(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化されたウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１（ＫＣＴＣ  １２１５３ＢＰ）抗原を含むヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチン。
【請求項２】
前記ワクチンは、注射によってヒラメに投与されることを特徴とする、請求項１に記載のヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチン。
【請求項３】
請求項１または請求項２によるワクチンを魚類に投与することを含む、ヒラメのウイルス性出血性敗血症の予防方法。
【請求項４】
前記ワクチンを魚類の腹腔に注射することを特徴とする、請求項３に記載のヒラメのウイルス性出血性敗血症の予防方法。
【請求項５】
ウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を１８℃〜２２℃の温度で培養させる段階を含む、
不活性化されたウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１（ＫＣＴＣ  １２１５３ＢＰ）抗原を含むヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチンの製造方法。
【請求項６】
ウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を熱不活性化させる段階を含む、
不活性化されたウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１（ＫＣＴＣ  １２１５３ＢＰ）抗原を含むヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性出血性敗血症（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ、ＶＨＳ）は、エグトベッド（Ｅｇｔｖｅｄ）病と呼ばれ、全世界的に淡水及び海水魚類に発生して大量斃死を誘発する疾病である。韓国の場合、ウイルス性出血性敗血症は、２００１年にヒラメで最初に報告されて以来、慶北及び済州地域で継続して確認されており、水温が低くなる晩秋から春期にかけて小さい稚魚のみならず、大きな魚体にも斃死を引き起こし、養殖業界に大きな損失を与えている。ウイルス性出血性敗血症は、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の感染によって発生し、感染したヒラメなどの魚類は、体色が黒くなり、腹部膨満と脱腸などの症状を示し、早ければ１週間、遅ければ一ヶ月後に斃死する傾向を示しており、養殖漁場の管理に細心の注意が要求されている。
【０００３】
ウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳ）の原因ウイルスは、一本鎖のＲＮＡウイルスであって、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）とノビラブドウイルス（Ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）属の外膜を有するウイルスである。前記ウイルスは、５０ｎｍ〜７０ｎｍ×１８０ｎｍ〜２４０ｎｍのサイズを有し、ウイルス粒子の模型は、典型的なラブドウイルスの形態である弾丸型であって、一側は丸く、他側は平らである。学界では、淡水で分離されたＶＨＳＶの糖蛋白質遺伝子塩基配列に基づいて前記ウイルスを遺伝子型に区分し、これら遺伝子型としては、地理的分離由来によってアメリカタイプ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ；Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  Ｉ）、ブリテン諸島タイプ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｉｓｌｅｓ  ｔｙｐｅ；Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩＩ）、ヨーロッパタイプ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｔｙｐｅ；Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩＩＩ）の３つの遺伝的区分が一般化されている。中和抗体試験に基づいて前記ウイルスを３個の血清型に分けているが、これら血清型間には交差反応が起こる。韓国で分離された遺伝子型は、遺伝子型（Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ）Ｉに属する北米地域と日本で分離されるウイルスと類似することが明らかになっている。また、ヒラメから分離されたＶＨＳＶは、淡水魚から分離されたそのウイルスと遺伝学的には区分されるが、血清学的には区分されない。
【０００４】
ウイルス性出血性敗血症は、水産動物疾病管理法第２条の水産動物伝染病であって、１５℃以下の低水温期にヒラメの斃死を引き起こすウイルス性疾病として斃死率が高く、且つ伝染性が強いので、種苗から前記ウイルスが検出される場合は、種苗の放流を禁止し、種苗の他の地域への移動を制限して管理している疾病である。
【０００５】
ウイルス性出血性敗血症は、一旦発病すると速い速度で伝染するので、疾病の予防が非常に重要であるが、飼育環境及び飼育管理の改善のみでは疾病の発生を抑制するのに限界がある。したがって、より根本的な予防対策として、ワクチンの開発が至急な実情にある。
【０００６】
現在まで、細菌による疾病を予防するためのワクチンは多く開発されているが、Ｐｈａｒｍａｑ社の伝染性膵臓潰瘍症ウイルス（ＩＰＮＶ）に対するワクチン、Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ  ａｎｉｍａｌ  ｈｅａｌｔｈ社の伝染性造血器壊死症の予防のためのＤＮＡワクチンであるＡｐｅｘ−ＩＨＮ、日本のイリドウイルスの不活化ワクチンなどを除いては、魚類ウイルスによる疾病を予防するために商用化されたワクチンはほとんどなく、韓国で品目が許可されたウイルスワクチンは、日本から輸入したイリドウイルスの不活化ワクチン１種である。また、ウイルス性出血性敗血症のワクチンを開発するために、出血性敗血症ウイルスの構造と抗原タンパク質に対する研究、これら基礎研究に基づいた不活化ワクチン、タンパク質組み換えワクチン、弱毒化ワクチン、ＤＮＡワクチンなどに対する研究が行われているが、未だに安定性及び効能が確保されたワクチンは開発されていない。これは、魚類ウイルスワクチンの製造のための適切な候補ウイルスの探索、ワクチンの効果的な製造及び安定性の確保などが非常に難しいことを示している。
