(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴミエリナーゼの製造方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、（ｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た培養物から形質転換体を分離してスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を得る工程；
を含む、スフィンゴミエリナーゼ含有組成物の製造方法。
【請求項４】
前記スフィンゴミエリナーゼ含有組成物に水又は緩衝液を添加してスフィンゴミエリナーゼ濃度が４ｍｇ／ｍＬの中性又は酸性の水溶液を調製し、３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して５０％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、請求項３に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物の製造方法。
【請求項５】
ロドコッカス属細菌を宿主とする発現ベクターに、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を挿入した組換えベクター。
【請求項６】
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を有し、スフィンゴミエリナーゼを培養物中に分泌することを特徴とする、ロドコッカス属細菌形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はスフィンゴミエリナーゼの製造方法、及び純度が高く安定性の高いスフィンゴミエリナーゼ含有組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴミエリナーゼ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）はスフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）をセラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン（Ｎ−ａｃｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ））とフォスフォリルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に加水分解する酵素である（ＥＣ  ３．１．４．１２）。
【０００３】
スフィンゴミエリナーゼとしては、バチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（非特許文献１）、レプトスピラ  インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒｓ）（非特許文献２）、リステリア  イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）（非特許文献３）、マウス（非特許文献４）、ラット（非特許文献５）、ヒト（非特許文献６）、及び、ストレプトマイセス  グリセオカルネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｓ）（非特許文献７）由来のもの等が知られている。非特許文献２及び３は、血清型レプトスピラ  インターロガンス及びリステリア  イバノビの、スフィンゴミエリナーゼと予想される遺伝子を開示する。非特許文献４は、マウス由来のスフィンゴミエリナーゼの機能を開示する。
【０００４】
スフィンゴミエリナーゼは、例えば、動脈硬化の診断に重要な小粒子高比重ＬＤＬ（ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅＬＤＬ）中のコレステロールの定量等に利用されている（特許文献１）。
【０００５】
スフィンゴミエリナーゼの製造法は、例えば、特許文献２及び特許文献３等に記載されている。特許文献２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ａ９１０７菌株を培養した培養物からスフィンゴミエリナーゼを採取することを特徴とする、スフィンゴミエリナーゼの製造法を開示する。特許文献３は、スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含むＤＮＡで形質転換したバチルス・ブレビス４７／ｐＮＵＳＭを培養し、培養物からスフィンゴミエリナーゼを採取することを特徴とする該酵素の製造法を開示する。
【０００６】
さらに、スフィンゴミエリナーゼの製造法として、非特許文献１は、バチルス  セレウス由来のスフィンゴミエリナーゼ遺伝子をエシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０に導入することによりスフィンゴミエリナーゼ含有培養物を取得する方法を開示する。非特許文献５は、ラット由来のスフィンゴミエリナーゼ遺伝子をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入することを含む、スフィンゴミエリナーゼ含有培養物を取得する方法を開示する。非特許文献６はヒト由来のスフィンゴミエリナーゼ遺伝子をアフリカミドリザル由来の培養細胞株ＣＯＳ−１細胞に導入したことを開示する。非特許文献７はストレプトマイセス  グリセオカルネウス由来のスフィンゴミエリナーゼ遺伝子をストレプトマイセス  リビダンス（Ｓｔｐｒｅｏｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）に導入することを含む、スフィンゴミエリナーゼ含有培養物を取得する方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０４８１４３
【特許文献２】特開昭５８−４３７８６号公報
【特許文献３】特開平５−３２８９７０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｈａｎｓｅｎ  Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ，６５，２９３−３０４（１９８８）
【非特許文献２】Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  Ａ．Ｌ．Ｔ．Ｏ．ら，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８６，２１６４−２１７２（２００４）
【非特許文献３】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３，５１０−５２３（１９９９）
【非特許文献４】Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｗ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２，４５５４−４５５９（２００５）
【非特許文献５】Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８５，２３６−２４６（２０００）
【非特許文献６】Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ  Ｅ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８５３１−８５３９（１９９１）
【非特許文献７】Ｓｕｇｉｍｏｒｉ  Ｄ．，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１０  Ｎｏｖ  ３０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献２に記載の方法により得られるスフィンゴミエリナーゼ含有培養物は、純度が低く安定性が悪いという問題がある。特許文献３に記載の方法により得られるスフィンゴミエリナーゼ含有培養物は、特異性が低いという問題がある。非特許文献１に記載の方法により得られるスフィンゴミエリナーゼ含有培養物は、フォスフォリパーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ）Ｃ活性を併せ持ち特異性が低いという問題がある。非特許文献５に開示された方法で得られるスフィンゴミエリナーゼ含有培養物は、リゾ血小板活性化因子を加水分解する活性を併せ持ち特異性が低いという問題があり、また、非特許文献５はスフィンゴミエリナーゼ含有培養物中のスフィンゴミエリナーゼの純度に関する記載はない。非特許文献６に開示された方法は、工業的生産に適していないという問題があり、また、非特許文献６はスフィンゴミエリナーゼ含有培養物中のスフィンゴミエリナーゼの純度を開示していない。非特許文献７に開示された方法で得られるスフィンゴミエリナーゼ含有培養物は、フォスフォリパーゼＣ活性を併せ持ち、特異性が低いという問題がある。
【００１０】
このように従来知られているスフィンゴミエリナーゼの製造法はいずれも実用性が低く、また、微生物の培養によりスフィンゴミエリナーゼ含有培養物を得る場合、得られる培養物中のスフィンゴミエリナーゼの純度が低いという問題があり、満足のいくものではないという現状を本発明者らは問題点として強く認識した。このような背景のもと、本発明が解決しようとする課題は、スフィンゴミエリナーゼの製造方法、並びに純度が高く安定性の高いスフィンゴミエリナーゼ含有組成物及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことにロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌を宿主として、当該宿主とは属が異なるストレストマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）由来のスフィンゴミエリナーゼをコードする遺伝子を導入し、得られた形質転換体を培養することで、スフィンゴミエリナーゼを容易に製造することができ、また、得られた培養物は純度が高く安定性の高いスフィンゴミエリナーゼ含有組成物であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のものに関する。
〔１〕
スフィンゴミエリナーゼの製造方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程；
を含む方法。
〔１−２〕
さらに以下の工程（ｃ）：
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物から形質転換体を分離してスフィンゴミエリナーゼを得る工程
を含む、前記〔１〕に記載の製造方法。
〔１−３〕
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス  エリスロポリスである、前記〔１〕又は〔１−２〕に記載の製造方法。
〔１−４〕
ロドコッカス  エリスロポリスが、ロドコッカス  エリスロポリス  Ｌ８８株である、前記〔１−３〕に記載の製造方法。
【００１３】
〔２〕
工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔１〕〜〔１−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔２−２〕
工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、
（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、
（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、直接結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔２〕に記載の製造方法。
〔２−３〕
工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、
（ｉｉｉ）のアミノ酸配列コードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔２〕又は〔２−２〕に記載の製造方法。
【００１４】
〔３〕
前記工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、（ｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記〔１〕〜〔２−３〕のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
〔４〕
以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得た培養物から形質転換体を分離してスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を得る工程；
を含む方法により得られる、スフィンゴミエリナーゼ含有組成物。
〔４−２〕
以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程；
を含む方法により得られる、形質転換体及びスフィンゴミエリナーゼ含有培養物。
〔４−３〕
以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程；
を含む方法により得られる培養物の培養上清であって、スフィンゴミエリナーゼを含有する培養上清。
〔４−４〕
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス  エリスロポリスである、前記〔４〕〜〔４−３〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔４−５〕
ロドコッカス  エリスロポリスが、ロドコッカス  エリスロポリス  Ｌ８８株である、前記〔４−４〕に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
