(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナ由来ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）遺伝子が形質転換されたポプラであって、対応野生型植物と比較して繊維細胞長さが 37〜60% 増加し、木部が40% 以上増加しており、上記ＲａｂＧ３ｂＣＡ遺伝子は、配列番号１の塩基配列である、形質転換されたポプラ。
【請求項２】
対応野生型植物と比較してセルロース及び／またはグルコース含量が増加した、請求項１に記載の形質転換されたポプラ。
【請求項３】
請求項１に記載の形質転換されたポプラを原料とする紙。
【請求項４】
請求項１に記載の形質転換されたポプラから生産されたパルプ。
【請求項５】
請求項１に記載の形質転換されたポプラから生産されたバイオマス。
【請求項６】
樹木を利用したバイオマスの生産方法において、
上記樹木は、請求項１に記載の形質転換されたポプラである、バイオマスの生産方法。
【請求項７】
上記ポプラを水酸化ナトリウムで前処理した後、酵素で加水分解し、バイオマスを生産する、請求項６に記載のバイオマスの生産方法。
【請求項８】
樹木を利用したパルプの生産方法において、
上記樹木は、請求項１に記載の形質転換されたポプラである、パルプの生産方法。
【請求項９】
シロイヌナズナ由来ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）遺伝子を過発現させてバイオマスが増加した形質転換されたポプラを製造する方法であって、上記ＲａｂＧ３ｂＣＡ遺伝子は、配列番号１の塩基配列である、方法。
【請求項１０】
上記バイオマスがセルロース及び／またはグルコースである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲａｂＧ３ｂＣＡを利用した形質転換された樹木及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上に存在する炭素基盤植物は、世界石油消費量の１０倍、すべての種類のエネルギー使用量の５倍に達するものと報告されている。世界バイオマス作物の可用現況は、稲わら（ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ）、麦わら（ｗｈｅａｔ ｓｔｒａｗ）、トウモロコシ茎葉（ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ）、バガス（ｂａｇａｓｓｅ）などの順であり、総量は、１５４９兆ｋｇである。最近、化石燃料を代替することができる次世代親環境エネルギー源として注目される植物バイオエネルギーの安定的な生産のために、生産性が高いバイオマス植物の開発に対する関心が増大されている。現在、最大のイシューになっている代替エネルギーバイオエタノールの原料は、大きく、糖質系（サトウキビ、サトウダイコンなど）、澱粉質系（とうもろこし、じゃがいも、さつまいもなど）、木質系（間伐材、廃木材、稲わらなど）などに分けることができ、商用化されたバイオエタノール生産技術は、すべて食糧資源である糖質系及び澱粉質系バイオマスを原料として使用するので、人類の食糧需給状況と非常に密接な連関関系が存在する。長期的に見るとき、このような問題を解決するために、さらに低価格で、原料需給に問題が少ない第２世代バイオマスと呼ばれる木質系バイオマスを原料として使用する技術が活発に開発されている。代表的な木質系バイオマス作物としては、ポプラとユーカリプタスなどがあり、これら樹木の木材は、紙、パルプ、繊維など多様な製品とバイオエタノール生産の重要な原料として注目されている。このような経済的な重要性を有するため、木材の量と質を高めるための研究が進められてきており、したがって、木材の合成経路と合成調節の機作に対する研究は非常に重要であると言える。樹木の木材層は、２次木部（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｘｙｌｅｍ）よりなり、主に導管細胞（ｖｅｓｓｅｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）と繊維（ｆｉｂｅｒ）で構成されている。木材、すなわち２次木部は、ポプラやユーカリプタスのような被子植物の場合、維管束形成層（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃａｍｂｉｕｍ）で作われ、２次細胞壁（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ）の形成と細胞死滅（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）の発達過程を経て完成される。最近、ポプラは、研究目的のモデル樹木であって、そしてバイオマス用樹木として重要な研究の対象作物になってきた。特に、ポプラのゲノム配
列の解読、ＥＳＴ、マイクロアレイデータ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ）の蓄積、分子マーカー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ）の開発、形質転換技術確立など多様な分子生物学的データベース構築とシステムの確立は、ポプラ研究の活性化のための重要な基盤になっている。
【０００３】
バイオマス用樹木を開発するためには、木材、すなわち木部の量的、質的な増加が行われなければならない。このためには、木部発達の分子的機作の理解が基本にならなければならないし、したがって、２次細胞壁形成と細胞死滅過程に対する研究が必須である。２次細胞壁の形成に対する研究は、非常に活発に進行されてきたが、相対的に細胞死滅に対する研究は、不足な状況である。現象的に見るとき、細胞死滅の過程は、液胞崩壊（ｖａｃｕｏｌｅ ｃｏｌｌａｐｓｅ）、多様な分解酵素の分泌と活性、細胞質の分解が順次に行われ、木部が最終形成されることを観察することができるが、具体的な分子的機序や核心の調節因子については、大部分知られていない。本研究室では、自食（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）が細胞死滅を調節する重要な過程であることを認識し、去る数年間自食と細胞死滅の機序に関する研究を行ってきた。一方、２０００年Ｆｕｋｕｄａ実験室で、導管細胞の分化の細胞死滅過程に自食の関連可能性について言及したりしたが、後続の研究は全く行われなかった。維管束形成層から由来する木部発達の機序を糾明するためには、特に導管細胞の分化の分子レベルでの研究と一緒に、導管細胞の分化過程における自食の機能と細胞死滅と自食の相互連繋性に対する研究が必須に行われなければならない。これにより、木部の発達を促進させて、木材層の質的、量的増加を誘導することによって、窮極的に産業的に有用な木質系バイオマス作物の開発を成功に導くことができる。
【０００４】
エタノール及びブタノールのような多様な液体燃料またはグルコースのような発酵性糖から生産されたポリ乳酸のような生重合体の単量体を含む多様な範囲の付加価置製品を含む“シューガプラットホーム（ｓｕｇａｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）”を達成するために、最近、原油精製業のような、リグノセルロース−由来バイオリファイナリーが有望な産業として注目されている［Ｋａｍｍ， Ｂ．， Ｋａｍｍ， Ｍ． ２００４． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｂｉｏｒｅｆｉｎｅｒｉｅｓ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ６４（２）， １９１ １３７−４５． ； Ｌｙｎｄ， Ｌ． Ｒ．， Ｗｙｍａｎ， Ｃ． Ｅ．， Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｔ． Ｕ． １９９９． Ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９８ Ｐｒｏｇ， １５（５）， ７７７−９３．］。高費用効率の供給原料の開発は、産業化のための主な挑戦中の１つであり、専用のリグノセルロースバイオマスの開発と関連した多様な研究が米国及びヨーロッパを含めた世界で依然として進行している。速い成長率及び短期循環によって、ポプラは、この分野で代表的なバイオマス作物であると言える［Ｓａｎｎｉｇｒａｈｉ， Ｐ．， Ｔｕｓｋａｎ， Ｇ． Ａ．， Ｒａｇａｕｓｋａｓ， Ａ． Ｊ． ２０１０． Ｐｏｐｌａｒ ａｓ ａ ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ：ａ ２００ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｂｉｏｆｕｅｌｓ Ｂｉｏｐｒｏｄ Ｂｉｏｒｅｆ， ４， ２０９−２２６．］。また、この多年生樹木は、糖転換の主な成分であるセルロース及びヘミセルロースが豊かであり、多量の化学製品投入を必要としないので、耕作においてさらに少ない投資を必要とする［Ｂａｕｃｈｅｒ， Ｍ．， Ｈａｌｐｉｎ， Ｃ．， Ｐｅｔｉｔ−Ｃｏｎｉｌ， Ｍ．， Ｂｏｅｒｊａｎ， Ｗ． ２００３． Ｌｉｇｎｉｎ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ １６６ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｐｕｌｐｉｎｇ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ３８（４）， ３０５−５０．］。今まで、リグノセルロースの転換は、木材比重及びリグニン及びセルロースの含量によって左右されることができるので、遺伝学的変形と関連したいくつかの研究が行われてきた。