(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスチック基質に非共有結合的に固定された結合ポリマーによって少なくとも部分的に直接被覆されたプラスチック基質を含む、分析物を検出するためのデバイスであって、前記結合ポリマーが、
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式の芳香族基（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表し、およびＺはアリール官能基を表す）；および
−Ｘ−ＣＯＯＨの式のカルボン酸基（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表す）
を備えた多糖骨格を含む、デバイス。
【請求項２】
多糖骨格が、デキストラン骨格である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
多糖骨格が反応性Ｆ基をさらに備え、前記反応性Ｆ基が、−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚ’の式である（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表し、およびＺ’は、別の分子に結合することができる基を表す）、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
反応性Ｆ基が、
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｘ’−Ｎ３の基；
−Ｘ−ＣＯＮＨ−ＮＨ２の基；
式（Ｖ）：
【化１】
0006013342.tif 000025
の基；
式（Ｖ’）：
【化２】
0006013342.tif 000026
の基；
（式中、ＸおよびＸ’は各々、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表し、Ｐｅｐはペプチドフラグメントを表す）
から選択される、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式および／または−Ｘ−ＣＯＯＨの式におけるＸがＣＨ２である；および／または
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式におけるＺが−ＣＨ２−Ｐｈもしくは−ＣＨ２−Ｐｈ−パラＯＨである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
結合ポリマーが、
多糖骨格の糖単位につき、０．４〜０．８個の芳香族基；および／または
多糖骨格の糖単位につき、０〜０．８個の反応性基；および／または
多糖骨格の糖単位につき、合計で０．５〜１．５個の芳香族基、カルボン酸基および反応性Ｆ基
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
基質が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリプロピレンの基質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
結合ポリマー上に固定化された捕捉エレメントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
捕捉エレメントが、
修飾および／またはコンジュゲートされていてもよい、ポリペプチド；
糖類、オリゴ糖類およびリポ多糖類；
ウイルスまたはウイルスフラグメントおよび細胞
から選択される、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
複数の検出領域を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
基質が、不透明または透明なスライドガラス、マイクロタイタープレート、一群のビーズ、培養プレート、ストリップまたはスティックである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
化学分子、生物学的分子、細胞または生体物質を検出するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析物を検出するためのデバイスの使用。
【請求項１３】
プラスチック基質を提供すること；
該基質を、結合ポリマーを含有する少なくとも１つの溶液と接触させること
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析物を検出するためのデバイスを製造する方法。
【請求項１４】
基質を、捕捉エレメントを含有する１以上の溶液と接触させることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プラスチック基質を提供すること；
該基質を、捕捉エレメントに結合した結合ポリマーを含有する１またはそれ以上の溶液と接触させること
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析物を検出するためのデバイスを製造する方法。
【請求項１６】
糖単位につき０．４〜０．８個の−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式の芳香族基（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表し、およびＺはアリール官能基を表す）；
