(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＨ（１−３４）を有効成分として含み、前記ＰＴＨ（１−３４）の投与量が０．１ｐｍｏｌｅから５０００ｐｍｏｌｅの範囲内である、ヒトの早期変形性関節症の治療を目的とした関節腔に投与するための医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物において、前記ＰＴＨ（１−３４）が１ｎＭから５００ｎＭの濃度で存在し、０．１ｍＬから１０ｍＬの溶液を送達することにより提供される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物において、前記ＰＴＨ（１−３４）が５ｎＭから１００ｎＭの濃度で存在し、１ｍＬから３ｍＬの溶液を送達することにより提供される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＰＴＨ（１−３４）を有効成分として含み、前記ＰＴＨ（１−３４）の投与量が０．１ｐｍｏｌｅから５０００ｐｍｏｌｅの範囲内である、早期ＯＡを患うヒトの罹患関節の関節軟骨細胞のアポトーシスの抑制を目的とした関節腔に投与するための医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物において、前記ＰＴＨ（１−３４）が１ｎＭから５００ｎＭの濃度で存在し、０．１ｍＬから１０ｍＬの溶液を送達することにより提供される請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物において、前記ＰＴＨ（１−３４）が５ｎＭから１００ｎＭの濃度で存在し、１ｍＬから３ｍＬの溶液を送達することにより提供される請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＰＴＨ（１−３４）を有効成分として含み、前記ＰＴＨ（１−３４）の投与量が０．１ｐｍｏｌｅから５０００ｐｍｏｌｅの範囲内である、早期ＯＡを患うヒトの罹患関節の関節軟骨細胞の変性過程を抑制することを目的とした関節腔に投与するための医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物において、前記ＰＴＨ（１−３４）が１ｎＭから５００ｎＭの濃度で存在し、０．１ｍＬから１０ｍＬの溶液を送達することにより提供される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物において、前記ＰＴＨ（１−３４）が５ｎＭから１００ｎＭの濃度で存在し、１ｍＬから３ｍＬの溶液を送達することにより提供される請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して提出された配列表を含み、その配列表は参照によりその全体が本明細書に援用される。２００９年１２月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは３８３２９５ＷＯ．ｔｘｔと名付けられ、大きさは４，２１９バイトである。
【０００２】
本開示は、変形性関節症の治療に関し、より詳細には副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン由来の物質を投与することにより早期変形性関節症を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節炎は身体における関節の損傷を含む一連の症状を包含する。関節炎は５５歳以上の人における身体障害の主な原因である。関節炎、変形性関節症（ＯＡ）の最も一般的な形態は、関節の外傷、関節の感染症、または加齢を原因とするものである。変形性関節症は軽度の炎症が関節において痛みとなる臨床的症候群であり、それは関節内部で広がり、かつクッションの役目を果たす軟骨の異常な消耗、およびそれらの関節を滑らかにする滑液の特性が破壊または変化することによって引き起こされる。骨表面において軟骨による保護が不十分になると、患者は歩行および立つことを含めて、体重を支えると痛みを覚える。痛みによって増えた動作により、局所筋肉が萎縮し、かつ靭帯がより弛緩し得る。
【０００４】
変形性関節症は米国においてほぼ２１００万人に影響し、それは一次診療医への訪問の２５％、および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）処方の半数を占める。人口の８０％が６５歳までにＸ線像による変形性関節症である証拠を得るが、それらの６０％の人のみが症状を示すであろう。
【０００５】
多くの国において高齢者の数が増加するにつれ、変形性関節症はますます一般的な関節疾患となっている。例えば、米国では６０歳以上の人口の１０％がＯＡを有する。ＯＡに対する現在の治療は、主に抗炎症薬、鎮痛薬、および潤滑補助剤の使用を含むものである。したがって、早期の段階においてＯＡの進行を抑制可能な薬剤を開発することが最優先される。
【０００６】
ＯＡを患う患者において、軟骨細胞は骨端成長板において起こるような表現型の変化を再び始められることで知られており、軟骨細胞は肥大して鉱質沈着し、ついにはアポトーシスに至る最終分化の過程を経る（Ｂｌａｎｃｏ  ＦＪら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９８；４１：２８４−９；Ｋｉｒｓｃｈ  Ｔら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２０００；８：２９４−３０２）。ＯＡにおける軟骨細胞は、アネキシン、アルカリホスファターゼ、およびＸ型コラーゲン（ＣｏｌＸ）を含む肥大軟骨細胞のマーカータンパク質を発現するが、そこにＩＩ型コラーゲン（ＣｏｌＩＩ）は含まれない。
【０００７】
成長板において軟骨内石灰化を制御するフィードバックループは、副甲状腺ホルモン−関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、およびＢｃｌ−２を含む。ＰＴＨｒＰは増殖性軟骨細胞の機能を維持し、かつ肥大に向かう軟骨細胞の分化を抑制する（Ｈｏｒｔｏｎ  ＷＥ  Ｊｒら、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  １９９８；１７：１０７−１５；Ｗｅｉｓｓｅｒ  Ｊら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２００２；２７９：１−１３）。以前の報告で、ＯＡが進行中の関節軟骨細胞における生物学的変化は、軟骨内石灰化のものと類似していることを示した（Ｂｌａｎｃｏ  ＦＪら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９８；４１：２８４−９；Ｋｉｒｓｃｈ  Ｔら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２０００；８：２９４−３０２）。
【０００８】
成長板における軟骨細胞の分化に伴う生物学的変化は、変形性関節症の進行において観察されるものと類似している。変形性関節症では、軟骨細胞の表現型変化は、骨端成長板におけるものと類似しており、軟骨細胞は、最終分化、肥大、鉱質沈着し、最終的にはアポトーシスを経ることが報告されている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．（１９９８）４１（２）：２８４−９；  Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．（２０００）５９（１２）：９５９−６５；  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０００）８（４）：２９４−３０２）。変形性関節症における軟骨細胞は、アネキシン、アルカリホスファターゼ、およびＸ型コラーゲン（ＣｏｌＸ）を含む肥大軟骨細胞のマーカータンパク質を発現するが、ＩＩ型コラーゲン（ＣｏｌＩＩ）の発現は除外される。
【０００９】
副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）は、変形性関節症を治療するために有益であり得ることが示唆されている。例えば国際公開２００８／１５６７２５号などのＰＣＴ特許出願において、ＰＴＨｒＰを関節軟骨の深部に注射することで関節軟骨の石灰化を抑制することが記載されている。上述したように、軟骨細胞の分化は、細胞増殖、肥大、最終分化、石灰化および細胞死（アポトーシス）を含む複雑な過程を含んでいる。しかしながら、その技術は、患者の変形性関節症が進行する間に起こる関節軟骨の石灰化を含む軟骨細胞の変性過程を好転させ得るいかなる方法も提供していないように思われる。
【００１０】
したがって、軟骨の石灰化および軟骨細胞のアポトーシスを抑制または阻止し、早期変形性関節症において軟骨細胞の変性過程を抑制または好転させ、かつ変形性関節症、特に早期変形性関節症の治療のために使用可能な方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開２００８／１５６７２５号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｌａｎｃｏ  ＦＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９８；４１：２８４−９
【非特許文献２】Ｋｉｒｓｃｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２０００；８：２９４−３０２
【非特許文献３】Ｈｏｒｔｏｎ  ＷＥ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  １９９８；１７：１０７−１５
【非特許文献４】Ｗｅｉｓｓｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２００２；２７９：１−１３
【非特許文献５】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．（１９９８）４１（２）：２８４−９
【非特許文献６】Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．（２０００）５９（１２）：９５９−６５
【非特許文献７】Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０００）８（４）：２９４−３０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本開示は動物における早期変形性関節症を治療するための方法を提供し、それは副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）から成る群より選択される薬剤の治療効果のある量を、このような治療を必要とする動物の罹患関節の関節腔に送達することを含む。
【００１４】
他の側面では、本開示は動物における関節軟骨細胞のアポトーシスを抑制するための方法を提供し、それは副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）から成る群より選択される薬剤の治療効果のある量を、このような治療を必要とする動物の罹患関節の関節腔に送達することを含む。
