(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、前記酸化鉄粒子の粒径が５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、前記複数の酸化鉄粒子が、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体のうち少なくともいずれか１つの疎水性ポリマーで被覆されて粒子形状をなし、前記疎水性ポリマーで被覆された粒子の表面にリン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルのうち少なくともいずれか１つの両親媒性化合物を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項２】
複数の酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、前記酸化鉄粒子の粒径が５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、前記複数の酸化鉄粒子が、ＰＥＧを結合させたオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体、ＰＥＧを結合させたスチレン−無水マレイン酸共重合体、ＰＥＧを結合させたポリ乳酸、ＰＥＧを結合させた乳酸−グリコール酸共重合体のうち少なくともいずれか１つの両親媒性ポリマーで被覆されていることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項３】
前記ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０から選択された少なくとも１つのポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルであることを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項４】
前記リン脂質がＰＥＧを有するホスファチジル系リン脂質を有することを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項５】
前記酸化鉄粒子の粒径が１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍのうち少なくともいずれかの波長の光を照射する工程と、前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程と、を有することを特徴とする光音響イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光音響イメージング用造影剤、及び、それを用いた光音響イメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する光音響イメージング法が知られている。光音響イメージング法では、検体に光を照射することで検体から発せられる光音響信号の強度と発生位置を測定することにより、検体内部の物質分布の画像を得る方法である。
【０００３】
ここで、リゾビスト（登録商標）（複数の酸化鉄粒子を多糖類のデキストランでコーティングした、ＭＲＩ用の造影剤）に光を照射すると、音響波を発生することが知られている（非特許文献１）。したがって、リゾビスト（登録商標）は光音響イメージング用造影剤として用いることができる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ  Ｔｅｃｈ２００９；  ５４：ｐｐ．８３−８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、リゾビスト（登録商標）を構成する酸化鉄粒子は粒径が小さく、発明者らの測定によると５ｎｍであった。酸化鉄粒子の粒径が小さい場合、発生する音響波は小さく、測定される光音響信号は小さいと考えられる。そこで本発明は、発生する音響波が大きく、測定される光音響信号が大きい光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤において、前記酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、強い光音響信号を発する酸化鉄粒子を用いることから、従来技術に比べて優れた光音響信号を発する造影剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図２】本発明の実施形態に係る光音響イメージング用造影剤の構造を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係る光音響イメージング用造影剤を製造する工程の一例を示す図である。
【図４】光音響信号強度の波形である。
【図５】酸化鉄粒子の粒径と、モル吸光係数と光音響信号との関係を示す図である。
【図６】光音響イメージング用造影剤１（ＮＰ１）の評価結果である。
【図７】光音響イメージング用造影剤２（ＮＰ２）の評価結果である。
【図８】光音響イメージング用造影剤２（ＮＰ２）の安定性を示す図である。
【図９】（ａ）光音響イメージング用造影剤３（ＮＰ３）のｃｒｙｏ−ＴＥＭ像である。（ｂ）光音響イメージング用造影剤３（ＮＰ３）のｃｒｙｏ−ＦＩＢ／ＳＥＭ像である。
【図１０】光音響イメージング用造影剤６（ＮＰ６）のｃｒｙｏ−ＴＥＭ像である。
【図１１】光音響イメージング用造影剤７（ＮＰ７）のＴＥＭ像である。
【図１２】光音響イメージング用造影剤１２（ＮＰ１２）の安定性を示す図である。
【図１３】光音響イメージング用造影剤１２（ＮＰ１２）の癌集積性を示す図である。
【図１４】光音響イメージング用造影剤の粒径と光音響信号強度の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１０】
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤（以下、造影剤と略すことがある）は、酸化鉄粒子を有し、酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることを特徴としている。酸化鉄粒子の粒径が１５ｎｍ以上の場合、１５ｎｍ未満の場合に比べて、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の値、及び、鉄原子１モルあたりから測定される光音響信号の値が大きい。そのため、光音響イメージング方法において、本実施形態に係る造影剤を用いることで、大きな光音響信号を得ることができる。また、酸化鉄粒子の粒径が２０ｎｍ以上であることがより好ましく、５０ｎｍ以上であることがさらに好ましい。また、酸化鉄粒子の粒径が１００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
【００１１】
本実施形態に係る造影剤の粒径は、１５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。造影剤の粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの造影剤を集積させることができる。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射すると、腫瘍部位から発せられる光音響信号は正常部位から発せられる光音響信号よりも大きくなる。したがって、造影剤の粒径を１０００ｎｍ以下とすることにより、腫瘍部位を特異的に検出することができる。また、造影剤の粒径は５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。造影剤の粒径が２００ｎｍ以下であると、造影剤が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
【００１２】
本明細書において造影剤の粒径とは、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）法によって測定される流体力学的直径を意味する。粒径は、上記装置を用いて１００回の積算を５回行い、算出された５つのデータの平均をとる。
【００１３】
本実施形態に係る造影剤は、酸化鉄粒子を１個のみ有していてもよく、２個以上有していてもよい。造影剤の有する酸化鉄粒子の粒径が５００ｎｍである場合、造影剤の有する酸化鉄粒子は３個以下であることが好ましい。なお、酸化鉄粒子の粒径が大きい場合、例えば５０ｎｍの場合、造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数が多くなるほど、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の値、及び、鉄原子１モルあたりから測定される光音響信号の値は大きい。一方で、酸化鉄粒子の粒径が５ｎｍの場合、造影剤に含まれる酸化鉄粒子の数が多くなっても、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数、及び測定される光音響信号の値はあまり変わらない。
【００１４】
本実施形態に係る造影剤の有する酸化鉄粒子は１次粒子でもよいし、２次粒子でもよい。
【００１５】
本実施形態において、酸化鉄粒子は、その１次粒子の表面、あるいは、２次粒子の表面が表面修飾剤で被覆されていてもよい。表面修飾剤としては、脂肪酸、両親媒性化合物などが挙げられる。また、酸化鉄粒子あるいは、脂肪酸で被覆された酸化鉄粒子を含有する疎水性ポリマーに両親媒性化合物を結合させてもよい。両親媒性化合物としては、リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、両親媒性ポリマーなどが挙げられる。なお、本実施形態において、表面修飾剤は１種類を用いてもよいし、複数種類用いてもよい。
【００１６】
（光音響イメージング用造影剤の一例）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤（以下、造影剤と略すことがある）の一例の概略図を図１（ａ）に示す。本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤１は、図１（ａ）のように、酸化鉄粒子２と、必要に応じて設けられる両親媒性化合物３と、からなる。両親媒性化合物３は、光音響イメージング用造影剤１の表面に存在する。
【００１７】
酸化鉄粒子２に光を照射すると、酸化鉄粒子２は、音響波を発生し、それを光音響信号として検出する。また、両親媒性化合物が光音響イメージング用造影剤１の表面に存在することにより、水や水溶液中で光音響イメージング用造影剤の凝集を抑制することができる。
【００１８】
（酸化鉄粒子）
