(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペノイドを含み、細胞膜完全性またはタンパク質合成を妨げる抗菌剤の抗菌活性を相乗的に向上させるための抗菌活性向上剤であって、
デヒドロアビエチン酸およびバニリン、ウルソール酸およびバニリン、オレアノール酸およびバニリン、ベツリンおよびバニリン、デヒドロアビエチン酸およびコニフェルアルデヒド、デヒドロアビエチン酸およびチモール、または、デヒドロアビエチン酸およびスチルベンを含み、
前記テルペノイドは、デヒドロアビエチン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、またはベツリンであり、
前記抗菌剤は、バニリン、コニフェルアルデヒド、チモールまたはスチルベンである、抗菌活性向上剤。
【請求項２】
テルペノイドおよび／または抗菌剤が広葉樹もしくは針葉樹由来である、請求項１に記載の抗菌活性向上剤。
【請求項３】
テルペノイドおよび／または抗菌剤が、ヒイラギ（モチノキ属）、カシ（コナラ属）、ブナノキ（ブナ属）、セイヨウトネリコ（トリネコ属）、カエデ（カエデ属）、ポプラ（ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属）、ヤナギ（ヤナギ属）、またはセイヨウ  トチノキ（クリ属）由来である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の抗菌活性向上剤。
【請求項４】
前記テルペノイドおよび／または前記抗菌剤は、マツ（マツ属）、トウヒ（トウヒ属）、ヒマラヤスギ（ヒマラヤスギ属）、モミ（モミ属）、カラマツ（カラマツ属）、ダグラスファー（トガサワラ属）、アメリカツガ（ドクニンジン属）、糸杉（ヒノキ科）、アメリカスギ（セコイア属）またはイチイ（イチイ属）由来である、請求項１または２のいずれかに記載の抗菌活性向上剤。
【請求項５】
デヒドロアビエチン酸およびバニリンを含み、さらに、デヒドロジンゲロンまたはコニフェルアルデヒドを含む、請求項１〜４のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤。
【請求項６】
細胞膜完全性またはタンパク質合成を妨げる抗菌剤の抗菌活性を増強させるための、テルペノイドの使用であり、前記テルペノイドは、ジテルペノイドまたはトリテルペノイドであり、前記ジテルペノイドまたはトリテルペノイドは前記抗菌剤の抗菌活性を相乗的に向上させ、この際、前記テルペノイドおよび前記抗菌剤は請求項１〜５のいずれかで定義されるものである、使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む、液状製剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む、床敷。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む、根覆い。
【請求項１０】
対象の表面に、請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を接触させる、または表面に組成物を塗布することを含む、対象の微生物コロニー形成を予防する、または阻害する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む、物品。
【請求項１２】
前記物品が、医療機器である、請求項１１に記載の物品。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む、布地または高分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の布地または高分子を含む、衣料品。
【請求項１５】
請求項１３に記載の布地または高分子を含む、履物またはその中敷き。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む、包装材料。
【請求項１７】
前記包装材料は、食品または食材の包装用に用いられる、請求項１６に記載の包装材料。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を食品の表面に接触させる、または抗菌活性向上剤を表面に塗布することを含む、食品の微生物感染を予防する、または阻害する方法における請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤の使用。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一に記載の抗菌活性向上剤を含む容器。
【請求項２０】
前記容器は、食べ物を保存することができる、または廃棄物容器である、請求項１９に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性組成物に関する。特に、本発明は抗菌剤とともにテルペノイドを含む抗菌性組成物に関するものであり、微生物感染を予防する、感染に対抗する、または治療する、あるいは微生物の成長または定着を阻止することを含む種々の用途におけるかような組成物の使用に関する。抗菌性組成物の特定の用途としては、家禽小屋のような動物床敷産業における使用、消毒剤および殺菌剤のような一般的な抗菌性製品における使用、パッケージ材料のような食品産業における使用、製品に直接処理するための使用、植物病原菌の拡大を阻止するための土壌、根覆い、または植物材料への適用のための使用が挙げられ、また、医薬用途に幅広く用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
家禽小屋において、敷料で微生物が活性化することにより、ニワトリの排泄物中の尿酸がアンモニアに転換する。リター（ｌｉｔｔｅｒ）中のアンモニア濃度が高くこれがアルカリ性となる、家畜密度の高い家禽小屋においては、これは特に問題となる。これが、アンモニアをアンモニアガスへと転換させ、このアンモニアガスが、濃度が上昇すると、鳥に毒性となり、大気中に放出されると酸性雨の主要な原因となる。したがって、動物小屋からのアンモニア放出は監視下にあり、新法により農家は厳格な放出規制（ＩＰＰＣ）を順守するように強いられている。実際の問題として、ＩＰＰＣの実現は４０，０００を超す鳥を有する農家は、（ｉ）アンモニアの放出を最小限にし、（ｉｉ）家禽小屋から関連する臭いを減らし、（ｉｉｉ）適所に肥料管理計画を有する必要がある。
【０００３】
アンモニアリッチである寝床で飼育されている家禽は、産物である食用製品の質を落とす、足しょ皮膚炎足（ｆｏｏｔ  ｐａｄ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）（ＦＰＤ）に加え、足または胸での「腐食火傷（ｃａｕｓｔｉｃ  ｂｕｒｎｓ）」になる可能性がある。アンモニアによる「腐食火傷」の予防は、動物の健康増進になるばかりでなく、良好な動物の成長および高品質の動物製品の結果として農家の損失を減ずるものでもある。したがって、家禽小屋における微生物活性を最小限にする必要がある。
【０００４】
床敷中の尿酸のアンモニアおよびアンモニウムへの微生物転換を予防するための微生物活性の低減は、寝床の湿度をできるだけ低く保つことによって現在のところ達成される。この点において効果的であるとしている報告は、湿気を吸収する敷料を使用している。しかしながら、実際には、鳥の家畜密度がしばしば高いので、寝床の湿度レベルを低く維持することは困難であり、結露（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）および液体の流出が起こり、その結果寝床が著しく湿ったものとなる。この湿度は微生物活性を助長し、その結果、ニワトリの排泄物中に存在する尿酸からアンモニウムが形成される。
【０００５】
アンモニウムは、ｐＨが７を超えるとアンモニアに変換し、ｐＨ８を超えるとアンモニアの濃度が顕著になってくる。敷料が苛性になるのを避けるため、尿酸がアンモニアに変換したらすぐに、ミョウバン（ＫＡｌ（ＳＯ４）２．１２Ｈ２Ｏ）または、重硫酸ナトリウムのような酸性塩をｐＨを低く保つために添加することができる。しかしながら、これらの化合物は永続的ではなく、農家にとって高価である。さらに、残ったリター中の多量のアルミニウムが、重金属濃度が高いためにごみ処理問題を生み出す。結果として、かような「酸性にする物質」の使用は一般的ではなく、家禽小屋におけるアンモニア形成は当たり前となっている。
【０００６】
肉や卵用に飼育されているニワトリのような動物使用の他の問題は、食品を介した病原体のリスクである。スーパーマーケットで売られている冷凍チキンの７５−９５％がカンピロバクターに感染していて、１０％がサルモネア菌に感染していると推定される。寝床を製造し、群れを横たわせる農家にとって、動物小屋でのサルモネア菌の検出は、今や全ての群れを殺戮する必要があり、その結果農家にとって多大な経済損失となることを意味する。これらのバクテリアは動物小屋、特に寝床から動物自身にたどり着くと考えられている。これらの問題の原因は、これらのバクテリアに最適な生育環境を床敷が提供していることであり、最適な生育環境には、これらのバクテリアの成長範囲内に適している、高温（２５−３５℃）、高湿度レベルおよび排泄物中の高濃度の栄養成分、およびｐＨ値を含む。したがって、これらの病原体の成長を抑制するために、床敷内の微生物活性の量を減少させることが活に必要である。
【０００７】
壊死桿菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）およびバクテロイデスメラニノジェニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｃｕｓ）は、足根（ｆｏｏｔ  ｒｏｏｔ）（足皮膚炎）の病原体であり、足根は、ヒツジ、ヤギ、ウシの足指間の領域が感染し、蹄を腐らせる病気である。病気は非常な痛みを伴い、接触伝染性である。接触によりバクテリアを死滅させることができる床敷によって、これらのバクテリアにより動物が双蹄となる害を顕著に減ずることができるであろう。
【０００８】
アルコール類、アルデヒド類、酸化剤、フェノール類または第４級アンモニウム化合物に基づいたものとして特徴付けられうる、市場での合成殺菌剤および殺菌剤は幅広く存在する。かような物質は、一般的には、微生物を死滅させるのに効果的であるが、下記の問題がある；（ｉ）バクテリアはアルデヒド類に対して耐性を獲得するようになる；（ｉｉ）酸化剤およびフェノール類は過度に腐食性である；（ｉｉｉ）アルデヒド類は有機物によって不活性化される；（ｉｖ）アルコール類は非永続性である；（ｖ）これらの多くはヒトに毒性である、または刺激物として働く；あるいは（ｖｉ）これらは負の環境影響を有する。
【０００９】
上記問題によって、バニリンのような抗菌性を有する精油および他の天然物のような「天然」でより「環境に優しい」抗菌剤への要求が高まってきている。精油の一般的な例として、チモール（タイム由来の天然フェノール性生成物）、ティーツリー油由来の産物、クローブ（オイゲノール）、ユーカリ、マツなど由来の他の精油を含む産物などが挙げられる。しかしながら、精油および他の植物由来抗菌産物は、抗菌性が弱く、有効量とするためには濃度を高くする必要があり、高価となるばかりでなく、使用者を不快にさせるこれらの産物の強い臭いを発するようになる。したがって、本分野において、公知の抗菌剤の活性を増加させる必要性がある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、テルペノイドおよびこの誘導体が公知の抗菌剤の抗菌性を顕著に向上させることを見出した。
【００１１】
したがって、本発明の第一の態様は、テルペノイドまたはこの誘導体、および細胞膜の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）または、タンパク質合成を妨げる抗菌剤を含む抗菌性組成物を提供する。
【００１２】
第二の態様において、細胞膜の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）または、タンパク質合成を妨げる抗菌剤の抗菌活性を向上させるためのテルペノイドまたはこの誘導体の使用を提供する。
【００１３】
本発明者らは、木削りかす（ｗｏｏｄ  ｓｈａｖｉｎｇｓ）を緩やかに加熱すると抗菌性となるメカニズムを研究し、驚くべきことにテルペノイド、デヒドロアビエチン酸、および抗菌剤であるバニリンの双方を含むこれらの削りかすからの抽出物が高い抗菌性を有することを観察した。しかしながら、実施例１で述べるように、最も驚くべきことは、双方の物質を含む抽出物がバニリンのみ、すなわちテルペノイドと組わせていないときの活性と比較して１０００倍より高い抗菌性を示したことを見出したことである。実施例３で示すように、この効果は、アビエチン、デヒドロアビエチンおよびピマル酸のようなジテルペノイドにだけ制限されるものではなく、ウルソール酸、オレアノール酸（ｏｌｅｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびベツリンのようなトリテルペノイドの範囲も及ぶ。一般的に、抗菌物質は純粋な形で用いられ、したがって、発明者らは、デヒドロアビエチン酸のようないかなるテルペノイドもバニリンのような天然または合成の抗菌剤の抗菌活性を驚くべきことに高めることができることを初めて見出したと確信している。
【００１４】
