(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
(a) 被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させる工程、及び
(b) 工程(a)における反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する工程
を含む、被検物質の酵素活性を検出する方法であって、
前記ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物が、下記式（I）：
0005875044.tif 000014
［式中、R1は、-CN、-CONH2、-CH=CH-CN又は-CH=CH-CONH2を表し、R2はC1-4アルキル基を表し、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はC1-4アルキル基を表し、R5は、水素原子、C1-4アルキルカルボニル基又はC1-4アルキルカルボニルオキシメチル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物であり、
前記酵素活性が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される一種の酵素の活性である、
方法。
【請求項２】
R1が-CN又は-CH=CH-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
R1が-CONH2又は-CH=CH-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
蛍光が、フローサイトメトリーを用いて測定されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
下記式（I）：
0005875044.tif 000015
［式中、R1は、-CN、-CONH2、-CH=CH-CN又は-CH=CH-CONH2を表し、R2はC1-4アルキル基を表し、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はC1-4アルキル基を表し、R5は、水素原子、C1-4アルキルカルボニル基又はC1-4アルキルカルボニルオキシメチル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物、その塩又はそれらの水和物を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用蛍光基質であって、前記ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される少なくとも１種である、基質。
【請求項７】
R1が-CN又は-CH=CH-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、請求項６に記載の基質。
【請求項８】
R1が-CONH2又は-CH=CH-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、請求項６に記載の基質。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の基質を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キットであって、前記ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される少なくとも１種である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物及び該化合物を含むニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質並びに前記化合物を用いた被検物質の酵素活性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、化学品の原料となる化合物の製造工程においては、転換率や選択率の高さ、光学活性化合物の場合には立体選択性の高さから、酵素反応が利用されている。例えば、種々の化学品の原料となるニトリル化合物（アクリルアミド、アクリル酸等）の製造には、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ等による酵素反応が用いられている。ニトリラーゼは、ニトリル基を加水分解してカルボン酸基に変換する酵素であり、ニトリルヒドラターゼは、ニトリル基を水和しアミド基に変換する酵素であり、アミダーゼはアミド基を加水分解してカルボン酸基に変換する酵素である。
これらの酵素を有する微生物は、土壌をはじめとする自然界よりスクリーニングされている。スクリーニング方法としては、一般に、ニトリル化合物などを唯一の窒素源または炭素源として生育する微生物を濃縮し、得られた微生物の中から酵素活性を有するものを取得する方法が採用されている。酵素活性は、ニトリル化合物やアミド化合物と微生物とを反応させ、生成物を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの機器により解析する。
一方で、自然界に存在する微生物のうち、現在の技術で単離・培養可能であるものは１％未満にすぎないという研究結果が報告されている（Ｍ．Ｓ．Ｒａｐｐｅ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，３６９（２００３））。
そこで、従来法のように微生物を単離するのではなく、自然界から遺伝子（環境ＤＮＡ又はメタゲノム）を直接単離し、その中から有用な酵素遺伝子をスクリーニングするという手法（メタゲノムスクリーニング）が行われるようになってきた。この手法を用いるためには、メタゲノムを利用した極めて多数の組換え体を作製し、これらの中から活性ある組換え体を効率よく選別する技術が求められる。しかしながら、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの機器を用いる方法は、ハイスループット性に欠ける。そこで、ハイスループットスクリーニングを可能とする新規な技術が求められるようになった。
