(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の工程：
ａ）３５℃未満の温度で、架橋されていない形態の少なくとも１つの多糖を含む水性ゲルを、少なくとも１つの二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤と一緒に提供する工程；
ｂ）工程ａ）の混合物を、３５℃未満の温度で少なくとも１時間維持する工程；及び
ｃ）工程ｂ）の後に得られた前記混合物の架橋反応を促進して架橋ゲルを形成する工程であって、３５から６０℃の間の温度で熱的に行われる工程
を含む、少なくとも１つの多糖又はその塩のうちの１つの架橋ゲルの製造方法。
【請求項２】
前記多糖が、ヒアルロン酸又はその塩のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）及びｂ）が、１５から２５℃の範囲の温度で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）が、１時間より長い時間行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）の後に得られた前記混合物が、適切な容器内に、
（ｉ）水性媒体；
（ｉｉ）架橋されていない形態の、少なくとも１つの多糖又はその塩のうちの１つ；及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤
を一緒に入れ、得られた混合物を均一化することによって得られ、化合物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を前記容器に加える順番は問題としない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記均一化する工程が、２００分未満の時間で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ｃ）が、４５から５５℃の間の温度で行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｃ）が、３０から３００分の範囲の時間で行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記架橋剤が、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多糖が、１ＭＤａ以上の分子量を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多糖が、前記水性ゲルの全質量に対して５から１５質量％の間の含有量で、架橋されていない形態で、前記多糖の前記水性ゲル中に存在する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アルカリ性媒体中のヒアルロン酸ナトリウム、及び架橋剤としてのブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を用いる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋ゲルが、主に弾性の粘弾性単相ゲルである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚の体積欠陥を持続的に埋めるための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を実行することによって得られた架橋ゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、架橋された多糖、好ましくはヒアルロン酸又はその塩のうちの１つに基づくヒドロゲルの製造方法を提供することである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚中に自然に存在するヒアルロン酸は、その粘弾性及びその非常に強い水を吸収する傾向が知られている。その特性により、皮膚の弾力性が主に説明される。その生体適合性、耐性及び毒性の欠如により、１０年以上の間、この分子は、医薬及び化粧品の分野において、特にしわを埋めるために用いられてきた。したがって、処置されるべきしわの真皮に架橋された多糖のヒドロゲルを注入することは、しわとなっている真皮の構造における局所的なたるみを低減する、もしくは除去することの助けとなる。
【０００３】
一般的に、多糖、より詳しくはヒアルロン酸は、分解及び熱に対する耐性により、架橋された形態で使用される。
【０００４】