「抗菌剤の抗菌活性を向上させる」という用語は、抗菌剤が、テルペノイド非存在よりもテルペノイドの存在下でより高い抗菌活性を示すことを意味する。驚くべき活性の向上は、微生物の細胞膜の完全性またはタンパク質合成を補完するように双方の物質が妨げるという相乗的効果の結果であると考えられる。したがって、抗菌剤は微生物の細胞膜の完全性または微生物のタンパク質合成（例えばＲＮＡ合成機構）の何れかを阻害することができ、テルペノイドはこれらの剤を細胞内に入りやすくするまたはこれらの機能を高めることができる。
【００１５】
抗菌剤の抗菌活性は、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍、増加されうる。抗菌活性は、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、７００倍、または１０００倍増加し得る。抗菌活性は、少なくとも１２００倍、少なくとも１５００倍、少なくとも１７００倍または少なくとも２０００倍またはそれ以上、増加さえしうる。抗菌活性のかような増加は、実施例で述べられるようなアッセイを用いて決定することができる。
【００１６】
本発明者らは、種々の加熱した植物材料を試験し、テルペノイドおよび抗菌剤を含む、例えば、松材や樹皮のような種々の広葉樹または針葉樹からの加熱した木の削りかす（ｗｏｏｄ  ｓｈａｖｉｎｇｓ）の加熱物が驚くべき抗菌性を示すことを見出した。したがって、テルペノイドおよび／または抗菌剤は、広葉樹または針葉樹のような植物由来でありうる。テルペノイドおよび／または抗菌剤の起源となりうる適切な広葉樹種の例としては、ヒイラギ（モチノキ属）、カシ（コナラ属）、ブナノキ（ブナ属）、セイヨウトネリコ（トリネコ属）、カエデ（カエデ属）、ポプラ（ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属）、ヤナギ（ヤナギ属）、およびクリ（ヨーロッパグリ（Ｃａｓｔａｎｅａ  ｓａｔｉｖａ））のようなセイヨウトチノキ（クリ属）が挙げられる。
【００１７】
テルペノイドおよび／または抗菌剤が得られうる適切な針葉樹種としては、針葉樹（ｃｏｎｉｆｅｒ）または松の木が挙げられる。したがって、針葉樹の適切な例としては、マツ（マツ属）、トウヒ（トウヒ属）、ヒマラヤスギ（ヒマラヤスギ属）、モミ（モミ属）、カラマツ（カラマツ属）、ダグラスファー（トガサワラ属）、アメリカツガ（ドクニンジン属）、糸杉（ヒノキ科）、アメリカスギ（セコイア属）またはイチイ（イチイ属）が挙げられる。本発明者らは、マツ、特にヨーロッパアカマツ（Ｓｃｏｔｓ  Ｐｉｎｅ）由来の材料が、驚くべき抗菌活性を示し、したがって、本発明の組成物の有用な起源を提供することを見出した。よって、テルペノイドおよび／または抗菌剤は、マツ科、好適には、ヨーロッパアカマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｕｓ）またはヨーロッパクロマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｎｅｇｒｕｓ）のようなマツ属起源でありうる。木由来のロジンおよび不均化（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｄ）ロジンのような材料もまた、本発明における使用のために適したテルペノイド源である。
【００１８】
テルペノイドおよび／または抗菌剤の起源となる植物材料は、例えば、少なくとも５０℃、または少なくとも１１５℃の温度に暴露することによって始めに加熱してもよい。植物材料は、２００℃より低い、または１５０℃より低い温度に暴露されうる。植物材料は、７５℃〜１７５℃の間、または１００℃〜１６０℃の間の温度に暴露されうる。植物材料は、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも５時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間または少なくとも７２時間、温度処理に暴露されうる。本発明者らは、かような熱処理の暴露が本発明の抗菌組成物をもたらすことを見出した。
【００１９】
第一の態様の組成物、または第二の態様の使用で用いられるテルペノイドは、イソプレンユニット、すなわち、２−メチル−１，３−ブタジエンまたはＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２）から構成される。イソプレンユニットは、一般式（Ｉ）：
【００２０】
【化１】
0005890778.tif 000002
【００２１】
で表わすことができる。
【００２２】
テルペノイドは、親水性部分（通常カルボン酸）および疎水性部分（通常多環構造）を有する。テルペノイドは樹脂酸であってもよい。樹脂酸は、木の中で樹脂道を囲む実質的な上皮細胞によって産生される保護剤および木材防腐剤であってもよい。
【００２３】
テルペノイドはイソプレンユニットの数にしたがって分類される。したがって、テルペノイドはジテルペノイドまたはトリテルペノイドであってもよい。ジテルペノイドは、４つのイソプレンユニットを有し、トリテルペノイドは６つのイソプレンユニットを有する。第一または第二の態様で用いられうるのに適したトリテルペノイドは、ウルソール酸、オレアノール酸、ベツリン酸、モロン酸（ｍｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびルペオール（ｌｕｐｅｏｌ）からなるトリテルペノイドの群から選択されうる。トリテルペノイドは実施例３で述べる。
【００２４】
樹脂酸および酸化樹脂酸を含むジテルペノイドは、置換されたデカリン骨格からなる疎水性部分および一の水素結合ドナー基を有する親水性領域を有する。ジテルペノイドは、実施例１および２において述べる。適切なジテルペノイドは、デヒドロアビエチン酸；アビエチン酸；ピマル酸；カウレン酸；ｅｎｔ−３−ｐ−ヒドロキシカウレン酸；シルビン酸（ｓａｌｖｉｃ  ａｃｉｄ）；トタロール（ｔｏｒａｒｏｌ）；１８−アセトキシ−ｃｉｓ−クレロダ（ｃｌｅｒｏｄａ）−３，１３−Ｚ−ジエン−１５−酸（ｏｉｃ  ａｃｉｄ）；アビエタノール（ａｂｉｅｔｉｎｏｌ）（７，１３−アビエタジエン−１８−オール（７，１３−ａｂｉｅｔａｄｉｅｎ−１８−ｏｌ））；デヒドロアビエチルグアニジン（ｄｅｈｙｄｒｏａｂｉｅｔｉｃｙｌｇｕａｎｉｄｉｎｅｓ）；ピシフェリン酸；フェルギノール；イソピマル酸；７−ｏｘｏ−デヒドロアビエチン酸；７−ヒドロキシ−デヒドロアビエチン酸；および１３−ヒドロキシ−ポドカルパ（ｐｏｄｏｃａｒｐａ）−８，１１，１３−トリエン−１８−酸（ｏｉｃ  ａｃｉｄ）からなるジテルペノイドの群から選択されうる。
【００２５】
アビエチン酸は化学式（ＩＩ）によって表わすことができる。
【００２６】
【化２】
0005890778.tif 000003
【００２７】
したがって、第一の態様の組成物、または第二の態様の使用におけるテルペノイドは、アビエチン酸またはこの誘導体でありうる。
【００２８】
本発明者らは、これらが、アビエチン酸および抗菌剤を含む殺菌剤または殺菌組成物を製造する最初であることを確信している。したがって、第一の態様の組成物は、消毒剤または殺菌剤でありうる。消毒剤は、微生物感染または敗血症を減らすまたは予防するために生体組織または皮膚に対して適用されるどんな抗菌性物質であってもよい。したがって、消毒剤中の活性成分は毒性または刺激を引き起こすことなく、皮膚や組織に適用され、それでもなお微生物を死滅させることができる十分な選択性と濃度を有することが好ましい。殺菌剤は、非生物物質または表面上に見出せる微生物を死滅させることができるどんな抗菌性の物質であってもよい。
【００２９】
本発明にしたがって用いられうる適切なアビエチン酸は、ネオ−アビエチン酸、パルストリン酸、レボピマル酸、デヒドロアビエチン酸、またはこれらの誘導体が挙げられる。
【００３０】
したがって、好適には、テルペノイドはデヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）、またはこれらの誘導体である。デヒドロアビエチン酸および適切なこの誘導体は一般式（ＩＩＩ），（ＩＶ）または（Ｖ）によって表すことができる：
【００３１】
【化３】
0005890778.tif 000004
【００３２】
【化４】
0005890778.tif 000005
【００３３】
【化５】
0005890778.tif 000006
【００３４】
この際、Ｒは、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｍｅ、ＣＨ２ＯＨまたはＣＨＯであり；Ｒ２はＣＯ２Ｈ，ＣＯ２ＭｅまたはＣＨ２ＯＨであり；およびＲ３はＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ＭｅまたはＣＨ２ＯＨである。
【００３５】
本明細書で開示されている特性を有する誘導体の範囲を形成するために、テルペノイドは、例えば、脱水、ハロゲン化、酸化またはメチル化を用いた種々の方法において改変することができる。したがって、テルペノイドの適切な誘導体としては、テルペノイドの、脱水された、酸化された、メチル化されたまたはハロゲン化された形態が挙げられる。例えば、アビエチン酸はピマル酸を形成するために脱水される。また、ＤＨＡＡは、１２，１４−ジクロロデヒドロアビエチン酸を形成するためにハロゲン化されうる。
【００３６】
テルペノイドまたはその誘導体は、対応する塩（例えば、水酸化ＤＨＡＡ）を形成するために、塩基、例えば、水酸化ナトリウムで処理してもよい。例えば、スプレーまたは溶液自身の浸漬によって表面に適用される、溶液作成のための水に塩は容易に溶解することができる。
【００３７】
本発明にしたがって用いられる抗菌剤は微生物の細胞膜の完全性を妨げることができる。これが生ずるメカニズムは異なる物質によって異なると考えられるが、抗菌剤の油溶性部分が微生物の細胞膜のリン脂質構成成分と相互作用し、膜におけるカルシウムおよびカリウムのイオンチャネルの活性を修飾することが考えられる。さらに、抗菌剤は、その生理化学的性質および分子形によって細胞膜と相互作用し、それにより膜酵素、膜キャリア分子および膜レセプターの活性に影響を与えることができる。これらのメカニズムの一部またはすべてによって、微生物の細胞膜の完全性を妨げ、細胞死に至らしめることができる。
【００３８】
植物由来のような多くの精油は種々の抗菌活性を示す。したがって、本発明の一実施形態は、第一または第二の態様において用いられる抗菌剤が精油を含む。用いられうる好適な精油としては、タイム油（活性成分：チモール）、丁子油（活性成分：オイゲノール）、ティーツリー油（活性成分テルピネン（Ｔｅｒｐｉｎｅｎ）−４−オール）、アニス油、ショウブ（Ｃａｌａｍｕｓ）油、樟脳油、シダーウッド（Ｃｅｄａｒ  ｗｏｏｄ）油、桂皮油、シトロネラ油、レモン油、レモングラス油、ライム油、ナツメグ油、パルマローザ（Ｐａｍａｒｏｓａ）油、ペパーミント油、ローズマリー油、メボウキ油、ベチベル油、黒コショウ油、ジンジャー油、モツヤクジュ油（Ｍｙｒｒｈ  ｏｉｌ）、オレガノ（Ｏｒｅｇａｎｏ）油、ロレール（Ｂａｙ  ｌｅａｖｅ）油、ゼラニウム油、オレンジ油、ジラ油または冬緑油が挙げられる。
【００３９】
したがって、抗菌剤は、チモールまたはこの誘導体を含んでいてもよい。チモールの化学式および構造は本明細書で開示される。
【００４０】
精油は、上述した方法で微生物細胞膜の完全性に相互作用する、すなわち、油の油溶性部分が細胞膜の脂質部分と反応し、膜のイオンチャネルの活性を修飾すると考えられる。さらに、精油は、その生理化学的性質および分子形によって細胞膜と相互作用すると考えられる。精油は、通常生物学的活性成分の混合物を含むが、抗菌活性に寄与すると考えられている主成分は、フェノール類である。精油中に見出されるフェノール化合物の例を表１に記載する。
【００４１】
【表１】
0005890778.tif 000007
【００４２】
したがって、本発明にしたがって用いられる抗菌剤は、表１にリストされたフェノール化合物のいかなる使用にまで拡張されうる。
【００４３】
抗菌活性を有するとも考えられている精油中の他の生物学的活性化合物としては、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、カルバクロール（Ｃａｒｖａｃｏｌ）、クレオゾール、イソオイゲノール、ハイドロキノン、グアヤコール、サリチル酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｓａｌｙｃｉｌａｔｅ）、Ｔｒａｎｓ−アネトール、メチルオイゲノール、メチルカビコール（Ｍｅｔｈｙｌ  ｃｈａｖｉｃｏｌ）、ｐ−メトキシフェニルアセトン、ベンズアルデヒド、アニスアルデヒドおよびクミンアルデヒドが挙げられる。したがって、本発明の抗菌剤は、これらの化合物のいかなる形態も含みうる。
【００４４】
実施例で述べているように、本発明者らは、薬剤、バニリンの抗菌活性が、テルペノイドであるデヒドロアビエチン酸と併用すると非常に増強されることを示した。したがって、抗菌剤はバニリンまたはその誘導体でありうる。バニリン（メチルバニリンまたは４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒドとしても知られる）は分子式Ｃ８Ｈ８Ｏ３を有し、式ＶＩによって表される：
【００４５】
【化６】
0005890778.tif 000008
【００４６】
