(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト対象における寄生虫症を治療する、または予防する、または遅らせるための、免疫原性を示すＬ５供給源および／または免疫原性を示すＬ３供給源の使用であって、
前記Ｌ３供給源が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ３供給源が、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
前記Ｌ５供給源が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ５供給源が、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
２つのアミノ酸配列の類似性は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ  Ｘを用いて、１つのポリペプチドの前記アミノ酸配列とその保存的アミノ酸置換を、第二のポリペプチドの前記配列と比較することにより決定され、前記第二のポリペプチドは、それと類似性が決定されるべき前記配列番号で定義される、
使用。
【請求項２】
免疫原性を示すＳ４および／またはＳ６供給源がＬ３および／若しくはＬ５供給源と併用され、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３２と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である；
ならびに／または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
非ヒト対象における寄生虫症を治療する、または予防する、または遅らせるための免疫原性を示すＳ６供給源の使用であって、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される、使用。
【請求項４】
アジュバントが存在する請求項１から３の何れか１項に記載の使用。
【請求項５】
請求項１または２において定義された前記Ｌ３供給源および／またはＬ５供給源および／またはＳ４供給源および／またはＳ６供給源はワクチンである請求項１から４の何れか１項に記載の使用。
【請求項６】
請求項１または２において定義された前記Ｌ３供給源および／またはＬ５供給源および／またはＳ４供給源および／またはＳ６供給源は、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、核酸である請求項１から５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記アジュバントがＴｈ１促進アジュバントである請求項４から６の何れか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ  ＯＤＮである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
免疫原性を示すＬ３供給源および／若しくは免疫原性を示すＬ５供給源を含む医薬若しくは診断組成物であって、
前記Ｌ５供給源が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ５供給源が、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
前記Ｌ３供給源が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ３供給源が、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される組成物。
【請求項１０】
免疫原性を示すＳ４供給源および／若しくは免疫原性を示すＳ６供給源が前記組成物に含まれており、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３２と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である；
ならびに／または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
免疫原性を示すＳ６供給源を含むか、若しくはそれから成る医薬若しくは診断組成物であって、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される組成物。
【請求項１２】
アジュバントをさらに含む請求項９から１１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントがＴｈ１促進アジュバントである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ  ＯＤＮである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容されるアジュバントおよび／または担体をさらに含む請求項９から１４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
対象における寄生虫症を治療する、または予防する、または遅らせるための請求項９から１５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物がワクチンである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
対象から得られた試料における寄生虫症をインビトロで診断するための免疫原性を示すＬ３供給源および／若しくは免疫原性を示すＬ５供給源の使用であって、
前記Ｌ５供給源が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ５供給源が、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
前記Ｌ３供給源が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ３供給源が、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される使用。
【請求項１９】
免疫原性を示すＳ４供給源および／若しくは免疫原性を示すＳ６供給源がさらに使用され、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３２と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である；
ならびに／または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
対象から得られた試料における寄生虫症をインビトロで診断するための免疫原性を示すＳ６供給源の使用であって、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価される使用。
【請求項２１】
前記Ｌ３供給源および／またはＬ５供給源および／またはＳ４供給源および／またはＳ６供給源がリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種から得られる請求項１から８の何れか１項または請求項１８から２０の何れか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記リーシュマニア種は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａである請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記寄生虫症はリーシュマニア症またはマラリアである請求項１から８の何れか１項または請求項１８から２２の何れか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記寄生虫症は、リーシュマニアまたはマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種によって引き起こされる請求項１から８の何れか１項または請求項１８から２３の何れか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記寄生虫症は、前記Ｌ３供給源および／またはＬ５供給源および／またはＳ４供給源および／またはＳ６供給源の由来となる種とは異なる種によって引き起こされる請求項１から８の何れか１項または請求項１８から２４の何れか１項に記載の使用。
【請求項２６】
対象における寄生虫症を診断するためのアッセイデバイスであって、免疫原性を示すＬ３供給源および／若しくは免疫原性を示すＬ５供給源を含み、
前記Ｌ５供給源が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ５供給源が、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
前記Ｌ３供給源が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｌ３供給源が、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する核酸配列、および／若しくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価されるアッセイデバイス。
【請求項２７】
免疫原性を示すＳ４供給源および／若しくは免疫原性を示すＳ６供給源がさらにその中に存在する請求項２６に記載のアッセイデバイスであって、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、若しくは、
前記Ｓ４供給源が、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３２と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である；
ならびに／または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、若しくは、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価されるデバイス。
【請求項２８】
対象における寄生虫症を診断するためのアッセイデバイスであって、免疫原性を示すＳ６供給源を含むか、またはそれから成り、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列、および／若しくは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、
前記Ｓ６供給源が、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有するヌクレオチド配列、および／若しくは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、
類似性は、請求項１に示された通りに評価されるデバイス。
【請求項２９】
前記アッセイはＥＬＩＳＡである、請求項２６から２８の何れか１項に記載のアッセイデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫症を治療するため、予防するため、および／またはその診断に使用するための医薬品または薬剤を調製するためのＬ３および／またはＬ５供給源に関する。
【背景技術】
【０００２】
リーシュマニア症は、ヒトとイヌとを含めた種々の哺乳動物のマクロファージに主に感染するリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属に属する細胞内の寄生原生動物によって引き起こされるいくつかの疾患を含む。主に寄生生物の種およびヒト宿主の免疫能の状態に応じて、疾患のスペクトルは、自己回復する皮膚リーシュマニア症（ＣＬ）から致死的な内臓リーシュマニア症（ＶＬ）またはカラアザールまでにわたる（１８）。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍおよびＬ．ｃｈａｇａｓｉによって引き起こされるイヌの内臓皮膚リーシュマニア症（ＶＣＬ：ｖｉｓｃｅｒｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）は、地中海沿岸諸国において、中東において、およびラテンアメリカにおいて見出される重要な新興人畜共通感染症である（１６）；イヌはこれらの寄生生物の主要な保有宿主になっており、サシチョウバエ亜科スナバエによるヒトへの伝染において中心的な役割を果たしている（４４）。感染の転帰は、宿主免疫系と種々の寄生生物種との間の相互作用によって決定されるが、リーシュマニア症の発病は、未だ不明のままであり、ヒトおよびイヌにおけるリーシュマニアに対する免疫応答に関与する機構に関する知見は今でも限られている。一般に、防御免疫は、Ｔ細胞に由来するサイトカインによるマクロファージの活性化を誘導する古典的な細胞性免疫応答を伴う。他方では、非治癒性疾患は強力な体液性応答の発生を伴う（１５、２４）。
【０００３】
多様なアジュバントを使用したいくつかの実験モデルにおいてワクチン候補として試験されてきた種々の寄生生物の表面分子または分泌型分子を同定するために、粗製の寄生生物画分または定義済みの寄生生物抗原に基づく第２世代のワクチンを開発するための研究が取り組まれている（１、１７、２０、４３、４５、４６、４９、５０）。感染した動物またはヒトからの血清を用いた発現ライブラリーをスクリーニングすることによっても、数種の抗原を候補ワクチンとして選択することが可能になった（（９）に概説されている）。それらの中で、感染したマウスまたはヒト患者の細胞において主としてＴｈ１型の免疫応答を引き出すものは、それらの細胞位置に関係なく、種々の動物モデルにおける防御応答の発生に関係づけられている（４８、５１、５２）。他方では、単離された抗原のいくつかは、ＶＬに罹患しているヒトまたはイヌにおける体液性応答、または実験的に感染させたマウスにおけるＴｈ２媒介性体液性応答を主に刺激する細胞内の保存されたタンパク質である（３、３３、３５、３７、３９）。それらに対して誘導される、リーシュマニア症に罹患しているイヌにおける不適切な体液性応答は、主に免疫複合体の有害作用に起因して、免疫病理的状態、例えば、ぶどう膜炎（１３）、中枢神経系の病変（１４）または腎炎（２１、２２、３０、３１）などをもたらすと考えられている。ＶＬのヒトにおけるＩｇＧ免疫複合体の存在は、感染を消散させることができないことと相関することも最近示され、これは、免疫複合体が感染した宿主にとって有害であり得ることを実証している（２７）。
【０００４】
最初は優良なワクチン候補と考えられていなかったにもかかわらず、感染プロセスの間に高い体液性応答を誘導するタンパク質が、防御応答の誘導に関連づけられている。例えば、寄生生物のチューブリンおよびヒストンＨ２Ｂは、免疫ドナーに由来するＴ細胞クローンによって認識された（３６）。さらに、ｒＫ３９により、免疫マウス由来のＴ細胞による増殖およびＩＦＮ−γの産生が引き起こされる（２３）。寄生生物のＨ２Ｂ遺伝子、Ｈ３遺伝子およびＨ４遺伝子を用いて遺伝子免疫化することにより、マウスの内臓リーシュマニア症のモデルにおいて防御が誘導されることも示された（６２）。また、活性化Ｃキナーゼ（ＬＡＣＫ）（２９）、いくつかの寄生生物のシステインプロテイナーゼ（３８、４１）または寄生生物のヌクレオソーム形成ヒストン（１１、１９）の受容体を、Ｔｈ１促進アジュバントを投与して免疫化することにより、マウスモデルにおける皮膚リーシュマニア症に対する防御と相関する免疫応答が発生する。
【０００５】
進化的に保存されたリーシュマニアの抗原の中で、いくつかの証拠により、リボソームタンパク質が、リーシュマニアの感染の間に免疫学的に関連する分子であることが示唆されている。ある場合では、リボソームの構成要素が、感染の間に細胞活性およびサイトカインの放出を調節する力を通じて、宿主免疫系の機能障害に寄与し得る。したがって、Ｌ．ｍａｊｏｒのリボソームタンパク質であるＳ３ａのＢＡＬＢ／ｃマウスへの注入は、Ｂ細胞クローンの多クローン性増殖を誘導し、Ｔ細胞の増殖を阻害した（１０）。また、推定上の６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１をコードするＤＮＡワクチンを用いた遺伝的免疫化は、ＩＬ−１０サイトカインおよびＴｈ２サイトカインの誘導により、マウスモデルにおいて疾患を悪化させた（４１、６３）。さらに、寄生生物の酸性Ｐタンパク質のようないくつかの寄生生物のリボソームタンパク質は、リーシュマニア症に罹患しているイヌおよびヒトにおける強力な体液性応答の発生に関係している（（３９）に概説されている）。しかし、試験された幾つかのリボソームタンパク質は免疫原性の防御応答を誘導することができないか、または、得られた免疫原性の防御応答が最適以下であったことも示された（５５、４１）。
【０００６】
これまでの全ての試みにもかかわらず、依然としてリーシュマニア症などの寄生虫症に対して価値があるワクチンは存在しない。したがって、そのようなワクチンに対する大きなニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【０００７】
この研究において、我々は、驚いたことに、２種のＬ．ｍａｊｏｒのリボソームタンパク質であるＬ３およびＬ５が抗原性であることを示す。これは、これらの２種のタンパク質のそれぞれが、リーシュマニア症を患っている個体由来の血清によって認識されたことを意味する。さらに、皮膚リーシュマニア症のマウスモデルにおいて、ＩｇＧ１アイソタイプの抗Ｌ３抗体および抗Ｌ５抗体が見出された。ＣｐＧ−ＯＤＮの存在下において、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける両タンパク質の免疫化は、それらに対するＴｈ１応答を誘導した。ワクチン接種の結果、マウスは、Ｌ．ｍａｊｏｒの攻撃後におけるＣＬの発症から保護された。我々は、さらに、Ｌ．ｍａｊｏｒのタンパク質は、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓへの感染に対する保護作用を付与すること実証している。我々は、Ｌ３リボソームタンパク質およびＬ５リボソームタンパク質が、少なくとも種々のリーシュマニア種の間で高度に保存されていることも実証している。そのような組成物は、医薬組成物として、好ましくは診断法、ワクチン、または治療への適用として使用するのに非常に魅力的である。本発明を以下にさらに説明する。
【０００８】
使用
本発明の第１の側面において、対象における寄生虫症を治療または予防するための、Ｌ３および／またはＬ５の供給源、および任意に薬剤または医薬品を調製するためのアジュバントの使用が提供される。
【０００９】
Ｌ３タンパク質およびＬ５タンパク質は、リボソームタンパク質である。リボソームタンパク質は、よく保存された細胞質タンパク質である。したがって、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、植物または動物といった任意の真核生物から調製してよく、哺乳動物、は虫類、魚類、昆虫類、または原性生物といった染色体を有する任意の他の生物に由来してよい。好ましくは、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、進化系統樹上、疾病の原因となる生物に近い生物、好ましくは寄生虫症の原因となる生物に近い生物から取得される。したがって、寄生虫症の予防および／または治療において使用されるＬ３および／またはＬ５供給源の供給源として特に興味深いのは、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、特にトリパノソーマファミリーのメンバー、さらに特にトリパノソーマ科の原生動物であるリーシュマニアの種々の種のような原生動物である。リーシュマニアの既知の種は２０種を超え、それらとしては、Ｌ．ｍａｊｏｒを含めたＬ．ｍａｊｏｒコンプレックス、Ｌ．ｃｈａｇａｓｉと、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉと、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍとを含めたＬ．ｄｏｎｏｖａｎｉコンプレックス、Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓとＬ．ｍｅｘｉｃａｎａとを含めたＬ．ｍｅｘｉｃａｎａコンプレックスを含むリーシュマニア亜属、ならびにＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓと、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａとを含めたＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓコンプレックス、およびＬ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓとＬ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓとを含めたＬ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓコンプレックスを含むビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）亜種の種が挙げられる。特に興味深いマラリア原虫種は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘである。好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、リーシュマニア種から得られ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉおよび／またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓから得られることが好ましい。Ｌ３供給源は、リーシュマニア種から得られることがより好ましく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍおよび／またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  Ｍｅｘｉｃａｎａから得られることが好ましい。Ｌ５供給源は、リーシュマニア種から得られることがより好ましく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓおよび／またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａから得られることが好ましい。実施例２において、我々は、少なくとも３種の別個のリーシュマニア種において、高度に保存されたＬ３およびＬ５相同体（少なくとも９０％の同一性、表１参照）が存在することを実証した。別の好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、マラリア原虫種から得られる。Ｌ３および／またはＬ５の供給源は、ここにおいて同定されているいくつかの別個の生物体由来のＬ３および／またはＬ５供給源を混合することによって調製することもできることは、当業者には理解されよう。ワクチンにおけるＬ３および／またはＬ５供給源の使用は、処置された対象において免疫防御応答を誘導することが示されているので、魅力的な免疫原特性を有することがここに実証されている。
【００１０】
「Ｌ３および／またはＬ５供給源」という用語は、「Ｌ３のおよび／またはＬ５の供給源」に置き換えてもよい。Ｌ３および／またはＬ５供給源は、好ましくは、Ｌ３および／またはＬ５タンパク質、Ｌ３および／またはＬ５由来のペプチドもしくはタンパク質断片、および／または、Ｌ３および／またはＬ５タンパク質またはそれに由来するペプチドもしくはタンパク質断片をコードする核酸を含む。好ましいＬ３タンパク質は、配列番号１で表される。この好ましいＬ３タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒに由来しており、好ましくは配列番号２によりコードされる。別の好ましいＬ３タンパク質は、配列番号４８で表される。この好ましいＬ３タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍに由来しており、好ましくは配列番号４９によりコードされる。別の好ましいＬ３タンパク質は、配列番号５０で表される。この好ましいＬ３タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａに由来し、好ましくは配列番号５１によりコードされる。
【００１１】
好ましいＬ５タンパク質は、配列番号３で表される。この好ましいＬ５タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒに由来し、好ましくは配列番号４によりコードされる。別の好ましいＬ５タンパク質は、配列番号５２で表される。この好ましいＬ５タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍに由来し、好ましくは配列番号５３によりコードされる。別の好ましいＬ５タンパク質は、配列番号５４で表される。この好ましいＬ５タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａに由来し、好ましくは配列番号５５によりコードされる。別の好ましいＬ５タンパク質は、配列番号５６で表される。この好ましいＬ５タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓに由来し、好ましくは配列番号６５によりコードされる。
【００１２】
本願全体を通して、特定のヌクレオチド配列の配列番号（例として、配列番号２または４または４９または５１または５３または５５または６５を挙げる）に言及した場合、それを配列番号２または４または４９または５１または５３または５５または６５と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に置き換えてよい。
【００１３】
本願全体を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号（例として、配列番号１または３または４８または５０または５２または５４または５６を挙げる）に言及する場合、それを配列番号１または３または４８または５０または５２または５４または５６のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドで置き換えてよい。
【００１４】
したがって、好ましい実施形態において、Ｌ３供給源は、配列番号１または４８または５０のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有し、および／または、配列番号２または４９または５１と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１５】
したがって、好ましい実施形態において、Ｌ５供給源は、配列番号３または５２または５４または５６のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有し、および／または、配列番号４または５３または５５または６５と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１６】
したがって、好ましい実施形態において、Ｌ３供給源は、配列番号２または４９または５１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有し、および／または、配列番号１または４８または５０と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。
【００１７】
したがって、好ましい実施形態において、Ｌ５供給源は、配列番号４または５３または５５または６５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有し、および／または、配列番号３または５２または５４または５６と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸である。
【００１８】
