(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする抗原に特異的な高親和性抗体を製造する方法であって、
a)前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞を選択するステップ、または前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞に分化することができるB細胞を選択するステップと、
b)前記B細胞におけるBCL6の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
c)前記B細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
d)前記B細胞の、B細胞の第一集団への増殖を可能にするステップと、
e)前記第一集団由来のB細胞の抗原染色とBCR染色を実施するステップと、
f)高抗原親和性を有するB細胞を選択するステップと、
g)前記B細胞の、B細胞の第二集団への増殖を可能にするステップと、
h)B細胞の前記第二集団由来の少なくとも１つのB細胞から産生された抗体の抗原会合速度および解離速度を測定するステップと、および、
i)前記目的とする抗原に対してB細胞の前記第一集団の平均親和性より高い、目的とする前記抗原に対する親和性を有する抗体を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップg)に続いて、ステップe)、f)およびg)を少なくとも1回繰り返すステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて前記抗原会合速度および解離速度がステップh)において測定される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも1つのB細胞が少なくとも4週間培養される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップa)で選択される前記B細胞が、記憶B細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記記憶B細胞がヒト記憶B細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記抗アポトーシス分子をコードする遺伝子が、BCL2ファミリーの遺伝子またはこの機能的部分である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記BCL2ファミリーの遺伝子が、Bcl-xLまたはMcl-1である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記B細胞に、増殖因子を与えるステップをさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増殖因子が、IL21またはCD40Lである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ステップa)で選択された前記B細胞におけるBlimp-1発現産物の量を直接または間接的に調節するステップをさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップa)で選択される前記B細胞が、前記目的とする抗原に以前に曝露された個体を起源とする、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ig重鎖および/またはIg軽鎖をコードする前記少なくとも1つのB細胞に由来する遺伝子を、第2の細胞で発現させるステップをさらに含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
目的とする抗原に特異的な低親和性抗体を製造する方法であって、
a)前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞を選択するステップ、または前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞に分化することができるB細胞を選択するステップと、
b)前記B細胞におけるBCL6の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
c)前記B細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
d)前記B細胞の、B細胞の第一集団への増殖を可能にするステップと、
e)前記第一集団由来のB細胞の抗原染色とBCR染色を実施するステップと、
f)低抗原親和性を有するB細胞を選択するステップと、
g)前記B細胞の、B細胞の第二集団への増殖を可能にするステップと、
h)B細胞の前記第二集団由来の少なくとも１つのB細胞から産生された抗体の抗原会合速度および解離速度を測定するステップと、
i)前記目的とする抗原に対してB細胞の前記第一集団の平均親和性より低い、目的とする前記抗原に対する親和性を有する抗体を選択するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、抗体製造の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体外B細胞培養物は、現在の生物学的および医学的適用における重要なツールである。1つの重要な適用は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体を回収するために抗体産生細胞を培養することである。モノクローナル抗体(mAb)は、単一抗体分子の複数の同一コピーを意味する。mAbの利点の1つが、抗原上の同一のエピトープに対する特異性である。この特異性は、より従来的な治療に勝るある特定の臨床的利点をmAbに与える一方、概して副作用が低い、効果的な忍容性に優れた治療選択肢を患者に提供する。さらにmAbは、生物学的および医学的研究に有用である。
【０００３】
成熟B細胞は、胚中心(GC)反応の幾つかの重要な側面、すなわち、CD40リガンド(L)、およびインターロイキン(IL)-4、IL-10またはIL-21のようなサイトカインの存在によるB細胞の活性化を模倣する条件下で、インビトロで培養することができる。CD40L、IL-2およびIL-4と共に培養されたB細胞はIgをほとんど産生しないが、IL-21の添加は、高Ig分泌を伴う形質細胞への分化をもたらす。このインビトロ系は、B細胞分化の幾つかの側面を研究するのに有用であることが証明されているが、ナイーブIgD+B細胞およびスイッチしたIgD-記憶B細胞は両方とも、長期抗原特異的BCR陽性細胞系の生成を妨げる細胞周期停止を伴う終末分化形質細胞に最終的に分化する。
【０００４】
最近の進歩は、Bリンパ球誘導成熟タンパク質(B-lymphocyte-induced maturation protein) 1 (BLIMP1)およびB細胞リンパ腫(BCL) 6を含む複数の転写因子が、最終的に停止した抗体産生形質細胞へのGC B細胞の発達をいかに調節するかの洞察を与えた。転写抑制因子BCL6は、形質細胞分化を妨げることが示されている。BCL6は、GC B細胞において高度に発現され、p53を下方制御してB細胞の拡大を促進し、BLIMP 1を負に制御して形質細胞へのGC細胞の未熟な分化を妨げる。
【０００５】
抗体産生形質芽球様B細胞を生成する改善された方法は、参照により本明細書に組み込まれているWO 2007/067046に最近記載された。この方法により、BCL6およびBcl-2ファミリーメンバー、好ましくはBcl-xLの量が、B細胞、好ましくは記憶B細胞で調整されて抗体産生形質芽球様B細胞を生成する。WO 2007/067046においてBCL6および/またはBcl-xL発現産物の量は、直接または間接的に影響を受ける。両方の発現産物は抗体産生B細胞の安定性に関与することから、好ましくは、前記抗体産生細胞内のBCL6およびBcl-xL発現産物の量は増加される。前記Bcl-xLは、抗アポトーシスBcl-2ファミリーのメンバーである。プロアポトーシスおよび抗アポトーシスタンパク質の両方を含むBcl-2ファミリーにより調節されるプロセスは、アポトーシスのミトコンドリア経路に関係する。この経路は、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の間に隔離された分子が、ミトコンドリア外膜透過化により細胞質ゾルに放出されるときに進行する。プロアポトーシスファミリーメンバーは、2つのクラスに分けることができる。いわゆるBcl-2相同性ドメイン3 (BH3)ドメインを含有するエフェクター分子BaxおよびBakは、プロテオリピドの孔の形成によるミトコンドリア外膜の透過化に関与し、プロアポトーシスBH3-onlyタンパク質(Bad、Bik、Bim、Bid、Hrk、Bmf、bNIP3、PumaおよびNoxa)は、他の(抗アポトーシス) Bcl-2ファミリーメンバーとのタンパク質-タンパク質相互作用による種々の細胞ストレス時に機能する。
