(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列の８５〜８９位に相当する位置におけるＲＸＥＬＲ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）、１２３〜１２５位に相当する位置におけるＱＸＨ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）、２２０〜２２８位に相当する位置におけるＹＦＫＡＧＸＹＸＱ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）が存在する、ＰＬ−７ファミリーに属するアルギン酸リアーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の８０位および２３２位に相当する位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の８５〜８９位に相当する位置におけるＲＸＥＬＲ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）、１２３〜１２５位に相当する位置におけるＱＸＨ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）、２２０〜２２８位に相当する位置におけるＹＦＫＡＧＸＹＸＱ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）が存在する、ＰＬ−７ファミリーに属するアルギン酸リアーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の８０位および／または２３２位に相当する位置におけるシステイン残基以外のアミノ酸残基をシステイン残基に置換して、これらの位置の両方にシステイン残基が存在するようにすることを含む、温度特性が向上したアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドをアルギン酸に作用させることを含む、アルギン酸の分解方法。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドを含む、アルギン酸分解用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドおよび当該酵素を使用するアルギン酸の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は褐藻類などの藻類と一部の細菌類が生産する多糖類であり、特にコンブ類やジャイアントケルプ類に多く含有されている。褐藻類から抽出されたアルギン酸はそのまま食品としてだけでなく、食品添加物、化粧品、医薬品、工業用品など様々な用途で活用されている。一方、アルギン酸は水に溶解すると極めて高粘性を示すため、食品、食品添加物、化粧品、医薬品、工業用品など様々な用途に適用するためには、アルギン酸リアーゼによりアルギン酸を分解することにより、アルギン酸水溶液の粘度を低下させることが有効である。また、アルギン酸分解によって生じるオリゴ糖には植物の根の生長促進効果、抗腫瘍効果などの様々な生理活性作用が報告されており、近年注目されている。また、褐藻類を用いる食品加工工場の排水にはアルギン酸が多量に含有され高い粘性を示すことから、アルギン酸分解による粘性の低下技術の構築も求められている。さらに、Pseudomonus属などのアルギン酸をバイオフィルムとして生産する細菌類の除去は、界面活性剤や熱処理だけでは困難であり、アルギン酸分解が必須と考えられている。【０００３】
アルギン酸の分解は大量のエネルギーを消費する熱による方法や廃液処理が煩雑な酸による方法よりは、酵素の利用が有効と考えられる。主に陸上あるいは海洋に棲息する細菌類や褐藻類を摂餌する海産軟体動物（アワビ、サザエ、巻貝類など）を対象にアルギン酸分解酵素であるアルギン酸リアーゼが探索されており、酵素の基質特異性、切断様式などの特性が詳細に検討され、いくつかの酵素については立体構造が明らかにされている。加えて、それらの酵素はオリゴ糖の生産や褐藻類からのプロトプラスト細胞の作出への利用が試みられているが実用化されている例はほとんど無い。このようにアルギン酸の分解や分解物であるオリゴ糖は有用であるが、分解酵素であるアルギン酸リアーゼは主に陸上の土壌細菌由来のものが市販されているにすぎない。【０００４】
アルギン酸分解酵素に限らず、一般に酵素を工業的および産業的に利用するには、酵素の安定性が重要である。温度、ｐＨ、イオン強度などの様々な要因に対して、酵素活性が持続的に維持され、容易に失活や変性を起こさないことが要求される。例えば、セルラーゼなどの糖質加水分解酵素やプロテアーゼでは様々な生息環境からそれらを生産する菌類が単離され、有用酵素が見出され実用化されている。しかしながら、これまでに知られているアルギン酸リアーゼを生産する生物種は上記の酵素に比べて少ないため、実用化のための様々な要因を克服したアルギン酸分解酵素についての報告例はほとんど無い。【０００５】
現在までにアルギン酸リアーゼを産生する生物としては主に土壌細菌、海藻、海藻付着細菌、藻食性軟体動物などが対象とされてきた（非特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Inoue, A. et al., Phycologia, 48:48 (2009)
【非特許文献２】Kawamoto, H. et al., Mar. Biotechnol., 8:481-490 (2006)
【非特許文献３】Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem., 279:31863-31872 (2004)
【非特許文献４】Miyake, O. et al., J. Bacteriol., 186:2891-2896 (2004)
【非特許文献５】Matsubara, Y. et al., J. Protein Chem., 17:29-36 (1998)
【非特許文献６】Kobayashi, T. et al., Extremophiles, 13:121-129 (2009)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらは陸上と海洋の区別はあるものの特異な環境に棲息しているとは言い難く、実際、得られた酵素活性に及ぼす温度、ｐＨなどの影響に大きな差異は認められない。本発明の目的は、より安定な酵素活性を有し、実用化に適している、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドおよび当該酵素を使用するアルギン酸の分解方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］配列番号１のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド；
