(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（i）〜（iii）：
（i）脱ガラクトースしており、かつＮ−アセチルガラクトサミンに対してシアル酸が結合してなる糖鎖構造を有する、ヒト血漿または血清に由来する１ｆサブタイプのＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、マクロファージを活性化するための医薬組成物。
【請求項２】
さらに、脱ガラクトースしており、かつＮ−アセチルガラクトサミンからなる糖鎖構造を有する、ヒト血漿または血清に由来する２サブタイプのＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、および、
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
を含む、請求項１に記載のマクロファージを活性化するための医薬組成物。
【請求項３】
以下の（i）〜（iii）：
（i）脱ガラクトースしており、かつＮ−アセチルガラクトサミンに対してシアル酸が結合してなる糖鎖構造を有する、ヒト血漿または血清に由来する１ｆサブタイプのＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、血管新生を阻害するための医薬組成物。
【請求項４】
さらに、脱ガラクトースしており、かつＮ−アセチルガラクトサミンからなる糖鎖構造を有する、ヒト血漿または血清に由来する２サブタイプのＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、および、
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、請求項３に記載の血管新生を阻害するための医薬組成物。
【請求項５】
以下の（i）〜（iii）：
（i）脱ガラクトースしており、かつＮ−アセチルガラクトサミンに対してシアル酸が結合してなる糖鎖構造を有する、ヒト血漿または血清に由来する１ｆサブタイプのＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項６】
さらに、脱ガラクトースしており、かつＮ−アセチルガラクトサミンからなる糖鎖構造を有する、ヒト血漿または血清に由来する２サブタイプのＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、および、
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、ヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のヒトＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、請求項５に記載の癌を治療するための医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物であって、ヒト血漿または血清ならびにヒトＧｃグロブリンが該医薬組成物を投与される被験体の血漿または血清に由来する、上記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿または血清に由来するＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体を製造する方法および当該脱糖体を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
怪我をしたとき、動物は自然に治癒する能力を持っている。このとき、血清中の糖タンパク質であるＧｃグロブリンは、炎症反応によって脱糖され、生体内で最終的にＮ−アセチルガラクトサミンを糖鎖構造に持つＧｃＭＡＦへと変換される。このＧｃＭＡＦがマクロファージを活性化させる。すなわち、Ｇｃグロブリンは、ＧｃＭＡＦの前駆体として機能する（非特許文献１）。【０００３】
ＧｃＭＡＦは、マクロファージ活性化作用および／または抗血管新生機構を介して様々な腫瘍形成を抑制または遅延させ、また形成腫瘍に対しては増殖抑制作用を示すことが報告されている（非特許文献２−１１、特許文献１）。【０００４】
ＧｃＭＡＦが有する抗腫瘍効果が明らかになるに伴いその臨床応用が期待されるが、未だに治療薬として開発がなされていないのが現状である。【０００５】
その理由のひとつには、原料となる規格化されたＧｃグロブリンを集めることの難しさがあげられる。【０００６】
ヒトＧｃグロブリンには、ガラクトース、シアル酸、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミンの糖鎖が付いているとされるが、少なくとも（１ｆ，１ｓおよび２）の３種類のサブタイプが存在している。そして、１のタイプには糖が３つ、２のタイプには糖が２つあるとされる。さらに、ヒト血清中には両親から１種類ずつのＧｃグロブリン種が含まれるので、これだけでも、ヒト個人に存在するタイプは、（１ｆ，１ｆ）、（１ｆ，１ｓ）、（１ｆ，２）、（１ｓ，１ｓ）、（１ｓ，２）、（２，２）の６通り、さらに詳しく云えば（１ｆ，１ｆ）、（１ｓ，１ｓ）、（２，２）のホモタイプと（１ｆ，１ｓ）、（１ｆ，２）、（１ｓ，２）のヘテロタイプの亜種が存在する。【０００７】
各サブセットについて、マクロファージ活性化に関連する糖鎖の構造が明らかにされている。１ｆの１タイプでは４１８と４２０番目にスレオニンが位置し、４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンにＮ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにガラクトースおよびシアル酸の糖が結合している。１ｓの１タイプでは４１８と４２０番目にスレオニンが位置し、４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンにＮ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにガラクトースおよびα−マンノースが結合している。２タイプでは４１８番目にスレオニンがみられ、この位置にＮ−アセチルガラクトサミンが結合し、さらにガラクトースが結合している（非特許文献１２，１３）。【０００８】
このうち、１ｆ１ｆタイプのヒト血清Ｇｃグロブリンの脱糖の反応については明らかにされており、すなわち、生体内で炎症が起こると、Ｂリンパ球のβ−ガラクトシダーゼの活性化が起こり、これによって脱ガラクトースされたＧｃグロブリンが、さらにＴ細胞のシアリダーゼによって脱シアル酸され、Ｎ−アセチルガラクトサミン末端のみを持つＧｃＭＡＦとなる。【０００９】
上記のとおりヒト血清中には、少なくても３種類のＧｃグロブリンサブセットが含まれており、また全てのサブセットについてその脱糖反応の過程が明らかにされているわけではない。先に述べたＧｃＭＡＦは１ｆ，１ｆのホモタイプのみを使って製造されるのみである。このため、集められた血清、血漿タンパク質、またはＧｃグロブリンを用いて、大量かつ容易に、すなわち規格化された方法によって、ＧｃＭＡＦを製造する技術は確立されておらず、当該分野においてはＧｃＭＡＦを製造するための新たな手法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００３−５３２６８２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，８５３９−８５４３（１９９１）．
【非特許文献２】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．，  １２２（２），  ４６１−７（２００８）．
【非特許文献３】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｔｒａｎｓｌ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １（２），  ６５−７２（２００８）．
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ５７（７），  １００７−１６（２００８）．
【非特許文献５】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，２１８７−９２（１９９７）
【非特許文献６】Ｋｏｇａら、Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｌ．  Ｍｅｄ．，２２０，  ２０−６（１９９９）
【非特許文献７】Ｋｏｒｂｅｌｉｋら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ７５，  ２０２−７（１９９７）
【非特許文献８】Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６，  ２８２７−３１（１９９６）
【非特許文献９】橋谷進ら、日本口腔科学会雑誌、４６（５）：５３２（１９９７）
【非特許文献１０】Ｋｉｓｅｒ，Ｏ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，  ５：３２−４０（２００３）
【非特許文献１１】Ｏｎｉｚｕｋａ  Ｓら、Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２８（３）：３１７−３１９（２００３）
【非特許文献１２】Ｍｏｈａｍａｄ  Ｓ．Ｂ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２３（６Ａ），  ４４５１−７，  ２００３．