したがって、一実施形態において、本発明の第一の態様の組成物は、デヒドロアビエチン酸またはこの誘導体、およびバニリンまたはこの誘導体を含む。第二の態様の使用の一実施形態において、デヒドロアビエチン酸またはこの誘導体は、バニリンまたはこの誘導体の抗菌特性を向上させるために用いられる。バニリンの一般的な誘導体は、式ＶＩＩによって表されるバニリン酸である：
【００４７】
【化７】
0005890778.tif 000009
【００４８】
他のバニリンの適切な誘導体としては、エチルバニリンが挙げられる。
【００４９】
図２に示すように、本発明者らは、ＤＨＡＡのようなテルペノイドによってスチルベンの抗菌活性を驚くべきことに増大させることができることを示した。したがって、他の実施形態において、抗菌剤はスチルベン、またはこの誘導体でありうる。スチルベンには２つの可能なアイソマー、シス−およびトランス−アイソマーが存在し、式ＶＩＩＩおよびＩＸで表される：
【００５０】
【化８】
0005890778.tif 000010
【００５１】
【化９】
0005890778.tif 000011
【００５２】
実施例１２で述べるように、本発明者らは、コニフェルアルデヒド（ｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）の抗菌活性がＤＨＡＡのようなテルペノイドによって驚くべきことに増強されうることを示した。したがって、他の実施形態において、抗菌剤はコニフェルアルデヒドまたはこの誘導体であり、式Ｘによって表される：
【００５３】
【化１０】
0005890778.tif 000012
【００５４】
実施例８で述べられているように、本発明者らは、デヒドロジンゲロン（ｄｅｈｙｄｒｏｚｉｎｇｅｒｏｎｅ）の抗菌活性もまた、ＤＨＡＡのようなテルペノイドによって驚くべきことに増強されうることも示した。したがって、さらに他の実施形態において、抗菌剤は、デヒドロジンゲロンまたはこの誘導体であり、式ＸＩによって表される：
【００５５】
【化１１】
0005890778.tif 000013
【００５６】
したがって、他の実施形態において、本発明の第一の態様の組成物は、デヒドロアビエチン酸もしくはこの誘導体、バニリンもしくはこの誘導体および／またはスチルベンおよび／またはコニフェルアルデヒドおよび／またはデヒドロジンゲロン、もしくはこの誘導体を含む。
【００５７】
さらに、他の実施形態において、第二の態様の使用は、バニリンまたはこの誘導体の抗菌特性を上昇させるために、デヒドロアビエチン酸および／またはスチルベンおよび／またはコニフェルアルデヒドおよび／またはデヒドロジンゲロン、あるいはこれらの誘導体を含む。
【００５８】
さらに他の実施形態において、抗菌剤はタンパク性であり、少なくとも一のポリペプチドを好適には含む。結果として、薬剤は対象による消費の際にプロテアーゼ酵素によって消化される。例えば、抗菌剤は、３４アミノ酸を有する多環式のペプチド抗菌性化合物であるナイシンである。対象による消費の際に、ナイシンは対象に存在するプロテアーゼによって急速に不活化される。実施例５で述べられているように、本発明者らはデヒドロアビエチン酸が水にあまり溶解せず、デヒドロアビエチン酸およびバニリンの双方を含む材料からの水抽出物が驚くべきことに微生物に対して非毒性であることを示した。代わりに、処理した材料では抗菌活性が残っている。したがって、デヒドロアビエチン酸が容易に溶解しないばかりでなく、変性したタンパク質ともに対象に対してなんら毒性効果を有しないので、デヒドロアビエチン酸をナイシンのようなタンパク性の抗菌剤と組み合わせると、非常に安全な製品となるであろう。
【００５９】
本発明の抗菌剤として用いられうる、前述した「天然物」に加え、微生物の細胞膜を破壊もでき、微生物の死滅を引き起こし、それ故、本発明にしたがった抗菌剤として用いることができる化学薬品も幅広く存在する。これらの化合物は、アルコール類、アルデヒド類、酸化剤、フェノール類または第４級アンモニウム化合物に分類されうる。通常、かような化合物は表面の清浄用や水道において（例えば塩素）用いられる。したがって、デヒドロアビエチン酸のようなテルペノイドと組み合わせてこれらの抗菌活性を増加させることによって希釈した際にこれらの化合物をより効果的にすることができる。抗菌剤は、抗生剤であってもよいし、抗生剤でなくともよい。抗菌剤は亜鉛のような重金属であってもよいし、重金属でなくともよい。
【００６０】
本発明者らは、テルペノイドの他、極性、酸性基または部分、および強固な疎水性部分を有する他の分子もまた、バニリンのような抗菌剤の抗菌活性を増加させるために用いられうることを見出した。
【００６１】
したがって、本発明の第三の態様は、精油またはバニリン、もしくはこれらの誘導体の抗菌活性を増加させるための、極性部および強固な疎水性部分を有する化合物の使用を提供する。
【００６２】
極性部としては、水酸基、例えば、カルボン酸部が挙げられる。疎水性部は、少なくとも一の芳香族環、好適には複数の芳香族環を含みうる。化合物は、イソフラバノイドフィトアレキシン（ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｉｄ  ｐｈｙｔｏ−ａｌｅｘｉｎ）（例えば、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）、グリセオリン（ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎ）または、プテロカルパン（ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎ）でありうる。精油は、本明細書ですでに述べたもの、またはこの活性成分うちいずれかでありうる。第三の態様の使用は、本発明の下記態様のいずれにおいて述べられている適用のいずれに対しても適用することができる。
【００６３】
本発明者らは、本発明にしたがって用いられうる本明細書で述べられる各抗菌剤の化学的構造について注意深く考慮し、同じ化学式によって表されることを見出した。
【００６４】
したがって、抗菌剤は式ＸＩＩによって表される；
【００６５】
【化１２】
0005890778.tif 000014
【００６６】
この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアルキレン；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ；Ｃ１−Ｃ４飽和または不飽和アルデヒド；Ｃ２−Ｃ４エステルまたはケトン；Ｃ１−Ｃ４カルボキシル；およびＣ１−Ｃ３アルキル置換フェニル基からなる群から選択される。
【００６７】
Ｒ１は、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルもしくはアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルデヒド、またはＣ１−Ｃ２アルキル置換フェニル基でありうる。Ｒ１は、ＯＨ、Ｃ１アルコキシ、Ｃ１アルデヒド、またはＣ１−Ｃ２アルキル置換フェニル基でありうる。
【００６８】
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキルもしくはアルコキシまたはＣ２−Ｃ４エステルでありうる。Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、もしくはＣ１−Ｃ３アルコキシ、またはＣ２−Ｃ４エステルでありうる。
【００６９】
Ｒ３は、Ｈ、またはＣ１−Ｃ４アルキルでありうる。Ｒ３は、Ｈ、またはＣ１−Ｃ３アルキルでありうる。
【００７０】
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキルもしくはアルキレン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４飽和もしくは不飽和アルデヒド、またはＣ２−Ｃ４ケトンでありうる。Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキルもしくはアルキレン、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２飽和もしくは不飽和アルデヒド、またはＣ２−Ｃ３ケトンでありうる。
【００７１】
Ｒ５は、Ｈ、またはＣ１−Ｃ４アルキルでありうる。Ｒ５は、Ｈ、またはＣ１−Ｃ２アルキルでありうる。
【００７２】
Ｒ６は、Ｈ、またはＣ１−Ｃ４アルキルでありうる。Ｒ６は、Ｈ、またはＣ１−Ｃ２アルキルでありうる。
【００７３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記表で規定されるものでありうる。
【００７４】
【表２】
0005890778.tif 000015
【００７５】
当然のことながら、一般式ＸＩＩを有し、上記リスト中で特に述べられていない酸化精油またはこの誘導体の化合物が多数存在する。
【００７６】
第四の態様において、テルペノイドまたはこの誘導体、および式ＸＩＩ：
【００７７】
【化１３】
0005890778.tif 000016
【００７８】
この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアルキレン；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ；Ｃ１−Ｃ４飽和または不飽和アルデヒド；Ｃ２−Ｃ４エステルまたはケトン；Ｃ１−Ｃ４カルボキシル；およびＣ１−Ｃ３アルキル置換フェニル基からなる群から選択される：で表される抗酸化剤を含む抗菌性組成物が提供される。
【００７９】
第五の態様において、式ＸＩＩ：
【００８０】
【化１４】
0005890778.tif 000017
【００８１】
この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアルキレン；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ；Ｃ１−Ｃ４飽和または不飽和アルデヒド；Ｃ２−Ｃ４エステルまたはケトン；Ｃ１−Ｃ４カルボキシル；およびＣ１−Ｃ３アルキル置換フェニル基からなる群から選択される：で表される抗酸化剤の抗菌活性を増加させるためのテルペノイドまたはこの誘導体の使用が提供される。
【００８２】
本発明に係る抗菌性組成物は、バクテリアであれ真菌であれ、微生物感染を予防し、抵抗し、または治療するために用いられうる。第一または第四の態様の抗菌剤組成物を用いて治療される、または予防されるバクテリア感染は、グラム−陽性またはグラム−陰性バクテリア感染でありうる。対処するために組成物が用いられるグラム−陽性菌の例としては、バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム属菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、スタヒロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）およびエンテロコッカス属菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）を含むファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）が挙げられる。例えば、グラム陽性菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でありうる。対処するために組成物が用いられるグラム−陰性菌の例としては、（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような）サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、および（Ｅ．ｃｏｌｉのような）エシェリキア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）のような腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられる。カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）およびシュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）は、本発明の組成物を用いて治療される他のグラム陰性菌の例である。
【００８３】
ヒトまたは動物に感染し、組成物が対抗するために用いられうる真菌感染の例は主に皮膚病である。例えば、対抗される真菌は、ペニシリウム属菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）のような糸状菌が挙げられる。皮膚に感染する真菌症の例は、鵝口瘡（病原体カンジダ・アルビカンス）のようなイースト菌感染症に加えて、癜風（病原体ピチロスポルム−オルビクラーレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｓｐｏｒｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒ））、白癬、水虫およびたむし（病原体は、小胞子菌属、白癬菌属、および表皮菌の真菌である）である。また、皮膚の剥離を引き起こす頭皮（ふけ）の真菌感染は、発明の組成物を用いて治療することができる。哺乳類を感染させる真菌感染に加えて、本発明の組成物は、植物または植物製品の真菌感染に対抗するために用いられうる。植物が枯れたときでさえ、植物残渣または胞子（ｓｐｏｒｕｌａｔｅ）上に生き残っている真菌は特に興味深い。枯れた植物材料に生存し、重大なダメージを引き起こす真菌症の例としては、疫病菌属、フハイカビ属、スクレロティニア属、バーティシリウム属、ベンチュラ属（Ｖｅｎｔｕｒａ）、ボトリチス属およびフサリウム属が挙げられる。特に有害な病気の一つが、Ｓｕｄｄｅｎ  Ｏａｋ  Ｄｅａｔｈの病原体であるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍである。この病気はシャクナゲ種に感染し、オーク（コナラ属）を破壊することができる。本発明の組成物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなイースト菌感染に対抗するために用いることができる。
