(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0006013354.tif 000044
の活性成分及びポリエチレングリコールとポリ乳酸のコポリマーのコンジュゲートであって、
式中、
−ｍＰＥＧはメトキシ−ポリエチレングリコールであり；
−ＰＬＡはポリ乳酸であり；
−ｍはポリエチレングリコール断片（ｍＰＥＧ）の平均分子量であり、１００から１５０００（Ｄａで表示）の範囲であり；
−ｎはポリ乳酸断片の平均分子量であり、１０００から５００００（Ｄａで表示）の範囲であり；
−ＡＰは活性成分残基であり；
−Ｌはリンカーであり；
−Ｘは水素原子、または場合によりハロゲン原子、ＯＲ、ＣＮ、ＣＦ3、ＮＲＲ'及びＣＯＯＲ基から選択される１個以上の置換基で置換されているアルキル基であり、Ｒ及びＲ'は同一または相互に異なっており、水素原子またはアルキル基である
コンジュゲート、及びその医薬的に許容され得る塩。
【請求項２】
ＡＰ残基は該ＡＰ中に存在しているＯＨ基によりＬに結合している、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
ＡＰはタキソイドである、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
タキソイドはパクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル及びラロタキセルから選択される、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
活性成分は２'位にグラフトされているカバジタキセルである、請求項１から４のいず
れか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ＰＬＡは、場合により残存している遊離ヒドロキシル末端において保護基を表す、請求項１から５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
式（Ｉａ）：
【化２】
0006013354.tif 000045
に相当し、式中、Ｌ、ＡＰ及びＸは請求項１から６のいずれか１項に定義されている通りであり並びにｐは１から３４０の範囲であり、並びにｑは１０から７００の範囲である
請求項１から６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
式（Ｉｂ）：
【化３】
0006013354.tif 000046
に相当し、式中、Ｌ及びＡＰは請求項１から６のいずれか１項に定義されている通りであり並びにｐは１から３４０の範囲であり、並びにｑは１０から７００の範囲である
請求項１から７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｌはコハク酸、グルタル酸またはジグリコール酸のジカルボキシレート誘導体を表す、請求項１から８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載のコンジュゲートの製造方法であって、式（ＩＩＩ）：
【化４】
0006013354.tif 000047
の化合物を式：
ＡＰ−Ｌ−Ｈ
に相当する活性成分の誘導体とカップリングすることを含み、式中、ｍＰＥＧ、ｍ、ＰＬＡ、ｎ、Ｘ、ＡＰは請求項１から９のいずれか１項に定義され、Ｌは、ｍＰＥＧ／ＰＬＡ
コポリマーに結合する末端に酸素原子およびＡＰに結合する他方の末端にカルボン酸基を有するＣ１〜Ｃ１０のアルキル鎖であり、このアルキル鎖は、場合により−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−から選択される１個以上の原子または基により中断されていてもよいものである、上記方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含むナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１３】
癌の治療及び／または予防において使用するための、請求項１から９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分、特にタキソイドのポリマーコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、タキソイドの水溶性は通常非常に低い。よって、タキソールは過敏症、腎毒性、心臓毒性や神経毒性のような重大な副作用を引き起こすアルコールとクレモホールの混合物中に処方されている。代替製剤が求められている。特に、代替の有効な投与形態を提供する目的でポリマーを主成分とする水溶性製剤、例えばミクロスフェア、ナノ粒子及びミセルが探求されている（Ｇａｕｃｈｅｒら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（２０１０），２−１２）。
【０００３】
ナノメトリックサイズの粒子は、その小さなサイズにより該粒子が腫瘍組織に達し得、親水性コロナを含むその構造により体循環時間を延長することができる点で特に有利である。
【０００４】
よって、ＵＳ特許５，７６６，６３５は、ポリエチレングリコールとポリ乳酸のコポリマーから製剤される活性成分のナノ粒子を記載しており、前記ナノ粒子は単純な沈殿により形成されている。しかしながら、こうして形成されるナノ粒子は活性成分を単に物理的にカプセル化して生じる。
【０００５】
更に、Ｎｅｄｅｒｂｅｒｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９，１０，１４６０−１４６８は、パクリタキセル及びポリエチレングリコールとポリ乳酸のＹコポリマーを含むミセルを記載している。しかしながら、ここでも、得られるミセルはパクリタキセルを前記の修飾したＰＥＧ−ＰＬＡコポリマーで単に物理的にカプセル化して生じる。
【０００６】
しかしながら、このタイプのカプセル化は、カプセル化を不十分にしかコントロールされず、通常活性成分が沈殿するリスクが高いという欠点を示す。更に、ナノカプセル化により、コントロールが困難であり、拡散及び生物分解次第となる放出が生ずる。
【０００７】
従って、これらの欠点がない別のタイプのナノ粒子が望ましい。よって、活性成分と（コ）ポリマーの共有結合性コンジュゲーションが提案された。
【０００８】
これは、共有結合性カプセル化での製剤化により、特に化学量論的カプセル化、活性成分の限定された沈殿及び／またはコントロールされた放出が可能となることが望ましいためである。
【０００９】
ＷＯ  ９９／１７８０４は、カンプトテシン及びメタクリロイル−グリシン−アミノアシル誘導体の共有結合性コンジュゲーションにより生ずるポリマーカンプトテシン誘導体を記載している。
【００１０】
しかしながら、この特許出願はカンプトテシン誘導体に限定されている。
【００１１】
ポリマーとタキソイドの共有結合性コンジュゲートも提供されている。例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６（２００５），２１２１−２１２８は、水性媒体中でミセルを形成するジグリコール酸リンカーを介するパクリタキセルとモノメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリラクチド（ＭＰＥＧ−ＰＬＡ）のコンジュゲートを提供している。しかしながら、ＰＬＡの末端に結合している活性成分がこうして形成されたミセルの疎水性領域に捕捉されており、実際殆ど接近不可能である。
【００１２】
Ｃｈｅｎｇら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００８，４７，４８３０も、活性成分が殆ど接近不可能な疎水性領域中のＰＬＡ末端にグラフトされているナノ粒子を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，７６６，６３５号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／１７８０４号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｇａｕｃｈｅｒら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（２０１０），２−１２
【非特許文献２】Ｎｅｄｅｒｂｅｒｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９，１０，１４６０−１４６８
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６（２００５），２１２１−２１２８
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００８，４７，４８３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
よって、化学量論的カプセル化及び活性成分の限定された沈殿を可能にする共有結合性カプセル化を用いてこのタイプの製剤中の（コ）ポリマーからの活性成分の放出のコントロールを改善することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、（コ）ポリマーと活性成分の間にリンカーを導入することによりコンジュゲーションと称される共有結合性カプセル化を行うことにより、加水分解のための活性成分の接近可能性を大きく改善することにより、この技術的問題に対して答えることを提案する。
【００１７】
よって、本発明者らは、上記した要件を満たすポリエチレングリコールとポリ乳酸の官能化コポリマーを見出した。
【００１８】
よって、第１の主題によれば、本発明は、式（Ｉ）：
【００１９】
【化１】
0006013354.tif 000002
の活性成分及びポリエチレングリコールとポリ乳酸のコポリマーのコンジュゲート及びその医薬的に許容され得る塩に関する。上記式（Ｉ）中、
−ｍＰＥＧはメトキシ−ポリエチレングリコールであり、
−ＰＬＡはポリ乳酸であり、
−ｍはポリエチレングリコール断片（ｍＰＥＧ）の平均分子量であり、１００から１５０００（Ｄａで表示）、特に１００〜１００００、より特に１０００から５０００の範囲であり、例えば約２０００であり、
−ｎはポリ乳酸断片の平均分子量であり、１０００から５００００（Ｄａで表示）、より特に３０００から２００００、更により特に５０００から２００００の範囲から選択され、例えば約１００００または１４０００であり、
−ＡＰは好ましくはタキソイドから選択される活性成分残基であり、
−Ｌはリンカーであり、
−Ｘは水素原子、または場合によりハロゲン原子、或いはＯＲ、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲＲ’またはＣＯＯＲ基から選択される１個以上の置換基で置換されているアルキル基であり、ここでＲ及びＲ’は同一であるかまたは相互に異なっており、水素原子またはアルキル基である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に従って得たナノ粒子の透過型電子顕微鏡により得た像を表す。
【図２】Ｔ  ０及びＴ  ＋３週でのＤＬＳ（動的光散乱）測定によるナノ粒子のサイズの分布を表す。
