(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオキセチンまたはその薬学的に許容し得る塩を含む軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物。
【請求項２】
前記フルオキセチンが、塩酸塩である請求項１に記載の軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物からなる変形性関節症治療用医薬組成物。
【請求項４】
フルオキセチンまたはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む変形性関節症治療用医薬組成物。
【請求項５】
前記フルオキセチンが、塩酸塩である請求項４に記載の変形性関節症治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物及び変形性関節症治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）は高齢者の運動機能を脅かす代表的な疾患であり、我が国で最も患者数の多い関節疾患である。罹患者の数は、社会の高齢化とともに増加の一途をたどっており、膝関節だけで国内に２５３０万人の患者がいると推定されている。
【０００３】
正常な関節において、関節軟骨はメカニカルストレスや炎症などの刺激に対する予備能力を有しており、関節軟骨の恒常性が保たれている。これに対し、アライメント異常や外傷などの過剰なメカニカルストレスに加齢や代謝異常による予備能力低下が加わると、関節軟骨の恒常性が破綻する。関節軟骨の恒常性が破綻すると、軟骨基質におけるタンパク分解酵素、炎症性サイトカインの発現増強や軟骨細胞のアポトーシスが生じ、関節軟骨の変性および破壊が進行する。
【０００４】
ＯＡの治療は保存療法と手術療法に大別できる。保存療法には患者教育、物理療法、運動療法や装具療法などの非薬物療法と薬物療法が挙げられる。薬物療法には、アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）やオピオイドなどの内服薬とステロイドやヒアルロン酸などの関節内注射に大別される。
【０００５】
ＯＡに対して現在行われている保存的治療の中で、薬物治療は重要な位置を占める。しかしながら、臨床で使用可能なＯＡに対する薬物治療としては対症療法のｓｙｍｐｔｏｍ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ＯＡ  ｄｒｕｇ（ＳＭＯＡＤｓ）のみであり、ＯＡそのものの進行を抑制あるいは修飾することが期待される、いわゆるｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ＯＡ  ｄｒｕｇ（ＤＭＯＡＤｓ）が求められている。ＤＭＯＡＤｓとしては、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩が期待されている（特許文献１参照）。
【０００６】
ところで、近年、軟骨細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の異常活性化がＯＡの発症と病態進行に関与することが解明されつつある（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−２０９４８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】川口浩，“II．ＯＡ基礎  ２．遺伝子変異マウスによる変形性関節症の分子背景へのアプローチ”，ＴＨＥ  ＢＯＮＥ  Ｖｏｌ．２３，  Ｎｏ．１  ２００９−１，ｐ３５−４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記特許文献１に記載されている３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩は、軟骨成分の一つであるＩＩ型コラーゲンの産生を促進し、また軟骨組織の骨化や分解に関与するＮｏｔｃｈ経路のシグナル伝達因子の産生を抑制するものであって、上記の軟骨細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制するものではない。そのため、軟骨細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制するＤＭＯＡＤｓの開発が望まれている。
【００１０】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたもので、鋭意研究を行ったところ、驚くべきことに、抗うつ剤として使用されているフルオキセチンが、軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制することを新たに見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の目的は、軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物、該組成物からなる変形性関節症治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下に示す軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物及び変形性関節症治療用医薬組成物に関する。
【００１３】
（１）フルオキセチンまたはその薬学的に許容し得る塩を含む軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物。
（２）前記フルオキセチンが、塩酸塩である上記（１）に記載の軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物。
（３）上記（１）又は（２）に記載の軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物からなる変形性関節症治療用医薬組成物。
（４）フルオキセチンまたはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む変形性関節症治療用医薬組成物。
（５）前記フルオキセチンが、塩酸塩である上記（４）に記載の変形性関節症治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
フルオキセチンは、軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制することができる。したがって、変形性関節症治療用医薬組成物として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１において、フルオキセチンが用量依存的にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制する測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は実施例２の結果を示すグラフで、図２（Ａ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンを添加した時の、図２（Ｂ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンを添加した時の、マウス軟骨前駆細胞株ＡＴＤＣ５のアルシアンブルー染色結果を示すグラフである。