【００１５】
他の側面では、本開示は動物における罹患関節の関節軟骨細胞の変性過程を抑制するための方法を提供し、それは副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン由来の物質から成る群より選択される薬剤の治療効果のある量を、このような治療を必要とする動物の罹患関節の関節腔に送達することで、関節軟骨細胞が薬剤と接触することを含む。
【００１６】
本明細書に開示された方法におけるある実施形態では、薬剤はＰＴＨのアミノ酸１−３４を含み、このような実施形態の特定の側面では、薬剤はヒト副甲状腺ホルモンのアミノ酸１−３４を含む。
【００１７】
本明細書に開示された方法におけるその他の実施形態では、薬剤は基本的にＰＴＨのアミノ酸１−３４から成り、このような実施形態の特定の側面では、薬剤は基本的にヒト副甲状腺ホルモンのアミノ酸１−３４から成る。
【００１８】
１つの実施形態では、薬剤の送達は関節内注射において達成される。
【００１９】
本明細書に開示された方法におけるある実施形態では、治療動物はヒトであり、かつ罹患関節は、指、手首、肘、肩、首、腰、膝、足首およびつま先の関節から成る群より選択される滑膜関節である。このような実施形態のある側面では、薬剤の治療効果のある量は、滑膜関節の滑液内において、約０．１ｎＭから約２００ｎＭの範囲内、約０．２５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内、約０．５ｎＭから約７５ｎＭの範囲内、約０．７５ｎＭから約５０ｎＭの範囲内、または約１ｎＭから約２５ｎＭの範囲内で薬剤の初期濃度を提供する量である。
【００２０】
本明細書に開示された方法におけるある実施形態では、薬剤の治療効果のある量は、約０．１ｐｍｏｌｅから約５０００ｐｍｏｌｅの範囲内、約０．５ｐｍｏｌｅから約１５００ｐｍｏｌｅの範囲内、約１ｐｍｏｌｅから約１０００ｐｍｏｌｅの範囲内、約２．５ｐｍｏｌｅから約５００ｐｍｏｌｅの範囲内、または約５ｐｍｏｌｅから約３００ｐｍｏｌｅの範囲内である。ある実施形態では、送達される溶液量は、約０．１ｍＬから約１０ｍＬの範囲内であり、溶液中に存在する薬剤の濃度は、約１ｎＭから約５００ｎＭの範囲内、約２．５ｎＭから約２５０ｎＭの範囲内、または約５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内であり得る。他の実施形態では、送達される溶液は、約１ｍＬから約３ｍＬの範囲内の量であり、約５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内の濃度の薬剤を含む。
【００２１】
本開示のその他の目的および特徴は、添付の図面と共に以下の詳細な説明を考慮することで明らかとなろう。
【００２２】
本開示における発明は、添付の図面を参照すると共に以下の説明によってさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩα１）（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘα１）（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示しており、３４−アミノ酸長鎖ペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端アミノ酸１から３４で構成されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩα１）（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘα１）（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示しており、３４−アミノ酸長鎖ペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端アミノ酸１から３４で構成されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩα１）（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘα１）（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示しており、３４−アミノ酸長鎖ペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端アミノ酸１から３４で構成されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩα１）（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘα１）（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示しており、３４−アミノ酸長鎖ペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端アミノ酸１から３４で構成されている。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩα１）（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘα１）（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示しており、３４−アミノ酸長鎖ペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端アミノ酸１から３４で構成されている。
【図１Ｆ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩα１）（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｘα１）（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示しており、３４−アミノ酸長鎖ペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端アミノ酸１から３４で構成されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）Ｂｃｌ−２のｍＲＮＡ発現、（Ｂ）ＢａｘのｍＲＮＡ発現、および（Ｃ）Ｂｃｌ−２とＢａｘの比率における変化を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）Ｂｃｌ−２のｍＲＮＡ発現、（Ｂ）ＢａｘのｍＲＮＡ発現、および（Ｃ）Ｂｃｌ−２とＢａｘの比率における変化を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、ＰＴＨ（１−３４）処理または未処理の、コントロールまたはａｚａＣ誘導ヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）Ｂｃｌ−２のｍＲＮＡ発現、（Ｂ）ＢａｘのｍＲＮＡ発現、および（Ｃ）Ｂｃｌ−２とＢａｘの比率における変化を示す。
【図３】図３は、ヒト関節軟骨細胞におけるＰＴＨ（１−３４）のａｚａＣ誘導アポトーシスに対する効果を示す。
【図４】図４は、正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、ＰＴＨ（１−３４）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルに対する効果を示す。
【図５】図５は、正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、ＰＴＨ（１−３４）の免疫局在化（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ）ＩＩ型コラーゲンに対する効果を示す。
【図６】図６は、正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、ＰＴＨ（１−３４）の軟骨細胞アポトーシスに対する効果を示す。
【図７】図７は、変形性関節症（ＯＡ）ラットの関節軟骨における、３つの投与量でのＰＴＨ（１−３４）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルに対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下の好ましい実施形態および図面の説明は単に例示することを目的として記載されており、本発明の限定を定義するものではない。そのためには添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【００２５】
本明細書において使用される用語は、単に発明の特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、限定を意図するものではない。別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明と関連する当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。
【００２６】
さらに、本明細書において上記または下記に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される
【００２７】
最後に、本明細書および添付の特許請求の範囲において、特に内容に明確な指示がない限り、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。
【００２８】
定義