【図３】ラット血漿中のカバジタキセルコンジュゲートナノ粒子製剤（すなわち、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−カバジタキセル、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−グルタリル−カバジタキセル及びＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−ジグリコリル−カバジタキセル）のインビトロプロフィールを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
用語「平均分子量」は重量平均分子量を指す。
【００２２】
通常、ＡＰ残基は、ＡＰ中に存在しているＯＨ基によりＬに結合している。
【００２３】
好ましくは、ＰＬＡは、場合により残存している遊離ヒドロキシル末端において保護基、例えばＣ（＝Ｏ）ＣＨ３基のようなＣ（＝Ｏ）アルキル基を呈する。
【００２４】
好ましくは、Ｘはメチル基である。
【００２５】
（ｍＰＥＧ）ｍ基は、式：
【００２６】
【化２】
0006013354.tif 000003
（式中、ｐはコポリマー中のエチレンオキシド単位の平均数を表す）
で表され得る。通常、ｐは１から３４０、例えば約２０から１１０の範囲である。
【００２７】
（ＰＬＡ）ｎ基は、式：
【００２８】
【化３】
0006013354.tif 000004
（式中、ｑはコポリマー中の乳酸単位の平均数を表す）
で表され得る。通常、ｑは１０から７００、例えば約４０から３００の範囲である。
【００２９】
本発明に従うコンジュゲートにより、ポリマーの鎖あたり１から５０％、通常最高１５％ｗ／ｗ、特に約５〜６％の活性成分の化学量論的カプセル化が可能になり、水性相中の活性成分の少ない沈殿及びリンカーによる活性成分のコントロールされた放出を示す。更に、ｍＰＥＧ／ＰＬＡコポリマーの特別のＹ構造のために、活性成分は疎水性／親水性界面に存在し、よって特異的及び非特異的加水分解に接近可能であり、疎水性コア中に位置している活性成分と比較して放出をコントロールすることができる。
【００３０】
上記した式（Ｉ）において、ＡＰはタキソイドから選択され得る。このタキソイドは特にパクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル及びラロタキセルから選択され、例えば式：
【００３１】
【化４】
0006013354.tif 000005
を有している。
【００３２】
通常、タキソイドの場合、ＯＨ基はタキソイドの側鎖の２’位または７位に存在している。
【００３３】
より特に、活性成分は２’位でグラフトされているカバジタキセルである。
【００３４】
特に、よって、式（Ｉ）の化合物は式：
【００３５】
【化５】
0006013354.tif 000006
を有する。
【００３６】
用語「リンカー」は、１から１０個の炭素原子を含み、ｍＰＥＧ／ＰＬＡコポリマーに結合しているその末端に酸素原子、ＡＰに結合しているその末端の他方に活性成分中に存在しているヒドロキシル基と反応する基、例えばカルボン酸基を有するアルキル鎖を意味すると理解される。このアルキル鎖は、場合により−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−から選択される１個以上の原子または基により中断されていてもよい。リンカーは、特にコハク酸、グルタル酸またはジグリコール酸のジカルボキシレート誘導体から選択され得る。特に、コハク酸、グルタル酸及びジグリコール酸のジカルボキシレート誘導体、より好ましくはコハク酸のジカルボキシレート誘導体を挙げることができる。
【００３７】
好ましくは、式（Ｉ）のコンジュゲートは、式（Ｉａ）：
（式中、ＡＰ、Ｘ、Ｌ、ｐ及びｑは上に定義した通りである）
【００３８】
【化６】
0006013354.tif 000007
に相当する。
【００３９】
より特に、式（Ｉ）の化合物は、次式（Ｉｂ）：
【００４０】
【化７】
0006013354.tif 000008
（式中、ＡＰ、Ｌ、ｐ及びｑは上に定義した通りである）
に相当する。
【００４１】
特定実施形態によれば、本発明に従うコンジュゲートは上記式（Ｉｂ）（式中、Ｌはコハク酸、グルタル酸またはジグリコール酸のようなジカルボキシレート誘導体である）に相当する。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物は１個以上の不斉炭素原子を含み得る。よって、前記化合物はエナンチオマーまたはジアステレオマーの形態で存在し得る。これらのエナンチオマー、ジアステレオマー、及びラセミ混合物を含めたその混合物が本発明の範囲内である。
【００４３】
式（Ｉ）の化合物は塩基または酸との付加塩の形態で存在し得る。これは、特にＸがＮＲＲ’基を含む場合である。前記付加塩も本発明の範囲内である。
【００４４】
これらの塩は医薬的に許容され得る酸を用いて製造され得るが、例えば式（Ｉ）の化合物を精製または単離する際に使用される他の酸の塩も本発明の範囲内である。
【００４５】
式（Ｉ）の化合物は水和物または溶媒和物の形態、すなわち１分子以上の水または溶媒との結合または会合の形態でも存在し得る。前記水和物及び溶媒和物も本発明の範囲内である。
【００４６】
本発明に関連して：
−ハロゲン原子はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味すると理解される；
−アルキル基は飽和の線状または分岐状（Ｃ１−Ｃ６）脂肪族炭化水素基を意味すると理解される。例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはペンチル基等が挙げられ得る；
−アリール基は５から１０個の炭素原子を含む芳香族環式基を意味すると理解される。アリール基の例としてフェニルまたはナフチルが挙げられ得る。
【００４７】
別の主題によれば、本発明は本発明に従うコンジュゲートの製造方法に関する。
【００４８】
第１の実施形態によれば、式（Ｉ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）：
【００４９】
【化８】
0006013354.tif 000009
の化合物を式：
ＡＰ−Ｌ−Ｈ
（式中、Ｌは一般式（Ｉ）に定義されている通りである）
に相当する活性成分の誘導体とカップリングすることにより得られ得る。
【００５０】
よって、タキソイドの場合、ＡＰ−Ｌ−Ｈは、タキソイドの側鎖の遊離ＯＨ基が通常ＬＨのカルボン酸基を介してＬＨ基でエステル化されているＡＰ誘導体に相当する。
【００５１】
このカップリング反応は当業者に公知のエステル化条件下で、特にカルボジイミド（例：ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ））のような活性化剤の存在下、場合によりジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のような触媒を用いて実施され得る。この反応は、ジクロロメタン、クロロホルムまたは酢酸エチルのような適切な溶媒中、０℃から溶媒の還流温度の範囲の温度で、より一般的には周囲温度で実施され得る。
【００５２】
修飾された活性成分ＡＰ−Ｌ−Ｈは、活性成分ＡＰから所望のリンカーＬの前駆体とのカップリングにより得られ得る。
【００５３】
よって、Ｌがジスクシネート化合物を表す場合には、使用される前駆体は無水コハク酸である。Ｌがジグリコレート基を表す場合には、使用される前駆体は無水ジグリコール酸である。
【００５４】
このカップリング反応は、通常ピリジンのような溶媒または塩素化溶媒中、ＤＭＡＰまたはピリジンのような触媒の存在下、０℃から溶媒の還流温度の範囲の温度で、より一般的には周囲温度で実施される。
【００５５】
第２の実施形態によれば、前記方法は、ＯＨ基を有する活性成分ＡＰを式（ＩＩ）：
【００５６】
【化９】
0006013354.tif 000010
（式中、ＬＨは末端カルボン酸基ＣＯＯＨを有し、ｍＰＥＧ、ｍ、Ｘ、ＰＬＡ及びｎは式（Ｉ）に定義されている通りである）
のＰＥＧ／ＰＬＡコポリマーとカップリングする段階を含む。
【００５７】
前記カップリング反応は、ジクロロメタンまたはクロロホルムのような溶媒中、カルボジイミド（例：ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ））のような活性化剤の存在下、場合によりジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のような触媒を用いて実施され得る。この反応は、通常０℃から溶媒の還流温度の範囲の温度で、より一般的には周囲温度で実施される。
【００５８】
式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：
【００５９】
【化１０】
0006013354.tif 000011
（式中、ｍＰＥＧ、ｍ、ＰＬＡ、ｎ及びＸは式（Ｉ）に定義されている通りである）
の化合物からリンカーＬＨの前駆体とカップリングすることにより得られ得る。よって、ＬＨがジスクシネート基を表す場合には、使用される前駆体は無水コハク酸である。Ｌがジグリコレート基の場合には、使用される前駆体は無水ジグリコール酸である。所望されるＬ基に従って利用される前駆体は通常当業者に公知であり、市販されている。
【００６０】
前記カップリング反応は、通常トルエンまたはジクロロメタンのような溶媒中、ピリジンのような触媒の存在下、周囲温度から溶媒の還流温度の範囲の温度で実施される。
【００６１】
この反応は、特にＤＭＡＰのような適当な触媒を用いて促進され得る。
【００６２】
上記合成ルートの１つまたは他に従って使用される式（ＩＩＩ）の化合物は新規である。よって、本発明は、式（ＩＩＩ）：
【００６３】
【化１１】
0006013354.tif 000012
（式中、ｍＰＥＧ、ＰＬＡ、ｍ、ｎ及びＸは式（Ｉ）、（Ｉａ）及び／または（Ｉｂ）に定義されている通りである）
の化合物にも関する。
【００６４】
好ましくは、化合物（ＩＩＩ）は以下の式（ＩＩＩａ）及び（ＩＩＩｂ）：
【００６５】
【化１２】
0006013354.tif 000013
に相当する。
【００６６】
別の主題によれば、本発明は式（ＩＩＩ）の中間体の製造方法にも関する。この方法は、
１．式（ＩＶ）：
【００６７】
【化１３】
0006013354.tif 000014
の化合物のヒドロキシル基を適当な保護基を用いて選択的にモノ保護する段階；
２．こうして得たモノ保護されている化合物を（ＰＬＡ）ｎ基の前駆体とカップリングする段階；
３．段階１で導入した保護基を脱保護する段階；
を含む。
【００６８】
段階１に対して、適当な保護基は特にシリル誘導体、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１、またはＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  １３，１９７３に記載されているものから選択され得る。
【００６９】
特に有利な態様によれば、保護のために以下のシリル誘導体：
【００７０】
【化１４】
0006013354.tif 000015
の１つまたは他、好ましくは
【００７１】
【化１５】
0006013354.tif 000016
（式中、Ｌｇは離脱基、例えばハロゲン原子またはトリフルオロメタンスルホネート基、好ましくは塩素のようなハロゲン原子を表す）
が使用される。
【００７２】
この反応は当業者に公知の条件下で、例えば塩基、特にトリエチルアミンのような有機塩基及びジクロロメタンのような溶媒の存在下、周囲温度から溶媒の還流温度の範囲の温度で、特に約４０℃で実施され得る。
【００７３】
（ＰＬＡ）ｎの前駆体とのカップリングの段階２）は、有利には前駆体３，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオンを用いる開環重合（ＲＯＰ）により実施され得る。純粋な代表として、この反応は以下のスキームにより説明され得る。
