(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体と、リン酸カリウム緩衝液と、トレハロースと、ポリソルベート８０とを含む液体組成物であって：ＫＬＨに結合したペプチドは配列番号１を含み；ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体は、３０〜６５の範囲のエピトープ密度を有し；緩衝液は、９ｍＭ〜１１ｍＭの範囲の濃度で存在し；組成物のｐＨは、７．３〜７．５の範囲であり；トレハロースは、８５ｍｇ／ｍＬ〜９５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し；ポリソルベート８０は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し；さらに、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、モノマー形態で存在するＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の量は、組成物の全質量の１８質量％〜３５質量％の範囲であり、かつダイマー形態で存在するＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の量は、組成物の全質量の５０質量％〜６５質量％である、前記液体組成物。
【請求項２】
緩衝液が、１０ｍＭの濃度で存在し、組成物のｐＨが、７．４であり、トレハロースが、９０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート８０が、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１２月２２日に提出された米国仮特許出願第６１／２８９，０８３号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、ワクチン組成物、特にＫＬＨ−ペプチド結合体、ならびにかかる組成物を作製する方法に関する。本開示は、本明細書に記載されている組成物を用いて異常な細胞成長を低減する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤＸ−１１０は、脳の癌の種である多形性膠芽腫に罹患している患者の処置のために開発されている。この疾患を有するかなりの部分の患者が、癌細胞の表面に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の変異体を発現する。この変異体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩとして知られており、癌細胞の表面に（典型的には１３のアミノ酸の）特有のペプチド配列をもたらすスプライス突然変異体から形成される。この変異体は、正常な細胞においては発現されないため、ＥＧＦＲｖＩＩＩ配列は、抗癌治療のための良好な標的である。
【０００４】
ＥＧＦＲは、癌治療のための標的として十分に検証されてきたタンパク質である。しかし、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲとは違って、正常な組織には存在せず、この標的が癌患者のための腫瘍特異的治療の開発を可能にすることを示唆している。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、癌細胞成長に直接寄与し得る形質転換癌遺伝子である。最も一般的で侵攻性の形態の脳の癌を多形性膠芽腫（ＧＢＭ）において元来発見したが、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現はまた、種々の他の癌、例えば、乳癌、卵巣癌、転移性前立腺癌、直腸結腸癌、および頭頸部癌においても観察されている。
【０００５】
ＣＤＸ−１１０は、Ｃ末端システインが付加されたＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドを、担体タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合的に連結させることによって形成される結合ワクチンである（例えば、米国特許第５，４０１，８２８号、同第６，２２４，８６８号；およびＷＯ２００７／０５６０６１号を参照されたい）。ＫＬＨはまた、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドに対する免疫応答を向上させる免疫刺激剤としても作用する。ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドとＫＬＨとの化学的連結は、二官能性リンカーであるスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）の使用を経て達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＤＸ−１１０の産生およびこれの製剤化のためのこれまでのプロセスは、商業的設定における使用に関していくつかの欠点を有していた。例えば、かかる欠点は、制御が困難である反応を結果としてもたらす、リンカー（ＳＭＣＣ）の完全な溶解性の欠失；許容されないレベルの、製造過程での不純物；スケールアップを受け入れにくいプロセス手順；重要な生物物理学的特徴、例えば、ペプチド：ＫＬＨ担体の比の十分な制御の欠失、サイズの不均一性、粒子状物質およびゲルの形成、ならびに生成物の不安定性を含んでいた。ＫＬＨは、高い製薬標準まで結合および製剤化することが非常に困難であると既に証明されている非常に大きな担体である。したがって、かかる欠点に対処するＫＬＨ−ペプチド結合体の組成物を提供する改善された製造方法および製剤が必要とされている。
【０００７】
本開示の他の特徴および利点は、限定的であると解釈されるべきでない以下の詳細な説明および実施例から明らかになるであろう。本開示を通して列挙されている全ての参照文献、図、Ｇｅｎｂａｎｋ登録、特許および公開されている特許出願は、これらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本開示は、ＫＬＨ−ペプチド結合体と、リン酸カリウム緩衝液と、二糖と、界面活性剤とを含む組成物を提供する。一実施形態において、リン酸カリウム緩衝液は、５ｍＭ〜３０ｍＭ、例えば、５ｍＭ〜２０ｍＭ、５ｍＭ〜１５ｍＭ、７ｍＭ〜１３ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ、９ｍＭ〜１１ｍＭ、または９．５ｍＭ〜１０．５ｍＭの範囲の濃度で存在する。別の実施形態において、リン酸カリウム緩衝液は、１０ｍＭの濃度で存在する。さらなる実施形態において、リン酸カリウム緩衝液は、４０℃において１２週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して１５％未満変化しているような濃度で存在する。
【０００９】
さらなる実施形態において、組成物中の二糖は、トレハロースである。一実施形態において、トレハロースは、４５ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、または８５ｍｇ／ｍＬ〜９５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。別の実施形態において、トレハロースは、９０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。別の実施形態において、トレハロースは、４０℃において１２週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して１５％未満変化しているような濃度で存在する。
【００１０】
さらなる実施形態において、組成物中の界面活性剤は、ポリソルベート８０である。例えば、一実施形態において、ポリソルベート８０は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．２５ｍｇ／ｍＬ、または０．１５ｍｇ／ｍＬ〜０．２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。一実施形態において、ポリソルベート８０は、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。さらなる実施形態において、ポリソルベート８０は、４０℃において１２週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して１５％未満変化しているような濃度で存在する。
【００１１】
一態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意の組成物であって、ＫＬＨ−ペプチド結合体においてＫＬＨに結合したペプチドは、配列番号１を含み、これから本質的になり、またはこれからなる組成物を提供する。さらなる実施形態において、ＫＬＨ−ペプチド結合体においてＫＬＨに結合したペプチドは、配列番号２を含み、これから本質的になり、またはこれからなる。一実施形態において、ペプチドは、スルホ−ＳＭＣＣリンカーを有するＫＬＨに結合される。
【００１２】
一態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意のＫＬＨ−ペプチド組成物であって、エピトープ密度が２０〜８０の範囲である、組成物を提供する。例えば、一実施形態において、エピトープ密度は、２５〜７５、２５〜７０、２５〜６５、３０〜６０、３０〜５５、３５〜５０、４０〜５０の範囲である。さらなる実施形態において、エピトープ密度は、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０である。
【００１３】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意の組成物であって、ダイマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量が、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の４５質量％〜６５質量％の範囲である、組成物を提供する。例えば、一実施形態において、ダイマー形態は、５０質量％〜６０質量％、５１質量％〜５９質量％、５２質量％〜５８質量％、５３質量％〜５７質量％、または５４質量％〜５６質量％の範囲である。さらなる実施形態において、ダイマー形態でのＫＬＨ−ペプチド結合体の量は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の５０質量％、５１質量％、５２質量％、５３質量％、５４質量％、５５質量％、５６質量％、５７質量％、５８質量％、５９質量％、または６０質量％である。さらなる実施形態において、ダイマー形態でのＫＬＨ−ペプチド結合体の量は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の８０質量％超である。例えば、一実施形態において、ダイマー形態での量は、８５質量％超、９０質量％超、９５質量％超、９６質量％超、９７質量％超、９８質量％超、または９９質量％超である。
【００１４】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意の組成物であって、ＵＶ吸収による検出によるサイズ排除クロマトグラフィに付されたとき、ダイマー形態のＫＬＨ−ペプチド結合体に相当するピークが、曲線下全面積の４５％〜６５％である、組成物を提供する。例えば、一実施形態において、ダイマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の５０％〜６０％、５１％〜５９％、５２％〜５８％、５３％〜５７％、または５４％〜５６％である。さらなる実施形態において、ダイマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％である。さらなる実施形態において、ダイマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の８０％超である。例えば、一実施形態において、ダイマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超である。
【００１５】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意の組成物であって、モノマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量が、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の１５質量％〜４０質量％の範囲である、組成物を提供する。例えば、一実施形態において、ダイマー形態は、２０質量％〜３５質量％、２１質量％〜３４質量％、２２質量％〜３３質量％、２３質量％〜３２質量％、２４質量％〜３１質量％、または２５質量％〜３０質量％の範囲である。さらなる実施形態において、モノマー形態でのＫＬＨ−ペプチド結合体の量は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の１８質量％、１９質量％、２０質量％、２１質量％、２２質量％、２３質量％、２４質量％、２５質量％、２６質量％、２７質量％、２８質量％、２９質量％、または３０質量％である。さらなる実施形態において、モノマー形態でのＫＬＨ−ペプチド結合体の量は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の８０質量％超である。例えば、一実施形態において、モノマー形態での量は、８５質量％超、９０質量％超、９５質量％超、９６質量％超、９７質量％超、９８質量％超、または９９質量％超である。
【００１６】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意の組成物であって、ＵＶ吸収による検出によるサイズ排除クロマトグラフィに付されたとき、モノマー形態のＫＬＨ−ペプチド結合体に相当するピークは、曲線下全面積の１５％〜４０％である、組成物を提供する。例えば、一実施形態において、モノマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の２０％〜３５％、２１％〜３４％、２２％〜３３％、２３％〜３２％、２４％〜３１％、または２５％〜３０％である。さらなる実施形態において、モノマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％である。さらなる実施形態において、モノマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の８０％超である。例えば、一実施形態において、モノマー形態に相当するピークは、曲線下全面積の８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超である。
【００１７】
本開示は、本明細書に記載されている任意のＫＬＨ−ペプチド結合体組成物であって、水性医薬組成物である組成物をさらに提供する。一実施形態において、該組成物のｐＨは、６〜８の範囲である。さらなる実施形態において、組成物のｐＨは、６．５〜７．５の範囲である。さらなる実施形態において、組成物のｐＨは、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４または７．５である。さらなる実施形態において、ｐＨは、４０℃において１２週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して１５％未満変化しているような量である。
【００１８】
さらなる態様において、本開示は、ＫＬＨ−ペプチド結合体と、リン酸カリウム緩衝液と、トレハロースと、ポリソルベート８０とを含む液体組成物であって、ＫＬＨに結合したペプチドは、配列番号１または配列番号２を含み、これから本質的になり、またはこれからなり；ＫＬＨ−ペプチド結合体は、３０〜６５の範囲のエピトープ密度を有し；緩衝液は、９ｍＭ〜１１ｍＭの範囲の濃度で存在し；ｐＨは、７．３〜７．５の範囲であり；トレハロースは、８５ｍｇ／ｍＬ〜９５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し；ポリソルベート８０は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し；さらに、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、モノマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量は、組成物の全質量の１８％〜３５質量％の範囲であり、ダイマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量は、組成物の全質量の５０％〜６５質量％である、液体組成物を提供する。例えば、一実施形態において、緩衝液は、１０ｍＭの濃度で存在し、組成物のｐＨは、７．４であり、トレハロースは、９０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート８０は、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。さらに、例えば、該液体組成物は、水によって凍結乾燥組成物を再構成することによって調製された。
【００１９】
本開示は、ＫＬＨ−ペプチド結合体と、リン酸カリウム緩衝液と、二糖と、界面活性剤とを含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる凍結乾燥組成物をさらに提供する。一実施形態において、該凍結乾燥組成物は、水によって再構成されるとき、６〜９の範囲のｐＨを有する。一実施形態において、二糖は、トレハロースであり、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。さらなる実施形態において、トレハロースは、ＫＬＨ−ペプチド結合体１ｍｇあたり８０〜１１０ｍｇの範囲の量で存在し；ポリソルベート８０は、ＫＬＨ−ペプチド結合体１ｍｇあたり０．０１〜０．３ｍｇの範囲の量で存在する。さらなる実施形態において、トレハロースは、ＫＬＨ−ペプチド結合体１ｍｇあたり９０ｍｇの量で存在し；ポリソルベート８０は、ＫＬＨ−ペプチド結合体１ｍｇあたり０．２ｍｇの量で存在する。
【００２０】
一態様において、本開示は、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を含む液体組成物であって、４０℃において１２週後に、ｍｇ／ｍＬで測定したときの該液体組成物中の該結合体の濃度が、元の濃度と比較して１５％未満、１３％未満、１１％未満、１０％未満、８％未満、または５％未満変化している、液体組成物を提供する。
【００２１】
さらなる態様において、本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって、該哺乳動物に本明細書に開示されている任意の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、異常な細胞成長は癌性である。さらなる実施形態において、癌は、膠芽細胞腫である。
【００２２】
さらなる態様において、本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって、ａ）本明細書に開示されている任意の組成物をアジュバントと混合する工程と；ｂ）得られた混合物を該哺乳動物に投与する工程とを含む方法を提供する。さらなる態様において、本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって、本明細書に開示されている任意の組成物を少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である。
【００２３】
本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって：ａ）本明細書に開示されている任意の凍結乾燥組成物を付与することと；ｂ）凍結乾燥組成物に水を添加して、再構成された組成物を付与することと；ｃ）再構成された組成物を該哺乳動物に投与することとを含む方法をさらに提供する。
【００２４】
本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって：ａ）本明細書に開示されている任意の凍結乾燥組成物を付与することと；ｂ）凍結乾燥組成物に水を添加して、再構成された組成物を付与することと；ｃ）再構成された組成物をアジュバント組成物と混合することと；ｄ）得られた混合物を該哺乳動物に投与することとを含む方法をさらに提供する。一実施形態において、該アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である。
【００２５】
本開示は、哺乳動物における異常な細胞成長の処置のための薬剤の製造における、本明細書に開示されている任意の組成物の使用をさらに提供する。
【００２６】
本開示は、ＫＬＨ−ペプチド結合体を含む凍結乾燥組成物を調製するためのプロセスであって、本明細書に開示されている任意の液体組成物を−２０℃以下、−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、または−６０℃以下の温度に、かつ真空条件に付すことを含むプロセスをさらに提供する。
【００２７】
本開示は、液体組成物を調製するプロセスであって、本明細書に開示されている任意の凍結乾燥組成物に水を添加することを含むプロセスをさらに提供する。
【００２８】
本開示は、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を調製するための方法であって：ａ）ＫＬＨをリンカーと組み合わせて、ＫＬＨおよびリンカーを３０〜６０分、３５〜５５分、４０〜５０分、または４５分の範囲の時間にわたって相互作用させることと；ｂ）配列番号１または配列番号２を含む、これから本質的になる、またはこれからなるペプチドを工程ａ）から得られる活性化ＫＬＨ生成物に添加して、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を付与することとを含む方法をさらに提供する。一実施形態において、工程ｂ）は、接線流濾過システムにおいて実施される。さらなる実施形態において、濃縮水流量は、１０〜１０００ｍＬ／分、例えば、５０〜５００ｍＬ／分、例えば、１００〜５００ｍＬ／分の範囲であり、さらに、例えば、５０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、１５０ｍＬ／分、２００ｍＬ／分、２５０ｍＬ／分、３００ｍＬ／分、３５０ｍＬ／分、４００ｍＬ／分、４５０ｍＬ／分、または５００ｍＬ／分である。
【００２９】
一実施形態において、リンカーは、７５：１〜３２５：１の範囲のリンカー：ＫＬＨモル比でＫＬＨと組み合わされる。例えば、一実施形態において、該リンカー：ＫＬＨモル比は、１００：１〜３００：１、１５０：１〜２５０：１、または１７５：１〜２２５：１の範囲である。例えば、一実施形態において、該リンカー：ＫＬＨモル比は、１７５：１、１８０：１、１８５：１、１９０：１、１９５：１、２００：１、２０５：１、２１０：１、２１５：１、２２０：１、または２２５：１である。
【００３０】
本開示は、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を含む液体組成物であって、５℃において２６週後に、１０μｍ以上の粒子状物質の数が、ＵＳＰ＜７８８＞で測定したときに１０００％未満、７５０％未満、５００％未満、４００％未満、３００％未満、２００％未満、または１００％未満増加している、液体組成物をさらに提供する。
【００３１】