本発明において、酸化鉄粒子の粒径は１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。
【００１９】
本実施形態における酸化鉄粒子は、特に限定されないが、６００乃至１３００ｎｍの近赤外波長領域に吸収をもつ。酸化鉄粒子として具体的には、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの混合物などが挙げられる。特に好ましくは、マグネタイトである。マグネタイトは、マグヘマイトより近赤外波長領域におけるモル吸光係数が高いことが知られており、したがって光を照射したときに発生する音響波も大きくなると考えられる。
【００２０】
また、本実施形態における酸化鉄粒子は、単結晶、多結晶、非晶質（アモルファス）のいずれの結晶状態でもよい。
【００２１】
本実施形態における酸化鉄粒子は市販のものを用いてもよいし、以下の方法で得たものを用いてもよい。例えば、ＦｅＣｌ３とＦｅＣｌ２を水に溶解させて溶解液とし、この溶解液を攪拌しながらアンモニア水を加えて、酸化鉄粒子を得る方法である。
【００２２】
（酸化鉄粒子の粒径）
本実施形態において、酸化鉄粒子の粒径とは、例えば透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）を用いて得られた画像から測定した酸化鉄の一次粒子の粒径である。酸化鉄粒子の形状が真球状でない場合は、酸化鉄粒子の像の短軸と長軸の長さを測定し、それらの値の平均値を直径とした。
【００２３】
（脂肪酸）
本実施形態において脂肪酸とは、オレイン酸などが挙げられる。オレイン酸で被覆された酸化鉄粒子は次のようにして得られる。まず乾燥させた酸化鉄粒子に有機溶媒を加え酸化鉄粒子の分散溶液とし、この分散溶液にオレイン酸を加え、酸化鉄粒子の表面にオレイン酸を被覆させる。その後、酸化鉄粒子の表面に存在しないオレイン酸を有機溶媒で洗浄し、オレイン酸で被覆された酸化鉄粒子を得ることができる。なお、両親媒性化合物を結合、又は吸着させることができる、あるいは後述する第一液体に含まれる有機溶媒に酸化鉄粒子を分散させることができる化合物であれば、オレイン酸に限定されない。
【００２４】
（両親媒性化合物）
本実施形態において両親媒性化合物は、リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、両親媒性ポリマーから選択された少なくとも１つであることが好ましい。
【００２５】
（リン脂質）
本実施形態においてリン脂質とは、リン酸を有する脂質であればどのようなものでもよい。本実施形態におけるリン脂質としては、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと略すことがある）を有するホスファチジル系リン脂質を有することが好ましい。本実施形態に係る酸化鉄粒子がＰＥＧを有するリン脂質を有する場合、ＰＥＧに水分子が集まることにより、造影剤が嵩高くなり、造影剤がタンパク質に吸着することを抑制する効果があると考えられる。また、ＰＥＧを有すると、マクロファージに貪食されにくい。また、ＰＥＧを有すると、水、あるいは、水溶液中で凝集しにくい。
【００２６】
また、リン脂質に、後述する抗体などの捕捉分子を結合する場合、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基、マレイミド基を有するリン脂質に、これら官能基を介して、捕捉分子を結合させることが好ましい。
【００２７】
本実施形態に係るリン脂質として例えば、化学式１で示されるＮ−（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、化学式２で示される３−（Ｎ−Ｇｌｕｔａｒｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ，ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、化学式３で示される３−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ，ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、化学式４で示されるＮ−［（３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、化学式５で示されるＮ−（Ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＮ）、化学式６で示される１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）等のリン脂質を挙げることができる。
【００２８】
【化１】
0005875242.tif 000002
【００２９】
【化２】
0005875242.tif 000003
【００３０】
【化３】
0005875242.tif 000004
【００３１】
【化４】
0005875242.tif 000005
【００３２】
【化５】
0005875242.tif 000006
【００３３】
【化６】
0005875242.tif 000007
【００３４】
（ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル）
本実施形態におけるポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルとしては特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０から選択された少なくとも１つのポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルであることが好ましい。
【００３５】
（両親媒性ポリマー）
本実施形態における両親媒性ポリマーとして、ＰＥＧを結合させたオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体、ＰＥＧを結合させたスチレン−無水マレイン酸共重合体、ＰＥＧを結合させたポリ乳酸、ＰＥＧを結合させた乳酸−グリコール酸共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン、ポリビニルアルコール等を挙げることができる。ここでＰＥＧの重量平均分子量は１０００乃至１０００００であり、好ましくは２０００乃至２００００のものを用いることができる。また、ＰＥＧの末端には、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基、又はマレイミド基のいずれかの官能基を有し、官能基がアミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基、又はマレイミド基の場合、捕捉分子を結合させることができる。
【００３６】
（疎水性ポリマー）
本実施形態における疎水性ポリマーは、疎水性で、複数の酸化鉄粒子を含有させるバインダーとしての機能をもつポリマーであればどのようなものでもよい。ポリマーが疎水性であることにより、含有する酸化鉄粒子、あるいは、脂肪酸で被覆された酸化鉄粒子が流出しにくい。
【００３７】
本実施形態における疎水性ポリマーとしては、炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するモノマーからなる、ホモポリマー、あるいは、２種類以上の前記モノマーからなるコポリマー、ビニル基を有するポリマーなどが挙げられる。ビニル基を有するポリマーはホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。本実施形態における酸化鉄粒子はこれらのうち少なくともいずれか１つで被覆されていることが好ましい。本実施形態に係る造影剤を生体内に投与する場合、長期にわたって造影剤が生体内に残らないように、疎水性ポリマーとしては、モノマーとして炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するポリマーを用いることが好ましい。これは、モノマーとして炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するポリマーは、加水分解によって切断させるエステル結合を有するからである。エステル結合を切断されたモノマーは代謝させやすいため、生体内に残りにくい。
【００３８】
炭素数６以下のヒドロキシカルボン酸を有するポリマーとして、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体などが挙げられ、ビニル基を有するポリマーとして、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルなどが挙げられる。上記疎水性のポリマーの重量平均分子量は２０００乃至１００００００であることが好ましく、１００００乃至６０００００であることがさらに好ましい。
【００３９】
（光音響イメージング用造影剤の他の例）
上記の例以外の光音響イメージング用造影剤について説明する。
図１（ｂ）は、リン脂質４のみで酸化鉄粒子２を被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００４０】
図１（ｃ）は、両親媒性ポリマー６のみで酸化鉄粒子２を被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００４１】
図１（ｄ）は、両親媒性ポリマー６のみで酸化鉄粒子２を被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図であり、酸化鉄粒子２は光音響イメージング用造影剤１の表面に局在化している。
【００４２】
図１（ｅ）は、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２をポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５のみで被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００４３】
図１（ｆ）は、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２をリン脂質４、及びポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５の両化合物で被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００４４】
