(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清を、β−ガラクトシダーゼと接触させる工程およびシアリダーゼと接触させる工程を含んでなる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物の製造方法。
【請求項２】
ヒト血清をβ−ガラクトシダーゼと接触させる工程と、ヒト血清をシアリダーゼと接触させる工程が同一の工程である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の製造方法により得られる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる、抗癌用または抗感染症用である医薬組成物。
【請求項４】
ヒト血清が、健康な他人から採取した血液から調製されたものである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
ヒト血清が癌患者または感染症患者から採取した血液から調製されたものであって、かつ、医薬組成物が血液を採取した該患者への投与用である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
１回の投与用として、０．１〜２．０ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および感染症などの疾病の治療や予防に有用な、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージは体内の老廃物の処理や、微生物、ウイルスなどの病原体や腫瘍細胞に対する防御機能を担っている。また、Ｔ細胞への抗原の提示とインターロイキン１の産生を介し、細胞性免疫のエフェクターとしての機能も有している。したがって、癌や感染症などの治療や予防にはマクロファージを活性化させることが重要であり、マクロファージの活性化により、癌や感染症の治療や予防を行うことが可能である。【０００３】
マクロファージを活性化する因子としては、例えばインターフェロンが挙げられ、その臨床応用も試みられている。また、ある種の多糖類が免疫賦活活性を有することが知られており、これらの一部は抗ウイルス剤や抗ガン剤としての開発が期待されるものである（特許文献１または２）。【０００４】
また、癌は、イニシエーション（第１段階、不死化）、プロモーション（第２段階、増殖）、プログレッション（第３段階、転移および浸潤）の過程を経て進展するが、このうち、プログレッションの段階において、血管新生が関与している。したがって、血管新生を阻害することにより、癌の転移・浸潤を抑制することができ、そのような効果を奏する薬剤は、癌転移の抑制薬や予防薬として有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−０９７６９５号公報
【特許文献２】特公平０６−０９９３１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌および感染症などの疾病の治療や予防に有用な、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物およびその製造方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ヒト血清を特定の酵素、すなわち、β−ガラクトシダーゼ、または、β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと接触させ、酵素処理すると、優れたマクロファージ活性化作用および／または血管新生阻害作用を示すことを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］ヒト血清を、β−ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物の製造方法、
［２］ヒト血清を、シアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、上記［１］記載の製造方法、
［３］上記［１］または［２］記載の製造方法により得られる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物、
［４］ヒト血清が、健康な他人から採取した血液から調製されたものである、上記［３］記載の医薬組成物、
［５］医薬組成物が抗癌用または抗感染症用である、上記［３］または［４］記載の医薬組成物、
［６］ヒト血清が癌患者または感染症患者から採取した血液から調製されたものであって、かつ、医薬組成物が血液を採取した該患者に投与されるものである、上記［５］記載の医薬組成物、
［７］１回の投与用として、０．１〜０．４ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む、上記［３］〜［６］のいずれか一つに記載の医薬組成物、
に関する。【０００９】
