(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団における万能性幹細胞の数またはパーセンテージを低減させる方法であって、
少なくとも１つの万能性幹細胞を含む細胞集団を、コーヒー酸、イベルメクチン、塩化ケレリトリンおよびそれらの組合せからなる群より選択される万能性幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤と接触させ、それによって前記細胞集団における万能性幹細胞の数またはパーセンテージを低減させることを含む前記方法。
【請求項２】
前記万能性幹細胞が霊長類の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記霊長類の細胞がヒトの細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記万能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１μΜのコーヒー酸、少なくとも１μΜのイベルメクチン及び少なくとも５μΜ塩化ケレリトリンから選択される１種以上を含む細胞培養培地で前記細胞集団を培養する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞集団が分化中の細胞または分化細胞をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の分化中の細胞または分化細胞が前記万能性幹細胞から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の選択性阻害剤または細胞傷害剤が前記の分化中の細胞または分化細胞の生存度または増殖に効果を持たない、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記の選択性阻害剤または細胞傷害剤が前記集団における前記分化中の細胞または分化細胞の分化または分化能を阻害しない、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の分化中の細胞または分化細胞が胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、内分泌始原細胞および内分泌前駆細胞から選択される少なくとも１つの細胞種を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞集団における万能性幹細胞の数またはパーセンテージの低減を確認することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
万能性幹細胞の集団を分化させる方法であって、
ａ）前記万能性幹細胞集団を少なくとも１つの分化条件と接触させ、それによって、少なくともいくらかの細胞が分化しつつあり、そして、少なくともいくらかの細胞が分化していない分化細胞集団を作製する工程、および
ｂ）前記分化細胞集団を、コーヒー酸、イベルメクチン、塩化ケレリトリンおよびそれらの組合せからなる群より選択される万能性幹細胞特異的阻害剤または細胞傷害剤で処理し、それによって、前記万能性幹細胞集団を分化させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
ａ）万能性幹細胞と、前記万能性幹細胞の分化中の派生物または前記万能性幹細胞の分化した派生物からなる群より選択される少なくとも１つの細胞；および
ｂ）コーヒー酸、イベルメクチン、塩化ケレリトリンおよびそれらの組合せからなる群より選択される万能性幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤
からなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、万能性幹細胞の細胞傷害剤または阻害剤をインビトロでスクリーニングすることおよび特定することに関連する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣまたはｈＥＳ細胞）を使用する細胞置換療法の開発の潜在的なハードルは、分化方法が全てのｈＥＳＣについて均一にその分化運命を決定することができないことである。未分化のｈＥＳＣ、部分的な分化細胞もしくは始原細胞、または不正確に分化運命が決定された細胞が分化細胞集団内に存在し続け得る。そのような細胞の存在が移植に対する「対象外の」生物学的効果の原因であり得るが、最大の問題は移植物の過成長または奇形腫の形成であることがわかった。存在し続けるｈＥＳＣだけが奇形腫の原因であるのか、部分的な分化細胞または始原細胞もまた奇形腫形成の原因になるのか明らかではない。ともかく、移植可能な細胞集団が安全であり、奇形腫の原因となる亜集団を含んでいないことを示すことが重要である。
【０００３】
低分子有機化合物、細胞表面マーカーまたは抗体などの標的化薬剤を含む様々なアプローチを用いて未分化細胞を除去、単離、殺滅または阻害することにより、移植または送達の前に望ましくない細胞亜集団を最小化することまたは所望の集団を精製することが可能である（Ｃｈｏｏら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、２００８年、第２巻：頁１４５４〜６３）。したがって、本来は移植可能な細胞から安全ではない可能性がある集団を除去するために使用可能な薬剤および方法を特定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、万能性幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞など）を候補阻害剤または細胞傷害剤と接触させ、万能性幹細胞の増殖または生存度が抑制されることを観察することにより、阻害剤および細胞傷害剤を特定する方法を提供する。分化細胞または分化中の細胞を候補阻害剤または細胞傷害剤と接触させ、その分化細胞または分化中の細胞の増殖と生存度が候補阻害剤または細胞傷害剤の影響を受けていないことを観察することによって、阻害剤または細胞傷害剤の選択性が決定され得る。例えば、本発明は、分化中の集団内の運命が決定していないｈＥＳＣを除去することが可能な様々な低分子化合物について説明する。その特定された化合物は、細胞療法製品の製造とスケールアップ生産において未分化細胞、例えば、万能性幹細胞を強力に除去する可能性があり、それによって、奇形腫の形成に対する向上した安全対策を提供することを含む候補である。
【０００５】
本発明の細胞は任意の種のものであり得るが、ある実施形態においては、ヒト細胞などの霊長類の細胞である。
【０００６】
当技術分野において公知の任意の方法によって増殖と生存度を決定することができるが、好都合なことに、インピーダンス分析を用いて決定することができる。あるいは、アルカリホスファターゼ染色またはマーカーの存在について細胞を分析することによって本発明に記載の細胞の増殖と生存度を決定することができる。
【０００７】
本発明の分化中の細胞または分化細胞は通常、万能性幹細胞から得られるが、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、内分泌始原細胞および内分泌前駆細胞のような細胞を含み得る。
【０００８】
例えば、万能性幹細胞からより分化した万能性幹細胞の派生物へと分化しつつある細胞の集団であり得る細胞の培養物の中で、分化中の細胞または分化細胞が万能性幹細胞と並行して分析されることができ、または、万能性幹細胞と併存することができる。例えば、前記細胞集団はステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４およびステージ５の分化過程の万能性幹細胞から膵臓内胚葉系細胞までの細胞を含むことができる。
【０００９】
本発明のある実施形態において、前記細胞培養物は接着培養物である。他の実施形態において、前記細胞培養物は懸濁培養物であり、それは細胞凝集体の懸濁液であり得る。
【００１０】
１つの態様において、本発明の幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤は細胞の分化または分化能に影響を与えず、特に、万能性幹細胞ならびにそれの分化中の派生物および分化派生物に影響がない。マーカーの存在について細胞を分析することによって、分化と分化能を判定することができる。そのようなマーカーには、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ‐１‐６０、ＴＲＡ‐１‐８１、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２などの、万能性幹細胞を特定するものが含まれ得る。ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２／ＨＮＦ３β、ＣＥＲ、ＭＩＸＬ１、ＥＯＭＥＳ、ＧＳＣおよびＣＸＣＲ４を含む、ステージ１分化過程および胚体内胚葉細胞を特定するもの；ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４αおよびＦＯＸＡ１などのステージ２分化過程およびＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を特定するマーカー；ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１などのステージ３分化過程またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を特定するマーカー；ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣなどのステージ４分化過程またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞を特定するマーカー；ならびにＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２などのステージ５分化過程、内分泌前駆細胞および／または内分泌始原細胞を特定するマーカーなど、本発明において有用なマーカーは分化中の細胞または分化細胞を特定することもできる。
【００１１】
いくつかの態様において、望ましくない分化（例えば、胚体内胚葉細胞に由来しない細胞または非膵臓型細胞）について細胞をモニターすることができるが、そのために次のマーカー、すなわち、ＡＦＰ、ＣＡＬＣＲ、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、ＦＯＸＱ１、ＧＡＴＡ４、ＧＣＧ、ＣＨＧＡ、ＣＰＡ、ＦＧＦ１７、ＧＨＲＬ、ＩＮＳ、ＭＡＦＡ、ＮＦＭ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ６、ＰＰ、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ６、ＳＯＸ７、ＳＳＴ、ＳＹＰ、ＶＷＦおよびＺＩＣ１、ならびに当技術分野において公知の他のマーカーを使用することができる。
【００１２】
公知の方法とは、Ｑ‐ＰＣＲ、免疫蛍光、免疫組織化学、セルソーティング、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティング、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉検出技術に依るマルチプレックス・デジタル遺伝子発現テクノロジーを含むが、これらに限定されない。当技術分野において公知の方法によりこれらのマーカーおよび他のマーカーを検出することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、マーカーの存在について分析する前に、候補阻害剤または細胞傷害剤で処理された細胞試料を万能性幹細胞の増殖を助ける条件で培養することが有利であり得る。この方法では、万能性幹細胞の検出が増強または増幅され得る。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法には様々な時点で候補阻害剤または細胞傷害剤の効果を分析することが含まれることも考えられている。例えば、第１時点で細胞または細胞培養物を候補阻害剤または細胞傷害剤と接触させ、そして、その後の第２時点でその阻害剤または細胞傷害剤の効果を検出することができる。前記の細胞または細胞培養物が分化しつつある細胞の集団である場合、前記第１時点は、例えば、ステージ１分化過程であることができ、前記第２時点はステージ２、ステージ３、ステージ４またはステージ５の分化過程
の間にあることができる。
【００１５】
本発明は、万能性幹細胞集団を万能性幹細胞を選択する阻害剤または細胞傷害剤と接触させることによって、細胞集団における万能性幹細胞の数またはパーセンテージを低下させる方法も提供する。ある実施形態において、万能性幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤はコーヒー酸、イベルメクチン、塩化ケレリトリンおよびそれらの組合せから選択される。通常、少なくとも約１μΜのコーヒー酸、少なくとも約１μΜのイベルメクチンまたは少なくとも５μΜの塩化ケレリトリンなどの有効量の幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤を含む細胞培養培地中で細胞を接触させる。
【００１６】
本発明は、そのような方法は、万能性幹細胞に由来する集団などの、分化中の細胞または分化細胞の集団における万能性幹細胞の数またはパーセンテージを低下させるのに特に有用であると考えている。
【００１７】
ある実施形態において、万能性幹細胞を膵臓系細胞などの内胚葉系細胞に分化させ、その後、本発明の万能性幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤で処理し、最終分化過程で、または分化過程中に未分化万能性幹細胞を低減させる。そのような分化中の細胞と分化細胞には胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞、内分泌始原細胞および内分泌前駆細胞が含まれる。
【００１８】
有利なことに、本発明の方法は、９６ウェルプレートおよび６ウェルプレート、および６０ｍｍ２、１００ｍｍ２、１５０ｍｍ２培養容器、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５フラスコ、Ｔ１７５フラスコ、トリプルフラスコなどのより大きいプレートまたはフラスコ、および２、５または１０スタックセルファクトリーなどの小規模のセルファクトリーなどでの小規模培養（例えば、約１０５細胞まで）、ならびに、スピナーフラスコ、バイオリアクター容器および当業者によく知られている４０スタックセルファクトリーのような他の容器などでの少なくとも約１×１０９細胞の大規模培養の両方で等しく応用可能である。当業者は、「小規模」および「大規模」という用語は非限定的なものであり、どの研究にとっても、細胞の数と、したがって、培養容器の容量は実験の性質に依存することを理解する。
【００１９】
したがって、本発明はまた、少なくともいくらかの細胞は分化中であり、そして、少なくともいくらかの細胞は分化していない（例えば、万能なままでいる）分化細胞集団を作製するために少なくとも１つの分化条件に万能性幹細胞集団を接触させることによって万能性幹細胞集団を分化させる方法、および、その後、分化した細胞集団を万能性幹細胞特異的阻害剤または細胞傷害剤で処理する方法を提供する。そのような方法によれば、万能性幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤は万能性幹細胞への阻害有効用量または細胞傷害有効用量では万能性幹細胞またはその分化した派生物の分化または分化能に効果を持たず、そして同時に、分化中または分化した派生物の生存度または増殖に効果がないものである。
【００２０】
さらに、万能性幹細胞のステージ１（胚体内胚葉）、ステージ２（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）、ステージ３（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）、ステージ４（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞）またはステージ５（内分泌始原細胞および内分泌前駆細胞）を経る膵臓内分泌細胞への連続的分化など、２つ以上の分化条件に万能性幹細胞を連続的に接触させることを含む分化プロトコルと共に本発明の方法を用いることができる。この種の分化シリーズに有用な分化条件には、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー；Ｗｎｔファミリーメンバー；Ｗｎｔ経路活性化剤；ＲＯＣＫ阻害剤；ＦＧＦファミリーメンバー；ヘッジホグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路阻害剤；ＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤；レチノイド；レチノイン酸類似体；ＥＧＦファミリーメンバー；および／またはγセクレターゼ阻害剤を含む
分化性細胞培養培地など、培地、化合物および成長因子が含まれる。血清の削減または除去；インスリンおよびインスリン様成長因子の削減または除去；ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達の削減または除去；γセクレターゼ活性の削減または除去；ヘッジホグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路シグナル伝達の削減または除去；ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達の活性化；ＦＧＦファミリー増殖因子シグナル伝達の活性化；ＥＧＦファミリー増殖因子シグナル伝達の活性化；Ｗｎｔ経路の活性化；およびレチノイン酸受容体ファミリーメンバーの活性化などの条件もまた含まれる。本発明の方法によってこれらの条件を容易に達成することができる。
【００２１】
本発明は、万能性幹細胞および分化中の派生物および／または分化した派生物および本明細書において記載される１つ以上の万能性幹細胞選択性阻害剤または細胞傷害剤を含む組成物も提供する。通常、その組成物は、対象への移植に細胞が使用される場合などの、万能性幹細胞の阻害または除去が必要とされる分化である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１は、様々なマーカーについて得られたＱ‐ＰＣＲによる遺伝子発現データを示すグラフ集であり、それは、混在した細胞集団における細胞種の相対量の尺度としてＱ‐ＰＣＲを使用することができることを示す。図１Ａは１００％のｈＥＳＣ（最も左のカラム）と１００％の胚体内胚葉細胞（ＤＥ；最も右のカラム）でのＳＯＸ１７遺伝子の発現を示す。１００％ｈＥＳＣと１００％ＤＥの間のカラムは、９９：１のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞（左から２番目のカラム）、９５：５のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞（左から３番目のカラム）および９０：１０のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞（左から４番目のカラム）という既知の希釈混合（または割合）のｈＥＳＣとＤＥ細胞でのＳＯＸ１７遺伝子の発現を示す。
【図１Ｂ】図１は、様々なマーカーについて得られたＱ‐ＰＣＲによる遺伝子発現データを示すグラフ集であり、それは、混在した細胞集団における細胞種の相対量の尺度としてＱ‐ＰＣＲを使用することができることを示す。図１Ｂは既知の割合（１００：０のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；９９：１のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；９０：１０のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；５０：５０のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；および０：１００のＨＥＦ：ｈＥＳＣ）の、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）と混合したｈＥＳＣでのＯＣＴ４遺伝子の発現を示す。
【図１Ｃ】図１は、様々なマーカーについて得られたＱ‐ＰＣＲによる遺伝子発現データを示すグラフ集であり、それは、混在した細胞集団における細胞種の相対量の尺度としてＱ‐ＰＣＲを使用することができることを示す。図１Ｃは、インスリン（ＩＮＳ）遺伝子の相対的発現はその集団でそのマーカー遺伝子を発現する細胞の数に比例することを示す。
【図２】図２は、分化培養物における万能性幹細胞のレベルをモニタリングし、そして、検出する例示的な概略図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ｈＥＳＣ培養物では細胞傷害性を示すが、分化中の胚体内胚葉では細胞傷害性を示さない、細胞のインピーダンスの低下または下落の原因となった７種のＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物の存在下でのｈＥＳ細胞（ｈＥＳＣ；図３Ａおよび３Ｂ）または胚体内胚葉細胞（ＤＥ；図３Ｃおよび３Ｄ）のリアルタイムインピーダンス分析の模様をなぞったグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ｈＥＳＣ培養物では細胞傷害性を示すが、分化中の胚体内胚葉では細胞傷害性を示さない、細胞のインピーダンスの低下または下落の原因となった７種のＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物の存在下でのｈＥＳ細胞（ｈＥＳＣ；図３Ａおよび３Ｂ）または胚体内胚葉細胞（ＤＥ；図３Ｃおよび３Ｄ）のリアルタイムインピーダンス分析の模様をなぞったグラフである。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ｈＥＳＣ培養物では細胞傷害性を示すが、分化中の胚体内胚葉では細胞傷害性を示さない、細胞のインピーダンスの低下または下落の原因となった７種のＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物の存在下でのｈＥＳ細胞（ｈＥＳＣ；図３Ａおよび３Ｂ）または胚体内胚葉細胞（ＤＥ；図３Ｃおよび３Ｄ）のリアルタイムインピーダンス分析の模様をなぞったグラフである。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ｈＥＳＣ培養物では細胞傷害性を示すが、分化中の胚体内胚葉では細胞傷害性を示さない、細胞のインピーダンスの低下または下落の原因となった７種のＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物の存在下でのｈＥＳ細胞（ｈＥＳＣ；図３Ａおよび３Ｂ）または胚体内胚葉細胞（ＤＥ；図３Ｃおよび３Ｄ）のリアルタイムインピーダンス分析の模様をなぞったグラフである。
【図４Ａ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＯＣＴ４（図４Ａ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図４Ｂ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＮＡＮＯＧ（図４Ｂ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図４Ｃ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＦＯＸＡ２（図４Ｃ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図４Ｄ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＳＯＸ１７（図４Ｄ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図４Ｅ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＳＯＸ７（図４Ｅ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図４Ｆ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＰＡＸ６（図４Ｆ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図４Ｇ】ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のＢＧ０２細胞の接着性ステージ１培養物への処理を経たＢＧ０２におけるＺＩＣ１（図４Ｇ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。３つのハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、ＣＹＣＧおよびＴＢＰの幾何平均を用いて発現レベルを正規化した。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。大きい矢頭は薬剤処理の時間を示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｃ＝塩化ケレリトリン；Ａ＝ＡＧ４９０；Ｂ＝ＢＴＯ‐１；Ｄｅ＝デホスタチン；Ｓ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ａ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＯＣＴ４（図５Ａ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｂ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＭＩＸＬ（図５Ｂ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｃ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＥＯＭＥＳ（図５Ｃ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｄ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＣＸＣＲ４（図５Ｄ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｅ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７（図５Ｅ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｆ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＨＮＦ１Ｂ（図５Ｆ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｇ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＨＮＦ４Ａ（図５Ｇ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｈ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＰＤＸ１（図５Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｉ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＰＴＦ１Ａ（図５Ｉ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｊ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＮＫＸ２．２（図５Ｊ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｋ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＮＧＮ３（図５Ｋ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｌ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＮＫＸ６．１（図５Ｌ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図５Ｍ】万能性細胞または膵臓系細胞において発現するマーカー、すなわち、ＰＡＸ４（図５Ｍ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）に由来する選択的細胞傷害剤候補のステージ１〜４の懸濁凝集細胞培養物への処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフはｈＥＳＣ試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｈ．Ｃｌ＝塩化ケレリトリン；Ｄｅｐｈ．＝デホスタチン；ＡＧ＝ＡＧ４９０；ＳＵ＝ＳＵ６６５６。
【図６Ａ】非膵臓系細胞のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１（図６Ａ；例えば、少なくとも胚体外細胞および神経系細胞において観察される）、ＺＩＣ１（図６Ｂ；例えば、少なくとも初期神経系細胞において観察される）、ＰＡＸ６（図６Ｃ；例えば、少なくとも神経外胚葉細胞において観察される）、ＳＯＸ７（図６Ｄ；例えば、少なくとも胚体外細胞において観察される）、ＡＦＰ（図６Ｅ；例えば、少なくとも肝臓細胞および胚体外細胞において観察される）およびＣＤＸ２（図６Ｆ；例えば、少なくとも胚体外細胞において観察される）の化合物処理後分化における相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ）およびデホスタチン（Ｄｅｐｈ．）は非膵臓系細胞または「対象外の」細胞の分化を促進しないが、膵臓細胞に特徴的でないマーカーであり、膵臓系列では通常発現していないＡＦＰとＣＤＸ２の発現の上昇が、それぞれ、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）によってもたらされるようである。
【図６Ｂ】非膵臓系細胞のマーカー、すなわち、ＺＩＣ１（図６Ｂ；例えば、少なくとも初期神経系細胞において観察される）の化合物処理後分化における相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ）およびデホスタチン（Ｄｅｐｈ．）は非膵臓系細胞または「対象外の」細胞の分化を促進しないが、膵臓細胞に特徴的でないマーカーであり、膵臓系列では通常発現していないＡＦＰとＣＤＸ２の発現の上昇が、それぞれ、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）によってもたらされるようである。
【図６Ｃ】非膵臓系細胞のマーカー、すなわち、ＰＡＸ６（図６Ｃ；例えば、少なくとも神経外胚葉細胞において観察される）の化合物処理後分化における相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ）およびデホスタチン（Ｄｅｐｈ．）は非膵臓系細胞または「対象外の」細胞の分化を促進しないが、膵臓細胞に特徴的でないマーカーであり、膵臓系列では通常発現していないＡＦＰとＣＤＸ２の発現の上昇が、それぞれ、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）によってもたらされるようである。
【図６Ｄ】非膵臓系細胞のマーカー、すなわち、ＳＯＸ７（図６Ｄ；例えば、少なくとも胚体外細胞において観察される）の化合物処理後分化における相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ）およびデホスタチン（Ｄｅｐｈ．）は非膵臓系細胞または「対象外の」細胞の分化を促進しないが、膵臓細胞に特徴的でないマーカーであり、膵臓系列では通常発現していないＡＦＰとＣＤＸ２の発現の上昇が、それぞれ、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）によってもたらされるようである。
【図６Ｅ】非膵臓系細胞のマーカー、すなわち、ＡＦＰ（図６Ｅ；例えば、少なくとも肝臓細胞および胚体外細胞において観察される）の化合物処理後分化における相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ）およびデホスタチン（Ｄｅｐｈ．）は非膵臓系細胞または「対象外の」細胞の分化を促進しないが、膵臓細胞に特徴的でないマーカーであり、膵臓系列では通常発現していないＡＦＰとＣＤＸ２の発現の上昇が、それぞれ、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）によってもたらされるようである。
【図６Ｆ】非膵臓系細胞のマーカー、すなわち、ＣＤＸ２（図６Ｆ；例えば、少なくとも胚体外細胞において観察される）の化合物処理後分化における相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ）およびデホスタチン（Ｄｅｐｈ．）は非膵臓系細胞または「対象外の」細胞の分化を促進しないが、膵臓細胞に特徴的でないマーカーであり、膵臓系列では通常発現していないＡＦＰとＣＤＸ２の発現の上昇が、それぞれ、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）によってもたらされるようである。
