(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性細菌細胞のペリプラズム間隙の内容物を、細胞質から夾雑タンパク質を放出することなく選択的に抽出するための方法であって、
スチレンマレイン酸共重合体（ＳＭＡ）を含む溶液中でグラム陰性細菌細胞を培養し、当該細菌細胞の外膜を破壊し、内膜を破壊しないことを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
スチレン：マレイン酸の比率は、１：２から１０：１までであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スチレン：マレイン酸の比率は、２：１であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＭＡは、０．５％〜４．５％の間の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＭＡの濃度は、２％〜２．５％であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グラム陰性細菌細胞は、１５分から６時間までの間、ＳＭＡとともに培養されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記グラム陰性細菌細胞は、ＳＭＡとともに２時間培養されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グラム陰性細菌細胞は、ＳＭＡとともに３７℃で培養されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記グラム陰性細菌種は、Ｅ．ｃｏｌｉ、サルモネラ（Salmonella）属、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シゲラ（Shigella）属、エルシニア（Yersinia）属、またはクレブシエラ（Klebsiella）属であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）グラム陰性細菌細胞の集団を作製する工程と、
（ｉｉ）グラム陰性細菌細胞を、２：１のスチレン：マレイン酸の比率を有するＳＭＡを含む溶液に２％〜２．５％の濃度で懸濁する工程と、
（ｉｉ）前記グラム陰性細菌細胞を３７℃で２時間にわたって前記溶液中で培養する工程とを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液は、ＥＤＴＡを実質的に含まないことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液は、０．５Ｍ  ＮａＣｌにおいて、ｐＨ８．０の５０ｍＭ  ＴＲＩＳを含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞を浸透圧ショックにさらすことをさらに含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴ糖、アミノ酸、およびペプチドから選択される、ペリプラズム間隙の１つの成分の少なくとも一部を前記溶液から回収することをさらに含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペリプラズム間隙は、組み換えポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
組み換えポリペプチドの少なくとも一部を前記溶液から回収することを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組み換えポリペプチドの実質的に純粋な試料を作製する方法であって、
（ｉ）組み換えポリペプチドを含むグラム陰性細菌細胞の集団を作製する工程と、
（ｉｉ）グラム陰性細菌細胞を、２：１のスチレン：マレイン酸の比率を有するＳＭＡを含む溶液に２％〜２．５％の濃度で懸濁する工程と、
（ｉｉ）前記グラム陰性細菌細胞を３７℃で２時間にわたって前記溶液中で培養する工程と、
（ｉｖ）前記溶液から前記組み換えポリペプチドを回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞からの物質の回収を改良するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセス産業は、バイオ治療薬およびバイオテクノロジーの分野で大きな成長を遂げており、近年、このような方法（たとえば、ワクチンおよびモノクローナル抗体）を用いて作製されたバイオ医薬品の量は大幅に増加した。最近のデータは、全ての医薬品の約４４％がバイオ医薬品であることを示した。
【０００３】
バイオプロセス技術は、多数の工程で構成される。目的のバイオ薬剤生成物を合成することができる宿主細胞が、作製される。宿主細胞の発酵（「バイオリアクター工程」）に続いて、生成物は、「生成物の放出工程」において、通常、細胞から分泌され、および／または抽出される。続いて、特定の生成物は、濾過、遠心分離、および様々なクロマトグラフィー工程などの下流の処理によって精製される必要がある。このような方法は、治療用途のためのバイオ医薬品製品を作製するために使用することができる。生成物放出工程と、そのような生成物のその後の回収は、バイオプロセス技術における重要な段階である。
【０００４】
様々な理由によって、バイオ医薬品の製造と、目的の他の組み換えタンパク質とのために選択される宿主細胞は、エシュリヒア・コリー（Escherichia coli）である。Ｅ．ｃｏｌｉは、グラム陰性細菌である。これらの細胞は、容易に増殖させることができ、比較的単純なゲノムを含む。これらの細胞の遺伝的特徴は、容易に操作することができ、それらを微生物学、バイオテクノロジー、バイオプロセスの分野において重要なものにしている。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性細菌は、通常の細胞膜だけではなく、リポ多糖類およびリポタンパク質、ならびにリン脂質および膜タンパク質を含むさらなる外膜を含む。リポ多糖類は、外膜に強い負の電荷をもたらすＯ−多糖類に連結される共有結合した脂質Ａで構成される。グラム陰性菌は、内膜と外膜との間に、薄いペプチドグリカンマトリクス層を含むペリプラズム間隙と称される空間があり、細胞壁に構造的機能をもたらすことが知られている。ペプチドグリカンマトリクス層は、Ｎ−アセチルムラミン酸と、（β１−４）Ｎ−アセチルグルコサミンとの２つの糖で構成され、それらは層構造内で交互に構成されている。Ｎ−アセチルムラミン酸単量体は、いくつかのアミノ酸残基からなるペプチド鎖を有する側鎖を含む。このペプチド鎖は、ペプチドグリカンが「メッシュ状」層を形成することができるようにするために、別のＮ−アセチルムラミン酸単量体における別のペプチド鎖に結合する能力を有する。このペプチドグリカン層は、タンパク質が通過するために十分に大きな、細孔または開口を含む。
【０００６】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの生物では、いくつかのタンパク質は、細胞質から出て、ペリプラズム間隙を含む様々な他の膜区画に輸送することができる。細胞質から排出されるタンパク質は、タンパク質のＮ末端の伸張部分である「シグナルペプチド」を含む。これらの「シグナルペプチド」は、Ｎ末端領域、コア領域、およびＣ末端領域の、３つの保存領域を含む。タンパク質がその必要な目的地に到達すると、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼと称される酵素によって成熟タンパク質から切断され、成熟ポリペプチドを細胞膜の指定された区画（ペリプラズムなど）に放出する。
【０００７】
ペリプラズム間隙へのタンパク質の移動は、バイオ医薬品を回収するためにバイオプロセス産業で利用されてきた。これは、細胞質から放出される汚染物質量を最小限にするとともに、細胞の微細化を回避するためである。
【０００８】
ペリプラズムタンパク質の放出に関する文献において多数の既存の方法が存在するが、どれも申し分のないものではない。界面活性剤（たとえば、トリトンＸ−１００）と、クロロホルムとを用いる細菌細胞の化学的処理は、外膜の透過性を増加させるたけではなく、低いタンパク質純度を導くので、下流の処理に関する費用が増加する。また、アニオン性界面活性剤を用いるＥ．ｃｏｌｉ細胞の処理は、ペニシリンアシラーゼを含む、多数のペリプラズムタンパク質の放出をもたらすことができる。また、外膜は、αアミラーゼを含む細菌のペリプラズム内容物を放出するために、グリシンを用いて処理することによって透過させることができ、このタンパク質の７０〜８０％の回収をもたらす。また、浸透圧ショックの技術は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからペニシリンアシラーゼの放出に有望であることが示された。これらの方法は、実験室における小規模での相対的成功を示したが、これらの技術を大規模に増大させる見込はほとんどない。
【０００９】
これまでで最も効率的なペリプラズムタンパク質放出方法は、リゾチーム酵素に組み合わせて、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を使用する。ＥＤＴＡは、ペリプラズムに存在するペプチドグリカンマトリクスを破壊するためにリゾチームを接触させ、膜の不安定化の原因になるＣａ２＋などの２価の陽イオンのキレート化をもたらす。このことは、αアミラーゼなどのペリプラズムタンパク質のより多くの量を放出させる。この方法は、小規模の実験室での実験ではペリプラズム放出の増加をもたらしたが、産業界における大きな体積における使用のためにスケールアップしたとき、高価な方法であることが証明された。
【００１０】
したがって、グラム陰性菌のペリプラズム内容物を放出するために、効率的でありながら安価な方法を開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、ペリプラズム標的化治療用タンパク質を抽出するためのより効率的な方法をもたらすために、新たなペリプラズムタンパク質放出方法を開発することにした。本発明者らは、驚くべきことに、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）共重合体が、細菌細胞の外膜を特異的に破壊することができ、ペリプラズム内容物を放出することができ、内膜を破壊しないので、細胞質からの夾雑タンパク質がタンパク質試料に存在することを回避することができることを見出した。
