(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチップ又はフローセルに形成された流路にサイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション粒子を含む流体を通流する送液手順と、
レーザ照射により前記マイクロチップ又は前記フローセルから発生する光を前記マイクロチップ又は前記フローセル上の複数の位置から検出する第一の信号取得手順と、
全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる位置を特定する手順と、を含み、
前記検出強度として、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値のエリア平均値を用い、
前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる第一の最適位置を特定する手順を含む微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法。
【請求項２】
前記第一の最適位置は、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値がより大きくなる位置である請求項１記載のキャリブレーション方法。
【請求項３】
前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値の変動係数がより小さくなる第二の最適位置を特定する手順を含む請求項１又は２記載のキャリブレーション方法。
【請求項４】
前記レーザに対する前記マイクロチップ又は前記フローセルの相対位置を、前記第一の最適位置又は前記第二の最適位置に設定する手順を含む請求項３記載のキャリブレーション方法。
【請求項５】
前記第一の最適位置と前記第二の最適位置が異なる場合に、前記相対位置を前記第二の最適位置に設定する請求項４記載のキャリブレーション方法。
【請求項６】
前記流路の一端に形成されたオリフィスから吐出される液滴に対して、前記流路を通流する前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出時刻から所定時間経過後にレーザを照射し、前記液滴から発生する光を検出する第二の信号取得手順と、
全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値、あるいは前記キャリブレーション粒子のうちサイズが大きい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値、がより大きくなる経過時間を特定する手順と、を含む請求項１〜５のいずれか記載のキャリブレーション方法。
【請求項７】
前記経過時間をディレイタイムとして設定する手順を含む請求項６記載のキャリブレーション方法。
【請求項８】
前記キャリブレーション粒子として、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子と、サイズが大きく蛍光強度が高い粒子と、の２種を用いる請求項１〜７のいずれか記載のキャリブレーション方法。
【請求項９】
前記キャリブレーション粒子中のサイズが大きく蛍光強度が高い粒子のポピュレーションが、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子のポピュレーションよりも大きい請求項８記載のキャリブレーション方法。
【請求項１０】
前記サイズが小さく蛍光強度が低い粒子の粒径が２〜４μｍであり、前記サイズが大きく蛍光強度が高い粒子の粒径が８〜１２μｍである請求項８又は９記載のキャリブレーション方法。
【請求項１１】
サイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション粒子を含む流体が流路に通流されたマイクロチップ又はフローセルにレーザを照射して発生する光を検出する照射検出部と、
該照射検出部に対する前記マイクロチップ又は前記フローセルの相対位置を変更する位置調整部と、
全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる位置への移動信号を前記位置調整部に出力する制御部と、を備え、
前記検出強度が、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値のエリア平均値であり、
前記制御部は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる第一の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する微小粒子分取装置。
【請求項１２】
前記制御部は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値の変動係数がより小さくなる第二の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する請求項１１記載の微小粒子分取装置。
【請求項１３】
前記制御部は、前記第一の最適位置と前記第二の最適位置が異なる場合に、前記第二の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する請求項１２記載の微小粒子分取装置。
【請求項１４】
前記流路の一端に形成されたオリフィスから吐出される液滴に対して、前記照射検出部による前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出時刻から所定時間経過後にレーザを照射する光源と、
前記液滴から発生する光を検出する検出部と、を備え、
前記制御部は、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値、あるいは前記キャリブレーション粒子のうちサイズが大きい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値、がより大きくなる経過時間をディレイタイムとして設定する請求項１１〜１３のいずれか記載の微小粒子分取装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法、該装置及びキャリブレーション粒子に関する。より詳しくは、マイクロチップ又はフローセルの光学位置及びディレイタイムを自動で最適化し、高精度な分析を可能とする微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞などの微小粒子の特性を光学的に検出し、所定の特性を有する微小粒子のみを分別して回収する微小粒子分取装置（例えばフローサイトメータ）が知られている。
【０００３】
フローサイトメータでは、フローセル又はマイクロチップに形成された流路に細胞を含むサンプル液を送液し、流路を通流する細胞にレーザを照射して細胞から発生する蛍光又は散乱光を検出器で検出することにより、細胞の光学特性を測定している。また、フローサイトメータでは、光学特性の測定の結果、所定の条件を満たすと判定されたポピュレーション（群）を、細胞中から分別回収することも行われている。
【０００４】
フローサイトメータにおける細胞分別（ソーティング）では、フローセル又はマイクロチップに形成されたオリフィスから細胞を含むサンプル液とシース液とを液滴化して吐出させることにより、流体ストリーム（液滴の流れ）を発生させる。サンプル液とシース液の液滴化は、振動素子によって所定周波数の振動をオリフィスに印加することにより行われる。細胞を含む液滴は電荷を付与されて吐出され、各液滴の移動方向を電気的に制御することで所望の特性を有する目的細胞とそれ以外の非目的細胞とを別々の回収容器に回収する。
