(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の検出方法であって、
二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備え、標的核酸に関連付けられる核酸増幅産物と、前記タグ鎖の１つとハイブリダイズ可能なプローブとを、目的ハイブリダイズ産物が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、
を備え、
前記ハイブリダイゼーション工程は、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）前記増幅用プライマーを含む前記核酸増幅産物を得るための増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物であって、前記標識物質又は前記標識物質結合物質を保持しうるとともに前記タグ鎖を備える増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとによる偽陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する工程であり、
前記増幅産物を得るための増幅工程後であって、前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、
前記少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部と、当該一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、がハイブリダイズしたクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を備える、検出方法。
【請求項２】
前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を融解後、前記（ｂ）の核酸構造体の構成鎖と前記マスキング剤とから前記クリーンアップハイブリダイズ産物を形成する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を熱融解する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を酸又はアルカリで融解する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を核酸変性剤で融解する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項６】
前記マスキング剤は、前記（ａ）の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記マスキング剤は、前記（ｂ）の核酸構造体の少なくとも一部と同一又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記核酸増幅産物は、前記二本鎖部分と、前記二本鎖の一方の端部にのみ突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備える核酸増幅産物を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーション工程は、クロマトグラフィー形態で実施する、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーション工程は、浸漬型ハイブリダイゼーションの形態で実施する、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
核酸ハイブリダイゼーションのための核酸増幅産物の精製方法であって、
二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物を取得する増幅工程後に、
前記核酸増幅産物の存在下で、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）前記増幅用プライマーを含む前記核酸増幅産物を得るための増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物であって、前記標識物質又は前記標識物質結合物質を保持しうるとともに前記タグ鎖を備える増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤をハイブリダイズ可能に付与する工程
を備える、精製方法。
【請求項１２】
核酸増幅産物を取得しその後核酸ハイブリダイゼーションに先だって前記増幅産物を精製するための精製剤であって、
前記核酸増幅産物は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物であり、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）前記増幅用プライマーを含む前記核酸増幅産物を得るための増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物であって、前記標識物質又は前記標識物質結合物質を保持しうるとともに前記タグ鎖を備える増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤を含む、精製剤。
【請求項１３】
二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物を得るための少なくとも一対の増幅用プライマーと、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）前記増幅用プライマーを含む前記核酸増幅産物を得るための増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物であって、前記標識物質又は前記標識物質結合物質を保持しうるとともに前記タグ鎖を備える増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、
を含む、前記核酸増幅産物を取得しその後前記核酸増幅産物を精製する、核酸ハイブリダイゼーションのためのキット。
【請求項１４】
さらに、核酸クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー用プローブ固定化体を含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、標的核酸の検出方法に関する。
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年７月２４日に出願された日本国特許出願である特願２０１３−１５３２８８及び２０１４年４月１日に出願された日本国特許出願である特願２０１４−０７５４６９に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を本明細書に援用するものである。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の検出方法として、標的核酸に基づき、ＤＮＡ二本鎖断片の末端に一本鎖のタグを付加したものをＰＣＲの増幅産物として取得し、この増幅産物のタグの相補鎖をプローブとしてクロマトグラフィーを用いることが開示されている（特許文献１、２）。これらの方法では、通常用いられるプライマーの５’末端側に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害又は抑制するように修飾した一本鎖タグとなる領域を有している。こうしたプライマーを用いることで、このプライマーの伸長産物とハイブリダイズするプライマーは、一本鎖タグに相補鎖を形成するように伸長されることはない。こうした伸長反応の繰り返しにより、結果として、一本鎖タグを備える増幅産物が得られる。【０００３】
一方、核酸増幅後におけるプライマー、プライマーダイマーを除去できる試薬も開示されている（非特許文１、２）。この方法では、増幅産物にその試薬を添加し、静置後、１３０００ｇで１０分間遠心後、ペレットをエタノール洗浄し、１４０００ｇで遠心してペレットを採取することで、プライマーやプライマーダイマー等の１００ｂｐ以下程度の低分子ＤＮＡを除去できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０７０６１８号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０３９２２８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗａｋｏ ＢｉｏＷｉｎｄｏｗ １０，Ｎｏ．９１、ｐ．５（和光純薬工業株式会社、２００８年１０月発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＣＲの増幅産物には、標的核酸に関連付けられる増幅産物のほか、未反応プライマーが含まれうるし、また、プライマーの塩基配列によっては、プライマーダイマーの増幅産物が含まれうる。こうした副生成物は、通常のハイブリダイゼーションではプローブと反応することが想定しにくかった。【０００７】
核酸増幅産物に付与した一本鎖タグをプローブへのハイブリダイズ部位とする系では、変性して核酸増幅産物を一本鎖にすることなく、そのままプローブとハイブリダイズさせることができるという利点がある。また、比較的低温でハイブリダイゼーションを実施できるという利点もある。【０００８】
しかしながら、本発明者らによれば、熱変性を省略し比較的低温でハイブリダイゼーションを実施する場合には、予想を超えて、こうした未反応プライマーやプライマーダイマーの増幅産物が、プローブとハイブリダイズ産物を形成してしまうことがわかった。この結果、標識物質や標識物質に結合しうる標識物質結合物質を備えるプライマーやプライマータイマー由来の増幅産物がプローブとハイブリダイズ産物を形成すると、偽陽性となってしまうことがわかった。【０００９】
本明細書は、こうした課題に鑑み、一本鎖タグを付与した核酸増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを、良好な確度で実施することができる、標的核酸の検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、種々検討した結果、増幅反応の副生成物とプローブとのハイブリダイズ産物の形成を抑制することにより、偽陽性を抑制できるという知見を得た。この知見に基づき、本明細書は、以下の手段を提供する。【００１１】
（１）標的核酸の検出方法であって、
二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備え、標的核酸に関連付けられる核酸増幅産物と、前記タグ鎖の１つとハイブリダイズ可能なプローブとを、目的ハイブリダイズ産物が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、
を備え、
前記ハイブリダイゼーション工程において、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとのと偽陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する、検出方法。
（２）前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、
前記少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部と、当該一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、がハイブリダイズしたクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程
を備える、（１）に記載の検出方法。
（３）前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記クリーンアップハイブリダイズ産物を、前記（ｂ）の核酸構造体を融解後、前記（ｂ）の核酸構造体の構成鎖と前記マスキング剤とから形成する、（２）に記載の検出方法。
（４）前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を熱融解する、（３）に記載の検出方法。
（５）  前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を酸又はアルカリで融解する、（３）に記載の検出方法。
（６）  前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を核酸変性剤で融解する、（３）に記載の検出方法。