好ましくは、特定の同定されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と少なくとも６０％の同一性または類似性を有する前記アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、本発明に包含され、コードされるタンパク質またはポリペプチド、タンパク質断片、ペプチドが、依然として、少なくとも配列番号１または３または４８または５０または５２または５４または５６によって得られる免疫応答を少なくともいくらかの程度で引き出すことができる場合、それは機能的であると言える。少なくともいくらかの程度とは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、７０％、８０％、少なくとも９０％または１００％を意味することが好ましい。免疫応答の誘発は、ここにおいて後で定義されている：化合物は、処置された対象において免疫応答を誘発できる場合、機能的であり、このことは、好ましくは、化合物は、所定の抗原であるＬ３および／またはＬ５に対するＴｈ１免疫応答を促進または誘発できること、および／または、皮膚または粘膜の病変の発症を予防および／または遅延させることができ、および／または皮膚および／または粘膜の病変において、および／または耳において、および／またはこれらの感染した領域（皮膚の領域、粘膜の領域、耳）のいずれかの排液をすることが好ましい流入領域リンパ節（ＤＬＮ）において、ならびに、内臓、例えば肝臓、脾臓、骨髄、腎臓、脳などにおいて寄生生物の負荷量（ｌｏａｄ）の有意な低下を誘導することを意味する。本発明に包含されるアミノ酸配列は、安定性、溶解性および免疫原性を増加させるために、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の置換および／または挿入および／または欠失および／または付加的なＮ末端またはＣ末端のアミノ酸または化学的部分を含んでよい。
【００１９】
ここで定義されているＬ３および／またはＬ５タンパク質断片またはＬ３および／またはＬ５由来のペプチドは、好ましくは、対応するＬ３および／またはＬ５タンパク質の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含み且つここにおいて前に定義されている通り免疫応答を引き出すことができる断片である。したがって、好ましい実施形態において、ここで定義されているＬ３および／またはＬ５タンパク質断片またはＬ３および／またはＬ５由来のペプチドは、好ましくは、配列番号１または３または４８または５０または５２または５４または５６の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む断片である。
【００２０】
好ましい実施形態として、好ましいＬ３タンパク質断片または好ましいＬ３由来のペプチドは、Ｌ３タンパク質のＣ末端部分の最後の４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれから成る。さらにより好ましくは、これは、配列番号１または４８または５０の最後の４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれから成る。さらにより好ましくは、これは、配列番号１のアミノ酸３９４−４１９を含むか、またはそれから成る。別の好ましい実施形態として、好ましいＬ５タンパク質断片または好ましいＬ５由来のペプチドは、Ｌ５タンパク質のＮ末端部分の最初の４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれから成る。さらにより好ましくは、これは、配列番号３または５２または５４または５６の最初の４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれから成る。さらにより好ましくは、これは、配列番号３のアミノ酸１−２３を含むか、またはそれから成る。別の好ましい実施形態として、好ましいＬ５タンパク質断片または好ましいＬ５由来のペプチドは、Ｌ５タンパク質のＣ末端部分の最後の４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれから成る。さらにより好ましくは、これは、配列番号３または５２または５４または５６の最後の４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれから成る。さらにより好ましくは、これは、配列番号３のアミノ酸３２２−３２８を含むか、またはそれから成る。別の好ましい実施形態において、Ｌ３およびＬ５供給源は、Ｌ３タンパク質の少なくとも１つのタンパク質断片とＬ５タンパク質の少なくとも１つのタンパク質断片とを含むタンパク質を含む。より好ましくは、Ｌ３タンパク質断片およびＬ５タンパク質断片は、融合してキメラタンパク質を形成している。したがって、本発明は、さらに、核酸またはそのようなＬ３およびＬ５供給源をコードする核酸を包含する。
【００２１】
好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、少なくとも１つのＬ３および／またはＬ５タンパク質、および／または少なくとも１つのＬ３および／またはＬ５のタンパク質断片を含む。より好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５の供給源は、少なくとも２つのＬ３および／またはＬ５タンパク質および／または少なくとも２つのＬ３および／またはＬ５のタンパク質断片を含む。この実施形態は、タンパク質ベースの供給源、好ましくはタンパク質ベースのワクチンに関する。
【００２２】
好ましい実施形態において、ここに同定されるＬ３および／またはＬ５供給源は、ＷＯ２００９／０９０１７５において同定されたリボソームタンパク質抽出物（ＲＰＥ）を包含すると理解することはできないことに留意すべきである。ＲＰＥは、対象中に存在すると寄生虫症を引き起こす寄生生物の細胞を用いて、以下のステップを実行することによって得ることができる：
ａ．寄生生物細胞と溶解緩衝液とを混合するステップ、
ｂ．得られた混合物を遠心分離して、細胞質抽出物を得るステップ、
ｃ．得られた細胞質抽出物からＲＰＥを調製するステップ。
【００２３】
したがって、好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、上で定義されたＲＰＥではない。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、少なくとも１つのＬ３および／またはＬ５をコードする核酸、および／または少なくとも１つのＬ３および／またはＬ５のタンパク質断片をコードする核酸を含む。より好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５の供給源は、少なくとも２つのＬ３および／またはＬ５タンパク質をコードする核酸、および／または少なくとも２つのＬ３および／またはＬ５のタンパク質断片をコードする核酸を含む。この実施形態は、核酸ベースの供給源、好ましくは核酸ベースのワクチンに関する。
【００２５】
Ｌ３および／またはＬ５の供給源は、タンパク質、タンパク質の消化物および／またはその断片であってよく、それは精製された形態であってよく、または、粗組成物中に含まれてよく、好ましくは細菌溶解物、酵母溶解物、真菌溶解物、超音波処理物または固定物といった生物由来の粗組成物中に含まれてよい。あるいは、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、インビトロで化学的にまたは酵素的に生成してよい。Ｌ３および／またはＬ５タンパク質、またはその断片の供給源は、ＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型に由来する、前記をコードする核酸またはその断片であってよい。ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、「裸の」ＤＮＡであってよく、好ましくは小胞またはリポソームの中に含まれ、または、それらは、ベクター内に含まれてよい。ベクターは、当該分野で既知の任意の（組換え）ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってよく、好ましくはプラスミドであり；この場合、潜伏抗原をコードする遺伝子は、コードされるメッセンジャーの発現および翻訳を付与する調節配列に作動可能に連結されている。ベクターは、任意のＤＮＡまたはＲＮＡウイルスであってよく、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、改変ワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）ウイルス（ＭＶＡ）または鶏痘ウイルス、または選択された対象にポリペプチドの発現を付与することができる任意の他のウイルスベクターであってよいが、これらに限定されない。ＤＮＡベクターは、エピソーム複製ベクターといった非組み込み型であってよく、またはランダムな組み込みによってまたは相同組換えによって宿主ゲノムに組み込まれるベクターであってよい。
【００２６】
任意にウイルスまたはプラスミドなどのベクターに埋め込まれた、本発明によるＬ３および／またはＬ５タンパク質またはその断片をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子は、対象のゲノムに組み込むことができる。本発明の好ましい実施形態において、そのような宿主は微生物であってよい。好ましくは、そのような組換え微生物は、本発明によるポリペプチドまたはその断片を宿主に送達することができる、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｙｕｅ．Ｙ．ら、（２００７年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４１巻：４１〜４８頁、Ｃａｙａｂｉｙａｂ  Ｙ．ら、（２００６年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８０巻：１６４５〜１６５２頁）またはＭ．ｂｏｖｉｓ、および最も好ましくは、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）またはＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの種のマイコバクテリウムである。組換えＢＣＧおよび組換えの方法は、当該分野で既知であり、例えば、ＷＯ２００４０９４４６９にある。そのような組換え微生物は、組換え生ワクチンおよび／または弱毒生ワクチンとして製剤化することができる。例えば、Ｊａｃｏｂｓら、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻（６１２２号）：５３２〜５頁）。ベクターは、さらに、微生物由来の宿主に含まれていてよく、例えば、生の弱毒化および／または組換え型シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌を含むがこれらに限定されないものに含まれていてよい。
【００２７】
任意の既知のアジュバントを、本発明において使用することができる。いくつかの適切なアジュバントが当業者には既知である。アジュバントは、最も好ましくは、以下のアジュバントの一覧から選択される：カチオン性（抗菌性）ペプチド、サポニンおよびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、例えば、これらに限定されないが、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧモチーフ、ＬＰＳ、リピドＡ、リポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓおよび細菌のフラジェリンなど、またはその一部、および化学的な修飾を有するそれらの誘導体。本発明による方法および組成物において使用するためのその他の好ましいアジュバントは、生ＢＣＧまたは死菌ＢＣＧとの混合物、前記潜伏抗原を有する免疫グロブリン複合体またはその一部、ＩＣ３１（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ．ｃｏｍから；ＷＯ０３０４７６０２）、ＱＳ２１／ＭＰＬ（ＵＳ２００３０９５９７４）、ＤＤＡ／ＭＰＬ（ＷＯ２００５００４９１１）、ＤＡ／ＴＤＢ（ＷＯ２００５００４９１１；Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２００４年Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４年３月；７２巻（３号）：１６０８〜１７頁）および可溶性ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）（ｗｗｗ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｐ．ｃｏｍから；ＵＳ２００２１９２１９５）である。さらに、別の好ましいアジュバントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｙｕｍまたはＰｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの使用を含む（６４、６５、６６）。
【００２８】
特に好ましいアジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用することが既知であるアジュバントである。先天性免疫系を活性化することができるアジュバントは、ＴＬＲ１−１０を含むＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して、および／またはＲＩＧ−１（レチノイン酸誘導性遺伝子−１）タンパク質を介して、および／またはエンドセリン受容体を介して、特に良好に活性化することができる。ＴＬＲ受容体、およびそれらの修飾体および誘導体を活性化することができる化合物は、当該分野において文書で十分に裏付けられている。ＴＬＲ１は、細菌のリポタンパク質およびそのアセチル化された形態によって活性化することができ、ＴＬＲ２は、さらに、グラム陽性細菌の糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、線毛、外膜タンパク質、細菌由来または宿主由来の熱ショックタンパク質、およびマイコバクテリアのリポアラビノマンナンによって活性化することができる。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡ、特にウイルス起源のｄｓＲＮＡによって、または化合物ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）によって活性化することができる。ＴＬＲ４は、グラム陰性のＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来または細菌由来の熱ショックタンパク質、ウイルスのコートタンパク質または外被タンパク質、タキソールまたはそれらの誘導体、オリゴ糖を含有するヒアルロナンおよびフィブロネクチンによって活性化することができる。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛またはフラジェリンを用いて活性化することができる。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアのリポタンパク質およびＢ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の熱に不安定な可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ）またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のモジュリンによって活性化することができる。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリンおよび誘導体によって活性化することができる。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡまたはクロマチン−ＩｇＧ複合体によって活性化することができる。とりわけ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９は、ウイルスの感染に対する先天性免疫応答の媒介において重要な役割を果たし、これらの受容体を活性化することができる化合物は、本発明における使用に特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、ＴＬＲ３受容体およびＴＬＲ９受容体を誘発するｄｓＲＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡを含む合成的に生成した化合物、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニストを含むが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態において、アジュバントは、ここにおいて先に定義されたＬ３および／またはＬ５供給源に物理的に連結されている。アジュバントおよび共刺激化合物または共刺激官能基と、ペプチドを含むＨＬＡクラスＩエピトープおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープとの物理的連結は、内部移行し、代謝され、抗原を提示する抗原提示細胞、とりわけ樹状細胞が同時に刺激されることによって、免疫応答の増強がもたらされる。別の好ましい免疫修飾性化合物は、Ｔ細胞の接着阻害剤であり、より好ましくは、ＢＱ−７８８などのエンドセリン受容体の阻害剤である（６７）。ＢＱ−７８８は、Ｎ−シス−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−ガンマ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニ��トリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかし、ＢＱ−７８８の誘導体または修飾されたＢＱ−７８８化合物はいずれも、同様に本発明の範囲に包含される。
【００２９】
他のアジュバントは、ＭＰＬ−ＳＥ（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）またはＥＭ００５（ＩＤＲＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）を含む。
【００３０】
好ましい実施形態において、アジュバントは、Ｔｈ１促進アジュバント（例えば、ＣｐＧ  ＯＤＮモチーフを含むアジュバント）である。Ｔｈ１促進アジュバントは、所与の抗原（ここでは、Ｌ３および／またはＬ５供給源）と一緒に用いた場合に、この抗原に対するＴｈ１免疫応答を促進または誘発することができるアジュバントであって、この抗原とともに培養した、処置された対象の脾細胞の上清において検出されるアジュバントであると文献（６８）に定義されている。コントロールとして、Ｔｈ１免疫応答の促進または誘発を、抗原およびアジュバントで処置していない同じ対象の脾細胞集団において、または抗原でのみ処置した同じ集団に関して評価する。Ｔｈ１免疫応答の誘発または促進は、好ましくは、抗原で処置された対象の脾細胞を培養することによって検出されるＩＦＮγの誘導によって、および／または抗原に特異的なＩｇＧ２ａ免疫グロブリンの生成を誘導することによって定義される。このサイトカインの誘導の評価は、好ましくは、実施例に記載されるように、脾細胞に対するＥＬＩＳＡによって行われる。ＩｇＧ２ａの誘導の評価は、好ましくは、実施例１に記載されるように、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって行われる。Ｌ３および／またはＬ５供給源およびアジュバントで脾細胞を刺激した際のＩＦＮγおよび／またはＩｇＧ２ａの誘導は、好ましくは、アジュバントがＴｈ１促進アジュバントとして適していることを意味する。
【００３１】
上述のようなＴｈ１免疫応答の誘発または促進の第１の定義の代わりに、またはそれとの組み合わせで、Ｔｈ１免疫応答の誘発または促進は、さらに、Ｔｈ２免疫応答がないこと（または、それが誘導されないこと）によって定義することができる。Ｔｈ２免疫応答は、無処置の脾細胞と比較した場合に、ＩＬ−４、ＩＬ−１０の誘導の検出可能な増大、および／または検出可能なＩｇＧ１免疫グロブリンの生成を特徴とする。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０の誘導の評価は、好ましくは、実施例に記載されるように、脾細胞に対するＥＬＩＳＡによって行われる。ＩｇＧ１の誘導の評価は、好ましくは、実施例１に記載されるように、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって行われる。
【００３２】
上述のＴｈ１免疫応答の誘発または促進の２つの第１の定義に代えて、またはそれとの組み合わせで、Ｔｈ１免疫応答の誘発または促進は、さらに、定義された抗原に対する、この場合はＬ３および／またはＬ５に対する、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比および／またはＩＦＮγ／ＩＬ−４比の増大、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の減少によって定義することができる。好ましい実施形態において、これらの任意の比率における２を超える変化（上述の通り増大または減少）は、アジュバントがＴｈ１特性を有することを示す。言及されたサイトカインのそれぞれの誘導の評価は、好ましくは、実施例に記載されるように、脾細胞に対するＥＬＩＳＡによって行われる。免疫グロブリンであるＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの誘導の評価は、好ましくは、実施例１に記載されるように、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって行われる。
【００３３】
好ましい実施形態において、Ｔｈ−１促進アジュバントは、オリゴデオキシヌクレオチドであるか、またはそれを含むか、またはそれから成る。より好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、Ｃがメチル化されていないＣｐＧ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）：３’プリン−ＣｐＧ−５’ピリミジンを含むか、またはそれから成る。好ましいオリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホロチオエートで修飾されたＯＤＮ配列であるか、またはそれを含むか、またはそれから成る。使用されるオリゴデオキシヌクレオチドは、それゆえ、修飾されていないオリゴヌクレオチドより安定であり、したがって、それらが一度血流に入ってしまえば容易に分解されないため、そのような修飾を有するオリゴデオキシヌクレオチドの使用は有利である。好ましいＴｈ−１促進アジュバントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣｐＧモチーフから成るか、またはそれを含む。免疫賦活性ＯＤＮ（５’から３’）の好ましい配列は、ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ（配列番号５）およびＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴ（配列番号６）であった。当業者は、ここに明確に記載された配列に制限されない。当業者は、他の配列を設計し、続いて、ここにおいて先に定義されるように、それらのＴｈ−１促進特性について試験することができる。ＬＲＰＥとこのＴｈ１促進アジュバントとの共接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統およびＣ５７ＢＬ／６マウス系統の両方において、Ｌ．ｍａｊｏｒ寄生生物の攻撃に対する防御を誘導することが実施例において実証されたため、この好ましい同定されたアジュバントＣｐＧ  ＯＤＮは非常に魅力的である。両モデルにおいて、防御はＩＦＮ−γの特異的な生成と相関する。ＢＡＬＢ／ｃでは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の生成の制限も検出された。
【００３４】
本発明は、１）予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）（予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））ワクチン、２）曝露／感染後のワクチン、または３）治療的な／治癒的なワクチンとして適したＬ３および／またはＬ５供給源の使用を提供する。本発明の１つの利点は、より広範なスペクトルの寄生虫症を治療するための医療用調製物、すなわち、異種間特異性を有する医療用調製物の調製を可能にすることである。多くの寄生虫症において、特定の種に対して生じたワクチンは、その特定の種に対してのみ働く。この事例である寄生虫症の一例はリーシュマニア症である。現在のところ、この疾患は、薬物によって制御されているが、薬物治療は疾患の蔓延を抑制することができず、多くの場合、あまり有効でない。好ましい実施形態において、寄生虫症はリーシュマニア症またはマラリアである。より好ましくは、寄生虫症は、リーシュマニアまたはマラリア原虫種によって引き起こされる寄生虫症である。さらに好ましい実施形態において、寄生虫症は、Ｌ３および／またはＬ５供給源が由来する種とは異なる種によって引き起こされる。特に、実験パートにおいて実証されている通り（実施例２を参照されたい）、幾つかのリーシュマニア種に由来するＬ３およびＬ５相同体は高度に保存されているため（少なくとも９０％の同一性、表１参照）、リーシュマニア属に由来する１つの種に起因するリーシュマニア症は、別のリーシュマニア種に由来するＬ３および／またはＬ５供給源ベースの組成物の使用によって治療することができる。さらに、我々は、実験パートにおいて（実施例１および３を参照されたい）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５タンパク質は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓの感染を防御することができることをすでに実証した。一実施形態において、Ｌ．ｍａｊｏｒによって引き起こされるリーシュマニア症は、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ、Ｌ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓまたはＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓに由来するＬ３および／またはＬ５供給源を含む組成物を用いて首尾よく治療される。別の実施形態において、Ｌ．ｃｈａｇａｓｉまたはＬ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓによって引き起こされるリーシュマニア症は、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍに由来するＬ３および／またはＬ５供給源を含む組成物を用いて首尾よく治療される。別の実施形態において、Ｌ．ｍａｊｏｒまたはＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓによって引き起こされるリーシュマニア症は、Ｌ．ｍａｊｏｒに由来するＬ３および／またはＬ５供給源を含む組成物を用いて首尾よく治療される。あるいは、マラリアなどの他の寄生虫症は、別の種のＬ３および／またはＬ５供給源ベースの組成物、例えば、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍまたはＬ．ｍａｊｏｒまたはＬ．ｍｅｘｉｃａｎａまたはＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓのＬ３および／またはＬ５供給源ベースの組成物を用いて首尾よく治療することができる。
【００３５】
本発明に関して、対象とは、ヒトまたは動物を意味する。本発明の範囲に包含される動物は哺乳動物を含み、好ましくはイヌを含む。
【００３６】
好ましい実施形態において、ここに定義される薬剤（または医療用調製物または医薬組成物または医薬品）が使用され、感染症および／または疾患、より好ましくは寄生虫感染症および／または寄生虫症と戦う、ヒトまたは動物の免疫系の能力が向上する。特に、これはヒト対象または動物対象に対する投与に使用してよい。ここに定義される薬剤は、好ましくは、例えば、静脈内経路、皮下経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、または病巣内経路で、注射または注入することによって非経口的に投与される。好ましい投与形式は皮下投与である。本発明は、Ｌ３および／またはＬ５供給源の特定の投与形式に限定されない。好ましい投与形式は、カプセル剤または錠剤を使用した経口投与である。あるいは、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、カテーテルまたはポンプ、または坐剤によって局部的に投与することができる。あるいは、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、局所的に投与することができる。Ｌ３および／またはＬ５供給源の処方またはＬ３および／またはＬ５供給源を含む組成物の処方は、意図された投与形式および（治療的な）適用に依存する。医薬担体は、対象に対するＬ３および／またはＬ５供給源の送達に適した、任意の適合性の無毒性物質であってよい。例えば、滅菌水、または不活性な固体または賦形剤を、通常、薬学的に許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤などで補完することで、担体として使用することができる。組成物は、液体の状態、例えばＬ３および／またはＬ５供給源の安定化された懸濁液、またはＬ３および／またはＬ５供給源を含む組成物、または固体の状態および／または乾燥した形態：例えば散剤のいずれかであろう。経口投与および直腸内投与のために、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、固体剤形、例えば、カプセル剤、錠剤、坐剤および散剤の状態で、または液体剤形、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、クリーム剤、軟膏剤および懸濁剤の状態で投与することができる。別の形態は、Ｌ３および／またはＬ５が、パッチ剤などの固体支持体の中にまたはそれに接して液体の形態で存在する半固体の形態または半液体の形態であってよい。