【０００５】
例えば、特許文献１には、マイクロチップ型のフローサイトメータとして、「微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設されたマイクロチップと、オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出するための振動素子と、吐出される液滴に電荷を付与するための荷電手段と、流路を通流する微小粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極と、対電極間を通過した液滴を回収する二以上の容器と、を備える微小粒子分取装置」が開示されている。
【０００６】
また、特許文献２には、オリフィスから射出されるサンプル液とシース液とが液滴化される位置（以下「ブレークオフポイント」と称する）を制御することが記載されている（当該文献請求項１参照）。各液滴は、このブレークオフポイントにおいて該液滴に含まれる細胞の特性に応じた電荷を付与される。フローセル又はマイクロチップに形成された流路で細胞の特性が検出されてから、当該細胞がブレークオフポイントに到達し、当該細胞を含む液滴に電荷が付与されるまでの時間は、「ディレイタイム」と称される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１９０６８０号公報
【特許文献２】特表２００７−５３２８７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微小粒子の光学特性を正確に測定するため、微小粒子分取装置では、フローセル又はマイクロチップに形成された流路内の微小粒子の通流位置と、レーザの光軸と、を高精度に位置合わせする必要がある。この位置合わせは、従来、キャリブレーション用の粒子（キャリブレーションビーズ）を用いてユーザが手動で行っており、習熟を要し、信頼性や安定性に問題があった。特に、マイクロチップ型の微小粒子測定装置では、マイクロチップの交換の都度あるいは分析の都度に光学位置の調整が必要となり、非常に煩雑であった。
【０００９】
また、微小粒子分取装置では、正確なソーティングを行うため、液滴に当該液滴に含まれる細胞の特性に応じた適切な電荷を付与し得るディレイタイムを設定する必要がある。従来、ユーザは、ソーティングされる液滴をプレパラート上に受け、目視で観測しながら良好なソーティングが達成されるようなディレイタイムを手動で設定していた。この操作も非常に煩雑で、習熟を要し、信頼性や安定性において不十分であった。
【００１０】
そこで、本技術は、レーザの光軸に対するマイクロチップ又はフローセルの位置調整及びディレイタイムの最適化を自動で高精度に行うことが可能な微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題解決のため、本技術は、マイクロチップ又はフローセルに形成された流路にサイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション粒子を含む流体を通流する送液手順と、レーザ照射により前記マイクロチップ又は前記フローセルから発生する光を前記マイクロチップ又は前記フローセル上の複数の位置から検出する第一の信号取得手順と、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度、好適には該検出強度の積算値のエリア平均値、がより大きくなる位置を特定する手順と、を含む微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法を提供する。
このキャリブレーション方法は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度、好適には該検出強度の積算値又は平均値、がより大きくなる第一の最適位置を特定する手順と、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値の変動係数がより小さくなる第二の最適位置を特定する手順と、を含む。
また、このキャリブレーション方法は、前記レーザに対する前記マイクロチップ又は前記フローセルの相対位置を、前記第一の最適位置又は前記第二の最適位置に設定する手順を含む。前記第一の最適位置と前記第二の最適位置が異なる場合には、前記相対位置は前記第二の最適位置に設定される。
このキャリブレーション方法では、照射検出部に対するマイクロチップの相対位置をこれらの位置に設定することで、レーザの光軸に対するマイクロチップの位置を自動で最適化できる。
さらに、このキャリブレーション方法は、前記流路の一端に形成されたオリフィスから吐出される液滴に対して、前記流路を通流する前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出時刻から所定時間経過後にレーザを照射し、前記液滴から発生する光を検出する第二の信号取得手順と、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値、あるいは前記キャリブレーション粒子のうちサイズが大きい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値、がより大きくなる経過時間を特定する手順と、を含んでいてもよい。この場合、前記経過時間は、最適なディレイタイムとして前記マイクロチップ型微小粒子分取装置に設定され得る。
このキャリブレーション方法では、前記キャリブレーション粒子として、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子と、サイズが大きく蛍光強度が高い粒子と、の２種を用いることが好ましい。この場合、前記キャリブレーション粒子中のサイズが大きく蛍光強度が高い粒子のポピュレーションが、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子のポピュレーションよりも大きいことが好適となる。
【００１２】
また、本技術は、サイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション粒子を含む流体が流路に通流されたマイクロチップ又はフローセルにレーザを照射して発生する光を検出する照射検出部と、該照射検出部に対する前記マイクロチップ又は前記フローセルの相対位置を変更する位置調整部と、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度、好適には該検出強度の積算値のエリア平均値、がより大きくなる位置への移動信号を前記位置調整部に出力する制御部と、を備える微小粒子分取装置を提供する。
この微小粒子分取装置において、前記制御部は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度、好適には該検出強度の積算値又は平均値、がより大きくなる第一の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する。
あるいは、前記制御部は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値の変動係数がより小さくなる第二の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する。