［２］配列番号１のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の８０位および２３２位に相当する位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド；
［３］配列番号１のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の８０位および／または２３２位に相当する位置におけるシステイン残基以外のアミノ酸残基をシステイン残基に置換して、これらの位置の両方にシステイン残基が存在するようにすることを含む、温度特性が向上したアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法；
［４］［１］または［２］のポリペプチドをアルギン酸に作用させることを含む、アルギン酸の分解方法；
［５］［１］または［２］のポリペプチドを含む、アルギン酸分解用組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、広範な条件下で高い酵素活性および安定性を示し、実用化に適している、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドおよび当該酵素を使用するアルギン酸の分解方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＮｉｔＡｌｙと他種アルギン酸リアーゼの一次構造比較を示す図である。
【図２】ＮｉｔＡｌｙによるアルギン酸の分解を示す図である。図中、黒丸は相対粘度を、黒三角は２３５ｎｍにおける吸光度を示す。
【図３】ＮｉｔＡｌｙの基質特異性を示す図である。ポリ（Ｍ）に対する活性を１００％とした相対活性を示す。
【図４】ＮｉｔＡｌｙの温度依存性を示す図である。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙについては１，３９０Ｕ／ｍｇの比活性を、ＦｌａＡｌｙについては２，３６０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図５】ＮｉｔＡｌｙのｐＨ依存性を示す図である。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙについては１，６４０Ｕ／ｍｇの比活性を、ＦｌａＡｌｙについては２，１２０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図６】ＮｉｔＡｌｙのｐＨ安定性を示す図である。１，４６０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図７】ＮｉｔＡｌｙの塩濃度依存性を示す図である。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙについては１，１４０Ｕ／ｍｇの比活性を、ＦｌａＡｌｙについては２，０００Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図８】ＮｉｔＡｌｙの熱安定性を示す図である。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙについては１，６６０Ｕ／ｍｇの比活性を、ＦｌａＡｌｙについては１，７４０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図９】ＮｉｔＡｌｙによる分解物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）解析を示す図である。
【図１０】ＮｉｔＡｌｙの長期熱安定性を示す図である。図中、黒丸、黒三角、黒四角、黒菱形はそれぞれ２０℃、３０℃、４０℃、５０℃でインキュベートした場合の結果を示す。１，６６０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図１１】ＮｉｔＡｌｙの予測立体構造を示す図である。
【図１２】ＮｉｔＡｌｙのＤＴＴ存在下における温度依存性（Ａ）および熱安定性（Ｂ）の変化を示す図である。図中、黒丸、黒菱形はそれぞれＤＴＴ非存在下（−ＤＴＴ）、ＤＴＴ存在下（＋ＤＴＴ）で得られた結果を示す。（Ａ）−ＤＴＴについては１，６６０Ｕ／ｍｇの比活性を、＋ＤＴＴについては１，５９０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。（Ｂ）−ＤＴＴについては１，５８０Ｕ／ｍｇの比活性を、＋ＤＴＴについては１，４６０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図１３】ＮｉｔＡｌｙ変異体の温度依存性（Ａ）および熱安定性（Ｂ）を示す図である。図中、黒丸、黒三角、黒四角はそれぞれ野生型（ＷＴ）、８０位にＧｌｙを有する変異体（Ｃ８０Ｇ）、８０位にＡｌａを有する変異体（Ｃ８０Ａ）についての結果を示す。（Ａ）ＷＴについては１，４８０Ｕ／ｍｇの比活性を、Ｃ８０Ｇについては１，３２０Ｕ／ｍｇの比活性を、Ｃ８０Ａについては１，９７０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。（Ｂ）ＷＴについては１，５３０Ｕ／ｍｇの比活性を、Ｃ８０Ｇについては１，７５０Ｕ／ｍｇの比活性を、Ｃ８０Ａについては１，５３０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【図１４】スサビノリ（Porphyra yezoensis）由来アルギン酸リアーゼＰｙＡｌｙへのジスルフィド結合の導入による温度依存性（Ａ）および熱安定性（Ｂ）の変化を示す図である。図中、黒丸および黒三角はそれぞれ野生型（ＰｙＡｌｙＷＴ）および変異体（ＰｙＡｌｙＣｙｓ）についての結果を示す。（Ａ）ＰｙＡｌｙＷＴについては１，０６０Ｕ／ｍｇの比活性を、ＰｙＡｌｙＣｙｓについては１，４４０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。（Ｂ）ＰｙＡｌｙＷＴについては１，２１０Ｕ／ｍｇの比活性を、ＰｙＡｌｙＣｙｓについては１，７２０Ｕ／ｍｇの比活性を１００％とした相対活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
［用語の説明］
本明細書において使用する「アルギン酸」という用語は、β−１，４’−マンヌロノ−１，４’−Ｌ−グルロノグリカンとも呼ばれるβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の２種のウロン酸のピラノース環が主としてβ１→４結合した多糖を指す。アルギン酸中にはβ−Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｍ）」または「Ｍブロック」とも呼ぶ）、α−Ｌ−グルロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｇ）」または「Ｇブロック」とも呼ぶ）、β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸のヘテロポリマー（以下、「ポリ（ＭＧ）」または「ＭＧブロック」とも呼ぶ）の領域が存在する。アルギン酸の由来には限定なく、例えば、褐藻類などの藻類、細菌類などから得ることができる。【００１２】