−Ｘ−ＣＯＯＨの式のカルボン酸基（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝アルキル鎖を表す）；及び
以下から選択される反応性Ｆ基
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｘ’−Ｎ３の基；
−Ｘ−ＣＯＮＨ−ＮＨ２の基；
式（Ｖ）：
【化３】
0006013342.tif 000027
の基；
式（Ｖ’）：
【化４】
0006013342.tif 000028
の基；
（式中、ＸおよびＸ’は各々、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表し、Ｐｅｐはペプチドフラグメントを表す）
を備えた多糖骨格を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイスにおいて使用することができる結合ポリマー。
【請求項１７】
多糖骨格が、デキストラン骨格である、請求項１６に記載の結合ポリマー。
【請求項１８】
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式、−Ｘ−ＣＯＯＨの式、−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｘ’−Ｎ３の式、−Ｘ−ＣＯＮＨ−ＮＨ２の式、式（Ｖ）及び／または式（Ｖ’）におけるＸおよび／もしくはＸ’がＣＨ２である；ならびに／または
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式、−Ｘ−ＣＯＯＨの式、−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｘ’−Ｎ３の式、−Ｘ−ＣＯＮＨ−ＮＨ２の式、式（Ｖ）及び／または式（Ｖ’）におけるＸおよび／もしくはＸ’が（ＣＨ２）２である；ならびに／または
−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚの式におけるＺが−ＣＨ２−Ｐｈもしくは−ＣＨ２−Ｐｈ−パラＯＨである、
請求項１６または１７に記載の結合ポリマー。
【請求項１９】
多糖骨格の糖単位につき、０．４〜０．６個の芳香族基；および／または
多糖骨格の糖単位につき、０〜０．８個の反応性基；および／または
多糖骨格の糖単位につき、合計で０．５〜１．５個の芳香族基、カルボン酸基および反応性基
を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の結合ポリマー。
【請求項２０】
デキストラン多糖を提供すること；
該多糖上にカルボン酸基をグラフトすること；
芳香族基を提供するために、グラフトしたカルボン酸基の一部を修飾すること；
反応性Ｆ基を提供するためにカルボン酸基の一部を修飾すること
を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の結合ポリマーを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物検出のために表面を官能基化する方法に関する。表面を官能基化する当該方法は、特に、様々な化学的、生物学的および診断アッセイを実施するために使用可能な、分析物を検出するためのデバイスを提供する。本発明はまた、表面を官能基化する前記方法に適した特殊なポリマーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
診断における標準アッセイは、いわゆる「ＥＬＩＳＡ」アッセイである。このアッセイにより、生体液中の分析物を検出または測定することが可能である。一般には、マイクロタイタープレートのウェルを、求める分析物（特に抗原）に特異的に結合することができる捕捉エレメント（例えば抗体）で被覆する（基本的には疎水的相互作用によって）。次に試験溶液をマイクロプレートのウェルに沈着させ、求める分子が存在する場合は、該分子が捕捉エレメントに特異的に結合する。
【０００３】
同じく求める分子に結合することができるトレーサ成分をウェルに添加する。このトレーサ成分は、例えば、このトレーサ成分を比色定量によって定量化することができるように、着色生成物の形成を触媒する酵素であり得る。
【０００４】
ＥＬＩＳＡアッセイは自動化によく適している。しかし、このアッセイのために慣例的に使用される（ポリスチレンの）表面は、負に荷電した多糖などの親水性分子または低分子量の分子を容易に固定化することができない。例えば、ポリリシンの吸着能を利用して、多糖をポリスチレン表面に固定することができるように、多糖をポリリシンとコンジュゲートすることも提案されている（Ｌｅｉｎｏｎｅｎ  ＆  Ｆｒａｓｃｈ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，３８（３）：１２０３−７，１９８２）。
【０００５】
相互作用は一般に負に荷電した表面に関してより特異的であるが（Ｇｒａｖｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（２）：１５７−６６，１９８８）、プラスチックの表面は疎水性であるので、ＥＬＩＳＡアッセイは表面電荷に関連する制約も有する。
【０００６】
