(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主鎖と側鎖とを有するリンカーであって、
前記主鎖は、
固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位と；
前記固相結合部を挟むように位置し、ＤＮＡ修復酵素で切断される損傷ＤＮＡを含む、前記リンカー上で固相合成されたｃＤＮＡを前記固相から前記リンカーごと前記ＤＮＡ修復酵素で切り離すための２以上の切断部位と；
前記リンカーの５’末端側に位置し、ＲＮＡリガーゼが認識し得るｍＲＮＡ連結部位と；
前記リンカーの３’末端側近傍に位置する側鎖連結部位と；
前記リンカーの３’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域と、
を備え、
前記側鎖は、前記側鎖連結部位に連結され、
前記固相結合部位及び前記切断部位は一本鎖ＤＮＡで構成されており、
前記ＤＮＡ修復酵素は、エンドヌクレアーゼＶ、Endo III、Endo IV、Endo VIII、Fpg、hAAG、hNEIL 1、hOGG1、T4 PDG、APE1、Tma Endo III、Tth Endo IVからなる群から選ばれるいずれかの酵素であり、
前記損傷ＤＮＡは、デオキシイノシン、アプリン酸、アピリミジン酸、酸化ピリミジン、酸化プリン、アルキル化プリン、デオキシウリジン、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−ホルミルウラシル、ピリミジンダイマー、ジヒドロチミン、６−メチルアデニン、８−オキソグアニン、及びデオキシウラシルからなる群から選ばれる塩基である、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【請求項２】
前記ＤＮＡ修復酵素は、一本鎖ＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ作用を有する酵素であることを特徴とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【請求項３】
前記所定の分子はビオチン又はその類縁体であり、
前記固相結合部位は、少なくとも１〜１０塩基で構成され、
前記切断部位は、損傷ＤＮＡを含む配列で構成され、
前記ｍＲＮＡ連結部位は、少なくとも１〜１０塩基で構成され、
前記側鎖連結部位は、前記プライマー領域の５’側に隣接する位置にある、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【請求項４】
前記損傷ＤＮＡは、下記式（Ｉ）で表されるデオキシイノシンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【化１】
0005858415.tif 000012
【請求項５】
前記ＤＮＡ修復酵素がエンドヌクレアーゼＶである、ことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【請求項６】
前記側鎖は、その３’末端に主鎖と相補的なｍＲＮＡから合成されたタンパク質を連結するためのタンパク質連結部位を有し、その５’末端で前記リンカーの主鎖と連結されている、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【請求項７】
前記側鎖は、前記タンパク質連結部位と前記側鎖連結部位との間に、スペーサーと蛍光基とを有することを特徴とする、請求項６に記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体作製用リンカーと、前記リンカーの主鎖と相補的な配列を有するｍＲＮＡを前記ｍＲＮＡ連結部位でＴ４  ＲＮＡリガーゼによって結合させる、ｍＲＮＡ−リンカー連結体生成工程と；
前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成し、前記合成されたタンパク質が、前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体中の前記タンパク質連結部位に連結する、ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体生成工程と；
前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を、前記固相結合部位を介して固相に結合させる固相結合工程と；
前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第１の緩衝液にて洗浄する、第１洗浄工程と；
前記主鎖の３’末端を反応開始点とし、前記ｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応を行ってｃＤＮＡ鎖を合成し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を得る工程と；
前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第２の緩衝液にて洗浄する第２洗浄工程と；
前記主鎖の切断部位を、前記所定のＤＮＡ修復酵素で切断する工程と；を備える、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は進化工学的ディスプレイ技術の中で、mRNA（メッセンジャーRNA）／cDNA−リンカー−タンパク質連結体を合成するのに必要なヌクレオチド合成用DNAリンカーと、前記連結体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
進化工学では、ランダムな配列を有する膨大な数のペプチド又はタンパク質のライブラリの中から、特定の分子に特異的に結合するペプチド等を選択するため、種々の技術が用いられる。こうした技術の中でも、「遺伝子型−表現型対応付け技術」の一種であるディスプレイ技術は重要であり、現在、ファージディスプレイ法が最も広く用いられている。
前記ディスプレイ技術は、「機能のあるペプチド分子を選択し、それに対応する遺伝子（DNA、RNA）をこれらの分子に連結させ、それらの配列をPCRによって増幅した後、シーケンシングによって読み取る」という技術である。
【０００３】
現在、最も広く用いられているディスプレイ技術はファージディスプレイ法である。しかしながら、この方法では、ライブラリサイズが108程度に限られ、宿主細胞に毒性のあるペプチドを取得できなかった。このため、1012程度のライブラリサイズのライブラリを用いることができる、無細胞翻訳系を用いたディスプレイ技術が検討され、リボゾームディスプレイ法とmRNAディスプレイ法とが開発された。その後、さらに改良が進められ、cDNAディスプレイ法が開発された。
【０００４】
上述したcDNAディスプレイ法では、リンカー（分子間連結のための分子）を使用する。そして、ここで使用するリンカーは、遺伝子をコードするmRNAと連結するmRNA連結部位と、このmRNAから合成されたタンパク質を連結するタンパク質連結部位とを有しており、タンパク質連結部位として、ピューロマイシン（Puromycin）等のアミノアシルtRNAアナログが用いられている。
【０００５】
cDNAディスプレイ法は、cDNAを用いて、一般的に、以下のような工程で進められる。まず、DNAライブラリを作製し、このDNAライブラリからmRNAへの転写と、そのリンカーへの連結とを行う。次に、連結されたmRNAを翻訳してタンパク質を生成し、生成されたタンパク質をリンカーに連結させ、リンカーを介してその連結体を固相に結合させる。その後、逆転写を行い、cDNAを合成した後に、リンカー部分で固相から切り離し、精製してスクリーニングを行う。そして、得られたcDNAを増幅させて変異を導入した後にライブラリを作製し、プロモーター配列を連結するという一連の工程を１サイクルとして、複数回繰り返す。こうした作業を効率的なものとするために、予めリンカーを固相に固定しておき、RNase T1を用いて固相からの切り離しを行うという方法が提案されている（特許文献１参照、以下、「従来技術１」という。）。
【０００６】
また、通常、リンカーには、cDNA合成の終了後にヌクレアーゼを用いて固相から切り離せるようにするために、ヌクレアーゼ切断部位が導入されている。具体的には、DNAを主体とするリンカーに１個のRNAを組み込み、この塩基を認識するRNA特異的な切断酵素を用いるという方法が提案されている。（特許文献２参照、以下、「従来技術２」という）。
固相からcDNAを分離する方法としては、また、デオキシウリジンとDNAグリコシラーゼとを利用する方法も提案されている（特許文献３参照、以下、「従来技術３」という。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO07/046520
