(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の循環癌細胞を検出する方法であって、
（ａ）末梢血からリンパ球を分離する分離工程と、
（ｂ）分離された末梢血リンパ球層を濃縮せずそのまま、１０００Ｕ／ｍｌより高濃度のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有する培養液で４８〜７２時間培養する培養工程と、
（ｃ）培養後、培養容器の底に付着した付着細胞に、抗ＥＭＡ（Epithelial Membrane Antigen）抗体を用いて免疫染色する免疫染色工程と、
（ｄ）前記免疫染色工程により免疫染色された付着細胞の観察画像内の染色細胞の個数に基づいて前記生体試料中の循環癌細胞を検出する検出工程と、
を備えたことを特徴とする末梢循環癌細胞の検出方法。
【請求項２】
前記培養工程に用いる培養容器と、前記免疫染色工程に用いる免疫染色容器が同一容器であり、培養後、前記培養容器から上澄み液を排出して底に付着した細胞だけを残し、前記培養容器に免疫染色させる抗体を注入することを特徴とする請求項１に記載の末梢循環癌細胞の検出方法。
【請求項３】
前記分離工程の後、分離された末梢血リンパ球層を、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体の少なくとも何れかを用いて固相化することを特徴とする請求項１又は２に記載の末梢循環癌細胞の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかの末梢循環癌細胞の検出方法における前記検出工程において、前記観察画像内の前記染色細胞の個数により、癌患者と健常者をスクリーニングする方法。
【請求項５】
末梢血からリンパ球を分離する分離手段と、
分離された末梢血リンパ球層を濃縮せずそのまま、１０００Ｕ／ｍｌより高濃度のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有する培養液で４８〜７２時間培養する培養手段と、
培養容器の底に付着した付着細胞に、抗ＥＭＡ（Epithelial Membrane Antigen）抗体を用いて免疫染色する免疫染色手段と、
免疫染色された付着細胞の観察画像内の染色細胞の個数に基づいて前記生体試料中の循環癌細胞を検出する検出手段と、
を備えたことを特徴とする末梢循環癌細胞の検出装置。
【請求項６】
前記培養手段に用いる培養容器と、前記免疫染色手段に用いる免疫染色容器が同一容器であることを特徴とする請求項５に記載の末梢循環癌細胞の検出装置。
【請求項７】
分離された末梢血リンパ球層を、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体の少なくとも何れかを用いて固相化することを特徴とする請求項５又は６に記載の末梢循環癌細胞の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢循環癌細胞（ＣＴＣ；Circulating Tumor Cell）を簡易に検出できる末梢循環癌細胞の検出方法および検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、末梢循環癌細胞（ＣＴＣ）が、１０６〜１０７の末梢血単核細胞中に１個の超低濃度で、上皮由来癌を有する患者の末梢血において観察されることが知られている。ＣＴＣは、進行した癌細胞が血液やリンパ液の流れに乗って循環し、離れた臓器にまで転移を起こす原因とされている。
血液中のＣＴＣは、乳癌や大腸癌などの転移性の癌の症例において、治療効果の判定や予後予測因子としての有用性が認められており、例えば、米国Veridex社の開発した乳癌、大腸癌などの領域の検出系のCellSearch（登録商標）システムが知られている。CellSearch（登録商標）システムでは、抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気ビーズを利用してＣＴＣを濃縮し分取した後、免疫染色法にてＣＴＣを同定することで、サンプル中のＣＴＣを計数する（例えば、非特許文献１を参照）。【０００３】
また、癌細胞がウロキナーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ））とその受容体（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ））を発現していることに鑑みて、ウロキナーゼ活性を指標にし、ＣＴＣを簡便かつ精度よく検出し回収する循環癌細胞の検出方法が知られている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−３９４８０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Riethdorf S et al., Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the CellSearch system. Clin Cancer Res. 2007 Feb 1;13(3):920-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したCellSearch（登録商標）システムでは、癌細胞表面に発現するＥｐＣＡＭ（上皮細胞表面分子）に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気ビーズを利用して、ＣＴＣを濃縮している。具体的には、ナノ鉄粒子にＥｐＣＡＭに対する抗体を結合された磁性粒子により、血液中の多くの細胞から特異的に上皮細胞を分離する。分離された上皮細胞に蛍光標識したサイトケラチンモノクローナル抗体を反応させ、それと共に蛍光性のＤＮＡ染色物質で細胞核を染色する。また、白血球をＣＴＣと識別するために、蛍光標識したＣＤ４５抗体を反応させる。その後、ＣＴＣの反応溶液は、磁石を固定したカートリッジ中に移される。磁石の発する磁力によりＣＴＣがカートリッジ上面に移動する。カートリッジ上面の蛍光発色状況を示す蛍光画像データを解析する。【０００７】