さらに、標準的なＥＬＩＳＡアッセイは単一パラメータ分析に限定され、これは、各試験および各試料につき単一の情報が入手可能であることを意味する。同じ試料に関していくつかの分析が必要である場合は、慣例的にまたは「バイオチップ」として公知のデバイスにおいて小型化して、ＥＬＩＳＡ型のいくつかのアッセイを、好ましくは並行して、実施する必要がある。現在極めてわずかなバイオチップしか市販されておらず、現在市販されているデバイスは主として顕微鏡スライドガラスを基質として使用する。そのような基質は大量使用にはあまり適さない。
【０００７】
他方で、プラスチック基質はバイオチップの製造にはあまり適さない。分析物のかなりの非特異的吸着のために、一般に基質への直接吸着において満足し得るシグナル／ノイズ比が得られない。疎水性プラスチック表面はまた、それらがタンパク質を変性させ、そのため修飾しなければ使用することができないという欠点も有する。
【０００８】
しかし、問題となるポリマーの化学的修飾によるプラスチックの官能基化の可能性は、ほとんどの化学基が導入できないので、非常に限られる。さらに、ポリマーの組成のわずかな変化またはバッチごとの組成の変動でさえも、官能基化された基質の特性の相違をもたらす。
【０００９】
さらに、そのような基質上にナノ液滴を再現可能に沈着させる（十分に定義された規則的な沈着物を得るために）ことは困難であるので、バイオチップのプリンティングの間に重大な制約に遭遇する。これに関連して液滴を沈着させるための最も実際的な方法である針との接触プリンティングは、技術的に困難であるため、圧電型の非接触沈着技術が一般的に使用される。しかし、その遅さを考慮すると、後者は工業生産にはあまり適さない。
【００１０】
９６穴プラスチックプレートの官能基化の例がいくつか提案されている。例えば、糖ベースのチップを調製するために、プラズマ技術がＭａｒｓｏｎ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９（２）：１５３７−４６（２００９）において提案された。この技術は、固定化後に糖の官能性を保存することの難しさを課す。別の例は、プラスチック表面を被覆するためのストレプトアビジンの使用に基づく（Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ａｌｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５  Ａｐｒｉｌ  ２００８）。
【００１１】
欧州特許出願第１９５３５５５号の文書は、水素結合を作り出すために生理的活性物質と化合物がその上に固定化されている金属膜で被覆されたプラスチック基質を含むデバイスを述べている。
【００１２】
欧州特許出願第２０３０６７７号の文書は、それによって陰イオンポリマーを固定する、金属膜で被覆された基質を含むバイオセンサーを述べている。
【００１３】
これらの文書は、ポリマーとプラスチック基質との間の直接相互作用を開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許出願第１９５３５５５号
【特許文献２】欧州特許出願第２０３０６７７号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｅｉｎｏｎｅｎ  ＆  Ｆｒａｓｃｈ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，３８（３）：１２０３−７，１９８２
【非特許文献２】Ｇｒａｖｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（２）：１５７−６６，１９８８
【非特許文献３】Ｍａｒｓｏｎ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９（２）：１５３７−４６（２００９）
【非特許文献４】Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ａｌｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５  Ａｐｒｉｌ  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そのため、製造が容易であり、堅固で使いやすい、および／または大量の分析物を並行して検出することを可能にする、分析物を検出するためのデバイスを提供することがまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、第一に、プラスチック基質に非共有結合的に固定された結合ポリマーで少なくとも部分的に被覆されたプラスチック基質を含み、前記結合ポリマーが芳香族基とカルボン酸基を備えた多糖骨格を含む、分析物を検出するためのデバイスに関する。
【００１８】
１つの実施形態によれば、多糖骨格は、分子量が好ましくは１５，０００〜１００，０００、より特に好ましくは３０，０００〜６０，０００であるデキストラン骨格である。
【００１９】
１つの実施形態によれば、多糖骨格は反応性基をさらに備え、前記反応性基は、好ましくは−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚ’（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表し、Ｘは、より特に好ましくはＣＨ２であり、およびＺ’は、別の分子に結合することができる基を表す）の形態である。
【００２０】
