(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７由来の細菌ゴーストおよび腫瘍関連抗原でインキュベートした抗原提示細胞を含む、腫瘍免疫治療用ワクチンとして使用するための組成物。
【請求項２】
前記抗原提示細胞が単核細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原提示細胞が樹状細胞を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
１つ以上の腫瘍溶解物を含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
溶解タンパク質をコードする遺伝子を含む細菌細胞から得られる細菌ゴーストを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
β−プロピオラクトンで処理された細菌ゴーストを含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
免疫系の活性剤又はサイレンサー、薬剤及び／又はＤＮＡを有する細菌ゴーストを含む、請求項１から６までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
組換え腫瘍関連抗原を提供する細菌ゴーストを含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記細菌ゴーストが、腫瘍関連抗原を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細菌ゴーストが、腫瘍関連抗原を組み換えて発現する細菌に由来する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
抗原提示細胞１個あたり、１〜１００００個、特に１０〜１０００個の細菌ゴーストを含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
１投与量あたり１〜１０００万個の抗原提示細胞を含む、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
腫瘍抗原認識、及びＴ細胞による腫瘍特異性の死滅を誘発する抗原提示細胞を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
自己抗原提示細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４までのいずれか１項に記載の組成物を含む治療用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍免疫療法のための樹状細胞及び細菌ゴーストを含むワクチンに関する。
【０００２】
樹状細胞を基礎とする治療は、腫瘍細胞を使用して抗腫瘍免疫を刺激する。それによって、樹状細胞は、腫瘍細胞で、特に自己腫瘍細胞（すなわち患者自身の腫瘍細胞）でインキュベートされて、抗腫瘍免疫を刺激する。腫瘍細胞でインキュベートされた樹状細胞は、腫瘍細胞から直接抗原を抽出する。腫瘍関連抗原を有する樹状細胞は、そして、腫瘍に対する免疫系を刺激するためのワクチンとして使用される。樹状細胞が癌に対する反応を活性化するために必要である一方で、それらは、しばしば、それらが、癌の成長を危険であると認識することに失敗するために、事前の活性化なしに効果がない。外部刺激を使用して樹状細胞を活性化することによって、関連のある腫瘍関連抗原提示樹状細胞が製造され、従って、効果的な抗腫瘍応答を誘発する。
【０００３】
かかるアプローチは、例えばＵ．Ｓ． ２００８／００３１９００号において記載されている。それらの中で、抗原提示細胞、例えば樹状細胞は、１つ以上の癌細胞の存在でＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンアルファで活性化される。
【０００４】
かなりの進行が、かかる組成物でなされる一方で、他の改良が未だ所望される。
【０００５】
従って、本発明は、
（ｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、及び
（ｉｉｉ）細菌ゴースト（ＢＧ）
を含む組成物を提供する。
【０００６】
本発明に従って、ワクチンとしての抗原提示細胞及び、特に、樹状細胞の効果を、さらに細菌ゴーストを含む組成物を提供することによって改良することができたことが見出されている。
【０００７】
細菌ゴースト（ＢＧ）は、細菌の、特にグラム陰性菌の空の細菌細胞外被である。好ましい細菌は、大腸菌（E. coli）又はフレクスナー赤痢菌２ａ（Shigella flexneri 2a）又はマンヘミア・ヘモリチカ（Mannheimia haemolytica）、及び特に大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７である。
【０００８】
ＢＧは、細菌膜完全性の破壊を生じ、かつ細菌の溶解を導く異種遺伝子の制御された発現によって製造されうる。溶解性遺伝子の例は、細菌の内側及び外側の膜の融合を標的とするポリペプチドをコードし、細胞内部と培養液との間の浸透圧での変化によって排出される全体の細胞質の内容物を介する一方で内膜構造及び外膜構造は、保存され、かつ無傷のままである全体の細胞外被をスパニングする膜内外トンネル構造を形成するバクテリオファージＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅである（Ｕ．Ｓ． ７，９６８，３２３号Ｂ２を参照）。膜内外構造のサイズは溶解条件に依存し、内径は２０〜４００ｎｍの範囲である。ＢＧの空の体は、核酸、リボソーム及び他の構成物が欠けているのに対し、抗原分子を含む必須の内膜構造及び外膜構造、例えば外膜タンパク質、アドヘシン、リポ多糖（ＬＰＳ）及びペプチドグリカンは、変性されておらず、無傷のままである。制御された溶解プロセスの誘発後に、病原性型に反転する危険性は完全にない。
【０００９】
