(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織マトリックスの成形方法であって、
コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと；
前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；
部分的に脱水した前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中の少なくとも一部のコラーゲン線維の配向を変化させるステップと；
前記部分的に脱水した前記組織マトリックスを放射線に曝露するステップと；
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップが、９５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）の含水量を有する組織マトリックスを製造するように水を除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記含水量が８０％（ｗ／ｗ）〜６５％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記組織マトリックスを再水和するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５Ｇｙ〜５０ｋＧｙの線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５Ｇｙ〜２０ｋＧｙの線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が１０ｋＧｙ未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５ｋＧｙ未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が１ｋＧｙ未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線がγ線、電子線、およびＸ線から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
組織製品に含まれるコラーゲンを含む細胞外組織マトリックスの安定な三次元形状を形成するための方法において、
前記細胞外組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；
部分的に脱水した前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中の少なくとも一部のコラーゲン線維を再配向させるステップと；
前記部分的に脱水した前記組織マトリックスを放射線に曝露するステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載の方法において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップが、９５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）の含水量を有する組織マトリックスを製造するように水を除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法において、前記含水量が８０％（ｗ／ｗ）〜６５％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法において、前記三次元形状がカップ状の形状であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法において、前記三次元形状が管状の形状であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５Ｇｙ〜５０ｋＧｙの線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５Ｇｙ〜２０ｋＧｙの線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が１０ｋＧｙ未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５ｋＧｙ未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が１ｋＧｙ未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線がγ線、電子線、およびＸ線から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスの流体透過性が、脱水、機械的力の印加、および照射の前の前記組織マトリックスの透過性より低いことを特徴とする方法。
【請求項２９】
組織製品に含まれるコラーゲンを含む細胞外組織マトリックスの安定な三次元形状を形成するための方法において、
前記細胞外組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；
部分的に脱水した前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中のコラーゲン線維の一部または全部を再配向させるステップと；
前記部分的に脱水した前記組織マトリックスを放射線に曝露することにより、前記マトリックスの三次元構造を安定化させるステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、前記三次元形状がカップ状の形状であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法において、前記三次元形状が管状の形状であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスの流体透過性が、脱水、機械的力の印加、および照射の前の前記組織マトリックスの透過性より低いことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法において、示差走査熱量測定で測定される前記マトリックスの変性温度は、前記マトリックスが製造される組織の変性温度の５℃以内であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、差走査熱量測定で測定される前記変性温度は、前記マトリックスが製造される組織の変性温度の３℃以内であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法において、前記細胞外組織マトリックスは、前記組織マトリックスが製造される組織の三次元形状と異なる安定な三次元形状を形成することを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法において、前記製品が実質的に流体不透過性であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法において、前記マトリックスが、化学架橋剤を使用することなく、安定な三次元形状を形成することを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項１〜１３または３８のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項１〜１３または３８〜３９のいずれか１項に記載の方法において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップが、９５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）の含水量を有する組織マトリックスを製造するように水を除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記組織マトリックスを再水和するステップをさらに含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜１３または３８〜４２のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５Ｇｙ〜５０ｋＧｙの線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項１〜１３または３８〜４３のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線がγ線、電子線、およびＸ線から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項１４〜３７のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項１４〜３７または４５のいずれか１項に記載の方法において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項１４〜３７または４５〜４６のいずれか１項に記載の方法において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項１４〜３７または４５〜４７のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線が５Ｇｙ〜５０ｋＧｙの線量で照射されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項１４〜３７または４５〜４８のいずれか１項に記載の方法において、前記放射線がγ線、電子線、およびＸ線から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法１１９条の下に、米国仮特許出願第６１／３６２，４２４号明細書（２０１０年７月８日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、組織マトリックス、より詳細には組織マトリックスの成形方法およびこれらの方法により製造される組織製品に関する。
【０００３】
患部または損傷組織および器官を再生、修復、またはその他の治療するために様々な組織由来製品が使用される。このような製品としては、インタクトな組織移植片および／または無細胞組織もしくは再構成された無細胞組織（例えば、細胞播種したまたはしていない皮膚、腸、または他の組織由来の無細胞組織マトリックス）を挙げることができる。しかし、このような組織は、一般に、その元の組織によって画定される形状を有する。例えば、皮膚または腸製品には、一般に、比較的柔軟な材料のシートが含まれる。
【０００４】
特定の組織または器官欠損を治療するために、治療される解剖学的構造に、よりぴったりと適合する所定の形状または形態を形成することが望ましい場合がある。従って、組織マトリックスの形状を変化させる方法、ならびに、これらの方法を使用して製造される組織マトリックスを提供する。
【発明の概要】
【０００５】
特定の実施形態により、組織マトリックスの成形方法を提供する。本方法は、コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと；組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；組織マトリックスに機械的力を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向を変化させるステップと；組織マトリックスを放射線に曝露するステップとを含む。
【０００６】
特定の実施形態では、組織製品を提供する。製品は、コラーゲンを含む細胞外組織マトリックスを含み、細胞外組織マトリックスは、細胞外組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；組織マトリックスに機械的力を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部を再配向させるステップと；組織マトリックスを放射線に曝露するステップとを含む方法により形成された安定な三次元形状を有する。
【０００７】
特定の実施形態では、組織製品を提供する。製品は、コラーゲン線維を含む細胞外組織マトリックスを含み、マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向は、マトリックスが製造される組織中の線維の配向と異なり、マトリックスは安定な三次元形状を形成し、示差走査熱量測定で測定したマトリックスの変性温度は、マトリックスが製造される組織の変性温度の５℃以内である。
【０００８】
特定の実施形態では、組織製品を提供する。製品は、コラーゲン線維を含む細胞外組織マトリックスを含み、マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向は、マトリックスが製造される組織中の線維の配向と異なり、マトリックスは、化学架橋剤を使用することなく、安定な三次元形状を形成する。組織製品を部分的に脱水し、製品を放射線に曝露することにより、安定な形状を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、特定の実施形態による成形組織製品である。
【図２】図２は、特定の実施形態による成形組織製品である。
【図３】図３は、特定の実施形態による成形組織製品である。
【図４】図４は、無細胞ヒト皮膚材料および特定の実施形態により製造された成形組織製品の示差走査熱量測定サーモグラムである。
【図５Ａ】図５Ａは、無細胞ヒト皮膚材料の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、無細胞ヒト皮膚材料の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】図６は、無細胞ブタ皮膚材料と特定の実施形態により製造された成形組織製品の示差走査熱量測定サーモグラムである。
【図７Ａ】図７Ａは、無細胞ブタ皮膚材料の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、無細胞ブタ皮膚材料の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図８】図８は、無細胞ブタ皮膚材料と特定の実施形態により製造された成形組織製品についての、フランツセル拡散チャンバ内で組織マトリックスシートを透過するフルオレッセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ウシ（ｂｏｒｉｎｅ）血清アルブミン（ＢＳＡ）の拡散速度のプロットである。
【図９】図９は、フランツセル拡散チャンバ内でフルオレッセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＢＳＡに曝露された後の無細胞ブタ皮膚材料と成形組織製品の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図１０】図１０は、無細胞ブタ皮膚材料と特定の実施形態により製造された成形組織製品の写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、無細胞ブタ動脈の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、無細胞ブタ動脈の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、特定の実施形態により製造された成形組織製品の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ここで、本開示による特定の例示的実施形態、添付の図面に示されている特定の実施例を詳細に参照する。同じまたは類似の部分を指すのに、可能な限り同じ参照番号を図面全体を通して使用する。
【００１１】
本願では、単数形の使用は、特記しない限り、複数形を含む。本願では、「または」の使用は、特記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書に記載する範囲はいずれも、端点および端点間の全ての値を含むものと理解されたい。
【００１２】
