(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄シアノ錯体からなる固体微粒子が３〜７ｇ／Ｌの濃度で分散してなる厚み１〜２ｍｍの固体培地を含むことを特徴とする固体培地プレート。
【請求項２】
鉄シアノ錯体を含まない支持培地を含み、その上に前記固体培地が積層された構成を有する請求項１に記載の固体培地プレート。
【請求項３】
前記鉄シアノ錯体が、Ｆｅ（III）4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］3、Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2、及びＦｅ（II）2［Ｆｅ（II）(ＣＮ）6］から選択される１種あるいは２種以上である請求項１または２に記載の固体培地プレート。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の固体培地プレートの固体培地に微生物を塗付する工程、前記微生物を培養する工程、及びハローを形成する微生物を選抜する工程を有することを特徴とするシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法。
【請求項５】
ロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）ＢＨ０２１３株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７９１）またはロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）ＢＨ０２３４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７１９）であるシアン化合物分解微生物。
【請求項６】
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＢＨ０４０１０１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７９０）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＢＨ０４０２０４株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７２２）、またはバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＢＨ０４０１０２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７２１）であるシアン化合物分解微生物。
【請求項７】
請求項５または６に記載のシアン化合物分解微生物の少なくとも１種を、シアン化合物含有土壌、排水または地下水に添加する、シアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体培地プレート、及びそれを用いるシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法に関する。さらに詳しくいえば、鉄シアノ錯体の固体微粒子を培地中に分散させた固体培地プレート、そのプレートでハロー形成させることによりシアン化合物分解微生物をスクリーニングする方法、及びそのシアン化合物分解微生物、並びにシアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアン化合物は、２００３年に施行された土壌汚染対策法の第二種特定有害物質に指定されており、近年その浄化技術として微生物によるバイオレメディエーションの開発が進められている。バイオレメディエーションで本質的に浄化性能を向上させるためには、栄養源などを系内に添加して常在微生物を活性化するだけでなく、分解性能の高い微生物を取得して系内に導入することが効果的である。
【０００３】
シアン化合物分解微生物の取得方法としては、窒素源として金属シアノ錯体やニトリル化合物などのシアン化合物を含有する培地に土壌を懸濁し集積培養した培養物を、シアン化合物を含有する寒天プレートで培養し、単一コロニーを形成した微生物を、シアン化合物を含有する培地で１０〜４０日間培養した後、残存全シアン濃度を測定してシアン化合物分解能の評価を行って高性能微生物を選抜する方法（特許文献１：特開２００１−２４５６５５号公報）や、土壌を懸濁した生理食塩水の上清をフェロシアン寒天プレートで培養して形成したコロニーを単離した後、フェロシアン液体培地に接種して３０℃で２週間、振とう培養した培養液の上清をＨＰＬＣによりフェロシアン濃度分析する性能評価試験を行い、濃度低下した菌株をスクリーニングする方法（特許文献２：特開２０００−２７０８５３号公報）が知られている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１及び２のいずれも、目的微生物のシアン化合物分解性能の有無や優劣をプレート上で直接判定できる方法でなく、高分解性能を有する微生物のスクリーニングは、比較したいコロニーを全て個別に液体培養してシアン化合物濃度の測定をしなくてはならず、時間と手間がかかり効率が良くない。
【０００５】
液体培養して濃度測定する方法以外でシアン化合物分解性能を有する微生物を検出する方法としては、微生物中の核酸から、シアン浄化に関わるロダナーゼ（チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ）遺伝子を検出させる方法（特許文献３：特開２００８−２８３８９０号公報）が知られている。この方法は、浄化プロセスにおける、微生物の浄化適合性の判断や浄化活性のモニタリングには有効であるものの、遺伝子の調製や増幅、増幅産物の検出などの工程を有し、時間と手間がかかるため、シアン化合物分解微生物のスクリーニングを効率的に行うことはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２４５６５５号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８５３号公報
