(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異が導入された複数のポリヌクレオチドを製造する方法であって、
（ａ）環状二本鎖ＤＮＡである鋳型のポリヌクレオチドの配列情報を取得すること、及び目的とする３以上の突然変異を鋳型ヌクレオチドに沿って同定すること；
（ｂ）少なくとも３個のプライマーを、単一の反応混合物の中の二重鎖の鋳型のポリヌクレオチドに添加すること；ここで、前記少なくとも３個のプライマーは重複しておらず；前記少なくとも３個のプライマーのそれぞれは、他のプライマーとは異なる少なくとも１個の突然変異を含み；少なくとも１個のプライマーは、前記鋳型のマイナス鎖に対合可能なフォワードプライマーであり；少なくとも１個のプライマーは、前記鋳型のプラス鎖に対合可能なリバースプライマーであり；
（ｃ）前記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に供して環状の鋳型分子に沿って伸長を完全に進行させ、前記少なくとも３個のプライマーから、伸長され、変異が導入された複数のポリヌクレオチドを得ること；及び
（ｄ）酵素で処理して環状の鋳型分子を破壊すること、を含む方法。
【請求項２】
更に、リガーゼにより処理されていない、伸長された複数の生成物を細胞に形質転換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドを前記細胞から回収することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
更に、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドを分析することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
分析が、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドの少なくとも１個を発現させ、そこから発現されたポリペプチドを分析することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
更に、目的とする突然変異を含んだ、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドを選択することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更に、ポリメラーゼ伸長により製造された、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドを分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
更に、処理され、伸長され、変異が導入された前記ポリヌクレオチドを細胞に形質転換すること、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドを細胞から回収すること、目的とする突然変異を含んだ、伸長され、変異が導入された前記複数のポリヌクレオチドを選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも４個のプライマーが添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１２個のプライマーが添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
それぞれのプライマーがシングルスポット突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２個のフォワードプライマーが、鋳型のポリヌクレオチド上の同一の位置に異なる変更を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２個のリバースプライマーが、鋳型のポリヌクレオチド上の同一の位置に異なる変更を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１個のプライマーが、鋳型のポリヌクレオチド上の異なる位置に少なくとも２個の変更を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１個のプライマーが鋳型のポリヌクレオチド上の異なる位置に少なくとも２個の変更を含み、且つ少なくとも２個のフォワードプライマー又は少なくとも２個のリバースプライマーが鋳型のポリヌクレオチド上の同一の位置に異なる変更を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１個のプライマーが、それぞれ１個の縮重部位を含む縮重プライマーのセットであり、目的とする突然変異が前記縮重部位における異なる多様なヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１個のプライマーが、前記鋳型のポリヌクレオチドの少なくとも１個のコドンに対応する少なくとも１個の縮重コドン、及び前記鋳型のポリヌクレオチドの前記コドンに隣接する配列に相同性を有する少なくとも１個の隣接する配列を含む縮重プライマーのセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記縮重コドンが、２０未満の天然アミノ酸をコードできる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記フォワードプライマーがフォワード群に分類され、前記リバースプライマーがリバース群に分類され、前記フォワード群のプライマー及び前記リバース群のプライマーが、互いに独立して、前記鋳型のポリヌクレオチド上の位置に関係なく、対応する群の中で等濃度となるように標準化され、標準化後に等量のフォワードプライマーとリバースプライマーとが反応に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記鋳型のポリヌクレオチド上のプライマーの位置に応じてプライマーを複数の群に組織化し；ここで、前記鋳型上の同一の選択された領域に亘るプライマーを１個の群に含め；
グループ化されたプライマーをそれぞれの群の中で等濃度となるように標準化し、
１つの群のフォワードプライマーをフォワード群に集めて、フォワードプライマーのそれぞれの群の間で濃度が等しくなるように標準化し、
１つの群のリバースプライマーをリバース群に集めて、リバースプライマーのそれぞれの群の間で濃度が等しくなるように標準化し、
集められた等量のフォワードプライマー及びリバースプライマーを反応に添加することを、工程（ｂ）の前に含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
更に、工程（ｂ）から（ｃ）を２回行い、第１の回で製造されたポリヌクレオチドを第２の回で鋳型ヌクレオチドとして使用する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年７月３１日に出願された米国仮出願・出願番号６０／９５３，１７１号に優先権を主張し、その内容は引用によりここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般的に、子世代の複数のポリヌクレオチドを製造し、遺伝子に特定の変更を加え、複数の位置に突然変異又は変更を再構築する方法としての、テイラードマルチサイトコンビナトリアルアセンブリー（「ＴＭＣＡ」）の方法に関する。上記突然変異又は上記変更は、短いオリゴヌクレオチド上において設計され、合成される。上記オリゴヌクレオチドは、野生型の遺伝子を含む鋳型ＤＮＡに対合する。ＤＮＡポリメラーゼが完全なＤＮＡを増幅するために使用される。結果として生じる増幅されたＤＮＡは、宿主から回収される。この方法の利点は、速さ、技術的な単純さ、及び上記アセンブリーを制御する能力である。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子に変更を加えるための発表された方法は、例えば、変異性ＰＣＲ、インビトロジェン社のＧｅｎｅ  Ｔａｉｌｏｒ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＫｉｔTM、ストラタジーン社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＫｉｔTM、重複ＰＣＲ、及びＰＣＲを基礎にしたライゲーション／組み換えを使用する。知られた方法についての調査は、これらの方法が、単一の位置に／隣接する領域に、突然変異及び／若しくは改変を生成することの基礎的な困難性に直面する傾向にあること、並びに／又は複数の領域に改変を加えることが骨の折れるものであることを明らかにしている。
【０００４】
米国特許第７，２０２，０８６号（「‘０８６特許」）は重複している又は重複していない少なくとも５個のオリゴヌクレオチド、及びｄｓＤＮＡ（プラスミド）を使用して突然変異させた遺伝子のライブラリーを生成する突然変異生成のための方法であって、それぞれの突然変異は、平均して、当該ライブラリー中の当該遺伝子の１／５未満に存在している方法の権利を請求している。上記‘０８６特許は、突然変異の頻度を制御して、１個のＤＮＡ分子中の「過剰な突然変異」を回避することを要件としているため、上記‘０８６特許は、開示された発明が、先行技術のものとは異なるものであると記載している（第５欄、２８行から４５行）。それぞれが１個の突然変異を有する突然変異体を取得することが望しい。この目標を達成するため、それぞれの突然変異体オリゴヌクレオチドの量と鋳型の量との比率を、０．０１から１００の間のものにしなくてはならない（第５欄、２８行から４５行）。この特徴は、複数のオリゴヌクレオチドを同時に使用することによって７５％を超える各プライマーの組み込みレベルとしている先行技術の特徴とは区別される（第５欄、２８行から４５行）。上記‘０８６特許は、突然変異の頻度の制御を要件とすることで、１個のＤＮＡ分子中の「過剰な突然変異」を回避し、それぞれ１個ずつの突然変異を有する突然変異体を生成している。
【０００５】
米国特許第７，１３２，２６５号（「‘２６５特許」）及び米国特許出願公開公報２００３／００６４５１６号は、対合プライマーを含む一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）分子に突然変異を導入し、ＤＮＡ鎖を合成し、且つ当該ＤＮＡ分子を消化する方法の権利を請求している。上記ＴＭＣＡ法は二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）を鋳型として使用する。上記‘２６５特許は、突然変異生成の手順において、開始時の鋳型としてｓｓＤＮＡを使用することとｄｓＤＮＡを使用することとの間で、明確な区別をしている（例えば、第６欄、４５行から５５行参照）。
【０００６】
公開された米国特許出願２００３／０１９４８０７号は、ライブラリーを対象としており、ここでタンパク質の突然変異体は、決められた領域の１箇所以上の位置の所定の単一のアミノ酸を含んでおり、当該決められた領域は少なくとも３個のアミノ酸である。１箇所において１つの変更のみが許容されており、即ち特定のアミノ酸の位置において縮重した変更は排除されている。
【０００７】
公開された米国特許出願２００６／００５１７４８号、２００６／０１３４６２４号、２００４／０２４８１３１号、及び２００２／００８３４８８号、並びに米国特許第６，６７３，６１０号、第６，３３５，１６０号、及び第５，３４５，６７０号のそれぞれは、合成されたＤＮＡを連結させて、子世代の突然変異を有する環状ＤＮＡを製造することを要件としている。
【０００８】
更に、公開された米国特許出願２００６／００５１７４８号は、フラップエンドヌクレアーゼを使用すること、及び同一のＤＮＡ鎖に全てのプライマーを対合させることを要件としている。公開された米国特許出願２００６／０１３４６２４号は、２個のプライマーを連続して（即ち、１回の反応中にではなく）使用することを要件としている。公開された米国特許出願２００４／０２４８１３１号では、プライマーが２本の鎖に対合するが、ここで、当該プライマーは２塩基対から４塩基対の相補的な塩基対を含んでいなくてはならない。米国特許第６，６７３，６１０号及び公開された米国特許出願２００２／００８３４８８号は親ＤＮＡ鎖を消化することにより作製される断片を、形質転換に用いる環状ＤＮＡを得るためのメガプライマーとして使用することを要件とする。米国特許第６，３３５，１６０号は、重複した断片からのジーンアセンブリーを対象とし、組み換えライブラリーを作製することを対象としている。最後に、米国特許第５，３５１，６７０号は２工程の形質転換工程と、介在する制限酵素による処理とを要件とする。
【０００９】
米国特許第７，１７６，００４号、第６，７１３，２８５号、及び第５，９３２，４１９号、並びに公開された米国特許出願２００４０２５３７２９号、第２００３００３２０３７号のそれぞれは、２個のプライマー（即ち、フォワードプライマーとリバースプライマー）が、反対の方向へ増幅を開始するために２本の異なる鎖に対合すること、及び相補的な領域を有していることを要件としている。米国特許第７，０７８，３８９号及び第５，９３５，８３０号は、プライマーが鋳型と相互作用する突然変異原（例えば、ソラレン）を含むことにより、三重鎖分子を形成することを要件とする。
