(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血管新生効果を有し、Ｓｌｉｔファミリーのタンパク質との相互作用能を保持するＲｏｂｏ１タンパク質の細胞外ドメインまたはこのドメインの一部、リンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む、Ｒｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質であって、
ＦｃドメインがＳ２４１ＰおよびＬ２４８Ｅ変異を含むヒト免疫グロブリンＧ４であり、Ｃ末端位置に局在するリジンが不存在であり、
Ｒｏｂｏ１の細胞外ドメインまたはこのドメインの一部が、Ｉｇ１およびＩｇ２免疫グロブリンドメインを含む、前記Ｒｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質。
【請求項２】
Ｒｏｂｏ１の細胞外ドメインが、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列から成り、Ｓｌｉｔファミリーのタンパク質との相互作用能を保持するタンパク質
である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｆｃドメインが、タンパク質の安定性の増加および／またはＦｃドメインの残留エフェクター活性の排除および／または生成の間の均一性の増加を目的とする少なくとも１個の点突然変異を含有する、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
生成の間の均一性を増加させるように、配列番号４のアミノ酸Ｓｅｒ２０およびＡｒｇ２１に相当するアミノ酸が欠失している、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列が、
（ａ）配列番号４、配列番号６または配列番号２４の配列であるか、又は
（ｂ）配列番号４、配列番号６または配列番号２４の配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号４、配列番号６または配列番号２４の配列を有するタンパク質をコードする発現プラスミドをＣＨＯ細胞に形質移入し、培養上清中で回収し、精製することにより生成される、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質の１種をコードする核酸分子。
【請求項８】
（ａ）配列番号３、配列番号５もしくは配列番号２３の配列から成る核酸、又は
（ｂ）配列番号３、配列番号５もしくは配列番号２３の配列を有する分子と少なくとも９５％の同一性を有する配列から成り、請求項１から５のいずれか一項に記載のＲｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質をコードする核酸
から選択される核酸分子。
【請求項９】
医薬品の製造のための、請求項１から６のいずれか一項に記載のＲｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質の使用。
【請求項１０】
医薬品が癌を治療するためのものである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
癌が肝臓癌である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
Ｒｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質が内皮細胞増殖を阻害しない、請求項９から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
癌が肺癌または肺転移である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＲｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質および少なくとも１種の賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＲｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質を含む、患者におけるＳｌｉｔファミリーの分子の過剰発現を検出するための診断ツール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質Ｒｏｂｏ１−ＦｃおよびＳｌｉｔタンパク質が過剰発現される疾患、特に癌を治療するためのこの使用に関する。本発明はまた、このような組換えタンパク質を含む組成物に関する。本発明の別の態様は、患者におけるＳｌｉｔファミリーの分子の過剰発現を検出するための診断ツールとしてのＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子の使用からなる。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｌｉｔリガンドは、まず第１に、神経細胞発達における軸索成長の阻止におけるこれらの役割について記載された。これ以降、Ｒｏｂｏ／Ｓｌｉｔ調節経路は腫瘍血管新生においても記載されている。具体的には、Ｒｏｂｏ４／Ｓｌｉｔ２経路がＶＥＧＦへの内皮細胞の応答の阻害について記載されている（Ｊｏｎｅｓ  Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ  １４，４４８−４５３（２００８））。Ｒｏｂｏ／Ｓｌｉｔ経路による調節により、内皮非成熟新血管または芽状突起の過剰増殖（非生産的血管新生）を導くことおよびこれらの血管を成熟させることが可能となる。転写レベルにおけるＳｌｉｔ２の発現は、幾つかのヒト癌系、特に結腸癌に由来するＨＣＴ１１６、卵巣癌に由来するＳｋｏｖ−３、子宮頸癌に由来するＨｅＬａ、黒色腫に由来するＭＤＡ−ＭＢ−４３５、子宮癌に由来するＨｅｃ−１Ａ、最後に腎癌に由来する７６９−Ｐにおいて実証されている（Ｓｔｅｌｌａ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｖｏｌ．２０，Ｉｓｓｕｅ  ２，６４２−６５７）。Ｓｌｉｔ２タンパク質の過剰発現は、癌腫：口腔癌（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００８  Ｍａｒ；９９（３）：５１０−７）、前立腺癌（Ｌａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｊａｎ  ２０；１０３（３）：３０６−１５）、結腸癌（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｊｕｌｙ  ２００３，Ｐａｇｅｓ  １９−２９）および肝癌（Ａｖｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ，８：３９２）に由来するヒト組織上でも実証されている。さらに近年、Ｓｌｉｔ２タンパク質の過剰発現は、子宮内膜症の試料上で示されている（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９，ＡＪＰ  １７５（２）：４７９）。
【０００３】
Ｒｏｂｏ１タンパク質は、２種のアイソフォームａおよびｂとして存在する。Ｒｏｂｏ１タンパク質アイソフォームｂ（ＮＰ＿５９８３３４）の細胞外ドメインは、５種の免疫グロブリンドメイン：Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４およびＩｇ５を含む。Ｒｏｂｏタンパク質は、Ｉｇ１およびＩｇ２ドメインのレベルにおいてＳｌｉｔリガンドと相互作用する。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２６：２３２−２４０）は、Ｓｌｉｔとの相互作用およびＲｏｂｏの活性（化学反発）におけるＩｇ２ドメインの重要性を実証している。
【０００４】
Ｒｏｂｏ１およびＳｌｉｔ２タンパク質に特異的な抗体の使用は、出願ＷＯ２００３／０７５８６０に記載されている。これらの抗体により、腫瘍血管新生を阻害することが可能となる。
【０００５】
しかしながら、癌を治療するための代替アプローチ、特にＳｌｉｔ２シグナリング経路を阻害することができる分子を提案することは有利である。
【０００６】
本発明者らは、Ｓｌｉｔリガンドを結合させることができ、結果的にＲｏｂｏ／Ｓｌｉｔ経路の細胞内シグナリングを阻害することができる可溶性キメラＲｏｂｏ１受容体の方策を開発した。驚くべきことに、本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子は、成熟血管の形成を防止することおよび内皮細胞の増殖を阻害しないことにより、抗血管新生効果を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０７５８６０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ  Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ  １４，４４８−４５３（２００８）
