(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（d）からなる群より選択されるいずれかのFEAT遺伝子に対するプローブ若しくは当該FEAT遺伝子の増幅用プライマー、又は以下の（e）〜（g）からなる群より選択されるいずれかのFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬。
（a）配列番号1に示す塩基配列からなるFEAT遺伝子
（b）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（c）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（e）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるFEATタンパク質
（f）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するFEATタンパク質
（g）配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するFEATタンパク質
【請求項２】
FEAT遺伝子の増幅用プライマーが、配列番号１１及び１２に示す塩基配列からなるものである請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
以下の（a）〜（d）からなる群より選択されるいずれかのFEAT遺伝子に対するsiRNA、又は以下の（e）〜（g）からなる群より選択されるいずれかのFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の形成又は発達の阻害又は予防用医薬組成物。
（a）配列番号1に示す塩基配列からなるFEAT遺伝子
（b）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（c）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（e）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるFEATタンパク質
（f）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するFEATタンパク質
（g）配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するFEATタンパク質
【請求項４】
FEAT遺伝子に対するsiRNAが、配列番号３〜８から選ばれるいずれかの塩基配列からなるものである請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
生体から採取された被験試料と請求項１又は２に記載の試薬とを反応させ、FEAT遺伝子又はFEATタンパク質の発現があったときは、当該被検試料中の細胞は腫瘍細胞又は前癌細胞であると判定することを特徴とする、腫瘍細胞又は前癌細胞の検出方法。
【請求項６】
FEAT遺伝子又はFEATタンパク質の発現が、正常細胞と比較して上昇したときは、前記被検試料中の細胞は腫瘍細胞又は前癌細胞であると判定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験試料が血液、体液又は組織切片である請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
以下の（a）〜（d）からなる群より選択されるいずれかのFEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物。
（a）配列番号1に示す塩基配列からなるFEAT遺伝子
（b）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（c）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするFEAT遺伝子
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするFEAT遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＥＡＴ遺伝子に対するプローブ若しくはＦＥＡＴ遺伝子の増幅用プライマー、又はＦＥＡＴタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬及び予防用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌形成の分子生物学的メカニズムの解明は進歩しているが、未だに癌の効果的なスクリーニング及び予防法は確立されていない（非特許文献１）。従って、分子標的を用いた癌のスクリーニング及び予防法を確立するためには、多種多様な癌と関連する癌遺伝子を発見し、特徴付け、そして分類していくことが必要である。
しかしながら、タンパク質をコードするエキソン領域の網羅的シークエンシング（非特許文献２〜４）、全ゲノムシークエンシング（非特許文献５）、及び体細胞における遺伝子転座を同定するためのペアード・エンド・シークエンス（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（非特許文献６）等の手法を用いて癌遺伝子を網羅的に同定しようとした結果判明したことは、ヒトの腫瘍形成過程が多様かつ複雑に入り組んでいるということであり、現時点では種々の癌に共通する特徴を見い出すことには成功していない。ヒトの癌化に関わる遺伝子変異は、癌の種類によっても大きく異なり、また、同種の癌であっても個々の腫瘍組織において異なっている（非特許文献７）。従って、現時点では、多種多様な癌において、共通して異常が認められる癌の分子生物学的特徴が存在するのかどうかさえ不明である。
癌においては異常が見られる癌遺伝子の組合せには統一性が無く（非特許文献７〜９）、個々の遺伝子よりは、むしろシグナル経路の異常によって腫瘍形成が促されることが示されている（非特許文献１０）。また、癌において異常が見られる共通のシグナル経路においても、異常が生じた構成要素は個々の腫瘍組織において異なっている（非特許文献２〜４）。
このような背景から、多数の癌組織で共通して高発現しているタンパク質の高発現は、腫瘍に特徴的な形質（解糖、高分子合成、ＤＮＡ複製といった代謝の増大）及びこれによって生じる細胞内ストレスを反映する副次的な変化に過ぎないものとみなされていた（非特許文献１０〜１２）。従って、このようなタンパク質の高発現が、癌の治療又は予防のターゲットとして注目されることはほとんどなかった。
従来の腫瘍の検出用試薬は、特定の種類の腫瘍に特異的なマーカーを指標として腫瘍を検出するものであったため、患者体内に生じうる腫瘍を網羅的に検出するためには、多種類の検査用試薬の同時使用を必要とした。多種類の検査用試薬を用いることは、コストが高く費用効果比が著しく低下するだけではなく、医療従事者の作業負担並びに患者の心理的及び生理的負担が増大するという問題がある。
また、従来の腫瘍の検出用試薬の多くは、腫瘍性形質変化後に生じる腫瘍マーカーを指標として腫瘍を検出するものであるため、腫瘍形成の早期段階又は前癌段階で腫瘍を検出することができない。従って、従来の検出用試薬を用いて腫瘍が検出された場合には、既に腫瘍疾患のステージが進行してしまっており、有効な治療の選択範囲が制限されるという問題もある。
【非特許文献１】Ｔｏｍａｔｉｓ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｕｆｆ，Ｊ．（２００１）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０９，Ａ４５８−４６０
【非特許文献２】Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，１８０７−１８１２
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，２００８
【非特許文献４】Ｄｉｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，１０６９−１０７５
【非特許文献５】Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，１８４−１９０
【非特許文献６】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，１００５−１０１０
【非特許文献７】Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｆｕｔｒｅａｌ，Ｐ．Ａ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，７１９−７２４
【非特許文献８】Ｈａｈｎ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２，３３１−３４１
【非特許文献９】Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １，３７−４７
【非特許文献１０】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０，７８９−７９９
【非特許文献１１】Ｆｕｔｒｅａｌ，Ｐ．Ａ．，Ｃｏｉｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４，１７７−１８３
【非特許文献１２】Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，１０２９−１０３３
【発明の開示】
【０００３】
このような状況から、種々の腫瘍において普遍的に発現するマーカーをターゲットとした検査用試薬及び治療用医薬組成物の開発が待たれている。そこで、本発明は、種々の腫瘍又は癌において普遍的に発現するマーカーをターゲットとした検査用試薬及び治療用医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、腫瘍形成の早期段階で腫瘍を検出可能な検出用試薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、多種多様なヒトの癌組織において早期のステージからＦＥＡＴタンパク質（ｆａｉｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｂｅｒｒａｎｔ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ）が共通して過剰発現していることを見出した。本発明者らは、発現マイクロアレイ解析を行い、ＦＥＡＴにより癌化シグナル経路が誘導されることを見出した。また、本発明者らは、ＦＥＡＴを過剰発現させるトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製し、該Ｔｇマウスを用いた実験により、ＦＥＡＴがｉｎ  ｖｉｖｏにおいても腫瘍形成を促進することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
従って、本発明は、以下を提供する。
［１］  ＦＥＡＴ遺伝子に対するプローブ若しくはＦＥＡＴ遺伝子の増幅用プライマー、又はＦＥＡＴタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬。
［２］  以下の（ａ）若しくは（ｃ）の物質又は（ｂ）の細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物。
（ａ）ＦＥＡＴ遺伝子の発現若しくはＦＥＡＴタンパク質の活性を阻害する物質
（ｂ）ＦＥＡＴタンパク質に反応する免疫細胞
（ｃ）ＦＥＡＴタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記（ａ）の物質若しくは前記（ｂ）の細胞を担持した物質
［３］  ＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害する物質がＦＥＡＴ遺伝子に対するｓｉＲＮＡである前記［２］に記載の医薬組成物。
［４］  ＦＥＡＴタンパク質の活性を阻害する物質がＦＥＡＴタンパク質に対する抗体である前記［２］に記載の医薬組成物。
［５］  免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞又は樹状細胞である前記［２］に記載の医薬組成物。
［６］  生体から採取された被験試料と前記［１］に記載の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法。
［７］  被験試料が血液、体液又は組織切片である前記［６］に記載の方法。
［８］  ＦＥＡＴ遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物。
本発明の試薬により、多様な種類の癌又は前癌病変を検出することができる。また、本発明の試薬を用いることにより、腫瘍形成の早期段階で腫瘍を検出することが可能である。さらに、本発明の医薬組成物を用いることにより、腫瘍を効果的に治療又は予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ＦＥＡＴタンパク質の生化学的精製の過程、種間での保存、酵素活性の検討結果を示す図である。
【図２】アポトーシス細胞死におけるＦＥＡＴタンパク質のカスパーゼによる切断部位の同定及びヒトＦＥＡＴタンパク質の構造を示す図である。図２Ｆ：ｈｕｍａｎ  ＦＥＡＴ中の黄色で表示される部分は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）結合部分を示す。
【図３】ＦＥＡＴタンパク質発現レベルとアポトーシスの逆相関及び細胞内でのＦＥＡＴタンパク質の分布を示す図である。
【図４】ヒト由来の各種細胞株全てでのＦＥＡＴタンパク質の発現を示すウェスタンブロットの結果、並びに野生型ＦＥＡＴ、変異型ＦＥＡＴ及びＦＥＡＴ断片によるアポトーシス抑制効果を示す図である。
【図５】ヒト正常組織内及び腫瘍組織内でのＦＥＡＴ発現を示すウェスタンブロットの結果及びＦＥＡＴタンパク質による癌化シグナル経路の誘導を示す図である。
【図６】ｎｏｎ−Ｔｇマウス及びＴｇマウスの各種器官内でのＦＥＡＴ発現を示すウェスタンブロットの結果、Ｔｇマウスの胸腺細胞のアポトーシス細胞死の低下、およびＴｇマウスに発生した腫瘍の頻度を示す図である。
【図７】Ｔｇマウスに発生した腫瘍の肉眼所見（矢印）並びにこれらマウスの非担癌生存率（ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を示す図である。
【図８】Ｔｇマウス及び同腹ｎｏｎ−Ｔｇマウスの非担癌生存率（ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）（Ａ）、肝癌の原発巣（Ｂ）と肺転移巣（Ｃ）での組織学的特徴、並びにＦＥＡＴ  Ｔｇマウスに発生した肝癌のアレイＣＧＨで検出されたコピー数変化遺伝子のヒト染色体上での分布（Ｄ）を示す図である。
【図９】ＦＥＡＴ  Ｔｇマウスに発生した各種腫瘍組織の顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】アレイＣＧＨで検出された、マウス染色体のうち肝癌で増幅していた個所（赤色）及び欠失していた個所（緑色）を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの続きの図である。
【図１１】種々のヒト正常および癌組織におけるＦＥＡＴ発現を示す免疫組織化学所見である。
【図１２】種々のヒト癌組織におけるＦＥＡＴ発現の上昇を示す図である。
【図１３】肝癌に隣接する前癌病変としての肝硬変におけるＦＥＡＴ発現の上昇を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１０年８月１６日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１０−１８１８３５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明者らは、ＦＥＡＴタンパク質が多種多様な腫瘍組織において過剰発現しており、ＦＥＡＴタンパク質が腫瘍形成に寄与することを見出した。
ＦＥＡＴ遺伝子及びタンパク質は、正常組織では殆ど全ての組織で発現が認められず、僅かに精巣、脳、肝臓に弱く発現しているのみである。一方、ＦＥＡＴ遺伝子は、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌を含む多種多様な腫瘍組織において、普遍的に発現している（図５Ｂ）。
本発明者らは、ヒトの癌形成において、ＦＥＡＴタンパク質が、腫瘍性形質変化に先立って生じていることを見出した（図１３）。また、本発明者らは、ＦＥＡＴタンパク質を培養細胞で過剰発現させることにより、発癌経路であるチロシンキナーゼ受容体のシグナル経路及びＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル経路が活性化されることを見出し（図５Ｄ）、更に、ＦＥＡＴタンパク質を過剰発現させたトランスジェニックマウスにおいて、種々の器官で腫瘍組織が形成されることを確認している（図７Ａ〜図７Ｃ）。
従って、現時点では腫瘍化していない細胞であっても、ＦＥＡＴタンパク質を発現している細胞は、将来腫瘍化する可能性が高い細胞（前癌細胞）であるといえる。
ここで、本発明において腫瘍マーカーとして使用されるＦＥＡＴについて説明する。
ＦＥＡＴタンパク質は、「ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ−０１（ＣＧＩ−０１）」、「ＫＩＡＡ０８５９」又は「ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｉｋｅ  １３（ＭＥＴＴＬ１３）」とも呼ばれる遺伝子にコードされるタンパク質である。
ＦＥＡＴタンパク質は、カスパーゼ３により切断されるが、カスパーゼ６では切断されない（図２Ｂ）。また、ＦＥＡＴタンパク質は、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する（図４Ｃ）。
ヒトＦＥＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列及びヒトＦＥＡＴタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０１５９３５）及び２に示す通りである。また、野生型ＦＥＡＴタンパク質（配列番号２）だけではなく、その変異体、例えば、カスパーゼ３により切断される部位の第２７４番目（配列番号２）のアスパラギン酸がアラニンで置換されたＤ２７４Ａ変異及びカスパーゼ３により切断される部位の第２８８番目（配列番号２）のアスパラギン酸がアラニンで置換されたＤ２８８Ａ変異又はこれらの両変異を有する変異体は、カスパーゼ３により切断されにくいため、より強いアポトーシス抑制機能を有する（図３Ｂ）。また更に、完全長ＦＥＡＴタンパク質（配列番号２）だけではなく、その断片、特にＦＥＡＴタンパク質のアミノ酸配列の第２８９〜６９９番目のアミノ酸からなる配列を含む断片は、アポトーシス抑制機能を有する。