このように、CellSearch（登録商標）システムでは、ＣＴＣを濃縮、上皮細胞を特異的に分離、血中に浮遊するＣＴＣを磁石で誘導して蛍光発色させることから、検出方法や検出装置が複雑になる。
かかる状況に鑑みて、本発明は、末梢循環癌細胞を簡便かつ精度良く検出できる検出方法および検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、末梢血から分離したリンパ球層を細胞培養したものの培養容器の底部に付着する付着細胞について鋭意研究した結果、細胞培養後に付着細胞を用いて末梢循環癌細胞を簡便かつ精度良く検出できることを知見した。【０００９】
すなわち、本発明の末梢循環癌細胞の検出方法は、生体試料中の循環癌細胞を検出する方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を備える。
（ａ）末梢血からリンパ球を分離する分離工程
（ｂ）分離された末梢血リンパ球層を培養液で培養する培養工程
（ｃ）培養後、培養容器の底に付着した細胞に免疫染色する免疫染色工程
（ｄ）免疫染色工程により得られた染色細胞の観察画像に基づいて生体試料中の循環癌細胞を検出する検出工程【００１０】
ここで、上記（ｃ）の免疫染色工程は、抗ＥＭＡ（Epithelial Membrane Antigen）抗体を用いて染色することがより好ましい。抗ＥＭＡ抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果は、解析データの特異度が低く、感度が高いことから、結果的に検査のカットオフ（Cut off）値を下げたことに等しく、スクリーニングテストとして利用できるからである。【００１１】
上記（ｂ）の培養工程に用いる培養容器と、上記（ｃ）の免疫染色工程に用いる免疫染色容器が同一容器であり、培養後、培養容器から上澄み液を排出して底に付着した細胞だけを残し、培養容器に免疫染色させる抗体を注入することが好ましい。より簡便に検出できるからである。【００１２】
また培養液は、少なくとも１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有することでも良い。末梢血リンパ球層を培養する培養液は、経験的に少なくとも１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２を含有するものが良い。
上記（ｂ）の培養工程は、４８〜７２時間培養することが良い。４８時間未満の培養では、経験的に循環癌細胞を検出することは困難であり、また７２時間を超えた培養では、循環癌細胞が自然消滅（アポトーシス）してしまうからである。【００１３】
上記（ａ）の分離工程の後、分離された末梢血リンパ球層を、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体の少なくとも何れかを用いて固相化することでも良い。通常、細胞培養は、抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ１６１抗体などで固相化されているフラスコを用いて行うためである。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体の何れかを用いて固相化させることにより、末梢血リンパ球層に含まれる細胞が増殖および活性化する。固相化させる処理は、特に限定されるものではなく、適宜選択することが可能である。【００１４】
また、本発明の癌患者と健常者をスクリーニングする方法は、上述した本発明の末梢循環癌細胞の検出方法における上記（ｄ）の検出工程において、観察画像内の染色細胞の個数に基づいて判定する。観察画像内の染色細胞の個数によって、グレードに分けて判定する。【００１５】
次に、本発明の末梢循環癌細胞の検出装置について説明する。
本発明の末梢循環癌細胞の検出装置は、末梢血からリンパ球を分離する分離手段と、分離された末梢血リンパ球層を培養液で培養する培養手段と、培養容器の底に付着した細胞に免疫染色する免疫染色手段と、得られた染色細胞の観察画像に基づいて生体試料中の循環癌細胞を検出する検出手段とを備える。
免疫染色手段は、抗ＥＭＡ（Epithelial Membrane Antigen）抗体を用いて染色することが好ましい。また、培養手段に用いる培養容器と、免疫染色手段に用いる免疫染色容器が同一容器であることが好ましい。培養後、培養容器から上澄み液を排出して底に付着した細胞だけを残し、培養容器に免疫染色させる抗体を注入することができ、より簡便な検出装置となる。
培養液は、少なくとも１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有しても良い。また、分離された末梢血リンパ球層を、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体の少なくとも何れかを用いて固相化しても良い。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の末梢循環癌細胞の検出方法および検出装置によれば、末梢循環癌細胞を簡便かつ精度良く検出できるといった効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の末梢循環癌細胞の検出フロー図
【図２】本発明の末梢循環癌細胞の検出フロー図（固相化工程を含む）
【図３】卵巣癌患者のＥＭＡ陽性細胞電子顕微鏡写真１
【図４】卵巣癌患者のＥＭＡ陽性細胞電子顕微鏡写真２
【図５】健常者のＥＭＡ陽性細胞電子顕微鏡写真１
【図６】健常者のＥＭＡ陽性細胞電子顕微鏡写真２
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。【００１９】
