(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体または病原性因子に対する感受性に影響を及ぼす候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物の阻害剤を同定する方法であって：
（ａ）培養中の近半数体（ｎｅａｒ−ｈａｐｌｏｉｄ）哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、前記遺伝子トラップベクターは、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる核酸構築物を含み、そして該核酸構築物は、核酸であって、前記核酸を含有する細胞の同定を可能にする前記核酸を含む；
（ｂ）ゲノム内に組み込まれた前記遺伝子トラップベクターを含有する細胞を同定し、ここで、該細胞は病原体または病原性因子に対する感受性を示す； 
（ｃ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって病原体または病原性因子に対する感受性に影響を及ぼす遺伝子を同定する；そして
（ｄ）前記病原体因子または病原性因子に対する感受性に影響を及ぼす遺伝子の発現産物の発現または活性に影響を及ぼす阻害剤を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
核酸が、該核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする、請求項１の方法。
【請求項３】
近半数体哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１の方法。
【請求項４】
近半数体哺乳動物細胞がＫＢＭ７細胞である、請求項１の方法。
【請求項５】
近半数体哺乳動物細胞が遺伝子修飾されている、請求項１の方法。
【請求項６】
核酸構築物が、５’から３’方向に、作動可能であるように関連した：（１）スプライス・アクセプター部位；（２）核酸であって、該核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸；および（３）ポリアデニル化配列を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
スプライス・アクセプター部位がアデノウイルス・スプライス・アクセプター部位である、請求項６の方法。
【請求項８】
前記病原体または病原性因子に対する感受性が、病原体に対する適切な対照細胞の感受性と比較した際の、病原体による感染に対する感受性の改変である、請求項１の方法。
【請求項９】
方法が、レポーターを発現し、そして病原体に対して耐性である細胞を同定する工程を含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記病原体または病原性因子に対する感受性が、関心対象の化合物に対する適切な対照細胞の感受性と比較した際の、該化合物に対する感受性の改変である、請求項１の方法。
【請求項１１】
関心対象の化合物が療法剤である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が遺伝子の部分を回収し、そして配列決定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
近半数体哺乳動物細胞が、前記病原体または病原性因子に対する感受性を有する細胞を同定するのに有用なレポーターをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）が、近半数体哺乳動物細胞株の細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入する工程を含み、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞の少なくともいくつかのゲノム内に組み込まれる；（ｂ）こうして組み込まれた前記遺伝子トラップベクターを含有する複数の細胞を同定し、ここで、該細胞は関心対象の表現型を示す；そして（ｃ）核酸構築物が組み込まれた複数の遺伝子を同定し、それによって細胞表現型に影響を及ぼす複数の遺伝子を同定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
病原体に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する方法であって：（ａ）近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる；（ｂ）近半数体哺乳動物細胞を病原体または病原性因子と接触させ；（ｃ）ゲノム内に組み込まれた前記核酸構築物を含有し、そして病原体または病原性因子に対する感受性改変を示す細胞を同定し；そして（ｄ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって病原体に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が、病原体または病原性因子に耐性である細胞を同定する工程を含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
哺乳動物細胞における剤の活性において役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する方法であって：（ａ）近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞の少なくともいくつかのゲノム内に組み込まれる；（ｂ）前記非突然変異体近半数体細胞に対して検出可能な影響を引き起こすのに十分な濃度の剤と、該哺乳動物細胞を接触させ；（ｃ）ゲノム内に組み込まれた前記核酸構築物を含有し、そして前記影響を示さない細胞を同定し；そして（ｄ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって哺乳動物細胞における剤の活性において役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
剤が薬剤である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）が、インフルエンザウイルス、炭疽毒素、またはジフテリア毒素に対する感受性を減少させる候補遺伝子の遺伝子産物の阻害剤を同定する工程を含む、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本出願は、本明細書にその全解説が援用される、２００９年７月９日出願の米国仮出願第６１／２２４，３３８号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]出芽酵母（ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ）、ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｔ−ｆｌｙ）、および蠕虫（ｗｏｒｍ）などの遺伝的に追跡可能なモデル生物における突然変異誘発を通じた大規模遺伝子不活性化は、生物学的プロセスに関する洞察を得るための最も強力なツールの１つである。ＲＮＡ干渉における最近の進歩にもかかわらず、哺乳動物細胞においては、全ゲノム遺伝子スクリーニングの成功はなお困難なままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
[0003]突然変異誘導を用いた古典的な遺伝学は、以前の知識または仮定とは独立に、生物学的プロセスの根底にある遺伝的構成要素を解明する、最も強力なアプローチの１つとなってきている。培養ヒト細胞の研究は、ヒト疾患の側面の再現を可能にする。しかし、ヒト二倍体細胞において、両アレル突然変異体を生成し、そして回収することが不可能であるため、ヒト疾患理解への突然変異誘発に基づく遺伝学の寄与は限られたものとなっている。本発明は、細胞表現型に影響を及ぼす哺乳動物遺伝子、遺伝子産物、および／または遺伝子機能（単数または複数）を同定するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]１つの側面において、本発明は、半数体または近半数体（ｎｅａｒｈａｐｌｏｉｄ）であるヒト細胞において、突然変異誘発を用いた単一突然変異誘発事象によって誘導される、大部分のヒト遺伝子に対する劣性突然変異によって引き起こされる表現型の研究を可能にする、新規アプローチを提供する。本発明は、細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する方法であって：（ａ）培養中の近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、前記遺伝子トラップベクターは、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる核酸構築物を含み、そして該核酸構築物は、核酸であって、前記核酸を含有する細胞の同定を可能にする前記核酸を含む；（ｂ）ゲノム内に組み込まれた前記遺伝子トラップベクターを含有する細胞を同定し、ここで、該細胞は関心対象の表現型を示す；そして（ｃ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、核酸は、該核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞はＫＢＭ７細胞である。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は遺伝子修飾されている。
【０００５】
[0005]いくつかの態様において、核酸構築物は、５’から３’方向に、作動可能であるように関連した：（１）スプライス・アクセプター部位；（２）核酸であって、該核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸；および（３）ポリアデニル化配列を含む。いくつかの態様において、スプライス・アクセプター部位はアデノウイルス・スプライス・アクセプター部位である。いくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、ポリＡ遺伝子トラップベクターである。いくつかの態様において、関心対象の表現型は、病原体に対する適切な対照細胞の感受性と比較した際の、病原体による感染に対する感受性の改変である。いくつかの態様において、方法は、病原体に対して耐性である細胞を同定する工程を含む。いくつかの態様において、関心対象の表現型は、関心対象の化合物に対する適切な対照細胞の感受性と比較した際の、該化合物に対する感受性の改変である。いくつかの態様において、関心対象の化合物は、療法剤、例えば癌を治療するのに用いられる療法剤である。いくつかの態様において、関心対象の化合物は細胞傷害剤である。いくつかの態様において、関心対象の化合物は、毒素、例えば細菌毒素である。いくつかの態様において、方法は、毒素に耐性である、例えば毒素の存在下で生存しそして／または増殖する細胞を同定する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、レポーターを発現し、そして該毒素に対して耐性である細胞を同定する工程を含む。いくつかの態様において、関心対象の表現型は、適切な対照細胞がアポトーシスを経る傾向と比較した際の、アポトーシスを経る傾向の改変である。いくつかの態様において、方法は、遺伝子の部分を回収し、そして配列決定する工程を含む。いくつかの態様において、大規模平行配列決定を用いて、多重挿入に関する配列情報を得る。多重挿入を有するゲノム領域は、表現型に影響を及ぼす遺伝子を含有する可能性が高い。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は、関心対象の表現型を有する細胞を同定するのに有用なレポーターをさらに含む。いくつかの態様において、工程（ａ）は、近半数体哺乳動物細胞株の細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入する工程を含み、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞の少なくともいくつかのゲノム内に組み込まれる；（ｂ）こうして組み込まれた前記遺伝子トラップベクターを含有する複数の細胞を同定し、ここで、該細胞は関心対象の表現型を示す；そして（ｃ）核酸構築物が組み込まれた複数の遺伝子を同定し、それによって細胞表現型に影響を及ぼす複数の遺伝子を同定する工程を含む。
【０００６】
[0006]別の側面において、本発明は、病原体に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する方法であって：（ａ）近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる；（ｂ）近半数体哺乳動物細胞を病原体または病原性因子と接触させ；（ｃ）ゲノム内に組み込まれた前記核酸構築物を含有し、そして病原体または病原性因子に対する感受性改変を示す細胞を同定し；そして（ｃ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって病原体に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、工程（ｂ）は、病原体または病原性因子に対して耐性である細胞を同定する工程を含む。
【０００７】
[0007]別の側面において、本発明は、哺乳動物細胞における剤の薬剤活性において役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する方法であって：（ａ）近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞の少なくともいくつかのゲノム内に組み込まれる；（ｂ）前記非突然変異体近半数体細胞に対して検出可能な影響を引き起こすのに十分な濃度の剤と、哺乳動物細胞を接触させ；（ｃ）ゲノム内に組み込まれた前記核酸構築物を含有し、そして前記影響を示さない細胞を同定し；そして（ｄ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって哺乳動物細胞における剤の薬剤活性において役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、剤は薬剤である。
【０００８】
[0008]別の側面において、本発明は、５’から３’方向に、作動可能であるように関連した：（１）アデノウイルス・スプライス・アクセプター部位；（２）核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸、ここで前記レポーターはネオマイシン耐性遺伝子でない；および（３）ポリアデニル化配列を含む、遺伝子トラップベクターを提供する。本発明は、前記遺伝子トラップベクターを含む、近半数体哺乳動物細胞をさらに提供する。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞はＫＢＭ７細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子修飾されている。
【０００９】
[0009]別の側面において、本発明は、正常哺乳動物体細胞を多能性に再プログラミングするのに十分な再プログラミング因子のセット、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを発現するように操作されている、哺乳動物癌細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は造血系癌細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト癌細胞である。いくつかの態様において、細胞はＫＢＭ７細胞またはそれに由来する派生物（derivative）である。いくつかの態様において、哺乳動物癌細胞は、少なくとも１０継代に渡って培養中で安定である細胞株の細胞である。
【００１０】
[0010]別の側面において、本発明は、非付着性近半数体哺乳動物細胞に由来する付着性近半数体哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様において、付着性近半数体哺乳動物細胞は、ＫＢＭ７細胞の派生物である。
【００１１】
[0011]本発明は、懸濁中で正常に増殖する哺乳動物細胞に由来する付着細胞を産生する方法であって：（ａ）懸濁中で正常に増殖する哺乳動物細胞を提供し；（ｂ）細胞を操作して、正常哺乳動物体細胞を多能性に再プログラミングするのに十分な再プログラミング因子のセットを発現させて；（ｃ）該細胞の子孫を、非ＥＳ細胞培地中、細胞増殖に適した条件下で培養し；そして（ｄ）該哺乳動物細胞の付着性子孫を単離する工程を含む、前記方法をさらに提供する。いくつかの態様において、懸濁中で正常に増殖する哺乳動物細胞は、近半数体細胞である。いくつかの態様において、懸濁中で正常に増殖する哺乳動物細胞は、不死化哺乳動物細胞株である。いくつかの態様において、不死化哺乳動物細胞株はＫＢＭ７細胞である。いくつかの態様において、方法は、少なくともいくつかの細胞内に遺伝子トラップベクターを導入する工程をさらに含む。いくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、作動可能であるように関連した：１）スプライス・アクセプター；２）前記スプライス・アクセプターの３’に位置するエクソンであって、前記エクソンを発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記エクソン；および３）前記の第一のエクソンの３’端に位置するポリアデニル化配列を含む。
【００１２】
[0012]本発明は、多能性以外の関心対象の表現型を有する哺乳動物細胞を産生する方法であって：（ａ）哺乳動物細胞集団を提供し；（ｂ）細胞を操作して、哺乳動物体細胞を多能性に再プログラミングするのに十分な再プログラミング因子のセットを発現させて；（ｃ）該細胞を、増殖に適した条件下で培養し；そして（ｄ）生じた細胞をスクリーニングして、多能性以外の関心対象の表現型を有する細胞を同定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は近半数体細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はＫＢＭ７細胞である。いくつかの態様において、方法は、多能性以外の関心対象の表現型を有する細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの態様において、関心対象の表現型は病原体に対する感受性である。いくつかの態様において、方法は、少なくともいくつかの細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入する工程をさらに含む。いくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、作動可能であるように関連した：１）スプライス・アクセプター；２）前記スプライス・アクセプターの３’に位置するエクソンであって、前記エクソンを発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記エクソン；および３）前記の第一のエクソンの３’端に位置するポリアデニル化配列を含む。
【００１３】
[0013]他の側面において、本発明は、同定される遺伝子およびコードされる遺伝子産物を用いる方法を提供する。例えば、同定される遺伝子および遺伝子産物は、薬剤発見のターゲットであってもよく、あるいは生合成プロセス、例えば産業に、医学的に、または生理学的に重要なプロセスを操作するために有用であってもよい。
【００１４】
[0014]本発明の実施は、別に示さない限り、典型的には、当該技術分野の技術内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えばＤＮＡ）技術、免疫学、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用するであろう。特定のこれらの技術の限定されない説明は、以下の刊行物中に見出される：Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．ら（監修），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、すべてＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、２００８年１２月版；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ２００１；  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．およびＬａｎｅ，  Ｄ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８８。本明細書に言及する、すべての特許、特許出願、および他の刊行物は、その全体が本明細書に援用される。別に示さない限り、本明細書において、標準的に当該技術分野に認められる用語の意味を用いる。多様な用語の標準的な略語を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0015]図１Ａは、近半数体ＫＢＭ７サブクローンの２４色ＦＩＳＨスペクトル核型決定分析である。図１Ｂは、内因性遺伝子中の遺伝子トラップベクター組込みの概略図を示す。挿入部位の概略図は、すべての遺伝子トラップ挿入物が、トラップされた遺伝子のコード配列を中断する（黒塗りボックス）ことを示す。図１Ｃは、ＣＤ４３遺伝子座内に組み込まれたＧＦＰ遺伝子トラップを有する細胞株中のＣＤ４３のウェスタンブロット分析である。
【図２−１】[0016]図２Ａは、ジフテリアおよび炭疽ＬＦ−ＤＴ毒素に対して耐性である突然変異細胞中の遺伝子トラップ組込み部位（それぞれ、配列番号１〜３１）を例示する。ＡＮＴＸＲ２中の組込み（青色）は、炭疽ＬＦ−ＤＴのみに耐性であり、緑で示す組込みは、ジフテリアおよび炭疽ＬＦ−ＤＴ毒素の両方に耐性であり、そしてピンクで示す組込みはジフテリア毒素にのみ耐性であった。それぞれの遺伝子座中の組込み部位の位置を、右パネル中に赤線で模式的に示す。すべての遺伝子トラップ組込みはセンス配向であった。
【図２−２】図２Ｂは、それぞれの遺伝子座中に遺伝子トラップを含有する細胞におけるＷＤＲ８５  ｃＤＮＡの加え直し（ａｄｄ  ｂａｃｋ）を例示する。図２Ｃは、ＷＤＲ８５−ｉｒｅｓ−ＧＦＰを発現している細胞（上部パネル）をジフテリア毒素で処理すると、こうした細胞が選択的に殺されるようになる（下部パネル）ことを示す。
【図３−１】[0017]図３Ａは、細胞致死性膨張性毒素が、細胞周期Ｇ２／Ｍ期にある細胞の特徴的な集積を引き起こすことを示す。耐性クローンは、ＳＧＭＳ１およびＴＭＥＭ１８１において遺伝子トラップ組込みを含有する（それぞれ、配列番号３２〜４４）。
【図３−２】図３Ｂは、ＳＧＭＳ１突然変異細胞がライセニンに対して耐性であることを示す。
【図４】[0018]図４Ａは、ＫＢＭ７細胞がインフルエンザウイルスに感染しうることを示す。図４Ｂは、インフルエンザに対して耐性であるクローンにおける遺伝子トラップ組込み部位（それぞれ、配列番号４５〜４８）を示す。図４Ｃは、感染１日後、インフルエンザＡ核タンパク質（緑色）およびアクチン（赤色）に関する染色による、野生型および突然変異細胞集団におけるインフルエンザウイルス感染の検出を示す。
【図５】[0019]図５は、高力価ポリオウイルスでのＫＢＭ７およびＨＡＰ１細胞感染が、ＨＡＰ１細胞集団において細胞死を生じることを示す。突然変異誘発された耐性である細胞クローンは、ポリオウイルス受容体ＰＶＲ中に組込みを含有する（それぞれ、配列番号４９〜５０）。
【図６】[0020]図６Ａは、増殖し、そして培地を酸性化するＴＲＡＩＬ耐性遺伝子トラップ・ノックアウトの同定を示す。図６Ｂは、カスパーゼ８中に遺伝子トラップ組込みを有する細胞のウェスタンブロット分析である。図６Ｃは、ＴＲＡＩＬおよびＧｌｅｅｖｅｃによるＫＢＭ−７における細胞死の誘導を示す。カスパーゼ８突然変異細胞は、ＴＲＡＩＬに対して耐性である。生存細胞は緑色に染色され、そして死亡細胞は赤色に染色される。
【図７】[0021]図７は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞致死性膨張性毒素による中毒に必要な宿主遺伝子に関するスクリーンにおいて同定された、多重挿入部位の同時マッピング後の、ゲノムに渡る挿入密度を示すプロットである。
【図８】[0022]図８Ａは、近半数体ＫＢＭ−７細胞の２４色スペクトル核型および遺伝子トラップ突然変異誘発スクリーンの概略図を示す。図８Ｂは、６−チオグアニン、ＴＲＡＩＬまたはＧｌｅｅｖｅｃに曝露された細胞における遺伝子トラップ挿入部位（それぞれ、配列番号５１〜６９）を示す（左パネル）。挿入部位の概略図（右パネル）は、すべての遺伝子トラップ挿入が、トラップされた遺伝子のコーディング配列を中断する（灰色のボックス）と予測されることを示す。図８Ｃは、それぞれの遺伝子座中に独立の遺伝子トラップ挿入を含有するクローンにおける、ＦＡＤＤ、カスパーゼ８、ＮＦ１、およびＨＰＲＴ発現レベルのイムノブロット分析を示す。ＣＤＫ４を装填対照として用いた。図８Ｄは、ＴＲＡＩＬで処理した、野生型、カスパーゼ８およびＦＡＤＤ遺伝子トラップ細胞の位相差写真である。
【図９】[0023]図９Ａは、対照ＫＢＭ−７細胞（左）、および大腸菌から精製されたＣＤＴに曝露された後のＫＢＭ−７細胞（右パネル）のフローサイトメトリー分析を示す。ＣＤＴに細胞を曝露すると、細胞周期のＧ２／Ｍ期にある細胞の増加（矢印Ａを参照されたい）および細胞死の増加（矢印Ｂを参照されたい）が生じる。図９Ｂは、ＣＤＴに反応しない突然変異細胞における挿入部位（それぞれ、配列番号７０〜８３）分析（上部パネル）、および影響を受ける遺伝子座における挿入部位の概略図を示す。図９Ｃは、ＣＤＴに対するＴＭＥＭ１８１突然変異細胞およびＳＧＭＳ１突然変異細胞のＣＤＴ耐性を例示する。それぞれのｃＤＮＡで再構成された突然変異細胞は、毒素感受性を再獲得する。図９Ｄは、Ｆｌａｇ−ＣＤＴの存在下または非存在下で、固定抗Ｆｌａｇ抗体とインキュベーションした対照およびＨＡ−ＴＭＥＭ１８１発現細胞由来の細胞溶解物のイムノブロット分析を示す。結合したタンパク質を、イムノブロット分析によって検出した。図９Ｅに示すように、ＴＭＥＭ１８１を発現するレトロウイルスに感染させたＮＩＨ３Ｔ３、Ｕ２ＯＳおよびＨＥＬＡ細胞を、増加する量のＣＤＴで処理した。５日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。図９Ｆは、大腸菌ＣＤＴによる細胞進入および中毒の推定されるモデルを示す。
【図１０】[0024]図１０Ａは、インフルエンザウイルスに対して耐性である細胞における挿入部位（それぞれ、配列番号８４〜８８）の分析を示す。同定される挿入部位の概略図は、これらが影響を受ける遺伝子のコーディング配列を中断する（灰色のボックス）ことを示す。図１０Ｂに示すように、細胞をインフルエンザウイルスに曝露し、そしてインフルエンザＡ核タンパク質に対して向けられる抗体を用いて、１２時間後に染色した。突然変異遺伝子産物に対応するｃＤＮＡで再構成された突然変異細胞は、ウイルス感受性を再獲得する。
【図１１−１】[0025]図１１Ａは、ジフテリア毒素（クラスＩ）、炭疽ＤＴＡ毒素（クラスＩＩ）または両方（クラスＩＩＩ）に対して耐性であるクローンにおける遺伝子トラップ挿入部位（それぞれ、配列番号８９〜１２０）を示す。図１１Ｂは、すべての挿入が、遺伝子の５’端に向かってクラスター形成していることを示す、挿入部位の概略図である。図１１Ｃは、ＷＤＲ８５に関するＲＴ−ＰＣＲによって、ＷＤＲ８５遺伝子座における遺伝子トラップ挿入を伴う独立のクローンにおいて、ＷＤＲ８５ｍＲＮＡが検出不能なレベルであることが示されることを例示する。
【図１１−２】図１１Ｄは、ジフテリア毒素（左）、外毒素Ａ（中央）または炭疽ＤＴＡ（右）に対するＷＤＲ８５ＧＴ細胞の耐性を例示する。ＨＢ−ＥＧＦ、ＤＰＨ５およびＡＮＴＲＸ２に突然変異を持つと同定されるクローンは、これらのそれぞれの毒素に関する非感受性対照として働き、そしてＷＤＲ８５  ｃＤＮＡで再構成されたＷＤＲ８５ＧＴ細胞は、３つの毒素すべてに対して感受性を再獲得した。
【図１２】[0026]図１２Ａは、ＮＡＤ−ビオチンの存在下での、ＤＴＡ−ＬＦＮによる、野生型、ＷＤＲ８５およびＤＰＨ５突然変異細胞から精製したＳＢＰタグ化ＥＦ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＰリボシル化を示す。ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてＡＤＰリボシル化を検出し、そしてイムノブロット分析によって総ＥＦ−２を検出した。図１２Ｂは、野生型、ＷＤＲ８５およびＤＰＨ５突然変異細胞溶解物による、「中間体」ＥＦ２のメチル化を示す。ＳＢＰタグ化「中間体」ＥＦ２をＤＰＨ５突然変異細胞から精製し、そしてメチルドナーとしての［メチル−３Ｈ］アデノシルメチオニン（Ａｄｏ−Ｓ−Ｍｅ）の存在下で、示す遺伝子型に由来する溶解物中でインキュベーションした。ＣＤＫ４を装填対照とするイムノブロット分析によって、供給された「中間体」ＥＦ２の量を検出した。図１２Ｃは、ＷＤＲ８５突然変異細胞から精製したＳＢＰタグ化ＥＦ２由来のトリプシンペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。非修飾Ｈｉｓ７１５に特徴的なペプチド断片を示す。図１２Ｄは、野生型およびＷＤＲ８５不全細胞から精製したＳＰＢ−ＥＦ２の銀染色、ならびにＷＤＲ８５不全細胞においてＥＦ２と同時精製されるタンパク質由来のペプチド配列を示す。図１２Ｅに示すように、ＩＰ−イイムノブロット分析によって、ＤＰＨ５（配列番号１２１）が、ＷＤＲ８５不全細胞由来のＥＥＦ２と同時精製されることが示される。図１２Ｆに例示するように、ＷＴ、ＹＫＬ１９１ＷおよびＹＢＲ２４６Ｗ不全サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）株由来のタンパク質抽出物を、ＮＡＤ−ビオチンの存在下で、ＬＦＮ−ＤＴＡとインキュベーションした。ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてＡＤＰリボシル化を検出し、そして装填対照としてＰＧＫ１を用いた。図１２Ｇは、ジフタミドの段階的な生合成に関して示唆される経路を示す。Ａｄｏ−Ｓ−Ｍｅ、メチルチオアデノシン；  Ａｄｏ−Ｈｃｙ、Ｓ−アデノシルホモシステイン。
【図１３】[0027]図１３は、増加する濃度のＣＤＴで４８時間処理した細胞のフローサイトメトリー分析によって例示されるように、ＣＤＴが誘導する、細胞周期のＧ２／Ｍ期にある細胞の集積には、ＴＭＥＭ１８１およびＳＧＭＳ１が必要であることを示す。突然変異遺伝子産物を発現するレトロウイルスまたはレンチウイルスに感染した同じ突然変異細胞は、毒素処理に対する反応性を再獲得した。
【図１４】[0028]図１４Ａに示すように、野生型細胞、ならびにＳＧＭＳ１およびＴＭＥＭ１８１に関する突然変異細胞を、孔形成ライセニン毒素に曝露し、そして生存染色を用いて、細胞生存度を監視した。図１４Ｂは、同じ細胞をライセニン毒素で処理し、そして細胞生存度を定量化した際の結果を例示する。ＳＧＭＳ１を発現するレンチウイルスベクターに感染させたＳＧＭＳ１突然変異細胞は、毒素に対する感受性を部分的に再獲得した。
【図１５】[0029]図１５Ａは、増加する濃度のＣＤＴで処理した、対照細胞、またはＴＭＥＭ１８１の発現を指示するレトロウイルスに感染させた細胞の顕微鏡画像を示す。Ｕ２ＯＳ細胞における実験を毒素処理の１日後に写真撮影し（上部パネル）、そしてＨＥＬＡ細胞における実験を毒素処理の２日後に写真撮影した。図１５Ｂは、毒素処理の４日後の同じ細胞の細胞生存度の定量化を示す。
【図１６】[0030]図１６Ａは、遺伝子トラップ細胞におけるＳＬＣ３５Ａ２  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図１６Ｂは、野生型細胞、ＣＭＡＳ不全細胞における、そしてＦｌａｇ−ＣＭＡＳを発現しているレトロウイルスに感染させた同じ細胞における、ＣＭＡＳタンパク質レベルのイムノブロット分析を示す。図１６Ｃは、野生型細胞における、そしてＣＭＡＳまたはＳＬＣ３５Ａ２に突然変異を持つ細胞における、インフルエンザウイルス感染の定量化を示すグラフである。それぞれのｃＤＮＡで補完した突然変異細胞を含んだ。細胞をインフルエンザウイルスに感染させ、１２時間後、インフルエンザＡ核タンパク質に関して染色し、そして感染した細胞をスコア付けした。
【図１７】[0031]図１７Ａは、炭疽致死因子毒素が、野生型、ＷＤＲ８５突然変異細胞、およびＷＤＲ８５で補完したＷＤＲ８５突然変異細胞において、ＭＥＫ−３切断を引き起こすことを示す、イムノブロット分析を示す。アクチンを装填対照として用いた。図１７Ｂに示すように、野生型およびＷＤＲ８５不全細胞の細胞溶解物を、ＮＡＤ−ビオチンの存在下で、ＬＦＮ−ＤＴＡに曝露した。ＷＤＲ８５  ｃＤＮＡで再構成したＷＤＲ８５突然変異細胞およびＤＰＨ５突然変異細胞が対照として働いた。ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてＡＤＰリボシル化を検出し、そしてＥＦ２総量を装填対照として用いた。図１７Ｃは、ＤＰＨ５抗体を用いて、野生型、ＷＤＲ８５不全細胞およびＤＰＨ５不全細胞溶解物を免疫沈降した際のイムノブロット分析を示す。ＤＰＨ５およびＥＦ２に関して免疫沈降物をブロッティングし、そしてＥＦ２に関して全細胞抽出物をブロッティングした。
【図１８】[0032]図１８Ａは、野生型細胞から精製したＳＢＰタグ化ＥＦ２由来のトリプシン断片ＦＤＶＨＤＶＴＬＨＡＤＶＩＨＲのＭＳ／ＭＳスペクトルの結果を示す。断片化は、四級アンモニウム塩として不安定な性質であるため、ジフタミドの存在下で特徴的な、５８Ｄａのニュートラルロスを伴うペプチドを生じた（Ｏｒｔｉｚら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１：３２６３９（Ｏｃｔ  ２７，  ２００６））。質量分析に用いたＳＢＰタグ化ＥＦ２構築物が、ジフタミド生合成に影響しない、ＰＣＲ中に偶発的に導入された突然変異（Ａ７１３Ｖ）を含有することに注目されたい。図１８Ｂは、Ｈｉｓ７１５に対するあらゆる修飾の非存在と一致する、ＷＤＲ８５不全細胞由来の同じペプチドに関するＭＳ／ＭＳスペクトルの結果を示す。図１８Ｃは、＋１０１「中間体」修飾を含有するＤＰＨ５不全細胞由来の同一ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルの結果を示す。
【図１９−１】[0033]図１９Ａは、ヒトＷＤＲ８５（配列番号１２２）およびサッカロミセス・セレビシエＹＢＲ２４６Ｗ（配列番号１２３）のアミノ酸配列の並列を示す。
【図１９−２】図１９Ｂは、１１４４の異なる条件から、ＹＢＲ２４６Ｗホモ接合体酵母細胞に特異的な１０の最も重要な適合度欠損を列挙する。図１９Ｃは、ＹＢＲ２４６Ｗと最も有意に表現型クラスター形成（ｐｈｅｎｏｃｌｕｓｔｅｒ）する酵母突然変異体、および相互作用する遺伝子に関する濃縮されたＧＯタームを列挙する。酵母適合性データベースを用いて、データを得た（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｔｄｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／；  Ｍ．Ｅ．  Ｈｉｌｌｅｎｍｅｙｅｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３６２（Ａｐｒ  １８，  ２００８）由来のウェブ補足）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0034]本発明は、哺乳動物細胞遺伝学を実行するための新規アプローチに、そして／または哺乳動物細胞において遺伝子スクリーンを実行する際に使用する哺乳動物細胞、核酸構築物、および組成物に関する。いくつかの側面において、本発明は、哺乳動物細胞において、遺伝子トラップベクターを用いた遺伝子スクリーンを実行する新規方法に関する。遺伝子トラップ突然変異誘発は、ＥＳ細胞において、多くのマウス遺伝子に関する遺伝子トラップアレルを生じるために使用されてきている（Ｎｏｒｄ，  ＡＳら，  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ：  ａ  ｐｏｒｔａｌ  ｔｏ  ａｌｌ  ｐｕｂｌｉｃｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｐ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ３４，  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ  Ｄ６４２−Ｄ６４８，  ２００６）。生じる細胞は、典型的には、突然変異体アレルに関してホモ接合体であるマウスを生成するために用いられる。これらのマウスの表現型を分析することによって、破壊された遺伝子の機能に関する洞察を得ることも可能である。しかし、このアプローチには時間が掛かり、そして関心対象の特定の細胞表現型または生物学的経路に影響を及ぼす遺伝子を同定するために捜索するアプローチには役立たない。本発明は、遺伝子トラップベクターを用いて、半数体または近半数体哺乳動物細胞において、関心対象の哺乳動物細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を効率的に同定可能であるという発見を含む。本発明のアプローチは、突然変異体アレルに関してホモ接合体である非ヒト哺乳動物を生成する必要を伴わない。その代わり、細胞を直接スクリーニングして、細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子中の突然変異を所持するものを同定可能である。
【００１７】
[0035]本発明は、哺乳動物細胞における順方向遺伝子スクリーン、すなわち突然変異細胞集団を提供し、そして関心対象の特定の表現型を有する細胞を検出した後、表現型に影響を及ぼす遺伝子（単数または複数）を同定する工程を含むスクリーンを実行する方法を提供する。特定の方法は：（ａ）培養中の近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、前記遺伝子トラップベクターは、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる、そして該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を含有する細胞の同定を可能にする前記核酸を含む；（ｂ）ゲノム内に組み込まれた前記遺伝子トラップベクターを含有する細胞を同定し、ここで、該細胞は関心対象の表現型を示す；そして（ｃ）遺伝子トラップベクターが組み込まれた遺伝子を同定し、それによって細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する工程を含む。本発明はまた、本発明の方法を実行するのに有用な組成物も提供する。