【０００７】
そこで、本発明者等は、韓国で発生したウイルス性出血性敗血症を分析した上で、ワクチン候補株を選抜し、前記候補株を用いてヒラメのウイルス性出血性敗血症を予防するための最適のワクチンを開発することによって、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチンを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ワクチンを用いたヒラメのウイルス性出血性敗血症の予防方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、不活性化されたウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１抗原（ＫＣＴＣ  １２１５３ＢＰ）を含むヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチンを提供する。
【００１１】
本発明は、前記ワクチンをヒラメに投与することを含む、ヒラメのウイルス性出血性敗血症の予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るワクチンは、ヒラメで発生するウイルス性出血性敗血症を効果的に予防できるので、ヒラメの養殖産業などに有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質塩基配列を、従来から知られているＶＨＳウイルスであるＮＣＢＩ  ＡＹ１６７５８７（ＮＢＣＩ）、ＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１（２００５年韓国済州で分離）、ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２（２０１０年韓国浦項で分離）及びＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１（２０１１年韓国済州で分離）の糖蛋白質塩基配列と比較した図である。
【図２】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質塩基配列を、従来から知られているＶＨＳウイルスであるＮＣＢＩ  ＡＹ１６７５８７（ＮＢＣＩ）、ＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１（２００５年韓国済州で分離）、ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２（２０１０年韓国浦項で分離）及びＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１（２０１１年韓国済州で分離）の糖蛋白質塩基配列と比較した図である。
【図３】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質塩基配列を、従来から知られているＶＨＳウイルスであるＮＣＢＩ  ＡＹ１６７５８７（ＮＢＣＩ）、ＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１（２００５年韓国済州で分離）、ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２（２０１０年韓国浦項で分離）及びＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１（２０１１年韓国済州で分離）の糖蛋白質塩基配列と比較した図である。
【図４】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質塩基配列を、従来から知られているＶＨＳウイルスであるＮＣＢＩ  ＡＹ１６７５８７（ＮＢＣＩ）、ＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１（２００５年韓国済州で分離）、ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２（２０１０年韓国浦項で分離）及びＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１（２０１１年韓国済州で分離）の糖蛋白質塩基配列と比較した図である。
【図５】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を多様な濃度で多様なサイズのヒラメに接種した後の累積斃死率（％）を示したグラフである。
【図６ａ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をヒラメに接種した後、腎臓組織内の免疫遺伝子の発現率を確認した結果であって、ａは、条件ツリー（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｔｒｅｅ）を示し、ｂは、散点図（ｓｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔ）を示し、ｃは、スキャンイメージを示す。
【図６ｂ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をヒラメに接種した後、腎臓組織内の免疫遺伝子の発現率を確認した結果であって、ａは、条件ツリー（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｔｒｅｅ）を示し、ｂは、散点図（ｓｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔ）を示し、ｃは、スキャンイメージを示す。
【図６ｃ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をヒラメに接種した後、腎臓組織内の免疫遺伝子の発現率を確認した結果であって、ａは、条件ツリー（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｔｒｅｅ）を示し、ｂは、散点図（ｓｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔ）を示し、ｃは、スキャンイメージを示す。
【図７ａ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の構造タンパク質を、多クローン性抗体を用いて（ａ）ＳＤＳ―ＰＡＧＥ及び（ｂ）ウェスタンブロットで分析した写真であって、レーンＭはマーカーを示し、レーン１は、ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をローディングしたものである。
