(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質の活性がＬ−グルタミン又はＬ−グルタミン酸を生産する親株に比べて向上したエシェリヒア属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミンを生成、蓄積せしめ、該培地中からＬ−グルタミンを採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミンの製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性があるアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質
【請求項２】
微生物が以下の［１］〜［２］のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換された微生物、又は該ＤＮＡの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が親株に比べて増加した微生物である、請求項１記載のＬ−グルタミンの製造法。
［１］請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の効率的な生産のために用いる微生物、および該微生物を培地に培養することを特徴とするＬ−アミノ酸の効率的な製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵法によるＬ−アミノ酸、特にＬ−グルタミンの製造法としてはコリネ型細菌を用いる方法が多く知られている。このようなL-グルタミンの製造法としては、アザセリン耐性を付与したコリネ型細菌を用いる方法（特許文献1）、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性を付与したコリネ型細菌を用いる方法（特許文献２）などがあげられる。
またグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌を用いるL-グルタミンの製造法としては、アデニリル化によりグルタミンシンテターゼの制御を行なうグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性が低下したコリネ型細菌を用いる方法(非特許文献１、特許文献３)、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼによりアデニリル化を受けるグルタミンシンテターゼORF中の４０５番目のアミノ酸残基が置換されたコリネ型細菌を用いる方法(非特許文献１、特許文献４)およびＰIIタンパク質の活性が低下したコリネ型細菌を用いる方法(非特許文献２、特許文献３)などが知られている。【０００３】
エシェリヒア・コリを用いたL-グルタミンの製造法としてはアデニリル化能を欠失したグルタミンシンテターゼを有するエシェリヒア・コリを用いる方法が報告されているのみである（特許文献４）。
エシェリヒア・コリにおいてyeiG遺伝子にコードされるYeiGはセリンエステラーゼモチーフを持ち、カルボキシルエステラーゼ活性を有することが報告されている（非特許文献３）。また、ホルミルグルタチオンに対して高い加水分解活性を有することから、グルタチオン依存型のホルムアルデヒド解毒経路で働くことが示唆されている。【０００４】
エシェリヒア・コリのfrmB(yaiM)遺伝子にコードされるホルミルグルタチオンヒドロラーゼの発現は培地中にホルムアルデヒドが存在することで誘導される（非特許文献３）。一方でYeiGは培地中にホルムアルデヒドが存在していなくとも構成的に発現しているため、未知の機能を有している可能性が考えられた。
YeiGを高発現した微生物を用いたL-グルタミンの製造法は知られておらず、YeiGがアミノ酸合成に関わっているか否か、またYeiGの高発現がアミノ酸合成に対しどのような影響を与えるかについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭55-148094号公報
【特許文献２】特開平3-232497号公報
【特許文献３】特開2002-300887号公報
【特許文献４】特開2003-164297号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】FEMS Microbiol. Lett., 201, 91-98(2001)
【非特許文献２】FEMS Microbiol. Lett., 173, 303-310(1999)
【非特許文献３】Jour. Biol. Chem., 281, 12514-14522(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、エシェリヒア属に属する微生物を用いて効率的なＬ−アミノ酸の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（１）〜（４）に関する。
（１）以下の［１］〜[３]のいずれかに記載の蛋白質の活性が親株に比べて向上した微生物を培地に培養し、該培地中にＬ-アミノ酸を生成、蓄積せしめ、該培地中からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ-アミノ酸の製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、YeiG活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性があるアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質
（２）微生物が以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のDNAで形質転換された微生物、又は該DNAの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が親株に比べて増加した微生物である、（１）記載のＬ‐アミノ酸の製造法。
［１］請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
［２］配列番号１で表される塩基配列を有するDNA
［３］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNA
（３）  微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である（１）または（２）記載のＬ‐アミノ酸の製造法。
（４）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミンである、（１）〜（３）のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、微生物を用いて効率的なＬ−アミノ酸の製造法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明の製造法で用いる微生物
（１）YeiG活性が親株に比べて向上した微生物
本明細書においてYeiG活性とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が有する活性をいい、本明細書においてYeiG活性を有する蛋白質とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と、実質的に同等の活性を有する蛋白質をいう。
【００１１】
YeiG活性が親株に比べて向上した微生物とは、（ａ）親株の染色体DNA上にあるYeiGをコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株より該蛋白質の比活性が向上した微生物、およびｉｉ）親株よりYeiGの生産量が向上した微生物、ならびに（ｂ）親株をYeiGをコードするDNAで形質転換して得られる微生物、である。なお、本明細書中における親株とは、野生株でも、変異株であってもよく、改変または形質転換の対象である元株である。該親株としては例えば微生物がEscherichia coli である場合、E. coli K-12株、B株、B/r株の野生株、またはその変異株をあげることができ、該変異株としてはE. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。
【００１２】
YeiG活性を有する蛋白質としては、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、
［１］配列番号２表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性があるアミノ酸配列を有し、かつYeiG活性を有する蛋白質、をあげることができる。
【００１３】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１４】
欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００１５】
アミノ酸残基の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列のN末端側およびC末端側の１０アミノ酸残基をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００１６】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、YeiG活性を有する蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつYeiG活性を有する蛋白質をあげることができる。