【００１８】
[0036]遺伝子トラップベクター
[0037]用語「遺伝子トラップベクター」は、内因性細胞性遺伝子内に挿入されて、そして潜在的に該遺伝子を不活性化することが可能な核酸構築物を含むベクターを指す。典型的には、遺伝子内への核酸構築物の挿入は、遺伝子を破壊し、そしてその同定を容易にする。こうした挿入を有する細胞を、「突然変異細胞」と称してもよい。挿入されたＤＮＡは、「分子タグ」として働き、以下にさらに論じるように、これを用いて、近傍に位置する内因性ゲノムＤＮＡを単離するかまたは別の方式で同定することも可能である。核酸構築物は、しばしば、発現された際に、ゲノム内に挿入された構築物を含有する細胞の同定を可能にするレポーターをコードするＤＮＡを含む。構築物は、典型的には、発現に通常必要とされるかまたは発現を有意に増加させる遺伝子要素、例えばプロモーターまたはポリアデニル化（ポリＡ）配列を欠き、したがって、構築物が内因性遺伝子内に挿入された場合のみ、細胞内へのベクターの導入後にレポーターの有効な発現が生じる。
【００１９】
[0038]本発明の多様な態様において、多様な異なる設計の遺伝子トラップベクターを用いてもよい。本発明のいくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、プロモーター不含レポーター遺伝子に隣接した上流スプライス・アクセプター（ＳＡ）部位および下流ポリアデニル化配列を含む核酸構築物を含む。言い換えると、プロモーター不含レポーター遺伝子は、スプライス・アクセプター部位の下流およびポリＡ配列（「ポリＡ部位」または「ポリＡシグナル」とも称される）の上流に位置する。図１Ｂは、例示的なプロモーター不含遺伝子トラップ構築物を模式的に示し、ここでレポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。発現される遺伝子のイントロン内に挿入されると、遺伝子トラップ構築物は、挿入部位上流のエクソン（単数または複数）がレポーター／選択可能マーカー遺伝子にインフレームでスプライシングされた融合転写物の形で、その遺伝子の内因性プロモーターから転写される。転写は、挿入されたポリアデニル化部位で未成熟に終結し、したがって、生じる融合転写物は、レポーターに融合された、一部切除され（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）そして機能しない型の細胞性タンパク質をコードする。レポーターは、遺伝子トラップベクターが活発に転写される遺伝子座内に挿入された細胞の同定を可能にする。したがって、これらの遺伝子トラップベクターは、挿入部位でトラップされた遺伝子を不活性化し、そしてかつその発現を報告し、そして破壊された遺伝子の迅速な同定を可能にする核酸タグを提供する。遺伝子トラップベクターにおいて、多様なスプライス・アクセプター部位が使用可能である。本発明のいくつかの態様において、ＳＡ部位はアデノウイルスＳＡ部位である。いくつかの態様において、アデノウイルス４０型の長い線維遺伝子由来のＳＡを用いる（Ｃａｒｅｔｔｅら  ２００５  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（８）１０５３−１０６２）。他の強いアデノウイルスＳＡ部位は、異なるアデノウイルス血清型の線維またはヘキソン遺伝子由来のものである。遺伝子トラップベクターにおいて、多様なポリＡ配列を用いてもよい。本発明のいくつかの態様において、ポリＡ配列はウシ成長ホルモンポリＡシグナルである。
【００２０】
[0039]本発明のいくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、ポリＡトラップベクターである。ポリＡトラップベクターは、（ｉ）作動可能であるようにプロモーターに連結された、レポーターをコードする核酸配列を含む、レポーター遺伝子；および（ｉｉ）レポーター遺伝子下流に位置するスプライス・ドナー（ＳＤ）部位を含む、核酸構築物を含む。遺伝子トラップベクターは、ポリＡ配列を欠くため、ベクターがイントロン中に挿入され、そして下流エクソンにスプライシングされることによってポリＡ部位が提供された場合にのみ、レポーターの効率的な合成が起こりうる。内因性遺伝子のイントロン内に挿入された際、遺伝子トラッププロモーターから発現される転写物は、最も３’側でポリＡ配列を含む内因性遺伝子の下流エクソンにスプライシングされ、内因性遺伝子のポリＡ配列で終結する融合転写物を生じる。融合転写物は、挿入されたプロモーターから発現されるため、ポリＡトラップベクターは、内因性遺伝子が発現されるかどうかには関わりなく、遺伝子をトラップする。レポーターは、遺伝子トラップベクターがイントロン内に挿入された細胞の同定を可能にし、そして挿入されたＤＮＡを用いて、挿入部位近傍のゲノム配列を同定することも可能である。本発明のいくつかの態様において、ＳＤ部位は、アデノウイルスＳＤ部位である。いくつかの態様において、ポリＡトラップベクターは、レポーター遺伝子の終結コドン下流およびスプライスドナー部位の上流に、ＩＲＥＳ配列をさらに含む。このアプローチは、例えば、レポーター遺伝子の終結コドンが、例えば最終スプライス接合部位の約５５ヌクレオチドを越えて上流である場合に、そうでなければ生じる可能性がある、ナンセンス仲介性減衰を克服するのに有用でありうる。
【００２１】
[0040]いくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、関心対象の特性を有する遺伝子、例えば膜貫通タンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子の選択的同定を促進する遺伝子要素を含む。例えば、いくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは分泌遺伝子トラップベクターである。いくつかの態様において、分泌遺伝子トラップベクターは、レポーターをコードする部分に対してＮ末端側に位置するＩＩ型膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードする部分を含む核酸構築物を含み、ここで、レポーターは、小胞体管腔中に位置しない場合の活性に比較して、小胞体管腔（または他の分泌性区画）中に位置する場合、その活性が有意に異なる（例えば減少する）特性を有する。
【００２２】
[0041]遺伝子トラップベクターを用いる近半数体哺乳動物細胞において、プロモーターが発現を指示することが可能であるならば、ポリＡトラップベクター（またはプロモーターを含む他の遺伝子トラップベクター）において、多様な異なるプロモーターを用いてもよい。多くの態様において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を指示するプロモーター）である。いくつかの態様において、プロモーターは恒常性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、広い範囲の哺乳動物細胞タイプにおいて活性である強力なプロモーター、例えばＣＭＶ極初期プロモーターまたは主要中間初期プロモーター、あるいは他の哺乳動物ウイルスプロモーター、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０または他のポリオーマウイルスプロモーター、およびアデノウイルスプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、哺乳動物遺伝子プロモーター、例えば伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）、ヒストン、またはｈＴＥＲＴプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、関心対象の１またはそれより多い細胞タイプまたは細胞系譜において活性であり、そして、多くのまたは大部分の他の細胞タイプまたは系譜において活性でないか、または実質的により活性でない。例えば、近半数体哺乳動物細胞が造血系細胞である場合、造血細胞系譜細胞で活性であるプロモーターを用いてもよい。いくつかの態様において、プロモーターは制御可能、例えば誘導可能である。制御可能プロモーターの例には、熱ショックプロモーター、メタロチオネインプロモーター、およびテトラサイクリンまたは関連化合物（例えばドキシサイクリン）などの小分子、あるいはホルモンに反応性である要素を含むプロモーターが含まれる。例えば、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン制御可能要素、またはプロモーターをホルモン受容体に対するリガンドに反応性にするホルモン反応要素を含んでもよい。例示的な受容体には、エストロゲン、プロゲステロン、およびグルココルチコイド受容体が含まれる。例示的なリガンドには、生理学的リガンド、例えばエストロゲン、プロゲステロン、またはコルチゾル、および非生理学的なリガンド、例えばタモキシフェン、デキサメタゾンが含まれる。細胞が、典型的にはＤＮＡ結合ドメイン、活性化または抑制ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む、適切なトランス活性化タンパク質を発現すべきであることが理解されるであろう。
【００２３】
[0042]いくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、それぞれ、第一および第二のレポーター遺伝子を含有する、第一および第二の核酸構築物を含む。レポーター遺伝子は、典型的には異なる。第一の核酸構築物は、関心対象の近半数体哺乳動物細胞において活性であるプロモーターに作動可能であるように連結されたレポーター遺伝子を含む。他方の核酸構築物は、上記のものなどのプロモーター不含遺伝子トラップ構築物またはポリＡトラップ構築物を含む。第一のレポーター遺伝子によってコードされるレポーターを用いて、遺伝子トラップベクターがゲノム内に組み込まれている細胞を同定する。第二のレポーター遺伝子によってコードされるレポーターを用いて、こうした組込みが内因性遺伝子で生じる細胞を同定する。いくつかの態様において、第一のレポーター遺伝子は選択可能マーカーをコードし、そして第二のレポーター遺伝子は検出可能マーカーをコードする。
【００２４】
[0043]組換えＤＮＡ技術および遺伝子操作の標準的な方法を用いて、遺伝子トラップ構築物を作製してもよく、そして多様なタイプのベクターを用いて、細胞内に導入してもよい。本発明の特定の態様において、遺伝子トラップベクターは、例えばそのゲノムの一部として、遺伝子トラップ構築物を含む、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス（例えばレンチウイルス）、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスベクターである。ウイルスベクターは、細胞を感染させるために用いられ、それによって遺伝子トラップ構築物を導入するウイルス（ウイルス粒子）であってもよい。感染後、ウイルスゲノムまたはそのコピーの少なくとも一部が、典型的には細胞ＤＮＡ内のランダムな部位で、細胞ゲノム内に組み込まれる。特定の関心対象の特定の態様において、レトロウイルスベクターを使用して、近半数体哺乳動物細胞に遺伝子トラップ構築物を送達する。レトロウイルスベクター、およびレトロウイルスを用いて外因性ＤＮＡを哺乳動物細胞内に導入する方法は、当該技術分野で周知である。レトロウイルスベクターは、典型的には、多様なタイプのレトロウイルスに由来しうるＬＴＲを含む。ＬＴＲ（単数または複数）を遺伝子修飾して望ましい特性を提供してもよく、そしてウイルスゲノムを修飾して、例えばプロモーター活性を欠き、そして／または細菌における増殖および選択に適した制御要素、例えば複製起点および抗生物質耐性マーカーを含むようにしてもよい。遺伝子トラップ構築物は、ＬＴＲ間に位置する。標準法を用いて、遺伝子トラップ構築物を含むレトロウイルスプラスミドをレトロウイルスパッケージング細胞株内にトランスフェクションすることによって、感染性であり、複製適合性のレトロウイルス遺伝子トラップ粒子を産生してもよい。細胞を培養し、そして培地内に放出されたウイルス粒子を収集し（例えば上清として）、そしてこれを用いて、哺乳動物近半数体細胞を感染させる。いくつかの態様において、粒子に対する細胞の比は、多重組込みの可能性を減少させるために、比較的低く、例えば約０．２５未満に維持される。
【００２５】
[0044]本発明のいくつかの態様において、遺伝子トラップベクターは、近半数体哺乳動物細胞内に遺伝子トラップ構築物を導入するために用いられるプラスミドである。
[0045]レポーターおよびレポーター遺伝子
[0046]用語「レポーター」は、しばしば、ＲＮＡもしくはタンパク質であって、細胞によって発現された際、該ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しない以外は類似である細胞から、細胞を区別するかまたは分離するために使用可能であるか、あるいは該ＲＮＡもしくはタンパク質を異なるレベルで発現するか、または該ＲＮＡもしくはタンパク質がより低いかもしくはより高い活性を有する他の細胞から、細胞を区別するかまたは分離するために使用可能である、前記ＲＮＡもしくはタンパク質を指す。用語「レポーター遺伝子」は、レポーターをコードする核酸を指す。しばしば、レポーター遺伝子は、ｍＲＮＡに転写されるＤＮＡを含み、ｍＲＮＡは細胞によって翻訳されてタンパク質を産生する。タンパク質は、該タンパク質を産生しない細胞から、細胞を区別するかまたは分離することを可能にする特性を有する。
【００２６】
[0047]本発明の多様な態様において、多様な異なるレポーターが利用される。いくつかの態様において、レポーターは選択可能マーカーを含む。本明細書において、用語「選択可能マーカー」は、細胞によって発現された際、レポーターを発現していない以外は類似である細胞に比較して、少なくともいくつかの条件（「選択条件」）下で、増殖または生存上の利点を細胞に与えるレポーターを指す。増殖または生存上の利点を与える選択可能マーカー、およびこうしたマーカーの発現に基づいて細胞を選択する方法が当該技術分野に知られる。選択可能マーカーの例には、多様な薬剤に対する耐性を与えるタンパク質（「薬剤耐性マーカー」）が含まれる。薬剤耐性マーカーのための選択条件は、典型的には、細胞生存度および／または増殖を有意に減少させるのに十分な濃度で適切な薬剤を含有する培地中で、細胞を培養する工程を含む。当業者は、適切な濃度を知るであろう。任意の特定の細胞タイプまたは細胞株に関する最適な濃度は、容易に決定可能である。薬剤耐性マーカーの例には、酵素であって、Ｇ４１８およびネオマイシンなどの多様なアミノグリコシド抗生物質（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩまたは「ｎｅｏ」）としても知られる、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ、３’ＡＰＨ  ＩＩ）、ゼオシンＴＭまたはブレオマイシン（例えば、ストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）由来のｂｌｅ遺伝子によってコードされるタンパク質）、ハイグロマイシン（例えば、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のハイグロマイシン耐性遺伝子、ｈｐｈ、あるいはリン酸化を通じて、ハイグロマイシンＢを不活性化するキナーゼ（ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ、ＨＰＴ）をコードする、大腸菌またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離されたプラスミド由来のもの）、ピューロマイシン（例えばストレプトミセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）・ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子）、またはブラストサイジン（例えばストレプトベルティシラム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）種ＪＣＭ  ４６７３由来のｂｌｓ遺伝子によってコードされるアセチルトランスフェラーゼ、あるいはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来のｂｓｒ、またはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のＢＳＤ耐性遺伝子によってコードされるデアミナーゼ）に対する耐性を与える酵素が含まれる。他の例示的な薬剤耐性マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）である。Ｐ−糖タンパク質および他の多剤耐性タンパク質などのタンパク質は、多様な細胞傷害性化合物、例えば化学療法剤、例えばビンブラスチンおよびアントラサイクリンが細胞から排出されるポンプと��て作用し（Ａｍｂｕｄｋａｒ  Ｓ  Ｖら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２２（４７）：７４６８−８５，  ２００３）、これもまた選択可能マーカーとして使用可能である。いくつかの態様において、レポーター、例えば薬剤耐性マーカーをコードする遺伝子の配列は、哺乳動物細胞における発現のために最適化される。本発明のいくつかの態様において、ｎｅｏ以外の薬剤耐性マーカー、例えばピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを用いる。
【００２７】
[0048]生合成経路において機能し、そして細胞生存または増殖に関して必要な特定の化合物に関する原栄養性を与えるタンパク質（「栄養マーカー」）もまた、選択可能マーカーとして使用可能である。栄養マーカーのための選択条件は、しばしば、細胞生存および／または増殖を補助するために十分な濃度の適切な化合物が欠けている培地中で、細胞を培養する工程を含む。一般的に、非選択条件下で、必要な化合物は環境中に存在するか、または細胞において代替経路によって産生される。選択条件下では、細胞が化合物を産生しなければならないため、生合成経路の機能が必要である。ＨＰＲＴおよびＴＫがその例である。ＨＰＲＴ発現を欠く（例えばＨＰＲＴ遺伝子の機能するコピーが欠けている）か、またはＴＫ発現を欠く（例えばＴＫ遺伝子の機能するコピーが欠けている）細胞は、標準培地中では増殖可能であるが、アミノプテリン、ヒポキサンチン、およびチミジンを含有するＨＡＴ培地中では死ぬ。ＨＰＲＴまたはＴＫ発現を欠く細胞において、それぞれ、ＨＰＲＴまたはＴＫは、ＨＡＴ培地中で、その存在に関して選択可能な、選択可能マーカーとして使用可能である。
【００２８】
[0049]ある細胞は、増殖または生存上の利点を与える選択可能マーカーを発現し、そして他の細胞は選択可能マーカーを発現しない場合、選択条件下で細胞集団を培養すると、一般的に、最終的には、選択可能マーカーを発現する細胞に関して濃縮された集団が生じるであろう。多くの態様において、選択可能マーカーを発現しない大部分のまたはすべての細胞は、十分な時間経過後、集団から排除されるであろう。選択可能マーカーを発現しない所定の割合の細胞を排除するのに必要な時間は、マーカー、条件、および細胞に応じるであろうし、そして当業者によって容易に決定可能である。「選択条件」は、単一セットの条件、または順番に適用可能な多数のセットの条件を指してもよいことが理解されるであろう。細胞が選択条件下に連続して維持される必要がないこともまた理解されるであろう。
【００２９】
[0050]いくつかの態様において、レポーターは発現する細胞上の細胞表面分子の存在に基づく物理的分離を可能にする。本明細書において、「細胞表面分子」（ＣＳＭ）は、細胞の形質膜の外に少なくともその一部が位置し、したがってこうした細胞が位置する環境中に存在する特異的結合剤にアクセス可能であるタンパク質を指す。例には、ＣＤ分子、細胞外ドメインを含む受容体、チャネル、および細胞接着分子が含まれる。多くの態様において、レポーター遺伝子はＣＳＭをコードする。当該技術分野に知られる方法を用いて、細胞表面分子を発現する細胞を発現しない細胞から物理的に分離することも可能である。特異的結合剤を用いて、ＣＳＭを発現する細胞を発現しない細胞から物理的に分離することも可能である。用語「特異的結合剤」は、別の分子に特異的に結合する分子または分子複合体を指す。抗体およびアプタマーは例示的な特異的結合剤である。本発明のいくつかの態様において、抗体または他の特異的結合剤を支持体に付着させる。支持体は、例えば、細胞を配置可能な入れ物または容器、あるいは粒子集団、例えば磁気粒子またはクロマトグラフィー樹脂であってもよい。細胞を液体培地中で支持体と接触させる。マーカーを発現する細胞は、特異的結合剤に結合し、そしてしたがって、マーカーを発現しない細胞から分離させることも可能である。続いて、標準法を用いて、支持体から細胞を放出させてもよい。他の態様において、フローサイトメトリーを用いて、ＣＳＭを発現する細胞を発現しない細胞から分離する。例えば、細胞を、ＣＳＭに結合する蛍光標識抗体と接触させる。次いで、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、蛍光に基づいて細胞を分離する。
【００３０】
[0051]いくつかの態様において、レポーターは、容易に検出可能なマーカー、例えば容易に検出可能なタンパク質、例えば蛍光または発光タンパク質、あるいは基質に作用して着色、蛍光、または発光物質を産生する酵素であるか、あるいはこれらを含む。いくつかの態様において、容易に検出可能なマーカーは、光に基づくかまたは光との相互作用に基づくシグナル（「光学的検出可能シグナル」）を産生するか、またはシグナルの変化を生じ、こうしたシグナルを、例えば視覚的に、または適切な器具を用いて、検出することも可能である。蛍光マーカーには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色、サファイア、黄色、赤色、オレンジ、およびシアン蛍光タンパク質、ならびに増進ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ等の蛍光変異体が含まれる。ルシフェラーゼ（例えばホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）またはレニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ）などの発光タンパク質もまた利用される。基質に作用する酵素の場合、細胞浸透性基質と細胞を接触させる。次いで、酵素を発現する細胞を発現しない細胞から区別することも可能である。
【００３１】
[0052]選択は、少なくとも部分的に、タンパク質発現の欠如に基づいてもよい。いくつかの態様において、細胞を操作して、ＣＳＭ、あるいは毒性であるかまたは特定の条件下で細胞傷害性を生じるタンパク質（例えば代謝物の前駆体を含有する培地中で培養した際に、毒性代謝物を生成する酵素）を発現させる。ＣＳＭまたは毒性タンパク質、あるいは機能に必須であるその部分をコードする遺伝子に、レコンビナーゼに認識される部位を隣接させて、組換え事象が該遺伝子を除去するかまたは無効にするようにする。次いで、レコンビナーゼはレポーターとして働くことも可能である。Ｃｒｅレコンビナーゼおよびｆｌｐレコンビナーゼ（それぞれ、ＬｏｘＰおよびＦｒｔ部位を認識する）は、例示的なレコンビナーゼである。さらに他の態様において、第一のレポーターは、第二のレポーター、例えば薬剤耐性マーカー、栄養マーカー、ＣＳＭ、または酵素の発現を調節する、例えば増進するかまたは阻害する。例えば、第一のレポーターは転写因子であってもよい。第二のレポーターの発現または発現欠如に基づいて、細胞を選択する。
【００３２】
[0053]レポーターの発現または活性に基づいて細胞を同定するかまたは選択する以外の多様な目的のために、レポーターを用いてもよいことが理解されるであろう。例えば、レポーターの発現または活性は、「報告する」ことも可能であり、例えば転写、翻訳、分解、シグナル伝達、タンパク質転位置、酵素活性、代謝、タンパク質−タンパク質相互作用などの細胞プロセス、あるいは任意の多様な他の関心対象のプロセスまたは表現型に関する情報を提供することも可能である。こうした情報は、特定の遺伝子、ＲＮＡ、タンパク質、またはシグナル伝達経路に関連してもよい。情報は定性的であってもよく、またはいくつかの態様において、定量的であってもよい。
【００３３】
[0054]近半数体哺乳動物細胞
[0055]ヒトを含むほぼすべての哺乳動物において、体を構成する大部分の体細胞は、通常、二倍体であり、すなわちこれらは各染色体の２つの相同なコピーを含有する（性別および特定の種に応じて、相同であるかまたは非相同であることもありうる、２つの性染色体を除く）。相同な対のメンバーは、どちらも同じ遺伝子座に同じ遺伝子を含有するが、これらの遺伝子のおそらく異なるアレル（すなわち異なる遺伝子変異体）を有する、非同一染色体である。対照的に、半数体細胞は、各染色体の単一のコピーしか含有しない。近半数体哺乳動物細胞は、本明細書において、５以下の染色体が２またはそれより多いコピー数で存在する哺乳動物細胞を指す。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は、１、２、３、または４以下の染色体が２またはそれより多いコピー数で存在する。便宜上、用語「近半数体」細胞は、本明細書において、半数体細胞を含むと理解されなければならない。いくつかの細胞が染色体転位置または融合を含有し、２つの染色体の一部が交換されるか、または１つの染色体の一部が別の染色体に融合していることが認識されるであろう。転位置または融合は、いくつかの技術によって、例えばバンディングパターンにおける改変を検出することによって、または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、認識されうる。本明細書の目的のため、ＦＩＳＨを用いて評価されるように、またはバンディングパターンを調べることによって、正常染色体上に存在する遺伝子情報の少なくとも半分が細胞内に存在し続けているならば、染色体は存在すると見なされる。
【００３４】
[0056]本発明のいくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のいくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞、例えば非ヒト霊長類細胞あるいはげっ歯類細胞、例えばマウス、ラットまたはウサギ細胞である。本発明のいくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は、造血系譜細胞、例えばリンパ系または骨髄系細胞である。本発明のいくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は腫瘍細胞であり、例えば元来は腫瘍から得られた細胞の子孫である。腫瘍は良性または悪性（「癌」）であってもよい。いくつかの態様において、腫瘍は癌腫、肉腫、または血液学的悪性疾患、例えば白血病（例えば慢性または急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ球性白血病）またはリンパ腫または骨髄腫である。いくつかの態様において、腫瘍細胞は造血系腫瘍細胞、例えば白血病またはリンパ腫または骨髄腫細胞である。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞株は、少なくともいくつかの近半数体細胞を含む細胞集団から単離され、例えばサブクローニングされる。例えば、個々の細胞からサブクローンを生成し、そして例えばフローサイトメトリーを用いてスクリーニングして、近半数体核型を有するサブクローンを同定してもよい。いくつかの態様において、近半数体細胞株は、染色体８に関するものを除いて半数体である。
【００３５】
[0057]特定の関心対象のいくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞は、ＫＢＭ７細胞株、またはそのサブクローンの細胞である（実施例を参照されたい）。本発明の他の態様において、近半数体哺乳動物細胞は、平滑筋肉腫細胞である（Ｄａｌ  Ｓｉｎ，  Ｐ．ら．，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，  １８５（１）：１１２−５，  １９８８）。
【００３６】
[0058]いくつかの態様において、近半数体細胞は、レポーターまたはセンサーをコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、レポーターまたはセンサーは、関心対象の表現型を持つかまたは持たない細胞を同定するために利用される。いくつかの態様において、レポーターをコードする遺伝子は、ゲノム内に安定して組み込まれる。例えば、転写レポーター遺伝子は、レポータータンパク質をコードする核酸を含んでもよく、ここで、核酸は、関心対象の転写制御要素、例えば関心対象のプロモーターに作動可能であるように連結されている。プロモーターの活性化は、レポータータンパク質をコードするｍＲＮＡの転写を生じる。レポータータンパク質が検出されると、プロモーターが活性であることが示され、そしてレポータータンパク質の発現レベルは、プロモーター活性レベルの指標を提供する。遺伝的にコードされる多様なセンサーが知られる（Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，  Ｋら  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．  ６４（１）：３−９，  ２００５）。
【００３７】
[0059]例えば上述のようなレポーターを使用して、当該技術分野に知られる多様なレポーター系を用いてもよい。以下にさらに記載するように、レポーターの活性を読み取り値として用いて、関心対象の遺伝子中に遺伝子トラップ構築物挿入を有する細胞を同定してもよい。関心対象の表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する目的のために用いられるレポーターまたはセンサーは、しばしば、ゲノム内に遺伝子トラップ構築物が挿入されている細胞を同定する目的で用いるものと同じではないことが認識されるであろう。
【００３８】
[0060]本発明は、遺伝子トラップベクターを含む近半数体哺乳動物細胞を提供する。本発明は、遺伝子トラップ構築物がゲノム内に挿入されて、遺伝子トラップ構築物が遺伝子を破壊している、近半数体哺乳動物細胞をさらに提供する。いくつかの態様において、構築物は安定に組み込まれ、したがって、細胞が分裂した際、娘細胞に引き継がれる。
【００３９】
[0061]非常に多様な方法が、近半数体哺乳動物細胞内に遺伝子トラップベクターを導入するのに適している。例には、ウイルス感染（例えばレトロウイルス感染）、トランスフェクション（例えばリン酸カルシウムまたは脂質に基づくトランスフェクション試薬を用いたもの）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等が含まれる。当業者は、例えばベクターおよび細胞の性質に基づいて、適切な方法を選択しうる。いくつかの態様において、細胞内に導入する前に、プラスミド遺伝子トラップベクターを直線化する。遺伝子トラップベクターと接触するすべての細胞がベクターを取り込むのではなく、そしてベクターを取り込んだすべての細胞がゲノム内への構築物の安定な挿入を生じるのではないことが認識されるであろう。いくつかの態様において、構築物の取り込みおよび挿入に適した条件下で、遺伝子トラップベクターと細胞を接触させた後、構築物を取り込み、そしていくつかの態様において、構築物がゲノム内に挿入された細胞を、レポーターに基づいて同定するかまたは選択する。例えば、細胞を分取に供してもよいし、あるいはレポーターを発現しない細胞の少なくとも、例えば９５％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれより多くが排除されるように、選択条件下で細胞を培養する。
【００４０】
[0062]本発明は、細胞の少なくともいくつかが、ゲノム内に組み込まれた本明細書記載の遺伝子トラップ構築物を含む、近半数体哺乳動物細胞のコレクション（「ライブラリー」）を提供する。（ａ）近半数体哺乳動物細胞集団（例えばほとんどまたは本質的に遺伝的に同一である近半数体細胞の集団、例えば単一細胞から得られるサブクローン）内に遺伝子トラップベクターを導入し（例えば感染、トランスフェクション、エレクトロポレーションによって）、ここで遺伝子トラップ構築物は少なくともいくつかの細胞のゲノム内に安定して挿入されるようになる；そして（ｂ）遺伝子トラップ構築物を含む細胞、例えばゲノム内に安定に組み込まれた遺伝子トラップ構築物を有する細胞を同定するかまたはこうした細胞に関して選択する工程によって、ライブラリーを産生することも可能である。典型的には、ライブラリーは、少なくともそのうちいくつかがゲノム中の異なる部位で組み込まれた遺伝子トラップ構築物を有する多数の細胞を含み、すなわちしたがって、ライブラリーは、複数の異なる遺伝子が不活性化された細胞を集合的に含む。本発明のいくつかの態様において、ライブラリー中の個々の細胞を単離し、そしてクローン拡大する。望ましい場合、単離され、そしてクローン拡大された、遺伝子改変細胞を分析して、以下にさらに論じるように組み込まれた構築物が隣接したゲノム配列を同定してもよい。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞のライブラリーは、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００細胞またはそれより多くを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、その種の細胞に存在する遺伝子の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％において、集合的に挿入を有する細胞を含む。
【００４１】
[0063]遺伝子同定および遺伝子スクリーン
[0064]本発明は、近半数体哺乳動物細胞において遺伝子スクリーンを行うための方法を提供する。いくつかの側面において、該方法は、細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する方法を提供する。本発明の方法のいくつかにしたがって、遺伝子トラップ構築物を含む遺伝子トラップベクターを近半数体哺乳動物細胞に導入する。いくつかの態様において、ベクターを取り込み、そして遺伝子トラップ構築物がゲノム内に挿入された細胞を同定する。いくつかの態様において、遺伝子、例えば活発に転写されている遺伝子内への（遺伝子間（ｉｎｔｅｇｅｎｉｃ）領域におけるのではなく）挿入が生じている細胞を同定する。関心対象の表現型を有する１またはそれより多い細胞を同定する。いくつかの態様において、細胞を操作するか、あるいは剤、例えば病原体もしくは化合物と接触させるか、または条件に曝露するなどのプロセスに細胞を供し、そしてこうした操作またはプロセスの後で、特定の表現型を示す細胞を同定する。構築物挿入部位に隣接するかまたはこうした部位近傍のゲノム配列を同定する。例えばこれらをクローニングし、そして配列決定してもよい。例えばゲノムデータベースと配列を比較することによって、構築物が挿入されている遺伝子を同定する。遺伝子破壊は、関心対象の表現型を生じるため、遺伝子が表現型に影響を及ぼすと推測されうる。
【００４２】
[0065]いくつかの態様において、本発明は、細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する方法であって：（ａ）培養中の近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、前記遺伝子トラップベクターは、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる核酸構築物を含み、そして該核酸構築物は、核酸であって、前記核酸を含有する細胞の同定を可能にする前記核酸を含む；（ｂ）ゲノム内に組み込まれた前記遺伝子トラップベクターを含有する細胞を同定し、ここで、該細胞は関心対象の表現型を示す；そして（ｃ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４３】
[0066]多様な方法を用いて、遺伝子トラップベクターが挿入されている遺伝子を同定することも可能である。いくつかの態様において、逆ＰＣＲを用いて、挿入に隣接するゲノム配列を同定する（例えば実施例を参照されたい）。いくつかの態様において、ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲを用いる（Ｈｏｒｎ，  Ｃ．ら，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ３９：８０７−８，  ２００７）。いくつかの態様において、５’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速増幅）を用いて、遺伝子トラップ融合転写物中に含有される細胞性配列を増幅する（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２（８），  ２００５を参照されたい）。Ｓｔａｎｆｏｒｄ，  Ｗ．ら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ４２０，  ２００６もまた参照されたい。
【００４４】
