(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、およびｎ−オクタン酸とｎ−デカン酸との混合物からなる群より選択される脂肪酸を有効成分として含み、蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現を抑制する、経口投与用の筋蛋白質の分解抑制剤。
【請求項２】
ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、およびｎ−オクタン酸とｎ−デカン酸との混合物からなる群より選択される脂肪酸とグリセリンとのエステルを有効成分として含み、蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現を抑制する、経口投与用の筋蛋白質の分解抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素数６〜１２のアシル基を一つ含有する脂肪酸系化合物を有効成分とする、生体内の蛋白質の分解抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体における蛋白質は、筋肉、臓器、皮膚、毛、爪等の構成成分の中心であり、常に、蛋白質合成と分解というサイクルが繰り返されており、適切に栄養摂取している場合、その合成と分解のバランスは保たれている。ところが、長期間の激しい運動、長期間の運動制限、過度のダイエット、高齢による食事量の低下等が原因で、蛋白質の分解が亢進すると、特に筋肉の萎縮や減少から筋力の低下が起こり、生体に様々な障害を生じる。【０００３】
例えば、筋肉減少症（サルコペニア）は、加齢に伴い筋肉の強度・筋力が低下し、筋肉量が損失して日常生活に悪影響をおよぼす。廃用性筋萎縮は、長期のベッドレストやギプス固定による運動制限や、宇宙滞在による無重力環境への暴露による筋肉の活動量の減少により、比較的短時間で筋萎縮が進行する（非特許文献１、２）。【０００４】
蛋白質・エネルギー低栄養状態（ＰＥＭ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍａｌｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）はマラスムス型とカシオコール型に分けられるが、マラスムス型ＰＥＭは骨格筋や脂肪組織の減少が著明で体重の減少が著しく、カシオコール型ＰＥＭは蛋白合成の抑制と異化亢進によって、内臓蛋白の減少が著しい（非特許文献３）。【０００５】
いずれの場合も、栄養治療や運動療法によって、十分回復する可能性を残した可逆性の変化であることが知られている。しかしながら、消化吸収機能が低下している高齢の方や、運動機能が低下している方に対しては、栄養治療や運動療法が適切に行なえない場合もあるため、生体内の蛋白質分解の亢進を抑制する薬剤が所望されている。そして、そのような薬剤として、食品成分を使用したものは僅かしかなく、例えばリコピンを有効成分としたものが開発されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４０３８０８８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｉｒ  ＫＳ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，８１（５），９５３−９６３，２００５
【非特許文献２】後藤勝正、大平充宣，宇宙航空環境医学，４４，４９−５８，２００７
【非特許文献３】大荷満生，静脈経腸栄養，２２，４３９−４４５，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、安全性が高く、継続投与しても副作用の懸念が少ない、生体内の蛋白質の分解抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、炭素数６〜１２の脂肪酸（以下、中鎖脂肪酸という。）が有効成分として作用し、生体内の蛋白質の分解に関与する酵素（以下、蛋白質分解因子（proteolysis factor）という）の発現を抑制することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
中鎖脂肪酸は、ヒトが食習慣を有している油脂成分、すなわち食用油脂や乳製品等の食品に含有される油脂成分で、通常はグリセリンとエステル結合したアシルグリセロールの形で摂取されている。食事により摂取された中鎖脂肪酸のアシルグリセロールは、消化管内で速やかに分解吸収され中鎖脂肪酸となり、肝臓で早くエネルギー化されることが知られている。中鎖脂肪酸は、このような特性から、医療において消化吸収機能が低下している方のエネルギー補給や、手術後の体力回復等の用途として、安全性の高いエネルギー源として使用されているが、生体内の蛋白質の分解抑制に効果があるという報告はされていなかった。【００１１】
一つの側面において、本発明は、以下の生体内の蛋白質の分解抑制剤を提供する。【００１２】
（１）炭素数６〜１２のアシル基（ＲＣＯ−）を一つ含有する脂肪酸系化合物を有効成分として含む、生体内の蛋白質の分解抑制剤。【００１３】
（２）前記脂肪酸系化合物が、
炭素数６〜１２の脂肪酸、または
生体内で炭素数６〜１２の脂肪酸に変換される脂肪酸前駆体