【００８４】
本発明の組成物を用いて対抗できる微生物の範囲が幅広いので、本発明者らは、第一または第四の態様の組成物は、公知の抗菌剤の活性を増加させることによって、微生物の活性または存在すら問題となる工業用、家庭用、ヘルスケア、包装およびエンジニア用途のような（臨床的な意味であるか否かにかかわらず）幅広い抗菌性の用途に対して適用することができると信じている。好ましくは、組成物は、溶解した（すなわちアルコールまたはアセトン中に溶解した）形態で、または、水溶性とすることができる塩に転換させることによって適用することができる。しかしながら、塩の形態ではない場合、一旦溶質を蒸発させると、組成物は、支持体表面または材料上に水不溶性形態として、すなわち、吸収され、一体化されるまたは塗布される形で存在する。
【００８５】
したがって、本発明の第六の態様では、第一または第四の態様の抗菌性組成物を含む液体製剤が提供される。
【００８６】
哺乳類への毒性が低く、心地よいまたは何ら味やにおいがなく、良好で幅広い抗菌特性を有する天然化合物は、多くの用途を有する。例えば、動物の敷料または寝床を衛生的にし、または、表面、例えば食品の調理用に用いられるものを衛生的にするために用いられる。組成物は、また殺菌性のハンドウォッシュおよびソープ、フケ防止シャンプー、皮膚クリーム、およびマウスウォッシュ中に用いることもできる。
【００８７】
有利には、バニリンまたは精油のような、細胞膜の完全性を妨げる抗菌剤活性を向上させるためのテルペノイドの使用は、元の活性成分が低い濃度（すなわち非常に希釈されている）の場合でさえ、存在する天然物の活性を顕著に増強させる。したがって、第一または第四の態様の組成物は臭いまたは味がないような低い濃度で効果的である。さらに、本発明の組成物がヒトまたは哺乳類に対して害がなく、化合物は環境の中で自然にあちらこちらに偏在しているので、処理されたものが通常のごみ処理経路を経て処理されても環境に対してあまり負荷をかけないことは重要である。
【００８８】
一実施形態において、抗菌性組成物は、その抗菌特性が、動物用床敷に関連していることが知られている主な動物病原体であるサルモネア菌、カンピロバクター、マイコバクテリウムおよび大腸菌の成長を抑制するので、動物用床敷を処理するために用いることができる。尿酸および尿素のアンモニアへの転換に関連する微生物を幅広く抑制することは、動物用床敷が苛性になることを予防し、大気中にアンモニアが放出されることを抑制する。
【００８９】
したがって、第七の態様において、第一または第四の態様にしたがって抗菌性組成物を含む動物用床敷（ａｎｉｍａｌ  ｂｅｄｄｉｎｇ）が提供される。
【００９０】
第五の態様の動物用床敷におけるアンモニア形成および病原体の数を効果的に減らすために、第一の態様の組成物とともに、木の削りかす（ｗｏｏｄ  ｓｈａｖｉｎｇｓ）または、紙、パーライトまたは他の多孔性材料のような他の吸収材が処理される。組成物は、バニリンと組み合わせて、デヒドロアビエチン酸またはその誘導体を含むことが好ましい。組成物は、アルコールまたはアセトンを溶媒として含んでいてもよい。したがって、直接スプレーすることによって、または敷料とともに溶液を浸し、混合し、次いで溶媒を蒸発させることによって、敷料を処理することができる。または、水または他の多孔性溶質とともに製剤化できるように、塩の形成によって初め組成物を水溶性にしてもよい。
【００９１】
有利には、第七の態様の床敷は臭いを低減し、動物の健康を増進させる。動物用床敷は、家畜産業、例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ニワトリ（ｆｏｕｌ）またはガチョウのような家禽において、また、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよび他の動物ようの動物用床敷として用いることができる。また、動物用床敷は、ペット産業、例えば、ウサギ、テンジクネズミ、ハムスター、アレチネズミ、ラット、ネズミまたはかごの鳥の床敷用に用いることができる。第七の態様の床敷は、また、マウス、ラットまたはウサギのような動物実験室試験（例えば、ノックアウト／ヌードマウス用）において使用される動物用に用いることができる。床敷は、動物園の動物の飼育における床敷／リターとして用いることもできる。床敷は、また、生きている動物を運搬するための、またはサルモネラ・エンテリティディスが健康なめんどりの卵巣に感染し、殻が形成される前に、タマゴを汚染することが知られているので、タマゴを生むめんどり用の動物床敷／リターとしての使用のための動物用床敷としても用いることができる。
【００９２】
第一および第四の態様の組成物もまた、真菌または細菌感染によって引き起こされる植物病からの収穫損失を避けるために園芸および造林において用いることができる。したがって、組成物は、植物、果物または野菜への感染から土壌病原体を予防する根覆い（ｍｕｌｃｈ）、すなわち、土壌上の保護カバーとして用いることができる。または、組成物はこれらの材料に定着している病原体が拡大することを抑制するために植物残渣に直接適用することができる。
【００９３】
したがって、第八の態様は、第一または第四の態様にしたがった抗菌性組成物を含む根覆いが提供される。
【００９４】
根覆いは、微生物感染による収穫の損失を最小限にする、または抑制するために用いられる。例えば、イチゴの５０％、ブドウの２０〜４０％がボトリチスのような真菌感染によって損失し、リンゴ赤カビ病（ａｐｐｌｅ  ｓｃａｂ）によって、リンゴの金銭価値の７０％が損失となりうる。根覆いを用いることによってそのような収穫損失を避けることができると考えられる。
【００９５】
本発明者らは、第一または第四の態様の組成物が、対象そのものの微生物コロニー形成の予防または阻害に対して適用することができると確信している。
【００９６】
したがって、第九の態様において、対象の微生物コロニー形成を予防する、または阻害する方法が提供され、該方法は、対象の表面に、第一または第四の態様の抗菌性組成物を接触させる、または表面に組成物を塗布することを含む。
【００９７】
病院「超強力細菌」は、医療制度の中で主要な問題の一つであり、抗菌性製品はこの問題を克服するための効果的な解決方法となりうる。本発明の組成物は、黄色ブドウ球菌およびクロストリジウム・ディフィシルのようなグラム陽性菌の成長の阻止において効果的であることが示されてきた。本技術は、患者用衣類およびベッド製品を製造するために用いられる、天然物（すなわちウール、綿、リンネル、黄麻など）ならびにナイロンおよびポリエステルから作られるもののような人工繊維に対して適用することができる。他の用途としては、医療機器、備品、電気および電子製品、ならびに窓枠の処理が挙げられる。
【００９８】
第十の態様において、第一または第四の態様の抗菌性組成物を含む対象が提供される。
【００９９】
組成物で対象を塗布することができる。好適には、一旦塗布した後、組成物は不溶性形態となる。好適には、第九の方法、または第十の対象において用いられる組成物の量は、微生物を死滅させる、または成長を抑制するために十分な効果的な量である。本発明の組成物は無菌とすることが必要な表面または対象に塗布するために特に有用であり、上述したように、該組成物は、長い期間にわたってこれらが抗菌性であるという利点を有する。本発明の組成物は、微生物感染または長期的に患者への感染につながりうる汚染を予防することが重要である、生物学的または医学的状況または環境において用いられる対象または装置に塗布するために用いることができる。
【０１００】
対象（物品）は医療機器でありうる。本発明の組成物を用いて塗布される医療装置の例としては、カテーテル、ステント、創傷包帯、救急絆、避妊具、外科的インプラントおよび置換ジョイント（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｊｏｉｎｔｓ）、コンタクトレンズなどが挙げられる。本発明の組成物は、バイオマテリアルならびにこれらから作られる対象および装置に塗布するのに特に有用である。微生物はそのような材料を成長の基質として用いることができるので、バイオマテリアルの微生物汚染／コロニー形成は特に問題となる。バイオマテリアル（例えば、コラーゲンおよび他の生体高分子）は、人工関節の表面を覆うために用いることができる。また、ある種のインプラントは、本発明の殺菌剤を含むバイオマテリアルを実質的に含む。
【０１０１】
感染性病原体に対して効果的な障壁を造ることは、救急絆、創傷包帯およびばんそうこうを開発する際には、考慮することが重量である。したがって、そのような製品を本発明の組成物で処理すると、病原体への障壁を造りつつ、ガス交換ができる。同様に、ベッドリネンを抗菌性とするために本発明の組成物で処理することもできる。
【０１０２】
本発明の組成物は、医療環境のような無菌であることが要求される環境における表面に塗布するために用いることができる。該組成物は、病院の病室を清潔にするために用いることができ、病院の大部分に対して本発明の組成物を塗布することができる。組成物は、手術室の壁および床に加えて、手術室における医療器具（例えば、手術台）の表面の感染を予防するために用いることができ、これらを本発明の組成物で塗布することができる。本発明者らは、本明細書で記載されている組成物は、一般的に、滅菌および清潔さを向上させるために大変有用であると確信している。
【０１０３】
本発明の組成物は、微生物感染しやすい家庭用品の幅広い範囲を保護するために用いることもできる。組成物で製品を塗布することができ、製品は、種々の製品系、例えば、食品の調理表面、キッチンまな板またはカーペットなどの幅広い範囲でありうる。カーペットは通常、ウール、ナイロン、ポリエステルおよびポリプロピレン繊維から作られ、単に本発明の組成物を塗布することができる。しかしながら、潜在的な用途はずっと広いと考えられる。本発明の組成物が適用できる対象の上記リストおよび表面は、網羅されていない。したがって、該組成物は、微生物感染または汚染しやすい表面、例えばキッチンおよびバスルーム表面、ならびに便座またはトイレそのもののような製品に対して適用することができる。
【０１０４】
本発明者らは、床敷を製造するために用いることができる高分子、布地または織物から製造される靴用の中敷きのような抗菌性材料の製造において本発明の組成物を用いることができ、衣類およびファッション関係においても用いることができると予想している。
【０１０５】
したがって、第十一の態様において、第一または第四の態様による抗菌性組成物を含む高分子または布地が提供される。
【０１０６】
高分子の布地は、例えば、病院および手術室において用いられる、例えば、枕カバー、ベッドシーツ、および羽毛掛け布団カバーのような寝具類においての用途を有する。布地または高分子は、例えば、下着や履物の中敷きのような微生物感染しやすい衣類の製造において用いることができる。
【０１０７】
したがって、第十二の態様において、第十一の態様にしたがった布地または高分子を含む衣類が提供される。
【０１０８】
衣類としては、下着または靴の中敷きの品物でありうる。衣類は、履物であってよい。
【０１０９】
したがって、第十三の態様において、第十一の態様にしたがった布地または高分子を含む、履物またはそのための中敷きが提供される。
【０１１０】
本発明の抗菌性組成物は、また防御用途において用いることもできる。兵隊、特に戦闘中の兵隊は、頻繁には洗うことができず、したがって微生物感染しやすいので、衛生状態が懸念される。したがって、第十二の態様の衣料品は制服、好適には軍服でありうる。
【０１１１】
本発明の他の用途としては、食品包装が挙げられる。果物を収穫した後、真菌および細菌感染による作物の損失はありふれており、収穫後の損失は、収穫前の損失と少なくとも等しいと見積もられている。したがって、食品包装産業において用いることができる抗菌性材料に対して高い要求がある。
【０１１２】
好適には、包装材料は、生鮮品、すなわち、保存期間が限定されている、または微生物感染のリスクがある製品の包装用に用いられる。好適には、包装材料は、食品または食材の包装用に用いられる。包装材料は、真菌および細菌のような微生物腐敗による感染を受けやすい果物および野菜のような、傷みやすい、または生鮮食品に対する損失を抑制することができる。腐敗細菌によって引き起こされる損失を避けるために、包装材料は第一または第四の態様の組成物で塗布され、スプレーされ、または浸漬されうる。
【０１１３】
包装材で包装されうる食品は、果物（例えば、ネクタリン、桃、リンゴ、またはナシ）もしくは野菜、肉、パン、またはビスケットなどでありうる。果物は、収穫後に病気に非常にかかりやすい生産物の例として本明細書で用いられるが、ジャガイモ、ニンジン、レタスなどの他の農産物も、本発明の組成物によって保護される恩恵を得ることができる。