他方、蛍光物質に関連する発明として、蛍光プローブ又は蛍光ラベル化剤の発明が知られている（国際公開公報  ＷＯ２００４／００５９１７、ＷＯ２００６／０１９１０５）。しかしながら、本発明の酵素活性の検出に有用な蛍光基質は知られていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、新規化合物及び該化合物を含むニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質並びに前記化合物を用いた被検物質の酵素活性の検出方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物、例えばニトリル関連酵素の作用により蛍光を発するようになる無蛍光（低蛍光）の基質化合物を開発した。また、本発明の基質の蛍光を測定することにより、ニトリル関連酵素の酵素活性を簡便に検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の工程を含む、被検物質の酵素活性を検出する方法：
（ａ）被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させる工程、及び
（ｂ）工程（ａ）における反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する工程。
（２）酵素活性が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される一種の酵素の活性である、上記（１）に記載の方法。
（３）ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物が、下記式（Ｉ）：
0005875044.tif 000002
［式中、Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ２を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表し、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−４アルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子、Ｃ１−４アルキルカルボニル基又はＣ１−４アルキルカルボニルオキシメチル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物である、上記（１）に記載の方法。
（４）Ｒ１が−ＣＮ又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、上記（３）に記載の方法。
（５）Ｒ１が−ＣＯＮＨ２又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ２であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、上記（３）に記載の方法。
（６）蛍光が、フローサイトメトリーを用いて測定されるものである、上記（１）に記載の方法。
（７）下記式（Ｉ）：
0005875044.tif 000003
［式中、Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ２を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表し、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−４アルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子、Ｃ１−４アルキルカルボニル基又はＣ１−４アルキルカルボニルオキシメチル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物。
（８）上記（７）に記載の化合物、その塩又はそれらの水和物を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用蛍光基質。
（９）ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される少なくとも１種である、上記（８）に記載の基質。
（１０）Ｒ１が−ＣＮ又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、上記（８）に記載の基質。
（１１）Ｒ１が−ＣＯＮＨ２又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ２であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、上記（８）に記載の基質。
（１２）上記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の基質を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キット。
本発明の化合物を用いることにより、ニトリル関連酵素の酵素活性を簡便に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ニトリル関連酵素による蛍光基質の反応経路を示す図である。
図２は、蛍光基質の蛍光測定の結果を示す図である。
図３は、ニトリルヒドラターゼ活性による蛍光基質の蛍光強度の増加を検出した結果を示す図である。
図４は、ニトリラーゼ活性による蛍光基質の蛍光強度の増加を検出した結果を示す図である。
図５は、ニトリラーゼ活性による蛍光基質の蛍光強度の増加を検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１０年５月２５日に出願された日本国特許出願（特願２０１０−１１９４３１号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．概要
本発明は、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物（以下、「本発明の化合物」とも称する。）及び該化合物を含むニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質に関する。また、本発明は、被検物質と本発明の化合物とを反応させ、この反応で生じた蛍光の波長及び強度を測定することにより、被検物質の酵素活性を検出する方法に関する。
本発明者らは、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための化合物として、ニトリル関連酵素と反応することにより蛍光が変化する化合物の合成を試みた。合成した化合物の蛍光を測定した結果、酵素反応前の化合物の蛍光よりも、酵素反応により生成されると考えられる化合物の蛍光が上昇することを見出した。そこで、本発明者らは、合成した化合物はニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であると考え、本発明を完成するに至った。
２．化合物
