(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗体、またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＶＲは、ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１により与えられ、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２により与えられ、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３により与えられ、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４により与えられ、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５により与えられ、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６により与えられ、前記抗体、またはその抗原結合断片はヒトＰＣＳＫ９に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７により与えられ、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号８により与えられる、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
２つのＨＣＶＲおよび２つのＬＣＶＲを含み、各々のＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７により与えられ、各々のＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号８により与えられる、請求項２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含み、前記ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、前記ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含み、各々のＨＣのアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、各々のＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる、請求項４に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含み、各々のＨＣのアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、各々のＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる、抗体。
【請求項７】
２つの重鎖および２つの軽鎖からなる抗体であって、各々の重鎖のアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、各々の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる、抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体または抗原結合断片と、１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
脂質異常症または高コレステロール血症を治療するための医薬の製造のための、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
【請求項１０】
脂質異常症または高コレステロール血症を治療するための医薬の製造のための、請求項６に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。特に、本発明は、前駆タンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）に対する抗体、そのようなＰＣＳＫ９抗体を含む組成物、および脂質異常症または高コレステロール血症を治療するためにＰＣＳＫ９抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前駆タンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）は、主に肝臓で生成される分泌セリンプロテアーゼであり、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の血漿濃度を調節する。分泌されたＰＣＳＫ９は、肝細胞の表面に位置するＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合し、内在化する。ＬＤＬＲは、分解のためにリソソームにＬＤＬ粒子を結合し、輸送することにより血漿からＬＤＬ−Ｃを除去する機能をする。ＬＤＬ粒子が分解のために送達されると、ＬＤＬＲは、さらなるＬＤＬ−Ｃに結合し、血漿からＬＤＬ−Ｃを除去するために肝細胞表面で再利用される。ＰＣＳＫ９は、細胞表面で再利用するよりむしろ、分解のために内在化されたＬＤＬＲを誘導することにより血漿ＬＤＬ−Ｃを調節し、それによりＬＤＬ−Ｃクリアランスを減少させる。ＰＣＳＫ９が欠損または過剰発現される齧歯動物における研究により、現在、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲのレベルを調節することにより循環ＬＤＬレベルを制御することが確認されている。循環ＰＣＳＫ９が肝臓ＬＤＬＲの分解に関与するという観測により、ＰＣＳＫ９の抗体中和がＬＤＬ−Ｃを低下させるための実行可能な治療アプローチであることが示唆される。さらに、ＬＤＬ−Ｃを低下させるための現在の標準的な治療であるスタチン薬剤が、ＰＣＳＫ９の発現および血清レベルを実際に増加させ得ることが報告されている。したがって、ＰＣＳＫ９抗体はまた、スタチン治療と相乗作用的にＬＤＬ−Ｃを減少させる可能性を有する。
【０００３】