また、ＦＥＡＴタンパク質は、２つのＳ−アデノシルメチオニン結合モチーフ（ＳＡＭ結合モチーフ）を含む。ＳＡＭ結合モチーフは、メチル基転移酵素及びその関連酵素に特徴的なモチーフであるが（図１Ｂ）、ＦＥＡＴタンパク質が、メチル基転移酵素活性を有するかどうかはまだ明らかではない。ＳＡＭ結合モチーフのコンセンサス配列としては、例えば、以下の配列が挙げられる。
0006021151.tif 000002
上記のＦＥＡＴタンパク質及びＦＥＡＴ遺伝子は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
１．腫瘍の検出用試薬
本発明は、ＦＥＡＴ遺伝子に対するプローブ若しくはＦＥＡＴ遺伝子の増幅用プライマー、又はＦＥＡＴタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬を提供する。
ＦＥＡＴ遺伝子又はＦＥＡＴタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞で広く特異的に発現されており、正常細胞では殆ど発現されていないため、被検細胞からＦＥＡＴ遺伝子又はＦＥＡＴタンパク質が検出された場合には、該被検細胞は、腫瘍細胞又は前癌細胞であると判断することができる。
ここで、「ＦＥＡＴ遺伝子」には、上記で述べた配列番号１に示す塩基配列を有するヒトの野生型ＦＥＡＴ遺伝子の他に、ヒト以外の種に由来するＦＥＡＴホモログ遺伝子並びにこれらの変異型遺伝子が含まれる。
具体的には、ＦＥＡＴ遺伝子の例として、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドのうち、（ａ）及び（ｂ）は、ヒト野生型ＦＥＡＴ遺伝子であり、（ｃ）〜（ｅ）は、ヒト以外の種に由来するＦＥＡＴホモログ遺伝子及び変異型ＦＥＡＴ遺伝子である。ＦＥＡＴ遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のいずれであってもよい。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”及び”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドと５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
塩基配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸやＢＬＡＳＴＰと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
本発明において、ＦＥＡＴ遺伝子に対するプローブ（以下、「本発明のプローブ」という）又はＦＥＡＴ遺伝子の増幅用プライマー（以下、「本発明のプライマー」という）の例としては、ＦＥＡＴ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。「ストリンジェントな条件」は、先に述べたとおりである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、５〜５００ｂｐ、より好ましくは、１０〜２００ｂｐ、さらに好ましくは、１０〜１００ｂｐの長さのヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託することもできる。
本発明の試薬が、ＦＥＡＴ遺伝子に対するプローブを含む場合、腫瘍を検出するためのアッセイ方法としては、該腫瘍に発現しているＦＥＡＴ遺伝子に対するノーザンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。また、本発明の試薬が、ＦＥＡＴ遺伝子に対するプライマーを含む場合、腫瘍の検出方法としては、該腫瘍に発現しているＦＥＡＴ遺伝子に対するＰＣＲ増幅又はシークエンス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。本発明の試薬は、プローブ及びプライマーの両方を含んでいてもよい。
本発明において、「ＦＥＡＴタンパク質」には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒト野生型ＦＥＡＴタンパク質だけではなく、ヒト以外の種に由来するＦＥＡＴホモログタンパク質並びにこれらの変異型タンパク質が含まれる。また、ＦＥＡＴタンパク質の切断により生じた断片であって、腫瘍促進機能を有する断片も、ＦＥＡＴタンパク質に含まれる。
ＦＥＡＴタンパク質の具体例としては、以下の（ｆ）、（ｇ）若しくは（ｈ）のポリペプチド又はその断片が挙げられる。
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド
（ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド
上記（ｇ）又は（ｈ）に記載のポリペプチドは、代表的には、ヒト以外の種に由来するＦＥＡＴホモログタンパク質又は野生型ＦＥＡＴタンパク質の変異タンパク質であるが、これら以外にも、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをベースに、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、”Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるポリペプチドも含まれる。
本明細書中、「配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド」としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドが挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
また、このようなポリペプチドとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．５％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドが挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
アミノ酸配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸやＢＬＡＳＴＰと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。アミノ酸配列の解析には、一般的にＢＬＡＳＴＰが用いられ、アミノ酸配列の同一性を解析する場合であって、６０％以上の同一性を有するアミノ酸を検索するときには、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝６０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。
被検タンパク質が、腫瘍促進機能を有するかどうかは、被検タンパク質又はその遺伝子を、ＦＥＡＴを発現しない適切な正常宿主細胞（例えば、ヒト好中球）に導入し、該宿主細胞を適切な培養条件下でインキュベートし、宿主細胞の腫瘍形成を観察することにより、確認することができる。
ある態様では、腫瘍促進機能は、アポトーシス抑制機能である。被検タンパク質が、アポトーシス抑制機能を有するかどうかは、被検タンパク質又はその遺伝子を、ＦＥＡＴを発現しない適切な宿主細胞（例えば、ヒト好中球）に導入し、該宿主細胞を適切な培養条件下でインキュベートし、宿主細胞群に含まれる断片化ＤＮＡ含有アポトーシス細胞の量をフローサイトメトリーで解析して、アポトーシス細胞数を測定することにより、確認することができる。
本発明において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された形態としては、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加が生じていてもよく、欠失、置換及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。また、アミノ酸残基の付加が生じている場合、該アミノ酸残基は、アミノ酸配列中に挿入される態様で付加されていてもよく、あるいはアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に付加されていてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
また、上記ＦＥＡＴタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
ＦＥＡＴタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞において発現しているが、アポトーシス細胞死を起こした場合、細胞に内在するカスパーゼ３により切断されるため、腫瘍細胞又は前癌細胞には、ＦＥＡＴタンパク質の断片も含まれることもある。従って、本発明の試薬は、ＦＥＡＴタンパク質の全長または断片を検出する。
前記断片は、特に限定されないが、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２８９〜６９９番目のアミノ酸からなる配列を含む断片である。この断片は、全長よりも弱いながらも腫瘍促進機能を有する点で好ましい。
ＦＥＡＴタンパク質（又はその断片）に対する抗体（以下、「本発明の抗体」）は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
（１）ポリクローナル抗体の作製
上記抗体を作製するに当たり、まず、免疫源（抗原）として用いるＦＥＡＴタンパク質を調製する。抗原となるＦＥＡＴタンパク質は、ＦＥＡＴタンパク質のアミノ酸配列に基づいて遺伝子工学的に作製することができる。
次に、得られた精製ＦＥＡＴを動物に免疫する。免疫は、ＦＥＡＴタンパク質を含む溶液を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ等）に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。必要に応じて適宜アジュバントを添加することもできる。続いて、免疫により得られる血清（抗血清）を採取する。血清の採取は限定されるものではなく、常法に従い、最終投与日から１〜２８日後に免疫した動物の血液から採取することができる。採取した抗血清の中から、公知の免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて目的の抗血清をスクリーニングする。上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる抗体はポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を単独で、又は２種以上を組み合わせることができる。
（２）モノクローナル抗体の作製
抗原及びその溶液の調製、並びに免疫方法は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができる。
抗原の最終投与の日から１〜１４日後に、抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞（ハイブリドーマ）を得る。
ミエローマ細胞としては、例えば、ＰＡＩ、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−１などを用いることができる。上記細胞融合は、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。融合反応は、一般には、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましい。あるいは、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
融合反応後の細胞は、例えばＨＡＴ選択培地による培養を行う。上記培養後、ＨＡＴ選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞（ハイブリドーマ）となる。上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマをスクリーニングする。硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、単独で、又は適宜組み合わせて用いることで前記ハイブリドーマからモノクローナル抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の作製方法については、米国特許第４，８１６，５６７号を参照することができる。
また、本発明においては、ヒト型化抗体、ヒト抗体、前記抗体の断片も使用することが可能である。
ヒト型化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）がヒト免疫グロブリン由来の可変領域のＦＲであり、かつその定常領域がヒト免疫グロブリン由来の定常領域である抗体である。
ヒト抗体とは、免疫グロブリンを構成する全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体をいう。
ヒト型化抗体及びヒト抗体の作製方法については、以下の文献を参照できる：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（６１６２）：３３２−３２３；特許公報第２９１２６１８号。
（３）抗体断片
抗体断片とは、上記抗体の抗原結合領域を含む部分断片を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ  Ｆｖ）等が挙げられる。
本発明の試薬が、ＦＥＡＴタンパク質に対する抗体を含む場合、腫瘍を検出するためのアッセイ方法としては、該腫瘍に発現しているＦＥＡＴタンパク質に対する免疫組織染色法（Ｌｏｒｅｔｔｅ  Ｃ．Ｊａｖｏｉｓ  ｅｄ．“Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）”Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，１９９９））、免疫沈降法、アフィニティークロマトグラフィー、プルダウンアッセイ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）及びウェスタンブロッティング（Ｇａｒｙ  Ｃ．Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｒ．Ｋａｓｅｒ  ｅｄ．“Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １３，２００６））、抗体マイクロアレイ（Ｃｈａｇａ  ＧＳ（２００８）．”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ”．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４１：１２９−５１；Ｒｉｖａｓ  ＬＡ，Ｇａｒｃ▲ｉ▼ａ−Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ  Ｍ，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｐａｚ  Ｍ，Ｃｒｕｚ−Ｇｉｌ  Ｐ，Ｇ▲ｏ▼ｍｅｚ−Ｅｌｖｉｒａ  Ｊ，Ｐａｒｒｏ  Ｖ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８）．”Ａ  ２００−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｂｉｏｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０（２１）：７９７０−９）等が挙げられる。
２．腫瘍の予防用医薬組成物
本発明者らは、腫瘍形成過程において、ＦＥＡＴタンパク質が、極めて早期の段階（腫瘍性形質変化前）から発現しており、さらにＦＥＡＴタンパク質の発現が腫瘍形成を促進することを見出した。
従って、既に腫瘍化したＦＥＡＴ発現細胞を破壊すると同時に、前癌段階のＦＥＡＴ発現細胞も破壊することにより、腫瘍の発達を阻害し、腫瘍形成を予防することが可能である。
また、本発明者らは、ＦＥＡＴタンパク質自体がアポトーシス抑制機能を有しており、ＦＥＡＴタンパク質の発現によって癌化シグナル経路が活性化されていることを見出した。
従って、ＦＥＡＴタンパク質又はその遺伝子の機能を阻害して、腫瘍細胞又は前癌細胞のアポトーシス細胞死を誘導することにより、腫瘍の形成を予防することも可能である。
よって、本発明は、以下の（ｉ）若しくは（ｉｉ）の物質又は（ｉｉｉ）の細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物を提供する。
（ｉ）ＦＥＡＴ遺伝子の発現若しくはＦＥＡＴタンパク質の活性を阻害する物質
（ｉｉ）ＦＥＡＴタンパク質に反応する免疫細胞
（ｉｉｉ）ＦＥＡＴタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記（ｉ）の物質若しくは前記（ｉｉ）の細胞を担持した物質
（ｉ−１）  ＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害する物質
上記（ｉ）に記載の「ＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害する物質」の具体例としては、ＦＥＡＴ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量を低下させる物質、例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質及び核酸等が挙げられ、１つの実施態様では、ＦＥＡＴ遺伝子の機能又は発現を抑制する核酸である。このような核酸の例としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を生じさせる、ヘアピン状のｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。阻害の対象となるＦＥＡＴ遺伝子の塩基配列は上記の通りであり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、ＦＥＡＴ遺伝子の塩基配列は配列番号１に示すものであるが、ＦＥＡＴのコード領域のみならず、非コード領域を使用することも可能である。
（１）ＲＮＡ干渉
本発明者らは、ｓｈＲＮＡを用いたＲＮＡｉにより宿主細胞のＦＥＡＴ発現をノックダウンし（図３Ｃ）、該宿主細胞のアポトーシスを促進することに成功している（図３Ｄ）。