【００１６】
〔５〕
工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔４〕〜〔４−５〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔５−２〕
工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、
（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、
（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、直接結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔５〕に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔５−３〕
工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子が、
（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔５〕又は〔５−２〕に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
【００１７】
〔６〕
前記スフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清に水又は緩衝液を添加してスフィンゴミエリナーゼ濃度が４ｍｇ／ｍＬの中性又は酸性の水溶液を調製し、３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して５０％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、前記〔４〕〜〔５−３〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔６−２〕
前記水溶液を３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して６５％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは７８％以上）のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、前記〔６〕に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔６−３〕
前記スフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清に水又は緩衝液を添加してスフィンゴミエリナーゼ濃度が４ｍｇ／ｍＬのｐＨ６．８の水溶液を調製し、３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して５０％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、前記〔４〕〜〔５−３〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔６−４〕
前記水溶液を３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して６５％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは７８％以上）のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、前記〔６−３〕に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔６−５〕
前記スフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清に水又は緩衝液を添加してスフィンゴミエリナーゼ濃度が４ｍｇ／ｍＬのｐＨ５．５の水溶液を調製し、３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して５０％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、前記〔４〕〜〔５−３〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔６−６〕
前記水溶液を３０℃で９６時間静置保存した場合、保存前と比較して７５％以上（好ましくは７８％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９７％以上）のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する、前記〔６−５〕に記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清。
〔６−７〕
得られるスフィンゴミエリナーゼが、ストレプトマイセス由来のスフィンゴミエリナーゼと同一のアミノ酸配列及び／又は特徴を有する、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
【００１８】
なお、上記〔１〕〜〔３〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔２−２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔２−２〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
【００１９】
〔６−８〕
得られるスフィンゴミエリナーゼが、ストレプトマイセス・エスピー由来のスフィンゴミエリナーゼと同一のアミノ酸配列及び／又は特徴を有する、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６−９〕
得られるスフィンゴミエリナーゼが、ストレプトマイセス・エスピー  Ａ９１０７株由来のスフィンゴミエリナーゼと同一のアミノ酸配列及び／又は特徴を有する、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６−１０〕
前記製造方法で得られるスフィンゴミエリナーゼあるいは前記組成物、培養物又は培養上清に含まれるスフィンゴミエリナーゼが、以下の（１）の作用を有し、さらに以下の（２）〜（５）のいずれか１つ以上の特徴を有するスフィンゴミエリナーゼである、前記〔１〕〜〔６−９〕のいずれかに記載の製造方法、組成物、培養物又は培養上清：
（１）作用
１分子の水の存在下、スフィンゴミエリン１分子を分解してセラミド１分子とフォスフォリルコリン１分子を生成する。
（２）基質特異性
スフィンゴミエリンに作用し、かつ、レシチン、リゾレシチン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン及びフォスファチジルイノシトールのいずれにも実質的に作用しない。
（３）Ｋｍ
スフィンゴミエリンに対するＫｍ値が約０．４５ｍＭである。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ７．０〜８．０。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約３８ｋＤａである。
〔６−１１〕
前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法により得られるスフィンゴミエリナーゼ。
【００２０】
〔７〕
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子を含有する組換えベクター。
〔７−２〕
前記遺伝子を、以下の群：ｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＱＴ１、ｐＴｉｐ  ＱＴ２、ｐＴｉｐ  ＲＣ１、ｐＴｉｐ  ＲＣ２、ｐＴｉｐ  ＲＴ１、ｐＴｉｐ  ＲＴ２、ｐＮｉｔ  ＱＣ１、ｐＮｉｔ  ＱＣ２、ｐＮｉｔ  ＱＴ１、ｐＮｉｔ  ＱＴ２、ｐＮｉｔ  ＲＣ１、ｐＮｉｔ  ＲＣ２、ｐＮｉｔ  ＲＴ１及びｐＮｉｔ  ＲＴ２；から選択される発現ベクターに挿入して得られる、前記〔７〕に記載の組換えベクター。
〔７−３〕
前記遺伝子が、（ｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記〔７〕又は〔７−２〕に記載の組換えベクター。
【００２１】
〔８〕
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を含有する組換えベクター。
〔８−２〕
前記遺伝子を、以下の群：ｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＱＴ１、ｐＴｉｐ  ＱＴ２、ｐＴｉｐ  ＲＣ１、ｐＴｉｐ  ＲＣ２、ｐＴｉｐ  ＲＴ１、ｐＴｉｐ  ＲＴ２、ｐＮｉｔ  ＱＣ１、ｐＮｉｔ  ＱＣ２、ｐＮｉｔ  ＱＴ１、ｐＮｉｔ  ＱＴ２、ｐＮｉｔ  ＲＣ１、ｐＮｉｔ  ＲＣ２、ｐＮｉｔ  ＲＴ１及びｐＮｉｔ  ＲＴ２；から選択される発現ベクターに挿入して得られる、前記〔８〕に記載の組換えベクター。
〔８−３〕
前記遺伝子が、
（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、
（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、直接結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔８〕又は〔８−２〕に記載の組換えベクター。
〔８−４〕
前記遺伝子が、（ｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記〔８〕〜〔８−３〕のいずれかに記載の組換えベクター。
〔８−５〕
前記遺伝子が、（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記〔８〕〜〔８−４〕のいずれかに記載の組換えベクター。
【００２２】
〔９〕
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子を有し、スフィンゴミエリナーゼを培養物中に分泌することを特徴とする、ロドコッカス属細菌形質転換体。
〔９−２〕
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス  エリスロポリスである、前記〔９〕に記載の形質転換体。
〔９−３〕
ロドコッカス  エリスロポリスが、ロドコッカス  エリスロポリス  Ｌ８８株である、前記〔９−２〕に記載の製造方法。
【００２３】
〔１０〕
前記遺伝子が、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔９〕〜〔９−３〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔１０−２〕
前記遺伝子が、
（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、
（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、直接結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である、前記〔１０〕に記載の形質転換体。
〔１０−３〕
前記遺伝子が、（ｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記〔９〕〜〔１０−２〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔１０−４〕
前記遺伝子が、（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記〔１０〕〜〔１０−３〕のいずれかに記載の形質転換体。
【００２４】
〔１１〕
前記〔７〕〜〔８−５〕のいずれかに記載の組換えベクターでトランスフェクトされたロドコッカス属細菌。
〔１１−２〕
ロドコッカス  エリスロポリスである、前記〔１１〕に記載のロドコッカス属細菌。
〔１１−３〕
ロドコッカス  エリスロポリス  Ｌ８８株である前記〔１１−２〕に記載のロドコッカス属細菌。
【００２５】
〔１２〕
前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法で得られるスフィンゴミエリナーゼ、あるいは前記〔４〕〜〔６−１０〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清を用いたスフィンゴミエリナーゼの基質の測定方法。
〔１３〕
前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法で得られるスフィンゴミエリナーゼ、あるいは前記〔４〕〜〔６−１０〕のいずれかに記載のスフィンゴミエリナーゼ含有組成物、培養物又は培養上清を用いたスフィンゴミエリナーゼの基質の消去方法。
〔１４〕
スフィンゴミエリナーゼ又はスフィンゴミエリナーゼ含有組成物の製造における前記〔７〕〜〔８−５〕のいずれかに記載の組換えベクターの使用。
〔１５〕
スフィンゴミエリナーゼ又はスフィンゴミエリナーゼ含有組成物の製造における前記〔１１〕〜〔１１−３〕に記載のロドコッカス属細菌の使用。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、スフィンゴミエリナーゼ、及び純度が高く、安定性の高いスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を効率的に製造することができる。したがって、純度が高く、安定性の高いスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を取得することができ、この組成物から容易にスフィンゴミエリナーゼを取得することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】比較例２において得られた配列番号２０の塩基配列の構造と、ＰＣＲ反応に用いたプライマーの位置を示す模式図である。
