(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインまたはその受容体結合ドメインと、
（ｉｉ）コレクチン三量体形成ドメインと
を含む融合タンパク質であって、
（ｉ）がヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１のアミノ酸を含むＴＲＡＩＬまたはその受容体結合ドメインであるか、または
（ｉ）がＴＲＡＩＬＲ１および／またはＴＲＡＩＬＲ２に結合および／または活性化するＴＲＡＩＬの変異体もしくはその受容体結合ドメインを含み、かつ
（ｉｉ）が配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄの２１７〜２５７、２１８〜２５７、２１９〜２５７、２２０〜２５７、２２１〜２５７、２２２〜２５７、２２３〜２５７、２２４〜２５７または２２５〜２５７のアミノ酸を含み、かつ前記（ｉ）のＣ末端に位置する、
前記融合タンパク質。
【請求項２】
（ｉ）および（ｉｉ）の間に可動性リンカーエレメントをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記可動性リンカーエレメントが３〜１５のアミノ酸の長さを有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記可動性リンカーエレメントがグリシン／セリン・リンカーである、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記可動性リンカーエレメントがアミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記可動性リンカーエレメントが３、９、１０、１２または１５のアミノ酸の長さを有する、請求項２から５までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
（ｉ）がＴＲＡＩＬ（配列番号１０）から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
（ｉ）が少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記アミノ酸置換がヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の次のアミノ酸位、Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９のうちの少なくとも一つで行われ、および前記アミノ酸置換が次のアミノ酸位、Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、またはＤ２６９Ｋのうちの少なくとも一つである、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
（ｉｉ）が配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄの２１７〜３７５、２１８〜３７５、２１９〜３７５、２２０〜３７５、２２１〜３７５、２２２〜３７５、２２３〜３７５、２２４〜３７５または２２５〜３７５のアミノ酸を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
（ｉｉ）が少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換が配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄのアミノ酸位Ｆ３５５で行われ、および前記アミノ酸置換が次のＦ３５５Ａ、Ｆ３５５Ｓ、Ｆ３５５Ｔ、Ｆ３５５Ｅ、Ｆ３５５Ｄ、Ｆ３５５Ｋ、またはＦ３５５Ｒのうちの一つである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
（ｉｉ）がマンノースに結合しない変異体を含む、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
プロテアーゼ切断部位を有し得るＮ末端シグナルペプチドドメインをさらに含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｎ末端シグナルペプチドドメインが配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の配列を含む、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号２６〜２８、配列番号４３、配列番号４４または配列番号４７〜５０の配列を含むか、または配列番号４３〜５１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０の配列を含む、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質がＮ末端またはＣ末端に位置する認識／精製ドメインをさらに含む、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記認識／精製ドメインがＳｔｒｅｐ−ｔａｇまたはポリＨｉｓドメインである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記認識／精製ドメインを有し得るおよび／または前記認識／精製ドメインに連結し得る末端の可動性エレメントをさらに含む、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
三量体複合体としてまたは三量体複合体のオリゴマーとして存在する、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記三量体複合体が三つの融合タンパク質間の共有結合によって形成され、および前記共有結合が（ｉｉ）のシステイン間のジスルフィド架橋からなる、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記三量体複合体が三つの同一の融合タンパク質からなる、請求項２０または２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
核酸分子であって、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２４】
発現制御配列に作用可能に結合される、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
ベクター上に位置する、請求項２３または２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の核酸分子を形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞。
【請求項２７】
原核細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
真核細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
前記真核細胞が、哺乳類細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の核酸分子で形質転換されたまたはトランスフェクトされた非ヒト生物。
【請求項３２】
活性剤として請求項１から２２までのいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２６から３０までのいずれか１項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
活性剤として請求項１から２２までのいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２６から３０までのいずれか１項に記載の細胞を含む、診断組成物。
【請求項３４】
ＴＮＦサイトカインの機能障害に関連しておよび／または付随して起こる増殖性障害、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および／または処置における医薬組成物の製造のための、請求項１から２２いずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３５】
ＴＮＦサイトカインの機能障害に関連しておよび／または付随して起こる増殖性障害、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および／または処置における医薬組成物の製造のための、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項３６】
ＴＮＦサイトカインの機能障害に関連しておよび／または付随して起こる増殖性障害、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および／または処置における医薬組成物の製造のための、請求項２６から３０までのいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項３７】
アポトーシス増感剤および／またはアポトーシス誘導剤と組み合わせた請求項３４から３６までのいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレクチン三量体形成ドメインと、融合タンパク質をコードする核酸分子と、核酸分子を有する細胞とに融合したＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカインまたはその受容体結合ドメインを含む融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、三量体複合体としてまたはそのオリゴマーとして存在する。本明細書に説明されるような融合タンパク質、核酸、細胞は、医薬組成物としてまたは治療への応用、診断への応用、および／もしくは研究への応用に適している。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのリガンドは、免疫系で重要な役割を果たしているだけでなく、上皮構造および内皮構造の発生にも関与してきた。1  ＴＮＦファミリーリガンドは、三量体II型の膜貫通タンパク質として主に発現され、および三量体としても構築される可溶性変異体にプロセシングされることが多い。1,2  一部のＴＮＦリガンドの脱落は、それらに対応する受容体を活性化するそれらの能力を妨げることなく、かつそれらの生理的機能にとって重大なことでさえあるのだが、他のＴＮＦリガンドは、タンパク質分解機能によって不活性される。2  活性でないまたはわずかに不十分に活性である可溶性ＴＮＦリガンドは、それらの同族の受容体と依然として相互作用する。例えば、ＴＮＦ、ＣＤ９５Ｌ、ＴＲＡＩＬ、およびＣＤ４０Ｌの可溶型は、それぞれＴＮＦＲ２、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬＲ２、およびＣＤ４０と相互作用するが、これらの受容体によってシグナル伝達を活性化しないか、あるいはわずかに不十分に活性化する。3〜6  特に、不活性の可溶性ＴＮＦリガンドまたは不十分に活性の可溶性ＴＮＦリガンドは、それらの結合活性を人為的に高めることによって高活性分子に変えられることができる。例えば、ＴＮＦ、ＣＤ９５Ｌ、ＴＲＡＩＬ、およびＣＤ４０Ｌの可溶性Ｆｌａｇ標識した変異体は、それらがＦｌａｇ特異的モノクローナル抗体Ｍ２で架橋された場合、それぞれＴＮＦＲ２、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬＲ２、およびＣＤ４０によって頑強なシグナル伝達を刺激する。同様に、可溶性ＣＤ９５Ｌおよび可溶性ＣＤ４０Ｌの六量体融合タンパク質および十二量体融合タンパク質ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に産生されたＴＦＮリガンドの非特異的凝集型製剤は、高活性を示す。6〜8
【０００３】
ＴＮＦファミリーのリガンドの構造的特徴は、カルボキシ末端の「ＴＮＦ２ホモロジードメイン」（ＴＨＤ）または「受容体結合ドメイン」（ＲＢＤ）であり、両用語は、ＴＮＦリガンドの膜貫通型および可溶型の両方の部分であり、本明細書では同様に使用される。1〜2  種々のＴＮＦリガンドのＴＨＤは、ほぼ同一の三次元的折り畳み構造の形をとり、かつ三量体に自己会合を起こす芳香族性残基および疎水性残基のフレームワークで構成されている。1〜2  ＴＨＤは受容体結合も媒介する。一般に、ＴＮＦファミリーの三量体リガンドは、それらに対応する受容体（複数の受容体を含む）の３つの分子に結合する。この単独の相互作用は、受容体関連の細胞内シグナル伝達経路を活性化するにはかならずしも十分ではない。三量体シグナル伝達の能力のあるリガンド受容体複合体の最初の形成は、超分子クラスターへの第２の多量体化を伴うことをいくつかの系統の証拠が示唆している。9〜11  ＴＮＦ受容体活性化におけるこれらの2つの段階（１．リガンド結合；２．受容体リガンド複合体の二次凝集）は、脂質ラフト局在化、細胞骨格支持体、受容体自己凝集、受容体関連のアダプタータンパク質を含むいくつかの因子に種々の程度で依存するだけでなく、リガンド受容体相互作用の親和性および結合活性、ならびにリガンドが受容体にどのような方法で提示されるか（膜リガンドもしくは固定化リガンド対可溶化リガンド、三量体対高凝集体）に依存する。
【０００４】
ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの三量体複合体を組換え単量体ユニットから製造するのは難しいことが公知である。
【０００５】
例えば、ＷＯ０１／４９８６６は、ＴＮＦサイトカインおよび多量体化成分を含む組換え融合タンパク質を開示している。しかし、これらの融合タンパク質の不利な点は、三量体形成ドメインが通常、高分子量を有することおよび／または三量体形成が多少非効率的であることである。
【０００６】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７  （１９８９），  １２０５−１２１３）は、ＴＮＦサイトカインの三量体がＮ末端に位置する安定化モチーフによって安定化されると説明している。ＣＤ９５Ｌでは、ＣＤ９５Ｌ受容体結合ドメインの三量体の安定化は、細胞膜近くに位置しているＮ末端アミノ酸ドメインによっておそらく起こる。
【０００７】
Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２２  （２００４），  １９７−２０２）は、ＣＤ９５Ｌの受容体結合ドメインがＮ末端に位置する人工αヘリックスコイルドコイル（ロイシンジッパー）モチーフによって安定化され得ると説明している。しかし、ポリペプチド鎖の相互の配向（例えば平行配向または逆平行配向）は、ほとんど予測できないことが分った。さらに、コイルドコイルジッパーモチーフにおける７アミノ酸繰り返しの最適数は、決定するのは難しい。さらに、コイルドコイル構造は、ｐＨおよび／またはイオン強度の変化後に、高分子凝集体を形成する傾向がある。
【０００８】
ＭｃＡｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００２，  ２７７（４３）：  ４１２７４−４１２８１）は、ヒトＩＩA型プロコラーゲンアミノ酸配列と、ラットサーファクタントタンパク質（ＳＰ−Ｄ）のネックドメインの最初の２つの７アミノ酸繰り返しに相当する１４アミノ酸配列との間の融合タンパク質の製造を開示している。
【０００９】
ＷＯ０１／４２２９８は、シグナル配列、コラーゲンドメイン、およびネックドメインを含むサーファクタントタンパク質Ｄと、ＣＤ４０Ｌとの間の融合タンパク質の製造を開示している。それらの融合タンパク質の不利な点は、それらが高い免疫抗原性を示す多量体凝集体をもたらすこと、およびそれらが機能的に明確な三量体リガンドを産生しないことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１／４９８６６号
【特許文献２】国際公開第０１／４２２９８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７  （１９８９），  １２０５−１２１３）
【非特許文献２】Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２２  （２００４），  １９７−２０２）
【非特許文献３】ＭｃＡｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００２，  ２７７（４３）：  ４１２７４−４１２８１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
良好な三量体形成特性および改善した医薬品特性を組み合わせた効率的な組換え生産を可能にする、ＴＮＦサイトカインまたは受容体結合ドメインを含む融合タンパク質を提供することが本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、（ｉ）ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインまたはその受容体結合ドメインと、（ｉｉ）コレクチン三量体形成ドメインとを含む融合タンパク質に関する。
【００１４】
本発明は、さらに、本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードする核酸分子、および本明細書に説明されるような核酸分子で形質転換されたもしくは核酸分子をトランスフェクトした細胞または非ヒト生物に関する。
【００１５】
本発明は、また、活性剤として本明細書に説明されるような融合タンパク質、核酸分子、もしくは細胞を含む医薬品組成物または診断組成物に関する。
【００１６】