【非特許文献１３】Ｎａｇａｓａｗａ  Ｈ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２４（５Ｃ），  ３３６１−６，  ２００４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、集められた血清、血漿タンパク質、またはＧｃグロブリンより、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリン誘導体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、Ｇｃグロブリンのサブセットに関係なく、Ｇｃグロブリンにβ−ガラクトシダーゼを作用させて得られるガラクトース脱糖体が、ＧｃＭＡＦとして利用可能であること、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化させることによって簡単にＧｃＭＡＦへと変換できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。【００１５】
［１］  血漿または血清に由来するＧｃグロブリンとβ−ガラクトシダーゼを反応させて、該Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体を製造する方法。【００１６】
［２］  Ｇｃグロブリンが血漿または血清より単離または粗精製されたものである、［１］の方法。【００１７】
［３］  さらに、製造されたガラクトース脱糖体をリンパ球またはリンパ球の培養上清と接触させるステップを含む、［１］または［２］の方法。【００１８】
［４］  ［１］〜［３］のいずれかの方法によって製造された、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。【００１９】
［５］  以下の（i）〜（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、マクロファージを活性化するための医薬組成物。【００２０】
［６］  以下の（i）〜（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、血管新生を阻害するための医薬組成物。【００２１】
［７］  以下の（i）〜（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、癌を治療するための医薬組成物。【００２２】
［８］  ［５］〜［７］のいずれかの医薬組成物であって、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体が該医薬組成物を投与される被験体の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、上記医薬組成物。【００２３】
［９］  癌を治療する方法であって、以下の（i）〜（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を癌患者に投与することを含む、上記方法。【００２４】
［１０］  Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体が、該ガラクトース脱糖体を投与される癌患者の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、［９］の方法。【００２５】
［１１］  癌患者における癌の治療に使用するための、以下の（i）〜（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体。【００２６】
［１２］  ［１１］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体であって、該ガラクトース脱糖体が該ガラクトース脱糖体を投与される癌患者の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、上記Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。【００２７】
［１３］  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；または
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。【００２８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-197485号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、Ｇｃグロブリンのサブタイプに関係なく、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリンガラクトース脱糖体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＣＢＢ染色した精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。Ｐ：ポジティブコントロール（Ｇｃタンパク質：シグマ社）、ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）、Ｍ：マーカー
【図２】図２は、ヒト抗Ｇｃグロブリン抗体を用いたプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のウェスタンブロットの結果を示す。一次抗体：抗ヒトＧｃグロブリン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。二次抗体：抗ウサギＨＲＰ−ＩｇＧ（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。感光３０秒。Ｐ：ポジティブコントロール（Ｇｃタンパク質：シグマ社）、ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）、Ｍ：マーカー
【図３−１】図３−１は、ＰＮＡレクチンを用いたプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のウェスタンブロットの結果を示す。一次抗体：ＰＮＡレクチン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。二次抗体：ストレプトアビジン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。感光１分間。Ｇｃ：Ｇｃグロブリン；ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）。
【図３−２】図３−２は、ＨＰＡレクチンを用いたプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のウェスタンブロットの結果を示す。一次抗体：ＨＰＡレクチン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。二次抗体：ストレプトアビジン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。感光１分間。ＭＡＦ：精製ＧｃＭＡＦ；ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）。
【図４−１】図４−１は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。
【図４−２】図４−２は、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。
【図４−３】図４−３は、原料である１ｆ１ｆタイプのＧｃグロブリン（１ｆ１ｆＧｃ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。
【図５−１】図５−１は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。
【図５−２】図５−２は、原料である１ｓ１ｓタイプのＧｃグロブリン（１ｓ１ｓＧｃ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。
【図６−１】図６−１は、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。
【図６−２】図６−２は、原料である２２タイプのＧｃグロブリン（２２Ｇｃ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。
【図７】図７は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）による抗癌効果を示す特性図である。数値およびエラーバーはn=3-4で行った実験のmean±SEMを示す。図中、黒は2mm以上の大きさまで成長した腫瘍の数を示し、白は2mm未満の大きさの腫瘍の数を示す。また、図中のアスタリスク（＊）および（＊＊）はBonferroniの多重比較検定により、無処置群に対する有意な減少（p<0.05）および（p<0.01）をそれぞれ示す。
【図８】図８は、各プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ、１ｓ１ｓＧｃＸ、１ｆ１ｆＧｃＸ）による抗癌効果を示す特性図である。数値およびエラーバーはn=3-4で行った実験のmean±SEMを示す。図中、黒は2mm以上の大きさまで成長した腫瘍の数を示し、白は2mm未満の大きさの腫瘍の数を示す。また、図中のアスタリスク（＊＊＊）はBonferroniの多重比較検定により、無処置群に対する有意な減少（p<0.001）を示す。
