(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記、式６ 
【化６】
0006021018.tif 000027
に示される塩基配列、または、
下記、式７
【化７】
0006021018.tif 000028
に示される塩基配列からなり、
常温常圧下２５％ヒト血清水溶液中において３０分浸漬した場合に分解が１０％以下であるヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするＲＮＡ分子。
【請求項２】
ヌクレオチドの糖部位の少なくとも一部がハロゲンあるいはアルコキシ基により置換されている、リン酸骨格構造の少なくとも一部が、蛍光物質、ポリエチレングリコールのいずれかにて修飾されている、またはいずれかの原子が放射標識されていることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１に記載のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする癌細胞に特異性を有するドラッグデリバリーの補助剤。
【請求項４】
請求項１に記載のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする癌細胞の検出剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年５月３０日に出願された日本国特許出願２０１１−１２０８０６に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、オリゴヌクレオチドに関し、特に、簡便に製造できると共にヌクレアーゼ耐性を備える天然型の直鎖状ＲＮＡ分子及びそのＤＮＡであるオリゴヌクレオチドに関するものである。また本発明は該ＲＮＡ分子を含む医薬組成物にも関するものである。
【背景技術】
【０００３】
染色体テロメア
テロメラーゼはＲＮＡ成分を含むリボ核タンパク質複合体であり、テロメア配列の鋳型となるＲＮＡと逆転写酵素、その他の制御サブユニットから構成される複合体である。ＲＮＡ構成要素はＴＥＲＣ（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ＲＮＡ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、逆転写酵素はＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と呼ばれる。ヒトのテロメラーゼは、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＣ、ジスケリン、ＴＥＰ１などのサブユニットによって構成されており、それらは異なる染色体上の遺伝子座にコードされている。ＴＥＲＴ翻訳産物は、非翻訳ＲＮＡであるＴＥＲＣと一緒に折りたたまれる。ＴＥＲＴは一本鎖テロメア反復配列を付加できるように染色体の周囲を覆う二股の構造をとる。ＴＥＲＴとテロメアの鋳型を含むＴＥＲＣは隣接している。ヒトＴＥＲＣの塩基配列は既知でありＮＩＢＣ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＲ＿００１５６６．１として開示されている（配列番号１）。【０００４】
ここで、染色体のテロメアは、細胞分裂の度に短縮していき、短縮が限界に達すると細胞死を引き起こすことが知られている。ところが、多くの癌細胞ではテロメラーゼと呼ばれるテロメア合成酵素が活性化しており、このテロメラーゼによるテロメアの修復作用によってテロメアの短縮が通常通りに生じず、癌細胞の無制限な増殖を引き起こしていると言われている。よってテロメラーゼを阻害することにより癌細胞の増殖を抑制できることが考えられる。【０００５】
テロメラーゼ活性を阻害するための従来技術
テロメラーゼの活性を阻害する方法として、特許文献１にはテロメラーゼを阻害するための改変オリゴヌクレオチドが開示されている。特許文献１に開示された化合物は脂質部分とオリゴヌクレオチド部分を含み、該オリゴヌクレオチド部分はヒトテロメーゼＲＮＡ成分の特定の領域内の配列に相補的であるために、該化合物は細胞内でテロメラーゼを阻害することができる。【０００６】
また特許文献２には、テロメラーゼのＲＮＡ成分に対する阻害性ポリヌクレオチドを利用することにより、テロメラーゼのＲＮＡ成分を検出および阻害するための方法が開示されている。特許文献２においてはそのような阻害性ポリヌクレオチドとして、テロメラーゼのＲＮＡ成分に対するアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドが具体的に開示されている。また特許文献２には、テロメラーゼＲＮＡ成分の配列中にリボザイム標的配列が存在することに基づいて、テロメラーゼのＲＮＡ成分を切断するリボザイムを採用することも提案されている。しかしながら特許文献２には、リボザイムを具体的に設計したことは開示されていない。【０００７】
特許文献３はヒトテロメーゼの触媒サブユニットのｍＲＮＡ（ヒトテロメラーゼ酵素逆転写酵素：ｈＴＥＲＴ）を標的とするリボザイムが開示するものであり、該文献にはそのようなリボザイムの配列が具体的に開示されている。【０００８】
ＲＮＡ分子利用の問題点
一般的に天然型ヌクレオチドによって合成されたＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼであるＲＮＡ分解酵素による分解を受けてしまう。そのために、ＲＮＡ分子を医療へ応用するには、該ＲＮＡ分子がＲＮＡ分解酵素による分解を受けることを回避することが要求される。ＲＮＡ分解酵素による分解を回避する一般的な方法として、ＲＮＡ分解酵素による分解を受けない人工核酸を代替利用すること、あるいはＲＮＡ分子の末端に化学修飾を施すことが行われている。更には特許文献１に関連して述べたように、ＲＮＡの末端にリンカーを介して脂質を結合した化合物が提案されている。【０００９】
また、通常のＲＮＡ分子は一本鎖の直鎖状であるが、このＲＮＡ分子の末端部分を連結した環状型にすることで、エキソ型ＲＮＡ分解酵素による分解を回避し、細胞内での該ＲＮＡ配列の安定性を向上させる技術が開発されている（非特許文献１参照）。【００１０】
リボザイム