前記製造方法は、ヒト血清をシアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなるものであることが好ましい。【００１０】
前記ヒト血清は、健康な他人から採取した血液から調製されたものであることが好ましい。【００１１】
前記医薬組成物は、抗癌用または抗感染症用であることが好ましい。【００１２】
前記ヒト血清は、癌患者または感染症患者から採取した血液から調製されたものであることが好ましい。【００１３】
医薬組成物は、血液を採取した患者に投与されるものであることが好ましい。【００１４】
前記医薬組成物は、１回の投与用として、０．１〜０．４ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含むものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物は、優れたマクロファージ活性化作用および／または血管新生阻害作用を有するので、癌や感染症などの疾病の治療や予防に有用であり、抗癌剤、抗感染症剤（抗ウイルス剤）などとして用いることができる。また、血管新生阻害作用を有することから、癌の転移の抑制剤や予防剤として用いることもできる。【００１６】
また、本発明の医薬組成物は、患者自身の血清を用いて調製することができるため、この場合には、他人の血清を用いることによる免疫応答に係る副作用リスクや未知の感染症に対する感染リスクを排除することができる。
さらに、本発明に係るヒト血清酵素処理物は、ヒト血清をβ−ガラクトシダーゼ、または、β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼで処理することによって調製できるため、これを含んでなる本発明の医薬組成物の製造方法は、簡便かつ低コストであるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】貪食能を評価するためギムザ染色したマクロファージを示す図面代用写真である。
【図２】本発明に係る検体の、０．５％オプソニン化ＳＲＢＣを用いたマクロファージ貪食能活性についての結果を示すグラフである。
【図３】比較検体の、０．５％オプソニン化ＳＲＢＣを用いたマクロファージ貪食能活性についての結果を示すグラフである。
【図４】Ａは受精卵の卵殻の気室上方部と側部の２ヶ所に、錐で穴をあけた状態を示す図面代用写真であり、Ｂは受精卵の卵殻膜の一部を、先の尖ったピンセットを用いて取り除いている状態を示す図面代用写真である。
【図５】受精卵に各検体を投与している状態を示す図面代用写真である。
【図６】エールリッヒ腹水癌担癌マウスを用いた抗腫瘍活性試験における、マウスの体重変化（癌細胞移植後の体重変化）の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明で使用する血清は、ヒトから採取された血液から調製されたものであれば、特に限定はなくいずれのものをも使用することができ、かかる血清は常法により調製することができる。血清については、他人の血清を用いることによる免疫応答に係る副作用リスクや未知の感染症に対する感染リスクを考慮すれば、本発明の抗癌用または抗感染症用医薬組成物が投与される患者自身の血液から調製されたものが好ましい。あるいは、血清は、癌および／または感染症などの疾病による悪影響を未だ受けていない血液を原料として使用することによる有利な効果を期待するとの観点からは、健康な他人の血液から調製されたものが好ましい。本明細書において、「健康な他人」とは、治療を受ける本人以外であって、癌および／または感染症などの疾病に罹患していない人をいう。
【００１９】
本発明で使用するβ−ガラクトシダーゼは、特に限定なく、周知のいずれの種類のものも使用することができる。そのようなものとしては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの、ウシ肝臓（bovine liver）由来のものなどがあげられる。市販されたものとしては、例えば、和光純薬工業（株）のカタログＮｏ．０７２−０４１４１、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社のＧ１８７５などが挙げられる。
本発明において、β−ガラクトシダーゼは、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本発明で使用するシアリダーゼは、特に限定なく、周知のいずれの種類のものも使用することができる。そのようなものとしては、例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringenes）由来のもの、レンサ球菌（Streptococcus 6646K）由来のもの、コレラ菌（Vibrio cholerae）由来のもの、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のものなどがあげられる。市販されたものとしては、例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品番号（Sigma Prod. Nos.）Ｎ２８７６、Ｎ２１３３、Ｎ２９０４、Ｎ３００１、Ｎ５６３１、生化学バイオビジネス社のコード番号（Code Number）１２００５２、ＢｉｏＬａｂｓ社のカタログ番号（Catalog#）Ｐ０７２０Ｌ、Ｐ０７２０Ｓなどがあげられる。