【００７４】
【化１６】
0006013354.tif 000017
【００７５】
通常、この開環重合をチオ尿素（例：Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］チオ尿素）、アミン（例：スパルテイン）及び／またはその混合物のような有機触媒の存在下、周囲温度から溶媒の還流温度の範囲の温度で実施することが有利である。適切な溶媒として、ジクロロメタンを挙げ得る。
【００７６】
脱保護段階３）は当業者に公知の脱保護方法、例えば上に掲げたＧｒｅｅｎら及びＭｃＯｍｉｅらに記載されている方法の適用または改変により実施され得る。有利には、フッ化物、例えばフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）：Ｂｕ４Ｎ＋，Ｆ−またはトリフルオロボラン（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）が使用され得る。この反応は、ＴＨＦまたはジクロロメタンのような適当な溶媒中、周囲温度から反応混合物の還流温度の範囲の温度で、例えば約４０℃で所望の変換度を得るのに十分な時間実施され得る。
【００７７】
化合物（ＩＶ）：
【００７８】
【化１７】
0006013354.tif 000018
は、式（Ｖ）：
【００７９】
【化１８】
0006013354.tif 000019
（式中、ｍＰＥＧ、ｍ及びＸは上に定義した通りであり、Ｐｇ１及びＰｇ２は同一または相互に異なっており、各々独立してヒドロキシル基に対する保護基を表すか、或いはＰｇ１及びＰｇ２はこれらが結合している酸素原子と一緒に場合により例えば置換または未置換のアリール基により置換されているアセタール基を形成することによりジオール基に対する保護基を形成する）
の化合物から、保護基Ｐｇ１及びＰｇ２を特に接触水素化Ｐｄ／Ｃまたは酸性加水分解により脱保護することにより得られ得る。
【００８０】
特定態様によれば、Ｐｇ１及びＰｇ２は一緒にベンジリデン基を形成し、よって式（Ｖ）の生成物が以下の式（Ｖａ）：
【００８１】
【化１９】
0006013354.tif 000020
（式中、ｉは０、１または２であり、各Ｒは同一または異なり、独立してＨまたはＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、好ましくはＯＭｅを表す）
に相当する。
【００８２】
式（Ｖ）の化合物は、式（ＶＩ）：
【００８３】
【化２０】
0006013354.tif 000021
の化合物を、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、４−（ジメチルアミノ）ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（ＤＰＴＳ）及び／またはその混合物のようなカップリング剤、またはＤＭＡＰの存在下で（ｍＰＥＧ）ｍとカップリングすることにより得られ得る。この反応は通常周囲温度で実施される。
【００８４】
化合物（ＶＩ）は、当業者に公知の方法に従って化合物（ＶＩＩ）：
【００８５】
【化２１】
0006013354.tif 000022
を保護することにより得られ得る。
【００８６】
特に、化合物（ＶＩａ）：
【００８７】
【化２２】
0006013354.tif 000023
の場合、後者は化合物（ＶＩＩ）及びベンズアルデヒドから、特にＵ．Ａｎｎｂｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，３９，３２１７を適用及び／または改変することにより得られ得る。
【００８８】
式（ＶＩＩ）の化合物は市販されており、または当業者に公知の方法を適用または改変することにより及び／または当業者の範囲内で、特にＬａｒｏｃｋら，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９に記載されている手順にてらして得られ得る。
【００８９】
本発明に従う方法は、更に所望化合物の単離及び／または精製を含む後続段階を含み得る。こうして製造された所望化合物は慣用の手段により反応混合物から回収され得る。例えば、化合物は反応混合物から溶媒を蒸留することにより、または所要により溶液の混合物から溶媒を蒸留した後残渣を水に注ぎ、その後水非混和性有機溶媒で抽出し、抽出物から溶媒を蒸留することにより回収され得る。加えて、化合物は、所望により各種技術により、例えば再結晶化、再沈殿または各種クロマトグラフィー技術、特にサイズ排除分取クロマトグラフィーにより精製され得る。
【００９０】
別の主題によれば、本発明は、本発明に従うコンジュゲートを含むナノ粒子にも関する。これらのナノ粒子は一般的に１０から３００ｎｍ、通常２０から２００ｎｍの範囲のサイズを有する。
【００９１】
典型的には、ナノ粒子はＡＰが存在する界面にＰＬＡコア及びＰＥＧコロナを含む。
【００９２】
ナノ粒子は、通常ナノ沈殿、特にアセトンのような適当な溶媒中にコンジュゲートを溶解し、前記溶媒を蒸発させることにより製造され得る。
【００９３】
別の主題によれば、本発明は、本発明に従うコンジュゲートを含む医薬組成物にも関する。
【００９４】
別の主題によれば、本発明は、癌の治療及び／または予防において使用するための本発明に従うコンジュゲートにも関する。
【００９５】
図１は、本発明に従って得たナノ粒子の透過型電子顕微鏡により得た像を表す。
【００９６】
図２は、Ｔ  ０及びＴ  ＋３週でのＤＬＳ（動的光散乱）測定によるナノ粒子のサイズの分布を表す。
【００９７】
図３は、ラット血漿中のカバジタキセルコンジュゲートナノ粒子製剤（すなわち、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−カバジタキセル、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−グルタリル−カバジタキセル及びＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−ジグリコリル−カバジタキセル）のインビトロプロフィールを表す。
【実施例】
【００９８】
本発明の代表及び説明として下記実施例を提示する。
【００９９】
特定されている場合を除いて、溶媒及び反応物質はそのまま使用する。合成及び重合はすべて不活性アルゴン雰囲気下、標準シュレンク技術を用いて実施する。使用前に、溶媒を予め脱水し、蒸留する：ジクロロメタン（ＤＣＭ）はＣａＨ２、トルエンはナトリウムまたは溶媒精製装置（Ｍｂｒａｕｎ  ＭＢ−ＳＰＳ−８００システム）を用いて、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）はナトリウムを用いて、ジエチルエーテルはナトリウムを用いて脱水する。ＤＬ−ラクチド（ＰＵＲＡＣ）は共沸蒸留し、トルエンから再結晶させることにより精製する。その後、昇華させ、次いでグローブボックス中アルゴン下で保存する。
【０１００】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）：ＮＭＲスペクトルは凍結探針を備えているＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ３００ＭＨｚ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４００ＭＨｚ及びＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００ＭＨｚデバイスを用いて周囲温度で記録する。１Ｈ及び１３Ｃにおける化学シフトδは残留溶媒に対してｐｐｍで報告し、２９Ｓｉにおける化学シフトδは外部標準としてのＭｅ４Ｓｉに対してｐｐｍで報告する。カップリング定数Ｊはヘルツで示す。シグナルを示すために以下の略号が使用されている：ｓ（一重項）、ｂｒ（広幅）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）及びｍ（多重項）。
【０１０１】
立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：数平均モル質量Ｍｎ、重量平均モル質量Ｍｗ及び多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）は、Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｗａｔｅｒｓ  ｅ２６９５、ＭＡＬＳ  ｍｉｎｉＤＡＷＮ（Ｗｙａｔｔ）光散乱デテクター、Ｖｉｓｃｏｓｔａｒ−ＩＩ（Ｗｙａｔｔ）粘度計及びＷａｔｅｒｓ  ２４１４屈折計から構成されるトリプル検出ラインを用いて３５℃で立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定する。ＴＨＦを溶離液として１．０ｍｌ／分の流速で使用する。Ｓｔｙｒａｇｅｌ（ＷＡＴ０５４４０５）予備カラム及び２つのＳｈｏｄｅｘ（ＫＦ−８０２．５及びＫＦ−８０４）カラムを使用する。校正はポリスチレン標準（４００〜１０００００ｇ／ｍｏｌ）を用いて実施する。サンプルは以下のように作成する：分析しようとする生成物（１０から２０ｍｇ）をマーカーとしてトルエンを含有しているＴＨＦ（１ｍｌ）中に溶解させる。その後、溶液を０．４５μｍフィルターを用いて濾過する。
【０１０２】
質量分析：化学イオン化（ＤＣＩ）質量スペクトルをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＳＱ分光計を用いて記録する。
【０１０３】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：ナノ粒子のモルホロジーを加速場が２００ｋｅＶのＪＥＯＬ−ＪＥＭ  ２１００Ｆ顕微鏡を用いてＴＥＭにより観察する。サンプルを作成するために、１０倍希釈した（０．５ｍｇ／ｍｌ）数滴のナノ粒子分散液を０．２％（ｗ／ｖ）のリンタングステン酸と３０分間インキュベートする。その後、サンプルを銅グリッド上に置き、周囲温度で乾燥する。
【０１０４】
動的光散乱（ＤＬＳ）：ナノ粒子のサイズ（流体力学的径）をゼータサイザー３０００  ＨＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてＤＬＳにより測定する。
【０１０５】
濾過（１．２μｍ  ＰＶＤＦフィルター）後、サンプル（５ｍｇ／ｍｌ）を毛細管セル中に配置する。測定は２５℃、９０℃の検出角度で実施する。使用した波長は６３３ｎｍである。
【０１０６】
以下の実施例中、（ｍＰＥＧ）ｍ及び（ＰＬＡ）ｎ中の添字ｍ及びｎは重量平均分子量である。ｎはＳＥＣ分析により得た重量から実験的に求められる。
【０１０７】
５−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン−５−カルボン酸（Ｂｎ−ビス−ＭＰＡ）（Ｉ）の合成
【０１０８】
【化２３】
0006013354.tif 000024
２，２’−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（ビス−ＭＰＡ）（１０ｇ，７４．６ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（８．３ｇ，７８．２ｍｍｏｌ）及びメタンスルホン酸（ＭＳＡ）（１．５ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）をトルエン（１００ｍｌ）中に溶解させる。反応媒体を周囲温度で５時間撹拌する。その後、溶媒を真空下で蒸発させ、次いで残渣が完全に溶解するまで１０％  ＮａＨＣＯ３溶液（３００ｍｌ）及びエーテル（３００ｍｌ）を添加する。水性相を回収し、氷酢酸（数滴）を添加する。ガスが強く発生した後、白色沈殿が形成される。沈殿を濾別し、水（２０ｍｌ）で濯ぎ、真空下で一晩乾燥する。Ｗｏｂｔ＝１３．３ｇ，Ｙ＝８０％。