図１（ｇ）は、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２をリン脂質４、及びポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５の両化合物で被覆した光音響イメージング用造影剤１であり、酸化鉄粒子２は光音響イメージング用造影剤１の表面に局在化した概略図である。
【００４５】
図２（ａ）は、疎水性ポリマー７に含有された酸化鉄粒子２を両親媒性ポリマー６のみで被覆した光音響イメージング用造影剤１の概略図である。
【００４６】
リン脂質４をもつ光音響イメージング用造影剤１には、少なくとも一部のリン脂質４に、腫瘍などの、標的組織、細胞、物質などに結合する捕捉分子９を結合させることができる。図２（ｂ）、図２（ｅ）、及び図２（ｆ）は、リン脂質４を有する光音響イメージング用造影剤１に、捕捉分子９を結合させた光音響イメージング用造影剤１０の概略図である。このようにして得られた光音響イメージング用造影剤１０は、標的組織、細胞、物質なども特異的に結合することができる。
【００４７】
また、両親媒性ポリマー６をもつ光音響イメージング用造影剤１には、少なくとも一部の両親媒性ポリマー６に捕捉分子９を結合させることができる。図２（ｃ）、図２（ｄ）、及び図２（ｇ）は、両親媒性ポリマー６をもつ光音響イメージング用造影剤に、捕捉分子９を結合させた光音響イメージング用造影剤１０の概略図である。このようにして得られた光音響イメージング用造影剤１０は、標的組織、細胞、及び物質などに特異的に結合させることができる。
【００４８】
また、以上の、本実施系形態に係る光音響イメージング用造影剤１及び１０は、目的とする用途に対して、光音響イメージング用造影剤の粒径を制御することが可能である。
【００４９】
（光音響イメージング用造影剤の製造方法）
本実施形態における光音響イメージング用造影剤の製造方法について説明する。
【００５０】
光音響イメージング用造影剤を得る方法として、下記のドライアップ法や、ナノエマルジョン法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
ドライアップ法で光音響イメージング用造影剤を製造する工程の一例を図３（ａ）に示している。具体的には、以下の（１）から（２）の工程を経て、光音響イメージング用造影剤の水分散液を得ることができる。
（１）有機溶媒に酸化鉄粒子２と、リン脂質４又は両親媒性ポリマー６を加えた第一液体１１から、有機溶媒を留去させる工程。
（２）（１）で得られた残渣に水１４を加えた後、超音波などを照射することにより、乳化させる工程。
【００５２】
ナノエマルジョン法で光音響イメージング用造影剤を製造する工程の一例を図３（ｂ）に示している。具体的には、以下の（１）から（３）の工程を経て、光音響イメージング用造影剤の水分散液を得ることができる。
（１）有機溶媒に酸化鉄粒子２と疎水性ポリマー７を加えた第一液体１１を、水に、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル５、リン脂質４又は両親媒性ポリマー６を加えた第二液体１２に加えて混合液を得る工程。
（２）前記混合液に超音波を照射して乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン１３を得る工程。
（３）前記エマルジョン１３の分散質から有機溶媒を留去する工程。
【００５３】
（第一液体）
ドライアップ法における第一液体とは、有機溶媒に、酸化鉄粒子、及びリン脂質又は両親媒性ポリマーを分散、及び溶解させた液のことである。ナノエマルジョン法における第一液体とは、有機溶媒に、酸化鉄粒子、及び疎水性ポリマーを分散、及び溶解させた液のことである。
【００５４】
第一液体に含まれる有機溶媒は、リン脂質、あるいは疎水性ポリマーを溶解し、かつ酸化鉄粒子が分散できる有機溶媒であればいかなる溶媒も適用可能であるが、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【００５５】
このような有機溶媒の具体例として、次の溶媒が挙げられる。ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル、ブタノール等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等。これらを単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。但し、第一液体に含まれる有機溶媒は上記に限定されるものではない。
【００５６】
また、第一液体中のリン脂質、両親媒性ポリマー、あるいは疎水性ポリマーの濃度は、これらが溶解する範囲であれば特に限定されないが、好ましい濃度として例えば、リン脂質については０．１乃至１００ｍｇ／ｍｌ、両親媒性ポリマーについては１乃至１００ｍｇ／ｍｌ、疎水性ポリマー７については０．５乃至１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００５７】
また、ドライアップ法における第一液体に含まれるリン脂質と酸化鉄粒子との重量比は、好ましくは、１０：１乃至１：１０の範囲である。ドライアップ法における第一液体に含まれる両親媒性ポリマーと酸化鉄粒子との重量比は、好ましくは、１０：１乃至１：１００の範囲である。ナノエマルジョン法における第一液体に含まれる疎水性ポリマーと酸化鉄粒子との重量比は、好ましくは、１０００：１乃至１：９の範囲である。
【００５８】
（第二液体）
ナノエマルジョン法における第二液体とは、第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることを目的として、水にリン脂質とポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルのうち、各々単独の化合物、あるいは各々複数の化合物、あるいは両親媒性ポリマーをあらかじめ加えた水溶液である。但し、第一液体と水を混合した分散液にリン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、あるいは両親媒性ポリマーを含ませることができれば、上記の方法に限定されるものではない。
【００５９】
また、ナノエマルジョン法における第二液体に含まれるリン脂質とポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルの濃度は、第一液体との混合比にも依るが、好ましい濃度として例えば、リン脂質の好ましい濃度として、０．００１ｍｇ／ｍｌ乃至１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルについては０．１ｍｇ／ｍｌ乃至１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。両親媒性ポリマーについては１ｍｇ／ｍｌ乃至１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００６０】
（乳化）
ドライアップ法では、酸化鉄粒子と、リン脂質又は両親媒性ポリマーの混合溶液を乾燥させた後に、水を加えた溶液を乳化させて、ミセルを得る。ナノエマルジョン法では、第一液体と第二液体との混合液を乳化させて、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンを得る。
【００６１】
エマルジョン及びミセルとは、本発明の目的を達成可能な範囲において如何なる物性のエマルジョン及びミセルも含めるものであるが、好ましくは１ピークの粒径分布のエマルジョン及びミセルである。
【００６２】
このようなエマルジョンやミセルは従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。従来公知の方法とは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等がある。これらの方法は、単独で用いることも、あるいは複数を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョン、及びミセルは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００６３】
特に、ナノエマルジョン法におけるエマルジョンは、第一液体と第二液体との混合液から調製される水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンである。ここで、第一液体と第二液体の混合とは、第一液体と第二液体を空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることであり、必ずしも互いに混和することを要さない。
【００６４】
上記の混合液における第一液体と第二液体との割合は、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョン１２を形成することができれば特に限定はないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、１：２乃至１：１０００となる範囲で混合することが好ましい。
【００６５】
（留去）
留去とは、第一液体に含まれる有機溶媒を除去する操作である。
【００６６】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００６７】
（捕捉分子）
本発明において、捕捉分子とは、癌などの標的部位に特異的に結合する物質、前記標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質など、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択される物質である。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。本実施形態において、捕捉分子としては、一本鎖抗体であることが好ましい。
【００６８】
本実施形態において、捕捉分子は、リン脂質又は両親媒性ポリマーをもつ光音響イメージング用造影剤に化学的に結合し、本発明に係る光音響イメージング用造影剤を構成する。このような光音響イメージング用造影剤を用いることで、標的部位の特異的な検出や、標的物質の動態、局在、薬効、及び代謝等の追跡を行うことができる。
【００６９】
（捕捉分子の固定化）
リン脂質をもつ光音響イメージング用造影剤に捕捉分子を結合させることにより、本実施形態の光音響イメージング用造影剤を得ることができる。
【００７０】
本実施形態において、リン脂質や両親媒性ポリマーをもつ光音響イメージング用造影剤に捕捉分子を結合させる方法として、リン脂質や両親媒性ポリマーが持つ官能基と捕捉分子８の官能基を反応させて化学結合する方法を使用することができる。
【００７１】