【特許文献３】特開２００８−２８３８９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、従来のシアン化合物の分解に有効な微生物を取得する方法は、いずれも時間と労力がかかるため、シアン化合物分解微生物を効率よく取得できる技術の確立が望まれていた。
本発明の目的の１つは、シアン化合物分解微生物を効率的に取得できる固体培地プレート及びそれを用いたシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法の提供にある。本発明の他の目的はシアン化合物分解微生物及びそれを用いたシアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、濃青色の鉄シアノ錯体の固体微粒子を培地に分散した固体培地プレートに微生物を塗布、培養し、微生物による鉄シアノ錯体の分解で形成されるプレートのハロー（クリアーゾン）を観察することによりシアン化合物分解微生物をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［５］の固体培地プレート、［６］のシアン化合物分解微生物スクリーニング方法、［７］〜［１０］のシアン化合物分解微生物、及び［１１］〜［１２］のシアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法に関する。
［１］  鉄シアノ錯体の固体微粒子が固体培地中及び／または固体培地上に分散していることを特徴とする固体培地プレート。
［２］  前記鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地が、前記鉄シアノ錯体を含まない支持培地上に積層されている前項［１］に記載の固体培地プレート。
［３］  前記鉄シアノ錯体が、Ｆｅ（III）4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］3、Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2、及びＦｅ（II）2［Ｆｅ（II）(ＣＮ）6］から選択される１種あるいは２種以上である前項［１］または［２］に記載の固体培地プレート。
［４］  前記鉄シアノ錯体の固体微粒子の濃度が１〜１０ｇ／Ｌである前項［１］〜［３］のいずれかに記載の固体培地プレート。
［５］  前記鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地の厚みが０．１〜３ｍｍである前項［１］〜［４］のいずれかに記載の固体培地プレート。
［６］  前項［１］〜［５］のいずれかに記載の固体培地プレートの鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散している固体培地上に微生物を塗付する工程、前記微生物を培養する工程、及びハローを形成する微生物を選抜する工程を有することを特徴とするシアン化合物分解微生物のスクリーニング方法。
［７］  前項［６］に記載のスクリーニング方法により選抜されたシアン化合物分解微生物。
［８］  ロドコッカス（Rhodococcus）属、バチルス（Bacillus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、またはアシネトバクター（Acinetobacter）属に属する前項［７］に記載のシアン化合物分解微生物。
［９］  ロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）ＢＨ０２１３株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７９１）またはロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）ＢＨ０２３４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７１９）であるシアン化合物分解微生物。
［１０］  バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＢＨ０４０１０１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７９０）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＢＨ０４０２０４株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７２２）、またはバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＢＨ０４０１０２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７２１）であるシアン化合物分解微生物。
［１１］  前項［７］〜［１０］のいずれかに記載のシアン化合物分解微生物の少なくとも１種を、シアン化合物含有土壌、排水または地下水に添加する、シアン化合物含有土壌、排水または地下水の浄化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の固体培地プレートを用いたスクリーニング法を用いれば、シアン化合物分解微生物を効率的に取得できる。また、スクリーニングされたシアン化合物分解微生物を用いることによりシアン化合物含有土壌、排水または地下水を浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】シアン非分解菌バチルス・ズブチリスＳＤ９０１株（左）とシアン分解菌アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）Ｎｏ．５株（右）を培養したブループレートの写真である。
【図２】ハロー形成菌のハロー直径と溶出全シアン分解濃度の関係を示すグラフである。