【図３】図３は実施例３の結果を示すグラフで、図３（Ａ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのＡｘｉｎ２発現量、図３（Ｂ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのＳｏｘ９発現量、図３（Ｃ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのＭｍｐ１３発現量、図３（Ｄ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのＡｘｉｎ２発現量、図３（Ｅ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのＳｏｘ９発現量、図３（Ｆ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのＭｍｐ１３発現量、を計測し、ＧＡＰＤＨの発現量で標準化したグラフである。
【図４】図４は実施例４の結果を示しており、図４（Ａ）は図面代用写真で、Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのβ―カテニンのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの写真、図４（Ｂ）は図４（Ａ）に基づきタンパク質量を数値化したグラフである。図４（Ｃ）は図面代用写真で、ＬｉＣｌ＋フルオキセチンのβ―カテニンのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの写真、図４（Ｄ）は図４（Ｃ）に基づきタンパク質量を数値化したグラフである。
【図５】図５は、図面代用写真で、実施例５において、ヒト変形性膝関節症由来軟骨細胞ＯＡＣ細胞を免疫蛍光染色した後の可視化した写真である。
【図６】図６（Ａ）は、図面代用写真で、実施例６においてＤＭＭ手術を行ったラットの写真である。図６（Ｂ）は、図面代用写真で、ラットの軟骨組織のＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ−Ｆａｓｔ−ｇｒｅｅｎ染色した写真、図６（Ｃ）は図６（Ｂ）の写真に基づいたｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｎｋｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｃｏｒｅの計測の合計値のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明の軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物（以下、「活性化抑制組成物」と記載することがある。）、該組成物からなる変形性関節症治療用医薬組成物（以下、「医薬組成物」と記載することがある。）について詳しく説明する。
【００１７】
本発明の活性化抑制組成物に含まれるフルオキセチンは、下記の構造式で表される化合物である。フルオキセチンは、米国特許第４，３１４，０８１号明細書に記載されており、Ｎ−メチル−３−（ｐ−トリフルオロメチルフェノキシ）３−フェニルプロピルアミンという化学名を有する。フルオキセチンは、一般には、２つの鏡像異性体のラセミ混合物であり、Ｐｒｏｚａｃという商品名の抗うつ剤として市販されている。フルオキセチンおよび新規な中間体の他の製造方法は、米国特許第５，２２５，５８５号明細書に開示されている。
【００１８】
【化１】
0005967685.tif 000002
【００１９】
フルオキセチンは薬学的に許容し得る塩であってもよい。フルオキセチンは、塩基性のアミンを含むことから、多数の無機および有機の酸と反応して薬学的に許容し得る酸付加塩を形成する。この様な塩を製造するために通常使用される酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸の様な無機酸、並びにパラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸の様な有機酸等の無機および有機酸がある。従ってこの様な薬学的に許容し得る塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、エナント酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１,４−ジオン酸塩、ヘキシン−１,６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロル安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、馬尿酸塩、グルコン酸塩、ラクトビオン酸塩等が挙げられる。好ましい薬学的に許容し得る酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸の様な鉱酸で形成された塩、およびフマル酸およびマレイン酸の様な有機酸で形成された塩が挙げられる。
【００２０】
また、フルオキセチンの薬学的に許容し得る塩は、例えば水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド等との、種々の溶媒和物として存在してもよい。
【００２１】
本発明の活性化抑制組成物、医薬組成物は、Ｐｒｏｚａｃと同様に経口投与してもよいし、関節に注射で投与してもよい。また、経皮、静脈内、筋肉内および経直腸経路によって投与してもよい。
【００２２】
本発明の活性化抑制組成物、医薬組成物の剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ、エアロゾル剤(固形としてまたは液体媒質中)、軟膏剤、ゼラチン軟および硬カプセル剤、座剤、滅菌注射用溶液および滅菌封入粉剤等が挙げられる。
【００２３】
また、本発明の活性化抑制組成物、医薬組成物は、担体、賦型剤、希釈剤を含んでいてもよい。例えば、ラクトース、デキストロース、シュクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ガムアカシア、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル−およびプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。更に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤または着香剤を加えてもよい。また、本発明の活性化抑制組成物、医薬組成物を注射により関節に投与する場合は、水溶性のヒアルロン酸、ステロイド、麻酔薬、抗炎症剤等、対処療法に用いられている公知の薬剤と組み合わせてもよい。
【００２４】