これらの架橋された多糖ゲルは、様々な製造方法で得ることができる。これらの方法は、一般的に、２つの主な工程を必要としており、１つ目は問題となっている多糖を水和させて、それを水性ゲルに転換する工程であり、２つ目は前記水性ゲルを、その架橋を引き起こす典型的な試薬の存在下で架橋させる工程である。
【０００５】
ヒアルロン酸の従来の架橋方法は、通常、約４０℃、又は５０℃の温度で、３時間未満の時間で行われ、これにより多糖ゲルを十分に架橋させることができる。この理由により、この製造方法は、産業界において広く用いられている。
【０００６】
これらの方法の例示として、米国特許出願公開第２００６／０１０５０２２号に記載された方法は、酸性又は塩基性の条件下において、少なくとも１０％のヒアルロン酸、架橋剤、及び水を含む混合物の使用を含むこと、国際公開第２００６／０５６２０４号に記載された方法は、ジビニルスルホンにより架橋されたヒアルロン酸のゲルを処理する工程を含むこと、米国特許出願公開第２００７／００３６７４５号に記載された方法は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）により架橋されたヒアルロン酸ポリマーから出発する凝集性ゲルをもたらすことが特に言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１０５０２２号
【特許文献２】国際公開第２００６／０５６２０４号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／００３６７４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
明らかな理由から、医薬及び化粧品の分野における用途のためのヒドロゲルの機械的特性を改良する一定の目的が存在する。
【０００９】
本発明の目的は、具体的には、特に有利な機械的性質を有する架橋ゲルを得るための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
予想に反して、本発明者らは、架橋ゲルの新規な製造方法により、従来の方法により得られたものによって現れる特性と比較して、ゲルの特性を大きく改善することが可能であることを発見した。
【００１１】
したがって、本発明は、その第一の態様によると、少なくとも以下の工程：
ａ）３５℃未満の温度で、架橋されていない形態の少なくとも１つの多糖を含む水性ゲルを、少なくとも１つの二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤と一緒に提供する工程；
ｂ）工程ａ）の混合物を、３５℃未満の温度で少なくとも１時間維持する工程；
ｃ）工程ｂ）の後に得られた混合物の架橋反応を促進する工程；及び必要があれば、
ｄ）形成した架橋ゲルを回収する工程
を含む、少なくとも１つの多糖又はその塩のうちの１つの架橋ゲルの製造方法に関する。
【００１２】
より正確には、本発明は、順々の２つの異なる架橋速度（１つ目は特に遅く、２つ目は十分に速い速度）の使用により、１つの架橋速度を用いる従来の方法により得られたゲルと比較して、十分に改善された粘弾性を有する架橋された多糖ゲルを得ることができる、という本発明者らによる予想外の観察に関する。
【００１３】
以下の実施例３から明らかであるとおり、本発明の方法を実行して得られた架橋ゲルにより現れる新規な粘弾性は、従来の架橋方法、すなわち４０℃より高い温度で１つの速度を適用する架橋反応を行う方法によって得られたゲルでは、この１つの反応速度を長時間適用しても、全く再現することができない。
【００１４】
特定の一実施形態によると、本発明の方法は、ｅ）架橋ゲルを、その架橋を停止するために都合の良い条件に曝すことからなる、架橋を停止する工程をさらに含み、この工程は、場合により回収工程ｄ）の前、間又は後に行ってもよい。
【００１５】
好ましい実施形態によると、工程ｅ）は、工程ｄ）の前に行われる。
【００１６】
有利には、本発明による方法を実行した後に得られる架橋ゲルは、単相ゲル、より詳しくは大部分が弾性の粘弾性ゲル、すなわち、その自重以外の応力の不存在下では、ほとんど又は全く流動しないものである。
【００１７】
本発明の別の態様によると、本発明は、皮膚の体積欠陥を持続的に埋めるため、特にしわを埋めるための、上記の方法を実行することによって得られた架橋ゲルの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】弾性係数Ｇ’（Ｐａ）により測定したヒアルロン酸ゲルの粘弾性を示す。
【図２】１２％水性ヒアルロン酸ゲルとＢＤＤＥとの混合物を、室温で２時間維持する第一工程、続けて前記混合物を５２℃で数時間保温する第二工程によって特徴付けられる架橋工程の後に得られたヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（Ｐａ）の変化を示す。
