(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコ核多角体病ウイルスＨ４株のＦタンパク質がカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のＦタンパク質に置換された組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターであって、
（１）（ａ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドを含む組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、又は
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドと９８％以上の同一性を示すヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、或いは
（２）（ｄ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドを含む組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、
（ｅ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、又は
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドと９８％以上の同一性を示すヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター。
【請求項２】
目的タンパク質発現用ベクターである、請求項１に記載の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター。
【請求項３】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドを
（２）前記Ｔ３株のＦタンパク質と異なるＦタンパク質をコードするヌクレオチドの上流配列及び下流配列で挟む構造を有するカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター。
【請求項４】
前記Ｔ３株のＦタンパク質と異なるＦタンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＦタンパク質である、請求項３に記載のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター。
【請求項５】
配列番号４で表される塩基配列からなるヌクレオチドを含む請求項３又は４に記載のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター。
【請求項６】
目的タンパク質の製造方法であって、
（１）請求項１又は２に記載の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターのヌクレオチドに、目的タンパク質をコードするヌクレオチドを相同組換えにより導入することによって、目的タンパク質のヌクレオチドが組込まれた目的タンパク質発現用ベクターを作製する工程、
（２）培養細胞又はカイコ生体に前記ウイルスベクターを感染させる工程、及び
（３）前記感染培養細胞若しくは培養上清、又は感染カイコ生体から目的タンパク質を回収する工程、を含む、目的タンパク質の製造方法。
【請求項７】
目的タンパク質がウシインターフェロン−τである請求項６に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項８】
カイコ核多角体病ウイルスＨ４株のＦタンパク質がカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のＦタンパク質に置換された組換えカイコ核多角体病ウイルスであって、
（１）（ａ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドを含む組換えカイコ核多角体病ウイルス、
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルス、又は
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドと９８％以上の同一性を示すヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルス、或いは
（２）（ｄ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドを含む組換えカイコ核多角体病ウイルス、
（ｅ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルス、又は
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるＨ４株のヌクレオチドと９８％以上の同一性を示すヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドから翻訳されるＴ３株のＦタンパク質のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるＨ４株のヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を示すヌクレオチドを含み、そしてカイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示す組換えカイコ核多角体病ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、及び目的タンパク質の製造方法に関する。本発明によれば、培養細胞及びカイコ幼虫のいずれにおいても、目的タンパク質を効率よく製造することができる。
【背景技術】
【０００２】
カイコ核多角体病ウイルス（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus：ＢｍＮＰＶ）はカイコ培養細胞及び個体で良く増殖する。このＢｍＮＰＶを用いたカイコ個体における外来タンパク質発現系は、真核細胞における最も効率の良いタンパク質発現系の一つとして知られている。ＢｍＮＰＶのウイルス粒子は、大型の棒状であり、増殖後期において感染核内に多角体と呼ばれる包埋体を形成し、内部に多くのウイルス粒子を包埋する。この包埋体はウイルス遺伝子にコードされるポリヘドリンと呼ばれるタンパク質でできており、感染末期には宿主細胞タンパク質の５０％以上を占めることがある。
このポリヘドリン遺伝子（polh）をコードする遺伝子を、目的タンパク質をコードする遺伝子と置き換えた組換えＮＰＶを用いることによって、感染細胞内で目的タンパク質を高効率に発現させることが可能である。このようなＮＰＶを用いたタンパク質の発現系は、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）と称され、現在このＢＥＶＳはさまざまな分野で利用されている。
【０００３】
しかしながら、従来、ＢＥＶＳに用いられていたカイコ核多角体病ウイルスの標準株であるＴ３株は、培養細胞における十分な増殖性を示していた（非特許文献１）が、カイコ生体、例えばカイコ幼虫又はカイコ蛹における増殖が十分満足できるものではなかった。ＢＥＶＳにおいては、培養細胞より、カイコ幼虫、又はカイコ蛹などのカイコの生体を用いる方が効率よく外来タンパク質を製造することが可能である。従って、カイコ生体における増殖性の優れた、カイコ核多角体病ウイルスベクターの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・セリカルチュラル・サイエンス・オブ・ジャパン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）」（日本）１９８４年、第５３巻、ｐ．５４７−５４８
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（英国）２００８年、第８９巻、ｐ．７９１−７９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、最近カイコから、新規なカイコ核多角体病ウイルス（Ｈ４株）を分離した。このＨ４株は、カイコ生体で優れた増殖性を示したため、ＢＥＶＳにおけるベクターとして期待された。しかしながら、Ｈ４株は培養細胞における増殖性が極めて低いために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えウイルスの作製などの培養細胞を用いる操作において、不便であった。