本明細書において使用する「アルギン酸リアーゼ」という用語は、アルギン酸に作用するリアーゼを指す。「リアーゼ」は、基質から加水分解や酸化によらず、ある基を脱離させ二重結合を残す反応を触媒する酵素の総称である。詳細には、アルギン酸リアーゼは、β脱離反応によってアルギン酸を分解する。本明細書において使用する「アルギン酸リアーゼ活性」という用語は、上記のような酵素の活性を意味する。【００１３】
アルギン酸リアーゼはその基質特異性に基づいて、ポリ（Ｍ）に特異的に作用するもの（ＥＣ４．２．２．３）、ポリ（Ｇ）に特異的に作用するもの（ＥＣ４．２．２．１１）、さらにポリ（ＭＧ）に作用するものなどに分類され得る。本発明のポリペプチドは、いずれの基質に作用するものであってもよく、１つの実施態様において、ポリ（Ｍ）選択的であり、別の実施態様において、ポリ（Ｇ）選択的である。本明細書において使用する「ポリ（Ｍ）選択的」という用語は、アルギン酸リアーゼがポリ（Ｇ）に比較してポリ（Ｍ）に優先的に作用することを指し、本明細書において使用する「ポリ（Ｇ）選択的」という用語は、アルギン酸リアーゼがポリ（Ｍ）に比較してポリ（Ｇ）に優先的に作用することを指す。いずれの場合も、さらにポリ（ＭＧ）に対する作用を有してもよい。優先的に作用する基質に対する活性と、そうでない基質に対する活性の差は、例えば、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍またはそれ以上である。【００１４】
以下、本発明の実施の態様について、詳細に説明する。なお、同様な内容については、繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。【００１５】
１つの実施態様において、本発明のアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる。本実施形態に係るアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドは、公知のアルギン酸リアーゼと比較して、最も高い至適温度、最も低い至適ｐＨ、最も高い至適ＮａＣｌ濃度、最も高い熱安定性を示すことが実証されており、広範な条件下で高い酵素活性および安定性を示し、実用化に適している。【００１６】
アルギン酸などの多糖類に作用するリアーゼは、その配列相同性に基づいていくつかのポリサッカリドリアーゼ（ＰＬ）ファミリーに分類されており（http://www.cazy.org/Polysaccharide-Lyases.html）、アルギン酸リアーゼは、ＰＬ−５、６、７、１４、１５、１７、１８ファミリーに分類されている。この中で、ＰＬ−７ファミリーに属するアルギン酸リアーゼには３箇所の保存領域、すなわち、それぞれ配列番号１の、８５〜８９位に相当する位置におけるＲＸＥＬＲ（Ｘは任意のアミノ酸を示す、以下同様）（保存領域Ｉ）、１２３〜１２５位に相当する位置におけるＱＸＨ（保存領域ＩＩ）、２２０〜２２８位に相当する位置におけるＹＦＫＡＧＸＹＸＱ（保存領域ＩＩＩ）が存在することが知られている。【００１７】
Nitratiruptor sp. SB155-2株は、中部沖縄トラフに位置する伊平屋北熱水活動域の深海約１，０００ｍの海底熱水噴出孔のチムニーから分離された中等度好熱性ε−プロテオバクテリアであり（Nakagawa, S. et al., Environ. Microbiol., 7:1619-1632 (2005)）、全ゲノム解析が行われている（Nakagawa, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:12146-12150 (2007)（GenBank accession no. AP009178）。【００１８】
Nitratiruptor sp.ゲノムには、配列相同性に基づいてアルギン酸リアーゼ様ポリペプチドをコードする可能性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在が推定された（GenBank accession no. BAF69299、UniProt accession no. A6Q1E0）。このＯＲＦのヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号２および１に示す。本発明者らは、ゲノム配列情報に基づいて上記ＯＲＦを含むＤＮＡをクローニングし、大腸菌において発現させて、この遺伝子によってコードされるポリペプチド（以下、「ＮｉｔＡｌｙ」という）が実際にアルギン酸リアーゼとして機能することを見出した。【００１９】
配列番号１のアミノ酸配列には上記の保存領域が見出され、この配列は既知のＰＬ−７ファミリーに属するアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列と相同性を示した。しかし、他の生物種由来のアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列との同一性の値は、高いものでも２０〜３０％程度と非常に低いので（スサビノリ（Porphyra yezoensis）（非特許文献１）、Vibrio sp. O2（非特許文献２）、Pseudomonas aeruginosa PAO1（非特許文献３）由来のアルギン酸リアーゼとのアミノ酸配列同一性はそれぞれ３９％、３６％、２２％である（図１参照））、配列の相同性に基づいてこの遺伝子産物がアルギン酸リアーゼ活性を示すかどうかは不明であった。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＤＤＢＪのウェブサイト（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）において利用可能な系統解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬＷをデフォルト条件（ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ）で使用するなどして決定することができる。【００２０】
本発明のポリペプチドの一例であるＮｉｔＡｌｙは以下のような性質を示す。ＮｉｔＡｌｙは、アルギン酸を分解する能力を有し、粘度測定とリアーゼ反応によって生じる二重結合の２３５ｎｍにおける吸光度変化の測定により、エンド型の切断様式を有すると考えられる。基質としてアルギン酸、ポリ（Ｇ）、ポリ（ＭＧ）、またはポリ（Ｍ）に対する分解能を調べた結果、特にβ−Ｄ−マンヌロン酸を多く含むポリ（Ｍ）を良く分解する。ポリ（Ｍ）を基質とした場合、分解物としては、３〜５糖、特に４および５糖が生じる。ＮｉｔＡｌｙの至適温度は約７０℃と決定され、４０℃〜８０℃で最大活性の５０％以上の活性を示す。至適ｐＨは６であり、ｐＨ４〜７の範囲で最大活性の５０％以上の活性を有するが、中性以上のｐＨでは著しく活性は低下する。ＮｉｔＡｌｙの至適ＮａＣｌ濃度は１，２００ｍＭである。ＮａＣｌ要求性は高く、８００〜１４００ｍＭ  ＮａＣｌ存在下で著しく活性化される。また、０〜１００℃で３０分間インキュベート後の残存活性を調べた場合、６２℃で３０分間のインキュベート後でも約５０％の活性が残存している。【００２１】