【図９】図９は、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１０】図１０は、１ｓサブタイプのＧｃグロブリンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１１】図１１は、２サブタイプのＧｃグロブリンのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、Ｇｃタイプに関係なく、簡単につくれ、かつ、ＧｃＭＡＦとして利用可能な、あるいは簡単にＧｃＭＡＦに変換する機能を持つＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体（プレＧｃＭＡＦ）の製造方法に関する。
【００３２】
本発明方法は、血漿または血清に由来するＧｃグロブリンとβ−ガラクトシダーゼを反応させる工程を含む。
【００３３】
本発明において利用できるＧｃグロブリンは、血漿、好ましくは血清に由来する。Ｇｃグロブリンは血清中に３００〜５００ｍｇ／ｌ程度含有され、血清タンパク中で２０番目に多いタンパク質とされる。したがって、血漿または血清を利用することによって、効率的かつ大量にＧｃグロブリンを得ることができる。
【００３４】
Ｇｃグロブリンは、血漿または血清中に含まれる形態であっても良いし、あるいは粗精製物の形態であっても、単離された形態であっても良い。「粗精製物の形態」とは、実質的に純粋なＧｃグロブリンとされたものではなく、不純物を含んだ状態をいう。ここで「実質的に純粋」とは、９５％以上、好ましくは９９％以上の純度を意味する。また、「単離された形態」とは、９５％以上、好ましくは９９％以上の純度を意味する。好ましくは、単離された形態である。
【００３５】
血漿または血清よりＧｃグロブリンを単離・精製する方法は、タンパク質精製に通常用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を１つまたは複数を適宜組み合わせて用いて精製することができる。好ましくは、アクチン結合カラム、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３結合カラム、抗Ｇｃグロブリン抗体結合カラムなどのアフィニティカラムに血漿または血清をアプライし特異的にＧｃグロブリンを結合させて、別のタンパク質を適当な洗浄液で遊離させ、その後、適当な溶出液でＧｃグロブリンを溶出する。また、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３結合樹脂によるバッチ式で行うこともできる。樹脂にＧｃグロブリンを吸着させ、洗浄後、酢酸緩衝液あるいはグアニジン液などで溶出させる。溶出液は、セントリコンなどを使用して緩衝液を置換、濃縮することができる。なお、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３は、２５位が水酸化されているビタミンＤ３であって、Ｇｃグロブリンに対する特異的結合力が極めて高く、これを用いることによって血漿または血清中のＧｃグロブリンを高い純度で分離、精製することができる。また、血漿よりＧｃグロブリンを透析する方法が公知であり（例えば、特表２００５−５０８８９２）、本発明においては当該方法を利用することもできる。
【００３６】
また、本発明において利用できるＧｃグロブリンには、遺伝子組換え技術（例えば、特表平１１−５１１９６２）を用いて人工的に製造されたＧｃグロブリン、すなわちＧｃグロブリンをコードする核酸を用いて適切な宿主細胞で組み換え的に発現させて得られるものも含まれる。Ｇｃグロブリンのアミノ酸配列は公知であり、GenBank等のデータベースに登録されており、これらの配列情報を利用することができる。
【００３７】
本発明において利用できるβ−ガラクトシダーゼは、いずれの生物由来のものであってもよく、あるいはβ−ガラクトシダーゼをコードする核酸を用いて適切な宿主細胞で組み換え的に発現させて得られる組換え酵素でもよい。β−ガラクトシダーゼは、粗精製形態、精製形態、固定化形態などの任意の形態を採ることが可能である。粗精製形態には、例えば細胞培養からの処理物（例えば、抽出物、凍結乾燥物など）が含まれる。また、市販のβ−ガラクトシダーゼ（例えばＧｒａｄｅ  ＩＩＩ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ（ＳＩＧＭＡ））を利用することもできる。固定化形態とは、適当な固相に固定された状態を意味する。このような固相の材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）が挙げられる。固相の形状および材質は特に限定されるものではない。
【００３８】
脱糖反応は、２０〜６０℃、好ましくは３５〜４２℃、より好ましくは３７．５℃にて、０．５〜５時間、好ましくは、０．５〜２時間、Ｇｃグロブリンにβ−ガラクトシダーゼを作用させることにより行う。反応ｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ１１、好ましくは中性域とする。脱糖反応のステップは、バッチ方式で行っても良いし、連続方式で行っても良い。
【００３９】
Ｇｃグロブリンにおけるいずれのサブタイプにおいても、糖鎖の中心であるＮ−アセチルガラクトサミンにガラクトースがＯ−グリコシド結合している共通の構造を有する。したがって、いずれのＧｃグロブリンサブタイプを用いたとしても、β−ガラクトシダーゼを作用させることによって、ガラクトース脱糖体を誘導することができる。以下、本発明において、当該ガラクトース脱糖体を「プレＧｃＭＡＦ」と記載する。したがって、「プレＧｃＭＡＦ」には、１ｆサブタイプに由来する−（ＳＡ）−ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を有するもの、１ｓサブタイプに由来する−（α−ＭＡＮ）−ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を有するもの、および／または２サブタイプに由来する−ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を有するものが、材料として用いた血漿または血清中に含まれるサブタイプに応じて任意の組み合わせで含まれ得る。
【００４０】
本発明において、プレＧｃＭＡＦは、Ｇｃグロブリンサブタイプの種類に応じて、以下の構造を有する。
【００４１】
１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する。
【００４２】
１ｓサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ−アセチルガラクトサミンに対してさらにα−マンノースが結合している糖鎖構造を有する。
【００４３】
２サブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ−アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する。
【００４４】
本明細書において、配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列にはそれぞれ、各アミノ酸配列に、１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有し、かつＧｃグロブリンタンパク質の活性・機能を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列も含まれる。ただし、ここで各アミノ酸配列において上記糖鎖構造を有する４１８または４２０番目のスレオニンは保存されている。「Ｇｃグロブリンタンパク質の活性・機能」としては公知のものが挙げられ、ビタミンD３と結合して、ビタミンD３を目的の組織に運ぶキャリアータンパク質としての機能や、細胞の分裂、形態変化および運動などの調節に関するアクチンの重合を調節する機能（F-アクチンの脱重合促進とG-アクチンの再重合の阻止作用など）や、上記のとおりＧｃＭＡＦへと変換されマクロファージを活性化する機能などが挙げられる。各機能の検出および測定方法は、公知の手法により行うことができる。「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個または２個である。
【００４５】
また、本明細書において、配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列にはそれぞれ、各アミノ酸配列とＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸列からなり、かつＧｃグロブリンタンパク質の活性・機能を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列も含まれる。ただし、ここで各アミノ酸配列において上記糖鎖構造を有する４１８または４２０番目のスレオニンは保存されている。
【００４６】
ここで、「同一性」とは、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（パーセンテージ）を意味する。同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム）を使用して求めることができる。
【００４７】