【０１１４】
第十五の態様において、食品の微生物感染を予防する、または抑制する方法における使用のための、第一または第四の態様の抗菌性組成物の使用が提供され、該方法は、第一または第四の態様の抗菌性組成物を食品の表面に接触させる、または組成物を表面に塗布することを含む。
【０１１５】
食品は、果物、野菜、肉、または乳製品でありうる。精油は揮発性により食品腐敗細菌を阻害する環境を作り出すので、果物の包装においてしばしば用いられる。食品が一旦解梱されると、精油は蒸発し、食品上になんら残らない。したがって、本発明者らは、果物のような食品を処理するために精油とともにテルペノイドを組み合わせる、第一または第四の態様の組成物の使用を予測する。精油のような細胞膜の完全性を妨げる抗菌剤とともにテルペノイドを用いると、抗菌効果をずっと高めることができる。果物が解梱されると、精油はなんら精油の残渣を残さずに蒸発し、残った分子自体は無害である。したがって、果物を食べるヒトに該処理は無害である。
【０１１６】
天然抗菌剤とともに、例えば、デヒドロアビエチン酸が塗布されるのは、果物片のような食品の表面上である。果物の表面だけが処理されるので、表面領域ユニットに対する濃度は高くとも、果物のサイズによって、重量または体積あたりの濃度は低くなるであろう。さらに、果物の摂取により、唾液および胃内の消化液と食物が混合される結果、さらに組成物が希釈されることとなるであろう。デヒドロアビエチン酸および他のテルペノイドはあまり水に溶解せず、したがって、細胞膜の完全性に影響を与える物質を適用するときでさえ、摂取した際の影響は少ないと考えられる。
【０１１７】
さらに、実施例５において、本発明者らは、加熱したマツの削りかす（ｈｅａｔｅｄ  ｐｉｎｅ  ｓｈａｖｉｎｇｓ）（デヒドロアビエチン酸およびバニリンを含む抗菌剤を広く含む）の水抽出物の抗菌特性を試験した。これらの各抽出物は、サルモネア菌に対してわずかな効果を示したが、木の削り自体は、抽出後に高い抗菌活性を維持したままであった。これは、デヒドロアビエチン酸の水溶性が低く、したがって、摂取した際に毒性を引き起こしにくいことを明白に示す。組成物をより安全にするために、ナイシンのような例えばタンパク性の化合物のような胃内で分解が早い抗菌剤とテルペノイドを併用することが好ましい。
【０１１８】
本発明者らは、容器またはコンテナーを処理する、またはこれらに塗布するための第一または第四の態様の組成物の使用も予想する。
【０１１９】
したがって、第十六の態様において、第一または第四の態様にしたがった抗菌性組成物を含む容器が提供される。
【０１２０】
容器は、食物を保存することができる、すなわち、食品容器でありうる。容器は、生鮮食品や製品のような、腐りやすく、消耗しやすく、または微生物感染しやすい、食品材料を保存することができる。例えば、食品としては果物または野菜が挙げられる。第一または第四の態様の組成物は、廃棄物用の容器に処置するために、または、廃棄物容器への添加剤として用いられうる。したがって、容器は廃棄物を含むことができる、すなわち廃棄物容器でありうる。容器は、食品廃棄物のような分解性の廃棄物を保存するために用いられうる。有機の台所ごみのような分解性廃棄物は、ハエをひきつけ、適切に処理しないと、悪臭を放つ。したがって、組成物で処理した廃棄物容器は、家庭内または商業的ごみ入れでありえ、ハエまたは臭いを低減することができる。
【０１２１】
要約すると、本発明の組成物は、微生物細胞膜の完全性またはＲＮＡ合成のようなタンパク質合成を阻害する抗菌剤と併用して、テルペノイドを含む。（フェノール類、アルコール類、塩素化化合物などのような）合成の抗菌剤の多くは、溶解性が高く、したがって、暴露されるヒト細胞に毒性であると認められる。精油はより疎水的であるが、抗菌性は穏やかである。しかしながら、実施例５で述べられているように、デヒドロアビエチン酸は水への溶解性が低く、処理される特定の表面のみにその効果が限定される。例えば、動物の床敷、病院および家庭内の表面および食材に対する適用が、上述した用途のどの場合においても、処理された対象に接触するヒトへ物質が移動しないであろうから、これは明らかに利点となる。さらに、デヒドロアビエチン酸のようなテルペノイドの精油のような穏やかな抗菌性天然物との併用により、通常は強い味と臭いとともに高価であるこれらの製品を、濃度を非常に減らして非常に効率よく用いることができる。
【０１２２】
さらなる態様において、テルペノイドまたはこの誘導体、および細胞膜完全性を阻害する抗菌剤を含む抗菌性組成物が提供される。
【０１２３】
さらなる態様において、細胞膜完全性を阻害する抗菌剤の抗菌活性を向上させるためのテルペノイドまたはこの誘導体の使用が提供される。
【０１２４】
（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）本明細書の述べられている全ての特徴、および／または開示されている方法またはプロセスの全ての段階は、かような特徴および／または段階の少なくともいくつかが相互に排除している組み合わせを除いて、いかなる組み合わせにおいても上記態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１２５】
理解をより深める目的で、またいかに同様の実施形態が効果を有するかを示すために、以下の図面および実施例が参照される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（グラム陽性）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む、本発明の組成物の一実施形態を用いた阻害実験を示す。
【図２】図２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（グラム陽性）に対する、スチルベンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す。
【図３】図３は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（グラム陰性）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す。
【図４】図４は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（グラム陰性）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌ（グラム陰性）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す。
【図６】図６は、ペニシリウム属菌（糸状菌）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す。
【図７】図７は、アスペルギルス属菌（糸状菌）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す、および
【図８】図８は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）に対する、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせを含む組成物を用いた阻害実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
［実施例］
本発明者らは、緩やかに加熱したマツの木の削り（ｈｅａｔｅｄ  ｐｉｎｅ  ｓｈａｖｉｎｇｓ）が抗菌性であるメカニズムを調べた。下記実施例で述べるように、本発明者らは、テルペノイドであるデヒドロアビエチン酸がバニリンおよび精油のような他の天然抗菌剤の抗菌活性を顕著に増強することができることを見出した。
【０１２８】
実施例１−バニリンの抗菌活性におけるデヒドロアビエチン酸の相乗効果
本実施例の目的は、デヒドロアビエチン酸がバニリンの抗菌活性をどの程度向上させるかを決定することである。
【０１２９】
方法
バニリンの２０ｍｍｏｌの２倍希釈物のエタノールおよび水溶液（８０／２０ｖ／ｖ）を用意し、２０ｍｍｏｌ−０．００９７５ｍｍｏｌの濃度を準備した。２０ｍｍｏｌのデヒドロアビエチン酸のアルコールおよび水溶液も準備した。
【０１３０】
バニリンの抗菌性効果におけるデヒドロアビエチン酸の効果を比較するために、各バニリン希釈物１０μｌを３つの１０ｍｇパーライト片上にピペットで載せ、２０ｍｍｏｌデヒドロアビエチン酸の１０μｌと一緒の溶液中と、ｇパーライトあたりの濃度を同じとした。コントロール処理の一連は、デヒドロアビエチン酸を入れず、他の一連は２０ｍｍｏｌデヒドロアビエチン酸のみを入れ、第三のコントロール処理はバニリンもデヒドロアビエチン酸も入れず、８０／２０の比率のアルコールおよび水１０μｌのみ入れた。一旦アルコールを蒸発させ、パーライト粒子あたり約５×１０４の細菌負荷を与える、ｍｌあたり約５×１０６のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を含むｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａの１０μｌの懸濁を全ての複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）に入れた。各粒子を０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液１ｍｌ中で分散させる前に、各パーライト粒子をエッペンドルフチューブ中で２５℃２４時間インキュベートした。各懸濁から、約１０００バクテリア細胞を各々含む６つの２０μｌ液滴をＸＬＤ寒天上に静置した。
【０１３１】
結果
結果を表２に示す。
【０１３２】
【表３】
0005890778.tif 000018
【０１３３】
結論
表２に示された結果は以下を示す：
（ｉ）２０ｍｍｏｌ以下ではバニリン自体はサルモネア菌に対して阻害効果がなかった；
（ｉｉ）デヒドロアビエチン酸と組み合わせると、バニリンの阻害効果は、０．０１９ｍｍｏｌの濃度で依然として顕著であった。これは、デヒドロアビエチン酸が少なくとも１０００−２０００倍バニリンの抗菌性効果を増加させることを示す；そして
（ｉｉｉ）２０ｍｍｏｌでデヒドロアビエチン酸は顕著な抗菌活性は持たなかった。
【０１３４】
実施例２−バニリンの抗菌活性に対する有機酸の効果
本実施例の目的は、バニリンに対するデヒドロアビエチン酸の相乗効果が特にデヒドロアビエチン酸に関連するかどうか、または、酸のｐＨ効果によって説明できるかどうかを確かめることである。
【０１３５】
方法
バニリンの２０ｍｍｏｌの２倍希釈物のエタノールおよび水溶液（８０／２０ｖ／ｖ）を用意し、２０ｍｍｏｌ−０．０７８ｍｍｏｌの濃度を準備した。２０ｍｍｏｌのクエン酸水溶液も準備した。
【０１３６】
クエン酸が（実施例１で述べた）デヒドロアビエチン酸と同様の効果を有するかどうかを確かめるために、各バニリン希釈物１０μｌを３つの１０ｍｇパーライト片上にピペットで載せ、溶液中でｇパーライトあたりの濃度を同じとした。次いで、２０ｍｍｏｌクエン酸１０μｌを各パーライト粒子上にピペットで載せた。コントロール処理の一連は、クエン酸を入れず、他のコントロールはバニリンもクエン酸も入れず、アルコールおよび水を８０／２０の割合で１０μｌのみ入れた。一旦アルコールを蒸発させ、パーライト粒子あたり約５×１０４の細菌負荷を与える、ｍｌあたり約５×１０６のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を含むサルモネラ菌の懸濁１０μｌを全ての複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）に入れた。
【０１３７】
各粒子を０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液１ｍｌ中で分散させる前に、各パーライト粒子をエッペンドルフチューブ中で２５℃２４時間インキュベートした。各懸濁から、約１０００バクテリア細胞を各々含む６つの２０μｌ液滴をＸＬＤ寒天上に静置した。
【０１３８】
結果
結果を表３に示す。
【０１３９】
【表４】
0005890778.tif 000019
【０１４０】
結論
表３に示された結果は以下を示す：
（ｉ）クエン酸はバニリンの効果をほんのわずかに向上させた（最大で２倍）；そして
（ｉｉ）デヒドロアビエチン酸のバニリン活性に対する効果は、ｐＨ効果に起因し得ない。
【０１４１】
実施例３
さまざまなトリテルペノイドと組み合わせたバニリンの抗菌活性
実施例３の目的は、親水性部分および疎水性部分も有するトリテルペノイドがバニリンと組み合わせた場合に、ジテルペノイドであるデヒドロアビエチン酸と同様の活性を有するかどうかを決定することである。
【０１４２】
方法
バニリンの２０ｍｍｏｌの１０倍希釈物のエタノールおよび水溶液（８０／２０ｖ／ｖ）を用意し、２０ｍｍｏｌ−０．０２ｍｍｏｌの濃度を準備した。２０ｍｍｏｌのウルソール酸、オレアノール酸およびベツリンのアルコール溶液も準備した。
【０１４３】
