(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、該Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が該ＬＤＨ遺伝子の上流に該ＬＤＨ遺伝子を発現するように連結され、該Ｇ３ＰＤプロモーターおよび該ＬＤＨ遺伝子が該ｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入されたＤＮＡコンストラクトであって、該ｐｙｒＦおよび該Ｇ３ＰＤプロモーターがモーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に由来し、該Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列が配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれ、かつ、該ＬＤＨ遺伝子が配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡコンストラクトを構築する工程と、
前記ＤＮＡコンストラクトを、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを相同組換えによって破壊して得られるｐｙｒＦ破壊株に形質転換する工程と
を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項２】
前記ＬＤＨ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）に由来する、請求項１に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項３】
前記ＬＤＨ遺伝子が配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなる、請求項１に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項４】
前記ｐｙｒＦが配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項５】
前記ｐｙｒＦのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項６】
前記ｐｙｒＦ破壊株がＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７で寄託されている株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項８】
ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１５４で寄託されている、請求項７に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項９】
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、該Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が該ＬＤＨ遺伝子の上流に該ＬＤＨ遺伝子を発現するように連結され、該Ｇ３ＰＤプロモーターおよび該ＬＤＨ遺伝子が該ｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入されたＤＮＡコンストラクトであって、該ｐｙｒＦおよび該Ｇ３ＰＤプロモーターがモーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に由来し、該Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列が配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれ、かつ、該ＬＤＨ遺伝子が配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
前記ＬＤＨ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）に由来する、請求項９に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１１】
前記ＬＤＨ遺伝子が配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなる、請求項９に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１２】
前記ｐｙｒＦが配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１３】
前記ｐｙｒＦのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１４】
モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを相同組換えによって破壊して得られるｐｙｒＦ破壊株に形質転換して、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製するために使用される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１５】
前記ｐｙｒＦ破壊株がＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７で寄託されている株である、請求項１４に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によって作製された乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸生産菌に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子組換えにより乳酸生産性を付与したモーレラ属細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
モーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）細菌は、炭水化物、メタノール等で有機栄養的に、または水素（Ｈ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）、もしくは一酸化炭素（ＣＯ）で無機栄養的に生育することができる、嫌気性好熱性酢酸生産菌である（非特許文献１）。モーレラ属の基準種モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）は、ホモアセトゲンであり、化学量論的に、グルコース１モルから酢酸３モルを生産することができるという特徴を有する（非特許文献２）。これは、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換する際に生じる二酸化炭素を利用して、さらにアセチルＣｏＡを合成する経路（Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路，下記化学式を参照）が存在するためである。また、他のモーレラ属細菌、酢酸生産性を持つクロストリジウム属細菌、メタン生成古細菌等でもこの経路を持つものがある（非特許文献２）。
【０００３】
【化１】
0005858463.tif 000002
【０００４】
近年、糖化の難しいリグノセルロース系バイオマスの利用法として、ガス化が期待されている。リグノセルロース系バイオマスのガス化により得られた合成ガスは、主に二酸化炭素、一酸化炭素および水素を含んでいる。そのため、モーレラ属細菌は、合成ガスからの有用物質生産における宿主として有望であると考えられている。
【０００５】
合成ガスからの有用物質生産を工業的に実用化するためには、分子育種による宿主の改良が必要となるが、モーレラ属細菌は、基準種モーレラ・サーモアセティカについて既に全ゲノムＤＮＡの塩基配列が解析されており（非特許文献３）、分子育種による改良が期待できる細菌である。
【０００６】
しかしながら、モーレラ属細菌の遺伝学的性質は、他の細菌と比べて特異的で、しかも十分に解明されておらず、形質転換をして有用物質の生産性を改善し、または付与することは困難であった（特許文献１）。
【０００７】
そのため、モーレラ属細菌の遺伝子組換えによって乳酸その他の有用物質の生産を成功させた例は、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１７１３１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Collins, M. D.、外７名、「The phylogeny of the genus Clostridium: Proposal of five new genera and eleven new species combinations」、International Journal of Systematic Bacteriology、国際微生物学連合（ＩＵＭＳ）、１９９４年１０月、第４４巻、第４号、ｐ．８１２−８２６
【非特許文献２】Ragsdale, S. W. and Pierce, E.、「Acetogenesis and Wood-Ljungdahl pathway of CO2 fixation」、Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins & Proteomics、エルゼビア、２００８年１２月、第１７８４巻、第１２号、ｐ．１８７３−１８９８