本明細書で使用される節の見出しは、構成を目的とするに過ぎず、前述の対象を限定するものと解釈されるべきではない。以下に限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍および条約文書を含む、本願に引用される文献または文献の一部は全て、あらゆる目的でその内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「組織製品」および「成形組織製品」は、細胞外マトリックスを含有し、細胞外マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向を変化させるように処理された任意のヒトまたは動物の組織を指す。「組織製品」としては、無細胞のまたは部分的に脱細胞化された組織マトリックス、外来細胞を再増殖させた（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅｄ）脱細胞化組織マトリックス、および／または、組織の細胞外マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向を変化させるように処理された細胞組織を挙げることができる。
【００１４】
様々なヒトおよび動物の組織を使用して、患者を治療するための製品を製造することができる。例えば、様々な疾患および／または構造的損傷（例えば、外傷、手術、萎縮、および／または長期摩耗および変性）により損傷または損失したヒトの組織を再生、修復、増大、補強、および／または治療するための様々な組織製品が製造されてきた。このような製品としては、例えば、無細胞組織マトリックス、組織同種移植片または異種移植片、および／または再構成組織（即ち、生存可能な材料を製造するために細胞が播種された少なくとも部分的に脱細胞化された組織）を挙げることができる。
【００１５】
特定の実施形態では、これらの製品を完全にまたは部分的に脱細胞化して、患者に使用される無細胞組織マトリックスまたは細胞外組織材料を得ることができる。例えば、皮膚、腸、骨、軟骨、神経組織（例えば、神経線維または硬膜）、腱、靭帯、または他の組織などの様々な組織を完全にまたは部分的に脱細胞化して、患者に有用な組織製品を製造することができる。場合によっては、外来細胞材料（例えば、幹細胞）を添加することなく、これらの脱細胞化製品を使用することができる。特定の場合、治療を促進するために、これらの脱細胞化製品に自己供給源または他の供給源（異種または同種供給源など）からの細胞を播種することができる。無細胞組織マトリックスを製造する好適な方法を後述する。
【００１６】
様々な異なる生物学的および機械的特性が得られるように、組織製品を選択することができる。例えば、マトリックスが移植される部位に通常見られる組織の再生を助けるために、組織の侵入（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）および再構築を可能にするように無細胞組織マトリックスまたは他の組織製品を選択することができる。例えば、無細胞組織マトリックスは、筋膜上または筋膜中に移植される場合、過度の線維化または瘢痕形成がなく、筋膜の再生を可能にするように選択されてもよい。特定の実施形態では、組織製品は、それぞれヒトおよびブタ無細胞皮膚マトリックスである、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）またはＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）から形成することができる。あるいは、以下に詳述する他の好適な無細胞組織マトリックスを使用することができる。細胞外マトリックスを有する組織の成形方法を使用して、任意の種類のコラーゲン組織を処理し、任意の組織マトリックス製品を得ることができる。例えば、Ｂａｄｙｌａｋらにより多くの生物学的足場材料が記載されており、これらの材料のいずれかまたは他のいずれかの類似の材料を使用して安定な三次元形状を有する組織を製造するために、本開示の方法を使用することができる。Ｂａｄｙｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｓ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ（２００８），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２００８．０９．０１３。
【００１７】
大部分の組織は、動物または死体提供者から最初に採取されたとき、元の組織供給源の略形状を維持している。例えば、皮膚移植片は、提供者から最初に切除されたとき、一般に、平面に置かれると平坦で柔軟なシートを形成する。同様に、膀胱、小腸、血管、硬膜、および他の材料も、元の組織供給源の形状を維持する。さらに、切断され、処理された場合（例えば、無細胞組織マトリックスを製造するように）、大部分の組織は、平面に置かれると比較的平坦なシートを形成することができる。
【００１８】
用途によっては、組織製品の形状を変化させることが望ましい場合がある。例えば、無細胞組織マトリックスは様々な異なる解剖学的部位に移植され、移植時に所望の形状に、よりぴったりと適合するように組織マトリックスの形状を制御することが有利な場合がある。例えば、無細胞組織マトリックスまたは他の組織製品は、乳房移植片の周囲に；血管構造の周囲にもしくはそれを置換するように；管腔構造（例えば、尿管、神経、リンパ組織、胃腸構造）の周囲にもしくはそれを置換するように；心臓弁、心膜、もしくは他の心臓構造上に、もしくはそれを置換するように；骨もしくは軟骨材料中もしくはその上に（例えば、耳、鼻、関節表面、歯構造の周囲、または短骨もしくは長骨に沿って）；および／または、いずれかの体腔（例えば、膀胱、胃）を包囲、被覆（ｌｉｎｉｎｇ）、支持、または置換するように、移植することができる。しかし、組織製品の形状を変化させて安定な三次元構造を形成することができる方法には、組織マトリックスに望ましくない変化を生じさせ得るものがある。例えば、化学架橋を使用して安定な三次元構造を形成することができるが、過度の架橋により組織の生物学的特性が変化するおそれがあり、化学架橋剤は、患者に移植されたとき、患者に有害な可能性がある。従って、組織製品の形状を制御する方法を提供する。
【００１９】
特定の実施形態により、組織マトリックスの成形方法を提供する。本方法は、コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと；組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；組織マトリックスに機械的力を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維の配向を変化させるステップと；組織マトリックスを放射線に曝露するステップとを含む。特定の実施形態では、組織製品を提供する。製品は、コラーゲンを含む細胞外組織マトリックスを含み、細胞外組織マトリックスは、細胞外組織マトリックスを部分的に脱水するステップと；組織マトリックスに機械的力を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させるステップと；組織マトリックスを放射線に曝露するステップとを含む方法により形成された三次元形状を有する。特定の実施形態では、コラーゲン線維を含む細胞外組織マトリックスを含む組織製品を提供し、細胞外組織マトリックスは、マトリックスが製造される組織の三次元形状と異なる安定な三次元形状を形成し、示差走査熱量測定で測定したマトリックスの変性温度は、マトリックスが製造される組織の変性温度の５℃以内である。特定の実施形態では、組織製品を提供する。製品は、コラーゲン線維を含む細胞外組織マトリックスを含み、マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向は、マトリックスが製造される組織中の線維の配向と異なり、マトリックスは、化学架橋剤を使用することなく、安定な三次元形状を形成する。
【００２０】