【００１７】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）。
【００１８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、YeiG活性を有する蛋白質であることは、例えば活性を確認したい蛋白質をコードするDNAで親株を形質転換し、得られた形質転換体のホルミルグルタチオン加水分解活性をJour. Biol. Chem. 281, 14514(2006)に記載の方法により測定し、親株のホルミルグルタチオン加水分解活性を比較することにより確認することができる。
【００１９】
上記（ａ）のｉ）の親株よりYeiG活性を有する蛋白質の比活性が向上した微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において１アミノ酸以上、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、さらに好ましくは１〜３アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株のYeiG活性を有する蛋白質と比較して、ホルミルグルタチオン加水分解活性が向上した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。
【００２０】
上記（ａ）のｉｉ）の親株よりYeiG活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物としては、親株の染色体DNA上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株のYeiG活性を有する蛋白質の生産量と比較して、該蛋白質の生産量が向上している微生物をあげることができる。
【００２１】
上記（ｂ）の親株をYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換して得られる微生物としては、
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA、
［５］配列番号１で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するDNA、または
［６］配列番号１で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNA、を用いて親株を形質転換して得られる微生物をあげることがでる。
【００２２】
該微生物としては、外来のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAをi)染色体DNA上に有する微生物、およびii)染色体外に有する微生物をあげることができる。すなわち、i)の微生物は、親株がYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを保有していない場合は、新たに導入された該DNAを１つまたは２つ以上、染色体DNA上に有する微生物であり、親株がYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを元来保有する場合には、新たに導入された該DNAを含む２つ以上のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを染色体DNA上に有する微生物である。ii)の微生物は、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAをプラスミドDNA上に有する微生物である。
【００２３】
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるDNAである。プローブとして用いられるDNAとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のDNAをあげることができる。
【００２４】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
【００２５】
上記のストリンジェントな条件とは、DNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００２６】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列からなるDNAと少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
２．本発明で用いられる微生物の調製
（１）YeiG活性が親株に比べて向上した微生物の調製
YeiG活性が親株に比べて向上した微生物のうち、比活性が親株のYeiG活性を有する蛋白質より高い微生物は、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAをin vitroにおける変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、該変異DNAを親株の染色体DNA上に存在する変異導入前のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAと公知の方法［Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2000, 6640 (2000)］を用いて置換することにより該変異DNAを発現する改変体を作成し、上記した方法により親株と改変体のYeiG活性、すなわちホルミルグルタチオン加水分解活性を比較することにより取得することができる。
【００２７】
また、YeiG活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、該蛋白質の生産量が親株の生産量より向上している微生物は、親株が有するYeiG蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するDNAをin vitroにおける変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、該変異DNAを親株の染色体DNA上に存在する変異導入前のYeiG活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域と公知の方法［Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2000, 6640 (2000)］を用いて置換することにより変異型の転写調節領域またはプロモーター領域を有する改変体を作成し、RT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションなどにより、親株と改変体のYeiG活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量を比較する方法、またはSDS-PAGEなどにより親株と改変体のYeiG活性を有する蛋白質の生産量を比較する方法により確認することができる。
【００２８】
また、親株のYeiG活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりYeiG活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、E. coliで機能するtrpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。
【００２９】
以下に、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの取得法、および親株を該DNAで形質転換して得られる微生物の調製法について詳細に説明する。
（ａ）YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの取得
YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAは、例えば上記１（１）のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくはE. coliの染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、微生物、好ましくはE. coliの染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
【００３０】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して上記１（１）のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法によりYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを取得することもできる。
【００３１】
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 DNAアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
【００３２】
