(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法であって、
（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、
前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、
前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、
少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、
（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、
（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有し、
前記検出用プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、
前記競合プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、
前記検出用プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に相補的なマッチ塩基から２塩基以内に位置し、
前記競合プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から１７塩基以内に位置し、
前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基は、プライマーの中心付近に配置し、かつ３’末端から７〜１５塩基目に位置し、
前記検出用プライマーが有する前記第1のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な前記第１のミスマッチ塩基の位置とは異なり、
前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１塩基以内であり、
前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであることを特徴とする標的塩基配列の検出方法。
【請求項２】
前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基の位置が同じであることを特徴とする請求項１に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）〜（ｄ）が、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＡＮ、ＴＲＣ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＳＭＡＰ、ＲＰＡ、ＨＤＡよりなる群から選ばれる１つにより行われる工程であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項４】
前記検出用プライマー、前記競合プライマー、または前記共通プライマーの少なくとも１つが標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項５】
前記標識に用いられる標識物質が、蛍光色素及びエネルギー吸収性物質からなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項４に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項６】
前記検出用プライマーと、前記競合プライマーとを、異なる種類の標識物質でそれぞれ標識し、前記工程（ｅ）が、前記検出用プライマーからの伸長産物と、前記競合プライマーからの伸長産物とを別個に検出する工程であることを特徴とする請求項４又は５に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項７】
前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）〜（ｄ）と同時に行われる工程であって、標識されたプライマーからの伸長産物が、２本鎖を形成している状態を検出する工程であることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項８】
前記工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）後に行われる工程であって、前記伸長産物の融解曲線または増幅曲線を用いて検出する工程であることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項９】
前記工程（ｅ）は、ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ）法、を用いて検出する工程であることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
【請求項１０】
多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法に用いるキットであって、
前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、
前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、
少なくとも１種の共通プライマーと、を含み、
前記検出用プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、
前記競合プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、
前記検出用プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に相補的なマッチ塩基から２塩基以内に位置し、
前記競合プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から１７塩基以内に位置し、
前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基は、プライマーの中心付近に配置し、かつ３’末端から７〜１５塩基目に位置し、
前記検出用プライマーが有する前記第1のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な前記第１のミスマッチ塩基の位置とは異なり、
前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１塩基以内であり、
前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであり、
前記方法は、
（ａ）標的核酸を有する核酸試料に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを添加する工程と、
（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、
（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有していることを特徴とする標的塩基配列検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
多型塩基を有する標的塩基配列の検出方法及び前記方法に用いられるキットに関する。さらに詳述すると、プライマーを競合させることによって、高精度に標的塩基配列を検出する方法、及び前記方法に用いられるキットに関する。
本願は、２０１０年３月２４日に、日本に出願された特願２０１０−６８４９０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近時、世界的なヒトゲノム解析により、その約３１億個の塩基対の配列が明らかにされ、ヒトの遺伝子の数が約３〜４万個であることが明らかとなった。【０００３】
ヒトには個体間で塩基配列の違いが存在し、特定の集団人口の１％以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。その中でも遺伝子の塩基配列が一塩基だけ異なっている一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）は、種々の疾患と関連性があることが示唆されている。例えば、ヒトの遺伝子病は、一つの遺伝子中の一塩基の違いが病気の原因となると考えられている。また、生活習慣病やガンなどは、複数の遺伝子における一塩基の違いが影響していると考えられている。
したがって、ＳＮＰの解析は、創薬ターゲットの探索または副作用の予見などの医薬品の開発において、極めて有効であると考えられる。このため、ＳＮＰの解析は世界的な巨大プロジェクトとして押し進められている。【０００４】
薬物の効果や副作用の程度に個人差があることの原因の一つとして、個々人の薬物代謝に関わる酵素群の違いが挙げられる。その違いも遺伝子上のわずかな違いによるものであることが最近明らかにされつつある。
そこで、あらかじめ患者の遺伝子を解析することによって、最適な薬剤を選択し患者に投与する方法が考えられている。さらに、単一遺伝子疾患のみならず多因子疾患についても、遺伝子診断の意義が急速に高まりつつある。【０００５】
また、病原細菌やウイルスを標的とした薬物の効果は、同一種であっても、個体毎に異なることがあり、これらは個体毎の遺伝子の微細な違いによることが多い。このような外来因子である病原細菌やウイルスの遺伝子診断も、今後は検査対象が確実に増加することが予想される。【０００６】
このようにポストゲノム時代の医療においては、ヒトや病原微生物の遺伝子の微細な違い、とりわけ一塩基の違いを検出できることは重要であり、今後もその重要性が増すと予想される。【０００７】
これまでに、塩基配列における微細な違い、とりわけ一塩基の違いを検出する方法が種々検討されている（非特許文献１〜２参照。）。
しかしながら、実用レベルでの検出を行うためには、低コスト、方法の簡便性、検出時間の短さ、検出結果の正確さなどの点がいずれも優れていることが要求される。しかしながら、現在までのところ、上記要求を満たす方法は知られていない。【０００８】
遺伝子の微細な違い、とりわけその一塩基の違いを検出する場合、目的とする遺伝子断片は試料中にわずかしか含まれていないのが一般的である。この場合、目的とする遺伝子を、何らかの方法によって予め増幅させておくことが必要となる。このような遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ   Ｃｈａｉｎ   Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が挙げられる。【０００９】
一般的に、目的の遺伝子の一塩基の違いを検出するためには、遺伝子増幅の段階と、増幅させた遺伝子の一塩基の違いを調べる段階との二段階の工程を必要とする（非特許文献２参照。）。しかしながら、二段階の工程を必要とする方法は、工程が複数あるため、処理が煩雑となる。【００１０】
このような二段階の工程の煩雑さを改善するため、例えば、蛍光色素とクエンチャーがついたプローブを用いるＴａｑＭａｎ法（非特許文献３参照。）や、質量分析計によるＤＮＡの質量分析を利用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（非特許文献４参照。）等が報告されている。また、遺伝子の増幅を必要としない方法として、ＤＮＡの構造を認識して切断する酵素を用いるＩｎｖａｄｅｒ法（非特許文献５参照。）が報告されている。しかしながら、これらの方法は依然として実施するコストが高く、またプローブの設計も複雑である。【００１１】
