油およびデカンが含まれる。適切な界面活性剤には、非イオン性表面活性剤（シック（Ｓｃｈｉｃｋ）、１９６６年）、例えばモノオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（商標）８０；ＩＣＩ）、モノステアリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（商標）６０；ＩＣＩ）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０；ＩＣＩ）、およびオクチルフェノキシエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）；イオン性表面活性剤、例えばコール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリム；化学的に不活性なシリコーンベースの表面活性剤、例えばポリシロキサン−ポリセチル−ポリエチレングリコール共重合体（セチルジメチコンコポリオール）（例えばＡｂｉｌ（商標）ＥＭ９０；ゴールドシュミット（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ））；およびコレステロールが含まれる。
【００９９】
フッ化炭素（またはペルフルオロカーボン）連続相を伴うエマルジョン（（クラフト（Ｋｒａｆｆｔ）ら、２００３年；リース（Ｒｉｅｓｓ）、２００２年）が特に有利である。例えば、界面活性剤としてＦ−アルキルジモルホリノホスファートを用いて、安定した臭化ペルフルオロオクチル中水型およびペルフルオロオクチルエタン中水型エマルジョンを形成させることができる（サトラー（Ｓａｄｔｌｅｒ）ら、１９９６年）。非フッ素化化合物は基本的に、フッ化炭素およびペルフルオロカーボン中で不溶性であり（カラン（Ｃｕｒｒａｎ）、１９９８年；ヒルデブランド（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ）およびコクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）、１９４９年；ハッドリキー（Ｈｕｄｌｉｃｋｙ）、１９９２年；スコット（Ｓｃｏｔｔ）、１９４８年；スチューダー（Ｓｔｕｄｅｒ）ら、１９９７年）、小さい薬物様の分子（標準的に、＜５００ＤａおよびＬｏｇＰ＜５）（リピンスキー（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ）ら、２００１年）が、マイクロカプセル間の交換がほとんどまたは全く無い状態で、フッ化炭素中水およびペルフルオロカーボン中水エマルジョンの水性マイクロカプセルにきわめて有効に区画化される。
【０１００】
エマルジョンを作り出すには、相を合わせて強制するために機械的エネルギーを加えることが一般に必要とされる。攪拌器（例えば磁気撹拌棒、プロペラおよびタービン撹拌器、パドルデバイスおよびホイスク）、ホモジナイザ（ロータ・スタータ・ホモジナイザ、高圧バルブ式ホモジナイザおよびジェットホモジナイザを含む）、コロイドミル、超音波および「膜乳化（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」デバイス（ベッヒャー、１９５７；ディキンソン（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１９９４年）、およびマイクロ流体デバイス（アンバンハウアーら、２０００年）を含めて、これを行なうさまざまな機械的デバイスを利用したさまざまな方法が存在する。
【０１０１】
複雑な生化学プロセス、特に遺伝子の転写および翻訳も同様に、油中水型エマルジョン中に形成された水性マイクロカプセルの中で活発である。これにより、エマルジョンマイクロカプセル内で転写され翻訳され、それらがコード化するタンパク質の結合または触媒活性により選択される遺伝子の選択のために、油中水型エマルジョンの区画化を用いることが可能となった（土井および柳川、１９９９年；グリフィスおよびタウフィーク、２００３年；リー（Ｌｅｅ）ら、２００２年；セップ（Ｓｅｐｐ）ら、２００２年；タウフィークおよびグリフィス、１９９８年）。これが可能となったのは、マイクロカプセル間の酵素触媒反応の生成物または核酸、タンパク質の交換がたとえあったとしてもごくわずかである状態で、エマルジョン内で形成された水性マイクロカプセルが一般に安定していたからである。
【０１０２】
何千リットルもの工業規模に至るまでの体積でエマルジョンを作り出す技術が存在する（ベッヒャー、１９５７年；シャーマン、１９６８年；リサン、１９７４年；リサン、１９８４年）。
【０１０３】
好ましいマイクロカプセルサイズは、本発明に従って実施されるべき任意の個々の選択プロセスの精確な必要条件に応じて変動することになる。全てのケースにおいて、遺伝子産物の効率の良い発現および反応度を達成するために、遺伝子ライブラリのサイズ、必要とされる富化および個々のマイクロカプセル内の構成要素の所要濃度の間の最適な平衡が存在することになる。
【０１０４】
発現プロセスは、本発明により提供される各々の個々のマイクロカプセルの内部で発生する。インビトロ転写および結合型転写−翻訳の両方共が、サブナノモルＤＮＡ濃度で効率が低下する。従って、各マイクロカプセル中には制限された数のＤＮＡ分子のみが存在することという必要条件のため、これは、考えられるマイクロカプセルサイズに対し実践上の上限を設定する。好ましくは、マイクロカプセルの平均体積は５．２×１０−１６ｍ３（１０μｍ未満の直径の球形マイクロカプセルに対応する）、より好ましくは６．５×１０−１７ｍ３（直径５μｍ）、より好ましくは約４．２×１０−１８ｍ３（直径２μｍ）そして理想的には約９×１０−１８ｍ３（直径２．６μｍ）である。
【０１０５】
マイクロカプセル中の有効なＤＮＡまたはＲＮＡ濃度は、当業者にとっては周知となるさまざまな方法によって人工的に増大される可能性がある。これらの方法としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といったような化学物質を除外した体積の付加および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といった細菌（ロバーツ、１９６９年；ブラットナー（Ｂｌａｔｔｎｅｒ）およびダルバーグ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、１９７２年；ロバーツら、１９７５年；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、１９７５年）、真核生物例えば（ヴェイル（Ｗｅｉｌ）ら、１９７９年；マンレイ（Ｍａｎｌｅｙ）ら、１９８３年）およびＴ７、Ｔ３およびＳＰ６といったバクテリオファージ（メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）ら、１９８４年）に由来するものを含めたＲＮＡポリメラーゼを用いる転写；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８８年）；Ｑｂレプリカーゼ増幅（ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）ら、１９８３年；カヒル（Ｃａｈｉｌｌ）ら、１９９１年；チェトヴェリン（Ｃｈｅｔｖｅｒｉｎ）およびスピリン（Ｓｐｉｒｉｎ）、１９９５年；カタナエフ（Ｋａｔａｎａｅｖ）ら、１９９５年）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、１９８８年；バラニー（Ｂａｒａｎｙ）、１９９１年）；および自立式配列複製システム（フェイ（Ｆａｈｙ）ら、１９９１年）およびストランド置換増幅（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２年）を含めたさまざまな遺伝子増幅技術が含まれる。エマルジョンおよびインビトロ転写または結合型転写−翻訳システムが熱安定性である（例えば、結合型転写−翻訳システムはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）といった熱安定性システムから作ることができる）場合には、ＰＣＲおよびＬＣＲといったような熱サイクリングを必要とする遺伝子増幅技術を用いることができる。
【０１０６】
有効局所的核酸濃度を増大させることにより、より大きなマイクロカプセルを有効に使用することが可能になる。こうして約５．２×１０−１６ｍ３（直径１０μｍの球に対応する）というマイクロカプセル体積に対する好ましい実際的上限が可能となる。
【０１０７】
マイクロカプセルサイズのサイズは好ましくは、マイクロカプセル内で起こる必要のある生化学反応の所要構成要素の全てを収容するのに充分大きいものである。例えば、インビトロで、転写反応および結合型転写−翻訳反応は両方共、約２ｍＭの合計ヌクレオシドトリホスファート濃度を必要とする。
【０１０８】
例えば、長さ５００塩基の単一の短かいＲＮＡ分子に遺伝子を転写するためには、１マイクロカプセルにつき最低５００のヌクレオシドトリホスファート分子（８．３３×１０−２２モル）が必要となる。２ｍＭの溶液を構成するためには、これだけの数の分子が４．１７×１０−１９リットル（４．１７×１０−２２ｍ３）の体積のマイクロカプセル内部に含まれ、このマイクロカプセルは球形である場合９３ｎｍの直径を有することになる。
【０１０９】
さらに、特に翻訳が関与する反応の場合には、翻訳が起こるために必要なリボソームがそれ自体直径約２０ｎｍであることに留意すべきである。従って、マイクロカプセルの好ましい下限は、約０．１μｍ（１００ｎｍ）の直径である。
【０１１０】
従って、マイクロカプセル体積は、好ましくは０．１μｍと１０μｍの間の直径の球形に対応するおよそ５．２×１０−２２ｍ３と５．２×１０−１６ｍ３の間、より好ましくは約５．２×１０−９ｍ３と６．５×１０−１７ｍ３（１μｍと５μｍ）の間である。約２．６μｍの球直径が最も有利である。
【０１１１】
区画の好ましい寸法（平均直径２．６μｍの液滴）が細菌のものに極く似通っているというのは、全く偶然の一致ではなく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属は１．１〜１．５×２．０〜６．０μｍの桿体でありアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）は直径１．５〜２．０μｍの卵形細胞である。ダーウィン的進化はその最も単純な形態において、「１遺伝子型１表現型」の機序に基づいている。単一の区画化された遺伝子またはゲノムの濃度は、直径２μｍの区画中の０．４ｎＭから、直径５μｍの区画中の２５ｐＭまで降下する。原核生物転写／翻訳機構は、単一遺伝子がおよそナノモルの濃度にある場合、直径が最高１〜２μｍである区画内で作動するように進化してきた。直径２．６μｍの区画内の単一遺伝子は、０．２ｎＭの濃度にある。この遺伝子濃度は、効率の良い翻訳にとって充分高いものである。かかる体積での区画化は同様に、遺伝子産物の単一分子のみが形成される場合でもそれが確実に約０．２ｎＭで存在するようにし、このことは、遺伝子産物が遺伝要素自体の修飾活性を有していなくてはならない場合に重要である。かくして、マイクロカプセルの体積は、遺伝要素の転写および翻訳に対する必要条件のみならず本発明の方法において遺伝子産物に要求される修飾活性をも念頭に置いて選択される。
【０１１２】
エマルジョンマイクロカプセルのサイズは、単に選択システムの必要条件に従って、エマルジョンを形成するのに用いられるエマルジョン条件を調整するだけで変動させることができる。究極的制限因子はマイクロカプセルのサイズひいては単位体積あたりに考えられるマイクロカプセル数であることから、マイクロカプセルのサイズが大きくなればなるほど、既定の遺伝要素のライブラリをカプセル化するのに必要となる体積は大きくなる。
【０１１３】
マイクロカプセルのサイズは、転写／翻訳システムの必要条件のみならず遺伝要素のために利用される選択システムの必要条件をも考慮して選択される。かくして、化学的修飾システムといったような選択システムの構成要素は、転写／翻訳にとって最適でない反応体積および／または試薬濃度を要求する可能性がある。本書に記述されているように、かかる必要条件は、二次的再カプセル化工程により対処され得る。さらに、転写／翻訳および選択全体を最大にするべくマイクロカプセルサイズを選択することにより、これらに対処することもできる。例えば本書で記されているような最適なマイクロカプセル体積および試薬濃度の経験的決定が好ましい。
【０１１４】
本発明に従った「遺伝要素」は、上述のとおりのものである。好ましくは、遺伝要素は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、専ら合成の塩基または天然発生塩基と合成塩基の混合物からなる部分的または全体的に人工的な核酸、上述のもののいいずれかをポリペプチドに連結させたもの、および上述のもののいずれかを任意のその他の分子群または構成体に連結させたものからなる群から選択された分子または構成体である。有利には、核酸、重合体物質、特にビーズ、例えばポリスチレンビーズおよび、磁性または常磁性ビーズといったような磁性または常磁性物質からなる群から、その他の分子群または構成体を選択することができる。
【０１１５】
前記遺伝要素の核酸部分は、例えばプロモータ、エンハンサ、翻訳開始配列、ポリアデニル化配列、スプライス部位などの遺伝子産物の効率の良い発現に必要とされるものといったような適切な調節配列を含み得る。
【０１１６】
以下で明らかになるように、数多くのケースにおいて、ポリペプチドまたはその他の分子群または構成体は、遺伝要素の光学特性を改変させるべく遺伝子産物に直接的または間接的に結合するかまたはそれと反応するリガンドまたは基質である。こうして、遺伝子産物の活性に基づいた遺伝要素の選別が可能になる。このリガンドまたは基質は、当業者にとって明らかとなるさまざまな手段により核酸に結合され得る（例えばハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、１９９６年を参照のこと）。
【０１１７】
核酸分子をリガンドまたは基質に連結させることのできる１つの方法は、ビオチニル化によるものである。これは、ビオチンおよび核酸が共有結合されるように５’−ビオチニル化プライマとのＰＣＲ増幅によって行なうことができる。
【０１１８】
リガンドまたは基質は、当業者にとって明らかとなるさまざまな手段により修飾済み核酸に付着可能である（例えばハーマンソン、１９９６年を参照のこと）。アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされ従って核酸を極めて高い親和力で結合させることになるポリスチレンまたは常磁性マイクロビーズ（直径０．０２〜約５．０μｍ）に対し、ビオチニル化核酸をカップリングすることができる。このビーズを、ビオチニル化基質の付加または共有結合カップリングなどの任意の適切な方法により、基質またはリガンドと誘導体化させることができる。
【０１１９】
代替的には、サイログロブリン（６６９Ｋｄ）またはフェリチン（４４０Ｋｄ）といったような大きなタンパク質分子に複合体化されたアビジンまたはストレプトアビジンに対して、ビオチニル化核酸をカップリングすることができる。この複合体は、リジンのＥ−アミノ基に対する共有結合カップリングによって、またはビオチン−アビジンといったような非共有結合的相互作用を通して、基質またはリガンドと誘導体化され得る。
【０１２０】
基質は、（例えば「ケージされた（ｃａｇｅｄ）」ビオチン類似体の（サンドバーグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）ら、１９９５年；ピルング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）およびファン（Ｈｕａｎｇ）、１９９６年）光活性化といったようなそれを活性化するためのさらなる工程を必要とする不活性「タグ」を含有するが遺伝要素には連結されていない形態で存在し得る。このとき選択されるべき触媒は、基質を生成物に転換する。このとき「タグ」は活性化され、「タグ付けされた」基質および／または生成物は、核酸と複合体化されたタグ結合分子（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）により結合される。基質対「タグ」を介して核酸に付着された生成物の比率は、従って、基質と溶解状態の生成物の比率を反映することになる。
【０１２１】
１つの代替案は、生成物特異的抗体（またはその他の生成物特異的分子）に対して核酸をカップリングすることである。この筋書においては、基質（または複数の基質のうちの１つ）は、遺伝要素に連結されていない各々のマイクロカプセル内に存在するが、分子「タグ」（例えばビオチン、ＤＩＧまたはＤＮＰまたは蛍光性基）を有する。選択されるべき触媒が基質を生成物に変換する場合、生成物は「タグ」を保持し、次に生成物特異的抗体によってマイクロカプセル内に捕捉される。この要領で、遺伝要素は、基質を生成物に転換する能力をもつ酵素をコードするかまたは生成する場合にのみ「タグ」と会合した状態となる。
【０１２２】
「単離」、「選別」および「選択」という用語、ならびにその変形形態が本書で用いられている。単離というのは、本発明に従うと、単離プロセスの前に会合された少なくとも１つの物質を含まなくなるような形で、例えば混合物などの不均質集団から１エンティティを分離するプロセスを意味する。好ましい実施形態においては、単離は、１エンティティを基本的に均質性に至るまで精製することを意味する。１エンティティの選別というのは、所望されないエンティティよりも優先的に所望エンティティを単離するプロセスを意味する。それが所望のエンティティの単離に関するかぎり、「単離」と「選別」は等価である。本発明の方法は、所望の遺伝要素を含有する遺伝要素プール（ライブラリまたはレパートリ）からの所望の遺伝要素の選別を可能にする。選択は、１エンティティをその特定の特性に応じて単離する（選別プロセスを含めた）プロセスを意味する。
【０１２３】
きわめて好ましい利用分野では、本発明の方法は、遺伝要素ライブラリを選別するために有用である。従って、本発明は、遺伝要素が、遺伝子産物レパートリをコードする遺伝要素ライブラリから単離される、本発明の先行する態様に従った方法を提供している。ここでは、「ライブラリ」、「レパートリ」および「プール」という用語は、当該技術分野におけるその元来の意味に従って用いられており、従って、遺伝要素ライブラリが遺伝子産物レパートリをコードするようになっている。一般に、ライブラリは遺伝要素のプールから構築され、選別を容易にする特性を有する。
【０１２４】
本発明を用いた遺伝要素ライブラリからの１つの遺伝要素の初期選択は、大部分の場合多数の変異体遺伝要素のスクリーニングを必要とする。遺伝要素ライブラリは、以下のものを含むさまざまな異なる方法で作り上げることができる。
【０１２５】
天然に発生遺伝要素のプールをゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからクローニングすることができる（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）。例えば、免疫化されたまたはされていないドナー由来の抗体遺伝子のＰＣＲ増幅レパートリによって作られたファージ抗体ライブラリは、機能的抗体フラグメントの非常に有効な供給源であることが判明している（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、１９９４年；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）、１９９７年）。遺伝子の全て（例えばスミス、１９８５年；パームレイ（Ｐａｒｍｌｅｙ）およびスミス、１９８８年参照）または遺伝子の一部分（例えばロウマン（Ｌｏｗｍａｎ）ら、１９９１年参照）または遺伝子プール（例えばニシム（Ｎｉｓｓｉｍ）ら、１９９４年参照）をランダム化されたまたはドープされた合成オリゴヌクレオチドによってコードすることにより、遺伝子ライブラリを作ることもできる。同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異Ｄ５といったような細菌の突然変異誘発株を用いること（リャオ（Ｌｉａｏ）ら、１９８６年；山岸ら、１９９０年；ロウ（Ｌｏｗ）ら、１９９６年）；Ｂ−リンパ球の抗体超突然変異システムを使用すること（イエラモス（Ｙｅｌａｍｏｓ）ら、１９９５年）を含めたさまざまなインビボ技術により「ランダムに」遺伝要素または遺伝要素プール内に突然変異を導入することによりライブラリを作ることもできる。ランダム突然変異は同様に、化学的突然変異原およびイオン化またはＵＶ照射（フリードバーグ（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ）ら、１９９５年参照）または突然変異誘発塩基類似体の取込み（フリース（Ｆｒｅｅｓｅ）、１９５９年；ザッコロ（Ｚａｃｃｏｌｏ）ら、１９９６年）によって、インビボおよびインビトロの両方で導入することもできる。例えば変異性ポリメラーゼを用いて重合の間にインビトロで遺伝子内にランダム突然変異を導入することもできる（レオン（Ｌｅｕｎｇ）ら、１９８９年）。
【０１２６】
インビボ（コワルチコフスキー（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９４年を参照）またはインビトロ（ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、１９９４年ａ；ステマー、１９９４年ｂ）のいずれかで相同組換えを使用してさらなる多様化を導入することが可能である。
【０１２７】
従って、本発明のさらなる態様に従うと、
（ａ）  本発明に従った遺伝要素ライブラリから１つ以上の遺伝要素を選択する工程；
（ｂ）  遺伝子産物に対するライブラリをコードする遺伝要素のさらなるライブラリを生成するべく、選択された遺伝要素を突然変異させる工程；および
（ｃ）  工程（ａ）および（ｂ）を反復的に繰り返して、増強した活性をもつ遺伝子産物を得る工程、を含む、インビトロ進化方法が提供される。
【０１２８】
突然変異は、以上で記述されている通りに遺伝要素内に導入され得る。
【０１２９】
