(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性の界面活性剤と、有効成分として尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物とを含む、溶液であることを特徴とする生物材料用透明化試薬。
【請求項２】
有効成分として尿素を含む、溶液であることを特徴とする請求項１に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項３】
水溶液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項４】
上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項５】
水溶性の高分子化合物をさらに含むことを特徴とする請求項３、又は請求項３を引用する請求項４に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項６】
水溶性の上記高分子化合物が、パーコール（登録商標）、フィコール（登録商標）、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項５に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項７】
尿素を１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、上記界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、水溶性の上記高分子化合物を２．５（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことを特徴とする請求項６に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項８】
さらに、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１から７の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項９】
多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものであることを特徴とする請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
【請求項１０】
請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤していることを特徴とする生物材料透明化処理システム。
【請求項１１】
請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴とする生物材料の透明化方法。
【請求項１２】
有効成分として尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む、溶液である生物材料用透明化試薬か、請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程を含む方法により透明化した生物材料に対して、平衡塩類溶液を浸潤することにより上記生物材料を透明化処理前の状態に戻す工程、を含むことを特徴とする透明化処理された生物材料の復元方法。
【請求項１３】
請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を含むことを特徴とする生物材料用透明化処理キット。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法により透明化した生物材料を、光学顕微鏡により観察する工程を含むことを特徴とする、生物材料の観察方法。
【請求項１５】
有効成分として尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む、溶液であることを特徴とする生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を当該化合物により透明化する工程、を含む方法によって透明化した生物材料を、光学顕微鏡により観察する工程を含むことを特徴とする、生物材料の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物材料用の透明化試薬、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡を用いて不透明な組織内部を観察する際には、透明化試薬を用いた前処理（透明化処理）が行われる。
【０００３】
透明化試薬及び前処理方法としては、例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載のAnn-Shyn ChiangによるFocus Clear（商品名）溶液、或いは非特許文献２に記載のHans-Ulrich Dodtらのtissue clearing methodが代表的なものとして知られている。これらは何れも、組織を透明化することで、組織中に存在する蛍光物質を観察する目的で使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
米国特許第６４７２２１６号公報（特許日２００２年１０月２９日）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ann-Shyn Chiang et al.: Insect NMDA receptors mediate juvenile hormone biosynthesis. PNAS 99(1), 37-42 (2002).
【非特許文献２】Hans-Ulrich Dodt et al.: Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 4 (4), 331-336 (2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Focus Clear溶液は、透明化を行う有効成分としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を含むことから生組織に用いることは難しく、適用対象が専ら固定化サンプルに限定されるという問題がある。
【０００７】
加えて、Focus Clear溶液は、非常に複雑な組成からなるため、その調製が複雑で、かつ非常に高価であるという問題がある。さらに、Focus Clear溶液は、蛍光タンパク質を用いた観察が可能である旨を示唆しているものの、神経系組織の収縮を引き起こし、かつ神経系組織の深部では充分に濁りが取り除かれないという問題がある。
【０００８】
Dodtらのtissue clearing methodも、透明化のステップに有機溶剤を多用することが必須なため生組織に用いることは難しく、適用対象が専ら固定化サンプルに限定されるという問題がある。
【０００９】
また、tissue clearing methodは、上記の通り有機溶剤の多用が必須なため、ほぼ全ての蛍光タンパク質にダメージを与える。そのため、蛍光タンパク質を用いた組織観察が困難になるという問題もある。
【００１０】
さらに、上記のtissue clearing methodは、用いる組成の性質から、透明化処理の対象となる組織の脱水を伴い、当該組織が不可逆的に収縮するという問題がある。
【００１１】
本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、有効成分として生物親和性のより高い成分を用いた新規な生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、生物親和性に優れた成分の中で尿素に生物材料の透明化能があることを新たに見出し、本願発明を想到するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、有効成分として尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む、溶液であることを特徴としている。