【図７Ａ】図７Ａと７Ｂは、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーを用いてスクリーニングしたｈＥＳＣに由来するｈＥＳＣおよび神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含有する９６ウェルプレートの写真である。アルカリホスファターゼ活性（図７Ａ）についてヒトＥＳＣを染色し、そして、クリスタルバイオレットでＮＰＣを染色した（図７Ｂ）。ＬＯＰＡＣプレートの左列および右列は空で、未処理対照として役に立つ。細胞傷害性または成長阻害を示すウェルは丸で囲ってある。
【図７Ｂ】図７Ａと７Ｂは、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーを用いてスクリーニングしたｈＥＳＣに由来するｈＥＳＣおよび神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含有する９６ウェルプレートの写真である。アルカリホスファターゼ活性（図７Ａ）についてヒトＥＳＣを染色し、そして、クリスタルバイオレットでＮＰＣを染色した（図７Ｂ）。ＬＯＰＡＣプレートの左列および右列は空で、未処理対照として役に立つ。細胞傷害性または成長阻害を示すウェルは丸で囲ってある。
【図８】図８は、様々な濃度の候補化合物のｈＥＳＣに対するものであり、アルカリホスファターゼ活性について染色したＬＯＰＡＣ１２８０（商標）の二次スクリーニングの写真である。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｆ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｇ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図９Ｈ】図９Ａ〜９Ｈは、ＯＣＴ４（図９Ａおよび９Ｅ）、ＳＯＸ１７（図９Ｂおよび９Ｆ）、ＰＡＸ６（図９Ｃおよび９Ｇ）およびＣＤＸ２（図９Ｄおよび９Ｈ）の、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）サブライブラリー（表４）由来の選択的細胞傷害剤候補のステージ１の懸濁凝集細胞培養物に対する処理による相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。ステージ２の最後まで培養物を分化させた。ステージ１分化過程（左のパネル）と以前に認定された第２日の試料の平均発現レベルに対して発現レベルを正規化してある。グラフは第２日の試料と比較した倍数調節を示す。Ｃｙ＝ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株；ＣＡ＝コーヒー酸；Ｃ＝カルミダゾリウム；Ｐ＝ピロカテコール；Ｎ＝ナプチシジン（Ｎａｐｔｈｙｃｉｄｉｎｅ）；Ｈ＝ヒドロキシアニリド；Ｕ＝Ｕ‐７３３４３；Ｍ＝ＭＧ６２４；Ｐ＝ペンタミジン；Ｇ＝ギナクリン（Ｇｕｉｎａｃｒｉｎｅ）；Ｄ＝ドピエリドン（Ｄｏｐｉｅｒｉｄｏｎｅ）；Ｉ＝イベルメクチン；ＡＰ＝アンモニウムピロリジニン（Ａｍｍ．  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｎｅ）；Ｏ＝オレオイルドーパミン；Ｓ＝ＳＫＦ９６３６５。
【図１０Ａ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＯＣＴ４（図１０Ａ）、ＭＩＸＬ（図１０Ｂ）、ＨＮＦ１Ｂ（図１０Ｃ）、ＨＮＦ４Ａ（図１０Ｄ）、ＰＡＸ４（図１０Ｅ）、ＮＧＮ３（図１０Ｆ）、ＮＫＸ２．２（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、およびＰＴＦ１Ａ（図１０Ｉ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｂ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＭＩＸＬ（図１０Ｂ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｃ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＨＮＦ１Ｂ（図１０Ｃ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｄ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＨＮＦ４Ａ（図１０Ｄ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｅ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＰＡＸ４（図１０Ｅ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｆ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＮＧＮ３（図１０Ｆ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｇ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＮＫＸ２．２（図１０Ｇ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｈ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１０Ｉ】ステージ１の懸濁凝集細胞培養物のＤＭＳＯ（対照）、０．１μΜのコーヒー酸または０．１７μΜのイベルメクチン薬剤での処理後のＰＴＦ１Ａ（図１０Ｉ）の相対的遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。未処理対照試料は第０日（ｄ０）および第１日（ｄ１）で収集された（左のパネル）。処理試料は第２日（ｄ２）、第３日（ｄ３）、第５日（ｄ５）、第７日（ｄ７）、第９日（ｄ９）、第１１日（ｄ１１）および第１３日（ｄ１３）に収集された。処理試料のそれぞれの日のカラムは（左から右に向かって）ＤＭＳＯ、コーヒー酸およびイベルメクチンである。ステージ４の最後まで培養物を分化させた。未処理の膵臓内胚葉分化過程に由来する結果は右に示されているが、第０日、第１日、第２日、第５日、第８日、第１０日および第１４日に収集された試料を用いた。
【図１１】図１１は、ｈＥＳＣに対して細胞傷害性であるが、分化細胞の細胞生存度には影響しない、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリー由来の３種の化合物の名称、作用および構造を示す表である。
【図１２Ａ】ｈＥＳＣ培地中の接着培養物にプレーティングし、そして、細胞核染色剤ＤＡＰＩ（左のパネル）およびＯＣＴ４（中央のパネル）で染色したステージ１後の懸濁凝集物の画像である。比較的小さい一次クラスターか比較的大きい二次クラスターの形状の黒塗りのクラスターとしてＯＣＴ４陽性培養物が右のパネルに示される。
【図１２Ｂ】ｈＥＳＣ培地中の接着培養物にプレーティングし、そして、細胞核染色剤ＤＡＰＩ（左のパネル）およびＯＣＴ４（中央のパネル）で染色したステージ１後の懸濁凝集物の画像である。比較的小さい一次クラスターか比較的大きい二次クラスターの形状の黒塗りのクラスターとしてＯＣＴ４陽性培養物が右のパネルに示される。
【図１２Ｃ】ｈＥＳＣ培地中の接着培養物にプレーティングし、そして、細胞核染色剤ＤＡＰＩ（左のパネル）およびＯＣＴ４（中央のパネル）で染色したステージ１後の懸濁凝集物の画像である。比較的小さい一次クラスターか比較的大きい二次クラスターの形状の黒塗りのクラスターとしてＯＣＴ４陽性培養物が右のパネルに示される。
【図１２Ｄ】ｈＥＳＣ培地中の接着培養物にプレーティングし、そして、細胞核染色剤ＤＡＰＩ（左のパネル）およびＯＣＴ４（中央のパネル）で染色したステージ１後の懸濁凝集物の画像である。比較的小さい一次クラスターか比較的大きい二次クラスターの形状の黒塗りのクラスターとしてＯＣＴ４陽性培養物が右のパネルに示される。
【図１２Ｅ】ｈＥＳＣ培地中の接着培養物にプレーティングし、そして、細胞核染色剤ＤＡＰＩ（左のパネル）およびＯＣＴ４（中央のパネル）で染色したステージ１後の懸濁凝集物の画像である。比較的小さい一次クラスターか比較的大きい二次クラスターの形状の黒塗りのクラスターとしてＯＣＴ４陽性培養物が右のパネルに示される。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＤＭＳＯで処理されたステージ１の対照細胞（図１３Ａおよび１３Ｄ）と比較した、塩化ケレリトリン（ＣｈＣｌ；図１３Ｂ）、イベルメクチン（図１３Ｃ）、およびコーヒー酸（図１３Ｅ）で処理したステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＤＭＳＯで処理されたステージ１の対照細胞（図１３Ａおよび１３Ｄ）と比較した、塩化ケレリトリン（ＣｈＣｌ；図１３Ｂ）、イベルメクチン（図１３Ｃ）、およびコーヒー酸（図１３Ｅ）で処理したステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＤＭＳＯで処理されたステージ１の対照細胞（図１３Ａおよび１３Ｄ）と比較した、塩化ケレリトリン（ＣｈＣｌ；図１３Ｂ）、イベルメクチン（図１３Ｃ）、およびコーヒー酸（図１３Ｅ）で処理したステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＤＭＳＯで処理されたステージ１の対照細胞（図１３Ａおよび１３Ｄ）と比較した、塩化ケレリトリン（ＣｈＣｌ；図１３Ｂ）、イベルメクチン（図１３Ｃ）、およびコーヒー酸（図１３Ｅ）で処理したステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＤＭＳＯで処理されたステージ１の対照細胞（図１３Ａおよび１３Ｄ）と比較した、塩化ケレリトリン（ＣｈＣｌ；図１３Ｂ）、イベルメクチン（図１３Ｃ）、およびコーヒー酸（図１３Ｅ）で処理したステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＤＭＳＯで処理された対照培養物（図Ａ）と比較した、コーヒー酸で処理されたＢＧ０２  ｈＥＳ細胞株のステージ１懸濁凝集培養物（図１４Ｂ）におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＤＭＳＯで処理された対照培養物（図Ａ）と比較した、コーヒー酸で処理されたＢＧ０２  ｈＥＳ細胞株のステージ１懸濁凝集培養物（図１４Ｂ）におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ステージ１の第１日から第２日まで塩化ケレリトリンを用いた、ステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。ｈＥＳＣ培地中の接着培養物に凝集体をプレーティングしてから２４時間（上部）または７２時間（下部）の後に染色を行った。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ステージ１の第１日から第２日まで塩化ケレリトリンを用いた、ステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。ｈＥＳＣ培地中の接着培養物に凝集体をプレーティングしてから２４時間（上部）または７２時間（下部）の後に染色を行った。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ステージ１の第１日から第２日まで塩化ケレリトリンを用いた、ステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。ｈＥＳＣ培地中の接着培養物に凝集体をプレーティングしてから２４時間（上部）または７２時間（下部）の後に染色を行った。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ステージ１の第１日から第２日まで塩化ケレリトリンを用いた、ステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像である。ｈＥＳＣ培地中の接着培養物に凝集体をプレーティングしてから２４時間（上部）または７２時間（下部）の後に染色を行った。
【図１６】図１６は、ステージ１の第１日から第２日までコーヒー酸を用いた、ステージ１懸濁凝集培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の除去を示す画像集である。ｈＥＳＣ培地中の接着培養物に凝集体をプレーティングしてから２４時間（左）または７２時間（右）の後に染色を行った。
【図１７】図１７は、第２日にＥＳ細胞培地へプレーティングし、さらに２４時間または７２時間培養した後の、ＣｙＴ４９ｈＥＳ細胞の分化について、（示されている濃度の）イベルメクチンまたはコーヒー酸の懸濁凝集培養物に対する効果を示す画像集である。ＯＣＴ４の免疫細胞化学染色が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の本発明の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによって本発明をより容易に理解することができる。しかしながら、本組成物および方法を開示および説明する前に、本発明は特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞種、特定の宿主細胞、特定の条件または特定の方法などに限定されることはなく、したがって、当然変更が可能であり、そして、それらの様々な改変や変更が当業者に明らかになると理解されるものとする。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、プレインビュー、ニューヨーク州；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、プレインビュー、ニューヨーク州；Ｗｕ（編）、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２１８巻、パートＩ；Ｗｕ（編）、１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻；Ｗｕら（編）、１９８３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１００巻および第１０１巻；ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏｌｄａｖｅ（編）、１９８０年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６５巻；Ｍｉｌｌｅｒ（編）、１９７２年、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；ＯｌｄおよびＰｒｉｍｒｏｓｅ、１９８１年、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、カリフォルニア州立大学出版会、バークレイ；ＳｃｈｌｅｉｆおよびＷｅｎｓｉｎｋ、１９８２年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ（編）、１９８５年、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第Ｉ巻および第ＩＩ巻、ＩＲＬプレス、オックスフォード、英国；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）、１９８５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬプレス、オックスフォード、英国；ならびにＳｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ、１９７９年、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１〜４巻、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、を参照のこと。最後に、略語と命名法が使用
される場合、それらは本分野で標準的であると見なされ、そして、本明細書において引用するような専門誌において一般的に使用されるものである。
【００２４】
別途、言及されない限り、本明細書において使用される用語は当該技術分野の当業者による従来の使用法に従って理解されるものとする。以下に提供される用語の定義に加えて、分子生物学で一般的な用語の定義をＲｉｅｇｅｒら、１９９１年、Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、第５版、ベルリン：シュプリンガー・フェアラーク；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、グリーン・パブリッシングアソシエーツ株式会社とジョンワイリ・アンド・サンズ株式会社のジョイントベンチャー（１９９８年、増刊号）に見つけ出すこともできる。明細書と特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、それが使用される文脈に応じて、１以上を意味し得ることが理解されるものとする。したがって、例えば、「単数の細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」に対する言及は少なくとも１つの細胞、２つの細胞または複数の細胞を意味し得る。
【００２５】
また、本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のため、別途、示されない限り、成分の量、物質のパーセンテージまたは割合、反応条件、および明細書および特許請求の範囲で用いられる他の数値を表す全ての数は全ての場合で「約」という用語によって修飾されると理解されるものとする。したがって、そうではないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲で示される数値パラメータは、本発明が得ることを求める所望の性質に応じて変化し得る近似値である。せめて、そして、本特許請求の範囲への均等論の適用を制限することを試みるものではないが、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を考慮して、そして、従来の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。
【００２６】
「約」または「およそ」は、本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」として言及された数が引用された数とその引用された数のプラスまたはマイナス１〜１０％を含むことを意味する。例えば、約５０ヌクレオチドは、状況に応じて、４５〜５５ヌクレオチドや少なくとも４９〜５１ヌクレオチドを意味し得る。本明細書において現れる場合、「４５〜５５」などの数値範囲は所与の範囲内の各整数を意味する。例えば、「４５〜５５％」は、そのパーセンテージが４５％、４６％など、５５％を含む５５％までのパーセンテージでありうることを意味する。本明細書において記載される範囲が「１．２％〜１０．５％」のような１０進法による数値を含む場合、その範囲は所与の範囲に示される最小単位で増える各１０進法による数値を意味する。例えば、「１．２％〜１０．５％」は、そのパーセンテージが１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、など、１０．５％を含む１０．５％までのパーセンテージであり得ることを意味する。一方、「１．２０％〜１０．５０％」は、そのパーセンテージが１．２０％、１．２１％、１．２２％、１．２３％など、１０．５０％を含む１０．５０％までのパーセンテージであり得ることを意味する。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「単一細胞懸濁液」または同等の表現は、あらゆる利用可能な機械的、生物学的または化学的手段によって調製され得る、互いに分離した（すなわち、凝集していない）細胞、より典型的には、複数の細胞と液体の混合物を意味する。本明細書において記載される単一細胞懸濁液は通常、基本塩溶液、生理食塩水、細胞培養培地などに懸濁した生存可能なｈＥＳ細胞またはｈＥＳ由来細胞である。一次組織、培養中の接着性細胞および細胞凝集体から単一細胞懸濁液を形成するために細胞クラスターを解離させるいくつかの方法が存在するが、それらには、物理的力（細胞をこすり落とすこと、先が細くて丸いピペットを通して粉砕すること、細いニードルでの吸引、ボルテックスによる脱凝集、および細かいナイロンメッシュまたはステンレスメッシュを通す強
制濾過などの機械的解離）、酵素（すなわち、トリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ（商標）などを使用する酵素的解離）、またはそれらの組合せによって細胞を解離する方法が含まれるが、それらに限定されない。また、ｈＥＳ細胞の単一細胞懸濁液の増殖と生存度を補助することが可能な方法と培地の条件はクローンの増殖、セルソーティングおよびマルチウェルプレート分析のための限定的播種に有用であり、培養方法とクローンの増殖の自動化を可能にする。したがって、本発明の１つの実施形態は、安定した単一細胞酵素解離ｈＥＳ細胞または未分化万能性ｈＥＳ細胞もしくは分化ｈＥＳ細胞の長期の維持および効率的な増殖を補助することが可能なｈＥＳ由来細胞培養系を作製する方法を提供する。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」（すなわち、細胞、例えば、分化可能な細胞を化合物と接触させること）という用語は、インビトロで（例えば、培養中の細胞に化合物を加えて）化合物と細胞を一緒にインキュベートすることを含むものとする。「接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語には、成分、化合物、成長因子など（例えば、神経伝達物質、ＥｒｂＢ３リガンド、ＴＧＦ‐βファミリーのメンバーなど）を含む限定細胞培養培地に細胞をインビボで曝露すること、または対象中で自然に生じるような成分、化合物、成長因子などに細胞をインビボで曝露すること（すなわち、自然な生理的過程の結果として起こり得る曝露）は含まれないものとする。例えば、神経伝達物質、ＥｒｂＢ３リガンド、およびＴＧＦ‐βファミリーのメンバーを含有する限定細胞培地に細胞を接触させる工程はあらゆる適切な方法で実行され得るが、それは、前述の成分と接触させるために細胞を曝露するものと理解される。例えば、接着培養または懸濁培養中で細胞を前記成分とともにインキュベート（培養）することによって細胞を接触させることができる。限定培地中で前記成分と接触した細胞は細胞分化環境でさらに処理されてその細胞を安定化する、またはその細胞を分化させることができると理解される。
【００２９】
細胞培養との関連で本明細書において使用される場合、「補助（ｓｕｐｐｏｒｔ）」は、細胞培養物の成長、生存度、多様性および／または他の特徴にとって充分な培地組成物、その特定の成分および培養条件を意味する。したがって、ｈＥＳ細胞の未分化増殖を補助する限定培地は、さらなる因子、化合物、添加物などを加えることなくその中でｈＥＳ細胞が培養されると、分化することなくその細胞が増殖する培地である。ｈＥＳ細胞の増殖を補助する化合物または因子は、記載された培地条件に添加されるとｈＥＳ細胞の増殖を可能にするものである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「限定細胞培養培地」、「限定培養培地」および「限定培地」が互換的に使用され、実質的に類似した特質と共に忠実に再現され得る、特定の割合、量または活性の無機成分および有機成分（生物的成分および生理活性成分を含む）を含有する水性組成物を意味する。限定培地は、ロット間またはバッチ間で著しく変動することなくそれらが調製または精製されるという条件で、タンパク質、好ましくは、組換えタンパク質を含み得る。動物の血清は本質的に非限定的および可変的であり、したがって、限定培地は血清を含まない。しかしながら、質量、モル当量または活性（例えば、測定可能な生物活性）に基づいた量または割合で個々の高精製度の血清または他のタンパク質、因子などを限定培地に含み得る。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「分化させる」という用語はそれが由来する細胞種よりも特殊化した細胞種の作製を意味する。したがって、その用語は部分的に分化した細胞種および最終的に分化した細胞種を包含する。ｈＥＳ細胞から得られた分化細胞は一般に「ｈＥＳ由来細胞」、「ｈＥＳ由来細胞凝集培養物」、「ｈＥＳ由来単一細胞懸濁液」、「ｈＥＳ由来細胞接着培養物」などと称される。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「実質的に」という用語は非常に（ｇｒｅａｔ  ｅｘｔｅｎｔ）または大いに（ｇｒｅａｔ  ｄｅｇｒｅｅ）を意味する。例えば、本文中の「実質的に類似した」は、別の方法に非常にまたは大いに類似した方法を説明するために使用され得る。しかしながら、本明細書において使用される場合、「実質的に無い」（例えば、「実質的に無い」または「混入汚染物質が実質的に無い」または「血清が実質的に無い」または「インスリンもしくはインスリン様成長因子が実質的に無い」または同等の発現）という用語によって、前記の溶液、培地、栄養補助剤、添加剤などで血清、混入汚染物質、インスリンまたはインスリン様成長因子が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも約１００％無いことを意味する。本発明の１つの実施形態において、血清を含まない、すなわち、１００％血清が無い、すなわち、血清が実質的に無い限定培養培地が提供される。対照的に、「実質的に類似した」組成物、処理、方法、溶液、培地、栄養補助剤、添加剤などは、本明細書おいてこれまでに説明された、またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる以前に記載された処理または方法においてこれまでに説明された基準組成物、処理、方法、溶液、培地、栄養補助剤、添加剤と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％類似している。
【００３３】
本発明のある実施形態において、「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」という用語は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える所望の細胞系列を含有する細胞培養物を指す。
【００３４】
本明細書において使用される場合、薬剤、例えば、化合物の「有効量」という用語または同等の表現は、その他の成分および条件があるなかで所望の結果、例えば、万能性幹細胞の成長阻害をもたらすのに充分な薬剤の量を意味する。本発明のある態様において、例えば、万能性幹細胞培養物を安定化するための化合物または成長因子の有効量は、フィーダー細胞が無いなかで、および血清または血清代替物が無いなかで１日、１週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月を超える期間および／または６か月以上の期間にわたって万能性幹細胞培養物の安定化をもたらす量である。本発明の他の態様において、薬剤、例えば、化合物の「有効量」または同等の表現は、その他の成分があるなかで、フィーダー細胞が無くても、および血清または血清代替物が無くても５継代、１０継代、１５継代、２０継代、２５継代、３０継代または４０継代より長い期間にわたって万能性幹細胞培養物の安定化をもたらすのに充分な化合物の濃度を意味し得る。同様に、この濃度は当業者によって容易に決定される。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「薬剤」という用語は、生物学的効果などの効果、好ましくは所望の効果をもたらす任意の分子、化合物および／または物質を意味する。ある実施形態において、本発明の薬剤は万能性幹細胞に対して細胞傷害性であり、また、万能性幹細胞の成長について阻害的である。１つの態様において、本発明の細胞傷害剤または阻害剤は、万能性幹細胞よりも分化した細胞であり得る少なくとも１つの他の細胞種と比較して、万能性幹細胞に対して選択的に細胞傷害性または細胞増殖抑制性である。
【００３６】
本発明の「候補細胞傷害剤または阻害剤」または「候補薬剤」は、しばしば有機化合物ではあるが、多数の化学薬品クラスを包含する合成または天然の生物学的製剤、生化学的製剤および化学的製剤を含むが、これらに限定されない。多くの場合、候補薬剤は低分子有機化合物、すなわち、約５０Ｄａより大きいが約２５００Ｄａ未満、通常は約２０００Ｄａ未満、しばしば約１５００Ｄａ未満、多くの場合約１０００Ｄａ未満そして通常約８００Ｄａ以下の分子量の有機化合物であり、ポリペプチドおよび／または核酸との構造的相互作用に必要な機能性化学基を含み、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、典型的には前記機能性化学基のうちの少なくとも２つ、そして、より頻繁には、前記機能性化学基のうちの少なくとも３つを通常含む。候補薬
剤は、上に挙げた官能基のうちの１つ以上で置換された炭素環状構造または複素環構造および／または芳香族構造または多環芳香族構造を含み得る。候補薬剤は核酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、抗体、リボザイム、ＲＮＡｉコンストラクト（ｓｉＲＮＡを含む）、アンチセンスＲＮＡ、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド類、プリン類、ピリミジン類、上記のものの派生物もしくは構造類似体、またはそれらの組合せなどのような生体分子でもあり得る。薬剤が核酸である場合、その薬剤は、修飾型核酸、異型体、類似体なども考慮されるが、通常ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００３７】
合成化合物または天然化合物のライブラリーまたはコレクションを含む多種多様な供給源から候補薬剤を得る。例えば、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為的合成および指向性合成に、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを含む多数の方法を用いることができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形状の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、または、直ぐに作製される。さらに、従来の化学的、物理的および生化学的手段により天然のおよび合成されたライブラリーおよび化合物を修飾することができる。また、公知の薬理活性薬剤にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化および当技術分野において周知の他の方法などの指向性化学修飾または無作為的化学修飾を受けさせてその薬剤の構造類似体を作製することができる。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「発現する」という用語は細胞でのポリヌクレオチドの転写および／またはポリペプチドの翻訳を意味するが、前記分子を発現する細胞では、その分子を発現しない細胞よりもその分子のレベルが測定可能なほど高くなる。分子の発現を測定する方法は当業者によく知られており、それらにはノーザンブロッティング、ＲＴ‐ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティングおよび免疫染色が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
細胞、細胞株、細胞培養物または細胞集団に言及するときに本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、その細胞、細胞株、細胞培養物または細胞集団がインビトロで培養されることが可能であるように、前記細胞の天然の供給源から実質的に分離されていることを意味する。さらに、「単離されている」という用語は、２つ以上の細胞を含む群から１つ以上の細胞が、細胞の形態および／またはマーカーの発現などの所望の特徴に基づいてその細胞が選択されて、物理的に分離されていることを意味するために使用される。本発明に記載の単離された細胞は混入汚染物質から部分的、実質的または完全に精製されていてもよいし、精製されていなくてもよい。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「リガンド」は受容体などの生体分子に結合する化学物質を意味する。本明細書において使用される場合、「アゴニスト」は、細胞の受容体に結合し、その細胞の反応を引き起こすリガンドを意味するが、「アンタゴニスト」は、受容体に結合し、アゴニストの結合を妨げることにより細胞の反応を阻害するリガンドを意味する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「標準細胞密度」は、培養時に生存可能であり、増殖可能であることが通常知られている万能性幹細胞の濃度範囲を意味する。例えば、ｈＥＳ細胞は、細胞または細胞株の成長サイクルに応じて通常約３０，０００〜６０，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングされ、そして、約１５０，０００〜３５０，０００細胞／ｃｍ２、例えば、６０ｍｍディッシュまたは約１９．６ｃｍ２当たり約２．５×１０６〜約５×１０７細胞を生じる。対照的に、「低細胞密度」は、例えば、標準細胞密度よりも著しく小さい細胞密度でプレーティングされた万能性幹細胞に当てはまる。当技術分野においてよく知られているが、ある閾値密度より下でプレーティングされた細胞は細胞分裂の遅れを経験することがある、または、継代を生き残ることができないことがある