【特許文献２】国際公開WO06/041194
【特許文献３】国際公開WO00/058329
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術１は、RNase T1が用いられており、効率的に固相とリンカーとを切り離すことができるという点では、優れた技術である。しかし、RNase T1を使用した場合、RNase T1が系から十分に除去されていないと、その後の工程でmRNAが分解されるおそれがあるというデメリットがあった。
【０００９】
従来技術３は、DNAグリコシラーゼの作用点がデオキシウリジン１塩基であるため、mRNAが分解されるおそれもなく、特定塩基配列も必要としないため、上記のような問題点はない。しかし、反応溶液のｐＨが高く、高温で処理する必要があるため、タンパク質の変性等の問題があり、cDNAディスプレイ法には不向きであるという問題点があった。
以上から、cDNAディスプレイ法に適合するリンカーであって、固相からリンカーを切り離す際に、mRNAを分解するおそれのある酵素を必要とせず、低廉な製造コストで製造が可能なリンカーであって、その合成効率が高く、また、ライゲーション効率も高いリンカーに対する高い社会的要請があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以上のような状況の下で完成されたものである。
具体的には、本発明の第１の態様は、主鎖と側鎖とを有するリンカーであって、
前記主鎖は、固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位と；前記固相結合部を挟むように位置し、DNA修復酵素で切断される損傷DNAを含む、前記リンカー上で固相合成されたcDNAを前記固相から切り離すための２以上の切断部位と；前記リンカーの５’末端側に位置し、RNAリガーゼが認識し得るmRNA連結部位と；前記リンカーの３’末端側近傍に位置する側鎖連結部位と；前記リンカーの３’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域と、を備え、前記側鎖は、前記側鎖連結部位に連結される、mRNA／cDNA−タンパク質連結体作製用リンカーである。
【００１１】
ここで、前記固相結合部位はビオチン又はその類縁体を所定の分子として有し、かつ少なくとも１〜10塩基で構成されており、前記切断部位は、損傷DNAを含み、かつ少なくとも1〜10塩基で構成されていることが好ましい。また、前記mRNA連結部位は、少なくとも１〜10塩基で構成され、前記側鎖連結部位は、前記プライマー領域の５’側に隣接する位置にあることが好ましい。
前記DNA修復酵素はエンドヌクレアーゼ作用を有する酵素であることが好ましく、エンドヌクレアーゼＶ、Endo III、Endo IV、Endo VIII、Fpg、hAAG、hNEIL 1、hOGG1、T4 PDG、APE1、Tma Endo III、Tth Endo IVからなる群から選ばれるいずれかの酵素であることがさらに好ましい
さらに、前記DNA修復酵素は、エンドヌクレアーゼＶ（以下、「Endo V」ということがある。）、Endo III、Endo VIII、Fpg、hNEIL 1、hOGG1、APE1、Tma Endo IIIからなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。
【００１２】
前記損傷DNAは、デオキシイノシン、アプリン酸、アピリミジン酸、酸化ピリミジン、酸化プリン、アルキル化プリン、デオキシウリジン、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−ホルミルウラシル、ピリミジンダイマー、ジヒドロチミン、６−メチルアデニン、８−オキソグアニン、及びデオキシウラシルからなる群から選ばれる塩基であることが好ましい。
前記損傷DNAは、デオキシイノシン、アプリン酸及びアピリミジン酸からなる群から選ばれる塩基であることがさらに好ましい。
【００１３】
前記ＤＮＡ修復酵素がエンドヌクレアーゼＶであり、前記損傷DNAが下記式（Ｉ）で表されるデオキシイノシンもしくは、前記ＤＮＡ修復酵素がEndo VIIIであり、前記損傷DNAが下記式(II)で表されるアプリン酸、アピリミジン酸であることがさらに好ましい。
前記ＤＮＡ修復酵素がエンドヌクレアーゼＶであり、前記損傷DNAが下記式（Ｉ）で表されるデオキシイノシンであることがさらに好ましい。
【００１４】
【化１】
0005858415.tif 000002
【００１５】
【化２】
0005858415.tif 000003
【００１６】
前記側鎖は、その３’末端に主鎖と相補的なmRNAから合成されたタンパク質を連結するためのタンパク質連結部位を有し、その５’末端で前記リンカーの主鎖と連結されている。ここで、前記側鎖は、前記タンパク質連結部位と前記側鎖連結部位との間に、スペーサーと蛍光基とを有することが好ましい。
【００１７】
本発明の第２の態様は、上述したmRNA/cDNA-タンパク質連結体作製用リンカーと、前記リンカーの主鎖と相補的な配列を有するmRNAを前記mRNA連結部位でT4 RNAリガーゼによって連結させる、mRNA-リンカー連結体生成工程と；前記mRNAからタンパク質を固相合成し、前記固相合成されたタンパク質が、前記mRNA−リンカー連結体中の前記タンパク質連結部位に連結する、mRNA−リンカー−タンパク質連結体生成工程と；前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体を、前記固相結合部位を介して固相に結合させる固相結合工程と；前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第１の緩衝液にて洗浄する、第１洗浄工程と；前記主鎖の３’末端を反応開始点とし、前記mRNAを鋳型として、逆転写反応を行ってcDNA鎖を合成し、mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体を得る工程と；前記mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第２の緩衝液にて洗浄する第２洗浄工程と；前記主鎖の切断部位を、前記所定のDNA修復酵素で切断する工程と；を備える、mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体の生成方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体を効率的に生成することができる。また、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体を固相から切り離す際に、RNA分解酵素を使用する必要がないリンカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、リンカーの構造を表す図である。
【図２】図２は、mRNAとリンカーの連結時の構造を表す図である。
【図３】図３は、ビオチンループの塩基配列を示す図である。
【図４】図４は、一本鎖DNAオリゴマーのEndo V処理物を表す電気泳動像である。左側の数字は塩基長を表し、以下の図で同様とする。
【図５】図５は、デオキシイノシンサイトを有しない化合物のEndo V処理物を表す電気泳動像である。
【図６】図６は、一本鎖DNAオリゴマーのRNase T1処理物を表す電気泳動像である。
【００２０】
【図７】図７は、ライゲーション反応の模式図である。
【図８】図８は、ライゲーション反応産物の電気泳動像である。
【図９】図９は、mRNAのEndo V処理物及びRNase T1処理物の電気泳動像である。
【図１０】図１０は、逆転写反応とEndo V処理の模式図である。
【図１１】図１１は、逆転写反応産物とEndo V処理物の電気泳動像である。
【図１２】図１２は、翻訳反応の模式図である。
【図１３】図１３は、mRNA−リンカー−タンパク質連結体の電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明を、図１及び２を参照しつつ、さらに詳細に説明する。
図１に示すように、本発明の第１の態様であるmRNA/cDNA-タンパク質連結体作製用リンカーは、（ａ）固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位（BB）と；（ｂ）前記固相結合部位を挟むように位置し、DNA修復酵素で切断される損傷DNAを含む、前記固相から切り離すための２以上の切断部位（C1及びC2）と；（ｃ）前記リンカーの５’末端側に位置し、RNAリガーゼが認識し得るmRNA連結部位（MB）と；（ｄ）前記リンカーの３’末端側近傍に位置する側鎖連結部位（SB）と；（ｅ）前記リンカーの３’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域（PR）と、を備える主鎖と；（ｆ）前記側鎖連結部位（SB）に連結される側鎖とを有する。