細菌ゴーストは、次の工程を含む方法によって製造されてよい：
（ａ）細菌細胞外被においてトンネル構造を形成することができる溶解タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陰性菌細胞を提供する工程、
（ｂ）場合により、溶解遺伝子が発現しない条件下で細菌細胞を培養する工程、
（ｃ）細菌細胞に、溶解遺伝子が発現せず、かつ細菌細胞の細胞質成分を遊離させる条件を受けさせる工程、並びに
（ｂ）細菌ゴーストを得る工程。
【００１０】
溶解タンパク質をコードする遺伝子の好ましい例は、バクテリオファージｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅである。
【００１１】
特に好ましくは、細菌ゴースト配合物の前記方法について使用した細菌細胞は、さらに、ＷＯ ０３／００６６３０号において記載されている細菌細胞において細胞質成分を加水分解できる酵素をコードする。細菌ゴースト配合物の対応する方法は、さらに、以下の工程を含む：
（ａ）場合により、酵素遺伝子が発現しない条件下で細菌細胞を培養する工程、
（ｂ）細菌細胞に、酵素遺伝子が発現せず、かつ細菌細胞の細胞質成分が分解されない条件を受けさせる工程。
【００１２】
加水分解酵素をコードする遺伝子は、有利には核酸分解酵素遺伝子、特に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）核酸分解酵素遺伝子である（ＷＯ ０３／００６６３０号）。
【００１３】
ＢＧは、マクロファージ、樹状細胞、腫瘍細胞、内皮細胞及び上皮細胞を含む広範囲の試験した細胞の生存性及び代謝活性に対して細胞毒性及び遺伝毒性の影響を示さない。それらの無傷の表面構造を有するＢＧは、効率的に認識され、かつウィルス表面レセプター、例えば補体レセプター及びＴｏｌｌ様レセプターを介して専門のＡＰＣ、例えば樹状細胞及びマクロファージによって貪食される。さらに、樹状細胞（ＤＣ）を使用する他の研究は、ほとんどの専門の抗原提示細胞（専門のＡＰＣ）のモデルとして、それらの貪食活性及びＢＧの摂取が、ＢＧの製造のために使用した細菌株に依存することを示している。
【００１４】
溶解プロセスは非常に有効であるが、まだ、ＢＧ１００００個あたり約１個の無傷の細菌細胞で潜在的な汚染があってよい。ＢＧ配合物におけるあらゆる生きている細胞の存在を避けるために、特にＢＧ試料の凍結乾燥前に、核酸中で反応して改質を生じるアルカリ化剤、例えばベータ−プロピオラクトンが、有利には、ＢＧの最終採取前に発酵システムに添加される。ヒト向けの薬剤及び獣医学における適用のための基準を満たす最終不活性化のためにベータ−プロピオラクトンを使用する製造プロセスは、特許明細書ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０００２７２号において開示されている。
【００１５】
ワクチン又は補助剤としての細菌ゴーストの使用及びそれらの細胞外被構造において非相同タンパク質を提供する組換え細菌ゴーストの製造は、特許明細書ＰＣＴ／ＥＰ９８／０４７２３号において開示されている。
【００１６】
活性成分のキャリヤー又はターゲティングビヒクルとしての細菌ゴーストの使用は、ＰＣＴ／ＥＰ００／０１９０６号において開示されている。
【００１７】
本発明による組成物は、成分として（ｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に専門の抗原提示細胞を含む。好ましい一実施態様において、前記組成物は、単核細胞、及び最も好ましくは樹状細胞（ＤＣ）を含む。特に、本発明の組成物は、インキュベーション及び適用のための準備の前に、ＤＣを有する成熟腫瘍関連抗原を含み、有利にはＤＣを有する腫瘍関連抗原は、腫瘍関連抗原提示樹状細胞である。
【００１８】
ＤＣは、ＭＨＣを制限するＴ細胞の鋭敏化、Ｔ細胞依存抗体製造の開発、及び免疫耐性の導入を含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞応答の最も効力のある専門のＡＰＣ、並びに効力のある開始剤及び調整剤である。ＤＣは、末梢組織及び二次リンパ組織の双方における高い食細胞活性、並びにマクロピノサイトーシス及びレセプター媒介エンドサイトーシスを含むいくつかの機構によるキャプチャー抗原（Ａｇ）を有する。ＤＣの主な役割は、外来抗原によって提供される潜在的危険シグナルの認識、それらの内在化、加工、及びＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の複合体内での提示に関連する。ほとんどの場合、通常の生理的条件で、ＤＣは、高い食作用能力、共刺激及びＡｇ提示分子の低い発現、並びに低いサイトカイン製造によって特徴付けられたそれらの未成熟状態で存在する。マンノースレセプター（グリコシル化Ａｇの摂取）及びＦｃレセプター（イムノグロブリンの摂取）による可溶性抗原の食作用は、抗原提示の効率を強く高める。さらに、ＤＣは、抗体を有するＡｇ複合体がＥｃレセプターを介して内在化された後に、マクロピノサイトーシスにより内在化された可溶性Ａｇと比較して、１００倍より低い濃度で存在しうる。有効なＴ細胞刺激は、サイトカイン製造、共刺激分子の発現、及びペプチド−ＭＨＣ複合体の提示に影響するＤＣ成熟に厳密に関連する。細胞外抗原のエンドサイトーシス、及びエンドソームのリソソーム経路によるそれらの提示は、通常ＭＨＣクラスＩＩ分子内で抗原断片の存在をもたらす。しかしながら、Ｆｃレセプターを介して媒介された細胞外抗原のエンドサイトーシスは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの制限された抗原提示を可能にし、かつＤＣ成熟を含む。ＭＨＣクラスＩ分子の記載における細胞外抗原の提示は、交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）又は交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）として公知である。共刺激分子の発現及びサイトカイン分泌と一緒に、ＭＨＣ分子による抗原の効率的な提示は、種々のタイプのＴ細胞、例えばＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ又はＴｈ１７の刺激を導く。Ｔｈ１リンパ球の活性化及びそれらの増殖について、成熟ＤｃによるＩＬ−１２の十分な製造が重要である。Ｔｈ１タイプのＴ細胞免疫応答に対する局在化は、腫瘍細胞の認識及び除去を導く効率的な抗腫瘍免疫応答の導入のために必要な最も重要な要因の１つと考えられる。