一方、特許文献３に記載されているように、ＲＮＡ分子を医療へ応用するアプローチの１つとしてリボザイムを用いる試みが行われている。リボザイムとはタンパク質同様に触媒能力を有するＲＮＡ分子の総称である。ハンマーヘッド型リボザイムは、その二次構造が金槌型をしていることから命名されたリボザイムの一種である。該ハンマーヘッド型リボザイムは、ＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵであり、Ｘ＝Ａ、Ｃ、又はＵの何れかである。）配列を持つあらゆるＲＮＡ配列を認識し、該ＮＵＸ配列のＸの３’側のホスホジエステル結合を切断することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００７−５０４８３０号公報
【特許文献２】特表２００１−５０７２２９号公報
【特許文献３】特表２００２−５３６９６７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ，Ｓｏ  Ｕｍｅｋａｇｅ  ＆  Ｙｏ  Ｋｉｋｕｃｈｉ；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，２６５−２７２（１５  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は癌の治療などを目的として、テロメアーゼを阻害するための新たな手段を提供することである。【００１４】
特許文献１および非特許文献１に示した従来技術は、いずれも化学的な修飾や、反応による環状化を行わなくてはならず、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性の向上したＲＮＡ分子を製造しようとすれば、その製造工程を煩雑化してしまうという問題点があった。【００１５】
更に、人工核酸など非天然型構造を導入しようとすれば、高度な合成技術が必要とされ、汎用的な生産が困難となりかねない上、得られるＲＮＡ分子のコストを上昇させてしまうという問題点があった。このため、汎用的に低コストで利用し得るヌクレアーゼ耐性に優れたＲＮＡ分子を提供することが困難となっていた。【００１６】
また、化学的修飾を行った場合や人工核酸などの非天然型のＲＮＡ分子は、場合によっては、天然型のＲＮＡ分子に比べて標的とする分子に対する結合能力を低下させかねず、ヌクレアーゼ耐性の向上と目的とする機能発現との両立が困難になるという問題点があった。【００１７】
一方特許文献３には、テロメラーゼの阻害剤として使用できる天然型ＲＮＡ分子のリボザイムが開示されている。しかしながら、特許文献３においては、ｉｎ  ｖｉｖｏ或いはそれと類似の環境（例えばＲＮＡ分解酵素と共存する環境）下で触媒活性を示すか、ヌクレアーゼ耐性を備えるかについては検討されていない。【００１８】
ＲＮＡ分子を分子標的薬やドラックデリバリーシステム用素材に用いる場合には、生体内で使用されるためヌクレアーゼに対する十分な耐性が要求されるが、これまで述べてきたように、天然型ＲＮＡ分子では未だ必要な耐性を実現できないという問題点を残している。【００１９】
本発明は、上述した問題点を解決するためになされたものである。具体的には、本発明は簡便に製造できると共にヌクレアーゼ耐性を備えるＲＮＡ分子を提供することを目的としている。ヌクレアーゼ耐性を備えるＲＮＡ分子がテロメアーゼ活性を阻害するリボザイムとして機能するならば、そのようなＲＮＡ分子は癌の治療に利用できると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、簡便に製造できると共にヌクレアーゼ耐性を備える天然型の直鎖状ＲＮＡ分子及びそのＤＮＡであるオリゴヌクレオチド、該ＲＮＡ分子を含む癌治療用の医薬組成物、癌細胞の検出剤、および癌細胞に特異性を有するドラッグデリバリーの補助剤を得た。【００２１】
本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。【００２２】
［態様１］
下記、一般式１
【化１】
0006021018.tif 000002
（一般式１においてＸ１からＸ１６はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す）
に示される塩基配列、あるいはこの配列中において１から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするＲＮＡ分子。【００２３】
［態様２］
下記、一般式２
【化２】
0006021018.tif 000003
（一般式２においてＸ１７からＸ２５はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す）
で示されるハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有することを特徴とする態様１に記載のＲＮＡ分子。【００２４】
［態様３］
ヒトテロメラーゼＲＮＡの鋳型領域にハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする態様１または態様２に記載のＲＮＡ分子。【００２５】
［態様４］
下記、一般式３
【化３】
0006021018.tif 000004
（一般式３においてＸ２、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１０からＸ１５はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す）
に示される塩基配列、あるいはこの配列中において１から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様１から３のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００２６】
［態様５］
下記、一般式４
【化４】
0006021018.tif 000005
（一般式４においてＸ２、Ｘ１２、Ｘ１３はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す）
に示される塩基配列、あるいはこの配列中において１から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様１から４のいずれかの１に記載のＲＮＡ分子。【００２７】
［態様６］
５’側末端の配列がＧＧ、Ｇ、ＡまたはＧＧＧであることを特徴とする態様１から５のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００２８】
［態様７］
一般式１の塩基配列のうち３９以上の塩基を備える直鎖状のＲＮＡ分子であることを特徴とする態様１から６のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００２９】