【図７ｂ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の構造タンパク質を、多クローン性抗体を用いて（ａ）ＳＤＳ―ＰＡＧＥ及び（ｂ）ウェスタンブロットで分析した写真であって、レーンＭはマーカーを示し、レーン１は、ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をローディングしたものである。
【図８ａ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をＥＰＣ細胞株に接種した後、多様な温度で培養した細胞の写真であって、ａは、正常細胞を示し、ｂ〜ｄは、ウイルスの接種後、それぞれ１５℃、２０℃、及び２５℃で３日間培養した細胞を示す。
【図８ｂ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をＥＰＣ細胞株に接種した後、多様な温度で培養した細胞の写真であって、ａは、正常細胞を示し、ｂ〜ｄは、ウイルスの接種後、それぞれ１５℃、２０℃、及び２５℃で３日間培養した細胞を示す。
【図８ｃ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をＥＰＣ細胞株に接種した後、多様な温度で培養した細胞の写真であって、ａは、正常細胞を示し、ｂ〜ｄは、ウイルスの接種後、それぞれ１５℃、２０℃、及び２５℃で３日間培養した細胞を示す。
【図８ｄ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をＥＰＣ細胞株に接種した後、多様な温度で培養した細胞の写真であって、ａは、正常細胞を示し、ｂ〜ｄは、ウイルスの接種後、それぞれ１５℃、２０℃、及び２５℃で３日間培養した細胞を示す。
【図９ａ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をＥＰＣ細胞株に接種した後、培養フラスコ（１２５ｃｍ２；ａ）及びローラー培養瓶（８５０ｃｍ２；ｂ）でそれぞれ培養した結果を示した図である。
【図９ｂ】実施例１で分離されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をＥＰＣ細胞株に接種した後、培養フラスコ（１２５ｃｍ２；ａ）及びローラー培養瓶（８５０ｃｍ２；ｂ）でそれぞれ培養した結果を示した図である。
【図１０ａ】ホルマリン（ａ）及び熱（ｂ）で不活性化されたＶＨＳワクチンを接種したＥＰＣ細胞株を２日間培養した後の写真である。
【図１０ｂ】ホルマリン（ａ）及び熱（ｂ）で不活性化されたＶＨＳワクチンを接種したＥＰＣ細胞株を２日間培養した後の写真である。
【図１１】ワクチン処理方法及びワクチン処理時におけるヒラメの飼育水温による免疫関連遺伝子の発現率変化を示した写真であって、ａは、高温実験群を示し、ｂは、低温実験群を示し、ｃは、対照群を示しており、ａ及びｂにおいて、レーン１及び２はワクチン浸漬群で、レーン３及び４はワクチン注射群で、ｃにおいて、レーン１及び２は陰性対照群で、レーン３及び４はＰＢＳ投与群である。
【図１２】ワクチン処理方法及びワクチン処理時におけるヒラメの飼育水温による攻撃実験後のヒラメの生存率を示したグラフである。
【図１３ａ】本発明のワクチン処理後に攻撃実験を実施する場合の平均累積斃死率（ａ）、リゾチーム活性（ｂ）、及びＶＨＳＶに対するＥＬＩＳＡ結果を示したグラフである。
【図１３ｂ】本発明のワクチン処理後に攻撃実験を実施する場合の平均累積斃死率（ａ）、リゾチーム活性（ｂ）、及びＶＨＳＶに対するＥＬＩＳＡ結果を示したグラフである。
【図１３ｃ】本発明のワクチン処理後に攻撃実験を実施する場合の平均累積斃死率（ａ）、リゾチーム活性（ｂ）、及びＶＨＳＶに対するＥＬＩＳＡ結果を示したグラフである。
【図１４】本発明のワクチン投与後にヒラメの各臓器組織をＨ＆Ｅ染色で観察した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、不活性化されたウイルス性出血性敗血症ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１（ＫＣＴＣ１２１５３ＢＰ）抗原を含むヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用不活性化ワクチンを提供する。
【００１５】
本発明のワクチンに使用されるウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳ）ウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１は、韓国巨済の養殖場でヒラメの大量斃死を引き起こした原因ウイルスとして分離された菌株であって、従来知られているＶＨＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋに登録されたＡＹ  １６７５８７；２００５年韓国済州で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１；２０１０年浦項で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２；及び２０１１年韓国済州で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１）とは異なる菌株であることが確認された（図１〜図４参照）。
【００１６】
前記ワクチンに使用される菌株であるＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１は、ヒラメに２×１０７ＴＣＩＤ５０／匹、２×１０６ＴＣＩＤ５０／匹及び２×１０５ＴＣＩＤ５０／匹の濃度で注射した場合、注射してから６日目には５０％以上の斃死率を示し、注射してから２週目には９０―１００％の斃死率を示し、このような斃死率は、ヒラメのサイズが小さいほど、そして、ウイルスの濃度が高いほど増加する。また、前記ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１は、ヒラメへの感染時、感染していないヒラメに比べて免疫遺伝子を３倍〜１３倍以上増加させる。これは、前記ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１が非常に高い病原性を有するウイルスであることを示す。
【００１７】
本発明に係るワクチンは、当業界で通常的に知られている製造方法によって製造することができる。前記方法は、ワクチン菌株の培養、ウイルス菌株の分離、ウイルスの不活性化、濃縮及び希釈などの過程を含む。