【非特許文献３】Pierce, E.、外１０名、「The Complete Genome Sequence of Moorella thermoacetica (f. Clostridium thermoaceticum)」、Environmental Microbiology、ワイリー−ブラックウェル、２００８年１０月、第１０巻、第１０号、ｐ．２５５０−２５７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をモーレラ属細菌に導入し、かつ該遺伝子が発現すると、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を得られること、より詳細には、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株（野生株）のウラシル生合成経路のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を破壊することにより得たウラシル要求性株（ｄｐｙｒＦ株）に、ｐｙｒＦを選択マーカーとして、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）３９Ｅ株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｔ−ｌｄｈ）を、その上流に野生株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を連結して導入すると、ＮＡＤＨを補酵素とした場合に、野生株およびｄｐｙｒＦ株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性が大幅に上昇し、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌株（Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株））を得られることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下に掲げる（１）〜（３７）を提供する。
【００１５】
（１）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が上記ＬＤＨ遺伝子の上流に上記ＬＤＨ遺伝子を発現するように連結され、上記Ｇ３ＰＤプロモーターおよび上記ＬＤＨ遺伝子が上記ｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入されたＤＮＡコンストラクトであって、上記ｐｙｒＦおよび上記Ｇ３ＰＤプロモーターがモーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に由来し、上記Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列が配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれ、かつ、上記ＬＤＨ遺伝子が配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡコンストラクトを構築する工程と、
上記ＤＮＡコンストラクトを、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを相同組換えによって破壊して得られるｐｙｒＦ破壊株に形質転換する工程と
を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
（２）上記ＬＤＨ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）に由来する、（１）に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
（３）上記ＬＤＨ遺伝子が配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなる、（１）に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
（４）上記ｐｙｒＦが配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
（５）上記ｐｙｒＦのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなる、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
（６）上記ｐｙｒＦ破壊株がＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７で寄託されている株である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
（８）ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１５４で寄託されている、（７）に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【００１６】
（９）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、上記Ｇ３ＰＤプロモーターが上記ＬＤＨ遺伝子の上流に上記ＬＤＨ遺伝子を発現するように連結され、上記Ｇ３ＰＤプロモーターおよび上記ＬＤＨ遺伝子が上記ｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入されたＤＮＡコンストラクトであって、上記ｐｙｒＦおよび上記Ｇ３ＰＤプロモーターがモーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に由来し、上記Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列が配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれ、かつ、上記ＬＤＨ遺伝子が配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、ＤＮＡコンストラクト。
（１０）上記ＬＤＨ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）に由来する、（９）に記載のＤＮＡコンストラクト。
（１１）上記ＬＤＨ遺伝子が配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなる、（９）に記載のＤＮＡコンストラクト。
（１２）上記ｐｙｒＦが配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
（１３）上記ｐｙｒＦのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなる、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
（１４）モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを相同組換えによって破壊して得られるｐｙｒＦ破壊株に形質転換して、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製するために使用される、（９）〜（１３）のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
（１５）上記ｐｙｒＦ破壊株がＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７で寄託されている株である、（１４）に記載のＤＮＡコンストラクト。
【００１７】
（１６）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によって作製された乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌およびその製造方法が提供される。
また、本発明によれば、乳酸生産性を付与した遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養して乳酸を製造する方法が提供される。
【００１９】
モーレラ属細菌を乳酸等の有用物質の生産に利用することの利点としては、（１）培養が高温、無酸素の状態で行われるため、コンタミネーションの危険が非常に少ない、（２）芽胞形成菌であるため有用菌株を保存・維持しやすい、（３）好熱性のモーレラ属細菌の培養温度（５０〜６０℃）に加熱するコストの方が酵母等の培養温度に冷却するコストに比べて安い、（４）培養温度が高温であるため、自然条件に左右されにくく、安定したオペレーションが可能になる、等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１はｐｙｒＦ近傍でのプライマーの位置を表す図である。
【図２】図２はＰＣＲによるＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）のｐｙｒＦおよびＴ−ｌｄｈの挿入の確認結果を示すアガロースゲル電気泳動像である（レーン１：ＡＴＣＣ３９０７３株（１．６ｋｂ）、レーン２：ｄｐｙｒＦ株（０．８７ｋｂ）、レーン３：Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）（２．８ｋｂ）、レーンＭ：分子量マーカー）。
【図３】図３はフルクトースを炭素源として培養した際の、各株のＴ−ｌｄｈ遺伝子の転写量を示す。
【図４】図４は野生株およびＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）をフルクトースとリン酸ｂｕｆｆｅｒを含む完全合成培地で培養した際の（Ａ）ＯＤ６００およびｐＨを［Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）  ＯＤ６００（●）、野生株  ＯＤ６００（○）、Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）  ｐＨ（■）、野生株  ｐＨ（□）］、（Ｂ）フルクトース消費量、乳酸および酢酸の生成量の経時変化を［Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）  フルクトース濃度（●）、野生株  フルクトース濃度（○）、Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）  酢酸濃度（▲）、野生株  酢酸濃度（△）、Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）  乳酸濃度（■）、野生株  乳酸濃度（□）］、それぞれ示す
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌
本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、「異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌」である。
上記ＬＤＨ遺伝子をモーレラ属細菌のホストに組み込む方法は、特に限定されないが、相同組換えを用いることが好ましい。