上記のベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、Escherichia属に属する微生物などをあげることができる。Escherichia属に属する微生物としては、例えば、E. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coliDH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coliW1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coliNo.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coliMP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coliME8415等をあげることができる。
【００３３】
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
【００３４】
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA、および配列番号１で表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。
（ｂ）YeiG活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターで形質転換された微生物の取得
上記（ａ）の方法で得られるYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、YeiG活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００３５】
該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、YeiG活性を有する蛋白質の活性が宿主細胞、すなわち親株より向上した形質転換体を得ることができる。
【００３６】
宿主細胞としては、微生物、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらに好ましくはEscherichia属に属する微生物、最も好ましくはE. coliを用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３７】
E. coli等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３８】
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００３９】
プロモーターとしては、E. coli等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、E. coliやファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４０】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４１】
このような組換え体DNAとしては、例えばプラスミドpTyeiGをあげることができる。  
（ｃ）YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAが染色体DNAに組み込まれた微生物の取得
上記（ａ）の方法で得られるYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを染色体DNAの任意の位置に組み込むことにより、YeiG活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。
【００４２】
YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを微生物の染色体DNAの任意の位置に組み込む方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができ、宿主、すなわち親株としてE. coliを用いる場合にはProc. Natl. Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)に記載の方法をあげることができる。
上記の方法に従って調製される親株よりもYeiG活性が向上した微生物の具体例としてはYeiG活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターであるpTyeiGを有する大腸菌JP/pTyeiGをあげることができる。
３．本発明のＬ-アミノ酸の製造法
本発明の微生物の培養は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える天然培地または合成培地培を用いて培養することができる。
【００４３】
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、キシロース、アラビノースこれらを含有する糖蜜、セルロース系バイオマスの糖化液、グリセロール、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００４４】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００４５】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００４６】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４７】
上記方法で取得することができる本発明の微生物を培地に培養し、該培地中にＬ-アミノ酸を生成、蓄積せしめ、該培地中からＬ-アミノ酸を採取することによりＬ−アミノ酸を製造することができる。
培地中に生成、蓄積したＬ−アミノ酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００４８】
以下、本発明の実施例を示すが本願発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
yeiG遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法でyeiG遺伝子発現プラスミドを造成した。
エシェリヒア・コリ JM101株をLB培地[10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l イーストエキス（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム]に植菌し30℃で一晩培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体DNAを単離精製した。【００５０】
yeiG遺伝子増幅用のプライマーDNAとして配列番号3および4で表される塩基配列からなる合成DNAを用いてPCRを行った。
PCRは、鋳型として0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5 unitsのPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ製)、5μLのPyrobestDNAポリメラーゼ用×10緩衝液(タカラバイオ製)、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）を含む反応液50μLを調製し、96℃で15秒間、55℃で30秒間、72℃で１分間の工程を30回繰り返すことにより行った。【００５１】
約0.8kbのDNA断片が増幅したことを確認し、該DNA断片を常法に従って精製した。
該DNA断片およびtrpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30［エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製］をそれぞれHindIII、SacIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（GENECLEAN II kit、BIO 101 社製）を用いて、制限酵素消化DNA断片をそれぞれ回収した。【００５２】
上記で得られたyeiG遺伝子を含む0.8kb断片、pTrs30の制限酵素消化断片をDNA ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
得られた連結体DNAを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（タカラバイオ製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にyeiG遺伝子が連結された発現ベクターであるpTyeiGが取得されていることを確認した。
【実施例２】
【００５３】
L-グルタミン、L-グルタミン酸生産能を有する微生物の作製
L-グルタミン、L-グルタミン酸生産能を持つエシェリヒア・コリを作製するため、L-プロリン合成経路上のγ-グルタミン酸キナーゼをコードするproBとγ-グルタミルリン酸レダクターゼをコードするproAを欠損した株、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコードするglnEを欠損した株、グルタミン酸シンテースをコードするgltB、gltDを欠損した株を作製した。
（１）proBA遺伝子欠損エシェリヒア・コリJM101の作製