１つの実施形態によれば、カルボン酸基は、−Ｘ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表し、Ｘは、好ましくはＣＨ２である）の形態である。
【００２１】
１つの実施形態によれば、芳香族基は、−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｚ（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖を表し、Ｘは、好ましくはＣＨ２であり、およびＺは、好ましくは６〜３０個の炭素原子を含む、アリール官能基を表し、Ｚは、好ましくは−ＣＨ２−Ｐｈまたは−ＣＨ２−Ｐｈ−パラＯＨなどの、置換されていてもよいベンジル官能基である）の形態である。
【００２２】
１つの実施形態によれば、結合ポリマーは、
−多糖骨格の糖単位につき、０．４〜０．８個の芳香族基、好ましくは０．４〜０．６個の芳香族基、好ましくは０．４５〜０．６個の芳香族基；および／または
−多糖骨格の糖単位につき、０〜０．８個の反応性基、好ましくは０〜０．６個の反応性基、および／または
−多糖骨格の糖単位につき、合計で０．５〜１．５個の芳香族基、カルボン酸基および反応性基、好ましくは合計で０．９〜１．３個の芳香族基、カルボン酸基および反応性基
を含む。
【００２３】
１つの実施形態によれば、基質は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリプロピレンの基質、好ましくはポリスチレンの基質である。
【００２４】
１つの実施形態によれば、デバイスは、結合ポリマー上に固定化された捕捉エレメントを含み、前記捕捉エレメントは、好ましくは、修飾および／またはコンジュゲートされていてもよいポリペプチド、糖類、オリゴ糖類またはリポ多糖類、ウイルスまたはウイルスフラグメントおよび細胞から選択され、捕捉エレメントは、好ましくは吸着によってまたは反応性Ｆ基への共有結合によって結合ポリマー上に固定化されている。
【００２５】
１つの実施形態によれば、デバイスは複数の検出領域を含み、検出領域は、好ましくは異なる捕捉エレメントを含む。
【００２６】
１つの実施形態によれば、基質は、不透明または透明なスライドガラス、マイクロタイタープレート、一群のビーズ、培養プレート、ストリップまたはスティックである。
【００２７】
本発明はまた、芳香族基、カルボン酸基ならびに式（Ｖ）：
【００２８】
【化１】
0006013342.tif 000002
（式中、ＸおよびＸ’は各々、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表す）
の反応性基を備えた多糖骨格を含むポリマーに関する。
【００２９】
本発明はまた、芳香族基、カルボン酸基ならびに式（Ｖ’）：
【００３０】
【化２】
0006013342.tif 000003
（式中、ＸおよびＸ’は各々、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表し、Ｐｅｐはペプチドフラグメントを表す）
の反応性基を備えた多糖骨格を含むポリマーに関する。
【００３１】
上記２つのポリマーの１つの実施形態によれば、ＸはＣＨ２を表し、および／またはＸ’は（ＣＨ２）２を表す。
【００３２】
本発明はまた、式（Ｖ）の反応性基を備えた上記ポリマーを製造する方法であって、
−多糖を提供すること；
−多糖上にカルボン酸基をグラフトすること；次に
−芳香族基を提供するためにグラフトしたカルボン酸基の一部を修飾すること；続いてまたはその前に、
−式（Ｖ）の反応性基を提供するためにグラフトしたカルボン酸基の別の一部を修飾し、前記修飾が、多糖と式（ＶＩＩ）：
【００３３】
【化３】
0006013342.tif 000004
（式中、Ｘ’は、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表す）
の化合物との反応を含むこと
を含む方法に関する。
【００３４】
本発明はまた、式（Ｖ’）の反応性基を備えた上記ポリマーを製造する方法であって、
−上記式（Ｖ）のポリマーを提供すること；および
−このポリマーをポリペプチドＨ−Ｃｙｓ−Ｐｅｐ（式中、Ｐｅｐはペプチドフラグメントを表し、Ｃｙｓはシステイン残基を表す）と反応させること
を含む方法に関する。
【００３５】
上述したデバイスの１つの実施形態によれば、結合ポリマーは上記ポリマー（式（Ｖ）または（Ｖ’）の反応性基を備える）である。
【００３６】
本発明はまた、化学分子、生物学的分子、細胞または生体物質を検出するためおよび場合により定量化するための、上述した分析物を検出するためのデバイスの使用に関する。
【００３７】
本発明はまた、
−プラスチック基質を提供すること；
−基質を、結合ポリマーを含有する少なくとも１つの溶液と接触させること
を含む、上述した分析物を検出するためのデバイスを製造する方法に関する。
【００３８】
１つの実施形態によれば、この方法は、基質を、捕捉エレメントを含有する１またはそれ以上の溶液と接触させることをさらに含む。
【００３９】
本発明はまた、
−プラスチック基質を提供すること；
−基質を、捕捉エレメントに結合した結合ポリマーを含有する１またはそれ以上の溶液と接触させること
を含む、上述した分析物を検出するためのデバイスを製造する方法に関する。
【００４０】