従って、本発明の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養における高い増殖性と、ｉｎ  ｖｉｖｏのカイコ生体における高い増殖性を併せ持った、優れたカイコ核多角体病ウイルスベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、培養細胞における高い増殖性及びカイコ生体における高い増殖性を有するカイコ核多角体病ウイルスについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、Ｈ４株のＦタンパク質を、Ｔ３株のＦタンパク質に置換することにより、培養細胞における高い増殖性及びカイコ生体における高い増殖性を有するカイコ核多角体病ウイルスを得ることができることを見出した。具体的には、Ｈ４株にＴ３株のＦタンパク質を組込んだ組換えＨ４−Ｔ３Ｆ株は、培養細胞においてＴ３株より優れた増殖能を示した。また、カイコ生体においてＨ４株と同等の増殖能を示した。
バキュロウイルス（ＮＰＶ）は、膜タンパク質としてＧＰ６４及びＦタンパク質を有するグループＩ、及び膜タンパク質としてＦタンパク質のみを有するグループＩＩに分類される。
グループＩＩのバキュロウイルスでは、ウイルスの感染において、細胞融合活性を示すＦタンパク質が必須であり、例えば非特許文献２では、オオタバコガ単核多角体病ウイルスのＦタンパク質を欠如させたバクミドで、感染性発芽ウイルスが産生されなかったことが開示されている。
一方、ＧＰ６４及びＦタンパク質を有するグループＩのバキュロウイルスでは、Ｆタンパク質には明確な細胞融合活性は認められず、Ｆタンパク質の感染における役割は、不明であった。従って、Ｈ４株にＴ３株のＦタンパク質を組込んだ組換えＨ４−Ｔ３Ｆ株が、培養細胞においてＴ３株より優れた増殖能を示したことは、当業者にとって驚くべきことである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］Ｆタンパク質を構成する６７４アミノ酸の第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、第５９３位が欠失、及び第５９８位がロイシンであるＴ３系Ｆタンパク質をコードするヌクレオチドを含み、カイコ生体内での増殖能を有することを特徴とする、組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、
［２］カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスの、Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド以外の一部若しくはすべてのヌクレオチドを含み、且つ前記Ｔ３系Ｆタンパク質をコードするヌクレオチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＦタンパク質をコードするヌクレオチドである、［１］に記載の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、
［３］前記カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスが、
（１）カイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示すカイコ核多角体病ウイルス、
（２）配列番号３で表される塩基配列からなるヌクレオチドを含むカイコ核多角体病ウイルス、又は
（３）カイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖能に対して１．１倍以上の増殖能を示し、且つ配列番号３で表される塩基配列からなるヌクレオチドとの相同性が９８％以上のヌクレオチドを含むカイコ核多角体病ウイルス、
である、［１］又は［２］に記載の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、
［４］目的タンパク質発現用ベクターである、［１］〜［３］のいずれかに記載の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター、
［５］Ｆタンパク質を構成する６７４アミノ酸の第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、第５９３位が欠失、及び第５９８位がロイシンであるＴ３系Ｆタンパク質をコードするヌクレオチドを含む、カイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター、
［６］前記ヌクレオチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＦタンパク質をコードするヌクレオチドである、［５］に記載のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター、
［７］配列番号４で表される塩基配列からなるヌクレオチドを含む［６］に記載のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター、
［８］目的タンパク質の製造方法であって、
（１）［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターのヌクレオチドに、目的タンパク質をコードするヌクレオチドを相同組換えにより導入することによって、目的タンパク質のヌクレオチドが組込まれた目的タンパク質発現用ベクターを作製する工程、
（２）培養細胞又はカイコ生体に前記ウイルスベクターを感染させる工程、及び
（３）前記感染培養細胞若しくは培養上清、又は感染カイコ生体から目的タンパク質を回収する工程、を含む、目的タンパク質の製造方法、
［９］目的タンパク質がウシインターフェロン−τである［８］に記載の目的タンパク質の製造方法、又は
［１０］［９］の目的タンパク質の製造方法によって得られる、糖鎖が付加されている遺伝子組換えウシインターフェロン−τ、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスによれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作性に優れ、且つカイコ生体、特にはカイコ幼虫又はカイコ蛹において増殖性の優れた目的タンパク質発現用ベクターを作製することができる。本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスを用いた目的タンパク質発現用ベクターは、操作が容易で、目的タンパク質が組込まれたウイルスベクターを簡便に作製することができる。また、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスを用いたバキュロウイルス発現ベクターシステムは、目的タンパク質を大量に且つ容易に製造することが可能である。更に、本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、目的タンパク質を大量に且つ容易に製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】カイコ核多角体病ウイルスのＦタンパク質におけるＴ３株とＨ４株とのアミノ酸配列の相違を示した図である。上側がＨ４株、下側がＴ３株であり、相違しているアミノ酸を下線で示す。
【図２】カイコ核多角体病ウイルスＴ３株のＦタンパク質の相同組換え用ベクター（トランスファープラスミドベクター）（Ａ）及びカイコ核多角体病ウイルスＨ４株のＦタンパク質の相同組換え用ベクター（トランスファープラスミドベクター）（Ｂ）の構造を模式的に示した図である。
【図３】培養細胞（ＢｍＮ細胞）におけるＴ３株、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株、ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株、及びＨ４株の増殖をウイルスＤＮＡ量により示したグラフである。ｍｏｃｋは非感染を示す。
【図４】培養細胞におけるＴ３株（レーン３及び４）、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株（レーン５及び６）、ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株（レーン７及び８）、及びＨ４株（レーン９及び１０）の感染４８時間後と７２時間後のポリヘドリンの発現（培養細胞と培養液に含まれる多角体の総体を解析）をＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動より示した写真である。レーン１及び２は非感染培養細胞で同様の解析を行った結果を示す。