ＰＣＳＫ９抗体および血漿ＬＤＬ−Ｃを低下させるそれらの作用は当該技術分野において知られている。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４は、このようなＰＣＳＫ９抗体およびそれらの使用を開示している。しかしながら、今まで、ＰＣＳＫ９を標的としている抗体は治療用途のために承認されていなかった。したがって、代替のＰＣＳＫ９抗体についての必要性が存在している。特に、高い有効性を有してＬＤＬ−Ｃを減少させる代替のＰＣＳＫ９抗体についての必要性が存在している。さらにより特に、高い有効性を有してＬＤＬ−Ｃを減少させ、作用持続時間の維持（例えばＬＤＬ−Ｃレベルの抑制の維持）を提供する代替のＰＣＳＫ９抗体についての必要性が存在している。このような抗体は好ましくはまた、開発、製造または処方を促進するための良好な物理化学特性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２４６１９２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０１４２３５２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１６６７６８号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１０／０２９５１３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＶＲは、ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１により与えられ、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２により与えられ、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３により与えられ、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４により与えられ、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５により与えられ、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６により与えられ、前記抗体またはその抗原結合断片はヒトＰＣＳＫ９に結合する。一実施形態において、本発明は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７により与えられ、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号８により与えられ、前記抗体またはその抗原結合断片はヒトＰＣＳＫ９に結合する。別の実施形態において、本発明は、２つの重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および２つの軽鎖可変領域を含む、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、各ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７により与えられ、各ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号８により与えられる。
【０００６】
別の特定の実施形態において、本発明は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる。さらにより特定の実施形態において、本発明は、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む抗体を提供し、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる。最も特定の実施形態において、本発明は、２つのＨＣおよび２つのＬＣからなる抗体を提供し、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９により与えられ、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０により与えられる。
【０００７】
本発明はさらに、本発明の抗体または抗原結合断片と、１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。より特には、本発明の医薬組成物はさらに、１種以上の追加の治療剤を含む。
【０００８】
さらに、本発明は、本発明の有効量の抗体または抗原結合断片を、それを必要とする患者に投与することを含む、脂質異常症または高コレステロール血症を治療する方法を提供する。本発明はまた、治療に使用するための本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。より特には、本発明は、脂質異常症または高コレステロール血症の治療に使用するための本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供する。さらに、本発明は、脂質異常症または高コレステロール血症を治療するための医薬の製造における本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【０００９】
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片をコードする核酸分子および発現ベクターに関する。さらに、本発明はプロセスに従って調製される抗体を提供し、前記プロセスは、（ａ）ポリペプチド配列が発現されるような条件下で、配列番号９により与えられるポリペプチド配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列および配列番号１０により与えられる第２のポリペプチド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）重鎖および軽鎖を含む抗体を前記宿主細胞から回収する工程とを含み、前記重鎖のポリペプチド配列は配列番号９により与えられ、前記軽鎖のポリペプチド配列は配列番号１０により与えられる。より特には、上述のプロセスにより産生される抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、各重鎖のポリペプチド配列は配列番号９により与えられ、各軽鎖のポリペプチド配列は配列番号１０により与えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
完全長抗体はジスルフィド結合により相互接続される２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、そこに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）による抗原認識に主に関与する約１００〜１１０アミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。軽鎖はカッパまたはラムダとして分類され、それらの各々は当該技術分野において公知である特定の定常領域により特徴付けられる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧ抗体はさらに、サブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられ得る。各重鎖タイプはまた、当該技術分野において周知の配列を有する特定の定常領域により特徴付けられる。本明細書で使用する場合、「抗原結合断片」とは、ヒトＰＣＳＫ９に結合するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、および一本鎖Ｆｖ断片を指す。本明細書で使用する場合、「ヒトＰＣＳＫ９に結合する」という用語は、配列番号１４のアミノ酸配列により与えられるヒトＰＣＳＫ９上のエピトープとの相互作用を指す。本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は本発明の抗体または抗原結合断片により認識される抗原上の別個の三次元部位を指す。