（７）前記マスキング剤は、前記（ａ）の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、（２）〜（６）いずれかに記載の方法。
（８）前記マスキング剤は、前記（ｂ）の核酸構造体の少なくとも一部と同一又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、（２）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記核酸増幅産物は、前記二本鎖部分と、前記二本鎖の一方の端部にのみ突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備える核酸増幅産物を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の検出方法。
（１０）前記ハイブリダイゼーション工程は、クロマトグラフィー形態で実施する、（１）〜（９）のいずれかに記載の検出方法。
（１１）  前記ハイブリダイゼーション工程は、浸漬型ハイブリダイゼーションの形態で実施する、（１）〜（９）のいずれかに記載の検出方法。
（１２）核酸増幅産物の精製方法であって、
二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物の存在下で、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤をハイブリダイズ可能に付与する工程
を備える、精製方法。
（１３）核酸増幅産物の精製剤であって、
前記核酸増幅産物は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物であり、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤を含む、精製剤。
（１４）二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物を得るための少なくとも一対の増幅用プライマーと、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、
を含むキット。
（１５）さらに、核酸クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー用プローブ固定化体を含む、（１４）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】副生ハイブリダイズ産物の形成状態を示す図である。
【図２Ａ】本発明の検出方法におけるクリーンアップハイブリダイズ産物形成状態の一例を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の検出方法におけるクリーンアップハイブリダイズ産物形成状態の他の一例を示す図である。
【図３Ａ】一本鎖タグを有する核酸増幅産物の増幅の一例を示す図である。
【図３Ｂ】一本鎖タグを有する核酸増幅産物の増幅の他の一例を示す図である。
【図４】一本鎖タグを有する核酸増幅産物の一例を示す図である。
【図５】一方の端にハイブリダイズタグを備え他方の端に標識物質を備える核酸増幅産物の増幅工程を示す図である。
【図６】一方の端にハイブリダイズタグを備え他方の端に標識物質結合物質を備える核酸増幅産物の増幅工程を示す図である。
【図７】二本鎖部分に標識物質又は標識物質結合物質を備える核酸増幅産物の増幅工程を示す図である。
【図８】実施例１で用いたメンブレンアレイ上のプローブの配置状態を示す平面図である。
【図９】実施例１におけるハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合）を示す図である。
【図１０】実施例１におけるハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない場合）を示す図である。
【図１１】実施例２で用いたクロマトグラフィーにおけるプローブの配置状態を示す平面図である。
【図１２】実施例２におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合）を示す図である。
【図１３】実施例２におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない場合）を示す図である。
【図１４】実施例３におけるハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。
【図１５】実施例４におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。
【図１６】実施例５におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。
【図１７】実施例７におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。
【図１８】実施例８におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書は、標的核酸の検出方法、核酸増幅産物の精製方法、核酸増幅産物の精製剤及び検出キット等に関する。
【００１４】
本明細書の開示によれば、一本鎖タグをプローブとのハイブリダイズ部位として備える核酸増幅産物に付随しうる未反応プライマー、プライマーダイマー増幅産物などの核酸構造体とプローブとのハイブリダイズ産物を排除することで、意図しないハイブリダイズ産物の形成を抑制して、意図した核酸増幅産物とプローブとのハイブリダイズ産物のみをハイブリダイゼーション工程において得ることができる。この結果、検出感度の低下や偽陽性を回避して確度の高い検出が可能となる。
【００１５】
図１に、副生ハイブリダイズ産物の形成状態の概略を示す。
【００１６】
さらに、図２に、副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制された状態の概略を示す。図２に示すように、こうした核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤とをハイブリダイズするようにすることで、核酸構造体のプローブとのハイブリダイズ能を抑制又は阻害することができる。この結果、簡易かつ迅速に副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制でき、偽陽性の発生を抑制できる。非特許文献３，４記載のプライマーダイマー除去試薬を用いる場合、煩雑な操作と時間が必要となるが、各種核酸構造体とマスキング剤とをハイブリダイズさせることで、簡易でかつ短時間で副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。核酸構造体とマスキング剤とのハイブリダイズは、本来のハイブリダイゼーション工程に先立つ先行ハイブリダイゼーション工程や前処理等として実施できる。
【００１７】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された標的核酸の検出方法を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
【００１８】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００１９】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【００２０】
以下、本明細書の開示に関するいくつかの実施形態を、適宜図面を参照して説明する。なお、本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体を意味しており、その数は特に限定しない。核酸は、数十程度のヌクレオチドが連結したオリゴヌクレオチドが包含され、さらに長いポリヌクレオチドも包含される。核酸は、ＤＮＡ１本鎖若しくは二本鎖のほか、ＲＮＡ一本鎖若しくは二本鎖、さらには、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラなども包含される。また、核酸は、天然の塩基、ヌクレオチド及びヌクレオシドからなるもののほか、非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むものであってもよい。また、核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡのほかペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。
【００２１】
また、本明細書において「標的核酸」とは、特に限定されないでその存在及び／又は量を検出するべき任意の核酸である。標的核酸は、天然のあるいは人工的に合成されたものであってもよい。天然の標的核酸としては、例えば、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒト、非ヒト動物などの生物における遺伝子上の指標となる塩基あるいは塩基配列を含んでいる。典型的には、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。また、合成の標的核酸としては、人為的になんらかの識別のために合成された核酸が挙げられる。また、ある種の天然あるいは人工の核酸に対して核酸増幅反応を行って得られる増幅産物が挙げられる。
【００２２】
標的核酸は、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸が増幅された増幅産物を用いることが好ましい。
【００２３】
本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料採取源は特に限定されないが、標的核酸が含まれうる試料としては、各種の生体由来の試料（血液、尿、痰、唾液、組織、細胞（各種の動物由来の培養動物細胞、培養植物細胞、培養微生物細胞を含む）等）あるいは、こうした生体試料からＤＮＡを抽出したＤＮＡ抽出試料等が挙げられる。さらには、上記生体試料からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡに変換したＤＮＡ試料等も含まれる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
【００２４】
本明細書において「標的配列」とは、検出対象の標的核酸に特徴的な１又は２以上の塩基からなる配列をいう。例えば、標的核酸同士のホモロジーの低い部分配列であってもよいし、試料に含まれる可能性のある他の核酸に相補性もしくは相同性の低い配列であってもよい。標的配列は、標的核酸に特徴的な配列であってもよい。こうした標的配列は、人工的に配列を変更したものであってもよい。
【００２５】
本明細書において、核酸クロマトグラフィーとは、キャピラリー現象により液体（展開媒体）を拡散・移動可能な多孔質状の固相担体を用いて、前記液体により核酸を固相担体内を移動させて固相担体に予め準備したプローブとの特異的な塩基対合によってハイブリダイズ産物を形成させて前記核酸を固相担体に補足するクロマトグラフィーをいう。
【００２６】
以下では、本明細書の開示の代表的かつ非限定的な具体例について、図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本明細書の開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本明細書の開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善された標的核酸の検出方法等を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
【００２７】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本明細書の開示を実施する際に必須のものではなく、特に本明細書の開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本明細書の開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００２８】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【００２９】
（標的核酸の検出方法）
本明細書に開示される標的核酸の検出方法は、少なくとも１つの一本鎖であるタグ鎖（一本鎖タグ）を備える核酸増幅産物と、前記タグとハイブリダイズ可能なプローブとを、これらがハイブリダイズ可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程を備えることができる。本検出方法は、このハイブリダイゼーション工程において、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）核酸増幅産物の増幅用プライマー