【００１０】
公開された米国特許出願２００６／０２２８７８６号は２個の異なるプライマーを２回の異なる反応に使用して２本の鎖の重合を行い、次いで合成されたｓｓＤＮＡ分子を対合させることを要件とする。公開された米国特許出願２００３／００７７６１３号は、ジーンアセンブリーのための方法及びライブラリーを作り出すための方法を対象とし、ここで、集められる遺伝子（ｓｓＤＮＡ）が足場ＤＮＡと対合してギャップを埋めベクターにサブクローニングされるｄｓＤＮＡを生成する。
【００１１】
公開された米国特許出願２００４／０００２０５７号は、試料において突然変異生成を含まないリガンドを検出する方法を記載している。公開された米国特許出願２００４／０００２０５７号は、培養された細胞で変異原を使用することにより、変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株を確立する方法について記載している。公開された米国特許出願２００６／０１９９２２２号は指向進化の一般的な方法について記載しており、ここで突然変異させられたＤＮＡが特定のＢａｃｉｌｌｕｓ株に形質転換されている。
【００１２】
特定の遺伝子変異体及び組み合わせられた遺伝子ライブラリーを効率的且つ迅速に生成させるより優れた、より効率的な方法に対する必要性が依然として存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第７，２０２，０８６号
【特許文献２】米国特許第７，１３２，２６５号
【特許文献３】米国特許出願公開公報２００３／００６４５１６号
【特許文献４】米国特許出願２００３／０１９４８０７号
【特許文献５】米国特許出願公開公報２００６／００５１７４８号
【特許文献６】米国特許出願公開公報２００６／０１３４６２４号
【特許文献７】米国特許出願公開公報２００４／０２４８１３１号
【特許文献８】米国特許出願公開公報２００２／００８３４８８号
【特許文献９】米国特許第６，６７３，６１０号
【特許文献１０】米国特許第６，３３５，１６０号
【特許文献１１】米国特許第５，３４５，６７０号
【特許文献１２】米国特許第６，６７３，６１０号
【特許文献１３】米国特許第５，３５１，６７０号
【特許文献１４】米国特許第７，１７６，００４号
【特許文献１５】米国特許第６，７１３，２８５号
【特許文献１６】米国特許第５，９３２，４１９号
【特許文献１７】米国特許出願公開公報２００４／０２５３７２９号
【特許文献１８】米国特許出願公開公報２００３／００３２０３７号
【特許文献１９】米国特許第７，０７８，３８９号
【特許文献２０】米国特許第５，９３５，８３０号
【特許文献２１】米国特許出願公開公報２００６／０２２８７８６号
【特許文献２２】米国特許出願公開公報２００３／００７７６１３号
【特許文献２３】米国特許出願公開公報２００４／０００２０５７号
【特許文献２４】米国特許出願公開公報２００６／０１９９２２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本明細書の属する技術の分野、例えば化学、生化学、細胞生物学、分子生物学、又は医学における当業者により本文中において見られたときに通常に理解されるであろう意味を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明の一つの目的は、複数の位置に多様な突然変異の異なる組み合わせを有する改変された複数のポリヌクレオチドを、テイラードマルチサイトコンビナトリアルアセンブリーによって製造する方法を提供することである。本発明は、遺伝子に特定の変更を加え、当該遺伝子の複数の位置における変異又は変更を再構築することを可能にする。以下の好ましい実施態様の詳細な説明と組み合わせることにより、より明らかになるであろう本発明のこれらの目的及び他の目的は、単独で又はそれらの組み合わせで、以下の工程を含む方法の発見により満足された：（ａ）少なくとも３個のプライマーを、単一の反応混合物の中の二重鎖の鋳型のポリヌクレオチドに添加すること；ここで、上記少なくとも３個のプライマーは重複しておらず；上記少なくとも３個のプライマーのそれぞれは、他のプライマーとは異なる少なくとも１個の突然変異を含み；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のマイナス鎖に対合可能なフォワードプライマーであり；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のプラス鎖に対合可能なリバースプライマーであり；及び
（ｂ）上記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に供し、上記少なくとも３個のプライマーから、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを得ること。
【００１６】
もう一つの実施態様において、目的とする突然変異を含んだ改変された複数のポリヌクレオチドを製造する方法は、以下の工程を含む：（ａ）少なくとも２個のプライマーを単一の反応混合物の中の二重鎖の鋳型のポリヌクレオチドに添加すること；ここで、上記少なくとも２個のプライマーは重複しておらず；上記少なくとも２個のプライマーのそれぞれは、他のプライマーとは異なる少なくとも１個の突然変異を含み；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のマイナス鎖に対合可能なフォワードプライマーであり；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のプラス鎖に対合可能なリバースプライマーであり；
（ｂ）上記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に供し、上記少なくとも２個のプライマーから、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを得ること、
（ｃ）伸長され、改変された上記複数のポリヌクレオチドを酵素で処理して上記鋳型ヌクレオチドを破壊すること、
（ｄ）リガーゼによって処理されていない、処理され、伸長され、改変された前記ポリヌクレオチドを、細胞に形質転換すること、
（ｅ）伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを細胞から回収すること、及び
（ｆ）目的とする突然変異を含む、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを選択すること。
【００１７】
本発明の１以上の実施態様の詳細は、以下の付随する記載の中で説明される。本明細書に記載された方法及び材料に類似する又は等価な如何なる方法又は材料も、本発明の実行及び試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料がここに記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈から別の態様に明確に指示されない限り、単数形は複数形の指示対象を含む。別の態様に明確に述べられない限り、本明細書において採用され、意図される技術は、当業者に熟知された標準の手順であるものとする。実施態様の例は、例示のみを目的とする。
【００１８】
添付の図面とあわせて以下の詳細な説明を検討し、それを参照して本発明をより理解することにより、本発明及びそれに付随する多くの利点の完全な認識が容易に得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＧＳＳＭSMの図示である。
【図２】エボリューション−ＧＳＳＭSM方法によるフローの図示である。
【図３】テイラードマルチサイトコンビナトリアルアセンブリーの図示である。
【図４Ａ】ＴＭＣＡ反応におけるプライマーの組み合わせである。
【図４Ｂ】ＴＭＣＡ反応におけるプライマーの組み合わせである。
【図４Ｃ】ＴＭＣＡ反応におけるプライマーの組み合わせである。
【図４Ｄ】ＴＭＣＡ反応におけるプライマーの組み合わせである。
【図５】６個の突然変異の会合において対合するプライマーの地図である。
【図６】６箇所の突然変異の位置の可能な組み合わせの分布である。標準：理想的状況において計算された変異体の分布；１Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件１；７Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件２；１３Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件３；合計：１Ａ、７Ａ、及び１３Ａから組み合わせたデータ；０×：突然変異なし；１×：単一の突然変異；２×：２個の突然変異；３×：３個の突然変異；４×：４個の突然変異；５×：５個の突然変異；６×：６個の突然変異。
【図７】６個の突然変異の会合における統計的データと実験データの比較である。
【図８】４個の突然変異の会合における対合するプライマーの地図である。
【図９】４箇所の突然変異の位置の可能な組み合わせの分布である。標準：理想的状況において計算された変異体の分布；２Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件１；８Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件２；１４Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件３；合計：２Ａ、８Ａ、及び１４Ａを組み合わせたデータ；０×：突然変異なし；１×：単一の突然変異；２×：２個の突然変異；３×：３個の突然変異；４×：４個の突然変異。
【図１０】４箇所の位置についての可能な組み合わせの分布である。標準：理想的状況において計算された変異体の分布；２Ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓｔｂｌ２を用いた反応条件１；８Ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓｔｂｌ２を用いた反応条件２；１４Ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓｔｂｌ２を用いた反応条件３；合計：２Ｂ、８Ｂ、及び１４Ｂから組み合わされたデータ；０×：突然変異なし；１×：単一の突然変異；２×：２個の突然変異；３×：３個の突然変異；４×：４個の突然変異。
【図１１】３個の突然変異の会合において対合するプライマーの地図である。
【図１２】３箇所の突然変異の位置の可能な組み合わせの分布である。標準：理想的状況において計算された変異体の分布；１５Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた反応条件３；９Ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓｔｂｌ２を用いた反応条件２；１５Ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓｔｂｌ２を用いた反応条件３；合計：１５Ａ、９Ｂ、及び１５Ｂを組み合わせたデータ；０×：突然変異なし；１×：単一の突然変異；２×：２個の突然変異；３×：３個の突然変異。
【図１３】５箇所の突然変異の位置に対合するプライマーの地図と１３の突然変異である。
【図１４Ａ】５箇所の突然変異の位置と１３個のプライマーにおける特有の変異体の組み合わせ−１回のＴＭＣＡにおける変異体の分析である。
【図１４Ｂ】５箇所の突然変異の位置と１３個のプライマーにおける特有の変異体の組み合わせ−２回のＴＭＣＡの後の変異体の分析である。
【図１４Ｃ】５箇所の突然変異の位置と１３個のプライマーにおける特有の変異体の組み合わせ−対合するプライマーの地図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＴＭＣＡ法は、多数の変更を含む特定の遺伝子の変異体、又は組み合わせられた遺伝子ライブラリーを効率的且つ迅速に生成することができ；最小限の費用と努力しか必要とされず；「必要性」に応じて、偏った組み合わせライブラリーを作製するように仕立てることができる。上記ＴＭＣＡ法はライゲーション工程を採用しなくても行うことができ、それゆえ、多数の突然変異を生成する方法を単純化することができる。特定のライブラリーの「必要性」は実験により異なる。見込まれる突然変異の位置−「必要性」−は、例えば、１）合理的に設計されたアミノ酸の変更か、２）酵素上で所望の効果を奏するように実験的に決められた個々のアミノ酸の変更（ＧＳＳＭSM及びスクリーニングの試みにより決められる）のいずれであってもよい。それぞれのライブラリーは、見込まれる突然変異の位置を、特定の数だけ備えて作製される。見込まれる突然変異の位置において、より多い又はより少ない突然変異を有する子世代となるように偏らせてライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。同様に、特定の突然変異又は特定の突然変異の位置に指向されて、又はこれに反して偏りが存在するライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。