本発明において、シアリダーゼは、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
本発明において、ヒト血清と、β−ガラクトシダーゼ若しくはシアリダーゼとの接触（酵素処理）は、それぞれ、十分な量の酵素を用いて十分な時間接触させることにより、それ以上実質的に酵素反応が進行しない程度まで行うのが好ましい。このような目的には、酵素の種類にもよるが、例えば、β−ガラクトシダーゼとして和光純薬工業（株）のカタログＮｏ．０７２−０４１４１を用いる場合、ヒト血清１００μｌに対して、酵素を６５ｍＵ使用すれば十分である。また、例えば、シアリダーゼとしてＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品番号（Ｎ２８７６）を用いる場合、ヒト血清１００μｌに対して、酵素を６５ｍＵ使用すれば十分である。この場合の酵素処理の時間としては、３時間行えば十分である。
【００２２】
酵素処理は、任意の容器中で、これら酵素を、ヒト血清に添加して実施することができるが、所望により、ヒト血清中の総タンパク質濃度を調整するために、この分野で通常用いられる緩衝液を加えてもよい。そのような緩衝液としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＳＰＢ）、リンゲル液などが挙げられる。
酵素処理の温度は、酵素が活性を示す温度であれば特に限定はないが、通常酵素が高い活性を示す３７℃付近の温度である。
【００２３】
酵素処理は、加熱（熱処理）により、酵素を失活させることにより終了する。かかる熱処理は、酵素を失活させることができる限り特に限定されないが、例えば、６０℃付近の温度で、約１０分間加熱することにより、実施することができる。
熱処理後の検体は、所望により、濃縮してもよい。当該濃縮は、市販の機器、例えば遠心濃縮器（例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製の１００００ＭＷＣＯ  ＹＭ−１０）を用いて行うことができる。
【００２４】
また、酵素処理は、固相に固定した酵素（固定化酵素）を用いて行うこともできる。酵素を固相に固定させる方法は、当業者に知られており、例えば、β−ガラクトシダーゼおよび／またはシアリダーゼを、シアンブロマイドの如きカップリング剤により、アガロースビーズに固定することができる。そのような固定化酵素としては、例えば、イモビライズド  β−ガラクトシダーゼ  Ｇ３Ｍ（Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ社、＃Ａ３１０２）、ノイラミニダーゼアガロース  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ウェルシュ菌）由来（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、製品番号（Product Number)：Ｎ５２５４）などが市販されている。固定化酵素を用いる利点は、酵素処理後、酵素を熱処理により失活させることなく回収することが可能なこと、および、そのような回収により夾雑物（熱処理により失活した酵素などのタンパク質等）の存在を減じることができることである。
【００２５】
このようにして得られる本発明のヒト血清酵素処理物は、そのまま医薬組成物として使用することができるが、さらに、適宜、薬学的に許容しうる担体を配合してもよい。このような薬学的に許容し得る担体としては、この分野で通常用いられるものをいずれも好適に使用することができ、そのような具体例として、例えば、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤等が挙げられる。
【００２６】
本発明の医薬組成物の剤型は特に制限されないが、注射剤が好ましい。注射剤は、本発明のヒト血清酵素処理物に、必要に応じて、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤等を添加することによって製造することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは筋肉内注射である。
【００２７】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、投与方法などにより異なるが、典型的な例としては、例えば、本医薬組成物に含まれるタンパク質の総量として、１回の投与あたり、体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇ〜約０．４ｍｇ、好ましくは約０．２ｍｇ〜約２．０ｍｇ、さらに好ましくは約０．３ｍｇ〜約１．３ｍｇの範囲にあるのがよい。なお、本明細書において、タンパク質の量は、波長５７０ｎｍでの吸光度により決定したタンパク質濃度をもとに、算定するものである。