（ｂ）増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物、
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとのと副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する、ことを特徴とする。
【００３０】
以下、本検出方法で用いる核酸増幅産物及びその取得工程について説明する。核酸増幅産物の取得工程は、ハイブリダイゼーション工程に先立って、本検出方法の一工程として実施してもよい。
【００３１】
（核酸増幅産物）
本検出方法における、少なくとも１つの一本鎖タグを備える核酸増幅産物は、図３Ａ及び図３Ｂの最下段に示すように、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備えている。核酸増幅産物は、図３Ａに示すように、二本鎖の一方の端部に１つの一本鎖タグを備えるものであってもよいし、図３Ｂに示すように、二本鎖の双方の端部にそれぞれ一本鎖タグを備えるものであってもよい。一本鎖タグは、二本鎖の各構成鎖の５’末端に位置されることが好ましい。
【００３２】
核酸増幅産物における二本鎖部分は、概して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長反応の基質となりうる天然塩基（アデニン、グアニン、チミン及びシトシン）を備えるヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で連結された構造を有するが、これに限定するものではない。
【００３３】
核酸増幅産物の、１つの一本鎖タグが、標的核酸に予め関連付けられたプローブとハイブリダイズ可能である。すなわち、特定プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列を有している。典型的には、１つの一本鎖タグ（以下、ハイブリダイズタグともいう。）は、特定プローブと完全に相補的なタグ配列を有している。核酸増幅産物が、もう１つの一本鎖タグを備えるとき、当該タグは、例えば、標識物質結合領域等として用いることができる。
【００３４】
ハイブリダイズタグは、核酸増幅反応によって合成可能に、概して、天然塩基（アデニン、グアニン、チミン及びシトシン）を備えるヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で連結された構造を有するが、これに限定するものではない。核酸増幅反応によらない非天然の合成によるオリゴヌクレオチド鎖であってもよい。このヌクレオチド鎖は、バックボーンに関しても、いわゆる天然のリボース−リン酸バックボーン以外にも、ＰＮＡ(ペプチド核酸）のバックボーン、ＢＮＡ（架橋化核酸）などのバックボーン等公知の人工的バックボーンを採用できる。また、塩基についても、プローブとの特異的とハイブリダイズ可能であればよいので、プローブを対応させることを前提に、非天然の、例えば、Ｌ−ＤＮＡを備えていてもよいし、Ｌ−ＤＮＡのみからなっていてもよい。また、非天然塩基を有していてもよく、非天然塩基のみから構成されていてもよい。
【００３５】
ハイブリダイズタグは、プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を有している。タグ配列の塩基長は、プローブの検出用配列の塩基長に一致し、好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下であり、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
【００３６】
核酸増幅産物は、検出しようとする標的核酸に関連付けられている。すなわち、標的核酸を含む可能性のある試料中の標的核酸を特異的に増幅できるように構築されたプライマーセットにより増幅される。また、核酸増幅産物は、一本鎖タグを付与するために、概して、後述する連結部位を備えたものとなっている。
【００３７】
（核酸増幅産物の取得工程）
こうした核酸増幅産物は、例えば、以下に示すプライマーセットを用いるＤＮＡポリメラーゼによる核酸増反応で得ることができる。本工程における核酸増幅法は、ＰＣＲを始めとするＤＮＡポリメラーゼ反応を用いてＤＮＡ等を鋳型として増幅して二重鎖ＤＮＡ断片を取得する各種の公知の方法が挙げられる。こうした工程の概要を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
【００３８】
図３Ａに示す工程では、第１のプライマーは、標的核酸に予め関連付けられたプローブに対するハイブリダイズタグである第１の任意の塩基配列と標的核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、第１の任意配列と第１の認識配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有している。また、第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。
【００３９】
連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼの反応を抑制又は停止させる。すなわち、当該連結部位は、天然塩基等を含まないなどの理由により、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の鋳型とはなりえない。このため、図３Ａに示すように、第１のプライマーによって増幅されたＤＮＡ一本鎖が鋳型鎖となって、さらに第２のプライマーによって増幅されるとき、第２のプライマーからのＤＮＡ伸長反応は、当該連結部位に対合する部位より３’側において抑制又は停止される。このため、増幅工程により得られる増幅産物片（ＤＮＡ二重鎖断片）は、結果として、一方の端部に第１の任意の塩基配列を突出する一本鎖として備えるとともに塩基の対合による二重鎖部分を備えたものとなると推論される。
【００４０】
また、図３Ｂに示す工程では、第２のプライマーが、第２の任意の塩基配列をさらに有し、当該第２の任意の塩基配列と第２の識別配列との間に前記連結部位を有する場合の工程を示す。図３Ｂに示すように、図３Ａで示した第１のプライマーと同様、第２のプライマーによって増幅されたＤＮＡ一本鎖が鋳型鎖となって、さらに第１のプライマーによって増幅されるとき、第１のプライマーからのＤＮＡ伸長反応は、当該連結部位に対合する部位より３’側において抑制又は停止される。このため、工程により得られる増幅産物（ＤＮＡ二重鎖断片）は、結果として、一方の端部にハイブリダイズタグを突出した一本鎖として備え、他方の端部に任意の塩基配列を突出した一本鎖として備えるとともに、塩基の対合による二重鎖部分を備えたものとなると推論される。なお、図３Ｂに示す形態では、第２のプライマーに由来する第２の任意の塩基配列は、標識物質や標識結合物質などを付与する部位（標識タグ）とすることもできる。
【００４１】
以下に、一本鎖タグを備える核酸増幅産物の取得工程についてより詳細に説明する。この核酸増幅産物は、以下の第１のプライマー及び第２のプライマーのセットにより取得できる。核酸増幅は、これらのプライマーを用いて実施する。核酸増幅法は既に説明したように各種公知の方法を適用できるが、典型的にはＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ等の各種ＰＣＲである。核酸増幅工程を実施するにあたっての、溶液組成、温度制御、時間等については、当業者であれば適宜設定することができる。
【００４２】
(第１のプライマー）
第１のプライマーは、ハイブリダイズタグと、第１の識別配列と、ＤＮＡポリメラーゼよるＤＮＡの鎖伸長反応を抑制又は停止可能な連結部位と、を備えている。既に記載したように、連結部位を備えることで、核酸増幅反応により、ハイブリダイズタグを備える第１の鎖を含む核酸増幅産物を合成できる。また、こうした連結部位を備えることで、ハイブリダイズタグの自由運動性を向上させることができ、プローブとの効率的なハイブリダイゼーションが可能となる。第１のプライマーは、概して、５‘側からハイブリダイズタグ、連結部位及び第１の識別配列を備えている。
【００４３】
（ハイブリダイズタグ）
ハイブリダイズタグは既に説明したとおりである。タグ配列は、増幅断片が検出用プローブとハイブリダイゼーションを可能とするための配列であり、標的核酸を検出するものであるため、標的核酸毎に検出用プローブの検出用配列にハイブリダイズ可能に設定される。典型的には、検出用配列に相補的な塩基配列となっている。したがって、一つの標的核酸は、一つのプローブに対応付けられることになる。
【００４４】
（第１の識別配列）
第１の識別配列は、核酸増幅により、標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の一部を構成する第１の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第１の識別配列は、第１の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
【００４５】
標的核酸中の第１の塩基配列と第２の塩基配列とは、標的核酸に対してどのような構成となっていてもよい。例えば、ＤＮＡ上の変異を検出する場合、いずれか一方の塩基配列にのみ１又は２以上の塩基の変異部位が含まれるようにしてもよいし、双方に変異部位が含まれるようにしてもよい。なお、第１のプライマーは、こうしたタグ配列及び第１の識別配列を有しており、こうした塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
【００４６】
（連結部位）
連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸（ないし塩基）がないとそれ以上ＤＮＡ鎖を伸長しないとされている。このため、本発明の連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まない。こうした天然塩基等を含まないことで、前記鋳型となることを回避して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を抑制又は回避できる。したがって、連結部位は、天然塩基等を有しないない単なる骨格鎖だけであってもよい。すなわち、糖−リン酸骨格や、他の公知の人工オリゴヌクレオチドに適用される骨格であってもよい。なお、ＤＮＡポリメラーゼは、各種公知のＤＮＡポリメラーゼが包含される。典型的には、各種ＰＣＲなどの核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００４７】
また、連結部位は、リン酸ジエステル結合を介してヌクレオチドに隣接される、元素数が２以上４０以下である一重鎖構造を含む鎖状の連結基であってもよい。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止が不完全になりやすく、元素数が４０を超えると、ヌクレオチドの溶解性が低下するおそれがあるからである。ＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止の効果を考慮すると、鎖状の連結基の元素は、２以上３６以下であることが好ましく、より好ましくは３以上１６以下である。
【００４８】
連結部位が、一重結合を含むのは、連結部位における回転を容易にするためであり、一重結合は、炭素−炭素一重結合、炭素−酸素一重結合、炭素−窒素一重結合、Ｓ−Ｓ一重結合などが挙げられる。連結部位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。また、連結部位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。
【００４９】
連結部位としては、元素数が２以上４０以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、構造的に簡易であるほか、連結部位としての導入も容易である。
【００５０】
こうした連結部位としては、例えば、以下の式（１）で表される連結部位が挙げられる。
５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’          式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）
【００５１】