【００１４】
本発明はまた、上記何れかの生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤している生物材料透明化処理システムを提供する。
【００１５】
本発明にかかる生物材料の透明化方法は、上記何れかの生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明にかかる透明化処理された生物材料の復元方法は、上記の方法により透明化した生物材料に対して、平衡塩類溶液を浸潤することにより上記生物材料を透明化処理前の状態に戻す工程を含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明はまた、上記何れかの生物材料用透明化試薬を含む生物材料用透明化処理キットを提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、有効成分として生物親和性のより高い成分を用いた新規な生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの海馬を処理した結果を示す図である。
【図２】本発明の他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの海馬を処理した結果を示す図である。
【図３】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの大脳全体を処理した結果を示す図である。
【図４】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬と、処理される生物材料の膨潤との関係性を示すグラフである。
【図５】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの大脳全体を処理した結果を示す図である。
【図６】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの脳切片を処理した後に、当該脳切片の光の透過率を測定した結果を示すグラフである。
【図７】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの胎仔を処理した結果を示す図である。
【図８】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの海馬を処理して神経幹細胞を観察した結果を示す図である。
【図９】本発明に係る生物材料用透明化試薬と従来技術（ＢＡＢＢ法）とでマウスの大脳を処理した結果を比較する図である。
【図１０】本発明に係る生物材料用透明化試薬と従来技術（ＢＡＢＢ法）とで、各種蛍光タンパク質を発現したHeLa細胞を処理した結果を比較する図である。
【図１１】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬で、神経幹細胞が移植された大脳皮質を処理して観察した結果を示す図である。
【図１２】本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理をする前の生物材料と、透明化処理後に処理前の状態に回復させた生物材料とに対して行った免疫染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２１】
（生物材料用透明化試薬の有効成分）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」とは、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素」を含む、溶液である。
【００２２】
本発明にかかる他の態様における「生物材料用透明化試薬」は、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素誘導体」を含む、溶液である。
【００２３】
上記尿素誘導体の種類は特に限定されないが具体的には例えば、各種のウレイン、又は、下記の一般式（１）に示す化合物である。なお、一般式（１）に示す化合物には一部のウレインが含まれる。本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含んでいればよいが、これらの中で尿素を含むことがより好ましい。
【００２４】
【化１】
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一般式（１）に示す尿素誘導体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立に水素原子（但し、Ｒ１〜Ｒ４の全てが水素原子の場合は尿素自体に相当するので除かれる）、ハロゲン原子、又は炭化水素基であり、炭化水素基を構成する炭素原子が複数個ある場合には当該炭素原子の一部が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子により置換されていてもよい。炭化水素基としては、鎖状炭化水素基、及び環状炭化水素基が含まれる。
【００２５】
上記鎖状炭化水素基として、例えば、鎖状アルキル基、鎖状アルケニル基、及び鎖状アルキニル基等が例示される。鎖状炭化水素基を構成する炭素数は特に限定されないが、例えば、６以下の直鎖状又は分岐状のものが挙げられ、好ましくは炭素数が１〜３のアルキル基である。鎖状炭化水素基は、例えば、ハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。鎖状アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。
【００２６】
上記環状炭化水素基として、例えば、シクロアルキル基、及びシクロアルケニル基等が例示される。環状炭化水素基は、例えばハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。シクロアルケニル基の例としては、シクロヘキセニル基等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。
【００２７】
上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００２８】
また、一般式（１）に示す尿素誘導体のより好ましい具体例は、以下の１）〜２）に示す通りである。
１）Ｒ１〜Ｒ４より選択される任意の３つの基が水素原子であり、残りの１つの基がハロゲン原子、又は炭素数１〜６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの１つの基が、炭素数１〜３、又は炭素数が１〜２のアルキル基である。
２）Ｒ１〜Ｒ４より選択される任意の２つの基が水素原子であり、残りの２つの基が互いに独立にハロゲン原子、又は炭素数１〜６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの２つの基が何れも、炭素数１〜３、又は炭素数が１〜２のアルキル基である。なお、水素原子となる２つの基の一方はＲ１、Ｒ２の何れかから選ばれ、他方はＲ３、Ｒ４の何れかから選ばれることがより好ましい。
【００２９】
（有効成分として尿素等を用いる利点）
尿素は、毒性が極めて低い生体由来の成分である。そのため、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、１）固定化された生物材料はもとより、固定化されていない（生きた）生物材料の透明化にも用いうるものとなる。２）また、尿素は、蛍光タンパク質へのダメージ、及びその蛍光の消失が比較的少なく、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適用しうるものとなる。３）尿素は、極めて安価で入手容易でもあり、かつ取扱い性に優れるため、極めて低コストかつ簡単な手順で透明化処理を行いうるものとなる。