【００２２】
ここで、本明細書において、「リンカー」とは、cDNAディスプレイ法において用いられる、mRNA−リンカー連結体、mRNA−リンカー−タンパク質連結体、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体（以下、この連結体を「IVV」ということがある）、及びcDNA−リンカー−タンパク質連結体からなる群から選ばれるいずれかの連結体を生成する際に使用するリンカーのことをいう。
前記リンカーは、主としてDNAで構成されるが、デオキシイノシン、ビオチン修飾デオキシチミン、Fluorescein修飾デオキシチミン等のDNAアナログを含むことができる。また、本発明において使用するリンカーは、全体として、柔軟性と親水性とを有するように、設計することが好ましい。
【００２３】
また、「固相合成」とは、ビーズ、反応容器の側壁、底面その他の固相表面に、本願発明のリンカーを直接的又は間接的に固定して行う合成反応をいう。
また、本明細書中において、「所定のmRNA」には、遺伝子をコードする配列、又は連結体形成、翻訳反応促進に必要な配列、あるいはその他の配列等を有するmRNAが含まれるものとする。
【００２４】
前記（ａ）中で使用する所定の分子としては、例えば、固相にアビジン及びストレプトアビジン等が結合されている場合にはビオチン、マルトース結合タンパク質が結合されている場合にはマルトース、Ｇタンパク質が結合されている場合にはグアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチドが結合されている場合にはNi又はCo等の金属、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが結合されている場合にはグルタチオン、配列特異的なDNA又はRNA結合タンパク質が結合されている場合にはこれらに特異的な配列を有するDNA又はRNA、抗体又はアプタマーが結合されている場合には抗原又はエピトープペプチド、カルモジュリンが結合されている場合にはカルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質が結合されている場合にはATP、エストラジオール受容体タンパク質が結合されている場合にはエストラジオール等を挙げることができる。
これらの中でも、ビオチン、マルトース、Ni又はCo等の金属、グルタチオン、抗原分子又はエピトープペプチド等を使用することが好ましく、リンカー合成の容易さの面から、ビオチンを使用することが、さらに好ましい。
【００２５】
また、前記固相結合部位（BB）は、少なくとも１〜10塩基で構成されることが好ましい。
こうした固相結合部位（BB）は、上述したmRNA−リンカー−タンパク質連結体等の連結体を、リンカーを介して固相に結合させるための部位である。具体的には、下記式（III）で示されるビオチン修飾デオキシチミジン（ｄＴ）であることが好ましい。
【００２６】
【化３】
0005858415.tif 000004
【００２７】
また、上記の特定のポリペプチド等の固相結合部位への導入は、タンニン酸、ホルマリン、グルタールアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート等を利用する方法によっても行うことができるが、ＩＶＶの変性を避けるために分子間の親和性のみを利用して行うことが好ましい。
前記（ｂ）中の切断部位（C1及びC2）は、前記固相結合部位（BB）を挟むように位置しており、かつエンドヌクレアーゼで切断される損傷DNAを含むものであることが好ましい。ここでいう「損傷DNA」には、アプリン酸、アピリミジン酸、酸化ピリミジン、酸化プリン、アルキル化プリン、デオキシイノシン、デオキシウリジン、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−ホルミルウラシル、ピリミジンダイマー、ジヒドロチミン、６−メチルアデニン、８−オキソグアニン、デオキシウラシル等が含まれるものとする。また、後述するエンドヌクレアーゼで認識される部位と、切断部位とは隣接していてもよいが、隣接していない場合があることは言うまでもない。
【００２８】
具体的には、損傷DNAを含む１本鎖もしくは2本鎖で構成されるものであることが好ましく、１〜10塩基で構成されるものであることが、リンカーの長さが長くならず、製造コストが低廉になることからさらに好ましい。
こうしたエンドヌクレアーゼ作用を有するDNA修復酵素としては、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hAAG、hNEIL 1、hOGG1、T4 PDG、APE1、Tma Endo III、Tth Endo IV等を挙げることができ、Endo V又はEndo VIIIを使用することが、特定の損傷DNAと組み合わせた時に反応効率が高いことから好ましい。
【００２９】
例えば、Endo Vは、下記式（Ｉ）で表されるデオキシイノシン（dI）を特異的に認識し、dIの下流側に隣接する２つのデオキシリボヌクレオチド（下流側の１塩基目と２塩基目）との間を切断するが、リボヌクレオチドの結合は切断しない。このため、Endo Vを利用すると、RNase T1等を使用した場合のように、リンカーに結合されたmRNAが切断されるという問題は生じないため、cDNAディスプレイ法で安定してmRNAを扱うことが可能となる。
【００３０】
【化４】
0005858415.tif 000005
【００３１】
なお、上記のEndo Vとしては、E.coli BW434株(nth-, xrth-)由来のEndo V（単体223アミノ酸、24.9kDa）を使用することが好ましく、MBP融合タンパク質としてE.coliの形質転換株で生産されるEndo V（NEB社製、M0305S）を使用することが入手容易であることからさらに好ましい。
【００３２】
前記（ｃ）の前記mRNA連結部位は、少なくとも１〜10塩基で構成されるものであることが好ましい。前記mRNA連結領域（MB）は、あらかじめリン酸化されている必要はないが、所定のmRNAと連結されるためには、前記mRNAの3'末端とのライゲーション反応に先だって、又はライゲーション反応中に、キナーゼ等によりリン酸化される必要がある。
【００３３】
前記（ｄ）の前記リンカーの３’末端側近傍に位置する側鎖連結部位（SB）は、後述する側鎖が連結する部位である。
また、例えば、リンカーの側鎖連結部位（SB）が、下記式（IV）で表わされるAmino-Modifier C6 dTで構成されている場合には、前記側鎖の5'末端を下記式（V）の5'-Thiol-Modifier C6として、下記式（VI）で表わされるEMCSを用いて架橋させ、主鎖と側鎖とを連結させることができる。なお、下記の式では保護基がついた状態を示している。
【００３４】
【化５】
0005858415.tif 000006
【００３５】
【化６】
0005858415.tif 000007
【００３６】
【化７】
0005858415.tif 000008
【００３７】
前記（ｅ）のプライマー領域（PR）は、前記リンカーの３’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能する領域であり、前記側鎖連結領域の３’側に隣接している。
ここで、プライマー領域（PR）は、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能する領域である。この領域は、約1〜15塩基からなることが好ましく、特に３〜５塩基からなることが好ましい。15塩基を越えると、リンカーとしての結合効率が悪くなるため、リンカーとの結合効率及びプライマーとしての反応効率という面から、上記の塩基数とすることが好ましい。
また、前記（ｆ）の前記側鎖連結部位（SB）に連結する側鎖は、主鎖と相補的なmRNAから合成されたタンパク質を連結するタンパク質連結部位（Ｐ）と前記側鎖連結部位との間に、スペーサーと蛍光基（Ｆ）とを有するものである。
【００３８】
ここで、前記側鎖のタンパク質連結部位としては、ヌクレオチド配列の３'末端とアミノ酸がアミド結合を形成しているピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン（rCpPur）、デオキシジルピューロマイシン（dCpPur）、デオキシウリジルピューロマイシン（dUpPur）等のピューロマイシン類縁体の他、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（PANS-アミノ酸）、3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（AANS-アミノ酸）等を挙げることができる。