【００２１】
本明細書において記載されたものと類似する又は等価な全ての方法及び材料は、本明細書に記載されている適切な方法及び材料とともに、本発明を実行又は試験するのに使用することができる。本明細書において言及された全ての文献、特許出願、特許、及びその他の引用は、その全体が引用により組み込まれる。更に、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、特に明示しない限り限定されるものではない。
【００２２】
本件出願において、本発明者らは、概略的に図３に示されるテイラードマルチサイトコンビナトリアルアセンブリーの方法を設計した。比較のため、図１及び図２は、それぞれの突然変異部位が、異なるアミノ酸の２個以上の突然変異を有する可能性があるエボリューション−遺伝子部位飽和突然変異生成（「ＧＳＳＭ」）を示す。上記エボリューション−ＧＳＳＭSMは特定の遺伝子にヌクレオチドの変更を導入するために使用することができ、エボリューション−ＧＳＳＭSMを使用して、あるオープンリーディングフレームの各コドンを、一度に１以上の残基において、他の全てのアミノ酸に突然変異させることができる。このようにして、ＴＭＣＡ法により作製されたライブラリー中の子世代のポリペプチドが、複数の突然変異、好ましくは、２個以上、より好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、及びより好ましくは１２個以上の突然変異を含みうる一方で、単一のクローンが１個の変更を有するＤＮＡを含むＧＳＳＭSMライブラリーが作製される。
【００２３】
上記ＧＳＳＭSM技術を使用することで、一度に１個の残基が変更され、２０アミノ酸全てに及ぶ。ライブラリーはスクリーニングされ、活性が向上した突然変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）が同定される。ＴＭＣＡ反応は、単一の分子の複数の位置に突然変異を作成するように設計されている。上記ＴＭＣＡ反応は、ＧＳＳＭSMライブラリーから同定され、活性が向上した突然変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）を組み合わせるために使用することができる。上記ＴＭＣＡ反応の条件の下では、複数のＰＣＲ産物が形成されることが期待される。上記ＰＣＲ産物は、細胞に形質転換されて、増幅されることが期待されない。
【００２４】
本発明の文脈においては、本明細書において使用される「アミノ酸」なる用語は、アミノ基（−−ＮＨ2）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を−好ましくは、遊離の基として、或いはペプチド結合の一部として縮合された後の基として−有する全ての有機化合物に言及するものである。「２０個の天然アミノ酸」は本発明の技術分野において、以下のアミノ酸に言及するものとして理解される：アラニン（ａｌａ又はＡ）、アルギニン（ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐ又はＤ）、システィン（ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕ又はＥ）、グルタミン（ｇｌｎ又はＱ）、グリシン（ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（ｌｅｕ又はＬ）、リジン（ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（ｐｒｏ又はＰ）、セリン（ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（ｔｙｒ又はＹ）、及びバリン（ｖａｌ又はＶ）。
【００２５】
「増幅」（「ポリメラーゼ伸長反応」）なる用語は、ポリヌクレオチドの複製物の数が増加することを意味する。
【００２６】
「〜に対応する」なる用語は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が引用されたポリヌクレオチド配列の全て若しくは一部に相同である（即ち、同一であり、厳密に進化的に関係していることではない）こと、又はポリペプチド配列が引用されたポリペプチド配列と同一であることを意図して使用される。逆に、「〜に相補的な」なる用語は、本明細書において、相補的な配列が、引用されたヌクレオチド配列の全て若しくは一部に相同であることを意図して使用される。例示すれば、「ＴＡＴＡＣ」なるヌクレオチド配列は、引用された「ＴＡＴＡＣ」に対応し、引用された「ＧＴＡＴＡ」なる配列に相補的になる。
【００２７】
「プライマー」は、本明細書において、鋳型の核酸に対合可能であり、ＤＮＡ増幅の開始点としての役割を果たす核酸鎖として定義される。上記プライマーは上記鋳型のポリヌクレオチドの特定の領域に完全に又は部分的に相補的であってもよい。非相補的ヌクレオチドは、本明細書において、不一致として定義される。不一致は、上記プライマーの内部、又は上記プライマーのいずれかの端部に位置していてもよい。単一のヌクレオチドの不一致、より好ましくは２個、そしてより好ましくは３個以上の連続する又は連続しない不一致がプライマー内に存在していることが好ましい。上記プライマーは、６ヌクレオチドから２００ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチドから８０ヌクレオチド、より好ましくは４３ヌクレオチドから６５ヌクレオチドを有する。より好ましくは、上記プライマーは１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１１５ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１３５ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１４５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１５５ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１６５ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１８５ヌクレオチド、又は１９０ヌクレオチドを有する。「フォワードプライマー」は、本明細書において、鋳型のポリヌクレオチドのマイナス鎖に相補的なプライマーとして定義される。「リバースプライマー」は、本明細書において、鋳型のヌクレオチドのプラス鎖に相補的なプライマーとして定義される。上記フォワードプライマーと上記リバースプライマーとは、重複したヌクレオチド配列を含んでいないことが好ましい。「重複したヌクレオチド配列を含んでいない」とは、本明細書において、プラス鎖とマイナス鎖が互いに相補的である部分において、フォワードプライマーが鋳型のヌクレオチドのマイナス鎖の領域に対合せず、リバースプライマーが鋳型のヌクレオチドのプラス鎖の領域に対合しないこととして定義される。鋳型のヌクレオチドの同一の鎖に対合するプライマーについては、「重複したヌクレオチド配列を含んでいない」とは、上記プライマーが上記鋳型のヌクレオチドの同一の鎖の同一の領域に相補的な配列を含んでないことを意味する。
【００２８】
上記プラス鎖は、センス鎖と同一であり、コーディング鎖又は非鋳型鎖とも呼称できる。これは、（Ｕの代わりにＴを有する点を除いては）ｍＲＮＡと同一の配列を有する鎖である。他方の鎖は、鋳型鎖、マイナス鎖、又はアンチセンス鎖と呼称され、ｍＲＮＡに相補的である。
【００２９】
「上記鋳型のポリヌクレオチドの同一の選択された領域に亘るプライマー」は、本明細書において、目的とする突然変異が縮重部位における多様な異なるヌクレオチドである、それぞれ少なくとも１個の縮重部位を有する縮重プライマーのセット；鋳型のヌクレオチドの少なくとも１個のコドンに対応する、少なくとも１個の縮重コドンを含む縮重プライマーのセット；又はそれらの組み合わせと定義される。例えば、３個のコドンの突然変異であるＹ２７６Ｆ／Ｓ２８２Ｌ、Ｓ２８２Ｈ、Ｓ２８２Ｐ、Ｓ２８２Ｒ、又はＳ２８２Ｃ／Ｌ２８４Ｆ（例えば、図４、図１５、又は図１６を参照）の全ての可能な組み合わせに対するプライマーのセットは、上記鋳型の同一の領域に亘るプライマーである。「上記鋳型のポリヌクレオチドの同一の選択された領域に亘るプライマー」は、例えば特定のプライマーのセットであってもよい。
【００３０】
ＤＮＡの「消化」は、上記ＤＮＡの特定の配列のみに作用する制限酵素を使用した上記ＤＮＡの酵素的開裂を意味する。本明細書で使用される多様な制限酵素は商業的に入手可能であり、それらの反応条件、補因子、及び他の要件は当業者に知られているように使用される。分析の目的では、典型的には１μｇのプラスミド又はＤＮＡ断片が、約２単位の酵素とともに、約２０μｌの緩衝液中で使用される。プラスミドを構築するためのＤＮＡ断片の単離の目的では、典型的には５μｇから５０μｇのＤＮＡが、２０単位から２５０単位の酵素を用いて、より大きな容量で消化される。特定の制限酵素についての緩衝液及び基質の適切な量は、製造業者により特定される。通常、３７℃で１時間のインキュベーション時間が採用されるが、供給者からの指示に従って変更してもよい。消化後に、反応物をゲル上で電気泳動してもよい。
【００３１】
「組み換え型」酵素は、組み換えＤＮＡ技術によって製造された、即ち、所望の酵素をコードする外来のＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から製造された酵素を意味する。「合成された」酵素は、化学合成によって調製された酵素である。
【００３２】
「制限部位」なる用語は、制限酵素の活性を発揮するために必要な認識配列を意味し、酵素的開裂部位を含む。開裂部位が、曖昧さの少ない配列（即ち、制限部位の発生頻度を決める第一の決定因子を含む配列）を含む制限部位の一部に含まれてもよいし、含まれていなくてもよいことが理解される。そのため、多くの場合には、関連する制限部位は内部に開裂部位を有する（例えば、ＥｃｏＲＩ部位であれば、Ｇ／ＡＡＴＴＣ）か、まさに隣接した開裂部位を有する曖昧さの少ない配列のみを有する（例えば、ＥｃｏＲＩＩ部位であれば、／ＣＣＷＧＧ）。他の場合には、関連する制限酵素（例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位又はＣＴＧＡＡＧ（１６／１４））は、外部に開裂部位を有する曖昧さの少ない配列（例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位であれば、上記ＣＴＧＡＡＧ配列）を有する（例えば、Ｅｃｏ６７Ｉ部位のＮ１６の位置）。酵素（例えば、制限酵素）がポリヌクレオチドを「開裂する」と言及されるとき、制限酵素がポリヌクレオチドの開裂を触媒するか、容易にすることを意味するものと理解される。
【００３３】
制限部位において「曖昧な塩基の要件」は、完全に特定されていないヌクレオチドの塩基の要件−即ち、（限定されない例示では、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴから選択される特定の塩基のような）特定の塩基ではなく、少なくとも２個以上の塩基のいずれか１個あってもよいこと−を意味する。塩基の曖昧さを示すために、本明細書以外にも本技術分野で用いられ共通して受け入れられている略記載は、以下のものが挙げられる：Ｒ＝Ｇ又はＡ；Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｋ＝Ｇ又はＴ；Ｓ＝Ｇ又はＣ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｈ＝Ａ、Ｃ、又はＴ；Ｂ＝Ｇ、Ｔ、又はＣ；Ｖ＝Ｇ、Ｃ、又はＡ；Ｄ＝Ｇ、Ａ、又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ。
【００３４】
「引用された配列」は配列比較の基礎として使用された配列と定義される；引用された配列は、例えば、全長ｃＤＮＡの区分や配列表の中で定められる遺伝子配列のような、より長い配列のサブセットであってもよいし、完全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列を含むものであってもよい。一般的に、引用された配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、少なくとも２５ヌクレオチド長であることがたびたびあり、多くの場合、少なくとも５０ヌクレオチド長である。２本のポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２本のポリヌクレオチドの間で同様の配列（即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分）を含んでいてもよいし、（２）２本のポリヌクレオチドの間で相違した配列を更に含んでいてもよいので、２本（又はそれ以上）のポリヌクレオチドの間での配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」上で２本のポリヌクレオチドの配列を比較して、配列相同性の部分領域を同定し、比較することによって行われる。
