(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症の治療のための組成物であって、
第一のＭＢＰペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなり、第二のＭＢＰペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなり、第三のＭＢＰペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなる、第一のベクターと結合した３種類のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを含み、
前記第一のベクターが表面に露出した標的化部分を有するリポソームを含み、
前記標的化部分がマンノシル化脂質を含み、
前記マンノシル化脂質がｍａｎＤＯＧである、
組成物。
【請求項２】
１つまたは複数の前記ＭＢＰペプチドが前記ベクターと共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１つまたは複数の前記ＭＢＰペプチドが前記ベクターと非共有結合している、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的化部分が、標的化部分が存在しないベクターと結合したＭＢＰペプチドに比して、
（ａ）前記ＭＢＰペプチドの免疫細胞への送達；または
（ｂ）前記ＭＢＰペプチドの免疫細胞内への取込み
を増大させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭＢＰペプチド（１つまたは複数）が前記リポソームに封入されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記リポソームの平均直径が１００ｎｍ〜２００ｎｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
必要とする患者の多発性硬化症治療のための医薬品の製造における請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記組成物が週１回投与剤形である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物を毎日投与剤形に製造する、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物が局所投与、腸内投与または非経口投与に適した形態である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬品が、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の治療のためのものである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬品が、二次進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の治療のためのものである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬品が、一次進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）の治療のためのものである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬品が、進行再発型多発性硬化症（ＰＲＭＳ）の治療のためのものである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物を作製する方法であって、
（ｉ）有機溶媒の存在下、ｍａｎＤＯＧと脂質とを混合することと、
（ｉｉ）前記有機溶媒を蒸発させて不均一な脂質層を形成することと、
（ｉｉｉ）前記不均一な脂質層を再水和して多層多ラメラ小胞（ＭＬＶ）を得ることと、
（ｉｖ）前記多ラメラ小胞をホモジナイズして小さい一枚膜小胞を得ることと、
（ｖ）前記一枚膜小胞と前記３種類のＭＢＰペプチドとを混合し、この混合物を凍結乾燥させることと、
（ｖｉ）前記小さい一枚膜小胞を再水和して、平均直径が６０〜１００ｎｍの小さい一枚膜小胞リポソームを得ることと
を含む方法。
【請求項１６】
前記３種類のＭＢＰペプチドを１：１：１の質量比で加える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質が卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、前記ｍａｎＤＯＧ対前記ＰＣのモル比が１対９９である、請求項１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記小さい一枚膜小胞リポソームが、表面にマンノース残基を前記リポソームの全重量に基づいて１．０重量％有する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年４月１１日に出願された「ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＯＬＩＧＯＰＥＰＴＩＤＥ  ＦＲＡＧＭＥＮＴＳ  ＯＦ  ＭＹＥＬＩＮ  ＢＡＳＩＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ，Ａ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＡＮＤ  Ａ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＳＣＬＥＲＯＳＩＳ」と題する米国特許出願第１３／４４４，７８８号の優先権を主張するものであり、上記出願の開示は、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄の軸索を取り囲み脂質に富むミエリン鞘が損傷し、脱髄および瘢痕化に至る神経変性疾患である。中枢神経系（ＣＮＳ）に生じた損傷は多様な神経症状を引き起こす。世界で約１００万人がこの自己免疫疾患に罹患しているが、その病因は不明であり、発生機序もほとんど理解されていない。ミエリン膜の成分に対して反応するＢ細胞およびＴ細胞が脳および脊髄脱髄を仲介しており、これらの細胞が疾患進行の大部分に関与すると思われる。
【０００３】
ＭＳ患者においてＢ細胞およびＴ細胞が反応する可能性のある自己抗原のリストは次第に増加しつつあり、数種のオリゴデンドロサイト関連タンパク質、最もよく知られるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）がこれに含まれる。マクロファージおよびリンパ球が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して中枢神経系に浸潤すると、脳および脊髄に炎症性脱髄性が形成される。
【０００４】
Ｔ細胞が脱髄作用の大部分に関与しているが、Ｂ細胞も大きな役割を果たしている。Ｂ細胞は、よく知られているように抗体産生に役割を果たしているほか、抗原提示細胞およびサイトカイン産生細胞としても機能するからである（ＨｉｋａｄａおよびＺｏｕａｌｉ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；１１：１０６５−８）。ほかにもＢ細胞が脱髄に関与している証拠があり、ＭＢＰに対する触媒抗体が多発性硬化症患者に検出されている。この触媒抗体は抗原と結合するだけでなく、それを分解することができる（Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ  ＮＡら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００６；１０３：２８１−６）。証拠から、ＭＳの進行には、神経抗原およびウイルス抗原と交差反応を示す自己抗体がＭＳの病因および病理発生に寄与する強力な環境的要素が存在することが示唆される（Ｇａｂｉｂｏｖら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０１１；２５：４２１１−２１）。
【０００５】
多くのＭＳ治療法が提案されており、このような治療法として、（ｉ）酢酸グラチラマー（ＧＡ）の投与；（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用する「改変ペプチドリガンド」（ＡＰＬ）の投与；（ｉｉｉ）ＩＦＮβの投与；（ｉｖ）抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２５および抗ＣＤ５２モノクローナル抗体の投与；（ｖ）各種の経口療法；（ｖｉ）不活性化したＴ細胞またはＴＣＲ超可変領域のワクチン接種；（ｖｉｉ）自己抗原投与またはＤＮＡワクチン接種による免疫系の寛容化；ならびに（ｖｉｉｉ）Ｂ細胞を標的とする枯渇療法が挙げられる。
【０００６】
しかし、有望な臨床データ、免疫学的データおよび生化学的データが得られているにもかかわらず、既存のいずれの治療法でもＭＳ進行を治療または予防することができない。したがって、有効なＭＳ治療法が当該技術分野で大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本発明は、必要とする対象に投与するベクターと結合した免疫優性ＭＢＰペプチドの治療用組成物を提供することによって、多発性硬化症（ＭＳ）治療に有効な組成物および方法という医学分野における必要性を満たすものである。特定の実施形態では、組成物は、マンノシル化リポソームに封入された免疫優性ＭＢＰペプチドを含む。本明細書に示される通り、このような組成物の投与により、ＥＡＥ誘導ＭＳラットモデルの進行中の実験的自己免疫性脳脊髄炎が改善する。
【０００８】
本発明は部分的には、特定のＭＢＰペプチドが多発性硬化症に罹患している患者の主要なＢ細胞エピトープであるという発見に基づくものである。このペプチドの遊離ペプチドではなくリポソーム製剤をＭＳのげっ歯類モデルに投与すると、麻痺の統計的に有意な減少が得られることがわかった。理論に束縛されるものではないが、このペプチドのリポソーム製剤により、同ペプチドの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞および／または抗原提示細胞）への送達の改善および／または同ペプチドの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞および／または抗原提示細胞）内への取込みの改善がもたらされる可能性が考えられる。
【０００９】
したがって、本発明は、諸態様のなかでも特に、多発性硬化症を治療する組成物および方法を提供する。組成物は、同定されベクター（例えば、マンノシル化リポソーム）と結合したＭＢＰペプチドを１つまたは複数含む。
【００１０】
一態様では、本発明は多発性硬化症の治療のための組成物を提供し、この組成物は第一のベクターと結合した第一のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを含み、第一のＭＢＰペプチドはアミノ酸配列：（Ｒ１）ａ−Ｐ１−（Ｒ２）ｂからなり、式中、Ｐ１は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ａおよびｂは、それぞれ独立して０または１である。
【００１１】
上記組成物の一実施形態では、ａおよびｂはともに０である。上記組成物の別の実施形態では、ａは１であり、ｂは０である。上記組成物の別の実施形態では、ａは０であり、ｂは１である。上記組成物の別の実施形態では、ａおよびｂはともに１である。
【００１２】
上記組成物の一実施形態では、Ｐ１は配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号１のアミノ酸配列である。
【００１３】
上記組成物の一実施形態では、Ｐ１は配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号２のアミノ酸配列である。
【００１４】
上記組成物の一実施形態では、Ｐ１は配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記組成物の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号３のアミノ酸配列である。
【００１５】
上記組成物の一実施形態では、組成物は第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドをさらに含み、第二のＭＢＰペプチドはアミノ酸配列：（Ｒ３）ｃ−Ｐ２−（Ｒ４）ｄからなり、式中、Ｐ２は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ｃおよびｄは、それぞれ独立して０または１であり、Ｐ１とＰ２は異なるアミノ酸配列である。
【００１６】
上記組成物の一実施形態では、第一のベクターと第二のベクターは同じベクターである。
【００１７】
上記組成物の一実施形態では、組成物は第三のベクターと結合した第三のＭＢＰペプチドをさらに含み、第三のＭＢＰペプチドはアミノ酸配列：（Ｒ５）ｅ−Ｐ３−（Ｒ６）ｆからなり、式中、Ｐ３は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ｅおよびｆは、それぞれ独立して０または１であり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は異なるアミノ酸配列である。
【００１８】
上記組成物の一実施形態では、第一、第二および第三のベクターは同じベクターである。
【００１９】
上記組成物の一実施形態では、Ｐ１は配列番号１のアミノ酸配列であり；Ｐ２は配列番号２のアミノ酸配列であり；Ｐ３は配列番号３のアミノ酸配列である。
【００２０】
上記組成物の一実施形態では、ＭＢＰペプチドはベクターと共有結合している。上記組成物の別の実施形態では、ＭＢＰペプチドはベクターと非共有結合している。
【００２１】
上記組成物の一実施形態では、ベクターはナノ粒子を含む。上記組成物の特定の実施形態では、ナノ粒子はリポソームである。
【００２２】
上記組成物の一実施形態では、ベクターは標的化部分を含む。上記組成物の特定の実施形態では、ベクターは標的化部分である。
【００２３】
上記組成物の一実施形態では、標的化部分は、標的化部分が存在しないベクターと結合したＭＢＰペプチドに比して、（ａ）ＭＢＰペプチドの免疫細胞への送達；または（ｂ）ＭＢＰペプチドの免疫細胞内への取込みを増大させる。
【００２４】
上記組成物の一実施形態では、標的化部分はマンノース残基を含む。上記組成物の別の実施形態では、標的化部分は免疫細胞と特異的に結合する抗体を含む。上記組成物の別の実施形態では、標的化部分は免疫細胞と特異的に結合するアプタマーを含む。上記組成物の一実施形態では、標的化部分は免疫細胞と特異的に結合するペプチドを含む。上記組成物の一実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。上記組成物の別の実施形態では、免疫細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。
【００２５】
一態様では、本発明は多発性硬化症の治療のための組成物を提供し、この組成物は、第一のベクターと結合した第一のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを含み、第一のＭＢＰペプチドはアミノ酸配列：（Ｒ１）ａ−Ｐ１−（Ｒ２）ｂからなり、式中、Ｐ１は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ａおよびｂは、それぞれ独立して０または１であり、ベクターはマンノシル化脂質を含むリポソームである。
【００２６】
上記組成物の一実施形態では、Ｐ１は配列番号１のアミノ酸配列である。
【００２７】
上記組成物の一実施形態では、組成物は、アミノ酸配列：（Ｒ３）ｃ−Ｐ２−（Ｒ４）ｄからなり第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドと、アミノ酸配列：（Ｒ５）ｅ−Ｐ３−（Ｒ６）ｆからなり第三のベクターと結合した第三のＭＢＰペプチドとをさらに含み、式中、Ｐ１は、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｐ２は、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｐ３は、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して０または１である。
【００２８】
上記組成物の一実施形態では、ＭＢＰペプチド（１つまたは複数）はリポソームと非共有結合している。上記組成物の別の実施形態では、ＭＢＰペプチド（１つまたは複数）はリポソームに封入されている。
【００２９】
上記組成物の一実施形態では、リポソームは平均直径が１００ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００３０】
上記組成物の一実施形態では、マンノシル化脂質はテトラマンノシル−３−Ｌ−リジン−ジオレオイルグリセロールである。上記組成物の別の実施形態では、マンノシル化脂質はｍａｎＤＯＧである。
【００３１】
一態様では、本発明は、必要とする患者の多発性硬化症を治療する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列：（Ｒ１）ａ−Ｐ１−（Ｒ２）ｂからなり第一のベクターと結合した第一のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを含む組成物を患者に投与することを含み、式中、Ｐ１は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ａおよびｂは、それぞれ独立して０または１である。
【００３２】
上記方法の一実施形態では、ａおよびｂはともに０である。上記方法の別の実施形態では、ａは１であり、ｂは０である。上記方法の別の実施形態では、は０であり、ｂは１である。上記方法の別の実施形態では、ａおよびｂはともに１である。
【００３３】
上記方法の一実施形態では、Ｐ１は配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号１のアミノ酸配列である。
【００３４】
上記方法の一実施形態では、Ｐ１は配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号２のアミノ酸配列である。
【００３５】
上記方法の一実施形態では、Ｐ１は配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。上記方法の別の実施形態では、Ｐ１は配列番号３のアミノ酸配列である。
【００３６】
上記方法の一実施形態では、組成物は第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドをさらに含み、第二のＭＢＰペプチドはアミノ酸配列：（Ｒ３）ｃ−Ｐ２−（Ｒ４）ｄからなり、式中、Ｐ２は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ｃおよびｄは、それぞれ独立して０または１であり、Ｐ１とＰ２は異なるアミノ酸配列である。
【００３７】
上記方法の一実施形態では、第一のベクターと第二のベクターは同じベクターである。
【００３８】
上記方法の一実施形態では、組成物は第三のベクターと結合した第三のＭＢＰペプチドをさらに含み、第三のＭＢＰペプチドはアミノ酸配列：（Ｒ５）ｅ−Ｐ３−（Ｒ６）ｆからなり、式中、Ｐ３は、配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり；Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；ｅおよびｆは、それぞれ独立して０または１であり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は異なるアミノ酸配列である。
【００３９】
上記方法の一実施形態では、第一、第二および第三のベクターは同じベクターである。
【００４０】
上記方法の一実施形態では、Ｐ１は配列番号１のアミノ酸配列であり；Ｐ２は配列番号２のアミノ酸配列であり；Ｐ３は配列番号３のアミノ酸配列である。
【００４１】
上記方法の一実施形態では、ＭＢＰペプチドはベクターと共有結合している。上記方法の別の実施形態では、ＭＢＰペプチドはベクターと非共有結合している。
【００４２】
上記方法の一実施形態では、ベクターはナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子はリポソームである。
【００４３】
上記方法の一実施形態では、ベクターは標的化部分を含む。
【００４４】
上記方法の一実施形態では、標的化部分は、標的化部分が存在しないベクターと結合したＭＢＰペプチドに比して、（ａ）ＭＢＰペプチドの免疫細胞への送達；または（ｂ）ＭＢＰペプチドの免疫細胞内への取込みを増大させる。
【００４５】
上記方法の一実施形態では、ベクターは標的化部分である。上記方法の別の実施形態では、標的化部分はマンノース残基を含む。上記方法の別の実施形態では、標的化部分は免疫細胞と特異的に結合する抗体を含む。上記方法の別の実施形態では、標的化部分は免疫細胞と特異的に結合するアプタマーを含む。上記方法の別の実施形態では、標的化部分は免疫細胞と特異的に結合するペプチドを含む。上記方法の一実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。上記方法の別の実施形態では、免疫細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。
【００４６】
上記方法の一実施形態では、組成物は配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＢＰペプチドを含み、ＭＢＰペプチドは標的化部分を含むベクターと結合しており、標的化部分を含むベクターは、マンノシル化脂質を含むリポソームである。
【００４７】
上記方法の一実施形態では、組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する第一のＭＢＰペプチド；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有する第二のＭＢＰペプチド；および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有する第三のＭＢＰペプチドを含む。
【００４８】
上記方法の一実施形態では、ＭＢＰペプチド（１つまたは複数）はリポソームと非共有結合している。
【００４９】
上記方法の一実施形態では、ＭＢＰペプチド（１つまたは複数）はリポソームに封入されている。
【００５０】
上記方法の一実施形態では、リポソームは平均直径が１００ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００５１】
上記方法の一実施形態では、マンノシル化脂質はテトラマンノシル−３−Ｌ−リジン−ジオレオイルグリセロールである。上記方法の別の実施形態では、マンノシル化脂質はｍａｎＤＯＧである。
【００５２】
上記方法の一実施形態では、組成物を少なくと週１回患者に投与する。上記方法の別の実施形態では、組成物を少なくとも週２回患者に投与する。上記方法の別の実施形態では、組成物を毎日患者に投与する。
【００５３】
上記方法の一実施形態では、組成物を局所投与、腸内投与または非経口投与によって投与する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】誘導されたＥＡＥを有するＤＡラットが抗ＭＢＰ自己抗体結合パターンの観点から最も適切なＭＳのげっ歯類モデルであることを表す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＳ患者および実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症しているげっ歯類モデル（ＤＡラット、ＳＪＬマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス）の血清自己抗体はＭＢＰと再現性良く結合する。ＢＡＬＢ／ｃウスの血清を陰性対照として用いた。（Ｂ）ＭＢＰエピトープライブラリーの設計。代表的なクーマシー染色および抗ｃ−ｍｙｃおよび抗ＭＢＰ  ｍＡｂとＭＢＰエピトープライブラリーとのウエスタンブロットハイブリダイゼーション。抗ｃ−ｍｙｃ  Ａｂは、全融合タンパク質に標的エピトープが存在することからＭＢＰエピトープライブラリーの全メンバーと結合し（最上部のスキーム）、したがって、ｃ−ｍｙｃエピトープの直接上流に位置するＭＢＰペプチドがすべて露出し接触可能であることが示唆される。モノクローナル抗ＭＢＰ  Ａｂ（クローンＦ４Ａ３、ＭＢＰエピトープ  ＲＨＧＦＬＰＲＨＲ（配列番号２０））は予測される通り、ＭＢＰ全体ならびにそのペプチドＭＢＰ２およびＭＢＰ３と反応する。（Ｃ）ＥＬＩＳＡによるＭＢＰエピトープライブラリーとの血清自己抗体結合パターン。本発明者らのデータから、ＥＡＥを発症しているＤＡラットがＭＳげっ歯類モデルとして最も適切である。エピトープライブラリーに示されるペプチドを有するＭＢＰ配列を最下段に示す（配列番号１７）。アミノ酸残基個ごとに太字で印が付してある。括弧は治療効果のスクリーニングに選択された免疫優性ペプチドＭＢＰ−１／−２／−３を表す。
【図２】ＭＢＰ（６３−８１）で免疫感作したＤＡラットのポリクローナル抗体の特異性および親和性の特徴付けを表す図である。（Ａ）上のパネルは、３種類のＭＢＰフラグメントが誘導されたＥＡＥを有するＤＡラットの血清ａｕｔｏＡｂによって認識されることを示している。エピトープライブラリーとの結合、さらには重複する配列の推定に基づく理論的計算により、免疫優性のペプチドを判定した。さらに、ＭＢＰエピトープライブラリーと抗ｃ−ｍｙｃおよび抗ＭＢＰ  Ｆ４Ａ３  ｍＡｂとを肺ブルダイズさせて、結合アッセイを確認した（下のパネル）。（Ｂ）ＳＰＲ技術によって測定されたａｕｔｏＡｂによる決定されたエピトープ認識の量的特徴。各ペプチドおよび効果的な解離定数を示す。正確なエピトープを太字で示し、ＮＤは決定されなかったことを表す。
【図３】ＭＢＰ免疫優性ペプチドをマンノシル化ＳＵＶリポソームに封入するのに用いたリポソーム技術の略図である。（上段左）クロロホルム中の脂質（卵ＰＣと１％マンノシル化ＤＯＧ）の混合物。（上段中央）有機溶媒蒸発時の不規則な脂質層の形成。（上段右）１回目の再水和による多層ＭＬＶリポソーム形成。平均直径は１〜５μｍである。（下段左）ＭＬＶリポソームから高圧ホモジナイゼーションにより得られたＳＵＶリポソームおよびペプチドと過剰な糖との混合物の凍結乾燥。（下段中央）ペプチドが、崩壊したＳＵＶリポソームの間に位置している。（下段右）２回目の再水和時の大きさ約６０〜８０ｎｍ、表面にマンノース残基を１．０％有するＳＵＶリポソームへのペプチドの封入。Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ社がレンダリングを実行した。
【図４】リポソームに閉じ込めた免疫優性ＭＢＰペプチドによりＤＡラットの実験的自己免疫性脳脊髄炎が改善することを示す図である。対照となる全グループ（Ａ〜Ｇ）を平均疾患スコア、グリオーシス／脱髄の比について検討した。未治療対照（ビヒクル）群を濃い太線（Ａ）で示し、比較のため同じものを各プロットに示す。マンノシル化ＳＵＶリポソームに封入したＭＢＰの３種類の免疫優性フラグメントをＤＡラットのＥＡＥ治療に使用した：ＭＢＰ（４６−６２）は初回発作時の疾患スコア最大値の減少に最も効果的であり（Ｂ）、ＭＢＰ（１２４−１３９）（Ｃ）およびＭＢＰ（１４７−１７０）（Ｄ）は寛解段階での発症を予防した。リポソームに閉じ込めたＭＢＰ（４６−６２）、ＭＢＰ（１２４−１３９）およびＭＢＰ（１４７−１７０）免疫優性ＭＢＰペプチドの混合物の投与では持続性のＥＡＥが有意に改善し（Ｅ）、コパキソン（Ｆ）および遊離ペプチドＭＢＰ（４６−６２）（Ｇ）をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。各グループの平均疾患スコアを示す。統計的有意差を薄い太線で示す。選択された個々のラット個体の代表的なプロファイルを細線で示す。代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色を右パネルに示す。