一方、遺伝子の増幅と一塩基の識別とを同時に行う方法が報告されている（非特許文献６参照。）。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応において、プライマーの３’末端がサンプル中の鋳型ＤＮＡと相補的（以下、マッチ）であるか否かによって、伸長反応が起こったり起こらなかったりすることを利用するものである。すなわち、ＰＣＲ反応に用いられる一対のプライマーセットにおいて、一方のプライマーの３’末端が一塩基多型に相補的な塩基を有るようにプライマーを設計すると、プライマーが鋳型と完全にマッチである場合には、伸長反応が起こり、他方のプライマーとの間で増幅反応が引き起こされる。ところが、一方のプライマーと鋳型との間で一塩基のミスマッチがある場合には、そのプライマーからの伸長反応は起こりにくく、他方のプライマーとの間での増幅反応も起こりにくい。このようにして増幅反応による増幅産物の量によって、一塩基の識別を行うことができる。この方法によれば、増幅反応後にさらに操作を行って一塩基を識別する必要がない。【００１２】
しかしながら、この方法は、反応条件、例えば、鋳型の量、温度、プライマーの量、または反応基質であるｄＮＴＰの濃度などにより、反応が影響を受けやすい。このため、常に再現性のあるデータを得ることが容易でない。【００１３】
別の方法として、例えば、プライマーの３’末端付近に人工的な変異（鋳型とミスマッチである塩基）を導入する方法が検討されている（非特許文献７参照。）。しかしながら、この方法でも、プライマーの最適化に一定の労力を必要とし、識別精度も試料の品質によって影響を受けることがある。【００１４】
これらの問題を解決するために、蛍光色素などで標識された少なくとも二種類のプライマーを競合させる方法が提案されている（特許文献１〜４参照。）。【００１５】
特許文献１〜３に提案されている様な、プライマーの３’末端または末端付近を調べたい塩基の位置に合わせ、サンプル中の標的核酸の塩基とマッチしたときは伸長反応が起こり、ミスマッチのときには伸長反応が起こりにくいことを利用した検出方法をアレル特異的ＰＣＲ（ＡＳＰ−ＰＣＲ）という。【００１６】
アレル特異的ＰＣＲを行う際に、２つ以上のアレル特異的なプライマーを競合させた場合と各アレル特異的プライマーを個別に増幅させた場合での塩基識別精度は、競合させたほうが高いことが分かっている（非特許文献８参照。）。これは、検出したいアレルと異なるアレルが存在するとき、異なるアレルにマッチするプライマーが、標的塩基配列に優先的に結合し、検出したいプライマーの非特異伸長反応を抑えるためである。さらに、異なるアレルにマッチするプライマーからの伸長が効率よく進むことで、伸長反応に必要な材料が消費されるため、検出したいアレルにミスマッチであるプライマーによるプライマーダイマーの生成を抑制することもできる。このようにプライマーを競合させる方法を競合オリゴヌクレオチドプライミング（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ、ＣＯＰ）といい、特許文献１〜４においては、ＣＯＰが用いられている。【００１７】
特許文献１で提案されている方法は、標的核酸に対して、ミスマッチ塩基の数が異なる複数の競合プライマーを用いた時に、ミスマッチ塩基の数が少ない競合プライマーが標的核酸と２本鎖を形成しやすいという性質を利用した方法であり、標的核酸中の一塩基変異を簡便に検出する場合には優れた方法である。
しかしながら、この方法では、ＳＮＰ解析の際に擬陽性が出る可能性がある。これは、標的核酸中の一塩基変異にのみ着目して競合プライマーの設計を行っているため、ミスマッチ塩基の数が多い競合プライマーからの伸長を抑制する能力が不十分であるためと考えられる。【００１８】
アレル特異的ＰＣＲに用いられるアレル特異的プライマーは、３’末端付近での標的核酸との２本鎖の安定性が重要であり、３’末端付近において、識別したい塩基以外の塩基が標的核酸と相補にならないように設定することでさらに塩基識別を高めることができる。【００１９】
特許文献２で提案されているＳＮＰ検出方法においては、特許文献１で問題となっていた擬陽性を低減すべく、競合プライマーの３’末端にＳＮＰを識別する塩基を導入し、更に３’末端から２〜５塩基のいずれか１つ以上に人工的な変異を導入している。【００２０】
また、特許文献３で提案されている塩基多型の検出方法においては、競合プライマーの３’末端から５番目までの位置に人工的な変異を導入している。【００２１】
特許文献２〜３に提案されている方法は、競合プライマー間で同じ位置に同じ変異を導入したものであり、プライマーの３’末端付近が標的核酸とマッチであれば効率よく伸長反応が進み、ミスマッチ塩基が増えるほど伸長効率が落ちることを利用したものである。また、ミスマッチ塩基が増えることによってプライマーと標的核酸との２本鎖が全体として不安定になることも伸長効率の低下に関連している。【００２２】
特許文献４で提案されている塩基多型の検出方法では、競合プライマー間で同じ位置に異なる変異を導入することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特許第２７６０５５３号公報
【特許文献２】特開２００３−５２３７２号公報
【特許文献３】特開２００５−２８７４９９号公報
【特許文献４】特許第４２２８０４１号公報
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ、１９９６年
【非特許文献２】Ａｈｍａｄｉａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３２巻、第１１２２〜１１３７頁、２００２年
【非特許文献３】Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．、第５巻、第３５７〜３６２頁、１９９５年
【非特許文献４】Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１８巻、第７７〜８４頁、２０００年
【非特許文献５】Ｒｙａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第４巻、第１３５〜１４４頁、１９９９年
【非特許文献６】Ｏｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、第１１４巻、第１０５〜１１３頁、１９８９年
【非特許文献７】Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１７巻、第２５０３〜２５１６頁、１９８９年
【非特許文献８】Ｍｙａｋｉｓｈｅｖら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、第１１巻、第１６３〜１６９頁、２００１年
【非特許文献９】Ｓｈｉｎｏｚｕｋａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１０巻、１３７７〜１３７８頁、１９９４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
しかしながら、これらの方法でも、鋳型と３’末端付近がミスマッチとなる競合プライマーからの伸長を抑制する能力が依然として不十分である。【００２６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、従来の方法と同様の簡便さを持ちながら、識別精度の高い標的塩基配列の検出方法、及び前記方法に用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、競合プライマーに導入する変異の位置を検討することにより、課題を解決できることを見出した。【００２８】
すなわち本発明は、下記（１）〜（１４）を提供するものである。
（１）多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法であって、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有し、前記検出用プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、前記競合プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、前記検出用プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に相補的なマッチ塩基から２塩基以内に位置し、前記競合プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から１７塩基以内に位置し、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基は、プライマーの中心付近に配置し、かつ３’末端から７〜１５塩基目に位置し、前記検出用プライマーが有する前記第1のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な前記第１のミスマッチ塩基の位置とは異なり、前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１塩基以内であり、前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであることを特徴とする標的塩基配列の検出方法。
（２）前記（１）の標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基の位置が同じであってもよい。
（３）前記（１）又は（２）の標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｂ）〜（ｄ）が、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＡＮ、ＴＲＣ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＳＭＡＰ、ＲＰＡ、ＨＤＡよりなる群から選ばれる１つにより行われる工程であってもよい。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマー、前記競合プライマー、または前記共通プライマーの少なくとも１つが標識されていてもよい。
【００２９】
（５）前記（４）の標的塩基配列の検出方法において、前記標識に用いられる標識物質が、蛍光色素及びエネルギー吸収性物質からなる群より選ばれる少なくとも１つであってもよい。
（６）前記（４）又は（５）に記載の標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマーと、前記競合プライマーとを、異なる種類の標識物質でそれぞれ標識し、前記工程（ｅ）が、前記検出用プライマーからの伸長産物と、前記競合プライマーからの伸長産物とを別個に検出する工程であってもよい。
（７）前記（４）〜（６）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）〜（ｄ）と同時に行われる工程であって、標識されたプライマーからの伸長産物が、２本鎖を形成している状態を検出する工程であってもよい。
（８）前記（４）〜（６）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）後に行われる工程であって、前記伸長産物の融解曲線または増幅曲線を用いて検出する工程であってもよい。
（９）前記（４）〜（８）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｅ）は、ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ）法、を用いて検出する工程であってもよい。