【００２８】
本発明の医薬組成物を、上記の如き１回あたりの投与量で投与する場合の、典型的な投与間隔および投与回数としては、週１〜２回の投与間隔で、全１２〜２４回投与することが挙げられる。また、投与方法としては、典型的には、投与初期（例えば、１〜２ヶ月間）に週２回投与し、その後週１回投与することが好ましい。なお、投与量および投与間隔は、医薬組成物中に含まれるタンパク質の総量を指標として、投与されるタンパク質の総量が同等となるような範囲内で、適宜変更することができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物はマクロファージ活性化作用および／または血管新生阻害作用を有する。したがって、本発明の医薬組成物は、これら作用によって治療または予防しうる疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。このような疾患としては、癌や感染症があげられる。
【００３０】
癌としては、癌腫（carcinoma）、肉腫（sarcoma）、その他の悪性腫瘍（malignant tumor）のいずれをも含むものであり、例えば、皮膚癌、気管支癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、舌癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵臓癌、腎臓癌、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、ウィルムス腫瘍、悪性黒色腫、髄膜腫、神経芽腫、骨肉腫、カポジ肉腫、リンパ腫、白血病などが挙げられる。なお、本明細書において、用語「癌」は、これら悪性腫瘍の他、その転移をも含むものである。
【００３１】
また、感染症としては、例えば、ウイルス感染症が挙げられ、具体的には、ＨＩＶ感染症、エイズなどが挙げられる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、他の抗癌剤や抗感染症剤とともに併用することができる。併用する場合には、当該他の薬剤の効能、効果、投与量を考慮の上、本発明の医薬組成物の投与量を適宜調節する。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、他人（例えば、健康な人）から採取した血液を用いて調製し、患者に投与することも、あるいは、患者自身から採取した血液を用いて調製し、当該患者自身に投与することもできる。前者の場合であって、健康な他人から血液を採取する場合、癌や感染症などの疾病による悪影響を未だ受けていない血液を使用することによる有利な効果を期待することができる。一方、後者の場合には、他人の血液を用いることによる免疫応答に係る副作用リスクや未知の感染症に対する感染リスクを排除することができる。
【実施例】
【００３４】
実施例にもとづいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。【００３５】
１．ヒト血清酵素処理物の調製
（検体１）
患者（属性：男性、６３歳、家族性高コレステロール血症）から血液５０ｍｌを、真空採血管に採取した。該血液を遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間）して、血球成分を分離し、血清を得た。
該血清１００μｌをエッペンチューブにとり、β−ガラクトシダーゼ（和光純薬工業（株）製、カタログＮｏ．０７２−０４１４１，１０ｍＵ／μｌ）６．５μｌ、シアリダーゼ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製，Ｎ２８７６，１０ｍＵ／μｌ）６．５μｌ、および１００ｍＭＳＰＢ（１５．６０１ｇのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏおよび３５．８１４ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを、５００ｍｌの蒸留水に溶解して、２００ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）を調製し、これを希釈して、１００ｍＭ  ＳＰＢとした。）８７μｌを加え、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１００ｍＭＳＰＢをさらに２００μｌ加え、６０℃で１０分間、熱処理した。熱処理後、マイクロコン（１００００ＭＷＣＯ  ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）で濃縮し、タンパク質濃度を、波長５７０ｎｍでの吸光度測定により決定したところ（ＢＳＡ（bovine serum albumin、ＳＩＧＭＡ，Ａ４５０３）について作成した検量線を使用）、７９．４μｇ／μｌであった（検体１）。【００３６】