本発明は、また、療法での使用のための本明細書に説明されるような融合タンパク質、核酸分子、または細胞（例えば、増殖性障害、特にＴＮＦサイトカインの機能障害に関連しておよび／または付随して起こる障害（例えば腫瘍（固形腫瘍もしくはリンパ性腫瘍）、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害（例えばリウマチ様疾患および／もしくは関節疾患）、変性疾患（例えば神経変性疾患（多発性硬化症等））、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応）の予防および／または処置における医薬組成物の製造のための本明細書に説明されるような融合タンパク質、核酸分子、または細胞の使用）に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、アフィニティー精製したＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤのＳＥＣを示す。
【図２】図２は、アフィニティー精製したＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤからのＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１１の銀染色ゲルを示す。
【図３】図３は、アフィニティー精製したＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤからのＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１５によって誘導されたＪｕｒｋａｌ細胞上のカスパーゼ活性を示す。
【図４】図４は、ＷＭ３５、ＨＴ１０８０、およびＨｅＬａ細胞に対するＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤの細胞障害性を示す。
【図５】図５は、アフィニティー精製したＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤのＳＥＣを示す。
【図６】図６は、ＨＶＥＭ−Ｆｃの固定化ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤとの結合を示す。
【図７】図７は、ＴＲＡＩＬコンストラクトを一過性にトランスフェクトした一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からのウエスタンブロットを示す。
【図８】図８は、Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ細胞におけるカスパーゼ活性を示す。
【図９】図９は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図１０】図１０は、ヒト癌細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤの細胞障害活性を示す。
【図１１】図１１は、ＪｕｒｋａｔにおけるＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ誘導カスパーゼ活性を示す。
【図１２】図１２は、ＨＴ１０８０細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬ−ＤＳＰＤによる細胞障害アッセイを示す。
【図１３】図１３は、ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤコンストラクトまたはＴＲＡＩＬ受容体選択的ＳＰＤコンストラクトを一過性にトランスフェクトした一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からのウエスタンブロットを示す。
【図１４】図１４は、ＴＲＡＩＬ受容体１−ＦｃまたはＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃによって差動的に検出されたストレプタクチンプレート上で固定化したＴＲＡＩＬ受容体選択的リガンドを示す。
【図１５】図１５は、ＴＲＡＩＬ受容体の受容体選択的「変異タンパク質」リガンドとの結合を示す。
【図１６】図１６は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図１７】図１７は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤからのＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１８】図１８は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤからのＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４のＪｕｒｋａｔ細胞上でのカスパーゼ活性を示す。
【図１９】図１９は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２０】図２０は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤからのＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２１】図２１は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤからのＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４のＪｕｒｋａｔによるＪｕｒｋａｔ細胞死滅アッセイを示す。
【図２２】図２２は、ヒト癌細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤ、およびＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤの細胞障害活性を示す。
【図２３】図２３は、高度に可溶性な受容体選択的ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤタンパク質を示す。
【図２４】図２４は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＡのＳＥＣを示す。
【図２５】図２５は、ＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１３の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２６】図２６は、ヒト癌細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａの細胞障害効果を示す。
【図２７】図２７は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＤのＳＥＣを示す。
【図２８】図２８は、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＤからのＳＥＣの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２９】図２９は、ヒト癌細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄの細胞障害効果を示す。
【図３０】図３０は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ融合タンパク質の糖質との結合を示す。
【図３１】図３１は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ（Ａ）またはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ（Ｂ）融合タンパク質についての薬物動態を示す。
【図３２】図３２は、初代ヒト肝細胞におけるカスパーゼ活性を示す。
【図３３】図３３は、三量体形成ＡＰＲＩＬコンストラクトを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２３９細胞からの上清のウエスタンブロットを示す。
【図３４】図３４は、ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤに結合するＴＡＣＩ−Ｆｃを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
融合タンパク質は、単量体タンパク質または多量体タンパク質であることもある。好ましくは、融合タンパク質は同一または異なることもある３つの単量体ユニットからなる三量体複合体として存在する。好ましくは、三量体複合体は、３つの同一の融合タンパク質からなる。さらに好ましい実施形態では、三量体複合体は、本明細書に説明されるような３つの融合タンパク質間の共有結合（例えば、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）のシステイン間のジスルフィド架橋の共有結合）によって形成される。そのような三量体複合体は、生物活性を示す。しかし、三量体複合体のオリゴマー（例えば基本的な三量体構造が２倍、３倍、もしくは４倍存在する明確な複合体）も、生物活性を有することが分った。従って、三量体複合体のオリゴマーも好ましい。
【００１９】
融合タンパク質の一つの成分（ｉ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインである。好ましくは、成分（ｉ）は、対立遺伝子変異および／またはその誘導体を含む、哺乳類のサイトカイン、特にヒトサイトカイン、またはその受容体結合ドメインである。さらに、ＴＮＦサイトカインは、対応するサイトカイン受容体に結合する能力がある、および好ましくはそれによってアポトーシス活性または増殖活性が起こり得る受容体活性化の能力がある、その受容体結合ドメインである。サイトカインは、例えば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー（例えば第１表に示されるようにヒトＴＮＦＳＦ−１〜１８）から、好ましくはＬＴＡ（配列番号１）、ＴＮＦα（配列番号２）、ＬＴＢ（配列番号３）、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）、ＣＤ４０Ｌ（配列番号５）、ＣＤ９５Ｌ（配列番号６）、ＣＤ２７Ｌ（配列番号７）、ＣＤ３０Ｌ（配列番号８）、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号９）、ＴＲＡＩＬ（配列番号１０）、ＲＡＮＫＬ（配列番号１１）、ＴＷＥＡＫ（配列番号１２）、ＡＰＲＩＬ１（配列番号１３）、ＡＰＲＩＬ２（配列番号１４）、ＢＡＦＦ（配列番号１５）、ＬＩＧＨＴ（配列番号１６）、ＴＬ１Ａ（配列番号１７）、ＧＩＴＲＬ（配列番号１８）、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号１９）、ＥＤＡ−Ａ２（配列番号２０）、またはその受容体結合ドメインから選択されてもよい。それぞれのタンパク質の好ましい受容体結合ドメインは、第１表（ＮＨ２−ａａ〜ＣＯＯＨ−ａａ）に示され、および、例えば、ＬＴＡ（配列番号１）の５９〜２０５もしくは６０〜２０５、ＴＮＦα（配列番号２）の８６〜２３３、ＬＴＢ（配列番号３）の８２〜２４４もしくは８６〜２４４、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）の５２〜１８３もしくは５５〜１８３、ＣＤ４０Ｌ（配列番号５）の１１２〜２６１もしくは１１７〜２６１、ＣＤ２７Ｌ（配列番号７）の５１〜１９３もしくは５６〜１９３、ＣＤ３０Ｌ（配列番号８）の９７〜２３４、９８〜２３４、もしくは１０２〜２３４、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号９）の８６〜２５４、ＲＡＮＫＬ（配列番号１１）の１６１〜３１７、ＴＷＥＡＫ（配列番号１２）の１０３〜２４９、１０４〜２４９、もしくは１０５〜２４９、ＡＰＲＩＬ１（配列番号１３）の１１２〜２４７もしくは１１３〜２４７、ＡＰＲＩＬ２（配列番号１４）の１１２〜２５０もしくは１１３〜２５０、ＢＡＦＦ（配列番号１５）の１４０〜２８５、ＬＩＧＨＴ（配列番号１６）の９１〜２４０、ＴＬ１Ａ（配列番号１７）の９１〜２５１もしくは９３〜２５１、ＧＩＴＲＬ（配列番号１８）の５２〜１７７、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号１９）の２４５〜３９１、ＥＤＡ−Ａ２（配列番号２０）の２４５〜３８９のアミノ酸を含む。
【００２０】
より好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ＣＤ９５ＬもしくはＴＲＡＩＬまたはそれらの受容体結合ドメインから選択される。特に好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ドメインに位置する膜のない受容体結合ドメインを含むＴＮＦサイトカインの細胞外部分を含む。
【００２１】
好ましい実施形態では、融合タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ヒトＣＤ９５Ｌ（配列番号６）、特にヒトＣＤ９５Ｌのアミノ酸１４２〜２８１または１４４〜２８１から選択される。
【００２２】
さらに好ましい実施形態では、融合タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）、特にヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１から選択される。別の好ましい実施形態では、ヒトＴＲＡＩＬは、最初のアミノ酸（配列番号１０のアミノ酸２８１）として９５〜１２０からの任意のアミノ酸を含む。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、本明細書に説明されるような融合タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）および／またはＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）を結合および／または活性化する、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインもしくはその受容体結合ドメインの変異体を含む。その変異体の結合および／または活性は、例えば本明細書に（例えば実施例に）開示されるようなアッセイによって、またはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，  ２００６，  １０３：８６３４−８６３９）、  Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００５，  ２８０：２２０５−２２１５）、またはＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００５，  ６５：  １１２６５−１１２７０）に開示されるアッセイによって、例えば測定され得る。
【００２４】
変異体は、任意の技法および当業者によって知られている技法、例えばｄｅｒ  Ｓｌｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，  ２００６，  １０３：８６３４−８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００５，  ２８０：２２０５−２２１５）、またはＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００５，  ６５：  １１２６５−１１２７０に開示されている技法によって生成され得、および構造突然変異のいずれの型（例えばアミノ酸の置換、欠失、重複、および／または挿入）を含み得る。好ましい実施形態は、置換の生成である。置換は、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインの少なくとも一つのアミノ酸に影響することがある。好ましい実施形態では、置換は、ＴＲＡＩＬ（例えばヒトＴＲＡＩＬ（例えば配列番号１０））のアミノ酸のうちの少なくとも一つに影響することがある。これに関して好ましい置換は、配列番号１０のヒトＴＲＡＩＬの以下のアミノ酸：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９のうちの少なくとも一つに影響する。配列番号１０のヒトＴＲＡＩＬの好ましいアミノ酸置換は、以下の置換：Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、またはＤ２６９Ｋのうちの少なくとも一つである。
【００２５】
アミノ酸置換（複数の置換を含む）は、ＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２のいずれかに対してもしくはいずれかの上で、ＴＲＡＩＬ（例えばヒトＴＲＡＩＬ）の結合および／または活性に影響することがある。あるいは、アミノ酸置換（複数の置換を含む）は、ＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２の両方に対してもしくは両方の上で、ＴＲＡＩＬ（例えばヒトＴＲＡＩＬ）の結合および／または活性に影響することがある。ＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性は、正に影響される（すなわち、受容体のより強い、より選択的なもしくは特異的な結合、および／またはより多くの活性化）こともある。あるいは、ＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性は、負に影響される（すなわち、受容体のより弱い、より選択的でないもしくはより特異的でない結合、および／または活性化がより少ないまたは活性化がない）こともある。
【００２６】
