(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養心筋細胞の周期的細胞運動を自動的に決定するシステム（１００）であって、当該システムが、
ａ）培養心筋細胞の第１の時系列の画像を取得するための撮像装置（１０４）であって、第１の時系列の画像が経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）及び基準フレーム（ｆＲ）を含んでいて、撮像の頻度が前記周期的細胞運動の頻度よりも大きくなるように経時フレーム間の時間間隔が選択される、撮像装置（１０４）と、
ｂ）ｉ）時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成し、
ｉｉ）時系列の差分画像から１以上の測定値を導き出し、
ｉｉｉ）１以上の測定値を解析して、第１の時系列の画像における周期的細胞運動を定量化する
ように動作し得るプロセッサー（１０７）と
を備えており、
時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成することが、基準フレーム（ｆＲ）から各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）を減算すること、或いは各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）から基準フレーム（ｆＲ）を減算することを含んでいる、システム。
【請求項２】
各フレームが、それぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、前記プロセッサーが、強度値に基づいて時系列の差分画像を生成するように動作できる、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記１以上の測定値が、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載のシステム。
【請求項４】
培養心筋細胞の周期的細胞運動を決定する方法であって、当該方法が、
ｉ）培養心筋細胞の第１の時系列の画像を取得する段階）であって、第１の時系列の画像が経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）及び基準フレーム（ｆＲ）を含んでいて、撮像の頻度が前記周期的細胞運動の頻度よりも大きくなるように経時フレーム間の時間間隔が選択される、段階と、
ｉｉ）時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成する段階と、
ｉｉｉ）時系列の差分画像から１以上の測定値を導き出す段階と、
ｉｖ）１以上の測定値を解析して、第１の時系列の画像における周期的細胞運動を定量化する段階と
を含んでいて、
時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成する段階が、基準フレーム（ｆＲ）から各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）を減算すること、或いは各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）から基準フレーム（ｆＲ）を減算することを含んでいる、方法。
【請求項５】
各フレームが、それぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成する段階が、基準フレーム（ｆＲ）の対応強度値から各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）の強度値を減算するか或いは各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）の対応強度値から基準フレーム（ｆＲ）の強度値を減算することを含んでいる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記１以上の測定値が、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される、請求項４又は請求項５記載の方法。
【請求項７】
当該方法が自動化された方法である、請求項４乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項４乃至請求項７のいずれか１項記載の方法を実行するようにデータ処理装置を構成するように動作し得る機械命令を含む、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体（biological object）の運動の決定、特に、培養生物又は細胞培養での運動の決定に関する。本発明は、生体の運動（培養心筋細胞の収縮運動など）に対する被験化合物又は環境刺激の影響を求めるのに用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