【００１９】
ＢＧは、ＤＣを含む専門のＡＰＣによる認識及び内在化するための優れた能力を示す。ＢＧＦを有するＤＮＡは、マウスにおける裸のＤＮＡよりも、より効率的に体液性及び細胞性のＡｇに特異的な免疫応答を刺激する。Ａｇに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を製造するＩＦＮガンマ製造の増加は、免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープを含むペプチドで加えたＡＰＣによる再刺激に対する応答における、ＢＧを有するＤＮＡでワクチン接種した動物において観察された。さらに、ＢＧは、ＤＣ上でのＭＨＣクラスＩ分子及び共刺激分子の発現を高めた。ＢＧによるＤＣに対して多様化された腫瘍関連Ａｇの交差提示は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を活性化し、かつ免疫系を刺激して、腫瘍によって発現された腫瘍関連Ａｇに対する免疫応答を高めることができる。
【００２０】
細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＤＣの成熟を高め、ＤＣのエンドソーム酸性化に作用し、かつＡｇの交差提示も改良する。ＬＰＳを含むＢＧの内膜構造及び外膜構造は、グラム陰性菌のタンパク質Ｅ媒介溶解後に無傷のままであり、従って、高い負荷容量に加えて、ＢＧは、ＤＣによる交差提示の刺激について、表面上で、ＬＰＳの高く効率的な分子を“提供”する。
【００２１】
従って、本発明の組成物におけるＡＰＣとＢＧとの相互作用は、刺激活性をもたらし、かつ従って、ＡＰＣの成熟をもたらす。
【００２２】
本発明による組成物は、さらに、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（成分（ｉｉｉ））を含む。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、例えば腫瘍細胞溶解物によって提供されうる。有利には、自己腫瘍細胞溶解物、すなわち治療されるべき患者に由来する腫瘍からの溶解物が提供される。しかしながら、腫瘍細胞系列からの腫瘍関連抗原を使用することも可能である。
【００２３】
有利には、治療されるべき腫瘍と同一の腫瘍タイプの腫瘍細胞系列が使用される。有利には、少なくとも２つの異なる腫瘍細胞溶解物が、本発明による組成物中で含まれる。
【００２４】
他の変法として、ＴＡＡはＢＧによって提供されてよい。一実施態様において、ＢＧは、ＴＡＡを有する。他の実施態様において、ＴＡＡを提供するＢＧは、組換えＴＡＡ（タンパク質）を提供するＢＧである。かかる組換えＴＡＡを提供するＢＧは、ＴＡＡを組換えで発現する細菌に由来する。
【００２５】
従って、本発明は、成分（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を、例えば組換えＴＡＡ（タンパク質）を提供するＢＧの形で結合した組成物にも関する。
【００２６】
腫瘍又は癌細胞は、有利には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨性肉腫、骨原性肉種、コード腫、血管肉腫、カポージ肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、膀胱腺癌、骨髄癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌腫、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮関連癌、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、及び白血病からなる群から選択される癌である。
【００２７】
一実施態様において、前記組成物は、Ｔ９８Ｇ腫瘍細胞溶解物を含む。
【００２８】
より有利には、前記組成物は、自己腫瘍細胞溶解物を含む。
【００２９】
本発明の組成物は、熱ショックした、化学的に処理した及び／又は殺した形で、腫瘍細胞を含んでよい。
【００３０】
本発明の組成物は、さらに、場合により、サイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦを含む。さらに、本発明の組成物は、場合により、インターフェロンアルファを含む。
【００３１】
本発明は、特に、単核細胞由来の樹状細胞（ＤＣ）、少なくとも１つの、有利には少なくとも２つの同一の腫瘍タイプからの異なる腫瘍細胞溶解物、細菌ゴースト（ＢＧ）、及び場合により、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、並びにインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）から製造された抗腫瘍ワクチンに関する。
【００３２】
本発明による組成物における抗原提示細胞は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び細菌ゴースト（ＢＧ）でインキュベートすることにより活性化及び／又は成熟される。特に、１つ以上の癌抗原を提示し、かつ１つ以上の癌細胞の存在で、有利には１つ以上の腫瘍又は癌細胞溶解物の存在で、及び細菌ゴーストの存在で、１つ以上の抗原提示細胞のインキュベートによってＴ細胞活性化を誘発する１つ以上の抗原提示細胞が活性化される。
【００３３】