本発明に従った遺伝要素は有利には、好ましくは薬理学的または工業的利点のある酵素、特に細胞シグナル変換機序といったような生体系の活性化因子または阻害物質、抗体およびそのフラグメントおよび診断および治療向け利用分野に適したその他の結合剤（例えば転写因子）をコードする。従って好ましい態様においては、本発明は、臨床的または工業的に有用な生成物の同定および単離を可能にする。本発明のさらなる態様においては、本発明の方法によって単離された場合の生成物が提供されている。
【０１３０】
適切なカプセル化条件の選択が望ましい。スクリーニングされるべきライブラリの複雑性およびサイズに応じて、１マイクロカプセルにつき１個以下の遺伝要素がカプセル化されるようなカプセル化手順を設定することが有益であり得る。こうして最大の分解能が得られることになる。しかしながら、ライブラリがより大きいおよび／またはより複雑である場合、これは実行不可能であるかもしれない。複数の遺伝要素を合わせてカプセル化し、所望の活性の選別を達成するのに本発明の方法の反復的応用に依存することが好ましいかもしれない。所望の富化を得るためには、カプセル化手順の組合せを使用することができる。
【０１３１】
理論的研究は、作り出された遺伝要素の変異体の数が多ければ多いほど望まれる特性をもつ分子が作り出される確率が高くなる、ということを示している（これがいかに抗体レパートリにあてはまるかの記述については、ペレルソン（Ｐｅｒｅｌｓｏｎ）およびオスター（Ｏｓｔｅｒ）、１９７９年を参照のこと）。最近になって、より大きいファージ−抗体レパートリが実際、より小さいレパートリに比べ優れた結合親和性をもつ抗体をより多く生み出すということも実践的に確認された（グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）ら、１９９４年）。稀な変異体が確実に生成されかくして選択される能力をもつようにするためには、大きいライブラリサイズが望ましい。かくして、最適な形で小さいマイクロカプセルの使用が有益である。
【０１３２】
インビボ工程を必要とする方法を用いて今日までに作り出された最大のレパートリは、１．６×１０１１クローンファージ−ペプチドライブラリであり、これは１５リットルの細菌の発酵を必要とした（フィッシュ（Ｆｉｓｃｈ）ら、１９９６年）。ＳＥＬＥＸ実験は、往々にして非常に数多くの変異体（最大１０５）上で実施される。
【０１３３】
本発明を用いると、２．６μｍの好ましいマイクロカプセル直径で、２０ｍｌのエマルジョン中１ｍｌの水相を用いて少なくとも１０１１のレパートリサイズを選択することができる。
【０１３４】
上述の遺伝要素に加えて、本発明に従ったマイクロカプセルはさらに、選別プロセスが起こるのに必要とされるさらなる構成要素を含むことになる。システムのその他の構成要素は、例えば、遺伝要素の転写および／または翻訳に必要なものを含むことになる。これらは、適当な緩衝液、必要な成分、酵素および補因子、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、核酸（天然または合成）、トランスファＲＮＡ、リボソームおよびアミノ酸を全て含有するインビトロ翻訳システムおよび／またはインビトロ転写／複製システム、および修飾された遺伝子産物の選択を可能にするための問題の反応の基質、の中から特異的システムの必要条件について選択される。
【０１３５】
適当な緩衝液は、その中で生体系の所望の構成要素の全てが活性であり従って各々の特異的反応システムの必要条件に左右されることになる緩衝液である。生物学的および／または化学的反応に適した緩衝液は、当該技術分野において既知であり、サンブルックら、１９８９年といったさまざまな実験所用テキストの中に製法が提供されている。
【０１３６】
インビトロ翻訳システムは通常、標準的に細菌（ズベイ（Ｚｕｂａｙ）、１９７３年；ズベイ、１９８０年；レスリー（Ｌｅｓｌｅｙ）ら、１９９１年；レスリー、１９９５年）、ウサギ網状赤血球（ペラム（Ｐｅｌｈａｍ）およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、１９７６年）または小麦胚芽（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、１９８３年）由来の細胞抽出物を含むことになる。結合型転写／翻訳を可能にする一部を含めた数多くの適切なシステムが市販されている（例えばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）（プロメガ社製の全ての細菌システムおよび網状赤血球および小麦胚芽ＴＮＴＴＭ抽出物システム）。使用されるアミノ酸混合物は、ライブラリ内で生産可能なタンパク質の数および種類を増大させるべく、望ましい場合には合成アミノ酸を内含し得る。これは、ｔＲＮＡに人工的アミノ酸を投入することそして選択されるべきタンパク質のインビトロ翻訳のためにこれらのｔＲＮＡを使用することによって達成可能である（エルマン(Ｅｌｌｍａｎ)ら、１９９１年；ベンナー（Ｂｅｎｎｅｒ）、１９９４年；メンデル（Ｍｅｎｄｅｌ）ら、１９９５年）。
【０１３７】
各選択ラウンドの後、問題の分子をコードするものについて遺伝要素のプールの富化を、非区画化インビトロ転写／複製または結合型転写−翻訳反応によって検定することができる。選択されたプールは、適切なプラスミドベクター内にクローニングされ、さらなる精製および検定のため個々のクローンからＲＮＡまたは組換えタンパク質が生成される。
【０１３８】
好ましい態様においては、マイクロカプセルの内部環境は、エマルジョンの油相に対し試薬を添加することで改変され得る。試薬は、油相を通って水性マイクロカプセル環境内へ拡散する。好ましくは、試薬は少なくとも部分的に水溶性であり、そのためその一部分は油相から水性マイクロカプセル環境へと分配されるようになっている。有利には、試薬は、油相内で実質的に不溶性である。試薬は、例えばボルテックス処理といった機械的混合により油相内に混合される。
【０１３９】
油相を介して添加され得る試薬には、基質、緩衝構成要素、因子などが含まれる。特に、油相に対し酸性または塩基性構成要素を添加することにより、インサイチュでマイクロカプセルの内部ｐＨを改変することができる。
【０１４０】
その上、本発明は、遺伝子産物をコードする遺伝要素が本発明の方法によりひとたび選別された時点で、遺伝子産物を生成するための方法に関する。明らかに、遺伝要素自体は、遺伝子産物を生成するべく従来の手段により直接発現され得る。しかしながら、当業者にとって明らかとなるように、代替的技術を利用することもできる。例えば、遺伝子産物の中に取込まれた遺伝情報を適切な発現ベクター内に取込んでそこから発現させることができる。
【０１４１】
本発明は同様に、本発明の第１に態様により同定された遺伝子産物と相互作用する能力をもつ化合物を同定するための従来のスクリーニング技術の使用についても記述している。好ましい実施形態においては、遺伝子産物をコードする核酸がベクター内に取込まれ、遺伝子産物を発現する形質転換された細胞系統を生成するべく適切な宿主細胞内に導入される。このとき、遺伝子産物の機能に影響を及ぼす潜在的薬物の効果の再現可能な定性的および／または定量的分析のために、結果として得られた細胞系統を生成させることができる。かくして、遺伝子産物発現細胞を、遺伝子産物の機能を変調させる化合物特に低分子量化合物の同定のために利用することができる。かくして遺伝子産物を発現する宿主細胞は薬物スクリーニングのために有用であり、遺伝子産物の活性を変調させる化合物を同定するための方法であって、遺伝子産物をコードする非相同ＤＮＡを含有する細胞（ここでこの細胞は機能的遺伝子産物を生成する）を、前記遺伝子産物の活性を変調する能力の決定が求められている少なくとも１つの化合物または化合物混合物またはシグナルに対して曝露する工程、そしてその後前記変調によってひき起こされる変化について前記細胞を監視する工程を含む方法、を提供することが本発明のさらなる目的である。かかる検定は、遺伝子産物のアゴニスト、アンタゴニストおよびアロステリックモジュレータといったモジュレータの同定を可能にする。本書で使用されている、遺伝子産物の活性を変調させる化合物またはシグナルは、（前記化合物またはシグナルの不在下に比べて）化合物またはシグナルの存在下で遺伝子産物の活性が異なるような形で遺伝子産物の活性を改変させる化合物を意味する。
【０１４２】
細胞ベースのスクリーニング検定は、レポータタンパク質すなわち□−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼといったような容易に検定可能なタンパク質の発現が遺伝子産物により左右される細胞系統を構築することによって設計可能である。かかる検定は、遺伝子産物の機能を直接的に変調させる化合物例えば遺伝子産物に拮抗する化合物、または遺伝子産物の活性に必要とされるその他の細胞機能を阻害または増強する化合物の検出を可能にする。
【０１４３】
本発明は同様に、細胞内で発生する遺伝子産物依存性プロセスに外部から影響を及ぼすための方法をも提供する。例えば哺乳細胞といった宿主細胞を生成する組換え型遺伝子産物をテスト化合物と接触させることができ、その後、テスト化合物の存在下および不在下で遺伝子産物媒介型応答を比較することまたはテスト細胞または制御細胞（すなわち遺伝子産物を発現しない細胞）の遺伝子産物媒介型応答を化合物の存在に関連づけすることにより、その変調効果を評価することができる。
【０１４４】
さらなる態様においては、本発明は、ポリペプチドにより促進される少なくとも１つの工程が関与する生成プロセスを最適化するための方法に関する。例えば、工程は、酵素により促進される触媒工程であり得る。かくして、本発明は以下の工程を含む１つ以上の化合物を調製するための方法を提供する：
（ａ）少なくとも１つの工程がポリペプチドにより促進される合成プロトコルを提供する工程；
（ｂ）その発現が結果として遺伝要素の光学特性の修飾を直接的または間接的にもたらす可能性のあるこの工程を促進する前記ポリペプチドの変異体をコードする遺伝要素を調製する工程；
（ｃ）前記遺伝要素をマイクロカプセルに区画化する工程；
（ｄ）前記遺伝要素を発現させて前記マイクロカプセル内部でそのそれぞれの遺伝子産物を生成する工程；
（ｅ）遺伝要素の変化した光学特性を用いて所望の活性をもつポリペプチド遺伝子産物を生成する前記遺伝要素を選別する工程；および
（ｆ）前記合成の前記関連工程を促進するべく（ｇ）において同定されたポリペプチド遺伝子産物を用いて前記化合物を調製する工程。
【０１４５】
本発明を用いると、化合物の調製に関与する酵素は、最適な活性についての選択により最適化可能である。この手順には、本書で言及されている通りのポリペプチドライブラリと一致するスクリーニングすべきポリペプチドの変異体の調製が関与する。変異体は、本書の他の箇所で論述されているライブラリと同じ要領で調製可能である。
【０１４６】
エマルジョンマイクロカプセルのサイズは、単にスクリーニングシステムの必要条件に従って、エマルジョンを形成するのに用いられるエマルジョン条件を調整するだけで変動させることができる。究極的制限因子はマイクロカプセルのサイズひいては単位体積あたりに考えられるマイクロカプセル数であることから、マイクロカプセルのサイズが大きくなればなるほど、既定のライブラリをカプセル化するのに必要となる体積は大きくなる。
【０１４７】
油中水型エマルジョンは、外部（連続）水相で水中油中水２重エマルジョンを作り出すべく再乳化され得る。これらの２重エマルジョンをフローサイトメトリーを用いて分析し、任意には選別することができる（ベルナス（Ｂｅｒｎａｔｈ）ら、２００４年）。
【０１４８】
マイクロ流体技術を用いて、高い単分散性のマイクロカプセルを生産することができる。例えば、油の同時フロー蒸気内の液滴中断により、１．５％未満の多分散性をもつ油中水型エマルジョンを生成することができる（アンバンハウアーら、２０００年）。マイクロ流体システムは同様に、マイクロ流体チャンネル内の油流の中に分散した微水滴の層流のためにも使用可能である（トールセンら、２００１年）。こうして、マイクロ液滴のフロー分析そして任意にはフロー選別のためのマイクロ流体デバイスが構築できる（フーら、２００２年）。
【０１４９】
有利には、流体種の電子制御のためのシステムおよび方法を用いて、高い単分散性のマイクロカプセルを形成させることができる。本発明の一態様は、液体により取り囲まれた流体の液滴を生産するためのシステムおよび方法に関する。流体および液体は、基本的に数多くのケースにおいて非混和性、すなわち、問題のタイムスケール（例えば、流体液滴が特定のシステムまたはデバイスを通って輸送されるのにかかる時間）上で非混和性であり得る。或る種のケースでは、液滴は、以下で詳述する通り、各々実質的に同じ形状またはサイズであり得る。流体は同様に、その他の種、例えば或る種の分子種（例えば以下で詳述する通り）、細胞、粒子などをも含有し得る。
【０１５０】
１組の実施形態においては、流体を液体内部で個々の液滴へと分離させ得る、液体によって取り囲まれた流体の上に電荷を作り出すことができる。一部の実施形態においては、流体および液体は、例えば液体との関係における流体の運動を制限することにより、例えばマイクロ流体チャンネルといった１本のチャンネルの中、または流体に対する（「ＡＣ」つまり交流、「ＤＣ」つまり直流などであり得る）電場の印加を容易にするその他の狭窄された空間の中に、存在し得る。かくして、流体は、液体内で一連の個々の荷電されたかつ／または電気的に誘発可能な液滴として存在し得る。一実施形態においては、流体液滴に対し加えられる電気力は、液滴が液体内を移動するのに充分なほど大きいものであり得る。一部のケースでは、流体液滴に加えられる電気力は、例えばチャンネルまたはマイクロ流体チャンネル（例えば以下で詳述するようなもの）などに対してまたはそれらの内部で、液体内部の液滴の所望の運動を導くために使用され得る。一例としては、図３Ａの器具５内では、流体供給源１０により作り出された液滴１５は、電場発生器２０により作り出された電場を用いて荷電され得る。
【０１５１】
電荷は、例えば（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）電場内に流体を置くことおよび／または、流体に電荷をもたせる反応、例えば化学反応、イオン反応、光触媒反応などを発生させることによるものといった任意の適切な技術を用いて液体内部で流体内に作り出され得る。一実施形態では、流体は導電体である。本書で使用する「導電体」というのは、少なくとも１８メガオーム（ＭＯｈｍまたはＭΩ）水の伝導度をもつ材料である。流体を取り囲む液体は、流体のものよりも小さい伝導度を有し得る。例えば、液体は、流体との関係において絶縁体であるかまたは少なくとも「漏洩しやすい絶縁体」であり得る、すなわち液体は、少なくとも短時限の間流体を少なくとも部分的に電気的に絶縁することができる。当業者であれば、流体伝導度を同定することができるだろう。限定的な意味のない一実施形態においては、流体は実質的に親水性であり、流体を取り囲む液体は実質的に疎水性であり得る。
【０１５２】
一部の実施形態においては、流体上（例えば一連の流体液滴上）に作り出される電荷は少なくとも約１０−２２Ｃ／立方マイクロメートルであり得る。一部のケースでは、電荷は少なくとも約１０−２１Ｃ／立方マイクロメートルであり得、かつその他のケースでは、電荷は少なくとも約１０−２０Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１９Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１８Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１７Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１６Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１５Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１４Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１３Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１２Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１１Ｃ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１０Ｃ／立方マイクロメートル、または少なくとも約１０−９Ｃ／立方マイクロメートル又それ以上であり得る。一部の実施形態では、流体上に作り出された電荷は少なくとも約１０−２１Ｃ／平方マイクロメートルであり得、かつ一部のケースでは、電荷は少なくとも約１０−２０Ｃ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１９Ｃ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１８Ｃ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１７Ｃ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１６Ｃ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１５Ｃ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１４Ｃ／平方マイクロメートル、または少なくとも約１０−１３Ｃ／平方マイクロメートル又それ以上であり得る。その他の実施形態では、電荷は少なくとも約１０−１４Ｃ／液滴であり得、かつ一部のケースでは、少なくとも約１０−１３Ｃ／液滴、その他のケースでは少なくとも約１０−１２Ｃ／液滴、その他のケースでは少なくとも約１０−１１Ｃ／液滴、その他のケースでは少なくとも約１０−１０Ｃ／液滴、またはさらにその他のケースでは少なくとも約１０−９Ｃ／液滴であって良い。
【０１５３】
一部の実施形態においては、電場は、電場発生器すなわち流体に印刷され得る電場を作り出すことのできるデバイスまたはシステムから発生される。電場発生器は、交流電場（すなわち、例えば正弦、のこぎり歯、方形など、時間との関係において周期的に変動するもの）、直流電場（すなわち時間との関係において恒常であるもの）、パルス電場などを生成することができる。電場発生器は、チャンネルまたはマイクロ流体チャンネルの内部に含まれた流体内に電場を作り出すように構築され配置され得る。電場発生器は、一部の実施形態に従ってチャンネルまたはマイクロ流体チャンネルを含む流体システムに一体化されていてもよいしまたはそれとは分離されていてもよい。本書で使用される「一体化した」という用語は、互いに一体化したコンポーネントの部分が、コンポーネントの少なくとも１つを切断または破壊することなく互いから手作業で分離され得ないような形で接合されていることを意味する。
【０１５４】
適切な電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）を生成するための技術は、当業者にとっては既知である。例えば、一実施形態においては、流体システム（例えばチャンネルまたはマイクロ流体チャンネルを構成する基質）上に位置づけされているかまたはその内部に埋込まれているかつ／または電場の少なくとも一部分が流体と相互作用するように流体に近接して位置づけされている可能性のある一対の電極を横断して電圧を印加することにより、電場が生成される。電極は、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、錫、カドミウム、ニッケル、インジウム錫酸化物（「ＩＴＯ」）など、ならびにそれらの組合せを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）、当業者にとって既知の任意の１つ以上の電極材料から作ることができる。一部のケースでは、透明または実質的に透明の電極を用いることができる。或る実施形態においては、少なくとも約０．０１Ｖ／マイクロメートル、かつ一部のケースでは、少なくとも約０．０３Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約０．０５Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約０．０８Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約０．１Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約０．３Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約０．５Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約０．７Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約１Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約１．２Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約１．４Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約１．６Ｖ／マイクロメートル、または少なくとも約２Ｖ／マイクロメートルという流体に印加可能な電場を作り出すように、電場発生器を構築し配置する（例えば位置づけする）ことができる。一部の実施形態においては、例えば少なくとも約２Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約３Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約５Ｖ／マイクロメートル、少なくとも約７Ｖ／マイクロメートル、または少なくとも約１０Ｖ／マイクロメートル又それ以上といったさらに高い電場強度を使用することができる。
【０１５５】