［態様８］
ヌクレオチドの糖部位の少なくとも一部がハロゲンあるいはアルコキシ基により置換されている、リン酸骨格構造の少なくとも一部が、蛍光物質、ポリエチレングリコール、ビオチン、チオール基のいずれかにて修飾されている、またはいずれかの原子が放射標識されていることを特徴とする態様１から７のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００３０】
［態様９］
下記、一般式５
【化５】
0006021018.tif 000006
（一般式５においてＸ２はアデニンまたはグアニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１２はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１３はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表す）
に示される塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様１から８のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００３１】
［態様１０］
下記、式６
【化６】
0006021018.tif 000007
に示される塩基配列、または、
下記、式７
【化７】
0006021018.tif 000008
に示される塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様１から９のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００３２】
［態様１１］
下記、式８
【化８】
0006021018.tif 000009
に示される塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様１あるいは態様３から９のいずれか１に記載のＲＮＡ分子。【００３３】
［態様１２］
態様１から１１のいずれか１に記載のＲＮＡの塩基配列と同一のまたは相補的な塩基配列を有するＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ分子。
［態様１３］
態様２記載のＲＮＡ分子を有効成分として含むことを特徴とする癌治療用の医薬組成物。
［態様１４］
態様３記載のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする癌細胞に特異性を有するドラッグデリバリーの補助剤。
［態様１５］
態様３記載のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする癌細胞の検出剤。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のＲＮＡ分子はヌクレアーゼに対する耐性を備えているので、ヌクレアーゼが存在する生体内でも使用することができるという点で有利である。このため、例えば、静脈注射によって本発明のＲＮＡ分子を全身投与した場合であっても、当該ＲＮＡ分子が直ちに分解されるといったことがなく、薬剤の体内輸送を実現し得る。【００３５】
その上、例えば、本発明のＲＮＡ分子がリボザイムの機能を発現するよう設計された場合には、ＲＮＡ分解酵素による分解速度が顕著に抑制されることから、長時間にわたって触媒活性を持続させることができる。【００３６】
また本発明のＲＮＡ分子は天然型のＲＮＡ分子であるので、煩雑な化学合成を行うことなく、鋳型となる塩基配列から転写によって製造することができる。故に汎用的な手法で簡便かつ低コストで製造することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１はヒトテロメラーゼに対応するＲＮＡの塩基配列を示した図である。なお図１は、ＣｈｅｎらＳｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＲＮＡ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １００，Ｉｓｓｕｅ  ５，３  Ｍａｒｃｈ  ２０００，Ｐａｇｅｓ  ５０３−５１４の内、Ｆｉｇ．２（一部）を転載したものである。図１の赤字のＧ，Ａ，Ｕ，Ｃは１００％保存領域を示す。緑色はユニバーサルコバリエーションにサポートされている部分である。青色はグループ特異的コバリエーションにサポートされている部分である。−はワトソン−クリック塩基対を示す（配列の９０％超）。黒丸はＧ／Ｕ塩基対を示す。白丸は非カノニカル塩基対を示す。星印は非ユニバーサル塩基対を示す。
【図２】図２は実施例１と比較例１のＲＮＡ分子の血清中での安定性を示した図である。レーンＣは血清のみのサンプルである。レーン１は凝集ＲＮＡのみのサンプルである。レーン２は凝集ＲＮＡに血清を加えて１分間反応させたサンプルである。レーン３は凝集ＲＮＡに血清を加えて１０分間反応させたサンプルである。レーン４は凝集ＲＮＡに血清を加えて３０分間反応させたサンプルである。レーン５は凝集ＲＮＡに血清を加えて６０分間反応させたサンプルである。レーン６は環状ＲＮＡのみのサンプルである。レーン７は環状ＲＮＡに血清を加えて１分間反応させたサンプルである。レーン８は環状ＲＮＡに血清を加えて６０分間反応させたサンプルである。
【図３】図３は実施例１のＲＮＡ分子のリボザイム活性を示した図である。図３においてＦＩＴＣ標識基質は３０ｎＭであり、実施例１のＲＮＡ分子の０．８μＭ、１．６μＭ、３．２μＭを用いて、３７℃にて１０分間反応を行った。レーン１は基質ＲＮＡのみのサンプルである。レーン２は基質ＲＮＡに実施例１のＲＮＡ分子（３．２μＭ）を加えたサンプルである。レーン３は基質ＲＮＡに実施例１のＲＮＡ分子（１．６μＭ）を加えたサンプルである。レーン４は基質ＲＮＡに実施例１のＲＮＡ分子（０．８μＭ）を加えたサンプルである。レーン５は基質ＲＮＡに実施例１のＲＮＡ分子（３．２μＭ）とＥＤＴＡを加えたサンプルである。
【図４】図４は比較例２のＲＮＡ分子の血清中での安定性を示した図である。図４においてヒト血清は２５％であり、比較例２のＲＮＡ分子は０．２μｇ／レーンである。レーン１は比較例２のＲＮＡ分子のみのサンプルである。レーン２は比較例２のＲＮＡ分子にヒト血清を加えて１分間反応させたサンプルである。レーン３は比較例２のＲＮＡ分子にヒト血清を加えて１０分間反応させたサンプルである。レーン４は比較例２のＲＮＡ分子にヒト血清を加えて３０分間反応させたサンプルである。レーン５は比較例２のＲＮＡ分子にヒト血清を加えて６０分間反応させたサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