【００３７】
薬剤は、当該分野で既知の従来の技術によって、薬学的に許容される媒体または送達ビヒクルと組み合わせることができる。例えば、Ｌ３および／またはＬ５供給源および任意にアジュバントは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させることができる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡＲ  Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２０版、２０００年、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＰＡ、ＵＳＡを含めた種々の情報源においてより詳細に記載されている。薬剤は、好ましくは、治療有効量で投与され、すなわち、ここに定義される感染症および／または疾患と戦う、ヒトまたは動物の免疫系の能力を増大させる量で投与される。好ましくは、治療有効量の本発明の医療用調製物は、ここで定義される免疫応答を引き出すことができる：用量は、処置された対象において免疫応答を引き出すことができる場合に治療的に有効であり、このことは、好ましくは、所与の抗原であるＬ３および／またはＬ５に対するＴｈ１免疫応答を促進または誘発することができることを意味し、および／または、皮膚の病変または粘膜の病変の発症を予防および／または遅延させることができ、および／または、皮膚および／または粘膜の病変において、および／または耳において、および／またはこれらの感染した領域（皮膚の領域、粘膜の領域、耳）のいずれかを好ましくは排液する流入領域リンパ節（ＤＬＮ）において、ならびに、肝臓、脾臓、骨髄、腎臓、脳といった内臓において、寄生生物の負荷量の有意な低下を誘導することを意味する。皮膚の病変が存在することの評価は、実施例１に記載されている（図４参照：フットパッドの腫脹）。寄生生物の負荷量についての評価は、実施例に記載されている（図４参照）。治療有効量の本発明の薬剤は、好ましくは、皮膚の病変の発症を予防し、および／または、好ましくは、本発明の組成物を使用した最初の１回のワクチン接種、その後の逐次的な寄生生物での１回の感染と、およそ６週間の待ち時間とを含む期間後に、耳においておよそ３桁の寄生生物の負荷量の低減、および／またはＤＬＮにおいておよそ同等の寄生生物の負荷量の低減を誘導するだろう。好ましい実施形態において、ここに定義される薬剤はワクチンである。より好ましい実施形態において、少なくとも１２μｇのＬ３および／またはＬ５供給源がワクチンに使用される。使用されるＬ３および／またはＬ５供給源の量は、使用されるＬ３およびＬ５の総量を指す。さらに好ましい実施形態において、免疫応答をもたらすために、少なくとも１２〜２０μｇのＬ３および／またはＬ５供給源を、任意に少なくとも５０μｇのアジュバント、好ましくは、例えばＣｐＧ  ＯＤＮなどのＴｈ１促進アジュバントとの組み合わせで、使用しなければならない。ここに定義されるワクチンは、予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンまたは治療的なワクチンであってよい。Ｌ３および／またはＬ５供給源および任意にアジュバント、好ましくはＴｈ１促進アジュバントを溶解させることができる容積は、１００〜５００マイクロリットルで変動してよい。
【００３８】
組成物
別の側面において、Ｌ３および／またはＬ５供給源および任意にアジュバント、好ましくはＴｈ１促進アジュバントを含む組成物が提供される。Ｌ３および／またはＬ５供給源およびアジュバントは、ここにおいてすでに定義されている。好ましい実施形態において、組成物は、Ｌ３および／またはＬ５供給源、およびＴｈ１促進アジュバントから成る。好ましいＴｈ１促進アジュバントは、ＣｐＧ  ＯＤＮである。好ましい組成物は、ＰＢＳに溶解したＬ３および／またはＬ５供給源および任意にアジュバント、好ましくはＴｈ１促進アジュバントを含むか、またはそれから成る。さらに好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源およびアジュバント、好ましくはＴｈ１促進アジュバントを逐次的に投与することも本発明に包含される。したがって、両方の成分は、それらが両方とも対象に投与される限りは、物理的に１つの単一の組成物中に存在する必要はない。
【００３９】
そのような組成物は、薬学的に許容されるアジュバントおよび／または担体をさらに含んでよい。
【００４０】
そのような組成物は、好ましくは、薬剤として使用される。薬剤は、好ましくは、ワクチンである。薬剤、アジュバントおよびワクチンは、すでにここにおいて広範囲にわたって定義されている。
【００４１】
組成物は、ここにおいてすでに定義されている通り、液体の形態、固体の形態、または半液体の形態、または半固体の形態であってよい。
【００４２】
好ましい実施形態において、治療的治療または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療の特異性を改善するために、他の化合物をＬ３および／またはＬ５供給源と逐次的にまたは同時に使用する。例えば、処置された対象の免疫応答をさらに増強する他の化合物を使用することが有利である。そのような化合物は、単一の組成物中でＬ３および／またはＬ５供給源と一緒に存在しないことがより好ましい。例えば、前記化合物は、リーシュマニア症などの寄生虫症を引き起こす寄生生物由来の他のタンパク質の供給源から成る群から選択される（１９）。所与のタンパク質の供給源には、ここにおいて前に定義されているＬ３および／またはＬ５の供給源と同じ意味が与えられる。好ましいタンパク質は、この場合、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４といったヒストン、Ｌｉ２Ａ（ＬｉＰ）、ＬｉＰ２ｂ（ＬｉＰ’）、ＬｉＰ０、Ｌ２、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ１６、Ｓ６、Ｌ１９およびＳ４といった別のリボソームタンパク質である。
【００４３】
好ましいＨ２Ａタンパク質は、配列番号７で表される。Ｈ２Ａをコードする好ましい核酸は、配列番号８で表される。好ましいＨ２Ｂタンパク質は、配列番号９で表される。Ｈ２Ｂをコードする好ましい核酸は、配列番号１０で表される。好ましいＨ３タンパク質は、配列番号１１で表される。Ｈ３をコードする好ましい核酸は、配列番号１２で表される。好ましいＨ４タンパク質は、配列番号１３で表される。Ｈ４をコードする好ましい核酸は、配列番号１４で表される。好ましいＬｉ２Ａは、ＬｉＰ２ａタンパク質とも称され、配列番号１５または１６で表される。Ｌｉ２Ａをコードする好ましい核酸は、配列番号１７で表される。配列番号１７は、ゲノム配列である。当業者は、好ましいコード配列をこのゲノム配列から得ることができる。そのような好ましいコード配列は、配列番号１５または１６で表されるＬｉ２Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡをコードする核酸に対応する：１つは配列番号１７のヌクレオチド７９１から１１１１までであり、１つは１６６２から１９８２までである。
【００４４】
好ましいＬｉＰ２ｂタンパク質は、配列番号１８で表される。ＬｉＰ２ｂをコードする好ましい核酸は、配列番号１９で表される。好ましいＬｉＰ０タンパク質は、配列番号２０で表される。ＬｉＰ０をコードする好ましい核酸は、配列番号２１で表される。
【００４５】
配列番号８、１０、１２、１４、１９および２１は、ゲノム配列である。当業者は、他の好ましいコード配列をこれらのゲノム配列から得ることができる。そのような他の好ましいコード配列は、それぞれのタンパク質をコードするｍＲＮＡをコードする核酸に対応する：これらの核酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２および７３で表される。
【００４６】
好ましいＬ２タンパク質は、配列番号２２で表される。Ｌ２をコードする好ましい核酸は、配列番号２３で表される。好ましいＬ７タンパク質は、配列番号２４で表される。Ｌ７をコードする好ましい核酸は、配列番号２５で表される。好ましいＬ８タンパク質は、配列番号２６で表される。Ｌ８をコードする好ましい核酸は、配列番号２７で表される。好ましいＬ１６タンパク質は、配列番号２８で表される。Ｌ１６をコードする好ましい核酸は、配列番号２９で表される。好ましいＬ１９タンパク質は、配列番号３０で表される。Ｌ１９をコードする好ましい核酸は、配列番号３１で表される。好ましいＳ４タンパク質は、配列番号３２で表される。Ｓ４をコードする好ましい核酸は、配列番号３３で表される。好ましいＳ６タンパク質は、配列番号３４で表される。Ｓ６をコードする好ましい核酸は、配列番号３５で表される。
【００４７】
別の例は、いくつかの寄生生物抗原を含有するポリタンパク質を使用することである（６３、６５）。ポリタンパク質の例は、ＥＰ１  １４１  ３０５において同定されたプロテインＱである。プロテインＱをコードする核酸分子は、配列番号３６で表される。対応するコードされるプロテインＱは、配列番号３７で表される。プロテインＱまたはその一部もしくは断片またはプロテインＱの供給源またはプロテインＱの断片の供給源を、Ｌ３および／またはＬ５の供給源と組み合わせて使用することができる。ポリタンパク質の別の例は、Ｌｅｉｓｈ−１１０ｆである（６９）。Ｌｅｉｓｈ−１１０ｆまたはその一部もしくは断片またはＬｅｉｓｈ−１１０ｆの供給源またはＬｅｉｓｈ−１１０ｆの断片の供給源を、Ｌ３および／またはＬ５の供給源と組み合わせて使用することができる。
【００４８】
次の段落において、Ｌ３タンパク質および／またはＬ５タンパク質の供給源と組み合わせて使用することができるタンパク質の例として、ヒストンタンパク質の供給源を取り上げている。これは上で定義されている他のタンパク質、好ましくはＬ３および／またはＬ５とは別のリボソームタンパク質についても同じである。好ましい化合物としては、ヒストンタンパク質またはその断片、または前記ヒストンまたは前記ヒストン断片をコードする核酸分子が挙げられる。ヒストンタンパク質は、ＥＰ  １  ６８７  ０２３において同定されたＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４であることがより好ましい。ヒストンのＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、よく保存された核タンパク質であり、それらの配列は当該分野で周知である。参照文献３９を参照されたい。ヒストンは、進化系統樹において、疾患を引き起こす生物体に近い生物体から得ることが好ましい。したがって、リーシュマニア症などの寄生虫症の治療において使用されるヒストンの供給源として特に興味深いものは、原生動物、特にトリパノソーマファミリーのメンバー、さらに特定するとトリパノソーマ科の原生動物であるリーシュマニアの種々の種である。
【００４９】
他の好ましい化合物としては、他のリボソームタンパク質もしくはその断片または前記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸分子が挙げられる。他のリボソームタンパク質の例としては、Ｌ１９およびＳ４が挙げられる。
【００５０】
他の好ましい化合物としては、ＷＯ２００９／０９０１７５において同定されたリボソームタンパク質抽出物が挙げられる。
【００５１】
それぞれの化合物またはこれらの化合物の供給源のそれぞれは、Ｌ３および／またはＬ５供給源の供給源と組み合わせて使用することができる。組み合わせた使用は、逐次的または同時であってよい。
【００５２】
好ましい実施形態において、Ｌ３および／またはＬ５供給源を、Ｓ４および／またはＳ６供給源と組み合わせて使用する。Ｌ３供給源と、Ｌ５供給源と、Ｓ４供給源と、Ｓ６供給源とを組み合わせて使用することがより好ましい。別のより好ましい実施形態において、Ｌ３供給源と、Ｌ５供給源と、Ｓ４供給源とを組み合わせて使用する。別のより好ましい実施形態において、Ｌ３供給源と、Ｌ５供給源と、Ｓ６供給源とを組み合わせて使用する。我々は、Ｌ３と、Ｌ５と、Ｓ４とを組み合わせて使用することにより、Ｌ３またはＬ５またはＳ４を単独で使用したときと比較して、相乗的な防御がもたらされることを実証した（実施例５を参照されたい）。この場合、好ましいＳ４タンパク質は、配列番号３２で表される。Ｓ４をコードする好ましい核酸は、配列番号３３で表される。好ましいＳ６タンパク質は、配列番号３４で表される。Ｓ６をコードする好ましい核酸は、配列番号３５で表される。「Ｓ４および／またはＳ６供給源」において使用される場合「供給源」という用語は、「Ｌ３および／またはＬ５供給源」において使用される場合「供給源」という用語と同じ意味を有する。
【００５３】
したがって、好ましい実施形態において、Ｓ４供給源は、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、および／または、配列番号３３と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである。
【００５４】
したがって、好ましい実施形態において、Ｓ６供給源は、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、および／または、配列番号３５と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである。
【００５５】
したがって、好ましい実施形態において、Ｓ４供給源は、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸であり、および／または、配列番号３２と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸である。
【００５６】
使用する供給源の種類に応じて（タンパク質ベースまたは核酸ベース）、どの種類の処方が適しているかは当業者にはわかるであろう。供給源は、それ自体（裸のタンパク質または核酸）を投与することができる。あるいは、核酸ベースの供給源は、ここで定義されている核酸構築物を使用して投与することができる。
【００５７】
Ｓ６供給源
別の側面において、Ｓ６供給源が提供され、またはＳ６供給源を含むか、またはＳ６供給源から成るが、Ｌ３および／またはＬ５供給源および／またはＳ４供給源を含まない組成物が提供される。我々は、Ｓ６を単独で使用することにより、リーシュマニア感染症への防御がもたらされることを実証した（実施例４を参照されたい）。
【００５８】
「Ｓ６供給源」において使用される場合「供給源」という用語は、「Ｌ３および／またはＬ５供給源」において使用される場合「供給源」という用語と同じ意味を有する。
【００５９】
ここにおいて定義されている、Ｌ３および／またはＬ５供給源を含む使用または方法または組成物の種類のそれぞれは、Ｓ６供給源にも適用される。
【００６０】
したがって、好ましい実施形態において、Ｓ６供給源は、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、および／または、配列番号３５と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである。
【００６１】
したがって、好ましい実施形態において、Ｓ６供給源は、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有する核酸配列を含む核酸であり、および／または、配列番号３４と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸である。
【００６２】
方法
別の側面において、本発明は、寄生虫症を予防および／または治療し、および／またはその進行を遅らせ、および／またはここで定義されているように免疫応答を引き出すことを可能にするための方法を提供する：方法は、それによって処置された対象において免疫応答を引き出すことができる場合に治療的に有効であり、このことは、好ましくは、所与の抗原であるＬ３および／またはＬ５、および／または所与のＬ３および／またはＬ５供給源に対するＴｈ１免疫応答を促進または誘発することができることを意味し、および／または、皮膚の病変または粘膜の病変を予防し、および／またはその発症を遅らせることができ、および／または皮膚の病変および／または粘膜の病変における、および／または耳における、および／または好ましくはこれらの感染した領域（皮膚の領域、粘膜の領域、耳）のいずれかを排液する流入領域リンパ節（ＤＬＮ）における、並びに、内臓、肝臓、脾臓、骨髄、腎臓、脳といった内臓における寄生生物の負荷量の有意な低下を誘導することを意味する。この方法では、本発明のワクチンは、治療的なワクチンとして機能する。一般には、感染と疾患との間には期間がある。この場合、ワクチンは、宿主において、感染症の病理学的な影響を打ち消す免疫応答を引き出すことによって疾患を予防および／または治療し、かつ／またはその進行を遅らせる薬理作用のある免疫製品として作用する。
【００６３】
治療的なワクチンは、治療的なワクチンにより、すでにその感染症または疾患を有する患者において防御が誘導されるという点で、予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンとは異なる。本発明は、治療的なワクチンまたは予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンのいずれかを包含する。この方法では、任意に、Ｓ４および／またはＳ６供給源をＬ３および／またはＬ５供給源と組み合わせて使用することができる。
【００６４】
使用
別の側面において、対象における寄生虫症を診断するための、Ｌ３および／またはＬ５供給源のさらなる使用が提供される。寄生虫症、Ｌ３および／またはＬ５供給源および対象はここにおいて前に定義されている。この使用では、任意に、Ｓ４および／またはＳ６供給源をＬ３および／またはＬ５供給源と組み合わせて使用することができる。
【００６５】
本発明の１つの利点は、それによってより広範なスペクトルの寄生虫症の特異的かつ早期の診断が実現されることである。この事例の寄生虫症の１つの例は、リーシュマニア症である。好ましい実施形態において、寄生虫症は、リーシュマニア症またはマラリアである。寄生虫症はリーシュマニアによって、またはマラリア原虫種によって引き起こされる寄生虫症であることがより好ましい。さらに好ましい実施形態において、寄生虫症は、Ｌ３および／またはＬ５が由来する種とは異なる種によって引き起こされる。具体的には、リーシュマニア属由来のある種によって引き起こされるリーシュマニア症は、別のリーシュマニア種由来のＬ３および／またはＬ５供給源ベースの組成物を使用することによって診断することができる。一実施形態において、Ｌ．ｍａｊｏｒによって引き起こされるリーシュマニア症は、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｚｉｓまたはＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ由来のＬ３および／またはＬ５供給源を含む組成物を用いて首尾よく診断される。あるいは、マラリアなどの他の寄生虫症は、別の種のＬ３および／またはＬ５供給源ベースの組成物、例えば、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｚｉｓまたはＬ．ｍｅｘｉｃａｎａのＬ３および／またはＬ５供給源ベースの組成物を用いて首尾よく診断することができる。
【００６６】
原理上は、いかなる対象も、本発明を用いて診断することができる。対象において必要になるたびに診断方法を適用することができる。診断される対象は、前記寄生虫症を引き起こす前記寄生生物に感染している危険性を有する疑いがある対象であることが好ましい。前記寄生生物に感染している危険性を有する疑いがある対象は、流行地域に住んでいるか、または流行地域を訪れている可能性がある。流行地域としては、アルジェリアからサウジアラビア、ケニア、スーダン、エチオピアまでの北アフリカが挙げられる。流行地域としては、さらに、南欧：地中海諸国のスペイン、フランス、ギリシャなどが挙げられる。流行地域としては、中米（全ての国）および南米：ブラジル、ベネズエラ、ペルー、ボリビア、コロンビア  アルゼンチンの北部、パラグアイ、ウルグアイ、中央〜南西アジア：インド、イラン、イラク、モンゴル、アフガニスタン、ネパール、バングラデシュも挙げられる。
【００６７】
本発明に関しては、ここで定義されている使用は、インビトロでの使用またはエキソビボでの使用であることが好ましい。前記使用は、前記対象由来の試料に対して行うことを意味することが好ましい。好ましい試料としては、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿が挙げられる。試料は、対象から得た血液試料または血清試料であることがより好ましい。
【００６８】
好ましい実施形態において、診断は、前記寄生虫症の症状が現れる前に達せられる、いわゆる前駆症状の診断または無症候性の対象の診断である。この場合、「前駆症状性」は、最初の症状が現れる少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも７日前、少なくとも８日前、少なくとも９日前、少なくとも１０日前、少なくとも１５日前、少なくとも２０日前、少なくとも２５日前、少なくとも３０日前またはそれ以上前であることを意味することが好ましい。リーシュマニア症などの寄生虫症に付随する最初の症状または最初の臨床的な徴候は、以下の一覧から選択することができる：発熱、脾腫、肝腫、リンパ節腫脹、結膜炎、皮膚炎、爪甲鉤彎症、角結膜炎、アパシーおよび悪液質。それらの大部分は、外見的な身体検査によって簡単に検出することができる。結膜炎、皮膚炎、爪甲鉤彎症、角結膜炎はそれぞれ、皮膚の変質の形態である。
【００６９】
リーシュマニア症に関連する好ましい最初の症状は、リンパ節腫脹である。これは、触診などの外見的な身体検査によって検出することができる。
【００７０】
別の好ましい実施形態において、診断は、前記寄生虫症の症状のうちのいくつかが現れる前に達せられる、いわゆる症状の乏しい対象の診断である。この場合、「症状の乏しい」は、上で定義された症状を最大３つ有する対象を意味することが好ましい。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、診断は、前記寄生虫症の症状の全てが現れる前に達せられる、いわゆる症候性の対象の診断である。この場合、「症候性の」は、上で定義された皮膚の変質の形態を含めた、上で定義された症状の少なくとも４つを有する対象を意味することが好ましい。
【００７２】
無症候性の対象の診断は、疾患がさらに蔓延することを予防するのに役立ち、また、無症候性の対象をそのような段階において診断すれば、その対象をより効率的に救い、治癒することができるので、最も重要な種類の診断が無症候性の対象の診断であることは、当業者には理解されよう。
【００７３】
この使用では、Ｌ３および／またはＬ５供給源および／またはＳ４および／またはＳ６供給源は、次の節において説明されている通り試料中の抗体の存在を検出するために使用されるＬ３タンパク質もしくはタンパク質断片および／またはＬ５タンパク質もしくはタンパク質断片および／またはＳ４タンパク質もしくはタンパク質断片および／またはＳ６タンパク質もしくはタンパク質断片であってよい。
【００７４】
あるいは、Ｌ３および／またはＬ５供給源および／またはＳ４および／またはＳ６供給源は、次の節において説明されている通り試料中のＬ３核酸および／またはＬ５核酸および／またはＳ４核酸および／またはＳ６核酸の存在を検出するために使用する核酸分子であってよい。
【００７５】
方法
別の側面において、Ｌ３および／またはＬ５供給源を使用して対象における寄生虫症を診断するための方法であって、対象から得た試料中に、Ｌ３および／またはＬ５供給源を認識する抗体が存在するかどうかを決定することを含む方法が提供される。任意に、Ｓ４および／またはＳ６供給源も、Ｌ３および／またはＬ５供給源と組み合わせて使用することができる。好ましい本発明の方法は、本発明の好ましい使用のために、インビトロまたはエキソビボで行うことが好ましい。定義は、ここにおいて前に与えられている。
【００７６】
好ましい方法では、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、組成物中に存在する。好ましい実施形態において、前記組成物中に別の化合物が存在する。あるいは、前記組成物中に他の化合物は存在しない。
【００７７】
好ましい実施形態において、方法の特異性を改善するために、他の化合物をＬ３および／またはＬ５供給源と逐次的にまたは同時に使用する。例えば、無症候性の対象と、症状の乏しい対象または症候性の対象と、ワクチン接種した対象との間を識別することを可能にする他の化合物を使用することが有利である。そのような化合物は、単一の組成物中でＬ３および／またはＬ５供給源と一緒に存在しないことがより好ましい。組成物という表題の節において同定されているタンパク質のそれぞれを、この状況において使用することができる。例えば、前記化合物は、リーシュマニア症などの寄生虫症を引き起こす寄生生物（１９）由来の他のタンパク質の供給源から成る群から選択される。所与のタンパク質の供給源には、ここにおいて前に定義されているＬ３および／またはＬ５の供給源と同じ意味が与えられる。好ましいタンパク質は、この場合、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４などのヒストン、Ｌｉ２Ａ（ＬｉＰ）、ＬｉＰ２ｂ（ＬｉＰ’）、ＬｉＰ０、Ｌ２、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ１６、Ｓ６、Ｌ１９およびＳ４などの別のリボソームタンパク質である。
【００７８】
別の例は、いくつかの寄生生物抗原を含有するポリタンパク質の使用である（５９、６１）。ポリタンパク質の例は、ＥＰ  １  １４１  ３０５において同定されたプロテインＱである。プロテインＱまたはその一部もしくは断片またはプロテインＱの供給源またはプロテインＱの断片の供給源は、Ｌ３および／またはＬ５の供給源と組み合わせて使用することができる。
【００７９】
好ましい抗原としては、ヒストンタンパク質もしくはその断片または前記ヒストンをコードする核酸分子が挙げられる。ヒストンタンパク質は、ＥＰ  １  ６８７  ０２３において同定されたＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４であることがより好ましい。ヒストンのＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、よく保存された核タンパク質であり、それらの配列は当該分野で周知である。参照文献３９を参照されたい。ヒストンは、進化系統樹において、疾患を引き起こす生物体に近い生物体から得ることが好ましい。したがって、リーシュマニア症などの寄生虫症の治療において使用されるヒストンの供給源として特に興味深いのは、原生動物、特にトリパノソーマファミリーのメンバー、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍなどのマラリア原虫であり、またはさらに特定するとトリパノソーマ科の原生動物であるリーシュマニアの種々の種である。
【００８０】
より好ましい診断方法では、Ｌ３および／またはＬ５供給源、好ましくはタンパク質またはペプチドまたはタンパク質の一部を認識する抗体が検出可能な量で存在する場合、および／または、前記抗体の量が増加している場合に、寄生虫症が診断される。コントロールまたは健康な対象では、前記抗体は、一般に検出不可能である。
【００８１】
前記抗体の存在の検出は、ＥＬＩＳＡなどの当業者に既知の方法を使用して行う。好ましい検出のやり方は、実施例１に記載されている。
【００８２】
Ｌ３および／またはＬ５供給源、好ましくはタンパク質またはペプチドまたはタンパク質の一部を認識する抗体とは、Ｌ３および／またはＬ５供給源中に存在する少なくとも１種の化合物を認識することができる少なくとも１種の抗体が存在することを意味することが好ましい。前記化合物は、Ｌ３タンパク質および／またはＬ５タンパク質、またはＬ３タンパク質断片もしくはタンパク質の一部もしくはペプチドおよび／またはＬ５タンパク質断片もしくはタンパク質の一部もしくはペプチドであってよい。これは、Ｓ４および／またはＳ６供給源を認識する抗体についても同じである。
【００８３】