本開示は、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を含む液体組成物であって、５℃において２６週後に、２５μｍ以上の粒子状物質の数が、ＵＳＰ＜７８８＞で測定したときに１０００％未満、７５０％未満、５００％未満、４００％未満、３００％未満、２００％未満、または１００％未満増加している、液体組成物をさらに提供する。
[本発明1001]
ＫＬＨ−ペプチド結合体と、緩衝液と、糖と、界面活性剤とを含む組成物であって、ＫＬＨ−ペプチド結合体においてＫＬＨに結合したペプチドが、ＥＧＦＲｖＩＩＩアミノ酸配列を含む、前記組成物。
[本発明1002]
緩衝液が、リン酸緩衝液を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
緩衝液が、リン酸カリウム緩衝液を含む、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
緩衝液が、5ｍＭ〜30ｍＭの範囲の濃度で存在する、本発明1001〜1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
緩衝液が、40℃において12週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して15％未満変化しているような濃度で存在する、本発明1001〜1003のいずれかの組成物。
[本発明1006]
糖が二糖である、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
二糖が、トレハロースであり、かつ45〜150ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在するかまたはＫＬＨ−ペプチド結合体1ｍｇあたり80〜110ｍｇの範囲の量で存在する、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
二糖が、トレハロースであり、かつ40℃において12週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して15％未満変化しているような濃度で存在する、本発明1006の組成物。
[本発明1009]
界面活性剤が、ポリソルベートであり、かつ0．01〜0．3ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在するかまたはＫＬＨ−ペプチド結合体1ｍｇあたり0．01〜0．3ｍｇの範囲の量で存在する、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
界面活性剤が、ポリソルベートであり、かつ40℃において12週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して15％未満変化しているような濃度で存在する、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
ＫＬＨ−ペプチド結合体においてＫＬＨに結合したペプチドが、配列番号1からなる、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1012]
ＫＬＨ−ペプチド結合体においてＫＬＨに結合したペプチドが、配列番号2からなる、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1013]
ペプチドが、スルホ−ＳＭＣＣリンカーを有するＫＬＨに結合されている、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1014]
エピトープ密度が20〜80の範囲である、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1015]
ダイマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量が、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の45％〜65質量％の範囲である、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1016]
モノマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量が、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、組成物の全質量の15％〜40質量％の範囲である、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1017]
サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、モノマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量が、組成物の全質量の18％〜35質量％の範囲であり、かつダイマー形態で存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の量が、組成物の全質量の50％〜65質量％の範囲である、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1018]
該組成物が水性医薬組成物であり、かつ該組成物のｐＨは6〜8の範囲である、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1019]
該組成物が水性医薬組成物であり、かつ該組成物のｐＨは、40℃において12週後に、該組成物中のＫＬＨ−ペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して15％未満変化しているような量である、上記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1020]
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体と、リン酸カリウム緩衝液と、トレハロースと、ポリソルベート80とを含む液体組成物であって：ＫＬＨに結合したペプチドは配列番号1を含み；ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体は、30〜65の範囲のエピトープ密度を有し；緩衝液は、9ｍＭ〜11ｍＭの範囲の濃度で存在し；組成物のｐＨは、7．3〜7．5の範囲であり；トレハロースは、85ｍｇ／ｍＬ〜95ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し；ポリソルベート80は、0．1ｍｇ／ｍＬ〜0．3ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し；さらに、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、モノマー形態で存在するＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の量は、組成物の全質量の18％〜35質量％の範囲であり、かつダイマー形態で存在するＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の量は、組成物の全質量の50％〜65質量％の範囲である、前記液体組成物。
[本発明1021]
液体組成物が、水によって凍結乾燥組成物を再構成することによって調製される、本発明1017の組成物。
[本発明1022]
緩衝液が、10ｍＭの濃度で存在し、組成物のｐＨが、7．4であり、トレハロースが、90ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート80が、0．2ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、本発明1017または1018の組成物。
[本発明1023]
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を調製するための方法であって：ａ）ＫＬＨをリンカーと組み合わせて、ＫＬＨおよびリンカーを30〜60分の範囲の時間にわたって相互作用させることと、ｂ）配列番号1を含むペプチドを工程ａ）から得られる活性化ＫＬＨ生成物に添加して、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を付与することとを含む、前記方法。
[本発明1024]
リンカーが、75：1〜325：1の範囲のリンカー：ＫＬＨモル比でＫＬＨと組み合わされる、本発明1020の方法。
[本発明1025]
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を調製するための方法であって：ａ）ＫＬＨをリンカーと組み合わせて、ＫＬＨおよびリンカーを相互作用させることと、ｂ）配列番号1を含むペプチドを工程ａ）から得られる活性化ＫＬＨ生成物に添加して、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を付与することとを含み、該リンカーが、非水性溶媒に添加されたスルホ−ＳＭＣＣリンカーである、前記方法。
[本発明1026]
非水性溶媒がＤＭＳＯを含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体を含む組成物であって、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるとき、モノマー形態で存在するＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の量は、該組成物の全質量の18％〜35質量％の範囲であり、かつダイマー形態で存在するＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の量は、該組成物の全質量の50％〜65質量％の範囲である、前記組成物。
[本発明1028]
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体を含む組成物であって、40℃において12週後に、該組成物中のＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体の濃度が、ｍｇ／ｍＬで測定されるときに元の濃度と比較して15％未満変化しているように安定化された水性医薬組成物である、前記組成物。
[本発明1029]
ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体を含む組成物であって、該結合体の平均エピトープ密度が約20〜80の間である、前記組成物。
[本発明1030]
以下の特性を有する、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体を含む組成物：
ｉ）30〜70個のペプチド／ＫＬＨの、アミノ酸組成物によって測定されたエピトープ密度；
ｉｉ）以下の通りの、ＳＥＣ  ＨＰＬＣによって測定されたサイズ分布プロファイル：
ピーク1  ＜2％
ピーク2  8〜17％
ピーク3  50〜60％
ピーク4  20〜30％
ピーク5  1〜5％
ｉｉｉ）以下の通りの、ＡＥＸ  ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された純度：
ペプチドダイマー≦5％
リンカーまたはリンカー関連の不純物≦1％
合計ペプチド−リンカー不純物≦10％。
[本発明1031]
緩衝液を含む、本発明1027〜1030のいずれかの組成物。
[本発明1032]
緩衝液が、リン酸緩衝液を含む、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
緩衝液が、リン酸カリウム緩衝液を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
凍結保護物質または凍結乾燥保護物質を含む、本発明1027〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
糖を含む、本発明1027〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1036]
糖が二糖である、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
二糖がトレハロースである、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
界面活性剤を含む、本発明1027〜1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
界面活性剤が、ポリソルベート、ポロキサマーまたはトリトン界面活性剤である、本発明1038の組成物。
[本発明1040]
界面活性剤が、ポリソルベート80である、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
5℃において26週後に、25μｍ以上の粒子状物質の数が、ＵＳＰ＜788＞で測定したときに1000％未満増加する、本発明1027〜1040のいずれかの組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＫＬＨ−ペプチド結合反応の実施の一例の一般的プロセスの概略を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、種々のクロスフロー実験の活性化反応の間に用いられる重要な操作パラメータの概要を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々のクロスフロー実験における初期のダイアフィルトレーション工程の間に用いられる重要な操作パラメータの概要を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、種々のクロスフロー実験における結合工程の間に用いられる重要な操作パラメータの概要を示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、クロスフロー濾過の開発実験に関する分析結果の概要を示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、種々の実験に用いた反応パラメータの概要を示す。
【図５】図５は、５個のピークのおよその保持時間を示す、ＣＤＸ−１１０ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体に関する代表的なＳＥＣ  ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、スルホ−ＳＭＣＣ比のエピトープ密度に対する影響を示すプロットである。
【図７】図７は、活性化時間のエピトープ密度に対する影響を示すプロットである。
【図８】図８Ａ（ダイマー）および８Ｂ（モノマー）は、スルホ−ＳＭＣＣ比のＳＥＣ不均一性に対する影響を示すプロットである。
【図９】図９Ａ（ダイマー）および９Ｂ（モノマー）は、活性化時間のＳＥＣ不均一性に対する影響を示すプロットである。
【図１０】図１０は、リンカースラリーとＤＭＳＯに溶解されたリンカーとのエピトープ密度の比較を示す。
【図１１】図１１Ａ（ダイマー）および１１Ｂ（モノマー）は、ＤＭＳＯの、活性化反応のＳＥＣプロファイルに対する影響を示すプロットである。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、エピトープ密度の結果の統計分析を示し、これは、スルホ−ＳＭＣＣ：ＫＬＨ比とタンパク質濃度との相互作用を示している。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ダイマーの結果の統計分析を示し、これは、スルホ−ＳＭＣＣ：ＫＬＨ比とタンパク質濃度との相互作用を示している。
【図１４】図１４は、ＣＤＸ−１１０を調製する元の最適化されたプロセスに用いられる反応パラメータの概要を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、有益な特性、例えば粒子状物質およびゲルの形成の低減ならびに結合体の安定性の増加を提供するＫＬＨ−ペプチド結合体のための新規の製剤の発見に基づいている。本明細書に記載されている製剤はまた、凍結乾燥および再構成されてもよく、これにより、搬送および長期の保存にさらなる利益を提供する。当業者に明らかであるかかる有益な特性などは、本明細書にさらに完全に記載される。さらに、本開示により、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合体ワクチンの製造のための改善されたプロセスが開発された。本明細書に開示されている新規のプロセスは、大規模な製造プロトコルを受け入れやすく、純度プロファイルについての改善、ならびに重要な生物物理学的特質、例えばペプチド／ＫＬＨの比、およびサイズの不均一性の制御を結果としてもたらす最適化された反応条件を提供する。
【００３４】
本開示がより容易に理解され得るように、ある一定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
【００３５】
本明細書において別途定義されない限り、本開示に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈によって別途必要とされない限り、単数形は複数を含み、複数形は単数を含む。一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、ならびにこれらの技術は、当該分野において周知され一般に用いられているものである。
【００３６】
本開示の方法および技術は、当該分野において周知の方法に従って一般的に実施され、別途示されない限り本明細書を通して列挙および議論されている種々の一般的かつより具体的な参照文献に記載されている通りである。かかる参照文献は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００２）、および  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９０）を含む。酵素反応および精製技術は、当該分野において一般に達成され、本明細書に記載されている、製造者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる命名法、ならびに実験室手順および技術は、当該分野において周知の一般に用いられているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤、および送達、ならびに患者の処置に用いられる。
【００３７】
本明細書において用いられるとき、以下の各用語は、本節において関連する意味を有する。
【００３８】
本明細書において用いられる冠詞「ａ（１個の）」および「ａｎ（１個の）」は、冠詞の文法的対象物が１個または１個を超える（すなわち、少なくとも１個）ことを称する。例として、「（１個の）要素」は、１個の要素または１個を超える要素を意味する。
【００３９】
本明細書において用いられるとき、２０の常套的なアミノ酸およびそれらの略語は、常套的な用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、Ｅｄｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。
【００４０】
本明細書において用いられるとき、「ＫＬＨ」は、タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン、キーホールリンペット（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ  ｃｒｅｎｕｌａｔａ）の血リンパにおいて見出されるマルチサブユニットの、酸素を運ぶ金属タンパク質、またはそのフラグメントもしくはサブユニットを称する。
【００４１】
本明細書において用いられるとき、用語「ＫＬＨ−ペプチド結合体」は、ＫＬＨタンパク質、またはそのフラグメントもしくはサブユニットを称し、ＫＬＨに関係しないポリペプチドに共有結合的に結合する。かかる共有結合的結合は、適切な化学リンカーの使用を経て典型的には達成される。
【００４２】
本明細書において用いられるとき、用語「エピトープ密度」は、ＫＬＨ−ペプチド結合体を参照して、各ＫＬＨサブユニットにカップリングするペプチドの平均数を称する。エピトープ密度は、本明細書に記載されているアミノ酸組成分析を用いて決定され得る。
【００４３】
用語「二糖」は、本明細書において用いられるとき、加水分解の際に、２個の単糖分子（例えば、グルコース、フルクトース、マンノースなど）を生ずる化合物を称する。好適な二糖として、限定されないが、スクロース、ラクトースおよびトレハロースが挙げられる。
【００４４】
本明細書において用いられるとき、用語「界面活性剤」は、液体のＫＬＨ−ペプチド結合体組成物の表面張力を変更することができる賦形剤を称する。本明細書においてさらに議論されているように、界面活性剤の例として、当業者に一般に公知である多くのものの中でも、限定されないが、ポリソルベート界面活性剤、プロキサマー（例えば、プロキサマー１８および４０７）、トリトン界面活性剤、例えば、トリトンＸ−１００（登録商標）、およびポリソルベート界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）およびＴｗｅｅｎ８０（登録商標）が挙げられる。
【００４５】
用語「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、「凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙ）された」は、乾燥すべき材料をまず凍結し、次いで氷または凍結した溶媒を真空環境において昇華によって除去するプロセスを称する。
【００４６】
本明細書において用いられるとき、用語「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に存在する変異体である突然変異体ＩＩＩの代表例であるペプチドを称し、配列番号１もしくは２に記載されているアミノ酸配列を典型的には含むもしくはこれからなり、または少なくともアミノ酸配列「Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ」を含む。
【００４７】
「異常な細胞成長」は、本明細書において用いられるとき、別途示されない限り、正常な細胞の異常な成長および異常な細胞の成長を含めた、正常な調節機構から独立した細胞成長（例えば、接触阻止の損失）を称する。これは、限定されないが：腫瘍細胞（腫瘍）、例えば、中皮腫、肝胆汁性（肝臓および胆管）、原発性または続発性のＣＮＳ腫瘍、原発性または続発性の脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨の癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃腸（胃、直腸結腸、および十二指腸）、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄の軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、あるいは上記癌の１種以上の組み合わせの異常な成長が挙げられる。
【００４８】
本明細書において用いられるとき、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を称し、ここで、対象とするのは、標的化された病的状態または症状を防止するまたは遅らせる（軽減する）ことである。処置が必要な対象として、状態を既に有する対象、ならびに状態を有する傾向がある対象および予防されるべき状態を有する対象が挙げられる。
【００４９】