【図５】カイコ幼虫におけるＴ３株、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株、ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株、及びＨ４株の増殖をウイルスＤＮＡ量により示したグラフである。ｍｏｃｋは非感染を示す。
【図６】カイコ幼虫におけるＴ３株（レーン３及び４）、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株（レーン５及び６）、ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株（レーン７及び８）、及びＨ４株（レーン９及び１０）の感染４８時間後と７２時間後のポリヘドリンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動より示した写真である。レーン１及び２は非感染カイコ体液を用いて同様の解析を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［１］組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、Ｆタンパク質を構成する６７４アミノ酸の第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、第５９３位が欠失、及び第５９８位がロイシンであるＴ３系Ｆタンパク質をコードするヌクレオチドを含み、カイコ生体内での増殖能を有する。本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、バキュロウイルス発現システムにおいて、目的タンパク質発現用ベクターとして用いることができる。
【００１０】
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、前記のＦタンパク質をコードするヌクレオチドを含み、且つカイコの培養細胞又はカイコ生体において、ポリヘドリンタンパク質、又は目的タンパク質を産生することができる限り、限定されるものではない。例えば、組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターとして、カイコ核多角体病ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子をすべて含みウイルス粒子を産生することができる組換えカイコ核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイルスの一部のタンパク質をコードする遺伝子を含みウイルス粒子を産生することができる組換えカイコ核多角体病ウイルス、又はカイコ核多角体病ウイルスの一部のタンパク質をコードする遺伝子を含みウイルス粒子を産生することができない組換えカイコ核多角体病ウイルス、を挙げることができる。
また、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、カイコ核多角体病ウイルスの遺伝子以外の遺伝子を含むことができ、例えば目的タンパク質の遺伝子が組込まれたウイルスベクター、又はマーカー遺伝子が組込まれたウイルスベクターを挙げることができる。マーカー遺伝子としては、例えば蛍光タンパク質遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺａＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２及びＨｃＲｅｄ１）、又は薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、除草剤ビアラフォス耐性遺伝子、又はスルホニル尿素耐性遺伝）を挙げることができる。
すなわち、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、カイコ核多角体病ウイルスそのものの遺伝子を有するカイコ核多角体病ウイルスでもよく、ＤｓＲｅｄなどのマーカー遺伝子を含んだベクター（例えば、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株）でもよく、更に目的のタンパク質を含んだベクター（例えば、後述のＨ４−Ｔ３Ｆ／Ｂｏτ）でもよく、バキュロウイルス発現システムに用いられるバクミドなどのベクターでもよい。
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターに含まれるヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２１〜４５０８番の塩基配列からなるヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるヌクレオチドが、この順番に結合したヌクレオチドを挙げることができるが、このヌクレオチドは、実施例１で得られたｒＨ４−Ｔ３Ｆ株のヌクレオチドの配列である。また、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターに含まれるヌクレオチドとしては、配列番号３で表される塩基配列における１〜１３５５９番の塩基配列からなるヌクレオチド、配列番号４で表される塩基配列における５２７〜２５４８番の塩基配列からなるヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における１５５８５〜１２７４５９番からなるヌクレオチドが、この順番に結合したヌクレオチドを挙げることができるが、このヌクレオチドは、Ｈ４株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドをＴ３株のＦタンパク質をコードするヌクレオチドに置換したヌクレオチドである。
【００１１】
（カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルス）
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスを骨格として含むものである。すなわち、カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスのヌクレオチドを骨格として含むものであり、ウイルスのすべてのヌクレオチドを含んでもよく、ウイルスの増殖に必要なタンパク質をコードする一部のヌクレオチドを含むものでもよい。特に、一部のヌクレオチドを含む場合、カイコ生体での優れた増殖能に関与するタンパク質をコードするヌクレオチドを含むものである。カイコ生体での優れた増殖能に関与するタンパク質としては、限定されるものでないが、ＧＰ６４を挙げることができる。従って、一部のヌクレオチドとしては、Ｈ４株のＧＰ６４をコードするヌクレオチドを挙げることができる。
【００１２】
本明細書において、「カイコ生体での増殖能を有する」とは、カイコ核多角体病ウイルスＴ３株と比較してカイコ生体における増殖能がよいことを意味する。具体的には、カイコ核多角体病ウイルスＴ３株のカイコ生体における増殖に対して、増殖能が優れているカイコ核多角体病ウイルスをすべて含む。しかしながら、Ｔ３株と比較して好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．３倍以上、更に好ましくは１．５倍以上、最も好ましくは２倍以上、カイコ生体における増殖能が優れているものである。
【００１３】
カイコ生体における増殖能の測定方法は、特に限定されるものではなく、又はＰＣＲによるカイコ核多角体病ウイルスのＤＮＡ量の測定、又はカイコ核多角体病ウイルスのＰＦＵアッセイを用いることができる。更に、測定のポイントも特に限定されるものではなく、感染後の任意の時間を選択することができ、いずれかの１つのポイントにおいてＴ３株と比較した増殖能が優れていればよい。
例えば、カイコ生体における増殖能の測定方法として、後述の実施例３及び実施例５に記載の方法を準用することもできる。具体的には、５齢１日目のカイコ（例えば錦秋×鐘和）に、感染価（又はＤＮＡ量）を揃えた、Ｔ３株及び対象のカイコ核多角体病ウイルスを接種する。その後飼育５日目に感染カイコの体表にカミソリで傷つけ、１００ｍＬ（４℃）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭＤＴＴ中に体液（約０．５ｍＬ／頭）を回収する。カイコ個体から採取した体液を水で１００倍希釈し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ．，４℃）を行い、その上清を回収する。この上清中のＤＮＡ量をＰＣＲ又はプラークアッセイで測定することによって、カイコ生体における増殖能を測定することが可能である。
