(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
室内空気に存在するイエダニ由来細胞外ベシクルを含む、
Ｔｈ１７免疫反応を誘導するための免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、室内空気由来細胞外ベシクルを含む組成物、並びに前記細胞外ベシクルを用いて炎症性呼吸器疾患などを診断、予防、及び／又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
室内空気の質(indoor air quality)は、建築物（buildings）を含む構造物（structures）の内部と周辺空気の質（air  quality）を意味し、特に、居住者又は棲息者の健康及び安楽な生活に関連している。室内空気には、身体に有害な気体、微細粉塵、細菌、カビなどが汚染している。有害な気体としてはベンゼン、ホルムアルデヒド、ペンタクロロベンゼン、酢酸ブチル、トルエンキシレン、スチレンなどの揮発性有機化合物（volatile organic chemicals、ＶＯＣ）、ラドンなどが知られている。生物学的汚染物質(biological contaminants)には細菌、カビ、ウイルス、イエダニ、ゴギブリ、動物のフケ、唾液、花粉などが含まれる。特に、イエダニ、カビ、ペット（pet）、ゴキブリ（cockroach）、細菌などから分泌される物質のサイズがマイクロメートル又はそれ以下の場合、吸入されて免疫反応を誘導して炎症性呼吸器疾患を引き起こす。
【０００３】
室内空気にはヒト、ペット、イエダニ、ゴキブリなどを含む様々な生命体の皮膚、胃腸管、呼吸器系などに生息している多種の細菌及びカビと共に、建築物を含む構造物の内部と周辺に生息する或いは流入した多様な種類の細菌及びカビが存在する。
【０００４】
室内空気に生息すると知られている細菌としては、バシラス(Bacillus sp.)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・ルテオラ(Pseudomonas luteola)、ストレプトミセテス(Streptomycetes)、コリネバクテリアセエ(Corynebacteriaceae)、大腸菌(Eshcerichia coli)などが含まれる。
【０００５】
また、前記室内空気に存在する多様な細菌又はこれらに由来する内毒素（lipopolysaccharide、ＬＰＳ）やペプチドグリカン(peptidoglycan)などによって免疫細胞及び肺表皮細胞で炎症性サイトカインの生成が誘導されることが知られている。
【０００６】
一方、グラム陰性細菌は、常に外部へ細胞外ベシクル(outer membrane vesicles)を分泌し、グラム陰性細菌から分泌される細胞外ベシクルは、球状のリン脂質二重層からなっており、２０〜２００ｎｍのサイズを有する。前記細胞外ベシクルは、ＬＰＳだけでなく、宿主の炎症反応を調節することが可能な外膜タンパク質(outer membrane protein)を持っている。最近、本発明者らは、グラム陽性細菌が外部に細胞外ベシクルを分泌し、プロテオーム分析を介して、ベシクル内には炎症を誘導するタンパク質が含まれていることを報告したことがある。
【０００７】
炎症性呼吸器疾患は、上気道に発生する鼻炎及び副鼻腔炎、下気道に発生する喘息及び気管支炎、小気道に発生する細気管支炎、肺実質に発生する肺気腫、肺炎などに大別することができる。臨床的に気道閉塞をもたらす疾患として、可逆的な気道閉塞を特徴とする喘息と、非可逆的気道閉塞を特徴とする慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）に分類することができる。慢性閉塞性肺疾患の原因疾患として、慢性閉塞性気管支炎、慢性閉塞性細気管支炎、肺気腫などが含まれる。喘息の原因物質に関連して、室内空気中に存在するタンパク質（アレルゲン）が重要であると知られており、慢性閉塞性肺疾患の原因に関連して、喫煙などの刺激性因子が重要であると知られている。
【０００８】
喘息と慢性閉塞性肺疾患の発生における炎症の重要性は既に報告されているが、炎症の様相が異なると知られている。喘息の場合は好酸球性炎症が、慢性閉塞性疾患の場合は非好酸球性又は好中球性炎症が重要であると知られている。ところが、重症喘息患者にはむしろ好中球性炎症が重要であり、特に非可逆的気道閉塞を伴う喘息患者には好中球性炎症が重要であると報告されている。特に、慢性的な肺炎症の発生においては、気道及び肺実質に発生する免疫機能の異常が重要であると知られている。本発明者らは、好酸球性炎症の発生にはＴｈ２免疫反応が、好中球性炎症の発生にはＴｈ１及びＴｈ１７免疫反応が重要であることを報告したことがある。
【０００９】
また、炎症が癌を引き起こすという事実は前々から提起されていた。最近では、腸内に生息する細菌に由来する毒素に対するＴｈ１７免疫反応によって大腸癌が発生すると報告されており、胃に共生すると知られているヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)によって慢性胃炎だけでなく胃癌も発生すると知られている。慢性閉塞性肺疾患と肺癌の病因に関連して、同一の原因因子により発生する疾病群であるという仮説が提起されているが、最近、臨床研究では吸煙と関係なく慢性閉塞性肺疾患自体が肺癌発生の重要な危険因子であるという事実がこれを裏付ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、室内空気には各種細菌などから分泌される細胞外ベシクルが存在し、前記細胞外ベシクルが哺乳動物に吸収されるときに炎症性呼吸器疾患を引き起こすという事実を見出すことにより、これに基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、室内空気に存在する細胞外ベシクルを含む組成物、及び前記細胞外ベシクルを用いて炎症性呼吸器疾患などを診断、予防、及び／又は治療する方法などを提供しようとする。
【００１２】
具体的に、本発明は、室内空気に存在する細胞外ベシクルを動物に投与して呼吸器疾患動物モデルを製造し、前記動物モデルを用いて呼吸器疾患に対する予防又は治療候補薬物をスクリーニングする方法などを提供しようとする。また、本発明は、呼吸器疾患に対する予防用又は治療用ワクチン、呼吸器疾患の原因物質を診断する方法、呼吸器疾患の発生及び悪化を予防するための目的で室内空気中の細胞外ベシクルの活性を抑制し或いは前記細胞外ベシクルを除去する方法、室内空気中の細胞外ベシクルの濃度を測定し、呼吸器疾患の発生に関連した室内空気の質を評価する方法などを提供しようとする。
【００１３】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は上述した課題に制限されず、上述していない他の課題は下記の記載から当業者に明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを含む組成物を提供する。
【００１５】
前記本発明の一具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、室内粉塵、イエダニ、カビ、ゴキブリ、ペットの分泌物、ヒトのフケ、花粉などに由来することができるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
前記本発明の他の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは室内空気に存在する細菌から分泌でき、前記細菌は室内粉塵、イエダニ、カビ、ゴキブリ、ペットの分泌物、植物、ヒトのフケで生息する細菌であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００１７】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、２種以上の細菌から分泌された細胞外ベシクルの混合物であってもよい。
【００１８】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細菌はスタフィロコッカス(Staphylococcus)、ミクロコッカス(Micrococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトミセテス(Streptomycetes)、及びコリネバクテリウム(Corinebacterium)を含む。
【００１９】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細菌は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、ミクロコッカス・ライレ(Micrococcus lylae)、大便連鎖球菌(Enterococcus faecalis)、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・ルテオラ(Pseudomonas luteola)、及び大腸菌(Escherichia coli)を含む。
【００２０】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、室内空気に存在するカビから分泌されるものを含む。前記カビから分泌される細胞外ベシクルは、室内粉塵に生息するカビから分泌されるものであってもよい。
【００２１】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細菌又はカビ由来細胞外ベシクルは細菌又はカビ培養液から分離したものであってもよく、前記細胞外ベシクルは細菌又はカビ培養液から自然に分泌されるもの及び人工的に分泌されるものを含む。
【００２２】
本発明の別の側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを動物に投与して製造された疾病モデルを提供する。
【００２３】
前記本発明の細胞外ベシクルは前述と同じである。
【００２４】
前記本発明の一具現例によれば、前記動物モデルはマウスであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２５】
前記本発明の疾病は鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、細気管支炎、肺炎、及び肺癌などを含む。
【００２６】
前記本発明の投与は鼻腔投与、口腔投与、及び気管（trachea）投与を含む。
【００２７】
本発明の別の側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを用いて疾病予防又は治療候補薬物を探索する方法を提供する。
【００２８】
前記本発明の細胞外ベシクルは前述と同じである。
【００２９】
前記本発明の疾病は、室内空気に存在する細胞外ベシクルにより発生又は悪化する、鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、細気管支炎、肺炎、及び肺癌などを含む。
【００３０】
前記本発明の一具現例によれば、前記探索方法は、前記本発明の動物疾病モデルに候補薬物を投与することを特徴とする。
【００３１】
前記本発明の他の具現例によれば、前記探索方法は、室内空気由来細胞外ベシクルを体外で細胞に処理するときに候補薬物を処理することを特徴とする。前記細胞は炎症細胞、上皮細胞、及び線維芽細胞などを含む。
【００３２】
前記本発明の別の具現例によれば、前記探索方法は、室内空気に存在する細胞外ベシクルと共に候補薬物を投与した後、炎症関連媒介体の水準を測定するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の別の側面は、疾病を予防又は治療するために室内空気由来細胞外ベシクルを含むワクチンを提供する。
【００３４】
前記本発明の細胞外ベシクルは前述と同じである。
【００３５】
前記本発明の疾病は、室内空気に存在する細胞外ベシクルによる鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気管支拡張症、細気管支炎、肺炎、肺癌などを含む。
【００３６】
前記本発明の一具現例によれば、前記疾病は、室内空気に存在する細菌又はカビによる副鼻腔炎、気管支拡張症、肺炎などを含む。
【００３７】
前記本発明の他の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させる目的で形質転換された細菌又はカビに由来するものを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させるために化学物質が処理された細菌又はカビに由来するものを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させる目的で化学物質が処理されたものを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させる目的で薬物を併用投与して使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の別の側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを含む感染予防又は治療用ワクチンを提供する。
【００４２】
前記本発明の細胞外ベシクルは前述と同じである。
【００４３】
前記本発明の感染は、室内空気に存在する細菌又はカビによる感染を含み、例えば、病院の室内空気に存在する細菌又はカビによる感染を挙げることができる。
【００４４】
前記本発明の一具現例によれば、前記感染は、細菌又はカビによる副鼻腔炎、気管支炎、気管支拡張症、肺炎及び敗血症などを含む。
【００４５】