本開示における用語「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」および「ＰＴＨ」は、副甲状腺ホルモン、特にヒト副甲状腺ホルモン、およびその誘導体を指す。本開示の方法において使用される副甲状腺ホルモンは、天然型のＰＴＨ、遺伝子工学技術によって製造されたＰＴＨ、または化学的に合成されたＰＴＨなど様々な形態で生じ得る。ＰＴＨ誘導体の例としては、上に定義したようにＰＴＨの部分ペプチド、その他のアミノ酸によって部分的に置き換え可能なＰＴＨまたはその部分ペプチドの構成アミノ酸、部分的に欠損し得るＰＴＨまたはその部分ペプチドの構成アミノ酸、およびＰＴＨまたはその部分ペプチドに加えられる１以上のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。ここで留意すべきは、ＰＴＨ誘導体としてのペプチドはＰＴＨそれ自体と同様の活性を有し得ることである。ＰＴＨの部分ペプチドの例としては、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）およびウシＰＴＨ（１−３４）が挙げられる。ＰＴＨ（１−３４）は、ＰＴＨのＮ末端から数えて３４個のアミノ酸で構成されるＰＴＨの部分ペプチドを指す。本明細書に開示された方法におけるある実施形態では、投与される薬剤はＰＴＨ（１−３４）（すなわちヒトＰＴＨ（１−３４））である。したがって、本明細書において使用される用語「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」および「ＰＴＨ由来の物質」は、限定されるものではないが、ヒトＰＴＨ塩、ヒトＰＴＨ（１−３４）、テリパラチドヒトＰＴＨ類似体、８４−アミノ酸ヒト副甲状腺ホルモンの３４Ｎ末端アミノ酸（生物学的活性領域）配列と同様にペプチド配列機能を有する近縁のペプチドおよび薬剤を含む。したがって、用語「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」、「ＰＴＨ」および「ＰＴＨ由来の物質」は、限定されるものではないが、組み換えヒトＰＴＨ（１−３４）、合成ヒトＰＴＨ（１−３４）、ＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３４）塩、テリパラチド、ヒトＰＴＨ（１−３４）アミドなどのヒトＰＴＨ（１−３４）の単純誘導体、ヒトＰＴＨ（１−３３）またはヒトＰＴＨ（１−３１）アミドなどの近縁分子、および近縁骨形成ペプチドを含む。適切なヒトＰＴＨ塩の例としては、限定されるものではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アンゲリカ酸塩、臭化物、酪酸塩、塩化物、クエン酸塩、シトラコン酸塩、シトラマル酸（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ）、クロトン酸塩、プロピオン酸塩、吉草酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、レブリン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、３−ヒドロキシイソ酪酸塩、トリカルバリル酸塩（ｔｒｉｃａｒｂａｌｌｙｌｉｃａｔｅ）、マロン酸塩、グルタル酸塩、イタコン酸塩、メサコン酸塩、ジメチロールプロピオン酸塩、チグリン酸塩（ｔｉｇｌｉｃａｔｅ）、グリセリン酸塩、メタクリル酸塩、イソクロトン酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、ヒドロアクリル酸塩（ｈｙｄｒａｃｒｙｌａｔｅ）、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、２−ヒドロキシイソ酪酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、ピルビン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩が挙げられる。また、���載された用語「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」および「ＰＴＨ由来の物質」は、酸、遊離塩基、荷電もしくは非荷電分子、分子錯体の成分、または非刺激性の薬理学的に受容可能な塩など様々な形態を包含し得る。
【００２９】
本明細書において使用される語句「早期変形性関節症」は、限定するものではないが、苦しんでいる動物−例えば、苦しんでいるヒトの関節軟骨がフィブリル化の兆候を全くかほとんど示さず、かつ全体としては軟骨の厚さは保護されているようでも、軟骨細胞のいくらかのクラスター化（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）が明らかであろう医学的状態を包含する。用語「早期変形性関節症」は、苦しんでいる動物の軟骨試料の７０％以下の軟骨細胞が、アルカリホスファターゼ、アネキシン、およびＸ型コラーゲンに対して免疫染色を示すことを観察することにより特徴付けられる。（Ｔ．Ｋｉｒｓｃｈら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  （２０００）  ８：２９４−３０２）。早期変形性関節症を患った、例えばヒトなどの苦しんでいる動物は、わずかなこわばりおよび時折の関節痛を感じ、彼らの中には局所的な関節痛を感じる人もいるであろう。
【００３０】
本明細書において使用される用語「関節腔」は、滑膜関節における骨の間の液体で満たされた空間を指す。
【００３１】
用語「関節内注射」は、注射器またはその他の注射器具の使用を含む、薬剤を患者の関節腔に投与する方法を指す。
【００３２】
開示された方法において治療される、苦しんでいる「対象」、「患者」または「動物」は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類であるため、苦しんでいる「対象」、「患者」または「動物」は、ヒトと同様に、イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、または霊長類であり、かつ実験動物、家畜および畜類を含み得る。ある実施形態では、苦しんでいる対象、患者、または動物は、変形性関節症に苦しむヒトであり、より詳細には早期変形性関節症に苦しむヒトである。
【００３３】
軟骨細胞の変性に関する用語「変性過程」は、例えばＩＩ型コラーゲンの減少およびＸ型コラーゲンの増加などの軟骨細胞の基質成分の合成の変化を特徴とし、限定されるものではないが、軟骨細胞の最終分化を包含する。
【００３４】
早期変形性関節症およびその治療
早期変形性関節症の症状は、痛み、こわばり、制限された関節運動、腫れ、および骨の肥大を含み得る。これらの症状は、身体における腰、膝、手、またはその他の関節など、苦しんでいる動物の様々な部分においてそれらが現れる。さらに、これらの症状は、曲げ、膝立ち、階段を上ること、走ること、漕ぐこと、およびその他の激しいまたは拡張した身体運動などのある活動の最中に現れ、関節の痛みおよびこわばりは、関節を使用している間もしくはその後、非活動期間の後、またはそれらの組み合わせにおいて現れ得る。さらに、例えば気圧の変化に関連した、天気が変化する前または最中の関節の不快症状などのように、症状は天気に関連しているかまたは天気によって悪化し得る。
【００３５】
本明細書に開示された方法における、ＰＴＨまたはＰＴＨ由来の物質を用いた早期変形性関節症で苦しむヒトなどの動物の治療は、軟骨形成および関節軟骨細胞の持続的生存を維持するため、変形性関節症の進行を抑制可能である。
【００３６】
変形性関節症において生じる軟骨細胞の変化は、ヒトの関節軟骨細胞のａｚａＣ誘導による最終分化を含む確立された細胞培養モデルによって模倣され、それは早期変形性関節症の治療に対するＰＴＨの使用を確立するために使用されていた。このヒト関節軟骨細胞培養モデルを用いて、ＰＴＨ（１−３４）による治療が、ａｚａＣ誘導ＩＩ型コラーゲン抑制を救済するだけでなく、ＩＩ型コラーゲンの発現を増加させることが発見された。ＰＴＨ（１−３４）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルの変化に対する同様の効果もまた発見された。正常な関節軟骨細胞は、関節軟骨の適切な機能のために必要とされるＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンを発現する。変形性関節症を引き起こす最終分化を経るときに、軟骨細胞はアルカリホスファターゼおよびＸ型コラーゲンを含むマーカーを発現し、一方で、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンの発現は減少し得る。この変性過程は軟骨細胞の石灰化、そして最終的には細胞死の原因となり得る。したがって、本開示の方法は、早期ＯＡにおける軟骨細胞の変性過程を抑制、停止、または好転させることを可能とするものである。
【００３７】
本明細書に開示される方法によると、ＰＴＨまたはＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）を用いた早期変形性関節症の治療は、軟骨細胞の細胞死（アポトーシス）を抑制または阻止可能である。
【００３８】
変形性関節症の臨床的特徴は、関節痛、３０分以上続く朝のこわばり、関節の不安定性、すなわち座屈（ｂｕｃｋｌｉｎｇ）、および機能喪失を含む。変形性関節症の兆候は、罹患関節における骨の肥大、動作範囲の制限、関節動作による摩擦音、動作に伴う痛み、罹患関節の不整列（ｍａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、および罹患関節の変形を含む。早期変形性関節症を検出するための例示的な方法は、関節軟骨におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の存在および濃度を検出および決定することが可能な放射線的方法に基づくものを含む。このような方法は、「軟骨の遅延型ガドリニウム造影ＭＲＩ」（ｄＧＥＭＲＩＣ）および「化学交換依存飽和転移」（ｇａｇＣＥＳＴ）（例えば、Ｌｉｎｇら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５（７）：２２６６−７０を参照のこと）、およびコンピューター断層撮影法（例えば、Ｊｏｓｈら（２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １３１（３７）：１３２３４−３５を参照のこと）として特定されるＭＲＩ技術を含む。変形性関節症の診断のためのさらなる方法は、超音波検査法および単純写真（Ｘ線）と同様に、関節造影法および関節鏡検査法を含む侵襲的方法も含む（例えば、Ｔｓａｉら（２００７）ＯｓｔｅｏＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １５：２４５−５０、およびＬｅｅら（２００８）ＯｓｔｅｏＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １６：３５２−５８を参照のこと）。
【００３９】
一旦診断されると、早期変形性関節症は本明細書に開示された方法を用いて治療可能である。ある実施形態では、早期変形性関節症はＰＴＨおよびＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）（ヒトＰＴＨ（１−３４））から成る群より選択される薬剤を、例えば滑膜関節における骨の間の液体で満たされた空間に注射し、患者の罹患関節腔に投与することによって治療される。このような実施形態の一態様では、薬剤はシリンジまたはその他の注射器具を使用して罹患関節の滑液に注入される。薬剤の量および処方設計ならびにそれの投与の頻度の決定は、本開示によって提供される、適切な医師の専門の範囲内にある。薬剤は、約０．１ｐｍｏｌｅから約５０００ｐｍｏｌｅの範囲内、約０．５ｐｍｏｌｅから約１５００ｐｍｏｌｅ、約１ｐｍｏｌｅから約１０００ｐｍｏｌｅの範囲内、約２．５ｐｍｏｌｅから約５００ｐｍｏｌｅの範囲内、または約５ｐｍｏｌｅから約３００ｐｍｏｌｅの範囲内の量で投与される。ある実施形態では、治療効果のある投与量は、滑膜関節の滑液内において薬剤の初期濃度を、約０．１ｎＭから約２００ｎＭの範囲内、約０．２５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内、約０．５ｎＭから約７５ｎＭの範囲内、約０．７５ｎＭから約５０ｎＭの範囲内、または約１ｎＭから約２５ｎＭの範囲内で提供する量である。他の側面では、薬剤の治療のための投与量は、約０．１ｍＬから約１０ｍＬの溶液を送達することで提供され、薬剤は約１ｎＭから約５００ｎＭの範囲内の濃度で存在する。他の側面では、薬剤は約１ｍＬから約３ｍＬの範囲内の量で送達され、かつ薬剤は約５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内の濃度で溶液中に存在する。