【図５】リポソームに閉じ込めた免疫優性ＭＢＰペプチドが血清抗ＭＢＰ自己抗体の力価を低下させ、Ｔｈ１  ＣＮＳサイトカインプロファイルをダウンレギュレートすることを示す図である。（Ａ）ＭＢＰ１  ＳＵＶ、ＭＢＰ１／２／３  ＳＵＶおよびコパキソンでそれぞれ治療したＥＡＥ  ＤＡラットの血清中抗ＭＢＰ  ａｕｔｏＡｂ濃度と、未治療ラットおよび非免疫感作ラットの血清中抗ＭＢＰ  ａｕｔｏＡｂ濃度との比較。ＭＢＰ１  ＳＵＶ（下段右）、ＭＢＰ１／２／３  ＳＵＶ（下段左）およびコパキソン（上段右）でそれぞれ治療したＤＡラットの脳切片の代表的なルクソールファーストブルー染色（Ｂ）、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮγ（Ｂ）およびＩＬ２（Ｃ）に対する免疫染色ならびにＢＤＮＦ（Ｄ）の免疫染色をそれぞれ未治療ラット（上段左）のものと対比させた。
【図６】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの平均麻痺スコアを示す図である。馴化、ＥＡＥ誘導、治療および治療後（計３５日間）の試験期間を通じて各ラットの麻痺スコアを毎日付けた。ＥＡＥ誘導ＤＡラット５４個体を同じ個体数の９つのグループに分けた。グループＩ〜ＶＩＩは製剤１〜７で治療し、グループＶＩＩＩはコパキソンで治療し（陽性対照群）、グループＩＸには水を注射した（陰性対照群）。麻痺スコアを毎日記録し、グループＩ〜Ｖ（Ａ）の平均値およびグループＶＩ〜ＩＸ（Ｂ）の平均値として表した。治療３日後および４日後、グループＩＶ（製剤４で治療）に対照に比して麻痺スコアの統計的に有意な減少が観察された（ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）。標準偏差をエラーバーで表す。
【図７】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの平均体重（ｇ）を示す図である。馴化、ＥＡＥ誘導、治療および治療後（計３５日間）の全試験期間を通じて全個体の体重を記録した。ＥＡＥ誘導ＤＡラット５４個体を同じ個体数の９つのグループに分けた。ＭＢＰペプチド製剤で治療したラットと対照群との間に体重の統計的有意差はみられなかった。標準偏差をエラーバーで表す。
【図８】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの脊髄のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す図である。（Ａ）（ラット３５；グループＩＩ）、（ラット５３；グループＩＶ）、（ラット６９；グループＩＸ）；（Ｂ）（ラット７１；グループＶＩＩＩ）、（ラット７７；グループＩＩＩ）、（ラット７９；グループＶ）；および（Ｃ）（ラット８１；グループＩ）、（ラット９５；グループＶＩＩ）、（ラット２００３；グループＶＩ）でそれぞれ処理したＥＡＥ誘導ラットから単離した脊髄の倍率１０倍および４０倍の画像。
【図９】実験計画を示す図である。実施例１２、１３および１４で試験した全実験製剤のペプチド名、リポソーム内容および投与量を含めた実験設定。ＭＢＰ１（配列番号１）；ＭＢＰ１ＦＬ（配列番号９）；ＭＢＰ１ＦＲ（配列番号１０）；ＭＢＰ２（配列番号２）；ＭＢＰ３（配列番号３）。
【図１０】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの平均麻痺スコアを示す図である。馴化、ＥＡＥ誘導、治療および治療後（計３６日間）の試験期間を通じて、各ラットの麻痺スコアを毎日付けた。ＥＡＥ誘導ＤＡラット５４個体を１０のグループに分けた。グループＩ〜ＶＩＩＩは製剤ＭＢＰ  Ｆ１〜８で治療し、グループＩＸはコパキソンで治療し（陽性対照群）、グループＸには水を注射した（陰性対照群）。治療２日後および３日後、グループＩＩＩおよびＩＶ（投与量２００ｍｇで治療）に対照に比して麻痺スコアの統計的に有意な減少が観察された（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５）。標準偏差をエラーバーで表す。
【図１１】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの平均体重（ｇ）を示す図である。馴化、ＥＡＥ誘導、治療および治療後（計３６日間）の全試験期間を通じて全個体の体重を記録した。ＥＡＥ誘導ＤＡラット５４個体を同じ個体数の１０のグループに分けた。ＭＢＰペプチド製剤で治療したラットの体重と対照群の体重の間に統計的有意差はみられなかった。標準偏差をエラーバーで表す。
【図１２】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの平均麻痺スコアを示す図である。馴化、ＥＡＥ誘導、治療および治療後の試験期間を通じて各ラットの麻痺スコアを毎日付けた。ＥＡＥ誘導ＤＡラット４２個体を７つのグループに分けた。グループＩＩ〜Ｖは製剤ＭＢＰ  Ｆ  Ｉ〜ＩＶで治療し、グループＶＩおよびＶＩＩはコパキソンで治療し（それぞれ１５０μｇおよび４５０μｇ；陽性対照群）、グループＩには水を注射した（陰性対照群）。治療１〜４日後、グループＩＩ（ＭＢＰ１のリポソーム製剤；ペプチドと脂質の比１：３３０で治療）（ｎ＝６、＊ｐ＜０．００５）；治療１日後、グループＩＩＩ（ＭＢＰ１／２／３のリポソーム製剤；ペプチドと脂質の比１：３３０で治療）（ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）；および治療１〜３日後、グループＶ（ＭＢＰ１／２／３のリポソーム製剤；ペプチドと脂質の比１：１１０で治療）（ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）に陰性対照に比して麻痺スコアの統計的に有意な減少が観察された。標準偏差をエラーバーで表す。
【図１３】ＭＳのＥＡＥ誘導ラットモデルの平均体重（ｇ）を示す図である。馴化、ＥＡＥ誘導、治療および治療後の全試験期間を通じて全個体の体重を記録した。ＥＡＥ誘導ＤＡラット４２個体の同じ個体数の７つのグループに分けた。ＭＢＰペプチド製剤で治療したラットの体重と対照群の体重の間に統計的有意差はみられなかった。標準偏差をエラーバーで表す。
【図１４】７種類のＭＢＰスプライスアイソフォームの配列アライメントを示す図である。ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ番号：Ｐ０２６８６（配列番号１３）；Ｐ０２６８６−２（配列番号１４）；Ｐ０２６８６−３（配列番号１５）；Ｐ０２６８６−４（配列番号１６）；Ｐ０２６８６−５（配列番号１７）；Ｐ０２６８６−６（配列番号１８）；およびＰ０２６８６−７（配列番号１９）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
Ｉ．諸言
多発性硬化症（ＭＳ）は自己免疫を背景とする重度の神経変性疾患である。多発性硬化症を管理する治療法はいくつか知られているが、この疾患の治癒方法は存在しない。さらに、現在用いられている治療法では効果が低く、望ましくない副作用が生じる場合がある。したがって、ＭＳ治療の新規な方法の開発が極めて重要である。本発明者らは、当該技術分野で認められているヒトＭＳのモデル、ＤＡラットの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の治療に有効なマンノシル化リポソームに封入したミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のＢ細胞エピトープの組成物およびその使用を本明細書に報告する。
【００５６】
一態様では、本発明は、多発性硬化症の治療に有用なベクターと結合した抗原ＭＢＰペプチド治療用組成物を提供する。特定の実施形態では、治療用組成物は、標的化部分（例えば、マンノシル化脂質）を任意選択で含むベクター（例えば、リポソーム）と結合した抗原ＭＢＰペプチドを１つ、２つまたは３つ含む。治療用組成物を多発性硬化症の患者に投与すると認知能力が改善し、麻痺の症状が軽減する。したがって、本発明はほかにも、必要とする対象の多発性硬化症を治療、管理および予防する方法を提供する。
【００５７】
ミエリン塩基性タンパク質のエピトープライブラリーを用いて、再発寛解型ＭＳ患者の血清自己抗体（ａｕｔｏＡｂ）の結合パターンを分析し、ＥＡＥのあるＳｗｉｓｓ  Ｊａｍｅｓ  Ｌａｍｂｅｒｔ（ＳＪＬ）マウス，Ｃ５７  ｂｌａｃｋ  ６（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスおよびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラットの抗ＭＢＰ  ａｕｔｏＡｂと比較した。ＭＢＰフラグメントに対するａｕｔｏＡｂのスペクトルに基づき、ＥＡＥのあるＤＡラットが最も適切なげっ歯類ＭＳモデルであることがわかった。マンノシル化ＳＵＶリポソームに封入したＭＢＰの免疫優性フラグメントをＤＡラットのＥＡＥ治療に用いた。ＭＢＰ（４６〜６２）が初回発作時の最大疾患スコアを減少させるのに最も効果が高かったのに対して、ＭＢＰ（１２４〜１３９）およびＭＢＰ（１４７〜１７０）では増悪段階の進展を予防できた。リポソーム内に封入した免疫優性ＭＢＰペプチドの混合物を投与すると、ＣＮＳにおけるＴｈ１サイトカインのダウンレギュレーションおよびＢＤＮＦ産生の誘導によって、持続性のＥＡＥが有意に改善する。ＭＢＰペプチドの相乗効果により疾患経過全般が短くなり、初回発作が中等度になり、増悪の転帰が迅速になることから、ＭＳ治療の新規な治療法が示唆される。
【００５８】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、積荷（例えば、治療用または診断用の小分子、ペプチド、核酸およびタンパク質生物製剤）と結合することができる分子構造を指す。一実施形態では、ベクターとは、必要とする対象に投与する治療用の積荷（例えば、ＭＢＰペプチド）を保有または誘導する分子構造のことである。ベクターには、必ずというわけではないが、以下に挙げることが可能である：積荷によって与えられる治療効果を改善すること；ｉｎ  ｖｉｖｏの位置または細胞型への積荷の送達を改善または標的化すること；積荷の細胞または特定の細胞内へのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの取込みを改善すること；積荷のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延ばすこと；積荷を望ましくないｉｎ  ｖｉｖｏの相互作用から保護すること；あるいは対象の血流および／または体内からの積荷のクリアランス速度を低下させること。一実施形態では、ベクターは、積荷を封入すること、埋め込むこと、係留することが可能な、以下で定義されるナノ粒子を含む。任意選択で、ベクター、例えばナノ粒子ビヒクルは標的化部分をさらに含み得る。別の実施形態では、ベクターは積荷と直接結合（共有結合または非共有結合）した標的化部分である。ベクターの非限定的な例としては、リポソーム、ミセル、ブロックコポリマーミセル、ポリマーソーム、ニオソーム、脂質コートナノバブルおよびデンドリマーなどのナノ粒子；金属粒子およびシリカ粒子などの固体運搬体；マンノース、マンノース誘導体、マンノース類似体またはマンノース残基、マンノース誘導体もしくはマンノース類似体を１つもしくは複数含む炭水化物などの糖部分；細胞受容体リガンドなどのペプチド；抗体またはその機能的フラグメントなどのポリペプチド；ならびにアプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）などの核酸が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用される「標的化部分」という用語は、治療用または診断用積荷と結合させると、積荷単独での効果に比して積荷の効果が改善する薬剤を指す。一実施形態では、標的化部分により、結合した積荷のｉｎ  ｖｉｖｏの位置もしくは細胞型への送達が改善し；かつ／または積荷の細胞内もしくは位置へのｉｎ  ｖｉｖｏの取込みが改善する。標的化部分は、特に限定されないが、共有結合、イオン結合、静電的相互作用、疎水性相互作用または物理的な閉込めを介するものを含めた共有結合または非共有結合により積荷（例えば、ＭＢＰペプチド）と結合し得る。特定の実施形態では、結合はリンカーまたはその他のベクター構造を介するものであり得る。標的化部分の例としては、特に限定されないが、糖部分（例えば、マンノースまたはマンノース残基を１つもしくは複数含む炭水化物）、ペプチド（例えば、細胞受容体リガンド）、ポリペプチド（例えば、抗体またはその機能的フラグメント）および核酸（例えば、アプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標））が挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用される「標的化部分を含むベクター」という用語は、積荷の細胞への送達を改善し、かつ／または積荷の細胞内への取込みを改善する分子構造を指す。一実施形態では、ベクターは、積荷（例えば、ＭＢＰペプチドまたはその他の治療剤）を運搬することができるナノ粒子ビヒクルと共有結合または非共有結合した標的化部分を含む。任意選択で、標的化部分を含むベクターは、積荷を保持することができるナノ粒子ビヒクルを含む。別の実施形態では、標的化部分を含むベクターは、積荷（例えば、ＭＢＰペプチドまたはその他の治療剤）と共有結合または非共有結合により直接結合した標的化部分からなる。特定の実施形態では、標的化部分を含むベクターはその標的化部分である。
【００６１】
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、積荷、例えばペプチド（例えば、ＭＢＰペプチド）、核酸、治療部分または診断部分と結合した、平均直径が約１ｎｍ〜約１０００ｎｍのベクターを指す。ナノ粒子は中空粒子（例えば、外殻とハローコア（ｈａｌｌｏｗ  ｃｏｒｅ）を有する）、固体粒子または多層粒子であり得る。積荷（例えば、ＭＢＰペプチド）は、ナノ粒子に係留されていても、埋め込まれていても、封入されていてもよい。多数のナノ粒子が当該技術分野で公知であり（例えば、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれるＥｌｉｚｏｎｄｏら，Ｐｒｏｇ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｃｉ．２０１１；１０４：１−５２を参照されたい）、特に限定されないが、リポソーム、ミセル、ブロックコポリマーミセル（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれるＫａｔａｏｋａら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００１  Ｍａｒ  ２３；４７（１）：１１３−３１に概説されている）、ポリマーソーム（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれるＣｈｒｉｓｔｉａｎら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００９  Ｍａｒ；７１（３）：４６３−７４に概説されている）、ニオソーム（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれるＫａｚｉら，Ｊ  Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｏｃｔ；１（４）：３７４−８０に概説されている）、脂質コートナノバブル（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれるＵｎｇｅｒら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００４  Ｍａｙ  ７；５６（９）：１２９１−３１４）、デンドリマー、金属粒子（例えば、酸化鉄粒子または金粒子）およびシリカ粒子がこれに含まれる。
【００６２】
一実施形態では、ナノ粒子は平均直径が約１〜約１０００ｎｍである。別の実施形態では、ナノ粒子は平均直径が約２０〜約５００ｎｍである。別の実施形態では、ナノ粒子は平均直径が約５０〜約４００ｎｍである。別の実施形態では、ナノ粒子は平均直径が約７５ｎｍ〜約３００ｎｍである。また別の実施形態では、ナノ粒子は平均直径が約１００ｎｍ〜約２００ｎｍである。特定の実施形態では、リポソームはカチオン性脂質、アニオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質またはその組合せを含み得る。
【００６３】
本明細書で使用される「リポソーム」という用語は、脂質二重層（すなわち、ラメラ）で囲まれた任意の構造を指す。リポソームという用語は、大きさが約０．１μｍ〜約５μｍの多重膜小胞（ＭＬＶ）リポソーム、大きさが約０．０２μｍ〜約０．０５μｍの小さい一枚膜小胞（ＳＵＶ）リポソームおよび大きさが約０．０６μｍ以上の大きい一枚膜小胞リポソームを包含する。本明細書で使用される「多重膜」という用語は、脂質層を３層以上含む脂質構造を指す。したがって、「一枚膜」という用語は、脂質層を２層含む脂質構造、すなわち単一の脂質二重層を指す。一般に、水性環境中に存在する場合、脂質二重層を含む脂質の大部分の親水性部分（例えば、脂質極性頭部基）が構造の表面（すなわち、二重層の外面または内面）に位置し、脂質二重層を含む脂質の大部分の疎水性部分（例えば、飽和または不飽和炭化水素基）が二重層の内部に位置する。
【００６４】
本明細書で使用される「ミセル」という用語は、脂質単層に囲まれた任意の構造を指す。一般に、水性環境中に存在する場合、ミセルを含む脂質の大部分の親水性部分（例えば、脂質極性頭部基）が構造の表面に位置し、ミセルを含む脂質の大部分の疎水性部分（例えば、飽和または不飽和炭化水素基）が構造の内部に位置する。特定の実施形態では、リポソームが大きいミセルの内部に封入され得る。同様に、特定の実施形態では、ミセルが大きいリポソームの内部に封入され得る。
【００６５】
本明細書で使用される「マンノシル化リポソーム」という用語は、脂質二重層の外部に結合した１つまたは複数のマンノース残基、マンノース誘導体またはマンノース類似体を含むリポソームを指す。一実施形態では、マンノシル化リポソームは、１つまたは複数のマンノース残基、マンノース誘導体またはマンノース類似体と結合した脂質を含む。特定の実施形態では、マンノース残基、マンノース誘導体またはマンノース類似体は、一般に水性環境中に存在する脂質二重層の外側（例えば、リポソームの外面および／または内面）に位置する極性頭部基またはその他の脂質構造と結合している。好ましくは、マンノシル化リポソームと結合したマンノース残基、マンノース誘導体またはマンノース類似体の少なくとも一定の割合のものがリポソームの外部環境に露出し、例えば免疫細胞と相互作用することが可能である。一実施形態では、マンノシル化リポソームはモノ−マンノシル化脂質を含む。特定の実施形態では、モノ−マンノシル化脂質はＭａｎＤＯＧ脂質（全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＰｏｎｐｉｐｏｍ，Ｍ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２４，１３８８；およびＥｓｐｕｅｌａｓら．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ａｕｇ  ４；１３（１５）：２５５７−６０を参照されたい）。ＭａｎＤＯＧ脂質の構造は図３に示されている。別の実施形態では、マンノシル化リポソームは、テトラマンノシル−３−Ｌ−リジン−ジオレオイルグリセロール脂質（Ｅｓｐｕｅｌａｓら，上記）を含む。マンノース誘導体およびマンノース類似体の非限定的な例としては、１−デオキシマンノジリマイシン、メチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−フルオロ−マンノース（２−ＦＭ）および２−デオキシ−２−クロロ−マンノース（２−ＣＭ）が挙げられ、いずれも脂質と結合し得るものである。
【００６６】
特定の実施形態では、マンノシル化リポソームを含む脂質の少なくとも０．０１％が、少なくとも１つのマンノース残基と結合している。別の実施形態では、マンノシル化リポソーム含む脂質の少なくとも０．１％が、少なくとも１つのマンノース残基と結合している。別の実施形態では、マンノシル化リポソーム含む脂質の少なくとも１％が、少なくとも１つのマンノース残基と結合している。また別の実施形態では、マンノシル化リポソームを含む脂質の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が少なくとも１つのマンノース残基と結合している。
【００６７】
本明細書で使用される「脂質」という用語は、水性環境中で単層または二重層構造、例えばミセルまたはリポソームを形成することができる、疎水性または両親媒性分子を指す。脂質としては、特に限定されないが、脂肪、ロウ、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドおよびリン脂質が挙げられる。リポソームおよびミセルなどのナノ粒子を形成するのに使用する脂質をさらに修飾しても、標的化部分と結合させてもよい。脂質と結合させ得る標的化部分の非限定的な例としては、糖部分（例えば、マンノースまたは１つもしくは複数のマンノース残基を含む炭水化物）、ペプチド（例えば、細胞受容体リガンド）、ポリペプチド（例えば、抗体またはその機能的フラグメント）および核酸（例えば、アプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標））が挙げられる。
【００６８】
本明細書で使用される「コレステロール」という用語は、４つの融合環をもつ天然のステロイドアルコール（ステロール）のほか、その長鎖脂肪酸とのエステルおよび膜流動性を調節する能力を保持する類似体を指す。コレステロールおよびコレステロールエステルは、動物細胞の血漿リポタンパク質および外側細胞膜の成分であり、膜流動性を調節する能力がある。膜流動性を調節する能力を保持するコレステロール類似体は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｇｉｍｐｌ，Ｇ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１０９５９−１０９７４を参照されたい）、例えば、５−コレステン、５−プレグネン−３β−オール−２０−オン、４−コレステン−３−オンおよび５−コレステン−３−オンがこれに含まれる。コレステロールおよびコレステロール類似体は、ミセルまたはリポソームを形成している脂質単層または二重層内への流動性をさらに付与し得る広く知られた成分である。
【００６９】
本明細書で使用される「結合している（ｌｉｎｋｅｄおよびｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」という用語は互換的に使用され、２つの部分の間、例えば、治療剤とベクターまたは標的化部分との間の共有結合または非共有結合を指す。２つの部分の間に形成される結合は、本来必ずしも共有結合性であるわけではないが、この２つの部分の間の結合を維持するよう働く。２つの部分、例えば、ＭＢＰペプチドと標的化部分とを結合させるのに使用し得る結合の非限定的な例としては、共有結合性相互作用（すなわち、第一の部分と第二の部分との間で直接またはリンカー分子を介して形成される共有化学結合）；イオン性相互作用（例えば、第一の部分と第二の部分との間で直接またはリンカー分子を介して形成されるイオン結合）；静電的相互作用（例えば、２つの逆の電荷の引力）；疎水性相互作用；ファンデルワールス力を介して結びつく相互作用；および物理的な閉込め（例えば、積荷分子のナノ粒子内への封入または埋め込み）を介して結びつく相互作用が挙げられる。一実施形態では、ベクター（例えば、リポソーム）内に封入された積荷分子（例えば、ＭＢＰペプチド）とベクターの外部に係留された標的化部分（例えば、マンノース残基）が結合している。
【００７０】
本明細書で使用される「〜内に埋め込まれている」という用語はベクターに対する積荷分子の位置を指し、この場合、積荷分子はベクター構造の基質内に位置する。例えば、ペプチドまたはその一部分が脂質二重層（リポソーム）または単層（ミセル）内に位置する場合、そのペプチド積荷はリポソームまたはミセルベクター内に埋め込まれていると言う。ベクター内に埋め込まれている積荷分子は、例えば共有結合、イオン結合、静電的相互作用、疎水性相互作用または物理的な閉込めを介して、ベクター基質（例えば、ポリマー殻）またはベクター基質の亜成分（例えば、リポソームの脂質二重層に存在する脂質）と共有結合または非共有結合し得る。
【００７１】
本明細書で使用される「〜に封入されている」という用語はベクターに対する積荷分子の位置を指し、この場合、積荷分子はベクター構造の内側に囲まれているか、含まれている。例えば、ペプチドがリポソームの脂質二重層の内部に位置することによってリポソームの外側の環境から保護されている場合、そのペプチド積荷はリポソームベクターに封入されていると言う。ベクターに封入されている積荷分子は、例えば共有結合、イオン結合、静電的相互作用、疎水性相互作用または物理的な閉込めを介して、ベクター（例えば、ポリマー殻）またはベクター基質の亜成分（例えば、リポソームの脂質二重層に存在する脂質）と共有結合または非共有結合し得る。
【００７２】
特定の実施形態では、リポソームまたはミセルベクターの内部は水性環境を含む。その結果、ペプチドまたは核酸などの親水性の積荷が、部分的にまたは完全にベクターの内部に溶媒和され得る。他の実施形態では、リポソームまたはミセルベクターの内部は非水性環境を含んでもよく、例えば、極性溶媒からなるものであってよい。その結果、非極性小分子などの疎水性の積荷が、部分的にまたは完全にベクターの内部に溶媒和され得る。
【００７３】
本明細書で使用される「係留されている」という用語は、ベクターに対する積荷分子に位置を指し、この場合、積荷分子は１つまたは複数の場所でベクター構造と結合している。積荷分子の係留は、共有結合によって（例えば、化学結合を介して）または非共有結合によって（例えば、核酸ハイブリダイゼーションを介して）行われ得る。積荷分子は、ベクター（例えば、ポリマー殻）またはベクター基質の亜成分（例えば、リポソームの脂質二重層に存在する脂質）の外部または内部に係留され得る。結合点でベクター構造に係留されている積荷分子であれば、別の方法で空間の周囲を自由に動くことができる（例えば、別の方法でベクターの外部または内部の環境によって溶媒和される）。ベクターに係留されている積荷分子は、例えば共有結合、イオン結合、静電的相互作用または疎水性相互作用を介して、ベクター（例えば、ポリマー殻）またはベクター基質の亜成分（例えば、リポソームの脂質二重層に存在する脂質）と共有結合または非共有結合し得る。
【００７４】
本明細書で使用される「アプタマー」、「ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ（登録商標）」および「核酸リガンド」という用語は互換的に使用され、特定の標的と特異的に結合する非天然のオリゴヌクレオチド（通常、１５〜２５０ヌクレオチド長）を指す。アプタマーとは、標的分子（例えば、細胞表面マーカーまたは受容体）に対する特異性を付与する特異的二次構造を含む核酸のことである。アプタマーは、核酸と標的分子との間の親和性にさらに寄与する特異的な三次構造、場合によっては四次構造をさらに含み得る。適切な三次元構造で存在する場合、アプタマーは特定の標的と特異的に結合する。アプタマーは、天然の核酸（例えば、ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧ、ｒＡ、ｒＵ、ｒＣおよびｒＧ）のほかにも、非天然の核酸（例えば、ｄＵ、ｄＩ、ｒＴ、ｒＩ）および修飾核酸の配列を包含する。ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ（登録商標）とは、天然に存在するＤ−核酸ではなくＬ−核酸で形成されるアプタマーのことである。アプタマーおよびＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ（登録商標）はＬ−核酸とＤ−核酸の混合物を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原と免疫学的に反応するポリペプチドを指す。本明細書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、各種アイソタイプのインタクトな分子のほかにも、抗原結合能を有するフラグメント、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧを包含する。例えば、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＰｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）を参照されたい。この用語はほかにも、組換え一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を包含する。この用語はさらに、二価または二重特異性分子、ダイアボディ、トライアボディおよびテトラボディを包含する。二価および二重特異性分子は、例えば、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７；ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９３  Ｊｕｌ  １５；９０（１４）：６４４４−８；Ｇｒｕｂｅｒら，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５３６８；Ｚｈｕら，（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：７８１；Ｈｕら，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５に記載されている。抗体という用語はほかにも、例えばヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体を包含する。
