(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス毒素と、
１又は２以上の正に荷電した有効基が共有結合した、ポリリジン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である正に荷電したポリマー性の骨格を含む正に荷電した担体と、
ポロクサマーと、
皮膚科学的又は薬学的に許容される賦形剤、媒体、又は媒質
とを含む製剤であって、
前記１又は２以上の正に荷電した有効基が、保護されたオリゴアルギニン又はＴＡＴドメインのいずれかであり、
前記ボツリヌス毒素が、前記正に荷電したポリマー性の骨格と共有結合しておらず、
前記正に荷電したポリマー性の骨格が、前記ボツリヌス毒素の経皮送達のための唯一の必要な作用剤である、ボツリヌス毒素の局所塗布及び経皮送達のための製剤。
【請求項２】
正に荷電したポリマー性の骨格が、２１，０００Ｄａ未満の分子量を有する請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
正に荷電したポリマー性の骨格が、ポリリジンである請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
粘度調節剤をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
粘度調節剤が、ヒドロキシプロピルセルロースである請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
１又は２以上の正に荷電した有効基が、(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q、及び(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q（下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜２０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項３に記載の製剤。
【請求項７】
１又は２以上の正に荷電した有効基の少なくとも１つが、アミノ酸配列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q（下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜２０の整数である）からなる請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
１又は２以上の正に荷電した有効基の少なくとも１つが、アミノ酸配列(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q（下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜２０の整数である）からなる請求項６に記載の製剤。
【請求項９】
１又は２以上の正に荷電した有効基の少なくとも１つが、アミノ酸配列(gly)ｐ-RKKRRQRRR-(gly)q（下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜２０の整数である）からなる請求項６に記載の製剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の製剤、及びボツリヌス毒素を皮膚に送達するデバイスを含む、ボツリヌス毒素の経皮送達のためのキット。
【請求項１１】
それを必要とする患者の皮膚の領域への局所塗布のために製剤化された、請求項１〜９のいずれかに記載の製剤を含む、しわを治療するために使用される医薬組成物。
【請求項１２】
それを必要とする患者の皮膚の領域への局所塗布のために製剤化された、請求項１〜９のいずれかに記載の製剤を含む、多汗症を治療するために使用される医薬組成物。
【請求項１３】
皮膚の領域への局所塗布が、顔、前頭部、首、手又は足にされる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
皮膚の領域への局所塗布が、腋窩、前頭部、背部、胸部、手掌、手の遠位部、足の甲又は足の足底部にされる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
筋肉の麻痺；分泌過多若しくは発汗の軽減；神経性疼痛、偏頭痛、しわ若しくは多汗症の治療、筋痙攣の軽減、ざ瘡の予防若しくは軽減；及び免疫応答の低下若しくは増強の１又は２以上から選択される生物学的効果を生じさせる薬剤の製造における請求項１〜９のいずれかに記載の製剤の使用。
【請求項１６】
正に荷電したポリマー性の骨格が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
正に荷電したポリマー性の骨格が、１０，０００〜１，５００，０００の分子量を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の製剤。
【請求項１８】
正に荷電したポリマー性の骨格が、２５，０００未満の分子量を有する、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜８の整数である、請求項６〜９のいずれかに記載の製剤。
【請求項２０】
下付き文字ｐ及びｑは各々独立に２〜５の整数である、請求項６〜９のいずれかに記載の製剤。
【請求項２１】
１又は２以上の正に荷電した有効基が、全担体重量の少なくとも０．０５重量％を含む、請求項１９又は２０に記載の製剤。
【請求項２２】
１又は２以上の正に荷電した有効基が、全担体重量の０．１〜３０重量％を含む、請求項１９又は２０に記載の製剤。
【請求項２３】
皮膚科学的又は薬学的に許容される賦形剤、媒体、又は媒質が、水溶性の希釈剤である、請求項１〜９、及び１６〜２２のいずれかに記載の製剤。
【請求項２４】
水溶性の希釈剤が、食塩溶液である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
分配剤をさらに含む、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２６】
分配剤が、エタノールである、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
正に荷電した担体及びボツリヌス毒素が、食塩溶液中に担体０．５μｇ／毒素１００Ｕに相当する量で存在し、前記食塩溶液が、さらに１５％のポロクサマーを含む、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２８】
１又は２以上の正に荷電した有効基が、前記１又は２以上の正に荷電した有効基のＣ末端又はＮ末端のいずれかを介して正に荷電したポリマー性の骨格に結合している、請求項１〜９、及び１６〜２７のいずれかに記載の製剤。
【請求項２９】
ボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧから選択される、請求項１〜９、及び１６〜２８のいずれかに記載の製剤。
【請求項３０】
ボツリヌス毒素が、血清型Ａである、請求項２９に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年３月３日に出願した米国特許仮出願第６０／６５８，４３４号の利益を主張するものである。米国特許出願第６０／６５８，４３４号は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外部環境の脅威から身体の器官を保護し、体温を保つサーモスタットとして作用する。皮膚は、各々特化された機能を有する数種の異なる層から構成されている。主要な層には、表皮、真皮及び皮下組織が挙げられる。表皮は、結合組織を構成する真皮の上に覆い被さる上皮細胞層の重層する層である。表皮及び真皮の両者は、脂肪組織の内層である皮下組織によりさらに支持されている。
【０００３】
皮膚の最上層である表皮の厚さは、わずか０．１〜１．５ミリメートルである（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。それはケラチノサイトからなり、分化の状態に基づいて数層に分かれる。表皮は、さらに角質層と顆粒マルピーギ細胞及び基底細胞からなる生きている表皮とに分類される。角質層は吸湿性で、その柔軟性及び柔らかさを維持するために少なくとも１０重量％の水分を必要とする。吸湿性は、一部ケラチンの保水能力に帰せられる。角質層が柔軟性及び柔らかさを失うと、それは粗で脆くなり、乾燥した皮膚になる。
【０００４】
表皮の直下にある真皮の厚さは、１．５〜４ミリメートルである。それは皮膚の３層の中で最も厚いものである。さらに、真皮は、汗腺及び脂腺（ポア又はコメドと呼ばれる皮膚の開口部を通して物質を分泌する）、毛包、神経端、血管及びリンパ管を含む皮膚構造の大部分があるところでもある（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。しかしながら、真皮の主要成分はコラーゲン及びエラスチンである。
【０００５】
皮下組織は皮膚の最も深部の層である。それは、体熱保持のための絶縁体として、及び器官保護のためのショック吸収体としての両方の役割を果たす（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。それに加えて、皮下組織はエネルギー貯蔵のための脂肪も蓄える。皮膚のｐＨは、通常５と６の間である。この酸性は、皮脂腺の分泌物からの両性アミノ酸、乳酸、及び脂肪酸の存在に基づいている。「酸被膜」という用語は、皮膚の大部分の上にある水溶性物質の存在を指す。皮膚の緩衝能力は、一部、皮膚角質層に貯蔵されているこれらの分泌物に基づいている。
【０００６】
皮膚の主機能の１つは、水及び正常なホメオスタシスに有害な可能性のある物質の輸送に対する障壁を提供することである。丈夫で耐久性のある、半透性の皮膚がなければ身体は急速に脱水するであろう。皮膚は有害な物質の身体への進入を防止することに役立つ。
【０００７】
しわは、加齢を告げる徴候の１つであり、環境的な損傷から蓄積した生化学的、組織学的及び生理学的な変化によって起きる場合がある（Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)）。それに加えて、特徴的な顔面のしわの、折り畳み、溝及び折れ目を生じさせる、その他の二次的な要因もある（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。これらの二次的な要因として、重力により絶えず引っ張られていること、皮膚上にかかる位置的な圧力（即ち、睡眠中）、及び顔面の筋肉の収縮によって生じる繰り返しの顔面運動が挙げられる（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。
【０００８】
加齢の徴候のいくつかを潜在的に和らげるために、異なる手法が利用されてきている。これらの手法は、アルファヒドロキシ酸及びレチノールを含有する顔用保湿クリームから、外科的な手順及び神経毒の注射に及ぶ。例えば、１９８６年には、Jean及びAlastair Carruthers、眼形成外科医及び皮膚科医からなる夫妻のチームが、眉間領域の運動に関連するしわの治療に、ボツリヌス毒素のＡ型の美容的な使用を展開しはじめた（Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)）。Carruthers夫妻によるボツリヌスＡ型のしわの治療への使用は、このアプローチの発展の基となる１９９２年の発表に至った（Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)）。１９９４年までには、同一のチームが、顔面のその他の運動に関連するしわに関する経験を報告した（Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)）。続いて、これは、美容的なボツリヌスＡ型による治療の時代を生むに至った。
【０００９】
ボツリヌスＡ型に加え、血清学的に関連があるが異なる７種の別のボツリヌス毒素がある。一般に、ボツリヌス毒素（ボツリン毒素又はボツリヌス神経毒としても知られている）は、グラム陽性細菌であるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）が産生する神経毒である。これらが作用すると、神経筋接合部を介するシナプス伝達又はアセチルコリンの放出を抑制することによって、筋肉の麻痺を起こし、これらは、その他の様式でも作用すると考えられている。これらの作用が通常であれば筋肉の痙攣又は収縮を起こすであろうシグナルを本質的に遮断する結果、麻痺に至る。
【００１０】
８種の血清学的に関連があるボツリヌス毒素のうち、７種、即ち、ボツリヌス神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧは、麻痺を起こすことができる。これらのそれぞれは、型に特異的な抗体を用いた中和によって区別される。しかし、これらの活性のあるボツリヌス毒素の血清型の７種すべてについて、ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、約１５０ｋＤである。細菌が放出する場合、ボツリヌス毒素は、当該の１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子と、それに結合している無毒性のタンパク質とを含む複合体である。ボツリヌス毒素Ａ型の複合体は、クロストリジウム属細菌によって、９００ｋＤ、５００ｋＤ及び３００ｋＤの形態で産生されることができる。ボツリヌス毒素Ｂ型及びＣ型は、７００ｋＤ又は５００ｋＤのいずれかの複合体としてのみ産生されるようである。ボツリヌス毒素Ｄ型は、３００ｋＤ及び５００ｋＤの複合体の両方として産生される。ボツリヌス毒素Ｅ型及びＦ型は、約３００ｋＤの複合体としてのみ産生される。複合体（即ち、約１５０ｋＤより大きい分子量）は、非毒素赤血球凝集素タンパク質及び非毒素及び無毒性の赤血球凝集素ではないタンパク質を含有すると考えられている。これらの２種の非毒素タンパク質（これは、ボツリヌス毒素分子と共に、関連する神経毒複合体を構成する）が作用して、ボツリヌス毒素分子に、変性に対する安定性、及び毒素を経口摂取した場合の胃酸に対する保護をもたらすことができる。その上、より大きな（約１５０ｋＤの分子量より大きい）ボツリヌス毒素複合体であれば、ボツリヌス毒素複合体を筋肉内注射する部位からのボツリヌス毒素の拡散速度を低下させることができる可能性もある。
【００１１】
異なる血清型のボツリヌス毒素は、それらが作用する動物種、並びにそれらが惹起する麻痺の重症度及び持続時間が異なる。例えば、ボツリヌス毒素Ａ型は、ラットにおいて生じる麻痺の速度によって測定した場合、ボツリヌス毒素Ｂ型よりも、５００倍強力であることが決定されている。その上、ボツリヌス毒素Ｂ型は、Ａ型の霊長類に対するＬＤ５０の約１２倍である４８０Ｕ／ｋｇの用量では、霊長類では毒性を示さないことが決定されている。ボツリヌス毒素の分子の大きさ及び分子構造のために、ボツリヌス毒素は、角質層及びその下にある皮膚構造の複数の層を越えることができない。
【００１２】
ボツリヌス毒素に全身的に曝された結果生じる毒性の状態（ボツリヌス中毒と呼ばれる）は、古代からヨーロッパに存在する。ベルギーで、１８９５年に、Emile P. van Ermengemが、ボツリヌス中毒で死亡した犠牲者の死後の組織から得た生の豚肉から、嫌気性の胞子を形成する桿菌をはじめて単離した。Ermengemは、この疾患の原因が、彼がBacillus botulinusと呼ぶものが産生する細胞外毒素であることを見出した（Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26:1-56; Rev Infect (1897)）。この名前は、１９２２年に、Clostridium botulinum（ボツリヌス菌）に変更になった。Clostridiumという名前は、微生物が嫌気性であること及び形態学的な特徴も反映するために使用された（Carruthers and Carruthers, Can J Ophthalmol, 31:389-400 (1996)）。１９２０年代には、ボツリヌス毒素Ａ型の粗形態が、その後に発生した食中毒の後に単離された。カリフォルニア大学、San Francisco校のHerman Sommer博士は、本神経毒の精製をはじめて試みた（Borodic et al., Ophthalmic Plast Recostr Surg, 7:54-60 (1991)）。１９４６年には、Edward J. Schantz博士らが、結晶の形態で、本神経毒素を単離した（Schantz et al., In: Jankovi J, Hallet M (Eds) Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY: Marcel Dekker, 41-49 (1994)）。１９４９年までに、Burgenらは、ボツリヌス毒素が、神経筋接合部を介する活動電位を遮断することを実証することができた（Burgen et al., J Physiol, 109:10-24 (1949)）。１９７３年に、Allan B. Scottが、サルにおいて、ボツリヌス毒素Ａ（ＢＴＡ−Ｘ）をはじめて使用した。Scottは、３カ月持続する可逆性の眼筋の麻痺を実証した（Lamanna, Science, 130:763-772 (1959)）。ほどなくして、ＢＴＡ−Ｘは、ヒトの斜視、眼瞼痙攣及び痙性斜頚に対して、有効な治療剤であることが報告された（Baron et al., In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM (Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO: Mosby Year Book, 504-523 (1994)；Carruthers and Carruthers, Adv Dermatol, 12:325-348 (1997)；Markowitz, In: Strickland GT (Eds) Hunters Tropical Medicine, 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 441-444 (1991)）。ボツリヌス毒素Ａ型は、これまで知られている最も致死性の高い自然の生物学的薬剤であるといわれている。ボツリヌス菌の胞子は、土壌に存在しており、不適切に滅菌及び密封された食品の容器内で増殖することができる。本細菌を経口摂取すると、ボツリヌス中毒を起こし、これは、致命的である場合がある。
【００１３】
同時に、ボツリヌス毒素の筋肉を麻痺させる効果が、治療的な効果を期待して使用されてきている。活動過多の骨格筋を特徴とする神経筋の障害等の状態を治療するために、ボツリヌス毒素を制御して投与して、筋肉を麻痺させるのに使用されてきている。ボツリヌス毒素を用いて治療されてきている状態として、片側顔面痙攣、成人発症型痙性斜頚、裂肛、眼瞼痙攣、脳性麻痺、痙性斜頚、偏頭痛、斜視、顎関節障害、並びに種々のタイプの筋肉の痙攣及び痙縮が挙げられる。より最近になって、ボツリヌス毒素の筋肉麻痺効果が、しわ、眉間のしわ及びその他の顔の筋肉の痙攣又は収縮の結果の治療等、顔への治療的及び美容的な塗布において利用されるようになった。
【非特許文献１】Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)
【非特許文献２】Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)
【非特許文献３】Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)
【非特許文献４】Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)