ＲＮＡｉは、複数の段階を経て行われるマルチステッププロセスである。最初に、ＲＮＡｉ発現ベクターから発現したｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡがＤｉｃｅｒによって認識され、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡｓに分解される。次に、ｓｉＲＮＡｓはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）と呼ばれるＲＮＡｉ標的複合体に組み込まれ、ＲＩＳＣとｓｉＲＮＡｓとの複合体がｓｉＲＮＡの配列と相補的な配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡを分解する。標的ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに相補的な領域の中央で切断され、最終的に標的ｍＲＮＡが速やかに分解されてタンパク発現量が低下する。最も効力の高いｓｉＲＮＡ二重鎖は、１９ｂｐの二重鎖の各３’末端にウリジン残基２個の突出部分を持つ２１ヌクレオチド長の配列であることが知られている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ，１５，１８８−２００（２００１））。
一般に、ｍＲＮＡ上の標的配列は、ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列から選択することができる。但し、本発明においてはこの領域に限定されるものではない。
ｓｉＲＮＡ分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくはＡＡ、ＴＡ、ＧＡ又はＣＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基のセグメントを選択することができる。ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、３０〜７０％、好ましくは３５〜５５％である。あるいは、ＲＮＡｉの標的配列は、Ｕｉ−Ｔｅｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，９３６−９４８）の記載に沿って適宜選択することができる。例えば、ヒトＦＥＡＴ遺伝子に対するＲＮＡｉを行う場合、ＦＥＡＴ  ｃＤＮＡのＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ領域の第１８３、２５９、１３８５、１５５０、１６３４、２０５６番目を始点とする１９塩基対の下記塩基配列（それぞれ、配列番号３、４、５、６、７、８）を標的としてＲＮＡｉを行うことにより、ＦＥＡＴ遺伝子の発現を抑制することができる。
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ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本鎖ＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順でこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するように連結し、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。スペーサーの長さも特に限定されるものではない。
配列Ａは、標的となるＦＥＡＴ遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
さらに、本発明は、マイクロＲＮＡを用いてＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害することができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、細胞内に存在する長さ２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）の一種である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
ｍｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに基づく阻害性核酸であるため、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに準じて設計し合成することができる。
ＲＮＡｉ用の発現ベクターは、ｐＭｕｎｉＨ１プラスミド、ｐＳＩＮｓｉベクター（タカラバイオ）、ｐＳＩＦ１−Ｈ１（システムバイオサイエンス社）等をベースに、市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型）を用いて容易に作製することができる。あるいは、ＲＮＡｉ用の発現ベクターは、コスモ・バイオ株式会社、タカラ・バイオ株式会社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社等の第三者機関に作製を委託することもできる。
（２）アンチセンス核酸
本発明の別の態様において、ＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンス核酸を使用することができる。アンチセンス核酸は、ＦＥＡＴ遺伝子のｍＲＮＡ又はＤＮＡ配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも１４ヌクレオチドであり、好ましくは１４〜１００ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、ＦＥＡＴ遺伝子の転写又は翻訳を抑制する。
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。
（３）デコイ核酸
本発明の別の態様では、デコイ核酸と呼ばれるおとり核酸を使用することにより、ＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害することができる。
デコイ核酸は、ＦＥＡＴ遺伝子又はＦＥＡＴ受容体遺伝子の転写因子に結合してプロモーター活性を抑制することにより、ＦＥＡＴ遺伝子発現を抑制する核酸であって、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味する。この核酸が癌細胞内に導入されると、転写因子がこの核酸に結合する。これにより、転写因子のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、転写因子の発現が抑制される。
本発明の好ましいデコイ核酸としては、例えばＦＥＡＴ遺伝子のプロモーターに結合する核酸、あるいはＦＥＡＴのｍＲＮＡやＦＥＡＴの上流に存在する因子のプロモーターに結合する核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、ＦＥＡＴ遺伝子のプロモーター配列をもとに、１本鎖又は２本鎖として設計することができる。デコイ核酸の長さは特に限定されるものではなく、１５〜６０塩基、好ましくは２０〜３０塩基である。
デコイ核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、修飾された核酸が含まれていてもよい。
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術に一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、ＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。
なお、デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばＰｒｏｍｅｇａ  ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。
（４）アプタマー
さらに、本発明は、アプタマーを用いてＦＥＡＴ遺伝子の発現を阻害することができる。
アプタマーとは、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子及びペプチド性分子であり、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。従って、配列番号１に示す塩基配列を基準にして、あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法又はＳＥＬＥＸ法として知られている進化工学的手法により得ることができる。
核酸アプタマーは、血流中ではヌクレアーゼにより速やかに分解及び除去されるため、必要に応じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などによる分子修飾を行って半減期を伸ばしておくことが好ましい。
（ｉ−２）  ＦＥＡＴタンパク質の活性を阻害する物質
上記（ｉ）に記載の「ＦＥＡＴタンパク質の活性を阻害する物質」の具体例としては、ＦＥＡＴタンパク質を分解する物質（例えば、各種プロテアーゼ）及びＦＥＡＴタンパク質の拮抗物質（例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質、抗体及び核酸等）が挙げられ、ある実施態様では、ＦＥＡＴタンパク質に対する抗体である。ＦＥＡＴタンパク質に対する抗体は、検査用試薬の項目で述べたとおりである。
（ｉｉ）  ＦＥＡＴタンパク質に反応する免疫細胞
上記（ｉｉ）に記載の「ＦＥＡＴタンパク質に反応する免疫細胞」の具体例としては、ＦＥＡＴタンパク質を抗原として認識する免疫細胞が挙げられる。免疫細胞の例としては、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
このような免疫細胞は、遺伝子組換えにより、抗癌剤の遺伝子又は抗癌剤のプロドラッグを活性薬剤に変換するプロドラッグ変換酵素の遺伝子を発現するように形質転換されたものであってもよい。
例えば、ＦＥＡＴタンパク質に反応する免疫細胞が抗腫瘍作用を持つ分子（以下において、「抗癌剤」と総称する）を発現する細胞である場合、ＦＥＡＴタンパク質は、腫瘍細胞で限定的に発現しているため、このような免疫細胞は、ＦＥＡＴタンパク質を介して腫瘍細胞と接触し、該免疫細胞内に発現する抗癌剤により腫瘍細胞が死滅する。ここで、「抗癌剤」には、そのプロドラッグも含まれる。
抗癌剤の例としては、以下に限定されるものではないが、パラスポリン、ＰＯＧＺ、パニツムマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツマブ、イムノマックス、ベバシツマブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ダサチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、アキシチニブ、スニチニブ、モテサニブ、デノスマブ、ニモツズマブ、イブリツモマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、ＣＳ−１００８、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＯＲＡｂ−００３、ＯＮＯ−４５３８、ＫＷ−０７６１、ＡＭＧ６５５、Ｒ７１５９（ＧＡ１０１）、Ｒ１５０７、ＣＭＣ−５４４、ＧＣ３３、ＫＲＮ３３０ｍ、Ｕ３−１２８７等が挙げられる。これらの抗癌剤をコードする遺伝子の塩基配列は、公知である。
また、抗癌剤は、癌遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、又は該ｓｉＲＮＡを生じさせるｓｈＲＮＡ若しくはｄｓＲＮＡであってもよい。癌遺伝子の具体例としては、ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ｃ−Ｍｙｃ）遺伝子、ｖ−Ｓｒｃ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ２（ＢＣＬ２）遺伝子、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＰＩＫ３ＣＡ）遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子、Ｌｉｖｅｒ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１（ＬＫＢ１）遺伝子、ｃ−Ａｂｌ遺伝子、ｃ−Ｓｉｓ遺伝子、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＤＧＦＲ）遺伝子、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）遺伝子，ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子、Ｒａｆキナーゼ遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子（例えば、Ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ４：Ｃｄｋ４）、及びこれらの変異遺伝子が挙げられる。ｓｉＲＮＡについては、ＲＮＡ干渉の項目で述べたとおりである。
本発明の免疫細胞がプロドラッグ変換酵素を発現する場合、前記免疫細胞と抗癌剤のプロドラッグとを患者に投与すると、前記細胞がＦＥＡＴタンパク質を発現する腫瘍細胞又は前癌細胞（以下、「腫瘍細胞」と総称する）を認識して、その腫瘍細胞周囲に局在し、その場で限定的にプロドラッグ変換酵素を生産する。その結果、投与されたプロドラッグは、腫瘍細胞周囲のみで抗癌剤に変換されるため、抗癌剤は、腫瘍細胞に限定的に効力を示し、正常細胞に対する影響を最小限にとどめることができる。
プロドラッグ変換酵素の例としては、チミジンキナーゼ、チミジンキナーゼとチミジレートキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）との融合タンパク質及びシトシンデアミナーゼ等が挙げられる。チミジンキナーゼは、ガンシクロビルのプロドラッグ変換酵素であり、チミジンキナーゼとチミジレートキナーゼとの融合タンパク質は、アジドチミジンのプロドラッグ変換酵素であり、シトシンデアミナーゼは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のプロドラッグ変換酵素である。これらのプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子の配列は公知である。
上記抗癌剤（癌遺伝子に対するｓｉＲＮＡを除く）又はプロドラッグ変換酵素の遺伝子（以下、「抗癌遺伝子」）は、適切な発現カセットとして発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞（例えば、免疫細胞）を形質転換すればよい。適切な発現カセットは、少なくとも以下を構成要素として含む。
宿主細胞で転写可能なプロモーター；
該プロモーターにｉｎ−ｆｒａｍｅに結合した抗癌遺伝子；及び
ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードする配列
哺乳動物由来の免疫細胞を宿主細胞とする場合、該宿主細胞で転写可能なプロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＬＴＲ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
癌遺伝子に対するｓｉＲＮＡの発現ベクターについては、ＲＮＡ干渉の項目で述べたとおりである。
前記発現ベクターは、前記発現カセットの他に、形質転換された宿主細胞をセレクションするための選択マーカー発現カセットを有していてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、ＬａｃＺ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、ジフテリア毒素Ａ断片（ＤＴＡ）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。
形質転換された宿主細胞は、上記マーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、Ｇ４１８を加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、ターゲティングベクターがＧＦＰ等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。
宿主細胞への抗癌遺伝子の導入に使用可能な発現ベクターは市販されており、例としてｐＥＧＦＰ−Ｃ１ＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＣＭＶ−ＨＡＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＶｉｒａＰｏｗｅｒＩＩ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｇａｔｅｗａｙ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等が挙げられる。発現ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウィルス感染等、公知の遺伝子導入法により宿主細胞へ導入することができる。遺伝子導入法の詳細については、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１」等を参照することができる。
ＦＥＡＴタンパク質に反応する免疫細胞は、以下の手順により作製することができる。
まず、ＦＥＡＴのアミノ酸配列の中で、個々人の組織適合抗原（ＨＬＡ）に合った免疫用のペプチドのアミノ酸配列を予測し、そのようなアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。ＨＬＡに合った免疫用のペプチドのアミノ酸配列の予測は、ＢＩＭＡＳ（  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／  ）又はＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／Ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐｉｔｏｐｅＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍ）のソフトウェアを用いて行うことができる。次に、（１）前記ペプチドをフロイト不完全アジュバントと混和し、ペプチドワクチンとしてヒトに皮下接種し、ヒトの体内で免疫細胞を作製させるか、又は、（２）ヒト末梢血より分離した細胞にペプチドおよび各種のサイトカインを加えて培養することで免疫細胞を作製させる。
（ｉｉｉ）  ＦＥＡＴタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記（ｉ）の物質若しくは前記（ｉｉ）の細胞を担持した物質
本発明において、「ＦＥＡＴタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記（ｉ）の物質若しくは前記（ｉｉ）の細胞を担持した物質」は、抗腫瘍剤、前記（ｉ）の物質若しくは前記（ｉｉ）の細胞をＦＥＡＴ発現細胞に送達可能な物質を意味する。このような物質の例としては、ＦＥＡＴタンパク質に結合可能なペプチド、糖、低分子、高分子、核酸、金属、抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、前記物質は、抗腫瘍剤が結合した抗ＦＥＡＴ抗体である。
本発明の医薬組成物の投与経路は、該候補薬剤の投与に一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移殖が挙げられ、好ましくは静脈内注射である。