【００１８】
本発明の一つの具体例において、前記ＶＨＳＶワクチンは、最適の条件の一つとして、ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を１８℃〜２２℃、好ましくは、２０℃の温度で培養することによって収得することができる。前記温度条件は、ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の最大増殖を誘導し、本発明のワクチン内に抗原を増大させるのに有利である。前記ウイルスの培養のための細胞株としては、ＥＰＣ細胞株が使用されてもよいが、これに制限されることなく、当業界で知られている通常の細胞株、例えば、ＢＦ―２、ＲＴＧ―２、ＦＨＭ、ＣＨＳＥ―２１４などが使用されてもよい。
【００１９】
他の具体例において、本発明のワクチンは、最適の条件の一つとして、前記の培養されたＶＨＳウイルスを熱を用いて不活性化させることによって、好ましくは、５０℃〜７０℃の温度下で２日〜５日間置くことによって収得することができる。本発明のワクチンは、ホルマリンを用いてＶＨＳウイルスを不活性化させて製造してもよいが、ホルマリン不活性化は、使用されたホルマリンを除去する追加の工程が必要であり、前記の不活性化されたウイルスが細胞の再培養時に毒性を示すので、熱を用いて不活性化させることが好ましい（図１０参照）。
【００２０】
一方、本発明のワクチンは、ヒラメのサイズが１３ｃｍ〜１７ｃｍである場合、注射によって接種することが好ましい。ワクチン接種方法として浸漬法が知られているが、浸漬法の場合、免疫関連遺伝子の発現増加及び斃死率の面で注射法に比べて低い効率を示す。また、本発明のワクチンは、処理時に低温（例えば、１０℃〜１４℃）に比べて高温（例えば、１８℃〜２２℃）で接種することが有利である。低温で処理する場合、免疫関連遺伝子の発現増加及び斃死率の面で高温で処理する場合に比べて低い効率を示す。本発明のワクチンは、高温／注射法によって接種されることが最も好ましい。
【００２１】
本発明に係る不活性化ワクチンは、免疫増強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含んでもよい。前記免疫増強剤としては、当該技術分野で知られているものであればいずれも制限なく使用することができる。また、安定化剤または添加剤としては、糖類やアミノ酸類、鉱物油、植物油、白飯、リン酸アルミニウム、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）誘導体、サイモシン、インターロイキンなどを使用することができる。
【００２２】
本発明に係るワクチンは、適当な容積、例えば、約１０ｍｌ〜５００ｍｌ体積のバイアルにワクチン液を分注した後、密封して使用することができる。
【００２３】
さらに、本発明は、前記ワクチンをヒラメに投与することを含む、ヒラメのウイルス性出血性敗血症の予防方法を提供する。前記ヒラメは、感染の危険性を有するヒラメなどの魚類を含む。
【００２４】
本発明の不活性化ワクチンを用いてヒラメのウイルス性出血性敗血症を予防する方法は、本発明のワクチンを腹腔内投与などを用いてヒラメに投与するステップを含む。
【００２５】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【００２６】
実施例１：ＶＨＳＶワクチン候補株の選抜
【００２７】
２０１０年、韓国の巨済地域のヒラメ養殖場を対象にしてＰＣＲ方法及び細胞培養によってウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）を検査した。検査の結果、２個の養殖場で合計５匹のヒラメから５種のＶＨＳＶが見出された。前記５種のＶＨＳＶに対して、病原性予備実験を通じて最も病原性の高い菌株をＶＨＳＶワクチンのための候補株として選抜し、これをＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１と命名した。前記菌株を２０１２年２月２９日に韓国生命工学研究院の生物資源センターにＫＣＴＣ１２１５３ＢＰとして寄託した。
【００２８】
実施例２：ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質塩基配列の分析
【００２９】
前記実施例１で選抜したＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質塩基配列を分析し、これを従来知られているＶＨＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋに登録されたＡＹ１６７５８７；２００５年韓国済州で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１；２０１０年韓国浦項で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２；及び２０１１年韓国済州で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１）と比較した。
【００３０】
具体的に、前記ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１に感染したヒラメの腎臓及び脾臓の組織をホモジナイザーで粉砕した後、トリゾル（ｔｒｉｚｏｌ）を用いて総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を分離した。前記の分離された総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、前記ｃＤＮＡを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、下記の配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いてＲＴ―ＰＣＲを行った。 
【００３１】
―  ＶＨＳＧ―ｅｘｐ―Ｆ：５'―ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧ―３'（配列番号１）；
【００３２】
―  ＶＨＳＧ―ｅｘｐ―Ｒ：５'―ＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡ―３'（配列番号２）
【００３３】