【００１２】
したがって、本発明の第１態様は、スチレンマレイン酸共重合体（ＳＭＡ）を含む溶液中で細菌細胞を培養することを含む、細菌細胞のペリプラズム間隙の内容物を放出するための方法を提供する。
【００１３】
本発明者らは、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）が、ペリプラズムタンパク質を細胞から抽出するために使用することができるかどうかを調査することにした。本発明者らは、驚くべきことに、ＳＭＡが、細菌細胞の外膜を特に破壊し、内膜を破壊しないことを見出した。したがって、ＳＭＡは、細胞質から夾雑タンパク質を放出することなく、ペリプラズムタンパク質を選択的に抽出するために使用することができる。抽出方法は、簡単に実施することができ、容易に大規模なバイオプロセス処理に規模を拡大することができる。この方法は、下流処理における精製工程が少ないので、費用を大幅に削減する。
【００１４】
ＳＭＡは、以前には、薬剤の送達のために単離および保存された膜貫通タンパク質を使用した。本発明に至るまで、ＳＭＡがペリプラズム間隙の内容物を放出するために使用することができることは、開示または示唆されていなかった。
【００１５】
実際には、本発明の方法は、ペリプラズム間隙の内容物を溶液中に選択的に放出するために容易に使用することができる。したがって、ペリプラズム間隙の特定の内容物、たとえば工業用の組み換えタンパク質は、溶液から容易に単離することができる。よって、本発明は、明確に有益な産業上の用途を有する。
【００１６】
本発明の第１態様の方法は、スチレンマレイン酸共重合体（ＳＭＡ）を含む溶液中で細菌細胞を培養する工程を含む。
【００１７】
細菌種は、一般的に「グラム陽性」および「グラム陰性」種に分けることができ、その差異は、細菌の細胞壁の構造的な差異に依存する特定の染料の保持に特に起因する。
【００１８】
本発明の方法において使用することができる細菌細胞は、任意の適切な細胞であってもよい。好ましくは、細菌細胞は、グラム陰性細菌種、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ、サルモネラ（Salmonella）属、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シゲラ（Shigella）属、エルシニア（Yersinia）属、またはクレブシエラ（Klebsiella）属である。このような細菌種は、当該分野で周知である。それらの種の細菌細胞は、商業的供給、またはATCC（http://www.lgcstandards-atcc.org/）などの生体物質コレクションのいずれかから容易に取得することができる。
【００１９】
当分野で周知であるように、産生されるタンパク質量の質および／または量を向上させる、グラム陰性細菌種などの変異した誘導体も作製された。したがって、それらも、本発明のこの態様で使用することができる細菌細胞の例であると考えられる。
【００２０】
本発明の方法における使用のための細菌細胞を作製する方法は、当技術分野において周知である。さらに以下に概説するように、いくつかの例において、細菌細胞は、組み換えポリペプチドを含有する。十分な時間、適切な条件下で上述の細胞などを培養培地中で培養し、組み換えポリペプチドの発現を得る方法は、当該分野で周知である。そのような方法の実施例は、添付の実施例の項において本明細書で提供される。
【００２１】
本発明の第１態様の方法は、スチレンマレイン酸共重合体（ＳＭＡ）を含む溶液を使用する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、スチレンとマレイン酸との共重合体を提供することは、スチレンと無水マレイン酸との共重合体を提供し、無水マレイン酸をマレイン酸に加水分解することを含む。スチレンと無水マレイン酸との共重合体は、ＳＭＡ（登録商標）２０００、およびＳＭＡ（登録商標）３０００の商品名でSartomer社、エクストン、ペンシルバニア、米国から入手可能である。適切な加水分解法は、当技術分野で知られている。
【００２３】
一例として、以下の手順は、本発明の第１態様の方法において使用することができるＳＭＡ溶液を作製するために使用することができる。
【００２４】
ＳＭＡ２０００Ｐの溶液（Sartomer社から入手した）、および１Ｍの水酸化ナトリウム（１０％ｗ／ｖ）は、マグネチックスターラー上の丸底フラスコ中において室温で穏やかに一晩混合された（２５ｇのＳＭＡ２０００Ｐが、２５０ｍｌのＮａＯＨに溶解された）。続いて、少量の抗沸顆粒を丸底フラスコに添加し、続いて当該丸底フラスコに凝縮器を取り付け、加熱マントル上に置いた。ＳＭＡ／ＮａＯＨ溶液を沸点に到達させた。煮沸後、熱が下げられ、溶液は、２日間冷室に移される前に、２時間還流された。これらの処理は、ドラフトチャンバー中で行われた。この冷却期間の後、体積を測定し、ＳＭＡの含有率を算出し、５０ｍｌファルコンチューブに等分して−７０℃で保存した。
【００２５】
使用する場合、好ましくは、溶液は、０．５Ｍ  ＮａＣｌにおいて５０ｍＭのトリスｐＨ８．０を含んでいる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、スチレン：マレイン酸の比率が０．５：１から１０：１までの間である、スチレンとマレイン酸との共重合体を提供することは、スチレン：マレイン酸の比率が１：１から５：１までの間である、スチレンとマレイン酸との共重合体を提供することを含む。いくつかのさらなる実施形態において、スチレン：マレイン酸の比率は、１．５：１から４：１まで、または２：１から３：１までの間である。
【００２７】
重合処理の性質に起因して、そのようなモノマー比率は、バルク平均であり、モノマーの定義された構成を有する特定の分子構造の記述として解釈されるべきではないことが理解されるであろう。
【００２８】
それにもかかわらず、一般的には、様々な単量体が共重合体全体に分布していることが予想される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、スチレンとマレイン酸との共重合体を提供することは、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有する、スチレンとマレイン酸との共重合体を提供することを含む。いくつかのさらなる実施形態において、共重合体は、５０００Ｄａ〜１５０００Ｄａの間の分子量を有する。いくつかのさらなる実施形態では、共重合体は、７０００〜１００００Ｄａの間の分子量を有する。
【００３０】
本発明者らは、ペリプラズム間隙の内容物を放出するために使用することができるＳＭＡの濃度範囲を調べた。本発明者らは、溶液中のＳＭＡの少なくとも約０．５〜４．５％の範囲が、この目的のためにうまく使用することができることを示した。一実施形態において、ＳＭＡの濃度は、約０．５％〜１０％、１％〜７％、または１．５％〜５％である。さらなる実施形態では、ＳＭＡの濃度は、約２〜２．５％である。
【００３１】
本発明者らは、ペリプラズム間隙の内容物の放出における、ＳＭＡの一時的な影響を調べた。本発明者らは、少なくとも約１５分〜６時間の培養時間の範囲が、この目的のためにうまく使用することができることを示した。好ましくは、培養時間は、約２時間である。また、好ましくは、細菌細胞は、約３７℃でＳＭＡとともに培養される。
【００３２】
したがって、本明細書に提供される情報から、本発明の第１態様の好ましい実施形態は、前記方法が、（ｉ）細菌細胞の集団を作製する工程と、（ｉｉ）細菌細胞を、約２：１のスチレン：マレイン酸の比率を有するＳＭＡを含む溶液に約２％〜２．５％の濃度で懸濁する工程と、（ｉｉ）前記細菌細胞を約３７℃で約２時間にわたって前記溶液中で培養する工程とを含む。
【００３３】
また、本発明者らは、ＳＭＡを含む溶液中のＥＤＴＡ（１ｍＭ）の存在が、ペリプラズム間隙から放出された物質の有意な減少をもたらすことを指摘した。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態は、前記溶液がＥＤＴＡを実質的に含まないものである。
【００３４】
また、本発明者らは、ペリプラズム間隙の内容物の放出効率における浸透圧ショックの影響を調べた。下記の実施例に示されるように、浸透圧ショックの使用は、ペリプラズム間隙から放出される物質の増加をもたらした。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態は、浸透圧ショックに細胞を暴露することを含む。好ましくは、浸透圧ショックは、ＳＭＡ溶液を用いる細胞培養の後に行われる。
【００３５】
本発明の方法は、ペリプラズム間隙の内容物を放出するために使用することができる。ペリプラズムの成分は、オリゴ糖、アミノ酸、ペプチド、および様々な小分子を含む。本発明の方法の操作者は、細胞からこれらの成分を放出するために、当技術分野で周知の方法を用いて溶液からさらに精製することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、細菌細胞は、標的の組み換えポリペプチドをペリプラズムで発現する。組み換えポリペプチドがペリプラズムを標的とする方法は、当該分野で周知である。したがって、本発明の方法は、ペリプラズム間隙の内容物を選択的に放出するための大規模なバイオプロセス処理の一部として使用することができ、その後の精製のための溶液にそのような組み換えポリペプチドを含めることができる。
【００３７】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、前記方法が、ペリプラズム間隙の１つの成分の少なくとも一部を溶液から回収することをさらに含む。本発明のさらなる実施形態は、ペリプラズム間隙が、組み換えポリペプチドを含むものである。本発明のさらなる実施形態は、前記方法が、組み換えポリペプチドの少なくとも一部を溶液から回収することをさらに含むものである。
【００３８】
組み換えポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の標準的な技術を用いて、溶液から容易に単離することができる。
【００３９】