別の方法では、Ｌ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子を、別の核酸分子を使用して検出する。Ｌ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子は、ここにおいて前に同定されているＬ３分子および／またはＬ５分子をコードする核酸分子またはその一部であることが好ましい。別の核酸分子は、Ｌ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子の存在を、ＰＣＲ反応において、またはノーザンブロット法によって検出することができるように設計されたプライマーであることが好ましい。これは、Ｓ４核酸分子および／またはＳ６核酸分子の存在を検出することができるプライマーについても同じである。Ｌ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子の存在を検出するために好ましいプライマーは、以下の配列を含む、またはそれから成る：
ＰＣＲによってＬ３を特異的に検出するためのプライマー配列
センス、５’−ＡＡＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣ−３’（ＬｍＬ３配列のヌクレオチド４１８〜４３８）（配列番号３８）
アンチセンス、５’−ＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧ−３’（リバースおよびＬｍＬ３配列のヌクレオチド１２４２〜１２６３に対して相補的）（配列番号３９）
ＰＣＲによってＬ５を特異的に検出するためのプライマー配列
センス、５’−ＴＧＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＡＣ−３’（ＬｍＬ５配列のヌクレオチド１０〜３１）（配列番号４０）
アンチセンス、５’−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（リバースおよびＬｍＬ５配列のヌクレオチド４６４〜４８３に対して相補的）（配列番号４１）
ノーザンブロット法によってＬ３を特異的に検出するためのプライマー配列
５’−ＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧ−３’（リバースおよびＬｍＬ３配列のヌクレオチド１２４２〜１２６３に対して相補的）（配列番号４２）
ノーザンブロット法によってＬ５を特異的に検出するためのプライマー配列
５’−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（リバースおよびＬｍＬ５配列のヌクレオチド４６４〜４８３に対して相補的）（配列番号４３）。Ｌ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子の発現レベルの検出または増加は、コントロールの対象における前記核酸分子の発現レベルと比較した、前記核酸分子の発現レベルの検出可能な変化であると定義されることが好ましい。通常コントロールの対象は、そのようなＬ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子を含まない。Ｌ３核酸分子および／またはＬ５核酸分子の発現レベルの増加は、ＰＣＲを使用して、ヌクレオチド配列の発現レベルが少なくとも５％増加することを意味することが好ましい。
【００８４】
アッセイ
別の側面において、対象における寄生虫症を診断するためのアッセイデバイスであって、Ｌ３および／またはＬ５供給源を含むアッセイデバイスが提供される。任意に、このアッセイデバイスの中に、Ｌ３および／またはＬ５供給源と組み合わせてＳ４および／またはＳ６供給源も存在してよい。前記供給源を特異的に認識する抗体の存在は、当業者に既知の任意の標準の方法によって検出することができる（例えば、参照によりここに組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい）。適切な方法としては、アフィニティークロマトグラフィー共電気泳動（ＡＣＥ：ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）アッセイおよび（酵素結合免疫吸着検定法）ＥＬＩＳＡが挙げられる。アッセイは、ＥＬＩＳＡを含むことが好ましい。いくつかのアッセイは、以下により広範囲にわたって記載されている。
【００８５】
好ましい実施形態において、アッセイは、抗体を結合させ、試料から取り出すために、固体支持体上に固定されたＬ３および／またはＬ５供給源の使用を伴う。次いで、抗体／Ｌ３供給源複合体および／または抗体／Ｌ５供給源複合体に結合し、かつ検出可能なレポーター基を含有する検出試薬を使用して、前記結合した抗体を検出することができる。適切な検出試薬としては、抗体／Ｌ３供給源複合体および／または抗体／Ｌ５供給源複合体に結合する抗体およびレポーター基で標識した遊離のポリペプチドが挙げられる（例えば、半競合的（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）アッセイにおいて）。あるいは、Ｌ３および／またはＬ５供給源に結合する抗体をレポーター基で標識し、供給源を試料と一緒にインキュベートした後、固定されたＬ３および／またはＬ５供給源に結合させる、競合的なアッセイを利用することができる。標識された抗体の前記Ｌ３および／またはＬ５供給源への結合が試料の成分によって阻害される程度により、固定されたＬ３および／またはＬ５供給源を有する試料の反応性が示される。
【００８６】
固体支持体は、Ｌ３および／またはＬ５供給源を付着させることができる当業者に既知の任意の材料であってよい。例えば、支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロースまたは他の適切なメンブレンであってよい。あるいは、支持体は、ビーズまたはディスク、例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルなどのプラスティック材料などであってよい。支持体は、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されているものなどの磁気粒子または光ファイバーセンサーであってもよい。
【００８７】
Ｌ３および／またはＬ５供給源は、当業者に既知の様々な技術を使用して固体支持体に結合させることができる。本発明に関しては、「結合した」という用語は、吸着などの非共有結合性の会合と共有結合性の付着の両方を指す（抗原と支持体上の官能基との間の直接連結であってよい、または、架橋剤による連結であってよい）。マイクロタイタープレートのウェルまたはメンブレンに吸着によって結合させることが好ましい。そのような場合では、吸着は、適切な緩衝液中のＬ３および／またはＬ５供給源を、固体支持体と適切な時間接触させることによって実現することができる。接触させる時間は、温度と共に変動するが、一般には１時間から１日の間である。一般に、適切な量のＬ３および／またはＬ５供給源を結合させるためには、プラスティックのマイクロタイタープレート（ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなど）のウェルと、１０ｎｇから１ｇの範囲の量、好ましくは１００ｎｇのＬ３および／またはＬ５供給源を接触させれば十分である。ここでは、また、Ｌ３および／またはＬ５供給源の数量または量が示されている場合、それは使用されるＬ３および／またはＬ５供給源の総量を定義している。
【００８８】
Ｌ３および／またはＬ５供給源の固体支持体への共有結合性の付着は、一般に、まず支持体を、支持体とポリペプチド上のヒドロキシル基またはアミノ基などの官能基の両方と反応する二機能性試薬と反応させることによって実現することができる。例えば、Ｌ３および／またはＬ５供給源は、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、ベンゾキノンを使用して、または支持体上のアルデヒド基とポリペプチド上のアミンおよび活性水素の縮合によって結合させることができる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９１年）、Ａ１２〜Ａ１３を参照されたい）。
【００８９】
ある特定の実施形態において、アッセイは、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイは、まず、試料中の前記Ｌ３および／またはＬ５供給源に特異的な抗体が、固定されたＬ３および／またはＬ５供給源に結合するように、固体支持体、一般にはマイクロタイタープレートのウェル上に固定されたＬ３および／またはＬ５供給源と試料を接触させることによって実施することができる。次いで結合していない試料を固定された供給源から除去し、固定された抗体−Ｌ３供給源複合体および／または抗体−Ｌ５供給源複合体に結合することができる検出試薬を加える。次に、固体支持体に結合したままである検出試薬の量を、特定の検出試薬に適した方法を用いて決定する。
【００９０】
Ｌ３および／またはＬ５供給源が支持体に固定されたら、一般には、支持体上の残りのタンパク質結合部位をブロッキングする。当業者に既知の任意の適切なブロッキング剤、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などを使用することができる。次に、固定されたＬ３および／またはＬ５供給源を試料と一緒にインキュベートし、抗体（試料中に存在すれば）を前記供給源に結合させる。試料は、インキュベートする前にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの適切な希釈剤で希釈することができる。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベートする時間）は、試料中の抗体の存在を検出することを可能にするために十分な期間である。接触時間は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡で実現される結合レベルの少なくとも９５％の結合レベルを実現するために十分であることが好ましい。当業者は、平衡を実現するために必要な時間は、ある期間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定することができることを理解されよう。室温では、一般に約３０分間のインキュベート時間が十分である。
【００９１】
次いで、固体支持体を、適切な緩衝液、例えば０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳなどで洗浄することによって結合していない試料を除去することができる。次いで、検出試薬を固体支持体に加えることができる。適切な検出試薬は、固定された抗体−Ｌ３供給源複合体および／または抗体−Ｌ５供給源複合体に結合し、当業者に既知の種々の手段のいずれかによって検出することができる任意の化合物である。検出試薬は、レポーター基とコンジュゲートした結合剤（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レクチンまたは遊離抗原など）を含有することが好ましい。好ましいレポーター基としては、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、基質、補因子、阻害剤、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられる。結合剤のレポーター基へのコンジュゲーションは、当業者に既知の標準の方法を使用して実現することができる。種々のレポーター基とコンジュゲートした一般的な結合剤を多くの供給源（例えば、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡおよびＰｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入することもできる。
【００９２】
次に、検出試薬を固定された抗体Ｌ３供給源複合体および／または抗体Ｌ５供給源複合体と一緒に、結合した抗体を検出するために十分な時間、インキュベートする。適切な時間は、一般に、製造者の説明書から、またはある期間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定することができる。次いで、結合していない検出試薬を除去し、レポーター基を使用して結合した検出試薬を検出する。
【００９３】
レポーター基を検出するために使用する方法は、レポーター基の性質に左右される。放射性基については、シンチレーション測定またはオートラジオグラフィーによる方法が一般に適している。色素、発光基および蛍光基は分光法を使用して検出することができる。ビオチンは、種々のレポーター基（一般に、放射性基または蛍光基または酵素）にカップリングしたアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基は、一般に、基質を加え（一般に、特定の期間にわたって）、その後、反応生成物の分光分析または他の分析を行うことによって検出することができる。
【００９４】
試料中の、リーシュマニア症などの寄生虫症に特異的な抗体の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままであるレポーター基から検出されるシグナルを、一般に、所定のカットオフ値に対応するシグナルと比較する。好ましい一実施形態において、カットオフ値は、固定されたＬ３および／またはＬ５供給源を、感染していない対象由来の試料と一緒にインキュベートする場合に得られる平均シグナルであることが好ましい。一般に、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを発生する試料が陽性であるとみなされる（すなわち、Ｌ３および／またはＬ５供給源と反応する）。代わりの好ましい実施形態において、カットオフ値は、受信者動作曲線を使用して、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０６〜７頁（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１９８５年）方法に従って決定する。簡単に述べると、この実施形態において、診断的な試験結果についての、それぞれの可能性のあるカットオフ値に対応する真陽性率（すなわち、感度）と偽陽性率（１００％−特異性）の対のプロットからカットオフ値を決定することができる。
【００９５】
プロット上の左上隅に最も近いカットオフ値（すなわち、最も大きな領域を包含する値）が最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定されるカットオフ値よりも大きなシグナルを発生する試料を、陽性とみなすことができる。あるいは、カットオフ値は、偽陽性率を最小にするためにプロットに沿って左側にシフトさせることができる、または、偽陰性率を最小にするために右側にシフトさせることができる。
【００９６】
関連する実施形態において、アッセイは、Ｌ３および／またはＬ５供給源をニトロセルロースなどのメンブレン上に固定し、フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）試験形式またはストリップ（ｓｔｒｉｐ）試験形式で実施する。フロースルー試験では、試料がメンブレンを通過するにつれて、試料中の抗体が固定されたＬ３および／またはＬ５供給源に結合する。次いで、メンブレンを通して検出試薬を含有する溶液を流すにつれて、検出試薬（例えば、プロテインＡ−コロイド金）が抗体−Ｌ３供給源複合体および／または抗体−Ｌ５供給源複合体に結合する。次いで、結合した検出試薬の検出を上記の通り実施することができる。ストリップ試験形式では、供給源を結合させたメンブレンの一端を、試料を含有する溶液に浸漬する。試料を、メンブレンに沿って検出試薬を含有する領域を通して、固定したポリペプチドの領域まで泳動させる。Ｌ３および／またはＬ５供給源に検出試薬が集中することよって、試料中の、リーシュマニア症などの寄生虫症を引き起こす寄生生物の抗原に特異的な抗体の存在が示される。一般には、その部位に検出試薬が集中することにより、視覚的に読み取ることができる線などのパターンが発生する。そのようなパターンがないことは、陰性の結果を示す。一般に、メンブレン上に固定するＬ３および／またはＬ５供給源の量は、上記の通り、ＥＬＩＳＡにおいて試料が陽性シグナルを発生するために十分なレベルの抗体を含有する場合に視覚的に識別可能なパターンが発生するように選択する。メンブレン上に固定するＬ３および／またはＬ５の量は、２５ｎｇ〜５００ｎｇの範囲であることが好ましい。そのような試験は、一般には、非常に少量（例えば、１滴）の対象の血清または血液を用いて行うことができる。
【００９７】
このアッセイデバイスでＳ４および／またはＳ６供給源をＬ３および／またはＬ５供給源と組み合わせて使用する場合、Ｌ３および／またはＬ５供給源に適用した際のアッセイデバイスのそれぞれの要素の開示をＳ４および／またはＳ６供給源にも適用することができる。
【００９８】
対象または医師は誰でも、診察室／家でこのデバイスを使用することができ、必要になるたびにそのようなデバイスの使用を繰り返すことができる。
【００９９】
通常、アッセイでは、陽性コントロールまたは陰性コントロールとして追加的な分子を使用する。典型的な陽性コントロールは、試験される試料中に存在することがわかっている分子を認識する抗体であってよい。典型的な陰性コントロールは、試験される試料中に存在しないことがわかっている分子を認識する抗体であってよい。
【０１００】
一般的な定義
本発明に関しては、タンパク質またはタンパク質断片は、アミノ酸配列で表される。
【０１０１】
本発明に関しては、核酸分子は、タンパク質またはポリペプチドまたはタンパク質断片をコードする核酸またはヌクレオチド配列で表される。核酸分子は、調節領域を含んでよい。
【０１０２】
ここにおいて所与の配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）によって同定されているそれぞれの核酸分子またはタンパク質またはタンパク質断片は、開示されたこの特定の配列に限定されないことが理解されるべきである。ここにおいて同定されているそれぞれの遺伝子配列またはヌクレオチド配列は、所与のタンパク質またはポリペプチドまたはタンパク質断片をコードする、またはそれ自体がタンパク質またはタンパク質断片である。本出願全体を通して、特定のヌクレオチド配列の配列番号（例として配列番号２または４を挙げる）に言及するときはいつも、それを以下のもので置き換えることができる：
ｉ．配列番号２または４または４９または５１または５３または５５または６５に対して少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（例として）。
【０１０３】
ｉｉ．その相補鎖が、（ｉ）の配列の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｉｉｉ．遺伝暗号の縮重に起因してその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列。
【０１０４】
ｉｖ．配列番号２または４または４９または５１または５３または５５または６５のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【０１０５】
本出願全体を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号（例として、配列番号１または３または４８または５０または５２または５４または５６を挙げる）に言及するときはいつも、それを以下のもので置き換えることができる：
配列番号１または３または４８または５０または５２または５４または５６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０１０６】
ここにおいて所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対するその同一性または類似性の百分率（少なくとも６０％）によって記載されているそれぞれのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、それぞれ、さらに好ましい実施形態において、所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対して、それぞれ少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性または類似性を有する。好ましい実施形態において、ここにおいて同定されている配列の全長を比較することによって配列の同一性または類似性を決定する。
【０１０７】
「配列同一性」は、ここでは、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係と定義される。好ましい実施形態において、配列同一性は、２つの所与の配列番号の全長に基づいて、またはその一部に基づいて算出する。その一部とは、両方の配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を意味することが好ましい。当該分野では、「同一性」は、アミノ酸配列間または核酸配列間の配列の関連性の程度も意味し、それは、任意には、一連のそのような配列の間のマッチによって決定される。
【０１０８】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定する。「同一性」および「類似性」は、これらに限定されないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；およびＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８巻：１０７３頁（１９８８年）に記載のものを含めた既知の方法によって容易に算出することができる。
【０１０９】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きなマッチを生じるように設計する。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２巻（１号）：３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｍアルゴリズムも、同一性を決定するために使用することができる。
【０１１０】
ポリペプチド配列を比較するための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｍおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較行列：ＢＬＯＳＳＵＭ６２、ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９巻：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年）；ギャップペナルティ：１２；およびギャップ長ペナルティ：４。これらのパラメータを用いて有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩに所在するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐによる「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。上述のパラメータは、アミノ酸を比較するための初期状態のパラメータである（末端ギャップに対するペナルティなしと一緒に）。
【０１１１】
核酸を比較するための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｍおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓに所在するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからギャッププログラムとして入手可能である。上記は、核酸を比較するための初期状態のパラメータである。
【０１１２】
任意に、アミノ酸の類似性の程度の決定において、当業者は、いわゆる「保存された」アミノ酸置換も考慮に入れることができ、これは当業者に明らかであるだろう。保存されたアミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存されたアミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。ここに開示されているアミノ酸配列の置換変異体は、開示されている配列の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に種々の残基が挿入されているものである。アミノ酸の変化は、保存的であることが好ましい。天然に存在するアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存された置換は、以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ；および、ＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕ。
【０１１３】
核酸構築物
核酸構築物は、ここで定義されているタンパク質またはタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ここで定義されている所与のタンパク質またはタンパク質断片をコードする核酸分子を含む核酸構築物により、処置された対象において所与の核酸分子、および対応するタンパク質またはタンパク質断片が発現されることが確実になる。より好ましい実施形態において、核酸構築物は、２つ以上の核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は所与のタンパク質またはタンパク質断片をコードする。さらに好ましい実施形態において、核酸構築物は、２つの核酸分子、３つの核酸分子、４つの核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は、所与のタンパク質またはタンパク質断片をコードする。好ましい実施形態において、核酸構築物は発現カセットを含み、前記発現カセットは、それぞれの必要とされる核酸分子を含む。それぞれの核酸分子は、存在する他の核酸分子に作動可能に連結されている。最も好ましくは、対象において核酸分子を確実に発現させるために、適切なプロモーターが発現カセットに作動可能に連結されている。
【０１１４】
本文書およびその特許請求の範囲において、「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞およびその活用は、非限定的な意味で使用されており、その単語の次に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されるものではないことを意味する。さらに「成る（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ）」という動詞は、「から本質的に成る（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に置き換えることができ、つまり、ここで定義されている生成物または組成物またはＬ３供給源またはＬ５供給源は、具体的に同定されているものに加えて追加的な成分（複数可）を含むことができ、前記追加的な成分（複数可）によって本発明の独特の特性は変化しない。
【０１１５】
さらに、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という不定冠詞によって要素に言及することにより、文脈によりたった１つのその要素があるということが明らかに必要とされている場合を除き、その要素が２つ以上存在する可能性は排除されない。したがって、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という不定冠詞は、通常、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を意味する。
【０１１６】
ここにおいて引用されている全ての特許および文献参照は、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１１７】
本発明は以下の実施例によってさらに例示され、実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】組換えＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５タンパク質の発現および精製を示す図。誘導後（ライン１）、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム通過後（ライン２）の、ｐＱＥＬｍＬ３ベクター（パネルＬ３）またはｐＱＥＬｍＬ５ベクター（パネルＬ５）を形質移入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ溶解液の溶解液ならびに精製された組換えｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５（ライン３）のクマシーブルー染色された１３％ポリアクリルアミドゲルである。