【００４０】
本開示は、ラットにおける変形性関節症のパパイン誘発モデルを提供し、それは変形性関節症が進行している間、生体内におけるＰＴＨ（１−３４）の関節軟骨に対する効果を検証するために使用された。この変形性関節症のパパイン誘発ラットモデルでは、ＰＴＨ（１−３４）の関節内投与は、ＧＡＧの減少を軽減させ、かつＩＩ型コラーゲンを修復した。さらに、５週間の治療によって、変形性関節症誘導軟骨におけるＧＡＧを正常のレベルまで戻し、かつＩＩ型コラーゲンを正常のレベルを超えるレベルまで増強させた。さらに、ＰＴＨ（１−３４）を用いた３−５週間の治療によって、変形性関節症誘導に起因するＸ型コラーゲンの発現を抑制するように思われた。さらに、ＯＡ誘導に起因する軟骨細胞のアポトーシスは、１−５週間のＰＴＨ（１−３４）処理によって著しく抑制された。
【００４１】
本明細書に開示される方法によると、ＰＴＨ（１−３４）処理は、正常ヒト関節軟骨細胞およびコントロールであるラットの膝関節（すなわち、非変形性関節症のラットの膝関節）において、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＡＬＰ、アグリカンおよびＧＡＧの発現を変化させないように思われた。出願人は、この信念に拘束されることを望むものではないが、ＰＴＨおよびＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）の投与は、変形性関節症罹患軟骨にのみ影響し得ることを確信する。本開示の方法によると、ＰＴＨまたはＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）は、変形性関節症にみられる進行と同様のヒト関節軟骨細胞の最終分化の進行を、抑制、停止または好転させることが可能である。したがって、ＰＴＨまたはＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）は、正常軟骨細胞に影響することなく早期変形性関節症を治療するために使用可能である。
【００４２】
本開示の方法によると、ＰＴＨまたはＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）は、早期変形性関節症を患う例えばヒトなどの苦しんでいる動物に対して連続してまたは定期的に投与可能である。それ故、関節のアポトーシスを抑制または阻止し、かつ関節軟骨細胞の変性過程を抑制、停止または好転させ得る。
【００４３】
処方設計および投与量
注射のための処方設計には、溶剤または分散媒であるキャリアが含まれていてもよい。適切なキャリアは、水、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州パーシッパニー所在）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール等）、およびそれらの混合物を含む。これらの組成物は注射可能であるように無菌かつ液体でなければならない。流動性はレシチンまたは界面活性剤などのコーティング剤で維持可能である。微生物汚染は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどの抗菌剤および抗真菌薬を包含することによって阻止可能である。マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの糖類および多価アルコールは、組成物中で等張性を維持するために使用可能である。
【００４４】
本明細書に開示するように、早期変形性関節症の治療のためのＰＴＨおよびＰＴＨ由来の物質、例えばＰＴＨ（１−３４）（ヒトＰＴＨ（１−３４））から成る群より選択される薬剤の治療効果のある投与量は、約０．１ｐｍｏｌｅから約５０００ｐｍｏｌｅの範囲内、約０．５ｐｍｏｌｅから約１５００ｐｍｏｌｅの範囲内、約１ｐｍｏｌｅから約１０００ｐｍｏｌｅの範囲内、約２．５ｐｍｏｌｅから約５００ｐｍｏｌｅの範囲内、または約５ｐｍｏｌｅから約３００ｐｍｏｌｅの範囲内である。ある実施形態では、治療効果のある投与量は、滑膜関節の滑液内において薬剤の初期濃度を、約０．１ｎＭから約２００ｎＭの範囲内、約０．２５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内、約０．５ｎＭから約７５ｎＭの範囲内、約０．７５ｎＭから約５０ｎＭの範囲内、または約１ｎＭから約２５ｎＭの範囲内で提供する量である。他の側面では、薬剤の治療のための投与量は、約０．１ｍＬから約１０ｍＬの溶液を送達することで提供され、薬剤は約１ｎＭから約５００ｎＭの範囲内の濃度で存在する。他の側面では、薬剤は約１ｍＬから約３ｍＬの範囲内の量で送達され、かつ薬剤は約５ｎＭから約１００ｎＭの範囲内の濃度で溶液中に存在する。
【００４５】
本開示の方法において送達される組成物は、有機ビスホスホネート、化学療法剤、放射性薬剤、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬、ステロイド、抗酸化剤、血管新生阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、ビタミン、選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）、エストロゲン−プロゲスチン、アンドロゲン、カルシトニン、抗生物質、カテプシンＫ阻害剤、スタチン、インテグリン受容体アンタゴニスト、骨芽細胞同化剤、もしくは選択的セロトニン再取り込み阻害剤、グルコサミン、ヒアルロン酸、またはそれらの混合物などの、追加のまたは第２の薬剤を含み得る。
【実施例】
【００４６】
材料および方法
ヒト関節軟骨細胞培養
正常ヒト関節軟骨の試料は、交通事故によって亡くなった２３歳のアジア人男性の膝関節から採取した。他の関節軟骨の試料は、関節形成術を受けた変形性関節症の６４歳の女性のドナーから採取した膝関節の正常な部分から採取した。軟骨の試料は細かく刻み、続いてヒアルロニダーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、プロナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、およびコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）中で消化した。その後、単離された軟骨細胞を、アルギン酸ビーズ内に封入した。１５個のビーズを６ウェルプレートのそれぞれのウェル内で、５ｍｌの培養培地で培養した。培養培地は、１００ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、１％インスリン−トランスフェリン−セレン、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地から構成されていた。ビーズをそれぞれの実験の前に、７日間５％ＣＯ２加湿インキュベータ内で３７℃で培養し、培養培地を３日ごとに交換した。
【００４７】
軟骨細胞培養におけるＡｚａＣ誘導およびＰＴＨ処理
軟骨細胞培養を４つのグループに分割した。ａｚａＣプラスＰＴＨ群には最初にａｚａＣ誘導を行い、その後ＰＴＨで処理した。ａｚａＣ群にはａｚａＣ誘導を行ったが、続けてＰＴＨでは処理しなかった。ＰＴＨ群ではＰＴＨを受理するが、ａｚａＣ誘導は行わなかった。コントロール群にはａｚａＣ誘導を行わず、かつＰＴＨ処理でも処理しなかった。ａｚａＣ誘導を軟骨細胞における最終分化を誘導するために使用した（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ（２００６）  ３０（３）：２８８−９４を参照のこと）。つまり、培養は４８時間１５μｇ／ｍｌの５−アザシチジン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス所在）で処理した。ａｚａＣ誘導後のＰＴＨ処理は、１０ｎＭのＰＴＨ（１−３４）を含む培地における軟骨細胞の培養を含むものであった。全ての群の細胞を、ＰＴＨ（１−３４）処理から３、７および１０日目で採取した。ビーズをｐＨ７．４の０．０５Ｍのクエン酸二ナトリウムおよび０．０３ＭのＥＤＴＡを含む０．９％のＮａＣｌ溶液中で溶解したときに、軟骨細胞がアルギン酸ビーズから放出された。細胞を１，５００ｒｐｍで５分間低速遠心分離して収集した。
【００４８】
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
軟骨細胞からの全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア所在）を使用して単離した。ファースト−ストランド相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州パロアルト所在）を使用して１μｇのＲＮＡから変換した。ＳＯＸ９、アグリカン、ＩＩ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、Ｘ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）、ＡＬＰ、ＩＨＨ、Ｂｃｌ−２、およびＢａｘのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）を用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）により、定量リアルタイムＰＣＲを使用して測定した。反応は、ｃＤＮＡ、それぞれの遺伝子に対する特定のプライマー、およびｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを含む２５μｌの混合物中で行った。
【００４９】
特定のＰＣＲ産物を、二本鎖ＤＮＡ結合蛍光染料であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによって検出した。相対ｍＲＮＡの濃度を、それぞれのＰＣＲ産物の閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（Ｃｔ）値から算出し、比較Ｃｔ法を用いてＧＡＰＤＨで標準化した。コントロール細胞におけるそれぞれの遺伝子発現の相対量を１に設定し、その他全てを比率に転換した。解離（融解）曲線をそれぞれのＰＣＲの後に作成してその特異性を調べた。全てのＰＣＲ増幅を３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行い、実験は少なくとも３回繰り返した。
【００５０】
ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）試験