[0067]ＤＮＡが増幅されたら、ベクター内にクローニングして、そして／または配列決定してもよい。例えばｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを探査することによって、ゲノム中、近傍に位置するさらなる配列を同定するプローブとして該ＤＮＡを用いてもよい。該配列を用いて、配列データベース、例えば、米国バイオテクノロジー情報センターウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能な、例えばＥｎｔｒｅｚ、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的に利用可能な配列データベースを検索してもよい。ヒトゲノムは完全に配列決定されているため、一般的に、比較的少量の部分的配列データに基づいて、大部分の遺伝子を容易に同定することが可能であろう。いくつかの態様において、「ハイスループット」または「大規模平行」配列決定を同時に用いて、巨大な細胞集団から、挿入に隣接する配列を回収し、そして配列決定する。こうした配列決定技術は、合成（例えばＳｏｌｅｘａ技術を用いる）、連結による配列決定（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ技術を用いる）、４５４技術、またはピロシーケンスによる配列決定を含んでもよい。いくつかの態様において、数千、数万、またはそれより多い配列決定反応を平行して行って、「実行」あたり数百万またはさらに数十億のＤＮＡ配列塩基を生成する。これらの技術のいくつかの限定されない考察に関しては、例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  Ｊ  ＆  Ｊｉ  Ｈ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２６（１０）：１１３５−４５，  ２００８を参照されたい。配列決定技術が迅速に発展し、そして改善されていることが認識されるであろう。いくつかの態様において、合成による大規模平行配列決定を用いる。関心対象の表現型、および挿入に関して濃縮されているゲノム領域に関して、細胞プールまたは集団を選択してもよい。こうした領域は、研究している表現型に関与する、候補遺伝的要素、例えば遺伝子を含有する。いかなる理論によって束縛されることも望ましくないが、多数の（例えば１０，０００またはそれより多く、例えば１０，０００〜１００，０００の間；１０，０００〜５００，０００；または１０，０００〜１００万、５００万、１，０００万、２，０００万、５，０００万、１億、またはそれより多い）挿入を分析するこうしたアプローチは、挿入頻度が、表現型に影響を及ぼす少なくともいくつかの他の遺伝子または遺伝子領域内への挿入頻度と比較して比較的低い、遺伝子および遺伝子要素を回収するのを補助する可能性もあり、そして飽和スクリーン実行を容易にする可能性もある。ハイスループットまたは大規模平行配列決定技術を用いた多数の挿入部位の同時同定のための方法が、本発明の側面である。
【００４５】
[0068]本発明の遺伝子スクリーンを適用して、非常に多様な細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定することも可能である。例えば、いくつかの態様において、本発明は、病原体、例えばウイルスまたは特定の細菌毒素によって用いられる宿主因子、あるいは療法剤に対する反応またはプログラム細胞死の実行に必要な細胞構成要素を同定する方法を提供する。いくつかの態様において、突然変異細胞集団、例えば遺伝子トラップベクターを用いて生成される突然変異細胞集団において認識可能である任意の表現型に、スクリーンを適用する。
【００４６】
[0069]本発明は、微生物による感染に対する哺乳動物細胞の感受性に影響を及ぼす哺乳動物遺伝子を同定する方法を提供し、用語、微生物は、本明細書において、ウイルス、細菌、真菌、および原核生物を含むように用いられる。「感染」は、通常、微生物による細胞または多細胞生物（ときに、こうした細胞または多細胞生物は、「宿主」と呼ばれる）の有害なコロニー形成を指し、そして細胞内へのまたは多細胞生物の少なくともいくつかの細胞内への微生物の進入（侵入）、およびその結果の宿主に対する微生物の影響を指す。関心対象のいくつかの態様において、微生物は病原体であり、すなわち宿主、例えば哺乳動物宿主、例えばヒトにおいて、疾患または望ましくない臨床状態を引き起こすのに少なくとも部分的に原因となっている。大部分の態様において、微生物は細胞内病原体であり、すなわち細胞内で複製し、そして／またはその一生の少なくとも一部の間、または生活環の１またはそれより多いステージの間、細胞内に常住する。いくつかの態様において、生物は、少なくともいくつかの個体において、潜在性または慢性感染を確立するものである。いくつかの態様において、本発明は、病原体が病原性因子を発現する場合、病原体に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、病原性因子に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する方法を提供する。「感受性」は、典型的には、病原体または有害な剤に感染するか、またはこれらに不都合に影響を受ける脆弱性または傾向を指す。「宿主細胞因子」は、宿主によって産生される分子、例えば核酸またはタンパク質を指す。宿主細胞因子は、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、または細胞小器官に少なくとも部分的に局在するタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、宿主細胞因子は酵素である。「病原性因子」は、疾患を引き起こすかまたは疾患に寄与するか、あるいは病原体の生存または増殖を可能にするかまたは促進するように、宿主の機能に影響を及ぼす、病原体によって産生される分子を指す。いくつかの態様において、病原性因子は毒素である。「毒素」は、宿主に対して直接作用する病原性因子サブセットを指し、例えばこれらは１またはそれより多い細胞性核酸、タンパク質、または構造と物理的に相互作用する。例えば、毒素は、細胞性タンパク質を共有的に修飾し、そしてそれによって該タンパク質を活性化するかまたは不活性化し、細胞に有害な影響を生じることも可能である。いくつかの態様において、病原性因子は、その生活環の少なくとも一部の間、細胞内に常在しない、病原体によって産生される毒素である。例えば、多細胞宿主の感染中、毒素は、病原体によって分泌され、そして続いて、宿主の細胞と接触する。こうした毒素はしばしば「外毒素」と称される。毒素は、細胞表面分子と相互作用し、そして／または細胞に取り込まれ、そして細胞内で作用することも可能である。いくつかの態様において、毒素は、病原体によって不活性型で分泌され、そして多細胞生物において、例えば細胞内で、毒性型にプロセシングされる（例えば切断される）か、または別の方式で活性化される。
【００４７】
[0070]多くの細菌外毒素が関心対象である。例えば、病原性大腸菌によって産生される外毒素は、食中毒から毒素ショック症候群に渡る多くの深刻な疾病で大きな役割を果たす。炭疽毒は、胞子形成細菌である炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の主要病原性因子であり、そして疾患、炭疽に関連する潜在的に致死性の症状のいくつかに広く関与する。関心対象の他の毒素には、例えばジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびＰａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅロイコシジン（ＰＶＬ）が含まれる。ＰＶＬは細胞毒素であり、そしてベータ孔形成毒素の１つである。ＰＶＬの存在は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の特定の株（単離体）の病原性増加と関連する。これは研究されているコミュニティ関連メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＣＡ−ＭＲＳＡ）の大部分に存在し、そして壊死性出血性肺炎を含む、皮膚または粘膜に関与する壊死性（「肉食性」）病変の原因である。
【００４８】
[0071]いくつかの態様において、毒素は多細胞生物によって産生される。多細胞生物は、植物または動物であってもよい。動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。いくつかの態様において、動物は節足動物である。いくつかの態様において、動物は爬虫類または両生類である。いくつかの態様において、動物はクモ類（ａｒａｃｈｎｉｄ）である。いくつかの態様において、動物は環形動物（ａｎｎｅｌｉｄ）である。例えば、ヘビ、昆虫、植物、魚、クラゲ、蠕虫、クモ、サソリ、貝、または巻き貝（例えばイモガイ（ｃｏｎｅ  ｓｎａｉｌ））によって産生される毒素または毒液が関心対象である。いくつかの態様において、毒素は海洋または淡水毒素であり、この用語は、植物プランクトンおよびラン藻（ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ）などの特定の水性微生物によって産生される毒素を指す。いくつかの態様において、毒素は、真菌、例えばキノコによって産生される。特定の態様において、毒素は植物によって産生される。例えば、ＡＢ１毒素ファミリーには、ＩＩ型リボソーム不活性化植物毒素、例えばリシン、アブリン、シナノミン（ｃｉｎｎａｎｏｍｉｎ）、ビスキュミン、エブリン（ｅｂｕｌｉｎ）、およびニグリンｂが含まれる（Ｈａｒｔｌｅｙ，  ＭＲ  ＆  Ｌｏｒｄ，  ＪＭ，  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １７０１（１−２）：１−１４，  ２００４；  Ｘｕ  Ｈら，  Ｃｉｎｎａｍｏｍｉｎ−−ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ３６（３）：１６９−７６）。
【００４９】
[0072]本明細書に論じる特定の毒素および多くの他のものに関するさらなる情報が、以下の参考文献中に見出されうる：  Ａｌｏｕｆ，  ＪＥ  ＆  Ｐｏｐｏｆｆ，  ＭＲ（監修）  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ，  第３版，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００６；  Ｓｃｈｍｉｔｔ，  ＭＪ  ＆  Ｓｃｈａｆｆｒａｔｈ，  Ｒ（監修）  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ，  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ２００５；  Ｐｒｏｆｔ，  Ｔ．（監修）  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｏｘｉｎｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｏｒｆｏｌｋ，  Ｅｎｇｌａｎｄ：  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ｃ２００５。
【００５０】
[0073]いくつかの態様において、方法は：（ａ）近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる；（ｂ）近半数体哺乳動物細胞を病原体または病原性因子（例えば毒素）と接触させ；（ｃ）ゲノム内に組み込まれた前記核酸構築物を含有し、そして病原体または病原性因子に対する感受性改変を示す細胞を同定し；そして（ｃ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって病原体または病原性因子に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する工程を含む。感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子がまた、「耐性」、例えば病原体または潜在的に有害な剤に抵抗するか、またはこれらによって有意に不都合に影響を及ぼされない能力に影響を及ぼす宿主細胞因子と見なされることも理解されるであろう。本発明のスクリーンにおいて同定される遺伝子は、突然変異された場合、細胞に対して、病原体または病原性因子（または他の有害な剤）に対する耐性を与える遺伝子であることも可能である。
【００５１】
[0074]本発明のスクリーンを用いて、非常に多様な病原体またはこうした病原体によって産生される病原性因子に対する感受性に影響を及ぼす遺伝子および／または宿主因子を同定することも可能である。関心対象のウイルスには、例えば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡウイルス、レトロウイルス等が含まれる。これらは、例えば以下の科に属してもよい：アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ラブドウイルス科、レオウイルス科、トガウイルス科。特定の例には、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、および黄熱病ウイルスである。ウイルスの限定されない例およびこれらに関する情報は、例えば、Ｋｎｉｐｅ，  ＤＭおよびＨｏｗｌｅｙ，  ＰＭ（監修）  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  第Ｉ巻および第ＩＩ巻  第５版  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００７；  Ｂｕｃｈｅｎ−Ｏｓｍｏｎｄ，  Ｃ．（監修），  （２００６）Ｉｎｄｅｘ  ｔｏ  ＩＣＴＶｄＢ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ．：  ＩＣＴＶｄＢ−  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，  バージョン４中  ＩＣＴＶｄＢ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  Ｍａｉｌｍａｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ；および“ＩＣＴＶｄＢ−  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ”，  バージョン４，  Ａｐｒｉｌ  ２００６．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｔｖｄｂ．ｏｒｇ／Ｉｃｔｖ／ＩＣＴＶｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）およびＩＣＴＶｄｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｔｖｄｂ．ｏｒｇ／ＩＣＴＶｄＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）に見られる。（オンライン・データベースは、現在書き換え中であることに留意されたい）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＳｏｃｉｅｔｉｅｓのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＩＣＴＶ）の最新の報告：“Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：  ＶＩＩＩｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”，  ２００５，  Ｃ．Ｍ．  Ｆａｕｑｕｅｔ，  Ｍ．Ａ．  Ｍａｙｏ，  Ｊ．  Ｍａｎｉｌｏｆｆ，  Ｕ．  Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ，  およびＬ．Ａ．  Ｂａｌｌ（監修），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓは、ウイルス分類学（分類および命名法）に関する標準的でそして決定的な参考文献と見なされ、ＩＣＴＶによって続いて認可される命名提唱によって補完されるとおりである（アップデートとして、ＩＣＴＶウェブサイト上で、ｈｔｔｐ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｄｉａ／２２／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ／．  ｈｔｔｐ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／��ｉｌｅｓ／ｉｃｔｖ＿ｏｆｆｉｃｉａｌ＿ｔａｘｏｎｏｍｙ＿ｕｐｄａｔｅｓ＿ｓｉｎｃｅ＿ｔｈｅ＿８ｔｈ＿ｒｅｐｏｒｔ／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘとして入手可能）。関心対象の細菌には、例えばグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、抗酸菌等が含まれる。例は、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、例えばトラコーマ・クラミジア（Ｃ．  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ））、エリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｅｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコプラズマ目（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）（例えばアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、髄膜球菌（Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｉ））、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ）（例えばアシノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（例えば炭疽菌（Ａｎｔｈｒａｘ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ））、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、ラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）等が含まれる。関心対象の真菌には、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コクシジウム属（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）等が含まれる。関心対象の寄生虫には、例えば、アピコンプレクサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎｓ），例えばトキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、またはプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）；キネトプラスト類（ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄｓ）、例えばトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）等が含まれる。細菌、真菌、寄生虫、ウイルスの限定されない例、およびこれらに関する情報は、例えば、Ｂ．  Ｆｏｒｂｅｓら監修，  Ｂａｉｌｅｙ  ＆  Ｓｃｏｔｔ’ｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第１２版，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｍｏｓｂｙ，  ２００７に、そして／またはＧａｒｃｉａ，  Ｌ，，  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ；  第５版，  ２００６に見出される。当業者は、本発明のスクリーンで使用するための感染性病原体を容易に得ることが可能である。例えば、多くのこうした剤が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、英国健康保護局のカルチャーコレクション、および／または多くの他の世界中の保管所、コレクション、および実験室から得られうる。さらに、天然存在病原体の組換え、修飾、または偽型バージョンを本発明の方法において用いてもよいことが注目される。こうしたバージョンは、天然存在株に対して減少したまたは増加した病原性を有するか、あるいは改変された宿主範囲を有する可能性もある。
【００５２】
[0075]いくつかの態様において、病原体による哺乳動物細胞の感染、または病原性因子と細胞の接触は、細胞傷害性または細胞増殖の有意な減少を生じる。こうした例において、いくつかの態様において、その少なくともいくつかがゲノム内に組み込まれた遺伝子トラップ構築物を有する、近半数体哺乳動物細胞を、病原体が細胞に進入し、そして感染を確立するのに適した条件下（すなわち遺伝的に修飾されていない細胞が該生物によって感染すると期待される条件下）で、病原体と接触させる。こうした感染を生き抜き、そして／または増殖する細胞を同定し、そしてこうした細胞において遺伝子トラップ構築物が組み込まれた遺伝子（単数または複数）を同定する。こうした遺伝子は、感染に対する感受性に影響を及ぼし、そして病原体が侵入し、細胞内で生き残り、複製し、そして／または有害な影響を発揮するのに必要な１またはそれより多いプロセスに関与する宿主遺伝子の候補である。例えば、こうした遺伝子は、病原体による細胞の侵入に必要であるかまたはこれを促進する、細胞表面受容体または他の細胞性遺伝子をコードすることも可能である。こうした遺伝子は、複製、組み立て、または細胞からの病原体の放出（細胞溶解を生じうる）に必要であるかまたはこれらを促進する細胞性タンパク質、例えば酵素をコードすることも可能である。
【００５３】
[0076]いくつかの態様において、その少なくともいくつかがゲノム内に組み込まれた遺伝子トラップ構築物を有する、近半数体哺乳動物細胞を、遺伝的に修飾されていない細胞が毒性の影響を示すと予期される条件下で、病原性因子と接触させる。こうした接触後または接触中に、生き抜き、そして／または増殖する細胞を同定し、そしてこうした細胞において遺伝子トラップ構築物が組み込まれた遺伝子（単数または複数）を同定する。こうした遺伝子は、病原性因子に対する感受性に影響を及ぼし、そして病原性因子が細胞と相互作用するかまたは細胞に進入し、そして／または有害な影響を発揮するのに必要な１またはそれより多いプロセスに関与する宿主細胞の候補である。例えば、こうした遺伝子は、中毒に必要であるかまたはこれを促進する、例えば細胞内への病原性因子の進入（内在化）または細胞中の活性部位への病原性因子の輸送に必要であるかまたはこれを促進する、細胞表面受容体または他の細胞性遺伝子をコードすることも可能である。こうした遺伝子は、不活性病原性因子を毒性型に活性化するのに必要な細胞性タンパク質、例えば酵素をコードしてもよい。こうした遺伝子は、病原性因子の直接細胞性ターゲット、すなわち、有害な影響を生じる方式で、病原性因子が物理的に相互作用する（例えば共有的に修飾することによって）細胞性分子をコードすることも可能である。
【００５４】
[0077]当該技術分野に知られる方法を用いて、毒素、病原性因子、または他の剤を産生するかまたは得ることも可能である。いくつかの態様において、毒素、病原性因子、または剤は、天然にこれを産生する生物から単離される。いくつかの態様において、組換え的に産生された毒素（または他の病原性因子または剤）を用いて、本発明のスクリーンを行う。いくつかの態様において、キメラ毒素（例えば異なる毒素に由来するサブユニットを含む毒素）を用いる。例えば、ＡＢ毒素（例えばＡＢ５毒素）は、第一の細菌種由来のＡサブユニットおよび第二の細菌種由来のＢユニットを有してもよい。いくつかの態様において、毒素は、近半数体細胞と接触させる前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで「活性化」される。例えば、細胞と接触させる前に、毒素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断または他のプロセシングに供してもよい。いくつかの態様において、ホロ毒素を用いる。いくつかの態様において、例えば、毒素が多重サブユニット毒素である場合、スクリーンを行う際には、毒素の細胞傷害部分のみを用いれば十分である。他の態様において、例えば毒素が多重サブユニット毒素である場合、毒素の細胞傷害性部分以外のサブユニットを用いる。いくつかの態様において、野生型バージョンからは改変された（例えばより高いまたはより低い）毒性を有してもよい、遺伝子操作された突然変異体毒素を用いる。
【００５５】
[0078]いくつかの態様において、関心対象の病原体または病原性因子は、少なくとも、スクリーンを実行するのに用いる近半数体哺乳動物細胞においては、細胞傷害性または有意な増殖阻害を引き起こさない。こうした態様において、多様なアプローチを取って、病原体または病原性因子に対する改変された感受性を有する細胞を同定してもよい。いくつかの態様において、近半数体哺乳動物細胞に対して細胞傷害性になるように、病原体または病原性因子を修飾する。例えば、非毒性細胞内病原体を遺伝子修飾して、細胞に対して毒性である産物を生じるようにしてもよい。例えば、ウイルスを操作して、細菌外毒素を産生させてもよい。非細胞傷害性病原性因子を修飾して、より毒性が高い型にしてもよい。例えば、非細胞傷害性細菌外毒素を細胞傷害性部分、例えば細胞傷害性細菌外毒素に融合させて、こうして非細胞傷害性細菌外毒素の毒性型を生じてもよい（実施例６Ａを参照されたい）。こうしたタンパク質は、遺伝的にコードされることも可能な融合タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、非細胞傷害性病原性因子に対する毒性部分のコンジュゲート化、または毒性型の合成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成する。他の態様において、近半数体哺乳動物細胞を修飾して、病原体または病原性因子に対して感受性にしてもよい。改変された感受性を有する細胞の同定および／または感受性を改変する遺伝子の同定後、さらなる研究を行って、毒性部分に対する感受性を仲介する細胞および／または遺伝子に対して、非毒性病原体または病原性因子に対する感受性を仲介するものの間を区別することも可能であることが認識されるであろう。いくつかの態様において、毒性の欠如の理由が知られている場合、近半数体細胞を遺伝子修飾して感受性にしてもよい。例えば、細胞が病原体または病原性因子に関する受容体の発現を欠く場合、細胞を遺伝子操作してこうした受容体を発現させてもよい。スクリーンが、受容体をコードする遺伝子内に遺伝子トラップ構築物の挿入を有する少なくともいくつかの細胞をよく回収可能であることが認識されるであろう。しかし、さらなる遺伝子もまた、同定される可能性が高いであろう。
【００５６】
[0079]いくつかの態様において、遺伝子スクリーンは、細胞傷害性または増殖阻害以外の「読み取り値」に基づく。例えば、いくつかの態様において、病原性因子を修飾して、細胞取り込み後に容易に検出可能になる部分を含むようにする。例えば、部分は、細胞取り込み後、光学的検出可能シグナルを放出してもよい。いくつかの態様において、修飾病原性因子は、細胞内プロテアーゼによって切断されて、蛍光または発光または別の方式で光学的に検出可能な部分を生成する。いくつかの態様において、細胞が維持されている培地とは異なるｐＨを有する細胞質内へのまたは細胞内区画への修飾病原性因子の転位置は、部分の改変を引き起こし、光学的に検出可能なシグナルを生じる。いくつかの態様において、シグナルは、少なくとも部分的に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく。例えば、病原性因子を修飾して、蛍光原基質を切断可能な酵素、例えばプロテアーゼを含むようにしてもよく、ここで、切断は分子内ＦＲＥＴを妨害し、そして発光スペクトルを変化させる。遺伝子トラップ構築物がゲノム内に挿入されている近半数体哺乳動物細胞を、基質が取り込まれる（こうしたプロセスを基質での細胞の「装填」と称することも可能である）条件下で基質と接触させ、そして次いで、修飾病原性因子と接触させる。細胞が修飾病原性因子を内在化した後、基質切断は、発光スペクトルを改変する。したがって、修飾病原性因子の内在化に失敗した細胞を同定可能である。例えば、セファロスポリンに基づくフルオレセイン／クーマリン蛍光原基質ＣＣＦ２を加水分解可能な、病原性因子−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を利用する系を用いてもよい。こうした加水分解は、分子内ＣＣＦ２  ＦＲＥＴを破壊し、そしてフルオレセイン（ＥＭ  ５３０ｎｍ）からクーマリン（ＥＭ  ４６０ｎｍ）蛍光への放出変化を生じる。例えば、Ｊ．Ｐ．  Ｈｏｂｓｏｎら  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：２５９（２００６）；  Ｍ．  ＭｏａｙｅｒｉおよびＳ．Ｈ．  Ｌｅｐｐｌａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７：１９（２００４）；  Ｓ．  ＬｉｕおよびＳ．Ｈ．  Ｌｅｐｐｌａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：５２２７（２００３）を参照されたい。いくつかの態様において、基質は、酵素の切断部位を含むリンカーによって互いに連結されたフルオロフォアおよび消光剤を含み、ここで消光剤は、フルオロフォアからの発光を消滅させる。細胞に基質を装填する。修飾病原性因子の内在化によって切断が生じ、消光剤からフルオロフォアが遊離して、したがって、蛍光がもはや消光されなくなる。
【００５７】
[0080]他の態様において、遺伝的にコードされうるレポーターまたはセンサーの発現または活性を、関心対象の表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定する読み取り値として用いる。こうしたレポーターまたはセンサーを用いて、非常に多様な細胞プロセスまたは事象、例えば特定の遺伝子の転写、特定のプロモーターの転写活性化、リン酸化などのタンパク質修飾、細胞内カルシウム放出または流入、特定のタンパク質の核転位置、または任意の非常に多様なシグナル伝達事象に関与する遺伝子を同定してもよい。いくつかの態様において、レポーターまたはセンサーは、プロセス、事象の検出、または代謝物などの物質の検出を可能にする。こうしたプロセス、事象、あるいは物質の合成または分解／除去において役割を果たすかまたはこれらに影響を及ぼす遺伝子産物をコードする遺伝子において挿入を有する細胞は、こうした挿入を持たない細胞とは異なる表現型を示し、そしてしたがって同定可能であり、したがって遺伝子の同定が可能になる。いくつかの態様において、レポーターを用いて、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達経路、ＴＧＦベータ・シグナル伝達経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ｐ５３経路、ＣＤＫ経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、あるいは生合成または分解経路に関する情報を提供する。例えば、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）  ＰＡＴＨＷＡＹ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ）を参照されたい。
【００５８】
[0081]いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物細胞において、剤の活性に役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定するための方法を提供する。剤は、関心対象の任意の物質であってもよい。剤は、有機または無機化合物、例えば小分子（この用語は、有機化合物、典型的には多数の炭素−炭素結合を含有し、２，５００ダルトンまたはそれ未満、例えば２，０００ダルトンまたはそれ未満、例えば１，５００ダルトンまたはそれ未満、あるいは例えば１，０００ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する有機化合物を指す）、核酸、タンパク質、脂質、または炭水化物であってもよい。剤は、化合物ライブラリーのメンバーであってもよく、用語、化合物ライブラリーは、構造的に関連しても、構造的に多様であっても、または関連しなくてもよい、化合物のコレクションを指す。ライブラリーは、例えば、１００〜５００，０００化合物、またはそれより多くを含んでもよい。剤は、合成剤（例えば、人によって発明された構造を有し、そして天然には見られない剤）または天然に存在する剤であってもよい。剤は、物質の組み合わせであってもよく、これらは定義されていても（すなわちこれらの構造または同一性が知られる）、または少なくとも部分的に定義されていなくても（例えば抽出物または培養上清）よい。
【００５９】
[0082]いくつかの態様において、剤は「薬剤」（本明細書において、「療法剤」とも称される）であり、該用語は、被験体における疾患または状態を治療するか、防止するか、もしくは診断するか、または特定の目的のため、体内において、化学的プロセスを修飾するのに用いられる物質、あるいはこうした使用のための候補である物質を指す。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  第１１版，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  ２００５，  Ｋａｔｚｕｎｇ，  Ｂ．（監修）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ；  第１０版（２００６）または第１１版（Ｊｕｌｙ  ２００９）を参照されたい。典型的には、用語「薬剤」は、主に、被験体への一般的な栄養を提供するために投与される食品または物質を指さない。「治療」は、疾患の１またはそれより多い症状または徴候を治癒させ、軽減し、そして／または疾患進行を遅延させることを指しうる。「防止」は、疾患または状態を発展させていない被験体に、疾患または状態が生じる可能性を減少させるように、あるいは疾患または状態が生じた場合に、これらの重症度を減少させるように、剤を投与することを指しうる。被験体は、疾患または状態を発展させるリスクがあると同定されることも可能である（例えば集団の多くの大部分の他のメンバーに比較して増加したリスクがあるかまたは疾患を発展させる可能性が増加しているリスク要因を有するとして）。いくつかの態様において、剤は有害な剤、例えば毒性剤（病原体によって産生される物質であってもまたはなくてもよい）である。本発明の特定の態様において、関心対象の剤、例えば薬剤は、抗新生物剤である。本発明の特定の態様において、関心対象の剤は、酵素阻害剤（例えばキナーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤）、プロテアソーム阻害剤、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ホルモン、サイトカイン、またはケモカインである。被験体は、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物または鳥類であってもよい。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ）、有蹄動物（例えばヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ種）、イヌ、およびネコであってもよい。いくつかの態様において、動物は、経済的に重要な哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、またはヒツジなどである。
【００６０】
[0083]本発明は、哺乳動物細胞における剤の活性において役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する方法であって：（ａ）近半数体哺乳動物細胞内に、遺伝子トラップベクターを導入し、ここで、該遺伝子トラップベクターは、核酸であって、前記核酸を発現している細胞の同定を可能にするレポーターをコードする前記核酸を含む核酸構築物を含み、前記核酸構築物は、前記近半数体哺乳動物細胞のゲノム内に組み込まれる；（ｂ）非突然変異体近半数体細胞に対して検出可能な影響を引き起こすのに十分な濃度の剤と、哺乳動物細胞を接触させ；（ｃ）ゲノム内に組み込まれた前記核酸構築物を含有し、そして前記影響を示さない（あるいはその影響をより高い度合いまたはより低い度合いで示す）細胞を同定し；そして（ｄ）核酸構築物が組み込まれた遺伝子を同定し、それによって哺乳動物細胞における剤の活性において役割を果たす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する工程を含む、前記方法を提供する。句「哺乳動物細胞において」は、少なくとも部分的に細胞外部で作用する剤、例えば細胞表面分子に結合し、そして細胞に対して影響を発揮するために内在化する必要がない剤を含むと理解されなければならない。こうした剤は、細胞表面分子であって、細胞内ドメインを有するか、または細胞内ドメインを有する別の細胞表面分子と相互作用する、前記細胞表面分子と相互作用して、そしてそれによって、細胞外にありつつ、細胞内で影響を発揮することも可能である。「細胞に対する影響」は、前記細胞におけるレポーターに対する影響であってもよいし、そして／または細胞内レポーターを細胞に対する影響の読み取り値または代理として用いてもよい。「非突然変異細胞に対する検出可能な影響を引き起こすのに十分な濃度」を経験的に決定してもよいし、またはこれらは当該技術分野に知られることも可能である。「非突然変異体」細胞は、典型的には、ゲノム内に組み込まれた遺伝子トラップ構築物を持たない近半数体細胞を意味する。
【００６１】