【非特許文献５】Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)
【非特許文献６】Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26:1-56; Rev Infect (1897)
【非特許文献７】Carruthers and Carruthers, Can J Ophthalmol, 31:389-400 (1996)
【非特許文献８】Borodic et al., Ophthalmic Plast Recostr Surg, 7:54-60 (1991)
【非特許文献９】Schantz et al., In: Jankovi J, Hallet M (Eds) Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY: Marcel Dekker, 41-49 (1994)
【非特許文献１０】Burgen et al., J Physiol, 109:10-24 (1949)
【非特許文献１１】Lamanna, Science, 130:763-772 (1959)
【非特許文献１２】Baron et al., In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM (Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO: Mosby Year Book, 504-523 (1994)
【非特許文献１３】Carruthers and Carruthers, Adv Dermatol, 12:325-348 (1997)
【非特許文献１４】Markowitz, In: Strickland GT (Eds) Hunters Tropical Medicine, 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 441-444 (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ボツリヌス毒素の毒性及び治療的利点の可能性の両方を考慮すると、本毒素を安全に塗布するための組成物及び方法を開発することが望まれるであろう。ボツリヌス毒素の局所塗布は、無痛性の塗布であること、覆うことができる治療表面積がより大きいこと、特異性のより高い活性を有する純粋な毒素を配合することができること、ボツリヌス治療薬を塗布するのに必要なトレーニングが減ること、所望の効果をもたらすために必要であろう用量が減ること、及び治療的臨床結果に達するための毒素の大きなウェルを必要としないことから、より安全な且つより望ましい治療の代替品となるであろう。従って、多くの状態を治療又は予防するための、注射を必要としない、ボツリヌス毒素を経皮的に送達する効果的な手段及びボツリヌス毒素を投与する効果的な手段が、特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ボツリヌス毒素を含む新規な組成物、より具体的には、ボツリヌス毒素の皮膚又は上皮を介する輸送又は送達（「経皮送達」とも呼ぶ）を可能にする、従って、本明細書に記載するように、治療的、美観的及び／又は美容的な種々の目的で、対象にボツリヌス毒素を提供するための局所塗布薬として使用することができるような組成物に関する。
【００１６】
本発明の一態様は、ボツリヌス毒素と担体とを含有する組成物を提供することである。担体は、正に荷電した分岐基が付加しているポリマー性の骨格を有する。担体とボツリヌス毒素との間の結合は、非共有結合性である。
【００１７】
また、本発明は、ボツリヌス毒素を対象に投与する方法であって、対象の皮膚又は上皮に、有効量の担体と組み合わせた、ボツリヌス毒素を局所塗布することになる方法も提供する。担体は、正に荷電した分岐基が付加しているポリマー性の骨格を有し、ボツリヌス毒素とは非共有結合的に結合している。
【００１８】
本発明の別の態様は、ボツリヌス毒素と、正に荷電した骨格と、分散剤、オリゴ架橋及びポリアニオン架橋からなる群から選択された少なくとも１種とを含有し、それによって、ボツリヌス毒素が、正に荷電した骨格と非共有結合性の複合体を形成している製剤を提供することである。この製剤を皮膚の領域に塗布することによって、しわの治療にこの製剤を使用することができる。所望ならば、遮断剤（occlusion agent）は製剤の塗布後に塗布してもよい。
【００１９】
また、本発明の製剤を多汗症の治療に使用することもできる。本発明が意図する治療方法は、皮膚の領域に本発明の製剤を塗布するステップと、遮断剤をそれに続いて任意で塗布するステップとを含む。
【００２０】
本発明の別の態様は、対象にボツリヌス毒素を投与するためのキットを提供することである。キットは、経皮送達に有効な量のボツリヌス毒素と、正に荷電した分岐基が付加しているポリマー性の骨格を有する担体とを含む。担体とボツリヌス毒素との間の結合は、非共有結合性である。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、対象にボツリヌス毒素を投与するためのキットを提供することである。キットは、ボツリヌス毒素を皮膚に送達するための装置と、正に荷電した分岐基が付加しているポリマー性の骨格を有する担体を含有する組成物とを含み、この分岐基は、-(gly)n1-(arg)n2-（但し、添字ｎ１は、０から約２０の整数であり、添字ｎ２は、独立に約５から約２５の奇数の整数である）、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤから選択される。
【００２２】
一態様においては、本発明は、（本明細書で定義する）ボツリヌス毒素、及び本明細書に記載した正に荷電した分岐基又は「有効」基を有する正に荷電した「骨格」を含む担体を含む組成物に関する。最も好ましくは、正に荷電した担体は、長鎖の正に荷電したポリペプチド、又は正に荷電した非ペプチジルポリマー、例えば、ポリアルキレンイミンである。さらに本発明は、有効量のそのような組成物を、そのような治療を必要とする対象又は患者の、好ましくは、皮膚に局所塗布することによって、筋肉の麻痺、分泌過多若しくは発汗の軽減、神経性疼痛若しくは偏頭痛の治療、筋痙攣の軽減、ざ瘡の予防若しくは軽減、又は免疫応答の低下若しくは増強等、生物学的効果を生じさせる方法にも関する。また、本発明は、例えば、ボツリヌス毒素を、顔面の筋肉に注射する代わりに、顔面に局所塗布することによって、美観的又は美容的な効果を生じさせる方法にも関する。
【００２３】
また、本発明は、担体、ボツリヌス毒素、並びに使用可能な製剤を作製するために必要とされるような追加の品目、又は上記のような製剤を製造するために使用することができるプレミックスを含む組成物を調製又は製剤化するためのキットも提供する。或いは、キットは対象にボツリヌス毒素及び担体を別々に、しかし組み合わせて投与する手段を含む。
【００２４】
すなわち本発明は、
（１）ボツリヌス毒素と、正に荷電した骨格と、分散剤、オリゴ架橋及びポリアニオン架橋からなる群から選択される少なくとも１種とを含む製剤であって、ボツリヌス毒素が、正に荷電した骨格と非共有結合性の複合体を形成している製剤、
（２）正に荷電した骨格が、さらに分岐基を含む上記（１）に記載の製剤、
（３）正に荷電した骨格が、２１，０００未満の分子量を有する上記（１）又は（２）に記載の製剤、
（４）正に荷電した骨格が、ポリリジン又はＰＥＩである上記（３）に記載の製剤、
（５）分岐基が、保護されたオリゴアルギニン又はＴＡＴドメインのいずれかである上記（２）に記載の製剤、
（６）粘度調節剤をさらに含む上記（１）に記載の製剤、
（７）粘度調節剤が、ヒドロキシプロピルセルロース又はセタフィルのいずれかである上記（６）に記載の製剤、
（８）上記（１）に記載の製剤を含む、ボツリヌス毒素の経皮送達のためのキット、
（９）患者の皮膚の領域に上記（１）に記載の製剤を塗布するステップと、遮断剤をそれに続いて任意で塗布するステップとを含む、しわを治療する方法、
（１０）患者の皮膚の領域に上記（１）に記載の製剤を塗布するステップと、遮断剤をそれに続いて任意で塗布するステップとを含む、多汗症を治療する方法、
（１１）皮膚の領域が、顔、前頭部、首、手及び足からなる群から選択される上記（９）に記載の方法、
（１２）皮膚の領域が、腋窩、前頭部、背部、胸部、手掌、手の遠位部、足の甲又は足の足底部から選択される上記（１０）に記載の方法、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、適切な製剤の局所塗布によるボツリヌス毒素の送達、特に経皮的送達のための組成物及び方法を提供する。
【００２６】
本発明により、本明細書に記載した有効基を有する正に荷電した担体分子は、ボツリヌス毒素を筋肉及び／又は他の皮膚関連構造に経皮投与することを可能にする、ボツリヌス毒素のための輸送系として適当であることが見出された。輸送はボツリヌス毒素の共有結合修飾なしで起こる。
【００２７】
「正に荷電した」とは、担体が、少なくともいくつかの溶液相条件下で、より好ましくは少なくともいくつかの生理学的適合性の条件下で正電荷を有することを意味する。より具体的に、本明細書で使用する「正に荷電した」は、関心のある基が、すべてのｐＨ条件下で荷電する官能性、例えば第４級アミンを含む、又は第１級アミンの場合におけるｐＨ変化などのある溶液相条件下で正電荷を獲得できる官能性を含むことを意味する。より好ましくは、本明細書で使用する「正に荷電した」は、生理学的適合性の条件を通してアニオンと会合する性質を有するこれらの基を指す。当業者に明らかであるように、正に荷電した部分を複数有するポリマーは、ホモポリマーである必要はない。正に荷電した部分の他の例は、先行技術において周知であり、当業者に明らかであるように、容易に利用することができる。
【００２８】
一般的に、正に荷電した担体（「正に荷電した骨格」とも称せられる）は、典型的には原子の直鎖であって、鎖中に生理的ｐＨで正電荷を帯びる基を有するか、又は骨格から伸びた側鎖に結合した正電荷を帯びる基を有するかのいずれかである。好ましくは、正に荷電した骨格それ自体は明確な酵素的又は治療的生物活性を有しないであろう。線状の骨格は炭化水素骨格であり、いくつかの実施形態においては、窒素、酸素、イオウ、ケイ素及びリンから選択されたヘテロ原子により中断されている。骨格鎖原子の大部分は通常炭素である。さらに、骨格は、しばしば、反復単位のポリマー（例えば、アミノ酸、ポリ（エチレンオキシ）、ポリ（プロピレンアミン）、ポリアルキレンイミン等）であるが、ヘテロポリマーであってもよい。実施形態の一群において、正に荷電した骨格は、多数のアミン窒素原子が正電荷を帯びたアンモニウム基（四置換）として存在するポリプロピレンアミンである。他の実施形態において、正に荷電した骨格は非ペプチジルポリマーであり、それは、約１０，０００〜約２，５００，０００、好ましくは約１００，０００〜約１，８００，０００、及び最も好ましくは約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有するポリアルキレンアミン、例えば、ポリエチレンアミン若しくはポリプロピレンイミンなどのヘテロ又はホモポリマーであってよい。実施形態の他の群において、骨格は、正に荷電した基（例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、グアニジニウム基、又はアミジニウム基）を含む複数の側鎖部分を結合している。この実施形態の群における側鎖部分は、骨格に沿って一貫した距離間隔で又は変化する間隔で置かれることができる。さらに、側鎖の長さは同様でも異なってよい。例えば、実施形態の一群において、側鎖は、１〜２０個の炭素原子を有し、上記の正に荷電した基の１つの遠位端（骨格から離れた）で末端となる線状又は分岐炭化水素鎖であってよい。本発明のすべての態様において、担体と生物活性物質との結びつきは、非共有結合相互作用によるものであり、その例にはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２９】
実施形態の一群において、正に荷電した骨格は、複数の正に荷電した側鎖（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニン等）を有するポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは約１０，０００〜約１，５００，０００、より好ましくは約２５，０００〜約１，２００，０００、及び最も好ましくは約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する。当業者は、本発明のこの部分においてアミノ酸が使用されるとき側鎖は結合の中心でＤ又はＬ型（Ｒ又はＳ立体配置）のいずれかを有することができることを理解するであろう。或いは、骨格は、ペプトイドなどポリペプチドの類似体であってもよい。例えば、Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992);及びSimon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992))を参照されたい。簡単に述べると、ペプトイドは、側鎖がα炭素原子よりもむしろ骨格窒素原子に結合したポリグリシンである。上記のように、側鎖部分は通常正に荷電した基で末端となり、正に荷電した骨格成分を提供する。ペプトイドの合成は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７７，２７８号に記載されている。この用語が本明細書において使用されるとき、ペプトイド骨格構造を有する正に荷電した骨格は、それらがα炭素位置に天然に生ずる側鎖を有するアミノ酸で構成されていないので、「非ペプチド」と見なされる。
【００３０】
種々の他の骨格が、例えば、Fletcher et al. ((1998) Chem. Rev. 98:763)により概説され、その総説中に引用されている文献により詳説されているように、例えば、エステル結合、チオアミド（−ＣＳＮＨ−）、逆チオアミド（−ＮＨＣＳ−）、アミノメチレン（−ＮＨＣＨ２−）、若しくは逆向きのメチレンアミノ（−ＣＨ２ＮＨ−）基、ケトメチレン（−ＣＯＣＨ２−）基、ホスフィネート（−ＰＯ２ＲＣＨ２−）、ホスホンアミデート及びホスホンアミデートエステル（−ＰＯ２ＲＮＨ−）、逆ペプチド（−ＮＨＣＯ−）、ｔｒａｎｓ−アルケン（−ＣＲ＝ＣＨ−）、フルオロアルケン（−ＣＦ＝ＣＨ−）、ジメチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、チオエーテル（−ＣＨ２Ｓ−）、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、メチレンオキシ（−ＣＨ２Ｏ−）、テトラゾール（ＣＮ４）、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、メチレンスルホンアミド（−ＣＨＲＳＯ２ＮＨ−）、逆スルホンアミド（−ＮＨＳＯ２−）などの代替基でペプチドのアミド結合を置き換え、並びに、骨格をマロン酸エステル及び／又はｇｅｍ−ジアミノアルキルサブユニットで置き換えた、ポリペプチドの立体的又は電子的模倣体を利用して使用され得る。前述の置換の多くは、α−アミノ酸から形成された骨格に比較してほぼ等比体積のポリマー骨格を生ずる。
【００３１】
上で提供された骨格の各々に、正に荷電した基を有する側鎖基を付け加えることができる。例えば、スルホンアミドで結合した骨格（−ＳＯ２ＮＨ−及び−ＮＨＳＯ２−）は、窒素原子に結合した側鎖基を有することができる。同様に、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）結合は、ヒドロキシサブユニットに結合した側鎖基を担持することができる。当業者は、標準的合成方法を使用して、正に荷電した側鎖基を提供するように、他の結合の化学的性質を容易に適合させることができる。
【００３２】
一実施形態において、正に荷電した骨格は、分岐基（有効基とも称せられる）を有するポリペプチドである。本明細書で使用する有効基又は分岐基は、正に荷電した骨格が組織又は細胞膜を通して移行することを促進する効果を有する任意の作用物質である。有効基又は分岐基の例には、-(gly)n1-(arg)n2（下付き文字ｎ１は０〜２０の整数であり、より好ましくは０〜８であり、さらにより好ましくは２〜５であり、下付き文字ｎ２は独立に約５〜約２５の、より好ましくは約７〜約１７の、最も好ましくは約７〜約１３の奇数の整数である）、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはそのフラグメント、又はアンテナペディアのタンパク質導入ドメイン若しくはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定はされない。ＨＩＶ−ＴＡＴフラグメントが式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q又は(gly)ｐRKKRRQRRR-(gly)q（下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜２０の整数である）を有し、フラグメントはそのＣ末端又はＮ末端のいずれかにより骨格に結合している実施形態がさらに好ましい。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴフラグメントは、下付き文字ｐ及びｑが各々独立に０〜８、より好ましくは２〜５であるものである。他の好ましい実施形態において、正に荷電した側鎖又は分岐基は、アンテナペディア（Ａｎｔｐ）タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）又は活性を保持しているそのフラグメントである。正に荷電した担体も、側鎖の正に荷電した分岐基を全担体重量の百分率として少なくとも約０．０５％、好ましくは約０．０５〜約４５重量％、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で含むことが好ましい。式-(gly)n1-(arg)n2を有する正に荷電した分岐基に対して、その最も好ましい量は約０．１〜約２５％である。
【００３３】
他の実施形態において、骨格部分はポリリジンであり、正に荷電した分岐基がリジン側鎖のアミノ基に結合している。ポリリジンは、約１０，０００〜約１，５００，０００、好ましくは約２５，０００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有することができる。ポリリジンは、例えば、７０，０００を超える分子量を有するポリリジン、７０，０００〜１５０，０００の分子量を有するポリリジン、１５０，０００〜３００，０００の分子量を有するポリリジン、及び３００，０００を超える分子量を有するポリリジンなどの市販ポリリジン（Sigma Chemical Company社製、St. Louis, Missouri, USA）のいずれでもよい。適当なポリリジンの選択は、組成物の残余の成分に依存し、組成物の全体の正味の正電荷を提供するために十分で、負に荷電した成分の長さの合計の好ましくは１〜４倍の長さを提供するであろう。好ましい正に荷電した分岐基即ち有効基には、例えば、-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg（-Gly3Arg7）又はＨＩＶ−ＴＡＴが含まれる。他の好ましい実施形態においては、正に荷電した骨格は、例えば約１，０００，０００の分子量を有するポリエチレンイミンなどの長鎖ポリアルキレンイミンである。
【００３４】
ポリペプチド若しくはポリアルキレンイミンを含み、上記の分岐基を有する正に荷電した骨格又は担体は新規化合物であり、本発明の態様を形成する。
【００３５】