【非特許文献２】Ｓｔｅｌｌａ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｖｏｌ．２０，Ｉｓｓｕｅ  ２，６４２−６５７
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００８  Ｍａｒ；９９（３）：５１０−７
【非特許文献４】Ｌａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｊａｎ  ２０；１０３（３）：３０６−１５
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｊｕｌｙ  ２００３，Ｐａｇｅｓ  １９−２９
【非特許文献６】Ａｖｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ，８：３９２
【非特許文献７】Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９，ＡＪＰ  １７５（２）：４７９
【非特許文献８】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２６：２３２−２４０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主題は、Ｒｏｂｏ１タンパク質アイソフォームｂの細胞外ドメインまたはこのドメインの一部、結合領域（リンカー）および免疫グロブリンＦｃドメインを含むＲｏｂｏ−Ｆｃ組換えタンパク質である。
【００１０】
１つの特定の実施形態において、Ｒｏｂｏ１タンパク質アイソフォームｂの細胞外ドメインは、Ｉｇ１およびＩｇ２ドメインからなる。これらのドメインは、配列番号１の核酸配列によりコードされる配列番号２のペプチドまたは配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列に対応する。
【００１１】
融合タンパク質は、「リンカー」とも称される結合領域も含む。本発明に関連して、リンカーにより、特にインビボ開裂を制限することにより組換えタンパク質の安定性を生じさせることが可能となる。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ分子において使用することができるリンカーは、例えばＧｌｕＡｒｇＰｒｏＳｅｒＰｈｅＶａｌおよびＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒである。当業者は、この使用に好適なリンカーを選択するための十分な見識を有する。
【００１２】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ組換え分子のＦｃドメインは、免疫グロブリンの結晶化可能な断片に対応する。このＦｃ断片は、種々の免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来し得る。この断片は、免疫応答のエフェクター機能を担う（ＷＯ２００８／０６５５４３）。
【００１３】
本発明による一実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する。１つの特定の実施形態において、特に２種のＦｃドメインから構成されるヒンジ領域を安定化することにより分子の安定性を増加させるように（Ａｎｇｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１０５−１０８）、ＩｇＧ４−Ｆｃの残留活性、特にエフェクター活性を低減または排除するように（ＷＯ９７／０９３５１）、および組換えタンパク質の生成の間の均一性を増加させるように少なくとも１個の点突然変異または欠失をＩｇＧ４Ｆｃドメイン内に導入した。特に、少なくとも２個の点突然変異、好ましくは３点突然変異をＩｇＧ４Ｆｃドメイン内に導入した。本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３分子において、好ましい突然変異は以下のものである：
Ｆｃヒンジ領域内のジスルフィド架橋結合を安定化するためのＳ２４１Ｐ（Ｋａｂａｔナンバリング）；
ＩｇＧ４−Ｆｃドメインの残留エフェクター活性を排除するためのＬ２４８Ｅ（Ｋａｂａｔナンバリング）；
タンパク質の不均一性を低減するためのＣ末端リジンの不存在。
【００１４】
Ｒｏｂｏ１アイソフォームｂのＩｇ１およびＩｇ２ドメイン、リンカーならびに上記の突然変異させたＩｇＧ４ドメインを含む本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３である。
【００１５】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１は、配列番号３の核酸配列によりコードされる配列番号４の配列のタンパク質に対応する。
【００１６】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２は、配列番号５の核酸配列によりコードされる配列番号６の配列のタンパク質に対応する。
【００１７】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２は、リンカーの性質の点で異なる。
【００１８】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３は、配列番号２３の核酸配列によりコードされる配列番号２４の配列のタンパク質に対応する。
【００１９】
本発明の１つの特定の実施形態において、生成の間の均一性を増加させるように１個以上の点突然変異または欠失を導入した。特に、１個のアミノ酸、好ましくは２個のアミノ酸をＮ末端位置においてトランケートした。本発明によるこのようなＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子は、２個のアミノ酸（Ｓｅｒ２０およびＡｒｇ２１）がトランケートされ、アミノ酸Ｌｅｕ２２がインターロイキン２のシグナルペプチドに融合しているＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３分子である。
【００２０】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子の均一性は、上記のとおりＣ末端Ｌｙｓを欠失させることによっても増加される。
【００２１】
本発明の主題はまた、タンパク質配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号２４の配列に対応し、または配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号２４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するタンパク質である。これらのタンパク質バリアントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号２４の配列を有するタンパク質と同一の生物学的活性、特にＳｌｉｔファミリーのタンパク質とのこれらの相互作用能を有する。
【００２２】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、これらのタンパク質をコードする発現プラスミドを、真核組換えタンパク質の発現に好適な任意の細胞タイプ：ＨＥＫ２９３、ＣＨＯなどに形質移入し、次いで培養上清中で回収し、慣用の方法に従って精製することにより生成することができる。
【００２３】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３タンパク質の特性決定により、これらのタンパク質が生物学的治療剤としての投与に要求される質を有することを確認することが可能となった。
【００２４】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、Ｓｌｉｔファミリーのタンパク質との相互作用能を有する。
【００２５】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、具体的には、ヒトＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２およびＳｌｉｔ３タンパク質ならびにマウスＳｌｉｔ２タンパク質を、特にこれらのＤ２ドメインとの相互作用により認識する。これらの親和性は、Ｓｌｉｔファミリーの３種のメンバーに関して同様である。
【００２６】
本発明による別の主題は、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子に対応する。
【００２７】
従って、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号２３の配列に対応し、または配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号２３の配列を有する分子と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する核酸分子は、本発明の一部である。
【００２８】