前記本発明の他の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させる目的で形質転換された細菌又はカビに由来するものを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させるために化学物質が処理された細菌又はカビに由来するものを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００４７】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させるために化学物質が処理されたものを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクルは、効能を増加させるか副作用を減少させる目的で薬物を併用投与して使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の別の側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを用いて、前記細胞外ベシクルによる疾病の発生又は悪化に関連した原因因子を診断する方法を提供する。
【００５０】
本発明の別の側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを用いて、室内空気に存在する細菌又はカビによる感染の発生又は悪化に関連した原因因子を診断する方法を提供する。
【００５１】
前記本発明の細胞外ベシクルは前述と同じである。
【００５２】
前記本発明の細胞外ベシクルによる疾病は、室内空気に存在する細胞外ベシクルによる 鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気管支拡張症、細気管支炎、肺炎、及び肺癌などを含む。
【００５３】
前記本発明の一具現例によれば、前記疾病は、室内空気に存在する細菌又はカビによる 副鼻腔炎、気管支拡張症、及び肺炎などを含む。
【００５４】
前記細菌又はカビによる感染は、副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎、及び敗血症などを含む。
【００５５】
前記本発明の別の具現例によれば、前記診断方法は、室内空気に存在する細胞外ベシクルに含まれた遺伝物質の塩基配列を分析することであってもよいが、これに限定されるものではない。前記遺伝物質は１６Ｓ rＲＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５６】
前記本発明の別の具現例によれば、前記診断方法は、室内空気に存在する細胞外ベシクルに含まれたタンパク質を測定することであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５７】
前記本発明の別の具現例によれば、前記診断方法は、室内空気に存在する細胞外ベシクルに対する免疫反応を測定することであってもよいが、これに限定されるものではない。前記免疫反応の測定は、室内空気に存在する細胞外ベシクルに対する抗体を測定することであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５８】
前記本発明の診断は室内粉塵を用いて行われてもよい。また、前記診断は、喀痰に由来する試料、胸水に由来する試料、鼻水に由来する試料、小便に由来する試料、及び血液に由来する試料などを用いて行われてもよい。
【００５９】
本発明の別の側面は、疾病の発生及び悪化を予防する目的で室内空気中の細胞外ベシクルの活性を抑制し或いは前記細胞外ベシクルを除去する方法を提供する。
【００６０】
前記本発明の疾病は、室内空気に存在する細胞外ベシクルによる鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気管支拡張症、細気管支炎、肺炎、及び肺癌などを含む。
【００６１】
前記細胞外ベシクルの活性の除去は、細胞外ベシクルに熱を処理し、或いは細胞外ベシクルに特異的に作用する化学物質を処理して行われてもよいが、これに限定されるものではない。前記化学物質は、細胞外ベシクル内のタンパク質、ＬＰＳ(lipopolysaccharide)、ペプチドグリカンの活性を抑制する物質などを含み、前記ＬＰＳ活性抑制化学物質はポリミキシンＢ(polymyxin B)であってもよい。
【００６２】
前記本発明の一具現例として、前記細胞外ベシクルの活性を除去する装置を用いることができる。前記装置は、前記細胞外ベシクルに熱を処理し、或いは細胞外ベシクルに特異的に作用する化学物質を処理する方法などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
前記本発明の他の具現例として、前記細胞外ベシクルを除去する装置を用いてもよい。前記装置は、微細フィルターを含むことができ、１０ｎｍ〜２００ｎｍの孔径(pore size)を有してもよいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明の別の側面は、呼吸器疾患の発生又は悪化に関連した室内空気の質を評価する方法であって、室内空気中の細胞外ベシクルの濃度を測定することを特徴とする方法を提供する。
【００６５】
前記本発明の一具現例として、前記細胞外ベシクルの濃度測定は、細胞外ベシクルの遺伝物質を測定することにより行われてもよく、前記遺伝物質は１６Ｓ ｒＲＮＡであってもよい。
【００６６】
前記本発明の他の具現例として、前記細胞外ベシクルの濃度測定は、細胞外ベシクルのタンパク質を測定することにより行われてもよい。
【００６７】
前記本発明の別の具現例として、前記細胞外ベシクルの濃度測定は、顕微鏡で細胞外ベシクルの数を測定することにより行われてもよく、前記顕微鏡で高解像度光学顕微鏡又は電子顕微鏡を用いてもよい。
【００６８】
本発明の別の側面は、室内空気由来細胞外ベシクルを哺乳動物に投与することを含む、疾病を予防又は治療する方法を提供する。
【００６９】
前記本発明の細胞外ベシクルは前述と同じである。
【００７０】
前記本発明の疾病は、室内空気に存在する細胞外ベシクルによる鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気管支拡張症、細気管支炎、肺炎、及び肺癌などを含む。
【００７１】
前記本発明の一具現例によれば、前記疾病は、室内空気に存在する細菌又はカビによる副鼻腔炎、気管支拡張症、肺炎、及び敗血症などを含む。
【００７２】
前記本発明の投与は皮下注射及び粘膜投与などを含む。
【発明の効果】
【００７３】
本発明者らは、室内空気中に細菌等由来の細胞外ベシクルが存在し、前記細胞外ベシクル（特に、グラム陰性細菌由来細胞外ベシクル）が吸入されたとき、肺にＴｈ１７及び／又はＴｈ１免疫反応を誘導し、これにより好中球性肺炎症が発生して重症喘息と慢性閉塞性肺疾患などの呼吸器疾患が発生するという事実を発見し、これに基づいて本発明を完成した。したがって、本発明の室内空気由来細胞外ベシクルを応用して次の多様な効果を得ることが可能である。
【００７４】
具体的に、本発明は、室内空気に存在する細胞外ベシクルを動物に投与して呼吸器疾患動物モデルを製造し、前記動物モデルを用いて呼吸器疾患に対する予防又は治療候補薬物を検索及び発掘することを可能とする。すなわち、疾病を予防又は治療する薬物を開発するためには、正確な原因物質を把握することが極めて重要である。例えば、原因物質を体外で細胞に投与する過程で候補薬物を処理して効能を検証することができ、前記動物モデルに候補薬物を投与して効能を検証することができる。したがって、本発明は、室内空気に存在する細胞外ベシクルによる疾病を予防又は治療する薬物を開発するために、室内空気に存在する細胞外ベシクルを用いた体外スクリーニングシステム及び／又は動物モデルを介して、室内空気に存在する細胞外ベシクルにより発生する呼吸器疾患を予防又は治療するための薬物を効率よく発掘することができる。
【００７５】
また、本発明は、重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺癌などの呼吸器疾患の原因因子を正確に診断することを可能とする。すなわち、室内空気に存在する細胞外ベシクルの遺伝物質の塩基配列分析、タンパク質分析、又は免疫反応の測定によって呼吸器疾患の原因因子を診断する方法への応用が可能である。
【００７６】
疾病の原因因子を正確に把握することは、疾病を予防又は治療することが可能なワクチンの開発に必須的である。ウイルス性感染疾患の場合は、原因ウイルスを弱毒化した形で体内に投与することにより、ウイルスに対する免疫反応を誘導して予防ワクチンを開発して使用しており、現在、ウイルスにより発生する疾患を予防ワクチンで効率よく予防することができった。本発明は、室内空気に存在する細胞外ベシクルが呼吸器疾患の原因因子であるという事実により、細胞外ベシクルを応用して体内で起きる免疫反応を調節することにより効率的なワクチンの開発を可能とする。
【００７７】
また、本発明は、室内空気に存在する細胞外ベシクルが呼吸器疾患の原因因子であるという事実を通じて、室内空気に存在する細胞外ベシクルの濃度を測定することにより、呼吸器疾患の発生又は悪化に関連した室内空気の質を評価することを可能とする。これに加えて、熱処理又は化学物質の処理が可能な空気浄化装置などによって室内空気中の細胞外ベシクルの活性を抑制し或いは病原性細胞外ベシクルを除去することにより、呼吸器疾患の発生及び悪化を予防又は治療することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】採集した室内粉塵から細胞外ベシクルを分離する過程を示す図である。
【図２】室内粉塵から分離した細胞外ベシクルの形状とサイズを透過電子顕微鏡（transmission electron microscope、ＴＥＭ）で分析した結果を示す図である。
【図３】室内粉塵をマウスの鼻腔内に投与して炎症性呼吸器疾患（肺炎症）を誘導する過程を示す図である。
【図４】室内粉塵をマウスの鼻腔内に投与したときの気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)における炎症細胞の数を測定した結果である。
【図５】室内粉塵をマウスの鼻腔内に投与して炎症性呼吸器疾患（肺炎症）を誘導したときに、肺組織からＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカインの発現を細胞内サイトカイン染色(intracellular cytokine staining)で測定した結果である。
【図６】マウスマクロファージに、室内粉塵から分離した細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）と水溶性成分（Ｄｕｓｔ−ｓｏｌｕｂｌｅ）を処理し、分泌されたサイトカインの量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果である。
【図７】マウスマクロファージに、室内粉塵から分離した細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）を処理したとき、細胞外ベシクルを投与する用量が増加するにつれてＴＮＦ−αとＩＬ−６の分微量が増加することを示す結果である。
【図８】室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）にポリミキシンＢ（ＰＭＢ）又は熱（heat）処理した後、マウスマクロファージに投与したときにＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌量を測定した結果である。
【図９】室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）によるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価するためのプロトコルである。
【図１０】図９のプロトコルに従い、室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）によるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価するために、肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)における炎症細胞の数を測定した結果である。
【図１１】室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）を反復的に投与して誘導したｉｎ ｖｉｖｏ後天免疫反応及びその結果により発生する肺炎症の発生に対する細胞外ベシクル及びベシクル内ＬＰＳの役目を評価するためのプロトコルである。
【図１２】図１１のプロトコルに従い、室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）及びベシクルへのポリミキシン（Polymyxin  B、ＰＢＭ）処理による肺炎症の発生を評価したものであって、肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)における炎症細胞の数を示すものである。
【図１３】図１１のプロトコルに従い、室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）及びベシクルへのポリミキシン（Polymyxin  B、ＰＢＭ）処理による後天免疫反応を評価するために、局所リンパ節から免疫細胞を分離して免疫細胞におけるＩＦＮ−γとＩＬ−１７の発現様相を細胞内サイトカイン染色(intracellular cytokine staining)で評価した結果を示すものである。