上記ホストに組み込まれた上記ＬＤＨ遺伝子を発現するプロモーターは、特に限定されないが、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）が好ましい。
上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリア（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）がさらに好ましい。
【００２２】
より詳細には、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、「乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）がオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流域または下流域に組み込まれ、該ＬＤＨ遺伝子が該Ｇ３ＰＤプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、該ＬＤＨ遺伝子が配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、該Ｇ３ＰＤプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌」である。
以下、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌について詳細に説明する。
【００２３】
１．モーレラ属細菌
遺伝子組換えを行うモーレラ属細菌（「ホストのモーレラ属細菌」ともいう。）は、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍ．  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、モーレラ・グリセリニ（Ｍ．  ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）もしくはモーレラ・ムルデリ（Ｍ．  ｍｕｌｄｅｒｉ）に分類される細菌または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されないが、モーレラ・サーモアセティカが好ましく、なかでも、ＡＴＣＣ  ３９０７３株またはその変異株がより好ましく、ＡＴＣＣ  ３９０７３株のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を破壊して作出したウラシル要求性変異株である、ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７株がさらに好ましい。
【００２４】
ここで、細菌分類学的にモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属に分類される細菌とは、ＩＪＳＥＭ（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology）誌にモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属として発表された細菌またはバージェイズ・マニュアル（De Vos, Paul、外７名編、"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"、第２版、第３巻、米国、シュプリンガー、２００９年）に従って分類した場合にモーレラ属に分類することが適当であると認められる細菌をいう。
【００２５】
本発明において、ホストのモーレラ属細菌に遺伝子組換えを行った結果作出されるモーレラ属細菌は、形態、資化性、醗酵性その他の表現形質が種の定義に合致しない場合であっても、ホストのモーレラ属細菌と同種とみなす。
【００２６】
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌としては、後記する本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌の製造方法に従って作出された形質転換株であって、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託された、受託番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１５４をもつ細菌株が特に好ましい。
【００２７】
２．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子
モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれる乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）に由来するもの、または配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなるものが好ましい。
【００２８】
配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２７）であり、下記式の反応を触媒する。
【００２９】
【化２】
0005858463.tif 000003
【００３０】
なお、本発明において、遺伝コードは標準コードと一部異なり、翻訳開始コドンとして、ＡＴＧ（ＡＵＧ）の他、ＴＴＧ（ＵＵＧ）、ＣＴＧ（ＣＵＧ）、ＧＴＧ（ＧＵＧ）、ＡＴＴ（ＡＵＵ）、ＡＴＣ（ＡＵＣ）、ＡＴＡ（ＡＵＡ）も使用され得る。翻訳開始コドンとして使用されるときはメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）をコードするが、翻訳開始コドン以外として使用されるときは、標準コードと同じく、ＴＴＧ（ＵＵＧ）およびＣＴＧ（ＣＵＧ）はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）を、ＡＴＴ（ＡＵＵ）、ＡＴＣ（ＡＵＣ）およびＡＴＡ（ＡＵＡ）はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）を、ＧＴＧ（ＧＵＧ）はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）を、それぞれコードする。
【００３１】
また、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌においては、上記ＬＤＨ遺伝子は、その上流に組み込まれたグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）により発現される。
【００３２】
３．グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（リン酸化）（ＧＡＰＤＨ，ＥＣ  １．１．１．１２）は、解糖系／糖新生に関与する酵素であり、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸と１，３−ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し（下記反応式）、常時発現している。
【００３３】
【化３】
0005858463.tif 000004
【００３４】
モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）は、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のＧ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列と同一であるもの、が好ましい。
【００３５】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列は、配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれるものが好ましい。
【００３６】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターは、その周辺の領域とともにホストのモーレラ属細菌のゲノムに組み込まれてもよく、Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が上記ＬＤＨ遺伝子の上流に直接連結されてホストのモーレラ属細菌のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）の上流域または下流域に組み込まれることが好ましい。
【００３７】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域は、上記Ｇ３ＰＤプロモーターが上記ＬＤＨ遺伝子を発現しうるものであれば、Ｇ３ＰＤプロモーター部分以外のＤＮＡ塩基配列は特に限定されないが、上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域のＤＮＡ塩基配列としては、そのＧ３ＰＤプロモーターが由来する菌株のＧ３ＰＤプロモーターおよびその周辺領域のＤＮＡ塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号３のＤＮＡ塩基配列からなるものがより好ましい。
【００３８】
４．オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）
オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ，ＥＣ  ４．１．１．２３）をコードする遺伝子である。
【００３９】
ＯＭＰデカルボキシラーゼは、ピリミジンの生合成に関与する酵素であり、オロチジンモノリン酸（ＯＭＰ）を脱炭酸してウリジンモノリン酸（ＵＭＰ）に変換する反応を触媒する（下記化学式）。この酵素はウリジン三リン酸およびシチジン三リン酸のｄｅ  ｎｏｖｏの生合成に不可欠である。したがって、ｐｙｒＦが破壊された菌株は、ウラシル要求性変異株となる。
【００４０】
【化４】
0005858463.tif 000005
【００４１】
上記オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）は、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のｐｙｒＦであってもよい。
【００４２】