本発明は、先行技術の欠点を克服することを可能にする。より詳細には、本発明は、製造が容易であり、堅固で使いやすい、分析物を検出するためのデバイスを提供する。１つの実施形態によれば、これらのデバイスは多数の分析物を並行して検出することを可能にする。特に、本発明は、親水性分子および／または低分子（のみならず抗体またはタンパク質も）を固定化することを可能にする。
【００４１】
これは、多糖骨格を有する結合ポリマーによる表面の官能基化を通して達成される。結合ポリマーは、比較的疎水性の表面への結合ポリマーの非共有結合固定を促進する芳香族基、ならびに結合ポリマーと検出すべき分析物（それら自体がしばしば負に荷電している）との間の非特異的吸着の現象を制限するために結合ポリマーを負に荷電させるためのカルボン酸基を含む。
【００４２】
本発明のデバイスにおけるプラスチック、特にポリスチレン表面の使用は、ガラスに関連する問題：ガラスの破損の危険性および付随する人員に対しての危険性、廃棄物処理に関連する費用、ガラスの化学的性質に関連する官能基化の不均一性、基質および特性づけの高いコスト、基質を分離することの難しさを回避することを可能にする。
【００４３】
一部の特定の実施形態によれば、本発明はまた、以下に列挙する有利な特徴の１つまたは好ましくは数個を有する。
【００４４】
−結合ポリマーは容易に大量に合成され、従来の分析技術（ＮＭＲ、ｐＨ測定、微量分析）によって特性づけることができ、厳密な製造の管理を可能にする。
【００４５】
−結合ポリマーは、簡単な吸着（非共有結合）によって、特に結合ポリマーの芳香族基によって表面上に固定される。これは、実施が特に簡単で、堅固であり、表面の物理化学的性質の多少の変化に対してあまり感受性ではない固定方法である。いずれの場合も、表面の性質との関連で結合ポリマー中の芳香族基の密度を調整することも可能である。
【００４６】
−本発明は、現在広く入手可能で安価な基質：ポリスチレンでできたマイクロタイタープレート、ペトリ皿等から出発して実施することができる。
【００４７】
−本発明はまた、バイオチップ、すなわちプラスチック、特にポリスチレン基質に基づく、多数の分析物の並行検出用の、分析物を検出するための小型デバイスを作製するためにも使用できる。
【００４８】
−本発明による表面の官能基化は、特に捕捉エレメントが低分子である場合は、共有結合的に（結合ポリマー上に存在する反応性基を介して）、またはさもなければ非共有結合的に（吸着によって）、結合ポリマー上に捕捉エレメント（またはプローブ）を固定することによって実施される。したがって、本発明は適用の高い柔軟性を提供する。
【００４９】
−官能基は、好都合にも水分または空気の存在下で安定である（それらの特性を保存する）。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ベンジルアミン当量の数（ｘ軸）に対する、実施例３からのポリマーＰｓＡｃＡｒ１中の芳香族基による置換度（ｙ軸）との関係を示す。これは実施例４で言及する。
【図２】図２は、アジ化アミン当量の数（ｘ軸）に対する、実施例７からのポリマーＰｓＡｃＦ１中のアジド基による置換度（ｙ軸）との関係を示す。これは実施例８で言及する。
【図３】図３は、官能基化されたまたは官能基化されていないポリスチレンプレート上の接触角（°）の測定を示すヒストグラムである。これは実施例２２で言及する。
【図４】図４、５および６は、本発明によるポリマー上のコンカナバリンＡの固定の特異性（他のレクチンと比較して）を例証する。これは実施例２３および２４で言及する。
【図５】図４、５および６は、本発明によるポリマー上のコンカナバリンＡの固定の特異性（他のレクチンと比較して）を例証する。これは実施例２３および２４で言及する。
【図６】図４、５および６は、本発明によるポリマー上のコンカナバリンＡの固定の特異性（他のレクチンと比較して）を例証する。これは実施例２３および２４で言及する。
【図７】図７は、官能基化されたポリスチレンプレート上の接触角（°）への芳香族置換度の影響を例証するヒストグラムである。これは実施例２５で言及する。
【図８】図８は、本発明によるポリマーで官能基化された表面へのペプチドアルデヒドの化学選択的結合を例証するヒストグラムである。これは実施例２６で言及する。
【図９】図９および１０は、ペプチドでの表面の官能基化および適切な抗体での検出（抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体とのインキュベーション）を示すヒストグラムである。これは実施例２７で言及する。
【図１０】図９および１０は、ペプチドでの表面の官能基化および適切な抗体での検出（抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体とのインキュベーション）を示すヒストグラムである。これは実施例２７で言及する。
【図１１】図１１は、本発明によるポリマーで官能基化された表面への、Ｎ末端システインを担持するペプチドの化学選択的結合を例証するヒストグラムである。これは実施例３３で言及する。
【図１２】図１２および１３は、９６穴ポリスチレンプレートの底部の抗体バイオチップに関する比色定量検出を例証する概略図である。これは実施例３４で言及する。
【図１３】図１２および１３は、９６穴ポリスチレンプレートの底部の抗体バイオチップに関する比色定量検出を例証する概略図である。これは実施例３４で言及する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明を、以下の説明においてより詳細かつ非限定的に述べる。
【００５２】