ポプラの遺伝学的改良と関連した詳細事項は、これら論文で確認することができる［Ｃｈｅｎ， Ｆ．， Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ． ２００７． Ｌｉｇｎｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｓｕｇａｒ ｙｉｅｌｄｓ ｆｏｒ １６８ ｂｉｏｆｕｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２５（７）， ７５９−６１．； Ｄｉｎｕｓ， Ｒ． Ｊ． ２００１ａ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｐｌａｒ ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ ｑｕａｌｉｔｙ ｆｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． １７０ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ９１−９３， ２３−３４．； Ｓａｎｎｉｇｒａｈｉ， Ｐ．， Ｔｕｓｋａｎ， Ｇ． Ａ．， Ｒａｇａｕｓｋａｓ， Ａ． Ｊ． ２０１０． Ｐｏｐｌａｒ ａｓ ａ ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ：ａ ２００ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｈ��ｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｂｉｏｆｕｅｌｓ Ｂｉｏｐｒｏｄ Ｂｉｏｒｅｆ， ４， ２０９−２２６．］。実際に、ポプラで５０％のリグニンが減少した遺伝学的変形を用いた改良が１９９９年に報告されている［Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｒ． Ｆ． ２００７． Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｔｈａｎｏｌ． Ｂｉｏｆｕｅｌ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｏ ｒｅａｐ ａ ｎｅｗ ｈａｒｖｅｓｔ． ２０４ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１５（５８１８）， １４８８−９１． ］。しかし、今まで、糖生産のためにポプラを含めて遺伝学的に変形された植物を使用するための体系的接近を実用的に示す研究はなかった。
【０００５】
本発明者らは、木部の代表的細胞層である導管細胞の分化過程に関する研究を進行している。特に、シロイヌナズナの分泌タンパク質体の分析を通じて発見した小さいＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂＧ３ｂに関心を持つようになり、シロイヌナズナＲａｂＧ３ｂが自食と導管細胞の分化に関与し、ひいては、自食が導管細胞の分化に関与することができるという可能性を考えるようになった。多様な分子生物学的、細胞学的研究によりＲａｂＧ３ｂが植物の導管細胞の分化、すなわち木部の発達に関与し、これは、ＲａｂＧ３ｂの自食調節機能を用いた機序であることを知見した。さらに、自食が導管細胞の分化に重要な過程であることを明らかにした。シロイヌナズナにＲａｂＧ３ｂＣＡを過発現させたとき、長さ生長と厚さ生長がいずれも野生型植物体に比べて増加することを示し、このような生長の増加が木部の発達の促進によるものであることを確認することができた［大韓民国特許出願第２０１０−００８５６０９号公報］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国特許出願第2010-0085609号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kamm, B., Kamm, M. 2004. Principles of biorefineries. Appl Microbiol Biotechnol, 64(2), 191 137-45. ; Lynd, L. R., Wyman, C. E., Gerngross, T. U. 1999. Biocommodity Engineering. Biotechnol 198 Prog, 15(5), 777-93.
【非特許文献２】Sannigrahi, P., Tuskan, G. A., Ragauskas, A. J. 2010. Poplar as a feedstock for biofuels:a 200 review of compositional characteristics. Biofuels Bioprod Bioref, 4, 209-226.
【非特許文献３】Baucher, M., Halpin, C., Petit-Conil, M., Boerjan, W. 2003. Lignin:genetic engineering and 166 impact on pulping. Crit Rev Biochem Mol Biol, 38(4), 305-50.
【非特許文献４】Chen, F., Dixon, R. A. 2007. Lignin modification improves fermentable sugar yields for 168 biofuel production. Nat Biotechnol, 25(7), 759-61.
【非特許文献５】Dinus, R. J. 2001a. Genetic improvement of poplar feedstock quality for ethanol production. 170 Appl Biochem Biotechnol, 91-93, 23-34.
【非特許文献６】Sannigrahi, P., Tuskan, G. A., Ragauskas, A. J. 2010. Poplar as a feedstock for biofuels:a 200 review of compositional characteristics. Biofuels Bioprod Bioref, 4, 209-226
【非特許文献７】Service, R. F. 2007. Cellulosic ethanol. Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. 204 Science, 315(5818), 1488-91.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
大部分の植物の特異遺伝形質は、発見され、これが異種植物に適用されても、同一の効果を示さないことが一般的であり、 特に草本植物の遺伝形質が木本植物でそのまま現れないことが一般的である。しかし、本発明者らは、シロイヌナズナ由来ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体であるＲａｂＧ３ｂＣＡを過発現させて、シロイヌナズナのような形質（木部の増大）を有する樹木を開発した。また、本発明で開発したＲａｂＧ３ｂＣＡ遺伝子形質転換された樹木の組成変化を分析した。特定触媒で前処理し、セルラーゼのような適量の酵素添加を利用して加水分解した。次いで、全体工程にわたって物質収支（ｍａｔｅｒｉａｌ ｂａｌａｎｃｅｓ）を樹立し、経済的観点で形質転換された樹木の可能性を確認した。本発明のＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木は、野生型樹木に比較して繊維細胞長さの増大による紙、パルプ生産及びセルロース及び／またはグルコース含量の増加によるバイオエタノール生産が可能であり、産業的に非常に有用なものと期待される。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、シロイヌナズナ由来ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）遺伝子が形質転換された樹木を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木を原料とする紙及び上記形質転換された樹木から生産されたパルプを提供することにある。
【００１０】
また、本発明のさらに他の目的は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木から生産されたバイオマスを提供することにある。
【００１１】
また、本発明のさらに他の目的は、樹木を利用したバイオマスの生産方法において、上記樹木は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木であるバイオマスの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）が形質転換された樹木を提供する。
【００１３】
本発明は、また、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木を原料とする紙及び上記形質転換された樹木から生産されたパルプを提供する。
【００１４】
本発明は、また、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木から生産されたバイオマスを提供する。
【００１５】