本発明の一実施形態においては、正に荷電した分岐基を有する正に荷電した担体のみが、ボツリヌス毒素の経皮送達に必要である。ある実施形態においては、正に荷電した担体は、複数の上記の正に荷電した側鎖基を有するポリペプチド（例えばリジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニン等）である。ポリペプチドは少なくとも約１０，０００の分子量を有することが好ましい。他の実施形態において、正に荷電した担体は、少なくとも約１００，０００の分子量を有する正に荷電した複数の側鎖基を有するポリアルキレンイミンなどの非ペプチジルポリマーである。そのようなポリアルキレンイミンには、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミンが含まれる。いずれの例においても、経皮送達のための唯一の必要な作用剤として使用するために、正に荷電した担体分子は、-(gly)n１-(arg)n２（下付き文字ｎ１は０〜２０の整数であり、より好ましくは０〜８であり、さらにより好ましくは２〜５であり、下付き文字ｎ２は独立に約５〜約２５の、より好ましくは約７〜約１７の、最も好ましくは約７〜約１３の奇数の整数である）、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはそのフラグメント、又はアンテナペディアＰＴＤ若しくはそのフラグメントを含む正に荷電した分岐基即ち有効基を含むことが好ましい。側鎖又は分岐基は、上記の一般式-(gly)n１-(arg)n２を有する。他の好ましい実施形態は、分岐基又は有効基が、式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q又は(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)qを有するＨＩＶ−ＴＡＴフラグメント（下付き文字ｐ及びｑは各々独立に０〜２０の整数である）であり、そのフラグメントはそのＣ末端又はＮ末端のいずれかにより担体分子に結合しているものである。側鎖の分岐基は結合の中心でＤ又はＬ型（Ｒ又はＳ立体配置）のいずれかを有することができる。適当なＨＩＶ−ＴＡＴフラグメントは、下付き文字ｐ及びｑが各々独立に０〜８、より好ましくは２〜５の整数であるものである。他の好ましい実施形態は、分岐基がアンテナペディアＰＴＤ基又はその基の活性を保持しているそのフラグメントであるものである。これらは、当技術分野において、例えばConsole et al., J Biol. Chem. 278:35109 (2003)により知られている。正に荷電した担体は、正に荷電した分岐基を、全担体重量の百分率として少なくとも約０．０５％、好ましくは約０．０５〜約４５重量％、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で含むことが好ましい。式-(gly)n1-(arg)n2を有する正に荷電した分岐基に対して、その最も好ましい量は約０．１〜約２５％である。
【００３６】
他の実施形態において、担体はリジンの側鎖アミノ基に結合した正に荷電した分岐基を有するポリリジンである。この特別の実施形態で使用されるポリリジンは、例えば７０，０００を超える分子量を有するポリリジン、７０，０００〜１５０，０００の分子量を有するポリリジン、１５０，０００〜３００，０００の分子量を有するポリリジン、及び３００，０００を超える分子量を有するポリリジンなどの市販ポリリジン（例えばSigma Chemical Company社製、St. Louis, Missouri, USA）のいずれでもよい。しかしながら、ポリリジンは少なくとも約１０，０００の分子量を有することが好ましい。正に荷電した分岐基即ち有効基には、例えば-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg（-G1y3Arg7）、ＨＩＶ−ＴＡＴ又はそのフラグメント、及びアンテナペディアＰＴＤ又はそのフラグメントが含まれることが好ましい。
【００３７】
本発明の他の実施形態において、担体は比較的短いポリリジン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）骨格（線状であっても分岐していてもよい）であり、正に荷電した分岐基を有する。そのような担体は、輸送効率を劇的に低下させる治療用組成物中の骨格及びボツリヌス毒素の制御されない凝集を最小化するのに有用である。担体が比較的短い線状ポリリジン又はＰＥＩ骨格であるとき、骨格は、７５，０００未満の、より好ましくは３０，０００未満の、最も好ましくは２５，０００未満の分子量を有するであろう。しかしながら、担体が比較的短い分岐ポリリジン又はＰＥＩ骨格であるときには、骨格は、６０，０００未満の、より好ましくは５５，０００未満の、最も好ましくは５０，０００未満の分子量を有するであろう。しかしながら、本明細書に記載するような分配剤が組成物中に含まれていれば、分岐したポリリジン及びＰＥＩ骨格の分子量は７５，０００までであってよく、一方線状ポリリジン及びＰＥＩ骨格の分子量は１５０，０００までであってよい。
【００３８】
本明細書で使用する「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素の既知の型、細菌によって産生されるもの又は組換え技術によって生成するもののいずれをも、及び設計による変異体又は融合タンパク質をはじめとする、引き続いて発見されるであろう型のいずれをも指すものとする。上記に述べたように、現在のところ、７種の免疫学的に異なるボツリヌス神経毒、即ち、ボツリヌス神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧが特徴付けられており、それらのそれぞれが、型に特異的な抗体を用いた中和によって区別される。ボツリヌス毒素の血清型は、Sigma-Aldrich社、Metabiologics社（Madison、ウィスコンシン州）及びその他の供給源から入手できる。異なる血清型のボツリヌス毒素は、それらが作用する動物種、並びにそれらが惹起する麻痺の重症度及び持続時間が異なる。少なくとも２つの型のボツリヌス毒素、Ａ型及びＢ型が、特定の状態を治療するための製剤として市販されている。例えば、Ａ型は、Allergan社製の登録商標BOTOX（登録商標）を有する調製物及びIpsen社製の登録商標DYSPORT（登録商標）を有する調製物に含有されており、Ｂ型は、Elan社製の登録商標MYOBLOC（登録商標）を有する調製物に含有されている。
【００３９】
本発明の組成物に使用するボツリヌス毒素は、別法として、ボツリヌス毒素の誘導体、即ち、ボツリヌス毒素の活性を有するが、自然に存在する又は組換えによるネイティブなボツリヌス毒素に対して、いずれかの部分又はいずれかの鎖に、１つ又は複数の化学的又は機能的な変更を含有する化合物であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、改変された神経毒（例えば、ネイティブに比較して、少なくとも１つのアミノ酸が欠失、修飾若しくは置換されている神経毒又は組換えによって生成した神経毒又はそれらの誘導体若しくは断片）であることができる。例えば、ボツリヌス毒素は、例えば、その特性が増強される又は望ましくない副作用が軽減されるが、所望のボツリヌス毒素の活性はそのまま維持されるように改変されたものであってもよい。ボツリヌス毒素は、上記に記載したように、細菌によって産生されるボツリヌス毒素の複合体のいずれかであることができる。別法として、ボツリヌス毒素は、組換え技術又は化学合成技術を使用して調製される毒素であることができる（例えば、組換えペプチド、融合タンパク質又は異なるボツリヌス毒素の血清型のサブユニット若しくはドメインから調製されるハイブリッド神経毒（米国特許第６４４４２０９号を参照））。また、ボツリヌス毒素は、必要なボツリヌス毒素の活性を有することが示されている、全体の分子の一部であることもでき、そのような場合、それ自体又は組み合わせた若しくは複合化した分子の部分、例えば、融合タンパク質として使用することができる。さらに、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素の前駆体であることもでき、それは、それ自体には毒性がなくてもよく、例えば、タンパク質分解性の切断で毒性を有するようになる、毒性のない亜鉛プロテアーゼであることができる。
【００４０】
また、ボツリヌス毒素の血清型の混合物は、それらの異なる性質及び特性のために、現在のところ、保健医療又は化粧品の業界では、通常は投与されていないが、本発明は、ボツリヌス毒素の組合せ及び混合物の一般的な使用も意図する。
【００４１】
本発明の組成物は、特定の治療を必要とする被験者又は患者即ちヒト又はその他の動物の皮膚又は上皮に塗布される製品の形態をしていることが好ましい。「必要とする」という用語は、例えば、望ましくない顔面筋痙縮を伴う状態を治療する薬学的及び健康関連の必要性、並びに例えば、顔面組織の外観を変更又は改変する美容的及び主観的必要性を含むことを意味する。一般的に、組成物はボツリヌス毒素を担体と、及び通常は１つ又は複数の薬学的に許容される追加の担体又は賦形剤と混合することにより調製される。それらの最も単純な形態では、それらは緩衝食塩水などの単純な水溶性の、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含むことができる。しかしながら、組成物は、皮膚科学的に又は薬学的に許容される担体、媒体、又は媒質（即ち塗布されると思われる組織に適合性の担体、媒体、又は媒質）を含めた、局所医薬用又は薬用化粧品組成物に典型的な他の成分を含むことができる。本明細書で使用する「皮膚科学的に又は薬学的に許容される」という用語は、そのように記述されるその組成物又は成分が、不適切な毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応等がなくて、これらの組織と接触して使用、又は一般的に患者に使用するのに適していることを意味する。本発明の組成物は、考慮している分野において、特に化粧品及び皮膚科において従来使用されている任意の成分を、必要に応じて含むことができる。組成物は、小アニオン、好ましくは多価アニオン、例えば、リン酸、アスパラギン酸又はクエン酸アニオンの一定量を含むこともできる。
【００４２】
それらの形態に関して、本発明の組成物は、溶液剤、乳液剤（マイクロエマルション剤を含む）、懸濁液剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、又は皮膚及び、組成物を使用することができる他の組織に塗布するために使用される他の代表的固体若しくは液体組成物を含むことができる。そのような組成物は、ボツリヌス毒素及び担体に加えて、抗菌剤、加湿剤及び水和剤、浸透剤、防腐剤、乳化剤、天然若しくは合成油、溶媒、界面活性剤、洗剤、皮膚軟化薬、酸化防止剤、香料、充填剤、増粘剤、ワックス、臭気吸収材、色素、着色剤及び粉末などの、並びに場合により麻酔薬、かゆみ止め、植物抽出物、品質改良剤、暗色化剤、淡色化剤、光沢材、保湿剤、雲母、鉱物、ポリフェノール、シリコーン若しくはその誘導体、日焼け止め、ビタミン及び植物医薬を含む、そのような製品で通常使用される他の成分を含むことができる。
【００４３】
特に好ましい実施形態において、組成物は、ゲル化剤及び／又は粘度改良剤を含む。これらの作用剤は、組成物の塗布を容易に及び正確にするように、通常、組成物の粘度を増大させるために添加される。それに加えて、これらの作用剤は、ボツリヌス毒素の活性の低下を惹起する傾向がある、ボツリヌス毒素／担体水溶液の乾燥を防止するのに役立つ。特に好ましい作用剤は、荷電していなくて、ボツリヌス毒素の活性又は毒素／担体複合体の皮膚に移動する効率に干渉しないものである。ゲル化剤は、例えばヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）などのあるセルロース系ゲル化剤であってよい。いくつかの実施形態において、ボツリヌス毒素／担体複合体は２〜４％のＨＰＣを有する組成物中で製剤化される。或いは、ボツリヌス毒素／担体複合体を含む溶液の粘度を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することにより変化させることができる。他の実施形態において、ボツリヌス毒素／担体複合体溶液は、Cetaphil（登録商標）保湿剤などの予め混合した粘性作用剤と配合される。
【００４４】
本発明の組成物は、分配剤を含んでいてもよい。本明細書で使用する「分配剤」は、本発明のボツリヌス毒素と担体との望ましくない又は制御されない凝集を防止又は最小化する性質を有する何らかの物質又は添加剤である。分配剤は、例えば、容量の制約により濃縮されたボツリヌス毒素溶液を使用しなければならないときに有用になり得る。これらの場合に、分配剤はボツリヌス毒素を分散状態に保ち、それにより分配剤がなければ起こるであろう毒素の凝集を防止する。一般的に分配剤は、（１）刺激性でなく、（２）ボツリヌス毒素を破壊せず、（３）透過性を少しも増加させず、（４）信頼できる且つ安定な粒子サイズを与え、（５）電荷を有せず、（６）毒素と経皮用担体との複合体に干渉しない。適当な分配剤の例は、エタノール（ＥｔＯＨ）である。好ましい実施形態において、ＥｔＯＨは組成物の２０％未満であり、最も好ましくは組成物の５％未満である。
【００４５】
例として、容量の制約から、１００Ｕのボツリヌス毒素を、２．５ｍｌではなく、０．５ｍｌの溶液中に再構成する必要がある場合、通常、ボツリヌス毒素に、望ましくない凝集が発生し、そのため、活性の低下が認められるであろう。しかし、１％ＥｔＯＨを、分散剤として添加することによって、この濃度において、２４時間後でも、完全な活性が維持される。別の例として、Botox（登録商標）は、０．９％ＮａＣｌ中の１．０ｍｌの再構成において、完全な活性を有するが、１％及び５％ＥｔＯＨに０．９％ＮａＣｌを添加した中の０．５ｍｌの再構成では、完全な活性を有する溶液を得る。
【００４６】
本発明の特定の実施形態においては、毒素と正に荷電した骨格である担体との複合体形成を改善するために、オリゴ架橋又はポリアニオン架橋を、ボツリヌス毒素の組成物に添加する。当技術分野で周知のように、ボツリヌス毒素は、実は、異なるタンパク質の複合体であり、それらの中には、正に荷電したもの及び負に荷電しているものがある。毒素の成分の厳密な分布は、毒素源によって異なることから、特定の源のボツリヌス毒素が、本明細書に記載する正に荷電した骨格とは、複合体を形成しにくい性向がある場合がある。しかし、本発明の一態様は、そのようなボツリヌス毒素に、オリゴ架橋又はポリアニオン架橋を添加することによって、局所投与の効率及び効力が、劇的に増加することを発見したことである。そのようなオリゴ−／ポリアニオン架橋の適切な例として、リン酸ナトリウム（５％）、ＰＢＳ又は５％ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（例えば、３０００のＭＷを有する）が挙げられる。
【００４７】
本発明の組成物は、徐放性又は持続性の組成物の形態であることができ、ボツリヌス毒素と担体とは、それらが皮膚上に時間をかけて制御されて放出されるような材料の中に被包されているか、そうでなければ含有されている。ボツリヌス毒素と担体とは、マトリックス、リポソーム、ベシクル、マイクロカプセル、マイクロスフェア等の中に、又は固体の粒子の材料の中に含有されており、それらはすべて、ボツリヌス毒素が時間をかけて放出されるように選択され且つ／又は構築される。ボツリヌス毒素と担体とを、（例えば、同一のカプセル内に）一緒に、又は（異なるカプセル内に）別々に被包することができる。
【００４８】
本明細書に記載の組成物を使用して、ボツリヌス毒素を、皮膚の下にある筋肉又は皮膚内の腺構造に、有効量で送達して、麻痺を起こすこと、弛緩を起こすこと、収縮を軽減すること、痙攣を予防若しくは軽減すること、腺分泌を減少させること又はその他の所望の効果をもたらすことができる。このようなボツリヌス毒素の局所送達によって、用量を減らすこと、毒性を低下させること、及び注射用又は埋め込み用の材料に比べ、所望の効果を得るためのより正確な用量の最適化が可能となるであろう。
【００４９】
本発明の組成物は、有効量のボツリヌス毒素を投与するように塗布される。本明細書で使用する「有効量」という用語は、所望の筋肉の麻痺又はその他の生物学的若しくは美観的効果をもたらすのに十分であるが、言うまでもなく安全な量、即ち重大な副作用を避けるのに十分なだけ低い、上で定義したボツリヌス毒素の量を意味する。所望の効果として、例えば、小じわ及び／若しくはしわの出現を、特に、顔において、減らすこと、又は目を大きく見せる、口の角を持ち上げる、若しくは上唇から扇状に広がるしわをのばす等、その他の様式で顔の外見を整えることを目的とする特定の筋肉の弛緩、或いは筋肉の緊張の全般的な軽減が挙げられる。この最後に述べた効果、即ち、筋肉の緊張の全般的な軽減は、顔又はその他の場所にもたらすことができる。本発明の組成物は、単回投与治療として塗布するために適当な有効量のボツリヌス毒素を含むことができ、又は、投与の場所で希釈するため、若しくは複数回塗布で使用するために、より濃縮することができる。本発明の正に荷電した担体の使用により、ボツリヌス毒素は、望ましくない顔筋若しくはその他の筋肉の痙攣等の状態、多汗症、ざ瘡、又は筋肉の痛み若しくは痙攣の軽減が望まれる体内のその他の場所の状態を治療するために、対象に経皮投与することができる。ボツリヌス毒素は、筋肉に又は他の皮膚関連構造に経皮送達するために局所投与される。例えば、脚、肩、背中（腰背部を含む）、腋窩、手掌、足、頚部、鼠径部、手及び足の甲、肘、上腕、膝、太腿、殿部、胴、骨盤、又はボツリヌス毒素の投与が望まれる任意の他の身体部分に投与を行うことができる。
【００５０】
また、本発明のボツリヌス毒素の製剤を投与して、その他の状態を治療することもでき、例として、神経性疼痛の治療、偏頭痛若しくはその他の頭痛の予防若しくは軽減、ざ瘡の予防若しくは軽減、（主観的若しくは臨床的な）ジストニア若しくはジストニア性の収縮の予防若しくは軽減、主観的若しくは臨床的な多汗症に伴う症状の予防若しくは軽減、分泌過多若しくは発汗の軽減、免疫応答の低下若しくは増強、又は注射によるボツリヌス毒素の投与が示唆若しくは実施されてきているその他の状態の治療が挙げられる。
【００５１】
また、免疫化に関連する目的で、本明細書に記載するボツリヌス毒素又はその他の治療用タンパク質を投与することもできる。驚くべきことに、本明細書に記載するボツリヌス毒素の投与によって、免疫応答を低下させることができる。より具体的には、本発明は、ボツリヌス毒素を、別の投与経路から送達し、それによって、本薬剤の複雑な抗原提示を変化させることができる。このようにして、本発明は、ボツリヌス毒素に対しての抗原に対する免疫応答を低下させる点、及び活性を免疫に関連して低下させることなく、反復投与を容易にする点で有用である。別法として、複合体を調製し、局所塗布して、免疫応答を増強させる、例えば、種々のタンパク質に関する免疫化を行うことができ、例として、注射によらない小児の免疫化に用いることができる。免疫活性に関連する使用の場合、「有効量」とは、それを塗布又は複数回塗布した後に、ボツリヌス毒素に対する免疫応答を対象に開始させるのに十分なボツリヌス毒素の量を指す。
【００５２】
組成物は、医師又は他の健康管理専門家の指示により又は指示の下に投与されることが最も好ましい。それらは、単回治療又は時間をかけた一連の定期的治療で投与することができる。上述の目的のボツリヌス毒素の経皮送達のために、上記の組成物は、効果が望まれる１カ所又は数カ所の位置で皮膚に局所的に塗布される。実施形態では、ボツリヌス毒素／担体の水溶液を直接皮膚に塗布し、毒素の活性低下に通じるであろう溶液の乾燥を防止するために、治療域を覆うか（例えば、Cetaphil（登録商標）保湿剤で）、又はバリア（例えば、Telfa）で治療域を封入することが好ましい。その性質上、最も好ましくは、ボツリヌス毒素の塗布される量を、如何なる副作用も望ましくない結果も生じないで所望の結果を生ずるであろう塗布率及び塗布頻度で注意して塗布すべきである。従って、例えば、本発明の局所用組成物は、皮膚表面１ｃｍ２当たり約１Ｕ〜約２０，０００Ｕ、好ましくは約１Ｕ〜約１０，０００Ｕのボツリヌス毒素で塗布すべきである。好ましくは、これらの範囲の高い方の用量は、例えば、放出制御材料と組み合わせて使用するか、又は除去するまでの皮膚上の滞留時間を短くして許容される。