【図２】「実施例１  １０．」記載の精製酵素と「比較例１  ２．」記載の比較試験用酵素を、それぞれ、３０℃で（Ａ）７２時間又は（Ｂ）９６時間静置保存した際のスフィンゴミエリナーゼ活性の残存率を示す図である。
【図３】「実施例１  １０．」記載の精製酵素と「比較例１  ２．」記載の比較試験用酵素を純水又は酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、３０℃又は−３０℃で９６時間静置保存したものを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」と略すことがある）について具体的に説明する。
【００２９】
本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼの製造方法は、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む。
（ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程。
【００３０】
工程（ａ）
工程（ａ）は、ロドコッカス属細菌に遺伝子をトランスフェクトして形質転換体を得る工程である。トランスフェクトする遺伝子は、得られた形質転換体を培養した場合にスフィンゴミエリナーゼを含む培養物が得られる限り特に限定されないが、好ましくは以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である。
【００３１】
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
上記工程（ａ）における（ｉ）のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ストレプトマイセス・エスピー  Ａ９１０７に由来するスフィンゴミエリナーゼである。
【００３２】
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
上記工程（ａ）における（ｉｉ）のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、酵素作用に関与しない一部のアミノ酸を変異させたアミノ酸配列が例示される。配列番号３に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列の５０〜５６番目の配列に対応）及び配列番号４に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１９９〜２０４番目の配列に対応）（但し、配列番号３及び４中、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す）は、いずれもスフィンゴミエリナーゼ活性に必須の配列として知られる（Ａｍｙ  Ｅ．Ａ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，３５０１１−３５０１７（２００５）、Ａｇｏ  Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，１６１５７−１６１６７（２００６）等）。したがって、上記工程（ａ）における（ｉｉ）のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号３及び４に対応する配列以外の部分のアミノ酸を変異させたアミノ酸配列が例示される。性質の似たアミノ酸への置換等であれば、変異後のアミノ酸配列からなるタンパク質のスフィンゴミエリナーゼ活性に影響しないであろう。例えば、上記工程（ａ）における（ｉｉ）のアミノ酸配列としては、ＤＶＶＸ1Ｘ2Ｘ3Ｅ（式中、Ｘ1はＶ又はＩを、Ｘ2はＬ又はＦを、Ｘ3はＤ、Ｎ、Ｑ又はＥを、それぞれ表す）、及びＸ4Ｘ5ＧＤＸ6Ｎ（式中、Ｘ4はＶ、Ｉ又はＬを、Ｘ5はＡ、Ｃ又はＧを、Ｘ6はＦ、Ｍ又はＬを、それぞれ表す）の配列を含むアミノ酸配列が好ましい。
【００３３】
上記工程（ａ）における（ｉｉ）のアミノ酸配列としては、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列に各種のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列も例示される。そのようなアミノ酸配列又は該アミノ酸配列からなるタンパク質としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端側にチオレドキシンタンパク質等機能性タンパク質を付加した融合タンパク質、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、タンパク質の精製や確認等をせしめることのできるタグと呼ばれる部分を付加した融合タンパク質等が挙げられる。タグの付加は、その全部又は一部であってもよい。例えば、本実施の形態における製造方法において、培養物からスフィンゴミエリナーゼを効率的に精製するために、配列番号１に記載のアミノ酸配列に５〜１０個のＨｉｓを付加してもよい。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、付加アミノ酸（配列）との間等に、数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加することもできる。更に、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端側に付加していてもよいアミノ酸残基（又はポリペプチド残基）としては、ＴＥＥ配列、Ｓタグ、Ｈｉｓタグ等が挙げられる。
【００３４】
上記工程（ａ）における（ｉｉ）のアミノ酸配列としては、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、各種のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列も例示される。そのような欠失の例としては、例えば：スフィンゴミエリナーゼの本質的な機能とは無関係の数個のアミノ酸からなるドメインの欠失；配列番号１に記載のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸からなるギャップの欠失；配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端側のＡｒｇから順に削除する欠失；配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側のＡｌａの欠失；それらの欠失の組み合わせ等が挙げられる。
【００３５】
変異後に得られるアミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、上記の欠失、置換又は付加等の変異は、適宜組み合わせることも可能である。任意のアミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するか否かは、当業者に公知の手法により確認することができる。例えば、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子をトランスフェクトして得た形質転換体を培養し、培養物のスフィンゴミエリナーゼ活性を測定することで確認することができる。培養物が、後述する理化学的性質＜１＞〜＜５＞を有するスフィンゴミエリナーゼを含むことが好ましい。
【００３６】
一態様において、工程（ａ）において、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトする遺伝子は、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のアミノ酸配列のうち、（ｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。別の態様として（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい場合もある。
【００３７】
上記（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、目的とするアミノ酸配列をもとに、容易に得ることができる。配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、特に限定されないが、例えば、配列番号５の塩基配列や、配列番号５の塩基配列を宿主のコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列が例示されるが、ロドコッカス属細菌のコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列が好ましく、ロドコッカス  エリスロポリスのコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列がより好ましい。そのようなコドン使用頻度は、 http://www.kazusa.or.jp/codon/ などで容易に検索することができる。塩基配列の調製には、通常用いられる公知の遺伝子操作を利用することができる。塩基配列が所望のアミノ酸配列をコードする限り、例えば、部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定塩基の断片を人工変異塩基で置換する等の種々の方法を用いて塩基配列に変異を加えてもよい。
【００３８】
微生物等を用いて酵素等のタンパク質を製造する場合、生産性を高めること等を目的として、シグナルペプチドと呼ばれるアミノ酸配列を、目的とする酵素等のタンパク質に付加することがある。本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼの製造方法においても、スフィンゴミエリナーゼのアミノ酸配列のＮ末端側にシグナルペプチドを付加することができる。そのようなシグナルペプチドは、本実施の形態における製造方法においてシグナルペプチドとして機能するものであれば特に限定されない。
【００３９】
本実施の形態において、あるペプチドが、「シグナルペプチドとして機能する」とは、該ペプチドと、上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列とが直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして得られた形質転換体を培養した場合に、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得ることができることを言う。純度が高く、安定性の高いスフィンゴミエリナーゼを含む培養物を効率的に得ることができるシグナルペプチドが好ましい。例えば、上記培養した場合に、スフィンゴミエリナーゼが培養液中に形成される（形質転換体内で生産されたスフィンゴミエリナーゼがシグナルペプチドにより培養液中に輸送される）シグナルペプチド（アミノ酸配列）が好ましい。また、シグナルペプチドとしては、得られるスフィンゴミエリナーゼの活性を低下させないものが好ましい。特に、純度が高く、安定性の高いスフィンゴミエリナーゼを含む培養物を効率的に得るという観点からは、シグナルペプチドとしてはストレプトマイセス・エスピー  Ａ９１０７株由来のシグナルペプチド（配列番号２）が好ましい。また、シグナルペプチドとしては、上記シグナルペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、シグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列を用いることもできる。
【００４０】
具体的には、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼの製造方法の工程（ａ）において、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するアミノ酸配列
のＮ末端と、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド）、又は
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列
のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を、ロドコッカス属細菌にトランスフェクトすることで、シグナルペプチドをスフィンゴミエリナーゼに付加することができる。
【００４１】
上記（ｉｖ）のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端側にチオレドキシンタンパク質等機能性タンパク質やＨｉｓタグ等のその他のアミノ酸配列からなる部分を付加したアミノ酸配列が例示され、融合タンパク質とすることも好ましい。場合によっては、上記の付加アミノ酸配列は、その全部又は一部であってもよい。上述の付加の例と同様に、シグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列が得られる限り、常法によってアミノ酸の欠失又は置換を行うことができ、例えば、該アミノ酸配列中に複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。また、上記の欠失、置換又は付加を適宜組み合わせることも可能である。
【００４２】
上記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、目的とするアミノ酸配列をもとに、容易に得ることができる。配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、特に限定されないが、例えば、配列番号６の塩基配列が挙げられる。このような塩基配列は上述のように宿主のコドン使用頻度にあわせて変更することができる。
【００４３】
上記遺伝子に含まれる塩基配列は、
上記（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、
上記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、直接又は１若しくは数個のアミノ酸を介して結合したアミノ酸配列をコードする。