前記制御部は、前記第一の最適位置と前記第二の最適位置が異なる場合には、前記第二の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する。
この微小粒子分取装置は、前記流路の一端に形成されたオリフィスから吐出される液滴に対して、前記照射検出部による前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出時刻から所定時間経過後にレーザを照射する光源と、前記液滴から発生する光を検出する検出部と、を備えることが好ましい。この場合、前記制御部は、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値、あるいは前記キャリブレーション粒子のうちサイズが大きい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値、がより大きくなる経過時間をディレイタイムとして設定するように構成される。
【００１３】
さらに、本技術は、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子と、サイズが大きく蛍光強度が高い粒子と、の２種を含む微小粒子分取装置用のキャリブレーション粒子をも提供する。
このキャリブレーション粒子は、前記サイズが大きく蛍光強度が高い粒子のポピュレーションが、前記サイズが小さく蛍光強度が低い粒子のポピュレーションよりも大きくされていることが好ましい。
また、このキャリブレーション粒子において、前記サイズが小さく蛍光強度が低い粒子の粒径は例えば２〜４μｍ、前記サイズが大きく蛍光強度が高い粒子の粒径は例えば８〜１２μｍとされる。
【００１４】
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１５】
本技術により、レーザの光軸に対するマイクロチップ又はフローセルの位置調整及びディレイタイムの最適化を自動で高精度に行うことが可能な微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】マイクロチップ型フローサイトメータとして構成された本技術に係る微小粒子分取装置１（フローサイトメータ１）の構成を説明するための図である。
【図２】フローサイトメータ１の構成を説明するための図である。
【図３】フローサイトメータ１に搭載可能なマイクロチップ２の一例の構成を説明するための図である。
【図４】マイクロチップ２のオリフィス２１の構成を説明するための図である。
【図５】フローサイトメータ１における光学位置の最適化のための制御ステップを説明するためのフローチャートである。
【図６】信号取得ステップＳ２〜エリア平均値最大位置判定ステップＳ３における制御を説明するための図である。
【図７】信号取得ステップＳ２及びＳ５において、各検出位置Ｄで一定時間内に得られる検出信号のヒストグラムである。
【図８】エリア平均値最大位置移動ステップＳ４〜積算値最大位置判定ステップＳ６における制御を説明するための図である。
【図９】変動係数判定ステップＳ７における制御を説明するための図である。
【図１０】フローサイトメータ１におけるディレイタイムの最適化のための制御ステップを説明するためのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子分取測定装置
（１）照射検出部
（２）位置調整部
（３）振動素子
（４）荷電部
（５）液滴検出部
（６）偏向板
（７）回収容器
（８）制御部等
（９）マイクロチップ
２．本技術に係る微小粒子分取測定装置におけるキャリブレーション方法
（Ａ）光学位置の最適化制御
（１）キャリブレーションビーズ送液ステップＳ１
（２）信号取得ステップＳ２
（３）エリア平均値最大位置判定ステップＳ３
（４）エリア平均値最大位置移動ステップＳ４
（５）信号取得ステップＳ５
（６）積算値最大位置判定ステップＳ６
（７）変動係数判定ステップＳ７
（８）位置最適化ステップＳ８
（Ｂ）ディレイタイムの最適化制御
（１）キャリブレーションビーズ送液ステップＳ１１
（２）信号取得ステップＳ１２
（３）最適経過時間探索ステップＳ１３
（４）ディレイタイム設定ステップＳ１４
【００１８】
１．微小粒子分取測定装置
図１及び図２は、マイクロチップ型フローサイトメータとして構成された本技術に係る微小粒子分取装置１（以下「フローサイトメータ１」とも称する）の構成を説明する模式図である。また、図３及び図４は、フローサイトメータ１に搭載可能なマイクロチップ２の一例を示す。図３（Ａ）は上面模式図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面模式図を示す。また、図４は、マイクロチップ２のオリフィス２１の構成を模式的に説明する図であり、（Ａ）は上面図、（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は正面図を示す。図４（Ｂ）は、図３（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する。
【００１９】
（１）照射検出部
フローサイトメータ１は、マイクロチップ２にレーザＬ１を照射する光源６１と、レーザＬ１の照射により発生する検出対象光を検出する検出器６２とを含んでなる照射検出部を備える。マイクロチップ２に対するレーザＬ１の照射方向（レーザＬ１の光軸）を図１中Ｚ軸正方向で示す。光源６１は、ＬＤ、ＬＥＤなどであってよい。
【００２０】
レーザＬ１は、マイクロチップ２のサンプル流路２２を通流する細胞に照射される。検出器６２は、細胞によるレーザＬ１の散乱光、及び、細胞又は細胞に標識された蛍光色素がレーザＬ１により励起されて生じる蛍光を検出する。図１中、サンプル流路２２を通流する細胞から発生する蛍光を符合Ｆ１で示す。
【００２１】
照射検出部は、光源６１から出射されたレーザＬ１を細胞に導光して集光するための集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系を含む。また、照射検出部は、レーザＬ１の照射によって細胞から発生する検出対象光を集光して検出器６２に導光する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、ＰＭＴ（photo multiplier tube）や、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子などによって構成される。
【００２２】
照射検出部の検出系により検出される検出対象光は、レーザＬ１の照射によって細胞から発生する光であって、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などとすることができる。蛍光は、細胞又は細胞に標識された蛍光色素から発生するものであってよい。これらの検出対象光は電気信号に変換され、細胞の光学特性判定及び後述する光学位置の自動調整に供される。
【００２３】
（２）位置調整部
フローサイトメータ１は、照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置を変更する位置調整部９を備える。位置調整部９は、マイクロチップ２の位置及び／又は照射検出部の位置を、レーザＬ１の光軸に対する垂直平面（ＸＹ平面）上で移動させる。これにより、位置調整部９は、レーザＬ１の光軸に対するマイクロチップ２の位置を調整して、レーザＬ１がサンプル流路２２内の細胞の通流位置に照射されるように最適化する。