ＴＲＡＩＬＲ１およびＴＲＡＩＬＲ２の両方の結合および／または活性に影響するアミノ酸置換（複数の置換を含む）を有するＴＲＡＩＬ変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の第１表に見出されることもあり、および配列番号１０の次の２つのアミノ酸置換（Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄ）または次の一つのアミノ酸置換（Ｙ１８９Ａ）を有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含むこともある。
【００２７】
ＴＲＡＩＬＲ１の結合および／または活性に影響するアミノ酸置換（複数の置換を含む）を有するＴＲＡＩＬ変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の第１表に見出されることもあり、および配列番号１０の次の４つのアミノ酸置換（Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、およびＳ２１５Ｄ）もしくは次の５つのアミノ酸置換（Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、およびＳ２１５Ｄ）を有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含むこともあり、またはＫｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の第２表に見出されることもあり、および次の６つのアミノ酸置換（Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、およびＫ２０１Ｒ、またはＹ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｒ）を有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含むこともある。
【００２８】
ＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性に影響するアミノ酸置換（複数の置換を含む）を有するＴＲＡＩＬ変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の第１表もしくはＫｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の第２表に見出されることもあり、および配列番号１４の次の６つのアミノ酸置換（Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、およびＤ２６７Ｑ）、またはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．の第２表（上記参照）に見出されることもあり、および次の１つのアミノ酸置換（Ｄ２６９Ｈ）、次の２つのアミノ酸置換（Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ、またはＤ２６９ＨおよびＴ２１４Ｒ）を有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含むこともある。
【００２９】
さらに好ましい実施形態では、融合タンパク質のサイトカイン部分は、ヒトＬＩＧＨＴ（配列番号１６）、特に配列番号１６のアミノ酸９１〜２４０に由来する。
【００３０】
さらに好ましい実施形態では、融合タンパク質のサイトカイン部分は、ヒトＡＰＲＩＬ（配列番号１３または１４）、特に配列番号１３のアミノ酸１１２〜２４７もしくは１１３〜２４７または配列番号１４のアミノ酸１１２〜２５０もしくは１１３〜２５０に由来する。
【００３１】
可動性リンカーエレメントは、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメイン（ｉ）と、本明細書に説明するようなコレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）との間に加えて位置していることもある。可動性リンカーエレメントは、好ましくは３〜２０のアミノ酸の長さ、特に６、９、１０、１２、１５、または１８のアミノ酸の長さを有する。より好ましくは、可動性リンカーエレメントの長さは、９〜１５のアミノ酸である。可動性リンカーエレメントは、好ましくは、グリシン／セリン・リンカー、すなわち実質的にアミノ酸グリシンおよびセリンからなるペプチドリンカーである。特に好ましい実施形態では、可動性リンカーエレメントは、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有する。ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインがＧで終結する（例えばヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０））場合、そのようなＧはリンカー配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ中のリンカーの最初のＧを形成し得ることは、当業者にとって明らかである。
【００３２】
コレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）は、任意のコレクチンファミリーメンバーを含んでもよい。そのようなメンバーおよびそれらの構造は、例えば、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０００，  ９：１６０７−１６１７）に要約されており、およびサーファクタントタンパク質Ｄ、サーファクタントタンパク質Ａ、マンナン結合タンパク質Ａ、マンナン結合タンパク質Ｃ、肝臓コレクチン１、胎盤コレクチン１、またはコレクチン１１を含むことがある。本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインは、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインと異なる種に由来してもよい。あるいは、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインは、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインと同一の種に由来してもよい。好ましい実施形態では、本明細書に説明されるようなコレクチンドメインは、ヒトに由来し、および本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ヒトに由来する。好ましい実施形態では、コレクチン三量体形成ドメインは、サーファクタントタンパク質Ｄのネックおよび糖結合ドメイン（ＣＲＤ）ドメイン、特に配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄに由来するアミノ酸２１７〜３７５、２１８〜３７５、２１９〜３７５、２２０〜３７５、２２１〜３７５、２２２〜３７５、２２３〜３７５、２２４〜３７５、２２５〜３７５を含む。別の好ましい実施形態では、コレクチン三量体形成ドメインは、サーファクタントタンパク質Ｄのネックドメイン、特に配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄに由来するアミノ酸２１７〜２５７、２１８〜２５７、２１９〜２５７、２２０〜２５７、２２１〜２５７、２２２〜２５７、２２３〜２５７、２２４〜２５７、または２２５〜２５７を含む。別の好ましい実施形態では、コレクチン三量体形成ドメインは、コレクチン１１のネックおよび糖結合ドメイン（ＣＲＤ）ドメイン、特に配列番号２２のヒトコレクチン１１のアミノ酸１１０〜２７１、１１６〜２７１、または１２１〜２７１を含む。別の好ましい実施形態では、コレクチン三量体形成ドメインは、コレクチン１１のネックドメイン、特に配列番号２２のヒトコレクチン１１のアミノ酸１１０〜１４７、１１０〜１４８、１１０〜１４９、１１０〜１５０、１１０〜１５１、１１６〜１４７、１１６〜１４８、１１６〜１４９、１１６〜１５０、１１６〜１５１、１２１〜１４７、１２１〜１４８、１２１〜１４９、１２１〜１５０、または１２１〜１５１を含む。
【００３３】
コレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）は、マンノースに結合しない変異体（例えばサーファクタントタンパク質Ｄまたはコレクチン１１の変異体）を含むこともある。そのような変異体は、当業者に公知の方法、例えばＣｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００６，  ２８１  （２６）：  １８００８−１８０１４）に開示された方法で同定され得る。コレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）は、本明細書に説明されるように少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、および本明細書に説明されるように作製され得る変異体をさらに含むこともある。そのようなアミノ酸置換は、療法でおよび／または医薬組成物として用いられるとき、コレクチン三量体形成ドメインのそのリガンドマンノースとの結合を修飾することもあり、ならびに本明細書に説明されるように融合タンパク質のクリアランス速度の変化をもたらすこともある。そのような修飾は、マンノースとの結合を減少させること、または結合をなくすこと、および低クリアランス速度をもたらすこともある。そのような修飾は、例えば、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄのアミノ酸位Ｆ３５５に影響するアミノ酸置換によって、特にアミノ酸置換Ｆ３５５Ａ、Ｆ３５５Ｓ、Ｆ３５５Ｔ、Ｆ３５５Ｅ、Ｆ３５５Ｄ、Ｆ３５５Ｋ、またはＦ３５５Ｒによって達成され得る。置換Ｆ３５５Ｄが特に好ましい。あるいは、この修飾は、マンノースとの結合の増加および高クリアランス速度をもたらすこともある。そのような修飾は、例えば、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄのアミノ酸位Ｆ３５５に影響するアミノ酸置換によって、特にアミノ酸置換Ｆ３５５Ｌ、Ｆ３５５Ｙ、またはＦ３５５Ｗによって達成され得る。
【００３４】
本明細書に説明されるように本発明の融合タンパク質では、コレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメイン（ｉ）のＣ末端に位置していてもよい。従って、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインと、ネックドメイン単独またはネックおよびＣＲＤドメイン（例えば、両方ともに本明細書に説明されるようなサーファクタントタンパク質ＤのネックドメインとＣＤＲおよび／もしくはネックドメイン、またはコレクチン１１のネックドメインとＣＲＤおよび／もしくはネックドメインを有し、ここで、これらのドメインは、ＴＮＦスーパーファミリーまたはその受容体結合ドメイン（ｉ）のＣ末端に位置している）を有するコレクチン三量体形成ドメインとを含むこともある。この実施形態では、コレクチン三量体形成ドメインはネックドメインとＣＲＤとを含むことが好ましい。
【００３５】
本発明の本明細書に説明されるような融合タンパク質では、コレクチン三量体形成ドメイン（ｉｉ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインおよびその受容体結合ドメイン（ｉ）のＮ末端に位置していることもある。従って、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインおよびその受容体結合ドメインと、ネックドメイン（例えば、両方とも本明細書に説明されるようなサーファクタントタンパク質Ｄのネックドメインまたはコレクチン１１のネックドメインを有し、ここで、これらのドメインはＴＮＦスーパーファミリーまたはその受容体結合ドメイン（ｉ）のＮ末端に位置している）を有するコレクチン三量体形成ドメインとを含むこともある。
【００３６】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは本明細書に説明されるようなＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインもしくはその変異体、特にサーファクタントタンパク質ＤのＣＲＤおよびネックドメイン、好ましくは、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄのアミノ酸２１７〜３７５、２１８〜３７５、２１９〜３７５、２２０〜３７５、２２１〜３７５、２２２〜３７５、２２３〜３７５、２２４〜３７５、２２５〜３７５とを含む。ここで、本明細書に説明されるようにコレクチン三量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に位置している。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号２６または２７である。あるいは、上述の融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有するリンカーをさらに含むこともある。好ましくは、リンカーは９〜１５のアミノ酸の長さを有する。
【００３７】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたはＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインもしくはその変異体、特にサーファクタントタンパク質Ｄのネックドメイン、好ましくは、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄのアミノ酸２１７〜２５７、２１８〜２５７、２１９〜２５７、２２０〜２５７、２２１〜２５７、２２２〜２５７、２２３〜２５７、２２４〜２５７、または２２５〜２５７とを含む。ここで、本明細書に説明されるようにコレクチン三量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に位置している。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号２８である。あるいは、上述の融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有するリンカーをさらに含むこともある。好ましくは、リンカーは９〜１５のアミノ酸の長さを有する。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたはＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインもしくはその変異体、特にコレクチン１１のＣＲＤおよびネックドメイン、好ましくは、配列番号２２のヒトコレクチン１１のアミノ酸１１０〜２１７、１１６〜２７１、または１２１〜２７１とを含む。ここで、本明細書に説明されるようにコレクチン三量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に位置している。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号２９または３０である。あるいは、上述の融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有するリンカーをさらに含むこともある。好ましくは、リンカーは９〜１５のアミノ酸の長さを有する。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたはＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインもしくはその変異体、特にコレクチン１１のネックドメイン、好ましくは、配列番号２２のヒトコレクチン１１のアミノ酸１１０〜１４７、１１０〜１４８、１１０〜１４９、１１０〜１５０、１１０〜１５１、１１６〜１４７、１１６〜１４８、１１６〜１４９、１１６〜１５０、１１６〜１５１、１２１〜１４７、１２１〜１４８、１２１〜１４９、１２１〜１５０、または１２１〜１５１とを含む。ここで、本明細書に説明されるようにコレクチン三量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に位置している。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号３１である。あるいは、上述の融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有するリンカーをさらに含むこともある。好ましくは、リンカーは９〜１５のアミノ酸の長さを有する。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号３６または３７である。