【００３５】
本明細書において使用される「比較ウインドウ」は、少なくとも２０塩基の連続したヌクレオチド位置の概念上の区分を意味し、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも連続した２０ヌクレオチドの引用された配列と比較されてもよく、且つ２本の配列の最適なアラインメントのために、比較ウインドウにおける上記ポリヌクレオチド配列の一部分は、上記引用された配列（付加及び欠失を含まない）に比較して２０％以下の付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウインドウを配置するための、配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈの局部的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ，１９８１；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ  Ｔｅｏｒ  Ｂｉｏｌ，１９８１；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９８１；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ，１９７０）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｃｓｃｈ，１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎの類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）、電子化されたこれらのアルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は検査によって行われ、多様な方法により生成された、最善のアラインメント（即ち、比較ウインドウに亘って最も高い相同性の割合を生じるもの）が選択される。
【００３６】
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミドを有する側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システィン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００３７】
引用されたポリペプチドに言及する場合、「断片」、「誘導体」、及び「類似体」なる用語は、引用されたペプチドの生物学的機能又は生物学的活性と少なくとも実質的に同一の、少なくとも１つの生物学的機能又は生物学的活性を保持したポリペプチドを含む。更に、「断片」、「誘導体」、又は「類似体」の用語は、開裂により改変されることにより著しく高い活性を有する成熟した酵素を生成しうる低活性のプロタンパク質のような「プロ体」分子により例示される。
【００３８】
「遺伝子」なる用語は、ポリペプチド鎖の生成に関係するＤＮＡの区分を意味する；遺伝子は、個別のコーディング区分（エキソン）の間に介在する配列（イントロン）の他にも、コーディング領域に先行する及びこれに続く領域（リーダー及びトレーラー）も含む。
【００３９】
「非相同の」なる用語は、１個の一本鎖核酸配列が、もう１個の一本鎖核酸配列又はその相補鎖にハイブリダイズできないことを意味する。従って、非相同の領域は、ポリヌクレオチドの領域又はポリヌクレオチドが、それらの配列中に、もう１個の核酸又はポリヌクレオチドにハイブリダイズできない領域を有することを意味する。そのような領域は、例えば突然変異の領域である。
【００４０】
「相同の」又は「略相同の」なる用語は、１個の一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの度合いは、後述するように、配列間の同一性の程度、並びに温度及び塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む多数の要件に依存しうる。同一性を有する領域は５ｂｐを越えることが好ましく、上記同一性を有する領域は１０ｂｐを超えることがより好ましい。
【００４１】
「同一の」又は「同一性」なる用語は、２本の核酸配列が同一の配列又は相補的な配列を有することを意味する。従って、「同一性を有する領域」は、ポリヌクレオチドの領域又はポリヌクレオチド全体が、もう１個のポリヌクレオチドの領域又はポリヌクレオチドと同一であるか相補的であることを意味する。
【００４２】
「単離された」なる用語は、その材料が元々の環境（もしその材料が自然発生のものであれば、自然環境）から分離されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する自然発生のポリヌクレオチド又は酵素は単離されていないものの、自然系において共存する材料の一部又は全部から分離された同様のポリヌクレオチド又は酵素は単離されている。斯かるポリヌクレオチドは、ベクターの一部分となっていてもよいし、及び／又は斯かるポリヌクレオチド又は酵素は組成物の一部であってもよく、且つ斯かるベクター及び組成物は自然環境の一部ではないという点において、やはり単離されていることとなる。
【００４３】
「単離された核酸」と記載されることによって、核酸−例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子−は、それが由来する生物体における自然発生のゲノム中に存在するときは、それが通常、直接連続している５’隣接配列及び３’隣接配列と直接連続していないことを意味する。このため、上記用語は、例えば、プラスミド、又はウイルスベクターのようなベクターに組み込まれた核酸；外来細胞のゲノム（又は、自然に見られる位置とは異なる位置における場合は、同種の細胞のゲノム）に組み込まれた核酸；及び分離された分子として存在する核酸、例えばＰＣＲ増幅若しくは制限酵素消化により製造されるＤＮＡ断片、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で製造されるＲＮＡ分子を記述する。上記用語は、同様に、例えば融合タンパク質の製造に用いられる、追加のポリペプチド配列をコードする、ハイブリッド遺伝子の一部をなす組み換え核酸をも記述する。
【００４４】
「ライゲーション」は、複数の核酸鎖の間で、リン酸ジエステル結合を形成する方法を意味する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８２，ｐ．１４６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）。ＤＮＡリガーゼは、一本鎖切断（ＤＮＡの両方の相補鎖について１箇所の切断）を有する２本のＤＮＡ鎖を一本に連結できる。二本鎖切断については、相補的な鎖を鋳型として使用することにより、異なる種類のＤＮＡリガーゼにより修繕できるが、最終のリン酸ジエステル結合を形成して完全にＤＮＡを修復するには、依然としてＤＮＡリガーゼが必要である。別段に規定されない限り、ライゲーションは知られた緩衝液を用い、０．５μｇの略等モル量の結合されるべき（複数の）ＤＮＡ断片あたり、１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて成し遂げられる。「生成物は連結されなかった」とは、プライマーを使用して環状二本鎖鋳型ポリヌクレオチドの全体を増幅して得られた核酸の（複数の）端部の間で、リン酸ジエステル結合が形成されないことを意味する。
【００４５】
「突然変異」なる用語は、野生型又は親世代の核酸配列の配列中の変更、又はペプチドの配列中の変更として定義される。斯かる突然変異はトランジション又はトランスバージョン等の点突然変異であってもよい。突然変異は１個以上のヌクレオチド配列又はコードされたアミノ酸配列の変更であってもよい。上記突然変異は、欠失、挿入、又は重複であってもよい。
【００４６】
本明細書においては、縮重した「Ｎ，Ｎ，Ｎ」ヌクレオチド配列はトリプレットを示し、ここで「Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴでありうる。
【００４７】
本明細書で物に付されて使用される「自然発生の」なる用語は、物が自然に見出されうるという事実を意味する。例えば、自然にある原料から単離することができ、研究室においてヒトによって意図的に改変が加えられていない生物体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、自然発生のものである。一般的に、自然発生の、なる用語は、当該種に典型的であろう、非病的な（病気になっていない）個体に存在する物を意味する。
【００４８】
本明細書において、「核酸分子」は一本鎖の場合は少なくとも１塩基、二本鎖の場合は少なくとも１塩基対からなる。更に、核酸分子は、何ら限定されるものではないが、専有的又はキメラ的に、以下の群により例示される核酸を含有する分子の如何なる群にも属する：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノム核酸、非ゲノム核酸、自然発生の又は自然発生でない核酸、及び合成された核酸。これは、限定されない例としては、ミトコンドリア、リボソームＲＮＡ等、如何なる細胞内小器官に付随する核酸、及び自然発生の成分とともに、１以上の自然発生ではない成分をキメラ的に含む核酸分子も含む。加えて、「核酸分子」は部分的に、特に限定されるものではないが、アミノ酸及び糖類等に例示される１以上の非ヌクレオチド系成分を有していてもよい。従って、限定されるものではないが、例としては、部分的にはヌクレオチド系であり、部分的にはタンパク質系であるリボザイムは、「核酸分子」と認められる。加えて、限定されるものではないが、例としては、放射性標識又は代替的には非放射性標識等、検出できる成分により標識された核酸分子も、同様に「核酸分子」と認められる。
【００４９】
特定のタンパク質又はポリペプチド「をコードする核酸配列」、「のＤＮＡコード配列」、又は「をコードする核酸配列」なる用語は、適切な制御配列の制御下に置かれることにより、タンパク質又はポリペプチドに転写され、翻訳されるＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター配列」は細胞内においてＲＮＡポリメラーゼが結合可能であり、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始可能なＤＮＡ制御領域である。上記プロモーターは、上記ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は開始コドンを３’末端に有する。上記プロモーター配列は、バックグラウンドを超えて検出可能な水準で転写を開始するのに必要な要素である最小数の塩基を有するものである。しかしながら、上記ＲＮＡポリメラーゼが上記配列に結合した後は、転写は（プロモーターの３’末端の）上記開始コドンから開始され、転写は３’方向に向かって下流に進行する。上記プロモーター配列の内部では、転写開始部位（便宜上、ヌクレアーゼＳＩによりマッピングされる）と、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）とが見出されるであろう。
【００５０】
「タンパク質又はペプチドをコードする核酸」、「タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ」、又は「タンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語、及びその他の同義の用語は、追加のコーディング及び／又は非コーディング配列を有するポリヌクレオチドに加えて、タンパク質又はペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドを含む。
【００５１】
従って、限定されない実施態様としては、「核酸ライブラリー」は１個以上の核酸分子の、ベクター系の収集物を含む。もう一つの異なる実施態様においては、「核酸ライブラリー」は核酸分子の非ベクター系の収集物を含む。更にもう一つの好ましい実施態様においては、「核酸ライブラリー」は、部分的にはベクター系であり、部分的には非ベクター系である核酸分子の組み合わせられた収集物を含む。好ましくは、ライブラリーを含む分子の収集物は、個々の核酸分子の種に応じて検索可能且つ分離可能である。
【００５２】
「オリゴヌクレオチド」（又は、同義的には「オリゴ」）は、化学的に合成されてもよい一本鎖のポリヌクレオチド、又は相補的な二本のポリヌクレオチド鎖のいずれかを意味する。斯かる合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有しても、有していなくてもよい。５’リン酸を有していないものは、キナーゼの存在下でＡＴＰを用いてリン酸を追加しない限り、もう１個のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成されたオリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片と結合する。