本発明は、また、樹木を利用したバイオマスの生産方法において、上記樹木は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木であるバイオマスの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木を製作し、１次的な形質分析を行った結果、バイオマスと関連した特性が観察された。すなわち、形質転換された樹木において野生型樹木に比べて長さ生長と厚さ生長がすべて増加し、特に木部、すなわち木材層が４０％以上増加し、製紙、パルプの質を決定する最も重要な要素である繊維細胞の長さが５０％以上増加する結果を得ることができた。
【００１７】
また、化学成分の分析結果、バイオエタノールの原料となるセルロース及び／またはグルコース含量が１０％増加したが、セルロース分解に妨害になるヘミセルロース含量は２５％減少することによって、本発明によるＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木が、産業的な価値を有するバイオマス／バイオエネルギー用樹木として活用することができることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＲａｂＧ３ｂの発現程度を野生型樹木（ＷＴ）と形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）で比較した結果である［（ａ）ＲａｂＧ３ｂＣＡ発現の半定量的なリアルタイムＰＣＲ分析、アクチンは対照群として使用；（ｂ）ウェスタンブロッティングでＲａｂＧ３ｂの発現程度分析、幹の４番目節間（節の間）で葉から抽出、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ染色は、ローディング対照群である。］
【図２】ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）と野生型樹木（ＷＴ）の間の形態学的比較を示すものである［（ａ）１０週間土壌で育てた形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）と野生型樹木（ＷＴ）の間の比較写真；（ｂ）幹長さ；（ｃ）幹直径；形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）と野生型樹木（ＷＴ）の幹成長は、１週間間隔で１０週間測定したものである（ｂ、ｃ）；（ｄ）１０週間育てた形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）と野生型樹木（ＷＴ）の節間数の比較；（ｅ）乾燥前に１０週になった形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）と野生型樹木（ＷＴ）の重量比較；（ｆ）乾燥後に１０週になった形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）と野生型樹木（ＷＴ）の重量比較；５回繰り返して平均±標準偏差を求める、ｔ−ｔｅｓｔ；＊Ｐ＜０．０５＊＊Ｐ＜０．０１］
【図３】ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木での維管束の発達変化を示すものである［（ａ）−（ｃ）：幹の基底断面をトルイジンブルーで染色し、維管束のパターンを観察；（ｄ）−（ｆ）：幹の基底断面をリグニン蛍光染色法を使用して木部細胞でのリグニンの蓄積程度を調べる；野生型樹木（ａ、ｄ）と形質転換樹木（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）の底部からレジンが充填された断面を準備、樹木は、培養培地で５週間育てたもの。Ｂａｒｓ＝５０μｍ］
【図４】ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木で増加した木部の発達を示すものである［（ａ）ＷＴとＯＸの１０番目の年輪の幹断面を切ってトルイジンブルーで染色し、ＰＰＦ（１次師部繊維）、Ｐ（師部）、ＶＣ（維管束形成層）、ＳＸ（２次木部）、ＰＸ（１次木部）分布を観察；（ｂ）ＷＴとＯＸの３０番目節間の幹断面をトルイジンブルーで染色し、ＯＢ（外皮）、Ｐ（師部）、Ｃ（維管束形成層）、Ｘ（木部）分布を観察；Ｂａｒｓ＝２００μｍ（ａ、ｂ）；（ｃ）（ｂ）で使用したサンプルで組職の幅を比較する（平均±標準偏差）；１０回以上実験して比較、ｔ−ｔｅｓｔ；＊＊Ｐ＜０．０１］
【図５】野生型樹木（ＷＴ）とＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木（ＯＸ）の幹での導管要素と繊維細胞の変化を示すものである。
【図６】ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木（ＯＸ）で木部の細胞サイズの変化を比較したものである［（ａ）繊維細胞長さ；（ｂ）繊維細胞直径；（ｃ）導管要素長さ；（ｄ）導管要素直径；土壌で１０週になったＷＴとＯＸ−８幹の下部分、中間部分を取って細胞を分離して得る、数値は、測定時に２５個細胞の平均±標準偏差；ｔ−ｔｅｓｔ；＊Ｐ＜０．０５＊＊Ｐ＜０．０１］。
【図７】ＲａｂＧ３ｂＣＡ培養細胞株での２次細胞壁のリグニン生成と自食増大を観察した写真である［（ａ）ＷＴ、ＯＸ−８培養細胞をフロログルシノール−ＨＣｌで染色し、リグニン化された木部細胞を光顕微鏡で観察；矢印は、導管要素の２次細胞壁パターン表示；（ｂ）ＷＴ、ＯＸ−８培養細胞をＬＴＧで染色し、自食構造を蛍光顕微鏡（左、中間）と光顕微鏡（右）で観察；Ｂａｒｓ＝１００μｍ］。
【図８】分化中のポプラ樹木の幹で自食構造の形成を示すものである［（ａ、ｇ）ＷＴ（ａ）とＯＸ−８（ｇ）２番目節間の幹の断面をトルイジンブルーで染色；（ｂ、ｈ）分化中の木部細胞を低倍率ＴＥＭイメージ；（ｃ、ｄ、ｉ、ｊ）ＷＴ（ｃ、ｄ）とＯＸ−８（ｉ、ｊ）幹分化中の木部細胞の自食構造ＴＥＭイメージ；（ｃ、ｄ、ｉ、ｊ）のボックス部分は、（ｅ、ｆ、ｋ、ｌ）で拡大；矢印：オートファゴソーム／オートリソソーム構造；Ｂａｒｓ＝５０μｍ（ａ、ｇ）、５μｍ（ｂ、ｈ）、１μｍ（ｃ、ｄ、ｉ、ｊ）、及び０．５μｍ（ｅ、ｆ、ｋ、ｌ）］。
【図９】幼いポプラ樹木の幹での木部発達過程と連携された遺伝子の発現分析を示すものである［（ａ）２次細胞壁の形成と関連した遺伝子の比較分析；（ｂ）細胞死滅と関連した遺伝子の比較分析；（ｃ）自食と関連した遺伝子の比較分析、結果値は、３回繰り返し実験したものであって、平均±標準偏差で示す］。
【図１０】硫酸、水酸化ナトリウム及び水性アンモニアの触媒それぞれで前処理する前と後、３つのポプラ樹木（ＷＴ、ＯＸ−３、ＯＸ−８）のグルコース収率を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）遺伝子が形質転換された樹木に関する。
【００２０】
上記樹木は、ポプラ、ユーカリプタス、シラカバ、ブナ、ハコヤナギ、オークなどの広葉樹と、マツ、モミ、カラマツなどの針葉樹を含む製紙パルプ原料とする樹木をすべて含むことができる。
【００２１】
本発明において、ＲａｂＧ３ｂは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来であるが、関心対象の他の種からのＲａｂＧ３ｂ遺伝子または類似遺伝子も、また使用することができる。
【００２２】
上記ＲａｂＧ３ｂＣＡ遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表示される。
【００２３】
本発明による形質転換された樹木は、対応野生型植物と比較してセルロース及び／またはグルコース含量が増加した。また、繊維細胞の長さが増加した。これは、木部が増加した形質から現われる結果である。
【００２４】
また、本発明は、上記形質転換された樹木から生産されたパルプまたは上記形質転換された樹木を原料とする紙を含むことができる。
【００２５】
また、本発明は、上記形質転換された樹木から生産されたバイオマスを含むことができる。
【００２６】
また、本発明は、上記形質転換された樹木を利用したバイオマスの生産方法を含むことができる。一般的な木材を利用したバイオマス生産方法と同一に実施する。上記バイオマスは、木質系から生産されるバイオマスをすべて含み、具体的に、セルロース、グルコースなどの糖類を含むことができる。特に、上記形質転換された樹木を水酸化ナトリウムで前処理した後、酵素で加水分解し、バイオマスを生産することを含むことができる。
【００２７】
また、本発明は、上記形質転換された樹木を利用したパルプの生産方法を含むことができる。一般的な木材を利用したパルプ生産方法と同一に実施する。
【００２８】
また、本発明は、ＲａｂＧ３ｂの活性型突然変異体（ＲａｂＧ３ｂＣＡ）遺伝子を過発現させて、セルロース及び／またはグルコースが増加した形質転換された樹木を製造する方法を含む。
【００２９】
以下、本発明の一実施例による形質転換ポプラ樹木に関する具体的な説明は、次の通りである。