【００４４】
ここで、上記（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、上記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、１若しくは数個のアミノ酸を介して結合する場合、該結合は、結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子をロドコッカス属細菌にトランスフェクトして得られた形質転換体を培養した場合に、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得ることができる限り特に限定されない。該結合は、プロテアーゼの切断部位であることが望ましく、代表的なプロテアーゼとそれに対応する配列としては、例えば、以下の配列が挙げられる（配列中、↓が切断部位を表す）。
トロンビン：ＬＶＰＲ↓ＧＳ
エンテロキナーゼ：ＤＤＤＤＫ↓
第Ｘ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）：ＩＥＧＲ↓
【００４５】
好ましい態様において、上記遺伝子に含まれる塩基配列は、上記（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列のＮ末端と、上記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のアミノ酸配列のＣ末端とが、直接結合したアミノ酸配列をコードする。
【００４６】
塩基配列の調製には、通常用いられる公知の遺伝子操作を利用することができる。ＤＮＡ合成により調製してもよい。塩基配列が所望のアミノ酸配列をコードする限り、例えば、部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定塩基の断片を人工変異塩基で置換する等の種々の方法を用いて塩基配列に変異を加えてもよい。
【００４７】
上記の塩基配列を含む遺伝子を、常法を用いてロドコッカス属細菌にトランスフェクトして形質転換体を得ることができる。より詳細には、形質転換体において導入遺伝子を発現させるための発現ベクターに、上記の塩基配列を含む遺伝子を挿入して得られる組換えベクターを使用することが出来る。このような発現ベクターとしては、ロドコッカス属細菌を宿主としてトランスフェクトし、得られた形質転換体を培養した場合に、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物が得られるベクターであれば特に限定されないが、純度が高く、安定性の高いスフィンゴミエリナーゼを含む培養物を効率的に得られる発現ベクターが好ましく、宿主微生物体内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドのうち、遺伝子組換え用として構築されたものが好ましい。
【００４８】
そのような発現ベクターとしては、例えば、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）並びにｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、ｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、ｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、ＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３、ｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＱＴ１、ｐＴｉｐ  ＱＴ２、ｐＴｉｐ  ＲＣ１、ｐＴｉｐ  ＲＣ２、ｐＴｉｐ  ＲＴ１、ｐＴｉｐ  ＲＴ２、ｐＮｉｔ  ＱＣ１、ｐＮｉｔ  ＱＣ２、ｐＮｉｔ  ＱＴ１、ｐＮｉｔ  ＱＴ２、ｐＮｉｔ  ＲＣ１、ｐＮｉｔ  ＲＣ２、ｐＮｉｔ  ＲＴ１及びｐＮｉｔ  ＲＴ２などが使用できる。好ましいベクターとしては、ｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＱＴ１、ｐＴｉｐ  ＱＴ２、ｐＴｉｐ  ＲＣ１、ｐＴｉｐ  ＲＣ２、ｐＴｉｐ  ＲＴ１、ｐＴｉｐ  ＲＴ２、ｐＮｉｔ  ＱＣ１、ｐＮｉｔ  ＱＣ２、ｐＮｉｔ  ＱＴ１、ｐＮｉｔ  ＱＴ２、ｐＮｉｔ  ＲＣ１、ｐＮｉｔ  ＲＣ２、ｐＮｉｔ  ＲＴ１及びｐＮｉｔ  ＲＴ２が挙げられ、ｐＴｉｐ  ＱＣ１及びｐＴｉｐ  ＱＣ２がより好ましい。本実施の形態においては、ロドコッカス属細菌を宿主とする発現ベクターが好ましい。より好ましくは大腸菌とのシャトルベクターとして機能する発現ベクターが挙げられる。
【００４９】
プロモーターは宿主中で発現出来るものであれば特に限定されないが、好ましくはｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＱＴ１、ｐＴｉｐ  ＱＴ２、ｐＴｉｐ  ＲＣ１、ｐＴｉｐ  ＲＣ２、ｐＴｉｐ  ＲＴ１、ｐＴｉｐ  ＲＴ２、ｐＮｉｔ  ＱＣ１、ｐＮｉｔ  ＱＣ２、ｐＮｉｔ  ＱＴ１、ｐＮｉｔ  ＱＴ２、ｐＮｉｔ  ＲＣ１、ｐＮｉｔ  ＲＣ２、ｐＮｉｔ  ＲＴ１及びｐＮｉｔ  ＲＴ２のプロモーターが挙げられ、さらに好ましくはｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＱＴ１及びｐＴｉｐ  ＱＴ２のプロモーターが挙げられる。
【００５０】
発現ベクターへの遺伝子の挿入は、常法により行うことができる。まず、挿入しようとする塩基配列を制限酵素により切断して生成する塩基配列の末端と同じ末端を生成する制限酵素により上記発現ベクターを切断し、発現ベクター断片を作製する。挿入しようとする塩基配列を該制限酵素で切断することにより作製した塩基配列の断片と、発現ベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼにより常法に従って結合し、遺伝子を発現ベクターに挿入することができる。得られたベクターに目的の遺伝子が挿入されていることは、例えばＤＮＡシーケンスにより確認することができる。得られた組換えベクターは、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼの製造等に有用である。
【００５１】
本実施の形態において、トランスフェクト（形質転換）とは、遺伝子を細胞（菌体）に導入し、形質転換体を得ることを意味し、その方法は当業者が一般に行うことができるものであれば特に限定されない。例えばコンピテントセルを用いる方法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法が例示される。好ましくは、ロドコッカス属細菌に効率的に遺伝子を導入することができる方法であり、形質転換効率がよいという観点から、より好ましくはエレクトロポレーション法である。
【００５２】
工程（ａ）において、遺伝子をトランスフェクトする微生物は、ロドコッカス属細菌であれば特に限定されないが、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）であることが好ましい。ロドコッカス  エリスロポリスとしては、得られた形質転換体を培養して、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物が得られる限り特に限定されないが、純度が高く、安定性の高いスフィンゴミエリナーゼを含む培養物が効率的に得られるものが好ましい。例えば、ロドコッカス  エリスロポリス  ＡＴＣＣ１５５９１、ロドコッカス  エリスロポリス  ＡＴＣＣ２５５４４、ロドコッカス  エリスロポリス  ＡＴＣＣ１７０４１、ロドコッカス  エリスロポリス  ＮＣＩＢ８１４７、ロドコッカス  エリスロポリス  ＪＣＭ３２０１、ロドコッカス  エリスロポリス  ＪＣＭ３２０１の変異株及びロドコッカス  エリスロポリス  Ｌ８８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４４４）が例示される。好ましくはロドコッカス  エリスロポリス  ＪＣＭ３２０１が挙げられ、より好ましくは特開２００４−０７３１１６号公報で開示されたロドコッカス  エリスロポリス  ＪＣＭ３２０１の変異株が挙げられ、さらに好ましくはロドコッカス  エリスロポリス  Ｌ８８株が挙げられる。任意の微生物が、ロドコッカス属細菌（又はロドコッカス・エリスロポリス）であるかの判断は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ's Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）に従って行うことができる。ｒＲＮＡ塩基配列解析によって行ってもよい。また、微生物同定検査会社に依頼して判別してもよい。
【００５３】
目的の遺伝子がトランスフェクトされた形質転換体を選択する際には、導入した発現ベクターに存在する抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを利用すればよい。例えば、ｐＴｉｐ  ＱＣ１、ｐＴｉｐ  ＱＣ２、ｐＴｉｐ  ＲＣ１、ｐＴｉｐ  ＲＣ２、ｐＮｉｔ  ＱＣ１、ｐＮｉｔ  ＱＣ２、ｐＮｉｔ  ＲＣ１及びｐＮｉｔ  ＲＣ２を発現ベクターとして用いる場合には、クロラムフェニコールに対する耐性により選択する方法が例示される。また、ｐＴｉｐ  ＱＴ１、ｐＴｉｐ  ＱＴ２、ｐＴｉｐ  ＲＴ１、ｐＴｉｐ  ＲＴ２、ｐＮｉｔ  ＱＴ１、ｐＮｉｔ  ＱＴ２、ｐＮｉｔ  ＲＴ１及びｐＮｉｔ  ＲＴ２を発現ベクターとして用いる場合にはテトラサイクリンに対する耐性により選択する方法が例示される。得られた形質転換体は、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼの製造等に有用である。
【００５４】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、上記工程（ａ）で得た形質転換体を培養し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物を得る工程である。
【００５５】
形質転換体の培養条件は、ロドコッカス属細菌の生理学的性質を考慮して選択すればよい。培養は、通常液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うことが有利である。
【００５６】
培養に用いる培地は、通常ロドコッカス属細菌の培養に用いられるものであれば特に限定されず、例えば、肉汁培地、肉汁ゼラチン培地、牛乳培地、コーンミール培地、トマトジュース培地、ＴＳＩ培地、ＳＩＭ培地、グルコース-ブイヨン培地、ＹＭ培地、Ｌｅｎｎｏｘ培地、ＬＢ培地、Ｄａｖｉｓ培地、トリス-グルコース培地、ＥＭＢ糖指示培地、Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地、ＹＰＡＤ培地、Ｖｏｇｅｌ培地、ツァペック-ドッグス培地等を用いることができる。さらに、例えば http://www.dsmz.de/ 等を参考にして、適切な培地を選択することもできる。
【００５７】
培養温度はロドコッカス属細菌が発育し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物が得られる範囲で適宜変更し得る。例えば、通常は下限が４℃以上、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、上限が５０℃以下、好ましくは４２℃以下、より好ましくは３７℃以下が例示される。
【００５８】
培養時間は、選択する培養条件によって多少異なるが、得られる培養物中のスフィンゴミエリナーゼが最大量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよい。例えば、後述の実施例１に記載の培養条件で培養した場合、通常は下限が１０時間以上、好ましくは１２時間以上、より好ましくは１７時間以上、上限が１００時間以下、好ましくは９０時間以下、より好ましくは８０時間以下が例示される。
【００５９】
培地ｐＨはロドコッカス属細菌が発育し、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物が得られる範囲で適宜変更し得る。例えば、下限としてｐＨ  ５．８以上、好ましくはｐＨ  ６．２以上、上限としてｐＨ  ８．５以下、好ましくはｐＨ  ７．５以下が例示される。
【００６０】
上記の手法で形質転換体を培養して得られる、スフィンゴミエリナーゼを含む培養物は、形質転換体内、培養液中又はその両方にスフィンゴミエリナーゼを含むことができるが、精製の容易性等の観点から、好ましくは、培養液中にスフィンゴミエリナーゼを含む。
【００６１】
本実施の形態は、上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む方法により得られる、形質転換体及びスフィンゴミエリナーゼ含有培養物並びに該培養物の培養上清であって、スフィンゴミエリナーゼを含有する培養上清にも関する。
【００６２】
本実施の形態は、また、上記工程（ａ）及び（ｂ）に続いて、以下の工程（ｃ）を行うことにより得られる、スフィンゴミエリナーゼ含有組成物にも関する。
【００６３】
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得た培養物から形質転換体を分離してスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を得る工程である。工程（ｂ）で得た培養物は、上述の通り、好ましくは培養液中にスフィンゴミエリナーゼを含む培養物である。この場合、工程（ｂ）で得られた培養物から、濾過又は遠心分離などの通常の手段により形質転換体を分離し、培養上清としてスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を得ることができる。
【００６４】