本発明の利点は、ＤＣを、自己患者腫瘍細胞及び／又は同一の組織学的腫瘍タイプから製造された腫瘍細胞系列から得られた腫瘍溶解物の存在でインキュベートすることができることである。従って、ＤＣは、治療されるべきそれぞれの癌のタイプについて仕込まれてよい。自己腫瘍細胞の使用は、他の疾患の感染又は転移の危険性が最小化される。
【００３４】
他の利点は、同一の腫瘍タイプから得られた２つ以上の異なる細胞系列から製造された腫瘍溶解物の存在でＤＣのインキュベートによって生じる。それによって、ＤＣによって提示された抗原の範囲を増加することができる。
【００３５】
ＢＧの無傷の表面免疫賦活性構造は、ＩＦＮ−α及び／又はＧＭ−ＣＳＦと一緒に、ＤＣの完全な成熟を刺激し、かつＩＬ−１２の製造を誘発する。ＧＭ−ＣＳＦは、典型的に成熟ＤＣの発生のために使用されるサイトカインである。
【００３６】
単核細胞は、十分な量の細胞を保証する血流又は白血球分離による患者の末梢血から得られてよい。
【００３７】
１つ以上の腫瘍溶解物でのインキュベートは、いくつかの腫瘍性の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の提示について提供し、かつ広範なＴＡＡに特異的な免疫応答の刺激を導く。
【００３８】
腫瘍溶解物は、患者の手術中に得られた腫瘍組織の自己資料から、又は同一の腫瘍タイプから生じた腫瘍細胞系列から製造されてよい。組織ドナーは、性的感染症（ＳＴＤ）、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、梅毒のための手術前にスクリーニングされ、陰性患者のみが組織ドナーとして考えられる。
【００３９】
ＤＣ、腫瘍溶解物及びＢＧに基づく抗腫瘍ワクチンは、腫瘍を有する、特に神経膠芽腫、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌及び黒色腫を有する患者のための治療として適用されてよい。有利には、腫瘍溶解物は、それぞれの腫瘍タイプ及び／又は腫瘍細胞系列から製造される。
【００４０】
本発明による組成物は、有利には、成分（ｉｉｉ）としてからの細菌ゴーストを含む。しかしながら、特に、免疫系の活性剤又はサイレンサーを有する細菌ゴーストを使用することも可能である。細菌ゴーストは、特に医薬品及び／又はＤＮＡを有してよい。
【００４１】
前記組成物は、場合により細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）を含んでよい。
【００４２】
本発明の組成物中に含まれ、かつＴＡＡ及びＢＧでインキュベートされるＡＰＣ、特に樹状細胞は、特定のサイトカイン、特にＩＬ−１２、ＩＬ−２３及び／又はＩＬ−１βを製造する。
【００４３】
成熟したＡＰＣ、特にＤＣを患者に投与する場合に、免疫応答が誘発される。特に、本発明の組成物は、細胞ゴーストでインキュベートされていない抗原提示細胞の組成物を投与する場合に観察されなかったＴｈ１７応答を誘発することが見いだされた。
【００４４】
本発明による組成物は、有利には、抗原提示細胞１つあたり、特に樹状細胞１つあたり、少なくとも１つの細菌ゴースト、より有利には少なくとも５つの細菌ゴースト、及びより有利には少なくとも１０又は少なくとも１００の細菌ゴーストを含む。前記組成物は、樹状細胞１つあたり、１００００個までの細菌ゴースト、有利には１０００個までの細菌ゴースト、及びより有利には５００個までの細菌ゴーストを含んでよい。
【００４５】
本発明は、さらに、本明細書において記載された組成物を含むワクチンに関する。かかるワクチンの投与によって、癌細胞に対する免疫応答が起こる。従って、本発明は、腫瘍免疫治療のためのワクチンにも関する。投与される場合に、本発明による組成物、及び特にそれらに含まれる抗原提示細胞は、高められた腫瘍抗原認識を、及び従って自己Ｔ細胞による腫瘍特異性の死滅を誘発する。
【００４６】
投与のために、ワクチンは、１投与あたり有利には約１００〜１０００万個の細胞、特に４００〜６００万個の細胞を含む。有利には、５〜１５、特に６〜１０投与量が投与される。投与は、数週間にわたって実施されうる。有利には、最初の２〜３投与量は、１週で投与され、続いて残りの投与量の投与を１ヶ月で投与する。
【００４７】
貯蔵のために、前記組成物を凍結又は凍結乾燥してよい。有利には、前記組成物は凍結される。
【００４８】
投与は、あらゆる適した方法で、例えば全身的に、皮下に、結節内に、皮内に、又は腫瘍内に行われてよい。有利には、前記組成物は、皮下に、結節内に、皮内に、又は腫瘍内に投与される。
【００４９】
投与のために、細菌ゴーストは、免疫系を活性化又はサイレンシングするための活性剤を含んでよい。ＡＰＣを成熟するために、細菌ゴーストは、追加の成分、例えば腫瘍溶解物、腫瘍ペプチド、腫瘍抗原又はサイトカインを含んでよい。細菌ゴースト及び腫瘍関連抗原での抗原提示細胞のインキュベートは、１０分〜１２時間、有利には１５分〜６時間、及びより有利には３時間〜５時間の範囲の時間で実施する。
【００５０】
特に好ましい一実施態様において、樹状細胞は、関連のあるＧＭＰ−ガイドラインに応じて、ＤＣの発生、臨床的体外使用のために最適化し、標準化し、製造し、試験し、かつ放出された市販のＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標） ＤＣ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＭＰ Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養される。
【００５１】