従って、本発明のポリペプチドを、例えば２０℃以上、３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上、６０℃以上、および１００℃以下、９０℃以下、８０℃以下、好ましくは７０℃の温度で、４以上、５以上、および７以下、好ましくは６のｐＨで、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、１０００ｍＭ以上、１１００ｍＭ以上、および１４００ｍＭ以下、１３００ｍＭ以下、好ましくは１２００ｍＭのＮａＣｌの存在下で使用することができる。【００２２】
下記表１にＮｉｔＡｌｙと他のアルギン酸リアーゼの性状を比較した結果を示す。Pseudomona aeruginosa（非特許文献３）、Sphingomonas sp. A1（非特許文献４）、Corynebacterium sp.（非特許文献５）、Agarivorans sp.（非特許文献６）についてのデータは文献から得、その他は本発明者らによって得られた結果である。表中、熱安定性は、括弧内に示す時間インキュベートした場合に最大活性の５０％となる温度を示す。この表に示すアルギン酸リアーゼの中で、ＮｉｔＡｌｙは、最も高い至適温度、最も低い至適ｐＨ、最も高い至適ＮａＣｌ濃度、最も高い熱安定性を示す。また、アミノ酸配列同一性が示されるPorphyra yezoensis、Vibrio sp. O2およびPseudomonas aeruginosa PAO1由来のアルギン酸リアーゼはそれぞれポリ（Ｍ）、ポリ（Ｇ）およびポリ（ＭＧ）に対して優先的に作用し、ＮｉｔＡｌｙはポリ（Ｍ）選択的な作用を示す。このように、ＮｉｔＡｌｙの性質は公知の他のアルギン酸リアーゼからは予想され得ないものである。【００２３】
【表１】
0005858542.tif 000002
【００２４】
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列には、他のＰＬ−７ファミリーに属するアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列には存在しないシステイン（Ｃｙｓ）残基が、配列番号１の８０位および２３２位に存在し、そして立体構造予測に基づいてこれらが互いに近接することに着目し（図１１参照）、これらのシステイン残基の間で形成されるジスルフィド結合がアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの温度特性の向上に寄与することを示した。【００２５】
本明細書において「温度特性」という用語は、ポリペプチドの示すアルギン酸リアーゼ活性の温度に関連する特性を指し、熱安定性、温度依存性を含む。従って、「温度特性が向上した」とは、例えば、熱安定性が増加すること、および／または温度依存性が上昇することを意味する。【００２６】
熱安定性を、ポリペプチドを一定期間（例えば３０分間）インキュベートした後の残存活性を測定することによって評価することができる。さらに、熱安定性を、一定期間インキュベートした後の残存活性が最大活性の５０％に低下する温度によって表すことができる。より長い時間の熱安定性（長期安定性）を、一定温度で長時間（例えば１６時間）インキュベートした後の残存活性を測定することによって評価することができる。例えば、熱安定性の増加は、３０分間のインキュベーション後に最大活性の５０％に活性が低下する温度の５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃の上昇として定義され得る。【００２７】
温度依存性を、ポリペプチドの示すアルギン酸リアーゼ活性の至適温度、または活性を示す最高温度によって評価することができる。例えば、温度依存性の上昇は、至適温度または活性を示す最高温度の５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃の上昇として定義され得る。【００２８】
１つの実施態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の８０位および２３２位に相当する位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。別の実施態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の８０位および／または２３２位に相当する位置におけるシステイン残基以外のアミノ酸残基をシステイン残基に置換して、これらの位置の両方にシステイン残基が存在するようにすることを含む、温度特性が向上したアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。かかる実施の態様により、システイン残基をこれらのいずれか一方または両方の位置に有しない元のアミノ酸配列からなるポリペプチドに比較して向上した温度特性を有するポリペプチドを得ることができる。【００２９】
これらのアミノ酸配列の位置は、それぞれ上記の保存領域Ｉの５残基上流、保存領域ＩＩＩの４残基下流としても特定することができる。置換は、ＰＣＲ、部位特異的変異誘発など任意の組換えＤＮＡ技術を使用して導入することができる。本発明のポリペプチドを、当該ポリペプチドを産生する微生物の培養液から得ることができる。微生物は天然の微生物でもよく、または組換え微生物でもよい。組換え微生物の場合、本発明のポリペプチドをコードする核酸を宿主内で発現可能な状態で（例えば、発現ベクター中、プロモーターに作動可能に連結されて）含む宿主微生物（例えば、細菌（Escherichia coliなど）、酵母、動物細胞、植物細胞など）を使用する。このような微生物を適切な条件下で培養し、産物が細胞内に産生される場合は細胞を、産物が細胞外に分泌される場合は培養上清を回収し、そこから産物を常法に従って精製することによって目的のポリペプチドを得ることができる。これらの技術は当技術分野において公知である。【００３０】
このようなポリペプチドは、システイン残基をこれらのいずれか一方または両方の位置に有しない元のアミノ酸配列からなるポリペプチドに比較して向上した温度特性を有する。元のアミノ酸配列としては、上記位置が特定できる程度の配列番号１のアミノ酸配列との相同性が存在し、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがアルギン酸リアーゼ活性を示す限り任意のアミノ酸配列を使用することができる。例えば、元のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の同一性を有する。【００３１】
