(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物であって、
該核酸が、
下記の（ａ）〜（ｏ）：
（ａ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方が配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方が配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方が配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方が配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方が配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方が配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方が配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方が配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｌ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｍ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｎ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；および
（ｏ）一方または両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失または置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｎ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ
からなる群より選択されるいずれか１つ以上からなる
医薬組成物。
【請求項２】
ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物であって、該核酸が配列番号８１〜９２のいずれか１つ以上からなる、医薬組成物。
【請求項３】
前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
下記の（ａ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのｓｉＲＮＡ：
（ａ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方が配列番
号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方が配列番
号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方が配列番
号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方が配列番
号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方が配列
番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方が配列
番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方が配列
番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方が配列
番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方が配列
番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３９で表される塩基配列であり、他方がその
相補配列である配列番号４０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４５で表される塩基配列であり、他方がその
相補配列である配列番号４６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；ならびに
（ｌ）一方または両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失または置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｋ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号８１〜９２のいずれか１つ以上からなるロックド核酸（ＬＮＡ）含有核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＭＳ２の新規用途に関する。より詳細には、本発明は、ＳＭＳ２を用いたメタボリックシンドロームの治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満の誘発は、ニューロペプチドＹ５受容体またはメラノコルチン受容体など視床下部発現タンパク質を介した摂食促進作用、またはアシルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）などを介した脂肪酸合成促進作用の関与などが知られている。現在、抗肥満薬として、ニューロペプチドＹ５受容体拮抗剤、メラノコルチン受容体拮抗剤およびＡＣＣ阻害剤などが開発されている。しかし、現在のところ、有効な抗肥満薬は見出されていないのが現状である。
【０００３】
脂肪肝は、肝臓において中性脂肪が蓄積する疾患であり、肥満が主要な発症原因とされている。しかし、抗肥満薬同様、有効な脂肪肝処置薬は見出されていないのが現状である。また、メタボリックシンドロームの代表例とされ、肥満や循環器系疾患のような生活習慣病の根本的原因であるとされる糖尿病については、スルホニル尿酸薬、ビグアナイド、αグルコシダーゼ、およびアゾリジン誘導体などが開発されているが、副作用および有効性に問題がある。したがって、より有効な処置薬の開発が期待されている。
【０００４】
スフィンゴミエリン合成酵素（ＳＭＳ）は、細胞膜に最も多量に存在するスフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリン（ＳＭ）を合成する酵素であり、細胞死および生存に重要な役割を果たしている（非特許文献１および２参照）。ＳＭＳは、２００４年に同定され、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２の２種類が存在することが知られている。ＳＭＳ１はゴルジ体に発現し、ＳＭのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与することが知られている。一方、ＳＭＳ２はゴルジ体および細胞膜に発現し、生理機能については詳細が不明であり（非特許文献３参照）、非特許文献４〜６において動脈硬化への関与の可能性が示唆されているにすぎない。
【０００５】
これまで中性脂肪の代謝／吸収阻害剤や阻害物質、中性脂肪の代謝を促進する物質等を用いてメタボリックシンドロームを改善する方法が試みられている。具体的には核内受容体ＰＰＡＲｓの合成リガンドによる高脂血症、ＩＩ型糖尿病改善薬、スタチン系薬剤によるコレステロール合成阻害を介した高脂血症改善薬等である。
【０００６】
現在のところ、スフィンゴ脂質の合成制御を介した肥満誘発作用は知られていない。また、糖尿病薬や、抗肥満薬または脂肪肝処置薬として開発されているＳＭＳ阻害剤も存在しない。
【０００７】
他方、ＲＮＡｉは１９９８年にＦｉｒｅらによって発見された現象（非特許文献７）で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。ＲＮＡｉを媒介する分子のうちでも、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、その応用が進んでいる（非特許文献８）。しかし、ＳＭＳ阻害剤としての開発はなされておらず、ＳＭＳ阻害剤としてメタボリックシンドロームを改善する効果も知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yamaokaら、The  Journal  of  Biological  Chemistry,279,  18688-18693,  (2004)
【非特許文献２】Huitemaら、The  EMBO  Journal,23,  33-44,  (2004)
【非特許文献３】Tafesseら、The  Journal  of  Biological  Chemistry,281,  29421-29425,  (2006)
【非特許文献４】Parkら、Circulation,110,  3465-3471,  (2004)
【非特許文献５】Liuら、Arteriosclerosis,Thrombosis,  and  Vascular  Biology,  29,  850-856,(2009)。
【非特許文献６】Liuら、Circulation  Research,105,  295-303,  (2009)
【非特許文献７】Fireら、Nature.  391:806-11,  (1998)
【非特許文献８】Elbashirら、Nature.  411:494-8,  (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、スフィンゴ脂質の合成を抑制することにより体重を減少させること、内臓脂肪を減少させること、肝臓におけるトリグリセリドを減少させること、および肥満および脂肪肝を改善すること、および糖尿病等他のメタボリックシンドロームの処置薬に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、スフィンゴミエリンの合成酵素を、特にＳＭＳ２の発現を抑制し制御することで、上記疾患に関する処置予防をすることができることを見出し、本発明を完成した。したがって、本発明は、以下を提供する。
（項目１）ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物。
（項目２）前記核酸がｓｉＲＮＡである、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）前記ｓｉＲＮＡが下記の（ａ）〜（ｏ）に記載のｓｉＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１つ以上からなる項目２記載の医薬組成物。
（ａ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ６＞；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ７＞；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ８＞；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０４＞；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０５＞；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０６＞；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０７＞；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０８＞；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０
９＞；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ３＞；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１１＞；
（ｌ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１＞；
（ｍ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ２＞；
（ｎ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ５＞；ならびに
（ｏ）一方または両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、  欠失または置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｎ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
（項目４）前記核酸がアンチセンス核酸である、項目１に記載の医薬組成物。
（項目５）前記核酸がロックド核酸（ＬＮＡ）を含むアンチセンス核酸である、項目１または４に記載の医薬組成物。
（項目５Ａ）前記核酸が５’末端にロックド核酸（ＬＮＡ）を、３’末端にＬＮＡを含むアンチセンス核酸である、請求項１、４または５に記載の医薬組成物。
（項目６）前記アンチセンス核酸が、配列番号８１〜９２のいずれか１つ以上からなる請求項４、５または５Ａ記載の医薬組成物。
（項目７）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である項目１〜５、５Ａまたは６いずれか記載の医薬組成物。
（項目７Ａ）前記核酸はＳＭＳ２の発現を抑制するのに有効な量で含まれる、項目１〜５、５Ａ、６または７いずれか記載の医薬組成物。
（項目７Ｂ）薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目１〜５、５Ａ、６、７または７Ａのいずれか記載の医薬組成物。
（項目８）下記の（ａ）〜（ｏ）からなる群より選択されるいずれかのｓｉＲＮＡ
（ａ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ６＞；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ７＞；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ８＞；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０４＞；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０５＞；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０６＞；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方がその
相補配列である配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０７＞；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０８＞；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０９＞；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ３＞；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１１＞；
（ｌ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１＞；
（ｍ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ２＞；
（ｎ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ５＞；ならびに
（ｏ）一方または両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、  欠失または置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｎ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
（項目９）メタボリックシンドロームの処置または予防のための項目８に記載のｓｉＲＮＡ。
（項目１０）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である項目９記載のｓｉＲＮＡ。
（項目１０Ａ）メタボリックシンドロームの処置または予防のための医薬を製造するための、項目８〜１０いずれかに記載のｓｉＲＮＡの使用。
（項目１０Ｂ）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である請求項１０Ａ記載の使用。
（項目１１）配列番号８１〜９２のいずれか１つ以上からなるロックド核酸（ＬＮＡ）含有核酸。
（項目１２）メタボリックシンドロームの処置または予防のための項目１１に記載のロックド核酸（ＬＮＡ）含有核酸。
（項目１３）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である項目１２記載のロックド核酸（ＬＮＡ）含有核酸。
（項目１４）メタボリックシンドロームを処置または予防するための方法であって、該方法は、項目１〜５、５Ａ、６、７、７Ａまたは７Ｂいずれかに記載の医薬組成物を該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１５）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である項目１４記載の方法。
（項目１６）メタボリックシンドロームを処置または予防するための方法であって、該方法は、項目８〜１０、１０Ａまたは１０Ｂいずれかに記載のｓｉＲＮＡを該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１７）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である項目１６記載の方法。