【００５３】
溶液の有効性を保つためには、ボツリヌス毒素／担体組成物の塗布に先立つ皮膚表面の適切な準備が大切である。例えば、塗布に先立って皮膚表面の油を除去清浄する目的で、皮膚表面に界面活性剤を導入することは、界面活性剤がボツリヌス毒素の活性を破壊するように思われるので、驚くほど逆効果を招く。たとえその後でボツリヌス毒素／担体溶液の塗布前に皮膚を水で数回洗浄しても、このことは起こる。乳児を拭くのに見られるものなど極めて穏やかな界面活性剤でさえ、この現象を引き起こすようである。従って、本発明の組成物を投与する好ましい方法においては、水だけを使用して皮膚を前清浄する。水のみで洗浄することは、ボツリヌス毒素の経皮輸送を中程度に改善するようでもある。
【００５４】
それに加えて、ボツリヌス毒素／担体複合体の塗布に先立って、角質層を減少させるために皮膚を剥がすことができる。原理的に、皮膚を剥がす過程はボツリヌス毒素の経皮輸送の効率増強に通じるはずである。しかしながら、皮膚を剥がすために使用される方法が重要である。例えば、ヒト又は動物の角質層をアセトンの媒介により減少させると、その後に塗布されるボツリヌス毒素の活性は低下するようである。対照的に、テープストリッピング（即ち皮膚にテープを貼ってそれからテープを除去する）は、ボツリヌス毒素のより深い浸透及びマウスモデル及びヒトの両方における用量の減少を可能にするようである。皮膚表面の擦過（例えば、研磨パッドの使用による）はテープストリッピングと同様な効果を生ずると推定される。
【００５５】
ボツリヌス毒素と本明細書で定義された分岐基の結合した正に荷電した骨格を有する担体とを含む組成物の経皮透過のためのデバイスも本発明に含まれる。そのようなデバイスは、皮膚パッチのように構造の簡単なものであってもよく、又は組成物を分配して分配をモニターする手段、及び場合により、被験者の状態をモニターする（例えば、分配された物質に対する被験者の反応をモニターする）手段を備えたより複雑なデバイスであってもよい。
【００５６】
装置の構築に用いる材料の選択が重要であることに留意されたい。送達装置の構築に好ましい材料は、分解又は装置の表面へのボツリヌス毒素の望ましくない吸収のいずれかによって、ボツリヌス毒素／担体溶液の活性の損失を起こさないものである。そのような望ましくない挙動が、例えば、水溶液中のボツリヌス毒素／担体が、ポリプロピレンの表面と接触した場合に観察されているが、ボツリヌス毒素／担体溶液が、塩化ビニル（ＰＶＣ）の表面と接触した場合には観察されていない。
【００５７】
一般に、組成物は、予め製剤化する、及び／又はデバイスに予め充填することができ、又は、例えば、２つの成分（ボツリヌス毒素及び担体）を別々に収容しているが、塗布時に又は塗布前に配合する手段を提供するキットを使用して後で調製することができる。担体分子の量又はボツリヌス毒素に対するその比は、関心のある組成物に使用するためにどの担体が選択されるかに依存するであろう。与えられた場合における担体分子の適当な量又は比は、例えば、下で述べるような１つ又は複数の実験を行うことにより容易に決定することができる。
【００５８】
一般に、本発明は、ボツリヌス毒素を、それが必要な対象又は患者に投与する方法も含む。本方法は、有効量のボツリヌス毒素を、本明細書に記載した正に荷電した分岐基が結合した正に荷電した骨格を有する担体と併せて局所投与することを含む。「と併せて」は、２つの成分（ボツリヌス毒素及び担体）が、それらを１つの組成物中に配合して続いてそれを被験者に投与するか、又はそれらを別々に投与するがそれらが一緒に作用して有効量の治療用タンパク質の必要な送達を提供するかのいずれかを含む組合せ手順で投与されることを意味する。例えば、最初に担体を含む組成物を被験者の皮膚に塗布して、次にボツリヌス毒素を含む皮膚パッチ又は他のデバイスを適用することができる。ボツリヌス毒素は皮膚パッチ又は他の分配デバイス中に乾燥形態で導入することができるが、パッチ適用の前に正に荷電した担体を皮膚に適用することができ、その結果その２つが一緒に作用して所望の経皮送達が行われる。従って、２つの物質（担体及びボツリヌス毒素）は、組合せで作用するか或いはその部位で組成物又は組合せを形成するように相互作用する。従って、本発明は、皮膚を通してボツリヌス毒素を分配するためのデバイスと、被験者の皮膚若しくは上皮に塗布するのに適した担体又は骨格を含む液剤、ゲル剤、クリーム剤等との両方を含むキットも含む。本発明の組成物を、健康管理の専門家の指示下に又は患者若しくは被験者により投与するためのキットは、その目的のために適した特製アプリケーターも含むことができる。
【００５９】
本発明の組成物、キット及び方法は、より高い活性及び可能性として改善された薬物動態を有する、より純粋なボツリヌス毒素の送達を可能にする。それに加えて、担体は安定剤として作用して、外来の補助的なタンパク質（例えば、４００〜６００ｍｇの範囲のヒト血清アルブミン又は２５０〜５００ｍｇの範囲の組換え血清アルブミン）及び／又は多糖安定剤の必要性を減少させ、ボツリヌス毒素に対する免疫応答の有益な減少をもたらすことができる。それに加えて、組成物はｐＨが約４．５〜約６．３の範囲の生理的環境における使用に適していて、そのようなｐＨを有することができる。本発明の組成物は、室温又は冷蔵条件下のいずれでも保存することができる。
【００６０】
以下に、本発明の代表的な実施例を示す。これらは、機能性のボツリヌス神経毒複合体の経皮送達を実証するものであり、送達するために本神経毒を共有結合的に改変する必要はない。
［実施例］
【実施例１】
【００６１】
Revance社製のペプチジル担体を使用したインビボにおけるボツリヌス毒素の輸送
本実験は、対照と比較した、単回投与後の、無処置の皮膚を介して、無処置の標識化タンパク質であるボツリヌス毒素を含有する大きな複合体を輸送するためのペプチジル担体の使用を実証する。
【００６２】
骨格の選択：
正に荷電した骨格を、-Gly3Arg7をポリリジン（ＭＷ１１２，０００）に、リジンの側鎖の遊離アミンへの末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度（即ち、リジン残基１００個毎に１８個が、-Gly3Arg7に結合する）で結合させることによって組み立てた。改変した骨格を、「ＫＮＲ」と名付けた。対照のポリカチオンは、同一サイズである、同一ロットから得た未改変のポリリジンとした（「Ｋ」と名付けた；Sigma Chemical社製、St. Louis、ミズーリ州）。
【００６３】
治療薬：
Botox（登録商標）の商標を有するボツリヌス毒素Ａ（Allergan社製）を、本実験のために選択した。これは、約１５０，０００の分子量を有する。
【００６４】
試料の調製：
ボツリヌス毒素を、メーカーの指示に従って再構成した。計算された１２倍モル過剰量のsulfo-NHS-LCビオチン（Pierce Chemical社製）で、タンパク質の一定分量をビオチン標識した。標識化した生成物を、「Ｂｔｏｘ−ｂ」と名付けた。
【００６５】
各々について、高度に負である大きなヌクレオチド複合体の輸送におけると同様に、過剰量のポリカチオンを利用して、過剰量の正の電荷を有する最終的な複合体を組み立てた。正味の中性又は正の電荷は、タンパク質複合体が、高度に負である細胞表面のプロテオグリカン及び細胞外基質に拒絶されるのを妨げる。Ｂｔｏｘ−ｂの用量を、すべての群にわたり標準化し、局所塗布する組成物の全容量及び最終ｐＨも標準化した。試料を、以下のように調製した。
【００６６】
「ＪＭＷ−７」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で２０Ｕ）のＢｔｏｘ−ｂとペプチジル担体ＫＮＲとを、４：１の計算されたＭＷ比で、均一になるまで混合した後、リン酸緩衝食塩水で希釈し、２００マイクロリットルとした。得られた組成物を、１．８ｍｌのCetaphil（登録商標）クリームと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００６７】
「ＪＭＷ−８」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で２０Ｕ）のＢｔｏｘ−ｂとＫとを、４：１のＭＷ比で、均一になるまで混合した後、リン酸緩衝食塩水で希釈し、２００マイクロリットルとした。得られた組成物を、１．８ｍｌのCetaphilと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００６８】
ペプチジル担体と標識化Ｂｔｏｘとを用いた、単回処置後の経皮送達効率を求めるための動物実験：
処置剤を塗布する間、動物をイソフルランの吸入による麻酔下に置いた。麻酔後、Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウス（各群ｎ＝４）に、計量した２００マイクロリットルの用量の、背側背部の皮膚の頭部（マウスの口又は肢は、この領域には達しないことから選んだ）に塗布するのに適切な処置剤を、局所塗布した。マウスには、脱毛術を施さなかった。初期処置３０分後、ＣＯ２の吸入により、マウスを安楽死させ、処置した皮膚区域を、完全な厚さで、盲検の観察者が収集した。処置区域を、３等分し、頭部を１０％中性緩衝ホルマリン中で、１２〜１６時間固定し、次いで、パラフィン包埋まで７０％エタノール中で保存した。中心部を急速冷凍し、以下に概要を述べるように、盲検の観察者によるビオチン可視化に直接利用した。処置した尾側の区域は、可溶化の研究用に急速冷凍した。
【００６９】
ビオチン可視化を、以下のように行った。要約すると、各切片を、NeutrAvidin（登録商標）緩衝液中に、１時間浸漬した。アルカリホスファターゼ活性を可視化するために、横断面を食塩水中で４回洗浄し、次いで、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Pierce Scientific社製）中に、１時間浸漬した。次いで、切片を食塩水中ですすいだ後、平面アポクロマートレンズを付けたNikon E600顕微鏡で、全体を撮影した。
【００７０】
データの取扱い及び統計解析：
完全陽性染色を、Image Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics社製、Sliver Spring、メリーランド州）を使用して、バッチ画像解析によって、盲検の観察者が求め、これを、各々について、全横断面領域に正規化して、陽性染色率を求めた。次いで、各群について、Statviewソフトウェア（Abacus社製、Berkeley、カリフォルニア州）を使用して、一元配置分散分析反復測定において、有意差検定を９５％の信頼度で行って、平均及び標準誤差を求めた。
【００７１】
結果：
ＫＮＲ（「ＥＢ−Ｂｔｏｘ」）又はＫ（「ｎｌ」）のいずれかを有するＢｔｏｘ−ｂを、単回局所投与した後、ビオチン標識したボツリヌス毒素に陽性であった平均横断面領域を、全領域に対するパーセントとして報告した。結果を、以下の表１に示し、図１に例示する。図１では、Ｂｔｏｘ−ｂとペプチジル担体ＫＮＲとを含有する「ＥＢ−Ｂｔｏｘ」、並びに対照として、Ｂｔｏｘ−ｂとポリカチオンＫとを含有する「ｎｌ」で、１日１回処置した３日後、標識に陽性であった領域を、全領域に対するパーセントとして求めた。各群について、平均及び標準誤差を示す。
【００７２】
【表１】
0005883371.tif 000002
【実施例２】
【００７３】
ペプチジル担体を有する局所ボツリヌス毒素調製物の治療的効力
実施例１は、無処置の皮膚のマウスモデルにおいて、局所投与後、ペプチジル経皮担体が、ボツリヌス毒素の効率的な移送を可能にすることを実証した。しかし、本実験では、複合タンパク質であるボツリヌス毒素が、皮膚を介して移動した後、機能を有する形態で放出されたかどうかという点は示さなかった。従って、以下の実験を構築して、ボツリヌス毒素を、このペプチジル担体を使用し、局所薬剤として、無処置の皮膚を介して、治療的に送達することができるかどうかを評価した（ここでも、タンパク質の共有結合的な改変はない）。
【００７４】
再度、正に荷電した骨格を、-Gly3Arg7をポリリジン（ＭＷ１１２，０００）に、リジンの側鎖の遊離アミンへの末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度（即ち、リジン残基１００個毎に１８個が、-Gly3Arg7に結合する）で結合させることによって組み立てた。改変した骨格を、「ＫＮＲ」と名付けた。対照のポリカチオンは、同一サイズである、同一ロットから得た未改変のポリリジンとした（「Ｋ」と名付けた；Sigma Chemical社製、St. Louis、ミズーリ州）。実施例１と同一のボツリヌス毒素治療薬を使用し、同一の方法で調製した。試料を、以下のように調製した。
【００７５】
「ＪＭＷ−９」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で６０Ｕ）のボツリヌス毒素とペプチジル担体ＫＮＲとを、４：１の計算されたＭＷ比で、均一になるまで混合した後、リン酸緩衝食塩水で希釈し、６００マイクロリットルとした。得られた組成物を、５．４ｍｌのCetaphilと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００７６】
「ＪＭＷ−１０」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で６０Ｕ）のボツリヌス毒素とＫとを、４：１のＭＷ比で、均一になるまで混合した後、リン酸緩衝食塩水で希釈し、６００マイクロリットルとした。得られた組成物を、５．４ｍｌのCetaphilと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００７７】
「ＪＭＷ−１１」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で６０Ｕ）のボツリヌス毒素を、ポリカチオンを添加せず、リン酸緩衝食塩水で希釈し、６００マイクロリットルとした。得られた組成物を、５．４ｍｌのCetaphilと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００７８】
ペプチジル担体とボツリヌス毒素とを用いた、単回処置後の治療的効力を求めるための動物実験：
処置剤を塗布する間、動物をイソフルランの吸入による麻酔下に置いた。麻酔後、Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウス（各群ｎ＝４）に、計量した４００マイクロリットルの用量の、つま先から大腿の中間部までに均一に塗布するのに適した処置剤を、局所塗布した。両肢を処置し、処置は、いずれかの側にランダムに割り付けた。マウスには、脱毛術を施さなかった。初期処置３０分後、マウスを、発表されている、ボツリヌス毒素投与後の足の可動性に関する指の外転スコアに従って、指の外転性について評価した［Aoki, KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec; 39(12):1815-20］。また、マウスの可動性も、主観的に評価した。
【００７９】
データの取扱い及び統計解析：
指の外転スコアを、２人の盲検の観察者が、独立に表にした。次いで、各群について、Statviewソフトウェア（Abacus社製、Berkeley、カリフォルニア州）を使用して、一元配置分散分析反復測定において、有意差検定を９５％の信頼度で行って、平均及び標準誤差を求めた。
【００８０】
結果：
ＫＮＲ（「ＪＭＷ−９」）、Ｋ（「ＪＭＷ−１０」）又はポリカチオンを含有しない希釈液（「ＪＭＷ−１１」）を有するボツリヌス毒素を、単回局所投与した後の指の外転スコアの平均を、以下に、表２に示し、図２の代表的な顕微鏡写真に例示する。ペプチジル担体ＫＮＲは、互いに比較可能である対照に対して、統計的に有意に機能的に、皮膚を介して、ボツリヌス毒素を送達した。対照は、互いに同等であった。さらに、本実験を、独立して繰り返して行ったところ、本知見が確認され（全部で３回の実験を独立して行い、対照には見られない、ＫＮＲを有する局所ボツリヌス毒素には、統計的に有意な麻痺を認める点で、同一の結果を得た）、Ｋを有する局所ボツリヌス毒素とＫなしの局所ボツリヌス毒素と（即ち、両方の対照）の間には、有意な差がないことが明らかになった。興味深いことに、マウスは、一貫して、麻痺した肢に向かって移動した（この発生率は、処置動物では１００％であり、いずれの対照群の対照動物でも０％であった）。図２に示すように、対照のポリカチオンであるポリリジンを添加したボツリヌス毒素を用いて、又はポリカチオンなしのボツリヌス毒素（「毒素単独」）を用いて処置した肢は、（持ち上げられたときの防御機構として）指を動かすことができるが、ペプチジル担体であるＫＮＲを添加したボツリヌス毒素（Revance社製のボツリヌス製剤）を用いて処置した肢は、指を動かすことができなかった。
【００８１】
【表２】
0005883371.tif 000003
【００８２】
結論：
本実験によって、ペプチジル経皮担体は、治療に有効な量のボツリヌス治療薬を、当該の治療薬を共有結合的に改変することなく、皮膚を介して輸送することができることが実証された。また、本実験によって、対照における局所塗布の場合、ボツリヌス毒素は、機能しないことも確認された。
【実施例３】
【００８３】
非ペプチジル担体を有する局所ボツリヌス毒素調製物の治療的効力
本実験は、本発明の非ペプチジル担体の性能を実証する。
【００８４】
方法：
骨格の選択：
正に荷電した骨格を、-Gly3Arg7をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＭＷ１，０００，０００、に、ＰＥＩの側鎖の遊離アミンへの末端グリシンのカルボキシルを介して、３０％の飽和度（即ち、リジン残基１００個毎に３０個が、-Gly3Arg7に結合する）で結合させることによって組み立てた。改変した骨格を、「ＰＥＩＲ」と名付けて、大きな非ペプチジル担体であることを意味した。対照のポリカチオンは、同一サイズである、同一ロットから得た未改変のＰＥＩとした（「ＰＥＩ」と名付けた；Sigma Chemical社製、St. Louis、ミズーリ州）。実施例１と同一のボツリヌス毒素治療薬を使用した。
【００８５】
ボツリヌス毒素を、メーカーの指示に従って、Botox製品から再構成した。各々について、高度に負である大きなヌクレオチド複合体の輸送におけると同様に、過剰量のポリカチオンを利用して、過剰量の正の電荷を有する最終的な複合体を組み立てた。正味の中性又は正の電荷は、タンパク質複合体が、高度に負である細胞表面のプロテオグリカン及び細胞外基質に拒絶されるのを妨げる。ボツリヌス毒素の用量を、すべての群にわたり標準化し、局所塗布する組成物の全容量及び最終ｐＨも標準化した。試料を、以下のように調製した。
【００８６】
「ＡＺ」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で６０Ｕ）のボツリヌス毒素と超純粋な非ペプチジル担体ＰＥＩＲとを、５：１の計算されたＭＷ比で、均一になるまで混合した後、リン酸緩衝食塩水で希釈し、６００マイクロリットルとした。得られた組成物を、５．４ｍｌのCetaphilと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００８７】
「ＢＡ」と呼ばれる群：一定分量当たり２．０単位（即ち、全体で６０Ｕ）のボツリヌス毒素とＰＥＩとを、５：１の仕込み比で、均一になるまで混合した後、リン酸緩衝食塩水で希釈し、６００マイクロリットルとした。得られた組成物を、５．４ｍｌのCetaphilと共に均一になるまで混合し、２００マイクロリットルずつ分注した。
【００８８】
単回処置後の治療的効力を求めるための動物実験：