【０１０９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−アセトン，３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）  １．０４（ｓ，３Ｈ，−Ｃ−ＣＨ３），３．７３（ｄ，２Ｈ，１ａ，Ｊ２Ｈａ−Ｈｂ＝１１．４Ｈｚ），４．５７（ｄ，２Ｈ，１ｂ，Ｊ２Ｈａ−Ｈｂ＝１１．３Ｈｚ），５．５２（ｓ，１Ｈ，Ｏ２−ＣＨ−），７．３２（ｍ，３Ｈ，ＡｒＨ），７．４２（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ）。
【０１１０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ｄ６−アセトン，７５．５ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）  １８．４（−ＣＨ３），４２．８（Ｃｑ），７４．２（−ＣＨ２−），１０２．１（−Ｏ２−ＣＨ−），１２７．３（アリールＣＨ），１２８．８（アリールＣＨ），１２９．５（アリールＣＨ），１４０．０（アリールＣｑ），１７６．２（−ＣＯＯＨ）。
【０１１１】
ＤＣＩ  計算値Ｃ１２Ｈ１４Ｏ４［Ｍ＋ＮＨ４］＋＝２４０．１２；実測値＝２３９．９０。
【０１１２】
メトキシ−ポリエチレングリコール−ベンジリデン（ｍＰＥＧ２０００−Ｏ２Ｂｎ）（ＩＩ）の合成
【０１１３】
【化２４】
0006013354.tif 000025
メトキシ−ポリエチレングリコール（平均分子量：２０００ｇ／ｍｏｌ、ここではｍＰＥＧ２０００と称する）（１０ｇ，５ｍｍｏｌ）及び保護されているビス−ＭＰＡ（Ｉ）（１．３５ｇ，６．１ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのシュレンク容器において無水ＤＣＭ（４５ｍｌ）中に溶解させる。その後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）（０．９６ｇ，５ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム（ＤＰＴＳ）（０．６ｇ，２ｍｍｏｌ）を媒体に添加する。反応媒体をアルゴン下４０℃で４８時間撹拌する。その後、反応媒体を１Ｍ  ＨＣｌ溶液（２０ｍｌ）、１０％  ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌ）及びＨ２Ｏ（２０ｍｌ）で抽出する。
【０１１４】
有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、溶媒を蒸発させた後、残渣を０℃でエーテルから沈殿させる。次いで、沈殿を濾別し、真空下で一晩乾燥する。白色固体を得る。Ｗｏｂｔ＝９．６８ｇ，Ｙ＝８８％。
【０１１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ  １．０５（ｓ，３Ｈ，６），３．３７（ｓ，３Ｈ，１），３．６３（ｂｓ，１８０Ｈ，２，２’＆７ｂ），４．３６（ｔ，２Ｈ，３，Ｊ３Ｈ−Ｈ＝４．８Ｈｚ），４．６６（ｄ，２Ｈ，７ａ，Ｊ２Ｈａ−Ｈｂ＝１１．５Ｈｚ），５．４４（ｓ，１Ｈ，８），７．３２（ｍ，３Ｈ，ＡｒＨ），７．４２（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ）。
【０１１６】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．５ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）  １７．８（Ｃ６），４２．３（Ｃ５），５８．９（Ｃ１），６４．１（Ｃ３），６８．９（Ｃ７），７０．５（Ｃ２），７１．８（Ｃ２’），７３．４（Ｃ２”），１０１．２（Ｃ８），１２６．１（アリールＣＨ），１２８．０（アリールＣＨ），１２８．８（アリールＣＨ），１３７．８（アリールＣｑ），１７３．８（Ｃ４）。
【０１１７】
ＳＥＣ：Ｍｎ＝２８６７ｇ／ｍｏｌ，ＰＩ＝１．０６。
【０１１８】
メトキシ−ポリエチレングリコール−ジオール（ｍＰＥＧ２０００−（ＯＨ）２）（ＩＩＩ）の合成
【０１１９】
【化２５】
0006013354.tif 000026
化合物（ＩＩ）（９．５ｇ，４．３ｍｍｏｌ）及び炭素担持パラジウム（１０％  Ｐｄ／Ｃ）（０．９５ｇ，１０％ｗ／ｗ）を水素（Ｈ２）が充填されているバルーンを備えた２５０ｍｌの２口丸底シュレンクフラスコにおいて混合した後、真空−アルゴンサイクルにかける。その後、ＤＣＭ（４０ｍｌ）及びメタノール（ＭｅＯＨ）（４０ｍｌ）を添加する。真空−Ｈ２サイクルを実施する。反応媒体を静的Ｈ２下、Ａｔで４時間撹拌する。その後、混合物をセライトを介して濾過する。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を真空下で一晩乾燥する。黄色っぽい固体を得る。Ｗｏｂｔ＝８．７ｇ，Ｙ＝９５％。
【０１２０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ  １．１１（ｓ，３Ｈ，６），３．３７（ｓ，３Ｈ，１），３．６３（ｂｓ，１８０Ｈ），３．６９−３．７８（ｍ，４Ｈ，７ａ＆７ｂ），４．３３（ｔ，２Ｈ，３，Ｊ３Ｈ−Ｈ＝４．８Ｈｚ）。
【０１２１】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５．７ＭＨｚ）：δ  １６．９（Ｃ６），４９．５（Ｃ５），５８．８（Ｃ１），６３．２（Ｃ３），６７．１（Ｃ７），６８．７（Ｃ２’），７０．４（Ｃ２），７１．８（Ｃ２”’），７２．６（Ｃ２”），１７５．５（Ｃ４）。
【０１２２】
ｍＰＥＧ２０００−（ＯＨ）−Ｙ−（ＯＴＢＤＰＳ）（ＩＶ）の合成
【０１２３】
【化２６】
0006013354.tif 000027
化合物（ＩＩＩ）（４ｇ，１．９０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのシュレンク容器において無水ＤＣＭ（１８ｍｌ）中に溶解させる。その後、ＫＯＨで蒸留したトリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．４ｇ，３．９５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳｉＣｌ）（１．１ｇ，３．９２ｍｍｏｌ）を０℃で一滴ずつ添加する。反応媒体をアルゴン下４０℃で撹拌する。２４時間後、形成された塩を濾別し、次いで有機相を１Ｍ  ＨＣｌ溶液（１５ｍｌ）、次いでＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍｌ）、最後にＨ２Ｏ（１５ｍｌ）で抽出する。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水する。濾過後、混合物を真空下で濃縮し、次いで残渣を０℃でエーテルから沈殿させる。次いで、得られた白色沈殿を濾別し、洗浄し、真空下で乾燥する。その後、生成物をトルエン中での共沸混合物を用いて乾燥する。生成物をグローブボックスにおいて保存する。Ｗｏｂｔ＝４．１ｇ，Ｙ＝９０％。
【０１２４】
ＲＭＮ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ  １．０２（ｓ，９Ｈ，１０），１．１９（ｓ，３Ｈ，６），３．３７（ｓ，３Ｈ，１），３．６３（ｂｒ，１８０Ｈ，２／２’／２”／２”’），３．７３−３．８０（ｍ，４Ｈ，７＆８），４．２６（ｔ，２Ｈ，３，Ｊ３Ｈ−Ｈ＝４．８Ｈｚ），７．３５−７．６４（ｍ，１０Ｈ，１１）。
【０１２５】
ＲＭＮ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３，７５．５ＭＨｚ）：δ  １６．９（Ｃ６），１９．１（Ｃ９），２６．５（Ｃ１０），５０．３（Ｃ５），５８．７（Ｃ１），６３．１（Ｃ３），６５．６（Ｃ７），６６．４（Ｃ８），６８．６（Ｃ２’），７０．３（Ｃ２），７１．７（Ｃ２”’），７２．３（Ｃ２”），１２７．５（ＣＨアリール），１２９．５（ＣＨアリール），１３２．９（Ｃｑアリール），１３５．３（ＣＨアリール），１７４．８（Ｃ４）。
【０１２６】
ＲＭＮ  ２９Ｓｉ（ＣＤＣｌ３，５９．６ＭＨｚ）：δ  −４．３３（−Ｏ−Ｓｉ−）。
【０１２７】
ｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ１４０００−Ｙ−ＯＴＢＤＰＳコポリマー（Ｖ）の合成
【０１２８】
【化２７】
0006013354.tif 000028
高分子開始剤（ＩＶ）（０．８ｇ，０．３４ｍｍｏｌ）及びＤＬ−ラクチド（５ｇ，３５ｍｍｏｌ，ＤＰ  １００）を無水ＤＣＭ（２５ｍｌ）中に溶解させる。その後、触媒の溶液（１０ｍｌ，４当量のチオ尿素（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］チオ尿素）及び４当量の（−）−スパルテイン）を添加する。作用を１Ｈ  ＮＭＲによりモニターしてラクチドが完全に消費されるまで反応媒体をアルゴン下３５℃で撹拌する。６時間後、無水酢酸（１６６μｌ，１．７１ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（４．５ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を反応媒体に添加する。後者を更に１時間撹拌する。その後、混合物を真空下で濃縮し、次いで０℃でＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）から沈殿させる。形成された白色沈殿を濾別し、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）で洗浄し、次いで真空下で一晩乾燥する。
【０１２９】
ＲＭＮ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  １．０２（ｓ，９Ｈ，１０），１．１９（ｓ，３Ｈ，６），１．５８（ｂｒ，５９５Ｈ，１４），２．１２（ｓ，３Ｈ，ＰＬＡ：１６），３．３７（ｓ，３Ｈ，１），３．６３（ｂｒ，１８０Ｈ，２／２’／２”／２”’），３．７３−３．８０（ｍ，２Ｈ，８），４．２０−４．４０（ｍ，４Ｈ，３＆７），５．１６（ｂｒ，１９２Ｈ，１３），７．３５−７．６４（ｍ，１０Ｈ，１１）。
【０１３０】
ＲＭＮ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３，１２５．７ＭＨｚ）：δ  １６．６（Ｃ１４＆Ｃ６），２０．４（Ｃ９），２６．６（Ｃ１０），４８．５（Ｃ５），５８．８（Ｃ１），６３．５（Ｃ３），６５．０（Ｃ７），６６．６（Ｃ８），６８．９（Ｃ１３），６８．２（Ｃ２’），７０．１（Ｃ２），７１．７（Ｃ２”’），７２．２（Ｃ２”），１２７．７，１２９．８，１３２．８，１３５．５（Ｃ１１），１６９．５０（Ｃ１２＆Ｃ１５），１７４．８２（Ｃ４）。
【０１３１】
平均分子量（ＮＭＲによる）：Ｍ＝１６１５０ｇ／ｍｏｌ。
【０１３２】