本発明のＲＮＡ分子
既に述べたように本発明は、下記の一般式９（配列番号２）に示される塩基配列、あるいはこの配列中において１から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするＲＮＡ分子である。ヌクレアーゼ耐性能を有する本発明のＲＮＡ分子は、該ＲＮＡの２分子以上が凝集した構造を有することができるが、本発明のＲＮＡ分子はそのような構造を有するものに限定されるものではない。
【００４０】
【化９】
0006021018.tif 000010
尚、本明細書において特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵは、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルの各塩基を示し、Ｘ１からＸ１６はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然型のヌクレオチドで形成されたものである。当該ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分解酵素などのヌクレアーゼに対する耐性を備えており、ＲＮＡ分解酵素存在下においても、通常の天然型ＲＮＡのように直ちに分解されるといったことがなく、長時間にわたって安定である。
【００４２】
本明細書において「ヌクレアーゼ耐性能を有する」とは、リボヌクレアーゼによる分解が通常のＲＮＡ分子と比べて遅いことを意味する。具体的には、例えば、常温常圧下２５％ヒト血清水溶中において３０分浸漬した場合にＲＮＡ分子の分解が１０％以下であることを意味する。なおヌクレアーゼ耐性能を有さない通常のＲＮＡ分子は、同じ条件下で９０％以上分解される。
【００４３】
２．ハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有することについて
ハンマーヘッドリボザイムは既に述べたようにハンマーヘッド型のリボザイムであって、そのリボザイム活性により特定のＲＮＡ配列を切断する活性を有する。ハンマーヘッドリボザイムは下記の一般式１０（配列番号３）で示される共通配列を含むことが知られており、本発明のＲＮＡ分子は、その様なハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有することが好ましい。
【００４４】
【化１０】
0006021018.tif 000011
一般式１０において、Ｘ１７からＸ２５はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す。
【００４５】
本発明のＲＮＡ分子のうち配列番号３に示すハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有するものは、ヒトテロメラーゼＲＮＡにハイブリダイズし、その触媒作用によってヒトテロメラーゼＲＮＡを切断分解することができる。よって後に述べるように、ハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有する本発明のＲＮＡ分子はテロメラーゼを分解することができるので、下記において詳しく述べるように抗癌剤として有用な医薬組成物となり得る。下記の実施例１（配列番号７）と実施例２（配列番号８）にて作製したＲＮＡ分子はハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有し、リボザイム活性を示すことが実際に示された。
【００４６】
３．ヒトテロメラーゼのＲＮＡ鋳型領域にハイブリダイズする塩基配列を有することについて
本発明のＲＮＡ分子は、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ鋳型領域にハイブリダイズする塩基配列を有することが好ましい。ヒトおよびマウスからのテロメラーゼのＲＮＡ成分は、単離され、そして配列決定されている（例えば、Ｆｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１２３６−４１（１９９５）；米国特許第５，５８３，０１６号；およびＢｌａｓｃｏら、Ｓｃｉｎｃｅ  ６９：１２６７−１２７０（１９９５）参照）。ヒトテロメラーゼのＲＮＡ鋳型領域をコードするヒトゲノムＤＮＡは、クローン化され、配列決定され、そして寄託されている。具体的には「２８−１」と称されるλクローンは、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ鋳型領域の遺伝子配列を含有する約１５ｋｂの挿入物を含んでいる。当該クローンは、ブダペスト条約に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ７５９２５号を与えられている。図１はヒトテロメラーゼの塩基配列を示した図である。図１に示されるようにヒトＴＥＲＣではヒトテロメラーゼのＲＮＡ鋳型領域の配列は３’−ＵＣＣＣＡＡＵＣ−５’（配列番号１０）であり、これを元にＴＥＲＴはテロメアの３’側へ塩基を付加する。
【００４７】
本発明のＲＮＡ分子は、その有する塩基配列の一部が、図１に示したヒトテロメラーゼＲＮＡ鋳型領域の塩基配列（３’−ＵＣＣＣＡＡＵＣ−５’：配列番号１０）にハイブリダイズするものであれば良い。なお配列番号２において５’末端から２番目から１１番目の塩基配列はＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡ（配列番号１１）であるが、この配列は上記のヒトテロメラーゼＲＮＡ鋳型領域の塩基配列にハイブリダイズする。後に詳細に述べるように、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ鋳型領域の配列にハイブリダイズする塩基配列を有する本発明のＲＮＡ分子は、癌細胞等の検出剤、あるいは、テロメラーゼが発現している癌細胞を標的としたドラッグデリバリーの補助剤として有用である。
【００４８】