ＲＴ―ＰＣＲは、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ及び１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２００μＭ  ｄＮＴＰ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）、０．２μＭのプライマー及び２Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）及び５０ｎｇの鋳型ｃＤＮＡを混合して９４℃で５分間反応させ、９４℃で１分、５５℃で１分及び７２℃で１分間３０回反応させた後、７２℃で７分間反応させて行った。前記の増幅されたＰＣＲ生成物を１Ｘ  ＴＡＥ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ａｃｅｔａｔｅ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝液上で１．５％のアガロースゲルにローディングした後、１００Ｖで１５分間電気泳動してサイズを確認した。前記ＰＣＲ産物をゲルから分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて精製した。前記の精製されたＤＮＡをｐＧＥＭ―Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐＧＥＭ―Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）に挿入した後、前記プラスミドをＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）コンピテント細胞に熱衝撃によって形質転換させた。前記の形質転換された細胞を２％（ｗ／ｖ）Ｘ―ｇａｌ  ４０μｌ、２０％（ｗ／ｖ）ＩＰＴＧ溶液７μｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌが含まれたＬＢ培地に塗抹して３７℃で１８時間培養した後、ＰＣＲ産物遺伝子が挿入された白色コロニーを選択した。前記コロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加されたＬＢ培地（Ｙｅａｓｙ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／ｌ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ  １０ｇ／ｌ、ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  １０ｇ／ｌ、Ｄｉｆｃｏ；Ｍｉｌｌｅｒ）で大量培養した後で遠心分離し、プラスミドを得て制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断し、挿入されたＤＮＡの有無とサイズを確認した。正確なサイズを有するＤＮＡの塩基配列を分析した後、２００５年韓国済州で分離されたＶＨＳウイルス及び２０１１年韓国済州で分離されたＶＨＳウイルスの糖蛋白質塩基配列と比較した。前記比較結果を図１〜図４に示した。比較の結果、ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の糖蛋白質は、従来知られているＶＨＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋに登録されたＡＹ  １６７５８７；２００５年韓国済州で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２００５―０１；２０１０年韓国浦項で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０２；及び２０１１年韓国済州で分離されたＦＰ―ＶＨＳ２０１１―０１）と９８％〜９９％の相同性を示す新たな菌株であることが確認された。
【００３４】
実施例３：ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の病原性の分析
【００３５】
前記実施例１で選抜したＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の病原性を検討するために、２０℃に適応させたＥＰＣ細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ；ＣＲＬ―２８７２）を２５ｃｍ２の培養フラスコに継代培養してから１２時間後、ＴＣＩＤ  １０７／ｍｌのウイルス溶液２００μＬを接種（培地５ｍＬ）して培養した。その後、下記のように特性を分析した。
【００３６】
＜３―１＞ウイルス濃度による病原性の実験
【００３７】
前記の培養したウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を遠心分離した後、１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌで希釈し、２×１０７ＴＣＩＤ５０／匹、２×１０６ＴＣＩＤ５０／匹の濃度になるようにそれぞれ１０匹のヒラメに腹腔注射法で人為感染させた後、１０℃〜１２℃で２週間累積斃死率を調査した。前記実験の結果、全実験群において注射したから６日目にヒラメの５０％以上が斃死し、注射してから２週目にはヒラメの９０％〜１００％が斃死した。
【００３８】
＜３―２＞ウイルス濃度及びヒラメのサイズによる病原性の実験
【００３９】
２０ｇ、４５ｇ、１００ｇ及び２００ｇの特別な異常症状を示さない健康なヒラメをそれぞれ１０匹ずつ準備した後、前記実施例＜３―１＞と同一の方法でＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―１を腹腔内に人為感染させ、１０℃〜１２℃で１７日間累積斃死率を調査した。２０ｇ実験群には２×１０５ＴＣＩＤ５０／匹及び１×１０４ＴＣＩＤ５０／匹の濃度で注射し、４５ｇ実験群には４×１０５ＴＣＩＤ５０／匹及び２．５×１０４ＴＣＩＤ５０／匹の濃度で注射し、１００ｇ実験群には１×１０６ＴＣＩＤ５０／匹の濃度で注射し、２００ｇ実験群には２×１０６ＴＣＩＤ５０／匹の濃度で注射した。
【００４０】
実験の結果、２０ｇ実験群（２×１０ＴＣＩＤ５０５／匹）は、１週に５０％の斃死率及び２週に８０％の斃死率を示し、４５ｇ実験群（４×１０５ＴＣＩＤ５０／匹）は、１週に２０％の斃死率及び２週に６０％の斃死率を示し、１００ｇ実験群（１×１０６ＴＣＩＤ５０／匹）は、１週に０％の斃死率及び２週に３０％の斃死率を示し、２００ｇ実験群（２×１０６ＴＣＩＤ５０／匹）は、１週に０％の斃死率及び２週に１４％の斃死率を示した（図５参照）。前記結果は、魚体のサイズが小さいほど、ウイルスの病原性が高いことを示す。
【００４１】
一方、ウイルスの濃度を変えて実験した、２０ｇ実験群（１×１０４ＴＣＩＤ５０／匹）は、１週に２０％の斃死率及び２週に５０％の斃死率を示し、４５ｇ実験群（２．５×１０４ＴＣＩＤ５０／匹）は、１週に０％及び２週に２０％の斃死率を示し、ウイルスの濃度が高いほど、病原性が高いことが分かった（図５参照）。