本発明の末梢循環癌細胞の検出方法は、図１のフローに示すように、末梢血からリンパ球を分離する分離工程（ステップＳ１）と、分離された末梢血リンパ球層を培養液で培養する培養工程（ステップＳ３）と、培養後、培養容器の底に付着した細胞に免疫染色する免疫染色工程（ステップＳ５）と、免疫染色工程により得られた染色細胞の観察画像に基づいて生体試料中の循環癌細胞を検出する検出工程（ステップＳ７）とから成る。【００２０】
具体的に、分離工程（ステップＳ１）では、生体試料の末梢血３０ｍｌからリンパ球分離液（比重１．０７７±０．００１）でリンパ球層を分離する。
培養工程（ステップＳ３）では、７５ｃｍ２プラスチックフラスコの中で、ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを基盤とした培養液に、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有させたリンパ球培養液を調製したものを用いて、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータにて４８〜７２時間培養する。なお、低濃度のＩＬ−２よりも１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有させることにより、細胞の増殖率及び活性度を向上させる。ＩＬ−２は細胞の増殖及び活性化に影響を与えることが知られているサイトカイン（細胞から遊離される免疫物質）であり、人工的にも合成できる。
免疫染色工程（ステップＳ５）では、培養後、上澄み液を破棄し、フラスコの底に付着した細胞をセルスクレーパーで剥離した後、９５％エタノールで固定し、常温にて免疫染色を行う。
検出工程（ステップＳ７）では、免疫染色工程で得られた標本に対して、前処理として内因性ペルオキシダーゼブロッキングを５分間行った後、後述する６種類の抗体を２０分間、ＤＡＢ発色試薬を４分間、ヘマトキシリン染色を１分間行って、顕微鏡下で観察する。【００２１】
ここで、図２のフローに示すように、分離工程（ステップＳ１）の後、分離されたリンパ球層を、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体の少なくとも何れかを用いて固相化する固相化工程（ステップＳ２）を付加しても構わない。
固相化工程（ステップＳ２）では、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ１６１抗体、或は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体を用いる。【００２２】
なお、末梢循環癌細胞の検出方法において、反応に用いた試薬、ブロッキング試薬、ポリマー試薬、ＤＡＢ発色試薬、洗浄液（ＥｎｖｉｓｉｏｎＦＬＥＸキット）は、Ｄａｋｏ社製を使用した。また、ヘマトキシリンは、マイヤーのヘマトキシリンを自家調整し使用した。【００２３】
そして、免疫染色工程（ステップＳ５）で用いる抗体は、Ｄａｋｏ社製の希釈済み抗ＥＭＡ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＫ（ＡＥ１／ＡＥ３）抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＣＤ２０（Ｌ−２６）抗体、或は、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体の何れかを使用し、染色は自動免疫染色装置を用いて行った。下記表１は、免疫染色に使用した６種類の抗体について、癌細胞の系譜と臨床的意義を示している。【００２４】
【表１】
0006052756.tif 000002
【００２５】
以下の実施例では、本発明の末梢循環癌細胞の検出方法の有用性を示すために実施した実験の結果について説明する。以下の実施例では、図２のフローに示すように、末梢血３０ｍｌからリンパ球分離液で分離したリンパ球層を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で固相化したフラスコの中で培養している。
抗ＣＤ３抗体としてＵＣＴＨ−１（ＢＤバイオサイエンス社製）、抗ＣＤ１６１抗体として１９１．Ｂ８（イムノテック社製）を用いた。固相化培養容器の作製は、底部の内表面積が７５ｃｍ２のフラスコに抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で固相化処理を施して固相化されたフラスコを作製した。固相化処理は、１μｇ／ｍｌに調整した抗ＣＤ３抗体をフラスコに注入し、２４時間室温にて静置した後、余分な抗体をリン酸緩衝液で洗い流すことにより行なった。次に、１０μｇ／ｍｌになるように調整した抗ＣＤ１６１抗体をフラスコに注入し、さらに２４時間室温にて静置した後、５℃の冷蔵庫に保存し、使用時に余分な抗体をリン酸緩衝液で洗い流して使用した。
なお、図１のフローに示すように、分離されたリンパ球層を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で固相化する工程を含めずとも良い。
【実施例１】
【００２６】
実施例１では、免疫染色工程（ステップＳ５）において抗ＥＭＡ抗体を使用して免疫染色を行った結果について説明する。【００２７】
（被験者の選定方法）
被験者の選定方法としては、初めに対象者を決めるのではなく、まず正解を調べて、癌患者と健常者を、それぞれ３７名（内、男性２２名、女性１５名）、３３名（内、男性１５名、女性１８名）、計７０名（男性３７名、女性３３名）を選び出した。【００２８】
表２は、癌患者検体３７名（検体名Ｐ１〜Ｐ３７）について、それぞれ年齢、性別、癌の種類、病期（Ｓｔａｇｅ）、免疫染色の結果（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：陽性、又は、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：陰性）、免疫染色の解析結果による判定グレード（０〜３）を示している。