即ち、リン脂質や両親媒性ポリマーの官能基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である場合、捕捉分子のアミノ基と反応させて、光音響イメージング用造影剤に捕捉分子を結合させることができる。捕捉分子の固定化後、リン脂質や両親媒性ポリマーの未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基に対して、グリシン、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコール等と反応させてスクシンイミド基を失活することが好ましい。
【００７２】
あるいは、リン脂質や両親媒性ポリマーの官能基がマレイミド基である場合、捕捉分子のチオール基と反応させて、光音響イメージング用造影剤に捕捉分子を結合させることができる。捕捉分子の固定化後、リン脂質や両親媒性ポリマーの未反応のマレイミド基に対して、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコール等と反応させてマレイミド基を失活することが好ましい。
【００７３】
あるいは、リン脂質や両親媒性ポリマーの官能基がアミノ基である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子８のアミノ基と反応させ、光音響イメージング用造影剤に捕捉分子を結合させることができる。捕捉分子を結合させた後、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコール等を反応させてアルデヒド基の活性をブロックすることが好ましい。
【００７４】
あるいは、アミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子を結合させても良い。
【００７５】
（分散媒）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、さらに、分散媒を有していてもよい。上記の分散媒は、本実施形態に係る酸化鉄粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る酸化鉄粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る酸化鉄粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００７６】
（光音響イメージング用造影剤の造影）
前記の光音響イメージング用造影剤及びは、生理食塩水や注射用蒸留水等の溶媒中に分散して使用することができる。また、必要に応じて薬理上許容できる添加物を適宜添加しても良い。これら光音響イメージング用造影剤は、静脈注射あるいは皮下注射によって体内に導入することができる。
【００７７】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下の各工程を有する。
（ｉ）上記の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｉｉ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程
ここで、音響波を検出する装置としては特に限定されないが、超音波探触子などを用いることができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する光音響イメージング用造影剤が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００７９】
なお、以下の実施例における光音響イメージング用造影剤の粒径は、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて測定した値である。上記装置を用いて１００回の積算を５回行い、Ｍａｒｑｕａｒｄｔ解析により重量平均値を、あるいはＣｕｍｕｌａｎｔ解析によりキュムラント値をそれぞれ算出した。算出された５つのデータの平均を造影剤の粒径とした。また、以下の実施例における酸化鉄粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）を用いて得られた画像から測定した酸化鉄の一次粒子の粒径である。
【００８０】
（実施例１）
（酸化鉄粒子の粒径と、モル吸光係数と光音響信号との関係）
粒径の異なる酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤について、鉄原子１ｍｏｌあたり、及び粒子数１モルあたりのモル吸光係数と光音響信号を測定した。
【００８１】
粒径の異なる酸化鉄粒子を有する光音響イメージング用造影剤として、ポリマーで被覆された酸化鉄粒子であって、その一次粒子の粒径がそれぞれ異なる酸化鉄粒子を用いた。具体的には、一次粒子の粒径が、５ｎｍ（鉄原子濃度１．４５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度１０ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−０５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、１０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度４．３ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−１０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、１５ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度１．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−１５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、２０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度０．５５ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−２０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及び５０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度０．０３４ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及び１００ｎｍ（後に記載の実施例１０の粒子）である酸化鉄粒子を用いた。
【００８２】
これらの酸化鉄粒子は水に分散し、酸化鉄粒子が１粒ずつの粒子化した状態で構成されている。分光光度計（Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ４０、Ｐｅｒｋｉｎ  ｅｌｅｍｅｒ社製）を用いて、７１０、７５０、８００、及び８５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定容器は、ポリスチレン製キュベットで、幅１ｃｍ、光路長０．１ｃｍを用いた。この容器に、酸化鉄粒子の分散液２００μｌを入れて、吸光度を測定した。
【００８３】
鉄原子１モルあたりのモル吸光係数と酸化鉄粒子数１モルあたりのモル吸光係数は、吸光度と鉄原子濃度および粒子濃度から計算した。
【００８４】
光音響信号の計測は、パルスレーザー光を水に分散した光音響イメージング用造影剤に照射し、圧電素子を用いて造影剤からの光音響信号を検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで波形を取得して行った。具体的な条件は以下の通りである。パルスレーザー光源として、チタンサファイアレーザ（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７１０、７５０、８００、及び８５０ｎｍ、エネルギー密度は２０乃至５０ｍＪ／ｃｍ２（選択した波長に依存する）、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返周波数は１０Ｈｚとした。水に分散した光音響イメージング用造影剤をおさめる測定容器には、上記ポリスチレン製キュベットを用いた。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサ（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ社製）を用いた。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ  ５６８２、オリンパス社製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス社製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザ光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号取得を行った。図４は、典型的な光音響信号の波形である。図中の矢印で示すように、波形から光音響信号強度（Ｖ）を求めた。得られた光音響信号強度を照射パルスレーザーのエネルギー（Ｊ）で割った値を規格化光音響信号（ＶＪ−１）と定義し、以下、評価手段として用いた。
【００８５】
鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号および酸化鉄粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は、それぞれ鉄原子濃度および粒子濃度から計算した。
【００８６】
図５は、粒径の異なる酸化鉄粒子のモル吸光係数および光音響信号である。図５（ａ）は７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子中に含まれる鉄原子１モルあたりのモル吸光係数を、図５（ｂ）は７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子数１モルあたりのモル吸光係数を示している。酸化鉄粒子の粒径が大きくなると、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数が上昇する傾向にあった。他の波長においても、鉄原子１モルあたりのモル吸光係数の上昇が認められた。この効果により、酸化鉄粒子数１モルあたりのモル吸光係数は、酸化鉄粒子の粒径が大きくなるにつれて著しく上昇した。
【００８７】
