(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの環状βグルカン（ＣβＧ）化合物を含む、１つ以上の抗原に対する獲得免疫応答を誘起するための免疫アジュバント組成物であって、
前記環状βグルカン（ＣβＧ）化合物は、β−（１，２）グリコシド結合だけで連結された１７〜２５個のグルコース残基を含む環状骨格を有する炭水化物である、免疫アジュバント組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのＣβＧが、スクシニル残基、ホスホグリセロール残基、ホスホエタノールアミン残基、ホスホコリン残基、アセチル残基およびメチルマロニル残基からなる群から選択される、少なくとも１つの天然置換残基で置換される、請求項１記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの天然置換残基がスクシニル残基である、請求項２記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項４】
天然置換残基の数は、１〜２５個である、請求項２又は３記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項５】
天然置換残基の数は、１〜３個である、請求項４記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのＣβＧが、ブルセラ（Brucella）から得られたＣβＧである、請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのＣβＧが、ブルセラ・メリテンシス（B. melitensis）またはブルセラ・アボルツス（Brucella abortus）から得られたＣβＧである、請求項６記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項８】
−  請求項１〜７のいずれか１項記載の免疫アジュバント組成物と、
−  少なくとも１つの抗原と
を含む、１つ以上の抗原に対する獲得免疫応答を誘起するためのキット。
【請求項９】
−  請求項１〜７のいずれか１項記載の免疫アジュバント組成物と、
−  １つ以上の抗原と
を含む、１つ以上の抗原に対する獲得免疫応答を増強するために使用されるワクチン組成物。
【請求項１０】
ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を増強することにより、１つ以上の抗原に対する獲得免疫応答を増強するために使用される、請求項９記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫アジュバントとして使用するための環状βグルカン化合物およびそれを含むワクチン組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
安全で有効なワクチンの開発は、依然として全世界の公衆衛生における主要な目標である。
【０００３】
今日のワクチンの大半は２つの主要な成分からなる：（ｉ）治療対象のターゲット抗原および（ｉｉ）前記抗原に対する免疫原性を刺激および／または誘発する免疫アジュバント（群）。
【０００４】
公知の免疫アジュバントの性質は大きく異なるが、しかしこうした免疫アジュバントとしては、特に鉱油、細菌抽出物、生きた生物および弱毒化生物、並びに水酸化アルミニウム金属の懸濁液がある。
【０００５】
たとえ免疫アジュバントが増強された免疫応答を与えるとしても、その使用により、特にその投与経路に応じて、有害な副作用を誘発する可能性もある。それ故、ヒトにおいて承認されかつ有効である免疫アジュバントの数は依然として比較的少ない。従って、内毒素副作用などの有害な副作用を引き起こすことなく免疫アジュバントとして使用することのできる新規な化合物が必要とされる。
【０００６】
細菌感染に対する免疫応答は、自然免疫系および獲得免疫系の両方の複合した作用に依拠する。樹状細胞（ＤＣｓ）は、免疫応答の開始および調節において重要な役割を果たす、最も効果のあるプロフェッショナル抗原提示細胞ＡＰＣｓである。ＤＣｓは、侵入する細菌およびウイルスなどの抗原を検出、捕獲、および処理する重要な番人であり、そして、末梢組織から二次リンパ器官へと移動して、一次Ｔ細胞応答を誘発する能力を有する。微生物による刺激にさらされると、ＤＣｓは、ＭＨＣ−ペプチド複合体の増加した形成、共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０）のアップレギュレーションおよびサイトカイン産生によって特徴付けられる成熟過程を受ける。その他に、ＤＣ成熟過程の他の特質は、所属リンパ節への移動を容易にするケモカインレセプター（ＣＣＲ７）の誘導およびＴ細胞を活性化する能力の向上である。
【０００７】
ＤＣｓは、微生物による刺激（病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）とも呼ばれる）を、高度に保存されたレセプターであるパターン認識レセプター（ＰＲＲｓ）によって認識する。最も良く知られ特徴付けられているクラスのＰＲＲｓはＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲｓ）およびＣ型レクチンレセプター（ＣＬＲｓ）である。例えば、リポタンパク質およびペプチドグリカンはＴＬＲ２によって、ｄｓＲＮＡはＴＬＲ３によって、ＬＰＳはＴＬＲ４によって、ＣｐＧはＴＬＲ９によって、フラジェリンはＴＬＲ５によって、ｓｓＲＮＡはＴＬＲ７／８によって、ＣｐＧはＴＬＲ９によって、マンノース含有分子はＤＣ−ＳＩＧＮによって、そして鎖状β−グルカンはデクチン−１によって認識される。これらのレセプターがトリガーされると、炎症応答の誘導のために下流シグナル伝達カスケードが活性化される。ＴＬＲ関与の後に活性化されるシグナル伝達経路は、ＭｙＤ８８が補充されるか否かに依存して変化し得る。ＴＬＲ３およびＴＬＲ４に独特であるＭｙＤ８８非依存性経路により、インターフェロン調節因子−３の発現がなされるが、一方、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲｓに存在するＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、ＭＡＰＫｓおよびＮＦ−κＢ誘導に収束して、最後にその生物学的効果を奏功する。
【０００８】
浸透圧調節性ペリプラスムグルカン（ＯＰＧｓ）は、グラム陰性細菌エンベロープのペリプラスム間隙の一般的な構成成分である（２２）。それらは試験した全てのプロテオバクテリアに見出された。ＯＰＧｓは様々な種間で極めて異なる構造を示すが、それらはいくつかの共通した特徴を共有する：（ｉ）それらは限定されたユニット数（５〜２４）からなるオリゴ糖である；（ｉｉ）Ｄ−グルコースが唯一の構成成分の糖である；（ｉｉｉ）グルコース単位が、少なくとも部分的には、β−グルコシド結合によって連結されている；（ｉｖ）ペリプラスムにおけるグルカン濃度は、環境の浸透圧の減少に応答して増加する。ＯＰＧｓは重要な生物学的機能を有するようである。なぜなら、ＯＰＧ合成の欠損した突然変異体は、高度に多面的な表現型を提示するからである（例えば、走化性、運動性、外膜の安定性の減少、および菌体外多糖の合成、並びに、低浸透圧培地における欠陥のある増殖）（２２）。加えて、それらは真核生物宿主と成功裏の病原性または共生の関連を確立することができない（１）。
【０００９】
ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）は、ヒトを含む、哺乳動物の通性の細胞内病原体として考えられているα−プロテオバクテリアである。ブルセラ症と呼ばれる、生じる人畜共通感染症の発病は、Ｂｒｕｃｅｌｌａが、プロフェッショナルおよび非プロフェッショナルの両方の食作用性宿主細胞において細胞内で生存および複製できる能力に最も連関している。Ｂｒｕｃｅｌｌａ属では、環状βグルカン（ＣβＧ）は、１７から２５の範囲の重合度を有する環状骨格からなり、全てのグルコース単位はβ−１，２結合によって連結されている（ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧ）（２）。環状グルカンの存在は、完全なブルセラ・アボルツス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）病原性に必要とされると記載されている（１）。さらに、Arellano-Reynoso et al. (3)は、脂質ミクロドメイン組成をモデュレーションするＢｒｕｃｅｌｌａのＣβＧは、リソソーム融合を防ぎ、そしてＢｒｕｃｅｌｌａがその複製ニッチに到達するのを可能とするのに必須であると決定した。ＣβＧは大量に発現され、細菌乾燥重量の１〜５％を示す（参考文献）。それ故、もし単一の細菌の内容物がＢｒｕｃｅｌｌａ含有液胞内に放出されると考えれば、その容量は約１０フェムトリットルであり、液胞内のＣβＧの濃度はmM範囲であろう。このことは、アポトーシス細胞から放出された数千個の細菌が死滅した場合に、外部培地に放出されるＣβＧをμMの範囲で推定することができることを意味し、そしてこれは免疫系に対していくらかの重要な結果を及ぼし得る。
【００１０】
宿主−病原体の相互作用に関与する重要なＰＡＭＰｓとしてのグルカン、特に鎖状βグルカンの役割（４、５）が詳細に記載されている。興味深いことに、鎖状（１---３）βグルカンはその免疫調節特性のために認識されている。なぜなら、それらは、抗腫瘍特性（６）および細菌（７）、ウイルス（８）、真菌（９）および原虫（１０）感染に対する抗感染特性を有することが示されているからである。しかしながら、現在までに、免疫系のモデュレーターとしての環状β−グルカンの特性に関する報告は全くない。
【００１１】
発明の要約
本発明者らは、Ｂｒｕｃｅｌｌａ環状βグルカン（ＣβＧ）が、本明細書の実施例に示したように免疫アジュバント活性を示すことを実証した。
【００１２】
また、本発明によると、これらの新規アジュバント化合物は、特に新規なクラスの樹状細胞活性化分子を示すことが示された。本発明者らは初めて、ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧがＴＬＲ４アゴニストであり、そしてマウスおよびヒトＤＣｓの強力なアクチベーターであることを実証する。なぜなら、それは樹状細胞の成熟、炎症誘発性サイトカインの分泌、並びにＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方の活性化および増殖を誘導できるからである。
【００１３】
従って、本発明の前記の新規な環状βグルカン化合物は、免疫応答を誘導および／または増強するための免疫アジュバントとして特に有用である。
【００１４】
従って、本発明は、少なくとも１つの環状βグルカン化合物を含む免疫アジュバント化合物に関する。
【００１５】
本発明はまた、前記に定義したような免疫アジュバント化合物、１つ以上の抗原、および場合により１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、ワクチン組成物に関する。
【００１６】
本発明はまた、医薬品として使用するための（特にアジュバント活性を誘導および／または増強するために）、前記に定義したような免疫アジュバント化合物に関する。
【００１７】