【００２４】
位置調整部９は、マイクロチップ２の位置、又は、光源６１及び検出器６２を含む照射検出部の位置の少なくとも一方を、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に移動可能なものであればよい。位置調整部９は、例えばステッピングモータなどにより構成される。なお、位置調整部９は、照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置をＺ軸方向（レーザＬ１の焦点方向）においても移動させるものであってよい。
【００２５】
（３）振動素子
フローサイトメータ１は、マイクロチップ２に形成されたオリフィス２１に振動を印加して、オリフィス２１から排出される、細胞を含むサンプル液とシース液との層流を液滴化して吐出させる振動素子３を備える。振動素子３は、例えばピエゾ素子とできる。吐出された液滴は、流体ストリームＳとなって図中矢印Ｙ軸正方向に射出される。なお、フローサイトメータ１において、マイクロチップ２は交換可能に搭載されるものである。
【００２６】
フローサイトメータ１において、振動素子３は、マイクロチップ２と一体に構成されたものであってもよく、搭載されたマイクロチップ２と接触可能なように装置側に配設されたものであってもよい。
【００２７】
（４）荷電部
オリフィス２１から吐出される液滴は、荷電部４１によって正又は負の電荷を付与される。一部の液滴は、電荷を付与されず、チャージなしとされていてもよい。液滴のチャージは、荷電部４１と電気的に接続され、マイクロチップ２に設けられたサンプルインレット２３に挿入されている電極４２によって行われる。なお、電極４２は、マイクロチップ２のいずれかの箇所に、流路を送液されるサンプル液又はシース液に電気的に接触するように挿入されていればよいものとする。
【００２８】
液滴への電荷の付与は、照射検出部により細胞が検出された時刻（Ｔ０）から、所定のディレイタイム（ΔＴ）が経過し、当該細胞がブレークオフポイントに到達した時点（Ｔ０＋ΔＴ）で行われる。
【００２９】
（５）液滴検出部
また、フローサイトメータ１は、オリフィス２１から吐出される液滴にレーザ光Ｌ２を照射する光源７１と、レーザＬ２の照射により発生する検出対象光を検出する検出器７２とを含んでなる液滴検出部を備える。流体ストリームＳに対するレーザＬ２の照射方向（レーザＬ１の光軸）を図２中Ｚ軸正方向で示す。光源７１は、ＬＤ、ＬＥＤなどであってよい。また、検出器７２は、ＰＭＴ（photo multiplier tube）や、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子などであってよい。
【００３０】
レーザＬ２は、流体ストリームＳ中の液滴に照射される。検出器７２は、該液滴に含まれる細胞によるレーザＬ２の散乱光、及び、細胞又は細胞に標識された蛍光色素がレーザＬ２により励起されて生じる蛍光を検出する。図２中、液滴から発生する蛍光を符合Ｆ２で示す。
【００３１】
光源７１は、照射検出部により細胞が検出された時刻（Ｔ０）から、ディレイタイム（ΔＴ）を模擬する所定時間（Δｔ）の経過後の時点（Ｔ０＋Δｔ）で、液滴にレーザ光Ｌ２を照射する。そして、発生する検出対象光が検出器７２により電気信号に変換され、後述するディレイタイムの最適化のために利用される。
【００３２】
（６）偏向板
さらに、フローサイトメータ１は、流体ストリームＳを挟んで対向して配置された一対の偏向板５１，５２を備える。偏向板５１，５２は、液滴に付与された電荷との間に作用する電気的な力によって流体ストリームＳ中の各液滴の進行方向を変化させる。偏向板５１，５２は、通常使用される電極であってよい。図１中、偏光板５１，５２の対向方向をＸ軸方向によって示す。
【００３３】
（７）回収容器
偏向板５１，５２の間を通過した流体ストリームは、回収容器８１、回収容器８２又は回収容器８３のいずれかに受け入れられる。例えば、偏向板５１を正、偏向板５２を負に帯電させる場合、荷電部４１により負にチャージされた液滴は回収容器８２に、正にチャージされた液滴は回収容器８３にそれぞれ回収される。また、荷電部４１によりチャージされていない液滴は、偏向板５１，５２からの電気的な作用力を受けずに真っ直ぐ飛行し、回収容器８１に回収される。フローサイトメータ１では、各液滴に含まれる細胞の特性に応じて該液滴の進行方向を制御することで、所望の特性を有する目的細胞とそれ以外の非目的細胞とを別々の回収容器に回収できる。
【００３４】
回収容器８１，８２，８３は、実験用として汎用のプラスチック製チューブあるいはガラス製チューブであってよい。これらの回収容器は、交換可能にフローサイトメータ１に配置されるものであることが好ましい。また、回収容器のうち非目的細胞を受け入れるものには、回収した液滴の排液路を接続してもよい。なお、フローサイトメータ１において、配置される回収容器の数は特に限定されないものとする。回収容器を３つよりも多く配置する場合には、各液滴が、偏向板５１，５２との間の電気的な作用力の有無及びその大小によっていずれか一つの回収容器に誘導され、回収されるようにする。
【００３５】
（８）制御部等
フローサイトメータ１は、上述の構成に加え、通常のフローサイトメータが備える、細胞の光学特性判定のためのデータ解析部、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部及びこれらの各構成を制御するための制御部１０などを備える。
【００３６】
制御部１０は、ＣＰＵ、メモリ及びハードディスクなどを備える汎用のコンピュータによって構成でき、ハードディスク内にはＯＳと次に説明する制御ステップを実行するプログラムなどが格納されている。
【００３７】
（９）マイクロチップ
マイクロチップ２は、サンプル流路２２が形成された基板層２ａ，２ｂが貼り合わされてなる。基板層２ａ，２ｂへのサンプル流路２２の形成は、金型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形により行うことができる。熱可塑性樹脂には、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの従来マイクロチップの材料として公知のプラスチックを採用できる。
【００３８】
サンプル液は、サンプルインレット２３に導入され、シースインレット２４に導入されるシース液と合流して、サンプル流路２２を送液される。シースインレット２４から導入されたシース液は、２方向に分かれて送液された後、サンプルインレット２３から導入されたサンプル液との合流部において、サンプル液を２方向から挟み込むようにしてサンプル液に合流する。これにより、合流部において、シース液層流の中央にサンプル液層流が位置された３次元層流が形成される。
【００３９】
符号２５は、サンプル流路２２に詰まりや気泡が生じた際に、サンプル流路２２内に負圧を加えて流れを一時的に逆流させて詰まりや気泡を解消するための吸引流路を示す。吸引流路２５の一端には、真空ポンプ等の負圧源に接続される吸引アウトレット２５１が形成され、他端は連通口２５２においてサンプル流路２２に接続している。
【００４０】
３次元層流は、送液方向に対する垂直断面の面積が送液方向上流から下流へ次第にあるいは段階的に小さくなるように形成された絞込部２６１（図３参照），２６２（図４参照）において層流幅を絞り込まれる。その後、３次元層流は、流路の一端に設けられたオリフィス２１から排出される。
【００４１】