遊走、運動、ケモタキシス又は創傷治癒の際の細胞の移動、又はゼブラフィッシュや線形動物のような小型生物の移動は、生物システムの研究における重要なパラメータである。例えば、物理的刺激又は化学的処理に対する細胞又は細胞培養の応答の測定に関する多くの研究がある。特に毒性学的研究は、化学物質が被験又は培養生物の増殖及び発生に悪影響を及ぼすか否かを求めるため、化学的処理に対する細胞培養の応答に着目することが多々ある。
【０００３】
心臓毒性は、現在、前臨床及び臨床開発時の医薬の失敗の３０％を占めており、製薬業界では損耗コストを削減するため予測能力の高い細胞モデルが強く求められている。ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞は、新薬候補物質の心臓毒性を評価するための臨床予測性の高いアッセイの開発に向けた進歩といえる。心筋細胞は、候補薬物による心臓易罹病性（cardiac liability）を評価するための、電気生理学、イオン流イメージング及び高含量解析を始めとする広範な用途に用いることができる。心筋細胞の機能は、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びナトリウムイオンの流入及び流出を調節して、細胞の収縮性を調節する、統合的なイオンチャネル系により制御されている。例えば、ＨＥＲＧカリウムチャネルとの相互作用を介するこれらの制御機構に対して薬物により干渉すると、心筋細胞の活動電位の短縮又は延長がもたらされる可能性があり、場合によっては、早期後脱分極又は遅延後脱分極をもたらす可能性があり、これは、インビボで不整脈及び心不全をもたらしかねない。
【０００４】
心筋細胞の拍動数の測定は、薬物による心臓易罹病性を評価するための、一般的に用いられる技法である。ビデオ顕微鏡法により培養心筋細胞を撮像し、ビデオエッジ検出法を用いて、細胞又は細胞クラスターのエッジが、ユーザーにより規定された検出帯域内へ、又は検出帯域外へと動く速度を測定する（Gervais-Pingot et. al. 1994 Cell Biol Toxicol. 10(5-6):297-300; Dolnikov et. al. 2006 Stem Cells. 4(2):236-45）。この方法は、ビデオ速度によるエッジの検出を実施するのに特化した電子ハードウェア、例えば、ＶＥＤ運動エッジ検出器（www.crescent-electronics.com）を始めとする専用装置を必要とする。この方法は、高コントラストによる対象エッジの動きの検出に依拠するので、すべての培養物に適するわけではなく、特に、撮像領域が細胞で満たされる、細胞密度の高い培養物には適さない。さらに、この技法は、解析される各試料について、エッジを検出するための解析領域を確立することを操作者に要求するので、この手法をハイスループットで実行することはできない。
【０００５】
米国特許出願公開第２００８／０３０４７３２号には、心筋細胞培養に適用される、細胞運動を評価するための方法について記載されているが、ここでは、時系列画像を取り込み、時系列全体で逐次に連鎖する画像対について運動ベクトルを誘導している。これらの運動ベクトルは、連続する画像対間における各個別の細胞の変位に基づき、逐次な画像間における動きの存在及び方向を示す変位ベクトル図の系列により細胞の運動を表す。次いで、オプティカルフローアルゴリズムを用いて細胞運動データを抽出し、得られる複雑なデータを、主成分分析などの因子化法を用いて縮約又は分解することによって、運動データを低次元空間で（例えば、波形プロットとして）表すことが可能となる。これらの方法は、複雑な画像及びデータの解析を実施するための膨大なコンピュータ処理力及び時間を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０３０４７３２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gervais-Pingot et. al. 1994 Cell Biol Toxicol. 10(5-6): 297-300