精製タグ（たとえば、複数のヒスチジン残基、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素）を含むように遺伝的に操作された、単離された特定の組み換えポリペプチドが望まれる場合、そのようなポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーなどの使用される特定の精製タグに適する任意の方法によって精製することができる。また、当業者によって容易に理解されるように、当技術分野で周知の他のタンパク質精製技術も使用することができる。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、組み換えポリペプチドの実質的に純粋な試料を作製する方法であって、（ｉ）組み換えポリペプチドを含む細菌細胞の集団を作製する工程と、（ｉｉ）細菌細胞を、約２：１のスチレン：マレイン酸の比率を有するＳＭＡを含む溶液に約２％〜２．５％の濃度で懸濁する工程と、（ｉｉ）前記細菌細胞を約３７℃で約２時間にわたって前記溶液中で培養する工程と、（ｉｖ）前記溶液から前記組み換えポリペプチドを回収する工程とを含む。
【００４１】
また、誤解を避けるために、本発明の第１態様の実施形態も、本発明のこの態様の方法に適用される。
【００４２】
したがって、一例として以下の手順が、本発明の方法の一実施形態として使用することができる。
【００４３】
細菌細胞の集団は、適切な培養条件下で増殖する。したがって、細菌細胞が組み換えペリプラズム標的化ポリペプチドを合成する場合、培養条件は、そのようなポリペプチドの発現および蓄積を促進するようなものである。したがって、細胞は、標準的な実験室的方法（たとえば、遠心分離）を用いて回収され、約２〜２．５％の濃度において約２：１のスチレン：マレイン酸の比率を有するＳＭＡを含む溶液中に懸濁される。細胞懸濁液は、約３７℃で２時間培養される。続いて、細胞は、標準的な実験室的手法（たとえば、遠心分離）を用いて溶液から除去される。得られる溶液は、ペリプラズム間隙の内容物を含む。ペリプラズム間隙の特定成分は、当技術分野で知られているようにアフィニティー精製手段などを用いて単離することができる。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、ペリプラズム間隙の内容物を放出するためのスチレンマレイン酸共重合体（ＳＭＡ）の使用を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、（ｉ）スチレンマレイン酸共重合体（ＳＭＡ）を含む溶液と、（ｉｉ）取扱説明書とを含む、部品のキットを提供する。好ましくは、部品の前記キットは、タンパク質精製カラムまたは樹脂を含む、１以上の追加の構成要素をさらに含む。
【００４６】
取扱説明書は、本明細書で提供されるような、好ましい培養条件、および反応手順などに関する情報と、必要に応じて他のそのような情報とを含み得る。
本発明は、非限定的な、図および実施例を参照して以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】グラム陰性細菌の細胞壁構造。
【図２】スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）。
【図３】膜貫通タンパク質の保護および分離のための、ＳＭＡによる脂質ナノディスクの形成。
【図４】αアミラーゼのペリプラズム放出における様々な条件の影響。
【図５】Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞からの様々なペリプラズム放出方法の効率。
【図６】ＳＭＡによるαアミラーゼのペリプラズム放出における延長された３７℃培養時間の影響。
【図７】ＳＭＡによるαアミラーゼのペリプラズム放出におけるより延長された３７℃培養時間の影響。
【図８】Ｅ．ｃｏｌｉからの様々なＳＭＡペリプラズム放出方法の効率。
【図９】ペリプラズムからのαアミラーゼ放出におけるＳＭＡ脂質重合体の濃度増加の影響。
【図１０】ペリプラズムからのαアミラーゼ放出におけるＳＭＡ脂質重合体の様々な濃度の影響。
【図１１】Ｅ．ｃｏｌｉからの様々なＳＭＡペリプラズム放出方法の効率。
【図１２】最適なＴＳＬＥ放出方法の作用機序における温度変化の影響。
【図１３】様々なペリプラズム放出方法における浸透圧ショックの影響。
【図１４】ペリプラズムのαアミラーゼ放出の、様々な処理におけるＥＤＴＡの影響。
【図１５】これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの存在を検出するための最初の試験。
【図１６】β−ガラクトシダーゼ放出における様々な条件の影響。
【図１７】Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのβ−ガラクトシダーゼ抽出における様々な条件の影響。
【図１８】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）試料の希釈系列についての線形応答。
【図１９】Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の様々なペリプラズム画分を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図２０】Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の様々なペリプラズム画分を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図２１】Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞における、ＴＳＬＥおよびＳＭＡの両者の作用機構案。
【図２２】Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムからのＦＡＢ断片の放出：（Ａ）ＳＭＡを使用して処理された細胞から放出されたＦＡＢ断片を示すウエスタンブロット結果。（Ｂ）浸透圧ショックを使用して処理された細胞から放出されたＦＡＢ断片を示すウエスタンブロット結果。（Ｃ）浸透圧ショックを使用して処理された細胞から放出された総タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ。（Ｄ）ＳＭＡを使用して処理された細胞から放出された総タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
実施例１：タンパク質をペリプラズムから選択的に放出するためのＳＭＡの使用
要約
スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）共重合体が、膜貫通タンパク質を分離して保持するために脂質／重合体の集合体（「脂質ナノディスク」）を形成することができるという最近の発見は、生物学の当該分野における飛躍的な前進であった。したがって、円偏光二色性などの技法は、構造的および機能的分析について、これらの膜貫通タンパク質を特徴付けるために使用されてきた(Knowles et al, 2009)。
【００４９】
数十年の間、タンパク質をエシュリヒア・コリー（Escherichia coli）細菌細胞のペリプラズム間隙から選択的に放出するために、大規模なバイオプロセス産業で規模を拡大することができる、効率的で、しかも安価な処理の必要性があった。本試験中に、本発明者らは、ペリプラズムに基づく治療用タンパク質を放出するための方法としてＳＭＡ共重合体を使用した。この試験は、ＳＭＡ濃度の変化、異なる培養時間、浸透圧ショック、およびＥＤＴＡの添加など、タンパク質放出の効率おける様々な要因の影響を調べることによって開発することができた。陽性コントロールは、この新規の方法と、トリス／スクロース／リゾチーム／ＥＤＴＡ（ＴＳＬＥ）を使用する最適な放出方法とを比較することによって全ての実験に使用された。この新しいペリプラズムタンパク質放出方法は、３つの生化学的分析（αアミラーゼ、βガラクトシダーゼ、およびＢＣＡ総タンパク質分析）を使用して開発された。
【００５０】
本発明者らは、ＳＭＡ共重合体は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからタンパク質を効率的かつ選択的に放出することができることを見出した。本発明者らは、この共重合体を使用する、これらの細胞の理想的な培養条件が、（２時間、３７℃において）２〜２．５％の濃度であることを見出した。したがって、この新規の処理は、大規模なバイオプロセス産業に規模を拡大する大きな可能性を有する。このことは、ＳＭＡが比較的に安価であることと、下流処理における精製工程をほとんど必要としないこととによって、顕著に費用を削減する。
【００５１】
序論
本発明者らは、標的の治療用タンパク質をペリプラズムから抽出する、より効率的な方法を得るために、新たなペリプラズムタンパク質放出方法を開発することを決定した。最も広く使用されているペリプラズム放出方法は、トリス／スクロース／リゾチーム／ＥＤＴＡ（ＴＳＬＥ）緩衝液を使用するので、実験においてコントロールとして使用した。このＴＳＬＥ放出法を用いて、タンパク質の高い割合をペリプラズムから放出することができるが、この方法は、リゾチーム酵素の量および費用が原因で、大規模な工業的プロセスで使用するために規模を拡大することは非常に困難である。
【００５２】
ＳＭＡ（スチレンマレイン酸；図２）と名付けられた重合体が脂質粒子に結合することができ、ＳＭＡ／脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）を形成するという最近の発見は、膜貫通タンパク質の研究における飛躍的進歩であった（Knowles et al, 2009；図３）。
【００５３】
したがって、本発明者らは、ＳＭＡ共重合体が、夾雑タンパク質を細胞質から放出することなく、ペリプラズムタンパク質を選択的に抽出するように、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の外膜を特異的に破壊することができるかどうかを調べることを決定した。
【００５４】
方法および材料
総タンパク質濃度を測定するためのＢＣＡ（ビシンコニン酸）分析
この分析は、（５６２ｎｍで）紫色のＢＣＡ−Ｃｕ＋反応複合体の比色検出に基づいており、試料中のタンパク質の総量を測定する。この手順は、アルカリ性媒体中におけるタンパク質による銅イオンの還元（Ｃｕ２＋――＞Ｃｕ＋）（ビウレット反応と称される）と、ＢＣＡの２分子にキレートすることができる単一のＣｕ＋イオンの性質とを組み合わせ、紫色の反応複合体を形成する。
【００５５】
【化１】
0005886940.tif 000002
【００５６】
この反応複合体は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度が増加するにつれて直線的に増加する、５６２ｎｍにおける強い吸光度を有する。
【００５７】
１０％ＳＭＡ２０００Ｐの作製