である（１）に記載の生体内の蛋白質の分解抑制剤。【００１４】
（３）前記脂肪酸が、炭素数８の脂肪酸、炭素数１０の脂肪酸、または炭素数８の脂肪酸と炭素数１０の脂肪酸との混合物である（２）に記載の生体内の蛋白質の分解抑制剤。【００１５】
（４）前記脂肪酸系化合物が、脂肪酸とグリセリンとのエステルである（１）〜（３）の何れか１に記載の生体内の蛋白質の分解抑制剤。【００１６】
（５）前記蛋白質が筋蛋白質である（１）〜（４）のいずれか１に記載の生体内の蛋白質の分解抑制剤。【００１７】
別の側面において、本発明は、炭素数６〜１２のアシル基を一つ含有する脂肪酸系化合物および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、生体内の蛋白質の分解亢進に起因する疾病を予防または治療するための薬学的組成物を提供する。【００１８】
更に別の側面において、本発明は、炭素数６〜１２のアシル基を一つ含有する脂肪酸系化合物を、効果的な量で、それを必要とする被検体に投与することを含む、生体内の蛋白質の分解亢進に起因する疾病を予防または治療するための方法を提供する。【００１９】
更に別の側面において、本発明は、生体内の蛋白質の分解亢進に起因する疾病を予防または治療するための医薬品を調製するための、炭素数６〜１２のアシル基を一つ含有する脂肪酸系化合物の使用を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の蛋白質の分解抑制剤は、生体内の蛋白質の分解亢進に起因する疾病の予防又は治療に用いることができ、特に、サルコペニア、廃用性筋萎縮等の筋蛋白質の分解亢進に起因する疾病の予防又は治療に用いることができる。ここで、本発明における予防とは、例えば、発症の抑制又は遅延等を意味し、治療とは、例えば、進行の遅延、症状の緩和、軽減、改善、治癒等を意味する。また、本発明の分解抑制剤は、ヒトが食習慣を有している油脂成分を有効成分として含むので、安全性が高く、副作用の懸念が少ないため、安心して摂取することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の具体的な実施形態について、詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定させるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００２２】
本発明の生体内の蛋白質の分解抑制剤は、有効成分である炭素数６〜１２の脂肪酸（以下、中鎖脂肪酸という。）そのものが、蛋白質の分解が亢進する組織中で作用する。したがって、生体内の蛋白質の分解抑制剤は、作用発現時に中鎖脂肪酸の形態で存在すればよく、投与時の形態については、炭素数６〜１２のアシル基を一つ含有する脂肪酸系化合物であれば特に限定されず、中鎖脂肪酸の形態であっても、生体内で中鎖脂肪酸に変換される脂肪酸前駆体（たとえば塩またはエステル）の形態であってもよいが、これまでの食経験による安全性の観点から、アシルグリセロールの形態が好ましい。
【００２３】
すなわち、本発明において、脂肪酸系化合物は、脂肪酸、脂肪酸の塩、および脂肪酸エステルを含む。
【００２４】
本発明において中鎖脂肪酸とは、例えばパーム核油やヤシ油を加水分解した後、精製することにより、得ることができる。また、市販品や試薬を使用することもできる。中鎖脂肪酸は、１種類の中鎖脂肪酸から構成されていてもよいし、複数種類の中鎖脂肪酸から構成されていてもよい。中鎖脂肪酸は、炭素数が偶数の飽和脂肪酸が好ましく；炭素数８の脂肪酸、炭素数１０の脂肪酸、または炭素数８の脂肪酸と炭素数１０の脂肪酸との混合物がより好ましく；炭素数が８の飽和脂肪酸が最も好ましい。
【００２５】
上記アシルグリセロールとは、中鎖脂肪酸とグリセリンとがエステル結合したものである。そして、エステル化度の違いにより、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、及びトリアシルグリセロールの形態が存在する。また、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールは、同じ種類の中鎖脂肪酸から構成されるアシルグリセロールであっても、異なる種類の中鎖脂肪酸から構成されるアシルグリセロールであってもよい。異なる種類の中鎖脂肪酸から構成されるアシルグリセロールの場合、各々の中鎖脂肪酸のグリセリンへの結合位置は、特に限定されない。
【００２６】
これらのアシルグリセロールは、１種又は２種以上を使用することができるが、中鎖脂肪酸の摂取効率及び食経験の観点から、トリアシルグリセロールの形態が好ましい。
【００２７】
中鎖脂肪酸で構成されるアシルグリセロールの製造方法は特に限定されないが、例えば、パーム核油やヤシ油由来の中鎖脂肪酸とグリセリンとをエステル化反応して、アシルグリセロールを得ることができる。エステル化反応は、例えば、加圧下で無触媒且つ無溶剤にて反応させる方法、ナトリウムメトキシド等の合成触媒を用いて反応させる方法、及び触媒としてリパーゼを用いて反応させる方法等が挙げられる。また、一般にＭＣＴ（Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃｈａｉｎ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）と称せられる、ヤシ油分解脂肪酸等の炭素数が８〜１０の飽和中鎖脂肪酸から構成されるトリグリセリドが好適に使用できる。