ポプラ樹木は、環境学的、経済学的価値を有しており、また、木材産業において重要な樹木のうち１つである［Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５２、２３４−２４３］。樹木での最も重要な生物学的資源は、樹木あるいは２次木部の部分であり、これは、リサイクル可能な紙、パルプ、バイオ燃料の生産に利用される［Ｄｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３、２９９−３０４］。最近の遺伝学的、遺伝工学的研究は、樹木の生産過程のいくつかの重要な核心遺伝子を明らかにし、樹木の生産過程に対する理解を広げた。しかし、本発明者らは、以前発明の結果でＲａｂＧ３ｂＣＡがシロイヌナズナで木部の発達過程の促進作用と関系があることを示し、本発明においてポプラ樹木でＲａｂＧ３ｂＣＡを増大させることによって、樹木の生産能力を変えることができることを示した。すなわち、ＲａｂＧ３ｂＣＡが過発現されたポプラ樹木で幹の成長速度と木部の発達が増大し、この効果は、シロイヌナズナとポプラ樹木との間で保存されることによって、機能的にシロイヌナズナのＲａｂＧ３ｂＣＡがポプラ樹木でも相同であることを示す。ポプラ樹木の誘電体分析（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｏｐｔｒ１＿１／Ｐｏｐｔｒ１＿１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ；Ｔｕｓｋａｎ ｅｔ ａｌ．２００６）結果を参照すれば、８個のポプラ樹木同属体がシロイヌナズナのＲａｂＧ３ｂと７０％に近いアミノ酸配列類似性を示しており、そのうち１つ（ｅｓｔＥｘｔ＿Ｇｅｎｅｗｉｓｅ１＿ｖ１．Ｃ＿ＬＧ＿ＩＩ２０９３）は、９０％に達する高い類似性と８３％に達する同一性をシロイヌナズナのＲａｂＧ３ｂタンパク質と比較して有している。これらＲａｂＧ同属体がシロイヌナズナのＲａｂＧ３ｂとその木部の発達に対する影響と機能的に類似しているかを調べるに値する価値を有している。
【００３０】
以前に、細胞培養システムと蛍光幹でシロイヌナズナのＲａｂＧ３ｂの管状要素増大の活性は、われらが管状要素の分化で自食の役目を知ることができるようにした［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４．；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．
（２０１０）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ６、１１８７−１１８９．］。本発明者らは、自食が木部の分化で重要な過程であることを証明し、シロイヌナズナで管状要素のプログラムされた細胞死滅と関連された要素であることを証明した。ポプラ樹木で木部細胞が分化する間に、自食構造が発見され、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木では、さらに多い蓄積を切られたサンプル分析を通じて発見した［図８］。注目すべきことは、カルス培養での野生型細胞株で木部分化やリグニンの蓄積が増加されなかったが、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された細胞株では、木部の分化が増大し、酸性染色によって現われた自食構造の形成の増加が伴われたということである［図７］。以前の研究結果で、ＡＴＧ遺伝子とタンパク質発現をシロイヌナズナで調査したとき、管状要素の分化中に自食の活性と関系があったことが分かった［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４．；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ６、１１８７−１１８９］。本発明においていくつかのＡＴＧ遺伝子がＲａｂＧ３ｂＣＡが増大した細胞株において野生型細胞株より２倍以上さらに多く増加したことを成長しているポプラ樹木の幹で示した［図９の（ｃ）］。これら結果は、自食が木部の分化に必ず経なければならない過程であり、シロイヌナズナの場合と同様に、ポプラ樹木でもＲａｂＧ３ｂのＧＴＰａｓｅ活性がこれを調節することを示す。特に、シロイヌナズナのような草本遺伝形質がポプラ樹木のような木本にそのまま現われることは非常にまれな場合であり、本発明は、産業的利用価値を有する。
【００３１】
プログラムされた細胞死滅は、管状要素の発達過程において重要な過程であり、終わりに起きる。以前の研究は、木部の分化過程において管状要素のプログラムされた細胞死滅が自食と関連があることを提示する［Ｆｕｋｕｄａ Ｈ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４、２４５−２５３．；Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ６８Ａ、８１−９１．］。そして、われらは、管状要素の分化で自食が液胞が裂けることで起きるプログラムされた細胞死滅と関連があることを証明した［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４．；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ６、１１８７−１１８９］。ポプラ樹木での遺伝子発現、組職学的、構造的分析は、ＲａｂＧ３ｂと自食が結合的に木部の発達での細胞死滅に関与することを示した。また、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木で自食構造の蓄積と液胞の崩壊と細胞内容物の分解が大きく増加したことを確認した［図８］。木部の形成過程中にＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木でプログラムされた細胞死滅と関連した遺伝子（ｉ．ｅ.、ＭＣ９、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ａｎｄβ−ＶＰＥ）とＡＴＧ遺伝子が大幅に増加した［図８の（ｂ）］。これら結果は、シロイヌナズナと同様に、ＲａｂＧ３ｂと連携された自食が細胞死滅を導いて、この自食による細胞死滅は、ポプラ樹木の木部の分化期間中のプログラムされた細胞死滅に必要であることが分かる。 
【００３２】
シロイヌナズナでは、管状要素の形成過程中にプログラムされた細胞死滅と自食が２次細胞壁の形成と密接に関連しているものと認められる［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４］。自食の活性は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが増大した細胞でプログラムされた細胞死滅、２次細胞壁蓄積に伴われる。対照的に、管状要素と関連した形態学的変化は、自食が欠乏されたＲａｂＧ３ｂＤＮ、ＲａｂＧ３ｂＲＮＡｉ、ａｔｇ５−１細胞では１つも観察されなかった。ＲａｂＧ３ｂＣＡが増大した細胞の管状要素の分化過程でプログラムされた細胞死滅と２次細胞壁と関連した遺伝子がすべて大きく増加した。ポプラ樹木でのＲａｂＧ３ｂＣＡの過発現は、プログラムされた細胞死滅と自食と関連した遺伝子、２次細胞壁構成要素のバイオ生合成と関連した遺伝子の発現増大を導く［図９］。そして、これは、木部の発達で２次細胞壁形成とプログラムされた細胞死滅の連関可能性を提示する。
【００３３】
セルロースは、重要な２次細胞壁構成要素であって、バイオ燃料の生産に使用され、セルロース分解酵素によって分解されて糖化され、グルコースに変換される［Ａｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７８、６１−７２］。リグニンとヘミセルロースは、セルロースの酵素的分解に物理的障壁の役目をし、遺伝工学者と化学者は、リグニンとキシランの生合成を低減し、さらに壊す方法を開発している［Ｐｉｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、６０７−６１２．；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６、８８−９５．；Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９、１６６−１７２］。本発明は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された幹の細胞壁の要素がバイオ燃料としての木の品質を良好にする方向に変更されたことを示している（セルロースとグルコースは１０％増加し、キシランは２５％減少したが、リグニンの含量には大きい変化がなかった（表３））。セルロース対キシランの比率の増加は、２次細胞壁の分解をさらに容易にし、よって、バイオエタノール生産をさらに増大させることができる［Ｓｔｉｃｋｌｅｎ Ｍ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７、３１５−３１９．；Ｐａｕｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３、３０５−３１２］。
【００３４】
おもしろい結果は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木の幹は、野生型ポプラ樹木の 幹に比べて繊維細胞が３７〜６０％延長していることを発見した［図５、図６］。初期発達過程で繊維細胞は、軸に過度に延長し、次いで、２次細胞壁が固くなることとプログラムされた細胞死滅がつながる［Ｄｅｊａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ ３３３、３２５−３３４。］。繊維細胞延長の過程は、花粉管と根毛の成長と類似していて、細胞のチップに向かって小胞の分泌が活性され、これは、アクチンフィラメントを通じて行われる［Ｃｈａｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２２、２３９−２４９．］。直接的な小胞の細胞のチップへの移動は、延長された区域への栄養供給に非常に重要であり、この栄養の再分配過程は、自食によって調節されることができる。紙を作る過程で繊維細胞の長さは、非常に重要な要素なので、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木を原料として製紙、パルプの製造が可能である。
【００３５】
ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木は、野生型樹木と類似するリグニンの量にもかかわらず、１００ｇバイオマスから２０％以上のグルコース収率を示した。これは、特にＯＸ８でさらに速い成長をもたらし、ヘミセルロース及びリグニンのような他の木材成分とセルロースの結合が緩くなり、次いで少ない立体障害によってセルロースへのセルラーゼ接近を容易に増強させるＲａｂＧ３ｂＣＡ遺伝子の効果によるものであることができる。また、全体バイオマス重量を考慮すれば、ＯＸ８が同一の期間内に２倍以上の重量の増加［図２の（ｅ）、（ｆ）参照］を示すので、可能なグルコース生産が非常に拡大される。
【００３６】
また、触媒前処理後、グルコース収率は、触媒によって異なる。ヘミセルロース除去収率が他の触媒を使用した場合に比べて、硫酸の浸漬でさらに高く調査されたとしても、最も低い消化率を示した。これは、低いセルロース回収率とリグニン除去率に起因して酵素のセルロース分子に対する接近性が減少したからであると言える。水酸化ナトリウムが消化率及びグルコース収率と関連してポプラに最も効果的な触媒として立証された。
【００３７】
本発明者らは、ＲａｂＧ３ｂＣＡの過発現に対する研究は、一年生草であるシロイヌナズナと多年生樹木であるポプラ樹木においてすべて木部の発達に対する形態学的変化を導いた。また、ＲａｂＧ３ｂの自食による細胞死滅を導く、そして樹木の形成中に２次細胞壁の生成を促進する生理学的な作用があることを明らかにした。本発明に基づいて、持続的なＲａｂＧ３ｂと自食要素の増加は、木の品質を増大させることができ、林業に適用させることができる。しかも、ＲａｂＧ３ｂと連関性がある知られた因子は、木部の発達過程の要素の複合ネットワークに新しい情報を提供し、樹木の生理学的理解をさらに高めるのに寄与することができる。
【００３８】
以下、下記実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲が下記提示された実施例によって制限されるものではない。
【００３９】
［実施例］
I．材料及び実験方法
１．植物と成長条件
ポプラ樹木の形質転換のために、成長点培養を維持するハイブリッドポプラ樹木クローンであるＢＨ１（Ｐ．ａｌｂａ ｘ Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ ｖａｒ．ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ ＢＨ１）を使用した。ＲａｂＧ３ｂＣＡ構造は、ｐＢＩ１２１植物発現ベクターに以前にクローンされ［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５２、７９−８７．］、ポプラ樹木細胞にアグロバクテリウム媒介（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）形質転換法によって伝達された［Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８、３５１−３５５．；Ｋｉｍ Ｙ．Ｈ.、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ９、３３４−３４７．］。形質転換された細胞は、５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムと５０ｍｇ／Ｌカナマイシンが含まれているカルス誘導培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ［ＭＳ］ｍｅｄｉｕｍ、ｐＨ ５．８、３％ ｓｕｃｒｏｓｅ、０．８％ ａｇａｒ、１ｍｇ／Ｌ ２、４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、０．０１ｍｇ／Ｌ ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ、ａｎｄ ０．１ｍｇ／Ｌ １−ｎａｐｈｔｈｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ［ＮＡＡ］）によって選別された。根は、樹木の培地に移されて再生された。形質転換過程中に、培地は、培養室で２５℃を維持し、１６時間白色光（３０μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）に晒し、８時間暗条件下で放置した。再生された根は、根付くために０．２ｍｇ／Ｌインドール酪酸を含むＭＳ培地に移された。根付いた植物は、植木鉢で適応期間を有し、追加研究のために温室の土壌に移された。植物は、温室、２８〜３０℃の温度、１２時間明条件／１２時間暗条件下で培養と実験をすべて実施した。
【００４０】
２．植物成長測定
植物の生長は、根の生長点から幹の基底までである幹の長さ、幹基底の直径、節間の数と長さを測定して決定した。初期の植物長さを同一にするために、植物が土壌で２０ｃｍ以内の長さに成長したとき、基底を切って同じ時間に同じ長さで測定し、測定は、３〜５回程度繰り返した。
【００４１】
３．組織化学的分析
組織化学的分析は、以前論文［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４．］のように行った。
ポプラ樹木の幹を０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．４）に２．５％グルタルアルデヒド及び４％ｐ−ホルムアルデヒドを含む溶液で４℃で４時間固定し、０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．４）で洗浄し、１％ ＯｓＯ４で２時間室温に固定した。０．１Ｍリン酸溶液で洗浄した後、サンプルを脱水し、ＬＲホワイトレジン（Ｌｏｎｄｏｎ Ｒｅｓｉｎ）に充填した。ウルトラマイクロトーム（ＲＭＣ ＭＴ Ｘ）を利用して断面（Ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）（１μｍ）を準備した後、染色し、光顕微鏡で観察した。６０〜７０ｎｍに切り出した後、濾過した１％トルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）で短く染色した。上記断面を光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１ＴＲＦ）で撮影した。走査式電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析で薄い断面（６０−７０ｎｍ）は、銅格子板（１−ＧＮ、１５０メッシュ）上に収集し、ウラニルアセテート及びクエン酸鉛で染色し、ＴＥＭ（Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｔｅｃｎａｉ １２）で照射した。リグニン自発蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）分析のための、ポプラ幹は、固定され、ｐａｒａｐｌａｓｔ（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に内蔵した。断面（１０μｍ）をマイクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２３５）を使用して準備した後、４０５／４６０ｎｍ励起／発光で共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）を使用して撮影した。リグニン染色のための培養細胞は、フロログルシノール溶液（２％ｅｔｈａｎｏｌ／ｗａｔｅｒ、９５／５［ｖ／ｖ］）で１時間染色し、６Ｎ ＨＣｌに浸した。染色された細胞培養サンプルの明視野写真（Ｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ）は、光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１ＴＲＦ）で撮影された。
【００４２】
ＬＴＧ（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）染色のための培養細胞は、１μＭ ＬＴＧ ＤＮＤ−２６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１時間暗条件の下で培養された。４８８／５０５ｎｍ励起／発光で共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）を使用してイメージを得た。染色用培養細胞をカルス誘導培地上で５週間葉ディスクを培養し、準備した。
【００４３】
４．浸軟した木部細胞を準備
導管要素と繊維のサイズを測るために、１０週間土壌で栽培された野生型樹木と形質転換されたポプラ樹木の底及び中間部位から取った幹部分（１ｃｍ）を２ｍｍＸ１ｍｍＸ２ｍｍサイズの切れに切った。木切れは、直ちに５０％硝酸内６％ ＫＣｌＯ３を含むＳｃｈｕｌｚｅ’ｓ 試薬に浸した後、１週間室温で保管された。このサンプルは、その後、６０℃で３０分間激しくシェーキングし、それぞれの個別的な細胞に分離した。浸軟した個別細胞を蒸留水で３回洗浄し、顕微鏡スライドに載置し、カバーグラスで覆った。そして光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１ＴＲＦ）で観察し、細胞の長さと幅を測定した。
【００４４】
５．２次細胞壁要素に対する分析
１０週間土壌で栽培された植物から得られた幹サンプルが細胞壁要素を分析するのに使用された。不要であり、主要ではない要素をアセトンと温水で抽出し、除去した。
【００４５】
幹（２ｇ）を液体窒素で４０−６０ｍｅｓｈに研磨し、２０ｍｌアセトン（９９．９％、ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ）で室温で８時間抽出し、ワットマンＮｏ．２濾過紙で濾過した。その後、アセトン−抽出されたサンプルを熱湯に２時間抽出し、ワットマンＮｏ．２濾過紙で濾過し、風乾した。
【００４６】