【００５３】
本明細書において、「親世代のヌクレオチドのセット」なる用語は、１以上の区別可能なポリヌクレオチド種からなるセットである。通常、この用語は、好ましくは親世代のセット（「親世代」、「初めの」、及び「鋳型」なる用語が置き換え可能に使用される）に突然変異生成を行うことにより得られる子世代のポリヌクレオチドのセットに言及する際に使用される。
【００５４】
本明細書において、「生理的条件」なる用語は、生きた生物体に適合可能な及び／又は生きた培養酵母細胞又は培養哺乳動物細胞において、細胞内に典型的に実在する、温度、ｐＨ、イオン強度、粘度、及び同様の生化学的パラメーターを意味する。例えば、典型的な研究室の培養条件の下で培養された酵母細胞の細胞内の条件は、生理的な条件である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写混合物用の好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応条件は、一般的に、生理的条件である。一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生理的条件は以下の条件を含む：５０ｍＭから２００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ６．５からｐＨ８．５、２０℃から４５℃、及び０．００１ｍＭから１０ｍＭの２価カチオン（例えば、Ｍｇ++、Ｃａ++）：好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ７．２から７．６、５ｍＭの２価カチオンであり、０．０１％から１．０％の非特異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含むことが多い。多くの場合、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を、通常は約０．００１体積％から２体積％、典型的には０．０５体積％から０．２体積％の割合で存在させることができる。実験者は、慣用の方法に従って、特定の水性の条件を選択することができる。一般的ガイダンスとしては、以下の緩衝化した水性の条件が適用可能である：１０ｍＭから２５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭから５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸；ｐＨ５からｐＨ８；２価カチオン、金属キレート剤、非イオン性界面活性剤、膜画分、消泡剤、及び／又は微量成分の任意的追加。
【００５５】
標準的な慣例（５’から３’方向への記述）を用いて、本明細書において二本鎖ポリヌクレオチドの配列を記載する。
【００５６】
「関連したポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌクレオチドの領域が同一であること、及びポリヌクレオチドの領域が非相同であること意味する。
【００５７】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチド（例えば、別のものであるが、実質的に上記第一のポリヌクレオチドと同一の配列を有するポリヌクレオチド）の間でのハイブリッド形成と定義され、実質的に関連していないポリヌクレオチド配列は混合物中でハイブリッドを形成しない。
【００５８】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間で少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも９７％の同一性があるときのみに起こることを意味する。本明細書によって、引用により全体が組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９を参照されたい。
【００５９】
「野生型」なる用語は、上記ポリヌクレオチドが如何なる突然変異も含まないことを意味する。「野生型」のタンパク質は、タンパク質が自然に見出される活性のレベルで活性なものであり、自然にみられるアミノ酸配列を有することを意味する。
【００６０】
元々のポリヌクレオチドの供給源は、個々の生物体から単離されてもよく（「単離物」）、所定の培地中で培養された生物体の収集物から単離されてもよく（「集積培養物」）、又は、もっとも好ましくは、培養されていない生物体から単離されてもよい（「環境試料」）。生物学的に多様な未開発の資源を入手できるので、培養に依存しない取り扱いを使用して、環境試料から新規の生物活性をコードするポリペプチドを誘導することが、もっとも好ましい。
【００６１】
ポリペプチドの調製に利用できる微生物は、真性細菌及び古細菌等の原核微生物、並びに菌類、藻類、及び原生動物等の下等な真核微生物を含む。ポリヌクレオチドは環境試料から単離でき、その場合、核酸は生物体を培養せずに回収してもよいし、１以上の培養した生物体から回収してもよい。一形態において、斯かる微生物は、超好熱菌、好冷菌、低温菌、好塩性生物、好圧菌、及び好酸菌等の極限微生物であってもよい。
【００６２】
以上に記載されたようにして選択され、単離されたポリヌクレオチドは、好適な宿主細胞に導入される。当該選択されたポリヌクレオチドは、既に、適切な制御配列を有するベクター中にあることが好ましい。上記宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞であってもよいし、酵母細胞のような下等真核細胞であってもよいし、また好ましくは、上記宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物であってもよい。上記構築物の上記宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、及び電気穿孔法（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８６）によって行うことができる。
【００６３】
適切な宿主の代表例としては、以下のものが挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ等の細菌細胞；バクテリオファージ；酵母、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ等の菌類細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、又はＢｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ等の動物細胞；アデノウイルス；並びに植物細胞。上記ＴＭＣＡライブラリーは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の中のプラスミド形式で作製でき、次いで上記ライブラリーが他の宿主に更に導入できる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者に自明な事項の範囲であるとみなされる。
【００６４】
特に、組み換えタンパク質を発現する上で採用される多様な哺乳動物細胞の培養系に関して、哺乳類の発現系の例は、“ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｓｉｍｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ＳＶ４０  ｍｕｔａｎｔｓ”（Ｓｌｕｚｍａｎ，１９８０）に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系；例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、及びＢＨＫ細胞系等、適合可能なベクターを発現することが可能なその他の細胞系を含む。哺乳動物の発現ベクターは、複製開始点；好適なプロモーター及びエンハンサー；任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びスプライスアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング配列を含む。上記ＳＶ４０の組み込みにより得られるＤＮＡ配列、及びポリアデニル化部位は、必要な非転写性遺伝因子を提供するために用いることができる。
【００６５】
目的とするポリヌクレオチドを有する宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、又は遺伝子を増幅するために好適となるように改変された、慣用の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現用に選択された上記宿主細胞について、従前使用されていた条件とし、斯かる条件は当業者に自明なものである。
【００６６】
使用することができる発現ベクターの代表例は上記ウイルス粒子、バキュロ・ウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリア人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、牛痘、アデノウイルス、梅毒ウイルス、仮性狂犬病、及びＳＶ４０派生物）、ＰＩ−系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び目的とする特定の宿主（バチルス、アスペルギルス、及び酵母等）に特異的なその他の任意のベクターであってもよい。従って、例えば、上記ＤＮＡは、ポリペプチドを発現するために、多様な発現ベクターのうち任意の１つに含まれていてもよい。斯かるベクターは、染色体性ＤＮＡ、非染色体性ＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ配列を含む。多数の好適なベクターが当業者に知られており、商業的に入手可能である。以下のベクターは例として提供される；原核生物性のもの：ｐＱＥベクター（キアゲン社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、ラムダ−ＺＡＰベクター（ストラタジーン社）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ファーマシア社）；真核生物性のもの：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（ストラタジーン社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（ファーマシア社）。しかしながら、他の如何なるプラスミド又は他の如何なるベクターもそれらが宿主中で複製可能で生存可能である限りにおいて使用できる。本発明においては、低コピー数のベクターも高コピー数のベクターも採用することができる。
【００６７】
本発明で使用される好ましい型のベクターは、Ｆ因子の複製開始点を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの上記Ｆ因子（即ち、稔性因子）は、接合時のそれ自身の高頻度の転移と、細菌染色体自身の低頻度の転移をもたらすプラスミドである。特に好ましい実施態様においては、「フォスミド」又は細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）と呼ばれるクローニングベクターが使用される。これらはＥ．ｃｏｌｉ  Ｆ因子から派生したものであり、ゲノムＤＮＡの巨大な区分に安定して組み込むことができる。混合され、培養されていない環境試料からのＤＮＡを組み込んだ場合、安定な「環境ＤＮＡライブラリー」の形で、巨大なゲノム断片を獲得することができる。
【００６８】
本発明に用いられるベクターのもう一つの好ましい類型はコスミドベクターである。コスミドベクターは元来、ゲノムＤＮＡの巨大な区分をクローン化し、増殖させるために設計された。コスミドベクターへのクローン化は”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９）に、詳細に記載されている。
【００６９】
上記発現ベクター中の上記ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を指向する適切な発現制御配列（プロモーター）に動作可能なように連結されている。特定の名称を付された細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダ  ＰR、ＰL、及びｔｒｐを含む。真核性のプロモーターはＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来するＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉ含む。好適なベクター及びプロモーターの選択は、当業者の水準の範囲内である。上記発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含む。上記ベクターはまた、発現増幅のための適切な配列を含んでいてもよい。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択マーカーを備える他のベクターを使用することにより、如何なる所望の遺伝子からもプロモーター領域を選択することができる。