前述のように、本開示の組織製品は、安定な三次元形状を有する細胞外マトリックスを含む。三次元形状は、任意の解剖学的構造に適合するように、および／または患者の身体内または身体上で任意の所望の構造的または機能的役割を果たすように選択することができる。例えば、図１〜３は、特定の実施形態による成形組織製品である。図１は、凸状の背面１２と凹状の内面１４とを有するカップ状のデバイス１０である。カップ状の組織製品は、乳房移植片、例えば、乳房増大および／または再建用の乳房移植片を支持するのに有用な場合がある。例えば、内面１４は、乳房移植片の周囲に配置され、周囲の筋膜、筋肉、または他の組織に結合して、乳房移植片を適切な位置に固定することを助ける、瘢痕形成を低減もしくは防止する、または他に移植片の美的外観を変化させることができる。さらに、このようなデバイスを使用して、体腔（例えば、膀胱または胃）を補強することができる。
【００２１】
必要に応じて、このようなデバイスを変更することができる、例えば、長円形（ｏｂｌｏｎｇ）、完全な球状、および／またはより凸状もしくは凹状にすることができる。さらに、形状は、例えば、特定の解剖学的または美的要求に適合するように、注文成形された製品として形成されてもよく、または特定の用途に標準的なサイズ（例えば、成形組織製品と共に使用される標準的な移植片（乳房移植片など）に適合するサイズ）であってもよい。組織製品は、例えば、縫合、接着剤、または他の接合機構により、組織の縁部を接合して継ぎ目を形成することにより製造されてもよい。さらに、組織製品は、フォルダ（ｆｏｌｄｅｒ）であってもまたは他に曲げられて所望の形状にされてもよい。
【００２２】
図２は、ルーメン２４を有する管状デバイス２０である。デバイス２０は、組織のシートから形成される場合、縫合、接着剤、または他の接合機構で結合される継ぎ目２６を備えてもよい。管状デバイスは、身体管腔構造に関連する症状の治療に、および／または結合組織構造の治療に有用な可能性がある。例えば、管状構造は、血管構造（例えば、動脈もしくは静脈）の治療、置換、もしくは補強に、神経修復もしくは再生を助ける導管として、および／または腱、靭帯、もしくは筋膜の置換、修復、もしくは再生に有用な可能性がある。本開示の方法を使用して、任意の解剖学的構造用の三次元形状を形成することができる。図３は、本開示の方法を使用して無細胞皮膚マトリックスから製造された、鼻の形状の組織製品２８の図である。このような形状を有する組織製品が製造された。本明細書に記載の方法を使用して、任意の所望の解剖学的構造に適合する形状を有する製品を製造することができる。
【００２３】
コラーゲン含有組織マトリックスとしては、無細胞組織マトリックス、または、インタクトな組織もしくは部分的に脱細胞化された組織の一部を形成する組織マトリックスを挙げることができる。幾つかの実施形態では、組織マトリックスは皮膚組織マトリックスを含む。特定の実施形態では、組織は、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択される。
【００２４】
前述のように、組織製品の成形方法は、組織を部分的に脱水するステップを含む。組織の部分的脱水により、コラーゲン材料の細胞外マトリックスの可撓性が増加し、それによりコラーゲン線維の再配向が可能になることが分かった。しかし、過度の脱水（例えば、凍結乾燥によるもの）で組織が脆弱になるおそれがあり、従って、過度の脱水により、後の処理ステップ中に組織が損傷するおそれがある。
【００２５】
様々な好適な方法を使用して、組織マトリックスを部分的に脱水することができる。例えば、好適な方法としては、吸水性タオルでの吸い取り乾燥（ｂｌｏｔ−ｄｒｙｉｎｇ）、湿度制御下での水の等温脱離、組織への機械的力の印加、遠心分離、および／または、制御凍結および／または指向性凍結を挙げることができる。方法がコラーゲンまたは他のタンパク質構造の変化、成長因子の損失、および／または過度の架橋などの望ましくない組織変化を引き起こさない限り、マトリックスの部分的脱水に好適な任意の方法を使用することができる。
【００２６】
様々な実施形態では、処理される組織の種類および製造される所望の形状に基づき、脱水量を選択する。幾つかの実施形態では、９５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）の含水量を有する組織マトリックスを製造するように組織を脱水する。他の実施形態では、８０％（ｗ／ｗ）〜６５％（ｗ／ｗ）、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜９０％、６０〜９０％、６５〜９０％、またはこれらの間の任意の値の含水量になるように組織製品を脱水する。
【００２７】
部分的に脱水した後、組織または無細胞組織マトリックスに機械的力を加えて、組織の細胞外マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させる。これは、最終的な所望の形状を形成するように力が加えられる限り、様々な方法で行うことができる。幾つかの実施形態では、所望の形状を有する成形型を作製し、部分的に脱水された組織または無細胞組織マトリックスのシートを成形型と接触して配置する。次いで、シートの一部に力を加えて繊維を再配向させ、成形型に対応する形状を有する組織製品を製造する。例えば、幾つかの実施形態では、図１に示すカップ状の製品を製造するために、凸状の表面を有する成形型を使用し、成形型上でシートを延伸または引張し、縫合糸で所定の位置に保持する。同様に、図２に示す管状の製品を製造するために、成形型としてダボまたは他の管状構造を選択し、組織または無細胞組織マトリックスのシートをシートに巻き付ける。
【００２８】
力を加える量、方向、および／または方法は、所望の形状に依存し得る。例えば、比較的簡単な形状では、単に、所望の形状を有する成形型に無細胞組織のシートを被せるだけで十分な場合があり、さらに力を加えてマトリックスを延伸または圧縮してもよい。他の場合、例えば、より複雑な形状を形成するために、無細胞組織マトリックスのシートを成形型上に配置することができ、対応する形態を有する第２の成形型を無細胞組織マトリックスの上に配置して、マトリックスを圧縮し、所望の形状を形成することができる。
【００２９】
例えば、前述のように、図３は、特定の実施形態による別の成形組織製品２８を示す。製品２８は鼻の形状を有し、鼻構造を修復または再成形するための組織移植片として使用することができる。製品２８は、２つの成形された成形型の間に無細胞皮膚マトリックスを配置して所望の形状を形成し、成形された形態のマトリックスに照射することにより製造された。
【００３０】
コラーゲン線維を再配向した後、細胞外マトリックスの三次元構造を安定化するように組織製品を処理した。組織製品を放射線に曝露することにより、構造を安定化することができる。放射線は、安定な三次元構造を製造するのに十分な、少しの組織架橋を引き起こすことができる。安定な構造は、成形型に類似の形状（または、照射時点でのマトリックスの形状）に適合する傾向があるが、一般に、組織製品が手術中に操作され、軟組織移植片として機能することを可能にするのに十分な柔軟性がある。例えば、乳房移植片用のカップとして成形された組織製品は、乳房移植片に適合するのに十分な柔軟性があり、望ましくないテクスチャを形成しないが、静止状態で比較的カップ状の形態を維持する。同様に、血管デバイス用の管状の製品は、曲げ、血管部位との吻合、および血管圧力下での拡張を可能にする十分な柔軟性があるが、静止状態のとき（即ち、それに機械的外力がかかっていないとき）管状の形状を維持する。
【００３１】
様々な実施形態では、製品が曝露される放射線の量は、５Ｇｙ〜５０ｋＧｙ、または５Ｇｙ〜２０ｋＧｙであってもよい。特定の実施形態では、放射線は１０ｋＧｙ未満、５ｋＧｙ未満、または１ｋＧｙ未満の線量で照射される。好適な放射線の形態としては、γ線、電子線、およびＸ線を挙げることができる。
【００３２】
前述のように、本開示の組織製品は、組織マトリックス中に望ましくない変化を生じさせることなく、安定な三次元構造を形成することができる。例えば、架橋は三次元形状の維持を助けることができるが、過度の架橋により組織製品の生物学的特性が変化するおそれがある。従って、幾つかの実施形態では、組織製品は、過度の架橋がなく、三次元構造を維持する。
【００３３】