【図１４】図１１のプロトコルに従い、室内空気に存在する細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）及びベシクルにポリミキシンＢ（Polymyxin  B、ＰＭＢ）処理を施したとき、室内粉塵から分離したベシクルに対する血清内特異抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した結果である。
【図１５】室内粉塵から分離した細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）に大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ及び大腸菌由来ベシクル（Ｅ．ｃｏｌｉ−ＯＭＶ）特異抗体に反応するタンパク質が存在することを示す結果である。
【図１６】大腸菌由来細胞外ベシクルの１回鼻腔投与の際に炎症性サイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液（BAL  fluid）で測定した結果である。
【図１７】大腸菌由来ベシクル（ＥＣ−ＥＶ）を３週間反復投与したときに発生する肺炎症を評価するためのプロトコルである。
【図１８】大腸菌由来ベシクル（ＥＣ−ＥＶ）を反復投与したときの、肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液（BAL  fluid）における炎症細胞の数を示すものである。
【図１９】高用量の大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ−ＥＶ）を４週間反復投与したときの組織学的変化を評価するためのプロトコルである。
【図２０】図１９のプロトコルに従い、大腸菌由来ベシクル（ＥＣ−ＥＶ）投与の際に肺組織に、肺胞の破壊を特徴とする肺気腫が発生することを示す結果である。
【図２１】イエダニに存在する細胞外ベシクルを分離するためのプロトコルである。
【図２２】イエダニから分離した細胞外ベシクルの形状とサイズを透過電子顕微鏡（transmission electron microscope、ＴＥＭ）と動的光散乱法（dynamic light scattering、ＤＬＳ）で分析した結果を示すものである。
【図２３】マウスマクロファージにイエダニ由来細胞外ベシクル（ＨＤＭ−ＥＶ）処理を施したときのサイトカインの量を測定した結果である。
【図２４】イエダニ由来細胞外細胞外ベシクル（ＨＤＭ−ＥＶ）によるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価するために、肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)における炎症細胞の数を示す図である。
【図２５】イエダニ由来細胞外ベシクル（ＨＤＭ−ＥＶ）によるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価するために、気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)におけるサイトカインの生成を測定した結果である。
【図２６】イエダニ由来細胞外ベシクル（ＨＤＭ−ＥＶ）によるｉｎ ｖｉｖｏ後天免疫反応を評価するために、肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)における炎症細胞の数を示す図である。
【図２７】イエダニ由来細胞外ベシクル（ＨＤＭ−ＥＶ）によるｉｎ ｖｉｖｏ後天免疫反応を評価するために、気管支肺胞洗浄液における、Ｔｈ１７細胞から分泌されるＩＬ−１７の生成を測定した結果である。
【図２８】室内粉塵で細菌とカビを培養した結果を示すものである。
【図２９】室内粉塵に生息する細菌を分離して同定するための過程を示すものである。
【図３０】ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（Ｓ−ＥＶ）及び熱処理したベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ先天免疫反応を評価するために、マウスマクロファージに前記細胞外ベシクルを投与したときのＴＮＦ−αとＩＬ−６を測定した結果を示すものである。
【図３１】ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価するためのプロトコルを示すものである。
【図３２】図３０のプロトコルに従い、ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（Ｓ−ＥＶ）を鼻腔内に投与し、気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)における炎症細胞の数を測定した結果である。
【図３３】図３０のプロトコルに従い、ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（Ｓ−ＥＶ）によるＩＬ−６の分泌を気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)で測定した結果である。
【図３４】ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる免疫反応の発生に対する、ベシクル内タンパク質又は熱に抵抗する成分の役割を評価するためのプロトコルを示すものである。
【図３５】図３３のプロトコルに従い、ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（Ｓ−ＥＶ）に熱処理を施した後、鼻腔投与したときに、気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数を測定した結果である。
【図３６】図３３のプロトコルに従い、ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（Ｓ−ＥＶ）に熱処理を施した後、鼻腔投与したときに、気管支肺胞洗浄液におけるＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡ法によって測定した結果である。
【図３７】大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）１μｇを１週間隔で３回腹腔投与する過程でマウス血液内のベシクル特異抗体の量を測定して示すグラフである。
【図３８】大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）ワクチンを投与したマウスの脾臓細胞に体外で大腸菌由来細胞外ベシクルを処理したときに分泌されるＩＦＮ−γの量を示すグラフである。
【図３９】大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）ワクチンを投与したマウスの脾臓細胞に体外で大腸菌由来細胞外ベシクルを処理したときに分泌されるＩＬ−１７の量を示すグラフである。
【図４０】大腸菌（ＥＣ）感染による敗血症モデルのマウス致死率を示す結果である。
【図４１】大腸菌（ＥＣ）腹腔投与による敗血症モデルにおける、敗血症による致死率に対する大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）ワクチンの効能を示すグラフである。
【図４２】大腸菌（ＥＣ）腹腔投与による敗血症モデルにおける、大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）の接種有無による血液内大腸菌数（ＣＦＵ）を示すグラフである。
【図４３】大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）を接種したマウスに高用量の大腸菌由来細胞外ベシクル（５μｇ）を反復的に（３回）腹腔投与し、６時間後にマウスの血清におけるＩＬ−６を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
室内空気に存在する有害物質を吸入したとき、呼吸器疾患が発生する。アレルギー反応は、免疫学的過敏反応を特徴とし、タンパク質を単独で吸入したときに免疫寛容が誘導されるが、先天免疫反応によりタンパク質に対する免疫寛容の代わりに免疫反応を誘導する物質がタンパク質と共に吸入されたときに、タンパク質に対する記憶を特徴とする後天免疫反応（感作）が発生する。タンパク質に対する感作が誘導されると、低い濃度のタンパク質が吸入されても、タンパク質に対する免疫反応で炎症を誘発する可能性がある。室内空気に存在する有害物質のうち、気体の場合には気体自体の毒性により炎症が誘導されるが、後天免疫反応による炎症を誘導しない。これに対し、室内空気に存在する生物学的汚染物質は先天免疫反応を誘導する物質とタンパク質を共に持っており、先天免疫反応と後天免疫反応を同時に誘導することができるという特徴がある。ところが、未だ室内空気に細菌等由来の細胞外ベシクルが存在し、或いは室内空気に存在する細胞外ベシクルが呼吸器疾患の原因物質であるという事実が報告されたことがない。本発明者らは、室内空気中に細菌等由来の細胞外ベシクルが存在し、これを吸入したときに呼吸器疾患が誘導されるという事実を最初に解明し、本発明を完成するに至った。
【００８０】
一方、炎症は好酸球の浸潤有無によって好酸球性炎症と非好酸球性（又は好中球性）炎症に区別することができる。慢性炎症はタンパク質に対する過敏反応（後天免疫反応）を特徴とする免疫機能の異常により発生し、好酸球性炎症はタンパク質に対するＴｈ２免疫反応の結果として発生し、好中球性炎症はＴｈ１７及び／又はＴｈ１免疫反応の結果として発生する。
【００８１】
本発明者らは、室内粉塵を吸入したときに好中球性炎症が誘導され、室内粉塵に存在する成分の中でも細胞外ベシクルが好中球性炎症を引き起こす主原因因子であり、細胞外ベシクルの活性が、グラム陰性細菌に由来する内毒素（エンドトキシン（endotoxin）又はＬＰＳ(lipopolysaccharide)）の活性を拮抗する薬物（ポリミキシンＢ（Polymyxin  B））を処理したときに抑制されるという事実に基づいて、室内空気に存在するグラム陰性細菌由来細胞外ベシクルが、好中球性炎症反応を特徴とする呼吸器疾患を引き起こす原因物質であるという事実を最初に解明した。
【００８２】
好中球性肺炎症は、非可逆的気道閉塞を伴う重症喘息と慢性閉塞性肺疾患の発生に重要な病態生理である。喫煙を問わず、好中球性炎症を特徴とする慢性閉塞性肺疾患は、肺癌発生の重要な危険因子であって、実際に慢性閉塞性肺疾患者の1／３は肺癌で死亡する。また、Ｔｈ１７免疫反応及びこれによる好中球性炎症により大腸癌が発生するという動物実験結果が最近報告された。これは肺に発生するＴｈ１７免疫反応及び／又は好中球性炎症は重症喘息と慢性閉塞性肺疾患の病因に重要であるうえ、肺癌の発生にも密接な関連があることを意味する。
【００８３】
本発明は、室内空気由来細胞外ベシクルを含む組成物、及び前記細胞外ベシクルを用いて炎症性呼吸器疾患などを診断、予防、及び／又は治療する方法などを提供する。
【００８４】
本発明において、「室内」とは建築物（buildingｓ）を含む構造物（structures）の内部と周辺を含む意味であり、「室内空気」とは室内粉塵だけでなく、室内に生息するイエダニ、ゴキブリ、ペット、植物、ヒトなどから分泌される物質を含む意味である。
【００８５】
本発明において、「室内空気由来細胞外ベシクル」とは、建築物を含む構造物の内部と周辺にある空気に存在する細胞外ベシクルを含む意味であり、たとえば、室内空気由来細胞外ベシクルは、室内空気に生息する細菌から分泌された細胞外ベシクル、及び室内に生息するイエダニ、ゴキブリ、ペット、植物、ヒトなどに存在する細菌が分泌して室内空気に存在する細胞外ベシクルを含み、サイズが元来の細胞より小さいことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００８６】
室内空気には様々な細菌とカビが生息するうえ、ヒト、ペット、イエダニ、ゴキブリなどを含む多様な生命体の皮膚、消火器、呼吸器などに生息している多種の細菌及びカビとともに、建築物を含む構造物の内部と周辺に生息する或いは流入した多様な種類の細菌とカビが存在する。室内、特に寝台マットレスやカーペットなどには多量の粉塵が存在し、粉塵には多様な細菌とカビが生息するうえ、イエダニなどの動物から分泌される物質が存在する。真空掃除機を用いて室内粉塵を得た後、ガーゼを用いて髪の毛などの大きい物質を除去してから培養する。この際、室内粉塵で多数のカビと細菌が培養された。また、サイズの大きい物質を除去した室内粉塵を生理食塩水（phosphate buffer saline、ＰＢＳ）に溶かした後、多数回の遠心分離過程を経て細胞外ベシクルを抽出した。透過電子顕微鏡写真を介して、室内空気から分離した細胞外ベシクルはサイズ５０〜１００ｎｍの球状であることを確認した。
【００８７】
また、室内に在る粉塵が炎症性呼吸器疾患を発生させるかを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに粉塵を３週間鼻腔投与した。粉塵を最後に鼻腔投与してから２４時間経過の後に評価したとき、マウスの気管支肺胞洗浄液（bronchoalvelolar lavege fluid、ＢＡＬＦ）における炎症細胞の数が増加し、特に好中球の数が著しく増加することが観察された。前記結果により、室内に在る粉塵が、好中球の浸潤を特徴とする炎症性呼吸器疾患（肺炎症）を誘導することを確認した。
【００８８】