表２に示すように、癌の種類は、肝臓癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、直腸癌、肝細胞癌、大腸癌、悪性リンパ腫など多岐に及んでいる。
また表３は、健常者検体３３名（検体名Ｎ１〜Ｎ３３）について、それぞれ年齢、性別、免疫染色の結果（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：陽性、又は、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：陰性）、免疫染色の解析結果による判定グレード（０〜３）を示している。【００２９】
【表２】
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【００３０】
【表３】
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【００３１】
抗ＥＭＡ抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果を、下記の表４，表５に示す。
表４において、真陽性、真陰性、偽陽性および偽陰性の用語の定義は以下の通りである（本明細書中における他の表中の表記および文中の表記も同様）。
・真陽性：検査で正しく陽性であった人（本当はその病気の人：癌患者）
・真陰性：検査で正しく陰性であった人（本当はその病気でない人：健常者）
・偽陽性：本当はその病気でない人で検査陽性と判定された人
・偽陰性：本当はその病気の人で検査陰性と判定された人【００３２】
また表５において、感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率および正診率の用語の定義は以下の通りである（本明細書中における他の表中の表記および文中の表記も同様）。
・感度：被験者を正しく陽性と言えた割合
・特異度：非病者を正しく陰性と言えた割合
・陽性適中率：陽性者が正しく病気であった割合
・陰性適中率：陰性者が正しく非病気であった割合
・正診率：総数のうち正しかった割合【００３３】
ここで、感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率および正診率の５つは、通常診断精度として用いられる指標である。陽性率および有病率は診断精度の指標ではないが、データを解釈するうえで重要な指標である。表５中には、それぞれの指標の算出式を示している。
感度が高ければ陽性者（有病者）の見落としが少なく、診断確率が高い検査である。一方、特異度が高ければ、見落とし（偽陽性者）が少ない検査である。すなわち、陽性適中率の高い検査で陽性と出ればその病気である可能性が極めて高く、陰性適中率の高い検査で陰性と出ればその病気は略否定できることになる。【００３４】
【表４】
0006052756.tif 000005
【００３５】
【表５】
0006052756.tif 000006
【００３６】
上記表４に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が２８人，陰性（偽陰性）が９人であり、健常者については陽性（偽陽性）が１７人，陰性（真陰性）が１６人であるという結果となった。
また上記表５に示すように、特異度は４８％と低いものの、感度が７６％と高く、陽性適中率は６２％であるという結果となった。抗ＥＭＡ抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果は、解析データの特異度は低く、感度が高いことから、結果的に検査のカットオフ（Cut off）値を下げたことに等しく、スクリーニングテストとして利用できることがわかる。なお、逆に、解析データの特異度が高く、感度が低い場合、データのカットオフ（Cut off）値が高くなるので治療を開始する目的の検査として利用することができる。【００３７】
ここで、抗ＥＭＡ抗体で染色された細胞の系譜について説明する。抗ＥＭＡ抗体は、上皮性腫瘍細胞以外に、骨髄中の形質細胞を染色することがある。健常者では骨髄形質細胞が末梢血中に出現することはないので、検査で発現した健常者のＥＭＡ陽性細胞が形質細胞であったという可能性は排除できる。癌患者で末梢血中にＥＭＡ陽性細胞がみられる疾患としては、ホジキン病（Ｈ＆Ｌ細胞）と未分化大細胞型リンパ腫（Ｔ細胞系細胞）があるが、今回これらの患者については検査していない。これらの理由から、抗ＥＭＡ抗体で染色された細胞は、上皮性腫瘍細胞あるいは上皮性由来の異常細胞と考えて良いと判断した。【００３８】
次に、細胞を培養する培養工程（ステップＳ３）において、培養液の組成によって、ＥＭＡ陽性細胞の発現に影響があるのか否かについて、健常者４名の細胞を用いて調べた結果について説明する。
１名はＥＭＡ陽性細胞が陰性、他の３名はＥＭＡ陽性細胞が発現した被験者を選び、ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを基盤とした培養液を用いて、ＥＭＡ陽性細胞の発現について比較した。培養は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で固相化処理したフラスコを使用して行った。比較結果を下記表６に示す。表６から、培養液の組成によって、ＥＭＡ陽性細胞の発現に影響が無いことがわかる。【００３９】
【表６】
0006052756.tif 000007
【００４０】
上述の如く、本実施例では、図２のフローに示すように、末梢血３０ｍｌからリンパ球分離液で分離したリンパ球層を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で固相化したフラスコの中で培養している。これは、通常、細胞培養は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で固相化されているフラスコを用いて行うためである。固相化工程（ステップＳ２）の有無が、ＥＭＡ陽性細胞の発現に影響を与えるか否かについて調べた。