【００３０】
また、上記の利点に加えて、４）従来の生物材料用透明化試薬と比較して、光散乱性が高い不透明な生物材料の透明性を格段に向上させることができ、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。５）特に脳組織では、これまで深部観察のバリアーであった白質層を透明化することが可能となり、白質層より深部に位置する領域（例えば脳梁）の観察が可能となる。６）本発明の試薬による透明化処理は可逆的である。具体的には、透明化処理後の生物材料を平衡塩類溶液に浸漬するのみで、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。透明化処理の前後においてタンパク質等の抗原性も変化せずに保存されるため、通常の組織染色、及び免疫染色の手法を用いた分析が可能である。
【００３１】
なお、尿素に代えて上記した尿素誘導体を用いることによっても、同様の利点が得られうる。
【００３２】
（界面活性剤）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、生物組織への本試薬の侵入を緩やかに向上させるという理由から、非イオン性の界面活性剤が好ましい。非イオン性の界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の脂肪酸系；ポリビニルアルコール等の高級アルコール系；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系の界面活性剤が挙げられる。具体的には、例えば、TritonX−100、及びTritonX-140等のTritonX（登録商標）シリーズ；Ｔween−20、Tween-40、Tween-60、及びTween-80等のＴween（登録商標）シリーズ；NP-40（商品名）；からなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。界面活性剤は、必要に応じて、二種以上を混合して使用することもできる。
【００３３】
これら界面活性剤は、尿素の、生物材料に対する浸透性を高め、透明化処理の効率を向上させうる。特に、脳組織の白質層等、のように、透明化処理が比較的困難な生物材料の透明化を行う場合には、「生物材料用透明化試薬」は界面活性剤を含むことが好ましい。
【００３４】
なお、上記界面活性剤は、尿素に対するのと同様に、生物材料に対する尿素誘導体の浸透性を高めうる。
【００３５】
（水溶性の高分子化合物）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて水溶性の高分子化合物をさらに含んでいてもよい。ここで、高分子化合物とは、分子量が例えば５万〜６万程度以上の大きさであって、細胞内に実質的に侵入しないものである。また、高分子化合物は、生物材料の変性等を引き起こさないものが好ましい。水溶性の高分子化合物として、具体的には、例えば、架橋型シュークロース高分子物質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はパーコール（商品名。コロイド状シリカをポリビニルピロリドン皮膜で被覆した高分子物質）等が挙げられる。架橋型シュークロース高分子物質として、具体的には例えば、フィコール（Ficoll）ＰＭ７０（商品名））のような、シュークロースをエピクロルヒドリンで架橋（共重合）した重量平均分子量約７万の高分子物質等が挙げられる。
【００３６】
これら水溶性の高分子化合物は、尿素及び尿素誘導体とは異なり細胞内に浸入することがなく、また水溶性であるから、細胞内外の浸透圧差の調整に寄与すると考えられる。そのため、透明化処理の対象となる生物材料の原型維持に寄与し、とりわけ、生物材料の膨張の防止に寄与する。特に限定されないが、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の浸透圧が比較的高い場合には、当該試薬はこれら水溶性の高分子化合物を含むことが好ましい。
【００３７】
（その他の成分）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、ならびにマクロゴールから選択される少なくとも一種の化合物を「乾燥抑制成分」として含むことができる。乾燥抑制成分は、透明化処理の対象となる生物材料の乾燥を防止する。とりわけ、透明化処理後に光学顕微鏡による観察に供されるまでの時間が比較的長い場合、或いは、光学顕微鏡による長時間観察に供される場合には、本発明の試薬は、上記の乾燥抑制成分を含むことが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、上述した「尿素及び／又は尿素誘導体」、「界面活性剤」及び「水溶性の高分子化合物」以外に、例えば、ｐＨ調整剤、及び浸透圧調整剤等の添加剤を必要に応じて含んでいてもよい。
【００３９】
（溶媒）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、尿素が可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、尿素が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された「生物材料用透明化試薬」を、水溶液としての「生物材料用透明化試薬」と称する。
【００４０】
なお、水を主溶媒として用いた場合には、例えば、固定化した標本にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を水と混合し用いてもよい。例えば固定化した標本にＤＭＳＯを混合して用いれば、生物材料に対する試薬の浸透性の向上、及び角質表面を有する組織の透明化処理促進等の効果が期待される。
【００４１】
溶媒として水を用いる主な利点は、以下の通りである。１）本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の有効成分である尿素は水への溶解性に優れているため、生物材料用透明化試薬の調製が容易かつ低コストとなる。２）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる。３）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる。４）固定化された材料に限定されず、生材料の透明化処理に適用可能となる。５）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる。６）有機溶剤を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
【００４２】
また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液であってもよい。さらに、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料の変形を招来せず、かつ生物材料内に尿素が充分に浸透する程度に、その浸透圧が調整されていてもよい。
【００４３】
なお、尿素誘導体に関しても、尿素と同様の上記溶媒を用いることができる。
【００４４】
（組成物の量的関係）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」における「尿素」の含有量は、生物材料の透明化処理が進展する限りにおいて特に限定されない。なお、「尿素」の含有量の上限は、使用する溶媒に対する尿素の溶解度により決定される。対象とする生物材料の種類にも依存するが、例えば、「生物材料用透明化試薬」における尿素の含有量が比較的少ない場合には処理時間を長くし、尿素の含有量が比較的多い場合には処理時間を短くすることで必要な透明化処理を行うことができる。しかしながら、透明化処理を様々な程度で実現可能となるという観点からは、１Ｍ以上で８.５Ｍ以下の範囲内の濃度であることが好ましく、３．５Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度であることがより好ましく、４Ｍ以上で８Ｍ以下の範囲内の濃度であることが特に好ましい。また、尿素に代えて尿素誘導体（又は尿素と尿素誘導体との混合物）を用いる場合にも、尿素と同じ含有量に設定することが出来る。