本明細書においてハイブリダイズするとは、相補的な塩基配列（ＵならばＡもしくはＧと、ＣならばＧと）の塩基対間で水素結合することであり、他の互いに異なる分子の存在下であっても、標的分子に対し接触および会合し得る能力をいう。ここで相補的な塩基配列と「特異的」に結合するとは、ストリンジェントな条件下で特定のポリヌクレオチドが、それと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることを言う。
【００４９】
ハイブリダイゼーションの条件については当業者が適宜選択をすることができるが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の例として、以下のような条件を挙げることができる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、例えば、６×ＳＳＣ、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬及び５０％フォルムアミドから成る。核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬としては、一例として、０．１Ｍマレイン酸と０．１５Ｍ  塩化ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．５）に市販の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬を１０％になるように溶解したものを使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、４〜７×ＳＳＣ、更に好ましくは５〜６×ＳＳＣの濃度で使用する。
【００５０】
ハイブリダイゼーションの温度は、３５〜６０℃、より好ましくは３５〜５０℃、更に好ましくは３７〜４５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは５〜６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。
【００５１】
本発明のＲＮＡ分子は、５’側末端の配列がＧＧ、Ｇ、ＡまたはＧＧＧであることが好ましい。本発明のＲＮＡ分子のうち、ＧＧ、Ｇ、ＡまたはＧＧＧの配列を備えたものは、当該ＲＮＡ分子を鋳型として二本鎖ＤＮＡを合成した場合、二本鎖ＤＮＡにＧＧ、Ｇ、ＡまたはＧＧＧの配列が組み込まれる。故に、その二本鎖ＤＮＡを用いＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応で本発明のＲＮＡ分子を生成することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応で、容易に、目的のＲＮＡ分子を得ることができる。Ｔ７ポリメラーゼによる酵素反応は、反応生成物であるＲＮＡ分子を高効率で生産できると共に、一般的に広く普及しているＲＮＡの製造手法である。故に、本ＲＮＡ分子を製造する場合には従来の製造技術を利用して行うことができ、製造者は、容易に本ＲＮＡ分子を製造することができる。
【００５２】
更に本発明のＲＮＡ分子を得るために、天然型オリゴヌクレオチドの公知の核酸合成法を適用することもできる。例えば、本技術分野で汎用されている核酸合成法として、例えばホスホロアミダイト法、ＣＥＭ法（特許公開２００８−１７４５２４、ＷＯ２００６／０２２３２３）を適用することができる。
【００５３】
また本発明のＲＮＡ分子は、配列番号２の塩基配列のうち３９以上の塩基を備える直鎖状のＲＮＡ分子であることが好ましい。当該塩基配列が３８塩基以下では、ヌクレアーゼ耐性を保持することが困難となる。下記の比較例２にて３８塩基で構成されるＲＮＡ分子について検討を行ったところ、ヌクレアーゼ耐性能を有していなかった。
【００５４】
本発明において好適なＲＮＡ分子は、下記の一般式１１（配列番号４）に示される塩基配列、あるいはこの配列中において１から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするＲＮＡ分子である。本明細書において「複数個」とは２、３、４、５個などの２以上の整数を意味するものであり、部位特異的変異誘発法により変異をさせることができる程度の数である。また本明細書において塩基の「変異を有する」とは、塩基の欠失、置換、付加による変異を含む意味である。
【００５５】
【化１１】
0006021018.tif 000012
一般式１１においてＸ２、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１０からＸ１５はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す。
【００５６】
配列番号４において５’末端における１２個の塩基配列と３’末端における１６個の塩基配列は保存されており、よってヌクレアーゼ耐性能を有する。また配列番号４の配列においてＸ２がＧである場合には、該配列において５’末端から数えて１２番目から３５番目に相当するハンマーヘッドリボザイムの共通配列（配列番号３）が維持されており、そのリボザイム活性によりテロメラーゼを分解することができる。また配列番号４の配列において５’末端から２番目から１１番目の塩基配列はＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡ（配列番号１１）であるので、この配列は上記のヒトテロメラーゼＲＮＡ鋳型領域の塩基配列とハイブリダイズする。
【００５７】
更に本発明において好適なＲＮＡ分子は、下記の一般式１２（配列番号５）に示される塩基配列、あるいはこの配列中において１から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするＲＮＡ分子である。
【００５８】
【化１２】
0006021018.tif 000013
一般式１２においてＸ２、Ｘ１２、Ｘ１３はそれぞれ独立にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルのうちのいずれかの塩基を表す。
【００５９】
更に本発明において好適なＲＮＡ分子は、下記の一般式１３（配列番号６）に示される塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするＲＮＡ分子である。
【００６０】
【化１３】
0006021018.tif 000014