そして、上記不要な要素が除去されたサンプル（２００ｍｇ）を７２％硫酸（１．５ｍｌ）に２時間２０℃で溶解させた。その後、３％硫酸が入っている熱湯に希釈させ、上記サンプル溶液を３時間沸かした。そして、沸いたサンプル溶液をＫｌａｓｏｎリグニンを沈澱させるために、一晩中室温に冷却させ、１Ｇ４磁器るつぼフィルタで濾過した。
【００４７】
そして、濾過残余物でＫｌａｓｏｎリグニン含量（ＴＡＰＰＩ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２２２ｏｍ−８８）を分析した。単糖類を分析するために、１／１０スケールダウンをして、実験を行った後、２段階加水分解は、１Ｈ−ＮＭＲ分光分析のために熱湯の代わりに、ＮＭＲ溶液であるＤ２Ｏで希釈を行った［Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ １５、２５５−２６０．］。
【００４８】
特異的ＮＭＲ条件は、下記の通りである：
Ｂｒｏａｄ ｂａｎｄ Ｏｂｓｅｒｖｅ Ｐｒｏｂｅ ｔｙｐｅ、３０℃、９０°、１１μｓｅｃ ｐｕｌｓｅ、１０ ｓｅｃ ｄｅｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｕｌｓｅｓ、２．７３ｓｅｃ ｆｏｒ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ、１０ｐｐｍ ｆｏｒ ｓｗｅｅｐ ｗｉｄｔｈ。
【００４９】
細胞壁で単糖類構成は、説明した通り、アノマリック水素（ａｎｏｍｅｒｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｎ）ピーク積分で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの解釈を基礎として推定した［Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ １５、２５５−２６０．］。
【００５０】
６．セルロースの結晶度分析
セルロースの結晶度分析は、以前に作った不要な要素が除去されたサンプルをＸ−ＲＡＹ回折分析機（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ５００５）により（４０Ｋｖ、４０ｍＡ）行われた。
回折スペクトルは、θ−２θ方法及び重複サンプルは、０．０１゜の段階で２θ＝１０゜−３０゜から１゜／ｍｉｎスキャンした。相対結晶指数が以前文献のように測定された［Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ（１９５９）Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ２９、７８６−７９４．］。
【００５１】
７．遺伝子発現分析
ＲａｂＧ３ｂＣＡ過発現株でＲａｂＧ３ｂＣＡの発現程度を確認するためのポプラ樹木の葉からまたは植物ＲＮＡ精製試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量的なＲＴ−ＰＣＲで多様な遺伝子発現を確認するための幼い幹から全体ＲＮＡを分離した。分離してそれぞれのサンプルで定量的なリアルタイムＰＣＲを用いて分析した。
【００５２】
その後、ゲノミックＤＮＡを除去するために、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉを処理した。定量的な発現分析のために、全体ＲＮＡ（１．５μｇ）を製造社のプロトコルによってＰｏｗｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ）を使用して一番目ストランドｃＤＮＡｓ合成に使用した。
【００５３】
定量的なリアルタイムＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）にＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを使用して実施した。
【００５４】
遺伝子と特異的なプライマーを使用し、それらの対応遺伝子モデルは、目録化した。
【００５５】
【表１】
0005967674.tif 000002
【００５６】
【表２】
0005967674.tif 000003
【００５７】
テストされた遺伝子発現レベルは、１８ＳｒＲＮＡの構成発現レベルに標準化し、２−ΔΔ方法を使用して計算された［Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ３、１１０１−１１０８］。
実験は、生物学的に独立的なサンプルで３回繰り返して行った。
【００５８】
８．ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、以前論文で明らかにしたものと同様に行われた［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５２、７９−８７．］。
【００５９】
タンパク質を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に分離し、ニトロセルローズ膜に移し、その後、４℃で一晩中抗−ＲａｂＧ３ｂ抗体と培養した。
抗体結合タンパク質は、コンジュゲートされた２次抗体と培養し、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって検出した。
【００６０】
９．サザンブロット分析
ゲノミックＤＮＡは、ＤＮＡｚｏｌ溶液（ＭＲＣ）を使用することによって、ポプラ葉から抽出し［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２、５５０−５５３．］、制限酵素ＥｃｏＲＩを一晩中処理した。
【００６１】
その後、切られたＤＮＡを０．７％アガロースゲル上に分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に移した。
【００６２】
ブロットは、混成反応緩衝溶液に６０℃で２４時間［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ−ｌａｂｅｌｅｄ ＲａｂＧ３ｂ ｃＤＮＡプローブで混成反応した。
【００６３】
混成反応されたブロットは、５０℃で３０分間２ｘＳＳＣ及び１ｘＳＳＣで持続的に洗浄し、Ｘ線フィルムに露出した。
【００６４】
１０．前処理
本実験でポプラの前処理のために硫酸（Ｄａｅｊｕｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＆ Ｍｅｔａｌｓ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ、Ｋｏｒｅａ）、水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び水性アンモニア（Ｊｕｎｓｅｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を含有する３種類の触媒を使用した。アンモニア処理のために、粉砕ポプラを８０℃の水槽（Ｂｉｏｆｒｅｅ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）内で１０時間１４％（ｗ／ｗ）の水性アンモニア溶液内にインキュベーションした。硫酸及び水酸化ナトリウム処理の場合、温度を３分以内に１９０℃に昇温しながらポプラを極超短波オーブンで１％（ｗ／ｖ）の各触媒に浸した。次いで、反応を抑制するために極超短波容器を氷水に移した。各処理が終決された後、前処理されたバイオマスを濾過布（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｌｏｔｈ）（２２〜２５μｍ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を利用して濾過し、液体のｐＨが６〜７になるまで十分な量の水で洗浄した後、３日間オーブン内で乾燥させた。
【００６５】
１１．酵素的加水分解
前処理効能を調査するために非処理及び前処理ポプラの両方をＮＲＥＬ手続によって消化した［Ｓｅｌｉｇ、Ｍ．、Ｗｅｉｓｓ、Ｎ．、Ｊｉ、Ｙ．２００８．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２０２ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｂｉｏｍａｓｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ．］。酵素活性は、１ｍｌ溶液当たり５６．８ ＦＰＵで測定された。１％（ｗ／ｖ）のバイオマスを０．０５Ｍのクエン酸緩衝液及びテトラサイクリンとシクロヘキシミドのような抗生剤が既に満たされた２０ｍｌバイアルに添加した後、１ｇのグルカン当たり１５ＦＰＵのアクセレラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ）１０００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用して７２時間インキュベーションした。酵素と基質の反応プロファイリングを確認するために、２、６、１０、２４、４８、及び７２時間目に試料をそれぞれ採集した。
【００６６】
１２．成分分析