（１０）多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法に用いるキットであって、前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を含み、前記検出用プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、前記競合プライマーは、３’末端又は３’末端から２塩基目に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な１又は２つの第１又は第１及び第２のミスマッチ塩基とを有し、前記検出用プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に相補的なマッチ塩基から２塩基以内に位置し、前記競合プライマーが有する前記第１のミスマッチ塩基が、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から１７塩基以内に位置し、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基は、プライマーの中心付近に配置し、かつ３’末端から７〜１５塩基目に位置し、前記検出用プライマーが有する前記第1のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な前記第１のミスマッチ塩基の位置とは異なり、前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１塩基以内であり、前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであり、前記方法は、（ａ）標的核酸を有する核酸試料に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを添加する工程と、（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有している。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の標的塩基配列の検出方法によれば、従来の方法と同様の簡便さを持ちながら、一塩基多型および一塩基の体細胞変異を高精度に識別することができる。
また、本発明の標的塩基配列検出キットによれば、本発明の標的塩基配列の検出方法をより簡便に行うことをできる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
【図２】従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
【図３】本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
【図４】本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
【図５】本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
【図６】本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
【図７Ａ】プライマー［１］と［２］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。
【図７Ｂ】プライマー［１］と［２］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。
【図８Ａ】プライマー［１］と［３］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。
【図８Ｂ】プライマー［１］と［３］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。
【図９Ａ】プライマー［１］と［４］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。
【図９Ｂ】プライマー［１］と［４］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。
【図１０】１本鎖状態と２本鎖状態を見分ける方法を模式的に示した図である。○；アクリジン、◇；フルオロセイン
【図１１】比較例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１２】比較例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１３】実施例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１４】実施例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１５】実施例３の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１６】実施例４の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１７】実施例５の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１８】実施例６の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図１９】実施例７の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２０】実施例８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２１】実施例９の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２２】実施例１０の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２３】実施例１１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２４】実施例１２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２５】実施例１３の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２６】実施例１４の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２７】実施例１５の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２８】実施例１６の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図２９】実施例１７の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図３０】実施例１８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
【図３１】実施例１９〜２７の結果を増幅曲線で示した図である。
【図３２】実施例２８〜３５の結果を増幅曲線で示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の標的塩基配列の検出方法は、多型塩基を有する標的核酸を検出する方法である。
【００３３】
本発明において、標的塩基配列とは、多型塩基を有する塩基配列をいう。
本発明において、標的塩基配列を検出するとは、核酸試料中に含まれている核酸の塩基配列が、既知の塩基配列と同一の塩基配列であるか否かを検出することをいう。
【００３４】
本明細書および特許請求の範囲において、識別対象である多型を有する核酸を「標的核酸」という。
標的核酸は、多型塩基を含有する塩基配列からなり、前記標的核酸とアニール可能なプライマーを設計できる程度に塩基配列が明らかにされているものであれば、特に限定されるものではない。
【００３５】
また、標的塩基配列が有する多型塩基は、一塩基多型であれば、ＳＮＰのような先天的な多型であってもよく、体細胞変異等の後天的な多型であってもよい。
ＳＮＰ（一塩基多型）とは、同一生物種の個体間のゲノム塩基配列中に一塩基の違いがあり、その変異が集団内で１％以上の頻度で見られるものと定義されている。
一方、体細胞変異とは同一固体内において後天的に生じた遺伝子の細胞間での違いを意味する。また、変異部位とは、配列中における塩基の相違する部位を意味する。塩基配列中の変異は一塩基置換のみならず複数の塩基が置換、欠失あるいは挿入されている場合がある。
【００３６】
検出の対象とする多型としては、たとえば、遺伝病、生活習慣病、がん等の各種疾患、薬物代謝に関連する遺伝子の多型等が挙げられる。本発明は、特に、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）や、がん遺伝子Ｋ−Ｒａｓの１２番目又は１３番目のコドンにおける変異の検出に好適に用いられる。
【００３７】
本発明において、検出用プライマーとは、標的塩基配列を検出するプライマーをいう。
検出用プライマーは、多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的塩基配列に対して、多型塩基以外に少なくとも１つのミスマッチ塩基とを有する。
検出用プライマーが有するミスマッチ塩基の数は、１つでもよく、２つ以上でもよい。好ましくは、１〜５であり、より好ましくは、１〜３であり、特に好ましくは１又は２である。
【００３８】
本発明において、競合プライマーとは、標的核酸中の多型塩基を含む領域に対して、前記検出用プライマーと競合的にアニールするプライマーであり、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基を有する。競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基を有するため、標的核酸にアニールした際に、標的核酸中の多型塩基とは塩基対を形成しない。また、競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基に加えて、前記標的塩基配列に対して、多型塩基以外に少なくとも１つのミスマッチ塩基を有する。
競合プライマーが有するミスマッチ塩基の数は、１つでもよく、２つ以上でもよい。好ましくは、１〜５であり、より好ましくは、１〜３であり、特に好ましくは１又は２である。
【００３９】
尚、本発明において、マッチとは、２本鎖を形成しているＤＮＡ塩基対がワトソンクリック型塩基対を形成している状態を意味し、ミスマッチとはワトソンクリック型塩基対を形成していない状態を意味する。ワトソンクリック型塩基対とはデオキシリボ核酸の２本のポリヌクレオチド分子が、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（もしくはウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）という組を作り、水素結合で繋がったものをいう。ミスマッチ塩基は天然塩基でも人工塩基でも構わないが、鋳型の塩基と異なっている必要がある。
【００４０】
検出用プライマーが有する少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置は、前記競合プライマーが有するミスマッチ塩基の位置とは異なる。従って、検出用プライマーと競合プライマーとの間では、塩基配列が少なくとも３塩基異なる。
ここで、ミスマッチ塩基の位置とは、鋳型とプライマーが２本鎖を形成したときに、プライマー中において多型塩基に対応する塩基を基準とした位置をいう。
標的核酸に対して両者を競合的にアニールさせることにより、多型塩基検出精度を向上させることができる。これは、検出したいアレル（本発明における標的核酸）と異なるアレルが存在するとき、目的のアレルを検出できるプライマーを検出用プライマーとし、異なるアレルを検出できるプライマーを競合プライマーとして用いた場合には、当該異なるアレルに競合プライマーが優先的に結合することにより、検出用プライマーの非特異反応を抑えるためである。また、３’末端付近の安定性の違いから競合プライマーからの伸長が効率よく進むことで、伸長反応に必要な材料が消費されるため、検出用プライマーからの非特異増幅を抑えることもできる。
【００４１】
本発明において、検出用プライマー及び競合プライマーは、標的塩基配列に本質的に相補的である。ここで、本発明において本質的に相補的であるとは、オリゴヌクレオチドが、伸長反応の反応条件下において、特定の配列を持つ標的核酸と２本鎖状態を形成することのできる塩基配列を持つことを意味し、必ずしも完全に相補的である必要はなく、いくつかのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。
【００４２】
また、検出用プライマー及び競合プライマーは、標的塩基配列中であれば、アニールする領域が異なっていてもよい。標的核酸に競合的にアニールさせる点からは、検出用プライマーがアニールする領域と同じ領域において、標的核酸と競合プライマーとがアニールするように、両プライマーを設計することが好ましい。