一般式１３においてＸ２はアデニンまたはグアニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１２はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１３はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。
【００６１】
更に本発明において特に好適なＲＮＡ分子は、下記の式１４（配列番号７）
【００６２】
【化１４】
0006021018.tif 000015
に示される塩基配列有するものである。
【００６３】
更に本発明において特に好適なＲＮＡ分子は、下記の式１５（配列番号８）
【００６４】
【化１５】
0006021018.tif 000016
に示される塩基配列を有するものである。
【００６５】
更に本発明において特に好適なＲＮＡ分子は、下記の式１６（配列番号９）
【００６６】
【化１６】
0006021018.tif 000017
に示される塩基配列を有するものである。これらのＲＮＡ分子については下記の実施例１乃至実施例３において、ヌクレアーゼ耐性を有することが実際に示されている。
【００６７】
ＲＮＡ分解酵素耐性を有するためには、本発明のＲＮＡ分子は、配列番号２で示されるＲＮＡ分子と８０％以上の同一性を備えることが好ましく、８５％以上の同一性を備えることがより好ましく、９０％の同一性を備えることが更に好ましく、９５％の同一性を備えることが更に好ましく、９９％の同一性を備えることが特に好ましい。
【００６８】
２つのヌクレオチド配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７）。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を��告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００６９】
４．本発明のＲＮＡ分子と同一あるいは相補的なＤＮＡ分子について
本発明は、上記した本発明のＲＮＡ分子におけるＲＮＡ配列と同一のまたは相補的な塩基配列を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子も含む。なおここで「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドの間の適合性をいい、第１のポリヌクレオチド中の塩基配列が第２のポリヌクレオチド中の塩基配列の結合パートナーである場合には、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対して相補的である。ここでいう結合パートナーとは具体例には、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）（あるいはチミン（Ｔ））、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の組み合わせである。またここで「同一の塩基配列」とは、ＲＮＡ分子の塩基であるウラシルとＤＮＡの塩基であるチミンの差を包含するものである。
【００７０】
このようなＤＮＡ分子から、上記において述べた本発明のＲＮＡ分子を得ることができる。当該ＤＮＡ分子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡあるいは環状プラスミドＤＮＡのいずれであっても良い。更には上記ＤＮＡ配列の上流にプロモーターの配列を供えたものであっても良い。プロモーター配列としては、上記ＲＮＡ配列を備えたＲＮＡ分子を本ＤＮＡ分子から転写するために設計されたものであれば特に限定されないが、好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列（Ｔ７プロモーター配列）やＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列（ＳＰ６プロモーター配列）が用いられる。
【００７１】
５．本発明のＲＮＡ分子の置換・修飾について
本発明のＲＮＡ分子は、置換又は分子修飾されていてもよく、例えば本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドの糖部位の少なくとも一部がハロゲンあるいはアルコキシ基により置換されているもの、本発明のＲＮＡ分子のリン酸骨格構造の少なくとも一部が、蛍光物質、ポリエチレングリコールのいずれかにて修飾されているもの、または本発明のＲＮＡ分子を構成するいずれかの原子が放射標識されているものでもよい。本発明において糖部位が置換されている態様の例として、ヌクレオチドの糖部位（リボース等）の２’位の水酸基（−ＯＨ）が、フッ素（この場合２’−ｄｅｏｘｙ−２−ｆｌｕｏｒｏ）や−ＯＣＨ３等に置換されているものを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また本発明において該ＲＮＡ分子の５’末端リン酸基、あるいは３’末端のリボース３’部位を修飾するのに使用可能な蛍光物質の例としてはフルオレセイン、テキサスレッド、ＦＩＴＣなどを挙げることができ、ポリエチレングリコールの例としては５万程度の分子量を有するものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。本発明のＲＮＡ分子を放射標識する例として、α位、あるいはγ位のリン酸部分が３２ＰラベルされたＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰもしくはＧＴＰの何れか、もしくはそれらの複数の組み合わせを用いた試験管内転写合成法あるいはキナーゼを用いた５’末端標識による該ＲＮＡ分子への放射標識などを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００７２】
ここで、本発明のＲＮＡ分子はヌクレアーゼに対する耐性を有しているので、生体内から採取した細胞や抽出物からヌクレアーゼを除去する操作（精製操作）を行うことなく、標的分子の存在を検出することができる。具体的には本発明のＲＮＡ分子を蛍光物質や放射活性物質等で修飾または標識すれば、標的分子とハイブリダイズさせることで標的分子の存在を検出するプローブとして利用することができる。
【００７３】
更には、一般に、天然型ヌクレオチド構造のＲＮＡ分子は、非天然型ヌクレオチド構造のものに比べ細胞膜透過性に優れている。このため、蛍光物質や放射活性物質で修飾・標識した本発明のＲＮＡ分子を生体内に導入すれば、本発明のＲＮＡ分子とハイブリダイズすることによって、生体細胞内に存在する標的物質を標識するマーカーとしての使用が可能となる。そのような標識するマーカーとしての使用については下記に詳細に述べる。