【００１１】
ＣＤＲは、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、十分に保存される領域に散在する。各々の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは抗原と特異的に相互作用を形成する残基のほとんどを含有する。本発明の抗体または抗原結合断片のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび配置は、周知のＫａｂａｔ番号付け法（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＲ２−３）に従って、またはＫａｂａｔプラスＣｈｏｔｈｉａ（ＨＣＤＲ１）に従って決定され得る。
【００１２】
抗体および抗原結合断片を産生し、精製するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５−８および１５章に見出され得る。例えば、マウスは、ヒトＰＣＳＫ９、またはその断片で免疫化され得、次いで得られる抗体が回収され得、精製され得、当該技術分野において周知の従来の方法を使用してアミノ酸配列が決定される。抗原結合断片もまた、従来の方法により調製されてもよい。本発明の抗体または抗原結合断片は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ周囲の１つ以上のヒトフレームワーク領域を含むように操作される。ヒトフレームワーク生殖細胞系配列は、それらのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒによりＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から、またはＭａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  ＬｅｆｒａｎｃおよびＧｅｒａｒｄ  ＬｅｆｒａｎｃによるＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１、ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得られ得る。特に、本発明の抗体または抗原結合断片に使用するための生殖細胞系列軽鎖フレームワークには、Ａ３およびＯ２が含まれる。本発明の抗体または抗原結合断片に使用するための特定の生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域には、ＶＨ３−２１およびＶＨ３−２３が含まれる。
【００１３】
本発明の操作された抗体または抗原結合断片は公知の方法を使用して調製および精製され得る。例えば、重鎖（例えば、配列番号９により与えられるアミノ酸配列）および軽鎖（例えば、配列番号１０により与えられるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列は、ＧＳ（グルタミン合成酵素）発現ベクター内でクローニングされ、操作され得る。次いで、操作される免疫グロブリン発現ベクターはＣＨＯ細胞中で安定にトランスフェクトされ得る。当業者が理解するように、抗体の哺乳動物発現の結果、グリコシル化、典型的にＦｃ領域において高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を生じる。安定なクローンが、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の発現のために検証されてもよい。陽性クローンは、バイオリアクタ中での抗体産生のために無血清培地中で増殖されてもよい。抗体が分泌される培地は従来技術により精製されてもよい。例えば、その培地は、リン酸緩衝生理食塩水などの適合緩衝液と平衡するプロテインＡまたはＧセファロースＦＦカラムに簡便に適用されてもよい。カラムは非特異的結合成分を除去するために洗浄される。結合抗体は、例えばｐＨ勾配により溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどにより抗体画分が検出され、次いでプールされる。抗体は一般的な技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過されてもよい。安定な凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術により効果的に除去されてもよい。生成物は例えば−７０℃にて即座に凍結されてもよいか、または凍結乾燥されてもよい。
【００１４】
本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む、単一コピーまたはクローン由来の抗体を指し、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えばＣＤＲ−グラフト、またはこのようなもしくは当該技術分野で公知の他の技術の組み合わせにより産生され得る。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれをコードする核酸は単離形態で提供される。本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、細胞環境に見出される他の高分子種を含まないかまたは実質的に含まないタンパク質、ペプチドまたは核酸を指す。本明細書に使用する場合、「実質的に含まない」とは、存在する高分子種の（モル基準で）８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超を含む、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸を意味する。
【００１６】
本発明の抗体または抗原結合断片は患者の治療に使用され得る。「治療している」（または「治療する」または「治療」）という用語は、存在する症状、障害、病態、または疾患の進行または重症度を遅延させること、中断させること、停止させること、軽減させること、止めること、減少させること、または反転させることを指す。本明細書に使用する場合、「患者」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を指すが、好ましくはヒトを指す。本明細書に使用する場合、「有効量」とは、患者へ単回または複数回投与すると、治療下の患者に所望の効果を与える、本発明の抗体または抗原結合断片の量または用量を指す。有効量は、哺乳動物の種；そのサイズ、年齢および全体的な健康；関連する特定の疾患；疾患の程度または重症度；個々の患者の反応；投与される特定の抗体；投与様式；投与される製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択される用法；ならびに任意の併用薬の使用などの複数の要因を考慮することにより、当業者としての担当の診断医により容易に決定され得る。