実験は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体で抗体処理を行ったフラスコと、抗体処理をしていないフラスコとを用いて、同時に細胞を培養後、ＥＭＡ免疫染色を実施した。下記表７に示すように、抗体で固相化処理しなかったフラスコで培養してもＥＭＡ陽性細胞が発現し、抗体の固相化処理とは無関係であった。すなわち、抗体で固相化していない未処理のフラスコを使用して細胞を培養しても、ＥＭＡ陽性細胞の発現に影響を与えず、固相化工程（ステップＳ２）の有無は、ＥＭＡ陽性細胞の発現に影響を与えないことがわかった。【００４１】
【表７】
0006052756.tif 000008
【００４２】
次に、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法の再現性を調査した。下記表８に示すように、健常者５名、癌患者７名の計１２名を選出し、ＥＭＡ免疫染色の再現性を調査した。２回目、３回目の検査は、１回目の検査終了後、１〜２か月後に実施した。表８に示すように、１例（Ｐ２）を除く１１例で再現性が認められた。表８の結果は、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法の再現率は９２％（１１／１２）であることを示している。【００４３】
【表８】
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【００４４】
本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法の結果について、他の方法で測定した結果と比較した。比較は、ＥＭＡ陽性細胞の被験者の検体をCellSearch（登録商標）システム（米国Veridex社の開発した乳癌、大腸癌などの領域の検出系システム）によって測定することにより行った。下記表９に示したごとく、ＥＭＡ染色で得られた結果とCellSearch（登録商標）システムで得られた検査結果は一致した。このことは、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法が、CellSearch（登録商標）システムの測定感度に劣らないことを示している。【００４５】
【表９】
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【００４６】
次に、ＥＭＡ陽性細胞の電子顕微鏡写真について説明する。図３および図４は、卵巣癌患者のＥＭＡ陽性細胞の電子顕微鏡写真である。図３および図４に観察される細胞は、全体にＮ／Ｃ比が高く、ミトコンドリアなどの形成が観察されるものの、ゴルジ野などの他の細胞質内小器官の形成に乏しい。また核小体の形成が目立つ。細胞間接着装置の形成を認め難い一方、細胞質突起による接着が示唆される。細胞系譜の特定は困難であるが何らかの腫瘍細胞と推定できる。【００４７】
一方、図５および図６は、健常者のＥＭＡ陽性細胞の電子顕微鏡写真である。図５および図６では、少数ながらＮ／Ｃ比が高く、核小体の目立つ異型細胞が観察される。一部で細胞相互の接着像が認められるが、細胞間接着装置の発達に乏しい。ミトコンドリアなどの細胞内小器官の発育も比較的乏しいものといえる。
上記の観察結果から、癌患者、健常者に発現したＥＭＡ陽性細胞は、細胞系譜の特定は困難であるものの、何らかの腫瘍細胞あるいは異型細胞と推察できる。下記表１０は、卵巣癌患者と健常者のＥＭＡ陽性細胞の電子顕微鏡写真による観察結果の比較を纏めたものである。【００４８】
【表１０】
0006052756.tif 000011
【００４９】
ここで、ＥＭＡ陽性細胞が非腫瘍性間質細胞の可能性について検討した結果を説明する。間質細胞には、免疫細胞、炎症性細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞がある。このうち、ＥＭＡ陽性細胞が間質細胞であったかどうか疑問を解いておく必要がある。特に、血液中の免疫細胞、炎症性細胞、内皮細胞であるか否かについてである。先ず、炎症性細胞には、好中球と形質細胞があるが、好中球は免疫染色によって非特異的にＣＥＡ陽性となることはあるが、ＥＭＡ陽性にはならない。また形質細胞は、ホジキン病や未分化大細胞型リンパ腫患者の末梢血に発現するが、健常者の末梢血には発現しない。ホジキン病および未分化大細胞型リンパ腫患者の疾患の患者については、今回被験者から除外されているので、形質細胞であった可能性は除外できる。また、骨髄中の形質細胞が希にＥＭＡ陽性になることがあるが、形質細胞は通常、健常者の末梢血中に現れることはないのでこの可能性も排除できる。
次に、免疫細胞である。末梢血中に胸腺上皮細胞から発生した非腫瘍性の未熟なＴ細胞が出現することがある。しかし、非腫瘍性の未熟なＴ細胞は、健常者には認められず、胸腺腫患者の末梢血中に現れる。胸腺腫患者についても、今回被験者から除外されているので、免疫細胞である可能性も除外できる。【００５０】
ところで、内皮細胞、線維芽細胞、あるいは周皮細胞が、末梢血ＥＭＡ陽性細胞として発現した可能性はないのかという問題が残る。問題となるのが、採血時に針の穴に混入する可能性のある血管内皮細胞、皮下に存在する線維芽細胞、周皮細胞である。これらの可能性を調べるために、採血時に最初の２ｍｌを廃棄した末梢血と、廃棄しない末梢血とを培養して比較した。【００５１】
下記表１１に示すように、採血時に２ｍｌ廃棄した末梢血中にも、２ｍｌ廃棄しなかった末梢血と同様にＥＭＡ陽性細胞が発現した。このことから、検出されたＥＭＡ陽性細胞は、採血時に針の穴に混入した血管内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞であるという可能性を排除することができる。
以上のことから、末梢血中に存在するＥＭＡ陽性細胞は、上皮系細胞と考えられるのである。【００５２】
【表１１】
0006052756.tif 000012
【００５３】