かかる検体１を、１００ｍＭＳＰＢを用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、０．１ｎｇ／１０μｌ（検体１−１）、１ｎｇ／１０μｌ（検体１−２）、１０ｎｇ／１０μｌ（検体１−３）、１００ｎｇ／１０μｌ（検体１−４）、１μｇ／１０μｌ（検体１−５）、１０μｇ／１０μｌ（検体１−６）である各検体を調製した。【００３７】
また、かかる検体１を、１％メチルセルロースを含む生理食塩水（ここで、生理食塩水とは、０．９％ＮａＣｌ溶液をいう。）を用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、０．１ｎｇ／１０μｌ（検体１−７）、１ｎｇ／１０μｌ（検体１−８）、１０ｎｇ／１０μｌ（検体１−９）、１００ｎｇ／１０μｌ（検体１−１０）である各検体を調製した。【００３８】
（検体２）
患者（属性：男性、６３歳、家族性高コレステロール血症）から血液を採取し、上記検体１の調製と同様に処理して、検体２（タンパク質濃度：１３７．９６μｇ／μｌ）を得た。【００３９】
（比較検体１）
検体１の調製に際し、酵素処理する前の血清について、タンパク質濃度を同様に決定したところ、１３４．１μｇ／μｌであった（比較検体１）。該比較検体１を、１００ｍＭＳＰＢを用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、０．１ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−１）、１ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−２）、１０ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−３）、１００ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−４）、１μｇ／１０μｌ（比較検体１−５）、１０μｇ／１０μｌ（比較検体１−６）である各検体を調製した。【００４０】
また、かかる比較検体１を、１％メチルセルロースを含む生理食塩水を用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、０．１ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−７）、１ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−８）、１０ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−９）、１００ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−１０）である各検体を調製した。【００４１】
（比較検体２）
さらに、ＴＸ−１９３４（２−［（４−メトキシ−３，５−ジメチルフェニル）メチレン］−４−シクロペンテン−１，３−ジオン）を、（ＤＭＳＯ）：（生理食塩水）：（２％メチルセルロースを含む生理食塩水）＝１：９：１０の割合で混合した溶媒に溶解して、１０μｇ／１０μｌの濃度とし、これを、比較検体２とした。該比較検体２は、血管新生阻害作用の観察において、ポジティブコントロールとして用いた。【００４２】
２．マクロファージ貪食能活性
マウス（８週齢、ＩＣＲ系雌性、日本エスエルシー）を頸椎脱臼し、腹部の外皮を剥ぎ、内臓を傷つけないようにして、腹腔にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．９％のＮａＣｌおよび５単位／ｍｌのヘパリンを含有する）を１０  ｍｌを注入した。腹部を１分程度タッピングした後、腹腔液を回収し、腹膜細胞を収集した。回収した腹腔液を遠心（１０００ｒｐｍ，４℃，１５分）した後、上清を破棄しＲＰＭＩ培地を加え、ピペッティングした。Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ型血球計算盤で細胞数を計測し、１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、さらにＲＰＭＩ培地を加えて調整した。なお、ＲＰＭＩ培地は以下の操作にて調製した。すなわち、クリーンベンチ内で、粉末培地（ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号：８５６８４６）を精製水９００ｍｌに溶解した後、さらに２ｇのＮａＨＣＯ3を溶解した。混合物を、１ＮＨＣｌでｐＨ７．２に調整した後、精製水を用いて全量を１０００ｍｌとした。こうして得た溶液をフィルター(ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＳＬＧＶＪ１３ＳＬ)にて濾過したものをＲＰＭＩ培地とし、使用時まで、４℃で保管した。【００４３】