【００４５】
また、「界面活性剤」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する界面活性剤の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００４６】
また、「水溶性の高分子化合物」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５(ｗ／ｖ)％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。また、生物材料の膨張抑制効果と透明化処理後の屈折率とのバランスという観点では、上記含有量は、５（ｗ／ｖ）％以上で２５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０（ｗ／ｖ）％以上で２０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０（ｗ／ｖ）％以上で１５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「水溶性の高分子化合物」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００４７】
また、グリセロール等の「乾燥抑制成分」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５（ｗ／ｖ）％以上で２０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、５（ｗ／ｖ）％以上で１５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「乾燥抑制成分」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
【００４８】
（対象となる生物材料）
本発明の「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料又は動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類（哺乳動物）等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
【００４９】
また、生物材料は、個体そのものであってもよく（生きているヒト個体そのものは除く）、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、或いは細胞であってもよい。本発明の「生物材料用透明化試薬」は優れた透明化処理能力を有するので、生物材料が、多細胞動物由来の組織又は器官（例えば、脳全体又はその一部）、或いはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても透明化処理を適用可能である。
【００５０】
また、上記の生物材料は、顕微鏡観察用に固定化（fixed）処理された材料であってもよく、固定化されていない材料であってもよい。なお、固定化された材料を用いる場合には、固定化処理後に、例えば２０（ｗ／ｖ）％ショ糖−ＰＢＳ溶液に、充分に（例えば、２４時間以上）浸漬する処理を行うことが好ましい。さらに、当該材料をOCT  compundに包埋して液体窒素で凍結後、ＰＢＳ中で解凍し、４（ｗ／ｖ）％ＰＦＡ−ＰＢＳ液で再度固定する処理を行うことが好ましい。
【００５１】
上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
【００５２】
（生物材料用透明化試薬の特に好適な組成の一例）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」の特に好適な組成の例示は以下の通りである。これらの透明化試薬は、特に、マウス等の哺乳動物の脳全体、脳の一部（例えば、海馬、大脳全体又は大脳の一部）、及び胚を透明化処理する目的で、極めて好適である。なお、後述する実施例１から９で用いた生物材料用透明化試薬も、以下の透明化試薬（１）〜（４）の条件を満たすものである。
・生物材料用透明化試薬（１）：
水に、尿素を４Ｍ以上で８Ｍ以下の範囲内の濃度で溶解した水溶液。
・生物材料用透明化試薬（２）：
水に、尿素を４Ｍ以上で８Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、さらに「乾燥抑制成分（例えば、グリセロール）」を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。
・生物材料用透明化試薬（３）：
水に、尿素を４Ｍ以上で８Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、「乾燥抑制成分（例えば、グリセロール）」を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、さらに「水溶性の高分子化合物（例えば、Ficoll）」を５（ｗ／ｖ）％以上で２５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。
・生物材料用透明化試薬（４）：
水に、尿素を４Ｍ以上で８Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、ＴritonＸ−１００）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。
【００５３】
なお、尿素に代えて尿素誘導体（又は尿素と尿素誘導体との混合物）を用いる場合には、上記した尿素と同じ濃度で尿素誘導体等を用いて、生物材料用透明化試薬（１）〜（４）を調製すればよい。
【００５４】
（生物材料用透明化試薬の調製）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」の調製方法は、「尿素及び／又は尿素誘導体」、並びに、必要に応じて用いる「界面活性剤」、「水溶性の高分子化合物」、及び「乾燥抑制成分」等を、溶媒中に溶解することで調製される。溶媒中に溶解、又は混合する手順は特に限定されない。
【００５５】
（生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理法の一例）
本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」を用いた生物材料の透明化処理方法は、上記の「生物材料」に対して「生物材料用透明化試薬」を浸潤させる工程（透明化処理工程）を含む方法である。より具体的には、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
【００５６】
上記の透明化処理工程において、透明化処理用の容器内に「生物材料用透明化試薬」と「生物材料」とを格納する順序は特に限定されないが、まず「生物材料用透明化試薬」を格納し、次いで「生物材料」を格納する（すなわち、生物材料用透明化試薬に生物材料を投入する）ことが好ましい。
【００５７】
上記の透明化処理工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、透明化処理を行う処理時間は、特に限定されないが、２時間以上で６ヶ月以内の範囲内であることが好ましく、１２時間以上で７日以内の範囲内であることがより好ましい。また、透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
【００５８】
上記の透明化処理工程で用いた、透明化処理された生物材料を格納した処理容器は、後述する観察工程に供されるまで、例えば、室温又は低温環境下で保存してもよい（透明化試料保存工程）。