【非特許文献２】Dolnikov et. al. 2006 Stem Cells. 4(2): 236-45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞密度、画像コントラスト、又は検出可能なエッジの存在に依存しない、単純な画像差分法を用いて、生体の運動を決定するシステム及び方法を提供することによって、先行技術による方法の限界を克服しようとするものである。さらに、本発明は、複雑なデータの縮約法又は分解法を必要とせず、自動化されたハイスループット撮像装置を用いて実行することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の方法は、生体の運動を定量化するための単純で簡易な自動化手段を提供する。本方法は、心筋細胞の拍動頻度を測定するなど、細胞培養の運動を定量化するのに特に適する。
【００１０】
本発明の第１の態様では、生体の運動を自動的に決定するシステム（１００）であって、
ａ）経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）及び基準フレーム（ｆＲ）を含む生体の第１の時系列の画像を取得するための撮像装置（１０４）と、
ｂ）ｉ）時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成し、
ｉｉ）時系列の差分画像から１以上の測定値を導き出し、
ｉｉｉ）１以上の測定値を解析して、第１の時系列の画像における運動を定量化する
ように動作し得るプロセッサー（１０７）と
を備えており、
時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成することが、基準フレーム（ｆＲ）から各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）を減算することを含んでいるか、或いは
時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成することが、各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）から基準フレーム（ｆＲ）を減算することを含んでいる、システムを提供する。
【００１１】
一態様では、各フレームはそれぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、プロセッサーは、強度値によって時系列の差分画像を生成するように動作し得る。
【００１２】
別の態様では、１以上の測定値は、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される。
【００１３】
追加の態様では、生体は培養生物又は細胞培養である。
【００１４】
好ましくは、培養生物はゼブラフィッシュ又は線虫からなる群から選択される。ゼブラフィッシュ（Danio rerio又は略してD. rerio）又はエレガンス線虫（Caenorhabditis elegans又は略してC. elegans）は、各種の生理学的研究、発生研究、遺伝学的研究、疾患研究及び毒性学的研究に用いられている。
【００１５】
好ましくは、細胞培養は、細菌細胞培養、真菌細胞培養、昆虫細胞培養、魚類細胞培養及び哺乳類細胞培養からなる群から選択される。さらに好ましくは、哺乳類細胞培養はヒト細胞培養である。最も好ましくは、ヒト細胞培養は心筋細胞培養である。
【００１６】
本発明の第２の態様では、生体の運動を決定する方法であって、
ｉ）経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）及び基準フレーム（ｆＲ）を含む生体の第１の時系列の画像を取得する段階と、
ｉｉ）時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成する段階と、
ｉｉｉ）時系列の差分画像から１以上の測定値を導き出す段階と、
ｉｖ）１以上の測定値を解析して、第１の時系列の画像における運動を定量化する段階と
を含んでいて、
時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成する段階が、基準フレーム（ｆＲ）から各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）を減算することを含んでいるか、或いは
時系列の差分画像（ｆＲ−１〜ｆＲ−ｎ）を生成する段階が、各経時フレーム（ｆ１〜ｆｎ）から基準フレーム（ｆＲ）を減算することを含んでいる、方法を提供する。
【００１７】
一態様では、各フレームはそれぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、段階ｉｉ）は、各フレームの強度値を基準フレーム（ｆＲ）の対応強度値から減算するか或いは基準フレーム（ｆＲ）の強度値を各フレームの対応強度値から減算することを含む。
【００１８】
別の態様では、１以上の測定値は平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される。
【００１９】