開環重合（ＲＯＰ）反応も３５及び１５０当量のラクチドを用いて実施して、ｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ５０００及びｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ２１０００コポリマーを得た。
【０１３３】
ｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ１４０００−Ｙ−ＯＨコポリマー（ＶＩ）の合成
【０１３４】
【化２８】
0006013354.tif 000029
コポリマー（Ｖ）（３．９６ｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（４０ｍｌ）中に溶解させる。その後、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）をＴＨＦ中に含む１Ｍ溶液（１．５ｍｌ，１．５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加する。反応媒体をアルゴン下３０℃で７時間撹拌する。その後、ＴＨＦを真空下で蒸発させる。残渣をＤＣＭ（１５ｍｌ）中に溶解させた後、０℃でエーテル（８００ｍｌ）から沈殿させる。白色沈殿を濾別した後、真空下で一晩乾燥する。Ｗｏｂｔ＝２．１４ｇ，Ｙ＝５５％。
【０１３５】
ＲＭＮ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ  １．５７（ｂｒ，５９０Ｈ，ＰＬＡ：１１），２．１２（ｓ，３Ｈ，ＰＬＡ：１３），３．３７（ｓ，３Ｈ，１），３．６３（ｂｒ，１８０Ｈ，８，２／２’／２”／２”’），４．３３（ｍ，４Ｈ，３＆７），５．１５（ｂｒ，１８６Ｈ，ＰＬＡ：１０）。
【０１３６】
ＲＭＮ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３，７５．５ＭＨｚ）：δ  １６．５（ＰＬＡ：Ｃ１１），４８．５（Ｃ５），５８．７（Ｃ１），６３．４（Ｃ３），６４．２（Ｃ７），６６．５（Ｃ８），６８．８（ＰＬＡ：Ｃ１０），６８．２（Ｃ２’），７０．１（Ｃ２），７１．７（Ｃ２”’），７２．２（Ｃ２”），１６９．５（ＰＬＡ：Ｃ９），１７４．８（ＰＥＧ：Ｃ４）。
【０１３７】
平均分子量（ＮＭＲによる）：Ｍ＝１５４９５ｇ／ｍｏｌ。
【０１３８】
保護もトリイソプロピルクロロシラン（ＴＩＰＳＣｌ）を用いて次のように実施した。
【０１３９】
【化２９】
0006013354.tif 000030
【０１４０】
ｍＰＥＧ２０００−（ＯＨ）−Ｙ−（ＯＴＩＰＳ）の合成
【０１４１】
【化３０】
0006013354.tif 000031
２５ｍｌのシュレンクにおいてｍＰＥＧ−ジオール誘導体（０．５ｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５ｍｌ）中に溶解させる。次いで、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（ＫＯＨで蒸留）（０．２ｇ，２．０１ｍｍｏｌ）を添加し、トリス−イソプロピルクロロシラン（ＴＩＰＳＣｌ）（０．４０ｇ，２ｍｍｏｌ）を０℃で一滴ずつ添加する。反応混合物をアルゴン下４０℃で撹拌する。２４時間後、形成された塩を濾過し、有機相をＨＣｌ  １Ｍ溶液（５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍｌ）及びＨ２Ｏ（５ｍｌ）で抽出する。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水する。濾過後、混合物を真空下で濃縮し、残渣を０℃でエーテル中に沈殿させる。次いで、白色沈殿を濾過し、洗浄し、真空下で乾燥する。次いで、生成物をトルエン中の共沸混合物を用いて乾燥する。生成物を密封ボックス中に保存する。Ｍｏｂｔ＝０．４ｇ，Ｒ＝７４％。
【０１４２】
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  ０．９８−１．０３（ｂｒ，２１Ｈ），１．１６（ｓ，３Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｍ，１８０Ｈ），３．７３−３．８０（ｍ，４Ｈ），４．２６（ｔ，２Ｈ，Ｊ３Ｈ−Ｈ＝４．８Ｈｚ）。
【０１４３】
コポリマーｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ１００００−Ｙ−ＯＴＩＰＳ（Ｖ’）の合成
【０１４４】
【化３１】
0006013354.tif 000032
高分子開始剤（０．１８ｇ，７９．６μｍｏｌ）及びＤＬ−ラクチド（０．８ｇ，５．６ｍｍｏｌ，７０当量）を無水ＤＣＭ（７ｍｌ）中に溶解させる。次いで、触媒の溶液（１ｍｌ，４当量のチオ尿素（Ｎ，Ｎ’−シクロヘキシル−３，５−ビス［トリフルオロメチル］フェニルチオ尿素）及び２当量の（＋）−スパルテイン）を添加する。１ＨＮＭＲによりコントロールしながらラクチドが完全に消費されるまで反応混合物をアルゴン下３５℃で撹拌する。３時間後、反応混合物に無水酢酸（３９μｌ，０．４０ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１０ｍｇ，８２μｍｏｌ）を添加する。これをもう１時間撹拌する。次いで、混合物を真空下で濃縮した後、０℃でエーテル（５０ｍｌ）中に沈殿させる。次いで、白色沈殿を濾過し、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）で洗浄し、次いで真空下で一晩乾燥する。Ｍｏｂｔ＝１ｇ，Ｒ  〜７５％。
【０１４５】
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  ０．９８−１．０３（ｂｒ，２１Ｈ），１．１６（ｓ，３Ｈ），１．５８（ｍ，４２３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ，１），３．６３（ｍ，１８０Ｈ），３．７３−３．８０（ｍ，２Ｈ），４．２０−４．４０（ｍ，４Ｈ），５．１６（ｍ，１４１Ｈ，１３）。
【０１４６】
ＳＥＣ：Ｍｗ＝１３６２８ｇ／ｍｏｌ，Ｍｎ＝１１８５０ｇ／ｍｏｌ，ＩＰ＝１．１５。
【０１４７】
コポリマーｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ１００００−Ｙ−ＯＨ（ＶＩ’）の合成
【０１４８】
【化３２】
0006013354.tif 000033
保護されているコポリマー（１ｇ，７１μｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍｌ）中に溶解させる。次いで、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（０．５ｇ，３．５６ｍｍｏｌ）を０℃で一滴ずつ添加する。反応混合物をアルゴン下０℃で１時間、次いで３０℃で１９時間撹拌する。次いで、ＤＣＭを真空下で蒸発させる。残渣をＤＣＭ（５ｍｌ）中で可溶化した後、０℃でエーテル（５０ｍｌ）中に沈殿させ、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）、次いでペンタン（２０ｍｌ）で洗浄する。白色沈殿を濾過し、真空下で一晩乾燥する。Ｍｏｂｔ＝０．８５ｇ，Ｒ  〜８５％。
【０１４９】
ＮＭＲ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  １．５８（ｍ，４２５Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｍ，１８０Ｈ），４．３３（ｍ，４Ｈ），５．１６（ｍ，１４２Ｈ）。
【０１５０】
ＳＥＣ：Ｍｗ＝１３９２５ｇ／ｍｏｌ，Ｍｎ＝１１８００ｇ／ｍｏｌ，ＩＰ＝１．１８。
【０１５１】
カバジタキセル−２’−スクシニル（ＶＩＩ）の合成
【０１５２】
【化３３】
0006013354.tif 000034
カバジタキセル（０．２ｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をＫＯＨで蒸留したピリジン（４ｍｌ）中に溶解させる。その後、無水コハク酸（０．２ｇ，２ｍｍｏｌ）を添加する、反応媒体をアルゴン下３０℃で撹拌する。反応を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニターする。８時間後、ピリジンを真空下で蒸発させ、残渣をクロマトグラフカラム（溶離液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９９／１から９７／３に勾配）を用いて精製する。その後、各種画分を蒸発させ、真空下で乾燥して、白色粉末を得る。Ｗｏｂｔ＝０．１８０ｇ，Ｙ＝８０％。
【０１５３】
ＲＭＮ  １Ｈ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ  １．１９（ｓ，３Ｈ，１６），１．２０（ｓ，３Ｈ，１７），１．３５（ｓ，９Ｈ，７’），１．６３（ｓ，１Ｈ，−ＯＨ第３級），１．７０（ｓ，３Ｈ，１９），１．７８（ｍ，１Ｈ，６ａ），１．８６（ｓ，３Ｈ，１８），２．１５（ｓ，６Ｈ，−ＣＨ３アセトン），２．１８−２．３３（ｍ，２Ｈ，１４ａ＆１４ｂ），２．３４（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ３アセチル，４），２．６５（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ２スクシニックａ，ａ’＆６ｂ），３．２８（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３，７），３．４４（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３，１０），３．８０（ｄ，１Ｈ，３，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．８４（ｄｄ，１Ｈ，７，Ｊ＝６．５及び１０．５Ｈｚ），４．１６（ｄ，１Ｈ，２０ａ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．２８（ｄ，１Ｈ，２０ｂ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．８０（ｓ，１Ｈ，１０），４．９５（ｄ，１Ｈ，５，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．２８−５．４４（ｂｒ，２Ｈ，２’／４’），５．６１（ｄ，１Ｈ，２，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．１９（ｂ，１Ｈ，１３），７．３１，７．３８，７．４７，７．５９，（ｍ，９Ｈ，ＡｒＨ），８．１０（ｄ，２Ｈ，Ｈオルトベンゾエート）。
【０１５４】
ＲＭＮ  １３Ｃ（ＣＤＣｌ３，７５．５ＭＨｚ）：δ  １０．８（Ｃ１９），１５．１（Ｃ１８），２１．２（Ｃ１６），２３．２（ＣＨ３アセチル），２７．３（Ｃ１７），２８．３５，２８．６２（−ＣＨ２スクシニックａ＆ａ’），２８．７（Ｃ７’），３２．６（Ｃ６），３５．７（Ｃ１４），４３．８（Ｃ１５），４７．９（Ｃ３），５６．７（Ｃ３’），５７．４（Ｃ８），５７．５（ＯＣＨ３，Ｃ７），５７．８（ＯＣＨ３，Ｃ１０），７３．１（Ｃ１３），７４．７（Ｃ２’），７５．０（Ｃ２），７７．０（Ｃ２０），７９．２（Ｃ１），８０．７（Ｃ６’），８１．２（Ｃ７），８２．３（Ｃ４），８３．１（Ｃ１０），８４．６（Ｃ５），１２７．３−１３８．９（Ａｒ），１３６．２（Ｃ１１），１３９．１（Ｃ１２），１５５．８（Ｃ５’），１６７．５（ＣＯベンゾエート），１６８．７（ＣＯアセチル，４），１７０．０−１７４．０（Ｃ１’，−ＣＯＯ−スクシニック），２０５．４（Ｃ９）。
