(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンおよび核酸を含有しているポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物であって、
該ナノ粒子は、約５ｎｍから５００ｎｍの大きさであり、該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、４０％〜８０％が脱アセチル化されていることを特徴とするポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物。
【請求項２】
上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン乳酸塩誘導体を含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、有機酸または無機酸を用いて可溶化されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、乳酸を用いて可溶化されていることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、５０％〜８０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、６５％〜７５％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、６５％〜８０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、６０％〜８０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、５０％〜６５％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、７０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、５０〜２００μｍの長さを有する繊維であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、５０〜１００μｍの長さを有する繊維であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
上記ナノ粒子の少なくとも５０％が約５ｎｍから５００ｎｍの大きさであることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記ナノ粒子の少なくとも５０％が約１０ｎｍから５００ｎｍの大きさであることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
上記ナノ粒子の少なくとも５０％が約２０ｎｍから２００ｎｍの大きさであることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
上記ナノ粒子の少なくとも５０％が約２５ｎｍから１５０ｎｍの大きさであることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
上記ナノ粒子の大きさは、透過電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって決定されることを特徴とする請求項１〜１７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
上記核酸はＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜１８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
上記核酸はｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、一重鎖ＲＮＡまたは二重鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜１８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、微細藻類に由来するものであることを特徴とする請求項１〜２０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
さらにアジュバントを含有していることを特徴とする請求項１〜２１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
上記アジュバントはサイトカインであることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
上記アジュバントは、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（「ポリＩ：Ｃ」）であることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
被験体に核酸を投与するための、請求項１〜２４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
上記被験体はヒトであることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
上記被験体は、ヒト以外の動物であることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与されるために調製されていることを特徴とする請求項２５〜２７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
皮下投与されるために調製されていることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
上皮細胞に投与されるために調製されていることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
投与することによって、少なくとも１週間にわたり、該組成物中の核酸が持続的に発現することを特徴とする請求項２５〜３０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
投与することによって、少なくとも２週間にわたり、該組成物中の核酸が持続的に発現することを特徴とする請求項２５〜３０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
投与することによって、少なくとも４週間にわたり、該組成物中の核酸が持続的に発現することを特徴とする請求項２５〜３０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
上記投与は繰り返し行われることを特徴とする請求項２５〜３３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
被験体に核酸を投与するための、請求項２２〜２４の何れか１項に記載の組成物であって、
投与することによって、上記核酸及び上記アジュバントの両方を持続的にかつ同時に放出することを特徴とする組成物。
【請求項３６】
ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物の製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）塩基をポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンに加え、該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも４０％を脱アセチル化する工程；
（ｂ）無機酸または有機酸を加え、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体を作製する工程；
（ｃ）緩衝剤を加え、希釈を容易にする工程；および
（ｄ）核酸を加え、それによってポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物を製造する工程。
【請求項３７】
上記無機酸または有機酸は乳酸であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｃ）における上記緩衝剤は、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記核酸は、塩と組み合わせられていることを特徴とする請求項３６〜３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
上記塩は、硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、４０％〜９０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、６５％を上回る割合のポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが脱アセチル化されていることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、６０％〜８０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、５０％〜８０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４５】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、５０％〜６５％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４６】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、７０％は脱アセチル化されていることを特徴とする請求項３６〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
さらに工程（ｄ）において、アジュバントを加える工程をさらに含むことを特徴とする請求項３６〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物をアジュバントと組み合わせる工程をさらに含むことを特徴とする請求項３６〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４９】
上記アジュバントは、ポリＩ：Ｃであることを特徴とする請求項４７または４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．導入
本発明は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を提供する。１つの局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、５００ｎｍ未満の脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン乳酸誘導体ナノ粒子および核酸を含んでいる。また、本発明は、核酸を被験体に投与する方法であって、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を被験体に投与する工程を含む方法をも提供する。ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は被験体に皮下投与される。
【０００２】
２．背景技術
ＤＮＡワクチンとは、正確かつ効果的に抗原を免疫系に提示する柔軟な戦略である。しかしながら、ＤＮＡワクチンは理論上あらゆる利点を持っているにも関わらず、ＤＮＡワクチンを用いた臨床実験は、期待を裏切る結果ばかりであった。ＤＮＡワクチンの臨床応用（clinical translation）における中心的な問題の一つが、プラスミドＤＮＡ送達に最適ではないプラットフォームであるということは、ますます明白になってきている。また、核酸送達のために改良されたプラットフォームは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおける様々な遺伝子治療への応用にも必要とされている。
【０００３】
レトロウイルスおよびアデノウイルスに基づいたウイルスプラットフォームなど、ＤＮＡ送達用のウイルスプラットフォームが開発されてきたが、ウイルスベクターには幾つか重大な欠点がある。組み換えウイルスを投与すると、ウイルス性タンパク質に対する免疫応答として、導入遺伝子によって引き起こされる反応よりも約２０倍も強い反応が引き起こされる（Harrington et al．、2002、Hum．Gene Ther．13(11):1263-1280；および、Harrington et al．、2002、J．Virol． 76(7)：3329-3337を参照）。上記免疫応答は、導入遺伝子そのものに対する免疫応答を抑制する。Ｔ細胞の先在、およびウイルス粒子に対する抗体媒介性免疫も、組み換えウイルスの連続投与の能力を制限している（Barouch et al．、2003、J．Virol．77(13):7367-7375；Premenko-Lanier et al．、2003、Virology 307(1)：67-75;Ramirez et al．、2000、J．Virol．74(16)：7651-7655；および、Ramirez et al．、2000、J．Virol．74(2)：923-933を参照）。そのため、反復治療計画を立てることができない。ウイルスベクターを反復投与すると、組み換えウイルスに対する中和抗体が発生する（Tewary et al．、2005、J．Infect．Dis．191(12)：2130-2137を参照）。異なるウイルスベクターを用いれば反復送達が可能になるかもしれないが、そのようなアプローチは労力を要し、生物学的安全性に懸念があるウイルスベクターを多種にわたり多量に用意する必要がある。さらに、ウイルス送達プラットフォームを用いることにより、ウイルス遺伝子配列とホストゲノムの遺伝子配列との相互作用によるリスクが生まれる。また、ほとんどのウイルスベクターは血清ヌクレアーゼによって劣化し、導入されたウイルスベクターの約９０％は２４時間以内に劣化することが知られている（Muzyczka、1992、Curr．Top．Microbiol．Immunol． 158：97-129；および、Varmus、1988、Science 240(4858)：1427-1435を参照）。ウイルスベクターの劣化が早い場合、当該ウイルスベクターが標的細胞に到達できないという結果をもたらし得る。総じて、核酸送達用ウイルスプラットフォームには重大な制限がある。
【０００４】
ＤＮＡ送達用の非ウイルスプラットフォームとしては、リポソーム（リポプレックス）、合成ポリマー（ポリプレックス）（Wasungu et al．、2006、J．Control．Release 116(2)：255-264;および、Wasungu、2006、Biochim．Biophys．Acta 1758(10)：1677-1684を参照）、およびキトサン（Mansouri et al．、2004、Eur．J．Pharm．Biopharm．57(1)：1-8を参照）が挙げられるが、これらも最適ではないプラットフォームであることが証明されている。リポプレックスの調製は、非常に労力を要し、ＤＮＡを賦形剤に調合する必要がある（Wasungu et al．、2006、J．Control．Release 116(2)：255-264；および、Wasungu、2006、Biochim．Biophys．Acta 1758(10)：1677-1684を参照）。さらに、Wasungu et al．の文献には、ｐＨおよび電荷など幾つかの物理的要因およびリポソームの構造的特徴が、リポソームとＤＮＡとの相互作用に影響していることや、リポプレックスが血液循環から迅速に排除されるために形質導入効率が低くなることが記載されている。リポプレックスの集合およびポリプレックスの集合のプロセスは、プラスミドＤＮＡの構造的一体性を脅かしかねず、例えば、結果として得られる、プラスミドをリポプレックスシェルで非効率に包んだものが、リポプレックスと細胞表面との相互作用に影響を与えうる。その結果、リポプレックスまたはポリプレックスによって送達された遺伝子の転写は、非常に貧弱になり得る（Hama、2006、Mol．Ther．13(4)：786-794を参照）。また、細胞内ＤＮＡを細胞質へ放出できないために、ほとんどのポリプレックスは、エンドソーム溶解性物質と共トランスフェクションする必要がある（Forrest and Pack、2002、Mol．Ther．6(1)：57-66を参照）。
【０００５】
高分子生成物の化学的および物理的異質性、ならびに、タンパク質や他の成分によるキチンまたはキトサン製剤の汚染により、ＤＮＡ送達に応用するためのキチンおよびキトサン系生成物は、使用が妨げられてきた（Vournakis et al．、2004、J．Trauma 57（1 Suppl．）：Ｓ２−６を参照）。
【０００６】
したがって、毒性を引き起こさずに高い導入効率を引き出す核酸送達用非ウイルスプラットフォームが必要とされている。また、核酸を持続的に放出でき、頻度を減らすことなく反復投与ができる送達賦形剤が必要とされている。
【０００７】
３．発明の概要
本発明は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（「ｐ−ＧｌｃＮＡｃ」）ナノ粒子／核酸組成物を提供する。一局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン、および核酸を含有し、該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも４０％は脱アセチル化されている。幾つかの実施形態において、上記核酸はＤＮＡである。ある実施形態においては、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の該ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから５００ｎｍである。幾つかの実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の該ナノ粒子の少なくとも５０％が、約５ｎｍから５００ｎｍのサイズである。ある実施形態においては、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の該ナノ粒子は、約１０ｎｍから５００ｎｍまで、２０ｎｍから２００ｎｍまで、２０ｎｍから１５０ｎｍまで、２０ｎｍから１００ｎｍまで、２５ｎｍから２５０ｎｍまで、２５ｎｍから１５０ｎｍまで、２５ｎｍから１００ｎｍまで、５０ｎｍから２００ｎｍまで、または５０ｎｍから１５０ｎｍまでのサイズである。特定の実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の該ナノ粒子のうち、少なくとも５０％は、約１０ｎｍから５００ｎｍまで、２０ｎｍから２００ｎｍまで、２０ｎｍから１５０ｎｍまで、２０ｎｍから１００ｎｍまで、２５ｎｍから２５０ｎｍまで、２５ｎｍから１５０ｎｍまで、２５ｎｍから１００ｎｍまで、５０ｎｍから２００ｎｍまで、または５０ｎｍから１５０ｎｍまでのサイズである。特定の実施形態においては、上記ナノ粒子の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、５ｎｍから５００ｎｍまで、１０ｎｍから５００ｎｍまで、２０ｎｍから２００ｎｍまで、２０ｎｍから１５０ｎｍまで、２０ｎｍから１００ｎｍまで、２５ｎｍから２５０ｎｍまで、２５ｎｍから１５０ｎｍまで、２５ｎｍから１００ｎｍまで、５０ｎｍから２００ｎｍまで、または５０ｎｍから１５０ｎｍまでのサイズである。ある実施形態においては、上記ナノ粒子のサイズは、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察に基づいて決定される。幾つかの実施形態において、上記組成物は、さらにアジュバントを含有している。特定の実施形態において、該アジュバントはポリＩ：Ｃである。別の実施形態では、該アジュバントはサイトカインである。