【００４３】
本発明において検出用プライマーは、３’末端、または３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的な塩基を有することが好ましい。標的核酸に競合的にアニールさせる点から、競合プライマーは、３’末端、または３’末端から２塩基目に多型塩基に非相補的な塩基を有することが好ましい。
【００４４】
例えば、標的塩基配列が５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣ−３’であり、５’末端から５塩基のＡが多型塩基であったときに、この多型塩基Ａを検出する検出用プライマーは３’末端付近の配列を５’−ＧＣＡＴ−３’または５’−ＧＣＡＴＧ−３’とすることができる。このとき競合プライマーは、３’末端付近の配列を５’−ＧＣＡＧ−３’ または５’−ＧＣＡＧＧとすることができる。前記の例は一例であり、ミスマッチにする塩基はマッチになる１種の塩基を除いて３種類の中から選ぶことができる。検出用プライマーが鋳型の塩基を識別する位置は３’末端、または３’末端から２塩基目がより好ましいが、３’末端から離れていてもよい。
【００４５】
競合プライマー塩基配列中の、多型塩基とミスマッチにする塩基の塩基種は、標的塩基配列以外の遺伝子型の多型とマッチする塩基種とすることが好ましい。例えば、野生型がＣであり、変異型がＡである多型を検出する場合であって、変異型を検出する場合に、多型塩基Ａを含む塩基配列を標的塩基配列とする場合、競合プライマーは、多型塩基Ａと非相補的な塩基として、Ａ、Ｇ、Ｃのいずれを選択してもよいが、野生型と相補的であるＧを選択することが好ましい。
【００４６】
本発明において、競合プライマーは、１種類を用いてもよく、２種類以上を用いてもよい。例えば、後述するＫ−ｒａｓのように、複数の遺伝子型がある多型の場合には、検出対象である遺伝子型以外の各遺伝子型にそれぞれマッチする複数種類の競合プライマーを用いることが好ましい。
【００４７】
本発明において共通プライマーとは、検出用プライマー又は競合プライマーと対になって標的核酸を増幅しうるものであり、検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長産物の３’末端側の１０〜３０塩基とマッチである配列を持ち、ＰＣＲ反応において検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長産物を鋳型として伸長を行う能力を持つものをいう。本発明においては、２種類以上の共通プライマーを用いてもよく、２種類以上の共通プライマーが競合関係にあってもよい。競合関係にある２種類以上の共通プライマーは多型塩基配列を含んでいてもよい。
【００４８】
検出用プライマー及び競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基が、前記検出用プライマーでは多型塩基に相補的なマッチ塩基から、前記競合プライマーでは多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から、いずれも１７塩基以内に位置することが好ましく、８塩基以内に位置することがより好ましい。
【００４９】
検出用プライマー及び競合プライマーは、それぞれ複数のミスマッチ塩基を有してもよい。検出用プライマー及び競合プライマーがそれぞれ２つのミスマッチ塩基を有している場合には、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーにおいて、第１のミスマッチ塩基が、３’末端から６塩基以内に位置し、第２のミスマッチ塩基が、３’末端から７塩基以上５’ 末端側に位置していることが好ましい。
更に、検出用プライマーの第１のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する第１のミスマッチ塩基の位置とは異なっていることが好ましい。
【００５０】
また、検出用プライマー及び競合プライマーにおいて、第２のミスマッチ塩基は、互いに位置が異なっていてもよく、塩基種が異なっていてもよい。
つまり、同じ位置の場合には、塩基種が異なっていてもよい。
本発明において、「前記検出用プライマーの第２のミスマッチ塩基と前記競合プライマーの第２のミスマッチ塩基が互いに異なる」とは、具体的には、両者の位置が異なる場合、又は、両者の位置が同じであり、かつ塩基種が異なる場合を意味する。
本発明において、検出プライマーと競合プライマーにおける、第２のミスマッチ塩基の位置が同じであってもよい。
【００５１】
検出用プライマー及び競合プライマーにおいて、第２のミスマッチ塩基は、３’末端から７塩基以上離れていることが好ましく、３’末端から９塩基以上離れていることがより好ましい。
また、第２のミスマッチ塩基は、プライマーの中央付近に配置することが、検出プライマーからの増幅反応の効率を上げることができる点で好ましい。例えば、２０〜２５塩基のプライマーを用いた場合には、第２のミスマッチ塩基は、３’末端から７〜１５塩基目に位置していることが好ましく、９〜１５塩基目に位置していることがより好ましい。
【００５２】
検出プライマーおよび競合プライマーの長さは、識別能や反応性に影響を与える場合がある。例えば、鎖長が長いプライマーほど標的核酸に優先的にアニールする傾向にある。従って、より精度よく標的塩基配列を検出するためには、前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１６塩基以内であることが好ましく、２塩基以内であることがより好ましく、１塩基以内であることが特に好ましい。
例えば、鎖長に差があり競合プライマーの鎖長が長い場合には、競合プライマーが、検出用プライマーよりも優先してアニールし、検出プライマーのアニールが阻害される場合がある。逆に、検出プライマーの鎖長が長い場合には、検出プライマーが、競合プライマーよりも優先してアニールし、競合プライマーのアニールが阻害される場合がある。このため、検出プライマーと競合プライマーの鎖長は同程度であることが好ましい。
【００５３】
次に、本発明の標的塩基配列の検出方法について、図１〜図６を用いてより詳細に説明する。
【００５４】
図１は、従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
図１には反応組成物の一部として、遺伝子多型（Ｃ＞Ｔ）を有する鋳型Ｓ、検出用プライマー（プライマーＡ：フォワードプライマーに相当）、競合プライマー（プライマーＢ：フォワードプライマーに相当）及び共通プライマー（リバースプライマーに相当）が挙げられている。
検出用プライマー及び競合プライマーがアニールした鋳型Ｓとのミスマッチ部位に下線を付した。
プライマーＡは、検出用プライマーであり、プライマーＡにおいて、３’末端に多型塩基を検出する塩基としてグアニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてチミンが導入されている。
また、プライマーＢは、競合プライマーであり、プライマーＢにおいて、３’末端に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてアデニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてチミンが導入されている。
ここで、プライマーＡ及びＢに導入された変異の塩基及び導入位置は同じである。
鋳型Ｓに、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び共通プライマーと共に２種類のプライマー（プライマーＡ及びＢ）を同時に作用させることで、検出用プライマー又は競合プライマーと、共通プライマーとの間で遺伝子が増幅される。
【００５５】
ここで、本明細書中において、ＲｏｕｎｄとはＰＣＲにおける２サイクルをいう。例えば１Ｒｏｕｎｄとは、検出用プライマー又は競合プライマーが鋳型とアニールした後、伸長反応し、変性後に検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長生成物と共通プライマーがアニールし、検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長産物を鋳型として共通プライマーから伸長反応する工程を意味する。
【００５６】
図１において、１ｓｔ  Ｒｏｕｎｄ目ではプライマーＡはプライマーＢと比較して鋳型Ｓと形成した２本鎖がより安定であるために伸長反応の効率が高い。両方のプライマーの３’末端から２塩基目に鋳型Ｓとミスマッチになるチミンを導入することにより、プライマーＡからの特異的伸長効率とプライマーＢからの非特異的伸長効率の差を大きくすることができるためである。
しかし、低頻度ながらも非特異的伸長反応によって生じた伸長産物は、次のサイクルで共通プライマーの鋳型（鋳型ｂ）となって複製され、プライマーＢの配列に相補的な配列を含むＤＮＡ（鋳型ｂ’）が合成される。鋳型ａ’あるいは鋳型ｂ’は、それぞれプライマーＡあるいはプライマーＢと完全に相補的であり、次のＲｏｕｎｄからはいずれも効率よく伸長される。
さらに、次のＲｏｕｎｄにおいて、プライマーＢの多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基は、鋳型ａ’に対してはマッチとなる。このため、プライマーＢは、鋳型ａ’と２本鎖を形成し、伸長反応する。このため２ｎｄ  Ｒｏｕｎｄ以降は、プライマーＡとプライマーＢの特異性を高めるために導入したミスマッチ塩基の効果がなくなってしまう。鋳型ａ’はＲｏｕｎｄを繰り返すごとに指数関数的に増加するため、特異的伸長反応に比べて効率は低いものの鋳型ａおよびａ’の増加に伴ってｂおよびｂ’が増加する。
従って、当該方法は、鋳型に対してプライマーＡとプライマーＢの伸長効率の差をいかに大きくするという点で改良の余地を残している。
【００５７】
従来の標的塩基配列の検出方法として、検出用プライマー及び競合プライマーの間で同じ位置に異なる変異を導入している場合を、図２を用いてより詳細に説明する。
【００５８】
図２は、従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。プライマーＡにおいて、３’末端に多型塩基を検出する塩基としてグアニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてチミンが導入されている。また、プライマーＢにおいて、３’末端に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてアデニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてシトシンが導入されている。
ここで、プライマーＡ及びＢに導入された変異の導入位置は同じであるが、塩基は異なる。図１と比較すると、鋳型ａ’に対する非特異的伸長反応は３’末端が２塩基のミスマッチとなり、多型塩基を検出するための位置以外に導入したミスマッチ塩基の効果が持続し非特異的反応は抑制される。
しかしながら、鋳型ａ’は増幅の過程で増え続けるため、より効果的な非特異伸長反応の抑制が必要である。
【００５９】
次に本発明の検出方法を図３〜５を用いて説明する。
【００６０】
図３、図４は、本発明において、多型を検出する塩基以外に導入したミスマッチ塩基の位置が検出用プライマーと競合プライマー間で異なる場合である。プライマーの構成以外は、図１で説明したものと同様であるため説明を省略する。検出用プライマー及び競合プライマーがアニールした鋳型Ｓ又は鋳型ａ’とのミスマッチ部位に下線を付した。
【００６１】
図３において、プライマーＡは鋳型Ｓに対して３’末端はマッチであるが、３’末端から２塩基目がミスマッチである。一方、プライマーＢは鋳型Ｓに対して３’末端と３’末端から３塩基目がミスマッチである。この場合、２ｎｄ  Ｒｏｕｎｄ以降、プライマーＢは鋳型ａ’に対して３’末端で３塩基がミスマッチとなり、非特異伸長反応は非常に効果的に抑制される。多型塩基を検出する塩基以外に導入するミスマッチ塩基は、１塩基にもかかわらず競合するプライマー間で位置を変えることで、非常に大きな効果をもたらす。
【００６２】