滅菌したカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ，ｍｉｃｒｏ  ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ，Ｎｏ．１）を各ウェル毎に３枚づつ入れた２４穴プレート（ＴＰＰ，９２０２４）に、上記で得たマクロファージ溶液を、５００μｌ／ｗｅｌｌ（５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）分注し、各ウェルにさらにＲＰＭＩ培地５００μｌ／ｗｅｌｌを加え、全体として１ｍｌ／ｗｅｌｌになるようにした。かかるプレートを、３７℃で、１時間インキュベーションした後、各ウェル内の液を破棄し、ＲＰＭＩ培地１ｍｌで、各ウェルを２回洗浄した。洗浄後、さらにＲＰＭＩ培地１ｍｌを各ウェルに加え、３７℃で、１５時間インキュベートした。【００４４】
インキュベート後、各ウェルに、上記で調製した検体１−１〜１−６、および、比較検体１−１〜１−６を、それぞれ１０μｌ加えた。３７℃で、３時間インキュベートして、マクロファージを刺激した。インキュベート後、各ウェルの溶液部分を破棄し、０．５％オプソニン化ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球，日本生物材料センター）１ｍｌを加え、３７℃で、９０分間インキュベートし、マクロファージに貪食させた。貪食後、順次１／５×ＰＢＳ，１×ＰＢＳ，１×ＰＢＳを用いて、カバーガラスを洗浄し、約３０分間風乾させた。風乾後、各カバーガラスを、メタノール（関東化学，２５１８３−２Ｂ）に１分程度浸し、メタノール固定した。該固定後、再び約３０分間風乾し、ＰＢＳで２０倍希釈したギムザ液（ＳＩＧＭＡ，Ａ１３２７）で、１時間染色した。染色後、水道水でカバーガラスの裏側から洗浄し、一晩風乾した。【００４５】
風乾後、スライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ，ｍｉｃｒｏ  ｓｌｉｄｅ  ｇｌａｓｓ，Ｓ２２１５）にカバーガラスを裏返して貼り付けた。光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ２００）にてカバーガラス１枚につき９点写真を撮り、観察される全マクロファージ数、貪食されたＳＲＢＣ数、貪食したマクロファージ数をカウントし、９点分の計測値を合計し、計測された全マクロファージのうちＳＲＢＣを貪食したマクロファージの割合に、１つのマクロファージの平均貪食数を掛けたものを摂食指数（ingestion index）として算出した。図１にギムザ染色後の写真を示す。ギムザ染色によってマクロファージは紫色の球体として、ＳＲＢＣは透明の球体として観察されている。マクロファージに接触しているＳＲＢＣを貪食されたＳＲＢＣ、ＳＲＢＣに接触しているマクロファージを貪食したマクロファージとして、摂食指数を算出した。【００４６】
各検体について、それぞれのカバーガラスごとに、３つの摂食指数を算出し、その平均値を求めた。コントロールとして、検体若しくは比較検体の代わりにＲＰＭＩ培地を用いて、上記と同様の操作を行った。【００４７】
結果を表１および表２（オプソニン化ＳＲＢＣを用いた、マウス腹腔マクロファージ貪食能活性）並びに図２および図３に示す。【００４８】
【表１】
0005860817.tif 000002
【００４９】
【表２】
0005860817.tif 000003
【００５０】
３．血管新生阻害作用（漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ）
（１日目）プレインキュベーション
孵卵０日目の鶏受精卵を、鶏卵台の上に尖った方を下に向けて置き、孵卵器で孵卵させながら３７．６℃で４日間、プレインキュベーションした。器内の底部にＳＤＷ（滅菌水）を満たしたバットを置き、湿度を保った。【００５１】
（５日目）試薬（ヒト血清酵素処理物）添加準備
４日間培養した受精卵を、鶏卵台に載せたまま孵卵器から取り出し、受精卵を７０％エタノール綿で消毒後、卵殻の気室上方部と側部の２ヶ所に、錐で穴をあけた（図４Ａ）。鶏卵側部の穴から約４ｍｌの卵白を注射器（１０ｍｌ，１８Ｇ）の針の穴を卵殻の方に向けた状態で吸引除去した。次に気室上方部の穴にシリコンスポイトをあてて吸引し、卵殻膜から卵黄のうや胚を剥離した。鶏卵側部の穴をテガタームでシールした。シールした受精卵は、クリーンベンチに移動させ、気室上方部の穴の周りの卵殻を、先の曲がったピンセットで除去し、直径１ｃｍ程度に広げて卵殻膜を露出させた。この露出した卵殻膜の一部を、先の尖ったピンセットを用いて取り除いた（図４Ｂ）。気室上方部にステンレス製のキャップをかぶせ、３９℃で湿度を保ったインキュベーターで２４時間、インキュベーションした。【００５２】
（６日目）試薬添加