【００４０】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたはＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインもしくはその変異体、特にサーファクタントタンパク質Ｄのネックドメイン、好ましくは、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質のアミノ酸２１７〜２５７、２１８〜２５７、２１９〜２５７、２２０〜２５７、２２１〜２５７、２２２〜２５７、２２３〜２５７、２２４〜２５７、または２２５〜２５７とを含む。ここで、本明細書に説明されるようにコレクチン三量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＮ末端に位置している。あるいは、上述の融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有するリンカーをさらに含むこともある。好ましくは、リンカーは９〜１５のアミノ酸の長さを有する。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたはＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１、または１２０〜２８１と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインもしくはその変異体、特にコレクチン１１のネックドメイン、好ましくは、配列番号２２のヒトコレクチン１１のアミノ酸１１０〜１４７、１１０〜１４８、１１０〜１４９、１１０〜１５０、１１０〜１５１、１１６〜１４７、１１６〜１４８、１１６〜１４９、１１６〜１５０、１１６〜１５１、１２１〜１４７、１２１〜１４８、１２１〜１４９、１２１〜１５０、または１２１〜１５１とを含む。ここで、本明細書に説明されるようにコレクチン三量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＮ末端に位置している。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号３２〜３４である。あるいは、上述の融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）を有するリンカーをさらに含むこともある。好ましくは、リンカーは９〜１５のアミノ酸の長さを有する。好ましい融合タンパク質は、これに関しては配列番号３５である。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＣＤ９５Ｌ、特にヒトＣＤ９５Ｌまたはその受容体結合ドメイン、例えば配列番号４０のアミノ酸２１〜１６０と、ネックドメインおよび場合によりヒトＳＰ−ＤのＣＲＤ、例えば配列番号４０のアミノ酸１７２〜２０９および２１０〜３２７を含むコレクチン三量体形成ドメインと、または本明細書に説明されるようなそれぞれその変異体とを含む。好ましくは、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなリンカー（例えば可動性リンカー）、より好ましくは、好ましくは９〜１５のアミノ酸の長さを有する本明細書に説明されるようなグリシン／セリン・リンカーを含むこともある。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号４０、特に配列番号４０のアミノ酸２１〜３２７である。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＬＩＧＨＴ、特にヒトＬＩＧＨＴまたはその受容体結合ドメイン、好ましくは配列番号４１のアミノ酸２１〜１７０と、ネックドメインおよび場合によりヒトＳＰ−ＤのＣＲＤ、例えば配列番号４１のアミノ酸１８２〜２１９および２２０〜３３７を含むコレクチン三量体形成ドメインと、または本明細書に説明されるようなそれぞれその変異体とを含む。好ましくは、サイトカインおよびコレクチンドメインは、好ましくは９〜１５のアミノ酸の長さを有する本明細書に説明されるようなリンカー（例えばグリシン／セリン・リンカー）によって結合される。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号４１、特に配列番号４１のアミノ酸２１〜３２７である。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるような、ＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたはＴＲＡＩＬの変異体、例えば、配列番号４３（野生型ＴＲＡＩＬ）のアミノ酸２１〜１８１、配列番号４７（ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質）のアミノ酸２１〜１８１、または配列番号４８（ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質）のアミノ酸２１〜１８１を含む。さらに、融合タンパク質は、ネックドメインおよび場合によりヒトＳＰ−ＤのＣＲＤ（例えば、配列番号４３のアミノ酸１９３〜２３０および２３１〜３８４）、または本明細書に説明されるようにそれぞれその変異体（例えば配列番号４９もしくは５０に示されるような変異体）から選択されるコレクチン三量体形成ドメインを含む。好ましくは、融合ポリペプチドは、ヒトＳＰ−Ｄのネック領域およびＣＤＲの両方を含む。サイトカインおよびコレクチンドメインは、好ましくは、リンカー（例えば、本明細書に説明されるようなグリシン／セリン・リンカー）によって結合される。好ましくは、リンカーは、９〜１５のアミノ酸の長さを有する。これに関して好ましい融合タンパク質は、（ｉ）配列番号４３、特に配列番号４３のアミノ酸２１〜３４８、（ｉｉ）配列番号４４、特に配列番号４４のアミノ酸２１〜２３０、（ｉｉｉ）配列番号４７、特に配列番号４７のアミノ酸２１〜３４８、（ｉｖ）配列番号４８、特に配列番号４８のアミノ酸２１〜３４８、（ｖ）配列番号４９、特に配列番号４９のアミノ酸２１〜３４８、または（ｖｉ）配列番号５０、特に配列番号５０のアミノ酸２１〜３４８を含む。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特にヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは上述のようにＴＲＡＩＬの変異体と、ヒトコレクチン１１のネックドメインであるコレクチン三量体形成ドメインと、場合によりヒトコレクチン１１のＣＲＤ（例えば、それぞれ配列番号４５のアミノ酸１９３〜２２４および２２５〜３４７）とを含む。好ましくは、ＣＲＤは存在する。好ましくは、サイトカインおよびコレクチンドメインは、好ましくは９〜１５のアミノ酸の長さを有する本明細書に説明されるようなリンカー（例えばグリシン／セリン・リンカー）によって結合される。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号４５および配列番号４６、特に配列番号４５のアミノ酸２１〜３４７または配列番号４６のアミノ酸２１〜２２９である。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に説明されるようなＡＰＲＩＬ、特にヒトＡＰＲＩＬ、またはその受容体結合ドメイン（例えば配列番号５１のアミノ酸２１〜１５８）と、本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインと、特にネックドメインおよび場合によりヒトＳＰ−ＤのＣＲＤと、または本明細書に説明されるような変異体（例えばそれぞれ配列番号５１のアミノ酸１７０〜２０７および２０８〜３２５）とを含む。好ましくは、サイトカインおよびコレクチンドメインは、好ましくは９〜１５のアミノ酸の長さを有する本明細書に説明されるようなリンカー（例えばグリシン／セリン・リンカー）によって結合される。これに関して好ましい融合タンパク質は、配列番号５１、特に配列番号５１のアミノ酸２１〜３２５である。
【００４７】
本明細書に説明されるような融合タンパク質は、プロセシング（例えば適した宿主細胞における細胞外分泌）を可能にするＮ末端のシグナルペプチドドメインをさらに含むこともある。好ましくは、Ｎ末端のシグナルペプチドドメインは、プロテアーゼ（例えばシグナルペプチダーゼ切断部位）を含み、および従って、成熟タンパク質を得るために発現後または発現の間に除去されてもよい。好ましい実施形態では、Ｎ末端のシグナルペプチドドメインは、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の配列を含む。
【００４８】
さらに、融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端に位置することもある認識／精製ドメイン（例えばＳｔｒｅｐ−ｔａｇドメインおよび／またはポリＨｉｓドメイン）を含む。
【００４９】
融合タンパク質は、例えば１〜５０、好ましくは１０〜３０のアミノ酸の長さを有するＣ末端の可動性エレメントをさらに含んでもよい。この可動性エレメントは、本明細書に説明されるような認識／精製ドメインを含むこともあり、および／またはこのドメインに結合することもある。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ分子）またはＲＮＡ分子であり得る。核酸分子は、融合タンパク質もしくはその前駆体（例えば、本明細書に説明されるようなシグナル配列を含み得る融合タンパク質のプロ−もしくはプレ−プロ体）と、または本明細書に説明されるような融合タンパク質の好ましくはＮ末端および／もしくはＣ末端に位置している分泌もしくは精製のための他の異種アミノ酸部分とをコードし得る。核酸分子は、異種アミノ酸部分がプロテアーゼ切断部位（例えば第Ｘａ因子、トロンビンもしくはＩｇＡプロテアーゼ切断部位）を介して第一のドメインおよび／または第二のドメインに結合されることもある融合タンパク質をコードし得る。
【００５１】
本明細書に説明されるような融合タンパク質のコード配列を含む核酸の例は、配列番号３８、３９、または４２である。
【００５２】
核酸分子は、発現制御配列（例えば、所望の宿主細胞で核酸分子の発現を可能にする発現制御配列）に作用可能に結合され得る。核酸分子は、ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、染色体組み込みベクター上に位置してもよい。適切な発現制御配列およびベクターの例は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、またはそれらの最新版に説明されている。
【００５３】
種々の発現ベクター／宿主細胞系を用いて、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を発現させてもよい。適切な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌等の原核細胞（例えば大腸菌）、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または動物細胞等の真核宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞、およびより好ましくはヒト細胞が挙げられる。本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードする核酸分子は、適切な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば哺乳類細胞またはヒト細胞））での発現のためのコドン出現頻度を考えて最適化されてもよい。
【００５４】
さらに、本発明は、本明細書に説明されるような核酸分子で形質転換された、またはトランスフェクトされた非ヒト生物（マウスもしくはラット）に関する。そのような生物は、相同組換えを含む遺伝子伝達に関する公知の方法によって作製されたノックアウト生物を含んでもよい。あるいは、そのような生物は、本明細書に説明されるような核酸分子のいくつかのコピーを有するトランスジェニック生物を含んでもよい。トランスジェニック生物の作製は当該技術分野で公知である。
【００５５】
融合タンパク質、それをコードする核酸、形質転換細胞もしくはトランスフェクトされた細胞、ならびに三量体複合体または三量体複合体のオリゴマーは、すべて本明細書に説明されるように医薬品への応用、診断への応用、および／または研究への応用のために使用され得る。これらの応用の場合、そのようなタンパク質をヒトに適用するとき、免疫効果を最小限に抑えるために、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーサイトカインもしくその受容体結合ドメインおよび本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインが両方とも同一の種（例えばヒト）に由来する融合タンパク質を使用することが好ましい。さらに、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーサイトカインもしくはその受容体結合ドメインの、本明細書に説明されるようなネック−コレクチン三量体形成ドメイン（例えばサーファクタントタンパク質Ｄもしくはコレクチン１１に由来するネックドメイン）との融合は、速いクリアランスをもたらし得る。あるいは、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーサイトカインもしくはその受容体結合ドメインの、本明細書に説明されるようなネックおよびＣＲＤ−コレクチン三量体形成ドメイン（例えばサーファクタントタンパク質Ｄもしくはコレクチン１１に由来するネックおよびＣＲＤドメイン）との融合は、遅いクリアランスをもたらし得る。本明細書に説明されるようなコレクチン三量体形成ドメインの変異体を使用することにより、本明細書で説明するような方法で、融合タンパク質のクリアランス速度を変更し得る。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、活性剤としてすべて本明細書に説明されるような少なくとも一つの融合タンパク質、それをコードする核酸、形質転換細胞もしくはトランスフェクトした細胞、ならびに三量体複合体もしくは三量体複合体のオリゴマーを含む医薬品組成物または診断組成物に関する。
【００５７】
すべて本明細書に説明されるような少なくとも一つの融合タンパク質、それをコードする核酸、形質転換細胞もしくはトランスフェクトした細胞、ならびに三量体複合体もしくは三量体複合体のオリゴマーは、療法で、例えば、種々の増殖性障害から選択された障害、特にＴＮＦサイトカインの機能障害に関連しておよび／または付随して起こる障害、例えば腫瘍（例えば固形腫瘍もしくはリンパ性腫瘍）、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害（例えばリウマチ様疾患および／もしくは関節疾患）、変性疾患（例えば神経変性疾患（多発性硬化症等））、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および／または処置で使用され得る。
【００５８】
組成物は、単独療法として、またはさらなる薬物（例えば細胞分裂阻害剤もしくは化学療法剤、副腎皮質ステロイド薬、および／または抗生物質）との併用療法として投与されてもよい。好ましくは、組成物は、腫瘍選択的なアポトーシスの感作剤および／または誘発剤（例えば、実施例２．８に記述）とともに投与される。
【００５９】
融合タンパク質は、それを必要とする被験者、特にヒト患者に、特定の状態の治療のために十分な用量を適切な方法で投与される。例えば、融合タンパク質は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントとともに医薬組成物として配合され得る。治療効果および毒性は、標準プロトコールに従って決定され得る。医薬組成物は、全身的に（例えば腹腔内に、筋肉内に、もしくは静脈内に）または局所的に（例えば鼻腔内に、皮下に、もしくはくも膜下腔内に）投与され得る。静脈投与が好ましい。
【００６０】
投与される融合タンパク質の用量は、当然、処置されるべき被験者、被験者の体重、疾患の種類および重症度、投与方法、および処方する医師の判断に依存する。融合タンパク質の投与に関しては、０．００１〜１００ｍｇ／ｌｋｇの一日量が適切である。
【００６１】
第１表は、本発明で使用され得るＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインの一覧表を示す。
【００６２】
第１表
【表１】
0006029646.tif 000002
【００６３】
別の態様では、本発明は、減少した糖結合能力を有する糖鎖認識ドメインを含み、少なくとも一つの異種ポリペプチドもしくはポリペプチドドメインならびにそのような融合ポリペプチドをコードする核酸分子に場合により融合したヒトサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）の新規のアミノ酸置換変異体に関する。好ましくは、本発明の変異型ＳＰ−Ｄポリペプチドは、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質ＤのＦ３５５位にアミノ酸置換、特に親水性アミノ酸または荷電アミノ酸によるアミノ酸置換（例えばＦ３５５Ｓ、Ｆ３５５Ｔ、Ｆ３５５Ｅ、Ｆ３５５Ｄ、Ｆ３５５Ｈ、またはＦ３５５Ｒ、特にＦ３５５Ｄ）を有する。異種ポリペプチドもしくはポリペプチドドメインは、好ましくは哺乳類、例えばヒト由来（上述するように例えばＴＮＳＦサイトカインドメイン）である。変異型ＳＰ−Ｄポリペプチドは、好ましくは、上述のようにＳＰ−Ｄネックドメインを含む。異種ポリペプチドは、ＳＰ−ＤドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合され得る。好ましくは、リンカー（例えば、本明細書で上述するようなリンカー）は、ＳＰ−Ｄおよび異種ポリペプチドドメインの間に存在する。
【００６４】
融合タンパク質の基本構造
以下に、本発明の組換えタンパク質の基本構造を、本明細書に説明されるようなＴＮＦスーパーファミリーサイトカインを例示して示す。
【００６５】
１．１ シグナルペプチドの配列
0006029646.tif 000003
【００６６】
１．２ フラッグ−エピトープ／エンテロキナーゼ−プロセシング部位
0006029646.tif 000004
【００６７】
１．３ ヒトコレクチン
サーファクタントタンパク質Ｄ（配列番号２１）
0006029646.tif 000005
【００６８】
コレクチン１１（配列番号２２）
0006029646.tif 000006
【００６９】
ヒトコレクチンサーファクタントタンパク質Ｄおよびコレクチン１１の種々の断片は、本明細書に説明されるような三量体形成ドメインとして考えられる。