図４において、プライマーＡは鋳型Ｓに対して３’末端はマッチであるが、３’末端から２塩基目がミスマッチである。一方、プライマーＢは鋳型Ｓに対して３’末端と３’末端から５塩基目がミスマッチである。この様な場合でもプライマーＢは鋳型ａ’に対して３’末端の２塩基および３’末端から５塩基目の一塩基がミスマッチになるので非特異反応は効果的に抑制される。
【００６３】
図５は、本発明において、多型塩基を検出する塩基をプライマーの３’末端から２塩基目に設定した場合を示したものである。この場合も多型塩基を検出するための塩基以外に導入したミスマッチ塩基がそれぞれのプライマーで一塩基であるにもかかわらずプライマーＢは鋳型ａ’に対して３’末端で３塩基のミスマッチとなり非特異反応は効果的に抑制される。
【００６４】
図６は、本発明において、競合プライマーを３種類用いた場合を示したものである。プライマーの構成以外は、図１で説明したものと同様であるため説明を省略する。検出用プライマー及び競合プライマーがアニールした鋳型Ｓ又は鋳型ａ’とのミスマッチ部位に下線を付した。
一般的なＳＮＰにおいてはアレルの種類は２種類であることが多いが、まれには３種類の場合がある。さらに、がん遺伝であるＫ−ｒａｓにおいては一箇所で可能性のある変異がすべて見出されている。このような場合、それぞれ４種類の塩基に対応する４種類のプライマーを競合させることが好ましい。
【００６５】
図６において、Ｋ−ｒａｓの変異を検出する位置をプライマーの３’末端とする。
プライマーＡはシトシン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとマッチであり、３’末端から２塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
プライマーＢはチミン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとミスマッチであり、さらに３’末端から３塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
プライマーＣはグアニン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとミスマッチであり、さらに３’末端から４塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
同様にプライマーＤはアデニン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとミスマッチであり、さらに３’末端から５塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
この場合、プライマーＢ、ＣおよびＤそれぞれは鋳型ａ’と３塩基ミスマッチになり、各プライマーからの非特異伸長反応が効果的に抑制される。
よって、本発明では競合する２種以上のアレル特異的なプライマーを競合させる場合においても、変異を識別する塩基以外に導入する変異の位置をそれぞれのプライマーで変えることにより、非特異伸長反応を実用的レベルで抑制することが可能となる。
【００６６】
図３で示した本発明による効果について、マイクロソフト・エクセルを用いた計算によりシミュレーションを行った。まず、検出するＳＮＰがシトシンかチミンであるかを想定し、４種類のプライマーを設計した。鋳型およびプライマーの配列を表１に示す。
【００６７】
【表１】
0005842811.tif 000002
太字：多型塩基位置        下線：鋳型（Ｃアレル）とミスマッチな塩基
【００６８】
プライマー［１］はＣアレル検出用であり、３’末端はグアニンで、３’末端から２塩基目は鋳型とミスマッチなチミンである。
プライマー［２］はＴアレル検出用であり、３’末端がアデニンで３’末端から２塩基目はプライマー［１］と同様、鋳型とミスマッチなチミンである。
プライマー［３］はプライマー［２］と同様Ｔアレル検出用だが、３’末端から２塩基目に導入したミスマッチになる塩基がシトシンであり、プライマー［１］とは異なる。
プライマー［４］はＴアレル検出用であり、プライマー［１］のミスマッチ塩基を導入した位置とは異なるように３’末端から３塩基目にミスマッチ塩基としてチミンを入れたものである。
【００６９】
シミュレーションに際し、以下のような設定を行った。
・  初期の鋳型濃度（鋳型Ｓ）を１とする。
・  鋳型Ｓあるいは伸長産物（鋳型ａ’、鋳型ｂ’）がそれぞれのプライマーと２本鎖を形成する割合を同等とする。
・  共通プライマーからの伸長効率は１とする。
【００７０】
表２はプライマー［１］とプライマー［２］、プライマー［３］またはプライマー［４］を競合させた場合のプライマー伸長効率を仮定したものである。伸長効率はかなり大胆な仮定であるが、それぞれのミスマッチの数と伸長反応の効率の順序は妥当な仮定である。鋳型ＳがＣアレルである場合を想定したものである。２本鎖の［１］、［２］、［３］および［４］はプライマー［１］、プライマー［２］、プライマー［３］、およびプライマー［４］に相当し、Ｓは鋳型Ｓ、［１］’はプライマー［１］からの伸長生成物を鋳型として共通プライマーから伸長してできたもの、［２］’はプライマー［２］からの伸長生成物を鋳型として共通プライマーから伸長してできたもの、以下［３］’および［４］’も同様である。配列の上段がプライマー、下段が鋳型の配列を示している。
尚、プライマーにおいて、鋳型とミスマッチな塩基に下線を付した。
【００７１】
【表２】
0005842811.tif 000003
【００７２】
表３〜表８にプライマー［１］とプライマー［２］、プライマー［３］またはプライマー［４］とを競合させた場合の２０Ｒｏｕｎｄまでの計算結果を示した。尚、プライマーにおいて、鋳型とミスマッチな塩基を斜体で示した。
また、各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表すグラフを図７Ａ〜９Ｂに示した。図７Ａはプライマー［１］から伸長される伸長産物の鋳型の内訳を示し、図７Ｂはプライマー［２］から伸長される伸長産物の鋳型の内訳を示している。
【００７３】
【表３】
0005842811.tif 000004
【００７４】
【表４】
0005842811.tif 000005
【００７５】
【表５】
0005842811.tif 000006
【００７６】
【表６】
0005842811.tif 000007
【００７７】
【表７】
0005842811.tif 000008
【００７８】
【表８】
0005842811.tif 000009
【００７９】
図７Ａ及び７Ｂより、プライマー［１］と［２］の組み合わせでは、鋳型とプライマーがミスマッチの場合でも、高頻度で伸長が行われるため、プライマー［２］からの伸長産物量が多い。特に、［１］’とプライマー［２］が２本鎖を形成して伸長反応が起こってしまう（図７Ｂ；［１］’を鋳型とした伸長）と、次のＲｏｕｎｄからはプライマー［２］とマッチな鋳型ができてしまう（図７Ｂ；［２］’を鋳型とした伸長）ため、プライマー［２］からの伸長産物がさらに増えてしまう結果となる。また、［２］’は、プライマー［１］の鋳型にもなりうる（図７Ａ；［２］’を鋳型とした伸長）ため、プライマー［１］からの偽陽性の伸長産物量も多くなる。
【００８０】
図８Ａ及び８Ｂより、プライマー［１］と［３］の組み合わせでは、鋳型とプライマーがミスマッチの場合には、伸長反応がある程度抑制されるため、プライマー［３］からの伸長産物量は少ない。［１］’とプライマー［３］が２本鎖を形成して伸長反応が起こってしまう（図８Ｂ；［１］’を鋳型とした伸長）と、次のＲｏｕｎｄからはプライマー［３］とマッチな鋳型ができ（図８Ｂ；［３］’を鋳型とした伸長）、プライマー［３］からの伸長産物量がさらに増えてしまう。
【００８１】
図９Ａ及び９Ｂよりプライマー［１］と［４］の組み合わせでは、鋳型とプライマーがミスマッチの場合には、ほとんど伸長反応が起こらないため、［１］’を鋳型とするプライマー［４］からの伸長産物量（図９Ｂ；［１］’を鋳型とした伸長）はごくわずかである。よって、プライマー［１］からの伸長産物量が増えてきてもプライマー［４］からの伸長産物量はほとんど増えない。
【００８２】
シミュレーション結果より、識別精度は、プライマー［１］と［２］の組み合わせや、プライマー［１］と［３］の組み合わせよりも、プライマー［１］と［４］の組み合わせの方が高い。よって、検出用プライマー及び競合プライマーに導入するミスマッチ塩基の位置を双方で変えることが、識別精度の向上につながることが確認された。
【００８３】
本発明の標的塩基配列を検出する方法は、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程、を有する。
以下、各工程について説明する。
【００８４】
まず、工程（ａ）において、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、１種の検出用プライマーと、少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する。
【００８５】
核酸試料とは、核酸を含有する試料であれば、特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物、培養細胞等から核酸を抽出したサンプルであることが好ましい。動物等からの核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。なお、核酸試料中に含有される核酸が、２本鎖核酸である場合、あらかじめ１本鎖核酸にしておくことが好ましい。１本鎖核酸を用いることにより、後述する工程（ｂ）において、該１本鎖核酸に、検出用プライマー、競合プライマーをアニールさせることができる。抽出された２本鎖核酸の１本鎖化は、熱エネルギーを加える等の公知の手法により行うことができる。
【００８６】
核酸試料中の核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであれば特に限定されず、天然のものであっても合成されたものであってもよい。天然の核酸としては、たとえば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸合成法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００８７】
なお、本発明において、オリゴヌクレオチドとは天然、非天然に限らずデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいい、ＰＮＡやＬＮＡなどの人工核酸も含まれるものとする。
本発明において、プライマーとは、鋳型と２本鎖状態になり、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素が  ＤＮＡを合成する際に３’水酸基を供給する役割をもつ短い核酸の断片である。
【００８８】
次に、工程（ｂ）において、核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する。
【００８９】
検出用プライマーまたは競合プライマーが、標的核酸にアニールする反応条件は、特に限定されるものではなく、各プライマーのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができる。
【００９０】
本発明において伸長反応とは、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬を用いて行われる核酸合成反応であり、ＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素による伸長反応も含まれる。
ＤＮＡポリメラーゼとはプライマーがアニールした鋳型ＤＮＡと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素の総称である。
本発明に用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。さらに、本発明においては、プライマーの３’末端近傍で塩基を識別するため、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを使用するのが特に好ましい。