【００１４】
カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスとして、最も好ましいものはカイコ核多角体病ウイルスＨ４株である。Ｈ４株の遺伝子配列を配列番号３に示す。このカイコ核多角体病ウイルスＨ４株はカイコ生体での優れた増殖能を示すが、Ｈ４株の遺伝子と相同性を示す遺伝子を有するカイコ核多角体病ウイルス、及び／又はＨ４株のタンパク質と高い同一性を示すタンパク質を有するカイコ核多角体病ウイルスも、カイコ生体での優れた増殖能を示す。従って、カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスとして、Ｈ４株の遺伝子と９８％以上の相同性を有する遺伝子を含むウイルスを挙げることができ、より好ましくは９８．５％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは９９．７％以上の相同性を有するウイルスを挙げることができる。また、カイコ生体での増殖能を有するカイコ核多角体病ウイルスとして、Ｈ４株のタンパク質のアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むウイルスを挙げることができ、より好ましくは９８．５％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは９９．７％以上の同一性を有するウイルスを挙げることができる。
【００１５】
なお、カイコ核多角体病ウイルスＨ４株は、２００５年２月２日付けで、独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンク（ＭＡＦＦ）に、受託番号ＭＡＦＦ２６１０００として、寄託されている。
【００１６】
（Ｆタンパク質）
本発明のベクターに含まれるＴ３系Ｆタンパク質をコードするヌクレオチドは、カイコ核多角体病ウイルスのＦタンパク質であり、且つ６７４アミノ酸からなるＦタンパク質をコードするヌクレオチドにおいて、第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、第５９３位が欠失、及び第５９８位がロイシンをコードするヌクレオチドを含む限り、限定されるものではない。本明細書において、前記のアミノ酸を有するＦタンパク質をＴ３系タンパク質と称し、最も好ましいＴ３系タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴ３Ｆタンパク質である。従って、本発明のベクターに含まれるＦタンパク質をコードするヌクレオチドとして、最も好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴ３Ｆタンパク質をコードするヌクレオチドである。
【００１７】
カイコ核多角体病ウイルスのＦタンパク質は、前記のように感染における機能は不明であった。培養細胞における優れた増殖能を示すＴ３株のＦタンパク質（配列番号１）と、カイコ生体における優れた増殖能を示すＨ４株のＦタンパク質（配列番号２）では、１２アミノ酸の違いが存在する。図１に示すように、Ｈ４株の６７４アミノ酸を基準としてＴ３株の置換を示すと、第１０２位のロイシンがリジンに、第１０３位のセリンがトレオニンに、第１０４位のフェニルアラニンがアルギニンに、第２１５位のセリンがアラニンに、第３３０位のバリンがロイシンに、第４０３位のセリンがアルギニンに、第４０４位のアスパラギンがアスパラギン酸に、第４０５位のイソロイシンがバリンに、第５７７位のチロシンがアスパラギンに、第５７８位のトレオニンがイソロイシンに、及び第５９８位のセリンがロイシンに置換され、そして第５９３位のロイシンが欠失している。
【００１８】
前記６７４アミノ酸からなるＦタンパク質のアミノ酸配列の第１０２位、第１０３位、第１０４位、第２１５位、第３３０位、第４０３位、第４０４位、第４０５位、第５７７位、第５７８位、及び第５９８位以外のアミノ酸配列は、カイコ生体における高い増殖性及び培養細胞における優れた増殖性を示す限りにおいて、限定されるものではない。すなわち、本発明のベクターに含まれるＦタンパク質をコードするヌクレオチドは、前記のアミノ酸をコードするヌクレオチド以外のヌクレオチドは特に限定されるものではない。またヌクレオチドの長さも、６７３アミノ酸をコードするヌクレオチドの長さである２０１９ヌクレオチドが好ましいが、これに限定されるものではない。
すなわち、Ｆタンパク質の前記の第１０２位等のアミノ酸以外のアミノ酸配列及びその長さは限定されるものではなく、Ｆタンパク質の６７４アミノ酸において、１〜１０個、又は１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列でもよい。カイコ核多角体病ウイルスは、変異を起こすことがあり、そのようなＦタンパク質においても、第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、第５９３位が欠失、及び第５９８位がロイシンであることにより、本発明の効果を示すことができるからである。なお、欠失及び／又は挿入が置きた場合、アミノ酸の番号がずれるが、周囲のアミノ酸配列から前記の第１０２位等のアミノ酸を特定することは、当業者にとって容易である。
【００１９】
（カイコ生体）
カイコ生体としては、例えばカイコ幼虫、又はカイコ蛹を挙げることができる。カイコ幼虫も限定されるものではないが、通常４齢〜最終齢の幼虫を用いることが好ましく、操作の容易性と、得られるタンパク質の収率から５齢幼虫がより好ましい。
【００２０】
（目的タンパク質発現用ベクター）
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、目的タンパク質発現用ベクターとして用いることができる。本明細書において「目的タンパク質発現用ベクター」とは、目的タンパク質をコードするヌクレオチドを組み込むためのベクター及び目的タンパク質をコードするヌクレオチドを組み込まれたベクターの両方を意味する。
カイコ核多角体病ウイルスは、増殖後期に感染核内に多角体と呼ばれる包埋体を形成し、内部に多くのウイルス粒子を包埋する。この包埋体はウイルス遺伝子にコードされるポリヘドリンと呼ばれるタンパク質からできており、感染末期には宿主細胞タンパク質の５０％以上を占めることがある。例えば、このポリヘドリン遺伝子（ｐｏｌｈ）のコード領域を目的タンパク質のコード配列と置換した目的タンパク質発現用ベクターを用いることにより、感染細胞内で目的タンパク質を効率よく発現させることができる。
【００２１】
目的タンパク質発現用ベクターにおける、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入する領域は、目的タンパク質が発現する限りにおいて、限定されるものではないが、ポリヘドリン遺伝子のプロモーター領域の下流が好ましく、ポリヘドリン遺伝子のコード領域と目的タンパク質のコード遺伝子とを置換してもよく、ポリヘドリン遺伝子と目的タンパク質のコード遺伝子とを融合させてもよい。ポリヘドリン遺伝子プロモーターの制御下で目的タンパクを発現することができるため、大量の目的タンパク質を得ることができる。
【００２２】
（カイコ核多角体病ウイルスベクター発現システム）
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは、カイコ核多角体病ウイルスベクター発現システムにおいて、目的タンパク質発現用ベクターとして用いることのできるものである。
カイコ核多角体病ウイルスベクター発現システムは、目的タンパク質発現用ベクター、目的タンパク質を目的タンパク質発現用ベクターに組み込むためのトランスファーベクター、カイコ培養細胞、又はカイコ生体（カイコ幼虫、又はカイコ蛹）などを含むことができる。
カイコ核多角体病ウイルスベクター発現システムは、後述の目的タンパク質の製造方法に記載の方法に従って用いることにより、目的のタンパク質を大量且つ容易に調製することが可能である。
【００２３】
［２］カイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクター
本発明のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクターは、カイコ核多角体病ウイルスの６７３アミノ酸からなるＦタンパク質をコードするヌクレオチドにおいて、第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、及び第５９７位がロイシンをコードするヌクレオチドを含むものである。本発明のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクターは、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターを製造するためのトランスファーベクターとして用いることができる。
【００２４】
本発明のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクターは、前記の第１０２位等の特定のアミノ酸を含むＦタンパク質をコードするヌクレオチドを含む限り、限定されるものではない。
本発明のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクターは、Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド以外の遺伝子を含むことができ、例えばマーカー遺伝子が組込まれたウイルスベクターを挙げることができる。マーカー遺伝子としては、例えば蛍光タンパク質遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺａＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２及びＨｃＲｅｄ１）、又は薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、除草剤ビアラフォス耐性遺伝子、又はスルホニル尿素耐性遺伝）を挙げることができる。また、マーカー遺伝子以外に、プロモーター遺伝子、エンハンサー又はｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルなどのシス・エレメントを含むこともできる。
本発明のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクターに含まれるヌクレオチドとしては、例えば配列番号４で表される塩基配列からなるヌクレオチドを挙げることができる。配列番号４に記載のヌクレオチドは、実施例１で構築したトランスファープラスミドベクターｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎに含まれるヌクレオチドであり、図（Ａ）に示すように、「Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐ」、「Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、「Ｐｏｌｙ（Ａ）」、「ｉｅ−１ｐ」、「ＤｓＲｅｄ」、「Ｐｏｌｙ（Ａ）」、及び「Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎ」を含む。
【００２５】
本発明のカイコ核多角体病ウイルスの相同組換え用ベクターに含まれるＦタンパク質をコードするヌクレオチドは、前記カイコ核多角体病ウイルスベクターに含まれるヌクレオチドと同じものであり、前記「Ｆタンパク質」の項に記載のＦタンパク質をコードするヌクレオチドを用いることができる。具体的には、本発明のベクターに含まれるＦタンパク質をコードするヌクレオチドは、カイコ核多角体病ウイルスのＦタンパク質であり、且つ６７４アミノ酸からなるＦタンパク質をコードするヌクレオチドにおいて、第１０２位がリジン、第１０３位がトレオニン、第１０４位がアルギニン、第２１５位がアラニン、第３３０位がロイシン、第４０３位がアルギニン、第４０４位がアスパラギン酸、第４０５位がバリン、第５７７位がアスパラギン、第５７８位がイソロイシン、第５９３位が欠失、及び第５９８位がロイシンをコードするヌクレオチドを含む限り、限定されるものではないが、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＦタンパク質をコードするヌクレオチドである。
【００２６】
［３］目的タンパク質の製造方法
本発明の目的タンパク質の製造方法は、（１）前記組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターのヌクレオチドに、目的タンパク質をコードするヌクレオチドを相同組換えにより導入することによって、目的タンパク質のヌクレオチドが組込まれた目的タンパク質発現用ベクターを作製する工程、（２）培養細胞又はカイコ生体に前記目的タンパク質発現用ベクターを感染させる工程、及び（３）前記感染培養細胞若しくは培養上清、又は感染カイコ生体から目的タンパク質を回収する工程、を含む。
【００２７】
（１）目的タンパク質発現用ベクター作製工程
目的タンパク質を発現させるための組換えウイルスの構築方法は、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターを用いることを除いては、公知の方法に従って行うことができる。すなわち、目的タンパク質を組込んだトランスファープラスミドベクターを作製し、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターとトランスファープラスミドベクターとの相同組換えにより、目的タンパク質のヌクレオチドが組込まれたウイルスベクターを作製することができる。
具体的には、トランスファープラスミドベクターにクローニングした目的遺伝子を挿入する。目的タンパク質を組込んだトランスファープラスミドベクターと、本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターとを、カイコ培養細胞、例えばＢｍＮ株にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した組換え体を限界希釈法、又はプラーク法などの一般的な方法によってクローニングする。目的タンパク質が組込まれた組換えカイコ核多角体病ウイルスベクターは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別できる。
【００２８】
トランスファープラスミドベクターとしては、通常使用されているトランスファープラスミドベクターを制限なく使用できるが、例えば、ｐＢＭ０３０、ｐＢＭ０１０、及びｐＢＭ０３０−ｓｉｓを挙げることができる。
【００２９】
（２）感染工程
本発明の目的タンパク質の製造方法における感染工程は、培養細胞又はカイコ生体に前記目的タンパク質発現用ベクターを感染させるものである。
カイコ生体（例えば、カイコ幼虫、又はカイコ蛹）への感染は、通常の方法を用いることができる。例えば５齢１日目のカイコ幼虫に、適当な希釈のウイルスを注射することによって感染させることができる。ウイルス接種後、４〜６日程度でウイルスを含む試料を回収することができる。また、カイコ蛹に適当な希釈のウイルスを注射することによって感染させることができ、６〜７日程度でウイルスを回収することができる。
培養細胞への感染も通常の方法に従って行うことができる。例えば、カイコ培養細胞を無血清培地で洗浄し、無血清培地で最適に希釈したウイルス液を添加する。１時間後に血清が添加された培地と交換し、２５〜２８℃で培養する。感染時間は適宜決定することができるが、例えば１〜３日程度培養して、ウイルス液を回収する。
【００３０】
（培養細胞）
本発明の目的タンパク質の製造方法において使用することのできる培養細胞は、特に限定されるものではないが、例えばＢｍＮ細胞（カイコ卵巣由来）、ＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｋｅ１、又はＢｍＮ４を挙げることができる。
【００３１】
（３）回収工程
本発明の目的タンパク質の製造方法における、目的タンパク質の回収は、通常の方法を用いることができる。
目的タンパク質を回収する試料としては、カイコ幼虫の体液、脂肪体、及び細胞、カイコ蛹の細胞、培養細胞の培養上清、及び培養細胞を用いることができるが、カイコ幼虫の体液が好ましい。
目的タンパク質の精製方法も、限定されるものではないが、例えばゲルろ過カラム、イオン交換カラム、疎水性カラム、逆相カラム、硫安塩析、及び透析などを単独で、又は組み合わせて用い、目的タンパク質を分離及び精製することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
《実施例１》
本実施例では、カイコ核多角体病ウイルスのＨ４株及びＴ３株のそれぞれのＦタンパク質を入れ換えた組換えＨ４−Ｔ３Ｆ株及び組換えＴ３−Ｈ４Ｆ株を作製した。