【図２ａ】Ｌ３およびＬ５タンパク質の抗原性を示す図。
【０１１９】
（ａ）１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０４のＬ．ｍａｊｏｒ、静止期前鞭毛型を左フットパッドにｓ．ｃ．感染させ、チャレンジ後８週で血清を得た。ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５に対する、皮膚リーシュマニア症（ＭＣＬ）を有するマウス由来の血清のＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体の関連性を、ＥＬＩＳＡにより個別に決定した。感染前の同じマウス由来の血清の反応性の欠如もまた提示した。ｒＬｍＬ３（ｂ）およびｒＬｍＬ５（ｃ）組換えタンパク質に対する、症候性ＣＶＬを有するイヌ由来の血清および対照血清のＥＬＩＳＡ反応性。
【図２ｂ】Ｌ３およびＬ５タンパク質の抗原性を示す図。
【０１２０】
（ａ）１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０４のＬ．ｍａｊｏｒ、静止期前鞭毛型を左フットパッドにｓ．ｃ．感染させ、チャレンジ後８週で血清を得た。ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５に対する、皮膚リーシュマニア症（ＭＣＬ）を有するマウス由来の血清のＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体の関連性を、ＥＬＩＳＡにより個別に決定した。感染前の同じマウス由来の血清の反応性の欠如もまた提示した。ｒＬｍＬ３（ｂ）およびｒＬｍＬ５（ｃ）組換えタンパク質に対する、症候性ＣＶＬを有するイヌ由来の血清および対照血清のＥＬＩＳＡ反応性。
【図２ｃ】Ｌ３およびＬ５タンパク質の抗原性を示す図。
【０１２１】
（ａ）１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０４のＬ．ｍａｊｏｒ、静止期前鞭毛型を左フットパッドにｓ．ｃ．感染させ、チャレンジ後８週で血清を得た。ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５に対する、皮膚リーシュマニア症（ＭＣＬ）を有するマウス由来の血清のＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体の関連性を、ＥＬＩＳＡにより個別に決定した。感染前の同じマウス由来の血清の反応性の欠如もまた提示した。ｒＬｍＬ３（ｂ）およびｒＬｍＬ５（ｃ）組換えタンパク質に対する、症候性ＣＶＬを有するイヌ由来の血清および対照血清のＥＬＩＳＡ反応性。
【図３ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種により誘導されたサイトカイン産生を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹／群）を、１０μｇのｒＬｍＬ３＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ３＋ＣｐＧ）または１０μｇのｒＬｍＬ５＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ５＋ＣｐＧ）ならびに５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ）またはＰＢＳ（食塩水）を用いて、３回免疫化した。ワクチン接種４週後に脾臓細胞を得、ｒＬｍＬ３（ａ、ｃおよびｅ）、ｒＬｍＬ５（ｂ、ｄおよびｆ）の存在下および媒体単独で４８時間、インビトロ培養した。培養液上清中のＩＦＮ−γ（ａおよびｂ）、ＩＬ−４（ｃおよびｄ）およびＩＬ−１０（ｅおよびｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより査定した。個々のバーは、個別のマウス由来のデータの平均±ＳＤを表す。
【図３ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種により誘導されたサイトカイン産生を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹／群）を、１０μｇのｒＬｍＬ３＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ３＋ＣｐＧ）または１０μｇのｒＬｍＬ５＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ５＋ＣｐＧ）ならびに５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ）またはＰＢＳ（食塩水）を用いて、３回免疫化した。ワクチン接種４週後に脾臓細胞を得、ｒＬｍＬ３（ａ、ｃおよびｅ）、ｒＬｍＬ５（ｂ、ｄおよびｆ）の存在下および媒体単独で４８時間、インビトロ培養した。培養液上清中のＩＦＮ−γ（ａおよびｂ）、ＩＬ−４（ｃおよびｄ）およびＩＬ−１０（ｅおよびｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより査定した。個々のバーは、個別のマウス由来のデータの平均±ＳＤを表す。
【図３ｃ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種により誘導されたサイトカイン産生を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹／群）を、１０μｇのｒＬｍＬ３＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ３＋ＣｐＧ）または１０μｇのｒＬｍＬ５＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ５＋ＣｐＧ）ならびに５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ）またはＰＢＳ（食塩水）を用いて、３回免疫化した。ワクチン接種４週後に脾臓細胞を得、ｒＬｍＬ３（ａ、ｃおよびｅ）、ｒＬｍＬ５（ｂ、ｄおよびｆ）の存在下および媒体単独で４８時間、インビトロ培養した。培養液上清中のＩＦＮ−γ（ａおよびｂ）、ＩＬ−４（ｃおよびｄ）およびＩＬ−１０（ｅおよびｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより査定した。個々のバーは、個別のマウス由来のデータの平均±ＳＤを表す。
【図３ｄ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種により誘導されたサイトカイン産生を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹／群）を、１０μｇのｒＬｍＬ３＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ３＋ＣｐＧ）または１０μｇのｒＬｍＬ５＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ５＋ＣｐＧ）ならびに５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ）またはＰＢＳ（食塩水）を用いて、３回免疫化した。ワクチン接種４週後に脾臓細胞を得、ｒＬｍＬ３（ａ、ｃおよびｅ）、ｒＬｍＬ５（ｂ、ｄおよびｆ）の存在下および媒体単独で４８時間、インビトロ培養した。培養液上清中のＩＦＮ−γ（ａおよびｂ）、ＩＬ−４（ｃおよびｄ）およびＩＬ−１０（ｅおよびｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより査定した。個々のバーは、個別のマウス由来のデータの平均±ＳＤを表す。
【図３ｅ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種により誘導されたサイトカイン産生を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹／群）を、１０μｇのｒＬｍＬ３＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ３＋ＣｐＧ）または１０μｇのｒＬｍＬ５＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ５＋ＣｐＧ）ならびに５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ）またはＰＢＳ（食塩水）を用いて、３回免疫化した。ワクチン接種４週後に脾臓細胞を得、ｒＬｍＬ３（ａ、ｃおよびｅ）、ｒＬｍＬ５（ｂ、ｄおよびｆ）の存在下および媒体単独で４８時間、インビトロ培養した。培養液上清中のＩＦＮ−γ（ａおよびｂ）、ＩＬ−４（ｃおよびｄ）およびＩＬ−１０（ｅおよびｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより査定した。個々のバーは、個別のマウス由来のデータの平均±ＳＤを表す。
【図３ｆ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種により誘導されたサイトカイン産生を示す図。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹／群）を、１０μｇのｒＬｍＬ３＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ３＋ＣｐＧ）または１０μｇのｒＬｍＬ５＋５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｌ５＋ＣｐＧ）ならびに５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ）またはＰＢＳ（食塩水）を用いて、３回免疫化した。ワクチン接種４週後に脾臓細胞を得、ｒＬｍＬ３（ａ、ｃおよびｅ）、ｒＬｍＬ５（ｂ、ｄおよびｆ）の存在下および媒体単独で４８時間、インビトロ培養した。培養液上清中のＩＦＮ−γ（ａおよびｂ）、ＩＬ−４（ｃおよびｄ）およびＩＬ−１０（ｅおよびｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより査定した。個々のバーは、個別のマウス由来のデータの平均±ＳＤを表す。
【図４ａ】チャレンジ後の、ワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬ．ｍａｊｏｒ感染の経過を示す図。（ａ  フットパッドの腫脹は、感染フットパッドおよび未感染の対側フットパッドの間の厚みの差として示される。（ｂ  感染した脚および脾臓の膝窩流入領域リンパ節における生存寄生生物の数を、チャレンジ後８週に限界希釈により個別に決定した（＊、Ｐ＜０．０１）
【図４ｂ】チャレンジ後の、ワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬ．ｍａｊｏｒ感染の経過を示す図。（ａ  フットパッドの腫脹は、感染フットパッドおよび未感染の対側フットパッドの間の厚みの差として示される。（ｂ  感染した脚および脾臓の膝窩流入領域リンパ節における生存寄生生物の数を、チャレンジ後８週に限界希釈により個別に決定した（＊、Ｐ＜０．０１）
【図５ａ】Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスにおいて、感染によって誘発された細胞性免疫応答を示す図。寄生生物チャレンジ後８週に、脾臓細胞培養液を確立させた。細胞は、刺激されない（媒体）、またはＬＲＰ（リーシュマニアリボソームタンパク質）（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＳＬＡ（可溶性リーシュマニア抗原）（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＭＲＰ（マウスリボソームタンパク質）（１２μｇ  ｍｌ−１）もしくはＬ３（６μｇ  ｍｌ−１）を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において別々に刺激された。ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｂ）およびＩＬ−１０（ｃ）のレベルを、培養液上清において、捕捉酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。個々のバーは、６匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均プラス標準偏差を表す。
【図５ｂ】Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスにおいて、感染によって誘発された細胞性免疫応答を示す図。寄生生物チャレンジ後８週に、脾臓細胞培養液を確立させた。細胞は、刺激されない（媒体）、またはＬＲＰ（リーシュマニアリボソームタンパク質）（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＳＬＡ（可溶性リーシュマニア抗原）（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＭＲＰ（マウスリボソームタンパク質）（１２μｇ  ｍｌ−１）もしくはＬ３（６μｇ  ｍｌ−１）を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において別々に刺激された。ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｂ）およびＩＬ−１０（ｃ）のレベルを、培養液上清において、捕捉酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。個々のバーは、６匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均プラス標準偏差を表す。
【図５ｃ】Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスにおいて、感染によって誘発された細胞性免疫応答を示す図。寄生生物チャレンジ後８週に、脾臓細胞培養液を確立させた。細胞は、刺激されない（媒体）、またはＬＲＰ（リーシュマニアリボソームタンパク質）（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＳＬＡ（可溶性リーシュマニア抗原）（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＭＲＰ（マウスリボソームタンパク質）（１２μｇ  ｍｌ−１）もしくはＬ３（６μｇ  ｍｌ−１）を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において別々に刺激された。ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｂ）およびＩＬ−１０（ｃ）のレベルを、培養液上清において、捕捉酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。個々のバーは、６匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均プラス標準偏差を表す。
【図６ａ】Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスにおいて、感染によって誘発された細胞性免疫応答を示す図。寄生生物チャレンジ後８週に、脾臓細胞培養液を確立させた。細胞は、刺激されない（媒体）、またはＬＲＰ（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＳＬＡ（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＭＲＰ（１２μｇ  ｍｌ−１）もしくはＬ５（６μｇ  ｍｌ−１）を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において別々に刺激された。ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｃ）およびＩＬ−１０（ｂ）のレベルを、培養液上清において、捕捉酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。個々のバーは、６匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均プラス標準偏差を表す。
【図６ｂ】Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスにおいて、感染によって誘発された細胞性免疫応答を示す図。寄生生物チャレンジ後８週に、脾臓細胞培養液を確立させた。細胞は、刺激されない（媒体）、またはＬＲＰ（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＳＬＡ（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＭＲＰ（１２μｇ  ｍｌ−１）もしくはＬ５（６μｇ  ｍｌ−１）を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において別々に刺激された。ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｃ）およびＩＬ−１０（ｂ）のレベルを、培養液上清において、捕捉酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。個々のバーは、６匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均プラス標準偏差を表す。
【図６ｃ】Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスにおいて、感染によって誘発された細胞性免疫応答を示す図。寄生生物チャレンジ後８週に、脾臓細胞培養液を確立させた。細胞は、刺激されない（媒体）、またはＬＲＰ（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＳＬＡ（１２μｇ  ｍｌ−１）、ＭＲＰ（１２μｇ  ｍｌ−１）もしくはＬ５（６μｇ  ｍｌ−１）を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において別々に刺激された。ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｃ）およびＩＬ−１０（ｂ）のレベルを、培養液上清において、捕捉酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。個々のバーは、６匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均プラス標準偏差を表す。
【図７ａ】チャレンジ後の、ワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ感染の経過を示す図。（Ａ）感染した耳における炎症性病変。病変サイズ（ミリメーター）は、５匹のマウスを用いて実施された、１つの実験の平均±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、ｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮまたはｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮをワクチン接種されたマウスと、両方の対照群との間（Ｂ）感染後５週に定量化された、耳の真皮中の寄生生物負荷量。結果は、５匹の耳／群の平均±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、ｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮと両方の対照マウス群との間の有意な減少。
【図７ｂ】チャレンジ後の、ワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ感染の経過を示す図。（Ａ）感染した耳における炎症性病変。病変サイズ（ミリメーター）は、５匹のマウスを用いて実施された、１つの実験の平均±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、ｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮまたはｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮをワクチン接種されたマウスと、両方の対照群との間（Ｂ）感染後５週に定量化された、耳の真皮中の寄生生物負荷量。結果は、５匹の耳／群の平均±ＳＤとして表される。＊Ｐ＜０．０５、ｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮと両方の対照マウス群との間の有意な減少。
【図８ａ】ＬｍＬ３およびＬｍＬ５タンパク質のリボソームの位置を示す図。１μｇのｒＬｍＬ３タンパク質（Ａ）、１μｇのｒＬｍＬ５タンパク質（Ｂ）および１０μｇのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのＬＲＰ抽出液（ＡおよびＢ）１０〜１３％の線形勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動にかけた。ゲルのクマシーブルー染色を、左パネル（ＡおよびＢ）に示す。等価のゲルをブロットし、ｒＬｍＬ３（パネルα−ＬｍＬ３）を用いて免疫化されたマウス由来の血清（Ａ）および５匹のイヌ内臓リーシュマニア症血清の親和性精製された抗ＬｍＬ５抗体分画（パネルα−ＬｍＬ５）（Ｂ）を用いてプローブした。
【図８ｂ】ＬｍＬ３およびＬｍＬ５タンパク質のリボソームの位置を示す図。１μｇのｒＬｍＬ３タンパク質（Ａ）、１μｇのｒＬｍＬ５タンパク質（Ｂ）および１０μｇのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのＬＲＰ抽出液（ＡおよびＢ）１０〜１３％の線形勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動にかけた。ゲルのクマシーブルー染色を、左パネル（ＡおよびＢ）に示す。等価のゲルをブロットし、ｒＬｍＬ３（パネルα−ＬｍＬ３）を用いて免疫化されたマウス由来の血清（Ａ）および５匹のイヌ内臓リーシュマニア症血清の親和性精製された抗ＬｍＬ５抗体分画（パネルα−ＬｍＬ５）（Ｂ）を用いてプローブした。
【図９ａ】ＣｐＧの存在下でリボソームタンパク質Ｓ６、Ｌ２、Ｌ７、Ｌ８およびＬ６をワクチン接種されたマウスにおける感染パラメータの分析を示す図。（Ａ）感染群における病変の発生を、感染後８週まで、週に１回モニターした。（＊Ｐ＜０．０５）Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮと対照（食塩水およびアジュバント）群との間のフットパッドの腫脹の差は、感染後８週において統計的に有意であった。
【図９ｂ】ＣｐＧの存在下でリボソームタンパク質Ｓ６、Ｌ２、Ｌ７、Ｌ８およびＬ６をワクチン接種されたマウスにおける感染パラメータの分析を示す図。（Ｂ）感染後８週に分析されたＤＬＮおよび脾臓における寄生生物負荷量の決定を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種された群の脾臓および対照（食塩水およびアジュバント）群の脾臓における寄生生物のロード量の差は、統計的に有意であった。明確にするために、食塩水群およびＳ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種された群由来のＳＤのみを示す。
【図１０ａ】Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮのワクチン接種により誘発された免疫応答の図。血清試料を、Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＣｐＧ  ＯＤＮおよび食塩水を用いて免疫化されたマウスから、最終用量の投与後４週に得た。血清を、ＥＬＩＳＡにより個別に試験し、抗Ｓ６特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の存在を決定した。（＊Ｐ＜０．０５）Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮ群と対照（食塩水およびＣｐＧ）群との間の統計的有意差。（Ｂ）脾臓細胞は、刺激されなかった（媒体）、またはＳ６を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において刺激された。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０レベルを、培養液上清中で、捕捉酵素結合免疫吸着測定法により測定した。個々のバーは、４匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均＋標準偏差を表す。（＊Ｐ＜０．０５）Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮ群と対照（食塩水およびＣｐＧ）群との間の統計的有意差。
【図１０ｂ】Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮのワクチン接種により誘発された免疫応答の図。血清試料を、Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＣｐＧ  ＯＤＮおよび食塩水を用いて免疫化されたマウスから、最終用量の投与後４週に得た。血清を、ＥＬＩＳＡにより個別に試験し、抗Ｓ６特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の存在を決定した。（＊Ｐ＜０．０５）Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮ群と対照（食塩水およびＣｐＧ）群との間の統計的有意差。（Ｂ）脾臓細胞は、刺激されなかった（媒体）、またはＳ６を用いて、４８時間、５％ＣＯ２中で３７℃において刺激された。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０レベルを、培養液上清中で、捕捉酵素結合免疫吸着測定法により測定した。個々のバーは、４匹の個別のマウス／群において決定されたサイトカインレベルの平均＋標準偏差を表す。（＊Ｐ＜０．０５）Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮ群と対照（食塩水およびＣｐＧ）群との間の統計的有意差。
【図１１ａ】Ｌ３、Ｌ５およびＳ４を用いて個別に、またはＣｐＧの不在下もしくは存在下で、混合調製品において免疫化されたマウスにおける病変の発生を示す図。病変を、感染後６週まで週に１回モニターした。（Ａ）対照マウス群およびアジュバントを含まない組換えタンパク質をワクチン接種されたマウス群。（Ｂ）対照マウス群および組換えタンパク質＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウス群。（＊Ｐ＜０．０５）Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＬ３＋Ｌ５＋Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮならびに対照（食塩水およびアジュバント）群の間のフットパッドの腫脹の差は、感染後６週で統計的に有意であった。
【図１１ｂ】Ｌ３、Ｌ５およびＳ４を用いて個別に、またはＣｐＧの不在下もしくは存在下で、混合調製品において免疫化されたマウスにおける病変の発生を示す図。病変を、感染後６週まで週に１回モニターした。（Ａ）対照マウス群およびアジュバントを含まない組換えタンパク質をワクチン接種されたマウス群。（Ｂ）対照マウス群および組換えタンパク質＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウス群。（＊Ｐ＜０．０５）Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＬ３＋Ｌ５＋Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮならびに対照（食塩水およびアジュバント）群の間のフットパッドの腫脹の差は、感染後６週で統計的に有意であった。
【図１２ａ】ワクチン接種されたマウスにおける寄生生物負荷量を示す図。寄生生物ロード量を、感染後７週に脾臓およびＤＬＮにおいて決定した。（Ａ）対照マウス群およびアジュバントを含まない組換えタンパク質をワクチン接種されたマウス群。（Ｂ）対照マウス群および組換えタンパク質＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウス群。（＊Ｐ＜０．０５）Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＬ３＋Ｌ５＋Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮならびに対照（食塩水およびアジュバント）群の間の脾臓寄生生物負荷量の差は、統計的に有意であった。（＊Ｐ＜０．０５）Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＬ３＋Ｌ５＋Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮならびに対照（食塩水およびアジュバント）群の間の膝窩寄生生物負荷量の差は、統計的に有意であった。