ＳＭＡ２０００Ｐ（Sartomer社から入手）と１Ｍの水酸化ナトリウム（１０％ｗ／ｖ）との溶液を、マグネチックスターラー上の丸底フラスコ中において穏やかに室温で一晩攪拌した（２５ｇのＳＭＡ２０００Ｐを２５０ｍｌのＮａＯＨ中に溶解させた）。続いて、いくつかの抗沸顆粒を、凝縮器を取り付けた加熱マントル上に置いた丸底フラスコに加えた。ＳＭＡ／ＮａＯＨ溶液を沸点に到達させた。煮沸後、熱を下げ、２時間還流し、溶液を２日間冷室に移した。これらの工程は、ドラフトチャンバー中で行われた。この冷却期間の後、体積を測定してＳＭＡの含有率を計算し、５０ｍｌファルコンチューブに等分し、−７０℃で保存した。
【００５８】
αアミラーゼ１２６培養の作製。
使用されたＥ．ｃｏｌｉ株は、プラスミドｐＱＲ１２６を含むＫ１２細菌株ＪＭ１０７であった。細胞を、１％デンプン（ｗ／ｖ）および２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する栄養寒天プレート上で一晩増殖させた。この栄養寒天プレートからの単一コロニーを、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した、５０ｍｌの「テリフィックブロス」（ＴＢ）を含む三角フラスコに植菌し、回転式振とう培養機内において一晩３７℃で植菌した。
【００５９】
細胞分画法
この一晩培養物を５０ｍｌファルコンチューブにおける１０個の４０ｍｌアリコートに分けた。続いて、これらのファルコンチューブを、ベックマンコールター社製ＧＳ−６Ｒ遠心分離機を用いて４℃で１０分間遠心分離（３７５０ｒｐｍ）し、上清（細胞外画分）を廃棄した。ペレットは、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて洗浄され、再度４℃で１０分間にわたって再遠心分離（３７５０ｒｐｍ）し、上清を再び除去した。
【００６０】
Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム画分からのαアミラーゼの抽出
これらの細胞の単一のペレットを、８ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中に十分に再懸濁し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおける８つの１ｍｌアリコートに分配した。その後、これらのチューブを、１４，０００ｒｐｍでベンチトップ遠心分離機（Spectrafuge（商標）16M）を用いて室温で５分間遠心分離した。続いて、ペレットを残して上清を除去した。ペリプラズム画分を、種々の抽出方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ細胞から放出した。
【００６１】
リゾチーム／ＥＤＴＡ処理
ペリプラズム放出の従来法は、リゾチーム／ＥＤＴＡを用いて得られた。単一細胞ペレットを、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２０％スクロース、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびリゾチーム（５００μｇ／ｍｌ）を含む緩衝液１ｍｌに再懸濁した。その後、これは、Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｅ緩衝液と称される。続いて、これを室温で１５分間培養し、１４，０００ｒｐｍの速度で室温において５分間の遠心分離することによって細胞を回収した。上清（ペリプラズム画分）を別々の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに静かに移した。
【００６２】
いくつかの実験では、さらに「冷水洗浄画分」が得られた。これは、１ｍｌの氷冷脱イオン水（４℃）を有するエッペンドルフチューブから残りの細胞ペレットを洗浄することによって得られた。続いて、細胞を、室温で５分間の遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）によって集め、上清（冷水洗浄画分）を別の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに静かに移した。
【００６３】
リゾチーム処理
単一細胞ペレットを、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２０％スクロース、およびリゾチーム（５００μｇ／ｍｌ）を含む緩衝液１ｍｌに再懸濁し、室温で１５分間攪拌した。続いて、細胞を、室温で５分間の遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）によって集め、上清（ペリプラズム画分）を別の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに静かに移した。
【００６４】
トリス／ＮａＣｌ処理
単一細胞ペレットを、特定の長さの時間（２時間または６時間）にわたって、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液１ｍｌに再懸濁し、３７℃で培養した。培養後、細胞を、室温で５分間の遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）によって集め、上清（ペリプラズム画分）を別の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに静かに移した。
【００６５】
スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）処理
また、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）の様々な濃度を用いた処理を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム内容物を抽出するために使用した。多くの別個の細胞ペレットを、異なる濃度のＳＭＡ（５０ｍＭトリス  ｐＨ８．０／０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を含む緩衝液中に十分に再懸濁し、室温または３７℃のいずれかで様々な期間で培養した。培養後、細胞を、室温で５分間遠心（１４，０００ｒｐｍ）することによって集め、上清（ペリプラズム画分）を別の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに静かに移した。
【００６６】
リゾチーム／ＥＤＴＡまたはＳＭＡ処理後の浸透圧ショック
細胞を、７５０μｌのＴ／Ｓ／Ｌ／Ｅ緩衝液（上述のように）、または７５０μｌのＳＭＡ（５０ｍＭトリス  ｐＨ８．０／０．５Ｍ  ＮａＣｌ）のいずれか中に十分に再懸濁した。細胞懸濁液を、これらの緩衝液のいずれかとともに室温で１５分間静的に培養した。この後、冷水を等量添加した。さらに、この細胞懸濁液を、特定の条件に応じて）特定の期間培養し、５分間にわたって１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによってペリプラズム画分を回収前した。
【００６７】
分析超遠心（ＡＵＣ）のための、αアミラーゼペリプラズム画分に由来する試料の作製
３つの別々のαアミラーゼペリプラズム画分（ＴＳＬＥ、２．５％ＳＭＡ、および５０ｍＭトリス／０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の使用は、ＡＵＣ実験で使用するために必要であった。Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｅ  αアミラーゼ画分を、１２〜１４ＫＤａの透析膜で透析した。これに対して、ＳＭＡおよびトリス／ＮａＣｌ  αアミラーゼ画分を、３．５ｋＤａの透析膜で透析した。これらの画分のすべてを、汚染物質の存在しない高度に純粋な試料を得るために、５０ｍＭトリス  ｐＨ８．０／５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中で透析した。これらの試料の分析は、その後、分析超遠心を使用して行った。
【００６８】
細菌細胞のペリプラズム間隙によって放出されたαアミラーゼ量を測定するための分析
分析における使用のために必要な停止溶液は、５０ｍｌのヨウ化カリウム（２％ｗ／ｖ）に溶解された、１００μｌのヨウ素保存溶液（２．２％Ｉ２／４．４％ＫＩ）を用いて作製された。
【００６９】
αアミラーゼ酵素の活性は、酵素活性がデンプン／ヨウ素複合体（２．２％Ｉ２／４．４％ＫＩ）の吸光度の比率の減少を測定することによって計算される分析を用いて測定された。
【００７０】
ペリプラズム画分の希釈物を、１：１０の比率で作製し（１００μｌ試料に加えて、９００μｌのトリス２００ｍＭ  ｐＨ７．５）、それぞれの希釈されたペリプラズム画分の１５０μｌを、９６ウェルプレートの別のウェル入れ、５０℃で予め培養した。分析の開始時点において、予め培養された（５０℃）１５０μｌのデンプン溶液（０．５％ｗ／ｖ）を、マルチチャンネルピペットを用いて適切なウェルに時間差で添加した。この反応を、５０℃で３分間にわたって生じさせた。
【００７１】
３分後、１５μｌの各反応混合物を、３００μｌの停止溶液（Ｉ２／ＫＩ）を含む別の９６ウェルプレート上の適切なウェルに加えた。各ペリプラズム画分について反応混合物の添加後、吸光度をMolecular Devices（商標）E-maxプレシジョンプレートリーダーを用いて５９０ｎｍで測定した。これらの反応のそれぞれは、複数のデータセットを得るために、各画分について２回または３回のいずれかで行った。
【００７２】
続いて、αアミラーゼ活性の効率を、デンプン／ヨウ素錯体の吸収率の減少を測定することによって計算した。
【００７３】
ペリプラズム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ペリプラズム画分（２０μｌ）を、５μｌのタンパク質試料ローディング色素に結合させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のウェルに入れた。タンパク質マーカーがゲルの末端に達するまで、ゲルを約１時間、１００Ｖで泳動した。続いて、ゲルを、Instant Blue（商標）（クーマシーブルー）を使用して染色し、多数のタンパク質バンドが見えるようになるまで、ロッカーの上に置いた。この染色処理の後、Instant Blue（商標）染色を除去し、ゲルを脱イオン水によって一晩脱染色した。続いて、ゲル上に存在するタンパク質バンドを、存在するタンパク質のサイズを決定するために、予め染色されたタンパク質マーカーに対して分析した。