このようなポリペプチドの例として、スサビノリ（Porphyra yezoensis）由来アルギン酸リアーゼのアミノ酸配列（配列番号３）の７９位のグリシン残基および２２９位のプロリン残基をそれぞれシステイン残基に置換した変異体が挙げられる（アミノ酸配列を配列番号１７に示す）。この変異体はもとのアミノ酸配列からなる野生型ポリペプチドと比較して、上昇した温度依存性を示す。詳細には、野生型では活性をほとんど示さない温度（６０℃）において、変異型は最大活性の４０％の値を示す。【００３２】
１つの実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをアルギン酸に作用させることを含む、アルギン酸の分解方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ポリペプチドを含む、アルギン酸分解用組成物を提供する。本発明の組成物を、本発明の分解方法に使用することができる。組成物は、ポリペプチドの安定化剤などの任意の成分をさらに含んでもよい。アルギン酸は、食品、食品添加物、化粧品、医薬品、工業用品など様々な用途で活用されている。一方、アルギン酸は水に溶解すると極めて高粘性を示すため、食品、食品添加物、化粧品、医薬品、工業用品など様々な用途に適用するためには、アルギン酸を分解することにより、アルギン酸水溶液の粘度を低下させることが有効である。従って、アルギン酸をより効果的に分解することができる本発明のポリペプチドを使用する本発明の方法、組成物は、これらに使用される材料の製造に有用である。【００３３】
本発明のポリペプチドの一例であるＮｉｔＡｌｙは、アルギン酸をエンド型で切断して、分解物（オリゴ糖）を生じる。従って、本発明のポリペプチドをアルギン酸に作用させることによってオリゴ糖を製造することができる。アルギン酸分解によって生じるオリゴ糖には植物の根の生長促進効果、抗腫瘍効果などの様々な生理活性作用が報告されている。従って、本発明の方法、組成物は、このような生理活性物質の製造に有用である。【００３４】
本発明の方法、組成物を、褐藻類を用いる食品加工工場排水などのアルギン酸含有廃液の粘度を低下させるために使用することができる。本発明のアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドは、公知のアルギン酸リアーゼと比較して、最も高い至適温度、最も低い至適ｐＨ、最も高い至適ＮａＣｌ濃度、最も高い熱安定性を示すことが実証されている。廃液中には高濃度の塩が含まれており、廃液のｐＨが酸性の場合が多く、このような環境で、本発明のポリペプチドは有効に作用する。また、本発明の方法、組成物を、アルギン酸産生微生物を除去するために使用することができる。アルギン酸産生微生物（Pseudomonas、Sphingomonasなど）はバイオフィルムとしてアルギン酸を産生して付着するので、単純な洗浄だけでは除去が困難であり、アルギン酸の分解が必要となる。【００３５】
このような工業的利用のために、広範な条件下で高い活性および安定性を示す本発明のポリペプチドは特に有用である。本発明のポリペプチドをそのまま反応液に添加してもよく、例えば支持体に固定化して使用してもよい。当業者は、酵素活性を示すポリペプチドの固定化方法を適切に選択することができる。【００３６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：Nitratiruptor sp. SB155-2株からのアルギン酸リアーゼ遺伝子のクローニングおよび大腸菌における生産
Nitratiruptor sp. SB155-2株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＮｉｔＡｌｙ−Ｆ１（配列番号５）およびＮｉｔＡｌｙ−Ｒ１（配列番号６）を使用したＰＣＲによりアルギン酸リアーゼ様ポリペプチド（ＮｉｔＡｌｙと称する）をコードするＤＮＡを得、これをE. coli DH5α（Biodynamics）を宿主としてクローニングベクターｐＴａｃ−１（Biodynamics）中にクローニングした。得られたＮｉｔＡｌｙ遺伝子のヌクレオチド配列およびそれにコードされるＮｉｔＡｌｙの推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および１に示す。【００３８】
図１にＮｉｔＡｌｙと他種アルギン酸リアーゼの一次構造比較を示す。ＤＤＢＪのウェブサイト（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）において利用可能な系統解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬＷをデフォルト条件（ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ）で使用してこれらの相同性を解析したところ、ＮｉｔＡｌｙ（Nit.）はスサビノリ（Porphyra yezoensis）（Por.）、Vibrio sp. O2（Vib.）、Pseudomonas aeruginosa PAO1（Pse,）由来のアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列とそれぞれ３９％、３６％、２２％の同一性を示した。ＮｉｔＡｌｙのアミノ酸配列にはＰＬ−７ファミリーに属するポリペプチドにおいて保存されている保存領域Ｉ〜ＩＩＩが見出された（８５〜８９位におけるＲＳＥＬＲ、１２３〜１２５位におけるＱＩＨ、２２０〜２２８位におけるＹＦＫＡＧＶＹＬＱ）。【００３９】
このＤＮＡを鋳型とし、成熟酵素（配列番号１の２３位〜２４３位）をコードする配列の両末端にそれぞれＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位を付加するためのプライマーＮｉｔＡｌｙ−ＢａｍＦ（配列番号７）およびＮｉｔＡｌｙ−ＸｂａＲを使用したＰＣＲによりＤＮＡを得、これをE. coli BL21(DE3)（Takara）を宿主として発現用ベクターｐＣｏｌｄ  Ｉ（Takara）中に挿入した。【００４０】
組換えアルギン酸リアーゼの発現は以下のように行った。形質転換された大腸菌のシングルコロニーを釣菌して、アンピシリンを含む２×ＴＹ培地５００ｍｌ中で１５０ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪した。続いて培養温度を１５℃に下げ１時間培養した後、終濃度で０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、８時間培養を行って、タンパク質の発現を誘導した。発現誘導後の培養液を１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離を行い、菌体を回収し、０．０１ｍｇ／ｍｌのｌｙｓｏｚｙｍｅを含む緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０））によく懸濁した後、氷冷下で３０分間静置して溶菌させ、その後大腸菌の超音波破砕  （３０秒×５回）を行った後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分）し、その上清にＮｉ−ＮＴＡレジン（ＱＩＡＧＥＮ）を加え、氷冷下で３０分間静置した。レジンは１，４００×ｇで２分間の遠心分離で回収し、カラム（Disposable Filter Colum、Fisher Scientific）に充填し、洗浄用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０））で洗浄を行った。その後、タンパク質は溶出用緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０））で溶出した。精製したタンパク質はｐＨ５．０において最も安定であるため直ちに５０ｍＭ酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ）緩衝液（ｐＨ５．０）および１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液に氷冷下で一晩透析し、酵素溶液として使用した。【００４１】