外来性のｐｙｒＦとしては、ホストのモーレラ属細菌種と同一種の細菌に由来するものが好ましく、ホストのモーレラ属菌株と同一株またはその野生株に由来するものがより好ましい。
【００４３】
上記ｐｙｒＦとしては、配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするものが好ましく、そのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなるものがより好ましい。
【００４４】
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌のゲノムにおいては、ｐｙｒＦの上流域または下流域に、Ｇ３ＰＤプロモーター領域およびＬＤＨ遺伝子が配置されるが、ｐｙｒＦ、Ｇ３ＰＤおよびＬＤＨ遺伝子の配置は、Ｇ３ＰＤおよびＬＤＨがｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入された配置であって、ｐｙｒＦおよびＬＤＨが正常に発現する配置であれば特に限定されない。
【００４５】
５．乳酸生産性
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において、乳酸生産性は、有機栄養的に培養した場合に乳酸を生産する能力があることをいう。有機栄養的に培養する場合の炭素源としては、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌が資化できるものであれば特に限定はされないが、例えば、グルコース、フルクトース等のヘキソース類が挙げられる。
【００４６】
ＩＩ．乳酸生産性を持つモーレラ属細菌の製造方法
本発明において、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造する方法は、特に限定されないが、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によることが好ましい。
【００４７】
上記工程において、ＬＤＨ遺伝子を組み込む方法は特に限定されないが、相同組換えにより行うことが好ましい。
【００４８】
ＬＤＨ遺伝子を組み込む際に、ＬＤＨ遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を組み込むことが好ましい。
【００４９】
上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリア（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）がさらに好ましい。
【００５０】
また、本発明において、Ｇ３ＰＤプロモーターおよびＬＤＨ遺伝子を、ｐｙｒＦの上流域または下流域に組み込んで乳酸生産性を持つモーレラ属細菌を製造する方法は特に限定されないが、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、該Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が該ＬＤＨ遺伝子の上流に該ＬＤＨ遺伝子を発現するように連結され、該Ｇ３ＰＤプロモーターおよび該ＬＤＨ遺伝子が該ｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入されたＤＮＡコンストラクトであって、該ｐｙｒＦおよび該Ｇ３ＰＤプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該ＬＤＨ遺伝子が配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡコンストラクトを構築する工程と、前記ＤＮＡコンストラクトをモーレラ属細菌のｐｙｒＦ破壊株に形質転換する工程とを備える方法が好ましい。
【００５１】
１．ＤＮＡコンストラクト（ターゲティングベクター）
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造するためのＤＮＡコンストラクト（ターゲティングベクター）は、骨格となるプラスミドベクターおよび相同組換え領域を含むものが好ましく、さらに薬剤耐性（感受性）遺伝子を含んでもよい。
【００５２】
１−１．相同組換え領域
上記相同組換え領域は、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を含み、上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域が上記ＬＤＨ遺伝子の上流に上記ＬＤＨ遺伝子を発現するように連結され、上記Ｇ３ＰＤプロモーターおよび上記ＬＤＨ遺伝子が上記ｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入されたものが好ましい。
【００５３】
１−１−２．ＬＤＨ遺伝子
前記ＬＤＨ遺伝子としては、配列番号１のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）に由来するもの、または配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなるものが好ましい。
【００５４】
１−１−３．Ｇ３ＰＤプロモーター
前記Ｇ３ＰＤプロモーターとしては、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のＧ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列と同一であるもの、が好ましい。
【００５５】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターのＤＮＡ塩基配列は、配列番号３のＤＮＡ塩基配列に含まれるものが好ましい。
【００５６】
上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域は、上記Ｇ３ＰＤプロモーターが上記ＬＤＨ遺伝子を発現しうるものであれば、Ｇ３ＰＤプロモーター部分以外のＤＮＡ塩基配列は特に限定されないが、上記Ｇ３ＰＤプロモーターを含む領域のＤＮＡ塩基配列としては、そのＧ３ＰＤプロモーターが由来する菌株のＧ３ＰＤプロモーターおよびその周辺領域のＤＮＡ塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号３のＤＮＡ塩基配列からなるものがより好ましい。
【００５７】
１−１−４．ｐｙｒＦ
上記ｐｙｒＦは、モーレラ属細菌のｐｙｒＦ破壊株に導入したとき正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のｐｙｒＦであってもよい。
【００５８】
外来性のｐｙｒＦとしては、モーレラ属細菌のｐｙｒＦ破壊株と同一種の細菌に由来するものが好ましく、モーレラ属細菌のｐｙｒＦ破壊株と同一株またはその野生株に由来するものがより好ましい。
【００５９】
上記ｐｙｒＦとしては、配列番号４のアミノ酸配列からなるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．２３）をコードするものが好ましく、そのＤＮＡ塩基配列が配列番号５のＤＮＡ塩基配列からなるものがより好ましい。
【００６０】
上記ｐｙｒＦの上流域は、そのｐｙｒＦが由来するモーレラ属細菌株のゲノムにおけるｐｙｒＦ翻訳領域の上流域をいい、長さは特に限定されないが、約２ｋｂ以下が好ましく、約１ｋｂ程度がより好ましい。
【００６１】
上記ｐｙｒＦの下流域は、そのｐｙｒＦが由来するモーレラ属細菌株のゲノムにおけるｐｙｒＦ翻訳領域の下流域をいい、長さは特に限定されないが、約２ｋｂ以下が好ましく、約１ｋｂ程度がより好ましい。
【００６２】
１−１−６．ｐｙｒＦ、Ｇ３ＰＤおよびＬＤＨ遺伝子の配置
ｐｙｒＦ、Ｇ３ＰＤおよびＬＤＨ遺伝子の配置は、Ｇ３ＰＤおよびＬＤＨがｐｙｒＦの上流域または下流域に挿入された配置であって、ｐｙｒＦおよびＬＤＨが正常に発現する配置であれば特に限定されない。
【００６３】
１−２．ＤＮＡコンストラクト（ターゲティングベクター）の構築方法
ＤＮＡコンストラクト（ターゲティングベクター）の構築方法としては、特に限定されず、適当なプラスミドベクターに上記相同組換え領域を組み込む方法が挙げられる。
【００６４】
プラスミドベクターに相同組換え領域を組み込む方法としては、従来公知の方法を使用することができ、例えば、相同組換え領域の全部を含むＤＮＡフラグメントを作製し、リニア化したプラスミドベクターにＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法、ｐｙｒＦ、その上流域および下流域を組み込んだ組換えベクターを作製しておき、ｐｙｒＦの上流域または下流域を制限酵素等で切断してプラスミドベクターをリニア化し、Ｇ３ＰＤ領域に対応するＤＮＡ断片およびＬＤＨ遺伝子に対応するＤＮＡ断片をＧ３ＰＤ領域がＬＤＨ遺伝子の上流に連結されるように、ＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法等が挙げられる。
【００６５】
プラスミドベクターは、相同組換えに利用することができるものであれば特に限定されず、用いることができ、例えば、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂが挙げられる。
【００６６】
ＤＮＡコンストラクトの構築は、例えば、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン）、Ｒｅｄ／ＥＴリコンビネーションシステム（オープンバイオシステムズ）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ（クロンテック）等を用いて行うことができる。
【００６７】
２．オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｙｒＦ）破壊株
ｐｙｒＦ破壊株の作出方法は特に限定されないが、モーレラ属細菌の野生株またはｐｙｒＦ未破壊株のｐｙｒＦを相同組換えによって破壊したものが好ましい。
【００６８】
前記ｐｙｒＦ破壊株としては、モーレラ属細菌株のｐｙｒＦを破壊したものであれば特に限定はされないが、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを相同組換えによって破壊して得られるものが好ましく、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７で寄託されているものがより好ましい。