別の態様では、生体は培養生物又は細胞培養である。
【００２０】
好ましくは、培養生物はゼブラフィッシュ又はエレガンス線虫からなる群から選択される。
【００２１】
好ましくは、細胞培養は、細菌細胞培養、真菌細胞培養、昆虫細胞培養、魚類細胞培養及び哺乳類細胞培養からなる群から選択される。さらに好ましくは、哺乳類細胞培養はヒト細胞培養である。最も好ましくは、ヒト細胞培養は心筋細胞培養である。
【００２２】
追加の態様では、本方法は自動化方法である。
【００２３】
本発明の第３の態様では、創薬及び／又は毒性試験における上述のシステム又は方法の使用を提供する。本システム及び／又は方法を用いて、生体の運動における、物理的刺激又は被験薬剤などの被験薬剤の効果を評価することができる。特に、システム及び／又は方法を用いて、被験薬剤が生体に対して悪影響又は毒性作用を及ぼすか否かを決定することができる。例えば、非処理の対照培養物と対比して、心筋細胞培養の運動に対する被験薬剤の効果を求め、被験薬剤が心拍数に対して悪影響を及ぼすか否かを確認することができる。
【００２４】
本発明の第４の態様では、上述の方法を実行するようにデータ処理装置を構成するように動作し得る機械命令を含んでなるコンピュータプログラムを提供する。
【００２５】
当業者には、生体の運動を決定する本発明の方法を、運動が認められる多くの多様な用途に適用しうることが明らかであろう。運動としては、特に限定されないが、心筋細胞の収縮が挙げられ、秒単位又は何分の１秒かの時間スケールで起こる迅速な運動であってもよい。或いは、運動は、分単位、時間単位又は日単位の比較的緩慢な運動であってもよい。かかる運動の例としては、特に限定されないが、細胞の遊走、運動、ケモタキシス又は創傷治癒の際の細胞の移動、又はゼブラフィッシュ若しくはエレガンス線虫など、小型の生物の動きが挙げられる。いずれの場合も、運動は、研究すべき運動の速度に適合させた撮像頻度で、時系列の画像を取得することによって運動を測定し、本明細書で説明される画像差分の工程を用いて運動を定量化する。
【００２６】
以下の図面を参照して、本発明の方法を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の主要な特徴についての概略図である。
【図２】ピクセルごとの画像差分の原理を示す図である。
【図３】等価画像による画像差分、及び不等価画像による画像差分の原理を示す図である。
【図４】拍動する心筋細胞のビデオフレーム画像による画像差分を示す図である。
【図５】時系列画像における運動を決定するための、画像差分手順についての概略図である。
【図６】ビデオフレーム画像の系列を、基準のビデオフレーム画像から減算することによってもたらされる、拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列から得られる差分画像を示す図である。
【図７】拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列からの差分画像におけるピクセル強度値の定量化を示す図である。
【図８】拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列から派生させた差分画像についての平均ピクセル値を示す図である。
【図９】拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列から派生させた差分画像の拡張系列についての平均ピクセル値を示す図である。
【図１０】拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列から派生させた差分画像の拡張系列から導き出される平均ピクセル値についての相関解析を示す図である。
【図１１】拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列から派生させた差分画像の拡張系列についての平均ピクセル値を示す図である。
【図１２】拍動する心筋細胞のビデオフレームの時系列から派生させた差分画像の拡張系列に由来するデータについてのフーリエ周波数解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の主要な態様を、細胞培養で例示される生体の運動を自動的に決定するシステム［１００］を図解する図１に示す。１以上の容器［１０３］で培養される細胞［１０２］を、撮像装置［１０４］により撮像し、第１のフレーム［１０５］で始まり、最後のフレーム［１０６］で終わる時系列の画像を生成させるが、画像の数及び画像間の時間間隔は解析すべき運動に適合するように選択される。一般に、撮像の頻度が、解析すべき細胞の運動の頻度又は速度よりも大きくなるように、フレーム間の時間間隔を選択する。画像差分［１０７］を用いて、時系列の画像［１０５〜１０６］を処理し、第１の画像［１０８］で始まり、最後の画像［１０９］で終わる系列の差分画像を生成させるが、この場合、各差分画像は、時系列における逐次画像を、時系列から選択した基準画像（系列における第１の画像［１０５］の場合もあり、或いは、系列における最後の画像［１０６］の場合もある）から減算する得られる。この手順は、差分画像の派生系列［１０８〜１０９］を生成させるが、この場合、画像の最大数は、時系列における画像［１０５〜１０６］の数より１枚少ない。時系列の差分画像から１以上の測定値を導き出［１１０］し、これらの測定値を解析［１１１］にかけ、運動データ［１１２］を定量化する。