【図３】実施例２によりスクリーニングされたシアン化合物分解微生物をシアン化合物含有土壌に添加した際の土壌中の溶出全シアン濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
［固体培地プレート］
本発明の固体培地プレート（以下、「ハロープレート」、「ブルー培地」、「ブループレート」と称することがある。）は、濃青色の鉄シアノ錯体の固体微粒子が固体培地中及び／または固体培地上に分散していることを特徴とし、培地支持体、鉄シアノ錯体の固体微粒子及び栄養成分を主成分とする。
【００１４】
培地支持体は、微生物の生育を阻害せずに、水に成分を添加した培地液を固形化できる機能を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、寒天、ゼラチン、ゲランガム、グルコマンナン等を用いることができ、好ましくは寒天を１０〜３０ｇ／Ｌ、より好ましくは１５〜２０ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。
【００１５】
本発明で使用する鉄シアノ錯体の固体微粒子は、上記の培地支持体に溶解せず、分散させることができる鉄シアノ錯体の沈殿物であり、一般名として紺青、ベルリンブルー、ターンブルブルー、プルシアンブルー、ミロリーブルー、チャイニーズブルー、パリブルーを指し、Ｆｅ（III）4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］3、Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2、Ｆｅ（II）2［Ｆｅ（II）(ＣＮ）6］の組成式で示される。
【００１６】
本発明では、Ｆｅ（III）4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］3、Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2、及びＦｅ（II）2［Ｆｅ（II）(ＣＮ）6］から選択される１種あるいは２種以上を、固体培地中１〜１０ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。鉄シアノ錯体の固体微粒子の濃度が１ｇ／Ｌ未満であると分散した微粒子の青色が薄くなり、１０ｇ／Ｌを超えると分散した微粒子の青色が濃くなるため、微生物による分解の結果（ハロー形成）の判別が困難となる。
【００１７】
前記鉄シアノ錯体の固体微粒子は市販品の入手が可能であるが、例えば３Ｋ4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］＋２Ｆｅ2（ＳＯ4）3 → Ｆｅ（III）4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］3↓＋６Ｋ2ＳＯ4、２Ｋ3［Ｆｅ（III）（ＣＮ）6］＋３ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ → Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）（ＣＮ）6］2↓＋３Ｋ2ＳＯ4＋２１Ｈ2Ｏ、Ｋ4［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］＋２ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ → Ｆｅ（II）2［Ｆｅ（II）（ＣＮ）6］↓＋２Ｋ2ＳＯ4＋１４Ｈ2Ｏのように鉄シアノ錯体に過剰の鉄イオンを加えて、１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは３〜７ｇ／Ｌの濃度で沈殿させたものを使用することが、沈殿生成反応前の溶液状態で滅菌できることから好ましい。
【００１８】
栄養成分としては、例えばニュートリエントブロス、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、酵母エキス、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、尿素、グルコース、シュークロース、フルクトース、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、ビオチン、チアミン等を、１種あるいは２種以上を組み合わせて、０．１〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは５〜１５ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。
上記各成分を水に加えて分散させた液を固体培地液として調製する。
【００１９】
固体培地の滅菌としては、オートクレーブ滅菌や除菌フィルターろ過等の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また各培地成分は、全成分一括、全成分分割、部分的な分割のいずれでも滅菌することができる。以下に固体培地液の滅菌及びハロープレートの作製方法の例を示す。
【００２０】
鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散しているハロープレートの形は特に限定されないが、例えば滅菌シャーレに上記の通り無菌的に、滅菌した固体培地液を、例えば厚み０．１〜３ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍになるように添加し室温放置して固めることができる。厚みは０．１ｍｍより薄いと微生物を含有する液をプレートに塗付する際にプレートが破損しやすくなることがあり、３ｍｍより厚いと微生物が生育している表層面から離れた培地中に分散している鉄シアノ錯体微粒子の青色により表層面におけるハロー形成（色ぬけ）を確認しにくくなる。
【００２１】