組織の架橋は、示差走査熱量測定で測定される組織マトリックスの変性温度の上昇により、測定することができる。従って、幾つかの実施形態では、本開示の組織製品は、マトリックスが製造される組織の三次元形状と異なる安定な三次元形状を形成する細胞外組織マトリックスを含み、示差走査熱量測定サーモグラムでのマトリックスの変性温度は、マトリックスが製造される組織の変性温度の５℃以内である。特定の実施形態では、示差走査熱量測定で測定される変性温度は、マトリックスが製造される組織の変性温度の３℃以内、２℃以内、または１℃以内である。様々な実施形態では、供給源と処理された組織の変性温度の特定に同じ方法を使用する限り、変性温度はＤＳＣ曲線のピークの温度であってもよく、または、変性開始温度から変性終了温度までの平均として特定されてもよい。さらに、化学架橋剤は不均一で過度の架橋を引き起こすおそれがあるため、および／または有害な可能性があるため、本開示の方法は、化学架橋剤を使用することなく、部分脱水と照射により、安定な三次元形状を有するマトリックスの形成を可能にする。
【００３４】
前述のように、「成形組織製品」としては、無細胞のまたは部分的に脱細胞化された組織マトリックス、外来細胞を再増殖させた脱細胞化組織マトリックス、および／または組織の細胞外マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向を変化させるように処理された細胞組織を挙げることができる。従って、様々な実施形態では、組織製品の成形に必要なもの以外のステップを使用して、組織製品を（例えば、細胞成分を除去して無細胞組織マトリックスを製造するように、および／または抗原性材料を除去するように）処理してもよい。様々な実施形態では、組織製品の成形方法は、他の処理ステップの前および／または後に行うことができる。例えば、無細胞組織マトリックス製品では、成形は脱細胞化プロセスの後にまたはインタクトな組織で行うことができ、インタクトな組織は後で、細胞を除去するように処理される。さらに、幾つかの実施形態では、三次元形状の安定化に放射線が使用されるため、組織製品の形状の安定化と病原菌の破壊の両方の目的で、最終滅菌ステップの一部として照射ステップを行ってもよい。他の実施形態では、放射線を組織製品に照射して安定な三次元形状を形成し、後の照射ステップおよび／または他の滅菌方法を使用して組織を滅菌する。
【００３５】
さらに、本開示の方法により成形された組織製品は、包装および／または再水和されてもよい。特定の実施形態では、低線量の放射線で製品を安定化した後、再水和し、包装することができる。包装後、再度放射線でまたは他の滅菌方法を使用して、製品を最後に滅菌してもよい。
【００３６】
特定の実施形態では、本開示の方法により製造された組織製品の透過性は、製品が製造される組織マトリックスの透過性と異なる。様々な実施形態で、透過性は、血液、漿液血液状液体、尿、または他の体液などの水性液体を含む液体の透過性とすることができる。
【００３７】
特定の実施形態では、成形組織製品は、製品が製造されるマトリックスと比較して、液体透過性が低い。透過性が低い組織製品は、多量の流体に曝露される解剖学的部位、または正常な機能を果たすために流体を保持または排除しなければならない解剖学的部位の治療に、より適している場合がある。例えば、血管構造または尿路構造の一部を修復、置換、または再生する場合、透過性が低く（または、透過性がほとんどもしくは全くなく）、それにより血液または尿などの洪水の漏出が防止されると共に、細胞の侵入と組織の再生が起こることが望ましい場合がある。従って、特定の実施形態では、成形組織製品は、実質的に血液不透過性の管状構造、または、血液、尿、もしくは他の流体を透過させない袋状の構造を備えることができる。
【００３８】
前述の便益および利点は、一実施形態に関する場合もあれば、幾つかの実施形態に関する場合もあることを理解されたい。さらに、「１つ」のものに言及する場合、そのようなものの１つ以上に言及しているものと理解されたい。
【００３９】
前述の実施例および実施形態のいずれかの態様を、適宜、記載されている他の実施例のいずれかの態様と組み合わせて、同等のまたは異なる特性を有し、同じまたは異なる問題に対処するさらに他の実施例を形成してもよい。
【００４０】
好ましい実施形態の前述の説明は単に例として記載しているに過ぎず、当業者により様々な変更が行われ得ることを理解されたい。上記の詳細な説明、実施例およびデータは、本発明の例示的実施形態の構造および使用を完全に説明する。本発明の様々な実施形態をある程度詳細に、または１つ以上の個々の実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、開示される実施形態に多くの変更を行うことが可能である。
【００４１】
実験番号１−無細胞ヒト真皮中のコラーゲン線維の再配向
脱細胞化し、コラーゲン線維を再配向させるための組織の処理：
死体提供者からヒト皮膚を得、上部を厚さ約２ｍｍに分割した。０．５％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ１００を含有する１．０Ｍ塩化ナトリウム溶液中でインキュベートすることにより、室温で１７時間、提供者の皮膚を脱表皮化した。２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム中で２２時間インキュベートすることにより、組織を脱細胞化した。脱表皮化され、脱細胞化された組織マトリックスを、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）中で洗浄し、一時的に貯蔵するために−８０℃で凍結した。凍結真皮は室温（約２２℃）で解凍し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ溶液で終夜洗浄した。
【００４２】
滅菌ＧＡＭＭＡ  ＷＩＰＥＳ（登録商標）で吸い取り乾燥することにより組織マトリックスを部分的に脱水し、乾燥質量１グラム当たり水３．１２±０．２２ｇ（平均±標準偏差、Ｎ＝３）の組織マトリックス水和または最終含水量７５．７％（ｗ／ｗ）を達成した。部分脱水により、組織マトリックス中の水の約５１％が除去されたことになる。吸い取りプロセスはまた、部分的に脱水した組織マトリックスに機械的圧力（圧縮力）を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させるためにも使用された。
【００４３】
脱水され、再配向された組織マトリックスサンプルを、滅菌したプラスチックフィルムバッグに封入した。次いで、プラスチックフィルムバッグを二次箔−箔バッグ（ｆｏｉｌ−ｔｏ−ｆｏｉｌ）に封入し、５００Ｇｙのγ線を３５分間にわたり照射した。照射後、組織マトリックスをＰＢＳ中で再水和した。再水和した組織マトリックスの含水量は、乾燥組織質量１グラム当たり水４．９２±０．３１グラム（Ｎ＝３）または８３．１％（ｗ／ｗ）であり、ＰＢＳ中で再水和した時、５７．７％増加したことになる。再水和されたヒト組織マトリックスの推定空隙率は、約８８±１％（Ｎ＝３）であった。
【００４４】
示差走査熱量測定：
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、対照組織マトリックス（脱細胞化したが、コラーゲン再配向を行わなかったもの）と再水和された成形組織製品との差を評価した。図４は、対照の無細胞ヒト皮膚材料と成形組織製品の示差走査熱量測定サーモグラムである。図示するように、対照の材料と成形組織製品のサーモグラムは非常に類似しており、類似の変性温度を有し、コラーゲン架橋または損傷がほとんどないことが分かった。従って、部分脱水および低線量γ線を用いたコラーゲン線維の再配向では、コラーゲン線維と組織マトリックスの構造および安定性はあまり変化しなかった。
【００４５】
電子顕微鏡検査：
再水和された組織マトリックスを２％グルタルアルデヒド中で２４時間固定し、２５％、５０％、７５％、９０％、９８％および１００％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中で順次脱水した。各エタノール脱水ステップの持続時間は、少なくとも２時間であった。エタノールで脱水したサンプルをヘキサメチルジシラザン中で乾燥させ、次いで、１０キロボルトで走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を行う前に金でスパッタコーティングした。