(a)遺伝子欠損用マーカー遺伝子の構築
相同組換えを用いたエシェリヒア・コリの遺伝子欠損および遺伝子置換のためのマーカー遺伝子として用いるcat遺伝子およびsacB遺伝子を以下の方法で単離した。【００５４】
配列番号5および6で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットとして用い、pHSG396を鋳型としてPCRを行い、cat遺伝子を含むDNA断片を得た。PCRはPyrobestDNA  polymerase（タカラバイオ社製）を用いて、添付説明書に従って行なった。また配列番号7および8で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットとして用い、常法により調製したバチルス・ズブチリス168株の野生株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、sacB遺伝子を含むDNA断片を得た。【００５５】
cat遺伝子を含むDNA断片、sacB遺伝子を含むDNA断片をそれぞれ精製した後、SalIで切断した。フェノール／クロロホルム処理、およびエタノール沈殿を行い、両者を等モルの比率で混合してDNA ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液をフェノール／クロロホルム処理、およびエタノール沈殿にて精製したものを鋳型とし、配列番号6および8で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットとして用いてPCRを行い、得られた増幅DNAをQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製し、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含むDNA断片(cat-sacB断片)を取得した。【００５６】
(b)proBA遺伝子欠損株の作成
配列番号9および10で表わされる塩基配列からなる合成DNA、並びに配列番号12および14で表わされる塩基配列からなる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリJM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。【００５７】
Qiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してcatB-sacB断片が挿入されたproBA周辺領域を含む約4.6kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。【００５８】
また配列番号9および11で表わされる塩基配列からなる合成DNA、ならびに配列番号13および14で表わされる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、JM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を得た。
Qiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してproBA遺伝子が欠失したproBA周辺領域を含む約2kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。【００５９】
次にエシェリヒア・コリJM101株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することでpKD46を保持するエシェリヒア・コリJM101株（以下、エシェリヒア・コリ JM101/pKD46と称す）を選択した。
10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリ JM101/pKD46に、電気パルス法により上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたproBA遺伝子周辺領域を含むDNA断片を導入した。【００６０】
得られた形質転換体を。25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（LB+クロラムフェニコール+アンピシリン）に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを10%シュクロース、25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(LB+シュクロース+クロラムフェニコール+アンピシリン)およびLB+クロラムフェニコール+アンピシリンにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。【００６１】
選択した株について配列番号7および9で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、proBA遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入されていることを確認した。proBA遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入された株を上記と同様に培養してコンピテントセルを調製し、上記で得られたproBA遺伝子が欠失したproBA周辺領域を含むDNA断片を電気パルス法により導入した。【００６２】
得られた形質転換体をLB+シュクロース寒天培地で培養し、シュクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はcat-sacB断片は含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示すため、選択したコロニーをLB+クロラムフェニコール寒天培地およびLB+シュクロース寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。【００６３】
選択した株の中からアンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落した株を選択し、その株について配列番号9および14で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、proBA遺伝子が欠損していることを確認した。
上記のようにしてproBA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリJP株と命名した。【００６４】
(2)glnE遺伝子欠損エシェリヒア・コリの作製
配列番号15および16で表わされる塩基配列からなる合成DNA、並びに配列番号18および20で表わされる塩基配列からなる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリJM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。【００６５】
Qiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してcatB-sacB断片が挿入されたglnE周辺領域を含む約4.6kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。【００６６】
また配列番号15および17で表わされる塩基配列からなる合成DNA、ならびに配列番号19および20で表わされる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、JM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を得た。
Qiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してglnE遺伝子が欠失したglnE周辺領域を含む約2kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。【００６７】
次にエシェリヒア・コリJP株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することでpKD46を保持するエシェリヒア・コリJP株（以下、エシェリヒア・コリ JP/pKD46と称す）を選択した。10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリ JP/pKD46に、電気パルス法により上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたglnE遺伝子周辺領域を含むDNA断片を導入した。【００６８】
得られた形質転換体を。25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（LB+クロラムフェニコール+アンピシリン）に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを10%シュクロース、25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(LB+シュクロース+クロラムフェニコール+アンピシリン)およびLB+クロラムフェニコール+アンピシリンにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。【００６９】