本発明はまた、特に１つ以上の抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強するための、ワクチン組成物を製造するための、本発明による免疫アジュバント化合物の使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、例えば病原体に対する防御免疫応答を誘導するための、または被験体もしくは動物を感染から効果的に防御するための、同時、別々または連続して使用するための複合調製物としての、
−  本発明による免疫アジュバント化合物、
−  少なくとも１つの抗原
を含むキットに関する。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体において樹状細胞（ＤＣｓ）の成熟を誘導するための治療法において使用するための環状βグルカン化合物に関する。
【００２０】
本発明の別のさらなる目的は、免疫アジュバントとして使用するための環状βグルカン化合物に関し、前記化合物は、それを必要とする被験体において樹状細胞（ＤＣｓ）の成熟を誘導するために使用される。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ヒトおよびマウスの両方のＤＣｓ上におけるサイトカインの産生、ＭＨＣ−ＩＩおよび共刺激分子の表面発現、遺伝子発現、毒性、並びに抗体応答の点に関して、ＤＣｓ成熟に対するＢｒｕｃｅｌｌａ環状βグルカン（ＣβＧ）および他の環状グルカンの効果を調べた。本発明者らは、ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧがマウスおよびヒトのＤＣｓの強力なアクチベーターであることを実証した。さらに、異なる構造を有する環状グルカンは、同じ活性化応答を誘導せず、このことは、異なる構造を有するＣβＧは、異なる活性化特性を有し得ることを示す。本発明者らはまた、ＣβＧが新規なクラスのＴＬＲ４アゴニストを示すことも実証した。実際に、前記の環状βグルカンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症誘発効果と共に、ＴＬＲ４により媒介されるアジュバント特性を有するが、全身注射後に有意な全身性の内毒素副作用を示さないことが実証された。本明細書の実施例に含まれる結果は、前記の環状βグルカンが有意な内因性抗原性作用を示さず、すなわち、対象の分子は、特に血清中への環状βグルカン抗体をトリガーする能力を防ぐまたは減弱することを示す。従って、本発明者らは、ＣβＧは次のクラスの免疫アジュバントを示し得ることを実証する。
【００２２】
従って、本発明の第１の局面は、少なくとも１つの環状βグルカン（ＣβＧ）化合物を含む免疫アジュバント化合物に関する。
【００２３】
本発明はまた、免疫アジュバントとして使用するための環状βグルカン化合物に関する。
【００２４】
本明細書において使用する「免疫アジュバント」という用語は、被験体または動物に投与された場合に、抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強することのできる化合物を指す。それはまた、特定の抗原に対する特定の免疫応答の品質を一般的に加速、延長または増強するように作用する物質を意味するものでもある。本発明の脈絡において、「免疫アジュバント」という用語は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に樹状細胞（ＤＣｓ）の活性化および成熟による、自然免疫応答の一過性反応に影響を及ぼすことによる自然免疫応答および獲得免疫応答のより長時間の作用の両方を増強する、化合物を意味する。
【００２５】
従って、本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体における樹状細胞（ＤＣｓ）の成熟を誘導するための治療法において使用するための環状βグルカン化合物に関する。
【００２６】
本発明の別のさらなる目的は、免疫アジュバントとして使用するための環状βグルカン化合物に関し、前記化合物は、それを必要とする被験体における樹状細胞（ＤＣｓ）の成熟を誘導するために使用される。
【００２７】
本明細書において使用する「抗原」という用語は、抗体によって、または処理されそしてＭＨＣ分子によって提示された場合にはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって特異的に結合され得る分子を指す。本明細書において使用する「抗原」という用語はまたＴ細胞エピトープも包含する。抗原はさらに、免疫系によって認識され得、そして／またはＢおよび／またはＴリンパ球の活性化に至る体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することができる。抗原は、１つ以上のエピトープまたは抗原性部位（ＢおよびＴエピトープ）を有し得る。
【００２８】
本明細書において使用する「環状βグルカン化合物」すなわち「ＣβＧ化合物」という用語は、β−（１，２）グリコシド結合だけで連結された１７〜２５個のヘキソース残基を含む環状骨格を有する低分子量の細胞表面炭水化物を指す。ヘキソース残基は、天然に存在するヘキソース単位、並びに天然に存在しないヘキソース、ヘキソース類似体および模倣体を取り込んだ構造的改変体からなる群より選択され得る。当業者は、どのような構造が機能的に等価なヘキソース類似体およびヘキソース模倣体を構成するかを知っているかまたは決定することができる。好ましくは、天然に存在するヘキソース単位は、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノースおよびタロースのような環状構造を形成し得るアルドヘキソースからなる群より選択され得る。好ましくは、天然に存在するヘキソース単位はグルコースである。
【００２９】
いくつかの態様において、ヘキソース単位上に位置する遊離ヒドロキシル基を使用することによって共有結合的に、および／または約１０Åの受容分子のニッチを示すドーナツ様の環の形状によって作り出される荷電相互作用によって非共有結合的に、種々の分子を本発明の環状βグルカン化合物に付着させることができる（１１）。前記分子は、ポリペプチド、炭水化物、核酸または脂質（例えばコレステロール）からなる群より選択され得る。
【００３０】
いくつかの態様において、ヘキソース残基は、少なくとも１つの天然の置換残基を用いて置換され得る。「天然置換残基」という用語は、スクシニル（Ｓｕｃ）残基（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓＣβＧおよびシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｔｏｔｉ）ＣβＧにおけるような）、ホスホグリセロール残基（Ｐ−Ｇｒｏ）（エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣβＧおよびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｔｏｔｉＣβＧにおけるような）；ホスホエタノールアミン（Ｐ−Ｅｔｎ）残基（Ｅ．ｃｏｌｉＣβＧにおけるような）；ホスホコリン残基（Ｐ−Ｃｈｏ）（ブラディリゾビム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＣβＧにおけるような）；アセチル（Ａｃｅ）残基（ロドバクター・スフェロイデス（Ｒ．  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＣβＧにおけるような）；メチルマロニル（ＭｅＭａｌ）残基（Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉＣβＧにおけるような）を意味し得る。好ましい態様において、天然置換残基はスクシニル残基である。このような置換は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓのような他の細菌種の環状βグルカンでは自然に起こる（Ｏ−スクシニル残基）。ＣβＧの免疫アジュバント活性を変化させない位置に他の置換を導入することができる。典型的には、環状βグルカン化合物上の置換基結合は、好ましくは、ヘキソースのヒドロキシル基上のＯ−エステル結合からなる。いくつかの態様において、天然置換残基の数は０〜２５である。好ましい態様において、天然置換残基の数は０〜３である。
【００３１】
当業者は、本発明による免疫アジュバント特性を有するＣβＧ化合物を、サイトカイン産生（例えばＩＬ−１２ｐおよびＴＮＦ−αの産生）および樹状細胞上の表面マーカーの発現（例えばＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６）を測定することによって前記化合物が樹状細胞の成熟を誘導し得るかどうかを試験することによって、容易に評価することができる。第２の工程において、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖および活性化の誘導も試験することができる。あるいは、ＴＬＲ４アゴニスト活性も決定し得る。典型的には、ＣβＧ化合物の免疫アジュバント活性を試験するために使用され得る試験は実施例に記載されている。
【００３２】
本発明の環状βグルカン化合物を、細菌の精製、より好ましくはＢｒｕｃｅｌｌａの細菌の精製によって、または当業者には周知である、化学合成またはオリゴ糖合成のいずれか１つの方法によって得ることができる。
【００３３】
例えば、対象の環状βグルカン化合物は、培養培地からまたは細菌細胞溶解液から回収され得る。典型的には、本発明のＣβＧ化合物は、Ｂｒｕｃｅｌｌａから単離される。例えば、本発明のＣβＧ化合物は、野生型Ｂｒｕｃｅｌｌａ細胞から、またはＢｒｕｃｅｌｌａ株、例えばブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）１６Ｍ(American Type Culture Collection 23456; 病原性株、生物型１)、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ２３０８から単離され得る（１２）。対象の環状βグルカンの産生に使用される細菌は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤などの種々の物理的または化学的手段によって破壊され得る。
【００３４】
細菌から対象の環状βグルカンを精製することが望ましくあり得る。実施例に記載の手順は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓまたはＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓの上清からのＣβＧｓの精製に適切な手順の例である。
【００３５】
以下の手順は、環状βグルカン化合物の適切な精製手順の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈降（実施例に使用したように）；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；例えばセファデックスＧ−７５を使用したゲルろ過；汚染物質を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；対象の環状βグルカンのエピトープタグ形に結合する金属キレートカラムによる。オリゴ糖精製の種々の方法を使用し得、そしてトリクロロ酢酸処理およびゲル透過クロマトグラフィーのようなこのような方法は、当技術分野において公知であり、そして例えば（２１）に記載されている。
【００３６】
選択される精製工程（群）は、例えば、使用される産生過程の性質および産生される具体的な環状βグルカン化合物に依存する。