。１ｃｍ２あたり約３０，０００以下でプレーティングされたｈＥＳ細胞の培養物は低細胞密度であるとみなされる。
【００４２】
ある実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）、例えば、マトリゲル（商標）の非存在下および／または存在下で本明細書において記載される限定培地で万能性幹細胞が培養される。ＥＣＭが無い中で培養された万能性細胞は約０．５〜２０％のヒト血清（ｈＳ）または３００Ｋおよび／もしくは１００Ｋ  ＭＷカットオフ・スピンカラム（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、ミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州）からのｈＳ残余画分を含むことができる。最大２０％のｈＳ、例えば、０．２％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％のｈＳまたはｈＳ残余画分を含有する培地にｈＥＳ細胞を加えて３７℃で一晩培養することによって、ｈＥＳ細胞凝集体懸濁液を作製することができる。ｈＳまたはｈＳ残余画分含有培地での幹細胞のプレーティング効率は、第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５号に記載されるようなＤＣ‐ＨＡＩＦに培養された、またはＥＣＭとしてマトリゲル（商標）もしくは他の類似のマトリックスを使用するＤＣ‐ＨＡＩＦ培地に培養されたｈＥＳ細胞について観察されたものに匹敵した。限定培地でｈＥＳ細胞を培養する方法は、ヒト血清を含む無フィーダー万能性幹細胞培地の方法と組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＦＥＥＤＥＲ‐ＦＲＥＥ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＭＥＤＩＡ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭ）という表題の２００９年４月２３日に提出された米国特許出願公開第２００９／０１０４６９６号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
さらに、他の実施形態において、単層にしても凝集体懸濁液にしても、万能性幹細胞が、動物の血清（例えば、ウシ胎児血清などの哺乳類の胎児血清）が実質的に無く、さらに、外部から添加される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が無い培地に培養される。そのような方法はＴｈｏｍｓｏｎに属する米国特許第７，００５，２５２号と区別可能であるが、その特許は、動物の血清は無いが、外部から添加されるＦＧＦを含む成長因子を含む培地でｈＥＳ細胞を培養することを必要とする。
【００４４】
本明細書において使用される場合、成熟細胞に分化することができる細胞もしくは細胞集団、すなわち、成熟細胞の始原細胞もしくは前駆細胞、または細胞の分化に関与することができる、例えば、成熟細胞に分化することができる他の細胞と融合することができる細胞もしくは細胞集団を説明するために「分化可能な細胞」という用語が使用される。特定の経路に沿った分化に拘束される多能性細胞、少能性細胞および単能性細胞を指すために「始原細胞」および「系譜限定始原細胞」という用語が本明細書において互換的に使用される。例えば、内胚葉系列の始原細胞は様々な内胚葉細胞種に分化することができるが、通常、外胚葉、中胚葉またはそれらの派生物に発生することはない。１つの実施形態において、本明細書において記載されるような膵臓内胚葉始原細胞または上皮は、様々な種類のインスリン、ソマチスタチン（ｓｏｍａｔｉｓｔａｔｉｎ）、グルカゴン、グレリンなどの膵臓ホルモン分泌細胞および膵臓ポリペプチド分泌細胞にさらに発生することができる始原細胞である。ある成人性幹細胞は数種類の始原細胞である。
【００４５】
本発明はまた、その細胞が本明細書において定義されるように分化可能であるのならば、動物のあらゆる供給源に由来する分化可能な細胞を考慮する。例えば、胚またはその中のあらゆる始原胚葉から、胎盤組織または絨毛膜組織から、または、脂肪、骨髄、神経組織、乳腺組織、肝臓組織、膵臓、上皮組織、呼吸器組織、生殖腺組織および筋肉組織を含むが、これらに限定されない成人性幹細胞を含有する組織など、より発達した組織から分化可能な細胞を採取することができる。特定の実施形態において、分化可能な細胞は胚性幹細胞である。他の特定の実施形態において、分化可能な細胞は成人性幹細胞または脱分化細胞である。さらに他の特定の実施形態において、幹細胞は胎盤由来幹細胞または絨毛膜由来幹細胞である。
【００４６】
もちろん、本発明は、分化可能な細胞を形成することができるあらゆる動物に由来する分化可能な細胞を使用することを考慮している。それから分化可能な細胞を採取する動物は脊椎動物または無脊椎動物、哺乳類動物または非哺乳類動物、ヒトまたは非ヒト動物である。動物供給源の例には霊長類動物、げっ歯類動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ウシ属動物およびブタが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「前駆細胞」は、幹細胞の多能性の大半または全てを失った、一種の系譜限定された、部分的に分化した、通常は単能性の細胞である。前駆細胞は通常ただ１つの、２つの、または少数の極めて近縁の最終細胞種に分化することができる）。そこで説明される内分泌前駆細胞は、例えば、膵臓ホルモン発現細胞に分化することができる。
【００４８】
本明細書において使用される場合、腸管または腸管由来の器官の細胞にさらに分化することができる多能性内胚葉系細胞を指すために「胚体内胚葉」および「ＤＥ」が互換的に使用される。特定の実施形態に従うと、胚体内胚葉細胞は哺乳類細胞であり、そして、好ましい実施形態において、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は特定のマーカーを発現し、および／または、他の特定のマーカーをあまり発現できない。いくつかの実施形態において、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１およびＣＥＲから選択される１つ以上のマーカーが胚体内胚葉細胞で発現する。他の実施形態において、ＯＣＴ４、α‐フェトタンパク質（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７およびＨＮＦ４αから選択される１つ以上のマーカーが胚体内胚葉細胞ではあまり発現しない。胚体内胚葉細胞集団およびその作製方法は、胚体内胚葉（ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００４年１２月２３日に提出された米国特許出願公開第１１／０２１，６１８号（現在では、米国特許第７，５１０，８７６号）にも記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本発明のさらに他の実施形態は「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「前腸内胚葉細胞」またはそれらと同等の名称の細胞培養物および細胞凝集体に関連する。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は多能性を有し、そして、胸腺、甲状腺、副甲状腺、肺／気管支、肝臓、咽頭、咽頭嚢、十二指腸の部分および耳管を含むが、これらに限定されない様々な細胞および組織を生ずることができる。いくつかの実施形態において、前腸内胚葉細胞は非前腸内胚葉細胞、例えば、胚体内胚葉またはＰＤＸ陽性内胚葉と比較して上昇したレベルのＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ１α、ＦＯＸＡ１を発現するが、非前腸内胚葉細胞はこれらのマーカーを検知できるほど発現しない。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞はまた低レベル〜検出不能レベルのＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７およびＳＯＸ１を発現する。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団およびその作製方法は、ＰＤＸ１発現背腹部前腸内胚葉（ＰＤＸ１‐ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＤＯＲＳＡＬ  ＡＮＤ  ＶＥＮＴＲＡＬ  ＦＯＲＥＧＵＴ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００６年１０月２７日に提出された米国特許出願公開第１１／５８８，６９３号にも記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
本発明の他の実施形態は「ＰＤＸ１陽性膵臓前腸内胚葉細胞」または「ＰＤＸ１陽性前膵内胚葉」または「ＰＤＸ１陽性前膵内胚葉始原細胞」またはそれらの同等物の細胞培養物に関連する。ＰＤＸ１陽性前膵内胚葉細胞は多能性を有し、そして、胃、小腸および膵臓を含むが、これらに限定されない様々な細胞および／または組織を生ずることができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前膵内胚葉細胞は非前膵内胚葉細胞と比較して上昇したレベルのＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１を発現するが、非前膵内胚葉細胞はこれらのマーカーを検知できるほど発現しない。ＰＤＸ１陽性前膵内胚
葉細胞はまた低レベル〜検出不能レベルのＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣを発現する。
【００５１】
本発明の他の実施形態は「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」または「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞」または「膵臓始原細胞」または「膵臓上皮」または「ＰＥ」またはそれらの同等物の細胞培養物に関連する。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞は多能性を有し、そして、腺房細胞、導管細胞、内分泌細胞を含むが、これらに限定されない膵臓中の様々な細胞を生ずることができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性膵臓始原細胞は非前膵内胚葉細胞と比較して上昇したレベルのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現するが、非前膵内胚葉細胞はこれらのマーカーを検知できるほど発現しない。ＰＤＸ１陽性膵臓始原細胞はまた低レベル〜検出不能レベルのＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰを発現する。
【００５２】
あるいは、本発明の他の実施形態は「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞」またその同等物の細胞培養物に関連する。いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞はＰＤＸ１陽性膵臓始原細胞と同様に上昇したレベルのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現するが、ＰＤＸ１陽性膵臓始原細胞と異なり、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞は上昇したレベルのＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣをさらに発現する。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞はまた低レベル〜検出不能レベルのＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰを発現する。
【００５３】
さらに、本発明の他の実施形態は「膵臓内分泌前駆細胞」、「膵臓内分泌始原細胞」またはそれらの同等物の細胞培養物に関連する。膵臓内分泌始原細胞は多能性または単能性を有し、そして、α細胞、β細胞、δ細胞および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞を含む成熟型内分泌細胞を生ずる。いくつかの実施形態において、膵臓内分泌始原細胞は他の非内分泌始原細胞種と比較して上昇したレベルのＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２を発現する。膵臓始原細胞はまた低レベル〜検出不能レベルのＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰを発現する。
【００５４】
本発明のさらに他の実施形態は「膵臓内分泌細胞」、「膵臓ホルモン分泌細胞」、「膵島ホルモン発現細胞」またはそれらの同等物の培養物に関連するが、それらはインビトロで万能性幹細胞から得られた細胞、例えば、α細胞、β細胞、δ細胞および／またはＰＰ細胞またはそれらの組合せを指す。これらの内分泌細胞は複数ホルモン分泌性または単一ホルモン分泌性であり得るが、例えば、インスリン、グルカゴン、グレリン、ソマトスタチンおよび膵臓ポリペプチドまたはそれらの組合せを発現する。これらの内分泌細胞は、したがって、１つ以上の膵臓ホルモンを発現することができ、そして、ヒト膵島細胞の機能の少なくとも１つまたはいくつかを有する。膵島ホルモン発現細胞は成熟または未成熟であり得る。ある種のマーカーの差示的な発現または機能上の能力、例えば、インビトロまたはインビボでのグルコース応答に基づいて未成熟膵島ホルモン発現細胞を成熟膵島ホルモン発現細胞から区別することができる。膵臓内分泌細胞はまた低レベル〜検出不能レベルのＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２を発現する。
【００５５】
細胞種
いくつかの実施形態において、内胚葉系、より具体的には、膵臓内胚葉系細胞への分化の出発物質として「万能性（幹）細胞」を使用する。本明細書において使用される場合、「万能性」、「万能性」、「万能性細胞」および同等の表現は、細胞培養中での増殖および自己再生も、多能性特性を示すものを含む様々な細胞集団への分化も可能である細胞を指す。例えば、万能性ＥＳ細胞は３つの胚性細胞系列の各々を生じることができ、そして、胚の全ての細胞種を形成することが可能であると一般に考えられている。しかしながら
、万能性細胞は一般に羊膜、絨毛膜、および胎盤の他の構成要素などの胚体外組織を生ずることができず、そして、器官全体を形成することができない可能性が有る、すなわち、万能性細胞は「全能性」細胞と区別される。１つの細胞の子孫細胞から３つの胚性胚葉全ての派生物を形成する、および、免疫抑制マウスへの注射後に奇形腫を形成する、安定した発生上の能力の証拠を提供することによって、万能性が示され得る。万能性の他の指標には、万能性細胞で発現することが知られている遺伝子の発現や当業者によって容易に特定される形態上の特徴が含まれる。当業者に知られている任意の方法を用いて本発明の万能性細胞を得ることができる。
【００５６】
ある実施形態において、本明細書において記載される方法の出発物質として使用される本発明の万能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞、ヒト胚性生殖（ＥＧ）細胞、ヒト人工万能性幹（ｉＰＳ）細胞などまたは単為発生性細胞さえ含む幹細胞である。
【００５７】
ある実施形態において、万能性細胞が利用されるとき、その万能性細胞は正常な核型を有する。例えば、検査された中期の万能性細胞培養物の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％よりも多く、または９５％よりも多くが正常な核型を示す。本明細書において使用される場合、「正常な核型」は正常な、または野生型の染色体数および／または全体形態を意味する。
【００５８】
「全能性」は、本明細書において使用される場合、３つの胚性胚葉細胞系列だけではなく、胚体外組織（例えば、胎盤）を含むあらゆる種類の細胞に発生し、そして、器官全体（例えば、マウスまたはヒト）を生ずる細胞の能力を意味する。
【００５９】
「自己再生」は細胞分裂して親幹細胞と同一の特質を有するより多くの幹細胞を形成する幹細胞の能力を意味し、それによって幹細胞集団の無期限の補充が可能になる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「胚性」は、単一の接合体から始まり、発生した配偶子細胞以外にはもはや万能性細胞や全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる範囲の生物の発生段階を意味する。「胚性」という用語は配偶子の融合により得られる胚に加えて体細胞核移植により得られる胚にも当てはまる。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、万能性幹細胞は胚に由来しない、または、直接由来しない。例えば、ｉＰＳ細胞は「脱分化」または「再プログラミング」として知られる過程を介して非万能性細胞、例えば、多能性細胞または最終分化細胞から得られる。本明細書において使用される場合、「脱分化」または「再プログラミング」は、分化細胞があまり特殊化していない前駆細胞状態、始原細胞状態または幹細胞状態に戻る過程を意味する。
【００６２】
分化と万能性の維持をもたらす遺伝子の抑制を確実にする中核性調節複合体を形成する転写因子であるＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ‐２；ならびに糖脂質であるＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４やケラチン硫酸抗原であるＴｒａ‐１‐６０およびＴｒａ‐１‐８１などの細胞表面抗原を含むいくつかの転写因子と細胞表面タンパク質によってヒト万能性幹細胞を限定または特徴づけることができる。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「人工万能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」、「ｉＰＳＣ」、「再プログラム化細胞」またはそれらと同等の句は、非万能性細胞、典型的には、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞などのような成人性体細胞または分化細胞から人工的に調製された種類の万能性幹細胞を意味する。再プログラミング因子と称されるある遺伝子または遺伝子産物を細胞で発現することにより体細胞からｉＰＳ細胞を作製することができる。タカハシら（２００７年）Ｃｅｌｌ誌、第１３１巻：頁８６１〜８７２；Ｗｅｒｎｉｇら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ誌、第４４８巻：頁３１８〜３２
４；Ｐａｒｋら（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ誌、第４５１巻：頁１４１〜１４６；米国特許出願公開第２００９／００４７２６３号を参照のこと。これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに近年、外来性の核酸を添加することなくｉＰＳ細胞が作製されている。例えば、Ｚｈｏｕら（２００９年）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第４巻：頁３８１〜４を参照のこと。ある種の幹細胞遺伝子およびタンパク質、クロマチンメチル化パターン、倍化時間、胚様体の形成、奇形腫の形成、生存性キメラの形成、および分化性と分化能を含む多くの点で、人工万能性幹細胞はｈＥＳ細胞などの天然のヒト万能性幹細胞と実質的に類似している。ヒトｉＰＳ細胞は、胚をそれに関連して使用することなく、万能性幹細胞の供給源を提供する。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「多能性」または「多能性細胞」またはそれらの同等物は、限定的な数の他の特定の細胞種を生ずることができる細胞種を指す。すなわち、多能性細胞は１つ以上の胚性細胞運命に拘束され、したがって、万能性細胞と対照的に、３つの胚性細胞系列の各々または胚体外細胞を生ずることができない。多能性体細胞は万能性細胞と比較してより分化しているが、最終分化してはいない。したがって、万能性細胞は多能性細胞よりも高い分化性を有する。例えば、体細胞を再プログラム化することができる、または、ｉＰＳ細胞を作製するために使用することができる分化性決定因子にはＯｃｔ‐４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｒｅｘ１、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘ１５、Ｍｙｂ１２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰＡ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２および／またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の１つの態様は、適切な条件で培養されると、異なる細胞系列に選択的に、いくつかの態様においては選択的に可逆的に、発生することができる万能性細胞、始原細胞または前駆細胞の集団を含む。本明細書において使用される場合、「集団」という用語は１つよりも多い細胞の集まり、通常は、細胞培養物を意味する。
【００６６】
「細胞系列」という用語は、胚の最初の卵割から完全に成熟した細胞（すなわち、特殊化した細胞）まで、特定の細胞種の発生段階の全てを意味する。しかしながら、細胞系列は胚から直接発生する細胞に限定されず、膵臓内胚葉系などの特定の系に沿って、例えば、万能性幹細胞から分化したものも含むことができる。本明細書において記載されるステージ１〜５の細胞は膵臓系列に含まれる。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「発生する」、「分化する」、「成熟する」または「万能性細胞から形成される」、「万能性細胞から得られる」、「万能性細胞から分化される」という用語および同等の表現は、例えば、インビトロもしくはインビボで万能性細胞から分化もしくはより特殊化した細胞種、または、内分泌細胞の場合、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、膵臓ホルモンの生産法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ）という表題のＰＣＴ国際特許出願公開第２００８／０１３６６４号に記載されるように、移植されたＰＤＸ１膵臓内胚葉細胞からインビボで成熟した細胞種の作製に当てはまる。全てが、特殊化により少なくとも２つの異なる細胞系列に分化し、そして、最終的には最終分化に至る能力を有する段階からの細胞の発達に当てはまる。本願の目的のため、このような用語を互換的に使用することができる。本発明は、万能性または少なくとも、１つよりも多い細胞系列に分化する能力を選択的に回復することができるように、そのような分化が可逆的であることを可能にする培養条件も考慮している。
【００６８】
万能性細胞の細胞傷害剤および阻害剤
本明細書において使用される場合、「細胞傷害剤」、「阻害剤」、「細胞傷害性および／または阻害剤」という用語および同等の表現は、細胞を殺す、細胞の成長、増殖および／または増大を阻害する、抑制する、妨害する、または低減させる薬剤を意味する。１つ
の実施形態において、混在した、異成分からなる細胞培養物においても、培養物中に比較的小さいパーセンテージの万能性細胞からなる実質的に均一な細胞培養物においても、細胞傷害剤は未分化万能性幹細胞の成長、増殖および／または増大を阻害または妨害する。細胞傷害剤および／または阻害剤という用語は、例えば、その薬剤が別の分子が反応に関わるのを抑制するにせよ、妨害するにせよ、その薬剤が生理的に機能する、または、反応を妨害もしくは反応速度を低減させる、または、別の因子もしくは分子、例えば、酵素もしくは器官の作用もしくは機能を減少、限定もしくは阻止する特定の機序に限定されない。本明細書において考慮されている細胞傷害剤または阻害剤は、万能性幹細胞の殺滅、万能性幹細胞の成長、増殖および／または増大の妨害、阻止、停止、低減または遅延化をもたらすものである。本発明は細胞の悪化および／または死をもたらす薬剤、ならびに、「細胞増殖抑制性」である、すなわち、細胞の分裂を妨げる薬剤を考慮しており、さらに、成長および／または細胞分裂を完全には阻止せずにそれらを低減させる薬剤は、全て、細胞増殖抑制性薬剤および／または阻害性薬剤という用語によって包含される。理論にとらわれるつもりはないが、細胞傷害性、細胞増殖抑制性および阻害性の間の違いは固有であり、および／もしくは可逆的ではないことがあり、または、用量に比例し得るし、可逆的でありことがあるということを本発明は考慮する。代表的な細胞傷害剤または阻害剤は潜在的に、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーに記載される薬剤、好ましくは表４に記載される薬剤、さらにより好ましくは表５に記載される薬剤を含む。
【００６９】
例えば、そのような薬剤の候補のなかで、フラボノイドの構造的類縁体であるコーヒー酸（３，４‐ジヒドロキシケイ皮酸）またはコーヒー酸フェニルエチルエステル（ＣＡＰＥ）が本発明にあう。これらは抗ウイルス特性、抗炎症特性および免疫調節特性を持つことが示されており、様々な種類の形質転換細胞の成長を阻害することが示されている。Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒら（１９８８年）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ誌、第４４巻：頁２３０〜３２；Ｂｕｒｋｅら（１９９５年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．誌、第３８巻：頁４１７１〜７８；Ｓｕら（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．誌、第５４巻：頁１８６５〜７０；Ｓｕら（１９９１年）Ｍｏｉ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．誌、第４巻：頁２３１〜４２；Ｈｌａｎｄｏｎら（１９８０年）Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．誌、第３０巻：頁１８４７〜４８；およびＧｕａｒｉｎｉら（１９９２年）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．誌、第３８巻：頁５１３〜２７を参照のこと。コーヒー酸に帰すものだとされる多くの活性の分子的基礎はあまり明らかになっていないが、コーヒー酸により阻害される活性の大半が核因子κＢ（ＮＦ‐κΒ）を活性化する。Ｎａｔａｒａｊａｎら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ誌、第９３巻：頁９０９０〜９５を参照のこと。
【００７０】
別の選択的阻害剤は、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の発酵産物から単離されたアベルメクチンに由来するラクトン系駆虫薬であるイベルメクチン（２２，２３‐ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ  ＋  ２２，２３‐ジヒドロアベルメクチンＢ１ｂ）である。それは、ストロメクトール（登録商標）（米国）、メクチザン（登録商標）（カナダ）およびイベクスターム（メキシコ）の商標で市販されている薬効範囲が広い抗寄生虫薬である。報告により、イベルメクチンは神経細胞または筋肉細胞に存在するグルタミン酸活性化クロライドチャネルに特異的で高い親和性で結合し、細胞膜を通過する塩化物イオンの膜透過性を上昇させることにより神経細胞または筋肉細胞の過分極を引き起こすことが示されている。
【００７１】
さらに別の選択的阻害剤は、グループＡプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソフォームおよびグループＢプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソフォームの選択的阻害剤である塩化ケレリトリンである。アポトーシスがインビトロでのケレリトリン誘導性細胞殺滅の主な機序であることが報告されている。Ｃｈｍｕｒａら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．誌、２０００年２月、第６巻：頁７３７を参照のこと。Ｃｈｍｕｒａら（２０００年）による前臨床発見は、ケレリトリンまたは他の類似の化合物は、本来、
標準的な最適治療計画に対して抵抗性を有するある種のヒト腫瘍に対して有効であり得ることを示唆している。ケレリトリンでの治療によってもたらされた毒性は最小であったことをＣｈｍｕｒａら（２０００年）は示している。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「異型体」という用語は相同体、類似体、オルソログおよびパラログならびにキメラポリペプチドおよび融合ポリペプチドなどの合成および天然の種をふくむ。細胞傷害剤または阻害剤の異型体、特に構造類似体は本発明の範囲内にある。さらに、基準タンパク質またはポリペプチドの異型体は、そのアミノ酸配列が、異型体という用語に包含される基準タンパク質またはポリペプチドに対して少なくとも約８０％同一であるタンパク質またはポリペプチドである。特定の実施形態において、異型体は基準タンパク質またはポリペプチドに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％も同一である。
【００７３】
天然の神経伝達物質や神経伝達物質受容体の合成リガンドなどの低分子化合物との関連で本明細書において使用される場合、「類似体」という用語は構造的類似性および／または機能的類似性を共有する化合物を意味する。類似体には、機能的類似性を有する「構造類似体」および同様の薬理学的性質を示す、化学的に異なる化合物である「機能類似体」が含まれる。例えば、ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物、または表４中の好ましい１７６候補、または表５中のより好ましい１０候補、または図１１Ｆ中の最も好ましい候補の構造的類似体および機能的類似体が本発明の方法での使用に適切であることが考えられている。
【００７４】
培養培地
本発明の組成物および方法には基本塩栄養溶液が含まれる。本明細書において使用される場合、「基本塩栄養溶液」は、正常な細胞の代謝に必須のある量の無機イオンを細胞に提供し、細胞内と細胞外の浸透圧バランスを維持する塩およびエネルギー源としての炭水化物および培地を生理的ｐＨ範囲に維持する緩衝系の水性溶液を意味する。基本塩栄養溶液の例にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ‐１６４０、ハムＦ‐１０、ハムＦ‐１２、α‐最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴウ最小必須培地（Ｇ‐ＭＥＭ）、アイコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）改変ダルベッコ培地、またはＸ‐ＶＩＶＯ（商標）（Ｌｏｎｚａ）血液性基本培地などの万能性細胞との使用のために改変された一般的目的用の培地、およびそれらの混合液が含まれるが、これらに限定されない。１つの特定の実施形態において、基本塩栄養溶液はＤＭＥＭとハムＦ１２のおよそ５０：５０（体積：体積）の混合液である。
【００７５】
万能性細胞の細胞増殖と生存度を維持するために本明細書において記載されるような基本塩栄養溶液を用いるが、本発明の他の実施形態において、万能性細胞の万能性を維持するために、または万能性細胞の分化のために、ＫＳＲ（インビトロジェン社）、ｘｅｎｏ‐フリーＫＳＲ（インビトロジェン社）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（ライフ・テクノロジーズ社）、ｍＴｅＳＲ（商標）１（ステムセル・テクノロジーズ社）およびＨＥＳ  ｃｅｌｌＧＲＯ（ミリポア社）、ＤＭＥＭおよびＸ  Ｖｉｖｏ（商標）（Ｌｏｎｚａ社）系の培地などを含むが、これらに限定されない代わりの万能性幹細胞培養培地を使用することができる。
【００７６】
本発明の限定培地は微量元素をさらに含むことができると考えられている。微量元素は、例えば、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社から購入することができる。微量元素の非限定的な例にはアルミニウム、塩素、硫酸塩、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン酸塩およびマグネシウムを含む塩および化合物が挙げられるが、これらに限定されない。微量元素を含有する塩と化合物の具体的な例にはＡｌＣｌ３、ＡｇＮＯ３、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｏＣｌ
２、ＣｒＣｌ３、Ｃｒ２（ＳＯ４）３、ＣｕＳＯ４、クエン酸第二鉄、ＧｅＯ２、ＫＩ、ＫＢｒ、ＬＩ、モリブデン酸、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３、ＮａＶＯ３、ＮＨ４ＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮｉＳＯ４、ＲｂＣｌ、セレン、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、亜セレン酸２Ｎａ、セレノメチオノン（ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｏｎｅ）、ＳｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｒＯＣｌ２、およびそれらの混合物およびそれらのさらなる塩が含まれるが、これらに限定されない。セレン、亜セレン酸またはセレノメチオノンが存在する場合、およそ０．００２〜およそ０．０２ｍｇ／Ｌの濃度である。さらに、ヒドロキシルアパタイトも存在してよい。
【００７７】
本発明の組成物および方法での使用に適切な限定培地にアミノ酸を添加することができると考えられている。そのようなアミノ酸の非限定的な例はグリシン、Ｌ‐アラニン、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐グルタミン／グルタマックス、Ｌ‐アルギニン塩酸塩、Ｌ‐アスパラギン‐Ｈ２Ｏ、Ｌ‐アスパラギン酸、Ｌ‐システイン塩酸塩‐Ｈ２Ｏ、Ｌ‐システイン２塩酸塩、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩‐Ｈ２Ｏ、Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐ロイシン、Ｌ‐リシン塩酸塩、Ｌ‐メチオニン、Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐プロリン、Ｌ‐ヒドロキシプロリン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐トレオニン、Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐チロシン２ナトリウム塩二水和物およびＬ‐バリンである。ある実施形態において、アミノ酸はＬ‐イソロイシン、Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐プロリン、Ｌ‐ヒドロキシプロリン、Ｌ‐バリンおよびそれらの混合物である。
【００７８】
限定培地はアスコルビン酸を含むことができると考えられている。アスコルビン酸が存在するとき、それは通常およそ１ｍｇ／Ｌ〜およそ１０００ｍｇ／Ｌ、またはおよそ２ｍｇ／Ｌからおよそ５００ｍｇ／Ｌまで、またはおよそ５ｍｇ／Ｌからおよそ１００ｍｇ／Ｌまで、またはおよそ１０ｍｇ／Ｌからおよそ１００ｍｇ／Ｌまで、またはおよそ５０ｍｇ／Ｌの初期濃度で存在する。
【００７９】
さらに、本発明の組成物および方法は血清アルブミン、トランスフェリン、Ｌ‐グルタミン、脂質、抗生物質、β‐メルカプトエタノール、ビタミン、ミネラル、ＡＴＰおよび同様の成分などの他の成分を含むこともできる。存在してよいビタミンの例にはビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｅ、トコトリエノール、Ｋ１およびＫ２が含まれるが、これらに限定されない。当業者は所与の細胞培養物との使用に最適なミネラル、ビタミン、ＡＴＰ、脂質、必須脂肪酸などの濃度を決定することができる。栄養補助剤の濃度は、例えば、約０．００１μΜから約１ｍＭまで、またはそれ以上であり得る。栄養補助剤が提供され得る濃度の具体的な例には約０．００５μΜ、０．０１μΜ、０．０５μΜ、０．１μΜ、０．５μΜ、１．０μΜ、２．０μΜ、２．５μΜ、３．０μΜ、４．０μΜ、５．０μΜ、１０μΜ、２０μΜ、１００μΜなどが含まれるが、これらに限定されない。１つの特定の実施形態において、前記組成物および方法はビタミンＢ６とグルタミンを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はビタミンＣと鉄栄養補助剤を含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はビタミンＫ１とビタミンＡを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はビタミンＤ３とＡＴＰを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はビタミンＢ１２とトランスフェリンを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はトコトリエノールとβ‐メルカプトエタノールを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はグルタミンとＡＴＰを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はオメガ‐３脂肪酸とグルタミンを含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はオメガ‐６脂肪酸とビタミンΒ１を含む。別の特定の実施形態において、前記組成物および方法はα‐リノレン酸とＢ２を含む。
【００８０】
本発明のある組成物は基本的に動物血清フリーである。本明細書において使用される場
合、「基本的に」は、わずかな混入汚染物質および／またはささいな変化を考慮して、記述された量または質と本質的にまたは事実上同じ組成物、製剤、方法などに当てはまる。一般に、「基本的に」は少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同じを意味する。したがって、「基本的に血清フリー」は動物の血清、例えば、胎児血清が無いこと、または本発明の溶液中に本質的にもしくは事実上動物血清が無いことを意味する。ある実施形態において、動物血清は本発明の組成物および方法の必須の成分ではない。したがって、基本的に動物血清フリーの組成物の中に非ヒト動物の血清が存在しても、それはただ、例えば、出発物質からの不純物または一次細胞培養物からの残存動物血清のせいである。例えば、基本的に動物血清フリーの培地または環境は５、４、３、２、１または０．５％未満の動物血清を含む場合がある。本発明の特定の実施形態において、基本的に動物血清フリーの組成物は動物血清もしくは血清代替物を含まない、または、限定培地に添加される動物血清もしくは血清代替物の成分を単離するため、痕跡的な量の動物血清もしくは血清代替物を含むだけである。
【００８１】
無血清限定培地は、分化可能細胞の培養に有用な組成物および方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ  ＣＥＬＬＳ）という表題の２００７年８月１３日に提出された米国特許出願公開第１１／８３８，０５４号、ならびに幹細胞凝集懸濁組成物およびその分化方法（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ  ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ
ＴＨＥＲＥＯＦ）という表題の２００８年１０月４日に提出された米国特許出願公開第１２／２６４，７６０号にさらに記載され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
インスリンと関連の分子
本発明の１つの実施形態において、前記組成物および方法は外来性インスリンおよびインスリン代替物を含まない。「外来性インスリンおよびインスリン代替物」という句は本発明の組成物または方法に意図的に加えられるインスリンまたはインスリン代替物を示すために本明細書において使用される。したがって、本発明のある実施形態において、前記方法および組成物は意図的に補充されるインスリンまたはインスリン代替物が無い。しかしながら、前記組成物または方法は必ずしも内在性のインスリンが無いわけではない場合もある。本明細書において使用される場合、「内在性インスリン」は、本発明の方法に従って培養されると、培養細胞が自発的にインスリンを産生し得ることを示す。一次細胞培養物由来の残存性不純物または出発物質由来の不純物を示すために内在性インスリンを用いることもできる。具体的な例では、現在の前記組成物および方法は５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μｇ／ｍＬ未満のインスリンを含有する。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「インスリン」という用語は、通常の生理的濃度でインスリン受容体に結合し、そして、インスリン受容体を介したシグナル伝達を誘導することができるタンパク質またはその異型体もしくは断片を指す。「インスリン」という用語は、天然のヒトインスリンまたは別の哺乳類動物のインスリンのポリペプチド配列またはこれらの配列のあらゆる相同体または異型体を有するタンパク質を包含する。さらに、インスリンという用語は、インスリン受容体に結合し、インスリン受容体を介したシグナル伝達を誘導することができるポリペプチド断片（すなわち、機能性断片）を包含する。「インスリン代替物」という用語は、インスリンと実質的に同様の生物学的効果をもたらすためにインスリンの代わりに使用され得る任意の亜鉛含有化合物を指す。インスリン代替物の例には塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛および硫酸亜鉛が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
明確にしておくと、本発明において考慮されるように、インスリン様成長因子はインスリン代替物でもインスリンの相同体でもない。したがって、別の特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は少なくとも１つのインスリン様成長因子（ＩＧＦ）またはその異型体もしくは機能性断片の使用を含む。他の実施形態において、本発明の組成物および方法はどのような外来性のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）も含まない、または実質的に含まない。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎｇ／ｍＬ未満のＩＧＦ‐１を含有する。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「ＩＧＦ‐１Ｒの活性化因子」という用語は、細胞増殖、分化およびアポトーシスの調節に重要な役割を果たす有糸分裂促進因子を意味する。ＩＧＦ‐１Ｒの活性化因子の効果は通常ＩＧＦ‐１Ｒによって仲介されるが、他の受容体によって仲介されることがあり得る。ＩＧＦ‐１Ｒはまた、腫瘍ウイルスタンパク質および癌遺伝子産物によって誘導される細胞トランスフォーメーションに関与し、そして、それらの間の相互作用は一群の特異的な結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）によって調節される。さらに、大きな一群のＩＧＦＢＰプロテアーゼがＩＧＦＢＰを加水分解し、結合していたＩＧＦを放出することになり、その後、そのＩＧＦはＩＧＦ‐１Ｒと相互作用する能力を回復する。本発明の目的にとって、リガンド、受容体、結合タンパク質およびプロテアーゼは全てＩＧＦ‐１Ｒの活性化因子と考えられる。１つの実施形態において、ＩＧＦ‐１Ｒの活性化因子はＩＧＦ‐１またはＩＧＦ‐２である。さらなる実施形態において、ＩＧＦ‐１Ｒの活性化因子はＩＧＦ‐１類似体である。ＩＧＦ‐１類似体の非限定的な例にはＬｏｎｇＲ３‐ＩＧＦ１、Ｄｅｓ（１‐３）ＩＧＦ‐１、［Ａｒｇ３］ＩＧＦ‐１、［Ａｌａ３１］ＩＦＧ‐１、Ｄｅｓ（２、３）［Ａｌａ３１］ＩＧＦ‐１、［Ｌｅｕ２４］ＩＧＦ１、Ｄｅｓ（２、３）［Ｌｅｕ２４］ＩＧＦ‐１、［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ‐１、［Ａｌａ３１］［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ‐１、［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩＧＦ‐１およびそれらの組合せが含まれる。さらなる実施形態において、ＩＦＧ‐１類似体は、ヒトインスリン成長因子‐１の組換え類似体であるＬｏｎｇＲ３‐ＩＧＦ１である。ＬｏｎｇＲ３‐ＩＧＦ１はおよそ１ｎｇ／ｍＬ〜およそ１０００ｎｇ／ｍＬ、通常はおよそ５ｎｇ／ｍＬ〜およそ５００ｎｇ／ｍＬ、しばしばおよそ５０ｎｇ／ｍＬ〜およそ５００ｎｇ／ｍＬ、多くの場合およそ１００ｎｇ／ｍＬ〜およそ３００ｎｇ／ｍＬの濃度で、またはほとんどの場合およそ１００ｎｇ／ｍＬの濃度で最初存在することが考えられている。
【００８６】
成長因子
ある実施形態において、本発明の組成物および方法はトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ‐β）またはＴＧＦ‐βファミリーメンバーまたはその異型体もしくは機能性断片またはＴＧＦ受容体の活性化因子である薬剤を含む。本明細書において使用される場合、「ＴＧＦ‐βファミリーメンバー」などという用語は、ＴＧＦ‐βファミリーの既知のメンバーとの相同性か、ＴＧＦ‐βファミリーの既知のメンバーとの機能の類似性のどちらかによってＴＧＦ‐βファミリーに属するものと当業者により一般に特徴づけられる成長因子を指す。本発明の特定の実施形態において、ＴＧＦ‐βファミリーのメンバーが存在する場合、そのＴＧＦ‐βファミリーメンバーまたはその異型体もしくは機能性断片がＳＭＡＤ２または３を活性化する。ある実施形態において、ＴＧＦ‐βファミリーのメンバーは、ほんのわずかな例を挙げると、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ‐β、骨形成タンパク質‐２（ＢＭＰ２）、ＧＤＦ‐８、ＧＤＦ‐１１および骨形成タンパク質‐４（ＢＭＰ４）からなる群より選択される。１つの実施形態において、ＴＧＦ‐βファミリーのメンバーはアクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ‐８およびＧＤＦ‐１１から選択される。万能性細胞を分化させるためにＴＧＦ‐βファミリーの成長因子を使用することは、胚体内胚葉の作製用の成長因子（ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ
）という名称の、２００８年６月３日に提出された米国特許出願公開第１２／１３２，４３７号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の組成物および方法はＦＧＦ受容体の活性化因子を含まない。本明細書において使用される場合、「ＦＧＦ受容体の活性化因子」という用語は、ＦＧＦファミリーの既知のメンバーとの相同性か、ＦＧＦファミリーの既知のメンバーとの機能の類似性かのどちらかによってＦＧＦファミリーに属するものと当業者により一般に認識される成長因子を指す。ある実施形態において、ＦＧＦ受容体の活性化因子はα‐ＦＧＦおよびＦＧＦ２などの、しかし、これらに限定されないＦＧＦである。特定の実施形態において、前記組成物および方法は外来性のＦＧＦ２を含まない。「外来性のＦＧＦ２」という句は、本発明の組成物または方法に意図的に加えられる線維芽細胞増殖因子２、すなわち、塩基性ＦＧＦを示すために本明細書において使用される。したがって、本発明のある実施形態において、前記方法および組成物は意図的に補充されるＦＧＦ２が無い。しかしながら、前記組成物または方法は必ずしも内在性ＦＧＦ２が無いわけではない場合もある。本明細書において使用される場合、「内在性ＦＧＦ２」は、本発明の方法に従って培養されると、培養細胞が自発的にＦＧＦ２を産生し得ることを示す。一次細胞培養物由来の残存性不純物または出発物質由来の不純物を示すために「内在性ＦＧＦ２」を用いることもできる。具体的な例では、現在の組成物および方法は１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ２を含有する。
【００８８】
しかしながら、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦポリペプチド、その機能性断片またはその異型体のいずれかを含む、ＦＧＦ受容体の少なくとも１つの活性化因子を含むことができると考えられている。ＦＧＦ２が存在する場合、およそ０．１ｎｇ／ｍＬ〜およそ１００ｎｇ／ｍＬ、通常はおよそ０．５ｎｇ／ｍＬ〜およそ５０ｎｇ／ｍＬ、しばしばおよそ１ｎｇ／ｍＬ〜およそ２５ｎｇ／ｍＬ、多くの場合およそ１ｎｇ／ｍＬ〜およそ１２ｎｇ／ｍＬの濃度、またはほとんどの場合およそ８ｎｇ／ｍＬの濃度で最初存在することが考えられている。別の特定の実施形態において、本発明の組成物および方法はＦＧＦ２の他に少なくとも１つのＦＧＦ受容体の活性化因子を含むことができる。例えば、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦ‐７、ＦＧＦ‐１０もしくはＦＧＦ‐２２またはそれらの異型体もしくは機能性断片のうちの少なくとも１つを含むことができる。特定の実施形態において、ＦＧＦ‐７、ＦＧＦ‐１０およびＦＧＦ‐２２またはそれらの異型体もしくは機能性断片のうちの少なくとも２つの組合せが存在する。別の実施形態において、ＦＧＦ‐７、ＦＧＦ‐１０およびＦＧＦ‐２２の３つ全て、またはそれらの異型体もしくは機能性断片が存在する。ＦＧＦ‐７、ＦＧＦ‐１０またはＦＧＦ‐２２または異型体または機能性断片のいずれかが存在する場合、およそ０．１ｎｇ／ｍＬ〜およそ１００ｎｇ／ｍＬ、より具体的にはおよそ０．５ｎｇ／ｍＬからおよそ５０ｎｇ／ｍＬまで、より具体的にはおよそ１ｎｇ／ｍＬからおよそ２５ｎｇ／ｍＬまで、より具体的にはおよそ１ｎｇ／ｍＬからおよそ１２ｎｇ／ｍＬまでの濃度で、または最も具体的にはおよそ８ｎｇ／ｍＬの濃度で各々が最初存在すると考えられている。
【００８９】
特定のさらなる実施形態において、本発明の組成物および方法は血清アルブミン（ＳＡ）を含む。特定の実施形態において、ＳＡはウシＳＡ（ＢＳＡ）か好ましくはヒトＳＡ（ＨＡＳ）のどちらかである。さらにより特定の実施形態において、ＳＡの濃度は、体積に対する重量（重量／体積）パーセントで、約０．２％より高いが約１０％重量／体積よりも低い。さらにより特定の実施形態において、ＳＡの濃度は約０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２．０％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３．０％、３．２％、３．４％、３．６％、３．８％、４．０％、４．２％、４．４％、４．６％、４．８％、５．０％、５．２％、５．４％、５．６％、５．８％、６．０％、６．２％、６．４％、６．６％、６．８％、７．０％、７．２％、７．４％、７．６％、７．８％、８．
０％、８．２％、８．４％、８．６％、８．８％、９．０％、９．２％、９．４％、９．６％および９．８％（重量／体積）よりも高い。
【００９０】
ローキナーゼ
細胞内の生化学的経路を順に調節する細胞外シグナルが細胞膜を通して伝達されることによって細胞制御がもたらされ得る。ローキナーゼは、阻害された場合、糖尿病、癌および様々な炎症性心循環系障害およびＡＩＤＳの治療と関連があり得るクラスの酵素である。
【００９１】
ローキナーゼファミリー低分子ＧＴＰ結合タンパク質は、ＲｈｏＡ〜ＥおよびＧ、Ｒａｃ１および２、Ｃｄｃ４２、ならびにＴＣ１０を含む、少なくとも１０メンバーを含む。阻害剤は、多くの場合、ＲＯＫ阻害剤またはＲＯＣＫ阻害剤と称され、そして、これらの名前は本明細書において互換的に使用される。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣのエフェクタードメインは同一のアミノ酸配列を持ち、類似した細胞内標的を持つようである。ローキナーゼはＲｈｏの一次下流メディエーターとして機能し、２つのアイソフォーム、すなわち、α（ＲＯＣＫ２）とβ（ＲＯＣＫ１）が存在する。典型的なローキナーゼファミリータンパク質はそのＮ末端ドメインに触媒（キナーゼ）ドメイン、中央部分にコイルド‐コイルドメイン、そして、そのＣ末端ドメインに推定上のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを持つ。ＲＯＣＫのＲｈｏ結合ドメインはコイルド‐コイルドメインのＣ末端部分に位置し、ＧＴＰ結合型のＲｈｏの結合によりキナーゼ活性の上昇がもたらされる。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ介在性経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン‐１、ノルエピネフリン、血小板由来増殖因子、ＡＴＰ／ＡＤＰおよび細胞外ヌクレオチド、およびウロテンシンＩＩを含む、多くのアゴニストによって開始されるシグナル伝達において重要な役割を果たす。その標的エフェクター／基質の修飾を介して、ローキナーゼは、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格構築、細胞接着および／または運動能および遺伝子発現を含む、様々な細胞機能において重要な役割を果たす。
【００９２】
したがって、本発明の他の実施形態において、例えば、ローキナーゼ阻害剤であるＹ‐２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ、およびＨ‐１１５２ＰならびにＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン；Ｇｉｂｃｏ社）を含むが、これらに限定されない、細胞生存を促進および／または補助する薬剤が様々な細胞培養培地に添加される。これらの細胞生存薬剤は、部分的には、解離したｈＥＳ細胞またはｈＥＳ由来培養物、例えば、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓上皮、膵臓内胚葉始原細胞の集団など、特に解離した膵臓内胚葉および膵臓始原細胞の集団の再会合を促進することにより機能する。ｈＥＳ細胞またはｈＥＳ由来細胞は、その細胞が（細胞外マトリックスを用いてまたは用いずに、動物血清を用いてまたは用いずに、線維芽細胞フィーダー細胞を用いてまたは用いずに）懸濁状態の細胞凝集体から作製されたか、接着性プレート培養物から作製されたかに関係なく、生存細胞の増大が達成されている。これらの細胞集団の生存度の向上が（例えば、セルソーターを使用する）精製を促進および改善し、それ故、細胞の回収の改善を可能にする。Ｙ２７６３２などのローキナーゼ阻害剤の使用は、解離した単一細胞の連続継代中または低温保存からの回復中に生存を促進することにより、同様にｈＥＳ由来細胞種の増殖を可能にし得る。Ｙ２７６３２などのローキナーゼ阻害剤はｈＥＳ細胞培養物およびｈＥＳ由来細胞培養物で試験されているが、他の細胞種、例えば、一般には、小腸、肺、胸腺、腎臓ならびに網膜色素上皮のような神経細胞種を含むが、これらに限定されない上皮性細胞種にローキナーゼ阻害剤を適用することができる。
【００９３】
細胞培養の方法
本発明の細胞培養の環境と方法は細胞をプレーティングして接着培養物にすることを含む。本明細書において使用される場合、「プレーティングする」、「プレーティングされた」および「プレーティング」という用語は、細胞が接着培養で培養されることを可能に
する任意の処理を意味する。本明細書において使用される場合、「接着培養」という用語は、以下に記載されるもののような基材、または、培養中に細胞が接着する、増殖する、および／または安定化するのを可能にする他のあらゆる化学物質または生物材料の表面被覆で被覆され得る不溶性基材で、同様に、被覆され得る、培養容器などの固相表面の上で細胞が培養される、その細胞培養系を指す。細胞は固相表面または基材にしっかりと接着してもよいし、しなくてもよい。
【００９４】
細胞基材、フィーダー層および条件培地
接着培養用の基材はポリオルニチン、ラミニン、ポリリシン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン類、マトリゲル（商標）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリ（乳酸‐グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のいずれか１つまたはそれらの組合せを含み得る。また、接着培養用の基材はフィーダー層が植えつけられたマトリックス、または細胞（例えば、万能性ヒト細胞）もしくはその細胞培養物が植えつけられたマトリックスを含み得る。本明細書において使用される場合、「細胞外マトリックス」という用語は、先に記載されたものならびにフィーダー細胞層または細胞（例えば、万能性ヒト細胞）もしくは細胞培養物が植えつけられたマトリックスまたは溶解した線維芽細胞フィーダー細胞からなるマトリックスなどの、しかし、これらに限定されない固形基材を包含する。１つの実施形態において、細胞はマトリゲル（商標）被覆プレートにプレーティングされる。別の実施形態において、細胞はフィブロネクチン被覆プレートにプレーティングされる。別の実施形態において、培地が細胞と接する前、培地が細胞と接するほぼ同時、または培地が細胞と接した後、培地に最大２４時間ヒト血清を添加することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ヒト血清を含む無フィーダー万能性幹細胞培地の方法と組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＦＥＥＤＥＲ‐ＦＲＥＥ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＭＥＤＩＡ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭ）という表題の２００７年１０月１９日に提出された米国特許出願公開第２００９‐０１０４６９６号を参照のこと。
【００９５】
本発明の組成物および方法は、基本的にフィーダー細胞またはフィーダー層が無い条件で万能性細胞および分化可能な細胞を培養することができることを考えている。本明細書において使用される場合、「フィーダー細胞」または「線維芽細胞フィーダー細胞」またはそれらの同等の表現は、インビトロで増殖し、標的細胞または目的の細胞と共培養される細胞である。本明細書において使用される場合、「フィーダー細胞層」は「フィーダー細胞」または「線維芽細胞フィーダー細胞」または「線維芽細胞フィーダー層」または「フィーダー」という用語またはそれらの同等の表現と互換的に使用される。本明細書において使用される場合、「基本的にフィーダー細胞が無い」という用語は、本明細書において記載されるもののような、少しもフィーダー細胞を含まない、または、最少のフィーダー細胞、もしくはフィーダー細胞からなるマトリックス、もしくは培養容器を被覆するために使用される、天然もしくは合成の細胞外マトリックスを含む組織培養条件、特に万能性幹細胞（例えば、ｈＥＳまたはｉＰＳ細胞）の培養条件に当てはまる。「最少の」は、フィーダー細胞との関連では、細胞がフィーダー細胞上で培養されていたかもしれない場合、それまでの培養条件から現在の培養条件に不注意に、いくつかの場合ではやむをえず、持ち越された最少のフィーダー細胞を意味する。
【００９６】
本発明のある態様において、どのような種類のフィーダー細胞もしくは、細胞から形成されているにしても、それらの細胞から溶解されたタンパク質から形成されているにしても、フィーダー層も必要とすることなく、または他の種類の、ヒト血清での被覆などの表面被覆を使用することなく、万能性幹細胞を培養することができる。
【００９７】
本発明の１つの実施形態において、細胞は、分化途中の状態でその細胞を安定化するフ
ィーダー細胞から得られた条件培地で培養される。別の実施形態において、本明細書において使用される限定培地は非条件培地であって、フィーダー細胞から得られるものではない培地である。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「安定化する」という用語は、細胞または細胞培養物の分化状態に言及するために用いられるとき、培養物中の細胞の全てではないとしても大半が同じ分化状態にある場合、培養中に複数の代にわたって細胞が増殖し続ける、好ましくは培養中に無限に培養し続けることを表す。さらに、安定化した細胞が分裂するとき、その分裂は通常同じ細胞種の細胞を生ずる、または同じ分化状態にある細胞を生ずる。安定化した細胞または細胞集団は、細胞培養条件が変えられず、細胞が過成長させることなく継代される場合、一般にさらに分化することも脱分化することもない。１つの実施形態において、安定化される細胞はその安定な状態で無限に、または少なくとも２継代よりも長い間増殖することができる。さらに特定の実施形態において、前記細胞は３継代、４継代、５継代、６継代、７継代、８継代、９継代より長い、１０継代より長い、１５継代より長い、２０継代より長い、２５継代より長い、または３０継代より長い間安定である。ある実施形態において、前記細胞は連続継代の間、およそ１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月または１１か月より長い間安定である。別の実施形態において、前記細胞は連続継代の間、およそ１年よりも長い間安定である。１つの実施形態において、万能性幹細胞は、それらを分化させることが望まれるまで、限定培地中でのルーチン的な継代により万能性状態のまま培養されて維持される。本明細書において使用される場合、「増殖する」という用語は細胞培養物中の細胞の数が増加することを意味する。
【００９９】
１つの実施形態において、分化可能な細胞が、動物胎児血清または血清代替物が無く、かつ、フィーダー細胞層または天然もしくは合成のマトリックスが無い状態で、本発明の組成物の少なくとも１つと接触すると、少なくとも１か月未分化状態で細胞が維持されるようになる。形態、表面マーカー、転写マーカー、核型、および３つの胚葉の細胞に分化する能力について細胞の特徴解析を行うことにより万能性を判定することができる。これらの特徴解析は当業者によく知られている。
【０１００】
懸濁培養
本明細書において使用される場合、「胚様体」または「ＥＢ」または「凝集塊」という用語または同等の表現は非限定培地中の懸濁培養物における分化細胞種を指し、または、それは非指向性プロトコルによって複数の胚葉組織へ分化する。例えば、形態的な基準によって、胚様体を懸濁状態の万能性幹細胞凝集体と区別することができる。当業者は、いつ胚性幹細胞の培養物に胚様体が存在するか日常的に決定する。例えば、約２０細胞または培養条件に応じてそれ以上の細胞からなる浮遊細胞塊がＥＢとみなされる。例えば、Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９１年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．誌、第５巻：頁７２８〜７４０；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら（１９８５年）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．誌、第８７巻：頁２７〜４５を参照のこと。前記の用語はまた、胚生殖巣領域から得られる初期細胞である、始原生殖細胞に由来する同等の構造体を指す。例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ誌、第９５巻：頁１３７２６を参照のこと。時には当技術分野においてＥＧ細胞または胚性生殖細胞とも称される始原生殖細胞は、適切な因子で処理されると、万能性ＥＳ細胞を形成し、それから胚様体を得ることができる。例えば、米国特許第５，６７０，３７２号および前述のＳｈａｍｂｌｏｔｔらを参照のこと。
【０１０１】
例えば、Ｎｇら（２００８年）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ誌、第３巻：頁４６８〜７７６）に記載されるようなスピン胚様体、および前述のＢａｕｗｅｎｓら（２００８年）に記載されるようなマイクロパターン細胞外マトリックスアイランドにプレーテ
ィングされた単一細胞懸濁液から作製される胚様体などの胚様体を作製する様々な方法が存在する。しかしながら、これらの方法は、スケールアップ生産を実際に始めることができるようになるまでにあまりに多くの工程を必要とするため、ｈＥＳ細胞およびｈＥＳ由来細胞の大規模生産（製造）にはコストがかかりすぎ、そして、効率が悪い。例えば、Ｂａｕｗｅｎｓらのプロトコルは、懸濁培養物を初めて創るために細胞を選択することができるようになる前に成長因子低減化マトリゲル（商標）上にｈＥＳ細胞を蒔くことを必要とする。特注のマイクロパターン組織培養プレートを必要とするため、この方法にかかる時間と費用がこの方法を扱いにくいものとしている。さらに、Ｎｇらによって用いられる方法は、均一な胚様体を作製するために遠心分離機を使用することを必要とするため、ｈＥＳ細胞およびｈＥＳ由来細胞の製造についてコストにみあうように規模を拡大することができない。最後に、これらの方法論全てにおいて、本明細書において記載される単一細胞凝集体懸濁培養物がそうであるように、万能性幹細胞の単一細胞懸濁液から細胞凝集体が作製されるのではない。
【０１０２】
未分化ＥＳ細胞の凝集体を非指向性分化シグナル、例えば、２０％ウシ胎児血清に曝露することによって胚様体を作製することもできる。この非指向性方法論の結果、インビトロで通常の胚発生を模倣するとされている細胞種の混合物がもたらされる。このアプローチは基礎研究のレベルでは胚発生の調査に有用であるが、細胞の収量、集団の同一性、集団の純度、バッチ間の一貫性、安全性、細胞機能および原価が主な関心事項である細胞療法の材料の生産に適切な大規模の製造工程に受け入れられるものではない。さらに、胚様体から所与の細胞種を精製するために用いられるどのような濃縮戦略にも関係なく、その分化プロトコルは、単一細胞種の均一な大集団を作製する指向性アプローチを提供しない。次いで、特定の集団を精製しようとするいかなる試みも妨害する混入細胞集団が常に存在するであろうし、それが優位を占める可能性が有る。