【００４２】
＜３―３＞ＶＨＳウイルス感染によるヒラメの免疫遺伝子発現率変化の確認
【００４３】
実施例１のＶＨＳウイルスの感染によるヒラメの免疫遺伝子発現率変化を検討するために、ＤＮＡチップマイクロアレイ（自社製作）を用いて前記ウイルスに感染したヒラメの腎臓組織での免疫遺伝子の発現様相を時間別に確認した。具体的に、１２℃で１０ｃｍのヒラメの腹腔にＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を接種した後、１日及び３日目に腎臓と脾臓の免疫遺伝子の発現量を対照群（正常所見のヒラメの腎臓と脾臓の免疫遺伝子の発現量）と比較した。
【００４４】
図６の結果から、ウイルスに感染してから１日と３日後にＣＤ８３、ＶＨＳＶ誘導タンパク質６、ＣＤ９、カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｌプリプロタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）、インターフェロン誘導性タンパク質５６、リゾチームＣ前駆体、ＩＦＩ５６などの発現量が対照群に比べて３倍〜１３倍以上増加する発現様相を確認することができた。前記結果は、ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―１が多くの免疫遺伝子の発現を増加させる高病原性ウイルスであることを示す。
【００４５】
実施例４：ウイルスワクチン候補株の構造タンパク質の分析
【００４６】
前記実施例１で選抜されたウイルス菌株ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の構造タンパク質を分析するために、下記のようにＳＤＳ―ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
【００４７】
＜４―１＞ウイルスの分離及び精製
【００４８】
ウイルスを分離及び精製するために、大量培養されたウイルス液の上澄液に７％のポリエチレングリコール（ＰＧＥ―６０００）及び２．３％のＮａＣｌを添加した後、４℃で撹拌しながら一晩中培養した。前記培養物を２０，０００ｇで４０分間遠心分離することによってペレットを得て、これを少量のＴＮＥ緩衝液（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＲＤＴＡ）に再懸濁した後、１５％のスクロースクッション（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｕｓｈｉｏｎ）上に重層し、４℃、１１５、０００ｇで１時間にわたって超高速で遠心分離することによってウイルスペレットを得た。これをＴＮＥ緩衝溶液に再懸濁し、２０％、３５％及び５０％スクロース不連続勾配上で８０，０００ｇで１．５時間遠心分離し、２０％と３５％の境界地点に形成されたウイルスバンドを回収した。これをＴＮＥ緩衝溶液に再懸濁した後、１１５，０００ｇで１時間遠心分離することによってウイルスを精製した。
【００４９】
＜４―２＞ＳＤＳ―ＰＡＧＥ
【００５０】
ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１菌株の抗原タンパク質体の分析のためにＳＤＳ―ＰＡＧＥ分析を行った。分離されたウイルスを１０分間超音波で粉砕した後、２×サンプルバッファー（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ  ２―ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）と１：１で混合し、１００℃で１０分間沸かして準備した。１２％のＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲルに準備された試料１５μｌをローディングし、１００Ｖで１時間２０分間電気泳動した。電気泳動が終了したゲルを染料（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅＲ―２５０）で染色・脱色して観察した。
【００５１】
＜４―３＞ウサギ抗体の製作
【００５２】
２週間安定化したウサギ２匹に０週目に本発明のウイルス液を注射した。４週目、６週目及び８週目に同一のウイルス液で１次〜３次ブースト注射を行った。その後、ウサギ血清１０ｍＬからタンパク質Ａカラムを用いてＩｇＧを精製した。その後、抗原が結合された親和性カラムを用いて抗原特異的抗体を精製した。前記の精製された抗体を透析及び濃縮させた。前記の精製された抗体にＦＩＴＣを結合させるために、抗体２ｍｇを透析した後、これをＦＩＴＣと混合して２時間にわたって撹拌した。結合されていない自由ＦＩＴＣを除去するために透析を行うことによって、ＦＩＴＣが結合された抗体を収得した。
【００５３】
＜４―４＞ウェスタンブロッティング
【００５４】
実施例＜４―２＞でＳＤＳ電気泳動したゲルにニトロセルロースメンブレンペーパー（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｏｌｓｅ  ｍｅｎｂｒａｎｅ  ｐａｐｅｒ、ＮＣ  ｐａｐｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を載せて１００Ｖで１時間にわたって移転させ、前記ＮＣペーパーをツイン（Ｔｗｅｅｎ  ２０）が含まれたＰＢＳ（Ｔ―ＰＢＳ）で５回洗浄した後、１％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）で１時間にわたってブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、Ｔ―ＰＢＳで５回洗浄した。前記実施例＜４―３＞で製作したＶＨＳＶ抗体を１／１０，００に希釈して２時間反応させた後、Ｔ―ＰＢＳで５回洗浄した。２次抗体としては、アルカリホスファターゼと結合された塩素抗―ウサギ兔疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ）を使用し、これを１／５，０００に希釈して１時間反応させた後、Ｔ―ＰＢＳで５回洗浄し、ＢＩＣＰ／ＮＢＴホスファターゼ気質（Ｓｉｇｍａ）を添加して発色させることによって観察した。
【００５５】