【００７４】
β−ガラクトシダーゼ測定のための培養物の増殖
この分析で使用されるＥ．ｃｏｌｉ株は、プラスミドｐＡＣＹＣ ΔＨＮを含む１８２細菌株ＭＡＬＸ４００であった。これらの細胞は、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを含む栄養寒天プレート上で一晩増殖させた。
【００７５】
この栄養寒天プレートに由来する単一コロニーを、無菌技術を用いて、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、および３５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補充した１０ｍｌのＬＢを含むフラスコに無菌ループ（sterile loop）を使用して植菌し、無菌技術を用いて３７℃において振盪水槽中で一晩培養した。培養後、（テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを有する）１０ｍｌのＬＢを含む別の三角フラスコを、一晩予め培養した培養物２００μｌを用いて植菌し、２〜３時間３７℃の水槽中で振盪した。このことを、培養物が氷上で保存されたとき、６５０ｎｍ（ＯＤ６５０ｎｍ）での光学密度が、０．３〜０．５の間になるまで行った。
【００７６】
細胞を透過するために、５０μｌのトルエンおよび１％デオキシコール酸ナトリウムの両者を培養物に添加し、パラフィルムでフラスコの首部分を覆うことによって簡単に混合した。続いて、培養物を、トルエンを蒸発させるために、振盪水槽中において３７℃で通気した。溶解液を、実験的な使用のために必要となるまで、アイスバケットに保存した。
【００７７】
β−ｇａｌの分析における使用のための、Ｚ緩衝液、ＯＮＰＧ、およびＮａ２ＣＯ３の作製
β−ガラクトシダーゼ分析における使用のためのＺ緩衝液は、０．０６ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．０４ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）、０．０１ＭのＭｇＳＯ４、および（実験当日に加えられた）０．０５Ｍのβ−メルカプトエタノールを用いて作製された。
【００７８】
ＯＮＰＧ溶液を、４ｍｇ／ｍｌの濃度で作製する必要があった。これは、２０ｍｌのＺ緩衝液中に凍結乾燥された、８０ｍｇのＯＮＰＧ粉末を添加することによって得られた。また、炭酸ナトリウム（「停止試薬」）も１Ｍの最終濃度で作製する必要があった。
【００７９】
Ｚ緩衝液（１．９ｍｌ）を、コントロール実験のための試験管を含む、必要な多くの試験管で測定した。細胞溶解物のアリコート（１００μｌ）を、β−ガラクトシダーゼ測定用チューブに加えたのに対して、１００μｌのＺ緩衝液をコントロールチューブに加えた。
β−ｇａｌチューブ：
１．９ｍｌ  Ｚ緩衝液＋０．１ｍｌ  細胞溶解物→０．５ｍｌ  ＯＮＰＧ→１ｍｌ  Ｎａ２ＣＯ３
コントロールＩ（細胞溶解物なし）：
２ｍｌ  Ｚ緩衝液→０．５ｍｌ  ＯＮＰＧ→１ｍｌ  Ｎａ２ＣＯ３
コントロールｉｉ（ＯＮＰＧなし）：
１．９ｍｌ  Ｚ緩衝液＋０．１ｍｌ  細胞溶解物→０．５ｍｌ  Ｚ緩衝液→１ｍｌ  Ｎａ２ＣＯ３
【００８０】
反応を０．５ｍｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を添加することによって開始させ、それぞれ０、５、１０および２０分間生じさせた。これらの特定時間の後、反応物を、１ＭのＮａ２ＣＯ３の１ｍｌを用いて停止させ、４２０ｎｍ（ＯＤ４２０ｎｍ）での光学密度を記録した。０分でのβ−ｇａｌ活性を試験するチューブについて、炭酸ナトリウムをＯＮＰＧの前に添加した。続いて、試験管の各々についてのβ−ガラクトシダーゼ活性を、適切な時点で培養物について計算した。
【００８１】
これらの試験管分析の間に、吸光度をCecil Instruments（商標）CE-272linear読出紫外線分光光度計を用いて測定した。
【００８２】
９６ウェルプレートに合わせるためのβ−ｇａｌ分析の調節
同一の基本的なプロトコルを、他の一連の実験に続いて行ったが、溶液の体積は、反応混合物を９６ウェルプレートに合わせるために１０倍縮小された。したがって、試料については、１０μｌのβ−ガラクトシダーゼ含有細胞または細胞画分の追加とともに、１９０μｌのＺ緩衝液をプレートの特定ウェルに添加した。
【００８３】
反応を開始するために、５０μｌのＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）を、特定ウェルに添加し、反応を０、５、および２０分間発生させた。１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）溶液１００μｌを添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける光学密度を測定した（ＯＤ４５０）。
【００８４】
この一連の実験の間、多くのコントロール試験を行った。陽性および陰性コントロールを、（ＯＮＰＧの添加の有無にかかわらず）５μｌのトルエンと５μｌのデオキシコール酸ナトリウムとを用いて透過処理された１ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ細胞を含むエッペンドルフチューブを用いて行った。一方、別の陰性コントロール試験を、細胞溶解物／画分をともに使用せずに行った。目的の酵素（β−ガラクトシダーゼ）を含む細胞画分は、（上述の）αアミラーゼ分析について記載された方法と同じ方法を用いて抽出した。
【００８５】
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析を、総タンパク質量を検出するために、９６ウェルプレート中で行った。ＢＣＡ作用試薬は、ＢＣＡ試薬Ａの５０部と、ＢＣＡ試薬Ｂの１部とを混合することによって作製した。この分析の場合、９．８ｍｌの試薬Ａを、０．２ｍｌの試薬Ｂに混合した。この作用試薬は、室温で保存することができ、１日間安定である。
【００８６】
９６ウェルマイクロアッセイプレートを用いて、１０μｌの各スタンダードまたは試料（ペリプラズム画分）をプレートの適切なウェルに加えた。スタンダードまたは試薬のこの容量に、２００μｌの作用試薬を添加した。また、一連のブランク溶液を、２００μｌの作用試薬で構成される適切な緩衝液１０μｌを用いて、プレートの適当なウェル中で作製した。プレートを３０秒間ロッカー上で混合し、３０分間３７℃で培養した。吸光度を５７０ｎｍでプレートリーダーを用いて測定した。続いて、５７０ｎｍでのブランクについての平均吸光度を、ＢＳＡ標準曲線を作成するために、各スタンダードまたは未知試薬のそれぞれについての平均吸光度から差し引いた。このＢＳＡ標準曲線から、各特定のペリプラズム画分のタンパク質濃度を決定することができた。
【００８７】
結果
エシュリヒア・コリー（Eschrichia coli）細胞からのペリプラズムαアミラーゼ放出の際に変化する条件の影響。
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（プラスミドｐＱＲ１２６を含むＫ１２細菌細胞株ＪＭ１０７）のペリプラズムからαアミラーゼを抽出するために、初期αアミラーゼ分析を確立し、この酵素の放出における条件の変化の影響を調べた。
【００８８】
この最初の分析において、個々のαアミラーゼペレットを、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム内容物を抽出するために、多くの緩衝液を用いて処理した。これらの異なるペリプラズム放出方法は、トリス／スクロース／リゾチーム（ＴＳＬ）緩衝液、トリス／スクロース／リゾチーム／ＥＤＴＡ（ＴＳＬＥ）緩衝液、２．５％スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）重合体緩衝液（様々な温度および培養時間で）、およびトリス／ＮａＣｌ緩衝液を使用することを含んでいた。
【００８９】
予測されるようにＴＳＬＥ緩衝液を用いるαアミラーゼ１２６ペレットの処理は、αアミラーゼの最大の抽出（８０．５％）をもたらしたが、他の個々のαアミラーゼ１２６ペレットは、スチレンマレイン酸重合体を（２．５％濃度で）用いて処理したとき、いくつかの有望な結果をもたらした。また、ＴＳＬＥ緩衝液は、ＴＳＬペリプラズム放出方法に比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞由来のαアミラーゼの３５％多い放出をもたらす（４５．７％に比較して８０．５％）。したがって、このことは、 ＥＤＴＡが、リゾチームの作用機序における刺激効果を有することを示している。
【００９０】
ペリプラズムタンパク質の放出のためのこれらの条件の最も著しいものは、αアミラーゼ１２６細胞が、２．５％のＳＭＡ重合体を用いて３７℃で２時間処理されたときのものであり、この酵素の６８％の抽出をもたらす（図４）。したがって、ＴＳＬＥ（１００％）を用いる最適な放出方法に比べて、このＳＭＡペリプラズム放出方法は、８４．５％の効率であった（図５）。これらの最初の結果の後、これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞のＳＭＡ処理における条件変化の影響を試験するために改良された分析を試験し開発する必要があった。
【００９１】
αアミラーゼ分析グラフのエラーバーの説明
本研究の間に行われたこれらの分析のそれぞれについて、反応を、複数のデータセットを得るために、２回または３回反復して行った。したがって、棒グラフは、それぞれのペリプラズムタンパク質の放出方法について、ペリプラズムから抽出されたαアミラーゼの平均割合（％）を示している。
【００９２】
これらの複数のデータセットのために、各グラフにエラーバーを含む必要がある。したがって、それぞれのペリプラズムタンパク質放出方法について、各棒グラフにおいて、上部のエラーバーは、ペリプラズムからのαアミラーゼの最大抽出を表すのに対し、下部のエラーバーは、ペリプラズムからのα−アミラーゼの最少抽出を表している。
【００９３】
ペリプラズムαアミラーゼ抽出は、３７℃における培養期間の増加とともに増加する。
この最初の結果の後、ＳＭＡ共重合体によるαアミラーゼのペリプラズム抽出における３７℃での培養の時間的な影響を示すために、αアミラーゼ分析を開発する必要があった。したがって、別の分析において、これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞を、３７℃で、様々な異なる培養時間にさらした。