次に、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法における観察画像内の染色細胞の個数により、癌患者と健常者をスクリーニング判定する方法について説明する。
判定はＧｒａｄｅで行い、例えば、Ｇｒａｄｅは下記表１２のように定める。すなわち、Ｇｒａｄｅ０とは、ＥＭＡ陽性細胞が０個の場合であり、この場合、癌や癌転移の心配は少ないが定期的な癌検診を受けることを勧めるものである。また、Ｇｒａｄｅ１とは、ＥＭＡ陽性細胞が１個出現の場合であり、癌の確率は低いが、癌検診を勧めるものである。この場合、将来的に癌に対する注意が必要である。また、Ｇｒａｄｅ２とは、ＥＭＡ陽性細胞が数個の場合であり、目に見えない小さな癌の存在の可能性が考えられ、癌の精密検査を受けることを勧めるものである。さらに、Ｇｒａｄｅ３とは、ＥＭＡ陽性細胞数が５％よりも多い場合であり、この場合、どこかに癌が存在している確率が高いので、できるだけ早期に癌の精密検査を受けることを勧めるものである。なお、ＥＭＡ陽性細胞数が５％よりも多い場合であれば、ＥＭＡ陽性細胞数が１０％であれ３０％であれ、数的な要素は考慮しないで良いとして構わない。【００５４】
【表１２】
0006052756.tif 000013
【００５５】
本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法の検出結果の解釈において、癌患者のＥＭＡ陽性細胞に対し、健常者のＥＭＡ陽性細胞が必ずしも癌細胞でないということはあり得る。その理由の一つとして、ＥＭＡ陽性細胞が発現した健常者で、現在、癌を発症している例はない。また、これを証明するためにＥＭＡ細胞陽性の一部の健常者において、ＰＥＴ−ＣＴ検査、腫瘍マーカー測定を実施した結果、現在のところ、癌などの異常を発見された人はいない。その反面、ＥＭＡ陽性細胞が認められた癌患者においては、癌の転移や再発が有意（７６％、真陽性２８／病者数３７）であり、癌患者におけるＥＭＡ陽性細胞は、癌細胞そのものをとらえている可能性が高いといえる。【００５６】
ＥＭＡ陽性細胞が発現した患者のうち、上述のCellSearch（登録商標）システムの測定結果でも、癌細胞の存在が認められている２症例（検体Ｎｏ＝Ｐ２，Ｐ１０）については、ＥＭＡ陽性細胞の発現と、癌の再発や転移との関連性が推察できる。このことは転移能を持ったＥＭＡ陽性細胞の存在が予後（再発、転移）に結び付くという可能性を示唆している。癌患者のＥＭＡ陽性細胞は、癌転移能が高く、再発に関与し、健常者のＥＭＡ陽性細胞は、造腫瘍形成能が低いという可能性が考えられる。すなわち、癌患者に発現するＥＭＡ陽性細胞は、転移性のある癌細胞であり、健常者に発現するＥＭＡ陽性細胞は、将来、癌を発症させる可能性を有する分裂の遅い癌幹細胞の可能性が考えられる。また、上述したように、卵巣癌患者とＥＭＡ細胞陽性の健常者の培養細胞とを、電子顕微鏡で観察した結果からもその可能性が推察できる（図３〜６を参照）。【００５７】
また、検査時点において転移や再発の認められない癌患者であっても、検査後、ＥＭＡ陽性細胞が確認されることによって、癌の転移や再発の確率が高くなるという可能性も考えられる。今後、癌患者や健常者におけるＥＭＡ陽性細胞が、確実に癌細胞なのか、あるいは癌幹細胞なのかを詳細に同定する必要がある。
細胞培養中に、ＥＭＡ陽性細胞が１個あるいは２個見つかった場合、それが本当に転移や再発の癌発症として成立するのかどうかは極めて重要なことである。たとえ、そのような細胞が末梢血中に１００個出現しても、培養している間に９９個が死んでしまう可能性もある。癌細胞が末梢血中に１万とか１０万とか１００万とかあって、そのうちの１個か２個で癌の転移が成立するかという確率の問題にもなる。末梢血中に発現した癌細胞は、１時間から２時間４０分くらいで自然消滅（アポトーシス）するという報告もある。【００５８】
人体の中では１日に３０００〜４０００個の癌細胞もしくは異常細胞が生み出されていると言われている。しかし、これらの細胞は免疫細胞によって排除されたり、自然消滅（アポトーシス）したりして、癌の発症が抑制されている。体内でこれらの細胞が１個でも２個でも残っていた場合、培養という条件と違い、生体内で癌が発症しないと１００%否定することはできない。【００５９】
一方、健常者では、末梢血中にＥＭＡ陽性細胞のような上皮性細胞が存在することは考えられない。ＥＭＡ陽性細胞が健常者においても５２%（上記表４における偽陽性１７／非病者数３３）の人に出現するという現象は、現在いわれているように男女ともに日本人の２人に１人が一生の内に癌と診断されるということを裏付けているのかもしれない。厚生労働省の２０１０年の試算では、生涯で癌にかかる確率は、男性６０%、女性４５%である。本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法の場合でも、健常者３３名（男性１５名、女性１８名）の内、ＥＭＡ陽性細胞が出現した人は、男性９名（６０%；９／１５）、女性８名（４４%；８／１８）であり、厚生労働省の試算と一致していることは興味深い。
【実施例２】
【００６０】
実施例２の末梢循環癌細胞の検出方法では、免疫染色工程（ステップＳ５）において、抗ＥＭＡ抗体の替わりに、抗ＣＥＡ抗体を使用して免疫染色を行った結果について説明する。抗ＣＥＡ抗体は、大腸、肺、乳房、肝臓、膵臓などの腺癌細胞を特異的に染色するので、上記表２に示す検体の癌の種類と癌細胞の系譜から、肺癌、膵臓癌、大腸癌、胃癌などの腺癌患者を選出し、症例数について実施例１の７０例（癌患者と健常者がそれぞれ３７名、３３名）から、５２例（癌患者と健常者がそれぞれ３０名、２２名）に絞った。
抗ＣＥＡ抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果を、下記の表１３，表１４に示す。なお、表中の用語や指標については、実施例１で説明したものと同じである。【００６１】
【表１３】
0006052756.tif 000014
【００６２】
【表１４】
0006052756.tif 000015