[0084]病原体は、関心対象の細胞タイプ、臓器または臓器系を感染させうる。例えば、いくつかの態様において、病原体は肝臓、例えば肝細胞を感染させる。いくつかの態様において、病原体は、免疫系細胞、例えばリンパ球またはマクロファージを感染させる。いくつかの態様において、病原体は、呼吸器系、例えば呼吸器上皮細胞を感染させる。いくつかの態様において、病原体は神経系（例えばニューロン）を感染させる。いくつかの態様において、病原体は皮膚細胞（例えばケラチノサイト）を感染させる。いくつかの態様において、病原体は粘膜細胞、例えば胃腸管の細胞を感染させる。いくつかの態様において、病原体は赤血球を感染させる。病原性因子または剤は、関心対象の細胞タイプ、臓器または臓器系に影響を及ぼしうる。例えば、いくつかの態様において、病原性因子または剤は、肝臓、例えば肝細胞に影響を及ぼしうる。いくつかの態様において、病原性因子または剤は、免疫系細胞、例えばリンパ球またはマクロファージに影響を及ぼしうる。いくつかの態様において、病原性因子または剤は、呼吸器系、例えば呼吸器上皮細胞に影響を及ぼしうる。いくつかの態様において、病原性因子または剤は神経系（例えばニューロン）に影響を及ぼすことも可能であり、例えば神経毒である。いくつかの態様において、病原性因子または剤は皮膚細胞（例えばケラチノサイト）に影響を及ぼしうる。いくつかの態様において、病原性因子または剤は粘膜細胞、例えば胃腸管の細胞に影響を及ぼしうる。いくつかの態様において、病原性因子または剤は赤血球に影響を及ぼしうる。
【００６２】
[0085]本発明のいくつかの態様において、関心対象の表現型は、例えばアポトーシスを誘導する能力を有する剤または状態に反応して、アポトーシスを経る傾向である。剤は、例えばプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導する薬剤であってもよい。
【００６３】
[0086]したがって、いくつかの側面において、本発明は、近半数体哺乳動物細胞集団および病原体を含む組成物を提供する。細胞、病原体、および感染多重度（ＭＯＩ）の絶対数は多様でありうる。「感染多重度」は、感染ターゲット（例えば細胞）に対する感染性病原体の比を指す。当業者は、用いる細胞および病原体の適切な量を決定することが可能であろう。望ましい場合、病原体ストックの希釈範囲を試験して、適切な量を同定してもよい。いくつかの態様において、１０−４〜１０２の間のＭＯＩを用いる。例えば、０．００１〜１０の間のＭＯＩ、例えば０．０１〜１の間のＭＯＩを用いてもよい。いくつかの態様において、１０％〜１００％の間の細胞に対して、検出可能な効果、例えば病的変化を生じるのに適した病原体の量を用いる。いくつかの側面において、本発明は、近半数体哺乳動物細胞集団および剤、例えば毒素、薬剤、または他の剤を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、１０％〜１００％の間の細胞に対して検出可能な効果を生じるのに適した剤の量を用いる。
【００６４】
[0087]最初のスクリーンにおいて剤が同定されたならば、さらなる研究を行って、関心対象の表現型における遺伝子の役割を確認し、そして／または分析してもよい。こうした確認の前には、遺伝子は、「候補遺伝子」と称されることも可能であり、これは該遺伝子が、関心対象の表現型に影響を及ぼす候補であることを示す。例えば、候補遺伝子は、遺伝子内に挿入された遺伝子トラップ構築物を持たない近半数体細胞において、または任意の関心対象の細胞において、「ノックダウン」されていてもよい。「ノックダウン」は、典型的には、例えば転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、またはタンパク質安定性レベルで生じることも可能な、発現の減少を指す。こうしたノックダウンは、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて達成可能である。こうした減少は、完全（例えば遺伝子産物量がバックグラウンドレベルに減少する）または完全未満であってもよい。例えば、ＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルでの発現は、５０％、７５％、９０％、またはそれより多く減少してもよい。こうしたノックダウンが表現型に影響を有する場合、遺伝子は表現型に影響を及ぼすと確認される。当業者は、多様なアプローチを用いて、ＲＮＡｉが達成可能であることを認識するであろう。例えば、細胞を、候補遺伝子にターゲティングされた小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と接触させてもよいし、または細胞を修飾して、候補遺伝子にターゲティングされた小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの前駆体分子を発現させてもよく、この前駆体分子が細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを生じる。当該技術分野で知られるように、ｓｉＲＮＡは、典型的には、互いにハイブリダイズして二重鎖部分を形成する、２つの別個の核酸鎖を含む。例えば、標準的核酸合成技術を用いて、あるいは例えばＲＮアーゼＩＩＩまたはＲＮアーゼＩＩＩ様酵素、例えばダイサーによって、より長いｄｓＲＮＡを切断することによって、これらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成してもよい。特定の態様において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、長さ約１５〜２９ヌクレオチド（ｎｔ）の間、例えば長さ１７〜２５ｎｔの間、例えば長さ１９〜２３ｎｔの間の二重鎖部分を含み、どちらかまたは両方の鎖は、場合によって、長さ１〜５ヌクレオチド（例えば２ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有し、これはデオキシヌクレオチドで構成されてもよい。いくつかの態様において、鎖は、二重鎖部分内で、完全に相補的である一方、他の態様において、二重鎖部分は１またはそれより多いミスマッチ・ヌクレオチド対またはバルジを含有してもよい。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡの各鎖は、長さ１５〜２９ヌクレオチドの間、例えば長さ１９〜２５ｎｔの間、例えば長さ２１〜２３ｎｔの間である。ｓｈＲＮＡは、主に非自己相補性領域によって分離された２つの相補性部分を含有する単一核酸鎖を含む。相補性部分はハイブリダイズして、二重鎖構造を形成し、そして非自己相補性領域は、二重鎖の一方の鎖の３’端および他方の鎖の５’端を連結するループを形成する。ｓｈＲＮＡは細胞内プロセシングを経て、ｓｉＲＮＡを生成することも可能である。いくつかの態様において、ノックダウンの効果が、候補遺伝子の発現を阻害する結果であ���（「オフ−ターゲット」効果であるよりも）ことを確実にするのを補助するため、候補遺伝子をターゲットとする少なくとも２つの異なるｓｉＲＮＡを用いる。他の態様において、候補遺伝子内への挿入を有する近半数体細胞を遺伝子修飾して、候補遺伝子を発現させる。こうした発現が挿入の効果を逆転させるならば、候補遺伝子は、細胞表現型に影響を及ぼすことが確認される。いくつかの態様において、遺伝子修飾は、細胞内に、候補遺伝子の遺伝子産物をコードする核酸を導入する工程を伴う。適切なベクター、例えばウイルスまたはプラスミドを用いて、核酸を細胞内に導入してもよい。典型的には、遺伝子産物をコードする核酸は、細胞中での発現を指示するのに適した発現調節要素（単数または複数）、例えばプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーに、作動可能であるように連結される。発現調節要素（単数または複数）は、恒常性または制御可能（例えば誘導可能）であってもよいし、そして細胞または組織タイプ特異的であってもよいし、あるいは多くの、大部分の、またはすべての細胞タイプにおいて、発現を指示してもよい。いくつかの態様において、導入される遺伝物質の少なくとも一部は、細胞ゲノム内に安定して組み込まれる。
【００６５】
[0088]いくつかの態様において、候補遺伝子内への挿入を有する近半数体細胞を遺伝子修飾して、候補遺伝子の遺伝子産物変異体を発現させる。変異体は、候補遺伝子にコードされる遺伝子産物と、１またはそれより多いヌクレオチドまたはアミノ酸の付加、欠失、または置換によって、異なってもよい。いくつかの態様において、変異体は、遺伝子産物長の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％に渡って、候補遺伝子にコードされる産物に、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも同一である。当該技術分野に知られる方法を用いて、同一性パーセントを決定してもよい。例えば、配列を並列させて、同一性が最大になるようにギャップの導入を許容し、同一残基と反対である残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定し、ＴＧＡおよびＴＧＢ（ここで、ＴＧＡおよびＴＧＢは、並列中の配列ＡおよびＢにおける残基および内部ギャップ位の数の合計である）の最小値で割り、そして１００を乗じることによって、関心対象の配列Ａおよび第二の配列Ｂの間の同一性パーセントを計算してもよい。特定の同一性パーセントを達成するのに必要な同一残基の数を計算する際、小数を最も近い整数に四捨五入する。当該技術分野に知られる多様なコンピュータプログラムを使用して、配列を並列させてもよい。例えば、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ等のコンピュータプログラムは並列を生成する。ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３におけるように修飾された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２２６４−２２６８，  １９９０）は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，  １９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。いくつかの態様において、比較目的のため、ギャップ化並列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されるように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメーターを使用してもよい。ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を有するウェブサイトを参照されたい。他の適切なプログラムには、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，  Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ，  Ｎｕｃ  Ａｃ  Ｒｅｓ，  ２２：４６７３−４６８０，  １９９４）およびＧＡＰ（ＧＣＧバージョン９．１；  ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの１９７０アルゴリズムを実行する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＳＢ，  Ｗｕｎｓｃｈ  ＣＤ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ４８：４４３−４５３，  １９７０．）が含まれる。変異体配列は、例えば、ランダムに産生されてもよいし、または人によって��計されてもよい。いくつかの態様において、変異体は、候補遺伝子によってコードされる産物と比較した際、減少した活性を有する。例えば、活性は、候補遺伝子によってコードされる産物と比較した際、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多く減少していてもよい。いくつかの態様において、変異体は、候補遺伝子によってコードされる産物と比較した際、不活性である（例えば活性は検出不能であるかまたはバックグラウンドレベル以内である）か、または非常に減少している（例えば少なくとも９０％減少している）。例えば、遺伝子産物が酵素である場合、酵素は触媒的に不活性であるか、または触媒活性が非常に減少していてもよい。いくつかの態様において、変異体は、酵素活性に必要な残基の欠失または置換を有してもよい。いくつかの態様において、残基は、他の酵素との相同性に基づいて、必要と予測される。いくつかの態様において、残基は、活性に必要であると実験的に検証されている。不活性であるかまたは非常に減少した活性を有する変異体の発現が、遺伝子トラップ挿入の影響を逆転させるのに失敗する場合、候補遺伝子は、細胞表現型に影響を及ぼすと確認される。例えば、いくつかの態様において、挿入は、近半数体哺乳動物細胞を病原体による感染に耐性にする。候補遺伝子の遺伝子産物の不活性変異体の発現が、感受性を回復するのに失敗する場合、候補遺伝子産物は、病原体の感染に必要であると確認される。いくつかの態様において、遺伝子産物が多数の活性を有する場合、特定の活性を欠く変異体が遺伝子トラップ挿入の影響を逆転させるのに失敗すれば、変異体において欠けている特定の活性に該表現型が起因することがさらに検証される。不活性であるかまたは非常に減少した活性を有する変異体は、さらなる使用を有しうる。いくつかの態様において、こうした変異体は、病原体、病原性因子、毒素、または他の剤の阻害剤として作用しうる。例えば、変異体は、剤に結合可能であるが、細胞に対する剤の影響を仲介不能である。いくつかの態様において、変異体は機能変異体であり、すなわち、変異体は、変異体である分子の少なくとも１つの生物学的活性を少なくとも部分的に保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、非相同または不活性ポリヌクレオチドまたはタンパク質から区別可能であるのに十分な活性を保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、変異体である分子の活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保持し、例えばほぼ等しい活性を保持する。いくつかの態様において、機能変異体は、変異体である分子よりも高い活性を有してもよい。
【００６６】
[0089]いくつかの態様において、タンパク質変異体は、１またはそれより多い保存的アミノ酸置換を含む。保存的置換は、関与する残基の側鎖サイズ、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて実行可能である。当該技術分野に知られるように、こうした置換は、一般的に、非保存的置換と比較した際、活性を保持する変異体を生じる可能性がより高い。１つの態様において、アミノ酸は、以下のように分類される：
特別：  Ｃ
中性および小さい：  Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ
極性および比較的小さい：  Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ
極性および比較的大きい：  Ｒ、Ｈ、Ｋ
非極性および比較的小さい：  Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ
非極性および比較的大きい：  Ｆ、Ｗ、Ｙ
特別：  Ｃ
[0090]例えば、Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ５０：５６−６８，  ２０００）を参照されたい。いくつかの態様において、プロリン（Ｐ）は、それ自体のグループ中、二番目に特別なアミノ酸と見なされる。特定のグループにおいて、ある置換が特に関心対象である可能性もあり、例えばイソロイシンによるロイシン（またはその逆）、スレオニンによるセリン（またはその逆）、またはグリシンによるアラニン（またはその逆）の置換である。もちろん、非保存的置換もまた、しばしば、機能の保持と適合する。いくつかの態様において、置換または欠失は、活性に重要なアミノ酸を改変するかまたは欠失させない。いくつかの態様において、機能変異体は、変異体であるポリペプチドの全長の例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％または１００％に渡って、変異体であるポリペプチドに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。望ましい場合、変異体は、その活性を評価する、細胞不含アッセイおよび／または細胞に基づくアッセイで試験されてもよい。
【００６７】
[0091]いくつかの態様において、本発明は、候補遺伝子中に挿入を含む近半数体細胞のコレクションを提供し、ここで近半数体細胞は、候補遺伝子にコードされる産物の変異体を発現し、変異体は配列が異なる。配列の改変は、例えば発現レベル、活性、局在等に影響を及ぼしうる。変異体を発現している近半数体細胞のコレクションを用いて、例えば遺伝子産物の機能および／または細胞に作用する剤の作用機構、あるいは病原体の生活環における遺伝子産物の役割をさらに分析してもよい。
【００６８】
[0092]いくつかの態様において、変異体は異種配列を含む。例えば、ポリペプチドの変異体は、異種ポリペプチド部分を含んでもよい。異種部分は、しばしば、ポリペプチド中に存在しないかまたは相同でない配列を有する。異種部分は、例えば、長さ５〜約５，０００アミノ酸またはそれより長くてもよい。異種部分は、しばしば、長さ５〜約１，０００アミノ酸の間である。いくつかの態様において、異種部分は、異なるタンパク質、例えば機能ドメイン中で見られる配列を含む。いくつかの態様において、異種部分は、タンパク質を精製し、発現し、可溶化し、そして／または検出するのに有用な配列を含む。いくつかの態様において、異種部分は、「タグ」、例えばアフィニティタグまたはエピトープタグを含む。例えば、タグは、アフィニティタグ（例えばＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、６ＸＨｉｓ、Ｆｌａｇ、ＧＳＴ）、蛍光または発光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ）、溶解度増進タグ（例えばＳＵＭＯタグ、ＮＵＳ  Ａタグ、ＳＮＵＴタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒタンパク質の単量体突然変異体）であってもよい。例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  ＤおよびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ＤＫ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；  １７（４）：３５３−８（２００６）を参照されたい。いくつかの態様において、タグは、多数の機能を行ってもよい。タグはしばしば、比較的小さく、例えば長さ数アミノ酸〜最大約１００アミノ酸の範囲内である。いくつかの態様において、タグは長さ１００アミノ酸を越え、例えば最大長さ約５００アミノ酸である。いくつかの態様において、タグは、例えばＮまたはＣ末端融合物として、ＮまたはＣ末端に位置する。ポリペプチドは、多数のタグを含んでもよい。いくつかの態様において、タグは切断可能であり、したがって、例えばプロテアーゼによって、ポリペプチドから除去可能である。例示的なプロテアーゼには、例えば、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、因子Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ等が含まれる。いくつかの態様において、「自己切断」タグを用いる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０５／０５７６３を参照されたい。いくつかの態様において、タグまたは他の異種配列は、ポリペプチドリンカーによって、タンパク質の残りから分離される。例えば、リンカーは、短いポリペプチド（例えば１５〜２５アミノ酸）であってもよい。しばしば、リンカーは、セリン、グリシン、および／またはアラニンなどの小さいアミノ酸残基で構成される。異種ドメインは、膜貫通ドメイン、分泌シグナルドメイン等を含んでもよい。ポリペプチドの変異体、または該変異体を発現する細胞を、例えばポリペプチドの活性または発現を調節する（例えば阻害する）化合物を同定するアッセイにおいて用いてもよいし、ポリペプチドの生成を促進するためなどに用いてもよい。したがって、特定の態様において、本発明は、本明細書に記載するように同定される候補遺伝子にコードされる遺伝子産物（例えばポリペプチド）のタグ化または別の方式で修飾されたバージョンの使用に関する。
【００６９】
[0093]望ましい場合、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、例えば細胞、例えば近半数体哺乳動物細胞に存在する配列を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはその変異体を産生してもよい。例えばポリペプチドを発現している細胞から（例えばＰＣＲまたは他の増幅法によって、あるいはクローニングによって）、あるいは既知のｃＤＮＡまたはポリペプチド配列に基づく合成によって、ポリペプチドをコードする核酸を容易に得ることも可能である。当業者は、遺伝暗号の縮重により、多くの異なる核酸配列が所望のポリペプチドをコードすることを知っている。場合によって、配列は、選択した宿主細胞において、発現のためにコドン最適化されている。例えば天然配列を、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて修飾することによって、または他の標準法によって、変異体をコードする核酸を容易に生成することも可能である。
【００７０】
[0094]通常、プラスミドまたはウイルス（例えばウイルスゲノムの一部として）などのベクター中で、適切な発現調節要素に作動可能であるように連結された、所望のポリペプチドをコードする核酸を、原核または真核細胞内に導入してもよい。他の態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて、ポリペプチドを産生する。例示的な細胞には、例えば、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞（例えば酵母）が含まれる。当業者は、適切な発現調節要素（例えばプロモーター）に気付くであろう。プロモーターは、恒常性または制御可能、例えば誘導可能または抑制可能であってもよい。細菌細胞で使用するのに適した例示的なプロモーターには、例えば、Ｌａｃ、Ｔｒｐ、Ｔａｃ、ａｒａＢＡＤ（例えばｐＢＡＤベクター中）、ファージプロモーター、例えばＴ７またはＴ３が含まれる。哺乳動物細胞において発現を指示するのに有用な、例示的な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス極初期プロモーター、あるいはウイルスプロモーター／エンハンサー配列、レトロウイルスＬＴＲ、哺乳動物遺伝子、例えばアクチン、ＥＦ−１アルファ、メタロチオネイン等に由来するプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーが含まれる。バキュロウイルス系のポリヘドリン・プロモーターは、昆虫細胞において、タンパク質を発現するのに利用される。当業者は、適切な発現調節要素（単数または複数）、選択可能マーカー、クローニング部位等を含有する多くの発現ベクターを知っており、そしてこれらを好適に用いて、関心対象のポリペプチドを発現させることも可能である。場合によって、こうしたベクターには、タグを含むポリペプチドの好適な産生を可能にする、タグをコードする配列が含まれる。ベクターを細菌、酵母、植物、または動物細胞内に導入するのに適した方法（例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等）、ならびに望ましい場合、ベクターを取り込んでいる細胞を選択する方法および安定な細胞株を得る方法。当該技術分野に知られる方法を用いて、ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物または植物を産生してもよい。
【００７１】
[0095]ポリペプチドを産生するため、適切な期間に渡って、培養中に細胞を維持してもよく、そしてポリペプチドを単離し、そして場合によってさらに精製する（もちろん、また、ポリペプチドを発現する生物から直接得た細胞または組織から、ポリペプチドを単離してもよい）。標準的タンパク質単離／精製技術を用いてもよい。いくつかの態様において、アフィニティに基づく方法を用いる。例えば、ポリペプチドに対する抗体を使用してもよい。タグ化ポリペプチドの場合、用いる特定のタグに応じて、適切な単離法を選択してもよい。
【００７２】
[0096]本発明の方法を用いて同定される遺伝子は、多くの異なる使用を有する。こうした使用法は、本発明の１つの側面である。例えば、微生物または病原性因子の病因形成に役割を果たすか、あるいは剤の毒性に役割を果たす宿主細胞因子（および／またはこうした宿主細胞因子をコードする遺伝子またはＲＮＡ）は、微生物または病原性因子または剤によって引き起こされるかまたはこれらに対して寄与する感染または疾患または有害な影響を治療する療法剤開発のためのターゲットである。本発明は、薬剤開発のためのターゲットを同定する方法であって、本発明の遺伝子トラップベクターに基づく方法を用いて、病原体または病原性因子または剤に対する感受性に影響を及ぼす遺伝子を同定し、ここで、遺伝子の突然変異は、病原体または病原性因子または剤に対する感受性を減少させる、それによって、病原体による感染を治療するかまたは防止する、あるいは少なくとも部分的に該病原性因子または剤によって引き起こされる疾患または状態を治療するかまたは防止する薬剤の開発のためのターゲットを同定する工程を含む、前記方法を提供する。本発明はさらに、候補薬剤を同定する方法であって、（ｉ）本発明の遺伝子トラップベクターに基づく方法を用いて、病原体または病原性因子または剤に対する感受性に影響を及ぼす遺伝子を同定し、ここで、遺伝子の突然変異は、病原体または病原性因子に対する感受性を減少させる；そして（ｉｉ）遺伝子の発現産物の発現または活性を阻害する化合物を同定し、それによって候補薬剤を同定する工程を含む。望ましい阻害の正確な性質、および化合物を同定する方式は、遺伝子産物の同一性および／または活性に、そして感受性に影響を及ぼす際のその役割に、少なくとも部分的に応じうる。例えば、遺伝子が、病原体または病原性因子の細胞表面受容体をコードする場合、細胞表面受容体を物理的に遮断するか、あるいはその合成（転写、翻訳、または翻訳後プロセシング）または輸送を阻害する化合物が望ましい可能性もある。遺伝子が酵素、例えば細胞内酵素をコードする場合、酵素またはその合成を阻害する化合物が望ましい可能性もある。阻害（例えばプロセス、発現レベル、または活性の阻害）の度合いは多様でありうることが理解されるであろう。例えば、本発明の多様な態様において、阻害は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の減少を指してもよい。化合物は、遺伝子産物の発現または活性を阻害するのではなく「相殺（ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔ）」してもよい。例えば、化合物は、遺伝子産物によって下方制御される経路を上方制御してもよいし、または遺伝子産物によって上方制御される経路を下方制御してもよい。当業者は、候補遺伝子によってコードされるＲＮＡが、タンパク質をコードする以外に、１またはそれより多い機能を有してもよいことを認識するであろう。例えば、ＲＮＡは、遺伝子またはタンパク質制御、スプライシング、ｍＲＮＡプロセシング、転写後修飾、ＤＮＡ複製、タンパク質合成等に直接関与してもよい。こうした「機能性ＲＮＡ」の例には、例えば、マイクロＲＮＡ前駆体、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、および当該技術分野において「長い非コーディングＲＮＡ」または「長い非タンパク質コーディングＲＮＡ」とときに称される、より長いＲＮＡが含まれる。特定の機能性ＲＮＡが、１またはそれより多い他の機能を有するのに加えて、タンパク質をコードしてもよいことに注目すべきである。
【００７３】
[0097]化合物を発見するために、当該技術分野に知られる方法を用いて、遺伝子、遺伝子産物、または経路に作用する化合物を同定してもよい。こうした方法は、化合物ライブラリーのスクリーニング（例えばハイスループットスクリーニングを用いる）、構造に基づくおよび／または計算的薬剤設計（例えばバーチャルスクリーニング）等を伴ってもよい。本発明の方法において、非常に多様な試験化合物を用いてもよい。例えば、試験化合物は、小分子、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはハイブリッド分子であってもよい。天然供給源から化合物を得てもよいし、または化合物を合成的に産生してもよい。化合物は、少なくとも部分的に純粋であってもよいし、あるいは、抽出物または他のタイプの混合物中に存在してもよい。抽出物またはその部分は、例えば、植物、動物、微生物、海洋生物、発酵ブロス（例えば土壌、細菌または真菌発酵ブロス）等から産生可能である。本発明の多様な態様において、核酸は、標準的ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕと略される）、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを含む。他の態様において、核酸は１またはそれより多い非標準ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、１またはそれより多いヌクレオチドは、非天然存在ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。核酸は、多様な態様において、化学的または生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、修飾糖（２’−フルオロリボース、アラビノース、またはヘキソース）、修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートまたは５’−Ｎ−ホスホロアミダイト連結）、ロック化核酸、またはモルホリノを含んでもよい。いくつかの態様において、核酸は、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、少なくともいくつかのヌクレオシドは、非ホスホジエステル結合によって連結される。核酸は、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖であってもよい。少なくとも部分的に二本鎖である核酸は、１またはそれより多いオーバーハング、例えば５’および／または３’オーバーハング（単数または複数）を有してもよい。研究または療法目的のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アプタマー、またはアンチセンスに基づく分子の背景において有用であると当該技術分野で知られる、核酸修飾（例えばヌクレオシドおよび／または主鎖修飾）、非標準ヌクレオチド、送達ビヒクルおよびアプローチ等が、本発明の多様な態様で使用するために意図される。例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，  ＳＴ（監修）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００８；  Ｋｕｒｒｅｃｋ，  Ｊ．（監修）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ＲＳＣ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００８を参照されたい。核酸は、検出可能標識、例えば蛍光色素、放射性原子等を含んでもよい。「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い核酸、例えば典型的には長さ約４〜約６０ヌクレオチドの間��核酸を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、交換可能に使用可能である。本明細書において、関心対象のタンパク質は、しばしば、標準的アミノ酸（タンパク質において、天然に最も一般的に見られる２０のＬ−アミノ酸）を含有する。しかし、本発明の特定の態様において、他のアミノ酸（天然に存在するものまたはしないものいずれか）および／または当該技術分野に知られるアミノ酸類似体を用いてもよい。ポリペプチド中の１またはそれより多いアミノ酸（例えばＮ末端またはＣ末端で、あるいは側鎖中で）を、例えばアルキル基、炭水化物基、リン酸基、ハロゲン、コンジュゲート化のためのリンカーなどの部分の付加、例えば共有結合によって、修飾してもよい。
【００７４】
[0098]いくつかの態様において、化合物コレクション（「ライブラリー」）を試験する。ライブラリーは、例えば、１００〜５００，０００化合物、またはそれより多くを含んでもよい。化合物は、しばしば、マルチウェルプレート中にアレイ化される。これらを溶媒（例えばＤＭＳＯ）中に溶解してもよいし、あるいは乾燥型で、例えば粉末または固体として提供してもよい。合成、半合成、および／または天然存在化合物のコレクションを試験してもよい。化合物ライブラリーは、構造的に関連した、構造的に多様な、または構造的に関連しない化合物を含んでもよい。化合物は人工的（人によって発明された構造を有し、そして天然には見られない）であってもまたは天然に存在してもよい。いくつかの態様において、ライブラリーは、他の薬剤発見プログラムにおいて、「ヒット」または「リード」と同定されている、少なくともいくつかの化合物、および／またはその誘導体を含む。化合物ライブラリーは、天然産物、および／または非配向性または配向性合成有機化学を用いて生成された化合物を含んでもよい。しばしば、化合物ライブラリーは、小分子ライブラリーである。他の関心対象のライブラリーには、ペプチドまたはペプトイドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、およびオリゴヌクレオチドライブラリーが含まれる。
【００７５】
[0099]ライブラリーは、フォーカシングされていてもよい（例えば、主に同じコア構造を有する化合物で構成されるか、同じ前駆体に由来するか、または少なくとも１つの生化学的活性を共通して有する）。化合物ライブラリーは、Ｔｏｃｒｉｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｎｏｓｙｎ、ＢｉｏＦｏｃｕｓなどの多くの商業的業者から、そして政府機関から、入手可能である。例えば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）分子ライブラリープログラムの構成要素である分子ライブラリー小分子リポジトリー（ＭＬＳＭＲ）は、例えば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイで用いるための既知のおよび未知の生物学的活性を持つ、＞３００，０００の化学的に多様な化合物のコレクションを同定し、獲得し、維持し、そして分配するように設計されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｌｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｌｉ／を参照されたい）。ＮＩＨ臨床コレクション（ＮＣＣ）は、ヒト臨床試験での使用歴を有する、およそ４５０の小分子のプレーティングされたアレイである。これらの化合物は安全プロファイルが知られた非常に薬剤様のものである。ＮＣＣコレクションは、６枚の９６ウェルプレート中にアレイ化されている。１００％ＤＭＳＯ中、およそ１０ｍＭ溶液として、５０μｌの各化合物を供給する。いくつかの態様において、「認可されたヒト薬剤」を含む化合物のコレクションを試験する。「認可されたヒト薬剤」は、米国食品医薬品局、欧州医薬品審査庁、または療法剤の市販を許可する前に、少なくともその安全性を評価する責任がある、類似の政府機関などの政府監督機関によって、ヒトを治療する際に使用することが認可されている化合物である。試験化合物は、例えば抗新生物、抗細菌、抗ウイルス、抗真菌、抗原生動物、抗寄生虫、抑鬱、抗精神病、麻酔、抗狭心症、降圧、抗不整脈、抗炎症、鎮痛、抗血栓、制吐、免疫調節、抗糖尿病、脂質またはコレステロール低下（例えばスタチン）、抗痙攣、抗凝固、抗不安、催眠（睡眠誘導）、ホルモン、または抗ホルモン薬剤等であってもよい。いくつかの態様において、化合物は、少なくともいくつかの前臨床または臨床開発を経ているか、あるいは「薬剤様」特性を有すると決定されているかまたは予測されているものである。例えば、試験化合物は、第Ｉ相試験または少なくとも非ヒト動物での前臨床試験を完了しており、そして安全性および許容性の証拠が示されているものであってもよい。いくつかの態様において、試験化合物は、化合物を投与可能な生物の細胞、または化合物を試験可能な細胞に対して、使用しようとする濃度で、またはいくつかの態様において、使用しようとする濃度の１０倍、１００倍、または１，０００倍より高い濃度で、実質的に非毒性である。例えば、細胞生存度および／または増殖に対して統計的に有意な影響はない可能性もあるし、あるいは多様な態様において、生存または増殖における減少は、１％、５％、または１０％より高くない可能性もある。任意の多様なアッセイ（このうちいくつかを上に言及する）を用いて、細胞傷害性および／または細胞増殖に対する影響を評価してもよい。いくつかの態様において、試験化合物は、当該技術分野に知られるかまたは用いられる細胞培地、例えば脊椎動物、��えば哺乳動物細胞を培養するのに適した培地中に見られる化合物ではなく、あるいは試験化合物が、当該技術分野に知られるかまたは用いられる細胞培地中に見られる化合物である場合、該試験化合物は、本発明の方法で用いられる場合、異なる、例えばより高い濃度で用いられる。
【００７６】