【図３】１２％水性ヒアルロン酸ゲルとＢＤＤＥとの混合物を、５２℃で数時間保温する単一の工程によって特徴付けられる架橋工程の後に得られたヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（Ｐａ）の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ）方法
本発明の方法は、第一の工程において、架橋されていない形態の少なくとも１つの多糖を含む水性ゲルを、二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤と一緒に提供する工程を含む。
【００２０】
用語「架橋されていない」は、本発明の文脈において、架橋されていない又はわずかに架橋された水性多糖ゲル、すなわち、１Ｈｚの動的なレオロジー条件下で測定される、１Ｐａより大きい応力を受けた場合の４０°より大きい位相シフト角（ｐｈａｓｅ−ｓｈｉｆｔ  ａｎｇｌｅ）δを有するゲルを意味する。
【００２１】
より正確には、工程ａ）において考えられる水性ゲルは、適切な容器内に、
（ｉ）水性媒体；
（ｉｉ）架橋されていない形態の少なくとも１つの多糖、又はその塩のうちの１つ；及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤
を一緒に入れ、得られた混合物を均一化することによって事前に得られてもよく、化合物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を容器に加える順番は問題としない。
【００２２】
実施形態の第一の変形例によると、この水性ゲルは、容器に水性媒体と多糖を導入し、形成した混合物を同時に及び／又は続けて均一化し、その後均一化と同時に及び／又は続けて架橋剤を加えることによって形成されてもよい。
【００２３】
実施形態の第二の変形例によると、この水性ゲルは、容器に水性媒体と多糖と架橋剤とを導入し、形成した混合物を同時に及び／又は続けて均一化することによって得られてもよい。
【００２４】
この実施形態の第二の変形例は、１つの均一化工程を行う点で有利である。
【００２５】
有利には、この水性ゲルを形成する工程は、３５℃未満の温度、好ましくは１５から２５℃の範囲の温度、さらに好適には室温で行われてもよい。
【００２６】
どの実施形態を問題としても、工程ａ）において考慮する水性ゲルの形成は、少なくとも１つの均一化操作を含む。
【００２７】
この操作の目的は、架橋剤の存在下で行われても行われなくても、より詳しくは、水性媒体中の多糖、及び必要があれば架橋剤に対して、完全に水和させ均一化させ、これにより期待される架橋ゲルの特性を最適化することを助けることである。
【００２８】
これらの理由から、架橋ゲルの均一性は、架橋する前のゲルの均一性に大きく依存する。
【００２９】
均一化は、得られた溶液が均一に着色され、凝集物が存在せず、均一な粘度を有する場合に十分であると考えられる。均一化は、有利には、穏やかな操作条件下で行われて、多糖鎖の分解を防ぐ穏やかな操作条件下で行われてもよい。
【００３０】
この工程は、多糖が高分子量を有する場合により重要であり、それはこのような化合物の水和が、凝集体の外観が一般的に観察される高粘度の溶液の形成をもたらす傾向があるからである。
【００３１】
この均一化工程の時間は、多糖の性質、より詳しくはその分子量及びその濃度、水性媒体中の操作条件、及び使用する均一化装置に依存する。
【００３２】
十分に均一な水性多糖ゲルを得るために好適な均一化時間を調整することは、当業者の一般的な知識の範囲内である。
【００３３】
好ましくは、本発明による均一化工程は、２００分未満、好ましくは１５０分未満、さらには１５から１００分の間の時間にわたって行われてもよい。
【００３４】
前述のとおり、順々に２つの異なる架橋速度を工程ａ）の水性ゲルに適用し、これらはそれぞれ本発明の工程ｂ）及びｃ）によって説明される。
【００３５】
架橋の目的は、多糖鎖、特にヒアルロン酸鎖の間に橋かけを作ることであり、これにより粘性溶液から緻密な固体の３次元構造を得ることができる。
【００３６】
ｉ）工程ｂ）を行う条件
工程ｂ）は、工程ａ）の混合物を、３５℃未満の温度で少なくとも１時間維持することを必要とする。
【００３７】
したがって、工程ｂ）は、それを行う環境条件下において、遅い架橋速度にのみ対応する。
【００３８】
好ましくは、工程ｂ）は、１５から２５℃の範囲の温度、さらに好適には室温で行われる。
【００３９】
工程ｂ）において考えられる遅い架橋速度は、特に、工程ａ）の後に得られる混合物中のエポキシ架橋剤の消失速度によって特徴付けられ得る。