プレＧｃＭＡＦは、材料中に複数のＧｃグロブリンサブタイプが含まれていたとしても、一律に一種類の酵素（β−ガラクトシダーゼ）のみを用いて製造することができ、サブタイプに応じて酵素の種類を変える必要がないために、迅速かつ大量に、また一方で患者に対して個別的に、プレＧｃＭＡＦを製造することができる。
【００４８】
製造されたプレＧｃＭＡＦは、さらなる精製工程に供しても良い。当該精製工程においては、プレＧｃＭＡＦがＧｃグロブリンと同じ性質を持つことから、上記Ｇｃグロブリンの精製に用いられる方法を適宜用いて行うことができる。
【００４９】
下記実施例にて詳述するように、本発明のプレＧｃＭＡＦは材料として用いるＧｃグロブリンサブタイプの種類に応じて、マクロファージを活性化する作用が相違する。ここで「マクロファージを活性化する作用」とは、マクロファージの貪食能（特にＦｃレセプターを介する貪食能）や活性酸素産生能および抗原提示作用を高める作用を意味する。なお、本明細書において、「マクロファージの貪食能」を「マクロファージの貪食活性」と記載する場合があるが、これらの用語は相互互換的に用いることができる。１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦそれ自体では、ＧｃＭＡＦと異なりマクロファージを活性化する作用を有していない。１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、リンパ球、特にＴリンパ球と接触させることによって、ＧｃＭＡＦへと変換されマクロファージを活性化する作用を得ることができる。実際、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦをリンパ球と接触させることによって、上清中にマクロファージを活性化する作用が得られる。あるいは、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは患者生体内へ投与されることによって、患者生体内のリンパ球と接触して、ＧｃＭＡＦへと変換されマクロファージを活性化する作用を得ることができる。一方、１ｓサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦおよび２サブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦでは、それ自体単独でマクロファージを活性する作用を有し、その作用はリンパ球と接触させても保持される。
【００５０】
このようにして作製されたプレＧｃＭＡＦは様々な疾患・障害を治療および予防するための医薬組成物の有効成分として利用することができる。
【００５１】
当該医薬組成物に含まれるプレＧｃＭＡＦは、血漿または血清を材料として製造される。また、当該医薬組成物を投与される被験体と同一のＧｃグロブリンサブセットを含む血漿または血清を材料として製造することができる。さらに好ましくは、当該医薬組成物に含まれるプレＧｃＭＡＦは、当該医薬組成物を投与される被験体自身の血漿または血清を材料として製造されたものである。被験体自身の血漿または血清を材料として利用することによって、製造されたプレＧｃＭＡＦや当該血漿または血清に含まれるタンパク質および／またはその誘導体を、ウイルス感染症伝搬、不規則抗体の産生、発熱・アナフィラキシーなどの問題を生じることなく、被験体に投与することができる。本発明において、「被験体」はヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれるが、好ましくはヒトである。
【００５２】
また、当該医薬組成物に含まれるプレＧｃＭＡＦは、上記リンパ球等または当該細胞の培養液と接触させていなくても良いし、上記リンパ球等または当該細胞の培養液と接触させることによって活性化された状態（すなわち、ＧｃＭＡＦへと変換された状態）であっても良い。
【００５３】
当該医薬組成物を用いて治療し得る疾患・障害としては、例えば、マクロファージの活性化や血管新生の阻害によって治療し得ることが公知である、または治療し得る可能性がある疾患や障害が挙げられ、創傷治癒、アレルギー疾患、自己免疫疾患、治療薬による副作用、癌、癌以外の血管新生疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。「癌」としては、黒色腫、転移、腺癌、肉腫、胸腺腫、リンパ腫、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮腫瘍、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、腎性腫瘍、卵巣腫瘍、脾臓腫瘍、脳腫瘍、精巣腫瘍、骨腫瘍、筋腫瘍、胎盤の腫瘍、胃性腫瘍など（これらに限定されない）が挙げられる。「癌以外の血管新生疾患」としては、糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、トラコーマ、新血管形成緑内障、乾癬、免疫性炎症（例えば、慢性関節リュウマチ、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、全身性脈管炎、硬皮症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、原発性胆管性肝硬変、自己免疫疾患など）、非免疫性炎症、アテローム性動脈硬化症および過剰創傷修復などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）によって投与することができる。
【００５５】
また、本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。
【００５６】
これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
【００５７】
賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビットおよび結晶セルロース、滅菌水、エタノール、グリセロール、生理食塩水、緩衝液などが、崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウムおよび合成ケイ酸マグネシウムなどが、結合剤としては、例えばメチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが、安定化剤としては、例えばアルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン４０、メチルセルロース、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが、その他の添加剤としては、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリウムなどがそれぞれ挙げられる。
【００５８】
また本発明の医薬組成物は、通常用いられている手法、例えば除菌フィルターを通す等によって、無菌的に作製することができる。
【００５９】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、プレＧｃＭＡＦを、１回の投与につき体重１ｋｇあたり０．４〜４０００ｎｇ、好ましくは２０〜２０００ｎｇの範囲から適宜選択される量を投与することができる。
【００６０】
本発明の医薬組成物の効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏの系であれば、当該医薬組成物の投与前後における疾患部位の寛解、増悪、治癒などを評価することによって行うことができる。たとえば、創傷治癒効果については、医薬組成物の投与前後における創傷サイズおよび／またはケロイド形成を評価することによって行うことができる。本発明の医薬組成物の投与によって、創傷サイズおよび／またはケロイド形成が縮小していることが確認できる。また当該医薬組成物の抗腫瘍効果については、医薬組成物の投与前後における皮膚塊の測定、Ｘ線などを用いた一般的な腫瘍サイズおよび／またはケロイド形成を評価することによって行うことができる。本発明の医薬組成物の投与によって、皮膚塊や腫瘍サイズおよび／またはケロイド形成が縮小していることが確認できる。さらに、糖尿病性網膜症においては、医薬組成物の投与前後における網膜病巣を診断・評価することによって行うことができる。本発明の医薬組成物の投与によって、網膜病巣の改善、進行の欠如などが確認できる。なお、本発明の医薬組成物の効果の確認は、ＧｃＭＡＦ投与による効果確認において、通常用いられている方法によって行うことができる。
【００６１】
一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系では、プレＧｃＭＡＦの効果は、マクロファージの活性化作用によって評価することができる。一般的に、ＧｃＭＡＦによるマクロファージの活性化作用は、マウス腹腔細胞を取り出し、無血清培地で予備培養を行い、付着細胞と非付着細胞に分け、その付着細胞にＧｃＭＡＦを加えて３時間培養した細胞で貪食活性を調べることによって確認することができる（Ｎａｇａｓａｗａ  Ｈ．ら、（２００４）上掲）。上記のとおり、１ｓサブタイプまたは２サブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦの場合は、プレＧｃＭＡＦ自体がマクロファージの活性化作用を有するために、上記の手法を用いてプレＧｃＭＡＦの効果を評価することができる。一方、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦの場合は、プレＧｃＭＡＦ自体がマクロファージの活性化作用を有さないために、上記の手法を用いて評価することはできない。そこで、非付着細胞にプレＧｃＭＡＦを加え２時間培養した後、当該培養液を付着細胞に加えて３時間培養した細胞で貪食活性を調べることによって確認することができる。