前記呼吸器疾患を引き起こす免疫学的メカニズムを評価するために、Ｔ細胞に発現するサイトカインをフローサイトメトリー(Flow cytometry)方法で評価した。Ｔ細胞による後天免疫反応は、ＩＦＮ−γを分泌するＴｈ１細胞による免役反応、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などを分泌するＴｈ２細胞による免役反応、及びＩＬ−１７を分泌するＴｈ１７細胞による免疫反応に分けることができる。粉塵により発生した好中球性肺炎症は、主にＩＬ−１７を生成するＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）とＩＦＮ−γを分泌するＴｈ１細胞によって媒介される炎症反応であることが分かった。Ｔｈ１及びＴｈ１７免疫反応は気道及び肺実質に好中球性炎症を特徴とする炎症性呼吸器疾患（喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎など）及び肺癌の発生に重要な役割を果たすが、特にＴｈ１炎症は肺気腫の発生に重要であり、Ｔｈ１７炎症は肺癌の発生に重要であると知られている。
【００８９】
室内粉塵による炎症反応の誘導と関連して、室内粉塵に存在する細胞外ベシクルと水溶性成分の役割を評価するために、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）に、粉塵から分離した細胞外ベシクルと水溶性因子を投与したとき、ＴＮＦ−αの分泌はいずれにおいても増加したが、ＩＬ−６の分泌は主に細胞外ベシクルを投与した場合に増加した。これは、ＩＬ−６を基とした免疫反応及び炎症の発生に、室内空気に存在する細胞外ベシクルが重要であることを意味する。
【００９０】
室内空気に存在する細胞外ベシクルは、室内空気に生息している細菌又はヒト、ペット、イエダニ、ゴキブリなどを含む多様な生命体に生息し、或いは建築物を含む構造物の内部と周辺に生息する多様な種類の細菌によって分泌できる。このような細胞外ベシクルは、細菌タンパク質、ＬＰＳ、ペプチドグリカンなどの物質を持っており、炎症反応を誘導することができる。
【００９１】
室内空気に存在する細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ先天免疫反応を評価するために、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）に、室内粉塵から分離した細胞外ベシクルを処理した。マクロファージは、炎症を誘導することが可能なＴＮＦ−α及びＩＬ−６などを分泌し、前記細胞外ベシクル処理の際にＴＮＦ−α及びＩＬ−６の量が細胞外ベシクルの用量に比例して増加することが分かった。
【００９２】
ＩＬ(interleukin)−６は、炎症反応の際に初期に分泌される炎症性サイトカインであって、初期炎症反応の尺度の役割を果たし、Ｔｈ１７細胞免疫反応によって好中球性炎症を誘導することに重要な媒介体として知られている。また、ＩＬ−６は、体内細胞でＳＴＡＴ３シグナリング（signaling）を増加させて肺細胞の増殖、血管新生、免疫反応抑制などを介して肺癌の発生と関連しているだけでなく、抗原に対するＴ細胞の後天免疫反応の発生においてｎａｉｖｅＴ細胞がＴｈ１７細胞に分化することに重要な役割を果たす。
【００９３】
したがって、室内空気に存在する細胞外ベシクルがマクロファージでＩＬ−６の量を増加させるという事実は、前記細胞外ベシクルが炎症反応を誘導して喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎などの炎症性呼吸器疾患だけでなく、肺癌などを発生させることができることを意味する。
【００９４】
前述したように、室内空気に存在する細胞外ベシクルは、炎症反応を誘導しうる様々なタンパク質とＬＰＳなどの物質を含むことができるので、室内空気に存在する細胞外ベシクルにより誘導される炎症反応における前記物質の役割を評価した。
【００９５】
ポリミキシンＢ（Polymyxin  B）は、ＬＰＳの作用基であるリピドＡ(lipid A)に反応してＬＰＳの機能を抑制する役割を果たす。これに基づいて、マウスマクロファージに、粉塵から分離した細胞外ベシクルとポリミキシンＢ（Polymyxin  B）を共に処理したとき、細胞外ベシクルにより誘導されるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌が阻害されたが、これはグラム陰性細菌に由来する細胞外ベシクルが前記媒介体を分泌することに重要であることを意味する。
【００９６】
一方、細胞外ベシクルには様々なタンパク質が存在するが、ベシクルに存在するタンパク質の役割を評価するために、１００℃で２０分間加熱した細胞外ベシクルをマウスマクロファージに処理した。前記ベシクルに熱処理を施した場合、ＴＮＦ(Tumor necrosis factor)-αの分泌は減少したが、ＩＬ−６の分泌はむしろ増加した。これはＴＮＦ−αの分泌にはベシクル内タンパク質が重要であるが、ＩＬ−６の分泌には熱に耐性を有するベシクル成分が重要であることを意味する。
【００９７】
また、室内空気から分離した細胞外ベシクルを実験動物に投与して呼吸器疾患の動物モデルを製造することができる。これに関連して、粉塵から分離した細胞外ベシクルをマウスに投与して肺炎症の発生及びＩＬ−６の分泌に対する影響を評価した。多様な濃度の細胞外ベシクルをマウスの気道に投与したとき、濃度に応じて炎症細胞の流入が増加することを確認した。細胞外ベシクルを投与したマウスにおけるＩＬ−６の生成量が増加した。前記結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験でベシクルによって炎症細胞からのＩＬ−６の分泌が増加する現象がｉｎ ｖｉｖｏシステムにおいても再現されることを意味する。
【００９８】
室内粉塵から分離した細胞外ベシクルを反復的に投与したとき、炎症性呼吸器疾患の発生有無を評価した。ベシクルを３週間気道に投与したときに好中球性炎症が発生した。これに対し、ポリミキシンＢ（Polymyxin  B）とベシクルを共に投与したときには炎症が顕著に抑制された。これは炎症の発生にグラム陰性細菌由来細胞外ベシクルが重要であることを意味する。
【００９９】
また、肺炎症の発生に関与する免疫学的病因を評価した結果、粉塵から分離したベシクルを投与した場合には肺組織内ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７を発現するＴ細胞が顕著に増加し、ポリミキシンＢ（Polymyxin  B）を前記ベシクルと共に投与した場合には前記細胞の浸潤が顕著に減少した。前記結果は、粉塵に存在する細胞外ベシクルにより発生する好中球性肺炎症がＴｈ１及びＴｈ１７免疫反応により誘導され、その発生にはベシクル内のＬＰＳ成分が重要な役割を果たすことを意味する。
【０１００】
また、室内空気に由来する細胞外ベシクル特異抗体を測定した結果、ベシクルを投与した場合にはベシクル特異ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体が有意に増加した。これは、ポリミキシンＢ（Polymyxin  B）をベシクルと共に投与した場合には顕著に減少した。前記結果は室内粉塵に存在する細胞外ベシクルが気道に吸入されたときに血清内ベシクル特異抗体が形成され、その生成にはベシクル内ＬＰＳ成分が重要な役割を果たすことを意味する。
【０１０１】
大腸菌はグラム陰性細菌として腸内に存在するが、室内粉塵に大腸菌が存在し、大腸菌が細胞外ベシクルを分泌することが報告されたことがある。室内粉塵から分離した細胞外ベシクルに大腸菌由来細胞外ベシクルが存在するかを評価した。大腸菌由来細胞外ベシクルに特異的に存在する１６Ｓ ｒＲＮＡに対するプライマー（primer）から遺伝型を分析したとき、陽性所見を示した。また、大腸菌由来細胞外ベシクルに対する抗体を作り、これを用いて、粉塵から分離した細胞外ベシクルタンパク質に対するウエスタンブロット(Western Blot)を施行したとき、粉塵から分離した細胞外ベシクル内タンパク質が大腸菌由来細胞外ベシクル特異抗体と結合した。前記結果は、室内粉塵には大腸菌由来細胞外ベシクルが存在することを意味する。大腸菌は、主に大腸に生息する菌であって、イエダニ、ゴキブリ、ペット、ヒトなどの腸に生息しながら持続的に細胞外ベシクルを分泌する。これはイエダニなどが大便を介して大腸菌由来細胞外ベシクルを持続的に分泌することを意味する。
【０１０２】
大腸菌由来細胞外ベシクルを１回気道内に投与して炎症媒介体の分泌を体内で評価したとき、細胞外ベシクルの投与用量に比例してＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌が増加した。
【０１０３】
大腸菌由来細胞外ベシクルを反復的に投与したときに炎症性呼吸器疾患が発生するかを評価するために、週２回３週間鼻腔投与したとき、気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数が大腸菌由来細胞外ベシクルの投与用量に依存的に増加した。
【０１０４】
前記の方法で高用量（１００ｎｇ）の細胞外ベシクルを４週間反復投与して肺気腫の発生を評価したとき、細胞外ベシクルを投与した場合に肺気腫が発生した。これは室内粉塵に大腸菌由来細胞外ベシクルのような病原性ベシクルが高濃度で存在してこれを吸入したとき、非可逆的気道閉塞をもたらす肺気腫が誘導されることを意味する。
【０１０５】
室内粉塵由来細胞外ベシクルは、粉塵に存在する様々な細菌により生成されてもよく、室内空気に存在するイエダニ、ゴキブリ、ヒト、ペッドなどを含む多様な生命体に生息する細菌が細胞外ベシクルを分泌することができる。
【０１０６】
本発明者らは、室内粉塵に生息するイエダニから細胞外ベシクルを分離した。イエダニ由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応を評価するために、細胞外ベシクルをマウスマクロファージに処理した。マクロファージからのＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌がベシクルの濃度に比例して増加した。また、ベシクルにより分泌される前記炎症媒介体は、ＬＰＳを拮抗するポリミキシンＢ（Polymyxin  B）の処理によって抑制された。これはイエダニに由来する細胞外ベシクルが呼吸器疾患を誘導することができ、これにはグラム陰性細菌から分泌された細胞外ベシクルが含まれていることを意味する。
【０１０７】
前述したように、イエダニに由来する細胞外ベシクルはｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で先天免疫反応を誘導することが分かった。これをｉｎ ｖｉｖｏシステムで再現されることを評価するために、イエダニ由来細胞外ベシクルを１回マウスの気道に投与して先天免疫反応を評価した。細胞外ベシクルの濃度に依存的に肺への炎症細胞の浸潤が増加した。これと共に、炎症媒介体としてのＴＮＦ−γ及びＩＬ−６の分泌も増加した。
【０１０８】
前記ｉｎ ｖｉｖｏシステムにおける先天免疫反応結果に基づいて、イエダニ由来細胞外ベシクルを反復的に吸入投与したときに肺炎症の発生有無を評価した結果、イエダニ由来細胞外ベシクルを３週間投与したときに好中球性肺炎症が誘導され、これと共にＩＬ−１７の分泌も増加した。
【０１０９】
前記結果より、イエダニに由来する細胞外ベシクルによって好中球性肺炎症が発生し、これは主にＴｈ１７免疫反応によって媒介される現象であることが分かった。
【０１１０】
本発明者らは、室内粉塵に生息する細菌を分離し、グラム陽性細菌の存在を同定した。その結果、グラム陽性細菌として黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus、S.aureus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)などが同定された。
【０１１１】
ブドウ球菌はグラム陽性細菌である。最近、本発明者らは、細胞外ベシクルを分泌することを最初に報告したことがある。ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応を評価するために、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウスマクロファージに処理した。ブドウ球菌由来ベシクルによってマクロファージからＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌が増加した。前記結果は、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが炎症性呼吸器疾患及び肺癌を誘導することができることを示唆する。
【０１１２】
前述したように、ブドウ球菌に由来する細胞外ベシクルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で先天免疫反応を誘導することを確認した。これはｉｎ ｖｉｖｏシステムで確認するために互いに異なる濃度（１μｇ、１０μｇ）のブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウスの気道内に投与した。細胞外ベシクルの投与量が増加するにつれて、マウスの肺に流入した炎症細胞が増加した。特に、好中球の過度な流入を確認することができた。気管支肺胞洗浄液におけるＩＬ−６の分泌量も細胞外ベシクルの濃度が増加するにつれて増加した。
【０１１３】
前記結果より、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルにより肺炎症が発生することが確認された。ＩＬ−６によるＴｈ１７後天免疫反応との関連性も予想することができる。
【０１１４】
これに加えて、ｉｎ ｖｉｖｏシステムにおけるブドウ球菌由来細胞外ベシクル内タンパク質の役割を確認するために熱処理した細胞外ベシクルをマウスの気道内に投与した。この際、肺癌及びタンパク質特異Ｔｈ１７後天免疫反応を引き起こすことに核心的な役割を果たすＩＬ−６の生成量が全て減少することを確認した。前記結果より、粉塵吸入により発生するＴｈ１７免疫反応による肺炎症の発生においてブドウ球菌由来細胞外ベシクル内のタンパク質はＩＬ−６の生成を増加させる役割を果たすことが分かる。