【００９４】
これらの分析の最初の結果（図６）は、１５分（１３．８％）〜２時間（６７．２％）の間にこれらの細胞のペリプラズムから抽出されたαアミラーゼの量における非常に有意な一時的な増大（〜５倍）を示した。この結果は、遅く機能するＳＭＡ脂質重合体を得ることは、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞のペリプラズムからαアミラーゼを抽出する可能性を高めるに違いないことを示している。
【００９５】
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞からのペリプラズムαアミラーゼの抽出において、ＳＭＡ（２時間〜６時間の間）を用いる長い培養時間の影響をさらに試験するためにこの分析を開発する必要があった。この分析の結果（図７）は、これらの期間の間に、この酵素の放出におけるごくわずかな増加（７８．７％に対して８２．３％）を示した。
【００９６】
様々なペリプラズムタンパク質放出方法の効率を測定するために、これらの２つの別々の経時的分析から得られる結果を組み合わせる必要があった（図８）。したがって、これらの結果は、最適なＴＳＬＥ放出方法（１００％）に比較して９０．９％効率的であったαアミラーゼのペリプラズム放出をもたらし、２．５％のＳＭＡを用いる２時間（３７℃）にわたるこれらのＥ．ｃｏｌｉ細胞の培養が最も有望な結果をもたらしたことを示した。
【００９７】
スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）の濃度が増加すると、ペリプラズムのαアミラーゼ抽出は減少する。
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからのαアミラーゼの抽出における、ＳＭＡの異なる濃度（０．５％〜４．５％）の効果を試験するためにこの分析をさらに発展させる必要があった。一定に維持するために、培養時間は、これらのＳＭＡ濃度のそれぞれについて２時間（３７℃）で保たれた。
【００９８】
多くの別の分析は、ＳＭＡの異なる濃度で確立された。第１のこれらのαアミラーゼ分析（図９）は、２％〜４．５％ＳＭＡの間のペリプラズムαアミラーゼの抽出において顕著な減少を示した（６４．３％から２９．３％）。この分析を、０．５％〜２．５％の間のＳＭＡ濃度で処理したとき、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからのαアミラーゼの抽出を調べるためにさらに発展させた。この分析についての結果（図１０）は、これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞から抽出されたαアミラーゼの量の顕著な増加があったことを示した（５９．７％から８１．６％）。
【００９９】
これらの様々なペリプラズム放出方法の効率を測定するために、これら２つの別々の分析からの結果を結合する必要があった（図１１）。このことが行われたとき、２％および２．５％ＳＭＡの両者は、ペリプラズムからのαアミラーゼの放出によって、最適な放出方法（ＴＳＬＥ緩衝液）に比較してほぼ同じ結果をもたらす。このことは、ＳＭＡ脂質重合体が、ペリプラズムからのαアミラーゼの非常に良好な放出をもたらしたことを示した。
【０１００】
温度は、ペリプラズムαアミラーゼ放出のＴＳＬＥ方法には影響しない。
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＴＳＬＥ処理における温度の影響を調べるために新たな分析が確立された。
最適なＴＳＬＥ放出方法（室温で１５分間の培養）を、４℃における、αアミラーゼ１２６細胞の分離したペレットと同様の培養時間と比較した。これらの２つの温度を、αアミラーゼのそれぞれの放出によって比較すると、現実的な差は認められなかった（１００％に対して９９．５％）。
【０１０１】
ペリプラズムタンパク質放出における「冷水洗浄」の効果
上述のペレットを氷冷水で洗浄して「冷水洗浄画分」を得た（方法において記載された）。これらの画分から得られた結果は、最適なＴＳＬＥペリプラズム放出方法（図１２）に比較して、αアミラーゼ放出の有意な減少があり、αアミラーゼ放出の１７．３％または５．４％（４℃）のいずれかをもたらすことを示した。この結果は、これらの条件から製造されたαアミラーゼのほとんどが「ペリプラズム画分」に放出されたことを示した。
【０１０２】
ペリプラズムαアミラーゼ放出の効率における浸透圧ショックの影響
さらなる分析を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからのαアミラーゼ抽出に、氷冷水の適切な体積を添加する効果を試験するために行った。この分析のために、この浸透圧ショック法（方法を参照のこと）を、ペリプラズムタンパク質放出についての、ＴＳＬＥ、２％ＳＭＡ、および２．５％ＳＭＡ処理（図１３）と併せて行った。この分析の結果は、浸透圧ショックが、細胞からαアミラーゼを放出するための、Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｅ処理の効率にほとんど影響を与えないことを示した（１００％に対して９９．３％の効率）。しかしながら、浸透圧ショックを、２％ＳＭＡ処理（８５．９％から９２．６％）と２．５％ＳＭＡ（７５．８％から８８．４％）との両者に組み合わせて両者を使用したとき、放出されるαアミラーゼの量がわずかに増加した。
【０１０３】
様々なペリプラズムタンパク質放出方法におけるＥＤＴＡの効果
リゾチーム作用におけるＥＤＴＡの効果は、既に以前に示されており（図４）、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムから放出されるαアミラーゼ量における刺激効果を有することが見出された。したがって、ＥＤＴＡが、ＳＭＡ脂質粒子（ＳＭＡＬＰｓ）の性質に任意の影響を有し、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙からαアミラーゼを放出するかどうかを確認する必要があった。
【０１０４】
同じ濃度のＥＤＴＡ（１ｍＭ）を、様々な組み合わせの培養条件を用いて２％ＳＭＡ緩衝液に添加すると、これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからのαアミラーゼの放出量は顕著に減少することが示された。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からペリプラズムαアミラーゼ放出を、２％ＳＭＡ緩衝液を用いて３７℃で２時間調べたとき（ＥＤＴＡの添加の有無で）、ペリプラズム間隙からのαアミラーゼの放出量が顕著に減少した（図１９）。αアミラーゼの量は、ＴＳＬＥ最適放出方法（１００％）に比較して、７９．５％から４．２％に減少した。
【０１０５】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのβ−ガラクトシダーゼ放出における様々な条件の影響。
第１の試験管分析は、これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞中のβ−ガラクトシダーゼの存在を示すために確立された。このことは、トルエンおよびデオキシコール酸ナトリウムを用いて細胞を透過性にすることによって得られた。ＯＮＰＧの存在下において、（４２０ｎｍの光学密度で）２０分間にわたって０．５３の吸光度の変化があった（０．０５から０．５８まで）ので、β−ガラクトシダーゼの有意な放出が示される。一方、ＯＮＰＧの非存在下において、同様の期間にわたって（同一の光学密度で）吸光度の変化はなかった。この場合、放出されたβ−ガラクトシダーゼは、その作用を発揮することができない。なぜなら、ＯＮＰＧ（無色）をＯＮＰ（黄色）に変換することができないからである。ＯＮＰＧの存在下においてＺ緩衝液を用いる別の陰性コントロール実験では、（４２０ｎｍでの）吸光度に変化はなかった。なぜなら、この酵素を含有する細胞が存在しないからである。これらのβ−ガラクトシダーゼ分析のそれぞれについて、吸光度の変化は、この酵素の活性の増加を表した（図１５）。
【０１０６】
エシュリヒア・コリー細胞（プラスミドｐＡＣＹＣ  ΔＨＮを含む１８２菌株ＭＡＬＸ４００）からの細胞質酵素β−ガラクトシダーゼの放出における、様々な処理および条件の影響を調べるために、様々な異なる分析を９６ウェルプレートに確立した。
【０１０７】
これらの分析の最初に、細胞は、ＴＳＬＥ緩衝液、２％ＳＭＡ緩衝液、および２．５％ＳＭＡ緩衝液で処理された（図１６）。また、細胞は、陽性コントロールとしてβ−ガラクトシダーゼを放出するために、トルエンおよびデオキシコール酸ナトリウムを用いて透過させることができた。この分析の結果は、ＴＳＬＥ処理のためだけでなく、（ＯＮＰＧの存在下での）透過された細胞について陽性の結果（β−ガラクトシダーゼの放出）を示した。一方、細胞をＳＭＡ重合体で処理したとき、β−ガラクトシダーゼの放出は、全くないか、最小であった。陰性コントロール実験を、β−ガラクトシダーゼの存在下（透過性細胞）、ＯＮＰＧの非存在下で行った。したがって、このβ−ｇａｌ基質の非存在下において、（４５０ｎｍでの）検出された吸光度の変化はなかった。
【０１０８】
これらの結果は、ＴＳＬＥ処理がＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞質からβ−ガラクトシダーゼを抽出することができたが、ＳＭＡ処理放出によって示される陰性結果は、ＳＭＡ脂質粒子（ＳＭＡＬＰｓ）が、任意のこの細胞質酵素を放出しないことを示した。
【０１０９】
β−ガラクトシダーゼの放出を検出するために、後続の分析では、トリス／ＮａＣｌ緩衝液を、エシュリヒア・コリー細胞のペリプラズム内容物を放出するために使用した（図１７）。この特定の緩衝液は、再度β−ガラクトシダーゼの放出をもたらさず、細胞膜が無傷のままであると考えられることが再度示された。
【０１１０】
β−ガラクトシダーゼの放出における「冷水洗浄」の影響
β−ガラクトシダーゼ細胞から「冷水洗浄画分」を得る方法（上述の方法）を、この酵素の放出を検出するために使用した。この処理の結果は、β−ガラクトシダーゼが、「冷水洗浄画分」（ｃｗｆ）において放出されなかったことを示した。このことは、すべてのβ−ｇａｌが「ペリプラズム画分」に放出されたことを示した（図１７）。
【０１１１】
ペリプラズムと冷水洗浄画分とに存在する総タンパク質量を検出するためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析の使用