サンプル流路２２の絞込部２６１と絞込部２６２との間では、細胞の特性検出が行われる。照射検出部によって、サンプル流路２２中を３次元層流の中心に一列に配列して送流される細胞に対してレーザＬ１が照射され、細胞から発生する蛍光Ｆ１及び散乱光が検出される（図３参照）。
【００４２】
サンプル流路２２のオリフィス２１への接続部は、直線状に形成されたストレート部２７とされている。ストレート部２７は、オリフィス２１から流体ストリームＳをＹ軸正方向に真っ直ぐ射出するために機能する。
【００４３】
オリフィス２１から排出される３次元層流は、振動素子３によりオリフィス２１に印加される振動によって液滴化され、流体ストリームＳとして射出される（図１参照）。オリフィス２１は基板層２ａ，２ｂの端面方向に開口しており、その開口位置と基板層端面との間には切欠部２１１が設けられている。切欠部２１１は、オリフィス２１の開口位置と基板端面との間の基板層２ａ，２ｂを、切欠部２１１の径Ｌがオリフィス２１の開口径ｌよりも大きくなるように切り欠くことによって形成されている（図４（Ｃ）参照）。切欠部２１１の径Ｌは、オリフィス２１から吐出される液滴の移動を阻害しないように、オリフィス２１の開口径ｌよりも２倍以上大きく形成することが望ましい。
【００４４】
２．本技術に係る微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法
（Ａ）光学位置の最適化制御
図５は、フローサイトメータ１におけるマイクロチップ２の光学位置の最適化のための制御ステップを説明するフローチャートである。制御ステップは、「キャリブレーションビーズ送液ステップＳ１」、「信号取得ステップＳ２」、「エリア平均値最大位置判定ステップＳ３」、「エリア平均値最大位置移動ステップＳ４」、「信号取得ステップＳ５」、「積算値最大位置判定ステップＳ６」、「変動係数判定ステップＳ７」及び「位置最適化ステップＳ８」の手順を含む。以下、各手順について説明する。
【００４５】
（１）キャリブレーションビーズ送液ステップＳ１
ユーザにより分析の開始信号が入力されると、制御部１０は位置調整部９へ移動信号を出力し、位置調整部９が照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置を予め設定された初期位置（図６、原点Ｏを参照）に移動させる。相対位置が原点Ｏにあるとき、照射検出部から出射されたレーザＬ１はマイクロチップ２上の原点Ｏに照射される。相対位置の変更は、マイクロチップ２の位置、又は、光源６１及び検出器６２を含む照射検出部の位置の少なくとも一方を、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に移動することによって行い得るが、以下ではマイクロチップ２の位置を移動する場合を例に説明する。
【００４６】
次に、制御部１０は、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部のポンプを駆動して、マイクロチップ２のサンプルインレット２３及びシースインレット２４へのサンプル液及びシース液の送液を開始する。サンプル液には、サイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション用の粒子（ビーズ）が含まれる。さらに、制御部１０は、振動素子３によるオリフィス２１への振動印加を開始する。これにより、オリフィス２１から射出されるサンプル液及びシース液の３次元層流が液滴化して吐出され、流体ストリームＳが発生する。
【００４７】
キャリブレーションビーズは、蛍光色素を含む樹脂組成物を粒子形状に成形したもの又は粒子形状に成形された樹脂の表面に蛍光色素を固着させたものなどを用いることができる。蛍光色素には、ＰＢ，ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＡＰＣＣＨなどの汎用の色素を用いればよい。一般に、サイズの大きいビーズほど蛍光強度が高くなるが、サイズ及び蛍光強度のばらつきが大きくなる。逆に、サイズの小さいビーズほど蛍光強度は低くなるが、サイズ及び蛍光強度のばらつきも小さくなる。
【００４８】
キャリブレーションビーズは、サイズが小さく蛍光強度が低いビーズＡと、サイズが大きく蛍光強度が高いビーズＢと、の２種を含むことが好ましい。また、ビーズＢのポピュレーションが、ビーズＡのポピュレーションよりも大きいことが好ましい。
【００４９】
ビーズＡとしては、例えば粒径が２〜４μｍであり、流体（サンプル液）中の濃度が５．０×１０５／ｍｌ程度で、蛍光強度のばらつき（変動係数）が１．５％以下のものを使用できる。また、ビーズＢとしては、例えば粒径が８〜１２μｍであり、流体中の濃度が５．０×１０６／ｍｌ程度で、蛍光強度のばらつき（変動係数）が２．５％以下のものを使用できる。
【００５０】
キャリブレーションビーズには、ビーズＡとビーズＢとの中間のサイズ及び蛍光強度を有するビーズが含まれていてもよい。以下では、ビーズＡとビーズＢの２種のビーズが混合されたキャリブレーションビーズを用いる場合を例に説明する。
【００５１】
サンプル液及びシース液の送液開始後、制御部１０は、位置調整部９へ移動信号を出力し、位置調整部９がマイクロチップ２の位置を原点Ｏから基準点Ｄ０に移動させる（図６矢印参照）。照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置が基準点Ｄ０にあるとき、照射検出部から出射されたレーザＬ１はマイクロチップ２上の基準点Ｄ０に照射される。
【００５２】
基準点Ｄ０は、マイクロチップ２の細胞の特性検出が行われるべき位置（すなわち、以下に説明するステップにより決定される最適位置）の近傍に予め設定される。より具体的には、基準点Ｄ０は、サンプル流路２２の絞込部２６１と絞込部２６２との間（図３及び図４参照）の近傍とされる。
【００５３】
（２）信号取得ステップＳ２（第一の信号取得ステップ）
本ステップＳ２では、照射検出部により、基準点Ｄ０を含むマイクロチップ２上の複数の位置から発生する蛍光又は散乱光（以下、単に「蛍光」と称する）の検出が行われる。本ステップＳ２において、蛍光の検出が行われるマイクロチップ２上の位置を図６中符号Ｄにより示す。図では、基準点Ｄ０を含めて２４箇所の検出位置Ｄを設定し、Ｘ軸方向に８列、Ｙ軸方向に３列に配列した検出位置Ｄからの蛍光を検出する場合を例に示した。
【００５４】
検出位置Ｄが設定される領域にはサンプル流路２２が含まれるようにされ、この限りにおいて検出位置Ｄの数及び配列態様は特に限定されず任意に設定される。検出位置Ｄは、図に示すようにＸ軸方向及びＹ軸方向に格子状に配列されることが好ましい。この場合、検出位置ＤのＸ軸方向及びＹ軸方向の配列間隔Ｗ及びＨは、サンプル流路２２の流路幅（流路径）とＸ軸方向及びＹ軸方向における検出位置Ｄの配列数Ｍ１，Ｎ１に応じて適宜設定され得る。サンプル流路２２の流路幅が７０〜１００μｍであり、配列数Ｍ１が８，Ｎ１が３である場合、配列間隔Ｗ及びＨは、例えばそれぞれ２５、７５μｍに設定される。
【００５５】
蛍光の検出は、一つの検出位置Ｄについて一定時間行われる。一定時間に検出された蛍光は積算されて電気信号に変換され制御部１０に出力される。蛍光の検出は、レーザＬ１をＸ軸方向及びＹ軸方向に走査して各検出位置Ｄに順次照射して、発生する蛍光を検出することによって行い得る。あるいは、レーザＬ１の照射により各検出位置Ｄから蛍光をエリア撮像素子によって一括検出してもよい。
【００５６】
（３）エリア平均値最大位置判定ステップＳ３