形質転換体の分離後、さらに、マイクローザ（旭化成ケミカルズ社製）やフィルトロン（富士フィルター社製）などを用いた限外濾過濃縮法などにより濃縮した形で、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を得ることもできる。
【００６５】
本実施の形態において、上記工程（ｃ）で得られたスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、純度が高く、保存安定性が高いため、さらなる精製を行うことなく保存が可能であるという利点を有するが、所望により、安定剤として各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形のものとすることができる。例えば凍結乾燥を行う場合、安定剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を０．５％〜１０％程度添加してもよい。このようにして得られた濃縮物や凍結乾燥物も、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ含有組成物に含まれる。
【００６６】
本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、水又は緩衝液を添加してスフィンゴミエリナーゼ濃度が４ｍｇ／ｍＬの中性又は酸性の水溶液を調製し、３０℃で９６時間静置保存して保存試験を行った場合、保存前と比較して５０％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持することが好ましい。
【００６７】
上記の保存試験における「中性又は酸性」とは、ｐＨが中性から酸性であることを意味し、ｐＨの下限は４．０であり、好ましくは５．０であり、より好ましくは５．５である。ｐＨの上限は７．５であり、好ましくは７．０であり、より好ましくは６．８である。
【００６８】
上記の保存試験における「緩衝液」は、スフィンゴミエリナーゼ溶液として中性又は酸性の水溶液が得られる限り特に限定されないが、例えば、弱酸の酢酸、クエン酸、リン酸、ホウ酸、又は酒石酸と、これらのナトリウム塩等を用いて調製される緩衝液であり、好ましくは酢酸緩衝液（酢酸＋酢酸ナトリウム）である。
【００６９】
上記の保存試験における温度の上限は、スフィンゴミエリナーゼ活性が残存する温度であればよく、例えば５０℃であり、好ましくは４０℃であり、より好ましくは３０℃である。静置保存する場合の温度の下限は、例えば４℃であり、好ましくは１０℃であり、より好ましくは２０℃である。特に好ましい温度は３０℃以下である。
【００７０】
上記の保存試験におけるスフィンゴミエリナーゼの水溶液の濃度は、特に制限されないが、下限は、例えば１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは２ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは３ｍｇ／ｍＬである。上限は、例えば３０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬである。例えば、４ｍｇ／ｍＬのスフィンゴミエリナーゼ水溶液を作成して、上記の３０℃で９６時間の静置保存をすることができる。
【００７１】
上記の条件で保存した本実施の形態の組成物中のスフィンゴミエリナーゼ活性は、保存前と比較して、少なくとも４０％より高い、例えば５０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは７８％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持し、特に好ましくは８０％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する。特に、上記の水溶液のｐＨが酸性（例えばｐＨ５．５）の場合、上記の条件で保存した本実施の形態の組成物中のスフィンゴミエリナーゼ活性は、保存前と比較して、例えば７５％以上、好ましくは７８％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９７％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する。
【００７２】
本実施の形態において、上記工程（ｃ）で得られたスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、高い純度（タンパク質量あたりのスフィンゴミエリナーゼ活性）を有する。例えば、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、タンパク質量あたりのスフィンゴミエリナーゼ活性として少なくとも１０Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは５０Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは１００Ｕ／ｍｇ以上の純度を有する。
【００７３】
純度は、後述のスフィンゴミエリナーゼ活性測定法と共に、タンパク質濃度の測定法を用いて決定することができる。タンパク質濃度の測定法としては、当該業者に公知の測定方法を用いればよく、特に限定されるものではない。例えば、２８０ｎｍの吸光度を測定する方法（紫外吸収法）、クーマシーブルーを用いる方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）、フェノール試薬を用いる方法（Ｌｏｗｒｙ法）、ビシンコニン酸を用いる方法（ＢＣＡ法）が例示される。標準試料として用いるタンパク質も、当該業者が一般的に用いるタンパク質を用いればよく、例えばウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ガンマグロブリン、ヒト血清アルブミン及びクリスタリンが例示され、ウシ血清アルブミン及びオボアルブミンが汎用される。
【００７４】
本実施の形態において、上記工程（ｃ）で得られたスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、高い保存安定性を有し、例えば７０時間以上、好ましくは８０時間以上、より好ましくは９０時間以上、例えば９６時間程度、静置保存しても、保存前と比較して、例えば５０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、特に好ましくは７８％以上のスフィンゴミエリナーゼ活性を保持する。保存時の温度は、上記の保存試験に関する記載も参照して適宜決定することができるが、保存温度は低いことが好ましい。
【００７５】
本実施の形態において、上記工程（ｃ）で得られたスフィンゴミエリナーゼ含有組成物の高い保存安定性は、例えば保存前後のサンプルの電気泳動によっても確認することができる。例えば、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、水又は緩衝液を添加してスフィンゴミエリナーゼ濃度が４ｍｇ／ｍＬである中性又は酸性の水溶液を調製し、３０℃又は−３０℃で９６時間静置保存後、ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で、電気泳動させた場合、例えばデンシトメーターで測定した場合、保存前と比較して、スフィンゴミエリナーゼのポリペプチドを示す帯が少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上残存する。
【００７６】
上記の工程（ｂ）で得た培養物又は上記の工程（ｃ）で得た組成物から、以下に記載の通り、常法によりスフィンゴミエリナーゼ（精製物）を得ることができる。
【００７７】
上記の工程（ｂ）で得た培養物において、スフィンゴミエリナーゼが形質転換体内に含まれる場合、例えば、まず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体（形質転換体）をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択し組み合わせて、形質転換体内のスフィンゴミエリナーゼを抽出することができる。
【００７８】
このようにして得た抽出物や、上記の工程（ｃ）で得た組成物から、さらに純度の高いスフィンゴミエリナーゼ（精製物）を得る工程としては、例えば、上記抽出物や組成物に、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒を添加することによる分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用してスフィンゴミエリナーゼを沈殿させ回収する工程が挙げられる。さらに、この沈殿物に対し、必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製し、スフィンゴミエリナーゼ（精製物）を得ることができる。これらの工程を組み合わせることにより目的酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００７９】
上記の工程（ｃ）で得た組成物は、純度が高いため、非常に簡便な精製法によりスフィンゴミエリナーゼ（精製物）を得ることができるという利点を有する。
【００８０】
本実施の形態における製造方法で得られるスフィンゴミエリナーゼ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）または本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ含有組成物（培養物、培養上清であってもよい）に含まれるスフィンゴミエリナーゼ（単に「本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼ」ともいう）とは、ＥＣ  ３．１．４．１２に分類されるタンパク質であり、好ましくはストレプトマイセス由来、より好ましくはストレプトマイセス・エスピー由来、さらに好ましくはストレプトマイセス・エスピー  Ａ９１０７株スフィンゴミエリナーゼと同一のアミノ酸配列及び／又は特徴を有する。該アミノ酸配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列が例示される。また、該特徴としては、以下の（２）〜（５）に記載の特徴が例示される。
【００８１】
本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼは、少なくとも以下の（１）に記載の作用を有するものであれば特に限定されないが、さらに以下の（２）〜（５）のいずれかに記載の１つ以上の性質を有することが好ましい。例えば、一態様において、スフィンゴミエリナーゼは、以下の（１）に記載の作用に加えて以下の（２）に記載の基質特異性を有することが好ましい。また、スフィンゴミエリナーゼは、以下の（１）に記載の作用に加えて以下の（２）〜（５）に記載の性質のうち、任意の２つ以上を備えていることも好ましい。特に好ましいスフィンゴミエリナーゼとしては、以下の（１）に記載の作用に加えて以下の（２）〜（５）の全てに記載の性質を有するものが挙げられる。
【００８２】
（１）作用
本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼの作用の一例は以下の（式１）に示す通りであり、1分子の水の存在下、スフィンゴミエリン（Ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）１分子を分解（加水分解）してセラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン（Ｎ−ａｃｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎ））１分子とフォスフォリルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）１分子を生成する。該スフィンゴミエリンの作用は、少なくとも２価の陽イオンの存在下で行われることが好ましく、マグネシウムイオン及び／又はマンガンイオンの存在下で行われることがより好ましい。
【００８３】
スフィンゴミエリン  ＋  Ｈ2Ｏ  ―＞
Ｎ−アシルスフィンゴシン  ＋  フォスフォリルコリン    （式１）
【００８４】
本実施の形態において、上記のスフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）とは、以下の一般式：
【化１】
0005875139.tif 000002
で表されるスフィンゴ脂質の一種であれば、由来や純度は限定されず、その塩、誘導体等であってもよい。上記一般式中、Ｒは飽和または不飽和炭化水素を表し、Ｘはコリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール等を表し、好ましくは生体中に多く存在するコリンを表す。本実施の形態において、スフィンゴミエリンは、好ましくは生体内に存在するスフィンゴミエリンであり、特に好ましくは本実施の形態の製造方法で得られるスフィンゴミエリナーゼにより加水分解されるスフィンゴミエリンであり、例えば、Ｎ−ヘキサデカノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−アセチル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ａｃｅｔｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−ヘキサノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｈｅｘａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−ドデカノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−ドデカノイル−スフィンガニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−ヘプタデカノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−オクタデカノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−オクタデカノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（９Ｚ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−テトラコサノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（ｔｅｔｒａｃｏｓａｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｎ−テトラコセノイル−スフィンゲニン−１−フォスフォリルコリン（Ｎ−（１５Ｚ−ｔｅｔｒａｃｏｓｅｎｏｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇ−４−ｅｎｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）などが例示される。本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼは、複数のスフィンゴミエリンに同時に作用するものであってもよい。