【００３７】
細菌（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））を培養し、そして培養溶液から表題化合物を回収することによる、環状βグルカン化合物、特にβ−１，２結合を有するものの調製および産生はまた、ＪＰ６１０４０７９９およびＪＰ６１０７０９９４に記載されている。
【００３８】
特定の態様において、本発明の環状βグルカン化合物は、慣用的な化学合成技術を通して合成され得る。例えば、国際特許出願ＷＯ０２１６３８４は、例えば、固相粒子上に固定された末端サブユニットへのサブユニットの付加によって形成される、固相支持体上におけるオリゴ糖の効率的な合成のためのオリゴ糖の自動合成のための装置および方法を記載する。本発明の環状βグルカン化合物はまた、ラミナリナーゼ１６Ａグライコシンターゼを使用することによっても合成され得る（２３）。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、場合により１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共に、免疫アジュバントとしての本発明によるＣβＧ化合物を含む、ワクチン組成物に関する。より特定すると、本発明は、１つ以上の抗原と一緒に、前記に定義したような免疫アジュバント化合物を含むワクチン組成物に関する。
【００４０】
「ワクチン組成物」は、一旦、被験体または動物に投与されると、それに含まれる前記の１つ以上の抗原（群）に対する防御的免疫応答を誘起する。従って、本発明のワクチン組成物は、一旦、被験体または動物に投与されると、例えば微生物に対する防御的免疫応答を誘導するか、または被験体もしくは動物を感染から効果的に防御する。
【００４１】
多種多様な物質を、化合物または製剤において、免疫原性またはワクチン型の抗原として使用することができる。例えば、弱毒化および不活性化されたウイルスおよび細菌病原体、精製された巨大分子、多糖、トキソイド、組換え抗原、病原体由来の外来遺伝子を含む生物、合成ペプチド、ポリ核酸、抗体および腫瘍細胞を使用して（ｉ）個体において免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性組成物、または（ｉｉ）病的状態を治療するのに有用なワクチンを調製することができる。
【００４２】
それ故、本発明の環状βグルカン化合物を多種多様な抗原と組み合わせることによって、個体において免疫応答を誘導するのに有用なワクチン組成物を産生することができる。
【００４３】
当業者は、特定の病的状態を治療するのに適切な抗原を選択することができ、そして単離された抗原が特定のワクチン製剤において好ましいかどうかを決定する方法を知っているだろう。
【００４４】
当業者はまた、本発明の免疫アジュバントを、前記の１つ以上の抗原に共有結合的に連結することが好ましいか、または共有結合的に連結しないことが好ましいかを決定することができる。従って、本発明のさらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの抗原に連結された本発明による環状βグルカン化合物に関する。
【００４５】
単離された抗原を、当技術分野において周知の多種多様な方法を使用して調製することができる。いずれかの免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、そして当技術分野において周知の組換え法を使用して、例えば、細菌、酵母、昆虫、爬虫類または哺乳動物細胞にクローニングすることができ、そしてこれは例えば、Sambrook et al., Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992)およびAnsubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1998)に記載されている。ウイルス、細菌および原虫病原体に由来する表面抗原をコードする数多くの遺伝子が成功裏にクローニングされ、発現され、そしてワクチン開発のための抗原として使用されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスの主要表面抗原、ＨｂｓＡｇ、コレラ毒素のＰサブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉのエンテロトキシン、マラリア寄生虫のスポロゾイト周囲タンパク質、およびエプスタイン・バーウイルス由来の糖タンパク質膜抗原、並びに、腫瘍細胞抗原が、種々の周知のベクター／宿主系において発現され、精製され、そしてワクチンにおいて使用されている。
【００４６】
病的に異常な細胞も、本発明によるワクチン組成物に使用され得、病的状態を有する１つ以上の個体、または１つ以上のこのような個体（得られるワクチンを用いて治療しようとする特定の個体を含む）から得られたｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養細胞などの任意の起源から得ることができる。
【００４７】
特定の態様において、ワクチン組成物の抗原は、「腫瘍関連抗原」であり得る。本明細書において使用する「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍組織に特徴的である抗原を指す。腫瘍組織によって発現される腫瘍関連抗原の例は、前立腺酸性ホスファチゼ抗原（phosphatise）（ＷＯ２００４０２６２３８参照）またはＭＡＲＴペプチドＴ（メラノーマ抗原）であり得る。
【００４８】
本発明によるワクチン組成物は、少なくとも１つの他の免疫アジュバントを含み得る。個体における免疫応答を改変するために多種多様な免疫アジュバントが適切であり得る。所望の改変のタイプは、前記の本発明の環状βグルカン化合物と合わせるために選択される免疫アジュバントのタイプを決定する。例えば、自然免疫応答を増強するために、本発明のワクチン組成物は、自然免疫応答を誘導することが知られるまたは疑われる他のＰＡＭＰまたは保存領域などの自然免疫応答を促進する別の免疫アジュバントを含み得る。多種多様のＰＡＭＰｓがｔｏｌｌ様レセプターファミリーの種々のメンバーの活性を刺激することが知られている。このようなＰＡＭＰｓを合わせて、有益なサイトカインプロファイルを誘導するｔｏｌｌ様レセプターの特定の組合せを刺激することができる。例えば、ＰＡＭＰｓを合わせて、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫応答を誘導するサイトカインプロファイルを刺激することができる。体液性または細胞性免疫応答を促進する他のタイプの免疫アジュバントを、本発明の環状βグルカン化合物と合わせることができる。例えば、サイトカインを投与して、Ｔｈ１およびＴｈ２免疫応答の平衡を変化させることができる。当業者は、特定の病的状態に対する免疫応答の有益な改変を得るのに有用な適切なサイトカインを決定する方法を知っているだろう。
【００４９】
別の特定の態様において、本発明によるワクチン組成物はさらに、界面活性剤、吸収促進剤、水吸収性ポリマー、酵素分解を阻害する物質、アルコール、有機溶媒、油、ｐＨ制御剤、保存剤、浸透圧制御剤、噴射剤、水およびその混合物からなる群より選択される１つ以上の成分を含む。
【００５０】
本発明によるワクチン組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含み得る。担体の量は、他の成分のために選択した量、所望の抗原濃度、投与経路（経口または非経口など）の選択に依存する。担体は、任意の簡便な時期にワクチンに加えられ得る。凍結乾燥ワクチンの場合には、担体は、例えば、投与直前に加えられ得る。あるいは、最終製品を担体を用いて製造し得る。
【００５１】
適切な担体の例としては、滅菌水、食塩水、緩衝液、リン酸緩衝食塩水、緩衝化塩化ナトリウム、植物油、最小必須媒体（ＭＥＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＭＥＭなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５２】
場合により、本発明のワクチン組成物は、アジュバントおよび所望の結果に依存して種々の量の慣用的な二次アジュバントを含み得る。慣用的な量は、他の成分および所望の効果に依存して、約０．０２重量％から約２０重量％の範囲である。本発明の目的のために、これらのアジュバントは、抗原性物質に対する体液性免疫応答を有意に増加させる抗原性物質と組み合わせられた、その効果のためにワクチン組成物において必須成分である前記した免疫アジュバント化合物と単に対照づけるために本明細書において「二次」と同定される。二次アジュバントは、主に加工補助剤としてワクチン製剤に含められるが、特定のアジュバントは、いくらかの程度で免疫増強特性を有し、そして二重の目的を有する。
【００５３】
適切な二次アジュバントの例としては、安定剤；乳化剤；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；ｐＨ調節剤、例えば水酸化ナトリウム、塩酸など；界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ．ＲＴＭ８０（ポリソルベート８０、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.から市販されている）；リポソーム；イスコムアジュバント；合成グリコペプチド、例えばムラミルジペプチド；増量剤（extender）、例えばデキストラン、または例えばリン酸アルミニウムとデキストランの組合せ；カルボキシポリメチレン；細菌細胞壁、例えばマイコバクテリア細胞壁抽出物；その誘導体、例えばコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）；プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅ）；マイコバクテリウム・ボヴィス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、例えばカルメット・ゲランウシ型結核菌（ＢＣＧ）；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタンパク質；サブウイルス粒子アジュバント、例えばオルビウイルス；コレラ毒素；Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン（ピリジン）；モノホスホリルリピドＡ；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ、Kodak, Rochester, N.Y.から市販されている）；合成物およびその混合物が挙げられるがそれらに限定されない。望ましくは、水酸化アルミニウムを、他の二次アジュバントまたはQuil Aなどの免疫アジュバントと混合する。
【００５４】
適切な安定剤の例としては、スクロース、ゼラチン、ペプトン、消化タンパク質抽出物、例えばＮＺ−ＡｍｉｎｅまたはＮＺ−ＡｍｉｎｅＡＳが挙げられるがそれらに限定されない。乳化剤の例としては、注射用または鼻内ワクチン組成物に有用な、鉱油、植物油、ピーナッツ油および他の標準的な代謝可能な無毒性油が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５５】