【０１０３】
万能性幹細胞の凝集体を作製し、分化させることについて以前に報告された全ての研究が、それらの方法論に次の要素、すなわち、１）ヒトＥＳ細胞よりもむしろマウスＥＳ細胞の使用；２）通常の細胞接着処理よりもむしろ、細胞を凝集させるために遠心分離に依存する強制凝集プロトコル；３）静置状態での細胞塊の凝集；４）凝集体を作製するための非単一細胞解離または表面からの細胞剥離；および５）１５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を使用する細胞凝集体の非指向性分化、のうちの１つ以上を有し、胚様体および全ての胚葉の細胞種の形成がもたらされる。出願人の知る限りでは、胚様体を分化させるために１５〜２０％のＦＣＳを使用することがない唯一の報告された研究は、強制凝集によって細胞凝集体が形成され、その後、形成された凝集体を中胚葉に適切な培地を使用して直ちに分化させた（Ｎｇら、Ｂｌｏｏｄ誌（２００５年）第１０６巻：頁１６０１）プロトコルを含む。しかしながら、この報告では、研究者らは、１０〜１２日の静置凝集培養後に胚様体を非凝集性接着培養に移行させたため、本願との比較を不適切なものとしている。
【０１０４】
対照的に、本明細書において記載される単一細胞凝集体は、１）ヒト万能性幹細胞（例えば、ヒトＥＳ細胞またはヒトＩＰＳ細胞）を単一細胞に解離させ、その後、凝集体の直径と細胞生存の制御を改善するために最適化したせん断速度での回転培養により凝集体を作製し；そして２）万能性幹細胞凝集体の、例えば、胚体内胚葉への、そして、その後に他の内胚葉系細胞種への指向性分化を可能にするアプローチによって作製される。それらの全体の開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０２６８５３４号（２００７年２月２３日に提出、表題「分化可能細胞の培養に有用な組成物および方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ  ＣＥＬＬＳ）」）；第２００８／０１１３４３３号（２００７年８月１３日に提出、表題「分化可能細胞の培養に有用な組成物および方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＵＳＥＦＵ
Ｌ  ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ  ＣＥＬＬＳ）」）；第２０１０／０１１２６９１号（２００８年１１月４日に提出、表題「幹細胞凝集懸濁組成物およびその分化方法（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ  ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦ）」）を参照のこと。この分化プロトコルは高い効率で、そして、混入集団を最小にして胚体内胚葉集団および膵臓系列集団を形成する。さらに、万能性幹細胞の凝集と分化へのこのアプローチは胚様体を形成せず、他の公開されている研究全てとは際立って対照的である。
【０１０５】
１つの特定の実施形態において、本発明の細胞培養培地を使用して、懸濁培養物として未分化細胞ならびに分化可能な細胞を増殖させる。別の特定の実施形態において、懸濁状態で分化可能な細胞が維持され、増殖することができる、すなわち、それらは未分化のままでいるか、さらに分化することを妨げられている。細胞培養との関連では「増殖させる」、「増殖した」および「増殖」という用語は、当技術分野で使用される通りに使用され、そして、細胞増殖および細胞の数の増加、好ましくは生存可能細胞の数の増加を意味する。特定の実施形態において、約１日、すなわち、約２４時間よりも長く培養することによって、懸濁状態で細胞が増殖する。さらに特定の実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日もしくはそれ以上、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間またはそれ以上培養することにより懸濁状態で細胞が増殖する。
【０１０６】
凝集懸濁培養
例えば、逆涙滴型容器内の組織培養培地中の細胞その涙滴型容器の底に沈み、そこでそれらが凝集する「ハンギング・ドロップ」；実験室用フラスコ中の細胞懸濁液の振盪；およびこれらの技法の様々な修正法などの、細胞凝集体を作製する様々な方法が当技術分野においてにおいて公知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｉｍｍｉｎｓら（２００４年）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ誌、第７巻：頁９７〜１０３；Ｄａｉら（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ誌、第５０巻：頁３４９〜３５６；Ｆｏｔｙら（１９９６年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、第１２２巻：頁１６１１〜２０；Ｆｏｒｇａｃｓら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．誌、第７４巻：頁２２２７〜３４（１９９８年）；Ｆｕｒｕｋａｗａら（２００１年）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．誌、第１０巻：頁４４１〜４４５；Ｇｌｉｃｋｌｉｓら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ誌、第８６巻：頁６７２〜８０；Ｃａｒｐｅｎｅｄｏら（２００７年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、第２５巻：頁２２２４〜３４；およびＫｏｒｆｆら（２００１年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．誌、第１５巻：頁４４７〜５７を参照のこと。さらに近年、マイクロパターンプレート上のコロニーをこそぎ落として懸濁状にすること、マイクロタイタープレートからコロニーを遠心分離し、そして、懸濁状にすること、または、パターン化マイクロウェルに培養されたコロニーを、ピペットを使用して取り外し、そして、懸濁することにより細胞凝集体が形成された（Ｕｎｇｒｉｎら、（２００８年）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ誌、第３巻（第２号）、頁１〜１２；Ｂａｕｗｅｎｓら（２００８年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、オンライン出版、２００８年６月２６日）。本明細書において記載される細胞凝集体を作製するためにそのような方法を用いることができるが、前述のＤ’Ａｍｏｕｒら（２００６年）に記載されるように、同期した指向性分化について本明細書において作製される細胞凝集体を最適化する。また、これらの他の方法と異なり、本明細書において記載される、懸濁状態の細胞凝集体を作製する方法は大規模製造に適している。
【０１０７】
細胞培養との関連で使用される場合、「懸濁」という用語は当技術分野で使用されている通りに使用される。すなわち、細胞培養懸濁液は、細胞または細胞凝集体が培養容器などの表面に接着しない細胞培養環境である。フローフード、恒温培養器および／または必要に応じて細胞を一定に動かし続けるために使用される他の装置、例えば、回転培養器、
振盪培養器などのような装置の使用を含むが、これに限定されない懸濁培養技術に当業者は精通しているであろう。本明細書において使用されるとき、細胞が動いている場合、または細胞の直近の環境がその細胞と相対的に動いている場合、細胞は「動いている（ｉｎ
ｍｏｔｉｏｎ）」。細胞が「動き」続けている場合、その動きは、１つの実施形態においては、せん断応力に細胞を曝すことを避けるような、または防ぐような「軽い動き」または「軽い撹拌」である。
【０１０８】
一般に、本発明の細胞培地組成物は少なくとも毎日１回新しくされるが、培養および閉鎖系ループ型バイオリアクターシステムなどの培養容器の特殊な必要品および環境に応じて、それよりも多い頻度で、または、それよりも少ない頻度で培地が交換され得る。インビトロでは、細胞は通常バッチモードで培養培地中に培養され、様々な培地条件に曝される。本発明のいくつかの実施形態において、培養物中の細胞は接着培養物か懸濁状態の細胞凝集体のどちらかとして維持され得るが、それらは周囲の培養培地と接して維持され、そして、定期的に廃棄培地が交換される。一般に、培養培地は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間毎に、またはそれらのあらゆる端数毎に新しくされ得る。さらなる例では、培地は、より少ない頻度で、例えば、これらに限定されないが１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９日毎、または２日以上毎、またはそれらの間のあらゆる時間枠で新しくされ得る。
【０１０９】
本発明の別の実施形態において、大規模製造方法を用いるが、その方法は、頻繁に交換されなくてはならない成長因子や他の薬剤の分解を防ぐために培地を新しくする灌流方法を用いる大規模バイオリアクターでの細胞の増殖、培養および分化を含み得る。ある一定時間にわたって、培養培地から老廃物を除去するための手段として灌流を用いることもできる。例えば、米国特許第５，３２０，９６３号は懸濁細胞の灌流培養のためのバイオリアクターについて記載している。米国特許第５，６０５，８２２号は、培養中の細胞の増殖のために、灌流により成長因子を供給する間質細胞を用いるバイオリアクター系について記載している。米国特許第５，６４６，０４３号は、細胞増殖用培地組成物を含む連続灌流および定期的灌流による細胞の増殖について記載している。米国特許第５，１５５，０３５号は液体培地循環による細胞の懸濁培養用のバイオリアクターについて記載している。これらの引用文献は全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
一般に、本発明の培地組成物で培養される細胞は毎週かそれ位で「分割される」または「継代される」が、懸濁培養の特殊な必要品および環境に応じて、それよりも多い頻度で、または、それよりも少ない頻度で細胞が分割され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日毎もしくはそれ以上、またはそれらの間のあらゆる時間枠で細胞が分割され得る。本明細書において使用される場合、「分割される」または「継代される」という用語は、細胞培養との関連で、当技術分野で使用されている通りに使用される。すなわち、細胞培養物の分割または継代とは、それまでの培養物から細胞を採取し、引き続いて、採取した（回収した）細胞のうちの少数の細胞を同じサイズの新しい細胞培養容器に移植（「播種」）することである。当業者は、「分割」または「継代」は回収した細胞の全てまたは一部のより大きい容器への移植、またはそれらをいくつかの容器用に分割することも包含することを理解する。一般に、細胞は細胞の継代によって健全な細胞培養環境で増殖し続けることができる。当業者は、細胞が増殖増大する間に凝集した細胞を脱凝集させるために使用され得る酵素的方法または非酵素的方法の使用を含みうるが、必ずしもそうではない、細胞培養物の継代処理および継代方法に精通している。
【０１１１】
本明細書において記載される実施形態は、低せん断環境を維持し、それにより系の操作上の細胞密度を維持し、そして、流体せん断応力を最小化することにより、増殖中および
／または分化中の万能性幹細胞（例えば、ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞）を大規模に製造する方法を提供する。特に、本発明は、６０ｍｍディッシュ、６ウェルプレート、回転ボトル、バイオリアクター（例えば、大きいスピナーフラスコ）、カルチャーベセル、閉鎖系ループ型システムなどで細胞懸濁液を培養することによって、大規模真核細胞製造系で低せん断環境を維持する方法を包含する。あるいは、細胞培養用の連続灌流システムは、例えば、増殖および／または分化のために細胞の懸濁、酸素供給および新鮮な栄養の供給を提供するバイオリアクターまたはカルチャーベセル内での撹拌または運動を必要とする。細胞を懸濁状態に保つために、バイオリアクター容器は、通常はせん断応力の潜在的な供給源でもある、１つ以上の可動式機械的撹拌装置を使用する。
【０１１２】
一定の、最適化された撹拌せん断速度を確立、維持することは細胞の増殖と生存能力を維持するために重要である。例えば、せん断速度の上昇は次の面で有害である：（１）過剰なせん断がエネルギー消費を増加させる、（２）過剰なせん断が膜表面での拡散を妨げる、（３）過剰なせん断が生物活性を有するある種の化合物を除去し得る、および（４）過剰なせん断が、細胞溶解を引き起こす破裂張力の閾値を越えて、細胞膜を変形させ得る。したがって、細胞凝集体の直径ならびに単一細胞解離およびせん断への特定の細胞株の感受性に応じて５〜５００秒−１という最適範囲内にせん断を維持することが望ましい。本発明の方法において有用な機器構成によりもたらされる例示的なせん断速度は、米国特許出願公開第１２／２６４，７６０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の実施例１７に示され、そこでは凝集体の直径は１００〜２００μｍであり、そして、６ウェルディッシュの回転速度は６０〜１４０ｒｐｍの間である。これらの値によって、大量の流体の回転中に生じる時間平均せん断応力が推定される。しかしながら、容器の璧でのせん断応力は境界効果のためより高いと予想される。
【０１１３】
さらに、プロペラなどのインペラ、または他の機械的手段、ブラダー、流体流もしくは気体流ベースの手段、超音波定常波発生機、振盪プラットフォームもしくは回転プラットフォーム、または細胞懸濁液を作製するそれらの組合せを含む、軽く撹拌された細胞懸濁液を作製する方法または装置の他の例が存在し、それは当業者によく知られている。本発明の方法では、回転プラットフォームは、細胞が６ウェルプレート中にあるとき、細胞を懸濁するための代表的手段であり、４００秒−１未満のせん断速度を生じる。回転機の種類または撹拌混合液体懸濁物を作製する機序に関わりなく、大量の流体での時間平均せん断速度およびせん断応力の推定値によって、全ての液体混合装置が関連し得る標準化係数が提供される。装置の間では流動様式は装置のプロファイルと層流または乱流の程度の点で異なる可能性があるが、様々な機序で混合する装置での流動を等しくするための基準がせん断の計算によって提供される。例えば、４ｃｍの直径のインペラ、６．４ｃｍの容器の幅、９０°のインペラの角度、および０．１ｃｍのインペラの幅を有する１２５ｍＬのスピナーフラスコについて、１３５ｒｐｍのインペラ回転速度は、１００μｍの直径の凝集体について１００ｒｐｍで回転する５ｍＬの培地を含む６ウェルディッシュと同じ大量の流体での時間平均せん断速度およびせん断応力を発生させる。
【０１１４】
本発明の限定培地との接触の前および／または後に、酵素的解離方法、非酵素的解離方法または手動解離方法を用いて分化可能な細胞を継代させることができると考えられている。手動継代技法は、Ｓｃｈｕｌｚら（２００４年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、第２２巻：頁１２１８〜３８など、当技術分野においてよく説明されている。機械的継代にはいかなる付加的な物質も関わらないが、それは万能性幹細胞やそれに由来する多くの細胞の大規模製造に効率的ではない。例えば、バイオリアクターまたは大きいフラスコでは、酵素の使用、例えば、ＧＭＰコラゲナーゼの使用が考慮されている。酵素的解離方法の非限定的な例にはトリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、アキュターゼ（商標）（ライフ・テクノロジーズ社、カールスバード、カリフォルニア州）などのプロテアーゼの使用が含まれる。１つの実施形態において、接触細胞を継代させるためにアキュターゼ（商標）を用
いる。酵素的継代方法が用いられるとき、その結果の培養物は、使用された酵素に応じてサイズが異なる、細胞の一重体、二重体、三重体および凝集体の混合物を含む。非酵素的解離方法の非限定的な例は細胞分散緩衝液である。継代方法の選択は、存在するとすれば、細胞外マトリックスの選択によって影響され、当業者によって容易に決定される。
【０１１５】
本発明の方法において使用される解離溶液は、細胞に対する過度の傷害性を引き起こすことなく細胞を単一の細胞に分ける、または脱凝集させることができる任意の解離溶液であり得る。脱凝集溶液の例にはトリプシン、アキュターゼ（商標）、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、またはバーゼン（商標）（ＥＤＴＡ）およびトリプシンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、少なくとも少数の単一細胞（またはより好ましくは大半の細胞）が脱凝集され、再度培養されることが可能であるのならば、結果として集密層または懸濁液の全ての細胞が単一細胞に脱凝集することを必要としない。
【０１１６】
培養の開始時か継代後のどちらかで、培養チャンバーにつき１細胞を含む任意の密度で分化可能な細胞を播種することができる。接着培養または懸濁培養の使用、使用する細胞培養培地の特殊なレシピ、増殖条件および培養された細胞の予期される使用を含むが、これらに限定されない様々な要因に応じて播種される細胞の細胞密度が調節され得る。本発明の方法での使用に適切であり得る細胞培養密度の例には０．０１×１０５細胞／ｍＬ、０．０５×１０５細胞／ｍＬ、０．１×１０５細胞／ｍＬ、０．５×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０５細胞／ｍＬ、１．２×１０５細胞／ｍＬ、１．４×１０５細胞／ｍＬ、１．６×１０５細胞／ｍＬ、１．８×１０５細胞／ｍＬ、２．０×１０５細胞／ｍＬ、３．０×１０５細胞／ｍＬ、４．０×１０５細胞／ｍＬ、５．０×１０５細胞／ｍＬ、６．０×１０５細胞／ｍＬ、７．０×１０５細胞／ｍＬ、８．０×１０５細胞／ｍＬ、９．０×１０５細胞／ｍＬもしくは１０．０×１０５細胞／ｍＬ、または、好適な細胞生存度で懸濁状に培養されるのなら、それよりも高い密度、またはそれらの間の任意の数値を含むが、それらに限定されない。
【０１１７】
上記に加えて、本明細書において使用される場合、「操作上の細胞密度」または「操作可能細胞密度」という用語または同等の表現は、増殖中または分化中のｈＥＳ細胞培養物を作製するために細胞培養プロトコルまたは製造工程もしくは系が運用される、その細胞密度を意味する。系に加えられるビタミン、ミネラル、アミノ酸または代謝物などの栄養ならびに酸素分圧などの環境条件が細胞の生存度を維持するのに充分であるときの細胞密度がそのような細胞密度である。あるいは、細胞の生存度を維持するのに充分である速度で系から老廃物を除去することができるときの細胞密度がそのような細胞密度である。当業者によって、そのような細胞密度が容易に決定され得る。
【０１１８】
また、インピーダンスのリアルタイム測定を可能にする９６ウェル培養装置に万能細胞を培養することもでき、ＡＣＥＡバイオサイエンシズ株式会社（ｗｗｗ．ａｃｅａｂｉｏ．ｃｏｍ）のＲＴ‐ＣＥＳ（商標）法または他の同様の細胞アッセイ研究ツールを用いて細胞増殖と生存度を測定するためにそれを使用することができる。そのようなアプローチによって、リアルタイムでの、分化可能な細胞への微妙な効果または即時の効果の無標識特定および定量ならびに増殖、アポトーシスおよび形態に対する変化の測定が可能になる。
【０１１９】
内胚葉系譜に沿った万能性幹細胞の分化と膵臓内胚葉系列株：ステージ１〜４の細胞の作製についての要約
ある種の内胚葉系細胞および膵臓内胚葉系細胞を作製する方法が本明細書において提供され、そして、内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞および作製法（ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥ‐ＥＸＰ
ＲＥＳＳＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ）という表題の２００７年３月２日に提出された米国特許出願公開第１１／６８１，６８７号の一部継続出願である、膵臓ホルモンの生産法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ）という表題の２００７年７月５日に提出された米国特許出願公開第１１／７７３，９４４号などの関連出願のどこかで説明される。それらの文献の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
簡単に説明すると、本明細書において記載される万能性幹細胞、例えば、ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞のための指向性分化方法を少なくとも４つまたは５つのステージに分けることができる。ステージ１は万能性幹細胞からの胚体内胚葉の作製であり、それは約２〜５日、通常２日または３日かかる。まず、成長、生存および増殖を向上させ、ならびに細胞間接着を促進するために、（動物血清を含まない、または非常に低いレベル、例えば、０．２％の動物血清を含む）ＲＰＭＩ；アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ‐８またはＧＤＦ‐１１（少なくとも１００ｎｇ／ｍＬ）などのＴＧＦβスーパーファミリーメンバー増殖因子；Ｗｎｔ３ａ（少なくとも２５ｎｇ／ｍＬ）などのＷｎｔファミリーメンバーまたはＷｎｔ経路活性化因子；および場合によりＹ‐２７６３２（約１０μΜ）などのローキナーゼ阻害剤またはＲＯＣＫ阻害剤を含む培地に万能性幹細胞を約２４時間懸濁する。あるいは、約１：５０００の割合で少量のＩＴＳ（インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州）を使用することもできるが、なお細胞培養培地中のインスリンと血清の含有量を低く保つ。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、胚体内胚葉の作製用の成長因子（ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００８年６月３日に提出された米国特許出願公開第１２／１３２，４３７号を参照のこと。約２４時間後、さらに２４時間（第２日）〜４８時間（第３日）のために培地を、０．２％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）などの少量の動物血清；アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ‐８またはＧＤＦ‐１１（約１００ｎｇ／ｍＬ）などのＴＧＦβスーパーファミリーメンバー増殖因子；場合により、ローキナーゼ阻害剤またはＲＯＣＫ阻害剤を、そして、場合により１：５０００のＩＴＳを有するＲＰＭＩを含む培地と交換する。重要なことに、胚体内胚葉の作製は、動物血清を含まない、または非常に低い濃度の動物血清を含む、およびインスリンもしくはインスリン様成長因子を含まない、または非常に低い濃度、例えば、０．２μｇ／ｍＬ未満のインスリンもしくはインスリン様成長因子を含む細胞培養条件を必要とする。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＬｅａｎら（２００７年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、第２５巻：頁２９〜３８を参照のこと。ＭｃＬｅａｎらはまた、０．２μｇ／ｍＬもの低い濃度でもステージ１でインスリンとｈＥＳ細胞を接触させることが胚体内胚葉の作製に有害であり得ることを示した。当業者は、実質的に本明細書およびＤ’Ａｍｏｕｒら（２００５年）において記載されるように、万能性幹細胞の胚体内胚葉へのステージ１分化を改変した。例えば、Ａｇａｒｗａｌら（２００８年）第２６巻：頁１１１７〜１１２７；Ａｍｅｒｉら（２０１０年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、第２８巻：頁４５〜５６；Ｂｉｎｇｈａｍら（２００９年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、第１８巻（第７号）：頁１〜１０；Ｂｏｒｏｗｉａｋら（２００９年）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第４巻：頁３４８〜３５８；Ｂｒｏｌｅｎら（２０１０年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ���誌、第１４５巻（２０１０年）頁２８４〜２９４；Ｂｒｕｎｎｅｒら（２００９年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．誌、第１９巻：頁１０４４〜５６；Ｃｈｅｎら（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ誌、第５巻（第４号）：頁２５８〜２６５；Ｄｕａｎら（２０１０年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ誌、第２８巻（第４号）：頁６７４〜８６．Ｈｉｎｔｏｎら（２００９年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、第１９巻（第６号）：頁７９７〜８０７；Ｇｉｂｓｏｎら（２００９年）Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．誌、第１巻、頁５４０〜５５１；Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら（２００９年）Ｐｌｏｓ  ＯＮＥ誌、第４巻（第３号）：頁ｅ４７９４；Ｋｉｎｇ、Ｃ、「プロテオミクスベースの用途のためのヒト胚性幹細胞の培養と調製（Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ‐Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ヒト胚性幹細胞プロトコル（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）第１９章、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｋｉｎｇら（２００８年）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ誌、第３巻（第２号）：頁１７５〜１８０；Ｍａｅｈｒら（２００９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａ  Ｓｃｉ誌、第１０６巻（第３７号）：頁１５７６８〜１５７７３；Ｓｙｎｎｅｒｇｒｅｎら（２００９年）Ｓｔｅｍｓ  Ｃｅｌｌｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、第１９巻（第７号）：頁９６１〜７８；およびＺｈｏｕら（２００８年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、第１７巻：頁７３７〜７５０を参照のこと。これらの文献全てについて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の内胚葉系細胞を得るために、胚体内胚葉の適切な分化、分化運命決定、特徴解析および同定が必要である。このステージの胚体内胚葉細胞はＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を共発現し、そして、少なくともＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴまたはＰＰを検知できるほど発現しない。
【０１２１】
好ましい実施形態において、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、胚体内胚葉（ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００４年１２月２３日に提出された米国特許出願公開第１１／０２１，６１８号（現在では、米国特許第７，５１０，８７６号）；胚体内胚葉のマーカー（ＭＡＲＫＥＲＳ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００５年１１月１４日に提出された米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号；胚体内胚葉細胞の増殖（ＥＸＰＡＮＳＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ）という表題の２００５年１２月２２日に提出された米国特許出願公開第１１／３１７，３８７号（現在では、米国特許第７，６２５，７５３号）；胚体内胚葉のマーカー（ＭＡＲＫＥＲＳ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００８年７月２１日に提出された米国特許出願公開第１２／０９３，５９０号；および胚体内胚葉細胞の増殖（ＥＸＰＡＮＳＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ）という表題の２００９年１０月２０日に提出された米国特許出願公開第１２／５８２，６００号に記載される方法のうちの１つ以上を用いて胚体内胚葉細胞を濃縮、単離および／または精製する。
【０１２２】
ステージ２は適切に分化運命が決定され、特徴解析された胚体内胚葉細胞培養物をステージ１から受け継ぎ、そして、成長、生存および増殖を向上させ、ならびに細胞間接着を促進するために、場合により量を増やした非ヒト動物血清（例えば、０．２〜２％ＦＢＳ）；１：１０００に希釈したＩＴＳ；２５ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ（またはＦＧＦ７）；場合により、ＲＯＣＫ阻害剤またはローキナーゼ阻害剤を、および、場合により、ＳＢ‐４３１５４２または阻害剤ＩＶなどのＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤を含むＲＰＭＩを用いてその懸濁培養物を２４時間（第３日または第４日）培養することによって、前腸内胚葉または具体的にはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を作製する。約２４時間後、少なくともさらに２４時間〜４８時間のために培地を、同じ配合だが、場合によりＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地に交換する。前腸内胚葉の適切な分化運命決定のために重要な工程はＴＧＦβファミリー成長因子の除去である。したがって、胚体内胚葉の誘導後またはステージ１の後、約２４時間、ＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特異的な阻害剤である、ＴＧＦβ阻害剤第ＩＶ番またはＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤を場合によりステージ２の細胞培養物に添加することができる。ステージ２の間に作製された前腸内胚葉細胞またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞はＳＯＸ１７、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αを共発現し、そして、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞ま
たは内分泌前駆細胞ならびに単一ホルモン分泌性細胞または複数ホルモン分泌性細胞の特徴である、少なくともＰＤＸ１またはＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴまたはＰＰを検知できるほど共発現しない。
【０１２３】
さらに別の実施形態において、胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給されるＦＧＦファミリー増殖因子はＦＧＦ１０および／またはＦＧＦ７である。しかしながら、ＦＧＦ１０および／もしくはＦＧＦ７の代わりに、またはＦＧＦ１０および／もしくはＦＧＦ７に加えて、他のＦＧＦファミリー成長因子またはＦＧＦファミリー増殖因子類似体もしくは模倣物を供給することができることが理解される。例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３などＦＧＦ２３までを含む群から選択されるＦＧＦファミリー増殖因子を提供することができる。
【０１２４】
他の実施形態において、ヘッジホグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）阻害剤はＫＡＡＤ‐シクロパミンである。しかしながら、他のヘッジホグ阻害剤を使用することができることが理解される。そのような阻害剤にはＫＡＡＤ‐シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホグ経路阻止抗体および当業者に知られているヘッジホグ経路機能の他の任意の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。単独で、またはＦＧＦファミリー増殖因子と併せて使用されるとき、少なくとも約０．０１μΜ〜約５０μΜの濃度でヘッジホグ阻害剤が提供され得る。