【００６２】
本発明は、さらに本発明の医薬組成物を用いた上記疾患・障害の治療および予防方法を包含する。
【００６３】
本発明におけるプレＧｃＭＡＦは、血清のＧｃグロブリンからガラクトースのみを外したＧｃグロブリンである。１ｓサブタイプまたは２サブタイプに由来する場合には、ＧｃＭＡＦと同様に利用することができ、１ｆサブタイプに由来するものであっても生体内環境では効率よく簡単にＧｃＭＡＦへと変換しＧｃＭＡＦと同様に利用することができる。このため、ＧｃＭＡＦ同様、プレＧｃＭＡＦを患者に投与することによって、マクロファージの活性化作用や血管新生阻害作用、さらに患者の抵抗性や修復力の増強が期待できる。
【００６４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：精製Ｇｃグロブリンを原料としたプレＧｃＭＡＦの合成と分取
（Ｉ）血清からのＧｃグロブリンの回収
１ｆ１ｆサブタイプのＧｃグロブリンを有するヒトより採血した血液２０ｍｌを、室温で３０分静置後、４℃、１０分間遠心分離（３０００ｒｐｍ）し、血清１０．３ｍｌを得た。【００６６】
血清３．５ｍｌにＳＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４，  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ６．０５ｇ，  ＥＤＴＡ・２ＮＡ  ０．５６ｇ，  ＮＡＣＬ  ８．７７ｇ，  ＳＤＷ  １０００ｍｌ，  ＴＲＩＴＯＮ−１００  １ｍｌ）を３．５ｍｌ加えて全量を７．０ｍｌとし、これを準備した２５（ＯＨ）ＶＤ３（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）を結合したアフィニティカラム（１０ｍｍ×８０ｍｍ）に０．４ｍｌ／ｍｉｎで流した。さらに、ＳＴＥ緩衝液を９０分間流した後、６Ｍのグアニジン塩酸塩を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して、溶出したタンパク質含有溶液約２０ｍｌを回収した。回収液は、片側をクリップで留めた透析膜に注入して、反対側もクリップで留め、浮きをつけて５ｍＭリン酸緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液（ＳＰＢ））４Ｌ中に浮かべて透析を行った。透析開始から９０分後、１８０分後、さらに２７０分後に透析液を交換した。３回目は一夜透析とした。【００６７】
透析後、液を集めて、準備したヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−ＳｃａｌｅＴＭ  Ｍｉｎｉ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ，  ４０μＭ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  Ｃａｔａｌｏｇ＃７３２−４３３２，  ＬＯＴ  ＮＯ．Ｂ０１２４０９Ｂ）に０．２ｍｌ／ｍｉｎで流した。その後、５ｍＭリン酸緩衝液（ＳＰＢ）を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して洗浄し、ベースラインが落ち着いたところで、２００ｍＭリン酸緩衝液（ＳＰＢ，ｐＨ７．０）につないでグラジエントを行い、Ｇｃグロブリン含有溶液としてほぼ９ｍｌを回収した。これを、準備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．Ｒ０ＤＡ２０９３１，  ３００００  ＭＶＣＯ）に入れ、回収用チャップを付けて、アングルローターを取り付けた遠心器で１０分間、遠心分離（３９００Ｇ）して、精製Ｇｃグロブリン７４２．６７μｇ／３００μｌを得た。【００６８】
なお、１ｓ１ｓまたは２２のサブタイプのＧｃグロブリンを有するヒトからも、上記と同様の方法を用いて、精製Ｇｃグロブリンを得ることができた。【００６９】
（ＩＩ）ＧｃグロブリンからのプレＧｃＭＡＦの合成と濃縮
精製Ｇｃグロブリンの２５μｇに、１０ｍＵ／μｌのβ−ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｄｅ  ＩＩＩ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ，  ＳＩＧＭＡ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．５４Ｈ７０２５，  Ｇ１８７５）２５μｌを加え、さらに１００ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）１６５μｌを加えて全量２００μｌとし、３７．５℃で１時間インキュベーションした。反応液を２５（ＯＨ）ＶＤ３結合ビーズ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）１．０ｇを加えた２．０ｍｌのエッペンチューブに移し、４℃にて１時間振とうした後、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。沈殿物にＳＴＥ緩衝液０．５ｍｌを加えて６０秒間振とうして、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた。この操作を３回繰り返した。次に、溶出液として０．４ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸塩を加え６０秒間振とうし、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）した。これを３回繰り返し、液をあわせてプレＧｃＭＡＦ含有抽出液とした。【００７０】
得られたプレＧｃＭＡＦ含有抽出液を、準備したｍｉｃｒｏｃｏｎ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．Ｒ９ＤＮ９５３１１，  １００００  ＭＶＣＯ）に入れ、回収用チャップを付けて、４℃にて１０分間、遠心分離（１３，５００ｒｐｍ）して、１０ｍＭ  ＳＰＢで緩衝液置換を行い、２０μｌのプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を得て、以下の実施例に用いた。【００７１】
実施例２：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の物性検査
（Ｉ）プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）によるタンパク質の可視化、ヒト抗Ｇｃグロブリンを用いたウェスタンブロットおよびＨＰＬＣ解析
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質測定キット（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ  ［Ｌｏｔ  ＮＯ．ＨＨ１０６１０１，  ＰＲＯＤ  ＃  ２３２２３］，  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ  ［Ｌｏｔ  ＮＯ．ＣＥ４９１８３，  ＰＲＯＤ  ＃  ２３２２４］）でプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のタンパク質濃度を測定したところ、１７．１μｇ／２０μｌとなった。【００７２】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色像でタンパク質の可視化を行ったところ、分子量５６ｋＤａ付近に１本の濃いバンドがみられた（図１）。【００７３】
このバンドは、ヒト抗Ｇｃグロブリン抗体を用いたウェスタンブロットにおいて陽性反応を示したことから、Ｇｃグロブリン誘導体であることが確認された（図２）。【００７４】
また、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のタンパク質バンドが単一バンドであったことから、ＨＰＬＣによるタンパク質分析（２８０ｎｍ）を行ったところ、保持時間１２．５５４ｍｉｎのシグマ社製のＧｃグロブリンピークに一致した。【００７５】
（ＩＩ）プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のＰＮＡレクチン、ＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロッティング
プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の糖鎖構造を調べるため、目的バンド（分子量５６ｋＤａ付近の濃いバンド）のＰＮＡレクチンを用いたウェスタンブロッティングを行った結果、精製ＧｃグロブリンはＰＮＡレクチンで染まったが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）はＰＮＡレクチンでは染まらなかった（図３−１）。また、目的バンドのＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロッティングを行った結果、精製ＧｃＭＡＦ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）はＨＰＡレクチンで染まったが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の分子量５６ｋＤａ付近のバンドはＨＰＡレクチンでは染まらなかった（図３−２）。【００７６】