PANS-アミノ酸としては、例えば、PANS-Gly、PANS-Val、PANS-Ala等を挙げることができ、AANS-アミノ酸としては、AANS-Gly、AANS-Val、AANS-Ala等を挙げることができる。また、ヌクレオシドとアミノ酸とがエステル結合したものなども使用することができるが、ピューロマイシンを使用することが、前記タンパク質連結部位におけるタンパク質の連結の安定性が高いことから特に好ましい。
また、スペーサーとしては、下記式（VII）で表わされるSpacer 18 Phosphoramidite等の分子を、柔軟性があり、立体障害性が低いことから好適に使用することができる。
【００３９】
【化８】
0005858415.tif 000009
【００４０】
前記側鎖が短い場合には、ピューロマイシン類縁体がリボソームに取り込まれるときに立体障害が発生するため、前記側鎖は上記のようなPhosphoramidite分子が１〜８個程度連なった構造を有するものであることが好ましい。リンカーの合成効率及び上述した各連結体の形成効率とのバランスの点から、こうしたPhosphoramidite分子が４個程度連なった構造を有するものであることがさらに好ましい。
【００４１】
前記側鎖が、前記タンパク質連結部位と、前記側鎖連結部位との間に蛍光基を有することで、後述するcDNAディスプレイ法の各工程において、リンカーの有無を容易に検出することが可能となる。
蛍光基としては、例えば、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホロアミダイドに変換可能な水酸基、又はアミノ基等のフリーの官能基を有し、標識された塩基としてリンカーに連結することができる蛍光化合物を使用することが好ましい。このような蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Fluorescein-dT等を挙げることができる。これらの中でも、分子標識用の化合物として使用されるFluorescein-dTを使用することが、合成が容易であることから好ましい。以下に、Fluorescein-dTの構造式（VIII）を示す。
【００４２】
【化９】
0005858415.tif 000010
【００４３】
以下に、本発明のリンカーの製造方法について説明する。
まず、所望の配列となるように、常法に従ってDNAを合成し、主鎖として使用するための一本鎖のオリゴマーを作製する。このように合成した一本鎖オリゴマーは、上述したように、固相結合部位と、２以上の切断部位と、mRNA連結部位と、側鎖連結部位と、プライマー領域とを備えている。２以上の切断部位の大きさ及び主鎖中の位置によって、主鎖となる一本鎖オリゴマーの長さを適宜決定する。
次いで、所望の長さの側鎖を合成し、主鎖上の側鎖連結部位に連結させる。側鎖の遊離末端に、例えば、ピューロマイシンを導入し、上述したFluorescein-dTを蛍光標識部位に導入して、本発明のmRNA/cDNA-タンパク質連結体作製用リンカーを得ることができる。
【００４４】
主鎖の設計に際しては、各種のmRNAのコード配列を参考にすることができる。こうしたmRNAとしては、例えば、配列が知られている各種のレセプタータンパク質をコードするmRNA、各種抗体又はその断片をコードするmRNA、各種酵素をコードするmRNA、各種遺伝子ライブラリ中のDNAから転写される配列未知のmRNA、有機合成によってランダムに合成された配列を有するDNAから転写されたランダムな配列を有するmRNA、PCR法を利用したランダム変異の挿入により配列未知のタンパク質をコードするようになったDNAから転写されるmRNAその他のmRNA等を挙げることができ、終始コドンを含まないものであれば、これらの中から選択することができる。
【００４５】
終止コドンを含まない配列であれば、mRNAのコード配列から翻訳されて生成されたポリペプチド鎖のＣ末端に、ピューロマイシンやその類縁体といったアミノアシルtRNAの3'末端アナログが取り込まれ、前記ポリペプチド鎖とmRNA−リンカー連結体とが連結されることになる。こうしたmRNAは、in vitro転写反応、化学合成、生体・細胞・微生物からの抽出その他の各種の方法を用いて得ることができる。リンカーとの連結及び無細胞翻訳の反応効率の点から、in vitro転写反応を用いて作製することが好ましい。
【００４６】
また、5'末端の７−メチル化グアノシンキャップ構造、又は3'末端のポリＡ尾部構造の少なくとも一方の構造を有するものであることが、タンパク質の合成効率の点から好ましい。Kozak配列や、Shine-Dalgarno配列を有することが、翻訳の開始を促進することから、さらに好ましい。
ここで使用するmRNAの長さは、原則として本発明を利用して分子進化させるべきタンパク質又はポリペプチドの長さより規定されるコード領域の長さに依存する。50〜1,000塩基長であることが、反応効率の面からであることが好ましく、200〜500塩基であることが、最も高い反応効率を得られることから、さらに好ましい。
【００４７】
本発明の第２の態様であるmRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体の生成方法は、（Ｓ１）上述したmRNA/cDNA-タンパク質連結体作製用リンカーと、前記リンカーの主鎖と相補的な配列を有するmRNAをmRNA連結部位でT4 RNA リガーゼによって連結させる、mRNA-リンカー連結体生成工程と；（Ｓ２）前記mRNAからタンパク質を合成し、前記合成されたタンパク質が、前記mRNA−リンカー連結体中の前記タンパク質連結部位に連結する、mRNA−リンカー−タンパク質連結体生成工程と；
【００４８】
（Ｓ３）前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体を、前記固相結合部位を介して固相に結合させる固相結合工程と；（Ｓ４）前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第１の緩衝液にて洗浄する、第１洗浄工程と；（Ｓ５）前記主鎖の３’末端を反応開始点とし、前記mRNAを鋳型として、逆転写反応を行ってcDNA鎖を合成し、mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体を得る工程と；（Ｓ６）前記mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第２の緩衝液にて洗浄する第２洗浄工程と；（Ｓ７）前記主鎖の切断部位を、前記所定のエンドヌクレアーゼで切断する工程と；を備えている。
【００４９】
ここで、（Ｓ１）工程では、mRNAと上記リンカーとがライゲーションによって連結される。この工程では、リガーゼを用いたライゲーションに先立って、アニーリングを行い、その後ライゲーションを行う。RNA／DNA間ライゲーションを行うRNAリガーゼのほか、RNA間及びRNA／DNA間のライゲーションを行うDNAリガーゼを利用することもできる。例えば、ATP依存性DNAリガーゼ（EC6.5.1.1）、NAD+依存性DNAリガーゼ（EC6.5.1.2）、RNAリガーゼ（EC6.5.1.3）、T4 RNAリガーゼ、TS2126耐熱性ファージ由来DNAリガーゼ等を挙げることができる。
こうしたリガーゼのうち、T4 RNAリガーゼ又はTS2126耐熱性ファージ由来DNAリガーゼを使用することが好ましく、T4 RNAリガーゼを利用することが、連結効率の点からさらに好ましい。
【００５０】
ライゲーション反応を行う反応系の体積は、4〜100μＬであることが好ましく、反応効率の点から20〜40μＬとすることがさらに好ましい。20〜25μＬとすることが、最も反応効率が高いことからさらに好ましい。
この反応系中でのRNA：リンカーとの比は、モル比で３：１〜１：６の範囲とすることができるが、ほぼ１：（１〜６）、具体的には、5〜100pmolのリンカーに対し、5〜100pmolのmRNAとすることが好ましい。反応効率を上げ、残余を最少化するために、１：（１〜２）とすることがさらに好ましい。この場合には、10pmolのmRNAに対し、10〜20pmolのリンカーを反応させることになる。
【００５１】
ライゲーション反応に先立つアニーリングは、以下のように行う。まず、ヒートブロック、アルミブロック、ウォーターバスその他の加温用器具を用いて、約60〜100℃にて約２〜約60分間、試料溶液を温めた後、室温で約２〜約60分間放置し、液温を穏やかに低下させる。その後、さらに、約−５℃〜約10℃まで冷却する。具体的には、例えば、90℃で５分間アルミブロック上にて試料溶液を温め、次に、70℃のアルミブロック上に移して５分間置き、その後上記mRNAと上記リンカーとのライゲーション反応を行う。