【００７６】
「キメラ抗体」とは、（ａ）定常領域またはその一部分を改変、置換または交換して、抗原結合部位（可変領域）を異なるまたは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと結合させた免疫グロブリン分子；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部分を異なるまたは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変または置換するか、これと交換した免疫グロブリン分子のことである。
【００７７】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含む免疫グロブリン分子のことである。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置換したヒト免疫グロブリンを含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基で置換する。ヒト化抗体はほかにも、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にもみられない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてのまたは実質的にすべてのフレームワーク（ＦＲ）領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク（ＦＲ）領域である少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインを実質的にすべて含む。ヒト化抗体はほかに免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むものが最適である（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＪｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。ヒト化は基本的に、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＪｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従い、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で対応するヒト抗体の配列を置き換えることによって実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に全体には及ばないインタクトなヒト可変ドメインが、対応するヒト以外の種の対応する配列に置き換わったキメラ抗体である（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号）。
【００７８】
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、非標的分子に比して少なくとも２倍の親和性で特定の標的（例えば、細胞表面マーカーまたは受容体）と結合する分子（例えば、標的化部分）を指す。特定の実施形態では、分子は非標的分子に比して少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれ以上の親和性で特異的に結合する。
【００７９】
本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、造血系を起源とし免疫応答に何らかの役割を果たしている細胞を指す。免疫細胞としては、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄性細胞が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用される「Ｂ細胞」という用語は、ほとんどの哺乳動物の骨髄で産生され、体液性免疫系で機能するリンパ球を指す。Ｂ細胞は様々な発生段階で、前駆（またはプレプロ）Ｂ細胞；早期プロ（またはプレプロ）Ｂ細胞；後期プロ（またはプレプロ）Ｂ細胞；大型プレＢ細胞；小型プレＢ細胞；未熟Ｂ細胞；および成熟Ｂ細胞と呼ばれ、それぞれがＢ細胞という用語に包含される。Ｂ細胞と他のリンパ球（例えば、Ｔ細胞）とを識別するのに使用できる表現型細胞表面マーカーとしては、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ１９およびＣＤ２１が挙げられる。「Ｂ細胞」という用語は、プラズマＢ細胞、記憶Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、辺縁帯Ｂ細胞および濾胞Ｂ細胞を包含する。
【００８１】
本明細書で使用される「抗原提示細胞」および「ＡＰＣ」という用語は互換的に使用され、専門の抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）およびその他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト）を指す。
【００８２】
本明細書で使用される「細胞表面マーカー」、「細胞表面受容体」および「細胞表面分子」という用語は、細胞の表面に存在する抗原構造を指す。細胞表面抗原は、特に限定されないが、細胞特異的抗原、免疫細胞特異的抗原、Ｂ細胞特異的抗原、抗原提示細胞特異的抗原、リンパ球特異的抗原、多発性硬化症に関連する抗原、受容体（例えば、増殖因子受容体）、表面エピトープ、Ｔ細胞などの特異的免疫エフェクター細胞によって認識される抗原およびマクロファージ細胞またはナチュラルキラー細胞などの非特異的免疫エフェクター細胞によって認識される抗原であり得る。「細胞表面抗原」の例としては、特に限定されないが、ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ１６およびＣＤ５６）、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＣＲαβ、ＣＤ３およびＣＤ４）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＴＣＲαβ、ＣＤ３およびＣＤ８）、γδＴ細胞（例えば、ＴＣＲγδおよびＣＤ３）およびＢ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９およびＣＤ２１）の表現型マーカーが挙げられる。細胞表面分子にはほかにも、目的とする細胞の表面に存在する炭水化物、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質またはその他の任意の分子が含まれ得る。
【００８３】
本明細書で使用される「ミエリン塩基性タンパク質」および「ＭＢＰ」という用語は互換的に使用され、ヒトミエリン塩基性タンパク質遺伝子（ＭＢＰ；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４１５５）によってコードされるタンパク質を指す。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、選択的スプライシングからＭＢＰタンパク質のアイソフォームが多数生じ（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＨａｒａｕｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００９）Ｓｅｐ  １；４８（３４）：８０９４−１０４を参照されたい）、それぞれが「ミエリン塩基性タンパク質」という用語に包含される。７種類の代表的なＭＢＰ配列のアライメントを図１４に示す。本明細書で使用されるＭＢＰペプチドのアミノ酸番号付けは、成熟ミエリンにみられる主要なＭＢＰアイソフォーム（スプライスアイソフォーム５；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ番号：Ｐ０２６８６−５）で１７１アミノ酸からなる１８．５ｋＤａのタンパク質（配列番号１７）のアミノ酸配列を指す。
【００８４】
本明細書で使用される「多発性硬化症」および「ＭＳ」という用語は互換的に使用され、脳および脊髄の軸索を取り囲み脂質に富むミエリン鞘が損傷および／または枯渇し、脱髄および瘢痕化のほか、広範囲にわたる徴候および症状に至る炎症性疾患を指す（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＣｏｍｐｓｔｏｎおよびＣｏｌｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ．２００８  Ｏｃｔ  ２５；３７２（９６４８）：１５０２−１７を参照されたい）。再発寛解型（ＲＲＭＳ）、二次進行型（ＳＰＭＳ）、一次進行型（ＰＰＭＳ）および進行再発型（ＰＲＭＳ）を含めたＭＳの数種類のサブタイプが分類されており、それぞれが多発性硬化症という用語に包含される。
【００８５】
本明細書で使用される「患者」または「対象」という用語は互換的に使用され、治療を必要とするか求めている個体を指す。例えば、対象は多発性硬化症（ＭＳ）またはそのサブタイプであると診断されているか、同疾患の発症リスクがあるであると診断されている個体であり得る。多発性硬化症の患者は、ＭＳであると診断され、ＭＳの治療を受けているか、以前ＭＳの治療を受けたことがあるか、ＭＳの治療を受けたことがない個体、ＭＳ再発のリスクがある個体またはＭＳのリスクがある個体（例えば、ＭＳの遺伝的素因がある個体）を指す場合がある。
【００８６】
本明細書で使用される多発性硬化症の「治療（ｔｈｅｒａｐｙ、ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は互換的に使用され、ＭＳによって生じる望ましくない生理学的またはフィスコロジカル（ｐｈｙｓｃｏｌｏｇｉｃａｌ）な状態の何らかの緩和または改善を指す。例えば、知覚鈍麻、異常知覚、筋力低下、クローヌス、筋攣縮、麻痺、運動失調、構音障害、嚥下障害、眼振、視神経炎（例えば、光視症または複視）、疲労、急性または慢性疼痛、膀胱および腸障害、認知障害、抑うつ、ウートフ現象およびレルミット徴候の重症度または頻度の低減がある。一実施形態では、ＭＳのある患者の疾患進行および重症度の尺度として総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）を用いることができる（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＫｕｒｔｚｋｅ  ＪＦ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９８３；３３：１４４４−５２を参照されたい）。したがって、一実施形態では、治療は患者のＥＤＳＳを改善する行為を指す。
【００８７】
本明細書で使用される多発性硬化症の「予防」および「予防的治療」という用語は互換的に使用され、ＭＳのリスク、重症度または臨床症状の発症を軽減する治療的処置を指す。予防は部分的なものであっても、全面的なものであってもよい。部分的な予防により、ＭＳを発症するリスクまたはＭＳ再発を招くリスクのある患者の病状または症状の発症または進行の遅延がもたらされ得る。ＭＳの原因となる遺伝的要素は厳密には明らかにされていないが、多発性硬化症の発症のリスク増大と相関のある遺伝因子がいくつか特定されており、このような遺伝因子としては特に限定されないが、Ｈａｆｌｅｒ  ＤＡら（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＮ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７  Ａｕｇ  ３０；３５７（９）：８５１−６２）で特定されているＳＮＰ、例えば、ｒｓ３１３５３８８（Ａ対立遺伝子；ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子）、ｒｓ１２７２２４８９（Ｃ対立遺伝子；ＩＬ２ＲＡ遺伝子）、ｒｓ２１０４２８６（Ｔ対立遺伝子；ＩＬ２ＲＡ遺伝子）、ｒｓ６８９７９３２（Ｃ対立遺伝子；ＩＬ７Ｒ遺伝子）、ｒｓ６４９８１６９（Ｇ対立遺伝子；ＫＩＡＡ０３５０）、ｒｓ６６０４０２６（Ｃ対立遺伝子；ＲＰＬ５）、ｒｓ１０９８４４４７（Ａ対立遺伝子；ＤＢＣ１遺伝子）、ｒｓ１２０４４８５２（Ｃ対立遺伝子；ＣＤ５８遺伝子）、ｒｓ７５７７３６３（Ａ対立遺伝子；ＡＬＫ遺伝子）、ｒｓ７５３６５６３（Ａ対立遺伝子；ＦＡＭ６９Ａ遺伝子）、ｒｓ１１１６４８３８（Ｃ対立遺伝子；ＦＡＭ６９Ａ遺伝子）、ｒｓ１０９７５２００（Ｇ対立遺伝子；ＡＮＫＲＤ１５遺伝子）、ｒｓ１０７３５７８１（Ｇ対立遺伝子；ＥＶＩ５遺伝子）、ｒｓ６６８０５７８（Ｔ対立遺伝子；ＥＶＩ５遺伝子）、ｒｓ４７６３６５５（Ａ対立遺伝子；ＫＬＲＢ１遺伝子）、ｒｓ１２４８７０６６（Ｔ対立遺伝子；ＣＢＬＢ遺伝子）およびｒｓ１３２１１７２（Ｃ対立遺伝子；ＰＤＥ４Ｂ遺伝子）が挙げられる。
【００８８】
本明細書で使用される「投与量（ｄｏｓｅおよびｄｏｓａｇｅ）」という用語は互換的に使用され、単一の時点で投与する有効成分の量を指す。本発明の文脈においては、投与量は対象に投与するＭＢＰペプチドを指す場合がある。投与量はほかにも、対象に投与するＭＢＰペプチドのベクター製剤、例えば、１つのＭＢＰペプチドまたはＭＢＰペプチドの組合せのリポソーム製剤の量を指す場合がある。患者に投与する量は、投与頻度、病態（例えば、多発性硬化症）の重症度、病態のサブタイプ（例えば、再発寛解型ＭＳ、二次進行型ＭＳ、一次進行型ＭＳおよび進行再発型ＭＳ）、病態の段階（例えば、初回発作、再発および寛解）、対象の大きさおよび耐容性、用いる投与経路、副作用のリスク、有害な薬物相互作用のリスクならびに以前の治療に対する奏効を含めた多数の因子によって異なり、ここに挙げた因子はいずれも、熟練した医師であれば容易に判定できるものである。「剤形」という用語は、特定の形式の医薬品、例えば、皮下投与のための液剤やデポによる放出制御のためのゲル剤を指す。
【００８９】
本明細書で使用される「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅおよびｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」という用語は互換的に使用され、投与の目的となる効果が得られる投与量を指す。正確な投与量は治療の目的によって決まり、当業者が既知の技術を用いて確認することができる（例えば、Ａｕｇｓｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈｏａｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（第１〜３巻，第３版，２００８）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（第３版，２００８）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（第８版，２００７）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，２００５，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【００９０】
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、治療剤と、任意選択で、ベクター、標的化部分、緩衝剤、塩、保存剤（例えば、抗酸化剤または抗菌剤）、浸透圧剤、増量剤、および特定の投与経路を介して治療剤を送達するのに適した他の任意の添加剤または担体のうちの１つまたは複数とを含有し、対象に投与するのに適した製剤を指す。
【００９１】
本明細書で使用される「対照」という用語は、試験結果、例えば特定の治療によって得られる治療利益を比較するための参照として用いる試料、レベルまたは表現型の結果を指す。対照という用語は、陽性対照（例えば、所与の治療法で予想される値または結果）および陰性対照（例えば、治療を実施しない場合に予想される値または結果）をともに包含する。
【００９２】
陽性対照は、病状または症状に有益な効果をもたらすことがわかっている治療剤の投与によって得られる結果を指す場合がある。例えば、ＭＳであると診断された対象またはＭＳの動物モデルにコパキソンを投与することによって得られる結果を実験的ＭＳ治療の陽性対照として用いる場合がある。この意味において、コパキソンの投与によって得られる結果と同等かこれより良好な転帰が得られる実験的治療であれば、ＭＳ治療の優れた候補であると考えられる。
【００９３】
陰性対照は、病状または症状の治療を実施せずに得られる結果を指す場合がある。例えば、ＭＳであると診断された対象またはＭＳの動物モデルへの水または何も含まないベクターの投与を実験的ＭＳ治療の陰性対照として用いる場合がある。この意味において、陰性対照で得られる結果と同等の結果が得られる実験的治療であれば、ＭＳ治療の優れた候補であるとは考えられない。これに対して、陰性対照で得られる結果よりも良好な転帰が得られる実験的治療であれば、ＭＳ治療の優れた候補であると考えられる。
【００９４】
本明細書で使用される「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、特に明示されないかぎり、天然ヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの既知の類似体を含むポリヌクレオチドを包含する。核酸分子がＤＮＡ配列で表される場合、「Ｔ」（チミジン）が「Ｕ」（ウリジン）に置き換わった対応するＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子もこれに含まれることが理解されよう。
【００９５】
本明細書で使用される「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、４つ以上のアミノ酸残基からなるポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーおよび天然のアミノ酸ポリマーに適用される。「組換えペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子由来のペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現によって生成するペプチドを指す。
【００９６】
本明細書で使用される「合成ペプチド」という用語は、化学的手段、例えば、液相または固相ペプチド合成法によって作製されるペプチドを指す。合成ペプチドには、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーおよび天然のアミノ酸ポリマーが含まれる。
【００９７】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を含めた天然および非天然アミノ酸を指す。天然アミノ酸には、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸のほかにも、後で修飾された天然アミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、５−ヒドロキシトリプトファン、ランチオニンが含まれる。天然アミノ酸には、例えば、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸が含まれ得る。本明細書で使用されるアミノ酸にはこのほか、非天然アミノ酸が含まれ得る。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合した任意の炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体はＲ基が修飾されていたり（例えば、ノルロイシン）、ペプチド骨格が修飾されていたりするが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。本明細書では、アミノ酸を一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する１文字記号で表す場合がある。
【００９８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸を変化、付加または欠失させる、核酸またはペプチド配列への置換、欠失または付加がそれぞれ、その変化がアミノ酸から化学的に同等なアミノ酸への置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に同等なアミノが記載された保存的置換の表が当該技術分野で周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられるものであり、これを排除するものではない。
【００９９】
以下に挙げる８つの各グループには互いに保存的置換となるアミノ酸が含まれる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい。
【０１００】
本明細書で使用される「同一」および「同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列に言及するのに使用される場合、最も対応するよう整列させたときに一致する配列中の残基を指す。ペプチドに関して配列同一性の百分率を用いる場合、同一ではない１つまたは複数の残基の位置が、第一のアミノ酸残基が同等の電荷または疎水性もしくは親水性などの同等の化学的特性を有する別のアミノ酸残基に対して置換されるため実質的にはペプチドの機能的特性が変化しない保存的アミノ酸置換によって異なるものであり得ることが認識される。保存的置換でペプチド配列が異なる場合、パーセント配列同一性を上方に調整して、置換の保存的性質を補正することができる。このような調整は周知の方法を用いて、例えば、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングすることにより百分率配列同一性を増大させて実施することがでる。したがって、例えば、同一のアミノ酸にスコア１を与え、非保存的置換にスコア０を与える場合、保存的置換には０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアの計算は、任意の周知のアルゴリズムを用いて実施することができる（例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７，１９８８；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４，１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−１０８９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．８：１５５−１６５，１９９２；Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：３０７−３３１，１９９４）を参照されたい。このほか、単純な目視と手作業による配列の整列とによりアライメントを実施することができる。
【０１０１】
ペプチド配列中の単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸（例えば、１５％未満、１０％未満または５％未満）を変化させる、付加するまたは削除する置換、欠失または付加については、変化がアミノ酸から化学的に同等なアミノ酸への置換をもたらす限り、保存的に修飾された変異体と見なされ得ることが認識されよう。
【０１０２】
機能的に同等なアミノ酸を与える保存的アミノ酸置換は当該技術分野で周知である。特定のアミノ酸の機能、すなわち、触媒的に重要であるか、構造的に重要であるか、立体的に重要であるかによって、様々なアミノ酸の分類が互いに保存的置換であると見なされ得る。アミノ酸の電荷および極性、アミノ酸の疎水性、アミノ酸の表面露出／構造的性質ならびにアミノ酸の二次構造の傾向に基づいて保存的置換であると見なされるアミノ酸の分類を表１に示す。
【０１０３】
【表１】
0006014241.tif 000002
【０１０４】
２つ以上のアミノ酸配列または２つ以上のヌクレオチド配列が、所与の比較範囲にわたって互いにまたは参照配列と少なくとも６０％の配列同一性を共有する場合、そのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は「実質的に同一である」と見なされる。したがって、実質的に同一である配列には、例えば、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列相同性、少なくとも８０％の配列相同性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列が含まれる。特定の実施形態では、実質的に同一である配列は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、配列は６０％〜９５％の配列同一性を共有する。別の実施形態では、配列は６５％〜９０％の配列同一性を共有する。別の実施形態では、配列は７０％〜８５％の配列同一性を共有する。また別の実施形態では、配列は６５％〜９５％の配列同一性、７０％〜９５％の配列同一性、７５％〜９５％の配列同一性、８０％〜９５％の配列同一性、８５％〜９５％の配列同一性または９０％〜９５％の配列同一性を共有する。
【０１０５】
特定の実施形態では、２つのポリペプチドが治療利益をもたらすのに効果的な同一のまたはほぼ同一のコアペプチド配列を共有する場合、その２つのポリペプチドは実質的に同一であると見なされる。例えば、第一のコアペプチド配列が、上流（すなわち、コア配列のＮ末端側）または下流（すなわち、コア配列のＣ末端側）に位置する追加のアミノ酸の存在に関係なく治療利益をもたらす場合、第一のコアペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を共有する第二のコアペプチド配列を含むポリペプチドは、実質的に同一であると見なされ得る。このことは、ポリペプチド配列全体が参照配列と少なくとも８０％の同一性を共有しない場合にも当てはまる。例えば、アミノ酸配列：（Ｒ１）ａ−Ｐ１−（Ｒ２）ｂおよび（Ｒ３）ｃ−Ｐ２−（Ｒ４）ｄを有する２つの治療用ポリペプチドであれば、（ｉ）Ｐ１とＰ２が少なくとも８０％同一であり、かつ（ｉｉ）Ｐ１とＰ２がＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のアミノ酸配列に関係なく、必要とする対象に治療利益を十分にもたらす場合、実質的に同一であると見なされ得る。
【０１０６】
特定の実施形態では、実質的に同一であるコアペプチド配列は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、コアペプチド配列は少なくとも８５％の配列同一性（すなわち、８５％〜１００％の同一性）を共有する。別の特定の実施形態では、コアペプチド配列は少なくとも９０％の配列同一性（すなわち、９０％〜１００％の同一性）を共有する。別の特定の実施形態では、コアペプチド配列は少なくとも９５％の配列同一性（すなわち、９５％〜１００％の同一性）を共有する。また別の特定の実施形態では、コアペプチド配列は、比較する２つのポリペプチドの全体の配列同一性に関係なく１００％の配列同一性を共有する。一実施形態では、コアペプチド配列は６０％〜９５％の配列同一性を共有する。別の実施形態では、コアペプチド配列は６５％〜９０％の配列同一性を共有する。別の実施形態では、コアペプチド配列は７０％〜８５％の配列同一性を共有する。また別の実施形態では、コアペプチド配列は６５％〜９５％の配列同一性、７０％〜９５％の配列同一性、７５％〜９５％の配列同一性、８０％〜９５％の配列同一性、８５％〜９５％の配列同一性または９０％〜９５％の配列同一性を共有する。