本ステップＳ３では、制御部１０は、各検出位置Ｄについて検出強度の積算値のエリア平均値を算出し、エリア平均値がより大きくなる検出位置Ｄ、好ましくは最大値となる検出位置Ｄを自動判定する。
【００５７】
「エリア平均値」とは、一つの検出位置Ｄと、それから所定の距離範囲内にある複数の検出位置Ｄと、で得られた検出強度の積算値の平均を意味する。図６では、エリア平均値を、一つの検出位置Ｄ１と、検出位置Ｄ１からＸ軸方向に２Ｗ、Ｙ軸方向に２Ｈの距離範囲内にある検出位置Ｄ２〜Ｄ９と、で得られた検出強度の積算値の平均とする場合を示した。
【００５８】
一つの検出位置Ｄからどれくらいの距離範囲内をエリア平均値として設定するかは、サンプル流路２２の流路幅（流路径）、配列間隔Ｗ及びＨに応じて適宜決定され得るものとする。
【００５９】
制御部１０は、各検出位置Ｄについて算出されたエリア平均値を比較し、エリア平均値がより大きくなる検出位置Ｄ、好ましくは最大値となる検出位置Ｄ、を決定する。ここでは、検出位置Ｄ１においてエリア平均値が最大値となるものとして説明する。
【００６０】
エリア平均値の算出は、各検出位置Ｄについて一定時間内に検出された蛍光のうち、キャリブレーションビーズから発生する蛍光に基づいて行われる。各検出位置Ｄにおいて一定時間内に検出信号のヒストグラムを図７に示す。ビーズＢは、ビーズＡに比して蛍光強度が高く、蛍光強度のばらつきが大きい。エリア平均値は、ビーズＡ及びビーズＢから発生する蛍光の検出強度の和として算出される。
【００６１】
蛍光はキャリブレーションビーズが通流されるサンプル流路２２で強く発生するため、エリア平均値が最大値となる検出位置Ｄ１〜Ｄ９を結んで形成される領域Ｒ１は、サンプル流路２２が位置する領域とみなし得る。なお、「エリア平均値」に替えて、各検出位置Ｄで得られた検出強度そのもの（ピーク強度）、又は該検出強度の平均値あるいは積算値を用いてもよい。ピーク強度、平均値又は積算値が最大値となる検出位置Ｄは、サンプル流路２２に近接する点とみなし得る。
【００６２】
（４）エリア平均値最大位置移動ステップＳ４
エリア平均値が最大値となる検出位置Ｄ１が特定されると、制御部１０は、位置調整部９へ移動信号を出力し、位置調整部９がマイクロチップ２の位置を基準点Ｄ０から検出位置Ｄ１に移動させる（図８矢印参照）。
【００６３】
（５）信号取得ステップＳ５（第一の信号取得ステップ）
本ステップＳ５では、照射検出部により、エリア平均値が最大値となる領域Ｒ１内の複数の位置から発生する蛍光の検出が行われる。本ステップＳ５における蛍光の検出位置Ｄを図８の拡大図中に示す。図では、エリア平均値が最大値となる検出位置Ｄ１を含めてＸ軸方向にＭ２列、Ｙ軸方向にＮ２列配列した（Ｍ２×Ｎ２）の検出位置Ｄから蛍光を検出する場合を例に示した。
【００６４】
検出位置ＤのＸ軸方向及びＹ軸方向の配列間隔ｗ及びｈは、サンプル流路２２の流路幅（流路径）とＸ軸方向及びＹ軸方向における配列数Ｍ２及びＮ２に応じて適宜設定され得る。配列数Ｍ２，Ｎ２は、例えばそれぞれ１１、７個とされる。列間隔ｗ及びｈは、例えばそれぞれ５、２５μｍに設定される。なお、本ステップＳ５においても、検出位置Ｄの数及び配列態様は特に限定されないものとする。なお、「エリア平均値」に替えて、各検出位置Ｄで得られたピーク強度、平均値又は積算値を用いる場合、これらの値が最大値となる検出位置Ｄを含む領域内に適当数の検出位置Ｄを設定する。
【００６５】
蛍光の検出は、一つの検出位置Ｄについて一定時間行われる。一定時間に検出された蛍光は電気信号に変換され制御部１０に出力される。蛍光の検出は、レーザＬ１をＸ軸方向及びＹ軸方向に走査して各検出位置Ｄに順次走査し、発生する蛍光を検出する。あるいは、エリア撮像素子によって、レーザＬ１の照射により各検出位置Ｄから蛍光を一括検出してもよい。
【００６６】
（６）積算値最大位置判定ステップＳ６
本ステップＳ６では、制御部１０は、各検出位置Ｄについて、検出強度の積算値又は平均値のどちらか一方又は両方と、それらの変動係数（ＣＶ値）とを算出する。以下では、検出強度の積算値とそのＣＶ値とを用いた処理を例に説明する。
【００６７】
制御部１０は、各検出位置Ｄについて算出された検出強度の積算値を比較し、積算値がより大きくなる検出位置Ｄ、好ましくは最大値となる検出位置Ｄ（第一の最適位置）、を決定する。ここでは、検出位置Ｄ１１において積算値が最大値となるものとして説明する（図８参照）。
【００６８】
検出強度の積算値及び変動係数の算出は、各検出位置Ｄについて一定時間内に検出された蛍光のうち、ビーズＡから発生する蛍光に基づいて行われる（図７のヒストグラムを参照）。ビーズＡから発生する蛍光とビーズＢから発生する蛍光との区別は、蛍光波長の違いによって区別してビーズＡの蛍光波長に一致する蛍光のみを検出すればよい。あるいは、サイズの違いによってビーズにゲーティングをかけて、選択されたサイズの範囲（ゲート）内のビーズから発生する蛍光のみを検出することで、ビーズＡから発生する蛍光とビーズＢから発生する蛍光とを区別することもできる。
【００６９】
（７）変動係数判定ステップＳ７
次に、制御部１０は、積算値が最大値となる検出位置Ｄ１１と隣接する検出位置Ｄ１２〜Ｄ１９との間でＣＶ値を比較し、検出位置Ｄ１１に比してより小さいＣＶ値を与える検出位置Ｄ（第二の最適位置）の存在の有無を自動判定する（図９参照）。
【００７０】
（８）位置最適化ステップＳ８
ステップＳ７において、積算値が最大値となる検出位置Ｄ１１に比してより小さいＣＶ値を与える検出位置Ｄが、検出位置Ｄ１１と隣接する検出位置Ｄ１２〜Ｄ１９のいずれにもみつからなった場合、制御部１０は、マイクロチップ２の位置を検出位置Ｄ１から検出位置Ｄ１１に移動させる。このとき、積算値が最大値となる検出位置（第一の最適位置）とＣＶ値が最小値となる検出位置（第二の最適位置）はいずれも検出位置Ｄ１１で一致している。
【００７１】
また、ステップＳ７において、検出位置Ｄ１２〜Ｄ１９のいずれかに検出位置Ｄ１１に比してより小さいＣＶ値を与える検出位置Ｄがみつかった場合、制御部１０は、マイクロチップ２の位置を検出位置Ｄ１から当該検出位置Ｄ（例えば検出位置Ｄ１８）に移動させる。このとき、積算値が最大値となる検出位置（第一の最適位置）とＣＶ値が最小値となる検出位置（第二の最適位置）は不一致である。
【００７２】
積算値が最大値となる検出位置Ｄ１１は、蛍光が最も強く発生する位置であり、サンプル流路２２のキャリブレーションビーズの通流位置とみなすことができる。すなわち、照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置が検出位置Ｄ１１にあるとき、照射検出部から出射されたレーザＬ１はサンプル流路２２のキャリブレーションビーズの通流位置に照射されることとなる。
【００７３】
例外的に、積算値が最大値となる検出位置Ｄ１１が、サンプル流路２２のキャリブレーションビーズの通流位置ではないにもかからず、蛍光強度の積算値が最大値となる場合がある。例えば、検出位置Ｄ１１が、マイクロ流路２２の流路壁に一致する場合には、蛍光の反射や散乱などによって異常に高い蛍光強度が散発的に検出されてしまう場合がある。この場合、当該位置において検出される蛍光強度にばらつきが生じ、蛍光強度の積算値のＣＶ値が大きくなる。
【００７４】
検出位置Ｄ１１がマイクロ流路２２の流路壁に一致する場合などでは、検出位置Ｄ１１と隣接する検出位置のうちより小さいＣＶ値を与える検出位置Ｄ１８が、サンプル流路２２のキャリブレーションビーズの通流位置とみなすことができる。すなわち、照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置が検出位置Ｄ１８にあるとき、照射検出部から出射されたレーザＬ１はサンプル流路２２のキャリブレーションビーズの通流位置に照射されることとなる。