【００２９】
画像差分は、２つの画像間の差異を決定するための、実行の容易な数学的手段である。画像差分を実施するには、２つの画像における等価ピクセルのピクセル強度値を減算し、得られる絶対（ＡＢＳ）値（すなわち、正又は負の符合を伴わない強度値）を記録する。ピクセル強度値が、０（黒色）〜２５５（白色）の範囲の８ビットのグレースケール（２５６のグレーレベル）の場合、差分画像で得られるピクセル強度値は、０（画像間のピクセルに差異がない）乃至２５５（一方の画像のピクセルが白色であり、第２の画像のピクセルが黒色である）である。
【００３０】
差分画像を形成するには、各等価ピクセルの対（すなわち、各画像の同じ（ｘ，ｙ）座標に位置するピクセル）のピクセル強度値（Ｐ）であるＰ１ｘｙとＰ２ｘｙとを減算し、得られるピクセル対の強度差値を等価位置（すなわち、同じ（ｘ，ｙ）座標））にあるピクセルに適用（ΔＰｘｙ）して第３の画像を生成することによって、得られる値を用いて第３の派生差分画像を創出する。
【００３１】
【数１】
0005860868.tif 000002
或いは、例えば以下に示すように、他の異なる測定値を、等価ピクセル対に適用することもできる。
【００３２】
【数２】
0005860868.tif 000003
ピクセルごとの画像差分を、図２に概略的に図解する。範囲１〜３内の（ｘ，ｙ）座標を伴う３×３のピクセルアレイを含むデジタル画像［２０１］は、３つの中間グレーピクセルの列［２０３］を有する。ピクセル（１，２）が白色ピクセルで置換され、ピクセル（２，２）が中間グレーピクセル［２０４］で置換されていることを除き、第２のデジタル画像［２０２］は、画像［２０１］と同一である。時系列の画像における画像［２０１］と画像［２０２］との間の１つのピクセルの差異は、２枚の画像の取り込み時点間における、撮像された生体の動きを表しうる。画像［２０２］を、画像［２０１］から減算することによって、画像［２０１］と画像［２０２］との間の差異についての情報を含有する第３の差分画像［２０５］が得られる。差し引きされた画像間で変化しないピクセル、すなわち、画像［２０１］及び画像［２０２］のいずれでも白色又は中間グレーであるピクセルは、等しいピクセル値どうしを減算すると、差分画像のピクセル値０が得られるので、差分画像［２０５］では黒色ピクセルをもたらす。画像［２０１］と画像［２０２］との間で異なるピクセルは、ピクセル値の差の絶対値に等しい値を有する差分画像［２０５］におけるピクセル値をもたらす。結果として、差分画像におけるピクセル（１，２）［２０６］及びピクセル（２，２）［２０７］のいずれも、画像［２０１］と画像［２０２］との間で異なる２つのピクセルを表す中間グレーの値を有する。したがって、差分画像［２０５］におけるピクセル値の解析を用いて、２つの画像［２０１］と画像［２０２］との間の差異についての定量的な測定値をもたらすことができる。
【００３３】
モデル画像全体についての画像差分の工程を、図３に概略的に図解するが、この場合、２つの同一の画像［Ａ］と画像［Ａ］とを減算すると、差分画像［Ａ−Ａ］がもたらされ、この場合、すべてのピクセル値はゼロとなり、完全な黒色画像が得られる。同一でない画像［Ａ］と画像［Ｂ］とを減算すると、黒色ピクセルと中間グレーピクセルとが混合した差分画像［Ａ−Ｂ］が結果としてもたらされる。差分画像［Ａ−Ｂ］において、黒色ピクセルは、画像［Ａ］と画像［Ｂ］とが同一である領域、すなわち、等価ピクセルがいずれも白色（２５５−２５５＝０）であるか、又はいずれも中間グレー（１２８−１２８＝０）である領域を示す。差分画像［Ａ−Ｂ］における中間グレーの領域は、画像［Ａ］と画像［Ｂ］とが異なる領域、すなわち、ＡＢＳ（１２８−２５５）＝１２７又はＡＢＳ（２５５−１２８）＝１２７であるので、１つの画像ではピクセルが白色であり、他の画像ではピクセルが中間グレーである領域を指す。結果として、画像［Ａ］及び画像［Ｂ］を時系列の画像から抜き出す場合、差分画像［Ａ−Ｂ］を用いて、例えば、画像［Ａ］における円が、画像［Ｂ］における楕円へと変形する、運動及び／又は変換を解析することができる。
【００３４】