【００７０】
加えて、上記発現ベクターは、好ましくは１個以上の選択マーカー遺伝子を有し、真核生物培養向けのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、又はＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型上の特徴を提供する。
【００７１】
一般的に、組み換え発現ベクターは、複製開始点；例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子等、上記宿主細胞の形質転換を許容する選択マーカー；及び高度に発現される遺伝子に由来し、下流の構造遺伝子の転写を指向するプロモーターを有する。斯かるプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）等の糖分解の酵素、アルファ因子、酸性ホスファターゼ、又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来しうる。異種の構造配列は、翻訳開始配列、翻訳終結配列、そして好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間又は細胞外の培地への分泌を指向させうるリーダー配列と適切に同調するように組み立てられる。
【００７２】
クローン化の戦略は、ベクターにより決められるプロモーター及び内在性のプロモーターの両者による発現を許容する；ベクターによる発現促進は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で機能しない内在性のプロモーターを有する遺伝子の発現に重要であるかもしれない。
【００７３】
微生物から単離され又は微生物に由来する上記ＤＮＡは、選択されたＤＮＡの探索に先立ってベクター又はプラスミドに挿入されることが好ましい。斯かるベクター又はプラスミドは、プロモーター、エンハンサー等の発現制御配列を有するものであることが好ましい。斯かるポリヌクレオチドは、ベクター及び／又は組成物の一部であってもよく、斯かるベクターや組成物がポリヌクレオチドを取り巻く自然環境の一部でないという点で、単離されたものとなる。特に好ましいファージ又はプラスミド、及びそれらへの導入及びパッケージ化の方法は、本明細書に記載されたプロトコルに詳細に記載されている。
【００７４】
精製された形態の核酸の如何なる供給源も開始時の核酸として使用可能である（「鋳型ポリヌクレオチド」とも規定される）。従って、上記方法は、ＤＮＡ、又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用でき、ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖であってもよく、好ましくは二本鎖である。加えて、ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれ一本の鎖を有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが使用できる。上記核酸配列は、突然変異が導入される核酸配列のサイズに応じて、さまざまな長さであってもよい。特定の核酸配列は、５０塩基対から５００００塩基対であることが好ましく、５０塩基対から１１０００塩基対であることがより好ましい。
【００７５】
上記核酸は、例えば、ｐＢＲ３２２等のプラスミド；クローン化したＤＮＡ若しくはＲＮＡ；又は細菌、酵母、ウイルス、及び植物若しくは動物等の高等生物体等、多様な供給源の天然のＤＮＡ若しくはＲＮＡ等の如何なる供給源からも取得することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは血液又は組織材料から抽出してもよい。上記鋳型ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連鎖反応（ＰＣＲ、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８３，１９５号を参照）を用いた増幅により取得することができる。或いは、上記ポリヌクレオチドは、細胞に存在するベクターに存在してもよく、上記細胞を培養し、本技術分野に知られた方法により細胞から核酸を抽出することによって十分な核酸を入手することができる。
【００７６】
突然変異を有する特定の核酸配列の、始めのわずかな集団は、さまざまな異なる方法によって作製することができる。突然変異は、変異性ＰＣＲにより作製することができる。変異性ＰＣＲは信頼性の低い重合条件を使用し、長い配列に亘って低いレベルの点突然変異を無作為に導入する。或いは、突然変異は、オリゴヌクレオチドにより指向される突然変異生成によって、上記鋳型ポリヌクレオチドに導入することができる。オリゴヌクレオチドにより指向される突然変異においては、制限酵素による消化を使用することにより、ポリヌクレオチドの短い配列が上記ポリヌクレオチドから除去され、元々の配列からさまざまな塩基が変更された、合成されたポリヌクレオチドに置き換えられる。上記ポリヌクレオチド配列は、化学的突然変異生成によっても変更することができる。化学的な突然変異原は、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、または葉酸を含む。ヌクレオチド前駆体の類似体であるその他の物質としては、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアデニンを含む。一般的にこれらの物質は、上記ＰＣＲ反応において、ヌクレオチドの前駆体に替えて添加され、これにより上記配列に突然変異を生成する。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン等のインターカレーション物質も使用することができる。ポリヌクレオチド配列の無作為突然変異生成は、Ｘ線又は紫外光の照射によっても成し遂げることができる。一般的には、斯くして突然変異を起こさせたプラスミドヌクレオチドをＥ．ｃｏｌｉに導入し、ハイブリッドプラスミドのライブラリーのプールとして増殖させる。
【００７７】
或いは、特定の核酸の混合された小さな集団が、自然に見出されてもよく、それらは同一の遺伝子又は同類の異なる種の同一の遺伝子（即ち、同族の遺伝子）の異なる対立遺伝子からなってもよい。或いはそれらは、例えば免疫グロブリン遺伝子のように、一つの種の中において見出される同類のＤＮＡ配列であってもよい。
【００７８】
上記特定の核酸配列の上記混合された集団がひとたび生成すれば、上記ポリヌクレオチドは、本技術分野に周知の技術を用いて直接使用することができるし、適切なクローニングベクターに挿入することもできる。
【００７９】
ベクターの選択は、本発明の方法において採用される上記ポリヌクレオチド配列の大きさ及び上記宿主細胞に依存する。本発明の上記鋳型は、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス等）、又はそれらの選択された部分（例えば、被覆タンパク質、スパイク糖タンパク質、キャプシドタンパク質）であってもよい。例えば、コスミド及びファージミド等のベクターは、巨大なポリヌクレオチドを安定して増殖させることができるので、突然変異生成される特定の核酸配列が巨大である場合はコスミド及びファージミドが好ましい。
【００８０】
単純化のため、本発明の上記ＴＭＣＡ法を、６箇所の異なる位置における６個の点突然変異を会合させる試みを例にとって説明する。
【００８１】
まず、６本のプライマーが設計され合成される。各プライマーは、野生型の配列と比較して、１個の点突然変異を有する。遺伝子に対合するため、３本のオリゴがフォワードプライマーとして設計されると共に、３本のオリゴがリバースプライマーとして設計される（図５）。６本のオリゴ全ては共に混合され、実施例に詳細に説明された条件でＴＭＣＡ反応を構成するために使用される。その後、ＴＭＣＡ反応の完了はアガロースゲルで検証し、上記反応が成功したかを決定する。ＤｐｎＩ制限酵素がＴＭＣＡ反応物に添加され、鋳型の環状ＤＮＡを破壊する。ＤｐｎＩを作用させるため、上記鋳型ＤＮＡはＤＮＡをメチル化可能なＥ．ｃｏｌｉ宿主から得たものでなくてはならない。ＤｐｎＩで処理された反応物はＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換され、所望の突然変異を有するＤＮＡを回収する。上記形質転換体は、シーケンシング又は所望の検定でスクリーニングされる。
【００８２】
本発明の方法は、６個の位置のものに限定されるものではない。変異位置の数が多いもの又は少ないものもこの方法により集めることができる。同様に、１個の位置について１個の変更のみ有するものに限定されるものでもない。同一の部位の異なる変更も対象とするために、それぞれのプライマーに１個の変更が導入された複数のプライマーを設計することができる。Ｅ．ｃｏｌｉは実証のために使用された；しかしながら、他の細菌性の宿主もこの方法のために有効である。本発明の方法は点突然変異を導入するのみではなく、欠失、挿入、または縮重プライマーを使用した複数の突然変異を作製できる。
【００８３】
上記ＴＭＣＡ反応は、プライマーの濃度、プライマーのＴｍ（鋳型への対合温度）、ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型濃度、上記プライマーと異なる宿主との組み合わせ等によって変更することにより、異なる位置の変更をどのように集めるかを制御することができる。
【００８４】
上記会合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ、又は両者の組み合わせで起こすことができる。図５は遺伝子に対合するプライマーの地図を図解する。本発明の方法の主な用途は、ＧＳＳＭSMにより活性が向上した突然変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）の組み合わせの再構築の用途である。しかしながら、本発明の方法は、以下に列挙した他の如何なる用途においても有効とすることができる。
【００８５】
１．ＴＭＣＡは、遺伝子に、突然変異、欠失、及び挿入等、特定の変更を加えるために使用できる。
２．ＴＭＣＡは、野生型の遺伝子を基礎として、特定の遺伝子変異体を作製するために使用できる。
３．ＴＭＣＡは、突然変異、欠失、又は挿入を組み合わせるために使用することもできる。
４．ＴＭＣＡは、突然変異、欠失、または挿入の組み合わせのライブラリーを、制御可能な様式により作製するために使用することができる。
５．ＴＭＣＡは、複数位置の組み合わせのＧＳＳＭSMライブラリーを作成するために使用することができる。
【００８６】
一般に本発明は、複数の位置に多様な突然変異の異なる組み合わせを有する、子世代の複数のポリヌクレオチドを製造するための方法を提供する。上記方法は、少なくとも以下の１以上の工程の組み合わせにより、部分的に実行することができる：
【００８７】
（第一の、又は鋳型の）ポリヌクレオチドの配列情報を取得すること。例えば、上記配列は、野生型のものであっても、突然変異した野生型のものであっても、自然発生ではない配列であってもよい。上記配列情報は、完全なポリヌクレオチドのものであってもよいし、結合部位をコードする配列、結合特異性を決める部位をコードする配列、触媒作用を決める部位をコードする配列、基質特異性を決める部位をコードする配列等の配列を含む目的とする一部の領域のものであってもよい。上記ポリヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレーム、遺伝子、ポリペプチドをコードする配列、又は酵素をコードする配列を含んでいてもよく、シグナル配列若しくは分泌配列を有していても有していなくてもよい。
【００８８】
ポリヌクレオチドの上記配列に沿って、３個、４個、５個、６個、８個、１０個、１２個、２０個、又はそれより多い位置の突然変異等、目的とする３個以上の突然変異を同定すること。上記突然変異は、ポリヌクレオチド配列のレベルのものであってもよいし、例えばコドン等、上記ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列の変異であってもよい。位置は絶対的位置によりあらかじめ定められていてもよいし、周囲の残基や相同性との関係によってあらかじめ定められていてもよい。上記突然変異の両側近傍に存在する配列が知られていることが好ましい。それぞれの突然変異部位は、異なるアミノ酸についての突然変異であるといったように、２以上の突然変異を含んでもよい。斯かる突然変異は、上述したとおり、及び米国特許第６，１７１，８２０号、米国特許第６，５６２，５９４号、米国特許第６，７６４，８３５号に記載されているとおり、Ｇｅｎｅ  Ｓｉｔｅ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＧＳＳＭ）を用いて同定することができる。