プレートの厚みが薄い場合、鉄シアノ錯体の固体微粒子を含まない培地支持体を水に添加し滅菌した液を固化した支持培地上に上記ハロープレートを積層した２層構造としてハロープレートの強度を補強することができる。また、鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散した固体培地は濃青色を呈しているので、その下層に鉄シアノ錯体の固体微粒子が分散されていない無色または白色の培地支持体を積層することにより単層構成の場合に比べてハロー（色ぬけ）の確認がしやすくなる。
【００２２】
ハロープレートの他の作製方法として、培地支持体及び栄養成分のみを水に添加し滅菌した液を、滅菌シャーレに無菌的に添加して放冷して固化した表面上に、滅菌済みの鉄シアノ錯体の固体微粒子の懸濁液を無菌的に垂らして、滅菌したコンラジ棒などで万遍なく広げて、沈殿層を形成させることもできる。
【００２３】
［スクリーニング方法］
ハロープレートで行うスクリーニングは、微生物を含有する土壌の水懸濁液を直接ハロープレートに塗付して培養することもできるし、一旦、プレート培地及び／または液体培地で培養した培養液を適宜無菌液に希釈してハロープレートに塗付して培養することもできる。
【００２４】
プレート培地及び／または液体培地の培地成分はシアン化合物や栄養源を適宜選択して使うことができるが、好ましくは唯一の窒素源としてフェリシアン化カリウム（Ｋ3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］）やフェロシアン化カリウム（Ｋ4［Ｆｅ（II）(ＣＮ）6］）などのシアン化合物を０．１〜１０ｇ／Ｌ添加し、その他に、グルコース、シュークロース、フルクトースなどの炭素源やＫＨ2ＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4などのリン酸塩、ＭｇＳＯ4、ＦｅＳＯ4、ＭｎＳＯ4などのミネラル類を必要最小限添加した最小培地を用いることができる。
【００２５】
ハロープレート培養条件は、微生物を十分生育させるという観点から、例えば温度は、３０〜４０℃、時間は１〜７日間で行うことができるが、これらに限定されるものではない。ハロープレート上で生育したコロニーの選抜は、ハローを形成し、ハローが大きいものから順に行うことができる。
【００２６】
［選抜した菌株のシアン化合物分解能の評価］
選抜した菌株のシアン化合物分解能の評価は、菌株の培養液を、シアン化合物を含有する土壌や液体培地に接種して評価培養した後のシアン化合物の減少量を確認することにより行うことができる。接種する菌株の培養液は適当な栄養培地で増殖できるが、複数の菌株の優劣を比較する観点から、培養液中の菌数を適当な栄養培地プレートで測定した上、添加後の終濃度を揃えることができる。終濃度は、例えば１０8〜１０10個／ｇの任意数値に設定することができる、
【００２７】
評価培養に用いるシアン化合物は、例えば鉄シアノ錯体、銅シアノ錯体、ニッケルシアノ錯体などの金属シアン錯体、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムなどの無機シアン化物や、ニトリル基を含む有機シアン化合物等を１種あるいは２種以上を組み合わせて、０．１〜５０ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。また栄養成分は、例えばニュートリエントブロス、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、尿素、グルコース、シュークロース、フルクトース、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、ビオチン、チアミン等を、１種あるいは２種以上を組み合わせて、０．１〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは５〜１５ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。評価培養条件は、例えば、温度は３０〜４０℃、時間は１〜６０日間で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
シアン化合物濃度は、土壌の評価培養サンプルの場合は、土壌汚染対策法で用いられる土壌溶出全シアン濃度（溶出全シアン）測定法、すなわち平成１５年度環境省告示１８号「土壌溶出量調査に係る測定方法」により分析することができる。なお、溶出全シアンの単位はｍｇ／Ｌであり、土壌汚染対策法指定基準は＜０．１である。また、液体培地の培養サンプルの場合は、ピリジン−ピラゾロン吸光光度法またはピリジンカルボン酸−ピラゾロン吸光光度法により、全シアン濃度を測定することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの記載により何らの限定を受けるものではない。
【００３０】
実施例１：固体培地プレートのハロー形成実験
ニュートリエントブロス（ＮＢ；Netrient Broth）が８．９ｇ／Ｌ、寒天が２２ｇ／Ｌになるように両成分を水に加えて分散した後、オートクレーブで１２１℃、２０分滅菌した液（Ａ液）と、０．４５μｍの除菌フィルターで除菌した、１１．１ｇ／ＬのＫ3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］水溶液と濃度１４．１ｇ／ＬのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ水溶液を等量ずつ混合して１０．０ｇ／ＬのＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2沈殿を含有する液（Ｂ液）を調製した後、Ｂ液及び水を、冷えて固まる前のＡ液に、表１に記載の各比率で無菌的に添加し混合して、Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2沈殿を１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌの各濃度含有する培地液（＝ブルー培地）を作製した。
【００３１】
【表１】
0005860243.tif 000002
【００３２】