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、粉末等の固形剤であってもよく、溶液、懸濁液若しくは乳液等の液剤、又は軟膏、クリーム若しくはペースト等の半液体製剤であってもよい。
本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、適切な剤形の例としては、細胞懸濁液が挙げられる。細胞懸濁液は、細胞の生存に適した培養培地、サイトカイン、血清（好ましくは、投与対象である患者から採取した自家血清）、非必須アミノ酸、抗生物質等を含んでいてもよい。一方、本発明の医薬組成物が細胞以外の物質を含む場合、適切な剤形の例としては、適切な剤形の例としては、懸濁液又は溶液が挙げられる。懸濁液又は剤形は、前記物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、抗体又は抗癌剤等）の構造維持に適した緩衝剤、生理食塩水、プロテアーゼ阻害剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）等を含んでいてもよい。
上記有効成分は、単独で使用してもよく、又は薬理学的に許容可能な他の成分と共に調合してもよい。薬理学的に許容可能な他の成分の例としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、抗酸化剤、保存剤、補助剤、滑沢剤、甘味剤、香料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の医薬組成物は、有効成分であるＦＥＡＴ阻害物質を治療上有効量で含み得る。ここで、「治療上有効量」とは、その量の有効成分を対象に投与することにより、腫瘍細胞又は前癌細胞の増殖率を低下させることが可能な量を意味する。例えば、静脈内注射剤の場合、治療上有効量は、０．００１〜１０重量％であり、好ましくは、０．０１〜５重量％であり、より好ましくは、０．１〜２重量％である。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、治療上有効量は、１ｘ１０３〜１０１０細胞／ｍｌであり、好ましくは、１ｘ１０４〜１０９細胞／ｍｌであり、より好ましくは、１ｘ１０５〜１０８細胞／ｍｌである。
本発明の医薬組成物の投与量及び投与頻度は、対象の種、体重、性別、年齢、腫瘍疾患の進行度、投与経路といった種々の要因に依存して変化するが、医師、獣医師、歯科医師又は薬剤師等の当業者であれば、それぞれの要因を考慮して投与量を決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物を体重６０ｋｇの成人に局所投与する場合、毎日１〜４回、好ましくは１又は２回投与してもよく、１回あたりの投与量は、０．１〜１５０ｍｇであり、好ましくは１〜５０ｍｇである。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、１回あたりの投与量は、１ｘ１０３〜１０１０細胞であり、好ましくは、１ｘ１０４〜１０９細胞であり、より好ましくは、１ｘ１０５〜１０８細胞である。
例えば、患者に、活性化リンパ球を１回当たり５Ｘ１０７または２Ｘ１０８個を点滴投与し、樹状細胞を１×１０７個を皮下注射してもよいが、投与量は、これに限定されるものではない。
上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度は、典型的な数値を列挙したものであり、これを超える数値又は下回る数値であっても腫瘍細胞又は前癌細胞の増殖率の増加率が低下する場合も十分に考えられる。従って、上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度を超える数値又は下回る数値であっても、本発明の医薬組成物の治療上有効量、投与量及び投与頻度として包含される。
本発明の医薬組成物の対象となる腫瘍の種類は、特に限定されず、良性腫瘍又は悪性腫瘍のいずれでもよい。このような腫瘍の例としては、（１）骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、（２）乳癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、舌癌、咽頭喉頭癌等の癌腫、（３）ホジキンや非ホジキン型のリンパ腫、（４）神経芽細胞腫、（５）メラノーマ、（６）多発性骨髄腫、（７）ウィルムス腫瘍、（８）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等の白血病、（９）グリオーマ等の脳腫瘍、（１０）網膜芽細胞腫等が挙げられ、好ましくは、ヒトでＦＥＡＴタンパク質を発現していることがウェスタンブロッティング、免疫組織的解析、マイクロアレイ解析で既に確認されている腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭喉頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、大腸癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の医薬組成物は、腫瘍増殖を抑制することが可能であるので、腫瘍の予防だけではなく、腫瘍の治療用医薬組成物としても使用することができる。本発明の医薬組成物の投与による、患者体内の腫瘍組織の縮小は、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）、ＰＥＴ（ポジトロン断層法）又はエコー等の診断機器を用いて容易にトレースすることができる。
３．検査方法
本発明は、生体から採取された被験試料と本発明の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法を提供する。
ＦＥＡＴ遺伝子又はＦＥＡＴタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞で限定的に発現されており、正常細胞では殆ど発現されていないため、被検細胞からＦＥＡＴ遺伝子又はＦＥＡＴタンパク質が検出された場合には、該被検細胞は、腫瘍細胞又は前癌細胞であると判断することができる。
本発明において、生体は、特に限定されず、いずれの生物種の生体であってもよい。好ましくは、生体は哺乳動物であり、例えば、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
被検試料は、組織、細胞、粘膜、血液成分（血清、血漿、血球細胞）、涙液、鼻汁、喀痰、唾液、胃液、胆汁、膵液等の消化液、尿、糞便、汗、体毛、乳汁等の生体に由来するサンプルであってもよく、又は培養組織若しくは細胞、培養細胞の抽出物、培養上清等の培養組織若しくは細胞に由来するサンプルであってもよい。
生体から被検試料を採取する方法は、被検試料の種類に応じて変化するが、一般的には、採血、バイオプシー、吸引細胞診、採尿、採便又は腫瘍の外科的切除が挙げられる。このように採取された腫瘍組織から、細胞抽出物を調製するが、細胞抽出物は、採取した腫瘍に含まれる細胞（初代腫瘍細胞）から直接調製してもよく、あるいは、採取した腫瘍に含まれる細胞を適切な条件で培養した後に、初代腫瘍細胞から１又は複数回の細胞分裂によって生じた細胞から調製してもよい。初代腫瘍細胞又は初代腫瘍細胞から細胞分裂によって生じた細胞を回収し、超音波破砕、細胞溶解剤の添加、ホモジェナイジング等によって細胞抽出物を得ることができる。細胞抽出物には、核酸又はタンパク質の分解を防ぐために、ヌクレアーゼインヒビター又はプロテアーゼインヒビターが添加されていてもよい。また、細胞抽出物は、冷凍保存（好ましくは、−８０℃以下の温度で）した後に、本発明の方法に用いてもよい。さらに、被検試料は、上記のように調製した細胞抽出物から更なる精製工程を経て得られた精製タンパク質又は核酸であってもよい。細胞抽出物の調製方法並びにタンパク質及び核酸の精製方法の詳細については、以下を参照できる。
”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”。
本検出方法において、被検試料と本発明の検査用試薬を反応させるには、これらの資料及び試薬を混合すればよい。混合した後に、混合物の組成分布を均一に保つため、混合物を（シェーカー又はローター等を用いて）穏やかに撹拌することが好ましい。本発明の方法は、サンプルに含まれるＦＥＡＴタンパク質若しくはＦＥＡＴ遺伝子及び本発明の試薬に含まれる核酸若しくは抗体の分解を防ぐ観点から、常温（２５℃前後）以下、好ましくは、１５℃、１０℃、８℃、５℃以下で行われ、最も好ましくは４±１℃で行われる。
また、被検試料と本発明の試薬との反応に先立って、被検試料若しくは本発明の試薬のいずれか又は両方をブロッキング剤と混合してブロッキング処理してもよい。あるいは、被検試料、本発明の試薬及びブロッキング剤を全て混合した混合物中で反応を行ってもよい。ブロッキング剤の例としては、血清含有緩衝溶液又はスキムミルク含有緩衝溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＦＥＡＴ遺伝子又はタンパク質を検出するためのアッセイ方法は、腫瘍の検出用試薬の項目で述べた通りである。
４．腫瘍のモデル動物
本発明者らは、ＦＥＡＴ遺伝子を導入することによりＦＥＡＴタンパク質を過剰発現するトランスジェニック（Ｔｇ）動物を作製した。ＦＥＡＴタンパク質の過剰発現により、Ｔｇ動物が複数の器官において腫瘍を形成することが判明した。該Ｔｇ動物に形成された腫瘍は、ヒト患者の腫瘍と病理学的特徴及び遺伝子変化が重複することから、該Ｔｇ動物は、ヒトの腫瘍を詳細に反映する腫瘍モデルとして有用である。
従って、本発明は、ＦＥＡＴ遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物を提供する。
本発明において、「ＦＥＡＴ遺伝子」は、検査用試薬の項目で述べた通りである。
また、本発明にかかる「トランスジェニック非ヒト動物」は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）であり、より好ましくは、遺伝子組換及び交配による次世代動物取得の容易性の観点からマウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類動物である。
４−１．トランスジェニック動物の作製方法
ＦＥＡＴ遺伝子の発現ベクターを作製し、これを受精卵に導入する。発現ベクターの種類、宿主細胞への導入方法、形質転換体のセレクション方法は、医薬組成物の項目で述べた通りである。
受精卵への導入は、マイクロインジェクション法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）により行うことができる。
マイクロインジェクション法は、ＦＥＡＴ遺伝子の発現ベクターを受精卵に直接注入する方法である。この方法では、動物から採取した受精卵に、マイクロマニピュレーター等を用いてＦＥＡＴ遺伝子の発現ベクターを顕微鏡下で直接注入する。
このようにして作製された受精卵を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植して発生させることにより所望のトランスジェニック動物を得ることができる。
前記トランスジェニック動物を、さらに同系の野性型動物とあるいはトランスジェニック動物同士で交配させることにより、トランスジェニック動物系統を維持できる。各個体のジェノタイプは、前述したサザンブロッティングやＰＣＲ法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。
上記のようにして作製されたＦＥＡＴ遺伝子トランスジェニック動物の子孫も、ＦＥＡＴ遺伝子が過剰発現されている限り、本発明のモデル動物に含まれる。
本発明のモデル動物は、動物の種類や系統を変えることにより、種々の腫瘍のモデルとして有用であると考えられる。例えば、腫瘍の例としては、（１）骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、（２）乳癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、舌癌、咽頭喉頭癌等の癌腫、（３）ホジキンや非ホジキン型のリンパ腫、（４）神経芽細胞腫、（５）メラノーマ、（６）多発性骨髄腫、（７）ウィルムス腫瘍、（８）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等の白血病、（９）グリオーマ等の脳腫瘍、（１０）網膜芽細胞腫等が挙げられ、好ましくは、ヒトでＦＥＡＴタンパク質を発現していることがウェスタンブロッティング、免疫組織的解析、マイクロアレイ解析で既に確認されている腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭喉頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、大腸癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のモデル動物は、好ましくは、トランスジェニックマウスである。
本発明のモデル動物は、特に肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）及び／又は悪性リンパ腫のモデル動物として有用である。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
＜１．実験方法＞
試薬
アゴニスト作用性抗Ｆａｓ  ＩｇＭモノクローナル抗体（ＣＨ−１１）は、ＭＢＬ（名古屋、日本）から購入した。カスパーゼ阻害剤のベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ（ｚＶＡＤ−ｆｍｋ）は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｕｂｌｉｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。
プラスミド
Ｈｉｓタグ化ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＦＦ）４０及びＤＦＦ４５（Ｌｉｕ，Ｘ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１３８３６−１３８４０）は、Ｄｒ．Ｘｉａｏｄｏｎｇ  Ｗａｎｇ（Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）から提供して頂いた。プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３は、Ｄｒ．Ｆｕｍｉｋｏ  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ−Ｍｏｒｉｍｏｔｏ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）から提供して頂いた。
組換えカスパーゼの精製
ｐＥＴ−１６ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にコードされるＨｉｓタグ化組換えカスパーゼ３及びカスパーゼ６を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）から以下の手順で精製した。
１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してカスパーゼ発現を１時間誘導した後に大腸菌をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、溶解バッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．５ｍＭスクロース，５％グリセロール，１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ），１％（ｖ／ｖ）アプロチニン（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），ＣＬＡＰ（キモトリプシン、リューペプチン、アンチパイン及びペプスタチン）を１μｇ／ｍｌ含む）中で超音波破砕することにより、細胞を溶解させた。その後、以下の工程を４℃にて行った。
細胞溶解物を遠心し、上清に１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び５ｍＭのイミダゾールを添加し、これを溶解バッファーで平衡化させておいたＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にアプライした。次いで、カラムを洗浄バッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．５ｍＭスクロース，５％グリセロール，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール，６０ｍＭイミダゾール，４００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０４％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０））で十分に洗浄した。Ｈｉｓタグ化カスパーゼを溶出バッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．５ｍＭスクロース，５％グリセロール，５００ｍＭイミダゾール，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１％（ｖ／ｖ）アプロチニン，１μｇ／ｍｌ  ＣＬＡＰ）で溶出し、ＫＰＭバッファー（５０ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ，ｐＨ７．０，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，１．９２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ），２０μＭサイトカラシンＢ，１００μＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ  ＣＬＡＰ）に対して透析を行った。
ラット由来ＦＥＡＴタンパク質の精製
ラットの肝臓の細胞質抽出物（６匹のＷｉｓｔｅｒラットから採取して、１００，０００ｘｇで遠心した上清のうち４ｇ）を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファローズＦＦ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、硫安分画、疎水性相互作用クロマトグラフィー（フェニルセファローズＨＰ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ５２；Ｗｈａｔｍａｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、金属キレートクロマトグラフィー（亜鉛）（ＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ，ＦＰＬＣ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，ＦＰＬＣ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の順に精製した。