【００４６】
図５Ａ〜図５Ｄは、対照の無細胞ヒト皮膚材料（図５Ａおよび図５Ｂ）と成形組織製品（図５Ｃおよび図５Ｄ）の走査型電子顕微鏡写真である。低倍率画像（図５Ａおよび図５Ｃ）から、処理の結果、コラーゲン線維の再配列が起こったことが分かる。さらに、より高倍率の画像（図５Ｂおよび図５Ｄ）から、処理によりコラーゲン線維の構造は変化しなかったことが分かる。
【００４７】
実験番号２−無細胞ブタ真皮中のコラーゲン線維の再配向
脱細胞化し、コラーゲン線維を再配向させるための組織の処理：
ブタ皮膚を分割し、表皮と皮下脂肪を除去した。残りの組織は、厚さ１．９±０．２ｍｍ（Ｎ＝５）であった。２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム中で２４時間室温でインキュベートすることにより組織を脱細胞化した後、１回の洗浄につき２時間、ＰＢＳで３回洗浄した。脱細胞化された皮膚マトリックスを滅菌ＧＡＭＭＡ  ＷＩＰＥＳ（登録商標）で吸い取り乾燥させることにより部分的に脱水し、乾燥組織質量１グラム当たり水２．３４±０．３７グラムの組織水和レベルまたは７０％（ｗ／ｗ）の最終含水量を達成した。脱水により約４３％の組織水が除去された。吸い取りプロセスは、組織マトリックスに機械的圧力（圧縮力）を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させるためにも使用した。
【００４８】
組織サンプルを滅菌したプラスチックフィルムバッグに封入した。プラスチックバッグを二次箔−箔バッグに封入し、５００Ｇｙのγ線を３５分間にわたり照射した。γ線照射後、ブタ皮膚マトリックスをＰＢＳ中で再水和した。完全に再水和された組織マトリックスは、乾燥組織質量１グラム当たり水２．８４±０．３８グラム（Ｎ＝１０）の水和または７４％（ｗ／ｗ）の含水量を有した。再水和されたブタ真皮マトリックスの推定空隙率は、組織マトリックス中の含水量によれば、約８０±２％（Ｎ＝１０）であった。
【００４９】
示差走査熱量測定：
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、対照組織マトリックス（脱細胞化したが、コラーゲン再配向を行わなかったもの）と再水和された成形組織製品との差を評価した。図６は、対照の無細胞ブタ皮膚材料と成形組織製品の示差走査熱量測定サーモグラムである。図示するように、サーモグラムでの成形組織製品の変性温度は、僅かに高温に（１〜２℃）シフトしたが、対照の材料と成形組織製品のサーモグラムは類似していた。コラーゲンの再配向とγ線照射により生じたシフトが小さかったことから、コラーゲン架橋の量が少ないことが分かった。
【００５０】
電子顕微鏡検査：
再水和されたサンプルを、ＳＥＭ観察について実施例１に記載したように、固定し、脱水し、準備した。図７Ａ〜図７Ｄは、対照の無細胞ブタ皮膚材料（図７Ａおよび図７Ｂ）と成形組織製品（図７Ｃおよび図７Ｄ）の走査型電子顕微鏡写真である。低倍率画像（図７Ａおよび図７Ｃ）から、処理の結果、コラーゲン線維の再配列が起こったことが分かる。さらに、より高倍率の画像（図７Ｂおよび図７Ｄ）から、処理によりコラーゲン線維が互いに接近したが、コラーゲン線維の構造は変化しなかったことが分かる。
【００５１】
組織の透過性：
０．９ｃｍの開口部を有するフランツセル拡散チャンバを使用し、組織マトリックスシートを透過するフルオレッセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＢＳＡの拡散速度を測定した。ドナーチャンバのＦＩＴＣ−ＢＳＡ濃度は１０μｇ／ｍｌに維持した。レセプターチャンバの溶液の蛍光を１時間毎に７時間測定した。拡散評価の終了時、組織サンプルを１０ミクロンの薄片に凍結薄切し、蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【００５２】
図８は、無細胞ブタ皮膚材料とこの実施例に記載のように製造された成形組織製品についての、フランツセル拡散チャンバ内で組織マトリックスシートを透過するフルオレッセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＢＳＡの拡散速度のプロットである。図９は、フランツセル拡散チャンバ内でフルオレッセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＢＳＡに曝露された後の、無細胞ブタ皮膚材料と成形組織製品の蛍光顕微鏡画像をそれぞれ示す。
【００５３】
図示するように、拡散速度プロットおよび顕微鏡画像で、成形組織製品を透過する拡散速度は、再成形されなかった無細胞ブタ皮膚マトリックスを透過する拡散速度より著しく低かった。このデータから、コラーゲンの再配列方法により組織マトリックスの透過性を変化させることができ、組織マトリックスの透過性を低下させることができることが分かる。
【００５４】
実験番号３−平坦な無細胞ブタ皮膚シートの３Ｄ形状への成形
ブタ皮膚を０．２％水酸化カルシウム溶液に５日間浸漬して、表皮と体毛を浸軟させ（ｌｏｏｓｅｎ）、表皮と体毛を擦り取ることにより機械的に除去した。脱表皮化し、脱毛した真皮を酢酸で中和し、蒸留水中で４８時間十分洗浄した。次いで、清浄にした真皮を、２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム溶液と１０ｍＭのＥＴＤＡとを含有する溶液中に４０時間浸漬することにより脱細胞化した。脱細胞化後、皮膚マトリックス（厚さ約２ｍｍ）をＰＢＳ溶液中で洗浄し、残留界面活性剤を除去した。
【００５５】
皮膚シートを３Ｄ湾曲組織マトリックスに成形するため、ＧＡＭＭＡ  ＷＩＰＥＳ（登録商標）で吸い取り乾燥することによりシートを部分的に脱水した。次いで、このシートを、半球状の形状を有する成形型の上に張力（約５Ｎ）をかけて載置した。シートを縫合糸で所定の位置に固定した。載置した材料を箔−箔バッグに包装し、１６．７ｋＧｙの電子線を照射した。電子線で処理された真皮を成形型から取り外し、ＰＢＳ溶液中で完全に再水和させた。無細胞ブタ真皮９０と成形組織製品９２の未処理シートを図１０に示す。図示するように、成形組織製品は安定な三次元カップ形状を維持したが、柔軟性を保ち、未処理無細胞シートに非常に類似する手触りを有した。
【００５６】
実験番号４−ヒト皮膚シートの３Ｄ形態への成形
死体提供者からヒト皮膚を得た。ダーマトームを使用して表皮を除去した。皮膚組織（約２．５ｍｍ）を２４時間２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウムで脱細胞化し、ＰＢＳ中で２０時間洗浄して、界面活性剤残留物を除去した。脱細胞化された皮膚シート片を吸い取り乾燥させ、プラスチックコーン（ｐｌａｓｔｉｃ  ｃｏｎｅ）（φ＝４ｃｍ）上に載置した。第２のプラスチックコーンをその上に載せ、皮膚マトリックスをコーンの形態に固定した。この構造物を箔−箔バッグに包装し、１６．７ｋＧｙの線量で電子線を照射した。
【００５７】
電子線で処理された真皮は、プラスチック成形型（図示せず）から取り外された後、そのコーンの形状を維持した。皮膚シートを折り畳み、角度の付いた／フォルダ（ｆｏｌｄｅｒ）形態を形成することにより、他の形状を形成した（結果は図示していない）。
【００５８】
実験番号５−無細胞ブタ動脈中のコラーゲン線維の再配向
ブタ頚動脈（長さ７〜８ｃｍ）を動物の首から切除し、その外径により２群に分けた（Ａ群、５〜６ｍｍ；Ｂ群、７〜８ｍｍ）。切除した動脈を３０分間０．５％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ１００で洗浄し、血液を除去した。動脈を凍結し、抗生物質カクテル（５０μｇ／ｍｌペニシリン、１．２５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢ、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含有する２％デオキシコール酸ナトリウム溶液中で３回解凍した。凍結−解凍サイクルの後、動脈を３７℃で９６時間、同じデオキシコール酸ナトリウム溶液中で脱細胞化した。脱細胞化された動脈を、５０ｕ／ｍｌペニシリン、１．２５ｕｇ／ｍｌアムホテリシンＢ、および５０ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを有するＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで４回洗浄した（１回の洗浄につき２時間）。Ａ群とＢ群の処理された動脈の半分を、抗生物質を有するＰＢＳ中で４℃で貯蔵した。処理された動脈の他方の半分にγ線を照射した。各動脈に５−ｍｍの外科用ドレーンを挿入して支持した後、動脈をＧＡＭＭＡ  ＷＩＰＥＳ（登録商標）で吸い取り乾燥させた。吸い取りプロセスは、組織マトリックスに機械的圧力（圧縮力）を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させるためにも使用した。