【０１５５】
ｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ１４０００−Ｙ−スクシニル−２’−カバジタキセルコンジュゲート（ＶＩＩＩ）の合成
【０１５６】
【化３４】
0006013354.tif 000035
コポリマー（ＶＩ）（２ｇ，１６３μｍｏｌ）及びカバジタキセル−２’−スクシニル（ＶＩＩ）（０．３３ｇ，３５３μｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（４０ｍｌ）中に溶解させる。その後、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）（４５ｍｇ，３５７μｍｏｌ）、次いでＤＭＡＰ（４５ｍｇ，３６８μｍｏｌ）を添加する。反応媒体をアルゴン下３５℃で２４時間撹拌する。その後、有機相を１Ｍ  ＨＣｌ溶液（３０ｍｌ）、１０％  ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍｌ）及び水（３０ｍｌ）を用いて抽出する。その後、有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水した後、濾過する。真空下で濃縮した後、残渣をＭｅＯＨ（４００ｍｌ）中に沈殿させる。濾過後、沈殿を真空下で一晩乾燥する。Ｗｏｂｔ＝１．５ｇ，Ｙ＝７５％。
【０１５７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：粗な生成物をＭｅＯＨから沈殿させた後、完全カップリング（１００％）を定量する。化合物（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）の同じ化学シフトが１／１比で検出される。
【０１５８】
１３Ｃ  ＮＭＲ：化合物（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）の化学シフトに加えて、スクシニックリンカー−（ＣＨ２）−のシグナルのシフト：２８．１３及び２６．７１ｐｐｍ。
【０１５９】
平均分子量（ＮＭＲによる）：Ｍ＝１６４３０ｇ／ｍｏｌ。
【０１６０】
ナノ粒子製剤：
上で得たコンジュゲート（ＶＩＩＩ）（２０ｍｇ）をアセトン（２ｍｌ）中に溶解させる（１０ｍｇ／ｍｌ）。得られた溶液を脱イオン水（４ｍｌ）に撹拌しながら一滴ずつ添加する。アセトンを例えば回転蒸発器を用いて蒸発させる。こうして、５ｍｇ／ｍｌのコンジュゲートの最終濃度を得る。
【０１６１】
こうして得たナノ粒子は以下のように特性づけられる。
【０１６２】
ＴＥＭ：得られた写真を図１に示す。２７ｎｍの平均直径が観察される。
【０１６３】
ＤＬＳ：サンプルを濾過する（１．２μｍ）：６２ｎｍの平均直径を得る。分布は３週間の間未変化のままであった。結果を図２に示す。
【０１６４】
ｍＰＥＧ２０００−ＰＬＡ１００００−Ｙ−スクシニル−２’−カバジタキセルコンジュゲート（ＶＩＩＩ’）の合成
【０１６５】
【化３５】
0006013354.tif 000036
コポリマー（ＶＩ’）（Ｍｗ＝１２７００ｇ／ｍｏｌ）（１４ｇ）及びスクシニル−カバジタキセル（２．２４ｇ）を乾燥ジクロロメタン中に溶解させ、活性化モレキュラーシーブ４Å（７ｇ）を粉末として添加する。溶液をＲＴで１０分間撹拌し、ＤＭＡＰ（３１０ｍｇ）及びＤＩＰＣ（３０５ｍｇ）を添加する。溶液を３５℃で２４時間撹拌する。濾過後、溶液を真空下４０℃で濃縮乾固する。残渣をメタノール（２．８Ｌ）及びジクロロメタン（１ｍｌ）と一緒に ０℃で２時間撹拌する。懸濁液を濾過し、固体をメタノール（１００ｍｌ）で洗浄する。ＲＴで一晩乾燥して、１４ｇの白色粉末を得る。７．５ｇの固体をＲＴで一晩撹拌することによりメタノール（７４９ｍｌ）を用いて再精製し、濾過し、乾燥後、７．１ｇの白色粉末を得る。
【０１６６】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ１）：１．２１（ｍ，９Ｈ）；１．３６（ｓ，９Ｈ）；１．４２−１．７２（ｍ，４６８Ｈ）；１．７９（ｍ，１Ｈ）；１．９８（広幅ｓ，３Ｈ）；２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．１８（ｍ，１Ｈ）；２．２９（ｍ，１Ｈ）；２．４３（広幅ｓ，３Ｈ）；２．５４−２．７７（ｍ，５Ｈ）；３．３１（ｓ，３Ｈ）；３．３８（ｓ，３Ｈ）；３．４４（ｓ，３Ｈ）；３．５０−３．７８（ｍ，１８０Ｈ）；３．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ）；３．８９（ｄｄ，Ｊ＝６．５＆１０．６Ｈｚ，１Ｈ）；４．０８−４．４１（ｍ，８Ｈ）；４．８２（ｓ，１Ｈ）；４．９９（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）；５．０１−５．３１（ｍ，１５６Ｈ）；５．３２（ｍ，１Ｈ）；５．４７（ｍ，２Ｈ）；５．６４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．２４（広幅ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．３１（ｍ，３Ｈ）；７．４０（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）；７．５０（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）；７．６１（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）；８．１１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１６７】
ＳＥＣ  Ｍｗ＝１３５３０ｇ／ｍｏｌ，Ｍｎ＝１１７７０ｇ／ｍｏｌ，ＩＰ＝１．１５。
【０１６８】
ナノ粒子製剤：
１）ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−カバジタキセル（ＶＩＩＩ’）（３０ｍｇ）をアセトン（１．５ｍｌ）中に溶解させる。溶液を撹拌しながら（５００ｒｐｍで２０分間）ＷＦＩ（３ｍｌ）中に一滴ずつ添加する。次いで、アセトンを回転蒸発器（３００から４５ｍｂａｒで３０分間）を用いて真空下３７℃で蒸発させる。
【０１６９】
次いで、蒸発中の水の損失を補うためにナノディスパージョンの最終容量を３ｍＬに調節する。
【０１７０】
ナノディスパージョンの最終濃度：１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１７１】
平均直径（ＤＬＳを用いる）＝４３ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１４。
【０１７２】
２）ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニルカバジタキセル（ＶＩＩＩ’）（１ｇ）を室温で撹拌しながらアセトン（５０ｍＬ）中に溶解させた。有機溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを介して濾過した後、５０ｍＬのハミルトンシリンジに導入した。Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ１５（マクロゴール１５  ヒドロキシステアレート）（０．２ｇ）及びデオキシコール酸ナトリウム（０．０４ｇ）を撹拌しながらＷＦＩ（４５０ｍＬ）中に溶解させた。この水溶液を０．２２μｍフィルターを用いて濾過した。有機溶液をシリンジポンプを用いることにより水性相に２０ｍＬ／ｈの速度で注入した。均質に分散させるために、前記シリンジに接続させたテフロン（登録商標）チューブを水性相に潜らせた。次いで、ナノディスパージョン（３０ｎｍの平均サイズ，ＰＤＩ＝０．１４）により、マルバーンナノサイドー（準弾性光散乱）を用いて測定して≦１００ｎｍのサイズのナノ粒子を得た。
【０１７３】
アセトン及び若干の水を真空下３７℃で回転蒸発器を用いることにより除去した。最終ナノディスパージョン濃度は１０から２００ｍｇ／ｇであった。ナノ粒子のサイズは≦１００ｎｍ（すべての濃度について３０ｎｍの平均サイズ）のままであった。より大きな粒子は０．４５μｍでの濾過により除去され得る。
【０１７４】
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−スクシニル−ラロタキセル（ＩＸ）の合成
スクシニル−ラロタキセルの製造
【０１７５】
【化３６】
0006013354.tif 000037
フラスコに窒素下でラロタキセル二水和物（２．３６ｇ，２．７２ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（４７ｍｌ）、無水コハク酸（２．７２ｇ，２７．１９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３３ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を３０℃に一晩加熱し、次いで水（４７ｍｌ）で２回洗浄する。有機溶液をＭｇＳＯ４で脱水した後、溶液を減圧下４０℃で濃縮乾固する。乾燥抽出物を３容量のジイソプロピルエーテルで処理し、懸濁液を２時間撹拌し、濾過し、固体を２容量のジイソプロピルエーテルで２回洗浄する。減圧下４０℃で乾燥後、２．２８ｇの白色粉末を得る。
【０１７６】
ＮＭＲ  １Ｈスペクトル（５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ）：１．２６（ｓ，３Ｈ）；１．２８（ｓ，３Ｈ）；１．３２（ｓ，９Ｈ）；１．３８（ｍ，１Ｈ）；１．６８（ｍ，１Ｈ）；１．９３（ｓ，３Ｈ）；２．１１（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ）；２．１９（広幅ｓ，４Ｈ）；２．２５（ｄｄ，Ｊ＝４．８＆１０．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．３５（ｍ，１Ｈ）；２．３８（ｓ，３Ｈ）；２．４９（ｔｄ，Ｊ＝４．８＆１５．９Ｈｚ，１Ｈ）；２．６１−２．８２（ｍ，４Ｈ）；４．０７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；４．１２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；４．３１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；４．７５（広幅ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）；５．３５−５．５１（ｍ．２Ｈ）；５．６９（ｄねＪ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．２３（広幅ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．３４（ｓ，１Ｈ）；７．３０（ｍ，３Ｈ）；７．３９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．５１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．６０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）；８．１６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１７７】