【０００６】
抗アポトーシスBcl-2ファミリーメンバーBcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、AlおよびMcl-1は、通常、ミトコンドリア外膜に組み込まれている。これらは、プロアポトーシスBcl-2タンパク質を直接結合および阻害してミトコンドリア膜完全性を保護する。
【０００７】
このような方法において前記抗体産生形質芽球様B細胞は、IL21およびCD40Lと共にインキュベートされることがさらに好ましい。ほとんどのB細胞の複製はCD40Lにより促進されることから、抗体産生形質芽球様B細胞などのB細胞は、好ましくはCD40Lの存在下で培養される。STAT3が前記抗体産生B細胞において活性化されることがさらに好ましい。STAT3の活性化は、さまざまな方法で達成することができる。好ましくは、STAT3は、抗体産生細胞にサイトカインを与えて活性化される。天然ではB細胞分化に関与するサイトカインは、STATタンパク質の制御に極めて有効である。STAT3の極めて有効な活性化因子は、IL2、IL10、IL21およびIL6であるが、IL7、IL9、IL15、IL23およびIL27もSTAT3を活性化することが知られている。さらに、または代替として、STAT3活性化は、STAT3に恒常的活性化を与えるSTAT3の変異体をコードする核酸のB細胞への移入により達成される(Sean A Diehl、Heike Schmidlin、Maho Nagasawa、Simon D van Haren、Mark J Kwakkenbos、Etsuko Yasuda、Tim Beaumont、Ferenc A Scheeren、Hergen Spits STAT3-mediated up-regulation of BLIMP1 is coordinated with BCL6 down-regulation to control human plasma cell differentiation J Immunol 2008  第180巻(7) 4805〜15頁)。
【０００８】
IL21は、抗体産生形質芽球様B細胞の安定性に影響を与えるのに特に適していることから、最も好ましくはIL21が使用される。STAT3の上方制御に加えて、IL21は、Blimp1発現がBCL6により妨げられる場合でさえBlimp1発現を上方制御することができる。WO 2007/067046に記載された方法を用いて、B細胞を複製が生じる発達段階に維持することができるため、抗体産生細胞の複製寿命を増加させることが可能になった。より初期の生体外B細胞培養物では複製寿命は、わずか数週間から2ヶ月であった。この間、培養細胞は複製する能力を失い、死滅する。しかし、WO 2007/067046に記載の方法を用いて、抗体産生記憶B細胞の複製寿命を延長させることができるようになったため、抗体を複製および産生することができる形質芽球様B細胞を含む生体外培養物が生成される。
【０００９】
これらの方法は、目的とする抗原を効率的に標的にする抗体の産生を可能にするが、結合親和性などの抗体特性の改善がしばしば望まれる。結合特性は、それ故にコード核酸、好ましくはCDRコード領域に変異を導入すること、および得られた抗体を試験することにより通常変更される。しかし、これは時間がかかる。高親和性抗体を得るための代わりの方法がそれ故に望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2007/067046
【特許文献２】特許出願US2008305076
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Sean A Diehl、Heike Schmidlin、Maho Nagasawa、Simon D van Haren、Mark J Kwakkenbos、Etsuko Yasuda、Tim Beaumont、Ferenc A Scheeren、Hergen Spits STAT3-mediated up-regulation of BLIMP1 is coordinated with BCL6 down-regulation to control human plasma cell differentiation J Immunol 2008  第180巻(7) 4805〜15頁
【非特許文献２】Kwakkenbosら(Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor- positive human memory B cells by genetic programming. Nature Medicine (2010)第16巻(1) 123〜8頁
【非特許文献３】Lokateら、2007、J. Am. Chem. Soc. 129: 14013-14018頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
高親和性抗体を製造および/または選択する方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、所与のB細胞培養物から始めて、最初のB細胞培養物より高い平均結合能力を有するB細胞集団を得るための手段および方法を提供する。好ましくは、モノクローナルB細胞培養物から始めてモノクローナルB細胞集団が製造される。本発明は、労力を要する変異技術を必要としない、平均結合能力が増加したB細胞集団を得る簡潔で洗練された方法を提供する。
【００１４】
本発明は、目的とする抗原に特異的な抗体を製造する方法であって、
a)前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞を選択するステップ、または前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞に分化することができるB細胞を選択するステップと、
b)前記B細胞におけるBCL6の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
c)前記B細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
d)前記B細胞の集団への前記B細胞の拡大を可能にするステップと、
e)前記目的とする抗原に対して前記B細胞の集団の平均結合能力より高い結合能力を有するB細胞受容体および/または抗体を産生する、前記B細胞の集団の少なくとも1つのB細胞を選択するステップと、
f)前記少なくとも1つのB細胞をB細胞の集団へと培養するステップと、
g)B細胞培養物により産生された抗体を得るステップと
を含む、方法を提供する。
【００１５】
目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるモノクローナルB細胞の集団内において、前記目的とする抗原に対する前記B細胞の集団の平均結合能力より高い、前記目的とする抗原に対する結合能力を有する少なくとも1つの、場合により複数の(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25または50個などの)B細胞を、本発明による方法のステップe)で選択することが可能である。目的とする抗原に対するB細胞の集団の平均結合能力より高い、前記目的とする抗原に対する結合能力を有するこのようなB細胞は、本明細書では「高親和性B細胞」とも呼ばれる。B細胞のモノクローナル集団における複数のB細胞間の結合能力の違いについて1つの考えられる理由は、BCRの発現が前記集団におけるB細胞間で異なることである。BCRの発現が比較的高いB細胞は、BCRの発現が比較的低いB細胞より多くの目的とする抗原を結合するであろう。しかし、BCRの発現が異なるB細胞により産生される抗体は、同一の結合親和性を有することが期待される。本発明者らは、驚くべきことに、比較的高いBCR発現に加えて、高親和性B細胞のコレクションが、前記B細胞の集団により産生される抗体の平均親和性より高い親和性で抗原を結合する、前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することを見出した。さらにより驚くべきことに、本発明者らは、本発明の方法で得られたB細胞培養物が、最初の培養物における平均B細胞より高い親和性で抗原を結合する細胞を含有することを見出した。単一B細胞は、故に、当技術分野で公知の方法により、所与のB細胞集団からこのより高い結合能力に基づき単離することができ、少なくとも3週間で新たなB細胞集団へと拡大することができる。これらの新たなB細胞は、新たなB細胞が由来する最初のB細胞集団により産生される抗体より高い親和性を有する抗体を産生する。この発見は予想に反する。その理由は、1つのB細胞(サブクローン)を前記B細胞の既にモノクローナルな集団から単離した後、前記既にモノクローナルなB細胞集団のサブクローンの子孫により産生される抗体の抗原に対する親和性は、少なくとも1つのB細胞が選択されたB細胞の集団の平均親和性に匹敵する抗原に対する平均親和性に戻ることを、当業者は期待するであろうためである。