前記ＳＤＳ―ＰＡＧＥ結果を図７の（ａ）に示し、ウェスタンブロット結果を図７の（ｂ）に示した。各図面のＭレーンはマーカーを意味し、１レーンは、ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１をローディングした結果である。図７（ａ）に示した本発明のＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１の構造タンパク質を従来報告された文献に記載されているＶＨＳウイルス（キム・スミ、養殖ヒラメ、Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓで発生するｖｉｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＶＨＳＶ）感染症に関する研究、釜慶大学大学院魚病学科、理学博士論文、ｐ．１０１）と比較した結果、互いに同一のタンパク質パターンを示し、他のウイルスＨＩＲＲＶなどとは異なるタンパク質パターンを示した。また、図７（ｂ）の結果から、ＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１ウイルスが抗原―抗体反応で抗原性を有することを確認することができた。
【００５６】
実施例５：ワクチン製造方法による効率の分析
【００５７】
実施例１で選抜されたＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１に対する最適のワクチンを製造するために、下記のようにワクチンの製造方法による効率を分析した。
【００５８】
＜５―１＞培養温度によるＶＨＳウイルスの増殖分析
【００５９】
ＶＨＳウイルスＦＰ―ＶＨＳ２０１０―０１を、海産魚由来ＶＨＳＶの増殖率が最も良いと知られているＥＰＣ細胞株に接種し、多様な温度条件（１５℃、２０℃及び２５℃）下で３日間培養した後、細胞の増殖を分析した。具体的に、ＥＰＣ細胞株を１％の抗生剤（Ｇｉｂｃｏ）及び１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＭＥＭ培地（ｗｅｌｇｅｎｅ）で単層培養した後、前記の培養されたＥＰＣ細胞株にＶＨＳウイルスを接種し、これを室温で３０分間吸着させた。その後、５％のＦＢＳと１％の抗生剤を添加したＭＥＭ培地を添加した後、１５℃、２０℃及び２５℃の温度で培養しながら細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）を倒立顕微鏡を用いて観察した。対照群としては、ＰＢＳを接種した正常細胞を使用した。
【００６０】
前記実験結果を図８に示した。図８のａは対照群を示し、ｂ〜ｄは、ウイルスの接種後、それぞれ１５℃、２０℃及び２５℃で培養した細胞株の写真である。前記図面に示すように、ＥＰＣ細胞株は２５℃で最も成長が速い一方、ウイルスは２０℃で増殖して最も高い細胞変性効果を示した。これは、通常の細胞株の培養温度とウイルスの増殖温度が異なることを示す。
【００６１】
＜５―２＞培養容器のサイズによる増殖分析
【００６２】
培養容器のサイズによる増殖の差を分析するために、ウイルスが含まれた３００ｍＬの培養液を培養フラスコ（１２５ｃｍ２；図９ａ）及びローラー培養瓶（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ、８５０ｃｍ２；図９ｂ）でそれぞれ培養した。
【００６３】
同一の量（３００ｍＬ）を培養するとしても、面積の大きいローラー培養瓶で培養する方が、より高い濃度のウイルス培養液を製造するのに有利であることが確認された。
【００６４】
＜５―３＞ウイルス不活性化方式によるワクチンの安定性検査
【００６５】
ワクチンの製造のための最適の不活性化方式を確認するために、実施例１で選抜したＶＨＳウイルスを通常的にウイルス不活性化に使用される方法であるホルマリン不活性化方法と熱不活性化方法を通じて不活性化した後、細胞を再培養することによって安定性を比較した。具体的に、ホルマリン不活性化方法は、冷凍されたウイルス培養液を解凍させ、遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）することによって細胞成分を除去し、上層液に１：４，０００（０．４％）の比率でホルマリンを処理し、３７℃で３日間反応させて行った。熱不活性化方法は、細胞成分を除去した前記上層液を６０℃で３日間不活性化させて行った。前記の製造されたワクチンは、４℃で保管した状態で使用した。
【００６６】
前記実験結果を図１０に示した。図１０のａは、本発明のウイルスをホルマリンで不活性化した後、ＥＰＣ細胞に接種して２日間培養した細胞の写真であって、図１０のｂは、本発明のウイルスを熱で不活性化した後、ＥＰＣ細胞に接種して２日間培養した細胞の写真である。前記図面に示すように、ホルマリンで不活性化されたウイルスは、ホルマリン毒性による細胞変性を示し、安全性において問題があることが確認された。また、ホルマリンを除去する追加の過程（不活化された反応物を遠心分離（Ｘ５０，０００ｇ、超遠心分離、４℃、１時間）して得たペレットをＦＢＳのないＭＥＭに再浮遊させた後で保存する過程）を追加すると、これによってウイルスの損失及び経済的損失が生じ、さらに、不活化されたウイルスが細胞の再培養時に毒性を示すという問題がある。その一方、熱で不活性化されたウイルスは、細胞変性がなくて安全であり、製造後に直ぐ使用できるので、熱不活性化方法が本発明のワクチン製造において効果的であると判断された。
【００６７】
実施例６：ワクチンの処理方法による効率の分析
【００６８】
前記実施例５で熱不活性化方法によって製造されたワクチンを対象にして、ワクチンの処理方法及び処理温度が免疫能に及ぼす影響を下記のように分析した。ヒラメ（平均体重２４．６ｇ、１３．４ｃｍ）を２０℃で飼育した高温実験群と１２℃で飼育した低温実験群とに分けた後、注射ワクチン（１０６ＴＣＩＤ５０／匹、腹腔注射）と浸漬ワクチン（１０６ＴＣＩＤ５０／匹、３分間浸漬、１回実施）を処理し、１２℃で飼育しながら２週後に各実験群別に２０匹ずつＶＨＳウイルスを接種した。前記接種後、免疫関連遺伝子の発現及び累積斃死率を調査した。
【００６９】
免疫関連遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｍｘ、ＩＦＮ及びＩＳＧ―１５）の発現量を下記のように測定した。ワクチンを投与してから２週後のヒラメを無作為に選定し、ＲＮＡを抽出した。前記の抽出したＲＮＡを対象にして、下記の表１に記載された各免疫関連遺伝子用プライマー及び条件を用いてＲＴ―ＰＣＲを行った。
【００７０】
【表１】
0005860569.tif 000002
【００７１】
ＲＴ―ＰＣＲ結果を図１１に示した。図１１において、ａは高温実験群を示し、ｂは低温実験群を示し、ｃは対照群（ＰＢＳ処理群）を示す。また、ａ及びｂにおいて、レーン１及び２はワクチン浸漬群で、レーン３及び４はワクチン注射群であって、ｃにおいて、レーン１及び２は陰性対照群で、レーン３及び４はＰＢＳ投与群である。
【００７２】