【００７４】
ここで、先に述べた非天然型ヌクレオチドとは、例えばリボースの２’位の水酸基がフッ素等に置換されたもの等を指し、この場合ヌクレアーゼによる分解が妨げられるため、生体内での半減期を増長させる効果が期待できる。また、ポリエチレングリコールを付加した場合、生体内での安定性を向上させる効果があり、かつ、ポリエチレングリコールの重合度を変えることで生体内での半減期をコントロールすることが可能である。
【００７５】
６．本発明のＲＮＡ分子のドラッグデリバリー剤、および癌細胞等検出剤としての使用について
本発明のＲＮＡ分子に癌細胞に特異的に認識する化合物あるいは核酸配列やペプチドを付加することや担持させることにより、標的となる癌細胞に医薬を送達することができる。例えば本発明のＲＮＡ分子において、前立腺癌細胞を特異的に認識するＲＮＡアプタマー配列を本発明のＲＮＡ分子の５’側あるいは３’側、あるいは２分子の本発明のＲＮＡ分子の間に配したものを、そのようなドラッグデリバリー補助剤として利用することができる。ドラッグデリバリー補助剤として利用した場合、ヌクレアーゼに対する耐性を備えているので、例えば、静脈投与や患部への注入によって医薬を安定に生体内に導入できる。ドラッグデリバリーの際には、カチオン性脂質、ポリ乳酸担持金コロイドなどのドラッグデリバリー物質との共役的な使用法も含まれる。さらに、蛍光物質で修飾された本発明のＲＮＡ分子または放射標識された本発明のＲＮＡ分子を用いれば、他の癌細胞標的試薬との共同的な使用により癌細胞の検出剤として使用もできる。
【００７６】
尚、本発明のＲＮＡ分子をこのような標的分子の検出に用いる場合や、ドラッグデリバリー補助剤として利用する場合には、リボザイム活性が好ましくない影響をもたらす場合などにおいては必要に応じて、ハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有していないものを選択することができる。
【００７７】
７．本発明のＲＮＡ分子を含む医薬組成物について
更に本発明は、上記において述べた本発明のＲＮＡ分子において配列番号３に示すハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有するものを、有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明のＲＮＡ分子が、ヒトテロメラーゼにハイブリダイズする塩基配列を備えて設計されたものであれば、ハンマーヘッドリボザイム活性によりテロメラーゼを切断分解することが可能である。また、本発明のＲＮＡ分子はＲＮＡ分解酵素耐性を備えているので、細胞内においても触媒として有効に作用する。このために本発明は天然型のＲＮＡ分子を有効成分として含む医薬組成物を提供することができる。従って、そのようなＲＮＡ分子を有効成分として含有する本発明の医薬組成物を、ヒトテロメラーゼの活性によって異常増殖が生じている細胞、例えば癌細胞に対し投与すれば、癌細胞の異常増殖を抑制することができる。
【００７８】
尚、ヒトテロメラーゼは、ヒトのみならず、哺乳動物全般に保存された配列であるので、本発明はヒトのみに適用されるものではなく、哺乳動物全般に適用しえる。
【００７９】
更に、本発明のＲＮＡ分子は、天然型のヌクレオチドで構成されたものであるため、非天然型のヌクレオチドで構成されたものに比べて安全性が高く、細胞膜への浸透性も高いため医薬組成物として用いた場合に、少量で有効な薬理効果を得られやすい。
【００８０】
本発明の医薬組成物は血清中のヌクレアーゼに対して耐性であるので、静脈注射により投与することが可能であるという利点を有するが、それに限定されるものではなく、投与経路としては、静脈注射、経口投与、経皮投与、直腸内投与、経眼投与、膀胱内投与など、いずれの投与経路を採用することもできる。本発明のＲＮＡ分子の投与量は該ＲＮＡ分子の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、通常は血中濃度が０．００１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは０．０１μＭ〜１００μＭ、更に好ましくは０．１μＭ〜１０μＭである。
【００８１】
剤型としては、注射剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤等の種々の剤型が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、特に好ましい剤型は注射剤である。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のＲＮＡ分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００８２】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００８３】
これらの製剤は、本発明のＲＮＡ分子を０．０１％〜１００重量％、好ましくは０．１％〜９５重量％、更に好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００８４】
また本発明は、本発明のＲＮＡ分子を有効成分として含む医薬組成物を投与することにより癌を治療する方法を包含する。更に本発明は、本発明のＲＮＡ分子を有効成分として含む医薬組成物を癌の治療のために使用する方法をも包含する。
【００８５】
その他、本発明は、趣旨を逸脱しない範囲で当業者の知識に基づき種々の改良、修正、変更を加えた形態で実施できるものである。
【実施例】
【００８６】
＜実施例１＞【００８７】
下記の式１７（配列番号７）のＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ配列とその上流にＴ７プロモーター配列をもつ二本鎖ＤＮＡを用い、ランオフ転写法によって該ＲＮＡ分子を作製し、ゲル電気泳動により該ＲＮＡ分子を純化した。純化した該ＲＮＡ分子はヒト血清を含む生理食塩水（ＰＢＳ）中で３７℃で一定時間静置した後、７Ｍウレア入りアクリルアミド電気泳動を行い、エチジウムブロミド染色を行うことで血清による該ＲＮＡ分子の分解耐性能評価を行った。結果を図２に示す。【００８８】
【化１７】
0006021018.tif 000018
図２は、第１実施例で作製したＲＮＡ分子のヒト血清中での分解耐性能の結果を示した図である。【００８９】