【０００８】
幾つかの実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体を含む。特定の実施形態において、上記組成物中の上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン乳酸塩誘導体を含む。幾つかの実施形態においては、上記組成物中の上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが有機酸または無機酸を用いて可溶化される。特定の実施形態において、上記組成物中の上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、乳酸を用いて可溶化される。
【０００９】
ある実施形態において、本明細書では、上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも６５％が脱アセチル化されているｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物について記載されている。幾つかの実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも７０％は、脱アセチル化されている。他の実施形態では、上記組成物中の上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、約４０％〜約９０％（例えば、４０％〜９０％）は脱アセチル化されている。一実施形態において、上記組成物中の上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、約６０％〜約８０％（例えば、６０％〜８０％）は脱アセチル化されている。他の実施形態では、上記組成物中の上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、約４０％〜約９５％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％、約５０％〜約８０％、約５５％〜約９５％、約５５％〜約９０％、約５５％〜約８５％、約５５％〜約８０％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約８５％、約６５％〜約９５％、約６５％〜約９０％、約６５％〜約８５％、約６５％〜約８０％、または約６５％〜約７５％が脱アセチル化されている。
【００１０】
幾つかの実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、約５０〜約２００μｍの長さを有する繊維である。特定の実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、５０〜１００μｍの長さを有する繊維である。幾つかの実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中における上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、少なくとも２×１０６Ｄａもしくは少なくとも２．５×１０６Ｄａの分子量、または、約２×１０６Ｄａから約３．５×１０６Ｄａまでもしくは約２．５×１０６Ｄａから約３×１０６Ｄａまでの分子量である。
【００１１】
別の局面において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、５００ｎｍ未満の脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン乳酸塩誘導体ナノ粒子、および核酸を含有している。ある実施形態において、例えば、透過型電子顕微鏡観察や走査型電子顕微鏡観察により、上記ナノ粒子の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％が１００〜２００ｎｍのサイズであると測定されている。幾つかの実施形態において、上記組成物は、さらにアジュバントを含有する。特定の実施形態において、上記アジュバントは、ポリＩ：Ｃである。別の実施形態では、上記アジュバントはサイトカインである。
【００１２】
別の局面において、本発明は、被験体に核酸を投与する方法であって、該被験体にｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、上記被験体はヒトである。他の実施形態において、上記被験体は、ヒト以外の動物である。ある実施形態において、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、上記被験体の皮下に投与される。特定の実施形態においては、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、皮下投与により被験体の上皮細胞に投与される。他の実施形態では、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、被験体の筋肉内または、静脈内に投与される。本明細書において述べられている上記方法は、少なくとも部分的には、被験体にｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与することにより上記組成物を投与した箇所では核酸が持続的に発現するという驚くべき発見に基づいている。さらに、発現した核酸は、プロフェッショナル抗原提示細胞によって効果的に取り込まれ、流入領域リンパ節へと運ばれ、その結果、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化される。幾つかの実施形態では、上記組成物の投与により、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、または少なくとも２か月にわたって、上記組成物中の上記核酸が持続的に発現する。ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が、被験体に反復投与される（例えば、２回、３回、４回、または３回もしくは４回を上回る数；または１週間に一度、２週間に一度、３週間に一度、４週間に一度、６週間に一度、８週間に一度）。幾つかの実施形態では、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、２年、３年、４年、もしくは５年の期間（または１年もしくは５年より長く）にわたり、反復投与される。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、核酸およびアジュバントを被験体に投与する方法であって、被験体にｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物およびアジュバントを投与する工程を含む方法を提供する。上記アジュバントは、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中に含まれた状態で投与されるか、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物と共に投与されてもよい（例えば、ｐ−ＧｌｃＮＡｃを含有する組成物とアジュバントとが別々で投与される）。幾つかの実施形態において、核酸とアジュバントとを含有している上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与することにより、該核酸および該アジュバントの両方を、持続的かつ同時に放出することができる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物の製造方法を提供する。特に、本明細書において説明するのは、（ａ）塩基をポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンに加え、該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも４０％を脱アセチル化する工程；（ｂ）無機酸または有機酸を加え、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体を作製する工程；（ｃ）緩衝剤を加え、希釈を容易にする工程；および（ｄ）核酸を加える工程を含む上記組成物の製造方法であり、これらの工程を経て、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物が製造される。上記実施形態のいくつかにおいて、上記無機酸または有機酸は、乳酸である。他の実施形態においては、上記無機酸または有機酸は、グルコン酸、琥珀酸、クエン酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸である。特定の実施形態において、工程（ｃ）における上記緩衝剤は、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液もしくは酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である。幾つかの実施形態において、上記核酸は、工程（ｄ）（核酸が、緩衝剤中で希釈された上記脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体に加えられる）より前に、塩（例えば、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウム）と組み合わせられる。ある実施形態において、上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物の製造に用いられる上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、４０％〜９０％脱アセチル化されている、６０％〜８０％脱アセチル化されている、または６５％より多く脱アセチル化されている。幾つかの特定の実施形態において、上記組成物の製造に用いられる上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、約４０％〜約９５％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％、約５０％〜約８０％、約５５％〜約９５％、約５５％〜約９０％、約５５％〜約８５％、約５５％〜約８０％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約８５％、約６５％〜約９５％、約６５％〜約９０％、約６５％〜約８５％、約６５％〜約８０％、または約６５％〜約７５％が脱アセチル化されている。
【００１５】
本明細書では、ある実施形態において、上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物の製造方法であって、上記の工程（ｄ）において、アジュバントを加える工程をさらに含む方法を説明する。本明細書において、他の実施形態では、上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物を製造する方法であって、上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンナノ粒子／核酸組成物をアジュバントと組み合わせる工程をさらに含む方法を説明する。上記アジュバントは、本明細書中に記載されているどのアジュバントでもよい（例えば、ポリＩ：Ｃまたはサイトカイン）。
【００１６】
３．１  専門用語
用語「アルキル」とは、一価の直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基のことであり、本明細書中に記載されているように、アルキレンを任意で置換してもよい。また用語「アルキル」は、特に記載しない限り、直鎖状のアルキルおよび分枝状のアルキルの両方を包含する。ある実施形態において、上記アルキルは、１〜２０（Ｃ１−２０）、１〜１５（Ｃ１−１５）、１〜１０（Ｃ１−１０）、もしくは１〜６（Ｃ１−６）の炭素原子を有する一価の直鎖状飽和炭化水素基であるか、または３〜２０（Ｃ３−２０）、３〜１５（Ｃ３−１５）、３〜１０（Ｃ３−１０）、もしくは、３〜６（Ｃ３−６）の炭素原子を有する一価の分枝状飽和炭化水素基である。本明細書中でも使用されているように、直鎖状Ｃ１−６アルキル基および分枝状Ｃ３−６アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。例えば、アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル（全ての異性体を含む）、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル（全ての異性体を含む）、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル（全ての異性体を含む）、およびヘキシル（全ての異性体を含む）などが包含されるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ１−６アルキルとは、１〜６の炭素原子を有する一価の直鎖状飽和炭化水素基、または、３〜６の炭素原子を有する一価の分枝状飽和炭化水素基である。
【００１７】
用語「アルケニル」とは、一価の直鎖状または分枝状の炭化水素基であり、１つ以上の炭素−炭素の二重結合を含み、一実施形態においては１〜５つの炭素−炭素の二重結合を含む。アルケニルは、本明細書に記載されているように、任意で置換されてもよい。また、用語「アルケニル」が、「シス」配置や「トランス」配置、あるいは「Ｚ」配置や「Ｅ」配置を有する基を包含することは、当業者であれば理解できる。本明細書中で用いられているように、用語「アルケニル」は、特に記載がない限り、直鎖状アルケニルおよび分枝状アルケニルの両方を包含する。例えば、Ｃ２−６アルケニルは、２〜６の炭素原子を有する一価の直鎖状不飽和炭化水素基、または３〜６の炭素原子を有する一価の分枝状不飽和炭化水素基である。ある実施形態において、アルケニルは、２〜２０（Ｃ２−２０）、２〜１５（Ｃ２−１５）、２〜１０（Ｃ２−１０）、もしくは２〜６（Ｃ２−６）の炭素原子を有する一価の直鎖状炭化水素基、または、３〜２０（Ｃ３−２０）、３〜１５（Ｃ３−１５）、３〜１０（Ｃ３−１０）、もしくは、３〜６（Ｃ３−６）の炭素原子を有する一価の分枝状炭化水素基である。例えば、アルケニル基としては、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、アリル、ブテニル、および４−メチルブテニルなどが挙げられるが、これらに限らない。
【００１８】
用語「アルキニル」とは、一価の直鎖状または分枝状の炭化水素基であり、１つ以上の炭素−炭素の三重結合を含み、一実施形態においては１〜５つの炭素−炭素の三重結合を含む。アルキニルは、本明細書に記載されているように、任意で置換されてもよい。また、用語「アルキニル」は、特に記載がない限り、直鎖状アルキニルおよび分枝状アルキニルの両方を包含する。ある実施形態において、アルキニルは、２〜２０（Ｃ２−２０）、２〜１５（Ｃ２−１５）、２〜１０（Ｃ２−１０）、もしくは２〜６（Ｃ２−６）の炭素原子を有する一価の直鎖状炭化水素基、または、３〜２０（Ｃ３−２０）、３〜１５（Ｃ３−１５）、３〜１０（Ｃ３−１０）、もしくは３〜６（Ｃ３−６）の炭素原子を有する一価の分枝状炭化水素基である。例えば、アルキニル基としては、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）およびプロパギル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）などが挙げられるが、これらに限らない。例えば、Ｃ２−６アルキニルは、２〜６の炭素原子を有する一価の直鎖状不飽和炭化水素基、または、３〜６の炭素原子を有する一価の分枝状不飽和炭化水素基である。
【００１９】
用語「ハロゲン」、「ハロゲン化物」、または「ハロ」とは、フッ素、塩素、臭素、および／またはヨウ素のことである。
【００２０】
「任意で置換される」とは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基、またはアルコキシ基などが、例えば、以下の（ａ）および（ｂ）から独立して選択される１つ以上の置換基と置換されてもよい、という意味である：（ａ）アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであって、これらはそれぞれ１つ以上、一実施形態においては１つ、２つ、３つ、または４つの置換基Ｑと任意で置換されてもよい；および（ｂ）ハロ、シアノ（−ＣＮ）、ニトロ（−ＮＯ２）、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＣ（＝ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲｄ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃであって、それぞれＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立して（ｉ）水素；（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであって、これらはそれぞれ１つ以上、一実施形態においては１つ、２つ、３つ、もしくは４つの置換基Ｑと任意で置換されてもよい；または（ｉｉｉ）ＲｂおよびＲｃが、ＲｂおよびＲｃが結合したＮ原子と共にヘテロシクリルを形成しており、、これらは１つ以上、一実施形態においては１つ、２つ、３つ、または４つの置換基Ｑと任意で置換されても良い。本明細書で使用されているように、特に記載がない限り、置換することのできる基は全て「任意で置換されても良い」。