ライゲーションは、例えば、塩化マグネシウム、ジチオスレイトール（以下、「DTT」と略すことがある。）、ATP、T4ポリヌクレオチドキナーゼ及びT4 RNAリガーゼを含むTris-塩酸緩衝液（pH 7.0〜8.0）中にて、所望の温度で所望の時間、反応させることにより行う。
【００５２】
例えば、約0.1〜約2.5Ｕ/μＬのT4ポリヌクレオチドキナーゼ、約0.4〜約５Ｕ/μＬのT4 RNAリガーゼ、約２〜約50mMの塩化マグネシウム、約２〜約50mMのDTT、約0.2〜約５mMのATPを含む10〜250mMのTris-塩酸緩衝液（pH 7.0〜8.0）中で行うことができ、約10℃〜約40℃で、約１分〜約60分間反応させることが好ましい。作業効率及び反応効率の面から、20℃〜30℃で５分〜30分間行うことが好ましく、25℃で15分間とすることがさらに好ましい。
この反応液には、必要に応じて、SUPERase RNase inhibitor（Ambion社）などのRNA分解酵素阻害剤を添加することもできる。
【００５３】
（Ｓ２）工程では、本工程では、mRNA−リンカー連結体を無細胞翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。まず、前記mRNAからタンパク質を合成する。ここで前記合成されたタンパク質は、前記mRNA−リンカー連結体中の前記タンパク質連結部位に連結するため、mRNA−リンカー−タンパク質の連結体が生成される。
【００５４】
上記無細胞翻訳系としては、動物由来細胞、植物由来細胞、菌類及び細菌類からなる群から選択したものを使用することができるが、部分的に又は全体として人工的に合成したものを使用することもできる。より具体的には、大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などを、無細胞系として使用することができる（Lamfrom H., Grunberg-Manago M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 1 (1967)）。
上記の無細胞翻訳系では、それらが由来する生物種に依存して翻訳に利用されるコドンの種類が異なる。このため、対象となる遺伝子や遺伝子の由来に合わせて無細胞翻訳系を選択することが好ましい。また、利用したい翻訳系に合うように、mRNAの配列や構造を設計しておくことが好ましい。
【００５５】
この工程では、前記無細胞翻訳系として哺乳類の網状赤血球細胞のライセートを利用することが好ましく、ウサギの血液から得られた網状赤血球細胞のライセートを利用することがさらに好ましい。また、血中の網状赤血球の割合を高めるため、前記哺乳動物に予めアセチルフェニルヒドラジンを投与して溶血性貧血等を誘導し、数日間経過した後に採血をすることが好ましい。
前記ライセートは、例えば、ヌクレアーゼによって細胞由来のmRNAを分解し、キレート剤によってカルシウムを除去した後に、ヌクレアーゼを不活化処理したものであることが好ましい。マイクロコッカルヌクレアーゼによって細胞由来のmRNAを分解し、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）を加えてカルシウムをキレートし、前記ヌクレアーゼを不活化処理したもの（以下、「マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済」という。）を使用することが、より好ましい。
【００５６】
例えば、約16〜約400mMの酢酸カリウム、約0.１〜約2.5mMの酢酸マグネシウム、約0.2〜約50mMのクレアチンリン酸、０〜約0.25mMのアミノ酸を含む反応液（濃度はいずれも終濃度）10〜100μＬ中に、マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済のウサギ網状赤血球ライセートと上記連結体とを加えて、翻訳反応を行うことができる。
反応効率の点から、ウサギ網状赤血球ライセートの量を約8.5〜約17μＬ、上記連結体の量を約1.2〜約２pmolとし、反応系のサイズを約12.5〜約25μＬとして、約20〜約40℃で約10〜約30分間行うことが好ましい。この場合に使用する反応液は、80mMの酢酸カリウム、0.5mMの酢酸マグネシウム、10mMのクレアチンリン酸、それぞれ0.025mMのメチオニン及びロイシン、0.05mMのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸を含むものであることが好ましい。生成効率と作業効率の点から、約30℃で約20分間、翻訳を行うことがさらに好ましい。
【００５７】
なお、必要に応じて、この反応液に、SUPERase RNase inhibitor（Ambion社製）などのRNA分解酵素阻害剤を添加してもよい。
翻訳反応後、翻訳産物であるタンパク質とmRNA−リンカー連結体とを、高塩濃度条件下で結合させることが好ましい。例えば、0.3〜1.6Ｍの塩化カリウム及び40〜170mMの塩化マグネシウムの存在下（濃度はいずれも終濃度）、約27〜約47℃で、約30分〜約1.5時間反応させると、タンパク質を上記連結体と効率よく結合させることができる。
【００５８】
次に、（Ｓ３）工程では、上記（Ｓ２）工程で得られたmRNA−リンカー−タンパク質の連結体を、固相に結合させる。
本工程にて、mRNA−リンカー−タンパク質連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体を使用する用途に応じて適宜選択することができる。こうした固相としては、生体分子を固定する担体となる各種の形状のものを用いることができる。例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフロリド（PVDF）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。
【００５９】
上記のような固相に上記連結体を結合させる方法は特に限定されず、当業者に公知の種々の方法を使用することができる。例えば、上述したリンカーに設けた固相結合部に予め所定の分子を導入しておき、固相に前記分子と結合する受容体分子を予め結合させておくことによって、行うことができる。こうした結合に使用できる組み合わせは、上述した通りである。
固相がスチレンビーズ、スチレン基板などのプラスチック材料で構成されているのであれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Qiagen社製、LiquiChip Applications Handbook等参照）。したがって、連結体にビオチン又はその類縁体が結合されている場合には、固相にアビジンを結合させておくことによって、上記連結体を容易に固相に結合させることができる。
【００６０】
（Ｓ４）工程は第１洗浄工程であり、固相に結合しなかった連結体を、緩衝液を用いて洗浄する。ここで使用する洗浄液としては、約0.1〜約10Mの塩化ナトリウム、約0.1〜約10mMのEDTA、約0.01〜約1%の界面活性剤を含む1〜100mMのTris-塩酸緩衝液（pH 7.0〜9.0）もしくはリン酸緩衝液(pH 7.0〜9.0)等を挙げることができ、1〜3Mの塩化ナトリウム、1〜3mMのEDTA、0.05〜0.02%のTriton X-100を含む10〜30mMのTris-塩酸緩衝液（pH 8.0）を使用することが、洗浄効率がよいことから好ましい。
【００６１】
次に、（Ｓ５）では、前記主鎖の３’末端を反応開始点とし、前記mRNAを鋳型として、所定の条件の下で、逆転写反応を行ってcDNA鎖を合成する。その結果、mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体が得られる。
逆転写反応系は任意に選択できるが、上記mRNA−リンカータンパク質連結体と、dNTP Mixと、DTTと、逆転写酵素と、標準溶液と、RNaseを除去した水（以下、「RNaseフリー水」という。）とを加えて反応系を調製し、この系中、５〜20分間、30〜50℃の条件で逆転写を行わせることが好ましい。
【００６２】
（Ｓ６）では、第２の緩衝液で洗浄し、遊離の前記mRNA／cDNA−リンカー−タンパク質連結体を除去する。ここで使用する第２の緩衝液は、第１の緩衝液と同様であり、適宜選択することができる。
次いで（Ｓ７）では、前記主鎖の切断部位を、前記所定のエンドヌクレアーゼで切断する。ここで使用するエンドヌクレアーゼは上述した通りである。この切断反応は、Tris-塩酸緩衝液を含む反応液中で、所定の温度で所定の時間行うことが好ましい。
例えば、Endo V（NEB社製、M0305S）を使用した場合には、約５〜20mMのTris-HCl、約2.5〜約10mMのEDTA、及び約0.1〜約0.4Ｍの酢酸ナトリウムの組成を有する反応液中で、約５〜約20分間、約30〜約45℃の温度範囲で反応させることができる。