この分析を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から抽出された、ペリプラズム画分（ｐｆ’ｓ）および冷水洗浄画分（ｃｗｆ’ｓ）の多くに存在するタンパク質の量および濃度を検出するために使用した。これらの画分のそれぞれの正味吸光度を、総タンパク質濃度を決定するために、ＢＳＡ標準曲線上にプロットした（図１８）。
【０１１２】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（プラスミドｐＱＲ１２６を含むＫ１２細菌株ＪＭ１０７）のペリプラズム画分から検出された総タンパク質の最大量は、ペリプラズムタンパク質放出のための最適ＴＳＬＥ方法を使用することによって検出され、（５７０ｎｍにおいて）０．３６２５の正味吸光度を得た。したがって。〜５００μｇ／ｍｌの総タンパク質濃度を示している。この結果は、ＴＳＬＥ緩衝液が、ペリプラズム間隙と細胞質との両者からタンパク質を多量に放出するために外膜および細胞膜を破壊することができることを示した。
【０１１３】
細胞を、ペリプラズム内容物を放出するために[５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）／０．５ＭのＮａＣｌ中の]２．５％ＳＭＡで処理すると、より小さい０．１１２の正味吸光度であり、細胞から放出された総タンパク質量がより少ないことを示した（〜２００μｇ／ｍｌ）。このことは、上述の結果を再び示している。なぜなら、タンパク質は、ペリプラズムからのみ放出され、これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞質からは放出されない。また、細胞を、ペリプラズム内容物を放出するために、トリス／ＮａＣｌ緩衝液によって処理したときも、より低い０．０６１５の正味吸光度（〜１００μｇ／ｍｌ）であった。この結果は、より少ないタンパク質がこの方法を用いて放出されたことを示し、αアミラーゼ分析に示された上述の結果を示している。これらの方法に由来する「冷水洗浄画分」を使用すると、５７０ｎｍの正味吸光度の真の変化は得られなかった。このことは、ほとんど、または全くタンパク質が、この方法を用いることによって放出されなかったことを示した。
【０１１４】
この特定のＢＣＡ総タンパク質分析の結果は、β−ガラクトシダーゼＥ．ｃｏｌｉ細胞（プラスミドｐＡＣＹＣ ΔＨＮを含む１８２細菌株ＭＡＬＸ４００）から得られたペリプラズム画分に非常に類似していた。最適なＴＳＬＥ放出方法を用いることによる唯一の違いは、わずかに低い０．２５４の正味吸光度が得られ、〜４００μｇ／ｍｌの総タンパク質濃度を示していることである。
【０１１５】
このことは、これらの細胞には、他の細菌株に比較して少ないαアミラーゼが存在するという事実のために、わずかに少ないタンパク質が、最適なＴＳＬＥペリプラズムタンパク質放出方法を用いてこれらのＥ．ｃｏｌｉ細胞から放出されたことを示した。最良適合の線は、５７０ｎｍにおいて公知のスタンダード、またはタンパク質試料の正味吸光度の直線を示している（ｘ軸およびｙ軸上の０における切片を有する）。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム画分中の様々なタンパク質の存在を示すために行った。結果は、図１９に示されている。
【０１１７】
別個のバンドが同じ分子量（ｋＤａ単位）付近で、レーン２および３に存在していた。バンドは、ＴＳＬＥ緩衝液単独であるレーン２においてより顕著であったが、レーン３におけるバンドは、ＴＳＬＥペリプラズム画分を表している。このバンドは、最も好ましくは、緩衝液またはペリプラズム画分のいずれかに存在するリゾチームを表していると考えられる。ＳＭＡ重合体は、２．５％ＳＭＡペリプラズム放出処理の使用によって、レーン５〜９に示された。このことは、約７．５ｋＤａの小さいタンパク質を表すバンドを示している。また、このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに使用されるすべてのペリプラズム画分は、αアミラーゼ分析において使用された、予備染色されたタンパク質マーカーに対して行われた（レーン１）。
【０１１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム内容物の抽出において使用されたタンパク質を調べるために、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行う必要があった（図２０）。
【０１１９】
ゲルのレーン１（ＴＳＬＥペリプラズム画分）に示されるタンパク質バンドが存在し、このことは、最も好ましくはリゾチームタンパク質を表している。このことは、約７．５ｋＤａのより小さいタンパク質を表すバンドを示すゲルのレーン２（２．５％ＳＭＡペリプラズム画分）（ＳＭＡ脂質重合体）とは対照的である。
【０１２０】
レーン２と同様のサイズのバンドは、レーン５〜７に見出される。これらのレーンには、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）ディスク、ホスファチジルコリン（ＰＣ）ディスク、および２．５％のＳＭＡ緩衝液をそれぞれ表している。
【０１２１】
ゲルのレーン４において、αアミラーゼタンパク質単独で行われた。これは、より大きなタンパク質（〜５４ｋＤａ）を表すバンドを示している。これらのペリプラズム画分／タンパク質は、予め染色されたタンパク質マーカーに対して行われた（レーン８）。
【０１２２】
これら３つの生化学的分析法を用いてＥ．ｃｏｌｉ細胞から放出された様々なタンパク質の量の観点から考察するための基本的結果指針
【０１２３】
【表１】
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注：プロジェクト全体を通して、ＳＭＡペリプラズムタンパク質放出処理は、最適化ＴＳＬＥ方法に比較して〜８０％〜９９．４％まで変化するαアミラーゼ放出をもたらした。この違いは、多くの異なる分析においてこの処理の使用に起因するのみである。
【０１２４】
記号
（−）＝特定タンパク質の放出がないことを示している。
（＋）または（＋＋）＝その特定タンパク質の最小限の放出を示している。
（＋＋＋＋）＝その特定タンパク質の非常に優れた放出を示している。
（＋＋＋＋＋）＝その特定タンパク質の最も優れた放出を示している。
【０１２５】
議論
Knowlesらによる最近の研究では、膜貫通タンパク質を研究する全く新規の方法が開発された。このことは、「スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）共重合による単分散脂質ディスク」の形成によるものである。これらの脂質「ナノディスク」（ＳＭＡＬＰｓ）の形成は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、および円二色性（ＣＤ）分光法などの、生物物理学的および構造的分析を正確に調べるために保存される膜貫通型タンパク質をもたらすことができる。
【０１２６】
この発見は、ＳＭＡＬＰｓが、結合し、外膜との複合体を形成することができ、これらの脂質ナノディスクが、様々な他の膜画分（すなわち、ペリプラズム）からタンパク質を分離し、抽出することを可能にする手段として使用することができるというものである。
【０１２７】
これまで、放出タンパク質の最大量の観点から、グラム陰性細菌（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質抽出の最適方法は、ＥＤＴＡと組み合わせたリゾチーム酵素を使用している。
【０１２８】
リゾチームは、細菌の細胞壁のペプチドグリカン成分を標的とすることが知られている。したがって、グラム陽性細菌（すなわちバチルス種）において、リゾチームは、簡単にこの層を破壊することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌では、付加的な外膜の存在は、ペプチドグリカン層を外部環境から保護することができる。ＥＤＴＡなどの薬剤の添加は、外膜の不安定化を引き起こす２価の陽イオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）のキレート化をもたらすことができるので、ペリプラズム間隙中に存在するペプチドグリカン層にリゾチームを接触させ、続いて「溶解した」細胞から大量のタンパク質の放出をもたらす。
【０１２９】
リゾチーム／ＥＤＴＡ処理によるＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞のペリプラズムタンパク質放出は、温度に依存しないので、この要因は、ペリプラズム間隙からタンパク質の放出における有意な変化をもたらさない。
【０１３０】
２．５％の濃度で、２時間３７℃におけるＳＭＡ共重合体を用いるＥ．ｃｏｌｉ細胞の処理は、ペリプラズムからのタンパク質の放出によって有望な結果をもたらした（図１）。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の外膜中の、リン脂質、リポ多糖類およびリポタンパク質の存在によって、これらの特異的ＳＭＡ重合体は、「脂質ナノディスク」としても知られる（Knowles et al, 2009）重合体／脂質の集合体を形成することができる。これらの複合体の形成は、ペリプラズムからのタンパク質の放出をもたらすことができる。脂質／重合体の集合体を形成し、ペリプラズムタンパク質を放出するＳＭＡ共重合体の能力を、重合体の濃度（図６〜８）、温度、および分析の経時変化における相違など様々な条件下で試験した。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を処理するために３７℃で２．５％ＳＭＡ重合体を使用し、１５分〜６時間までの範囲の時間にわたって、ペリプラズムからのαアミラーゼ放出における非常に顕著な増加をもたらした。ＳＭＡ脂質重合体（ＳＭＡＬＰ）がある期間にわたって外膜と相互作用するとき、このことは、大量のペリプラズムαアミラーゼの放出をもたらす。この反応は、２時間で使い尽くされるようである。なぜなら、その後αアミラーゼは、ほとんど放出されないからである。
【０１３２】
したがって、３７℃で培養器を動かす費用の増加のために、６時間にわたるＳＭＡ共重合体を有するＥ．ｃｏｌｉ細胞の処理は、バイオプロセス産業における実行可能な選択肢ではないであろう。したがって、ペリプラズムを標的とする治療薬の放出のためのバイオプロセス設計によって、２．５％のＳＭＡを用いる２時間の処理は、より経済的であろう。