【００１７】
本発明の抗体もしくは抗原結合断片、それを含む医薬組成物は、非経口経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮的）により投与されてもよい。本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、（１９９５）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）により調製されてもよく、本明細書に開示される抗体、またはその抗原結合断片と、１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む。例えば、本発明の抗体または抗原結合断片は、クエン酸ナトリウム、クエン酸、ポリソルベート８０、およびスクロースなどの薬剤と製剤化されてもよく、次いで、得られる組成物は凍結乾燥され、２℃〜８℃で保存されてもよい。次いで凍結乾燥組成物は、投与前に注射のために滅菌水で再構成され得る。
【００１８】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、実施例は例示の目的で記載され、限定されず、種々の修飾が当業者によりなされてもよいことは理解される。
【実施例】
【００１９】
実施例１
操作したＰＣＳＫ９抗体
マウス宿主を、ヒトＰＣＳＫ９（配列番号１７）のＣ末端切断断片を含むペプチドで免疫化し、ＰＣＳＫ９結合ＩｇＧ抗体を単離し、標準的な方法を使用してクローニングする。単離したマウスＦａｂのＣＤＲを突然変異生成によりランダム化し、得られた抗体をヒトＰＣＳＫ９に対する親和性についてスクリーニングする。親和性が増強した変異を合わせ、最適化したＣＤＲをヒトＶＨ３−２１およびＡ３重鎖および軽鎖フレームワーク上でそれぞれ操作する。ヒト化抗体の生物物理学的特性をさらに最適化するために、ＣＤＲ配列内の芳香族および疎水性アミノ酸の標的とする置換を生成する。ランダム化したＣＤＲライブラリーもまた、さらなる親和性が増強した変異についてスクリーニングする。有益なＣＤＲ変異をランダムに合わせ、発現させ、得られた抗体をヒトＰＣＳＫ９に対する親和性についてスクリーニングする。以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒト化および最適化ＰＣＳＫ９抗体が得られる。
【００２０】
【表１】
0006013487.tif 000002
【００２１】
配列番号９および配列番号１０のそれぞれの重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする対応するｃＤＮＡ配列は以下の通りである：
【００２２】
【表２】
0006013487.tif 000003
【００２３】
実施例２
操作したＰＣＳＫ９抗体の発現
実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体は、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株中で発現できる。配列番号１１（配列番号９の重鎖アミノ酸配列をコードする）および配列番号１２（配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列をコードする）のｃＤＮＡを含有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターを使用して、エレクトロポレーションによりチャイニーズハムスター細胞株、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ、Ｓｌｏｕｇｈ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶ早期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳについての遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞により必要とされるアミノ酸、グルタミンの生化学的合成を可能とする。トランスフェクション後、５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いて細胞をバルク選択に供する。ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用して、選択のストリンジェンシーを増加させる。宿主細胞ゲノムの転写活性領域内に発現ベクターｃＤＮＡを組み込んだ細胞は、ＧＳの内因性レベルを発現する、ＣＨＯＫ１ＳＶ野生型細胞に対して選択できる。バルク培養物を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）技術を使用して単一細胞クローニングに供し、クローン細胞株を増殖させ、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体の発現についてスクリーニングする。
【００２４】
実施例３
エピトープ結合
マウスＩｇＧのＰＣＳＫ９結合エピトープ（それから実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体が誘導される）を、エピトープ抽出および水素／重水素交換質量分析により測定し、ヒトＰＣＳＫ９の触媒ドメインの線形アミノ酸配列１６０−１８１内の領域に狭める（アミノ酸番号付けは、２８のアミノ酸シグナルペプチドを含む、完全長ヒトＰＣＳＫ９配列に基づいた）。ヒトＰＣＳＫ９の触媒ドメイン内にこのエピトープを有する実施例１の操作した抗体の相互作用を、残基１６０−１８１に対応する合成ペプチドに対するその結合の評価により確認する（表１）。実施例１の操作した抗体はインタクトなヒトＰＣＳＫ９より高い親和性を有するペプチド１６０−１８１に結合し、その相違は、より速い会合速度（ｋｏｎ）により引き起こされる。解離速度（ｋｏｆｆ）はインタクトなＰＣＳＫ９の２倍以内であり、（結合が生じた後の）相互作用の強度は類似していることを示唆している。さらに、データは、ほぼ全ての結合決定基がＰＣＳＫ９のこの線形領域内に含まれることを示唆している。ペプチド１６６−１８１に対する実施例１の操作した抗体の結合はペプチド１６０−１８１より顕著に弱く、１６０−１６５領域内のアミノ酸（または複数のアミノ酸）の役割を実証する。ペプチド１６３−１７４に対する実施例１の操作した抗体の結合は１６６−１８１より顕著に強く、同様に残基１６３−１６５からの寄与を示唆している。
【００２５】
【表３】
0006013487.tif 000004
【００２６】
実施例４
結合キネティクスおよび結合親和性