また、この伸長反応を行う際の反応条件等の具体的な方法については、実験医学第８巻第９号（羊土社、（１９９０））、ＰＣＲテクノロジー・ストックトン・プレス（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ）（１９８９）等の文献に記載された公知の方法に従い行うことができる。
【００９１】
次に、工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成し、工程（ｄ）において、前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する。これらの工程により標的核酸が増幅される。
【００９２】
上記核酸増幅工程としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００９３】
例示した上記核酸増幅工程において、等温増幅反応が用いられる場合には常法に従う。
【００９４】
ＰＣＲ反応において、検出用プライマー、競合プライマー、または共通プライマーの濃度としては、適宜最適な濃度を検討することができるが、共通プライマーの濃度を検出用プライマーと競合プライマーの合計濃度以下に設定することが好ましく、さらに好ましくは検出用プライマーおよび競合プライマーの合計濃度の２５％以下である。これは、ＰＣＲが進んでいくと鋳型とマッチである検出用プライマーが優先的に消費され、鋳型とミスマッチである競合プライマーの相対濃度が上がってしまい識別精度が落ちてしまうのを防ぐためである。共通プライマーの濃度を低くすることで、鋳型とマッチである検出用プライマーの消費とともに共通プライマーも消費され、識別制度を維持することができる。
【００９５】
次に、工程（ｅ）において、前記伸長産物ＡまたはＢを検出する。
工程（ｅ）におけるプライマーからの伸長産物の検出方法は、特に限定するものではなく、蛍光色素等によるプライマーの標識、電気泳動、高速液体クロマトグラフィーやマススペクトル、融解曲線分析、増殖曲線分析など、核酸を分析できるあらゆる方法が挙げられる。
【００９６】
検出用プライマー、競合プライマー、又は共通プライマーを、標識物質により標識しておくことにより、標識物質を指標として伸長産物を検出することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光色素、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素、抗体等が挙げられる。プライマーに標識する位置については、特に限定するものではないが、伸長反応を阻害しないような位置が好ましい。
【００９７】
プライマーを異なる蛍光色素で標識していずれのプライマーから増幅したものかを区別する方法は、特異性に与える影響も少なく、融解曲線を測定する必要もなく簡便な方法であるため好ましい。
【００９８】
より好ましくは、プライマーの５’末端にフルオロセインとアクリジンを導入する方法が挙げられる（非特許文献９参照）。このプライマーは１本鎖状態で存在する場合、フルオロセインの励起波長を照射してもエネルギー吸収性物質であるアクリジンによって消光されてフルオロセインからの蛍光は観察されない。
一方、２本鎖を形成している場合、インターカレーターでもあるアクリジンは２本鎖核酸に結合するため、フルオロセインとの距離が離れフルオロセインからの蛍光を吸収することができなくなる。よってプライマー伸長反応が生じたプライマーのみ蛍光を発光することになる（図１０参照。）。
従って、検出用プライマー及び競合プライマーの蛍光色素を異なるものにすることにより、いずれのプライマーからの伸長生成物であるかを判断することができる。
よって例えば、本発明の検出方法において、野生型と変異型の２種類からなる多型のうち、変異型アレルを検出するプライマーを検出用プライマーとし、野生型アレルを検出し得るプライマーを競合プライマーとして用い、かつ、検出用プライマーと競合プライマーをそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、各プライマーの伸長産物をそれぞれ検出することにより、試料中の１つの多型の有無を検出することができるだけでなく、試料中の複数の多型を検出することができる。
【００９９】
蛍光色素を導入する位置については、特に限定するものではないが、競合プライマーに標識するため、ポリメラーゼ反応を阻害しないような位置が好ましい。
また、アクリジンの代わりにピレンを用いてもよい。ピレンもまたエネルギー吸収性を有し、２本鎖に結合できるため、アクリジンと同様に２本鎖形成反応を調べることができる。
このほか、２つ以上のアレル特異的プライマーのどれから伸長が起こったかを検出する方法としては、ＬＵＸ（商標名）プライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標名）ＵＮＩプライマー（商標名）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）など、プライマーの１本鎖状態と２本鎖状態を判別することができる方法があり（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、第４４巻、第５４８７〜５５０２頁、２００５年）、いずれの方法も適用可能である。
【０１００】
蛍光色素を用いた好適な検出方法としては、ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ）法を用いた検出方法が挙げられる。
【０１０１】
ＱＰ法は、ある種の蛍光色素に、グアニン塩基が空間的に近接することにより、蛍光が消光することを利用した検出方法である。
本発明の検出用プライマーを、グアニン塩基との近接により消光する蛍光色素で標識することにより、検出用プライマーと、標的核酸との近接の有無を検出することができる。該グアニン塩基を有するのは、標的核酸であっても、検出用プライマーであってもよいが、検出用プライマーであることが好ましい。
【０１０２】
前記グアニン塩基との近接により消光する蛍光色素としては、ＱＰ法に通常使用される蛍光色素を用いて行うことができ、たとえば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商品名、インビトロジェン社製）、ＰＡＣＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商品名、インビトロジェン社製）、ＣＲ６Ｇ（商品名、インビトロジェン社製）、ＴＡＭＲＡ（商品名、インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【０１０３】
電気泳動で検出する場合、競合する二つのプライマーの長さを変えておき、伸長生成物の長さを変えることによって泳動度の差により検出することができる。ただし、プライマーの長さを変えることによって特異性に影響が出ないようにすることが重要である。
電気泳動による検出に用いる試薬としては二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発するので、臭化エチジウムやサイバーグリーンがより好ましい。
【０１０４】
また、サイバーグリーンは蛍光色素であるため、後述する融解曲線を測定することによっていずれのプライマーから伸長した生成物かを区別することができる。
【０１０５】
高速液体クロマトグラフィーでも同様に二つのプライマーからの伸長生成物を区別することができる。
また、質量分析法を利用する場合は二つのプライマーからの伸長生成物の長さが異なるようにしてもよいし、プライマーを質量が異なる物質で標識してもよい。後者の場合、特異性に与える影響が少なく好ましい。
【０１０６】
前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）〜（ｄ）からなる核酸増幅工程と同時に設けられてもよく、核酸増幅工程後に行われてもよい。
【０１０７】
核酸増幅工程中の識別方法としては、標識されたプライマー、またはその伸長産物の２本鎖状態を測定する方法が挙げられる。この識別方法は、鋳型と２本鎖を形成している競合するプライマーまたは競合するプライマーからの伸長産物が２本鎖を形成する能力差を利用している。
また、プライマーからの伸長産物は２本鎖を形成する温度下で蛍光測定してもよい。この方法では、競合するプライマーから伸長した産物だけを検出することができるので、さらに高精度に識別が可能である。
【０１０８】
核酸増幅工程後の識別方法としては、融解曲線を測定する方法が挙げられる。これは、増幅生成物が２本鎖から１本鎖に遷移する温度依存性を利用する方法である。この方法では、競合する２つのプライマーによる増幅産物だけを検出することができるので、さらに高精度に識別が可能である。
【０１０９】
本発明の検出方法をリアルタイムＰＣＲ装置のようなＤＮＡ配列検査器具に用いることができる。この場合、上述したＰＣＲに必要な試薬と、プライマーとを添加した容器内に検体ＤＮＡを入れ、リアルタイムＰＣＲを行い、検出用プライマーからの伸長産物の検出を行う。検体ＤＮＡを入れた後、密閉したまま検出を行うことで増幅産物の飛散や汚染を防ぐことができる。
【０１１０】
本発明の標的塩基配列検出キットは、多型塩基を有する標的塩基配列を検出する上記方法に用いるキットであり、上記検出用プライマーと競合プライマーと共通プライマーとを含むことを特徴とする。
その他、試料前処理用の細胞破壊試薬や、標識物質の標識を検出するための試薬等を組み合わせてもよい。
このように、本発明の標的塩基配列の検出方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便かつ短時間で一塩基多型の識別をすることができる。
【０１１１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１２】
比較例１〜２及び実施例１〜２では、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を識別対象とした。
表９に示されるように、ＶＫＯＲＣ１の上記遺伝子多型を検出する２種類の検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ及びＶＫ１Ｍｔｇ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ）及び共通プライマー（ＶＫ１Ｒ２）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端にアクリジンホスホロアミダイト（グレンリサーチ社）を用いてアクリジンを導入し、さらにその５’末端に６−フルオロセイン（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入した。表９に示される４種の競合プライマー（ＶＫ１Ｍｔｇ、ＶＫ１Ｍａｔ、ＶＫ１Ｍａｃ、ＶＫ１Ｗａｔ）および共通プライマー（ＶＫ１Ｒ２）については、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入した。鋳型となるゲノムＤＮＡとしてはＣｏｒｉｅｌｌ社から購入したものを用いた。
表９中、１１７３位及び多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付した。また、「Ａｃｒｉｄｉｎｅ」はアクリジンを、「６−ＦＡＭ」は６−フルオロセイン標識を、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。【０１１３】
【表９】
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【０１１４】
（比較例１）
鋳型として、ＶＫ１ＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍａｔを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１０記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６２℃２０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを５５サイクル行い、９５℃から４０℃まで融解曲線解析を行った。なお、鋳型に蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いたものをネガティブコントロールとした。結果を図１１に示す。【０１１５】