刺激剤とＤＣとの前記組合せに従った抗腫瘍ワクチンの製造は、有利には、単核細胞、特に患者の末梢血から得られたＤＣを、２時間、ＤＮＡｓｅで補ったＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で＋３７℃で５％ ＣＯ2加湿インキュベーター中でインキュベートし、続いて、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−αで補ったＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で３日間インキュベートすることによって実施し、未成熟ＤＣの個体群を得る。同一の腫瘍タイプの少なくとも２つの異なる細胞系列から製造された、少なくとも１つの腫瘍溶解物、及び有利には少なくとも２つの腫瘍溶解物を、ＢＧと共に混合し、ボルテックスし、そして１時間室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートする。続いて、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−αを、ＢＧと腫瘍溶解物のブレンドと混合し、そして未成熟ＤＣに添加し、そして５％ ＣＯ2加湿インキュベーター中で＋３７℃でインキュベートする。
【００５２】
１０分〜１２時間のインキュベート、より有利には４時間のインキュベート後に、内在化されていない腫瘍溶解物及びＢＧを、媒体の穏やかな採取によって、ＤＣから滅菌５０ｍｌ管に注意深く取り出し、そして７００ＲＰＭ／５分／ＲＴで遠心沈殿する。一方、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−αで補った新らたなＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液を、残りの細胞に添加する。遠心分離後に、その上澄みを素早く及び注意深く取り出し、そのペレットを、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−αで補ったＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中に再懸濁し、そしてその細胞を培養フラスコに戻す。ＤＣを、ワクチンを低温凍結する前に、さらに６時間、５％ ＣＯ2加湿インキュベーター中で、＋３７℃でインキュベートする。
【００５３】
本発明を、さらに、同封した図面及び続く実施例によってさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＤＣ上での細胞表面マーカーの発現を示す図。
【図２】腫瘍溶解物及びＬＰＳでのインキュベート又はＢＧでの短い刺激後のＤＣの遊走能力を示す図。
【図３】腫瘍溶解物及びＬＰＳの存在で成熟したＤＣ、又はＢＧでの短時間インキュベートのサイトカイン分布を示す図。
【図４】分析したＤＣの異質遺伝子型（Ａ）及び自己（Ｂ）の免疫刺激力を示す図。
【図５】ＢＧでの短時間刺激後の、腫瘍溶解物を有するＤＣによって誘発された異質遺伝子型（Ａ）及び自己（Ｂ）のＴ細胞の腫瘍細胞の認識及び細胞毒性効果を示す図。
【００５５】
図１．  ＤＣ上での細胞表面マーカーの発現。未成熟のＤＣを、ＩＦＮ−α（３０００ＩＵ／ｍＬ）及びｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍＬ）で補ったＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ培地中で、通常の健康なドナーの末梢血から得られた単核細胞を３日間インキュベートすることによって製造した。ＤＣの成熟マーカーを、ＩＦＮ−α及びｒｈＧＭ−ＣＳＦの存在で、大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（１０及び１００個のＢＧｓ／１ＤＣ）からの腫瘍溶解物及びＢＧでの未成熟ＤＣの短い（４時間）の刺激後に、４８時間多色フローサイトメトリーによって分析した。未成熟ＤＣを、ＩＦＮ−α及びｒｈＧＭ−ＣＳＦ、並びにリポ多糖（ＬＰＳ）（２００ｎｇ／ｍＬ）で補った腫瘍溶解物で、又は対照として供給した外部成熟刺激を有さずに、インキュベートした。ｙ軸は、特定の分化抗原を発現する細胞のパーセンテージを示す。データは、異なるドナーから得られた細胞を使用して実施した４つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【００５６】
ＣＤ１４は、樹状細胞の成熟の指示薬である。単核細胞は、ＣＤ１４発現を示す一方で、成熟した樹状細胞は、ＣＤ１４発現を示さないか又はほとんど示さない。
【００５７】
ＣＣＲ７は、リンパ節への細胞の誘引物質のためのマーカーである。図１から見いだせるように、マーカーＣＣＲ７の発現は、それらの移動度を示す細菌ゴーストでインキュベートした樹状細胞について増加する。
【００５８】
ＣＤ８３は、成熟樹状細胞の主なマーカーである。
【００５９】
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ及びＨＬＡ−ＤＲは、樹状細胞についての成熟マーカーである。
【００６０】
図２．  腫瘍溶解物及びＬＰＳでのインキュベート又はＢＧでの短い刺激後のＤＣの遊走能力。ＩＦＮ−α、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、並びに大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（１０及び１００個のＢＧｓ／１ＤＣ）からのＢＧ、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で補った腫瘍溶解物の存在で、又はＣＣＬ２１（細胞表面ケモカインレセプターＣＣＲ７に結合することによってその効果を高めたケモカイン）に応じた外部成熟刺激を有さずに、成熟した異なるＤＣ個体群の化学遊走を、種々の濃度のＣＣＬ２１を含むトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）系の下部中に遊走させた多数の細胞として測定され、フローサイトメーターによって計数した。それぞれのバーは、異なるドナーから得られた細胞を使用して実施した４つの独立した実験の遊走した細胞の平均数±ＳＤを示す。
【００６１】