本発明において、「ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物」とは、酵素の作用により、化合物に含まれるニトリル基（−ＣＮ）がアミド基（−ＣＯＮＨ２）又はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に、又は化合物に含まれるアミド基がカルボキシル基に変換されるのに伴って蛍光が変化する化合物を意味する。本発明の化合物は、蛍光団及びニトリル基又はアミド基を有するものであり、化合物中のニトリル基がアミド基又はカルボキシル基に変換されることにより、又は化合物中のアミド基がカルボキシル基に変換されることにより、蛍光団に由来する蛍光が変化するという特徴を有するものであれば、限定されるものではない。
また、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化するメカニズムは一様ではないが、例えば式（Ｉ）で示される化合物については以下のように説明することができる。
本化合物においては、ニトリル関連酵素の反応前には、ＰｅＴ（光誘起電子移動：Ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）によりほぼ無蛍光又は低蛍光である。しかしながら、酵素反応によりニトリル基やアミド基が加水分解されるとＰｅＴが起こらなくなり、蛍光を発する。Ｐｅｔは、光励起されることにより生じる電子移動反応である。
例えば、後述する化合物１は、そのキサンテン部位からベンゼン環部位へのＰｅＴにより、励起蛍光団であるキサンテン環部位からの蛍光が消光されており、ほぼ無蛍光の状態となっている。しかしながら、化合物１のニトリル基がニトリラーゼにより加水分解され、化合物５が生成すると、ＰｅＴが起こらなくなり、化合物５は蛍光を発する。
本発明において、ニトリル関連酵素とは、ニトリル関連化合物（ニトリル基を有する化合物及びアミド基を有する化合物）に作用する酵素を意味する。このような酵素しては、例えば、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼが挙げられる。
ニトリル関連酵素の「作用」とは、水和反応又は加水分解反応を意味する。
蛍光の「変化」とは、蛍光波長のシフト及び／又は蛍光強度の変化を意味する。「変化」したか否かは、以下の基準に基づき判断することができる。蛍光強度が強くなる場合は、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上になる場合をいい、蛍光強度が弱くなる場合は、２／３以下、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下になる場合をいう。また、蛍光波長が変化する場合は、１０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ、より好ましくは６０ｎｍ以上、長波長側または短波長側にシフトする場合をいう。
本発明において、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物としては、例えば、以下の式（Ｉ）で示される化合物が挙げられる。
0005875044.tif 000004
式（Ｉ）において、Ｒ１で表される置換基としては、ニトリル関連酵素と反応する置換基であれば限定されるものではなく、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ２が挙げられる。
Ｒ２で表される置換基としては、Ｃ１−４アルキル基が挙げられる。
Ｒ３及びＲ４で表される置換基としては、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−４アルキル基が挙げられる。
Ｒ５で表される置換基としては、水素原子、Ｃ１−４アルキルカルボニル基又はＣ１−４アルキルカルボニルオキシメチル基が挙げられる。
本発明において、「Ｃ１−４アルキル基」とは、炭素数が１〜４個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられるが、好ましくはメチル基である。
本発明において「Ｃ１−４アルキルカルボニル基」としては、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピオニルカルボニル基、イソブチルカルボニル基などが挙げられるが、好ましくはアセチル基である。
本発明において「Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシメチル基」としては、例えば、アセトキシメチル基、エトキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基などが挙げられるが、好ましくはアセトキシメチル基である。
本発明において「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子又は塩素原子である。
Ｒ２が水素原子ではなくＣ１−４アルキル基であることが好ましい理由としては、Ｒ２が水素原子の場合、ベンゼン環の電子密度が十分に低くはないため、光誘起電子移動による蛍光団の消光が起こりにくいことが挙げられる。すなわち、Ｒ２が水素原子の場合、酵素反応前でも蛍光強度が大きいため、ニトリル関連酵素による酵素反応による大きな蛍光強度変化が望めない。一方、Ｒ２をＣ１−４アルキル基にした場合、ベンゼン環の電子密度は十分に低下し、これにより光誘起電子移動による蛍光団の消光が起こり、酵素反応による蛍光強度の変化が期待できる。
式（Ｉ）で示される化合物の代表例を以下に示す（式中、Ｍｅはメチル基を表す）。
0005875044.tif 000005
上記式（Ｉ）で示される化合物は、その塩又は水和物を形成してもよい。塩は、本発明の効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。
酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸との塩、蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩などを挙げることができる。
塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩（有機アミン塩）、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。
また、本発明の化合物としては、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することもできる。
式（Ｉ）で示される化合物は、以下の方法により製造することができる。
0005875044.tif 000006