組成物の「治療有効量」は、異常な細胞成長の処置または予防的防止を含めた、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間において有効である量を称する。投与量の値は、寛解されるべき状態の重症度によって変動し得ることに注意されたい。任意の特定の被験体に関して、具体的な投与レジメンが個体の必要性および組成物を投与するまたは該投与を管理する者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載の投与量範囲が、単に例示的であり、特許請求の組成物の範囲または実施を限定することは意図されないことがさらに理解されたい。同様に、組成物の治療有効量は、因子、例えば、個体の疾患状態、年齢、性別、および個体の重量、治療組成物が個体における所望の応答を引き出す能力、ならびに所望の投与経路に従って変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な影響が組成物のあらゆる毒性または有害な影響を上回る量でもある。
【００５０】
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効であるような形態にある調製物を称する。
【００５１】
「薬学的に許容される賦形剤」（ビヒクル、添加剤）は、使用される有効用量の活性成分を付与するように被験体に適度に（すなわち、安全に）投与され得る賦形剤である。用語「賦形剤」または「担体」は、本明細書において用いられるとき、薬剤のための希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤または安定剤として一般に用いられる不活性な物質を称する。本明細書において用いられるとき、用語「希釈剤」は、薬学的に許容される（ヒトへの投与に安全かつ非毒性）溶媒を称し、本明細書における液体製剤の調製物に有用である。例示的な希釈剤として、限定されないが、注入のための滅菌水および静菌水（ＢＷＦＩ）が挙げられる。
【００５２】
別途記述されない限り、本明細書に開示されている組成物の種々の成分の濃度およびｐＨ値は、周囲条件における（すなわち、２５℃および周囲圧における）濃度である。濃度およびｐＨ範囲が本明細書において列挙されているとき、列挙されている明確な範囲の中間にあるかかる範囲もまた、本開示の部分であることが意図される。例えば、上限値および／または下限値としての任意の値の組み合わせを用いた値の範囲も包含されると意図される。
【００５３】
本開示により、ＫＬＨ−ペプチド結合体について、粒子状物質および／またはゲルの形成が低減され得、結合体の安定性が、結合体をリン酸カリウム緩衝液、二糖、例えばトレハロース、および界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０と組み合わせることによって改善され得ることが発見された。さらに、これらの成分がある一定量で用いられるとき、同時に粒子およびゲルの形成を最小にして結合体の安定性および生物物理学的特徴を維持しながら、凍結乾燥（続いて、水溶液として再構成）が可能であることが発見された。
【００５４】
いずれの特定の理論によっても拘束されることを望まないが、本開示の組成物は、以下：ＫＬＨ−ペプチド凝集、フラグメント化、酸化、凍結／解凍不安定性、１箇所から別の箇所への搬送もしくは輸送に関係する不安定性、変色、および／または脱アミド化の１つ以上の発生を低減することによって、ＫＬＨ−ペプチド結合体の安定性を改善し、ＫＬＨ−ペプチド結合体の粒子状物質および／またはゲルの形成を低減することを助けると考えられる。したがって、本開示は、既に開示されている組成物と比較して改善された化学的および／または物理的安定性を有するＫＬＨ−ペプチド結合体組成物を提供する。
【００５５】
したがって、ある一定の態様において、本開示は、ＫＬＨ−ペプチド結合体と、リン酸カリウム緩衝液と、二糖と、界面活性剤とを含む組成物を提供する。さらに他の態様において、上記組成物は、限定されないが、緩衝液、塩、抗酸化剤、等張化剤、界面活性剤、およびこれらの混合物を含めたさらなる薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。したがって、本開示は、ＫＬＨ−ペプチド結合体のための新規の製剤を提供する。
【００５６】
ＫＬＨ−ペプチド結合体
ＫＬＨは、抗原ペプチドの担体として用いられ得る複合マルチマータンパク質である。かかるペプチドは、ＫＬＨに結合され得、得られるＫＬＨ−ペプチド結合体は、抗原ペプチドを対象とした免疫応答を刺激する際にワクチンとして用いられ得る。
【００５７】
本開示の一態様において、抗原ペプチドは、化学的架橋を介して、典型的にはヘテロ二官能性架橋剤を用いてＫＬＨに結合される。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野において公知である。いくつかの実施形態において、ヘテロ二官能性架橋剤は、第１付着部位、すなわちＫＬＨのリシン残基の側鎖アミノ基と反応し得る官能基を含有し、好ましい第２付着部位、すなわち、抗原ペプチドに融合され、場合により、還元による反応にも利用可能となるシステイン残基と反応し得る官能基をさらに含有する。手順の第１工程は、典型的には誘導体化と呼ばれ、ＫＬＨと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化ＫＬＨであり、活性化担体とも呼ばれる。第２工程において、未反応の架橋剤が、標準方法、例えば、ゲル濾過または透析を用いて除去される。第３工程において、抗原ペプチドが、活性化ＫＬＨと反応し、この工程は、典型的にはカップリング工程と呼ばれる。未反応の抗原ペプチドは、第４工程において、例えば、透析によって場合により除去されてよい。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野において公知である。これらとして、架橋剤、例えば、ＳＭＰＨ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡおよび、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能な、アミノ基に対して反応性の１個の官能基およびシステイン残基に対して反応性の１個の官能基を有する他の架橋剤が挙げられる。上記架橋剤は、全てがチオエーテル連結の形成をもたらす。
【００５８】
ＫＬＨ−ペプチド結合体の一例は、ＫＬＨタンパク質の表面に化学的に結合される、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１）として公知のペプチドを含む。このＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドは、ＩＩＩ型変異体形態の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の１３のアミノ酸を含有する（例えば、米国特許第５，４０１，８２８号を参照されたい）。ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドは、ペプチド（例えば、配列番号２または３を参照されたい）のＮ−またはＣ−末端にＣｙｓ残基を含み、次いでスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）をリンカーとして用いることによって、ＫＬＨの表面おける（例えば、Ｌｙｓ側鎖における）第一級アミン基にカップリングされ得る。したがって、典型的なカップリング反応は、スキーム１において以下に示すように実施され得る。
【００５９】
【化１】
0006007105.tif 000002
【００６０】
当業者は、スキーム１に従って結合を達成する適切な反応条件を認識する。例えば、上記スキーム１における第１工程（活性化反応）は、ＫＬＨ、緩衝液、水、およびリンカーが一緒に混合されることである。この活性化反応を次いでおよそ４５±５分間進行させ得る。反応時間の終わりに、活性化反応混合物を希釈し、適切な濾過システムに移して、過剰なリンカーおよびリンカー関連の不純物を除去することができる。次いで適切な緩衝液に予め溶解したペプチドを導入し、結合反応を２〜３時間進行させる。結合プロセス時間の終わりに、第２濾過操作を行って、過剰なペプチドおよびペプチド関連の不純物を除去して、適切な最終緩衝液に緩衝液交換することができる。さらなる処理は、希釈、賦形剤の添加、最終濾過、および充填による濃度調整を含んでいてよい。図１は、このプロセスをどのように実施することができるかの一例の一般的な概略を提供する。
【００６１】
ＫＬＨサブユニットあたりのペプチドの数（本明細書において「エピトープ密度」とも称する）は、具体的な反応条件に依存するが、ＫＬＨ分子あたりのペプチドは、典型的には約３０〜約１００個の範囲である。このエピトープ密度は、本明細書に記載されている結合されたＫＬＨと結合されていないＫＬＨとの間の合計アミノ酸組成を比較することによって測定され得る。ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体に関するサイズ分布プロファイルは、モノマー、ならびにマルチマー形態、例えば、ダイマー、トリマーを含むことができる。反応条件に応じて、このサイズプロファイルは変動し得、分析技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって測定され得る。
【００６２】
上記結合スキームにおいて用いられるペプチドが（配列番号２または３に記載のように）ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドである場合、得られるＫＬＨ結合体は、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体と称される。ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を製造するための最適化されたプロセスが、既に臨床状態にある薬剤物質ロットに対する互換性を同時に維持しながら元のプロセスの失敗に対処するように開発された。プロセス開発に用いた重要な分析特質は、アニオン交換（ＡＥＸ）および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による純度、ＳＥＣ  ＨＰＬＣによって測定される分子サイズ分布、ならびにエピトープ密度であった。最適化されたプロセスに関する基準は、所望の範囲内で、薬剤物質の純度を維持または改善すること、ならびにサイズ分布プロファイルおよびエピトープ密度をもたらすことを含む。
【００６３】
抗原ペプチド
ＫＬＨへの結合に用いられるポリペプチドは、天然源から誘導され得、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、またはラットなどから単離され得る。本開示のポリペプチドは、したがって、標準的なタンパク質精製技術を用いて細胞または組織源から単離され得る。
【００６４】
代替的には、ポリペプチドは、化学合成され得または組み替えＤＮＡ技術を用いて製造され得る。例えば、本開示のポリペプチド（例えば、配列番号：１〜３に示されているもの）は、当該分野において周知の固相手順によって合成され得る。好適な合成は、「Ｔ−ｂｏｃ」または「Ｆ−ｍｏｃ」手順を利用することによって行われてよい。環状ペプチドは、完全に自動化された装置において周知の「Ｆ−ｍｏｃ」手順およびポリアミド樹脂を使用した固相方法によって合成され得る。代替的には、当業者が、プロセスを手動で行うのに必要な実験室手順を知っているであろう。固相合成のための技術および手順は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＰｒｅｓｓにおけるＩＲＬによって出版された、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．ＳｈｅｐｐａｒｄによるＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８９）ならびにＤ．ＡｎｄｒｅａｕらによるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄ．Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎおよびＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ）、ｃｈａｐｔｅｒ  ７、ｐｐ．９１−１７１に記載されている。
【００６５】
代替的には、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野において周知の技術を用いて好適な発現系において発現され得る発現ベクターに導入され得、続いて、目的とする発現されたポリペプチドを単離または精製する。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫の発現系が、当該分野において利用可能であり、あらゆるかかる発現系が用いられ得る。場合により、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞不含翻訳系において翻訳され得る。
【００６６】
キーホールリンペットヘモシアニン
当業者は、ＫＬＨを、その大きなサイズおよび区別できるエピトープゆえに免疫応答を増加させる能力に起因して、抗原ペプチドの有益な担体であると認識している（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｍｉｃｒｏｎ  ３０（６）：５９７−６２３（１９９９）を参照されたい）。ＫＬＨは、キーホールリンペットからの精製によって典型的には直接得られ、いくつかの供給源（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏｓｙｎ）から市販されている。
【００６７】
ＫＬＨ−ペプチド結合体組成物の調製
本発明のＫＬＨ−ペプチド結合体は、被験体に対する非経口投与のための医薬組成物として典型的には製剤化される。一実施形態において、組成物は液体組成物である。別の実施形態において、組成物は、凍結乾燥組成物である。本開示の組成物は、ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を、リン酸カリウム緩衝液、二糖、および界面活性剤と組み合わせて含む。ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体の量は、０．０１〜２０．０ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、または０．５〜５ｍｇ／ｍＬの量で本開示の組成物に存在し得る。例えば、特定の実施形態において、ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体は、０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、例えば１．０ｍｇ／ｍＬの量で液体製剤に存在する。
【００６８】
かかる組成物は、７〜８のｐＨを有する水性液体組成物であり得る。特定の実施形態において、ｐＨは７．３〜７．５、例えば７．４である。当業者は、典型的には０．１ｐＨ単位の多さでいずれの特定の溶液のｐＨの測定においても装置間でいくらか変動することを認識している。したがって、ｐＨの数値が本開示を通して列挙されている場合、当業者は、かかる数値がかかる装置内変動を包含することが意図されると認識している。
【００６９】
本開示の組成物はまた、溶媒、例えば水の添加によって続いて再構成された凍結乾燥組成物も含む。
【００７０】
本開示の組成物は、ｐＨを所望のレベルに調整するのに典型的には用いられるリン酸カリウム緩衝液を含み得る。しかし、本開示は、リン酸カリウム緩衝液が本明細書に開示されている組成物において作用する任意の特定のメカニズムによって限定されることは意図されず、本明細書に開示されている組成物において用いられるリン酸カリウム緩衝液は、ｐＨを所望のレベルに調整する能力には全く関係ないメカニズムを通して特性を得ることができる。本明細書において用いられるとき、用語「緩衝液」は、液体組成物がｐＨの変化に抵抗するようにする、添加された組成物を称する。ある一定の実施形態において、添加された緩衝液は、液体ＫＬＨ−ペプチド結合体組成物が酸塩基結合体成分の作用によるｐＨ変化に抵抗することを可能にする。緩衝液の濃度が称されるとき、列挙した濃度が遊離酸または遊離塩基形態の緩衝液のモル濃度を表すことを意図している。
【００７１】
当業者は、リン酸塩が、凍結の間に結晶化する傾向を有するため、リン酸緩衝液が非経口製剤において−特に凍結乾燥された生成物において典型的には用いられないことを認識しているが−本開示は、驚くべきことに、リン酸カリウム緩衝液がかかる結晶化を全く伴わずにＫＬＨ−ペプチド結合体製剤において有用であることを示す。特に、リン酸カリウム緩衝液は、５ｍＭ〜１５ｍＭ、例えば、７ｍＭ〜１２ｍＭ、８〜１１ｍＭ、または９．５ｍＭ〜１０．５ｍＭの範囲の濃度で用いられ得る。当業者は、リン酸カリウム緩衝液が、一塩基性リン酸２水素および二塩基性リン酸１水素の混合物（例えば、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４）として効率的なそれぞれの濃度で典型的には調製されて、所望のｐＨに達することを認識している。かかる緩衝液は、市販されており、または当業者は、本開示の文脈内でかかる緩衝液をどのように調製および使用するのかを認識している。
【００７２】
本開示の組成物はまた、凍結の間に凍結保護物質としておよび凍結乾燥（凍結−乾燥）の間に凍結乾燥保護物質としての使用のための二糖、例えばトレハロースを含むこともできる。しかし、本開示は、本明細書に開示されている組成物において作用するあらゆる特定のメカニズムによっても限定されることを意図しておらず、本明細書において開示されている組成物に用いられる二糖は、これらの特性を、凍結の間に凍結保護物質としておよび凍結乾燥（凍結−乾燥）の間に凍結乾燥保護物質として作用する能力とは全く関係ないメカニズムを経て達成することができる。本開示において、かかる二糖は、７０〜１１０ｍｇ／ｍＬの量で用いられ得る。当業者は、二糖、例えばトレハロース、デキストラン、およびスクロース（とりわけ）が商業的供給源を経て容易に入手可能であることを認識するであろう。
【００７３】
本開示の組成物はまた、界面活性剤、例えばポリソルベート８０も含み、ＫＬＨ−ペプチド結合体と空気−水または氷−水界面との相互作用を減少させることによって、粒子の形成の減少を助けることもできる。しかし、本開示は、本明細書に開示されている組成物において作用するあらゆる特定のメカニズムによっても限定されることを意図しておらず、本明細書において開示されている組成物に用いられる界面活性剤は、これらの特性を、ＫＬＨ−ペプチド結合体と空気−水または氷−水界面との相互作用を減少させる能力とは全く関係ないメカニズムによって達成することができる。本明細書において用いられるとき、用語「界面活性剤」は、液体のＫＬＨ−ペプチド結合体組成物の表面張力を変更することができる賦形剤を称する。ある一定の実施形態において、界面活性剤は、液体のＫＬＨ−ペプチド結合体組成物の表面張力を低減する。さらなる他の実施形態において、「界面活性剤」は、ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体の安定性の改善に寄与することができる。例えば、界面活性剤は、ＫＬＨ−ペプチド結合体の凝集を低減し、ならびに／または組成物における粒子状物質の形成を最小化しおよび／または吸着を低減することができる。界面活性剤は、凍結／解凍サイクルの間または後にＫＬＨ−ペプチド結合体の安定性を改善することもできる。
【００７４】
好適な界面活性剤として、ポリソルベート界面活性剤、プロキサマー（例えば、プロキサマー１８および４０７）、トリトン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００（登録商標）、ポリソルベート界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）およびＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノレアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタイン、イソステラミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ジメチルアミン、パルミドプロピル−ジメチルアミン、イソステラミドプロピル−ジメチルアミン、タウリン酸メチルココイルナトリウム、タウリン酸メチルオレイル二ナトリウム、ジヒドロキシプロピルｐｅｇ５リノールアンモニウムクロリド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００７５】
一実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の賦形剤を含むポリソルベート界面活性剤である。
【００７６】
組成物に存在するときの界面活性剤の濃度は、一般に、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜５．０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬ、または０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．７ｍｇ／ｍＬの範囲である。別の実施形態において、界面活性剤は、０．２ｍｇ／ｍＬである量で存在する。別の実施形態において、界面活性剤は、０．５ｍｇ／ｍＬである量で存在する。別の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート８０（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））であり、０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．２ｍｇ／ｍＬの量で存在する。先に列挙した界面活性剤濃度の中間にある範囲もまた、本開示の部分であると意図される。例えば、上限値および／または下限値として先に列挙した値のいずれかの組み合わせを用いた値の範囲が含まれると意図される。当業者は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０（登録商標）が、商業的供給源を経て容易に入手可能であることを認識するであろう。
【００７７】
ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体は、一旦作製されると、当業者に周知である方法を用いて上記の成分と共に製剤化され得る。例えば、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体は、好適な配合容器内に導入されて穏やかに撹拌され、均質を達成することができる。次いで、結合体は、製剤緩衝液（例えば、リン酸カリウム）によって約１．０ｍｇ／ｍＬまで希釈され得る。次いで、溶液は、サンプリングされて、適切なｐＨおよび濃度を確認することができる。次いで、溶液は、直列の２個の滅菌フィルタ（０．２２ミクロン）を通過することができる。
【００７８】
投与経路および投与量
本開示の組成物は、液体溶液（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）中にあってよい。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的適用に依存し得る。典型的な好ましい組成物は、注射可能なまたは注入可能な溶液の形態、例えば、ヒトの受動免疫化に用いられるものと同様の組成物の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮内、動脈内、皮下、骨内、腹腔内、筋肉内、および胸骨下）であるか、または注入技術、注射可能な滅菌液体もしくは油性懸濁液の形態である。経路および／または投与様式は、当業者によって認識されているように、所望される結果に応じて変動する。