図５（ｃ）は７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子中に含まれる鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号を、図５（ｄ）は７１０ｎｍにおける酸化鉄粒子数１モルあたりの規格化光音響信号を示している。酸化鉄粒子の粒径が大きくなると、鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号が上昇した。他の波長においても、同様に、鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号が上昇した。この効果により酸化鉄粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は、酸化鉄粒子の粒径が大きくなるにつれて著しく上昇した。
【００８８】
酸化鉄粒子の粒径が大きくなるほど、光の吸収量が多くなり、それにともなって、酸化鉄粒子から出る光音響信号が強くなった。特に、１５ｎｍ以上の酸化鉄粒子において、光の吸収量の増加と、光音響信号の増加が認められた。
【００８９】
（実施例２）
（光音響イメージング用造影剤１（ＮＰ１）の作製）
ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。
【００９０】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍ酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ、Ｍ．Ｗ．２００００、乳酸：グリコール酸＝１：１、ＰＬＧＡ５０２０、和光純薬工業社製）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。
【００９１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、６０ｍｇ、キシダ化学社製）を溶解した水溶液（１２ｍｌ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。
【００９２】
その後、超音波分散機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ＵＤ−２００、Ｔｏｍｙ製）で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００９３】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤１の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤１をＮＰ１と略す場合がある。
【００９４】
（実施例３）
（光音響イメージング用造影剤２（ＮＰ２）の作製）
リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。
【００９５】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍ酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。
【００９６】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ）と化学式４で示される末端がマレイミド基のリン脂質（７．３ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ、日油社製）を溶解した水溶液（１２ｍｌ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。
【００９７】
その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００９８】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤２の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤２をＮＰ２と略す場合がある。
【００９９】
（ＮＰ１及びＮＰ２の物性評価）
ＮＰ１及びＮＰ２は水に分散させ、上記動的光散乱解析装置を用いて、粒径を測定した。その結果を図６（ａ）及び図７（ａ）に示す。ＮＰ１及びＮＰ２の粒径（重量換算）は、各々２０５及び１７６ｎｍであった。
【０１００】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ８００、日立社製）を用いて、ＮＰ１及びＮＰ２を観察した。図６（ｂ）及び図７（ｂ）は光音響イメージング用造影剤のＴＥＭ写真である。酸化鉄粒子を複数個有する光音響イメージング用造影剤が観察できた。
【０１０１】
発光分光装置（ＩＣＰ、ＣＩＲＯＳ  ＣＣＤ、ＳＰＥＣＴＲＯ社製）を用いて、ＮＰ１及びＮＰ２に含まれる酸化鉄粒子量を定量した。光音響イメージング用造影剤を濃硝酸で溶解し、ＩＣＰでＦｅ量を定量し、酸化鉄粒子の質量を計算した。光音響イメージング用造影剤の水分散液を凍結乾燥し、その後に質量を測定して、光音響イメージング用造影剤全体の質量を求めた。酸化鉄粒子の質量と、光音響イメージング用造影剤の質量から、光音響イメージング用造影剤中の酸化鉄粒子の含有率を計算したところ、ＮＰ１及びＮＰ２は各々５８及び６３（ｗｔ）％であった。酸化鉄粒子を高い率で含有する光音響イメージング用造影剤が得られた。
【０１０２】
得られたＮＰ１及びＮＰ２の光吸収性は、光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりのモル吸光係数を求めることで評価した。水に分散したＮＰ１及びＮＰ２の光吸収は、分光光度計を用いて測定した。光音響イメージング用造影剤の粒子濃度は、上記の方法で得られた物性値より計算した。波長７１０、７５０、８００、及び８５０ｎｍにおける光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は表１にまとめた。波長７１０ｎｍにおけるＮＰ１、ＮＰ２、及びリゾビスト（登録商標）のモル吸光係数は、各々２．１×１０１０、９．９×１０９、１．６×１０６  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であった。リゾビスト（登録商標）に比べて、優れた光吸収をもつ光音響イメージング用造影剤が得られた。
【０１０３】
【表１】
0005875242.tif 000008
【０１０４】
表２は、ＮＰ１及びＮＰ２の１粒子あたりの規格化光音響信号である。波長７１０ｎｍにおけるＮＰ１、ＮＰ２、及びリゾビスト（登録商標）の粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は、それぞれ３．５×１０１１、２．０×１０１１、６．０×１０７（ＶＪ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であった。既知の光音響イメージング用造影剤であるリゾビスト（登録商標）に比べて、強い音響信号を発する光音響イメージング用造影剤が得られた。
【０１０５】
【表２】
0005875242.tif 000009
【０１０６】
（ＮＰ２の安定性の評価）
ＮＰ２の安定性を以下の方法で評価した。まず、ＮＰ２を水中、４℃で保存し、一定時間ごとに、ＮＰ２の粒径（キュムラント値）及び光音響信号を測定した。
【０１０７】
図８（ａ）は、ＮＰ２の粒径を経時的に測定した結果である。ＮＰ２の粒径に変化はなく、凝集は認められなかった。図８（ｂ）は、波長７１０ｎｍの光を照射した場合におけるＮＰ２の光音響信号を経時的に測定した結果である。長期に保存しても、ＮＰ２の鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号に変化はなく、優れた保存安定性を示した。
【０１０８】
（ＮＰ２上のリン脂質の定量）
ＮＰ２の表面に導入されたリン脂質の量は、末端のマレイミド基の活性を利用して定量した。ＮＰ２とＬ−システインを混合し、１晩インキュベートすることにより、ＮＰ２上のマレイミド基と、Ｌ−システイン上のチオール基との共有結合反応をさせた。遠心分離でＮＰ２を沈殿させ、上澄みを回収することで、未反応のＬ−システインを回収した。未反応のＬ−システインは、５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）と混合し、４２０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。１粒のＮＰ２上にあるリン脂質の量は、５．６×１０５個／個であった。
【０１０９】
（実施例４）
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５’末端には制限酵素ＮｃｏＩ−を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。
５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１）
なお、５’末端から５つ目のアミノ酸までの配列ＣＣＡＴＧ、及び、３’末端の８つ目のアミノ酸までの配列ＧＣＧＧＣＣＧＣは制限酵素の認識サイトを示す。
【０１１０】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩ−とＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。
【０１１１】
この発現プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１リットルの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す。以後、ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖをｓｃＦｖと略すことがある。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号２）
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖとＮＰ２との結合）
上記で調製したｓｃＦｖを５  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ／１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／  １ｍ  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、ｓｃＦｖのモル量に対して２０倍のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で約２時間、還元処理した。この還元処理したｓｃＦｖを、２５℃で３時間、上記で作製したＮＰ２と反応させた。ＮＰ２の粒子モル量に対して２０００倍のｓｃＦｖを反応に用いた。遠心分離により、ｓｃＦｖを結合させたＮＰ２の沈殿物と、未反応のｓｃＦｖの上澄みを得た。未反応のｓｃＦｖを液体クロマトグラフィーで定量した。１粒のＮＰ２上に結合させたｓｃＦｖは、１．４×１０３個／個であった。