なお、フルオキセチンをリウマチの治療薬として用いることは知られている（Ｓａｃｒｅ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｉｔａｌｏｐｒａｍ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，２０１０  Ｍａｒ，６２（３），６８３−９３、参照）。しかしながら、リウマチは自己免疫疾患により、滑膜組織に持続的な炎症が生じる疾患で、上記論文においても、フルオキセチンは、抗炎症性の作用を示すことが記載されている。
【００２５】
一方、本発明の活性化抑制組成物、医薬組成物は、後述する実施例で示すとおり、軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制することで、変形性関節症を治療する。変形性関節症では、主に関節にかかる負担や関節の使いすぎによって関節軟骨がいたみ病気が進行するため、薬物療法で症状をやわらげながら、運動療法で関節周りの筋肉を鍛えて関節機能を保つことが重要である。一方、リウマチは、免疫異常が強く関係するため、免疫異常を抑制する薬剤を使い炎症や関節の破壊を抑制することが重要である。したがって、変形性関節症はリウマチ性疾患の１種として扱われる場合もあるが、病因、治療法は大きく異なっており、リウマチに有効な薬剤が変形性関節症にも有効であることは推測できない。本発明の活性化抑制組成物、医薬組成物に含まれるフルオキセチンは、上記論文に記載されているフルオキセチンとは明らかに作用機序が異なっており、本発明は、フルオキセチンがＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制するという新たな作用機序に基づいた新規の発明である。
【００２６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００２７】
＜実施例１＞
［ＴＯＰＦｌａｓｈ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙによるフルオキセチンの用量依存的効果の確認］
Ｗｎｔ−３Ａ（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化剤）を培養液中に分泌する安定株Ｌ  Ｗｎｔ−３Ａ（ＣＲＬ−２６４７，ＡＴＣＣ）を培養後、培養上清を回収してＷｎｔ−３Ａ培養上清（Ｗｎｔ−３Ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ、以下「Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ」と記載することがある。）を得た。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化状態を測定するため、ヒト軟骨様細胞株ＨＣＳ−２／８（Ｔａｋｉｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９，Ｊｕｌｙ  １５  １９８９，ｐ３９９６−４００２）に、このシグナルに依存して応答するＴＯＰＦｌａｓｈ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ社）とコントロールとしてｐｈＲＬ−ＴＫ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子導入した。培養液全体に対して２５％のＷｎｔ３Ａ−ＣＭ存在下に、フルオキセチン濃度が０〜２５μＭとなるように添加した。添加後、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＭＸ（ＤＳ  Ｐａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）にて測定した。図１は、測定結果を示すグラフである。図１から明らかなように、フルオキセチンは、用量依存的にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制することが明らかとなった。
【００２８】
＜実施例２＞
［アルシアンブルー染色］
マウス軟骨前駆細胞株ＡＴＤＣ５（理研バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）より入手）に、２週間インスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して軟骨分化誘導を行った。その後、培養液全体に対して２０％のＷｎｔ３Ａ−ＣＭ、又は１０ｍＭのＬｉＣｌ（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化剤）存在下で、フルオキセチン濃度が０から１０μＭとなるように加え、７２時間の培養を行った。細胞は−２０℃メタノールで３０分間固定し、１ＮのＨＣｌに溶かした０．５％  Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ８  ＧＸ溶液（Ｓｉｇｍａ社）にて染色し、２００μｌの６Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ＨＣｌにて室温で６時間溶解した。この溶液の６５０ｎｍの吸光度を、ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ４（ＤＳ  Ｐａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を用いて測定し、細胞のプロテオグリカン産生能を評価した。なお、Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ、ＬｉＣｌを添加するとＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化し、細胞外基質であるプロテオグリカン産生能は低下する。図２（Ａ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭを添加した時の、図２（Ｂ）はＬｉＣｌを添加した時の、アルシアンブルー染色結果を示すグラフである。図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ、ＬｉＣｌを添加することでＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が活性化し、プロテオグリカン産生能が低下した（左から２番目のバー）。そして、フルオキセチンの添加量を増やすことでプロテオグリカン産生能が向上したことから、フルオキセチンがＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制することを確認した。
【００２９】
＜実施例３＞
［ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓによるｍＲＮＡ量の計測］