スクシニル−ラロタキセルとコポリマー（ＶＩ’）のコンジュゲーション
【０１７８】
【化３７】
0006013354.tif 000038
２５ｍｌのフラスコに窒素下でｍＰＥＧ−ＰＬＡ−Ｙ−ＯＨコポリマー（ＶＩ’）（０．２ｇ，０．０１５７ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（４ｍｌ）中のスクシニル−ラロタキセル（３１．６ｍｇ，２．２ｅｑ）、次いで粉末状の活性化モレキュラーシーブ４Ａ（１００ｍｇ）を添加する。１０分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（４．４ｍｇ，２．３ｅｑ．）及びＤＩＰＣ（４．３ｍｇ，２．２ｅｑ．）を添加する。懸濁液を３５℃で２４時間撹拌した後、濾過する（０．２２ミクロン）。有機相を濃縮乾固し、抽出物をメタノール（４０ｍｌ）及びジクロロメタン（２滴）で処理する。懸濁液をＲＴで２時間撹拌し、次いで濾過し、固体を減圧下ＲＴで乾燥して、１７４ｍｇの予想される化合物を得る。
【０１７９】
ＮＭＲ  １Ｈスペクトル（５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ）：１．２２（ｍ，３Ｈ）；１．２４（ｓ，３Ｈ）；１．２７（ｓ，３Ｈ）；１．２９（ｓ，９Ｈ）；１．３５−１．８５（ｍ，５１２Ｈ）；１．９１（広幅ｓ，３Ｈ）；２．０８−２．７５（ｍ，９Ｈ）；２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．２０（ｓ，３Ｈ）；２．４１（広幅ｓ，３Ｈ）；３．３９（ｓ，３Ｈ）；３．４８−３．８１（ｍ，１９２Ｈ）；４．０２−４．３９（ｍ，８Ｈ）；４．７５（広幅ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ）；５．０１−５．３３（ｍ，１６９Ｈ）；５．３４（ｍ，１Ｈ）；５．４０−５．５２（ｍ，２Ｈ）；５．６８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）；６．２６（広幅ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．３４（ｓ，１Ｈ）；７．３０（ｍ，３Ｈ）；７．３９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．５１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．６１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．１８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１８０】
ＳＥＣ  Ｍｗ＝１４１４０ｇ／ｍｏｌ，Ｍｎ＝１１２６０ｇ／ｍｏｌ，Ｄ＝１．２５。
【０１８１】
ナノ粒子製剤：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−ラロタキセル（３０ｍｇ）をアセトン（１．５ｍｌ）中に溶解させる。溶液を撹拌しながら（５００ｒｐｍで２０分間）注射用水（ＷＦＩ）（３ｍｌ）に一滴ずつ添加する。次いで、アセトンを回転蒸発器を用いて真空下３７℃で蒸発させる。
【０１８２】
次いで、蒸発中の水の損失を補うためにナノディスパージョンの最終容量を３ｍＬに調節する。
【０１８３】
ナノディスパージョンの最終濃度：１０ｍｇ／ｍＬ
平均直径（ＤＬＳを用いる）＝４８ｎｍ，ＰＤＩ＝０．１７。
【０１８４】
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−グルタリル−カバジタキセル（Ｘ）の合成
グルタリル−カバジタキセルの製造
【０１８５】
【化３８】
0006013354.tif 000039
５００ｍｌのフラスコに窒素下でカバジタキセルアセトン溶媒和物（１０ｇ，１１．２４ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２００ｍｌ）、無水グルタル酸（１３．５１ｇ，１１２．４５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１４ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を３０℃に一晩加熱した後、水（１００ｍｌ）で数回洗浄する。有機溶液をＭｇＳＯ４で脱水した後、溶液を減圧下４０℃で濃縮乾固する。乾燥抽出物を１０容量のジイソプロピルエーテルで処理し、懸濁液を濾過し、固体を２容量のジイソプロピルエーテルで２回洗浄する。減圧下ＲＴで乾燥した後、６．７５ｇの白色粉末を得る。
【０１８６】
ＮＭＲ  １Ｈスペクトル（５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ）：０．９７（ｓ，３Ｈ）；０．９８（ｓ，３Ｈ）；１．３８（ｓ，９Ｈ）；１．５０（ｍ，５Ｈ）；１．７９（ｍ，６Ｈ）；２．２４（ｓ，３Ｈ）；２．２８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；２．４６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．６６（ｍ，１Ｈ）；３．２１（ｓ，３Ｈ）；３．２９（ｓ，３Ｈ）；３．５９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．７５（ｄｄ，Ｊ＝６．６＆１０．７Ｈｚ，１Ｈ）；４．０２（ｓ，２Ｈ）；４．４７（ｓ，１Ｈ）；４．７０（ｓ，１Ｈ）；４．９５（広幅ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．０２−５．１２（ｍ，２Ｈ）；５．３７（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８１（広幅ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．１８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．３６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．４３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．６６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．７４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．８５（ｄ  大きい，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；７．９８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；１２．１３（非常に広幅ｓ，１Ｈ）。
【０１８７】
グルタリル−カバジタキセルのコポリマー（ＶＩ’）とのコンジュゲーション
【０１８８】
【化３９】
0006013354.tif 000040
２５ｍｌのフラスコに窒素下でｍＰＥＧ−ＰＬＡ−Ｙ−ＯＨコポリマー（ＶＩ’）（０．２ｇ，０．０１５７ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（４ｍｌ）中のグルタリル−カバジタキセル（３１．６ｍｇ，２．２ｅｑ）、次いで粉末状活性化モレキュラーシーブ４Ａ（１００ｍｇ）を添加する。１０分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（４．４ｍｇ，２．３ｅｑ．）及びＤＩＰＣ（４．３ｍｇ，２．２ｅｑ．）を添加する。懸濁液を３５℃で２４時間撹拌した後、濾過する（０．２２ミクロン）。有機相を濃縮乾固し、抽出物をメタノール（４０ｍｌ）及びジクロロメタン（２滴）で処理する。懸濁液をＲＴで２時間撹拌し、次いで濾過し、固体を減圧下ＲＴで乾燥して、１７０ｍｇの予想される化合物を得る。
【０１８９】
ＮＭＲ  １Ｈスペクトル（５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ）：１．２１（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，３Ｈ）；１．２５（ｍ，３Ｈ）；１．３５（ｓ，９Ｈ）；１．４０−１．７０（ｍ，４５２Ｈ）；１．７２（ｓ，３Ｈ）；１．８０（ｍ，１Ｈ）；１．８７（ｍ，２Ｈ）；２．００（ｓ，３Ｈ）；２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．１５−２．５１（ｍ，６Ｈ）；２．４５（広幅ｓ，３Ｈ）；２．７１（ｍ，１Ｈ）；３．３２（ｓ，３Ｈ）；３．３９（ｓ，３Ｈ）；３．４５（ｓ，３Ｈ）；３．４８−３．８１（ｍ，１７２Ｈ）；３．８６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）；３．９１（ｄｄ，Ｊ＝６．３＆１１．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．１０−４．４０（ｍ，８Ｈ）；４．８３（ｓ，１Ｈ）；５．００（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．０１−５．３３（ｍ，１５２Ｈ）；５．３５（ｍ，１Ｈ）；５．４４−５．６３（ｍ，２Ｈ）；５．６６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．２７（広幅ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．３２（ｍ，３Ｈ）；７．４０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．５０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．６１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．１２（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１９０】
ＳＥＣ  Ｍｗ＝１４１４０ｇ／ｍｏｌ，Ｍｎ＝１１２１０ｇ／ｍｏｌ，Ｄ＝１．２６。
【０１９１】
ナノ粒子製剤：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−グルタリル−カバジタキセル（３０ｍｇ）をアセトン（１．５ｍｌ）中に溶解させる。この溶液を撹拌（５００ｒｐｍで２０分間）しながらＷＦＩ（３ｍｌ）に一滴ずつ添加する。次いで、アセトンを回転蒸発器を用いて真空下３７℃で蒸発させる。
【０１９２】
次いで、蒸発中の水の損失を補うためにナノディスパージョンの最終容量を３ｍＬに調節する。
【０１９３】
ナノディスパージョンの最終濃度：１０ｍｇ／ｍＬ
平均直径（ＤＬＳを用いる）＝６０ｎｍ，ＰＤＩ＝０．２１。
【０１９４】
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ジグリコリル−カバジタキセル（ＸＩ）の合成
ジグリコリル−カバジタキセルの製造
【０１９５】
【化４０】
0006013354.tif 000041