【００５９】
（透明化処理された生物材料の観察工程）
透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、上記透明化処理工程の事前に、又は透明化処理工程後で観察工程前に、染色或いはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
【００６０】
例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化処理工程の事前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。
【００６１】
また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、又は蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、上記透明化処理工程の事前に行うことが好ましいが、上記透明化処理工程後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。
【００６２】
観察工程は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、観察工程は、３次元超分解顕微鏡技術（例えば、ＳＴＥＤ、３Ｄ  ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ  ＳＴＯＲＭ、及びＳＩＭ）を適用して行うこともできる。また、観察工程は、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して行うことが好ましい。
【００６３】
（その他の応用）
本発明に係る「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、生物材料透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。ここで、平衡塩類溶液とは、具体的には例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液(TBS)；人工脳脊髄液(ACSF)；MEM, DMEM, 及びHam’s F-12などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。
【００６４】
上記「生物材料用透明化試薬」を用いた場合、透明化処理の前後において、或いは、透明化処理後に透明化処理前の状態に戻す場合において、生物材料に含まれるタンパク質等の変性等を招来しない。そのため、生物材料に含まれるタンパク質等の抗原性も変化せずに保存される。そのため、例えば、生物材料を透明化処理して光学顕微鏡による観察を行った後に、当該生物材料を透明化処理前の状態に戻して汎用の組織染色、又は免疫染色の手法を用いた詳細分析を行うことなども可能となる。
【００６５】
（生物材料用透明化処理キット）
本発明にかかる「生物材料用透明化処理キット」は、上記の「生物材料用透明化試薬」を備える。「生物材料用透明化処理キット」は、さらに、上記の透明化処理工程で用いる「処理容器」、「生物材料把持器具（ピンセット等）」、透明化処理後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す「平衡塩類溶液」、及び「キットの取扱説明書」から選択される少なくとも一つを備えていてもよい。
【００６６】
（生物材料透明化処理システム）
本発明に係る生物材料透明化処理システムは、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」と、単離された上記「生物材料」とを含んでなり、この「生物材料」を透明化するために当該「生物材料」の内部に「生物材料用透明化試薬」が浸潤したものである。すなわち、当該処理システムとは、例えば、透明化処理の途中段階にある生物材料を含む処理システム、又は、透明化処理が完了した生物材料を含む処理システムを包含する概念である。
【００６７】
（本発明に係る様々な態様）
以上のように、本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、有効成分として尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む、溶液であることを特徴としている。
【００６８】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、有効成分として尿素を含む、溶液であることがより好ましい。
【００６９】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、水溶液であることがより好ましい。
【００７０】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、界面活性剤を含むことがより好ましい。
【００７１】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、上記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤であることがより好ましい。
【００７２】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、上記非イオン性の界面活性剤が、ＴritonＸ（登録商標）、Ｔween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましい。
【００７３】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、水溶性の高分子化合物をさらに含むことがより好ましい。
【００７４】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、水溶性の上記高分子化合物が、パーコール（登録商標）、フィコール（登録商標）、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましい。
【００７５】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、上記の構成において、尿素を１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で、上記界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、水溶性の上記高分子化合物を２．５（ｗ／ｖ）％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことがより好ましい。
【００７６】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、さらに、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことがより好ましい。
【００７７】
本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものであることが好ましい。
【００７８】
本発明はまた、上記何れかの生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤している生物材料透明化処理システムを提供する。
【００７９】
本発明にかかる生物材料の透明化方法は、上記何れかの生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴としている。
【００８０】
本発明にかかる透明化処理された生物材料の復元方法は、上記の方法により透明化した生物材料に対して、平衡塩類溶液を浸潤することにより上記生物材料を透明化処理前の状態に戻す工程を含むことを特徴としている。
【００８１】