【００６３】
以上のようにして、本発明のリンカーを用いて、種々のタンパク質を得るとともに、そのタンパク質に対応するcDNAをも得ることができる。
前記切断分離工程に引き続いて、得られたタンパク質のアフィニティー等を利用したカラムクロマトグラフィー等によって、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体を選別することができる。
その後、選別された前記連結体中の塩基配列に、PCR法等を用いて変異を導入して増幅反応を行う。増幅産物を所望のプロモーター配列を有する二本鎖DNAと所定の方法で連結し、第１世代の変異型mRNA（以下、「mRNA G1」と略す。）を得る。次いで、mRNA G1を用いて、上述したcDNAディスプレイ法の各工程を繰り返すことによって、mRNA G2、mRNA G3等を得ることが可能となる。
【００６４】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
（実施例１  dIを切断部位とするDNAオリゴマーの合成）
１．DNAオリゴマー及びリンカーの合成
本発明で使用する合成DNAであるI-hybri、及び比較対象の側鎖用分子Puro-F-S及びLong-Biotin-ピューロマイシン・リンカー（LBPリンカー）を以下のように合成した。
まず、以下に示す特殊DNAの合成をジーンワールド（株）及び（株）ＢＥＸに委託した。
【００６６】
（Ａ）I-hybri［(28mer) 配列番号１：5'-CCICC(T-B)CIACCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3'］
ここで、Ｉはデオキシイノシンを表わす。(T)は、Amino-Modifier C6 dT（5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoroacetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine, 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)を表わし；(T-B)はBiotin-dT（5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((4-t-butylbenzoyl)-biotinyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)を表わす（いずれも、Glen Research 社製）。修飾塩基を表す記号は、同様である。
【００６７】
（Ｂ）Puro-F-S［配列；5'-(S)-(PL)C(F)-(Spacer18)-(Spacer18)-(Spacer18)-(Spacer18)-CC-(Puro)-3'］
ここで、(S)は、Thiol-Modifier C6 S-Sである（化合物名：o-(dimethoxytrityloxy-hexyl-dithiohexyl)-o'-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl-phosphoramidite）(PL)は、PC Linker Phosphoramiditeである（化合物名：3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2-nitrophenyl)-1-propanyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite）。(F)は、Fluorescein-dTである（化合物名：（5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-deoxyUridine-3'-succinoyl-long chain alkylamino）。また、(Puro)は、ピューロマイシンを表わす。(Spacer18)は、Spacer Phosphoramidite 18である（化合物名：18-0-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite）。）（いずれも、Glen Research社製）。
（Ｃ）Biotin-loop［(56 mer)配列番号２；5'-CCCGG TGCAG CTGTT TCATC (T-B)CGGA AACAG CTGCA CCCCC CGCCG CCCCC CG(T)CCT-3'］
ここで、制限酵素Pvu IIの認識部位を、図３中に下線を付して示した。また、Thiol-Modifier C6 S-Sの化学式を下記式（IX）に示す。
【００６８】
【化１０】
0005858415.tif 000011
【００６９】
上記LBPリンカーは、前記（B）Puro-F-Sと（C）Biotin-loopを以下の方法に従って架橋し精製して得た。まず、10nmolのPuro-F-Sを22.5μlの１Ｍのリン酸バッファー（pH 9.0）に溶かし、2.5 μＬの１Ｍ DTTを加え、室温で１時間放置し、Puro-F-Sのトリチル化メルカプト基をチオール基に還元した。架橋反応を行う直前に、20mMリン酸バッファー（pH 7.2）で平衡化したNAP-5 Columns（GEヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いてDTTの除去及び脱塩を行った。
【００７０】
50μＬの0.2Mリン酸バッファー（pH 7.2）に、10μＬの500 pmol/μＬのBiotin-loop及び10μＬの100 mMの EMCS（6-Maleimidehexanoic acid N-hydroxysuccinide ester：架橋剤、（株）同人化学研究所製）を加えて良く攪拌し、37℃で30分反応させた。その後、４℃で反応産物をエタノール沈殿させ、未反応のEMCSを除去した。沈殿物を500μＬの70%エタノールにて洗浄し、減圧下で乾燥させた。
この反応産物を、上記のように還元したPuro-F-S（〜10nmol）に速やかに溶解し、４℃で一晩放置してサンプルとした。このサンプルに、終濃度が50mMになるようにDTTを加え、37℃で30分間放置し、チオール基の架橋反応を停止させた。エタノール沈殿法により、室温で、合成したリンカーを沈殿させ、未反応のPuro-F-Sを除去した。
さらに未反応のBiotin-loop及びそれらのEMCS架橋物を取り除くために、以下の条件でHPLCを用いたグラジエント法で精製を行った。
【００７１】
(HPLC)条件
カラム：Symmetry 300 C18, 5μm, 4.6φ×250 mm (Waters Corporation製)
溶離液：下記の溶液Ａと溶液Ｂとを混合して使用した。
溶液Ａ：0.1M TEAA (triethylammonium acetate)
溶液Ｂ：80 ％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：0.5 mＬ/分
溶離液の濃度勾配：溶液Ａ：溶液Ｂを、30分間で85：15→65：35に変化させた。
HPLCにより分画された生成物を、16％アクリルアミドゲル（８Ｍ 尿素、60 ℃）を使用した電気泳動にて検出し、目的の画分を減圧下に乾燥させた。この後、DEPC（二炭酸ジエチル、Diethylpyrocarbonate)処理水に10pmol/μＬとなるように溶解した。
【００７２】
２．エンドヌクレアーゼＶによる切断
Endo VはEndonuclease V (M0305S、New England Biolabs, Inc.（以下、「NEB社」と略すことがある。）製)を使用した。
10pmolのI-hybri（被験物質）、0.5 μＬのエンドヌクレアーゼＶ(10Ｕ/μＬ)、１μＬの10 x NEBuffer及び蒸留水を含む10μＬの反応液中にて、37℃で、30分間反応させた。反応終了後、P6カラム（Bio-Rad Laboratories, Inc.製）で脱塩した。I-hybriで５pmol相当の溶液を取り、SDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、８Ｍ尿素を含有する12％ポリアクリルアミドゲルにて、60℃で、200Ｖの条件下に、30分間行った。電気泳動終了後、SYBR（登録商標） Goldにて染色し、泳動像を蛍光観察した。
比較例として、上記と同様の反応液中にて10pmolのPuro-F-S（対照物質）又はLBPリンカーを、37℃で、30分反応させた。その後、反応液全量をそれぞれSDS-PAGE法にて分析した。
【００７３】
３．結果
図４中、第１レーンは、分子量マーカーを表す（図中、Ｍと示す）。第２レーンは、Endo Vを入れない反応液でI-hybriを反応させた陰性対照を示し（図中、−と示す）、第３レーンはEndo Vを入れた反応液中でI-hybriを反応させた試料を示す（図中、＋と示す）。泳動像の左側の数字は分子量マーカーの塩基長を表し、右側の数字は反応後の被験物質の塩基長を表す。