処置剤を塗布する間、動物をイソフルランの吸入による麻酔下に置いた。麻酔後、Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウス（各群ｎ＝３）に、計量した４００マイクロリットルの用量の、つま先から大腿の中間部までに均一に塗布するのに適した処置剤を、局所塗布した。両肢を処置し、処置は、いずれかの側にランダムに割り付けた。マウスには、脱毛術を施さなかった。初期処置３０分後、マウスを、発表されている、ボツリヌス毒素投与後の足の可動性に関する指の外転スコアに従って、指の外転性について評価した［Aoki, KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec; 39(12):1815-20］。また、マウスの可動性も、主観的に評価した。
【００８９】
データの取扱い及び統計解析：
指の外転スコアを、２人の盲検の観察者が、独立に表にした。次いで、各群について、Statviewソフトウェア（Abacus社製、Berkeley、カリフォルニア州）を使用して、一元配置分散分析反復測定において、有意差検定を９５％の信頼度で行って、平均及び標準誤差を求めた。
【００９０】
結果：
超純粋ＰＥＩＲ（「ＡＺ」）又は対照ポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ」）を有するボツリヌス毒素を、単回局所投与した後の指の外転スコアの平均を、表３に示し、繰り返し実験を、表４に示す（本実験を、独立してもう１回繰り返した）。非ペプチジル担体ＰＥＩＲは、対照に比較して、統計的に有意に機能的に、皮膚を介して、ボツリヌス毒素を送達した。前回と同様、マウスは、麻痺した肢に向かって歩き、旋回することが観察された。
【００９１】
【表３】
0005883371.tif 000004
【００９２】
【表４】
0005883371.tif 000005
【００９３】
結論：
本実験によって、非ペプチジル経皮担体は、治療用量のボツリヌス毒素を、当該のボツリヌス毒素を共有結合的に改変することなく、皮膚を介して輸送することができることが実証された。これらの知見は、ペプチジル伝達剤から得た知見を補完する。治療効果を達成するのに非ペプチジル担体又はペプチジル担体を使用するという選択肢があることから、特定の状況、状態及び塗布方法に適合することが可能になり、本発明の経皮送達の構築基盤の幅が広がる。
【実施例４】
【００９４】
前頭部の多汗症及びしわに対するペプチジル担体を有する局所ボツリヌス毒素調製物の治療的効力
本実験は、ヒトの対象の前頭部の多汗症及びしわを治療するために、ボツリヌス毒素を、本ペプチジル担体を使用し、局所薬剤として、無処置の皮膚を介して、治療的に送達することができることを実証する。
【００９５】
前頭部の多汗症及びしわに関する研究の実験手順：
Nikon TTL Macro-speedlight SB29sフラッシュ付きNikon D70カメラ（Nikon社製、米国）を使用して、青色の背景で、ベースライン及び処置後の対象の前頭部の写真を撮影した。
【００９６】
Sony Digital Handycam小型ビデオカメラを使用して、青色の背景で、ベースライン及び処置後の対象の前頭部の映像を撮影した。
【００９７】
１０％外用ポビドンヨード溶液（Walgreen社製、Deerfield、イリノイ州）及びKingsfordの１００％トウモロコシデンプン（ACH Food Companies社製、Memphis、テネシー州）を使用して、Minorのデンプンヨウ素反応を行って、発汗を可視化した。対象の前頭部に、ヨウ素溶液を、滅菌生綿（Johnson & Johnson Consumer Product Company社製、Skillman、ニュージャージ州）を使用して塗り、次いで、完全に乾燥させた。当該の領域に、デンプン粉末を、滅菌生綿を使用して軽く振りかけた。周囲の室温にて、体を動かすことによって、発汗させた。汗がヨウ素を溶解し、デンプン粉末と反応するにつれ、暗青色の点が出現した。Nikon TTL Macro-speedlight SB29sフラッシュ付きNikon D70カメラを使用して、青色の背景で、ヨウ素デンプン反応のベースライン及び処置後の写真を撮影した。対象の前頭部を、７０％ＥｔＯＨ、次いで、脱イオン水で清浄した。
【００９８】
処置剤を塗布する前に、角質層をテープではく離する非侵襲的な方法を用いて、予め定めた対象の前頭部の処置領域を準備した。予め切断したテープを、処置領域に、数秒間しっかりと押しつけた。テープの一端を引っ張って、テープを素早くはがした。第１のテープをはがした直後に、第２のテープを、同一の領域に慎重に塗布した。テープによるはく離を、３〜５回繰り返した。
【００９９】
処置剤の調製：
滅菌０．９％塩化ナトリウム溶液（Abbott Laboratories社製、North Chicago、イリノイ州）と５％ＥｔＯＨとＡ−３Ｃと表示されている５％短鎖ポリアスパラギン酸溶液（Donlar BioPolymer社製、Bedford Park、イリノイ州）とのBotox再構成用溶液を調製した（即ち、溶液各１．０ミリリットルにつき、９００マイクロリットルの滅菌０．９％塩化ナトリウムと、５０マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨと、５０マイクロリットルの短鎖ポリアスパラギン酸溶液とを含有）。Ｋｎ２１Ｔを、０．９％塩化ナトリウムと５％ＥｔＯＨとを用いて、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で調製した（即ち、５００マイクロリットルのＫｎ２１Ｔを分取し、２５マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨを添加した）。本明細書で使用する場合、Ｋｎ２１Ｔは、分子量が２１，０００であり、ＴＡＴの分岐基を有する、正に荷電したポリリジンの骨格を指す。１００単位のBotox（Allergan社製、Irvine、カリフォルニア州）を、滅菌済みのラテックスを含まない１８Ｇ１ １／２、３ｍｌの注射器（Becton Dickinson & Co.社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）を使用し、１．０ミリリットルの再構成用溶液を用いて再構成した。再構成したBotoxを、８回反転させることによって、慎重に混合した。２００単位のBotoxを、各対象に使用した。Revance社製のボツリヌス製剤を、２００単位のBotoxとＫｎ２１Ｔ及び５％ＥｔＯＨとを用いて調製し（即ち、２．０ミリリットルのBotoxを、５００マイクロリットルのＫｎ２１Ｔ及び２５マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨに添加した）、室温にて、５分間放置して、複合体を形成させた。
【０１００】
対照溶液を、再構成用溶液とＫｎ２１Ｔ及び５％ＥｔＯＨとを用いて調製し（即ち、２．０ミリリットルの再構成用溶液を、５００マイクロリットルのＫｎ２１Ｔ及び２５マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨに添加した）、室温にて放置した。
【０１０１】
処置剤の塗布：
目、顔面及び上体を覆って保護し、対象を台にもたれかからせた。ピペットを使用して、処置剤を対象の前頭部に均一に塗布し、粉末を含まないニトリル製の手袋を着用した指を、円を描くように動かし、皮膚内に処置剤をもみ入れた。処置領域を、Cetaphil（登録商標）保湿クリーム（Galderma社製、Fort Worth、テキサス州）の薄い層で覆い、６０分間インキュベートした。６０分間インキュベートした後、処置剤を、滅菌したガーゼのパッドを用いて除去した。ガーゼのパッド及び手袋は、バイオハザードバッグに捨てた。
【０１０２】
結果：
図３は、ペプチジル担体とボツリヌス毒素との組合せを局所塗布した後の、しわの長さ、深さ及び幅が有意に減少したことを示す。この実験によって、経皮担体と組み合わせると、局所投与したボツリヌス毒素は、顕著な筋肉麻痺を起こして、美容的な効果をもたらすことが確認される。図４は、処置皮膚（Ａ）対未処置皮膚（Ｂ）のMikrosilによる鋳型である。しわが、未処置皮膚の鋳型上に認められる。
【０１０３】
図５及び６は、Minorのデンプンヨウ素反応の結果を示す。図５は、塗布２分後の写真を示し、写真（Ａ）は、Revance社製のボツリヌス製剤で処置した側に対応し、写真（Ｂ）は、Ｋｎ２１Ｔ担体のみを含有する対照の製剤で処置した側に対応する。図６は、４分の時点で撮影した以外は、図５と同一である。対照の製剤の側が、より顕著に呈色しており、こちら側の皮膚の方が、発汗量が多いことを示唆している点に留意されたい。また、未処置の側の方が、発汗が早期にはじまる点にも留意されたい。
【０１０４】
結論：
本実施例は、局所塗布されたボツリヌス毒素の複合体は、細かいしわ及び粗いしわを減少させる点で、顕著な美観的利点をもたらすことができることを実証する。さらに、この経上皮効果によって、適切な担体を用いれば、本明細書に記載するようなボツリヌス毒素の複合体の局所塗布後に、筋肉の麻痺を達成することができることも確認される。従って、本実施例によって、ボツリヌス毒素の局所塗布によって、眼瞼痙攣又は斜頚等の筋肉の痙攣の軽減、及び腰痛等の筋肉の痙攣に関連する疼痛の軽減をもたらすことができることが示唆される。
【実施例５】
【０１０５】
腋窩多汗症に対するペプチジル担体を有する局所ボツリヌス毒素調製物の治療的効力
本実験は、ヒトの対象の腋窩多汗症を治療するために、ボツリヌス毒素を、本ペプチジル担体を使用し、局所薬剤として、無処置の皮膚を介して、治療的に送達することができるかどうかを実証する（ランダム割り付け二重盲検様式で、各患者から処置腋窩を１個と対照腋窩を１個とし、各群ｎ＝１０個の腋窩）。
【０１０６】
腋窩多汗症の研究に含む基準：
・ 年齢：１８歳以上
・ 健康な志願者
・ 説明と同意が提供され、志願者によって署名される
・ 対象は、指示に従い、経過観察のために来診する意志がある
・ 対象には、主観的な腋窩多汗症が先在する
・ 対象は、妊娠していないか、今後３カ月以内に妊娠する予定がない
・ 対象は、San Francisco又は研究場所の近くに居住及び／又は勤務している
・ 対象は、過去６カ月以内に、腋窩の発汗について治療を受けていない
・ 対象は、今後３カ月以内に、腋窩の発汗について治療を受ける予定がない
【０１０７】
重量測定の手順：
重量測定の手順の一部として、はじめに、対象を、試験場所に順応させた。具体的には、各対象を、安静な位置で、７２〜７７°Ｆの室温にて、１５分間すわらせた。
【０１０８】
腋窩の準備：（以下の手順には、粉末を含まないニトリル製の手袋を着用した。）対象は、使い捨てのケープ及びブラ（女性の場合）に着替えるか、上体の衣服をすべて脱いで（男性の場合）、両方の腋窩を完全に露出させた。投与領域は、各腋窩における、体毛を有する皮膚が覆う領域及び体毛を有する皮膚から１ｃｍ外に及ぶ領域とすることを予め定めた。投与領域を、５０ｍｌのコニカルチューブからの予め湿らせた滅菌したガーゼのパッドを用いて、ガーゼの片面を使用して、上から下に向けて同一方向に５回長い距離を拭くことによって清浄した。このステップを、皮膚を刺激又は擦過しないように注意して、さらに３回、毎回清潔な予め湿らせたガーゼのパッドを用いて、繰り返した。ガーゼのパッドは、ゴミ箱に捨てた。同一の洗浄手順を、他方の腋窩で繰り返した。腋窩を、皮膚を刺激又は擦過しないように注意して、乾燥した滅菌ガーゼを用いて、腋窩の上から下に向けて、しっかりと軽くたたくようにして乾燥させた。次いで、腋窩の折れ目の下にろ紙を置いて、ろ紙を試験部位に５分間留置させることによって、さらに腋窩を乾燥させた後、重量測定による評価の手順を行った。患者を、安静な位置で、腕を体の横に保持した状態ですわらせた。ろ紙は、ゴミ箱に捨てた。第１回目の重量測定による評価の前に、対象を、腋窩を操作しない状態で、１分間休息させた。
【０１０９】
発汗量の測定（重量測定）：（これらの測定前に、新しい粉末を含まないニトリル製の手袋を着用した。）体を斜め（約４５度）にした状態で、対象は、持ち上げた手を頭の後ろで組んで、腋窩を完全に露出させた。予め重量を測定したろ紙を保存用のコニカルチューブから取り出し、ろ紙の先端部が腋窩の折れ目の中心に並ぶような状態で、対象の腋窩下に置いた。対象は腕を体の横に下ろした状態で、指を使用して、ろ紙をその場所に保った。対象を、両腕を胴体の横にしっかりと保持した状態で、５分間すわらせた。両方の腋窩にろ紙が確実に置かれた時から時間の測定を開始した。両方の腋窩を、同時に測定した。５分後、腋窩からろ紙を取り除き、対応する同一のコニカルチューブに戻した。最初に置いたろ紙を、先に取り除いた。コニカルチューブから汗が蒸発しないように、チューブのキャップをしっかりとねじって閉じた。１分間の間隔を置いて、さらに２回、発汗させた。
【０１１０】
Minorのデンプンヨウ素反応：
対象は、持ち上げた手を頭の後ろで組んで、腋窩を完全に露出させた。ヨウ素溶液を、予め定めた腋窩の領域に、滅菌したガーゼのパッドを用いて塗り、風乾させた。ヨウ素が完全に乾燥したら、ヨウ素で覆われている領域の上に、デンプンの薄い層を、生綿を用いて軽くたたきつけた。擬陽性及びバックグラウンドを減らすために、デンプンを施用する前に、ヨウ素を風乾させた。次いで、対象を、両腕を胴体の横にしっかりと保持した状態で、すわらせた。５分後、対象に、持ち上げた手を頭の後ろで組ませて、腋窩を完全に露出させた。腋窩の左右及び実験日を明確に表示した各腋窩の写真を撮影した。腋窩を、７０％ＥｔＯＨ、次いで、滅菌脱イオン水で清浄した。
【０１１１】
処置剤の調製：
Ｋｎ２１ｐｒを、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で、食塩水と５％ＥｔＯＨとを用いて調製した（即ち、５００マイクロリットルのＫｎ２１ｐｒを分取し、２５マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨを添加した）。本明細書で使用する場合、Ｋｎ２１ｐｒは、分子量が２１，０００であり、保護されたオリゴアルギニンを含む分岐基を有する、正に荷電したポリリジンの骨格を指す。１００単位のBotox（登録商標）（Allergan社製、Irvine、カリフォルニア州）を、滅菌済みのラテックスを含まない１８Ｇ１ １／２、３ｍｌの注射器（Becton Dickinson and Company社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）を使用し、０．７５ミリリットルの０．９％塩化ナトリウム（Abbott Laboratories社製、North Chicago、イリノイ州）を用いて再構成した。再構成したBotox（登録商標）を、８回反転させることによって、慎重に混合した。２００単位のBotox（登録商標）を、各対象に使用した。処置溶液を、２００単位のBotox（登録商標）とＫｎ２１ｐｒ及び５％ＥｔＯＨとを用いて調製し（即ち、１．５ミリリットルのBotox（登録商標）を、５００マイクロリットルのＫｎ２１ｐｒ及び２５マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨに添加した）、室温にて、５分間放置して、複合体を形成させた。５分間のインキュベート後、約１．０ミリリットルの４％ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）を（１％ＥｔＯＨと共に）添加し、小型の金属製のへらを用いて、穏やかに且つ完全に混合した。均一な処置溶液を、注射器の先端キャップを有する３ｍｌの注射器に移した（Becton Dickinson and Company社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）。
【０１１２】
対照溶液を、０．９％塩化ナトリウムとＫｎ２１ｐｒ及び５％ＥｔＯＨとを用いて調製し（即ち、１．５ミリリットルの０．９％塩化ナトリウムを、５００マイクロリットルのＫｎ２１ｐｒ及び２５マイクロリットルの１００％ＥｔＯＨに添加した）、室温にて、５分間放置した。インキュベート後、約１．０ミリリットルの４％ＨＰＣを（１％ＥｔＯＨと共に）添加し、小型の金属製のへらを用いて、穏やかに且つ完全に混合した。均一な対照溶液を、注射器の先端キャップを有する３ｍｌの注射器に移した。
【０１１３】
処置剤の塗布（粉末を含まないニトリル製の手袋を着用）：
対象は、指を絡み合わせた状態で手を持ち上げ、その手を頭の後ろで保って、対象の腋窩を完全に露出させた。次いで、対象を、約４５度の角度で傾けた椅子にすわらせた。図７に示すように、塗布のために、投与領域を、視覚的に位置付けた（即ち、体毛を有する皮膚から１ｃｍ）。投与領域の乾燥を点検した。左には「Ｌ」及び右には「Ｒ」が記されている表示のある注射器から、注射器の先端キャップをはずし、対象の腋窩上への投与に備えた。処置液を、注射器を用いて、投与領域に均一に広げ、皮膚内に指で１分間もみ入れた。次いで、対象に、両腕を胴体の横に下ろさせ、６０分間インキュベートした。６０分間のインキュベート後、処置剤を、滅菌したガーゼのパッドで清浄した。ガーゼのパッド及び手袋は、バイオハザードバッグに捨てた。対象を解放した。
【０１１４】
結果：
Revance社製の局所ボツリヌス製剤は、発汗を６５％減少させた（Ｐ＝０．０１３７）。図８は、Ｋｎ２１ｐｒ骨格単独（対照）、又はｋｎ２１ｐｒ骨格及び２００ＵのBotoxを用いた処置（左右によりランダムに割り付けた）から４週間後の発汗量の比較を示す（ベースラインに対する比）。示すようにＰ値を用いたＮＰＳＳ及びＰ＜０．０５の有意差を使用して、ウィルコクソン符号順位によって統計解析を行った［ｎ＝１０対象］。
【０１１５】
第２の比較：図８ｂは、ベースライン及び４週間後における対照に対する処置の比を示す。本図は、Ｋｎ２１ｐｒ骨格単独（対照）、又はｋｎ２１ｐｒ骨格及び２００ＵのBotoxを用いた、腋窩の処置（左右によりランダムに割り付けた）から４週間後の発汗量（ｍｇ／５分）を示す（対照に対する処置の比）。示すようにＰ値を用いたＮＰＳＳ及びＰ＜０．０５の有意差を使用して、ウィルコクソン符号順位によって統計解析を行った（Ｐ＝０．０１９５）（Ｐｒ Ｔ ｐ＝０．０２１７）［ｎ＝１０］。
【０１１６】
図９は、腋窩多汗症を局所的に治療するために、Revance社製のボツリヌス製剤を用いた処置前後のMinorのデンプンヨウ素反応を示す写真を示す。１２番の対象について、右腋窩をRevance社製のボツリヌス製剤で処置し（ａ及びｃ）、左腋窩には対照を塗布した（ｂ及びｄ）、ベースライン対２週間後のデンプンヨウ素反応を示す。これらの写真は、デンプンヨウ素中で、担体＋botoxを用いた処置後に見られる典型的な利点を例示している。対照側で、いくらかのクロスオーバー（重量測定データにおける２５％の減少と一致する）が見られるが、処置により有意な減少（処置側の重量測定データにおける６５％の減少と一致する）がもたらされている。
【０１１７】
結論：
本実施例によって、本明細書に開示する本発明に従って形成したボツリヌス複合体の局所塗布によって、主観的又は定量的な多汗症の患者のコホートにおいて、発汗を減少させる点で治療的利点が容易にもたらされることが確認される。また、発汗を減少させるこの効果は、上記で示した前頭部の症例において、及び留置時間中に製剤が広がるのを限定するために手袋と組み合わせた手掌／足底への塗布においてももたらされている。さらに、治療的利点が期待されるボツリヌス毒素の複合体の経上皮層送達によって、本アプローチを、膀胱の機能不全若しくは痙攣等、ＳＮＡＰ機能若しくはアセチルコリンのシグナルが重大であるその他の症例、消化器系への適用、又は体臭減弱のための皮脂腺分泌若しくはざ瘡の予防／治療に拡大することができることも確認される。
【実施例６】
【０１１８】
ワイプ−オンRevance社製ボツリヌス製剤のパイロット実験
目的：
マウスモデルにおいて、ワイプ−オンDysportの輸送効率及びペプチジル経皮担体（骨格）の性能を求める。
【０１１９】
方法：
研究計画：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River社、Wilmington、マサチューセッツ州）、体重１９〜２０ｇを使用した。マウスに、イソフルランを使用して、麻酔を施し、マウスの後肢上に、「Revance社製Dysport溶液」（表５）の局所塗布を行った。回復後、後肢の筋肉の衰弱を、指の外転スコア（ＤＡＳ）の値を使用して、点数化した。