【００８９】
上記鋳型配列に対して、目的とする上記突然変異を含むプライマーを提供すること。上記プライマーは合成されたオリゴヌクレオチドであってもよい。好ましくは、プライマーは目的とする突然変異毎に提供される。上記突然変異は、１個以上のヌクレオチドの変更、又は１個以上のコードされたアミノ酸配列の変更であってもよいし、挿入又は欠失であってもよい。従って、目的とする３個の突然変異を有する位置には３個のプライマーを使用できる。上記プライマーは、目的とする突然変異がいずれかのヌクレオチド又はいずれかの天然アミノ酸の範囲内での変更となるように、又はその範囲のサブセットとなるように縮重した部位を有するプライマーのプールとしても提供されうる。例えば、脂肪族のアミノ酸残基となるようにされた突然変異を提供するプライマーのプールが提供されうる。
【００９０】
上記プライマーは、フォワードプライマー又はリバースプライマーとして、好ましくは少なくとも１個のフォワードプライマーと少なくとも１個のリバースプライマーとして、より好ましくは各プライマーの数が比較的バランスの取れたものとして（例えば、３個のフォワードと４個のリバース）調製することができる。例えば、１Ｆ、２Ｆ、３Ｆ、４Ｒ、５Ｒ、７Ｒといったように、３個のフォワードプライマーは比較的近隣するように選択することができ、リバースプライマーも同様に近隣するように選択することができる。突然変異がお互いに近傍に位置している場合、１箇所以上の位置に突然変異を有しているか、複数の位置に突然変異の異なる組み合わせを有しているプライマーを使用することが便利である。
【００９１】
上記鋳型ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを提供すること。プラスミド又は、クローニングベクター、シーケンシングベクター、若しくは発現ベクターに見られるように、上記ポリヌクレオチドは好ましくは環状であり、より好ましくはスーパーコイル形成されたものである。上記ポリヌクレオチドは一本鎖（「ｓｓＤＮＡ」）であってもよく、好ましくは二本鎖（「ｄｓＤＮＡ」）である。例えば、上記ＴＭＣＡ法は、スーパーコイル形成された（「ｓｃ」）ｄｓＤＮＡの鋳型を９５℃で１分間加熱工程に供するが、上記鋳型はｓｓＤＮＡとならない（Ｌａｖｙ，ＮＡＲ，２８（１２）：ｅ５７（ｉ−ｖｉｉ）（２０００）参照，ｓｃ  ｄｓＤＮＡを９５℃で５分間加熱してもｓｓＤＮＡ分子とならず、加熱後に分子を冷却すれば元に戻すことができることが示されている（ｐａｇｅ  ｉｉ−ｉｉｉ、図２））。
【００９２】
プライマーが鋳型のポリヌクレオチドに対合可能な条件下で、反応混合物の上記鋳型のポリヌクレオチドにプライマーを添加すること。好ましくは、上記プライマーは単一の反応混合物中のポリヌクレオチドに添加されるが、実験計画に従って、複数の反応物に添加されてもよい。
【００９３】
プライマーのポリメラーゼ伸長を行い、好ましくは環状の鋳型分子に沿って、伸長を完全に進行させること。伸長生成物（本明細書では、「子世代」又は「改変され、伸長されたポリヌクレオチド」と規定される）は慣用の方法によって増幅される。
【００９４】
上記生成物は長さ、配列、所望の核酸の性質について、分析され、ポリヌクレオチドとして及び／又はポリペプチドとして発現されてもよい。他の分析方法としては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、配列スクリーニング、又は発現スクリーニングが挙げられる。上記分析は、所望の特性についての、１回以上の回数のスクリーニングと選択を有していてもよい。
【００９５】
上記生成物は、細胞、又は無細胞系などの他の発現システムに形質転換される。無細胞系はＤＮＡ複製、修復、組み換え、転写に関連した酵素、又は翻訳のための酵素を含んでいてもよい。典型的な宿主は、細菌性の細胞及び細胞株、酵母細胞及び細胞株、植物細胞及び細胞株、並びに動物細胞及び細胞株を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ又はＳｔｂ１２株が宿主として使用できる。Ｅ．ｃｏｌｉを（所望されない鋳型を反応後に除去するのに使用することができる）ＤｐｎＩと共に使用する場合、上記鋳型ＤＮＡは、ＤＮＡをメチル化するＥ．ｃｏｌｉの宿主から得られるものであってよい。上記細胞は子世代のポリヌクレオチドの発現に用いることができる。
【００９６】
ポリヌクレオチドの発現生成物、又はポリペプチドの発現生成物は、細胞から回収し、長さ、配列、核酸の所望の性質を分析し、ペプチドとして発現させることができる。上記分析は、所望とされる性質についての１回以上のスクリーニング及び選択を含んでいてもよい。
【００９７】
本発明の方法は、実施例中に例示される条件１Ａ、７Ａ、及び１３Ａのような異なる反応条件で同一の又は異なるプライマーを用いて使用され、異なる組み合わせ又は数の突然変異を有する生成物を生じさせてもよい。
【００９８】
上述された方法を行うことにより、本発明は上記方法により製造され、所望の性質についてスクリーニングされ又は選択されることができる１個以上のポリヌクレオチドを提供することもできる。１個以上の子世代のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとして発現させることができ、必要に応じて所望の性質についてスクリーニングされ、選択される。従って、本発明は、本発明の方法により製造されたポリヌクレオチド及びポリペプチドのライブラリーの他にも、本発明の方法により製造されたポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本発明は更に、ライブラリーをスクリーニングし、選択することによるライブラリーのスクリーニングを提供し、これにより１個以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドを取得することができる。
【００９９】
本発明の一つの態様においては、複数の改変されたポリペプチドを生成するための好ましい方法は、以下の工程を含む。
【０１００】
（ａ）少なくとも３個のプライマーを、単一の反応混合物の中の二重鎖の鋳型のポリヌクレオチドに添加すること；ここで、上記少なくとも３個のプライマーは重複しておらず；上記少なくとも３個のプライマーのそれぞれは、他のプライマーとは異なる少なくとも１個の突然変異を含み；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のマイナス鎖に対合可能なフォワードプライマーであり；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のプラス鎖に対合可能なリバースプライマーであり；及び
【０１０１】
（ｂ）上記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に供し、上記少なくとも３個のプライマーから、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを得ること。
【０１０２】
本発明のもう一つの態様では、細胞が、リガーゼで処理されていない伸長された複数の生成物により形質転換される。もう一つの態様では、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドが細胞から回収される。本発明のもう一つの実施態様では、例えば、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１個を発現し、そこから発現されたポリペプチドを分析することにより、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドが分析される。もう一つの実施態様では、目的とする突然変異を含み、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを選択する。
【０１０３】
一つの実施態様では、上記鋳型のポリヌクレオチドが、例えばプラスミドＤＮＡやベクターＤＮＡ等の環状ＤＮＡである。もう一つの実施態様では、上記環状ＤＮＡはスーパーコイル形成されたＤＮＡである。
【０１０４】
もう一つの態様では、鋳型のポリヌクレオチドについての配列情報が取得され、目的とする３以上の突然変異を鋳型ヌクレオチドに沿って同定することができる。もう一つの実施態様では、伸長し、改変された生成物を細胞に形質転換される前に、ポリメラーゼ伸長により取得された生成物を分析することができる。
【０１０５】
本発明のもう一つの態様では、ポリメラーゼ伸長により得られた生成物を、酵素、好ましくは制限酵素、より好ましくはＤｐｎＩ制限酵素で処理して、上記鋳型のポリヌクレオチド配列を破壊する。上記処理された生成物は、細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換される。
【０１０６】
もう一つの実施態様では、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、又はそれ以上のプライマーが使用される。一つの実施態様では、それぞれのプライマーは単一の点突然変異を有する（図４Ａ）。もう一つの実施態様では、２個のフォワードプライマーと、２個のリバースプライマーは、上記鋳型のポリヌクレオチド上の同一の位置に異なる変更を含む（図４Ｂ）。本発明のもう一つの態様では、少なくとも１個のプライマーが、上記鋳型のポリヌクレオチドの異なる位置に、少なくとも２個の変更を含む（図４Ｃ）。さらにもう一つの実施態様では、少なくとも１個のプライマーが、鋳型のポリヌクレオチド上の同一の位置に少なくとも２個の変更を含み、少なくとも２個のフォワード又はリバースプライマーが上記鋳型ポリヌクレオチドの同一の部位に異なる変更を含む（図４Ｄ）。
【０１０７】
一つの実施態様では、フォワードプライマーがフォワード群に分類され、リバースプライマーがリバース群に分類され、上記フォワード群のプライマー及び上記リバース群のプライマーが、互いに独立して、上記鋳型のポリヌクレオチド上の位置に関係なく、対応する群の中で等濃度となるように標準化され、標準化後に等量のフォワードプライマーとリバースプライマーとが反応に添加される。この標準化方法において、一部の位置の組み合わせは偏っていてもよい。この偏りは、例えば、複数のプライマーを有する位置に比較した、単一のプライマーを有する一つの位置における比較的低いプライマー濃度に起因する。「位置の偏り」は、そのフォワード群又はリバース群の中において、他の位置に比較して、一つの位置においてプライマーの組み込みに強い選択を示す、結果として生じるポリヌクレオチドを意味する。これは、そのフォワードプライマーの群、又はリバースプライマーの群の中において、単一のプライマーの位置において突然変異の高い確率を有するものの、もう一つの位置において突然変異の低い確率を有する可能性がある、改変されたポリヌクレオチドの組み合わせをもたらす。この偏りは、ＴＭＣＡの目的が全ての可能な鋳型への変更の組み合わせを有する子世代のポリヌクレオチドを生成することである場合には好ましくない。上記偏りは、例えば、上記プライマーを、各位置が同等にされたプールに標準化することにより是正することができる。第２回のＴＭＣＡ法において第１回のＴＭＣＡ法において得られた一部の変異体を使用した２回のＴＭＣＡ法を行うことは、鋳型に複数の変更を有する所望の子世代のポリヌクレオチドの収率を向上させることができる。
【０１０８】
もう一つの実施態様においては、上記プライマーの標準化が以下のようにして行われる；鋳型のポリヌクレオチド上のプライマーの位置に応じて、プライマーを複数の群に組織化すること−ここで、上記鋳型上、同一の選択された領域に亘るプライマーを１個の群に含める；グループ化されたプライマーをそれぞれの群の中で等濃度になるように標準化すること；１個の群のフォワードプライマーをフォワード群に集め、上記フォワードプライマーのそれぞれの群の間で濃度が等しくなるように標準化すること；１個の群のリバースプライマーをリバース群に集め、リバースプライマーのそれぞれの群の間で濃度が等しくなるように標準化すること；集められた等量の上記フォワードプライマー及び上記リバースプライマーを反応に添加すること。位置の組み合わせについては、偏りは観察されなかった。
【０１０９】
一つの実施態様においては、それぞれ１個の縮重部位を有する縮重プライマーのセットが提供されるが、ここで、目的とする上記突然変異は上記縮重部位におけるさまざまな異なるヌクレオチドである。もう一つの態様においては、鋳型の上記ヌクレオチドの少なくとも１個のコドンに対応する少なくとも１個の縮重コドン、および上記鋳型のポリヌクレオチドの配列の上記コドンに隣接する配列に相同性を有する少なくとも１個の隣接する配列を有する縮重プライマーのセットが提供される。もう一つの実施態様においては、上記縮重コドンがＮ，Ｎ，Ｎであり、２０個の天然アミノ酸のいずれかをコードする。もう一つの実施態様においては、上記縮重コドンが２０個未満の天然アミノ酸をコードする。
【０１１０】
異なる実施態様においては、目的とする突然変異を含む改変された複数のポリヌクレオチドを製造する好ましい方法は、以下の工程を含む。