式（１）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（１）中のＨの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１〜８であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
【００５２】
また、他の連結部位としては、以下の式（２）で表される連結部位が挙げられる。
５’−（ＯＣnＨ2n）l−Ｏ−３’        式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。）
【００５３】
式（２）において（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（２）中のＨの置換基は、式（１）中の置換基と同様の態様が適用される。
【００５４】
連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
【００５５】
【化１】
0005967785.tif 000002
【００５６】
さらに、連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
【００５７】
【化２】
0005967785.tif 000003
【００５８】
連結部位は、このほか、強固なヘアピン構造やシュードノット構造のようにポリメラーゼの進行を阻害する立体構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸や人工核酸等の標的核酸天然型核酸や、ＲＮＡ及び脂肪鎖のような非核酸構造が挙げられる。人工核酸としては、ペプチド核酸、架橋化核酸、アゾベンゼン等が挙げられる。
【００５９】
（第２のプライマー）
第２のプライマーは、核酸増幅産物の第１の鎖と対合する第２の鎖を得るためのプライマーである。図４に示すように、第２のプライマーは、連結部位を含まずに構成することができる。こうした第２のプライマーを用いることで、ハイブリダイズタグのみを備える核酸増幅産物（一方にのみ一本鎖タグを備える核酸増幅産物）を得ることができる。ハイブリダイズタブのみを備える核酸増幅産物は、特に、クロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーション工程において、高い感度と正確性で標的核酸を検出できるため好ましい。
【００６０】
（第２の識別配列）
既に説明したように、第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。第２の識別配列は、核酸増幅により、第１のプライマーとともに標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の他の一部を構成する第２の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第２の識別配列は、第２の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
【００６１】
図５に示すように、第２のプライマーは、予め標識物質を備えることができる。標識物質４０は、固相担体上でプローブに結合した部分二本鎖核酸１０を検出するためのものである。標識物質としては後述するが、従来公知のものを適宜選択して用いることができる。標識物質は、第２のプライマーの５’末端に備えられていることが好ましい。
【００６２】
また、第２のプライマーは、図６に示すように、標識物質結合物質を備えていてもよい。標識物質結合物質は、第２のプライマーの５’末端に備えられていることが好ましい。さらに、第２のプライマーは、図７に示すように、標識物質及び標識物質結合物質を備えていなくてもよい。すなわち、増幅工程において、標識物質又は標識物質結合物質を備えるヌクレオシド誘導体三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸組成物を用いて核酸増幅反応を実施することで、ＤＮＡ伸長部位に標識物質又は標識物質結合物質が導入され標識された核酸増幅産物を得ることができるからである。
【００６３】
第２のプライマーにおいては、その５’側から、標識物質又は標識物質結合物質、第２の識別配列の順でこれらを有していることが好ましい。これにより、５’末端に標識物質又は標識物質結合物質を備える第２の鎖を得ることができる（図４〜図６参照）。
【００６４】
第２のプライマーが、連結部位を備えるとき、２つの一本鎖タグを備える核酸増幅産物を得ることができる。すなわち、ハイブリダイズタグと、もう１つの一本鎖タグ（例えば標識タグ）を備える核酸増幅産物を得ることができる（図３Ｂ参照）。
【００６５】
連結部位を備える第２のプライマーは、標識タグ、連結部位及び第２の識別配列を備えることができる。標識タグは、標識物質又は標識物質結合物質を保持する標識プローブと特異的にハイブリダイズ可能に形成されている。こうした標識プローブは後述するハイブリダイゼーション工程や検出工程において固相担体上のプローブとハイブリダイズしたハイブリダイズ産物の標識タグとハイブリダイズさせて、そのハイブリダイズ産物を標識することができる。
【００６６】
（標識物質）
標識物質又は標識物質結合物質は、最終的に核酸増幅産物のいずれかの箇所に備えられていればよい。第２のプライマーに依拠して増幅工程、ハイブリダイゼーション工程及び検出工程のいずれかで組み込まれてもよいし、第２のプライマーに依拠せずに、増幅工程において、標識物質又は標識物質結合物質を備えるヌクレオシド誘導体三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸組成物を用いて核酸増幅反応を実施することで核酸増幅産物に組み込まれていてもよい。
【００６７】
本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
【００６８】
標識物質は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。検出工程で迅速かつ簡易に行うことができる。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
【００６９】
この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００７０】
標識物質は上記のように、その一部に粒子を備えていてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、０．１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、固相担体の孔径等によって適宜選択することができる。
【００７１】
好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
【００７２】
標識物質結合物質は、タンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用等を利用できる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように修飾される。増幅産物が標識物質結合物質を備える場合には、ハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物の標識物質結合物質と、標識物質結合物質と結合する部位を備える標識物質との複合体を形成させて、標識物質により増幅産物を検出する。
【００７３】
こうした標識物質や標識物質結合物質は商業的に入手できるほか、標識物質及び標識物質結合物質の製造及び標識物質等を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子や標識物質結合物質と、ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
【００７４】
こうしたプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法にしたがって合成することができる。例えば、連結部位については、アルキレン鎖を有するホフォスホアミダイト試薬を用いて合成することができる。こうした試薬自体は、公知であり、例えば、GlenResearch社等から入手することができる。例えば、以下の試薬が挙げられる。なお、以下の式においてＤＭＴは、水酸基保護基として典型的なジメトキシトリチル基を表すが、他の公知の水酸基保護基であってもよい。また、以下の式においてＰＡは、ホスホアミダイト基を表す。
【００７５】
【化３】
0005967785.tif 000004
【００７６】
ハイブリダイズタグを有する核酸増幅産物は、プローブとハイブリダイゼーションさせるとき、熱変性させなくても、極めて高感度にかつ迅速に標的核酸を検出できる。
【００７７】
以上説明した核酸増幅産物の取得工程は、２以上の標的核酸について同時に実施することができる。複数の標的核酸に関連付けられた複数の増幅産物を一挙に得る工程は、一般的にはマルチプレックスＰＣＲと称される。
【００７８】
本検出方法は、複数の標的核酸からそれぞれ核酸増幅産物を得る場合において特に有意義である。こうした場合においては、通常、それぞれの標的核酸に応じて複数のプライマーセットを用いる。こうした場合には、プライマーダイマーの形成を抑制することが困難な場合が多く、偽陽性を呈する可能性が高いからである。
【００７９】
（ハイブリダイゼーション工程）
本検出方法は、核酸増幅産物を、標的核酸に予め関連付けられたハイブリダイズタグとこの標的核酸と予め関連付けられたプローブとを、これらのハイブリダイズ産物（目的ハイブリダイズ産物）が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、を備える。
【００８０】
目的ハイブリダイズ産物が形成可能な条件は当業者であれば適宜設定できる。すなわち、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度及び溶媒の種類等、ハイブリダイゼーション時間は当業者であれば適宜設定できる。本検出方法において、特には、クロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーションでは、例えば、１０℃〜５０℃程度、好ましくは２０℃〜３５℃程度で、数分から数十分程度、典型的には、３０分以内、好ましくは２０分以内でハイブリダイゼーション工程を実施できる。
【００８１】
ハイブリダイゼーション工程においては、核酸増幅産物において第２のプライマー等に基づいて予め標識物質を備えていない場合には、適宜、こうした標識物質や標識結合物質を備える標識プローブを供給するようにして、後段での検出工程で目的ハイブリダイズ産物を検出できるようにすることができる。
【００８２】
本検出方法においては、核酸増幅産物は、ハイブリダイズタグを一本鎖として備えているため、核酸増幅産物をプローブとハイブリダイズ可能に変性して一本鎖化する工程を省略することができる。
【００８３】
ハイブリダイゼーション工程は、通常、固相担体に結合されたプローブに対して実施される。プローブ及び固相担体については後述する。ハイブリダイゼーションの形態としては、プローブが固定化された固相担体全体にハイブリダイゼーション溶液を供給して実施するハイブリダイゼーションの形態（浸漬型ハイブリダイゼーション）に限定されない。例えば、固相体の一部に移動相でもあるハイブリダイゼーション溶液を供給して、固相体に対して所定の方向性でハイブリダイゼーション溶液を展開するクロマトグラフィーの形態（展開型ハイブリダイゼーション）であってもよい。本検出方法においては、クロマトグラフィー形態を採用することが好ましい。簡易で迅速性に優れるクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション工程において、検出確度の向上の意義はより高いからである。
【００８４】
なお、クロマトグラフィー形態でハイブリダイゼーション工程を実施するとき、ハイブリダイゼーション工程に用いる展開媒体は、水性媒体であることが好ましい。水性媒体は、こうしたクロマトグラフィーに用いられる公知の成分等を適宜配合して調製することができる。
【００８５】
（副生ハイブリダイズ産物の形成抑制）
本検出方法では、ハイブリダイゼーション工程において、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとの偽陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する。
【００８６】