【００２１】
一実施形態において、Ｑは、それぞれ独立して、（ａ）シアノ、ハロ、およびニトロ；ならびに（ｂ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル；ならびに、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇからなる群から選ばれる；Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈはそれぞれ独立して、（ｉ）水素；もしくは（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであり、または（ｉｉｉ）ＲｆおよびＲｇが、ＲｆおよびＲｇが結合したＮ原子と共にヘテロシクリルを形成する。
【００２２】
４．図面の簡単な説明
図１（Ａ）−（Ｆ）は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【００２３】
図２は、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを用いて、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子と共に、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子を伴わずに、ワクチン接種をした後のルシフェラーゼ活性の生物発光検出を示す。ルシフェラーゼの遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡは、上記のように（つまり、ネイキッドｐＤＮＡの皮下注射；ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡの皮下注射；もしくは、ネイキッドＤＮＡの筋肉内注射によって）送達される。ルシフェラーゼ活性は、指示された時間間隔をおいたルシフェリンの腹腔内（ｉ．ｐ）注射後、検出される。生物発光は、ＩＶＩＳシステムを用いてイメージ化される。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子は、皮下注射後１日目、７日目、および１４日目に、ＤＮＡを効果的に放出する。
【００２４】
図３は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を用いたＤＮＡを送達することによって、コードされた抗原が、プロフェッショナル抗原提示細胞により流入領域リンパ節に取り込まれ、輸送される図である。６匹のネズミの足裏に、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子のみ（ｎ＝３）、またはＧＦＰをコードしたプラスミドＤＮＡ１００μｇと混合したｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子（ｎ＝３）が注入された。注射１日後、膝窩リンパ節が除去され、細胞懸濁液が、ＰＥと結合したＭＨＣクラスＩＩに対するモノクローナル抗体を用いて染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって解析された。ヒストグラムは、ＧＦＰシグナルを用いた場合のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞のパーセンテージを示している。各ヒストグラムは、個々のマウスの結果を示している。
【００２５】
図４は、ｈｇｐ１００ＤＮＡワクチン接種に対するドナーＰｍｅｌ細胞の増殖を示す。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐｈｇｐ１００ワクチン接種は、ＣＤ８＋特異反応を誘導する。ネズミは、１０６のＰｍｅｌ脾細胞（Ｔｈｙ１．１＋）の養子免疫伝達の２４時間後に、指示されたように、皮下にワクチンを接種された。血中Ｐｍｅｌ細胞の濃度は、フローサイトメトリーによって決定された。ドナー細胞の頻度は、すべてのＣＤ８＋Ｔ細胞（ｎ＝３）のパーセンテージの平均±ＳＤＥＶとして示される。
【００２６】
図５は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子を伴ったＤＮＡおよびポリＩ：Ｃの共送達は、抗腫瘍性免疫および自己腫瘍抗原(self tumor antigens)をコードしたＤＮＡワクチンの治療効力を高める。（Ａ）ネズミ（ｎ＝５）は、静脈（ｉ．ｖ．）注射により、３×１０４のＢ１６メラノーマ細胞を導入された。ワクチン接種は、Ｂ１６腫瘍細胞注射後３日目に開始され、３日おきに３回行われた（つまり、生理食塩水コントロール、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２／ポリＩ：Ｃが接種された）。続いて、動物を殺し、肺を切除して重さを量った。（Ｂ）ネズミ（ｎ＝５）は、皮下（ｓ．ｃ．）注射により、１０５のＢ１６メラノーマ細胞を導入された。ワクチン接種は、Ｂ１６腫瘍細胞注射後５日目に開始され、３日おきに３回行われた（つまり、生理食塩水コントロール、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２／ポリＩ：Ｃが接種された）。この処置に続いて、腫瘍の進行が、１週間に３回の頻度でモニターされた。
【００２７】
５．詳細な説明
５．１  ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物
以下、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物について説明する。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物がポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体を含有している。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、β−１→４配置を有している。他の実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、α−１→４配置を有している。また、ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの純度は、約１００％、９９．９％、９９．８％、９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、または２０％である。特定の実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの純度は９０〜１００％である。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは９０％より高い、９５％より高い、９８％より高い、９９％より高い、または９９．５％より高い純度にもなる。ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、２５％〜５０％、４０％〜９５％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、６０％〜９５％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６５％〜７５％、６５％〜９５％、６５％〜９０％、６５％〜８０％、７０％〜９５％、７０％〜９０％、７５％〜８０％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％が脱アセチル化されている。幾つかの実施形態では、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が脱アセチル化されている。幾つかの実施形態では、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはそれを上回る割合が脱アセチル化されている。特定の実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたは脱アセチル化されたポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが、それらの可溶化を容易にするために、有機酸または無機酸を用いて誘導体化され、アンモニウム塩を生成しているものもある。ある実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたは脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを、乳酸を用いて誘導体化している。ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたは脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、それらの可溶化を容易にするために、乳酸を用いて誘導体化されている。米国特許第5,622,834号; 第5,623,064号; 第5,624,679号; 第5,686,115号; 第5,858,350号; 第6,599,720号; 第6,686,342号;および第7,115,588号（各文献は、その全体を参照により本明細書に援用する）には、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンとその誘導体、およびそれらを製造する方法が記載されている。
【００２８】
ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、例えば、微細藻類、好ましくは珪藻から製造されてもよく、またそれらから精製されてもよい。ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造の出発素材として使用することができる珪藻としては、特に限定されないが、Coscinodiscus属、Cyclotella属およびThalassiosira属の種が挙げられる。ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、当該技術分野で公知の機械的な力を利用する方法や化学的／生物学的方法（例えば、米国特許第5,622,834号; 第5,623,064号; 第5,624,679号; 第5,686,115号; 第5,858,350号; 第6,599,720号; 第6,686,342号;および第7,115,588号を参照、各文献はその全体を参照により本明細書に援用する）などの多数の異なった方法を用いて、珪藻培養物から得ることができる。ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが、貝類、甲殻類、昆虫、菌類、および酵母菌のうちの一つ以上から由来したものでない場合もある。ある実施形態において、上記組成物がコラーゲン繊維を含まない場合もある。ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの純度が約１００％、９９．９％、９９．８％、９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、または２０％のものもある。特定の実施形態では、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの純度は、９０〜１００％である。ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが１５μｍより長い繊維のものもある。特定の実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維は、１５μｍより長い。幾つかの実施形態においては、５０％より多い、７５％より多い、９０％より多い、９５％より多い、９９％より多いポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維が、１５μｍより長い。一実施形態において、１００％のポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維が、１５μｍより長い。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、長さが５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、または８０〜１００μｍの繊維である。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、直径が１〜５ｎｍ、２〜４ｎｍ、２〜１０ｎｍ、１０〜２５ｎｍ、１０〜５０ｎｍ、２５〜５０ｎｍ、または５０〜１００ｎｍである繊維である。
【００２９】
ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを塩基で処理することによって脱アセチル化し、遊離アミノ基を有するグルコサミン残基を得てもよい。この加水分解過程は、濃縮された水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液を用いて高温で行われてもよい。あるいは当該技術分野において既知の技術を用いたポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アシル化のために、キチン脱アセチル化酵素を利用した酵素処理が行われてもよい。特定の実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、後述のセクション６．１に記載された方法を用いて脱アセチル化される。ある実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの分子量は、１×１０４Ｄａ〜３．５×１０６Ｄａ、５×１０４Ｄａ〜３．５×１０６Ｄａ、１×１０５Ｄａ〜３．５×１０６Ｄａ、５×１０５Ｄａ〜３．５×１０６Ｄａ、１×１０６Ｄａ〜３×１０６Ｄａ、１．５×１０６Ｄａ〜３．５×１０６Ｄａ、１．５×１０６Ｄａ〜３×１０６Ｄａ、２×１０６Ｄａ〜３×１０６Ｄａ、２×１０６Ｄａ〜５×１０６Ｄａ、２×１０６Ｄａ〜８×１０６Ｄａである。特定の実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの分子量は、２．８×１０６Ｄａである。幾つかの実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの分子量は、少なくとも１×１０４Ｄａである。一実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの分子量は、少なくとも２×１０６Ｄａ。幾つかの実施形態においては、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの分子量は３×１０６Ｄａ未満である。
【００３０】
ある実施形態において、任意の有機酸または無機酸を用いて脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを誘導体化し、ｐ−ＧｌｃＮＡｃアンモニウム塩を形成してもよく、該誘導体化には、塩の誘導体を形成するための対イオン置換が包含される。幾つかの実施形態では、有機酸がＲＣＯＯＨ構造を有しており、ここでＲは任意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルである。幾つかの実施形態において、Ｒは任意に置換されたアルキルである。幾つかの実施形態では、Ｒは、１つ以上の水酸基に置換されたアルキルである。ある実施形態において、ＲＣＯＯＨはグルコン酸または乳酸である。他の実施形態では、ＲＣＯＯＨは、クエン酸、琥珀酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸である。特定の実施形態において、ＲＣＯＯＨは乳酸である。ある実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンとポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンとの比は、１：１、１．２：２：１、１：３、または３：１である。特定の実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、後述のセクション６．１に記載された方法を用いて乳酸により誘導体化されてもよい。幾つかの実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを可溶化するために誘導体化している。ある実施形態においては、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが、（本明細書に記載されているか、当該技術分野で公知の）任意の有機酸または無機酸を用いたインキュベーションにより、可溶化される。特定の実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが誘導体化されることにより、可溶性ｐ−ＧｌｃＮＡｃアンモニウム塩が形成される。幾つかの実施形態では、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの溶解性は、約４〜約５のｐＨ、例えば、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、または４と５の間のｐＨで達成される。一実施形態において、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを可溶化するために、乳酸を用いて（例えば、ｐＨ４．５などｐＨ４〜ｐＨ５の間で）、インキュベートする。このような実施形態において、Ｈ＋イオンは、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの可溶化を容易にするために、乳酸塩の対イオンによって置換されている。
【００３１】
ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、乳酸塩の誘導体などの、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩の誘導体を含有している。特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、脱アセチル化されたポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン乳酸塩の誘導体を含んでいる。ある実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、２５％〜５０％、４０％〜９５％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、６０％〜９５％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６５％〜９５％、６５％〜９０％、６５％〜８０％、７０％〜９５％、７０％〜９０％、７５％〜８０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％が脱アセチル化されている。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が脱アセチル化されている。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンのうち、少なくとも２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれらを上回る割合が脱アセチル化されている。特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、後述のセクション６．１に記載した過程からできた組成物である。
【００３２】
特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、後述のセクション５．２に記載されているような核酸を含んでいる。ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、核酸を０．１μｇ〜２ｍｇ、０．２μｇ〜１ｍｇ、０．５μｇ〜５００μｇ、１μｇ〜７５０μｇ、１μｇ〜５００μｇ、１μｇ〜２００μｇ、１μｇ〜１００μｇ、１μｇ〜５０μｇ、５μｇ〜２５μｇ、５μｇ〜１５μｇ、５０μｇ〜１５０μｇ、１μｇ〜５μｇ、２μｇ〜５μｇ、１μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、１５μｇ〜２５μｇ、１００μｇ〜７５０μｇ、１００μｇ〜５００μｇ、１００μｇ〜１ｍｇ、または５００μｇ〜７５０μｇ含んでいる。幾つかの実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、２種類、３種類、またはそれ以上の種類の核酸を含むものもある。幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、２種類、３種類、またはそれ以上の種類のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしている２種類、３種類、またはそれ以上の種類の核酸を含んでいるものもある。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、核酸だけでなくアジュバントも含んでいる。
【００３３】
ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、多量のタンパク質材料を含まない。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、いかなるタンパク質またはペプチドアジュバントも含まない。他の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物に含まれるタンパク質材料は、０．１重量％、０．５重量％、または１重量％以下である。幾つかの実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物に含まれるタンパク質材料は、当該分野にて公知の技術（例えば、クマシー染色）によって測定され、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、または２重量％以下である。他の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物におけるタンパク質含有量が、クマシー染色では測定不能である。さらに他の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、タンパク質またはペプチドアジュバントを含有している。
【００３４】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである。幾つかの実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが５ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜３００ｎｍ、５ｎｍ〜１５０ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、２０ｎｍ〜３００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、２５ｎｍ〜５００ｎｍ、２５ｎｍ〜３００ｎｍ、２５ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１２５ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または５０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００３５】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが５ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜３００ｎｍ、５ｎｍ〜１５０ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、２０ｎｍ〜３００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、２５ｎｍ〜５００ｎｍ、２５ｎｍ〜３００ｎｍ、２５ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１２５ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または５０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００３６】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはそれを上回る割合のナノ粒子は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはそれを上回る割合のナノ粒子は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、５ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜３００ｎｍ、５ｎｍ〜１５０ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、２０ｎｍ〜３００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、２５ｎｍ〜５００ｎｍ、２５ｎｍ〜３００ｎｍ、２５ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１２５ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または５０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００３７】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％以上、またはそれを上回る割合のナノ粒子は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、約１０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６００ｎｍ、５０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約５０〜約３００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍである。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはそれを上回る割合のナノ粒子は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、１０ｎｍ〜８００ｎｍ、１０ｎｍ〜６００ｎｍ、５０ｎｍ〜８００ｎｍ、５０ｎｍ〜６００ｎｍ、５０ｎｍ〜５００ｎｍ、５０ｎｍ〜４００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、７５ｎｍ〜５００ｎｍ、７５ｎｍ〜３００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、１００ｎｍ〜３００ｎｍ、１５０ｎｍ〜５００ｎｍ、１５０ｎｍ〜４００ｎｍ、または１５０ｎｍ〜３００ｎｍである。
【００３８】
用語「約」および「およそ」は、数値または数値範囲を修正するために本明細書中で使用される場合、その数値または範囲からの妥当な誤差（一般的には、その数値または範囲から10％前後）であれば、その数値や範囲の意図する意味を損なわないことを示している。
【００３９】
幾つかの実施形態においては、記載されたナノ粒子のサイズは、球状のナノ粒子の直径を示している。特定の実施形態においては、記載されたサイズは、ナノ粒子の断面寸法の長さの何れか一つを示している（例えば、２つの断面寸法のうちより長い方）。
【００４０】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は５００ｎｍ未満である。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、３００ｎｍ未満である。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、２５０ｎｍ未満である。幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、２００ｎｍ未満である。これら実施形態のうち幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも２５ｎｍ、または少なくとも５０ｎｍのサイズである。
【００４１】
ある実施形態においては、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のナノ粒子が、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、もしくは５０ｎｍ、またはそれより大きいサイズである。ある実施形態においては、２５％より多い、３５％より多い、４５％より多い、５０％より多い、５５％より多い、６０％より多い、６５％より多い、７０％より多い、７５％より多い、８０％より多い、８５％より多い、９０％より多い、９５％より多い、９８％より多い、または９９％より多いナノ粒子が、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、もしくは５０ｎｍ、またはそれより大きいサイズである。特定の実施形態において、ナノ粒子の１００％が、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、もしくは５０ｎｍ以上、またはそれより大きいサイズである。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が１００ｎｍ、５００ｎｍ、または７５０ｎｍ未満のサイズである。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが８００ｎｍ以下である。幾つかの実施形態ではｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、８００ｎｍ以下である。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または５０ｎｍのサイズである。
【００４２】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、６００ｎｍ以下である。幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、６００ｎｍ以下である。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のサイズが、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または５０ｎｍである。
【００４３】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、５００ｎｍ以下である。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、５００ｎｍ以下である。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のサイズが、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または５０ｎｍである。
【００４４】
ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、４００ｎｍ以下である。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、４００ｎｍ以下である。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のサイズが、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または５０ｎｍである。
【００４５】
ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、３００ｎｍ以下である。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、３００ｎｍ以下である。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のサイズが、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または５０ｎｍである。
【００４６】
ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが２００ｎｍ以下である。幾つかの実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の２５％〜５０％、４０％〜６５％、５０％〜６５％、６５％〜７５％、７５％〜８５％、８５％〜９５％、９０％〜９９％、または９５％〜１００％は、例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察によって測定されたサイズが、２００ｎｍ以下である。これら実施形態のうちの幾つかにおいては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子の少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のサイズが、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または５０ｎｍである。
【００４７】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子は、不規則な形状である。他の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中のナノ粒子は、規則的な形状（例えば、円形状や球状）である。
【００４８】
特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、生体適合性および／または生物分解性である。生体適合性は、様々な技術（例えば、溶出試験、筋肉内移植、または被験動物に対する皮内注射、もしくは全身投与する方法などがあるが、これらの方法に限定されない）によって判定することができる。このような試験は、米国特許第6,686,342号（この特許は、その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている。一実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、溶出試験のスコアが「０」であり、筋肉内移植試験のスコアが「０」であり、皮内注射試験のスコアが「０」であり、かつ／または、全身投与による重量減少とは対照的に重量が増加している。一実施形態において、ポリマーまたはファイバーの溶出試験のスコアは「０」である。
【００４９】
特定の実施形態において、生物分解性のｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、患者への投与または移植後、約１日、２日、５日、８日、１２日、１７日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、または１００日以内に分解する。一局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物の生分解が緩慢に進む性質により、核酸を持続的に放出することができる。この性質が核酸の導入効率を向上させ、血清ヌクレアーゼによる分解から核酸を守る。
【００５０】
ある局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、免疫応答を引き起こさないという点で免疫的に中性である。特定の局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、動物に投与する場合（例えば、ネズミやウサギなどの動物に皮下注射や筋肉内注射した場合）に免疫応答を引き起こさないという点で、免疫的に中性である。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、この非免疫性のために、被験体に反復投与することができる。
【００５１】