本発明による別の主題は、Ｓｌｉｔファミリーのタンパク質が過剰発現される疾患を治療するための、本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の使用からなる。
【００２９】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃにより標的化することができるＳｌｉｔファミリーのタンパク質は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２またはＳｌｉｔ３である。
【００３０】
Ｒｏｂｏ１は、Ｓｌｉｔファミリーの種々のメンバーと相互作用することできることが示された。結果的に、本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質が、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２およびＳｌｉｔ３により媒介されるシグナリング経路を同時に阻害することができ、このことによりこれらの経路の１種のみに特異的な抗体と比較して治療スペクトルを拡大することが可能となることに留意することは有利である。
【００３１】
別の実施形態において、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、内皮細胞増殖を阻害することなく血管新生を阻害することにより、Ｓｌｉｔファミリーのタンパク質が過剰発現される疾患を治療するために使用される。血管成熟欠如に結びつくこの抗血管新生活性は、「非生産的血管新生」と称される。
【００３２】
具体的には、実験的研究は、本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子が内皮細胞増殖を阻害することなく小管の形成を阻害することができることを示した。このことにより、肺癌のマウスモデルにおける腫瘍容積を極めて顕著に低減することが可能となる。
【００３３】
１つの好ましい実施形態において、Ｓｌｉｔタンパク質が過剰発現される疾患を治療するために使用することができるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３ならびにこれらから誘導され、特に分子の生物学的特性を顕著に改変することなく生成の間の均一性を増加することを目的とする点突然変異または欠失を含む分子である。
【００３４】
一般に、本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質により治療することができる疾患は、Ｓｌｉｔ経路の阻害が治療効果を有することができる全ての疾患、特にＳｌｉｔファミリーのタンパク質が過剰発現される疾患および特にＳｌｉｔ２が過剰発現される疾患である。
【００３５】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子はＳｌｉｔ２分子を特異的に結合させるので、前記分子が、Ｓｌｉｔ２が関与する２種の経路、即ちＲｏｂｏ１／Ｓｌｉｔ２およびＲｏｂｏ４／Ｓｌｉｔ２経路を同時に阻害することができることに留意することは興味深い。
【００３６】
従って、本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、癌、特に膵癌、結腸癌、リンパ行性転移を有するまたは有さない結腸直腸癌、乳癌、肺癌および肺転移、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、腎癌、口腔癌、前立腺癌、肝癌などを治療するために使用することができる。
【００３７】
１つの特定の実施形態において、Ｒｏｂｏ−Ｆｃタンパク質は、肺癌および肺転移を治療するために使用される。
【００３８】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子は、現行治療の代替物または補助物としての抗癌医薬品として使用することもできる。
【００３９】
特に、これらの分子は、抗癌化合物と組み合わせて（場合により同時に）投与することができる。
【００４０】
本発明の別の主題は、上記定義のＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質および１種以上の医薬的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。
【００４１】
本発明によるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与などを目的とする医薬組成物に配合することができる。好ましくは、医薬組成物は注射配合物のための医薬として許容されるビヒクルを含有する。これらのビヒクルは、特に等張滅菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）または適切な場合に滅菌水もしくは生理食塩水の添加により注射溶質の形成を可能とする乾燥、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【００４２】
本発明の別の態様は、患者におけるＳｌｉｔファミリーの分子の過剰発現を検出するための診断ツールとしてのＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子の使用からなる。これは、Ｓｌｉｔ経路が多くの癌に関与することが示されているからである。Ｓｌｉｔシグナリング経路の撹乱を評価するための試験の提供は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ分子の投与に基づく治療に応答することができる患者を選択する目的に極めて有用である。
【００４３】
この診断ツールは、Ｓｌｉｔ分子の過剰発現を示す傾向がある患者からの生物試料（血液、尿、腫瘍生検物）との接触に好適な形態のＲｏｂｏ１−Ｆｃ分子を含む既製のキットの形態であり得る。Ｒｏｂｏ−Ｆｃ分子は、場合により予備標識することができ、Ｒｏｂｏ−ＦｃおよびＳｌｉｔの組合せを検出して対照試料と比較して生物試料中のＳｌｉｔタンパク質の発現の増加を評価する。このキットは、例えばＥＬＩＳＡキットの形態であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３タンパク質のための発現プラスミドを示す図である。
【図２】ＥＬＩＳＡによるＲｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質バリアントとＳｌｉｔ２タンパク質との相互作用の評価を示す図である。
【図３】ＦＡＣＳにより計測されたＳｌｉｔ２を発現しないＨＥＫ２９３細胞についてのＲｏｂｏ１−Ｆｃの親和性を示す図である。
【図４】ＦＡＣＳにより計測されたＳｌｉｔ２を発現するＨＥＫ２９３細胞についてのＲｏｂｏ１−Ｆｃの親和性を示す図である。
【図５Ａ】マウスにおける静脈内注射後のＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１タンパク質の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図５Ｂ】マウスにおける静脈内注射後のＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２タンパク質の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図６Ａ】内皮細胞および間葉細胞を用いる共培養試験におけるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子の効果を示す図である。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１は培養物中で小管形成を阻害する。
【図６Ｂ】内皮細胞および間葉細胞を用いる共培養試験におけるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子の効果を示す図である。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１はＶＥＧＦ誘導性擬小管（ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｕｌｅ）形成を顕著に阻害する。
【図７Ａ】マウスにおけるエクスビボ大動脈輪モデルについてのＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子の効果の評価を示す図である。大動脈輪を調製するためおよび小管を計測するためのプロトコルの説明である。
【図７Ｂ】マウスにおけるエクスビボ大動脈輪モデルについてのＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子の効果の評価を示す図である。ａ．対照；ｂ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス５００μｇ／ｍＬ＋ＶＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ；ｃ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１  ５００μｇ／ｍＬ＋ＶＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ。