本発明はまた、上記何れかの生物材料用透明化試薬を含む生物材料用透明化処理キットを提供する。
【実施例】
【００８２】
本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００８３】
〔実施例１：海馬の観察〕
（灌流固定工程）
神経系のニューロンに蛍光タンパク質ＹＦＰを発現したトランスジェニックマウス（ＹＦＰ−Ｈ  ｌｉｎｅ：米国Harvard大学  Josh Sanes教授より供与されたもの。[参考文献] Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000）の生後７−８週齢のものを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷ＰＢＳを灌流した後、氷冷固定液（４％  パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ,  ｐＨ７．４）を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
【００８４】
（生物材料の摘出及び固定工程）
次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、海馬を注意深く摘出した。そして、摘出した海馬を氷冷固定液（４％  パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ,  ｐＨ７．４）に一晩、４℃の環境下で浸漬した。その後、この海馬を、２０％  シュークロース−ＰＢＳ溶液中に移し２４時間、４℃の環境下で緩やかに振盪した。
【００８５】
次いで、海馬の組織を２０％  シュークロース−ＰＢＳ溶液で完全に置換した後、ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。そして、凍結後の海馬を、ＰＢＳ中に移し室温で解凍した。解凍後の海馬は、再び、４％  パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で１時間再固定した。
【００８６】
（生物材料の透明化処理及び観察工程）
最後に、再固定した海馬を、本実施例に係る生物材料用透明化試薬に３日間、浸漬し、室温で振盪した。生物材料用透明化試薬は、４Ｍ濃度の尿素を純水に溶解した水溶液である。透明化が進んだ時点（処理開始から３日後）で、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）中に海馬を封入し、９２０ｎｍの波長のレーザーを備えた正立型２光子顕微鏡（商品名FV1000MPE：オリンパス社製）で、海馬の基底側から表面側まで観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離（working distance）は２ｍｍであった。
【００８７】
観察の結果は、図１に示す。図１に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、歯状回（Ｄｅｎｔａｔｅ  Ｇｙｒｕｓ：ＤＧ）、ＣＡ１、及び海馬表面までをカバーした約１．９ｍｍの深度（生物材料の厚みに相当）にわたるクリアな観察が可能であった。
【００８８】
〔実施例２：海馬の観察、及び試薬の検討〕
上記（生物材料の透明化処理工程）で用いる生物材料用透明化試薬として、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液（ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬と呼称）を用いた点、及び、海馬の表面側から基底側へ観察を行った点以外は、上記実施例１と同じ方法に従い、マウスの海馬の観察を行った。
【００８９】
観察の結果は、図２に示す。図２に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、海馬表面、ＣＡ１、歯状回（ＤＧ）、及び海馬基底までをカバーした約２ｍｍの深度（生物材料の厚みに相当）にわたるクリアな観察が可能であった。
【００９０】
〔実施例３：大脳の観察〕
以下の点１）〜３）以外は、実施例１と同じ方法に従い、マウスの大脳の観察を行った。
１）  上記（生物材料の摘出及び固定工程）において大脳全体を摘出し、この大脳を固定したものを生物材料として用いた点。
２）  上記（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、実施例２と同一のＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬を生物材料用透明化試薬として用いた点。
３）  上記（生物材料の透明化処理及び観察工程）において、作動距離が３ｍｍの対物レンズを用いて大脳の表面（大脳皮質）側から海馬側に向けて観察を行った点。
【００９１】
観察の結果は、図３に示す。図３に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、大脳皮質、Ｖ−ＶＩ層はもちろん、大脳皮質下部の白質領域（corpus callosum）を越え、さらに海馬の繊維叢（fiber tract）を越えて、ＣＡ１及び歯状回（ＤＧ）等を構成する細胞群までをカバーした約３ｍｍの深度（対物レンズの作動限界）にわたるクリアな観察が可能であった。
【００９２】
なお、従来の透明化試薬では、大脳皮質下部の白質領域を透明化することが出来なかったため、白質領域より深部の領域を観察することは不可能であった。
【００９３】
〔実施例４：試薬の検討〕
以下の条件に従い、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬が生物材料を膨潤させる程度の評価、及びＦｉｃｏｌｌを併用した膨潤抑制の効果について評価をした。
１）まず、透明化処理の期間を２日間とした以外は、実施例３に記載の方法に従い、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬を用いてマウスの大脳の透明化処理を行った。そして、透明化処理後の大脳の体積を測定した。なお、透明化処理の期間を２日間確保すれば、マウスの大脳は、観察可能な程度に透明化されていた。
２）また、透明化試薬として、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬にＦｉｃｏｌｌを５％（ｗ／ｖ）濃度、或いは２０％（ｗ／ｖ）濃度、添加したものを用いた以外は、上記１）と同様にしてマウスの大脳の透明化処理を行った。そして透明化処理後の大脳の体積をそれぞれ測定した。
３）コントロールとして、ＰＢＳ中に浸漬した直後（０日間）のマウスの大脳の体積を測定した。
【００９４】
観察の結果は、図４に示す。図４に示すように、コントロール（図中でＰＢＳと示す）と比較して、上記１）の処理を行ったもの（図中でＳＣＡＬＥ−Ａ２と示す）は膨潤し、上記２）の処理を行ったものはＦｉｃｏｌｌの添加量に応じて膨潤が抑制された。特に、２０％（ｗ／ｖ）濃度のＦｉｃｏｌｌを添加した透明化試薬を用いることで、膨潤が８５％以上抑制された（図中でＳＣＡＬＥ−Ａ２＋２０％Ｆｉｃｏｌｌと示す）。
【００９５】
なお、膨潤又は退縮が見られないものが特に好ましいが、膨潤又は退縮が見られた大脳も、光学顕微鏡観察用の試料として用いることは可能である。
【００９６】
〔実施例５〕
以下の点１）・２）以外は、実施例１と同じ方法に従い、マウスの大脳の観察を行った。
１）  （生物材料の透明化処理及び観察工程）において、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロール、及び１０％（ｗ／ｖ）濃度のＦｉｃｏｌｌを純水に溶解した水溶液を生物材料用透明化試薬として用い、３日間の透明化処理を行った点。
２）  （生物材料の透明化処理及び観察工程）において、作動距離が２ｍｍの対物レンズを用いて大脳の表面（大脳皮質）側から海馬側に向けて観察を行った点。
【００９７】