幾つかの実施形態において、１つ以上の生物適合性試験によって示されているように、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は生物学的反応性がない。一実施形態において、溶出試験、皮下注射試験、筋肉内移植試験、および／または全身投与試験によって示されているように、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は生物学的反応性がない。
【００５２】
ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、使用前の一定期間２０℃〜３０℃、または２０℃〜２５℃で貯蔵されてもよい。特定の実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、使用前の一定期間室温で貯蔵されてもよい。一実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、約３０分、４５分、１時間、１．５時間、または２時間、２０℃〜３０℃または２０℃〜２５℃で貯蔵されてもよい。別の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、３０〜４５分、４５分〜１時間、１時間〜１．５時間、１〜２時間、または１．５〜２時間、２０℃〜３０℃または２０℃〜２５℃で貯蔵されてもよい。一実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、約３０分、４５分、１時間、１．５時間、または２時間、室温で貯蔵されてもよい。別の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、３０〜４５分、４５分〜１時間、１時間〜１．５時間、１〜２時間、または１．５〜２時間室温で貯蔵されてもよい。特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、約３０分、４５分、１時間、１．５時間、または２時間まで、４℃、２０℃〜３０℃、２０℃〜２５℃、または室温で貯蔵されてもよい。幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、２時間より長く（例えば、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、または２４時間）、さらには１日より長く、４℃、２０℃〜３０℃、２０℃〜２５℃、または室温で貯蔵されてもよい。一実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、４℃で貯蔵されている。特定の実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を、凍結、または低温保存する（そして、患者に投与する前に解凍する）ことができる。例えば、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、−２０℃もしくは−７０℃で凍結されてもよい。他の実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を、患者に投与する前に、凍結、もしくは低温保存したり、解凍したりしない。
【００５３】
５．２  核酸
ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、当業者に知られている任意の核酸を含むことができる。このような核酸としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、一重鎖ＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、一重鎖もしくは二重鎖オリゴヌクレオチド、三重鎖オリゴヌクレオチド、および他の核酸などの、ＤＮＡやＲＮＡがあるが、これらに限らない。ここでの核酸は、センス方向やアンチセンス方向における核酸、修飾核酸、非修飾核酸、および合成核酸を含む。特定の実施形態において、核酸は遺伝子のコード領域である。
【００５４】
一局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、治療用ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードした核酸を含有している。当該治療用ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、これらの製造が被験体にとって有用となるような障害（例えば癌、感染症、特定の必須タンパク質の遺伝的欠損、および／または後天的な代謝異常もしくは調節の不均衡（regulatory imbalances））の治療および／または予防に役立つだろう。例えば、インターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５などのサイトカインをコードした核酸は、感染症および／または癌の治療および／または予防に役立つかもしれない。インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ−７）およびその他の因子をコードした核酸は、ある種の癌細胞（例えば、乳癌の癌細胞）の増殖および／またはある種の腫瘍（例えば、乳房腫瘍）の成長を抑制するために役立つかもしれない。インスリンをコードした核酸は、糖尿病の治療および／または予防に役立つかもしれない。例えば、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードした核酸は、ニーマン・ピック病の治療に役立つかもしれない。
【００５５】
もう一つの局面において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、抗原をコードした核酸を含んでいる。核酸は、興味のある任意の疾患の標的をコードしていてもよい。例えば、核酸は、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生虫抗原、および／または腫瘍関連の抗原をコードしていてもよい。特定の実施形態において、核酸は、自己の抗原をコードしている。ウイルス抗原として、例えば、アデノウイルス科（例えば、マストアデノウイルスやアビアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、単純疱疹ウイルス５、単純疱疹ウイルス６、エプスタイン−バーウイルス、ＨＨＶ６−ＨＨＶ８、およびサイトメガロウイルス）、レビウイルス科（例えば、レビウイルス、腸内細菌フェーズＭＳ２、およびアロレビウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、脊椎動物ポックスウイルス亜科、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、および昆虫ポックスウイルス亜科）、パポバウイルス科（例えば、ポリオーマウイルスおよびパピローマウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１、モルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、ニューモノウイルス亜科（pneumonovirinae）（例えば、肺炎ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス））、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、およびメタニューモウイルス（例えば、トリニューモウイルスやヒトメタニューモウイルス）、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルスやライノウイルス、ヘパトウイルス（例えば、ヒトA型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス、およびアフトウイルス）、レオウイルス科（例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、フィトレオウイルス、およびオリザウイルス）、レトロウイルス科（例えば、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、鳥類Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルスのグループ、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１およびヒト免疫不全ウイルス２）、およびスプマウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）およびルビウイルス（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス、およびネクレオラブドウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピーウイルス、およびラッサウイルス）、およびコロナウイルス科（例えば、コロナウイルスおよびトロウイルス）などに由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
細菌性抗原としては、例えば、Aquaspirillum科、Azospirillum科、Azotobacteraceae科、Bacteroidaceae科、Bartonella属の種、Bdellovibrio科、Campylobacter属の種、Chlamydia属の種（例えば、Chlamydia pneumoniae）、クロストリジウム、Enterobacteriaceae科（例えば、Citrobacter属の種、エドワードシエラ属、Enterobacter aerogenes、Erwinia属の種、Escherichia coli、ハフニア属の種、Klebsiella属の種、モルガネラ属の種、Proteus vulgaris、プロビデンシア属、Salmonella属の種、Serratia marcescens、およびShigella flexneri）、Gardinella科、Haemophilus influenzae、Halobacteriaceae科、Helicobacter科、Legionallaceae科、Listeria属の種、Methylococcaceae属の種、マイコバクテリア（例えば、Mycobacterium tuberculosis）、Neisseriaceae科、Oceanospirillum科、Pasteurellaceae科、Pneumococcus属の種、Pseudomonas属の種、Rhizobiaceae科、Spirillum科、Spirosomaceae科、Staphylococcus属（メチシリン耐性Staphylococcus aureusおよびStaphylococcus pyrogenes）、Streptococcus属（Streptococcus enteritidis、Streptococcus fasciae、およびStreptococcus pneumoniae）、Vampirovibr Helicobacter科、およびVampirovibrio科の細菌に由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
真菌性抗原としては、例えば、Absidia属の種（例えば、Absidia corymbiferaおよびAbsidia ramosa）、Aspergillus属の種（例えば、Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、およびAspergillus terreus）、Basidiobolus ranarum、Blastomyces dermatitidis、Candida属の種（例えば、Candida albicans、Candida glabrata、Candida kerr、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida pseudotropicalis、Candida quillermondii、Candida rugosa,、Candida stellatoidea、およびCandida tropicalis）、Coccidioides immitis、Conidiobolus属の種、Cryptococcus neoforms、Cunninghamella属の種、皮膚糸状菌、Histoplasma capsulatum、Microsporum gypseum、Mucor pusillus、Paracoccidioides brasiliensis、Pseudallescheria boydii、Rhinosporidium seeberi、Pneumocystis carinii、Rhizopus属の種（例えば、Rhizopus arrhizus、Rhizopus oryzae、およびRhizopus microsporus）、Saccharomyces属の種、Sporothrix schenckii、接合菌、ならびに、Zygomycetes、Ascomycetes、Basidiomycetes、Deuteromycetes、およびOomycetes等の綱の真菌に由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
腫瘍関連の抗原としては、例えば、メラノサイト系タンパク質（ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、およびチロシナーゼなど）、および腫瘍特異的抗原（ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、非メラノーマ抗原、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（乳癌及び卵巣癌）、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、Ｅ７（子宮頸癌）、およびＭＵＣ−１（乳癌、卵巣癌、および膵臓癌）など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
治療用ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードした核酸配列、または抗原を、クローン技術によって判定するか、ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉｐｒｏｔなどの配列データベース内で見つけることもできる。
【００６０】
ある実施形態において、上記した核酸は、転写制御因子と、任意で翻訳制御因子とを備えるベクターもしくはプラスミドの一部であるか、ベクターもしくはプラスミドに含有されている。選ばれたベクターまたはプラスミドは、特に限定されないが転写制御因子の強さなどを含む様々な要因に依存する。
【００６１】
本発明の局面を実施するための技術として、特に記載のない限り、当業者が日常的に実施している分子生物学の従来技術、組み換えＤＮＡの操作技術及び産出技術が用いられる。
【００６２】
５．３  アジュバント
ある実施形態においては、本明細書におけるｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、アジュバントを含んでいるか、またはアジュバントとともに投与される。本明細書における組成物と共に投与されるアジュバントは、該組成物の投与前に投与されても、組成物と共に投与されても、組成物の投与後に投与されてもよい。特定の実施形態において、アジュバントは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中に含まれた状態で投与される。他の実施形態では、アジュバントは、核酸と同一の組成物とともに投与されるが、核酸と同一の組成物中に含まれた状態では投与されない。
【００６３】
幾つかの実施形態において、用語「アジュバント」とは、本明細書における組成物とともに、またはその組成物の一部として投与すると、免疫応答を増強する（augments）、向上させる（enhances）、および／または助長する（boosts）化合物のことである。例えば、アジュバントは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素に対する免疫応答を向上、および／または助長することができるが、該化合物を単独で投与しても、免疫応答は生じない。幾つかの実施形態では、該アジュバントは免疫応答を生じさせるが、アレルギーまたは別の副作用を起こさない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、およびマクロファージの刺激等の複数のメカニズムによって、免疫応答を向上させることができる。
【００６４】
ある実施形態において、アジュバントは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の核酸によってコードされた抗原に対する内因性の免疫応答を増強する。ある実施形態において、アジュバントは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の核酸にコードされた抗原に対する内因性の免疫応答を、核酸にコードされた生成物の立体構造を変化させることなく、増強する。ある実施形態において、アジュバントは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中の核酸にコードされた抗原に対する内因性の免疫応答を、該免疫応答に質的な面で影響する核酸にコードされた生成物の立体構造を変化させることなく、増強する。
【００６５】
特定の実施形態において、上記アジュバントはタンパク質またはペプチドである。他の実施形態では、該アジュバントはタンパク質またはペプチドではない。幾つかの実施形態では、該アジュバントは化学物質である。他の実施形態では、該アジュバントは化学物質ではない。
【００６６】
幾つかの実施形態では、アジュバントは核酸である。該アジュバントは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物中に送達される「一次」核酸と同一の組成でも、異なる組成でもよい。該アジュバントは、同一の「一次」ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物に添加されるか、別途準備したアジュバント／ポリマー賦形剤における該「一次」ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物と同時に、または「一次」ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物の後に、投与されてもよい。２つ以上のアジュバント（例えば、核酸アジュバント）を、２つ以上の別個のｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物に含まれた状態で投与することができる。ある実施形態においては、該アジュバントは核酸ではない。