【０１０７】
本明細書で使用される「比較範囲」という用語は、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列同一性または類似性の比較の対象となる一続きの隣接するアミノ酸またはヌクレオチドを指す。治療用ペプチドでは、比較範囲は約５アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、比較範囲は約５アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さであり得る。さらに別の実施形態では、比較範囲は約１０〜約２０アミノ酸の長さであり得る。比較するポリペプチドの長さなどの因子に応じて、比較範囲は、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０アミノ酸またはそれ以上の長さであり得る。特定の実施形態では、比較範囲は参照アミノ酸配列の全長である。
【０１０８】
配列のアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４の類似性検索法、上に挙げたアルゴリズムのコンピュータによる遂行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）または目視によって実行することができ、選択した様々な方法によって最適アライメント（すなわち、比較範囲にわたって相同性の百分率が最も高くなるアライメント）が得られる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのによく適している（開示全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ．２１５：４０３−４１０，（１９９０））。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを組み込んだいくつかのソフトウェアプログラムが米国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手可能である。このプログラムにはｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｘおよびＰＳＩ−ｂｌａｓｔソフトウェアプログラムが含まれている。
【０１０９】
ＩＩＩ．ＭＢＰペプチド
Ａ．諸言
一態様では、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）の再発を治療または予防するのに有用なミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のペプチドを提供する。図１Ｃに示される通り、ＭＳのＥＡＥ誘導ＤＡラットモデルに、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）であると診断されたヒト患者のＭＢＰに対する免疫応答と相関があるＭＢＰの２つの免疫優性領域、ＭＢＰ（４３−６４）およびＭＢＰ（１１５−１７０）が同定された。ＥＡＥ誘導ＤＡラットモデルでこの２つの領域に対するポリクローナルＩｇＧ自己抗体が生成することが明らかになり（図２）、両領域がＭＳの病理に重要なＢ細胞エピトープを含むことが示唆された。したがって、この２つの領域の一部分または全体を含むペプチドがＭＳの治療または予防に有用であると考えられる。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドはＢ細胞エピトープを含む。
【０１１０】
本発明の一態様では、同定されたＭＢＰの免疫優性領域と同一または実質的に同一であるアミノ酸配列を含むペプチドをＭＳの治療に提供する。特定の実施形態では、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含むＭＢＰペプチドをＭＳの治療に提供する。ＭＢＰペプチドは一般に、６〜１００アミノ酸の長さからなる。一実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜５０アミノ酸の長さからなる。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜２５アミノ酸の長さからなる。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のアミノ酸からなる。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜４０アミノ酸の長さからなる。
【０１１１】
一実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも１０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも１５個のアミノ酸を含む。他の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個または２２個のアミノ酸を含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。一実施形態では、ＭＢＰペプチドは、標的化部分を含んでいても含んでいなくてもよいベクターと結合している。特定の実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１１２】
別の態様では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する６〜２５個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する１０〜２０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する６〜４０個、６〜３５個、６〜３０個または６〜２０個のアミノ酸を含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する６〜２０個、６〜１８個、６〜１６個、６〜１４個、６〜１２個、６〜１０個または６〜８個のアミノ酸を含む。一実施形態では、ＭＢＰペプチドはベクターと結合している。特定の実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列：ＧＧＤＲＧＡＰＫＲＧＳＧＫＤＳＨＨ（ＭＢＰ（４６−６２）；配列番号１）を含む。一実施形態では、ＭＢＰ（４６−６２）はベクターと結合している。特定の実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１１４】
別の特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列：ＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫ（ＭＢＰ（１２４−１３９）；配列番号２）を含む。一実施形態では、ＭＢＰ（１２４−１３９）はベクターと結合している。特定の実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１１５】
別の特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列：ＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ（ＭＢＰ（１４７−１７０）；配列番号３）を含む。一実施形態では、ＭＢＰ（１４７−１７０）はベクターと結合している。特定の実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１１６】
Ｂ．アミノ酸置換
本明細書に提供されるＭＢＰペプチドは、野生型ＭＢＰ配列（配列番号１７）に対して１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含み得る。一実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。例えば、同等の疎水性を有するアミノ酸（例えば、ＬｅｕとＩｌｅ）であれば互いに容易に置換し得る。アミノ酸の電荷および極性、アミノ酸の疎水性、アミノ酸の表面露出／構造的性質ならびにアミノ酸の二次構造の傾向に基づいて保存的置換であると見なされるアミノ酸の分類が表１に示されている。別の実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換ではない。
【０１１７】
一実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸のペプチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸のペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸のペプチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸のペプチド配列と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号１を少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号１と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号２と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、配列番号３と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
Ｃ．ペプチド隣接領域
Ｂ細胞リンパ球、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、様々なタイプのＴ細胞を刺激するために外来抗原（例えば、病原体感染症に応答した場合）または自己抗原（例えば、自己免疫疾患の場合）を内部に取り込み、処理し、処理済みのこれらの抗原を提示することによって、免疫応答を刺激する。理論に束縛されるものではないが、ＡＰＣは大きい抗原を内部に取り込み、Ｔ細胞機構によって認識されるより小さい抗原ペプチドに処理することができるため、ＭＢＰ（４３−６４）またはＭＢＰ（１１５−１７０）の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含むものとして本明細書に記載されるＭＢＰペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に追加のアミノ酸、すなわち隣接残基を有し得る。
【０１２２】
ＭＢＰの隣接残基は、野生型ＭＢＰタンパク質中に存在する天然の隣接領域（例えば、ＭＢＰ残基４３および１１５のＮ末端側のアミノ酸ならびに／またはＭＢＰ残基６４および１７０のＣ末端側のアミノ酸）を含み得るか、外来性の配列またはランダムな配列を含み得る。一実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端隣接残基はＭＢＰペプチドに有益な特性を付与し得る。例えば、隣接アミノ酸残基は、ペプチドを安定化させる；特定の細胞内もしくは細胞外の位置にペプチドを標的化する；ペプチドのベクター付加特性を改善する；または免疫細胞（例えば、Ｂ細胞もしくはＡＰＣ）の抗原処理もしくは提示を改善もしくは指令するものであり得る。
【０１２３】
一実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜５０個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜２５個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜１０個の追加のアミノ酸をさらに含む。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個またはそれ以上の追加のアミノ酸をさらに含む。
【０１２４】
特定の実施形態では、配列：ＧＧＤＲＧＡＰＫＲＧＳＧＫＤＳＨＨ（ＭＢＰ（４６−６２）；配列番号１）を含むＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜５０個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰ（４６−６２）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜２５個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰ（４６−６２）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜１０個の追加のアミノ酸をさらに含む。また別の実施形態では、ＭＢＰ（４６−６２）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個またはそれ以上の追加のアミノ酸をさらに含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、配列：ＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫ（ＭＢＰ（１２４−１３９）；配列番号２）を含むＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜５０個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰ（１２４−１３９）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜２５個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰ（１２４−１３９）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜１０個の追加のアミノ酸をさらに含む。また別の実施形態では、ＭＢＰ（１２４−１３９）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個またはそれ以上の追加のアミノ酸をさらに含む。
【０１２６】
特定の実施形態では、配列：ＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ（ＭＢＰ（１４７−１７０）；配列番号３）を含むＭＢＰペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜５０個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰ（１４７−１７０）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜２５個の追加のアミノ酸をさらに含む。別の実施形態では、ＭＢＰ（１４７−１７０）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１〜１０個の追加のアミノ酸をさらに含む。また別の実施形態では、ＭＢＰ（１４７−１７０）ペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個またはそれ以上の追加のアミノ酸をさらに含む。
【０１２７】
本明細書に提供されるＭＢＰペプチドは、コアペプチド配列（Ｐｘ）、任意選択のＮ末端隣接配列（Ｒｎ）および任意選択のＣ末端隣接配列（Ｒｃ）で表され得る。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドのＰｘ、ＲｎおよびＲｃ部分のアミノ酸の総数は２５０個未満である。別の実施形態では、アミノ酸の総数は１００個未満である。別の実施形態では、アミノ酸の総数は５０個未満である。また別の実施形態では、アミノ酸の総数は２５０個、２４０個、２３０個、２２０個、２１０個、２００個、１９０個、１８０個、１７０個、１６０個、１５０個、１４５個、１４０個、１３５個、１３０個、１２５個、１２０個、１１５個、１１０個、１０５個、１００個、９９個、９８個、９７個、９６個、９５個、９４個、９３個、９２個、９１個、９０個、８９個、８８個、８７個、８６個、８５個、８４個、８３個、８２個、８１個、８０個、７９個、７８個、７７個、７６個、７５個、７４個、７３個、７２個、７１個、７０個、６９個、６８個、６７個、６６個、６５個、６４個、６３個、６２個、６１個、６０個、５９個、５８個、５７個、５６個、５５個、５４個、５３個、５２個、５１個、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個または７個未満である。一実施形態では、アミノ酸の総数は６〜２５０個である。別の実施形態では、アミノ酸の総数は６〜１００個である。別の実施形態では、アミノ酸の総数は６〜５０個である。また別の実施形態では、アミノ酸の総数は１０〜２５０個、１０〜１００個、１０〜５０個、１５〜２５０個、１５〜２００個、１５〜１７５個、１５〜１５０個、１５〜１２５個、１５〜１００個、１５〜９０個、１５〜８０個、１５〜７５個、１５〜７０個、１５〜６５個、１５〜６０個、１５〜５５個、１５〜５０個、１５〜４５個、１５〜４０個、１５〜３５個、１５〜３０個、１５〜２５個または１５〜２０個である。
【０１２８】
一実施形態では、コアペプチド配列（Ｐｘ）は、ＭＢＰ（４３−６４）またはＭＢＰ（１１５−１７０）の連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくはＭＢＰ（４６−６２）、ＭＢＰ（１２４−１３９）またはＭＢＰ（１４７−１７０）の連続する少なくとも６個のアミノ酸と同一または実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、Ｐｘは、配列番号１〜３のうちの１つと少なくとも６０％、６５、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１２９】
一実施形態では、ＲｎおよびＲｃはそれぞれ、１〜２５０アミノ酸である。特定の実施形態では、ＲｎとＲｃとの組合せが１〜２５０アミノ酸である。一実施形態では、ＭＢＰペプチドは、Ｎ末端隣接領域（Ｒｎ）およびＣ末端隣接領域（Ｒｃ）の両方を有する。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドはＮ末端隣接領域（Ｒｎ）を有するが、Ｃ末端隣接領域（Ｒｃ）は有さない。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドはＣ末端隣接領域（Ｒｃ）を有するが、Ｎ末端隣接領域（Ｒｎ）は有さない。
【０１３０】
Ｄ．ペプチド合成
本明細書に開示されるＭＢＰペプチドを任意の適切な方法、例えば、固相ペプチド合成法を含めた固相合成法により合成することができる。ペプチドを合成する従来の固相法では、結晶化状態で調製するか、新たに溶液で調製したＮ−アルファ−保護アミノ酸無水物から出発し、Ｎ末端への連続的なアミノ酸付加に使用する。各残基の付加では、伸長する（固体担体上の）ペプチドを酸で処理してＮ−アルファ−保護基を除去し、数回洗浄して残留する酸を除去し、ペプチド末端と反応媒体との接触を促進する。次いで、ペプチドと活性化したＮ−保護アミノ酸対称無水物とを反応させ、固体担体を洗浄する。各残基付加段階では、合計２つまたは３つ別々の付加反応でアミノ酸付加反応をを繰り返して、反応する伸長ペプチド分子の割合を増大させることができる。通常、最初の１２残基の付加に１〜２回の反応サイクルを用い、残りの残基に２〜３回の反応サイクルを用いる。
【０１３１】
ペプチド鎖の伸長が完了した後、保護ペプチドレジンを液体のフッ化水素酸またはトリフルオロ酢酸などの強酸で処理して脱ブロックし、担体からペプチドを遊離させる。アミド化ペプチドを調製するには、ペプチドがレジンから切断された後にＣ末端アミドが付加されるよう、合成に使用するレジン担体を選択する。強酸を除去した後、ペプチドを１Ｍ酢酸溶液中に抽出し、凍結乾燥させ得る。ゲルろ過による最初の分離でペプチドを単離してペプチド二量体および高分子量ポリマーを除去し、また望ましくない塩を除去することもできる。部分的に精製されたペプチドを分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーによってさらに精製し、アミノ酸組成分析、質量分析および分析用ＨＰＬＣ（例えば、２つの異なる溶媒系で実施する）によってペプチドの純度および同一性を確認することができる。
【０１３２】
同様に、本明細書に開示されるＭＢＰペプチドを、適切な宿主細胞での発現およびそれに続く細胞培養物から精製によって調製することができる。ペプチド発現のための多数の系が当該技術分野で公知である。適切な宿主株の例としては、特に限定されないが、真菌または酵母種、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）など；細菌種、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）；ヒト細胞系、ハムスター細胞系およびげっ歯類細胞系などの哺乳動物細胞；ならびにバキュロウイルスベースの発現系などの昆虫細胞系が挙げられる。
【０１３３】
ＩＶ．ＭＢＰペプチドベクター
Ａ．諸言
本発明のＭＢＰペプチドは、必要とする対象に投与するためにベクターと結合させる。しかるべきベクターの選択は多数の因子、例えば、用いる具体的な投与経路、送達するペプチドの量、投与頻度、以前の治療の効果、治療する疾患または症状の重症度および対象の疾患の現時点での段階に基づくものとなる。
【０１３４】
ＭＢＰペプチド積荷はベクターと共有結合または非共有結合で結合し得る。例えば、ＭＢＰペプチドは共有結合、イオン結合、静電的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力を介してベクターと結合していても、ベクター内に埋め込まれていても、ベクターに係留されていても、ベクターに物理的に閉じ込められていてもよい。
【０１３５】
一実施形態では、ＭＢＰペプチドと結合するベクターはナノ粒子である。ナノ粒子の非限敵的な例としては、リポソーム、ミセル、ブロックコポリマーミセル、ポリマーソーム、ニオソーム、脂質コートナノバブル、デンドリマー、金属粒子（例えば、酸化鉄粒子または金粒子）およびシリカ粒子が挙げられる。ペプチド積荷はナノ粒子ベクターに封入されていても、ナノ粒子ベクター内に埋め込まれていても、ナノ粒子ベクターの表面にあっても、ノ粒子ベクターに係留されていてもよい。
【０１３６】
治療剤の送達にナノ粒子を使用することには、治療剤単独で投与することに比べていくつかの利点がある。例えば、ナノ粒子を用いて、天然のペプチドまたはポリヌクレオチドなど、そのままでは不安定な治療剤を細胞内および／または細胞外での損傷から保護することができる。ナノ粒子はほかにも、治療剤によって引き起こされる毒性作用を低減または除去するよう機能し得る。したがって、ナノ粒子製剤を用いれば、潜在的に有害なまたは毒性のある治療剤の投与量を多くして送達することができる。
【０１３７】
ナノ粒子を水溶性または高分子量の非免疫原性ポリマーと結合させて、リポソームの血清中半減期を延ばすことができる（例えば、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０１３，５５６号、同第５，６７６，９７１号および同第６，１３２，７６３号を参照されたい）。適切な水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリ（アルキレングリコール）、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなど、ポリ（ポリオキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖類、例えばポリシアル酸またはカルボキシメチルセルロース、デキストラン、デンプンもしくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などのデンプン誘導体、ヒアルロン酸およびキチンなど、ポリ（メタ）アクリラートならびに上記ポリマーの任意の組合せが挙げられる。
【０１３８】
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドベクターはさらに標的化部分と結合している。他の実施形態では、ＭＢＰペプチドと結合しているベクターは標的化部分である。特定の実施形態では、標的化部分は、（ｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）への送達を増大させ；かつ／または（ｉｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）内への取込みを増大させる。特定の実施形態では、標的化部分は、あるクラスまたはタイプの細胞、例えば、特定の細胞表面抗原を含む免疫細胞と特異的に結合する。
【０１３９】
Ｂ．リポソーム
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドベクターはリポソームである。治療剤の送達でのリポソームの使用は当該技術分野で周知である（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＣｈｒａｉ，Ｒ．ＭｕｒａｒｉおよびＩ．Ａｈｍａｄ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（概説）．Ｐａｒｔ  ｔｗｏ：Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．ＢｉｏＰｈａｒｍ．１５（１）：４０，４２−４３，４９（２００２）を参照されたい）。
リポソーム組成物の例としては、米国特許第４，９８３，３９７号、同第６，４７６，０６８号、同第５，８３４，０１２号、同第５，７５６，０６９号、同第６，３８７，３９７号、同第５，５３４，２４１号、同第４，７８９，６３３号、同第４，９２５，６６１号、同第６，１５３，５９６号、同第６，０５７，２９９号、同第５，６４８，４７８号、同第６，７２３，３３８号および同第６，６２７２１８号；米国特許出願公開第２００３／０２２４０３７号、同第２００４／００２２８４２号、同第２００１／００３３８６０号、同第２００３／００７２７９４号、同第２００３／００８２２２８号、同第２００３／０２１２０３１号、同第２００３／０２０３８６５号、同第２００４／０１４２０２５号および同第２００４／００７１７６８号；国際公開第００／７４６４６号、同第９６／１３２５０号および同第９８／３３４８１号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｌｕｌｏｓ  Ｄ．ら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９１）８８：１１４６０−１１４６４）、ＡｌｌｅｎおよびＭａｒｔｉｎ（Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００４）３１：５−１５（ｓｕｐｐｌ  １３））およびＷｅｉｓｓｉｇら（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９８）１５：１５５２−１５５６）が挙げられ、上記参考文献は、その内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、リポソームはリン脂質、例えばホスファチジルコリンを含む。リン脂質は天然であっても、半合成であっても、合成であってもよい。いくつかの実施形態では、リン脂質は非天然ホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、リン脂質はカチオン性である。他の実施形態では、リン脂質はアニオン性である。また別の実施形態では、リン脂質は中性である。例示的なリン脂質としては、特に限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロールが挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、リン脂質はホスファチジルコリンである。ホスファチジルコリンの非限定的な例としては、２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−１−ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）および水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）が挙げられる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、リポソームはカチオン性脂質を含む。本明細書で使用されるカチオン性脂質は、少なくとも１つ、最も典型的には２つの脂肪酸鎖と、正に帯電した極性頭部基とからなる分子を指す。典型的なカチオン性脂質はドデシル（Ｃ１２）またはヘキサデシル（セチル、Ｃ１６）脂肪酸鎖を有するが、「カチオン性脂質」という用語はほかにも、他の長さの脂肪酸鎖を有する脂質を包含するものとする。カチオン性脂質の非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＴＭＡ（［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアヌノニウム（ａｎｕｎｏｎｉｕｍ）クロリド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＤＡＢ（ジオクタデシルジアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（ジオクタデシルジアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−Ｎ−Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ−（ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル）、ＤＯＩＣ（１−［２−（オレオイルオキシ）−エチル］−２−オレオイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド）、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）およびＤＭＲＩＥ（ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）が挙げられる。