観察の結果は、図５に示す。図５に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、大脳皮質、Ｖ−ＶＩ層はもちろん、大脳皮質下部の白質領域（corpus callosum）を越え、さらに海馬の繊維叢（fiber tract）を越えて、ＣＡ１等を構成する細胞群までをカバーした約２．１６ｍｍの深度（対物レンズの作動限界）にわたるクリアな観察が可能であった。
【００９８】
なお、従来の透明化試薬では、大脳皮質下部の白質領域を透明化することが出来なかったため、白質領域より深部の領域を観察することは不可能であった。
【００９９】
〔実施例６：光透過率の評価〕
水、ＰＢＳ、８Ｍ濃度の尿素水溶液（透明化試薬）、４Ｍ濃度の尿素水溶液（透明化試薬）、透明化試薬ＳＣＡＬＥ−Ａ２（４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを含む水溶液）、及び透明化試薬ＳＣＡＬＥ−Ｄ２（４Ｍ濃度の尿素＋０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のＤＭＳＯを含む水溶液）、の各々で１日間処理を行ったマウス脳切片（厚さ６０μｍ）の大脳皮質部分を用いて、波長２００ｎｍ〜１０００ｎｍの光の透過率を測定した。なお、光の波長帯２００ｎｍ〜１０００ｎｍは、２光子顕微鏡観察で常用する励起波長領域と、観察対象となる蛍光タンパク質の主たる蛍光波長の波長領域との双方をカバーする。
【０１００】
なお、光の透過率測定は、マルチチャンネル検出PMA-2（浜松ホトニクス社）を用いて行った。測定の結果は、図６に示す。同図に示すように、８Ｍ濃度の尿素水溶液、４Ｍ濃度の尿素水溶液、透明化試薬ＳＣＡＬＥ−Ａ２、及び透明化試薬ＳＣＡＬＥ−Ｄ２は何れも光の透過率が８０％以上であり、水又はＰＢＳを用いた処理とは異なり顕著な透明化処理の効果を奏した。
【０１０１】
〔実施例７：マウス胎仔の透明化処理〕
Ｆｕｃｃｉ−Ｓ−Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ−Ｓ／Ｇ２／Ｍ）を発現するトランスジェニックマウス（理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。[参考文献Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.]の胎生１３．５日目の胎仔を、４（ｗ／ｖ）％ PFA-PBSで２日固定後に２０（ｗ／ｖ）％ショ糖-PBS溶液に浸漬し、一旦凍結後に解凍を行った。この後、再び４（ｗ／ｖ）％PFA-PBSで1時間固定を行った。その後、実施例２に記載のＳＣＡＬＥ−Ａ２に７日間浸漬することで透明化処理を行った。
【０１０２】
次いで、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）中に上記胎仔を封入し、蛍光実体顕微鏡（商品名MZ10F：Leica社製）で観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離は70ｍｍであった。
【０１０３】
観察の結果は、図７に示す。同図に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、肝臓だけはやや黄色が残ったもののマウス胎仔の全身が顕著に透明になった。なお、同図中に示すｍｒ（Mounting rubber）は、マウス胎仔の頭部を支えるために用いたものである。
【０１０４】
〔実施例８：マウス海馬における神経幹細胞の観察〕
（灌流固定工程）
Ｆｕｃｃｉ−Ｓ−Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ−Ｓ／Ｇ２／Ｍ）を発現するトランスジェニックマウス（理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。[参考文献] Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.）の生後６週齢のものを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷ＰＢＳを灌流した後、氷冷固定液（４％  パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ,  ｐＨ７．４）を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
【０１０５】
（生物材料の摘出及び固定工程）
次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、海馬の歯状回を注意深く摘出した。そして、摘出した海馬の歯状回を氷冷固定液（４％  パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ,  ｐＨ７．４）に一晩、４℃の環境下で浸漬した。その後、この海馬の歯状回を、２０％  シュークロース−ＰＢＳ溶液中に移し２４時間、４℃の環境下で緩やかに振盪した。
【０１０６】
次いで、海馬の歯状回を２０％  シュークロース−ＰＢＳ溶液で完全に置換した後、ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。そして、凍結後の海馬の歯状回を、ＰＢＳ中に移し室温で解凍した。解凍後の海馬の歯状回は、再び、４％  パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で１時間再固定した。
【０１０７】
なお、本実施例で用いた海馬の歯状回は、レクチン−テキサスレッド（Ｌｅｃｔｉｎ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）コンジュゲートによりその血管が染色されている。
【０１０８】
（生物材料の透明化処理及び観察工程）
最後に、再固定した海馬の歯状回を、本実施例に係る生物材料用透明化試薬に３日間、浸漬し、室温で振盪した。生物材料用透明化試薬は、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。透明化が進んだ時点（処理開始から３日後）で、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）の薄膜中に海馬の歯状回を封入し、９２０ｎｍの波長のレーザーを備えた正立型２光子顕微鏡（商品名FV1000MPE：Olympus社製）で観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離（working distance）は２ｍｍであった。また、観察は、海馬腹側表面から１．７ ｍｍの深さまで１８個の連続視野について行い、当該観察の結果を統合画像として再構成した。
【０１０９】
観察の結果は、図８に示す。図８に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことで、Ｆｕｃｃｉ−Ｓ−Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ−Ｓ／Ｇ２／Ｍ）陽性の神経幹細胞が血管周囲に見られることが確認された。
【０１１０】
〔実施例９：神経幹細胞移植の観察〕
蛍光タンパクＶｅｎｕｓを発現させた大人のラット海馬由来の神経幹細胞を取得し、この神経幹細胞をラット系統Fisher（F344）（日本SLCより購入）の大脳皮質部分(第V層付近、深さ約1.7 mmの部位)に移植した。
【０１１１】
神経幹細胞の移植後、３日が経過したラット系統Fisher（F344）を、上記実施例８の（灌流固定工程）に記載の方法に従い、固定をした。次いで、上記実施例８の（生物材料の摘出及び固定工程）に記載の方法に従い、ラット系統Fisher（F344）の大脳皮質を固定した。なお、本実施例で用いたラットの大脳皮質は、レクチン−テキサスレッド（Ｌｅｃｔｉｎ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）コンジュゲートによりその血管が染色されている。