【００２８】
なお、本発明の生体内の蛋白質の分解抑制剤における、中鎖脂肪酸の含量を確認する方法としては、例えば、生体内の蛋白質の分解抑制剤中の中鎖脂肪酸をメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィーにより分析する方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の生体内の蛋白質の分解抑制剤は、生体内の任意の組織に存在する蛋白質の分解を抑制するために使用可能であり、とりわけ筋肉に存在する蛋白質である筋蛋白質の分解を抑制するために使用可能である。本発明の生体内の蛋白質の分解抑制剤は、生体内の蛋白質の分解亢進に起因する疾病に対して、予防又は治療効果を発揮する。生体内の蛋白質の分解亢進に起因する疾病としては、たとえば、サルコペニア（筋肉減少症）、廃用性筋萎縮、蛋白質・エネルギー低栄養状態（ＰＥＭ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍａｌｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、横紋筋融解症、筋ジストロフィー、及び腎不全による尿素窒素とクレアチニンの増加が挙げられる。本発明の中鎖脂肪酸は、天然に広く存在するものであり、食用となる天然物にも含まれていることから、その安全性は非常に高い。したがって、本発明の蛋白質の分解抑制剤は、医薬用途として安全に用いることができる。
【００３０】
本発明の生体内の蛋白質の分解抑制剤を医薬用途として用いる場合、投与方法は経口投与又は非経口投与のいずれかの方法を任意に選択できる。経口投与のための形態としては、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等の製剤が挙げられる。非経口投与のための形態としては、注射剤、輸液剤等の製剤が挙げられる。さらに該製剤は、有効成分である中鎖脂肪酸またはその前駆体と、薬理上及び製剤上許容しうる添加物とを含む組成物の形態にすることが好ましい。該添加物は、通常、製剤分野において賦形剤として常用され、且つ本発明の有効成分と反応しない物質が用いられる。
【００３１】
本発明の生体内の蛋白質の分解抑制剤は、既存薬と組み合わせて用いることにより、該既存薬の用量を下げて、これらが有する副作用を低減することができる。他の薬との組み合わせは、配合剤のように同一の医薬組成物中に含むものであってもよいし、別々の医薬組成物中に含むものであってもよい。
【００３２】
本発明の蛋白質の分解抑制剤の投与量は、患者の症状、予防又は治療、年齢、体重、投与方法、投与期間等の諸条件に応じて、適宜設定可能である。本発明の蛋白質の分解抑制剤の投与量は、中鎖脂肪酸の量で、たとえば、０．０１〜１ｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。
【００３３】
本発明の蛋白質の分解抑制剤が投与される被検体は、任意の動物であり、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら制限を受けるものではない。【００３５】
本実施例では、通常の食事において油脂の形態で摂取されている、中鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸について、生体内の蛋白質の分解抑制効果を確認した。【００３６】
生体内の蛋白質の分解については、主にユビキチン−プロテアソーム系、カルパイン−カルパスタチン系、リソソーム系の３つの経路がある。本実施例では、このうち、ユビキチン−プロテアソーム系、及びカルパイン−カルパスタチン系について着目した。【００３７】
また、ユビキチン−プロテアソーム系は、ユビキチンリガーゼによって、ユビキチンで修飾された蛋白質が、プロテアソームに分解される系であり、分解の律速段階は、ユビキチンリガーゼによるユビキチン修飾の段階である。一方、カルパイン−カルパスタチン系は、カルパインによる各種分解酵素の活性化と、カルパスタチンによるカルパインの作用調節の系である。【００３８】
よって、ユビキチン−プロテアソーム系ではユビキチン及びユビキチンリガーゼの発現量、カルパイン−カルパスタチン系ではカルパインの発現量が抑制できれば、生体内の蛋白質の分解が抑制できると考えられる。【００３９】
また、ユビキチン−プロテアソーム系による骨格筋の蛋白質の分解は、例えば、敗血症のラットの骨格筋におけるユビキチンｍＲＮＡの増加に伴い、ラットの骨格筋の蛋白質分解が亢進することが報告されており（参考文献：  Ｔｉａｏ  Ｇ，Ｆａｇａｎ  ＪＭ，Ｓａｍｕｅｌｓ  Ｎ，Ｊａｍｅｓ  ＪＨ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  Ｍ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＪＥ，Ｈａｓｓｅｌｇｒｅｎ  ＰＯ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，９４（６），２２５５−２２６４，１９９４）、ユビキチンｍＲＮＡの発現量は筋肉中のタンパク質分解に対する有用な指標となる。【００４０】