慣用的な保存剤を、約０．０００１重量％から約０．１重量％の範囲の有効量でワクチン組成物に添加することができる。製剤に使用される保存剤に依存して、この範囲に前後する量が有用なこともある。典型的な保存剤としては、例えば、ソルビン酸カリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、フェノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、チメロサールなどが挙げられる。
【００５６】
本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容される媒体と一緒に、溶液または懸濁液として製剤化され得る。
【００５７】
このような薬学的に許容される媒体は、例えば、水、リン酸緩衝食塩水、通常の食塩水または他の生理学的に緩衝化された食塩水、または他の溶媒もしくはビヒクル、例えばグリコール、グリセロール、および油、例えばオリーブ油または注射用有機エステルであり得る。薬学的に許容される媒体はまた、リポソームまたはミセルを含み得、そして洗浄剤およびグリコシド、例えばＱｕｉｌ  Ａと一緒にポリペプチドまたはペプチド抗原を混合することによって調製した免疫刺激性複合体を含み得る。
【００５８】
本発明のワクチン組成物の経口投与のための液体投与形態は、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。活性成分（群）に加えて、液体投与形態は、当技術分野において一般的に使用される不活性な希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、並びにその混合物を含み得る。
【００５９】
不活性な希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、着色剤、香料および保存剤などの補助剤を含み得る。
【００６０】
懸濁剤は、活性成分（群）に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、アガーアガーおよびトラガカント、並びにその混合物を含み得る。
【００６１】
直腸または膣内投与のための本発明のワクチン組成物の製剤は、坐剤として提示され得、これは活性成分（群）を１つ以上の適切な非炎症性の賦形剤または担体と混合することによって調製され得、こうした賦形剤または担体は、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックスまたはサリチレートを含み、これらは室温では固体であるが、体温では液体であり、それ故、直腸または膣腔内では融解し、そして活性成分（群）を放出する。膣内投与に適した本発明の製剤としてはまた、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤が挙げられ、該製剤は、当技術分野において適切であることが知られているそのような担体を含む。
【００６２】
非経口投与に適した本発明のワクチン組成物は、１つ以上の薬学的に許容される無菌等張水性水溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または無菌粉末（使用直前に無菌注射溶液または分散液へと復元し得る）と組み合わせて活性成分（群）を含み、このような溶液または分散液は、抗酸化剤、緩衝液、製剤を意図するレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。
【００６３】
本発明のワクチン組成物に使用され得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
【００６４】
これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤も含み得る。また、組成物中に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましくあり得る。さらに、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによって達成することができる。
【００６５】
注射可能なデポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で活性成分（群）のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって製造される。ポリマーに対する活性成分（群）の比率、および使用する具体的なポリマーの性質に依存して、活性成分（群）の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリオルトエステルおよびポリ無水物が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に活性成分（群）を閉じ込めることによっても調製される。注射可能な材料は、例えば細菌保持フィルターを通したろ過によって滅菌することができる。
【００６６】
製剤は、単位用量または複数回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアルで提示してもよいし、凍結乾燥状態で保存してもよく、これは使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい。即時注射溶液および懸濁液は、前記したタイプの無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００６７】
本発明によるワクチン組成物中の抗原および免疫アジュバント化合物の量は、具体的な抗原、具体的な動物または患者の年齢、性別、体重、種および状態、並びに投与経路などの要因を考慮に入れて、製薬分野の当業者に周知の技術によって決定される。
【００６８】
ワクチン組成物の投与量は、特に、抗原、ワクチン接種したまたはワクチン接種すべき宿主の種などに依存するが、ワクチン組成物の薬理学的に有効な量の投与量は、通常、１用量あたり約０．０１μgから約５００μg（特に５０μgから約５００μg）の本発明の免疫アジュバント化合物である。
【００６９】
併用する特定の抗原性物質の量は、免疫応答を改善するのに必要とされる本発明による免疫アジュバント化合物の量に影響を及ぼすが、医師は、個々の状況に合うように慣用的な試験を通して免疫アジュバント化合物の有効投与量を容易に調整することができると考えられる。
【００７０】
本発明によるワクチン組成物を、当技術分野において周知の多種多様な前臨床毒性試験および安全性試験において試験することができる。
【００７１】
例えば、このようなワクチン組成物を、抗原が免疫原性であることが分かっており、しかもヒト臨床試験について提案されているのと同じ経路によって再現性よく免疫化され得る動物モデルにおいて評価することができる。
【００７２】
例えば、本発明によるワクチン組成物を、例えば、生物学的製剤評価研究センター／米食品医薬品局および米国立アレルギー感染症研究所によって示された手法によって試験することができる（１３）。
【００７３】
当業者は、特定の動物種における特定の病的状態を治療するのに有用な、具体的なワクチン組成物、適切な抗原負荷量、免疫化の経路、投与体積、抗原の純度、およびワクチン接種計画を決定する方法を知っているだろう。
【００７４】
ワクチン接種プロトコールでは、ワクチンは有利には、初回／追加免疫法に従い、単回投与で、あるいは好ましくは１週または１カ月間隔で数回、例えば２回、３回または４回投与され得る。適切な投与量は種々のパラメーターに依存する。
【００７５】
一般的な原則として、本発明のワクチン組成物は、簡便には、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、または腹腔内）、頬側内、鼻腔内、または経皮、リンパ内、腫瘍内、膀胱内、腹腔内および脳内に投与される。本発明によって考えられる投与経路は抗原に依存する。
【００７６】
本発明は、前記に定義したような免疫アジュバント化合物（すなわち本発明によるＣβＧ化合物）および少なくとも１つの抗原を含む、キットに関する。
【００７７】
より特定すると、本発明は、例えば病原体に対する防御免疫応答を誘導するための、または被験体もしくは動物を感染から効果的に防御するための、同時、別々または連続して使用するための複合調製物としての、
−  前記に定義したような免疫アジュバント化合物、
−  前記に定義したような少なくとも１つの抗原
を含むキットに関する。
【００７８】
ＣβＧ化合物は、被験体への少なくとも１つの抗原の投与前、投与と同時にまたは投与後に投与されることにより、例えば病原体に対する防御免疫応答を誘導する、または被験体もしくは動物を感染から効果的に防御することができる。ＣβＧ化合物および抗原は、ＣβＧ化合物が、抗原と一緒に作用できるような順序および時間間隔内で被験体に投与され、これにより別様に投与された時よりも、前記抗原に対して増加した免疫応答を提供する。好ましくは、ＣβＧ化合物および抗原は、被験体に同時に投与される。また好ましくは、前記分子は、同時に毎日、前記患者に投与される。
【００７９】
本発明のさらなる局面は、薬理学的に有効な量の抗原および薬理学的に有効な量の本発明による免疫アジュバント化合物を投与することを含む、それを必要とする被験体にワクチン接種するための方法に関する。
【００８０】
本明細書に使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類を示す。好ましくは、本発明による被験体はヒトである。
【００８１】
薬理学的に有効な量の本発明による免疫アジュバント化合物は、例えば、経口で、非経口でまたは別様に、抗原の免疫原性を増強、加速または延長するために抗原の投与と同時に、連続的に、または直後に投与され得る。
【００８２】
ワクチン組成物の投与量は、特に、選択される抗原、投与経路、種および他の標準的な要因に依存する。当業者は、個々の抗原の免疫原性応答のための適切な投与量を容易にそしてすぐに滴定して、効果的な免疫化量および投与法を達成することができると考えられる。
【００８３】
本発明はまた、本発明によるＣβＧ化合物からなる、ＴＬＲ４アゴニストに関する。
【００８４】
本明細書に使用したようなＴＬＲ４アゴニストは、ＴＬＲ４の生物学的活性またはＴＬＲ４レセプター活性化またはシグナル伝達を実質的に誘導、促進または増強することのできる薬剤を指す。
【００８５】
本発明のさらなる目的は、薬理学的に有効な量の本発明による免疫アジュバント化合物を投与することを含む、それを必要とする被験体において樹状細胞（ＤＣｓ）の成熟を誘導するための方法に関する。
【００８６】