【０１２５】
ステージ３は適切に分化運命が決定されたＰＤＸ陰性前腸内胚葉細胞培養物をステージ２から受け継ぎ、そして、１％（体積／体積）のＢ２７；２５μΜのＫＡＡＤシクロパミン；約０．２μΜのレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドまたは約３ｎＭのアロチノイド酸、すなわち、４‐［（Ｅ）‐２‐（５，６，７，８‐テトラヒドロ‐５，５，８，８‐テトラメチル‐２‐ナフタレニル）‐１-プロペニル］安息香酸もしくはＴＴＮＰＢなどのレチノイン酸類似体；および約５０ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を含むＤＭＥＭまたはＲＰＭＩで約２４時間〜７２時間培養することによって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を作製する。また、成長、生存および増殖を向上させ、ならびに細胞間接着を促進するためにＹ‐２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ステージ３の間に作製されるＰＤＸ１陽性前腸細胞はＰＤＸ１およびＨＮＦ６ならびにＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１を共発現し、そして、ステージ１および２の上述したような胚体内胚葉細胞またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを検知できるほど共発現しない。ステージ２および３について、ＰＤＸ１発現背腹部前腸内胚葉（ＰＤＸ１‐ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＤＯＲＳＡＬ  ＡＮＤ  ＶＥＮＴＲＡＬ  ＦＯＲＥＧＵＴ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００６年１０月２７日に提出された米国特許出願公開第１１／５８８，６９３号にさらなる詳細が記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
ステージ４は適切に分化運命が決定された細胞をステージ３から受け継ぎ、そして、約２４時間〜９６時間（約１〜４日）またはそれ以上のため、培養培地を、約１％（体積／体積）のＢ２７補充物、約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦおよび５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよび約５０ｎｇ／ｍＬのノギンを有するＤＭＥＭを含む培地と交換する。また、成長、生存および増殖を向上させ、ならびに細胞間接着を促進するためにＹ‐２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ステージ４の間に作製されたＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞は少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１ならびにＰＴＦ１Ａを共発現し、そして、ステージ１、２および３の上述したような胚体内胚葉細胞およびＰＤＸ１陰性細胞およびＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、または内分泌細胞または内分泌前駆細胞に特徴的な他のある種のマーカーまたは全てのマーカーを検知できるほど発現しない。
【０１２７】
本発明の別の実施形態において、ステージ１〜４は細胞の混合集団からなる分化細胞培
養物をもたらす。例えば、ステージ４分化過程は、天然のヒトβ細胞に機能の上で生理的に類似した機能性インスリン分泌細胞にインビボで発生し、成熟する能力を有するＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞を作製するが、他の細胞集団を作製することもできる。例えば、ステージ４細胞培養物はまた内分泌前駆細胞またはＣＨＧＡ陽性細胞のかなり大きい集団を作製する。ステージ４分化過程の後のこれらの様々な細胞集団について、ｈＥＳ細胞由来の内胚葉細胞および膵臓内胚葉細胞の精製方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＡＮＤ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ）という表題の２００８年６月３日に提出された米国特許出願公開第１２／１３２，４３７号にさらなる詳細が記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
万能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化についての処理のいくつかに関して、上述の成長因子が細胞に供給され、万能性細胞の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞への分化を促進するに充分である濃度で成長因子が培養物中に存在する。いくつかの処理では、上述の成長因子は少なくとも５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｎｇ／ｍＬまたは５０００ｎｇ／ｍＬよりも高い濃度で培養物中に存在し、または、レチノイン酸（ＲＡ）の場合、少なくとも０．０５μΜ、少なくとも．１μΜ、少なくとも１．５μΜもしくは少なくとも２μΜのＲＡがステージ２培養物（またはＰＤＸ‐１陰性前腸内胚葉細胞培養物）に供給され、またはＴＴＮＰＢなどのＲＡ類似体を使用する場合は同等の効果を有する濃度の類似体が供給される。分化した胚体内胚葉細胞および内胚葉系細胞への万能性細胞の分化のためのある処理では、上述の成長因子は添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、成長因子は、それらの添加から約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日またはそれ以上の後に除去され得る。典型的な処理では、成長因子は、それらの添加から約１、２または３日の後に除去される。
【０１２９】
他の実施形態において、γセクレターゼ阻害剤（上記のどこかでこれについて説明しているだろうか？）が分化処理の開始時、例えば、万能性ステージで供給され、そして、膵島ホルモン発現細胞への分化過程を通して細胞培養物中に維持される。さらに他の実施形態において、分化開始後だがＰＤＸ１陽性前腸内胚葉ステージへの分化の前にγセクレターゼ阻害剤が添加される。好ましい実施形態において、胚体内胚葉のＰＤＸ１陽性内胚葉への転換を促進する分化因子を供給するのとほぼ同じ時間に細胞培養物または細胞集団にγセクレターゼ阻害剤を供給する。他の好ましい実施形態において、細胞培養物または細胞集団中の細胞のかなりの部分がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化した後で、γセクレターゼ阻害剤を細胞培養物または細胞集団に供給する。
【０１３０】
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞のカプセル化
ステージ４により作製されたＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞を含む培養物がマクロカプセル化装置に負荷され、そして、全てその装置に含まれ、そして、患者に移植され、そして、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞が生理的に機能する膵臓ホルモン分泌細胞、例えば、インスリン分泌細胞にインビボで成熟する。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉始原細胞のカプセル化とインスリンのインビボ作製について、ｈＥＳ細胞由来の膵臓始原細胞のカプセル化（ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ）という表題の２００８年１１月１４日に提出された特許仮出願第６１／１１４，８５７号、および膵臓内胚葉細胞のカプセル化（ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  
ＣＥＬＬＳ）という表題の２００８年１２月９日に提出された米国特許仮出願第６１／１２１，０８４号の優先権の利益を主張する、ヒト万能性幹細胞由来の膵臓毛列細胞のカプセル化（ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＬＩＮＥＡＧＥ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＵＭＡＮ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ）という表題の２００９年１１月１３日に提出された米国特許出願公開第１２／６１８，６５９号に詳細が記載される。これらの出願の各々の開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
本明細書において記載される方法、組成物および装置は好ましい実施形態を現在のところ表すものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。それらの変更および他のものの使用が当業者に想起されるであろうが、それらは本発明の精神の範囲内に包含され、本開示の範囲によって限定される。したがって、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な置換および改変が本明細書において開示される発明に対してなされ得ることが当業者に明らかである。
【０１３２】
例えば、万能性幹細胞、例えば、ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から胚体内胚葉を作製するためにＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子またはシグナル伝達タンパク質のメンバーであるアクチビンＡを使用するが、しかしながら、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、胚体内胚葉の作製のための成長因子胚体内胚葉の作製用の成長因子（ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ
ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の２００８年６月３日に提出されたＰＣＴ国際特許出願公開第２００９／１５４６０６号に記載されるように、胚体内胚葉を作製するために他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバー、例えば、ＧＤＦ‐８およびＧＤＦ‐１１を使用することができる。
【０１３３】
ステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をステージ３のＰＤＸ１陽性前腸細胞に分化させるためにレチノイン酸（ＲＡ）を使用する。しかしながら、４‐［（Ｅ）‐２‐（５，６，７，８‐テトラヒドロ‐５，５，８，８‐テトラメチル‐２‐ナフタレニル）‐１-プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）および同様の類似体（例えば、４‐ＨＢＴＴＮＰＢ）などの他のレチノイドまたはレチノイン酸類似体を使用することができる。
【０１３４】
例えば、ノギンは骨形成タンパク質‐４（ＢＭＰ４）などのＴＧＦβスーパーファミリーのシグナル伝達タンパク質のメンバーを不活性化するタンパク質である。しかしながら、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）およびツイステッド・ガスチュレーション（Ｔｗｉｓｔｅｄ  Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）などの他のＢＭＰ４阻害因子または抗ＢＭＰ中和抗体はＢＭＰのその細胞表面受容体への結合を防ぐことができ、それによってＢＭＰシグナル伝達を効果的に阻害する。さらに、例えば、ＢＭＰを不活性化または阻害するために、化合物Ｃとしても知られるドルソモルフィン（６‐［４‐（２‐ピペリジン‐１‐イル‐エトキシ）フェニル］‐３‐ピリジン‐４‐イル‐ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン）などの低分子およびその派生物を使用することもできる。あるいは、ノギンの代替物は、クローン化され配列決定されているヒトノギンに由来し得る。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０７５，００７号を参照のこと。ノギン配列の解析によってクニッツ型プロテアーゼ阻害因子に対する相同性を有するカルボキシ末端領域が示されているが、これは、他のクニッツ型プロテアーゼ阻害剤がＢＭＰを阻害する同様の効果を潜在的に持ち得ることを意味している。本明細書と（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）米国特許出願公開第１２／６１８，６５９号において記載されるマクロカプセル化装置も例示的なものであるだけで、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。特に、装置の大きさ、装置のチャンバーまたはサブコンパートメントの数、ポートの数に対する変更、または、装置を読み込みおよび抽出する機構に対する変更ですら全て本発明の精神の範囲内に包含される。したがって、本発明の範囲および精神から逸
脱することなく、本明細書において記載される分化方法ばかりかプセル化装置に関する置換および改変も同様に本明細書において開示される発明に対してなされ得ることが当業者に明らかである。
【０１３５】
多能性細胞または分化細胞の作製のモニタリング
本発明の分化可能な細胞を部分的に、最終的にまたは可逆的に分化させるために細胞分化培地または細胞分化環境を活用することができる。本発明に従えば、細胞分化培地または細胞分化環境は、例えば、ＫＯＤＭＥＭ培地（ノックアウト・ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地、ＦＢＳ（胎児ウシ血清）、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）、ＫＳＲまたはｈＬＩＦ（ヒト白血病阻害性因子）を含む、様々な成分を含有することができる。細胞分化培地または細胞分化環境はＬ‐グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２、Ｂ２７およびβ‐メルカプトエタノール（β‐ΜΕ）などの栄養補助剤を含有することもできる。フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ）メンバー、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、および／もしくはＦＧＦ１０を含む線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）メンバー、増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦ）メンバー、ノギン、ホリスタチン、コーディン、グレムリン（ｇｒｅｍＬｉｎ）、サーベラス（ｃｅｒｂｅｒｕｓ）／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、高用量アクチビン、およびアムニオンレス（ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）を含むが、これらに限定されないトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長分化因子（ＧＤＦ）因子ファミリーアンタゴニストまたはそれらの異型体もしくは機能性断片を含むが、これらに限定されない追加的な因子を細胞分化培地または細胞分化環境に添加することができると考えられている。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体‐Ｆｃキメラの形態でＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストを添加することもできる。添加され得る他の因子には、デルタ様（Ｄｅｌｔａ‐ｌｉｋｅ）ファミリーとＪａｇｇｅｄファミリーのタンパク質ならびにＮｏｔｃｈのプロセッシングまたは切断の阻害因子またはそれらの異型体もしくは機能性断片を含むが、これらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを介するシグナル伝達を活性化または不活性化し得る分子が含まれる。他の成長因子には、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＦ）、インスリン、ウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、およびヘッジホグ因子ファミリーのメンバーまたはそれらの異型体もしくは機能性断片が含まれ得る。内胚葉系中胚葉幹／始原細胞、内胚葉系幹／始原細胞、中胚葉系幹／始原細胞、または胚体内胚葉系幹／始原細胞の増殖および生存、ならびにこれらの始原細胞の派生物の生存および分化を促進するために付加的な因子を添加することができる。
【０１３６】
本明細書において記載される組成物は、試験化合物が分化可能な細胞の万能性、増殖、および／または分化を調節するかどうか判定するための試験化合物のスクリーニングに有用である。分化可能な細胞の万能性、増殖および／または分化は当業者によって容易に確認され得る。非限定的な方法には細胞の形態、様々なマーカーの発現、奇形腫の形成、細胞数の調査およびインピーダンスの測定が含まれる。
【０１３７】
万能性細胞の多能性細胞への、さらに多能性細胞または分化細胞への進行は、外来性因子、例えば、ＴＧＦ‐βシグナル伝達因子の添加前および添加後の様々な時点で特定の遺伝子マーカーの有無を検出することなど、ある種の遺伝子マーカーの発現レベルを測定および定量することによりモニターされ得る。あるいは、細胞培養物または細胞集団の細胞にある種のマーカーが存在するそのレベルを測定することによってそのマーカーの発現を判定することができる。例えば、ある処理では、万能性細胞に特徴的なマーカーの発現ならびに多能性細胞または分化細胞に特徴的なマーカーの有意な発現の欠如が判定される。
【０１３８】
別の実施形態、すなわち、胚体内胚葉系列の他のあまり分化していない細胞種の作製の
モニターでは、マーカーの発現を測定するために、ブロットトランスファー法および免疫細胞化学（ＩＣＣ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）などの定性的または半定量的技法を用いることができる。あるいは、Ｑ‐ＰＣＲなどの技法を用いてマーカーの発現を正確に定量することができる。さらに、ポリペプチドレベルでは、膵島ホルモン発現細胞のマーカーの多くが分泌タンパク質であることが認識される。したがって、ＥＬＩＳＡなどの、細胞外マーカーの含量を測定する技法を活用することができる。このモニタリングおよびスクリーニング方法論ならびに他のモニタリングおよびスクリーニング方法論について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、胚体内胚葉の因子の特定方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ）という表題の、現在では米国特許第７，５４１，１８５号である、２００５年６月２３日に提出された米国特許出願公開第１１／１６５，３０５号に詳細が記載される。
【０１３９】
発生経路に沿って、各万能性細胞由来細胞種に特徴的なマーカーの発現を決定することにより、本明細書において記載される万能性細胞（例えば、ステージもしくはステップ１〜４または前述のＤ’Ａｍｏｕｒら、２００６年に記載されるステップ１〜５の結果として作製される細胞）の発生の進行をモニターすることができる。例えば、いくつかの処理では、万能性細胞由来細胞種の特定と特徴解析はある種のマーカーの発現または１つよりも多くのマーカーの様々な発現レベルおよび発現パターンによる。すなわち、前記マーカーの１つ以上の有無、高レベルの発現または低レベルの発現が細胞種を典型的に表し、そして、特定する。また、ある種のマーカーは一過的に発現することができ、そのマーカーは１つの発生ステージでは高発現するが別の発生ステージではあまり発現しない。ある種のマーカーが細胞培養物または細胞集団の細胞に存在するそのレベルを測定し、標準化または正規化した対照マーカーと比較することによりそのマーカーの発現を決定することができる。そのような処理では、マーカーの発現の測定は定性的または定量的であり得る。マーカー遺伝子によって産生されるマーカーの発現を定量する１つの方法は定量的ＰＣＲ（Ｑ‐ＰＣＲ）の使用によるものである。Ｑ‐ＰＣＲを実行する方法は当技術分野において周知である。
【０１４０】
さらに他の実施形態において、細胞種を効率的および正確に特徴解析および特定し、そして、対象細胞種でのそのようなマーカーの量および相対的な割合を決定するために免疫組織化学技法またはフローサイトメトリー技法と併せてＱ‐ＰＣＲを用いることができる。１つの実施形態において、Ｑ‐ＰＣＲは、混在した細胞の集団を含む細胞培養物におけるＲＮＡ発現のレベルを定量することができる。しかしながら、Ｑ‐ＰＣＲは、対象マーカーまたはタンパク質が同じ細胞で共発現しているか規定または識別することができない。別の実施形態において、フローサイトメトリー法と併せてＱ‐ＰＣＲを用いて細胞種を特徴解析および特定する。したがって、本明細書において記載される方法および上述したもののような方法の組合せを用いることによって、内胚葉系列系細胞を含む様々な細胞種の完全な特徴解析と特定を達成および実証することができる。
【０１４１】
混在した細胞集団の中の、特定の遺伝子を差示的に発現する細胞の相対量を正確に推定するために、その特定の遺伝子の発現のＱ‐ＰＣＲによる測定を用いることができることが示されている。したがって、遺伝子発現のＱ‐ＰＣＲベースの測定を用いて、様々な細胞培養条件下のある混在した細胞集団で万能性細胞、分化した多能性細胞、分化した単能性細胞および／または最終的な分化細胞の量を決定することができる。例えば、万能性細胞およびステージ１（胚体内胚葉）細胞などの分化細胞の集団を既知の割合で１つに混合し、胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現について分析した。１０，０００個の細胞全体から全ＲＮＡを単離し、そして、各条件（試料）について３回の反復実験を行った。次に単離したＲＮＡの３分の１（１／３）をｃＤＮＡ合成に使用し、ｃＤＮＡ反応の４０分の１（１／４０）を各Ｑ‐ＰＣＲ増幅に用いた。したがって、各ＰＣＲデータポイントは大本の
１０，０００細胞インプットのおよそ１／１２０（または、約８３個の細胞全体に等しいＲＮＡ）に由来する。当技術分野においてよく確立されている方法論を用いてＱ‐ＰＣＲを実行した。前述のＤ’Ａｍｏｕｒら（２００６年）を参照のこと。
【０１４２】
図１Ａは、ステージ１細胞（胚体内胚葉、ＤＥ）で発現するが、万能性細胞、例えば、ｈＥＳＣでは発現しないＳＯＸ１７マーカーについて得られたＱ‐ＰＣＲ遺伝子発現データのグラフによる表示を提供する。図１Ａの最初のカラム（最も左）は１００％のｈＥＳＣに由来するＱ‐ＰＣＲによりもたらされたシグナルを示し、最も右のカラムは１００％のＤＥ細胞に由来するＰＣＲによりもたらされたシグナルを示す。１００％のｈＥＳＣと１００％のＤＥ細胞の間のカラムは既知の希釈混合（または割合）のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞に由来するＱ‐ＰＣＲによりもたらされたシグナルを示す。例えば、カラム２は９９：１のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞の混合物に由来するＱ‐ＰＣＲによりもたらされたシグナルを示し、カラム３は９５：５のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞の混合物に由来するＱ‐ＰＣＲによりもたらされたシグナルを示し、カラム４は９０：１０のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞の混合物に由来するＱ‐ＰＣＲによりもたらされたシグナルを示し、１：９９のｈＥＳＣ：ＤＥ細胞の混合物に由来するＱ‐ＰＣＲによりもたらされたシグナルを示す最後から２番目のカラムまで同様である。
【０１４３】
図１Ａにおいて提示されるデータは、混在した集団におけるヒト胚体内胚葉細胞の数が増加するにつけ、胚体内胚葉特異的遺伝子の遺伝子発現レベルが上昇することを示す。さらに、このＱ‐ＰＣＲアッセイは非常に感度がよく、胚体内胚葉が細胞集団のわずか１％を構成する、例えば、パネルＡのカラム２が９９：１のｈＥＳＣ：ＤＥ比を有するときに胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現を検出する。このことは、このＱ‐ＰＣＲ方法は混在した細胞培養物において単一の胚体内胚葉細胞に相当するものでさえ検出することができることを示している。さらに、Ｑ‐ＰＲＣシグナル反応は細胞濃度の範囲の大半（１％から９０％までの胚体内胚葉）にわたって適度に線形である。
【０１４４】
試料サイズが５０，０００細胞／試料であったとき、ヒト胚体内胚葉細胞の量と胚体内胚葉マーカーの発現の間の関係も観察された。さらに、胚体内胚葉細胞に存在する他の遺伝子マーカーを分析し、そして、その結果はＳＯＸ１７について観察された結果と一致した。
【０１４５】
別の実施形態において、万能性幹細胞マーカー遺伝子についての相対的遺伝子発現値を決定することによって、混在した細胞集団に存在する万能性細胞の相対量を測定することができる。例えば、未分化ｈＥＳＣをヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）と既知の割合で、すなわち、１００：０のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；９９：１のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；９０：１０のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；５０：５０のＨＥＦ：ｈＥＳＣ；および０：１００のＨＥＦ：ｈＥＳＣで混合した。基本的に本明細書において記載されるような懸濁凝集培養物を形成するために、未クラスター化細胞の記載の混合物を含む各試料を回転培養にかけた。培養４８時間目にＱ‐ＰＣＲ試料を採取し、ＯＣＴ４などの、表１に記載されるものを含む万能性マーカー遺伝子の発現について分析した。図１Ａにおいて先に説明された結果と同様に、万能性細胞マーカー遺伝子であるＯＣＴ４の相対的発現は培養された万能性細胞のパーセンテージ（割合）に比例する。図１Ｂを参照のこと。したがって、特定の細胞種の遺伝子マーカーの発現レベルを決定することにより相対的細胞量を決定する、説明された方法はどのような特定の細胞種にも依存せず、むしろ、その方法は万能性細胞（例えば、ｈＥＳＣ）とステージ１（胚体内胚葉またはＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β胚体内胚葉）細胞、ステージ２（前腸、またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉またはＳＯＸ１７、ＨＮＦ３βおよびＨＮＦ４α前腸内胚葉）細胞、ステージ３（後部前腸内胚葉またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞、ステージ４（膵臓始原細胞または膵臓内胚葉もしくは上皮またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉）細胞およびステージ５（内分泌細胞もしくは内分泌前駆細胞また
はＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌前駆細胞またはインスリン陽性内分泌細胞）細胞などの万能性細胞由来細胞について等しく再現性が有る。表１に記載されるものなどのさらに他の万能性細胞マーカー遺伝子、特にＳＯＸ２、を同様に解析することができる。
【表１】
0005875597.tif 000002
【０１４６】
フローサイトメトリーを用いてＱ‐ＰＣＲの結果を確認することができる。ヒトＥＳＣをステージ５（膵臓内分泌細胞）に分化させた。前述のＤ’Ａｍｏｕｒら（２００６年）を参照のこと。インスリンに対する抗体を使用するフローサイトメトリーにより膵臓内分泌細胞に分化した細胞集団の割合を決定した。およそ１％、１０％または２０％のインスリン発現内分泌細胞を有する集団が得られた。次に、これらの３つの集団からメッセンジャーＲＮＡ試料を採取し、そして、Ｑ‐ＰＣＲを行った。図１Ｃに示される結果は、インスリン遺伝子の相対的発現は前記集団において前記マーカー遺伝子を発現する細胞の数に実際に比例することを示した。この方法は非常に再現性があったが、それはマーカー遺伝子の発現量と前記マーカー遺伝子を発現する細胞集団中の細胞のパーセンテージの間の相関をさらに示す。さらに、他の膵臓内分泌細胞遺伝子マーカーを解析したが、結果はインスリンについて観察された結果と一致した。
【０１４７】
マーカー遺伝子の発現を定量するために、当技術分野において公知である、さらに他の方法を使用することもできる。例えば、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより（例えば、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学または免疫蛍光などにより）マーカー遺伝子産物の発現を検出することができる。ある処理では、万能性細胞由来細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現ならびに万能性細胞由来細胞に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が判定され得る。万能性細胞由来細胞種を特徴解析し、特定するなおさらなる方法は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、先に示したような関連出願に記載されている。
【０１４８】
増幅分析での使用に適切な増幅プローブ／プライマーの組合せは次のものを含む：イン