【００７９】
一実施形態において、ＫＬＨ−ペプチド結合体組成物は、静脈内注入または注入によって投与される。別の実施形態において、組成物は、筋肉内または皮下注入によって投与される。治療組成物は、典型的には滅菌性であり、製造および保存条件下にて安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、またはリポソームとして製剤化され得る。注射可能な滅菌溶液は、適切な希釈剤中の所要量のＫＬＨ−ペプチド結合体組成物を先に列挙した成分の１種またはこれらの組み合わせに組み込み、続いて滅菌（例えば、フィルタ滅菌）することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散液媒体および先に列挙した成分以外の所要の成分を含有する滅菌ビヒクル内に組み込むことによって調製される。
【００８０】
注射可能な滅菌調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、非毒性の非経口で許容される希釈剤または溶媒中の注射可能な滅菌溶液または懸濁液であってもよい。許容されるビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンゲル溶液および生理食塩液が使用され得る。また、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として常套的に使用される。この目的で、合成モノ−またはジグリセリドを含めたいずれの無刺激性の固定油が使用されてもよい。また、ｎ−３多価不飽和脂肪酸は、注射可能物の調製における使用を見出すことができる。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌性粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末およびその予め滅菌濾過された溶液からのあらゆるさらなる所望の成分を生じさせる真空乾燥、噴霧乾燥、および凍結乾燥（凍結−乾燥）である。適切な溶液流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には所要の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
【００８１】
注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることによって、または組成物を、持続的吸収形態、例えば、デポー、リポソーム、高分子ミクロスフェア、高分子ゲル、および移植片などに製剤化することによって、もたらされ得る。
【００８２】
本明細書に記載されている組成物の投与のための他の方法として、被験体の皮膚内に薬剤を直接放出する皮膚パッチが挙げられる。かかるパッチは、接着剤に溶解および／もしくは分散された、またはポリマーに分散された、場合により緩衝された液体溶液中に、本開示の組成物を含有することができる。本明細書に記載されている組成物のさらに他の投与方法として、眼用の液体眼科用滴剤が挙げられる。
【００８３】
ＫＬＨ−ペプチド結合体組成物は一度で投与されても複数回で投与されてもよい。例えば、組成物は、１日１回から６ヶ月以上に１回まで投与されてよい。投与は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、２日１回、３日１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回および６ヶ月に１回のスケジュールであってよい。
【００８４】
組成物は、ミニポンプを介して継続的に投与されてもよい。組成物は、腫瘍部位もしくは炎症を起こした身体の部分に、腫瘍もしくは炎症を起こした身体の部分内に、または腫瘍部位もしくは炎症を起こした身体の部分から離れた部位に投与され得る。組成物は、状態が処置、緩和または治癒されるまで１回、少なくとも２回または少なくとも一定期間にわたって投与され得る。ＫＬＨ−ペプチド結合体組成物は、腫瘍が存在する限り、一般に投与されてよい。ただし、組成物が、所望される治療効果をもたらすことを条件とする。組成物は、本明細書に記載されている医薬組成物の一環として典型的には投与される。本開示の組成物は、本明細書に開示されている、治療有効量のＫＬＨ−ペプチド結合体を含み得る。製剤の調製の際、製剤中に存在するＫＬＨ−ペプチド結合体の治療有効量は、例えば、所望される用量体積および投与様式（複数可）、処置されるべき状態の性質および重症度、ならびに被験体の年齢および大きさを考慮することによって決定され得る。
【００８５】
被験体への本開示の組成物の投与に関する例示的な非限定的な用量範囲は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重１キログラム（ｋｇ）あたり投与されるＫＬＨ−ペプチド結合体１ミリグラム（ｍｇ）で表現される）、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇである。本開示の目的では、平均のヒト被験体の体重は約７０ｋｇである。本明細書に列挙した投与量のいずれかの中間の範囲、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１９９ｍｇ／ｋｇはもまた、本開示の部分として意図される。例えば、上限値および／または下限値としての任意の値の組み合わせを用いた値の範囲も包含されると意図される。
【００８６】
投与レジメンはまた、経時的に被験体にいくつかの分割用量を投与することによって、所望される最適な応答（例えば、治療的または予防的応答）を提供するように調整され得、用量は、治療的状況の緊急事態によって示されるように比例的に低減されても増加されてもよい。投与容易性および投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。投与単位形態は、本明細書において用いられるとき、処置されるべき哺乳動物被験体のための単位投与量として好適な物理的に別々の単位を称し；各単位は、所望の医薬担体に関連して所望される治療効果をもたらすように算出された、予め決定された量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態のための仕様書は、（ａ）ＫＬＨ−ペプチド結合体の特有の特徴および達成されるべき特定の治療的または予防的効果、ならびに（ｂ）個体間での感度の処理のためにかかるＫＬＨ−ペプチド結合体を配合する分野における固有の制限によって指示され、これらに直接依存する。
【００８７】
本開示の液体製剤は、単位剤形として調製され得る。例えば、バイアルあたりの単位投与量は、１〜１０００ミリリットル（ｍＬ）の種々の濃度のＫＬＨ−ペプチド結合体を含有し得る。他の実施形態において、バイアルあたりの単位投与量は、０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬまたは１００ｍＬの種々の濃度のＫＬＨ−ペプチド結合体を含有し得る。必要に応じて、これらの調製は、滅菌希釈剤を各バイアルに添加することによって所望の濃度に調整され得る。本開示の液体製剤はまた、直接投与に用いられ得るおよび／または静脈内投与ラインもしくはカテーテルへの接続に好適である滅菌バッグ、容器、予め充填されたシリンジ、ペン、または極微針において単位剤形として調製され得る。
【００８８】
ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体は、他の免疫刺激剤、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、例えば、サルグラモスチムまたはモルグラモスチムと組み合わされ得る。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体と直接組み合わされ、次いで被験体に投与され得る。一例において、０．５ｍｇ／ｍＬで濃縮された０．３５ｍｌのＧＭ−ＣＳＦは、１ｍｇ／ｍＬで濃縮された０．６ｍｌのＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体組成物と組み合わされて、０．５ｍｇのＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体および０．１５ｍｇのＧＭ−ＣＳＦを含有する０．９５ｍＬの組み合わせ溶液を提供することができる。次いで、この組み合わせ組成物は、被験体に直接投与され得る。当業者は、それを必要とする被験体に適切な投与量を提供するのに種々の量および濃度が用いられ得ることを認識するであろう。
【００８９】
安定性評価
本開示は、本明細書に記載されているＫＬＨ−ペプチド結合体を含む安定な液体組成物および凍結乾燥組成物を提供する。安定な組成物は、例えば、生成物の外観および完全性（生物学的活性の低減を潜在的にもたらす物理的または化学的分解を含む）を維持するまたはこれらの変化に耐えることが望ましい。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術および指標は、文献において報告されており、多数のこれらの技術および指標は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７−３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１）  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ、Ａ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に再検討されている。
【００９０】
一般に、本開示の組成物は、長期にわたって低い保存温度に付されるときおよび／または１回以上の凍結／解凍サイクルに付されるとき、改善された安定性を示す。ＫＬＨ−ペプチド結合体の安定性は、当業者に周知である種々の分析技術、例えば、分析アッセイ、例えば、外観（目視検査によっておよび／またはＵＶ光散乱によって測定される）、顕微鏡、光遮蔽、サイズ排除クロマトグラフィ、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィ、および逆相高速液体クロマトグラフィを用いて測定され得る。かかるアッセイは、複数の分解経路に関する安定性についてのデータ、例えば、酸性種の形成に起因する、モノマー／ダイマーの含量比の変化、ペプチド−リンカー不純物の形成、Ａ２８０／Ａ３４０比の変化、およびＫＬＨ−ペプチド結合体ピークのＡＥＸ保持時間を提供することができる。かかる分析アッセイは、時間および温度の関数として結合体の安定性をモニタリングするのに用いられ得る。
【００９１】
液体医薬組成物におけるタンパク質のフラグメント化は、当該分野において公知の種々の方法によって測定され得る。かかる方法として、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、紫外検出（例えば、２１４ｎｍにおける）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）が挙げられる。荷電変化（例えば、脱アミド化の結果として起こる）を引き起こすタンパク質のフラグメント化は、例えば、イオン交換クロマトグラフィまたは等電点電気泳動法（ＩＥＦ）によって評価され得る。組成物の変色は、組成物自体の目視観察によって一般に測定され得る。本明細書に開示されている組成物は、一般に、組成物の変色（例えば、桃色または黄色）を低減しおよび／または組成物の透明度（例えば、濁度、混濁および／または粒子状物質形成）を維持する。本開示の目的で、用語「変色」は、色の変化（例えば、無色透明から桃色または黄色）および透明度の変化（例えば、無色透明から濁った、混濁したおよび／または粒子状物質を有する）の両方を称する。組成物の変色は、例えば、２１４ｎｍにおける紫外検出によっておよび／または比較される組成物の標準的な明度に対する目視の比較によって、さらなる技術を用いて一般に測定され得る。
【００９２】
本明細書において用いられるとき、用語「凍結／解凍サイクル」は、サンプルの温度が液体サンプルを凍結するために０℃以下の温度まで低下される凍結保存後の液体サンプルを用い、次いでサンプルの使用を可能にするのに十分な期間にわたってその液体状態を保存する温度までサンプルを付し、その後好ましくは０℃以下の温度での凍結保存に付され、該凍結保存に戻す技術を称する。本明細書において用いられるとき、用語「凍結保存」は、０℃以下、好ましくは、−２０℃以下の温度で先の液体サンプルを凍結および維持することを称する。
【００９３】
処置の方法
本明細書に記載されている任意のＫＬＨ−ペプチド組成物は治療的に用いられてよい。一実施形態において、ＫＬＨ−ペプチド結合体は、本明細書に記載されているＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体であり、ヒト被験体を処置するのに用いられる。代替的には、被験体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体を発現する哺乳動物であってよい。したがって、本明細書に開示されているＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体組成物は、獣医目的でまたはヒトの疾患の動物モデルとしてのＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体を発現する非ヒト哺乳動物に投与され得る。かかる動物モデルは、本開示の組成物の治療効能を評価するのに有用であり得る。
【００９４】
本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって、該哺乳動物に本明細書に開示されている任意の組成物、特に、ＫＬＨ−ペプチド結合体がＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体である組成物を投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、異常な細胞成長は癌性である。さらなる実施形態において、癌は、膠芽細胞腫である。本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって、ａ）本明細書に記載されている任意の組成物をアジュバントと混合する工程と；ｂ）得られた混合物を該哺乳動物に投与する工程とを含む方法をさらに提供する。一実施形態において、ＫＬＨ−ペプチド結合体は、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体であり、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、例えば、サルグラモスチムまたはモルグラモスチムである。
【００９５】
本開示は、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって：ａ）本明細書に開示されている任意の凍結乾燥組成物を付与することと、水を凍結乾燥組成物に添加して、再構成された組成物を付与することと、再構成された組成物を該哺乳動物に投与することとを含む方法をさらに提供する。また、それを必要とする哺乳動物において異常な細胞成長を低減する方法であって、本明細書に記載されている任意の凍結乾燥組成物を付与することと、水を凍結乾燥組成物に添加して、再構成された組成物を付与することと、再構成された組成物をアジュバント組成物と混合することと、得られた混合物を該哺乳動物に投与することとを含む方法も提供される。特定の実施形態において、哺乳動物はヒトであり、ＫＬＨ−ペプチド結合体はＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体である。
【００９６】
治療的方法は、本開示によって企図されるように、処置が必要な被験体に、治療有効量、または「有効量」の、ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を含む組成物を投与することを含む。本明細書において用いられるとき、「治療有効」、または「有効」量は、単回投与としてまたは複数回投与レジメンに従って、単独でまたは他の剤と組み合わせて、疾患の症状の重症度の低下、疾患の症状がない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の防止を結果としてもたらすのに十分な量のＫＬＨ−ペプチド結合体の量を称する。当業者は、かかる量を、被験体の大きさ、被験体の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などのかかる因子に基づいて決定することができる。被験体は、ヒトであっても非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、サルまたは他の低次霊長類）であってもよい。本開示の組成物は、公知の薬剤と共投与されてもよい。
【００９７】
本明細書に開示されているＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体組成物は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体が望ましくないことに発現または見出される種々の状況における治療生成物として用いられる。種々の癌、例えば膠芽細胞腫におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体の発現を考慮とすると、本開示のＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体組成物による処置に特に好適な障害および状態として、異常な細胞成長、例えば、中皮腫、肝胆汁性（肝臓および胆管）、原発性または続発性のＣＮＳ腫瘍、原発性または続発性の脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨の癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃腸（胃、直腸結腸、および十二指腸）、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄の軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、あるいは上記癌の１種以上の組み合わせが挙げられる。
【００９８】
本明細書に記載されている組成物は、処置される障害の種類に応じて変動し得るいずれの好適な手段によって投与されてもよい。可能な投与経路として、非経口（例えば、静脈内、皮内、動脈内、皮下、骨内、腹腔内、筋肉内、および胸骨下）、肺内および鼻腔内、ならびに、所望により局所的な免疫抑制処置のための、または病巣内投与が挙げられる。また、本開示の組成物は、パルス注入によって、例えば、ＫＬＨ−ペプチド結合体の用量を減少しながら投与され得る。好ましくは、投与は、投与が短期であるか長期であるかに部分的に応じて、注入、最も好ましくは、皮内または筋肉内注入によって与えられる。
【００９９】
投与される量は、種々の因子、例えば、臨床的症状、個体の重量、他の薬剤が投与されるか否かに依存する。当業者は、投与経路が、処置される障害または状態に応じて変動することを認識するであろう。例えば、本開示によるＫＬＨ−ペプチド結合体（例えば、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体）を含む組成物の治療有効量の決定は、特定の患者の特徴、投与経路、および処置される障害の性質に大部分が依存する。一般的なガイダンスは、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎの文献およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおけるｃｈａｐｔｅｒｓ  ２７  ａｎｄ  ２８、４８４−５２８頁（１８ｔｈ  ｅｄ．、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ。Ｃｏ．、１９９０に見出され得る。より具体的には、治療有効量の決定は、薬剤の毒性および効能などの因子に依存する。毒性は、当該分野において周知の方法を用いて決定され得、以上の参照文献において見出され得る。効能は、同ガイダンスを利用して決定され得る。
【０１００】
アジュバント
いくつかの実施形態において、本開示のＫＬＨ−ペプチド結合体組成物（例えば、ＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体）は、少なくとも１種のアジュバントと組み合わされても同時投与されてもよい。好適なアジュバントとして、哺乳動物における、好ましくは、ヒトにおける使用に好適なアジュバントが挙げられる。ヒトにおいて用いられ得る公知の好適なアジュバントの例として、必ずしも限定されないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（商標）（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸（シトシンが非メチル化されていない）、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アセチル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６４：７１３（１９９８）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ０６／１３４４２３およびＷＯ０７／０２６１９０号を参照されたい）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ  Ａ、インターロイキンなどが挙げられる。限定されないが動物実験を含めた獣医用途のために、フロイントＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰとも称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'−２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）、およびＲＩＢＩを用いることができ、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に細菌から抽出された３種の抽出物、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する。
【０１０１】