【００１６】
故に、1つの実施形態において、本発明による方法のステップa)では好ましくは単一B細胞が、例えばポリクローナルB細胞の集団から選択される。単一B細胞は、この後、ステップb)からd)でB細胞のモノクローナル集団へと拡大される。これは、例えば、本明細書で以前に論じられているWO 2007/067046に記載の方法を用いて達成される。故に、ステップd)では、目的とする抗原に特異的なモノクローナルB細胞系が得られる。原則として、モノクローナルB細胞系における全てのB細胞は、前記抗原に特異的な本質的に同一の抗体を産生するが、前記抗原に対する親和性の小さな違いが前記モノクローナルB細胞系の細胞間に存在する可能性がある。すなわち、モノクローナル集団中のあるB細胞は、平均親和性よりわずかに高い親和性を有する抗体を産生し、モノクローナル集団中のあるB細胞は、わずかに低い親和性を有する抗体を産生する。B細胞の集団は、再びわずかに不均一になる。ステップe)では、平均親和性より高い親和性を有するこのようなB細胞の少なくとも1つが、モノクローナルB細胞系から選択される。ステップf)では、B細胞またはステップe)で選択されたB細胞が、この後第2の(好ましくはモノクローナル)B細胞系へと培養される。本発明は、この第2の(好ましくはモノクローナル)B細胞系が、ステップd)で得られた最初のモノクローナルB細胞集団の平均親和性より高い平均親和性を有するという洞察を提供する。上記の通り、選択されたB細胞の高親和性は、たとえ培養が長時間の間行われるとしても、最初の集団の平均親和性に戻る代わりに培養後維持されることが驚くべきことに見出された。故に、ステップf)で培養されたB細胞の第2のモノクローナル集団は、ステップd)で培養されたB細胞のモノクローナル集団より高い、抗原に対する平均親和性を有する。同様に、ステップf)の第2のモノクローナル集団中のほとんどのB細胞の親和性は、ステップd)のモノクローナル集団中のほとんどのB細胞の親和性より高い。
【００１７】
本発明は故に、1つの実施形態において、目的とする抗原に対する所与の平均親和性を有する最初のモノクローナルB細胞集団と比べて、前記目的とする抗原に対する平均親和性が増加したB細胞集団を得る方法であって、
-前記目的とする抗原に特異的なモノクローナルB細胞集団を提供するステップと、
-前記目的とする抗原に対して前記B細胞の集団の平均結合能力より高い結合能力を有するB細胞受容体および/または抗体を産生する、前記B細胞の集団の少なくとも1つのB細胞を選択するステップと、
-前記少なくとも1つのB細胞をB細胞の集団へと培養するステップと
を含む方法を提供する。
【００１８】
さらに提供されるのは、目的とする抗原に特異的な抗体を製造する方法であって、
a)前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができる単一B細胞を選択するステップ、または前記目的とする抗原に特異的な抗体を産生することができるB細胞に分化することができるB細胞を選択するステップと、
b)前記B細胞におけるBCL6の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
c)前記B細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強および/または維持するステップと、
d)第1のモノクローナルB細胞系への前記B細胞の拡大を可能にするステップと、
e)前記第1のモノクローナルB細胞系の平均結合能力より高い、前記目的とする抗原に対する結合能力を有するB細胞受容体および/または抗体を産生する少なくとも1つのB細胞を、前記第1のモノクローナルB細胞系から選択するステップと、
f)ステップe)で選択された前記少なくとも1つのB細胞を、第2の(好ましくはモノクローナル)B細胞系へと培養するステップと、
g)前記第2の(好ましくはモノクローナル)B細胞系により産生された抗体を得るステップと
を含む方法である。前記第1のモノクローナルB細胞系のB細胞により産生される抗体の前記目的とする抗原に対する平均親和性より高い、前記目的とする抗原に対する親和性を有する抗体が得られる。
【００１９】
別の実施形態において、複数のB細胞、例えば2、3、4、5、10、15、25、50または100個のB細胞が本発明の方法のステップa)で選択される。B細胞は、例えばB細胞のポリクローナル集団、または生物学的試料から選択される。選択されたB細胞は、この後、例えばWO 2007/067046に記載の方法を用いて、ステップb)からd)でB細胞の集団へと拡大される。得られたB細胞集団は、故に(第2の)ポリクローナルB細胞集団である。この後、および本発明の方法のステップe)が実施される前に、B細胞のモノクローナル集団が好ましくは製造される。これは、例えば、本明細書で以下に説明される蛍光活性化細胞選別(Fluorescence Activated Cell Sorting)または限界希釈を用いて、前記(第2の)ポリクローナルB細胞の集団から単一B細胞を選択すること、および前記選択された単一B細胞をB細胞のモノクローナル集団へと拡大させることにより行われる。次いで、本発明の方法のステップe)が実施され、モノクローナルB細胞集団の平均親和性より高い親和性を有する少なくとも1つのB細胞が選択される。ステップf)では、ステップe)で選択された1つまたは複数のB細胞が、この後第2のモノクローナルB細胞系へと培養され、この後前記第2のモノクローナルB細胞系により産生された抗体が、ステップg)で得られる。
【００２０】
本明細書に記載の方法は、改善された高親和性抗体、好ましくはモノクローナル抗体を、組換え技術を使用することなく得ることを可能にする。本発明以前は、(モノクローナル)抗体の親和性は、このような組換え技術を用いて増加される。抗体をコードする核酸の配列が、最初に決定される必要がある。この後、1つまたは複数の変異が、抗体をコードする核酸の配列に導入される。次いで、1つまたは複数の変異を含有する遺伝子は細胞で発現される必要があり、この後にプロデューサー細胞での抗体の産生が続く。最後に、非変異抗体と比べて、前記抗原に対する親和性が改善された抗体が得られるかどうかを決定するために、変異抗体は、目的とする抗原への結合能力が試験されなければならない。抗体の親和性を改善するためのこのようなプロセスは複雑であり、時間がかかる。本発明による方法は、分子工学を必要とすることなく、簡単で複雑さのより少ないプロセスでの高親和性抗体の製造を可能にする。
【００２１】
本発明の1つの実施形態において、前記B細胞の既にモノクローナルな集団(上記の本発明の方法のステップe))から、少なくとも1つの高親和性B細胞を選択するステップ後、前記少なくとも1つの高親和性B細胞は、B細胞の集団、好ましくはモノクローナルB細胞系へと再び拡大できるようにされ、この後、前記B細胞の新たな集団、好ましくは前記新たなモノクローナルB細胞系から、少なくとも1つの高親和性B細胞を選択する別のステップが行われる。集団への選択されたB細胞の拡大を可能にするステップを繰り返すこと、および抗原に対する結合能力に基づき、少なくとも1つのB細胞を選択すること、すなわち、ステップd)およびe)を繰り返すことにより、高親和性抗体産生B細胞を生成することが可能である。好ましくは、上記の拡大および選択のステップを繰り返すことにより、各選択サイクルにつれて、得られたB細胞集団により産生される抗体の、目的とする抗原に対する親和性を増加させることが可能である。
【００２２】
故に、本発明の方法のステップe)に続いて、B細胞の集団、好ましくはモノクローナルB細胞系への、少なくとも1つの選択された高親和性B細胞の拡大を可能にするステップ、および少なくとも1つの高親和性B細胞を再び選択するステップを繰り返すステップ、すなわち、本発明の方法のステップd)およびe)を少なくとも1回繰り返すステップを含む方法が提供される。前記ステップは、例えば1回、ただし好ましくは2回、3回、4回、5回またはさらに多い回数繰り返される。
【００２３】
1つの実施形態において、ステップe)で選択された前記少なくとも1つのB細胞が、少なくとも4週間培養される本発明の方法が提供される。好ましくは、ステップe)で選択された前記少なくとも1つのB細胞は、少なくとも6週間、より好ましくは少なくとも9週間、より好ましくは少なくとも3ヶ月間、より好ましくは少なくとも6ヶ月間培養される。
【００２４】