【００８５】
本実施の形態において、上記スフィンゴミエリナーゼの作用はスフィンゴミエリナーゼ活性として測定できる。スフィンゴミエリナーゼ活性とは、上記の（式１）の反応を触媒する活性であり、スフィンゴミエリナーゼ活性１単位（ユニット）は、３７℃で１分間に１マイクロモルのスフィンゴミエリンを分解する酵素量とする。スフィンゴミエリナーゼ活性の測定方法を以下に例示するが、測定方法はこれに限定されるものではない。
【００８６】
＜スフィンゴミエリナーゼ活性測定法＞
（反応試薬混合液組成）
１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０          １５０μＬ
１０ｍＭ  スフィンゴミエリン溶液              ３００μＬ
０．３％  ４−アミノアンチピリン溶液          ３００μＬ
０．２％  ＴＯＤＢ溶液                        ３００μＬ
１Ｍ  塩化マグネシウム水溶液                  ６μＬ
１Ｍ  塩化ナトリウム水溶液                    ３０μＬ
１０％  トリトンＸ−１００溶液                ３０μＬ
５００Ｕ／ｍＬ  アルカリフォスファターゼ溶液  ６０μＬ
６００Ｕ／ｍＬ  コリンオキシダーゼ溶液        ５０μＬ
５００Ｕ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ溶液          １２０μＬ
精製水                                        １６５４μＬ
【００８７】
小試験管に上記組成の反応試薬混合液を０．８ｍＬとり、３７℃で予備加温する。５分後、適当に希釈したスフィンゴミエリナーゼ溶液（被験液）を０．０３ｍＬ加えて混和し、３７℃で反応を開始し、５分間インキュベートして反応を行う。続いてこの反応液に１％  ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１．６ｍＬ加えて反応を停止する。反応停止後５４６ｎｍにおける吸光度を測定し、これをＡｓとする。スフィンゴミエリナーゼ溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂとする。スフィンゴミエリナーゼ活性１単位を、３７℃で１分間に１マイクロモルのスフィンゴミエリンを分解する酵素量として、上記反応液中におけるＴＯＤＢのミリモル吸光係数を１６として、得られたＡｓ及びＡｂの値に基づき以下の（式２）を用いて算出する。
【００８８】
スフィンゴミエリナーゼ活性（単位）
＝［｛（Ａｓ−Ａｂ）／１６｝／５］×（２４３０／３０）          （式２）
【００８９】
（２）基質特異性
本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼ及びスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、上記のスフィンゴミエリンに対する作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはスフィンゴミエリンに作用し、かつ、レシチン、リゾレシチン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン及びフォスファチジルイノシトール（以下、「レシチン等」ともいう）のいずれにも実質的に作用しない。ここで、「実質的に作用しない」とは、通常、上記のスフィンゴミエリナーゼの活性測定法における条件下でレシチン等に反応しないことをいう。スフィンゴミエリナーゼ活性測定法における条件（酵素の希釈の程度、反応試薬混合液中の各組成物の濃度等）を変更してもレシチン等に反応しないことが好ましい。
【００９０】
（３）至適ｐＨ
本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼの至適ｐＨは、上記スフィンゴミエリナーゼ活性が測定できるｐＨであれば特に限定されないが、上記スフィンゴミエリナーゼ活性が最大となるｐＨが好ましい。ｐＨの下限としては、例えばｐＨ４．０以上であり、好ましくはｐＨ５．０以上であり、より好ましくはｐＨ７．０以上である。またｐＨの上限としては、例えばｐＨ１０．０以下であり、好ましくはｐＨ９．０以下であり、より好ましくはｐＨ８．０以下である。
【００９１】
（４）Ｋｍ
本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼのスフィンゴミエリンに対するＫｍは、温度や気圧などの測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得るが、例えば２ｍＭ以下であり、好ましくは１ｍＭ以下であり、より好ましくは約０．４５ｍＭである。
【００９２】
（５）分子量
本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼの分子量は、温度や気圧などの測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得るが、例えば３０ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲にあり、好ましくは３５ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲にあり、より好ましくはドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で約３８ｋＤａである。
【００９３】
なお、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼの分子量は、工程（ａ）においてトランスフェクトする遺伝子の変異や、工程（ｂ）における培養時の翻訳後修飾、工程（ｂ）や（ｃ）の後の化学修飾等によって変化する場合があり、例えば、トランスフェクトする際のベクターとしてｐＴｉｐ  ＱＣ１やｐＴｉｐＱＣ２（特許第３７９３８１２号公報、特開２００４−３２１０１３号公報、特開２００４−０７３１１６号公報参照）を利用してＣ末端にＨｉｓタグを付加する場合には、上記の分子量が約１，０００程度大きくなることがある。
【００９４】
このように、翻訳後修飾（Ｎ末端側がアシル基やアルキル基等による修飾を受ける等）、化学修飾（無水コハク酸やＰＥＧ等）等を受けたスフィンゴミエリナーゼも、本実施の形態のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。化学修飾等により、スフィンゴミエリナーゼの至適ｐＨや安定性等の性質を、利用しやすいように変化させることが可能である。
【００９５】
本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ又はスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を用いれば、スフィンゴミエリナーゼを定性的、半定量的又は定量的に測定することができる。その方法としては、例えばスフィンゴミエリンに対するスフィンゴミエリナーゼの作用で生成したフォスフォリルコリンにさらにグリセロホスフォコリンホスフォジエステラーゼ（ＥＣ  ３．１．４．２）を作用させて生成したコリンをコリンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１７）で酸化し、生成した過酸化水素を４−アミノアンチピリンとフェノールなどと縮合して発色させる方法など、公知の方法が挙げられる。
【００９６】
また、本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ又はスフィンゴミエリナーゼ含有組成物を用いれば、上記（式１）の反応により、スフィンゴミエリナーゼの基質を消去することもできる。
【００９７】
本実施の形態におけるスフィンゴミエリナーゼ又はスフィンゴミエリナーゼ含有組成物は、そのまま、あるいは精製、濃縮、凍結乾燥等の後、各種製品、試薬、キット、センサー、原薬、製剤、化粧品、食品等に利用することができる。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明を実施例等に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されるものではない。尚、記述した技術は、市販の各種酵素、キット類に添付された手順書等に従えば実施できるものである。「常法に従い」と記述した技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８２年、１９８９年）や蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年、南光堂）、等に従えば実施できるものである。又、以下に示した測定値等は測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得る。
【００９９】
なお、以下の実施例で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等であり、市販で容易に入手できるものを使用することができる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されない。
【０１００】
〔実施例１〕
１．ＤＮＡの抽出
配列番号１のアミノ酸配列（スフィンゴミエリナーゼ）を含むタンパク質を発現するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ａ９１０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０５８）の菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるように添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、３０分撹拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液（以下「ＴＥ」と記載する場合もある）に溶解し、適量のＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。このゲノムＤＮＡ（染色体）をＴＥに溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）とエタノールを加え、撹拌後、−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈殿したゲノムＤＮＡを７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．のＤＮＡ標品を得た。
【０１０１】
２．精製酵素の取得
容量５００ｍＬの三角フラスコに、前培養用培地として培地Ａ（３％  脱脂大豆ニッカミルキー（日華油脂社製）、２％  コーンスターチ、０．３％  塩化カリウム、０．４％  炭酸カルシウム、ｐＨ７．０）１００ｍＬを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ａ９１０７の菌体を白金耳で植菌した。次いで２５℃で７２時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量３０Ｌのジャーに、培地Ａを２０Ｌ入れ、１２１℃で２０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２０ｍＬ植菌し、２５℃、１２５ｒｐｍで９６時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して培養上清を得た。この培養上清を２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ５．０に調製し、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＧＥヘルスケア社製のＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いたカラムに吸着させた。２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で充分に洗浄した後、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いてベッド体積の１０倍量のリニアグラジエントで溶出を行った。活性画分を回収し、１００倍量の１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で透析し、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＰＣ）の精製酵素を得た。
【０１０２】
３．酵素の部分アミノ酸配列決定