組成物の有効性を向上させるさらなる例示的なアジュバントとして、限定されないが：（１）水中油エマルション製剤（他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁成分を含むまたは含まない）、例えば（ａ）微流動化装置を用いてサブミクロン粒子に製剤化された、５％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．５％のＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および０．５％のＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）に共有結合的に連結したムラミルトリペプチドを場合により含有する）を含有するＭＦ５９（商標）（ＰＣＴ公報第ＷＯ９０／１４８３７号；ワクチン設計における第１０章：サブユニットおよびアジュバントアプローチ、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、（ｂ）サブミクロンエマルション中に微流動化されているか、またはボルテックスされてより大きな粒径のエマルションを形成している、１０％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロック化ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、および１種以上の細菌細胞壁成分、例えば、モノホスホルリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（２）用いることができるサポニンアジュバント、例えばＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、Ａｂｉｓｃｏ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、またはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、またはこれらから生成された粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（さらなる洗浄剤を含んでいなくてよい、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ００／０７６２１号）；（３）完全なフロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＰＣＴ公報第ＷＯ９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、例えばモルグラモスチムまたはサルグラモスチム）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アセチル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、英国特許第ＧＢ−２２２０２２１号、および欧州特許第ＥＰ−Ａ−０６８９４５４号（場合により、肺炎球菌糖と共に用いられるときにはミョウバンが実質的に存在しない、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ００／５６３５８号）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルションとの組み合わせ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−��−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ、ワクチン（２０００）１９：６１８−６２２；Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００１）３：１５−２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９９７）９４：１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８）１６０：８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９９７）１８６：１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）２７：２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８８）１６：１２１６−１２２４、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７４：５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９９６）９３：２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９６）１５７：１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５６：４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１６７：７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、（１９８８）７９：８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９６）１５７：２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９１）１４７：１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５７：４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５７：５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９８）１６０：４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９８）１６０：５８９８−５９０６；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０２５５５号、同第ＷＯ９８／１６２４７号、同第ＷＯ９８／１８８１０号、同第ＷＯ９８／４０１００号、同第ＷＯ９８／５５４９５号、同第ＷＯ９８／３７９１９号および同第ＷＯ９８／５２５８１号］、すなわち少なくとも１種のＣＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド（シトシンは非メチル化されている）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９９／５２５４９号；（９）オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＰＣＴ公報第ＷＯ０１／２１２０７号）または少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤、例えばオクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（ＰＣＴ公報第ＷＯ０１／２１１５２号）；（１０）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＰＣＴ公報第ＷＯ００／６２８００号）；（１１）免疫刺激物質、および金属塩の粒子、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ００／２３１０５号；（１２）サポニンおよび水中油エマルション、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９９／１１２４１号；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により＋ステロール）、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９８／５７６５９号；（１４）組成物の効能を向上させる免疫刺激剤として作用する他の物質、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'−２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含めたムラミルペプチド、（１５）ＴＬＲ３リガンド、例えば、ポリｌ：Ｃおよび同様の化合物、例えば、ヒルトノールおよびアンプリゲンを含めた、天然または合成の、トル様受容体（ＴＬＲ）のためのリガンド（例えば、Ｋａｎｚｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１３：１５５２−１５５９（２００７）に記載されている）が挙げられる。
【０１０２】
一実施形態において、本開示の組成物は、少なくとも１種のアジュバントと同時投与または投与の前に組み合わされる。特定の実施形態において、該アジュバントは、サイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ（例えば、モルグラモスチムまたはサルグラモスチム）である。
【０１０３】
製造物品
本開示の別の実施形態において、本明細書に記載されているＫＬＨ−ペプチド結合体を含む液体組成物を保持し、使用指示書を場合により提供する、容器を含む製造物品が提供される。好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが挙げられる。容器は、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成されていてよい。例示的な容器は、３〜２０ｃｃの使い捨てガラスバイアルである。代替的には、複数回投与製剤のために、容器は、３〜１００ｃｃのガラスバイアルであってよい。容器は、組成物、および容器の上またはそれに付随するラベルを保持し、容器は、使用のための指示を示してよい。製造物品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、ならびに使用のための指示書、禁忌、および／または潜在的副作用のリストを含むパッケージ挿入物を含めた商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含んでいてよい。
【０１０４】
本開示はまた、ＫＬＨ−ペプチド結合体の液体組成物を調製するためのキットであって、ＫＬＨ−ペプチド結合体、例えばＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体を溶液中に含む第１容器、および十分量のアジュバント、例えばＧＭ−ＣＳＦを単独または他の賦形剤と組み合わせて含む第２容器を含むキットも提供する。
【０１０５】
本開示を、さらに限定的であると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明する。本開示を通して列挙された全ての図および全ての参照文献、特許および公開特許出願は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例において、「エピトープ密度」を以下のようにアミノ酸分析を用いて決定した。二官能性リンカーを介したＫＬＨへのＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドのカップリングは、ＫＬＨ担体タンパク質に結合したペプチドの分布をもたらす。ＫＬＨに結合したペプチドの数を、アミノ酸組成分析を用いて測定した。その寄与がペプチドではなく専らＫＬＨ担体タンパク質に由来するいくつかのアミノ酸が存在する。これらのアミノ酸をペプチドおよびＫＬＨの両方から生ずるアミノ酸と比較することにより、モル過剰を算出することができる。これらのアミノ酸のモル過剰は、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドに帰属され得、ＫＬＨサブユニットあたりのペプチド数を算出するのに用いられる。サンプルは、アミノ酸分析の前に、あらゆる残りのプロセス不純物、例えば、ペプチドダイマーまたはペプチド：リンカー結合体を除去するのに緩衝液交換される。これらの不純物は、アミノ酸レベルに寄与して結果を歪曲する可能性を有する。次いで、サンプルを６Ｎ  ＨＣＩを用いて加水分解し、蛍光タグによって標識化し、ＨＰＬＣを用いて分離および定量化する。
【０１０７】
実施例１：ｐＨ／緩衝液の影響
研究の目的は、液体製剤および凍結乾燥製剤の両方に関して、種々の温度（５℃、２５℃および４０℃）におけるＣＤＸ−１１０の保存安定性に対するｐＨおよび緩衝液種の影響を調査することであった（表１Ａ）。調査したｐＨ範囲は４．５〜７．４であり、種々の緩衝種は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、スクシネートおよびヒスチジンであった。本明細書において報告されているデータは、８週の終わりに停止されたスクシネート（Ｊ）を除いて、全ての製剤について１２週の終わりにおけるものであった。タンパク質濃度、ｐＨおよびポリソルベート含量を、表１Ａに示すように一定に保った。「ｌｉｑ」は液体製剤を示す一方で、「ｌｙｏ」は、凍結乾燥製剤を示す。ｐＨ範囲を皮内投与について選択した。全ての比較は、本製剤Ｆ（ＰＢＳ中液体およびｌｙｏの両方；表１Ｂ内の組成物）に対して行う。
【０１０８】
（表１Ａ）ｐＨ／緩衝液研究のための製剤組成物
0006007105.tif 000003
＊表１Ｂに与えられるＰＢＳ組成物。製剤Ｊを、８週間だけ研究した。製剤ＣおよびＤは、トレハロース含量においてのみ６ｍｇ／ｍＬ異なる。全ての凍結乾燥製剤を、最終ＣＤＸ−１１０濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬであるようにＷＦＩによって再構成した。
【０１０９】
（表１Ｂ）ＰＢＳ（Ｆ）中の本ＣＤＸ−１１０製剤組成物
0006007105.tif 000004
【０１１０】
緩衝液溶液の調製
５種の緩衝液溶液を以下の表１Ｃに記載のように調製した。各溶液を、まず、ある量の（表１Ｃに列挙した）緩衝液種を注入用の水（ＷＦＩ）に溶解することによって調製した。各緩衝液溶液のｐＨを測定した。次いで緩衝液溶液を、滅菌フィルタ（０．２２ミクロンの細孔径）を通して滅菌容器内に濾過し、その後使用した。
【０１１１】
（表１Ｃ）緩衝液溶液
0006007105.tif 000005
【０１１２】
ＣＤＸ−１１０製剤の調製
評価した製剤を表１Ａに列挙する。各製剤を調製するために、ＣＤＸ−１１０材料を１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１．０ｍｇ／ｍＬで得た。先に示した製剤溶液へのＣＤＸ−１１０材料の緩衝液交換を、５℃にて４５００ＲＰＭで運転するＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ２１Ｒ遠心分離器におけるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５ＭＷＣＯ５０遠心濃縮によって実施した。およそ８回の体積交換を行い、溶液を１．４〜１．８ｍｇ／ｍＬの間に濃縮した。およそ７０〜９９ｍＬの全ての製剤を調製した。ＣＤＸ−１１０濃度を、２８０ｎｍにて１．３８（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて紫外−可視分光（ＵＶ−Ｖｉｓ）法を用いることによって決定した。
【０１１３】
４００ｍｇ／ｍＬの二糖溶液を表１Ａに記載の適切な製剤緩衝液によるトレハロース／スクロースの希釈および溶解によって調製した。また、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）溶液を適切な製剤緩衝液へのＰＳ８０の溶解によって調製した。次いで、適切な体積の二糖原液およびＰＳ８０原溶液をＣＤＸ−１１０原溶液に添加して、表１Ａに列挙した製剤組成物中１．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０１１４】
次いで、製剤を０．２μｍの滅菌フィルタを通して濾過し、バイアル内に充填した。０．６ｍＬの充填体積を２ｍＬのＩ型ガラスバイアルに充填した。液体製剤バイアルをコーティングされた血清ストッパであるＤａｉｋｙｏ７７７−１Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）で栓をし、クリンプおよびシールした。凍結乾燥製剤のバイアルを、コーティングされたＤａｉｋｙｏ７７７−１Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）Ｂ２−ＴＲで部分的に栓をし、次いで、表１Ｄに概説される凍結−乾燥サイクルパラメータに従って凍結乾燥し、栓をし、クリンプおよびシールした。液体製剤および凍結乾燥製剤の両方を、５、２５および４０℃で２、４、８、１３、２６、５２および１０４週間保存された安定性チャンバに置いた。１３ｍｍのＤａｉｋｙｏ７７７−１の血清ストッパおよびｌｙｏストッパと同様にバイアルを洗浄およびオートクレーブした。ｌｙｏストッパを１００℃で６時間乾燥した。サンプルを、外観、ｐＨ、およびＵＶ−Ｖｉｓ吸光度によるタンパク質濃度、サイズ排除ＨＰＬＣ、アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣによって分析した。研究は継続しており、報告された値は、中間地点または１２週からのものである。
【０１１５】
（表１Ｄ）凍結−乾燥サイクルパラメータ
0006007105.tif 000006
【０１１６】
アッセイ
外観
各製剤を０（最初）および定時点の後に粒子状物質の形成、色変化および透明度について視覚的に評価した。サンプルを、適当な照明によって明るい背景および暗い背景に保持した。サンプルは、レベル６の色範囲よりもさらに強く着色され得ず、参照懸濁液ＩＩＩよりも乳白色となり得ない。可視の粒子状物質も報告した。
【０１１７】
ｐＨ
サンプルを電位差滴定によるｐＨ測定に付した。ｐＨメータの較正をｐＨ４〜１０の範囲の市販の標準緩衝液を用いて行った。
【０１１８】
ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度によるタンパク質濃度
タンパク質濃度測定を、好適な吸光光度計を用いて実施した。サンプルを２８０ｎｍにおいて走査し、２８０ｎｍにおける吸光度を用いて、タンパク質の濃度を決定した。２８０ｎｍにおいて実験的に誘導された吸光係数１．１９（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１および１．３８（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１（Ｄ  ｌｉｑおよびＤ  ｌｙｏ）を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１１９】
サイズ排除ＨＰＬＣ
モノマー、ダイマーおよび高分子量種（ＨＭＭＳ）の存在を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いてモニタリングした。サイズ排除クロマトグラフィを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｂｉｏｓｕｉｔｅ４５０ＳＥＣカラム、移動相である５０ｍＭのリン酸ナトリウム、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．３ｍＬ／分の流量、および２１４ｎｍにおけるＵＶ検出を用いて実施した。モノマー、ダイマーおよびＨＭＭＳのレベルを、各製剤についてのクロマトグラムピーク下での面積を積分し、モノマー、ダイマーおよび高分子量種の積分面積を全ピーク面積の百分率として報告することによって算出した。
【０１２０】
アニオン交換ＨＰＬＣ
アニオン交換クロマトグラフィを、移動相である１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．３）、および１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３の勾配溶離、１ｍＬ／分の流量、ならびに２８０ｎｍにおけるＵＶ検出により、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを用いて実施した。アニオン交換クロマトグラフィは、荷電固定相とイオン強度を変動させる移動相との間の分配に基づいて、ＣＤＸ−１１０をＫＬＨ、ペプチド、リンカー、および関係する化合物から分離する。目的とする種を紫外吸光度によって検出し、相対面積によって定量する。
【０１２１】
逆相ＨＰＬＣ
逆相クロマトグラフィを、移動相である０．１％のＴＦＡ水、およびアセトニトリル勾配溶離における０．１％のＴＦＡ、１ｍＬ／分の流量、ならびに２１５ｎｍにおけるＵＶ検出により、Ｗａｔｅｒｓ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００Ｃ４カラムを用いて実施した。逆相クロマトグラフィは、無極性固定相と極性移動相との間の分配において、ＣＤＸ−１１０をペプチドおよびリンカー関連の不純物から分離する。ピークは、ペプチドおよびリンカーベースの不純物が吸収を有する固定波長において紫外光検出器を用いて検出する。
【０１２２】
結果
外観
外観分析から、リン酸ナトリウム（Ｂ）、リン酸カリウム（Ａ、ＣおよびＤ）およびヒスチジン（Ｅ）における全ての製剤が、液体製剤および凍結乾燥製剤の両方において同様に挙動することを結論づけることができた。製剤Ｊ（ｌｉｑ、スクシネート）およびＦ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）は、最も悪い挙動を示した。詳細については、表１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおいて概説した液体製剤および凍結乾燥製剤を参照されたい。
【０１２３】
液体製剤（表１Ｅ）
全てのＴ０（時間０）製剤は、無色およびＮＭＯ  ＲＳＩと報告された。粒子状物質に関して、製剤Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）については１種の白色フレーク粒子が観察された一方で、トレハロース含量が６ｍｇ／ｍＬ異なる製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）については、可視粒子を実質的に含まない（ＥＦＶＰ）、ＥＦＶＰである。本製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）もまた、無色でありＥＦＶＰである。
【０１２４】
５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤が無色でありＮＭＯ  ＲＳＩであった。Ｂ（ｌｉｑ）およびＣ（ｌｉｑ）製剤については１個の粒子が観察された一方で、本製剤Ｆ（ＰＢＳ中）ではＥＦＶＰでありＮＭＯ  ＲＳＩのままであった。
【０１２５】
２５℃（Ｔ＝１２週）において、Ｊ（ｌｉｑ、スクシネート−ＮＭＯ  ＲＳＩＩ）およびＤ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ−ＮＭＯ  ＲＳＩ）製剤は、非常に僅かに褐色であることが報告された。Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）製剤は、多くの異なる種の粒子を有することが報告されたが、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）は１個の粒子を有した。
【０１２６】
４０℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤は、色が黄色または褐色に変化し（ＰＢＳすなわち、Ｆを除く）、Ｊ（ｌｉｑ、スクシネート）は乳白色に関して最も悪かった（ＮＭＯ  ＲＳＩＶ）。リン酸カリウム液体製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＤ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）は、１個の粒子を有してまたは粒子を有さずに、非常に僅かに褐色であることが報告された。製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、２個の白色のフレーク様の粒子を有して無色であった。製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）製剤は、ＰＳ８０を有さない唯１種であった。
【０１２７】
凍結乾燥製剤（表１Ｅ）
Ｔ＝０において、全ての製剤は、段ボール包装に似た多くの褐色／黄褐色粒子も有したＦ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）製剤（再構成において僅かに褐色）を除き、無色であった。Ａ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）はまた、再構成において１個の粒子を有した。
【０１２８】