アルギン酸ビーズを上述したように溶解し、さらに６０℃で１８時間パパイン（３００μｇ／ｍｌ）で消化した。試料中のＤＮＡおよび硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のレベルを、ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染料および１，９−ジメチルメチレンブルー染料をそれぞれ用いて定量した。ＤＭＭＢ試験のための検量線を、０から２５μｇ／μｌの範囲の濃度の水性コンドロイチン硫酸Ｃ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス所在）を用いて作成した。
【００５１】
ＴＵＮＥＬ染色
私達は、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ＴＭＲ  ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ社、独国マンハイム所在）を使用して、ＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）染色法を用いてアポトーシス細胞を測定した。製造ガイドラインに従って、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で４％のパラホルムアルデヒドを用いて１×１０６／ｍｌの細胞密度にて固定し、室温で１０分間インキュベートした。その後、サイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ３；Ｓｈａｎｄｏｎ社、英国チェシャー州所在）を使用して、５分間２，０００ｒｐｍの速度の遠心分離によって細胞をスライド上に定着させた。スライドをＰＢＳで二回洗浄し、細胞を氷上で２分間、透過溶液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．１％クエン酸ナトリウム中で０．１％トリトンＸ−１００）中でインキュベートすることによって透過化した。末端デオキシヌクレオチド転移酵素およびローダミン（標識染料）を含むＴＵＮＥＬ反応混合物をスライドに添加し、暗所加湿室内にて６０分間３７℃でインキュベートした。反応はブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中で０．１％トリトンＸ−１００／０．５％ウシ血清アルブミン）で停止した。細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。スライドをローダミンの５８０ｎｍおよびＤＡＰＩの３６５ｎｍの励起波長を用いて蛍光顕微鏡下で観察した。細胞核はＤＡＰＩで青色に染色され、アポトーシス細胞のみがローダミンによって赤色に染色された。染色された細胞をそれぞれのスライド上の５顕微鏡視野（１．５６６ｍｍ２／フィールド）において数えた。データをイメージ−プロプラス（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ）解析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング所在）を使用して解析した。軟骨細胞におけるアポトーシスの割合を、赤色染色細胞（アポトーシス細胞）の青色染色細胞（全細胞）に対する比率として定義した。
【００５２】
動物実験
５４匹の１２週の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０−３００ｇｍ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ社から購入し、餌および水を絶えず与えて（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）標準の実験室条件（温度２４℃、１２時間の明暗サイクル）下で飼育した。動物は実験前に１週間実験室環境に慣れさせた。
【００５３】
変形性関節症誘導およびＰＴＨ処理
ラットを以下の３つの群に分割した：ＯＡ（ＰＴＨ［１−３４］処理無しのＯＡ誘導）（ｎ＝１８）、ＯＡプラスＰＴＨ（ＯＡ誘導に続いてＰＴＨ［１−３４］処理）（ｎ＝１８）、およびＰＴＨ（ＯＡ誘導無しのＰＴＨ［１−３４］処理）（ｎ＝１８）。対側コントロール膝としての役割を果たすそれぞれの左膝にＰＴＨ処理もＯＡ誘導も行わずに賦形剤を注射した。右膝は調査用関節である。２０μｌの４％パパイン溶液および２０μｌの０．０３Ｍシステインを関節内に注射して、ＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群のラットの右膝にＯＡを誘導した。注射は実験の１、４および７日目に、膝蓋腱を介して２６ゲージ針を用いて行った（Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９９６）１７（６）：５２９−３５を参照のこと）。ＯＡプラスＰＴＨ群では、ＯＡ誘導の後、ラットは殺されるまで３日ごとに４０μｌの１０ｎＭＰＴＨ（１−３４）を右膝の関節内に注射された。ＰＴＨ群では、同じＰＴＨ（１−３４）処理を行ったが、ＯＡ誘導は行わなかった。それぞれの群の６匹のラットはＯＡプラスＰＴＨ群のラットと同時期にＣＯ２吸入によって殺され、ＰＴＨ（１−３４）処理は１、３および５週間行われた。
【００５４】
組織学的分析
ラットを殺した後に、膝を採取し、関節軟骨と共に脛骨プラトーを集めて、組織学的準備の前に１０％の中性緩衝ホルマリンで固定した。その後、試料を１０％のギ酸／ＰＢＳ中で脱灰した。脱灰した脛骨関節（ｔｉｂｉａ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ）試料をパラフィンで包埋し、冠状面（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｐｌａｎｅ）における５−μｍの検鏡試片を作成した。ＧＡＧをサフラニンＯ−ファストグリーン（１％のサフラニンＯ、対比染色は０．７５％のヘマトキシリン、その後１％のファストグリーン）（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス所在）で染色した。局所ＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンを免疫染色した。軟骨内のアポトーシス細胞はＴＵＮＥＬ染色した。
【００５５】
組織形態計測的分析
ＧＡＧはサフラニンＯで赤色に染色され、それぞれの脛骨近位端における関節軟骨の全体および赤色染色領域を、イメージ−プロプラスソフトウェア、バージョン５．０を用いて測定した。それぞれの群における赤色染色領域の全体領域に対する比率（赤色：全体）を算出した。
【００５６】
免疫組織化学
脛骨関節の切片を水で戻し、組織内の内因性ペルオキシダーゼを３％の過酸化水素でブロックした。一次抗体と共にインキュベートする前に、エピトープを回復させるために酵素によって試料を消化した（例えば、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ（２００２）５０（８）：１０４９−５８を参照のこと）。ＩＩ型コラーゲンの免疫染色のための酵素消化に対する最適な条件は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４；Ｓｉｇｍａ社）中で２．５％のヒアルロニダーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのプロナーゼの混合物を３７℃で１時間であった。Ｘ型コラーゲンの免疫染色のための最適な条件は、０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＢＣ（シグマ社）を１時間、およびトリス塩酸（ｐＨ３．０）中で１ｍｇ／ｍｌのペプシンを３７℃で１５分であった。その後、切片は１時間ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）でブロックし、ＩＩ型コラーゲンに対する一次抗体（マウスモノクローナル抗体；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、カリフォルニア州テメキュラ所在）およびＸ型コラーゲンに対する一次抗体（ラットポリクローナル抗体）（１：２００；Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ社、日本、東京）または（マウスモノクローナル抗体）（１：１００）（Ｓｉｇｍａ社）を３７℃で４時間または室温で１時間インキュベートした。二次抗体を、ＩＩ型コラーゲンに対するビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ社、カリフォルニア州カーピンテリア所在）、およびＸ型コラーゲンに対するビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、カリフォルニア州ウォールナットクリーク所在）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ−複合化ストレプトアビジン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（Ｄａｋｏ社、カリフォルニア州カーピンテリア所在またはＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社）を用いて、３０分間インキュベートした。０．０１％の過酸化水素を含む３，３’−ジアミノベンジジン溶液を用いた染色により褐色となった。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色し、顕微鏡で観察した。免疫染色の相対密度（密度／領域；ｍｅａｎ±ＳＥＭ領域２５．４４±２．７７ｍｍ２）を、イメージ−プロプラスソフトウェア、バージョン５．０（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を使用して測定した。
【００５７】
脛骨関節切片に対するＴＵＮＥＬ染色
それぞれの切片におけるアポトーシス細胞を、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ＴＭＲ  ｒｅｄを使用したＴＵＮＥＬ染色によって測定した。切片を水で戻し、プロテイナーゼＫ（トリス塩酸［ｐＨ７．４］中で１０μｇ／ｍｌ）と共に２０分間インキュベートした。透過化の後、切片をペプシン（ＨＣｌ［ｐＨ２．０］中で０．２５％）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。以下の方法は上述した軟骨細胞培養に対するものと同様である。また、切片はＤＡＰＩおよびヘマトキシリンおよびエオシンで染色して細胞の局在化を確認した。ＤＡＰＩ−染色細胞（ｍｅａｎ±ＳＥＭ  １５０±４０）を脛骨プラトーにおける軟骨の中心領域で数えた。アポトーシスの割合は軟骨細胞培養において使用したものと同様の方法を用いて定義した。
【００５８】
統計的分析