【００７５】
以上のように、フローサイトメータ１では、レーザＬ１の照射によりマイクロチップ２から発生する蛍光の検出強度の積算値あるいは平均値がより大きくなる位置、又はＣＶ値がより小さくなる位置に、レーザＬ１に対するマイクロチップ２の相対位置を設定する。これにより、フローサイトメータ１では、マイクロチップ２のサンプル流路２２の細胞の通流位置と、レーザＬ１の光軸と、を自動で高精度に位置決めし、簡便に高精度な測定を行うことが可能とされている。
【００７６】
また、フローサイトメータ１では、蛍光検出強度の積算値のエリア平均値がより大きくなる位置を特定する粗調整（ステップＳ２・Ｓ３）と、エリア平均値がより大きくなる領域内において積算値あるいは平均値がより大きくなる位置、又はＣＶ値がより小さくなる位置を特定する微調整（ステップＳ５〜Ｓ７）との２段階の手順によって、マイクロチップ２の光学位置を最適化している。これにより、マイクロチップ２の光学位置の最適化を小さい処理負荷で迅速に行うことが可能とされている。
【００７７】
さらに、フローサイトメータ１では、粗調整（ステップＳ２・Ｓ３）を、全種のキャリブレーションビーズ（ここではビーズＡ及びビーズＢ）から発生する光の検出強度に基づいて行い、微調整（ステップＳ５〜Ｓ７）は、サイズが小さい種のビーズ（ビーズＡ）のみから発生する光の検出強度に基づいて行っている。これにより、粗調整では、強い検出信号を用いて制御を行うことができ、微調整では、サンプル流路２２の細胞の通流位置とレーザＬ１の光軸との位置合わせを高精度に行うことができる。ここでは、流路をマイクロチップに形成したマイクロチップ型フローサイトメータを例に説明したが、フローセルに流路が形成されたフローセル型フローサイトメータにおいても、同様の効果を得ることができる。
【００７８】
（Ｂ）ディレイタイムの最適化制御
図１０は、フローサイトメータ１におけるディレイタイムの最適化のための制御ステップを説明するフローチャートである。制御ステップは、「キャリブレーションビーズ送液ステップＳ１１」、「信号取得ステップＳ１２」、「最適経過時間探索ステップＳ１３」及び「ディレイタイム設定ステップＳ１４」の手順を含む。以下、各手順について説明する。
【００７９】
（１）キャリブレーションビーズ送液ステップＳ１１
ユーザにより分析の開始信号が入力されると、制御部１０は、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部のポンプを駆動して、マイクロチップ２のサンプルインレット２３及びシースインレット２４へのサンプル液及びシース液の送液を開始する。サンプル液には、上述のキャリブレーションビーズが含まれる。さらに、制御部１０は、振動素子３によるオリフィス２１への振動印加を開始する。これにより、オリフィス２１から射出されるサンプル液及びシース液の３次元層流が液滴化して吐出され、流体ストリームＳが発生する。
【００８０】
（２）信号取得ステップＳ１２（第二の信号取得ステップ）
本ステップＳ１２では、オリフィス２１から吐出される液滴に、光源７１からレーザＬ２を照射して、液滴から発生する蛍光の検出が行われる。レーザＬ２は、照射検出部によりキャリブレーションビーズが検出された時刻（Ｔ０）から所定時間（Δｔ）の経過後に光源７１から液滴に照射され、液滴から発生する蛍光が検出器７２により検出される。
【００８１】
制御部１０は、時刻Ｔ０から異なる時間の経過後に光源７１からレーザＬ２を出射させる。具体的には、制御部１０は、時刻（Ｔ０＋Δｔ１）、（Ｔ０＋Δｔ２）、・・・（Ｔ０＋ΔｔＮ）において光源７１からレーザＬ２を出射させる。ここで、Ｎは３以上の整数を示す。各時刻において、検出器７２により検出された蛍光の検出強度は、制御部１０に出力されて保持される。
【００８２】
時刻（Ｔ０＋ΔｔＮ）における検出強度は、キャリブレーションビーズが照射検出部により検出された時刻Ｔ０から時間ΔｔＮ経過後に、レーザＬ２をオリフィス２１から吐出される液滴に照射して得られる検出強度を、例えばＭ個のビーズについて積算した値とされる。
【００８３】
（３）最適経過時間探索ステップＳ１３
本ステップＳ１３では、制御部１０は、液滴から発生する蛍光の検出強度の積算値がより大きくなる（好ましくは最大値となる）経過時間ΔｔＳを決定する。具体的には、時刻（Ｔ０＋Δｔ１）〜（Ｔ０＋ΔｔＮ）において取得された検出強度の積算値を比較し、積算値がより大きくなる経過時間ΔｔＳを特定する。
【００８４】
経過時間ΔｔＳの決定は、液滴に含まれるビーズＡ及びビーズＢから発生する蛍光の検出強度の和に基づいて行われる。より好ましくは、経過時間ΔｔＳの決定は、ビーズＢから発生する蛍光の検出強度に基づいて行われる（図７のヒストグラムを参照）。ビーズＡから発生する蛍光とビーズＢから発生する蛍光との区別は、蛍光波長の違いによって区別してビーズＢの蛍光波長に一致する蛍光のみを検出すればよい。あるいは、サイズの違いによってビーズにゲーティングをかけて、選択されたサイズの範囲（ゲート）内のビーズから発生する蛍光のみを検出することで、ビーズＢから発生する蛍光とビーズＢから発生する蛍光とを区別することもできる。
【００８５】
（４）ディレイタイム設定ステップＳ１４
本ステップＳ１４では、最適経過時間探索ステップＳ１３で特定された経過時間Δｔｓからディレイタイム（ΔＴ）の算出が行われる。経過時間Δｔｓは、時刻Ｔ０において照射検出部により検出されたキャリブレーションビーズが光源７１から出射されるレーザＬ２の照射位置を通過するまでの時間とみなすことができる。従って、経過時間Δｔｓに基づけば、照射検出部により検出されたキャリブレーションビーズがブレークオフポイントに到達するまでの時間であるディレイタイム（ΔＴ）を算出できる。制御部１０は、算出されたディレイタイム（ΔＴ）を荷電部４１に設定し、最適なディレイタイムにおいて液滴に電荷が付与されるようにする。
【００８６】
以上のように、フローサイトメータ１では、全種のキャリブレーションビーズ（ここではビーズＡ及びビーズＢ）から発生する光、あるいは蛍光強度が高い種のビーズ（ビーズＢ）のみから発生する光の検出強度に基づいて、ディレイタイムの最適化を行っている。これにより、強い検出信号を用いてディレイタイムの最適化制御を行うことができる。キャリブレーションビーズ中のサイズが大きく蛍光強度が高いビーズ（ビーズＢ）のポピュレーションを、サイズが小さく蛍光強度が低いビーズ（ビーズＡ）のポピュレーションよりも大きくしておくことで、より強い検出信号を用いたディレイタイムの最適化制御が可能となる。
【００８７】
また、フローサイトメータ１では、上述した光学位置の最適化制御とディレイタイムの最適化制御とを、キャリブレーションビーズを入れ替えることなく行うことができる。従来、レーザの光軸に対するマイクロチップの位置調整はサイズの小さいビーズを用いて行い、別個に、蛍光強度の高いビーズを用いてディレイタイムの最適化を行う必要があった。これに対して、フローサイトメータ１では、サイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のビーズを含むキャリブレーションビーズを用いてマイクロチップの光学位置調整とディレイタイムの最適化とをキャリブレーションビーズを入れ替えることなく簡便に行うことが可能とされている。
【００８８】
本技術に係る微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法は以下のような構成もとることができる。