そこで、本実施例では、ユビキチン（Ｕｂｂ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｂ）及びユビキチンリガーゼの２種のｍＲＮＡ（ＭＡＦｂｘ：ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ  Ｆ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  及び  ＭｕＲＦ：ｍｕｓｃｌｅ  ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）並びにカルパインの２種のｍＲＮＡ（Ｃａｐｎ１：ｃａｌｐａｉｎ  １  及び  Ｃａｐｎ２：ｃａｌｐａｉｎ  ２）の発現量を測定することで、蛋白質の分解抑制の効果を確認した。【００４１】
〔試験例１〕蛋白質の分解抑制効果の検討（１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの蛋白質の分解抑制効果の検討として、各種脂肪酸を添加した培養細胞における、ｍＲＮＡの発現量を測定した。【００４２】
（培養細胞）
培養細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓより供与された、ラット骨格筋由来の筋芽細胞株Ｌ６を用いた。【００４３】
（通常培地）
通常培地は、ＤＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、１０％ウシ胎児血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加し、さらに抗生剤であるペニシリンを１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍＬを添加したものを用いた。【００４４】
（分化誘導培地）
分化誘導培地は、ＤＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、２％ウシ胎児血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加し、ペニシリンを１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍＬを添加したものを用いた。【００４５】
（試験細胞の調製）
試験細胞は、９．２ｃｍ２ペトリデッシュ（Ｔｅｃｈｎｏ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）に通常培地１０ｍＬをいれ、Ｌ６細胞を播種し、５％二酸化炭素、９５％空気、３７℃の条件下でＬ６細胞を培養し、細胞がコンフルエント（培養皿全体に密になった状態）となった後、分化誘導培地で、５％二酸化炭素、９５％空気、３７℃の条件下、２日間培養し、分化誘導した筋管細胞を用いた。【００４６】
（蛋白質の分解抑制剤、比較品）
蛋白質の分解抑制剤は、炭素数８の飽和脂肪酸であるｎ−オクタン酸（実施例１，商品名：ｎ−Ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、及び炭素数１０の飽和脂肪酸であるｎ−デカン酸（実施例２，商品名：ｎ−Ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い、比較品には、炭素数１８の飽和脂肪酸であるステアリン酸（比較例１，和光純薬工業（株）製）を用いた。【００４７】
蛋白質の分解抑制剤及び比較品は、試験細胞の培養液に添加し易くするために、それぞれ５０ｍＭのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）溶液とした。【００４８】
（測定サンプルの調製）
測定サンプルは、試験細胞の培養液に、分解抑制剤及び比較品が５０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、さらに、５％二酸化炭素、９５％空気、３７℃の条件下、１日間培養したものを用いた。また、ブランクは、ＤＭＳＯのみを添加し、同条件で培養した。測定サンプルは、分解抑制剤、比較品及びブランクにつき、各５サンプル調製した。【００４９】
（ｍＲＮＡの定量方法）
測定サンプル中のｍＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。抽出した各ＲＮＡ５００ｎｇ相当を、トランスクリプター  ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてｃＤＮＡへ逆転写した。【００５０】
次に、得られたｃＤＮＡ１μＬを以下に示したプライマーペアを用い、２０μＬの系でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を利用した、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で定量を行なった（反応プロトコール〔熱変性  ９４℃で３０秒，アニーリング  ５５℃で３０秒，伸長反応  ７２℃で１分（３０サイクル）〕）。ＰＣＲ反応試薬にはＰｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ社製）を用いた。【００５１】