【００５９】
吸い取り乾燥後、動脈を滅菌したプラスチックフィルムバッグおよび二次箔−箔バッグに包装した。動脈に１ｋＧｙのγ線を照射した。脱細胞化プロセスにより、内膜から内皮細胞を、媒体から平滑筋細胞を、および外膜中の線維芽細胞を除去した。脱細胞化された動脈は、自重で崩壊し得る非常に疎な（ｌｏｏｓｅ）コラーゲンとエラスチンの組織マトリックスを含んだが、成形製品（脱水し、コラーゲン再配列したもの）は、平面上に置かれても、管状構造を有する開放管腔を維持した。
【００６０】
図１１Ａ〜図１１Ｄは、吸い取り乾燥と照射を行わなかった無細胞ブタ動脈（図１１Ａおよび図１１Ｂ）と、吸い取り乾燥と照射を行った無細胞動脈を含む成形組織製品（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の走査型電子顕微鏡写真である。部分脱水と照射により、動脈マトリックスの強度が増加し、管状構造が自重で崩壊することが防止された。さらに、図１１Ａ〜図１１Ｄで分かるように、処理された動脈組織マトリックスの方がコラーゲン線維の密度が高かったが、それらは吸い取り乾燥時に再配向された。
【００６１】
実験番号６−巻かれたヒトおよびブタ真皮マトリックスの安定化
ＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）およびＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）皮膚組織マトリックスを入手した。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）は凍結乾燥させた無細胞ヒト皮膚マトリックスであり、ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）は水和された無細胞ブタ皮膚マトリックスである。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）組織マトリックスをＰＢＳ中で無菌的に再水和させ、３回洗浄して凍結保護物質を除去した。使用の準備が整うまで、再水和されたヒト皮膚マトリックスを４℃で貯蔵した。ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）組織マトリックスをＰＢＳ中で３回無菌的に洗浄し、組織保存溶液を除去した。
【００６２】
水和後、ヒトおよびブタ皮膚組織マトリックスは、円筒状の形状に巻くことができる柔軟なシートとなった。しかし、巻かれたシートは、生理食塩水溶液に入れると、容易に広がり平坦なシートになった。シートロールを安定化させるため、ヒトおよびブタ皮膚シートを、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）では含水量が約７５％（ｗ／ｗ）になるまで、ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）では７０％（ｗ／ｗ）になるまで吸い取り乾燥させた。外科用ドレーンチューブを使用して、吸い取り乾燥させた（部分的に脱水した）シートを巻いた。巻かれたシートを滅菌したプラスチックフィルムバッグおよび二次箔−箔バッグに包装し、１ｋＧｙのγ線を照射した。γ線照射後、巻かれた皮膚マトリックスは、生理食塩水溶液に入れても広がらなかった。
【００６３】
ＳＥＭ分析のため、実施例１に記載のようにサンプルを準備した。図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ、成形されたヒト皮膚無細胞組織マトリックスと成形されたブタ皮膚無細胞組織マトリックスのＳＥＭ画像である。図示するように、コラーゲン線維は、圧縮領域１１０と伸長領域１２０とを有し、これらの領域で線維は安定に再配向されて管状構造を形成した。
【００６４】
無細胞組織マトリックス
「無細胞組織マトリックス」という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞および／または細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）、および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを製造することができる。無細胞組織マトリックスが細胞および／または細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、多くの方法で無細胞組織マトリックスの試験または評価を行うことができる。例えば、処理された組織を光学顕微鏡検査で検査して、細胞（生細胞もしくは死細胞）および／または細胞成分が残存するかどうか判定することができる。さらに、特定のアッセイを使用して細胞または細胞成分の有無を確認することができる。例えば、ＤＮＡまたは他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス中に残存する核物質を定量化することができる。一般に、残存するＤＮＡまたは他の核酸がない場合、完全に脱細胞化されている（即ち、細胞および／または細胞成分が除去されている）ことが分かる。最後に、細胞特有の成分（例えば、表面抗原）を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。
【００６５】
一般に、無細胞組織マトリックスの製造に必要なステップには、提供者（例えば、ヒトの死体または動物供給源）から組織を採取するステップと、生物学的および構造的機能を維持する条件で細胞を除去するステップとが含まれる。特定の実施形態では、本方法は、細胞除去と共にまたはその前に、組織を安定化させ、生化学的および構造的分解を回避するための化学処理を含む。様々な実施形態では、安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己分解性およびタンパク質分解性の分解を抑制および防止し、微生物汚染から保護し、例えば、平滑筋成分（例えば、血管）を含む組織で起こり得る機械的損傷を低減する。安定化溶液は、適切な緩衝液、１種類以上の酸化防止剤、１種類以上の膠質浸透圧剤（ｏｎｃｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、１種類以上の抗生物質、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１種類以上の平滑筋弛緩剤を含有してもよい。
【００６６】
次いで、組織を脱細胞化溶液に入れ、コラーゲンマトリックスの生物学的および構造的完全性を損なわないように構造的マトリックスから生細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞）を除去する。脱細胞化溶液は、適切な緩衝液、塩、抗生物質、１種類以上の界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、架橋を防止する１種類以上の薬剤、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１種類以上の酵素を含有してもよい。幾つかの実施形態では、脱細胞化溶液は、ゲンタマイシンを有するＲＰＭＩ媒体中１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）および２５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む。幾つかの実施形態では、組織を脱細胞化溶液中で、３７℃で終夜、９０ｒｐｍで穏やかに振盪しながらインキュベートする。特定の実施形態では、追加の界面活性剤を使用して、組織サンプルから脂肪を除去してもよい。例えば、幾つかの実施形態では、２％デオキシコール酸ナトリウムを脱細胞化溶液に添加する。