（項目１８）メタボリックシンドロームを処置または予防するための方法であって、該方法は、項目１１〜１３いずれかに記載のＬＮＡ含有核酸を該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１９）前記メタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択される１または２以上である項目１８記載の方法。
【００１１】
本発明に関して、メタボリックシンドロームは複合的な要因で起こることが知られている。よって新しい作用機序を持つ医薬品の登場は、これまでの医薬品の弱点を補うことができる可能性がある。
【００１２】
本発明者らは、スフィンゴ脂質の代謝を制御する事で、間接的に中性脂質合成／代謝に影響を与えるというこれまでに無かった作用機序でメタボリックシンドロームを改善する方法を開発した。
【００１３】
本発明者らは、スフィンゴ脂質の一つスフィンゴミエリンの合成酵素ＳＭＳ２などのスフィンゴミエリン合成酵素を制御することでトリアシルグリセロールの合成量に影響を与え、それによってメタボリックシンドロームを改善する方法を提案する。ＳＭＳはスフィンゴミエリンを合成する際に等モル量のジアシルグリセロールを生成する。本明細書において例示した実験からこのジアシルグリセロールは代表的な中性脂質であるトリグリセロール合成の原料となる可能性が示された。具体的には、例示的な例として、ＳＭＳ２遺伝子を欠損したマウスに高脂肪食を負荷した際の体重増加が、対照群に比べて有意に減少し、通常食を負荷した際の体重により近かった。つまりＳＭＳの活性を制御することでトリアシルグリセロールの合成量を制御し結果的にメタボリックシンドロームを改善することが期待できる。
【００１４】
そこで、ＳＭＳ２機能を阻害することにより、メタボリックシンドロームの治療効果を期待することができると考え、例えば、新規分子特異的ノックダウン法であるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA  interference）法の治療への応用を検討した。
【００１５】
ＲＮＡｉ法とは、短い干渉ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（small  interfering  RNA））を用いて、特定遺伝子の発現を遺伝子レベルで速やかに発現抑制する技術である（非特許文献７および８）。ＳＭＳ２のｍＲＮＡ配列から、ターゲットとなる配列を複数選択し、そのｓｉＲＮＡを合成し、ＳＭＳ２をノックダウンさせることにより疾患治癒に結びつけられることを見出した。
【発明の効果】
【００１６】
従来、スフィンゴ脂質の合成制御を介したメタボリックシンドローム改善薬は存在しないので、本発明により新しい作用機序を持つ医薬品を作成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１におけるＳＭＳｓノックアウト（ＮＯ）マウスの作製に用いたターゲティングベクターの概略を示す。左は、ＳＭＳ１遺伝子のノックアウトに用いたターゲティングベクターの概略を示し、右は、ＳＭＳ２遺伝子のノックアウトに用いたターゲティングベクターの概略を示す。図中、ＥはＥｃｏＲＩ、ＰはＰｓｔＩ、ＳはＳａｌＩ、ＳｐはＳｐｅＩ、ＳｍａはＳｍａＩ、ＸｈｏはＸｈｏＩの制限酵素切断部位を示す。
【図２】図２は、実施例１における体重に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際の９週間にわたる体重（ｇ）の変動を示す。高脂肪食を投与した野生型マウス（ＷＴ／ＨＦＤ）は体重が増加したが、高脂肪食を投与したＳＭＳ２−ＫＯマウス（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）の体重増加は、通常食を投与した野生型マウス（ＷＴ／ＮＤ）および通常食を投与したＳＭＳ２−ＫＯマウス（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）と差がなく、体重増加が有意に抑えられた。三角；ＷＴ／ＨＦＤ、菱形；ＷＴ／ＮＤ、丸；ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ、四角；ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ、である。
【図３】図３は、実施例１における白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、精巣上体に付着した脂肪重量（ｍｇ）の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べて、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に減少傾向は見られるものの、有意な差ではなかった。図には示さないが、対照通常食（ＮＤ）を並行して与えた同様の実験も行っており、ＷＴ／ＨＦＤ群に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかったことがわかっている。
【図４】図４は、実施例１における肝トリグリセリド量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、肝ホモジネート中のトリグリセリド量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では有意にトリグリセリド量が減少していた。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例１における肝トリグリセリド量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、肝ホモジネート中のトリグリセリド量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では有意にトリグリセリド量が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかった。
【図５】図５は、実施例１におけるアディポネクチン量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、脂肪組織でのアディポネクチンｍＲＮＡの相対的な発現量の比較を示す。ＷＴ／ＨＦＤ群（左）ではアディポネクチンの発現が抑制されているが、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では、比較的高い発現量が維持されていた。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例１におけるアディポネクチン量に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、脂肪組織のアディポネクチンｍＲＮＡの相対的な発現量の比較を示す。図５Ａでは、左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡの相対量を示す。ＷＴ群では、高脂肪食を付与することにより、アディポネクチンの発現が抑制されるが、ＳＭＳ２  ＫＯ群では、高脂肪食を付与しても、比較的高い発現量が維持されていた。
【図５Ｂ−１】図５Ｂ−１は、実施例１における脂肪組織におけるインスリン受容体に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のインスリン受容体の相対的な発現量の比較を示す。左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡの相対量を示す。野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとインスリン受容体の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは高脂肪食によるインスリン受容体の発現低下はおこっておらず、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２−ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のインスリン受容体の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。以上の結果から、ＳＭＳ２−ＫＯマウスの脂肪組織において、野生型のマウスでみられるような高脂肪食によるインスリン受容体の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。
【図５Ｂ−２】図５Ｂ−２は、実施例１における脂肪組織におけるＧｌｕｔ４に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のＧｌｕｔ４の相対的な発現量の比較を示す。左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡの相対量を示す。野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとＧｌｕｔ４の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下についてはその低下の度合いが抑えられており、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２−ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のＧｌｕｔ４の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。以上の結果から、ＳＭＳ２−ＫＯマウスの脂肪組織において、野生型のマウスでみられるような高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例１における血糖値に対する６０％脂肪食投与の影響を検討した結果を表す。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに９週間投与した後に２４時間絶食させた後、マウスの腹腔内に２ｇ／ｋｇのグルコースを投与し、投与直前、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に血糖値を測定した。投与直前には、４つの群で有意差はなかったが、投与後１２０分後には、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群はＷＴ／ＨＦＤ群に比べて有意に血糖値が低下していた。白三角はＷＴ／ＮＤを示し、薄い四角はＷＴ／ＨＦＤを示し、塗りつぶした三角はＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤを示し、濃い四角はＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤを示す。Ｙ軸は血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示し、Ｘ軸は時間（分）を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５Ｃのグラフの下の面積（ＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ））を棒グラフで表したものである。左から順に、野生型に通常食を与えた群（ＷＴ／ＮＤ）、野生型に高脂肪食を与えた群（ＷＴ／ＨＦＤ）、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに通常食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ）、およびＳＭＳ２―ＫＯマウスに高脂肪食を与えた群（ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ）を示す。ＷＴ／ＨＦＤとＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤとの間には有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。Ｙ軸は、ＧＴＴ  ＡＵＣ（面積＝ＡＵ、単位はｍ２（面積単位））でその相対値を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、実施例１における血中インスリン量に対する通常食（ＮＤ）の影響を検討した結果を表す。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を４週間投与した後、２４時間絶食させ、その後通常食を投与し、２４時間絶食時および通常食投与後１時間経過時の血中インスリン濃度を測定した。左は絶食時および右は食後１時間経過時のものを示し、それぞれのうち、左側（濃い部分）が野生型（ＷＴ）を示し、右側（薄い部分）がＳＭＳ２  ＫＯを示す。Ｙ軸は、血中インスリン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスの間において、２４時間の絶食時および通常食投与後１時間経過時いずれにおいても血中インスリン濃度に有意差は見られなかった。この実験からは、ＳＭＳ２をノックアウトしても、インスリンの量および食事に対するインスリン分泌応答そのものについては、影響がないといえる。したがって膵ベータ細胞の異常によるインスリンの分泌異常の結果、惹起されることが予想される体重減少および血糖値の低下などの懸念は払拭できた。
【図５Ｆ】図５Ｆは、実施例１における血糖値に対する高脂肪食の影響を検討した結果を表す。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに２週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、高脂肪食投与前に４時間絶食させたときおよび２週間高脂肪食を投与した後に４時間絶食させて血糖値を測定した。左の群は、０日目を示し、右の群は、１５日目を示す。黒い棒はＳＭＳ２―ＫＯマウスを示し、白い棒は野生型（ＷＴ）を示す。Ｙ軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。高脂肪食を投与する前には、野生型のマウスとＳＭＳ２−ＫＯマウス間において、血糖値に有意差は見られないけれども、高脂肪食を２週間投与した後は、野生型のマウスの血糖値は、ＳＭＳ２−ＫＯマウスと比較して有意に血糖値が高かった（ｐ＜０．０５）。この結果、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは、有意差をもって、血糖値が低下していたことを意味する。図５Ｅの結果をあわせみると、ＳＭＳ−２をノックアウトすれば、インスリン抵抗性の糖尿病にはならないといえる。
【図５Ｇ】図５Ｇは、実施例１における血中インスリン量に対する高脂肪食の影響を検討した結果を表す。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を２週間投与した後、４時間絶食させ、血中インスリン量を測定した。左は野生型（ＷＴ）を示し、右はＳＭＳ２−ＫＯマウス（ＫＯ）を示す。Ｙ軸は、血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。その結果、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは、野生型のマウスと比較して、有意差をもって、血中インスリン量が低下していた。
【図５Ｈ−１】図５Ｈ−１は、実施例１におけるインスリンに対する血中グルコース濃度を検討した結果を表す。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに６週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、６週間経過時に腹腔内にインスリンを０．５Ｕ／ｋｇで投与し、投与前および投与後１５、３０、６０、９０、１２０分での血中グルコース濃度を測定した結果を示す。特に、投与後、３０、６０、９０分後には、ＳＭＳ２−ＫＯマウスは、野生型のマウスと比較して、有意に血中グルコース濃度が低下していたので、ＳＭＳ２―ＫＯマウスはインスリンに対してより感受性であることが明らかとなった。白丸は、野生型（ＷＴ）を示し、黒丸はＳＭＳ２−ＫＯマウスを示す。＊および＊＊はいずれも有意（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）を示す。Ｙ軸は血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示し、Ｘ軸は投与後経過時間（分）を示す。
【図５Ｈ−２】図５Ｈ−２は、図５Ｈ−１のグラフの下の面積（ＡＵＣ）の野生型（ＷＴ）に対する比（ＷＴ＝１）を棒グラフで表す。ＳＭＳ２−ＫＯマウスにおいては、野生型のマウスと比較して、２０％程度有意に減少していたので、インスリンに対してより感受性であることが明らかになった。以上の結果から、図５Ｆ，Ｇ、Ｈ−１、Ｈ−２より、ＳＭＳ−２をノックアウトすれば、ＷＴと比較してインスリン抵抗性の糖尿病にはなりにくいといえる。
【図６】図６は、実施例２において作製した、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２を欠失させたＺＳ２細胞、ＳＭＳ１を過剰発現する細胞（ＺＳ２／ＳＭＳ１）、およびＳＭＳ２を過剰発現する細胞（ＺＳ２／ＳＭＳ２）について、抗Ｖ５モノクローナル抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングの結果を示す。ＺＳ２細胞においてはバンドが検出されなかったが、ＺＳ２／ＳＭＳ１およびＺＳ２／ＳＭＳ２において、抗Ｖ５  ｍａｂで検出されるＳＭＳ１、ＳＭＳ２のバンドがそれぞれ確認された。
【図７】図７は、実施例３において行ったＺＳ２細胞、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞のＳＭＳ活性についての検討結果を示す。ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞（左）およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞（中央）がＳＭＳ活性を有していたのに対し、ＺＳ２細胞（右）はＳＭＳ活性がなかった。グラフの縦軸は、ＳＭＳ活性（単位：ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）を示す。