こうすることで、偽陽性を生じる副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。すなわち、標識物質又は標識結合物質を備えうる未反応プライマーとプローブとの副生ハイブリダイズ産物や、標識物質又は標識結合物質を備えうるプライマーダイマー増幅産物との副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制することができる。
【００８７】
副生ハイブリダイズ産物を形成する核酸構造体は、未反応プライマーである場合もあるし、プライマーダイマー由来増幅産物である場合もあるし、これらの双方である場合もある。プライマーの配列や、ハイブリダイゼーション条件によって、これら変化する傾向がある。
【００８８】
（未反応プライマー等の除去）
偽陽性を生じる副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する１つの方法として、ハイブリダイゼーション工程に先立って、未反応プライマーやプライマーダイマー由来増幅産物を、核酸増幅産物を含む核酸増幅反応液から除去する工程を実施することが挙げられる。例えば、ポリエチレングリコール（平均分子量３０００〜１００００程度、好ましくは、６０００〜１００００程度、より好ましくは８０００程度）などのＤＮＡ吸着剤を用いて、比較的長い核酸増幅産物（本明細書で意図する核酸増幅産物は概して１００ｂｐ〜１０００ｂｐ程度である）を吸着するようにする。これを遠心分離により１００ｂｐ以下、概して６０ｂｐ以下の未反応プライマーやプライマーダイマー由来の増幅産物を上清に、核酸増幅産物をペレットとして分離することができる。遠沈後は、ペレットをエタノール洗浄することでポリエチレングリコール等のＤＮＡ吸着剤を除去することができる。
【００８９】
このような精製には、典型的には、市販されている非特許文献１に記載のプライマー、プライマーダイマー由来増幅産物の除去試薬を用いることができる。
【００９０】
未反応プローブ等の除去には、核酸増幅反応液に、核酸増幅産物をペレットとし、未反応プローブ等を上清に分離できるような密度の溶液を添加して、よく混合等したのち、所定の重力及び時間で遠心分離することが挙げられる。ペレットとして取得した核酸増幅産物をエタノール等で洗浄し、再度ペレットとして取得することで、核酸構造体を除去した核酸増幅産物を得ることができる。
【００９１】
（先行ハイブリダイゼーション）
また、他の１つの方法として、ハイブリダイゼーション工程に先立って、偽陽性ハイブリダイズ産物を生じうる少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部と、当該一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、がハイブリダイズしたクリーンアップ用ハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を実施することが挙げられる。この先行ハイブリダイゼーション工程によれば、簡易にかつ迅速に不都合な核酸構造体をクリーンアップハイブリダイズ産物として除去（捕捉）しておくことができる。
【００９２】
例えば、未反応の増幅用プライマーを除去（捕捉）するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成するには、図２Ａに示すように、増幅に用いた標識物質又は標識結合物質を保持しうる第２のプライマーの第２の識別配列の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤が挙げられる。こうしたマスキング剤の１種又は２種以上を用いて核酸増幅反応液との先行ハイブリダイゼーション工程を実施することで、第２のプローブに基づく擬陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。なお、本明細書において、ハイブリダイズ可能であるとは、ハイブリダイズする相手鎖と完全に相補的であることを包含している。
【００９３】
未反応増幅用プライマーを除去するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を実施するには、クリーンアップハイブリダイズ産物を形成する条件で行う。未反応プライマーは、核酸増幅反応液において概して一本鎖で存在するため、マスキング剤を供給することで、容易にクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する。
【００９４】
また、第１のプライマーと標識物質又は標識結合物質を保持しうる第２のプライマーとのプライマーダイマー由来の増幅産物を除去（捕捉）するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成するには、図２Ｂに示すように、プライマーダイマー由来増幅産物の再アニールを抑制するように、これらの構成鎖（すなわち、プライマーダイマー増幅産物における第１のプライマー伸長物と第２のプライマー伸長物）の少なくとも一部と同一又はハイブリダイズする核酸であるマスキング剤が挙げられる。
【００９５】
典型的には、第１のプライマーの第１の識別用配列の少なくとも一部と同一か又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤が挙げられる。また、第２のプライマーの第２の識別用配列の少なくとも一部と同一か又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤が挙げられる。マスキング剤は、好ましくはハイブリダイズタグや標識タグにハイブリダイズ可能でないようにする。
【００９６】
プライマーダイマー増幅産物を捕捉するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を実施するには、こうしたクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する条件で行えばよい。プライマーダイマー増幅産物は、核酸増幅反応液において概して二本鎖で存在するため、一旦、変性して融解させて一本鎖状態としないとマスキング剤とクリーンアップハイブリダイズ産物を形成できない。
【００９７】
こうした変性処理（融解処理）は、熱変性処理（熱融解処理）であってもよいし、化学物質による変性処理であってもよい。化学変性処理は、加熱を伴わない点において、簡易でありより安全であり、かつ迅速に実施できる。
【００９８】
熱による変性処理は、通常、９０℃〜９５℃程度に加熱し、所定時間、例えば、１〜５分程度維持することが挙げられる。なお、加熱処理後には、再アニールによりクリーンアップハイブリダイズ産物を形成するために、急冷ないし放冷する。また、核酸増幅産物のＴｍが核酸構造体のＴｍよりも高い場合には、核酸増幅産物は変性せず、核酸構造体のみが変性できる温度条件により変性処理することも可能である。
【００９９】
化学変性の場合、通常、０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳの添加、尿素添加、ホルムアミドなどのＤＮＡを変性可能な溶媒などの核酸変性剤の添加、アルカリ条件を採用することができる。アルカリ条件による変性は、公知の有機アルカリ及び無機アルカリから選択されるアルカリを用いて、適当な濃度に設定することにより、当業者であれば実施可能である。化学変性処理後には、クリーンアップハイブリダイズ産物の形成のため、例えばアルカリによる変性処理であれば、酸を添加して中和するようにする。また、尿素やジメチルホルムアミドについてはウレアーゼで分解することが可能である。
【０１００】
マスキング剤は、変性処理を行う場合、変性処理に先立って核酸増幅反応液に供給してもよいし、変性処理中（加熱中等）に供給してもよいし、その後の再アニール過程において供給してもよい。
【０１０１】
なお、マスキング剤は、本明細書で意味するところの核酸で構成されている。マスキング剤は、概して、ＤＮＡ一本鎖として、あるいは、適宜ハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖として供給される。
【０１０２】
マスキング剤は、例えば、増幅用プライマーセットの初期量として２５０ｆｍｏｌによる反応結果物に対して、２．５ｐｍｏｌ以上２．５ｎｍｏｌ以下用いることができる。この範囲であると、マスキング剤によって副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。
【０１０３】
こうした未反応プライマー等の除去工程を行った核酸増幅産物又はその核酸増幅反応液を、プローブとのハイブリダイゼーション工程に供する。本ハイブリダイゼーション工程によれば、先行プローブと標識物質又は標識物質結合物質を備える（あるいは備えることとなる）未反応の第２のプローブと副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されるため、偽陽性の検出が抑制又は回避される。また、本ハイブリダイゼーション工程によれば、標識物質又は標識物質結合物質を備える（あるいは備えることとなる）プライマーダイマー由来増幅産物とプローブとの副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されるため、偽陽性の検出が抑制又は回避される。結果として、簡易かつ迅速で、しかも高い確度で標的核酸を検出できる。
【０１０４】
特に、クリーンアップハイブリダイズ産物を形成することは、プライマー等の除去工程を行うことよりも操作を格段に簡素化できるため、標的核酸の検出の簡易化、迅速化への貢献程度はより大きい。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション工程で用いるプローブは、固相担体に固定化された状態で使用される。プローブは、それぞれプロービングのための固有の塩基配列である検出用配列を有している。このような検出用配列は、標的核酸に特徴的な配列で設定することもできるし、標的配列と、無関係に設定することができる。標的配列と無関係に設定することで、プローブの検出用配列を、複数のプローブ間での非特異的結合を抑制又は回避できるように、かつ、ハイブリダイゼーションに好適な温度及び時間等のハイブリダイゼーション条件を考慮して設定することができる。また、標的核酸の種類にかかわらず、いつも同じ検出用プローブを用いることができるようになる。
【０１０６】
検出用配列の長さは、特に限定しないが、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。この範囲であると、各検出用配列の特異性を確保しつつハイブリダイゼーション効率も確保できるからである。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、後述する配列番号１〜１００及びその相補配列から選択される各２３塩基長の塩基配列を２つ組み合わせた４６塩基長の配列や、当該組み合わせた塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、配列番号１〜１００の各２３塩基長の塩基配列及びその相補配列又はこれらの塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。なお、第１のプライマーにおけるタグ配列は、検出用配列と対合する塩基配列であるため、タグ配列の塩基長は、検出用配列と同様、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
【０１０７】
こうしたプローブの検出用配列としては、例えば、配列番号１〜配列番号１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長（２３塩基長）であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件、例えば、融解温度マイナス１５℃程度でのハイブリダイズにおいて均質なハイブリダイズ結果が得ることができるようになっている。ただしクロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーションにおいては、常温（２０℃±１５℃）での使用を想定し、これらのなかでも１５℃程度においてプローブ間の非特異反応が発生しにくいプローブの組合せを使用している。なお、上述したように、これらの塩基配列群から選択される２種を組み合わせることもできる。さらに、こうした配列に対して、特異性を失わない範囲で塩基を付加、欠失、置換等することができる。同時に用いる検出用プローブのための検出用配列は、配列番号１〜１００で表される塩基配列（群）か、あるいはこれらに相補的な塩基配列（群）のいずれかの群から選択されることが好ましい。
【０１０８】
このようなプローブにおける検出用配列は、正規直交化配列ともいい、H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
【０１０９】