本発明はさらに、以下の図面および実施例によって説明される。しかしながら、これらの実施例および図面を、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１Ａ】ｍＤＣ成熟の誘導は、環状グルカンの構造に依存する。マウスＤＣｓを８時間および２４時間かけて、培地（neg）、０．２５mMの等濃度のＥ．ｃｏｌｉＬＰＳまたはＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧ、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ＣβＧおよびＭβＣＤを用いて刺激した。ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面レベルをフローサイトメトリーによって測定し、そして培養上清中のＩＬ−１２およびＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡによって決定した（Ｂ）。データは、少なくとも３回の独立した実験の代表である。ネガティブと比較して＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｂ】ｍＤＣ成熟の誘導は、環状グルカンの構造に依存する。マウスＤＣｓを８時間および２４時間かけて、培地（neg）、０．２５mMの等濃度のＥ．ｃｏｌｉＬＰＳまたはＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧ、ＲａｌｓｔｏｎｉａＣβＧおよびＭβＣＤを用いて刺激した。ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面レベルをフローサイトメトリーによって測定し、そして培養上清中のＩＬ−１２およびＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡによって決定した（Ｂ）。データは、少なくとも３回の独立した実験の代表である。ネガティブと比較して＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧはヒトＤＣｓにおいてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強する。Ａ）ヒト単球由来ＤＣｓを、２４時間かけて、培地（neg）、１０ng/mlのＥ．ｃｏｌｉＬＰＳ並びに０．２μM、２μMおよび２０μMのＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧを用いて刺激し、そしてＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ８３およびＣＤ８６表面レベルをＦＡＣＳによって分析した。Ｂ）血液ｍＤＣｓを、２０mg/mlのＣβＧを用いて２４時間かけて刺激した。培養上清中のサイトカインをルミネックスによって測定した。
【図２Ｂ】Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧはヒトＤＣｓにおいてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強する。Ａ）ヒト単球由来ＤＣｓを、２４時間かけて、培地（neg）、１０ng/mlのＥ．ｃｏｌｉＬＰＳ並びに０．２μM、２μMおよび２０μMのＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧを用いて刺激し、そしてＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ８３およびＣＤ８６表面レベルをＦＡＣＳによって分析した。Ｂ）血液ｍＤＣｓを、２０mg/mlのＣβＧを用いて２４時間かけて刺激した。培養上清中のサイトカインをルミネックスによって測定した。
【図３Ａ】Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧによって誘導されたＩＬ−１２産生およびＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６表面発現はＴＬＲ４に依存する。ＷＴからのＤＣｓ（Ａ、ＢおよびＣ）、ＭｙＤ８８ＫＯ（Ａ）、ＴＲＩＦＫＯ（Ａ）、ＴＬＲ２ＫＯ（Ｂ）およびＴＬＲ４ＫＯ（ＢおよびＣ）マウスを、２４時間かけて、培地（neg）、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧを用いて刺激した。ＡおよびＢ）培養上清中のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。Ｃ）ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面レベルをフローサイトメトリーによって決定した。陽性コントロールとして：Ｐａｍ２ＣＳＫ４（１００ng/ml）、ＬＰＳ（１００ng/ml）、ＣｐＧ（１μM）およびポリＩ：Ｃ（１mg/ml）。データは３回の独立した実験の代表である。ＷＴマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｂ】Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧによって誘導されたＩＬ−１２産生およびＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６表面発現はＴＬＲ４に依存する。ＷＴからのＤＣｓ（Ａ、ＢおよびＣ）、ＭｙＤ８８ＫＯ（Ａ）、ＴＲＩＦＫＯ（Ａ）、ＴＬＲ２ＫＯ（Ｂ）およびＴＬＲ４ＫＯ（ＢおよびＣ）マウスを、２４時間かけて、培地（neg）、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧを用いて刺激した。ＡおよびＢ）培養上清中のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。Ｃ）ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面レベルをフローサイトメトリーによって決定した。陽性コントロールとして：Ｐａｍ２ＣＳＫ４（１００ng/ml）、ＬＰＳ（１００ng/ml）、ＣｐＧ（１μM）およびポリＩ：Ｃ（１mg/ml）。データは３回の独立した実験の代表である。ＷＴマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｃ】Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧによって誘導されたＩＬ−１２産生およびＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６表面発現はＴＬＲ４に依存する。ＷＴからのＤＣｓ（Ａ、ＢおよびＣ）、ＭｙＤ８８ＫＯ（Ａ）、ＴＲＩＦＫＯ（Ａ）、ＴＬＲ２ＫＯ（Ｂ）およびＴＬＲ４ＫＯ（ＢおよびＣ）マウスを、２４時間かけて、培地（neg）、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４およびＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧを用いて刺激した。ＡおよびＢ）培養上清中のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。Ｃ）ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面レベルをフローサイトメトリーによって決定した。陽性コントロールとして：Ｐａｍ２ＣＳＫ４（１００ng/ml）、ＬＰＳ（１００ng/ml）、ＣｐＧ（１μM）およびポリＩ：Ｃ（１mg/ml）。データは３回の独立した実験の代表である。ＷＴマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】ボスロプス・アスペル（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒ）の毒液に対するＢ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧのアジュバント活性。Ａ；毒液＋アルギン酸カルシウム＋ＣβＧの混合物の（＊＊）は、アルギン酸カルシウムの混合物中に単独で注入された毒液に対してｐ＜０．００１の値を示す。Ｂ．免疫化から２１日後のＢｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒの毒液に対するＣβＧのアジュバント活性。１グループあたり１０匹のマウスの血清プール（全３０匹）。ＳＤは５％未満である。
【図４Ｂ】Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒの毒液に対するＢ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧのアジュバント活性。Ａ；毒液＋アルギン酸カルシウム＋ＣβＧの混合物の（＊＊）は、アルギン酸カルシウムの混合物中に単独で注入された毒液に対してｐ＜０．００１の値を示す。Ｂ．免疫化から２１日後のＢｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒの毒液に対するＣβＧのアジュバント活性。１グループあたり１０匹のマウスの血清プール（全３０匹）。ＳＤは５％未満である。
【００８８】
実施例１：細菌性β１，２環状グルカンは、新規な樹状細胞のアクチベーターである。
材料および方法：
抗体および試薬
ＣＤ８、ＣＤ４５．２、ＣＤ４４、ＣＤ２５およびＣＤ６２Ｌに対する蛍光色素のコンジュゲートした抗体を、BD BiosciencesまたはeBiosciencesから購入した。
【００８９】
オボアルブミン（ＯＶＡ）は、純度＞９８％およびエンドトキシン濃度＜１ＥＵ/mgでEndoGradeから購入した。
【００９０】
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）は、Invitrogenから注文した。
【００９１】
４０５nの励起のためのＡｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）を使用して、フローサイトメトリー実験のための死滅細胞を検出した。
【００９２】
ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをSchafer-Nから購入した。
【００９３】
環状グルカンの抽出、精製および特徴付け
環状グルカン分子は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  １６Ｍ (American Type Culture Collection 23456; 病原性株、生物型１)、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ２３０８  (12)およびラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ） (Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍからの精製ＣβＧは、Dr. JP Bohin, CNRS UMR8576, Lille, Franceからの贈り物である)から得られた。前記株を、Ｂｒｕｃｅｌｌａ株の場合にはバイオセイフティレベル３の部屋で３６℃、３５％Ｏ２飽和の発酵槽で増殖させ（１４）、そしてフェノール（０．５％、３６℃で４８時間かけて）を用いて不活性化した。細菌を蒸留水に再懸濁し（１００ml中２０ｇの湿重量）、そして１２０℃で３０分間かけて加熱した。細胞片を除去し（８０００ｇで３０分間かけて４℃で）、そして抽出物を−２０℃で一晩かけて３容量のエタノールを用いて沈降させた。沈降物を除去し（５，０００ｇで１０分間）、そして上清を２容量のエタノールと混合した。新たな沈降物を回収し（５，０００ｇで１０分間）、１７５mM ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３および０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁し、そして最初に１８時間かけて３７℃でヌクレアーゼ（1mlあたり５０mgのＤＮａｓｅ−ＩＩタイプＶおよびＲＮａｓｅ−Ａ（Sigma-Aldrich））を用いて消化し、そしてその後、プロテイナーゼＫ（５０mg/ml；Merck）を用いて１時間かけて５５℃で、その後、２４時間かけて２５℃で消化した。液体を１容量のフェノールを用いて３０分間かけて７０℃で抽出し、その後、混合物を冷却し、そして遠心分離にかけ（８，０００ｇで１５分間かけて０℃で）、そして水相を回収し、そして同じ条件を使用してフェノールを用いて再度抽出した。水相を透析し、簡潔な遠心分離によって清澄化し、そして凍結乾燥した。環状グルカンの実体は、Aragonおよび共同研究者によって記載されているような、１３Ｃ核磁気共鳴分析法、高速液体クロマトグラフィーおよび高性能薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認された。多糖およびリポ多糖または他の汚染物質が存在しないことは、紫外分光法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル免疫沈降および３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸の測定によって実証された（１４）。