５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤は、多くの粒子を有し乳白色であったＦ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除いて無色でありＥＦＶＰであった。２５℃（Ｔ＝１２週）において、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除く全ての製剤は無色でありＮＭＯ  ＲＳＩであった。Ｃ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）について２個の小さな白色粒子もまた、報告された。４０℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤は、再構成におけるＦ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除き、無色でありＮＭＯ  ＲＳＩであった。１個および２個の粒子がＢ（ｌｙｏ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）およびＤ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）においてそれぞれ観察されたが、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）は複数の粒子を有した。
【０１２９】
濃度
液体製剤（表１Ｆ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、有意な変化は観察されなかった。２５℃（Ｔ＝１２週）において、Ｅ（ｌｉｑ、Ｈｉｓ、Ｔｒｅ）製剤について濃度の増加が観察された。全ての他の製剤は何ら有意な変化を示さなかった。４０℃において、製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＦ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は何ら有意な変化を示さなかったが、Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）、Ｂ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）およびＥ（ｌｉｑ、Ｈｉｓ、Ｔｒｅ）は、顕著な濃度増加を示した。
【０１３０】
凍結乾燥製剤（表１Ｆ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、僅かな濃度降下を示したＦ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除いて、有意な変化が観察されなかった。２５℃（Ｔ＝１２週）においては、Ｅ（ｌｙｏ、Ｈｉｓ、Ｔｒｅ）およびＦ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）についての僅かな減少を除き有意な変化なし。４０℃（Ｔ＝１２週）においては、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除き有意な変化なし。Ａ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）については僅かな増加が観察された。
【０１３１】
Ａ２８０／Ａ３４０比
２８０ｎｍにおける吸光度対３４０における吸光度の比は、特徴的な青色を付与する、ＣＤＸ−１１０中の結合された銅の存在に起因した重要性を想定する。３４０ｎｍの吸光度は、銅の存在に起因しており、したがって、この波長における吸光度の低下は、銅の損失または銅の酸化状態の変化を示す。
【０１３２】
液体製剤（表１Ｇ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、増加が観察される製剤Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）を除き比の有意な変化がなかった。２５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての液体製剤は、製剤Ｊ（ｌｉｑ、スクシネート）を除いて、銅分子に対する損失／変化を示す比の増加を示す。製剤Ｊ（ｌｉｑ、スクシネート）は、他の液体製剤とは異なり、比の減少を示した。製剤のいくつかは、他と比べて比の大きな変化を示し、例えば、製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＦ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）およびＢ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）よりも有意な増加を有した。Ｅ（ｌｉｑ、Ｈｉｓ、Ｔｒｅ）は、比の中程度の増加を有した。
【０１３３】
４０℃において、製剤Ｊ（ｌｉｑ、スクシネート）は、比の有意な減少を示す（表１Ｂ）。製剤Ｃ、ＤおよびＥは、有意な増加を示し、Ｆは、最大の増加を示す。スクロース含有製剤Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）およびＢ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）に関する比は、一定であるとみられる。データをさらに見ると、スクロース含有製剤が時間および温度に伴う２８０ｎｍにおける吸光度の増加および３４０ｎｍにおける吸光度の増加を示し、これにより、Ａ２８０対Ａ３４０比が一定と見なすことが可能であった。トレハロース含有製剤およびＰＢＳ含有製剤について、この比の増加は、３４０ｎｍにおける吸光度の減少に起因して観察される。
【０１３４】
凍結乾燥製剤（表１Ｇ）
５℃（Ｔ＝１２週）においては、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除いて、変化なし／最小であると観察された。２５℃においては、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除いて、変化なし／最小であると観察された。４０℃においては、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除く全ての製剤について、比における有意な変化は観察されなかった。
【０１３５】
ダイマー／モノマー／ＨＭＭＳ
液体製剤（表１Ｈ、１Ｉおよび１Ｊ）
温度の増加に伴い、ダイマー含量（表１Ｈ）が全ての製剤について減少した。最小の減少は、Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＤ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）製剤について観察された。モノマー含量は、全ての糖含有製剤について増加した一方で、ヒスチジン（Ｅ）およびＰＢＳ（Ｆ）製剤は、減少を示した。ヒスチジン製剤は、ＨＭＭＳ含量の同時の増加に伴い（表１Ｉ）２５および４０℃においてモノマー含量（表１Ｈ）の顕著な減少を示した。ＨＭＭＳからのモノマーの形成の増加がより高い温度で起こった確かな反対の傾向は、リン酸ナトリウム製剤、リン酸カリウム製剤について観察された。
【０１３６】
凍結乾燥製剤（表１Ｈ、１Ｉおよび１Ｊ）
全ての凍結乾燥製剤は、凍結乾燥ＰＢＳ製剤（Ｆ  ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除き、１２週の終わりに、５、２５および４０℃にて変化を示さなかった／最小の変化を示した。
【０１３７】
ＡＥＸによる不純物％およびＣＤＸ−１１０保持時間の変化
液体製剤（表１Ｋおよび１Ｌ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤についての不純物％は、スクシネート製剤（Ｉ）を除いて１％以下であった。ＣＤＸ−１１０ピークについての保持時間は、スクシネートを除いて全ての製剤についておよそ１分、移動した。保持時間のシフトは、リンカーの加水分解と脱アミド化との組み合わせに帰属し得る酸性種の形成を示した。２５℃および４０℃（Ｔ＝１２週）において、不純物％は、全ての製剤について有意に増加した。保持時間の変化もまた、酸性種の形成の増加を示す同様の傾向に従った。
【０１３８】
凍結乾燥製剤（表１Ｋおよび１Ｌ）
全ての凍結乾燥製剤について、不純物％の変化および保持時間のシフトは、全ての温度において、Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）製剤を除いて有意でなかった。
【０１３９】
ＲＰ  ＨＰＬＣによる不純物％
液体製剤（表１Ｍ）
ペプチドおよびリンカー関係の不純物の形成の増加が、温度の増加に伴って製剤について観察され、ヒスチジン製剤（Ｅ）は、不純物の最小の形成を示した。
【０１４０】
凍結乾燥製剤（表１Ｍ）
凍結乾燥ＰＢＳ（Ｆ）製剤を除き、あらゆる製剤について有意な変化が観察されなかった。
【０１４１】
マウス効能
効能に関する薬剤の製品仕様は、マウスにおいて≧７５％のセロコンバージョンに設定されている。試験製剤は、リン酸カリウム（Ａ、Ｃ、Ｄ）、ヒスチジン（Ｅ）およびＰＢＳ（Ｆ）であった。試験サンプルを５℃において８および１２週間保存した。全てのサンプルは、＞７５％のセロコンバージョン（表１Ｋ）を実証し、したがって薬剤の製品仕様を満たした。
【０１４２】
（表１Ｅ）ｐＨ／緩衝液研究についての外観データ
0006007105.tif 000007
0006007105.tif 000008
ＥＦＶＰ：可視粒子を本質的に含まない；ＮＭＯ  ＲＳ  Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ：参照懸濁液Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩよりも乳白色でない。＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである。
【０１４３】
（表１Ｆ）濃度変化
0006007105.tif 000009
0006007105.tif 000010
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである。
【０１４４】
（表１Ｇ）Ａ２８０／Ａ３４０比の変化
0006007105.tif 000011
0006007105.tif 000012
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである。
【０１４５】
（表１Ｈ）ダイマー％の変化
0006007105.tif 000013
0006007105.tif 000014
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである；ＮＭ−研究を行ったときのアッセイ方法が異なるため測定しなかった。
【０１４６】
（表１Ｉ）モノマー％の変化
0006007105.tif 000015
0006007105.tif 000016
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである；ＮＭ−研究を行ったときのアッセイ方法が異なるため測定しなかった。
【０１４７】
（表１Ｊ）ＨＭＭＳ％の変化
0006007105.tif 000017
0006007105.tif 000018
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである；ＮＭ−研究を行ったときのアッセイ方法が異なるため測定しなかった。
【０１４８】
（表１Ｋ）ＡＥＸによる不純物％の変化
0006007105.tif 000019
0006007105.tif 000020
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである。
【０１４９】
（表１Ｌ）ＡＥＸ保持時間の変化
0006007105.tif 000021
0006007105.tif 000022
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである。
【０１５０】
（表１Ｍ）逆相による不純物％の変化
0006007105.tif 000023
0006007105.tif 000024
＊製剤Ｊは、８週後に中止した。報告データは、８週の終わりにおけるものである；ＮＭ−研究を行ったときのアッセイ方法が異なるため測定しなかった。
【０１５１】
（表１Ｎ）マウス効能の結果
0006007105.tif 000025
＊ＤＰ  Ｓｐｅｃ≧７５％；ＮＭ：測定せず
【０１５２】
実施例２：二糖の影響
種々の液体製剤および凍結乾燥製剤を調製してｐＨ７．４において二糖の影響を研究する研究を実施した。トレハロースおよびスクロースを研究に用いた。ＣおよびＤ製剤は、２種の異なる濃度のトレハロースを有し、成分の残りが同じであった。タンパク質濃度およびｐＨを表２Ａに示すように一定に保った。リン酸カリウム緩衝液種およびリン酸ナトリウム緩衝液種をこれらの製剤に用いた。全ての比較をＰＢＳ中の本製剤（製剤Ｆ−液体およびｌｙｏの両方）について行った（表１Ｂを参照されたい）。
【０１５３】
（表２Ａ）二糖の影響のための製剤組成物
0006007105.tif 000026
＊表１Ｂに与えられるＰＢＳ組成物。製剤ＣおよびＤは、トレハロース含量においてのみ６ｍｇ／ｍＬ異なる。全ての凍結乾燥製剤を、最終ＣＤＸ−１１０濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬであるようにＷＦＩによって再構成した。
【０１５４】
安定性について行った分析アッセイは、外観、ＵＶ、ｐＨ、ＳＥＣ、ＡＥＸおよびＲＰＨＬＣであった。表２Ｂ〜２Ｋは、モノマー／ダイマー／高分子量種含量の変化、ペプチド−リンカー関係の不純物の形成、Ａ２８０／Ａ３４０比の変化、酸性種の形成に起因するＣＤＸ−１１０ピークのＡＥＸ保持時間およびマウス効能の研究を含めた、複数の分解経路についての安定性のデータを示す。
【０１５５】
緩衝液溶液の調製
５種の緩衝液溶液を以下の表２Ｂに記載のように調製した。各溶液を、まず、ある量の（表２Ｂに列挙した）緩衝液種を注入用の水（ＷＦＩ）に溶解することによって調製した。各緩衝液溶液のｐＨを測定した。次いで緩衝液溶液を、滅菌フィルタ（０．２２ミクロンの細孔径）を通して滅菌容器内に濾過し、その後使用した。
【０１５６】
（表２Ｂ）緩衝液溶液
0006007105.tif 000027
【０１５７】
ＣＤＸ−１１０製剤の調製
評価した製剤を表２Ａに列挙する。各製剤を調製するために、ＣＤＸ−１１０材料を１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１．０ｍｇ／ｍＬで得た。先に示した製剤溶液へのＣＤＸ−１１０材料の緩衝液交換を、５℃にて４５００ＲＰＭで運転するＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ２１Ｒ遠心分離器におけるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５ＭＷＣＯ５０遠心濃縮によって実施した。およそ８回の体積交換を行い、溶液を１．４〜１．８ｍｇ／ｍＬの間に濃縮した。およそ７０〜９９ｍＬの全ての製剤を調製した。ＣＤＸ−１１０濃度を、２８０ｎｍにて１．３８（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて紫外−可視分光（ＵＶ−Ｖｉｓ）法を用いることによって決定した。
【０１５８】
４００ｍｇ／ｍＬの二糖溶液を表２Ａに記載の適切な製剤緩衝液によるトレハロース／スクロースの希釈および溶解によって調製した。また、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）溶液を上記の適切な製剤緩衝液へのＰＳ８０の溶解によって調製した。次いで、適切な体積の二糖原液およびＰＳ８０原溶液をＣＤＸ−１１０原溶液に添加して、表２Ａに列挙した製剤組成物中１．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０１５９】
次いで、製剤を０．２μｍの滅菌フィルタを通して濾過し、バイアル内に充填した。０．６ｍＬの充填体積を２ｍＬのＩ型ガラスバイアルに充填した。液体製剤バイアルを、コーティングされた血清ストッパであるＤａｉｋｙｏ７７７−１Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）で栓をし、クリンプおよびシールした。凍結乾燥製剤のバイアルを、コーティングされたＤａｉｋｙｏ７７７−１Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）Ｂ２−ＴＲで部分的に栓をし、次いで、表２Ｃに概説される凍結−乾燥サイクルパラメータに従って凍結乾燥し、栓をし、クリンプおよびシールした。液体製剤および凍結乾燥製剤の両方を、５、２５および４０℃で２、４、８、１３、２６、５２および１０４週間保存された安定性チャンバに置いた。１３ｍｍのＤａｉｋｙｏ７７７−１の血清ストッパおよびｌｙｏストッパのようにバイアルを洗浄およびオートクレーブした。ｌｙｏストッパを１００℃で６時間乾燥した。サンプルを、外観、ｐＨ、およびＵＶ−Ｖｉｓ吸光度によるタンパク質濃度、サイズ排除ＨＰＬＣ、アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣによって分析した。研究は継続しており、報告された値は、中間地点または１２週からのものである。
【０１６０】
（表２Ｃ）凍結−乾燥サイクルパラメータ
0006007105.tif 000028
【０１６１】
アッセイ
外観
各製剤を０（最初）および定時点の後に粒子状物質の形成、色変化および透明度について視覚的に評価した。サンプルを、適当な照明によって明るい背景および暗い背景に保持した。サンプルは、レベル６の色範囲よりもさらに強く着色され得ず、参照懸濁液ＩＩＩよりも乳白色となり得ない。可視の粒子状物質も報告した。
【０１６２】
ｐＨ
サンプルを電位差滴定によるｐＨ測定に付した。ｐＨメータの較正をｐＨ４〜１０の範囲の市販の標準緩衝液を用いて行った。
【０１６３】
ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度によるタンパク質濃度
タンパク質濃度測定を、好適な吸光光度計を用いて実施した。サンプルを２８０ｎｍにおいて走査し、２８０ｎｍにおける吸光度を用いて、タンパク質の濃度を決定した。２８０ｎｍにおいて実験的に誘導された吸光係数１．１９（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１および１．３８（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１（Ｄ  ｌｉｑおよびＤ  ｌｙｏ）を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１６４】
サイズ排除ＨＰＬＣ
モノマー、ダイマーおよび高分子量種（ＨＭＭＳ）の存在を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いてモニタリングした。サイズ排除クロマトグラフィを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｂｉｏｓｕｉｔｅ４５０ＳＥＣカラム、移動相である５０ｍＭのリン酸ナトリウム、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．３ｍＬ／分の流量、および２１４ｎｍにおけるＵＶ検出を用いて実施した。モノマー、ダイマーおよびＨＭＭＳのレベルを、各製剤についてのクロマトグラムピーク下での面積を積分し、モノマー、ダイマーおよび高分子量種の積分面積を全ピーク面積の百分率として報告することによって算出した。
【０１６５】
アニオン交換ＨＰＬＣ
アニオン交換クロマトグラフィを、移動相である１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．３）、および１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３の勾配溶離、１ｍＬ／分の流量、ならびに２８０ｎｍにおけるＵＶ検出により、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを用いて実施した。アニオン交換クロマトグラフィは、荷電固定相とイオン強度を変動させる移動相との間の分配に基づいて、ＣＤＸ−１１０をＫＬＨ、ペプチド、リンカー、および関係する化合物から分離する。目的とする種を紫外吸光度によって検出し、相対面積によって定量する。
【０１６６】
逆相ＨＰＬＣ
逆相クロマトグラフィを、移動相である０．１％のＴＦＡ水、およびアセトニトリル勾配溶離における０．１％のＴＦＡ、１ｍＬ／分の流量、ならびに２１５ｎｍにおけるＵＶ検出により、Ｗａｔｅｒｓ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００Ｃ４カラムを用いて実施した。逆相クロマトグラフィは、無極性固定相と極性移動相との間の分配において、ＣＤＸ−１１０をペプチドおよびリンカー関連の不純物から分離する。ピークは、ペプチドおよびリンカーベースの不純物が吸収を有する固定波長において紫外光検出器を用いて検出する。
【０１６７】
結果
外観
外観分析から、スクロース製剤およびトレハロース製剤が、液体製剤および凍結乾燥製剤の両方において同様に挙動することを結論づけることができた。製剤Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）は、最も悪い挙動を示した。さらなる詳細を以下に記述する。
【０１６８】
液体製剤（表２Ｄ）
全てのＴ０（時間０）製剤は、無色であると報告された。粒子状物質に関して、製剤Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）については１個の白色フレーク粒子が観察された一方で、トレハロース含量が６ｍｇ／ｍＬのみ異なる製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）については、ＥＦＶＰである。本製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）もまた、無色でありＥＦＶＰである。５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤が無色でありＮＭＯ  ＲＳＩであった。Ｂ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｅ）およびＣ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）製剤については１個の粒子が観察された一方で、製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）はＥＦＶＰのままであった。
【０１６９】
２５℃（Ｔ＝１２週）において、製剤Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ−ＮＭＯ  ＲＳＩ）は、非常に僅かに褐色であることが報告された。製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、多くの異なる種の粒子を有することが報告されたが、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）は１個の粒子を有した。４０℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤は、製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）を除き、色が黄色または褐色に変化した。トレハロース製剤ＣおよびＤは、は、１個の粒子を有しまたは有さずに非常に僅かに褐色であることが報告された。製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、２個の白色のフレーク様粒子を有して無色であった。製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、ＰＳ８０を有さない唯一の製剤であった。