プローブは、担体に固定化されている。こうした担体としては、固相担体を用いることができる。例えば、担体はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質担体は、特に、アフィニティークロマトグラフィーにより、固相担体に固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。
【０１１０】
なお、担体の形状は平板状であってもよいが、ビーズ状であってもよく、形状は特に限定されない。固相体は、好ましくは、担体が固相平板状であり、複数の検出用プローブが一定の配列で固定されたアレイ（特にマイクロアレイ）である。アレイは、多数個のプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の標的核酸を検出するのに都合がよい。
【０１１１】
また、ハイブリダイゼーションを、アフィニティークロマトグラフィーの原理を用いて多孔質体である固相担体に固定化したプローブとの間で実施する形態では、少なくとも、検査や研究用に汎用されているエッペンドルフチューブ（商標）のようなマイクロチューブに供給されるハイブリダイゼーション溶液に対して担体の端部が浸漬可能なサイズ（幅方向）及び形状を備えていることが好ましい。好ましくは、この種のチューブの底部近傍から上端までに収容可能な部位を備える長尺体である。
【０１１２】
クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに用いる固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。クロマトグラフィー用のプローブ固定化体は、単一の固相担体で構成されている必要は必ずしもない。全体としてキャピラリー現象により展開媒体を移動可能であれば、複数の固相担体で連結されていてもよい。また、クロマトグラフィー用プローブ固定化体の全体形態は特に問わない。シート状や細い棒状など、キャピラリー現象によるクロマトグラフィー用液の展開拡散が可能な形態であればよい。好ましくは、長尺状体であって、その長手方向に沿う一つの端部がクロマトグラフィーの展開媒体に接触するようになっている。
【０１１３】
（検出工程）
検出工程は、目的ハイブリダイズ産物を、標識物質に基づいて検出する工程である。より具体的には、ハイブリダイズ産物を標識物質固有のシグナルにてその位置を確認する工程である。標識物質によるシグナルを検出するには、標識物質の種類に応じて適宜選択される。特異的結合反応や酵素による発色反応が必要な場合には、適宜そうした操作が行われる。
【０１１４】
標識物質が、例えば、ラテックス粒子、金コロイド粒子、銀コロイド粒子など、肉眼で検出可能な発色又は発光を提示する標識物質であるときには、肉眼で直ちに標的核酸の存在やその量（色の濃さ等で）を検出できる。このため、一層の迅速検出が可能となっている。
【０１１５】
（核酸増幅産物の精製方法）
本明細書に開示される核酸増幅産物の精製方法は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物の存在下で、以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤をハイブリダイズ可能に付与する工程
を備えることができる。
【０１１６】
本精製方法は、既に説明した本検出方法の先行ハイブリダイゼーション工程を核酸増幅産物の精製方法として表現したものである。本精製方法は、ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出に先立つ前処理方法としても実施できる。
【０１１７】
（核酸増幅産物の精製剤）
本明細書に開示される核酸増幅産物の精製剤は、前記核酸増幅産物は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であってプローブとハイブリダイズ可能なハイブリダイズタグを備える核酸増幅産物であり、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤を含むことができる。
【０１１８】
本精製剤は、既に説明した本検出方法の先行ハイブリダイゼーション工程に用いるマスキング剤を核酸増幅産物の精製剤として表現したものである。本精製剤は、ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出に先立つ前処理用の試薬としても実施できる。
【０１１９】
（検出キット）
本明細書に開示される検出キットは、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であってプローブとハイブリダイズ可能なハイブリダイズタグを備える核酸増幅産物を得るための少なくとも一対の増幅用プライマーと、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、を備えることができる。
【０１２０】
本検出キットは、既に説明した本検出方法に用いるプライマーセットと、先行ハイブリダイゼーション工程に用いるマスキング剤との組合せと、標的核酸の検出キットとして表現したものである。本検出キットには、さらに、核酸クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー用プローブ固定化体とを組み合わせていてもよい。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。
【実施例１】
【０１２２】
（メンブレンタイプアレイによるハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出）
本実施例では、以下の方法で標的核酸を検出した。
（１）メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイの作製
メルクミリポア製Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に以下の表に示す塩基配列からなるキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のＤ１_１からＤ１_１００の１００種のうち以下の表に示す４４種の配列（表１）をプローブとして使用し、図８に示す配置でアレイ化した。なお、プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３‘末端をアミノ基で修飾した配列を使用した。【０１２３】
【表１】
0005967785.tif 000005
【０１２４】
プローブのスポットの後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置（ＸＬ−１５００ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を用いて、２００〜５００ｍＪ／ｃｍ２程度の紫外線光の照射を行って固定化した。【０１２５】
（２）サンプル遺伝子の増幅
増幅に使用したゲノムＤＮＡとしてはヒト由来のものを使用し、表２に記す配列のプライマーを使用して増幅を行った。なお、連結部位（Ｘ）には、以下に示すGlen Research社 Spacer Phosphoramidite C3を用い、通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成した。なお、以下の断片１〜４は、プローブＤ１−００１、００２，００３、００５によって検出されるようにプライマーが設計されている（ハイブリダイズタグはイタリックで記載している。）。【０１２６】
【表２】
0005967785.tif 000006
【０１２７】
【化４】
0005967785.tif 000007
【０１２８】
なお、サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のmultiplex PCR master mix を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System9700を使用した。【０１２９】
（試薬調製）
ｄＨ２Ｏ                                               ４．０μｌ
2×multiplex PCR master mix                            ５．０μｌ
プライマー混合物（各500nM）                            ０．５μｌ
サンプル：ヒトゲノムDNA（50ng/μｌ）またはPCR water（フナコシ）
０．５μｌ
合計                                                 １０．０μｌ【０１３０】
次に、増幅用試薬をサーマルサイクルプレートに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後；９５℃で３０秒、８０℃で１秒、６４℃で６分を４０サイクル、その後１０℃に下げる）を行って増幅試料とした。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照試料とした。【０１３１】
増幅したサンプルはＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitにて精製を行った後、アガロース電気泳動により意図した長さで増幅していることを確認した。【０１３２】
（３）先行ハイブリダイゼーション
サンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料及び対照試料につき、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムＤＮＡ配列に対して特異的な配列）に相補な配列の１本鎖合成ＤＮＡ（表３）を混合した水溶液を適当量加え（以下組成記載）、９０℃〜１００℃にセットされたヒートブロックにて数秒から１分程度熱処理を実施した。熱処理後常温程度に放冷して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した。【０１３３】
【表３】
0005967785.tif 000008
【０１３４】
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
ＰＣＲ完了サンプル                                  １０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液（１０μＭ，ｅａｃｈ）１０．０μｌ
合計                                                ２０．０μｌ【０１３５】
（４）メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いた検出
（２）にて増幅し、（３）先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料、並びに増幅しただけで先行ハイブリダイゼーション工程を実施していない増幅試料及び対照試料を用いてのメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイへの反応を行った。反応手順及びその検出手順は以下の通りとした。【０１３６】
（ハイブリダイズサンプル組成）
Hybri Solution*（0.5%Tween20-1%BSA-PBS）        ２００．０μｌ
D1-100プローブ配列に相補な配列のビオチン標識オリゴＤＮＡ（２５μＭ）
４．０μｌ
サンプル                                           ４．０μｌ
合計                                            ２０８．０μｌ【０１３７】
（ハイブリダイズおよび発色反応）
メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを０．２ｍｌチューブに入る大きさに切断し、チューブ内にセットし、調製したハイブリダイズサンプル各２００μｌを変性等のために加熱することなく添加し、ヒートブロック温度３７℃で３０分間ハイブリダイゼーション反応を行った。【０１３８】
ハイブリダイゼーション反応終了後、メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−１ｍＭ ＥＤＴＡ−ＴＢＳ）入り０．２ｍｌチューブに移し、３７℃のヒートブロック内で洗浄作業（３７℃×１ｍｉｎ、３７℃×１０ｍｉｎ、３７℃×１ｍｉｎ）を行った。【０１３９】