【０１１５】
疾病の原因因子を解明することは、原因因子を用いた免疫調節を可能とする。本発明者らは、室内空気に存在する大腸菌由来細胞外ベシクルが吸入されたときに炎症性呼吸器疾患が誘発されることを確認した。大腸菌由来細胞外ベシクルを低用量で注射したときに細胞外ベシクル特異抗体が形成され、ベシクルに対する特異Ｔ細胞反応でＩＦＮ−γとＩＬ−１７を分泌するＴｈ１及びＴｈ１７免疫反応が誘導された。よって、大腸菌由来細胞外ベシクルをワクチンとして予め注射した後、大腸菌感染を誘導したときに、大腸菌感染が顕著に抑制された。また、前記ベシクルワクチンを予め投与したとき、大腸菌由来細胞外ベシクルの血管吸収により起こる炎症媒介体の分泌が有意に抑制された。これは細菌由来細胞外ベシクルを注射することにより免疫反応を誘導し、これにより室内空気に存在する細胞外ベシクルによる疾病だけでなく、室内空気に存在する細菌に対する感染を効率よく予防することができることを意味する。
【０１１６】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。ところが、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【０１１７】
実施例１．室内粉塵からの細胞外ベシクルの抽出及び特性解明
本発明者らは、室内空気に細胞外ベシクルが存在するか否かを確認するために、室内粉塵から細胞外ベシクルを分離、同定する実験を行った。
【０１１８】
具体的に、真空掃除機を用いて、特定住居地の寝具に存在する粉塵を収去した。真空掃除機のフィルター内に存在する粉塵を綺麗なガラス瓶に移して質量を測定した。室内粉塵５ｇを２００ｍＬのＰＢＳ入りのビーカーに４℃で１２時間溶解させた。その後、一次的にガーゼを用いて大きな異物を濾過し、濾過した溶液を高速遠心分離チューブ(high speed centrifuge tube)に分けて入れた後、４℃で１０，０００×ｇにて１５分間高速遠心分離(high speed centrifugation)を連続的に２回行った。１８０ｍＬの上澄液を孔径０．４５μｍのメンブレインフィルター(membrane filter)を１回通過させた後、容量７０ｍＬの超遠心分離チューブ(ultracentrifuge tube)に分けて入れ、４℃で１００，０００×ｇにて４時間超遠心分離(ultracetrifugation)を行った。上澄液は捨て、チューブの下に存在する沈殿物はＰＢＳで溶かして細胞外ベシクルを抽出した。
【０１１９】
室内粉塵由来細胞外ベシクルの特性解明のために細胞外ベシクルを分離したとき、スクロースクッション方法で追加精製を行った。容量３５ｍＬの超遠心分離チューブに０．５ｍＬの２．５Ｍスクロース、１ｍＬの０．８Ｍスクロース、及び３２ｍＬの異物が除去された溶液を順次仕込み、４℃で１００，０００×ｇにて４時間超遠心分離を行った。超遠心分離の後、細胞外ベシクルはその密度によって２．５Ｍスクロース層と０．８Ｍスクロース層との間に位置した。チューブの上方から溶液を除去して細胞外ベシクル含有層を分離した。
【０１２０】
図１は室内粉塵から細胞外ベシクルを得た過程を示す。図２は室内粉塵由来細胞外ベシクルの形状とサイズを透過電子顕微鏡（trasmission electron microscope、ＴＥＭ）で撮影した結果を示すもので、前記細胞外ベシクルは脂質二重層からなっており、５０〜１００ｎｍのサイズを有し、球状をしていることが分かる。
【０１２１】
前記結果より、室内粉塵に細胞外ベシクルが存在し、これは室内空気に細胞外ベシクルが存在することを意味する。
【０１２２】
実施例２．室内から採集した粉塵による炎症性呼吸器疾患（肺炎症）の誘導
本発明者らは、室内から採集した粉塵が哺乳動物で炎症性呼吸器疾患を引き起こすか否かを評価するための実験を行った。
【０１２３】
具体的に、室内粉塵又は４０μｍのフィルター（filter）を通過した室内粉塵１００ｎｇを３０μＬのＰＢＳに溶かした。マウスはＣ５７ＢＬ／６、６週齢雌（各群当たり５匹）を使用した。ＰＢＳ(phosphate buffered saline)に溶かした粉塵を０、１、７、８、１４、１５日目にマウスの気道内に投与し、１６日目にマウスに対して肺炎症を測定した。この際、ＰＢＳを投与したマウスを対照群とし、前記粉塵を投与したマウスを実験群とした。
【０１２４】
ケタミン(ketamin)とキシラジン(xylazine)とを混合した麻酔液をマウスの腹腔に投与して麻酔した後、胸部を切開し、気管を露出させてカテーテルを気道に挿入し、結紮させた。無菌性生理食塩水を１ｍＬずつ２回注入し、気道を洗浄して気管支肺胞洗浄液を得た。気管支肺胞洗浄液を４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離した後、細胞ペレット(cell pellet)をＰＢＳ溶液に溶かした。前記細胞ペレットをサイトスピン(cytospin)してスライドに塗抹し、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ染色を行って光学顕微鏡の１００倍視野で３００個以上の炎症細胞を観察し、これをマクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球に分類して各炎症細胞数を測定した。
【０１２５】
図３は室内粉塵をマウスの鼻腔内に投与して炎症性呼吸器疾患（肺炎症）を誘導する過程を示し、図４は気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数を測定した結果を示す。
【０１２６】
図４に示すように、粉塵を鼻腔内投与した場合に肺炎症が発生（ＢＡＬ細胞の増加）することが分かった。特に、好中球（neutrophil）の浸潤が顕著であった。また、粉塵を４０μｍのフィルター（filter）を通過させることによりサイズの大きい物質を除去して鼻腔投与したとき、好中球の浸潤を特徴とする好中球性肺炎症が発生した。これは、好中球性肺炎症を誘導する物質が、室内粉塵に存在する物質の中で４０μｍ未満の成分であることを意味する。
【０１２７】
前記結果より、室内から採集した粉塵が哺乳動物に吸入されたとき、好中球性炎症を特徴とする呼吸器疾患が誘発できることが分かる。
【０１２８】
実施例３．室内から採集した粉塵による好中球性肺炎症の免疫学的発生メカニズム
前記実施例２の結果より、室内粉塵によって哺乳動物で好中球性肺炎症が誘発されることを確認した。これに関連し、本発明者らはその免疫学的メカニズムを解明するための実験を行った。
【０１２９】
具体的に、前記実施例２の方法によって肺炎症を誘導したマウスから肺を摘出した。摘出された肺組織を剃刀の刃で切り刻んだ後、コラゲナーゼＩＶ型(collagenase type ＩＶ)を添加し、３７℃で１０分間培養した。その後、セルストレーナー(cell strainer)を用いて組織から細胞を分離した後、４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離した。
【０１３０】
遠心分離した肺細胞は、赤血球溶解溶液に１０分間入れて赤血球を破壊した。その後、さらに前記の条件で遠心分離を行った。ヘマトサイトメーター(hematocytometer)を用いて細胞を計数し、２×１０６／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ(fetal bovine serum)及び抗生物質(antibiotics)が入っている溶液に溶解させた。細胞を４８ウェルプレート（well  plate）に入れる一日前に、４８ウェルプレート（well  plate）にＣＤ３とＣＤ２８に対する抗体を各１μｇ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳを用いて希釈した後、ウェル当たり２５０μＬを入れて１０〜１８時間４℃を維持させて抗体をウェル（well）にコート（coating）させた。
【０１３１】
肺細胞が前記の濃度で準備されると、抗体がコート（coating）されている４８ウェルプレート（well  plate）をＰＢＳで洗浄することにより、プレート（plate）の底部にコート（coating）されずにフリーフォーム(free form)で駆け巡る抗体を除去した。その後、肺細胞を仕込んでから４時間後、細胞外にタンパク質などの物質が分泌されることを阻害するブレフェルジンＡ(brefeldin A)を１０μｇ／ｍＬ入れて２時間さらに培養し、細胞外に分泌されるサイトカインを細胞内に閉じ込めた。培養済みの細胞は、蛍光付きＣＤ４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８（ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ３（ＡＰＣ）抗体を用いて、肺細胞の表面にある各タンパク質を染色した。３０分が経過すると、４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離して洗浄した後、４％ホルマリン（formalin）を用いて、細胞表面に孔を穿設してサイトカインに対する抗体がよく挿入されるようにした。ホルマリン（formalin）を１０分間処理した後、蛍光付きＩＦＮ−γ（ＰＥ）、ＩＬ−４（ＰＥ）、ＩＬ−１０（ＰＥ）、ＩＬ−１７（ＰＥ）抗体を用いてサイトカインを３０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いて、肺に流入したＴ細胞におけるサイトカインの発現を測定した。
【０１３２】
図５は前記の方法でＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカインの発現量をフローサイトメトリー(Flow cytometry)方法で測定した結果である。図５の濾過された粉塵(filtered dust)は前記実施例２と同様に粉塵を４０μｍのフィルター（filter）を通過させたものである。Ｔ細胞による後天免疫反応は、ＩＦＮ−γを分泌するＴｈ１細胞による反応、ＩＬ−４を分泌するＴｈ２細胞による反応、及びＩＬ−１７を分泌するＴｈ１７細胞による反応に大別される。
【０１３３】
図５に示すように、粉塵により肺炎症を誘導したマウスは、対照群（ＰＢＳ）に比べて、ＩＦＮ−γとＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が肺組織で増加し、粉塵を４０μｍのサイズにフィルタリングした場合にはＩＬ−１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞がさらに増加した。これは、室内粉塵により発生した好中球性肺炎症はＩＦＮ−γとＩＬ−１７を生成するＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞とＴｈ１７細胞）によって起こることを意味する。Ｔｈ１及びＴｈ１７免疫反応は、気道及び肺実質に発生する炎症性呼吸器疾患、例えば重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎などの発生だけでなく、肺癌の発生においても重要な免疫学的過敏反応であって、Ｔｈ１細胞から分泌されるＩＦＮ−γは肺気腫の発生に重要であり、Ｔｈ１７細胞から分泌されるＩＬ−１７は肺癌の発生に重要な役割を果たす。
【０１３４】
前記結果より、室内粉塵が、Ｔｈ１及びＴｈ１７免疫反応を誘導し、好中球性肺炎症を特徴とする喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎などの炎症性呼吸器疾患と肺癌を引き起こすことが分かる。
【０１３５】
実施例４．室内空気に存在する細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ先天免疫反応
前記実施例１で室内粉塵、すなわち室内空気に細胞外ベシクルが存在することを確認したとともに、室内粉塵から分離した細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ先天免疫反応を評価した。このために、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）に、室内粉塵から分離した細胞外ベシクルを処理した。
【０１３６】
まず、室内粉塵をＰＢＳに溶かした後、細胞外ベシクルと水溶性成分を分離した。前記のベシクルと水溶性成分による先天免疫反応を評価するために、細胞外ベシクルと水溶性成分をマウスマクロファージに処理し、上澄液を集めてサイトカインの量を測定した後、その結果を図６に示した。
【０１３７】
具体的に、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を１×１０５となるように２４ウェルプレート（well  plate）に２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭ培地に、粉塵から分離した細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ、０．１μｇ／ｍＬ）及び水溶性成分（Ｄｕｓｔ−ｓｏｌｕｂｌｅ、８μｇ／ｍＬ）をそれぞれ処理した後、１５時間培養した。培養液を集めて４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離し、上澄液を集めてサイトカインの量をＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法によって測定した。
【０１３８】
図６に示すように、室内粉塵から分離したベシクルと水溶性成分によりＴＮＦ−αの分泌が増加したのとは異なり、ＩＬ−６の分泌は主にベシクルにより誘導されることが分かる。これは、ＩＬ−６を基とする炎症疾患の発生に、室内粉塵に存在する細胞外ベシクルが重要であることを意味する。