このようにして、１，０００ｍｌの培養液当たり０．８〜１．０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で単一のバンドを示すＮｉｔＡｌｙが得られた。【００４２】
実施例２：ＮｉｔＡｌｙによるアルギン酸の分解
ＮｉｔＡｌｙによる基質の分解様式を調べるために、酵素反応中の反応混液の経過時間における粘度低下を調べた。測定はオストワルド粘度計を用いて行い、反応系（０．００５ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１％アルギン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ）は５ｍｌとした。反応液は恒温槽を用いて３０℃の一定温度に保った。また、粘度測定と併せて反応液の吸光度も測定した。同条件において４８０分間酵素反応を行い、経過時間ごとに反応液の２３５ｎｍにおける吸光度も同時に測定した。【００４３】
結果を図２に示す。図中、黒丸は相対粘度を、黒三角は２３５ｎｍにおける吸光度を示す。ＮｉｔＡｌｙは、溶液の粘度を低下させることからアルギン酸を分解する能力を有し、リアーゼ反応によって生じる二重結合の生成に伴う２３５ｎｍにおける吸光度の上昇を示したことから、エンド型の切断様式を有すると考えられた。【００４４】
実施例３：ＮｉｔＡｌｙの基質特異性
ＮｉｔＡｌｙの基質特異性を以下のようにして調べた。アルギン酸のポリ（Ｍ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（ＭＧ）、および解集合アルギン酸は、既報の方法（P. Gacesa et al., Appl. Environ. Microbiol, 56:2265-2267 (1990))に従い、市販のアルギン酸ナトリウム（Sigma、Macrosystis pyrifera由来）から調製した。【００４５】
０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、および０．２５％の上記で調製したポリ（Ｍ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（ＭＧ）、またはアルギン酸を含む１ｍｌの反応液を調製し、４０℃で１０分間活性を測定した。２３５ｎｍにおける吸光度を１分間当たり０．０１上昇させる酵素量を１Ｕと定義した。【００４６】
結果を図３に示す。ＮｉｔＡｌｙはポリ（Ｍ）を最も良く分解した（ｐＨ５、６０℃で１，５８０Ｕ／ｍｇ）。【００４７】
実施例４：ＮｉｔＡｌｙの温度依存性
ＮｉｔＡｌｙの示すアルギン酸リアーゼ活性を各種温度で測定した。対照として、市販のFlavobacterium sp.由来アルギン酸リアーゼ（ＦｌａＡｌｙ）（Sigma）を１０ｍｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、酵素溶液とした。【００４８】
ＮｉｔＡｌｙの活性は５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％ポリ（Ｍ）およびアルギン酸リアーゼ（０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ）を含む１ｍｌの反応液をスタンダードの条件として測定した（以下の実施例においても同様）。測定時間は１０分間とし、２３５ｎｍにおける吸光度を１分間当たり０．０１上昇させる酵素量を１Ｕと定義した。【００４９】
ＮｉｔＡｌｙの温度依存性を、上記反応液中で、１０〜８０℃に保ち各１０分間活性測定した。【００５０】
ＦｌａＡｌｙの温度依存性は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．２５％アルギン酸ナトリウム、アルギン酸リアーゼ（０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＦｌａＡｌｙ）を含む１ｍｌの反応液中で、１０〜８０℃に保ち各１０分間活性測定した。【００５１】
結果を図４に示す。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙの至適温度は約７０℃と決定され、４０℃〜８０℃で最大活性の５０％以上の活性を示した。なお、８０℃以上は使用した装置の温度限界のため測定できなかった。一方、ＦｌａＡｌｙは、他の菌類のアルギン酸リアーゼと良く似た４０℃が至適温度であった。【００５２】
実施例５：ＮｉｔＡｌｙのｐＨ依存性
ＮｉｔＡｌｙのｐＨ依存性は、ｐＨ３．３〜３．８の範囲では５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液を、ｐＨ３．８〜５．９の範囲では５０ｍＭ酢酸緩衝液を、ｐＨ６．０〜７．４の範囲では５０ｍＭリン酸緩衝液を、ｐＨ７．０〜８．３の範囲では５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を、ｐＨ８．１〜１０．５の範囲では５０ｍＭ  ＮａＯＨ−グリシン緩衝液をそれぞれ使用し、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％ポリ（Ｍ）、アルギン酸リアーゼ（０．０１  ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ）を含む１ｍｌの反応液中で、４０℃に保ち１０分間活性測定した。【００５３】
ＦｌａＡｌｙのｐＨ依存性は、ｐＨ５．１〜５．８では５０ｍＭ酢酸緩衝液を、ｐＨ６．２〜７．９の範囲では５０ｍＭリン酸緩衝液を、ｐＨ９．０〜９．９の範囲では５０ｍＭ  ＮａＯＨ−グリシン緩衝液をそれぞれ使用し、０．２５％アルギン酸ナトリウム  、アルギン酸リアーゼ（０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＦｌａＡｌｙ）を含む１ｍｌの反応液中で、３０℃に保ち１０分間活性測定した。【００５４】