上記の各精製工程で得られた分画は、脱塩カラム（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム又はＢｉｏ−Ｓｐｉｎクロマトグラフィーカラム；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にアプライして、溶媒をＫＰＭバッファーに交換した。各分画を、Ｈｉｓタグ化カスパーゼ３及びカスパーゼ６、単離した核（Ｌａｚｅｂｎｉｋ，Ｙ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２３，７−２２）及びＡＴＰ再生系（ＡＴＰ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３１，１２３−１３１）と共に３７℃で２時間インキュベートした。核を１μｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，東京、日本）を用いて形態を観察した。
また、各分画に含まれるタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ，東京、日本）で分離し、２Ｄ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ  ＩＩ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，東京、日本）を用いて染色した（図１Ａ、上段パネル）。
精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に転写し、０．２％Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ及び１％酢酸で染色した。これを切り取ってトリプシン消化した後に質量分析を行った。タンパク質は、マイクロシークエンスに十分な量を回収できていないことが分かった。収量を増加させるため、上記の精製工程を以下のように変更する工夫を加えた。
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファローズＦＦ）、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ５２）、再度の陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファローズＨＰ，ＦＰＬＣ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，ＦＰＬＣ）。このように精製工程を変更することにより、精製タンパク質を複数種類の内部オリゴペプチドとしてマイクロシークエンスすることができた。
ヒトＦＥＡＴ  ｃＤＮＡのクローニング
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＫＢ上皮がん細胞及びＨｅＬａ細胞からＲＮＡを回収した。ヒトＦＥＡＴのｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ（ＥＳＴ）の配列に基づいて作製したプライマーを用いて、逆転写ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。全ての細胞株で検出された２．５ｋｂのｃＤＮＡ断片を、サブクローニングし、シークエンスした後に［３２Ｐ］−ラベルプローブとして用いて、ヒト皮膚λＺＡＰ  ＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２７，５０５−５２０）に対して製造元の使用説明に基づいてスクリーニングを行った。
抗体の作製
プラスミドｐＥＴ−１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）にコードされるＨｉｓタグ化ＦＥＡＴアミノ末端（Ｎ末端）タンパク質（第１−２７４番目のアミノ酸（ａａ）配列；Ｈｉｓ−ＦＥＡＴΔＣ）及びＨｉｓタグ化カルボキシル末端（Ｃ末端）タンパク質（第２８８−６９９番目アミノ酸配列；Ｈｉｓ−ＦＥＡＴΔＮ）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）にて発現させた。発現タンパク質を、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造元の使用説明に従って変性条件下で精製した。精製したタンパク質をＰＢＳで希釈し、これをウサギに注射した。ウサギの抗血清を、Ｈｉｓ−ＦＥＡＴΔＣタンパク質及びＨｉｓ−ＦＥＡＴΔＮタンパク質を用いてアフィニティー精製した（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，東京、日本）。
トランスフェクション
哺乳動物細胞発現プラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を用いて、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅＬａ又はＭＣＦ−７の各細胞にトランスフェクトした。また、同プラスミドを、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、Ｋａｒｐａｓ２９９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬の製造元の使用説明に従って行った。
免疫沈降
以下の全ての工程は、４℃で行った。１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１％（ｖ／ｖ）アプロチニン及び１μｇ／ｍｌ  ＣＬＡＰを添加したＴＮＥバッファー（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．８），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１５分間かけて溶解させ、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清に各抗体を添加して３０分間インキュベートした。ＴＮＥバッファーで平衡化させておいてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファローズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、得られた混合物を２時間ローターで混和させた。ビーズをＴＮＥバッファーで３回洗浄した。ビーズを９５℃のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー中に３分間インキュベートすることにより、ビーズに結合したタンパク質を溶離させた。
メチル基転移酵素活性アッセイ
プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα−ｍｙｃ及びｐｃＤＬ−ＳＲα−ＨＡを用いて、Ｍｙｃタグ化又はＨＡタグ化したヒト由来のＦＥＡＴ、ＦＥＡＴΔＣ及びＦＥＡＴΔＮをＣＯＳ−７細胞中で過剰発現させ、抗ヒトｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０；ｓｃ−４０：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）及び抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｙ−１１；ｓｃ−８０５：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物をメチル基転移酵素バッファー（２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ）で平衡化させた。Ｈｉｓタグ化ＦＥＡＴ及びＦＥＡＴ変異体をコードするｐＥＴ−１６ｂプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で１６℃で１６時間でインキュベートして発現を誘導し、発現タンパク質をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造元の使用説明に従って変性条件下で精製した。次に、精製タンパク質を透析バッファー（５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４），５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％グリセロール，５ｍＭ  ＤＴＴ）に対して透析した。
健康な成人ボランティアから採取した末梢血から、先の文献（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．４８，１９６−２０１）の記載に沿って、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単核球を単離した。Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋａｒｐａｓ２９９細胞及びヒト末梢血単核球を溶解バッファー（２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１％（ｖ／ｖ）アプロチニン，１μｇ／ｍｌ  ＣＬＡＰ）で溶解したものを基質として使用した。組換えＦＥＡＴ（８０ｎｇ／μｌ）、免疫沈降ＦＥＡＴ又はその変異体を、メチル基転移酵素バッファー中で細胞溶解物（１μｌ当たり４μｇのタンパク質を含む）及び５ｎＣｉ／μｌ［１４Ｃ］−Ｓ−アデノシルメチオニンと混合し、３７℃で６０分間インキュベートした。放射性同位体標識メチル化タンパク質を１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イメージアナライザー（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，東京、日本）を用いて可視化した。
スペルミン／スペルミジン合成活性
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで３７℃にて４時間又は１６時間処理することにより、ｐＥＴ−１６ｂプラスミドにコードされるＨｉｓタグ化ＦＥＡＴ及びその変異体の発現を誘導した。大腸菌におけるスペルミン及びスペルミジンの生成量を測定するため、スペルミン／プトレシン比及びスペルミジン／プトレシン比を測定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスペルミン及びスペルミジン合成酵素活性を測定するため、組換えＦＥＡＴ（３０μｇ／ｍｌ）、免疫沈降ＦＥＡＴ又はその変異体を、１ｍＭ  プトレシンジヒドロクロリド（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，大阪、日本）及び０．２ｍＭ  脱カルボキシル化Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｏｓａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓａｉｔａｍａ，ＪａｐａｎのＤｒ．Ａｋｉｒａ  Ｓｈｉｒａｈａｔａから提供）を添加した反応バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加して反応を停止させた。サンプルを１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清をスペルミン及びスペルミジンについて解析した。ポジティブコントロールとしてＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｙｖｅｓｔｒｉｓ由来のスペルミジン合成酵素（ｃＤＮＡは、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎａｒａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｒａ，ＪａｐａｎのＤｒ．Ｔａｋａｓｈｉ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏから提供）を用いた。
ユビキノン生合成の酵母相補性試験
Ｎ末端にＳＡＭ結合モチーフを有することは、ユビキノン合成酵素にも共通する特徴であるので、ヒトＦＥＡＴをコードする２．６ｋｂの完全長ｃＤＮＡ若しくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はＦＥＡＴΔＣのｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ３Ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にサブクローニングした。ＧａｔｅｗａｙクローニングシステムのリーディングフレームカセットＡが酵母発現用プラスミドｐＤＲ１９６（Ｒｅｎｔｓｃｈ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７０，２６４−２６８）のＳｍａＩ部位に組み込まれたｐＤＲ１９６ＧＷベクター（Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣのＤｒ．Ｗ．Ｆｒｏｍｍｅｒから提供）とＬＲ組換えすることにより、ｐＤＲ１９６ＧＷ−ＦＥＡＴ（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）、ｐＤＲ１９６ＧＷ−ＦＥＡＴ（ＯＲＦ）及びｐＤＲ１９６ＧＷ−ＦＥＡＴΔＣのプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、酵母内で強力な恒常的遺伝子発現を可能にする細胞膜ＡＴＰａｓｅ１プロモーターの制御下でＦＥＡＴ又はＦＥＡＴΔＣをコードするものである。これらのプラスミドを、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ａ−Δｃｏｑ５株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＤｒ．Ｃ．Ｆ．Ｃｌａｒｋｅ及びＤｒ．Ｐ．Ｇｉｎからの提供）に導入した。同株は、ＣＯＱ５遺伝子が破壊されている（Ｂａｒｋｏｖｉｃｈ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，９１８２−９１８８）。
上記ＦＥＡＴ発現ベクターを導入した酵母株を、中間対数期（ＯＤ６００〜２．０）に達するまでＳＤ（−ウラシル）液体培地中で培養した。次いで、この培養物５μｌを、唯一の炭素源としてグルコース（コントロール）又はグリセロールのいずれかを含む基礎培地を含有するＳＤ（−ウラシル）アガープレート上にスポッティングした。ユビキノンは、非発酵性炭素源を消費する必要があるため、Ｃ−メチル基転移酵素活性を欠損した出芽酵母ΔＣＯＱ５株は、グリセロールプレート上では、増殖障害を示す。これらのプレートを３０℃で２４時間（グルコース）又は４８時間（グリセロール）インキュベートし、グリセロールプレート上での増殖能の回復を指標としてＣＯＱ５遺伝子の相補性を評価した。
上記相補性試験のポジティブコントロールとして、ＣＯＱ５遺伝子を発現する酵母を以下の手順で作製した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて野生型出芽酵母（Ｗ３０３−１Ａ株）からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。２．０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用いて、逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，大阪、日本）及び以下のプライマーを用いて、ＣＯＱ５遺伝子のコード領域をＰＣＲ増幅した。
0006021151.tif 000004
上記プライマーの下線部は、それぞれＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ認識部位である。得られたＰＣＴ産物（９２４ｂｐ）をｐＥＮＴＲ３ＣベクターにサブクローニングしてｐＥＮＴＲ３Ｃ−ＣＯＱ５を作製した。次に、ｐＥＮＴＲ３Ｃ−ＣＯＱ５をｐＤＲ１９６ＧＷとのＬＲれコンビネーションに用いて、ｐＤＲ１９６ＧＷ−ＣＯＱ５を作製した。
ウェスタンブロッティング
氷上で細胞を氷温の１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸／ＰＢＳに３０分間浸して固定した。１５０００ｒｐｍ、３７℃にて５分間遠心した後、１５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）を添加したＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーにペレットを再懸濁し、９５℃で３分間インキュベートした。以下の全ての工程は室温で行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質は、ＮＡ−１５１２  ｓｅｍｉｄｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ（Ｎｉｈｏｎ  Ｅｉｄｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及びトランスファーバッファー（１７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１．３４４  Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ，ａｎｄ  ５％  ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、１８０ｍＡで４５分間かけてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に転写した。膜をブロッキングバッファー（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、５％脱脂粉乳（Ｄｉｆｃｏ  Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））で１５分間ブロッキングし、次いで、１次抗体を含むブロッキングバッファーで４５分間インキュベートすることで染色を行った。ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で５分間の洗浄を３回行い、ブロッキングバッファーで１：１００００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合２次抗体（ヒツジ由来抗ウサギＩｇＧ（ｓｃ−２００４：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又は抗マウスＩｇＧ（ｓｃ−２００５：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））と１５分インキュベートして、膜をプローブした。膜に対し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間の洗浄を４回行い、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可視化した。