一部の実施形態においては、液滴に電気力を経験させるべく流体液滴に対し電場を加えることができる。流体液滴上に及ぼされる電気力は、一部のケースでは、少なくとも約１０−１６Ｎ／ｍｉｃｏｒｏｍｅｔｅｒ３であり得る。或るケースでは、流体液滴上に及ぼされる電気力はさらに大きく、例えば少なくとも約１０−１５Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１４Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１３Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１２Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１１Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−１０Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−９Ｎ／立方マイクロメートル、少なくとも約１０−８Ｎ／立方マイクロメートル、または少なくとも約１０−７Ｎ／立方マイクロメートル又それ以上であり得る。その他の実施形態においては、流体の表面積との関係における流体液滴上に及ぼされる電気力は、少なくとも約１０−１５Ｎ／平方マイクロメートル、および一部のケースでは、少なくとも約１０−１４Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１３Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１２Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１１Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−１０Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−９Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−８Ｎ／平方マイクロメートル、少なくとも約１０−７Ｎ／平方マイクロメートル、または少なくとも約１０−６Ｎ／平方マイクロメートルまたはそれ以上であり得る。さらにその他の実施形態においては、流体液滴上に及ぼされる電気力は、少なくとも約１０−９Ｎ、少なくとも約１０−８Ｎ、少なくとも約１０−７Ｎ、少なくとも約１０−６Ｎ、少なくとも約１０−５Ｎ、または一部のケースでは少なくとも約１０−４Ｎ又それ以上であり得る。
【０１５６】
本発明の一部の実施形態においては、例えば上述の通りの電荷をもつ流体液滴といった流体液滴の上に存在する電荷を少なくとも部分的に中和するためのシステムおよび方法が提供されている。例えば、電荷を少なくとも部分的に中和するために、流体液滴を、例えば本書で記述されているようなものといった技術を用いて、電場内に通し、かつ／または電極に接近させることができる。（電場がもはや流体液滴に実質的な影響を及ぼすことのできる強度をもたないように）電場から流体液滴が退出した時点で、および／または電場がその他の形で除去された時点で、流体液滴は電気的に中和された状態になりかつ／または削減された電荷を有する可能性がある。
【０１５７】
もう１組の実施形態においては、個々の液滴を形成するように流体を誘発することのできるような形でチャンネルの寸法を改変させることにより、チャンネルの内部で液体により取り囲まれた流体から、流体液滴を作り上げることができる。チャンネルは例えば、流体がチャンネルの壁に付着せず、代りに個々の液滴を形成するような形で、フロー方向との関係において拡張するチャンネルであるか、または例えば流体が強制的に個々の液滴内に合体するような形でフロー方向との関係において狭くなるチャンネルであってよい。１つの例が図７Ａに示されており、ここでチャンネル５１０は、液体５０５により取り囲まれたフローする流体５００（下向きに流れる）を内含している。チャンネル５１０は、５０１の場所で狭くなり、流体５００に一連の個々の流体液滴５１５を形成させる。その他の実施形態においては、液滴形成を起こさせるように内部閉塞を使用することもできる。例えば、流体を流体液滴へと合体させるような形で液体流を分断するために、じゃま板、尾根、柱などを使用することができる。
【０１５８】
一部のケースでは、個々の流体液滴の形成を起こさせるような形で時間との関係において（例えば機械式または電気機械式、空気圧式などで）チャンネルの寸法を改変させることが可能である。例えば、液滴形成をひき起こすようにチャンネルを機械的に収縮（「圧搾」）することができ、そうでなければ、例えば移動式じゃま板、回転羽根などの使用を通して液滴形成をひき起こすべく流体流を機械的に分断することができる。限定的な意味のない例として、図７Ｂでは、流体５００は下向き方向にチャンネル５１０を通って流れる。流体５００は、液体５０５によって取り囲まれている。チャンネル５１０の近くに位置づけされたまたはこのチャンネルに一体化された圧電デバイス５２０が、このときチャンネル５１０を機械的に締め付けるかまたは「圧搾」して、流体５００を個々の流体液滴５１５へと崩壊させることができる。
【０１５９】
さらにもう１組の実施形態においては、３つの基本的に相互に非混和性の流体（すなわち問題の１タイムスケール上で非混和性）を含むシステムの中で、個々の流体液滴を作り上げ維持することができる。このようなシステムにおいては、第２および第３の流体の流体液滴の分離を確保するために界面活性剤が必ずしも必要ではない。一例として、図１４Ａを参照すると、チャンネル７００の内部で、第１の流体７０１および第２の流体７０２は各々液体担体７０５内に担持されている。第１の流体７０１および第２の流体７０２は、各々チャンネル７００内部で液体担体７０５により担持されている一連の交番する個々の液滴として交番する。第１の流体と同様、第２の流体および液体担体は全て基本的に互いに非混和性であり、流体のうちのいずれか２つ（または３つの流体全て）が、液滴の合体を発生させることなく接触することができる。かかるシステムの一例の顕微鏡写真が図１４Ｂに示され、液体担体７０５内部に各々含まれた個々の交番する液滴として存在する第１の流体７０１および第２の流体７０２を例示している。
【０１６０】
３つの基本的に相互に非混和性である流体が関与するシステムの１例としては、シリコーン油、鉱油そして水溶液（すなわち、水、または中に溶解および／または懸濁した１つ以上のその他の種を含有する水、例えば塩溶液、生理食塩溶液、粒子または細胞を含有する水の懸濁液など）がある。システムのもう１つの例は、シリコーン油、フッ化炭素油、および水溶液である。システムのさらにもう１つの例は、炭化水素油（例えばヘキサデカン）、フッ化炭素油、および水溶液である。これらの例においては、これらの流体のいずれかを液体担体として使用することができる。適切なフッ化炭素油の限定的な意味のない例としては、オクタデカフルオロデカヒドロナフタレンが含まれる：
【化１】
0005903067.tif 000002
または１−（１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−ウンデカフルオロシクロヘキシル）エタノール：
【化２】
0005903067.tif 000003
が含まれる。
【０１６１】
かかるシステムの限定的な意味のない例が、図１４Ｂに例示されている。この図では、流体ネットワーク７１０には、液体担体７０５を含むチャンネル、および第１の流体７０１および第２の流体７０２が含まれている。液体担体７０５は、入口７２５を通って流体ネットワーク７１０内に導入され、一方第１の流体７０１は入口７２１を通って導入され、第２の流体７０２は入口７２２を通って導入される。流体ネットワーク７１０内のチャンネル７１６は、入口７２５から導入された液体担体７１５を含む。当初、第１の流体７０１が液体担体７０５内に導入されて、内部で流体液滴を形成する。次に液体７０５の中に第２の流体７０２が導入され、第１の流体７０１を含む流体液滴が散在した流体液滴を中に形成する。かくして、チャンネル７１７に到達した時点で、液体担体７０５は、第２の流体７０２を含む第２の流体液滴セットが散在した、第１の流体７０１を含む第１の流体液滴セットを含む。例示された実施形態においては、チャンネル７０６は、任意には、以下で詳述する通り流体液滴の各々の中で混合が発生できるようにし得る一連の湾曲部を含んでいる。しかしながら、この実施形態においては、第１の流体７０１および第２の流体７０２は基本的に非混和性であることから、第２の流体７０２を含む液滴と第１の流体７０１を含む液滴の有意な融合および／または混合は一般に予期されない。
【０１６２】
液体により取り囲まれた流体液滴生産のその他の例は、その各々が本明細書に参照により本書により援用されている、リンクら、により２００４年４月９日付けで出願された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３号明細書およびストーンら、により出願され、２００４年１月８日付けで国際公開第２００４／００２６２７号パンフレットとして公開された２００３年６月３０日付けで国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２０５４２号明細書の中で記述されている。
【０１６３】
一部の実施形態においては、流体液滴は、各々実質的に同じ形状および／またはサイズであり得る。形状および／またはサイズは、例えば液滴の平均直径またはその他の特徴的寸法を測定することによって判定可能である。本書で使用される「判定（決定）する」という用語は、例えば定量的または定性的な、１つの種の分析または測定、および／または種の存在および不在の検出を一般に意味する。「判定（決定）する」という用語は同様に、例えば定量的または定性的な、または相互作用の存在または不在を検出することによる、２つ以上の種の間の相互作用の分析または測定をも意味する。限定的意味のない適切な技術例としては、分光学、例えば赤外光、吸光、蛍光、可視紫外光、ＦＴＩＲ（「フーリエ変換赤外分光」）、またはラマン；重量分析法；偏光解析法；圧電測定法；免疫学的検定法；電気化学測定法；光学測定、例えば光学密度測定法；円二色法；光散乱測定法、例えば、準電気光散乱；偏光分析法；屈折計法；または濁度測定法などが含まれる。
【０１６４】
複数のまたは一連の液滴の「平均直径」は、液滴の各々の平均直径の算術平均である。当業者であれば、例えばレーザー光散乱、顕微鏡検査またはその他の既知の技術を用いて、複数のまたは一連の液滴の平均直径（またはその他の特徴的寸法）を判定することができるだろう。非球形液滴においては、液滴の直径は、表面全体を横断して積分した液滴の数学的に定義された平均直径である。１つの液滴（および／または複数のまたは一連の液滴の）平均直径は、例えば、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、または一部のケースでは約５マイクロメートル未満であり得る。平均直径は同様に、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートル、または一部のケースでは少なくとも約２０マイクロメートルでもあり得る。
【０１６５】
或るケースでは、本発明は、基本的に内部の種の実質的に均等な数のエンティティ（すなわち分子、化合物、細胞、遺伝要素、粒子など）からなる液滴の生産を提供している。例えば約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％または約９９％以上の複数のまたは一連の液滴が各々、同じ数の特定の種のエンティティを含み得る。例えば、上述した通りの実質的な数の生産された流体液滴は、１エンティティ、２エンティティ、３エンティティ、４エンティティ、５エンティティ、７エンティティ、１０エンティティ、１５エンティティ、２０エンティティ、２５エンティティ、３０エンティティ、４０エンティティ、５０エンティティ、６０エンティティ、７０エンティティ、８０エンティティ、９０エンティティ、１００エンティティなどを含むことができ、ここでエンティティは分子または高分子、細胞、粒子などである。一部のケースでは、液滴は各々個々に、一範囲のエンティティ、例えば、２０未満のエンティティ、１５未満のエンティティ、１０未満のエンティティ、７未満のエンティティ、５未満のエンティティ、または一部のケースでは３未満のエンティティを含み得る。１組の実施形態においては、一部は問題の種を含み一部はそれを含んでいない流体液滴を含む液体の中で、流体液滴は、以下で詳述するように（例えば以上で記述したような蛍光またはその他の技術を用いて）種を含む流体液滴についてスクリーニングまたは選別され得、一部のケースでは、液滴は、例えば前述した通り、問題の種の特定の数、または範囲のエンティティを含むような流体液滴についてスクリーニングまたは選別され得る。かくして、一部のケースでは、一部が種を含み一部がこれを含んでいない複数のまたは一連の流体液滴を、例えば少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、少なくとも約７５０、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、または少なくとも約５０００または一部のケースではそれ以上の倍数だけ、種をまさに含む液滴の比率について富化（または枯渇）させることができる。その他のケースでは、富化（または枯渇）は少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも約１０１０、少なくとも約１０１１、少なくとも約１０１２、少なくとも約１０１３、少なくとも約１０１４、少なくとも約１０１５、又それ以上の比率であり得る。例えば、特定の種を含む流体液滴を、さまざまな種を含む流体液滴ライブラリから選択することができ、ここでこのライブラリは、例えばＤＮＡライブラリ、ＲＮＡライブラリ、タンパク質ライブラリ、組合せ化学ライブラリ、遺伝要素のライブラリなどといったように、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５以上の項目を有し得る。或る実施形態においては、種を担持する液滴は次に、以下で詳述するように、例えば１つの反応を開始するかまたは判定するために融合、反応またはその他の形で使用または加工され得る。
【０１６６】
本発明に従ってマイクロカプセルを作り出すためのマイクロ流体ハンドリングの使用には次のような多数の利点がある。
（ａ）  それらは、各々がほぼ同一の非常に小さい超小型反応器として機能する高単分散性のマイクロカプセル（１．５％未満の多分散性）の形成を可能する、（ｂ）  マイクロカプセルは約１フェムトリットルから約１ナノリットルの範囲の体積を有することが可能である、
（ｃ）  マイクロカプセルの区画化は放物線流に起因する拡散および分散を防止する。
（ｄ）  ペルフルオロカーボン担体流体を用いることにより、マイクロカプセル間の分子交換を防止することが可能である。
（ｅ）  マイクロカプセル内の試薬は、不活性ペルフルオロカーボン担体流体層により分離されるためマイクロチャンネルの構造と反応または相互作用できない。
（ｆ）  マイクロカプセルを１秒につき１０，０００以下で作り出し、かつ同じ速度で光学的方法を用いてスクリーニングされ得る。これは一日あたり最高１０９の処理量である。
【０１６７】
マイクロカプセル（または液滴；これらの用語は本書で考慮されている目的では互換性ある形で使用可能である）は、有利にも融合または分割可能である。例えば、微水滴は、マイクロ流体システムを用いて併合および分割可能である（リンクら、２００４年；ソングら、２００３年）。マイクロカプセル融合は、試薬の混合を可能にする。例えば、遺伝要素を含むマイクロカプセルと転写因子を含むマイクロカプセルの融合が遺伝情報の転写を開始させることができる。マイクロカプセル分割は、単一のマイクロカプセルをより小さい２つ以上のマイクロカプセルに分割させることができる。例えば、試薬を含む単一のマイクロカプセルを多数のマイクロカプセルに分割することができ、これらを次に異なる試薬または遺伝要素を含む異なるマイクロカプセルと各々融合させることができる。試薬を含む単一のマイクロカプセルも同様に多数のマイクロカプセルに分割でき、これらをその後、１つの異なる遺伝要素またはたとえば異なる濃度の他の試薬を含む異なるマイクロカプセルと融合させることができる。
【０１６８】
一態様では、本発明は、流体液滴を２つ以上の液滴に分割するためのマイクロ流体システムおよび方法に関する。流体液滴は、例えば前述の通り、液体により取り囲まれていてよく、流体および液体は一部のケースにおいて基本的に非混和性である。当初の流体液滴を分割することによって作り出される２つ以上の液滴は各々実質的に同形状および／またはサイズであり得、そうでなければ２つ以上の液滴は、当初の流体液滴の分割に用いられる条件に応じて、異なる形状および／またはサイズを有し得る。数多くのケースにおいて、当初の流体液滴を分割するのに用いられる条件は、手動式または自動式に（例えば以下で論述するとおりプロセッサを用いて）、何らかの形で制御可能である。一部のケースでは、複数または一連の流体液滴中の各々の液滴を独立した形で制御することができる。例えば、いくつかの液滴を等部分または不等部分に分割する一方で他の液滴を分割しないことも可能である。
【０１６９】
１組の実施形態に従うと、印加された電場を用いて、１つの流体液滴を分割することが可能である。電場は、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る。この実施形態における流体液滴は、周囲の液体よりも高い導電率を有していてよく、一部のケースでは、流体液滴は中性に荷電され得る。一部の実施形態においては、もとの流体液滴から生産された液滴はほぼ等しい形状および／またはサイズを有する。或る実施形態においては、印加された電場の中で、電荷を促して流体液滴の内部から分配対象表面まで移動させ、かくして、液滴の内部に見られる電場を相殺することが可能である。一部の実施形態においては、流体液滴の表面上の電荷は、印加された電場に起因する力を経験することもでき、こうして相対する極性をもつ電荷を反対方向に移動させることになる。電荷の移動は、一部のケースにおいて、滴が２つの分離した流体液滴へと引き離されるようにする。流体液滴に対し印加される電場は、例えば反応、電場発生器などの上述の技術を用いて作り出すことができる。
【０１７０】
いかなる電場も印加されない図１Ａ中の限定的意味のない例として、チャンネル２３０内に含まれた流体液滴２１５は、チャンネル２５０および２５５へと通じる交差部２４０に向かって流れる周囲の液体によって担持されている。この例では、周囲の液体は、等しい流速でチャンネル２５０および２５５を通って流れる。かくして交差部２４０では、流体液体２１５は好ましい配向性または方向をもたず、周囲液体流に起因して等しい確率で出口チャンネル２５０および２５５内へと移行する。これとは対照的に、図１Ｂでは、周囲液体流が１．４Ｖ／マイクロメートルの印加電場の影響下で図１Ａと同じ要領で流れる一方で、流体液滴２１５は交差部２４０で２つの液滴へと分割されて、新しい液滴２１６および２１７を形成する。液滴２１６はチャンネル２５０内を左へと移動し、一方液滴２１７はチャンネル２５５内を右へと移動する。
【０１７１】
このプロセスの概略図は図５に見られ、ここでは、チャンネル５４０中の液体５３５により取り囲まれている中性流体液滴５３０が、電極５２６および５２７により作り出された印加電場５２５に付されている。電極５２６はチャンネル５４２近くに位置づけされ、一方電極５２７はチャンネル５４４の近くに位置づけされている。電場５２５の影響下で、電荷分離が流体液滴５３０内部で誘発される、すなわち液滴の片端で正の電荷が誘発される一方で液滴のもう一方の端部では負の電荷が誘発されるようになっている。液滴は次に、負の荷電された液滴５４５と正の荷電された液滴５４６へと分割され得、これらはその後それぞれチャンネル５４２および５４４内を走行することができる。一部のケースでは、結果として得られた荷電液滴上の電荷の一方または両方を、前述の通りに中和することも可能である。
【０１７２】
流体液滴を２つの液滴に分割するその他の例は、各々本明細書に参照により援用されているリンク、らにより２００４年４月９日付けで出願された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３号パンフレット；リンクら、により２００３年８月２７日付けで出願された米国仮特許出願第６０／４９８，０９１号明細書；およびストーンらにより２００３年６月３０日付けで出願され、２００４年１月８付けで国際公開第２００４／００２６２７号パンフレットとして公開された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２０５４２号明細書の中で記述されている。
【０１７３】
本発明は、さらにもう１つの態様において、２つ以上の流体液滴を１つの液滴に融合または合体させるためのシステムおよび方法に関する。例えば、１組の実施形態においては、例えば組成、表面張力、液滴サイズ、界面活性剤の有無などに起因して２つ以上の液滴が普通に融合または合体できない場合に、２つ以上の液滴（例えば流体の不連続流から生じたもの）を１つの液滴へと融合または合体させることのできるシステムおよび方法が提供される。或るマイクロ流体システムにおいては、液滴のサイズとの関係における液滴の表面張力も同様に、一部のケースで液滴の融合または合体が発生するのを妨げることができる。
【０１７４】
一実施形態においては、２つの流体液滴には、相対する電荷（すなわち正および負の電荷、絶対値が同じとは限らない）が与えられてよく、こうして２つの液滴の電気的相互作用は増大させられ、かくして例えば本書に記述されている技術を用いて液滴の相対する電荷に起因して液滴の融合または合体が発生し得るようにすることができる。例えば、液滴に電場を印加することができる、液滴をコンデンサに通すことができる、化学反応が液滴を荷電状態にさせることができる等々である。一例としては、図１３Ａに概略的に示されているように、マイクロ流体チャンネル６５３内部に含まれた液体６５４により担持された未荷電液滴６５１および６５２は、互いに接触させられるが、液滴はそのサイズおよび／または表面張力などのため融合も合体もできない。液滴は、一部のケースでは、液滴の表面張力を低下させるべく界面活性剤が適用された場合でさえ融合できない可能性がある。しかしながら、流体液滴が、（同じ絶対値でありうるものの必ずしもそうとは限らない）反対の電荷で荷電されている場合、液滴は、融合または合体することができるかもしれない。例えば、図１３Ｂでは、正に荷電された液滴６５５および負に荷電された液滴６５６が一般的に互いに向かって導かれ、かくして、相対する荷電を受けた液滴の電気的相互作用が液滴を融合した液滴６５７へと融合させるようになっている。
【０１７５】