【００４０】
したがって、工程ｂ）の間のエポキシ架橋剤の平均消失速度は、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸濃度に対して、５ｐｐｍ／分未満、好ましくは２ｐｐｍ／分未満である。
【００４１】
好ましくは、工程ｂ）は、１時間より長い時間、好ましくは２時間より長い時間行われる。
【００４２】
好ましくは、工程ｂ）は、１から２時間３０分、さらには１時間３０分から２時間の間の時間にわたって行われてもよい。
【００４３】
ｉｉ）工程ｃ）を行う条件
しかし、工程ｃ）は、架橋反応を促進することを必要とする。
【００４４】
したがって、用語「促進する」は、本発明の文脈において、架橋反応の速度を十分に増加させることを意味する。
【００４５】
架橋反応を促進するために適した特定の条件は、多糖の性質、その分子量、水性媒体、及び架橋剤の性質に依存し得る。
【００４６】
一般的に、この促進は、工程ｂ）の後に得られた混合物を、誘発要因又は促進剤と接触させることによって、例えば加熱又はＵＶへの曝露、或いは前記混合物を触媒タイプの物質と接触させることによって達成されてもよい。
【００４７】
このような誘発要因の選択は、当業者の一般的な知識の範囲内である。
【００４８】
したがって、誘発要因は、
−工程ｂ）の後に得られた混合物を含む容器を、熱い流体を含有する槽の中に浸漬すること；
−前記混合物を、特定の波長の放射、例えばＵＶ、マイクロ波又は赤外放射に曝露すること；
−米国特許出願公開第２００８／０１３９７９６号に記載された方法により、電離線により照射すること；及び
−酵素による架橋
によって適用されてもよい。
【００４９】
本発明の文脈において、この誘発要因は、有利には、工程ｂ）の後に得られた混合物の温度の上昇によって表される。
【００５０】
工程ｃ）に対する特に好適な温度は、問題となる多糖の性質に依存する。
【００５１】
多糖がヒアルロン酸である場合、工程ｃ）に対する特に好適な温度は、３５℃から６０℃の間、好ましくは４５から５５℃の間、さらに好適には４８から５２℃の間である。
【００５２】
上記の工程ｂ）の場合、工程ｃ）において考えられる速い架橋速度は、特に、工程ｂ）の後に得られる混合物中のエポキシ架橋剤の消失速度によって特徴付けられ得る。
【００５３】
したがって、工程ｃ）の間の架橋剤の平均消失速度は、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸濃度に対して、５ｐｐｍ／分より大きく、好ましくは７ｐｐｍ／分より大きい。
【００５４】
架橋の程度は、工程ｂ）の後に得られた混合物の架橋時間にも依存する。時間が長くなるほど、架橋の程度は高くなるが、最適化は、多糖の分解のリスクを負うことなしには超えない。
【００５５】
したがって、工程ｃ）は、３０から３００分、好ましくは１００から２００分、さらには１５０から１９０分の範囲の時間にわたって行われてもよい。
【００５６】
有利には、架橋条件を調整して、架橋効率を最大化する、すなわち、使用された最小量の架橋剤に対して、最大の効率の架橋度を得る。
【００５７】
特定の好ましい一実施形態によると、架橋する工程ｂ）及びｃ）は塩基性媒体中で行われ、工程ａ）の後に得られる混合物を含む容器は、室温で１時間維持され、その後約５０から５５℃の温度に加熱された恒温槽中に、少なくとも１時間、好ましくは１時間半から３時間半の間入れられる。
【００５８】
上で説明したとおり、架橋を停止する工程（工程ｅ））は、ゲルを回収する工程ｄ）の前、間又は後に行われてもよい。
【００５９】
本発明による方法におけるこのような工程は、架橋したゲルを、又は架橋する間に、さらにはそれを含む容器を、架橋を停止するために都合の良い条件、或いは様々な多糖鎖の間の結合の形成を停止することができる条件に曝すことを必要とする。
【００６０】
好ましい実施形態の変形例によると、工程ｅ）は、工程ｄ）の前に行われる。
【００６１】
例えば、架橋プロセスを促進するために適用される熱的条件について、架橋は、
−恒温槽から容器を単純に取り出し、それを室温に戻るまで冷却することによって；
−容器を室温に近い温度になるまで、好ましくは室温より低い温度の冷水槽に入れることによって；又は
−容器からゲルを抽出することによって
停止されてもよい。
【００６２】
放射による架橋の場合、これはゲルの放射への曝露を停止することによって停止される。
【００６３】
特定の一実施形態によると、本発明の方法は、工程ａ）の後に得られた混合物、又は工程ｂ）の後に得られた混合物を、１００ミクロンより大きい直径を有するあらゆる粒子を保持することができる少なくとも１つの装置を通すことからなる、少なくとも１つの工程を含む。