いかなる理論にも拘束されることなく、モノクローナルB細胞の集団内における、目的とする抗原に対する抗体の親和性の違いは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)により媒介されるプロセスの結果生じ得ることが考えられる。胚中心における抗原活性化ナイーブおよび記憶B細胞は、大規模に増殖し、AIDにより媒介される体細胞超変異(SHM)およびIg遺伝子のクラススイッチ組換え(CSR)を伴う。AIDは、免疫グロブリン遺伝子中のデオキシシチジン残基からアミノ基を取り除き、これが抗体多様化を引き起こす。IL21は、BLIMP、BCL6およびAID発現を誘導するが、体細胞超変異を直接誘導しないことが特許出願US2008305076で実証された。しかし、本発明者らは、AIDが、本明細書に記載の方法により培養されるB細胞で発現されることを見出した。抗体産生B細胞(へと発達するであろうB細胞)におけるAIDの発現は、BCL6および抗アポトーシス核酸を形質導入する前の、最初のB細胞には存在しなかった変異を有する新規の免疫グロブリンの生成を可能にする。故に、体細胞超変異がAIDの発現により誘導されるB細胞を培養することは、例えば、目的とする抗原に対してより高いまたは低い親和性を有する免疫グロブリンバリアント、あるいは、例えば、水溶液中もしくは上昇した塩条件下、またはこれらの任意の組み合わせにおいてより安定である免疫グロブリンバリアントの生成を可能にする。
【００２５】
前記B細胞の集団から少なくとも1つの高親和性B細胞を選択すると、AIDは、前記選択された少なくとも1つのB細胞内で依然として発現される。それ故に、このようなB細胞を選択した後、前記B細胞におけるAIDは、前記B細胞の子孫の免疫グロブリン遺伝子における変異の誘導を依然として可能にする。免疫グロブリン遺伝子での体細胞超変異は、Ig遺伝子のCDR3領域で優先的に生じる。免疫グロブリンのCDR3領域に導入された変異は、結合親和性の増加よりも、前記免疫グロブリンの抗原に対する結合親和性の減少または喪失をもたらす可能性が高い。しかし、本発明者らは、結合親和性の増加を見出した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】(A)ポリクローナルB細胞集団内における、H3特異的細胞のBCRへの標識HA H3タンパク質の結合を示す図である。H3タンパク質を高親和性で結合するB細胞が単一細胞選別によりクローン化された。培養の2〜3週間後、培養上清がH3特異的抗体についてスクリーニングされた。(B)H3特異的クローンを選択するために行われたスクリーニングの例を示す図である。(左のパネル) ELISAによるスクリーニングを示す図である。組換えH3タンパク質がプレートにコートされ、この後培養上清と共にインキュベートされた。抗体結合は抗ヒトIgG-HRPを用いて検出された。(右のパネル)細胞表面発現HAに関するスクリーニングを示す図である。H3N2感染細胞が、B細胞培養上清と共にインキュベートされた。抗体結合はPE標識ヤギ抗ヒトF(ab') 2で検出された。
【図２】(左) 23 BCL6-およびBcl-xL形質導入モノクローナル細胞系と比較した、CD19+CD38+CD20+IgD-扁桃GC B細胞およびCD19+IgG+CD27+末梢血記憶B細胞におけるAICDAのmRNAレベルを示す図である。(右) H3特異的クローン内での高結合または低結合サブクローンの選択を示す図である。枠で囲まれた集団が細胞選別により選択され、さらに拡大された。
【図３】(A)クローン細胞からより高いまたはより低いH3 BCR結合について選択された13日後の、選択された細胞への標識HA H3の結合に関するFACS分析を示す図である。増加または低下したH3結合が維持され、サブクローニング後安定である。(B)種々の選択された亜集団のBCRに対するFACS染色を示す図である。選択された集団へのH3結合の増加または低下したレベルは、これらの集団の細胞表面でのBCR発現と相関する。薄い灰色の線:高いH3結合について選択されたB細胞、塗りつぶされたグラフ:選択されなかったB細胞(親細胞)、濃い灰色の線:低いH3結合について選択されたB細胞。
【図４】種々の(亜)集団の培養上清のH3 ELISAを示す図である。H3-APCタンパク質へのより高い結合について選択された細胞から分泌されたIgGは、非選別親系由来のIgGと比べて、H3 ELISAにおいて結合の増加を示す。上の線:高いH3結合について選択されたB細胞、真ん中の線:選択されなかったB細胞(親細胞)、下の線:低いH3結合について選択されたB細胞。
【図５】H3特異的クローン(AT10_004)内における高または低親和性サブクローンの選択を示す図である。細胞は、IgG-PE抗体と一緒にアレクサ647標識HA H3抗原で染色された。円で囲まれた集団が細胞選別により選択され、さらに拡大された。
【図６】より高いまたはより低いH3 BCR結合に関する第3選択ラウンドから2週間後に選択された細胞、および親AT10_004への、BCR染色(重鎖、IgG-PE、または軽鎖、カッパ-PEのどちらかに対する)と一緒の標識HA H3の結合に関するFACS分析を示す図である。
【図７】親和性が増加または減少した選択された亜集団で見出されたアミノ酸変化の概略を示す図である。H3抗原結合の増加と関連するAT10_004の配列における変異がAT10_004配列に組み込まれ、これらの抗体が293T細胞において組換え産生され、さらなる分析のために精製された(AT10_004変異体BおよびAT10_004変異体C)。
【図８】HA H3へのAT10_004抗体の結合のSPR分析を示す図である。抗体AT10_004、AT10_004変異体A、AT10_004変異体BおよびAT10_004変異体Cの結合曲線。
【図９】FACSアッセイにおけるH3N2感染細胞に結合するAT10_004抗体バリアントの平均蛍光強度(MFI)を示す図である。種々の濃度の組換えAT10_004、AT10_004変異体B、AT10_004変異体Cおよびリツキシマブ(陰性対照)が、H3N2感染細胞と共にインキュベートされた。抗体結合はPE標識ヤギ抗ヒトF(ab') 2で検出された。プロットされているのは、得られたPEシグナルのMFIの平均およびSEMである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書で使用されるとき、用語「抗アポトーシス核酸」は、B細胞におけるアポトーシスを遅延および/または防止することができる核酸を指す。好ましくは、前記抗アポトーシス核酸は、抗体産生B細胞におけるアポトーシスを遅延および/または防止することができる。好ましくは、外因性核酸を含む抗アポトーシス核酸が使用される。これは、B細胞において天然で発現されない核酸配列が使用されること、または得られたB細胞での発現が天然のB細胞と比べて増強されるように、自然発生核酸の別のコピーが使用されることのどちらかを意味する。さまざまな抗アポトーシス核酸が当技術分野で知られているため、さまざまな実施形態が利用可能である。好ましくは、抗アポトーシス分子をコードする遺伝子が使用される。抗アポトーシスBcl-2タンパク質は良好なアポトーシス阻害剤であるため、より好ましくは、Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバーである核酸が使用される。Bcl-2ファミリー(このファミリーは、プロアポトーシスタンパク質および抗アポトーシスタンパク質の両方を含む)により調節される多くのプロセスは、以下の本明細書により詳細に概説されているように、アポトーシスのミトコンドリア経路に関係している。抗アポトーシスBcl-2ファミリーメンバーBcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、AlおよびMcl-1が好ましい。その理由は、これらが通常、ミトコンドリア外膜に組み込まれているためである。これらは、Bcl-2ファミリーに属するプロアポトーシスタンパク質を直接結合および阻害してミトコンドリア膜完全性を保護する。
【００２８】
特に好ましい実施形態において前記抗アポトーシス核酸は、Bcl-xLおよび/もしくはMcl-1ならびに/またはBcl-xLの機能的部分および/もしくはMcl-1の機能的部分をコードする。BCL6核酸とBcl-xL核酸の組み合わせ、およびBCL6核酸とMcl-1核酸の組み合わせは、B細胞の不死化および得られた形質芽球様B細胞の長期培養に特に適している。BCL6とBcl-xLの組み合わせはB細胞を特によく安定化させるため、最も好ましくは、前記抗アポトーシス核酸は、Bcl-xLまたはこの機能的部分をコードする。
【００２９】
Bcl-xLの機能的部分およびMcl-1の機能的部分は、それぞれBcl-xLおよびMcl-1の断片として本明細書で定義され、該断片は、性質において(ただし必ずしも量ではない)、完全長のBcl-xLおよびMcl-1とそれぞれ同じ種類の抗アポトーシス特性を保持している。Bcl-xLおよびMcl-1の機能的断片は典型的には、B細胞におけるアポトーシスを遅延および/または防止することができるBcl-xLおよびMcl-1のより短い断片である。このような機能的断片は、例えば、Bcl-xLまたはMcl-1の抗アポトーシス活性に寄与しない配列を欠いている。