【００６７】
アジュバントとして、具体的には、例えば、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウム）、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（ＧＢ２２２０２１１参照）、ＭＦ５９（Novartis）、ＡＳ０３（GlaxoSmithKline）、ＡＳ０４（GlaxoSmithKline）、ポリソルベート８０（Tween 80、ICL Americas, Inc.）、イミダゾピリジン化合物（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４８５７号（国際公開ＷＯ２００７／１０９８１２号として公開）を参照）、イミダゾキノキサリン化合物（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４８５８号（国際公開ＷＯ２００７／１０９８１３号として公開）を参照）、およびＱＳ２１（Kensil et al.、in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)；米国特許５，０５７，５４０号を参照）等のサポニンが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、該アジュバントはフロイント完全または不完全アジュバントである。他のアジュバントは、水中油型乳剤（例えば、スクアレンまたはピーナッツ油）であり、モノホスホリルリピドＡ（Stoute et al.、N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)参照）等の免疫性刺激薬と任意で組み合わせられる。別のアジュバントは、ＣｐＧ（Bioworld Today, Nov. 15, 1998）である。上記のようなアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリグルタミン酸もしくはポリリジン等の重合体もしくは単量体のアミノ酸、または当該分野にて公知の免疫増強剤等の、他の特異的な免疫賦活剤と併用しても併用しなくてもよい。
【００６８】
一局面において、アジュバントは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−α等のサイトカインである。別の局面において、該アジュバントは、ポリイノシン・ポリシチジル酸（“ポリＩ：Ｃ”）またはＣＰＧである。一実施形態において、該アジュバントはポリＩ：Ｃである。幾つかの実施形態では、該アジュバントは、１回の投与につき約１μｇ〜１００μｇの濃度で使用される。幾つかの実施形態では、該アジュバントは、１回の投与につき、約０．５μｇ〜２００μｇ、１μｇ〜１５０μｇ、１μｇ〜２０μｇ、１μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜２５μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜７５μｇ、１０μｇ〜１００μｇ、１０μｇ〜１５０μｇ、２０μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜８０μｇ、２０μｇ〜１００μｇ、２５μｇ〜７５μｇ、５０μｇ〜７５μｇ、５０μｇ〜１００μｇ、または５０μｇ〜１５０μｇの濃度で使用される。特定の実施形態において、ポリＩ：ＣまたはＣｐＧは、１回の投与につき、約１μｇ〜５００μｇ、１０μｇ〜２５０μｇ、２０μｇ〜２００μｇ、２５μｇ〜１５０μｇ、２５μｇ〜１００μｇ、２５μｇ〜７５μｇ、３０μｇ〜７０μｇ、または４０μｇ〜６０μｇの濃度で使用される。他の特定の実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２は、１回の投与につき、約０．１μｇ〜２５０μｇ、０．５μｇ〜１００μｇ、０．５μｇ〜７５μｇ、０．５μｇ〜５０μｇ、１μｇ〜１００μｇ、１μｇ〜５０μｇ、１μｇ〜２５μｇ、１μｇ〜１５μｇ、１μｇ〜１０μｇ、２μｇ〜１５μｇ、２μｇ〜１０μｇ、または２．５μｇ〜７．５μｇの濃度で使用される。特定の実施形態において、アジュバントはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物に添加されるか、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物と組み合わせて用いられる。
【００６９】
５．４  ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物の生成方法
ある実施形態において、可溶化するために（セクション５．１で上述）、乳酸、クエン酸、琥珀酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸等の無機酸または有機酸によって誘導体化された、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有するｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物は、緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液等の酢酸緩衝液）中で希釈され、任意で、一定の温度（例えば、４５℃〜５５℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、５５℃〜６０℃、５５℃〜６５℃、６０℃〜７５℃、または４５℃〜７５°）で、一定時間（例えば、５〜１０分、５〜１５分、１０〜１５分、１０〜２０分、１５〜３０分、３０〜４５分、３０分〜１時間、４５分〜１時間、５分〜１時間、１０分〜１時間、または少なくとも５〜１０分）インキュベートされる。ある実施形態において、上記有機酸は、ＲＣＯＯＨの構造を有しており、Ｒは任意で置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルでもよい。幾つかの実施形態では、Ｒは、任意で置換されたアルキルでもよい。幾つかの実施形態では、Ｒは１または複数の水酸基によって置換されたアルキルである。ある実施形態において、ＲＣＯＯＨは、グルコン酸または乳酸である。他の実施形態では、ＲＣＯＯＨはクエン酸、琥珀酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸である。特定の実施形態において、本明細書中上記の方法において用いられる該緩衝剤は、上記ｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物を希釈する上で効力のあるものであれば、どのような緩衝剤でもよい。
【００７０】
幾つかの実施形態では、乳酸、クエン酸、琥珀酸、グルコン酸、グルクロン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、またはフマル酸等の、アンモニウム塩誘導体（セクション５．１で上述）を形成するための無機酸または有機酸によって誘導体化／可溶化された、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有するｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物は、ｐＨ５．７の酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液）等の緩衝剤中で溶解／希釈され、一定の温度（例えば、４５℃〜５５℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、５５℃〜６０℃、５５℃〜６５℃、または６０℃〜７５℃）で、一定時間（例えば、５〜１０分、５〜１５分、１０〜１５分、１０〜２０分、１５〜３０分、３０〜４５分、３０分〜１時間、または４５分〜１時間）インキュベートされる。一実施形態において、乳酸によって誘導体化／可溶化された脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有するｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物は、ｐＨ５．７の酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液）等の緩衝剤中で溶解／希釈され、最終濃度が約０．００１％〜約０．０１％、約０．０１％〜約０．１％、約０．１％〜約０．２％、約０．１％〜約０．２５％、約０．１％〜約０．３％、約０．１％〜約０．４％、約０．１％〜約０．５％、約０．１％〜約１％、約０．２％〜約０．３％、約０．２〜約０．４％、または約０．２％〜約０．５％である誘導体化された該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが得られる。別の実施形態では、乳酸によって誘導体化／可溶化された脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有するｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物は、ｐＨ５．７の酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液）等の緩衝剤中で溶解／希釈され、最終濃度が０．００１％〜０．０１％、０．０１％〜０．１％、０．１％〜０．２％、０．１％〜０．２５％、０．１％〜０．３％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．５％、０．１％〜１％、０．２％〜０．３％、０．２〜０．４％、または０．２％〜０．５％である誘導体化された該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが得られる。特定の実施形態において、乳酸によって誘導体化／可溶化された脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含むｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物は、ｐＨ５．７の酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液）等の緩衝剤中で溶解／希釈され、最終濃度が０．２％である誘導体化された該ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンが得られる。一実施形態において、選択された該緩衝剤は、該ｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物を沈殿させる。
【００７１】
次に、一定量の溶解／希釈されたｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物は、一定濃度の核酸と組み合わせることができ、その混合物は、一定時間（例えば、５〜１０秒、５〜１５秒、５〜２０秒、１０〜２０秒、２０〜３０秒、２０〜４０秒、３０〜４０秒、４０〜５０秒、５０〜６０秒、１〜２分、２〜４分、または２〜５分）（例えば、混合、ボルテックス撹拌、または振動によって）撹拌され、本明細書におけるｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を生成することができる。ある実施形態においては、５０〜１００マイクロリットル、７５〜１５０マイクロリットル、７５〜１００マイクロリットル、または１００〜２００マイクロリットルの溶解／希釈されたｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物を、一定濃度の核酸と組み合わせる。特定の実施形態において、１００マイクロリットルの溶解／希釈されたｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物を、一定濃度の核酸と組み合わせる。ある実施形態において、核酸は、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウム等の塩と組み合わせられ、一定の温度（例えば、４５℃〜５５℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、５５℃〜６０℃、５５℃〜６５℃、または６０℃〜７５℃）で一定時間（例えば、５〜１０分、５〜１５分、１０〜１５分、１０〜２０分、１５〜３０分、３０〜４５分、３０分〜１時間、または４５分〜１時間）インキュベートされる。特定の実施形態においては、０．１μｇ〜２ｍｇ、０．２μｇ〜１ｍｇ、０．５μｇ〜５００μｇ、１μｇ〜２００μｇ、１μｇ〜１００μｇ、１μｇ〜５０μｇ、５μｇ〜２５μｇ、５μｇ〜１５μｇ、５０μｇ〜１５０μｇ、１μｇ〜５μｇ、２μｇ〜５μｇ、１μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、または１５μｇ〜２５μｇの核酸を、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウム等の塩と組み合わせる。特定の実施形態においては、核酸を、５０ｍＭの硫酸ナトリウム１００マイクロリットルと組み合わせる。ある実施形態において、溶解／希釈されたｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物と核酸との混合物は、ボルテックス撹拌によって一定時間（例えば、５〜１０秒、５〜１５秒、５〜２０秒、１０〜２０秒、２０〜３０秒、２０〜４０秒、３０〜４０秒、４０〜５０秒、５０〜６０秒、１〜２分、２〜４分、または２〜５分）撹拌される。特定の実施形態において、溶解／希釈されたｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物と核酸との混合物は、ボルテックス撹拌によって２０秒間撹拌される。ある実施形態においては、核酸と同様にアジュバントも、溶解／希釈されたｐ−ＧｌｃＮＡｃ組成物と組み合わせる。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物に添加され得るアジュバントの例については、上述のセクション５．３を参照のこと。
【００７２】
核酸は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を生成する上記方法に用いるために、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウム等の塩と核酸とを組み合わせるか、または混合し、任意で得られた組み合わせまたは混合物を一定の温度（例えば、４５℃〜５５℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、５５℃〜６０℃、５５℃〜６５℃、６０℃〜７５℃、または４５℃〜７５℃）で一定時間（例えば、５〜１０分、５〜１５分、１０〜１５分、１０〜２０分、１５〜３０分、３０〜４５分、３０分〜１時間、４５分〜１時間、５分〜１時間、１０分〜１時間、または少なくとも５または１０分）インキュベートすることによって調製されてもよい。特定の実施形態においては、０．１μｇ〜２ｍｇ、０．２μｇ〜１ｍｇ、０．５μｇ〜５００μｇ、１μｇ〜２００μｇ、１μｇ〜１００μｇ、１μｇ〜５０μｇ、５μｇ〜２５μｇ、５μｇ〜１５μｇ、５０μｇ〜１５０μｇ、１μｇ〜５μｇ、２μｇ〜５μｇ、１μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、または１５μｇ〜２５μｇの核酸を、硫酸ナトリウム等の塩と組み合わせる。特定の実施形態においては、核酸を、５０ｍＭの硫酸ナトリウム１００マイクロリットルと組み合わせる。特定の実施形態においては、０．５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ  ３０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、または６ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌの硫酸ナトリウムを核酸と組み合わせる。
【００７３】
特定の実施形態においては、後述のセクション６．１で説明する方法を用いて、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を生成する。
【００７４】
５．５  ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物の使用
ここでは、被験体へのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの核酸の送達方法について説明する。特定の実施形態において、遺伝子治療やワクチン接種のための、被験体へのｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸の送達方法が述べられている。該方法は、一般的に、被験体にｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与する工程を含む。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が核酸だけでなくアジュバントも含有している。他の実施形態において、アジュバントは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物の投与前、投与中、または投与後に、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物とは別個で投与される。
【００７５】
一実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与することにより、該組成物中の核酸が持続的に発現する。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与することにより、該組成物中の核酸が、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、１．５か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、１年間、またはそれ以上の期間にわたり発現する。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与することにより、核酸が、投与後２時間から３か月、２時間から２か月、２時間から１か月、２時間から２週間、６時間から３か月、６時間から２か月、６時間から１か月、６時間から２週間、１２時間から３か月、１２時間から２か月、１２時間から１か月、１２時間から２週間、１日から３か月、１日から２か月、１日から１か月、１日から２週間、２日から３か月、２日から２か月、２日から１か月、または２日から２週間の期間にわたり発現する。