もう１つの実施形態においては、流体液滴は、必ずしも反対の電荷が与えられなくてもよく（一部のケースでは、電荷が全く与えられない可能性がある）、流体液滴を合体させる流体液滴内に誘発された双極子の使用を通して融合される。図１３Ｃに示されている例においては、チャンネル６７０内で液体６６５により取り囲まれている液滴６６０および６６１（これらは各々独立して荷電されているかまたは中性であり得る）は、印加された電場６７５による影響を受けるような形でチャンネルを通って移動する。電場６７５はＡＣ場、ＤＣ場などであり得、例えばここで示されているように電極６７６および６７７を用いて作り出すことができる。図１３Ｃに示されている通りの流体液滴の各々の中の誘発双極子は、流体液滴をその局所的な相対する電荷に起因して互いに向かって電気的に引きつけられた状態にし、かくして液滴６６０および６６１を融合させて液滴６６３を生成させることができる。図１３Ｄでは、液滴６５１および６５２は一緒に流れて融合し、第３のチャンネルを流れる液滴６５３を形成する。
【０１７６】
さまざまな実施形態において、合体できるようにされた２つ以上の液滴は必ずしも「真っ正面から」遭遇する必要がないということを指摘しておくべきである。液滴の少なくとも一部の融合が最初に発生するかぎり、任意の接触角で充分である。一例として、図１２Ｈにおいては、液滴７３および７４は各々実質的に同じ方向に（例えば異なる速度で）走行しており、遭遇して融合できる。もう１つの例として、図１２Ｉにおいては、液滴７３および７４は一定の角度で遭遇し、融合する。図１２Ｊにおいては、３つの流体液滴７３、７４および６８が遭遇し、融合して液滴７９を生成する。
【０１７７】
流体液滴の融合または合体のその他の例は、本明細書に参照により援用されているリンクら、により２００４年４月９日付けで出願された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３号パンフレットの中で記述されている。
【０１７８】
従ってマイクロカプセルの流体ハンドリングは結果として次のようなさらなる利点をもたらす：
（ａ）  マイクロカプセルは２つ以上のより小さいマイクロ液滴に分割され得、かくして中に含まれた試薬を並行して一連の異なる分子と反応させるかまたは多系にて（インキュベーションｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｅ）検定することができるようにする。
（ｂ）  マイクロカプセルを融合することができる。こうして、分子は（ａ）希釈され得、（ｂ）その他の分子と混合され得、かつ（ｃ）反応が精確に定義された時刻に開始、終結または変調され得ることになる。
（ｃ）  カオス的移流を用いてマイクロカプセル内できわめて迅速に（２ｍｓ未満で）試薬を混合でき、かくして高速の反応速度測定および非常に高い処理量が可能となる。
（ｄ）  試薬を組合せにより混合できる。例えば、テストすべきライブラリ内の化合物の考えられる全ての対様の組合せの効果を可能にする。
【０１７９】
マイクロ流体システム内のマイクロカプセルの創出および操作は、以下のことを意味する：
（ａ）  マイクロカプセルの安定流をマイクロチャンネル内に形成し、その相対的位置により同定することができる。
（ｂ）  反応に光シグナル（例えば蛍光変化）が随伴する場合、マイクロ流体ネットワークの空間的に分解された光学的画像が、各マイクロカプセル内の反応の時間分解測定を可能にする。
（ｃ）  マイクロカプセルが含む分子の回収およびさらなる分析または操作を可能にするべくマイクロ流体フロー選別デバイスを用いてマイクロカプセルを分離することができる。
【０１８０】
マイクロカプセルのスクリーニング／選別
さらにもう１つの態様においては、本発明は、一部のケースでは液体中の流体液滴を比較的高い速度でスクリーニングまたは選別するためのシステムおよび方法を提供している。例えば、液滴の特性を検知しかつ／または何らかの形で（例えば以下で詳述する通り）判定することができ、その後液滴を、例えば選別またはスクリーニングを目的としてデバイスの特定の領域に向かって導くことができる。
【０１８１】
一部の実施形態においては、流体液滴の特性を何らかの形で、例えば本書に記述されている通りに検知および／または判定することができ（例えば流体液滴の蛍光を判定することができる）、かつこれに応えて、特定の領域（例えばチャンネル）に、流体液滴を導くべく電場を印加するかまたは流体液滴から除去することができる。一部のケースでは、本発明の或るシステムおよび方法を用いて、高い選別速度を達成することができる。例えば、一部のケースでは少なくとも毎秒約１０液滴を判定し選別することができ、その他のケースでは、少なくとも毎秒約２０液滴、少なくとも毎秒約３０液滴、少なくとも毎秒約１００液滴、少なくとも毎秒約２００液滴、少なくとも毎秒約３００液滴、少なくとも毎秒約５００液滴、少なくとも毎秒約７５０液滴、少なくとも毎秒約１０００液滴、少なくとも毎秒約１５００液滴、少なくとも毎秒約２０００液滴、少なくとも毎秒約３０００液滴、少なくとも毎秒約５０００液滴、少なくとも毎秒約７５００液滴、少なくとも毎秒約１０，０００液滴、少なくとも毎秒約１５，０００液滴、少なくとも毎秒約２０，０００液滴、少なくとも毎秒約３０，０００液滴、少なくとも毎秒約５０，０００液滴、少なくとも毎秒約７５，０００液滴、少なくとも毎秒約１００，０００液滴、少なくとも毎秒約１５０，０００液滴、少なくとも毎秒約２００，０００液滴、少なくとも毎秒約３００，０００液滴、少なくとも毎秒約５００，０００液滴、少なくとも毎秒約７５０，０００液滴、少なくとも毎秒約１，０００，０００液滴、少なくとも毎秒約１，５００，０００液滴、少なくとも毎秒約２，０００，０００液滴またはそれ以上、或いは少なくとも毎秒約３，０００，０００液滴またはそれ以上をこのような形で判定および／または選別することができる。
【０１８２】
１組の実施形態においては、液滴上に電荷を作り出し（例えば前述の通り）、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る印加電場を用いて液滴を操縦することによって、流体液滴を導くことができる。一例として、図２−４を参照すると、特定の領域に流体液滴を導くために必要とされる通りに、電場を選択的に印加し除去することができる（或いは又例えば図４Ａに示されているように、逆電場といった異なる電場を印加してもよい）。一部の実施形態では、流体液滴を含有する液体のフローを実質的に改変させることなく、必要に応じて、電場を選択的に印加し除去することが可能である。例えば液体は、実質的に定常状態ベース（すなわち、流体液滴を含有する液体の平均流速は、定常状態流または時間との関係における液体のフローの予測値の２０％未満または１５％未満しか逸脱せず、一部のケースでは平均流速は１０％未満または５％未満しか逸脱し得ない）、または本発明の流体システムを通した（例えば１本のチャンネルまたはマイクロチャンネルを通した）その他の予め定められたベースでフローでき、液体内部に含まれた流体液滴は、流体システムを通った液体のフローを実質的に改変することなく例えば電場を用いてさまざまな領域に導かれ得る。特定の例として、図２Ａ、３Ａおよび４Ａでは、流体液滴１５を含有する液体は、流体供給源１０からチャンネル３０を通って交差部４０まで流れ、チャンネル５０および５５を通って退出する。図２Ａでは、流体液滴１５がチャンネル５０および５５の両方を通って導かれ、一方図３Ａでは、流体液滴１５はチャンネル５５のみに導かれ、図４Ａでは流体液滴１５はチャンネル５０のみに導かれる。
【０１８３】
もう１組の実施形態においては、（当初荷電されているかまたはされていないものであり得る）流体液滴内で双極子を誘発し、印加された電場を用いて液滴を選別または操縦することにより、流体液滴を選別または操縦することができる。電場は、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る。例えば、図９Ａを参照すると、流体液滴５３０および液体５３５を含むチャンネル５４０は、チャンネル５４２および５４４に分かれる。流体液滴５３０は電場を有していてもよいしまたは非荷電であってもよい。電極５２６はチャンネル５４２の近くに位置づけされ、一方電極５２７はチャンネル５４４の近くに位置づけされる。電極５２８は、チャンネル５４０、５４２および５４４の接合部近くに位置づけされる。図９Ｃおよび９Ｄでは、電極５２６、５２７および／または５２８を用いて、流体液滴の中に双極子が誘発される。図９Ｃでは、電極５２７および５２８を用いて電場５２５を液滴に印加することにより、液滴５３０内に双極子が誘発される。電場の強度に起因して、液滴の右へ、チャンネル５４４内へと強くひきつけられる。類似の要領で、図９Ｄでは、電極５２６および５２８を用いて液滴に電場５２５を印加することによって液滴５３０内に双極子が誘発され、液滴をチャンネル５４２内にひきつけさせる。かくして、適切な電場を印加することにより、所望のとおり、いずれかのチャンネル５４２または５４４に対し液滴５３０を導くことができる。
【０１８４】
しかしながら、その他の実施形態においては、液滴を含む液体のフローを改変することにより、本発明の流体システム内部で流体液滴をスクリーニングまたは選別することができる。例えば、１組の実施形態においては、第１のチャンネル、第２のチャンネルなどの中に流体液滴を取り囲む液体を導くことによって、流体液滴を操縦または選別することができる。限定的な意味のない例として、図１０Ａを参照すると、流体液滴５７０はチャンネル５８０内で液体５７５によって取り囲まれている。チャンネル５８０は３本のチャンネル５８１、５８２および５８３に分かれる。液体５７５のフローは、例えばバルブ、ポンプ、ピストンなどの当業者にとって既知のフロー制御デバイスを用いて、望まれる通り、いずれかのチャンネル５８１、５８２および５８３内に導かれ得る。かくして、図１０Ｂでは、流体液滴５７０は、（矢印５７４により表わされているように）チャンネル５８１内に流れ込むように液体５７５を導くことによりチャンネル５８１内に導かれ；図１０Ｃでは、流体液滴５７０は、（矢印５７４により表わされているように）チャンネル５８２内に流れ込むように液体５７５を導くことにより、チャンネル５８２内に導かれ；図１０Ｄでは、流体液滴５７０は、（矢印５７４により表わされているように）チャンネル５８３内に流れ込むように液体５７５を導くことにより、チャンネル５８３内に導かれる。
【０１８５】
しかしながら、流体液滴のフローを中に導くためにマイクロ流体システム内の液体のフロー制御は使用されず、代替的方法が使用されることが好ましい。従って、有利には、マイクロカプセルは、マイクロ流体システム内の担体流体のフローの方向を改変することによって選別されない。
【０１８６】
もう１組の実施形態においては、例えば異なるチャンネル内部または１本のチャンネルの異なる部分の内部といった流体システム内部の圧力が、流体液滴のフローを導くために制御可能である。例えば、液滴を、さらなるフロー方向についての多数のオプションを含めたチャンネル接合部に向かって導くことができる（例えば任意の下流側フローチャンネルを構成するチャンネル内を分岐または二又に向かって導かれる）。任意の下流側フローチャンネルのうちの１つ以上のものの内部圧力は、チャンネルのうちの１本の中に選択的に液滴を導くように制御可能であり、接合部に連続的液滴が到達するのにおおよそ必要とされる時間で、圧力変化がもたらされ、かくして、各々の連続する液滴の下流側フロー経路は独立して制御できるようになっている。１つの配置においては、例えば流体液滴を含む液体の定方向運動をひき起こすことにより、流体液滴を１本のチャンネル内に操縦または選別するべく、液体タンクの膨張および／または収縮を使用することができる。液体タンクは、活動化された時点で、活動化されたタンクによりひき起こされる液体の運動が好ましい方向に液体を流れさせ、流体液滴をその好ましい方向に搬送するような形で、位置づけされ得る。例えば、液体タンクの膨張は、タンクに向かう液体のフローをひき起こすことができ、一方、液体タンクの収縮は、タンクから離れる液体のフローをひき起こすことができる。一部のケースでは、液体タンクの膨張および／または収縮を、例えば本書で記述するように、その他のフロー制御デバイスおよび方法と組合わせることが可能である。液体タンクの膨張および／または収縮をひき起こすことのできるデバイスの限定的意味のない例としては、ピストンおよび圧電コンポーネントが含まれる。一部のケースでは、例えば電気的シグナルに応えるその応答時間が比較的速いことから、圧電コンポーネントが特に有用であり得る。
【０１８７】
限定的意味のない例としては、図１１Ａにおいて、流体液滴６００がチャンネル６１０内で液体６０５により取り囲まれている。チャンネル６１０はチャンネル６１１、６１２に分かれる。チャンネル６１１および６１２と流体連絡状態に位置づけされているのは、例えば圧電コンポーネント６１５および６１６、ピストン（図示せず）などにより膨張および／または収縮され得る液体タンク６１７および６１８である。図１１Ｂにおいては、液体タンク６１７は、膨張され、一方液体タンク６１８は収縮されている。タンクの膨張／収縮の効果は、矢印６０３により表わされているように、チャンネル６１１に向かっての液体の正味フローをひき起こすことにある。かくして流体液滴６００は、チャンネル間の接合部に達した時点で、液体６０５の運動によりチャンネル６１１に導かれる。逆の状況は図１１Ｃに示されており、ここでは液体タンク６１７が収縮され、一方液体タンク６１８は膨張されている。（矢印６０３により表わされている）チャンネル６１２に向かっての液体の正味フローが発生し、流体液滴６００をチャンネル６１２内に移動させる。ただし、チャンネル６１１または６１２内に流体液滴６００を導くためにタンク６１７および６１８の両方を活動化させる必要はない、という点を指摘しておくべきである。例えば、一実施形態においては、（タンク６１８のいかなる改変もなく）液体タンク６１７の膨張により、流体液滴６００をチャンネル６１１に導くことができ、一方、もう１つの実施形態では、（タンク６１７のいかなる改変もなく）液体タンク６１８の収縮によりチャンネル６１１に流体液滴６００を導くことができる。一部のケースでは、３つ以上の液体タンクを使用することができる。
【０１８８】
一部の実施形態においては、流体液滴を２本以上のチャンネル内に選別することができる。液滴の送達のために流体システム内部に多数の領域をもつ本発明の実施形態の限定的意味のない例が、図６Ａおよび６Ｂに示されている。その他の配置が、図１０Ａ−１０Ｄに示されている。図６Ａにおいては、それぞれに電極３２１／３２２、３２３／３２４および３２５／３２６を用いて交差部３４０、３４１および３４２において液滴の運動を制御するべく電場を印加することにより、出口チャンネル３５０、３５２、３５４または３５６のいずれか１本に対し、望まれる通り、チャンネル３３０内に荷電液滴３１５を導くことができる。図６Ａでは、上述のものと類似の原理を用いて、印加電場３００および３０１を用いてチャンネル３５４に液滴３１５が導かれる。類似の要領で、図６Ｂでは、それぞれに電極４２１／４２２、４２３／４２４、４２５／４２６および４２７／４２８を用いて交差部４４０、４４１、４４２および４４３において液滴の運動を制御するべく電場を印加することにより、チャンネル４３０内の荷電液滴４１５を出口チャンネル４５０、４５２、４５４または４５６のいずれか１本に導くことができる。この図では、液滴４１５はチャンネル４５４に導かれ、当然のことながら、望まれる場合、荷電液滴を任意のその他の出口チャンネルに導くことができる。
【０１８９】
もう１つの例においては、器具５において、図２Ａに概略的に例示されるように、流体供給源１０により作り出された流体液滴１５は、２つの電極２２、２４を含む電場発生器２０を用いて作り出された印加電場に起因して、正に荷電されている。流体液滴１５は、液滴を含む液体によりチャンネル３０を通して導かれ、交差部４０に向かって導かれる。交差部４０では、流体液滴は好ましい配向性または方向をもたず、同等の確率で出口チャンネル５０および５５内へと移動する（この実施形態では、液体は、実質的に等しい速度で、両方の出口チャンネル５０および５５を通って排出する）。類似の要領で、電極１２２および１２４を含む電場発生器１２０を用いて作られた印加電場に起因して、流体供給源１１０により作り出された流体液滴１１５は負に荷電される。交差部１４０に向かってチャンネル１３０を通って走行した後、流体液滴は、好ましい配向性または方向を有しておらず、液体が実質的に等しい速度で出口チャンネル１５０および１５５を通って退出するにつれて、同等の確率で出口チャンネル１５０および１５０内に移動する。交差部１４０の代表的な顕微鏡写真が図２Ｂに示されている。
【０１９０】
図３Ａの概略図においては、器具５の右に向かう方向で、図２Ａの器具５に対し、１．４Ｖ／マイクロメートルの電場１００が印加されている。チャンネル３０内の正に荷電された流体液滴１５は、交差部４０に到達した時点で、印加電場１００に起因してチャンネル５５内を右に導かれ、一方液滴を含む液体は実質的に等しい速度で出口チャンネル５０および５５を通って退出し続ける。類似の要領で、チャンネル１３０内の負に荷電された流体液滴１１５は、交差部１４０に到達した時点で、印加電場１００に起因してチャンネル１５０内を左に導かれ、一方液体流体は、実質的に等しい速度で出口チャンネル１５０および１５５を通って退出し続ける。かくして望まれる通り特定のチャンネル内に流体液滴を導くために電場１００を使用することができる。交差部１４０の代表的顕微鏡写真が図３Ｂに示されている。
【０１９１】
図４Ａは、同じく１．４Ｖ／マイクロメートルのただし反対方向である（すなわち−１．４Ｖ／マイクロメートル）印加電場１００を伴う、図２Ａの器具５の概略図である。この図では、チャンネル３０内の正に荷電された流体液滴１５は、交差部４０に到達した時点で、印加電場１００に起因してチャンネル５０内へと左に導かれ、一方、チャンネル１３０内の負に荷電された流体液滴１１５は、交差部１４０に到達した時点で、印加電場１００に起因してチャンネル１５５内へと右に導かれる。液滴を含む液体は、実質的に等しい速度で出口チャンネル５０および５５および１５０および１５５を通って退出する。交差部１４０の代表的顕微鏡写真が図４Ｂに示されている。
【０１９２】
本発明の一部の実施形態においては、例えば特定の利用分野に応じて、２つ以上の別々の液滴へと選別および／または分割され得る。液滴を分割および／または選別するために、上述の技術のいずれかを用いることができる。限定的意味のない例として、例えばデバイス（またはその一部分）に第１の電場を印加（または除去）することにより、第１の領域またはチャンネルに対し流体液滴を導くことができる；デバイス（またはその一部分）に第２の電場を印加（または除去）することにより、第２の領域またはチャンネルに対し液滴を導くことができる；デバイス（またはその一部分）に第３の電場を印加（または除去）することにより第３の領域またはチャンネルに対して液滴を導くことができる。ここで、電場は、何らかの形で、例えば、強度、方向、周波数、持続時間などにおいて異なる可能性がある。一連の液滴において、各々の液滴は独立して選別および／または分割され得る。例えば一部の液滴を一つの場所またはもう１つの場所に導くことができ、一方その他の液滴は、２つ以上の場所に導かれる多数の液滴へと分割可能である。
【０１９３】
１つの特定の例として、図８Ａでは、チャンネル５６０内の流体液滴５５０、周囲の液体５５５は、チャンネル５５６、チャンネル５５７に導かれるかまたは、何らかの形でチャンネル５６２と５６４の間で分割され得る。図８Ｂでは、周囲液体５５５をチャンネル５６２に向かって導くことにより、流体液滴５５０はチャンネル５６２へと左に向かって導かれ得る。図８Ｃでは、周囲液体５５５をチャンネル５６４に向かって導くことにより、流体液滴５５０はチャンネル５６４へと右に向かって導かれ得る。図８Ｄでは、液滴に接合部５６１を攻撃させて液滴が２つの別々の流体液滴５６５、５６６に分割させ得る電場が、流体液滴５５０を取り囲む液体５５５のフローの制御と組合わせて印加され得る。流体液滴５６５はチャンネル５６２に導かれ、一方流体液滴５６６はチャンネル５６６に導かれる。液滴形成を制御するため、印加電極の高度の制御が達成可能である。かくして例えば、流体液滴５６５が液滴５６５および５６６に分割された後、液滴５６５および５６６は実質的に等しいサイズのものであり得、そうでなければ、それぞれ図８Ｅおよび８Ｆに示されているように、液滴５６５および５６６のいずれかが大きい可能性もある。
【０１９４】
もう１つの例として、図９Ａでは、流体液滴５３０および液体５３５を担持するチャンネル５４０は、チャンネル５４２および５４４に分かれる。流体液滴５３０は、荷電されていてもよいし、又非荷電であってもよい。電極５２６はチャンネル５４２近くに位置づけされ、一方電極５２７はチャンネル５４４の近くに位置づけされている。電極５２８は、電極５４０、５４２および５４４の接合部の近くに位置づけされている。流体液滴５３０が接合部に到達した時点で、それは電場を受けかつ／または、例えば周囲液体をチャンネル内に導くことによりチャンネルまたはその他の領域へと導かれ得る。図９Ｂに示されているように、電極５２６および５２７を用いて液滴に電場５２５を印加することにより、流体液滴５３０は、２つの別々の液滴５６５および５６６に分割可能である。図９Ｃでは、電極５２７および５２８を用いて液滴に電場５２５を印加することにより、液滴５３０内に双極子を誘発することができる。印加された電場の強さに起因して、液滴は右に、チャンネル５４４内へと強くひきつけられ得る。類似の要領で図９Ｄでは、電極５２６および５２８を用いて液滴に電場５２５を印加することによって液滴５３０内に双極子が誘発されて、液滴をチャンネル５４２内にひきつけさせることができる。液滴５３０を横断する電場を誘発するのにどの電極を用いるかおよび／または印加電場の強さを制御することにより、チャンネル５４０内部の１つ以上の流体液滴を選別しかつ／または２つの液滴へと分割し、かつ各液滴を個別に選別しかつ／または分割することができる。
【０１９５】
マイクロカプセルは、例えば蛍光色素を取込むことによって光学的にタグ付けされ得る。好ましい構成では、マイクロカプセルは量子ドットを取込むことによって光学的にタグ付けされる。すなわち、１０個の濃度での６色の量子ドットによって１０６個のマイクロカプセルのコード化が可能になる（ハン（Ｈａｎ）ら、２００１年）。マイクロ流体チャンネルを整然とした順序で流れるマイクロカプセルを、マイクロカプセルの流れの中でそのシーケンスにより（全体的または部分的に）コード化することができる（位置的コード化）。