【図８】図８は、実施例３において行ったＺＳ２細胞、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞のＴＧ合成についての検討結果を示す。ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞（左）およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞（中央）におけるＴＧ量と、ＺＳ２細胞（右）におけるＴＧ量との間には有意差があった（各々、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０２）。グラフの縦軸は、［１４Ｃ］ＴＧの対照（ＺＳ２細胞）に対する割合（％）を示す。
【図９】図９は、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞に対して各種ｓｉＲＮＡを投与して、マウスＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡとして機能するのかスクリーニングした結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ１、ｉ３、ｉ６、ｉ７およびｉ８はマウス細胞であるＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞で発現するマウスＳＭＳ２に対して６５％以上のノックダウン活性を保持していた。
【図１０】図１０は、ＨｅＬａ細胞に対して各種ｓｉＲＮＡを投与して、ヒトＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡとして機能するのかスクリーニングした結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ１０４、ｉ１０５、ｉ１０６、ｉ１０７、ｉ１０８およびｉ１０９はヒト細胞であるＨｅＬａ細胞で発現するヒトＳＭＳ２に対して少なくとも７５％以上のノックダウン活性を保持していた。
【図１１】図１１は、ＳＭＳ２−ｉ８が、実施例２において作製した、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対して、ＳＭＳ２の発現抑制作用を有しているのかを検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ８を投与した場合には、対照のｓｉ−ＲＮＡを投与した場合に比べて、８０％以上、ＳＭＳ２の発現が抑制されていた。
【図１２】図１２は、ＳＭＳ２−ｉ８を、実施例２において作製した、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対して投与することによって、細胞のＭｅβＣＤに対する感受性が変化するのかを検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ８を投与した場合には、対照のｓｉ−ＲＮＡを投与した場合に比べて、有意に細胞の生存率が低かった。
【図１３】図１３は、ＳＭＳ２−ｉ３を、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞に導入することで、細胞内のＳＭＳ２の発現が抑制されるのかを検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ３を導入した場合には、対照のｓｉ−ＲＮＡを導入した際に比べて、細胞内のＳＭＳ２の発現量は８０％以上抑制された。
【図１４】図１４は、ＳＭＳ２−ｉ１１を、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞に導入することで、細胞内のＳＭＳ２の発現が抑制されるのかを検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ１１を導入した場合には、対照のｓｉ−ＲＮＡを導入した際に比べて、細胞内のＳＭＳ２の発現量は８０％以上抑制された。
【図１５】図１５は、ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を、レプチン欠損性肥満マウスに尾静脈注射して投与することで、マウス肝臓のＳＭＳ２の発現が抑制されるのかを検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ３を投与した場合には、対照のｓｉ−ＲＮＡを導入した際に比べて、マウス肝臓におけるＳＭＳ２の発現量は６０％以上抑制され、ＳＭＳ２−ｉ１１を投与した場合には、対照のｓｉ−ＲＮＡを導入した際に比べて、マウス肝臓におけるＳＭＳ２の発現量は７０％以上抑制された。
【図１６】図１６は、ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を、マウス尾静脈内注射して投与し、投与後１０日経過した時点での体重の変化を検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を投与した場合も、対照群のマウスにおいても体重の変化に有意差はなかった。
【図１７】図１７は、ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を、マウス尾静脈内注射して投与し、投与後１０日間における平均摂餌量を検討した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を投与した場合も、対照群のマウスにおいても平均摂餌量に変化はなかった。
【図１８】図１８は、ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を、マウス尾静脈内注射して投与し、投与１０日後に４時間絶食させたマウスの肝臓におけるトリグリセリド量の検討をした結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１を投与した場合には、対照群のマウスと比較して、有意に肝臓のトリグリセリド量が低下していた。
【図１９】図１９は、ヒト肝実質細胞株であるＨｅｐＧ２細胞に対照ｓｉＲＮＡ配列（ＣＴＲ−ｉ）、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換し、４８時間後のＳＭＳ２の発現量を図９と同じ方法で測定した結果を表す。ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９のいずれを用いた場合においても、対照配列を用いた場合と比較して、６０％程度ＳＭＳ２の発現量が低下した。
【図２０】図２０Ａは、ヒト肝実質細胞株であるＨｅｐＧ２細胞に対照ｓｉＲＮＡ配列（ＣＴＲ−ｉ）を形質転換し、７２時間後に、トリグリセリドを特異的に染色できる蛍光試薬ＡｄｉｐｏＲｅｄ(ＮｉｌｅＲｅｄ)で染色し、５分後に蛍光顕微鏡で細胞を観察した結果を表す。図２０―Ｂは、ヒト肝実質細胞株であるＨｅｐＧ２細胞にＳＭＳ２−ｉ１０４を形質転換し、７２時間に、トリグリセリドを特異的に染色できる蛍光試薬ＡｄｉｐｏＲｅｄ(ＮｉｌｅＲｅｄ)で染色し、５分後に蛍光顕微鏡で細胞を観察した結果を表す。ＣＴＲ−ｉと比較して、ＳＭＳ２−ｉ１０４を形質転換した場合には細胞内の脂肪滴の粒子径が小さくなっていることが確認できた。図２０―Ｃは、ヒト肝実質細胞株であるＨｅｐＧ２細胞にＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換し、７２時間後に、トリグリセリドを特異的に染色できる蛍光試薬ＡｄｉｐｏＲｅｄ(ＮｉｌｅＲｅｄ)で染色し、５分後に蛍光顕微鏡で細胞を観察した結果を表す。ＣＴＲ−ｉと比較して、ＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換した場合には細胞内の脂肪滴の粒子径が小さくなっていることが確認できた。
【図２１】図２１は、図２０ＡないしＣで蛍光染色した細胞について、ランダムに５視野を撮像し、直径が１．２５μｍ以上の脂肪滴数を計測した結果を表す。対照のｓｉＲＮＡの配列を形質転換した場合と比較して、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換した場合には、直径が１．２５μｍ以上の脂肪滴数が３０％程度まで有意に減少していることが確認できた。このことから、ＳＭＳ２を肝細胞で阻害することにより、抗肥満効果が惹起されることが示唆された。
【図２２】図２２は、実施例１０において、ＬＮＡ含有核酸の一例としてＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞でのノックダウン実験を行った結果を示す。使用したＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒ  アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞培養液に最終濃度５μＭでそのまま添加し、形質転換後７２時間に定量的ＰＣＲを行った結果を示す。左から使用したアンチセンスオリゴのＳＭＳ２−１３−ＸＸＸのＸＸＸに当たる数字（それぞれ配列番号８１〜９２に該当する。）を示す。生理食塩水１および生理食塩水２は、それぞれ生理食塩水を添加した対照である。ＮＴ−１およびＮＴ−２は、それぞれ何も加えていない未処理の対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２０】
本明細書において、「スフィンゴミエリン合成酵素」（本明細書において「ＳＭＳ」ともいう。）とは、スフィンゴミエリン（本明細書において「ＳＭ」ともいう。）を合成する酵素であって、ホスファチジルコリン（本明細書において「ＰＣ」ともいう。）の存在下で、セラミドをスフィンゴミエリンへと変換する酵素をいい、細胞死および生存に重要な役割を果たしている（非特許文献１および２参照）。ここで、ホスファチジルコリンは、変換後ジアシルグリセロールに変換される。スフィンゴミエリン合成酵素としては、代表的に、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２が知られており、このほかにもホモログがあることが知られている（非特許文献1および２参照）。ＳＭＳ１はゴルジ体に発現し、ＳＭのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与することが知られている。一方、ＳＭＳ２はゴルジ体および細胞膜に発現し、生理機能については詳細が不明である（非特許文献３参照）。なお、ＳＭＳ１のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、ＮＭ＿１４７１５６（ヒト）、ＮＭ＿１４４７９２（マウス）であり、ＳＭＳ２は、ＢＣ０２８７０５．１（ヒト）、ＢＣ０４１３
６９．２（ヒト）、ＮＭ＿０２８９４３（マウス）である。
【００２１】
本明細書において「メタボリックシンドローム」または「メタボリック疾患」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味で用いられ、内臓脂肪型肥満を共通の要因として高血糖、脂質異常症、高血圧が引き起こされる状態をいい、従前は、「生活習慣病」、「成人病」などと呼ばれており、これらの用語はすべて、本明細書において交換可能に使用される。メタボリックシンドロームまたはメタボリック疾患は、本明細書では特に糖尿病、肥満、脂質異常症（内臓脂肪過多）、脂肪肝等の疾患、あるいはアディポネクチン発現低下のような状態の少なくとも１つを含む。また、メタボリックシンドロームになった結果、それが原因で何年か後に動脈硬化になることも多いことから、「メタボリックシンドローム」には、動脈硬化一般が含まれるのではないが、上記メタボリックシンドローム（たとえば糖尿病、肥満など）により惹起される動脈硬化も含まれることが理解される。
【００２２】
本明細書において「糖尿病薬」とは、糖尿病を処置（たとえば、抑制、予防など）しうる薬剤をいう。糖尿病は、当該分野において通常使用される意味で用いられ、血糖値（血液中のグルコース濃度）が病的に高い状態をいい、糖尿病は、膵臓からインスリン分泌されないことで引き起こされる１型糖尿病と、インスリンの働きが低下することにより引き起こされる２型糖尿病に大別される。本明細書では、型にとらわれることなく、Ｉ型、ＩＩ型を含む。そして、本明細書では、特にＩ型についていう場合「Ｉ型糖尿病薬」といい、ＩＩ型についていう場合「ＩＩ型糖尿病薬」ということがある。
【００２３】
ここで、インスリン抵抗性症候群とは糖尿病の主原因（特に２型糖尿病）であり、肥満や循環器系疾患のような生活習慣病の根本的原因である。インスリン抵抗性とは末梢組織がインスリンに対する応答が鈍化した状態を意味し、インスリンに対する応答が鈍化した結果、末梢組織がインスリンに応答できないため、血中グルコースを取り込めず、血糖値の高い状態が維持されることとなる。膵臓は血糖を低下させるために大量のインスリンを放出するので、血中インスリン濃度が高い値となる。
【００２４】
したがってインスリン抵抗性の改善により血糖値が低下し、上記生活習慣病の治療や予防に有用である。インスリン抵抗性改善の指標は血中インスリン濃度を測定し、低下していること、さらに血中アディポネクチン濃度が上昇していることが一つの指標となる。以上のことからアディポネクチンを上昇させる薬や、血糖値を正常レベルに維持しながらなおかつ血中インスリン濃度を低下させる薬はインスリン抵抗性改善薬となり、それに起因する糖尿病や肥満、循環器病（動脈硬化や高血圧など）やメタボリックシンドロームの治療にも有効である。
【００２５】
本明細書において「抗肥満薬」とは、肥満を処置（たとえば、抑制、予防など）しうる薬剤をいう。「肥満」は、メタボリックシンドロームの１つであり、疾患の一つとして捉えることができる。肥満状態としては、例えば、体重過多、脂肪過多などを挙げることができる。体格指数として測定されるＢＭＩが２５以上の場合肥満とされる。体脂肪率の場合は、１８％以上を基準とする。肥満の処置効果は、体重の測定、脂肪の測定、脂肪中に蓄えられたトリグリセリドの測定などで判定することができる。
【００２６】
本明細書において「体重減少薬」とは、体重を減少させるかあるいは節食を抑制させる薬剤をいう。本明細書において「体重減少」または「体重を減少させる」とは、現在の体重を減少させる場合のほか、体重増加を抑制して現在の体重を維持する場合を含めて最も広義に解釈しなければならない。体重減少は、体重の測定、脂肪の測定、脂肪中に蓄えられたトリグリセリドの測定、または節食量の測定で判定することができる。
【００２７】
本明細書において「内臓脂肪減少薬」とは、内臓脂肪を減少させるかあるいは内臓脂肪
の増加を防止する薬剤をいう。内臓脂肪は、当該分野において通常使用される意味で用いられ、体脂肪のうち、内臓の周囲に付いた脂肪をいう。内臓脂肪の減少は、白色脂肪細胞重量を測定すること、腹部ＣＴ画像により測定すること、などで判定することができる。内臓脂肪減少の対象としては、内臓脂肪過多、あるいは脂質異常症などの疾患または症状を挙げることができる。「脂質異常症」は、血液中に含まれる脂質が過剰、もしくは不足している状態を指し、以前は、高脂血症とも呼ばれていた。脂質異常症は、メタボリックシンドロームの１つであり、疾患の一つとして捉えることができる。
【００２８】
本明細書において「脂肪肝処置薬」とは、脂肪肝を処置（たとえば、抑制、予防）し得る薬剤をいう。「脂肪肝」とは、当該分野において通常使用される意味で用いられ、肝臓に多量の脂肪が蓄積する状態をいう。その原因としては、アルコール性・栄養性・糖尿病性・薬剤性などが知られている。脂肪肝になると、その一部は肝硬変に移行するといわれる。その意味では、本発明は、肝硬変の予防剤と捉えることもできる。脂肪肝処置の効果は、脂肪中のトリグリセリド（ＴＧ）を測定すること、肝重量を測定すること、肝臓を肉眼的観察することなどで判定することができる。
【００２９】
本明細書において「アディポネクチン発現上昇剤」とは、アディポネクチンの発現を上昇させる薬剤をいう。アディポネクチンは、当該分野において通常使用される意味で用いられ、脂肪細胞から分泌される分泌タンパク質であり、内臓脂肪量に逆相関するといわれており、いわゆるメタボリック疾患の指標となるといわれている。アディポネクチン発現上昇は、たとえば、脂肪を採取しｍＲＮＡを抽出し、アディポネクチンｍＲＮＡの発現量を測定すること、抗アディポネクチン抗体を用いての免疫学的測定、などで判定することができる。
【００３０】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００３１】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００３２】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては
、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００３３】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【００３４】
本明細書において、「（ＳＭＳ２等の遺伝子の）発現を抑制する物質（例えば、核酸）」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを分解する物質（例えば、核酸）、またはｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質（例えば、核酸）であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはこれらの発現ベクター等の核酸などが例示される。その中でも、ｓｉＲＮＡおよびその発現ベクターが好ましく、特にｓｉＲＮＡが好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。なお、本発明において標的遺伝子は、ＳＭＳ２遺伝子である。
【００３５】
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、ＳＭＳ２遺伝子のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含んでなるＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。
【００３６】
二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デ
オキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
【００３７】
さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において1〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
【００３８】
さらに、該ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
【００３９】
ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
【００４１】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
【００４２】
本発明のＳＭＳ２等の遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する
。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五炭糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース等；六炭糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
【００４３】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００４４】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、配列表に記載の配列を好ましく用いることができる。これらのｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を表１に示す。表１中、大文字で示されるのはセンスＲＮＡ配列およびアンチセンスＲＮＡ配列であり、小文字またはｄ＋大文字（デオキシ体を意味する）で示されるのは３’末端オーバーハング配列である。
【表１】
0005860038.tif 000002
【００４５】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物（または細胞等）に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれたかまたは欠失もしくは抑制された生物（例えば、動物（マウスなど）を含む）（または細胞等）をいう。トランスジェニック生物（または細胞等）のうち、ある遺伝子が欠失または抑制されているものをノックアウト生物（または細胞等）という。したがって「ノックアウト」とは、動物または細胞等について言及するとき、標的となる生来の遺伝子を機能しない状態または発現しない状態となっていることをいう。
【００４６】
本明細書において「遺伝子導入」は、目的となる遺伝子を細胞、組織、または動物中に導入することをいい、概念として、「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」などを包含するものであり、当該分野において公知の任意の手法によって実現することができる。また、「遺伝子導入」には導入部位を限定しない導入および導入部位を
限定する相同組換による導入のいずれも含むものである。遺伝子導入の手法としては、たとえば、レトロウイルス、プラスミド、ベクター等を用いた手法、あるいは、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法が挙げられるがそれに限定されない。遺伝子導入に使用される細胞は、どのような細胞でもよいが、未分化細胞（たとえば、線維芽細胞など）を利用することが好ましい。
【００４７】
本明細書において、「予防する」とは、本発明の標的とする疾患、障害または症状が発生する前に、何らかの手段により、その疾患、障害または症状を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは疾患、障害または症状の原因自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。
【００４８】
本明細書において、「治療する」とは、既に発症している本発明の標的とする疾患、障害または症状の進行を食い止めるか、または完全または部分的に拘わらず、本発明の標的とする疾患、障害または症状の進行が止まるか、または改善することをいう。
【００４９】
本明細書において「処置」とは、疾患、障害または症状に対して何らかの影響を与えるか、そのような疾患、障害または症状になることを防止することをいい、治療および予防の両方を含みうる。狭義には、「処置」は、「予防」に対して、発症後の上記行為をさす。
【００５０】
本明細書において「細胞死誘導剤」とは、細胞死を誘導しうる任意の薬剤をいう。本発明では、細胞膜のコレステロールと結合することにより細胞膜を破壊して細胞死を誘導ことができる薬剤であれば、いかなる物質をも使用することができる。SMSが欠損した細胞では、シクロデキストリン類を使用して細胞死を誘導することができるが、これに限定されないことが理解される。本明細書で「シクロデキストリン」という場合、広義に使用され、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し環状構造をとった任意の環状オリゴ糖およびその誘導体をいい、置換（例えば、置換基として、アルキル基、ヒドロキシアルキル基等が挙げられるがこれらに限定されない）または非置換のシクロデキストリン類の任意の一つを指す。細胞死誘導剤として使用しうるシクロデキストリンとしては、たとえば、メチルαシクロデキストリン、メチルβシクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、αシクロデキストリン、βシクロデキストリンなどを挙げることができる（参考として、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９，１７２５０−１７２５６，１９９５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，４４，３４０２８−３４０３４；特開２００７−３３２１２８などを参照。）。
【００５１】
本明細書において「再構成細胞」とは、ある細胞について、必要に応じてノックアウトにより特定の遺伝子を欠失させた後、目的となる遺伝子を導入して生産した細胞をいう。再構成細胞としては、本発明のスフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１およびＳＭＳ２をノックアウトした細胞において、少なくとも１つのスフィンゴミエリン合成酵素（例えば、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２またはＳＭＳ１およびＳＭＳ２の両方）を遺伝子導入させた細胞などを挙げることができる。
【００５２】
本明細書において「医薬」とは、当該分野でもっとも広義に解釈され、任意の薬を含み、薬事法上の医薬品、医薬部外品等のほか、骨形成による治療または予防を意図する任意の用途の薬剤、組成物等を包含することが理解される。そのような例として、医療分野、歯科分野等における応用が挙げられ、たとえば、遺伝子治療剤などが挙げられる。通常、医薬は固体または液体の賦形剤を含むとともに、必要に応じて崩壊剤、香味剤、遅延放出剤、滑沢剤、結合剤、着色剤などの添加剤を含むことができる。医薬品の形態は、錠剤、注射剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、徐放製剤などを含むが、これらに限定されない
【００５３】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００５４】
（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）
本発明は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を提供する。本発明の核酸は、核酸の翻訳または転写等を抑制する働きを有する。そのような核酸としては、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ作用を有する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、リボザイム活性を有する核酸等を挙げることができる。本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸は、修飾された核酸を含みうる。
【００５５】
このような核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）は、メタボリックシンドロームの改善、処置または予防のために用いられる。
【００５６】
本発明のＳＭＳ２のｓｉＲＮＡなどのＳＭＳ２の発現を抑制する核酸の好ましい態様としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される核酸を挙げることができる：（ａ）ＳＭＳ２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸（ｂ）ＳＭＳ２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸；および（ｃ）ＳＭＳ２タンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）。
【００５７】
ＳＭＳ２としては、代表的には、配列番号７９（ヒト）（LocusはNM_152621、6246bp）、配列番号８０（マウス）（NM_028943、5791bp）（ＳＭＳ２の全長配列）等を挙げることができるが、これ以外にも、ＳＭＳ２として知られる配列であれば、どれでも標的として使用することができることが理解される。このような配列としては、ゲノムデータベース上の複数のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で参照される配列（例えば、ヌクレオチドデータベースでは、上記以外に、ＮＭ＿００１１３６２５７、ＮＭ＿００１１３６２５８、ＢＣ０４１３６９、ＢＣ０２８７０５（ヒト）等が検索され、タンパク質データベースでは、ＮＰ＿００１１２９７３０、ＮＰ＿６８９８３４、ＮＰ＿００１１２９７２９、Ｑ８ＮＨＵ３、ＡＡＨ４１３６９、ＡＡＨ２８７０５、Ｑ８６ＶＺ５（以上ヒト）、ＮＰ＿０８３２１９（マウス）等）として公共遺伝子データベースＮＣＢＩ上で検索される。
【００５８】
上記以外のタンパク質であっても、例えば、これらのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載された配列と高い相同性（通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば、細胞内のスフィンゴミエリンを合成する機能等）を持つタンパク質は、本発明の標的となるタンパク質に含まれる。上記タンパク質に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が３０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内であるものも包含されることが理解される。あるいは、上記ヌクレオチド配列に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のＤＮＡ配列と高い相同性を有するものも包含される。高い相同性とは、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、さらには９６％、９７％、９８％または９９％以上）の相同性を意味する。この相同性は、ｍＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−８；  Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−７）に
よって決定することができる。あるいは、本発明の標的となる配列は、上記ヌクレオチド配列に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」および「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件を挙げることができる。
【００５９】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、スフィンゴミエリンの合成活性を測定する方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、実施例にて例示的に記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【００６０】
ＳＭＳ２などの特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，  日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．）。
【００６１】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のＳＭＳ２をコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のＳＭＳ２をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のＳＭＳ２をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のＳＭＳ２をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの
長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。このようなＬＮＡ含有アンチセンス核酸としては、配列番号８１〜９２などを挙げることができるがそれに限定されない。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．に記載される方法を用いて、配列番号７９または８０に記載されるＳＭＳ２の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。参考となる配列としては、配列番号１〜１８、２１〜２４、３９〜４２、４５、４６などを用いることができるがこれらに限定されない。例えば、実施例１０に記載される配列番号８１〜９２のようなものが好ましく使用されるがこれに限定されない。これらのアンチセンス核酸を、実施例７および８に例示されるマウスおよびＨｅｐＧ２細胞を用いた手法で本発明のアンチセンスの効果を確認することができる。
【００６２】
ＳＭＳ２の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１
ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
【００６３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８９，１７，７０５９．）。
【００６４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いてＳＭＳ２をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００６５】
ＳＭＳ２などの内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられるという、現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞にお
いては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所においても詳述されている。
【００６６】
上述したように、本発明の上記「ｓｉＲＮＡ」は、当業者においては、該二本鎖ＲＮＡの標的となる上述ＳＭＳ２をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。二重鎖ＲＮＡ部分のセンス鎖の例を示せば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２１および２３などを挙げることができるがそれに限定されない。ＳＭＳ２の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００６７】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、ＳＭＳ２（例えば、配列番号７９、８０、ＳＭＳ２の全長配列）のｓｉＲＮＡである。このようなｓｉＲＮＡとしては、具体的には、本発明者らが独自に配列設計した配列に基づくｓｉＲＮＡである以下のような（ａ）〜（ｏ）からなる群より選択されるいずれかに記載のｓｉＲＮＡを挙げることができるがこれらに限定されない：
（ａ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ６＞；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ７＞；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ８＞；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０４＞；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０５＞；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０６＞；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０７＞；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０８＞；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０９＞；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ３＞；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１１＞；
（ｌ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１＞；
（ｍ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ２＞；
（ｎ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ５＞；ならびに