まず、出発物質である化合物（ａ）は、東京化成工業（ＴＣＩ）より購入することにより取得することができる。次に、化合物（ａ）をＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ及びＣｓ２ＣＯ３と室温で１時間反応させることにより化合物（ｂ）を得る。次に、化合物（ｂ）を１２Ｎ  ＨＣｌに溶かし、氷浴上でＮａＮＯ２を滴下し、攪拌する。３０分０℃で攪拌した後、水に溶かしたＫＩを滴下し１０分攪拌する。室温に戻し、一時間反応させることにより化合物（ｃ）を得る。さらに、化合物（ｃ）をＴＨＦ中ＣｕＩ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４触媒下で、ＫＣＮと約８０℃  ｒｅｆｌｕｘで３時間反応させることにより化合物（ｄ）を得る。化合物（ｄ）をＭｅＯＨ中でＭｅＯＮａと室温で１０分反応させることにより、化合物（ｅ）を得る。最後に、化合物（ｅ）をＣｓＦ及びＤＭＦ中で１当量のＣＨ３Ｉと室温で約１時間反応させることにより化合物１を得ることができる。
３．蛍光基質
上記式（Ｉ）で示される化合物、その塩又はそれらの水和物は、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として用いることができる。
以下、上記式（Ｉ）で示される化合物が蛍光を生じるメカニズムについて説明する。
上記式（Ｉ）で示される化合物は、ニトリル関連酵素の反応前には、ＰｅＴ（光誘起電子移動：Ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）によりほぼ無蛍光である。しかしながら、酵素反応によりニトリル基やアミド基が加水分解されるとＰｅＴが起こらなくなり、蛍光を発する。Ｐｅｔは、光励起されることにより生じる電子移動反応である。
例えば、化合物１は、そのキサンテン部位からベンゼン環部位へのＰｅＴにより、励起蛍光団であるキサンテン環部位からの蛍光が消光されており、ほぼ無蛍光の状態となっている。しかしながら、化合物１のニトリル基がニトリラーゼにより加水分解され、化合物５が生成すると、ＰｅＴが起こらなくなり、化合物５は蛍光を発する（図１）。
蛍光を検出することができれば、被検サンプル中にニトリル関連酵素が存在していることがわかる。
本発明において、ニトリル関連酵素としては、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、及びアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、式（Ｉ）で示される化合物において、Ｒ１が−ＣＮ又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮである場合は、ニトリル関連酵素はニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼであることが好ましく、Ｒ１が−ＣＯＮＨ２又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨ２である場合は、ニトリル関連酵素はアミダーゼであることが好ましい。
４．酵素活性の検出方法
本発明は、酵素活性の検出方法を提供する。具体的には、被検物質の酵素活性を検出する方法であって、（ａ）被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させる工程；及び（ｂ）工程（ａ）における反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する工程を含む。
本発明において、被検物質としては、ニトリル関連酵素の酵素活性を有するタンパク質又は当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むと予測されるものであれば限定されるものではないが、例えば、自然界から取得したメタゲノムライブラリー又は変異酵素遺伝子ライブラリーなどに含まれる物質が挙げられる。さらに、被検物質には、ＤＮＡ及びタンパク質だけでなく、当該タンパク質を産生する細胞も含まれる。このような細胞としては、細菌、真菌（酵母、糸状菌など）、植物細胞、動物細胞などが挙げられる。さらに、前記細胞には、ニトリル関連酵素の酵素活性を有するタンパク質を発現するように形質転換された細胞が含まれる。前記細胞としては、限定されるものではないが、例えば、宿主ベクター系の開発されているエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の等の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等の糸状菌、などが挙げられる。
メタゲノムライブラリーとは、自然環境中に存在する多様な微生物のＤＮＡから構築されたゲノムライブラリーであり、微生物の培養を行うことなく環境試料から直接ＤＮＡを抽出し、ライブラリー化したものである。変異酵素遺伝子ライブラリーとは、既知の酵素をコードするＤＮＡにランダムに変異を導入し、ライブラリー化したものである。
メタゲノムライブラリーの作製方法については、例えば特開２００７−１５９４１７に記載され、変異酵素遺伝子ライブラリーの作製方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．や、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載されており、当業者であればこれらの文献に基づいて前記ライブラリーを作製することができる。
本発明の検出方法は、具体的には、例えば以下のような方法で行うことができる。
メタゲノムライブラリー又は変異酵素遺伝子ライブラリーを被検物質として用いる場合、これらのライブラリーに含まれるＤＮＡを細胞に形質導入し、形質転換体のライブラリーを作製する。次に、形質転換体に本発明の化合物又は蛍光基質を導入することにより、形質転換体中で産生されたタンパク質と本発明の化合物又は蛍光基質とを反応させる。その後、前記反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する。蛍光の測定には、蛍光検出機器である蛍光分光光度計やイメージャー、フローサイトメトリー等を用いることができる。
フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は、レーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、フローセル中を通過する単一細胞の大きさ、ＤＮＡ量、細胞表面抗原の分布状態、細胞内酵素活性などを計測する方法をいう。本発明の方法においては、被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させ、この反応により生じた蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。