２５０ｍｌのフラスコに窒素下でカバジタキセルアセトン溶媒和物（５ｇ，５．６２ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１００ｍｌ）、無水ジグリコール酸（６．５３ｇ，５６．２２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１０７，０．５６ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を２２℃に一晩加熱した後、水（５０ｍｌ）で２回洗浄する。有機溶液をＭｇＳＯ４で脱水した後、溶液を減圧下４０℃で濃縮乾固する。乾燥抽出物を４容量のジイソプロピルエーテルで処理し、懸濁液を３０分間撹拌し、次いで濾過し、固体を２容量のジイソプロピルエーテルで２回洗浄する。減圧下４０℃で乾燥した後、５．０４ｇの白色粉末を得る。
【０１９６】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ）：０．９６（ｓ，３Ｈ）；０．９８（ｓ，３Ｈ）；１．３７（ｍ，９Ｈ）；１．４４−１．５８（ｍ，２Ｈ）；１．５１（ｓ，３Ｈ）；１．８０（広幅ｓ，４Ｈ）；２．２３（ｓ，３Ｈ）；２．６７（ｍ，１Ｈ）；３．２１（ｓ，３Ｈ）；３．２８（ｓ，３Ｈ）；３．５８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）；３．７５（ｄｄ，Ｊ＝６．８＆１０．５Ｈｚ，１Ｈ）；４．０２（ｓ，２Ｈ）；４．１３（ｓ，２Ｈ）；４．３１（ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．３８（ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．５１（ｓ，１Ｈ）；４．７０（ｓ，１Ｈ）；４．９５（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．０６（ｍ，１Ｈ）；５．１６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．３７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）；５．８２（広幅ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）；７．１９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）；７．３６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．４３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．６６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．７３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）；７．８８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）；７．９７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；１２．７８（非常に広幅ｓ，１Ｈ）
【０１９７】
ジグリコリル−カバジタキセルのコポリマー（ＶＩ’）とのコンジュゲーション
【０１９８】
【化４１】
0006013354.tif 000042
２５ｍｌのフラスコに窒素下でｍＰＥＧ−ＰＬＡ−Ｙ−ＯＨコポリマー（ＶＩ’）（０．２ｇ，０．０１５７ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（４ｍｌ）中のジグリコリル−カバジタキセル（３２．３ｍｇ，２．２ｅｑ）、次いで粉末状活性化モレキュラーシーブ４Ａ（１００ｍｇ）を添加する。１０分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（４．４ｍｇ，２．３ｅｑ．）及びＤＩＰＣ（４．３ｍｇ，２．２ｅｑ．）を添加する。懸濁液を３５℃で２４時間撹拌した後、濾過する（０．２２ミクロン）。有機相を濃縮乾固し、抽出物をメタノール（４０ｍｌ）及びジクロロメタン（２滴）で処理する。懸濁液をＲＴで２時間撹拌し、次いで濾過し、固体を減圧下ＲＴで乾燥して、１８４ｍｇの予想される化合物を得る。
【０１９９】
ＮＭＲ  １Ｈスペクトル（５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ３−ｄ）：１．２１（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，３Ｈ）；１．２６（ｍ，３Ｈ）；１．３５（ｓ，９Ｈ）；１．４０−１．７０（ｍ，４８６Ｈ）；１．７２（ｓ，３Ｈ）；１．８０（ｍ，１Ｈ）；２．０１（広幅ｓ，３Ｈ）；２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．２１（ｍ，１Ｈ）；２．３２（ｍ，１Ｈ）；２．４５（広幅ｓ，３Ｈ）；２．７１（ｍ，１Ｈ）；３．３１（ｓ，３Ｈ）；３．３８（ｓ，３Ｈ）；３．４５（ｓ，３Ｈ）；３．４８−３．８１（ｍ，１８０Ｈ）；３．８６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）；３．９１（ｄｄ，Ｊ＝６．６＆１１．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．０８−４．４０（ｍ，８Ｈ）；４．８３（ｓ，１Ｈ）；５．０２（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．０３−５．３３（ｍ，１６２Ｈ）；５．４０−５．５７（ｍ，３Ｈ）；５．６７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．２９（広幅ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）；７．３１（ｍ，３Ｈ）；７．４０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．５０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．６０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．１１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ）。
【０２００】
ＳＥＣ  Ｍｗ＝１４８３０ｇ／ｍｏｌ，Ｍｎ＝１１９２０ｇ／ｍｏｌ，Ｄ＝１．２４。
【０２０１】
ナノ粒子製剤：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−ジグリコリル−カバジタキセル（３０ｍｇ）をアセトン（１．５ｍｌ）中に溶解させる。溶液を撹拌（５００ｒｐｍで２０分間）しながらＷＦＩ（３ｍｌ）に一滴ずつ添加する。次いで、アセトンを回転蒸発器を用いて真空下（３０分間で３００ｍｂａｒから４５ｍｂａｒに）３７℃で蒸発させる。
【０２０２】
次いで、蒸発中の水の損失を補うためにナノディスパージョンの最終容量を３ｍＬに調節する。
【０２０３】
ナノディスパージョンの最終濃度：１０ｍｇ／ｍＬ
平均直径（ＤＬＳを用いる）＝５２ｎｍ，ＰＤＩ＝０．１８。
【０２０４】
カバジタキセルコンジュゲートナノ粒子製剤のインビトロ放出研究
３つのカバジタキセルコンジュゲートナノ粒子製剤、すなわちＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−カバジタキセル、ＰＥＧ−Ｙ−グルタリル−カバジタキセル及びＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−ジグリコリル−カバジタキセルからの遊離カバジタキセルのインビトロ放出カイネティックスをＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから得た血漿（血漿中１０ｍＭの最終濃度まで５００ｍＭ  リン酸緩衝液を用いて予め緩衝した）において高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を用いて評価した。血漿アリコートを収容しているバイアルに、標準カバジタキセルまたはカバジタキセルコンジュゲートナノ粒子製剤（１ｍｇ／ｍＬ）を８００μＬの最終容量に達するようにマイクロピペットを用いて添加した。次いで、バイアルを撹拌装置（撹拌速度２５０ｒｐｍ）上に３７℃で置いた。サンプル分析を０時間目、１時間目、２時間目、４時間目、１６時間目及び２４時間目に実施した。
【０２０５】
時間間隔毎に、１００μＬのサンプルをアセトニトリル：水  ８５：１５ｖ／ｖ（０．３ｍＬ）を収容しているバイアル中に集め、５分間撹拌してタンパク質を沈殿させ、遊離カバジタキセルを抽出した。次いで、内容物を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、透明な上清を集め、ＨＰＬＣを用いて定量した。
【０２０６】
使用したＨＰＬＣ条件は次の通りであった：
カラム：１５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢフェニル  ３．５μｍ
流束：１ｍＬ  分；カラム温度は３０℃であった。
２３０ｎｍ（滴定のために使用した原理）及び２１０ｎｍでの紫外（ＵＶ）二重検出モード
無勾配移動相：アセトニトリル  ６０％／水  ４０％／トリフルオロ酢酸  ０．００６％
カバジタキセルの保持時間＝４．１分。
【０２０７】
結果を下表に要約する。
【０２０８】
【表１】
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【０２０９】
ラット血漿でのインビトロ放出研究から、すべてのカバジタキセルコンジュゲート製剤が持続性薬物放出プロフィールを示し、異なるリンカーを用いて合成したコンジュゲートにより異なる放出プロフィールが生じた（図３）ことが明らかとなった。スクシニルリンカーを含有しているコンジュゲートは最も遅い放出プロフィール（２４時間で〜１７％の遊離カバジタキセルが放出された）を示し、次いでグルタリルリンカーを含有しているコンジュゲート（２４時間で〜２７％の遊離カバジタキセルが放出された）であった。一方、ジジリコリルリンカーを含有しているコンジュゲートの場合には比較的迅速な放出が観察された（２４時間で〜４７％の遊離カバジタキセルが放出された）。特に、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−カバジタキセルの場合には、スクシニル−カバジタキセルの放出をＨＰＬＣを用いて定量した。結果は、無視できる濃度（ナノ粒子中に最初に存在するカバジタキセルの＜１％）のスクシニル−カバジタキセルしか製剤から放出されなかったことを示した。結局、薬物放出の順序は次の通りであった：ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−ジグリコリル−カバジタキセル＞ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−グルタリル−カバジタキセル＞ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｙ−スクシニル−カバジタキセルナノ粒子。これらの結果は、異なるリンカーを有するカバジタキセルコンジュゲートによりインビトロ放出プロフィールが異なることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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