データはインビトロ研究の４試料およびインビボ研究の６試料からのｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭとして示す。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。統計的有意性を一元配置分散分析により評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。０．０５未満のＰ値が有意であると判断した。
【実施例１】
【００５９】
ヒト関節軟骨細胞の変性過程の抑制（インビトロ）
正常な関節軟骨細胞は、関節軟骨の適切な機能のために必要とされる、ＩＩ型コラーゲン、ＧＡＧおよびアグリカンを発現する。ＯＡをもたらす最終分化を経るとき、軟骨細胞はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、およびＸ型コラーゲンを含むマーカーを発現し、それと同時に、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンの発現は減少し得る。この変性過程は軟骨細胞の石灰化そして最終的には細胞死をもたらし得る。
【００６０】
図１Ａ−１Ｆは、副甲状腺ホルモン関連物質ＰＴＨ（１−３４）で処理した後のヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）アグリカン、（Ｂ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、（Ｃ）ＩＩ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、（Ｄ）Ｘ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）、（Ｅ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および（Ｆ）インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）のｍＲＮＡレベルの変化を示す。細胞は左から未処理（コントロール）、ＰＴＨ単独で処理、ａｚａＣ単独で処理、またはａｚａＣおよびＰＴＨの両方で処理したものである。ａｚａＣプラスＰＴＨ群がＰＴＨ処理から３、７および１０日目に到達したときに、全群の細胞を採取した。ｍＲＮＡ発現はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって定量化した。バーは４つの同型培養のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。全ての実験は少なくとも３回繰り返した。データを一元配置分散分析により評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。コントロールと比べて＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．０１；＃＝Ｐ＜０．０５；＃＃＝Ｐ＜０．０１。
【００６１】
材料および方法で上述したように、軟骨細胞からの全ｍＲＮＡを単離し、ファースト−ストランド相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。ＳＯＸ９、アグリカン、ＩＩ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、Ｘ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）、ＡＬＰ、ＩＨＨ、Ｂｃｌ−２、およびＢａｘのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）を用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）によって、定量リアルタイムＰＣＲを使用して測定した。反応は、ｃＤＮＡ、それぞれの遺伝子に対する特定のプライマー、およびｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを含む２５μｌの混合物中で行った。
【００６２】
サイクル条件は以下の通りである：ＩＩ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、Ｘ型α１コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＤＰＨ）に対して、サイクル条件は１サイクルを９５℃で３分間、続いて４０サイクルを９５℃で１０秒、６１℃で３０秒よび５５℃で１分とした；ＡＬＰに対しては、サイクル条件は１サイクルを９５℃で３分間、続いて４０サイクルを９５℃で１０秒、６５℃で３０秒および５５℃で１分とした。プライマー配列は以下の通りである：（ｉ）ＩＩ型α１コラーゲン（８１ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と指定；リバースプライマー：５’−ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＣＴ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と指定。（ｉｉ）Ｘ型α１コラーゲン（８５ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  Ａ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と指定；リバースプライマー：５’−ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  Ｇ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と指定。（ｉｉｉ）ＧＡＰＤＨ（１２６ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と指定；リバースプライマー：５’−ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  Ｃ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と指定。（ｉｖ）アルカリホスファターゼ（６４ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  Ａ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と指定；リバースプライマー：５’−ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＧＴＧ  ＴＴ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と指定。（ｖ）アグリカン（１８９ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＧＧ  −３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と指定；リバースプライマー：５’−  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＴ  −３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０と指定。（ｖｉ）インディアンヘッジホッグ（８２ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＡＧ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１と指定；リバースプライマー：５’−  ＡＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  −３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と指定。（ｖｉｉ）Ｂｃｌ−２（２５４ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＡＧ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と指定；リバースプライマー：５’−  ＡＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＧＧ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と指定。（ｖｉｉｉ）Ｂａｘ（１６１ｂｐ産物）：フォワードプライマー：５’−  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５と指定；リバースプライマー：５’−  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＴＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６と指定。
【００６３】
特定のＰＣＲ産物を、二本鎖ＤＮＡ結合染料であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光によって検出した（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）２４（６）：９５４−８、９６０、９６２）。相対ｍＲＮＡの発現レベルを、それぞれのＰＣＲ産物の閾値サイクル（Ｃｔ）値から算出し、比較Ｃｔ法を用いてＧＡＰＤＨで標準化した（Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１）２５（４）：４０２−８）。Ａｚａｃ誘導後３日のコントロール細胞のそれぞれの遺伝子発現の相対量を１００％に設定し、その他全てを基準に対する変化率に転換した。ＰＣＲ反応の後、解離（融解）曲線を作成してＰＣＲ反応の特異性を調べた。全てのＰＣＲ増幅を３重に行い、実験は少なくとも３回繰り返した。
【００６４】