フローサイトメトリーは、市販されているフローサイトメーターを用い、製造業者の説明書に従って行うことができる。フローサイトメーターは、レーザー発生装置、光学系、ノズル、データ処理装置を含む装置であり、蛍光を生じる細胞の自動分離、蛍光の分析及びコンピューターによる解析をすることができる。特に、細胞の分取機能を有するフローサイトメーター（セルソーター）は、目的の蛍光を生じる細胞のみを高速に選別及び分取することが可能である。セルソーターは、セルソーター内のノズルを超音波振動させることによりシース流に液滴を形成させ、目的の細胞を含むシース流が液滴を形成する瞬間に荷電する。荷電した液滴はマイナスに荷電した偏向板に引き付けられ、チューブに回収される。このようにして、目的の蛍光を有する細胞は選別及び分取される。市販されているフローサイトメーターとしては、例えば、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩＩセルソーター（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）などが挙げられる。
本発明においては、被検物質と本発明の化合物との反応により生じた蛍光をフローサイトメトリーを用いて測定し、目的の蛍光を生じる細胞、すなわち目的の酵素活性を有する物質を含む細胞を高速でスクリーニングし、分離又は分取することができる。フローサイトメトリーを用いない場合、一日当たり数百個の細胞の蛍光を測定することが可能であるのに対し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）システムによるフローサイトメトリーを用いた場合、一日あたり数万〜数百万個の細胞の蛍光を測定することが可能である。このことは、ＦＡＣＳによる処理細胞数が１秒当たり数百個である場合、百万個の細胞の測定が１〜２時間で完了することを意味し、より高性能のＦＡＣＳ（１秒当たり約７０００個）であれば、百万個の細胞の測定を数分で完了することを意味する。
従って、本発明の方法においてフローサイトメトリーを用いて蛍光を測定することにより、被検物質の酵素活性の検出を自動化及び高速化することができるだけでなく、目的の酵素活性を有する物質を含む細胞の選別及び分取を自動化及び高速化（ハイスループットスクリーニング）することが可能である。
５．キット
本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物を含む蛍光基質を含有する、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の蛍光基質の他に、溶解液、緩衝液、使用説明書など、ニトリル関連酵素の酵素活性の検出に必要な他の任意の構成要素を適宜含めることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
１．ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物の合成
（１）式（Ｉ）で示される化合物
ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物として、本発明における式（Ｉ）で示される化合物の代表例を以下に示す（式中、Ｍｅはメチル基を表す）。
0005875044.tif 000007
（２）式（Ｉ）で示される化合物の合成
化合物１は、以下のスキーム１に従って合成した。
＜スキーム１：化合物１の合成＞
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出発物質である化合物（ａ）は、東京化成工業（ＴＣＩ）より購入することにより取得した。次に、化合物（ａ）をＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ及びＣｓ２ＣＯ３と室温で１時間反応させることにより化合物（ｂ）を得た。次に、化合物（ｂ）を１２Ｎ  ＨＣｌに溶かし、氷浴上でＮａＮＯ２を滴下し、攪拌した。３０分０℃で攪拌した後、水に溶かしたＫＩを滴下し１０分攪拌した。室温に戻し、一時間反応させることにより化合物（ｃ）を得た。さらに、化合物（ｃ）をＴＨＦ中ＣｕＩ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４触媒下で、ＫＣＮと約８０℃  ｒｅｆｌｕｘで３時間反応させることにより化合物（ｄ）を得た。化合物（ｄ）をＭｅＯＨ中でＭｅＯＮａと室温で１０分反応させることにより、化合物（ｅ）を得た。最後に、化合物（ｅ）をＣｓＦ及びＤＭＦ中で１当量のＣＨ３Ｉと室温で約１時間反応させることにより化合物１を得た。
化合物１
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ６．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３３Ｈｚ），６．６８−６．７３（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１１Ｈｚ），８．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４７，８．２５Ｈｚ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１０Ｈｚ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ−Ｈ］−，３７０．０７１６，Ｆｏｕｎｄ，３７０．０６７２（−４．３８ｍｍｕ）
化合物２も上記スキーム１に準ずる方法により合成した。
化合物２
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，（ＣＤ３ＯＤ）：δ３．６６（ｓ，３Ｈ），６．６７−６．７４（ｍ，４Ｈ），６．９６−６．９９（ｍ，２Ｈ），６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ），８．１８（ｄｄ，１Ｈ  Ｊ＝８．０７，１．４７Ｈｚ），８．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ−Ｈ］−，３７０．０７１５５，Ｆｏｕｎｄ，３７０．０６８３１（−３．２４ｍｍｕ）
化合物３及び４は、以下のスキーム２に従って合成した。
＜スキーム２：４（５）−ＣＯＮＨ２フルオレセインメチルエステルの合成＞