「実施例１  ２．」で取得した精製酵素の一部を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法で５〜２０％のポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。これを用いてＮ末端アミノ酸配列解析を行った結果、配列番号７のアミノ酸配列を得た。また、「実施例１  ２．」で取得した精製酵素の一部を消化酵素トリプシンにより処理し、上記と同様に操作を行い、Ｎ末端アミノ酸配列解析を行った結果、配列番号８のアミノ酸配列を得た。
【０１０３】
４．酵素遺伝子の部分塩基配列決定
「実施例１  ３．」で得られた配列番号７及び８のアミノ酸配列を元に配列番号９及び１０の塩基配列を有するＰＣＲ用ＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーを用い、「実施例１  １．」で調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．のＤＮＡ標品を鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンスして部分塩基配列を決定した。
【０１０４】
５．酵素遺伝子の塩基配列決定
「実施例１  ４．」で決定した部分塩基配列を元に、配列番号１１及び１２の塩基配列を有するＰＣＲ用ＤＮＡプライマーを設計した。「実施例１  １．」で調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．のＤＮＡ標品の一部をＳａｌＩにより制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡ断片を常法に従ってライゲーションし、環状ＤＮＡを得た。配列番号９及び１０の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いてＳａｌＩ切断環状ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンスして塩基配列を決定した。「実施例１  １．」で調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．のＤＮＡ標品の一部をＢａｍＨＩにより制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡ断片をライゲーションし、環状ＤＮＡを得た。配列番号１１及び１２の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いてＢａｍＨＩ切断環状ＤＮＡを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を常法に従ってＤＮＡシーケンスして塩基配列を決定した。決定した塩基配列は、配列番号６（配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列）と、配列番号５（配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列）とが順に結合した塩基配列を含む塩基配列であった。
【０１０５】
６．ＰＣＲ法による酵素遺伝子の増幅
「実施例１  ５．」で決定した塩基配列を元に、配列番号１３及び１４の塩基配列を有するＰＣＲ用ＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーを用い、「実施例１  １．」で調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．のＤＮＡ標品を鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた約１２００ｂｐのＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い精製した。
【０１０６】
７．発現ベクターとのライゲーション
「実施例１  ６．」で取得したＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理した。このＤＮＡ断片は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。精製したＤＮＡ断片は、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＴｉｐ  ＱＣ２と常法に従ってライゲーションし、配列番号１５の塩基配列を有するｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣを作製した。作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣはＤＮＡシーケンスして挿入した塩基配列が正しいことを確認した。
【０１０７】
８．Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株の形質転換
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４４４）の菌体を、「実施例１  ７．」で作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣと混合し、氷上で３０分静置した後、バイオ・ラッド社のＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いてエレクトロポレーション法（２．５ｋＶ、２５μＦ、４００Ω）により形質転換した。形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株をＳＯＣ培地（２％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１０ｍＭ  塩化ナトリウム、２５ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  硫酸マグネシウム、２０ｍＭ  グルコース）に懸濁した後、３０℃で１時間培養し、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム、１．５％  アガー）に塗布して３０℃で７２時間培養し、ｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣにより形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（Ｌ８８／ＳＰＣ）を得た。
【０１０８】
９．Ｌ８８／ＳＰＣの培養
容量５００ｍＬの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム）１００ｍＬを入れて、蒸気加圧滅菌した後、「実施例１  ８．」で形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（Ｌ８８／ＳＰＣ）を白金耳で植菌した。次いで３０℃で７２時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２Ｌのジャーに、ＬＢ液体培地を１．６Ｌ入れ、１２１℃で２０分間蒸気加圧滅菌した後、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを１．６ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬのチオストレプトンを８０μＬ添加し、上記の前培養液を１．６ｍＬ植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで７２時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して培養上清を得た。３基培養を行ったところ、スフィンゴミエリナーゼの培養力価は５０〜５２Ｕ／ｍＬであった。培養力価は、上述の＜スフィンゴミエリナーゼ活性測定法＞に記載の方法を用いて、培養上清を被験液として（式２）を用いて算出した。
【０１０９】
１０．精製
「実施例１  ９．」で得られた培養上清の一部を２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ５．０に調製し、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＧＥヘルスケア社製のＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いたカラムに吸着させた。２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で充分に洗浄した後、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いてベッド体積の１０倍量のリニアグラジエントで溶出を行った。活性画分を回収し、１００倍量の１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で透析した後、凍結乾燥して粉末状の精製酵素（スフィンゴミエリナーゼ）約８０ｍｇを得た。
【０１１０】
〔比較例１〕
１．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．の培養
容量５００ｍＬの三角フラスコに、前培養用培地として培地Ａ（実施例１と同様）１００ｍＬを入れて、蒸気加圧滅菌した後、「実施例１  １．」に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．の菌体を白金耳で植菌した。次いで２５℃で７２時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量３０Ｌのジャーに、培地Ａを２０Ｌ入れ、１２１℃で２０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２０ｍＬ植菌し、２５℃、１２５ｒｐｍで９６時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して培養上清を得た。２基培養を行ったところ、スフィンゴミエリナーゼの培養力価は６２〜６７Ｕ／ｍＬであった。
【０１１１】
２．精製
「比較例１  １．」で取得した培養上清を２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ５．０に調製し、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＧＥヘルスケア社製のＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いたカラムに吸着させた。１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて溶出し、活性画分を回収した。活性画分をゲル濾過により脱塩し、その一部にマンニトールを重量パーセント濃度で１％となるように添加した後、凍結乾燥して粉末状の比較試験用酵素（野生型スフィンゴミエリナーゼ）約９５０ｍｇを得た。
【０１１２】
〔比較例２〕
１．挿入遺伝子の調製
配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡプライマーとを用いてｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片Ａ（配列番号６の塩基配列（配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列）を含む）を得た。また、配列番号１７及び１８の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーを用いて配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ（カンジダ  シリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（ＡＴＣＣ１４８３０）由来のコレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ）をコードする塩基配列）を鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片Ｂを得た。配列番号１３及び１８の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いてＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂを混合したものを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｃを得た。ＤＮＡ断片Ｃを得るまでのＰＣＲ反応の模式図を図１に示す。得られたＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い精製した。
【０１１３】
２．発現ベクターとのライゲーション
「比較例１  １．」で取得したＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理した。このＤＮＡ断片は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡ断片は、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＴｉｐ  ＱＣ２とライゲーションし、配列番号２１の塩基配列を有するｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＢＰを作製した。作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＢＰは常法に従ってＤＮＡシーケンスして挿入した塩基配列が正しいことを確認した。
【０１１４】
３．Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株の形質転換
「実施例１  ７．」と同様の方法で、「比較例２  ２．」で作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＢＰによりＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株を形質転換し、ｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＢＰにより形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（Ｌ８８／ＣＥＢＰ）を得た。