（ｏ）一方または両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失または置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｎ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【００６８】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【００６９】
さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制し得る核酸の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７０】
（メタボリックシンドロームの医薬ならびに治療および予防方法）
別の局面において、本発明は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物を提供する。ここで使用されるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、本明細書において（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）に記載される任意の核酸を用いることができることが理解される。
【００７１】
あるいは、本発明は、メタボリックシンドロームの処置または予防のためのＳＭＳ２の発現を抑制する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）を提供する。メタボリックシンドロームの処置または予防のために使用されるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、本明細書において（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）に記載される任意の核酸を用いることができることが理解される。
【００７２】
好ましくは、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸であり、上記具体的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を例示することができる。
【００７３】
種々の実施形態において、本発明が標的とするメタボリックシンドロームは、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝からなる群より選択されることが理解される。したがって、本発明の核酸または医薬を使用する場合は、メタボリック疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば、肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝等を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。
【００７４】
１つの実施形態では、本発明の医薬は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。本発明の組成物を医薬または医薬品として使用する場合、その投与剤型としては、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、徐放製剤、カプセル剤、注射剤などが挙げられる。該医薬品は賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤、着色剤、遅延放出剤などの添加剤を含むことができる。経口製剤の場合、賦形剤として、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロースなど、結合剤として、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマーなど、崩壊剤として、例えば、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチンなど、滑沢剤として、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油など、香味剤として、例えば、ココア末、ハッカ油、桂皮末などが使用できるが、これらに限定されない。必要により、徐放性または腸溶性製剤とするためのコーティングを施すことができる。注射用製剤の場合には、ｐH調整剤、溶解剤、等張化剤、緩衝化剤などが使用されるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の医薬は、上記のような生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、上述のような顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤（ネブライザー）あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤、頭蓋内投与注射剤、あるいは鼻腔内投与注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００７６】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の核酸または医薬に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００７７】
本発明の核酸または医薬を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００７８】
また注射剤は、主成分である本発明の核酸または医薬を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水
性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００７９】
また、本発明の核酸または医薬を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００８０】
本発明の核酸または医薬を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の核酸または医薬を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００８１】
また、本発明の核酸または医薬をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。肥満、糖尿病、脂質異常症および脂肪肝の部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ｏｃｈｉｙａ，ＴらのＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：７０７−７１０，１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１
：３１−５２，２００１より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸または医薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ
Ｆ．  ＰＮＡＳ．（２００３）  １０２（３４）  １２１７７−８２、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ  Ｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ（２００４）  ３２（１３）  ｅ１０９では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
【００８２】
本発明の核酸または医薬は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の核酸または医薬の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えば、アデノウイルスの場合の投与量は
１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
【００８３】
また、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えば、アデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【００８４】
本発明の医薬または医薬組成物において、さらに有効成分が含まれていてもよい。そのような含まれていてもよいさらなる医薬は、目的に応じ種々考えられる。
【００８５】
別の局面において、本発明は、メタボリックシンドロームの処置または予防のための医薬を製造するための、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）の使用を提供する。ここで使用されうるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、上記（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）の節あるいは本節（メタボリックシンドロームの医薬ならびに治療および予防方法）で説明した任意の核酸を使用しうることが理解される。
【００８６】
１つの別の局面において、本発明の方法は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するメタボリックシンドロームの処置または予防用医薬組成物または医薬を生産する方法であって、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を薬学的に許容可能な賦形剤と混合する工程を包含する。医薬の形態のほか、当局が認める場合食品、健康食品、機能性食品なども同様に製造することができる。その場合、薬学的に許容可能な賦形剤に代えて、目的に応じた二次成分を用いることができる。
【００８７】
本発明の医薬または医薬組成物の有効量は、本発明の医薬または医薬組成物が目的とする薬効を発揮することができる量をいい、本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがあり、本明細書の記載に基づいて当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。
【００８８】
さらなる局面において、本発明は、メタボリックシンドロームを処置または予防する方法であって、該方法は、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）を該処置または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。ここで使用されうるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、上記（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）の節あるいは本節（メタボリックシンドロームの医薬ならびに治療および予防方法）で説明した任意の核酸を使用しうることが理解される。
【００８９】
個体への投与は、は本節（メタボリックシンドロームの医薬ならびに治療および予防方法）で説明されているとおりであり、任意の方法を用いることができ、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００９０】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、メタボリックシンドロームを発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【００９１】
本発明の処置方法または予防方法において使用される有効成分の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定すること
ができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１日〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００９２】
本発明の処置方法において使用される成分の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被験体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１日〜１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００９３】
本発明は、キットなどとして使用されてもよく、その場合、指示書を伴うこともありうる。本明細書において「指示書」は、本発明の治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、適切に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００９４】
（一般技術）
本明細書において用いられる医療器具製造技術、製剤技術、微細加工、分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ
．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００９５】
本発明で使用される培養方法は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【００９６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、北海道大学において規定される基準を遵守した。
【００９８】
使用した略語は以下のとおりである。
ＳＭＳ：スフィンゴミエリン合成酵素
ＳＭＳ１、ＳＭＳ２：遺伝子名
ＫＯ：ノックアウト
ｗＫＯ：ダブルノックアウト
ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＴＧ：トリグリセリド
ＳＭ：スフィンゴミエリン
ＭｅβＣＤ：メチルβシクロデキストリン
ＨＦＤ：高脂肪食
ＮＤ：通常食
ＷＡＴ：白色脂肪細胞量
ＷＴ：野生型
【００９９】
（実施例１：ＳＭＳ２の抑制による肝臓への中性脂肪蓄積の抑制）
１）ＳＭＳｓノックアウトマウスの作製
マウスのＳＭＳはこれまでに、発現クローニング法によって単離されたＳＭＳ１と、そのホモログとして同定されたＳＭＳ２、ＳＭＳｒの３つのアイソフォームが見つかっている。ＳＭＳ１ノックアウト（ＳＭＳ１−ＫＯ）マウス、ＳＭＳ２ノックアウト（ＳＭＳ２−ＫＯ）マウスはともに、図１に示すターゲティングベクターを用いて、一般的なノックアウトマウス作製方法に則してエキソン１を欠損させて、作製した。
【０１００】
２）体重に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
４週齢の雄の野生型マウス（ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ６）とＳＭＳ２−ＫＯマウスにそれぞれ高脂肪食（ＨＦＤ；５８Ｙ１，ｔｅｓｔＤｉｅｔ社）と対照通常食（ＮＤ；ＡＩＮ７６Ａ，ｔｅｓｔＤｉｅｔ社）を投与し、その後の体重変動を９週に渡って計測した。その結果、図２に示すように、ＳＭＳ２  ＫＯマウスにＨＦＤを負荷した場合、ＷＴに同様のＨＦＤを投与した場合と比較して、体重増加が有意に抑えられた。
【０１０１】
３）白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
２）と同様にＨＦＤを投与したＷＴとＳＭＳ２  ＫＯマウス（１２週後）を開腹し、精巣上体に付着した脂肪を採取しその重量を計測した。その結果、図３に示すように、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤでは、白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）に減少傾向は見られるものの有意な差ではなかった。図には示さないが、対照通常食（ＮＤ）を並行して与えた同様の実験も行っており、ＷＴ／ＨＦＤ群に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では白色脂肪細胞量（ＷＡＴ）が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかったことがわかっている。
【０１０２】
４）肝トリグリセリド量に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
２）と同様にＨＦＤを投与したＷＴとＳＭＳ２  ＫＯマウス（１２週後）を開腹し、肝臓を採取した。肝ホモジネート中のトリグリセリドをＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｑｕａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）にて定量した。方法はキットの説明書に従った。ホモジネート中のタンパク質量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて定量し、トリグリセリド量の補正に用いた。その結果、図４に示すように、ＷＴ／ＨＦＤ群に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では有意にトリグリセリド量が減少していた。
【０１０３】
さらに、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、肝ホモジネート中のトリグリセリド量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）の比較をした結果を図４Ａに示す。その結果、図４Ａに示すように、ＷＴ／ＨＦＤ群（左）に比べてＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群（右）では有意にトリグリセリド量が減少していた。一方、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群とＳＭＳ２  ＫＯ／ＮＤ群との間には有意差は見られなかった。
【０１０４】
５）アディポネクチン量に対する６０％脂肪食投与の影響の検討