【００７６】
別の実施形態では、アジュバントを含有しているｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を投与することにより、被験体に核酸とアジュバントとを共送達することができる。特定の実施形態において、核酸とアジュバントとの両方を持続的に、かつ同時に放出するために、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が、ＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−１２などのアジュバントを効率的に放出することができる。本発明はいかなる理論にも縛られるものではないが、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物による核酸とアジュバントとの共送達は、抗原提示細胞が適切な刺激条件下において核酸を取り込む可能性を増加させる。この刺激条件は、例えば、抗原をコードした核酸を投与する場合に役立つだろう。
【００７７】
ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、遺伝子治療プロトコルおよびワクチン接種プロトコルの一部として被験体に投与されてもよい。遺伝子治療またはワクチン接種は、様々な障害またはその障害の症状を治療および／または予防するために用いられてもよい。例えば、遺伝子治療は、癌、感染症、特定の必須タンパク質の遺伝的欠損、および／または後天性代謝異常もしくは調節の不均衡を治療および／または予防するのに用いられる。
【００７８】
核酸を発現させることができる限り、非経口、局所、皮内、鼻腔内、粘膜内、腹腔内、硬膜外、舌下、脳内、膣内、経皮的、直腸、吸入、腫瘍内、局所などどのような経路によってｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を被験者に投与してもよい。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が被験体に皮下、筋肉、もしくは静脈内を通して送達される。特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、皮下注射によって投与される。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は静脈投与されない。
【００７９】
特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、上皮細胞、例えば、皮膚の細胞、つまり表皮や真皮に投与される。一実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、例えば、皮膚細胞を標的とするために、注射により皮下投与される。皮下投与は、樹状細胞などの抗原提示細胞を標的として投与できるという利点があり、そのため、強い抗原特異的免疫応答の発動や確立において中心的な役割を担う。被験体の皮膚へ本明細書中に記載されている組成物を送達することによって、核酸によりコードされた抗原の樹状細胞へのターゲティングを可能にする。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を、例えば、サイトカインなどのアジュバントと組み合わせて投与する。抗原をコードした核酸およびサイトカインなどの免疫応答活性化因子を皮下投与することが有利である。なぜなら上記皮下投与により、樹状細胞の活性化および／または成熟を誘導することができるからである。上記組成物の投与は樹状細胞の活性化を促進することができ、樹状細胞にとって、抗原をＴ細胞へとクロスプライミングし（cross-prime）、効果的に免疫性を生み出すために重要である。
【００８０】
幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は反復投与のために使用されている。幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、１か月、２か月、３か月、６か月、１年間、または１年より長い期間にわたって、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、１週間に１回、２週間に１回、または１か月に１回、投与される。他の実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、１回だけの投与であり、繰り返されない。
【００８１】
幾つかの実施形態では、０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、１．５μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１２５μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、または５００μｇの核酸を含有しているｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が被験体に投与される。ある実施形態において、０．１μｇ〜２ｍｇ、０．２μｇ〜１ｍｇ、０．５μｇ〜５００μｇ、１μｇ〜２００μｇ、１μｇ〜１００μｇ、１μｇ〜５０μｇ、５μｇ〜２５μｇ、５μｇ〜１５μｇ、５０μｇ〜１５０μｇ、１μｇ〜５μｇ、２μｇ〜５μｇ、１μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、または、１５μｇ〜２５μｇの核酸を含有しているｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が、被験体に投与される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物が有利である。なぜなら、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、その成分を、治療濃度を望ましいレベルで維持しながら、持続的に放出および／または発現させることができるため、該成分の投与の頻度を減らすことができるからである。
【００８３】
「被験体」および「患者」とは、ヒト以外の動物やヒトを含む動物のことにも交換可能に使用される。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、生後０〜６か月、６〜１２か月、１〜５年、５〜１０年、１０〜１５年、１５〜２０年、２０〜２５年、２５〜３０年、３０〜３５年、３５〜４０年、４０〜４５年、４５〜５０年、５０〜５５年、５５〜６０年、６０〜６５年、６５〜７０年、７０〜７５年、７５〜８０年、８０〜８５年、８５〜９０年、９０〜９５年、または９５〜１００年の哺乳類に投与される。ある実施形態においては、該哺乳類は、ヒト以外の哺乳類である。幾つかの実施形態では、該哺乳類は、特定の障害のための動物モデルである。ある実施形態においては、該哺乳類は、特定の障害になるリスクがあるか、または特定の障害になりやすい。他の実施形態では、該哺乳類は、特定の障害を有していると診断されている。幾つかの実施形態では、該哺乳類は、特定の障害の症状を示している。
【００８４】
特定の実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、ヒトに投与される。ある実施形態においては、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、生後０〜６か月、６〜１２か月、１〜５年、５〜１０年、５〜１２年、１０〜１５年、１５〜２０年、１３〜１９年、２０〜２５年、２５〜３０年、２０〜６５年、３０〜３５年、３５〜４０年、４０〜４５年、４５〜５０年、５０〜５５年、５５〜６０年、６０〜６５年、６５〜７０年、７０〜７５年、７５〜８０年、８０〜８５年、８５〜９０年、９０〜９５年、または９５〜１００年のヒトに投与される。幾つかの実施形態では、該ヒトは、特定の障害になるリスクがあるか、または特定の障害になりやすい。他の実施形態では、該ヒトは、特定の障害を有していると診断されている。幾つかの実施形態では、該ヒトは、特定の障害の症状を示している。
【００８５】
ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、例えば、犬または猫などのペットに投与される。ある実施形態において、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、例えば、豚、牛、馬、鶏、などの家畜（farm animal）または家畜（livestock）に投与される。幾つかの実施形態では、該ペット、家畜（farm animal）または家畜（livestock）は特定の障害になるリスクがある、もしくは特定の障害になりやすい。他の実施形態では、該ペット、家畜（farm animal）または家畜（livestock）は、特定の障害を有していると診断されている。幾つかの実施形態では、該ペット、家畜（farm animal）または家畜（livestock）は、特定の障害の症状を示している。
【００８６】
幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、標準的な治療では効果がない被験体に投与される。幾つかの実施形態では、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、従来の治療（単数または複数）に対して副作用の影響を受けやすい被験体に投与される。
【００８７】
さらに、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの使用に適した核酸遺伝子産物を大量に製造するために、細胞にトランスフェクション（例えば、安定的にトランスフェクション）することができる。一実施形態において、核酸送達に用いられる細胞は、細胞系である。別の実施形態では、核酸送達に用いられる細胞は、被験体に由来する初代細胞である（被験体は、好ましくはヒトである）。特定の実施形態において、核酸送達に用いられる細胞は、癌細胞である。核酸送達組成物を用いてトランスフェクションされる細胞はまた、遺伝子治療プロトコルの一部として、被験体（被験体は、好ましくはヒトである）に投与されても良い。
【００８８】
５．６  キット
本発明は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物を製造するための１つ以上の原料で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。特定の実施形態において、薬学的パックまたはキットは容器中に脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体（例えば、乳酸誘導体）を含んでいる。ある実施形態において、上記薬学的パックまたはキットは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のうち１つ以上を含んでいる：（ｉ）容器に入れられたｐＨ５．７酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（例えば、２５ｍＭのｐＨ５．７酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液）；（ｉｉ）容器に入れられた硫酸ナトリウム（例えば、５０ｍＭの硫酸ナトリウム）；（ｉｉｉ）容器に入れられた核酸；および（ｉｖ）容器に入れられたアジュバント。
【００８９】
ある実施形態において、薬学的パックまたはキットは脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体（例えば、乳酸誘導体）、核酸、および任意にアジュバントを含んでいる。幾つかの実施形態において、薬学的パックまたはキットは脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体（例えば、乳酸誘導体）、核酸、および任意にアジュバントを含み、上記ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体は、核酸および任意でアジュバントが入った容器とは別の容器に入れられている。幾つかの実施形態において、薬学的パックまたはキットは、脱アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体（例えば、乳酸誘導体）、核酸、およびアジュバントを含み、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体、核酸およびアジュバントは、それぞれ別の容器に入れられている。他の実施形態において、上記核酸および上記アジュバントは、薬学的パックまたはキットの、同じ容器に入れられている。ある実施形態において、薬学的パックまたはキットは、さらに下記（ｉ）〜（ｉｉ）のうち１つ以上を含む：（ｉ）容器に入れられた酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液または酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（例えば、２５ｍＭのｐＨ５．７酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液等のｐＨ５．７）等の酢酸緩衝液；および／または（ｉｉ）容器に入れられた硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウム（例えば、５０ｍＭの硫酸ナトリウム）。幾つかの実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体は、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液や酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液などの酢酸緩衝液と同じ容器に入れられている。他の実施形態において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンアンモニウム塩誘導体は、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液または酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液などの酢酸緩衝液とは別の容器に入れられている。幾つかの実施形態において、核酸は、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウムと同じ容器に入れられている。さらに他の実施形態において、核酸は硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、または硫酸マグネシウムとは別の容器に入れられている。
【００９０】
上記容器には、調合薬や生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって規定された様式の通知書を、任意に添付してもよい。上記通知書とは、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売に関する行政機関による承認が示されたものである。
【００９１】
本明細書に記載のキットは、上述した方法において使用することができる。
【００９２】
６．実施例
６．１  実施例１：ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／核酸組成物の調製
ステップ１：ｐ−ＧｌｃＮＡｃスラリー濃度の決定
１．１  ｐ−ＧｌｃＮＡｃスラリー原料を、脱イオン（ＤＩ）水を用いて２０リットルに希釈し、一晩中もしくは２４時間シェーカーで混ぜる。
【００９３】
１．２  希釈したスラリー１０ｍＬを、Ｓｕｐｒｏ８００フィルター膜を用いてろ過し、これを３回行う。（合計体積３０ｍＬ）。この３枚の膜を、８５℃のオーブン内で乾燥するまでインキュベートする。
【００９４】
１．３  この３枚の膜の重さを量り、平均重量を求める。
【００９５】
１．４  求めた平均重量を１０で割り、濃度を計算する。
【００９６】
例えば、得られたｐ−ＧｌｃＮＡｃスラリーの平均重量が６．３ｍｇであれば、濃度は、６．３ｍｇ／１０ｍＬ＝０．６３ｍｇ／ｍＬとなる。
【００９７】
ステップ２：マットを作製するために必要な体積を計算する
マットボックスの寸法は、２２ｃｍ×２２ｃｍであり、したがってボックスの面積は４８４ｃｍ２である。
【００９８】
２．１  使用され得る、または必要とされ得るポリマー量は０．５ｍｇ／ｃｍ２であるため、１つのマットに必要なポリマー量は０．５ｍｇ／ｃｍ２×４８４ｃｍ２、つまり２４２ｍｇである。
【００９９】
２．２  １つのマットに使用され得る、または必要とされ得る体積は、２４２ｍｇ／０．６３ｍｇ／ｍＬ、つまり３８４ｍＬである。
【０１００】
２．３  希釈したスラリー３８４ｍＬを、金属ふるいを介して金属製の箱に注ぎ入れ、マットをろ過および除去する。マットを５０℃のオーブンで乾燥するまでインキュベートするか、またはペーパータオルの上で室温にて自然乾燥させる。
【０１０１】
ステップ３：膜（マット）の脱アセチル化
３．１  ４０％のシグマ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨフレーク）溶液は、冷却されるまでに２４時間かかるため、脱アセチル反応をする１日前に作製しておく。ここでは、体積に対する重量で記載する；つまり、ＤＩ水６０ｍＬに対して、ＮａＯＨフレークは４０グラムである（体積に対する重量）。溶液が冷めたら、１リットルのボトルに注ぎ入れる。
【０１０２】
３．２  ウォーターバスをＯＮにし、８０℃に設定する。膜を４０％のＮａＯＨ溶液に浸してふるいから離し、離した膜を１リットルのガラスボトル中に移す。金属ふるいを４リットルのビーカー中に置く。全ての膜をガラスボトルに移したら、ボトルを残りの４０％ＮａＯＨ溶液で１０００ｍＬマークより上まで満たし、当該ボトルをウォーターバス中に置く。
【０１０３】
３．３  膜が入ったボトルを３時間インキュベートする。３０分おきにボトルを取り出し振動させて混ぜる。３時間のインキュベーションにより、約７５％の脱アセチル化を測定することができる。
【０１０４】
３．４  ボトルを取り出して、ウォーターバスをＯＦＦにする。膜を冷やし、４０％ＮａＯＨ溶液を４リットル容量のフラスコに注ぎ入れ、ｐＨが中性（７）になるまで膜をＤＩ水で洗浄する。膜をＤＩ水中に一晩浸し、４０％ＮａＯＨ溶液は適切に廃棄する。
【０１０５】