【００６９】
３．形質転換
上記ＤＮＡコンストラクト（ターゲティングベクター）を上記ｐｙｒＦ破壊株に形質転換をする方法は特に限定されず、ＤＮＡコンストラクトの骨格となるプラスミドベクターに合わせて適宜選択することが好ましい。大腸菌およびモーレラ属細菌の両方で複製するシャトルベクターでない場合には、ｐｙｒＦ破壊株への導入方法としては、エレクトロポレーションが好ましい方法の一つである。
【００７０】
上記方法によって形質転換をして製造されたモーレラ属細菌としては、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１５４で寄託されているものが挙げられる。
【００７１】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
本実施例では、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）  ＡＴＣＣ  ３９０７３株（「野生株」または「ＷＴ」ともいう。）のｐｙｒＦ破壊、ウラシル要求性変異株（ｄｐｙｒＦ株）に、当該ＡＴＣＣ  ３９０７３株由来のｐｙｒＦ、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）  ３９Ｅ株由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｔ−ＬＤＨ）遺伝子（Ｔ−ｌｄｈ）、およびＴ−ｌｄｈを発現するための当該ＡＴＣＣ  ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を導入して、ウラシル要求性の除去および乳酸生産性の付与を行い、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌（Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株））を作製した。
【００７３】
さらに、作製したＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）、ｄｐｙｒＦ株および野生株（ＷＴ）について、フルクトースを炭素源として培養した場合のｌｄｈ転写量、ＬＤＨ酵素活性、乳酸および酢酸の生産量を対比した。
【００７４】
１．ｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）の作製
モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦを破壊し、ウラシル要求性変異株を作製した。
【００７５】
（１）遺伝子破壊ベクターｐＫ１８−ｄｐｙｒＦの構築
以下の手順でモーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｐｙｒＦを破壊するためのベクターを構築した。
【００７６】
［遺伝子破壊ベクターｐＫ１８−ｄｐｙｒＦの構築］
モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株を完全合成培地（改変ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ  Ｍｅｄｉｕｍ、表２２Ａを参照）に植菌し、５５℃で嫌気的に培養した。
培養後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いてトータルＤＮＡを抽出した。
【００７７】
まず、表１に示したプライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６：5'-tgacgttctagaccctacctctccaagattacc-3'）とｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１（配列番号７：5'-tgacgtactagtggcaagcaggccagaag-3'）との組合せ、およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１（配列番号８：5'-tgacgtactagtaacttcggcctgctttcatgc-3'）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９：5'-tgacctgatatctgtccaagcttatgcaccttcc-3'）との組合せを用いて、表２に示す反応液の組成で、表３に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦの上流域および下流域のそれぞれ約１０００ｂｐを増幅した。表２において、プライマーＦとプライマーＲとの組合せは、上記組合せである。また、テンプレートＤＮＡは、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のトータルＤＮＡである。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【００７８】
【表１】
0005858463.tif 000006
【００７９】
【表２】
0005858463.tif 000007
【００８０】
【表３】
0005858463.tif 000008
【００８１】
図１に示すとおり、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）およびｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１（配列番号７）は、ｐｙｒＦの上流の隣接領域を増幅し、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１（配列番号８）およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）は、ｐｙｒＦの下流の隣接領域を増幅する。
【００８２】
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理した後に、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｅｒ  Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて精製を行い、ｐｙｒＦ上流域のＰＣＲ産物を５μＬ、下流域のＰＣＲ産物を５μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡）を１０μＬ混合し、１６℃で３０分間インキュベートし、ライゲーション産物をテンプレートＤＮＡとして、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）およびｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１（配列番号７）を用いて、表４に示す反応液組成で、表５に示す条件でＰＣＲを行った。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【００８３】
【表４】
0005858463.tif 000009
【００８４】
【表５】
0005858463.tif 000010
【００８５】
得られたＰＣＲ産物をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った後、２μＬのＳｍａＩ処理をしたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍコンビテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く撹拌した後、氷中に１０分静置し、４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【００８６】
ＳＯＣ培地を１ｍＬ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫し、３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００８７】
［遺伝子破壊ベクターの確認］
上記「遺伝子破壊ベクターｐｋ１８−ｄｐｙｒＦの構築」で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したＬＢ培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表１に示すｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆｌ（配列番号６）、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの反応液組成を表６に、反応条件を表７に示す。コロニーを反応液に入れてＰＣＲを行った。なお、ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （２×Ｐｒｅｍｉｘ）および滅菌蒸留水は、ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。
【００８８】
【表６】
0005858463.tif 000011
【００８９】
【表７】
0005858463.tif 000012
【００９０】
得られたＰＣＲ産物について、電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【００９１】
吸光度による濃度測定および電気泳動による確認後、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的の遺伝子破壊ベクターｐｋ１８−ｄｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
【００９２】
（２）ｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）の作製
上記（１）で構築した遺伝子破壊ベクターｐＫ１８−ｄｐｙｒＦを、以下の手順で、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってｐｙｒＦが破壊された株（ｄｐｙｒＦ株）を選抜した。
【００９３】
［ＡＴＣＣ  ３９０７３株への遺伝子破壊ベクターの導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ  ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ７に合わせたＨＳ緩衝液を調製し、２０分間Ｎ２ガスで溶存酸素を置換した。