以上の結果より、ＧｃグロブリンはＧａｌ−（ＳＡ）−ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造、また、ＧｃＭＡＦはＧａｌＮＡｃ糖鎖構造であるが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の糖鎖構造はいずれにも属さないことが明らかとなった。【００７７】
実施例３−１：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）によるマクロファージ貪食活性への影響（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるマウス腹腔マクロファージのＦｃレセプターを介するヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の貪食試験において、Ｇｃグロブリンはマクロファージの貪食活性に影響を与えないが、ＧｃＭＡＦはマクロファージの貪食活性を上昇させることが知られている（N.Yamamoto, N.P.Willett and D.D.Lindsay. Inflammation 1994;18(3):311-322.；N.Yamamoto, S.Homma and I.Millman. J.Immunol.1991;147:273-280.）。この知見に基づいて、１ｆ１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の、マクロファージの貪食活性に及ぼす影響を調べた。【００７８】
プレＧｃＭＡＦ精製物のマクロファージの貪食活性に及ぼす影響は以下の手順で評価した。【００７９】
＜実験１＞
８週齢のＩＣＲマウス（雌）の腹腔にＰＢＳ  １０ｍｌを注入して腹腔内混合細胞を取り出し、４℃、１，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。集めた細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０６細胞／ｍｌに調節し、カバーグラスを沈めたプレートに５．０×１０５細胞／ｗｅｌｌになるように５００μｌずつ播種した。当該細胞にＲＰＭＩ培地を５００μｌ加えて、３７．５℃で１時間予備培養して、マクロファージをカバーグラスに定着させた。その後、上清を除き、付着したマクロファージ層を洗浄して、新しいＲＰＭＩ培地を加えて３７℃で１５時間培養した。【００８０】
この準備したマクロファージ層に、それぞれ１０ｎｇのプレＧｃＭＡＦ精製物、１０ｎｇの精製ＧｃＭＡＦ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）、または１μｇのＬＰＳ（シグマ社）を加えて、３７℃、３時間培養した。続いて、マクロファージに、ＩgＧをコートした０．５％ＳＲＢＣを加えて９０分間貪食させた後、マクロファージを固定、ギムザ染色した。その後、顕鏡して貪食されたＳＲＢＣをカウントして貪食指数（ingestion index）を算出し、マクロファージの貪食活性を評価した。【００８１】
＜実験２＞
実験１の予備培養時の上清を回収し、回収した上清液約１ｍｌに１０ｎｇのプレＧｃＭＡＦ精製物を加えて、３７℃、１時間培養した。その後、培養物を遠心分離して培地に含まれる非付着細胞を除き、この処理液を実験１と同様に準備したマクロファージ層に培養液として加えて、３７℃、３時間培養した。続いて、マクロファージに、ＩｇＧをコートした０．５％ＳＲＢＣを加えて９０分間貪食させた後、細胞を固定、ギムザ染色した。その後、顕鏡した後、貪食されたＳＲＢＣをカウントして貪食指数（ingestion index）を算出し、マクロファージの貪食活性を評価した。【００８２】
なお、「コントロール」としてはマウス腹腔から抽出した腹腔液の上清（上記実験１の予備培養時の上清に該当）を用いた。【００８３】
プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を用いた、実験１の結果を図４−１に、実験２の結果を図４−２に示す。【００８４】
実験１において、貪食指数の平均(n=3)は、コントロール群に対してＧｃＭＡＦ投与群では上昇したが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）投与群においては変化がなかった（図４−１）。コントロール群に対する有意差検定（ｔ−ｔｅｓｔ）を行った結果、ＧｃＭＡＦ投与群はp=0.0040（p<0.01）、LPS投与群はp=0.0017（p<0.01）と、それぞれ有意差が見られたが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）投与群はp=0.1595で有意差は見られなかった。【００８５】
実験２において、マクロファージの平均貪食指数(n=3)はコントロール群に対して、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の投与群は上昇した（図４−２）。コントロール群に対する有意差検定（ｔ−ｔｅｓｔ）を行った結果、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の投与群はp=0.0009（p<0.01）と有意差がみられた。プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）はマクロファージの貪食活性に直接的な影響を及ぼさないが、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったときにはマクロファージの貪食活性を上昇させた。【００８６】
なお、原料である1f1fタイプのGcグロブリンは、実験１および２のいずれにおいても、マクロファージ貪食活性を上昇させなかった（図４−３）。【００８７】
以上の結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（1f1fGcX）は腹腔非付着細胞と共存させることによって、すなわち、生体内環境において、GcMAF様のマクロファージ貪食活性化能を示すことが明らかとなった。【００８８】
実施例３−２：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）によるマクロファージの貪食活性への影響（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
1s1sのサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦ精製物を、実施例１と同様の方法で作製し（以下、「プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）」と記載）、実施例３−１の実験１、実験２と同様の手順で、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）がマクロファージの貪食活性に及ぼす影響を調べた。【００８９】
結果を図５−１、ならびに図５−２に示す。【００９０】
図５−１に示すとおり、実験１の結果、マクロファージの平均貪食指数(n=4)は、コントロール群に対してＧｃＭＡＦ投与群およびプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群において上昇した。コントロール群に対する各群の有意差検定（ｔ−ｔｅｓｔ）を行った結果、ＧｃＭＡＦ投与群はp=0.0238（p<0.05）、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群はp=0.0463（p<0.05）と、それぞれ有意差が見られた。また、実験２において、マクロファージの平均貪食数(n=4)はコントロール＊群に対してプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群（1s1sGcX＊）において上昇した。コントロール＊群に対する有意差検定（ｔ−ｔｅｓｔ）を行った結果、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群（1s1sGcX＊)はp=0.0396（p<0.05）と有意差がみられた。【００９１】
一方、図５−２に示すとおり、原料である1s1sタイプのGcグロブリンは、実験１および２のいずれにおいても、貪食活性の上昇を示さなかった。【００９２】
以上の結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（1s1sGcX）はGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能を示すことが明らかとなった。また、プレＧｃＭＡＦ精製物（1s1sGcX）のGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能は、腹腔非付着細胞と共存させることによって、すなわち、生体内環境においても低下しないことが明らかとなった。【００９３】
実施例３−３：プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）によるマクロファージの貪食活性への影響（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