[00100]適切なアッセイは、多様な態様において、細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイである。例えば、適切なアッセイにおいて、遺伝子産物を産生する（例えば組換え技術または化学合成を用いる）かまたは精製して（例えば該産物を発現する細胞から）、そして遺伝子産物の発現または活性を調節する（例えば阻害する）化合物を同定するのに適したアッセイにおいて用いるか、あるいは、細胞を化合物と接触させて、そして活性または発現を調節する（例えば阻害する）ものを同定してもよい。望ましい場合、本発明の特定の態様において、候補遺伝子産物の変異体、例えばポリペプチドのタグ化型を用いてもよい。アッセイの詳細は、例えば特定の遺伝子産物の性質に基づいて選択可能である。例えば、遺伝子産物が酵素である場合、該酵素活性に適したアッセイを用いてもよい。結合アッセイを用いてもよい。レポーターに基づくアッセイを用いて、例えば発現に対する影響を評価してもよい。特定の態様において、ハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）を行う。ハイスループットスクリーンは、細胞不含アッセイまたは細胞に基づくアッセイを利用してもよい。ハイスループットスクリーンは、しばしば、高い効率で、例えば平行して、非常に多数の化合物を試験することを伴う。例えば、短時間に、例えば数時間から数日間で、何万または何十万の化合物をルーチンにスクリーニングすることも可能である。しばしば、こうしたスクリーニングは、例えば９６、３８４、１５３６、３４５６、またはそれより多いウェル（しばしばマイクロウェルまたはマイクロタイタープレートまたはディッシュと称される）を含有するマルチウェルプレート、あるいは支持体中に多数の物理的に分離された腔が存在する他の容器で行われる。ハイスループットスクリーンは、例えば液体取り扱い、画像化、データ獲得およびプロセシング等のため、自動化の使用を伴ってもよい。本発明をいかなる点でも限定することなく、本発明のＨＴＳの態様において適用可能な特定の一般的な原理および技術が、Ｍａｃａｒｒｏｎ  Ｒ  ＆  Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ  ＲＰ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５６５：１−３２，  ２００９および／またはＡｎ  ＷＦ  ＆  Ｔｏｌｌｉｄａｙ  ＮＪ．，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８６：１−１２，  ２００９、および／またはこれらのいずれかにおける参考文献に記載される。例示的な方法はまた、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｐ．  ＪａｎｚｅｎによるＨｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（２００２）およびＪｏｒｇ  ＨｕｅｓｅｒによるＨｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（２００６）にも開示される。
【００７７】
[00101]最初のスクリーンにおいて同定された化合物を、例えば、療法剤として使用するため、化合物の１またはそれより多い特性を改善することを目的とする医薬品化学の取り組みの出発点として、そして／または療法剤として使用するためにより望ましい特性を有しうる構造的に関連する化合物を同定するために、用いてもよい。化合物は、例えば、最初のヒットと比較した際、１またはそれより多い改善された（すなわちより望ましい）薬力学および／または薬物動態学的特性を有してもよいし、あるいは単に異なる構造を有してもよい。例えば、化合物は、関心対象の分子ターゲットに対するより高いアフィニティ、非ターゲット分子に対するより低いアフィニティ、より高い可溶性（例えば増加した水溶性）、増加した安定性、増加した生物学的利用能、および／または減少した副作用（単数または複数）等を有してもよい。遺伝子産物に作用する、例えば該産物を阻害する化合物を、さらに性質決定し、そして／または試験して、関連する病原体による感染を阻害する能力、および／または関連する病原性因子または他の剤によって引き起こされる有害な影響（または他の影響）を阻害する能力を評価してもよい。こうした化合物は、細胞培養中、動物モデル中、および／またはヒトにおいて、性質決定し、そして／または試験することも可能である。こうした方法は、本発明の側面である。
【００７８】
[00102]いくつかの態様において、化合物は、同定される遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗体またはアプタマーなどの他の剤である。関心対象の分子に結合する抗体およびアプタマーを産生するための方法は、当該技術分野によく確立されている。用語「抗体」は、免疫グロブリン、および抗原に結合可能な免疫グロブリンドメインを含有するその誘導体を含む。抗体は、哺乳動物または鳥類種、例えばヒト、げっ歯類（例えばマウス、ウサギ）、ヤギ、ニワトリ等から生じてもよいし、あるいはファージディスプレイなどの技術を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されてもよい。抗体には、多様な免疫グロブリンクラスのメンバー、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２等が含まれる。本発明の多様な態様において、「抗体」は、抗原結合部位を保持し、そして１またはそれより多い可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）を含む組換え分子を含む、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）などの抗体断片または分子を指す。抗体は、多様な態様において、一価、二価または多価であってもよい。抗体は、キメラまたは「ヒト化」抗体であってもよい。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい可能性もある。いくつかの側面において、抗体はイントラボディであり、これを細胞内で発現させてもよい。いくつかの態様において、化合物は、一本鎖抗体およびタンパク質形質導入ドメイン（例えば融合ポリペプチドとして）を含む。したがって、本発明は、本発明の遺伝子トラップ挿入スクリーンを用いて同定される候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物に特異的に結合する抗体およびアプタマーを提供する。
【００７９】
[00103]いくつかの態様において、化合物は、例えば対応するｍＲＮＡの切断を誘導することによって、同定された遺伝子の発現を特異的に阻害するよう設計されたＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡである。したがって、本発明は、本発明の遺伝子トラップ挿入スクリーンを用いて同定された候補遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤を提供する。
【００８０】
[00104]いくつかの側面において、候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物を、療法剤としてまたは研究目的のために用いてもよい。例えば、いくつかの態様において、候補遺伝子は、病原体または毒性剤が結合する遺伝子産物、例えば病原体または毒性剤の細胞内への進入を仲介する受容体をコードする。こうした遺伝子産物の組換え体、精製された、または化学的に合成された型（あるいは病原体または毒性剤に結合する能力を保持するその変異体）を被験体に投与してもよく、そして病原体または毒性剤への結合に関して、内因性細胞性遺伝子産物と競合させ、こうして細胞に対する病原体または毒性剤の影響を減少させてもよい。
【００８１】
[00105]いくつかの態様において、遺伝子産物または該遺伝子産物に関与する生物学的経路に作用する化合物は、すでに知られている。このアプローチは、既知の化合物、例えばＦＤＡ認可薬剤の新規使用の同定を補助しうる。いくつかの態様において、薬剤開発のためのターゲットは、本発明のスクリーンを用いて同定された遺伝子または宿主細胞因子であり、ここで、遺伝子または宿主細胞因子は、細胞生存および／または増殖に必須ではない。いくつかの態様において、薬剤開発のためのターゲットは、本発明のスクリーンを用いて同定される遺伝子または宿主細胞因子であり、ここで、遺伝子または宿主細胞因子の発現または活性を阻害しても、細胞に対して検出可能な有害な影響はない。
【００８２】
[00106]特定の毒素が、療法剤または診断剤として利用されることが注目される。例えば、ボツリヌス毒素は、神経筋肉伝達を遮断し、そして多様な療法的および美容的目的のために用いられている。毒性を仲介する際に、または有用な毒素の他の影響を仲介する際に関与する遺伝子の同定を利用して、例えば類似の目的のために、または潜在的な副作用を減少させるために、あるいはこうした毒素の活性を改善するかまたは修飾する目的のために用いようとする、新規剤の開発を促進してもよい。毒素の影響を仲介する遺伝子が同定されると、こうした毒素がその影響を発揮する生物学的経路（単数または複数）をターゲットとする新規剤の開発のためのターゲットが提供されることも可能であり、こうしたターゲットを、例えばこうした経路が関与する疾患を治療するための療法剤を開発するために利用してもよい。
【００８３】
[00107]本発明はまた、剤が細胞に対する影響を有するために必要な遺伝子産物を同定する方法も提供する。１つのこうした方法は、近半数体哺乳動物細胞において遺伝子を同定する工程を含み、ここで遺伝子への遺伝子トラップ構築物の挿入が、該影響を阻害するかまたは防止する。いくつかの態様において、同定される遺伝子は、剤の直接または間接的ターゲット、例えば細胞表現型に影響を及ぼす方式で、剤によって改変される遺伝子産物をコードする。いくつかの態様において、同定される遺伝子は、剤の活性に必要なタンパク質、例えば細胞内への剤の進入を仲介する輸送体、または剤を活性型に変換する酵素をコードする。該方法を用いて、剤、例えば薬剤の作用機構を解明してもよい。剤が薬剤である場合、同定される遺伝子産物は、例えば薬剤を用いようとするものと同じかまたは類似の疾患または状態を治療するための、薬剤開発のためのターゲットである。いくつかの態様において、方法を用いて、薬剤に対する耐性に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する。例えば、癌細胞はしばしば、抗新生物剤に耐性になる。本発明の方法を用いて、こうした耐性を仲介する遺伝子を同定することも可能である。こうした遺伝子にコードされるＲＮＡまたはタンパク質を阻害する化合物を利用して、薬剤耐性を防止するかまたは逆転させることも可能である。
【００８４】
[00108]本発明は、多くの異なる細胞表現型に影響を及ぼす遺伝子、ならびに該遺伝子を使用する方法を提供する。実施例６Ａ、６Ｂ、および７に記載するように、炭疽およびジフテリア毒素、ならびに細胞致死性膨張性毒素に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する遺伝子スクリーンを行って、そして突然変異が耐性を与える遺伝子を同定した。実施例８に記載するように、インフルエンザウイルスに対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する遺伝子スクリーンを行って、そして突然変異が耐性を与える遺伝子を同定した。スクリーンで同定された遺伝子を、例えば薬剤開発のターゲットとして用いる方法は、本発明の側面である。したがって、いくつかの側面において、本発明は、炭疽毒素に対する感受性を減少させる（耐性を増加させる）候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物の阻害剤を同定し、それによって炭疽毒素を産生する病原体（例えば炭疽菌（Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ））による感染に苦しんでいるかまたはそのリスクがある、あるいは炭疽毒素による有害な影響に苦しんでいるかまたはそのリスクがある被験体を治療するための候補剤を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、候補遺伝子はＷＤＲ８５である。いくつかの態様において、本発明は、ジフテリア毒素に対する感受性を減少させる（耐性を増加させる）候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物の阻害剤を同定し、それによってジフテリア毒素を産生する病原体（例えばジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））による感染に苦しんでいるかまたはそのリスクがある、あるいはジフテリア毒素による有害な影響に苦しんでいるかまたはそのリスクがある被験体を治療するための候補剤を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、候補遺伝子はＷＤ反復ドメイン８５（ＷＤＲ８５；  ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：９２７１５；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：６７２２８）。いくつかの側面において、本発明は、細胞致死性膨張性毒素に対する感受性に影響を及ぼす候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物の阻害剤を同定し、それによって細胞致死性膨張性毒素（ＣＴＤ）を産生する病原体による感染に苦しんでいるかまたはそのリスクがある、あるいは細胞致死性膨張性毒素による有害な影響に苦しんでいるかまたはそのリスクがある被験体を治療するための候補剤を同定する工程を含む方法を提供する。ＣＴＤは、多様な細菌、例えばグラム陰性細菌、例えばアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｅｃｏｍｉｔａｎｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）種、大腸菌、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種（例えばチフス菌（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ））、およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種によって産生される。いくつかの側面において、本発明の方法は、大腸菌ＣＴＤに関する。いくつかの態様において、候補遺伝子は、膜貫通タンパク質８１（ＴＭＥＭ８１；ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：３８８７３０；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：７４６２６）、スフィンゴミエリン・シンターゼ１（ＳＧＭＳ１；ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２５９２３０；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２０８４４９）、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２（ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２３５４５；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２１８７１）、またはゴルジ糖タンパク質１（ゴルジ装置タンパク質１とも呼ばれる；  Ｇｌｇ１；ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２７３４、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２０３４０）である。いくつかの側面において、本発明は、インフルエンザウイルスに対する感受性を減少させる（耐性を増加させる）候補遺伝子の遺伝子産物の阻害剤を同定し、それによってインフルエンザウイルス感染に苦しんでいるかまたはそのリスクがある被験体を治療するための候補剤を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、候補遺伝子は、溶質キャリアーファミリー３５（ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）、メンバーＡ２（ＳＬＣ３５Ａ２；ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：７３５５；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：２２２３２）またはシチジン・モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ；ヒト遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：５５９０７；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子に関する遺伝子ＩＤ：１２７６４）である。当業者は、米国バイオテクノロジー情報センターウェブサイトで利用可能なものなどの公共データベース、例えばＧｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎおよび／またはＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースを用いて、これらのポリペプチドに関するアミノ酸配列、およびこれらをコードする遺伝子の配列（例えばヒトまたは他の種において）を容易に見出すことも可能である。
【００８５】
[00109]遺伝子産物を阻害する化合物をさらに性質決定し、そしてまたは試験して、関連する病原体による感染を阻害し、そして／または関連する毒素によって引き起こされる有害な効果を阻害する能力を評価することも可能である。こうした化合物を細胞培養中、動物モデル中、および／またはヒトにおいて試験してもよい。こうした方法が本発明の側面である。
【００８６】
[00110]療法使用の化合物を、場合によって、例えば当該技術分野に知られるような、１またはそれより多い適切な薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤と組み合わせて、薬学的組成物を産生してもよい。経口、鼻内、皮下、筋内、静脈内、動脈内、非経口、腹腔内、クモ膜下腔内、気道内、眼、舌下、膣、直腸、皮膚、または例えばエアロゾルとして、吸入によるなどの任意の適切な手段によって、被験体に薬学的組成物を投与してしてもよい。薬学的組成物および投与経路の特徴および成分を、例えば治療しようとする状態に少なくとも部分的に基づいて、選択してもよい。用語「薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤」は、組成物の活性成分（単数または複数）の生物学的活性または有効性に有意に干渉せず、そして用いられるかまたは投与される濃度で、被験体に対して過剰に毒性でない、キャリアー（この用語は、キャリアー、媒体、希釈剤、溶媒、ビヒクル等を含む）または賦形剤を指す。他の薬学的に許容されうる成分もまた、組成物中に存在しうる。薬学的活性化合物の配合に適した物質およびその使用が当該技術分野に周知である（例えば、薬学的に許容されうる物質および多様なタイプの薬学的組成物を調製する方法の考察に関しては、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  第１９版，  １９９５，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．：  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ、およびその最近の版またはバージョン、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．  第２１版  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００５を参照されたい）。薬学的組成物は、典型的には、意図される投与経路と適合するように配合される。例えば、非経口投与のための調製には、無菌水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンが含まれる。水性キャリアーには、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体、例えば塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチル、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；保存剤、例えば抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調整のための剤である。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨを調整してもよい。こうした非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに封入されていてもよい。監督機関によって規定される標準または規準を満たす条件下で、こうした組成物中で使用するための薬学的組成物および化合物を製造してもよい。例えば、製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）にしたがってこうした組成物および化合物を製造してもよいし、そして／またはこうした組成物および化合物を、ヒトに投与しようとする薬学的剤に適切な品質管理法に供してもよい。
【００８７】
[00111]経口投与のため、当該技術分野に周知の薬学的に許容されうるキャリアーと、活性化合物を組み合わせることによって、化合物を容易に配合することも可能である。こうしたキャリアーは、本発明の化合物が、治療しようとする被験体による経口摂取のため、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁物等として配合されることを可能にする。経口投薬型に適した賦形剤は、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。望ましい場合、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどを添加してもよい。場合によって、また経口配合物を生理食塩水または内部酸性状態を中和するための緩衝剤中に配合してもよいし、あるいはいかなるキャリアーも含まずに投与してもよい。適切なコーティングを伴う糖衣錠コアを提供する。この目的のため、濃縮糖溶液を用いてもよく、該溶液は、場合によってアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。同定するため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるため、染色剤または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【００８８】
[00112]経口で使用可能な薬学的調製物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールで作製された柔らかい密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに場合によって安定化剤と混合された、活性成分を含有してもよい。軟カプセル中、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用に配合された微小球体もまた使用可能である。こうした微小球体は、当該技術分野においてよく定義されてきている。
【００８９】
[00113]経口送達用の配合物は、胃腸管における安定性を改善し、そして／または吸収を増進する剤を取り込んでもよい。
[00114]吸入による投与のため、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素、フルオロカーボンなどのガスを含有する加圧容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で、本発明の組成物を送達してもよい。液体または乾燥エアロゾル（例えば乾燥粉末、巨大孔粒子等）を用いてもよい。本発明はまた、鼻スプレーまたは鼻投与の他の形を用いた組成物の送達も意図する。
【００９０】
[00115]局所適用のため、こうした組成物中で使用するのに適した１またはそれより多い薬学的に許容されうるキャリアー中に懸濁または溶解された活性構成要素を含有する、適切な軟膏、ローション、ジェル、またはクリーム中に薬学的組成物を配合してもよい。
【００９１】
[00116]目への局所送達のため、例えば点眼剤において、または軟膏において使用するため、等張、ｐＨ調整無菌生理食塩水中の溶液または微粒子化懸濁物として、薬学的に許容されうる組成物を配合してもよい。
【００９２】
[00117]経粘膜または経皮送達のため、薬学的組成物を配合してもよい。経粘膜または経皮投与のため、配合物中で、障壁に浸透するのに適した浸透剤を用いてもよい。こうした浸透剤は、当該技術分野に一般的に知られる。本発明の薬学的組成物を、座薬として（例えばココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用的な座薬基剤とともに）または直腸送達のための停留浣腸として、配合してもよい。
【００９３】
[00118]いくつかの態様において、薬学的組成物には、体からの迅速な排除に対して活性剤（単数または複数）を保護することを意図する１またはそれより多い剤が含まれ、例えば徐放配合物、移植物、微小被包送達系などがある。化合物を粒子、例えばマイクロ粒子またはナノ粒子内に被包するかまたは取り込んでもよい。生体分解性生体適合性ポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリエーテル、およびポリ乳酸を用いてもよい。こうした配合物の調製法は、当業者には明らかであろう。例えば、そして限定なしに、ｓｉＲＮＡの送達のため、粒子に基づく多くの送達系が当該技術分野に知られる。本発明はこうした組成物の使用を意図する。リポソームまたは他の脂質に基づく粒子もまた、薬学的に許容されうるキャリアーとして用いられうる。
【００９４】
[00119]いくつかの態様において、本発明の方法にしたがって同定されるかまたは検証される化合物の薬学的に許容されうる誘導体を用いる。本発明にしたがって、特定の化合物の薬学的に許容されうる誘導体には、限定されるわけではないが、必要とする被験体に投与した際、直接または間接的に、化合物を提供することが可能な、薬学的に許容されうる塩、エステル、こうしたエステルの塩、あるいは任意の他の付加体または誘導体が含まれる。したがって、薬学的に許容されうる誘導体には、塩、プロドラッグ、および／または活性代謝物が含まれうる。用語「薬学的に許容されうる塩」は、確かな医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー性反応等を伴わずに、ヒトおよび／またはより低次の動物の組織と接触させて使用するのに適しており、そして合理的な利益／リスク比と釣り合っている、塩を指す。非常に多様な適切に薬学的に許容されうる塩が、当該技術分野に周知である。薬学的に許容されうる塩には、限定されるわけではないが、適切な無機および有機酸および塩基に由来するものが含まれる。薬学的に許容されうる誘導体を配合し、そして一般的に同じ目的（単数または複数）のために用いる。
【００９５】
[00120]薬学的組成物は、被験体に投与される際、好ましくは、例えば感染を治療するかまたは毒性剤の影響を軽減するために投与される疾患または状態を治療するのに十分な時間、および十分な量で投与される。細胞培養または実験動物において、標準的薬学的方法によって、活性剤の療法効率および毒性を評価してもよい。ヒトまたは他の被験体で使用するのに適した投薬量範囲で配合する際に、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを用いてもよい。当該技術分野に知られるように、ヒトにおける臨床試験において、ヒト投与のため、異なる用量をさらに試験してもよい。用いる用量は許容される最大用量またはより低い用量であってもよい。薬学的組成物における活性剤の療法的に有効な用量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であってもよい。他の例示的な用量には、例えば、約１μｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。いくつかの態様において、単一用量を投与する一方、他の態様において、多用量を投与する。一般の当業者は、特定の任意の状況において適切な用量は、利用する剤（単数または複数）の強度に応じ、そして場合によって特定のレシピエントに対して合わせる（ｔａｉｌｏｒ）ことも可能であることを認識するであろう。被験体のための特別の用量レベルは、使用する特定の剤（単数または複数）の活性、疾患または障害の重症度、被験体の年齢、体重、全身健康状態を含む多様な要因に応じる可能性もある。
【００９６】
[00121]薬学的組成物、特に経口または非経口組成物を、投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、単位投薬型で配合することが望ましい可能性もある。単位投薬型は、本明細書においてこの用語を用いる際、治療しようとする被験体のための単位投薬型として適した、物理的に別個の単位を指し；各単位は、適切な薬学的に許容されうるキャリアーと関連して、望ましい療法効果を生じるように計算された、あらかじめ決定された量の活性剤（単数または複数）を含有する。
【００９７】
[00122]療法措置には、長期に渡る、多数の単位投薬型の投与が含まれてもよいことが理解されるであろう。少なくとも部分的に、治療中の特定の状態および／または被験体の反応に基づいて、投与期間を選択してもよい。期間は、数日から数週、数ヶ月、または数年の範囲であってもよい。いくつかの態様において、期間は、１日から約４週である。他の態様において、より長い療法期間、例えば約４〜約１０週間の間に渡って投与する。いくつかの態様において、状態の少なくとも１つの症状または徴候の重症度が減少し始めるか、あるいは重症度が有意に減少するか、あるいは被験体がもはや状態を発展させるリスクがなくなるまで、被験体を治療する。いくつかの態様において、治療を無期限に、例えば予防を達成するために続けてもよい。被験体は、１日に１より多い用量を投与されてもよいし、あるいは治療期間内で、１日おきにまたはより頻繁でなく用量を投与されてもよい。
【００９８】
[00123]いくつかの態様において、２またはそれより多い化合物を組み合わせて投与し、ここで、化合物の少なくとも１つは、本発明の遺伝子トラップ挿入スクリーンを用いて同定された遺伝子産物を阻害する。いくつかの態様において、第二の化合物は、関心対象の状態を治療するのに有用であることがすでに当該技術分野で知られている。併用治療に関する句「組み合わせて」は、本明細書において、第一および第二の化合物の投与に関して、（ｉ）最近投与された第一の剤の用量の９０％より多くが不活性型に代謝されるかまたは体から排出される前に、第二の化合物の用量が投与されるか；あるいは（ｉｉ）第一および第二の化合物の用量が互いに４８時間以内に投与されるか；あるいは（ｉｉｉ）重複する期間（例えば連続するかまたは中断する注入によって）、剤が投与されるか；あるいは（ｉｖ）前述の任意の組み合わせのように行われる投与を意味する。化合物は、単一の組成物の構成要素としてともに投与されてもよいが、そうである必要はない。いくつかの態様において、これらは、実質的に同時に（これによって、互いに１０分以内であることを意味する）個々に投与されてもよい。いくつかの態様において、これらは、互いに短時間の間に（これによって、３時間未満、ときに１時間未満離れていることを意味する）個々に投与されてもよい。化合物は、同じ投与経路によって投与されてもよいが、そうである必要はない。第二の化合物と組み合わせて投与される場合、特定の生物学的反応を誘発するのに必要な第一の化合物の有効量は、第二の化合物の非存在下で投与される際の第一の化合物の有効量より少なくてもまたは多くてもよく（またはその逆も可能である）、それによって、一方の化合物が他方の化合物の非存在下で投与される際に必要であろう量と比較して、どちらかまたは両方の剤の用量の調整が可能になる。例えば、特定の態様において、化合物を組み合わせて投与する場合、どちらかの化合物の療法投薬量未満、または両方の療法投薬量未満を、投与が必要な被験体の治療において使用してもよい。「療法量未満」は、本明細書において、他方の化合物の非存在下で投与された際、被験体において療法的結果を生じると予期される量よりも少ない、例えば推奨される量よりも少ない量を指す。多数の化合物の効果は、付加的または相乗的であってもよいが、そうである必要はない。１またはそれより多い化合物を多数回投与してもよい。
【００９９】
[00124]いくつかの態様において、特定の病原体に感染した被験体を治療するのに有用であると当該技術分野に知られる剤を、第二の化合物として、本明細書に記載するように同定された化合物、例えばその阻害が病原体による感染に対する感受性を減少させる候補遺伝子の阻害剤と組み合わせて用いる。いくつかの態様において、療法的に有用であるには十分に活性でない化合物は、本明細書に記載するように同定された阻害剤と組み合わせて投与された際、療法的に有用となる。いくつかの態様において、本明細書に記載するように同定された化合物と組み合わせて投与された際、こうした化合物をより低い用量で用いることも可能である。
【０１００】
[00125]いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載するように同定された化合物、および同じ状態を治療するのに有用な第二の化合物を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、２つ（またはそれより多く）の剤を含む単位投薬型を提供する。
【０１０１】
[00126]薬学的に許容されうる化合物、および場合によって１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分を含有する、１またはそれより多い容器（例えばバイアル、アンプル、瓶）を含む、薬学的パックまたはキットとして、化合物を提供してもよい。こうした容器（単数または複数）と場合によって関連するのは、薬学的製品の製造、使用または販売を監督する政府機関によって規定された形の公示であってもよく、こうした公示は、ヒト投与のための製造、使用または販売の該機関による認可を反映する。公示は、例えば投与用量、経路、および／または方法、認可される適応症、作用機構、あるいは開業医および／または患者に対する使用情報を記載してもよい。異なる成分が、固体（例えば凍結乾燥）または液体型で供給されてもよい。各成分は、一般的に、それぞれの容器中でアリコットされるか、または濃縮型で提供されるのに適しているであろう。キットにはまた、凍結乾燥成分の再構成用の媒体も含まれてもよい。キットの個々の容器は、好ましくは、商業的販売のため、厳重な閉鎖（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）下で維持される。
【０１０２】
[00127]いくつかの態様において、本発明は、関心対象の化合物の合成または代謝などの生物学的プロセスに関与する遺伝子の同定を可能にする。こうした遺伝子の同定は、改善された合成経路の操作、および／または薬剤作用を改善するかまたは副作用の可能性を減少させる方法の開発を可能にすることも可能である。
【０１０３】
[00128]近半数体哺乳動物細胞と同じ種由来の候補遺伝子を、本発明の多様な側面において使用してもよいし、または特定の態様において、異なる哺乳動物種由来の相同遺伝子（例えばオルソログまたは最も類似の配列を有する遺伝子）を用いてもよいことが認識されるであろう。例えば、近半数体ヒト細胞を用いて、候補遺伝子を同定してもよく、そして非ヒト動物の相同遺伝子の阻害剤に関するスクリーンを行ってもよいし、または相同遺伝子が遺伝子修飾されている遺伝子修飾非ヒト動物を産生してもよい。例えば候補遺伝子または遺伝子産物の名称および／または配列を用いて、データベースを検索することによって、異なる種において相同遺伝子を容易に同定することも可能である（または当該技術分野に知られる方法を用いて、異なる種由来の関心対象の遺伝子をクローニングしてもよい）。同様に、第一の種によって産生される遺伝子産物の調節剤（例えば阻害剤）として同定される化合物を、例えば異なる種の細胞または動物において、調節剤、例えば異なる種で見られるような相同遺伝子産物の阻害剤として、用いてもよい。いくつかの態様において、候補遺伝子は、非哺乳動物生物において、相同体を有する。例えば、生物は、非哺乳動物脊椎動物、例えば鳥類、爬虫類、両生類、魚類等であってもよい。本発明の多様な側面には、こうした相同遺伝子およびその使用に関する態様が含まれる。
【０１０４】
[00129]特定の病原体による感染に関与する宿主細胞因子は、類似の病原体、例えば系統学的に関連する病原体による感染に関与しうる。したがって、病原体（例えばウイルス）に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子が同定されたならば、これを、類似の病原体、例えば同じ科または属内の病原体によって引き起こされる感染を治療するのに有用な化合物を発見するためのターゲットとして用いることも可能である。こうした病原体は、近半数体哺乳動物細胞と同じ種の宿主細胞を感染させ、そして／または他の種、例えば他の脊椎動物の宿主細胞を感染させることも可能である（異なる種における候補遺伝子配列が、多数の種に渡って保存される相同遺伝子に関して典型的であるように、近半数体哺乳動物細胞に存在するものとは異なる可能性もあることが認識されるであろう）。第一の病原体に関して、宿主細胞因子に作用する化合物を用いて、その科または属内の他の病原体によって引き起こされる感染を治療してもよい。いくつかの態様において、本発明の方法を用いて、比較的低い病原性を有する（または有効なワクチンが存在する）病原体に関する宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定する。遺伝子産物に作用する、例えば該産物を阻害する化合物を同定する。こうした化合物は、より病原性が高い関連病原体による感染を治療するのに有用でありうる。同様に、毒素または他の剤の活性を仲介する際に関与する宿主細胞遺伝子（例えばこうした毒素または剤のターゲットである遺伝子産物をコードする、および／または毒素または剤の活性に必要である、遺伝子）は、関連する剤（例えば、構造的および／または機能的に関連する剤）の活性を仲介する際に関与する可能性もある。したがって、本発明は、こうした関連化合物の影響を調節する（例えば阻害する）化合物の発見のため、および／またはこうした関連化合物の作用機構を調べるため、こうした候補遺伝子を調べる工程を含む。