【０１１２】
（実施例５）
（光音響イメージング用造影剤３（ＮＰ３）の作製）
両親媒性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。
【０１１３】
クロロホルム（３ｍｌ）にスチレン−無水マレイン酸共重合体（１２．５ｍｇ、平均分子量：９５００、スチレン：無水マレイン酸＝７５：２５（モル比）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を溶解し、そこへＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（４５ｍｇ、平均分子量：５０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−５０ＥＡ、日油社製）を加えて反応させることによって、両親媒性ポリマー（ＰＥＧを結合させたスチレン−無水マレイン酸共重合体）を得た。
【０１１４】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍ酸化鉄粒子（１４ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及び上記の両親媒性ポリマー（５０ｍｇ）をクロロホルム（３ｍｌ）に加えた後、エバポレーションによってクロロホルムを留去した。
【０１１５】
その後、水（１８ｍｌ）を加えて超音波バスで１分間処理することによって、光音響イメージング用造影剤３の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤３をＮＰ３と略す場合がある。
【０１１６】
ＮＰ３の粒径は２１１ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ３の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．９×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は４．８×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１１７】
ｃｒｙｏ−ＴＥＭを用いてＮＰ３を観察し、その結果を図９（ａ）に示した。図９（ａ）から、ＮＰ３では、複数個の酸化鉄粒子が含有されていることが確認された。
【０１１８】
ｃｒｙｏ−ＦＩＢ／ＳＥＭを用いてＮＰ３を観察し、その結果を図９（ｂ）に示した。図９（ｂ）において、加速電圧が２ｋＶの時、ＮＰ３の粒子表面側に酸化鉄粒子が局在化していることが確認された。更に、加速電圧を５ｋＶ、８ｋＶに上げていくと、２ｋＶで観察された環状に並んだ酸化鉄粒子の奥側（本明細書紙面の裏面方向）に酸化鉄粒子が存在し、ＮＰ３が中空構造を有していることが確認された。
【０１１９】
（実施例６）
（光音響イメージング用造影剤４（ＮＰ４）の作製）
両親媒性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤４は、以下の方法で作製した。
【０１２０】
クロロホルム（３ｍｌ）にオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体（１２．５ｍｇ、平均分子量：４００００、オクタデセン：無水マレイン酸＝５０：５０（モル比）、アルドリッチ社製）を溶解し、そこへＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（９４ｍｇ、平均分子量：１００００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−１００ＥＡ、日油社製）を加えて反応させることによって、両親媒性ポリマー（ＰＥＧ鎖を導入したオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体）を得た。
【０１２１】
酸化鉄粒子（１４ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及び上記の両親媒性ポリマー（１００ｍｇ）をクロロホルム（３ｍｌ）に加えた後、エバポレーションによってクロロホルムを留去した。
【０１２２】
その後、水（１８ｍｌ）を加えて超音波バスで１分間処理することによって、光音響イメージング用造影剤４の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤４をＮＰ４と略す場合がある。
【０１２３】
ＮＰ４の粒径は１６１ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ４の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．０×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は２．０×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１２４】
（実施例７）
（光音響造影剤５（ＮＰ５）の作製）
両親媒性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤５は、実施例６と同様の方法で作製した。
【０１２５】
クロロホルム（３ｍｌ）にオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体（１２．５ｍｇ）を溶解し、そこへＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（４７ｍｇ、平均分子量：５０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−５０ＥＡ、日油社製）を加えて反応させることによって、両親媒性ポリマー（ＰＥＧ鎖を導入したオクタデセン−無水マレイン酸交互共重合体）を得た。
【０１２６】
酸化鉄粒子（１４ｍｇ）、及び上記の両親媒性ポリマー（５０ｍｇ）をクロロホルム（３ｍｌ）に加えた後、エバポレーションによってクロロホルムを留去した。
【０１２７】
その後、水（１８ｍｌ）を加えて超音波バスで１分間処理することによって、光音響イメージング用造影剤５の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤５をＮＰ５と略す場合がある。
【０１２８】
ＮＰ５の粒径は１６３ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ５の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．２×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は２．８×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１２９】
（実施例８）
（光音響イメージング用造影剤６（ＮＰ６）の作製）
リン脂質、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤６は、以下の方法で作製した。
【０１３０】
クロロホルム（３ｍｌ）に化学式５で示される末端がメトキシ基のリン脂質（２０ｍｇ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油社製）を溶解した。
【０１３１】
酸化鉄粒子（１４ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）を上記リン脂質のクロロホルム溶液に加えた後、エバポレーションによってクロロホルムを留去した。
【０１３２】
その後、水（１８ｍｌ）を加えて超音波バスで１分間処理することによって、光音響イメージング用造影剤６の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤６をＮＰ６と略す場合がある。
【０１３３】
ＮＰ６の粒径は１８３ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ６の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は２．５×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は４．４×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１３４】
ｃｒｙｏ−ＴＥＭを用いてＮＰ６を観察し、その結果を図１０に示した。図１０から、ＮＰ６では、複数個の酸化鉄粒子が含有されていることが確認された。
【０１３５】
（実施例９）
（光音響イメージング用造影剤７（ＮＰ７）の作製）
リン脂質、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤７は、実施例８と同様の方法で作製した。
【０１３６】
クロロホルム（３ｍｌ）に化学式５で示される末端がメトキシ基のリン脂質（２０ｍｇ、ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油社製）を溶解した。
【０１３７】
オレイン酸で被覆された酸化鉄粒子（１５ｍｇ、粒径１００ｎｍ、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製の試作品）を上記リン脂質のクロロホルム溶液に加えた後、エバポレーションによってクロロホルムを留去した。
【０１３８】
その後、水（１８ｍｌ）を加えて超音波バスで１分間処理することによって、光音響イメージング用造影剤７の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤７をＮＰ７と略す場合がある。
【０１３９】
ＮＰ７の粒径は１１７ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ７の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．５×１０９  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は２．６×１０１０（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１４０】
ＴＥＭを用いてＮＰ７を観察し、その結果を図１１に示した。図１１（ｂ）は図１１（ａ）を拡大した図である。図１１から、ＮＰ７では、１個の酸化鉄粒子がリン脂質で被覆されていることが確認された。