２２のサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦ精製物を、実施例１と同様の方法で作製し（以下、「プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）」と記載）、実施例３−１の実験１、実験２と同様の手順で、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）がマクロファージの貪食活性に及ぼす影響を調べた。【００９４】
結果を図６−１、ならび図６−２に示す。【００９５】
図６−１に示すとおり、実験１の結果、マクロファージの平均貪食指数(n=4)は、コントロール群に対してＧｃＭＡＦ投与群およびプレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群において上昇した。コントロール群に対する各群の有意差検定（ｔ−ｔｅｓｔ）を行った結果、ＧｃＭＡＦ投与群は p=0.0214（p<0.05）、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群はp=0.0319（p<0.05）と、それぞれ有意差が見られた。また、実験２において、マクロファージの平均貪食数(n=4)はコントロール＊群に対してプレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群（22GcX＊）において上昇した。コントロール＊群に対する有意差検定（ｔ−ｔｅｓｔ）を行った結果、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群（22GcX＊）はp=0.0254（p<0.05）と有意差がみられた。【００９６】
一方、図６−２に示すとおり、原料である22タイプのGcグロブリンは、実験１および２のいずれにおいても、貪食活性能の上昇を示さなかった。【００９７】
以上の結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）はGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能を示すことが明らかとなった。また、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）のGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能は、腹腔非付着細胞と共存させることによって、すなわち、生体内環境においても低下しないことが明らかとなった。【００９８】
実施例４：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の血管新生阻害活性（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
プレＧｃＭＡＦ精製物がＧｃＭＡＦと同様に血管新生阻害活性を示すかについて、鶏胚漿尿膜法（ＣＡＭ法）によるｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生阻害活性を調べた。【００９９】
＜実験＞
孵卵０日目の鶏受精卵を孵卵器で３７．６℃、４日間培養し、気室上方部と鶏卵側部の卵殻の２ヶ所に錐で穴をあけ、鶏卵側部の穴から約４ｍｌの卵白を吸引除去した。次いで、気室上方部の穴にシリコンスポイトをあてて吸引し、卵殻膜から卵黄のうや胚を剥離した後、鶏卵側部の穴をオプサイトでシールした。次に、気室上方部の穴の卵殻を一部除去して卵殻膜を露出させ、気室上方部にステンレス製のキャップをかぶせて３９℃で２４時間培養した。培養後、絨毛尿膜（ＣＡＭ）が２〜３ｍｍになっていることを確認してシリコンリングをＣＡＭの中心に置き、精製ＧｃＭＡＦ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）およびプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を投与して３９℃で１日、次いで３９．５℃で１日間培養した。培養後、卵殻を取り除いてイントラリポス約１ｍｌをＣＡＭに注入し、ＣＡＭ上に成長した毛細血管の数や大きさを目視にて判定し、阻害が見られた鶏卵数を実験に使用した全体数で割り、血管新生阻害率を算出した。【０１００】
＜結果＞
１００ｎｇ  ＧｃＭＡＦのｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生阻害率は２０％であり、ポジティブコントロールのＴＸ−１９３４（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）（阻害率３０％）と比較してやや弱い阻害活性を示した。【０１０１】
一方、同じ用量（１００ｎｇ）のプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の阻害率は２３％、１０ｎｇのプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）では３１％であり（コントロール群との間に有意差を示す（ｐ＜０．０５））、ＴＸ−１９３４（阻害率２５％）よりもやや強い阻害活性を示した。【０１０２】
この結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）はＧｃＭＡＦに比べてやや強い血管新生阻害活性を有することが示された。【０１０３】
実施例５−１：血清からのプレＧｃＭＡＦの簡易合成とその物性検査
血清から直接、プレＧｃＭＡＦ精製物の合成が可能か否かを調べるため、準備した血清５０μｌ（１ｆ１ｆサブタイプを有するヒトに由来する）に１７５μｌの１００ｍＭ  ＳＰＢおよび１０ｍＵ／μｌのβ−ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｄｅ  ＩＩＩ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ，  ＳＩＧＭＡ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．５４Ｈ７０２５，  Ｇ１８７５）２５μｌを加えて３７．５℃にて１時間インキュベートした。得られた反応物を準備した２５（ＯＨ）ＶＤ３結合ビーズ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）１．０ｇを入れた２．０ｍｌのエッペンチューブに移し、４℃にて１時間振とうした。４℃にて２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた後、沈殿物をＳＴＥ緩衝液０．５ｍｌを用いて６０秒間振とうして洗浄し、さらに４℃にて２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた。この操作を３回繰り返した後、０．５ｍｌの５．０Ｍ  酢酸緩衝液を加え６０秒間振盪し、Ｇｃグロブリン誘導体を溶出し、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、溶出液を取り出す。この操作を３回繰り返し、溶出液をあわせて、ｍｉｃｒｏｃｏｎ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．Ｒ９ＤＮ９５３１１，  １００００  ＭＶＣＯ）を用いて１０ｍＭ  ＳＰＢ緩衝液で置換し、プレＧｃＭＡＦの粗精製物（２）２１．６４μｇ／２９μｌを得た。【０１０４】
プレＧｃＭＡＦの粗精製物（２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）によるタンパク質の可視化では、計３つのバンドが見られた。ヒト抗Ｇｃグロブリンを用いたウェスタンブロットを行った結果、Ｇｃグロブリンに相当する、最も濃いバンド（分子量５６ｋＤａ付近）のみに陽性反応が認められた。その他の２つバンドは陽性反応を示さなかった。【０１０５】
ＣＢＢ染色の結果よりＷｉｎｄｏｗｓ用汎用画像処理パッケージＷｉｎＲｏｏｆを用いて目的バンドの染色濃度を１．０としたとき、それぞれのバンドの染色濃度・バンド面積を測定し、目的バンド値／全バンド値×１００％を目的バンドの純度として求めた結果を表１に示す。目的バンドの純度は６６．１１％であった。
【表１】
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【０１０６】
血清から簡易法により得られた粗精製物（２）にはプレＧｃＭＡＦが含まれるが、夾雑物として血清由来のタンパク質も含まれる。【０１０７】
実施例５−２：プレＧｃＭＡＦ粗精製物（２）のＰＮＡレクチン、ＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロッティング
陽性反応を示すバンドでのＰＮＡレクチン、ＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロットを行なった結果、上記実施例２と同様に、ＧｃグロブリンおよびＧｃＭＡＦに該当する染色バンドが見られなかった。【０１０８】
また、１ｓ１ｓサブタイプまたは２２サブタイプを有するヒトの血清から簡易法により得られた粗精製物を用いて、上記と同様にウェスタンブロッティングを行った結果、１ｓ１ｓサブタイプについてはＧｃグロブリンおよびＧｃＭＡＦに該当する染色バンドが見られなかった。２２のサブタイプではＰＮＡレクチンを用いたウェスタンブロットを行なった結果、Ｇｃグロブリンに該当する染色バンドが見られなかった。【０１０９】
この結果は、１ｓ１ｓサブタイプまたは２２サブタイプを有するヒトの血清から簡易法により得られた粗精製物にもプレＧｃＭＡＦが含まれることを示唆する。【０１１０】
実施例６：プレＧｃＭＡＦ製造例とその物性検査
（Ｉ）血清からのプレＧｃＭＡＦ合成とプレＧｃＭＡＦの精製