結果を図５に示す。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙの至適ｐＨは６であり、ｐＨ４〜７の範囲で最大活性の５０％以上の活性を有していたが、中性以上のｐＨでは著しく活性は低下した。一方、ＦｌａＡｌｙは、ｐＨ６〜９で高い活性を示すがｐＨ６以下では急激な活性の減少が見られた。【００５５】
実施例６：ＮｉｔＡｌｙのｐＨ安定性
ＮｉｔＡｌｙのｐＨ安定性を以下のように調べた。ＮｉｔＡｌｙを精製後、直ちに１，０００倍容量のｐＨ４〜８（ｐＨ４および５は５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６および７は５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用）の各緩衝液に対して０℃、１２時間透析した後、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％ポリ（Ｍ）を含む１ｍｌの反応液を調製し、４０℃に保って１０分間活性測定した。【００５６】
結果を図６に示す。ＮｉｔＡｌｙはｐＨ５でインキュベートした場合に最大活性、すなわち最も高い安定性を示した。【００５７】
実施例７：ＮｉｔＡｌｙの塩濃度依存性
ＮｉｔＡｌｙの塩濃度依存性は５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、２５〜１６００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％ポリ（Ｍ）、アルギン酸リアーゼ（０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ）を含む１ｍｌの反応液中で、４０℃に保ち１０分間活性測定した。【００５８】
ＦｌａＡｌｙの塩濃度依存性は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０〜１２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％アルギン酸ナトリウム、アルギン酸リアーゼ（０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＦｌａＡｌｙ）を含む１ｍｌの反応液中で、３０℃に保ち１０分間活性測定した。【００５９】
結果を図７に示す。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙの分解活性はＮａＣｌ濃度依存的に上昇し、８００〜１，４００ｍＭ  ＮａＣｌが至適条件であった。一方、ＦｌａＡｌｙの活性は、ＮａＣｌ濃度の上昇に伴って活性は減少した。【００６０】
実施例８：ＮｉｔＡｌｙの熱安定性
ＮｉｔＡｌｙを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析して得た酵素溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を様々な温度（０〜１００℃）で３０分間インキュベートした後に１０分間の氷冷を行い、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％ポリ（Ｍ）を含む１ｍｌの反応液を調製し、４０℃に保って１０分間活性測定した。【００６１】
ＦｌａＡｌｙの熱安定性は以下の方法で測定した。酵素溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を上記と同様にインキュベートし、１０分間の氷冷を行った後に、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＦｌａＡｌｙ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．２５％  アルギン酸ナトリウムを含む１  ｍｌの反応液を調製し、３０℃に保って１０分間活性測定した。【００６２】
結果を図８に示す。図中、黒丸はＮｉｔＡｌｙについての結果を、白丸はＦｌａＡｌｙについての結果を示す。ＮｉｔＡｌｙはＦｌａＡｌｙに比べて高い熱安定性を示し、６０℃で３０分間インキュベートした後も７０％程度の残存活性を示した。【００６３】
実施例９： ＮｉｔＡｌｙによる分解物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）解析
ＮｉｔＡｌｙをアルギン酸に作用させた際に生じる分解物を以下のように調べた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はTLC plate Silicagel-60（MERCK）を用いて行った。試料とするための酵素反応液は、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％アルギン酸ポリ（Ｍ）および０．０２ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙを含むものを用い、３０℃で酵素反応させた。経時的にこの反応液の２３５ｎｍにおける吸光度を測定した後に反応液を２５０μｌずつ分取した。その後、脱塩濃縮を行うために、イソプロパノール沈殿を行った。すなわち、分取した反応液を氷冷し、同じく氷冷した７５０μｌのイソプロパノールを加えてよく混合し、遠心分離（１６，０００×ｇ、５分）して沈殿を得た。次いで１０００μｌのイソプロパノールを加えてよく混合し、遠心分離して得られた沈殿に室温のエタノールを１０００μｌ加え、混合し遠心分離を行った。得られた沈殿を風乾し、１０μｌの蒸留水に溶解してスポット用試料とした。試料は１μｌずつスポットし、乾燥後、１−ブタノール：酢酸：蒸留水（３：２：２、ｖ／ｖ／ｖ）を展開溶媒としてスポットの展開を行った。プレート上に展開された糖質は、１０％硫酸−エタノール溶液を噴霧し、１３０℃で１５分間加熱することで検出した。マーカーとして、アルギン酸のアワビ粗酵素によるアルギン酸Ｍ−ｂｌｏｃｋ分解物溶液を用いた（図９中のＭ）。【００６４】
図９に示すように、ＮｉｔＡｌｙによって３〜５糖、特に４および５糖が生じた。【００６５】
実施例１０：ＮｉｔＡｌｙの長期熱安定性
ＮｉｔＡｌｙ（０．５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））を様々な温度（２０〜５０℃）で０〜１６時間インキュベートした後に１０分間の氷冷を行い、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｔＡｌｙ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％ポリ（Ｍ）を含む１ｍｌの反応液を調製し、４０℃で１０分間活性を測定した。【００６６】
結果を図１０に示す。図中、黒丸、黒三角、黒四角、黒菱形はそれぞれ２０℃、３０℃、４０℃、５０℃でインキュベートした場合の結果を示す。２０〜３０℃では１６時間後も９０％以上、４０℃では６０％以上の残存活性が見られた。【００６７】
実施例１１：ＮｉｔＡｌｙのＤＴＴ存在下における温度依存性および熱安定性の変化