【０１９６】
本発明を用いると、化合物の調製に関与する酵素は、最適な活性についての選択により最適化可能である。手順には、本書で言及されている通りのポリペプチドライブラリと一致するスクリーニングすべきポリペプチドの変異体の調製が関与する。変異体は、本書の他の箇所で論述されているライブラリと同じ要領で調製可能である。
【０１９７】
（Ｂ）  選択手順
触媒、調節または結合活性をもつＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質遺伝子産物分子について選択するようにシステムを構成することができる。
【０１９８】
（ｉ）  結合についての選択
特異的リガンドに対する親和性をもつ遺伝子産物についての選択の場合、リガンドを介してマイクロカプセル内の遺伝子産物に遺伝要素を連結することができる。従って、リガンドに対する親和性をもつ遺伝子産物のみが遺伝要素に結合することになり、リガンドを介して結合された遺伝子産物をもつ遺伝要素のみが、変化した光学特性を獲得することになり、この特性により選択工程においてこれらを保持することが可能となる。この実施形態においては、かくして遺伝要素は、遺伝子産物のためのリガンドに連結された遺伝子産物をコードする核酸を含むことになる。
【０１９９】
リガンドに対する遺伝子産物の結合の後の遺伝要素の光学特性の変化は、以下のものを含めたさまざまな要領で誘発可能である：
（１）  遺伝子産物自体は独特の光学特性を有し得、例えば、蛍光性である（例えば緑色蛍光タンパク質（ローレンツ（Ｌｏｒｅｎｚ）ら、１９９１年）。
（２）  遺伝子産物の光学特性はリガンドに対する結合時点で修飾され得、例えば遺伝子産物の蛍光は結合時点でクエンチングまたは増強される（ギシェ（Ｇｕｉｘｅ）ら、１９９８年；キー（Ｑｉ）およびグラボウスキー（Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ）、１９９８年）。
（３）  リガンドの光学特性は遺伝子産物の結合時点で修飾され得、例えばリガンドの蛍光は結合時点でクエンチングまたは増強される（ヴォス（Ｖｏｓｓ）、１９９３年；マスイおよび倉光、１９９８年）。
（４）  結合時点でリガンドおよび遺伝子産物の両方の光学特性を修飾させる、例えばリガンドから遺伝子産物（またはその逆）への蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が存在し得、その結果として励起が「ドナー」吸収波長にある場合「アクセプタ」発光波長での発光をもたらす（ハイム（Ｈｅｉｍ）およびツィン（Ｔｓｉｅｎ）、１９９６年；マハヤン（Ｍａｈａｊａｎ）ら、１９９８年；宮脇ら、１９９７年）。
【０２００】
この実施形態においては、リガンドを介した遺伝要素に対する遺伝子産物の結合が光学特性の変化を直接的に誘発する必要はない。選択すべき全ての遺伝子産物は、それについて選択されるべき推定上の結合ドメインおよび共通の特長つまりタグを含有することができる。各々のマイクロカプセル中の遺伝要素は、リガンドに対し物理的に連結されている。遺伝要素から生成された遺伝子産物がリガンドに対する親和性を有する場合、それはこのリガンドに結合し、それをコードしたのと同じ遺伝要素に物理的に連結された状態となり、結果として遺伝要素は「タグ付け」されることになる。反応の終りで、マイクロカプセルは全て組合わされ、全ての遺伝要素および遺伝子産物は合わせて１つの環境内にプールされる。所望の結合を示す遺伝子産物をコードする遺伝要素は、「タグ」に特異的に結合するかまたは「タグ」と特異的に反応しかくしてそれらの選別を可能にする遺伝要素の光学特性の変化を誘発する試薬を添加することによって選択可能である。例えば、蛍光標識された抗「タグ」抗体を使用することができ、そうでなければ、抗「タグ」抗体とそれに続いて最初に結合する第２の蛍光標識された抗体を使用することもできる。
【０２０１】
一変形実施形態においては、リガンドに結合する遺伝子産物が、例えばそうでなければ遺伝要素の光学特性を修飾すると思われるさらなる結合パートナからリガンドを隠すことがほとんどないということに基づいて遺伝要素を選別することができる。この場合、未修飾の光学特性をもつ遺伝要素が選択されることになる。
【０２０２】
一変形実施形態においては、本発明は、工程（ｂ）において遺伝子産物がそれらをコードする遺伝要素に結合する、本発明の第１の態様に従った方法を提供している。遺伝子産物は付着した遺伝要素と共に、そのとき、所望の結合活性をもつ遺伝子産物に対するリガンドの結合の結果として選別される。例えば、全ての遺伝子産物は、遺伝要素に対して共有結合または非共有結合に結合する不変領域、および所望の結合活性を生成するべく多様化される第２の領域を含有することができる。
【０２０３】
一変形実施形態においては、遺伝子産物のためのリガンドはそれ自体遺伝要素によりコードされ、遺伝要素に結合する。換言すると、遺伝要素は２つ（または実際にはそれ以上）の遺伝子産物をコードし、そのうちの少なくとも１つは遺伝要素に結合し、これらの遺伝子産物は潜在的に互いに結合することができる。遺伝子産物がマイクロカプセル内で相互作用する場合にのみ、遺伝要素は、その選別を可能にするその光学特性の変化を結果として究極的にもたらすような形で修飾される。この実施形態は例えば、互いに結合するタンパク質対をコードする遺伝子対について遺伝子ライブラリをサーチするために使用される。
【０２０４】
遺伝要素を蛍光性にするため、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ(商標)）を用いることにより蛍光を増強することができる。これには、マイクロビーズに結合しかつフルオレセインチラミンから後に遺伝要素と（局所的に）反応する遊離ラジカル形態への転換の触媒として作用する（もう１つの化合物に連結された）ペルオキシダーゼが関与する。ＴＳＡを実施するための方法は、当該技術分野において既知であり、キットはＮＥＮから市販されている。
【０２０５】
ＴＳＡは、それが結果として遺伝要素の蛍光の直接的増加をもたらすような形で、または第２の蛍光分子または蛍光性である１つ以上の一連の分子により結合される遺伝要素にリガンドが付着されるような形で、構成され得る。
【０２０６】
（ｉｉ）  触媒についての選択
選択が触媒についてのものである場合、各々のマイクロカプセル中の遺伝要素は反応の基質を含み得る。遺伝要素が、触媒として作用する能力をもつ遺伝子産物をコードする場合、遺伝子産物は基質から生成物への転換の触媒として作用することになる。従って、反応の終りで、遺伝要素は触媒反応の生成物に物理的に連結される。
【０２０７】
一部のケースでは、基質が遺伝要素の１構成要素でないことも望まれる。この場合、基質は、（例えば「ケージされた」ビオチン類似体の（サンドバーグら、１９９５年；ピルングおよびファン、１９９６年））光活性化といったようなそれを活性化するさらなる工程を必要とする不活性「タグ」を含有することになると思われる。このとき選択されるべき触媒は基質を生成物へと転換する。このとき「タグ」は活性化され、「タグ付け」された基質および／またはタグ結合分子（アビジンまたはストレプトアビジン）により結合された生成物は核酸と複合体化される。従って、「タグ」を介して核酸に付着された生成物に対する基質の比は、溶解状態の生成物と基質の比を反映する。
【０２０８】
生成物が付着された状態にあり所望の触媒活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素の光学特性は次のいずれかによって修飾可能である：
（１）  例えば
（ａ）  基質と生成物が異なる光学特性を有すること（グリコシダーゼ、ホスファターゼ、ペプチターゼおよびプロテアーゼ（クレイグ（Ｃｒａｉｇ）ら、１９９５年；ファンら、１９９２年；ブラインズ（Ｂｒｙｎｅｓ）ら、１９８２年；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９７年；又吉ら、１９９０年；ワン（Ｗａｎｇ）ら、１９９０年）を含めた数多くの蛍光発生酵素基質が市販されている（例えばホーグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ）、１９９６年を参照））、
（ｂ）  基質および生成物が類似の光学特性を有するものの、基質ではなく生成物だけが遺伝要素に結合するかまたはそれと反応すること、
に起因して、基質−遺伝要素複合体の中に見られない特徴的光学特性を、生成物−遺伝要素複合体が有すること；または
（２）  生成物に特異的に結合するかまたはそれと反応し、かくしてその選別を可能にする遺伝要素の光学特性の変化を誘発する試薬を添加すること（これらの試薬は、マイクロカプセルを破壊し遺伝要素をプールする前または後に添加され得る）、
のいずれかによって修飾可能である。前記試薬は；
（ａ）  基質および生成物の両方が遺伝要素に付着されている場合、基質ではなく生成物に対し特異的に結合するかまたはこれと特異的に反応するかまたは
（ｂ）  基質ではなく生成物のみが遺伝要素に結合するかまたはそれと反応する場合、基質および生成物の両方を任意に結合させる。
【０２０９】
このとき、触媒分子をコードするプールされた遺伝要素は、修飾された光学特性をもつ遺伝要素について選択することによって富化され得る。
【０２１０】
１つの代替案は、生成物特異的抗体（またはその他の生成物特異的分子）に対し核酸をカップリングすることにある。この筋書では、基質（または基質のうちの１つ）は、遺伝要素に連結されていない各マイクロカプセルの中に存在するが、分子「タグ」（例えばビオチン、ＤＩＧまたはＤＮＰまたは蛍光基）を有する。選択されるべき触媒が基質を生成物に転換する場合、生成物は「タグ」を保持し、次に生成物特異的抗体によりマイクロカプセル内で捕捉される。この要領で、遺伝要素は、基質を生成物に転換させる能力をもつ酵素をコードまたは生成する場合にのみ「タグ」と会合した状態になる。全ての反応が停止され、マイクロカプセルが組合わされた場合、活性酵素をコードする遺伝要素は「タグ付け」されることになり、例えば「タグ」が蛍光基であった場合にはすでに光学特性を変化させている可能性がある。代替的には、「タグ付けされた」遺伝子の光学特性の変化は、「タグ」（例えば蛍光標識されたアビジンまたはストレプトアビジン、蛍光性の抗「タグ」抗体、または第２の蛍光標識された抗体により検出され得る非蛍光抗「タグ」抗体）を結合させる蛍光標識されたリガンドを添加することによって誘発され得る。
【０２１１】
代替的には、第１の反応を同じマイクロカプセル内で起こる後続する反応にカップリングすることによって、間接的に選択を行なうことができる。これを実施できる方法は一般に２つある。第１の実施形態においては、第１の反応の生成物は、第１の反応の基質と反応しない分子と反応させられるかまたはそれにより結合される。第２のカップリングされた反応は、第１の反応の生成物の存在下でのみ進行することになる。次に、上述の通りの遺伝要素の光学特性の変化を誘発するため第２の反応の生成物の特性を使用することによって、所望の活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝要素を精製することができる。
【０２１２】
代替的には、選択対象の反応の生成物は第２の酵素−触媒作用を受ける反応のための基質または補因子であり得る。第２の反応を触媒するための酵素をマイクロカプセル内でインサイチュで翻訳するかまたはマイクロカプセル化に先立ち反応混合物内に取込むことが可能である。第１の反応が進行している場合にのみ、カップリングされた酵素は、上述の通りの遺伝要素の光学特性の変化を誘発するのに使用できる生成物を生成することになる。
【０２１３】
このカップリングの概念を練り上げて、各々以前の反応の生成物を基質として使用する多数の酵素を取込むことができる。こうして、固定化された基質と反応しない酵素の選択が可能になる。１つの反応の生成物が選択可能な生成物を導く第２の反応または一連の反応のための触媒または補因子である場合、シグナル増幅により増大した感応性を与えるように、それを設計することも又可能である（例えば、（ヨハンソン（Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ）およびベイツ（Ｂａｔｅｓ）、１９８８年、ヨハンソン、１９９１年）を参照のこと）。さらに、酵素カスケードシステムは、１酵素のための活性化物質の産生または酵素阻害物質の破壊に基づくものであり得る（（マイズ（Ｍｉｚｅ）ら、１９８９年）参照）。カップリングは同様に、同じ生成物を生成する酵素の一群全体について共通の選択システムを使用することができるという利点も有しており、単一の工程で行われ得ない複雑な多段階化学変換の調節選択を可能にする。
【０２１４】
かくして、このようなカップリング方法は、段階的にインビトロで新規「代謝経路」の進化を可能にし、まず１つの工程そしてその後次の工程を選択し改善する。選択戦略は、経路の最終生成物に基づくものであり、かくして、それより前の工程は全て、反応の各工程について新しい選択システムをセットすることなく、独立した形でまたは逐次的に展開され得る。
【０２１５】
代替的な形で表現すると、ここでは、所望の触媒活性をもつ遺伝子産物をコードする１つ以上の遺伝要素を単離する方法であって、、
（１）  遺伝要素を発現してそのそれぞれの遺伝子産物を提供する工程；
（２）  所望の活性に従って、直接的に選択可能であってもなくてもよい生成物への基質の転換を遺伝子産物が転換できるようにする工程；
（３）  １つ以上の後続する反応に第１の反応を任意にカップリングする工程であって、各反応が、先行する反応の生成物により変調され、最終的な選択可能な生成物の新規作成を導く工程；
（４）ａ）  生成物が遺伝要素と会合した状態でとどまるような形で遺伝要素に基質をカップリングすること、または
ｂ）  生成物上にとどまる基質に付着された適切な分子「タグ」を用いて遺伝要素に対して選択可能な生成物を反応または結合させる工程、または、
ｃ）  生成物特異的反応または生成物との相互作用を用いて、遺伝要素に選択可能な生成物（基質ではなく）をカップリングする工程；
のいずれかにより遺伝要素に対し触媒作用の選択可能な生成物を連結させる工程、および
（５）  その特徴的光学特性を用いて、あるいは生成物に特異的に結合するかまたは生成物と特異的に反応し、かくして遺伝要素の光学特性の変化を誘発する試薬を添加することによって、触媒生成物をそれが結合している遺伝要素と共に選択する工程、を含む方法であって、工程（１）〜工程（６）で各々の遺伝要素およびそれぞれの遺伝子産物がマイクロカプセル内部に含まれている方法が提供されている。
【０２１６】
（ｉｉｉ）  酵素基質特異性／選択性についての選択
基質特異性または選択性をもつ酵素をコードする遺伝要素は、１つの基質との反応についての正の選択およびもう１つの基質との反応についての負の選択を実施することによって特異的に富化され得る。かかる組合せ型の正および負の選択圧力は、領域選択的および立体選択的酵素（例えば同じ基質の２つの鏡像異性体を区別できる酵素）を単離する上できわめて重要であるはずである。例えば、２つの基質（例えば２つの異なる鏡像異性体）は、酵素触媒反応によりタグが遺伝要素に付着した状態となるような異なるタグ（例えば２つの異なる蛍光プローブ）で各々標識される。２つのタグが遺伝要素上で異なる光学特性を付与する場合、酵素の基質特異性は、遺伝要素の光学特性から決定可能であり、誤った特異性をもつ（または全く特異性のない）遺伝子産物をコードするような遺伝要素に拒絶される。光学活性の変化を全く付与しないタグも、異なる光学特性をもつタグ特異的リガンドが添加される場合（例えば異なる蛍光プローブで標識されたタグ特異的抗体）には使用可能である。
【０２１７】
（ｉｖ）  調節についての選択
酵素の調節特性について選択するためには、類似のシステムを使用することができる。
【０２１８】
生化学プロセスの活性化因子または阻害物質として作用する調節分子についての選択の場合、生化学プロセスの構成要素を、各マイクロカプセル内でインサイチュで翻訳するかまたはマイクロカプセル化に先立ち反応混合物内に取込むことができる。選択対象の遺伝要素が活性化因子をコードすべきである場合、触媒作用に関連して上述した通り、調節された反応の生成物について選択を実施することができる。阻害物質が望まれる場合、選択は、調節された反応の基質に特異的な化学的特性について行なわれる。
【０２１９】
従ってここでは、所望の調節活性を示す遺伝子産物についてコードする１つ以上の遺伝要素を選別する方法であって、、
（１）  遺伝要素を発現してそのそれぞれの遺伝子産物を提供する工程；
（２）  選択可能な分子の生成または存続を可能にするような形で、所望の活性に従って、１つの生化学反応またはカップリングされた複数の一連の反応を遺伝子産物が活性化または阻害できるようにする工程；
（３）  ａ）  選択可能分子またはそれが誘導する基質を遺伝要素に付着させること、または
ｂ）  生成物上にとどまる基質に付着された適切な分子「タグ」を用いて遺伝要素に対して選択可能な生成物を反応または結合させる工程、または、
ｃ）  生成物特異的反応または生成物との相互作用を用いて、遺伝要素に触媒生成物（基質ではなく）をカップリングする工程；
のいずれかにより遺伝要素に対し選択可能な生成物を連結させる工程、および
（４）  その特徴的光学特性を用いてかまたは、生成物に特異的に結合するかまたは生成物と特異的に反応し、かくして遺伝要素の光学特性の変化を誘発する試薬を添加することによって、選択可能生成物をそれが結合している遺伝要素と共に選択する工程、を含む方法であって、工程（１）〜工程（３）で各々の遺伝要素およびそれぞれの遺伝子産物がマイクロカプセル内部に含まれている方法が提供されている。
【０２２０】
（ｖ）  遺伝子産物の光学特性についての選択
マイクロカプセル内で遺伝子産物が、例えば遺伝要素の一部であるリガンドに結合する遺伝子産物の共通要素を通して、遺伝要素に結合し戻った場合、遺伝子産物の固有の光学特性について選択することが可能である。遺伝要素をプールした後、次に、結合した遺伝子産物の光学特性を用いてこれらを選別することができる。この実施形態は、例えば、改善された蛍光性および／または新規の吸光および発光スペクトルで、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）の変異体を選択するために使用することができる（コールマック（Ｃｏｒｍａｃｋ）ら、１９９６年；ドラグラーブ（Ｄｅｌａｇｒａｖｅ）ら、１９９５年；エーリッヒ（Ｅｈｒｉｇ）ら、１９９５年）。
【０２２１】
（ｖｉ）  細胞を用いたスクリーニング
現行の薬物発見パラダイムにおいては、有効な組換え型標的がインビトロの高速大量処理スクリーニング（ＨＴＳ）検定の基礎を成している。しかしながら、単離された遺伝構造またはポリペプチドを、複雑な生体系を代表するものとみなすことはできない。従って、細胞ベースの系は、無傷の生体系の中での化合物活性に対する信頼性を高くすることができる。リード薬物のための広範囲の細胞ベースの検定が当業者にとって既知である。油中水型エマルジョンの微水滴といったようなマイクロカプセルに、細胞を区画化することができる（ガデシー（Ｇｈａｄｅｓｓｙ）、２００１年）。標的に対する化合物の効果は、遺伝要素と共にマイクロカプセルに細胞を区画化し、細胞に対する所望の効果をもつ遺伝要素を含むこれらの区画を同定するために適切な細胞ベースの検定を用いることにより、判定可能である。フッ化炭素中水型エマルジョンの使用が特に有用であり得る。フッ化炭素の高いガス溶解能力は、呼吸ガスの交換を支援することができ、又、細胞培養系にとって有益であることが報告されている（ルーヴ（Ｌｏｗｅ）、２００２年）。
【０２２２】
（ｖｉｉ）  フロー分析および選別
本発明の好ましい実施形態においては、マイクロカプセルは、フローサイトメトリーにより分析され、任意には選別される。マイクロカプセルの数多くのフォーマットがフローサイトメトリーを用いて分析され、任意には直接選別される。
【０２２３】
きわめて好ましい実施形態においては、マイクロカプセルのフロー分析そして任意にはフロー選別（フー（Ｆｕ）、２００２年）のためのマイクロ流体デバイスが使用されることになる。このような選別デバイスは、マイクロ流体デバイス上に直接組込むことができ、マイクロカプセルおよび／または遺伝要素を選別するために電子手段を使用し得る。選別を始動させるためにマイクロカプセルをスクリーニングするのに、同じくマイクロ流体デバイス上に直接組込まれた光学検出を使用することができる。マイクロ流体デバイス上には、電荷に加えてマイクロカプセルのその他の制御手段を内蔵することもできる。
【０２２４】
分析のために、および選別を始動させるために、光散乱（ケルカー、１９８３年）および蛍光偏光（ローランドら、１９８５年）を含めたさまざまな光学特性を使用することができる。きわめて好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学特性の差異は蛍光の差異となり、必要な場合には、マイクロ流体または従来の蛍光活性化細胞選別装置（ノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）、１９８０年；マッケンジー（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）およびピンダー（Ｐｉｎｄｅｒ）、１９８６年）または類似のデバイスを用いて、マイクロカプセルまたはマイクロビーズが選別されることになる。フローサイトメトリーには以下のような一連の利点がある：
（１）  定評のあるメーカー（例えばベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、サイトメーション（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ））製の蛍光活性化細胞選別デバイスは、毎秒最高１００，０００個のマイクロカプセルまたはマイクロビーズの速度での分析および選別を可能にする。
（２）  各々のマイクロカプセルまたはマイクロビーズからの蛍光シグナルは、存在する蛍光分子の数に密に対応する。マイクロカプセルまたはマイクロビーズ１個あたり数百個の蛍光分子という少量の分子を定量的に検出することができる。
（３）  蛍光検出器の広いダイナミックレンジ（標準的に４ｌｏｇ単位）は、選別手順のストリンジェンシーを容易に設定できるようにし、かくして出発プールからの最適な数のマイクロカプセルまたはマイクロビーズの回収が可能となる（実施中の選択に応じて小さい蛍光差をもつマイクロカプセルまたはマイクロビーズを分離するかまたは大きな蛍光差をもつマイクロカプセルまたはマイクロビーズのみを分離するようにゲートを設定できる）。