【００９４】
マウスおよび細胞
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＣＳの補充されたＤＭＥＭ中に維持した。
【００９５】
野生型Ｃ５７ＢＬ/６マウスおよびＴＬＲ２−/−、ＴＬＲ４−／−、ＭｙＤ８８−/−、ＴＲＩＦ−/−ノックアウト（ＫＯ）マウスを、Centre d’Immunologie Marseille-Luminy (CIML), Marseille, Franceで維持した。二重（ＭｙＤ８８/ＴＲＩＦ−/−）ＫＯ細胞は、Caetano Reis y Souza laboratory, London, UKによって提供された。
【００９６】
マウス骨髄由来ＤＣｓは、以前に記載されているように（１５）、７〜８週令の雌のＣ５７ＢＬ/６マウスまたはＴＬＲ２−/−、ＴＬＲ４−/−、ＭｙＤ８８−/−、ＴＲＩＦ−/−ノックアウト（ＫＯ）マウスから調製された。簡潔には、マウスの大腿および脛骨を除去し、そして筋肉および腱を取り除いた。骨を７０％エタノールに２分間入れ、そして続いてＰＢＳで洗浄した。両方の骨末端を切除し、そして骨髄をＲＰＭＩ１６４０培地で流した。細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）の補充された完全ＲＰＭＩ１６４０（５％ＦＣＳおよび５０μMのβ−メルカプトエタノール）と共に２４ウェルプレート中に播種した。３日目に培地を交換し、そして６日目に実験を実施した。
【００９７】
マウス骨髄由来マクロファージを、７〜８週令の雌のＣ５７ＢＬ/６マウスの大腿から、骨髄由来ＤＣｓと同じように調製した。細胞を、Ｍ−ＣＳＦの補充された完全ＤＭＥＭ（２mM Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ）中に播種した。５および６日目に培地を交換し、そして７日目に実験を実施した。
【００９８】
ヒト単球由来ＤＣｓは、健常人からのフィコールで分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から生成した（１６）。単球を粘着性によって濃縮し、そして完全ＲＰＭＩ培地（６日間の間は顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＬ−４で、３日間の間はＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮで補充されている）中で培養した。血液骨髄ＤＣｓ（ｍＤＣｓ：ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１２３−Ｌｉｎ−）は、ＦＡＣＳ ａｒｉａ(BD Biosciences, CA)を使用してＰＢＭＣから選別された。ナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）（純度＞９９．２％）をＦＡＣＳ選別によって精製した。
【００９９】
Jackson LaboratoryからのＣ５７Ｂｌ/６Ｌｙ５．１マウスおよびＣＩＭＬ動物施設で生育されたＣ５７Ｂｌ/６バックグラウンドのＯＴ−Ｉ ＴＣＲトランスジェニックＬｙ５．２マウスを実験のために使用した。
【０１００】
免疫蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリー
免疫蛍光顕微鏡観察のために、刺激したＤＣｓを３７℃で１５分間かけて３％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして以前に記載されているように（１７）免疫蛍光標識のために処理した。
【０１０１】
マウスＩ−Ａに対するウサギリボリ（rivoli）抗体（１８）およびマウス抗体ＦＫ２（Biomol）を一次抗体として使用した。染色後、試料を、イメージ獲得のために、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢＥ落射蛍光顕微鏡またはＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡のいずれかで調べた。その後、102431024ピクセルのイメージをＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７．０を使用して構築した。定量は、常に、４つの独立した実験において少なくとも１００個の細胞を計測することによって行ない、合計して少なくとも４００個の宿主細胞を分析した。
【０１０２】
フローサイトメトリーのために、刺激したＤＣｓを回収および染色した。ＣＤ８０およびＣＤ４０に対するＦＩＴＣをコンジュゲートした抗体、ＣＤ８３およびＩＡ−ＩＥ（ＭＨＣクラスＩＩ）に対するＰＥをコンジュゲートした抗体、およびＣＤ１１ｃに対するＡＰＣをコンジュゲートした抗体は、Pharmingenから得られた。適切なアイソタイプ抗体をコントロールとして使用した。染色後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして３％パラホルムアルデヒド中で固定し、その後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。細胞は、常に分析のためにＣＤ１１ｃ上でゲートオン（gated on）され、そして１０，０００個のゲートイベントを各試料から回収した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ヒストグラムを描き、そして蛍光強度の中央値をゲート個体群上で決定した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖および活性化を追跡するために、流入領域膝窩リンパ節（ＤＬＮｓ）を免疫化の３日後に回収し、そしてコラゲナーゼタイプＩ消化にかけた。細胞を、異なる蛍光色素のコンジュゲートした抗体を使用してフローサイトメトリーによる分析のために染色した。少なくとも１００，０００個のイベントをＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ(BDBiosciences)で回収した。フローサイトメトリー分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実施された。
【０１０３】
サイトカイン濃度の測定
全マウスＩＬ−１２およびＴＮＦ−αを、製造業者の指示（Abcys）に従って、サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、刺激したＤＣｓの培養上清中において定量した。ヒトサイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−1ｂ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２ｐ４０を含む）を、製造業者のプロトコールによりBeadLyteサイトカインアッセイキット（Upstate, MA）を使用して定量した。
【０１０４】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答
５×１０３個の血液ｍＤＣｓを、ＣＦＳＥで標識された同種のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（１〜２×１０５個）と共に培養した。６日目にＣＦＳＥ希釈率を測定することによって細胞増殖を試験した。ＩＬ−２（２０単位/ml）の存在下における８〜１０日間かけてのＣＤ８＋Ｔ細胞。ＨＬＡ−Ａ０２０１＋健康ドナーからの５×１０３個の血液ｍＤＣｓに、０．２ｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）の熱不活性化インフルエンザウイルス（ＰＲ８）を３７℃で２時間かけてのせた。自己ＣＤ８＋Ｔ細胞（１〜２×１０５個）を混合し、そして２０単位/mlのＩＬ−２の存在下において７日間培養した。その後、細胞を抗ＣＤ８抗体およびテトラマー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｆｌｕ Ｍ１５８−６６）を用いて染色した。ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、１０mMのＭＡＲＴ−１２６−３５（２７Ｌ）ペプチドをのせたｍＤＣと共に培養した後に測定した。
【０１０５】
ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の養子移植および免疫化
ＯＶＡからのＨ−２Ｄｂ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに特異的なＴＣＲを発現するＯＴ−Ｉトランスジェニック細胞を使用した。リンパ節ＯＴ−Ｉ Ｌｙ５．２マウスを収集し、そしてコラゲナーゼタイプＩ（Sigma）を用いて３７℃で３０分間かけて消化した。その後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、マウスＣＤ８ネガティブ単離キット（Dynal）を使用することによってネガティブに選別した。日常的には、得られた細胞は＞９０％であった。ＣＤ８の比率をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μMのＣＦＳＥを用いて３７℃で１０分間かけて標識した。
【０１０６】
ＣＤ８＋Ｌｙ５．２ ＣＦＳＥ＋Ｔ細胞を、ナイーブでコンジェニックなＣ５７Ｂｌ/６ Ｌｙ５．１レシピエントマウスに静脈内に養子移植した（２０００００個の細胞／マウス）。ＯＴ−Ｉ養子移植から２４時間後に、レシピエントマウスに、エンドトキシンを含まないＰＢＳ中の３０μgのＯＶＡ単独で、または２００μgの環状グルカンの混合された３０μgのＯＶＡ、または５０μgのポリＩ／Ｃの混合された３０μgのＯＶＡ、またはＩＦＡ（容量／容量）で乳化された３０μgのＯＶＡのいずれかを用いて皮下（ｓ．ｃ．）に免疫化した。
【０１０７】
Ｔ細胞の増殖および活性化
生存細胞は常にＣＤ８＋ＣＤ４５．２＋個体群上でゲートオンされ、そして本発明者らは細胞分裂に相関するＣＦＳＥ標識の減少を分析した。細胞活性化レベルを研究するために、本発明者らは、ＣＤ２５、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌなどの活性化マーカーの発現を考察した。
【０１０８】