【０１２０】
【表５】
0005883371.tif 000006
【０１２１】
試験化合物の調製：滅菌０．９％塩化ナトリウム（Abbott Laboratories社製、North Chicago、イリノイ州）のDysport再構成用溶液を調製した。骨格を、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で、０．９％塩化ナトリウムを用いて調製した。５００単位のDysport（Ipsen社製）を、滅菌済みのラテックスを含まない１８Ｇ１ １／２、３ｍｌの注射器（Becton Dickinson & Co.社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）を使用し、２．５ミリリットルの再構成用溶液を用いて再構成した。再構成したDysportを、８回反転させることによって、慎重に混合した。Revance社製のボツリヌス製剤を、微量遠心機用チューブ中で、３０単位のDysportと骨格とを用いて調製し（即ち、１５０マイクロリットルのDysportを、７５マイクロリットルのRevance社製の担体に添加した）、室温にて、５分間放置して、複合体を形成させた。
【０１２２】
局所塗布：マウスに、酸素と混合した１．５％イソフルランを使用して、麻酔を施し、次いで、０．０５ｍｌのげっ歯類用麻酔混合物（３．７５ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌケタミン、３．００ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌキシラジン及び２３．２５ｍｌの食塩水）を、腹腔内に注射した。麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（各群ｎ＝３）を、ランダムに分け、処置に備えた。マウスに、アセトンによるはく離を３回施した。「Revance社製Dysport溶液」を、マウスの後肢に、ピペットを使用して塗布し、ニトリル製の手袋を着用して、皮膚内にもみ入れた。低体温を防止するために、調節した熱環境で、マウスを回復させた。ベースライン及び処置後の写真、マウスの回復の映像並びに指の外転スコア（ＤＡＳ）の値を記録した。
【０１２３】
統計解析：
次いで、各群について、Statview（登録商標）ソフトウェア（Abacus Concepts社製、Berkeley、カリフォルニア州）を使用して求め、平均及び標準誤差として表した。全比較に関して、統計的な有意差を、９５％の信頼度で、一元配置分散分析反復測定及びフィッシャーの保護最小有意ポストホック試験を使用して求めた。
【０１２４】
結果：
ＤＡＳ値を使用し、足の可動性のスコアを表にした。但し、スコア０は、正常な指の外転（筋肉の衰弱がない）を示し、スコア４は、指の外転の最大低下（最大の筋肉の衰弱）を示す［Aoki, K.R. A Comparison of the Safety Margins of Botulinum Neurotoxin Serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001;39:1815-1820］。
【０１２５】
３種の異なる比較によって、統計解析を求め、結果を、表６〜８に示す。平均ＤＡＳ値は、処置群と対照群との間で、「Revance社製Dysport溶液」の単回局所投与後の統計的に有意な筋肉の衰弱／麻痺を示している。表６は、各群対対照に関して、統計的に有意な麻痺（Ｐ＝０．０００１）を示し、表７は、全処置群対対照に関して、統計的に有意な麻痺を詳述する（Ｐ＝０．００１３）。表８は、製剤１を用いて処置した群又は製剤２を用いて処置した群対対照に関して、統計的に有意な麻痺を詳述する（Ｐ＝０．００２４）。
【０１２６】
回復後、マウスが麻痺した肢に向かって歩き、旋回するのが認められた。
【０１２７】
【表６】
0005883371.tif 000007
【０１２８】
【表７】
0005883371.tif 000008
【０１２９】
【表８】
0005883371.tif 000009
【０１３０】
結論：
本実験によって、ペプチジル経皮担体は、治療的に有効な量のDysportボツリヌス治療薬を、当該の治療薬を共有結合的に改変することなく、皮膚を介して輸送することができることが実証される。
【実施例７】
【０１３１】
マウス後足モデルにおける局所ボツリヌス毒素による発汗の抑制
目的：
マウスモデルにおいて、ペプチジル担体を有するボツリヌス毒素（Revance社製のボツリヌス製剤）の局所塗布による発汗の抑制を求める。
【０１３２】
方法：
研究計画：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River社、Wilmington、マサチューセッツ州）、体重１９〜２１ｇを使用した。マウスに、酸素と混合した１．５％イソフルランを使用して、麻酔を施し、研究期間にわたり、麻酔状態を保った。Botoxを、各マウスの足に２単位の容量で局所塗布した（表９）。発汗を、コリン作動薬ピロカルピンによって誘発した［Kaszynski, E and Frisch SB. Mouse Foot Screen for the Inhibition of Sweating by Anticholinergic Drugs. (1974) Journal of Investigative Dermatology, 62:510-513］。発汗を、Minorのデンプンヨウ素反応で可視化した。
【０１３３】
【表９】
0005883371.tif 000010
【０１３４】
試験化合物の調製：ピロカルピン溶液（Sigma Aldrich社製、カタログ番号Ｐ０４７２）を、注射の２４時間前に調製した。ピロカルピン溶液を、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で、０．９％塩化ナトリウムを用いて調製し、ボルテックスによって、２分間十分に混合した。ピロカルピン溶液を、PURADISC 25 TF使い捨てろ過装置（Whatman、直径２５ｍｍ、カタログ番号６７８４−２５０４）及び大きな注射器を用い、滅菌したバイアル内へのろ過によって滅菌した。次いで、溶液を、箔で覆った。７０％エタノール中に２％ヨード溶液（Sigma Aldrich社製、カタログ番号２６６４２６）を調製し、ボルテックスによって、十分に混合した。次いで、ヨウ素溶液を、１５分間超音波処理し、さらに、再度ボルテックスした。骨格を、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で、脱イオン水を用いて調製した。１００単位のBotox（Allergan社製、Irvine、カリフォルニア州）を、滅菌済みのラテックスを含まない１８Ｇ１ １／２、３ｍｌの注射器（Becton Dickinson & Co.社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）を使用し、１．０ミリリットルの０．９％塩化ナトリウムを用いて再構成した。再構成したBotoxを、８回反転させることによって、慎重に混合した。処置溶液を、微量遠心機用チューブ中で、７単位のBotoxと骨格とを用いて調製し（即ち、７０マイクロリットルのBotoxを、３５マイクロリットルのＫＮＲ又はＫＮＴに添加し、３５マイクロリットルのＰＢＳで希釈した）、室温にて、５分間放置して、複合体を形成させた。対照溶液を、Botox及びＰＢＳを用いて調製した（即ち、７０マイクロリットルのBotoxを、７０マイクロリットルのＰＢＳに添加した）。
【０１３５】
局所塗布：マウスに、酸素と混合した１．５％イソフルランを使用して、麻酔を施し、次いで、０．０７ｍｌのげっ歯類用麻酔混合物（３．７５ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌケタミン、３．００ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌキシラジン及び２３．２５ｍｌの食塩水）を、腹腔内に注射し、必要であれば、イソフルランを追加した。麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（各群ｎ＝６）を、試験群にランダムに割り付けた。２０マイクロリットルの処置溶液又は対照溶液を、割り当てられた後肢に塗布した。足の裏を、溶液で、完全に且つ十分にコートした。ピペットを使用して、足に、試験溶液の薄い均一な被膜を塗布した。低体温を防止するために、調節した熱環境で、マウスを回復させた。溶液を、２分間熱ランプを使用し完全に乾燥させ、次いで、５分間風乾した。次いで、後足を、約５０マイクロリットルのCetaphilクリームを用いてコートした。
【０１３６】
デンプンヨウ素反応：Minorのデンプンヨウ素試験を行って、ベースライン及び処置１週間後における汗の分布を可視化した。マウスを、生命徴候を有する完全な麻酔状態に１０分間保った後、後足を２％ヨウ素溶液に漬けることによって、ヨウ素溶液を塗布した。ヨウ素溶液を、３分間熱ランプを使用し完全に乾燥させ、次いで、５分間風乾した。次いで、粉末を含まない手袋を着用して、デンプン粉末を指で擦り入れた。過剰のデンプン粉末を、小型の絵筆で取り除き、次いで、デンプン粉末を、密なビロードのパッドで軽く塗布して、より均一にした。ベースライン及び処置後の写真を、ピロカルピン注射後１０、２０及び６０分で記録した。
【０１３７】
結果：
マウスの足の汗を、Minorのデンプンヨウ素反応によって可視化した。汗を、青−黒の呈色によって示した。［Kuttner, C et al. Treatment of Gustatory Sweating with Botulinum toxin A. (2001) Int Poster J Dent Oral Med. 3;3:poster 82］。
【０１３８】
典型的には、青−黒の陽性の点が、ピロカルピン注射後５０〜６０分で、最もよく見られた。デンプンヨウ素反応によって、図１０ａ〜ｄの代表的な写真に示すように、処置群では、対照と比較して、青−黒の陽性の点が顕著に少ないことが示された。
【実施例８】
【０１３９】
Revance社製ボツリヌス製剤の局所塗布後の筋力の発生の評価
目的：
マウスモデルにおいて、ボツリヌス毒素Ｂ型の局所塗布後に、筋収縮力の発生によって神経筋遮断効果を評価する。
【０１４０】
方法：
研究計画：雄ＣＤ１マウス（Charles River社、Wilmington、マサチューセッツ州）、体重２７〜３３ｇを使用した。各群５匹として、マウスを飼育し、処置まで、食餌及び水を自由に摂取させた。マウスに、酸素と混合した１．５％イソフルランを使用して、麻酔を施し、研究期間にわたり、麻酔状態を保った。各マウスの後肢の投与部位を、Andis Edjer IIコードレス充電式バリカン（Andis社製、Sturtevant、ウィスコンシン州）を用いて、慎重に剪毛した。Dysportを、各マウスの肢に２５単位の用量で局所塗布した。未処置の正常マウス、及び同等の容量で局所塗布する基剤製剤（毒素なし）で処置したマウスを、対照とした。筋収縮力を、局所処置後２〜３．５時間で測定した。
【０１４１】
試験化合物の調製：５％ＥｔＯＨ及び５％ポリアスパラギン酸溶液を有する滅菌０．９％塩化ナトリウム（Abbott Laboratories社製、North Chicago、イリノイ州）のDysport再構成用溶液を調製した。骨格を、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で、０．９％塩化ナトリウムを用いて調製した。５００単位のDysport（Ipsen社製）を、滅菌済みのラテックスを含まない１８Ｇ１ １／２、３ｍｌの注射器（Becton Dickinson & Co.社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）を使用し、２．５ミリリットルの再構成用溶液を用いて再構成した。再構成したDysportを、８回反転させることによって、慎重に混合した。Revance社製のボツリヌス製剤を、微量遠心機用チューブ中で、２５単位のDysportと骨格とを用いて調製し（即ち、１２５マイクロリットルのDysportを、６２．５マイクロリットルの上記の先の実験に基づく、専売の短いペプチジルの骨格に添加した）、室温にて、５分間放置して、複合体を形成させた（ｎ＝生存したマウス２匹）。対照は、食塩水のみを活性剤として使用した（ｎ＝４匹）。
【０１４２】
局所塗布：後肢に、対照又はRevance社製のボツリヌス製剤を、ピペットを使用して塗布し、ニトリル製の手袋を着用して皮膚内にもみ入れた。Dysport及び骨格は、４℃にて保存した。低体温を防止するために、調節した熱環境で、マウスをインキュベートした。筋収縮力を、局所処置後２〜３．５時間で測定した。
【０１４３】
筋収縮力の発生：Ｋ鋼線を大腿及び脛骨を介して使用して肢を木製の台に縛りつけることによって、肢を固定して、動きを抑制した。腓腹筋は、原位置に残した。鋼線の縫合糸を、アキレス腱の遠位端の周りで結んだ。次いで、腱を縫合糸に対して遠位で横切し、縫合糸を、力変換器（FT03型、Grass社製、West Warwick、ロードアイランド州）に付着させ、この力変換器は、次に、力変換器の増幅器（13-G4615-50型、Gould社製、Cleveland、オハイオ州）に接続した。Dysport処置側の坐骨神経を、最大の等尺性の単一収縮力が発生するまで電圧を増加させて、直接刺激した（SD9刺激装置、Grass社製、West Warwick、ロードアイランド州）。次いで、刺激の周波数を、最大の強縮力が発生するまで増加させた。収縮を、１つの運動単位を刺激することによって発生させ、強縮を、超最大の刺激による全運動単位の相加を作用させることによって発生させた。同一の手順を、対照の肢で繰り返した。応答を、力変換器に連結している較正された振動の記録（RS 3800、Gould社製、Cleveland、オハイオ州）を用いて記録した。［Ma J, Elsaidi GA, Smith TL, et al. Time course of recovery of juvenile skeletal muscle after botulinum toxin A injection. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2004; 83(10):774-780］。
【０１４４】
結果：
ボツリヌス毒素Ａの注射を用いた以前の研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの筋力発生の正常値は、６０±１５グラムの平均単一収縮力及び２４０±３０グラムの平均強縮力を有する。本パイロット前臨床研究では、匹敵する５４±２グラムの平均単一収縮力及び２４１±２０グラムの平均強縮力を認めた。
【０１４５】
Ｋｎ２１Ｐｒを有する局所Dysportの筋力発生を評価したところ、記録上、対照と比較して、Ｋｎ２１Ｐｒを有するRevance社製の局所ボツリヌス製剤の単回投与を用いて処置したマウスにおいては、応答が見られず、その結果、単一収縮及び強縮の応答が約１００％低下し、下限に関しては、対照と比較して、ＫｎＴを有するRevance社製の局所ボツリヌス製剤の単回投与を用いて処置したマウスにおいては、筋力発生は、単一収縮では約５８％の低下及び強縮では約６１％の低下を示した。表１０及び１１に、単一収縮試験及び強縮試験のそれぞれについて、平均及び標準誤差を示す。
【０１４６】
【表１０】
0005883371.tif 000011
【０１４７】
【表１１】
0005883371.tif 000012
【０１４８】
結論：
本研究によって、Dysportの２５単位／マウスの肢での局所塗布は、運動力発生を効果的に低下させることができることが実証され、治療的利点の証拠が示されている。
【実施例９】
【０１４９】
Revance社製ボツリヌス製剤の局所塗布後の筋力の発生の評価
目的：
マウスモデルにおいて、ボツリヌス毒素Ａ型の局所塗布後に、筋収縮力の発生によって神経筋遮断効果を評価する。
【０１５０】
方法：
研究計画：雄ＣＤ１マウス（Charles River社、Wilmington、マサチューセッツ州）、体重２７〜３３ｇを使用した。各群５匹として、マウスを飼育し、処置まで、食餌及び水を自由に摂取させた。マウスに、酸素と混合した１．５％イソフルランを使用して、麻酔を施し、研究期間にわたり、麻酔状態を保った。各マウスの後肢の投与部位を、Andis Edjer IIコードレス充電式バリカン（Andis社製、Sturtevant、ウィスコンシン州）を用いて、慎重に剪毛した。Botoxを、各マウスの肢に１０単位の用量で局所塗布した。未処置の正常マウス、及び同等の容量で局所塗布する基剤製剤（毒素なし）で処置したマウスを、対照とした。筋収縮力を、局所処置後２〜３．５時間で測定した。
【０１５１】
試験化合物の調製：５％ＥｔＯＨ及び５％ポリアスパラギン酸溶液を有する滅菌０．９％塩化ナトリウム（Abbott Laboratories社製、North Chicago、イリノイ州）のBotox再構成用溶液を調製した。骨格を、１ミリグラム／ミリリットルの濃度で、０．９％塩化ナトリウムを用いて調製した。１００単位のBotox（Allergan社製、Irvine、カリフォルニア州）を、滅菌済みのラテックスを含まない１８Ｇ１ １／２、３ｍｌの注射器（Becton Dickinson & Co.社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州）を使用し、１．０ミリリットルの再構成用溶液を用いて再構成した。再構成したBotoxを、８回反転させることによって、慎重に混合した。「Revance社製のBotox溶液」を、微量遠心機用チューブ中で、１０単位のBotoxと骨格とを用いて調製し（即ち、１００マイクロリットルのBotoxを、５０マイクロリットルの上記の先の実験に基づく、専売の短いペプチジルの骨格に添加した）、室温にて、５分間放置して、複合体を形成させた（ｎ＝生存したマウス２匹）。対照は、食塩水のみを活性剤として使用した（ｎ＝４匹）。
【０１５２】
手順：後肢に、対照又は「Revance社製のBotox溶液」を、ピペットを使用して塗布し、ニトリル製の手袋を着用して皮膚内にもみ入れた。Botox及び骨格は、４℃にて保存した。低体温を防止するために、調節した熱環境で、マウスをインキュベートした。筋収縮力を、局所処置後２〜３．５時間で測定した。
【０１５３】
筋収縮力の発生：Ｋ鋼線を大腿及び脛骨を介して使用して肢を木製の台に縛りつけることによって、肢を固定して、動きを抑制した。腓腹筋は、原位置に残した。鋼線の縫合糸を、アキレス腱の遠位端の周りで結んだ。次いで、腱を縫合糸に対して遠位で横切し、縫合糸を、力変換器（FT03型、Grass社製、West Warwick、ロードアイランド州）に付着させ、この力変換器は、次に、力変換器の増幅器（13-G4615-50型、Gould社製、Cleveland、オハイオ州）に接続した。Botox処置側の坐骨神経を、最大の等尺性の単一収縮力が発生するまで電圧を増加させて、直接刺激した（SD9刺激装置、Grass社製、West Warwick、ロードアイランド州）。次いで、刺激の周波数を、最大の強縮力が発生するまで増加させた。収縮を、１つの運動単位を刺激することによって発生させ、強縮を、超最大の刺激による全運動単位の相加を作用させることによって発生させた。同一の手順を、対照の肢で繰り返した。応答を、力変換器に連結している較正された振動の記録（RS 3800、Gould社製、Cleveland、オハイオ州）を用いて記録した。［Ma J, Elsaidi GA, Smith TL, et al. Time course of recovery of juvenile skeletal muscle after botulinum toxin A injection. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2004; 83(10):774-780］。
【０１５４】
結果：