【００６７】
脱細胞化プロセスの後、組織サンプルを生理食塩水で十分に洗浄する。幾つかの例示的実施形態では、例えば、異種間材料を使用する場合、脱細胞化された組織を終夜、室温でデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）溶液で処理する。幾つかの実施形態では、組織サンプルをＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２および２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で調製されたＤＮアーゼ溶液で処理する。任意選択により、抗生物質溶液（例えば、ゲンタマイシン）をＤＮアーゼ溶液に添加してもよい。緩衝液が好適なＤＮアーゼ活性を付与する限り、任意の好適な緩衝液を使用してもよい。
【００６８】
無細胞組織マトリックスは無細胞組織マトリックス移植片のレシピエントと同種の１つ以上の個体から製造されてもよいが、必ずしもこのように製造されるわけではない。従って、例えば、無細胞組織マトリックスはブタ組織から製造され、ヒトの患者に移植されてもよい。無細胞組織マトリックスのレシピエント、および無細胞組織マトリックスを製造するための組織または器官のドナーの役割を果たすことができる種としては、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、ヒヒ、またはチンパンジー）、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスなどの哺乳類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
コラーゲン含有材料からα−ｇａｌエピトープを除去すると、コラーゲン含有材料に対する免疫反応を低下させることができる。α−ｇａｌエピトープは、霊長類以外の哺乳類および新世界ザル（南米のサル）に、ならびに細胞外成分である糖タンパク質などの高分子に発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５（１９８８）。しかし、このエピトープは、旧世界霊長類（アジアやアフリカのサル、および類人猿）およびヒトには存在しない。抗ｇａｌ抗体は、ヒトおよび霊長類では、腸内細菌のα−ｇａｌエピトープ糖鎖構造に対する免疫反応の結果として産生される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７３０（１９８８）；Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２２３（１９９２）。
【００７０】
霊長類以外の哺乳類（例えば、ブタ）は、α−ｇａｌエピトープを産生するため、コラーゲン含有材料をこれらの哺乳類から霊長類に異種移植すると、コラーゲン含有材料上のこれらのエピトープに霊長類の抗Ｇａｌが結合するため、拒絶が起こることが多い。結合の結果、補体結合により、および抗体依存性細胞障害によりコラーゲン含有材料が破壊される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：４８０（１９９３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１３９１（１９９３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５００（１９９５）。さらに、異種移植の結果、免疫系の著しい活性化が起こり、多量の高親和性抗ｇａｌ抗体が産生される。従って、幾つかの実施形態では、α−ｇａｌエピトープを産生する動物を組織供給源として使用する場合、細胞から、およびコラーゲン含有材料の細胞外成分からα−ｇａｌエピトープを実質的に除去することにより、ならびに細胞α−ｇａｌエピトープの再発現を防止することにより、α−ｇａｌエピトープへの抗ｇａｌ抗体の結合に伴うコラーゲン含有材料に対する免疫反応を低下させることができる。
【００７１】
α−ｇａｌエピトープを除去するため、組織を生理食塩水で十分に洗浄してＤＮアーゼ溶液を除去した後、組織サンプル中に特定の免疫原性抗原が存在する場合、それを除去するために、組織サンプルに１つ以上の酵素処理を施してもよい。幾つかの実施形態では、組織中にα−ｇａｌエピトープが存在する場合、それを除去するために、組織サンプルをα−ガラクトシダーゼ酵素で処理してもよい。幾つかの実施形態では、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で調製された３００Ｕ／Ｌの濃度のα−ガラクトシダーゼで組織サンプルを処理する。他の実施形態では、採取した組織からα−ｇａｌエピトープを十分除去するために、α−ガラクトシダーゼの濃度を４００Ｕ／Ｌまで増加させる。抗原の十分な除去が達成される限り、任意の好適な酵素濃度および緩衝液を使用してもよい。
【００７２】
あるいは、組織を酵素で処理するのではなく、１つ以上の抗原性エピトープが欠損するように遺伝子操作された動物を組織供給源として選択してもよい。例えば、末端α−ガラクトース部分が欠損するように遺伝子操作された動物（例えば、ブタ）を組織供給源として選択することができる。適切な動物の説明については、同時係属中の米国特許出願第１０／８９６，５９４号明細書および米国特許第６，１６６，２８８号明細書を参照されたい（これらの開示は、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、α−１，３−ガラクトース部分が減量または欠損しているまたはしていない、無細胞マトリックスを製造するための特定の例示的組織処理方法が、Ｘｕ，Ｈｕｉ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｔｈａｔ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  Ｓｏｆｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−α−（１，３）−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１５，１−１３（２００９）に記載されており、この文献は参照によりその内容全体が援用される。
【００７３】
無細胞組織マトリックスを形成した後、任意選択により組織適合性生細胞を無細胞組織マトリックス中に播種して移植片を製造してもよく、それはさらに宿主により再構築され得る。幾つかの実施形態では、移植前に標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞共培養法により、または移植後にｉｎ  ｖｉｖｏ再増殖により組織適合性生細胞をマトリックスに添加してもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ再増殖は、無細胞組織マトリックス中に移動するレシピエント自身の細胞で行われても、またはレシピエントから得られた細胞もしくは別のドナーからの組織適合性細胞を無細胞組織マトリックス中にｉｎ  ｓｉｔｕで注入もしくは注射することにより行われてもよい。胚性幹細胞、成人幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）、および／または神経細胞を含む様々な種類の細胞を使用することができる。様々な実施形態では、これらの細胞を移植直前または移植後に無細胞組織マトリックスの内部に直接付着させることができる。特定の実施形態では、移植前に、移植される無細胞組織マトリックス中に細胞を配置し、培養してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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