当該技術分野において周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイは、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびウサギＰＣＳＫ９に対する試験ＰＣＳＫ９抗体の結合キネティクスおよび親和性を評価するために使用される。生理学的緩衝条件（イオン強度およびｐＨ）および温度（３７℃）下で、実施例１の操作した抗体は、１．２×１０５Ｍ−１ｓ−１の平均会合速度（ｋｏｎ）および１．２×１０−３ｓ−１の平均解離速度（ｋｏｆｆ）でヒトＰＣＳＫ９に結合する。実施例１の操作した抗体に対するヒトＰＣＳＫ９結合についての平均ＫＤは約１１ｎＭであると決定した。実施例１の操作した抗体は１．１×１０５Ｍ−１ｓ−１の平均会合速度（ｋｏｎ）および２．５×１０−３ｓ−１の平均解離速度（ｋｏｆｆ）でカニクイザルＰＣＳＫ９に結合し、カニクイザルＰＣＳＫ９結合について約２５ｎＭのＫＤを得た。以下の表２は、マウス、ラットおよびウサギＰＣＳＫ９を使用して実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体で得たさらなる結果の要約を示す。これらのデータは、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体が、生理学的条件のｐＨ、イオン強度、および温度下でヒトおよびカニクイザルＰＣＳＫ９の両方に対してナノモル親和性で結合することを示す。
【００２７】
【表４】
0006013487.tif 000005
【００２８】
実施例５
ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合の阻害
ＰＣＳＫ９は肝臓のＬＤＬＲ含有量を減少させることにより血漿ＬＤＬ−Ｃを調節し、それにより肝細胞によるＬＤＬ取り込みを減少させる。ＰＣＳＫ９の触媒ドメインはＬＤＬＲに結合する部位である。したがって、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインを認識する抗体は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の結合を阻害すると予想される。
【００２９】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）フォーマットを使用して、ＬＤＬ受容体へのＰＣＳＫ９結合に対する試験ＰＣＳＫ９抗体の効果を決定する。アッセイに使用した組換え完全長ＰＣＳＫ９は、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３安定細胞株（Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４８：１４８８−１４９８、２００７）においてＣ末端ＨＩＳタグ化タンパク質として発現される。組換えＬＤＬ受容体細胞外ドメインは、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｅ細胞（Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４８：１４８８−１４９８、２００７）においてＣ末端ＦＬＡＧタグ化タンパク質として発現される。ヒトＰＣＳＫ９のＣ末端ドメインに結合するマウス抗ＰＣＳＫ９  Ｍａｂは、ＨＥＫ２９３細胞において発現され、プロテイン−Ｇアフィニティカラム、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００上で精製される。モノクローナルＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）ＢｉｏＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）は、ヒドラジド結合によりビオチンに共有結合する精製したマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  ＢｉｏＭ２は、ＦＬＡＧ融合タンパク質のＮ末端、Ｍｅｔ−Ｎ末端またはＣ末端におけるＦＬＡＧ配列を認識する。ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  ＢｉｏＭ２はアビジンまたはストレプトアビジンコンジュゲートにより検出できる。モノクローナルＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  ＢｉｏＭ２−ビオチンは、５０％グリセロール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２５、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する１５０ｍＭのＮａＣｌ中に供給され、−２０℃で保存される。
【００３０】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）実験は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５％のＴＸ−１００、０．１％のカゼイン、１ｍｇ／ｍｌのデキストラン−５００、および０．０５％のプロクリン−３００を緩衝液として使用して３８４ウェル白色プロキシプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中で実施する。そのアッセイは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ストレプトアビジンドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アクセプタービーズにコンジュゲートしたマウス抗ＰＣＳＫ９Ｍａｂを使用する。ビーズが結合パートナーの相互作用を介して近接した場合、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬＲ、一重項酸素をドナービーズからアクセプタービーズに移す。６８０ｎｍでのレーザ励起により、一重項酸素はアクセプタービーズを励起して発光する。アクセプタービーズは、ＮａＢＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ）を使用して還元的アミノ化によりマウス抗ＰＣＳＫ９Ｍａｂに結合し、４℃で保存する。マウス抗ＰＣＳＫ９Ｍａｂがコンジュゲートしたアクセプタービーズ（２２μｇ／ｍｌ）を１時間、２．２２ｎＭのＰＣＳＫ９で予め負荷する。ドナービーズ（４４μｇ／ｍｌ）を１時間、５．５５ｎＭのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）ＢｉｏＭ２および２．２２ｎＭのＦＬＡＧタグ化ＬＤＬＲで予め負荷する。予め負荷した後、２μｌの試験ＰＣＳＫ９抗体または対照ＩｇＧを、完全に自動化したＭｕｌｔｉｍｅｋ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して９μｌの各ビーズ混合物（最終濃度のＰＣＳＫ９およびＬＤＬＲ＝１ｎＭ）を含有するプロキシプレートに加え、室温で一晩結合する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）信号（１秒当たりのカウント）をＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｔｕｒｂｏ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイを用いて全ての実験を微光条件下で実施する。
【００３１】