ＨＥＫ２９３細胞ルシフェラーゼリポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞リポーターアッセイを、以前に記載されているように指定されたプラスミドを使用して実施した。マウスＴＬＲｓ、ＭＤ２およびＣＤ１４ｃＤＮＡを、骨髄由来マクロファージから調製された全ＲＮＡからの逆転写酵素ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（Promega）へサブクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を、Fugene（Roche）を使用して、製造業者の指示に従って、５０ngのレセプタープラスミド、２００ngのｐＢＩＩＸＬｕｃリポータープラスミド、５ngのコントロールウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ｎｕｌｌ、Promega）からなる合計で０．４μgのＤＮＡで一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を、６時間かけて記載のアゴニストで刺激し、そしてその後、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を使用して測定した。
【０１０９】
結果：
ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧはマウスＤＣ成熟のモデュレーターである
マウスＤＣｓの成熟は、多くの形態機能的変化によって特徴付けられ、とりわけ、細胞表面における共刺激性およびＭＨＣクラスＩＩの分子のアップレギュレーション、形態の変化、および大きなサイトゾルの樹状細胞アグリソーム様誘導性構造（ＤＡＬＩＳと呼ばれ、これは欠陥のある新たに合成されたユビキチン化タンパク質からなる）の形成がある。Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧが、マウスＤＣｓの成熟のアクチベーターであるかどうかを最初に決定するために、細胞を、種々の濃度のＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧと共にインキュベーションした。８時間後および２４時間後に、ＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現およびＤＡＬＩＳの形成を共焦点顕微鏡によって分析した。ＤＣ活性化のコントロールとして、０．２５mMのＥ．ｃｏｌｉＬＰＳを使用した。Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧまたはＥ．ｃｏｌｉＬＰＳで処理されたがＢｒｕｃｅｌｌａＬＰＳでは処理されていないマウスＤＣｓは成熟を受けた。なぜなら、それらはＭＨＣ ＩＩ表面局在化およびＤＡＬＩＳ形成を示したからである。しかしながら、非処理ＤＣｓおよびＢｒｕｃｅｌｌａＬＰＳで処理されたＤＣｓでは、ＭＨＣ ＩＩ分子は殆ど細胞内に留まり、そしてＤＡＬＩＳは観察されなかった。それぞれの刺激と共に８時間および２４時間インキュベーションした後のＤＡＬＩＳを有するＤＣｓの比率。Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳの場合、細胞の８０％が８時間後に大きく数多くのＤＡＬＩＳを含んでいたが、一方、非処理細胞の僅か２０％がＤＡＬＩＳを含んでいた。Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧは０．０２５μMにおいて細胞の４５％にＤＡＬＩＳの形成をすでに誘導し、そして０．２５μMおよび２．５μMでは細胞の数はそれぞれ７９％および７２％に増加し、０．２５μMのＥ．ｃｏｌｉＬＰＳで得られたレベルに達した。２４時間後に、ＤＡＬＩＳの数は減少し始め、これは以前に観察されたものと一致する。なぜなら、ＤＣ成熟の過程におけるＤＡＬＩＳ発現は一過性イベントであるからである。
【０１１０】
ＤＣ成熟過程におけるＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧの効果へのさらなる洞察を得るために、本発明者らは次に、ＣＤ１１ｃ陽性マウスＤＣｓにおいてフローサイトメトリーによって古典的成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ分子）の表面発現を分析した。蛍光の中央値の分析は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧによる全ての共刺激性およびＭＨＣクラスＩＩの分子の明瞭な用量依存的誘導を示した。これは、高い比率のＭＨＣクラスＩＩ分子が細胞表面上に存在していた顕微鏡の観察と一致する。
【０１１１】
これらの観察は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧがＤＣ成熟を促進することを示唆する。本発明者らはその後、マウスＤＣｓによるサイトカインの分泌も、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧの刺激後に誘導されるかどうかを調べた。刺激したマウスＤＣｓの上清中におけるＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのレベルを決定した。結果は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧが、用量依存的に両方のサイトカインの分泌を誘導したことを示した。この効果は、刺激から８時間後並びに２４時間後に観察され、両時点の間に有意な差はなかった。合わせて考えると、これらのデータは、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧがマウスＤＣｓの強力な活性化分子であることを確認した。
【０１１２】
マウスＤＣ成熟は、種々の環状グルカン構造によってモデュレーションされる
本発明者らは、その後、異なる起源の種々のＣβＧと共にＤＣｓをインキュベーションすることによって、環状グルカン構造とＤＣ活性化との間の可能性ある関係について調べた。Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧは、β−１，２結合によって連結された１７〜２５個のグルコース残基を含む環状骨格からなる（２２）。Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧの場合には、環状β−１，２−グルカンの何分の１かが、Ｏ−スクシニル残基によって置換されている（１９）。ＲａｌｓｔｏｎｉａＣαＧは、１３個のグルコースを有する環状骨格によって構成される。１つの結合はα−１，６であるが、他の全てのグルコース残基はβ−１，２によって連結されている（２２）。合成メチルシクロデキストリン（ＭβＣＤ）は、β−１，４結合によって連結され、Ｏ−メチル置換基を有する７個のグルコース環状骨格からなり、これはまた、生物学者には、膜コレステロールを抽出するその特性を使用して脂質ラフト破壊剤としても知られている（２２）。
【０１１３】
第１に本発明者らは、成熟マーカーの表面発現を分析し、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓおよびＢ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ分子の急激な発現を誘導したが、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧと共にインキュベーションした細胞においては僅かに低いレベルであった。これに対し、ＲａｌｓｔｏｎｉａＣαＧおよびＭβＣＤはＤＣを有意に活性化できなかった。
【０１１４】
サイトカイン分泌の分析は、表面マーカー発現を実証する。Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓおよびＢ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧはＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の分泌を誘導した。ＲａｌｓｔｏｎｉａＣαＧに応答して、ＤＣは殆どＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２を産生せず、そしてＭβＣＤに応答してサイトカインは全く分泌されなかった。
【０１１５】
前記のデータは第１に、環状グルカン依存性ＤＣ活性化は、分子構造に大きく依存し、そして第２にコレステロール抽出は、ＤＣにおける免疫系応答に全く効果を及ぼさないことを実証した。
【０１１６】
ＣβＧによるＤＣ活性化はＴＬＲ４、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを必要とするが、ＣＤ１４には非依存性である
本発明者らは、ＣβＧの認識に対するＴＬＲｓおよびアダプターの寄与を分析した。ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦは、ＴＬＲシグナル伝達に関与するアダプター分子である。ＭｙＤ８８は、ＴＬＲ１、２、４、５、７、８、９、ＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１８Ｒ経路に関与するが、ＴＲＩＦはＴＬＲ３およびＴＬＲ４に独特である。ＴＬＲ４、ＴＬＲ２、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８およびＣＤ１４ＫＯマウスに由来するＢＭＤＣをＣβＧで処理した。共刺激分子の表面発現および炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）の分泌を測定することによって示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳおよびＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧのいずれかによって刺激されたＴＬＲ４、Ｍｙｄ８８、Ｍｙｄ８８／ＴＲＩＦおよびＴＲＩＦ ＫＯマウス由来ＢＭＤＣにおいては活性化を全く観察できなかった（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧが、ＴＬＲ４経路の活性化を介してＤＣ成熟を誘導することを示す。Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓによって誘導されるＤＣ成熟に関与する経路を描写するために、ＣβＧ活性化を、ＭｙＤ８８ＫＯ、ＴＲＩＦＫＯ、および二重ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦＫＯマウスに由来するＢＭＤＣにおいて試験した。Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳと同様に、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧによるＩＬ−１２の誘導は、ＭｙＤ８８−ＫＯおよびＴＲＩＦ−ＫＯマウスに由来するＢＭＤＣにおいて妨害され、細胞をＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧと共にインキュベーションした場合には、二重ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦ ＫＯ細胞においてＩＬ−１２の分泌は全く観察されず、カードラン（アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からの鎖状α−１，３グルカン）で処理したＤＣとは対照的であった。カードランは、重要なβ−グルカンレセプターであるデクチン−１と、ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦ非依存性に相互作用することが知られている。