さらに、寒天が２０ｇ／Ｌになるように水に加えて分散した後、オートクレーブで１２１℃、２０分滅菌した液（支持培地）を調製し、固化する前の支持培地を、直径９０ｍｍの滅菌済みシャーレに、表２に記載の各容量を無菌的に分注し室温で静置して固化させた後、固化する前の各濃度のブルー培地を表２に記載の各容量を分注し室温で静置して固化させて、Ｆｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2濃度が１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌで、厚みが１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍのブルー培地層を持つ、合計９種類の固体培地プレート（ブループレート）を作製した。
【００３３】
【表２】
0005860243.tif 000003
【００３４】
次に、シアン分解菌アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）Ｎｏ．５株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０１９号，平成１９年１０月１８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４００号として国内寄託され、平成２０年９月１６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０１９号として国際寄託された。）及びシアン非分解菌バチルス・ズブチリスＳＤ９０１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６６，平成１２年８月７日付で、工業技術院生命工学研究所に生命研寄託第ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８９号として寄託され、平成１３年７月１６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６６号として国際寄託された。）を、それぞれφ１８ｍｍ試験管のＮＢ寒天培地（組成：ＮＢ８ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）で３５℃、２４時間培養して、滅菌水１０ｍＬで懸濁した懸濁液を、白金耳で1回ずつ、９種類のブループレート上に塗付して、３５℃、５日間培養した。
【００３５】
シアン非分解菌バチルス・ズブチリスＳＤ９０１株では、どのブループレートにもハローの形成は確認できなかったが、シアン分解菌アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）Ｎｏ．５株では、厚みが１ｍｍでＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2濃度が１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、及び厚みが２ｍｍでＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2濃度が１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌの５種類のブループレートでハローの形成が確認された。ハローの形成状態を以下の基準で評価した結果を表３に示す。
◎：ハローを形成し判別性が良好なもの、
○：ハローを形成しているもの、
×：ハローを形成していないもの。
特に、厚みが１ｍｍでＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2濃度が５ｇ／Ｌのブループレートが、プレートの色調とハローの色抜けのコントラストが明瞭で判別性が最も良好であった（図１参照）。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
本実験においてハロー形成を確認できなかったプレートは、菌の生育は確認されたが、厚みやＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2濃度が大きいため、本培養条件では、濃い青色を示すＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2を、ハローを確認できるレベルまで脱色できなかったものと考えられる。
【００３８】
実施例２：固体培地プレートによる菌株のスクリーニングとシアン化合物分解能評価
土壌サンプル１ｇを、ＫＨ2ＰＯ4  ０．７ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4  １．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、グルコース  ３ｇ／Ｌ、Ｋ3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］  １ｇ／Ｌの組成の培地液（シアン錯体含有最小培地）１００ｍＬが入った５００ｍＬフラスコに添加して、３５℃で３日間培養した。この培養液を、シアン錯体含有最小培地に１ｍＬ接収し３５℃で３日間培養した培養液を滅菌水で適宜希釈した液０．１ｍＬを、厚みが１ｍｍでＦｅ（II）3［Ｆｅ（III）(ＣＮ）6］2濃度が５ｇ／Ｌのブループレートに塗付して３５℃、５日間培養した。
【００３９】
ブループレート培養の結果、表４に示す通り、直径２ｍｍから６ｍｍのハローを形成したコロニーを１０株取得した。取得した１０株のシアン化合物分解評価は、各菌株をシアン化合物含有土壌に添加して行った。
【００４０】
まず、各菌株を、直径１８ｍｍ試験管のＮＢ寒天培地（組成：ＮＢ８ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）で３５℃、２４時間培養して、滅菌水１０ｍＬで懸濁した懸濁液１ｍＬを、ペプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ、グルコース  ２０ｇ／Ｌの培地液１００ｍＬが入った５００ｍＬフラスコに添加して、３５℃で１日間培養した培養液を作製し、適宜希釈した培養液をＮＢ寒天培地プレートで３５℃、２４時間培養して培養液の菌数を測定した。