バニリンの抗菌効果に対するウルソール酸、オレアノール酸およびベツリンデヒドロアビエチン酸の効果を確かめるために、各バニリン希釈物１０μｌを３つの１０ｍｇパーライト片上にピペットで載せ、２０ｍｍｏｌの各トリテルペノイド１０μｌを含む溶液中とｇパーライトあたりの濃度を同じとした。コントロール処理の一連は、トリテルペノイドを入れず、他のコントロールには２０ｍｍｏｌのデヒドロアビエチン酸のみ入れた。一旦アルコールを蒸発させ、パーライト粒子あたり約５×１０４の細菌負荷を与える、ｍｌあたり約５×１０６のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を含むｓａｌｍｏｎｅｌｌａの懸濁１０μｌを全ての複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）に入れた。各粒子を０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液１ｍｌ中で分散させる前に、各パーライト粒子をエッペンドルフチューブ中で２５℃２４時間インキュベートした。各懸濁から、約１０００バクテリア細胞を各々含む６つの２０μｌ液滴をＸＬＤ寒天上に静置した。
【０１４４】
結果
結果を表４に示す。
【０１４５】
【表５】
0005890778.tif 000020
【０１４６】
結果
表４に示された結果は以下を示す：
（ｉ）試験した全てのトリテルペノイドはバニリンの活性を向上させた、
（ｉｉ）３つのトリテルペノイド間で抗菌効果の向上における顕著な差はなかった、そして
（ｉｉｉ）バニリンとの組み合わせのトリテルペノイドの相乗効果は、デヒドロアビエチン酸およびバニリンを組み合わせて用いた時に観察されたものよりも少なかった。この最も可能性のある理由は、トリテルペノイドは非常に不溶性であり、近接させた場合でも、十分な効果を与えるほどに微生物細胞に十分な量で占めることができないことである。
【０１４７】
実施例４−異なる木種由来の加熱および非加熱木削りの抗菌効果
実施例４の目的は、種々の代表的な針葉樹および広葉樹由来の加熱および非加熱の木削りの抗菌効果を確かめることである。
【０１４８】
方法
本実験において、異なる針葉樹（マツ、トウヒ、ヒマラヤスギ）および異なる広葉樹（ブナノキ、カバノキ、セイヨウトリネコ、クリ、アカガシワ）由来の木の幹からの削りかすを採取し、各削りかすを６つのバッチ中で静置した。これらのバッチのうち３つは、７２時間１４０℃で加熱し、他の３つは２０℃で乾燥させ、各処理において３つの複製を準備した。続いて、各セットの削りかす１ｇをユニバーサルボトル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｏｔｔｌｅ）中で静置し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａの乳白色懸濁（ｍｌあたり約１０８ｃｆｕ）１ｍｌを接種した。接種された削りかすを２５℃で２０時間インキュベートした。続いて、削りかすから１０倍希釈物（きっちり１０−８）を準備し、各希釈物の０．１ｍｌをＸＬＤ寒天上に載せた。２５℃で３６時間インキュベーション後にＳａｌｍｏｎｅｌｌａのコロニー数を数えた。
【０１４９】
結果
結果を表５に示す。
【０１５０】
【表６】
0005890778.tif 000021
【０１５１】
結論
表５に示されたデータから、以下のことが結論付けられる：
（ｉ）非加熱の木の削りかすの抗菌特性において、小さいが有意な差が存在した。バクテリアコロニー数が数多く回復しているので、トウヒ、カバノキ、オークは抗菌性が最も少ないように見える。糸杉およびユーカリは、成長したコロニー数が最も少ないので、加熱処理前で最も抗菌性が高いように見える；
（ｉｉ）試験した木種の全ての抗菌活性において加熱により顕著な増加となった；
（ｉｉｉ）加熱により、ユーカリにおいて３倍、トウヒにおいて１０００倍抗菌活性が上昇し、マツ、糸杉、セイヨウトリネコ、ブナノキ、オークおよびカバノキにおいては完全な阻害となった；そして、
（ｉＶ）マツおよびヒマラヤスギには、バニリンの他、他の抗菌性物質が存在するに違いない。
【０１５２】
実施例５−毒性試験
本実施例の目的は、バニリン（または木由来の他の抗菌性物質）とデヒドロアビエチン酸との組み合わせがヒト消費において安全であることを示すことである。
【０１５３】
物質によって引き起こされる潜在的な害は、潜在的な毒性およびその標的細胞に対する暴露によって決定される。したがってヒト細胞に対する潜在的な毒性物質が自体で存在することができる潜在的な経路を理解することは、潜在的な害（リスク）を決定するのに重要である。物質（または物質の有毒な組み合わせ）が、ヒト標的細胞へ接触状態になりにくいことが示されれば、物質は安全であるとみなされる。デヒドロアビエチン酸およびバニリン（または他の天然抗菌剤）の場合、製品でコートした食品を接種した際、ヒト細胞の暴露を避けることができる少なくとも４つのメカニズムが存在する、すなわち；
１）組成物の摂取により、これらを無効にさせるほど十分に化合物は希釈される；
２）細胞の消化系は、組成物との接触に対して消化系の細胞を保護する粘液層によって保護される；
３）一つの（または双方の）化合物は消化系によって不活性化される。これは、酵素活性の結果としてでありうる；そして
４）化合物は、消化系の細胞に衝撃を与えるほどには胃液中で十分には溶解されない。
【０１５４】
可能性４だけが、摂取試験をすることなく、試験されうる。
【０１５５】
方法
本実験では、加熱および非加熱のマツ削りかすを試験材料として用いた。前の研究では、加熱したマツ削りかすが抗菌性が高くなることを示してきた。この効果は、少なくとも部分的には、緩やかで長期の加熱（実施例１および３参照）の間に形成される多数の穏やかな抗菌性物質に対してデヒドロアビエチン酸が有する相乗的効果によるものであると考えられている。これらの物質がマツの削りかすに付随して留まって、水で抽出できない場合、消化系においてこれらは溶けず、露出しないと考えられる。サルモネア菌細胞はアビエチン酸およびバニリンの組み合わせに感受性であることがすでに示されているので（実施例１参照）、サルモネア菌を試験微生物として用いた。
【０１５６】
水抽出物
下記浸漬条件を用いて５ｍｌの滅菌水を２ｇの削りかす（３つずつ）に添加することによって、水中に加熱および非加熱のマツ削りかすの各セットから６ｇの材料を浸漬させた：
・２４時間室温で浸漬
・２４時間９０℃のウォーターバス中で浸漬
抽出物が抗菌性であるかどうかを確かめるために、下記手順を続けた：
１．断片（オートクレーブした）ろ紙１ｇに抽出物１ｍｌを入れる（１２サンプル）；
２．コントロールとして、０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液を用いる（３サンプル）；
３．５０℃でオーバーナイト（または乾燥するまで）サンプルを乾燥する；
４．サルモネア菌の乳白色懸濁を０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液中に準備し、この１ｍｌを各サンプルに対して添加する；
５．３０℃でオーバーナイトインキュベートする；
６．各希釈群（１０−１〜１０−６）を塗布する（１５×６＝９０プレート）；
７．インキュベートし、数えられるプレートを数える；そして
８．コントロール処理および非加熱削りかすからの抽出物に対する阻害を比較する。
【０１５７】
抽出した削りかすの抗菌活性を確かめるために、下記手順を続けた：
１．５０℃でオーバーナイト（または乾燥するまで）削りかすを乾燥する；
２．コントロールとして、ろ紙断片２ｇを用いる（３サンプル）；
３．削りかす各２ｇおよびサルモネラ菌懸濁のろ紙２ｍｌを添加する；
４．３０℃で２４時間インキュベートする；
５．希釈群（１０−１〜１０−６）を塗布する；
６．インキュベートし、数えられるプレートを数える；そして
７．コントロール（ろ紙）および非加熱削りかすに対する阻害を比較する。
【０１５８】
アルコール抽出物
各加熱および非加熱群から材料を６ｇ採り、５ｍｌのメタノールを２ｇの削りかす（３つずつ）に添加することによって浸漬し、２４時間浸漬する：
抽出物が抗菌性であるかどうかを確かめるために、下記手順を続けた：
１．断片（オートクレーブした）ろ紙１ｇに抽出物１ｍｌを入れる（６サンプル）；
２．コントロールとして、０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液を用いる（３サンプル）；
３．（アルコール残渣が微生物残渣を阻害しないことを確かめるために）メタノールで３つの１ｇサンプルを浸漬する
４．５０℃でオーバーナイト（または乾燥するまで）各サンプルを乾燥する；
５．サルモネア菌の乳白色懸濁を０．２５強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）リンガー溶液中に準備し、この１ｍｌを各サンプルに対して添加する；
６．３０℃でオーバーナイトインキュベートする；
７．各々（１２×６＝７２プレート）に対する希釈群（１０−１〜１０−６）を塗布する；
８．インキュベートし、数えられるプレートを数える；そして
９．コントロールおよび非加熱削りかすに対する阻害を比較する。
【０１５９】
抽出した削りかすの抗菌活性を確かめるために、下記手順を続けた：
１．５０℃でオーバーナイト（または乾燥するまで）抽出したサンプルを乾燥する；
２．コントロールとして、ろ紙断片２ｇを用いる（３サンプル）；
３．削りかす各２ｇおよびサルモネラ菌懸濁のろ紙２ｍｌを添加する；
４．３０℃で２４時間インキュベートする；
５．各々（９×６＝５４プレート）に対する希釈群（１０−１〜１０−６）を塗布する；
６．インキュベートし、数えられるプレートを数える；そして
７．コントロール（ろ紙）および非加熱削りかすに対する阻害を比較する。
【０１６０】
結果
表６および７に結果を示す。
【０１６１】
【表７】
0005890778.tif 000022
【０１６２】
【表８】
0005890778.tif 000023
【０１６３】
結論
表６および７から以下のことが結論付けられる：
（ｉ）加熱したマツ削りかすからの冷水および温水双方の抽出物はサルモネラ菌に対して非毒性である；
（ｉｉ）微生物毒性は、冷水または温水で抽出した後のマツ削りかすに付随したままである；
（ｉｉｉ）加熱マツ削りかすのアルコール抽出物はサルモネラ菌に毒性である；
（ｉＶ）アルコール抽出物は加熱マツ削りかすに付随した毒性のある程度を除去した；
（Ｖ）加熱マツ削りかす中の他の抗菌物質と組み合わせたデヒドロアビエチン酸は、バクテリア細胞に顕著な毒性を引き起こすほど水中で十分には溶解しない；
（ｖｉ）バニリンのような天然の抗菌剤と一緒にデヒドロアビエチン酸を処理した食品の摂取は、ヒト細胞へ顕著に露出することはないと予想される。
【０１６４】
実施例６−本発明の組成物の用途
テルペノイドとの併用によりバニリンのような公知の抗菌剤の抗菌活性を劇的に向上させうるという驚くべき知見を本発明者らは、幅広い用途へと適用している。
【０１６５】
（ｉ）動物用床敷
デヒドロアビエチン酸およびバニリンの双方を含む組成物の液体製剤を準備し、次いで、家禽小屋において用いられている型の存在する動物用床敷上に該製剤をスプレーした。本発明者らは、かような床敷はカンピロバクターおよびサルモネア菌への感染のレベルを減少させ、床敷にいるニワトリがバクテリア感染の兆候を何ら示さないことを見出した。
【０１６６】
（ｉｉ）根覆い
本発明者らは、デヒドロアビエチン酸およびバニリンを含む液体製剤中に浸漬させた根覆いも製造し、製剤の十分な量が吸収されるようにオーバーナイト放置した。次いで、根覆いを土壌の１区画に置き、土壌病原体の植物、果物または野菜への感染を根覆いが防止できることを確認するため試験を行った。喜ばしいことに、通常の根覆いを用いたときのコントロールと比較して、処理した根覆いが根覆い中で成長したイチゴへの微生物感染を抑制したことを確認した。
【０１６７】
（ｉｉｉ）医療器具
本発明者らは、医療器具表面に対して抗菌活性を付与できるかどうか次いで試験し、モデルとして創傷包帯（すなわち救急絆）を用いた。製剤中に救急絆を浸漬させ、活性量吸収させるためにそれをオーバーナイト放置した。驚くべきことに、救急絆下の傷から広がる微生物感染の広がりを救急絆は阻害したことを見出した。
【０１６８】
（ｉｖ）織物または高分子
該製剤は、衣料品の製造に用いられる綿およびウール断片に適用される。また、靴が製造され、本発明者らは、全ての場合において、微生物感染が抑制されることを見出した。履物の場合、悪臭の発生も最小限化された。
【０１６９】
（ｖ）食品包装材料
本発明者らは、段ボール型のような食品包装材料を液体製剤でスプレーした。果物や野菜のような生鮮材料は包装材中で保存され、本発明者らは、食材が、従来の包装材料中で保存されたコントロール食材と同程度に早く腐ることはないことを見出した。
【０１７０】
要約
本発明者らは、極性の、熱分解性（ｐｒｏｌｙｔｉｃ）の置換基および強固な疎水性部分を有する分子が、微生物細胞膜の完全性を妨げる穏やかな抗菌性物質の抗菌活性を増加させることができることを示した。デヒドロアビエチン酸のようなテルペノイドが抗菌剤であるバニリンの抗菌活性を１０００〜２０００倍増加させることができる。また、デヒドロアビエチン酸が水へあまり溶解せず、故に、デヒドロアビエチン酸およびバニリンの双方を含む材料由来の水抽出物が微生物細胞に非毒性であることも示した。代わりに、抗菌活性は処理した材料内に残っている。したがって、バニリンのような天然の抗菌剤とともにデヒドロアビエチン酸のようなテルペノイドで処理した食品を摂取してもヒト細胞への顕著な露出へとはつながらないであろう。
【０１７１】