【実施例】
【００４５】
［実施例１］
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の調製
【００４６】
ａ．生物学的治療剤として使用されるＲｏｂｏ１−Ｆｃ組換えタンパク質の発現を可能とする構築物。
【００４７】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ組換えタンパク質は、ヒトＲｏｂｏ１タンパク質アイソフォームｂ（ＮＰ＿５９８３３４）の最初の２種の免疫グロブリンドメイン（Ｉｇ１−Ｉｇ２）と、ヒト免疫グロブリンＧ４のＦｃドメイン（ｈＩｇＧ４−Ｆｃ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＧＨＧ４＿ＨＵＭＡＮ）との融合物からなる。
【００４８】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１構築物を得るため、このタンパク質（配列番号２）の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインＩｇ１およびＩｇ２に続くＧｌｕＡｒｇＰｒｏＳｅｒＰｈｅＶａｌリンカーに対応するｃＤＮＡ（配列番号１）の断片を、ヒト胎児心臓ｃＤＮＡライブラリー（商品番号ＨＬ５０４２Ｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するＰＣＲにより増幅した。次いで、Ｒｏｂｏ１の２種のＩｇドメインがＣ末端位置におけるヒトＩｇＧ４のＦｃドメインとの融合物として発現されるように、この増幅された断片を真核発現ベクターｐＸＬ４９０４（図１に記載）中にクローニングした。以下の特徴を得るように３点突然変異をＩｇＧ４−Ｆｃドメイン中に導入した：Ｆｃヒンジ領域内のジスルフィド架橋結合を安定化するためのＳ２４１Ｐ（Ｋａｂａｔナンバリング）；ＩｇＧ４−Ｆｃドメインの残留エフェクター活性を排除するためのＬ２４８Ｅ；タンパク質の不均一性を低減するためのＣ末端リジンの不存在。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号３の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１と称し、このタンパク質は配列番号４のタンパク質配列に対応する。
【００４９】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２構築物を得るため、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインに対応するが上記リンカーを有さない同一のｃＤＮＡを、真核発現ベクターｐＸＬ４９０９（図１記載）中にクローニングし、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１の構築において記載の３点突然変異を含有するＩｇＧ４の同一Ｆｃドメインとの融合物としてのこれらのＩｇドメインの発現を可能としたが、このときＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒリンカーをＦｃドメインの上流に導入した。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号５の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２と称し、このタンパク質は配列番号６のタンパク質配列に対応する。
【００５０】
ｂ．対照として使用されるＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の構築
【００５１】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス構築物を得るため、ｐＸＬ４９０４プラスミド中に事前にクローニングされたｃＤＮＡを、３８位におけるロイシンのグルタミンへの置換および８９位におけるフェニルアラニンのチロシンへの置換を可能とする点突然変異を導入するようにＰＣＲにより改変した。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号７の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナスと称し、このタンパク質は配列番号８のタンパク質配列に対応する。
【００５２】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナス構築物を得るため、ｐＸＬ４９０４プラスミド中にクローニングされたｃＤＮＡを、９７位におけるアルギニンのアニリンへの置換および９８位におけるリジンのアラニンへの置換を可能とする点突然変異を導入するようにＰＣＲにより改変した。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号９の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＲｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナスと称し、このタンパク質は配列番号１０のタンパク質配列に対応する。
【００５３】
ｃ．種々のＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の生成
【００５４】
２種のタンパク質Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２を、それぞれｐＸＬ４９０４およびｐＸＬ４９０９プラスミドならびに出願ＷＯ２００８／０６５５４３に記載の２種のＮ−グリカングリコシル化酵素、即ちα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を可能とするヘルパープラスミドｐＸＬ４５４４およびｐＸＬ４５５１を使用するＨＥＫ２９３系（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞  商品番号５１−００２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、供給業者の推奨に従う。）における一過性形質移入により生成した。これらのタンパク質は、それぞれｐＸＬ４９０４およびｐＸＬ４９０９プラスミドを使用するＣＨＯ系（ＣＨＯ−Ｓ細胞、商品番号１１６１９−０１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、供給業者の推奨に従う。）における形質移入によっても生成した。
【００５５】
ＨＥＫ２９３細胞の浮遊培養物中で発現させたＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２タンパク質を、プロテインＡアフィニティーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  商品番号１７−５１９９−０２、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのクロマトグラフィーおよび２０ｍＭのＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸緩衝液中での溶出により精製し、次いでＰＢＳ緩衝液（商品番号１４１９０−０９４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に配合した。
【００５６】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナスおよびＲｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナス組換えタンパク質を同一の手法において生成および精製した。
【００５７】
ｄ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ組換えタンパク質の物理化学的特性決定
【００５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル浸透分析により、タンパク質が二量体であり、９６％超の純度であることを示すことが可能となった。質量分析により、これらのタンパク質のアイデンティティーを実証することが可能となり、計測された脱グリコシル化タンパク質の重量はインシリコで計算された重量と完全に一致した。Ｓａｄｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２００２．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４：２３−３６およびＡｎｕｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６８５−６９４）により記載のとおり単糖組成の分析およびＮ−グリカンシアル酸の定量により、タンパク質が極めて広範にシアリル化されることを実証することが可能となった。結果を表１に挙げる。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２分子のＮ末端分析が、これらの精製タンパク質が変動する割合（０から４０％）のトランケートされた最初の２個の残基（Ｓｅｒ２０およびＡｒｇ２１）を有する形態を含有することを示したことが留意される。