【０１４１】
（実施例１０）
（光音響イメージング用造影剤８（ＮＰ８）の作製）
両親媒性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤８は、以下の方法で作製した。
【０１４２】
クロロホルム（３ｍｌ）にＰＬＧＡ−ＰＥＧ（３５ｍｇ、ＰＬＧＡ（乳酸−グリコール酸共重合体、平均分子量２００００、ＰＬＧＡ−５０２０、和光純薬工業社製）の末端カルボン酸にＰＥＧ（平均分子量５０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、日油社製）をアミド結合した両親媒性ポリマー、自社合成品）を溶解した。
【０１４３】
酸化鉄粒子（１６ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）を上記ＰＬＧＡ−ＰＥＧのクロロホルム溶液に加えた後、均一に分散させた。
【０１４４】
その後、水（１３ｍｌ）を加えて超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１４５】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤８の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤８をＮＰ８と略す場合がある。
【０１４６】
ＮＰ８の粒径は２１３ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ８の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．３×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は１．８×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１４７】
（実施例１１）
（光音響イメージング用造影剤９（ＮＰ９）の作製）
両親媒性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤９は、実施例１０と同様の方法で作製した。
【０１４８】
クロロホルム（３ｍｌ）にＰＬＧＡ−ＰＥＧ（３１ｍｇ、ＰＬＧＡ−５０２０の末端カルボン酸にＰＥＧ（平均分子量２０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日油社製）をアミド結合した両親媒性ポリマー、自社合成品）を溶解した。
【０１４９】
酸化鉄粒子（１６ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）を上記ＰＬＧＡ−ＰＥＧのクロロホルム溶液に加えた後、均一に分散させた。
【０１５０】
その後、水（１３ｍｌ）を加えて超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１５１】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤９の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤９をＮＰ９と略す場合がある。
【０１５２】
ＮＰ９の粒径は４４１ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ９の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は８．１×１０１０  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は８．７×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１５３】
（実施例１２）
（光音響イメージング用造影剤１０（ＮＰ１０）の作製）
両親媒性ポリマー、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響造影剤１０（ＮＰ１０）は、以下の方法で作製した。
【０１５４】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ社製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調整した。
【０１５５】
次に、ポリビニルアルコール（４８０ｍｇ、Ｍ．Ｗ．３１０００、ケン化度８８％、シグマアルドリッチ社製）を溶解した水溶液１２ｍｌに、前記クロロホルム溶液を加えて混合溶液とした。
【０１５６】
その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調整した。
【０１５７】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤１０の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤１０をＮＰ１０と略す場合がある。
【０１５８】
ＮＰ１０の粒径は９６ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ１０の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．３×１０９  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は３．８×１０１０（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１５９】
（実施例１３）
（光音響イメージング用造影剤１１（ＮＰ１１）の作製）
リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響造影剤１１（ＮＰ１１）は、以下の方法で作製した。
【０１６０】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ社製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調整した。
【０１６１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ）と化学式５で示される末端がメトキシ基のリン脂質（７．３ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＮ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油社製）を溶解した水溶液１２ｍｌに、前記クロロホルム溶液を加えて混合溶液とした。
【０１６２】
その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調整した。
【０１６３】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤１１の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤１１をＮＰ１１と略す場合がある。
【０１６４】
ＮＰ１１の粒径は１７２ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ１１の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は９．２×１０９  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は１．６×１０１１（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。
【０１６５】
（実施例１４）
（光音響イメージング用造影剤１２（ＮＰ１２）の作製）
２種類のリン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響イメージング用造影剤１２（ＮＰ１２）は、以下の方法で作製した。
【０１６６】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ社製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調整した。
【０１６７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ）、化学式５で示される末端がメトキシ基のリン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＮ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油社製）、及び化学式１で示される末端がアミノ基のリン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ、日油社製）を１２ｍｌの水に溶解させた。ただし、末端がメトキシ基のリン脂質と末端がアミノ基のリン脂質はそれぞれのモル比が１００：０、９９．９：０．１、９９．５：０．５、９９：１、９５：５、９０：１０、合計のモル数が２．５×１０−６ｍｏｌとなるように混合した。調整した水溶液に、前記クロロホルム溶液を加えて混合溶液とした。
【０１６８】
その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調整した。
【０１６９】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤１２の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤１２をＮＰ１２と略す場合がある。
【０１７０】
表３は、光音響イメージング用造影剤１２の粒径（キュムラント値）と、ゼータ電位値である。光音響イメージング用造影剤を作製するときに末端がアミノ基のリン脂質の割合が高くなると、得られた光音響イメージング用造影剤のゼータ電位は高くなる傾向となり、光音響イメージング用造影剤の表面により多くのアミノ基が導入されることが示された。なお、表３のＮＨ２はアミノ基ＮＨ２である。
【０１７１】
【表３】
0005875242.tif 000010
【０１７２】
（ＮＰ１２の安定性の評価）
ＮＰ１２のうち、末端がメトキシ基のリン脂質と末端がアミノ基のリン脂質の比率  ＣＮ：ＮＨ２＝９０：１０の条件で作製した光音響イメージング用造影剤（以下ＮＰ１２（９０：１０）と表記する）の安定性を以下の方法で評価した。
【０１７３】
ＮＰ１２（９０：１０）を水、ＰＢＳ、及び５００ｍＭ  ほう酸バッファー（Ｂｏｒ、ｐＨ８．５）に混合し、４℃及び３７℃で保存した。１日後及び３日後の粒径（キュムラント値）と吸光度を測定した。
【０１７４】