【０１１１】
（ａ）少なくとも２個のプライマーを単一の反応混合物中の二重鎖の鋳型ポリヌクレオチドに添加すること；ここで、前記少なくとも２個のプライマーは重複しておらず；前記少なくとも２個のプライマーのそれぞれは、他のプライマーと異なる少なくとも１個の突然変異を含み；少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のマイナス鎖に対合可能なフォワードプライマーであり、少なくとも１個のプライマーは、上記鋳型のプラス鎖に対合可能なリバースプライマーである；
【０１１２】
（ｂ）上記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に供し、上記少なくとも２個のプライマーから、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを得ること；
【０１１３】
（ｃ）伸長され、改変された上記複数のポリヌクレオチドを酵素で処理して上記鋳型ヌクレオチドを破壊すること；
【０１１４】
（ｄ）リガーゼによって処理されていない、伸長され、改変された上記ポリヌクレオチドを、細胞に形質転換すること；
【０１１５】
（ｅ）伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを細胞から回収すること；及び
【０１１６】
（ｆ）目的とする突然変異を含む、伸長され、改変された複数のポリヌクレオチドを選択すること。
【実施例】
【０１１７】
以下に示す実施例は、鋳型又は遺伝子の複数の位置における単一の突然変異が、単純な単一の反応混合物の中で、首尾よく組み合わされることを示すが、これは突然変異を生成する知られた方法に基づいて予測されなかった。実験から得られた可能な組み合わせの分布は、統計的計算から得られた分布パターンと類似したものであった。上記反応は、必要性を踏まえて、偏った組み合わせを生成するように仕立てることができる。
【０１１８】
ＧＳＳＭSM技術の下では、上記ＴＭＣＡ技術は、上記鋳型のポリヌクレオチドのプラス鎖及びマイナス鎖の両方に対合する相補的プライマーを採用しない。本ＴＭＣＡ発明のために記載された（単一の温度サイクル反応についてフォワード群とリバース群を含む）プライマーを有する温度サイクリングによる伸長から合理的に予想されることは、フォワードプライマー及びリバースプライマー個々の組から規定される、増幅された線形のポリヌクレオチドの排他的コレクションが生成するということである。上記ＴＭＣＡ条件の設定は、標準的なＰＣＲ条件とほとんど同一である。上記ＴＭＣＡ反応においては、複数のＰＣＲ生成物が製造され、ここで、それぞれの生成物が有する突然変異の数は、単一の反応において使用されるプライマーのセットにより網羅される突然変異の完全なセットよりも少なくなる、例えば、６個のプライマーが使用され、それぞれのプライマーが１個の突然変異を有する場合に、突然変異が６個よりも少なくなることが予測されるだろう。更に、上記ＰＣＲ生成物は、細胞に形質転換され、増幅されることが予期されない。驚くべきことに、上記ＴＭＣＡ法は、１個の分子中に複数の変更を含む特定の遺伝子変異体を生成できると共に、ライゲーション工程を採用することなく実施することができ、以って複数の突然変異を生成する方法を単純化する。
【０１１９】
＜実施例１；ＴＭＣＡ法の例示的手順を以下に示す＞
ＴＭＣＡ反応
↓
ＤｐｎＩ処理
↓
宿主への形質転換
↓
スクリーニング
【０１２０】
１．ＴＭＣＡ反応の設定
条件１
Ｐｆｕ  １０×緩衝液          ２．５μｌ
ＤＭＳＯ                      ２．５μｌ
ｄＮＰＴ混合液（１０ｍＭ）    ０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ（２５ｎｇ／μｌ）      １μｌ
Ｐｆｕターボ                  ０．５μｌ
水                              １４μｌ
フォワードプライマー（５μＭ）    ２μｌ
リバースプライマー（５μＭ）      ２μｌ
合計                            ２５μｌ
【０１２１】
条件２
Ｐｆｘ  Ａｃｃｕ  緩衝液          ５μｌ
鋳型ＤＮＡ（２５ｎｇ／μｌ）      １μｌ
Ｐｆｘ  Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ    ０．４μｌ
水                          ３７．６μｌ
フォワードプライマー（５μＭ）    ３μｌ
リバースプライマー（５μＭ）      ３μｌ
合計                            ５０μｌ
【０１２２】
条件３
Ｐｆｘ  Ａｃｃｕ緩衝液        ２．５μｌ
鋳型ＤＮＡ（２５ｎｇ／μｌ）      １μｌ
Ｐｆｘ  Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ    ０．２μｌ
水                          １７．３μｌ
フォワードプライマー（５μＭ）    ２μｌ
リバースプライマー（５μＭ）      ２μｌ
合計                            ２５μｌ
【０１２３】
サイクル Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
始めの変性      ９５℃；１分            ９３℃；３分          
変性            ９５℃；４５秒          ９５℃；４５秒        ｜
対合            ５０℃；１分            ５０℃；４５秒        ｜２０サイクル
伸長            ６８℃；２分／ｋｂ      ６８℃；２分／ｋｂ    ｜
改良            ６８℃；５分            ６８℃；５分
４℃；無期限            ４℃；無期限
２．ＴＭＣＡ反応物のうち５０を電気泳動に供し、上記反応が成功しているかを決定する。
３．Ｄｐｎ１制限酵素のうち１０を３μｌの水と１μｌの緩衝液４（ニューイングランドバイオラボ社）で希釈する。ＴＭＣＡ反応物のそれぞれに、希釈した酵素を５μｌずつ加える。３７℃で４時間から８時間保温する。
４．標準的な形質転換の手順により、Ｄｐｎ１で処理した反応物をＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。
５．シーケンシング又は所望の検定により、結果として生じたコロニーをスクリーニングする。
【０１２４】
＜実施例２＞
最初の実験では、遺伝子上の６箇所の位置が選択されて組み合わされた（図５）。反応は、３箇所の位置のフォワードプライマーと残る３箇所の位置の３個のリバースプライマーとを用いて設計された。上記反応から得られた変異体は、シーケンシングにより同定された。６４個の異なる可能な組み合わせが存在した。条件１の下では、より少ない数の突然変異部位を有する変異体がより多く生成した（図６）。条件２及び２の下では、より多い数の突然変異部位を有する変異体がより多く生成した。組み合わされたデータ（合計）からの全ての可能な組み合わせの分布は、統計的な計算による分布パターンと類似していた（図６）。図７の一つの曲線は、突然変異体の予測されるカバー率（％）を示し、もう一つの曲線は、０クローンから６００クローンがスクリーニングされたときの、完全なカバーの可能性を示す。予測されるカバー率（％）の曲線上の円（即ち、７８％、９５％、９９％、及び１００％）は、９６クローン、１９２クローン、２８８クローン、又は３８４クローンがスクリーニングされたときの予測されるカバー率を示す。予測されるカバー率（％）の曲線の下の四角（即ち、７０％、９１％、９５％、及び９８％）は、実験データから得られる実際のカバー率を示す。上記データでは、予測されるカバー率と実際のカバー率との間でのほぼ完全な一致を示す。
【０１２５】
表１  ６個の突然変異のアセンブリー
0006014805.tif 000002
【０１２６】
＜実施例３＞
第２の実験において、遺伝子上の４箇所の位置が選択され、組み合わせた（図８）。上記反応は、２箇所の位置のフォワードプライマーと残る２箇所の位置の２個のリバースプライマーとを用いて設計された。上記反応により得られた変異体は、シーケンシングにより同定された。１６個の異なる可能な組み合わせが存在した。第１の実験と同様に、条件１はより少ない数の突然変異部位を有する変異体をより多く生成し、条件２及び３はより多い数の突然変異部位を有するより変異体をより多く生成した（図９及び図１０）。組み合わされたデータ（合計）からの全ての可能な組み合わせの分布は、統計的計算から得られる分布パターンと類似していた（図９及び図１０）。
【０１２７】
表２  ４個の突然変異のアセンブリー
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【０１２８】
＜実施例４＞
第３の実験において、遺伝子上の３箇所の位置が選択され、組み合わされた（図１１）反応は、２箇所の位置のフォワードプライマーと、第３の位置の１個のリバースプライマーを用いて設計された。上記反応から得られた変異体は、シーケンシングにより同定された。この場合において、８個の異なる可能な組み合わせが存在した。条件９Ｂの下では、２４コロニーのシーケンシングによって、８個の変異体全てが回収された。図１２参照。
【０１２９】
＜実施例５＞
熱的安定性を改善し、リパーゼの特異的活性を向上させるために、ＧＳＳＭSMにより活性が向上した１３個の突然変異（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）が選択された（５箇所の位置）（図１３）。３箇所の位置（Ｎ１６８Ｓ、Ｎ１７１Ｅ、及びＭ１７６Ｗ）は共にグループ化され、単一のプライマーに含まれた。ライブラリーの大きさは、６×６×２×２×２＝２２８となった。反応は、以下の方法により準備された：フォワードプライマーがフォワード群に分類され、リバースプライマーがリバース群に分類され、そしてフォワード群のプライマーとリバース群のプライマーが、互いに独立に、対応する群の中で鋳型のポリヌクレオチドの位置に関係なく等濃度になるように標準化され、標準化された後に等量の上記フォワードプライマーと上記リバースプライマーが反応溶物に添加された。位置１と位置２の組み合わせは偏っていた（図１３、及び図１４Ａ、Ｂ、Ｃ）。位置１及び位置３の組み合わせ、又は位置２及び位置３の組み合わせと比較して、位置１及び位置２の組み合わせにおいて、可能な特有の変異体のより低い確率が実現した。２回のＴＭＣＡ反応が行われた。第２の回において、第１の回から得られた変異体のうちの一部が使用された。７２０クローンのシーケンシングの後（２．５×ライブラリーの被覆率）、第１の回の２８８の特有の変異体のうち４６％が得られた。ここで、１×被覆率のシーケンシングは、シーケンシングされた変異体（子世代）の数が可能な特有の変異体の数に等しいことを意味し、従って、２．５×被覆率は、シーケンシングされた変異体（子世代）の数が可能な特有の変異体の数（２８８）の２．５倍であることを示す。２回のＴＭＣＡ反応が行われた。第２の回において、第１の回により得られた変異体の一部が鋳型のポリヌクレオチドとして使用された。第２の回において、それぞれのＴＭＣＡ反応に使用されたプライマーは、第１の回において得られなかった変異体を得られるように仕立てられた。第２の回の後、２８８の特有な変異体の９５．５％が得られた。スクリーニングの後、このライブラリーから、１０個の活性が向上した突然変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）が得られた（図１４Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【０１３０】
実施例は、上記ＴＭＣＡ法が組み合わせライブラリーを効率的に作製することを可能にすることを示す。突然変異体の位置に応じていくつかの制限が明確になるが、代替する方法が設計されることにより、これらの制限を解消することができる。新たな改良された改変は、偏りを著しく減少させることができる。ＴＭＣＡ反応を多数回行って、いくらかの偏りを解消することができる。上記ＴＭＣＡ法は、複数の酵素や複数のベクター系に有効であることが示された。ベクターの大きさの制限は１１ｋｂにも及びうる。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
上記の教示を踏まえると、明らかに、本発明の数多くの改変及び変更が可能である。添付した特許請求の範囲の範囲内で、本明細書に具体的に記載された態様以外の態様で、本発明が実施できることが理解されるであろう。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１３】
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【図１４Ｃ】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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