【００５９】
【表１】
0005858442.tif 000002
【００６０】
［実施例２］
リガンドとして使用されるＳｌｉｔタンパク質の調製
【００６１】
ヒトＳｌｉｔ２タンパク質をコードするｃＤＮＡは、基準タンパク質ＮＰ＿００４７７８に対応する。このｃＤＮＡの断片を、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（商品番号６３９３００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するＰＣＲにより増幅した。
【００６２】
Ｄ２ドメインに対応するｃＤＮＡを、真核発現ベクターｐＸＬ４９１１中にクローニングしてＣ末端位置におけるＨｉｓタグを含有するこのドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号１１の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＳｌｉｔ２−Ｄ２と称し、このタンパク質は配列番号１２のタンパク質配列に対応する。
【００６３】
Ｄ１−Ｄ２ドメインに対応するｃＤＮＡを真核発現ベクターｐＸＬ４９１２中にクローニングしてＣ末端位置におけるＨｉｓタグを含有するこれらの２種のドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号１３の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＳｌｉｔ２−Ｄ１Ｄ２と称し、このタンパク質は配列番号１４のタンパク質配列に対応する。
【００６４】
Ｓｌｉｔ２タンパク質の細胞外部分（Ｎｔ）に対応するｃＤＮＡを真核発現ベクターｐＸＬ５０３３中にクローニングしてＣ末端位置におけるＨｉｓタグを有するこのタンパク質を発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号１５の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＳｌｉｔ２−Ｎと称し、このタンパク質は配列番号１６のタンパク質配列に対応する。
【００６５】
マウスＳｌｉｔ２タンパク質のＤ２ドメインをコードし、記載の基準タンパク質ＮＰ＿８４８９１９のＤ２ドメインに対応するｃＤＮＡを、ｐＸＬ４９１１プラスミド中にクローニングされたｃＤＮＡから得た。５点突然変異を生じさせることを可能とする４種の断片を、テンプレートとしてｐＸＬ４９１１を用いるＰＣＲにより作製し、次いでこれらの断片をテンプレートとして使用して完全なＤ２ドメインをコードするｃＤＮＡを逐次ＰＣＲにより増幅させた。タンパク質は、マウスＳｌｉｔ２タンパク質のＤ２ドメインと同一であることを可能とするＴｈｒ３１１Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３１３Ａｒｇ、Ｉｌｅ３２９Ｌｅｕ、Ｉｌｅ４１１ＶａｌおよびＰｒｏ４１８Ａｌａ突然変異を有する。このプラスミドにより、Ｃ末端位置におけるＨｉｓタグを有するマウスＳｌｉｔ２タンパク質のＤ２ドメインを発現させることが可能となる。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号１７の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をｍＳｌｉｔ２−Ｄ２と称し、このタンパク質は配列番号１８のタンパク質配列に対応する。
【００６６】
ヒトＳｌｉｔ１タンパク質をコードするｃＤＮＡは、記載の基準タンパク質ＮＰ＿００３０５２に対応する。このｃＤＮＡの断片を、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（商品番号６３９３００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するＰＣＲにより増幅した。Ｄ２ドメインに対応するｃＤＮＡを真核発現ベクターｐＸＬ５０２０中にクローニングして発現してＣ末端位置におけるＨｉｓタグを含有するこのドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号１９の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＳｌｉｔ１−Ｄ２と称し、このタンパク質は配列番号２０のタンパク質配列に対応する。
【００６７】
ヒトＳｌｉｔ３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、記載の基準タンパク質ＮＰ＿００３０５３に対応する。このｃＤＮＡの断片を、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（商品番号６３９３００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するＰＣＲにより増幅した。Ｄ２ドメインに対応するｃＤＮＡを真核発現ベクターｐＸＬ５０２１中にクローニングしてＣ末端位置におけるＨｉｓタグを含有するこのドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号２１の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をＳｌｉｔ３−Ｄ２と称し、このタンパク質は配列番号２２のタンパク質配列に対応する。
【００６８】
Ｓｌｉｔ２−Ｄ２、Ｓｌｉｔ２−Ｄ１Ｄ２およびＳｌｉｔ２−Ｎと称される３種のタンパク質を、ｐＸＬ４９１１プラスミド（それぞれｐＸＬ４９１２またはｐＸＬ５０３３）を使用するＨＥＫ２９３系（供給業者の推奨に従うＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における一過性形質移入により生成した。
【００６９】
ＨＥＫ２９３細胞の培養物上清中に発現させたＳｌｉｔ２−Ｄ２およびＳｌｉｔ２−Ｄ１Ｄ２タンパク質を、Ｎｉ−キレーティングセファロースカラム（商品番号１７−０４０９−０３、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのクロマトグラフィーおよびイミダゾール緩衝液中での溶出により精製し、次いで１Ｍ  ＮａＣｌに調整したＰＢＳ緩衝液（商品番号１４１９０−０９４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に配合した。質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により、これらのタンパク質のアイデンティティーを実証することが可能となった。
【００７０】
ｍＳｌｉｔ２−Ｄ２、Ｓｌｉｔ１−Ｄ２およびＳｌｉｔ３−Ｄ２と称される３種のタンパク質を、比較可能な様式において生成、精製および特性決定した。
【００７１】
［実施例３］
３種の方法：ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲおよびＦＡＣＳによるＳｌｉｔタンパク質およびヘパリンについてのＲｏｂｏ１−Ｆｃ組換えタンパク質の親和性の試験
【００７２】
ａ．ヘパリンについてのＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の親和性
【００７３】
ヘパリンについてのＲｏｂｏ１−Ｆｃ構築物の親和性を決定するため、精製し、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０中に配合した２ｍｇのＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質を、０から１．５ＭのＮａＣｌの線形勾配を用いる溶出によりヘパリンカラム上（１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）でクロマトグラフィーにかけた。
【００７４】
表２は、文献（Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３  ｐ１６２２６−１６２３４）に記載のとおりＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１タンパク質の溶出に必要な４４８ｍＭのＮａＣｌ濃度を示す。
【００７５】
【表２】
0005858442.tif 000003
【００７６】
これらの結果は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナスタンパク質がこのカラム上で保持されず、従ってこのタンパク質がもはやヘパリンについてのいかなる親和性も有さないことを示す。従って、このタンパク質はヘパリン陰性突然変異体である。
【００７７】
ｂ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質バリアントとヒトＳｌｉｔ２タンパク質のＤ２ドメインとの相互作用の評価
【００７８】