まず、Ｔ７プロモーター下流に該ＲＮＡ配列をコードするプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるランオフ転写によって該ＲＮＡ配列を含む転写反応液を得た。次に、転写反応液中から該ＲＮＡを精製するため、１６％変性アクリルアミドゲル電気泳動を行い、該ＲＮＡのみを切り出すことで該ＲＮＡ分子を純化した。また、環状ＲＮＡに関しては、非特許論文１に記載の手法に従い調製した。該ＲＮＡ分子または環状ＲＮＡを０．２μｇ用意し、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）中において、ヒト血清（Ｃａｍｂｒｅｘ社）を２５％含む条件下で、３７℃で浸漬した。図２内に示される反応時間後にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液と混合し、ボルテックスによる混合後、液体窒素を用いて反応液を氷結させることで該ＲＮＡ分子および環状ＲＮＡのヌクレアーゼ分解反応を停止させた。分解反応停止後、遠心処理して水層のみを回収し、エタノール沈殿による該ＲＮＡ分子及び環状ＲＮＡを濃縮した。分解耐性能評価のため、先に濃縮したＲＮＡを１６％変性アクリルアミドゲル電気泳動を行い、フルオロイメージアナライザーＦＬＡ−９００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）により、各反応時間後の該ＲＮＡ分子の残存率を定量することで分解耐性能評価を行った。【００９０】
図２においてレーン２からレーン５は実施例１で作製したＲＮＡ分子（配列番号７）の実験系における結果である。一方図２においてレーン６からレーン８は比較例１で作製したＲＮＡ分子（配列番号１２）の実験系における結果である。図２のレーン２からレーン５に示されるように、本ＲＮＡ分子は、ヒト血清中において少なくとも１時間は分解されること無く安定に存在していることが示された。
＜実施例２＞【００９１】
下記の式１８（配列番号８）に示すＲＮＡ分子を実施例１と同様のランオフ転写方法で作製し、ゲル電気泳動法により純化した。該ＲＮＡ分子は、ヒトテロメラーゼに対してハイブリダイズする配列を備えると共に、配列番号７に示すＲＮＡ分子と２つの塩基配列が異なったものである。このＲＮＡ分子に対し実施例１と同様の分解耐性能評価を行った。この結果により、本ＲＮＡ分子は、ヒト血清中において少なくとも１時間は分解されないことが示された。【００９２】
【化１８】
0006021018.tif 000019
＜実施例３＞【００９３】
本実施例では、下記の式１９（配列番号９）に示すＲＮＡ分子を実施例１と同様のランオフ転写方法で作製した。該ＲＮＡ分子は、ヒトテロメラーゼに対してハイブリダイズする配列を備えると共に、配列番号７に示すＲＮＡ分子と１つの塩基配列が異なったものである。このＲＮＡ分子に対し実施例１と同様の分解耐性能評価を行ったところ、該ＲＮＡ分子は、ヒト血清中において少なくとも１時間は分解されること無く安定に存在した。【００９４】
【化１９】
0006021018.tif 000020
＜実施例４＞【００９５】
実施例１にて作製したＲＮＡ分子（配列番号７）（０．８−３．２μＭ）と該ＲＮＡ分子の基質とする５’末端をＦＩＴＣ標識したテロメラーゼＲＮＡ配列（鋳型領域のみ）を混合し、リボザイム反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、該テロメラーゼＲＮＡ  ２０ｎＭ）中で、３７℃で１０分反応させた後、１６％変性アクリルアミドゲル電気泳動を行い、該基質ＲＮＡ（該テロメラーゼＲＮＡ）の切断率をフルオロイメージアナライザーＦＬＡ−９００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）によって定量した。配列番号７に示すＲＮＡ分子は、ハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有するものである。【００９６】
図３は、実施例１にて作製したＲＮＡ分子のリボザイム活性評価を示した図である。図３においてレーン１は基質ＲＮＡ（３０ｎＭ）のみ、レーン２は基質ＲＮＡ＋実施例１にて作製したＲＮＡ分子（３．２μＭ）、レーン３は基質ＲＮＡ＋実施例１にて作製したＲＮＡ分子（１．６μＭ）、レーン４は基質ＲＮＡ＋実施例１にて作製したＲＮＡ分子（０．８μＭ）、レーン５は基質ＲＮＡ＋実施例１にて作製したＲＮＡ分子（３．２μＭ）＋ＥＤＴＡの実験系である。図３からも分るように実施例１で作製したＲＮＡ分子により基質ＲＮＡは分解され、リボザイム活性が認められた。
＜実施例５＞【００９７】
実施例２および３で作製したＲＮＡ分子について、実施例４と同様のリボザイム活性評価を行った。ハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有する実施例２のＲＮＡ分子はリボザイム活性を有し、ハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有していない実施例３のＲＮＡ分子はリボザイム活性を備えないことが示された。
＜比較例１＞【００９８】
下記式２０（配列番号１２）で示される環状ＲＮＡ分子を作製し、実施例１と同様の条件にてＲＮＡ分子の分解耐性能評価を行った。図２のレーン７と８に示されるように、比較例１のＲＮＡ分子はヒト血清中において１分以内に完全に分解した。【００９９】
【化２０】
0006021018.tif 000021
＜比較例２＞【０１００】
下記式２１（配列番号１３）で示されるＲＮＡ分子を実施例１と同様に作成し、実施例１と同様の条件にてＲＮＡ分子の分解耐性能評価を行った。比較例２のＲＮＡ分子は、３８塩基で構成されている。結果を図４に示す。図４は、比較例２のＲＮＡ分子のヒト血清中での分解耐性能の結果を示した図である。図４に示すように、ヒト血清中において比較例２のＲＮＡ分子は１分以内に分解した。【０１０１】
【化２１】
0006021018.tif 000022
［配列表］
0006021018.tif 000023
0006021018.tif 000024
0006021018.tif 000025
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【図１】
0006021018.tif 000029
【図２】
0006021018.tif 000030
【図３】
0006021018.tif 000031
【図４】
0006021018.tif 000032