【００９４】
８０％の水素、２０％の二酸化炭素の混合ガスを基質とし、改変型ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ培地、またはグリシンを終濃度５ｇ／Ｌになるように添加した改変型ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ培地で、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株を培養した。
【００９５】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．３になるまで培養し、培養液約１００ｍＬ分を集菌した後、ＨＳ緩衝液で菌体を２回洗浄した。
【００９６】
洗浄した菌体を適当な量のＨＳ緩衝液（約３ｍＬ）に懸濁し、懸濁液３８０μＬとプラスミド２０μＬとを混合した。
【００９７】
Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭエレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）および電極間距離（ギャップ）０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の懸濁液を、ピルビン酸４０ｍＭの終濃度で添加した５ｍＬの培地に植菌し、５５℃で２日間培養後に、ウラシル１０μｇ／ｍＬ、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）０．２％の終濃度で添加した寒天培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【００９８】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）の確認］
上記寒天培地に形成された２０個のコロニーを、５ｍＬのウラシル１０μｇ／ｍＬ、５−ＦＯＡ  ０．２％の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養３日目に培地が濁っていることが確認できた６株を選択し、培養液１ｍＬを集菌した。
【００９９】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ／ｍＬ）＋リゾチーム（２０ｍｇ／ｍＬ）の入ったＴＥ緩衝液  ２０μＬで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートし、ＤＭＳＯを２０μＬ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【０１００】
下記表に示すプライマーのうち、ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ２（配列番号１０：5'-tgtcctcaacaccctcacc-3'）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ２（配列番号１１：5'-tcttcccaggtcctgtagg-3'）、ｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ３（配列番号１２：5'-tgtcctcaacaccctcacc-3'）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ３（配列番号１３：5'-tcttcccaggtcctgtagg-3'）、またはｐｙｒＦ−Ｆ（配列番号１４：5'-acctgaagttccacgacatcc-3'）とｐｙｒＦ−Ｒ（配列番号１５：5'-ggtcacgatgacgaactc-3'）との組合せを用い、各々の組合せについて、表９に示す反応液組成で、表１０に示す反応条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行い、電気泳動によりバンドを確認した。表９において、プライマーＦとプライマーＲとの組合せは、上記組合せである。また、コロニーを反応液に入れてＰＣＲを行った。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１０１】
【表８】
0005858463.tif 000013
【０１０２】
【表９】
0005858463.tif 000014
【０１０３】
【表１０】
0005858463.tif 000015
【０１０４】
ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを２０株選択し、液体培地（１０μｇ／ｍＬ  ウラシル、０．２％  ５−ＦＯＡ）にて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトＰＣＲによる確認を行った。
【０１０５】
培養３日目に増殖が確認できた６株について、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ２（配列番号１０）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ２（配列番号１１）との組合せ、またはｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ３（配列番号１２）とｐｙｒ−ｄｎ−Ｒ３（配列番号１３）との組合せを用いて、ｐｙｒＦの外側からＰＣＲを行ったところ、６株中１株において、野生株よりも短いバンドが確認できた。
【０１０６】
さらに、プライマーｐｙｒ−Ｆ（配列番号１４）とｐｙｒＦ−Ｒ（配列番号１５）との組合せを用いて、ｐｙｒＦの内側をＰＣＲしたところ、前述の株においてはバンドが確認できなかった。
【０１０７】
これらの結果から、野生株よりも短いバンドを確認できた株がｐｙｒＦ破壊株（ｄｐｙｒＦ株）である可能性があると判断し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った後に、もう一度ＰＣＲを行った。その結果、ダイレクトＰＣＲの際と同様のバンドパターンが得られた。
【０１０８】
さらに、ｐｙｒＦが破壊された部分には、制限酵素ＳｐｅＩサイトが１カ所付与されることから（プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｒ１、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｆ１参照）、上記のＰＣＲ産物についてＳｐｅＩで消化したところ、ＳｐｅＩサイトで切断が起こり、バンドが２本になることを確認した。
【０１０９】
次に、ｐｙｒＦ破壊候補株についてウラシル要求性試験を行った。酵母エキスを除いた改変型ＡＴＣＣ  １７５４  ＰＥＴＣ培地に、ｐｙｒＦ破壊株を植菌し、１０μｇ／ｍＬの終濃度でウラシルを添加した場合と添加しなかった場合とで増殖の確認を行った。
【０１１０】
その結果、ウラシルを添加したサンプルでは、培養２日目には菌体の増殖が確認できたが、ウラシルを添加しなかったサンプルにおいては、増殖が確認できなかった。これらの結果から、ｐｙｒＦの破壊が確認できた。
【０１１１】
このｐｙｒＦ破壊株は、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
【０１１２】
２．Ｔ−ｌｄｈ導入株の作製
（１）ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦの構築
［ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦの構築］
以下に示すプライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）との組み合わせを用いて、以下の条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂの遺伝子断片を増幅した。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１１３】
【表１１】
0005858463.tif 000016
【０１１４】
【表１２】
0005858463.tif 000017
【０１１５】
得られたＰＣＲ産物についてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った。
２μＬのＳｍａI処理をしたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６°Ｃで１時間インキュベートした。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く攪拌した。
氷中に１０分静置した。
４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
ＳＯＣ培地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫した。
３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【０１１６】
［ｐｙｒＦ相補ベクターの確認］
上記（１）で生育が見られたコロニーをカナマイシン添加ＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーはｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１（配列番号６）、ｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１（配列番号９）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を以下に示す。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１１７】
【表１３】
0005858463.tif 000018
【０１１８】
【表１４】
0005858463.tif 000019
【０１１９】
電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
【０１２０】
（２）Ｔ−ｌｄｈ導入用相補ベクターｐＫ１８−ｌｄｈの構築