実施例７−パーライトバイオアッセイ（ｐｅｒｌｉｔｅ  ｂｉｏ−ａｓｓａｙ）を用いたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対する市販のバニリンの抗菌活性における精製したデヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）の相乗効果
前の実施例で記載したように、加熱した木削りかすから分離したデヒドロアビエチン酸および／またはバニリンのいずれかを用いると顕著な結果が得られた。培養液中での従来の希釈アッセイの代わりに、「パーライトバイオアッセイ」を用いて、（加熱した木から単離した）バニリンの抗菌効果を２０００倍にまで増強させる実験を行った。パーライト上で組み合わせを乾燥させること、およびパーライト重量に基づいて濃度を計算することが、結果を偏在化させうることが議論されうる。
【０１７２】
したがって、この実験は、パーライトバイオアッセイが不均化（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｄ）ロジンから単離された純ＤＨＡＡ、およびシグマ−アルドリッチ社から購入した純バニリンを用いた結果を偏在化させるかどうかを確認する。
【０１７３】
ストック溶液の準備：２０ｍＭのバニリンのストック溶液をアセトン中で作製し、２０〜０．０７８ｍＭの範囲の濃度を作製するために、２倍希釈によってさらに希釈した。また、一つのＤＨＡＡ２０ｍＭストックアセトン溶液を作製した。
【０１７４】
バイオアッセイ試験：微パーライトの１０ｍｇを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブを用いて試験を行った。バニリンの各濃度の１０μｌを各濃度４つの複製を得るために４つのエッペンドルフチューブ中に分配した。このうち２つには、ＤＨＡＡを１０μｌ入れた。アセトンを蒸発させるためにチューブを積層フローチャンバー中に３時間静置した。続いて、各チューブにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓのオーバーナイト培養物１μｌを入れた。インキュベーションの間、パーライトの湿潤状態を保つために、滅菌Ｒ．Ｏ水１０μｌを各チューブ中に分配した。コントロールとして、２つのチューブにはＤＨＡＡのみを、２つのチューブにはＲ．Ｏ水のみを入れた。
【０１７５】
チューブをオーバーナイトでインキュベートし、バクテリア計算用の栄養寒天上に各チューブの内容物を塗布することによって、バクテリア生存を定量化した。
【０１７６】
結果
【０１７７】
【表９】
0005890778.tif 000024
【０１７８】
結論
本実験においてＤＨＡＡはバニリンを約８倍効果的にさせた。したがって、パーライトバイオアッセイは、明らかに抗菌剤の活性に対して確かな結果を提供し、試験した２つの純化合物間の相乗効果を示す。また、本発明者らは、これらの化合物を加熱した木削りかすから単離した際、ＤＨＡＡおよびバニリンの相乗活性にさらに寄与することができるある未知の因子が存在すると確信している。
【０１７９】
実施例８−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対するバニリンおよびＤＨＡＡ混合物の組み合わせでのデヒドロジンゲロンおよびコニフェルアルデヒドの最小限の阻害濃度（ＭＩＣｓ）の決定
加熱したマツの木から単離されたバニリンおよびＤＨＡＡを組み合わせたときに見られた（すなわち×２００）ほどではなかったが、純デヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）および純バニリンの組み合わせが２つの化合物間に抗微生物相乗効果（すなわち×８）をもたらすことがわかった。化合物のただ一つが加熱したマツの木由来で、他が精製形態での市販品から得られた場合、同様の強い抗菌効果が得られた。興味深いことに、かように得られた抗菌効果は混合物のオレンジ色をもたらし、橙黄色を呈している未知の混入物質が、バニリンおよびＤＨＡＡ間の相乗効果を増加させることに関与している可能性があることを示す。可能性のある候補分子は、加熱したマツ削りかすから以前に分離されたコニフェルアルデヒドであると考えられた。
【０１８０】
同様に、もしバニリンをすぐに使用せず、アセトン中で保存した場合、バニリンとＤＨＡＡとを組み合わせた抗菌効果は大きく回復した。バニリンはアセトンと反応し、ケトン、すなわちデヒドロジンゲロンを形成することが知られている。したがって、デヒドロジンゲロンがＤＨＡＡおよびバニリン間で得られる抗菌効果において役割を果たすことが仮定された。
【０１８１】
材料＆方法
純バニリンはシグマ−アルドリッチ社から購入した。デヒドロジンゲロンはアセトンでバニリンを濃縮することによって得られた。純デヒドロアビエチン酸は不均化ロジンから単離した。
【０１８２】
２０ｍＭのバニリンのストック溶液を最終的な濃度にするために作製した。また、デヒドロジンゲロンの０．１、１、５および１０ｍＭストック溶液およびＤＨＡＡの２０ｍＭストック溶液をアセトンに化合物を溶解させることによって作製した。ストック溶液は冷蔵庫内５℃で保存した。
【０１８３】
インビトロアッセイ：可能性のある相乗的分子と組み合わせたバニリンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を微量培養液希釈法（ｍｉｃｒｏ−ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて決定した。２０ｍＭから０．０７８ｍＭバニリンまでの２倍希釈物を得るために、９６穴マイクロタイタープレートを用いて、滅菌栄養培養液で希釈することによって、６つのバニリンの２倍希釈物を準備した。デヒドロジンゲロン（ＤＨＺ）の４つの異なる濃度（１０ｍＭ、５ｍＭ、ｌｍＭおよび０．１ｍＭ）を作製し、各ウェルに対して各ストック溶液１００μｌを添加することによってバニリンの異なる濃度を結合させた。別の実験において、ＤＨＺをコニフェルアルデヒドで置換した。１００μｌアセトンを添加することによってコントロールウェルを準備した。プレートを積層フローチャンバー中でアセトンが蒸発するように８時間静置した。各ウェルの抗菌活性を決定するために、２５℃オーバーナイトで成長させた１０８ｃｆｕ／ｍｌのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含むバクテリア細胞培養液の５μｌをプレートに接種した。接種後、プレートを２５℃で２４時間インキュベートした。処理が殺菌性であるか否かを確かめるために、各ウェルから０．０１ｍｌをニュートリエント寒天培地上にスポットした。次いで、接種されたニュートリエント寒天培地を２４〜４８時間インキュベートし、何らバクテリア成長がない、またはほんのわずかコロニーが見られるスポットを殺菌性であるとした。静菌効果を決定するために、代謝活性を測定する目的でテトラゾリウム塩溶液を各ウェルに添加した。２５℃でオーバーナイトインキュベーションした後、何ら色の変化がないものを静菌効果として決定し、代謝（効果なし）は赤から紫いろとして示した。
【０１８４】
結果
【０１８５】
【表１０】
0005890778.tif 000025
【０１８６】
【表１１】
0005890778.tif 000026
【０１８７】
結論
コニフェルアルデヒドは、バニリンおよびＤＨＡＡと組み合わせるとＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対して強い抗菌効果を与える効果的な抗菌剤である。デヒドロジンゲロンは、バニリンおよびＤＨＡＡと組み合わせるとＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対して強い抗菌効果を与える温和な抗菌剤である。この結果は、静菌性であるためには（ＤＨＡＡと組み合わせて）バニリンおよびデヒドロジンゲロンの５ｍＭを超える合計濃度が必要であることを示す。
【０１８８】
実施例９−コニフェルアルデヒドおよびバニリン間の抗菌活性におけるデヒドロアビエチン酸の役割
前の実験において、ＤＨＡＡはバニリンおよびコニフェルアルデヒドの組み合わせに添加された。ＤＨＡＡが必須であるか否かを確かめるため、３つの物質の抗菌効果の役割を定量化するために別の実験を行った。
【０１８９】
材料＆方法
バニリンおよびコニフェルアルデヒドは、シグマ−アルドリッチ社から購入した。デヒドロアビエチン酸はカラムクロマトグラフを用いて不均化ロジンから単離した。
【０１９０】
２０ｍＭのバニリンのストック脱イオン化溶液を準備した。５および１０ｍＭコニフェルアルデヒドおよび２０ｍＭデヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）のアセトンストック溶液を準備した。全てのストック溶液は５℃で保存した。
【０１９１】
インビトロアッセイ：異なる処理のＭＩＣを微量培養液希釈法（ｍｉｃｒｏ−ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて決定した。２０ｍＭから０．０００２ｍＭまでの濃度のバニリンを得るために、９６穴マイクロタイタープレートを用いて、滅菌水で２０ｍＭストック溶液を希釈することによって、バニリンの４倍希釈物を準備した。コニフェルアルデヒドの５および１０ｍＭの２つの濃度を準備し、各ウェルに対して各ストック溶液１００μｌを添加することによってバニリンの異なる濃度を結合させた。１００μｌアセトンを添加することによってコントロールウェルを準備した。半分のウェルに最終濃度が２０ｍＭとなるようにＤＨＡＡを添加し、他の半分には添加しなかった。各処理は４回繰り返した。プレートを積層フローチャンバー中で溶媒が蒸発するように８時間静置した。続いて、２５℃オーバーナイトで成長させた１０８ｃｆｕ／ｍｌを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ懸濁の５μｌを各ウェルに接種した。接種の後、プレートを２５℃で２４時間インキュベートした。処理が殺菌性であるか否かを確かめるために、各ウェルから０．０１ｍｌをニュートリエント寒天培地上にスポットした。プレートを２４〜４８時間インキュベートし、何らバクテリア成長がない、またはほんのわずかコロニーが見られるスポットを殺菌性であるとした。可能な場所では、より正確な定量データを得るために、コロニー数を計測した。静菌効果を決定するために、代謝活性を測定する目的でテトラゾリウム塩溶液５０μｌを各ウェルに添加した。２５℃でオーバーナイトインキュベーションした後、何ら色の変化がないものを静菌効果として決定し、代謝（効果なし）は赤から紫色として示した。
【０１９２】
結果
【０１９３】
【表１２】
0005890778.tif 000027
【０１９４】
【表１３】
0005890778.tif 000028
【０１９５】
結論
デヒドロアビエチン酸は、コニフェルアルデヒドおよびバニリンの併用の効果に対して相乗効果を与える。（ＤＨＡＡが２０ｍＭ存在する場合に）５ｍＭのコニフェルアルデヒドを殺菌性にするためには低濃度のバニリン（少なくとも０．０００３ｍＭ）の存在が必要とされる。
【０１９６】
実施例１０−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対するバニリンおよびデヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）の混合物に対するデヒドロジンゲロンの効果
以前、（バニリンから形成された）デヒドロジンゲロンが、加熱された木削りかすの抗菌活性を説明する寄与因子である可能性があることが示された。バニリンおよびデヒドロジンゲロンの双方がデヒドロアビエチン酸と組み合わせて用いられている実験において、２つの分子の抗菌活性が相加的であることを示した。ここでは、本発明者らは、２つの比率に依存して相乗効果があるか否かを調べた。
【０１９７】
材料＆方法
バニリンは、シグマ−アルドリッチ社から購入した。デヒドロジンゲロンを次のようにしてアセトンでバニリンを濃縮することによって製造した：０．５ｇのバニリンを２ｍｌのアセトンに添加し、ねじ口バイアル中でバニリンを溶解させるために振とうさせた。バニリンを溶解させた後、１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ溶液１ｍｌを添加した。次いで、混合物を室温で２４時間保存した。続いて、３Ｍ  ＨＣＬ溶液１０ｍｌを添加し、混合物をデヒドロジンゲロンの黄色結晶が形成するように激しく振とうした。次いでブフナー漏斗を用いて得られたデヒドロジンゲロンの懸濁物をろ過することによって精製されたデヒドロジンゲロンを分離し、次いで、水で結晶を洗った。材料の大気乾燥の後、単離したデヒドロジンゲロンの構造をＮＭＲを用いて確認した。
【０１９８】
バニリン−デヒドロジンゲロン溶液の準備
バニリンおよびデヒドロジンゲロンを含む溶液を１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、０：１００の比率（ｗ／ｗ）で５ｍｌアセトン中で調製した。デヒドロジンゲロンおよびバニリンの希釈していない合計濃度は１０ｍＭであった。抗菌試験の前に、各比率に対して３０．４ｍｇを添加することによって各処理に対して２０ｍＭデヒドロアビエチン酸を添加した。コントロール処理は、ＤＨＡＡのみ、および溶媒のみから構成される。ストック溶液を冷蔵庫中５℃で４８時間貯蔵した。
【０１９９】
アッセイ方法