【０１１２】
次いで、上記実施例８の（生物材料の透明化処理及び観察工程）に記載の方法に従い、大脳皮質の観察を行った。観察の結果は、図１１に示す。同図に示すように、本実施例に係る生物材料透明化試薬で透明化処理を行うことで、蛍光タンパクＶｅｎｕｓを発現した神経幹細胞が血管(Lectin Texas-Redコンジュゲートで染色されている)付近に集まっている様子が観察された。本方法は移植後の細胞の移動及び形態変化などを観察することにも適している。
【０１１３】
〔比較例１：BABB法との比較（１）〕
神経系に蛍光タンパク質ＹＦＰを発現したトランスジェニックマウス（ＹＦＰ−Ｈ  ｌｉｎｅ：米国Harvard大学  Josh Sanes教授より供与されたもの。[参考文献] Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000）の生後１２週齢のものから大脳を摘出して、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬（本発明：実施例２参照）を用いた透明化処理と、非特許文献２に記載のＤｏｄｔらによるベンジルベンゾエート／ベンジルアルコール（benzylbenzoate / benzylalchol (BABB)）法による透明化処理との比較を行った。
【０１１４】
なお、透明化処理は、何れも２日間、大脳を透明化処理液に浸漬することにより行った。また、上記ＢＡＢＢ法で用いた透明化処理液の組成は、benzylalchol、およびbenzylbenzoate（両者の組成比＝1：2）であった。
【０１１５】
結果を図９に示す。同図中で、Transmissionと示す列及びＹＦＰと示す列の上段はＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬による処理結果であり、下段はＢＡＢＢ法による処理である。なお、「Transmission」は透過型顕微鏡による観察結果を、「ＹＦＰ」は蛍光顕微鏡を用いたＹＦＰからの蛍光を観察した結果を示す。
【０１１６】
図９に示すように、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬による透明化処理では、ＹＦＰが発する蛍光を明確に観察することが可能であった。一方、ＢＡＢＢ法による透明化処理を行った大脳は著しく縮小し、かつＹＦＰからの蛍光が著しく減弱した。
【０１１７】
〔比較例２：BABB法との比較（２）〕
各種の蛍光タンパク質をコードする遺伝子をHeLa細胞（東京大学医科学研究所より分与されたもの。Scherer et al., J. Exp. Med. 97(5):695-710, 1953）に導入して対応する蛍光タンパク質を発現させた。ここで、発現させた蛍光タンパク質は、ＳＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＡＧ１、Ｖｅｎｕｓ、及びＤｓＲｅｄである（EGFPおよび DsRedはClontech社より使用ライセンスを得て購入した。mAG1はMBL社より使用ライセンスを得て購入した。VenusおよびSECFPは理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームがGFPをもとに遺伝子的に変異を導入し作製した。[参考文献]SECFP, Hadjantonakis et al., BMC Biotechnol., 2:11, 2002.: EGFP, Zhang et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 227: 707-711, 1996.: Venus, Nagai et al., Nat. Botech., 20: 87-90, 2002.: mAG1, Karasawa et al., J. Biol. Chem., 278(36): 34167-34171, 2003.: Baird et al., PNAS., 97(22): 11984-11989, 2000.）。
【０１１８】
次いで、比較例１と同様にして、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬（実施例２参照）を用いた透明化処理と、非特許文献２に記載のＤｏｄｔらによるベンジルベンゾエート／ベンジルアルコール（benzylbenzoate / benzylalchol (BABB)）法による透明化処理とを行い、両者を比較した。
【０１１９】
観察の結果は、図１０に示す。同図では、透明化処理前の蛍光タンパク質由来の蛍光強度を１００とした、各透明化処理後の蛍光タンパク質由来の蛍光強度の相対値を示している。図１０より明らかな通り、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬（本発明：実施例２参照）による透明化処理では蛍光タンパク質由来の蛍光強度は何れの場合も８０％以上維持されたが、ＢＡＢＢ法による透明化処理では蛍光タンパク質由来の蛍光強度は何れの場合も顕著に減弱させた。
【０１２０】
〔実施例１０：透明化処理後の組織の回復〕
ＧＦＰトランスジェニックマウスおよびＹＦＰトランスジェニックマウス(GFP-M lineおよびYFP-H line, 米国ハーバード大学Josh Sanes教授より供与されたもの)の海馬より2.5 ｍｍ厚のスライスを作製し、一旦ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬（実施例２参照）による透明化処理を５日間行って透明化した後、ＰＢＳで３回リンスして不透明状態の組織に戻した際の免疫染色性を、ＳＣＡＬＥ−Ａ２試薬による透明化処理前のものと比較した。
【０１２１】
免疫染色には幼若な神経細胞の表面に存在するPSA-NCAMのポリシアル酸を認識するマウス由来抗PSA-NCAM（polysialilated neural cell adhesion molecule）モノクローナル抗体(Millipore社)と、アストログリアに特異的な中間径フィラメントGFAP（glial fibrillary acidic protein）を認識するウサギ由来抗GFAPポリクローナル抗体(Sigma社)とを１次抗体として用い、２４時間４℃で反応させた後にＰＢＳでリンスした。その後、抗PSA-NCAMモノクローナル抗体は、Alexa Fluor 546で標識された抗マウスIgM抗体（Invitrogen, Molecular Probes社）を、GFAPポリクローナル抗体はAlexa Fluor 633で標識された抗ウサギIgG抗体を２次抗体（Invitrogen, Molecular Probes社）として室温で３時間反応させることで免疫組織染色を行った。これらのスライスの蛍光はこの間減衰することはなかったため、ＧＦＰあるいはＹＦＰの蛍光を含めた３重蛍光像が得られた。観察は倒立型共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus社)を用いて２０倍の対物レンズ(UplanApo20, Olympus社)により行った。
【０１２２】
図１２に示すように、ＳＣＡＬＥ−Ａ２の処理前（図中でBefore SCALE）、処理後（図中でAfter Recovery）ともに、抗PSA-NCAMモノクローナル抗体によって、海馬歯状回に存在する幼若な神経細胞とその細胞からCA3領域へと伸長した苔状線維とが実質的な問題なく染色された。また同様に、抗GFAPポリクローナル抗体によって、アストログリアも問題なく染色された。
【０１２３】
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明は、有効成分として生物親和性のより高い成分を用いた新規な生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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