【表１０】
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【０１１６】
図１１は、比較例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ）が、２本鎖を形成すると、エネルギー吸収物質であるアクリジンが２本鎖核酸にインターカレートし、アクリジンによるエネルギー吸収量が小さくなるため、６−フルオロセインからの蛍光強度が大きくなる。
融解曲線とは、温度を低温から徐々に上げることにより、ＰＣＲ法により増幅された２本鎖核酸が１本鎖状態に変性するまでの蛍光強度を測定して得られる曲線をいう。融解曲線の負の一次微分曲線は温度変化に対する蛍光変化量を示すもので、変化量が最大のところが２本鎖ＤＮＡのＴｍとなる。
比較例１において、ＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの伸長産物は、８３℃から８６℃の範囲で１本鎖状態と２本鎖状態の変化量が最も多いことが既に分かっている。よって、融解曲線の負の一次微分曲線において８３℃から８６℃の範囲でピークが見られる場合には、ＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅから伸長反応が起きたと判断することができる。
比較例１の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｃアレル、またはＴアレルのどちらを鋳型として用いても同様の結果が得られた。これは、上記プライマーセットでは、伸長反応がＣアレル特異的でないことを示唆している。【０１１７】
（比較例２）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍａｃを用いた以外は、比較例１と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１２に示す。【０１１８】
図１２は、比較例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
比較例２の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｃアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が優位に観察された。しかしながら、Ｔアレルを鋳型として用いたときにわずかなピークが見られる。これは、ＴアレルをサンプルとしたときＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの伸長抑制は十分ではないことを示唆している。【０１１９】
（実施例１）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍｔｇを用いた以外は、比較例１と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１３に示す。【０１２０】
図１３は、実施例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例１の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｃアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が優位に観察された。さらに、比較例２の結果に比べＴアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｗａｔ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が抑えられていることから、上記プライマーセットでは、Ｃアレル特異性がより優れていることを示唆している。【０１２１】
（実施例２）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｍｔｇ−Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔを用いた以外は、比較例１と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１４に示す。【０１２２】
図１４は、実施例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例２において、ＶＫ１Ｍｔｇ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの伸長産物は、８３℃から８６℃の範囲で１本鎖状態と２本鎖状態の変化量が最も多いことが既に分かっている。よって、融解曲線の負の一次微分曲線において８３℃から８６℃の範囲でピークが見られる場合には、蛍光標識されたＶＫ１Ｍｔｇ−Ａｃｒｉｄｉｎｅから伸長反応が起きたと判断することができる。
実施例２の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｔアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｍｔｇ−Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が優位に観察された。これは、上記プライマーセットでは、伸長反応がＴアレル特異的であることを示唆している。【０１２３】
実施例２のプライマーセットは、実施例１のプライマーセットとは蛍光標識が変異型プライマーに導入されていることのみが異なるだけで塩基配列のセットとしては同じである。よって、実施例１及び２の結果から、ＶＫ１Ｗａｔ及びＶＫ１Ｍｔｇのどちらを蛍光標識しても、蛍光標識されたプライマーからの伸長反応の有無を判断できることが明らかとなった。
従って、ＶＫ１Ｗａｔ及びＶＫ１Ｍｔｇに互いに蛍光波長の異なる蛍光色素を導入することにより、各蛍光標識プライマーからの伸長反応を同時に測定することができる。【０１２４】
実施例３〜５では、上記と同様、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出対象とし、競合プライマーの多型塩基以外に導入するミスマッチ塩基の位置が検出精度に与える影響を調べた。
表１１に示されるように、新たにＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型を識別する検出用プライマー（ＶＫ１Ｍｔｇ−ｐｙｒｅｎ）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端から２塩基目のアデニンにＡｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｅｒ  Ｃ６  ｄＡ（グレンリサーチ社）を導入し、さらにその５’末端に６−フルオロセイン（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入し、１−ピレンブタノイックアシッドサクシンイミジルエステル（インビトロジェン社）を用いてアミノ基へピレン修飾を行ったものを用いた。
競合プライマーおよび共通プライマーとしては、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入したものを用いた。競合プライマーについては、ミスマッチ塩基の導入位置を変えたものを複数作製した。他は、比較例１の記載と同様である。
表１１中、多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付し、ピレン修飾した塩基は二重下線を付した。また、「ｐｙｒｅｎｅ」はピレンを、「６−ＦＡＭ」は６−ＦＡＭ標識を、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。尚、用いたテンプレートは表９記載の配列と同様のものである。【０１２５】
【表１１】
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【０１２６】
（実施例３）
鋳型として、ＶＫ１ＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレルまたは、Ｔアレルを、検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ−ｐｙｒｅｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍ４ｔを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１２記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、５８℃２０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを５５サイクル行い、９５℃から４０℃まで融解曲線解析を行った。なお、鋳型に蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いたものをネガティブコントロールとした。結果を図１５に示す。【０１２７】
【表１２】
0005842811.tif 000013
【０１２８】
図１５は、実施例３の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例３の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例１と同様の結果が得られた。したがって競合プライマーのミスマッチ塩基が３’末端から４塩基目に位置する場合でも実施例１の３’末端から３塩基目に位置する場合と同様に、Ｃアレル特異性がより優れていることが示唆された。【０１２９】
（実施例４）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｍ５ｔを用いた以外は、実施例３と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１６に示す。【０１３０】
図１６は、実施例４の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例４の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例３と同様の結果が得られた。したがって競合プライマーのミスマッチ塩基が３’末端から５塩基目に位置する場合でも実施例１の３’末端から３塩基目に位置する場合と同様に、Ｃアレル特異性がより優れていることが示唆された。【０１３１】
（実施例５）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｍ８ｔを用いた以外は、実施例３と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１７に示す。【０１３２】
図１７は、実施例５の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例５の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例３と同様の結果が得られた。したがって競合プライマーのミスマッチ塩基が３’末端から８塩基目に位置する場合でも実施例１の３’末端から３塩基目に位置する場合と同様に、Ｃアレル特異性がより優れていることが示唆された。【０１３３】
（実施例６）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｍｔｇ−ｐｙｒｅｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｗ４ｔを用いた以外は、実施例３と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１８に示す。【０１３４】
図１８は、実施例６の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例６の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例２と同様の結果が得られた。したがって変異を検出するプライマーセットにおいて競合プライマーの３’末端から４塩基目にミスマッチ塩基を導入しても、Ｔアレル特異性がより優れていることが示唆された。【０１３５】