【００７０】
１．４ 可動性リンカーエレメント
（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（配列中、ａ、ｂ、ｃは、各０、１、２、３、４、５、または６である）。
【００７１】
１．５ ＴＮＦスーパーファミリーサイトカイン／その受容体結合ドメイン（第１表も参照）
0006029646.tif 000007
【００７２】
0006029646.tif 000008
【００７３】
0006029646.tif 000009
【００７４】
0006029646.tif 000010
【００７５】
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【００７６】
0006029646.tif 000012
【００７７】
0006029646.tif 000013
【００７８】
種々の断片（例えばＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの受容体結合ドメイン）は、本明細書に説明されるように考えられる。
【００７９】
１．６ 融合タンパク質の例
0006029646.tif 000014
【００８０】
0006029646.tif 000015
【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【実施例】
【００８５】
実施例
１． 材料および方法
１．１  三量体形成ドメインに由来のＣ末端に位置するコレクチンによって安定化したＴＮＦ−ＳＦタンパク質の構築
ヒトコレクチン１１（Ｃｏｌ１１）、コレクチン１１「コイルドコイル」（ＣＣ１１）、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、ＳＰ−Ｄの「コイルドコイル」（ＣＣＳＰＤ）に由来する三量体形成モチーフ（第２表および第３表）を、それぞれＣＤ９５Ｌのヒト受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（「ＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤ」；Ｇｌｕ１４２−Ｌｅｕ２８１）、ヒトＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ（Ｇｌｎ１２０−Ｇｌｙ２８１）、ヒトＬＩＧＨＴ−ＲＢＤ（Ｇｌｕ９１−Ｖａｌ２４０）、およびヒトＡＰＲＩＬ−ＲＢＤ（Ｌｙｓ１１３−Ｌｅｕ２５０）にＣ末端融合させた。
【００８６】
【表２】
0006029646.tif 000020
【００８７】
第２表：三量体形成モチーフの構築のために使用した野生型配列由来の領域の一覧表
三量体形成モチーフ
【表３】
0006029646.tif 000021
【００８８】
第３表：安定したＴＮＦＳＦ融合タンパク質を作製するために使用したＣ末端三量体形成モチーフの説明
ＴＮＦＳＦ−ＲＢＤと三量体形成ドメインとの間に、可動性リンカーエレメントを種々の長さで置いた（第４表）：
【表４】
0006029646.tif 000022
【００８９】
第４表：リンカー名およびアミノ酸配列（Ｇ＝グリシン；Ｓ＝セリン）
１．２  発現コンストラクトの作製
本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードする核酸分子は、融合タンパク質を発現するための適切なベクターにクローン化され得る。そのようなベクターを作製するために必要な分子ツールは、当業者に公知であり、ならびに制限酵素、ベクター、およびベクターを伝播するための適切な宿主を含む。
【００９０】
精製および分析の戦略のために、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（アミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ）をＣ末端に加えた。この親和性タグを、可動性リンカーエレメント（アミノ酸配列ＰＳＳＳＳＳＳＡ）によって三量体形成ドメインに結合させた。分泌に基づいた発現を可能にさせるために、ヒトＩｇκに由来するシグナルペプチドを前述のタンパク質のＮ末端に融合させた。この融合タンパク質のアミノ酸配列を逆翻訳して、哺乳類細胞に基づいた発現のためにそれらのコドン出現頻度を最適化した。遺伝子合成を、ＥＮＴＥＬＥＣＨＯＮ  ＧｍｂＨ（ドイツ国レーゲンスブルク）によって行った。最終的な発現カセットを、プラスミドの固有なＨｉｎｄ−ＩＩＩ部位およびＮｏｔ−Ｉ部位を用いて、ｐＣＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘの主鎖にサブクローニングした。すべての発現カセットを常にＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９１】
データを以下のコンストラクトについてここに提示する（第５ａ表および第５ｂ表）：
【表５】
0006029646.tif 000023
第５ａ表：表示したデータを有するＴＲＡＩＬ融合タンパク質の概要。黒丸はデータが提示されていることを、ｎ．ｓ．は示されてないことを示す。
【００９２】
【表６】
0006029646.tif 000024
第５ｂ表：表示したデータを有するＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬ、およびＣＤ９５Ｌのコンストラクトの概要。黒丸はデータが提示されていることを、ｎ．ｓ．は示されてないことを示す。
【００９３】
１．３  ＴＮＦスーパーファミリーの遺伝子操作したリガンドの発現および精製
１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）培地で増殖させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードするプラスミドに一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、組換えタンパク質を含有する細胞培養の上清を収集して、３００ｘｇで遠心分離し、続いて０．２２μｍ無菌フィルターを通す濾過によって浄化した。アフィニティー精製のために、４ｍｌの５０％ストレプタクチン・セファロース（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ゲッティンゲン）を２ｍｌカラムに充填して、３０ｍｌのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．  １００１０）または緩衝液Ｗ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化した。細胞培養の上清を、４℃で、カラムに２ｍｌ／分の流速で注いだ。続いて、カラムをＰＢＳまたは緩衝液Ｗで洗浄して、特異的に結合したタンパク質を５×２ｍｌの緩衝液Ｅ（ＰＢＳまたは２．５ｍＭのデスチオビオチンを加えた緩衝液Ｗ、ｐＨ７．４）を加えることによって段階的に溶出させた。溶出液画分のタンパク質含有量を、吸収分光法および銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。陽性画分を、続いて限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，  Ｖｉｖａｓｐｉｎ，  １０，０００Ｄａカットオフ）によって濃縮し、さらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。
【００９４】
Ａｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＳＥＣをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上で行った。カラムをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．  １００１０）で平衡化して、濃縮したストレプタクチン精製タンパク質をＳＥＣカラム上に、０．５ｍｌ／分の流速で添加した。この溶出を、２８０ｎｍの吸光度で観察した。精製したタンパク質の見かけの分子量を、ゲル濾過の標準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ミュンヘン）によるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムのキャリブレーションに基づいて決定した。
【００９５】
１．４  細胞死アッセイ
カスパーゼ活性化を分析するために、Ｊｕｒｋａｔ  Ａ３永久ヒトＴ細胞株（カタログ番号ＣＲＬ２５７０、ＡＴＣＣ）による細胞アッセイを用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧｉｂＣｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）を用いてフラスコ内で増殖させた。アッセイの前に、ウェルあたり１００，０００細胞を９６ウェルのマイクロタイタプレートに播種した。架橋抗体の有無にかかわらずタンパク質を含有する異なる溶液をウェルに添加（最終容量：２００μｌ）し、続いて３７℃で３時間インキュベートした。２０μｌの溶解緩衝液（２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＥＧＴＡ、５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１００ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＥＢＳＦ、ｐＨ  ７．５）を加えることで、細胞を溶解させて、プレートを氷上で３０分から２時間インキュベートした。アポトーシスはカスパーゼの活性の増加に近似する。従って、特定のカスパーゼ基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｂｉｏｍｏｌ）の切断を用いてアポトーシスの程度を決定した。カスパーゼ活性アッセイのために、２０μｌの細胞可溶化物を黒い９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のショ糖、０．１％のＣＨＡＰＳ、５０μＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ、および２５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５を含有する８０μｌの緩衝液を添加した後、プレートを、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度の増加を観察した（励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ）。
【００９６】
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、およびＷＭ３５黒色腫細胞における細胞死の決定のために、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）の９６ウェルプレートに１５，０００細胞をプレーティングして、一晩培養した。Ｃｏｌｏ２０５細胞の場合、５０，０００細胞をプレーティングして一晩培養した。翌日、表示したリガンドで細胞を刺激して、さらに１８時間インキュベートした。ＨｅＬａ細胞およびＨＴ１０８０細胞に対しては、リガンドによる刺激の間、２．５μｇ／ｍｌの最終濃度のシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を使用した。緩衝液ＫＶ（０．５％のクリスタルバイオレット、２０％のメタノール）を用いて染色することによって、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、およびＷＭ３５の細胞死を定量化した。染色後、ウェルを水で洗浄して、風乾した。メタノールで溶出させた色素を、５９５ｎｍの吸光度でＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。Ｃｏｌｏ２０５細胞の生存能をＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量化した。
【００９７】
１．５  肝細胞の細胞障害アッセイ
ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の効果を決定するために、初代ヒト肝細胞を健常なドナーから調製して、９６ウェルプレートでウェルあたり２５，０００細胞を用いて、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地で培養した。２日目に培地を、１０％のＦＣＳ、ヒトインスリン、ペニシリン／ストレプトマイシン、最小必須培地（ＭＥＭ）、ピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２に変えて、もう一日培養した。３日目に、架橋抗体（ＳｔｒｅｐＭａｂｉｍｍｏ，  ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）の存在下または非存在下で、表示したタンパク質の濃度を変えて細胞を刺激した。化学療法剤とリガンドの同時処置の潜在的な肝毒性作用を評価するために、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄを種々の濃度で、５ｍＭのドキソルビシンまたは５ｍＭのゲムシタビンとともに同時インキュベートした。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、５時間または２４時間インキュベートし、次いで、「細胞死アッセイ」のセクションで説明するように、カスパーゼ活性の決定のために溶解した。
【００９８】
１．６  ストレプタクチン−ＥＬＩＳＡ
構築したリガンドとの受容体の結合を決定するために、ストレプタクチンをコーティングした９６ウェルマイクロプレートを使用した。従って、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、マウス血清、または精製タンパク質からの上清をストレプタクチンプレート（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）上で、ＰＢＳ中で１〜３時間固定化した。試料を、ＥＬＩＳＡ結合／遮断緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、２０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０−ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ））で希釈した。プレートを、ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄して、マウス坑ＴＲＡＩＬ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，クローンＲＩＫ−２）、ＴＲＡＩＬ受容体１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＡＣＩ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＨＶＥＭ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄して、Ｆｃタンパク質を、坑ヒト−もしくは坑マウス−Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼ結合型抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。呈色反応を、ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加することで行った。停止液として２５％のＨ2ＯＳ4を２５μｌ加えてから、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。値を、４５０ｎｍ〜６３０ｎｍとしてＭＳ  Ｅｘｃｅｌで算出した。
【００９９】
１．７  マンナン結合アッセイ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、無菌のコーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ2ＣＯ3、３５ｍＭのＮａＨＣＯ3、０．０２５％のＮａＮ3、ｐＨ９．６）中で、１０μｇ／ウェルの酵母マンナン（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃で一晩インキュベートした。プレートを、最初に緩衝液ＢＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2、０．１％のＢＳＡ、および２０％のＳｕｐｅｒＢＩｏｃｋ  Ｔ２０−ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ））とともに室温で１時間インキュベートし、次に緩衝液ＢＢ中で、表示したリガンドの濃度を変えてさらに９０分間インキュベートした。プレートを緩衝液ＷＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄して、緩衝液ＢＢ中で、ストレプタクチン−ＨＲＰ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を用いての検出を行った。プレートを洗浄して、ＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で展開させた。停止液として２５％のＨ2ＯＳ4を２５μｌ加えてから、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸収をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。値を、４５０ｎｍ〜６３０ｎｍとしてＭＳ  Ｅｘｃｅｌで算出した。