【００６４】
この特定の工程は、以下で「押出工程」とも呼ばれ、工程ａ）の後且つ工程ｂ）の前、及び／又は工程ｂ）の後且つ工程ｃ）の前に行われる。
【００６５】
以下の実施例から浮かび上がるとおり、この押出工程と関連する有利な効果は、さらに改善された粘弾性を有する架橋ゲルが得られることである。
【００６６】
押出装置の種類の選択は、当業者の一般的な知識の範囲内である。
【００６７】
有利には、押出工程は、少なくとも１つのフィルターを含む少なくとも１つの装置を使用して行われる。
【００６８】
当業者は、このようなフィルターの空隙率、形状、強度及び保持力の点における好適な特徴を定めることができ、１００ミクロンより大きい直径を有するあらゆる粒子を保持しながら、工程ａ）の後、又は工程ｂ）の後に得られる混合物を通すことができる。
【００６９】
本明細書の残りにおいて、押出工程を行うために使用される少なくとも１つのフィルターを含む装置が、「押出装置」の表現によって記載されてもよい。
【００７０】
有利には、押出工程は、２から１００ミクロンの範囲、好ましくは５から５０ミクロンの範囲、さらに好適には８から３０ミクロンの範囲、より詳しくは１０ミクロンの空隙を有する少なくとも１つのフィルターを含む少なくとも１つの装置によって行われる。
【００７１】
有利には、押出装置を通した工程ａ）及び／又はｂ）の後に得られる混合物の押出の線形速度は遅く、その通過の間に多糖鎖は分解しない。
【００７２】
したがって、押出装置を通した工程ａ）及び／又は工程ｂ）の後に得られる混合物の押出の線形速度は、１から１００ｃｍ／分、好ましくは１から４ｃｍ／分の間である。
【００７３】
さらに別の特定の実施形態によると、本発明の方法は、変形可能な壁面を有する特定の容器、例えばポーチの中で、少なくとも部分的に行われてもよい。
【００７４】
これは、このような容器の変形性及びその密閉性により、本発明の方法の様々な工程、特には均一化工程及び架橋工程を、より優れた架橋ゲル、すなわちポット又はタンクタイプの従来の容器を用いる方法によって得られるゲルによって示されるものよりも優れた注入性を有するものが得られる最適な条件下で行うことができるからである。
【００７５】
上記の本発明の方法の後に得られた架橋ゲルは、一般的に、特にその高い多糖濃度及び／又は場合により架橋剤残留物の存在により、或いは上で想定される用途の分野における使用と適合しないその生理学的及び／又はｐＨの条件により、直接注入することができない。
【００７６】
さらに、本発明の方法の後に得られたゲルは、特に、それ自体を患者に注入するには剛性が高すぎる。
【００７７】
それゆえ、当業者に知られている様々な追加の工程を行って、注入可能なヒドロゲルを得ることができる。
【００７８】
より詳しくは、このゲルを中性化し、膨張させる工程が、その埋め込み品質を付与するために必要である。その後、多糖ネットワークの鎖が伸びて水和し、一方ｐＨは真皮のものとなる。
【００７９】
ゲルを保護し、再び密度を高くする工程が、当業者のノウハウによって、埋め込みの品質をさらに改善するために行われ得る。ゲルは、注入される媒体のものと等価の量の塩の存在により、生理学的に処方されなければならない。
【００８０】
高い純度のために、さらなる精製工程を行ってもよい。
【００８１】
最後に、こうして得られたヒドロゲルを使用して、制御された雰囲気条件下でシリンジを満たしてもよく、前記シリンジは、その後場合によって殺菌工程、好ましくは熱的殺菌工程を受けてもよい。
【００８２】
ＩＩ）多糖
用語「多糖」は、グリコシド結合によって一緒に結合される様々な単糖からなり、一般式：−［Ｃｘ（Ｈ２Ｏ）ｙ］ｎ−を有する、あらゆるポリマーを意味するものと理解される。
【００８３】
本発明による多糖は、より詳しくは、本発明により得られる架橋ゲルが示すことが望まれる特性の点で選択される。より詳しくは、このような多糖は、優れた生体適合性を有しなければならない。
【００８４】
したがって、生理学的に許容可能な多糖又は多糖の塩は、天然由来又は合成由来のものであってもよい。
【００８５】
本発明に好適な多糖は、特に、以下から選択されてもよい：コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、キサンタン、カラギーナン、ヒアルロン酸、キトサン、セルロース及びその誘導体、アルギネート、デンプン、デキストラン、プルラン、ガラクトマンナン、並びにこれらの生物学的に許容可能な塩。
【００８６】
本発明による多糖の塩は、より詳しくは、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銀塩及びこれらの混合物などの生理学的に許容可能な塩、好ましくはナトリウム塩から選択される。