ＮｉｔＡｌｙのアミノ酸配列を既知の他種のアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列と詳細に比較したところ、ＮｉｔＡｌｙに特有の２個のシステイン（Ｃｙｓ）残基（配列番号１の８０位および２３２位）が見出された。図１１にＮｉｔＡｌｙの予測立体構造を示す。上記２つのＣｙｓ残基は立体構造において互いに近接していることが予測された。すなわち、これらのＣｙｓ残基によって形成され得るジスルフィド結合がＮｉｔＡｌｙの高い熱安定性に寄与している可能性があると考えられた。そこで、ＮｉｔＡｌｙの温度依存性および熱安定性に対する、ジスルフィド結合を切断する還元剤ＤＴＴの影響を調べた。【００６８】
温度依存性および熱安定性を、それぞれ実施例４および８に記載の方法に従って調べた。ＤＴＴ存在下での温度安定性は、予め酵素を５ｍＭ  ＤＴＴを含む基質（ポリ（Ｍ））を除いた酵素反応溶液中で３０分間氷冷した後、終濃度５ｍＭ  ＤＴＴを含む反応液中で様々な温度（１０〜８０℃）で酵素反応を行うことによって調べた。ＤＴＴ存在下での熱安定性は、５ｍＭ  ＤＴＴの存在下で酵素溶液を様々な温度（０〜１００℃）で３０分間インキュベートした後にＤＴＴを含まない反応液中で酵素活性を測定することによって調べた。【００６９】
結果を図１２に示す。図１２において、ＡはＤＴＴの存在による温度依存性の変化を、そしてＢは熱安定性の変化を示す。図中、黒丸、黒菱形はそれぞれＤＴＴ非存在下、ＤＴＴ存在下で得られた結果を示す。ＤＴＴ存在下では、ＮｉｔＡｌｙの至適温度はほとんど変化しなかったが（図１２Ａ）、熱安定性は低下した（図１２Ｂ）。特に６０℃で３０分間インキュベート後の残存活性には大きな差が見られ、ＮｉｔＡｌｙ内のジスルフィド結合が熱安定性に寄与している可能性が示唆された。【００７０】
実施例１２：ＮｉｔＡｌｙ変異体の温度依存性および熱安定性
配列番号１の８０位および２３２位におけるＣｙｓ残基によって形成され得るジスルフィド結合のＮｉｔＡｌｙの温度特性（温度依存性、熱安定性）に対する影響をより詳細に調べるために、Ｃｙｓ残基を別のアミノ酸残基に置換したＮｉｔＡｌｙ変異体を作製した。実施例１で得られたＤＮＡを鋳型とし、ＮｉｔＡｌｙの８０位のＣｙｓ残基をグリシン（Ｇｌｙ）残基に置換するためのプライマーＣ８０Ｇ−Ｆ（配列番号９）およびＣ８０Ｇ−Ｒ（配列番号１０）またはＮｉｔＡｌｙの８０位のＣｙｓ残基をアラニン（Ａｌａ）残基に置換するためのプライマーＣ８０Ａ−Ｆ（配列番号１１）およびＣ８０Ａ−Ｒ（配列番号１２）を使用したＰＣＲにより、８０番目のＣｙｓ残基をＧｌｙ残基またはＡｌａ残基に置換した変異体（それぞれＣ８０Ｇ、Ｃ８０Ａ）をコードするＤＮＡを得、実施例１と同様にして精製タンパク質を調製して、その温度依存性と熱安定性を調べた。【００７１】
結果を図１３に示す。図１３において、Ａは置換による温度依存性の変化を、そしてＢは熱安定性の変化を示す。図中、黒丸、黒三角、黒四角はそれぞれ野生型（ＷＴ）、８０位にＧｌｙ残基を有する変異体（Ｃ８０Ｇ）、８０位にＡｌａ残基を有する変異体（Ｃ８０Ａ）についての結果を示す。いずれの変異体も野生型ＮｉｔＡｌｙに比べて温度依存性は大きくは変わらないが（図１３Ａ）、熱安定性は野生型ＮｉｔＡｌｙ（ＷＴ）と比べて低下した（図１３Ｂ）。これらの結果は、８０位および２３２位のＣｙｓ残基間で形成され得るジスルフィド結合がＮｉｔＡｌｙの熱安定性に寄与していること示唆した。【００７２】
実施例１３：スサビノリ（Porphyra yezoensis）由来アルギン酸リアーゼＰｙＡｌｙへのジスルフィド結合の導入による温度依存性および熱安定性の変化
実施例１２で得られた知見をもとに、熱安定性が低いPorphyra yezoensisのアルギン酸リアーゼに、ＮｉｔＡｌｙの場合と同様にジスルフィド結合を形成するように２個のＣｙｓ残基を置換により７９位および２２９位に導入した変異体を作製した。Porphyra yezoensisのアルギン酸リアーゼ（ＰｙＡｌｙ）遺伝子のヌクレオチド配列およびＰｙＡｌｙのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４および３に示す。配列番号３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを鋳型にし、ＰｙＡｌｙの７９位のＧｌｙ残基をＣｙｓ残基に置換するためのプライマーＰｙ−Ｇ７９ＣＦ（配列番号１３）およびＰｙ−Ｇ７９ＣＲ（配列番号１４）ならびにＰｙＡｌｙの２２９位のプロリン（Ｐｒｏ）残基をＣｙｓ残基に置換するためのプライマーＰｙ−Ｐ２２９ＣＦ（配列番号１５）およびＰｙ−Ｐ２２９Ｒ（配列番号１６）を使用して、７９位および２２９位にＣｙｓ残基を有する変異体（ＰｙＡｌｙＣｙｓ）をコードするＤＮＡを得た。ＰｙＡｌｙＣｙｓのアミノ酸配列を配列番号１７に示す。このＤＮＡからＰｙＡｌｙＣｙｓを実施例１と同様に発現させ精製し、その温度依存性と熱安定性を調べた。【００７３】
測定の際の条件は、野生型または変異体ＰｙＡｌｙ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、０．２５％ポリ（Ｍ）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（５０ｍＭリン酸緩衝液）を含む０．５ｍｌの反応液中で３０℃、１０分間活性測定をスタンダードの条件とした。【００７４】
結果を図１４に示す。図１４において、ＡはＣｙｓ残基導入による温度依存性の変化を、そしてＢは熱安定性の変化を示す。図中、黒丸および黒三角はそれぞれ野生型（ＰｙＡｌｙＷＴ）および変異体（ＰｙＡｌｙＣｙｓ）についての結果を示す。変異型ＰｙＡｌｙＣｙｓの熱安定性は野生型（ＰｙＡｌｙＷＴ）のものと大きくは変わらなかったが（図１４Ｂ）、野生型では活性をほとんど示さない温度（６０℃）において、変異型ＰｙＡｌｙ（ＰｙＡｌｙＣｙｓ）は最大活性の４０％の値を示した（図１４Ａ）。このようにＮｉｔＡｌｙに熱安定性をもたらす一因と考えられるＣｙｓ残基の他の酵素への導入は高温で活性を示すアルギン酸リアーゼの創出にも有効であると示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドおよび当該酵素を使用するアルギン酸の分解方法が提供される。
【図２】
0005858542.tif 000003
【図３】
0005858542.tif 000004
【図４】
0005858542.tif 000005
【図５】
0005858542.tif 000006
【図６】
0005858542.tif 000007
【図７】
0005858542.tif 000008
【図８】
0005858542.tif 000009
【図１０】
0005858542.tif 000010
【図１２】
0005858542.tif 000011
【図１３】
0005858542.tif 000012
【図１４】
0005858542.tif 000013
【図１】
0005858542.tif 000014
【図９】
0005858542.tif 000015
【図１１】
0005858542.tif 000016
【配列表】
0005858542000001.app