図３．  腫瘍溶解物及びＬＰＳの存在で成熟したＤＣ、又はＢＧでの短時間インキュベートのサイトカイン分布。未成熟ＤＣを、２４時間及び４８時間のインキュベート後の上澄み中に放出されるサイトカインを測定する前に、純粋なＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）又は大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（１０及び１００個のＢＧｓ／１ＤＣ）からのＢＧの存在で、短時間（４時間）ＩＦＮ−α、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ及び腫瘍溶解物で刺激した。追加の刺激なしでインキュベートした細胞は、陰性の対照として提供した。ＤＣから放出されたサイトカインのレベルを、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定した。データは、種々の通常の健康なドナーから得られた細胞を使用して実施した４つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｐ値＜０．０５を有意であると考え、アスタリスクで示す（*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１）。
【００６２】
ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γはＴｈ１タイプ中のＴリンパ球の分化についての主な活性マーカーである。
【００６３】
ＩＬ−２３（成長及び安定因子）及びＩＬ−６（分化因子）は、Ｔｈ１７リンパ球の発生において含まれるサイトカインである。図３は、Ｔヘルパー細胞が、本発明による組成物によって誘発されたことを示す。
【００６４】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αは、炎症誘発マーカーである。
【００６５】
ＩＬ−１０は、抗炎症サイトカインである。
【００６６】
ＩＬ−２は、Ｔ細胞成長因子である。
【００６７】
図４．  分析したＤＣの異質遺伝子型（Ａ）及び自己（Ｂ）の免疫刺激力。ＩＦＮ−α、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍溶解物及びＢＧでの未成熟ＤＣの短時間インキュベート（４時間）は、純粋なＬＰＳで補ったＩＦＮ−α、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ及び腫瘍溶解物で、又は外部成熟刺激を有さずに成熟したＤＣと比較して、自己Ｔ細胞の刺激増殖に対するＤＣの能力を著しく高めた。分析したＤＣの自己及び異質遺伝子型の免疫刺激力を、蛍光ラベル（ＣＦＳＥラベル）した異質遺伝子型又は自己のＴ細胞のＤＣ：Ｔ細胞−１：１０での存在で、６日のインキュベート後に測定した。刺激した細胞を、モノクローナル抗体（抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８）のパネルでのインキュベート後に染色し、そして自己及び異質遺伝子型のＴ細胞の双方の増殖を、多色フローサイトメトリーによって測定した。値を、ＤＣの異なる個体群での刺激後に増殖した細胞のパーセンテージから自発的に増殖したＴ細胞のパーセンテージを引いて算出した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（５μｇ／ｍｌ）でインキュベートしたＴ細胞は、陰性の対照として提供した。データは、異なるドナーから得られた細胞を使用して実施した４つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｐ値＜０．０５を有意であると考え、アスタリスクで示す（*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１）。
【００６８】
図５．  ＢＧでの短時間刺激後の、腫瘍溶解物を有するＤＣによって誘発された異質遺伝子型（Ａ）及び自己（Ｂ）のＴ細胞の腫瘍細胞の認識及び細胞毒性効果。異質遺伝子型又は自己のＴ細胞を、純粋なＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で刺激したＤＣを有する腫瘍細胞溶解物（Ｔ９８Ｇ細胞）の存在で６日間インキュベートし、大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（１０及び１００個のＢＧｓ／１ＤＣ）からのＢＧで又は外部成熟刺激を有さずに短時間インキュベートした（４時間）。続いて、刺激したＴ細胞を、エフェクター：ターゲット比１０：１で新たな蛍光ラベル（ＣＦＳＥラベル）したＴ９８Ｇ腫瘍細胞に加えた。腫瘍細胞の特異的な溶解を、フローサイトメトリーによって相互共インキュベートの２４時間後に測定した。１０％Ｅｔ−ＯＨでのインキュベート後の腫瘍細胞の溶解は、陽性の対照（１００％）として提供した。前刺激したエフェクターの存在なしにインキュベートした腫瘍細胞は、自発的な細胞死についての陰性の対照として提供した。データは、異なるドナーから得られた細胞を使用して実施した４つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｐ値＜０．０５を有意であると考え、アスタリスクで示す（*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１）。
【００６９】
特に、Ｔ９８Ｇ腫瘍細胞の処理の結果は、ＤＣのみ又はＤＣ＋ＬＰＳと比較して、ＤＣ＋ＢＧについての相当な増大を示す。
【００７０】
図１〜５において示したすべての実験において、ヒト樹状細胞を含む。
【００７１】
実施例
実施例１．  細菌ゴースト
細菌ゴーストを、特許明細書ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０００２７２号に従って製造する。
【００７２】
実施例２．  腫瘍溶解物配合物