ＮＲＥＬ手続によって成分分析を行った［Ｓｌｕｉｔｅｒ、Ａ．、Ｈａｍｅｓ、Ｂ．、Ｒｕｉｚ、Ｒ．、Ｓｃａｒｌａｔａ、Ｃ．、Ｓｌｕｉｔｅｒ、Ｊ．、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、Ｄ．、Ｃｒｏｃｋｅｒ、Ｄ．２００８．２１０ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｌｉｇｎｉｎ ２１１ ｉｎ ｂｉｏｍａｓｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ．］。要約すれば、０．３ｇの乾燥バイオマスを７２％（ｗ／ｗ）硫酸を使用して前消化し、４％に希釈した後、１２１℃で１時間消化した。バイオマススラリーをるつぼを用いて濾過した。るつぼ上の残渣を５７５℃で３時間溶鉱炉内に移動させた（Ｄａｉｈａｎ Ｌａｂ Ｔｅｃｈ、Ｋｙｏｎｇｇｉ−Ｄｏ、Ｋｏｒｅａ）。溶鉱炉内での燃焼の前及び後に重量差を測定し、酸−不溶性リグニンを決定した。中和貫流（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を５分間１６，０００ｒｐｍで遠心分離し、０．２μｍ注射濾過器（Ｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈ、Ａｐｐｌｅ Ｖａｌｌｅｙ、ＭＮ）を使用して濾過し、ＳＰ０８１０カラム（Ｓｈｏｄｅｘ、Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ、Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｊａｐａｎ；Ｐｂ２＋ｆｏｒｍ、３００ｍｍｘ８．０ｍｍｘ７μｍ）及び屈折率検出器（Ｇ１３６２Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が装着された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ａｇｉｌｅｎｔ １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でグルコース、キシロースなどを含む炭水化物を分析した。すべての分析は、３回繰り返して行った。
【００６７】
II．実験結果
１．ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木構成
インシリコデータによれば、シロイヌナズナＲａｂＧ３ｂは、ブラシノリド／ホウ酸投与とプログラムされた細胞死滅のような木部の分化条件下で高く発現される［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５２、７９−８７．；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４．］。以前の研究で、ＲａｂＧ３ｂは、シロイヌナズナでのその自体の自食を通じて管状要素の分化を調節することを示した［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４。］。本発明者らは、シロイヌナズナのようにポプラ樹木でＲａｂＧ３ｂが同じ役目を行うか、そしてポプラ樹木の木部の成長を促進させるかを調べるために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプローモーターを通じてＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木を製作した。ＲＴ−ＰＣＲとウェスタンブロッティングを使用して形質転換された遺伝子発現で１４個ラインが発見され、これは、転写レベルとタンパク質レベルで良い一致を示した［図１］。
９個のライン（ＯＸ−１、−３、−７、−８、−１１、−１２、−１３、−１５、−１６）は、単一コピー挿入を示した。この結果を通じて見れば、３個の独立的なライン（ＯＸ−３、−８、−１５）は、高い発現レベルと単一遺伝子コピーを示し、次の研究のために選択された。
【００６８】
２．ＲａｂＧ３ｂＣＡ形質転換されたポプラ樹木の発現された表現型
ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木の幹成長が先に測定された［図２の（ａ）］。形質転換されたポプラ樹木（Ｐ．ａｌｂａ ｘ Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ ｖａｒ．ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）（ＯＸ）が培地と土壌の両方で対照群（ＷＴ）に比べてさらに速く成長した。培養培地では、５週間対照群は５ｃｍ成長し、形質転換された樹木は、７〜８ｃｍ程度成長した。土壌に移され、１０週間栽培した後、測定した結果、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木は、幹の長さでは対照群に比べて１３〜２０％さらに成長し、厚さは、１０〜１２％さらに成長した［図２の（ｂ）、（ｃ）］。節間数字は、約１０％程度形質転換されたポプラ樹木で増加することを示した［図２の（ｄ）］。また、木を乾かした後、重さを測ったところ、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木が対照群に比べて重さが２倍程度多い［図２の（ｅ）、（ｆ）］。
【００６９】
３．ＲａｂＧ３ｂＣＡ形質転換されたポプラ樹木での木部発達及び繊維細胞増大
ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたシロイヌナズナのようにＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木で木部の発達が増大されることによる幹成長の増加が解剖学的分析を通じて明らかにされた［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４］。
【００７０】
培地で５週間成長した樹木を幹の下部分を切って、維管束のパターンを観察した［図３］。たとえ、総合的な維管束の形態は、形質転換された樹木や対照群で類似しているが、形質転換された樹木で木部の変形が目立つように増加した［図３の（ａ）−（ｃ）］。リグニンの蛍光分析は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木で対照群に比べてリグニンの形成と２次細胞壁形成がさらに増大したことを示した［図３の（ｄ）−（ｆ）］。維管束の発達は、土壌で栽培された樹木で追加観察された。幹の上部分で１０番目節間を切り出した断面で、２次木部は、形質転換された樹木で目立つように発達された状態であったが、対照群では、発達し始まる段階であった［図４の（ａ）］。下側で二次成長をしている３０番目節間を切り出した追加断面を得た［図４の（ｂ）、（ｃ）］。組職部分を観察したとき、形質転換された樹木で対照群より４０％直径がさらに広い２次木部（ＳＸ）の成長を示したとを発見した。しかし、師部（Ｐ）、維管束形成層（Ｃ）、外皮（ＯＢ）では、形質転換された樹木と対照群の差がほとんどなかった。この結果は、ポプラ樹木でのＲａｂＧ３ｂＣＡの過発現が木部成長の増大による２次木の成長の増加を導いたことを示す。
【００７１】
木部の細胞のサイズが形質転換された樹木に及んだ影響を調べるために、導管要素と繊維細胞の細胞を分離し、長さと幅を測定した［図５及び図６］。
【００７２】
ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木では、繊維細胞の長さが大きく増大し（ｍｉｄｄｌｅ：４５−６０％、ｂｏｔｔｏｍ：３７−４７％増加）、直径もやはり大きく増大（ｍｉｄｄｌｅ：４０−４７％、ｂｏｔｔｏｍ：２５−４１％増加）することは勿論、導管要素の直径も有意的に増加したが（ｍｉｄｄｌｅ：４０−５７％、ｂｏｔｔｏｍ：６６−８０％増加）、導管要素の長さは、有意的に増加しなかった（ｍｉｄｄｌｅ：１８−２０％、ｂｏｔｔｏｍ：２４−３３％減少）。
【００７３】
４．ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木の幹での化学的構成
ＲａｂＧ３ｂＣＡ形質転換されたポプラ樹木幹での細胞壁構成要素の変化を見るために構成要素を分析した［表３］。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
２つの主要構造的構成要素であるセルロースとリグニンを観察したが、リグニンは、形質転換されたポプラ樹木で対照群と比較したとき、変化がなかったが、セルロースは、略１０％（ＯＸ−８）増加した。全体多糖類の含量は、対照群と形質転換されたポプラ樹木の両方の間で類似した。セルロースの１次的要素であるグルコースの量は、形質転換された樹木で６〜１１％程度さらに高かった。対照的にヘミセルロースであるキシラン、キシロース（キシランの主要要素）は、形質転換された樹木で２３〜２６％減少した。セルロースの結晶度は、対照群と形質転換された樹木との間で差がなかった。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
５．ポプラ樹木での木部発達中の自食活性
本発明者らの以前研究で、自食は、シロイヌナズナの管状要素の分化を活性化させ、自食と管状要素の分化は、また、ＲａｂＧ３ｂＣＡの過発現によって有意的に刺激された［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４．］。カルスは、ポプラ樹木葉で増加し、ＭＳ固体培地で成長した。たとえカルス培養培地が木部の分化に適していないが、本発明者らは、フロログルシノール−ＨＣｌでリグニン染色を用いた分析を通じてＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の細胞が自然な木部の増加を起こしていると認められる［図７の（ａ）］。ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の細胞株で略２０〜３０％増加した強いリグニン染色程度が発見され、対照群では捜すことができなかった。特に、いくつかの染色されたＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の細胞株で注目すべき導管要素の２次細胞壁パターンを示した［図７の（ａ）、矢印］。これは、リグニンの蓄積を示すと同時に、野生型樹木の細胞株では木部の分化が促進されない条件で木部の分化がＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の細胞株で増加したことを示す。