画像の任意の時系列で、撮像される生体又は標本が、撮像中にカメラ又は他の画像捕捉デバイスに対して動かないと仮定し、照明の強度が一定に維持されるとさらに仮定すれば、逐次に記録される画像間における任意の差異は、生体領域内の運動に起因し、本発明の方法による画像差分を用いて生体内の運動を解析するのに、時系列の画像を用いることができる。
【００３５】
ヒト胚性幹細胞を分化させることによって誘導した、自発的に拍動する心筋細胞のビデオ顕微鏡法によるシークエンスからの２つのフレームを用いる図４に、この工程を図解する。時系列からの２つの画像［Ａ］と画像［Ｂ］とを減算すると、差分画像［Ａ−Ｂ］が得られ、この場合、大半のピクセルが低値（黒色及び暗いグレー）であることから、これらの点では、２つの画像間の差異が最小であることが示される。他の領域では、ピクセルが高値であることから、［Ａ］と［Ｂ］との間の差異が示される。ビデオ画像を取得する間、心筋細胞培養もビデオカメラも動かさなかったので、差分画像［Ａ−Ｂ］で＞０のピクセル値を結果としてもたらす、フレーム［Ａ］とフレーム［Ｂ］との差異は、画像領域内の運動に起因する、すなわち、心筋細胞の拍動に起因する運動である。
【００３６】
画像差分の工程は、時系列における多数の画像の解析、例えば、ビデオ画像のシークエンス全体における複数のフレームの解析を可能とするように拡張することができる。時系列の画像における複数のフレームを解析する場合（図５）、個別のフレーム［ｆ１］〜［ｆｎ］を、基準フレーム［ｆＲ］から差し引いて、対応する差分画像［ｆＲ−１］〜［ｆＲ−ｎ］をもたらす。基準フレーム［ｆＲ］は、系列［ｆ１］〜［ｆｎ］の外部にある時系列中の任意の時点から選択することができる、すなわち、系列の差分画像［ｆＲ−１］〜［ｆＲ−ｎ］から抽出される得られるデータが連続であることを確保するため、［ｆＲ］を、［ｆ１］に先行するフレームであるように選択することもでき、［ｆｎ］に後続するように選択することもできる。差分画像をもたらす工程は、半自動化された工程又は完全に自動化された工程で、標準的な画像処理ソフトウェアを用いて容易に実行することができる。
【００３７】
次いで、系列の差分画像を用いて、１以上の測定値を導き出し、これを用いて、画像の差異を定量化してグラフ表示し、撮像時系列内の運動をさらに解析することができる。適切な測定値としては、特に限定されないが、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度が挙げられる。得られるデータを時系列として、例えば、平均ピクセル強度を画像取り込み時間に対してプロットすると、ある時間にわたる細胞培養内の運動についてのグラフ表示が得られる。自発的に拍動する心筋細胞培養により示されるような一定の収縮運動及び弛緩運動を示す培養物の場合、定義域を時間とする運動のグラフ表示は、反復波の形態をとるであろう。
【００３８】
検出される運動の頻度、例えば、心筋細胞培養の拍動数を確立するには、標準的なフーリエ解析手順（Fast Fourier Transforms, Walker, J.S. CRC Press. 1996）を用いて、データを、定義域を時間とするものから、定義域を周波数とするものへと変換することができる。或いは、時系列データに対して相関解析を実施して、反復の頻度を確立することもできる。
【実施例】
【００３９】
実施例１
心筋細胞は、米国特許第７４５２７１８号に記載されている通り、Ｈ７ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系列を分化させることによって得た。未分化のＨ７  ｈＥＳＣ細胞を、２４ウェルのＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたプレートに播種した。未分化細胞として１週間にわたり増殖させた後で、培地を、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４を伴うＲＰＭＩ＋Ｂ２７補充培地に交換した。４日後、培地の交換により、増殖因子を除去し、次いで、単独のＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地中でさらに１４日間にわたり細胞を培養したところ、Ｎｋｘ２．５、α−アクチニン、及び心筋細胞の他のマーカーを発現する細胞が結果として得られ、これらは、自発的な拍動を示した。
【００４０】