【００８７】
好ましくは、本発明による多糖又は多糖の塩は、問題となる用途に応じて、高分子量、好ましくは１０００００Ｄａ以上、さらに好適には１ＭＤａ（つまり１×１０６Ｄａ）以上、さらには３ＭＤａ（つまり３×１０６Ｄａ）より高い分子量を有する。
【００８８】
特定の好ましい多糖は、ヒアルロン酸又はその塩のうちの１つ、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）である。
【００８９】
有利には、多糖は、水性ゲルの全質量に対して、５から１５質量％の範囲の含有量で、好ましくは１０質量％より高い含有量で、架橋されていない形態で多糖の水性ゲルの中に存在してもよい。
【００９０】
上記のとおり、本発明による方法の工程ａ）の混合により、少なくとも１つのエポキシ架橋剤と組み合わされた、架橋されていない形態の少なくとも１つの水性多糖ゲル、又はその塩のうちの１つが得られる。
【００９１】
ここで、前記水性多糖ゲルは、前記多糖、又はその塩のうちの１つを前もって水性媒体と接触させることによって得られてもよい。
【００９２】
用語「水性媒体」は、本発明の文脈において、水を含み、多糖又はその塩のうちの１つを溶解する特性を有するあらゆる液体媒体を意味するものと理解される。
【００９３】
水性媒体の性質は、より詳しくは、想定される架橋の種類だけでなく、使用するポリマーの種類にも依存する。
【００９４】
この点について、好適な水性媒体は、酸性又は塩基性のどちらであってもよい。
【００９５】
特に好ましい水性媒体は、アルカリ性の媒体、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、より詳しくは１２より高いｐＨを有する水酸化ナトリウム溶液である。
【００９６】
ＩＩＩ）エポキシ架橋剤
用語「架橋剤」は、様々な多糖の鎖の間に架橋を導入することができるあらゆる化合物を意味するものと理解される。
【００９７】
架橋される多糖のためのこの架橋剤の選択は、明らかに当業者の能力の範囲内である。
【００９８】
本発明による架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ジエポキシオクタン又は１，２−ビス（２，３−エポキシプロピル）−２，３−エチレンなどの二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤、及びこれらの混合物から選択される。
【００９９】
好ましくは、本発明による架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテルである。
【０１００】
架橋反応を行うための架橋剤の量の調整も、当業者の能力の範囲内である。
【０１０１】
特に好ましい一実施形態によると、本発明の方法は、アルカリ性媒体中のヒアルロン酸ナトリウムを、架橋剤としてのブタンジオールジグリシジルエーテルとともに用いる。
【０１０２】
特許請求の範囲も含む記載を通じて、語句「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ）」は、他で特に記載されていない限り、「を少なくとも１つ含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」と同義であるものと理解されるべきである。
【０１０３】
語句「間の（ｂｅｔｗｅｅｎ  …  ａｎｄ  …）」及び「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ  ｆｒｏｍ  …  ｔｏ  …）」は、他で特に記載されていない限り、境界値を包含することを意味するものとして理解されるべきである。
【０１０４】
以下の実施例及び図面は、本発明の非限定的な例示として提示される。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
以下に記載する架橋ゲルのそれぞれについて、１０ｇのヒアルロン酸（１．５ＭＤａ）、７３ｇの１％水酸化ナトリウム及び１．２ｇのブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を用いた。
【０１０６】
それぞれのゲルに適用した具体的な条件は、以下のとおりであった。
【０１０７】
生成物Ａ（対照）
製造手順は以下の通りであった。
１．ヒアルロン酸／１％水酸化ナトリウムの混合物を、室温で約１時間３０分均一化して、完全に均一な粘性溶液を得た；
２．架橋剤（ＢＤＤＥ）を加え、室温で約２０分間さらに均一化した；
３．ヒアルロン酸／１％水酸化ナトリウムの混合物／ＢＤＤＥの粘性溶液を、５２℃で３時間保温した；及び