（実施例７）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｗ５ｔを用いた以外は、実施例６と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１９に示す。【０１３６】
図１９は、実施例７の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例７の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例６と同様の結果が得られた。したがって変異を検出するプライマーセットにおいて競合プライマーの３’末端から５塩基目に変異を導入してもＴアレル特異性がより優れていることが示唆された。【０１３７】
（実施例８）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｗ８ｔを用いた以外は、実施例７と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図２０に示す。【０１３８】
図２０は、実施例８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例８の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例６と同様の結果が得られた。したがって変異を検出するプライマーセットにおいて競合プライマーの３’末端から８塩基目に変異を導入してもＴアレル特異性がより優れていることが示唆された。【０１３９】
（実施例９〜１８）
鋳型として、ＶＫ１ＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、プライマーとして、表１３に示す検出用プライマー及び競合プライマーのセットを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１１記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６２℃２０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを５５サイクル行い、９５℃から４０℃まで融解曲線解析を行った。なお、鋳型に蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いたものをネガティブコントロールとした。結果を図２１〜３０に示す。【０１４０】
【表１３】
0005842811.tif 000014
【０１４１】
図２１〜３０は、実施例９〜１８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例９〜１３の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例３と同様の結果が、実施例１４〜１８の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例６と同様の結果が得られた。【０１４２】
実施例９〜１３から、検出用プライマーが有するミスマッチ塩基及び競合プライマーが有するミスマッチ塩基が、多型塩基にマッチな塩基から１７塩基以内に位置する場合には精度良く検出できることが確認された。
また、実施例３〜８から、アニール温度が低い条件下においても８塩基以内に位置する場合には精度良く検出できることが確認された。【０１４３】
実施例１９〜２７では、上記と同様、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出対象とし、競合プライマーと検出用プライマーの鎖長の差が検出精度に与える影響を調べた。
表１４に示されるように、新たにＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型を識別する検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ−Ｐ−ＦＡＭ１）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端から４塩基目のシトシンにＡｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｅｒ  Ｃ６  ｄＣ（グレンリサーチ社）を導入し、さらに５’末端から６塩基目のチミンにフルオロセインｄＴ（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入し、１−ピレンブタノイックアシッドサクシンイミジルエステル（インビトロジェン社）を用いてアミノ基へピレン修飾を行ったものを用いた。
表１４に示される競合プライマーおよび共通プライマーとしては、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入したものを用いた。競合プライマーについては、鎖長を変えたものを複数作製した。
表１４中、１１７３位及び多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付した。また、「ＦＡＭｄＴ」はフルオロセインｄＴを、「ＰｙｒｅｎｄＣ」はピレン標識を行ったＡｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｅｒ  Ｃ６  ｄＣを、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。尚、用いたテンプレートは表９記載の配列と同様のものである。【０１４４】
（実施例１９〜２７）
鋳型として、ＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、プライマーとして、表１５に示す検出用プライマー及び競合プライマーのセットを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１０記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６４℃３０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを６０サイクル行った。鋳型としてＣアレルを用いて反応させて得られた結果を図３１に示す。【０１４５】
【表１４】
0005842811.tif 000015
【０１４６】
【表１５】
0005842811.tif 000016
【０１４７】
図３１に示すように、実施例１９〜２７の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、遺伝子多型を精度よく検出できることが確認された。
検出用プライマーよりも２塩基〜１６塩基長い競合プライマーを用いた実施例２１〜２６は、検出プライマーより２０塩基長い競合プライマーを用いた実施例２７よりも反応性に優れていることが確認された。
更に、検出用プライマーと同じ鎖長、または１塩基長い競合プライマーを用いた実施例１９及び実施例２０は、検出用プライマーよりも２塩基〜１６塩基長い競合プライマーを用いた実施例２１〜２６よりも反応性に優れていることが確認された。【０１４８】
実施例２８〜３５では、上記と同様、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出対象とし、競合プライマーと検出用プライマーに導入した第２のミスマッチ塩基が検出精度に与える影響を調べた。
表１６に示されるように、新たにＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型を識別する検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ−Ｐ−ＦＡＭ２〜８）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端から４塩基目のシトシンにＡｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｅｒ  Ｃ６  ｄＣ（グレンリサーチ社）を導入し、さらに５’末端から６塩基目のチミンにフルオロセインｄＴ（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入し、１−ピレンブタノイックアシッドサクシンイミジルエステル（インビトロジェン社）を用いてアミノ基へピレン修飾を行ったものを用いた。
表１６に示される競合プライマーおよび共通プライマーとしては、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入したものを用いた。競合プライマーについては、第２のミスマッチ塩基の導入位置を変えたものを複数作製した。
表１６中、１１７３位及び多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付した。また、「ＦＡＭｄＴ」はフルオロセインｄＴを、「ＰｙｒｅｎｄＣ」はピレン標識を行ったＡｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｅｒ  Ｃ６  ｄＣを、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。尚、用いたテンプレートは表９記載の配列と同様のものである。【０１４９】
（実施例２８〜３５）
鋳型として、ＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、プライマーとして、表１７に示す検出用プライマー及び競合プライマーのセットを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１０記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６４℃３０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを６０サイクル行った。鋳型としてＣアレルを用いて反応させて得られた結果を図３２に示す。【０１５０】
【表１６】
0005842811.tif 000017
【０１５１】
【表１７】
0005842811.tif 000018
【０１５２】
図３２に示すように、実施例２８〜３５の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、遺伝子多型を精度よく検出できることが確認された。
第２のミスマッチ塩基が、３’末端から７塩基以上離れている検出プライマー及び競合プライマーのセットを用いた実施例２９〜３５は、第２のミスマッチ塩基が導入されていない実施例２８よりも反応性に優れていることが確認された。
中でも第２のミスマッチ塩基が、３’末端から９塩基以上離れている検出プライマー及び競合プライマーのセットを用いた実施例２９〜３４は、特に反応性に優れていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明の競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法によれば、遺伝子型の識別精度が非常に優れているため、臨床検査等の分野、特に一塩基多型や体細胞変異の分野において利用が可能である。
【図１】
0005842811.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005842811.tif 000024
【図７Ａ】
0005842811.tif 000025
【図７Ｂ】
0005842811.tif 000026
【図８Ａ】
0005842811.tif 000027
【図８Ｂ】
0005842811.tif 000028
【図９Ａ】
0005842811.tif 000029
【図９Ｂ】
0005842811.tif 000030
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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