今回行われたように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの筋力発生の正常値は、６０±１５グラムの平均単一収縮力及び２４０±３０グラムの平均強縮力である。本パイロット前臨床研究では、匹敵する５４±２グラムの平均単一収縮力及び２４１±２０グラムの平均強縮力を認めた。
【０１５５】
Ｋｎ２１Ｐｒを有する局所Botoxの筋力発生を評価したところ、記録上、対照と比較して、Ｋｎ２１Ｐｒを有する局所「Revance社製のBotox溶液」の単回投与を用いて処置したマウスにおいては、応答が見られず、その結果、単一収縮及び強縮の応答が約１００％低下し（図１１）、対照と比較して、ＫＮＰを有する局所「Revance社製のBotox溶液」の単回投与を用いて処置したマウスにおいては、筋力発生は、単一収縮では約９０％の低下及び強縮では１００％の低下（応答なし）を示した。表１２に、単一収縮試験及び強縮試験のそれぞれについて、平均及び標準誤差を示す。表１３に、単一収縮及び強縮について、筋力発生の平均及び低下率の概要を示す。
【０１５６】
【表１２】
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【０１５７】
【表１３】
0005883371.tif 000014
【０１５８】
結論：
本研究によって、Dysportの２５単位／マウスの肢及びBotoxの１０単位／マウスの肢での局所塗布は、運動力発生を効果的に低下させることができることが実証され、治療的利点の証拠が示されている。
【実施例１０】
【０１５９】
ブタの皮膚を介するボツリヌス毒素Ａ型のインビトロにおける担体仲介経皮送達−流通分析、その１
目的：
皮膚関門を介するボツリヌス毒素Ａ型（ＢｏＮＴＡ）の送達における我々の担体の効率を評価する。
【０１６０】
方法：
毒素のビオチン標識：１０マイクログラムのボツリヌス毒素Ａ型（List Biological Laboratories社製、Campbell、カリフォルニア州）を１００マイクロリットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁した。sulfo-NHS-LC-Biotin（Pierce社製、Rockford、イリノイ州）を、２０倍モル過剰量で添加し、反応容量を、１ミリリットルとした。反応液を、室温にて、１時間インキュベートし、ＰＢＳに対して、10 K MWCO Slide-A-Lyzer Dialysis Casette（Pierce社製、Campbell、カリフォルニア州）を使用して、一晩透析した。
【０１６１】
皮膚の収集：無処置の皮膚を、雌雄のブタの腹部（Lychron社製、Mountain View、カリフォルニア州）から収集した。輸送中、皮膚を、ＰＢＳ、１０単位／ミリリットルのペニシリン及び１０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシンを含有する氷浴中に浸漬した。上皮及び真皮を、厚さ０．８ｍｍに設定したDermatome（Padgett Instruments社製、Plainsboro、ニュージャージ州）を使用して単離した。皮膚を、液体窒素中で急速冷凍し、使用まで−８０℃にて保存した。
【０１６２】
試験：全実験条件を、三つ組みで試験した。各試料について、適切な量の担体及び毒素を添加し（表１４）、容量を、ＰＢＳで２００マイクロリットルとした。
【０１６３】
【表１４】
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【０１６４】
使用直前に、皮膚を、３７℃の水浴中で解凍し、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの正方形に切断し、改変したFranz Chamber装置（PermeGear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）中に固定した。Haake DC 10循環型水浴（Thermo Electron社製、Karlsruhe、独国）を、３７℃に設定した。試料を、皮膚表面に塗布し、IPC Ismatec蠕動ポンプ（Idex社製、Wertheim-Mondfeld、独国）を使用して流通速度を８．０２マイクロリットル／分に設定した。流通画分を、Retriever IVフラクションコレクター（Teledyne Isco社製、Lincoln、ネブラスカ州）を使用して採取し、ATM10 Indexing Controller（Permegear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）を使用して０〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜６、６〜８、８〜１２及び１２〜２０時でプールした。装置の機構については、図１２を参照。
【０１６５】
試料の分析：ビオチン標識した毒素溶液を段階希釈して、検量線を求めた。プレートを２００マイクロリットルの流通試料及び標準物質でコートし、室温にて、２時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で、３回洗浄した。次いで、２００マイクロリットルのブロッキング緩衝液／ウェル（ＰＢＳＴ中に２０％ＦＢＳ）を添加し、室温にて、２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した。ＰＢＳＴ中の２％ＦＢＳ中に１０００倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰの１００マイクロリットルを、各ウェルに添加し、室温にて、１時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴで、５回洗浄した。１００マイクロリットルのOptEIA基質（BD Bioscience社製）を、各ウェルに添加し、室温にて、１０分間インキュベートして、展開した。５０マイクロリットルの１ＮＨ２ＳＯ４を添加して、反応をクエンチし、吸収を４５０ｎｍで測定した。
【０１６６】
結果：
Revance社製の担体は、毒素の送達を増加させた（図１３を参照）。毒素の濃度及び担体：毒素の質量比を最適化することによって、対照と比較して、毒素の送達を、統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）増加させた。
【実施例１１】
【０１６７】
ブタの皮膚を介するボツリヌス毒素Ａ型のインビトロにおける担体仲介経皮送達−流通分析、その２
目的：
改変したFranzチャンバーを使用して、ブタの皮膚モデルにおいて、皮膚関門を介するボツリヌス毒素Ａ型及び子ウシ腸管ホスファターゼ（ＣＩＰ）の送達におけるRevance社製の担体の効率を評価する。
【０１６８】
方法：
毒素のビオチン標識：１０マイクログラムのボツリヌス毒素Ａ型（List Biological Laboratories社製、Campbell、カリフォルニア州及びSigma-Aldrich社製）を１００マイクロリットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁した。sulfo-NHS-LC-Biotin（Pierce社製、Rockford、イリノイ州）を、２０倍モル過剰量で添加し、反応容量を、ＰＢＳで１ミリリットルとした。ｐＨを調べて、結合のためにｐＨ範囲を７〜９に確保した。反応液を、室温にて、１時間インキュベートし、ＰＢＳに対して、10 K MWCO Slide-A-Lyzer Dialysis Casette（Pierce社製、Campbell、カリフォルニア州）を使用して、一晩透析した。
【０１６９】
皮膚の収集：無処置の皮膚を、雌雄のブタの腹部及び肩部（Lychron社製、Mountain View、カリフォルニア州）から収集した。輸送中、皮膚を、ＰＢＳ、１０単位／ミリリットルのペニシリン及び１０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシンを含有する氷浴中に浸漬した。植皮（上皮及び真皮を含む完全な厚さ）を、厚さ０．８ｍｍに設定したDermatome（Padgett Instruments社製、Plainsboro、ニュージャージ州）を使用して単離した。植皮を、液体窒素中で急速冷凍し、使用まで−８０℃にて保存した。
【０１７０】
試験：全実験条件を、三つ組みで試験した。３種のペイロード群及び６種の異なる担体があった。各試料について、適切な量の担体及び毒素を添加した（表１５）。ペイロード及び担体を、以下の濃度で調製した：Ｋｎ８担体（Ｋｎ８、Ｋｎ８Ｒ及びＫｎ８Ｔ）は、１０ミリグラム／ミリリットルで調製し、Ｋｎ２１Ｔ担体は、１ミリグラム／ミリリットルで調製し、Ｋ３０Ｔ及びＫｎ２１ｐＲ並びにボツリヌス毒素Ａ型（List Labs社製及びSigma社製の毒素）は、０．１ミリグラム／ミリリットルで調製し、ＣＩＰは、１００単位／ミリリットルで調製した。
【０１７１】
【表１５】
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【０１７２】
使用直前に、皮膚を、３７℃の水浴中で解凍し、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの正方形に切断し、改変したFranz Chamber装置（PermeGear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）中に固定した。Haake DC 10循環型水浴（Thermo Electron社製、Karlsruhe、独国）を、３７℃に設定した。試料を、皮膚表面に塗布し、IPC Ismatec蠕動ポンプ（Idex社製、Wertheim-Mondfeld、独国）を使用して流通速度を８．０２マイクロリットル／分に設定した。流通画分を、Retriever IVフラクションコレクター（Teledyne Isco社製、Lincoln、ネブラスカ州）を使用して採取し、ATM10 Indexing Controller（Permegear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）を使用して０〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜６、６〜８、８〜１２及び１２〜２０時でプールした。
【０１７３】
試料の分析：ビオチン標識した毒素溶液を段階希釈して、検量線を求めた。プレートを２００マイクロリットルの流通試料及び標準物質でコートし、室温にて、２時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で、３回洗浄した。次いで、２００マイクロリットルのブロッキング緩衝液／ウェル（ＰＢＳＴ中に２０％ＦＢＳ）を添加し、室温にて、２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した。ＰＢＳＴ中の２％ＦＢＳ中に１０００倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰの１００マイクロリットルを、各ウェルに添加し、室温にて、１時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴで、５回洗浄した。１００マイクロリットルのOptEIA基質（BD Bioscience社製）を、各ウェルに添加し、室温にて、１０分間インキュベートして、展開した。５０マイクロリットルの１ＮＨ２ＳＯ４を添加して、反応をクエンチし、吸収を４５０ｎｍで測定した。
【０１７４】
ＣＩＰ：ＣＩＰについて使用したのと同様な手順。ＣＩＰは、ボツリヌス毒素に非常に類似していることから、代替物として選ばれた。これは、１６０ｋＤの類似の分子量を有する球状のタンパク質である。ＣＩＰは、それほど高価ではなく、高度に特異的な活性を有する。
【０１７５】
結果：
【０１７６】
【表１６】
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【０１７７】
表１６に示すように、異なる担体は、異なる複合体に関して、深さ及び指向性に影響する。より短い骨格（Ｋｎ８系）は、より表面的に存在するので、流通の容易さが低い。所与の骨格の長さでは、ＴＡＴは、オリゴアルギニンよりも深く貫通する。ＣＩＰのような荷電が少ない種は、効果的な粒子を形成しないので、それほど深くは貫通しない。ラクトース等の複合体の成分は、担体の優先度を変化させることができる（又は安定な粒子を形成させるための戦術が必要になる）。
【実施例１２】
【０１７８】
ブタの皮膚を介するボツリヌス毒素Ａ型のインビトロにおける担体仲介経皮送達−流通分析、その３
目的：
改変したFranzチャンバーを使用して、ブタの皮膚モデルにおいて、皮膚関門を介するボツリヌス毒素Ａ型の送達におけるRevance社製の担体の効率を評価する。
【０１７９】
方法：
皮膚の収集：無処置の皮膚を、雌のブタの肩部及び腹部（Lychron社製、Mountain View、カリフォルニア州）から収集した。輸送中、皮膚を、１０単位／ｍｌのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＰＢＳ中に浸漬し、それを、氷上に保存した。植皮（上皮及び真皮を含む完全な厚さ）を、厚さ０．８ｍｍに設定したDermatome（Padgett Instruments社製、Plainsboro、ニュージャージ州）を使用して単離し、液体窒素中で急速冷凍し、使用まで−８０℃にて保存した。
【０１８０】
毒素のビオチン標識：１０μｇのボツリヌス毒素Ａ型（List Biological Laboratories社製、Campbell、カリフォルニア州）を１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁した。sulfo-NHS-LC-Biotin（Pierce社製、Rockford、イリノイ州）を、１００倍モル過剰量で添加し、反応容量を、ＰＢＳで１ｍｌとした。ｐＨを調べて、結合のためにｐＨ範囲を７〜９に確保した。反応液を、室温にて、２時間インキュベートし、ＰＢＳに対して、10 K MWCO Slide-A-Lyzer Dialysis Casette（Pierce社製、Campbell、カリフォルニア州）を使用して、一晩透析した。翌日、ビオチン標識した毒素を、分注し（１００μｌ／チューブ）、４℃にて保存した。
【０１８１】
Franz Chamber用皮膚の調製：使用直前に、皮膚を、３７℃の水浴中で解凍し、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの正方形に切断し、改変したFranz Chamber装置（PermeGear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）中に固定した。Haake DC 10循環型水浴（Thermo Electron社製、Karlsruhe、独国）を、３７℃に設定した。試料を、皮膚表面に塗布し、IPC Ismatec蠕動ポンプ（Idex社製、Wertheim-Mondfeld、独国）を使用して流通速度を８．０２μｌ／分に設定した。流通画分を、Retriever IVフラクションコレクター（Teledyne Isco社製、Lincoln、ネブラスカ州）を使用して採取し、ATM10 Indexing Controller（Permegear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）を使用して０〜１、１〜２、２〜３、３〜４時でプールした。
【０１８２】
製剤：各試料について、適切な量の担体及び毒素を添加した。全実験条件を、四つ組みで試験した。処置群は、Revance社製の担体を有するビオチン標識した毒素であり、対照群は、ビオチン標識した毒素のみであった。毒素の濃度及び毒素：担体の質量比を最適化するために、担体及びボツリヌス毒素Ａ型を、異なる質量比で調製した。
【０１８３】
エライザ法（タンパク質定量法）：ビオチン標識した毒素を（１：３及び１：２に）段階希釈して、検量線を求めた。プレートを２００μｌの流通試料及び標準物質でコートし、室温にて、２時間インキュベートした。２時間後、試料及び標準物質を捨て、各プレートを、３００μｌのスーパーブロックブロッキング緩衝液で、室温にて、１分間ブロックし、２回繰り返した。ブロッキング緩衝液を除去し、２％ＦＢＳを有するＰＢＳＴ中に１０００倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰの１００μｌを、各ウェルに添加し、室温にて、１時間インキュベートした。次いで、プレートを、（各ウェルについて）３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で、室温にて、５分間洗浄し、２回繰り返した。洗浄後、１００μｌのOptEIA基質（BD Biosciences社製）を、各ウェルに添加し、室温にて、１０分間インキュベートして、展開した。次いで、５０μｌの１ＮＨ２ＳＯ４を添加して、反応をクエンチし、吸収を４５０ｎｍで測定した。
【０１８４】
結果：
Revance社製の担体は、対照と比較して、毒素の送達の増加を示した（図１４ａ〜ｆを参照）。
【実施例１３】
【０１８５】
ブタの皮膚を介するボツリヌス毒素Ａ型のインビトロにおける担体仲介経皮送達−皮膚分析
目的：
改変したFranzチャンバーを使用して、ブタの皮膚モデルにおいて、皮膚関門を介するボツリヌス毒素Ａ型の送達におけるRevance社製の担体の効率を評価する。
【０１８６】
方法：
毒素のビオチン標識：１０マイクログラムのボツリヌス毒素Ａ型（List Biological Laboratories、Campbell、カリフォルニア州）を１００マイクロリットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁した。sulfo-NHS-LC-Biotin（Pierce社製、Rockford、イリノイ州）を、２０倍モル過剰量で添加し、反応容量を、ＰＢＳで１ミリリットルとした。ｐＨを調べて、結合のためにｐＨ範囲を７〜９に確保した。反応液を、室温にて、１時間インキュベートし、ＰＢＳに対して、10 K MWCO Slide-A-Lyzer Dialysis Casette（Pierce社製、Campbell、カリフォルニア州）を使用して、一晩透析した。
【０１８７】
皮膚の収集：無処置の皮膚を、雌のブタの肩部（Lychron社製、Mountain View、カリフォルニア州）から収集した。輸送中、皮膚を、ＰＢＳ、１０単位／ミリリットルのペニシリン及び１０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシンを含有する氷浴中に浸漬した。植皮（上皮及び真皮を含む完全な厚さ）を、厚さ０．８ｍｍに設定したDermatome（Padgett Instruments社製、Plainsboro、ニュージャージ州）を使用して単離した。植皮を、液体窒素中で急速冷凍し、使用まで−８０℃にて保存した。
【０１８８】
試験：全実験条件を、三つ組みで試験した。２つの試験群があった。処置群は、Revance社製のＫ３０Ｔｓ担体を有するビオチン標識した毒素であり、対照群は、ビオチン標識した毒素のみであった。各試料について、適切な量の担体及び毒素を添加した（表１７）。担体及びボツリヌス毒素Ａ型は、０．１ミリグラム／ミリリットルの濃度で調製した。
【０１８９】
【表１７】
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【０１９０】