ＰＴＨ（１−３４）処理後３−１０日では、ＰＴＨ群における、アグリカン、Ｃｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）、Ｃｏｌ１０ａ１（Ｘ型コラーゲン）、ＡＬＰ、およびＩＨＨの遺伝子発現は、コントロール群のものと著しい差異はなかった（図１Ａおよび１Ｃ−１Ｆ）。ａｚａＣ群では、アグリカンおよびＣｏｌ２ａ１のｍＲＮＡレベルは、ａｚａＣ誘導後３日および７日においてコントロール群におけるものよりも低かった（図１Ａおよび１Ｃ）。ａｚａＣ誘導後３日では、アグリカンレベルはコントロールの５６％（Ｐ＜０．０５）、およびＣｏｌ２ａ１レベルはコントロールの４６．３％（ｐ＜０．０１）であった。ａｚａＣ誘導後７日では、アグリカンレベルはコントロールの３１％（Ｐ＜０．０１）、およびＣｏｌ２ａ１レベルはコントロールの６４．８％（ｐ＜０．０５）であった。さらに、ａｚａＣ群におけるＣｏｌ１０ａ１のレベル（コントロールの２．３−２．４倍）およびＡＬＰのレベル（コントロールの５．３−１０．９倍）は、ａｚａＣ誘導後７および１０日においてコントロール群よりも著しく高かった（Ｐ＜０．０１）（図１Ｄおよび１Ｅ）。また、ＩＨＨ発現は、ａｚａＣ誘導後３、７および１０日において著しく上昇した（レベルはａｚａＣ誘導後３日ではコントロールの６．５倍［Ｐ＜０．０１］、ａｚａＣ誘導後７日ではコントロールの２．６倍［Ｐ＜０．０５］、およびａｚａＣ誘導後１０日ではコントロールの２．７倍［Ｐ＜０．０５］）。（図１Ｆ）。ａｚａＣプラスＰＴＨ群において、ａｚａＣ誘導後３、７および１０日におけるＰＴＨ（１−３４）処理により、Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｏｌ１０ａ１、ＡＬＰ、ＩＨＨおよびアグリカンのｍＲＮＡレベルにおけるａｚａＣ誘導による変化が好転した（Ｃｏｌ２ａ１およびアグリカンの１０日培養を除いて）（図１）。ａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるアグリカンのｍＲＮＡレベルは、処理後３および７日においてａｚａＣ群のものよりも著しく高く（処理から３日目に対してＰ＜０．０５、および処理から７日目に対してＰ＜０．０１）、コントロール群のものと著しい差異はなかった。しかしながら、ＰＴＨ処理後１０日では、アグリカンレベルはａｚａＣ群のものと差異はなく、コントロール培養のものよりも低かった（Ｐ＜０．０５）（図１Ａ）。ａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるＣｏｌ２ａ１の発現レベルは、ＰＴＨ（１−３４）処理後３日においてａｚａＣ群のものよりも著しく高く（Ｐ＜０．０５）、コントロール群と著しい差異はなかった。ＰＴＨ（１−３４）処理後７日では、ａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるＣｏｌ２ａ１の発現レベルは、ａｚａＣ（Ｐ＜０．０１）またはコントロール（Ｐ＜０．０５）群のそれよりも高かった（図１Ｃ）。しかしながら、ＰＴＨ（１−３４）処理後１０日では、全ての３群間で著しい差異は見つからなかった。ａｚａＣによって誘導された、Ｃｏｌ１０ａ１、ＡＬＰおよびＩＨＨのｍＲＮＡレベルにおける変化は、ＰＴＨ（１−３４）処理後のａｚａＣプラスＰＴＨ培養において著しく取り除かれた（処理後３、７および１０日のＣｏｌ１０ａ１およびＡＬＰに対してＰ＜０．０１；処理後３日のＩＨＨに対してＰ＜０．０１；処理後７および１０日のＩＨＨに対してＰ＜０．０５）（図１Ｄ−１Ｆ）。特筆すべきは、ＰＴＨ（１−３４）処理から３日目において、ａｚａＣプラスＰＴＨ培養におけるＣｏｌ１０ａ１およびＡＬＰの発現は、コントロール培養のものよりも低かったことである（Ｐ＜０．０１）（図１Ｄおよび１Ｅ）。しかしながら、処理から７日目では、どちらの遺伝子の発現においても、コントロールとａｚａＣプラスＰＴＨ群との間で著しい差異は見つからなかった。処理から１０日目では、ａｚａＣプラスＰＴＨ培養におけるＡＬＰの発現は、コントロール培養のものよりも高かった（Ｐ＜０．０５）（図１Ｅ）。ａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるＩＨＨのｍＲＮＡレベルは、ＰＴＨ（１−３４）処理後３−１０日においてコントロール培養のものより４７−７１％低かったが、１０日後の差異のみが、統計的にほぼ有意であった（図１Ｆ）。
【００６５】
軟骨細胞培養におけるＧＡＧレベルは、ＰＴＨとコントロール群との間で著しい差異はなかった。ａｚａＣ群におけるＧＡＧレベルは、ａｚａＣ誘導後３および７日においてコントロールよりも著しく低かった（Ｐ＜０．０１）（図１Ｂ）。ａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるＧＡＧレベルは、ＰＴＨ（１−３４）処理後３、７および１０日においてａｚａＣ群のものよりも著しく高かった（Ｐ＜０．０１）。アグリカンのｍＲＮＡの発現は、ａｚａＣプラスＰＴＨ群において、ＰＴＨ（１−３４）処理後１０日において好転しないが、それでもａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるＧＡＧレベルは、７および１０日後におけるコントロール群のものよりも高い（Ｐ＜０．０１）（図１Ｂ）。ａｚａＣ誘導ＯＡを患うヒト関節軟骨細胞を、ＰＴＨを用いて治療する間に観察されたＣｏｌ１０ａ１、ＡＬＰ、およびＩＨＨの遺伝子発現の減少、アグリカン、Ｃｏｌ２ａ１、およびＧＡＧによって、ＰＴＨ処理はヒト関節軟骨細胞の変性過程を好転させ、かつ軟骨細胞の最終分化を抑制可能であることが示された。さらに、アグリカン、Ｃｏｌ２ａ１、およびＧＡＧの発現は、正常ヒト関節軟骨細胞に対するＰＴＨ処理によって著しく影響されず、それはＰＴＨまたはＰＴＨ由来の物質が正常軟骨細胞に影響せずに早期ＯＡを治療するために使用可能であることを示している。
【実施例２】
【００６６】
ヒト関節軟骨細胞アポトーシスの抑制（インビトロ）
Ｂｃｌ−２およびＢａｘは、アポトーシスを制御する細胞質タンパク質のファミリーメンバーである。２つのタンパク質は非常によく似たアミノ酸配列を有するが、機能的には正反対である：Ｂｃｌ−２はアポトーシスを抑制する一方、Ｂａｘはこの効果に対抗する（Ｈｕｎｔｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（１５）：８５２１−４）。
【００６７】
図２Ａ−２Ｃは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）で処理した後のヒト関節軟骨細胞における、（Ａ）Ｂｃｌ−２のｍＲＮＡの発現、（Ｂ）ＢａｘのｍＲＮＡの発現、および（Ｃ）Ｂｃｌ−２のＢａｘに対する比率における変化を示す。細胞は左から未処理（コントロール）、ＰＴＨ単独で処理、ａｚａＣ単独で処理、またはａｚａＣおよびＰＴＨの両方で処理したものである。ａｚａＣプラスＰＴＨ群がＰＴＨ処理から３、７、１０および１４日目に到達したときに、全群の細胞を採取した。ｍＲＮＡ発現はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって定量化した。バーは４つの同型培養のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。全ての実験は少なくとも３回繰り返した。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。コントロールと比べて＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．０１；＃＝Ｐ＜０．０５；＃＃＝Ｐ＜０．０１。
【００６８】
長期にわたるＢｃｌ−２およびＢａｘの発現における変化を調査するために、１４日群を追加した。ＰＴＨ群において、Ｂｃｌ−２およびＢａｘの発現はコントロール群と比較して著しい差異を示さなかった。Ｂｃｌ−２の発現は、処理後３−１０日においてコントロールのものの１．７倍であったが、統計的に著しい差異は見つからなかった。ａｚａＣ群では、Ｂｃｌ−２のｍＲＮＡレベルは、ａｚａＣ誘導後３および１０日で著しく増加した（処理後３日でコントロールの３．２倍［Ｐ＜０．０５］；処理後１０日でコントロールの４．７倍［Ｐ＜０．０１］）（図２Ａ）。また、ａｚａＣプラスＰＴＨ群では、Ｂｃｌ−２の発現はコントロール培養のものよりも高く（処理後３日でコントロールの２．１倍［Ｐ＜０．０５］；処理後７日でコントロールの２．１倍［Ｐ＜０．０５］；および処理後１０日でコントロールの６．０倍［Ｐ＜０．０１］）、それはＰＴＨ処理によってａｚａＣのＢｃｌ−２発現に対する影響を好転させることは不可能であることを示していた。ＰＴＨによる処理後１４日では、Ｂｃｌ−２の発現は群間で著しい差異を示さなかった（図２Ａ）。ＢａｘのｍＲＮＡ発現のレベルは、ＰＴＨ処理後３−１０日において、ａｚａＣおよびａｚａＣプラスＰＴＨ群の両方においてわずかに減少したが（コントロールの６１−８８％）、差異は統計的に有意なものではなかった。しかしながら、ａｚａＣ誘導後１４日では、ａｚａＣ群におけるＢａｘの発現が著しく増加し（コントロールの２．１倍［Ｐ＜０．０１］）、かつａｚａＣプラスＰＴＨ群におけるＢａｘの発現も依然コントロール培養のものの１．６倍であった。これは、ＰＴＨ処理によってａｚａＣのＢａｘ発現に対する影響を完全に好転させることは不可能であることを示していた（図２Ｂ）。Ｂｃｌ−２のＢａｘに対する比率は、ＰＴＨ処理後３日（Ｐ＜０．０５）および１０日（Ｐ＜０．０１）では、ａｚａＣおよびａｚａＣプラスＰＴＨ群においてコントロール群よりも高かった。ＰＴＨ処理後７または１４日では、ａｚａＣとａｚａＣプラスＰＴＨ群との間で、Ｂｃｌ−２：Ｂａｘの比率において著しい差異は見つからなかった（図２Ｃ）。軟骨細胞のアポトーシスが、例えば後期ＯＡを患う患者に発生したとき、ＰＴＨ処理によって細胞死を好転させることは不可能である。
【００６９】
ＴＵＮＥＬ染色を用いて、コントロール、ａｚａＣ、およびａｚａＣプラスＰＴＨ群において、ヒト関節軟骨細胞培養におけるアポトーシスの比率を、（ａｚａＣプラスＰＴＨ群のために）ＰＴＨ（１−３４）処理から１４日後に比較した。
【００７０】
図３はヒト関節軟骨細胞における副甲状腺ホルモンのａｚａＣ誘導によるアポトーシスに対する効果を示す。コントロール細胞、ａｚａＣ単独で処理した細胞、およびａｚａＣプラスＰＴＨで処理した細胞におけるアポトーシスの割合を比較した。バーは４つの同型培養のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。コントロールと比べて＊＊＝Ｐ＜０．０１；＃＃＝Ｐ＜０．０１。
【００７１】
ヒト関節軟骨細胞におけるアポトーシスの割合は、ａｚａＣ培養においてコントロール培養のものよりも著しく高かった（４．８倍の増加、Ｐ＜０．０１）。ａｚａＣプラスＰＴＨ培養におけるアポトーシスの割合は、ａｚａＣ培養のものよりも著しく低いが（Ｐ＜０．０１）、それでもコントロール培養のものよりは高かった（３．１倍の増加、Ｐ＜０．０１）（図３）。一度アポトーシスが始まると、ＰＴＨ処理によって軟骨細胞のアポトーシスを好転させることは不可能であるが、それらがＯＡの進行の早期の段階にあるとき、軟骨細胞の変性過程を好転させることによって、軟骨細胞死を阻止し、かつアポトーシスの割合を減少させることが可能である。
【実施例３】
【００７２】
ラット動物モデルにおける関節軟骨細胞の変性過程の抑制
図４は、正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、副甲状腺ホルモンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルに対する効果を示す。ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節、並びにＯＡ、ＯＡプラスＰＴＨ、およびＰＴＨ群のラットの調査用関節からの脛骨近位端におけるサフラニンＯで染色された関節軟骨を、サフラニンＯ染色領域の全体領域に対する比率のため測定した。サフラニンＯ染色領域の全体領域に対する比率（赤色／全体）を、ＰＴＨ処理後１、３および５週間の全群間で比較した。バーは６試料のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。それぞれの時点でのＯＡ群における調査用関節と比べて＊＊＝Ｐ＜０．０１；＃＃＝Ｐ＜０．０１。