癌患者から得られた腫瘍組織又は組織培養プレート（フラスコ）を、ＮＡＣｌ（注入“Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ”のために水で０．９％の塩化ナトリウム）で満たした管に貯蔵する。腫瘍組織又は細胞を有する管を、＋４℃で貯蔵し、そして手術の３日後までに加工する。その管を、組織の加工前に照射（１２０Ｇｙ）した。ドナー（患者）を、性的感染症（ＳＴＤ）、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、梅毒についてスクリーニングし、そして挙げたあらゆる疾患の陽性検出を有する患者を除外する。前記患者から得られた腫瘍組織を、５〜１０ｍｌの（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｌｏｎｚａ、Ｎｏ．：１０−５４７Ｆ又は１０−５２７Ｆ；ｃＧＭＰ調節に従って製造した）で満たした滅菌ペトリ皿に移す。壊死性組織及び結合組織の双方を、外科用メス及びピンセットによって取り出す。残りの腫瘍組織を、約５ｍｍの小片に切断し、そして滅菌シリンジピストンによって研磨する。得られた細胞懸濁液を、さらに、均質な懸濁液が得られるまで数回、滅菌シリンジに取り付けた２０Ｇ（０．９ｍｍ）針に懸濁液を通過することによって均質化する。続いて、細胞懸濁液を、ナイロンストレナー（１００μｍ）を通して濾過し、そして滅菌５０ｍｌ管に採取する。ペトリ皿を、残りのＨＢＳＳで洗浄し、ナイロンストレナーを通して濾過し、そして濾過した細胞と合する。その細胞懸濁液を、１６００ＲＰＭで７時間＋４℃で遠心沈殿する。その懸濁液を、素早く及び注意深くデカンテーションし、そしてペレットを、２ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で再懸濁する。単一の細胞懸濁液を、マイクロチューブに均等に分ける。そのマイクロチューブを、液体Ｎ2中に、又はドライアイスとメタノールとの混合物中に、約３分間置く。続いて、凍結した細胞を、室温（ＲＴ）で１５〜３０分管、細胞ペレットが完全に溶けるまで溶解する（細胞は、腫瘍細胞タンパク質の破壊を妨げるために、ＲＴで長時間保持すべきでない）。凍結融解の手順を５回繰り返す必要がある。そして、細胞溶解物を、超音波よく中で５分間超音波処理する。細胞破片を細胞溶解物と共に１つの管に採取し、１００００〜１５０００ＲＰＭで１０分間遠心沈殿し、続いてペレットを分離する細い針を使用して上澄み（細胞溶解物）を素早く及び注意深く採取する。細胞溶解物を濾過する必要はなく、すべての工程は、滅菌条件下で行うべきである。濾過していない細胞溶解物を、等分し、そしてさらに使用するまで−８０℃で貯蔵する。その細胞溶解物を、１０ｘ ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、１０ｘ ＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ、Ｎｏ．：１７−５１５Ｆ）で希釈する。分光光度計を、タンパク質濃度の測定のために使用する。
【００７３】
実施例３．  抗ワクチン配合物のための単核細胞の樹状細胞の培養
患者の末梢血から得られた単核細胞を、溶離（Ｅｌｕｔｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ Ｅｕｒｏｐｅ ＮＶ／ＳＡ）又は磁器分離（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）によって単離する。ＧＭ−ＣＳＦを、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で溶解して、１×１０5ＩＵ／ｍｌの最終濃度を得て、マイクロチューブ中に等分し（１つのチューブあたり７００μｌ）、そして−８０℃で貯蔵する。ＩＦＮ−α（Ｒｏｃｈｅ、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ １２×１０6ｌＵ／ｍｌ）を、マイクロチューブ中に等分し（１つのチューブあたり１７．５μｌ）、そして＋２℃〜＋８℃で貯蔵する。凍結保存で凍結した媒体ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２又はＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５を、マイクロチューブ中に滅菌条件下で等分する（１つのチューブあたり１．５ｍｌ）。分離した単核細胞を、培養液中で再懸濁し、そして培養フラスコ中に、培養液７０ｍｌ中で約１６７×１０6個の単核細胞を加える。腫瘍溶解物の約１５０μｇを、１つの培養フラスコについて、又は未成熟ＤＣ（単核細胞）の３倍の腫瘍細胞の数に対応する細胞からの腫瘍溶解物を要求する。培養液からの単核細胞細胞懸濁液を、ＲＴで１０分間１５００ＲＭで遠心分離する。上澄みのデカンテーション後に、細胞ペレットを、少量のＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で再懸濁し、そして３５ｍｌまでＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液で仕上げる。その細胞懸濁液を、培養フラスコに移す。３５ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中でＧＭ−ＣＳＦ（７００μｌ／７×１０4ＩＵ）及びＩＦＮ−α（１７．５μｌ／２．１×１０5ＩＵ）を単核細胞細胞懸濁液に添加する。培養フラスコの含有物を、フラスコを左右に穏やかに動かすことによって注意深く混合する。細胞を、５％ ＣＯ2加湿インキュベーター中で、＋３７℃で３日間インキュベートする。
【００７４】