【００３０】
本発明によるB細胞の集団は、好ましくは、B細胞のモノクローナル集団である。本発明によるB細胞の集団の例は、B細胞の細胞系、好ましくはモノクローナルB細胞である。故に、本発明によるB細胞の集団は、最も好ましくはモノクローナルB細胞系である。前記B細胞の集団への前記B細胞の拡大を可能にすることは、例えば、前記B細胞の集団が得られるまで前記B細胞を培養して達成される。
【００３１】
B細胞の集団内では、モノクローナルB細胞の集団においてさえ、前記集団のB細胞のBCRの結合能力、および前記集団のB細胞により産生される抗体の結合能力は同等ではない。代わりに、前記結合能力のばらつきが存在する。B細胞の集団の平均結合能力は、前記集団における全ての個々のB細胞のBCRおよび/または抗体の結合能力の平均または平均親和性として本明細書で定義される。B細胞またはB細胞の集団により産生される抗体の、目的とする抗原に対する平均親和性は、前記集団における全ての個々のB細胞により産生される抗体の、前記目的とする抗原に対する親和性の平均として本明細書で定義される。本発明によるB細胞の集団由来、好ましくはモノクローナルB細胞系由来の高親和性B細胞は、結合能力および/または親和性に関して、集団のB細胞、好ましくはモノクローナルB細胞系の上位40%、好ましくは前記集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位30%、より好ましくは前記集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位25%、より好ましくは前記集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位20%、より好ましくは前記集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位15%、より好ましくは前記集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位10%、より好ましくは前記集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位1%から好ましくは選択される。1つの実施形態において、1つの高親和性B細胞は、結合能力および/または親和性に関して、集団のB細胞またはモノクローナルB細胞系の上位1%から選択される。
【００３２】
本発明による少なくとも1つの高親和性B細胞から選択されたB細胞の集団、好ましくはモノクローナルB細胞系により産生される抗体の、目的とする抗原に対する平均親和性は、好ましくは、少なくとも1つの高親和性B細胞が選択されるB細胞の集団の、前記目的とする抗原に対する平均親和性の少なくとも1.1倍、より好ましくは、前記目的とする抗原に対する平均親和性の少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、10.0、20、50、100倍、またはこれ以上である。
【００３３】
抗体の親和性は、当業者に公知の任意の方法を用いて決定することができる。抗体の親和性は、例えば酵素結合免疫吸着測定(ELISA)、表面プラズモン共鳴(Biacoreなどの)またはOctet (ForteBio)を用いて決定される。表面プラズモン共鳴(SPR)およびOctetは、ラベルフリー環境でリアルタイムに生体分子相互作用を測定する技術である。SPRに関して、反応体の1つ、例えば抗体がセンサー表面に固定化され、他(例えば抗原)は溶液中に遊離し、および表面を通過する。結合および解離は、任意の単位で測定され、好ましくはセンサーグラムで表示される。バイオセンサーチップに結合された分子の数のいかなる変化も、リアルタイムで測定することができる干渉縞のシフトをもたらす。Octetを用いて、2つの表面、バイオセンサーチップに固定化されたタンパク質の層、および内部参照層から反射される白色光の干渉縞が分析される。バイオセンサーチップ表面に固定化されたリガンド、例えば抗体と、溶液中のタンパク質、例えば目的とする抗原の間の結合は、バイオセンサーチップにおける光学的厚さの増加を生み、生物学的層の厚さにおける変化の直接的尺度となる波長シフトをもたらす。ELISAは、タンパク質、例えば目的とする抗原を、固体担体、例えば96ウェルプレートの表面に固定化すること、および検出または定量化される試料を固体担体に適用することを含む。あるいは、捕捉抗体が固体担体の表面に固定され、この後、検出または定量化されるタンパク質を含有する試料が、目的とするタンパク質を結合させる固定化された捕捉抗体に適用される。非結合タンパク質は、次いで洗い流される。この後、標識または酵素にコンジュゲートされた特異的抗体(または標識もしくは酵素にコンジュゲートされた1次抗体とこれに続く2次抗体)が固体担体に添加される。好ましくは、本発明によるB細胞により産生される抗体の親和性定数(KD)が決定される。
【００３４】
目的とする抗原への本発明によるB細胞の結合は、当業者に公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、目的とする抗原は、例えば、蛍光標識で標識される。結合の検出は、この後さまざまな技術により決定することができ、その中には蛍光顕微鏡検査および蛍光活性化細胞選別(FACS)がある。FACSは、表面抗原に対してコンジュゲートされた抗体のサイズおよび蛍光に基づき、懸濁液中での細胞の分離を可能にする。
【００３５】
B細胞の集団、好ましくはモノクローナルB細胞系からの少なくとも1つの高親和性B細胞の選択は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。本発明による少なくとも1つの高親和性B細胞の選択は例えば、例えばFACS (上記参照)または限界希釈(限界希釈)を用いた細胞選別により行われる。限界希釈は、単一細胞が所与の体積中に存在するまでの、細胞、例えばB細胞の懸濁液の連続希釈を含む。この後、抗原に対する親和性が高い抗体を産生するB細胞の選択を可能にする各B細胞の結合能力(集団への単一細胞の拡大後の)が試験される。
【００３６】
抗体を産生することができるB細胞は、B細胞が、抗体もしくはこの機能的部分を産生および/もしくは分泌することができる、ならびに/または細胞が、抗体もしくはこの機能的部分を産生および/もしくは分泌することができる細胞に発達することができるB細胞として定義される。
【００３７】
抗体の機能的部分は、必ずしも量ではなく性質において、前記抗体と少なくとも1つの同じ特性を有する部分として定義される。
【００３８】
前記機能的部分は、必ずしも同程度ではないが、前記抗体と同じ抗原を好ましくは結合することができる。抗体の機能的部分は、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、FAB断片、ナノボディ、ユニボディ、単鎖可変断片(scFv)、またはF(ab')2断片を好ましくは含む。
【００３９】
本発明による方法において使用または選択されるB細胞の非限定例には、ヒト個体、齧歯類、ウサギ、ラマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、類人猿、チンパンジー、マカクおよびゴリラに由来するB細胞が含まれる。好ましくは、前記B細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ウサギ細胞、類人猿細胞、チンパンジー細胞、マカク細胞および/またはラマ細胞である。最も好ましくは、前記B細胞はヒトB細胞である。
【００４０】
好ましい実施形態において、記憶B細胞は、本明細書に記載の方法のステップa)で選択され、例えばヒト記憶B細胞である。特に好ましい実施形態において、前記記憶B細胞は末梢血記憶B細胞である。末梢血記憶B細胞は、これらが由来する個体にひどい不快感がない状態で容易に得られ、本発明による方法における使用に極めて適しているようである。
【００４１】
本発明による方法で得られたB細胞またはB細胞の集団、好ましくはモノクローナルB細胞系は、少なくとも4週間、より好ましくは少なくとも6週間、より好ましくは少なくとも9週間、より好ましくは少なくとも3ヶ月間、より好ましくは少なくとも6ヶ月間好ましくは安定であり、これは、このようなB細胞が、前記期間中に抗体を複製および産生することができる、または抗体を産生する細胞へ複製および発達することができることを意味する。本発明によるB細胞は、IgMを産生する細胞、またはIgG、もしくはIgA、もしくはIgEのような他の免疫グロブリンアイソタイプ、好ましくはIgGを産生する細胞を好ましくは含む。本発明によるB細胞は、抗体産生細胞系の製造における使用に特に適している。高親和性B細胞、または本発明による高親和性B細胞の集団もしくはモノクローナルB細胞系は、好ましくは生体外で培養され、抗体は、好ましくはさらなる使用のために回収される。本発明による方法で製造された抗体またはこの機能的部分は、例えば治療的、予防的および診断的適用などの多様な適用のほか、研究目的および生体外実験に有用である。例えば、目的とする抗原が存在するかどうかを決定するために、本発明による抗体または機能的部分が試料と共にインキュベートされるスクリーニングアッセイが行われる。