【０１３９】
これに加えて、前記と同様の方法を用いて細胞外ベシクル１００ｎｇ／ｍＬと１μｇ／ｍＬを処理した後、サイトカインの量を測定した結果、ベシクルを投与する用量が増加するにつれてＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌量が増加することを確認した（図７参照）。
【０１４０】
一方、グラム陰性細菌の外膜（outer  membrane）にはＬＰＳが存在し、室内粉塵にはＬＰＳが含まれており、ＬＰＳが先天免疫反応を誘導するという事実はよく知られている。図８は室内粉塵から分離した細胞外ベシクルによる免疫反応におけるＬＰＳの役割（ＬＰＳ役割阻害剤：ポリミキシンＢ（Polymyxin B、ＰＭＢ））とタンパク質の役割（熱処理による破壊）を評価した結果である。ベシクルによるＴＮＦ−αの分泌はＰＭＢ又は熱を処理した場合の両方ともにおいて顕著に減少した。これに対し、ベシクルによるＩＬ−６の分泌は、ＰＭＢを処理した場合には顕著に減少したが、熱処理を施した場合にはむしろ増加した。
【０１４１】
実施例３の結果より、室内粉塵がＴｈ１７免疫反応を誘導して好中球性肺炎症を誘発することを予想することができる。これに加えて、前記実施例４の結果より、室内粉塵によるＴｈ１７免疫反応による好中球性肺炎症は室内粉塵から分離した細胞外ベシクルによってＩＬ−６の分泌が増加したのと関連があることを意味する。すなわち、室内空気に存在する細胞外ベシクルがＴ細胞をＴｈに分解させるのに核心となるサイトカインＩＬ−６の分泌を増加させ、その結果としてＴｈ１７免疫反応を誘導して好中球性肺炎症を発生させることを予想することができる。また、このような炎症性呼吸器疾患を誘導する病原性ベシクルはＬＰＳを含有しているベシクルが重要であることを意味する。
【０１４２】
実施例５．室内空気に存在する細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応
本発明者らは、実施例４で確認したｉｎ ｖｉｔｒｏ先天免疫反応に加えて、室内空気に存在する細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価するための実験を図９の実験プロトコルに従って行った。
【０１４３】
具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり４匹）を用いて、室内粉塵から分離した細胞外ベシクル０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇを３０μＬのＰＢＳに溶かして鼻腔内に１回投与し、２４時間後に評価した。この際、ＰＢＳを投与したマウスを対照群とした。前述の方法によって、麻酔液を用いてマウスを麻酔した後、気管支肺胞洗浄液を得た。気管支肺胞洗浄液を４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離した後、細胞ペレット（cell  pellet）をＰＢＳ溶液に溶かし、流入した炎症細胞の数を測定した。
【０１４４】
図１０は肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）における炎症細胞の数を測定した結果である。図１０に示すように、対照群（ＰＢＳ）に比べて、細胞外ベシクルを投与した場合（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）はベシクルの用量に比例して気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数が増加することが分かる。また、Ｔｈ１７免疫反応を引き起こす核心サイトカインＩＬ−６の場合、細胞外ベシクルの投与量に比例してその分泌量が増加することが分かる。
【０１４５】
前記結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステム及びｉｎ ｖｉｖｏシステムで室内粉塵から分離した細胞外ベシクルが先天免疫反応を誘導するという事実を確認し、ひいては室内粉塵から分離した細胞外ベシクルがＩＬ−６の分泌を促進させ、これによりＴｈ１７免疫反応が誘導され、好中球性肺炎症を特徴とする呼吸器疾患を引き起こすことが明白である。
【０１４６】
実施例６．室内空気に存在する細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ後天免疫反応
図１１に示したプロトコルに従って、室内粉塵から分離した細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ後天免疫反応を評価する実験を行った。
【０１４７】
具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり４匹）に、室内粉塵から分離した細胞外ベシクル１μｇを３０μＬのＰＢＳに溶かして週２回３週間鼻腔内投与し、最終投与２４時間後に評価した。また、ＬＰＳを含有している細胞外ベシクルの役割を評価するために、ベシクルにＰＭＢを処理してこれを投与した実験を同時に行った。
【０１４８】
図１２は肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数を示すもので、対照群（ＰＢＳ）に比べて、細胞外ベシクル投与群（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）における炎症細胞の数が顕著に増加することを確認することができる。また、室内粉塵から分離した細胞外ベシクルにＰＢＭを処理したとき（Ｄｕｓｔ−ＥＶ＋ＰＭＢ）、ベシクルにより増加した炎症細胞の数が顕著に減少した。これは、室内空気に存在するベシクルに反復的に露出されたときに好中球性肺炎症が発生し、その発生にはＬＰＳを含有しているベシクルが重要であることを意味する。
【０１４９】
これに加えて、本発明者らは、肺炎症の発生に関連した免疫学的病因メカニズムを評価するために、局所リンパ節から免疫細胞を分離して免疫細胞におけるＩＦＮ−γとＩＬ−１７の発現様相を評価した結果を図１３に示した。その結果、粉塵から分離したベシクルを投与した場合、ＰＢＳを投与した場合に比べて局所リンパ節内Ｔ細胞の数が顕著に増加し、特にＩＦＮ−γとＩＬ−１７を発現するＴ細胞が顕著に増加した。また、細胞外ベシクルにＰＭＢを処理した場合には、局所リンパ節内Ｔ細胞の数が減少し、ＩＦＮ−γとＩＬ−１７を発現するＴ細胞の数も顕著に減少した。
【０１５０】
図１４は血清内に存在する室内粉塵から分離したベシクル特異抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した結果である。その結果、ベシクル特異ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの量が、室内粉塵から分離したベシクルを投与した場合には顕著に増加し、ベシクルにＰＭＢを処理した場合にはＰＢＳ投与群と同様の程度に減少した。
【０１５１】
前記結果は、室内空気に存在する細胞外ベシクルによる肺炎症は、好中球性炎症を特徴とし、Ｔｈ１及びＴｈ１７免疫反応によって発生し、その誘発にはＬＰＳを含有しているベシクルが重要であることを意味する。また、室内空気に存在するベシクルを吸入したときに血清内ベシクル特異ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体が増加することが分かるため、血清でベシクル特異抗体を測定することにより、反復的に露出された病原性ベシクルを診断することができる。
【０１５２】
実施例７．室内空気に存在する細胞外ベシクルに対する大腸菌由来細胞外ベシクルの存在確認
前記実施例５及び実施例６の結果より、室内空気に存在する細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応及び後天免疫反応の発生に、ＬＰＳを含有しているベシクルが重要であることが分かった。ＬＰＳはグラム陰性細菌の外膜に存在する物質であり、ＬＰＳを含有しているベシクルはグラム陰性細菌に由来することが自明である。
【０１５３】
大腸菌はグラム陰性細菌として室内空気に存在し、ＬＰＳを含有する細胞外ベシクルを分泌し、ベシクル内にはＬＰＳだけでなく、免疫及び炎症反応を誘導するタンパク質を含有していることを本発明者らが報告したことがある。そこで、本発明者らは、室内粉塵から分離した細胞外ベシクルに対して大腸菌由来細胞外ベシクルの存在を評価した。
【０１５４】
室内粉塵から分離した細胞外ベシクルに大腸菌由来ベシクルが存在するかを評価するために、大腸菌特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡプライマー（primer）を用いて遺伝型を評価した。具体的に、粉塵から分離した細胞外ベシクルを１００℃で２０分間加熱してＤＮＡとＲＮＡを溶出させ、これを鋳型(template)としてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として大腸菌特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡプライマー（primer）を入れ、９４℃（４０秒）と７２℃（４０秒）を１サイクルとして２段階（２step）ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase  Chain Reaction、ＰＣＲ）を４０サイクル行った。
【０１５５】
その結果、大腸菌由来細胞外ベシクル（Ｅ．ｃｏｌｉ−ＥＶ）と同様に、室内粉塵から分離した細胞外ベシクル（Ｄｕｓｔ−ＥＶ）にも大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡが存在することを確認した（図１５参照）。
【０１５６】
また、室内粉塵から分離したベシクルに対して、大腸菌由来ベシクルに含有されたタンパク質の存在を確認した。このために、大腸菌由来ベシクルにより生成された抗体（ａｎｔｉ−Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ Ａｂ）を用いてウエスタンブロット（Western Blot）を行った結果、室内粉塵には細菌などを含んでいるペレット（pellet）成分及び室内粉塵から分離したベシクルに、大腸菌由来ベシクル特異抗体に反応するタンパク質が存在することを確認した（図１５参照）。
【０１５７】
前記結果より、室内空気には大腸菌由来細胞外ベシクルが存在することが明白である。
【０１５８】
実施例８．大腸菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応
実施例７では室内空気に大腸菌由来細胞外ベシクルが存在することが分かった。これに基づいて、大腸菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価した。
【０１５９】
大腸菌由来細胞外ベシクルは大腸菌培養液から抽出した。具体的に、大腸菌を３ｍＬのＬＢ溶液が入っている試験管に３７℃で４時間培養した後、その１０μＬずつを５００ｍＬのＬＢ溶液が入っている２Ｌの８つの三角フラスコに移して３７℃で４時間培養した。培養液を容量３５０ｍＬの１２つの高速遠心分離チューブに分けて入れた後、４℃で５０００×ｇにて１５分間連続的に２回行った。４Ｌ程度の上澄液を孔径０．４５μｍのメンブレインフィルター（membrane  filter）を１回通過させた後、１００ｋＤａ以下の分子のみを通過させることが可能なＱｕｉｘｓｔａｎｄ ｓｙｓｔｅｍを用いて３００ｍＬの量まで濃縮した。濃縮液を孔径０．２２μｍのメンブレインフィルターを１回通過させた後、容量５０ｍＬの超遠心分離チューブ（ultracentrifuge  tube）に分けて入れた後、４℃で１５０，０００×ｇにて３時間超遠心分離（ultracentrifugation）を行った。上澄液は捨て、チューブの下部に存在する沈殿物をＰＢＳで溶かして腸内大腸菌由来細胞外ベシクルを抽出した。
【０１６０】
免疫反応を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり４匹）を用いて前記の方法で抽出した大腸菌由来細胞外ベシクル１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを３０μＬのＰＢＳに溶かして１回鼻腔内投与し、２、８、２４時間の経過後に媒介体の分泌を評価した。この際、ＰＢＳを投与したマウスを対照群とした。前述の方法によって麻酔液を用いてマウスを麻酔した後、気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)を得た。
【０１６１】
図１６は大腸菌由来細胞外ベシクルによる炎症性サイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果である。その結果、ベシクルを投与した場合、対照群に比べて気管支肺胞洗浄液内ＴＮＦ−αとＩＬ−６の量が８時間目に増加し、これはベシクルの用量に比例いて増加することが分かる。
【０１６２】
実施例９．大腸菌由来細胞外ベシクルの反復投与による肺炎症
実施例８で大腸菌由来ベシクルが用量依存的にＴｈ１７免疫反応を誘導するＩＬ−６の分泌を誘導するという事実に基づいて、大腸菌由来ベシクルを反復的に投与して肺炎症を評価した。
【０１６３】
図１７に示したプロトコルに従って、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり４匹）に大腸菌由来細胞外ベシクル１０ｎｇ、１００ｎｇを３０μＬのＰＢＳに溶かして週２回３週間鼻腔内に投与した後、最終ベシクル投与２４時間後に評価した。
【０１６４】