I-hybriは、陰性対照では28塩基長の位置にバンドが検出されたが、Endo Vと反応させると、切断されて19塩基長の位置にバンドが検出された（図４、＋のレーン参照）。このことは、Endo VがI-hybri中の切断領域中に存在するデオキシイノシン（dI）を認識し、I-hybriを特異的に切断したことを示す。
【００７４】
図５中、第１レーンのＭは分子量マーカーを表す（図中、Ｍと示す）。第２レーン及び第３レーンは、Puro-F-SがEndo Vで切断されるか否かを検討した結果である（第２レーン（陰性対照）は、Endo Vを入れない反応液（図中、−と示す）、第３レーンはEndo Vを入れた反応液）中でPuro-F-Sを反応させた試料を示す（図中、＋と示す）。また、第４レーンと第５レーンは、LBPがEndo Vで切断されるか否かを検討した結果である（第４レーン（陰性対照）はEndo Vを入れない反応液（図中、−と示す）、第５レーンはEndo Vを入れた反応液（図中、＋と示す））。
Puro-F-S及びLBPでは、いずれも、Endo Vによって切断された産物は検出されなかった。このことはEndo VがdIを含有しないリンカーを非特異的に切断することはないことを示す。
上記の試験結果から、dIを含む切断部位を含むリンカーを用いて、mRNA−リンカー−タンパク質連結体を形成することで、切断用酵素Endo Vによる固相からの遊離が可能となることが示された。
【実施例２】
【００７５】
（実施例２  rGを切断部位とするリンカーの合成）
１．リンカーの合成
本発明で使用するイノシン-Short-Biotin-ピューロマイシン・リンカー（SBP(I)リンカー）及びrG-Short-Biotin-ピューロマイシン・リンカー（SBP(rG)リンカー）を以下のように合成した。
まず、実施例１に記載した（Ａ）及び（Ｂ）に加えて、以下の特殊DNAの合成をジーンワールド（株）（東京）に委託した。
（Ｃ）rG-Hybri［(26mer) 配列番号３：5'-CC(rG)C(T-B) C(rG)CCC CGCCG CCCCC CG(T)CC T-3'］
【００７６】
ここで、(rG)はリボＧを表わし；(T)及び(T-B)は実施例１と同様である。
上記SBP(I)リンカーは、（Ａ）Puro-F-Sと（Ｂ）I-Hybriとを、以下の方法に従って架橋し精製して得た。また、上記SBP(rG)リンカーは（Ａ）Puro-F-Sと（Ｃ）rG-hybriを架橋して得た。
【００７７】
1.7μＬの３mM Puro-F-Sを、22.5μＬの１Ｍリン酸バッファー（pH 9.0）と混合し、2.5μＬの１Ｍ DTTを加え、室温で１時間放置し、Puro-F-Sのトリチル化メルカプト基をチオール基に還元した。架橋反応を行う直前に、20 ｍＭリン酸バッファー（pH 7.2）で平衡化したNAP-5 Columns（GE・ヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いてDTTの除去及び脱塩を行った。
50μＬの0.2Ｍリン酸バッファー（pH 7.2）に、2.5μＬの１mM I-HybriまたはrG-Hybri、及び10μＬの100mMのEMCSを加えて良く攪拌し、37℃で30分反応させた。その後、反応産物を４℃でエタノール沈殿させて未反応のEMCSを除去した。沈殿物を200μＬの70%エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【００７８】
この反応産物を、上記のように還元したPuro-F-S溶液（〜５nmol）に速やかに溶解し、４℃で一晩放置してサンプルとした。このサンプルに、終濃度が50mMとなるようにDTTを加え、37℃で30分間放置し、チオール基の架橋反応を停止させた。室温でエタノール沈殿により合成したリンカーを沈殿させ、未反応のPuro-F-Sを取り除き、さらに未反応のI-HybriまたはrG-Hybri、及びそれらのEMCS架橋物を取り除くために、実施例１と同様の条件でHPLC精製を行った。
HPLCにより分画された生成物を、８Ｍの尿素を含有する12％アクリルアミドゲルにて、200Ｖ、60℃の条件下で30分間電気泳動を行い分画した。目的の画分を減圧下で乾燥させた。この後、DEPC（Diethylpyrocarbonate）処理水で溶かして、10 pmol/μＬとした。
【００７９】
２．リンカーのRNase耐性検査
上記のように合成したリンカーSBP(rG)及びSBP(I)のRNase耐性検査を、大腸菌（E.coli）のペリプラズムに由来のRNase ONE（プロメガ（株）製）を用いて行った。RNase ONEは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各RNAの3'末側のリン酸ジエステル結合を切断する活性を有するRNA分解酵素である。
１pmolのSBP(rG)又はSBP(I)と、0.5μＬのRNase ONE（10Ｕ/μＬ）と、１μＬの10 x RNase ONE reaction buffer（プロメガ（株）製））と、RNaseフリー水とを加えて混合し、10μＬの混合液とした。
【００８０】
次にこの混合液を、37℃で30分間反応させ、反応産物をSDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、８Ｍの尿素を含有する12％ポリアクリルアミドゲルにて、200Ｖ、60℃の条件下で30分間行い、リンカー中のFITCを、Molecular Imager Pharos FX (Bio-Rad Laboratories, Inc.製)を用いて、波長488nmのレーザー光にて励起し、蛍光検出した。結果を図６に示す。
図６中、第１レーンには、100bp DNA ladder（プロメガ（株）製）をサイズマーカーとして１μＬアプライした。第２レーンには未処理のSBP(rG)を0.5 pmol、第３レーンにはRNase ONEで処理したSBP(rG)を５μＬ、第４レーンには未処理のSBP(I)を0.5 pmol、第５レーンにはRNase ONEで処理したSBP(I)を５μＬ、それぞれアプライした。
【００８１】
図６中、未処理のSBP(rG)をアプライした第２レーンとRNase ONEで処理したSBP(rG)をアプライした第３レーンとを比較すると、第３レーンでバンドの位置が低分子側にシフトしていた。このため、SBP(rG)はリボＧサイトにてRNase ONEによって切断されたことが示された。一方未処理のSBP(I)をアプライした第４レーンとRNase ONEで処理したSBP(I)をアプライした第５レーンとを比較すると、バンドの位置の低分子側へのシフトは認められなかった。このため、SBP(I)はRNase ONEで切断されていないことが示された。
以上の検査により、SBP(I)は、旧来のSBP(rG)リンカーにはないリボヌクレアーゼ耐性を有することが示された。
【実施例３】
【００８２】
（実施例３：リンカーとmRNAとの連結）
１．mRNAの合成
モデルmRNAとしてPDO（POU-specific DNA binding domain of Oct-1）を用いることとした。終始コドンを含まないPDOのコード配列（CDS）（216塩基長）の5'側上流にT7プロモーター配列と翻訳促進配列を、また、3'側下流にスペーサー領域及びピューロマイシン・リンカーとの相補鎖領域を有する配列を、それぞれ付加したDNA(配列番号４：391塩基長)をPCR法で合成し、精製した。
その後、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System（プロメガ（株）製）を用いて、添付のプロトコールに従い、5〜30pmol/μＬのmRNA(配列番号６：361塩基長)を合成した。配列番号５及び配列番号７のアミノ酸配列は、前記PDOのコード配列から翻訳され得るポリペプチド鎖を表し、末端の終始コドンを含んでいないことを特徴としている。
【００８３】
２．リンカーとmRNAとの連結
20 pmolのPDO mRNAと10 pmolのSBP(I)と2.2 μlの10 x T4 RNA Ligase buffer（タカラバイオ（株）製）とに、RNaseフリー水を加えて混合し、21.2 μlの混合液とした。この溶液をアルミブロック上で２分間90℃に保った後、１分間70℃に保ち、その後自然放冷して最後に室温（25℃）とした。この溶液に、0.5μＬのT4 ポリヌクレオチドキナーゼ（10Ｕ/μＬ、東洋紡績（株）製）と、0.5μＬのT4 RNAリガーゼ（40Ｕ/μＬ、タカラバイオ（株）製）を加えて混合液とし、15分間、25℃に保って、前記リンカーとmRNAとを連結させ、ライゲーション産物を得た。図７に模式図を示した。
【００８４】