【０１７０】
凍結乾燥製剤（表２Ｄ）
Ｔ＝０において、全ての製剤が無色であった。Ａ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）はまた、１個の粒子を有することが報告された。５℃（Ｔ＝１２週）においては、全ての製剤が無色でありＥＦＶＰであった。２５℃（Ｔ＝１２週）においては、全ての製剤が無色でありＮＭＯ  ＲＳＩであった。２個の小さな白色の粒子は、Ｃ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）に関するものであることが報告された。４０℃（Ｔ＝１２週）においては、全ての製剤が無色でありＮＭＯ  ＲＳＩであった。１個および２個の粒子がＢ（ｌｙｏ、ＮａＰｉ、Ｓｕｅ）およびＤ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）においてそれぞれ観察された。
【０１７１】
濃度
液体製剤（表２Ｅ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、有意な変化は観察されなかった。２５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての製剤が何ら有意な変化を示さなかった。４０℃において、製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＦ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、何ら有意な変化を示さなかったが、Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）およびＢ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）は顕著な濃度増加を示した。これは、トレハロース製剤がスクロース製剤よりも良好な挙動をすることを実証した。
【０１７２】
凍結乾燥製剤（表２Ｅ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、有意な変化が観察されなかった。２５℃（Ｔ＝１２週）においては、製剤Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除き、有意な変化なし。４０℃（Ｔ＝１２週）においては、製剤Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除き、有意な変化なし。Ａ（ｌｙｏ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）については僅かな増加が観察された。
【０１７３】
Ａ２８０／Ａ３４０比
液体製剤（表２Ｆ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、増加が観察されるスクロース製剤（ＡおよびＢ）を除き比の有意な変化がない。２５℃（Ｔ＝１２週）において、全ての液体製剤は、銅分子に対する損失／変化を示す比の増加を示す。製剤のいくつかは、他と比べて比の大きな変化を示し、例えば、製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＦ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）およびＢ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）よりも有意な増加を有した。４０℃において、スクロース含有製剤Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｅ）およびＢ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）の比は、他の製剤よりもあまり影響されない（表２Ｆ）とみられる。濃度データ（表２Ｅ）は、製剤Ａ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｓｕｃ）およびＢ（ｌｉｑ、ＮａＰｉ、Ｓｕｃ）が４０℃において有意に高い濃度（または２８０ｎｍにおいて高い吸収値）値を有したことを示す。また、３４０ｎｍにおける吸光度も、スクロース含有製剤について経時的に増加し、そのため、Ａ２８０／Ａ３４０比がほとんど変化しなかった。トレハロース含有製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）、Ｄ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）および本ＰＢＳ製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）について、この現象（すなわち、Ａ２８０が経時的に増加しない）が観察されず、３４０ｎｍにおける吸光度の減少に大きく起因して、Ａ２８０／Ａ３４０比の増加をもたらした。
【０１７４】
凍結乾燥製剤（表２Ｆ）
製剤Ｆ（ｌｙｏ、ＰＢＳ）を除き、いずれの凍結乾燥製剤においても有意な変化が観察されなかった。
【０１７５】
ダイマー／モノマー／ＨＭＭＳ含量
液体製剤（表２Ｇ、２Ｈ、および２Ｉ）
温度の増加に伴い、ダイマー含量（表２Ｇ）が全ての製剤について減少した。最小の減少は、トレハロース含有製剤Ｃ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）およびＤ（ｌｉｑ、ＫＰｉ、Ｔｒｅ）について観察された。モノマー含量は、全ての二糖含有製剤について増加した一方で、本製剤Ｆ（ｌｉｑ、ＰＢＳ）は、減少を示した。ＰＢＳ製剤は、ＨＭＭＳ含量の同時の増加に伴い（表２Ｉ）２５および４０℃においてモノマー含量の顕著な減少を示した（表２Ｈ）。ＨＭＭＳおよびダイマー含量の同時の減少に伴うモノマーの形成の増加がより高い温度で観察された確かな反対の傾向は、スクロース（ＡおよびＢ）含有製剤およびトレハロース（ＣおよびＤ）含有製剤について観察された。２５℃において、スクロース（ＡおよびＢ）含有製剤およびトレハロース（ＣおよびＤ）含有製剤の両方が同様に挙動した。４０℃において、トレハロース製剤（ＣおよびＤ）は、４０℃におけるスクロース（ＡおよびＢ）製剤と比較して、ダイマー、モノマーおよびＨＭＭＳ含量において有意に小さな変化を示した。これは、４０℃においてトレハロース製剤がスクロース含有製剤よりも比較的安定であることを実証した。
【０１７６】
凍結乾燥製剤（表２Ｇ、２Ｈおよび２Ｉ）
全ての凍結乾燥製剤は、凍結乾燥ＰＢＳ（Ｆ）製剤を除き、１２週の終わりに、５、２５および４０℃にて変化を示さなかった／最小の変化を示した。
ＡＥＸによる不純物％および保持時間のシフト
【０１７７】
液体製剤（表２Ｊおよび２Ｋ）
５℃（Ｔ＝１２週）において、スクロース製剤およびトレハロース製剤の両方の不純物は１％以下であった。ＣＤＸ−１１０ピークについての保持時間は、全ての製剤についておよそ１分、移動した。保持時間の移動は、リンカーの加水分解と脱アミド化との組み合わせに帰属する酸性種の形成を示した。２５℃および４０℃（Ｔ＝１２週）において、不純物％は、全ての製剤について有意に増加した。保持時間の変化もまた、酸性種の形成の増加を示す同様の傾向に従った。トレハロース含有製剤についての保持時間のシフトは、スクロース製剤と比較して少なく、トレハロース製剤における酸性種の形成が少ないことを示した。
【０１７８】
凍結乾燥製剤（表２ＪおよびＫ）
全ての凍結乾燥製剤について、全ての温度における不純物％の変化は、有意でなかった。同様の傾向が、全ての製剤についての保持時間（＜１分）で観察された。
【０１７９】
ＲＰＨＰＬＣによる不純物％
液体製剤（表２Ｌ）
ペプチドおよびリンカー関係の不純物の形成の増加が、温度の増加に伴ってスクロース製剤およびトレハロース製剤の両方について観察された。トレハロース製剤は、スクロース製剤よりも不純物の形成が少ないことを示した。
【０１８０】
凍結乾燥製剤（表２Ｌ）
凍結乾燥ＰＢＳ（Ｆ）製剤を除き、あらゆる製剤について有意な変化が観察されなかった。
【０１８１】
マウス効能
試験した全ての液体製剤および凍結乾燥製剤（５℃のサンプル）が、マウスにおいて≧７５％のセロコンバージョンの薬剤の製品仕様を満たした（表２Ｍ）。
【０１８２】
（表２Ｄ）外観データ
0006007105.tif 000029
0006007105.tif 000030
ＥＦＶＰ：可視粒子を本質的に含まない；ＮＭＯ  ＲＳ  Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ：参照懸濁液Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩよりも乳白色でない。
【０１８３】
（表２Ｅ）濃度データの変化
0006007105.tif 000031
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【０１８４】
（表２Ｆ）Ａ２８０／Ａ３４０比の変化
0006007105.tif 000033
【０１８５】
（表２Ｇ）ダイマー％データの変化
0006007105.tif 000034
【０１８６】
（表２Ｈ）モノマー％データの変化
0006007105.tif 000035
【０１８７】
（表２Ｉ）ＨＭＭＳ％データの変化
0006007105.tif 000036
【０１８８】
（表２Ｊ）ＡＥＸデータによる不純物％の変化
0006007105.tif 000037
【０１８９】
実施例３：濾過プロセスの開発
３．１  材料および装置
この研究の間、以下のプロセス材料および装置を用いた：ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＡＫＴＡクロスフロー接線流濾過ユニット；２００ｃｍ２の膜面積を有する３０Ｋおよび１００ＫのＨｙｄｒｏｓａｒｔカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ＃３０８１４４５９０  ２Ｅ−ＳＧ；３０８１４４６８０  ２Ｅ−ＳＧ）；０．１ｍ２の膜を有する３０ＫのＨｙｄｒｏｓａｒｔカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ＃３０８１４４５９０  ２Ｅ−ＳＧ）；Ｖａｃｍｕｎｅ（登録商標）として購入されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｂｉｏｓｙｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ロット７３９６９０Ｖ１、Ｒ６２５２５８、８１７８７３Ｖ１、および８１７８７３Ｖ２）；ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド（Ａｍｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．ロットＡＰｉ  ０８０６１６）；ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＰＣ）ロット番号ＣＨ−０６００４５３）；スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ、種々のロット、カタログ番号２２３２２）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、無水９９．９％（Ｓｉｇｍａカタログ番号２７６８５５）；リン酸ナトリウム緩衝液＝１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）；ＰＢＳ＝ＯｍｎｉＰｕｒ１０×リン酸緩衝化食塩水（１×希釈）（ＶＷＲカタログ番号ＥＭ６５０６）；リン酸カリウム緩衝液＝１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）；ＰＥＴＧ（ポリエチレンテレフタレートコポリエステル）ボトル（種々のサイズ、Ｎａｌｇｅｎｅ製）。
【０１９０】
３．２  方法
プロセス全体は以下を含んだ：（１）ＫＬＨとリンカーとの間の活性化反応；（２）過剰のリンカーおよびリンカー関連の不純物を除去する第１ＴＦＦ工程；（３）活性化ＫＬＨとペプチドとの間の結合反応工程；その後の（４）過剰のペプチドおよびペプチド関連の不純物を除去し、緩衝液を変化させる第２ＴＦＦ工程。この研究を通して、ＣＤＸ−１１０について１．３８の吸光係数を用いた。各工程のより詳細な記載は以下である。
【０１９１】
３．２．１  活性化反応工程
ＴＦＦ運転の大部分で、ＫＬＨ（１００〜１６０ｍｇ）を１５ｍＬまたは５０ｍＬのプラスチック管にアリコートし、リン酸ナトリウム緩衝液および注入用の水（ＷＦＩ）で希釈し、管の反転により数回混合した。（水またはＤＭＳＯのいずれかにおいて予め溶解した）リンカー溶液をＫＬＨ混合物に添加し、管を数回反転させることによって穏やかに混合し、次いで残りの４５±５分間、静置した。運転１２１１６１〜１６５および１２１１６１〜１７２について、ＰＥＴＧボトルを反応容器として用い、溶液を、リンカーの添加の間に撹拌棒によって激しく混合し、残りの反応についてはより穏やかに混合した。種々の活性化反応パラメータ、例えば、リンカー：ＫＬＨモル比、緩衝液濃度、リンカー原液の溶液濃度、および反応時間をＴＦＦシステムへの種々のプロセス入力として調査した。完全な詳細を図２Ａに与える。
【０１９２】
３．２．２  第１ＴＦＦ操作
活性化反応の終わりに、活性化ＫＬＨ溶液をリン酸ナトリウム緩衝液で１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈し、その後、移送ポンプを通してクロスフローシステム内に移送した。膜を使用前に予め除菌した。ＴＦＦ操作の開発および最適化の間に、種々のパラメータ、例えば、ダイアフィルトレーションの間のタンパク質濃度、ダイアフィルトレーション緩衝液、膜分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、膜間圧（ＴＭＰ）、濃縮水流量、およびターンオーバーダイアフィルトレーション体積の数（ＴＯＶ）を調査した。完全な詳細を図２Ｂに与える。
【０１９３】
３．２．３  結合工程
ＴＦＦシステムにおいて処理された、ダイアフィルトレーション後の活性化ＫＬＨ溶液を１０ｍＬ／分で再循環し、合計２５５分間（活性化反応の開始からペプチドの添加まで）保持するか、またはペプチド溶液によって直ちに結合した。結合工程の前に、貯蔵装置におけるタンパク質溶液を、結合反応工程のための標的濃度に達するように、２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。全ての結合反応について、ＫＬＨおよびペプチドの両方についての標的濃度は１．５ｍｇ／ｍＬであった。ペプチド原溶液をリン酸ナトリウム緩衝液に予め溶解し、ピペットによってＴＦＦ貯蔵装置内に直接単回ボーラスで添加した。ＫＬＨ：ペプチド比を（質量比で）１：１で一定に保持した。調査したパラメータは、ペプチド原溶液濃度および結合反応時間であった。反応の間、ＴＦＦシステムを、浸透ラインを閉鎖し濃縮水ラインを解放しながら、０．５Ｌ／ｍｉｎ／ｍ２で再循環するように設定した。完全な詳細を図２Ｃに与える。
【０１９４】
３．２．４  第２ＴＦＦ操作
結合反応の終了後、第２ダイアフィルトレーションを実施して、結合されたＫＬＨを緩衝液交換し、過剰のペプチドおよびペプチド関連の不純物を除去した。この第２ダイアフィルトレーション工程では、第１ダイアフィルトレーションと同じ膜および同じ操作条件を用いた。第２ダイアフィルトレーションの終了時に、濃縮水をＴＦＦシステムから除去し、０．２μｍのフィルタを用いて濾過した。膜を横切って緩衝液リンスを行い、別々に収集した。
【０１９５】
３．２．５  クロスフロー実験の概要
図２Ａ〜２Ｃは、最適化されたプロセスを開発するのに完了させた１０回の開発用ＴＦＦ運転に重要な操作パラメータを要約する。運転１２１１６１〜０９０、１２１１６１〜０９３、１２１１６１〜０９６、および１２１１６１〜１００は、リンカー：ＫＬＨ比、リンカー原液濃度および溶解溶媒、ならびにペプチド原液濃度を評価する一連の第１運転であった。さらに、膜のＭＷＣＯを評価した（３０ｋＤａ対１００ｋＤａ）。
【０１９６】
運転１２１１６１〜１２０、１２１１６１〜１２５、および１２１１６１〜１３０の主な目的は、ＴＦＦ操作パラメータ、例えば、ＴＭＰ、濃縮水流量、およびフラックスを決定することであった。運転１２１１６１〜１４７は、１２１１６１〜１２５の繰り返しであった。１２１１６１〜１２５を繰り返す理由を以下にさらに示す。運転１２１１６１〜１６５および１２１１６１〜１７２は、パイロットプラントに移送されるプロセスのデモ運転であった。運転１２１１６１〜１６５を１６０ｍｇのＫＬＨの投入を用いて行い、運転１２１１６１〜１７２を１ｇのＫＬＨの投入を用いて行って、最適化されたプロセスのスケーラビリティを評価した。
【０１９７】
実施例４：濾過プロセス開発の結果および議論
全てのプロセス開発の運転に関する重要な分析結果を図３Ａ〜３Ｄに要約する。最終的な薬剤物質を、賦形剤の添加の前にＴＦＦシステムから回収された濃縮水を用いたエピトープ密度を除き、全てのアッセイに用いた。添加された賦形剤の１種であるＰＳ８０が、エピトープ密度のアッセイに干渉するか否かは不明であった。標的範囲は、アッセイにおける通常のばらつきを考慮して、先の臨床ロット（すなわち、以下の表３Ａに示すように、ロット０６−０４４−００１および０７−０４４−００１）からの結果をベースとした。ほぼ全ての運転が、全てのアッセイの標的であるまたは目標とする範囲に少なくとも近い材料を製造した。唯一の例外は、他と比較していくつかのロットにおいて有意に高いＡＥＸアッセイによって決定されるリンカー％であった。
【０１９８】
（表３Ａ）
0006007105.tif 000038
【０１９９】
運転１２１１６１〜０９０、−０９３、−０９６、および−１００
運転１２１１６１〜０９０、−０９３、−０９６、および−１００から、活性化反応に関していくつかの決定をすることができた。第１に、１２１１６１〜０９０の後に、１００ｋＤから３０ｋＤの膜に切り替えるという決定がなされた。この決定は、膜を通して起こり得る活性化ＫＬＨの損失をベースとした。浸透のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、活性化ＫＬＨのいくつかの漏れを示すと思われた；しかし、後の作業で、アッセイがある一定の条件下にキャリーオーバーされる傾向にあると判断された。浸透において見られる活性化ＫＬＨは、カラムにおける先の運転からのキャリーオーバーにおそらく起因し、膜を通した漏れに起因するものではなかった。
【０２００】
第２に、ＤＭＳＯをプロセス内に組み込んで、リンカーの完全な溶解を付与することによりリンカー：ＫＬＨ比を制御するという決定がなされた。これらの運転から、ＤＭＳＯが生成物の品質に有害な影響を与えないことが判断された。適切なＳＥＣプロファイルが維持され、エピトープ密度は標的範囲に近かった；しかし、元の３５７：１のリンカー：ＫＬＨ比（１２１１６１〜０９０および１２１１６１〜１００）は、所望の範囲のすぐ上のエピトープ密度を結果としてもたらし、１００：１は、低すぎるエピトープ密度を結果としてもたらした（１２１１６１〜０９３）。これらの運転からのデータおよび小規模な活性化実験からの追加のデータにより、リンカー：ＫＬＨ比を２００：１に設定する決定が導かれた。
【０２０１】
リンカー原溶液を１００ｍｇ／ｍＬに設定するという決定もなされた。濃度を高く保つことで、反応に添加されるＤＭＳＯの量を最小にするが、リンカーが迅速かつ容易に溶解する濃度であることが望ましかった。運転１２１１６１〜１００は１８０ｍｇ／ｍＬのリンカー原液を用いたが、リンカーの溶解は、１００ｍｇ／ｍＬによるものほど迅速ではなかった。
【０２０２】
ペプチド原溶液の濃度を６ｍｇ／ｍＬに設定した。この原液濃度は、さらに緩衝液を添加する必要なしに、１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの所望のペプチドおよび活性化ＫＬＨ濃度を結果としてもたらす結合反応に添加される適切な体積のペプチド溶液を付与した。これらの４回の運転に基づく最終的な決定は、リン酸ナトリウム緩衝液を活性化反応において４０ｍＭに設定することであった。
【０２０３】
運転１２１１６１〜１２０、−１２５、−１３０、および−１４７
運転の次の設定の目的は、ＴＦＦパラメータ、例えば、ＴＭＰ、濃縮水流量、およびフラックスについての最適値を判断することであった。このときまでに、製剤の指定を行い、結果として、第２ダイアフィルトレーション緩衝液をリン酸カリウム緩衝液に対しての全ての運転について変更した。リンカー：ＫＬＨ比を２００：１に設定し、リンカーをＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍＬで溶解した。運転１２１１６１〜１２０を、低い範囲のＴＭＰおよび濃縮水流量を調査するように設定した。アッセイ結果は、製造した材料が、ＡＥＸによって測定されるリンカー％が先に見られたものよりも有意に高いことを除いて、全ての標的とする仕様を満したことを示した。このリンカーの増加は、４回の運転の最初の設定と１２１１６１〜１２０との間の濃縮水流量の減少（５０対１００ｍＬ／分）に起因すると元来は考えられた。
【０２０４】
運転１２１１６１〜１２５を、濃縮水流量の減少がリンカーのクリアランスの減少の原因であるという仮説に対処するように設定した。ＳＥＣプロファイルは、ダイマー％が僅かに標的範囲外であったこと、およびエピトープ密度が、３６のペプチド／ＫＬＨにおいて、標的範囲（３０〜６４のペプチド／ＫＬＨ）の下端に近かったことを示した；しかし、リンカーのクリアランスが有意に改善された（１２１１６１〜１２０から０．３％対３．０％。
【０２０５】
運転１２１１６１〜１３０では、不純物のクリアランスを改善しようと、より高いＭＷＣＯ膜（１００ｋＤ）を試みるという決定がなされた。同時に、リンカー：ＫＬＨ比を２５０：１に増加させてエピトープ密度を増加させ、結果として、標的とする範囲の中間にさらに向かうペプチド／ＫＬＨ数をもたらした。得られた材料は、３．４％まで増加したリンカー％を除き、全ての分析目標を満たした。２種のパラメータをこの運転において変更した（膜のＭＷＣＯおよびリンカー：ＫＬＨ比）ため、何が、運転１２１１６１〜１２５と比較してリンカー％を増加させたかが不明であった。運転１２１１６１〜１３０が１００ｋＤの膜を用いたことに対する利点を示さなかったため、３０ｋＤのＭＷＣＯ膜を用いるように戻すという決定がなされた。
【０２０６】
リンカー％の通常レベルのロット間ばらつきに関する課題に対処するため、運転１２１１６１〜１２５をできるだけ密接に繰り返して、低いレベルのリンカー％を再び達成し得るかどうかを判断するという決定がなされた。この運転の結果は、リンカーのレベルが１．９％まで減少したが、依然として初期の運転（＜１％）ほど低くはなかったことを示した。これらのレベルのリンカー不純物の真の影響を評価するために、面積％と実際のｐｐｍとの間の相関関係を判断する算出を行った。プロセス開発運転におけるリンカーの面積％は＜３ｐｐｍに相当したということが判断され；したがって、リンカー不純物の質量基準での実際の量は、実際にはかなり少なく、許容されるレベルである。
【０２０７】
運転１２１１６１〜１６５および−１７２
運転１２１１６１〜１６５は、１６０ｍｇのＫＬＨの投入を用いた実験室規模のデモ運転であり、プロセス開発の間に決定された最適化されたパラメータによって作製された材料の受容可能性を試験した。これらのパラメータを図２Ａ〜２Ｃに要約し、分析結果を図３Ａ〜３Ｄに示す。最適化されたプロセスにおいてさらなる確かさを構築するために、大規模な実験室運転を実施した。この運転（１２１１６１〜１７２）は、１ｇのＫＬＨの投入を用いた。ＴＦＦパラメータを図２Ａ〜２Ｃに要約し、分析結果を図３Ａ〜３Ｄに示す。プロセスを１ｇにスケールアップするためのパラメータは、フラックスを一定に保つことをベースとした（以下の表３Ｂを参照されたい）。また、１０ｇのスケールでプロセスを運転するのに用いられ得るスケールアップパラメータも表３Ｂに示す。