２）と同様にＨＦＤを投与したＷＴとＳＭＳ２  ＫＯマウス（１２週後）を開腹し、精巣上体に付着した脂肪を採取しｍＲＮＡを抽出し、ＱＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  ＴＰ８００，タカラバイオ社）によってアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量を計測した。その際に同サンプル中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正を行った。試薬は、第１鎖ｃＤＮＡ合成には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を、ＱＰＣＲには、ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社）を用いた。ＰＣＲプライマーは、
Ｆｗプライマー：ＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣＡＡ（配列番号２５）；Ｒｖプライマー：ＡＴＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号２６）
を用いた。
【０１０５】
その結果、図５に示すように、ＷＴ／ＨＦＤ群ではアディポネクチンの発現が抑制されているが、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群では、比較的高い発現量が維持されていた。さらに、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに１２週間投与した際の、アディポネクチンの相対的な発現量の比較をした。その結果、図５Ａに示すように、ＷＴ群では、高脂肪食を付与することにより、アディポネクチンの発現が抑制されるが、ＳＭＳ２  ＫＯ群では、高脂肪食を付与しても、比較的高い発現量が維持されていた。
【０１０６】
以上の結果から、ＳＭＳ２の阻害によって、肝臓への中性脂肪の蓄積が抑えられる可能性があることが分かった。
【０１０７】
６）インスリン抵抗性に関する実験
６−１）インスリン受容体の発現分析
次にＷＴおよびＳＭＳ２−ＫＯマウスでの脂肪組織におけるインスリン受容体のｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲにて分析した。高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のインスリン受容体の相対的な発現量を調べた。使用したプライマー配列と対照プライマー配列を示す。定量的ＰＣＲは、５）に記載のものと同様の手法で行った。
【０１０８】
インスリン受容体（ＩＲ）
フォワード（Ｆｗ）：ＣＡＧＣＴＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧ（配列番号２７）
リバース（Ｒｖ）：ＧＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡ（配列番号２８）
【０１０９】
結果を図５Ｂ−１に示す。図５Ｂ−１に示すように、野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとインスリン受容体の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは高脂肪食によるインスリン受容体の発現低下はおこっておらず、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のインスリン受容体の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。
【０１１０】
以上から、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは野生型にみられるようなＨＦＤによるインスリン受容体の発現低下はおこっておらず、ＮＤとほぼ同程度の発現量であった。以上の結果からＳＭＳ２―ＫＯマウスの脂肪組織において、ＷＴでみられるようなＨＦＤによるインスリン受容体の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。（図５Ｂ−１）
【０１１１】
６−２）Ｇｌｕｔ４の発現分析
次に、脂肪組織におけるＧｌｕｔ４に対する６０％脂肪食投与の影響を検討し、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）または対照通常食（ＮＤ）を野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与した際のＧｌｕｔ４の相対的な発現量を比較した。使用したプライマー配列と対照プライマー配列を示す。
【０１１２】
ＧＬＵＴ４：  
フォワード（Ｆｗ）：ＣＴＧＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧ（配列番号２９）
リバース（Ｒｖ）：ＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＡＡＣ（配列番号３０）
内在性対照遺伝子であるヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）：
フォワード（Ｆｗ）：ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＧＡＣＴＡ（配列番号７）
リバース（Ｒｖ）：ＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡ（配列番号８）。
【０１１３】
その結果を図５Ｂ−２に表す。図５Ｂ−２から明らかなように、野生型のマウスでは、高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を与えるとＧｌｕｔ４の発現量が低下するけれども、ＳＭＳ２―ＫＯマウスでは高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下についてはその低下の度合いが抑えられており、対照通常食を与えた場合とほぼ同程度の発現量であった。また、ＳＭＳ２―ＫＯマウスに対して高脂肪食を投与した場合のＧｌｕｔ４の発現量は、野生型のマウスに対して高脂肪食を投与した場合と比較して有意に高かった。以上の結果から、ＳＭＳ２―ＫＯマウスの脂肪組織において、野生型のマウスでみられるような高脂肪食によるＧｌｕｔ４の発現低下がおこっておらず、インスリン抵抗性にはなっていないことが示唆された。
【０１１４】
６−３）耐糖能試験
上記「２）体重に対する６０％脂肪食投与の影響の検討」において記載される対照通常食（ＮＤ）または高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を野生型（ＷＴ）またはＳＭＳ２−ＫＯマウスに投与し、さらに９週間成育させたマウスを用いて耐糖能試験を行った。２４時間絶食させた当該マウスの腹腔内に２ｇ／ｋｇでグルコースを投与し、投与直前、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に血糖値を尾静脈からの採血により測定した。測定にはグルコメーターを使用した。その結果、高脂肪食を投与した野生型およびＳＭＳ２―ＫＯマウス間において１２０分の時点で、ＳＭＳ２―ＫＯマウスで有意に血糖値が低下することが判明した（Ｐ＜０．０５；図５Ｃ）。この耐糖能試験のグラフのグラフ下の面積を比較したところ（ＧＴＴ  ＡＵＣ；図５Ｄ）、高脂肪食を投与した野生型およびＳＭＳ２―ＫＯマウス間において、ＳＭＳ２―ＫＯマウスで有意に面積が低下していた（Ｐ＜０．０５）。
【０１１５】
図５Ｄには、図５Ｃのグラフの下の面積（ＡＵＣ）を棒グラフで表したものであるが、このように表現しても、ＳＭＳ２  ＫＯ／ＨＦＤ群はＷＴ／ＨＦＤ群に比べて有意に血糖値が低下していることが理解できる。
【０１１６】
以上の結果から、グルコース負荷にたいして有意に感受性になっていることが確認できた。
【０１１７】
次に血漿インスリン量を測定した。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに通常食を８週齢の時点から４週間投与した後、２４時間絶食させ、その後通常食を投与し、２４時間絶食時および通常食投与後１時間経過時の血中インスリン濃度を測定した。その結果を図５Ｅに示す。図５Ｅから明らかなように、野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスの間において、２４時間の絶食時および通常食投与後１時間経過時いずれにおいても血中インスリン濃度に有意差は見られなかった。したがって、野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスの両者で血中インスリン濃度および応答性に有意差は認められなかったといえる。以上の結果よりＳＭＳ２―ＫＯマウスのインスリン産生能およびグルコースによる応答性に異常がないことが確認でき、したがって膵臓β細胞の異常は認められなかった。
【０１１８】
次に、血糖値に対する高脂肪食の影響を検討した。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに２週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、高脂肪食投与前に４時間絶食させたときおよび２週間高脂肪食を投与した後に４時間絶食させて血糖値を測定した。図５Ｆに示されるように、高脂肪食を投与する前には、野生型のマウスとＳＭＳ２−ＫＯマウス間において、血糖値に有意差は見られないけれども、高脂肪食を２週間投与した後は、野生型のマウスの血糖値は、ＳＭＳ２−ＫＯマウスと比較して有意に高かった。
【０１１９】
次に、血中インスリン量に対する高脂肪食の影響を検討した。野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を２週間投与した後、４時間絶食させ、血中インスリン量を測定した。その結果、図５Ｇに示されるように、ＳＭＳ２−ＫＯマウスでは、野生型のマウスと比較して、有意差をもって、血中インスリン量が低下していた。
【０１２０】
次に、インスリンに対する血中グルコース濃度を検討した。４週齢の野生型（ＷＴ）およびＳＭＳ２−ＫＯマウスに６週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪食）を投与し、腹腔内にインスリンを０．５Ｕ／ｋｇで投与し、投与前および投与後１５、３０、６０、９０、１２０分での血中グルコース濃度を測定した結果を図５Ｈ−１に示す。図５Ｈ−１に示されるように、特に、投与後３０、６０、９０分後には、ＳＭＳ２−ＫＯマウスは、野生型
のマウスと比較して、有意に血中グルコース濃度が低下していたので、ＳＭＳ２−ＫＯマウスはインスリンに対して感受性であることが明らかとなった。
【０１２１】
また、図５Ｈ−１のグラフの下の面積（ＡＵＣ）を棒グラフで表す図５Ｈ−２からも明らかなように、ＳＭＳ２−ＫＯマウスにおいては、野生型のマウスと比較して、２０％程度減少していたので、インスリンに対して感受性であることが明らかになった。
【０１２２】
ＳＭＳ２―ＫＯマウスではＷＴと比較して、血漿インスリン量が有意に低下していた。したがってＳＭＳ２−ＫＯマウスではインスリン抵抗性になっていないことが実証された。したがってＳＭＳ２―ＫＯマウスではインスリンに対して感受性であり、野生型のマウスのようにインスリン抵抗性が惹起されていなかった。（特に、図５Ｅ、図５Ｆおよび図５Ｇ参照）。
【０１２３】
以上の結果から、ＳＭＳ２の阻害によって、糖尿病の治療、特にインスリン抵抗性を改善することができる可能性があることが分かった。
【０１２４】
（実施例２：ＳＭＳｓ再構成細胞の作製）
１）不死化ＭＥＦ細胞の作製
新培養細胞実験法（羊土社）第４章  初代培養  線維芽細胞  ｐ．６６−７０に記載されるようにして、実施例１において作製したＳＭＳ１−ＫＯマウスとＳＭＳ２−ＫＯマウスとを交配させて得た、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２を共に欠損したダブルノックアウト（ＳＭＳ１，２−ｗＫＯ）の胎児からＭＥＦ（マウス胚性線維芽細胞）を単離した。ｐＭＦＧ−ＳＶ４０Ｔｓｔを安定的に保持した２９３Ｔ細胞の培養上清に放出されたレトロウイルスをこのＭＥＦに感染させて、ＭＥＦを不死化した。
【０１２５】
ａ）ウイルス液の調製
ウイルス産生細胞としてＮＩＨ３Ｔ３エコトロピック・プロデューサー細胞  ΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ（ＲＣＢ１１１９；ＳＶ４０  Ｔ抗原発現ウイルス産生細胞；http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=RCB1119&type=1を参照のこと）を使用した。ΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ細胞は、ＳＶ４０ｔｓＴを発現するレトロウイルスを培地中に放出し、マウス宿主細胞に感染する。サブコンフルエントのΨＣＲＥ−ＭＦＧｔｓＴ細胞を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清をウイルス液として回収し、０．２０ｍｍシリンジフィルター（ＣＯＲＮＩＮＧから入手可能）で濾過した。
【０１２６】
ｂ）ウイルス感染および細胞株のクローニング
ＭＥＦの培養物において、１０％  ＦＢＳ、ウイルス原液１ｍＬを含むＤＭＥＭ  ５ｍＬで培地を置換し、３４℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間培養してウイルスに感染させた後、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  ５ｍＬを加えてさらに一晩培養した。翌日、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  １０ｍＬに培地交換した。２〜３日ごとに培地を交換し、ＭＥＦの不死化細胞株を樹立し、さらに不死化したＭＥＦからいくつかの細胞株をクローニングし、その一つをＺＳ２と命名した。
【０１２７】
２）ＳＭＳ１またはＳＭＳ２を過剰発現する不死化ＭＥＦ細胞の作製
ｐＱＣＸＩＰ（クロンテック社）に、Ｃ末端にＶ５タグを付加したＳＭＳ１およびＳＭＳ２を組み込み、レトロウイルスベクターを作製した。このプラスミドとＧＰ２−２９３細胞（クロンテック社）を用いて、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２をそれぞれ発現するレトロウイルスを作製し、クロンテック社の説明書に従って、１）でクローニングした細胞株の一つＺＳ２細胞に感染させた。４μｇ／ｍｌのピューロマイシンで非感染細胞を除き、ＳＭＳ１を過剰発現した細胞ＺＳ２／ＳＭＳ１、およびＳＭＳ２を過剰発現した細胞株ＺＳ２／Ｓ
ＭＳ２を得た。これら３つの細胞株について、抗Ｖ５  ｍａｂ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体を用いてウエスタンブロティングを行った。ＳＭＳ１を発現させた細胞およびＳＭＳ２を発現させた細胞では、図６に示すように、抗Ｖ５  ｍａｂで検出されるＳＭＳ１、ＳＭＳ２のバンドがそれぞれ確認された。
【０１２８】
（実施例３：ＺＳ２、ＺＳ２／ＳＭＳ１およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞の機能の検討）
実施例２で作製したＺＳ２、ＺＳ２／ＳＭＳ１およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞の機能、特に、ＳＭＳ活性およびＴＧ合成について検討した。
【０１２９】
１）ＳＭＳ活性
実施例２で作製した細胞（２×１０５細胞／ウェル）を各々６ウェルプレートに播き、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で一晩培養した後、血清を含まないＤＭＥＭに培地を交換し、最終濃度が１μＭとなるように調整したＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−セラミド（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社）を加えて、３７℃で３０分間反応させた。ピペッティングで細胞を剥がした後、１００μｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１×ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶解させ、タンパク量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）で測定した。溶解液からＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で脂質を抽出し、ＨＰＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて、ＢＯＤＩＰＹ−セラミドと生成したＢＯＤＩＰＹ−Ｃ５−スフィンゴミエリンを、Ｆｌａ７０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ）で定量し、ＳＭＳ活性を算出した。ＳＭＳ活性はタンパク質量で補正した。図７に示すように、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞がＳＭＳ活性を有していたのに対し、ＺＳ２細胞はＳＭＳ活性がなかった。
【０１３０】
２）ＴＧ合成