３．５  脱アセチル化した膜を金属ふるいの上に置き、５０℃のオーブン内でそれらを乾燥させ、脱アセチル化を測定する。
【０１０６】
ステップ４：脱アセチル化比率（パーセンテージ）を測定する
４．１  酢酸標準品（０．０１、０．０２、および０．０３Ｍ）およびグルコサミン標準品（０．００５、０．０１５、および０．０３５ｍｇ／ｍＬ）を生成し、それらをプログラムされた分光光度計にかけて標準曲線を得る。
【０１０７】
４．２  各サンプルにつき０．５ｍｇ〜１．０ｍｇの間で２つの重さを量る。該サンプルを１００μＬの酢酸で２０分間溶解し、ＤＩ水９００μＬを用いて体積を１ｍＬにする。５０μＬ、１００μＬ、１５０μＬのサンプルを、０．０１Ｍの酢酸９５０μＬ、９００μＬ、８５０μＬが入った３本のエッペンドルフチューブに分け入れてよく混合し、該サンプルを分光光度計で読み取る。
【０１０８】
４．３  標準とサンプルとを読み取ったら、エクセル表計算ソフトを用いて脱アセチル化比率を計算する。
【０１０９】
ステップ５：脱アセチル化を測定した後、ゲルの生成に必要な乳酸の量を計算する。
６９％脱アセチル化膜の例：
アセチルグルコサミン  ２２１．２×．３１＝６８５７．２
グルコサミン  ２１５．６×．６９＝１４８７６．４
合計＝２１７３３．６／１００＝２１７−平均ＭＷ
ポリマーの重量  １０ｇ／２１７＝０．０４６Ｍ
３０％乳酸＝３．３３Ｍ
ｐ−ＧｌｃＮＡｃ：ＬＡのモル比を１：１にする場合、
４６／３．３３＝１３．８１ｍＬの乳酸が本サンプルには必要である。
【０１１０】
ステップ６：１３．８１ｍＬの３０％乳酸をＤＥＡＣ膜と９８６ｍＬの脱イオン水が入ったビーカーに注ぎ入れる。溶液をＤＥＡＣ膜で一晩かき混ぜて、均一な溶液を得る。ゲル材料をガラスフィルターでろ過する。−２０℃の冷凍庫内で、プラスチックで覆われたトレイに入れて凍らせ、凍結乾燥する。
【０１１１】
ステップ７：凍結乾燥させたもの２ｇを１００ｍｌの脱イオン水で溶かし、１００ｍｌの２％ｐ−ＧｌｃＮＡｃゲルを得る。１２０℃の高圧蒸気殺菌法によってゲルを２０分間殺菌する。
【０１１２】
ステップ８：本手順は、動物に対する１回の注射に必要な用量で示している：
（１）ｐ−ＧｌｃＮＡｃゲルを２５ｍＭのｐＨ５．７酢酸ナトリウム−酢酸緩衝剤で１００倍に希釈し、５５℃のウォーターバスに１５分間置く（希釈後の最終ｐ−ＧｌｃＮＡｃゲルの濃度は０．０２％になる）。（２）１０マイクログラムのＤＮＡプラスミドを１００マイクロリットルの５０ｍＭ硫酸ナトリウムに添加し、５５℃のウォーターバスに１０分間置く。（３）サンプルを高速の渦流にかけながら、１００マイクロリットルの希釈したｐ−ＧｌｃＮＡｃゲルをＤＮＡ−硫酸ナトリウム溶液に添加する。（４）当該混合物の渦流処理を２０秒間継続する。（５）被験動物に注射する前に、混合物を室温で２時間未満置いておく。得られたｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物は被験動物への注射に使用する。
【０１１３】
図１にｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【０１１４】
６．２  実施例２：ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子組成物を伴った、または伴わない、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＮＡワクチン接種
セクション６．１に記載の手順を用いて、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを含有するｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を生成した。ルシフェラーゼをコードしたＤＮＡを含むプラスミド調製品（ｐｃＤＮＡＬｕｃ）（１００μｇ／マウス）をネイキッドのＤＮＡ調製品として筋肉内に（「ｉ．ｍ」）注射し、または、ネイキッドのＤＮＡもしくはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物として皮下（「ｓ．ｃ」）に注射した。上記ＤＮＡ組成物の投与後１日目、７日目、および１４日目に、ルシフェリン基質を腹腔内注射し、ＩＶＳシステムを用いた生物発光イメージングによってルシフェラーゼ活性を検出した。図２はｐｃＤＮＡＬｕｃ組成物が注射された全てのマウスのルシフェラーゼ活性を示す。全体の内で最も高いルシフェラーゼ活性は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物の皮下注射を受けたマウスにおいて検出された。注目すべきことに、筋肉内注射を受けたマウスと同程度のＤＮＡ発現が、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を一回皮下注射した同じ動物において注射後４日までに検出された。さらに、図２はｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物の接種後１４日までに検出された導入遺伝子の発現を示す。これによれば、投与された箇所において抗原の有効性が局所的に継続している事が示唆されている。このデータによれば、ｐ−ＧｌｃＮＡｃポリマーナノ粒子が、コードされた抗原の継続的発現をもたらすようにプラスミドＤＮＡを放出することが可能であることがわかる。
【０１１５】
６．３  実施例３：ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を用いたプロフェッショナル抗原提示細胞による流入領域リンパ節へのＤＮＡにコードされた抗原の効果的な取り込みおよび輸送
ＤＮＡがプロフェッショナル抗原提示細胞に効果的に取り込まれ、流入領域リンパ節に輸送されたか否かを判断するために、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子を単独で、またはＧＦＰをコードしたプラスミドＤＮＡ１００μｇを含むｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を、６匹のマウスの足蹠に注射した。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物の生成にはセクション６．１に記載の手順を用いた。注射の１日後に流入領域リンパ節を摘出し、ＰＥに結合されたＭＨＣクラスＩＩに対するモノクローナル抗体を用いて細胞懸濁液を染色した。ＭＨＣクラスＩＩおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の二重発現について、フローサイトメトリー法によって細胞懸濁液を調べた。図３はｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＧＦＰ組成物を用いて免疫性を付与したマウスおよびｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子単体を用いて免疫性を付与したマウスの流入領域リンパ節に由来する細胞懸濁液をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。図３によれば、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を接種したマウスでは、摘出したリンパ節の約３０％のＭＣＨクラスＩＩ陽性細胞中にＧＦＰシグナルが見られた。このことから、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子が局所的に注射された箇所にＤＮＡを送達することが可能であり、その結果、コードされた生成物がプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）によって流入領域リンパ節に取り込まれ、かつ輸送され、該生成物の発現に成功したことがわかる。
【０１１６】
６．４  実施例４：ｈｇｐ１００ＤＮＡ接種に反応したドナーＰｍｅｌ細胞の増殖
ｈｇｐ１００ＤＮＡを含有したｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子をセクション６．１の手順を用いて生成した。１０６のＰｍｅｌ脾細胞（ナイーブＰｍｅｌ細胞：ヒトｇｐ１００（つまり、ｈｇｐ１００）内のエピトープに対するＴＣＲトランスジェニックのＣＤ８＋Ｔ細胞）の養子免疫伝達の２４時間後、ネイキッドのｈｇｐ１００ＤＮＡを筋肉注射および皮下注射でマウスに接種するか、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｈｇｐ１００を皮下注射でマウスに接種するか、またはマウスにワクチンを接種しなかった。血中Ｐｍｅｌ細胞濃度は、血液サンプルのフローサイトメトリーによって判定した。図４に脾臓、末梢血液（「血液」）、およびリンパ節（「ＬＮ」）内へのネイキッドのｈｇｐ１００ＤＮＡまたはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｈｇｐ１００ＤＮＡの接種に反応したＰｍｅｌ細胞の増殖を示す。リンパ節において、増殖したドナーＰｍｅｌ細胞がより高頻度で見られた。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐｈｇｐ１００組成物を用いた免疫付与に反応したナイーブＰｍｅｌ細胞の増殖から分かるように、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物は抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を効果的に促進した。
【０１１７】
６．５  実施例５：ポリＩ：Ｃの共送達が自己腫瘍抗原をコードしたＤＮＡワクチンの治療効力を高める
マウスおよびヒトのメラノーマに高発現するメラノサイト分化抗原であるＴＲＰ２をコードしたＤＮＡを用いた既に確立されたワクチン接種モデルが用いられた。従来の研究によれば、ＴＲＰ２をコードしたネイキッドＤＮＡの接種による治療効力は最低限のものである。２種類の実験手法、つまり、皮下治療モデルおよび転移治療モデルを利用して、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物およびｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ／アジュバント組成物の有効性を検査した。
【０１１８】
転移治療モデルでは、ＰＢＳ生理食塩水コントロール、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ、およびｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ／ポリＩ：Ｃ毎に、３×１０４のＢ１６メラノーマ細胞を５匹のマウスに静脈内注射した。ＰＢＳ生理食塩水、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ／ポリＩ：Ｃを用いて、腫瘍注射の３日目から３日置いてマウスにワクチンを皮下接種した（３回のワクチン接種）。腫瘍注射後、全てのマウスを殺し、それらの肺を摘出して重さを量った。図５Ａに示す通り、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡを注射したマウスの肺の重さの平均が、ＰＢＳ生理食塩水を注射したマウスの肺の重さよりも軽いことが分かる。注目すべきことに、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ／アジュバントを注射したマウスの肺の重さの平均はｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡまたはＰＢＳ生理食塩水を注射したマウスの肺の重さよりも極めて軽いことが図５Ａから分かる。
【０１１９】
皮下治療モデルでは、ＰＢＳ生理食塩水コントロール、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ、およびｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡ／ポリＩ：Ｃ毎に、１０５のＢ１６メラノーマ細胞を５匹のマウスに皮下注射した。生理食塩水、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２／アジュバント（ここで、アジュバントはポリＩ：Ｃ）を用いて、腫瘍細胞の注射後５日目から３日置いて３回、マウスにワクチンを皮下接種した。処置後、週に３回、腫瘍の進行を観察した。図５Ｂは、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子組成物の腫瘍サイズに対する効果を示す。図５Ｂによれば、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物は生理食塩水コントロールと比較して腫瘍の成長を阻害していることが示されている；また、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ／アジュバント組成物はアジュバント無しのｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物よりも、腫瘍の成長をかなり阻害していることが示されている。
【０１２０】
これらをまとめると、図５は、治療用ワクチン接種に関連して、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物へのアジュバントの添加が、転移モデルおよび皮下モデルの両方において、抗腫瘍免疫を高め、腫瘍進行を遅らせることを示唆している。
【０１２１】
それぞれの刊行物または特許出願が明確に個々に参照によって援用されるように、本明細書において引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は参照によってここに援用される。上述の発明は、明確な理解の為に図面および実施例を用いて幾分詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を超えない限り、変更および修正を加えてもよいことは本発明の技術に照らして当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１（Ａ）−（Ｆ）は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを用いて、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子と共に、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子を伴わずに、ワクチン接種をした後のルシフェラーゼ活性の生物発光検出を示す。ルシフェラーゼの遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡは、上記のように（つまり、ネイキッドｐＤＮＡの皮下注射；ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＤＮＡの皮下注射；もしくは、ネイキッドＤＮＡの筋肉内注射によって）送達される。ルシフェラーゼ活性は、指示された時間間隔をおいたルシフェリンの腹腔内（ｉ．ｐ）注射後、検出される。生物発光は、ＩＶＩＳシステムを用いてイメージ化される。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子は、皮下注射後１日目、７日目、および１４日目に、ＤＮＡを効果的に放出する。
【図３】図３は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ＤＮＡ組成物を用いたＤＮＡを送達することによって、コードされた抗原が、プロフェッショナル抗原提示細胞により流入領域リンパ節に取り込まれ、輸送される図である。６匹のネズミの足裏に、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子のみ（ｎ＝３）、またはＧＦＰをコードしたプラスミドＤＮＡ１００μｇと混合したｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子（ｎ＝３）が注入された。注射１日後、膝窩リンパ節が除去され、細胞懸濁液が、ＰＥと結合したＭＨＣクラスＩＩに対するモノクローナル抗体を用いて染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって解析された。ヒストグラムは、ＧＦＰシグナルを用いた場合のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞のパーセンテージを示している。各ヒストグラムは、個々のマウスの結果を示している。
【図４】図４は、ｈｇｐ１００ＤＮＡワクチン接種に対するドナーＰｍｅｌ細胞の増殖を示す。ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐｈｇｐ１００ワクチン接種は、ＣＤ８＋特異反応を誘導する。ネズミは、１０６のＰｍｅｌ脾細胞（Ｔｈｙ１．１＋）の養子免疫伝達の２４時間後に、指示されたように、皮下にワクチンを接種された。血中Ｐｍｅｌ細胞の濃度は、フローサイトメトリーによって決定された。ドナー細胞の頻度は、すべてのＣＤ８＋Ｔ細胞（ｎ＝３）のパーセンテージの平均±ＳＤＥＶとして示される。
【図５】図５は、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子を伴ったＤＮＡおよびポリＩ：Ｃの共送達は、抗腫瘍性免疫および自己腫瘍抗原をコードしたＤＮＡワクチンの治療効力を高める。（Ａ）ネズミ（ｎ＝５）は、静脈（ｉ．ｖ．）注射により、３×１０４のＢ１６メラノーマ細胞を導入された。ワクチン接種は、Ｂ１６腫瘍細胞注射後３日目に開始され、３日おきに３回行われた（つまり、生理食塩水コントロール、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２／ポリＩ：Ｃが接種された）。続いて、動物を殺し、肺を切除して重さを量った。（Ｂ）ネズミ（ｎ＝５）は、皮下（ｓ．ｃ．）注射により、１０５のＢ１６メラノーマ細胞を導入された。ワクチン接種は、Ｂ１６腫瘍細胞注射後５日目に開始され、３日おきに３回行われた（つまり、生理食塩水コントロール、ｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２、またはｐ−ＧｌｃＮＡｃナノ粒子／ｐＴＲＰ２／ポリＩ：Ｃが接種された）。この処置に続いて、腫瘍の進行が、１週間に３回の頻度でモニターされた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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