【００６３】
上記表１３に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が１０人，陰性（偽陰性）が２０人であり、健常者については陽性（偽陽性）が３人，陰性（真陰性）が１９人であるという結果となった。
また上記表１４に示すように、特異度は８６％と高いが、感度が３３％と低く、また陽性適中率は７７％であるという結果となった。抗ＣＥＡ抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果は、解析データの特異度が高く、感度が低いことから、結果的に検査のカットオフ（Cut off）値が高くなるので、実施例１に示す抗ＥＭＡ抗体を用いて免疫染色する場合とは異なり、癌の治療を開始するか否かの判断のための検査として利用できることがわかる。
上記の結果から、癌の治療を開始するか否かの判断のための検査として使える可能性があるが、抗ＣＥＡ抗体は、大腸、肺、乳房、肝臓、膵臓などの腺癌細胞を特異的に染色する一方で、しばしば炎症時に現れる好中球も非特異的に染色する。そのため、実施例２の末梢循環癌細胞の検出方法、すなわち抗ＣＥＡ抗体による免疫染色は、検査における抗体の特異性という観点からみると実施例１の末梢循環癌細胞の検出方法と比べて劣ることになる。
【実施例３】
【００６４】
実施例３の末梢循環癌細胞の検出方法では、免疫染色工程（ステップＳ５）において、抗ＥＭＡ抗体によるＥＭＡ免疫染色の結果と、抗ＣＥＡ抗体によるＥＭＡ免疫染色の結果とを同時に使用して、指標の精度を向上できるか否かについて調べた結果について説明する。
症例数について実施例１の７０例（癌患者と健常者がそれぞれ３７名、３３名）から、５７例（癌患者と健常者がそれぞれ３５名、２２名）に絞った。
抗ＥＭＡ抗体によるＥＭＡ免疫染色の結果と、抗ＣＥＡ抗体によるＥＭＡ免疫染色の結果とを同時に使用して得られた判定結果を、下記の表１５，表１６に示す。なお、表中の用語や指標については、実施例１で説明したものと同じである。【００６５】
【表１５】
0006052756.tif 000016
【００６６】
【表１６】
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【００６７】
上記表１５に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が６人，陰性（偽陰性）が２９人であり、健常者については陽性（偽陽性）が２人，陰性（真陰性）が２０人であるという結果となった。
また上記表１６に示すように、特異度は９１％と非常に高いが、感度が１７％と非常に低く、正診率が４６％と５割を下回る結果となった。このことから、抗ＥＭＡ抗体によるＥＭＡ免疫染色の結果と、抗ＣＥＡ抗体によるＥＭＡ免疫染色の結果とを同時に使用して判定することは適当でないことがわかったが、更なるデータの蓄積によって、有用性を見出せる可能性はある。
【実施例４】
【００６８】
実施例４の末梢循環癌細胞の検出方法では、免疫染色工程（ステップＳ５）において、抗ＥＭＡ抗体の替わりに、抗ＣＫ（ＡＥ１／ＡＥ３）抗体を使用して免疫染色を行った結果について説明する。抗ＣＫ（ＡＥ１／ＡＥ３）抗体は、上皮性腫瘍や細胞増殖活性細胞を特異的に染色する。症例数は３０例（癌患者と健常者がそれぞれ１９名、１１名）である。なお、癌患者は、癌の種類に関係なく無作為に選出した。
抗ＣＫ（ＡＥ１／ＡＥ３）抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果を、下記の表１７，表１８に示す。なお、表中の用語や指標については、実施例１で説明したものと同じである。【００６９】
【表１７】
0006052756.tif 000018
【００７０】
【表１８】
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【００７１】
上記表１７に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が１６人，陰性（偽陰性）が３人であり、健常者については陽性（偽陽性）が９人，陰性（真陰性）が２人であるという結果となった。
上記表１８に示すように、感度が８４％と高いが、特異度は１８％と非常に低く、感度との相関も認められなかった。そのため、現時点の結果からは、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法、すなわち抗ＣＫ（ＡＥ１／ＡＥ３）抗体による免疫染色を使用して判定することは適当でないことがわかったが、更なるデータの蓄積によって、有用性を見出せる可能性はあろう。
【実施例５】
【００７２】
実施例５の末梢循環癌細胞の検出方法では、免疫染色工程（ステップＳ５）において、抗ＥＭＡ抗体の替わりに、抗Ｋｉ−６７抗体を使用して免疫染色を行った結果について説明する。抗Ｋｉ−６７抗体は、細胞増殖活性細胞を特異的に染色する。症例数は１５例（癌患者と健常者がそれぞれ８名、７名）である。なお、癌患者は、癌の種類に関係なく無作為に選出した。
抗Ｋｉ−６７抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果を、下記の表１９，表２０に示す。なお、表中の用語や指標については、実施例１で説明したものと同じである。【００７３】
【表１９】
0006052756.tif 000020
【００７４】
【表２０】
0006052756.tif 000021
【００７５】
上記表１９に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が６人，陰性（偽陰性）が２人であり、健常者については陽性（偽陽性）が５人，陰性（真陰性）が２人であるという結果となった。
上記表２０に示すように、感度が７５％と高いが、特異度は２９％と低く、感度との相関も認められなかった。そのため、現時点の結果からは、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法、すなわち抗Ｋｉ−６７抗体による免疫染色を使用して判定することは適当でないことがわかったが、更なるデータの蓄積によって、有用性を見出せる可能性はあろう。