実施例２で作製した細胞（２×１０５細胞／プレート）を６ウェルプレートに播き、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ中で一晩培養後、血清を含まないＤＭＥＭに培地を交換し、最終濃度が１μＣｉの［１４Ｃ］オレイン酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を加えて、３７℃で３０分間反応させた。ピペッティングで細胞を剥がした後、１００μｌの溶解バッファー（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１×ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶解させ、蛋白量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）で測定した。溶解液からＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で脂質を抽出し、ＨＰＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて［１４Ｃ］オレイン酸と、生成した［１４Ｃ］オレイン酸−トリグリセリドを、Ｆｌａ７０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ）で定量し、ＴＧ量を算出した。図８に示すように、ＺＳ２／ＳＭＳ１細胞およびＺＳ２／ＳＭＳ２細胞におけるＴＧ量と、ＺＳ２細胞におけるＴＧ量との間には有意差があった（各々、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０２）。
【０１３１】
（実施例４：ＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡのスクリーニング）
本実施例では、ＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡのスクリーニングを行った。具体的手順は以下のとおりである。
【０１３２】
下記に示す、独自に配列設計したｓｉＲＮＡを合成し、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞またはＨｅＬａ細胞に形質転換した。４８時間後にＳＭＳ２ｍＲＮＡ量を測定することで、ｓｉＲＮＡによるＳＭＳ２発現抑制率（ノックダウン率）を比較した。１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で両細胞を培養した。トランスフェクション前日に細胞を１２ウェルプレートに播種し、２４時間培養後、ＲＮＡｉＭＡＸ(インビトロゲン)を用いて最終濃度１００ｎＭとなるように、各ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、その４８時間後に、ＳＭＳ２のｍＲＮＡ量を測定した。ＲＮｅ
ａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いて添付マニュアルに従いＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、全ＲＮＡを回収し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ(インビトロゲン)を用いて添付マニュアルに従いｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイム定量ＰＣＲを行ない、ＳＭＳ２のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイム定量ＰＣＲは反応試薬としてＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＡＢＩ）を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステム(ＡＢＩ)を用いて測定を実施した。Ｇ３ＰＤＨの発現量でサンプル間のｃＤＮＡの均一化をおこなった。
【０１３３】
ヒトおよびマウスＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したリアルタイム定量ＰＣＲプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣ（配列番号３３）；
Ｒｖプライマー：ＣＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＣ（配列番号３４）
を用い、
ヒトＧ３ＰＤＨの発現量を測定するために使用したリアルタイム定量ＰＣＲプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号３５）；
Ｒｖプライマー：ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡ（配列番号３６）
を用い、
マウスＧ３ＰＤＨの発現量を測定するために使用したリアルタイム定量ＰＣＲプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣ（配列番号３７）；
Ｒｖプライマー：ＣＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＡＧ（配列番号３８）
を用いた。
【０１３４】
以下に、用いたマウス特異的ｓｉＲＮＡの配列を示す。
SMS2-i1  5’-ggucacuuggaaagucaaa-3’  (センス鎖)（配列番号３９）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号４０）
SMS2-i2  5’-ccggacuacauccagauuu-3’  (センス鎖)（配列番号４１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号４２）
SMS2-i3  5’-ggaugguauugguuggguu-3’  (センス鎖)（配列番号２１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２２）
SMS2-i4  5’-gcagauuguuguugaucau-3’  (センス鎖)（配列番号４３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号４４）
【０１３５】
以下に、用いたヒトとマウスとで相同なｓｉＲＮＡの配列を示す。
SMS2-i5  5’-cauagagacagcaaaacuu-3’  (センス鎖)（配列番号４５）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号４６）。
SMS2-i6  5’-gcauuuucuguaucagaaa-3’  (センス鎖)（配列番号１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２）
SMS2-i7  5’-gucacuucuggugguauca-3’  (センス鎖)（配列番号３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号４）
SMS2-i8  5’-cuguuuuggugguaccauu-3’  (センス鎖)（配列番号５）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号６）
用いたヒト特異的ｓｉＲＮＡの配列を示す。
【０１３６】
SMS2-i104  5'-gggcauugccuucauauau-3'  (センス鎖)（配列番号７）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号８）
SMS2-i105  5'-ggcuguuucugagauacaa-3'  (センス鎖)（配列番号９）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１０）
SMS2-i106  5'-ggugguggauuguccauaa-3'(センス鎖)（配列番号１１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１２）
SMS2-i107  5'-ggauuguccauaacuggau-3'  (センス鎖)（配列番号１３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１４）
SMS2-i108  5'-ccauaacuggaucacauau-3'  (センス鎖)（配列番号１５）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１６）
SMS2-i109  5'-gcacacgaacacuacacua-3'  (センス鎖)（配列番号１７）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１８）
【０１３７】
その結果、図９に示すようにヒトとマウスで相同なｓｉＲＮＡ配列（ｉ６、ｉ７、およびi８）は全てマウス細胞であるＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞でマウスＳＭＳ２に対して７０％以上のノックダウン活性を保持していた（対照のＣＴＲ−ｉを１００％として表示している）。また、図１０に示すように、これら３種のｓｉＲＮＡの配列は、ヒトＨｅＬａ細胞でも８０％以上のノックダウン活性を保持していた（ＣＴＲ−ｉを１００％として表示）。さらに、図１０に示すように、ヒトＳＭＳ２に特異的なｓｉＲＮＡであるｉ１０４〜ｉ１０９はすべてＨｅＬａ細胞で７５％以上のノックダウン活性を保持していた。
【０１３８】
（実施例５：ＳＭＳｓ再構成細胞におけるＳＭＳ２のノックダウン）
図１１に示すように、マウスＺＳ２／ＳＭＳ２細胞でＳＭＳ２−ｉ８を用いて実施例４と同じ実験を行った。ｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭであり、形質転換後４８時間に定量的ＰＣＲを行った。その結果８０％程度のＳＭＳ２の遺伝子発現抑制が確認できた。内在性対照としてＧ３ＰＤＨを使用した。
【０１３９】
次いで、マウスＺＳ２細胞でＳＭＳ２−ｉ８が、ＳＭＳ２の遺伝子発現を抑制し、細胞膜上のＳＭを減少させるのかの確認を行なった。図１２に示すように、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞を用いて、ヒトＳＭＳ２に対するＳＭＳ２−ｉ８を用いてノックダウンを行い、ＭｅβＣＤ感受性評価試験を行った。
【０１４０】
６ウエルデッシュにＺＳ２／ＳＭＳ２細胞２ｘ１０５個を２ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地にサスペンドして撒き、各種ｓｉＲＮＡを最終濃度１００ｎＭになるように、市販の形質転換試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社）と混合後に添加する。業者のプロイコルに従い形質転換した。その後２４時間後に培地を０．３％  ＦＣＳ  ＯＰＴＩＰＲＯ  ＳＦＭ（ギブコ）に置き換えて、さらに２４時間培養後に、ＭｅβＣＤを最終濃度５ｍＭになるように添加し、さらに５％  ＣＯ２  ３７℃にて１６時間培養した。ＷＳＴ８を含む生細胞数測定試薬（ドウジンドウ社）を１０μＬ／ウエルで添加し、さらに６時間５％  ＣＯ２  ３７℃にて培養する。生細胞数はプロトコル通りに測定した。
【０１４１】
ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞に対してヒトＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡ（ＳＭＳ２−ｉ８）を用いてノックダウンすると、当該細胞がＭｅβＣＤに感受性になり、細胞増殖が最終濃度５ｍＭのＭｅβＣＤで有意に低下（有意差検定でＰ＜０．０１）した。
【０１４２】
したがって当該ｓｉＲＮＡによりＳＭＳ２がノックダウンされることによって、細胞膜上のＳＭが減少し、ＺＳ２／ＳＭＳ２細胞がＭｅβＣＤ感受性になることがわかり、したがって当該ｓｉＲＮＡが細胞膜上のＳＭを減少させる活性があることがわかる。
【０１４３】
対照として使用したｓｉＲＮＡ（ＣＴＲ−ｉ）配列を示す。
ＣＴＲ−ｉ  ５’−ｕｕｃｕｃｃｇａａｃｇｕｇｕｃａｃｇｕ−３’（センス鎖）配列番号１９）
同アンチセンス鎖（配列番号２０）
【０１４４】
（実施例６  マウス肝臓におけるＳＭＳ２のノックダウン）
本実施例では、マウスＳＭＳ２に対する２種類のｓｉＲＮＡ（ＳＭＳ２−ｉ３、ｉ１１）を用いてマウス肝実質細胞株であるＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（ＡＴＣＣ）でＳＭＳ２をノックダウンし、その効果を確認した。
【０１４５】
１２ウエルデッシュに１ｘ１０４個の細胞を撒き、２４時間後に市販の形質転換試薬であるＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、業者のプロトコルに従い形質転換を行った。ｓｉＲＮＡは最終濃度１００ｎＭで行った。４８時間後に細胞を０．５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で溶解し、プロトコルにしたがいＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡへの逆転写は市販のキットであるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて定法通り行った。定量的ＰＣＲは上記プライマーを使用し、市販のキット（ＡＢＩ社）を用いて行った。
【０１４６】
いずれのｓｉＲＮＡ配列を使用した場合であっても、８０％以上のノックダウンを確認できた（図１３、図１４）。ｃＤＮＡの標準化のためにＧ３ＰＤＨを用いた。
【０１４７】
用いたマウスＳＭＳ２に特異的なｓｉＲＮＡ配列を示す。
ＳＭＳ２−ｉ３  ５’−ggaugguauugguuggguu−３’（センス鎖）（配列番号２１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２２）
ＳＭＳ２−ｉ１１  ５’−ggcucuuucugcguuacaa−３’（センス鎖）（配列番号２３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２４）
【０１４８】
これら細胞レベルでノックダウン活性を確認したｓｉＲＮＡ（ｉ３およびｉ１１）をマウスに投与するために、いわゆるｓｉＲＮＡ搭載リポソームを作製した。ｓｉＲＮＡ搭載リポソームは以下の論文（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、  Ｖｏｌ２８、Ｎｏ２、ｐ１７２−１７６  ２０１０）を参考にして作製した。脂質とｓｉＲＮＡをエタノールインジェクション法で混合することで作製した。論文と比較して脂質組成を少し改良し、Ｃ１８ＰＥＧ：Ｄｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ．＝２：５６．６：３．５：３４．３（％）で作製した。作製したリポソームの粒子径を測定した所、どのｓｉＲＮＡを使用して作製した場合にも約１００ｎｍ、ゼータ電位も同様にすべてほぼ中性であった。
【０１４９】
次にＣ５７ＢＬ／６ＪＨａｍＳｌｃ―ｏｂ／ｏｂ(日本ＳＬＣ、以下ｏｂ／ｏｂマウスと呼ぶ)に通常食を与えることでレプチン欠損性肥満マウスを作製した。前述のようにして作製したｓｉＲＮＡ搭載リポソームをｏｂ／ｏｂマウス(５週齢、♀)尾静脈よりｓｉＲＮＡ量にして１．２５ｍｇ／ｋｇで注射して投与した（ｎ＝３）。投与後３日目で肝臓を回収し、図９で示した細胞からのＲＮＡ定量方法と同じ方法で、ノックダウン率を測定した。ＳＭＳ２発現抑制群としてＳＭＳ２−ｉ３またはｉ１１（それぞれｎ＝３）、ネガティブ対照群としてＣＴＲ−ｉ（ｎ＝３）を投与して評価した。肝臓ＳＭＳ２発現を解析した結果、ｍＲＮＡレベルはＳＭＳ２―ｉ１１投与群において８０％、ｉ３投与群においても７０％程度発現抑制されていた。以上より、肝臓ＳＭＳ２発現抑制に成功したことが確認できた。
【０１５０】
（実施例７  マウス肝臓におけるＳＭＳ２の抑制による肝臓トリグリセリドの減少）
７週齢のｏｂ／ｏｂマウス(♂)へｓｉＲＮＡ搭載リポソームをｓｉＲＮＡ量にして１．２５ｍｇ／ｋｇでマウス尾静脈内注射して投与した（ｎ＝３）。投与後１０日間、体重と摂餌量の測定を行った。投与から１０日後、４時間絶食させたｏｂ／ｏｂマウスの肝臓組織を回収した。投与後１０日経過後の体重の変化と１０日間の平均摂餌量を測定した結果を図１６および図１７に示す。対照群と比較して体重増加および平均摂餌量に有意差はなかった。
【０１５１】
肝臓からの脂質成分の抽出はＦｏｌｃｈ法に従った。肝臓０．５ｇをホモジナイズしマイクロチューブへ入れ、０．１Ｍ  ＫＣｌを加えて１．４ｍＬにメスアップし、よく攪拌して１５ｍＬファルコンチューブへ移す。次に、ＣＨＣｌ３とＭｅＯＨ混合液（２：１）６ｍＬを入れ、室温で２時間攪拌する。２ｍＬの滅菌水を加えてよく攪拌し、５分間放置する。３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、下層（有機層）を７２０μＬ回収する。エバポレーションを行って完全に有機溶媒を除去すると黄透明な脂質成分が得られる。抽出したトリグリセリドはトリグリセライドE-テストワコー（ＧＰＯ・ＤＡＯＳ法：和光純薬）を用いて添付マニュアルに従い測定した。肝臓トリグリセリド量の測定結果を図１８に示す。測定結果より、対照群(ＣＴＲ−ｉ投与)と比較してＳＭＳ２発現抑制(ｉ３またはｉ１１投与)によって肝臓トリグリセリドの低下（ｐ＜０．０５）が見られた（ｎ＝３）。
【０１５２】
以上の結果、マウスＳＭＳ２に対する２種類の異なる配列のｓｉＲＮＡの両方の配列において、肝臓のトリグリセリドの低下が確認できたことから、この効果はいわゆるオフターゲット効果ではなく、ＳＭＳ２の発現抑制により惹起されていることが確認できた。以上の結果から内臓脂肪蓄積抑制、脂肪肝抑制が確認された。
【０１５３】
また、ｏｂ／ｏｂモデルは糖尿病モデルでもあり、実施例８等の実験結果から、本発明のｓｉＲＮＡは、糖尿病における効果も期待しうることが理解される。
【０１５４】
（実施例８  ＨｅｐＧ２細胞に対するＳＭＳ２の抑制によるトリグリセリドの減少）
ヒト肝実質細胞株であるＨｅｐＧ２細胞に対照のｓｉＲＮＡ配列であるＣＴＲ−ｉ、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換した。４８時間後のＳＭＳ２のノックダウン率を図９と同じ方法で測定した。その結果いずれのｓｉＲＮＡ配列を用いた場合にも６０％程度のノックダウンが確認できた（図１９）。
【０１５５】