用いた１次抗体は、以下の通りである：抗アクチン抗体（Ａ５０６０；Ｓｉｇｍａ）；抗ヒトｃ−Ｍｙｃ抗体（Ａｎｔｉ−Ｍｙｃ  Ｔａｇ，０６−５４９；Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
ＩＮＳＴＡ−Ｂｌｏｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＩＭＢ−１０５）（ＩＭＧＥＮＥＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、以下のヒト細胞株の細胞溶解物を含む（１レーン当たり１０μｇのタンパク質量）：ＨｅＬａ（子宮頸癌）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）、Ｄａｕｄｉ（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫）、２９３（５型アデノウィルスで形質転換した胎児腎臓細胞）、Ｒｈ３０（横紋筋肉腫）、Ａ３７５（悪性メラノーマ）、Ｔ９８Ｇ（グリオブラストーマ）、ＨＣＴ−１１６（大腸癌）、Ｈｅｐ−２（咽頭癌）。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂｌｏｔ（ヒト）（ＷＢ４６）及びＨｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂｌｏｔ（ＷＢ５１）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）から購入した。ＷＢ４６は、種々の正常組織に由来するタンパク質を含む（１レーン当たり７５μｇのタンパク質量）。ＷＢ５１は、以下の癌細胞に由来するタンパク質を含む（１レーン当たり５０μｇのタンパク質量）：卵巣間質肉腫（ｏｖａｒｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、肺腺癌、肝細胞癌、直腸腺癌、頸部扁平上皮癌、皮膚悪性メラノーマ、精巣胚性癌腫、濾胞性甲状腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、咽喉頭扁平上皮癌、乳管癌、前立腺肥大、膵臓腺癌。
カスパーゼ切断部位の決定
カスパーゼは、一般的には基質のアスパラギン酸残基のカルボキシル側を切断することが知られている（Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８，３８３−４２４）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入したＦＥＡＴ  ｃＤＮＡにコードされる、切断項部位候補となるアスパラギン酸を、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いてアラニンに変異させた。ｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳は、ＴＮＴ  Ｔ７／Ｔ３  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＴｒａｎ３５Ｓ−ｌａｂｅｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。［３５Ｓ］−標識組換え野生型又は変異型ＦＥＡＴタンパク質を、精製した組換えカスパーゼ−３と共に３７℃で２時間インキュベートし、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙで可視化した。
悪性リンパ腫細胞株のＲＴ−ＰＣＲ解析
悪性リンパ腫患者からは、以下の細胞株が樹立されている（Ａｋａｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）：Ｓａｔｏｈ（風土病性Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株）、ＫＳ−Ｂｕ３（散発性Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株）、ＤＬ−４（ｔ（８；１４）転座を有するＤＬＢＬ細胞株）、ＫＩＳ−１（ｔ（９；１４）染色体転座を有するＤＬＢＬ細胞株）、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ（精巣ＤＬＢＬ細胞株）、Ｍｕｒａｎａｋａ（Ｔ細胞リンパ腫細胞株）、Ｋａｒｐａｓ（ｔ（２；５）染色体トランスロケーションを有するＡＬＣＬ細胞株）、ＤＬＢＬ（びまん性巨大Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ））、ＡＬＣＬ（未分化巨大細胞リンパ腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ））。
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡの１ｓｔストランドを合成した。ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）及び以下のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った：
0006021151.tif 000005
Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）発現細胞におけるアポトーシス性ＤＮＡ切断の解析
細胞に野生型ＦＥＡＴ若しくは変異型ＦＥＡＴタンパク質をコードするプラスミド及びｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ）をコトランスフェクトし、スタウロスポリン（ＳＴＳ）（Ｓｉｇｍａ）で処理した。断片化ＤＮＡ含有を有するＥＧＦＰ発現アポトーシス細胞を、Ｌａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７の記載に沿って定量した。即ち、細胞を、穏やかな固定溶液（２％パラホルムアルデヒド、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭスクロース、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０））を用いて室温で３０分間固定し、次いでエタノール固定を行い、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
好中球の単離、タンパク質導入及び自発的アポトーシスの解析
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．４８，１９６−２０１）の記載に沿って、ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  Ｐｅｒｃｏｌｌ濃度勾配による分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行い、健康な成人ボランティアから採取した末梢血から好中球を単離した。Ｈｉｓタグと野生型又は変異型ＦＥＡＴタンパク質のＮ末端との間に、タンパク質を細胞膜透過性に変化させるＰＴＤ−４配列（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ：配列番号１５）（Ｈｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，４７４−４７７）を導入した。好中球は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）培地（ＦＢＳ−ＲＰＭＩ）に懸濁し、１μＭの精製タンパク質で３７℃にて１５分間処理した。その後、細胞をＦＢＳ−ＲＰＭＩで希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞をＦＩＴＣ結合ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及びＰＩ（ＡｐｏＡｌｅｒｔ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）で染色し、断片化ＤＮＡ含有細胞の量をフローサイトメトリー解析することにより好中球のアポトーシス率を測定した。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）．
ｐＭｕｎｉＨ１プラスミドは、Ｄｒ．Ａｒａｓａｍｂａｔｔｕ  Ｋ．Ｍｕｎｉｒａｊａｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｄｒａｓ，Ｔｅｒａｍａｎｉ，Ｉｎｄｉａ）から提供して頂いた。ｐＭｕｎｉＨ１プラスミドには、Ｈ１  ＲＮＡプロモーターにより発現されるｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）とネオマイシン選択マーカーがコードされている。Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，９３６−９４８）に記載される基準に沿って、ＦＥＡＴ  ｃＤＮＡのうちＲＮＡｉに適切な部位を選択した。選択の結果、ＯＲＦ内の第１８３、２５９、１３８５、１５５０、１６３４、２０５６番目を始点とする２１塩基対を標的とするオリゴヌクレオチドを合成し、ｐＭｕｎｉＨ１にライゲーションした。ｓｈＲＮＡプラスミドを、Ｍｙｃタグ化ＦＥＡＴをコードするプラスミドと共にＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションし、各プラスミドによるｍｙｃ−ＦＥＡＴ発現の抑制能力を、抗ヒトｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体（抗Ｍｙｃタグ）を用いたウェスタンブロッティングにより評価した。ＲＮＡｉ活性を有するプラスミドを選択してＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ）の存在下で１０日間セレクションを行った後にコロニーピックアップを行い、内在性ＦＥＡＴタンパク質の発現が抑制されたクローンのスクリーニングを行った。
免疫蛍光法
特記しない限り、下記の全ての工程は室温で行った。３５ｍｍガラス底ディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ，大阪、日本）に接着させた細胞を、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定し、０．５％（ｗ／ｗ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで３０分間透過処理し、次いで、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳでブロッキングした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、３％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した抗ＦＥＡＴΔＮ抗体（他のタンパク質と最も交差反応性が低い：図４Ａ及び図５Ａ参照）と１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又は５８８と結合した抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩと１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ガラス底ディッシュにカバースリップを乗せ、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントした。染色細胞をＤＭ  ＩＲＥ２蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察し、Ｌｅｉｃａ  Ｑ  Ｆｌｕｏｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で制御可能なＤＣ  ３５０Ｆカメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて画像撮影を行った。アクチンを可視化させるため、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２次抗体と共に添加した。ミトコンドリアを可視化させるため、生細胞を固定化する前に、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３７℃で３０分間インキュベートした。小胞体（ＥＲ）を可視化させるため、細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１５分間固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで１０分間透過化させ、ＥＲ染色試薬（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ブロッキングを行い、更にＦＥＡＴ染色を行った。
マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリング
ヒトＦＥＡＴのＯＲＦのｃＤＮＡを、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のエントリーベクターｐＥＮＴＲ３Ｃにサブクローニングした。ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのＬＲリコンビネーションにより、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １αプロモーター制御下でＦＥＡＴが発現されるｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ＦＥＡＴを作製した。ＨｉｌｙＭａｘ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，熊本、日本）を用いてｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ＦＥＡＴをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳ（Ｋａｋｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，東京、日本）の存在下で７日間セレクションを行った後に、コロニーピックアップを行い、ＦＥＡＴタンパク質を過剰発現するクローンを選別した。ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ベクターのｃｃｄＢ遺伝子を切除してｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ΔｃｃｄＢプラスミドを作製した。ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ΔｃｃｄＢプラスミドを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に安定にトランスフェクトすることで、コントロール細胞株ΔｃｃｄＢ−１、−２及び−３を作製した。
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたコントロール細胞並びにＦＥＡＴ強制発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞株（ＦＥＡＴ−３、−１５及び−２０）からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｙｕｓｈｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙが所有するＳｅｎｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ−６  ｖ２  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて遺伝子発現プロファイルの解析を行った。最初に、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ  ３．０ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて遺伝子発現の生データを正規化した。検出ｐ値＞０．０１（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｂｅに基づく）の平均シグナルは、解析から除外した。以下のＵＲＬから入手可能なソフトウェアを用いてＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を行った。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／
ＦＥＡＴトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの作製
全ての動物実験は、千葉県がんセンターの動物実験委員会の承認に基づいて行った。ヒトＦＥＡＴ  ＯＲＦのｃＤＮＡをｐＫＣＲ−Ｈ−２Ｋｄベクター（Ｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１，２６７−２６９）（Ｄｒ．Ｔ．Ｈｏｎｊｏ及びＤｒ．Ｉ．Ｃｈｕｎｇ−Ｏｋａｚａｋｉ（Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）から提供）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。Ｎａｇｙ，Ａ．，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．ｅｄｓ．（（２００３）．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））の記載に従って、Ｈ−２Ｋｄ（ＭＨＣクラスＩ）プロモーター、ＦＥＡＴ  ＯＲＦ、βグロビンのイントロン及びＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含むＫｐｎＩ／ＳｐｈＩ断片を精製した。
Ｔｇマウス及び同腹のトランスジーン陰性マウス（非トランスジェニック：ｎｏｎ−Ｔｇ）は、千葉県がんセンター研究局のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）動物施設で飼育した。メスのＴｇマウスの子孫は殆ど生まれてくることがなく、ホモ接合Ｔｇマウスを作製することはできなかった。従って、オスのＴｇマウスを正常メスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と交配させることにより、Ｔｇマウス系統を維持した。マウスは、定期的に腫瘍及び他の疾患の兆候について検査した。腫瘍を患ったマウス又は瀕死状態のマウスは、楽死させて死体解剖を行った。Ｔｇマウスの副睾丸から精子を回収し、九動株式会社（鳥栖、日本）に凍結保存を委託した。