【００７８】
ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の細胞株での自食が増加される可能性については、自食構造を酸性染色ＬＴＧ（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）して研究した［Ｖｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１１、８９７−９０５．；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６４、１５１−１６４］［図７の（ｂ）］。ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の細胞株では、野生型樹木の細胞株に比べて酸性染色試薬で染色された斑点がさらに多く観察された。
【００７９】
この染色によって得られた結果がポプラ樹木に直接適用されるかを観察するために、２番目節間で得られたサンプルを走査式電子顕微鏡で分析した［図８］。１次木部細胞株の分化は、野生型樹木、形質転換された樹木の両方で同一に観察された［図８の（ａ）、（ｇ）］。野生型樹木の木部細胞では、多くの部分が損傷されない細胞内容物で満たされていて、いくつかの細胞は、２次細胞壁が沈着されている［図８の（ｂ）］。これは、この細胞が分化の初期段階にあることを示す。注目すべきことは、野生型樹木の細胞株では、自食構造が細胞器官と構造を取り囲んで分解しているものであった［図８の（ｃ）−（ｆ）］。対照的に、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木の木部細胞では、大きく液胞の崩壊が進行されながら細胞内容物が分解されており［図８の（ｈ）］、多くの自食構造が蓄積されていた［図８の（ｉ）−（ｌ）］。この結果が示すことは、木部細胞株の分化過程中に自食が起きることができ、この木部細胞株の分化作用と自食がＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木でさらに活発であることである。
【００８０】
６．木部の発達と関連した遺伝子の分析
以前のシロイヌナズナとポプラ樹木での木部発達に対する研究結果に基づいて、木部の発達に関与する遺伝子の複数のグループを選別し、それらの発現程度を野生型樹木とＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換されたポプラ樹木で幼い幹であるとき、木部の分化が進行される間に比較分析した［Ｃｏｕｒｔｏｉｓ−Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５８、２６０−２７４．；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６０、１０００−１０１４．；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｌａｎｔ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５１、１４４−１６３．；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ １８７、７７７−７９０］。
【００８１】
本発明者らは、２次細胞壁形成と関連した２グループ（ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ合成遺伝子（４ＣＬ３、Ｃ３Ｈ３、ＣＣｏＡＯＭＴ１、ＣＯＭＴ２、ＣＡＤ１、ＣＡＤ４、ＣＡＤ１０）と細胞壁炭水化物合成遺伝子（ＣｅｓＡ４、ＣｅｓＡ７、ＣｅｓＡ８、ＣｅｓＡ１８、ＩＲＸ８、ＩＲＸ９、ＦＲＡ８）の発現程度を比較した［図９の（ａ）］。少数（ｅ．ｇ．ＣｅｓＡ４）を除いた大部分の細胞壁合成遺伝子がＲａｂＧ３ｂＣＡ形質転換された樹木で増加した。また、本発明者らは、細胞内容物を分解する２つのグループの遺伝子［プログラムされた細胞死滅と関連した遺伝子（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＶＰＥ、ａｎｄ ＭＣ９）と自食と関連した遺伝子（ＡＴＧ８ｄ１、ＡＴＧ８ｆ２、ＡＴＧ８ｉ）］の発現程度を分析した［Ｃｏｕｒｔｏｉｓ−Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５８、２６０−２７４］［図９の（ｂ）、（ｃ）］。形質転換された樹木で現われる細胞壁が分解が増加し、自食構造の形成が増加する表現型的特徴と同様に、これら分解する遺伝子は、形質転換された樹木でさらに増加した。この結果は、ＲａｂＧ３ｂＣＡが形質転換された樹木での形質転換された表現型と木部の分化程度がこれら遺伝子の発現と連関があることを証明する。
【００８２】
７．酵素接近性の調査
セルロースに対する酵素接近性を非間接的に調査するために、ＷＴ、ＯＸ３、及びＯＸ８を含む３種のポプラを７２時間１ｇグルカン当たり１５ ＰＦＵのアクセレラーゼ１０００を使用して加水分解した。ＷＴを加水分解すれば、理論的最大グルコースを基準として３２．８％の消化率（ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ）が収得された。このように相対的に低い消化率は、リグノセルロースの天然難消化性及び強直性に起因したものであることができる。しかし、大部分の非処理バイオマスで通常２０％未満として確認されたセルロース加水分解収率は、若干さらに高かった。ＯＸ３及びＯＸ８で、それぞれ３３．９％及び４２．９％の加水分解収率が得られた。ＯＸ３が任意の差を示さないとしても、ＯＸ８は、ＷＴと類似なリグニン含量にもかかわらず、消化率で約１０％の改善を示した。このような結果は、ＲａｂＧ３ｂＣＡ遺伝子が長さ及び厚さのような表現形質だけでなく、組成において任意の有意味な変化なしに形状または形態にも影響を及ぼしたことを立証した。したがって、バイオマス加水分解収率を増加させるための多様な前処理を在来式及び形質転換ポプラの両方に適用した。
【００８３】
硫酸、水酸化ナトリウム、及びアンモニアをリグノセルロースの前処理用触媒として使用した。各触媒で前処理条件は、われらの事前研究に基づいて決定した。ＷＴの場合に、硫酸、水酸化ナトリウム、及びアンモニア前処理で６０ ＦＰＵセルラーゼを使用した不溶性固形物の回収率は、それぞれ４９．０％、５８．７％、６７．２％であり、酵素的消化率は、それぞれ５４．４％、５８．７％、４４．９％であった。各処理で、２３．８％、３７．３％、３６．４％水準の軽微な脱リグニン化によって、３４．８％の消化率を示す非処理ＷＴに比べて消化率は、それぞれ１．６−、１．７−及び１．３−倍増加を示した。ＯＸ３及びＯＸ８を含む形質転換ポプラの場合、全般的な結果様相は、ＷＴと多少類似していた。ＯＸ３で、硫酸、水酸化ナトリウム及びアンモニア前処理で不溶性固形物の回収率は、それぞれ４３．５％、５８．２％、６６．３％であり、酵素的消化率は、それぞれ６９．４％、７４．３％、５３．３％であった。各前処理条件でリグニン含量において３０．５％、３７．３％、及び３４．１％減少とともに非処理ＯＸ３で３５．１％の消化率に比べて２．０−、２．１−及び１．５−倍増加が測定された。最後に、硫酸、水酸化ナトリウム、及びアンモニア前処理で処理されたＯＸ８から不溶性固形物回収率は、それぞれ４４．１％、６０．０％、６３．７％であり、酵素的消化率は、それぞれ６１．９％、６９．４％、６１．３％であった。また、各前処理条件で２７．６％、３７．６％、及び３８．４％の脱リグニン化を示すとき、処理された４３．０％消化率と比較して１．４−、１．６−及び１．４−倍改善が開発された。アンモニア再循環浸出ハイブリッドポプラに関する実験によれば、６０％以上のリグニン除去にもかかわらず、１５ＦＰＵのセルラーゼを使用した消化率は、残余リグニン及びリグニンに対する酵素の非生産的結合によって５０％以下であった。したがって、本研究で、形質転換ポプラであるＯＸ３及びＯＸ８は、エタノールのような高付加価値製品の生産に適したリグノセルロースであることができる。
【００８４】
これら結果から、図１０に示されたように、在来式及び遺伝学的に操作されたポプラを前処理するための各触媒の効率を評価するために、酵素的糖化により獲得された全体グルコース収率（不溶性固形物ｘグルカン含量ｘ酵素的消化率）を比較した。１００ｇの乾燥重量基準の非処理ＷＴ、ＯＸ３及びＯＸ８の場合、生産されたグルコース収率は、それぞれ１５．９、１５．８、及び２１．５ｇであった。１００ｇの前処理ポプラの場合、ＷＴで１５．３−１８．５ｇ、ＯＸ３で１７．７−２４．０ｇ、及びＯＸ８で１５．８−２３．７ｇ範囲の計算されたグルコース収率が収得された。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号１：シロイヌナズナ RabG3b 活性構造遺伝子
【図１（ａ）】
0005967674.tif 000006
【図１（ｂ）】
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【図３】
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【図８】
0005967674.tif 000009
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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