【０１０５】
[00130]本発明は、本発明のスクリーンを用いて、候補遺伝子を同定し、そして候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現または活性が改変された（例えば減少した）細胞を生成するかまたは同定する工程を含む。いくつかの態様において、本発明は、遺伝子修飾された細胞であって、近半数体哺乳動物細胞ではなく、候補遺伝子の一方または両方のコピーに操作された改変を有し、そして／または候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物の変異体を発現する、前記細胞を提供する（細胞が遺伝子改変を受け継いでいてもよい、すなわち細胞が元来産生された遺伝子操作細胞に由来していてもよいことが認識されるであろう）。例えば、候補遺伝子は、少なくとも部分的に欠失していてもよく、そして／または外因性遺伝物質が遺伝子内に導入されていてもよい。細胞は、半数体細胞（例えば配偶子）、二倍体細胞、または多様な態様の異数体細胞であってもよく、そして関心対象の任意の細胞タイプであってもよい。本発明は、本明細書記載の任意の細胞に由来する、細胞集団を含む細胞株を提供する。
【０１０６】
[00131]いくつかの態様において、本発明は、非ヒト遺伝子修飾動物（また、「トランスジェニック動物」とも称される）、例えば哺乳動物または鳥類であって、動物のいくつかまたはすべての細胞が、候補遺伝子において操作された改変を有し、そして／または候補遺伝子によってコードされる遺伝子産物変異体を発現する、前記動物を提供する（動物が遺伝子改変を受け継いでいてもよい、すなわち動物が元来産生された遺伝子操作動物に由来していてもよいことが認識されるであろう）。通常、改変は、動物細胞の大部分またはすべてのゲノムに存在し、典型的には生殖系列細胞が含まれる。例えば、候補遺伝子は、少なくとも部分的に欠失していてもよく、そして／または外因性遺伝物質が遺伝子内に導入されていてもよい。
【０１０７】
[00132]いくつかの態様において、本発明は、候補遺伝子の発現が改変されている非ヒト遺伝子修飾動物、例えば哺乳動物（例えばマウス）または鳥類を提供する。例えば、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの細胞は、候補遺伝子の発現を阻害する短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体、またはアンチセンスＲＮＡを発現してもよい。当該技術分野に知られる標準法を用いて、本発明の非ヒト遺伝子修飾動物を産生してもよい。
【０１０８】
[00133]他の側面において、候補遺伝子の発現が減少しているかまたは存在しない動物を生成するかまたは同定する。本発明は、病原体（例えばウイルス）または有害な剤に対する耐性が増加した、非ヒト多細胞生物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト脊椎動物を生成する方法を提供する。１つの側面において、非ヒト多細胞生物は、同じ種の正常な非トランスジェニック生物と比較した際、候補遺伝子産物の活性が減少している。いくつかの態様において、生物は、該動物が機能遺伝子産物の減少した発現を有するように、候補遺伝子の一方または両方のコピー内にターゲティングされた挿入を有するか、またはこれらの少なくとも一部の欠失を有する、トランスジェニック非ヒト脊椎動物である。改変または破壊が、遺伝子の転写部分または非転写領域であってもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様において、改変または破壊は、発現調節要素（例えばプロモーターまたはエンハンサー）などの制御領域中である。
【０１０９】
[00134]他の態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、候補遺伝子の発現を減少させるＲＮＡｉ剤、例えばｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡを発現する。いくつかの態様において、生物はげっ歯類、例えばマウスである。いくつかの態様において、生物はげっ歯類でない。いくつかの態様において、脊椎動物は、商業的に重要な動物である。例えば、生物は、少なくとも１つの国の国民総生産に少なくとも＄１０，０００寄与することも可能であり、そして／または州間または国家間の交易の対象であってもよい。商業的に重要な例示的な動物は、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、魚である。いくつかの態様において、動物は家畜化された動物、例えば農場動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはウマなどの家畜である。いくつかの態様において、動物は、非家畜化種である。場合によって、種は危機に瀕している。該方法を用いて、病原体感染または有害な剤の影響に耐性であり、そして野生においてまたは飼育下で、生き延びる可能性が改善されている個体を同定してもよい。感染に耐性である動物は、動物およびヒト宿主の両方が感染しうる病原体の蔓延を減少させうる。当該技術分野に知られる、多様な適切な方法等を用いて、突然変異または欠失を操作してもよい。トランスジェニック生物を生成するために、当該技術分野で知られる標準法を用いて、こうした生物を生成してもよい。例えば、体細胞核トランスファー（ＳＣＮＴ）を用いてもよい。
【０１１０】
[00135]別の側面において、本発明は、本発明の遺伝子トラップ挿入スクリーンを用いて同定された候補遺伝子の機能産物が減少しているかまたは欠如している、非ヒト多細胞生物、例えば非ヒト脊椎動物、例えば非ヒト動物を同定する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、生物はげっ歯類ではない。いくつかの態様において、動物はマウスではない。いくつかの態様において、生物は、減少した遺伝子産物の発現を有する。いくつかの態様において、生物は、遺伝子産物の機能的に不活性な変異体または断片を発現する。例えば、生物は、フレームシフト突然変異、あるいは活性に必要な少なくともいくつかの残基の欠失または改変を有してもよい。例えば遺伝子型を決定し（例えば減少したまたは改変された発現または活性を生じる突然変異または多型を有する動物を同定するため）、そして／または組織における発現レベルを調べ、そして発現または活性が低いかまたは欠如している動物を同定して、生物を同定してもよい。いくつかの態様において、当該技術分野に知られる多型、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を調べる。例えば、ゲノムプロジェクトおよび他の配列決定努力によって、動物ゲノム中の多くのＳＮＰが同定されてきている。ＳＮＰ、例えば候補遺伝子中またはその近傍に位置するＳＮＰを評価して、改変された、例えば機能遺伝子産物の減少または欠如と関連するものと同定してもよい。こうしたＳＮＰを所持する動物を同定してもよい。いくつかの態様において、発現または活性の減少または欠如は、病原体による感染のためのターゲット、または有害な剤（例えば毒素）のためのターゲットである、少なくともいくつかの組織および／または細胞で起こる。いくつかの態様において、発現または活性の減少または欠如は、大部分のまたはすべての組織で起こる。望ましい特質（例えば少なくともいくつかの組織における発現または活性の減少または欠如）を持つ生物を選択してもよい。標準的交雑技術を適用して、発現および／または活性が特に低い動物を産生してもよい。例えば、家畜交雑の標準法を用いてもよい。伝統的な交雑スキームおよび／またはマーカー補助選択を使用してもよい。いくつかの態様において、突然変異または多型は自発的に生じる突然変異であり、すなわち人によって生成されない。いくつかの態様において、突然変異は人によって、例えば放射線または化学的突然変異誘発を用いて、生成される。したがって、本発明は、機能遺伝子産物が減少したかまたは欠如した、遺伝子修飾されていない非ヒト生物、例えば非ヒト動物を産生する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、機能遺伝子産物が減少したかまたは欠如した生物を同定するかまたは選択する工程を含む。いくつかの態様において、非ヒト生物は、選択的交雑技術を用いて産生される。本発明は、こうした生物およびその使用法をさらに提供する。
【０１１１】
[00136]いくつかの態様において、方法は、農業および／または畜産において、機能的遺伝子産物が減少しているかまたは欠如している生物を提供するかまたは用いる工程を含む。生物は、遺伝子修飾された生物または遺伝子修飾されていない生物であってもよい。生物は、病原体に感染する可能性が減少していてもよいし、そして／または感染重症度が減少していてもよい。いくつかの態様において、本発明は、（ａ）候補遺伝子産物の機能的発現または活性が減少しているかまたは欠如している動物を提供し；そして（ｂ）該動物を用いて畜産に従事する工程を含む方法を提供する。畜産は、食肉用、または動物産物（例えばミルク、卵、またはウール）を採取するための動物の交雑および飼育、ならびに作業および／または交友のための種の育種および世話を含む。農業は、農業経営を通じた、食品および／または製品の産生を指す。
【０１１２】
[00137]近半数体細胞および／または腫瘍細胞の再プログラミング
[00138]転写因子の組み合わせ、例えば４つの転写因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃはなくてもよいが、ｃ−Ｍｙｃを省くと再プログラミング効率が減少する）、または４つの転写因子、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＬｉｎ２８のレトロウイルス仲介性導入を通じて、マウスおよびヒト線維芽細胞ならびに多様な他の正常体細胞タイプをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再プログラミングして、多能性状態にすることが可能であることが、最近、示された（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，  Ａ．ら，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２５（１０）：ｌ１７７−８１（２００７）；  Ｙｕ，  Ｊ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８（５８５８）：１９１７−２０（２００７）；およびＮａｋａｇａｗａ，  Ｍ．ら，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６（１）：１０１−６（２００８）を参照されたい。これらの転写因子はしばしば、「再プログラミング因子」と呼ばれる）。人工多能性幹細胞（「ｉＰＳ細胞」）と呼ばれる、生じた細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞と本質的に同一に見え、そしてこれを用いて、生殖系列に寄与する生存キメラを生成することも可能である。
【０１１３】
[00139]本発明のいくつかの態様において（例えば実施例１２に記載するように）、近半数体細胞は、体細胞再プログラミング技術を用いて、少なくとも部分的に「再プログラミング」される。こうした再プログラミングは、そうでなければ近半数体哺乳動物細胞によって発現されない遺伝子の発現を生じることも可能であり、これにはいくつかの場合、細胞傷害性に必要な宿主細胞因子、または関心対象のプロセスに必要な宿主細胞因子をコードする遺伝子が含まれうる。いくつかの態様において、再プログラミングは、細胞の１またはそれより多い特性を改変するか、または細胞を異なる細胞タイプに似た細胞に変換する。いくつかの態様において、造血系細胞を再プログラミングして、例えば細胞タイプ特異的マーカーの発現の改変および／または細胞表現型の改変によって明らかであるように、非造血系細胞タイプにすることも可能である。例えば、再プログラミング因子の形質導入によって、懸濁中ではなく付着方式で増殖するＫＢＭ７由来細胞の単離が可能になることが観察された。本発明のいくつかの態様において、再プログラミングに供された近半数体細胞（またはこうした細胞を含むコロニー）を、血清（例えばウシ胎児血清）および／または細胞増殖を促進する他の構成要素を補ってもよい非ＥＳ細胞培地、例えば標準的培地（例えばＤＭＥＭ）に移す。本発明にしたがって、近半数体哺乳動物細胞を再プログラミングして、本発明の方法を用いて研究可能な細胞タイプおよび表現型の範囲を拡大することも可能である。望ましい場合、また、再プログラミングされた近半数体哺乳動物細胞を、当該技術分野に知られるプロトコルを用いて培養し、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を、多様な分化経路に沿って分化させることも可能である。例えば、神経細胞系譜、筋細胞系譜等に向かう分化を促進するプログラムを用いてもよい。
【０１１４】
[00140]本発明は、腫瘍細胞である体細胞を再プログラミングする方法をさらに提供する。こうした再プログラミングされた腫瘍細胞を、例えば抗新生物剤を同定するスクリーンで用いてもよい。いくつかの態様において、腫瘍細胞は癌腫から生じる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は肉腫から生じる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は血液学的悪性疾患、例えばリンパ腫または白血病または骨髄腫から生じる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、乳房、膀胱、骨、脳、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭部および頸部、喉頭、肝臓、肺（小細胞または非小細胞）、卵巣、膵臓、前立腺、胃、腎臓、皮膚（例えば基底細胞、黒色腫、扁平細胞）、精巣、または甲状腺癌から生じる。腫瘍細胞は、樹立された腫瘍細胞株（例えばＮＣＩ−６０腫瘍細胞株の１つ）、あるいは当該技術分野に知られるかまたは新規に樹立された別の腫瘍細胞株の細胞であってもよい。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、生検または手術試料より得られ、そして場合によって、再プログラミング前に、培養中で拡大される。
【０１１５】
[00141]いくつかの態様において、レトロウイルス組込みに対する依存を減少させた再プログラミング法、例えば一過性トランスフェクションおよびタンパク質形質導入アプローチが用いられる。特定の小分子が再プログラミングプロセスを増進しうる。例えば、Ｓｈｉ，  Ｙ．ら，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ２：５２５−５２８（２００８）；  Ｈｕａｎｇｆｕ，  Ｄ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  オンライン刊行：  ２２  Ｊｕｎｅ  ２００８｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔｌ４１８を参照されたい。本発明は、こうした分子またはその他のもの、例えばヒストン・デアセチラーゼ阻害剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤、Ｗｎｔ経路アゴニスト、本発明の方法においてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２などの内因性遺伝子の発現を増進させる分子、あるいは１またはそれより多い再プログラミング因子の代わりに使用可能な分子の使用を含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０２４９（ＷＯ／２００９／０３２１９４）およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４５１６（ＷＯ／２００８／１２４１３３）；  Ｌｙｓｉｏｔｔｉｓら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０６（２２）：８９１２−７，  ２００９を参照されたい。
【０１１６】
[00142]当業者は、目的を実行し、そして言及する結果および利点、ならびにそれに固有のものを得るために、本発明がよく適応することを容易に認識する。本明細書の説明および実施例の詳細は、特定の態様の代表であり、例示的であり、そして本発明の範囲に対する限定とは意図されない。本明細書の修飾および他の使用が、当業者には明らかであろう。これらの修飾が、本発明の精神内に含まれる。当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に対して、多様な置換および修飾を行いうることが容易に明らかであろう。
【０１１７】
[00143]冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、明細書および請求項中、明確に逆に示さない限り、複数の指示対象を含むと理解されなければならない。群の１またはそれより多いメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、群メンバーの１、１より多く、またはすべてが、所定の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別の方式で関連する場合、逆に示さない限りまたは文脈から別に明らかでない限り、満たされると見なされる。本発明には、群の正確に１つのメンバーが所定の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別の方式で関連する態様が含まれる。本発明にはまた、群メンバーの１より多く、またはすべてが、所定の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別の方式で関連する態様も含まれる。さらに、別に示さない限り、あるいは矛盾または不一致が生じることが一般の当業者に明らかでない限り、１またはそれより多い制限、要素、条項、記述用語等が、列挙する請求項の１またはそれより多くから、同じ基本請求項に依存する別の請求項（または適切であるように、任意の他の請求項）に導入されている、すべての変動、組み合わせ、および順列を、本発明が提供することが理解されるものとする。要素が、例えばマーカッシュ群または類似の形式で、リストとして提示される場合、要素の各下位群もまた開示され、そして任意の要素（単数または複数）が群から除去されうることが理解されるものとする。一般的に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素、特徴等を含むと称される場合、本発明の特定の態様または本発明の側面は、こうした要素、特徴等からなるかまたは本質的にこれらからなると理解しなければならない。単純化するために、これらの態様は、すべての場合で、本明細書の非常に多くの用語で特に記述されているわけではない。特定の排除が明細書中に列挙されるかどうかにかかわらず、本発明の任意の態様または側面が、請求項から明確に排除されうることもまた理解しなければならない。
【０１１８】
[00144]請求項または説明が、問題の組成物、例えば細胞または遺伝子トラップベクターに関する場合、別に示さない限り、あるいは矛盾または不一致が生じることが一般の当業者に明らかでない限り、本明細書に開示する任意の方法にしたがって、問題の組成物を作製するかまたは用いる方法、ならびに本明細書に開示する任意の目的のため、問題の組成物を用いる方法が、本発明の側面であることが理解されるものとする。請求項または説明が、方法、例えば細胞または遺伝子トラップベクターを用いる方法に関する場合、別に示さない限り、あるいは矛盾または不一致が生じることが一般の当業者に明らかでない限り、細胞または遺伝子トラップベクター、およびこれを用いる方法が、本発明の側面であることが理解されるものとする。
【０１１９】
[00145]本明細書に範囲が与えられる場合、本発明には、終点が含まれる態様、両方の終点が排除される態様、および一方の終点が含まれ、そしてもう一方が排除される態様が含まれる。別に示さない限り、両方の終点が含まれると仮定されるべきである。さらに、別に示さない限り、または文脈および一般の当業者の理解から明らかでない限り、範囲として示される値は、文脈が明らかに別に示さない限り、本発明の異なる態様において、言及される範囲内の任意の特定の値または下位範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１までと仮定しうることが理解されるものとする。また、本明細書において、一連の数値に言及する場合、本発明には、同様に、一連の任意の２つの値によって定義される任意の介在する値または範囲に関連する態様、ならびに最低の値を最小限としてもよく、そして最高の値を最大限としてもよい態様も含まれることが理解される。本明細書に用いる数値には、割合として表される値が含まれる。数値の前に、「約」または「およそ」が置かれる、本発明の任意の態様に関して、本発明には、正確な値が列挙される態様が含まれる。数値の前に、「約」または「およそ」が置かれない、本発明の任意の態様に関して、本発明には、数値の前に「約」または「およそ」が置かれる態様が含まれる。「およそ」または「約」には、別に示さない限り、または文脈から明らかでない限り（こうした値が、ありうる値の１００％を許容されないほど越える場合を除く）、一般的に、いずれかの方向に（数値より大きいかまたは小さい）１％の範囲内に属する、またはいくつかの態様において、数値の５％の範囲内に属する、またはいくつかの態様において、数値の１０％の範囲内に属する数値が含まれる。１より多い行為が含まれる、本明細書に請求する任意の方法において、明確に逆に示されない限り、方法の行為の順序は、方法の行為を列挙する順序に必ずしも限定されないが、本発明には、順序がこのように限定される態様が含まれる。本発明の任意の産物または組成物が、「単離される」、例えば通常、天然に関連する構成要素の少なくともいくつかから分離され；人の手を伴うプロセスによって調製されるかまたは精製され；そして／または天然には生じないことも可能である。
【０１２０】
[00146]本明細書に引用されるすべての文書、参考文献、ウェブサイトおよびデータベースの解説は、すべての目的のために、その全体が本明細書に援用され、これには、Ｃａｒｅｔｔｅら，  “Ｈａｐｌｏｉｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｈｏｓｔ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，  １２３１（２００９）、および対応する補助オンライン素材が含まれる。本発明は、以下の限定されない実施例によってさらに例示されるであろう。
【実施例】
【０１２１】
モデル生物における古典的な遺伝子スクリーンは、多くの基本的生物学的プロセスの根底にある遺伝子プログラムを解明してきた。哺乳動物細胞において、二倍性および無性生殖は、大規模遺伝子破壊を複雑にする。本明細書に記載するのは、染色体８を除くすべての染色体に関して半数体であるヒト細胞株において、挿入突然変異誘発を用いて、ヌルアレルを生成する遺伝子スクリーンのための多用途アプローチである。重要なターゲットとして、宿主−病原体相互作用を用いて、本明細書において、このアプローチの有効性および一般性を立証する。ＷＤＲ８５は、ジフテリア毒素および外毒素Ａの細胞傷害効果に必要な遺伝子と同定されてきている。本明細書に記載する研究は、細胞致死性膨張性毒素（ＣＤＴ）の作用に必要な第一のヒト遺伝子を同定し、そしてインフルエンザ感染に必須の宿主因子を同定する。ＷＤＲ８５は、ジフタミドの生合成経路の重要な要素をコードし、そしてＣＤＴは、中毒に必須の細胞表面受容体であるＴＭＥＭ１８１と相互作用する。
【０１２２】
[00147]実施例１：ＫＢＭ７サブクローンの性質決定およびレトロウイルス感染
[00148]本発明者らは、効率的な順方向遺伝的アプローチを可能にすると考えられる、ヒト細胞における半数体ゲノム設定をまず性質決定した。ＣＭＬ細胞株ＫＢＭ７のサブクローンは、ほぼ半数体の染色体セットを所持すると記載されている［１４］。本発明者らはまず、この細胞株（Ｂ．Ｈ．  Ｃｏｃｈｒａｎ博士、タフツ大学医学部、マサチューセッツ州ボストンの寛大な提供による）が容易に増殖し、ウイルス感染に耐容性であり、そして効率的にサブクローン可能であるかどうかを調べた。用語「ＫＢＭ７細胞株」は、本明細書において、この近半数体細胞株またはそのサブクローンを指すよう用いられる。ＫＢＭ７細胞株またはそのサブクローンの細胞を「ＫＢＭ７細胞」と称してもよい。ＫＢＭ７細胞は、高いサブクローニング効率（ほぼ〜８０％）を有し、そしていくつかのサブクローンをさらに調べた。ＫＢＭ７サブクローンは、およそ２４時間の世代時間で容易に増殖し、そして低いおよび非常に高い細胞密度（例えば〜１ｘ１０７細胞／ｍｌ）で維持可能であった。重要なことに、フローサイトメトリー分析によって、ＫＢＭ７サブクローンが、二倍体ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞に比較した際、低二倍体核型を有することが示された。１つのサブクローンを、２４色ＦＩＳＨスペクトル核型決定によって、さらに調べた。図１ａに示すように、これらの細胞は、染色体８以外のすべての染色体に関して半数体であり、そしてＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換慢性骨髄性白血病細胞に特徴的なフィラデルフィア染色体（ｔ（９；２２））を含有する。
【０１２３】
[00149]実施例２：ＫＢＭ７細胞のレトロウイルス感染
[00150]本発明者らは、次に、ＫＢＭ−７細胞をレトロウイルスに感染させることが可能であるかどうかを決定した。２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから得た）において、パッケージングベクターを伴うＧＦＰ発現レトロウイルスベクターのトランスフェクションによって、ウイルスを産生した。レトロウイルスベクターは、ｐＬＩＢ−ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であったが、多くの異なるレトロウイルスベクターが使用可能であることが理解されるであろう。ウイルスを含有する上清を用いて、ＫＢＭ７細胞を感染させた。レトロウイルスによるＫＢＭ７細胞の感染効率を改善するため、異なる条件を試験した。２４ウェル組織培養ディッシュ中、２，０００ｒｐｍで、室温で４５分間、細胞を遠心分離すると、遠心分離なしの場合に比較して、感染効率の２倍の増加が生じた。次に、レトロネクチン、ポリブレンおよび硫酸プロタミン添加の効果を試験して、それぞれ、２５％、３３％および４４％の効率を生じた。１ミリリットルの培地あたり、８マイクログラムの硫酸プロタミンが好ましい添加である。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローター中、２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１．５時間、超遠心することによって、ウイルスを濃縮すると、未希釈ウイルスに比較して、感染率が劇的に改善され、そしてＡｍｉｃｏｎフィルターによる濃縮よりも好ましかった。結論として、硫酸プロタミンの存在下で、スピン感染のために濃縮ウイルスを用いた場合、細胞は最適に感染した。これらのサブクローンは、ＶＳＶ−Ｇ偽型であるＧＦＰ発現レトロウイルスまたはレンチウイルスに効率的に（〜７０−９０％）感染可能であり、そして高レベルのＧＦＰ発現を数ヶ月維持した。
【０１２４】
[00151]実施例２：ＫＢＭ７細胞における挿入突然変異誘発のための遺伝子トラップベクターの選択
[00152]本発明者らは、次に、ＫＢＭ７サブクローン中のゲノム配列の大部分の観察される半数体性質が、突然変異誘発によるノックアウト細胞の生成を可能にするかどうかを決定した。本発明者らは、該細胞がレトロウイルスに容易に感染可能であることを知っているため、本発明者らは、発現される遺伝子をトラップするよう設計されているいくつかのウイルス遺伝子トラップベクターのこれらの細胞における使用を調べた。文献に記載されるプロモーター不含遺伝子トラップベクターの大部分は、ネオマイシン（Ｇ４１８、ジェネティシン）選択に基づく。驚くべきことに、最初の実験によって、ＫＢＭ７細胞が生得的に非常に高濃度のネオマイシンに耐性であることが示され、あらかじめ存在しているベクターの使用が妨げられた。潜在的な例外は、ネオマイシンに加えてＧＦＰを含有するＵＰＡ−Ｔｒａｐベクター（Ｓｈｉｇｅｏｋａら  ２００５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００５  ３３（２）：ｅ２０に記載される）であった。このベクターを試験するため、２９３Ｔ細胞において、レトロウイルス・パッケージングベクターを伴うこのベクターのトランスフェクションによってウイルスを産生した。感染３６時間後にウイルスを採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローター中、２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１．５時間、超遠心することによって濃縮し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（２００μｌ）中に再懸濁した。該ウイルスを用い、スピン感染を用いて、ＫＢＭ７細胞を感染させた。別個の感染において、対照として含まれる、ｐＬＩＢ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の〜３０％の感染パーセントを生じる条件を用いた。ＵＰＡ−Ｔｒａｐ感染細胞において、ＦＡＣＳ分析を用い、感染３日後にＧＦＰ蛍光を測定した。１００万の計測した細胞のうち、ＧＦＰ陽性細胞は観察されなかった。本発明者らは、このベクターが、本発明者らのアプローチには有用でないと結論づけた。次に、Ｕ３−ＣＥＯ（Ｇｅｂａｕｅｒ  Ｍら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００１  １１（１１）：１８７１−７）ベクターを修飾して、ネオマイシン耐性遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子と交換した。この目的のため、オーバーハングＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ制限部位を含有するプライマー（５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧ−３’（配列番号１２４）および５’−ＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧ−３’（配列番号１２５））を用いたＰＣＲ増幅によって、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列を得て、そしてＵ−３−ＣＥＯ中に挿入してネオマイシンを置換した。このベクターからウイルスを産生し、そして感染３日後、０．５μｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシンを用いて、感染細胞を選択した。ピューロマイシン耐性コロニーは、５０万の感染細胞のうち１未満の効率で発展した。この効率は、ゲノム全体の挿入突然変異誘発に望ましいよりもかなり低かった。
【０１２５】
[00153]実施例３：ピューロマイシンおよびＧＦＰ選択可能マーカーを含有するベクターを含有する遺伝子トラップベクターの構築
[00154]不活性化ＬＴＲ、アデノウイルス血清型４０の長い線維遺伝子由来の強いスプライス−アクセプター部位（Ｃａｒｅｔｔｅら  ２００５  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（８）１０５３−１０６２）、およびＧＦＰまたはピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＵＲＯ）のいずれか、その後、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する新規レトロウイルス遺伝子トラップベクターを以下のように構築した。オーバーハングＣｌａＩおよびＮｈｅＩ制限部位ならびに部分的スプライス・アクセプター部位を含有するプライマー：（ＧＦＰ：  ５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１２６）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１２７）  ＰＵＲＯ：  ５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１２８）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１２９））を用いたＰＣＲ増幅によって、ＰＵＲＯまたはＧＦＰのコード配列を得た。これらのＰＣＲ産物をｐＥＧＦＰＣ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に挿入してＥＧＦＰを置換した。続いて、オーバーハングＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ部位ならびにスプライス・アクセプターシグナルの５’端を含有するプライマー（ＧＦＰ：  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１３０）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１３１）  ＰＵＲＯ：  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３２）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１３３））を用いたＰＣＲを行って、完全スプライス・アクセプター部位を導入し、そしてＧＦＰまたはＰＵＲＯいずれかの後のポリアデニル化シグナルを得た。これらのＰＣＲ産物をｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら  ２００２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２（３）：２４３−７）中に挿入してｐｏｌＩＩＩプロモーターを置換した。生じたプラスミドをｐＧＴ−ＧＦＰおよびｐＧＴ−ＰＵＲＯと名付けた。３つのリーディングフレームすべてにＧＦＰまたはピューロマイシン・レポーター遺伝子を含有する遺伝子トラップ構築物を生成した。
【０１２６】
[00155]ウイルスベクターは、プロモーター不含レポーターおよびポリアデニル化シグナルのすぐ上流にアデノウイルス・スプライス・アクセプター部位を含有し、したがって、活性遺伝子のイントロン内へのベクター挿入は、天然遺伝子座を不活性化し、そして遺伝子のプロモーターによって駆動される転写は、上流エクソン（単数または複数）がＧＦＰまたはＰＵＲＯ遺伝子にスプライシングされた、融合転写物を生じる。転写は、挿入されたポリＡ部位で終結するため、ＧＦＰ遺伝子をコードする遺伝子がレポーター遺伝子として働く遺伝子トラップベクターに関して図１Ｂに模式的に示すように、生じる融合転写物は、一部切除され、そして機能しないバージョンの細胞性タンパク質およびＧＦＰまたはＰＵＲＯのいずれかをコードする。
【０１２７】
[00156]実施例４：突然変異細胞ライブラリーの生成
[00157]ほぼすべての遺伝子においてノックアウト・アレルを持つ細胞ライブラリーを生成するため、近半数体ＫＢＭ７細胞を、実施例３に記載するように生成された遺伝子トラップに感染させた。レトロウイルス・パッケージング・プラスミドと組み合わせて、ｐＧＴ−ＧＦＰまたはｐＧＴ−ＰＵＲＯのいずれかで、Ｔ１７５ディッシュ中の２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって、遺伝子トラップウイルスを作製した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローター中、２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１．５時間の超遠心を用いて、ウイルス含有上清を濃縮した。突然変異体ＫＢＭ７細胞のバッチは、典型的には、実施例１に記載する方法を用いて、ウェルあたり１５０万細胞を含有する１枚の２４ウェル組織培養ディッシュの感染によって作製される。１ミリリットルあたり５００ｎｇのピューロマイシンを用いて、感染２日後に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有する遺伝子トラップに感染した細胞を選択した。限界希釈によって選択した後、細胞を拡大し、そしてさらなるスクリーンのために凍結した。活発に発現される遺伝子に関して遺伝子トラップが導入するバイアスを無効にするために、ＧＦＰ遺伝子トラップ感染細胞を選択せずにスクリーンに用いるか、またはＧＦＰ発現細胞に関するＦＡＣＳ分取を用いて選択するか、いずれかとした。いくつかの場合、ＧＦＰ発現に基づくさらなる層別化を行って、異なるレベルのＧＦＰを含む細胞のバッチを得た。比較的より長い半減期の遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する可能性を増加させるため、遺伝子トラップ感染６日後またはそれより後に、スクリーンを実行して、それによって遺伝子産物が細胞増殖中に希釈されるのを可能にした。
【０１２８】
[00158]実施例５：組み込まれたレトロウイルス遺伝子トラップの隣接配列をマッピングするための方法