マウス臓器内でのタンパク質発現
６ヶ月齢のＴｇマウス及びｎｏｎ−Ｔｇ同腹子を二酸化炭素で安楽死させた後に解剖した。各臓器を液体窒素で凍結させ、ハンマーで破砕した。破砕した組織をＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０，１％デオキシコレート（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％ＳＤＳ）に懸濁し、液体窒素と氷上での凍結融解を３回繰り返すことで完全に溶解させた。１５０００ｒｐｍ、０℃で１０分間遠心して上清を回収した。抽出物に含まれるタンパク質の濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに１レーン当たり３０μｇの総タンパク質量となるようにサンプルをローディングし、これを抗ＦＥＡＴΔＮ抗体でウェスタンブロッティングした。
マウス胸腺細胞のアポトーシス性細胞死
胸腺を切除して、３７℃にて１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）と共に１ｍｌ滅菌シリンジを用いて粉砕することにより胸腺細胞を単離した。次いで、５％  ＣＯ２インキュベーターで、細胞をＦａｓリガンド（ｒｈｓＳｕｐｅｒＦａｓＬｉｇａｎｄ：Ａｌｅｘｉｓ，Ｌａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又はデキサメタゾン（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，京都、日本）のいずれかで処理するか、あるいは未処理で維持した。細胞をａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＣＦＳ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）及びＰＩで染色し、次いでフローサイトメトリー解析することにより、細胞死を測定した。
マウス組織の顕微鏡解析
マウスの各臓器を切除した後、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、２ｍｍ厚に切り出し、組織カセット（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｕｎｉ−Ｃａｓｓｅｔｔｅ；サクラファインテックジャパン株式会社、東京、日本）にセットした上で、新たな固定液に浸潤させた。更なる加工及び病理組織学的検討は、奈良病理研究所（奈良、日本）において行った。
固定した組織をエタノールの段階希釈液（２０％〜１００％）及びキシレン溶液を用いて脱水し、自動組織プロセッサーを用いて組織をパラフィン包埋し、マイクロトームで切片化し、脱パラフィン化して、再水和させ、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）を行った。Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、以下のマーカーについて免疫組織化学染色を行った：ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）（Ｂ細胞マーカー）；ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）。
免疫組織化学
パラフィン包埋した切片をＣｌｅａｒ−Ａｄｖａｎｔａｇｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で脱パラフィン化し、再水和させ、Ｃｉｔｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で処理し、ＩｍｍＰＲＥＳＳ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＩｍｍＰＡＣＴ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造元の使用説明に従って用いて染色を行った。スライドをＭａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）で対比染色し、Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてカバースリップをマウントした。
以下の１次抗体を用いた：抗アルブミン・ウサギポリクローナル抗体（Ａ０００１；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、抗ｐｒｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ（ｐｒｏＳＰ−Ｃ：２型肺胞上皮細胞のマーカー）ウサギポリクローナル抗体（ＡＢ３７８６；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）マウスモノクローナル抗体（ＡＢ３７８６；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び抗βカテニン・マウスモノクローナル抗体（６１０１５３；ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
ＭＤＭ２は、抗ＭＤＭ２マウスモノクローナル抗体（ｓｃ−９６５；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｍ．Ｏ．Ｍ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＤＡＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色した。抗ＦＥＡＴΔＮ抗体及び抗ＦＥＡＴΔＣ抗体は、それぞれ、ＦＥＡＴタンパク質の別の部位を認識する抗体であり、そのエピトープは、重複しない。これらの抗体で染色を行った結果、マウスの脳及び精巣において同一の領域が染色され、ＦＥＡＴ染色の特異性が示唆された。
アレイＣＧＨ用のゲノムＤＮＡの調製
Ｔｏｍｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８の記載に沿って、マウス組織からゲノムＤＮＡを調製した。即ち、２ｍｌマイクロチューブ内で粉砕した組織を１ｍｌの氷冷ＴＥＮバッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、５０μｌの１０％  ＳＤＳと共に穏やかに撹拌した。２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを２５μｌ添加し、組織を５０℃で一晩インキュベートした。次に、１ｍｌ  ＴＥ飽和フェノール（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，東京、日本）を添加し、サンプルを室温にて１時間ローターで混和した後に８０００ｒｐｍ、１５℃で１５分間遠心して水層を回収した。上記のフェノール抽出を繰り返した後、水層を回収し、１ｍｌのクロロホルムイソアミルアルコールを添加した。混合物を室温にて１時間ローターで混和し、３０００ｒｐｍ、１５℃で１０分間遠心して水層を回収した。事前に−２０℃に冷却しておいたエタノールを２ｍｌ添加し、穏やかに撹拌するとゲノムＤＮＡの沈殿が生じた。パスツールピペットを用いてこの沈殿物を１ｍｌの７０％エタノールの入った１．５ｍｌ微小遠心管に写し、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。ペレットを２００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で再懸濁し、ローターで室温にて一晩混和させて溶解させた。ＤＵ  ８００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて２６０ｎｍ吸光度を測定してＤＮＡ濃度を測定した。ＤＮＡの純度は、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含有する０．８％アガロースゲルを用いて２００ｎｇのＤＮＡを電気泳動することにより評価した。スメアの生じなかったＤＮＡ試料のみを次の工程に用いた。
アレイ−ＣＧＨ
アレイ−ＣＧＨ用の２４４ｋスライドフォーマット６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ  ２４４Ａ）に対し、以下のＤＮＡを用いてＤＮＡ標識及びハイブリダイゼーションを行った：マウス肝細胞癌由来ゲノムＤＮＡ（実験サンプル）；正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝臓由来ゲノムＤＮＡ（対照サンプル）。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の使用説明に従い、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてマイクロアレイをスキャンし、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いてデータ抽出を行い、ＣＧＨ  ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ３．４ソフトウェアを用いてデータ解析を行った。
組織アレイ
ホルマリン固定パラフィン包埋された種々の正常組織及び腫瘍組織断片スポットされた組織アレイ（Ｂｌｏｗ，２００７）をＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．（Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から購入した。以下のマイクロアレイを用いた：ＭＣ５００１（複数器官の癌及び正常組織の高密度マイクロアレイ）；ＢＲ７２１（同一個体の癌隣接正常組織及び正常組織コントロールを含む乳癌組織マイクロアレイ；ＢＣ０５０２１（大腸腺癌（悪性及び正常試料の組み合わせ）；ＬＶ８０３（肝臓癌（癌組織、癌隣接組織及び正常組織の組み合わせ）。
マウス肝細胞癌におけるｐ５３及びβカテニンの変異の解析
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて切除直後のマウス肝細胞癌組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。ｐ５３のＯＲＦの増幅には、以下の２セットのプライマーを用いた：
0006021151.tif 000006
増幅産物に対しダイレクト・シークエンスを行った。さらに遺伝子変異の確認を行うため、ゲノムＤＮＡと以下のプライマーセットを用いてマウスｐ５３遺伝子のシークエンスを行った：
0006021151.tif 000007
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ、アレイ−ＣＧＨ用に調製した肝細胞癌ゲノムＤＮＡ及び以下のプライマーセットを用いてマウスβカテニン遺伝子のエキソン１〜３の領域をＰＣＲ増幅した。この領域に含まれるエキソン２は、変異が頻繁に生じるホットスポットである（ｄｅ  Ｌａ  Ｃｏｓｔｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，８８４７−８８５１）。
0006021151.tif 000008
さらにＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼと以下のプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った：
0006021151.tif 000009
得られた増幅産物に対し、ダイレクト・シークエンスを行った。
統計解析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのアドインパッケージであるＳｔａｔｃｅｌ２（オーエムエス出版、所沢、日本）を用いて統計解析を行った。
＜２．実験結果＞
ＦＥＡＴタンパク質の生化学的精製
無細胞系を用いた核アポトーシスの制御分子の解析から、活性分画の中央においてアポトーシス促進活性の減弱が見られると共に、見かけの分子量がそれぞれ７４ｋＤａ及び６６ｋＤａの２種類のペプチドが出現していることを見い出した（図１Ａ）。これらのペプチドを精製したところ、６６ｋＤａのタンパク質は、ＳＷＡＰ−７０と呼ばれるＢ細胞のアポトーシスを制御する分子であった。７４ｋＤａのタンパク質は、「ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ−０１（ＣＧＩ−０１）」（Ｌａｉ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０，７０３−７１３）、「ＫＩＡＡ０８５９」又は「ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｉｋｅ  １３（ＭＥＴＴＬ１３）」と呼ばれるタンパク質のラットホモログであることが判明した。その発現パターン及び機能から、「ＦＥＡＴ」（ｆａｉｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｂｅｒｒａｎｔ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ）と命名した。
ＦＥＡＴは、Ｓ−アデノシルメチオニン結合モチーフ（ＳＡＭ結合モチーフ）を２つ含んでいる。ＳＡＭ結合モチーフは、メチル基転移酵素及びその関連酵素に特徴的なモチーフである（Ｋａｇａｎ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１０，４１７−４２７）。種間においてＦＥＡＴの構造は高度に保存されている（図１Ｂ）。図１Ｂに示すアライメントの上部の棒線Ｉ、ｐｏｓｔＩ、ＩＩ及びＩＩＩは、ＳＡＭ結合モチーフを示す。また、アライメント上の矢印は、カスパーゼ３の切断部位を示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＢｏｘｓｈａｄｅソフトウェアを用いて作製した。
完全長又は切断型のいずれのタイプのＦＥＡＴタンパク質においても、タンパクメチル基転移酵素活性又はスペルミジン／スペルミン合成活性は認められなかった（データ非公開）。酵母を用いた相補性試験では、ＦＥＡＴは、ユビキノン合成酵素ではないことが示唆された（図１Ｃ）。
カスパーゼ３によるＦＥＡＴの切断
スタウロスポリン（ＳＴＳ）でＣＯＳ−７細胞のアポトーシスを誘導したところ、トランスフェクションで発現させたＦＥＡＴが切断されていた（図２Ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写／翻訳されたＦＥＡＴは、カスパーゼ３では切断されたが、カスパーゼ６では切断されなかった（図２Ｂ）。カスパーゼ３欠損のＭＣＦ−７細胞では、ＦＥＡＴは殆ど切断されていなかったが、プロカスパーゼ３を共発現させると、ＦＥＡＴは効率的に切断された（図２Ｃ）。部位特異的変異導入試験を行い、ヒトＦＥＡＴタンパク質のカスパーゼ切断部位を同定した（図２Ｄ）。Ｆａｓ及びＳＴＳでアポトーシス誘導したＪｕｒｋａｔＴ細胞では、内在性ＦＥＡＴは切断されていた（図２Ｅ）。これらの結果から、ＦＥＡＴは、アポトーシス細胞死においてカスパーゼ３によって切断されることが示された（図２Ｆ）。
ＦＥＡＴによるアポトーシス細胞死の抑制
ヒトＦＥＡＴ遺伝子は、染色体の１ｑ２４．３に位置するが、この部位は、悪性リンパ腫において高頻度で増幅されており、予後不良と関連している。リンパ腫細胞株において、ＦＥＡＴ  ｍＲＮＡの発現量は、ＳＴＳ誘導性アポトーシスの抑制と相関していた（図３Ａ）。カスパーゼによる抗アポトーシス性キナーゼ及びホスファターゼの切断により、生存系のシグナルが遮断され、アポトーシス誘導ペプチド断片が生じることにより、アポトーシスが誘導されることが知られている（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｓ．（２００９）Ｃｅｌｌ  １３８，８３８−８５４）。ＦＥＡＴ又はカスパーゼ３により切断されたＦＥＡＴ断片がアポトーシスに影響するかどうかを確かめるため、カスパーゼ３切断部位に変異を有するＦＥＡＴ又は有しないＦＥＡＴをコードするｃＤＮＡをＫａｒｐａｓ２９９細胞に導入した。Ｄ２７４Ａ／Ｄ２８８Ａ変異体を発現するＫａｒｐａｓ２９９細胞では、ＳＴＳ誘導性アポトーシスが有意に減少していた（図３Ｂ）（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（＊，Ｐ＜０．０１；＊＊，Ｐ＜０．０２５，ｎ＝３；ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ））。Ｄ２７４Ａ／Ｄ２８８Ａ変異体に更にＤ１１２Ａ変異を導入することにより、Ｄ２７４Ａ／Ｄ２８８Ａ変異体がアポトーシスを抑制する能力が消失した（Ｄ１１２Ａ／Ｄ２７４Ａ／Ｄ２８８Ａ）。これにより、Ｄ１１２が、抗アポトーシス機能に不可欠であることが示唆された。
ウェスタンブロッティングを行ったところ、Ｋａｒｐａｓ２９９細胞は、内在的にＦＥＡＴを発現していることが判明した（データ非公開）。ＦＥＡＴを発現しない細胞を探索したところ、殆ど全ての癌由来細胞株はＦＥＡＴを発現していたため（図４Ａ）、好中球を用いることにした（図４Ｂ：急性リンパ性白血病患者から採取した末梢血単球（ＡＬＬ）及び健常ボランティアから採取した好中球（ｎｏｒｍａｌ−１〜４））。野生型ＦＥＡＴ（ＦＥＡＴ  ｗｔ）及びＦＥＡＴΔＮ（アミノ酸（ａａ）２８９−６９９：カスパーゼ３に切断された断片に相当）のタンパク質導入により、好中球の自発的アポトーシスが有意に抑制された（図４Ｃ）（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ；＊，Ｐ＜０．００２，ｎ＝９；＊＊，Ｐ＜０．０００２，ｎ＝９；＊＊＊，Ｐ＜０．０２，ｎ＝４；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０２，ｎ＝４；ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。Ｄ２７４Ａ／Ｄ２８８Ａ変異体では、ＦＥＡＴ  ｗｔ又はＦＥＡＴΔＮと比べてより強力な抑制効果が認められた。一方、ＦＥＡＴΔＣ（ａａ  １−２７４）は、アポトーシスに対する抑制効果が認められないが、ＦＥＡＴΔＮの抗アポトーシス効果に干渉することが判明した（図４ＣのＦＥＡＴΔＮ＋Ｃ）。ショートヘアピンＲＮＡによりＦＥＡＴ発現をノックダウンしたところ（図３Ｃ）、ＨｅＬａ細胞のＳＴＳ誘導性アポトーシスが増加した（図３Ｄ）（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（＊，Ｐ＜０．０１；＊＊，Ｐ＜０．０２５，ｎ＝３；ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ））。これにより、内在性のＦＥＡＴによってもアポトーシス細胞死が抑制されていることが示された。一方、ＦＥＡＴをノックダウンしても、細胞周期及び細胞増殖には影響が認められなかった。以上を考慮すると、ＦＥＡＴにはアポトーシス抑制能があり、この抑制能は、カスパーゼがＦＥＡＴのＤ２７４及びＤ２２８を切断することにより失われることが導き出される。