本実施例は、ＥＬＩＳＡアッセイによるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２と称される２種のバリアントと、これらの天然リガンド（これらの実験において、ヒトＳｌｉｔ２のＤ２ドメイン）との相互作用を説明する。
【００７９】
ヒトＳｌｉｔ２−Ｄ２タンパク質を、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）に結合させた。ある濃度範囲（２０μｇ／ｍＬから０．０２μｇ／ｍＬ）のＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２バリアントを添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ；商品番号Ａ０１７０、１：５００００に希釈）により検出した。可視化は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ；商品番号ＵＰ６６４７８０）を用いて実施し、計測は、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおいて実施した。結果を図２に報告する。これらの結果は、２種のバリアントＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＬ２がヒトＳｌｉｔ２タンパク質と（特にＤ２ドメインと）特異的に相互作用することを示す。
【００８０】
ｃ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質とＳｌｉｔファミリー、即ちＳｌｉｔ１およびＳｌｉｔ３のヒトバリアントとの相互作用の評価
【００８１】
本実施例は、ＥＬＩＳＡアッセイによるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１融合タンパク質とＳｌｉｔ１−Ｄ２、Ｓｌｉｔ２−Ｄ２およびＳｌｉｔ３−Ｄ２バリアントとの相互作用を説明する。
【００８２】
ヒトＳｌｉｔバリアントのＤ２ドメインをＩｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）に結合させた。ある濃度範囲（１μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍＬ）のＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１融合タンパク質を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ；商品番号Ａ０１７０、１：５００００に希釈）を使用して検出した。可視化は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ；商品番号ＵＰ６６４７８０）を用いて実施し、計測は、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおいて実施した。同様に、Ｓｌｉｔ２結合部位のレベルにおいて突然変異させたＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナスバリアントを、ある濃度範囲（２０μｇ／ｍＬから０．０２μｇ／ｍＬ）に従って上記と同一の条件下でＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。結果を以下の表３に報告する。
【００８３】
【表３】
0005858442.tif 000004
【００８４】
これらの結果は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質がファミリーＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２およびＳｌｉｔ３の３種のタンパク質と（特にこれらのＤ２ドメインと）特異的に相互作用することを示す。
【００８５】
さらに、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナスタンパク質は、もはやヘパリンについての親和性を有さず、従ってこのタンパク質はヘパリン陰性突然変異体である。
【００８６】
ｄ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質とマウスＳｌｉｔ２タンパク質との相互作用の評価
【００８７】
本実施例は、ＥＬＩＳＡアッセイによるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１融合タンパク質とマウスタンパク質ｍＳｌｉｔ２−Ｄ２との相互作用を説明する。
【００８８】
マウスタンパク質ｍＳｌｉｔ２−Ｄ２をＩｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）に結合させた。ある濃度範囲（２μｇ／ｍＬから０．００２μｇ／ｍＬ）のＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１融合タンパク質を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ；商品番号Ａ０１７０、１：５００００に希釈）を使用して検出した。可視化は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ；商品番号ＵＰ６６４７８０）を用いて実施し、計測は、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおいて実施した。結果を以下の表４に報告する。
【００８９】
【表４】
0005858442.tif 000005
【００９０】
これらの結果は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質がマウスＳｌｉｔ２タンパク質と特異的に相互作用することを示す。
【００９１】
ｅ．ＳＰＲにより計測されたＳｌｉｔタンパク質についてのＲｏｂｏ１−Ｆｃの親和性
【００９２】
本実施例は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴；ＢＩＡｃｏｒｅ２０００）による、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１融合タンパク質とヒトＳｌｉｔ２タンパク質（本実験においてはＳｌｉｔ２−Ｄ２）との親和性定数の決定を説明する。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質とヒトＳｌｉｔ２タンパク質との相互作用を、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質をＣＭ５チップに結合させた後に分析した。速度論的計測をＣａｎｚｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２５：３０１−３０７）のプロトコルに従って実施した。
【００９３】
【表５】
0005858442.tif 000006
【００９４】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１融合タンパク質とヒトＳｌｉｔ２タンパク質との親和性定数を決定する第２の方法を、Ｓｌｉｔ２−Ｄ２タンパク質をＣＭ５チップに結合させた後に分析した。速度論的計測を、２種の非等価結合部位を有するモデルに従うＳｃａｔｃｈａｒｄ法を使用するＣａｎｚｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２５：３０１−３０７）のプロトコルに従って実施した。
【００９５】
【表６】
0005858442.tif 000007
【００９６】
ｆ．ＦＡＣＳにより計測されたＳｌｉｔについてのＲｏｂｏ１−Ｆｃの親和性
【００９７】
本実施例は、Ｓｌｉｔ２を発現するＨＥＫ２９３哺乳動物細胞に対するＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の親和性を説明する。
【００９８】
実施例１に記載し、使用したＨＥＫ２９３細胞に、哺乳動物細胞内でコードするｃＤＮＡを有さないバラストプラスミド（ｂａｌｌａｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）または実施例２に記載のＳｌｉｔ２−Ｄ２タンパク質をコードするｐＸＬ４９１１プラスミドまたはＳｌｉｔ２−Ｄ１Ｄ２タンパク質をコードするｐＸＬ４９１２プラスミドまたはＳｌｉｔ２−Ｎタンパク質をコードするｐＸＬ５０３３を形質移入した。細胞を形質移入４８時間後に９６ウェルプレート中に分配し、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質を０．０１から３ｍｇ／Ｌの濃度範囲で４℃において３０分間添加した。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１生物学的治療剤またはＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス突然変異体またはＲｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナス突然変異体である。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８（商品番号：Ａ−１１０１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により標識された抗ヒトＦｃ抗体を４℃において３０分間インキュベートした。次いで標識されたＨＥＫ２９３細胞をＦＡＣＳ（Ｇｅｏｍｅａｎ）により定量する。