４．酸性化リン酸塩緩衝溶液中（架橋ヒアルロン酸溶液）で得られた固体を中性化し、膨潤させ、均一化して、中性に近いｐＨを有する、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸を含有するヒドロゲルを得た。
【０１０８】
生成物Ｂ（本発明による）
生成物Ａに対して記載した手順と同じであるが、工程２と３の間に、工程２の後に得られた混合物を室温で２時間維持する中間工程を行った。
【０１０９】
中間工程は、本明細書の残りにおいて、語句「休止工程」と記されてもよい。
【０１１０】
したがって、５２℃の保温前の合計の「ヒアルロン酸／ＢＤＤＥ」接触時間は、約２時間２０分であった。
【０１１１】
生成物Ｃ（本発明による）
生成物Ａに対して記載した手順と同じであるが、工程２の後に、ＢＤＤＥを加えて１５分間均一化し、押出す工程、続けて生成物Ｂを室温で２時間維持する中間工程、その後５２℃での３時間の保温工程３を行った。
【０１１２】
押出工程は、１０ミクロンのメッシュサイズを有する押出機のスクリーンパック型の円形スクリーンによって行われた。
【０１１３】
５２℃での保温前の合計のヒアルロン酸／ＢＤＤＥ接触時間は、約２時間２０分であった。
【０１１４】
シリンジを、生成物Ａ、Ｂ及びＣで全て満たした。これらの３つの生成物の粘弾性を、コーン／プレート形状（１°のコーン角度／３５ｍｍ直径のプレート）を有するレオメーター（Ｈａａｋｅ  ＲＳ６０００）を使用して測定した。歪み走査（ｓｔｒａｉｎ  ｓｃａｎ）を行い、弾性係数Ｇ’（Ｐａ）及び位相シフト角δ（°）を、５Ｐａの応力に対して測定した。
【０１１５】
結果
以下の図１は、測定された弾性係数Ｇ’値（Ｐａ）を示す。表示について、位相シフト角δの値（°）をそれぞれの棒の上のＧ’値の右に示す。
【０１１６】
測定された位相シフトは非常に小さく、これはこれらのゲルが主に弾性の特徴を示すことを意味している。
【０１１７】
図１の結果、特に生成物Ｂの結果は、架橋反応が本発明の方法を介して行われた場合、すなわち架橋反応を行うために、順々の２つの異なる速度を用いた場合、Ｇ’が大きく増加することを示している。
【０１１８】
この効果は、１０ミクロンの空隙のフィルターを含む装置を用いて押出工程を行った場合、さらに顕著である。
【０１１９】
（実施例２）本発明による方法を受けたヒアルロン酸ゲル中の架橋剤の量の、様々な段階での評価
様々な架橋ヒドロゲルを、特定の容器、すなわち上で定めた変形可能なポーチを用いて、本発明の方法を使用して同時に製造した。
【０１２０】
１％ＮａＯＨ中の１２％ヒアルロン酸溶液を製造した。ヒアルロン酸が水和した後、１％ＮａＯＨで５倍に希釈したＢＤＤＥ溶液を加えた。
【０１２１】
それゆえ、使用したＢＤＤＥの合計量は、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸ヒドロゲル中で１．８ｍｇ／ｇに等価な理論的含有量に対応する。
【０１２２】
その後、様々な画分Ａ、Ｂ及びＣを、上で得られた混合物から製造した。
【０１２３】
画分Ａは、以下に記載する保温工程の前に、室温（ＲＴ）で１時間維持したヒアルロン酸ゲルに対応する。
【０１２４】
画分Ｂは、以下に記載する保温工程の前に、室温で２時間維持したヒアルロン酸ゲルに対応する。
【０１２５】
最後に、画分Ｃは、以下に記載する保温工程の前に、室温で１時間維持したヒアルロン酸ゲルに対応し、この休止工程は、１０μｍのメッシュサイズのスクリーンを通した押出工程とさらに組み合わされた。
【０１２６】
上記の様々な処理の後、画分Ａ、Ｂ及びＣを、５２℃で３時間保温した。
【０１２７】
その後、この保温工程の後に得られたそれぞれの固形分（架橋ヒアルロン酸溶液）を中性化し、膨潤させ、７．３のｐＨのリン酸塩緩衝溶液中で均一化して、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸ヒドロゲルを得た。
【０１２８】
本発明の方法の様々な工程で消費された架橋剤の量をモニターするために、ＢＤＤＥの分析を様々な工程において行った。
【０１２９】
したがって、サンプルＴ１及びＴ２は、５２℃で３時間保温する工程の前に、ヒアルロン酸／ＢＤＤＥ混合物を室温でそれぞれ１時間及び２時間維持した後のゲルのサンプルに対応する。
【０１３０】
その後、サンプルＴ１及びＴ２を、画分Ａ、Ｂ及びＣに対して上で記載されたものと同じ中性化、膨潤及び均一化工程にかけ、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸のヒドロゲルを得た。
【０１３１】
サンプルＡ、Ｂ及びＣは、５２℃で３時間保温され、２０ｍｇ／ｇのヒドロゲルに転換された後の対応する画分からのゲルのサンプルに対応する。