【０１４３】
特定の実施形態では、リポソームは、リポソームの脂質二重層に流動性をさらに付与するコレステロール、コレステロール類似体および／またはコレステロール誘導体をさらに含む。本明細書に提供されるリポソームに使用し得るコレステロール類似体および誘導体の非限定的な例としては、５−コレステン、５−プレグネン−３β−オール−２０−オン、４−コレステン−３−オンおよび５−コレステン−３−オンが挙げられる。特定の実施形態では、コレステロールは、リポソーム中に約０．０１ｍｏｌ％〜約２５ｍｏｌ％の濃度で存在する。特定の実施形態では、コレステロールは、リポソーム中に約０．１ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％の濃度で存在する。また別の実施形態では、リポソーム中のコレステロールの濃度は約０．０１ｍｏｌ％、０．０２ｍｏｌ％、０．０３ｍｏｌ％、０．０４ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％、０．０６ｍｏｌ％、０．０７ｍｏｌ％、０．０８ｍｏｌ％、０．０９ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、１６ｍｏｌ％、１７ｍｏｌ％、１８ｍｏｌ％、１９ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２１ｍｏｌ％、２２ｍｏｌ％、２３ｍｏｌ％、２４ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％またはそれ以上である。
【０１４４】
特定の実施形態では、リポソームは標的化部分と結合した脂質を含む。リポソームの形成に使用する脂質と結合し得る標的化部分の非限定的な例としては、糖部分（例えば、マンノースまたは１つもしくは複数のマンノース残基を含む炭水化物あるいはその類似体もしくは誘導体）、ペプチド（例えば、細胞受容体リガンド）、ポリペプチド（例えば、抗体またはその機能的フラグメント）および核酸（例えば、アプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標））が挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、標的化部分と結合した脂質は、リポソームの総脂質含有量の少なくとも０．０１％の最終濃度で含まれる。別の実施形態では、標的化部分と結合した脂質のリポソーム中の濃度は、総脂質含有量の少なくとも０．１％である。別の実施形態では、標的化部分と結合した脂質のリポソーム中の濃度は、総脂質含有量の少なくとも１％である。別の実施形態では、標的化部分と結合した脂質の濃度は、リポソームの総脂質含有量の少なくとも５％または少なくとも１０％である。また別の実施形態では、標的化部分と結合した脂質の濃度は、リポソームの総脂質含有量の約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％である。
【０１４６】
特定の実施形態では、リポソームは１つまたは複数のマンノース残基と結合した脂質を含む（すなわち、マンノシル化リポソーム）。マンノシル化脂質の非限定的な例としては、ＭａｎＤＯＧ脂質（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＥｓｐｕｅｌａｓら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ａｕｇ  ４；１３（１５）：２５５７−６０，）、テトラマンノシル−３−Ｌ−リジン−ジオレオイルグリセロール脂質（Ｅｓｐｕｅｌａｓら，上記）およびマンノシル化ホスファチジルイノシトール（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＢａｒｒａｔｔら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ，８６２：１５３−１６４）が挙げられる。
【０１４７】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるリポソームは、平均直径が約５０〜約５００ｎｍである。例えば、リポソームの平均直径は約５０〜約４００ｎｍ、約５０〜約３００ｎｍ、約５０〜約２５０ｎｍ、約５０〜約２２５ｎｍ、約５０〜約２００ｎｍ、約５０〜約１７５ｎｍ、約７５〜約５００ｎｍ、約７５〜約４００ｎｍ、約７５〜約３００ｎｍ、約７５〜約２５０ｎｍ、約７５〜約２２５ｎｍ、約７５〜約２００ｎｍ、約１００〜約５００ｎｍ、約１００〜約４００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１００〜約２５０ｎｍ、約１００〜約２２５ｎｍ、約１００〜約２００ｎｍであり得る。特定の実施形態では、リポソームの平均直径は約１００ｎｍ〜約２００ｎｍである。
【０１４８】
リポソームは、押出し、逆相蒸発、超音波処理、攪拌および水溶液中での自己集合を含めた当該技術分野で周知の多数の技術によって作製することができる（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｃｈｉｌｉｎ  ＶＰ，Ｗｅｉｓｓｉｇ  Ｖ（２００３）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ  ２６４，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙを参照されたい）。さらに、リポソームを作製する方法をリポソームに封入された積荷の組成物の作製にも用い得ることがよく知られている。
【０１４９】
リポソーム組成物を調製する方法の非限定的な例が、国際公開第１９９９／６５４６５号および同第２０１０／０５２３２６号；米国特許第７，３８１，４２１号、同第７，６０４，８０３号、同第８，０７５，８９６号、同第７，７９０，６９６号、同第７，３８４，９２３号、同第７，００８，７９１号ならびに米国特許出願公開第２００９／００６８２５４号および同第２００８／０３１７８３８号（いずれも内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ペプチド（１つまたは複数）のリポソーム組成物を形成するための例示的なスキームは以下の５段階の方法からなる：段階１）有機溶媒（クロロホルム中の脂質）の蒸発によって、乾燥した不規則な脂質層を形成する；段階２）乾燥した不規則な脂質層を再水和して多層ＭＬＶリポソームを形成する；段階３）高圧ホモジナイゼーションによってＭＬＶリポソームからＳＵＶリポソームを作製する；段階４）ＳＵＶリポソームと過剰な糖を含むペプチド（１つまたは複数）混合物との混合物を凍結乾燥により脱水する；段階５）脱水したＳＵＶリポソームと過剰な糖を含むペプチド（１つまたは複数）混合物との混合物を再水和して、大きさ約１００〜２００ｎｍのＳＵＶリポソームにする。
【０１５０】
Ｖ．標的化部分
Ａ．諸言
本明細書に記載されるＭＢＰペプチド組成物の治療効果を増大させるため、これを標的化部分と結合させ得る。標的化部分は、例えば共有結合、イオン結合、静電的相互作用、疎水性相互作用または物理的な閉込めを介して、ＭＢＰペプチドと共有結合または非共有結合により結合させることができる。特定の実施形態では、結合はリンカーまたはベクター構造を介するものであり得る。標的化部分の例としては、特に限定されないが、糖部分（例えば、マンノースまたは１つもしくは複数のマンノース残基を含む炭水化物あるいはその類似体または誘導体）、ペプチド（例えば、細胞受容体リガンド）、ポリペプチド（例えば、抗体またはその機能的フラグメント）および核酸（例えば、アプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標））が挙げられる。
【０１５１】
標的化部分が結合している場合、標的化部分によりＭＢＰペプチドの効果が積荷単独の効果に比して改善する。一実施形態では、標的化部分により、結合したＭＢＰペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏの位置もしくは細胞型への送達が改善し；かつ／またはＭＢＰペプチドの細胞内もしくは位置へのｉｎ  ｖｉｖｏの取込みが改善する。特定の実施形態では、標的化部分により、結合したＭＢＰペプチドの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞またはＡＰＣ）への送達が改善し；かつ／またはＭＢＰペプチドの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞またはＡＰＣ）内への取込みが改善する。
【０１５２】
標的化部分が１つまたは複数のＭＢＰペプチドと共有結合または非共有結合している場合、標的化部分により：（ｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）への送達が少なくとも１０％増大し；かつ／または（ｉｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）内への取込みが少なくとも１０％増大する。特定の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも２５％増大させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも２５％増大させる。別の実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも５０％、７５％もしくは１００％増大させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも５０％、７５％もしくは１００％増大させる。さらに別の実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも倍に増加させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも２倍に増加させる。また別の実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍または１０００倍にし；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍または１０００倍に増加させる。
【０１５３】
Ｂ．糖残基
一実施形態では、標的化部分は炭水化物部分（例えば、糖残基）を含む。特定の実施形態では、糖部分は単糖、二糖または多糖であり得る。糖部分は天然の糖、天然の糖の類似体または天然の糖の誘導体であり得る。標的化部分として使用し得る糖部分の非限定的な例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボース、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、ルチヌロース、キシロビオース、その類似体またはその誘導体が挙げられる。
【０１５４】
マンノース誘導体および類似体の非限定的な例としては、１−デオキシマンノジリマイシン、メチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）、２−デオキシ−２−フルオロ−マンノース（２−ＦＭ）および２−デオキシ−２−クロロ−マンノース（２−ＣＭ）が挙げられ、いずれも脂質と結合し得るものである。
【０１５５】
Ｃ．抗体
別の実施形態では、標的化部分は、本明細書で定義される抗体またはその機能的フラグメントを含む。一実施形態では、抗体は細胞表面抗原と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は免疫細胞上に存在する細胞表面抗原と特異的に結合する。さらに特定の実施形態では、抗体はＢ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在する細胞表面抗原と結合する。特定の実施形態では、抗体は細胞の表面に存在するマンノース受容体と特異的に結合する。
【０１５６】
ＭＢＰペプチドまたはこれと結合しているベクターと結合した抗体の標的となり得る細胞表面抗原の非限定的な例としては、ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ１６およびＣＤ５６）、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＣＲαβ、ＣＤ３およびＣＤ４）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＴＣＲαβ、ＣＤ３およびＣＤ８）、γδＴ細胞（例えば、ＴＣＲγδおよびＣＤ３）およびＢ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９およびＣＤ２１）の表現型マーカーが挙げられる。細胞表面分子にはほかにも、目的とする細胞の表面に存在する炭水化物、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質またはその他の任意の分子が含まれ得る。
【０１５７】
Ｄ．アプタマー
別の実施形態では、標的化部分はアプタマーを含む。一実施形態では、アプタマーは細胞表面抗原と特異的に結合する。特定の実施形態では、アプタマーは免疫細胞上に存在する細胞表面抗原と特異的に結合する。さらに特定の実施形態では、アプタマーはＢ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在する細胞表面抗原と結合する。特定の実施形態では、アプタマーは細胞の表面に存在するマンノース受容体と特異的に結合する。
【０１５８】
ＭＢＰペプチドまたはこれと結合しているベクターと結合したアプタマーの標的となり得る細胞表面抗原の非限定的な例としては、ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ１６およびＣＤ５６）、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＣＲαβ、ＣＤ３およびＣＤ４）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＴＣＲαβ、ＣＤ３およびＣＤ８）、γδＴ細胞（例えば、ＴＣＲγδおよびＣＤ３）およびＢ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９およびＣＤ２１）の表現型マーカーが挙げられる。細胞表面分子にはほかにも、目的とする細胞の表面に存在する炭水化物、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質またはその他の任意の分子が含まれ得る。
【０１５９】
ＶＩ．治療用組成物
Ａ．諸言
一態様では、本発明は多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための治療用組成物を提供し、この組成物は、ベクターと結合した、本明細書で定義されるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを含む。一実施形態で、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含む。一般に、ＭＢＰペプチドは６〜１００アミノ酸の長さからなる。一実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜５０アミノ酸の長さからなる。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜２５アミノ酸の長さからなる。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは約６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個またはそれ以上のアミノ酸からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、ベクターは標的化部分を含み、マンノシル化リポソームである。
【０１６０】
Ｂ．ベクター組成物
一実施形態では、組成物は少なくとも２つのＭＢＰペプチドを含み、そのＭＢＰペプチドがそれぞれベクターと結合している。一実施形態では、ＭＢＰペプチドがともに単一のベクターと結合している（例えば、単一のリポソーム内に封入されている）。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドがそれぞれ別々のベクターと結合しており（例えば、別々のリポソームに封入されており）、投与前にそれぞれのＭＢＰ−ベクター複合体を混合する。
【０１６１】
一実施形態では、組成物は、配列番号１の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第一のベクターと結合した第一のＭＢＰペプチドと、配列番号２の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドとを含む。特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含み、第二のＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなり、第二のＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【０１６２】
一実施形態では、組成物は、配列番号１の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第一のベクターと結合した第一のＭＢＰペプチドと、配列番号３の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドとを含む。特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含み、第二のＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなり、第二のＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０１６３】
一実施形態では、組成物は、配列番号２の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第一のベクターと結合した第一のＭＢＰペプチドと、配列番号３の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドとを含む。特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含み、第二のＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなり、第二のＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０１６４】
一実施形態では、組成物は少なくとも３つのＭＢＰペプチドを含み、そのＭＢＰペプチドがそれぞれベクターと結合している。一実施形態では、３つのＭＢＰペプチドがすべて単一のベクターと結合している（例えば、単一のリポソーム内に封入されている。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドがそれぞれ別々のベクターと結合しており（例えば、別々のリポソームに封入されており）、投与前にそれぞれのＭＢＰ−ベクター複合体を混合する。
【０１６５】
別の１つの実施形態では、組成物は、配列番号１の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第一のベクターと結合した第一のＭＢＰペプチドと、配列番号２の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第二のベクターと結合した第二のＭＢＰペプチドと、配列番号３の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含み第三のベクターと結合した第三のＭＢＰペプチドとを含む。特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含み、第二のＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含み、第三のＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、第一のＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなり、第二のＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなり、第三のＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０１６６】
一態様では、本発明は多発性硬化症の治療のための組成物を提供し、この組成物は本明細書で定義されるＭＢＰペプチドを含み、このペプチドは標的化部分を含むベクターと結合している。特定の実施形態では、標的化部分を含むベクターは、標的化部分の存在しないベクターと結合したペプチドに比して、（ｉ）免疫細胞へのペプチドの送達；または（ｉｉ）免疫細胞内へのペプチドの取込みを増大させる。特定の実施形態では、ベクターはリポソームを含む。別の特定の実施形態では、標的化部分はマンノシル化脂質を含む。
【０１６７】
本明細書に記載される組成物の特定の実施形態では、ベクターは標的化部分と共有結合または非共有結合している。一実施形態では、標的化部分は、（ｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）への送達を増大させ；かつ／または（ｉｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）内への取込みを増大させる。特定の実施形態では、細胞は免疫細胞である。さらに特定の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。
【０１６８】
Ｃ．リポソームベクター組成物
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物はリポソームベクターを含む。したがって、本発明は、リポソームに封入されたＭＢＰペプチドを含む、ＭＳの治療のための組成物を提供する。特定の実施形態では、リポソームは標的化部分と結合している。さらに特定の実施形態では、標的化部分はリポソーム二重層に存在するマンノシル化脂質である。
【０１６９】
特定の実施形態では、リポソームはマンノース標的化部分と結合している、すなわち、マンノシル化リポソームである。特定の実施形態では、マンノシル化リポソームを含む脂質の少なくとも０．０１％が少なくとも１つのマンノース残基と結合している。別の実施形態では、マンノシル化リポソームを含む脂質の少なくとも０．１％が少なくとも１つのマンノース残基と結合している。別の実施形態では、マンノシル化リポソームを含む脂質の少なくとも１％が少なくとも１つのマンノース残基と結合している。また別の実施形態では、マンノシル化リポソームを含む脂質の少なくとも０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が少なくとも１つのマンノース残基と結合している。
【０１７０】
リポソーム組成物を当該技術分野で周知の方法に従って製剤化することができる。リポソーム製剤は、以下に挙げるものを１つまたは複数含む：緩衝剤（例えば、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤または酒石緩衝剤）；糖（例えば、トレハロース、マルトース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロースまたはフルクトース）；糖アルコール（例えば、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マンニトールまたはグリセロール）、アルコール（例えば、エタノールまたはｔ−ブタノール）；塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム）；抗酸化剤（例えば、グルタチオン）。
【０１７１】
Ｄ．標的化部分
特定の実施形態では、標的化部分は、糖部分（例えば、マンノースまたは１つもしくは複数のマンノース残基を含む炭水化物）、ペプチド（例えば、細胞受容体リガンド）、ポリペプチド（例えば、抗体またはその機能的フラグメント）または核酸（例えば、アプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標））である。特定の実施形態では、標的化部分はマンノース残基である。
【０１７２】
一実施形態では、標的化部分は、（ｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）への送達を少なくとも１０％増大させ；かつ／または（ｉｉ）標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、ＭＢＰペプチドの細胞（例えば、免疫細胞）内への取込みを少なくとも１０％増大させる。特定の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも２５％増大させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも２５％増大させる。別の実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも５０％、７５％もしくは１００％増大させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも５０％、７５％もしくは１００％増大させる。さらに別の実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも倍に増加させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも２倍に増加させる。また別の実施形態では、標的化部分は、標的化部分と結合していないＭＢＰペプチドに比して、（ｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への送達を少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍または１０００倍に増加させ；かつ／または（ｉｉ）ＭＢＰペプチドの細胞内への取込みを少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍または１０００倍に増加させる。
【０１７３】