【００４１】
次に、蓋付き１００ｍＬポリ容器に、溶出全シアン（ＣＮ）０．９ｍｇ／Ｌ（比重１．７ｋｇ／Ｌ、含水率２５質量％）の土壌を１００ｇ入れ、終濃度として菌数が１×１０8個／ｇ、酵母エキスが０．１質量％、水分が３０質量％になるように各成分を添加、混和して３５℃、１４日間静置後の各土壌の溶出全ＣＮを測定した。その結果を表４及び図２に示す。
【００４２】
【表４】
0005860243.tif 000005
【００４３】
取得した菌はいずれも溶出全シアンが低下し分解能が確認された。さらに形成したハローの大きさと溶出全シアン分解濃度は正の相関があり、ブループレートでのハロー形成がシアン化合物分解菌取得のスクリーニングに有効であることが確認された。
【００４４】
上記スクリ−ニング方法により良好な結果が得られた５種（ＢＨ０２１３株，ＢＨ０２３４株，ＢＨ０４０１０１株，ＢＨ０４０１０２株，ＢＨ０４０２０４株）のシアン化合物分解菌の同定結果は以下の通りである。
【００４５】
［シアン化合物分解微生物１／ＢＨ０２１３株］
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物ＢＨ０２１３株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態：多形性桿菌、
グラム染色性：陽性、
胞子：形成せず、
運動性：なし、
酸素に対する態度：好気性、
オキシダーゼ：陰性、
カタラーゼ：陽性、
ＯＦ(Oxidation Fermentation)テスト：試験用培地に生育せず、
集落の色調：オレンジ系。
また、本菌株の同定は、ＰＣＲ法により増幅した１６ＳｒＲＮＡ領域のＤＮＡについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer［Applied Biosystems］を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar［Applied Biosystems］のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法（ＮＪ法）により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が０．０９％でロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）に最近縁であると確認された。
本菌株はロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）ＢＨ０２１３株と命名し、平成２１年３月１９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７９１号として寄託されている。
【００４６】
［シアン化合物分解微生物２／ＢＨ０２３４株］
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物ＢＨ０２３４株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態：多形性桿菌、
グラム染色性：陽性、
胞子：形成せず、
運動性：なし、
酸素に対する態度：好気性、
オキシダーゼ：陰性、
カタラーゼ：陽性、
ＯＦ(Oxidation Fermentation)テスト：試験用培地に生育せず、
集落の色調：オレンジ系。
また、本菌株の同定は、ＰＣＲ法により増幅した１６ＳｒＲＮＡ領域のＤＮＡについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer［Applied Biosystems］を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar［Applied Biosystems］のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法（ＮＪ法）により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が０．０７％でロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）に最近縁であると確認された。
本菌株はロドコッカス・アエセリボランス（Rhodococcus aetherivorans）ＢＨ０２３４株と命名し、平成２０年１１月７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７１９号として寄託されている。
【００４７】
［シアン化合物分解微生物３／ＢＨ０４０１０１株］
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物ＢＨ０４０１０１株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態：桿菌、
グラム染色性：陽性、
胞子：形成する（形：楕円形、位置：亜端立、胞子嚢：非膨出）、
運動性：あり、
酸素に対する態度：好気性、
カタラーゼ：陽性、
集落の色調：黄色系。
また、本菌株の同定は、ＰＣＲ法により増幅した１６ＳｒＲＮＡ領域のＤＮＡについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer［Applied Biosystems］を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar［Applied Biosystems］のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法（ＮＪ法）により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が０．１６％でバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）に最近縁であると確認された。