Ｈ４のＦタンパク質をＴ３のＦタンパク質に置換した組換えウイルスであるｒＨ４−Ｔ３Ｆ株を作製するためのトランスファープラスミドベクターｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｔ３のＦタンパク質をＨ４のＦタンパク質に置換した組換えウイルスであるｒＴ３−Ｈ４Ｆ株を作製するためのトランスファープラスミドベクターｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ、及びＴ３のＦタンパク質をＴ３のＦタンパク質に置換した組換えウイルス（ｒｅｃ  Ｔ３−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を作製するためのトランスファープラスミドベクターｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎを作製した。作製の際に用いたプライマー（１）〜（６）は表１に示した。
【００３４】
【表１】
0006044974.tif 000002
【００３５】
（ｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎの構築）
まず、Ｈ４のゲノムライブラリーの中からｐＰｓｔ  Ｒを鋳型とし、プライマー（１）、プライマー（２）を用いてＰＣＲを行うことで、制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩの認識配列を５’あるいは３’末端に付加したＨ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ上流配列（５２０塩基、Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐ）を増幅し、これをｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした（ｐＧＥＭ−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐ）。
次に、Ｔ３のゲノムライブラリーの中からｐＥｃｏ  Ｃを鋳型とし、プライマー（３）、プライマー（４）を用いてＰＣＲを行うことで、制限酵素ＡｐａＩとＳｍａＩの認識配列を５’あるいは３’末端に付加したＴ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ配列を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした（ｐＧＥＭ−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
更に、Ｈ４のゲノムライブラリーの中からｐＰｓｔ  Ｊを鋳型とし、プライマー（５）、プライマー（６）を用いてＰＣＲを行うことで、制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩの認識配列を５’あるいは３’末端に付加したＨ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎの下流配列（５３９塩基、Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎ）を増幅し、それをｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした（ｐＧＥＭ−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎ）。
制限酵素ＰｓｔＩとＳａｃＩの認識配列を５’あるいは３’末端に付加したＳＶ４０  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ（ＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ））をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングしたものから、制限酵素ＳａｃＩとＰｓｔＩでＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）を切り出した。また、ｐＢＩＳ−ｖｅｃｔｏｒを制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、ＢｍＮＰＶ  ｉｅ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域を切り出した。これら２断片をＰｓｔＩとＳａｌＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した（ｐＢｌｕｅ−ｐｏｌｙＡ−ｉｅ１ｐ）。
【００３６】
次に、ｐＢｌｕｅ−ｐｏｌｙＡ−ｉｅ１ｐを制限酵素ＳｍａＩとXhoIで消化して切り出したＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）及びｉｅ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域を含む断片を平滑末端化した後、SmaIで消化したｐＧＥＭ−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎに挿入した（ｐＧＥＭ−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙＡ−  ｉｅ１ｐ）。
次に、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＥｃｏＲＩとＡｆｌＩＩで消化し、ＤｓＲｅｄのＯＲＦ及びＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）を含む領域を切り出した。また、ｐＧＥＭ−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎをＡｆｌＩとＳａｃＩＩで消化し、Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ下流配列を切り出した。これら２断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）ｖｅｃｔｏｒに挿入した（ｐＢｌｕｅ−ＤｓＲｅｄ−ｐｏｌｙＡ−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎ）。
更に、ｐＧＥＭ−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐを制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩで消化して、Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  上流配列（Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐ）を切り出し、また、ｐＧＥＭ−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙＡ−ｉｅ１ｐをＡｐａＩとＥｃｏＲＩで消化して、Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ配列及びＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）、ｉｅ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列（ｉｅ−１ｐ）を含む断片を切り出した。次に、ｐＢｌｕｅ−ＤｓＲｅｄ−ｐｏｌｙＡ−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎをＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで消化して、ＤｓＲｅｄのＯＲＦとＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）及びＨ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ下流配列（Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｗｎ）を含む領域を切り出した。これら３断片を制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）ｖｅｃｔｏｒに挿入した（ｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。ｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎの構造を図２Ａに示す。
【００３７】
（ｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｈ４Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎの構築）
Ｔ３株とＨ４株を入れ換えて、前記「ｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎの構築」の操作を繰りかえすことによって、トランスファープラスミドベクターｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎを得た。ｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎの構造を図２Ｂに示す。
また、コントロールとしてトランスファープラスミドベクターｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎを得た。
【００３８】
（ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株及びｒＴ３−Ｈ４Ｆ株の作製）
３μｇのｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ及び１μｇのＢｍＮＰＶ  Ｈ４ゲノム、３μｇのｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ及び１μｇのＢｍＮＰＶ  Ｔ３ゲノム、３μｇのｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎと１μｇのＢｍＮＰＶ  Ｔ３ゲノムを各々のウェルのＢｍＮ細胞にコトランスフェクションして相同組換えを行い、５〜６日後に培養上清を回収した。
培養上清中の組換えウイルスの選抜は次のように行った。１０５〜１０７倍に希釈した培養上清を培養細胞に接種し、４〜６日後にＤｓＲｅｄが発現しているキメラウイルス（ｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｈ４  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎウイルス、ｐ−ｒｅｃ  Ｈ４−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎウイルス、ｐ−ｒｅｃ  Ｔ３−Ｔ３  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎウイルス）のプラークを、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＭＺ  ＦＩ  ＩＩＩ）を用いて確認しながらゲルごと採取して、ＴＣ１００培地１００μＬに懸濁した（ウイルスの純化）。更に、それらのウイルスの純化を３回繰り返し、クローン化組換えウイルスとした。
【００３９】
得られた組換えウイルスの構造の確認は、ＰＣＲにより確認した。Ｈ４株ではＴ３株の７６９５４から７７５４５に相当する位置に約６００塩基の欠失が認められる。従って、ＰＣＲ産物の長さによって、目的の組換えウイルスであることを確認した。
【００４０】
《実施例２：培養細胞における増殖及び多角体タンパク質の産生》
本実施例では、ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株及びｒＴ３−Ｈ４Ｆ株の培養細胞における増殖及びポリヘドリンタンパク質の発現を確認した。
カイコ卵巣由来のＢｍＮ細胞を、ＴＣ１００培地（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ）に１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を加えた血清ＴＣ１００培地を用いて２６℃で培養した。
ＢｍＮ細胞へのウイルス感染は、１２ウエルプレートのウェルあたりＢｍＮ細胞を５×１０５個になるように播種し、２時間無血培養したものを無血清ＴＣ１００培地で２回洗浄した後、多重感染度ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）＝１となるように無血清ＴＣ１００培地で希釈したウイルス液をそれぞれのウェルに加えることで行った。１時間後、ウイルス接種液をウェルにつき１ｍＬの血清ＴＣ１００培地に交換し、感染後８４時間まで１２時間毎に培養上清を回収した。それぞれの時間の培養上清中のウイルスＤＮＡ量をＰＣＲにより測定した。また、４８時間及び７２時間のＢｍＮ細胞及び培養上清中のポリヘドリンの発現をウエスタンブロットにより調べた。
【００４１】
【表２】
0006044974.tif 000003
【００４２】
（ウイルスＤＮＡ量の測定）
ウイルスＤＮＡ量は、ｉｅ−１プライマー（表２）及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ）を用いた定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で見積もった。
培養上清１０μＬに等量の０．１％ＳＤＳを加え、９５℃で５分間加熱処理を行った。その後、氷中に２分間静置し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ．，４℃）を行い、その上清２μＬに７．２μＬの滅菌水、０．４μＬずつの各プライマー溶液（１０μＭ）、１０μＬのＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭを混合し、反応条件〔９５℃−３０ｓｅｃ．〕×１ｃｙｃｌｅ、〔９５℃−４ｓｅｃ．，６０℃−２５ｓｅｃ．〕×４０ｃｙｃｌｅｓに設定したＴａＫａＲａ  Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を用いて反応を行い、ＤＮＡの増幅及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光強度を計測した。結果を図３に示す。
ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株は、親株であるＨ４株と比較して、例えば８４時間において６倍程度の高い増殖能が示した。また、Ｔ３Ｆタンパク質の親株であるＴ３株と比較しても２倍近く高い増殖能を示した。
一方、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株は、Ｈ４Ｆタンパク質が組込まれたにもかかわらず、ＢｍＮ細胞における増殖能は低下せず、親株であるＴ３株と同等の増殖能を示した。
【００４３】
（ポリヘドリンの発現）
ポリヘドリンの発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。回収した細胞及び上清に１ＭのＮａ２ＣＯ３を終濃度５０ｍＭになるように加えて多角体を完全に溶解させたものを多角体溶解液とした。この多角体溶解液に１／５量の５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、沸騰水中で３分間加熱後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ．，４℃）した上清１０μＬを１０％ｐｏｌｙａｃｒｉｌｃｍｉｄｅ  ｇｅｌを用いて、８０Ｖで３０分間、１２０Ｖで１時間電気泳動をした。分子量マーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｂｒｏａｄ−Ｒａｎｇｅ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。泳動バッファーは１／５量のＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いた。染色は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ染色液に浸して５５℃で１５分間振とうすることで行った。その後１０％酢酸に浸し、バンドが確認できるまで２〜３回１０％酢酸を交換しながら５５℃で振とうして脱色した。結果を図４に示す。
ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株は、４８時間及び７２時間のいずれでも最も高いポリヘドリンの発現量を示した。
【００４４】
《実施例３：カイコ生体における増殖及び多角体タンパク質の産生》
本実施例では、ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株及びｒＴ３−Ｈ４Ｆ株のカイコ幼虫における増殖及びポリヘドリンタンパク質の発現を確認した。