【０１１５】
４．Ｌ８８／ＣＥＢＰの培養
容量５００ｍＬの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍＬを入れて、蒸気加圧滅菌した後、「比較例２  ３．」で形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（Ｌ８８／ＣＥＢＰ）を白金耳で植菌した。次いで３０℃で７２時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２Ｌのジャーに、ＬＢ液体培地を１．６Ｌ入れ、１２１℃で２０分間蒸気加圧滅菌した後、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを１．６ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬのチオストレプトンを８０μＬ添加し、上記の前培養液を１．６ｍＬ植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで７２時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して培養上清を得た。しかしながら、配列番号１９にコードされるＣａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来のコレステロールエステラーゼの発現は確認できなかった。なお、コレステロールエステラーゼの発現は、コレステロールエステラーゼの活性として、ＡＳＡＨＩ  ＫＡＳＥＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ（旭化成ファーマ株式会社２００８年７月１３１ページの方法に従い確認した。
【０１１６】
〔比較例３〕
１．挿入遺伝子の調製
配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡプライマーとを用いてｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片Ａ’（配列番号６の塩基配列（配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列）を含む）を得た。また、配列番号２３及び２４の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーを用いて配列番号２５の塩基配列を有するＤＮＡ（バークホルデリア  スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０１４）（特開２００８−０８６２７７）由来のコレステロールエステラーゼ（ＣＥＮ）及びその補助タンパク質をコードする塩基配列）を鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片Ｂ’を得た。配列番号１３及び２４の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いてＤＮＡ断片Ａ’とＤＮＡ断片Ｂ’を混合したものを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、配列番号２６の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｃ’を得た。得られたＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い精製した。
【０１１７】
２．発現ベクターとのライゲーション
「比較例３  １．」で取得したＰＣＲ産物に対して「比較例２  ２．」と同様の操作を行い、配列番号２７の塩基配列を有するｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＮを作製した。作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＮは常法に従ってＤＮＡシーケンスして挿入した塩基配列が正しいことを確認した。
【０１１８】
３．Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株の形質転換
「実施例１  ７．」と同様の方法で、「比較例３  ２．」で作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＮによりＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株を形質転換し、ｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＣＥＮにより形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（Ｌ８８／ＣＥＮ）を得た。
【０１１９】
４．Ｌ８８／ＣＥＢＰの培養
「比較例３  ３．」で得たＬ８８／ＣＥＮに対して「比較例２  ４．」と同様の操作を行い、培養上清を得た。しかしながら、配列番号２５にコードされるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ由来のコレステロールエステラーゼの発現は確認できなかった。なお、コレステロールエステラーゼの発現は、コレステロールエステラーゼの活性として、ＡＳＡＨＩ  ＫＡＳＥＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ  （旭化成ファーマ株式会社２００８年７月４８ページの方法に従い確認した。
【０１２０】
〔比較例４〕
１．挿入遺伝子の調製
配列番号２８の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡプライマーとを用いてｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＳＰＣを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片Ａ”（配列番号６の塩基配列（配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列）を含む）を得た。また、配列番号２９及び３０の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。このＤＮＡプライマーを用いて配列番号３１の塩基配列を有するＤＮＡ（クロモバクテリウム  ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）（工発研菌寄第１３７号）（特公昭４６−２９７８７）由来のリパーゼ（ＬＰ）及びその補助タンパク質をコードする塩基配列）を鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片Ｂ”を得た。配列番号１３及び３０の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いてＤＮＡ断片Ａ”とＤＮＡ断片Ｂ”を混合したものを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、配列番号３２の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｃ”を得た。得られたＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い精製した。
【０１２１】
２．発現ベクターとのライゲーション
「比較例４  １．」で取得したＰＣＲ産物に対して「比較例２  ２．」と同様の操作を行い、配列番号３３の塩基配列を有するｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＬＰを作製した。作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＬＰは常法に従ってＤＮＡシーケンスして挿入した塩基配列が正しいことを確認した。
【０１２２】
３．Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株の形質転換
「実施例１  ７．」と同様の方法で、「比較例４  ２．」で作製したｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＬＰによりＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株を形質転換し、ｐＴｉｐ  ＱＣ２／ＬＰにより形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８株（Ｌ８８／ＬＰ）を得た。
【０１２３】
４．Ｌ８８／ＬＰの培養
「比較例４  ３．」で得たＬ８８／ＬＰに対して「比較例２  ４．」と同様の操作を行い、培養上清を得た。しかしながら、配列番号３０にコードされるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来のリパーゼの発現は確認できなかった。なお、リパーゼの発現は、リパーゼの活性として、ＡＳＡＨＩ  ＫＡＳＥＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ（旭化成ファーマ株式会社２００８年７月１５ページ）に記載の方法に従い確認した。
【０１２４】
〔試験例１〕＜比活性試験＞
「実施例１  ９．」で得た培養上清と、「比較例１  １．」で得た培養上清のタンパク質量あたりのスフィンゴミエリナーゼ活性を計算したところ、「実施例１  ９．」で得た培養上清は１４２．７Ｕ／ｍｇ、「比較例１  １．」で得た培養上清は２．１Ｕ／ｍｇであり、「実施例１  ９．」で得た培養上清は、「比較例１  １．」で得た培養上清よりも比活性が７０倍以上高かった。なお、培養上清中のタンパク質量は、ビシンコニン酸を用いる方法（ＢＣＡ法）により測定した。スフィンゴミエリナーゼ活性は、上述の＜スフィンゴミエリナーゼ活性測定法＞に記載の方法を用いて、培養上清を被験液として（式２）を用いて算出した。これらの測定から、タンパク質量あたりのスフィンゴミエリナーゼ活性を計算した。
【０１２５】
〔試験例２〕＜安定性試験１＞
「実施例１  １０．」で得た精製酵素、及び「比較例１  ２．」で得た比較試験用酵素を、４ｍｇ／ｍＬになるように純水（ｐＨ６．８）又は５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、それぞれ−３０℃又は３０℃で静置保存した。保存した酵素溶液について、保存開始から７２時間後及び９６時間後に残存活性を測定した（保存前の活性を１００％とする）。その結果、図２に示すように、３０℃で静置保存した場合、「比較例１  ２．」で得た比較試験用酵素は、７２時間後及び９６時間後の残存活性がいずれも４０％以下であるのに対して、「実施例１  １０．」で得られた精製酵素は、７２時間後及び９６時間後のいずれにおいても７８％以上の活性を保持しており、高い保存安定性を示した。特に、ｐＨ５．５の緩衝液に溶解した場合、７２時間後及び９６時間後のいずれにおいても９７．６％以上の活性を保持しており、非常に高い保存安定性を示した。なお、−３０℃で静置保存した場合も同様に、「実施例１  １０．」で得られた精製酵素は高い保存安定性を示した（図示せず）。
【０１２６】
〔試験例３〕＜安定性試験２＞
試験例２で得られた、−３０℃又は３０℃で９６時間保存した酵素溶液の一部を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法で５〜２０％のポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、常法に従ってクーマシーブルー（ＣＢＢ）で染色した。結果を図３に示す。図３中（Ａ）〜（Ｈ）のバンドは、それぞれ以下の処理を行った酵素溶液に対応する。
（Ａ）比較例１の酵素を純水（ｐＨ６．８）に溶解し、−３０℃で保存。
（Ｂ）比較例１の酵素を純水（ｐＨ６．８）に溶解し、３０℃で保存。
（Ｃ）比較例１の酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、−３０℃で保存。
（Ｄ）比較例１の酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、３０℃で保存。
（Ｅ）実施例１の酵素を純水（ｐＨ６．８）に溶解し、−３０℃で保存。
（Ｆ）実施例１の酵素を純水（ｐＨ６．８）に溶解し、３０℃で保存。
（Ｇ）実施例１の酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、−３０℃で保存。
（Ｈ）実施例１の酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、３０℃で保存。
【０１２７】
図３に示すように、比較例１で得た比較試験用酵素は、３０℃で９６時間保存した場合（（Ｂ）及び（Ｄ））には、−３０℃で保存した場合（（Ａ）及び（Ｃ））と比較して明らかにスフィンゴミエリナーゼを示すバンドが薄くなり、分解されていた。一方、「実施例１  １０．」で得た精製酵素は、３０℃で９６時間保存した場合（（Ｆ）及び（Ｈ））も、−３０℃で保存した場合（（Ｅ）及び（Ｇ））と同程度のバンドが確認され、分解されていなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明は、スフィンゴミエリナーゼ、及び純度が高く安定性の高いスフィンゴミエリナーゼ含有組成物の効率的な製造に利用することができる。本発明は、特に、試薬、医薬品、化粧品等の分野において、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
0005875139.tif 000003
【図２】
0005875139.tif 000004
【図３】
0005875139.tif 000005
【配列表】
0005875139000001.app