【００９９】
図３は、Ｓｌｉｔ２発現の不存在下でＦＡＣＳにより計測される蛍光を介してＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質へのＨＥＫ２９３細胞の結合を説明する。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質およびさらにはＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス突然変異体は、ＨＥＫ２９３細胞に結合する一方、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナス突然変異体は結合しない。従って、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃは、０．３から０．０３ｍｇ／Ｌの低いＲｏｂｏ１−Ｆｃ濃度においてヘパリン結合を介してＨＥＫ２９３細胞に部分的に結合する。
【０１００】
図４は、Ｓｌｉｔ２−Ｎを一過性形質移入により発現させる場合にＦＡＣＳにより計測される蛍光を介してＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質へのＨＥＫ２９３細胞の結合を説明する。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質のみが、Ｓｌｉｔ２−Ｎを発現させるＨＥＫ２９３細胞に結合する。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナスおよびＲｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナス突然変異体は、生物学的治療Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１タンパク質と比較して３．０から０．３ｍｇ／ＬのＲｏｂｏ１−Ｆｃ濃度範囲において結合しない（または実質的に結合しない。）。
【０１０１】
表７は、Ｓｌｉｔ２−Ｎ、Ｓｌｉｔ２−Ｄ１Ｄ２またはＳｌｉｔ２−Ｄ２タンパク質をＨＥＫ２９３系内で発現させる場合にＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質についてＦＡＣＳにより計測される親和性定数を説明する。
【０１０２】
【表７】
0005858442.tif 000008
【０１０３】
上記実施例のとおり、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス突然変異体はＳｌｉｔ２陰性であると証明され、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃヘパリン−マイナス突然変異体は、Ｓｌｉｔ２について生物学的治療タンパク質よりも弱い親和性を有する。
【０１０４】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃは、ＨＥＫ２９３細胞により発現させたＳｌｉｔ２−ＮおよびＳｌｉｔ２−Ｄ１Ｄ２に、Ｓｌｉｔ２−Ｄ２についての親和性よりも良好な比較可能な親和性で結合する。
【０１０５】
［実施例４］
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２タンパク質の薬物動態特性
【０１０６】
本実施例は、マウスにおいて静脈内（ｉｖ）で１回注射したＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の薬物動態プロファイルおよび血漿濃度を説明する。
【０１０７】
３匹のＢａｌｂ／Ｃマウス（各時間について）に、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質のそれぞれを２．５ｍｇ／ｍＬにおいて１００μＬ／１０ｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）の割合で尾静脈を介して注射した。所定の時間（投与０．５、１、６、２４、４８および７２時間後）において、マウスに麻酔をかけ、血液をサンプリングし、１０μＬのクエン酸塩（ＣＰＤ−Ａ、Ｃ−４４３１  Ｓｉｇｍａ）および２μＬのプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する試験管中に回収した。試験管を遠心分離し、血漿試料を回収し、−２０℃において冷凍した。
【０１０８】
９６ウェルプレートのウェルをＳｌｉｔ２タンパク質（Ｓｌｉｔ２−Ｄ２）によりコーティングし、１／５０００および１／２００００に希釈した血漿試料を３７℃において１時間接触させた。続いてペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体（商品番号３１４１３、Ｐｉｅｒｃｅ）をインキュベートし、次いでＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２（商品番号ＵＰ６６４７８０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を用いて可視化し、吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。較正範囲は各精製Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質により整えた。
【０１０９】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ２タンパク質の血漿濃度を図５に表す。薬物動態パラメーターを以下の表８に説明し、このパラメーターはタンパク質がマウスにおける注射後に安定であることを示す。
【０１１０】
【表８】
0005858442.tif 000009
【０１１１】
［実施例５］
Ｎ末端位置における均一性に関して改善されたＲｏｂｏ１−Ｆｃ生物学的治療タンパク質の説明
【０１１２】
本実施例は、最初の２個の残基Ｓｅｒ２０およびＡｒｇ２１の不存在の点でＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１タンパク質とは異なるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３と称される別のＲｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質の発現プラスミド、生成および物理化学的特性決定を説明する。
【０１１３】
ｐＸＬ４９０４プラスミド中にクローニングされたｃＤＮＡを、Ｓｅｒ２０およびＡｒｇ２１コドンを排除し、次のコドン（Ｌｅｕ２２）をインターロイキン２のペプチドシグナルのコーディング配列に融合させるようにＰＣＲにより改変した。次いで、ｐＸＬ５００４発現プラスミドを作製した。図１を参照のこと。この組換えタンパク質を発現させるために使用したｃＤＮＡ配列は、配列番号２３の配列に対応する。
【０１１４】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３タンパク質を実施例１に記載のとおり生成、精製および特性決定した。Ｎ末端分析は、この精製タンパク質が完全に均一性であることを示した。得られた組換えタンパク質をＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３と称し、このタンパク質は配列番号２４のタンパク質配列に対応する。
【０１１５】
［実施例６］
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３タンパク質とヒトＳｌｉｔ２タンパク質との相互作用の評価
【０１１６】
本実施例は、ＥＬＩＳＡアッセイによるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３融合タンパク質とヒトＳｌｉｔ２タンパク質（Ｓｌｉｔ２−Ｄ２）との相互作用を説明する。
【０１１７】
ヒトＳｌｉｔ２−Ｄ２タンパク質を、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）に結合させた。ある濃度範囲（１μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍＬ）のＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３融合タンパク質を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ；商品番号Ａ０１７０、１：５００００に希釈）により検出した。可視化は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ；商品番号ＵＰ６６４７８０）を用いて実施し、計測は、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおいて実施した。得られた結果を以下の表９に報告する。