実質的に上記の手順の後、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイにおけるＬＤＬＲに対するヒトＰＣＳＫ９の結合はＰＣＳＫ９濃度に応じて増加する。実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体（試験ＰＣＳＫ９抗体）の添加により、約９０ｐＭの平均ＩＣ５０で、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９結合の濃度に関連した完全な阻害が生じた。対照ＩｇＧ４はそのアッセイにおいて効果を有さなかった。このアッセイの結果により、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体はＬＤＬＲに対するヒトＰＣＳＫ９の結合を阻害することが実証される。
【００３２】
実施例６
ＨｅｐＧ２細胞上でのＰＣＳＫ９機能の阻害
肝細胞上のＬＤＬＲの密度に対する試験ＰＣＳＫ９抗体の効果を決定するために、ヒトＨｅｐＧ２細胞を、ポリ−Ｄ−リシンをコーティングしたＴ７５フラスコ中で培養する。２４時間後、ポリ−Ｄ−リシンをコーティングした９６ウェルブラックプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中の５％（ｖ／ｖ）ヒトリポタンパク質が枯渇した血清（ＬＰＤＳ；Ｉｎｔｒａｃｅｌ）を含有する１００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２（３：１）培地中で５，０００細胞／ウェルにて細胞を播種する。ＬＰＤＳを含有する培地中で一晩インキュベーションした後、２．６〜１３３３ｎＭの範囲の濃度にて２時間、６９ｎＭ（５μｇ／ｍＬ）のＣ末端ＨＩＳタグ化組換えヒトＰＣＳＫ９および試験ＰＣＳＫ９抗体またはＩｇＧ４対照抗体と共に細胞をインキュベートする。全てのインキュベーションは３７℃で実施する。Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８マウスＩｇＧ２ｂ標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光標識したＬＤＬＲ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ）を用いてＬＤＬＲレベルをモニターする。室温にて９０分間、細胞を検出抗体とインキュベートし、次いでホルマリンを含まない固定剤（Ｐｒｅｆｅｒ；ＡＮＡＴＥＣＨ、Ｌｔｄ）を使用して１０分間固定し、その後、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で透過処理する。１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を染色して全細胞数を決定する。Ａｃｕｍｅｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）レーザ走査蛍光マイクロプレート血球計算器蛍光検出器（ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ）を使用してＬＤＬＲ信号を定量する。
【００３３】
実質的に上記の手順の後、ヒトＰＣＳＫ９により、１８ｎＭのＥＣ５０で、ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲの濃度依存性の減少が生じる。実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体（試験ＰＣＳＫ９抗体）は、１０４ｎＭのＩＣ５０で、ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲのＰＣＳＫ９により誘導される抑制を阻害した。ヒトＩｇＧ４対照は１３３３ｎＭまでの濃度で比較的不活性であった。これらのデータにより、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体が、ＰＣＳＫ９により媒介されるＬＤＬＲ分解を阻害することが実証される。
【００３４】
実施例７
ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９誘導性減少の阻害
ＬＤＬ取り込みに対する試験ＰＣＳＫ９抗体の効果を決定するために、ポリ−Ｄ−リシンをコーティングした９６ウェルブラックプレート上で５％のヒトＬＰＤＳを補足した１００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２（３：１）培地中で５，０００細胞／ウェルにてＨｅｐＧ２細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて１８時間インキュベートする。ヒトＰＣＳＫ９（６９ｎＭ）を、２．６ｎＭ〜１３３３ｎＭの範囲の濃度にてＰＣＳＫ９試験抗体またはヒトＩｇＧ４対照と共にまたは有さずに細胞に加え、３７℃にて２時間、細胞とプレインキュベートする。１００ｎｇ／ウェルの蛍光標識したＬＤＬ（ＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を添加した後、次いで細胞を３７℃にて４時間インキュベートする。室温にて２０分間、ホルマリンを含まない固定剤（Ｐｒｅｆｅｒ；ＡＮＡＴＥＣＨ、Ｌｔｄ）中で細胞を固定する。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、室温にて１５分間、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ緩衝液を用いて細胞を透過処理し、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色して全細胞数を決定する。Ａｃｕｍｅｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）レーザ走査蛍光マイクロプレート血球計算器を使用してＬＤＬ取り込みを決定し、全細胞に対する蛍光細胞のパーセントとして表す。試験ＰＣＳＫ９抗体または対照ＩｇＧに対する反応は、ＰＣＳＫ９の阻害パーセント、すなわち、ＰＣＳＫ９単独の存在下でのベースラインＬＤＬ−Ｃ取り込みに対してＰＣＳＫ９の非存在下での最大ＬＤＬ取り込みに戻るパーセントとして表す。ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９誘導性減少の阻害についての対応するＩＣ５０値もまた、計算する。
【００３５】
実質的に上記の手順の後、ヒトＰＣＳＫ９により、３２ｎＭのＥＣ５０で、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬ取り込みの濃度に関連した減少が生じた。実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳＫ９誘導性阻害を反転させ、増加したＬＤＬ取り込みとして示されるのに対して、対照ＩｇＧは阻害を反転しなかった。具体的には、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体により、８４％のＰＣＳＫ９の平均最大阻害パーセントおよび１９４ｎＭの平均ＩＣ５０が実証された。これらのデータにより、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体が、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９誘導性減少を阻害することが実証される。