（４）  蛍光活性化細胞選別デバイスは、多数の波長で同時励起および検出を実施することができ（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）、１９９５年）、２〜１３個（またはそれ以上）の蛍光マーカーでのマイクロカプセルまたはマイクロビーズの標識を監視することにより正および負の選択を実施できるようにする。例えば、２つの交番標的のための基質が異なる蛍光タグで標識される場合、マイクロカプセルまたはマイクロビーズを、調節対象標的に応じて異なる蛍光プローブで標識することができる。
【０２２５】
マイクロカプセルまたはマイクロビーズが光学的にタグ付けされている場合、フローサイトメトリーを使用してマイクロカプセル内のまたはマイクロビーズ上にコーティングされた遺伝要素を同定することができる（以下参照）。光学タグ付けは同様に、マイクロカプセル内の試薬の濃度（複数の濃度が単一の実験内で使用されている場合）またはマイクロビーズ上にコーティングされた化合物分子の数（２つ以上のコーティング密度が単一の実験内で使用される場合）を同定するためにも使用可能である。さらに、光学タグ付けを使用してマイクロカプセル内の標的を同定することもできる（２つ以上の標的が単一の実験内で使用される場合）。この分析は、測定活動と同時に、マイクロビーズを含むマイクロカプセルの選別の後、またはマイクロビーズの選別の後に実施可能である。
【０２２６】
（ｖｉｉｉ）  マイクロカプセルの同定および選別
本発明は、利用中の選別技術によりそれが可能となっている場合には、無傷のマイクロカプセルの同定そして任意にはその選別を提供する。所望の遺伝要素によって誘発された変化がマイクロカプセルの表面で発生するかまたは現われるかまたはマイクロカプセルの外側から検出可能である場合、マイクロカプセルを同定し、任意にそのように選別することができる。変化は、遺伝子産物の直接的作用によってひき起こされてもよいし、または、所望の活性をもつ遺伝子産物がそのうちの１つに関与している一連の反応がその変化を導く間接的作用によってひき起こされてもよい。例えば、マイクロカプセルが膜形成性マイクロカプセルである場合、そのマイクロカプセルは、標的を含む生化学系のコンポーネントがその表面で表示され、かくしてマイクロカプセル内部の遺伝子産物によって調節される生化学系の中の変化を検出し得る試薬にアクセス可能であるような形で構成され得る。
【０２２７】
しかしながら、本発明の好ましい態様においては、マイクロカプセルの同定そして任意には選別は、マイクロカプセルの光学特性の変化、例えばその吸収または発光特性、例えばマイクロカプセルに付随する吸収、発光、リン光または蛍光の変化を導く反応の結果もたらされるマイクロカプセルの光学特性の改変に依存している。かかる特性は全て、「光学特性」という用語の中に含まれている。このような場合、マイクロカプセルを、発光、蛍光またはリン光活性化選別により同定しかつ任意には選別することができる。きわめて好ましい実施形態においては、マイクロカプセル内の蛍光分子の産生を結果としてもたらす所望の活性を有する遺伝子産物を含むマイクロカプセルを分析しかつ任意には選別するために、フローサイトメトリーを利用することができる。
【０２２８】
本発明の方法は、試薬を迅速に混合させることができ（２ｍｓ未満で）、従ってマイクロ流体ネットワーク内のマイクロカプセルの空間的に分解された光学画像が、各マイクロカプセル内の反応の時間分解測定を可能にする。マイクロカプセルは任意には、それが含む分子の回収およびさらなる分析または操作を可能にするため、マイクロ流体フロー選別デバイスを用いて分離可能である。有利には、フロー選別デバイスは電子的フロー選別デバイスであると思われる。かかる選別デバイスは、マイクロ流体デバイス上に直接一体化され得、かつ、マイクロカプセルを選別するために電子手段を使用することができる。同様にマイクロ流体デバイス上に直接組込まれた光学検出を用いてマイクロカプセルをスクリーニングし、選別を始動させることができる。電荷に加えて、マイクロカプセルを制御するその他の手段も同様に、マイクロ流体デバイス上に内蔵することができる。
【０２２９】
一変形実施形態においては、マイクロカプセル蛍光中の電荷が同定された場合、それは区画内部のマイクロビーズの修飾をひき起こすために使用される。本発明の好ましい態様においては、マイクロカプセルの同定は、マイクロカプセル内部の発光、リン光または蛍光を導く反応の結果としてもたらされるマイクロカプセルの光学特性の変化に依存している。マイクロカプセル内部のマイクロビーズの修飾は、発光、リン光または蛍光の同定によりひき起こされるものと思われる。例えば、発光、リン光および蛍光の同定が、光子（またはその他の粒子または波動）での区画のボンバードをひき起こし、これが、マイクロビーズまたはそれに付着した分子の修飾を導く。細胞の高速選別のための類似の手順が以前に記述されている（ケイジ（Ｋｅｉｊ）ら、１９９４年）。マイクロビーズの修飾は例えば、マイクロビーズに対し感光性保護基によりケージングされた分子「タグ」をカップリングさせることによってもたらされ得る。適当な波長の光子でのボンバードは、ケージの除去を導く。その後、全てのマイクロカプセルは組合わされ、マイクロビーズは１つの環境の中に一緒にプールされる。所望の活性を示す遺伝要素でコーティングされたマイクロビーズを、「タグ」に対し特異的に結合するかまたはそれと特異的に反応する分子を用いて親和性精製により選択することができる。
【０２３０】
（ｉｘ）  遺伝要素のフロー選別
本発明の好ましい実施形態においては、遺伝要素は、フローサイトメトリーにより選別されることになる。光散乱（ケルカー、１９８３年）および蛍光偏光（ローランドら、１９８５年）を含めたさまざまな光学特性を使用して、選別を始動することができる。きわめて好ましい実施形態においては、遺伝要素の光学特性の差異は、蛍光の差異となり、遺伝要素は蛍光活性化細胞選別装置（ノーマン、１９８０年；マッケンジーおよびピンダー、１９８６年）または類似のデバイスを用いて選別されることになる。このような選別デバイスは、マイクロ流体デバイス上に直接組込むことができ、遺伝要素を選別するために電子手段を使用し得る。選別を始動させるために遺伝要素をスクリーニングするのに、同じくマイクロ流体デバイス上に直接組込まれた光学検出を使用することができる。マイクロ流体デバイス上には、電荷に加えて遺伝要素のその他の制御手段を内蔵することもできる。特に好ましい実施形態においては、遺伝要素は、最適には直径０．６〜１．０μｍの非蛍光非磁性（例えばポリスチレン）または常磁性マイクロビーズからなり（フォルヌセク（Ｆｏｒｎｕｓｅｋ）およびヴェトヴィッカ（Ｖｅｔｖｉｃｋａ）、１９８６年参照）、これに対し、蛍光シグナルを生成するのに関与する基および遺伝子の両方が付着される：すなわち、
（１）  定評あるメーカー（例えばベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、コルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ））製の蛍光活性化細胞選別装置は、毎時最高１０８の遺伝要素（事象）の選別を可能にする；
（２）  各々のビーズからの蛍光シグナルは、ビーズに付着した蛍光分子の数に密に対応する。現在、一粒子あたり数百個という少量の蛍光分子を定量的に検出することができる。
（３）  蛍光検出器の広いダイナミックレンジ（標準的に４ｌｏｇ単位）は、選別手順のストリンジェンシーを容易に設定できるようにし、かくして出発プールからの最適な数の遺伝要素の回収が可能となる（実施中の選択に応じて小さい蛍光差をもつビーズを分離するかまたは大きな蛍光差をもつマビーズのみを分離するようにゲートを設定できる。
（４）  蛍光活性化細胞選別装置は、最高２つの異なる波長で同時励起を実施し、最高４つの異なる波長で蛍光を検出することができ（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）、１９８３年）、２個（またはそれ以上）の異なる蛍光マーカーでの遺伝要素の標識を監視することにより正および負の選択を同時に実施できるようにする。例えば、１つの酵素のための２個の代替的基質（例えば２つの異なるエナンチオマー）が異なる蛍光タグで標識される場合、使用される基質に応じて異なる蛍光プローブで遺伝要素を標識することができ、エナンチオ選択性をもつ酵素をコードする遺伝子のみが選択される。
（５）  非常に均等に誘導体化されたおよび誘導化されていない非磁性および常磁性／微小粒子（ビーズ）が数多くの供給源（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））から市販されている（フォルヌセクおよびヴェトヴィッカ、１９８６年）。
【０２３１】
（ｘ）  多段階手順
本発明に従うと、転写／複製および／または翻訳そして選択の全てのプロセスが、単一の工程で進められ、全ての反応が１つのマイクロカプセル中で起こることは必要でない。選択手順は２つ以上の工程を含み得る。最初に、遺伝要素ライブラリの各々の遺伝要素の転写／複製および／または翻訳が第１のマイクロカプセルの中で起こり得る。各々の遺伝子産物は次に、例えば抗体といったような遺伝子産物特異的リガンドを介して、（同じマイクロカプセル中に常在する）それをコードした遺伝要素に連結される。次に、マイクロカプセルは破壊され、そのそれぞれの遺伝子産物に付着した遺伝要素は任意に精製される。代替的には、カプセル化に依存しない方法を用いて、遺伝要素をそのそれぞれの遺伝子産物に付着させることができる。例えば、ファージディスプレイ法（スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｇ．Ｐ．、１９８５年）、ポリソームディスプレイ法（マテアキスら、１９９４年）、ＲＮＡ−ペプチド融合（ロバーツおよびショスタック、１９９７年）またはｌａｃリプレッサーペプチド融合（カル、ら、１９９２年）がある。
【０２３２】
手順の第２の工程では、その遺伝子産物に付着した各々の精製された遺伝要素が、選択されるべき反応の構成要素を含む第２のマイクロカプセル内に入れられる。次にこの反応が開始される。反応が完了した後、マイクロカプセルは再び破壊され、修飾された遺伝要素が選択される。数多くの個々の構成要素および反応工程が関与する複雑な多段階反応の場合には、最初の遺伝子産物を作り上げ遺伝要素に連結する工程と遺伝要素内で選択可能な変化を生成する最終工程の間で１つ以上の介入工程を実施することができる。
【０２３３】
必要な場合、二次的マイクロカプセル内部の遺伝要素からの遺伝子産物の放出を、結合部位に対する低分子量生成物による特異的競合、または酵素的（特異的プロテアーゼを用いる）または自己触媒作用的（インテグリンドメインを用いる）に触媒ドメインから遺伝子産物の結合ドメインに接合するリンカー領域を開裂させることを含めたさまざまな方法で達成することができる。
【０２３４】
（ｘｉ）  インサイチュでのレポータ遺伝子発現の活性化による選択
遺伝要素によりコードされた所望の結合、触媒または調節活性が、全てのマイクロカプセル内に存在する「レポータ遺伝子」の発現の活性化を導くように、システムを構成することができる。所望の活性をもつ遺伝子産物のみがレポータ遺伝子の発現を活性化する。レポータ遺伝子発現の結果としての活性は、本書に記述されている方法のいずれかにより遺伝要素（またはそれを含有する区画）の選択を可能にする。
【０２３５】
例えば、レポータ遺伝子の活性化は、「２ハイブリッドシステム」（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）およびソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９年）と類似する形で、遺伝子産物の結合活性の結果であり得る。活性化は、所望の遺伝子産物を触媒とする反応の生成物の結果でもあり得る。例えば反応生成物は、レポータ遺伝子の転写誘発因子であり得る。例えば、ａｒａＢＡＤプロモータから転写を誘発するためには、アラビノースを使用することができる。望ましい遺伝子産物の活性は同じく、転写因子の修飾を結果としてもたらし、レポータ遺伝子を発現させる結果となり得る。例えば、所望の遺伝子産物がキナーゼまたはホスファターゼである場合、転写因子のリン酸化または脱リン酸化がレポータ遺伝子発現の活性化を導き得る。
【０２３６】
（ｘｉｉ）  増幅
本発明のさらなる態様に従うと、本方法は、さらに遺伝要素の増幅工程を含む。所望の遺伝子産物をコードする遺伝要素について富化するための手段として、選択的増幅を使用することができる。
【０２３７】
上述の構成の全てにおいて、遺伝要素内に含まれる遺伝物質を増幅し、反復工程でプロセスを繰り返すことができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応による（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８８年）かまたは、Ｑｂレプリカーゼ増幅（カヒル、フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）およびマハン（Ｍａｈａｎ）、１９９１年；チェトヴェリンおよびスピリン、１９９５年；カタナエフ、クルナソフ（Ｋｕｒｎａｓｏｖ）およびスピリン（Ｓｐｉｒｉｎ）、１９９５年）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、１９８８年；バラニー（Ｂａｒａｎｙ）、１９９１年）；自己保持配列複製システム（フェイ、コー（Ｋｗｏｈ）およびジンジャラス（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）、１９９１年）および鎖置換増幅（ウォーカーら、１９９２年）を含めたその他のさまざまな遺伝子増幅技術の１つを用いることによって行なうことができる。有利には、マイクロ流体デバイス内で増幅を実施することができる。
【０２３８】
（Ｃ）  マイクロカプセル内の試薬の高速混合
有利には、マイクロカプセルの融合後、融合されたマイクロカプセルの中に含まれた試薬は、カオス的移流を用いて急速に混合可能である。液滴内部の流体の層流線を分断するチャンネルの中に液滴を通過させることにより、その中味を迅速に混合し、あらゆる化学的反応を完全に開始させることができる。
【０２３９】
（Ｄ）  マイクロカプセル特性の検知
本発明の或る態様においては、流体液滴の１つ以上の特性を判定できるようにする形で、流体液滴の１つ以上の特性および／または流体液滴を含む流体システム（例えば流体液滴を取り囲む液体）の一部分の１特性を検知および／または判定できるセンサーが提供されている。液滴に関して判定可能でありかつ本発明において使用可能である特性は、当業者が同定可能である。かかる特性の制限的意味の無い例としては、蛍光、質量分析（例えば光学、赤外線、紫外線など）、放射能、質量、体積、密度、温度、粘度、ｐＨ生物学的物質（例えばタンパク質、核酸など）といった均質の濃度、などが含まれる。
【０２４０】
一部のケースでは、センサーは、プロセッサに接続でき、このプロセッサが今度は、例えば前述の通りに、液滴を選別すること、液滴に電荷を印加または除去すること、液滴にもう１つの液滴を融合すること、液滴を分割すること、液滴内で混合を起こさせることなどにより、流体液滴に対する作業を実施させることができる。例えば、流体液滴のセンサー測定値に応えて、プロセッサは流体液滴を分割させ、第２の流体液滴と併合させ、選別させることなどができる。
【０２４１】
１つ以上のセンサーおよび／またはプロセッサを流体液滴とセンシング通信状態になるよう位置づけすることができる。本書で使用する「センシング通信」というのは、流体システム内（例えば１本のチャンネル内）の流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの一部分が何らかの形で検知および／または判定され得るように、センサーをどこかに位置づけすることができることを意味する。例えば、センサーは、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの一部分と、流動的に、光学的にまたは視覚的、熱的、空気圧的、電子的といった形でセンシング通信状態にあり得る。センサーは、流体システムの近くに位置づけされる、例えばチャンネルの壁の内部に埋込まれるかまたはこの壁に一体化して連結される、または流体システムと物理的、電気的および／または光学的に連絡しながら流体システムから分離して位置づけされ、かくして流体液滴および／または流体液滴を含む流体システム（例えばチャンネルまたはマイクロチャンネル、流体液滴を含む液体）の一部分を検知および／または判定することができるようになっている可能性がある。例えば、センサーは、液滴を含むチャンネルとのいかなる物理的連結も有していなくてよいが、赤外線、紫外線または可視光線といったような液滴または流体システムから生じる電磁放射線を検出するように位置づけされ得る。電磁放射線は、液滴により生成され得、かつ／または流体システムのその他の部分から（または流体システムの外部で）発生し、例えば吸光、反射、回折、屈折、蛍光、リン光、極性変更、位相変化、時間に関する変化などを通して、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの一部分と相互作用することができる。一例として、流体液滴および／または流体液滴を取り囲む液体に向かってレーザーを導くことができ、流体液滴および／または周囲の液体の蛍光を判定することができる。本書で使用する「センシング通信」は、直接的でも間接的でもあり得る。一例としては、流体液滴からの光をセンサーに導くこともできるし、または最初に光ファイバシステム、導波管などを通って導き、その後センサーへと導くこともできる。
【０２４２】
本発明において有用であるセンサーの限定的意味のない例としては、光学または電磁ベースのシステムが含まれる。例えば、センサーは、蛍光センサ（例えばレーザーにより刺激されるもの）、顕微鏡システム（これはカメラまたはその他の記録デバイスを内含し得る）などであり得る。もう１つの例としては、センサーは、電子センサー、例えば電場またはその他の電気的特性を判定できるセンサーであり得る。例えばセンサーは、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの一部分のキャパシタンス、インダクタンスなどを検出することができる。
【０２４３】
本書で使用される、「プロセッサ」または「マイクロプロセッサ」は、例えば数式または電子または計算回路を使用することによって（例えば上述の通りに）１つ以上のセンサーからシグナルを受信し、シグナルを記憶しかつ／または１つ以上の応答を導くことのできるあらゆるコンポーネントまたはデバイスである。シグナルは、例えば空気圧シグナル、電子シグナル、光シグナル、機械的シグナルなどといった、センサーが判定する環境因子を表わす適切なあらゆるシグナルであり得る。
【０２４４】
特定の限定的な意味のない例としては、本発明のデバイスは、１つ以上の細胞を含有する流体液滴を含み得る。１つ以上の遺伝子産物の所望の活性は結果として、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のための遺伝子といった「マーカー」遺伝子の発現（または発現阻害）をもたらし得る。細胞は、或る条件が存在した場合に結合する蛍光シグナルマーカーに曝露され得、例えばマーカーは第１の細胞型には結合するが第２の細胞型には結合しない可能性もあるし、発現されたタンパク質に結合する可能性もあり、細胞の生存能力を標示することもでき（すなわち細胞が生きているか死んでいるか）、細胞の発達または分化状態などを標示する可能性もあり、細胞は蛍光シグナルマーカーの有無および／または絶対値に基づいて本発明の流体システムを通って導かれ得る。例えば、蛍光シグナルマーカーの判定は、細胞をデバイスの１領域（例えば収集チャンバ）に導かせることができ、一方蛍光シグナルマーカーの不在は、細胞をデバイスのもう１つの領域（例えば廃棄チャンバ）に導かせる可能性がある。かくしてこの例では、細胞集団は、例えば生きた細胞、或るタンパク質を発現する細胞、或る細胞型などを選択するべく、細胞の１つ以上の判定可能なまたはターゲティング可能な特性に基づいて、スクリーニングおよび／または選別され得る。
【０２４５】
（Ｅ）  材料
本発明のマイクロ流体システムおよびデバイスの上述のコンポーネントのいずれかを形成するためには、本発明の或る態様に従ってさまざまな材料および方法を使用することができる。一部のケースでは、選択されたさまざまな材料が、さまざまな方法に役立つ。例えば、本発明のさまざまなコンポーネントを固体材料で形成させることができ、ここでは、マイクロマシニング、スピンコーティングおよび化学蒸着といったような膜蒸着プロセス、レーザー製造、フォトリソグラフィ技術、湿式化学またはプラズマプロセスを含めたエッチング方法などを介してチャンネルを形成させることができる。例えばＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、第２４８号４４〜５５頁、１９８３年（エンジェル（Ａｎｇｅｌｌ）、ら）を参照のこと。一実施形態においては、シリコンチップ内にフィーチャをエッチングすることにより、流体システムの少なくとも一部分がシリコンで形成される。シリコンを用いた本発明のさまざまな流体システムおよびデバイスの精確で効率の良い製造のための技術が知られている。もう１つの実施形態においては、本発明のシステムおよびデバイスのさまざまなコンポーネントが、例えばポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）、ポリテトラフルオロエチレン（「ＰＴＦＥ」またはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））などといったようなエラストマ重合体などの重合体で形成され得る。
【０２４６】