インキュベーターから受精卵を取り出し、クリーンベンチ内に移動させた。ステンレス製のキャップを取り、ＣＡＭを３段階でサイズ分けした（１：直径５ｍｍ以上，２：直径３ｍｍ以上〜５ｍｍ未満，３：直径３ｍｍ未満）。異なる検体を添加する各群間において、ＣＡＭの大きさがほぼ平等になるように分け、いずれの検体を添加するのかわかるよう、ラベリングして並べた。このときコントロール群には、最も成長のよいものを選んだ。
シリコンリングをＣＡＭのほぼ中心に乗せ、各検体をシリコンリングの中央に１０μｌ添加した（図５）。なお、コントロールとして、（ＤＭＳＯ）：（生理食塩水）：（２％メチルセルロースを含む生理食塩水）＝１：９：１０の割合で混合した溶媒を１０μｌ添加した。再びステンレス製のキャップを被せ、インキュベーターに戻した。【００５３】
（７日目）リング位置確認
インキュベーターから受精卵を取り出し、クリーンベンチ内に移動させた。ステンレス製のキャップを取り、リングがＣＡＭの上に乗っているかを確認し、リングが移動している場合は、先の尖ったピンセットを用いて、ＣＡＭの上にスライドさせた。その後、再びステンレス製のキャップを被せ、インキュベーターに戻した。そして、インキュベーターの温度を３９．５℃に変え、インキュベートした。【００５４】
（８日目）判定
インキュベーターから受精卵を取り出し、プラッテの上に置いた。ハサミを用いて殻を取り除き窓を広げ、ＣＡＭを観察しやすいようにした。このとき、卵殻膜が残っていた場合は、血管を傷つけないように先の尖ったピンセットで剥した。シリンジ（１ｍｌ，２７Ｇ）に、イントラリポス輸液（大塚製薬（株）製、承認番号２２０００ＡＭＸ００２８４）約１ｍｌをとり、空気が入らないように注意しながら、ＣＡＭ上の血管の少ない部分に針を刺して、ゆっくり注入した。このときイントラリポスが漏れたり、流血したりしたときはキムワイプを用いてふき取った。
各卵についての血管新生阻害効果を表３の判断基準に基づき判定した。【００５５】
【表３】
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【００５６】
各卵について得たポイントをもとに、数式（１）
【数１】
0005860817.tif 000005
により、各検体についてのポイントを算出し、こうして得た各検体についてのポイントをもとに、数式（２）
【数２】
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により、血管新生阻害指数を算出し、血管新生阻害作用を評価した。結果を表４および表５に示す。【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
４．抗腫瘍活性（エールリッヒ腹水癌担癌マウス）
１群５匹のＩＣＲマウス（１０週齢、メス）に、エールリッヒ腹水癌細胞（細胞起しから、in vivoで、２代継代培養したもの）を腹腔内移植した（１×１０7cell／マウス）。移植翌日から、１日１回７日間、各マウスに、検体２を含む生理食塩水０．１ｍｌ／マウスを腹腔内投与した。検体２の投与量は、投与したタンパク質量の総量が、１１．２５μｌ／ｋｇとなるようにそれぞれ調節した。なお、検体２を含む生理食塩水は、７回投与分を一度にまとめて調製後、０．２２μｍの滅菌フィルターに通し、４℃、遮光条件下で保存したものを使用した。コントロールとして、検体２を含む生理食塩水に代えて、等量（０．１ｍｌ／マウス）の生理食塩水を投与した。【００６０】
癌細胞移植後、１５日間（いずれの投与群にも、死亡・脱落が発生しなかった期間）にわたりマウスの体重変化を観察するとともに、その後引き続き、生死確認を行った。結果を表６および図６（体重は各群についての平均値である。バーは標準偏差を表す。）に示す。【００６１】
【表６】
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【００６２】
上記結果について、GraphPad Software社のPrism5.04（デモ版）を用いて，Log-rank(Mantel-Cox) Test および Gehan-Breslow-Wilcoxon Test にて有意差検定を行ったところ、検体２投与群は、コントロール群に対し、生存率を有意に高めた（Ｐ＜０．０１）。【００６３】
また、図６の結果から、検体２投与群では、コントロール群に比べて、体重増加が抑制されていることがわかる。これは、検体投与群で、エールリッヒ腹水癌細胞の増殖が抑えられたためである。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物は、優れたマクロファージ活性化作用および／または血管新生阻害作用を有するので、癌や感染症などの疾病の治療剤や予防剤として、癌転移の抑制剤や予防剤として有用である。
【符号の説明】
【００６５】
１  貪食しているマクロファージ
２  貪食されているＳＲＢＣ
３  マクロファージ
４  漿尿膜（ＣＡＭ）
５  シリコンリング
６  胎児
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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