【０１３３】
０．５％から４．５％まで、様々な濃度でＳＭＡ重合体を用いて（２時間、３７℃）、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムから放出されたαアミラーゼの量に関する様々な結果を得た。この結果は、ＳＭＡの濃度を増加する（４．５％〜２．５％の間）と、このことが、脂質／重合体の集合体を形成し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムの内容物を放出するＳＭＡの能力を阻害する影響を与えることを示した。他の可能性は、ＳＭＡの濃度を４．５％まで増加すると、円偏光二色性分析によって確認をする必要があるペリプラズムαアミラーゼの天然の非折り畳みをもたらし得ることである。したがって、ペリプラズム環境は、タンパク質が、その特徴的な三次構造を形成することができないように、より酸化度が少なくなる。一方、ＳＭＡの濃度が増加したとき（０．５％〜２．５％の間）、このことは、ペリプラズムαアミラーゼ放出の増加をもたらし、脂質／重合体の集合体の複合体がより強く結合することができ、αアミラーゼの増加した放出を刺激することを示唆する。したがって、スチレンマレイン酸を（２〜２．５％で）用いることは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズムからタンパク質を得るためのより経済的な選択肢として、バイオプロセスにおける使用のための最良の選択肢である。
【０１３４】
また、（２％の濃度で）ＳＭＡ共重合体が１ｍＭのＥＤＴＡに組み合わせて使用されたとき、このことは、ペリプラズムからのαアミラーゼの最小の放出をもたらした。このことは、ＥＤＴＡが、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜の形成からＳＭＡ脂質粒子（ＳＭＡＬＰｓ）を分離することを示している可能性がある。形成される脂質／重合体の集合体の不全は、ほとんど、または全くペリプラズムタンパク質の放出をもたらさない。
【０１３５】
この研究の間、浸透圧ショック（French et al, 1996によって開発された）が、様々なペリプラズム放出処理と組み合わせて用いられた。水の添加は、αアミラーゼを放出するＳＭＡ法においてわずかに陽性の効果を有した。このことは、浸透圧ショックによる、外膜でのＳＭＡＬＰ複合体の集合体の増加または強化が、より安定なペリプラズムタンパク質放出機構をもたらす可能性があることを示しているかもしれない。
【０１３６】
バイオプロセス方法の間、ペリプラズムベースの治療用タンパク質を標的とする場合、細胞質から汚染物質を放出することなく、ペリプラズムからタンパク質を選択的に除去する必要がある。細胞質酵素，β−ガラクトシダーゼの放出は、同一のタンパク質放出法を使用して、新規の分析において試験された。得られた結果は、ＴＳＬＥ処理が大量のβ−ガラクトシダーゼを放出したが、（２および２．５％濃度での）ＳＭＡ処理は、この酵素を全く放出しなかったという事実において、非常に興味深いものであった。このことは、ＳＭＡ重合体が外膜においてのみ複合体を形成し、内側の細胞膜を標的としないことを示唆している。また、外膜における「脂質ナノディスク」の形成は、この膜によって示される強い負電荷が原因である可能性がある。この負電荷は、リポ多糖類およびリポタンパク質の存在によるものである。
【０１３７】
したがって、この印象的な結果と以前の分析からの結果とを組み合わせ、ＳＭＡ処理は、任意の細胞質タンパク質からの汚染なく、ペリプラズムからのαアミラーゼの非常に多量の放出をもたらすことができる。このことは、バイオプロセス産業において非常に重要であるであろう。なぜなら、最初の「細胞破壊」工程における純粋タンパク質の放出は、ペリプラズムベース治療薬（バイオ医薬品）の製造における下流のプロセスに関するさらなる費用を劇的に減少させることができる（Bracewell et al, 2009）。
【０１３８】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＴＳＬＥ処理によるβ−ガラクトシダーゼの多量の放出は、リゾチームがムラミダーゼとして作用し、ペプチドグリカン層における特定の結合を破壊するという事実に起因する。以前の研究（Vollmer et al, 2004; Demchick and Koch, 1996）は、ペプチドグリカン層が２．０６ｎｍの平均半径を有する細孔を含むことが示された。したがって、このサイズの細孔は、２２〜２４ｋＤａの質量を有する球状タンパク質を浸透させることができる。したがって、（１４〜１５ｋＤａの分子量を有する）リゾチームは、これらの細孔を容易に通過し、細胞膜を損傷することができるであろう。また、陰性染色されたＳＭＡＬＰｓ（Knowles et al, 2009）の電子顕微鏡研究は、これらの複合脂質／重合体の集合体の〜１１ｎｍの平均直径を示した。したがって、これらのＳＭＡＬＰｓは、ペプチドグリカン層に存在する細孔を通過することができない。したがって、それらは、ペリプラズムタンパク質の放出を選択的に標的にすることができる。
【０１３９】
ＴＳＬＥ「冷水洗浄画分」を用いる、αアミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの両者の放出の最小化または欠如は、初期のペリプラズム画分中に存在するこれらのタンパク質が非常に多量であることの指標である。したがって、この最初のペリプラズム画分中のタンパク質の最大量を放出する、この方法の効率の向上を示している。
【０１４０】
αアミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの両者の生化学的分析から得られた結果は、ＢＣＡ総タンパク質分析を用いて確認された。ＴＳＬＥペリプラズムタンパク質放出法によって、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から放出された総タンパク質のより多い量は、（ペリプラズム由来の）αアミラーゼおよび（細胞質由来の）β−ガラクトシダーゼの両者の多量の放出を表すものである。一方、ＳＭＡペリプラズムタンパク質放出法によってＥ．ｃｏｌｉ細胞から放出された総タンパク質量の減少は、細胞質タンパク質からの汚染のない、非常に多いαアミラーゼ放出を示す上述の結果の典型である。
【０１４１】
結論
結論として、ＴＳＬＥタンパク質放出法は、ある時はαアミラーゼのわずかに多い量をもたらし得るが、このことは細胞質タンパク質（すなわち、β−ガラクトシダ−ゼ）の放出によって汚染された可能性がある。したがって、大規模なバイオプロセス産業において、リゾチームを用いる費用と、下流処理におけるその後の精製工程とによってこのことは高価な選択肢であろう。一方、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）の使用は、外膜にＳＭＡＬＰ複合体を形成することによって、ペリプラズム間隙からタンパク質を選択的に放出するために使用することができる（図２１）。したがって、大規模なバイオプロセス産業において、この方法は、スチレンマレイン酸重合体の費用削減と、このタンパク質を製造するために必要な精製工程を削減するという事実とによって、良好な経済的価値があるであろう。
【０１４２】
参考文献
French C., Keshavarz-Moore E., Ward JM. -'Development of a simple method for the recovery of recombinant proteins from the Escherichia coli periplasm' - Enzy. Micro. Tech. 1996;19;332-338. 
Knowles TJ, Finka R, Smith C, Lin YP, Dafforn T, Overduin M. - 'Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer' - J Am Chem Soc. 2009 Jun 10;131(22):7484-5.
Vollmer W., Holtje JV. (2004) - ‘The Architecture of the Murein (Peptidoglycan) in Gram-Negative Bacteria: Vertical Scaffold or Horizontal Layer(s)?’ - J. Bacteriol. 186(18); 5978-5987
Demchick, P., and A. L. Koch. - ‘The permeability of the wall fabric of Escherichia coli and Bacillus subtilis.’ - J. Bacteriol. 178:768-773.
【０１４３】
実施例２：ＳＭＡを使用する、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムからのＦＡＢ抗体断片の放出
Ｅ．ｃｏｌｉは、抗体断片（ＦＡＢ断片）をコードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換された。細胞を増殖させ、遺伝子発現を誘導した。細胞を遠心分離によって分離し、続いて３７℃におけるＳＭＡの増加した量を含む緩衝液（たとえば、５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再懸濁した。１時間の培養後、スフェロプラストを遠心分離によって溶液から分離し、その後（ＦＡＢ断片を含む）上清を回収した。放出されたＦＡＢ断片の量は、ＦＡＢ断片に対する抗体で標識されたウエスタンブロットを用いて評価された。上清中の総タンパク質は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて評価された。
【０１４４】
図２２に示されるように、ＦＡＢ断片を発現する細胞を、３７℃で２時間にわたって２．５％ＳＭＡで処理したときのＦＡＢ断片量（Ａ）は、浸透圧ショック法を用いて得られたもの（Ｂ）と同等である。ＳＭＡ法を用いて放出された非ＦＡＢ断片タンパク質の量（Ｄ）は、浸透圧ショックを使用する（Ｃ）よりも著しく低い。
【図２】
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【図３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２２】
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