【００３６】
実施例８
インビボ有効性
試験ＰＣＳＫ９抗体のインビボ薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）効果を決定するために、試験抗体を正常なカニクイザルに投与でき、続いて種々のＰＫおよび／またはＰＤパラメータを決定できる。例えば、試験ＰＣＳＫ９抗体を健康な未処置のカニクイザルに静脈内または皮下に投与でき、次いでヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡの使用により試験抗体の血清濃度を測定できる。抗体投与後に種々の時点にわたって得られた血清濃度を使用して、Ｔ１／２、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよび血漿クリアランス（ＣＬ）を含む、試験抗体の種々のＰＫパラメータを決定できる。同様に、試験ＰＣＳＫ９抗体を健康な未処置のカニクイザルに静脈内または皮下に投与でき、自動分析装置（Ｄｉｒｅｃｔ  ＬＤＬ−Ｃ  Ｐｌｕｓ、２ｎｄＧｅｎ．、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によりＬＤＬ−Ｃの血清濃度を測定できる。
【００３７】
実質的に上記の手順の後、１、５または１５ｍｇ／ｋｇの単回用量の静脈内投与後、および５ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量後の健康なカニクイザルにおける実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体の薬物動態を評価した。これらの研究から決定した薬物動態パラメータを以下の表３に与える。
【００３８】
【表５】
0006013487.tif 000006
【表６】
0006013487.tif 000007
【００３９】
２回の独立した研究において実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体の投与後に血清ＬＤＬを測定した。両方の研究において、ＬＤＬ−Ｃ抑制の証拠は、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体の２４時間の投与後に明白であった。５ｍｇ／ｋｇでの実施例１の抗体の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後、６０％（研究１）および２５％（研究２）の最大平均ＬＤＬ−Ｃ減少を観測した。５ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．にて、約８週間（研究１）および２週間（研究２）、平均ＬＤＬ−Ｃ抑制を維持した。研究２において、ＬＤＬ−Ｃ抑制の大きさ（２５〜３５％）に対する用量（１〜１５ｍｇ／ｋｇ）の適度の効果が存在した。ＬＤＬ−Ｃ抑制の期間に対する用量の効果は、より明白であった。皮下投与（５ｍｇ／ｋｇ）した場合、実施例１の操作した抗体は、静脈内投与後に観測されたものと同様の大きさまでＬＤＬ−Ｃレベルを抑制するのに効果的であった。実施例１の操作した抗体の任意の用量の投与後の血清高密度リポタンパク質コレステロールに対する効果は存在しなかった。
【００４０】
実施例９
操作したＰＣＳＫ９抗体の物理化学的性質
実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体はまた、良好な溶解度、化学的安定性、および物理的安定性を有することを見出した。
Ａ．溶解度
十分に高い溶解度は簡便に投与できることが望まれる。例えば、１００ｋｇの患者へ１．０ｍＬの注射により投与される１ｍｇ／ｋｇ用量は１００ｍｇ／ｍＬの溶解度を必要とする。さらに、高濃度で高分子量（ＨＭＷ）の凝集体を有さずに単量体状態で抗体を維持することもまた望まれる。試験抗体の溶解度を決定するために、抗体を、（１）１０ｍＭのクエン酸塩ｐＨ６；（２）１０ｍＭのクエン酸塩ｐＨ６、１５０ｍＭのＮａＣｌ；および（３）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に透析できる。次いで回収した透析物を、ＨＭＷパーセントを測定するために分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析できる。次いで試験抗体を、溶解限度に到達するかまたは濃縮器の空隙容量に到達するまで、約２５℃にて４ｍＬの遠心濃縮器中で濃縮できる。空隙容量に到達する場合、濃度は≧として表す。次いで濃縮した抗体をＳＥＣにより分析してＨＭＷパーセントを測定できる。濃度が元に戻ってＨＭＷ％の増加があるかどうかを決定するために、濃縮した試料を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＳＥＣにより分析できる。
【００４１】
実質的に上記の手順の後、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体は、試験した全ての条件下で１２８ｍｇ／ｍＬより大きい溶解度を示した。さらに、低レベルのＨＭＷのみが高濃度で存在した。
【００４２】
【表７】
0006013487.tif 000008
【００４３】
Ｂ．化学的安定性
化学的安定性は十分な保存期間を有する薬剤の開発を促進する。試験抗体の化学的安定性を評価するために、抗体は、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、またはｐＨ７にて緩衝した１０ｍＭのクエン酸中の１ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化できる。次いで製剤化した試料を、促進した分解研究において４℃、２５℃、および４０℃にて４週間インキュベートする。化学変化を反映する抗体の電荷プロファイルの変化は、標準的な手順に従ってキャピラリ等電点集束（ｃＩＥＦ）を使用して評価できる。実質的に上記の手順の後、実施例１の操作した抗体の化学安定性の分析により以下の結果が与えられた。
【００４４】
【表８】
0006013487.tif 000009
【００４５】
この結果は、２５℃で４週間の保存後、ｐＨ６（抗体製剤に使用される一般的なｐＨ）で製剤化した場合、主要ピーク％は４．１パーセントポイントのみ減少し、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体が、適切な保存期間を有する溶液製剤の開発を促進するのに十分な化学安定性を示すことを実証する。さらに、抗体はまた、ｐＨ５、およびより少ない程度でｐＨ７において良好な化学的安定性を示し、抗体が、様々な範囲のｐＨ単位にわたって製剤化を可能とし得る安定な特徴を有することを示す。
【００４６】