本菌株はバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＢＨ０４０１０１株と命名し、平成２１年３月１９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７９０号として寄託されている。
【００４８】
［シアン化合物分解微生物４／ＢＨ０４０２０４株］
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物ＢＨ０４０２０４株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態：桿菌、
グラム染色性：陽性、
胞子：形成する（形：楕円形、位置：中立〜亜端立、胞子嚢：非膨出）、
運動性：あり、
酸素に対する態度：好気性、
カタラーゼ：陽性、
集落の色調：黄色系。
また、本菌株の同定は、ＰＣＲ法により増幅した１６ＳｒＲＮＡ領域のＤＮＡについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer［Applied Biosystems］を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar［Applied Biosystems］のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法（ＮＪ法）により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が０．１３％でバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）に最近縁であると確認された。
本菌株はバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＢＨ０４０２０４株と命名し、平成２０年１１月７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７２２号として寄託されている。
【００４９】
［シアン化合物分解微生物５／ＢＨ０４０１０２株］
本発明により分離されたシアン化合物分解微生物ＢＨ０４０１０２株の形態観察及び生理的性状は、以下の通りである。
形態：桿菌、
グラム染色性：陽性、
胞子：形成する（形：楕円形、位置：亜端立、胞子嚢：非膨出）、
運動性：あり、
酸素に対する態度：好気性、
カタラーゼ：陽性、
集落の色調：特徴的集落色素を生成せず。
また、本菌株の同定は、ＰＣＲ法により増幅した１６ＳｒＲＮＡ領域のＤＮＡについて、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer［Applied Biosystems］を用いて塩基配列を解析し、得られた配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている配列及びMicroSeq Analysis Softwar［Applied Biosystems］のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹をMicroSeq Analysis Softwarを用いて近接結合法（ＮＪ法）により作成して行った。
その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が０．０２％でバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）に最近縁であると確認された。
本菌株はバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＢＨ０４０１０２株と命名し、平成２０年１１月７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７２１号として寄託されている。
【００５０】
実施例３：シアン化合物分解微生物の土壌浄化評価
実施例２によりスクリーニングされたシアン化合物分解微生物ＢＨ０２１３株、ＢＨ０２３４株、ＢＨ０４０１０１株、ＢＨ０４０２０４株、ＢＨ０４０１０２株を、直径１８ｍｍ試験管のＮＢ寒天培地（組成：ＮＢ８ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）で３５℃、２４時間培養して、滅菌水１０ｍＬで懸濁した懸濁液１ｍＬを、ペプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ、グルコース  ２０ｇ／Ｌの培地液１００ｍＬが入った５００ｍＬフラスコに添加して、３５℃で１日間培養した培養液を作製し、適宜希釈した培養液をＮＢ寒天培地プレートで３５℃、２４時間培養して培養液の菌数を測定した。
【００５１】
次に、蓋付き１００ｍＬポリ容器に、溶出全ＣＮ０．９ｍｇ／Ｌ（比重１．７ｋｇ／Ｌ、含水率２５質量％）の土壌を１００ｇ入れ、終濃度として菌数が１×１０8個／ｇ、酵母エキスが０．１質量％、水分が３０質量％になるように各成分を添加、混和して３５℃で静置し、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日に各土壌をサンプリングして溶出全ＣＮを測定した。その結果を図３に示す。
【００５２】
ＢＨ０４０１０２株は１４日目に、ＢＨ０２１３株は２１日目に、ＢＨ０４０２０４株は２８日目に、ＢＨ０２３４株及びＢＨ０４０１０１株は４２日目に、それぞれ溶出全ＣＮが、土対法における溶出全指定基準である検出限界未満（＜０．１ｍｇ／Ｌ）まで低減し、土壌浄化されたことが確認された。
【００５３】
上記結果より、スクリ−ニングされたシアン化合物分解微生物をシアン化合物含有土壌、排水または地下水に添加することによりシアン化合物分解微生物含有土壌、排水または地下水を浄化することができることが示唆された。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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