スリン（ＩＮＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０００２０７）：プライマー  ＡＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡ（配列番号１）、ＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号２）；Ｎｋｘ６．１（ＮＭ＿００６１６８）：プライマー  ＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡ（配列番号３）、ＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号４）；Ｐｄｘ１（ＮＭ＿０００２０９）：プライマー  ＡＡＧＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧ（配列番号５）、ＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣ（配列番号６）；Ｎｇｎ３（ＮＭ＿０２０９９９）：プライマー  ＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣ（配列番号７）、ＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴ（配列番号８）；ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）（ＮＭ＿０２１７８４）：プライマー  ＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡ（配列番号９）、ＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡ（配列番号１０）；グルカゴン（ＧＣＧ）（ＮＭ００２０５４）：プライマー  ＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号１１）、ＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴ（配列番号１２）；ＨＮＦ６（ＮＭ＿０３０７１２）：プライマー  ＣＧＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴ（配列番号１３）、ＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号１４）；ＨＮＦ４α（ＮＭ＿０００４５７）：プライマー  ＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡ（配列番号１５）、ＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧ（配列番号１６）；Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０２２４５４）：プライマー  ＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号１７）、ＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＴ（配列番号１８）；ＨＬｘＢ９（ＮＭ＿００５５１５）：プライマー  ＣＡＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣ（配列番号１９）、ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＣＧＡ（配列番号２０）；Ｎｋｘ２．２（ＮＭ＿００２５０９）：プライマー  ＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡ（配列番号２１）、ＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＣＴ（配列番号２２）；ＰＴＦ１ａ（ＮＭ＿１７８１６１）：プライマー  ＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧ（配列番号２３）、ＧＧＣＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴ（配列番号２４）；ＳＳＴ（ＮＭ＿００１０４８）：プライマー  ＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（配列番号２６）；ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）：プライマー  ＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧ（配列番号２７）、ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＴＡ（配列番号２８）；Ｏｃｔ４プライマー  ＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧ（配列番号２９）、ＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧ（配列番号３０）；ＭＩＸＬ１プライマー  ＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡ（配列番号３１）、ＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧ（配列番号３２）；ＧＡＴＡ４プライマー  ＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧ（配列番号３３）、ＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴ（配列番号３４）；ＧＳＣプライマー  ＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧ��ＣＴＧＧＴＴ（配列番号３５）ＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３６）；ＣＥＲプライマー  ＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴ（配列番号３７）、ＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ（配列番号３８）；ＡＦＰプライマー  ＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号３９）、ＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４０）；ＳＯＸ１プライマー  ＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号４１）、ＣＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＧＡＧＴＴＧ（配列番号４２）；ＺＩＣ１プライマー  ＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号４３）、ＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴ（配列番号４４）；ＮＦＭプライマー  ＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号４５）、ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴ（配列番号４６）。ＦＧＦ１７（ＨｓＯＯ１８２５９９ｍ１）、ＶＷＦ（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＣＭＫＯＲ１（Ｈｓ００６０４５６７＿ｍ１）、ＣＲＩＰ１（Ｈｓ００８３２８１６＿ｇ１）、ＦＯＸＱ１（Ｈｓ００５３６４２５＿ｓ１）、ＣＡＬＣＲ（Ｈｓ００１５６２２９＿ｍ１）およびＣＨＧＡ（Ｈｓ００１５４４４１＿ｍ１）を含む他のプライマーはＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ社より入手可能である。
【０１４９】
万能性細胞のモニタリング
上述した特定の遺伝子を発現する混在した細胞集団における万能性細胞または万能性細胞由来細胞の相対量の推定値をモニタリングし、決定する方法の他には、少なくとも万能性細胞のレベルをモニタリングし、決定する別の方法は万能性細胞の培養条件で図２に記載されるように分化細胞培養物を再プレーティングすることである。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、幹細胞凝集懸濁組成物およびその分化方法（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ  ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ
ＭＥＤＨＯＤ  Ｓ  ＯＦ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦ）という表題の２００８年１１月４日に提出された米国特許出願公開第１２／２６４，７６０号に記載されるように、接着性細胞培養物または懸濁凝集培養物を用いてこれを行うことができる。万能性細胞の培養条件は、フィーダー層上での成長、または無フィーダー条件だが、溶解した線維芽細胞フィーダー細胞に由来する細胞外マトリックス上での成長、または合成表面マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）上の成長、または、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ヒト血清を含む無フィーダー万能性幹細胞培地の方法と組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＦＥＥＤＥＲ‐ＦＲＥＥ
ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＭＥＤＩＡ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭ）という表題の２００８年１０月２０日に提出された関連する米国特許出願公開第１１／８７５，０５７号に記載されるような無フィーダー万能性細胞培養培地での成長を含む、万能性成長と増殖を促進する条件である。移植または再プレーティングされ、そして、万能性細胞の培養条件下で培養されると、少数の万能性細胞であってもより早く増殖し、万能性培養条件での他の万能性細胞の倍化時間（例えば、ｈＥＳＣは一晩または約１８〜２４時間で倍加する）に類似した倍化時間を獲得するので、このアプローチはどんな培養でも少数の万能性細胞を増幅する。再プレーティングされた培養物の細胞が増殖していることがＫｉ６７での陽性染色により確認された。
【０１５０】
万能性懸濁凝集培養物を用いるスクリーニング方法
いくつかの実施形態において、万能性細胞、多能性細胞および／または分化細胞を含むある細胞集団を得るためのスクリーニング方法が用いられる。次に、その細胞集団に候補分化因子を供給する。候補分化因子を供給する前またはほぼ同じ時間である第１時点で、マーカーの発現を測定する。あるいは、候補分化因子を供給した後でマーカーの発現を測定することができる。第１時点の後であり、候補分化因子を細胞集団に供給する工程の後である第２時点で、同じマーカーの発現を再度測定する。第１時点での前記マーカーの発現と第２時点での前記マーカーの発現を比較することによって、候補分化因子が膵臓前駆細胞の分化を促進することができるかどうか判定する。第１時点での前記マーカーの発現と比較して第２時点での前記マーカーの発現が上昇または低下している場合、候補分化因子は膵臓始原細胞の分化を促進することができる。
【０１５１】
本明細書において記載されるスクリーニング方法の実施形態において、候補（試験）分化因子もしくは細胞傷害性因子もしくは阻害性因子と細胞集団を接触させる、または他の方法では、細胞集団に候補（試験）分化因子もしくは細胞傷害性因子もしくは阻害性因子を供給する。候補分化因子または細胞傷害性因子または阻害性因子は、上述の細胞のいずれかの分化を促進する、または万能性幹細胞の増殖を防ぐ、またはそれら万能性幹細胞を殺滅する能力を有する可能性が有る任意の分子を含み得る。別の実施形態において、候補分化因子または細胞傷害性因子または阻害性因子は、細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好ましい実施形態において、候補分化因子または細胞傷害性因子または阻害性因子は、ヒト膵臓始原細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。
【０１５２】
本明細書において記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態において、候補分化因子または細胞傷害性因子または阻害性因子は低分子を含む。「低分子」は、当技術分野において、定義では重合体ではない低分子量有機化合物を意味するように、本明細書
において使用される。低分子は天然に生じたもの（例えば、内在性神経伝達物質）であり得るし、当技術分野において公知の合成有機化学方法によって調製され得る。ある実施形態において、低分子は約８００ダルトン以下の分子質量を有する分子である。
【０１５３】
本明細書において記載される他の実施形態において、候補分化因子または細胞傷害剤または阻害剤は高分子、例えば、ポリペプチドを含む。そのポリペプチドは、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成長因子を含むが、これらに限定されない任意のポリペプチドであり得る。好ましいポリペプチドには成長因子が挙げられる。
【０１５４】
本明細書において記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態において、１つ以上の濃度で候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を細胞集団に供給する。いくつかの実施形態において、細胞の周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬまでの範囲にあるように、候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を細胞集団に供給する。いくつかの実施形態において、細胞の周囲の培地中の候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤の濃度は約１ｎｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬまでの範囲である。他の実施形態において、細胞の周囲の培地中の候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤の濃度は約１０ｎｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬまでの範囲である。さらに他の実施形態において、細胞の周囲の培地中の候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤の濃度は約１００ｎｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬまでの範囲である。好ましい実施形態において、細胞の周囲の培地中の候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤の濃度は約５ｎｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬである。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるスクリーニング方法の工程は第１時点および第２時点で少なくとも１つのマーカーの発現を測定することを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、第１時点は、候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を細胞集団に供給する前またはおよそ同じ時間であり得る。あるいは、いくつかの実施形態において、第１時点は候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を細胞集団に供給した後である。いくつかの実施形態において、第１時点で複数のマーカーの発現を測定する。
【０１５６】
前述の方法は、細胞傷害性である、または万能性幹細胞の成長、増大および／もしくは増殖を阻害する、または、候補分化因子の場合、生存度を改善する、分化状態を安定化する、成長を増大させる、およびｈＥＳ細胞の万能性を維持する低分子化合物または他の化合物のスクリーニングに等しく応用可能である。本明細書において記載される教示をそのようなスクリーニング方法に適合させることは充分に当技術分野の技術水準の範囲内である。
【０１５７】
第１時点での少なくとも１つのマーカーの発現の測定に加えて、本明細書において記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、第１時点の後であり、細胞集団に候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を供給した後である第２時点で少なくとも１つのマーカーの発現を測定することを考えている。そのような実施形態において、第１時点と第２時点の両方で同じマーカーの発現を測定する。いくつかの実施形態において、第１時点と第２時点の両方で複数のマーカーの発現を測定する。そのような実施形態において、第１時点と第２時点の両方で同じ複数のマーカーの発現を測定する。いくつかの実施形態において、各々が第１時点の後であり、細胞集団に候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を供給した後である複数の時点でマーカーの発現を測定する。ある実施形態において、Ｑ‐ＰＣＲによりマーカーの発現を測定する。他の実施形態において、免疫細胞化学によりマーカーの発現を測定する。
【０１５８】
本明細書において記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態において、細胞集団に候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を供給することと第２時点でマーカーの発現を測定することの間に充分な時間を経過させる。細胞集団に候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を供給することと第２時点でマーカーの発現を測定することの間の充分な時間はわずか約１時間〜約１０日もの時間であり得る。いくつかの実施形態において、細胞集団に候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤を供給した後に少なくとも１つのマーカーの発現を複数回測定する。いくつかの実施形態において、充分な時間は少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間〜数日〜数週間である。
【０１５９】
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、第２時点でのマーカーの発現が第１時点でのこのマーカーの発現と比べて上昇したか、低下したかさらに判定する。少なくとも１つのマーカーの発現の上昇または低下は、候補分化因子または候補細胞傷害剤または阻害剤が細胞の分化を促進する、または細胞を阻止または抑制することができることを示す。同様に、複数のマーカーの発現を測定する場合、第２時点でのその複数のマーカーの発現が第１時点でのこの複数のマーカーの発現と比べて上昇したか、低下したかさらに判定する。第１時点および第２時点での細胞集団における前記マーカーの量、レベルまたは活性を測定することにより、そうでなければ、評価することにより、マーカーの発現の上昇または低下を判定することができる。そのような判定は他のマーカー、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現に対して相対的または絶対的である。マーカーの発現が第１時点に比べて第２時点で上昇するある実施形態において、上昇した量は少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍である、または少なくとも約１００倍よりも多い上昇である。いくつかの実施形態において、上昇した量は２倍未満である。マーカーの発現が第１時点に比べて第２時点で低下する実施形態において、低下した量は少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍である、または少なくとも約１００倍よりも多い低下である。いくつかの実施形態において、低下した量は２倍未満である。
【０１６０】
本願を通して、様々な文献が参照されている。本発明が関係する最新の状況をより充分に説明するために、これらの文献とそれらの文献の全体で引用されている参考文献の全ての開示の全体が本願への参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例で使用される単純限定培地（ＤＣ）はＤＣ‐ＨＡＩＦという名称であり、基本的にＤＭＥＭ／Ｆ１２；２ｍＭのグルタマックス；１×非必須アミノ酸；０．５Ｕ／ｍＬのペニシリン；０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン；１０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（全て、インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州、米国より）；０．１ｍＭのβ‐メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）；０．２％の脂肪酸フリー第Ｖコーン画分のＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）；１×微量元素ミックスＡ、ＢおよびＣ（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）；５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社）；１０ｎｇ／ｍＬのＨＲＧ‐β（Ｈ）；１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ａ）；２００ｎｇ／ｍＬのＬＲ‐ＩＧＦ１（Ｉ）ならびに８ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｆ）からなる。ＤＣ‐ＨＡＩＦが長期の万能性ｈＥＳ細胞の維持ならびにアキュターゼ（商標）を使用するｈＥＳ細胞の単一細胞継代および培養規模拡大を助けた。Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００７年）Ｂｌｏｏｄ誌、第１１０巻（第１２号）：頁４１１１〜４１１９を参照のこと。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭの商標で市販されているバッチ検査済みのＤＣ‐ＨＡＩＦ配
合物がインビトロジェン社から入手可能である。
【０１６２】
背景となる研究を通して、ＦＧＦ２は限定培地に必要な成分ではないことが明らかになった。たとえ高濃度であっても成長因子による刺激の後にわずかな、または中程度のＦＧＦ受容体のリン酸化だけが観察され、そして、増殖、突発的な分化または万能性の維持に関して培養物にいかなる測定可能な影響も与えることなく限定培地からＦＧＦ２を省略することができた。前述のＷａｎｇ，Ｌ．ら（２００７年）を参照のこと。したがって、本文および図の説明文に示されているように、ＦＧＦ２を添加することなく、下記の特定の研究を行った。また、いくつかの分析は様々な成長因子の組合せを必要としたので、成長因子無しのバッチのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭを、そのような柔軟性をもたらすために、ライフ・テクノロジーズ社に特別注文し、購入した。
【０１６３】
ｈＥＳ細胞培養において重要な機能を有する付加的なシグナル伝達経路を強調することを目的として、既知の生物活性を有する低分子化合物のライブラリーから基本的になるＬＯＰＡＣライブラリーを、ｈＥＳ細胞培養物に対してスクリーニングを行うために用いた。その目的は培養物の増殖および／または万能性に負の影響を与える低分子を特定することであった。重要な経路の阻害が増殖の遅滞化、細胞傷害性、アポトーシスまたは分化を引き起こすことが予想された。重要なことに、血清または半分画化アルブミンなどの非限定成分により通常引き起こされる可変性を低下させる、上述した、および本明細書において説明される単純限定培地の背景でこれらの一次スクリーニングおよび二次スクリーニングを行った。化合物の活性を決定するために、アルカリホスファターゼ染色アッセイを行った。アルカリホスファターゼは未分化万能性幹細胞に関連した幹細胞マーカーである。このアッセイを用いると、約５０種の低分子化合物が、ｈＥＳ細胞の増殖および生存度の低下を含む負の影響をｈＥＳ細胞に与えるそれらの能力に関して、いくらか測定可能な量の活性を示した。これらの化合物のうち、細胞表面神経伝達物質受容体の阻害剤が多数特定されたが、このことは、自己再生に関するこれらの受容体の少なくともシグナル伝達における役割を示唆する。天然のリガンドまたは薬理的に関連する派生物を用いて、ホルモンとしても作用することができるいくつかのクラスの低分子神経伝達物質が特定され、そして、それらは低密度でのｈＥＳ細胞の増殖と生存の補助および／または拡大を示した。そのような活性は、信頼できる単一細胞クローニング、完全に限定的かつ医薬品製造品質管理基準（ＧＭＰ）に準拠した条件での新しいｈＥＳ細胞株の効率的な誘導、懸濁状態でのｈＥＳ細胞の増殖および継代時の生存度の向上など、ｈＥＳ細胞の商業的用途および臨床用途のための先進技術の開発にとって重要であり得た。以下の研究のゴールは万能性幹細胞に対して反対の効果を持つ薬剤を同様に特定することであった。より具体的には、指向性インビトロ分化過程の間に未分化細胞の集団を減少させるために使用することが可能な万能性幹細胞阻害剤および細胞傷害剤を特定するために本発明のスクリーニング方法を用いた。
【０１６４】
上述のことは本発明の例示的な実施形態に関連し、そして、本発明の範囲から逸脱することなくそれらに多数の変更を行うことができることが理解されるものとする。本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、それらは本発明の範囲を限定するものとして多少なりとも解釈されてはならない。反対に、本明細書中の説明を読んだ後に当業者に自明となる、本発明の精神および／または添付される特許請求項の範囲から逸脱しない多様な他の実施形態、改変および同等の表現を行うことができることが明確に理解されるものとする。
【０１６５】
本明細書において記載される方法、組成物および装置は好ましい実施形態を現在のところ表すものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。例えば、あるｈＥＳ細胞株が使用されたが、本発明は、ヒトｉＰＳ細胞株ならびにそれぞれ下記の表１および表２の中の細胞株などの、言及されていない他のｈＥＳ細胞
株およびｉＰＳ細胞株を含む任意の万能性幹細胞株を使用することを考えている。それらの表はｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ上にある米国衛生研究所の幹細胞登録ならびに米国マサチューセッツ州ウースターのマサチューセッツ大学医学部にあるヒト胚性幹細胞登録および国際幹細胞登録から翻案されたものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録されると、定期的に最新のものにされる。その細胞株のいくつかはＮＳＣＢ幹細胞登録所から発送不可能である。それでも、少なくとも下記のｈＥＳ細胞株は本発明の日付の時点では商業的に利用可能とされている可能性がある。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【０１６６】
実施例１：ｈＥＳ細胞に対して細胞傷害性だが分化細胞には細胞傷害性ではない化合物の特定
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を抑制する、またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対して細胞傷害性を有する候補化合物のスクリーニング。
薬理活性化合物ライブラリー（ＬＯＰＡＣ）、具体的にはＬＯＰＡＣ１２８０（商標）コレクション（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＬＯ１２８０）からある化合物を選択した。ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物は公知であり、または、よく特徴解析された特質を有する。ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）の完全なリストはｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｄｒｕｇ‐ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ／ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ‐ｌｉｂｒａｒｉｅｓ／ｌｏｐａｃ１２８０‐ｎａｖｉｇａｔｏｒ．ｈｔｍｌで見ることができる。細胞シグナル伝達経路、リン酸化事象または受容体などの公知の阻害剤であるという理由で選択された１７６種の化合物からなるＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーのサブセットを使用して最初のスクリーニングを行った。選択された１７６種の化合物を記載する表４を参照のこと。これらの化合物は、ＤＭＳＯを含有する対照ウェルを含む、２×９６ウェルトレイに配列された。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【０１６７】
次に、リアルタイムインピーダンス分析（ＡＣＥＡバイオサイエンシズＲＴ‐ＣＥＳシステム）を用いてヒト万能性幹細胞、例えば、ｈＥＳＣとステージ１（胚体内胚葉）の分化中の培養物をスクリーニングにかけるために、完全ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーに由来する前述の１７６種の選択された化合物を用いた。ＲＴ‐ＣＥＳシステムは、細胞インデックスの尺度に解釈される電気的インピーダンスの変化をモニターする埋め込み型マイクロセンサーを含む９６ウェルトレイを用いる。細胞増殖、移動、細胞拡散、アポトーシス、分化などを含むが、これらに限定されない細胞培養物内でのいかなる明白な変化も検出することができる。ＲＴ‐ＣＥＳトレイ内でｈＥＳ細胞が効率的に接着し、増殖することが以前の実験により示されている。細胞インデックスの増加は細胞の増殖、例えば、未分化細胞の増殖を示す。Ｑ‐ＰＣＲによって増殖を確認した。図１も参照のこと。細胞インデックス（インピーダンス）の減少または低下が、化合物が細胞に対して阻害性効果または細胞傷害性効果を有することを示した。対照的に、不活性化合物、すなわ
ち、阻害性および／または細胞傷害性ではないことが分かった化合物は通常、ＤＭＳＯ対照で示されたものと類似した細胞インデックス（インピーダンス）を有する。「スキャロップ」細胞インデックスは、集密細胞培養物であるため高いままであるが、毎日の栄養補充の間に高下する（スキャロップ）細胞インデックスである。逆に、分化しつつある細胞は、上皮間葉転換、扁平化、細胞移動、アポトーシスまたは同様の分化と増殖に関連する変化を示す可能性がある、細胞インデックスのピークとトラフなどの固有のパターンを有する。
【０１６８】
阻害剤および細胞傷害剤向けのインピーダンス分析。
ヒト万能性幹細胞、例えば、２×１０４個のｈＥＳＣ（ＢＧ０２）をインピーダンスモニタリングプレート中のヘレグリン系の限定培地であるＤＣ‐ＨＡＩＦ中で毎日栄養補充して培養した。約２４時間後、１０μΜの選択されたＬＯＰＡＣ１２８０（商標）化合物を各ウェルに添加し（図３ＡおよびＢの矢頭を参照のこと）、そして、さらに約５日培養した。７種の化合物（ＢＴＯ‐１（化合物番号１６）、塩化ケレリトリン（化合物番号２５）、デホスタチン（化合物番号４８）、チルホスチンＡＧ４９４（ＡＧＡ４９４；化合物番号１４６）、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧＡ４９０；化合物番号１５２）、ＳＵ６６５６（化合物番号１２６）およびノルジヒドログアラレチン酸（ＮＤＧＡ；化合物番号１１１））が、ＤＭＳＯ対照と比較して、ｈＥＳＣに対する阻害性効果または細胞傷害性効果を示す細胞インデックス（すなわち、インピーダンス）の著しい減少を引き起こしたので、それらが特定された。これらの研究の最中にそれらは並行して行われた。約１１２時間でのデホスタチンのウェルで観察されたインピーダンスのスパイクは混入汚染物質によるものであったが、それは人為的結果である（図３Ａ）。
【０１６９】
上記の表４の化合物を用いるｈＥＳＣに対するインピーダンス分析では２０を超えるヒットが生じた。しかしながら、本発明の理想的な候補化合物はｈＥＳＣまたはｈＩＰＳＣなどのヒト万能性幹細胞に対して阻害性または細胞傷害性を持つだけではなく、同時に、ステージ１、２、３、４および５のタイプの細胞培養物（それぞれ、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞、後部前腸細胞、膵臓内胚葉細胞および内分泌細胞）を含む分化細胞集団または分化中の細胞集団の細胞生存度に効果を持たないものとする。したがって、次に、分化中の胚体内胚葉（ＤＥ）細胞培養物（図３ＣおよびＤ）に対して表４の化合物をスクリーニングにかけた。ウェル当たりおよそ３×１０４個のｈＥＳ細胞を蒔き、ＤＣ‐ＨＡＩＦ限定培地（すなわち、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社、カールスバード、カリフォルニア州）に２４時間培養した。次に、培地を交換し、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、および１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含むＲＰＭＩで培養することにより、ステージ１または胚体内胚葉分化過程を誘導した。分化過程の最初の２４時間だけ、１０ｎＭ／ｍＬのＧＳＫ‐３β阻害剤１５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カタログ番号３６１５５８）を培養物に添加した。分化が誘導されてから約４８時間すなわち２日後に１０μΜの各々の候補化合物を添加し（図３ＣおよびＤ、大矢頭を参照のこと）、そして、細胞をさらに２日培養した。表４に記載される化合物のうち、下記の表５中の以下の化合物がｈＥＳＣの成長と増殖の細胞傷害性効果または阻害性効果を示したが、同時に、分化中のｈＥＳＣまたは分化した内胚葉細胞の細胞生存度に明確に影響することはなかった。
【表５】
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【０１７０】
選択された化合物を用いる二次スクリーニング。
上述したように分化中のステージ１培養物（胚体内胚葉）に化合物を添加することにより、表５の１０種の候補化合物のうちの９種を用いる二次スクリーニングを行った。二次スクリーニングのために、インピーダンス分析を用いる一次スクリーニングで使用されたＲＴ‐ＣＥＡＳ９６ウェル培養プレートの代わりにより大きい標準６ウェルトレイを使用した。表５の１０種の化合物のうち９種だけが試験された。というのも、分析が行われた時点では１０番目の化合物は充分な量が利用可能ではなかったためである。より大きい６ウェルトレイでは、表５に記載した９種の化合物のうちの５種は分化中の細胞または分化した胚体内胚葉の生存度に効果を持たなかった。つまり、胚体内胚葉細胞は次の５種の化合物、すなわち、塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ；化合物番号２５）、デホスタチン（Ｄｅｐｈ．；化合物番号）、ＳＵ６６５６（ＳＵ；化合物番号１２６）およびチルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ４９０；化合物番号１５２）の存在下で成長および増殖することができた。分化中の細胞および分化した胚体内胚葉細胞の生存度は、試験した細胞の数またはサイズ、体積、または培養容器の供給源に無関係に、明らかに一貫していたことがこの分析によっても確認された。
【０１７１】
ステージ１〜５分化過程への効果に対するスクリーニング。