洗浄済みのメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイをビオチン−ＨＲＰとストレプトアビジンとの混合液が入った０．２ｍｌチューブに移して室温下で２０分間の反応を行った。【０１４０】
反応終了後、メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−１ｍＭ ＥＤＴＡ−ＴＢＳ）入り０．２ｍｌチューブに移し、洗浄作業（室温×１ｍｉｎ、室温×１０ｍｉｎ、室温×１ｍｉｎ）を行った。【０１４１】
洗浄済みメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイをＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ，３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを用いて室温下で５分程度の発色反応を行った。【０１４２】
（検出判定）
先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料についてアレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図９に示す。図９上段には、増幅試料の結果を示す。図９上段に示すように、増幅断片１〜４のすべてにおいて、メンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）にて発色することを確認できた。一方、図９下段に対照試料の結果を示す。図９下段に示すように、断片１〜４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）にて発色は確認されず、偽陽性を示す副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されていることがわかった。【０１４３】
これに対して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない増幅試料及び対照試料の結果を図１０に示す。図１０上段に示すように、ＰＣＲ時のサンプルにヒトゲノムＤＮＡを用いた場合では実施例１同様、断片１〜４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）にて発色が確認された。一方で、図１０下段に示すように、対照試料では、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合とは異なり、メンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）には発色が確認された。すなわち、偽陽性反応が生じていることがわかった。
【実施例２】
【０１４４】
(クロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出）
（１）クロマトグラフィーの作製
メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０ｍｍｘ６００ｍｍ）に以下の表に示す塩基配列からなるキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のＤ１_１からＤ１_１００の１００種のうち任意の８種の配列の３’末端側にアミノ基）を付加した配列（表４）をプローブとして使用し、図１１の通りの配置とした。【０１４５】
【表４】
0005967785.tif 000009
【０１４６】
スポットの後の処置としてＳｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ２程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。【０１４７】
（２）サンプル遺伝子の増幅
サンプル遺伝子の増幅は、実施例１と同様に行った。【０１４８】
（３）先行ハイブリダイゼーション
サンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料及び対照試料につき、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムＤＮＡ配列に対して特異的な配列）に相補な配列の１本鎖合成ＤＮＡ（表３）を混合した水溶液を適当量加え（以下組成記載）、９０℃〜１００℃にセットされたヒートブロックにて数秒から１分程度熱処理を実施した。熱処理後常温程度に放冷して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した。【０１４９】
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
ＰＣＲ完了サンプル                                  １０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液（１０μＭ，ｅａｃｈ）１０．０μｌ
合計                                                ２０．０μｌ【０１５０】
（４）クロマトグラフィーを用いた検出
先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料、ならびに増幅しただけで先行ハイブリダイゼーション工程を実施していない増幅試料及び対照試料を用いてクロマトグラフィーへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。【０１５１】
サンプル組成
展開液*                      ３０．０μｌ
ラテックス液＊                 ２．０μｌ
サンプル                     １０．０μｌ
合計                         ４２．０μｌ【０１５２】
*本発明に使用したラテックス保存液には青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズにアビジン(ストレプトアビジン)を被覆させたものを任意の濃度となるようにクロマト展開液で調製を行って使用した。【０１５３】
*クロマト展開液には、Phosphate buffered salineを使用した。【０１５４】
（ハイブリダイズおよび発色反応）
上記試料各４２μｌを０．２ｍｌチューブに加えて、クロマトグラフィーを差込んで反応を開始した。サンプル液は約２０分間ですべて吸い上がり反応は完了した。反応終了後、クロマトグラフィーを風乾させた後、目視による反応箇所の確認及び画像を撮影した。【０１５５】
（検出判定）
先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料についてアレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１２に示す。図１２上段には、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料の結果を示す。図１２上段に示すように、増幅断片１〜４のすべてにおいて、クロマトグラフィー上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）にて発色することを確認できた。一方で、対照試料についての結果を図１２下段に示す。図１２下段に示すように、対照試料の場合、断片１〜４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）にて発色が確認されず、偽陽性を示す副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されていることがわかった。【０１５６】
これに対して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない増幅試料及び対照試料の結果を図１３に示す。図１３上段に示すように、先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない場合でも、断片１〜４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）にて発色が確認された。一方で、図１３下段に示すように、対照試料では、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合とは異なり、メンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１−００１，００２，００３，００５）には発色が確認された。すなわち、偽陽性反応が生じていることがわかった。
【実施例３】
【０１５７】
本実施例では、浸漬型ハイブリダイゼーションに先だってアルカリ／ＳＤＳとマスキング剤とを用いた前処理について評価した。【０１５８】
実施例１において得られたサンプル遺伝子の増幅試料につき、以下の手順に従い前処理を行った後、実施例１に準じてメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いた検出を実施した。【０１５９】
実施例1におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料に対し、実施例１と同様、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムDNA配列に対して特異的な配列）に相補な配列の1本鎖合成DNA（マスキング剤）を混合した水溶液を適当量加え、0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液を加え混合し、その後、さらに3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)を加え混合する工程を実施した後、実施例１に記載のメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いて増幅産物を検出した。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照試料とし、同様の操作を行った。【０１６０】
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
PCR完了サンプル                                  １０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)       １０．０μｌ
0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液                   ５．０μｌ
3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)                      ５．０μｌ
合計                                             ３０．０μｌ【０１６１】
（検出判定）
アレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１４に示す。増幅試料については、実施例１と同様、断片1〜4が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（D1-001，002，003，005）にて発色が確認された。一方で、対照試料については、メンブレン上の各プローブ位置（D1-001，002，003，005）には発色が確認されなかった。【０１６２】
以上のことから、増幅試料及び対照試料に対して、ＰＣＲ反応で用いたプライマー中の識別用配列（ヒトゲノムＤＮＡに対して特異的な配列）に相補な一本鎖合成ＤＮＡの存在下、増幅試料を一旦アルカリ／ＳＤＳ変性後に、中性に戻すことで、偽陽性反応を抑制できることがわかった。すなわち、増幅試料及び対照試料中に存在する可能性のあるプライマーダイマーを一旦変性させ、生じた一本鎖プライマーと一本鎖合成ＤＮＡ（マスキング剤）とをハイブリダイズさせることで偽陽性反応が抑制されたことがわかった。また、これらの結果から、上記前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成が抑制されたことがわかった。
【実施例４】
【０１６３】
本実施例では、展開型ハイブリダイゼーションに先だってアルカリ／ＳＤＳとマスキング剤とを用いた前処理について評価した。【０１６４】
実施例１におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料に対して、以下の手順にて前処理を行った後、実施例２に準じてクロマトグラフィーを用いた検出を実施した。【０１６５】