Ｃ．物理的安定性
試験抗体の物理的安定性を評価するために、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、またはｐＨ７（または１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８）にて緩衝した１０ｍＭのクエン酸塩中の１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で抗体を製剤化できる。次いで試料を、促進した分解研究において４℃、２５℃、および４０℃にて４週間インキュベートする。インキュベーション後、凝集した高分子量（ＨＭＷ）抗体から所望の単量体抗体を分離する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して物理的安定性を評価する。
【００４７】
表６は、実質的に上記の手順の後、実施例１の操作したＰＣＳＫ９抗体の物理的安定性の分析の結果をまとめる。そのデータは、ｐＨ５、ｐＨ６、およびｐＨ７において、２５℃または４０℃で４週間にわたるＨＭＷの変化が１％未満であったことを示し、この抗体が良好な物理的安定性有し、自己会合および凝集に耐性があることを示す。
【００４８】
【表９】
0006013487.tif 000010
【００４９】
配列
ＨＣＤＲ１（配列番号１）：
ＧＦＰＦＳＫＬＧＭＶ
ＨＣＤＲ２（配列番号２）：
ＴＩＳＳＧＧＧＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ
ＨＣＤＲ３（配列番号３）：
ＥＧＩＳＦＱＧＧＴＹＴＹＶＭＤＹ
ＬＣＤＲ１（配列番号４）：
ＲＳＳＫＳＬＬＨＲＮＧＩＴＹＳＹ
ＬＣＤＲ２（配列番号５）：
ＱＬＳＮＬＡＳ
ＬＣＤＲ３（配列番号６）：
ＹＱＮＬＥＬＰＬＴ
ＨＣＶＲ（配列番号７）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＳＫＬＧＭＶＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＳＧＧＧＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＩＳＦＱＧＧＴＹＴＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＬＣＶＲ（配列番号８）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＲＮＧＩＴＹＳＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＱＬＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＹＱＮＬＥＬＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＨＣ（配列番号９）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＳＫＬＧＭＶＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＳＧＧＧＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＩＳＦＱＧＧＴＹＴＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ＬＣ（配列番号１０）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＲＮＧＩＴＹＳＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＱＬＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＹＱＮＬＥＬＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＨＣ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＴＡＡＧＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＴＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡ
ＬＣ  ｃＤＮＡ（配列番号１２）
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＴＴＡＣＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＴＣＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＴＡＡ
ｈＰＣＳＫ９（配列番号１３）：
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ｈＰＣＳＫ９  １６０−１８１（配列番号１４）：
ＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥ
ｈＰＣＳＫ９  １６６−１８１（配列番号１５）：
ＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥ
ｈＰＣＳＫ９  １６３−１７４（配列番号１６）：
ＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰ
Ｃ末端切断ｈＰＣＳＫ９（配列番号１７）：
ＱＥＤＥＤＧＤＹＥＥＬＶＬＡＬＲＳＥＥＤＧＬＡＥＡＰＥＨＧＴＴＡＴＦＨＲＣＡＫＤＰＷＲＬＰＧＴＹＶＶＶＬＫＥＥＴＨＬＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱＡＡＲＲＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡＬＫＬＰＨＶＤＹＩＥＥＤＳＳＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥＶＹＬＬＤＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶＴＤＦＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱＡＳＫＣＤＳＨＧＴＨＬＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳＭＲＳＬＲＶＬＮＣＱＧＫＧＴＶＳＧＴＬＩＧＬＥＦＩＲＫＳＱＬＶＱＰＶＧＰＬＶＶＬＬＰＬＡＧＧＹＳＲＶＬＮＡＡＣＱＲＬＡＲＡＧＶＶＬＶＴＡＡＧＮＦＲＤＤＡＣＬＹＳＰＡＳＡＰＥＶＩＴＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧＴＬＧＴＮＦＧＲＣＶＤＬＦＡＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳＧＴＳＱＡＡＡＨＶＡＧＩＡＡＭＭＬＳＡＥＰＥＬ
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