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まず、出発物質である化合物（ｆ）は、ＳＩＧＭＡ社から購入することにより得た。次に、化合物（ｆ）をＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ及びＣｓ２ＣＯ３と室温で１時間反応させることにより化合物（ｇ）を得た（収率９６％）。次に、化合物（ｇ）をＴｓＣｌ及びトリエチルアミン中で、シリカゲルに担持したＮＨ４Ｃｌと室温で１０分反応させることにより化合物（ｈ）を得た。さらに、化合物（ｈ）をＭｅＯＨ中でＭｅＯＮａと室温で１０分反応させることにより化合物（ｉ）を得た。最後に、化合物（ｉ）をＣｓＦ及びＤＭＦ中で１当量のＣＨ３Ｉと室温で１時間反応させることにより化合物３及び４を得た（収率２．３％）。
化合物３
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ），８．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０７，１．４７Ｈｚ），７．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ），７．０１（ｍ，２Ｈ），６．６４（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，３９０．０９７７６，Ｆｏｕｎｄ，３９０．０９４７３（−３．０４ｍｍｕ）
化合物４
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ８．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ），８．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０７，２．２０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ），７．００（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｓ，１Ｈ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，３９０．０９７７６，Ｆｏｕｎｄ，３９０．０９４５７（−３．１９ｍｍｕ）
化合物５及び６は、以下のスキーム３に従って合成した。
＜スキーム３：４（５）−ＣＯＯＨフルオレセインメチルエステルの合成＞
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化合物（ｊ）をＨ２ＳＯ４中のＭｅＯＨと１００℃  ｒｅｆｌｕｘで１時間反応させることにより化合物（ｋ）を得た（収率８．６％）。次に、化合物（ｋ）をＭｅＯＨ中の１当量のＮａＯＨと１００℃  ｒｅｆｌｕｘで２時間反応させることにより化合物５及び６を得た（微量（ｔｒａｃｅ））。
化合物５及び６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，３９１．０８１７８，Ｆｏｕｎｄ，３９１．０８５３６（＋３．５７ｍｍｕ）
２．化合物の蛍光及び蛍光量子収率の測定
上記化合物１〜６の蛍光を測定した。その結果を図２に示す。
図２において、「ＣＮ」は化合物１を表し、「ＣＯＮＨ２−１」は化合物４を表し、「ＣＯＮＨ２−２」は化合物３を表す。また、「ＣＯＯＨ−１」は５−ＣＯＯＨフルオレセインを表し、「ＣＯＯＨ−２」は化合物５及び６の混合物を表す。
また、化合物１〜６の蛍光量子収率（Φｆ１）を測定した。その結果、化合物１〜６の蛍光量子収率は、それぞれ、０．００７、０．１６１、０．０１８、０．３９７、０．０７２９、０．５６５であった。なお、化合物５及び６については、ＨＰＬＣから求めた濃度比に基づき、単離した場合の値を算出した。
これらの測定結果を以下に示す。
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【表１】
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【表２】
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上記結果より、化合物１はほぼ無蛍光であり、ニトリル基（−ＣＮ）がアミド基（−ＣＯＮＨ２）まで加水分解されて化合物３になったとしてもあまり蛍光は上昇しないが、アミドがさらに加水分解されて化合物５になると蛍光が大きく上昇することが明らかとなった（表１）。この結果から、化合物１は、ニトリラーゼの酵素活性を検出するための蛍光基質として用いることができることが示された。
また、化合物３はほぼ無蛍光であり、化合物３のアミド基が加水分解されると蛍光性の化合物５となることから、化合物３はアミダーゼの酵素活性を検出するための蛍光基質として使用できることが示された。
さらに、化合物２は、ニトリル基（−ＣＮ）が、アミド基（−ＣＯＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に変換されるのに伴って蛍光強度が上昇することから、ニトリルヒドラターゼ及びニトリラーゼの活性を検出するための蛍光基質の候補となることが明らかとなった（表２）。
以上より、本実施例において設計及び合成した化合物は、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの酵素反応を、蛍光の変化という形で可視化できる蛍光特性を有しており、酵素活性を検出するための蛍光基質として機能することが示された。
【実施例２】
【０００７】
ニトリルヒドラターゼによる反応
１．ニトリルヒドラターゼ粗酵素液（細胞抽出液）の調製
ロドコッカス属細菌においてロドコッカス  ロドクロウスＪ１株由来ニトリルヒドラターゼを構成的に発現させるためのプラスミドｐＳＪ０３４をロドコッカス  ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株に導入した。ｐＳＪ０３４は、プラスミドｐＳＪ０２３から特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法により作製したものである。ｐＳＪ０２３は、形質転換体  Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２）として産業総合技術研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
プラスミドｐＳＪ０３４によりロドコッカス  ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株を形質転換し、ＡＴＣＣ１２６７４株／ｐＳＪ０３４株を作製した。ベクターｐＫ４を導入した１２６７４株を対照実験に用いた。
ＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換は次のようにして行った。ＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド溶液１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。これを遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）用キュベットに移し、同装置を用いて２．０ＫＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置後、３７℃で１０分間インキュベートし、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌ  を加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。得られたコロニーを培養し、プラスミドが導入されていることを確認した。
培養は、次のように行った。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＹＫ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃にて２４時間前培養を行った。培養液を１ｍｌ取り１００ｍｌの同培地に加え、３０℃にて４８時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ  リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。
得られた菌体懸濁液から１ｍｌを用い、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール４、ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ  ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で氷冷しながら３分間破砕した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液として採取した。
２．酵素反応
１０μＬリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、７５μＬ滅菌水および５μＬの０．０１ｍＭニトリル蛍光基質（化合物２：１０％ＤＭＳＯに溶解）を混合し、３０℃でプレインキュベーションを行った。上記のように調製した細胞抽出液１０μＬを加えることにより反応を開始した。３０℃で１時間反応後、９６穴マイクロプレートに移し、蛍光イメージャー（ＢｉｏＲａｄ社  Ｐｈａｒｏｓ  ＦＸ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ、励起４８８ｎｍ、検出５３０ｎｍ）にて蛍光を検出した。
結果を図３に示した。対照サンプルであるベクターｐＫ４を導入した組換え体より得られた細胞抽出液では蛍光に変化が無かったのに対し、ニトリルヒドラターゼを発現させた組換え体を用いた場合には、顕著な蛍光強度の増加が認められた。
この結果により、本発明の化合物が、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であることが示された。
【実施例３】
【０００８】
ニトリラーゼによる反応
１．ニトリラーゼ粗酵素液（細胞抽出液）の調製
ロドコッカス  ｓｐ．ＳＫ９２株由来ニトリラーゼを高発現する大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＳＫ００２（特開平８−１７３１６９）を１ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に植菌し、３７℃にて７時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１００ｍｌの同培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃にて１５時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ  リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。対照株としてＪＭ１０９／ｐＵＣ１１８を用いた。
得られた菌体懸濁液から１ｍｌを用い、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロ−ル４、ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ  ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で氷冷しながら１分間破砕した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液として採取した。
２．酵素反応
実施例２と同様にして、ニトリル蛍光基質（化合物２）を用いて反応を行い、蛍光イメージャーにて検出した。
結果を図４に示した。対照サンプルであるＪＭ１０９／ｐＵＣ１１８より得られた細胞抽出液では蛍光に変化が無かったのに対し、ニトリラーゼを発現させた組換え体由来の細胞抽出液を用いた場合には、顕著な蛍光強度の増加が認められた。
この結果により、本発明の化合物が、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であることが示された。
【実施例４】
【０００９】
１０μＬリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、７５μＬ滅菌水および５μＬ０．１ｍＭニトリル蛍光基質（化合物２：ＤＭＳＯに溶解）を混合し、３０℃でプレインキュベーションを行った。実施例３と同様の方法で調製した細胞抽出液１０μＬを加えることにより反応を開始した。２４時間反応後、対照サンプルであるＪＭ１０９／ｐＵＣ１１８より得られた細胞抽出液では色の変化はほとんど認められなかったのに対し、ニトリラーゼを発現させた組換え体由来の細胞抽出液を用いた場合には、顕著な緑色の蛍光が認められた（図５）。
この結果により、本発明の蛍光基質の蛍光強度は、肉眼で対照と区別できるほど顕著に高いものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明の化合物を用いることにより、蛍光により簡便に酵素活性を検出することが可能となる。さらに、ＦＡＣＳなどを併用すれば、ハイスループットな酵素活性検出システムを構築することが可能となる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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