実施例２と同様の処理を行った細胞からＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ社）とランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡに対して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ社）酵素とマーカー遺伝子特異的なプライマーを用いてｑｕａｎｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ社）で行い、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を計測した。マーカー遺伝子には、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のターゲットＡｘｉｎ２、軟骨形成マーカーＳｏｘ９、軟骨分解マーカーＭｍｐ１３を選択した。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化剤であるＷｎｔ３Ａ−ＣＭ、ＬｉＣｌを添加すると、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のターゲットであるＡｘｉｎ２は活性化する。一方、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化により軟骨形成マーカーであるＳｏｘ９は抑制され、逆に軟骨分解マーカーであるＭｍｐ１３は活性化する。
【００３０】
図３（Ａ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのＡｘｉｎ２発現量、図３（Ｂ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのＳｏｘ９発現量、図３（Ｃ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのＭｍｐ１３発現量、図３（Ｄ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのＡｘｉｎ２発現量、図３（Ｅ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのＳｏｘ９発現量、図３（Ｆ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのＭｍｐ１３発現量、を計測し、ＧＡＰＤＨの発現量で標準化したグラフである。図３（Ａ）及び（Ｄ）が示すように、Ａｘｉｎ２はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ、ＬｉＣｌの添加により活性化したが、フルオキセチンの添加により活性化が抑制された。また、図３（Ｂ）及び（Ｅ）が示すように、Ｓｏｘ９はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ、ＬｉＣｌの添加により活性化が抑制されたが、フルオキセチンの添加により活性化の抑制が解除され、フルオキセチンの添加量の増加に伴い、Ｓｏｘ９の活性が回復した。逆に、図３（Ｃ）及び（Ｆ）が示すように、Ｍｍｐ１３はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ、ＬｉＣｌの添加により活性化したが、フルオキセチンの添加により活性化が抑制された。以上の結果より、フルオキセチンは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制すること、そして、軟骨形成マーカーであるＳｏｘ９を活性化するが、逆に軟骨分解であるマーカーＭｍｐ１３を抑制することを確認した。
【００３１】
＜実施例４＞
［Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ］
上記実施例２と同様の処理を行った細胞に、ＲＩＰＡ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に０．１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、１ｍｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｎｔｉｎｉｎを添加した溶液を加え、細胞の総たんぱく質を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動により回収したタンパク質を分離し、メンブレンへ転写後に抗β−カテニン抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を行った。β−カテニン、ＧＡＰＤＨのタンパク質量をＩｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定し、数値化した。
【００３２】
図４（Ａ）はＷｎｔ３Ａ−ＣＭ＋フルオキセチンのβ―カテニンのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの写真、図４（Ｂ）は図４（Ａ）に基づきタンパク質量を数値化したグラフである。図４（Ｃ）はＬｉＣｌ＋フルオキセチンのβ―カテニンのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの写真、図４（Ｄ）は図４（Ｃ）に基づきタンパク質量を数値化したグラフである。図４（Ｂ）及び（Ｄ）に示すように、Ｗｎｔ３Ａ−ＣＭ又はＬｉＣｌを添加することでβ―カテニンの生産量が増加したが、フルオキセチンを添加することでβ―カテニンの生産量は減少した。フルオキセチンが、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制したためと考えられる。
【００３３】
＜実施例５＞
［免疫蛍光染色］
膝人工関節置換術時に採取したヒト変形性膝関節症由来軟骨細胞ＯＡＣ（ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）を１０ｍＭ  ＬｉＣｌ存在下で、フルオキセチン濃度が１０μＭとなるように加え、７２時間培養した。得られた細胞は４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した。β−カテニン抗体を用いて免疫蛍光染色した後、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にて核を染色し、β−カテニンの核局在をＦＳＸ１００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）にて可視化した。なお、ヒト変形性膝関節症由来軟骨細胞は、名古屋大学医学部付属病院における膝人工関節置換術時に大腿骨、脛骨、膝蓋骨の軟骨表面をメスにて多数の小片へスライスし、得られた検体を３ｍｇ／ｍｌの２型コラーゲン分解溶液（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）に浸し、６時間後にナイロンメッシュのフィルターを通して回収し、この溶液をシャーレ上で培養することにより得た。なお、ヒト変形性膝関節症由来軟骨細胞の取集方法については、「Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｍ．，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓ１００Ａ１２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４２２，２０１２，ｐ５０８−５１４」にも記載されている。