図１８は肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数を示すもので、対照群（ＰＢＳ）に比べて、大腸菌由来細胞外ベシクル投与群（ＥＣ−ＥＶ）における炎症細細胞の数が増加し、これはベシクルの投与用量に依存的に増加することが分かる。
【０１６５】
実施例１０．大腸菌由来細胞外ベシクルによる肺気腫
実施例９で大腸菌由来細胞外ベシクルを３週間気道内に反復投与したとき、用量依存的に肺炎症が発生するという事実に基づいて、高用量のベシクルを４週間反復投与して構造的な変化を評価した。
【０１６６】
図１９に示したプロトコルに従って、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり４匹）に大腸菌由来細胞外ベシクル１００ｎｇを３０μＬのＰＢＳに溶かして週２回４週間鼻腔内投与した後、２４時間目に組織学的変化を評価した。
【０１６７】
図２０は肺組織における肺胞の破壊を示す結果であって、大腸菌由来ベシクルを投与した場合、対照群に比べて、肺胞の破壊を特徴とする肺気腫が発生することが分かる。これをコード長(chord length)に定量したとき、ベシクルを投与した場合は対照群に比べてコード長が大きく増加することが分かる。
【０１６８】
前記結果は、大腸菌由来細胞外ベシクルを比較的高い濃度で反復的に露出させる場合、非可逆的気道閉塞をもたらす肺気腫が発生することを意味する。
【０１６９】
実施例１１．室内空気に生息するイエダニからの生エキス(crude extract)の製造及び細胞外ベシクルの抽出及び特性解明
本発明者らは、室内に生息するイエダニ（house dust mite、ＨＤＭ）に細胞外ベシクルが存在するか否かを調べるために、イエダニから細胞外ベシクルを抽出して特性を解明する実験を行った。
【０１７０】
具体的に、韓国の延世大学校医用節足動物素材銀行からイエダニ２０ｇを購入して綺麗なビーカーに移し、５００ｍＬのＰＢＳを入れた後、４℃で２４時間攪拌した。その後、高速遠心分離チューブ(high speed centrifuge tube)に分けて入れた後、４℃で１０，０００×ｇにて１５分間高速遠心分離（high  speed  centrifugaion）を連続的に２回行った。４５０ｍＬ程度の上澄液を孔径０．２２μｍのメンブレインフィルター（membrane  filter）を１回通過させた後、容量７０ｍＬの超遠心分離チューブ（ultacentrifuge  tube）に分けて入れ、４℃で１００，０００×ｇにて３時間超遠心分離（ultracentrifugation）を行った。上澄液は捨て、チューブの下部に存在する沈殿物はＰＢＳで溶かして細胞外ベシクルを抽出した。
【０１７１】
イエダニ由来細胞外ベシクルの特性解明のために細胞外ベシクルを分離するとき、ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ溶液を用いて追加精製を行った。容量１０ｍＬの超遠心分離チューブに分離した沈殿物を溶かした４．８ｍＬの５０％ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ溶液、３ｍＬの４０％ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ溶液 、及び２．５ｍＬの１０％ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ溶液を順次入れ、４℃で１００，０００×ｇにて２時間超遠心分離を行った。超遠心分離の後、４０％ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ層と１０％ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ層との間に白層が位置することを確認した。チューブの上方から１ｍＬずつ分けて入れた後、ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ ｓｏｌｕｓｉｏｎを除去するためにそれぞれ９ｍＬのＰＢＳと混ぜた後、容量１０ｍＬの超遠心分離チューブに入れ、４℃で１００，０００×ｇにて２時間超遠心分離（ultracentrifugation）を行った。上澄液を捨て、チューブの下部に存在する沈殿物はさらに１ｍＬのＰＢＳに溶かして細胞外ベシクルを抽出した。
【０１７２】
図２１はイエダニから細胞外ベシクルを得る過程を示す図である。図２２はイエダニ由来細胞外ベシクルの形状とサイズを透過電子顕微鏡（transmission electron microscope、ＴＥＭ）及び動的光散乱法（dynamic light scattering、ＤＬＳ）を用いて測定した結果を示す。図２２より、イエダニ由来細胞外ベシクルは脂質二重層からなっており、１００〜２００ｎｍのサイズを有し、球状をしていることが分かる。
【０１７３】
前記結果は、イエダニ抽出物（extract）に細胞外ベシクルが存在することを示す結果である。
【０１７４】
実施例１２．室内空気に生息するイエダニ由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ先天免疫反応
実施例１１ではイエダニ由来細胞外ベシクルが存在することが分かった。イエダニから分離した細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価した。このために、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）にイエダニ由来細胞外ベシクルを処理した。
【０１７５】
具体的に、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を１×１０５となるように２４ウェルプレート（well  plate）に２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭ培地に、イエダニから分離した細胞外ベシクル（ＨＤＭ−ＥＶ）１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇをそれぞれ処理した後、１５時間培養した。培養液を集めて４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離し、上澄液を集めてサイトカインの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０１７６】
図２３に示すように、イエダニから分離したベシクルによってＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌が誘導されることが分かる。処理用量が増加するにつれてＴＮＦ−αとＩＬ−６の生成が増加することを確認した。
【０１７７】
実施例１３．室内空気に生息するイエダニ由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応
実施例１１ではイエダニ由来細胞外ベシクルが存在することが分かり、実施例１２ではイエダニ由来ベシクルによる免疫反応を確認することができた。これに基づいて、イエダニ由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応を評価した。
【０１７８】
具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり５匹）を用いて、イエダニ由来細胞外ベシクル０．１μｇ、１μｇ、１０μｇを３０μＬのＰＢＳに溶かして鼻腔投与し、１２時間後に炎症細胞の浸潤と媒介体の分泌を評価した。この際、ＰＢＳを投与したマウスを対照群とした。前述の方法によって麻酔液を用いてマウスを麻酔した後、気管支肺胞洗浄液(BAL fluid)を得た。
【０１７９】
図２４はイエダニ由来細胞外ベシクルによる炎症を評価した結果であって、肺炎症の指標である気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数を示す。図２４に示すように、対照群（ＰＢＳ）に比べてイエダニ由来細胞外ベシクル投与群（ＥＶ）における炎症細胞の数が増加し、これはベシクルの投与用量に比例して増加することが分かる。
【０１８０】
図２５はサイトカインの分泌を気管支肺胞洗浄液で測定した結果である。図２５に示すように、ベシクルを投与した場合、対照群に比べてＢＡＬ ｆｌｕｉｄ内ＴＮＦ−αとＩＬ−６の量が増加し、これはベシクルの用量に依存的に増加することが分かる。特に１０μｇのベシクルを投与した群ではＴＮＦ−αとＩＬ−６の量が有意に増加することを確認した。
【０１８１】
実施例１４．室内空気に生息するイエダニ由来細胞外ベシクルの反復投与による肺炎症
実施例１３ではイエダニ由来細胞外ベシクルによる免疫反応を確認することができた。これに基づいて、イエダニ由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ後天免疫反応を評価した。
【０１８２】
具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり５匹）を用いて、実施例１３で効果があったイエダニ由来細胞外ベシクル１０μｇを１日１回３日間鼻腔投与して感作させた後、週２回２週間鼻腔投与した。２４時間後、炎症細胞の浸潤及び炎症媒介体の分泌を評価した。この際、ＰＢＳを投与したマウスを対照群とした。前述の方法によって麻酔液を用いてマウスを麻酔した後、気管支肺胞洗浄液（BAL  fluid）を得た。
【０１８３】
図２６は炎症細胞の浸潤を示す結果であって、イエダニ由来ベシクル（ＨＤＭ ＥＶ）を投与した場合、対照群（ＰＢＳ）に比べて気管支肺胞洗浄液内の炎症細胞の数が大きく増加し、特に好中球の数が顕著に増加していた。
【０１８４】
図２７は後天免疫反応の類型を分析するために気管支肺胞洗浄液におけるサイトカインの生成量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果であって、Ｔｈ１７細胞から分泌されるＩＬ−１７がイエダニ由来細胞外ベシクルの投与によって有意に増加することを確認することができた。
【０１８５】
前記結果は、イエダニに存在する細胞外ベシクルが吸入されたとき、Ｔｈ１７免疫反応を媒介とする好中球性肺炎症が発生することを意味する。
【０１８６】
実施例１５．室内粉塵における細菌とカビの培養及び細菌同定
室内空気に存在する細胞外ベシクルは、室内粉塵に存在する多様な細菌又はカビによって生成できる。本発明者らは、真空掃除機を用いて、特定住居地の寝具に存在する粉塵を収去した。真空掃除機のフィルター内に存在する粉塵を綺麗なガラス瓶に移して質量を測定した。室内粉塵５ｇを２００ｍＬのＰＢＳが入っているビーカーに４℃で１２時間溶かし、カーゼを用いてサイズの大きい物質を除去した。このときの粉塵液を１とし、濃度を１／１０ずつ希釈して細菌とカビの成長が可能な培養液入りのプレート（plate）に粉塵液を塗抹した。一定の時間が経過した後、成長した細菌とカビを確認した。図２８に示すように、室内粉塵に多様な細菌とカビが生息していることが分かった。
【０１８７】
その後、本発明者らは、室内粉塵に生息する細菌を分離、同定する実験を行った。室内粉塵に生息する細菌を分離する方法を図２９に示した。具体的に、寝台から集めた粉塵を実施例１と同様の方法で溶かした後、ガーゼ（gauze）を用いてサイズの大きい物質を除去した。このときの粉塵液を１とし、濃度を１／１０ずつ希釈し、細菌の成長が可能な培養液入りのプレート（plate）に粉塵液を塗抹した。一定の時間が経過した後、サイズと色が異なる様々なコロニー（colony）を確認し、各コロニー（colony）を接種して３ｍＬの栄養液入りの試験管に３７℃で培養した。生化学的方法を用いて細菌を同定する微生物自動検査システム（ＶＩＴＥＫ）装備を用いて、粉塵に生息する細菌を同定した。その結果、グラム陽性細菌として黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)などを同定した。
【０１８８】
これにより、粉塵にある細胞外ベシクルはグラム陽性細菌から分泌されるものを含んでいることを予測することができる。
【０１８９】
実施例１６．ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応及びベシクル内タンパク質の役割
最近、本発明者らは、グラム陽性細菌としてのブドウ球菌が細胞外ベシクルを分泌することを最初に発見して報告した。室内空気に存在するグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルによる呼吸器疾患の発生への役割を評価するために、ブドウ球菌培養液から、実施例１の方法でブドウ球菌から分泌される細胞外ベシクルを分離し、呼吸器疾患の病因に対する役割を評価した。
【０１９０】
具体的に、ブドウ球菌を３ｍＬの栄養液が入っている試験管に接種した後、３７℃で６時間培養し、その５ｍＬを５００ｍＬの栄養液が入っている２Ｌの三角フラスコに移して３７℃で４時間培養して吸光度（６００ｎｍ）値が１．０となるようにした。培養液を容量５００ｍＬの高速遠心分離チューブ(high speed centrifuge tube)に入れた後、４℃で１０，０００×ｇにて２０分間遠心分離を行った。細菌を除去した上澄液を孔径０．４５μｍのメンブレインフィルター（membrane  filter）を１回通過させた後、分子量１００ｋＤａ以下のタンパク質を除去することが可能なメンブレインを装着したＱｕｉｘｓｔａｎｄ ｓｙｓｔｅｍを用いて２５倍濃縮した。濃縮液を孔径０．２２μｍのメンブレインフィルターを１回通過させた後、容量７０ｍＬの超遠心分離チューブ（ultracentrifuge  tube）に入れ、４℃で１５０，０００×ｇにて３時間超遠心分離（ultracetrifugation）した。沈殿物をＰＢＳ（phoshate  buffered  saline）で懸濁（resuspension）した後、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを得た。