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株の乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｔ−ｌｄｈ）を取得し、上記（２）で構築したｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦのｐｙｒＦ遺伝子領域へ挿入し、Ｔ−ｌｄｈ遺伝子導入用相補ベクターｐＫ１８−ｌｄｈを構築することを目的とした。
形質転換のためのホストは、モーレラ・サーモアセティカ  ＡＴＣＣ  ３９０７３株のｐｙｒＦ遺伝子破壊株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７  株を用いた。
【０１２１】
［Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲによるＴ−ｌｄｈ導入用相補ベクターｐＫ１８−ｌｄｈの構築］
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株のＴｏｔａｌ  ＤＮＡ、およびプライマーｐｙｒＦ−１７６５−Ｆ（配列番号１６：5'-tcggcctgctttcatgcttg-3'）とｐｙｒＦ−１７６４−Ｒ（配列番号１７：5'-agttattatttcaccatctctatttc-3'）とを用いて、ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦを鋳型として、ｐｙｒＦ領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ  ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１２２】
【表１５】
0005858463.tif 000020
【０１２３】
【表１６】
0005858463.tif 000021
【０１２４】
プライマーＧ３ＰＤ−Ｆ１１（配列番号１８：5'-ggtgaaataataactggacggttgccaagtacc-3'）とＧ３ＰＤ−ＳＤ−Ｒ１２（配列番号１９：5'-tatgtactcctccttatatttattgtaacg-3'）とを用いて、ＡＴＣＣ  ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＳＤ配列を含むプロモーター領域（Ｇ３ＰＤプロモーター領域）を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１２５】
【表１７】
0005858463.tif 000022
【０１２６】
【表１８】
0005858463.tif 000023
【０１２７】
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株のＴｏｔａｌ  ＤＮＡ、およびプライマーｌｄｈ−Ｆ−１（配列番号２０：5'-aaggaggagtacataatgaacaaaatatctataataggttc-3'）とｌｄｈ−Ｒ−１（配列番号２１：5'-atgaaagcaggccgattatatatcaagctcttgtattacac-3'）との組合せを用いて、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ株の乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｔ−ｌｄｈ）を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応終了後、各ＰＣＲ産物をゲル抽出した。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１２８】
【表１９】
0005858463.tif 000024
【０１２９】
【表２０】
0005858463.tif 000025
【０１３０】
下記表に記載の反応溶液でＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。反応条件は、３７℃３０分→５０℃１５分とした。なお、５×  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒおよびＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ）  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。
【０１３１】
【表２１】
0005858463.tif 000026
【０１３２】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μｌ加えて希釈した。
希釈したサンプル１０μｌを形質転換に用いた。
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
【０１３３】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。
ｌｄｈ−Ｆ−１およびｌｄｈ−Ｒ−１をプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＰｓｔＩ）処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてＴ−Iｄｈの挿入が確認できた。
【０１３４】
（３）Ｔ−ｌｄｈ導入用相補ベクターｐＫ１８−ｌｄｈによるｄｐｙｒＦ株の形質転換
宿主としては、Ｍ．  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３のｐｙｒＦ破壊株として、先に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託したｄｐｙｒＦ株（登録名ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５７）を用いた。ここでは、上記（２）で構築したＴ−ｌｄｈ導入用相補ベクターｐＫ１８−ｌｄｈをｄｐｙｒＦ株の細胞内にエレクトロポレーション法によって導入し、ダブルクロスオーバーの相同組換えによって、ｄｐｙｒＦ株の染色体にＴ−ｌｄｈを組み込むことを目的とした。
【０１３５】
［ｄｐｙｒＦ株の培養］
ｄｐｙｒＦ株は完全合成培地＋終濃度０．０１ｇ／Ｌのウラシルに植菌し、Ｈ２＋ＣＯ２を炭素源として５５℃で培養した。ＯＤ６００＝０．１前後まで培養し、エレクトロポレーション用のサンプルとした。
【０１３６】
完全合成培地の組成を表２２Ａに示す。炭素源としてフルクトースを添加する場合には終濃度５ｇ／Ｌで、ウラシルを添加する場合には終濃度０．０１ｇ／Ｌで、それぞれ添加した（特に断りがある場合を除く）。また、ロールチューブ法に用いる場合には、Ａｇａｒ高温用２０ｇ／Ｌを添加した。
【０１３７】
【表２２】
0005858463.tif 000027
【０１３８】
［エレクトロポレーションによるｐＫ１８−ｌｄｈの導入］
培養液を２７２ｍＭスクロースｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。
洗浄後のペレットにスクロースｂｕｆｆｅｒを４ｍｌ加えて懸濁した。
エレクトロポレーション用のキュベット（２ｍｍギャップ）に懸濁液を３８０μｌ、形質転換用プラスミドを２０μｌ加えた。この際、プラスミド量が１μｇ〜２μｇとなるように調整した。
１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦでパルスを与えた。
パルスを与えた懸濁液を、５ｍｌの完全合成培地＋終濃度０．０１ｇ／Ｌのウラシル＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
５５℃で４８時間培養した。
ロールチューブ法により、コロニー形成を試みた。
培養５〜７日で得られたコロニーを、５ｍｌの完全合成培地＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
増殖が確認できた３株を５０ｍｌの完全合成培地＋Ｈ２＋ＣＯ２の入ったバイアルへ移し、Ｔ−ｌｄｈ遺伝子導入株候補とした。
【０１３９】
［Ｔ−ｌｄｈ遺伝子導入株の確認］
３株のＴ−ｌｄｈ導入株候補からＴｏｔａｌ  ＤＮＡを抽出した。抽出キットにはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。
【０１４０】
染色体上（ｐｙｒＦ周辺領域）への遺伝子の挿入は、プライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ２（配列番号１０）とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ２（配列番号１１）との組合せを用いて、ＰＣＲにより確認した。ＰＣＲの条件を以下に示す。なお、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、２×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏおよび２ｍＭ  ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
【０１４１】
【表２３】
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【０１４２】
【表２４】
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【０１４３】
ｐＫ１８−ｌｄｈを用いてｄｐｙｒＦ株を形質転換した。ロールチューブ法により形質転換体のコロニー形成を試みた結果、コロニーが得られた。コロニーを分離して培養し、生育が見られた３つのＴ−ｌｄｈ導入候補株からＴｏｔａｌ  ＤＮＡを抽出した。染色体上の遺伝子挿入周辺領域をＰＣＲにより増幅した。その結果、全ての株においてｐｙｒＦおよびＴ−ｌｄｈの挿入が確認できた。それらの株の中からＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）を選択し、以降の実験に用いた。Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）のｐｙｒＦおよびＴ−ｌｄｈの挿入の確認結果を図２に示す。野生株のＡＴＣＣ３９０７３株では、ｐｙｒＦ遺伝子が存在するので、１．６ｋｂの位置にバンドが見られる。ｄｐｙｒＦ株では、０．７３ｋｂのｐｙｒＦ遺伝子が欠失しているので、０．８７ｋｂの位置にバンドが見られる。Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）では、０．７３ｋｂのｐｙｒＦに加えて、１．２ｋｂのＴ−ｌｄｈが挿入されていることから２．８ｋｂの位置にバンドが見られる。