一態様では、本発明はＭＳの治療のための組成物を提供し、この組成物は、標的化部分と共有結合した（例えば、ベクターが標的化部分である）、本明細書で定義されるＭＢＰペプチドを含む。特定の実施形態では、標的化部分は共有結合によりＭＢＰペプチドと直接結合している。標的化部分は、例えば、ＭＢＰタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端、リジン、グルタミンもしくはアスパラギン側鎖の第一級アミン基、セリンもしくはトレオニン側鎖のヒドロキシル基または遊離システイン側鎖のチオールと結合し得る。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドと直接結合している標的化部分は、糖部分（例えば、マンノース残基または１つもしくは複数のマンノース残基を含む炭水化物あるいはその類似体または誘導体）、ペプチド（例えば、細胞受容体リガンド）、ポリペプチド（例えば、抗体またはその機能的フラグメント）または核酸（例えば、アプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標））である。特定の実施形態では、標的化部分はマンノース残基である。
【０１７４】
Ｅ．併用療法
現時点で多発性硬化症の治癒方法は存在しない。しかし、ＭＳによる症状の管理には治療方法がいくつか承認されている。このようなこのような治療法としては、リンパ球をリンパ節中に隔離して自己免疫反応に寄与するのを防ぐスフィンゴシン１−リン酸受容体モジュレーター、フィンゴリモド；抗炎症性により、ＭＳ再発率を減少させてＭＳ患者の能力障害の進行を遅らせるよう同じように機能するインターフェロンβ−１ａおよびβ−１ｂ；ＭＢＰにみられる４種類の主要なアミノ酸、グルタミン（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、アラニン（Ａｌａ）およびチロシン（Ｔｙｒ）のランダムポリマーであり、非インターフェロン、非ステロイド性免疫調節剤である酢酸グラチラマー（コパキソン）；二次進行型ＭＳの治療に使用されるＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ミトキサントロン；ならびに細胞接着分子α４−インテグリンに対するヒト化モノクローナル抗体、ナタリズマブが挙げられる。
【０１７５】
さらに、以下に挙げる治療法を用いることにより、ＭＳであると診断されたか、同疾患の発症リスクがあるであると診断された患者に何らかの治療利益をもたらし得る：（ｉ）再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）の治療に承認されている酢酸グラチラマー（ＧＡ）の投与。ＧＡは、ＢＢＢを通過し、抗炎症性サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および脳由来神経成長因子を産生する能力を有するＴｈ２調節Ｔ細胞集団を誘導する、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｌａおよびＴｙｒの合成ランダムコポリマーである（Ａｈａｒｏｎｉ  Ｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００３；１００：１４１５７−６２）；（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用する、いわゆる「改変ペプチドリガンド」（ＡＰＬ）の投与。ＡＰＬは修飾された（Ｌｕｃａ  ＭＥら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１６０：１７８−８７）、変異した（Ｋａｔｓａｒａ  Ｍ．ら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００９；５２：２１４−８）または制限された（Ｗａｒｒｅｎ  ＫＧら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００６；１３：８８７−９５）ＴＣＲ結合部分を有し、Ｔ細胞を部分的に活性化させ、表現型をＴｈ１からＴｈ２に切り替え、場合によってはＴ細胞アナジーを誘導することができる。ＭＢＰの脳炎惹起性フラグメントに由来するＡＰＬのＭＢＰペプチド、ＭＢＰ（８２−９８）は、ＨＬＡ−ＤＲ２−ＤＲ４ハプロタイプを有する患者のＭＳ進行に有望な阻害作用を示す。しかし、このペプチドをベースにした医薬組成物は第ＩＩＩ相臨床試験に合格していない（ＦｏｎｔｏｕｒａおよびＧａｒｒｅｎ，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０１０；５１：２５９−８５）。ＭＢＰ（８３−９９）ペプチドに二重変異があると、ＩＬ−４応答を誘導しＩＦＮ−ガンマ応答と拮抗する（Ｋａｔｓａｒａ  Ｍ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；２００：７７−８９）；（ｉｉｉ）ＩＦＮβ投与；（ｉｖ）Ｂ細胞を標的とするリツキシマブ（抗ＣＤ２０）などのモノクローナルＡｂ（Ｈａｕｓｅｒ  ＳＬら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００８；３５８：６７６−８８）、活性化Ｔ細胞（Ｒｏｓｅ  ＪＷ．ら，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００４；５６：８６４−７）を枯渇させるダクリズマブ（抗ＣＤ２５、ＩＬ−２受容体のアルファサブユニット）およびアレムツズマブ（抗ＣＤ５２、あらゆる成熟リンパ球および単球上に提示され機能が明らかにされていない糖タンパク質）（Ｃｏｌｅｓ  Ａ．ら，Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ２００４；１０６：２７０−４）；（ｖ）経口療法、例えばリン酸化形態のＦＴＹ７２０（ＳＰ１関連Ｇ−タンパク質共役レセプターの阻害剤）、テリフルノミド（Ｔ細胞増殖の阻害剤）、ＢＧ−１２（Ｔｈ２−サイトカインの誘導物質）、ラキニモド（Ｔ細胞およびマクロファージのＣＮＳ内への移動の阻害剤、Ｔｈ２／Ｔｈ３移行のトリガー）、クラドリビン（デオキシシチジンキナーゼの基質、ＤＮＡ修復およびリンパ球の細胞死に干渉する）（以上、ＦｏｎｔｏｕｒａおよびＧａｒｒｅｎ，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０１０；５１：２５９−８５で概説されている）など；（ｖｉ）ＴＣＲに特異的な対抗制御的ＣＤ８＋細���を刺激する不活性化Ｔ細胞の注射またはＴＣＲ超可変領域によるワクチン接種；（ｖｉｉ）免疫系の寛容化：自己抗原による「経鼻」もしくは「経口耐容性」の誘導またはＭＢＰ分子全体をコードし、数種類のミエリン抗原に対するＴ細胞および自己抗体両方の有意な大幅な寛容化を誘発するＢＨＴ−３００９プラスミドによるＤＮＡワクチン接種；（ｖｉｉｉ）近年提案された特定のＢ細胞標的とする新規な枯渇療法（Ｓｔｅｐａｎｏｖ  ＡＶら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；６：ｅ２０９９１）。
【０１７６】
一態様では、本発明は、多発性硬化症であると診断されたか、同疾患のリスクがあるであると診断された患者に対する併用療法を提供する。一実施形態では、治療法は、本明細書に記載されるＭＢＰペプチド組成物と、既に確認されている治療剤、例えばフィンゴリモド、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、酢酸グラチラマー、二次進行型ＭＳの治療に使用されるＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤ミトキサントロンおよび抗α４−インテグリン抗体との共投与を含む。
【０１７７】
一実施形態では、共投与は、ベクターと結合した抗原ＭＢＰペプチドと第二の治療剤の同時投与または連続投与を含む。別の実施形態では、共投与は、ＭＢＰペプチド組成物または代替療法の第一の薬物による第一の全治療サイクルの実施と、それに続く他の治療による全治療レジメンの実施とを含む。この実施形態では、２つの薬物の投与は重複せず、むしろ２つの治療法が互いに相反するサイクルになっている。
【０１７８】
ＶＩＩ．多発性硬化症の治療
Ａ．諸言
一態様では、本発明は、必要とする対象に本明細書に記載されるベクターと結合したＢ細胞エピトープＭＢＰペプチドを投与することによって対象の多発性硬化症（ＭＳ）を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、必要とする対象に、配列番号１〜３のうちの１つと実質的に同一である配列を含みリポソームに封入されたＭＢＰペプチドを投与することを含む。
【０１７９】
一実施形態では、この方法は、ＭＢＰ（４３−６４）（配列番号１１）またはＭＢＰ（１１５−１７０）（配列番号１２）の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含みベクター（例えば、リポソーム）と結合した治療用ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを投与することを含む。一般に、ＭＢＰペプチドは６〜１００アミノ酸の長さからなる。一実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜５０アミノ酸の長さからなる。別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは６〜２５アミノ酸の長さからなる。また別の実施形態では、ＭＢＰペプチドは約６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個またはそれ以上のアミノ酸からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、ベクターはマンノシル化リポソームである。
【０１８０】
特定の実施形態では、この方法は、必要とする対象に、配列：ＧＧＤＲＧＡＰＫＲＧＳＧＫＤＳＨＨ（ＭＢＰ（４６−６２）；配列番号１）の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含みベクターと結合したＭＢＰペプチドを投与することを含む。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１８１】
別の特定の実施形態では、この方法は、必要とする対象に、配列：ＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫ（ＭＢＰ（１２４−１３９）；配列番号２）連続する少なくとも６個のアミノ酸を含みベクターと結合したＭＢＰペプチドを投与することを含む。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１８２】
別の特定の実施形態では、この方法は、必要とする対象に、配列：ＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ（ＭＢＰ（１４７−１７０）；配列番号３）の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含みベクターと結合したＭＢＰを投与することを含む。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１８３】
別の特定の実施形態では、この方法は少なくとも２つのＭＢＰペプチドを投与することを含み、各ＭＢＰペプチドはそれぞれ、配列番号１、配列番号２または配列番号３の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含みベクターと結合している。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドはそれぞれ、配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドはそれぞれ、配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１８４】
また別の特定の実施形態では、この方法は３つのＭＢＰペプチドを投与することを含み、各ＭＢＰペプチドはそれぞれ、配列番号１、配列番号２または配列番号３の連続する少なくとも６個のアミノ酸を含みベクターと結合している。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドはそれぞれ、配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに特定の実施形態では、ＭＢＰペプチドはそれぞれ、配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ベクターはリポソームである。さらに特定の実施形態では、リポソームはマンノシル化リポソームである。
【０１８５】
特定の実施形態では、対象は多発性硬化症であると診断されている。一実施形態では、対象は再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）であると診断されている。別の実施形態では、対象は二次進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）であると診断されている。別の実施形態では、対象は一次進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）であると診断されている。別の実施形態では、対象は進行再発型多発性硬化症（ＰＲＭＳ）であると診断されている。
【０１８６】
一実施形態では、治療は、急性症状の発作時または発作直後にＭＢＰペプチド組成物を投与することを含む。一実施形態では、急性症状の発作は初回発作である。別の実施形態では、急性症状の発作は再発発作である。特定の実施形態では、急性症状の発作時、対象に静脈内副腎皮質ステロイド剤（例えば、メチルプレドニゾロン）を共投与し得る。特定の実施形態では、対象は一次進行型、二次進行型または再発寛解型ＭＳであると診断されている。一実施形態では、治療は、対象の急性発作の重症度を軽減するか、１つまたは複数の身体的またはフィスコロジカル（ｐｈｙｓｃｏｌｏｇｉｃａｌ）な症状を改善する。
【０１８７】
別の実施形態では、治療は、患者のＭＳ寛解期にＭＢＰペプチド組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、対象は二次進行型または再発寛解型ＭＳであると診断されている。一実施形態では、治療により、治療は、対象の急性発作の発症を予防するか、急性発作の発症を遅延させるか、次の急性発作の重症度を軽減するか、１つまたは複数の身体的またはフィスコロジカル（ｐｈｙｓｃｏｌｏｇｉｃａｌ）な症状を改善する。
【０１８８】
別の実施形態では、治療は、対象の進行性衰退期にＭＢＰペプチド組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、対象は二次進行型、一次進行型または進行再発型ＭＳであると診断されている。一実施形態では、治療は、患者の急性発作の発症を予防するか、急性発作の発症を遅延させるか、次の急性発作の重症度を軽減するか、疾患の進行を軽減するか、疾患の進行を停止させるか、１つまたは複数の身体的またはフィスコロジカル（ｐｈｙｓｃｏｌｏｇｉｃａｌ）な症状を改善する。
【０１８９】
さらに別の実施形態では、治療は、ＭＳの発症リスクが高いと診断された対象にＭＢＰペプチド組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、特に限定されないが、ＭＳの家族歴、ＭＳの疾患バイオマーカー（例えば、インターロイキン６、一酸化窒素および一酸化窒素合成酵素、オステオポンチン、フェチュインＡおよび抗ＭＢＰ自己抗体）およびＭＳの遺伝マーカーの存在、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを含めたＭＳの１つまたは複数の危険因子を有する。特定の実施形態では、必要とする対象へのＭＢＰペプチド組成物の予防的投与が、疾患を予防するか、疾患の発症を遅延させるか、初期の急性発作を予防するか、初期の急性発作の発症を遅延させるか、疾患の重症度を軽減するか、初期の急性発作の重症度を軽減する。
【０１９０】
特定の実施形態では、対象は以前にＭＳの治療を受けたことがある。他の実施形態では、対象は以前にＭＳの治療を受けたことがない。
【０１９１】
Ｂ．投与
本発明のＭＢＰペプチド組成物は、任意の既知の投与経路、例えば、局所投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、真皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、吸入、硬膜外投与、カニューレ挿入（例えば、静脈内、経鼻、経口または頭蓋間カニューレ）、中枢神経系への直接投与またはその他の同様の投与経路により投与することができる。特定の治療的処置に選択される投与経路は、例えば、医薬組成物、送達する治療剤の量、治療する病状、特定の製剤の有効性および特定の製剤の安全性プロファイルなど臨床試験によって得られた結果ならびに予想される患者コンプライアンスによって決まる。特定の実施形態では、ＭＢＰペプチド組成物を皮下投与する。
【０１９２】
特定の実施形態では、ＭＢＰペプチド組成物が中枢神経系に送達されるか蓄積するよう投与する。一実施形態では、組成物を、例えば脊髄硬膜外、鼻腔内投与（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＬｉｕ  Ｘ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１  Ｄｅｃ；８（１２）：１６８１−９０およびＷｅｎ  ＭＭ．，Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｊｕｎ；１１（６１）：４９７−５０３を参照されたい）または薬物送達システムの埋込み（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＴｒｅｓｃｏおよびＷｉｎｓｌｏｗ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２０１１；３９（１）：２９−４４を参照されたい）によって中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与する。
【０１９３】
治療剤のＣＮＳへの直接投与には、致命的となる可能性のある感染症のリスクを含めた多数の困難が伴うため、組成物をＣＮＳの外部に投与してもよい。この方法で送達される治療剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してＣＮＳに入る必要がある。治療剤のＢＢＢ通過を増大させる戦略がいくつか提案されている（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＨｏｓｓａｉｎ  Ｓら，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  Ｄｅｃ；７（５）：３８９−９７を参照されたい）。例えば、表面にＢＢＢに特異的なＢＢＢ受容体リガンド、ペプチドもしくは抗体を提示するベクターシステム（概説については、内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＣｏｓｔａｎｔｉｎｏ  Ｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１０  Ｎｏｖ；２（１１）：１６８１−７０１およびＣｒａｐａｒｏら，ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ｄｅｃ；１７（６）：６７０−７を参照されたい）または内因性内皮受容体系でＲＭＴを受けてＢＢＢを通過する内因性ペプチド、修飾タンパク質もしくはペプチド模倣物モノクローナル抗体（ＭＡｂ）などのＢＢＢ輸送ベクターと融合したＭＢＰペプチドを含むキメラペプチド（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＰａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖ．，２００３，３（２），９０−１０５を参照されたい）の使用がある。
【０１９４】
一実施形態では、治療は、所与の期間わたる定期的投与、例えば月１回、月２回、週１回、週２回、週３回、隔日、毎日または１日２回の投与を含む。治療レジメンおよび患者の病状に応じて、治療サイクルを少なくとも１か月間または少なくとも２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月もしくは１２か月間継続し得る。必要に応じて、治療サイクルを少なくとも１年間または少なくとも２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間もしくはそれ以上継続し得る。熟練した医師であれば、患者に対する治療の効果を必要に応じて監視および調節して、例えば、効果を改善したり、副作用を軽減したりすることができる。
【０１９５】
患者に投与する量は、投与頻度、病態（例えば、多発性硬化症）の重症度、病態のサブタイプ（例えば、再発寛解型ＭＳ、二次進行型ＭＳ、一次進行型ＭＳおよび進行再発型ＭＳ）、病態の段階（例えば、初回発作、再発および寛解）、対象の大きさおよび耐容性、用いる投与経路、副作用のリスク、有害な薬物相互作用のリスクならびに以前の治療に対する奏効を含めた多数の因子によって異なり、ここに挙げた因子はいずれも、熟練した医師であれば容易に判定できるものである。
【０１９６】
上で述べた通り、投与頻度を含めた多数の因子がしかるべき投与量の構成要素に寄与する。一実施形態では、本明細書に提供されるＭＢＰペプチド組成物を約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し得る。他の実施形態では、投与量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇであり得る。別の実施形態では、投与量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／であり得る。別の実施形態では、投与量は約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。別の実施形態では、投与量は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。さらに別の実施形態では、投与量は約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。また別の実施形態では、投与量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約２５０ｍｇ／ｋｇまたは約２００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇであり得る。一実施形態では、この投与量を毎日投与する。別の実施形態では、この投与量を隔日、２日置き、３日置き、４日置き、５日置きまたは６日置きに投与する。一実施形態では、この投与量を週１回投与する。別の実施形態では、この投与量を隔週投与する。他の実施形態では、この投与量を２週間置き、３週間置き、４週間置き、５週間置き、６週間置き、７週間置き、８週間置き、９週間置き、１０週間置きまたは１１週間置きに投与する。
【実施例】
【０１９７】
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１−超音波処理によるＭＢＰペプチド含有リポソームの調製
マンノシル化ＤＯＧ脂質（ＭａｎＤＯＧ）１重量部と２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−１−ホスファチジルコリン９９重量部とを含有するリン脂質混合物４５ｇをクロロホルム４５０ｍＬに溶かし、１Ｌの真空蒸発装置フラスコに入れた。真空下でクロロホルムを蒸発させて、フラスコ壁面に脂質薄膜を形成させた。蒸発後、フラスコに窒素ガスを充満させ、そこに注射用水（ＷＦＩ）８００ｍＬをゆっくり注いだ。フラスコを超音波浴に３０分間入れて、予め形成されたリポソームを破壊した。超音波処理後にリポソームが再形成され、リポソームの水性エマルジョンが生じた。
【０１９８】
次いで、ＧＧＤＲＧＡＰＫＲＧＳＧＫＤＳＨＨ（配列番号１；ＭＢＰ１）、ＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫ（配列番号２；ＭＢＰ２）およびＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ（配列番号３；ＭＢＰ３）を含有するＭＢＰペプチド混合物０．７５ｇと、等量の過剰ラクトース（ラクトースと脂質の比は３：１）とを注射用水４０ｍＬに溶かした。このＭＢＰペプチド溶液にリポソームエマルジョンを加え、混合物を３０分間攪拌すると、大きさ１００ｎｍ〜２００ｎｍのリポソームのエマルジョンおよび封入されていないＭＢＰペプチドが得られた。次いで、得られた単層リポソームのエマルジョンを凍結乾燥させた。
【０１９９】
次の段階では、制御された条件下で脱水した後、得られたＳＵＶリポソームを遠心分離によって洗浄し、組み込まれなかった材料を除去した。洗浄したペレットを必要な投与体積になるまでＰＢＳに再懸濁させた。Ｃ１８カラムにアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣに基づいて、ペプチドの組込みを推定した。分散液２０μｌをＰＢＳまたはしかるべき媒質で必要な体積に希釈することによって、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰｌｕｓゼータサイザーでリポソームのｚ平均直径およびゼータ電位を２５℃にて測定した。ＭＢＰペプチドおよびＭａｎＤＯＧの添加以外を同一にして、それぞれペプチドを含まない対照リポソーム（ビヒクル）およびマンノシル化脂質を欠くリポソームを得た。
【０２００】
実施例２−破砕によるＭＢＰペプチド含有リポソームの調製
マンノシル化ＤＯＧ脂質（ＭａｎＤＯＧ）１重量部と２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−１−ホスファチジルコリン９９重量部とを含有するリン脂質混合物４５ｇをクロロホルム４５０ｍＬに溶かし、１Ｌの真空蒸発装置フラスコに入れた。真空下でクロロホルムを蒸発させて、フラスコ壁面に脂質薄膜を形成させた。蒸発後、フラスコに窒素ガスを充満させ、そこに注射用水（ＷＦＩ）８００ｍＬをゆっくり注いだ。得られた混合物を流れている破砕機の受け器に移し、破砕機のストローク容積圧を１５０ＭＰａに設定する。１回の投入で混合物１００ｍｌを流れている破砕機に加え、得られたリポソームエマルジョンを破砕機の受け器から収集する。
【０２０１】
次いで、ＧＧＤＲＧＡＰＫＲＧＳＧＫＤＳＨＨ（配列番号１；ＭＢＰ１）、ＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫ（配列番号２；ＭＢＰ２）およびＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ（配列番号３；ＭＢＰ３）を含有するＭＢＰペプチド混合物０．７５ｇと、等量の過剰ラクトース（ラクトースと脂質の比は３：１）とを注射用水４０ｍＬに溶かした。このＭＢＰペプチド溶液にリポソームエマルジョンを加え、混合物を３０分間攪拌すると、大きさ１００ｎｍ〜２００ｎｍのリポソームのエマルジョンおよび封入されていないＭＢＰペプチドが得られた。次いで、得られた単層リポソームのエマルジョンを凍結乾燥させた。
【０２０２】
次の段階では、制御された条件下で再水和した後、得られたＳＵＶリポソームを遠心分離によって洗浄し、組み込まれなかった材料を除去した。洗浄したペレットを必要な投与体積になるまでＰＢＳに再懸濁させた。Ｃ１８カラムにアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣに基づいて、ペプチドの組込みを推定した。分散液２０μｌをＰＢＳまたはしかるべき媒質で必要な体積に希釈することによって、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰｌｕｓゼータサイザーでリポソームのｚ平均直径およびゼータ電位を２５℃にて測定した。ＭＢＰペプチドおよびＭａｎＤＯＧの添加以外を同一にして、それぞれペプチドを含まない対照リポソーム（ビヒクル）およびマンノシル化脂質を欠くリポソームを得た。
【０２０３】
実施例３−ＭＢＰペプチドを含有する水性リポソーム製剤
実施例１に記載される通りに調製した凍結乾燥ＭＢＰペプチドリポソーム１０００ｍｇに緩衝リン酸生理食塩水（ＦＢＲ）１００ｍＬを無菌条件下で加え、攪拌した。次いで、抗酸化剤としてベータ−カロテンを最終濃度０．０１％で組成物に加えた。次いで、リポソーム組成物を無菌条件、窒素雰囲気下で加水分解クラスＩのガラス容器に分注した。次いで容器をゴム栓で密閉し、アルミニウムキャップを装着した。
【０２０４】
実施例４−ＭＢＰペプチドを含有する凍結乾燥リポソーム製剤