異なるコンポーネントを異なる材料で製造することができる。例えば、シリコンまたはＰＤＭＳといった不透明な材料から、底壁および側壁を含めた基底部分を製造し、流体プロセスの観察および／または制御のため、ガラスまたは透明な重合体といったような透明なまたは少なくとも部分的に透明な材料で上部部分を製造することができる。基底支持材料が精確な所望の官能基を有していない場合、内部チャンネル壁に接触する流体に所望の化学的官能基を曝露するべくコンポーネントをコーティングすることができる。例えば、内部チャンネル壁がもう１つの材料でコーティングされている状態で、例示されている通りにコンポーネントを製造することができる。本発明のシステムおよびデバイスのさまざまなコンポーネントを製造するために用いられる材料、例えば流体チャンネルの内部壁をコーティングするために用いられる材料は、望ましくは、流体システムを通って流れる流体に不利な影響を与えたりまたはそれによる影響を受けることのない材料、例えばデバイス内部で使用されるべき流体の存在下で化学的に不活性である材料の中から選択され得る。
【０２４７】
一実施形態においては、重合体および／または可とう性および／またはエラストマ材料から、本発明のさまざまなコンポーネントが製造され、成形（例えばレプリカ成形、射出成形、注型など）を介しての製造を容易にする硬化可能な流体で都合良く形成され得る。硬化可能な流体は、基本的に、流体ネットワーク内でおよびそれと共に使用するように考慮されている流体を含みかつ／または輸送する能力をもつ固体へと凝固するように誘発され得るか、または自然に凝固することのできるあらゆる流体であり得る。一実施形態においては、硬化可能な流体には、重合体液体または液体重合体前駆物質（すなわちプレポリマー）が含まれる。適切な重合体液体には、例えば熱可塑性重合体、熱硬化性重合体、またはその融点を超えて加熱されるかかる重合体の混合物が含まれ得る。もう１つの例としては、適切な重合体液体には、適切な溶媒中の１つ以上の重合体の溶液が含まれていてよく、かかる溶液は例えば蒸発などにより溶媒を除去した時点で固体重合体材料を形成する。例えば溶融状態からまたは溶媒蒸発により凝固され得るかかる重合体材料は、当業者にとっては周知のものである。その数多くがエラストマであるさまざまな重合体材料が適切であり、同様に、モールドマスターの一方または両方がエラストマ材料で構成されている実施形態について、モールドまたはモールドマスターを形成するためにも適している。かかる重合体の限定的意味のない例のリストには、一般的クラスのシリコーン重合体、エポキシ重合体、およびアクリラート重合体といった重合体が含まれる。エポキシ重合体は、一般にエポキシ基、１，２−エポキシドまたはオキシランと呼ばれる３員の環式エーテル基の存在を特徴としている。例えば、芳香族アミン、トリアジン、および脂環式主鎖に基づく化合物に加えて、ビスフェノールＡのジグリシジルエーテルを使用することができる。もう１つの例には、周知のノボラック重合体が含まれる。本発明に従って使用するのに適したシリコーンエラストマの限定的な意味のない例としては、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシランなどといったクロロシランを含む前駆物質から形成されたものが含まれる。
【０２４８】
１組の実施形態においては、例えばシリコーンエラストマポリジメチルシロキサンといったシリコーン重合体が好ましい。ＰＤＭＳ重合体の限定的な意味のない例としては、ミシガン州Ｍｉｄｌａｎｄのダウケミカル（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）により、Ｓｙｌｇａｒｄの商標名、特にＳｙｌｇａｒｄ１８２、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４およびＳｙｌｇａｒｄ１８６として販売されているものが含まれる。ＰＤＭＳを含めたシリコーン重合体は、本発明のマイクロ流体構造の製造を簡略化するいくつかの有益な特性を有する。例えば、かかる材料は廉価であり、容易に入手でき、熱による硬化を介してプレポリマー液体から凝固され得る。例えば、ＰＤＭＳは、約１時間といった曝露時間、約６５℃〜約７５℃の温度にプレポリマー液体を曝露することにより、標準的に硬化可能である。同様に、ＰＤＭＳといったようなシリコーン重合体は、エラストマであり得、かくして本発明の或る実施形態において必要である比較的高いアスペマクト比をもつ非常に小さいフィーチャを形成するために有用であり得る。この点において、可とう性（例えばエラストマ）モールドまたはマスターが有利であり得る。
【０２４９】
本発明のマイクロ流体構造といったような構造をＰＤＭＳといったシリコーン重合体から形成することの１つの利点は、かかる重合体が例えば空気プラズマといったような酸素含有プラズマに対する曝露により酸化され得、かくして酸化された構造はその表面その他の酸化されたシリコーン重合体表面またはその他のさまざまな重合体および非重合体材料の酸化された表面に対し架橋できる化学基を含有することになる、という点にある。かくして、コンポーネントを製造し、その後酸化させ、別の接着剤またはその他の封止（ｓｅａｌ）手段の必要なく、その他のシリコーン重合体表面または酸化されたシリコーン重合体表面と反応性をもつその他の基板の表面に対し基本的に不可逆的に封止させることができる。大部分のケースにおいて、封止は、シールを形成するのに補助的圧力を加える必要なく、酸化したシリコーン表面をもう１つの表面に接触させるだけで完成させることができる。すなわち、予備酸化されたシリコーン表面は、適切なあわせ面に対する接触接着剤として作用する。特定的には、自らに不可逆的に封止可能であることに加えて、酸化ＰＤＭＳといったような酸化シリコーンは、（例えば酸素含有プラズマに対する曝露を介して）ＰＤＭＳ表面に対し類似の要領で酸化された、例えばガラス、ケイ素、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス状炭素およびエポキシ重合体を含めた、それ自体以外の一範囲の酸化材料に対しても、不可逆的に封止され得る。本発明に関連して有用である酸化および封止方法は、全体的成形技術と同様、例えば本明細書に参照により援用されている「Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第７０号、４７４〜４８０頁、１９９８年（Ｄｕｆｆｙら）という表題の論文中という題の論文の中で記述されている。
【０２５０】
酸化シリコーン重合体から本発明のマイクロ流体構造（または内部流体接触表面）を形成することのもつもう１つの利点は、これらの表面が、（親水性内部表面が望まれる）標準的なエラストマ重合体の表面よりもはるかに親水性が高いものであり得るという点にある。かかる親水性チャンネル表面はかくして、標準的な未酸化エラストマ重合体またはその他の疎水性材料からなる構造が可能であるよりもさらに容易に水溶液で充てんされ加湿され得る。
【０２５１】
一実施形態においては、底面壁は、１つ以上の側壁または１つの上面壁またはその他のコンポーネントとは異なる材料で形成される。例えば、底面壁の内部表面は、シリコンウェーハまたはマイクロチップまたはその他の基板の表面を含み得る。その他のコンポーネントは、上述の通り、かかる代替的基板に封止され得る。異なる材料の基板（底面壁）にシリコーン重合体（例えばＰＤＭＳ）を含むコンポーネントを封止することが望まれる場合、基板を、酸化シリコーン重合体が不可逆的に封止できる材料の一群（例えば酸化されたガラス、ケイ素、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、エポキシ重合体、およびガラス状炭素の表面）の中から選択することができる。代替的には、別の接着剤、熱ボンディング、溶媒ボンディング、超音波溶接などの使用を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）当業者にとって明らかであると思れるその他の封止技術を使用することができる。
【０２５２】
本発明のさまざまな態様および実施形態が以下の実施例の中で例示されている。本発明の範囲から逸脱することなく、詳細の修正を行なうことが可能であることもわかるだろう。
【０２５３】
本文中で言及されている全ての文書は、本発明に参照により援用されている。
【実施例】
【０２５４】
実施例１：インビトロ区画化を用いた遺伝子の選別のためのマイクロ流体デバイス
マイクロ流体デバイスの概略的表示が、図１５に示されている。マイクロチャンネルを、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）（マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）およびホワイトサイズ、２００２年）での高速プロトタイプ製造を用いて矩形断面を伴って製造し、（ソングおよびイスマギロフ（Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ）、２００３年）の通りに疎水性にした。フローを駆動するには、シリンジポンプを使用した（ハーバード・アパレイタス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）ＰＨＤ、２０００還流ポンプ）。水溶液のためには、２７ゲージの取外し可能な針のついた２５０μｌ入りのハミルトン・ガスタイト（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｇａｓｔｉｇｈｔ）シリンジ（１７００シリーズ、ＴＬＬ）を、３０ゲージのテフロン管類（ウェイコ・ワイヤー・アンド・ケーブル（Ｗｅｉｃｏ  Ｗｉｒｅ  ａｎｄ  Ｃａｂｌｅ））と共に使用する。担体流体のためには、ハミルトン製の１つのハブ付き３０ゲージのテフロン針（ソングおよびイスマギロフ、２００３年）と共に、１ｍｌ入りのハミルトン・ガスタイトシリンジ（１７００シリーズ、ＴＬＬ）を使用する。担体流体は、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）中の９％（ｖ／ｖ）のＣ６Ｆ１１Ｃ２Ｈ４ＯＨである（ソングら、２００３年）。マイクロ流体デバイスは、一連の相互接続されたモジュールからなる。各モジュールは、特定の機能を有する。これらのモジュールには、液滴を生成する、液滴を融合する、液滴を混合する、液滴を反応させる、液滴を検出するおよび液滴を選別するモジュールが含まれる（図１６参照）。一実施例においては、異なる分子または異なる濃度の分子からなる液滴が作られる。液滴は最高１０４秒−１の速度で作られ、１．５％未満の多分散性および１μｍ〜１００μｍの範囲内のサイズで作られる。各々の液滴は第２組の反応物質を含む第２の液滴と融合され、急速に混合されて化学反応を開始する。この化学反応は、各液滴を遅延チャンネルの中で通過させることによって各液滴内で進行できるようになっている。次に各々の液滴は第２の組の反応物質を含むもう１つの液滴と融合され、その後第２の化学反応を開始させるべく急速に混合される。第２の反応が遅延モジュール内で進行した後、反応の結果は、光センサーまたはその他の形態の検出モジュールを用いて判定される。最終的に、所望の液滴は、光学検出モジュールからのシグナルに基づいて２つの集団内に選別され、一方の集団はさらなる処理のために保たれ、もう一方は廃棄される。これらのおよびその他のモジュールを、この組合せまたはその他の組合せで使用することができる。
【０２５５】
液滴発生モジュール：我々は、液滴を形成するためにフロー集束幾何形状を使用する。水流が１本のチャンネルから狭い狭窄を通して注入され、対抗伝搬する油流が、水流を流体力学的に集束させ、それが図１７Ａに示されている通りの狭窄を通過するにつれてそのサイズを削減する。この液滴発生器は、油中の水の均質な液滴の定常流を生成するフロー様式で作動させることができる。水滴のサイズは、油および水の相対的流速により制御され、粘性力が表面張力に打ち克って均質な液滴を作り出す。水の流速が速すぎる場合、オリフィスの中をより長い流体噴流が通過し、さらに下流側で液滴の形に崩壊する。これらの液滴はサイズがさほど均等でない。水の流速が低すぎる場合、オリフィス内の液滴崩壊は再び不規則になり、より広範囲の液滴サイズを生成する。この乳化技術は堅牢であるものの、それは、任意の既定の流速での１つのサイズの液滴の生成に制限され、この液滴サイズは概してチャンネルの寸法により決定される。その上、液滴生産のタイミングを制御することができない。
【０２５６】
我々は、電気的に対処可能な乳化システムを作り出すために電場を内蔵することによりこれらの制限を克服している。これを達成するために、我々は、図１７Ａに概略的に示されているように、水流に高圧を印加し、油水界面に荷電する。水流は導体として挙動し、一方油は絶縁体である。電気化学反応が、コンデンサのように流体界面に荷電する。スナップオフの時点で、界面上の電荷は、液滴上にとどまる。さらに、油または水の注入速度を変えることなく、液滴体積Ｖｄおよび周波数ｆをほぼ３ケタにわたり調整することができる。液滴サイズおよび周波数は、独立しておらず、むしろそれらの積は分散相の注入速度により決定されるＱｄ＝ｆＶｄ。液滴サイズは、図１７、Ｂ〜Ｅに示されているように、電場の強さの増大に従って減少する。３つの異なる流速についての印加電圧に対する液滴サイズの依存性は、図１７Ｆにまとめられている。低い印加電圧では、電場は無視できるほどの効果しかなく、液滴の形成は専ら表面張力と粘性流の間の競合によって駆動される。これとは対照的に、高い電場強度では、成長する滴に対する有意な付加的力が存在する、Ｆ＝ｑＥ（なお式中ｑは液滴上の電荷である）。液滴の界面はコンデンサとして挙動することから、ｑは印加電圧Ｖに正比例している。こうして力のＶ２依存性が導かれ、このことが、図１７Ｆに示されている印加電場の増大に伴う液滴サイズの減少を説明している。電場が過度に大きくなった場合、水流の荷電界面は強く荷電された滴によってはじかれる。これにより、生産は不安定になり液滴サイズの変動が増大する。
【０２５７】
電場により誘発された液滴形成によって提供される電子的制御は、さらなる貴重な利益をもたらす。すなわち、これにより、液滴中断の段階を生産サイクル内部で調整することが可能となるのである。これは、液滴が必要とされる瞬間においてのみ臨界的中断電場より高く電場を増大させることによって達成される。こうして、特定の場所への個々の液滴の到着と生産を精確に同期化するための便利な手段が得られる。
【０２５８】
液滴合体モジュール：あらゆる液滴ベースの反応−閉込めシステム内に不可欠な１つのコンポーネントは、化学反応を開始させるために２つ以上の試薬を組合せる液滴合体モジュールである。表面張力、界面活性剤安定化および排液力の全てが液滴の合体を妨害することから、これをマイクロ流体デバイス内で達成するのは著しく困難である。その上、液滴は、そのそれぞれのフローを規定する流線を横断しなくてはならず、合体のために精確な場所にたどりつくように完全に同期化されなくてはならない。
【０２５９】
静電電荷の使用は、これらの問題点を克服する。各液滴上に反対の正負符号の電荷を置き、電場を印加すると、それらを強制的に合体させることになる。一例として我々は、図１８Ａに素描されている、異なる組成と反対の電荷をもつ液滴を生成する２つの別々のノズルからなるデバイスを示している。液滴は２つの流れの合流点で統合される。形成時点で液滴に荷電するのに用いられる電極も同様に、液滴を強制して流線を横断させ、合体を導くために、電場を提供する。２本のノズルの構造におけるわずかな変動が結果として、電場の不在下でのその液滴生成の周波数と相にわずかな差異をもたらす。かくして、注入速度が同一でも、液滴のサイズは異なる。その上、液滴は正確に同時に合流点に到着しない。その結果、液滴は、図１８Ｂに示されているように合体しない。これとは対照的に、電場の印加時点で、液滴形成は正確に同期化された状態となり、同一サイズの液滴の対が各々合流点に確実に同時に到達するようにする。その上、液滴は、反対に荷電されており、これらを強制的に流線を横断させ互いに接触させ、かくして、図１８Ｃに示されている通り、これらを合体させる。液滴形成の驚くべき同期化は、電場により媒介されるような液滴の各々の中断をカップリングさせる結果もたらされる。電場の絶対値は２つの液滴の前縁間の離隔距離が変わるにつれて変動し、液滴中断の周波数は、電場にモードロックされる。おそらくは界面活性剤コーティングの安定化効果を理由として、液滴を合体させるためには最小の電荷が必要とされる。このことは、実際に合体する互いに接触した滴の百分率の電圧依存性を示す図１８Ｄから明らかである。
【０２６０】
液滴ミキサーモジュール：並進運動と回転の連続的反復を通してか、図１９、またはフロー方向に平行な方向に沿って滴を合体させることによって、図２０、高速混合が達成される。
【０２６１】
液滴反応器／時間遅延モジュール：反応のための定時間を提供するために使用される。いかにしてこれが達成できるかの２つの限定的意味のない例は「単一ファイル」と「大断面」チャンネルである。「単一ファイル」遅延ラインは、定められた反応時間を達成するために長さを用いる。これによると例外的に長いチャンネルが結果としてもたらされることが多いことから、担体油と水滴の両方と非混和性である第３の流体のスペーサ液滴を水滴対の間に置くことが望ましい。このとき担体油内の水性と非水性液滴の間に交番が存在する。このことは図２１Ａに示されている。長い時間的遅延を達成するための第２の可能性は、液滴の平均速度を低くするため「大きな断面積」をもつ広く深いチャンネルを使用することである。この例は図２１Ｂに示されている。
【０２６２】
再荷電モジュール：試薬を組合わせ混合するための反対に荷電された液滴および電場の使用はきわめて堅実なことであり、１００％の液滴が反対の流れからのそのパートナーと合体する。しかしながら、これらが合体した後、結果としての液滴はいかなる静電電荷も担持していない。形成中に液滴に荷電するのは便利であるが、さらなる処理のために必要とされる場合、混合した液滴に再荷電するため、いずれかの堅牢な液滴ベースのマイクロ流体システムの中でその他の方法を利用しなければならない。これは、中性液滴を分極する電場の存在下で中性液滴を分割しその結果２つの相対する電荷をもつ娘液滴をもたらすために伸長流を使用することによって容易に達成される。これは、図２２Ａに素描されている。図２２Ｂの中の顕微鏡写真は、分岐に入り荷電娘液滴へと分割する中性液滴を示す。図２２Ｂの破線領域は、電場内の荷電液滴の非対称素描を示すため、図２２Ｃで拡大されている。垂直破線は、液滴がその対称な球形形状に戻る電極の縁部を表わしている。電場は同様に、液滴分割の精密制御をも可能にし、同一試薬の２つ以上のアリコートへの中味の分割を可能にして同じマイクロ反応器の中味についての多数の検定を容易にする堅牢な液滴分裂モジュールのための基礎を提供している。
【０２６３】
検出モジュール：検出モジュールは、図２３に素描されているように、光ファイバ、１つ以上のレーザー、１つ以上の二色性ビームスプリッタ、帯域通過フィルター、および１つ以上の光電子増倍管（ＰＭＴ）で構成されている。
【０２６４】
選別モジュール：個々の液滴の中味は、プローブ探査されなくてはならず、選択された液滴は個々の流れに選別されなくてはならない。液滴の静電荷電の使用は、精確に制御され得、高周波数で切替えされ得かつ可動部分を全く必要としない選別用手段を提供する。液滴上の静電電荷は、外部電場への電荷の線形カップリングに基づく滴毎の選別を可能にする。一例としては、担体流体の流れを等分割するＴ字形接合分岐が同様に、図２４Ａに示される通り、２つの流れへと液滴集団を無作為に等分割する。しかしながら、分岐点に印加される小さな電場は、どのチャンネルにその液滴が入るかを精確に指図する。電極構成の概略図が図２４Ｂに示されている。電場の方向を変動させることになり、図２４Ｃおよび２４Ｄに示されている通り、選別された液滴の方向が変動する。液滴に付与され得る大きな力、および高い切替え周波数がこれを、可動部分の全く無い高速かつ堅牢な選別エンジンにしている。かくして処理速度は、液滴発生速度によってのみ制限される。
【０２６５】
実施例２．  マイクロ流体デバイス内の水滴内部の□−ガラクトシダーゼ活性に基づく突然変異体ｌａｃＺ遺伝子のプール由来のｌａｃＺ遺伝子の富化
実施例１で記述されたマイクロ流体デバイスを用いて水滴を作り操作することにより、遺伝子プールから所望の活性をもつ酵素をコードする単一遺伝子をいかに選択できるかの一例が示されている。（１）（ａ）カップリングされたインビトロ転写／翻訳システムおよび（ｂ）遺伝子を含む液滴を形成すること；（２）液滴（ａ）および（ｂ）を融合させて、組合された液滴（ｃ）の大部分が１液滴あたり１個以下の遺伝子を含むような形で遺伝子の濃度で翻訳を開始すること；（３）翻訳を可能にするためマイクロ流体チャンネルを下に向かって組合された液滴（ｃ）を通過させること；（４）翻訳阻害物質（ピューロマイシン）および蛍光発生基質、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）を含む液滴（ｄ）と各々の液滴（ｃ）を融合させること；（５）触媒作用を可能にするべくマイクロ流体チャンネルを下に向かって組合された液滴（ｅ）を通過させることおよび；（６）液滴の蛍光を監視することにより、突然変異ｌａｃＺ遺伝子のプールから活性β−ガラクトシダーゼ酵素についてコードするｌａｃＺ遺伝子が選択できることが実証されている。水滴内に存在する遺伝子が活性□−ガラクトシダーゼ酵素についてコードする場合、区画内のＦＤＧは蛍光性生成物フルオレセインへと転換されることになる（励起４８８ｎｍ、発光５１４ｎｍ）。単一の選択ラウンドの後、ｌａｃＺ遺伝子は、遺伝子混合物から１００倍以上富化され得る。
【０２６６】
ＤＮＡ調製
□−ガラクトシダーゼについてコードするｌａｃＺ遺伝子は、プライマＧＡＬＢＡおよびＧＡＬＦＯ（ＧＡＬＢＡ：５’−ＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ−３’；ＧＡＬＦＯ：５’−ＡＣＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧ−３’）を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＢＬ２１菌株から単離されたゲノムＤＮＡから増幅される。ＰＣＲ生成物を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州、米国）で消化する。消化したＤＮＡをゲル精製し、同じ酵素で消化されるベクターｐＩＶＥＸ２．２ｂ（ロシュバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）へとライゲートさせる。ライゲーション生成物をＸＬ−１０ｇｏｌｄ細胞に形質転換させる（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））。ミニ培養を、一晩３７℃で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンで補足した３ｍｌのＬＢ培地内で５つの単一コロニーから成長させる。これらの一晩培養からプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を単離し、正しいインサートの存在について配列決定する。鋳型としての（適正なｌａｃＺ配列を含む）配列決定済みクローンからのｐＤＮＡおよびプライマＬＭＢ２−１０Ｅ（５’−ＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＴＣＣ−３’）およびＰＩＶＢ−４（５’−ＴＴＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＴ−３’）を用いて、ＰＣＲにより線形ＤＮＡ構成体を生成する。