【００３４】
図５は、実施例５で免疫蛍光染色した後の可視化した写真である。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ−ＤＡＰＩ及びＵｎｔｒｅａｔｅｄ−Ｍｅｒｇｅの写真が示すように、核の部分は染色されていた。しかしながら、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ−β−ｃａｔｅｎｉｎの写真では、核に相当する部分が黒く抜けている細胞が多かった。これは核にβカテニンを蓄積している細胞があまりないことを示している。一方、ＬｉＣｌ−β−ｃａｔｅｎｉｎの写真が示すように、ＬｉＣｌを添加することで核の中にβ−ｃａｔｅｎｉｎの蓄積が認められた細胞が増えたが、ＬｉＣｌ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ−β−ｃａｔｅｎｉｎの写真が示すように、ＬｉＣｌに更にＦｌｕｏｘｅｔｉｎｅを加えることで、核の中にβカテニンを蓄積している細胞があまり増えなくなった。以上の結果より、フルオキセチンを添加することで、βカテニンの核の中での蓄積を抑制できることが分かった。
【００３５】
＜実施例６＞
［Ｉｎ  ｖｉｖｏラットＯＡモデルの作成と組織学的評価］
ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ）の右膝にｍｅｎｉｓｃｏ−ｔｉｂｉａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ切除による内側半月板不安定化手術（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｍｅｄｉａｌ  ｍｅｎｉｓｃｕｓ；ＤＭＭ  ｓｕｒｇｅｒｙ）を行い、ＯＡモデルラットとした。同じラットの左膝には皮膚切開と関節包切開のみを行い、Ｓｈａｍ足とした。図６（Ａ）はＤＭＭ手術を行ったラットの写真である。フルオキセチンをＰＢＳに溶かして５０μＭとし、両膝に各５０μｌのフルオキセチン混合液またはＰＢＳのみの液を週１回、関節腔内投与した。手術から８週後膝関節周囲の軟部組織を除去し、４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅにて組織を固定した。その後、大腿骨内側顆の左右中央にて矢状断で切片を作成し、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ−Ｆａｓｔ−ｇｒｅｅｎ染色をおこなった。ＯＡの進行度は、脛骨側と大腿骨側軟骨のｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｎｋｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｃｏｒｅを計測しその合計値で評価した。なお、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｎｋｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｃｏｒｅとは、関節軟骨の組織学的変性度を示すもので、軟骨の構造、細胞の状態、Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏの染色性、Ｔｉｄｅｍａｒｋの状態を数値化したものである（「Ｍａｎｋｉｎ  ＨＪ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｏｓｔｅｏ−ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｐｓ．  ＩＩ．  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄａｔａ．”，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ．，１９７１  Ａｐｒ；５３（３）：５２３−３７」、及び「Ｆｕｒｍａｎ  ＢＰ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｊｏｉｎｔ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｃｌｏｓｅｄ  Ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｎｅｅ：  Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．，Ｍａｙ  ２００７，ｐ５７８−５９２」参照。）
【００３６】
図６（Ｂ）はＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ−Ｆａｓｔ−ｇｒｅｅｎ染色の写真、図６（Ｃ）はｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｎｋｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｃｏｒｅの計測の合計値のグラフである。図６（Ｃ）から明らかなように、ＤＭＭ手術を行ったＳＤラットにフルオキセチンを投与することで、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｎｋｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｃｏｒｅの合計値が低くなった。
【００３７】
以上の結果より、フルオキセチンはＯＡを治療できる医薬組成物であることが分かった。また、フルオキセチンはＧＳＫインヒビターであるＬｉＣｌが活性化するＷｎｔ／βカテニンシグナルも抑制したことから、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの比較的下流側で機能していると考えられる。そのため、病態進行をより直接的に抑制できる可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
フルオキセチンは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制することで、変形性関節症治療用医薬組成物として用いることができる。したがって、変形性関節症治療用の創薬に有用である。
【要約】
【課題】軟骨細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を抑制する化合物を探索する。
【解決手段】フルオキセチンまたはその薬学的に許容し得る塩を含む軟骨細胞のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化抑制組成物。
【選択図】図２【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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