バニリンおよびデヒドロジンゲロン溶液の組み合わせの阻害活性を微量培養液希釈法（ｍｉｃｒｏ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ  ｍｅｔｈｏｄ）によって測定した。９６穴プレートを９．６ｍｌの栄養培養液で満たした。サンプルのＭＩＣ（最小阻害濃度）を決定するために、サンプルの希釈物を培養液で作製した（０、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８）。希釈物を作製した後、プレートを積層フローキャビネット中で溶媒が蒸発するように５時間静置した。
【０２００】
続いて、２５℃オーバーナイトで成長させた１０８ｃｆｕ／ｍｌを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ懸濁の５μｌを各ウェルに接種した。接種の後、プレートを２５℃で２４時間インキュベートした。処理が殺菌性であるか否かを確かめるために、各ウェルから０．０１ｍｌをニュートリエント寒天培地上にスポットした。プレートを２４〜４８時間インキュベートし、何らバクテリア成長がない、またはほんのわずかコロニーが見られるスポットを殺菌性であるとした。可能な場所では、より正確な定量データを得るために、コロニー数を計測した。静菌効果を決定するために、代謝活性を測定する目的でテトラゾリウム塩溶液５０μｌを各ウェルに添加した。２５℃でオーバーナイトインキュベーションした後、何ら色の変化がないものを静菌効果として決定し、代謝（効果なし）は赤から紫色として示した。
【０２０１】
【表１４】
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【０２０２】
結論
デヒドロジンゲロンおよびバニリンを組み合わせた効果は、相加的ではなかったが、２つの分子間の比率に依存していた。最もよい結果は、どちらかの分子の１：３の比率で用いられている場合に得られた。自身ではデヒドロジンゲロンおよびバニリンは同じような抗菌活性を有していたが、１／３の比率で組み合わせた場合に、単独で、または５０：５０の比率で用いた場合よりも４〜８倍と驚くべき結果となった。
【０２０３】
実施例１１−デヒドロアビエチン酸の溶解性に対するｐＨの影響およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対するバニリンおよびデヒドロアビエチン酸の組み合わせの抗菌活性におけるストック溶液の保存状態の影響
デヒドロアビエチン酸およびバニリンを高いｐＨ（＞９）で組み合わせると、組み合わせの効果がより少なくなった。これはアルカリ条件下でデヒドロアビエチン酸の溶解性が低くなった（その結果、デヒドロアビエチン酸が溶液から析出した）ためであると仮定された。これまで記載した多くの実験がｐＨ７で行ってよい活性を与えたが、加熱した木削りかすから直接得られた抽出物ほど良好ではなかった。加熱した削りかすはｐＨが約４であった。しかしながら、そのような低いｐＨは、通常より好ましいのは中性であるバクテリアの成長に影響を与えうる。ＤＨＡＡが溶解していることを確かめる一方で、ｐＨの影響を試験するために、化合物の溶解方法を２つ用いた。一つ目では、化合物をｐＨ４のリン酸緩衝液に溶解し、他の処理では、ＤＭＳＯをｐＨ７で用いた。
【０２０４】
次の処理を試験した：
・実験の開始４８時間前に作製したバニリンストック溶液：溶液を冷蔵庫内５℃で保存した；
・実験の開始４８時間前に作製したデヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）ストック溶液；溶液を冷蔵庫内５℃で保存した；
・実験の開始４８時間前に作製したバニリン／ＤＨＡＡ混合ストック溶液；溶液を冷蔵庫内５℃で保存した；
・実験の開始４８時間前に作製し、室温（２０℃）保存したバニリンストック溶液；
・実験の開始４８時間前に作製し、室温（２０℃）保存したＤＨＡＡストック溶液；
・実験の開始４８時間前に作製し、室温（２０℃）保存したバニリン／ＤＨＡＡ混合ストック溶液。
【０２０５】
材料＆方法
バニリンはシグマ−アルドリッチ社から購入し、ＤＨＡＡは不均化ロジンから単離した。
【０２０６】
ｐＨ４で培養液に基づいたバッファー中のストック溶液：バニリンの２０ｍＭストック溶液の２バッチおよびバニリン／ＤＨＡＡ（１０ｍＭ／２０ｍＭ）の２バッチのアセトン溶液を作製した。各バッチの１を冷蔵庫内で保存し、他を室温で保存した。
【０２０７】
ｐＨ７で培養液に基づいたバッファー中で試験するストック溶液：バニリンの２０ｍＭストック溶液の２バッチおよびバニリン／ＤＨＡＡ（１０ｍＭ／２０ｍＭ）の２バッチのＤＭＳＯ溶液を作製した。各バッチの１を冷蔵庫内で保存し、他を室温で保存した。
【０２０８】
バイオアッセイ試験：微量培養液希釈法を用いて試験を行った。１０ｍＭ〜０．６２５ｍＭの範囲の濃度を作製するために、バニリンおよびバニリン／ＤＨＡＡストック溶液を２倍希釈でさらに希釈した。各濃度１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル中の栄養培養液１００μｌに添加した。各濃度に対して３つの複製を作製した。プレートは溶媒を蒸発させるために積層チャンバー中で静置した。
【０２０９】
続いて、各ウェルに２５℃でオーバーナイト成長させた１０８ｃｆｕ／ｍｌ含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ懸濁の５μｌを接種した。接種の後、プレートを２５℃で２４時間インキュベートした。処理が殺菌性であるかどうかを確かめるために、各ウェルから０．０１ｍｌをニュートリエント寒天培地上にスポットした。プレートを２４〜４８時間インキュベートし、バクテリア成長がない、またはほんのわずかコロニーが見られるスポットを殺菌性であるとした。可能な場所では、より正確な定量データを得るために、コロニー数を計測した。静菌効果を決定するために、代謝活性を測定する目的でテトラゾリウム塩溶液５０μｌを各ウェルに添加した。２５℃でオーバーナイトインキュベーションした後、何ら色の変化がないものを静菌効果として決定し、代謝（効果なし）は赤から紫色として示した。
【０２１０】
【表１５】
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【０２１１】
結論
デヒドロアビエチン酸は、ｐＨ４およびｐＨ７の双方でバニリンの抗菌活性を増強する（ｐＨ自体はサルモネア菌の生存に対してあまり影響がなかった）。デヒドロアビエチン酸を４８時間バニリンと相互作用させると、２つの分子の抗菌活性を増加させる。
【０２１２】
実施例１２−コニフェルアルデヒド、チモールおよびスチルベンに対するＤＨＡＡの相乗的効果
前の実験では、抗菌性化合物は、バニリンと組み合わせて試験したので、ＤＨＡＡが単にバニリンの活性を増加させたのか、またはチモール、コニフェルアルデヒドおよびスチルベンのような他の天然抗菌分子の活性も増加させるのかを決定することが難しかった。第一の試験では、これらの化合物はグラム陰性菌であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対して試験し、第二の試験では、同じ化合物をグラム陽性菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して試験した。
【０２１３】
材料＆方法
チモール、トランス−スチルベンおよびコニフェルアルデヒドはシグマ−アルドリッチ社から購入した。デヒドロアビエチン酸は不均化ロジンから単離した。
【０２１４】
バイオアッセイ試験：微量培養液希釈法を用いて試験を行った。ＤＨＡＡ（２０ｍＭ）を、コニフェルアルデヒド、チモールまたは（トランス）スチルベンのいずれかと組み合わせ、２５℃で４８時間インキュベートした。コントロール溶液はデヒドロアビエチン酸なしで、コニフェルアルデヒド、チモールおよびスチルベンから作製した。アセトンだけの溶媒コントロールも準備した。試験用に、１０〜０．１５６ｍＭの範囲の濃度の活性成分を作製するために、溶液を２倍希釈で希釈した。次いで、２０ｍＭデヒドロアビエチン酸の最終濃度となるように各濃度をデヒドロアビエチン酸で補正した。各濃度１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル中の栄養培養液１００μｌに添加した。各濃度に対して３つの複製を作製した。プレートは溶媒を蒸発させるために積層チャンバー中で静置した。
【０２１５】
続いて、各ウェルに２５℃でオーバーナイト成長させた１０８ｃｆｕ／ｍｌ含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ懸濁の５μｌを接種した。第二の試験では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを用いた。接種の後、プレートを２５℃で２４時間インキュベートした。処理が殺菌性であるかどうかを確かめるために、各ウェルから０．０１ｍｌをニュートリエント寒天培地上にスポットした。プレートを２４時間インキュベートし、バクテリア成長がない、またはほんのわずかコロニーが見られるスポットを殺菌性であるとした。静菌効果を決定するために、代謝活性を測定する目的でテトラゾリウム塩溶液５０μｌを各ウェルに添加した。２５℃でオーバーナイトインキュベーションした後、何ら色の変化がないものを静菌効果として決定し、代謝（効果なし）は赤から紫色として示した。
【０２１６】
結果
【０２１７】
【表１６】
0005890778.tif 000031
【０２１８】
結果
ＤＨＡＡはコニフェルアルデヒドに対して強い相乗活性を持ち、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対して化合物を約１６倍効果的にした。ＤＨＡＡはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対してチモールを約２倍効果的にした。
【０２１９】
実施例１３−種々の微生物に対するデヒドロアビエチン酸およびバニリンの組み合わせの抗菌活性
本発明者らは、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）ペーパー上の抑制地帯を用いて、微生物（グラム−陽性およびグラム陰性菌、糸状菌および酵母）に対する種々の化合物の抗菌活性を試験した。
【０２２０】
材料および方法
２つの試験溶液を準備した、すなわち：（ｉ）ＤＨＡＡと組み合わせたバニリン、および（ｉｉ）デヒドロアビエチン酸（ＤＨＡＡ）と組み合わせたスチルベン。溶液の活性は次いで次のようにいくつかの異なる微生物に対して試験した。
【０２２１】
ＴＬＣプレート上に試験溶液の液滴を静置した。溶液を蒸発させ、培養液中の試験微生物（グラム−陽性およびグラム陰性菌）懸濁をＴＬＣプレート上に均一に塗布した。プレートをオーバーナイトでインキュベートした。微生物活性を可視化するため、ＴＬＣプレートをテトラゾリウム塩溶液でスプレーした。微生物活性は赤−ピンク色によって示された。
【０２２２】
糸状菌に対する溶液の有効性を示すため、糸状菌が胞子を形成するまで接種したＴＬＣプレートをインキュベートした。酵母に対する有効性を示すため、インキュベーションの後、ＴＬＣプレートをニュートリエント寒天培地に対してプレスした。プレートを酵母コロニーがはっきりと視覚化されるまでインキュベートした。
【０２２３】
結果
図１〜８は、試験した微生物の成長に対する試験溶液の効果を示す。
【０２２４】
図１を参照すると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対するバニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせの活性が示されている。バクテリア成長が広まっているかどうかコントロールと比較した試験において阻害のクリアゾーンが示されている。図２は、スチルベンだけ、およびコントロールだけよりもスチルベンおよびＤＨＡＡの組み合わせがＳ．ａｕｒｅｕｓに対してより顕著な抗菌性であることを示す。図３は、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせが、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対して抗菌性であり、これらの２つの化合物自身は効果がないことを示す。図４は、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対して抗菌性であることを示す。図５は、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせがＥ．ｃｏｌｉに対して抗菌性であることを示す。図６は、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせがペニシリウム属糸状菌に対して抗菌性であることを示す。図７は、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせがアスペルギルス属に対して抗菌性であることを示す。最後に、図８は、バニリンおよびＤＨＡＡの組み合わせが酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して抗菌性であることを示す。バニリン自体は５ｍＭで効果があるが、ＤＨＡＡと組み合わせるとわずか０．０７８ｍＭで効果がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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