【０１１７】
ＬＰＳの認識には、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、ＣＤ１４、およびＴＬＲ４／ＭＤ２複合体が関与する。ＩＬ−１２などの炎症誘発性サイトカインの分泌、並びに、共刺激分子（ＭＨＣ−ＩＩ）の細胞表面発現は、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ処理ＣＤ１４ＫＯ ＢＤＭＣにおいて完全に消失した。これに対し、ＣβＧで処理したＢＭＤＣｓの活性化はＣＤ１４に非依存性であった。ＣβＧがＴＬＲ４経路を活性するためにＣＤ１４を必要としないという事実は、ＬＰＳとは異なる認識機序を強調する。合わせて考えると、これらの結果は、ＣβＧが新規なＴＬＲ４アゴニストであることを実証する。
【０１１８】
ＬＰＳなどの強力な生物学的誘導物質は、高い毒性および免疫原性を示し、これらの特性は、アジュバントとしてのこれらの分子の使用を妨げる。それ故、精製されたＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧ調製物においてこれらの特性を探索することは関連性があった。Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳとは対照的に、ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧは細胞培養液または動物に対して毒性がなく（表１）、そしてマウス、ウサギまたは天然に感染したウシにおいて抗体の産生を誘導しなかった（示していない）。これらの結果は、細胞培養液中においてＣβＧは非常に高い濃度（１０mM）でさえも毒性ではなかったことを示す以前の結果を実証する。従って、ＣβＧは、ＬＰＳの毒性特性を示さないＴＬＲ４アゴニストである。
【０１１９】
ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ８応答を誘導する
本発明者らは、外来性遊離抗原に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する環状グルカンの能力を調べた。本発明者らはＣＤ８＋Ｌｙ５．２ＣＦＳＥ＋ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞をＣ５７Ｂｌ/６ Ｌｙ５．１マウスに導入し、これをその後、ＰＢＳ単独（グループ１）、ＯＶＡ単独（グループ２）、環状グルカンとＯＶＡ（グループ３）、またはポリＩ/Ｃなどの公知のアジュバントとＯＶＡ（グループ４）またはＩＦＡ（グループ５）のいずれかを用いて免疫化（ｓ．ｃ．）した。免疫化から３日後に、本発明者らはＰＢＳを用いて免疫化したコントロールを除く全てのグループのマウスにおける流入領域リンパ節においてＯＴ−Ｉ Ｔ細胞増殖を観察することができた。本発明者らは次に、ＣＤ８＋ＣＤ４５．２＋個体群における活性化マーカーの表面発現を探索した。本発明者らはフローサイトメトリーによってＣＤ２５、ＣＤ４４発現のアップレギュレーション、およびＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションを分析し、これはリンパ節から感染部位へのＴ細胞の移動に相関する。ＰＢＳ単独またはＯＶＡとＰＢＳを用いてワクチン接種されたマウスにおいては細胞の活性化は全くなかった。しかしながらＯＶＡおよび環状グルカンを用いて免疫化されたグループにおいては、本発明者らはＣＤ２５およびＣＤ４４のアップレギュレーション、並びに、ＣＤ６２Ｌ発現の強力なダウンレギュレーションを観察することができ、これは、ポリ：ＩＣなどの公知のアジュバントを用いて免疫化されたグループよりも高い。
【０１２０】
これらのデータは、ＣβＧが、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖および活性化をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて誘導することができることを示す。
【０１２１】
ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧは、ヒトＤＣｓの成熟を誘導する
本発明者らは、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧもまたヒト単球由来ＤＣに対する刺激であるかどうかを調べた。ヒトＤＣｓは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６日間、またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮの存在下で３日間かけて、ヒト末梢血から得られた単球から分化した。それ故、本発明者らはＤＣｓ成熟に対するＢ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧの種々の濃度の効果を試験した。ＩＦＮ分化ＤＣでは、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＣβＧによる処理後の２４時間の間に、細胞表面上でのＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＣＤ８６のアップレギュレーションが用量依存的に検出された（図２Ａ）。マウスＤＣと同様に、使用したより低い濃度（０．２μM）はこのＤＣ表現型を誘導することができなかった。同じ結果が、ＩＬ−４により分化したヒトＤＣｓについても存在していた。本発明者らはさらに、ＣβＧがヒト血液ｍＤＣｓを効率的に活性化し、その結果、マウスＤＣｓで観察されたように、有意な量のＩＬ−１ｂ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２が生じることを実証した。特に、ＣβＧは、血液ｍＤＣｓからのＩＬ−１ｂの誘導についてはＥ．ｃｏｌｉＬＰＳよりも強力であった（図２Ｂ）。
【０１２２】
ＣβＧを用いてのｍＤＣｓ活性化により、同種のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は増加した。また、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答並びにＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も増強された。ＣβＧは、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対してＥ．ｃｏｌｉＬＰＳよりも効率的であったが、ＣβＧおよびＥ．ｃｏｌｉＬＰＳの両方により、交差提示アッセイに示されたように、同じようなレベルのＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が得られた。
【０１２３】
合わせて考えると、これらの結果は、ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧが、ＤＣおよびマクロファージのパンアクチベーターであることを示した。
【０１２４】
ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧはｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて内毒素性ではない
ＣβＧは強力な活性化をトリガーすることができたので、そして媒介される活性化はＴＬＲ４経路に依存するようであったので、本発明者らはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる可能性のある内毒素性を考察した。種々のアッセイ、特にリムルスアメボサイトライセートアッセイ、種々のアゴニストによって注射されたＳｗｉｓｓマウスのＤＬ５０、およびクロム放出によって測定したマクロファージの毒性を使用した。表Ｉは、ＣβＧが、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳおよびＢｒｕｃｅｌｌａＬＰＳと比較して全く毒性ではなかったことを示す。予期されたように、ＢｒｕｃｅｌｌａＬＰＳと比較して、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳは、非常に低い濃度で内毒素ショックを誘導することができた。
【０１２５】
【表１】
0005860871.tif 000002
【０１２６】
Pyrogent MA Bio products Inc. Walkersville USAからのリムルスアメボサイトライセート。方法は、マニュアルの指示に従って実施された。
【０１２７】
ＬＤ５０は、０．１mlの適切なＬＰＳ濃度を用いてＳｗｉｓｓマウス（２０〜２２ｇ）で決定された。１２、２４、４８および７２時間後に死亡を記録し、そして５０％致死用量をプロビット法によって決定した。プロビット法。（２０）。腹腔マクロファージについての毒性は、クロム放出法を使用して実施された。
【０１２８】
実施例２：ＢｒｕｃｅｌｌａＣβＧのアジュバント活性
方法：
ヘビ毒液に対する抗体の産生のためのＣβＧのアジュバント活性を、（２４）によって提案されている方法に従って評価した。簡潔には、ＰＢＳ中で希釈したＢｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒの毒液をアルギン酸カルシウムとまたはＰＢＳ（コントロール）と混合し、そして混合物を乳化した。その後、ＣＤ−１マウスに、混合物を皮下注射し、これにより５０μl/マウスの容量中２０μgの毒液に等価なものを与えた。別のグループのマウスに、同じ経路を通して、アルギン酸カルシウムと毒液の同じ混合物であるが、１匹のマウスあたり１００μgのＢ．ａｂｏｒｔｕｓＣβＧも含むものを注射した。最後に１つのマウスのグループに、ＰＢＳ中で希釈した毒液のみを注入した。免疫化マウスから「０」から３０日目まで採血し、そしてＢ．ａｓｐｅｒの毒液に対する抗体を、完全毒液抗原を用いてコーティングされたプレートを使用して、そしてコンジュゲート抗マウスＩｇセイヨウワサビペルオキシダーゼとして、間接的なＥＬＩＳＡによって決定した（２４）。種々のグループのマウスの独立した値を評価し、そして差異を一方向性ＡＮＯＶＡ分析（http://www.uv.es/~lejarza/anova/anova.html）、その後のフィッシャー有意性（ＰＬＳＤ）分析（http://www.graphpad.com/faq/viewfaq.cfm?faq=176）によって評価した。
【０１２９】
結果：
アルギン酸カルシウムは、毒液に対して免疫応答を誘導するために古典的に使用される免疫アジュバントである。図４に示したように、ＣβＧは、２１および２８日後に抗毒液免疫グロブリンの産生のためにアルギン酸カルシウムと相乗作用する（図４Ａ）。従って、抗体産生の動態は加速され、そしてアジュバント活性は、アルギン酸カルシウム単独で観察されるものよりも高い（図４Ｂ）。
【０１３０】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３１】
【表２】
0005860871.tif 000003
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0005860871.tif 000005
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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