【０１１８】
【表９】
0005858442.tif 000010
【０１１９】
これらの結果は、Ｓｌｉｔ２−Ｄ２タンパク質についての２種のバリアントＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１およびＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ３の親和性が比較可能であることを示す。
【０１２０】
［実施例７］
新血管形成に対するＲｏｂｏ−Ｆｃタンパク質の活性の評価
【０１２１】
ａ．インビトロ内皮細胞および線維芽細胞共培養モデル：Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子の特異的活性
【０１２２】
インビトロ血管新生モデルは、ヒト皮膚線維芽細胞の単層上のヒト静脈内皮細胞のリアレンジメントに対応する。手短に述べると、線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ）を２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に４００００個の細胞／ウェルにおいて１ｍｌの培地中で播種する。増殖３日後（Ｄ３）、ヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−Ｌｏｎｚａ）を線維芽細胞単層上に１００００個の細胞／ウェルにおいて５００μｌのＥＧＭ（登録商標）培地（内皮基礎培地、Ｌｏｎｚａ）＋２％ＦＣＳ（仔ウシ血清−Ｌｏｎｚａ）＋１０μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ（組換えヒト表皮成長因子−Ｌｏｎｚａ）中で播種する。細胞を３０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子またはＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス陰性対照により５００μｇ／ｍｌの濃度において刺激する（Ｄ３からＤ９）。３日後、培地を交換し、ウェルを実験の条件に従って刺激する。
【０１２３】
２日後、細胞をエタノールにより固定し、ＨＵＶＥＣに特異的な抗ＣＤ３１抗体により標識し、次いで抗アルカリホスファターゼ抗体により標識し、次いでアルカリホスファターゼ基質を用いて可視化する（Ｄ１１）。抗ＣＤ３１抗体により標識した小管の定量を顕微鏡（×４対物レンズ）下でなされる画像収集により実施し、擬小管の長さを画像分析ソフトウエア（Ｂｉｏｃｏｍ  Ｖｉｓｉｏｌａｂ  ２０００ソフトウエア）を使用して分析する（図６）。
【０１２４】
このインビトロ血管新生アッセイにおいて、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１（５００μｇ／ｍｌ）はＨＵＶＥＣにより形成される小管の形成に対して阻害活性を示す。この阻害率は８２％であり、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス分子（陰性対照）を用いて得られる効果と比較して統計的に有意である。
【０１２５】
ｂ．エクスビボマウス大動脈輪モデル：Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子の特異的活性
【０１２６】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子を、マウス大動脈輪モデルにおいて評価した。手短に述べると、マウス大動脈を切除し、洗浄し、１ｍｍの区画に切断する（Ｄ０）。これらの輪をラットコラーゲン中に、１０ｎｇ／ｍｌにおけるＶＥＧＦ、５００μｇ／ｍｌの濃度におけるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子または５００μｇ／ｍｌの濃度におけるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス陰性対照の存在下で埋設する。小管は輪から形成し、こうしてインビトロで新血管の形成を模倣する。６日後、標識小管の定量を顕微鏡（×３対物レンズ）下でなされる画像収集により実施し（図７Ａ）、擬小管の長さを画像分析ソフトウエア（Ｂｉｏｃｏｍ  Ｖｉｓｉｏｌａｂソフトウエア２０００）を使用して分析した（図７）。
【０１２７】
これらの実験条件下、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１（５００μｇ／ｍｌ）は、陰性対照として使用されるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｓｌｉｔ２−マイナス分子と比較して形成される小管の形成に対して強力な阻害活性を示す。
【０１２８】
これらの結果は、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１が内皮細胞増殖を阻害することなく新血管の形成を阻害することができることを示唆する。血管成熟欠如に結びつくこの抗血管新生活性は、「非生産的血管新生」と称される。
【０１２９】
［実施例８］
マウスの肺腫瘍モデルにおけるＲｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１タンパク質の評価
【０１３０】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ  Ｌ１分子を、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの肺癌腫瘍のモデルにおいて評価した。
【０１３１】
ａ．マウス肺腫瘍モデル
【０１３２】
マウス肺腫瘍モデルを確立するため、８週齢雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに麻酔をかけた。マウスの左肩胛骨の高さにおける領域を剃り、消毒した。１ｃｍの切開をこの肩胛骨上で行った。
【０１３３】
注射すべき細胞は、Ｌｅｗｉｓ肺癌腫瘍系（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６４２）に由来する。細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と、１容量のＭａｔｒｉｇｅｌと４容量の細胞との比で混合した。細胞濃度は６２５００個の細胞／ｍｌであった。細胞を肺内にマウス当たり２０μｌの割合において注射し、次いで傷口を縫合した。
【０１３４】
２３日後、マウスを安楽死させた。胸郭を切開し、左肺および縦隔リンパ節を切除した。左肺上に存在する腫瘍を、電子キャリパーを使用して計測して式：ｌ２×Ｌ×０．５２に従って腫瘍容積を測定した。縦隔リンパ節を秤量する。結果を、平均値±この平均からの標準偏差として表現する。統計分析をパラメトリックＳｔｕｄｅｎｔ検定により実施した。
【０１３５】
ｂ．Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ組換えタンパク質による肺腫瘍を担持するマウスの処置
【０１３６】
Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質を使用する処置を以下のとおり実施した：Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質を含有する調製物を、２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量において、腫瘍細胞の注射後Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２１に静脈内注射した。対照群にはＰＢＳ緩衝液（１０ｍｌ／ｋｇ）を注射した。
【０１３７】
ｃ．結果
【０１３８】
Ｄ２３において、Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ組換えタンパク質により処置した群において得られた腫瘍の平均容積は２１．４５±２．１６ｍｍ３であり；対照群において得られた腫瘍の平均容積は３９．９３±８．４１ｍｍ３であった。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質により処置した動物における腫瘍容積の低減率は４６％である。この差は統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質により処置した群において得られた縦隔リンパ節（転移リンパ節）の平均重量は、１２．５０±１．２６ｍｇである。対照群において得られた縦隔リンパ節の平均重量は、３０．６７±７．６９ｍｇである。Ｒｏｂｏ１−Ｆｃタンパク質により処置した群についての縦隔リンパ節の重量の低減率は、有意限界（ｐ＝０．０７）において５９％である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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