実施例１におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた各産物に対し、増幅工程にて使用したプライマー配列中の識別配列に相補な配列の１本鎖合成ＤＮＡ（表３）を混合した水溶液を適当量加え、0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液を加え混合し、さらに3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)を加え混合させる工程を実施した後、実施例２のクロマトグラフィーを用いた検出に記載された方法にて検出した。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照試料とし、同様の操作を行った。【０１６６】
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
PCR完了サンプル                                  １０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)       １０．０μｌ
0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液                   ５．０μｌ
3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)                      ５．０μｌ
合計                                             ３０．０μｌ【０１６７】
（検出判定）
アレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１５に示す。増幅試料については、実施例２と同様、断片1〜4が増幅した際に反応する各プローブ位置にて発色が確認された。一方で、対照試料については、各プローブ位置には発色が確認されなかった。【０１６８】
以上のことから、増幅試料及び対照試料に対して、ＰＣＲ反応で用いたプライマー中の識別用配列に相補な一本鎖合成ＤＮＡの存在下、増幅試料を一旦アルカリ／ＳＤＳで変性後に、中性に戻すことで、偽陽性反応を抑制できることがわかった。また、これらの結果から、アルカリ／ＳＤＳを用いた前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成が抑制されたことがわかった。
【実施例５】
【０１６９】
本実施例では、展開型ハイブリダイゼーションに先だって尿素とマスキング剤とを用いた前処理について評価した。【０１７０】
実施例１におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた各増幅試料に対して、以下の手順にて作業を行った後、クロマトグラフィーを用いた検出を実施した。【０１７１】
実施例１おけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた各増幅試料に対し、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムDNA配列に対して特異的な配列）に相補な配列の1本鎖合成DNA(表３)を混合した水溶液を適当量加え（以下組成の一例を記載）、1M尿素水溶液を加え混合し、さらに1%ウレアーゼ水溶液を加え混合する工程を実施した後、実施例２のクロマトグラフィーを用いた検出に記載された方法にて検出した。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照料とし、同様の操作を行った。【０１７２】
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
PCR完了サンプル                                    １０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)         １０．０μｌ
1M尿素水溶液                                         ５．０μｌ
1%ウレアーゼ水溶液                                   ５．０μｌ
合計                                               ３０．０μｌ【０１７３】
（検出判定）
アレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１６に示す。結果は、実施例３、４と同様に、増幅試料については、各プローブ位置にて発色が確認されたが、対照試料については、各プローブ位置には発色が確認されなかった。【０１７４】
以上のことから、増幅試料及び対照試料に対して、ＰＣＲ反応で用いたプライマー中の識別用配列に相補な一本鎖合成ＤＮＡの存在下、増幅試料を一旦尿素で変性後に、尿素を除去することで、偽陽性反応を抑制できることがわかった。また、これらの結果から、尿素を用いた前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成を抑制されたことがわかった。
【実施例６】
【０１７５】
本実施例では、展開型ハイブリダイゼーションに先だってＤＭＦとマスキング剤とを用いた前処理について評価した。【０１７６】
実施例５に準じて、1M尿素水溶液を1Mホルムアミド水溶液に変えて検出を実施したところ、実施例５同様の効果が確認できた。これらの結果から、ＤＭＦを用いた前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成を抑制されたことがわかった。
【実施例７】
【０１７７】
本実施例では、未反応プライマー自体とクロマトグラフィー上のプローブとのミスハイブリダイゼーションの抑制について評価した。【０１７８】
以下記載の塩基配列を有する5‘ビオチン標識オリゴDNAをサンプルに用いてクロマトグラフィー上のプローブへのハイブリダイゼーションを実施した。なお、この塩基配列は、プローブＤ１_２に対して完全相補ではない。このサンプルに対して、以下のとおり、マスキング剤として一本鎖合成ＤＮＡ（5’- GCAGTGGCTTGGTTCATATAGGC-3）（配列番号１１８）を含む前処理液を調製しよく混合して前処理を行った。この前処理液につき、実施例２に準じてクロマトグラフィーを実施した。なお、対照として、マスキング剤溶液５μｌに替えてサンプルを４μｌ増量する以外は以下の前処理サンプル組成と同一の組成でクロマトグラフィー用液を調製し、実施例２に準じてクロマトグラフィーを実施した。【０１７９】
5’biotin-GCCTATATGAACCAAGCCACTGC-3’（配列番号１１７）【０１８０】
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
サンプル（0.8μM）                                  ５．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)          ５．０μｌ
展開液*                                           ３０．０μｌ
ラテックス液*                                       ２．０μｌ
合計                                              ４２．０μｌ
【０１８１】
（検出判定）
乾燥後の発色の有無を目視で確認した。前処理実施試料についての結果を図１７下段に示し、前処理未実施の対照試料の結果を図１７上段に示す。図１７に示すように、前処理実施試料については、クロマトグラフィー上のプローブのうち（D1-002）おいて発色が確認されなかった。すなわち、ミスハイブリダイゼーションが抑制されていた。これに対し、前処理未実施対照試料については、完全相補でないにも関わらず上記プローブにミスハイブリダイゼーションしていた。【０１８２】
以上の結果から、増幅試料中に存在する未反応プライマーによるミスハイブリダイゼーションによっても偽陽性となるが、プライマーをターゲットとするマスキング剤によって未反応プライマーによる偽陽性を抑制できることがわかった。
【実施例８】
【０１８３】
本実施例では、未反応プライマーとクロマトグラフィー上のプローブとのミスハイブリダイゼーションによる感度低下の抑制について評価した。【０１８４】
以下記載の各種サンプルを用いての実施例２に準じてクロマトグラフィーへのハイブリダイゼーションを実施した。
サンプル１：5’- CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCA-biotin-3’（D1-002に相補な配列）（配列番号１１９））
サンプル２：5’-GCCTATATGAACCAAGCCACTGC-3’（配列番号１２０）
サンプル３：5’- GCAGTGGCTTGGTTCATATAGGC-3’（サンプル２に相補な配列）（配列番号１２１）【０１８５】
サンプル組成I
展開液                        ３０．０μｌ
ラテックス液                    ２．０μｌ
サンプル１（0.4μM）          １０．０μｌ
合計                          ４２．０μｌ【０１８６】
サンプル組成II
展開液                        ３０．０μｌ
ラテックス液                    ２．０μｌ
サンプル１(0.8μM)              ５．０μｌ
サンプル２（0.8μM）            ５．０μｌ
合計                          ４２．０μｌ【０１８７】
サンプル組成III
展開液                        ３０．０μｌ
ラテックス液                    ２．０μｌ
サンプル１(1.6μM)              ２．５μｌ
サンプル２（1.6μM）            ２．５μｌ
サンプル３（10μM）             ５．０μｌ
合計                          ４２．０μｌ【０１８８】
（検出判定）
乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１８に示す。サンプル組成Iではクロマトグラフィー上のプローブのうち（D1-002）おいて強い発色が確認され、サンプル組成IIでは発色が薄くなる結果となった。このことは、増幅試料中にプライマーそのものが未反応状態で残っている場合、そのプライマー配列によっては、プローブに非特異的に反応し、反応すべきサンプルの反応を抑制しうることを示している。【０１８９】
一方、サンプル組成IIIでは、プローブ（D1-002）おいてサンプル組成Iと同等の強い発色が確認された。このことは、未反応状態で残っていたプライマーそのものが相補な配列のマスキング剤によりマスクされたことで、非特異的反応が解消され、反応すべきサンプルの反応結果が適切に得られたことを示している。【０１９０】
以上説明したように、いずれも５分未満の短い作業時間内でミスハイブリダイゼーションを抑制し、偽陽性を回避できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１９１】
配列番号１〜１００、１０９〜１１６：プローブ
配列番号１０１〜１０８：プライマー
配列番号１１７〜１２１：合成ＤＮＡ
【図１】
0005967785.tif 000010
【図２Ａ】
0005967785.tif 000011
【図２Ｂ】
0005967785.tif 000012
【図３Ａ】
0005967785.tif 000013
【図３Ｂ】
0005967785.tif 000014
【図４】
0005967785.tif 000015
【図５】
0005967785.tif 000016
【図６】
0005967785.tif 000017
【図７】
0005967785.tif 000018
【図８】
0005967785.tif 000019
【図９】
0005967785.tif 000020
【図１０】
0005967785.tif 000021
【図１１】
0005967785.tif 000022
【図１２】
0005967785.tif 000023
【図１３】
0005967785.tif 000024
【図１４】
0005967785.tif 000025
【図１５】
0005967785.tif 000026
【図１６】
0005967785.tif 000027
【図１７】
0005967785.tif 000028
【図１８】
0005967785.tif 000029
【配列表】
0005967785000001.app