【０１００】
１．８  ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質の薬物動態
雄ＣＤＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、３００μｌのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解させた１０μｇのタンパク質を静脈内注入した。０分（投与前）、５分後、３０分後、２時間後、６時間後、および２４時間後に血液を採取した。各時点で、試料を２つ採取した。血液試料を処理して血清を取得し、−１５℃で保管した。ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の濃度を、以下（第１．９章）に説明するようにＥＬＩＳＡを用いて測定し、半減期を算出した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４．０）。
【０１０１】
１．９  マウス血清中のＴＲＡＩＬコンストラクトの定量化ためのＥＬＩＳＡ
マウス血清（薬物動態研究に由来する）中のＴＲＡＩＬタンパク質の濃度を定量化するために、９６ウェルマイクロプレートを使用するＥＬＩＳＡ方法を用いた。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍｌのマウス坑ＴＲＡＩＬ（クローンＲＩＫ−２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、３７℃で３０分間遮断した後、濃度０．２％および５％の血清試料、キャリブレーション試料、ならびに対照試料を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。潜在的なマトリクス効果を明らかにするために、キャリブレーション試料および対照試料をそれぞれＴＲＡＩＬバッチ（ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤもしくはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＡもしくはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ）から調製し、次いで０．２％または５％の無処置のプールしたＣＤＩマウス血清を補充した。所定のアッセイウインドウでのＴＲＡＩＬ定量化の精度および正確さを確実にするために、対照試料（高濃度、中濃度、および低濃度のＴＲＡＩＬコンストラクト）を品質管理として加えた。プレートを再び洗浄し、次いでＳｔｒｅｐＴａｇを含有するＴＲＡＩＬコンストラクトを、１：１０００に希釈したＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＰＯＤ（ＩＢＡ）を用いて検出した。すべての試料およびタンパク質を、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、５％のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ））で希釈した。ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を加えてから、呈色反応を開始した。停止液として２５％のＨ2ＯＳ4を２５μｌ加えてから、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。値を、４５０ｎｍ〜６３０ｎｍとしてＭＳ  Ｅｘｃｅｌで算出した。
【０１０３】
２．  結果
２．１  ＣＤ９５Ｌ融合タンパク質の特徴づけ（ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤ）
ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、ストレプタクチンアフィニティー精製したＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤから０．５ｍｌ（０．８６ｍｇのタンパク質）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に０．５ｍｌ／分の流速で添加した。０．５ｍｌの画分を収集した（Ａ１〜Ａ１１を表示する）。サイズ排除基準から測定すると、１１．９２ｍｌでの主ピークの保持量は、１７０ｋＤａに相当した。これは、タンパク質がグリコシル化単量体で構成された三量体であることを示した。単量体ポリペプチドの算出分子量は、３８ｋＤａである。画分Ａ１〜Ａ１１のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびカスパーゼ活性のために使用した。明確な三量体ピーク（画分Ａ７〜Ａ１０）だけを、最終分析で用いた。結果を図１に示す。
【０１０４】
アフィニティー精製したＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーからのアリコートを、後に銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元するために使用した。およそ４０〜４５ｋＤＡで検出されたバンド（矢印で示す）は、ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤに相当した。三量体種は、画分Ａ７〜Ａ１０に存在した。結果を図２に示す。
【０１０５】
アフィニティー精製したＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤを用いたＳＥＣからの画分Ａ１〜Ａ１５から最終的に８倍に希釈したアリコートとともにＪｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。３時間のインキュベーション後、細胞を溶解して、カスパーゼ活性を蛍光発生アッセイで測定した。これらの細胞は架橋リガンドを広範に必要とすることが知られているように、Ｊｕｒｋａｔにおいて三量体ピークに相当する画分（画分Ａ７〜Ａ１０）は弱いが明らかにカスパーゼ活性を誘導した。従って、画分Ａ１〜Ａ６において凝集した不明確な種は、カスパーゼ活性化の強力な誘導因子である（それ以上使用しなかった）。重要なことに、明確な三量体種（Ａ７〜Ａ１０）だけを収集して、最終分析のために使用した。結果を図３に示す。
【０１０６】
架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下で、表示した濃度の精製した三量体ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤとともに、ヒト癌細胞株ＨＴ１０８０（Ａ）、ＨｅＬａ（Ｂ）、またはＷＭ３５（Ｃ）をインキュベートした。細胞を１８時間インキュベートして、クリスタルバイオレット染色によって細胞障害性を分析した。結果として、ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤは、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞では細胞死を誘導したが、ＷＭ３５メラノーマ細胞では誘導しなかった。結果を図４に示す。
【０１０７】
ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤのアミノ酸配列を以下に示す。
【０１０８】
0006029646.tif 000025
【０１０９】
２．２  ＬＩＧＨＴ融合タンパク質（ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤ）の特徴づけ
ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、アフィニティー精製したＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤから０．５ｍｌ（１．５６ｍｇ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に０．５ｍｌ／分の流速で添加して、分解させた。１１．９６ｍｌで検出した主ピークは、サイズ１７０〜１８０ｋＤａに相当し、ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤが３つのグリコシル化単量体で構成された三量体であることを示した。三量体ピーク（画分Ａ７〜Ａ１０）を収集して、最終分析で用いた。挿入図は、個別に精製した三量体ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤの２つのバッチ（０９１７および０９１８と名付ける）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。結果を図５に示す。
【０１１０】
ストレプタクチンをコーティングしたマイクロプレート上でＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを介して固定化させるために、アフィニティーおよびＳＥＣ精製した三量体ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤを種々の濃度（０〜１０マイクログラム／ｍｌ）で用いた。次いで、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの受容体ＨＶＥＭのＦｃ融合タンパク質およびＴＲＡＩＬ受容体１のＦｃ融合タンパク質を使用してＥＬＩＳＡ設定で、ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤを検出した。ＥＬＩＳＡシグナルは、固定化リガンド量の増加とともにＨＶＥＭ−Ｆｃに対しては増加したが、分析した全範囲にわたりＴＲＡＩＬ受容体１−Ｆｃに対してはシグナルが検出されなかった。これは、ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤがその受容体ＨＶＥＭに結合でき得る機能分子であることを示した。結果を図６に示す。
【０１１１】
ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す：
0006029646.tif 000026
【０１１２】
２．３  ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の特徴づけ
ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質をコードする２４の異なる発現ベクターを一過性にトランスフェクトした（第６表）。
【０１１３】
【表７】
0006029646.tif 000027
【０１１４】
第６表：発現ベクターを一過性にトランスフェクションすることで生成した融合タンパク質の概要。リガンドＴＲＡＩＬを、６つの安定化三量体形成モチーフのうちの一つと、リンカーエレメント（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤリンカー）とを含む融合タンパク質としてトランスフェクトした。
【０１１５】
上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥのために使用し、およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によってＴＲＡＩＬコンストラクトを検出した。
【０１１６】
検出した特異的バンドを矢印で示す。発現強度は、構築のために使用した三量体形成モチーフの型（ＳＰＤ＞６９／Ｔ４／コレクチン１１／ＣＣＳＰＤ／ＣＣ１１）ならびにリンカーエレメントの長さ（Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ）に依存する。結果を図７に示す。
【０１１７】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下（黒い棒、坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）または非存在下（白い棒）で、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からの上清とともに３時間インキュベートした。上清は、種々のリンカーエレメント（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのリンカー）を介して融合した種々の三量体形成モチーフ（Ｔ４、６９、ＳＰＤ、ＣＣＳＰＤ、Ｃｏｌ１１、ＣＣ１１）を有するＴＲＡＩＬ融合タンパク質を含有した。負の対照として、トランスフェクトしてない細胞からの細胞上清を使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解して、蛍光発生アッセイによってカスパーゼ活性を分析した。
【０１１８】
結果として、カスパーゼ活性は、使用したリンカーエレメントの型（Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ）によっておよび使用したＦｏｌｄ−Ｏｎ上で減少した。ＴＲＡＩＬコンストラクトを含有するコレクチン１１またはコレクチン１１のコイルドコイル（ＣＣＣｏｌ１１）は、発現された（ウエスタンブロット分析によって示される）が機能的ではなく、フォールドオンモチーフに由来するＳＰＤは、機能的なＴＲＡＩＬリガンドをもたらした。結果を図８に示す。
【０１１９】
ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤを、０．５ｍｌ（０．４ｍｇのタンパク質）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に０．５ｍｌ／分の流速で添加することで、ＳＥＣにかけた。タンパク質溶出を、２８０ｎｍでの吸収によって観察して、０．５ｍｌの画分を収集した。サイズ排除基準から測定すると、１２．２８ｍｌの保持量は１３５〜１４０ｋＤａに相当する。これは、単量体ポリペプチドの算出分子量が４０ｋＤａであるので、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤはホモ三量体であることを示した。重要なことに、ＳＥＣで分析した、野生型ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ配列からなるすべての融合タンパク質については、およそ８ｍｌで、凝集した非活性ＴＲＡＩＬ融合タンパク質に相当するさらなるピークが観察された。収集した画分Ａ１〜Ａ１４から、三量体ピーク（Ａ８〜Ａ１０）だけをさらなる分析のために使用した。結果を図９に示す。
【０１２０】
架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下で、ヒト癌細胞株（ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、Ｃｏｌｏ２０５、またはＷＭ３５）を、表示した濃度の精製した三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤとともに１８時間インキュベートした。細胞死を、クリスタルバイオレット染色（ＨｅＬａ、ＷＭ３５、およびＨＴ１０８０）またはＭＴＳアッセイ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量化した。高リガンド濃度でＣｏｌｏ２０５細胞の生存能が上昇したことは、架橋抗体の制限のためと思われる。結果を図１０に示す。
【０１２１】
ストレプタクチンをコーティングした９６ウェルプレート上での固定化のために、アフィニティーおよびＳＥＣ精製した三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤを種々の濃度（Ａ）または一定濃度（Ｂ）で用いた。次いで、ウェルあたり１００，０００のＪｕｒｋａｔ細胞を有するプレートを、３７℃、５％ＣＯ2で、５時間インキュベートして、蛍光発生アッセイでカスパーゼ活性を測定した。特異性を分析するために、細胞を添加する前にプレート（Ｂ）を、アンタゴニスト坑ＴＲＡＩＬ抗体（クローンＲＩＫ−２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を表示した様々な濃度で３０分間インキュベートした。結果を図表１１に示す。
【０１２２】
同じ９６ウェルプレート上で、ＨＴ１０８０細胞を、表示した濃度の精製三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬ−ＤＳＰＤとともにインキュベートした。翌日、クリスタルバイオレット染色によって細胞死を定量化した。ＴＲＡＩＬ−ＤＳＰＤおよびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤに対してそれぞれ２７ｎｇ／ｍｌおよび６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値が示されたように、Ｄリンカーの使用によって生理活性がおよそ４、５倍減少した。結果を図１２に示す。
【０１２３】
ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
【０１２４】
0006029646.tif 000028
【０１２５】
0006029646.tif 000029
【０１２６】
0006029646.tif 000030
【０１２７】
0006029646.tif 000031
【０１２８】
２．４  受容体選択的ＴＲＡＩＬ（「変異タンパク質」）融合タンパク質の特徴づけ
ＨＥＫ２９３細胞に、種々のＴＲＡＩＬ受容体選択的ＳＰＤコンストラクトをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトさせた：