また、測定サンプル毎に、定量値のばらつきを補正するためのコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ２９（ＲＰＳ２９）ｍＲＮＡの定量も行った。そして、各測定サンプルの定量値をＲＰＳ２９のｍＲＮＡの定量値で除して、相対値を算出した。【００５２】
（プライマー）
（ユビキチンｍＲＮＡ）
Ｕｂｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＮＭ１３８８９５）
Ｕｂｂ−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１）
Ｕｂｂ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＧＴＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧ−３’（配列番号２）
（ユビキチンリガーゼｍＲＮＡ）
ＭＡＦｂｘ（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ０５９６２８）
ＭＡＦｂｘ−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＣＧ−３’（配列番号３）
ＭＡＦｂｘ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号４）
ＭｕＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ０５９６２７）
ＭｕＲＦ−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号５）
ＭｕＲＦ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧ−３’（配列番号６）
（カルパインｍＲＮＡ）
Ｃａｐｎ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＮＭ０１９１５２）
Ｃａｐｎ１−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＡＴＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号７）
Ｃａｐｎ１−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＧＡＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧ−３’（配列番号８）
Ｃａｐｎ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＮＭ０１７１１６）
Ｃａｐｎ２−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＧＡＧＣＴＡＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号９）
Ｃａｐｎ２−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＡＣＣＧ−３’（配列番号１０）
（コントロールｍＲＮＡ）
ＲＰＳ２９（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＮＭ０１２８７６）
ＲＰＳ２９−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＴ−３’（配列番号１１）
ＲＰＳ２９−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＧＡＣＧＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１２）
【表１】
0005860803.tif 000002
【表２】
0005860803.tif 000003
【００５３】
表１及び表２の結果より、蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現の程度は、Ｕｂｂ、ＭＡＦｂｘ、ＭｕＲＦ、Ｃａｐｎ１、及びＣａｐｎ２の全てにおいて、実施例１（炭素数８のｎ−オクタン酸添加）及び実施例２（炭素数１０のｎ−デカン酸添加）が、比較例１（炭素数１８のステアリン酸添加）よりも低値であり、特に、実施例１が顕著に低値であった。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔより、ｎ−オクタン酸は、蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現を有意に抑制できることが示された。ｎ−デカン酸は、Ｕｂｂに対して有意な発現抑制効果を有し、他の蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現も増大させることなく低下させたため、ここでの実験結果は、ｎ−デカン酸も、細胞において蛋白質の分解を抑制できることを示していた。また、比較例１はブランクと同程度であった。【００５４】
〔試験例２〕蛋白質の分解抑制効果の検討（２）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの蛋白質の分解抑制効果の検討として、ラットに各種脂肪酸をトリアシルグリセロールの形態で摂取させた後、採取した筋肉について、ｍＲＮＡの発現量を測定した。また、血漿中の中鎖脂肪酸の含量も測定した。【００５５】