【図１２ｂ】ワクチン接種されたマウスにおける寄生生物負荷量を示す図。寄生生物ロード量を、感染後７週に脾臓およびＤＬＮにおいて決定した。（Ａ）対照マウス群およびアジュバントを含まない組換えタンパク質をワクチン接種されたマウス群。（Ｂ）対照マウス群および組換えタンパク質＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウス群。（＊Ｐ＜０．０５）Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＬ３＋Ｌ５＋Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮならびに対照（食塩水およびアジュバント）群の間の脾臓寄生生物負荷量の差は、統計的に有意であった。（＊Ｐ＜０．０５）Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＬ３＋Ｌ５＋Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮならびに対照（食塩水およびアジュバント）群の間の膝窩寄生生物負荷量の差は、統計的に有意であった。
【図１３】提案されるキメラ構築体の図の表示。設計されたプライマーおよびクローニングのために選択された切断部位を示す。
【実施例】
【０１２２】
例１：Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５タンパク質のクローニングならびにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ感染症に対する、これらのタンパク質によりもたらされる保護作用。
【０１２３】
材料および方法
マウスの血統および寄生生物
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ  Ｉｂｅｒｉｃａ  Ｓ．Ａ．（バルセロナ、スペイン）から購入した。
【０１２４】
Ｌ．ｍａｊｏｒ寄生生物（ＷＨＯＭ／ＩＲ／−／１７３）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける継代により毒性状態を維持した。Ｌ．ｍａｊｏｒの無鞭毛型を得、２０％ウシ胎児血清を添加したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ媒体（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）において、２６℃において培養することによって前鞭毛型に形質転換させた。
【０１２５】
ＣｐＧ−ＯＤＮ
ホスホロチオエート修飾ＣｐＧ−ＯＤＮ（５’−ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ−３’および５’−ＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴ−３’）（配列番号５、６）は、Ｉｓｏｇｅｎ（オランダ）により合成された。
【０１２６】
Ｌ．ｍａｊｏｒのリボソームタンパク質Ｌ３およびＬ５をコードするＤＮＡ配列のクローニング
Ｌ．ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、Ｌ．ｍａｊｏｒゲノムデータベース（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｌｅｉｓｈ）から、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬ３およびＬ５タンパク質配列をプローブとして使用して得た（５６）。ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５タンパク質の発現のために、これらのコーディング領域（ＣＲ）を、Ｌ．ｍａｊｏｒ（ＭＨＯＭ／ＩＬ／８０（Ｆｒｉｅｄｌｉｎ））由来のＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅させた。増幅させたＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）内にクローニングし、配列決定し、その後ｐＱＥ３０発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）内にクローニングした。
【０１２７】
ＬｍＬ３のＣＲのクローニングのために用いたプライマーは：センス、５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＧ−３’（ＬｍＬ３のＣＲの１から２０位（ＬｍｊＦ３４．２８８０））（配列番号４４）；アンチセンス、５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＧ−３’（ＬｍＬ３のＣＲ（ＬｍｊＦ３４．２８８０）の１２４１から１２６０位に対してリバースおよび相補的）（配列番号４５）。ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限部位（下線付き）を、クローニングの目的のために含めた。
【０１２８】
ＬｍＬ５のＣＲのクローニングにために用いたプライマーは：センス，５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＧＣ  ＴＧＧＣＡＡＡＴＴＧ−３’（ＬｍＬ５のＣＲ（ＬｍｊＦ３５．１８９０）の１から２０位）（配列番号４６）；アンチセンス，５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＧＣ−３’（ＬｍＬ５のＣＲ（ＬｍｊＦ３５．１８９０．３１９）の９６８−９８７位に対してリバースおよび相補的）（配列番号４７）。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線付き）を、クローニングの目的のために含めた。
【０１２９】
タンパク質の精製
ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５タンパク質を、ｐＱＥ−ＬｍＬ３またはｐＱＥ−ＬｍＬ５のプラスミドを用いて形質転換させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて過剰発現させ、変性条件下でＮｉ−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）において精製した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースに結合させた後、組換えタンパク質を、（５７）に記載のように、親和性カラムにおいて再フォールディングさせた。組換えタンパク質を、ポリミキシン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）に通した。残留エンドトキシン含有量（＜１２ｐｇ／μｇの組換えタンパク質）を、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ａｓｓａｙ  ＱＣＬ−１０００（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）により測定した。
【０１３０】
免疫化、寄生生物のチャレンジおよび寄生生物の定量化
２つの独立したＢＡＬＢ／ｃマウス群（６匹／群）に、１０μｇのｒＬｍＬ３または１０μｇのｒＬｍＬ５を２５μｇの各ＣｐＧ−ＯＤＮと混合して、右フットパッドに皮下（ｓ．ｃ．）接種した。対照として、２つの追加のマウス群に、２５μｇの各ＣｐＧ−ＯＤＮを単独で、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を接種した。個々の群に、２週および４週後に、プライミングに使用した同じ用量をブーストした。寄生生物のチャレンジを、５×１０４の静止期前鞭毛型のＬ．ｍａｊｏｒ（ＷＨＯＭ／ＩＲ／−／１７３）を、左（未処置）フットパッドに最終接種後４週間にｓ．ｃ．接種することによって実施した。フットパッドの腫脹を、メートル法のキャリパーを用いて測定し、左フットパッドの厚み−右フットパッドの厚みとして計算した。寄生生物の数を、耳、流入領域リンパ節（ＤＬＮ）および脾臓において、（７０）に記載のように限界希釈によって決定した。
【０１３１】
リーシュマニアの抗原およびマウスリボソームタンパク質
Ｌ．ｍａｊｏｒのＬＲＰの調製のために、１０９の前鞭毛型を収穫し、予備冷蔵の洗浄ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＮＰ４０溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５％ＮＰ４０）に再懸濁し、１０回上下にピペッティングした。溶解後、試料を、３，０００×ｇで２分間４℃において微量遠心分離し、核をペレット化した。上清を、１３，０００×ｇで１５分間、４℃において２回微量遠心分離し、［５７］に記載のようにサイトゾルの上清からリボソームを調製した。簡潔に言うと、サイトゾルを、９０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃においてＢｅｃｋｍａｎ  ＴＬ１００．３  ローターで高速遠心分離に供した。粗リボソームペレットを、バッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）に再懸濁し、バッファーＡ中不連続ショ糖勾配（２０／４０％）を介して、９０，０００ｒｐｍで４℃においてＴＬ１００．３ローターで遠心分離にかけた。洗浄されたリボソームのペレットをＰＢＳに溶解し、リボソームのＲＮＡ分解が完了するまで超音波処理した。マウスリボソームタンパク質抽出液（ＭＲＰ）を、５×１０７のＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞から、同じ手順を使用して調製した。
【０１３２】
Ｌ．ｍａｊｏｒの全タンパク質（可溶性リーシュマニア抗原［ＳＬＡ］）を、（７０）に記載のように調製した。簡潔に言うと、Ｌ．ｍａｊｏｒ前鞭毛型（１０１０）をＰＢＳで２回洗浄し、５００ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３回の凍結および解凍のサイクルによって溶解した。細胞溶解後、可溶性抗原を、微量遠心分離を使用する１５分間、１２，０００×ｇの遠心分離によって不溶性分画から分離した。上清をアリコートに分け、−７０℃において保存した。
【０１３３】
上清中のサイトカインの測定
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の放出を、組換えタンパク質を用いて刺激された脾細胞の細胞培養液の上清において、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、フランス）を使用して測定した。簡潔に言うと、３×１０６脾臓細胞を、４８−ウェルプレートに、４８時間３７℃において、ｒＬｍＬ３（６μｇ  ｍｌ−１）またはｒＬｍＬ５（６μｇ  ｍｌ−１）または媒体単独の存在下で播種した。
【０１３４】
マウスおよびイヌにおける抗Ｌ３および抗Ｌ５抗体の応答の検出
イヌ血清試料を、エストレマドゥーラ（Ｅｘｔｒｅｍａｄｕｒａ）地方（スペイン）のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍに自然に感染した、２０匹の臨床的に症候性のイヌから採取した。感染した動物を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｅｘｔｒｅｍａｄｕｒａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃａｃｅｒｅｓ、スペインにおいて臨床的および分析的に評価した。間接的免疫蛍光法によって試験した場合、すべての血清は陽性であり、寄生生物の無鞭毛型の存在が、膝窩および前肩甲骨のリンパ節における直接観察によって確認された。対照血清は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ（Ｅｘｔｒｅｍａｄｕｒａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）において飼育された８匹の健康な動物から得た。
【０１３５】
５×１０４のＬ．ｍａｊｏｒ（ＷＨＯＭ／ＩＲ／−／１７３）の静止期前鞭毛型に実験的に感染させた１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清を、感染後８週に採取した。対照として、同じマウス由来の血清を、感染前に採取した。
【０１３６】
標準的ＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌの組換えリボソームタンパク質（ＰＢＳ中２μｇ  ｍｌ−１）のそれぞれ１つを用いて、室温において一晩コーティングした。イヌおよびマウスの血清試料を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．５％）−カゼイン（５％）中１／２００希釈においてアッセイした。二次抗体として、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔｉｌｂｕｒｇ、オランダ）から購入したホースラッディシュペルオキシダーゼ標識された抗イヌＩｇＧ（１／１０００）、抗マウスＩｇＧ１（１／１０００）および抗マウスＩｇＧ２ａ（１／５００）を使用した。オルトフェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）（Ｄａｋｏ、Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を、ＥＬＩＳＡアッセイ用のペルオキシダーゼ基質として使用した。１５分後、反応を、１００μｌのＨ２ＳＯ４  １Ｍの添加により停止させ、吸光度を、４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１３７】
統計分析
統計分析を、スチューデントｔ検定によって実施した。Ｐ＜０．０５の場合、差は有意であると考えた。
【０１３８】
結果および考察
ＬｍＬ３およびＬｍＬ５タンパク質の同定、クローニングおよび発現
Ｌ．ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５のコーディング領域を同定するために、本発明者らは、プローブとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬ３およびＬ５のアミノ酸配列（それぞれ、ＹＯＲ０６３ｗおよびＹＰＬ１３１ｗ）を使用して、ＢＬＡＳＴＰ検索を実施した［５８］。推定ＬｍＬ３およびＬｍＬ５タンパク質として注釈を付けた、２つの異なるエントリ（ＬｍｊＦ３４．２８８０およびＬｍｊＦ３５．１８９０）を、ＢＬＡＳＴスコアの有意値を用いてレスキューした。データベースの配列データに基づき、ＰＣＲプライマーを設計し、クローニングを目的とするさまざまな制限酵素のためのカット部位を含む、ＬｍＬ３およびＬｍＬ５のＣＲを増幅した。増幅されたＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、配列決定した。Ｌ．ｍａｊｏｒの推定Ｌ３タンパク質は、分子量４７．５ｋＤａおよび予測等電点１１．６７を有する、４１９個のアミノ酸を保有する。Ｌ．ｍａｊｏｒの推定Ｌ５タンパク質は、分子量３６．６ｋＤａおよび予測等電点１０．６９を有する、３２８個のアミノ酸を保有する。Ｌ．ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５の推定アミノ酸配列と、それらのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅカウンターパートとの比較により、高度の相同性：Ｌ３タンパク質に関して５７％の同一性、７３．５％の類似性、Ｌ５タンパク質に関して；５１．２％の同一性、６６．３％の類似性が明らかにされた（アライメントを参照されたい）。ここに提示されたアライメントは、ＬｅｉｓｈｍａｎｉａのＬ３およびＬ５タンパク質が、高度の類似性を有するいくつかのドメインを含有することを示す。両方の寄生生物タンパク質は酵母タンパク質より長く、ＬｍＬ３に関してはカルボキシ末端およびＬｍＬ５に関しては両方の末端に余分なアミノ酸残基を提示することが観察されることもまた、注目に値する。感染期間中にこれらのタンパク質に対して誘発された液性応答および細胞性応答は、宿主カウンターパート由来の相同タンパク質との交差反応性を有さない寄生生物に対して特異的であるので、保存タンパク質ファミリーに属するＬｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質の稀な一次構造は、免疫学的に関連していると思われる（３９、３６、５８）。
【０１３９】
ＬｍＬ３およびＬｍＬ５のＣＲを、ｐＱＥ３０発現ベクターにサブクローニングした。推定組換えタンパク質のアミノ酸配列を、アライメントのパートＣおよびＤに示す。両方のタンパク質は、親和性クロマトグラフィー精製に使用される６個のヒスチジンを含むＮ末端タグとして表す。その後、両方のタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ培養液中で過剰発現させ、精製した。図１に示されるように、精製されたｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５タンパク質は、それぞれ、これらのＮ末端領域に１２アミノ酸の追加のｈｉｓタグの伸張の存在に一致する、見かけの分子量４８ｋＤａおよび３８ｋＤａを示した。クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、両方の精製された組換えタンパク質に関する単一のバンドが観察されたので、タンパク質の純度が実証された（図１）。
【０１４０】
ＬｍＬ３およびＬｍＬ５は、イヌ内臓リーシュマニア症（ＣＶＬ）の血清によって、およびＬ．ｍａｊｏｒ（ＭＣＬ）に感染したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清によって認識される。
【０１４１】
ＶＬの影響を受ける、イヌにおけるＬ．ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５タンパク質の抗原性を決定するために、組換えｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５タンパク質を、２０匹のＬ．ｉｎｆａｎｔｕｍに感染したイヌ由来の血清を使用するＥＬＩＳＡアッセイの抗原として用いた。対照として、両方の組換えタンパク質に対する、８匹の健康なイヌから得た血清の反応性をアッセイした。ＣＶＬ血清のうち、７５％（１５／２０）がｒＬｍＬ３タンパク質（図２ｂ）を認識し、９０％（１８／２０）が、カットオフ値より高い反応性の値でｒＬｍＬ５タンパク質を認識した（図２ｃ）。ｒＬｍＬ５に対するＣＶＬ血清の反応性（平均＝０．６１±０．３６）は、ｒＬｍＬ３に対して得られたもの（平均＝０．２８±０．１０）より高かったので、ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５に対する反応性の間の吸光度の値のスペクトルは異なった。両方の寄生生物タンパク質は、イヌ自然リーシュマニア症の期間に免疫系に曝露され、ＬｍＬ５タンパク質は、ＬｍＬ３より広く行き渡った免疫原であると結論付けることができる。ここにおいて、限られた数の血清を用いたが、得られたデータは、他の抗原と組み合わせて、ＣＶＬの血清診断試験の開発のために両方の組換え寄生生物タンパク質を使用できることの指摘であると解釈することができる。
【０１４２】
次に、本発明者らは、Ｌ．ｍａｊｏｒの感染による皮膚リーシュマニア症（ＭＣＬ）を患うＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する血清を使用して、ＬｍＬ３およびＬｍＬ５タンパク質の抗原性を分析した。この目的のために、両方の組換えタンパク質に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の存在を、ＥＬＩＳＡにより分析した。両方のタンパク質は、それらに対して誘発された抗体、大部分はＩｇＧ１アイソタイプであるＭＣＬ血清により認識された（図２ａ）。感染前の同じマウスにおいて、両方のタンパク質に対する反応性は観察されなかった（図２ａ）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の誘導は、それぞれ、Ｔｈ２−タイプおよびＴｈ１タイプの免疫応答のマーカーとして使用されるので（８）、本発明者らは、Ｌ．ｍａｊｏｒ感染期間中に、Ｔｈ２−様液性応答が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてこれらの抗原に対して誘導されると結論付けることができる。
【０１４３】
ＣｐＧ  ＯＤＮの存在下のｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５組換えリボソームのタンパク質による免疫化は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、それらに対するＴｈ１タイプの応答を誘導する。
【０１４４】
それらに対するＴｈ２介在性液性応答は、感染したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘発されるので、本発明者らは、Ｔｈ１誘導性アジュバント（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の存在下で、ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５の免疫化の効果を分析した。この目的のために、６匹のマウスの群を、ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５をＣｐＧ−ＯＤＮと組み合わせて用い、独立して免疫化した。対照として、６匹のマウスの群を、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独を用いて、およびＰＢＳ（賦形剤として用いたバッファー）を用いて免疫化した。３用量後、免疫化により引き起こされた細胞性応答を分析した。脾臓細胞を得、対応するｒＬｍＬ３またはｒＬｍＬ５抗原の存在下、および不在下で培養した。ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮを用いて免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、ｒＬｍＬ３抗原を用いた刺激後、高レベルのＩＦＮ−ガンマを産生した（図３ａ）。同様のＩＦＮ−ガンマレベルが、ｒＬｍＬ５の刺激後に、ｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮを用いて免疫化されたマウス由来の脾臓細胞培養液の上清において検出された（図３ｂ）。対照的に、アジュバントまたは賦形剤を用いて免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、ｒＬｍＬ３またはｒＬｍＬ５の刺激に対する応答において、低レベルのＩＦＮ−ガンマを産生した（図３ａｂ）。ＩＬ−４の産生に関して、ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮ（図３ｃ）またはｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮ（図４ｄ）を用いて免疫化されたマウスから得られた脾臓細胞の、それぞれｒＬｍＬ３またはｒＬｍＬ５刺激後、非常に低レベルのこのサイトカインが検出された。最終的に、任意の群において、ＩＬ−１０特異的産生は検出されなかった（図３ｅｆ）。したがって、ＣｐＧ−ＯＤＮアジュバントが、Ｔｈ１応答に向かう組換え抗原に対する免疫応答を歪めたことを結論付けることができる。
【０１４５】
ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮを用いたワクチン接種は、Ｌ．ｍａｊｏｒチャレンジに対してＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する。
【０１４６】
本発明者らは、両方の組換えタンパク質の投与が、感受性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＬ．ｍａｊｏｒ感染症に対する保護を誘導できるかどうかを分析した。ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮまたはｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮをワクチン接種されたマウスのフットパッドの腫脹は、ＰＢＳまたはＣｐＧ−ＯＤＮ対照群のフットパッドの腫脹と比較して有意に低かった（図４ａ）。さらに、寄生生物負荷量におけるおよそ２−ｌｏｇの減少が、ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮまたはｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮにより免疫化されたマウス由来の流入領域リンパ節細胞において観察された。最終的に、脾臓において寄生生物は検出できず、一方、両方の対照群由来のマウスの脾臓において寄生生物が検出された（図３ｂ。ＣｐＧ−ＯＤＮと混合された、組換えタンパク質として発現された寄生生物ＬｍＬ３およびＬｍＬ５タンパク質を用いて免疫化されたマウスは、Ｌ．ｍａｊｏｒ感染症に対して保護されたと結論付けることができる。ワクチン接種されたマウスにおいて、真皮の病状は存在しない、または非常に低かった。これらのマウスにおいて、寄生生物の存在は、膝窩流入領域リンパ節に制限された。観察された保護は、ＬｅｉｓｈｍａｎｉａのヌクレオソームヒストンをコードするプラスミドＤＮＡカクテル（１９）、ＤＮＡワクチンとして投与されたＰ０タンパク質（５４）およびＣｐＧ−ＯＤＮと組み合わせたＬＲＰ抽出液（５５）を用いたマウスの免疫化によって得られた保護と同様であった。したがって、本発明者らは、その免疫化がリーシュマニア症に対するワクチンに定義される有効な分子のより合理的な開発に寄与する、２種のリボソーム成分を特徴付けた。
【０１４７】
保護に関与する免疫学的パラメータの分析
保護に関与する免疫学的パラメータを決定するために、ＳＬＡ、ＬＲＰ、ＭＲＰおよび対応する組換えタンパク質（Ｌ３およびＬ５）により駆動されるサイトカインの産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０）を、ワクチン接種されたマウス群および対照マウス群においてチャレンジ後８週に分析した。Ｌ３およびＬ５をワクチン接種されたマウス由来の脾臓細胞は、チャレンジ後８週に、対照マウス由来の脾臓細胞より多くのＳＬＡ、ＬＲＰおよび組換え抗原特異的ＩＦＮ−γを産生した（Ｌ３に関して図５ａおよびＬ５に関して図６ａ）。ＭＲＰを用いた脾臓細胞培養液の刺激は、ＩＦＮ−γの産生をもたらさなかったので、このサイトカインの産生は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａのリボソームタンパク質により特異的に誘導されることが見出された（Ｌ３に関して図５ａおよびＬ５に関して図６ａ）。さらに、対照マウス（ＣｐＧおよび食塩水）と比較した場合、低レベルのＳＬＡおよびＬＲＰ特異的ＩＬ−１０（Ｌ３に関して図５ｂおよびＬ５に関して図６ｂ）およびＩＬ−４（Ｌ３に関して図５ｃおよびＬ５に関して図６ｃ）が、保護されたマウスから得られた脾臓細胞の上清において見出された。さらに、ＭＲＰ特異的Ｌ３およびＬ５依存性のＩＬ−１０およびＩＬ−４の産生は、保護されたマウスにおいて非常に低かった。したがって、感染後、保護の表現型は、寄生生物により誘導されるＩＬ−４およびＩＬ−１０の応答を調節できる、Ｌ３およびＬ５のＴｈ１応答の誘導と関連したことを結論付けることができる。
【０１４８】
ＬｍＬ３およびＬｍＬ５の配列データのアライメント。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのＬ３（Ａ）およびＬ５（Ｂ）タンパク質ならびにそれらのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのオルソログのアミノ酸配列アライメント。保存されたアミノ酸は陰を付けた。ＬｍＬ３およびＬｍＬ５のアミノ酸の数を示す。Ｌ．ｍａｊｏｒのアミノ酸配列を、それらの対応するＤＮＡ配列から予測した。（ＣおよびＤ）組換えＬｍＬ３（ｒＬｍＬ３）（Ｃ）およびＬｍＬ５（ｒＬｍＬ５）（Ｄ）タンパク質のアミノ酸配列または予測されたアミノ酸配列を、細菌において発現させた。それらのＮ末端に位置する追加のｈｉｓ−タグ配列を、太字および下線付きで示す。ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５タンパク質のアミノ酸の数を示す。