３．生成物の検出
上記産物を、SDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、８Ｍの尿素を含有する５％ポリアクリルアミドゲルにて、200Ｖ、60℃の条件下で60分間行い、SYBR Gold（Invitrogen製）にて染色観察した。結果を図８に示す。
図８中、第１レーンには、100bp DNA ladder（プロメガ（株）製）をサイズマーカーとして１μＬアプライした。第２レーンには未処理のPDO mRNAを0.5 pmol、第３レーンには上記ライゲーション産物をRNA量換算にて0.5 pmol相当、それぞれアプライした。上記mRNA−リンカー連結体であるmRNA-SBP(I)のバンドがサイズマーカーの400〜500bp付近に現れたことから、SBP(I)リンカーはPDO-mRNAと連結する能力のあることが示された。
【実施例４】
【００８５】
（実施例４：mRNA−リンカー連結体からの逆転写反応及びEndo Vによる切断）
１．mRNAのEndo V耐性検査
DNA切断活性を有するDNA修復酵素として、10Ｕ/μＬのEndo V（NEB社製）を使用した。Endo VがmRNAを分解しないことを確認するために、以下の検査を行なった。上記PDO-mRNAを1 pmolと、Endo Vを１pmolと、10 x reaction bufferと、RNaseフリー水とを加えて10μＬの混合液１を調製した。また、同量のPDO-mRNAと、RNase T1（Ambion社製）を１pmolと、10 x reaction bufferと、RNaseフリー水とを加えて混合し、10μＬの混合液２を調整した。
【００８６】
上記混合液１及び２を、30分間、37℃にて反応させた。上記産物を９Ｍの尿素を含有する８％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。電気泳動は200Ｖ、60℃の条件下で30分間行い、SYBR Goldにて染色観察した。結果を図９に示す。
図９中、第１レーンには100bp DNA ladder（プロメガ（株）製）を、サイズマーカーとして１μＬアプライした。第２レーンには未処理のPDO-mRNAを0.5 pmol、第３レーンにはRNase T1にて処理した混合液を５μＬ、第４レーンにはEndo Vで処理した混合液を５μＬ、それぞれアプライした。
【００８７】
図９中、未処理のPDO-mRNAをアプライした第２レーンと、RNase T1処理物をアプライした第３レーンとを比べると、第３レーンでは第２レーンで検出されたバンドが消失しており、PDO-mRNAがRNase T1により分解されたことが示された。
一方、第２レーンとEndo V処理物をアプライした第４レーンとを比べると、同じ位置にバンドが検出されており、PDO-mRNAはEndo Vによっては分解されないことが示された。
このことから、SBP(rG)とRNase T1とを用いるcDNAディスプレイ法の場合、固相からの切り離し工程の後に、反応液中にRNase T1が残留していると、その後の工程で合成されるmRNAが切断される可能性があることが明らかになった。一方、SBP(I)とRNase T1とを用いる本願発明のcDNAディスプレイ法では、そのような影響のないことが示された。
【００８８】
２．逆転写反応
RNA量換算にて2 pmol相当の上記ライゲーション反応産物、２μＬの2.5 mMのdNTP Mix、0.5μＬの0.1ＭのDTTを、0.25μＬの200Ｕ/μＬのSuper script III reverse transcriptase（Invitrogen製、Superscriptは登録商標）、２μＬの5 x First strand bufferとに、RNaseフリー水を加えて混合し、10μＬの混合液とした。上記の混合液中で、10分間、40℃にて逆転写反応をさせ、mRNA−リンカー連結体から逆転写産物を得た。図10に模式図を示した。
【００８９】
３．Endo Vによる切断
得られた逆転写反応産物のうち５μＬを取り、ここにDNA切断活性を有するDNA修復酵素としてEndo V（10Ｕ/μＬ）を0.5μＬ加え、10分間、37℃にて反応させた。
４．生成物の検出
上記産物をSDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、８Ｍの尿素を含有する５％ポリアクリルアミドゲルにて、200Ｖ、60℃の条件下で60分間行い、リンカー中のFITCを蛍光検出した。結果を図11に示す。
図11中、第１レーンにはmRNA-SBP(I)をRNA量換算にて0.5 pmol相当、第２レーンにはEndo V未処理の逆転写反応産物を2.5μＬ、第３レーンにはEndo V処理逆転写反応産物を2.5μＬ、それぞれアプライした。
【００９０】
図11中、mRNA-SBP(I)をアプライした第１レーンとEndo V未処理の逆転写反応産物をアプライした第２レーンとの比較から、mRNA-SBP(I)連結体から、高効率に逆転写反応が行われて、mRNA/cDNA-SBP(I)連結体が生成されたことが示された。
また、第２レーンとEndo V処理逆転写反応産物をアプライした第３レーンとの比較から、mRNA/cDNA-SBP(I)連結体が、Endo V がmRNA/cDNA-SBP(I)連結体中の切断領域に組み込まれたデオキシイノシンを認識し、特定の切断部位で切断したことが示された。ここで上記連結体から分離したのは、mRNA及びリンカーの5'末端側部分からなる断片であり、cDNA及びFITCを含むリンカーの3'末端側部分からなる断片は分離されなかった。
なお、上記の連結体のmRNAが分解され、その結果、上記連結体のcDNAを含む部分が断片化されたわけではないことは、上記１．のEndo V耐性検査で確認済みである。
【実施例５】
【００９１】
（実施例５：mRNA−リンカー連結体からのIVVの形成）
１．翻訳反応
mRNA−リンカー連結体を用いて、無細胞翻訳系にて翻訳反応を行った。RNA量換算にて２pmol相当の上記ライゲーション産物と、0.3μＬの20 x translation Mix (Met-)（Ambion社製）と、0.3μＬの20 x translation Mix (Met-)（Ambion社製）と、8.5μＬのウサギ網状赤血球の細胞溶解液であるRabbit Retic Lysate（Ambion社製）とに、RNaseフリー水を加えて混合し、12.5μlの混合液とした。この混合液中、30℃にて20分間反応させ、上記コード配列からPOUのポリペプチド鎖又はタンパク質を合成し、mRNA−リンカー−タンパク質連結体（IVV）を生成させた。図12に模式図を示す。
【００９２】
次に、上記翻訳反応後の混合液に、さらに５μＬの３Ｍの塩化カリウム溶液と、1.5μＬの１Ｍの塩化マグネシウム溶液を加えて混合した。この混合液を37℃にて30分間保ち、ピューロマイシンを上記タンパク質のＣ末端に取り込ませて、IVVを形成させた。
反応終了後、生成したIVVをSDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は８Ｍの尿素を含有する６％のゲルを用いて、10mA、室温の条件下で150分間行い、リンカー中のFITCを蛍光検出した。蛍光検出の条件は、実施例２と同様とした。結果を図13に示す。
【００９３】
図13中、第１レーンにはmRNA-SBP(I)をRNA量換算にて0.8 pmol相当、第２レーンには上記翻訳反応の産物を８μＬアプライした。
mRNA-SBP(I)をアプライした第１レーンと翻訳反応産物をアプライした第２レーンとを比較すると、第２レーンにmRNA−リンカー−タンパク質連結体に相当するバンドが現れていた。このことはmRNA-SBP(I)連結体から、正常にタンパク質が合成され、ピューロマイシンを介してSBP(I)と前記タンパク質とが結合したことを表す。
以上の結果から、SBP(I)からIVVを形成できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は新規タンパク質又はポリペプチド創出のための進化工学的手法の効率化に貢献し、ペプチド医薬又は産業用酵素創出のための研究開発に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
I-hybri
Deoxyinosine
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
Biotin-loop
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
rG-Hybri
DNA
RNA
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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