未成熟ＤＣの製造した細胞懸濁液を採取し、３本の滅菌５０ｍｌ管中に分配した。新たなＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液（５ｍｌ）を、それぞれの培養フラスコに同時に添加して、培養フラスコの表面に付着した細胞の死を妨げる。その細胞懸濁液を、１５００ＲＰＭで１０分間ＲＴで遠心沈殿する。その懸濁液を、素早く及び注意深くデカンテーションし、そして細胞ペレットを、２ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で再懸濁し、そして培養フラスコから細胞を１つの管に移す。細胞の遠心沈殿のために使用したそれぞれの管を、４ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液で穏やかに洗浄し、そして内容物を採取した細胞を有する管に移す。腫瘍組織又は腫瘍細胞系列から得られた腫瘍溶解物（５ｍｌ）（腫瘍細胞：ＤＣ＝３：１の比；５０１×１０6：１６７×１０6）を、大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７から製造した１６７×１０8個の細菌ゴーストと混合し（ＢＧ：ＣＤ＝１００：１の比）、完全にボルテックスし、そしてＲＴで６０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートする。ＧＭ−ＣＳＦ（２５μｌ／２．５×１０4ＩＵ）及びＩＦＮ−α（６．２５μｌ／７．５×１０4ＩＵ）で補ったＢＧと腫瘍細胞溶解物の混合物をＤＣ懸濁液に添加する。続いて、全ての試薬での細胞懸濁液を、培養フラスコに移す。細胞懸濁液を含む管を、５ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液で洗浄し、その媒体を、培養フラスコに移し、そして左右に穏やかに撹拌しながら注意深く混合する。その細胞を、５％ ＣＯ2加湿インキュベーター中で、＋３７℃で４時間インキュベートして、ＢＧ及び腫瘍溶解物の内在化させ、そして成熟プロセスを開始する。インキュベートの４時間後に、その細胞を５０ｍｌ管に移し、そして培養フラスコを、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液で穏やかに洗浄する。フラスコの洗浄のために使用した媒体を、細胞懸濁液を有する管に移す。新たなＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液（５ｍｌ）を、培養フラスコに同時に添加して、培養フラスコの表面に付着した細胞の死を妨げた。その細胞懸濁液を、１５００ＲＰＭで１０分間ＲＴで遠心沈殿する。その懸濁液を、素早く及び注意深くデカンテーションし、そして細胞ペレットを、ＧＭ−ＣＳＦ（２５μｌ／２．５×１０4ＩＵ）及びＩＦＮ−α（６．２５μｌ／７．５×１０4ＩＵ）で補った２０ｍｌの新たなＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培養液中で再懸濁する。その細胞懸濁液を、左右に注意深くかつ穏やかに撹拌している元の培養フラスコに移し、そして細胞を、５％ ＣＯ2加湿インキュベーター中で、＋３７℃でさらに６時間インキュベートする。
【００７５】
実施例４．  抗腫瘍ワクチン配合物の貯蔵
実施例３で得られた刺激したＤＣを有する培養フラスコを、完全に撹拌してフラスコ壁に付着した細胞を落とす。その細胞懸濁液を、ラベルした５０ｍｌ管に完全に移す。培養フラスコを、腫瘍溶解物配合物のために使用したさらに２倍の同一のＨＢＳＳ（１０ｍｌ）で洗浄し、適宜、ＨＢＳＳの全容量を、細胞懸濁液を有する管に移す。元の培養フラスコを、５ｍｌのＨＢＳＳで見たし、インキュベーターに戻す。細胞懸濁液の容量を、ＨＢＳＳで５０ｍｌまで満たし、そして管をひっくり返すことにより穏やかに混合した。その細胞懸濁液を、１５００ＲＰＭで１０分間＋４℃で遠心沈殿する。その上澄みを、素早くかつ注意深くデカンテーションし、その細胞ペレットを、最初に５ｍｌのＨＢＳＳで再懸濁し、続いてさらに４５ｍｌのＨＢＳＳを添加して、管をひっくり返すことによりよく混合する。１０μｌの細胞懸濁液を、Ｂｕｅｒｋｎｅｒ計数チャンバーを使用して、細胞数を測定するために使用する。懸濁液内での細胞の濃度が１．４×１０6個／ｍｌ未満である場合に、アクターゼを使用して、残りの細胞を培養フラスコから放し、又はそれぞれ５×１０6個の細胞を含む細胞アリコートを、患者にさらに投与するために凍結する。患者への投与のために少なくとも６アリコート、品質管理のために１アリコート、免疫監視のために１アリコート、マイコプラズマの試験のために１アリコート、及びアービトラージ（ａｒｂｉｔｒａｇｅ）のために３アリコートを製造することが必須である。その細胞懸濁液を、１５００ＲＰＭで１０分間＋４℃で遠心沈殿する。凍結管を、予め冷却したＭｉｎｉＣｏｏｌｅｒに移す。その懸濁液を、素早く及び注意深くデカンテーションし、そして細胞ペレットを、凍結保存で凍結した媒体ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２中で再懸濁し、そして凍結管に移す。抗腫瘍ワクチン配合物の等分後すぐに、全ての凍結管を、−８０℃でのイソプロパノールボックスに置く。−８０℃で２４時間後に、全ての凍結したワクチン配合物を、液体窒素で満たしたＤｅｗａｒ容器に移し、抗腫瘍ワクチン配合物について目的の使用のみに特定に設定する。
【００７６】
【表１】
0006029677.tif 000002
【図１】
0006029677.tif 000003
【図２】
0006029677.tif 000004
【図３−１】
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【図３−２】
0006029677.tif 000006
【図３−３】
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【図３−４】
0006029677.tif 000008
【図３−５】
0006029677.tif 000009
【図３−６】
0006029677.tif 000010
【図３−７】
0006029677.tif 000011
【図３−８】
0006029677.tif 000012
【図４】
0006029677.tif 000013
【図５−１】
0006029677.tif 000014
【図５−２】
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