番号  トランスフェクトした発現ベクター
１    ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−Ａ−ＳＰＤ
２    ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−Ａ−ＣＣＳＰＤ
３    ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−Ｄ−ＳＰＤ
４    ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−Ｄ−ＣＣＳＰＤ
５    ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−Ａ−ＳＰＤ
６    ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−Ａ−ＣＣＳＰＤ
７    ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−Ｄ−ＳＰＤ
８    ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−Ｄ−ＣＣＳＰＤ
９    ＴＲＡＩＬ−Ａ−ＳＰＤ
１０  ＴＲＡＩＬ−Ａ−ＣＣＳＰＤ
１１  ＴＲＡＩＬ−Ｄ−ＳＰＤ
１２  ＴＲＡＩＬ−Ｄ−ＣＣＳＰＤ
トランスフェクションから３日後、上清を収集して、抗体特異的Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングのためにアリコートを使用した。およそ３８ｋＤａ（ＳＰＤ融合タンパク質）および２８ｋＤａ（コイルドコイル−ＳＰＤ融合タンパク質）で特異的バンドを検出した。発現したタンパク質の量は、リガントそれ自体（ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質＞ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質＞ＴＲＡＩＬ）に、第二に使用したリンカーの長さ（Ａ＞Ｄ）、および第三に使用した三量体形成モチーフ（ＳＰＤ＞ＣＣＳＰＤ）に依存した。見かけの分子量は、算出したサイズ（ＳＰＤ融合タンパク質およびＣＣＳＰＤ融合タンパク質に対してそれぞれ４０ｋＤａおよび２７ｋＤａ）から予想どおりであった。結果を図１３に示す。
【０１２９】
ＳＰＤ／ｃｃＳＰＤとＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質とＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質の融合タンパク質に対するＴＲＡＩＬ受容体１またはＴＲＡＩＬ受容体２の選択性は、ストレプタクチン−ＥＬＩＳＡによって示された。従って、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上清中のＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質を、ストレプタクチンをコーティングしたマイクロプレート上で固定化した。トランスフェクトされてない細胞からの細胞上清を負の対照とした。結果を図１４に示す。特異的に結合したタンパク質を、ＴＲＡＩＬ受容体１−ＦｃまたはＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃのいずれかの一定濃度（Ａ、Ｂ）または種々の濃度（Ｃ、Ｄ）で検出した。（Ａ）に示すように、ＳＰＤ変異体に融合したリガンドＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質は、ＴＲＡＩＬ受容体１によって検出されるが、リガンドＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質は検出されない。（Ｂ）に示すように、リガンドＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質は、ＴＲＡＩＬ受容体２によって優先的に検出されるが、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質のコンストラクトおよびＴＲＡＩＬ野生型コンストラクトは、同様に良好に検出される。（Ｃ）に示すように、ＴＲＡＩＬ受容体１−Ｆｃは、受容体の滴定範囲全体にわたり同様に良好にＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤおよびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤに結合したが、ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤは良好に検出されない。（Ｄ）に示すように、ＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃは、分析した受容体の滴定範囲にわたりＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤおよびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤに同様に良好に結合したが、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤのシグナルは、受容体の濃度の低下とともに急速に低下した。
【０１３０】
１００マイクロリットルのＰＢＳ中１マイクログラム／ｍｌのアフィニティー精製した三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤ、またはＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤを、ストレプタクチンをコーティングしたマイクロプレート上でのＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを介する固定化のために使用した。結合リガンドを、ＴＲＡＩＬ受容体１（Ａ）またはＴＲＡＩＬ受容体２（Ｂ）のＦｃ−融合タンパク質を用いてＥＬＩＳＡ設定で検出した。（Ａ）に示すように、ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤと比較して、ＴＲＡＩＬ受容体１は、受容体選択的ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤに優先的に結合した。（Ｂ）に示すように、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤと比較してＴＲＡＩＬ受容体２は、ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤに優先的に結合した。結論として、ＳＰＤに融合した構築したＴＲＡＩＬ変異体は、受容体選択的である。結果を図１５に示す。
【０１３１】
アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤを、０．５ｍｌ（０．９５ｍｇのタンパク質）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に添加することで、ＳＥＣにかけた。結果を図１６に示す。ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、タンパク質を０．５ｍｌ／分で分解させて、０．５ｍｌの画分を収集した（画分Ａ１〜Ａ１４を示す）。サイズ排除基準によって測定すると、１２．４６ｍｌの保持量は１４０〜１４５ｋＤａに相当した。１０．８３ｍｌでの小ピークは、いくつかの凝集種を示した。しかし重要なことに、ランニングの前面（８ｍｌ）ではピークは検出されなかった。これは、野生型ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列の部分を含有するタンパク質と比較すると、この分子がさらに可溶性が高いことを示している。
【０１３２】
図１７に示すように、その後に銀染色を伴う非還元（Ａ）または還元（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーからのアリコートを使用した。非還元条件下で、３５ｋＤａおよび７０ｋＤａで２つのバンドを検出したが、還元条件下では、４０ｋＤａの一つのバンド（矢印で示す）を検出した。これは、ジスルフィド架橋分子の形成を示す。三量体種は画分Ａ８〜Ａ１１に存在し、これを後の分析で使用した。
【０１３３】
アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤのＳＥＣからの画分Ａ１〜Ａ１４から最終的に８０倍に希釈したアリコートとともに、２．５マイクログラム／ｍｌの架橋抗体の非存在下（白い棒）または存在下（黒い棒）でＪｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。結果を図１８に示す。負の対照としてＪｕｒｋａｔ細胞を培地だけでインキュベートした。３時間のインキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解して、蛍光発生アッセイによってカスパーゼ活性を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は主にＴＲＡＩＬ受容体２を発現することが示されているように、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤをＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ特異的抗体によって架橋したときでさえ、有意なカスパーゼ活性を誘導した画分はなかった。これは、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤがＴＲＡＩＬ受容体２に結合しないことを示した。
【０１３４】
図１９に示すように、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤを、０．５ｍｌ（０．５ｍｇのタンパク質）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに添加することで、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、タンパク質を０．５ｍｌ／分で分解させて、０．５ｍｌの画分を収集した（画分Ａ１〜Ａ１４を示す）。サイズ排除基準から測定すると、１２．６０ｍｌの保持量は１３０〜１３５ｋＤａに相当した。これは、４０ｋＤａの予想される単量体分子量から算出されるようにＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤがホモ三量体であることを示していた。重要なことに、９５％以上が三量体ピーク画分に存在し、凝集体は検出されなかった。三量体ピークを、後の分析で使用した。
【０１３５】
図２０に示すように、その後に銀染色を伴う非還元（Ａ）または還元（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーからのアリコートを使用した。非還元条件下で、３５ｋＤａおよび７０ｋＤａで２つのバンドを検出したが、還元条件下では、およそ４０ｋＤａの一つのバンド（矢印で示す）を検出した。これは、ジスルフィド架橋分子の形成を示した。三量体種は画分Ａ９〜Ａ１１に存在し、これを後の分析で使用した。
【０１３６】
ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤによるＪｕｒｋａｔ細胞死滅アッセイの結果を図２１に示す。アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤのＳＥＣからの画分Ａ１〜Ａ１４からのアリコートとともに、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の非存在下（白い棒）または存在下（黒い棒）で、Ｊｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。試料を６４０倍の最終希釈で使用した。３時間のインキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解して、蛍光発生アッセイによってカスパーゼ活性を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、効率的シグナリングのために多量体を形成したリガンド形を必要とするＴＲＡＩＬ受容体２を主に発現することが示されているように、架橋したときに、ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤはカスパーゼ活性を誘導した。これは、ＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤが機能分子であることを示した。
【０１３７】
種々のヒト癌細胞へのＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤ、およびＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤの細胞障害活性を図２２に示す。表示した細胞株ＨＴ１０８０（ＡおよびＢ）、ＨｅＬａ（ＣおよびＤ）、またはＣｏｌｏ２０５（ＥおよびＦ）を、架橋抗体（坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の非存在下（Ａ、Ｃ、およびＥ）または存在下（Ｂ、Ｄ、およびＦ）で、精製した三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤ、もしくはＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤの種々の濃度で処置した。細胞を、表示した濃度のリガンドとともに１８時間インキュベートし、次いで細胞死をクリスタルバイオレット染色（ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ）またはＭＴＳアッセイ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量化した。結果として、リガンドＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤは、検査した３種類の細胞株上で細胞死を誘導し、およびＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤは優れた細胞死滅活性を示した。対照的に、ＴＲＡＩＬ受容体１選択的ＴＲＡＩＬＲ１変異タンパク質−ＡＳＰＤは、検査したいずれの細胞株上でも活性がなかった。
【０１３８】
アフィニティー精製したＴＲＡＩＬＲ２変異タンパク質−ＡＳＰＤを、１０ｋＤａ膜を通す遠心分離によってＰＢＳ中で２０倍に濃縮して、２．５ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。この濃縮物から０．１ｍｌをサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。結果として、三量体ピークだけを検出し、凝集体は検出されなかった。これは、この組成物が向上した生成能力を有することを示した（図２３）。同様の結果がＴＲＡＩＬＲＩ変異タンパク質−ＡＳＰＤに対しても達成された。ＴＲＡＩＬＲＩ変異タンパク質−ＡＳＰＤは５．４ｍｇ／ｍｌの濃縮溶液でさえも凝集の徴候を示さなかった（図示せず）。対照的に、野生型ＴＲＡＩＬ配列から構成される受容体結合ドメインを含有する、検査したすべての融合タンパク質は、０．４ｍ／ｍｌ程度の低い濃度で４０％凝集体を有する凝集を示した。
【０１３９】
受容体選択的ＴＲＡＩＬ変異タンパク質の融合ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
【０１４０】
0006029646.tif 000032
【０１４１】
２．５  ＳＰＤ糖変異体の特徴づけ
図２４に示すように、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａを、０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（０．４ｍｇのタンパク質）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに添加することによって、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、タンパク質を０．５ｍｌ／分で分解させて、０．５ｍｌの画分を収集した（画分Ａ１〜Ａ１３を示す）。サイズ排除基準から測定すると、１２．２７ｍｌの保持量は１３５〜１４５ｋＤａに相当する。これは、４０ｋＤａの予想される単量体分子量から算出されるようにＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａがホモ三量体であることを示した。８．３２ｍｌおよび１０．６８ｍｌでの２つのさらなるピークは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａの凝集体が形成されたことを示した。三量体ピークだけを、後の分析で使用した。
【０１４２】
サイズ排除クロマトグラフィーから収集した画分Ａ１〜Ａ１３のアリコートを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、次いでそのゲルを銀染色した（図２５）。およそ４０ｋＤａで検出したバンドは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａに対して算出した４０ｋＤａの分子量に相当した。ＳＥＣ流出の三量体分子（Ａ８、Ａ９、Ａ１０）に対応する陽性画分をプールして、さらなる分析で使用した。