（実験動物）
実験動物は、３週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ＳＬＣ社より購入）を用いた。【００５６】
（試験飼料）
試験飼料は、ラットの生体内の蛋白質合成と分解のバランスを壊し、蛋白質の分解を亢進させるために、蛋白源であるミルクカゼインを、「通常食（ＡＩＮ−９３Ｇ）」の２５％に減らした組成に設計した。すなわち、表３に示す、「低蛋白植物油食」及び「低蛋白ＭＣＴ食」の組成を設計した。【００５７】
試験飼料の調製に関しては、まず油脂（ＭＣＴ及び大豆油）以外の各成分の粉末を混合し、最後に油脂を混合して均一化して、それぞれ、「通常食」、「低蛋白植物油食」、及び「低蛋白ＭＣＴ食」とした。なお、「低蛋白ＭＣＴ食」には、必須脂肪酸を補給させるために、大豆油を１質量％配合した。
【表３】
0005860803.tif 000004
【００５８】
大豆油は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びα−リノレン酸を主成分として含む。ＭＣＴ（中鎖脂肪酸トリグリセリド）は、ｎ−オクタン酸（中鎖脂肪酸）、及びｎ−デカン酸（中鎖脂肪酸）とグリセリンとがエステル結合したトリグリセリドである。【００５９】
（飼育方法）
試験は、「低蛋白ＭＣＴ食」を摂食させる「低蛋白ＭＣＴ食摂食群（実施例２）」、「低蛋白植物油食」を摂食させる「低蛋白植物油食摂食群（比較例２）」、及び「通常食」を摂食させる「対照群（対照例１）」の３群（各群９匹）にて行った。【００６０】
飼育方法は、温度２３±１℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクル（８：００〜２０：００照明）の環境下でステンレス製メッシュケージにて個別飼育し、上記ラットを、２日間馴化飼育した後、試験飼料（表３）を摂取させて１５日間飼育した。また、試験飼料は、「低蛋白ＭＣＴ食摂食群（実施例２）」と「低蛋白植物油食摂食群（比較例２）」の摂取量が、対照群（対照例１）の６０質量％となるように制限給餌を行なった。【００６１】
（測定試料の採取方法）
測定試料の採取方法は、ラットを飼育最終日の最後の飼料摂取から３時間後にエーテル麻酔して解剖し、右後肢筋肉を採取した後、心臓より採血を行った。【００６２】
（ｍＲＮＡの定量方法）
ｍＲＮＡの定量方法は、ＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ラット右後肢の筋肉中のｍＲＮＡを抽出し、その他の方法は、試験例１と同様とした。
【表４】
0005860803.tif 000005
【表５】
0005860803.tif 000006
【００６３】
表４及び表５の結果より、蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現程度は、Ｕｂｂ、ＭｕＲＦ、Ｃａｐｎ１において、実施例が、比較例よりも低値であった。ＭＡＦｂｘおよびＣａｐｎ２については、実施例と比較例において、同程度のｍＲＮＡの発現を示したが、Ｕｂｂ、Ｃａｐｎ１については、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔより蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現抑制効果が明らかに証明されたため、ここでの実験結果は、中鎖脂肪酸が、ラットにおいて蛋白質の分解を抑制できることを示していた。【００６４】
また、実施例に加えて比較例の各ｍＲＮＡの発現量も、対照例（無処置）より低値であったが、これはラットが低栄養状態に長期間おかれ、生体内の蛋白質分解が亢進し、基質となる蛋白質の減少に伴い、蛋白質分解酵素も減少したことが原因と考えられた。【００６５】
（血漿中の中鎖脂肪酸含量の測定方法）
血漿中の中鎖脂肪酸含量の測定は、採血した血液を、ヘパリンナトリウム入りの遠沈管に移し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄を血漿として得た。血漿中の中鎖脂肪酸含量は、「基準油脂試験法（１９９６）」に準じて測定した。
【表６】
0005860803.tif 000007
【００６６】
表６の結果より、ラット血漿中の中鎖脂肪酸含量は、実施例２では、ｎ−オクタン酸（Ｃ８：０）が２３．７μｇ／ｍＬ（１６４μＭ）、ｎ−デカン酸（Ｃ１０：０）が４０．３μｇ／ｍＬ（２３４μＭ）であったが、比較例２では中鎖脂肪酸は検出されなかった。このように中鎖脂肪酸のトリアシルグリセロールであるＭＣＴを含む飼料を摂取すると、吸収、代謝された後、中鎖脂肪酸として血液から筋肉に供給され、筋肉中のタンパク質分解を抑制すると考えられた。【００６７】
以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ結果より、中鎖脂肪酸であるｎ−オクタン酸及びｎ−デカン酸は、蛋白質分解因子のｍＲＮＡの発現を抑制することが明らかとなった。このことから、結果的に、ユビキチン−プロテアソーム系、及びカルパイン−カルパスタチン系の蛋白質の分解経路が阻害され、ひいては生体内の蛋白質の分解が抑制されると考えられる。
【配列表】
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