図１２は、ＰＮ１２（９０：１０）の各バッファー中における安定性試験の結果である。ＮＰ１２（９０：１０）をＰＢＳ中で保存したとき、粒径がやや大きくなる傾向にあり、凝集した可能性がある。しかし、水及びＢｏｒ中では、粒径に大きな変化はなく、凝集は認められなかった。ＮＰ１２（９０：１０）の吸光度は、いずれのバッファーにおいても大きな変化はなく、光音響イメージング用造影剤としての効果を維持していた。
【０１７５】
（実施例１５）
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖとＮＰ１２（９０：１０）との結合）
ＮＰ１２（９０：１０）に、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖを以下の方法で結合させた。
【０１７６】
実施例４で調製したｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖを５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、１０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で約２時間、還元処理した。
【０１７７】
ＮＰ１２（９０：１０）の表面に存在する１級アミノ基を介して、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖを結合させた。まず、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ（ＳＭ（ＰＥＧ）２、サーモサイエンティフィック社）の０．０３ｍｇ（６０ｎｍｏｌ）を、ＮＰ１２（９０：１０）の水分散液（粒子濃度：３．６×１０１２個／ｍｌ）の１．０ｍｌに溶解した。次に、０．１１ｍｌの５００ｍＭ  ほう酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えた。この粒子懸濁液を室温で２時間撹拌した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、マレイミド基を導入したＮＰ１２（９０：１０）（以下、マレイミド化ＮＰ１２と略す）と未反応のＳＭ（ＰＥＧ）２を、水を展開溶媒として分離し、マレイミド化ＮＰ１２の水溶液およそ３ｍｌを得た。この水溶液に１Ｍの２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）溶液を６０μｌ加えることで、マレイミド化ＮＰ１２のＨＥＰＥＳ溶液を得た。
【０１７８】
前記還元処理したｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖを、前記マレイミド化ＮＰ１２のＨＥＰＥＳ溶液に添加し、４℃で１５時間以上反応させた。仕込みの反応モル比（ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ／マレイミド化ＮＰ１２）は、１１２５で行った。ここで「仕込み」とは反応系に加えられた、という意味であり、「仕込みの反応モル比」とは、反応系に加えられたｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖとマレイミド化ＮＰ１２のモル濃度比のことをいう。反応後、この溶液に、末端チオール基を有するポリエチレングリコール（分子量１０００、ＰＬＳ−６０６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製）６．８ｎｍｏｌを加え、室温で３０分撹拌した。次いで、この溶液をフィルターろ過（ポアサイズ１．２μｍ）した後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりマレイミド化ＮＰ１２へ結合しなかったｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖを除去して、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖが修飾されたＮＰ１２（９０：１０）を得た。
【０１７９】
ＢＣＡ法を用いて、ＮＰ１２（９０：１０）へのｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖの修飾量を算出した結果、粒子あたりに８４７個のｓｃＦｖが修飾されていることがわかった。
【０１８０】
（実施例１６）
（ＮＰ１２（９０：１０）の癌集積性）
ＮＰ１２（９０：１０）の担癌マウスにおける癌集積性（ＥＰＲ効果）を以下の方法で確認した。
【０１８１】
ＮＰ１２（９０：１０）を公知の方法に従い、各粒子を放射性同位体（以後、ＲＩと略す）で標識した。ＲＩ核種としては、１２５−ヨウ素（１２５Ｉと略す事がある）を用いた。１２５Ｉの粒子標識には、ＳＩＢ法に従って行った。ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて、ＰＢＳで精製することで、１２５Ｉ標識ＮＰ１２（９０：１０）溶液を得た。
【０１８２】
Ｃｏｌｏｎ２６癌細胞を移植したヌードマウスに、１匹あたり１．８×１０１１個（鉄量に換算して０．４５ｍｇ）の１２５Ｉ標識ＮＰ１２（９０：１０）をヌードマウスの尾静脈から投与した。投与１、３、２４、７２時間後に、ヌードマウスを犠牲死し、血液及び癌の放射活性を測定した。投与量に対する割合と、血液及び癌の重さから、集積率（％ＩＤ／ｇ）を求めた（図１３）。投与後の時間経過とともに１２５Ｉ標識ＮＰ１２（９０：１０）は血液中から消失したが、投与３時間後には癌への集積が認められた。
【０１８３】
（実施例１７）
（光音響イメージング用造影剤１３（ＮＰ１３）の作製）
リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、及び酸化鉄粒子からなる光音響造影剤１３（ＮＰ１３）は、以下の方法で作製した。
【０１８４】
オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ、ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ社製）及び、ポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調整した。
【０１８５】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６００ｍｇ）と化学式５で示される末端がメトキシ基のリン脂質（７３ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＮ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油社製）を溶解した水溶液１２ｍｌに、前記クロロホルム溶液を加えて混合溶液とした。
【０１８６】
その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調整した。
【０１８７】
次に、前記エマルジョンを４０℃、１００ｈＰａで２時間減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、光音響イメージング用造影剤１３の水分散液を得た。遠心分離により精製した。以後、この得られた光音響イメージング用造影剤１３をＮＰ１３と略す場合がある。
【０１８８】
ＮＰ１３の粒径は７０ｎｍ（重量換算）であった。また、ＮＰ１３の粒子数１モルあたりのモル吸光係数は１．２×１０９  （Ｍ−１ｃｍ−１（粒子数１モル））であり、粒子数１モルあたりの規格化光音響信号は３．０×１０１０（Ｖ  Ｊ−１Ｍ−１（粒子数１モル））であることを確認した。実施例１３と比較して、実施例１７ではＴｗｅｅｎ２０とリン脂質の濃度を１０倍高くした。Ｔｗｅｅｎ２０とリン脂質の濃度により、光音響イメージング造影剤の粒径をコントロールすることができた。
【０１８９】
（実施例１８）
（光音響イメージング用造影剤の粒径と光音響信号）
粒径の異なる光音響イメージング用造影剤は、以下の方法で作製した。酸化鉄粒子として、オレイン酸に被覆された５０ｎｍの酸化鉄粒子（ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、２０ｎｍの酸化鉄粒子（ＳＯＲ−２０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及びオレイン酸に被覆された５ｎｍの酸化鉄粒子（ＳＯＲ−０５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）を用いた。
【０１９０】
５ｎｍ、２０ｎｍ、及び５０ｎｍの酸化鉄粒子（１３．８ｍｇ）、及びポリ乳酸とグリコール酸の共重合体（９．２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。
【０１９１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ、キシダ化学社製）を溶解した水溶液（１２ｍｌ）に、リン脂質の添加ありなし、リン脂質を添加する場合はリン脂質の末端の官能基の種類を変え、様々な種類のＴｗｅｅｎ２０水溶液を作製し、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。以下、ＮＰ１及びＮＰ２と同様の方法で作製した。
【０１９２】
ＴＥＭ観察と、光音響イメージング用造影剤中の酸化鉄粒子の含有率から、得られた光音響イメージング用造影剤には、複数個の酸化鉄粒子が密に詰まっていることが確認できた。図１４は、５０ｎｍ、２０ｎｍ、及び５ｎｍの酸化鉄粒子を含有する光音響イメージング用造影剤の粒径（重量換算）と、光音響信号との関係を示している。光音響信号として、図１４（ａ）では鉄原子１モルあたりの規格化光音響信号を、図１４（ｂ）では光音響イメージング用造影剤粒子数１モルあたりの規格化光音響信号を示している。５０ｎｍ及び２０ｎｍの酸化鉄粒子を含有させた光音響イメージング用造影剤では、光音響イメージング用造影剤の粒径が大きくなると、鉄原子１モルあたりの光音響信号の増加が認められた。その傾向は、作製方法、つまり酸化鉄粒子以外の成分に関係がなかった。また、この傾向により、５０ｎｍの酸化鉄粒子を含有する光音響イメージング用造影剤では、光音響イメージング用造影剤の粒子数１モルあたりの光音響イメージング用造影剤も増加し、強い光音響信号を発する光音響イメージング用造影剤が得られた。
【符号の説明】
【０１９３】
１  光音響イメージング用造影剤
２  酸化鉄粒子
３  両親媒性化合物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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