【００７３】
ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節と同様に、ＯＡ、ＯＡプラスＰＴＨ、およびＰＴＨ群におけるラットの調査用関節からのサフラニンＯで染色された（ＧＡＧポジティブ）関節軟骨の顕微鏡写真を前述した方法に従って作成した。サフラニンＯ染色領域の全体領域に対する比率（赤色／全体）を測定し、群間で比較した（図４）。ＯＡ、ＯＡプラスＰＴＨ、およびＰＴＨ群における対側コントロール軟骨の赤色：全体の比率は、どの時点においても全ての３群間で著しい差異はなかった。ＯＡ群における調査用関節からの軟骨の赤色：全体の比率は、ＯＡ誘導後１、３および５週間において、対側コントロール軟骨のものよりも著しく低かった（Ｐ＜０．０１）（図４）。また、ＯＡプラスＰＴＨ群における調査用軟骨の赤色：全体の比率も、ＯＡ誘導に続くＰＴＨ（１−３４）処理後１および３週間において、対側コントロールのものよりも著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。しかしながら、比率は時間と共に上昇した。ＰＴＨ（１−３４）処理の５週間後、ＯＡプラスＰＴＨ群からの軟骨は、対側コントロール軟骨と著しい差異はなかった（図４）。ＯＡプラスＰＴＨ群における赤色：全体の比率は、ＰＴＨ（１−３４）処理後１、３および５週間におけるＯＡ群のものよりも著しく高かった（Ｐ＜０．０１）（図４）。ＰＴＨ群では、どの時点においても、調査用軟骨と対側コントロール軟骨との間で著しい差異はなかった（図４）。
【００７４】
ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節と同様に、ＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群におけるラットの調査用関節からの免疫組織化学的染色を行った関節軟骨の顕微鏡写真を前述した方法に従って作成した。相対密度を定量化することによる免疫組織化学分析により、対側コントロール軟骨における免疫局在化ＩＩ型コラーゲンの密度は３群間で著しい差異がないことが示された。
【００７５】
図５は、正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、副甲状腺ホルモンの免疫局在化ＩＩ型コラーゲンに対する効果を示す。ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節、並びにＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群のラットの調査用関節からの脛骨近位端における関節軟骨のＩＩ型コラーゲンの免疫染色によって関節軟骨を測定した。成長板軟骨をポジティブコントロールとして染色した。一次抗体なしで染色した成長板および関節軟骨試料をネガティブコントロールとして使用した。対側コントロール軟骨、ＯＡ軟骨、およびＰＴＨ処理後３および５週間のＯＡ軟骨における相対密度を比較した。バーは６試料のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。それぞれの時点でのＯＡ群における調査用関節と比べて＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．０１；＃＝Ｐ＜０．０５。
【００７６】
免疫局在化ＩＩ型コラーゲンは、ＯＡ誘導後３および５週間におけるＯＡ群のラットからの調査用軟骨において、対側コントロール軟骨と比較して著しく取り除かれた（Ｐ＜０．０５）。ＯＡプラスＰＴＨ群の調査用軟骨では、免疫局在化ＩＩ型コラーゲンの密度はＯＡ群のものよりも著しく高かったが（Ｐ＜０．０５）、ＯＡ誘導に続くＰＴＨ（１−３４）処理後３週間では、対側コントロール軟骨のものと差異はなかった（図５）。ＰＴＨ（１−３４）処理から５週間後、ＯＡプラスＰＴＨ群の調査用軟骨における免疫局在化ＩＩ型コラーゲンの密度は、ＯＡ群のもの（Ｐ＜０．０１）だけでなく、ＯＡプラスＰＴＨ群の対側コントロールのもの（Ｐ＜０．０５）よりも著しく高かった。免疫局在化Ｘ型コラーゲンは、ＯＡ群の関節軟骨細胞において主に見られたが、ＰＴＨ（１−３４）処理後３および５週間のＯＡプラスＰＴＨ群の軟骨においては不明確であった。明らかなＸ型コラーゲン染色軟骨細胞は対側コントロール軟骨では見つからなかった。パパイン誘発ＯＡを患うラット対してＰＴＨ処理を行ったとき、ＧＡＧ、ＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンの発現もまた、関節軟骨細胞の変性過程の好転させる効果を示した。
【実施例４】
【００７７】
ラット動物モデルにおける関節軟骨細胞アポトーシスの抑制
ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節と同様に、ＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群におけるラットの調査用関節からのＴＵＮＥＬ染色された関節軟骨の代表的な顕微鏡写真を前述した方法に従って作成した。
【００７８】
図６は正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、副甲状腺ホルモンの軟骨細胞アポトーシスに対する効果を示す。ＰＴＨ処理後１、３および５週間における、ＯＡ群のラットの対側コントロール関節、ならびにＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群のラットの調査用関節からの脛骨近位端におけるＴＵＮＥＬ染色および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色した関節軟骨を測定した。対側コントロール関節、ＯＡ関節、およびＰＴＨで処理したＯＡ関節におけるアポトーシスの割合を比較した。バーは６試料のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。それぞれの時点でのＯＡ群における調査用関節と比べて＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＃＝Ｐ＜０．０５；＃＃＝Ｐ＜０．０１。
【００７９】
ＯＡ群の調査用軟骨における細胞のアポトーシスの割合は、ＯＡ誘導後３週間（Ｐ＜０．０５）および５週間（Ｐ＜０．０１）における対側コントロール軟骨のものよりも著しく高いという結果を示した（図６）。ＯＡプラスＰＴＨ群では、調査用軟骨における軟骨細胞のアポトーシスの割合は、ＯＡ群のものよりも著しく低く（Ｐ＜０．０１）、かつ対側コントロール軟骨との著しい差異を示さなかった（図６）。したがって、パパイン誘発ＯＡを患うラットをＰＴＨで処理すると、軟骨細胞死は阻止され、かつアポトーシスの割合は減少した。
【００８０】
本明細書に開示するように、ａｚａＣ誘導による軟骨細胞の最終分化（ＯＡ変化を模倣）培養モデルおよびパパイン誘発ＯＡラットモデルは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は早期変形性関節症を治療し、関節軟骨細胞のアポトーシスを阻止し、かつ関節軟骨細胞の変性過程を好転させるために使用可能であることを実証するために使用された。さらに、本開示の方法によると、パパイン誘発ＯＡラットモデルは、関節内注射を介した早期ＯＡのＰＴＨを用いた治療を実証するために使用された。
【実施例５】
【００８１】
ラット動物モデルにおける関節軟骨細胞の変性過程を抑制するための投与量範囲
図７は、処理後５週間の正常および変形性関節症（ＯＡ）のラットの関節軟骨における、副甲状腺ホルモンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルに対する効果を示す。方法は、ＰＴＨ（１−３４）の投与量の濃度が５ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭであることを除いて、「動物実験」および「変形性関節症誘導およびＰＴＨ処理」と題する節において上述した通りである。ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節、ならびにＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群におけるラットの調査用関節からの脛骨近位端におけるサフラニンＯで染色された関節軟骨を、サフラニンＯ染色領域の全体領域に対する比率のため測定する。サフラニンＯ染色領域の全体領域に対する比率（赤色／全体）を、ＰＴＨ処理後５週間の全群間で比較する。バーは６試料のｍｅａｎ  ａｎｄ  ＳＥＭを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施する。＊＊＝Ｐ＜０．０１：それぞれの時点でのＯＡ群におけるコントロール関節対調査用関節；＃＃＝Ｐ＜０．０１：ＯＡ関節対ＯＡプラスＰＴＨ５ｎＭ、ＯＡプラスＰＴＨ１０ｎＭ、およびＯＡプラスＰＴＨ１００ｎＭ群における調査用関節。
【００８２】
ＯＡ群におけるラットの対側コントロール関節と同様に、ＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群におけるラットの調査用関節からのサフラニンＯで染色された（ＧＡＧポジティブ）関節軟骨の顕微鏡写真を前述した方法に従って作成する。サフラニンＯ染色領域の全体領域に対する比率（赤色／全体）を測定し、群間で比較する（図７）。ＯＡおよびＯＡプラスＰＴＨ群における対側コントロール軟骨の赤色：全体の割合は、全ての３群間で著しい差異はなかった。ＯＡ群における調査用関節の軟骨の赤色：全体の比率は、ＯＡ誘導後５週間において対側コントロール軟骨のものよりも著しく低かった（Ｐ＜０．０１）（図７）。ＰＴＨ（１−３４）処理から５週間後、ＯＡプラスＰＴＨ群の軟骨は対側コントロール軟骨と著しい差異はなく（図７）、すなわち、ＯＡプラスＰＴＨ群における赤色：全体の比率は、ＰＴＨ（１−３４）処理後５週間において、ＯＡ群のものよりも著しく高かった（Ｐ＜０．０１）（図７）。これらの結果から、５週間にわたる（３日ごとに注射）５、１０および１００ｎＭのＰＴＨ（１−３４）を用いた処理によって、ＧＡＧの損失を著しく抑制可能とすることが示される。ＯＡ群のＧＡＧレベルはコントロール群のものより著しく低い（Ｐ＜０．０１）。５、１０、または１００ｎＭのＰＴＨ（１−３４）で処理した後に観察されたＧＡＧレベルは、ＯＡ群のものよりも著しく高い（Ｐ＜０．０１）。さらに、コントロール群とＰＴＨ処理群との間に著しい差異はない。
【００８３】
本発明を実施例によって、および好ましい実施形態の観点から説明してきたが、本発明は開示された実施形態に限定されないことを理解すべきである。それとは反対に、（当業者に明確であるように）様々な修正および類似の変更を網羅することが意図される。したがって、添付の特許請求の範囲は、全てのこのような修正および類似の変更を包含するように、最も広い解釈が与えられるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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