【０２０８】
（表３Ｂ）
0006007105.tif 000039
【０２０９】
実施例５：反応パラメータプロセス開発
５．１  材料および方法
この研究の間、以下のプロセス材料および装置を用いた：Ｖａｃｍｕｎｅ（登録商標）として購入されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｂｉｏｓｙｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ロット７３９６９０Ｖ１、Ｒ６２５２５８、８１７８７３Ｖ１、および８１７８７３Ｖ２）；ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド（Ａｍｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．ロットＡＰｉ  ０８０６１６）；ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＰＣ）ロット番号ＣＨ−０６００４５３）；スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ、種々のロット、カタログ番号２２３２２）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、無水９９．９％（Ｓｉｇｍａカタログ番号２７６８５５または等価物）；リン酸ナトリウム緩衝液＝１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）；ＰＢＳ＝Ｇｉｂｃｏ  １×ＰＢＳ、ｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２）、またはＤｕｌｂｅｃｃｏｓ  １×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）、またはＯｍｎｉＰｕｒ  １０×リン酸緩衝化食塩水（１×希釈）（ＶＷＲカタログ番号ＥＭ６５０６）；＜２ｍＬの反応用の２ｍＬのガラスＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔカタログ番号５１８２−０７１５または等価物）；≧２ｍＬの反応用の１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇポリプロピレン管；Ａｍｉｃｏｎ  ５０Ｋおよび１００Ｋ遠心分離フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ８０５９０６およびＵＦＣ８１００９６）または等価物；Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎカラム、０．５ｍｌ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号８９８８３）；卓上遠心分離器。
【０２１０】
５．２  方法
最適化された製造プロセスは以下を含む：１）ＫＬＨタンパク質のアミノ基をスルホ−ＳＭＣＣリンカーのＮＨＳ−エステル基と共有結合的に連結して活性化ＫＬＨを形成する活性化反応；２）過剰のリンカーおよびリンカー関連の不純物を除去する最初のＴＦＦ工程；３）合成ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドのＣ末端システインを、結合されたＣＤＸ−１１０を形成する活性化ＫＬＨ分子の一部であるスルホ−ＳＭＣＣリンカーのマレイミド基と共有結合的に付着させる結合反応、その後の；４）過剰のペプチドおよびペプチド関連の不純物を除去して緩衝液を交換する第２ＴＦＦ工程。この報告は、ワンポット反応と呼ばれるスケールダウンシステムを用いた反応条件の最適化を記載している。この研究を通して、ＫＬＨおよび活性化ＫＬＨについて１．３０の吸光係数ならびにＣＤＸ−１１０について１．３８の吸光係数を用いた。
【０２１１】
５．２．１  ワンポット反応
ＫＬＨを２ｍＬのガラスＨＰＬＣバイアルまたは１５ｍＬのポリプロピレン管にアリコートし、リン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、反転によって穏やかに混合した。リンカー溶液（水またはＤＭＳＯのいずれかにおいて予め溶解した）をＫＬＨ混合物に添加し、簡単にボルテックスし（１５〜３０秒）、次いでオービタルミキサにおいて４５±５分間保持した。４５分後、４：１のペプチド：リンカーの比でペプチド溶液によって反応をクエンチし、簡単にボルテックスする（１５〜３０秒）ことによって結合を開始した。結合反応をオービタルミキサにおいて約２〜３時間反応させ、次いでミキサまたは冷蔵庫において一晩保持した後、緩衝液交換した。ペプチドおよびペプチド関連の不純物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルタによるダイアフィルトレーションによって除去した後、エピトープ密度分析した。反応パラメータを必要に応じて調整し、所望の可変数、例えば、リンカー：タンパク質比、活性化時間、タンパク質濃度、およびＤＭＳＯ％を調査した。次の節で各実験を簡単に記載する。図４Ａ〜４Ｃは、各実験について用いた反応パラメータの概要を含む。
【０２１２】
５．２．２  実験番号１２２１２３−０６５
ＫＬＨを、約４５分間で１００：１と３５７：１との間で変動するリンカー：ＫＬＨモル比においてスルホ−ＳＭＣＣによって活性化した。スルホ−ＳＭＣＣリンカーを添加の前に８ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した。２４２：１のモル比（ペプチド：ＫＬＨ）でペプチドを活性化の終わりに直ちに反応に添加した。ペプチド：ＫＬＨ比を２４２：１に保持し、より高いリンカー比の実験において過剰とはなり得なかった。増加したペプチド：リンカー比を後の実験において用いた。
【０２１３】
５．２．３  実験番号１２２１２３−０９７、１２２１２３−１０９、１２２１２３−１１２
ＫＬＨを、約４５分間で１００：１と４４０：１との間で変動するリンカー：タンパク質比においてスルホ−ＳＭＣＣによって活性化した。スルホ−ＳＭＣＣリンカーを添加の前に８ｍｇ／ｍＬで水に、または３０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯのいずれかに溶解した。ＤＭＳＯは実験１２２１２３−０９７に存在しなかった。ＤＭＳＯは、実験１２２１２３−１０９については３．５％と１５．６％との間で変動し、実験１２２１２３−１１２については１５．６％と一定を保持した。実験１２２１２３−０９７については２．４２：１のペプチド：リンカーのモル比でペプチドを活性化の終わりに直ちに反応に添加した。結果は許容されるものであったが、ペプチド：リンカーのモル比は、ペプチドが過剰であることを確かにする後の実験で４：１まで増加した。
【０２１４】
５．２．４  実験番号１２２１２３−１１５
実験１２２１２３−１１５は、図４Ｃに示す全部の因子の実験計画（ＤＯＥ）を用いてＤＭＳＯ％、スルホ−ＳＭＣＣ：ＫＬＨのモル比、およびタンパク質濃度を試験した。スルホ−ＳＭＣＣリンカーを添加の前に１２１．８ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した。４：１のペプチド：リンカーのモル比でペプチドを活性化の終わりに直ちに反応に添加した。
【０２１５】
５．２．５  実験番号１２２１２３−１９０
ＫＬＨを、図４Ａに従った種々の活性化時間について２５：１と３５０：１との間で変動するリンカー：タンパク質のモル比でスルホ−ＳＭＣＣで活性化した。スルホ−ＳＭＣＣリンカーを添加の前に１００ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した。４：１のペプチド：リンカーのモル比でペプチドを活性化の終わりに直ちに反応に添加した。
【０２１６】
実施例６：反応パラメータプロセス開発の結果
反応パラメータプロセス開発の焦点は、スケールダウンされたシステムを用いた反応パラメータの最適化であった。反応体積は、２ｍＬ未満であり、ペプチドのクリアランスをＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルタの使用を通して達成した。エピトープ密度の正確な分析を有するにはペプチドのクリアランスが必要であった。スケールダウンされた反応を用いてもたらされた傾向は、プロセスパラメータの影響および相互作用を理解するのに用いられ得るが、ペプチドのクリアランスは連続的なＴＦＦ操作と等価ではない。反応の最適化に有意な分析特質は、エピトープ密度およびサイズ分布プロファイルである。ＡＥＸおよび／またはＲＰ−ＨＰＬＣによる結合体の純度を用いることで、ペプチドがアミノ酸組成物による分析の前に除去されたことを確かにしたが、これは本明細書には含まれない。最適化されたプロセスの目標を以下の表４に列挙する。
【０２１７】
（表４）ＣＤＸ−１１０薬剤物質の質的目標
0006007105.tif 000040
【０２１８】
図５は、ＣＤＸ−１１０に典型的なＳＥＣＨＰＬＣクロマトグラムを含有し、これは、５つのピークのおよその保持時間を示している。ピーク１および２は、高分子量種であると考えられ、ピーク３は、ダイマーであると考えられ、ピーク４は、モノマーであると考えられ、ピーク５は、低分子量種であると考えられる。
【０２１９】
６．１  ワンポット反応
スケールダウンされた反応モデルは、複数のパラメータを一度に試験することを含み、２ｍＬ未満の反応体積を用いた。いくつかの実験は、Ａｍｉｃｏｎフィルタによる遅いダイアフィルトレーションにより活性化からリンカーを除去したが、大部分の実験は、ワンポット反応モデルを用いた。ワンポットシステムは、活性化反応およびあらゆるリンカー不純物を、該反応からリンカーを取り除く代わりに、ペプチドのモル比の増加（４：１のペプチド：リンカーモル比）によってクエンチする。この小規模でリンカーを除去する技術は、不純物を除去する際に有効でなかったか、または処理の間にＳＥＣ分布を変化させたかのいずれかであった。
【０２２０】
ワンポット反応は、操作時間と試験された可変数とを混同させず、活性化パラメータについての真の傾向を示すことができる。しかし、ワンポット反応からのＳＥＣ分布の結果は、ＴＦＦ操作時間が存在しないため、薬剤物質プロセスに関する標的範囲内に概して常にあるわけではない。ＳＥＣ分布およびエピトープ密度は、リンカーのクリアランスの後に活性化されたＫＬＨについておよび活性化時間について示されているように、経時的に変化し続ける（６．２を参照されたい）。ＳＥＣ分布およびエピトープ密度への時間の影響は、最適化されたプロセスに関するパラメータを選択するときに考慮した。
【０２２１】
６．２スルホ−ＳＭＣＣ：ＫＬＨのモル比および活性化時間
エピトープ密度
実験１２２１２３−１９０についてのリンカー比の増加に伴うエピトープ密度の増加は、図６に示される二次多項式に適合した。二次曲線を予備の動力学モデリング評価において用いた。この近似曲線を用いて、同じ活性化条件を用いた、所与のリンカー：タンパク質比におけるエピトープ密度を予測することができる。実験１２２１２３−０６５からの結果は、図６にも示されるように、実験１２２１２３−１９０に匹敵する。
【０２２２】
最適化されたプロセスについて選択された比である、２００：１のリンカー：タンパク質比は、ワンポット反応スキームを用いて、約４５のペプチド／ＫＬＨのエピトープ密度を結果としてもたらす。２００：１比は、中程度のエピトープ密度を付与し、３０〜６４のペプチド／ＫＬＨの全標的範囲は、４５分の活性化時間による２００±１２５のリンカーモル比によって達成することができる。製造プロセスに期待されるエピトープ密度は、これ未満であり、ダイアフィルトレーションによってリンカーを除去するための処理時間に相当する。
【０２２３】
約１５０分の活性化時間は、３５０：１のスルホ−ＳＭＣＣ：ＫＬＨのモル比を用いた反応では約８０のペプチド／ＫＬＨの最大エピトープ密度、および２００：１のスルホ−ＳＭＣＣ：ＫＬＨを用いた反応では約６０のペプチド／ＫＬＨの最大エピトープ密度を結果としてもたらした（図７）。１５０分後、各リンカー比において達成されたエピトープ密度は、下降し始める。エピトープ密度の経時的な下降は、活性マレイミドの加水分解またはリンカー分解に関係した。
【０２２４】
類似のエピトープ密度曲線は、４５分および４時間の両方の活性化時間からの結果である（図６を参照されたい）。曲線の類似性は、図７に示される活性化時間の結果に関係し、ここで、４５分および２５０分（４時間）は類似のエピトープ密度を有する。より高いエピトープ密度は、同じリンカー比曲線が最大値（１５０分）において生じたときに類似の状態で達成され得る。
【０２２５】
ＳＥＣ分布
曲線の形状を決定するにはさらなるデータ点が必要とされるが、図８Ａおよび８Ｂにおいて示される実験１２２１２３−１９０からのＳＥＣ結果は、一般的な傾向を示す線形曲線に適合した。モノマー種（ピーク４）は増加することが示されたが、高分子量種（ピーク２）およびダイマー種（ピーク３）は、増加するリンカー：タンパク質比に伴って減少することが示された。最適化されたプロセス条件：２００：１のリンカータンパク質比および４５分の活性化時間；において、ＳＥＣ分布は、反応がさらなる保持または処理時間を有さないワンポット反応を用いて実施されたため、薬剤物質のプロセス目標を満たさない。
【０２２６】
活性化反応の間、時間と共により高い分子量種（ピーク１、２および３）が形成される。この観察は、リンカー：タンパク質比に関わらず一貫している。活性化時間についてのＳＥＣ結果（図９Ａおよび９Ｂ）もまた、実際の関係が線形ではないが、一般的な傾向を示す線形曲線に適合した。
【０２２７】
ピーク１および５に関する結果は提示されていないが、リンカー：タンパク質比の減少および活性化時間の増加に伴うさらにより高い分子量種という類似の傾向に概して従う；しかし、各種の百分率または値の変化は非常に小さい。
【０２２８】
エピトープ密度とＳＥＣの不均一性との間の直接の関係は見出されていない。それぞれが同じパラメータによって影響されるが、必ずしも同じようにではない。最適化されたプロセスについてのパラメータは、全てのパラメータがどのように相関するかを考慮することによって選択した。ＴＦＦプロセスについての操作時間を経時的なＳＥＣ分布の変化と組み合わせるとき、全てのＳＥＣピークおよびエピトープ密度が標的範囲内にある。
【０２２９】
６．３  リンカーの溶解
先のプロセスにおけるスルホ−ＳＭＣＣリンカーを、活性化を開始する前にリン酸緩衝液に懸濁させた。リンカーは、この濃度では水性緩衝液に可溶でなく、リンカースラリーを結果として生じた。スルホ−ＳＭＣＣは、１００ｍｇ／ｍＬを超える濃度ではＤＭＳＯに完全に可溶性であり、プロセス全体をより堅牢にするといういくつかの利点を付与する。これらの利点として：１）リンカー加水分解の低減−リンカーは、水溶液と接触するや否や分解および加水分解し始めるが、無水ＤＭＳＯ中では依然として安定であるはずであり、製造にさらなる柔軟性を付与する；および２）リンカー：タンパク質比のより良好な制御−スラリーの移送および溶解は、水溶液よりも制御が困難である；が挙げられる。リンカー比の小さな変化は、エピトープ密度およびＳＥＣ分布に有意に影響し得る。
【０２３０】
リンカースラリー対ＤＭＳＯへの溶解
エピトープ密度は、スラリー（ＤＭＳＯなし）として添加されたリンカーとＤＭＳＯに溶解されたリンカーとを比較すると、１００：１および４４０：１のリンカー：タンパク質比に関して類似している（図１０）。この観察は、ＤＭＳＯによるおよびこれによらない反応についても類似するエピトープ密度を有する、実験１２２１２３−０６５（ＤＭＳＯなし）と実験１２２１２３−１９０（ＤＭＳＯ＜３．４％）とを比較すると、図６に示される結果と一致している。
【０２３１】
活性化反応に添加されたＤＭＳＯは、より高い分子量種の量を低減させることが示された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ダイマー（ピーク３）およびモノマー（ピーク４）は、ＤＭＳＯが０％から約１５．６％まで増加するに従い、１０から１５％に変化した。ピーク１、２、および５は、各種の百分率または値の変化が非常に小さくても、概して同じ傾向に従う。
【０２３２】
６．４  ＤＭＳＯ、タンパク質濃度、およびスルホ−ＳＭＣＣ比の影響を決定するＤＯＥ
リンカースラリーを検討する最初の実験は、エピトープ密度の変化をほとんど示さず、ＳＥＣ分布へのＤＭＳＯの有意な影響を示した。追跡実験１２２１２３−１１５を、全部の因子の実験計画（ＤＯＥ）を用いてＤＭＳＯの影響をさらに検査するように設計した。実験を、ＤＭＳＯ（４．７〜１５．６％）、リンカー：タンパク質モル比（２００：１〜３５７：１）、およびタンパク質濃度（５〜１５ｍｇ／ｍＬ）を試験するように設計した。
【０２３３】
エピトープ密度
９５％信頼区間を有するエピトープ密度の結果の分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、リンカー：タンパク質比が統計的に有意な因子であることを示す。エピトープ密度は、さらなるスルホ−ＳＭＣＣが存在するときに増加し、これは、節６．２において議論された結果と一致している。統計的相互作用ではないが、所与のスルホ−ＳＭＣＣ比について得られた最終のエピトープ密度は、ＤＭＳＯおよびタンパク質濃度によって影響される。低いＤＭＳＯ濃度（４．７％）では、エピトープ密度（図１２Ａ）に対する影響はほとんどないが、高いＤＭＳＯ濃度（１５．６％）では、エピトープ密度がタンパク質濃度に応じておよそ１０のペプチド／ＫＬＨだけずれる（図１２Ｂ）。
【０２３４】
信頼区間が９０％に低減すると、タンパク質濃度およびタンパク質濃度とＤＭＳＯとの相互作用もまた、エピトープ密度に影響する有意なパラメータとなる。４．７％のＤＭＳＯにおいて、エピトープ密度の変化はほとんど観察されない。５〜７．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度において、エピトープ密度は、反応におけるＤＭＳＯの百分率が増加するに従い増加し始める。１２〜１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度において、エピトープ密度は反応におけるＤＭＳＯの百分率が増加するに従い減少し始める。
【０２３５】
ＳＥＣ分布
９５％信頼区間を有するダイマー（ピーク３）の結果のＡＮＯＶＡは、リンカー：タンパク質比、ＤＭＳＯ％、タンパク質濃度、およびＤＭＳＯ％とタンパク質濃度との相互作用が全て統計的に有意な因子であることを示す。ダイマー（ピーク３）は、さらなるスルホ−ＳＭＣＣが存在するときに減少し、これは、節６．２に議論された結果と一致している。統計的相互作用ではないが、所与のスルホ−ＳＭＣＣ比について得られたダイマー％は、ＤＭＳＯおよびタンパク質濃度によって影響される。高いＤＭＳＯ濃度（１５．６％）では、エピトープ密度（図１３Ｂ）に対する影響はほとんどないが、低いＤＭＳＯ濃度（４．７％）では、エピトープ密度がタンパク質濃度に応じて１５％ほどずれる（図１３Ａ）。
【０２３６】
ダイマー（ピーク３）に対する、タンパク質濃度とＤＭＳＯとの間の相互作用効果を以下に要約することができる。１５．６％のＤＭＳＯでは、エピトープ密度の変化はほとんど観察されない。５〜１１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度では、ダイマー（ピーク３）は、反応におけるＤＭＳＯの百分率が低下するに従い、増加し始める。
【０２３７】
最適化されたプロセス（１０ｍｇ／ｍＬ）についてのタンパク質濃度は、元のプロセスから変化しなかった。この濃度において、ダイマー（ピーク３）は、ＤＭＳＯ％が４．７％から１５．６％まで増加するに従い僅かに変化する。９５％信頼区間を有するモノマー（ピーク４）の結果のＡＮＯＶＡは、スルホ−ＳＭＣＣ比およびＤＭＳＯ％の両方が統計的に有意な因子であることを示す。モノマーは、さらなるスルホ−ＳＭＣＣおよびさらなるＤＭＳＯが存在するときに増加し、これは、節６．２に議論された結果と一致している。
【０２３８】
６．５  最適化されたプロセス
図１４は、元のプロセスおよび最適化されたプロセスの両方を用いた反応パラメータを要約する。（太字でハイライトした）反応条件への変化は以下である：１）無水ＤＭＳＯ中へのスルホ−ＳＭＣＣの溶解−リンカー加水分解を低減させ、スルホ−ＳＭＣＣ：リンカー比のより良好な制御を付与した；２）２００×まで低減したスルホ−ＳＭＣＣモル比−この変化は、ＤＭＳＯ中へのリンカーの溶解を補償するものであった；３）温度−１５℃まで低減した；４）ペプチド原溶液濃度−ＴＦＦ操作後、ＫＬＨの濃度に相当するように増加した。ペプチドは＞２０ｍｇ／ｍＬで可溶であり、ダイマー化が遅いため、これは、反応にほとんど影響を及ぼさないはずである。
【０２３９】
実施例７：粒子状物質の計数
Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ＜７８８＞（注入におけるＵＳＰ＜７８８＞粒子状物質）は、バイアルあたりの粒子状物質の計数の測定に関するある一定の基準およびプロトコルを記載する。ＵＳＰ＜７８８＞に示されるように、粒子状物質の測定に、２つの手順を用いることができる：光遮蔽粒子計数試験；および微視粒子計数試験。ＵＳＰ＜７８８＞に記載された基準は以下の通りである：粒径≧１０μｍ：６０００以下／容器；および粒径≧２５μｍ：６００以下／容器。ＣＤＸ−１１０では、５℃における、時間＝０および２６週後の２つの製剤を比較して研究を実施して、ＵＳＰ＜７８８＞に記載された標準プロトコルを用いた粒子状物質計数に対する製剤成分の影響を決定した。第１製剤（製剤Ａ）は、１．０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体ＣＤＸ−１１０、１．０ｍｇ／ｍＬの１０ｍＭのリン酸緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、および２．７ｍＭのＫＣｌを含有した。第２製剤（製剤Ｂ）は、１．０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合体ＣＤＸ−１１０、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース、および０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含有した。
【０２４０】
表５および表６は、それぞれ、５℃における、時間＝０および２６週後の製剤Ａの粒子状物質計数を列挙する。表７および表８は、それぞれ、５℃における、時間＝０および２６週後の製剤Ｂの粒子状物質計数を列挙する。データは、製剤Ｂの２６週後において粒子状物質含量の有意な増加を実証しない。しかし、１０を超え２５μｍの、顕微鏡でしか見られない粒子の有意な増加は、製剤Ｂと比較したとき、製剤Ａでは２６週で観察された。
【０２４１】
（表５）時間＝０における製剤Ａの粒子状物質の計数
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【０２４２】
（表６）時間＝２６週、５℃における製剤Ａの粒子状物質の計数
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【０２４３】
（表７）時間＝０における製剤Ａの粒子状物質の計数
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【０２４４】
（表８）時間＝２６週、５℃における製剤Ｂの粒子状物質の計数
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【０２４５】
配列リストの概要
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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