前記結果は、高温及び低温処理されたワクチンを接種した実験群において、対照群に比べて免疫関連遺伝子の発現量が増加したことを示す。特に、高温処理されたワクチンを使用した実験群での免疫関連遺伝子の発現量が、低温処理されたワクチンを使用した実験群での免疫関連遺伝子の発現量に比べてより高いことから、ワクチンを高温処理することが有利であることが確認された。
【００７３】
一方、累積斃死率の結果を図１２に示した。前記図面に示すように、対照群の斃死率は７７％である一方、高温／ワクチン注射群は１７％、高温／ワクチン浸漬群は７１％、低温／ワクチン注射群は４５％、低温／ワクチン浸漬群は５０％の斃死率を示した。前記結果から、低温よりは高温での処理が効果的であって、浸漬よりは注射方法が効果的であることが分かった。高温／ワクチン注射群の場合、相対生存率が７８％と最も高いので、最も効果的であることが確認された。
【００７４】
実施例７：ワクチンの効能評価
【００７５】
ＶＨＳＶワクチンの効能変化を検討するために、前記ワクチンをそれぞれ２０匹のヒラメ（平均体重４１ｇ、１７ｃｍ）に接種した。前記接種６週後に、ＶＨＳウイルスを１０５ＴＣＩＤ５０／匹（０．１ｍｌ／匹）に注射した後、対照群（ＰＢＳ投与）に対する斃死率、リゾチーム活性及びＥＬＩＳＡによるエドワード菌に対する凝集抗体価を調査した。
【００７６】
リゾチーム活性及び凝集抗体価は、下記の方法によって行った。
【００７７】
リゾチーム活性の測定
【００７８】
１．３２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ０．４３５ｇを３次蒸溜水１００ｍｌに溶解させた（以下、溶液Ａ）。
【００７９】
２．３２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４  ０．２７８ｇを３次蒸溜水５０ｍｌに溶解させた（以下、溶液Ｂ）。 
【００８０】
３．溶液Ａ１００ｍｌと溶液Ｂ２５ｍｌを混合した（以下、ＬＹ溶液）。
【００８１】
４．ミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ；Ｓｉｇｍａ  ｎｏ．Ｍ―３３７０）０．００１４ｇをＬＹ溶液１ｍｌに溶かした（以下、菌液）。
【００８２】
５．９６ウェル平底プレートのウェルに実験血清を５０μｌずつ３回繰り返して分注し、これに菌液を５０μｌずつ分注した。
【００８３】
６．ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５５０ｎｍで０分及び１５分に吸光度を測定した。
【００８４】
７．式｛（０分の吸光度値）−（１５分の吸光度値）｝×１００００で計算し、活性を測定した。
【００８５】
凝集抗体価の測定
【００８６】
１．９６ウェル丸底プレートのウェルにマルチピペットを用いて１×ＰＢＳを２５μｌずつ分注した。
【００８７】
２．実験する血清を１番目の列のウェルのみに２５μｌずつ分注した。
【００８８】
３．マルチピペットを用いて１番目の列のウェルから１１番目の列のウェルまで２５μｌずつ段階希釈した。
【００８９】
４．マルチピペットを用いてＦＫＣ菌を１２番目の列から１番目の列まで順次２５μｌずつ分注した。
【００９０】
５．プレート蓋を閉じた後、内容物がよく混ざるように注意深く振った後、冷蔵状態で一晩中保管した。
【００９１】
前記実験結果を図１３に示した。図１３ａに示すように、ＰＢＳ対照群の斃死率は９０％である一方、ウイルス単独ワクチンの斃死率は２０％で、相対生存率は７７％と良い効果を有した。また、図１３ｂ及び図１３ｃに示すように、リゾチーム活性及びＥＬＩＳＡは、対照群に比べて高い活性を示すことを確認することができた。
【００９２】
実施例８：ＶＨＳＶワクチンの安全性の調査
【００９３】
本発明のワクチンの安全性を検討するために、ヒラメにＶＨＳＶワクチンを投与した後、様々な臓器（肝、脾臓、腎臓、心臓、胃、鰓）をＨ＆Ｅ染色し、これを顕微鏡（×２００）を通じてＰＢＳ投与群と比較した。
【００９４】
具体的に、１０％のＢＮＦに固定した各臓器は、４８時間以内に同一の固定液中で細切して再固定させ、２４時間後に６時間〜１２時間にわたって流水で洗い、濃度別にアルコール（７０％〜１００％）で脱水させた後、キシレンで透明化し、パラフィン浸透によってパラフィンブロックを作り、ミクロトームを用いて細切（４μｍ）した後でスライドに付着させた。前記の付着したスライドを５０℃で一晩中乾燥させた後、Ｈ＆Ｅ染色法によって染色させて顕微鏡で観察した。
【００９５】
前記実験結果を図１４に示した。図１４は、ＶＨＳＶワクチン処理後の肝、脾臓、腎臓、心臓、胃及び鰓の顕微鏡写真を示す。前記図面に示すように、ＶＨＳＶワクチンの投与時、全ての臓器で正常所見が観察され、本発明のＶＨＳＶワクチンはヒラメの安全に影響を及ぼさないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明に係るワクチンは、ヒラメで発生するウイルス性出血性敗血症を効果的に予防できるので、ヒラメの養殖産業などに有用に使用することができる。
【図１】
0005860569.tif 000003
【図２】
0005860569.tif 000004
【図３】
0005860569.tif 000005
【図４】
0005860569.tif 000006
【図１３ａ】
0005860569.tif 000007
【図１３ｃ】
0005860569.tif 000008
【図５】
0005860569.tif 000009
【図６ａ】
0005860569.tif 000010
【図６ｂ】
0005860569.tif 000011
【図６ｃ】
0005860569.tif 000012
【図７ａ】
0005860569.tif 000013
【図７ｂ】
0005860569.tif 000014
【図８ａ】
0005860569.tif 000015
【図８ｂ】
0005860569.tif 000016
【図８ｃ】
0005860569.tif 000017
【図８ｄ】
0005860569.tif 000018
【図９ａ】
0005860569.tif 000019
【図９ｂ】
0005860569.tif 000020
【図１０ａ】
0005860569.tif 000021
【図１０ｂ】
0005860569.tif 000022
【図１１】
0005860569.tif 000023
【図１２】
0005860569.tif 000024
【図１３ｂ】
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【図１４】
0005860569.tif 000026
【配列表】
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