[00159]遺伝子トラップ組込みによって生成された突然変異体アレルを回収するため、本発明者らは、逆ＰＣＲプロトコルを用いた。このため、４マイクログラムのゲノムＤＮＡを、３７℃で、ＮｌａＩＩまたはＭｓｅＩのいずれかで一晩消化した。続いて、消化したＤＮＡをカラム精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、室温で一晩、３００マイクロリットルの体積中で、１マイクログラムのＤＮＡを連結した。別の周期のカラム精製を行った後、外側に向かうプライマーを用いた逆ＰＣＲのため、ＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＬＴＲの５’端で隣接するゲノムＤＮＡ配列を同定するため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた：  ５’−ＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１３４）および５’−ＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１３５）。ｐＧＴＧＦＰ遺伝子トラップのＬＴＲの３’端で隣接するゲノムＤＮＡ配列を同定するため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた：  ５’−ＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１３６）および５’−ＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号１３７）。ｐＧＴＰＵＲＯ遺伝子トラップのＬＴＲの３’端で隣接するゲノムＤＮＡ配列を同定するため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた：  ５’−ＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１３８）および５’−ＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１３９）。ＰＣＲ産物をカラム精製し、そして５’端に隣接するＤＮＡ配列に関しては、プライマー５’−ＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１４０）を、そして３’端に隣接するＤＮＡ配列に関しては、プライマー５’−ＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１４１）を用いて、直接配列決定した。ＰＣＲ増幅後に多数のバンドが存在する場合、Ｓｔｒａｔａｃｌｏｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、産物をまず、プラスミド中にサブクローニングした。
【０１２９】
[00160]本発明者らの最初の実験において回収された組込みの大部分は、遺伝子プロモーター領域に比較的近く、そしてしたがって、ノックアウト・アレルを生成すると予測された。本発明者らは、ＧＦＰ陽性であるいくつかのクローンをマッピングすることによって同定されている、細胞表面抗原ＣＤ４３（シアロフォリンとも称され、Ｔリンパ球、単球、顆粒球、およびいくつかのＢリンパ球上の主な細胞表面シアロ糖タンパク質である）の遺伝子座にユニークなトラップを持つサブクローンにおいて、この可能性を評価した。ウェスタンブロット分析によって、内因性遺伝子の発現が、検出不能なレベルまで減少することが示された（図１Ｃ）。また、ＣＤ４３発現に関するフローサイトメトリー分析によって、トラップされた細胞集団において検出可能なＣＤ４３発現が示されなかった（データ未提示）。これらのデータは、半数体ゲノム背景において、単一の組込み遺伝子トラップ系統が、効率的に遺伝子を破壊し、そして遺伝子発現を排除することを示す。
【０１３０】
[00161]実施例６Ａ：炭疽およびジフテリア毒素細胞傷害性に対する耐性に関するスクリーン
[00162]次に、本発明者らは、遺伝子スクリーンにおいて、本発明者らの半数体突然変異誘発スキームを使用して、細菌毒素に対する感受性に影響を及ぼす宿主細胞因子をコードする遺伝子を同定した。このため、本発明者らは、２つの細菌毒素−ジフテリア毒素および炭疽致死性因子（ＬＦ）を用いた。どちらの毒素も、既知の受容体を通じて細胞に進入し、そしてジフテリア毒素の進入および細胞傷害性は、３０年間に渡って徹底的に研究されてきている［１８、１９］。ジフテリア毒素は、ＨＢ−ＥＧＦ受容体に結合することによって、進入し、そして伸長因子−２（ＥＦ−２）のジフタミド残基をターゲティングすることによって、細胞に対して細胞傷害性である［１９］。炭疽−ＬＦは、細胞表面進入受容体に結合する細菌防御抗原（ＰＡ）と複合体を形成して細胞に進入する［２０］。炭疽−ＬＦ自体は、ＫＢＭ７細胞に対して細胞傷害性でないため、致死性因子がジフテリアの毒素ドメインに融合しているタンパク質を用いて、耐性細胞（ＬＦ−ＤＴ）に関して選択した。
【０１３１】
[00163]３つの異なるリーディングフレームでＧＦＰおよびピューロマイシンカセットをコードする遺伝子トラップウイルス混合物に、近半数体ＫＢＭ７サブクローンの数百万の細胞を感染させた。ＧＦＰまたはピューロマイシン発現に関して細胞を選択し、そして短時間培養して、遺伝子トラップ突然変異の等しい提示を維持した。本発明者らは、これらの細胞を、９６ウェルプレート中の１０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、そして次いで、いずれかの毒素で処理することによって、遺伝子スクリーンを行った。また、未感染対照細胞を細菌毒素に曝露した。遺伝子トラップで突然変異誘発された約３０ウェルの細胞が、毒素処理を生き抜く一方、突然変異誘発されていない細胞では、生存細胞を含有するのはわずか５ウェルだった。いくつかの突然変異体は、増殖が非常に劣っていた。遺伝子トラップで突然変異誘発された、生き延びた細胞を拡大し、そして組込み部位に隣接するゲノム配列を回収するために用いた。さらに、ジフテリア毒素に対して耐性であるクローンを炭疽ＬＦ−ＤＴに曝露し、そして逆も行った。図２に示すように、炭疽およびジフテリア毒素に関して知られる進入受容体における多くの独立の組込みを回収した。これらの組込みはすべて、センス配向であり、そして対応する受容体の本質的な部分を破壊すると予測される。さらに、ジフタミドの生合成に関与することが知られる遺伝子におけるいくつかの組込みを回収し［２１、２２］；炭疽致死性因子による細胞致死性は、ジフテリアの毒素ドメインに融合することによって仲介されるため、これらの突然変異体は、本発明者らのアッセイにおいて、「二重耐性」としてスコア付けされる。ジフタミド生合成に必須のこのクラスの遺伝子に関する突然変異体アレルは、毒素受容体よりもより低い頻度で回収され、これは、ＫＢＭ７細胞において、これらの遺伝子の喪失が、増殖上の不都合な点を強く与えるためである可能性が最も高い。これらの結果によって、本発明者らのアプローチを用いてよく研究された生物学的プロセスにおいて、新規制御遺伝子を同定可能であることが示される。重要なことに、このスクリーンの結果によって、結果の直接的な解釈が可能になり、これは、多数の独立の組込みの回収によって、関心対象の生物学的プロセスにおいて重要な構成要素が指し示されるためである。
【０１３２】
[00164]実施例６Ｂ：大腸菌細胞致死性膨張性毒素に関する第一の宿主因子の同定
[00165]細胞致死性膨張性毒素（ＣＤＴ）は、未知の機構を通じて哺乳動物細胞に進入し、そしてＤＮＡを切断することによってＤＮＡ損傷を引き起こし、細胞周期のＧ２／Ｍ期にある細胞の集積後、細胞死を生じる［２３］。ＫＢＭ７細胞は、この毒素に感受性であり、そして特徴的なＧ２／Ｍ期細胞周期停止を示す（図３Ａ）。毒素によって用いられる第一の宿主因子を同定するため、本発明者らは、スクリーンを開始して、ＣＤＴの細胞傷害性効果に対して耐性であるノックアウト細胞を同定した。３つの遺伝子：スフィンゴミエリン・シンターゼ１（１１の独立の組込み）、ＴＭＥＭ１８１（２つの独立の組込み）に分布する、１４の突然変異体が回収された。予期されるように、ＳＧＭＳ１の喪失は、細胞表面スフィンゴミエリンに結合し、そして細胞に浸透する、ミミズ（ｅａｒｔｈｗｏｒｍ）毒素ライセニンに対する細胞非感受性を導く（図３Ｂ）。対照的に、膜貫通含有ＧＰＣＲファミリーメンバーであるＴＭＥＭ１８１の喪失は、ライセニン感受性には影響を及ぼさない。さらなる実験的追跡が必要であるが、ＣＤＴがまず新規に同定された細胞表面受容体（ＴＭＥＭ１８１）に結合し、そして次いで、脂質ラフト依存性エンドサイトーシスを経るが、これが脂質ラフト構成要素スフィンゴミエリンの枯渇によって攪乱されうると考えるのが説得力があるようである。図７は、大腸菌細胞致死性膨張性毒素（ＣＤＴ）による中毒に必要な宿主遺伝子に関する本発明のスクリーンに関する結果をさらに示す。突然変異誘発された細胞をＣＤＴで処理した。この選択工程後、Ｓｏｌｅｘａ配列決定を用いて、遺伝子トラップ挿入部位を完全にマッピングした。プロットされるのは、ゲノム上の位置上にマッピングされるような、レトロウイルス挿入部位である。近接指数は、その近隣物に比較した、各挿入部位の距離の測定値である。近隣物により近ければ、近接指数はより高い。示すのは、挿入部位がクラスターを形成している遺伝子である。Ｎは、これらの遺伝子中の独立の挿入の数である。
【０１３３】
[00166]実施例７：毒素細胞傷害性に影響を及ぼす宿主細胞因子としてのＷＤＲ８５の同定および最初の性質決定
[00167]実施例６Ａに記載するスクリーンにおいて、現在、機能が知られていないＷＤ−４０反復タンパク質であるＷＤＲ８５において、４つの独立の組込みが同定された。ＷＤＲ８５中に組込みを含有する細胞は、ジフテリア毒素および炭疽ＬＦ−ＤＴの両方に対して耐性である。ＤＴＡ毒素耐性スクリーンにおいて、多数のＷＤＲ８５組込みが回収されたのには２つの説明がありうる。第一に、レトロウイルスに関して、共通の組込み部位であった可能性がある。第二に、ジフテリア毒素進入および細胞傷害性は非常によく研究されているが、この遺伝子は、このプロセスにおいて、新規の必須要因である可能性もある。ＷＤＲ８５遺伝子座は、組込みホットスポットであるとは報告されておらず、そしてすべての組込みがセンス配向であるという事実は、後者の説明を支持する。本発明者らは、ｃＤＮＡ補完実験によって、この問題に取り組んだ。ＧＦＰおよびＨＡタグ化ＷＤＲ８５  ｃＤＮＡの両方を発現するレトロウイルスを生成した（図２Ｂを参照されたい）。このウイルスを用いて、ＷＤＲ８５に遺伝子トラップ組込みを含有するＫＢＭ７細胞（ＷＤＲ８５ＧＴ）を感染させた。フローサイトメトリー分析によって、細胞の約１８％が感染し、そしてＧＦＰを発現することが示された。この細胞集団をジフテリア毒素で３日間処理すると、ＧＦＰ発現細胞が毒素によって排除されることが明らかになり、ＷＤＲ８５  ｃＤＮＡを導入すると、毒素耐性表現型が元に戻り、そして細胞が感受性になることが示された（図２Ｃ）。
【０１３４】
[00168]ＷＤＲ８５は、毒素進入またはジフタミド生合成に役割を果たしうる。これに取り組むため、本発明者らは、未変性ゲル電気泳動を用いて検出される移動度シフトを生じる、ジフテリアによるＥＦ−２修飾を調べた。図２Ｄは、ＫＢＭ７細胞をジフテリア毒素で処理すると、ＥＦ−２に移動度シフトが生じることを示し、ＨＢ−ＥＧＦ進入受容体およびＷＤＲ８５の両方の存在に依存するＡＤＰ−リボシル化が示された。ＷＤＲ８５ＧＴ細胞におけるＷＤＲ８５  ｃＤＮＡの加え直しによって、野生型細胞におけるように、ＥＦ−２は毒素処理に反応する。
【０１３５】
[00169]実施例８：インフルエンザウイルス感染に対する耐性に関するスクリーン
[00170]ウイルス感染に必要な宿主因子の同定は、抗ウイルス療法の価値ある新規ターゲットを提供しうる。ＫＢＭ７細胞は、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株ＰＲ８に容易に感染しうる（図４Ａ）。遺伝子スクリーンにおいて、本発明者らは、インフルエンザ感染に耐性であるいくつかの突然変異体ＫＢＭ７細胞を単離した。１００万の野生型または突然変異体ＫＢＭ７細胞を、１００μｌ血清不含ＩＭＤＭ培地中、５０，０００ＨＡ単位のスクロース勾配精製インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）と、室温で１時間インキュベーションした。続いて、５μｇ／ｍｌトリプシンを含有するＩＭＤＭ培地中に細胞を取り込み、そして２４ウェル組織培養プレートのウェル中にプレーティングした。２つの遺伝子：ＣＭＡＳおよびＳＬＣ３５Ａ２において、独立の組込みが同定された。ＣＭＡＳおよびＳＬＣ３５Ａ２はどちらも、グリコシル化タンパク質内へのシアル酸基の取り込みに影響を及ぼし、そしてシアル酸は、インフルエンザウイルスの受容体として機能することが知られるため、これらの実験によって、インフルエンザウイルスが、慣用的な方式で、ＫＢＭ７細胞に結合し、そして進入することが示される（図４Ｃ）［２４］。ＫＢＭ７ゲノムは、インフルエンザに対する耐性に関して、飽和状態でスクリーニングされていないが、本明細書で同定される輸送体（ＳＬＣ３５Ａ２）および酵素（ＣＭＡＳ）は細胞増殖または生存性に必須ではないため、インフルエンザ療法剤のターゲットとして働きうる。いずれの遺伝子も、以前には、インフルエンザに対する感受性を決定する際に必須であると同定されていなかった。
【０１３６】
[00171]実施例９：ＴＲＡＩＬおよびＧｌｅｅｖｅｃに対する感受性
[00172]本発明者らは次に、近半数体ＫＢＭ７サブクローンが、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに感受性であるかどうかを分析した。対照細胞、および遺伝子トラップで突然変異誘発された少数の細胞を、７００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下で培養した。２日間の期間後に、細胞生存度は劇的に減少し、一方、遺伝子トラップ突然変異誘発プールには、いくつかの生存細胞が残った（図６Ａ）。これらの細胞を拡大し、そして遺伝子トラップ組込み部位を同定した。細胞は、ＴＲＩＡＬ誘導性アポトーシスに関与することが知られる遺伝子であるカスパーゼ８遺伝子座に単一の組込みを含有した。遺伝子トラップはセンス配向であり、そしてカスパーゼ８発現を攪乱すると予測された。実際、ウェスタンブロット分析によって、カスパーゼ８タンパク質レベルが検出不能レベルまで減少していることが明らかになった（図６Ｂを参照されたい）。これらの結果によって、ＴＲＡＩＬ感受性ＫＢＭ７細胞における遺伝子トラップスクリーンが、この誘導性アポトーシス反応に必須の遺伝子構成要素（例えば遺伝子、遺伝子産物、遺伝子機能、および遺伝子経路）を同定可能であることが示される。誘導性アポトーシス反応に必要なこれらの遺伝子における突然変異は、アポトーシスを誘導することによって少なくとも部分的に作用する化学療法剤の影響に対する耐性に寄与しうる。
【０１３７】
[00173]近半数体ＫＢＭ７細胞は、ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換慢性骨髄性白血病細胞に特徴的なフィラデルフィア染色体（ｔ（９；２２））を含有する。ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性の小分子阻害剤であるＧｌｅｅｖｅｃは、慢性骨髄性白血病の成功した治療である［２７］。したがって、本発明者らは、ＫＢＭ７細胞がＧｌｅｅｖｅｃに対して感受性であるかどうかを調べた。図６Ｃは、これらの細胞がＧｌｅｅｖｅｃに対して非常に感受性であり、そしてアポトーシスを経ることによって均一に反応することを示す。これらのデータによって、ＫＢＭ７細胞における遺伝子スクリーンを通じて、ＴＲＡＩＬおよびＧｌｅｅｖｅｃ仲介性細胞傷害性に必須の遺伝子産物が明らかになりうることが示唆される。Ｇｌｅｅｖｅｃが仲介する細胞傷害性に必要な遺伝子における突然変異は、この剤に対する耐性に寄与しうる。
【０１３８】
[00174]実施例１０：選択を伴わない遺伝子トラッピング
[00175]本発明者らは、本発明者らのスクリーニング系において、ウイルスが組み込まれている遺伝子座の発現に関するいかなる選択も含まずに、遺伝子トラッピングを用いることが実現可能であるかどうかを調べた。この問題に取り組むため、本発明者らは、所望の表現型を示す突然変異体の選択前に、薬剤またはＧＦＰ選択されていない細胞を用いた。炭疽およびジフテリア毒素を用いた研究において、このアプローチは、選択を伴って達成されるのと同じ突然変異体対立遺伝子の回収を導き（実施例６Ａを参照されたい）、この戦略を用いて、非常に低レベルで発現される遺伝子において組込みを有する突然変異体を同定可能であることが示唆された。
【０１３９】
[00176]高発現される遺伝子に向かうバイアスを回避するのを補助する別のオプションは、プロモーター不含遺伝子トラップベクターに基づく戦略の代わりに、ポリＡに基づく遺伝子トラッピングを用いることである。本発明者らは、ＣＭＶまたはＰＧＫプロモーターなどの強いプロモーターを所持し、そして選択マーカーの下流にスプライス・ドナー部位を導入してポリＡ配列を置換するように、本発明者らの現存するベクターを修飾するであろう。効率および同定される遺伝子に関して、これらの戦略に基づく遺伝子トラッピングを用いて突然変異誘発された細胞集団を、上述のプロモーター不含遺伝子トラップベクターを使用した戦略と比較するであろう。
【０１４０】
[00177]実施例１１：関心対象の表現型を示す突然変異体同定の最適化
[00178]上記実施例に記載するアプローチを用いた、関心対象の細胞表現型に関与する遺伝子範囲の同定は、現在、本発明者らが個々に培養し、そしてＤＮＡ単離および逆ＰＣＲを用いたウイルス組込み部位のマッピングに使用可能である、いくつかのクローンに限定されうる。マッピング法がより効率的であれば、より大きな集団の細胞を本発明者らの遺伝子トラップウイルスに感染させることによって、少なくとも１０〜１００倍、関心対象の表現型に関して回収される個々の突然変異体数を増加させることが、原理的には可能であろう。これによって、ポリＡトラップ遺伝子トラップベクターを用いて、より小さい遺伝子またはおそらくより低いレベルで発現される遺伝子における組込みを発見する可能性が増加させることによって、潜在的に、より多くの遺伝子を同定することが可能になるであろう。本明細書において、本発明者らは、Ｓｏｌｅｘａ配列決定技術を用いて、数百または数千の組込みを同時にマッピングする新規配列決定技術を利用することを提唱する。
【０１４１】
[00179]多数の組込みの同時マッピングの実現可能性を立証するため、本発明者らは、ウイルス組込み部位の正確な位置を知っている５０のクローン性細胞株を用いて、そしてこれらの細胞を、５つのクローンが集団の１０％、５つのクローンが２％、５つのクローンが０．５％、そして５つの他のクローンが０．０１％に相当するような方式で、１：１で混合するであろう。次に、この細胞集団からＤＮＡを単離し、そして１０ｎｇ〜１μｇまでの範囲で増加する量のゲノムＤＮＡを用いた逆ＰＣＲ反応を設定するであろう。ゲノムＤＮＡとウイルスＬＴＲの接合部の非常に近傍にアニーリングするように設計されたＳｏｌｅｘａアダプター配列を含有するプライマーを用いて、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）逆ＰＣＲを行うであろう。この材料を用いて、Ｓｏｌｅｘａ配列決定を行うであろう。得られた配列をヒトゲノムに対してマッピングし、そして本発明者らは、組込み部位の正確なインプットおよびその存在量を知っているため、Ｓｏｌｅｘａ配列決定を用いた単一マッピング反応において分析可能であるクローン集団が、どの程度大きい可能性があるかを決定することも可能である。
【０１４２】
[00180]実施例１２：新規細胞タイプの生成およびポリオウイルスに関する宿主因子の同定
[00181]本発明者らは、半数体遺伝学に適したさらなる細胞タイプを得ることを望んだ。分化した細胞状態の再プログラミングを可能にする、近年記載されている方法は、多能性誘導性転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃの導入を使用する［２６］。本発明者らが知る限り、この方法は、培養ヒト癌細胞株においては用いられてきていない。本発明者らは、細胞性再プログラミングが、造血系ＫＢＭ７細胞の分化した細胞状態を改変させることが可能であるかどうかを試験した。４つの転写因子を導入すると、付着細胞クローンの形成が生じた。これらのクローンのいくつかまたは大部分は、造血系細胞表面マーカーＣＤ４３およびＣＤ４５を失った。これらの細胞の大部分は、多能性ではなく、そしてＨＡＰ１細胞は、１０％ＦＣＳを含有する培地中で培養可能であり、そしてトリプシンを用いて拡大可能であった。これらの細胞は、造血性ではなく、そしてこれらの細胞の大部分は、染色体８を含む各染色体を単一コピーで有した。
【０１４３】
[00182]次に、本発明者らは、この新規細胞タイプを用いて、ＫＢＭ７細胞で研究不能な生物学を研究可能であるかどうかを調べた。インフルエンザウイルスとは対照的に、ＫＢＭ７細胞は、ポリオウイルスには生産的に感染不能である（図５）。しかし、ＨＡＰ１細胞は、ポリオウイルス感染に非常に感受性であり、そして数日以内に、大規模な細胞死を経る。続いて、新鮮なＨＡＰ１細胞を本発明者らの遺伝子トラップ・レトロウイルス構築物に感染させ、そしてポリオウイルスに曝露した。２つの耐性コロニーを拡大し、そして組込みをマッピングした。図５に示すように、どちらの突然変異体も、既知のポリオウイルス進入受容体ＰＶＲに独立の組込みを含有し、したがってその耐性が説明された。これらの結果は、ＫＢＭ７細胞由来の再プログラミングされた非造血系細胞株における半数体遺伝子スクリーンを通じて、ポリオウイルス感染に必須の因子が発見可能であることを示す。さらに、これらは、多能性以外に、関心対象の表現型（例えば付着、病原体に対する改変された感受性）を持つ細胞を生成するため、再プログラミング技術が有用であることを立証する。
【０１４４】
[00183]実施例１３：新規半数体細胞タイプの生成
[00184]実施例１２に記載するように、転写因子ｃ−Ｍｙｃ／ＯＣＴ４／ＳＯＸ２およびＫＬＦ４によって仲介される再プログラミングを通じて、ＫＢＭ７細胞の分化細胞状態を改変することも可能である。このアプローチによって、ＫＢＭ７細胞においては取り組み不能な、少なくともいくつかの生物学的問題の研究を可能にする、少なくとも１つの新規非造血系細胞タイプが生じた。本発明者らは、再プログラミングを用いて、ＫＢＭ７細胞由来のさらなる非造血系細胞株を生成し、そして性質決定するであろう。いくつかの場合で、本発明者らは、細胞再プログラミングおよび／または非組込み送達戦略を刺激して、細胞に再プログラミング因子を供給する、他の再プログラミング遺伝子または転写因子または小分子を用いるであろう。
【０１４５】
[00185]実施例１２に記載する実験において、本発明者らは、他の研究者によって、体細胞を再プログラミングするのに、以前、成功裡に用いられているベクター系を用いた［２６］。これらのレトロウイルスベクターは、ゲノム内に組み込まれて、遺伝子配列の潜在的な不活性化、ならびにレトロウイルスベクターがサイレンシングを経ない限り続く、これらの４因子の発現を生じる。これらの潜在的な問題を回避するためには、４つの因子を発現する非組込み性アデノウイルスベクターを用いて、非造血系細胞タイプを生成する［３０］。別のアプローチにおいて、細胞が後成的に安定した改変分化状態に到達した際に、導入された遺伝子配列の切除を可能にするように、ＬＴＲ中にＬｏｘＰ配列を含有する、修飾レトロウイルス発現ベクターを用いて、４つの因子を近半数体ＫＢＭ７細胞に形質導入する。本発明者らはすでに、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅウイルスでの感染に際して、本発明者らの細胞タイプにおいて、ＬｏｘＰ部位間の組込みが効率的に起こることを検証している。
【０１４６】
[00186]多数の（例えば５つの）独立に得られる非造血性細胞株は、どの細胞タイプに似ているかを解明する遺伝子発現分析を用いて、性質決定される。ＫＢＭ７細胞および非造血系由来細胞株のマイクロアレイ遺伝子発現プロファイルを生成し、そして異なる組織起源の６１の異なる純粋細胞培養由来の公的に入手可能な遺伝子発現パターン（ＮＣＢＩ  ＧＥＯ寄託ＧＤＳ１４０２）または７９の異なる組織由来のヒトゲノムの遺伝子発現アトラス（ＮＣＢＩ  ＧＥＯ寄託ＧＤＳ  ５９４）に比較する。これによって、非造血系細胞クローンが最もよく似ている分化細胞状態の同定が可能になる。
【０１４７】
[00187]多数の（例えば２０の）独立に得られる非造血系細胞株は、染色体８を含むすべての染色体に関して半数体である大部分の細胞を含有する細胞集団を同定するための核型決定を用いて性質決定される。
【０１４８】
[00188]実施例１４：近半数体ｉＰＳ細胞の生成
[00189]近半数体ｉＰＳ細胞を生成するため、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃを発現するウイルスにＫＢＭ７細胞を感染させ、そしてマウスフィーダー細胞、ｂ−ＦＧＦおよびノックアウト血清代替物を用いて、ヒトＥＳ細胞に最適な増殖条件において、クローンを拡大する。ヒトＥＳ細胞クローンの形態を有するコロニーを拡大し、そして多能性に関するマーカーの発現を調べる。Ｔｒａ−１−８１、Ｌｉｎ−２８、Ｎａｎｏｇおよび／またはアルカリホスファターゼ活性などの、多能性に関連するマーカーを発現するクローンを核型決定して、これらが近半数体染色体数を維持しているかどうかを決定し、そしてマウスに注射して、これらの細胞が多能性であり、そして各胚葉に由来する細胞タイプを含有する腫瘍を生じさせることが可能かどうかを決定する。近半数体多能性細胞は、将来の遺伝子スクリーンのための多くの異なる細胞タイプの生成を可能にするであろう。特に、本発明者らは、すでに、実施例１２に記載する実験において、アルカリホスファターゼ（ヒトおよびマウスＥＳ細胞に関して用いられるマーカー）に関して陽性であるＥＳ様コロニーの出現を観察している。
【０１４９】
[00190]実施例１５：多重挿入部位の同時マッピング
[00191]上記実施例において、挿入部位の同定および１つずつ行うマッピングの前に、細胞をサブクローニングした。特定の細胞表現型に関して選択されている細胞プールにおいて、多数の挿入部位を効率的にマッピング可能であれば、分析は非常に促進されるであろう。さらに、これによって、表現型の選択が、例えば細胞傷害性に基づくスクリーンよりもよりストリンジェントでない、濃縮スクリーンまたは欠乏スクリーンが可能になるであろう。同時にマッピング可能な挿入数を増加させるため、本発明者らは、実施例５に言及する逆ＰＣＲプロトコルを、大規模平行配列決定技術に使用可能であるように適用させるよう着手した。遺伝子トラップベクターに感染させた３０００万の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。２つはＮｌａＩＩＩそして２つはＭｓｅＩを用いて、試料あたり４つの消化反応を行った。続いて、消化したＤＮＡをカラム精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、３００マイクロリットルの体積中、１マイクログラムのＤＮＡを室温で一晩連結した。別の周期のカラム精製後、外側に向かうプライマーを用いた逆ＰＣＲのテンプレートとしてＤＮＡを用いた。大規模平行配列決定プラットホームである「Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析装置」で使用するのに必要なアダプター配列を含有するように、オリゴヌクレオチドを設計した。ＮｌａＩＩＩで消化したテンプレートに関して、用いたオリゴヌクレオチドは：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１４２）  ５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１４３）であった。ＭｓｅＩで消化したテンプレートに関して、用いたオリゴヌクレオチドは：  ５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１４４）  ５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号１４５）であった。４つのＰＣＲ反応をプールし、そして製造者のプロトコルにしたがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析装置上での分析に用いた。典型的には、この分析から、ヒトゲノム上の異なる位置にマッピングされる〜２０，０００の挿入部位が得られる。遺伝子トラップ挿入が豊富であるゲノム遺伝子座の同定を容易にするため、グラフ中に「挿入密度」をプロットしてもよい。１／（３つの続く挿入部位までの平均距離）を計算することによって、すべての挿入に関して、挿入密度を決定する。図７は、こうした分析の例を示す。高い挿入密度を持つ領域は、ノックアウトされると探査されている表現型を導く遺伝子を含有するゲノム領域を、潜在的に示す。４つの遺伝子座が耐性を与えることが直ちにわかる。
【０１５０】
[00192]参考文献
【０１５１】
【化１−１】
0005886195.tif 000002
【０１５２】
【化１−２】
0005886195.tif 000003
【０１５３】
【化１−３】
0005886195.tif 000004
【０１５４】
実施例１６：
材料および方法
遺伝子トラップベクターの構築
[00193]不活性化された３’ＬＴＲ、強いアデノウイルス（Ａｄ４０）スプライス−アクセプター部位、ＧＦＰまたはピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＵＲＯ）いずれか、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有するレトロウイルス遺伝子トラップベクターを以下のように構築した。オーバーハングＣｌａＩおよびＮｈｅＩ制限部位、ならびに部分的スプライス・アクセプター部位を含有するプライマー：（ＧＦＰ：  ５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１４６）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１４７）  ＰＵＲＯ：  ５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１４８）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１４９））を用いたＰＣＲ増幅によって、ＰＵＲＯまたはＧＦＰのコード配列を得た。これらのＰＣＲ産物をｐＥＧＦＰＣ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に挿入して、ＥＧＦＰを置換した。続いて、プライマー：（ＧＦＰ：  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１５０）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１５１）  ＰＵＲＯ：  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１５２）および５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１５３））を用いたＰＣＲを行って、完全スプライス・アクセプター部位を導入し、そしてポリアデニル化シグナルを含むマーカー遺伝子を得た。これらのＰＣＲ産物をｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲ（１）中に挿入して、ｐｏｌＩＩＩプロモーターを置換した。生じるプラスミドはｐＧＴ−ＧＦＰおよびｐＧＴ−ＰＵＲＯである。順方向プライマー（ＰＵＲＯ：  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡ−３’（配列番号１５４）およびＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡ（配列番号１５５）；  ＧＦＰ：  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１５６）および５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１５７））と逆方向プライマー（ＡＡＴＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧ（配列番号１５８））を用い、これらのプラスミドをＰＣＲテンプレートとして用いて、２つのさらなるリーディングフレームにある遺伝子トラップベクターを得た。これらのＰＣＲ産物をｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲ中に挿入して、ｐｏｌＩＩＩプロモーターを置換した。元来のベクタ��に比較して、＋１および＋２リーディングフレームを持つ、生じたプラスミドを、ｐＧＴ＋１−ＧＦＰ、ｐＧＴ＋２−ＧＦＰ、ｐＧＴ＋１−ＰＵＲＯおよびｐＧＴ＋２−ＰＵＲＯと称した。
【０１５５】
組織培養、ウイルス産生、および突然変異体ライブラリー生成
[00194]２９３Ｔ、Ｕ２ＯＳ、ＨｅＬａおよびＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３をＡＴＣＣから得て、そして１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＫＢＭ−７細胞（Ｂｒｅｎｔ  Ｃｏｃｈｒａｎ博士、タフツ大学医学部、マサチューセッツ州ボストンの寛大な提供による）を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＩＭＤＭ中で維持した。Ｔ１７５ディッシュ中、ｐＧＴ−ＧＦＰまたはｐＧＴ−ＰＵＲＯのいずれかとレトロウイルス・パッケージングプラスミドを組み合わせて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって、遺伝子トラップウイルスを産生した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローター中、２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．、１．５時間の超遠心を用いて、ウイルス含有上清を濃縮した。突然変異体ＫＢＭ７細胞のバッチは、典型的には、２，０００ｒｐｍで４５分間のスピン感染を用いて、ウェルあたり１５０万細胞を含有する１枚の２４ウェル組織培養ディッシュの感染によって作製された。０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有する遺伝子トラップに感染させた細胞を、感染２日後に選択した。選択後、細胞を拡大して、そしてさらなるスクリーンのため凍結した。ＧＦＰ遺伝子トラップ感染細胞をスクリーンに直接用いるか、またはＧＦＰ発現細胞に関するＦＡＣＳ分取を用いてまず選択した。遺伝子トラップ感染の少なくとも６日後にスクリーンを開始した。
【０１５６】
スクリーン
[00195]一般的に、適切な濃度のスクリーニング剤を含有する培地中に、突然変異誘発されたＫＢＭ７細胞を再懸濁し、そして９６ウェル組織培養プレート中に、ウェルあたり２０，０００細胞でプレーティングした。細胞を２〜３週間インキュベーションした後、耐性細胞は明らかに可視のコロニーを形成した。典型的には、ウェルあたり１より少ないコロニーが存在するため、ピックされるコロニーは大部分クローン性であり、そしてこれを用いて挿入部位をマッピングした。
【０１５７】
挿入部位のマッピング
[00196]逆ＰＣＲプロトコルを用いて、プロウイルス挿入部位に隣接する宿主配列を決定した。ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、５００万の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そして４μｇをＮｌａＩＩＩまたはＭｓｅＩで消化した。スピンカラム精製（Ｑｉａｇｅｎ）後、３００μｌの体積中、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１μｇの消化したＤＮＡを連結した。スピンカラムを用いて反応混合物を精製し、そして遺伝子トラップベクター中の内部配列にアニーリングするプライマー（５’−ＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１５９）および５’−ＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１６０））を用いるＰＣＲ反応で用いた。隣接配列を含む、生じたＰＣＲ産物を、（５’−ＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１６１））を用いて配列決定した。
【０１５８】
補完のためのレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの構築