実施例１に記載される通りに調製した凍結乾燥ＭＢＰペプチドリポソーム１０００ｍｇに固体のアルファトコフェロール２ｍｇを無菌条件下で加えた。得られた乾燥混合物１００ｍｇを無菌条件、窒素雰囲気下で加水分解クラスＩのガラス容器に分注した。次いで容器をゴム栓で密閉し、アルミニウムキャップを装着した。乾燥ＭＢＰリポソーム混合物を使用する前に１容器当たり１〜２ｍＬのＷＦＩで復元し、１〜２分間振盪して均一なリポソームエマルジョンを形成させた。
【０２０５】
実施例５−ＤＡラットＥＡＥのリポソーム封入ＭＢＰペプチドによる治療
重量２２０〜２５０ｇ（１２〜１４か月齢）のＤＡラットに実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導するため、フロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳ）に１０％（ｍ／ｖ）の濃度で乳化させたミエリン塩基性タンパク質脳炎惹起性ペプチドフラグメント  ＡＲＴＴＨＹＧＳＬＰＱＫＳＱＲＳＱ（配列番号４；Ａｎａｓｐｅｃ、ＵＳ）１０μｇを前肢の真皮下に注射した。毎日、ラットの体重を測定し、ＥＡＥ神経症状を監視した。以下に挙げる尺度に従って各速度のＥＡＥ症状をスコア化した：（０）−ＥＡＥ症状なし；（１）−尾の緊張低下；（２）−正向反射の低下；（３）−不全麻痺；（４）−完全麻痺；および（５）−瀕死状態または死亡。中間的な症状には０．５単位を加算または減算してスコアを付けた。ＥＡＥ誘導６日後、ラットを７つのグループ（各グループ１２個体）に無作為に割り振った。
【０２０６】
誘導後６日〜７日に、各グループのラットの真皮下に実施例２に記載されるリポソーム製剤（リン酸生理食塩水、ｐＨ７．４に乳化させたもの）、酢酸グラチラマーの陽性対照製剤（ＧＡ；コパキソン、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｉｓｒａｅｌ）、原型ペプチド：ＤＥＮＰＶＶＩＩＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴ（配列番号５）またはプラセボの緩衝リン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）を注射した。ペプチド、酢酸グラチラマーおよびリポソーム製剤は、投与直前に緩衝リン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）を用いて製剤化したものである。各組成物０．１ｍＬを１５０μｇ／個体の濃度で毎日投与した。試験の結果を表２に示す。
【０２０７】
【表２】
0006014241.tif 000003
【０２０８】
表２に示される通り、ＭＢＰペプチドリポソーム組成物の投与により、ＤＡラットにおけるＥＡＥ進行の強度および速度の低減による治療利益が原型ペプチドまたは酢酸グラチラマー組成物の投与よりも有意に高い値を示した（第２０日の平均ＥＡＥスコアを比較されたい）。
【０２０９】
実施例６−多発性硬化症と診断された女性ヒト対象のリポソーム封入ＭＢＰペプチドによる治療
多発性硬化症（脳脊髄型、進行性の経過）と診断された女性患者（３０歳）は以前、副腎皮質ステロイド剤、ベータ−インターフェロンおよび酢酸グラチラマーによる治療を受けていたが、神経障害および認知障害の進行が止まらなかったため、いずれの薬剤にも効果がないことが明らかになった。対象のＭＢＰ抗体の血清中濃度は１０７単位／１ｍＬであり、患者のＴリンパ球の刺激指数（ＳＩ）は６．５と測定された。
【０２１０】
適正な同意の下、実施例３に記載されるリポソームＭＢＰトリペプチド組成物製剤を２００ｍｇの投与量で隔週、６か月間、真皮下に投与した。治療過程全体で、患者の神経障害の１．５単位（ＥＤＳＳ尺度）の消退が観察された。抗ＭＢＰ  ＩｇＧ抗体の血清中濃度は検出不可能な濃度まで減少した。Ｔリンパ球のＳＩは６か月後に２と測定された。
【０２１１】
以上の結果は、ヒトにおいて、本明細書に記載されるリポソームＭＢＰペプチド組成物の投与によりＭＳを効果的に治療し得ることを示している。
【０２１２】
実施例７−多発性硬化症と診断された男性ヒト対象のリポソーム封入ＭＢＰペプチドによる治療
多発性硬化症（脳脊髄型、寛解性の経過）と診断された再発段階の男性患者（３６歳）は以前、副腎皮質ステロイド剤による反復治療を受けていた。患者には３年間、ＭＳの症状がみられた。治療時、患者には、右側を見るときの水平眼振、活発な腱反射、脚のＳ＜Ｄ、活発な上部腹壁反射、中部および下部腹壁反射の欠如、両側バビンスキー症状、足クローヌス（右足の方が強い）がみられ、四肢の不全麻痺はみられず、筋緊張は変化しておらず、失調性歩行、ロンベルグ姿勢でのバランス喪失、踵脛試験実施時の運動失調および尿貯留がみられた。ＥＤＳＳ尺度による患者の神経障害の数値は６であった。
【０２１３】
この患者にはほかにも、視神経乳頭の耳側半分の眼部蒼白化が認められた。患者のＰＢＭＣを検査したところ、ＭＢＰに対するＴリンパ球の活性が刺激指数（ＳＩ）７．４５であることがわかった。血清中ＩｇＧ抗体の濃度は７５単位／１ｍＬであった。
【０２１４】
患者の同意の下、原型ペプチド組成物を５００ｍｇの投与量で２週間に１回投与した。各注射７日の後、ＭＢＰに対するＴリンパ球活性および自己抗体濃度の変化を求めるため患者の末梢（静脈）血を採取した。７週間の間に患者のＭＳの臨床症状がわずかに進行した。第４週、患者のＩｇＧ自己抗体濃度が１１２単位／１ｍＬに増加し、Ｔ細胞ＳＩが２倍になった。
【０２１５】
原型ペプチドによる最初の治療過程の後、上記リポソームＭＢＰトリペプチド組成物による治療に患者の同意を得た。患者に組成物１００ｍｇを２週間に１回、１２週間にわたって投与した（計６回の注射）。
【０２１６】
リポソームＭＢＰトリペプチド治療レジメンの第３週から寛解の徴候が現れ始めた。第８には患者のＩｇＧ自己抗体濃度が２５単位／１ｍＬに低下し、Ｔ細胞ＳＩが治療前の測定値したレベルの３分の１になっていた。臨床的には、患者の排尿および歩行運動が正常になり、ロンベルグ姿勢でバランスを維持することが可能になり、踵脛試験に容易に合格し、ＥＤＳＳ尺度による神経障害の数値が５に低下した。
【０２１７】
以上の結果は、ヒトにおいて、本明細書に記載されるリポソームＭＢＰペプチド組成物の投与によりＭＳを効果的に治療し得ることを示している。
【０２１８】
実施例８−適切な多発性硬化症げっ歯類モデルの特定
ＥＡＥはミエリン抗原による免疫感作によって多くの種に誘導することができ、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして用いられる。このようなＭＳモデルは多くの研究で用いられているが、ＭＳ疾患に完全に対応するものではない。例えば、提案されるＭＳの治療法の有効性をＥＡＥ動物モデルを用いて示した多数の研究が、ヒトＭＳ患者の治療で有益な効果となって表れたことはなく、増悪さえ引き起こす（ＨｏｈｌｆｅｌｄおよびＷｅｋｅｒｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００４；１０１：１４５９９−６０６）。したがって、ＥＡＥげっ歯類モデルの検討を慎重に実施して、ＭＳ患者に存在するＭＢＰ自己抗体（ａｕｔｏＡｂ）のスペクトルとより厳密に一致する系を特定した。
【０２１９】
チオレドキシン担体タンパク質融合したこの神経抗原のフラグメントを提示するＭＢＰエピトープライブラリーがこれまでに調製されている（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＢｅｌｏｇｕｒｏｖ  ＡＡら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１８０：１２５８−６７）。ａｕｔｏＡｂとＭＢＰエピトープライブラリーとの結合パターンがＭＳにおける病原性Ｂ細胞応答の分子署名またはスナップショットと見なされ得ることが報告されている。ＭＳに最も対応するげっ歯類モデルを特定するため、３種類のげっ歯類系統：ＳＪＬマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＤＡラットにＥＡＥを誘導した（図１Ｂ）。抗ＭＢＰおよび抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂとのハイブリダイゼーションによりＭＢＰエピトープライブラリーを試験して（図１Ａ）、ＥＡＥ誘導げっ歯類モデルの抗ＭＢＰ自己抗体結合パターンを明らかにした。次いで、この結合パターンをヒトＭＳ患者１２例で明らかになった抗ＭＢＰ自己抗体結合パターンと比較した。
【０２２０】
全動物試験をアサーフハロフェ医療センター（Ａｓｓａｆ  Ｈａｒｏｆｅｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｚｅｒｉｆｉｎ、Ｉｓｒａｅｌ）の動物施設にて標準的な承認された動物管理の実施法に従い実施した。８〜９週齢のＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）雌ラットにＥＡＥの誘導を実施した。簡潔に述べると、ＣＦＡ（不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、Ｓｉｇｍａ）と混合した生理食塩水（１：１）に溶かしたＭＢＰ（６３−８１）（ＡＮＡＳＰＥＣ）５０μｇとＭＴ（Ｈ３７ＲＡ株；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）１ｍｇとを含有する総体積２００μｌの接種材料をラットの尾基底の皮内に注射した。ＭＳの症状を発現している個体を試験に含めた。ラットにほぼ同じ条件下で様々なリポソーム製剤（表３）、コパキソンまたはプラセボ（ビヒクル）による治療を６日間実施した。いずれの製剤も１日１回の皮下注射により投与した。ＥＡＥ誘導後第２８日まで個体の経過観察を実施した。全試験期間中、毎日臨床徴候のスコア化を実施した。スコアの等級分けは以下の通りであった：０−正常、１−尾の脱力、２−後肢の脱力または麻痺、３−後肢を引きずる後肢麻痺、４−動くことができない完全麻痺、５−死亡。
【０２２１】
確立されたプロトコル（Ｃｏｌｉｇａｎ  ＪＥ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．［Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］：Ｗｉｌｅｙ，１９９６，ｐ．Ｓｕｐｐｌ．１９，Ｕｎｉｔ  ５．１  ＆  Ｓｕｐｐｌ．２１，Ｕｎｉｔ  ２．８）に従い、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）２ｍｇ／ｍｌを含有する完全フロイントアジュバントに溶かしたウシＭＢＰを６〜８週齢のＳＰＦ雌ＳＪＬマウスに５０μｇ／マウスで注射して免疫感作した。確立されたプロトコル（Ｏｌｉｖｅｒ  ＡＲら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７１：４６２−８）に従い、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）０．５ｍｇ／ｍｌを含有する完全フロイントアジュバントに溶かしたＭＯＧの組換え細胞外ドメインを６〜８週齢のＳＰＦ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００μｇ／マウスで注射して免疫感作した。２回目の免疫感作１４〜２８日後、臨床症状が顕著なマウスを安楽死させ、分析用に血清を採取した。
【０２２２】
再発寛解型ＭＳ患者１２例から得られた１０ｍＬの血液試料を市民病院（Ｃｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）＃１１のモスクワ多発性硬化症センター（Ｍｏｓｃｏｗ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。ＭＳ患者は２３〜６１歳（中央値３２．２歳）であった。患者の総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）スコアの範囲は０〜４（中央値２．０）であった。ＥＤＳＳは０〜１０の尺度でスコア化され、スコアが高いほど能力障害の程度が大きいことを示していた。いずれの患者も血液試料採取前の少なくとも１か月間は副腎皮質ステロイド剤による治療を受けていなかった（Ｋｕｒｔｚｋｅ  ＪＦ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９８３；３３：１４４４−５２）。いずれの患者もロシア連邦保健省の規制に従い市民病院（Ｃｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）＃１１の倫理委員会によって承認されたインフォームドコンセントに署名した。
【０２２３】
ＥＡＥ誘発げっ歯類モデルおよびヒトＭＳ患者の血清における抗ＭＢＰ自己抗体の結合パターンを明らかにするため、ＥＬＩＳＡ実験を以下の通りに実施した。ＭＢＰまたは組換えＭＢＰペプチドを１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶かした１０μｇ／ｍｌ溶液５０μｌでマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ−Ｎｕｎｃ）の奇数列のウェルをコートした。プレートをＥＬＩＳＡプレートシーラー（Ｃｏｓｔａｒ）で密閉し、４℃で一晩インキュベートした後、０．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した（３００μｌ／ウェル）。次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）を炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶かした２％溶液２５０μｌで全ウェルをブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。０．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した。０．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０と０．５％ＢＳＡとを含有するＰＢＳで血清抗体を最終希釈１：１０００〜１：５００００で希釈し、希釈試料５０μｌをプレートの各ウェルに加えた。ラット抗ＭＢＰモノクローナル抗体（ａｂ７３４９、Ａｂｃａｍ）を対照として用いた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。１：４０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗全抗ラットＩｇＧ（Ａ９０３７、Ｓｉｇｍａ）５０μｌを各ウェルの緩衝液中に加え、３７℃で１時間インキュベートした。０．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５回洗浄した後、テトラメチルベンジジン５０μｌを各ウェルに加え、暗所に５〜１５分間保管した。５０μｌ／ウェルの１０％リン酸により反応を停止させた。マイクロプレートリーダー、Ｖａｒｉｏｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を用いてＯＤ４５０値を測定した。
【０２２４】
ａｕｔｏＡｂ応答に関して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスには免疫優性領域が１つ、ＭＢＰ（１２４−１４７）が同定され；ＳＪＬマウスには２つ、ＭＢＰ（２４−４４）およびＭＢＰ（７２−１３９）が同定され；ＤＡラットには２つ、ＭＢＰ（４０−６０）およびＭＢＰ（１０７−１７０）が同定された。最後の２つは２つのフラグメントＭＢＰ（４３−６４）およびＭＢＰ（１１５−１７０）を含むヒトＭＳ患者と相関するものであり、ＥＡＥを誘導したＤＡラットにみられる免疫応答がヒトＭＳのモデルとして極めて重要であることを示唆している。ＭＳ患者およびＤＡラットともに最も免疫優性であった３種類のペプチド、ＭＢＰ（４６−６２）（「ＭＢＰ１」）、ＭＢＰ（１２４−１３９）（「ＭＢＰ２」）およびＭＢＰ（１４７−１７０）（「ＭＢＰ３」）をさらなる解析に選択した。Ｂｉｅｌｅｋｏｖａらによって記載されている結合力の高いミエリン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＢｉｅｌｅｋｏｖａ  Ｂら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７２：３８９３−９０４）が本試験で同定されたＭＢＰフラグメントと重複するＭＢＰペプチド１１１−１２９および１４６−１７０に対して反応性を有することは重要であり、これらのＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとの間に交差反応性があることを示している。
【０２２５】
実施例９−ＭＢＰ６３−８１で免疫感作したＥＡＥ  ＤＡラットは脳炎惹起性ＭＢＰペプチドおよびＣ末端ＭＢＰペプチドを認識する抗ＭＢＰ自己抗体を放出する
これまでにＧＰＢＰ（６２−８４）のみが、また程度は少ないにせよＧＰＢＰ（６８−８８）がＤＡラットにＥＡＥを誘導できることが示されている（Ｍｉｙａｋｏｓｈｉ  Ａ．ら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：６３７１−８）。しかし、脳炎惹起性ペプチド、ＭＢＰ（８１−１０４）がＭＳ評価に重要な役割を果たしていること（Ａｈａｒｏｎｉ  Ｒ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；９１：１３５−４６）を考えると、Ｃ末端ＭＢＰフラグメントおよびＭＢＰ脳炎惹起性領域に対する高レベルの自己抗体が再現可能な免疫感作プロトコルが望まれた。ＭＳの顕著な特徴であるエピトープ拡散がげっ歯類モデルのＥＡＥ発生機序に含まれるようにするため、本試験に使用したホモジネートから脊髄ホモジネートを排除した。
【０２２６】
簡潔に述べると、所望のＥＡＥ病理を得るため、ＤＡラットをペプチドＭＢＰ（６３−８１）で免疫感作した。免疫感作後のＤＡラットから得られた血清抗体の分析から、３種類のＭＢＰフラグメント、ＭＤＨＡＲＨＧＦＬＰＲＨ（配列番号６）、ＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶ（配列番号７）およびＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ（配列番号８）に対する自己抗体応答の増強が明らかになった。ＭＢＰエピトープライブラリーとの結合、さらには重複するペプチドの推定に基づく理論的計算により、ポリクローナルＩｇＧ抗ＭＢＰ自己抗体の特異性を判定した（図２Ａ）。ＥＡＥ  ＤＡラットの血清ａｕｔｏＡｂのＭＢＰ（６３−８１）に対する有意な活性は確認されなかった。ＭＢＰ（６３−８１）ペプチドを抗原として使用したことから、この結果はＤＡラットのＥＡＥ発症時にエピトープ拡散が起こったことを示唆するものである。この観察結果はほかにも、ＤＡラットの主要な脳炎惹起性ペプチド、ＭＢＰ（６２−７５）は免疫優性ではないとするＳｅｒｃａｒｚらのこれまでの知見（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＳｅｒｃａｒｚ  ＥＥら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９３；１１：７２９−６６）と一致している。
【０２２７】
同定されたＭＢＰエピトープのａｕｔｏＡｂ認識を定量化し、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏの配列を確認するため、免疫感作したＤＡラットから単離したポリクローナル血清抗ＭＢＰ抗体のビオチン化ＭＢＰペプチドに対する親和性を表面プラズモン共鳴により明らかにした（図２Ｂ）。完全長ＭＢＰタンパク質の効果的な解離定数（１．５×１０−８）はナノモルであることが明らかになり、同様にＭＢＰ脳炎惹起性フラグメント（９．６×１０−９）およびＣ末端フラグメント（８．４×１０−９）解離定数も同様であったことから、これらが主要なＢ細胞エピトープであることが確認された。ＭＤＨＡＲＨＧＦＬＰＲＨ（配列番号６）ペプチドとの結合は検出されなかったため、ＥＡＥ進行のバイオマーカーとして本試験でさらに評価することから除外した。
【０２２８】
表面プラズモン共鳴による測定はすべてＢｉａＣｏｒｅ  Ｔ−２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳ）で実施した。ビオチン化ＭＢＰペプチド（５０μｇ／ｍｌ）（図２に挙げられている）およびＭＢＰをそれぞれＳＡチップおよびＣＭ−５チップ上に固定化した。すべての手順を製造業者の推奨に従って実施した。いずれの測定時にもＨＢＳ−ＥＰ緩衝液の流速を１０μｌ／分に維持した。両チップとも標準的な結合／解離時間、３００／３００秒で抗体（５０μｇ／ｍｌ）を試験した。ＢｉａＣｏｒｅ  Ｔ−２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア１．０を用いて解離定数を計算した。
【０２２９】
実施例１０−マンノシル化ＳＵＶリポソームに封入したＭＢＰ由来Ｂ細胞エピトープの投与によりＭＳラットモデルのＥＡＥが有意に改善する
これまでにＬｅｗｉｓラットのＥＡＥの治療が、本明細書に提供されるものとは異なる封入ミエリン自己抗原を用いて実施されている（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＳｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｊ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；７３：９０−１００；ならびにＡｖｒｉｌｉｏｎｉｓおよびＢｏｇｇｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１；３５：２０１−１０を参照されたい）。一方、Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅｎのグループにより、ＳＪＬマウスにマンノシル化ＡＰＬ  Ｍ−ＰＬＰ１３９−１５１を投与するとＥＡＥに対するペプチド特異的寛容が誘導されることが示されている（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＬｕｃａ  ＭＥら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１６０：１７８−８７）。
【０２３０】
新たに同定されたＢ細胞ＭＢＰペプチド抗原を表面にマンノース残基を有する小さい一枚膜小胞（ＳＵＶ）リポソームに封入した。この方法の主な有益性は、リポソーム内部に免疫優性の非修飾ペプチドが本来の形態で存在するとともに、表面に露出したマンノースによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）への送達が増強されるという点にある。ＡＰＣの表面にはマンノース受容体が高レベルで存在し、マンノシル化リポソーム粒子の細胞質ゾル内へのエンドサイトーシスを増強する（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＫｅｌｅｒ  Ｔ．ら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００４；４：１９５３−６２）。これに対して、Ｄｕｒｏｖａらが「抗ＨＩＶワクチン」に関して記載しているように、マンノースを欠くカチオン性リポソームを投与すると抗体応答が有意に増大する可能性があり（開示全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＤｕｒｏｖａ  ＯＭら，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；４７：８７−９５）、自己寛容を誘発するには避けなければならない。
【０２３１】
卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）と１モルパーセントマンノシル化したＤＯＧ（ＭａｎＤＯＧ）（Ｄｕｒｏｖａ  ＯＭ、上記）との混合物からリポソームを構築した。ＳＵＶリポソームの構築は図３に示される通りに実施した：（ｉ）有機溶媒の蒸発により不規則な脂質層が形成した後、再水和により多層の多重膜小胞（ＭＬＶ）リポソームを形成し；（ｉｉ）高圧ホモジナイゼーションにより空のＳＵＶを形成し；（ｉｉｉ）ＳＵＶリポソームをペプチドとともに凍結乾燥させ（この段階ではペプチドが崩壊したＳＵＶリポソームの間に位置している）；（ｉｖ）２回目の再水和時に、平均直径約６０〜１００ｎｍ、表面にマンノース残基を１．０％含有するＳＵＶリポソーム内にペプチドが封入される。この試験には４種類の製剤、すなわち、各Ｂ細胞エピトープＭＢＰペプチド（ＭＢＰ１、ＭＢＰ２およびＭＢＰ３）の製剤および全３種類のペプチドの１：１：１混合物（質量比）の製剤を用いた。
【０２３２】
高圧ホモジナイゼーション（Ｄｕｒｏｖａ  ＯＭ、上記）により卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびマンノシル化ＤＯＧから小さい一枚膜小胞（ＳＵＶ）（モル比１：１００）を調製した（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＥｓｐｕｅｌａｓ  Ｓ．ら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｔｅｔｒａａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｍａｎｎｏｓｙｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃａｒｒｉｅｒｓ，２００３  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．，Ａｕｇ  ４；１３（１５）：２５５７−６０）。簡潔に述べると、ＣＨＣｌ３に溶かした脂質混合物（１００ｍｇ／ｍｌ）を真空下で乾燥させ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水にさらに再懸濁させて最終脂質濃度５０ｍｇ／ｍｌにした後、高圧ホモジナイゼーション（２０，０００ｐｓｉ（約１３８ＭＰａ））を実施した。得られたＳＵＶをペプチド（脂質とペプチドの比は３３０：１）および過剰の糖（ラクトースと脂質の比は３：１）と混合した後、凍結乾燥させた。制御された条件下で再水和した後、得られたＳＵＶリポソームを遠心分離によって洗浄し、組み込まれなかった材料を除去した。洗浄したペレットを必要な投与体積になるまでＰＢＳに再懸濁させた。Ｃ１８カラムにアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣに基づいて、ペプチドの組込みを推定した。分散液２０μｌを１ｍＭ  ＰＢＳまたはしかるべき媒質で必要な体積に希釈することによって、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰｌｕｓゼータサイザーでリポソームのｚ平均直径およびゼータ電位を２５℃にて測定した。
【０２３３】
４種類の製剤の治療効果の可能性を試験するため、誘導されたＥＡＥを発症しているＤＡラットに４種類のマンノシル化リポソーム製剤、コパキソン（陽性対照）、遊離（封入されていない）ＭＢＰ１ペプチド（陰性対照）および空のマンノシル化リポソーム（ビヒクル対照；表３）のうちのいずれか１つを皮下注射した。
【０２３４】
【表３】
0006014241.tif 000004
【０２３５】
各ラットの治療をＥＡＥ臨床症状の最初の徴候がみられた時点で開始した。表４に示される通り、リポソームＭＢＰ１およびＭＢＰ１／２／３ペプチド製剤による治療ではＥＡＥ誘導ＤＡラットの疾患スコアの最大値および累計値が有意に減少した。さらに、リポソームＭＢＰペプチドで治療した全グループでは、空のリポソームビヒクル（３／１７）で治療したグループに比して死亡率が低下した（ＭＢＰ２  ＳＵＶ−１／１１；全ＭＢＰ  ＳＵＶ−１／５４）。このほか、遊離ＭＢＰ１で治療したグループで１個体が死亡したＭＢＰ１（１／１５）。
【０２３６】
【表４】
0006014241.tif 000005
【０２３７】
図４に示される通り、各治療群の平均疾患スコアおよびグリオーシス／脱髄の比を求めた。図に示される通り、ＭＢＰ１のリポソーム製剤による治療では初回発作時に疾患スコア最大値が最も大きく減少した（パネル４Ａ）。ＭＢＰ２およびＭＢＰ３リポソーム製剤による治療では寛解段階での疾患進行が抑制された（パネル４Ｃおよび４Ｄ）。ＭＢＰペプチド全３種類の混合物のリポソーム製剤の投与では持続性のＥＡＥが有意に改善し、疾患プロファイルの全体的な減少がみられた（パネル４Ｅ）。