【０２６７】
内部フレームシフトを有し従って活性β−ガラクトシダーゼをコードしない全長突然変異体ｌａｃＺ（ｌａｃＺ突然変異）を、制限酵素ＳａｃＩ（ＮＥＢ）でｐＩＶＥＸ２．２ｂ−ＬａｃＺを切断することによって獲得する。消化されたＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ）およびｄＮＴＰｓ（５００μＭの最終濃度）と共に１２℃で１５分間インキュベートすることによって平滑化する。１０ｍＭの最終濃度までＥＤＴＡを添加し２０分間７５℃まで加熱することにより反応をクエンチングする。平滑化したＤＮＡを精製し、２２℃で２時間インキュベートすることにより、５％ＰＥＧ４，０００の存在下でＴ４ＤＮＡリガーゼ（１ワイスユニット）でセルフライゲートさせる。ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ細胞に直接ｐＤＮＡを形質転換させる。一晩３７℃で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンで補足された３ｍｌのＬＢ培地中で５つの単一コロニーからミニ培養を成長させ、プラスミドＤＮＡを単離させる。ＳａｃＩでｐＤＮＡを消化し、上述の通り線形ＤＮＡ構成体を生成するために内部ＳａｃＩ部位が欠如したクローンの１つを用いる。
【０２６８】
マイクロ流体システム内の水滴内部のインビトロ転写および翻訳
ヌクレアーゼを含まない水の中でそれぞれ１：５、１：１００および１：１０００のモル比でＬａｃＺおよびｌａｃＺｍｕｔ線形ＤＮＡを混合する。
【０２６９】
メーカーのプロトコルに従って、市販のインビトロ翻訳システム（ＥｃｏＰｒｏＴ７、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）／ＥＭＤバイオサイエンシーズ（ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ｌｔｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウイスコンシン州、米国）を使用する。実施例１で記述したデバイスを用いて、平均直径１０μｍ（５２０ｆｌ体積）の液滴にＥｃｏＰｒｏＴ７抽出物を区画化する。ヌクレアーゼを含まない水の中で０．６７ｍＭのＬ−メチオニンおよび０．２５ｍＭの７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））（励起３８６ｎｍ、発光４４８ｎｍ）および０．７５ｐＭのＤＮＡ（上述の比率のＬａｃＺおよびｌａｃＺｍｕｔ線形ＤＮＡの混合物）を含む平均直径７．４μｍ（２２０ｆｌ体積）の液滴（ｂ）を形成させる。液滴は、ペルフルオロ油からなる担体流体中で形成され、ペルフルオロ化油（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｏｉｌ）は、実施例１で記述された混合物または代替的に３Ｍ（商標）Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）液体の１つのいずれかで構成され得る。各々の液滴（ａ）を液滴（ｂ）と融合させる。ＤＮＡの濃度は、組合された液滴（ｃ）の大部分が液滴１個あたり１個以下の遺伝子を含むようなものである（液滴１個あたりの遺伝子の平均数＝０．１）。ポワソン分布に従うと、Ｐ（ａ）＝ｅ−ｍ［ｍａ／ａ！］であり、ここでｍ＝０．１＝１液滴あたりの遺伝子の平均数であり、Ｐ（ａ）＝１液滴あたりａ個の遺伝子を見出す確率であり、９０．５％の液滴はいかなる遺伝子も含まず、９．０５％は１個の遺伝子を含み、０．４５％は２個の遺伝子を、そして０．０１６％は３個以上の遺伝子を含む）。組合された液滴（ｃ）を、インビトロ転写および翻訳を可能にするべく３０分間３０℃に保たれたマイクロ流体チャンネルを下向きに通過させる。
【０２７０】
□−ガラクトシダーゼ活性についてのスクリーニングおよび選択
翻訳工程の後、直径１１．２μｍ（７４０ｆｌ体積、液滴（ｃ）と体積が等しい）で水中４ｍＭでピューロマイシン（翻訳を停止させるため）および１ｍＭのＦＤＧ（分子プローブ）を含む一連の液滴（ｄ）。各液滴（ｃ）を、翻訳を停止させ触媒反応を開始するべく液滴（ｄ）と融合させる。組合された液滴（ｅ）を、触媒作用を可能にするべく１０分間３０℃で保持されたマイクロ流体チャンネル内を下向きに通過させる。液滴の蛍光を監視する。全ての液滴は、その同定を可能にする７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸を含む。個々の液滴からの蛍光シグナルの監視は、光ファイバを通して液滴に対し励起および蛍光シグナルの両方をカップリングすることで達成される。励起二色性ビームスプリッタのためには、２つのダイオードレーザー（３６３ｎｍおよび４８８ｎｍ）からの連続波発出を用い、光電子増倍管で測定されるようなフルオレセイン蛍光および７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸蛍光を検出するべく蛍光発光を隔離するためには、帯域通過フィルタ（４５０±２０ｎｍおよび５３０±２０ｎｍ）を使用する。最高のフルオレセイン蛍光をもつ液滴を（液滴の集団の０．０５％未満がＤＮＡ無しの負の対照を形成するような形でセットされた選別ゲートで）選別する。各々の選別について、１０，０００個の液滴を収集する。
【０２７１】
選別された液滴からのＤＮＡ回収
担体としての２０μｇのグリコーゲン（ロシュバイオケミカルズＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）の存在下でｐＨ５．２の０．３Ｍの酢酸ナトリウム１００μｌと７０μｌのイソプロパノールを添加することにより、選別された液滴からのＤＮＡを沈殿させる。４℃で１５分間、２０，０００×ｇでの遠心分離によりＤＮＡをペレット化する。沈殿させたＤＮＡを７０％のエタノール１００μｌで２回洗浄し、ＤＮＡペレットをＳｐｅｅｄｖａｃ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））を用いて乾燥させる。１０μｌのヌクレアーゼを含まない水の中でＤＮＡを再度懸濁させる。
【０２７２】
回収したＤＮＡのＰＣＲ増幅
メーカーのプロトコル（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って緩衝液１と共に伸長鋳型（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ）  ＰＣＲミックスを用いて、合計体積５０μｌでＰＣＲ反応をセットする。プライマ（ＬＭＢ２−１１Ｅ（５’−ＧＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＧＧ−３’）およびＰＩＶＢ−８（５’−ＣＡＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡ−３’））を、各々３００μＭの濃度で使用する。９４℃で２分間反応をインキュベートし、その後、９４℃、１５秒；５５℃、３０秒；６８℃、２分で１０サイクル、１０秒／サイクルの延長時増分でさらに２２サイクルそして６８℃で７分間の最終インキュベーション工程に付す。
【０２７３】
ＰＣＲ産物のＳａｃＩ消化
ＬａｃＺ  ＤＮＡとｌａｃＺｍｕｔ  ＤＮＡを区別することができるように、２０ＵのＳａｃＩ酵素で、精製済みＰＣＲ生成物を消化させる。ＳａｃＩはｌａｃＺ遺伝子を切断するがｌａｃＺｍｕｔを切断しない。ＳａｃＩ酵素を熱不活性化（６５℃で１５分）させ、消化済みＤＮＡ５μｌをＴＡＥ中の１％のアガロースゲル上にロードする。５Ｖ／ｃｍでＤＮＡを電気泳動させる。臭化エチジウムで染色することでＤＮＡを視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬゲル分析ソフトウェア（アマーシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて定量化する。
【０２７４】
活性β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）をコードする遺伝子を、テストしたｌａｃＺ；ｌａｃＺｍｕｔの全ての比率で不活性β−ガラクトシダーゼとコードする突然変異体遺伝子（ｌａｃＺｍｕｔ遺伝子）のプールから著しく富化させる。０．１％のｌａｃＺ遺伝子という初期遺伝子濃度で、単一の選択ラウンドで、ｌａｃＺ遺伝子を１００倍超富化させることができた。
【０２７５】
実施例３：マイクロ流体デバイス内の水滴中の遺伝子の区画化を用いて、進化したβ−ガラクトシダーゼ（Ｅｂｇ）のランダム突然変異誘発ライブラリから改良型β−ガラクトシダーゼ活性をもつ突然変異体を選択することができる。
１つの生体内の新規酵素機能の進化を研究するためのモデルとして、進化したβ−ガラクトシダーゼ（Ｅｂｇ）についてコードする遺伝子を使用することが多い。大腸菌の野生型ｅｂｇＡ遺伝子は弱々しいβ−ガラクトシダーゼ活性をもつ酵素をコードするが、ｅｂｇＡは、糖ラクトースおよびラクツロース上の成長のためｌａｃＺ遺伝子に置換わるのに充分な活性を進化させる潜在性を有している。これらの突然変異体の遺伝分析は、わずか２つのアミノ酸交換がβ−ガラクトシダーゼ活性の劇的な増加を説明している、ということを明らかにした。
【０２７６】
ここで我々は、ｅｂｇ遺伝子のランダム突然変異誘発ライブラリを作り上げ、実施例１で記述したマイクロ流体デバイスを用いて水滴を作り操作することによるβ−ガラクトシダーゼ活性についての選択にこれらを付すことで、インビトロで類似の突然変異体を得ることができるということを示している。
【０２７７】
塩基類似体を用いたＥｂｇＡＣのエラープローン突然変異誘発（Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
進化したβ−ガラクトシダーゼ酵素のＡドメインおよびＣドメインについてコードする遺伝子セグメントを、プライマＥｂｇＡＣＦｗ（５’−ＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＧＡＡＴＣＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＧＣ−３’）およびＥｂｇＡＣＢｗ（５’−ＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＧ−３’）を用いて大腸菌菌株ＢＬ２１のゲノムＤＮＡから増幅させる。制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩＩおよびＳａｃＩ（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ生成物をベクターｐＩＶＥＸ２．２ｂ内にクローニングする。ＤＮＡをＸＬ１０−ｇｏｌｄ細胞へとトランスフェクトし、正しいヌクレオチド配列をもつＥｂｇＡＣ遺伝子構成体の存在について単一コロニーをスクリーニングする。基本的にザッコロら、（Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ、第２５５（４）号、５８９〜６０３頁、１９９６年）により記述されているようにヌクレオシド類似体を用いてランダム突然変異誘発ライブラリを生成するための鋳型として、正しいＥｂｇＡＣ遺伝子配列をもつ単一クローンからのｐＤＮＡを使用する。それぞれ２ｍＭと１０ｍＭの濃度でＰＣＲグレードの水の中で、６−（２−デオキシ−ｂ−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド−［４，５−Ｃ］［ｌ，２］オキサジン−７−オン（ｄＰＴＰ）の５’−トリホスファートと８−オキソ−２’デオキシグアアノシン（８−オキソｄＧ）の混合物を調製する。この塩基類似体ミックスを、合計反応体積５０μｌでＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（５００μＭ）、伸長鋳型ＰＣＲポリメラーゼ酵素ミックス（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））、プライマＬＭＢ２−９Ｅ（５’−ＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣ−３；５００ｎＭ’）および３重ビオチニル化プライマＰＩＶＢ−１（５’−３Ｂｉ−ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴＴＴＣＴ−３’；５００ｎＭ）を含有する伸長鋳型ＰＣＲ緩衝液１（ロッシュ）の中で１６７倍および３３３倍に希釈する。５ナノグラムのｐＩＶＥＸ２．２ｂ−ＥｂｇＡＣＤＮＡを添加し、試料を、９４℃で２分を１サイクル、それに続く９４℃で１分；５０℃で１分；６８℃で４分の３サイクルそしてそれに続いて６８℃で７分の最終伸長に付す。Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製する前に、ＤＮＡに対し１０マイクログラムの分子生物学グレードのグリコーゲンを添加する。精製の後、５０μｌのＰＣＲグレードの水中でＤＮＡを回収する。１０マイクログラムのストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ（ダイナビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ)Ｍ−２８０ストレプタビジン、ダイナルバイオテク（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）をビーズを含む２倍の結合緩衝液中で洗い流し、５０μｌの２倍結合緩衝液中に再懸濁させ、精製済みＤＮＡに添加する。ビーズとＤＮＡを２．５時間、回転するデバイスの中で室温でインキュベートする。ビーズを磁石で収集し、ビーズの備わったｉｓｈ緩衝液で２回、そしてＰＣＲグレードの水で２回洗い流す。最終的に２５μｌの水中でビーズを再懸濁させる。第２のＰＣＲ反応（９４℃で１５秒、５５℃で３０秒そして６８℃で２分の２５サイクル）では、鋳型として５μｌのビーズ結合ＤＮＡを使用する。Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いてＰＣＲ生成物を精製し、５０μｌのＰＣＲグレード水中で回収する。
【０２７８】
マイクロ流体システムを用いた反復的インビトロ選択ラウンド
生成されたｅｂｇＡＣランダム突然変異誘発ライブラリを２回の連続する選択ラウンドに付す。各々の選択ラウンドは次の７つの別々の工程から成っていた：（１）（ａ）カップリングされたインビトロ転写／翻訳システムおよび（ｂ）遺伝子を含む液滴を形成する工程；（２）組合された液滴（ｃ）の大部分が１液滴あたり２個以上の遺伝子を含まないような遺伝子濃度で翻訳を開始させるべく液滴（ａ）および（ｂ）を融合させる工程；（３）翻訳を可能にするべくマイクロ流体チャンネルを下向きに、組合せられた液滴（ｃ）を通過させる工程；（４）翻訳阻害物質（ピューロマイシン）および蛍光発生基質、フルオレセインシガラクトシド（ＦＤＧ）を含む液滴（ｄ）と各液滴（ｃ）を融合させる工程；（５）触媒作用を可能にするべくマイクロ流体チャンネルを下向きに、組合された液滴（ｅ）を通過させる工程；（６）液滴の蛍光を監視する工程（水滴中に存在する遺伝子が活性β−ガラクトシダーゼ酵素についてコードする場合、区画内部のＦＤＧは、蛍光生成物フルオレセイン（励起４８８ｎｍ、発光５１４ｎｍ）へと転換されることになる）そして（７）選択された２重発光液滴からの遺伝子の回収および増幅。手順全体は、以上で詳述されている（実施例２）。後続する選択ラウンドについてはネスト化されたプライマが使用される（表１）。
【０２７９】
【表１】
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【０２８０】
各々の選択ラウンドの後、Ｅｂｇライブラリ内部の陽性液滴の数を少なくとも１０倍だけ増大させる。
【０２８１】
Ｅｂｇライブラリの単一成員のβ−ガラクトシダーゼ活性の特徴
第２の選択ラウンドの後、標準イソプロパノール沈殿により２重エマルジョンからＤＮＡを回収し、プライマＬＭＢ２−１１およびＰＩＶＢ−１１を用いてＰＣＲ増幅する。増幅したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＳａｃＩＩで消化し、同じ酵素で消化されるｐＩＶＥＸ２．２ｂ内にクローニングする。ライゲーション生成物を電気泳動法（１７ｋＶ／ｃｍ、６００Ω、２５μＦ）によりＥｌｅｃｔｒｏ  Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞（ストラテジーン(Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ)）内に形質転換させ、アンピシリンでＬＢ寒天平板上に固定させる。プライマＬＭＢ２−１０ＥおよびＰＩＶＢ−４を用いてコロニーＰＣＲにより単一コロニーからＥｂｇ遺伝子構成体を増幅する。１４μｌのＩＶＴミックス（２００μＭのＬ−メチオニンで補足された（ノヴァゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＰｒｏＴ７抽出物）に１マイクロリットルのＰＣＲ生成物を添加し、３０℃で９０分間インキュベートする。４０マイクロリットルの基質溶液（ｐＨ７．９の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ中２５０μＭのＦＤＧ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）を添加し、フルオレセインへのＦＤＧの転換を３７℃で９０分間４５秒毎に監視する。
【０２８２】
スクリーニングされたクローンは、多様なβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。最高５０％のコロニーが、野生型Ｅｂｇに匹敵するかまたはそれより低いβ−ガラクトシダーゼ活性を有する。最高１２．５％のクローンがホール（Ｈａｌｌ）ら、（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、第１７４（１）号、１〜８頁、１９９９年；Ｇｅｎｅｔｉｃａ、第１１８（２−３）号、１４３〜５６頁、２００３年）により記述されたクラスＩおよびクラスＩＩの突然変異体（単一点突然変異）に匹敵するβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。結論として、ここで記述されたシステムは、大きい遺伝子ライブラリからの改良型β−ガラクトシダーゼ活性をもつｅｂｇ変異体の選択のために使用可能である。
【０２８３】
参考文献
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０２８４】
以上の明細書中で言及されている全ての刊行物および前記刊行物中で引用されている参考文献は、本明細書に参照により援用されるものである。本発明の記述された方法およびシステムのさまざまな修正および変形形態が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかになることであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記述されてきたが、請求されている通りの本発明がかかる特定の実施形態に不当に制限されるべきものではないということを理解すべきである。実際、分子生物学またはそれに関係する分野の当業者にとって明白である本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は上記特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
0005903067.tif 000040
【図１０ａ】
0005903067.tif 000041
【図１０ｂ】
0005903067.tif 000042
【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
0005903067.tif 000044
【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
0005903067.tif 000048
【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１２ｈ】
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【図１２ｉ】
0005903067.tif 000056
【図１２ｊ】
0005903067.tif 000057
【図１３ａ】
0005903067.tif 000058
【図１３ｂ】
0005903067.tif 000059
【図１３ｃ】
0005903067.tif 000060
【図１３ｄ】
0005903067.tif 000061
【図１４ａ】
0005903067.tif 000062
【図１４ｂ】
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【図１５】
0005903067.tif 000064
【図１６】
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【図１７】
0005903067.tif 000066
【図１８】
0005903067.tif 000067
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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