【０１４３】
ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ糖変異体融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１４４】
0006029646.tif 000033
【０１４５】
ヒト癌細胞へのＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａの細胞障害効果を図２６に示す。架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下で、表示したヒト癌細胞株を、種々の濃度のアフィニティーおよびＳＥＣ精製した三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａとともに一晩インキュベートした。細胞生存能を、クリスタルバイオレット染色（ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、およびＷＭ３５）またはＭＴＳ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量化した。高リガンド濃度でＣｏｌｏ２０５細胞の生存能が上昇したことは、架橋抗体の制限のためと思われる。
【０１４６】
図２７に示すように、アフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄを、０．５ｍｌ（０．２ｍｇのタンパク質）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに添加することによってサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、タンパク質を０．５ｍｌ／分で分解し、０．５ｍｌの画分を収集した（Ａ１〜Ａ１３を示す）。サイズ排除基準から測定すると、１２．２９ｍｌの保持量は１３５〜１４５ｋＤａに相当する。これは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄが４０ｋＤａの予想される単量体分子量から算出されるようにホモ三量体であることを示した。８．３５でのピークは、野生型ＴＲＡＩＬアミノ酸配列の部分を含有するすべての融合タンパク質に対して一般的に見られる不活性なＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ凝集体に相当した。
【０１４７】
サイズ排除クロマトグラフィーから収集した画分Ａ１〜Ａ１３のアフィニティー精製したＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄのアリコートを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、次いでそのゲルを銀染色した（図２８）。およそ４０ｋＤａで検出したバンド（矢印で示した）は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄに対して算出した４０ｋＤａの分子量に相当した。三量体タンパク質（画分Ａ８〜Ａ１０）を含有する画分をプールして、さらなる分析で使用した。
【０１４８】
架橋抗体（坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下で、ヒト癌細胞株ＨＴ１０８０（Ａ）、ＨｅＬａ（Ｂ）、ＷＭ３５（Ｃ）、またはＣｏｌｏ２０５（Ｄ）を、種々の濃度のアフィニティー精製した三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄとともに一晩インキュベートした。細胞生存能を、クリスタルバイオレット染色（ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、およびＷＭ３５）またはＭＴＳ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量化した。ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄが例証した癌細胞系で細胞死を誘導する能力があることをデータは示している（図２９）。高リガンド濃度でＣｏｌｏ２０５細胞の生存能が上昇したことは、架橋抗体の制限のためと思われる。
【０１４９】
２．６  ＳＰＤ三量体形成モチーフ変異体の糖結合の特徴の分析
いくつかの種に由来する野生型で完全長のオリゴマーのＳＰ−Ｄタンパク質およびヒトＳＰ−Ｄの三量体ネック＋ＣＲＤは、いくつかの異なる糖に結合することが示されている。さらに、ヒトＳＰ−Ｄのネック＋ＣＲＤは、免疫細胞（例えば好中球）のための走化性因子として役割を果たすことによって免疫調節効果を発揮することも示されている（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６：１３１−１３６）。他の細胞も、ＳＰ−Ｄによって補充されることもある。マルトースの添加によって走化性機能が抑制されるように、ヒトＳＰ−Ｄのネック＋ＣＲＤの走化性効果は、グリコ結合機能に依存することが示されている。従って、ＳＰ−Ｄが媒介する走化性機能を有するＴＮＦＳＦのリガンドは、天然のアミノ酸配列を有するリガンドまたはそのコンストラクトと比較して、優れた活性であり得る。例えば、癌治療におけるように細胞効果が望ましい場合のシナリオでは、そのような記述されたリガンドが望ましいこともある。
【０１５０】
さらに、ＳＰ−Ｄが糖質機能をもたないリガンドは、他の設定で望ましいこともある。ヒトＳＰ−Ｄの場合、アミノ酸フェニルアラニン３３５（配列番号２１のアミノ酸３５５に相当する）がアラニンに変異されている変異体が記述されている（ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａ，  Ｃｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ  ２８１：  １８００８−１８０１４）。この変異体は、極めて弱い糖結合を示した。しかし、糖結合を所望しない場合、荷電アミノ酸（例えば酸性アミノ酸）を導入することで、Ｆ３３５Ａと比較してさらによくなることさえもある。従って、変異体ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄは、Ｆ３３５Ａ変異体よりも優れていることもある。
【０１５１】
ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の糖との結合を分析するために、酵母由来のマンナンをマイクロプレート上で固定化し、次いでＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ、ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａ、またはＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄの結合をＥＬＩＳＡによって検出した。結果を図３０に示す。予想したように、ＥＬＩＳＡシグナルは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤの濃度の増加とともに増加した。対照的に、糖変異型ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａは、極めて低いＥＬＩＳＡシグナルを示した。さらに、新たに構築した変異体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄは、最も低いＥＬＩＳＡシグナルを示した（挿入図および矢印参照）。これは、変異体Ｆ３３５Ｄが前述のＳＰ−Ｄ変異型Ｆ３３５Ａと比較して、さらに低いマンナン結合親和性を有することを示した。
【０１５２】
２．７  ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質の薬物動態
ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質の半減期を測定するために、１０マイクログラムのＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ（Ａ）またはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ（Ｂ）を雄ＣＤ１マウスの静脈内に注入し、次いで血清試料をいくつかの時点（投与前、５分後、３０分後、２時間後、６時間後、および２４時間後）で採取した。マウスの血清中のＴＲＡＩＬタンパク質を、ＥＬＩＳＡによって定量化し、そのデータを用いて半減期を算出した。結果を図３１に示す。分析した２つのタンパク質に関しては、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ（Ａ）およびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ（Ｂ）に対して７〜１４時間の半減期を算出した。観察期間中、死亡したまたは不耐性の徴候を示した動物はなかった。げっ歯類において３〜５分の範囲で半減期間を有することが報告されている（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ．  ａｌ  ２００１）野生型ＴＲＡＩＬと比較して、血清半減期が少なくとも８０倍向上したことを、データは示している。
【０１５３】
２．８  ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ融合タンパク質の細胞障害性
ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａ、またはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄの潜在的な肝毒性作用を分析するめに、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、架橋抗体(坑Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ)とともにまたは架橋抗体なして、種々の濃度の表示したＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ−融合タンパク質とともにインキュベートした。対照として、ＣＤ９５Ｌの安定化変異体、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（ＷＯ２００８／０２５５１６に記載されている）を用いた。結果を図３２に示す。
【０１５４】
さらに、５ｍＭの化学療法薬とのＰＨＨの同時インキュベーションの効果を、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄに対して分析した。インキュベーションから５時間後（Ａ、Ｂ、およびＥ）または２４時間後（Ｃ、Ｄ、およびＦ）細胞を溶解して、カスパーゼ活性を蛍光発生アッセイによって評価した。
【０１５５】
結果として、リガンドを抗体によって二次的に架橋した場合でも、分析したすべてのＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質は、肝毒性作用を誘導しなかった。対照的に、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、活性カスパーゼ（Ａ〜Ｄ）の増加によって示されたように肝毒性である。化学療法薬との三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄによる初代ヒト肝細胞の５時間の同時インキュベーションの間、カスパーゼ活性は誘導されなかった（Ｅ）。しかし、ドキソルビシンとの同時インキュベーションから２４時間後、可溶性ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄは強力なカスパーゼ活性シグナルを誘導した（Ｆ）。
【０１５６】
これは、本発明のＴＲＡＩＬ融合タンパク質が医薬用途において望ましくない肝毒性を示し得ないことを示している。従って、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、好ましくは、薬物と併用して投与される。それらの薬物は、アポトーシス増感剤および／もしくはアポトーシス誘発剤（例えばオキサリプラチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル,、エトポシド、ゲムシタビン、イリノテカンの化学療法薬）、またはＢｃｌ２結合分子（例えば低分子もしくはペプチド化合物。これらはＢｃｌ２ファミリー、特にＢｃ１２またはＢｃｌｘｌのポリペプチドに結合する）である。
【０１５７】
２．９  ＡＰＲＩＬ融合タンパク質の特徴づけ
ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＰＲＩＬ−Ａ６９（ＷＯ２００８０２５５１６）、ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤ、ＡＰＲＩＬ−ＡＣＣＳＰＤ、またはＡＰＲＩＬ−ＡＣｏｌ１１をコードする発現ベクターを一過性にトランスフェクした。３日後、上清を、ウエスタンブロッティングによって分泌タンパク質について分析した。結果を図３３に示す。ＡＰＲＩＬ融合タンパク質の検出のために、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩに特異的な抗体を使用した。矢印は、およそ４０ｋＤａ（それぞれＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤおよびＡＰＲＩＬ−ＡＣｏｌ１１）で、ならびにおよそ２５ｋＤａ（それぞれＡＰＲＩＬ−Ａ６９およびＡＰＲＩＬ−ＡＣＣＳＰＤ）で検出した特異的バンドを示す。従って、ＡＰＲＩＬ発現カセットは機能的であり、これらのタンパク質が適切に折り畳まれていることをタンパク質の分泌は示した。分析した他のＴＮＦＳＦタンパク質に関しては、最高レベルの分泌タンパク質は、ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」＋ＣＲＤから構成された三量体形成モチーフに融合したＡＰＲＩＬに見られた（ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤ、レーン番号２）。ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤを用いて、受容体ＴＡＣｌとの結合を分析した。
【０１５８】
構築したＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤ融合タンパク質が機能的であることを示すために、ＡＰＲＩＬの公知の受容体（すなわちＴＡＣｌ）との結合を評価した（図３４）。従って、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上清中のＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤを、ストレプタクチンをコーティングしたマイクロプレート上で固定化した。トランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞からの細胞上清を負の対照として用いた。ペルオキシダーゼと結合した、後に坑ヒトＦｃ特異的抗体とのインキュベーションを伴う、種々の濃度のＴＡＣＩ−Ｆｃを用いて、特異的に結合したタンパク質を検出した。結果として、ＥＬＩＳＡシグナルは、ＴＡＣＩ−Ｆｃの濃度の増加とともに増加し、ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤが機能分子であることを示した。
【０１５９】
ＡＰＲＩＬ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１６０】
0006029646.tif 000034
【０１６１】
0006029646.tif 000035
【図１】
0006029646.tif 000036
【図２】
0006029646.tif 000037
【図３】
0006029646.tif 000038
【図４】
0006029646.tif 000039
【図５】
0006029646.tif 000040
【図６】
0006029646.tif 000041
【図７】
0006029646.tif 000042
【図８】
0006029646.tif 000043
【図９】
0006029646.tif 000044
【図１０】
0006029646.tif 000045
【図１１】
0006029646.tif 000046
【図１２】
0006029646.tif 000047
【図１３】
0006029646.tif 000048
【図１４】
0006029646.tif 000049
【図１５】
0006029646.tif 000050
【図１６】
0006029646.tif 000051
【図１７】
0006029646.tif 000052
【図１８】
0006029646.tif 000053
【図１９】
0006029646.tif 000054
【図２０】
0006029646.tif 000055
【図２１】
0006029646.tif 000056
【図２２】
0006029646.tif 000057
【図２３】
0006029646.tif 000058
【図２４】
0006029646.tif 000059
【図２５】
0006029646.tif 000060
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
0006029646.tif 000069
【配列表】
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