【０２３８】
遊離ＭＢＰ１ペプチドによる治療では何ら有益な効果が得られなかった（パネル４Ｇ）のに対して、コパキソン治療ではＭＢＰ１／２／３  ＳＵＶ製剤による治療とほぼ同じＥＡＥ改善率が得られた（パネル４Ｆ）。しかし、コパキソン治療では初回発作後に完全な回復はみられず、これはリポソームＭＢＰ１／２／３  ＳＵＶ製剤で治療したラットでも同じであった。以上のデータは代表的なヘマトキシリン／エオシン染色およびグリオーシス／脱髄スコアの計算によるものである（図４、右パネル）。さらに、ＭＢＰ１およびＭＢＰ１／２／３  ＳＵＶでは最大疾患スコアの中央値および累計疾患スコアの中央値がともに有意に減少し、両製剤の治療効果の可能性が示唆された（表４）。
【０２３９】
実施例１１−リポソームＭＢＰペプチドはＣＮＳにおけるＴｈ１サイトカインのダウンレギュレーションおよびＢＤＮＦ産生の誘導によってＥＡＥ発症を阻害する
リポソーム封入ＭＢＰペプチドによる治療後のＥＡＥ誘導ＤＡラットの免疫状態を検討するため、実施例１０に記載される通りに治療したラットから単離した血清の抗ＭＢＰ抗体およびＣＮＳサイトカイン染色を分析した（図５）。リポソーム封入ＭＢＰペプチドで治療したラットの血清に、ビヒクル陰性対照で治療したラットの血清に比して抗ＭＢＰ  ａｕｔｏＡｂ濃度の有意な減少が観察された（図５Ａ）。同定された主要なＭＢＰ  Ｂ細胞エピトープの両方に特異的な自己抗体の濃度は完全長ＭＢＰに対して反応性の自己抗体と同様であった。いずれのリポソーム製剤にもＭＢＰ（８１−１０３）エピトープは存在しなかったが、このエピトープを認識する自己抗体の濃度が完全長ＭＢＰタンパク質を認識する自己抗体と同程度に減少したことは注目に値する。したがって、この観察された効果は血流中の病原性抗体の初期の中和では説明できないものである可能性があるとの結論が導かれる。
【０２４０】
本明細書に記載されるＭＢＰペプチド組成物は、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの重複により、部分的には自己反応性Ｔ細胞が関与する機序を介して作用する可能性がある（内容全体があらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれるＢｅｌｏｇｕｒｏｖ  Ａ．ら，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２００９；３１：１１６１−７１）。この可能性を検討するため、実施例１０に記載される通りに治療したＥＡＥ誘導ＤＡラットの試料にＴｈ１サイトカインの染色を実施した（図５Ｂ）。リポソームＭＢＰペプチド製剤で治療したラットでＩＬ−２およびＩＦＮγのレベルが有意にダウンレギュレートされることが明らかになり（表５）、設計した製剤が抗炎症薬として機能することが示唆された。リポソームＭＢＰペプチド組成物で治療したＥＡＥ誘導ＤＡラットにはこのほか、脱髄の減少が観察された。この観察結果にはＢＤＮＦ産生の増強との間に相関がみられ（図５Ｂ）、リポソームに閉じ込めたＭＢＰペプチドが、ＢＤＮＦ発現をアップレギュレートすることが知られているコパキソン（Ａｈａｒｏｎｉ  Ｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００３；１００：１４１５７−６２）と同様の機序を介して機能することが示唆された。
【０２４１】
【表５】
0006014241.tif 000006
【０２４２】
組織学的分析およびサイトカイン染色を以下の通りに実施した。ラットの脊髄を採取し、パラフィンに包埋して薄切し、Ｈ＆Ｅおよびルクソールファーストブルー（ＬＦＢ）で染色した。組織学的パラメータは以下の通りである：グリオーシスの等級（スコアリングの等級０〜３；０はグリオーシスなし、１は軽度のグリオーシス（細胞数５〜１０以下）、２は中等度のグリオーシス（病巣当たりの細胞数１０〜５０）、３は重度のグリオーシス（病巣当たりの細胞数５０超）にそれぞれ対応する。脱髄スコアは０〜３の等級に分けられ；０は脱髄なし、１は軽度の脱髄、２は中等度の脱髄、３は重度の脱髄にそれぞれ対応する。製造業者のプロトコルに従ってＩＬ−２、ＩＦＮガンマおよびＢＤＮＦサイトカインの染色を実施した。
【０２４３】
本試験は、ヒトＭＳ患者でも同定されるＭＢＰの２つの免疫優性領域をＥＡＥ誘導ＤＡラットで同定するものである。マンノシル化リポソームに封入した場合、この２つの免疫優性領域に対応するペプチドの投与により、ＤＡラットのＥＡＥが有意に抑制され、初回発作が軽減され、増悪からの回復が増強される。この組成物はＴｈ１サイトカインをダウンレギュレートし、ＢＤＮＦ発現を誘導し、抗ＭＢＰ  Ａｂ産生を阻害することがわかった（表５）。理論に束縛されるものではないが、この治療効果をもたらす１つの作用機序として、ＭＢＰペプチドを付加したリポソームの表面に存在するマンノース残基によりリポソーム封入ＭＢＰペプチドのＡＰＣ細胞内への取込みが増大することによりミエリン塩基性タンパク質に対する寛容の誘導が増大し、その結果疾患が改善することが考えられる。ここで観察されたリポソーム封入ＭＢＰフラグメントがＤＡラットのＥＡＥ疾患進行に及ぼす有益な効果は、ＥＡＥ誘導ＤＡラットとＭＳ患者との間の免疫学的類似性とともに、ＭＳ治療の新規な治療法を示唆するものである。
【０２４４】
実施例１２−ＭＳラットモデル（ＤＡ−ＥＡＥ−２８−０１）におけるリポソーム封入ＭＢＰペプチドの治療効果
ＭＳ治療におけるＭＢＰ  Ｂ細胞エピトープペプチドの使用を評価するため、ＥＡＥ誘導ＤＡラットを用いて試験を実施した。この試験の目的には以下に挙げるものを含めた：雌Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラットの急性ＥＡＥモデルを用いることにより、１）ＭＢＰ１ペプチドの治療効果を裏付けること；２）ＳＵＶ封入がさらなる治療利益をもたらすかどうかを判定すること；３）ＭＳＬベースのＳＵＶ製剤がさらなる治療利益をもたらすかどうかを判定すること；４）ＭＢＰ１の隣接領域の付加がＳＵＶの混合様式にさらなる有益性をもたらすかどうかを判定すること；５）ＭＢＰ１の隣接領域の付加がＭＳＬベースのＳＵＶの混合様式にさらなる有益性をもたらすかどうかを判定すること；６）ＳＵＶ  ＭＳＬ製剤でのＭＢＰ１／ＭＢＰ１ＦＬ／ＭＢＰ１ＦＲの活性を比較すること。
【０２４５】
評価する７種類の製剤をそれぞれ凍結乾燥粉末として準備し、４℃で保管した。グループの毎日の投与の再水和を表６に従って注射用水で実施した。ＭＢＰペプチド製剤を注射用水（Ｃｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）に再懸濁させ、コパキソン（Ｔｅｖａ  ＬＴＤ）を生理食塩水で最終濃度１５０μｇ／ｍＬに希釈した。各対象個体に被験製剤を６日間連続で皮下注射により投与した。
【０２４６】
【表６】
0006014241.tif 000007
【０２４７】
体重１２５〜１４５グラムの９週齢Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）雌ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を試験対象として用いた。この試験に用いるラットの健康状態を到着時に検査した。健康状態が良好なラットのみを実験室の条件に馴化させ試験に用いた。ラットにはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｔｅｋｌａｄ）および飲用水を自由摂取させた。２０℃〜２４℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間／１２時間の明／暗サイクルに制御された環境でラットを飼育した。ラットをそれぞれの試験群に無作為に割り付けた。この試験はアサーフハロフェ医療センター（Ａｓｓａｆ  Ｈａｒｏｆｅｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の実験動物の倫理的な管理および使用のための委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、Ｂｅｅｒ  Ｙａａｋｏｖ、倫理委員会番号：６８／２００９による審査を受けたのち実施されたものである。
【０２４８】
ＥＡＥの誘導には、ＣＦＡ（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ）と混合した生理食塩水（１：１）に溶かしたＭＢＰ（６３−８１）（ＡＮＡＳＰＥＣ）５０μｇとＭｔ（Ｈ３７  ＲＡ株；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）１ｍｇとを含有する総体積２００μｌの接種材料をラットの尾基底の皮内に注射した。
【０２４９】
免疫感作２４時間後からラットを毎日評価した。免疫感作８日後、５０％超のラットに麻痺の徴候が発現した。治療開始にあたって、ＭＳの症状を示す個体を９つのグループに分けた。治療前、各グループ２個体から血液を採取した。免疫感作９日後および１０日後、ラット６０個体のうち５５個体に麻痺の徴候が発現した。
【０２５０】
ＥＡＥ誘導７〜１０日後、５４個体を９つのグループ（各グループ６個体）に分け、治療開始前に各グループ２個体から血液を採取した。表７に従って各ラット群に製剤による治療を１日１回、６日間連続で実施した。製剤は腹側下部への皮下注射により投与した。最後の注射の２４時間後、ラット全個体から血液を採取した。ＥＡＥ誘導後第２８日までラットを飼育し評価した。試験期間中、毎日臨床スコアを付けた。ＥＡＥ誘導２８日後、ラットを屠殺し、ラットの心臓から血漿および血清を採取した。４％ＰＦＡでラットを灌流し、脳および脊髄を採取して４％ホルムアルデヒドで固定した。
【０２５１】
【表７】
0006014241.tif 000008
【０２５２】
全試験期間を通じて、ラットを個体ごとに観察し臨床徴候を記録した。観察項目には被毛、眼球、呼吸数、発声、麻痺、活動および行動パターンの変化を含めた。各個体のＭＳによる麻痺の徴候を表８の基準に従って毎日スコア化した。全試験期間を通じて各個体の体重を毎日計測した。麻痺スコアが２以上のラットには全個体とも毎日、水２ｍｌおよび水で十分に湿らせたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｔｅｋｌａｄ）２ｍｌを強制給餌針により摂取させた。
【０２５３】
【表８】
0006014241.tif 000009
【０２５４】
生存段階での血液採取：生きたラットの眼窩静脈洞から血液を採取した。血液はＥＤＴＡ管および２ｍＬエッペンドルフ管の２種類の管に採取した。各個体の分離した血漿および血清をＥＬＩＳＡによりサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＧＦ−ベータの濃度についてさらに評価した。収量段階での血液採取：屠殺直後、ラットの心臓から血液をＥＤＴＡ管および２ｍＬエッペンドルフ管の２種類の管に採取した。血清および血漿を分離し、−２０℃で保管した。
【０２５５】
屠殺後、４％ＰＦＡ  ０．５Ｌで灌流した。血液採取直後、脈管系を生理食塩水２０ｍＬで洗浄し、右心房から１８０〜２００ｍｍＨｇを用いてＰＦＡ  ０．５Ｌを灌流した。各個体の脳および脊髄を採取し、４％ホルムアルデヒドで固定した。組織をトリミングしてパラフィンで包埋し、厚さ約５ミクロンに薄切し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＰＡＳ染色で染色した。
【０２５６】
結果
表９にまとめる通り、遊離ＭＢＰ１（グループ１；１／６、グループ２；１／６およびグループ３；２／６）、コパキソン（グループＶＩＩＩ；２／６）およびＷＦＩ（グループＩＸ；２／６）で治療したグループに死亡例がみられた。これに対して、で治療したグループ（それぞれグループＩＶ〜ＶＩＩ）のラットには死亡例はみられなかった。
【０２５７】
【表９】
0006014241.tif 000010
【０２５８】
治療３日後および４日後、Ｂ細胞エピトープペプチドＭＢＰ１／ＭＢＰ１ＦＬ／ＭＢＰ１ＦＲのマンノシル化リポソーム製剤で治療したラット（グループＩＶ）に他のグループに比して麻痺スコアの統計的に有意な減少が観察された（図６Ａ；（ｘ））。
【０２５９】
馴化期間中、体重増加は全個体とも通常の予測値の範囲内にあることがわかった。疾患ピーク時、全グループの個体に体重減少が観察された。疾患ピーク後の期間中、全グループに体重増加が認められた。いずれの体重測定値についても治療群と対照群との間に統計的有意差はみられなかった（図７）。
【０２６０】
治療前と治療後および被験製剤で治療したグループ間にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＧＦ−ベータのレベルの統計的有意差は認められなかった。ＭＢＰペプチド製剤治療群と対照群との間のサイトカインレベルの差の比較に統計的な有意性はみられなかった。
【０２６１】
製剤Ｉ〜ＩＸで治療したＥＡＥ誘導ラットの有髄化を評価するため、組織学的検査を１人の病理学者により盲検的に、すなわち、いずれの個体をいずれの製剤で治療したかを知らせずに実施した。その結果を未治療個体の組織学的検査の結果と比較した。
【０２６２】
簡潔に述べると、全スライドをＨＥ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）およびルクソールファーストブルー（ＬＦＢ）染色で染色した。病変の性状を特徴付ける組織学的パラメータを選択した。以下の尺度に従ってグリオーシスを０〜３にスコア化した：０＝グリオーシスなし、１＝軽度のグリオーシス（細胞数５〜１０以下）、２＝中等度のグリオーシス（病巣当たりの細胞数１０〜５０）および３＝重度のグリオーシス（病巣当たりの細胞数５０超）。以下の尺度に従って脱髄を０〜３にスコア化した：０＝脱髄なし、１＝軽度の脱髄、２＝中等度の脱髄および３＝重度の脱髄。病巣がほかにも存在する場合、それも記録した。
【０２６３】
各グループから無作為に選択した２個体の脊髄の組織病理学的分析では、分析した全ラットにグリオーシスの出現が認められた。しかし、グループＩＶ（マンノシル化リポソームに封入したＭＢＰ１／ＭＢＰ１ＦＬ／ＭＢＰ１ＦＲ）の両個体およびグループＶ（未修飾リポソームに封入したＭＢＰ１／ＭＢＰ１ＦＬ／ＭＢＰ１ＦＲ）の１個体には他のグループに比して有髄化の有意な改善がみられた。例示的なＨ＆Ｅ染色パターンを図８Ａ〜８Ｃに示す。
【０２６４】
この試験は、マンノシル化リポソームに一緒に封入したＢ細胞エピトープペプチド、ＭＢＰ１、ＭＢＰ１ＦＬおよびＭＢＰ１ＦＲの投与により、ＭＳげっ歯類モデルの麻痺の統計的に有意な減少がもたらされることを示している。この試験は、リポソーム（ペプチドと脂質の比が１：３３０の１％モルマンノシル化脂質組成物）製剤にした各種ペプチド配列、ＭＢＰ１、ＭＢＰ１ＦＬおよびＭＢＰ１ＦＲの効果を検討するものである。全３種類のペプチドのリポソーム製剤では、個々のペプチド単独の製剤（グループ２、３、６および７）および陰性対照（グループ９）に比して有意に効果的な反応がみられる（グループ４）。比較から、１％モルマンノース脂質を含まないリポソーム組成物に一緒に封入した３種類のペプチド（グループ５対グループ４）では有意な効果がみられず、マンノシル化脂質を含むことによって反応が増強されることが示される。ＭＢＰ１ペプチド単独（グループ１）または同ペプチドのリポソーム製剤（グループ２）では総合的な疾患スコアに差はみられないが、各グループから無作為に選択した２個体から採取した脊髄のグリオーシスおよび有髄化の組織病理学的分析では、ＭＢＰ１ペプチド単独のリポソーム製剤（グループ２）に病理学的結果の改善を示す低い脱髄スコアがみられた。最も優れた（すなわち、最低点の）脱髄スコアは全３種類のＭＢＰペプチドのリポソーム製剤の投与（グループ４）によって得られたものであり、ほかにも総合的な疾患スコアの有意な改善がもたらされた。
【０２６５】
実施例１３−ＭＳラットモデル（ＤＡ−ＥＡＥ−２８−０２）におけるリポソーム封入ＭＢＰペプチドの治療効果
ＭＳ治療におけるＭＢＰ  Ｂ細胞エピトープペプチドの使用をさらに評価するため、ＥＡＥ誘導ＤＡラットを用いて試験を実施した。ＭＳのＥＡＥ誘導ＤＡラットモデルを用いて、ＭＢＰペプチド、ＭＢＰ１、ＭＢＰ１ＦＬ、ＭＢＰ１ＦＲ、ＭＢＰ２およびＭＢＰ３の種々の組合せのマンノシル化リポソーム製剤の治療効果の可能性を上に記載した通りに試験した。
【０２６６】
８種類のＭＢＰペプチド製剤をそれぞれ凍結乾燥粉末として準備し、４℃で保管した。注射用水による各製剤の再水和を表１０に従って毎日実施した。ＭＢＰペプチド製剤を注射用水（Ｃｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）に再懸濁させ、コパキソン（Ｔｅｖａ  ＬＴＤ）を生理食塩水で最終濃度４５０μｇ／ｍＬに希釈した。各対象個体に被験製剤を６日間連続で皮下注射により投与した。
【０２６７】
【表１０】
0006014241.tif 000011
【０２６８】
体重１１０〜１４５グラムの８〜９週齢Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）雌ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を試験対象として用いた。この試験に用いるラットの健康状態を到着時に検査した。健康状態が良好なラットのみを実験室の条件に馴化させ研究に用いた。ラットの食餌および飲水を自由摂取とした。２０℃〜２４℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間／１２時間の明／暗サイクルに制御された環境でラットを飼育した。ラットをそれぞれの試験群に無作為に割り付けた。この試験はアサーフハロフェ医療センター（Ａｓｓａｆ  Ｈａｒｏｆｅｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の実験動物の倫理的な管理および使用のための委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、Ｂｅｅｒ  Ｙａａｋｏｖ、倫理委員会番号：８３０＿ｂ２４５１＿６による審査を受けたのち実施されたものである。
【０２６９】
ＥＡＥの誘導には、ＣＦＡ（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ）と混合した生理食塩水（１：１）に溶かしたＭＢＰ（６３−８１）（ＡＮＡＳＰＥＣ）５０μｇとＭｔ（Ｈ３７  ＲＡ株；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）１ｍｇとを含有する総体積２００μｌの接種材料をラットの尾基底の皮内に注射した。
【０２７０】
免疫感作２４時間後からラットを毎日評価した。免疫感作９日後、５０％超のラットに麻痺の徴候が発現した。治療開始にあたって、ＭＳの症状を示す個体を１０のグループに分けた。治療前、各グループ２個体から血液を採取した。免疫感作９日後および１１日後、ラット６０個体のうち５４個体に麻痺の徴候が発現した。
【０２７１】
ＥＡＥ誘導９〜１１日後、５４個体を１０のグループ（各グループ５〜６個体）に分け、治療開始前に各グループ２個体から血液を採取した。表１１に従って各ラット群に製剤による治療を１日１回、６日間連続で実施した。ＥＡＥ誘導後第２８日までラットを飼育し評価した。試験期間中、毎日臨床スコアを付けた。ＥＡＥ誘導２８日後、イソフルランを用いてラットを屠殺した。屠殺直後、ラットの心臓から血液を採取した。血清および血漿を分離し、−２０℃で保管した。４％ＰＦＡでラットを灌流し、脳および脊髄を採取して４％ホルムアルデヒドで固定した。
【０２７２】
【表１１】
0006014241.tif 000012
【０２７３】
全試験期間を通じて、１日１回、ラットを個体ごとに観察し臨床徴候を記録した。観察項目には被毛、眼球、呼吸数、発声、麻痺、活動および行動パターンの変化を含めた。各個体のＭＳによる麻痺の徴候を表８の基準に従って毎日スコア化した。全試験期間を通じて各個体の体重を毎日計測した。麻痺スコアが２以上のラットには全個体とも毎日、水２ｍｌおよび水で十分に湿らせたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｔｅｋｌａｄ）２ｍｌを強制給餌針により摂取させた。
【０２７４】
結果
表１２にまとめる通り、遊離リポソーム封入ＭＢＰ２（グループＶ；１／６）、コパキソン（グループＩＸ；１／５）およびＷＦＩ（グループＸ；１／５）で治療した各グループのラット１個体が死亡した。
【０２７５】
【表１２】
0006014241.tif 000013
【０２７６】
治療２日後および３日後、高投与量のリポソーム封入ＭＢＰ１ペプチドで治療したラット（グループＩＶ）に水対照（グループＸ）に比して麻痺スコアの統計的に有意な減少が観察された（図１０（Δ））。
【０２７７】
馴化期間中、体重増加は全個体とも予測される値の範囲内にあることがわかった。疾患ピーク時、全グループの個体に体重減少が観察された。疾患ピーク後の期間中、全グループの個体に体重増加が認められた。リポソーム封入ＭＢＰペプチド投与群と対照群との間に統計的有意差はみられなかった（図１１）。
【０２７８】
この試験は、グループ２を除いて、単一のリポソーム製剤（１％モルマンノース脂質組成物およびペプチドと脂質の比が１：３３０）を試験し、種々のＢ細胞エピトープＭＢＰペプチドおよびその組合せの治療効果を検討したものである。リポソーム封入ＭＢＰ（４６−６２）２００μｇ（名目値）で治療したラット（グループ４）に陰性対照に比して麻痺の統計的に有意な減少が観察されたことは注目に値する。さらに、治療４日後および５日後、リポソーム封入ＭＢＰ（４６−６２）２００ｍｇで治療したラット（グループ４）にはコパキソン治療ラット（グループ９）に比して統計的有意差（傾向）は観察されなかった。
【０２７９】
この試験で観察された疾患重症度プロファイルには明確な初期段階と再発段階がみられた。同じ投与量（５０μｇ／日）のリポソーム封入単一ＭＢＰペプチドで治療したラットの結果を比較したところ、疾患初期段階にはＭＢＰ（４６−６２）の投与（グループＩＩＩ）が最も治療利益が高いのに対して、疾患再発段階にはリポソーム封入ＭＢＰ（１２４−１３９）（グループＶ）またはＭＢＰ（１４７−１７０）（グループＶＩ）の投与が最も治療利益が高いことがわかった。この偏りは絶対的なものとして観察されたわけではなく、高投与量のリポソーム封入ＭＢＰ（４６−６２）の投与（グループ４）が両疾患段階とも最も効果的であったことから、ペプチド投与量によって否定され得るものである。複数のＭＢＰペプチドを含有するリポソーム製剤の治療利益は、おそらく各ペプチドの投与量が低いことから解釈がさらに難しくなる。ペプチドと脂質の比を変えて製剤化した同じペプチドに使用については（グループＩとＩＩを比較されたい）、総合的な疾患重症度スコアの差は観察されなかった。
【０２８０】
実施例１４−ＭＳラットモデル（ＤＡ−ＥＡＥ−２８−０５）におけるリポソーム封入ＭＢＰペプチドの治療効果
ＭＳ治療におけるＭＢＰ  Ｂ細胞エピトープペプチドの使用をさらに評価するため、ＥＡＥ誘導ＤＡラットを用いて試験を実施した。この試験の目的には以下に挙げるものを含めた：１）ＭＢＰ１単独およびＭＢＰ１／２／３のリポソーム製剤がＭＳラットモデルに治療利益をもたらすことをさらに裏付けること；および２）リポソームＭＢＰ製剤の投与量およびペプチドと脂質の比を変えて治療効果を検討すること。
【０２８１】
評価する４種類のＭＢＰペプチド製剤をそれぞれ凍結乾燥として準備し、４℃で保管した。各製剤を表１３に従って注射用水で再水和した。コパキソン（Ｔｅｖａ  ＬＴＤ）を生理食塩水で最終濃度７２０μｇ／ｍＬに希釈した。各対象個体に被験製剤を６日間連続で皮下注射により投与した。
【０２８２】
【表１３】
0006014241.tif 000014
【０２８３】
体重１１０〜１４５グラムの８〜９週齢Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）雌ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を試験対象として用いた。この試験に用いるラットの健康状態を到着時に検査した。健康状態が良好なラットのみを実験室の条件に馴化させ試験に用いた。ラットの食餌および飲水を自由摂取とした。２０℃〜２４℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間／１２時間の明／暗サイクルに制御された環境でラットを飼育した。ラットをそれぞれの試験群に無作為に割り付けた。この試験はＳｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｃｔｉｏｎ  ＬＴＤ社（Ｒｅｈｏｖｏｔ）の実験動物の倫理的な管理および使用のための委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、倫理委員会番号：ＩＬ−１０−１１−１０９による審査を受けたのち実施されたものである。
【０２８４】
ＥＡＥの誘導には、ＣＦＡ（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ）と混合した生理食塩水（１：１）に溶かしたＭＢＰ（６３−８１）（ＡＮＡＳＰＥＣ）５０μｇとＭｔ（Ｈ３７  ＲＡ株；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）１ｍｇとを含有する総体積２００μｌの接種材料をラットの尾基底の皮内に注射した。
【０２８５】
免疫感作２４時間後からラットを毎日評価した。免疫感作６〜１０日後、ラット５０個体のうち４２個体に麻痺の徴候が発現した。治療開始にあたって、ＭＳの症状を示す個体を７つのグループ（各グループ６個体）に分けた。表１４に従って各ラット群に製剤による治療を１日１回、６日間連続で実施した。製剤は腹側下部への皮下注射により投与した。最後の注射の２４時間後、ラット全個体から血液を採取した。ＥＡＥ誘導後第２８日までラットを飼育し評価した。試験期間中、毎日臨床スコアを付けた。ＥＡＥ誘導２８日後、ラットを屠殺し、ラットの心臓から血漿および血清を採取した。４％ＰＦＡでラットを灌流し、脳および脊髄を採取して４％ホルムアルデヒドで固定した。
【０２８６】
【表１４】
0006014241.tif 000015
【０２８７】
全試験期間を通じて、１日１回、ラットを個体ごとに観察し臨床徴候を記録した。観察項目には被毛、眼球、呼吸数、発声、麻痺、活動および行動パターンの変化を含めた。各個体のＭＳによる麻痺の徴候を表８の基準に従って毎日スコア化した。全試験期間を通じて各個体の体重を毎日計測した。
【０２８８】
結果
この試験では、ＥＡＥ誘導後２８日までに死亡したラットはみられなかった。
【０２８９】
治療後１〜４日、１：３３０で製剤化したＭＢＰ１ペプチド（ペプチド：脂質；グループ２）、１：３３０で製剤化したＭＢＰ１／２／３ペプチド（ペプチド：脂質；グループ３）および１：１１０で製剤化したＭＢＰ１／２／３ペプチド（ペプチド：脂質；グループ５）でそれぞれ治療したラットに水対照（グループ１）に比して麻痺スコアの統計的に有意な減少が観察された（図１２）。コパキソンで治療したラット（グループ６および７）には水対照（グループ１）に比して麻痺の統計的有意差（傾向）は観察されなかった。
【０２９０】
馴化期間中、体重増加は全個体とも予測値の範囲内にあることがわかった。疾患ピーク時、全グループの個体に体重減少が観察された。疾患ピーク後の期間中、全グループの個体に体重増加が認められた。リポソーム封入ＭＢＰペプチド投与群と対照群との間に統計的有意差はみられなかった（図１３）。
【０２９１】
この試験は、リポソームで製剤化したＢ細胞エピトープペプチドＭＢＰ１およびリポソームで一緒に製剤化したＢ細胞エピトープペプチドＭＢＰ１／２／３による治療がＭＳのラットモデルに統計的に有意な治療利益をもたらすことを示している。脂質に対するペプチドの比が大きくなると、ＭＢＰ１／２／３を一緒に製剤化した製剤の方がＭＢＰ１ペプチド単独よりも治療利益が高くなると思われる。逆に、脂質に対するペプチドの比が小さくなると、ＭＢＰ１単独の製剤の方がＭＢＰ１／２／３を一緒に製剤化した製剤よりも治療利益が高くなると思われる。しかし、いずれの場合も、リポソームで製剤化したＭＢＰ１ペプチドの方が、再発寛解型多発性硬化症の治療に承認されている治療剤、コパキソンよりも高い治療利益をもたらした。
【０２９２】
本明細書に記載される実施例および実施形態は単に例示を目的とするものであり、これらを踏まえた様々な修正または変更が当業者に示唆され、本願の趣旨および範囲ならびに添付の「特許請求の範囲」の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用される刊行物、特許および特許出願はすべて、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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