カイコ個体へのウイルス接種は、ウイルス液を無血清ＴＣ１００培地で希釈した１００ＰＦＵ相当量のウイルス液２μＬを注射することで行った。注射後７２時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間にカイコ個体体液の採取を行った。それぞれの時間の培養上清中のウイルスＤＮＡ量をＰＣＲにより測定した。また、４８時間及び７２時間のＢｍＮ細胞及び培養上清中のポリヘドリンの発現をウエスタンブロットにより調べた。
【００４５】
（ウイルスＤＮＡ量の測定）
カイコ個体から採取した体液を即座に水で１００倍希釈し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ．，４℃）を行い、その上清を回収した。培養上清に代えて、前記遠心分離で回収した上清を用いたことを除いては、前記実施例２の「ウイルスＤＮＡ量の測定」の操作を繰り返した。結果を図５に示す。
ｒＨ４−Ｔ３Ｆ株は、Ｈ４Ｆタンパク質がＴ３タンパク質に置換されたにもかかわらず、Ｈ４株と同程度の増殖能を示した。
一方、ｒＴ３−Ｈ４Ｆ株は、Ｈ４Ｆタンパク質が組込まれたにもかかわらず、カイコ幼虫における増殖能は向上しなかった。
【００４６】
（ポリヘドリンの発現）
カイコ個体から採取した体液は即座に１０倍量の水で希釈した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ．，４℃）を行い、上清を除き、沈殿を水に懸濁した。これをサンプルとして、１ＭのＮａ２ＣＯ３を終濃度５０ｍＭになるように加えて多角体を完全に溶解させ、多角体溶解液とした。この多角体溶解液を用い、前記実施例２の「ポリヘドリンの発現」の操作を繰り返し、ポリへドリンの発現を確認した。結果を図６に示す。
【００４７】
《実施例４：組換えウイルスの感染性》
本実施例では、組換えＨ４−Ｔ３Ｆ株及び組換えＴ３−Ｈ４Ｆ株の感染性を検討した。
１２ウエルプレートのウェルあたりＢｍＮ細胞を５×１０５個になるように播種し、２時間無血培養したものを無血清ＴＣ１００培地で２回洗浄した。多重感染度ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）＝１となるように無血清ＴＣ１００培地で希釈した組換えＨ４−Ｔ３Ｆ株、組換えＴ３−Ｈ４Ｆ株、Ｔ３株、及びＨ４株のウイルス液をそれぞれのウェルに加えた。１時間後、ウイルス接種液をウェルにつき１ｍＬの血清ＴＣ１００培地に交換した。６日後に培養上清を回収し、ウイルス粒子を精製した。それぞれの時間の培養上清中のウイルスＤＮＡ量をＰＣＲにより測定し、１．５×１０５コピー／ｍＬの濃度に調整した。
１．５×１０５コピー／ｍＬの濃度に調整したＨ４−Ｔ３Ｆ株、組換えＴ３−Ｈ４Ｆ株、Ｔ３株、及びＨ４株のウイルス液の感染価を、ＢｍＮ細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。Ｈ４−Ｔ３Ｆ株は、１．５×１０５コピー／ｍＬあたり、１．０×１０７ＰＦＵ／ｍＬの感染価を示した。この感染価は、Ｔ３株の約１０倍であった（表３）。
【００４８】
【表３】
0006044974.tif 000004
【００４９】
《実施例５：目的タンパク質の製造》
本実施例では、Ｔ３株、Ｈ４株、及び組換えＨ４−Ｔ３Ｆ株にウシインターフェロン−τ（ＢｏＩＦＮ−τ）の遺伝子を組み込み、カイコ生体により製造した。
市販の牛肉片（２０ｍｇ）からＤＮＡｚｏｌ（インビトロジェン）を用い、定法によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを鋳型にして、以下の２つのプライマーを用いたＰＣＲ（ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑを用いた）を行った。なお、ｔｏｕ５はＢｏＩＦＮ−τ遺伝子配列の５’側配列を含み、その上流に制限酵素ＳａｌＩの認識配列を持つものであり、ｔｏｕ３はＢｏＩＦＮ−τ遺伝子配列の３’側配列の相補配列を含み、その上流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を持つものである。
ｔｏｕ５：５’−ＣＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１３）
ｔｏｕ３：５’−ＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧ−３’（配列番号１４）
増幅された断片をプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ）を用いてクローニングした（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／ＢｏＩＦＮ−τ）。
【００５０】
得られたＢｏＩＦＮ−τ遺伝子断片（配列番号１５）（DNAデータベース ID: AF238612）を、ＢｍＮＰＶの多角体遺伝子外来遺伝子を挿入するためのトランスファープラスミドｐＢＭ０３０（Horiuchi et al., High-level expression of the human-a-interferon gene through the use of an improved baculovirus vector in the silkworm, Bombyx mori. Agric. Biol. Chem. 51, 1573-1580, 1987）のクローニング部位（ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩサイト）に挿入し、ＢｏＩＦＮ−τ遺伝子組換えトランスファープラスミドｐＢＭ０３０−Ｂｏτを得た。すなわち、ｐＢＭ０３０をＸｂａＩで切断し平滑末端化を行い、更にＥｃｏＲＩで切断したベクターと、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ／ＢｏＩＦＮ−τ（２ｕｇ）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し平滑末端化を行い、更にＥｃｏＲＩで切断した断片をライゲーションし、ｐＢＭ０３０−Ｂｏτを作製した。
得られたｐＢＭ０３０−Ｂｏτと、Ｔ３株、Ｈ４株及びＨ４−Ｔ３Ｆ  のＤＮＡをカイコＢｍＮ細胞に同時導入することによって相同組換えを行い、Ｔ３−／Ｂｏτ株、Ｈ４／Ｂｏτ株、及びＨ４−Ｔ３Ｆ／Ｂｏτ株を得た。
【００５１】
Ｔ３−／Ｂｏτ株、Ｈ４／Ｂｏτ株、及びＨ４−Ｔ３Ｆ／Ｂｏτ株によるカイコ幼虫におけるＢｏＩＦＮ−τの発現を確認した。５齢１日目のカイコ（錦秋×鐘和、３０頭、愛媛蚕種株式会社より入手）に同じ感染価のＴ３−／Ｂｏτ株、Ｈ４／Ｂｏτ株、及びＨ４−Ｔ３Ｆ／Ｂｏτ株を接種し、その後飼育５日目に感染カイコの体表にカミソリで傷つけ、１００ｍＬ（４℃）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ中に体液（約０．５  ｍＬ／頭）を回収した。この体液回収液から、陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  １ｍＬ（ＧＥヘルスケア）と金属キレートカラムＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ  １ｍＬ（ＧＥヘルスケア）を用いて、添付のプロトコールに従ってＢｏＩＦＮ−τを精製した。ＢｏＩＦＮ−τの回収量は、Ｔ３−／Ｂｏτが８０ｕｇ／幼虫、Ｈ４／Ｂｏτ及びＨ４−Ｔ３Ｆ／Ｂｏτが１８０ｕｇ／幼虫であった。
精製したＢｏＩＦＮ−τのＮ末端アミノ酸配列を確認したところ、シグナルペプチド部分が昆虫細胞においても切断されてカイコ体液中に分泌されていることが判明した。実際には１アミノ酸多い、Ｎ末端から２４アミノ酸が切断されている組換えタンパク質（配列番号１６）であった。このタンパク質の推定分子量は１９．６ｋＤａであるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの見かけの大きさは約２２ｋＤであり、糖鎖が付加されていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスは、カイコ生体を用いたバキュロウイルス発現ベクターシステムにおいて、増殖性の優れた目的タンパク質発現用ベクターとして用いることができる。本発明の組換えカイコ核多角体病ウイルスを用いたバキュロウイルス発現ベクターシステムは及び本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、目的タンパク質を大量に且つ容易に製造することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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