【０１４４】
（３）Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）のＴ−ｌｄｈ遺伝子の転写量測定
上記（２）で構築したＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）に導入されたＴ−ｌｄｈが転写されているか、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。
【０１４５】
［Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出と定量ＲＴ−ＰＣＲ］
Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）およびＡＴＣＣ３９０７３株を完全合成培地＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトースで、ｄｐｙｒＦ株を完全合成培地＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトース＋終濃度０．０１ｇ／Ｌのウラシルで、それぞれ培養した。
【０１４６】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出にはＮｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。
【０１４７】
定量ＲＴ−ＰＣＲのキットにはＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。方法は添付のマニュアルに従った。反応条件を以下に記す。
【０１４８】
【表２５】
0005858463.tif 000030
【０１４９】
図３はフルクトースを炭素源として培養した際の、各株のＴ−ｌｄｈ遺伝子の転写量を示した。ＡＴＣＣ３９０７３株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子Ｍ−ｌｄｈの転写量はすべての株において、ほぼ同程度の転写量だった。
【０１５０】
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ３９Ｅ  株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子Ｔ−ｌｄｈの転写はＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）でのみ観察された。Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）において、フルクトースを炭素源として培養した場合は約１９倍強く転写されていた。なお、ｇｙｒＢの転写量を内部標準とした。
【０１５１】
（４）ＬＤＨの酵素活性測定
上記（３）でＴ−ｌｄｈの転写が確認できた。そこで、Ｔ−ｌｄｈの転写産物から乳酸デヒドロゲナーゼが合成され、機能しているかを確認するために乳酸デヒドロゲナーゼの比活性を測定した。
【０１５２】
ＡＴＣＣ３９０７３株およびＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）を完全合成培地＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトースで、ｄｐｙｒＦ株を完全合成培地＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトース＋終濃度０．０１ｇ／Ｌのウラシルで、それぞれ培養した。ＯＤ６００＝０．５前後で菌体を回収し、超音波破砕した。破砕した菌体溶液を２０４００×Ｇで３０分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液として酵素活性測定に用いた。乳酸生成のＬＤＨ活性は、５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．０）中に１ｍＭ  ピルビン酸、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ  ｏｒ  ＮＡＤＰＨ、０．２ｍＭ  フルクトース−１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）を含む反応液で、５５℃における吸光度Ａ３４０を測定することで求めた。ピルビン酸生成のＬＤＨ活性は、５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ  ７．５）中に５０ｍＭ  Ｌ−乳酸、１ｍＭ  ＮＡＤ＋  ｏｒ  ＮＡＤＰ＋、０．２ｍＭ  ＦＢＰを含む反応液を用いて、５５℃で測定した。１分あたり１ｍＭのＮＡＤＨを酸化または１ｍＭのＮＡＤ＋を還元する酵素量を１Ｕとした。タンパク質濃度はＢＳＡをスタンダードとして用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により決定した。
【０１５３】
ＬＤＨ比活性を下記表２６に示した。全ての反応において、野生株とｄｐｙｒＦ株の比活性は同程度であった。ＮＡＤＨを補酵素とした際の乳酸生成反応は、Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）が高い活性を示した。Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）のＬＤＨ比活性は野生株やｄｐｙｒＦ株と比較して約１０倍高かった。ＮＡＤＰＨを補酵素とした場合の乳酸生成反応は、すべての株においてほぼ同じであった。
【０１５４】
【表２６】
0005858463.tif 000031
【０１５５】
（５）Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）による乳酸生産
完全合成培地にリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）を５０ｍＭとなるように添加した。炭素源としてフルクトースを６０ｍＭとなるように加えた。
Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）、ＡＴＣＣ３９０７３株を上述の培地に１０％植菌した。
ＯＤ６００、ｐＨ、フルクトース濃度（ＨＰＬＣ分析）、乳酸濃度（ＨＰＬＣ分析）、酢酸濃度（ＨＰＬＣ分析）を経時的に測定した。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
・装置名：  日本分光製  ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓ  シリーズ（ポンプ：ＰＵ−２０８０Ｐｌｕｓ、オートサンプラー：ＡＳ−２０５７Ｐｌｕｓ、カラムオーブン：ＣＯ−２０６５Ｐｌｕｓ、検出器：ＲＩ−２０３１Ｐｌｕｓ）
・カラム：  ＢＩＯ−ＲＡＤ製  発酵モニタリングカラム（カタログNo.１２５−０１１５）
・カラム温度：  ６５℃
・使用バッファー：  １ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４
・流速：  １ｍｌ／ｍｉｎ
・検出器：  ＲＩ
【０１５６】
野生株（ＡＴＣＣ３９０７３株）とＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）を酢酸生成によるｐＨ低下を防ぐために５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒを含んだ完全合成培地＋終濃度５ｇ／Ｌのフルクトースで培養した。
図４（Ａ）には野生株とＣ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）をフルクトースとリン酸ｂｕｆｆｅｒを含んだ完全合成培地で培養した際のＯＤ６００とｐＨ、図４（Ｂ）にはフルクトース消費量、乳酸および酢酸の生成量の経時変化を示した。
Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）と野生株は増殖に伴い、フルクトースが消費され、酢酸が生成され、ｐＨが低下した。ｐＨはリン酸ｂｕｆｆｅｒの影響で、ｐＨ５程度までしか下がらなかった。野生株は乳酸を蓄積しなかったが、Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）は酢酸の生成と同様に、増殖と連動して乳酸を蓄積し、定常期に入ると生成は止まった。Ｃ３１株（ＭＴＡ−Ｔ−ｌｄｈ株）は最終的には０．７ｇ／Ｌ（６．８ｍＭ）の乳酸を蓄積した。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
本発明は、モーレラ属細菌の遺伝子組み換え技術を開発し、さらに外来遺伝子を発現させることに初めて成功したものである。ｄｐｙｒＦ株を用いて本発明に係る技術を用いれば、モーレラ属細菌で機能する抗生物質マーカーの探索や、モーレラ−大腸菌シャトルベクターの構築も可能になると考えられる。本発明に係る技術は、今後、モーレラ属細菌を用いた合成ガスからの有用物質生産のプラットフォームを整備するための分子育種技術の開発に大きな貢献をすることが期待される。
【受託番号】
【０１５８】
識別の表示：MTA-D-pF
受託番号：NITE P-1057
寄託日：２０１１年２月１５日
受託機関：独立行政法人製品技術評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター(NPMD)
識別の表示：MTA-T-ldh
受領番号：NITE AP-1154
受領日：２０１１年１０月２４日
受託機関：独立行政法人製品技術評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター(NPMD)
【図１】
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【図２】
0005858463.tif 000033
【図３】
0005858463.tif 000034
【図４】
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【配列表】
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