使用直前に、皮膚を、３７℃の水浴中で解凍し、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの正方形に切断し、改変したFranz Chamber装置（PermeGear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）中に固定した。Haake DC 10循環型水浴（Thermo Electron社製、Karlsruhe、独国）を、３７℃に設定した。試料を、皮膚表面に塗布し、IPC Ismatec蠕動ポンプ（Idex社製、Wertheim-Mondfeld、独国）を使用して流通速度を８．０２マイクロリットル／分に設定した。流通画分を、Retriever IVフラクションコレクター（Teledyne Isco社製、Lincoln、ネブラスカ州）を使用して採取し、ATM10 Indexing Controller（Permegear社製、Bethlehem、ペンシルベニア州）を使用して０〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜６、６〜８、８〜１２及び１２〜２０時でプールした。
【０１９１】
ストレプトアビジン染色：急速冷凍した皮膚を切断し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で、水和させた。切片を、Blottoのブロッキング緩衝液で、室温にて、２時間ブロックし、次いで、ＰＢＳＴで５分間ずつ３回リンスした。ＰＢＳＴ中の２％ＦＢＳ中に１０００倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、切片を、室温にて、３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで５分間ずつ３回リンスした。OptEIA基質（BD Bioscience社製）を添加し、切片を、室温にて、３分間インキュベートして、展開した。切片を、ＰＢＳＴで洗浄し、カバーガラスで覆った。
【０１９２】
結果：
写真：染色した切片の写真を、倍率４×の平面アポクロマート対物レンズ付きNikon E600顕微鏡上で、Retina 1300Bカメラ（Imaging社製、Burnaby、BC、カナダ）を用いて撮影した（図１５）。
【実施例１４】
【０１９３】
筋肉麻痺の発生におけるボツリヌス毒素Ａ型の有効性
目的：
筋力発生試験によって、Revance社製のボツリヌス製剤中の毒素を局所塗布した後に、マウスに発生する筋肉の麻痺におけるボツリヌス毒素Ａ型の有効性を研究する。
【０１９４】
材料及び方法：
ボツリヌス毒素：
Neuronox（Medy-Tox社製、韓国）ロット番号：ＮＮＸ０５０２、１００Ｕ／バイアル；
０．９％ＮａＣｌ（保存剤なし、Abbott Laboratories社製、North Chicago、イリノイ州）
【０１９５】
ポリリジンペプチド（担体）：
Ｋ１５Ｔ２
【０１９６】
【表１８】
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【０１９７】
ポリリジンペプチド／毒素複合体調製物：
標的担体：アルブミン／毒素の質量比＝１．１：１
【０１９８】
Neuronox調製物：（アルブミン０．５ｍｇ／毒素１００Ｕ）
微量遠心機用チューブ中に、０．９％ＮａＣｌを用いて、Ｋ１５Ｔ２担体の１．１ｍｇ／ｍｌ保存液を作り、ボルテックスによって混合した。１００Ｕ（バイアル１本）のＮＮＸを、０．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌを用いて、０．９％ＮａＣｌをバイアルの側壁内にゆっくり注入することによって再構成し、穏やかに反転させることによって混合した。（濃度は、毒素１００Ｕ／０．５ｍｌとなった）。０．５ｍｌの担体保存液を、０．５ｍｌの再構成した毒素からゆっくり注入し、担体／毒素のバイアルを穏やかに１０回反転させ、バイアルをまっすぐに立たせた状態で、室温にて、５分間放置し、さらに、投与前に再度穏やかに反転させた。（濃度は、毒素１００Ｕ／１．０ｍｌとなった）。１００μｌの混合物を、１ｍｌの注射器及び針で取り出した。針は、塗布前にはずした。（最終濃度は、毒素１０Ｕ／１００μｌとなる）。
【０１９９】
研究計画：雄ＣＤ１マウス（Charles River社、Wilmington、マサチューセッツ州）、体重２２〜２６ｇを処置に、及び体重２８〜３１ｇを対照に使用した。各群５匹として、マウスを飼育し、処置まで、食餌及び水を自由に摂取させた。マウスに、酸素と混合した１．５％イソフルランを使用して、麻酔を施し、処置期間にわたり、麻酔状態を保ったが、留置期間は３０分であった。各マウスの後肢の投与部位を、Andis Edjer IIコードレス充電式バリカン（Andis社製、Sturtevant、ウィスコンシン州）を用いて、慎重に剪毛した。ＮＮＸを、各マウスの肢に１０単位の用量で局所塗布した。同等の容量で局所塗布したペプチジル担体なしの毒素を、対照とした。筋収縮力を、局所処置後４日で測定した。
【０２００】
局所塗布：
マウスに、酸素と混合したイソフルランを用いて、麻酔を施した。１００μｌ（１０単位）の担体／毒素の混合物を、針なしの１ｍｌの注射器を使用することによってゆっくり塗布して、ランダムに選択したマウスの（剪毛した）後足に広げた。他方の足は、対照の混合物で処置した。マウスが麻酔下にある間に、ニトリル製の手袋を着用して、混合物を、後足にもみ付け、３０分間インキュベートし、次いで、投与部位を水でリンスし、ペーパータオルで拭いて、投与部位に残っている毒素を清浄して除去した。局所塗布及び清浄の後、マウスを飼育ケージに戻し、熱を調節した環境で麻酔から回復させた。マウスを、呼吸数の減少、呼吸困難、下垂及び散瞳等の全身毒性の行動上の徴候、又は筋肉の麻痺について、毎日観察した。筋力の発生を、処置後４日で測定した。
【０２０１】
筋収縮力の発生：
Ｋ鋼線を大腿及び脛骨を介して使用して肢を木製の台に縛りつけることによって、肢を固定して、動きを抑制した。腓腹筋は、原位置に残した。鋼線の縫合糸を、アキレス腱の遠位端の周りで結んだ。次いで、腱を縫合糸に対して遠位で横切し、縫合糸を、力変換器（FT03型、Grass社製、West Warwick、ロードアイランド州）に付着させ、この力変換器は、次に、力変換器の増幅器（13-G4615-50型、Gould社製、Cleveland、オハイオ州）に接続した。ＮＮＸ処置側の坐骨神経を、直接刺激した（SD9刺激装置、Grass社製、West Warwick、ロードアイランド州）。刺激の周波数を、最大の強縮力が発生するまで増加させた。強縮を、超最大の刺激による全運動単位の相加を作用させることによって発生させた。同一の手順を、対照の肢で繰り返した。応答を、力変換器に連結している較正された振動の記録（RS 3800、Gould社製、Cleveland、オハイオ州）を用いて記録した。［Ma J, Elsaidi GA, Smith TL, et al. Time course of recovery of juvenile skeletal muscle after botulinum toxin A injection. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2004; 83(10):774-780］。
【０２０２】
結果：
ペプチジル担体を有する局所ＮＮＸの筋力発生を評価したところ、単回局所投与を用いて処置したマウスにおいては、筋力の低下が見られ、その結果、強縮の応答が約５５％低下し、それは、Ｋ１５Ｔ２を有するＮＮＸ（処置群）については１２８±１１グラムの平均、及び担体なしのＮＮＸ（対照群）については２８６±１６グラムの平均を有した（表１８）。表１９に、刺激周波数の概要を示し、これには、各刺激周波数について、筋力の低下率の平均（average）、平均（mean）及び標準誤差が含まれる。図１６は、Ｋ１５Ｔ２を有するＮＮＸ（処置群）、担体なしのＮＮＸ（対照群）、及びＮＮＸ注射に関して、筋力の低下率を示す。
【０２０３】
【表１９】
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【０２０４】
【表２０】
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【０２０５】
結論：
本研究は、専売の担体システムにおけるRevance社製のボツリヌス製剤中のボツリヌス毒素Ａは、単回局所塗布後にマウスにおいて筋肉の麻痺を発生させる効果があることを実証した。
【実施例１５】
【０２０６】
ヒトのパイロット研究：表情の機能的障害なしに前頭部のしわを減らす局所ボツリヌス毒素Ａ型
局所ボツリヌス毒素の調製物及び塗布：
対象１：第１の処置−４μｇのＫ１５Ｔ２Revance社製の担体を、（ＥｔＯＨを含有しない０．９％塩化ナトリウム中の）１５％ポロクサマー２．０ｍｌに溶解し、反転によって混合した。１．０ｍｌのポロクサマー−担体混合物を使用して、４００ＵのBotox（Allergan社製、Irvine、カリフォルニア州）を、段階的に再構成し、反転によって混合した。担体の毒素に対する比の最終濃度は、担体０．５μｇ／毒素１００Ｕであった。局所毒素溶液を、室温にて、５分間放置した。全容量１．０ｍｌを、注射器を使用して、前頭部に塗布した。３０分間インキュベートした後、処置した前頭部の領域を、５枚の湿らせたペーパータオルを用いて洗浄し、この場合、各ペーパータオルを、前頭部を１方向にのみ１回拭くのに使用した。処置前（ベースライン）及び処置後に、写真で記録した。
【０２０７】
対象２：第１の処置−１０μｇのボツリヌス毒素Ａ型（List Biological Laboratories社製、Campbell、カリフォルニア州、製品番号１３０Ａ）を、１．０ｍｌの０．９％塩化ナトリウム中に再構成し、さらに希釈して、最終濃度５ｎｇ／１００μｌとした。再構成した毒素を、反転によって混合した。Revance Carrierを、１ｎｇ／２０μｌの濃度で調製した。１ｎｇのCarrierを、（ＥｔＯＨを含有しない）０．９％ＮａＣｌ中の１５％ポロクサマー９００μｌ中に混合した。次いで、１００ｍｌの毒素を、９２０μｌのポロクサマーに添加して、１：１０＝毒素：希釈液の比を得た。全容量１．０２ｍｌを、注射器を使用して、前頭部に塗布した。３０分間インキュベートした後、処置した前頭部の領域を、５枚の湿らせたペーパータオルを用いて、対象１と同様な方法で洗浄した。処置前（ベースライン）及び処置後に、写真で記録した。
【０２０８】
結果：
図１７に、処置の前後の写真を示す。これらの写真は、局所ボツリヌス毒素Ａ型によって、前頭部のしわが減少したことを示す。処置前（ベースライン）及び処置後のヒトの対象１（上列）及び対象２（下列）の写真。
【実施例１６】
【０２０９】
多汗症の研究−ヒトの対象において過剰な発汗を治療するRevance社製の局所ボツリヌス製剤
目的：
Revance社製のボツリヌス製剤の局所塗布による発汗抑制の可能性を決定する。
【０２１０】
調製：ＫＮＲ及びＰ６Ｒ−Ｂの骨格のそれぞれ１ｍｇ／ｍｌを、別々のチューブ内の脱イオンＨ２Ｏ中に調製し、ボルテックスして、よく混合した。BOTOX（登録商標）−１００単位（Allergan社製、Irvine、カリフォルニア州）を、１．０ｍｌの脱イオンＨ２Ｏ（対象１）又は０．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（対象２及び３）のいずれかを用いて再構成し、反転によって混合した。処置剤の保存液を、以下の表に示す成分を１．７ｍｌの微量遠心機用チューブに添加し、９０秒間ボルテックスし、室温にて５分間インキュベートし、複合体を形成させることによって調製した。コニカルチューブに、右にはＲ及び左にはＬと表示した。１．０ｍｌの保存液を、割り当てたコニカルチューブに移し、１：５の希釈液を、４．０ｍｌのCetaphil（Galderma社製、Fort Worth、テキサス州）を添加することによって調製し、金属製のへらを使用してよく混合した。
【０２１１】
【表２１】
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【０２１２】
重量測定による評価：ニトリル製（又は粉末を含まない）の手袋を着用して、手順の各ステップを実施した。３層のろ紙を準備し、ピンセットを使用して、コニカルチューブ内に置き、ろ紙がスクリューキャップ付近にあることを確認した。ろ紙の重量を、天秤皿の中心にスクリューキャップを下にしてチューブを置くことによって、チューブ中で予め測定した。３セットのろ紙重量を、各対象について、予め測定した。ろ紙を、各腋窩に同時に置いた。対象は、安静な位置ですわり、腕を体の横に保持し、手を体の前で組んでいた。対象は、熱せられた部屋で、採取期間中、じっとすわっていた。１０分間の汗採取期間毎に、ろ紙を取り除き、チューブに戻した。ピンセットを使用して、ろ紙を破らないように注意して、ろ紙を、広げた状態で、スクリューキャップ付近のもともとの位置に置いた。ベースラインの発汗量を、１０分間隔で、３回求めた。ろ紙の重量を、天秤皿の中心にスクリューキャップを下にしてチューブを置くことによって、再度測定し、重量を記録した。
【０２１３】
薬剤塗布の手順：ニトリル製の手袋を着用して、５．０ｍｌ（対象１）及び１．５ｍｌ（対象２の場合）の試験品又は対照を、金属製のへらを使用して（対象１の場合）、又は回転式アプリケーターを使用して（対象２の場合、上下運動、次いで、円を描くようにして）、腋窩に局所塗布した。対象２の場合、小型のへらを使用して、約４ｍｌのCetaphilで各腋窩をコートし、室温（７２〜７７°Ｆ）にて、１時間インキュベートして、処置剤を吸収させた。腋窩を拭き、清浄用の布（Johnson & Johnson社製）で清浄した。
【０２１４】
観察：腋窩の体毛には、変化がなかった。処置剤を塗布する前に、脱毛はしなかった。対象は、痛みや不快感を訴えなかった。両側の腋窩で、うずく感じがした。炎症の徴候もなく、皮膚の色素の変化もなかった。
【０２１５】
結果
重量測定による分析（ヒトの対象１）：可能性試験において、各腋窩に、Revance社製ペプチジル担体を有する又は有しない２０Ｕのボツリヌス毒素（Botox）を、局所塗布した後の最初の７日後のヒトの対象１番の場合。標準的な条件下での１０分毎の発汗量（ｍｇ）（ｐ＝０．００４３）。
【０２１６】
【表２２】
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【０２１７】
重量測定による分析（ヒトの対象２）：可能性試験において、各腋窩に、Revance社製ペプチジル担体を有する又は有しない５０Ｕのボツリヌス毒素（Botox）を局所塗布した後の最初の７日後のヒトの対象２番の場合。標準的な条件下での１０分毎の発汗量（ｍｇ）（ｐ＝０．０１１７）。図１８に、一方の腋窩には、本発明によるボツリヌス毒素製剤を塗布し、他方の腋窩には、対照の製剤を塗布した後の対象２の写真を示す。
【０２１８】
【表２３】
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【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】ペプチド骨格を含む本発明の組成物を使用した、ボツリヌス毒素の経皮送達の効率を実証する実験の結果を示すグラフである。
【図２】一方の肢の領域を本発明の組成物で処置し、他方の肢の領域を本発明による担体を含有しない、ボツリヌス毒素を含有する別の組成物で処置したマウスの後肢の状態を示す写真である。
【図３】Revance社製のボツリヌス製剤で局所的に処置した前と後の対象の前頭部上のしわを示す写真である。
【図４】Revance社製のボツリヌス製剤でしわを局所的に処置した後（Ａ）及び処置の前（ｂ）の前頭部のMikrosilによる鋳型を示す図である。これらのMikrosilによる鋳型は、実際の対象の写真を撮影した場合には生じる恐れのある人為的な効果を最小限に留めるので有用であり、これらの鋳型には、未処置の側に、より深いしわが認められる。
【図５】処置前に対象の前頭部上で行ったMinorのデンプンヨウ素反応を示す写真である。
【図６ａ】Revance社製のボツリヌス製剤（Ａ）及び対照の製剤（Ｂ）を塗布した５日後のMinorのデンプンヨウ素反応を示す写真である。対照の製剤は、分子量が約２１，０００であり、ＴＡＴの分岐基を有する、正に荷電したポリリジンの骨格を含有した。これらの写真は、塗布の２分後に撮影した。
【図６ｂ】４分後である以外は、図６ａと同じ写真である。
【図７】腋窩の多汗症の研究に使用した投与領域を示す写真である。投与領域は、腋窩毛に覆われる皮膚の領域から１センチメートル外に及ぶことに留意されたい。
【図８ａ】ヒトの対象の腋窩の多汗症を治療するために、短いペプチジル担体を使用する局所薬剤として、無処置の皮膚を介して治療的に送達されたボツリヌス毒素の効率を実証する実験の結果を示すグラフである。グラフは、短いペプチジル担体を添加したBotox又は担体単独で処置した４週間後の重量測定による発汗量（ｍｇ／５分）の有意な減少を示す。結果は、Ｐ＜０．０５で、ウィルコクソン解析によって求めた有意差での、同一の群について、ベースラインの値に対する比としての４週間後の値である。Ｎ＝患者１０人。
【図８ｂ】ヒトの対象の腋窩の多汗症を治療するために、短いペプチジル担体を使用する局所薬剤として、無処置の皮膚を介して治療的に送達されたボツリヌス毒素の効率を実証する実験の結果を示すグラフである。グラフは、短いペプチジル担体を添加したBotox又は担体単独で処置した４週間後の重量測定による発汗量（ｍｇ／５分）の有意な減少を示す。結果は、Ｐ＜０．０５で、ウィルコクソン解析によって求めた有意差での、両方の時点について、対照の値に対する比としての処置の値である。Ｎ＝患者１０人。
【図９】腋窩の多汗症を治療するために、Revance社製のボツリヌス製剤で局所的に処置した前と後のMinorのデンプンヨウ素反応を示す写真である。１２番の対照について、右腋窩をRevance社製のボツリヌス製剤で処置し（ａ及びｃ）、左腋窩には対照を塗布した（ｂ及びｄ）、ベースライン対２週間後のデンプンヨウ素反応を示す。これらの写真は、デンプンヨウ素中で、担体＋botoxを用いた処置後に見られる典型的な利点を例示している。対照側で、いくらかのクロスオーバー（重量測定データにおける２５％の減少と一致する）が見られるが、処置により有意な減少（処置側の重量測定データにおける６５％の減少と一致する）がもたらされている。
【図１０】２匹の異なる動物において、担体なしのボツリヌス毒素（ａ及びｃ）又はＫＮＲを有するボツリヌス毒素（ｂ及びｄ）を局所塗布した７日後のヨウ素−デンプン染色（青−黒が陽性）によって可視化したマウスの足の発汗を示す写真である。
【図１１】［図１１ａ］雄ＣＤ１マウスに対照の製剤を塗布した後の筋力発生の図である。［図１１ｂ］局所「Revance社製のBotox溶液」を塗布した後の筋力発生の図である。
【図１２】改変したFranz Chamberを示す図である。（ａ）貯留槽、循環型水浴、インライン蠕動ポンプ、インラインFranzチャンバー及びフラクションコレクターを含む装置の機構を示す図である。（ｂ）インプット及びアウトプットの配管、皮膚の膜及び供与化合物の配置を示す単一のFranzチャンバーの断面図である。
【図１３】Ｋ３０Ｔ対対照を使用した流通の増加を示すグラフである。（ａ）Ｋ３０Ｔ対ポリ−リジン。（ｂ）Ｋ３０Ｔ対担体なし。
【図１４】改変したFranzチャンバーを使用して、ブタの皮膚モデルにおいて、皮膚関門を介するボツリヌス毒素Ａ型の送達におけるRevance社製の担体の効率を評価したグラフである。局所塗布後の毒素の流通の増加を示す（図１３ａ〜ｆ）。各図は、異なる担体：毒素の質量比を用いたブタの皮膚を介する局所毒素送達の平均及び標準誤差をパーセントで示す。
【図１５】担体なしのビオチン標識したボツリヌス毒素（対照群、ａ〜ｃ）又はＫ３０Ｔｓ担体を有するビオチン標識したボツリヌス毒素（処置群、ｄ〜ｆ）を局所塗布した後のストレプトアビジン染色（青が陽性）を示す代表的な写真である。
【図１６】Ｋ１５Ｔ２を有するＮＮＸ（処置群）、担体なしのＮＮＸ（対照群）、及びＮＮＸ注射に関して、筋力の低下率を示す図である。
【図１７】局所ボツリヌス毒素Ａ型によって、前頭部のしわが減少したことを示す写真である。ヒトの対象１を上列に示し、対象２を下列に示す。写真は、処置前（ベースライン）及び処置後を例示する。
【図１８】本発明による製剤を対照の製剤と比較した、ヒトの腋窩の多汗症の研究を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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