（１）マイクロチップ又はフローセルに形成された流路にサイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション粒子を含む流体を通流する送液手順と、レーザ照射により前記マイクロチップ又は前記フローセルから発生する光を前記マイクロチップ又は前記フローセル上の複数の位置から検出する第一の信号取得手順と、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値のエリア平均値がより大きくなる位置を特定する手順と、を含む微小粒子分取装置におけるキャリブレーション方法。
（２）前記検出強度として、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値のエリア平均値を用いる上記（１）記載のキャリブレーション方法。
（３）前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる第一の最適位置を特定する手順を含む上記（２）記載のキャリブレーション方法。
（４）前記第一の最適位置は、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値がより大きくなる位置である上記（３）記載のキャリブレーション方法。
（５）前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値の変動係数がより小さくなる第二の最適位置を特定する手順を含む上記（２）〜（４）のいずれかに記載のキャリブレーション方法。
（６）前記レーザに対する前記マイクロチップの相対位置を、前記第一の最適位置又は前記第二の最適位置に設定する手順を含む上記（５）記載のキャリブレーション方法。
（７）前記第一の最適位置と前記第二の最適位置が異なる場合に、前記相対位置を前記第二の最適位置に設定する上記（６）記載のキャリブレーション方法。
（８）前記流路の一端に形成されたオリフィスから吐出される液滴に対して、前記流路を通流する前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出時刻から所定時間経過後にレーザを照射し、前記液滴から発生する光を検出する第二の信号取得手順と、
全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値、あるいは前記キャリブレーション粒子のうちサイズが大きい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値、がより大きくなる経過時間を特定する手順と、を含む上記（１）〜（７）のいずれかに記載のキャリブレーション方法。
（９）前記経過時間をディレイタイムとして設定する手順を含む上記（８）記載のキャリブレーション方法。
（１０）前記キャリブレーション粒子として、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子と、サイズが大きく蛍光強度が高い粒子と、の２種を用いる上記（１）〜（９）のいずれかに記載のキャリブレーション方法。
（１１）前記キャリブレーション粒子中のサイズが大きく蛍光強度が高い粒子のポピュレーションが、サイズが小さく蛍光強度が低い粒子のポピュレーションよりも大きい上記（１０）記載のキャリブレーション方法。
【００８９】
また、本技術に係る微小粒子分取装置は以下のような構成をとることもできる。
（１）サイズ及び蛍光強度が異なる２種以上のキャリブレーション粒子を含む流体が流路に通流されたマイクロチップ又はフローセルにレーザを照射して発生する光を検出する照射検出部と、該照射検出部に対する前記マイクロチップ又は前記フローセルの相対位置を変更する位置調整部と、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる位置への移動信号を前記位置調整部に出力する制御部と、を備える微小粒子分取装置。
（２）前記検出強度が、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値のエリア平均値である上記（１）記載の微小粒子分取装置。
（３）前記制御部は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度がより大きくなる第一の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する上記（２）記載の微小粒子分取装置。
（４）前記制御部は、前記エリア平均値がより大きくなるエリア内において、前記キャリブレーション粒子のうちサイズが小さい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値又は平均値の変動係数がより小さくなる第二の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する上記（２）又は（３）記載の微小粒子分取装置。
（５）前記制御部は、前記第一の最適位置と前記第二の最適位置が異なる場合に、前記第二の最適位置への移動信号を前記位置調整部に出力する上記（４）記載の微小粒子分取装置。
（６）前記流路の一端に形成されたオリフィスから吐出される液滴に対して、前記照射検出部による前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出時刻から所定時間経過後にレーザを照射する光源と、前記液滴から発生する光を検出する検出部と、を備え、前記制御部は、全種の前記キャリブレーション粒子から発生する光の検出強度の積算値、あるいは前記キャリブレーション粒子のうちサイズが大きい種の粒子から発生する光の検出強度の積算値、がより大きくなる経過時間をディレイタイムとして設定する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の微小粒子分取装置。
【００９０】
さらに、本技術に係るキャリブレーション粒子は以下のような構成をとることもできる。
（１）サイズが小さく蛍光強度が低い粒子と、サイズが大きく蛍光強度が高い粒子と、の２種を含む微小粒子分取装置用のキャリブレーション粒子。
（２）前記サイズが大きく蛍光強度が高い粒子のポピュレーションが、前記サイズが小さく蛍光強度が低い粒子のポピュレーションよりも大きい上記（１）記載のキャリブレーション粒子。
（３）前記サイズが小さく蛍光強度が低い粒子の粒径が２〜４μｍであり、前記サイズが大きく蛍光強度が高い粒子の粒径が８〜１２μｍである上記（１）又は（２）記載のキャリブレーション粒子。
【符号の説明】
【００９１】
１：マイクロチップ型微小粒子分取装置、２：マイクロチップ、２１：オリフィス、２２：サンプル流路、２３：サンプルインレット、３：振動素子、４１：荷電部、４２：電極、５１，５２：偏向板、６１，７１：光源、６２，７２：検出器、８１，８２，８３：回収容器、９：位置調整部、１０：制御部、Ｄ：検出位置、Ｆ１，Ｆ２：蛍光、Ｌ１，Ｌ２：レーザ
【図１】
0005905317.tif 000002
【図２】
0005905317.tif 000003
【図３】
0005905317.tif 000004
【図４】
0005905317.tif 000005
【図５】
0005905317.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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