[00197]異なるレトロウイルスおよびレンチウイルス発現系を用いた。ｐＬＩＢ−ＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＧＬＵＥを用いて、アフィニティタグを含むＣ末端融合体として、ＷＤＲ８５およびＥＦ２を発現させた。まず、ＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＧＬＵＥカセットを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＧＬＵＥ（Ｓ．  Ａｎｇｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：３４８（Ａｐｒ  ２００６）；  Ｒａｎｄａｌｌ  Ｍｏｏｎ博士、ワシントン大学医学部、ワシントン州シアトルの寛大な提供による）から、ＳｆｉＩおよびＣｌａＩオーバーハング制限部位を含有するプライマー（５’−ＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧ−３’（配列番号１６２）および５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＧＴＣＧＧＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１６３））を用いてＰＣＲ増幅し、そしてＰＣＲ産物をレトロウイルス発現ベクターｐＬＩＢ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に挿入して、ｐＬＩＢ−ＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＧＬＵＥを得た。ＮｏｔＩオーバーハング制限部位を含むプライマー（ＷＤＲ８５：  ５’−ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＧＣＣＣＴＧＣＡＡＡＣＧ−３’（配列番号１６４）および５’−ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１６５）、ＥＦ２：  ５’−ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１６６）および’−ＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１６７））を用いて、ＷＤＲ８５およびＥＦ２のコーディング配列をＫＢＭ−７細胞由来のｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をｐＬＩＢ−ＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＧＬＵＥ中に挿入した。ｐＷＺＬ−ｈｙｇｒｏ−ＨＡを用いて、ＨＡエピトープを含むＮ末端融合体として、ＴＭＥＭ１８１を発現させた。まず、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩならびにアニーリングさせたオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＡＡＧ−３’（配列番号１６８）および５’−ＴＣＧＡＣＴＴＡＧＧＣＧＴＡＧＴＣＧＧＧＣＡＣＧＴＣＧＴＡＧＧＧＧＴＡＴＴＧ−３’（配列番号１６９））を用いて、レトロウイルス発現ベクターｐＷＺＬｈｙｇｒｏ中にＨＡエピトープを挿入した。オーバーハングＢｓｔＸＩ制限部位を含有するプライマー（５’−ＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧ−３’（配列番号１７０）および５’−ＣＣＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１７１））を用いて、ＴＭＥＭ１８１のコーディング配列をＰＣＲ増幅し、そして生じたプラスミド中に挿入した。ｐＭＸｓＩＲＥＳｂｌａｓｔ−ＦＬＡＧを用いて、ＦＬＡＧエピトープを含むＣ末端融合体として、候補を発現させた。まず、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩならびにアニーリングさせたオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣ−３’（配列番号１７２）および５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣ−３’（配列番号１７３））を用いて、ＦＬＡＧエピトープを、レトロウイルス発現ベクターｐＭＸｓＩＲＥＳｂｌａｓｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中に挿入し、ｐＭＸｓＩＲＥＳｂｌａｓｔを得た。オーバーハングＢｓｔＸＩ制限部位を含有するプライマー（ＳＧＭＳ１：  ５’−ＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号１７４）および５’−ＧＡＴＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１７５）、ＣＭＡＳ：  ５’−ＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧ−３’（配列番号１７６）および５’−ＧＡＴＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＣ（配列番号１７７）、ＴＭＥＭ１８１：  ５’−ＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１７８）およびＧＡＴＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＡＴＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７９））を用いて、ＳＧＭＳｌ、ＣＭＡＳおよびＴＭＥＭ１８１のコーディング配列をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＭＸｓＩＲＥＳｂｌａｓｔ中に挿入した。オーバーハングＸｂａ１およびＮｈｅ１制限部位を含有するプライマー（５’−ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１８０）および５’−ＡＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号１８１））を用いて、ＳＬＣ３５Ａ２のコーディング領域をＰＣＲ増幅し、そしてＲＦＰをコードする二シストロン性レンチウイルスベクター（Ｍａｒｉｕｓ  Ｗｅｒｎｉｇ博士、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州ケンブリッジの寛大な提供による）中に挿入した。
【０１５９】
毒素処理のための細胞生存度アッセイ
[00198]ＫＢＭ−７野生型または突然変異細胞を、９６ウェル組織培養プレート中、ウェルあたり２０，０００細胞で植え付け、そして示す濃度の毒素で処理するかまたは未処理のままにした。処理４日後、製造者のプロトコルにしたがって、ＸＴＴ比色アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細胞生存度を測定した。未処理対照に比較した生存度パーセントとして、生存度をプロットする。ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳまたはＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞におけるＴＭＥＭ１８１過剰発現の影響を評価するため、レトロウイルスベクターｐＭｘＩＲＥＳｂｌａｓｔ−ＦＬＡＧＴＭＥＭ１８１で細胞に形質導入した。２５μｇ／ｍｌブラストサイジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での選択後、ポリクローナル集団を得た。２４ウェル組織培養プレート中、ウェルあたり１０，０００細胞で細胞をプレーティングし、そして植え付け１日後、示す濃度のｃｄｔホロ毒素で処理した。処理６日後、生存付着細胞をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、その後、７０％エタノール中の０．５％クリスタルバイオレット染色剤で３０分間染色した。水で穏やかに３回洗浄した後、風乾させたプレートをスキャンした。生存度を定量的に決定するため、９６ウェルプレート中、ウェルあたり２，０００細胞で細胞を植え付け、そして１日後、ｃｄｔで処理した。処理６日後、示す濃度の毒素で処理するかまたは未処理のままにした。処理４日後、製造者のプロトコルにしたがって、ＸＴＴ比色アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細胞生存度を測定した。
【０１６０】
細胞周期分析
[00199]細胞周期分析のため、ＫＢＭ７野生型および突然変異細胞を、２４ウェル組織培養プレート中、ウェルあたり５０万細胞で植え付け、そして示す濃度のｃｄｔで処理した。中毒２４時間後、フローサイトメトリーのため、細胞を以下のようにプロセシングした。細胞懸濁物を遠心分離し、そして上清を取り除き、そして２００μｌ染色溶液（０．１％クエン酸ナトリウムに加えて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、ヨウ化プロピジウム５０μｇ／ｍｌ）中に、細胞ペレットを再懸濁した。氷上で６０分間インキュベーションした後、ＦＡＣＳ  ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによって、染色した細胞を分析した。
【０１６１】
遺伝子トラップ突然変異体における発現を決定するためのウェスタンブロット分析
[00200]Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で細胞を直接溶解し、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、そしてポリビニリデン・ジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした。ＨＰＲＴ（Ａｂｃａｍ）、ＦＡＤＤ（ＦＤ１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、カスパーゼ８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＮＦ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＤＫ４（Ｃ−２２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＣＭＡＳ（ａｂｃａｍ）に関する一次抗体を用い、標準法にしたがって、イムノブロットをプロセシングした。
【０１６２】
遺伝子トラップ突然変異体における発現を決定するためのＲＴ  ＰＣＲ
[00201]オンカラムＤＮアーゼＩ消化を用い、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に記載されるように、総ＲＮＡを調製した。オリゴ（ｄＴ）２０プライミング逆転写のため、各試料由来の１マイクログラムの総ＲＮＡを用いて、製品プロトコル（ＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ第一鎖合成系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載されるように反応を行った。２８回のＰＣＲ周期を用い、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマー配列は、ＷＤＲ８５（５’−ＣＡＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１８２）および５’−ＧＣＣＡＧＴＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１８３））  ＳＬＣ３５Ａ２（ＣＴＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣ（配列番号１８４）およびＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＧ（配列番号１８５））である。
【０１６３】
ＭＥＫ切断
[00202]ＭＥＫ切断が、ＷＤＲ８５突然変異細胞において起こりうるかどうかを試験するため、炭疽保護性因子（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を炭疽致死性因子（ＬＦ；Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と組み合わせ、そしてそれぞれ、６００ｎｇおよび１５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で、細胞に添加した。３７℃で９０分間インキュベーションした後、細胞をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で溶解し、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、そしてポリビニリデン・ジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした。ＭＥＫ−３に対する一次抗体（Ｃ−１９  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて、標準法にしたがってイムノブロットをプロセシングした。
【０１６４】
イマチニブ、６−チオグアニンまたはＴＲＡＩＬでの細胞処理
[00203]代謝拮抗剤６−チオグアニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に関しては、全インキュベーション期間中、２０μＭの濃度を用いた。イマチニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に関しては、４日間は１μＭの濃度を用い、その後の２週間は３００ｎＭに希釈して用いた。組換えＴＲＡＩＬ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２４ウェルプレート中、２００万細胞に対して、１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。１週間後、１枚の９６ウェルプレート中に細胞をプレーティングし、それによって、ＴＲＡＩＬを２０倍希釈した。
【０１６５】
ジフテリア、ＬＦ−ＤＴＡおよびＣＤＴ処理
[00204]ジフテリア毒素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に関しては、全インキュベーション期間中、４００ｎｇ／ｍｌの濃度を用いた。製造者のプロトコルにしたがって、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ｐＥＴ−１５ｂ  ＬＦＮ−ＤＴＡ（Ｍｉｌｎｅら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５：６６１（Ｆｅｂ  １９９５）；  Ｊｏｈｎ  Ｃｏｌｌｉｅｒ博士、ハーバード大学医学部、マサチューセッツ州ボストンの寛大な提供による）で形質転換した大腸菌から、炭疽スクリーンで用いるＬＦＮ−ＤＴＡを精製した。このタンパク質を、炭疽保護性抗原（ＰＡ；Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と合わせて、ＰＡおよびＬＦＮ−ＤＴＡに関して、それぞれ、最終濃度６００ｎｇおよび１５０ｎｇ／ｍｌにした。プラスミドｐＤＳ７．９６（Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｋａｐｅｒ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６２：２４４（Ｊａｎ  １９９４）；  Ｊａｍｅｓ  Ｋａｐｅｒ博士、メリーランド大学医学部、メリーランド州ボルティモアの寛大な提供による）から、大腸菌由来細胞致死性膨張性毒素を産生した。このプラスミドで形質転換したＤＨ５ａ株のフィルター滅菌培地上清をμｌあたり５μｇの総タンパク質に濃縮した。スクリーンのため、細胞致死性膨張性毒素を全インキュベーション期間中、５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【０１６６】
インフルエンザ感染
[00205]１００万の野生型または突然変異体ＫＢＭ７細胞を、１００μｌ血清不含ＩＭＤＭ培地中、スクロース勾配精製インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）５０，０００ＨＡ単位と、室温で１時間インキュベーションした。続いて、５μｇ／ｍｌトリプシンを含有するＩＭＤＭ培地中に細胞を採取し、そして２４ウェル組織培養プレートのウェル中にプレーティングした。感染１２時間後、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、そしてインフルエンザウイルスＡ核タンパク質に対して作製された一次抗体（ＡＡ５Ｈ、Ａｂｃａｍ）を用いて染色した。ウイルスタンパク質は、ウイルスの複製が起こった場合にのみ、検出可能なレベルまで集積するため、蛍光細胞の割合は、感染した細胞の割合に相当すると見なされる。４つのランダムに選択した顕微鏡視野において、感染細胞あたり〜２００細胞を計数することによって、割合を計算した。
【０１６７】
ライセニン処理
[00206]ＫＢＭ７野生型または突然変異細胞を、シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｆｏｅｔｉｄａ）由来の５００ｎｇ／ｍｌのライセニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベーションした。続いて、細胞完全性に基づくＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存度／細胞傷害性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞生存度を直ちに決定した。あるいは、細胞を９６ウェル組織培養プレート中に、ウェルあたり３０，０００細胞でプレーティングし、そして処理２日後、製造者のプロトコルにしたがって、ＸＴＴ比色アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、生存度を決定した。
【０１６８】
ＴＭＥＭ１８１とＣＤＴの相互作用
[00207]２ｍｌ  ＮＥＴＮ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を補充した、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）中に再懸濁した抗Ｆｌａｇ  Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＨ５アルファ細胞、またはＣＤＴのＦＬＡＧタグ化型（部位特異的突然変異誘発によって、サブユニットＣＤＴＡのシグナル分泌ペプチド下流にタグを導入（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を発現しているＤＨ５アルファ細胞の４００μｌ濃縮フィルター滅菌培地上清とインキュベーションした。回転振盪装置中、４℃で一晩インキュベーションした後、ビーズをＮＥＴＮ緩衝液で３回洗浄した。ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣＬ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％ＣＨＡＰＳ）中で溶解させたＫＢＭ−７細胞およびＨＡ−ＴＭＥＭ１８１を過剰発現するＫＢＭ−７細胞の細胞溶解物と、洗浄したビーズを、プロテアーゼ阻害剤の存在下でインキュベーションした。遠心分離して不溶性物質を除去した後、試料を半分にし、そして等量の対照またはＦＬＡＧ−ＣＤＴカップリングビーズのいずれかを添加した。インキュベーション６時間後、ビーズをＣＨＡＰＳ溶解緩衝液で４回洗浄し、そして３ｘＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、タンパク質複合体を溶出させ、そしてイムノブロッティングによって分析した。
【０１６９】
ＥＦ２の精製
[00208]１０９のＫＢＭ−７細胞またはｐＬＩＢ−Ｇｌｕｅ−ＥＦ２に感染したＫＢＭ−７細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＮＥＴＮ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）中で溶解し、そしてストレプトアビジン・セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、タンパク質複合体を精製し、そして５０ｍＭビオチンを用いて溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を用いて、タンパク質を分離し、そして銀染色を用いて視覚化した。質量分析のため、ゲルからＥＦ２バンドを精製し、そしてトリプシンを用いて消化した。
【０１７０】
ＥＦ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏリボシル化およびｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化
[00209]５ｎｇ  ＬＦＮ−ＤＴＡおよび２．５μＭ  ＮＡＤ−ビオチン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）を用いて、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液中、ＥＦ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏリボシル化を行った。反応を３０℃で４５分間インキュベーションした。「中間体」ＥＦ２  ＤＰＨ５突然変異細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化のため、プロテアーゼ阻害剤を含有するＭ−緩衝液（３０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＡｃ、６ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．５％ＮＰ４０）中で、ｐＬＩＢ−Ｇｌｕｅ−ＥＦ２を発現している突然変異細胞を溶解した。Ｍ−緩衝液を用いて、ビーズを２回洗浄し、そしてＭ−緩衝液中で溶解した野生型細胞ならびにＷＤＲ８５およびＤＰＨ５不全細胞由来の細胞溶解物とインキュベーションした。反応あたり５μＣｉ  Ｈ３−ＡｄｏＭｅｔを添加し、そして反応を３０℃で６０分間インキュベーションした。
【０１７１】
結果
ヒト細胞における機能喪失遺伝学に関する新規アプローチの開発
[00210]ヒト細胞における突然変異誘発に基づく遺伝学アプローチを促進するため、本発明者らは、染色体８以外は半数体核型を持つＫＢＭ−７  ＣＭＬ細胞株のユニークな誘導体を用いた（７）（図８Ａを参照されたい）。この細胞株において、遺伝子活性化は、大部分の非必須遺伝子に関して、ヌルアレルの生成を可能にするはずである。本発明者らは、挿入突然変異誘発を用いて遺伝子を不活性化することを選択したが、これはこのアプローチが多様な生物において、非常に突然変異誘発性であり、そして組み込まれたＤＮＡ配列が破壊された遺伝子を迅速に同定する分子タグを提供するためである。本発明者らは、レトロウイルス主鎖と逆配向で、強いアデノウイルス・スプライス・アクセプター部位およびマーカー遺伝子（ＧＦＰまたはピューロマイシン耐性遺伝子）を含有する遺伝子トラップ・レトロウイルスを用いた。遺伝子トラップ挿入が実際に突然変異誘発性であるかどうかを調べるため、酵素ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ）によって毒性代謝物に変換されるヌクレオチド類似体６−チオグアニン（６−ＴＧ）を用いてパイロットスクリーンを行った。遺伝子トラップウイルスを滴定して、大部分の感染細胞において、単一のウイルス組込みを得た。６−ＴＧに対して耐性である細胞株を回収し、そしてプロウイルス／宿主接合部のユニークな配列によって、５つの独立の突然変異体が、Ｘ連鎖ＨＰＲＴ遺伝子のイントロン１中に挿入を所持することが示された（図８Ｂ）。本発明者らは、常染色体遺伝子をターゲットとする２つの遺伝子スクリーンを行った。ＫＢＭ−７細胞は、腫瘍壊死因子リガンドＴＲＡＩＬに対して感受性であり、そしてキナーゼ阻害剤ＧｌｅｅｖｅｃによるＢＣＲ−ＡＢＬ発癌性融合タンパク質の阻害に対して感受性である。遺伝子トラップによって突然変異誘発されたＫＢＭ７細胞を、ＴＲＡＩＬまたはＧｌｅｅｖｅｃのいずれかに曝露し、そして耐性突然変異体を回収した。５つのＴＲＡＩＬ耐性クローンによって、カスパーゼ８中に独立の挿入が示され、そしてＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに必要であることが知られる遺伝子であるＦＡＤＤ（８）中に２つの独立の挿入が示された（図８Ｄ）。ＴＲＡＩＬに対する耐性が、これらの突然変異体において確認された（図８Ｃ）。５つの独立のＧｌｅｅｖｅｃ耐性突然変異体は、ＮＦ１に挿入を含有し、そして１つはＰＴＰＮ１に挿入を含有し；どちらの遺伝子もＧｌｅｅｖｅｃに対するＣＭＬ細胞の反応において、重要な役割を果たす（９）。ｃ−ａｂｌと相互作用し、そしてその活性を負に制御するチロシンホスファターゼであるＰＴＰＮ１２に、１つの挿入が見られた（１０）。したがって、本発明者らのスクリーンによって、ＰＴＰＮ１２がＧｌｅｅｖｅｃ感受性に必須であることが示唆される。すべての挿入は、ターゲット遺伝子と同じ転写配向であり、そしてＨＰＲＴ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ８およびＮＦ−１突然変異細胞のイムノブロット分析は、対応する遺伝子産物を検出するのに失敗した（図８Ｃ）。したがって、ＫＢＭ７の半数体バックグラウンドは、常染色体遺伝子に関する突然変異体アレルの生成を可能にし、そして研究中の生物学的プロセスに関与する遺伝子を正確に示す。
【０１７２】
ＣＤＴに必要な宿主因子の同定
[00211]細菌毒素またはウイルスなどの多くの病原体は、ターゲットとする細胞を容易に殺すため、ヒト遺伝子に関するノックアウト・アレルの大規模産生は、病原性に必須の宿主因子、例えば毒素またはウイルスによって認識される構造を生成する酵素、あるいは受容体自体の同定を可能にしうる。大腸菌、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター属種、チフス菌およびヘモフィルス・デュクレイなどのいくつかの病原性細菌は、細胞致死性膨張性毒素（ＣＤＴ）と呼ばれる強力な細菌毒素を共有する。これらの注目すべき毒素のＤＮアーゼＩ様ＣｄｔＢサブユニットは、核に進入し、そしてＤＮＡ切断を誘導することによって、細胞傷害性を引き起こす（１１、１２）。これまでに、ＣＤＴの進入または作用を説明する膜受容体または他の必須宿主遺伝子はまったく同定されてきていない。ＫＢＭ７細胞は、細胞死に先行する細胞周期のＧ２／Ｍ期停止（図９Ａ）を経ることによって、型どおりの方式で、大腸菌由来ＣＤＴに反応する。突然変異誘発されたＫＢＭ７細胞をＣＤＴで処理し、そして耐性クローンを単離した。スフィンゴミエリン・シンターゼ１（ＳＧＭＳ１）における１１の独立の挿入、および推定上のＧタンパク質カップリング受容体（ＧＰＣＲ）をコードする遺伝子であるＴＭＥＭ１８１（１４、１５）における３つの挿入を回収した（図９Ｂ）。ＳＧＭＳ１およびＴＭＥＭ１８１突然変異体はＣＤＴに耐性であり、この表現型は、対応するｃＤＮＡで突然変異細胞を補完することによって元に戻った（図９Ｃおよび図１３）。ＳＧＭＳ１突然変異は、スフィンゴミエリン特異的孔形成毒素であるライセニンで細胞を処理することによって検証されるように、スフィンゴミエリン・レベルを減少させた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。スフィンゴミエリンは、脂質ラフトの重要な構成要素である：ＳＧＭＳ１活性の枯渇は、脂質ラフト機能を妨害し、そして受容体クラスター形成を防御し（１３）、これはＣＤＴ結合および／または進入におそらく関連する特質である。
【０１７３】
[00212]ＴＭＥＭ１８１突然変異体は、ライセニンに対して完全に感受性であるままであり、ＴＭＥＭ１８１耐性が、スフィンゴミエリン枯渇以外の機構によって達成されることが示唆される。ＣＤＴの受容体は、形質膜に局在しなければならないため、本発明者らは、ＣＤＴがＴＭＥＭ１８１に結合するかどうかを試験した。ＦＬＡＧタグ化ＣＤＴを抗Ｆｌａｇビーズ上に吸着させ、そして野生型ＫＢＭ７細胞から、そしてＨＡタグ化ＴＭＥＭ１８１を発現するＫＢＭ−７細胞から調製された細胞溶解物とインキュベーションした。イムノブロット分析によって、ＣＤＴに対するＴＭＥＭ１８１の頑強な結合が示された（図９Ｄ）。ＴＭＥＭ１８１が、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３、Ｕ２ＯＳおよびＨｅｌａ細胞におけるレトロウイルス形質導入によって過剰発現されると、ＴＭＥＭ１８１は、これらの関連しない細胞タイプを、ＣＤＴ中毒に対して感作し（図９Ｅおよび図１５）、これによって、ＴＭＥＭ１８１発現レベルが、中毒を律速することが示唆された。本発明者らは、ＣＤＴが細胞表面受容体ＴＭＥＭ１８１に結合し、この事象は中毒に必要とされ、そしてかつ律速するものであり、そして次いで、スフィンゴミエリン依存性脂質ラフト仲介性エンドサイトーシスを通じて細胞に進入し、その後、核に進入し、そして細胞性ＤＮＡを切断すると提唱する（図９Ｆ）。多くのＧＰＣＲに関しては、その結合は、シグナル伝達を導くだけでなく、迅速なエンドサイトーシスも誘発する。Ｇタンパク質シグナル伝達が、ＣＤＴによる細胞中毒において役割を果たすかどうかはなお決定されないままである。
【０１７４】
インフルエンザウイルス感染力に必須の宿主因子の単離
[00213]ＫＢＭ７細胞はインフルエンザウイルスに曝露されると容易に殺されてしまうため、本発明者らは次に、インフルエンザウイルスＡ（ＰＲ／８／３４；Ｈ１Ｎ１）に耐性である突然変異細胞を単離した。ＮｅｕＡｃから、シアル酸含有複合糖質合成で用いられるグリコシル・ドナーであるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃへの活性化に関与する酵素をコードする遺伝子、ＣＭＡＳにおける２つの独立の挿入が、プロウイルス／宿主接合部の配列決定によって明らかになった。これらの構造は、インフルエンザ赤血球凝集素によって認識されることも可能であり、そしてインフルエンザ感受性細胞上の受容体である。本発明者らは、ＳＬＣ３５Ａ２における３つの独立の挿入を回収した（図１０Ａ）が、ＳＬＣ３５Ａ２は、その産物が、ＵＤＰガラクトースを細胞質からゴルジまで輸送する遺伝子であり、ＵＤＰ−ガラクトースは、ゴルジで、シアル酸で修飾されるグリカンの生成に重要なグリコシル・ドナーとして働く（１４）。突然変異細胞がインフルエンザに感染可能であるかどうかを決定するため、本発明者らは、細胞をウイルスに曝露して、そして感染１２時間後、インフルエンザ核タンパク質に関して染色した。予期されるように、ＫＢＭ７細胞は、高レベルの感染（〜９５％感染）を示し、一方、ＣＭＡＳおよびＳＬＣ３５Ａ２突然変異細胞は、ウイルス感染に対してほぼ完全な耐性を示した（＜０．０１％感染）；図１０Ｂおよび１８Ｃを参照されたい。突然変異体におけるＣＭＡＳおよびＳＬＣ３５Ａ２発現の欠如を、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノブロット分析によって検証した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。破壊された遺伝子をコードするｃＤＮＡでの形質導入は、インフルエンザ感染に対する感受性を完全に回復し（図１１Ｂ）、観察される耐性が、突然変異遺伝子座に寄与されうることが示された。ＫＢＭ７ゲノムは、インフルエンザに対する耐性に関して、飽和状態ではスクリーニングされていないが、本明細書で同定される輸送体（ＳＬＣ３５Ａ２）および酵素（ＣＭＡＳ）は細胞増殖または生存性に必須ではないため、インフルエンザ療法剤のターゲットとして働きうる。いずれの遺伝子も、以前には、インフルエンザに対する感受性を決定する際に必須であると同定されていなかった。
【０１７５】
ＡＤＰリボシル化毒素に関する宿主因子の同定
[00214]ジフテリアおよび炭疽毒素は、細胞結合部分（Ｂ）、および病原性を増加させるために宿主機能をターゲットとする活性サブユニット（Ａ）で構成される、ＡＢ毒素である。本発明者らは、ジフテリア毒素がどのように細胞に進入し、そして細胞死を誘導するのか、詳細な分子理解を有する（１５、１６）。本発明者らは、突然変異誘発された細胞を、ジフテリアまたは炭疽毒素を用いてスクリーニングした。天然炭疽毒素は、ＫＢＭ７細胞に対して細胞傷害性ではないため、本発明者らは、細胞を、炭疽毒素の細胞結合構成要素−防御抗原（ＰＡ）−およびジフテリア毒素の触媒ドメインに融合させた炭疽致死性因子（ＬＦＮ）（ＬＦＮ−ＤＴＡ）に曝露した（１７）。耐性突然変異体を、炭疽毒素に耐性である（クラスＩ）か、ジフテリア毒素に耐性である（クラスＩＩ）か、または両方に耐性である（クラスＩＩＩ）かのいずれかとして分類した。１０の独立の挿入を有する、既知の炭疽毒素受容体（ＡＮＴＸＲ２）（１８）中の突然変異体を回収し、そして既知のジフテリア毒素受容体（ＨＢ−ＥＧＦ）（１９）に関しては、１２の挿入を有するものを回収した（図１１Ａ）。突然変異体の第三のクラスには、ジフタミド生合成に関与する遺伝子（ＤＰＨ１、ＤＰＨ２およびＤＰＨ５、（１６）を参照されたい）、および以前は性質決定されていなかったＷＤＲ８５と称される遺伝子が含まれた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。これらの挿入物はすべて、突然変異した遺伝子と同じ転写配向にあり、そしてしたがって、遺伝子機能を損なうと予期された。ＷＤＲ８５突然変異体（本明細書において、以後、ＷＤＲ８５ＧＴと称する）において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した際、ＷＤＲ８５転写物はまったく観察されなかった（図１１Ｃ）。ＷＤＲ８５ＧＴの耐性は、ＷＤＲ８５  ｃＤＮＡでのトランスフェクションによって容易に補完され、該ｃＤＮＡは、ジフテリア毒素、炭疽毒素（ＰＡ−ＬＦＮ−ＤＴＡ）および第三の毒素、シュードモナス外毒素Ａに対するＷＤＲ８５ＧＴ細胞の感受性を回復させた（図１０Ｄ）。天然炭疽毒素は、ＫＢＭ−７を含めて、大部分の細胞タイプに対して致死性でないが、その細胞進入および活性は、細胞ターゲットＭＥＫ−３の切断を監視することによって、探査可能である。ＷＤＲ８５ＧＴ細胞は、天然炭疽毒素になお反応性であり、これはＭＥＫ−３のタンパク質分解性切断の度合いが、ＷＤＲ８５ＧＴおよび野生型細胞で匹敵するためであり（図１７Ａ）、これによって、毒素進入はＷＤＲ８５ＧＴ細胞において正常であることが示唆される。
【０１７６】
ＷＤＲ８５は、ジフタミド生合成経路の一部である
[00215]ＷＤＲ８５突然変異細胞が、異なる細菌毒素に対して強い耐性を有することを所与として、本発明者らは、ＷＤＲ８５が毒素仲介性細胞死に対する感受性を与える機構をさらに調べた。ジフテリア毒素、ＬＦＮ−ＤＴＡおよび外毒素Ａは、伸長因子２（ＥＦ２）のＡＤＰリボシル化を通じて宿主翻訳を強力に阻害し、細胞死を導く。ＡＤＰ−リボシル化は、ＥＦ２においてユニークに存在し、そしてすべての真核生物間で保存される、翻訳後修飾ヒスチジン、ジフタミドに対して起こる。ＷＤＲ８５は、毒素進入に必要ではないため、本発明者らは、ジフテリア毒素に反応したＥＦ２リボシル化を調べた。ＷＤＲ８５ＧＴ細胞由来の細胞溶解物において、ＥＦ２リボシル化は損なわれ、そしてＷＤＲ８５  ｃＤＮＡの再発現によって回復可能であった（図１７Ｂ）。ＷＤＲ８５ＧＴ細胞から精製される、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）に融合したＥＦ−２もまた、ＡＤＰリボシル化の劣った基質であった。したがって、損なわれたＡＤＰリボシル化は、ＷＤＲ８５ＧＴ細胞由来のＥＦ−２に生得的な特性であり、そして細胞溶解物中に存在する他の因子の存在または非存在のためではない（図１２Ａ）。ジフタミド生合成は、Ｈｉｓ１７５の段階的翻訳後修飾の結果であり（図１２Ｇ）、これに関与するタンパク質が知られている（１６、２０、２１）。第二の工程は、Ｓ−アデノシルメチオニンをメチルドナーとして用いた、メチルトランスフェラーゼＤＰＨ５による「中間体」ＥＦ２のトリメチル化を含む（２２）。このメチル化工程がＷＤＲ８５の喪失によって影響を受けるかどうかを調べるため、本発明者らは、ＤＰＨ５ヌル細胞由来の中間体ＥＦ２を精製し、そして細胞溶解物に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを行った。野生型およびＷＤＲ８５ＧＴ細胞溶解物による「中間体」ＥＦ２の効率的なメチル化によって、ＷＤＲ８５が、ジフタミド生合成の第二の工程に必要ではないことが示唆された（図１２Ｂ）。次に、本発明者らは、ＷＤＲ８５ＧＴ細胞からＥＦ２を精製し、そしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、Ｈｉｓ１７５の関連する修飾を監視した。Ｈｉｓ１７５の修飾は、修飾Ｈｉｓ残基を所持するこれらのペプチドに関して、＋１４３（ジフタミド）、＋１４２（ジフチン）、および＋１０１（中間体）質量単位で質量を増加させると予測される。ＷＤＲ８５ＧＴから単離されたＳＢＰタグ化ＥＦ２は、非修飾Ｈｉｓ１７５の存在と一致する質量を示し、一方、野生型およびＤＰＨ５突然変異細胞から精製したＥＦ２の修飾によって、それぞれ、ジフタミドおよび「中間体」の存在に関して予期される質量が示された（図１２Ｃおよび図１９）。ＥＦ２において修飾ヒスチジンが存在しないことから、ＷＤＲ８５がジフタミド生合成の最初の工程において役割を果たすことが示唆される。
【０１７７】
[00216]ＷＤＲ８５ＧＴ細胞からのＥＦ２の精製過程において、本発明者らは、ＥＦ２と強く相互作用するタンパク質を検出した（図１２Ｄおよび図１７Ｃ）。質量分析によって、このタンパク質がＤＰＨ５であることが同定され、イムノブロット分析によって（図１２Ｅ）および内因性タンパク質の共免疫沈降によって（図１７Ｃ）確認された。ＷＤＲ８５は、ジフタミド生合成に関与することが以前同定されたタンパク質に対して相同性を欠くが、タンパク質−タンパク質相互作用にしばしば関与する、ＷＤ４０反復を含有する。本発明者らは、ＷＤＲ８５が、ジフタミドの段階的生合成に必要な、酵素複合体の会合（または脱離）をコーディネートする足場として働きうると示唆する。
【０１７８】
[00217]ＷＤＲ８５は、酵母ＹＢＲ２４６Ｗに対する相同性を持つ保存タンパク質である（図１９）。本発明者らは、ＹＢＲ２４６Ｗに対して類似のプロファイルを持つ遺伝子をクラスター形成するため、１１４４の化学的条件下でのすべての非必須酵母遺伝子の欠失株の適合プロファイルを含有するデータベースを用いた（２３）。ホモ接合性共感受性（ｃｏ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）によって、ＹＢＲ２４６Ｗと表現型クラスター形成（ｐｈｅｎｏｃｌｕｓｔｅｒ）する上位１０位の遺伝子に、ＤＰＨ２およびＤＰＨ５が含まれた。本発明者らが濃縮されることを発見した唯一の遺伝子注釈用語は、ジフタミド生合成に関するものであった（ｐ値、９ｅ−０４、図１９）。ＹＢＲ２４６Ｗがジフタミド生合成に関与するかどうかを直接試験するため、本発明者らは、ＷＴ酵母、あるいはＹＫＬ１９１Ｗ（ＤＰＨ２）またはＹＢＲ２４６Ｗが欠失した酵母株由来のタンパク質抽出物において、リボシル化アッセイを行った。喜ばしいことに、ＹＫＬ１９１ＷおよびＹＢＲ２４６Ｗの不全は、どちらも、酵母において、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル・アクセプター活性を損なう（図１２Ｆ）。これらのデータによって、ジフタミド生合成におけるＷＤＲ８５の役割は、真核生物において保存され、そして提唱される足場としての役割が、細胞におけるＷＤＲ８５の主な機能でありうることが示唆される。結論として、本発明者らのアプローチは、この複雑な翻訳後修飾に関与するすべてのタンパク質が知られているとする以前の示唆（１６）にもかかわらず、ジフタミド生合成の第一の工程に関与する、以前は認識されなかった宿主遺伝子として、ＷＤＲ８５を同定した。
【０１７９】
[00218]参考文献
【０１８０】
【化２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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