【００４２】
1つの実施形態において、本発明による高親和性B細胞または本発明による高親和性B細胞の集団もしくはモノクローナルB細胞系は、ヒト抗体を産生することができるヒトB細胞を含む。その理由は、ヒト抗体が、ヒト個体での治療的および/または予防的適用に特に適しているためである。
【００４３】
B細胞におけるBCL6の発現は、さまざまな方法で誘導され、増強され、および/または維持される。1つの実施形態においてB細胞は、BCL6または相同体をコードする核酸を与えられる。別の実施形態においてB細胞は、BCL6発現を直接または間接的に増強することができる化合物を与えられる。このような化合物は、好ましくは、シグナル伝達兼転写活性化因子5 (STAT5)タンパク質またはこの機能的部分、誘導体および/もしくは類似体、ならびに/あるいはこれらをコードする核酸配列を含む。STAT5は、BCL6発現を増強することができるシグナル伝達物質である。STAT5の2つの公知の形態、STAT5aおよびSTAT5bがあり、これらは、2つの異なる縦に連結した遺伝子によりコードされている。STAT5の投与および/または活性化は、BCL6レベルの増強をもたらす。故に、Blimp-1によるBCL6の下方制御は、STAT5またはこの機能的部分、誘導体および/もしくは類似体によるBCL6の発現の上方制御により、少なくとも部分的に代償される。故に、STAT5またはこの機能的部分、誘導体および/もしくは類似体は、BCL6発現に直接影響を与えることができる。BCL6発現に間接的に影響を与えることも可能である。これは、例えば化合物の量を制御して行われ、今度は直接または間接的にSTAT5を活性化するおよび/またはSTAT5発現を制御することができる。故に、1つの実施形態において、内因性および/または外因性STAT5の発現および/または活性が増加される。例えば、インターロイキン(IL) 2および/またはIL4またはSTAT5を活性化することができる他のサイトカインの存在下で抗体産生細胞を培養して、BCL6発現を間接的に増強することが可能である。
【００４４】
本発明による方法において前記B細胞は、少なくともある段階でIL21およびCD40Lと共にインキュベートされることがさらに好ましい。ほとんどのB細胞の複製はCD40Lにより促進されることから、抗体産生形質芽球様B細胞などのB細胞は、好ましくはCD40Lの存在下で培養される。STAT3が前記B細胞において活性化されることがさらに好ましい。IL21は、本発明によるB細胞の安定性に影響を与えるのに特に適していることから、最も好ましくはIL21がSTAT3を上方制御するのに使用される。STAT3の上方制御に加えて、IL21は、Blimp1発現がBCL6により妨げられる場合でさえBlimp1発現を上方制御することができる。
【００４５】
別の実施形態において、本発明による方法のステップa)で選択された前記B細胞におけるBlimp-1発現産物の量は、直接または間接的に調節される。Blimp-1発現産物の量は、さまざまな方法で、例えばSTAT3またはこの機能的部分、誘導体もしくは類似体を制御して調節することができる。STAT3はさまざまな方法で活性化される。好ましくは、STAT3は、本発明によるB細胞にサイトカインを与えて活性化される。天然ではB細胞分化に関与するサイトカインは、STATタンパク質の制御に極めて有効である。STAT3の極めて有効な活性化因子は、IL-21およびIL-6であるが、IL-2、IL-7、IL-10、IL-15およびIL-27も活性化することが知られている。さらに、先天性免疫に関与するToll様受容体(TLRs)もSTAT3を活性化することができる。最も好ましくはIL-21が使用される。IL-21は、Blimp1発現がBCL6により妨げられる場合でさえBlimp1発現を上方制御することができる。
【００４６】
STAT5またはSTAT3の機能的部分により、それぞれSTAT5またはSTAT3と比べて、必ずしも量ではなく性質において、抗体産生細胞の安定性に影響を与える同じ能力を有するタンパク質性分子が意味される。STAT5タンパク質またはSTAT3タンパク質の機能的部分は、例えば、前記能力に関与しない、またはごくわずかにしか関与しないアミノ酸を欠いている。STAT5またはSTAT3の誘導体は、抗体産生細胞の安定性に影響を与えるタンパク質の能力が、必ずしも量ではなく性質において本質的に同じであるように変更されたタンパク質として定義される。誘導体は、多くの方法で、例えば保存的アミノ酸置換を通じて提供される。保存的アミノ酸置換は、全体的な機能が重大な影響を受ける可能性がないように、1つのアミノ酸が概ね類似した特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸により置換される。例えば誘導体は、活性が4ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の存在に依存するSTAT5-ER融合タンパク質などの融合タンパク質を含む。STAT5またはSTAT3の類似体は、必ずしも量ではなく性質において、抗体産生細胞の安定性に影響を与える同じ能力を有する分子として定義される。前記類似体は、前記STAT5またはSTAT3タンパク質に必ずしも由来しない。
【００４７】
本発明による方法は、商業的高親和性抗体製造が可能になるように、少なくとも1週間、好ましくは少なくとも1ヶ月間、より好ましくは少なくとも3ヶ月間、より好ましくは少なくとも6ヶ月間安定である高親和性B細胞の細胞系の生成に好ましくは使用される。好ましくは、モノクローナル高親和性抗体を産生することができる安定な細胞系が製造される。これは、例えば、CD19 (B細胞マーカー)および細胞表面IgGおよび/またはCD27 (記憶細胞をマークする)の選択により、試料から単離された記憶B細胞を用いて好ましくは行われる。さらに、目的とする抗原を特異的に結合することができる記憶B細胞は、例えば、前記目的とする抗原を用いた結合アッセイにおいて選択される。この後、BCL6および抗アポトーシス核酸、好ましくはBcl-XLまたはMcl-1は、前記B細胞で好ましくは共発現され、前記目的とする抗原に特異的な細胞の集団をもたらす。モノクローナル抗体を産生する本発明によるB細胞集団(モノクローナルB細胞系)が得られるように、好ましくは1個のみの記憶細胞が、本明細書に記載の方法のステップa)で選択される。
【００４８】
1つの実施形態において、目的とする抗原に以前に曝露された個体を起源とするB細胞(好ましくは記憶B細胞であるが必ずしも記憶B細胞ではない)が、本発明による方法において使用される。しかし、これは必須ではない。前記目的とする抗原に曝露されていない個体由来のB細胞も使用することが可能である。例えば、別の抗原に特異的であるが、目的とする抗原と交差反応性を示すB細胞が使用される。別の例として、ある個体のナイーブB細胞集団から選択されたB細胞が使用される。ある個体のナイーブB細胞集団は、該個体が前記目的とする抗原に曝露されていなくても、目的とする抗原との反応性を示すB細胞を含有する可能性がある。ナイーブB細胞集団由来のこのようなB細胞は、例えば、標識された目的とする抗原を用いて選択される。
【００４９】
本発明はさらに、本発明による方法により得られる、単離または組換えB細胞およびB細胞の集団、好ましくはモノクローナルB細胞系を提供する。このような高親和性B細胞は、少なくとも1週間、好ましくは少なくとも1ヶ月間、より好ましくは少なくとも3ヶ月間、より好ましくは少なくとも6ヶ月間好ましくは安定であり、これは、B細胞が、前記期間中に抗体を複製および産生することができる、または抗体を産生する細胞へ複製および発達することができることを意味する。本発明によるB細胞は、IgMを産生する細胞、またはIgG、もしくはIgA、もしくはIgEのような他の免疫グロブリンアイソタイプ、好ましくはIgGを産生する細胞を好ましくは含む。本発明によるB細胞は、抗体産生細胞系の製造における使用に特に適している。本発明による高親和性B細胞は、好ましくは生体外で培養され、抗体は、好ましくはさらなる使用のために回収される。本発明によるB細胞またはB細胞集団もしくはモノクローナル細胞系から得られる抗体もまた提供される。本発明による方法で製造された高親和性抗体またはこの機能的部分は、例えば治療的、予防的および診断的適用などの多様な適用のほか、研究目的および生体外実験に有用である。例えば、目的とする抗原が存在するかどうかを決定するために、本発明による抗体または機能的部分が試料と共にインキュベートされるスクリーニングアッセイが行われる。