【表Ａ−１】
0005875987.tif 000002
【表Ｂ−１】
0005875987.tif 000003
【表Ｃ−１】
0005875987.tif 000004
【表Ｄ−１】
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【０１４９】
例２：Ｌ３およびＬ５のホモログの分析
Ｌ３およびＬ５のホモログのアライメント
本発明者らは、さまざまなリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種間のＬ３およびＬ５リボソームタンパク質の保存の程度を分析した。この目的のために、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍおよびＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ（配列番号４８および５０）由来のＬ３タンパク質ならびにＬ．ｉｎｆａｎｔｕｍ（クローンＪＰＣＭ５［ＭＣＡＮ／ＥＳ／９８／ＬＬＭ−８７７］）、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＭＨＯＭ／ＢＲ／７５／Ｍ２９０４）およびＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ（ＭＨＯＭ／ＧＴ／２００１／Ｕ１１０３）（配列番号５２、５６および５４）由来のＬ５タンパク質のアミノ酸配列を、ゲノムデータベース（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ）からｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によってレスキューし、Ｌ．ｍａｊｏｒオルソログ（Ｌ３に関して配列番号１およびＬ５に関して配列番号３）からのアミノ酸配列と比較した（次ページにアライメントを示す、パートＡおよびＢ）。Ｌ．ｍａｊｏｒのＬ５タンパク質中のＮ末端の伸張の存在を除き、高度の保存が、さまざまな種の間で観察された。表１Ａ−Ｂはそれぞれ、Ｌ３およびＬ５オルソログの間の同一性および類似性の百分率を示す。
【０１５０】
リボソーム中のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒＬ３およびＬ５の位置
本研究に用いた組換えＬｍＬ３およびＬｍＬ５が、寄生生物リボソーム中に位置するタンパク質に対応することを実証するために、本発明者らは、組換えタンパク質に特異的な抗体を、組換えタンパク質およびＬＲＰ抽出液を含有するウェスタンブロットに用いた。図８Ａは、組換えタンパク質を用いて免疫化されたマウスから得られた抗ＬｍＬ３抗体が、ＬＲＰ抽出液中の予想分子量（４７．５ｋＤａ）を有する単一バンドを認識したことを示す。同様の結果が、Ｌ５タンパク質に関しても観察された（図８Ｂ）。本発明者らが、先に記載のようにｒＬｍＬ５−Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムにおける親和性クロマトグラフィーによって、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍに自然に感染したイヌ血清から精製された抗ＬｍＬ５抗体を用いた場合、３６．６ｋＤａの単一バンドがＬＲＰ抽出液中に観察された（７１）。陽性対照として、両方の事例において、対応する組換えタンパク質は、特異的抗体によって認識された。
【０１５１】
ＬｅｉｓｈｍａｎｉａのＬ３およびＬ５の配列比較。Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍおよびＬ．ｍｅｘｉｃａｎａのＬ３（Ａ）（配列番号１、４８および５０）ならびにＬ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍおよびＬ．ｍｅｘｉｃａｎａのＬ５（Ｂ）（配列番号３、５６、５２および５４）のアミノ酸配列アライメント。Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ（ＧｅｎｅＤＢ識別子  ＬｉｎＪ３２＿Ｖ３．３３２０）およびＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ（ＧｅｎｅＤＢ識別子  ＬｍｘＭ３３．２９００）のＬｍＬ３タンパク質、推定Ｌ３タンパク質の配列ならびにＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＧｅｎｅＤＢ識別子  ＬｂｒＭ３４＿Ｖ２．１７９０）、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ（ＧｅｎｅＤＢ識別子  ＬｉｎＪ３５＿Ｖ３．１８７０）およびＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ（ＧｅｎｅＤＢ識別子  ＬｍｘＭ３４．１８８０）のＬｍＬ５タンパク質および推定Ｌ５タンパク質の配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡｓｔａｒプログラム）のデフォルト設定を使用してアライメントした。アミノ酸置換は陰を付けた。
【表Ａ−２】
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【表Ｂ−２】
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【表１】
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【０１５２】
例３：ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮを用いたワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓチャレンジに対して保護する
本発明者らは、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓの感染により引き起こされた皮膚リーシュマニア症の発症における、Ｔｈ１誘導性アジュバント（ＣｐＧ−ＯＤＮ）と組み合わせたＬ．ｍａｊｏｒの組換えタンパク質ｒＬｍＬ３およびｒＬｍＬ５の免疫化の効果を分析した。この目的のために、５匹のマウスの群を、５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（２５μｇのＣｐＧ−１［５’−ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ−３’］＋２５μｇのＣｐＧ−２［５’−ＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴ−３’）］（配列番号５および６））と組み合わせて、１０μｇのｒＬｍＬ３または１０μｇのｒＬｍＬ５を用いて独立に免疫化した。対照として、５匹のマウスの群を、５０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ単独またはＰＢＳ（賦形剤として用いたバッファー）を用いて免疫化した。マウスに、耳の真皮（左耳）に接種した。各群に、２週および４週後に、プライミングに使用した同じ用量をブーストした。寄生生物のチャレンジを、右（未処置）耳に１０５の静止前鞭毛型のＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＭＨＯＭ／ＢＲ／０１／ＢＡ７８８）を、２対のＬｕｔｚｏｍｙａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａスナバエの唾液腺と組み合わせて注射することにより実施した。感染のこのモデルにおいて、寄生生物のチャレンジ後、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、感染した耳において炎症性病変を発症し、着実に進行し、およそ５週に最大に達する。その後、病変サイズは退行し、完全な耳の瘢痕化が、感染後およそ９週に観察された（７２）。本発明者らは、４匹のマウス群における皮膚病変の発症を、寄生生物チャレンジ５週まで、メートル法のキャリパーを用いて病変の厚みを測定して分析した。図７Ａに示すように、ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮまたはｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮをワクチン接種されたマウスの耳病変は、ＰＢＳまたはＣｐＧ−ＯＤＮの対照群と比較して有意に低かった。さらに、寄生生物負荷量を、感染した耳において感染後５週に分析した。寄生生物の数を、（７３）に記載のように限界希釈アッセイにより決定した。対照群と比較した場合、寄生生物負荷量の減少が、ワクチン接種されたマウスにおいて観察された。差は、両方の対照群に対してｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群において有意であったことが見出された（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。さらに、５匹のマウスのうちの４匹（ｒＬｍＬ５＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群）および５匹のマウスのうちの１匹（ｒＬｍＬ３＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群の耳において寄生生物は検出できなかった（図７Ｂ）。したがって、組換えタンパク質として発現され、ＣｐＧ−ＯＤＮと組み合わされたＬ．ｍａｊｏｒのＬ３およびＬ５リボソームタンパク質をワクチン接種されたマウスは、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓによる異種チャレンジに対して保護されることが結論付けられた。
【０１５３】
例４：Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  Ｓ６によりもたらされる、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ感染症に対する部分的保護
５つのマウス群（ｎ＝４／群）を、配列番号５および６（５０μｇ）で先に同定されたＣｐＧ  ＯＤＮの存在下で、１０μｇのＳ６（配列番号３４）、Ｌ２（配列番号２２）、Ｌ７（配列番号２４）、Ｌ８（配列番号２６）およびＬ１６（配列番号２８）を用いて独立に免疫化した。対照として、マウスの群を、アジュバントを用いて免疫化し、他の群を、賦形剤（ＰＢＳ−食塩水）を用いて免疫化した。３用量を２週の間隔で投与した。すべての免疫化は、右のフットパッドに実施した。最終用量の１ヵ月後、マウスを、１０５の静止期前鞭毛型のＬ．ｍａｊｏｒを左フットパッドに皮下注射し、感染させた。真皮の病変の発症を、フットパッドの腫脹を、チャレンジ後８週まで測定することによって評価した（図９Ａ）。Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウス由来のフットパッドの腫脹は、対照および他の４種のタンパク質を用いて免疫化されたマウスにおいて観察されたフットパッドの腫脹に対して有意に低かったが、すべての群からのマウスが炎症性病変を発症した。さらに、マウスの流入領域リンパ節（ＤＬＮ）および脾臓における寄生生物負荷量を分析した。Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮを用いて免疫化された動物は、それぞれ、食塩水およびＣｐＧ  ＯＤＮの群と比較して、脾臓における寄生生物の数が２−ｌｏｇの減少を示した（図９Ｂ）。しかし、Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮの群のＤＬＮ中に見出される寄生生物負荷量は、対照において観察された寄生生物負荷量と同様であった。このアッセイから、ＣｐＧ  ＯＤＮアジュバントの存在下のＳ６組換えタンパク質を用いたワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＬ．ｍａｊｏｒ感染によるＣＬに対する部分的保護をもたらす免疫状態の誘導であると結論付けることができる：感染部位における対照より低い炎症性病変および脾臓における対照より低い寄生生物負荷量の存在。他方では、他の４種の抗原（Ｌ５、Ｌ７、Ｌ８およびＬ１６）を用いたワクチン接種では、対照と比較してＣＬの進行に有意な変化はもたらされなかった。
【０１５４】
ワクチン接種により誘導された免疫応答を分析するために、Ｓ６＋ＣｐＧ  ＯＤＮを用いたワクチン接種により、マウスにおいて誘導された液性応答および細胞性応答を、アジュバントおよびワクチン希釈剤を用いて免疫化したマウスと比較した。図１０は、抗Ｓ６特異的ＩｇＧ２ａおよびｇＧ１抗体が、ワクチン接種されたマウスの血清において検出されたので、ワクチン製剤が、Ｓ６タンパク質に対するＴｈ１／Ｔｈ２混合応答を誘発していたことを示す（図１０Ａを参照されたい）。さらに、ワクチン接種されたマウスから確立された脾臓細胞のインビトロのＳ６刺激後、ＩＦＮガンマが産生されたが、検出可能なＩＬ−４サイトカインの存在が、培養液上清においても観察された（図１０Ｂを参照されたい）。
【０１５５】
ワクチン接種は、Ｓ６タンパク質に対する優勢なＴｈ１応答を誘導したが、タンパク質に対するＴｈ２応答のわずかな刺激もまた観察されたと結論付けることができる（検出可能なレベルのＳ６特異的ＩＬ−４およびＳ６特異的ＩｇＧ１抗体）。
【０１５６】
例５：Ｌ３、Ｌ５およびＳ４  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ組換えタンパク質に基づくワクチン
Ｌ３、Ｌ５およびＳ４リボソームタンパク質により誘導される保護をより詳細に分析するために、新たな免疫化−感染実験を実施した。マウスの１２の群（ｎ＝４／群）が分析に含まれた。すべての場合において、マウスを、皮下に３回（２週間空けて）、右のフットパッドに免疫化した。次の群をアッセイした：
ワクチン賦形剤：食塩水。  
ワクチンアジュバント：ＣｐＧ−ＯＤＮ。１回当たりの用量：５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ（２５μｇＣｐＧ−ＯＤＮ−１［５’−ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ−３’］（配列番号５）および２５μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ−２［５’−ＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴ−３’］（配列番号６）。  
Ｌ３（配列番号１）。１回当たりの用量：１０μｇの組換えタンパク質。  
Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮ。１回当たりの用量。１０μｇの組換えタンパク質および５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ。  
Ｌ５（配列番号３）。１回当たりの用量：１０μｇの組換えタンパク質。  
Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ。１回当たりの用量。１０μｇの組換えタンパク質および５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ。  
Ｓ４（配列番号３２）。１回当たりの用量：１０μｇの組換えタンパク質。  
Ｓ４＋ＣｐＧ  ＯＤＮ。１回当たりの用量。１０μｇの組換えタンパク質および５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ。  
Ｌ３＋Ｌ５。１回当たりの用量：１０μｇの合計組換えタンパク質；５μｇの各タンパク質。  
Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ。１回当たりの用量。１０μｇの合計組換えタンパク質および５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ。  
Ｌ３＋Ｌ５＋Ｓ４。１回当たりの用量：１０μｇの合計組換えタンパク質；３．３μｇの各タンパク質。  
Ｌ３＋Ｌ５＋Ｓ４＋ＣｐＧ  ＯＤＮ。１回当たりの用量：１０μｇの合計組換えタンパク質および５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ。
【０１５７】
簡潔に言うと、３種の抗原を、ＣｐＧ  ＯＤＮの存在下または不在下でアッセイした。さらに、Ｌ３＋Ｌ５およびＬ３＋Ｌ５＋Ｓ４の組み合わせを、ＣｐＧ  ＯＤＮの存在下または不在下で分析した。最終用量の１ヵ月後、マウスに、１０５の静止期前鞭毛型のＬ．ｍａｊｏｒを左フットパッドに皮下注射して感染させた。
【０１５８】
真皮病変の発症を、チャレンジ後６週まで、フットパッドの腫脹を測定することによって評価した。図１１Ａにおいて、両方の対照群（食塩水およびＣｐＧ  ＯＤＮ）およびアジュバントを含まない抗原をワクチン接種された５つの群を示す。対照群とアジュバントの不在下でタンパク質をワクチン接種され５つのマウス群との間で、炎症性病変における差は観察されなかった。図１１Ｂにおいて、両方の対照群（食塩水およびＣｐＧ  ＯＤＮ）およびアジュバントと組み合わせた抗原をワクチン接種された５つの群を示す。この場合において、アジュバントの存在下で組換えタンパク質をワクチン接種されたすべてのマウス群は、Ｓ４＋ＣｐＧ  ＯＤＮ群を除いて、フットパッドの腫脹の減少を示した。炎症性病変の低下は、Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｌ３＋Ｌ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮおよびＬ３＋Ｌ５＋Ｓ４＋ＣｐＧ  ＯＤＮの各群において観察された。
【０１５９】
すべてのマウス群のＤＬＮおよび脾臓における寄生生物負荷量を、感染後７週に分析した。対照群に含まれるマウスとアジュバントを含まないリボソームタンパク質を用いて免疫化されたマウスとの間に、統計的差異は見出されなかった（図１２Ａ）。他方では、リボソームタンパク質＋ＣｐＧ  ＯＤＮを用いて免疫化されたマウスは、Ｓ４＋ＣｐＧ  ＯＤＮ群を除いて、脾臓における寄生生物負荷量の有意な減少を示した（図１２Ｂ）。膝窩リンパ節中の寄生生物のロード量に関しては、本発明者らは、２種（Ｌ３＋Ｌ５）または３種（Ｌ３＋Ｌ５＋Ｓ４）のリボソームタンパク質＋ＣｐＧ  ＯＤＮの組み合わせをワクチン接種された群においてのみ、有意な減少を見出した。Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮおよびＬ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスもまた、対照より低い寄生生物負荷量を示した。しかし、さまざまな動物間に見出される高度の変動性のため、結果は統計的に有意ではなかった。先のアッセイにおいて、本発明者らは、Ｌ３＋ＣｐＧ  ＯＤＮおよびＬ５＋ＣｐＧ  ＯＤＮをワクチン接種されたマウスと、対照との間に統計的差異を見出したので、これらのアッセイは、局所的寄生生物負荷量におけるワクチンの影響を分析するために、より多くの数のマウスを用いて反復されるべきである。
【０１６０】
個別の抗原またはさまざまな抗原の同時投与に基づくワクチンの使用に関して、本発明者らの結果は、組み合わせから生じるワクチンが、個別の抗原から構成されるワクチンより高度の保護を誘導していることを示す。
【０１６１】
例６：４種の既に特徴付けられた保護性リボソーム抗原（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ由来のＬ３、Ｌ５、Ｓ４およびＳ６）を組み合わせる組換え分子の構築のためのクローニング手順の設計
先の結果に基づいて、本発明者らは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのＬ３（配列番号１）、Ｌ５（配列番号３）、Ｓ４（配列番号３２）およびＳ６（配列番号３４）タンパク質に基づく新しい組換え産物の調製を計画した。
【０１６２】
第１に、４種のタンパク質をコードするＤＮＡインサートを、真核生物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−３；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングする。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質を哺乳動物細胞において発現できるこのベクターは、ＤＮＡワクチンの試験に用いることができる。第２に、本発明者らは、４種の抗原の異なる組み合わせによるさまざまなキメラタンパク質のクローニング手順を設計した（図１３）。遺伝子キメラを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（分析プラスミド）に最初にクローニングし、その後、ＤＮＡインサートを、２種の異なる発現プラスミド：
ｐＱＥ３０；原核生物発現プラスミド
ｐｃＤＮＡ３、真核生物発現プラスミド
にクローニングするものとする。
【０１６３】
このクローニング戦略は、本発明者らが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＤＮＡワクチンおよび組換えタンパク質と、提案される抗原の組み合わせとの両方を有することを可能にすると思われる。
【０１６４】
以下のプライマーを使用した：
ＬｍＬ３  フォワード  ５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＧ−３’（配列番号５７）
リバース  ５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号５８）
ＬｍＳ４  フォワード  ５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号５９）
リバース  ５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧ−３’（配列番号６０）
ＬｍＳ６  フォワード  ５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＴＣＧＣＧＴＡＣ−３’（配列番号６１）
リバース  ５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号６２）
ＬｍＬ５  フォワード  ５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＴＧ３’（配列番号６３）
リバース  ５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＧＣ−３’（配列番号６４）
得られたキメラタンパク質は、配列番号６７から成るアミノ酸配列で表される。このキメラタンパク質は、配列番号６６から成る核酸分子で表される核酸によってコードされる。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  対象における寄生虫症を治療する、または予防する、または遅らせるための、Ｌ５および／またはＬ３供給源の使用。
［２］  Ｌ３供給源が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、および／または配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであり、且つ、Ｌ５供給源が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、および／または配列番号４と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである［１］に記載の使用。
［３］  Ｓ４および／またはＳ６供給源がＬ３および／またはＬ５供給源と併用される［１］または［２］に記載の使用。
［４］  対象における寄生虫症を治療する、または予防する、または遅らせるためのＳ６供給源の使用。
［５］  アジュバントが存在する［１］から［４］の何れか１項に記載の使用。
［６］  前記Ｌ３および／またはＬ５および／またはＳ４および／またはＳ６供給源はワクチンである［１］から［５］の何れか１項に記載の使用。
［７］  前記Ｌ３および／またはＬ５および／またはＳ４および／またはＳ６供給源は、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、核酸である［１］から［６］の何れか１項に記載の使用。
［８］  前記アジュバントがＴｈ１促進アジュバントである［５］から［７］の何れか１項に記載の使用。
［９］  前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ  ＯＤＮである［８］に記載の使用。
［１０］  Ｌ３および／またはＬ５供給源を含む組成物。
［１１］  Ｓ４および／またはＳ６供給源が前記組成物に含まれている［１０］に記載の組成物。
［１２］  Ｓ６供給源を含むか、またはＳ６供給源から成る組成物。
［１３］  アジュバントをさらに含む［１０］から［１２］の何れか１項に記載の組成物。
［１４］  前記アジュバントがＴｈ１促進アジュバントである［１３］に記載の組成物。
［１５］  前記Ｔｈ１促進アジュバントがＣｐＧ  ＯＤＮである［１４］に記載の組成物。
［１６］  薬学的に許容されるアジュバントおよび／または担体をさらに含む［１０］から［１５］の何れか１項に記載の組成物。
［１７］  薬剤として使用するための［１０］から［１６］の何れか１項に記載の組成物。
［１８］  前記薬剤がワクチンである［１７］に記載の組成物。
［１９］  対象における寄生虫症をインビトロで診断するためのＬ３および／またはＬ５供給源の使用。
［２０］  Ｓ４および／またはＳ６供給源がさらに使用される［１９］に記載の使用。
［２１］  対象における寄生虫症をインビトロで診断するためのＳ６供給源の使用。
［２２］  前記Ｌ３および／またはＬ５および／またはＳ４および／またはＳ６供給源がリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種から得られる［１］から［９］の何れか１項または［１９］から２１の何れか１項に記載の使用。
［２３］  前記リーシュマニア種は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａである［２２］に記載の使用。
［２４］  前記寄生虫症はリーシュマニア症またはマラリアである［１］から［９］の何れか１項または［１９］から２３の何れか１項に記載の使用。
［２５］  前記寄生虫症は、リーシュマニアまたはマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種によって引き起こされる［１］から９の何れか１項または［１９］から[２４]の何れか１項に記載の使用。
［２６］  前記寄生虫症は、前記Ｌ３および／またはＬ５および／またはＳ４および／またはＳ６供給源の由来となる種とは異なる種によって引き起こされる［１］から［９］の何れか１項または［１９］から２５の何れか１項に記載の使用。
［２７］  Ｌ３および／またはＬ５の供給源を使用して対象における寄生虫症を診断するための方法であって、前記対象から得た試料中に、前記供給源を認識する抗体が存在するかどうかを決定することを含む方法。
［２８］  Ｓ４および／またはＳ６供給源がさらに使用される［２７］に記載の方法。
［２９］  Ｓ６の供給源を使用して対象における寄生虫症を診断するための方法であって、前記対象から得た試料中に前記供給源を認識する抗体が存在するかどうかを決定することを含む方法。
［３０］  対象における寄生虫症を診断するためのアッセイデバイスであって、Ｌ３および／またはＬ５供給源を含むデバイス。
［３１］  Ｓ４および／またはＳ６供給源がさらにその中に存在する、［３０］に記載のアッセイデバイス。
［３２］  対象における寄生虫症を診断するためのアッセイデバイスであって、Ｓ６供給源を含むか、またはＳ６供給源から成るデバイス。
［３３］  前記アッセイはＥＬＩＳＡである、［３０］から［３２］の何れか１項に記載のアッセイ。
【参考文献】
【０１６５】
1.Aguilar-Be, I., R. da Silva Zardo, E. Paraguai de Souza, G. P. Borja-Cabrera, M. Rosado-Vallado, M. Mut-Martin, R. Garcia-Miss Mdel, C. B. Palatnik de Sousa, and E. Dumonteil. 2005. Cross-protective efficacy of a prophylactic Leishmania donovani DNA vaccine against visceral and cutaneous murine leishmaniasis. Infect Immun 73:812-9. 