準備した血清１．０ｍｌ（１ｆ１ｆサブタイプを有するヒトに由来する）にＳＴＥ緩衝液１．０ｍｌおよび１０ｍＵ／μｌのβ−ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｄｅ  ＩＩＩ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ，  ＳＩＧＭＡ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．５４Ｈ７０２５，  Ｇ１８７５）１５０μｌ加えて３７．５℃にて１時間インキュベートした。【０１１１】
反応液に１０ｍｌのＳＴＥ緩衝液を加えて、準備した２５（ＯＨ）ＶＤ３結合ビーズ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）のアフィニティカラム（１０ｍｍ×８０ｍｍ）に０．４ｍｌ／ｍｉｎで流した。さらに、ＳＴＥ緩衝液を５分間流した後、６Ｍのグアニジンを加えたＳＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して、溶出してくるＧｃグロブリン誘導体  約２５ｍｌを回収した。回収液は、片側をクリップで留めた透析膜に移して、反対側もクリップで留め、浮きをつけて５ｍｍリン酸緩衝液（ＳＰＢ）４Ｌの中に浮かべて透析を行った。透析開始から９０分後、１８０分後および２７０分後に透析液を変えて、３回目は一夜透析とする。【０１１２】
（ＩＩ）ヒドロキシアパタイトカラム処理での二次精製とその物性検査
試薬などの混入物を除くため、透析後の液を集め、準備したヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−ＳｃａｌｅＴＭ  Ｍｉｎｉ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ，  ４０μＭ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃７３２−４３３２，  Ｌｏｔ  ＮＯ．  Ｂ０１２４０９Ｂ）に０．２ｍｌ／ｍｌでサンプルを流した。その後、５ｍＭ  ＳＰＢ緩衝液を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して洗浄し、ベースラインが落ち着いたところで、２００ｍＭ  ＳＰＢ緩衝液（ｐＨ７．４）につないでグラジエントを行った。Ｇｃグロブリンのほぼ９ｍｌを回収した。これを、準備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，  Ｌｏｔ  ＮＯ．Ｒ０ＤＡ２０９３１，  ３００００  ＭＶＣＯ）にサンプルを入れ、回収用チャップを付けて、アングルローターを取り付けた遠心器で１０分間、遠心分離（３９９０Ｇ）して、２００μｌの最終精製物を得た。このタンパク質濃度はＢＣＡ法で２００．６μｇ／２００μｌであった。【０１１３】
最終精製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）によるタンパク質の可視化で単一のバンドであることが確認でき、ヒト抗グロブリンによるウェスタンブロットでそのバンドは陽性反応を示した。【０１１４】
実施例７：  ＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ)肺転移マウスにおけるプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の腫瘍生育の制御
５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを最低７日間馴化させたのち、２ｘ１０５個のＬＬＣを尾部静脈から注入した。７日後のマウスを無処置群（対照群）と陽性対照群（ＧｃＭＡＦの４ｎｇ／ｋｇ／日投与）および治療群（プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の０．０４μｇ／ｋｇ／日および０．４μｇ／ｋｇ／日投与の２群）の４群に無作為に分けた。薬剤は１０日間ｉ．ｐ．投与した後、１１日目にマウスを屠殺し、肺に形成された腫瘍結節の数（全数および２ｍｍ未満と２ｍｍ以上の大きさの数）を集計し、プレＧｃＭＡＦ精製物による腫瘍生育の抑制効果を調べた。【０１１５】
結果を図７に示す。【０１１６】
各群（ｎ＝３または４）での肺に形成された腫瘍結節の数（平均値±ＳＥＭ）は、対照群に対して治療群（上記実施例１で製造したプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を投与された２群）において大きく減少した。当該腫瘍結節数の減少について、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った結果、治療群は対照群に対して有意差を示した（＊  ｐ＜０．０５）。したがって、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を０．０４μｇ／ｋｇまたは０．４μｇ／ｋｇで投与することによって、有意な抗がん活性を示すことが明らかとなった。【０１１７】
さらに、図７に示すとおり、治療群においては２ｍｍ以上の大きさまで成長した腫瘍結節の数が、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の用量に依存して減少しており、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）投与により、腫瘍結節の成長が抑制されることが観察された。通常、腫瘍は３ｍｍ３（腫瘍径約２ｍｍ）以上の大きさまで成長すると、腫瘍中心部の酸素濃度が低下するため血管新生が誘導される。治療群で観察される腫瘍結節の成長抑制は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）が腫瘍組織での血管新生を抑制し、腫瘍の生育を阻害することを示唆する。また、治療群においては、２ｍｍ未満の腫瘍結節数の減少が観察されたが、これは血管から肺組織に一次着床した癌細胞が、着床した腫瘍からさらにニ次転移することが抑制されていることを示唆する。【０１１８】
実施例８：  ＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）肺転移マウスにおけるタイプ別のプレＧｃＭＡＦ精製物による腫瘍生育の制御
５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを最低７日間馴化させたのち、２ｘ１０５個のＬＬＣを尾部静脈から注入した。７日後にマウスを、無処置群（対照群）および治療群（１ｆ１ｆＧｃＸ、１ｓ１ｓＧｃＸまたは２２ＧｃＸ投与群、各々０．４μｇ／ｋｇの１０日間ｉ．ｐ．投与（各プレＧｃＭＡＦ精製物は上記実施例１、３−２、３−３で製造したもの））の４群に無作為に分けた。薬剤は１０日間ｉ．ｐ．投与した後、１１日目にマウスを屠殺し、肺に形成された腫瘍結節の数（全数および２ｍｍ未満と２ｍｍ以上の大きさの数）を集計し、各プレＧｃＭＡＦ精製物の投与による腫瘍育成の抑制効果を調べた。【０１１９】
結果を図８に示す。各群（ｎ＝３−４）の肺に形成された平均腫瘍結節数の±ＳＥＭとして示す。【０１２０】
治療群の平均腫瘍結節数は無処置群に対して大きく減少する傾向を示し、治療群の対照群に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った結果、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）およびプレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）は有意な腫瘍結節数の減少を示した（＊＊＊  ｐ＜０．００１）。これは上記実施例１〜３−３に示した、各プレＧｃＭＡＦ精製物のマクロファージ活性化能の結果と同様の傾向を示す。【０１２１】
また、２ｍｍ以上の腫瘍結節に目を向けると、プレＧｃＭＡＦ精製物では肺がん無処置群より少なく、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）およびプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）では個数０であり、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）では個数１となった。これらの結果は、これらのプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ、１ｓ１ｓＧｃＸ、２２ＧｃＸ）が腫瘍組織での血管新生を抑制し、腫瘍の生育を阻害することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明により、Ｇｃグロブリンのサブタイプに関係なく、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリンガラクトース脱糖体を提供することができる。このため、ＧｃＭＡＦ同様、Ｇｃグロブリンガラクトース脱糖体を患者に投与することによって、マクロファージの活性化作用や血管新生阻害作用、さらに患者の抵抗性や修復力の増強など様々な疾患や障害を治療又は予防するために利用することができる。【０１２３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
0005860401.tif 000003
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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