【０１９１】
ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫反応を評価するために、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を１×１０５となるように２４ウェルプレート（well  plate）に２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄してＦＢＳ(fetal bovine serum)を除去した後、ＤＭＥＭ培地にブドウ球菌由来細胞外ベシクルを１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬで処理して対照群とした。この際、１００℃で２０分間沸かして熱に弱い成分の機能を除去したブドウ球菌由来細胞外ベシクルを処理した細胞を実験群とした。各細胞外ベシクルを１５時間処理した後、培養液を集めて４℃で８００×ｇにて１０分間遠心分離し、上澄液を集めてサイトカインの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。図3０はそれぞれ代表的な炎症性サイトカインとしてのＴＮＦ−αとＩＬ−６を測定した結果を示す。
【０１９２】
図３０に示すように、ＴＮＦ−αの場合、熱を処理した細胞外ベシクル（Ｈｅａｔ−Ｓ−ＥＶ）１μｇ／ｍＬを処理した群はその生成量が１／２以下に減少したが、１０μｇ／ｍＬを処理した群は大きい差異がなかった。これに対し、ＩＬ−６の場合、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルに熱を処理した群（Ｈｅａｔ−Ｓ−ＥＶ）はＩＬ−６の生成量がベシクルの濃度を問わず顕著に減少することが分かる。
【０１９３】
前記結果は、ブドウ球菌由来細胞外ベシクル内のタンパク質又は熱に弱い成分がＩＬ−６による炎症反応を起こすことに重要な役割を果たすことを意味する。
【０１９４】
実施例１７．ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ先天免疫反応及び肺炎症
ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるｉｎ ｖｉｖｏ免疫反応を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢雌マウス（各群当たり３匹）を使用した。ＰＢＳに溶かしたブドウ球菌由来細胞外ベシクル１μｇ、１０μｇをマウスの気道内に投与した群を実験群とし、ＰＢＳを気道内に投与した群を対照群とした。細胞外ベシクルを１回投与した後、翌日にマウスに対して初期肺炎症とサイトカインＩＬ−６の量を測定した（図３１の実験プロトコルを参照）。
【０１９５】
図３２はブドウ球菌由来細胞外ベシクルを気道内に投与し、気管支肺胞洗浄液から炎症を評価した結果である。その結果、細胞外ベシクルを気道内に投与した群（Ｓ−ＥＶ）の場合、濃度に比例して気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数が増加した。特に炎症細胞中の好中球の数が顕著に増加することが分かる。
【０１９６】
また、気管支肺胞洗浄液からＴｈ１７免役反応における核心物質ＩＬ−６の生成量をＥＬＩＳＡ法で確認した結果、図３３に示すように、ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（Ｓ−ＥＶ）の濃度に比例してＩＬ−６の分泌量も増加することが分かる。
【０１９７】
前記結果より、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを哺乳動物に吸入させたときに好中球性肺炎症が発生し、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルはＴｈ１７免役反応において核心的な役割を果たすＩＬ−６の生成を増加させることが分かる。
【０１９８】
実施例１８．ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる先天免役反応の発生におけるタンパク質又は熱に弱い成分の役割
前記実施例１６のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に加えて、先天免役反応の発生に対するブドウ球菌由来細胞外ベシクル内のタンパク質の役割をｉｎ ｖｉｖｏ実験によって検証した。
【０１９９】
具体的に、マウスはＣ５７ＢＬ／６、６週齢雌（各群当たり３匹）を使用した。細胞外ベシクル１μｇ、１０μｇをマウスの気道内に投与した群を対照群とした。細胞外ベシクルを１００℃で２０分間沸かした群を実験群とした。マウスに細胞外ベシクルを１回投与した後、翌日にマウスに対して初期肺炎症とサイトカインＩＬ−６の量を測定した（図３４の実験プロトコルを参照）。
【０２００】
図３５はブドウ球菌由来細胞外ベシクルを気道内に投与し、気管支肺胞洗浄液における炎症反応を評価した結果である。その結果、熱処理を施した細胞外ベシクル１０μｇを気道内に処理した群（Ｈｅａｔ−Ｓ−ＥＶ １０μｇ）と、対照群（Ｓ−ＥＶ １０μｇ）とは肺炎症（気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の数）に大きい差異が無かった。
【０２０１】
図３６は気管支肺胞洗浄液におけるＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示すもので、肺炎症結果とは異なり、熱処理を施したブドウ球菌由来細胞外ベシクル（１μｇ、１０μｇ）を投与した群は対照群に比べてＩＬ−６の生成量が顕著に減少することを確認した。
【０２０２】
前記結果より、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルのタンパク質又は熱に弱い成分がＩＬ−６による免役反応及び炎症性呼吸器疾患の発生に重要な役割を果たすことを再び確認した。
【０２０３】
実施例１９．大腸菌由来細胞外ベシクルワクチンの免疫学的特性
実施例８の方法によって分離した大腸菌由来細胞外ベシクル１ｍｇを１週間隔で３週間３回Ｃ５７ＢＬ／６（雄、６週、グループ当たり１０匹）の腹腔に注入した。毎注入６時間、２４時間、７日後にマウスの血液を得て、血液内に存在する細胞外ベシクル特異的な抗体を測定した。大腸菌由来ベシクル２００ｎｇがコートされた黒色８６ウェルプレートに、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで１：５００希釈されたマウス血清を入れ、常温で２時間培養した後、ぺルオキシダーゼ(peroxidase)が結合したマウス抗体を介して観察した。
【０２０４】
図３７はマウス血液内大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）特異抗体の量を時間経過に伴って観察した結果である。図３７に示すように、細胞外ベシクル特異抗体は、１回細胞外ベシクル投与７日後から形成され始め、２番目と３番目の細胞外ベシクル投与後にさらに多くの抗体が形成され、３番目のベシクルワクチン接種完了７日後に最も高い抗体形成の度合いを示した。
【０２０５】
前記の方法で３回の大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）接種が完了した７日後にマウスから脾臓細胞を分離した。分離された脾臓細胞（２×１０４）に大腸菌由来細胞外ベシクル１００ｎｇを入れて７２時間培養した後、脾臓細胞が分泌する免役反応関連サイトカインとしてのＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−４の量をそれぞれＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０２０６】
図３８はマウス脾臓細胞に大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）を処理したときに分泌されるＩＦＮ−γの量を示す結果である。図３８に示すように、 大腸菌由来細胞外ベシクルを接種していないマウスグループから得た脾臓細胞に比べて、 細胞外ベシクルを接種したマウスから得た脾臓細胞におけるＩＦＮ−γの分泌が増加した。
【０２０７】
図３９はマウス脾臓細胞に大腸菌由来細胞外ベシクル（ＥＣ＿ＥＶ）を処理したときに分泌されるＩＬ−１７の量を示す結果である。図３９に示すように、大腸菌由来細胞外ベシクルを接種していないマウスグループから得た脾臓細胞に比べて、 細胞外ベシクルを接種したマウスから得た脾臓細胞におけるＩＬ−１７の分泌が増加した。
【０２０８】
前記結果より、大腸菌由来細胞外ベシクルの接種の際に細菌感染に対する防御メカニズムとしてのＢ細胞で生成される抗体反応とＴ細胞免役反応が誘導されることを確認した。特に、Ｔ細胞免役反応は、細菌感染に対する防御に重要なＩＦＮ−γを分泌するＴｈ１免役反応とＩＬ−１７を分泌するＴｈ１７免役反応が大腸菌由来細胞外ベシクルの接種によって効率的に誘導された。
【０２０９】
実施例２０．大腸菌感染による敗血症に対する大腸菌由来細胞外ベシクルワクチンの効能
大腸菌由来細胞外ワクチンの効能を評価するために、大腸菌の感染による敗血症動物モデルを確立した。大腸菌１×１０６、１×１０８、１×１０１０ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６（雄、６週、グループ当たり１０匹）の腹腔内に注入して５日間８時間間隔でマウスの生存率を観察した。
【０２１０】
図４０は大腸菌（ＥＣ）の感染によるマウス致死率を示す結果である。図４０に示すように、大腸菌１×１０１０ＣＦＵを注入した場合はマウスが２４時間内に死亡し、大腸菌１×１０６、１×１０８ＣＦＵを注入した場合はマウスの生存には影響がなかった。
【０２１１】
実施例１９の方法によって大腸菌由来細胞外ベシクル０．５μｇ、１μｇを１週間隔で３週間３回Ｃ５７ＢＬ／６（雄、６週、グループ当たり１０匹）の腹腔内に注入した。３回の大腸菌由来細胞外ベシクルの接種が完了した７日後、大腸菌１×１０１０ＣＦＵを腹腔に注入して５日間８時間間隔でマウスの生存率を観察した。図４１は前述の方法で確立された大腸菌の感染による敗血症の発生に対する大腸菌由来細胞外ベシクルワクチンの効能を観察した結果である。図４１に示すように、５日後に大腸菌由来細胞外ベシクルが接種されていないマウスの生存率２０％に比べて、大腸菌由来細胞外ベシクルが接種されたマウスグループの生存率は８０〜１００％であった。
【０２１２】
前記方法によって、大腸菌由来細胞外ベシクル１μｇを１週間隔で３回腹腔内に接種した後、大腸菌１×１０１０ＣＦＵをマウスの腹腔に注入して６時間後に、血液内に存在する大腸菌の数を測定して図４２に示した。
【０２１３】
図４２に示すように、大腸菌由来細胞外ベシクルの接種の際に、大腸菌由来細胞外ベシクルが接種されていないマウスから得た血液内の大腸菌数に比べて、ベシクルが接種されたマウスから得た血液内の大腸菌数が顕著に減少した。
【０２１４】
前記結果は、大腸菌由来細胞外ベシクルをワクチンとして予め投与したとき、大腸菌による感染を効率よく予防することができることを意味する。
【０２１５】
実施例２１．大腸菌由来細胞外ベシクルによる炎症の発生に対する大腸菌由来細胞外ベシクルワクチンの効能
大腸菌由来細胞外ベシクルによる炎症の発生に対するベシクルワクチンの効能を評価するために、実施例１９の方法によって大腸菌由来細胞外ベシクル１μｇを１週間隔で３回Ｃ５７ＢＬ／６（雄、６週、グループ当たり５匹）の腹腔に注射して接種した後、大腸菌由来細胞外ベシクルを腹腔投与し、しかる後に、血液から炎症媒介体の分泌を測定した。
【０２１６】
図４３は大腸菌由来細胞外ベシクルが接種されたマウスに高用量の大腸菌由来細胞外ベシクル（５μｇ、３回）を注入して６時間後に、マウスの血液を採取し、血清内のＴｈ１７免役反応を誘導する炎症媒介体ＩＬ−６の量を測定した結果である。大腸菌由来細胞外ベシクルを接種していないマウスグループに比べて、大腸菌由来細胞外ベシクルを接種したマウスグループにおけるＩＬ−６の量が顕著に減少した。
【０２１７】
前記結果は、低用量の大腸菌由来細胞外ベシクルをワクチンとして予め投与したとき、大腸菌由来細胞外ベシクルにより発生する炎症を効率よく予防することができることを意味する。
【０２１８】
以上の説明は本発明を例示的に説明したものに過ぎない。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲内において、多様な修正、変更及び置換が可能であろう。よって、本発明に開示された実施例及び添付図面等は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく、説明するためのものである。これらの実施例及び添付図面等によって本発明の技術思想の範囲が限定されないのは、当業者には明白である。
【産業上の利用可能性】
【０２１９】
本発明の室内空気由来細胞外ベシクルを用いて炎症性呼吸器疾患などを診断、予防、及び／又は治療することができる。具体的に、本発明の室内空気由来細胞外ベシクルを動物に投与して呼吸器疾患の動物モデルを製造し、前記動物モデルを用いて呼吸器疾患に対する予防又は治療候補薬物を効率よく検索及び／又は発掘することが可能である。また、本発明は重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺癌などの呼吸器疾患の原因因子を正確に診断することを可能とし、ひいては前記疾病を予防及び／又は治療することが可能なワクチンの開発に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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