【実施例６】
【００７６】
実施例６の末梢循環癌細胞の検出方法では、免疫染色工程（ステップＳ５）において、抗ＥＭＡ抗体の替わりに、抗ＣＤ２０（Ｌ−２６）抗体を使用して免疫染色を行った結果について説明する。抗ＣＤ２０（Ｌ−２６）抗体は、細胞増殖活性細胞を特異的に染色する。症例数は３例（癌患者と健常者がそれぞれ１名、２名）である。なお、癌患者は、多発性骨髄腫の患者を選出した。
抗ＣＤ２０（Ｌ−２６）抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果を、下記の表２１，表２２に示す。なお、表中の用語や指標については、実施例１で説明したものと同じである。【００７７】
【表２１】
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【００７８】
【表２２】
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【００７９】
上記表２１に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が１人，陰性（偽陰性）が０人であり、健常者については陽性（偽陽性）が２人，陰性（真陰性）が０人であるという結果となった。
症例数が不足しているため、上記表２２に示すように、感度が１００％、特異度が０％となった。そのため、現時点の結果からは、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法、すなわち抗ＣＤ２０（Ｌ−２６）抗体による免疫染色を使用して判定することは適当でないことになるが、更なるデータの蓄積によって、有用性を見出せる可能性は十分に残されている。
【実施例７】
【００８０】
実施例７の末梢循環癌細胞の検出方法では、免疫染色工程（ステップＳ５）において、抗ＥＭＡ抗体の替わりに、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を使用して免疫染色を行った結果について説明する。抗ＣＤ４５ＲＯ抗体は、Ｔ細胞リンパ球腫や成熟Ｔ細胞を特異的に染色する。症例数は１３例（癌患者と健常者がそれぞれ１０名、３名）である。なお、癌患者は、癌の種類に関係なく無作為に選出した。
抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を使用して免疫染色を行って得られた結果を、下記の表２３，表２４に示す。なお、表中の用語や指標については、実施例１で説明したものと同じである。【００８１】
【表２３】
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【００８２】
【表２４】
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【００８３】
上記表２３に示すように、癌患者については陽性（真陽性）が１０人，陰性（偽陰性）が０人であり、健常者については陽性（偽陽性）が３人，陰性（真陰性）が０人であるという結果となった。
本実施例も、上記表２４に示すように、感度が１００％、特異度が０％となった。そのため、現時点の結果からは、本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法、すなわち抗ＣＤ４５ＲＯ抗体による免疫染色を使用して判定することは適当でないことになるが、症例数が不足していることも考えられ、更なるデータの蓄積によって、有用性を見出せる可能性は十分に残されている。
【実施例８】
【００８４】
（ベイズの定理を用いたデータ解析について）
本実施例の末梢循環癌細胞の検出方法の検出精度について、データをベイズの定理によって解析した。ベイズの定理を用いる際、有病率は事前確率とし、陽性適中率は事後確率とした。これは、検査前には病気である確率（有病率）だったのが、検査陽性であるとわかった後は、病気である確率（陽性適中率）にまで上昇することを示している。
ここで、データの計算は、下記表２５に示す計算式に従って実施した。表２５中、尤度比は、感度と特異度を組み合わせた指標で、検出精度の指標として用いられるものであり、感度、特異度、尤度比、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線は有病率に依存しないものとした。【００８５】
計算によって得られたＥＭＡ免疫染色による判定、ＣＥＡ免疫染色による判定、ＥＭＡ免疫染色とＣＥＡ免疫染色を同時に用いて判定（ＥＭＡ＋ＣＥＡ）したときの検出精度を下記表２６に示す。
表２６の結果から解るように、感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率、正診率、および尤度比から、ＥＭＡ免疫染色がスクリーニングテストとして最も適当である。【００８６】
【表２５】
0006052756.tif 000026
【００８７】
【表２６】
0006052756.tif 000027
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、健常者には癌の早期発見のためのスクリーニング検査用の検出装置として、癌患者には手術後の再発検査用装置として、また、抗癌剤、放射線治療あるいは癌免疫療法の効果の判定装置として有用である。
【符号の説明】
【００８９】
１    ＥＭＡ陽性細胞
【図１】
0006052756.tif 000028
【図２】
0006052756.tif 000029
【図３】
0006052756.tif 000030
【図４】
0006052756.tif 000031
【図５】
0006052756.tif 000032
【図６】
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