選択した株について配列番号7および15で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、glnE遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入されていることを確認した。glnE遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入された株を上記と同様に培養してコンピテントセルを調製し、上記で得られたglnE遺伝子が欠失したglnE周辺領域を含むDNA断片を電気パルス法により導入した。【００７０】
得られた形質転換体をLB+シュクロース寒天培地で培養し、シュクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はcat-sacB断片は含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示すため、選択したコロニーをLB+クロラムフェニコール寒天培地およびLB+シュクロース寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。【００７１】
選択した株の中からアンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落した株を選択し、その株について配列番号15および20で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、glnE遺伝子が欠損していることを確認した。
上記のようにしてglnE遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリJPE株と命名した。【００７２】
(3)gltB、gltD遺伝子欠損エシェリヒア・コリの作製
配列番号21および22で表わされる塩基配列からなる合成DNA、並びに配列番号24および26で表わされる塩基配列からなる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリJM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。【００７３】
Qiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してcatB-sacB断片が挿入されたgltB、gltD周辺領域を含む約4.6kbのDNA断片が増幅されことを確認した。【００７４】
また配列番号21および23で表わされる塩基配列からなる合成DNA、ならびに配列番号25および26で表わされる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、JM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を得た。
Qiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してgltB、gltD遺伝子が欠失したgltB、gltD周辺領域を含む約2kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。【００７５】
次に10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリ JP/pKD46に、電気パルス法により上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたgltB、gltD遺伝子周辺領域を含むDNA断片を導入した。
得られた形質転換体を、25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（LB+クロラムフェニコール+アンピシリン）に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを10%シュクロース、25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(LB+シュクロース+クロラムフェニコール+アンピシリン)およびLB+クロラムフェニコール+アンピシリンにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。【００７６】
選択した株について配列番号7および21で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、gltB、gltD遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入されていることを確認した。gltB、gltD遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入された株を上記と同様に培養してコンピテントセルを調製し、上記で得られたgltB、gltD遺伝子が欠失したgltB、gltD周辺領域を含むDNA断片を電気パルス法により導入した。【００７７】
得られた形質転換体をLB+シュクロース寒天培地で培養し、シュクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はcat-sacB断片は含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示すため、選択したコロニーをLB+クロラムフェニコール寒天培地およびLB+シュクロース寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。【００７８】
選択した株の中からアンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落した株を選択し、その株について配列番号21および26で表わされる塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、gltB、gltD遺伝子が欠損していることを確認した。
上記のようにしてgltB、gltD遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリJPBD株と命名した。
【実施例３】
【００７９】
L-グルタミンの生産
実施例２で得られたJP株、JPE株およびJPBD株に実施例１で得られたpTyeiGおよびpTrs30を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれJP/pTyeiG、JP/pTrs30、JPE/pTyeiG、JPE/pTrs30、JPBD/pTyeiG、JPBD/pTrs30と命名した。
上記で得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、30℃で17時間培養した。該培養液を100μg/mlのアンピシリンを含む培地［16g/L リン酸水素二カリウム、14g/L リン酸二水素カリウム、5g/L 硫酸アンモニウム、1g/L クエン酸（無水）、5g/L カザミノ酸（ディフコ社製）、10g/L グルコース、10mg/L ビタミンB1、25mg/L 硫酸マグネシウム・７水和物、50mg/L 硫酸鉄・７水和物、100mg/L L-プロリン、pH7.2に10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に加圧滅菌後添加した］が8ml入っている試験管に１％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。該培養上清中の培養生成物の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。結果を表１に示す。グリセロール培地、キシロース培地、アラビノース培地ではグルコースの代わりにこれらを炭素源として用いた。これらの培地を用いた場合の培養生成物の蓄積量を表２〜表４に示す。【００８０】
【表１】
0005860287.tif 000002
【００８１】
【表２】
0005860287.tif 000003
【００８２】
【表３】
0005860287.tif 000004
【００８３】
【表４】
0005860287.tif 000005
【００８４】
表１〜４に示した通り、グルコース、グリセロール、キシロース、アラビノースのいずれを原料とした場合でもエシェリヒア・コリJP株にプラスミドpTrs30を導入した株ではL-グルタミンの蓄積が全く認められなかったのに対し、プラスミドpTyeiGの導入によりyeiG遺伝子の発現を強化したJP/pTyeiG株では、いずれの培地においてもL-グルタミンの蓄積が認められた。また、その他の宿主を用いた場合においてもpTyeiGの導入によりpTrs30を導入した場合と比べ顕著なL-グルタミン蓄積量の増加が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明により、ＹｅｉＧ活性が親株に比べて向上した微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積せしめ、該培地中からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列番号３−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人口配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
0005860287000001.app