【０１３２】
結果
表１は、測定された架橋剤の量及び得られたヒドロゲルの弾性係数（Ｇ’、Ｐａ）の値を示す。
【０１３３】
表示について、複素粘度η＊及び位相シフト角δが示されている。
【０１３４】
【表１】
0005860060.tif 000002
【０１３５】
測定された残留物のＢＤＤＥ含有量は、殺菌されておらず、精製されていないゲルに対応することに注意すべきである。
【０１３６】
サンプルＴ１及びＴ２中の測定された架橋剤（ＢＤＤＥ）の含有量は、同じ桁である。上で示された理論的な含有量と比較した、測定されたＢＤＤＥの含有量の小さな減少は、遅い速度の架橋反応によって説明され、これはエポキシ官能基の不安定性によるＢＤＤＥの分解と関連し得る。
【０１３７】
対照的に、ＢＤＤＥ含有量の減少は、５２℃での３時間の保温工程の後に大きく加速され、このＢＤＤＥの実質的な消費は、速い速度の架橋反応に対応する。
【０１３８】
得られたゲル（画分Ａ、Ｂ及びＣ）の機械的性質について、（ｉ）測定された位相シフトは非常に小さく、これはこれらのゲルが主に弾性の特徴を有することを意味し、（ｉｉ）最も高い弾性係数Ｇ’は、画分Ｂから得られたゲル、すなわち５２℃での保温前に室温で２時間維持する工程を有するものに対して得られ、（ｉｉｉ）架橋の前に押し出された画分Ｃは、押し出されていない同じヒドロゲル（画分Ａ）と比較して、十分に大きい弾性係数Ｇ’を有する、という点を指摘する価値がある。
【０１３９】
上記の（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の点は、本発明による架橋ゲルを製造するための方法において、架橋反応についての順次の２つの異なる架橋速度を用いることだけでなく、押出工程による有利な影響を裏付けるものである。
【０１４０】
（実施例３）
実施例２で記載したものと同一の水性多糖ゲル／架橋剤の混合物を製造した。
【０１４１】
その後、２つの試験を行った。
−第一の場合、上記の混合物から様々な画分Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを製造した。架橋反応を、前記画分を２時間室温にし、その後様々な時間５２℃にすることによって行った。
−第二の場合、様々な画分Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’も製造した。画分Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤとは異なり、これらは５２℃で様々な時間直接保温した。
【０１４２】
様々な画分に対する５２℃での保温時間は以下のとおりであった。
・画分Ａ及びＡ’：２時間４０分
・画分Ｂ及びＢ’：２時間５０分
・画分Ｃ及びＣ’：３時間
・画分Ｄ及びＤ’：３時間１０分
【０１４３】
その後、保温工程の後に得られた架橋ヒアルロン酸ゲルを中性化し、その後膨潤させ、７．３のｐＨのリン酸塩緩衝液（ＰＢ）中で均一化して２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸ヒドロゲルを得た。以下の特性評価及び分析を、得られたヒドロゲルに対して行った。
【０１４４】
結果
以下の表２は、得られたヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（Ｐａ）の値を示す。表示について、複素粘度η＊及び位相シフト角δが示されている。
【０１４５】
【表２】
0005860060.tif 000003
【０１４６】
以下の図２及び図３は、上の表２で示した結果を示す。
【０１４７】
架橋の５２℃の保温工程の最適な効果は、室温で水性多糖ゲル／架橋剤の混合物を維持する前工程を有していても有していなくても、約３時間で発生する。
【０１４８】
５２℃の保温工程の前に室温で２時間維持する工程を用いる方法によって得られたヒドロゲルは、室温で維持する工程を有しない手順で得られたヒドロゲルに対して測定された最大値よりも、十分に優れた粘弾性を有している。
【０１４９】
これらの結果は、水性多糖ゲル／架橋剤の混合物を周囲温度で長時間維持する工程の架橋反応を行うことの存在による有益な効果が、５２℃での架橋時間を延長することによっては単純に再現され得ないことを実証している。
【０１５０】
これは、本発明の架橋方法によって得られたヒドロゲルに対して測定された最適なＧ’が、５２℃での保温工程の時間に関わらず、従来の架橋方法によって得られたヒドロゲルによっては達成されなかったからである。
【図１】
0005860060.tif 000004
【図２】
0005860060.tif 000005
【図３】
0005860060.tif 000006