図３Ａは、リンパ腫細胞株のＲＴ−ＰＣＲの結果を示すものであり、この結果は、ＦＥＡＴ発現量が、アポトーシス発生率と逆相関することを示している。
免疫染色を行ったところ、ＦＥＡＴは、びまん性に細胞質、核、及び部分的にＥＲに局在していた（図３Ｅ）。ＰＳＯＲＴ  ＩＩ解析において得られた、３４．８％の確率でＥＲに存在するという予測と一致するものであった。ＦＥＡＴは、アクチン及びミトコンドリアとは共局在していなかった（図３Ｅ：拡大率ｘ４００）。
ヒト癌細胞におけるＦＥＡＴの発現異常
ＦＥＡＴは、一連のヒトの遺伝子発現のＳＡＧＥトランスクリプトーム実験にて使用されるＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧタグ（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３，３８７−３８８）に相当することが判明した。ＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧタグは、正常組織よりもヒトの大腸癌、脳腫瘍、乳癌、肺癌、メラノーマにおいて発現レベルが上昇している。ヒトの正常細胞をウェスタンブロット解析したところ、ＦＥＡＴは、精巣、脳及び肝臓において弱い発現が見られる程度であった（図５Ａ）。このウェスタンブロット解析の結果は、メッセンジャーＲＮＡの発現と一致している（Ｌａｉ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０，７０３−７１３）。正常細胞とは対照的に、殆どの種類のヒト癌組織においてＦＥＡＴタンパク質の中程度〜強い発現が観察され（図５Ｂ）、ＦＥＡＴが腫瘍発達に関与する遍在タンパク質であることが示された。
腫瘍形成においてＦＥＡＴが何らかの機能を有するか否かを調べるため、ＦＥＡＴタンパク質の発現量が低いＮＩＨ３Ｔ３細胞内でＦＥＡＴを過剰発現させ、マイクロアレイにより転写プロファイルの変化を網羅的に解析した。図５Ｃにコントロールプラスミド（ΔｃｃｄＢ−１、ΔｃｃｄＢ−２及びΔｃｃｄＢ−３）並びにヒトＦＥＡＴ  ｃＤＮＡ発現プラスミド（ＦＥＡＴ−３、ＦＥＡＴ−１５及びＦＥＡＴ−２０）が導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の抗ＦＥＡＴ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，１５５４５−１５５５０）を行ったところ、ＦＥＡＴの過剰発現に伴って、チロシンキナーゼ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＲＴＫ）及びＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル経路のシグナルの上昇が認められた（図５Ｄ（左パネル、エンリッチメントプロット；右パネル、ヒートマップ）及び表１）。これらのシグナル経路は、腫瘍の発生及び維持に重要な役割を果たすことが知られている（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０，７８９−７９９；Ｒｕｂｉｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５，１０２６−１０３３）。これらの結果は、ＦＥＡＴが、腫瘍促進タンパク質としてのポテンシャルを有することを示唆している。
【表１】
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図５Ｄは、ヒトＦＥＡＴ  ｃＤＮＡをトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞のゲノムワイド発現プロファイルのＧＳＥＡ解析結果を示す。図５Ｄの左パネル及び右パネルは、それぞれエンリッチメントプロット及びヒートマップを示し、これらには、エンリッチメントスコア（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＥＳ）＞０．５及びフォルスディスカバリーレート（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ：ＦＤＲ）ｑ−ｖａｌｕｅ＜０．２５の遺伝子セットがリストされている。
ＦＥＡＴの上方制御によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成促進性
ＦＥＡＴの発現量の上昇の腫瘍形成への寄与を評価するため、ヒトＦＥＡＴを発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製した（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２１，２２５８−２２７０）。ヒトＦＥＡＴは、種々のヒト組織で活性を示すプロモーターの制御下で発現させた。Ｔｇマウスは、メンデルの法則に従った比率で出生した。新生Ｔｇマウスの約１５％に先天性の白内障が認められたこと以外は、月齢９ヶ月に成長するまで他の器官は正常に発達し、組織学的にも異常は認められなかった。初代Ｔｇマウス６匹のうち、１匹のメス（ライン１０）及び一匹のオス（ライン１４）については、複数の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交尾させたところ、生殖能を有していないものと判断した。１匹の初代Ｔｇオスマウス（ライン２３）の１世代目の子孫、及び１匹の初代Ｔｇオスマウス（ライン１８）の２世代目の子孫は、生殖能を有していなかった。
２世代目Ｔｇマウス（ライン１、１６及び１８）の精子を顕微鏡観察したところ、同腹の非トランスジェニック（ｎｏｎ−Ｔｇ）マウスと比べて精子の運動性が低下していた。ウェスタンブロット解析では、Ｔｇマウスの胸腺、脾臓、肝臓及び肺においてヒトＦＥＡＴの発現が認められた（図６Ａ：左パネル、ｎｏｎ−Ｔｇマウス；右パネル、Ｔｇマウス）。Ｔｇマウス由来の胸腺細胞では、Ｆａｓリガンド誘導性細胞死及びグルココルチコイド誘導性細胞死が有意に減少しており（図６Ｂ）（Ｆａｓリガンド（左パネル）；ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、＊，Ｐ＜０．０２５；＊＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．０２５，ｎ＝５；ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ：デキサメタゾン（右パネル）；ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、＊，Ｐ＜０．０４；＊＊，Ｐ＜０．０５，ｎ＝６；ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ））、Ｔｇマウス内でのＦＥＡＴの発現により、アポトーシスが抑制されたことが示された。初代、第１世代及び第２世代ＦＥＡＴ  Ｔｇマウスに発生した腫瘍を図６Ｃに示す（ＨＣＣ：肝細胞癌）。
Ｔｇマウスが月齢１２ヶ月に達すると、肝臓内で肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）（図７Ａ：矢印）及び悪性リンパ腫の発生が観察され始めた（図７Ｃ：矢印）。対照的に、同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウスでは、肝細胞癌の発症は認められず、リンパ腫についても、非常に低い発症率（１８％、１７匹中３匹）しか認められなかった。従って、Ｔｇマウスは、同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウスと比べて腫瘍を形成しやすいか、あるいは寿命が短かった（図８Ａ：Ｔｇマウス（赤線：ｎ＝４０）及び同腹ｎｏｎ−Ｔｇマウス（青線：ｎ＝１７）の非担癌生存率（ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット（Ｐ＜０．０４，ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ））。Ｔｇマウスの肝細胞癌及びリンパ腫は、４匹の異なる初代Ｔｇマウスの子孫（ライン）において観察された（図６Ｃ）。このことは、内在性の癌遺伝子に導入遺伝子が挿入されて活性化された結果として腫瘍が形成されたという可能性を否定するものである。肝細胞癌は、ヒトにおいて男性に頻繁に発症するが（Ｎａｕｇｌｅｒ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７，１２１−１２４）、マウスにおいても同様の傾向が認められた（図６Ｃ）。ヒトの肝細胞癌と同様、殆どのマウス肝細胞癌は、高分化腫瘍であった（図８Ｂの上段パネル）。また、マウス肝細胞癌では、明細胞型（図８Ｂの左下段パネル）及び細胞質封入体（図８Ｂの右下段パネル）といった変異型も観察された。２匹の肝細胞癌マウスでは、肺への転移も観察された（図８Ｃ）。殆どのリンパ腫は、胚中心芽球性（ｃｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｉｃ）又は免疫芽球性（ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ）のびまん性Ｂ細胞リンパ腫及び、いわゆる“星空像（ｓｔａｒｒｙ−ｓｋｙ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）”を示すＢｕｒｋｉｔｔ様Ｂ細胞リンパ腫に属するものであった（図９Ａ）。いずれの変異型もＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を発現し（１００％，１５匹中１５匹）（図９Ａの挿入図）、イムノグロブリン遺伝子のクローン性再構成を示した（８３％、６匹中５匹）。これらの特徴は、ヒトのリンパ腫患者に最もよく見られるＢ細胞型リンパ腫の特徴と一致する。実験に用いたリンパ腫のいずれもＣＤ３陽性を示さなかった（０％、７匹中０匹）。巨細胞を伴うＣＤ４５Ｒ及びＣＤ３陰性の変異型も観察された（図９Ｂ）。これらのリンパ腫は、浸潤性が強く、高頻度で膵臓に浸潤していた（図９Ｃ）。２匹のマウスは、リンパ腫及び肝細胞癌の両方を患っており（図９Ｄ）、そのうち１匹は肺腺癌も患っていた（図９Ｅ）。肝細胞癌で発現するＦＥＡＴ導入遺伝子をシークエンスしたところ、突然変異は認められなかった（０％、５匹中０匹）。このことは、腫瘍形成において、ＦＥＡＴの構造変化が必要とされないことを示している。ＣＦ−１及びＣ３Ｈ純系マウスとは異なり、Ｃ５７ＢＬ／６純系マウスでは肝細胞癌は殆ど発症しないことが知られている（Ａｎｉｓｉｍｏｖ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ５，８０７−８１９）。従って、ＦＥＡＴ  Ｔｇマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６純系種において肝細胞癌及びリンパ腫の両方を高い浸透度で発症するユニークなマウスモデルである。
肝細胞癌及び悪性リンパ腫を患うＦＥＡＴ  Ｔｇマウスの初代、第１世代及び第２世代マウスの肉眼写真をそれぞれ図７Ａ及び図７Ｃに示す。図７Ａの矢印は、肝臓に発生した腫瘍を示し、図７Ｃの矢印は、悪性リンパ腫によって腫大した腸間膜リンパ節、縦隔リンパ節及び腋窩リンパ節並びに肝臓及び脾臓を示す。図７Ｂに示す写真は、精子保存のために解剖した際に偶然初期の肝細胞癌を発見された月齢９ヶ月のオスＴｇマウス（図８Ｂの左下段パネル）の写真であり、肝臓に微小な腫瘍（矢印）を有する。これにより、肝臓癌の発生は、月齢１２ヶ月よりも早期に起こることが分かった。図７Ｄは、同じＴｇマウスに同時に生じたリンパ腫（上段パネル）及び横紋筋肉腫（下段パネル）の顕微鏡写真を示す（Ｈ＆Ｅ染色：ｘ４００拡大率）。図７Ｅは、肝細胞癌を患うＴｇマウス（赤線）及びリンパ腫を患うＴｇマウス（青線）の非担癌生存率（ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。
図１０は、マウス染色体のうち、増幅個所（赤色）及び欠失個所（緑色）を示すＧｒａｐｈｉｃａｌ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎである。該Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎは、６匹のＦＥＡＴ  Ｔｇマウスの肝細胞癌（ＨＣＣ）、１匹のＴｇマウスの正常な肝臓、及び１匹のｎｏｎ−Ｔｇマウスの正常な肝臓由来のＤＮＡをＣＧＨ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ３．４  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｚ−ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：２．５）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解析した結果である。
ヒト肝細胞癌モデルとしてのＦＥＡＴ  Ｔｇマウス
ヒト癌患者と生理学的及び分子レベルでの特徴が酷似する癌を生じるモデルマウスを用いれば、ヒトの癌の原因を決定し、癌の予防方法を開発し、新たな治療法を開発及び試験することができる。そこで、ＦＥＡＴ  Ｔｇマウスの肝細胞癌が、ヒト肝細胞癌と同様の遺伝子変化を有するかどうかを評価した。
マウス肝細胞癌が、ヒト患者と同様の染色体変化を有するかどうかを調べるため、マイクロアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ａｒｒａｙ−ＣＧＨ）、アレイＣＧＨ）により、ゲノム領域の増幅（ｇａｉｎ）及び欠失（ｌｏｓｓ）（コピー数変化：ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ（ＣＮＡ））を解析した。巨視的に、マウス肝細胞癌では、ゲノムの状態が不安定であり、欠失よりも増幅が多く観察された（図１０）。この結果は、ヒトの肝細胞癌と類似するものであった（Ｚｅｎｄｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２５，１２５３−１２６７）。一方、肝細胞癌を患っていないＴｇマウスに由来する肝臓では、著しいコピー数変化は認められなかった。以上の結果から、ゲノムの不安定性は、ＦＥＡＴ導入遺伝子による直接的な影響によるものではなく、肝癌形成過程を通じて生じたものであることが示された。最近の研究において、ヒト乳癌のゲノムでは、３ｋｂ〜１Ｍｂの微小な領域のタンデム重複が、構造上の変化として共通して観察されることが報告されている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，１００５−１０１０）。今回の高分解能アレイＣＧＨでも、マウス肝細胞癌において、染色体の微小な領域の増幅及び欠失が認められた。微小な領域のコピー数変化には、以下の１８種類のがん関連遺伝（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓ／）が含まれていた：ＭＤＳ１，ＰＤＧＦＲＡ，ＰＩＫ３Ｒ１，ＪＡＺＦ１，ＷＨＳＣ１Ｌ１，ＨＯＯＫ３，ＰＣＭ１，ＭＬＬＴ３，ＰＴＥＮ，ＣＢＬ，ＥＲＣＣ５，ＥＲＣＣ４，ＣＹＬＤ，ＣＢＦＢ，ＢＲＩＰ１，ＭＬＬＴ１，ＴＭＰＲＳＳ２，ＮＦ２）（表２）。がん関連遺伝子として登録されていないＴＴＮ、ＳＫＰ２、ＥＥＤ１及びＰＶＴ１も腫瘍形成に寄与するものと考えられている。
【表２】
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マウス肝細胞癌及びヒト肝細胞癌の微小な領域のコピー数変化を直接比較するため、マウス肝細胞癌に共通するコピー数変化領域に対応するヒト染色体上のシンテニー領域に含まれる遺伝子をリストアップした（表２）。図８Ｄは、ＦＥＡＴ  Ｔｇマウス肝細胞癌（ｎ＝６）のアレイＣＧＨで検出されたコピー数変化に対応するヒト染色体のシンテニー領域に存在する遺伝子数を示す図である。図８Ｄにおいて示されたシンテニー領域は、ヒト肝細胞癌に関与することが示唆されている染色体変異領域（Ｆａｒａｚｉ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６，６７４−６８７）の殆どすべてを含む。しかも、マウス肝細胞癌のアレイＣＧＨの結果は、既に報告されているヒト肝細胞癌のａｒｒａｙ−ＣＧＨの結果（Ｚｅｎｄｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２５，１２５３−１２６７）と非常に類似するものであった。このように種間を超えて共通の遺伝子領域のコピー数変化が確認されたことにより、これらのＴｇマウスの肝細胞癌は、ヒト患者の肝細胞癌を忠実に再現したものであり、ＦＥＡＴ  Ｔｇマウスが、ヒト肝細胞癌の有用なモデル動物であることが示唆されたと言える。
種々のヒト癌組織におけるＦＥＡＴ発現の上昇
ＦＥＡＴがヒトのどれだけの種類の癌の発生に寄与するかを見積もるため、組織アレイを用いてヒトの正常組織、種々の癌及びその亜型におけるＦＥＡＴの発現レベルを調べた。大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌及び非小細胞性肺癌において、正常組織に比べてＦＥＡＴの有意な発現上昇が確認された（図１１、図１２、表３）。ＦＥＡＴは、がん細胞では発現上昇していたが、癌組織に隣接する非腫瘍性間質細胞又は正常細胞では、発現上昇は見られなかった。従って、ＦＥＡＴの発現上昇は、ヒトの癌において広く共通する特徴であり、殆どの癌の発達において不可欠な過程であることが示唆される。驚くべきことに、ヒト肝細胞癌において、ＦＥＡＴの過剰発現が、腫瘍性形質変化に先立って起こっている：肝硬変組織中の肝細胞癌に隣接する肝細胞では、高レベルのＦＥＡＴ発現が確認された（図１３）。図１３において、図中の数字は患者の年齢を示し、Ｍは、患者の性別（男性：Ｍａｌｅ）を示す。この結果から、これらの肝硬変組織において、癌形成が進行していることを反映しているものと考えられる。また、乳管内癌（早期進行性浸潤）においてもｉｎ  ｓｉｔｕで著しいＦＥＡＴ過剰発現が観察された（図１２Ａ）。以上の結果から、ＦＥＡＴは、多種多様なヒトの癌において、前癌段階又は早期腫瘍形成段階から関与するものと考えられる。
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０００７】
ＦＥＡＴは、正常細胞では発現されておらず、その発現が腫瘍細胞又は前癌細胞に限定されており、また、腫瘍形成の早期段階から発現しているため、本発明の検査用試薬を用いてＦＥＡＴ発現細胞を検出することにより、腫瘍を早期に検出することが可能である。
また、本発明の医薬組成物を用いてＦＥＡＴ発現細胞を死滅させることにより、腫瘍の更なる発達を予防することが可能であり、また、既に発達した腫瘍を治療することも可能である。
また、本発明のＦＥＡＴ発現腫瘍モデル動物は、ヒトの肝細胞癌又は悪性リンパ腫の病理的特徴を忠実に再現したモデル動物であり、これらの癌及び腫瘍の研究に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ペプチド
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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