１０フレーム／秒で取り込んだ、ｈＥＳＣに由来する、自発的に拍動する心筋細胞のビデオ画像ファイルを、Ａｄｏｂｅ  ＩｍａｇｅＲｅａｄｙへとインポートし、１１４枚のビデオ画像フレームの代表的な系列を、．ｗｍｖによるビデオ画像ファイルから抽出し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐへとエクスポートした。得られるファイルは、各々が、時系列で昇順に並べられた、元のビデオ画像からの単一のフレームを含む、１１４の画像層を含有した。画像対の差引は、フレーム１１４を基準フレームと指定し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐの画像層ブレンドモードを、この画像層についての「差」に設定した。１〜１１３の各画像フレーム層を逐次に選択することによって、系列の差分画像が得られた。
【００４１】
画像１０を基準フレームから減算する差分画像［ｆＲ−１０］から、画像１８を基準フレームから減算する差分画像［ｆＲ−１８］までの差分画像の例を、図６に示す。差分画像［ｆＲ−１０］〜［ｆＲ−１８］を目視により検討したところ、画像のピクセル強度は、黒色が優勢な［ｆＲ−１０］から、ピクセル強度が増大し、次いで減少する、［ｆＲ−１１］〜［ｆＲ−１７］の画像を経て継時的に変化し、系列における最後の画像である［ｆＲ−１８］は、低値のピクセル強度値が優勢となった。差分画像におけるピクセル強度のこれらの変化は、画像フレームと基準フレームとの間における画像の差異の周期的な変化を示す。
【００４２】
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐのヒストグラム表示関数を用いてピクセル強度値を検討した（図７）ところ、目視検討により観察されるピクセル強度の変化が、差分画像［ｆＲ−１０］の平均ピクセル強度値を６．４２とし、差分画像［ｆＲ−１２］の平均ピクセル強度値を２５．１２とする、ピクセル強度の定量的変化と相関することが示された。系列の差分画像について平均ピクセル強度値をプロットした（図８）ところ、各々のフレーム間における画像の差異について観察される周期的パターンが確認されたことから、この方法により、ビデオによる時系列画像における運動が検出されていることが示された。
【００４３】
ビデオ画像における心筋細胞の拍動頻度を測定するため、１１３枚の差分画像についての平均ピクセル強度を、それらの対応するフレーム番号に対してプロットした（図９）。結果は、８フレームごとに１回の拍動サイクルの頻度で、ビデオ画像のシークエンスの持続時間にわたり振幅の変化がわずかである、連続的な自発的拍動を示す。１１３のフレームにわたる平均ピクセル強度値の系列（図８）と、１フレームの増分でシフトさせた同じデータ系列との絶対差の合計を計算することによる相関解析（図１０）を用いて、心筋細胞の拍動頻度を数学的に裏付けた。データにおいて、８フレームのシフトにより差異の最小値が得られたこと（図１０）は、画像差分により検出された、８フレームの運動周期と符合する。これは、ｘ及びｙによるデータ間における８回の位置シフトを用いる、時系列データについてのスタガード格子による散布図に対して、線形回帰解析（ｒ2＝０．９９及び傾き＝０．９９の相関をもたらす）を用いて裏付けた。ビデオによる撮像に用いた１０フレーム／秒の場合、これは、自発的に拍動するヒト心筋細胞の典型的な値である、１秒間当たりの拍動１．２５回、又は１分間当たりの拍動７５回の拍動数に相当する。
【００４４】
実施例２
１０フレーム／秒で取り込んだ、ヒト胚性幹細胞に由来する、自発的に拍動する心筋細胞の第２のビデオ画像ファイルからの画像フレームを、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）へとインポートし、３３２枚の時系列画像を解析した。撮像フィールド内で、４つの矩形の部分領域を規定し、３３１枚の時系列画像の各々における各部分領域を、画像差分の基準としてのフレーム３３２における等価部分領域を用いて個別に処理した。異なる領域における心筋細胞の拍動頻度を測定するため、４つの領域の各々について、３３１枚の差分画像の平均ピクセル強度を、それらの対応するフレーム番号に対してプロットした（図１１）。これらの領域のうちの１つに由来するデータに対して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌによりフーリエ解析を実施した（図１２）ところ、心筋細胞の拍動について、１分間当たりの拍動１２４回に相当する主周波数２．０７Ｈｚが示された。
【００４５】
本発明を、多様な実施形態との関連で説明してきたが、当業者は、多くの異なる実施形態及び変更が可能であることを認めるであろう。かかる変更及び実施形態のすべては、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲内に収まることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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