【００５０】
本発明による方法で生成されたB細胞は、目的とする抗原に対する高親和性抗体を製造するのに特に適している。しかし、1つの好ましい実施形態において、Ig重鎖および/または軽鎖をコードする遺伝子は、前記細胞から単離され、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系の細胞などの第2の細胞で発現される。本明細書でプロデューサー細胞とも呼ばれる前記第2の細胞は、好ましくは商業的抗体製造に適合される。前記プロデューサー細胞の増殖は、抗体を産生することができるプロデューサー細胞系をもたらす。好ましくは、前記プロデューサー細胞系は、ヒトにおいて使用するための化合物を製造するのに適している。故に、前記プロデューサー細胞系は、好ましくは病原微生物などの病原体を含まない。
【００５１】
本発明は、以下の非限定例によりさらに説明される。
【００５２】
図面の簡単な説明
図１．(A)ポリクローナルB細胞集団内における、H3特異的細胞のBCRへの標識HA H3タンパク質の結合を示す図である。H3タンパク質を高親和性で結合するB細胞が単一細胞選別によりクローン化された。培養の2〜3週間後、培養上清がH3特異的抗体についてスクリーニングされた。(B)H3特異的クローンを選択するために行われたスクリーニングの例を示す図である。(左のパネル) ELISAによるスクリーニングを示す図である。組換えH3タンパク質がプレートにコートされ、この後培養上清と共にインキュベートされた。抗体結合は抗ヒトIgG-HRPを用いて検出された。(右のパネル)細胞表面発現HAに関するスクリーニングを示す図である。H3N2感染細胞が、B細胞培養上清と共にインキュベートされた。抗体結合はPE標識ヤギ抗ヒトF(ab') 2で検出された。
図２．(左) 23 BCL6-およびBcl-xL形質導入モノクローナル細胞系と比較した、CD19+CD38+CD20+IgD-扁桃GC B細胞およびCD19+IgG+CD27+末梢血記憶B細胞におけるAICDAのmRNAレベルを示す図である。(右) H3特異的クローン内での高結合または低結合サブクローンの選択を示す図である。枠で囲まれた集団が細胞選別により選択され、さらに拡大された。
図３．(A)クローン細胞からより高いまたはより低いH3 BCR結合について選択された13日後の、選択された細胞への標識HA H3の結合に関するFACS分析を示す図である。増加または低下したH3結合が維持され、サブクローニング後安定である。(B)種々の選択された亜集団のBCRに対するFACS染色を示す図である。選択された集団へのH3結合の増加または低下したレベルは、これらの集団の細胞表面でのBCR発現と相関する。薄い灰色の線:高いH3結合について選択されたB細胞、塗りつぶされたグラフ:選択されなかったB細胞(親細胞)、濃い灰色の線:低いH3結合について選択されたB細胞。
図４．種々の(亜)集団の培養上清のH3 ELISAを示す図である。H3-APCタンパク質へのより高い結合について選択された細胞から分泌されたIgGは、非選別親系由来のIgGと比べて、H3 ELISAにおいて結合の増加を示す。上の線:高いH3結合について選択されたB細胞、真ん中の線:選択されなかったB細胞(親細胞)、下の線:低いH3結合について選択されたB細胞。
図５．H3特異的クローン(AT10_004)内における高または低親和性サブクローンの選択を示す図である。細胞は、IgG-PE抗体と一緒にアレクサ647標識HA H3抗原で染色された。円で囲まれた集団が細胞選別により選択され、さらに拡大された。
図６．より高いまたはより低いH3 BCR結合に関する第3選択ラウンドから2週間後に選択された細胞、および親AT10_004への、BCR染色(重鎖、IgG-PE、または軽鎖、カッパ-PEのどちらかに対する)と一緒の標識HA H3の結合に関するFACS分析を示す図である。
図７．親和性が増加または減少した選択された亜集団で見出されたアミノ酸変化の概略を示す図である。H3抗原結合の増加と関連するAT10_004の配列における変異がAT10_004配列に組み込まれ、これらの抗体が293T細胞において組換え産生され、さらなる分析のために精製された(AT10_004変異体BおよびAT10_004変異体C)。
図８．HA H3へのAT10_004抗体の結合のSPR分析を示す図である。抗体AT10_004、AT10_004変異体A、AT10_004変異体BおよびAT10_004変異体Cの結合曲線。
図９．FACSアッセイにおけるH3N2感染細胞に結合するAT10_004抗体バリアントの平均蛍光強度(MFI)を示す図である。種々の濃度の組換えAT10_004、AT10_004変異体B、AT10_004変異体Cおよびリツキシマブ(陰性対照)が、H3N2感染細胞と共にインキュベートされた。抗体結合はPE標識ヤギ抗ヒトF(ab') 2で検出された。プロットされているのは、得られたPEシグナルのMFIの平均およびSEMである。
【００５３】
(実施例)
(実施例1)
抗インフルエンザヘマグルチニン(HA) H3特異的モノクローナルヒト抗体の生成
ヒト記憶B細胞を、Kwakkenbosら(Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor- positive human memory B cells by genetic programming. Nature Medicine (2010)第16巻(1) 123〜8頁、および特許出願MEANS AND METHODS FOR INFLUENCING THE STABILITY OF ANTIBODY PRODUCING CELLS [WO 2007/067046]により記載されているBCL6/Bcl-xL技術を用いて不死化した。手短に述べると、BCL6およびBcl-xL形質導入細胞(GFP陽性)を、CD40リガンド発現L-細胞およびインターロイキン(IL)-21と共にインキュベートした後、HA H3結合細胞を蛍光活性化細胞選別機(Fluorescence Activated Cell Sorter)(FACS)を用いて選別した(図1A)。インフルエンザHAタンパク質(Protein Sciences)はアレクサフルオロ647 (Molecular Probes)で標識し、ポリクローナル培養B細胞と共にインキュベートした。HA陽性細胞を1ウェルあたり単一細胞に選別し、2〜3週間培養下で維持した後、HA結合についてクローンを、1) ELISAまたは2) H3感染細胞への結合によりスクリーニングした(図1B)。
【００５４】
(実施例2)
より高いおよびより低い親和性B細胞クローンの選択
BCL6 Bcl-XL形質導入B細胞は、Kwakkenbosらにより記載されている酵素、活性化誘導デアミナーゼ(AID、遺伝子命名はAICDA)を発現する(図2左パネルおよび「Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor- positive human memory B cells by genetic programming」Nature Medicine (2010)第16巻(1) 123〜8頁)ことから、個々のB細胞は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖におけるヌクレオチド変化をもたらすことができる。これらの変化は、抗原に対するクローンの結合親和性に影響を与えることができる。HA H3結合クローンのサブクローンが、実際に、異なる結合プロフィールを有し得るかどうかを決定するために、H3特異的クローンを、標識HA H3抗原と共に再びインキュベートした。FACSを用いて、高HA H3結合細胞の集団および低HA H3結合細胞の集団を選別し(図2、右パネル)、少なくとも13日間培養下で維持した後、B細胞上清を回収し、試験した。
【００５５】
(実施例3)
HA H3高および低親和性選別B細胞は、安定だが可変レベルの表面免疫グロブリンを発現する
最初に本発明者らは、標識HA H3へのB細胞受容体(BCR)の結合能力をFACSにより分析して選別細胞の安定性を特徴付けた(図3A)。HA H3高選別細胞は、より高い結合能力を依然として示したことから、本発明者らは次に、FACSにより表面免疫グロブリン発現レベルを決定した(図3B)。HA H3に対する比較的低い結合能力について選別された細胞は、高いHA結合について選別された細胞と比べて、表面での免疫グロブリンタンパク質の発現がより少ないことが観察された。このより高いまたはより低いBCR発現およびより高いまたはより低いHA H3タンパク質へのBCR結合は経時的に維持され、第2ラウンドの選別後、さらにより顕著になった(データ不図示)。
【００５６】
(実施例4)
HA H3結合原細胞ならびに高および低親和性HA H3結合細胞に由来する抗体のHA H3に対する親和性