2. Anderson, C. F., M. Oukka, V. J. Kuchroo, and D. Sacks. 2007. CD4(+)CD25(-)Foxp3(-) Th1 cells are the source of IL-10-mediated immune suppression in chronic cutaneous leishmaniasis. J Exp Med 204:285-97. 
3. Badaro, R., D. Benson, M. C. Eulalio, M. Freire, S. Cunha, E. M. Netto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, J. M. Burns, R. L. Houghton, J. R. David, and S. G. Reed. 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. J Infect Dis 173:758-61. 
4. Belkaid, Y., K. F. Hoffmann, S. Mendez, S. Kamhawi, M. C. Udey, T. A. Wynn, and D. L. Sacks. 2001. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med 194:1497-506. 
5. Belkaid, Y., S. Kamhawi, G. Modi, J. Valenzuela, N. Noben-Trauth, E. Rowton, J. Ribeiro, and D. L. Sacks. 1998. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. J Exp Med 188:1941-53. 
6. Buffet, P. A., A. Sulahian, Y. J. Garin, N. Nassar, and F. Derouin. 1995. Culture microtitration: a sensitive method for quantifying Leishmania infantum in tissues of infected mice. Antimicrob Agents Chemother 39:2167-8. 
7. Campos-Neto, A. 2005. What about Th1/Th2 in cutaneous leishmaniasis vaccine discovery? Braz J Med Biol Res 38:979-84. 
8. Coffman, R. L. 1993. Mechanisms of helper T-cell regulation of B-cell activity. Ann N Y Acad Sci 681:25-8. 
9. Coler, R. N., and S. G. Reed. 2005. Second-generation vaccines against leishmaniasis. Trends Parasitol 21:244-9. 
10. Cordeiro-Da-Silva, A., M. C. Borges, E. Guilvard, and A. Ouaissi. 2001. Dual role of the Leishmania major ribosomal protein S3a homologue in regulation of T- and B-cell activation. Infect Immun 69:6588-96. 
11. Chenik, M., H. Louzir, H. Ksontini, A. Dilou, I. Abdmouleh, and K. Dellagi. 2006. Vaccination with the divergent portion of the protein histone H2B of Leishmania protects susceptible BALB/c mice against a virulent challenge with Leishmania major. Vaccine 24:2521-9. 
12. Chiaramonte, M. G., M. Hesse, A. W. Cheever, and T. A. Wynn. 2000. CpG oligonucleotides can prophylactically immunize against Th2-mediated schistosome egg-induced pathology by an IL-12-independent mechanism. J Immunol 164:973-85. 
13. Garcia-Alonso, M., A. Blanco, D. Reina, F. J. Serrano, C. Alonso, and C. G. Nieto. 1996. Immunopathology of the uveitis in canine leishmaniasis. Parasite Immunol 18:617-23. 
14. Garcia-Alonso, M., C. G. Nieto, A. Blanco, J. M. Requena, C. Alonso, and I. Navarrete. 1996. Presence of antibodies in the aqueous humour and cerebrospinal fluid during Leishmania infections in dogs. Pathological features at the central nervous system. Parasite Immunol 18:539-46. 
15. Gradoni, L. 2001. An update on antileishmanial vaccine candidates and prospects for a canine Leishmania vaccine. Vet Parasitol 100:87-103. 
16. Gramiccia, M., and L. Gradoni. 2005. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. Int J Parasitol 35:1169-80. 
17. Handman, E., A. H. Noormohammadi, J. M. Curtis, T. Baldwin, and A. Sjolander. 2000. Therapy of murine cutaneous leishmaniasis by DNA vaccination. Vaccine 18:3011-7. 
18. Herwaldt, B. L. 1999. Leishmaniasis. Lancet 354:1191-9. 
19. Iborra, S., M. Soto, J. Carrion, C. Alonso, and J. M. Requena. 2004. Vaccination with a plasmid DNA cocktail encoding the nucleosomal histones of 
Leishmania confers protection against murine cutaneous leishmaniosis. Vaccine 22:3865-76. 
20. Jaafari, M. R., A. Ghafarian, A. Farrokh-Gisour, A. Samiei, M. T. Kheiri, F. Mahboudi, F. Barkhordari, A. Khamesipour, and W. R. McMaster. 2006. Immune response and protection assay of recombinant major surface glycoprotein of Leishmania (rgp63) reconstituted with liposomes in BALB/c mice. Vaccine 24:5708-17. 
21. Lopez, R., R. Lucena, M. Novales, P. J. Ginel, E. Martin, and J. M. Molleda. 1996. Circulating immune complexes and renal function in canine leishmaniasis. Zentralbl Veterinarmed B 43:469-74. 
22. Mancianti, F., A. Poli, and A. Bionda. 1989. Analysis of renal immune-deposits in canine leishmaniasis. Preliminary results. Parassitologia 31:213-30. 
23. Martins, D. R., S. M. Jeronimo, J. E. Donelson, and M. E. Wilson. 2006. 
Leishmania chagasi T-cell antigens identified through a double library screen. Infect Immun 74:6940-8. 
24. McMahon-Pratt, D., and J. Alexander. 2004. Does the Leishmania major paradigm of pathogenesis and protection hold for New World cutaneous leishmaniases or the visceral disease? Immunol Rev 201:206-24. 
25. Mendez, S., Y. Belkaid, R. A. Seder, and D. Sacks. 2002. Optimization of DNA vaccination against cutaneous leishmaniasis. Vaccine 20:3702-8. 
26. Mendez, S., S. Gurunathan, S. Kamhawi, Y. Belkaid, M. A. Moga, Y. A. Skeiky, A. Campos-Neto, S. Reed, R. A. Seder, and D. Sacks. 2001. The potency and durability of DNA- and protein-based vaccines against Leishmania major evaluated using low-dose, intradermal challenge. J Immunol 166:5122-8. 
27. Miles, S. A., S. M. Conrad, R. G. Alves, S. M. Jeronimo, and D. M. Mosser. 2005. A role for IgG immune complexes during infection with the intracellular pathogen Leishmania. J Exp Med 201:747-54. 
28. Moore, K. W., R. de Waal Malefyt, R. L. Coffman, and A. O'Garra. 2001. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 19:683-765. 
29. Mougneau, E., F. Altare, A. E. Wakil, S. Zheng, T. Coppola, Z. E. Wang, R. Waldmann, R. M. Locksley, and N. Glaichenhaus. 1995. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science 268:563-6. 
30. Nieto, C. G., R. Barrera, M. A. Habela, I. Navarrete, C. Molina, A. Jimenez, and J. L. Serrera. 1992. Changes in the plasma concentrations of lipids and lipoprotein fractions in dogs infected with Leishmania infantum. Vet Parasitol 44:175-82. 
31. Nieto, C. G., I. Navarrete, M. A. Habela, F. Serrano, and E. Redondo. 1992. Pathological changes in kidneys of dogs with natural Leishmania infection. Vet Parasitol 45:33-47. 
32. Noben-Trauth, N., R. Lira, H. Nagase, W. E. Paul, and D. L. Sacks. 2003. The relative contribution of IL-4 receptor signaling and IL-10 to susceptibility to Leishmania major. J Immunol 170:5152-8. 
33. Pateraki, E., R. Portocala, H. Labrousse, and J. L. Guesdon. 1983. Antiactin and antitubulin antibodies in canine visceral leishmaniasis. Infect Immun 42:496-500. 
34. Peters, N., and D. Sacks. 2006. Immune privilege in sites of chronic infection: Leishmania and regulatory T cells. Immunol Rev 213:159-79. 
35. Pollock, K. G., K. S. McNeil, J. C. Mottram, R. E. Lyons, J. M. Brewer, P. Scott, G. H. Coombs, and J. Alexander. 2003. The Leishmania mexicana cysteine protease, CPB2.8, induces potent Th2 responses. J Immunol 170:1746-53. 
36. Probst, P., E. Stromberg, H. W. Ghalib, M. Mozel, R. Badaro, S. G. Reed, and J. R. Webb. 2001. Identification and characterization of T cell-stimulating antigens from Leishmania by CD4 T cell expression cloning. J Immunol 166:498-505. 
37. Rafati, S., A. Nakhaee, T. Taheri, A. Ghashghaii, A. H. Salmanian, M. Jimenez, M. Mohebali, S. Masina, and N. Fasel. 2003. Expression of cysteine proteinase type I and II of Leishmania infantum and their recognition by sera during canine and human visceral leishmaniasis. Exp Parasitol 103:143-51. 
38. Rafati, S., A. H. Salmanian, T. Taheri, M. Vafa, and N. Fasel. 2001. A protective cocktail vaccine against murine cutaneous leishmaniasis with DNA encoding cysteine proteinases of Leishmania major. Vaccine 19:3369-75. 
39. Requena, J. M., C. Alonso, and M. Soto. 2000. Evolutionarily conserved proteins as prominent immunogens during Leishmania infections. Parasitol Today 16:246-50. 
40. Rhee, E. G., S. Mendez, J. A. Shah, C. Y. Wu, J. R. Kirman, T. N. Turon, D. F. Davey, H. Davis, D. M. Klinman, R. N. Coler, D. L. Sacks, and R. A. Seder. 2002. Vaccination with heat-killed Leishmania antigen or recombinant leishmanial protein and CpG oligodeoxynucleotides induces long-term memory CD4+ and CD8+ T cell responses and protection against Leishmania major infection. J Exp Med 195:1565-73. 
41. Roberts, M. T., C. B. Stober, A. N. McKenzie, and J. M. Blackwell. 2005. Interleukin-4 (IL-4) and IL-10 collude in vaccine failure for novel exacerbatory antigens in murine Leishmania major infection. Infect Immun 73:7620-8. 
42. Rodriguez-Gabriel, M. A., M. Remacha, and J. P. Ballesta. 2000. The RNA interacting domain but not the protein interacting domain is highly conserved in ribosomal protein P0. J Biol Chem 275:2130-6. 
43. Rosa, R., C. Marques, O. R. Rodrigues, and G. M. Santos-Gomes. 2007. Immunization with Leishmania infantum released proteins confers partial protection against parasite infection with a predominant Th1 specific immune response. Vaccine 25:4525-32. 
44. Santos-Gomes, G. M.-, R. Rosa, C. Leandro, S. Cortes, P. Romao, and H. Silveira. 2002. Cytokine expression during the outcome of canine experimental infection by Leishmania infantum. Vet Immunol Immunopathol 88:21-30. 
45. Santos, W. R., V. M. de Lima, E. P. de Souza, R. R. Bernardo, M. Palatnik, and C. B. Palatnik de Sousa. 2002. Saponins, IL12 and BCG adjuvant in the FML-vaccine formulation against murine visceral leishmaniasis. Vaccine 21:30-43. 
46. Saraiva, E. M., A. de Figueiredo Barbosa, F. N. Santos, G. P. Borja-Cabrera, D. Nico, L. O. Souza, C. de Oliveira Mendes-Aguiar, E. P. de Souza, P. Fampa, L. E. Parra, I. Menz, J. G. Dias, Jr., S. M. de Oliveira, and C. B. Palatnik-de-Sousa. 2006. The FML-vaccine (Leishmune) against canine visceral leishmaniasis: a transmission blocking vaccine. Vaccine 24:2423-31. 
47. Serezani, C. H., A. R. Franco, M. Wajc, J. K. Umada Yokoyama-Yasunaka, G. Wunderlich, M. M. Borges, and S. R. Uliana. 2002. Evaluation of the murine immune response to Leishmania meta 1 antigen delivered as recombinant protein or DNA vaccine. Vaccine 20:3755-63. 
48. Skeiky, Y. A., J. A. Guderian, D. R. Benson, O. Bacelar, E. M. Carvalho, M. Kubin, R. Badaro, G. Trinchieri, and S. G. Reed. 1995. A recombinant Leishmania antigen that stimulates human peripheral blood mononuclear cells to express a Th1-type cytokine profile and to produce interleukin 12. J Exp Med 181:1527-37. 
49. Stager, S., D. F. Smith, and P. M. Kaye. 2000. Immunization with a recombinant stage-regulated surface protein from Leishmania donovani induces protection against visceral leishmaniasis. J Immunol 165:7064-71. 
50. Tonui, W. K., J. S. Mejia, L. Hochberg, M. L. Mbow, J. R. Ryan, A. S. Chan, S. K. Martin, and R. G. Titus. 2004. Immunization with Leishmania major exogenous antigens protects susceptible BALB/c mice against challenge infection with L. major. Infect Immun 72:5654-61. 
51. Webb, J. R., A. Campos-Neto, Y. A. Skeiky, and S. G. Reed. 1997. Molecular characterization of the heat-inducible LmSTI1 protein of Leishmania major. Mol Biochem Parasitol 89:179-93. 
52. Webb, J. R., D. Kaufmann, A. Campos-Neto, and S. G. Reed. 1996. Molecular cloning of a novel protein antigen of Leishmania major that elicits a potent immune response in experimental murine leishmaniasis. J Immunol 157:5034-41. 
53. Zimmermann, S., O. Egeter, S. Hausmann, G. B. Lipford, M. Rocken, H. Wagner, and K. Heeg. 1998. CpG oligodeoxynucleotides trigger protective and curative Th1 responses in lethal murine leishmaniasis. J Immunol 160:3627-30. 
54. S. Iborra, M. Soto, J. Carrion, A. Nieto, E. Fernandez, C. Alonso, J.M. Requena, The Leishmania infantum acidic ribosomal protein P0 administered as a DNA vaccine confers protective immunity to Leishmania major infection in BALB/c mice, Infect Immun 71 (2003) 6562-6572. 
55. S. Iborra, N. Parody, D.R. Abanades, P. Bonay, D. Prates, F.O. Novais, M. Barral-Netto, C. Alonso, M. Soto, Vaccination with the Leishmania major ribosomal proteins plus CpG oligodeoxynucleotides induces protection against experimental cutaneous leishmaniasis in mice, Microbes Infect 10 (2008) 1133-1141.
56. W.H. Mager, R.J. Planta, J.G. Ballesta, J.C. Lee, K. Mizuta, K. Suzuki, J.R. Warner, J. Woolford, A new nomenclature for the cytoplasmic ribosomal proteins of Saccharomyces cerevisiae, Nucleic acids research 25 (1997) 4872-4875.
57. P.Y. Shi, N. Maizels, A.M. Weiner, Recovery of soluble, active recombinant protein from inclusion bodies, BioTechniques 23 (1997) 1036-1038.
58. N. Santarem, R. Silvestre, J. Tavares, M. Silva, S. Cabral, J. Maciel, A. Cordeiro-da-Silva, Immune response regulation by leishmania secreted and nonsecreted antigens, J Biomed Biotechnol 2007 (2007) 85154.
59. Boarino, A., A. Scalone, L. Gradoni, E. Ferroglio, F. Vitale, R. Zanatta, M. G. Giuffrida, and S. Rosati. 2005. Development of recombinant chimeric antigen expressing immunodominant B epitopes of Leishmania infantum for serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol 12:647-53.
60. Porrozzi, R., M. V. Santos da Costa, A. Teva, A. Falqueto, A. L. Ferreira, C. D. dos Santos, A. P. Fernandes, R. T. Gazzinelli, A. Campos-Neto, and G. Grimaldi, Jr. 2007. Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clin Vaccine Immunol 14:544-8.
61. Soto, M., J. M. Requena, L. Quijada, and C. Alonso. 1998. Multicomponent chimeric antigen for serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol 36:58-63.
62. Melby P.C.G.B., Ogden H.A., Flores W., Zhao C., Geldmacher, N.M., Biediger S.K., Ahuja, J., Uranga and M. Melendez (2000), Identification of vaccine candidates for experimental visceral leishmaniasis by immunization with sequential fractions of a cDNA library. Infect. Immun., 68: 5595-5602.
63. Stober C.B.U.G., Lange M.T., Roberts B, Gilmartin R., Francis R., Almeida C.S., Peacok S., McCann and J.M. Blackwell, (2006), From genome to vaccines for leishmaniasis: screening 100 novel vaccine candidates against murine Leishmaniasis major infection. Vaccine., 24: 2602-2616.
64. Aebischer T., et al, (2000) Infection and Immunity., 68: 1328-1336.
65. Poot J et al, (2009), Vaccine, 27: 4439-4446.
66. Ferreira J.H. et al, (2008), Vaccine, 26: 67-685.
67. Buckanovich  R.J., et al, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4892.
68. Liu N., et al (2003), Nature Immunology, 687-693).
69. Bertholet S, Goto Y, Carter L, Bhatia A, Howard RF, Carter D, Coler RN, Vedvick TS, Reed SG.Vaccine. 2009 Nov 23;27(50):7036-45.
70. S. Iborra, J. Carrion, C. Anderson, C. Alonso, D. Sacks, M. Soto, Vaccination with the Leishmania infantum acidic ribosomal P0 protein plus CpG oligodeoxynucleotides induces protection against cutaneous leishmaniasis in C57BL/6 mice but does not prevent progressive disease in BALB/c mice, Infect Immun 73 (2005) 5842-5852
71. M. Soto, J.M. Requena, L. Quijada, M.J. Perez, C.G. Nieto, F. Guzman, M.E. Patarroyo, C. Alonso, Antigenicity of the Leishmania infantum histones H2B and H4 during canine viscerocutaneous leishmaniasis, Clin Exp Immunol 115 (1999) 342-349.
72. T.R. de Moura, F.O. Novais, F. Oliveira, J. Clarencio, A. Noronha, A. Barral, C. Brodskyn, C.I. de Oliveira, Toward a novel experimental model of infection to study American cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania braziliensis, Infect Immun 73 (2005) 5827-5834.
73. S. Iborra, J. Carrion, C. Anderson, C. Alonso, D. Sacks, M. Soto, Vaccination with the Leishmania infantum acidic ribosomal P0 protein plus CpG oligodeoxynucleotides induces protection against cutaneous leishmaniasis in C57BL/6 mice but does not prevent progressive disease in BALB/c mice, Infect Immun 73 (2005) 5842-5852.
【図１】
0005875987.tif 000009
【図２ａ】
0005875987.tif 000010
【図２ｂ】
0005875987.tif 000011
【図２ｃ】
0005875987.tif 000012
【図３ａ】
0005875987.tif 000013
【図３ｂ】
0005875987.tif 000014
【図３ｃ】
0005875987.tif 000015
【図３ｄ】
0005875987.tif 000016
【図３ｅ】
0005875987.tif 000017
【図３ｆ】
0005875987.tif 000018
【図４ａ】
0005875987.tif 000019
【図４ｂ】
0005875987.tif 000020
【図５ａ】
0005875987.tif 000021
【図５ｂ】
0005875987.tif 000022
【図５ｃ】
0005875987.tif 000023
【図６ａ】
0005875987.tif 000024
【図６ｂ】
0005875987.tif 000025
【図６ｃ】
0005875987.tif 000026
【図７ａ】
0005875987.tif 000027
【図７ｂ】
0005875987.tif 000028
【図８ａ】
0005875987.tif 000029
【図８ｂ】
0005875987.tif 000030
【図９ａ】
0005875987.tif 000031
【図９ｂ】
0005875987.tif 000032
【図１０ａ】
0005875987.tif 000033
【図１０ｂ】
0005875987.tif 000034
【図１１ａ】
0005875987.tif 000035
【図１１ｂ】
0005875987.tif 000036
【図１２ａ】
0005875987.tif 000037
【図１２ｂ】
0005875987.tif 000038
【図１３】
0005875987.tif 000039
【配列表】
0005875987000001.app