ステージ１で添加されたこれらの５種の候補化合物が他の分化細胞種（例えば、ステージ２〜５：それぞれ、前腸内胚葉細胞、後部前腸内胚葉細胞、膵臓内胚葉細胞および内分泌前駆細胞）に影響を与えるかさらに判定するために、化合物の存在下または非存在下でｈＥＳ細胞を分化させ、そして、Ｑ‐ＰＣＲによる遺伝子発現解析のために、様々なステージでＲＮＡ試料を採取した。
【０１７２】
ステージ１の最後でのＤＭＳＯ処理対照と比べて（図４）、そして、未分化ｈＥＳＣ凝集体と比べて（図５および６）遺伝子発現レベルをプロットした。図４、５および６中の「対照」を参照のこと。塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ；化合物番号２５）；デホスタチ
ン（Ｄｅｐｈ；化合物番号２４８）；ＳＵ６６５６（ＳＵ；化合物番号１２６）およびチルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ；化合物番号１５２）で処理された培養物（図４Ａおよび４Ｂ、２番目、３番目、５番目および６番目の棒）はＤＭＳＯ対照と比較して（図４Ａおよび４Ｂ、１番目の棒）ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの遺伝子発現の微妙な相対的低下を示した。塩化ケレリトリン、デホスタチン、ＳＵ６６５６およびチルホスチンＡＧ４９０化合物はそれぞれＤＭＳＯ対照と比較してＳＯＸ１７遺伝子発現の上昇を引き起こしたが、これはステージ１胚体内胚葉細胞培養物（図４Ｄ）の遺伝子発現プロファイルと一致した。しかしながら、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ）とＳＵ６６５６（ＳＵ）はそれぞれＤＭＳＯ対照と比較してＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３β）発現の低下を引き起こしたが、これはこれらの２種の化合物の胚体内胚葉（図４Ｃ）への有害効果を表す。さらに、いずれの化合物も、ＳＯＸ７、ＰＡＸ６またはＺＩＣ１を含む非胚体内胚葉マーカーの発現にあまり影響を与えないようであったので（図４Ｅ、４Ｆおよび４Ｇ）、他の細胞種に対する分化誘導を基準にそれらを排除しなかった。ＢＴＯ‐１（ＢＴＯ１；化合物番号１６）はどのような効果も持たないようであったので（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ）、さらなる解析からそれを排除した。この化合物は、万能性幹細胞選択性阻害剤／細胞傷害剤に期待されているように、ＯＣＴ４またはＮＡＮＯＧの発現を低下させることもＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３β）またはＳＯＸ１７の発現を上昇させることもなかった。
【０１７３】
懸濁凝集培養における候補阻害剤／細胞傷害剤の効果。
細胞療法用の理想の阻害剤候補は、スケールアップ製造工程（例えば、大きいバイオリアクターで増殖され得るであろう懸濁凝集培養物）ならびに９６ウェルプレートまたは６ウェルトレイなどでの小規模細胞培養において膵臓細胞系列の生存と両立する。したがって、さらなるスクリーニングは、商用スケール工程での条件に類似した条件を含む。先に言及したように、ＢＴＯ‐１はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＦＯＸＡ２またはＳＯＸ１７に対してどのような効果も持たないようであったので、ＢＴＯ‐１をこの実験に含めなかった。スケールアップ製造工程に対応することができる懸濁凝集タイプの培養物中で増殖する万能性幹細胞の選択的阻害について残りの４種の化合物、すなわち、塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ；化合物番号２５）、チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ；化合物番号１５２）、デホスタチン（Ｄｅｐｈ；化合物番号４８）およびＳＵ６６５６（ＳＵ；化合物番号１２６）をスクリーニングにかけた。簡単に説明すると、回転培養でヒトＥＳＣを凝集させ、そして、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、分化可能細胞の培養に有用な組成物および方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＵＳＥＦＵＬ
ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ  ＣＥＬＬＳ）という表題の２００７年８月１３日に提出された米国特許出願公開第１１／８３８，０５４号および幹細胞凝集懸濁組成物およびその分化方法（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ
ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦ）という表題の２００８年１１月４日に提出された米国特許出願公開第１２／２６４，７６０号に実質的に記載される通りにステージ１〜４まで分化させて膵臓内胚葉を作製した。Ｑ‐ＰＣＲによる解析のために、上記のような分化の最中の様々な時点で対照化合物および化合物で処理した細胞培養物からＲＮＡ試料を採取した。図５Ａ〜５Ｍは万能性幹細胞またはステージ１〜５のうちの少なくとも１つに特徴的なマーカーの発現を示す。図６Ａ〜６Ｆは、万能性幹細胞またはステージ１〜５では通常発現しないマーカーの発現を示す。各グラフは５つの区分を含む。図５Ａ〜５Ｍの各グラフの最も左にある「対照」区分である第０日（ｈＥＳＣ）に対してＱＰＣＲ試料が正規化された。対照区分の右側にある他の４つの区分は細胞を処理するために使用された４種の化合物に対応する（左から右に、それぞれ、塩化ケレリトリン（Ｃｈ．Ｃｌ；化合物番号２５）；チルホスチンＡＧ４９０（ＡＧ４９０；化合物番号１５２）、デホスタチン（Ｄｅｐｈ；化合物番号４８）およびＳＵ６６５６（ＳＵ６６５６；化合物番号１２６））。対照は未処理細胞（ｄ０およびｄ２）とＤＭＳＯ処理細胞（ｄ３、ｄ５、ｄ７、ｄ９およびｄ１１（左から右に））を含んだ。４種の化合物のうちの３種、す
なわち塩化ケレリトリン、デホスタチンおよびＳＵ６６５６が、対照と比較して、ステージ２、３および４（それぞれ、前腸、後部前腸および膵臓内胚葉）でＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の遺伝子発現を上昇させることがデータの解析により示された。図５Ｈおよび５Ｋの最後の３つの棒を参照のこと。チルホスチンＡＧ４９０で処理された培養物が少なくともＰＤＸ１とＮＫＸ６．１の遺伝子発現を低下させたが、これは膵臓内胚葉分化の低下を示唆する。図５Ｈおよび５Ｌを参照のこと。さらに、チルホスチンＡＧ４９０とＳＵ６６５６が、それぞれ、ＡＦＰとＣＤＸ２の遺伝子発現の上昇を誘導することが非膵臓内胚葉細胞種（図６Ａ〜６Ｆ）のマーカーの解析により示された。図６Ｅおよび６Ｆを参照のこと。
【０１７４】
上述したスクリーニングパラダイムは、未分化ｈＥＳＣに対する選択的細胞傷害性を示す、および／または未分化ｈＥＳＣの成長と増殖を阻害するが、同時に、ステージ１、２、３および４の細胞（それぞれ、胚体内胚葉、前腸内胚葉、後部前腸内胚葉、膵臓始原細胞または膵臓内胚葉）を含む分化中のｈＥＳＣおよび／または分化細胞に対して実質的にほとんどまたは全く効果を持たない化合物を特定するアプローチを概説する。
【０１７５】
実施例２：完全ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）コレクション中の選択的細胞傷害性化合物／阻害性化合物の特定
潜在的な候補ｈＥＳＣ細胞傷害性化合物および阻害性化合物の数を拡大するために、完全ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）コレクション（１，２８０種の化合物を含む）がスクリーニングにかけられた。一次スクリーニングでは、１６枚の標準９６ウェルトレイ内の、１：２００に希釈して成長因子を低減させたマトリゲル（商標）上のＤＣ‐ＨＡＩＦ限定培地中の、毎日栄養補充される、未分化ｈＥＳＣ（約３×１０４個のＢＧ０１細胞）に対して細胞傷害性を試験した（図７Ａ）。プレーティングから１日後に１０μΜの各化合物をｈＥＳＣに添加し、そして、細胞をさらに２日培養した。次に、プレートを固定し、そして、（ＡＰ染色の低下として）ｈＥＳＣの増殖または成長の相対的減少を特定するためにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）について染色したが、プレートはｈＥＳＣの割合の低下を示した。図７Ａの丸で囲ったウェルを参照のこと。
【０１７６】
さらに、ｈＥＳＣから得られる神経始原細胞（ＮＰＣ）に対する効果についても完全ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）コレクションをスクリーニングにかけた。無血清ＭｅｄＩＩ条件培地に６×１０４細胞／ウェルの割合で神経始原細胞をプレーティングし、毎日栄養補充をした。プレーティングから２日後に１０μΜの各化合物を添加し、そして、細胞をさらに２日培養した。次に、プレートを固定し、そして、相対的な増殖または成長活性を明らかにすることができる一般的細胞染色剤であるクリスタルバイオレットで染色した。クリスタルバイオレット染色の低減がＮＰＣの割合の低下を示した。図７Ｂの丸で囲ったウェルを参照のこと。化合物を分配するためのＬＯＰＡＣ１２８０（商標）プレートの左と右のカラムは空であり、それらは未処理対照として機能した。細胞傷害性および／または成長阻害（すなわち、ＡＰ染色またはクリスタルバイオレット染色の低下）を示すｈＥＳＣ試料またはＮＰＣ試料を特定した。図７ＡおよびＢの丸で囲ったウェルを参照のこと。少なくとも２つの異なる細胞種、すなわち、ｈＥＳＣとＮＰＣに対していくらか細胞傷害性効果または阻害性効果を示す４１種の異なる化合物が一次スクリーニングにより特定された。このスクリーニングにおいて特定された各候補化合物の名称と活性の分類を記載する下記の表６を参照のこと（表５に記載される塩化ケレリトリンを除く）。その後のスクリーニングの回にはＣｈＣｌを含めなかった。したがって、４０種の化合物だけをさらに試験した。
【０１７７】
０．１μΜから５０μΜまでの範囲の様々な濃度を用いて、表６の４０種の化合物を、ｈＥＳＣおよびＮＰＣを用いる再スクリーニング（二次スクリーニング）にかけた。二次スクリーニングの間に細胞傷害性を生じた化合物の最低濃度を有効用量（ＥＤ）として定
義した。図８は、細胞を含むウェルをＡＰで染色した結果を示す。色が濃いウェルが、ウェル内で増殖または成長する万能性幹細胞の数またはパーセンテージの増加を示した。さらに、分化中の胚体内胚葉（ＤＥ）細胞培養物について（上述した）９６ウェルプレートインピーダンス分析でこれらの４０種の化合物をスクリーニングにかけ、これらの化合物のうちのどれが、ｈＥＳＣかＮＰＣに対しての最小有効用量で胚体内胚葉細胞に対して細胞傷害性を持たないか判定した。分化中のＤＥ培養物に対して細胞傷害性を持たないようであった化合物に「生存可能」と印をつけたが、それは、その化合物が分化細胞の生存、成長、増殖または分化に影響を与えなかったことを意味する。表６の「ＡＣＥＡ  ＤＥ」カラムを参照のこと。前の焦点を当てたスクリーニングで特定された２種の化合物（実施例１を参照のこと）を含む２０種の化合物がｈＥＳＣに対して細胞傷害性を持っていたが、同時に、それらは胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の生存、成長、増殖または分化に明確な影響を与えなかった。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０１７８】
次に、懸濁凝集培養の分化したｈＥＳＣを用いて上記の２０種の候補化合物（表６：ＡＣＥＡ  ＤＥ「生存可能」）をスクリーニングにかけた。ヒトＥＳＣ（ＣｙＴ４９細胞）を培養し、そして、ステージ１（胚体内胚葉）とステージ２（前腸内胚葉）に懸濁状態で分化させた。上述したように、そして、表６に示されるように各化合物の最小有効用量を決定し、そして、この濃度の化合物に分化中の細胞培養物を第１日（ｄ１）から第２日（ｄ２）まで曝露した。次に、ステージ２の最後（約第５日、ｄ５）まで培養物をさらに分化させた。Ｑ‐ＰＣＲによるマーカー遺伝子の発現解析のためにｄ２およびｄ５でＲＮＡ試料を採取した。化合物で処理した試料を分化中の未処理対照試料と比較し、そして、以前に認定された胚体内胚葉分化過程のｄ２試料に対して正規化した。図９の対照を参照のこと。処理された分化中の凝集体が悪化した、生存できなかった、またはＱ‐ＰＣＲによってそれらを調べることができなかったので、いくつかの化合物をさらなる検討から排除
した。対象外の分化（非内胚葉系列または非膵臓系列）とＰＡＸ６またはＣＤＸ２の発現の上昇を誘導するようであったので（図９Ｇおよび９Ｈ）、さらなる検討からその他の化合物をいくつか排除した。
【０１７９】
（対象外の分化を誘導した化合物を除いた）上記の化合物の効果をさらに決定するために、膵臓分化の後期のステージ（例えば、ステージ２〜５）での効果について、３種の選択された化合物（塩化ケレリトリン（図５および６）、コーヒー酸およびイベルメクチン）をスクリーニングにかけた。まず、上記と同様に、ヒトＥＳＣをステージ１に、次にステージ２〜５に懸濁凝集培養物中で分化させた。実質的に上述した通りにＤＭＳＯ、コーヒー酸またはイベルメクチンでステージ１培養物を処理した。未処理対照試料をｄ０（ｈＥＳＣ）およびｄ１で採取し（図１０、左のパネル）、処理試料を第２日、第３日、第５日、第７日、第９日、第１１日および第１３日で採取した（それぞれ、図１０のｄ２、ｄ３、ｄ５、ｄ７、ｄ９、ｄ１１およびｄ１３）。採取した試料における遺伝子発現レベルを、Ｑ‐ＰＣＲを用いて解析し、そして、ｄ０（ｈＥＳＣ）試料ならびに認定された膵臓内胚葉（図１０、右パネル）と比較した。認定された膵臓内胚葉対照は、フローサイトメトリーによって判定されたように、約５０％の膵臓内胚葉、約４６％の内分泌細胞および約４％の「他の」細胞からなる。コーヒー酸もイベルメクチンも膵臓内胚葉分化の生存、成長および／または増殖に影響を与えなかった。すなわち、選択された化合物はｈＥＳＣの成長と増殖を阻害もしくは妨害した、または、ｈＥＳＣに対して細胞傷害性を有したが、同時に、膵臓内胚葉の生存度には影響を与えなかった。ステージ３、４および５の細胞に典型的な遺伝子発現レベルは正常であった。例えば、ステージ４、すなわち、膵臓内胚葉でのＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１Ａ（図１０Ｈおよび１０Ｉ）、ならびにステージ５、すなわち、内分泌前駆細胞および内分泌細胞でのＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２（図１０Ｆおよび１０Ｇ）の発現の上昇が観察された。
【０１８０】
要約すると、一次および二次スクリーニング（実施例１）とＬＯＰＡＣ１２８０（商標）コレクションの完全スクリーニング（実施例２）の両方から特定された最後の３種の候補は塩化ケレリトリン、コーヒー酸およびイベルメクチンであった。図１１はこれらの３種の化合物の公知または推測される作用モードならびにそれらの構造を記載する。リアルタイムインピーダンス分析を用いて、接着培養で増殖する未分化ｈＥＳＣに対するそれぞれの細胞傷害性効果のＥＣ５０値を決定した。
【０１８１】
実施例３：分化細胞集団中の万能性幹細胞に対する選択
細胞培養物（例えば、分化中の細胞または分化細胞培養集団）における未分化万能性幹細胞の存在および／または除去を追跡するために、万能性幹細胞の検出と、したがって、除去を向上する分析法を開発した。Ｑ‐ＰＣＲによってｍＲＮＡ発現の変化を測定することができるが、既に低レベルの未分化万能性幹細胞での低下を検出するにはこの方法だけでは充分に機能的ではない。同様に、分化の最中の細胞は低レベルの、時には中間レベルのＯＣＴ４タンパク質をなお発現するような場合があり、例えば、胚体内胚葉細胞に移行しているところのｈＥＳ細胞はＯＣＴ４＋／ＳＯＸ１７＋について共陽性であり得るので、ステージ１（胚体内胚葉分化）でのＯＣＴ４タンパク質だけの免疫蛍光検出（または免疫組織化学）は決定的ではない。
【０１８２】
上述したように、回転培養でヒトＥＳ細胞懸濁凝集物を形成し、そして、ステージ１（胚体内胚葉）に分化させた。１：２００に希釈したマトリゲル（商標）で被覆した４ウェル組織培養ディッシュにウェル当たり約２０〜３０個の凝集体をプレーティングし、そして、ｈＥＳＣ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のＸＦ‐ＫＳＲ、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン）中で２４時間培養した。このアプローチは、未分化ｈＥＳＣと分化過程に拘束された細胞の間でのＯＣＴ４の発現の差異を増大させることを意図するものであった。ヘレグリン‐ＥＲＢＢ２／３およびインスリン‐インスリ
ン受容体／ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達の存在下では、未分化ｈＥＳＣは高いＯＣＴ４遺伝子の発現を示すであろうが、分化段階に拘束された細胞はＯＣＴ４遺伝子発現の下方制御を示すであろう。つまり、ｈＥＳＣ培地での混合集団細胞培養物は残存する未分化（ｈＥＳＣ）の増大／増殖を助ける可能性があるが、それによって、ＯＣＴ４遺伝子の発現を低下させていたであろう分化過程に拘束された細胞と比較して上昇したＯＣＴ４遺伝子の発現を示す。プレーティングされた凝集体をＯＣＴ４タンパク質について免疫染色し、そして、細胞核染色剤であるＤＡＰＩで対比染色した（図１２）。プレーティングされた細胞凝集体が２４時間の内に扁平化し、拡散した。一方、凝集体の中央はなお盛り上がっていた。その盛り上がりは目に見えるものであったが、それは、凝集体は高さがたった約２０〜４０μｍであることを示唆した。薄く染色されているＯＣＴ４陽性細胞が簡単に特定され、そして、大多数のＯＣＴ４陰性細胞から区別できた。ＯＣＴ４陽性細胞は一般に、プレーティングされた凝集体の盛り上がった領域内に最も頻繁にクラスター状に見つかった。通常はプレーティングされた最小の凝集物にたった１つのＯＣＴ４陽性クラスターが観察されたが、より大きい凝集体には２つ以上のクラスターがあった。図１２Ｃ〜Ｅと比較して、図１２Ａおよび１２Ｂを参照のこと。ＤＡＰＩで染色された細胞培養物の解析によると、複数のＯＣＴ４陽性クラスターが同定された場合、それぞれが異なるより小さい凝集体または比較的大きい凝集体内の亜領域と関連しているようであったので、比較的大きい凝集体はより小さい凝集体からなることが示唆された。より大きい凝集体の中に在るより小さい凝集体は、小さいクラスター（一次凝集体）が最初に形成する回転培養の初期ステージまたは凝集過程の結果として生じる可能性がある。２つ以上の一次凝集体の凝集が、その直径が１００〜１５０μｍになり得るより大きい二次凝集体の形成を引き起こすようである。したがって、一次凝集体の中央にＯＣＴ４陽性細胞の任意の１つのクラスターが存在し、そして、それが分化に抵抗する可能性がある。そのようなクラスターが実質的に未分化のままであり、そして、ＯＣＴ４陽性に染色されるのであろう。一次凝集体は、それらの一次凝集体と二次凝集体での配置に呼応して分化するよう分化運命が決定されるというのが１つの仮説である。例えば、図１２Ａ〜１２Ｅは、ＯＣＴ４陽性クラスター（黒色の円）を含む、プレーティングされた小さい（一次）凝集体（例えば、図１２Ａおよび１２Ｂ）およびプレーティングされたより大きい（二次）凝集体（例えば、図１２Ｃ〜１２Ｅ）からの一連の代表的な画像を示す。したがって、凝集の過程および／またはカイネティクスを変えることが分化の全体的な効率を改善するが、また、明らかに分化に抵抗している、または分化していない細胞に対する影響を持つ可能性がある。
【０１８３】
上述したプレーティングアッセイを用いてステージ１分化過程でのＯＣＴ４陽性細胞の除去が調査された。ｈＥＳ細胞に対するＥＣ５０濃度の実施例２に記載した候補化合物（塩化ケレリトリン、コーヒー酸およびイベルメクチン）で第１日から第２日までステージ１分化過程のｈＥＳ細胞を処理した。プレーティングされた未処理凝集体およびＤＭＳＯ処理凝集体は区別がつかず、両方が別々に分離したＯＣＴ４陽性細胞のクラスターを含有した。ＤＭＳＯ処理試料について図１３Ａの上のパネルと下のパネルを参照のこと。ＤＭＳＯで処理した分化中の凝集細胞培養物（対照）でのＯＣＴ４陽性染色の強度は未分化ｈＥＳ細胞と同等であった。しかしながら、１．４μΜの塩化ケレリトリン（図１３Ｂ）、０．１７μΜのイベルメクチン（図１３Ｃ）または０．１μΜのコーヒー酸（図１３Ｅ）で処理した凝集細胞培養物は著しく低下したＯＣＴ４染色の強度を示した。ＯＣＴ４陽性細胞のクラスターを観察することができたが、未処理対照またはＤＭＳＯ対照と比較してずっと低いレベルであった。さらに、別の研究では、ｈＥＳＣ培地にプレーティングしてから２４時間後に存在するＯＣＴ４陽性クラスターのサイズが、０．１μΜのコーヒー酸での処理によってさらに著しく減少することになった。図１４を参照のこと。
【０１８４】
より高い濃度の化合物を用いて追加実験を行ったが、その実験は、染色前に２４時間または７２時間ｈＥＳＣ培地で培養された細胞培養物播種凝集体でのその化合物の効果を拡大した（図１５および１６）。ｈＥＳＣ培地での培養時間の延長がＤＭＳＯ処理された凝
集体のＯＣＴ４陽性クラスターのサイズの全般的な拡大を助けたが（図１５Ａ）、このことは、細胞が増殖し、分化過程に拘束されていない未分化細胞をさらに生成することができたことを強く示唆する。別のグループのステージ１の分化中の培養物を並行して処理したが、１０μＭの塩化ケレリトリンで処理した。プレーティングしてから２４時間後にＯＣＴ４陽性細胞の数が塩化ケレリトリンによってかなり少なくなった。約７２時間まで、ＯＣＴ４陽性細胞が増殖していたようであったが、対照培養物でＯＣＴ４陽性細胞について観察された程度よりも明らかに低かった。同様に、５μＭまたは１０μＭのコーヒー酸（図１６）で処理された細胞懸濁凝集物では、ＯＣＴ４陽性細胞のクラスターは、ＤＭＳＯ処理（または未処理）対照のものと比較して、２４時間でそのサイズが小さいようであったし、７２時間でＤＭＳＯ処理対照と比較してＯＣＴ４陽性細胞のクラスターがあまり拡大しなかった。図１６を参照のこと。
【０１８５】
ｈＥＳＣ培地に曝され、ｈＥＳＣ培地で維持される場合、未分化万能性細胞は２日間のステージ１分化過程の最後までそのままでいることができ、増殖することができ、そして、ＯＣＴ４タンパク質の発現の存在によって示されるように、それらの未分化状態または万能性状態を維持することができることをこれらのデータは示している。少なくとも、塩化ケレリトリンおよびコーヒー酸を含む候補選択的細胞傷害性化合物での処理により、未処理対照またはＤＭＳＯ対照と比較して、ＯＣＴ４陽性細胞の割合（または数）が減少し、ならびに、長期培養物におけるＯＣＴ４陽性細胞の残留性が低下する。したがって、選択的万能性細胞傷害性化合物の使用によって未分化細胞または万能性細胞のレベルを効果的に低下させることができ、そして、仮に細胞療法のために移植される場合、インビボでの奇形腫の発生頻度を最終的に低下させる。さらに、未分化細胞または万能性細胞のレベルの低下が、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の治療のための治療法など、細胞ベースの治療法において、望ましくない対象外の（非内胚葉）系列の過剰増殖の可能性をさらに低下させることができる。
【０１８６】
実施例４：その他の細胞傷害性／阻害性化合物の特定
対象外の細胞種または非内胚葉細胞種に対して選択的に細胞傷害性または阻害性である化合物、ならびにｈＥＳＣの他の細胞種への分化に有用な化合物を特定することも興味深い。選択的阻害性または細胞傷害性活性についてｈＥＳＣ細胞傷害性化合物および阻害性化合物ならびに／または、ライブラリーの化合物など、その他の候補細胞傷害性化合物および阻害性化合物をスクリーニングにかける。一次スクリーニングでは、ｈＥＳＣ、内胚葉系細胞（すなわち、非膵臓内胚葉系細胞または膵臓内胚葉系細胞）、外胚葉系細胞または中胚葉系細胞に対して細胞傷害性を試験する。標準９６ウェルトレイのウェル当たり約３×１０４個の細胞を適切な培地中で培養し、そして、毎日栄養補充する。プレーティングの１日後に１０μΜの各候補化合物を添加し、そして、細胞をさらに１〜２日から約２週間培養する。
【０１８７】
次に、プレートを固定し、そして、クリスタルバイオレットまたは相対的な増殖もしくは成長活性を明らかにすることができる別の一般的な細胞染色剤で染色する。アルカリホスファターゼについてｈＥＳＣを含むプレートを染色する。染色の低下は、候補化合物で処理した試料における細胞の数または割合の低減を示す。細胞傷害性および／または成長阻害を示す試料が特定される。分析した細胞種に対して細胞傷害性または阻害性効果を示す化合物が一次スクリーニングによって特定される。
【０１８８】
約０．１から約５０μΜまでの範囲の様々な濃度を用いて、一次スクリーニングで特定された化合物をｈＥＳＣ、および非標的内胚葉系細胞、外胚葉系細胞または中胚葉系細胞から選択される２種以上の細胞種に対して再スクリーニング（二次スクリーニング）にかける。二次スクリーニングの間に細胞傷害性を生じる化合物の最低濃度を有効用量（ＥＤ）として決定する。次に、二次スクリーニングからの化合物を対象の分化中の細胞培養物
、例えば、胚体内胚葉（ＤＥ）に対してスクリーニングにかける。ある実験では、二次スクリーニングからの候補化合物のどれが最小有効用量で対象の分化中の細胞（例えば、胚体内胚葉）に対して細胞傷害性を持たないか決定するために、（上述した）９６ウェルプレートインピーダンス分析を用いる。対象の分化中の細胞に対して細胞傷害性を持たないようである化合物に「生存可能」と印をつけるが、それは、その化合物が対象の分化細胞の生存、成長、増殖または分化に影響を与えないことを意味する。
【０１８９】
次に、懸濁凝集培養の分化したｈＥＳＣを用いて、「生存可能」とスコアされた候補化合物をスクリーニングにかける。ヒトＥＳＣを培養し、懸濁状態で対象の分化細胞種に分化させる。（上述した）二次スクリーニングから最小有効量を決定し、そして、対象の系譜に沿って分化する細胞培養物を分化過程中の様々な時点でこの濃度の化合物に曝露する。場合により、その分化過程の最後まで培養物をさらに分化させる。対象の分化および対象外の分化に特徴的なマーカーの遺伝子発現を解析するために、処理および分化過程の様々な時点でＲＮＡ試料を採取する。化合物で処理された試料を未処理の分化中の対照試料と比較し、そして、以前に認定された対象の分化過程の試料に対して正規化する。対象の細胞種の分化が影響を受ける、または、対象の分化中の細胞が処理によって悪化する、もしくは生存できなくなることを理由に、化合物がさらなる検討から排除される。対象外の分化を誘導することを理由に、その他の化合物がさらなる検討から排除される。
【０１９０】
こうして特定された化合物の効果をさらに決定するために、対象の分化過程の後期のステージでの効果について選択された化合物をスクリーニングにかける。ヒトＥＳＣを懸濁凝集培養状態で対象の分化過程の初期から中期のステージまで分化させる。分化過程の初期から中期のステージの間に実質的に上述した通りにＤＭＳＯまたは候補化合物で培養物を処理する。未処理試料、ＤＭＳＯ処理試料および候補化合物処理試料をｄ０（ｈＥＳＣ）、ｄ１および分化過程中に時折採取する。採取した試料中の対象の分化過程および対象外の分化過程のマーカーの遺伝子発現レベルを解析し、そして、ｄ０（ｈＥＳＣ）試料ならびに認定された対象の分化過程に対して比較する。いくつかの実験では、上記のように採取された試料内に存在する細胞種はフローサイトメトリー、直接的観察または免疫組織化学によっても決定される。ｈＥＳＣまたは対象外の分化のパーセンテージまたは数が小さいとき、分析の前に非分化条件で（例えば、ＥＳ細胞培地中で）細胞試料を増大させることができる。対象の分化の生存、成長および／または増殖に影響を与えないが、ｈＥＳＣおよび／もしくは対象外の分化細胞種の成長および増殖を妨害し、またはｈＥＳＣおよび／もしくは対象外の分化細胞種に対して細胞傷害性である候補化合物をさらなる研究のために選択する。
【０１９１】
したがって、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書において開示された実施形態に対して様々な置換、改変もしくは最適化、またはその組合せを行うことができることが当業者に明らかとなる。
【０１９２】
下記の特許請求の範囲およびこの開示において使用される場合、「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、その句の後に記載されるあらゆる要素、および記載された要素に関する開示において特定化された活性または作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定されるあらゆる要素を含むことを意味する。したがって、「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、記載された要素は必要または必須であるが、他の要素は選択的であり、記載された要素の活性または作用に影響を与えるか否かに応じてあってもなくてもよいということを表す。
【図１Ａ】
0005875597.tif 000036
【図１Ｂ】
0005875597.tif 000037
【図１Ｃ】
0005875597.tif 000038
【図２】
0005875597.tif 000039
【図４Ａ】
0005875597.tif 000040
【図４Ｂ】
0005875597.tif 000041
【図４Ｃ】
0005875597.tif 000042
【図４Ｄ】
0005875597.tif 000043
【図４Ｅ】
0005875597.tif 000044
【図４Ｆ】
0005875597.tif 000045
【図４Ｇ】
0005875597.tif 000046
【図５Ａ】
0005875597.tif 000047
【図５Ｂ】
0005875597.tif 000048
【図５Ｃ】
0005875597.tif 000049
【図５Ｄ】
0005875597.tif 000050
【図５Ｅ】
0005875597.tif 000051
【図５Ｆ】
0005875597.tif 000052
【図５Ｇ】
0005875597.tif 000053
【図５Ｈ】
0005875597.tif 000054
【図５Ｉ】
0005875597.tif 000055
【図５Ｊ】
0005875597.tif 000056
【図５Ｋ】
0005875597.tif 000057
【図５Ｌ】
0005875597.tif 000058
【図５Ｍ】
0005875597.tif 000059
【図６Ａ】
0005875597.tif 000060
【図６Ｂ】
0005875597.tif 000061
【図６Ｃ】
0005875597.tif 000062
【図６Ｄ】
0005875597.tif 000063
【図６Ｅ】
0005875597.tif 000064
【図６Ｆ】
0005875597.tif 000065
【図９Ｂ】
0005875597.tif 000066
【図９Ｃ】
0005875597.tif 000067
【図９Ｄ】
0005875597.tif 000068
【図９Ｅ】
0005875597.tif 000069
【図９Ｆ】
0005875597.tif 000070
【図９Ｇ】
0005875597.tif 000071
【図９Ｈ】
0005875597.tif 000072
【図１０Ａ】
0005875597.tif 000073
【図１０Ｂ】
0005875597.tif 000074
【図１０Ｃ】
0005875597.tif 000075
【図１０Ｄ】
0005875597.tif 000076
【図１０Ｅ】
0005875597.tif 000077
【図１０Ｆ】
0005875597.tif 000078
【図１０Ｇ】
0005875597.tif 000079
【図１０Ｈ】
0005875597.tif 000080
【図１０Ｉ】
0005875597.tif 000081
【図１１】
0005875597.tif 000082
【図３Ａ】
0005875597.tif 000083
【図３Ｂ】
0005875597.tif 000084
【図３Ｃ】
0005875597.tif 000085
【図３Ｄ】
0005875597.tif 000086
【図７Ａ】
0005875597.tif 000087
【図７Ｂ】
0005875597.tif 000088
【図８】
0005875597.tif 000089
【図９Ａ】
0005875597.tif 000090
【図１２Ａ】
0005875597.tif 000091
【図１２Ｂ】
0005875597.tif 000092
【図１２Ｃ】
0005875597.tif 000093
【図１２Ｄ】
0005875597.tif 000094
【図１２Ｅ】
0005875597.tif 000095
【図１３Ａ】
0005875597.tif 000096
【図１３Ｂ】
0005875597.tif 000097
【図１３Ｃ】
0005875597.tif 000098
【図１３Ｄ】
0005875597.tif 000099
【図１３Ｅ】
0005875597.tif 000100
【図１４Ａ】
0005875597.tif 000101
【図１４Ｂ】
0005875597.tif 000102
【図１５Ａ】
0005875597.tif 000103
【図１５Ｂ】
0005875597.tif 000104
【図１５Ｃ】
0005875597.tif 000105
【図１５Ｄ】
0005875597.tif 000106
【図１６】
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【図１７】
0005875597.tif 000108
【配列表】
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