種々のHA H3認識B細胞により産生された抗体の結合親和性を決定するために、HA H3結合原細胞ならびに高および低親和性HA H3結合細胞の13日目の培養物の培養上清をELISAにより分析した。HA H3 (1ug/ml、Protein Sciences)をプレートに直接コートした後、ウェルを種々のB細胞上清と共にインキュベートした。HA H3タンパク質へのヒトIgGの結合は、HRP標識した抗ヒトポリクローナルヤギ抗体で検出した。H3-APCタンパク質へのより高い結合について選択された細胞から分泌されるIgGは、非選別親系由来のIgGと比べて、H3 ELISAにおいて結合の増加を示す(図4)。
【００５７】
(実施例5)
高および低親和性クローンの選択のための複合BCR-抗原染色
実施例2および3において、モノクローナルB細胞クローンの不均一な亜集団内における最も高いレベルのH3結合を有するB細胞の選択は、BCR発現のレベルが上昇した細胞について選択することができることが示されている。故に、選択をH3結合のレベルにのみ基づいて行う場合、抗原親和性は増加したがBCR発現のレベルが低い細胞は除外してもよい。高親和性クローンの選択に対する免疫グロブリン発現のレベルの影響を除外するために、抗原染色(H3-アレクサ647)およびBCR染色の組み合わせを用いて、新たな一連の選択ラウンドを行った(図5)。BCR染色は、BCRの重鎖または軽鎖に結合する抗体により行った。高H3染色および低BCR染色が高い抗原親和性を示唆するのに対し、低H3染色および高BCR染色は低い抗原親和性を示唆する。
【００５８】
HA H3特異的B細胞クローン(AT10_004)を2〜3週間培養して数百万個の細胞を生成させた後、抗原-BCR染色を行った。逸脱する抗原親和性を示した細胞(陽性および陰性の両方)を選択し、細胞選別機で選別した。第3ラウンドの選別および増殖後、抗原結合の違いを決定するために、これらの細胞についてFACS分析を行った。増加または減少した抗原結合について3回選別した細胞は、非選択細胞と比べて抗原結合における明らかなシフトを示す(図6)。図6は、増加または低下したH3結合が選択後に維持され、および安定であることを実証している。
【００５９】
(実施例6)
選択された細胞由来のBCRの配列決定
本発明者らは、RNeasy(登録商標)ミニキット(Qiagen)を用いて、高または低親和性について選択されたAT10_004およびAT10_004変異体B細胞培養物から全RNAを単離し、RNAからcDNAを生成し、PCRを行い、BCRの重鎖および軽鎖の配列を分析した。重鎖においてアラニンへのグリシンの交換を生じさせる、38位(CDR1)にアミノ酸変化をもたらす変異は、減少した親和性について選別された細胞に関して見出された(以下変異体Aという)。(親AT10_004配列と比べて)軽鎖においてアミノ酸変化をもたらす変異は、親和性が増加した選別細胞に関して見出された。配列分析は、セリンからチロシンへのカッパ軽鎖におけるアミノ酸108 (CDR3)の変化を示した(以下、変異体Bという)。フェニルアラニンへのチロシンの置換をもたらす38位での別の変異は、幾つかの配列で見出された(以下、変異体Cという)(図7およびTabl1e 1(表1))。組換えAT10_004および親和性が増加した変異体BおよびC mAbを製造するために、本発明者らは、ヒトIgG1およびカッパ定常領域を有するフレームにおける重および軽可変領域を、pcDNA3.1 (Invitrogen)ベースのベクターにクローン化し、293T細胞に一過性にトランスフェクトした。本発明者らは、AKTA (GE healthcare)を用いて培養上清から組換えmAbを精製した。
【００６０】
(実施例7)
表面プラズモン共鳴(SPR)分析
SPR分析は、記載のような(Lokateら、2007、J. Am. Chem. Soc. 129: 14013-14018頁) IBIS MX96 SPR画像システム(IBIS Technologies BV.、エンスヘーデ、オランダ)で行った。手短には、1回のSPR分析サイクルは、分析物がコートされたセンサー上に流される1つまたは複数のインキュベーションステップと、これに続く、結合分析物がセンサーから除去される再生ステップからなる。複数のサイクルを1回の実験で行うことができる。結合緩衝液(PBS+0.03%トゥイーン20+0.01mg/ml BSA)中のAT10_004およびAT10_004変異体抗体の希釈系列(0.30〜10μg/mlの範囲の濃度)を、連続流マイクロスポッター装置(continuous flow microspotter device) (Wasatch Microfluidics、ソルトレイクシティー、UT、USA)を用いてヒトIgG特異的金膜ゲル型SPRチップ(Ssens、エンスヘーデ、オランダ)に99分間固定化した。スポッティング後、センサーをPBS+0.03%トゥイーン20 (PBST)で3回洗浄した。
【００６１】
抗IgGコートSPRチップにおけるいかなる非占有部位もブロックするため、チップに非特異的ヒトIgG (リツキシマブ、PBST中10μg/ml)を最初に注入し、45分間インキュベートし、これに続いてPBSTと共に100分間インキュベートした。このブロッキングステップ後、それぞれが、空のアッセイ緩衝液(1×PBST+0.01% BSA)の45分間の注入と、これに続く100分間のPBSTとのインキュベーションからなる、2回のブランク注入サイクルを行った。次いで、センサーに、アッセイ緩衝液中1μg/ml組換えインフルエンザHA3タンパク質(H3N2、Wyoming、03/2003由来、Sino Biological inc.、北京、中国)を注入し、45分間インキュベートした。この後、センサーをPBSTで洗浄し、100分間インキュベートした(複合体解離を測定するために)。得られたデータは、Sprintソフトウェア(バージョン1.6.8.0、IBIS Technologies BV.、エンスヘーデ、オランダ)を用いて分析した。結合定数は、Scrubber2ソフトウェア(Biologic Software、キャンベル、オーストラリア)を用いてフィットさせた。図8は、組換えHA3がAT10_004変異体Aと結合しないことを示している。非変異AT10_004と比べて、AT10_004変異体BおよびCに対するHA3の結合速度の増加が見られる。AT10_004および各変異体について得られた結合定数をTable 2(表2)に示す。
【００６２】
(実施例8)
ウイルス感染細胞への抗体結合
ウイルス感染細胞へのAT10_004およびAT10_004変異体の結合能力を試験するために、本発明者らはインフルエンザH3N2 (A/Netherlands/177/2008)感染細胞についてFACS分析を行った。MDCK-SIAT細胞をDMEM/FCS/PS/G418において80〜100%コンフルエンシーまでT175培養フラスコで増殖させた。細胞層を10ml PBSで2×洗浄した後、15mlのOptimem/PS/G418/トリプシンを添加した。この後、0.5mlの100.000 TCID50インフルエンザウイルスをフラスコに添加し、細胞を37℃で培養した。24〜48時間後、細胞を10ml PBSで2×洗浄し、トリプシン-EDTAを用いてプラスチックから剥離した。細胞をカウントし、使用まで-150℃で凍結させた。感染細胞を解凍し、AT10_004 (変異体)抗体またはリツキシマブ(陰性対照として)と共に幾つかの濃度で30分間、4℃でインキュベートし、次いで150μl PBS/2%FCSで2×洗浄した。抗体結合は、抗ヒトIgG-PE (Southern Biotech)で検出し、Guava easyCyte 8HT (Millipore)で分析した。AT10_004変異体BおよびCの両方は、親AT10_004抗体と比べてH3N2感染細胞において染色強度の増加を示す(図9)。
【００６３】
【表１Ａ】
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【００６４】
【表１Ｂ】
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【００６５】
【表１Ｃ】
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【００６６】
【表１Ｄ】
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【００６７】
【表２】
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【００６８】
定数は1:1相互作用モデルへのグローバルフィットを用いて、Scrubber2でフィットされた。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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