ノックダウンが確認できたので、次に、ＨｅｐＧ２細胞を、ＣＴＲ−ｉ、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９の３種類のｓｉＲＮＡを用いて形質転換し、２４時間後に培地のＦＣＳを０．５％にした。さらにその２４時間後にエタノールに溶解したオレイン酸をＢＳＡと混合し、バスタイプソニケーターを用いて超音波処理をほどこし、分散させたオレイン酸・ＢＳＡ混合物を培地に添加した。加えたオレイン酸の最終濃度は０．４ｍＭ、ＢＳＡは１％にした。さらにその２４時間後に培地を取り除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、１０％ホルマリン・ＰＢＳ溶液を加えて１０分間細胞を固定した。その後細胞からホルマリン溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄後にＰＢＳを完全に除去し、トリグリセリドを特異的に染色できる蛍光試薬であるＡｄｉｐｏＲｅｄ（ＮｉｌｅＲｅｄ）の溶液（Ｌｏｎｚａ社）を最終濃度４％になるように添加したＰＢＳ溶液を細胞に添加した。５分後に蛍光顕微鏡で細胞を観察した（図２０Ａ〜Ｃ）。また、ＣＴＲ−ｉを形質転換した場合と比較して、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換した場合には、細胞内の脂肪滴の粒子径が小さくなっていると思われることから、視野をランダムに５視野を撮像し、直径が１．２５μｍ以上の脂肪滴数を計測した。その結果、ＣＴＲ−ｉを形質転換した場合と比較して、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換した場合には、直径が１．２５μｍ以上の脂肪滴数が３０％程度まで減少していた（図２１）。このような現象は例えば、カベオリンやペリリピン、ＤＧＡＴ２などの阻害によりおこることがしられており、またそれらの遺伝子をノックアウトしたマウスはすべて抗肥満効果があることから、実施例８の結果と実施例７の結果をあわせると、ＳＭＳ２の肝細胞での阻害により抗肥満効果が惹起されていることが示唆された。
【０１５６】
次にこの脂肪滴中のＴＧ量を画像の蛍光量を定量することで輝度として算出した。用いた測定ソフトはＫＥＹＥＮＣＥ社製のＢＺＩＩ解析ソフトを用いた。その結果ＣＴＲ−ｉ
を形質転換した場合と比較して、ＳＭＳ２−ｉ１０４またはＳＭＳ２−ｉ１０９を形質転換した場合には、蛍光量が有意に低下しており、ヒト肝実質細胞でオレイン酸の取り込みかそのＴＧへの変換あるいはその両方が阻害されていることが判明した。このようにＴＧ蓄積の抑制効果は前述のカベオリン阻害などでも同様の効果があり、また一般的にいって細胞内へのＴＧ蓄積を抑制するような作用は抗肥満効果を惹起することが知られている。したがってＳＭＳ２阻害によりヒトｓｉＲＮＡを用いた細胞レベルの解析においても、マウス肝臓でのノックダウンにより肝ＴＧ蓄積抑制作用と同じように、内臓脂肪蓄積抑制、脂肪肝抑制を示唆する効果が確認できた。
【０１５７】
（実施例９：ｓｉＲＮＡ以外の核酸の例（リボザイム））
次に、例えばＫｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．に記載される方法を用いて、配列番号７９または８０に記載されるＳＭＳ２の核酸配列に基づき、リボザイム配列を設計する。
【０１５８】
これを、実施例７および８に記載されるマウスおよびＨｅｐＧ２細胞を用いた手法で本発明のリボザイムの効果を確認することができる。
【０１５９】
（実施例１０：ＳＭＳ２に対するアンチセンス核酸のスクリーニング）
本実施例では、ヒトおよびマウスのＳＭＳ２の塩基配列での相同性領域（１３マー以上の連続相同性領域）をもとに設計したアンチセンス核酸の有効性を実証した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、製造し、ヒトＨＥＫ２９３細胞でノックダウン実験を行った。配列の構造の設計はNucleic  Acid  Research  2010,  Vol38,  No.1
のEfficient  gene  silencing  by  delivery  of  locked  nucleic  acid  antisense  ligonucleotides,  unassisted  by  transfection  reagents.を参考にした。
【０１６０】
以下に、本実施例において用いた１３マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列および形状を示す。使用した核酸は、ＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドとも称されるＬＮＡ含有核酸である。大文字はＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ）であり、小文字はＤＮＡである。ＬＮＡはＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の一種で、ＢＮＡは１０種類以上が知られており、このうちＬＮＡは、糖の２’位と４’位とを−Ｏ−ＣＨ２−で架橋しコンフォメーションをＮ型に固定した人工核酸であり、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ等から入手可能である。これらのオリゴヌクレオチドにおいて、すべての核酸は、ホスホロチオエート修飾のバックボーンでつながっている。ＬＮＡ部分のＣはすべてメチルシトシンである。以下の例では、５’末端にロックド核酸（ＬＮＡ）が３つ、３’末端にＬＮＡが２つ含まれる。
【表２】
0005860038.tif 000003
【０１６１】
上記で作製した１２種類のＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞でのノックダウン実験を行った。ＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞培養液に最終濃度５μＭでそのまま添加した。形質転換後７２時間に定量的ＰＣＲを行った。内在性対照としてＧ３ＰＤＨを使用した。
ヒトＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣ（配列番号３３）；
Ｒｖプライマー：ＣＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＣ（配列番号３４）
を用い、
ヒトＧ３ＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号３５）；
Ｒｖプライマー：ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡ（配列番号３６）
を用いた。
【０１６２】
その結果、上記オリゴヌクレオチドを使用したいずれの実施形態でも生理食塩水投与細胞（アンチセンス未添加細胞）と比較してＳＭＳ２の遺伝子発現抑制が確認でき、そして、ＳＭＳ２−１３−００６，００７，００８，０１２，０１４，０１７，０１９＜それぞれ、配列番号８２、８３、８４、８８、８９、９０および９１＞において、生理食塩水投与細胞（アンチセンス未添加細胞）と比較して、５０％以上のＳＭＳ２の遺伝子発現抑制が確認できた（図２２）。
【０１６３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０１０年９月２２日に出願された米国特許仮出願番号61/385,377に対して優先権を主張するものであり、その全体の内容は、具体的に本明細書に記載されているのと同様に本明細書の一部を構成するものとして援用されるべきであるこ
とが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明は、メタボリック疾患の治療・予防剤を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【０１６５】
配列番号１：SMS2-i6の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号２：SMS2-i6の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号３：SMS2-i7の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号４：SMS2-i7の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号５：SMS2-i8の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号６：SMS2-i8の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号７：SMS2-i104の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列  
配列番号８：SMS2-i104の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号９：SMS2-i105の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１０：SMS2-i105の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１１：SMS2-i106の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１２：SMS2-i106の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１３：SMS2-i107の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１４：SMS2-i107の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１５：SMS2-i108の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１６：SMS2-i108の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１７：SMS2-i109の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１８：SMS2-i109の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１９：ＣＴＲ−ｉの二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号２０：ＣＴＲ−ｉの二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２１：SMS2-i3の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号２２：SMS2-i3の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２３：SMS2-i11の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号２４：SMS2-i11の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２５：実施例１で用いたアディポネクチンＦｗプライマー
配列番号２６：実施例１で用いたアディポネクチンＲｖプライマー
配列番号２７：インスリン受容体（ＩＲ）のＦｗプライマー
配列番号２８：インスリン受容体（ＩＲ）のＲｖプライマー
配列番号２９：ＧＬＵＴ４のＦｗプライマー
配列番号３０：ＧＬＵＴ４のＲｖプライマー
配列番号３１：ヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のＦｗプライマー
配列番号３２：ヒポキサン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のＲｖプライマー
配列番号３３：ヒトおよびマウスＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したリアルタイム定量ＰＣＲのＦｗプライマー
配列番号３４：ヒトおよびマウスＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したリアルタイム定量ＰＣＲのＲｖプライマー
配列番号３５：ヒトＧ３ＰＤＨのＦｗプライマー
配列番号３６：ヒトＧ３ＰＤＨのＲｖプライマー
配列番号３７：マウスＧ３ＰＤＨのＦｗプライマー
配列番号３８：マウスＧ３ＰＤＨのＲｖプライマー
配列番号３９：SMS2-i1の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号４０：SMS2-i1の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号４１：SMS2-i2の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号４２：SMS2-i2の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号４３：SMS2-i4の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号４４：SMS2-i4の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号４５：SMS2-i5の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号４６：SMS2-i5の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号４７：SMS2-i6のセンス鎖部分の配列
配列番号４８：SMS2-i6のアンチセンス鎖の配列
配列番号４９：SMS2-i7のセンス鎖部分の配列
配列番号５０：SMS2-i7のアンチセンス鎖の配列
配列番号５１：SMS2-i8のセンス鎖部分の配列
配列番号５２：SMS2-i8のアンチセンス鎖の配列
配列番号５３：SMS2-i104のセンス鎖部分の配列  
配列番号５４：SMS2-i104のアンチセンス鎖の配列
配列番号５５：SMS2-i105のセンス鎖の配列
配列番号５６：SMS2-i105のアンチセンス鎖の配列
配列番号５７：SMS2-i106のセンス鎖の配列
配列番号５８：SMS2-i106のアンチセンス鎖の配列
配列番号５９：SMS2-i107のセンス鎖の配列
配列番号６０：SMS2-i107のアンチセンス鎖の配列
配列番号６１：SMS2-i108のセンス鎖の配列
配列番号６２：SMS2-i108のアンチセンス鎖の配列
配列番号６３：SMS2-i109のセンス鎖の配列
配列番号６４：SMS2-i109のアンチセンス鎖の配列
配列番号６５：ＣＴＲ−ｉのセンス鎖の配列
配列番号６６：ＣＴＲ−ｉのアンチセンス鎖の配列
配列番号６７：SMS2-i3のセンス鎖の配列
配列番号６８：SMS2-i3のアンチセンス鎖の配列
配列番号６９：SMS2-i11のセンス鎖の配列
配列番号７０：SMS2-i11のアンチセンス鎖の配列  
配列番号７１：SMS2-i1のセンス鎖部分の配列
配列番号７２：SMS2-i1のアンチセンス鎖の配列
配列番号７３：SMS2-i2のセンス鎖部分の配列
配列番号７４：SMS2-i2のアンチセンス鎖の配列
配列番号７５：SMS2-i4のセンス鎖の配列
配列番号７６：SMS2-i4のアンチセンス鎖の配列
配列番号７７：SMS2-i5のセンス鎖の配列
配列番号７８：SMS2-i5のアンチセンス鎖の配列
配列番号７９：ヒトSMS2の核酸配列
配列番号８０：マウスSMS2の核酸配列
配列番号８１：実施例１０で使用されたSMS2-13-003のアンチセンス核酸の配列
配列番号８２：実施例１０で使用されたSMS2-13-006のアンチセンス核酸の配列
配列番号８３：実施例１０で使用されたSMS2-13-007のアンチセンス核酸の配列
配列番号８４：実施例１０で使用されたSMS2-13-008のアンチセンス核酸の配列
配列番号８５：実施例１０で使用されたSMS2-13-009のアンチセンス核酸の配列
配列番号８６：実施例１０で使用されたSMS2-13-010のアンチセンス核酸の配列
配列番号８７：実施例１０で使用されたSMS2-13-011のアンチセンス核酸の配列
配列番号８８：実施例１０で使用されたSMS2-13-012のアンチセンス核酸の配列
配列番号８９：実施例１０で使用されたSMS2-13-014のアンチセンス核酸の配列
配列番号９０：実施例１０で使用されたSMS2-13-017のアンチセンス核酸の配列
配列番号９１：実施例１０で使用されたSMS2-13-019のアンチセンス核酸の配列
配列番号９２：実施例１０で使用されたSMS2-13-020のアンチセンス核酸の配列
【図５Ｄ】
0005860038.tif 000004
【図２０（Ａ）】
0005860038.tif 000005
【図２０（Ｂ）】
0005860038.tif 000006
【図２０（Ｃ）】
0005860038.tif 000007
【図１】
0005860038.tif 000008
【図２】
0005860038.tif 000009
【図３】
0005860038.tif 000010
【図４】
0005860038.tif 000011
【図４Ａ】
0005860038.tif 000012
【図５】
0005860038.tif 000013
【図５Ａ】
0005860038.tif 000014
【図５Ｂ−１】
0005860038.tif 000015
【図５Ｂ−２】
0005860038.tif 000016
【図５Ｃ】
0005860038.tif 000017
【図５Ｅ】
0005860038.tif 000018
【図５Ｆ】
0005860038.tif 000019
【図５Ｇ】
0005860038.tif 000020
【図５Ｈ−１】
0005860038.tif 000021
【図５Ｈ−２】
0005860038.tif 000022
【図６】
0005860038.tif 000023
【図７】
0005860038.tif 000024
【図８】
0005860038.tif 000025
【図９】
0005860038.tif 000026
【図１０】
0005860038.tif 000027
【図１１】
0005860038.tif 000028
【図１２】
0005860038.tif 000029
【図１３】
0005860038.tif 000030
【図１４】
0005860038.tif 000031
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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