結合ポリマーおよびその製造
本発明に関連して使用される結合ポリマーは、カルボン酸基（以下「Ａｃ」と略記）および芳香族基（以下「Ａｒ」と略記）を備えた多糖骨格（以下「Ｐｓ」と略記）を含む。１つの実施形態によれば、多糖骨格はまた、上記カルボン酸基とは異なる反応性基（以下「Ｆ」と略記）も備えることができる。
【００５３】
「多糖骨格」により、Ｏ−オシド結合によって共に連結された、糖（または糖単位）の集合によって形成される構造体が意味される。この構造体は直鎖または分枝であり得る。構造体は、好ましくは８０〜６００糖単位、より特に好ましくは１５０〜３５０糖単位を含む。
【００５４】
糖単位は、好ましくは環状である。それらはトリオース、テトラオース、ペントース、ヘキソースまたはヘプトースであり得、好ましくは、それらはヘキソースである。
【００５５】
「置換のレベル」または「置換度」は、糖単位当たりの置換基（Ａｃ、ＡｒまたはＦ）の平均数である。置換度を決定する方法は実施例の章で述べる。
【００５６】
Ａｃ、ＡｒおよびＦ基はすべて、好ましくは糖単位のヒドロキシル官能基の一部または全部にグラフトされる。
【００５７】
多糖骨格の分子量は、好ましくは１５，０００〜１００，０００、より特に好ましくは３０，０００〜６０，０００で構成される。
【００５８】
多糖骨格は、ホモ多糖型（同一糖単位）またはヘテロ多糖型（異なる糖単位）であり得る。
【００５９】
ホモ多糖の例として、以下のものが挙げられる：グルコサンまたはグルカン（α−グルカンまたはβ−グルカン）、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロース、デキストラン、プルラン、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン（キチンの脱アセチル化形態）；アラビナン、キシランおよびペクチン。ヘテロ多糖の例としては、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノースおよびＤ−グルクロン酸を含む分枝構造体であるゴム、ならびにヘミセルロースが挙げられる。
【００６０】
好ましい実施形態によれば、糖単位はグルコース（またはデキストロース）単位である。好ましくは、多糖骨格はデキストラン分子であり、すなわち多糖骨格は、α−１，６グリコシド結合によって共に連結されたグルコースの主鎖を有し、α−１，２および／またはα−１，３および／またはα−１，４結合によって主鎖に結合された分枝を有していてもよい。デキストランは大量に入手可能であり、安価で、水に良好な溶解度を有する。
【００６１】
説明の残りの部分では、デキストラン型の多糖骨格に言及するが、この説明は他の型の多糖骨格にも同様にあてはまることが理解される。
【００６２】
反応性Ｆ基を備えていない本発明による結合ポリマー（「ＰｓＡｃＡｒ」型のポリマー）は、
−多糖Ｐｓ（非置換多糖骨格）を提供すること；
−この多糖上にＡｃ基をグラフトして「ＰｓＡｃ」型のポリマーを得ること；
−ポリマーＰｓＡｃのＡｃ基の一部を修飾してポリマーＰｓＡｃＡｒを得ること
によって入手できる。
【００６３】
したがって、以下の一般式（Ｉ）：
【００６４】
【化４】
0006013342.tif 000005
を参照すると、出発ポリマーＰｓは式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３基はすべて水素原子を表す）のポリマーであり；中間体ポリマーＰｓＡｃは、式（Ｉ）（式中、一部のＲ１、Ｒ２およびＲ３基は水素原子を表し、その他のＲ１、Ｒ２およびＲ３基はカルボン酸官能基を担持する基を表す）のポリマーであり；そして結合ポリマーＰｓＡｃＡｒは、式（Ｉ）（式中、一部のＲ１、Ｒ２およびＲ３基は水素原子を表し、他のＲ１、Ｒ２およびＲ３基はカルボン酸官能基を担持する基を表し、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３基の３番目で最後の部分は芳香族核を担持する基を表す）のポリマーである。
【００６５】
カルボン酸Ａｃ基は、−Ｘ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、塩素、臭素、ケトン基、フッ素、アルコール基、カルボン酸基および芳香族基（特にフェニル）から選択される１またはそれ以上の置換基を備えていてもよい、１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝アルキル鎖を表す）の形態である。好ましくは、この鎖は直鎖であり、置換されておらず、および／または多くても５個の炭素原子、多くても４個の炭素原子、多くても３個の炭素原子または多くても２個の炭素原子を含む。過度の反応性という起こり得る問題が回避される、好ましい実施形態によれば、Ａｃ基は、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（メチルカルボン酸基）の形態である。
【００６６】
Ａｃ基は、状況に応じてイオン化型（対イオンと結合したＣＯＯ−で置換されたＣＯＯＨ）または塩化型（例えばＣＯＯＮａで置換されたＣＯＯＨ）であり得ることが理解される。
【００６７】
好ましくは、Ａｃ基はすべて同一であるが、異なるＡｃ基のグラフト化を考慮することも可能である。
【００６８】
芳香族Ａｒ基は、−Ｙ−Ｚ（式中、Ｙは結合基を表し、Ｚは、好ましくは６〜３０個の炭素原子、好ましくは６〜２４個の炭素原子、より特に好ましくは６〜１２個の炭素原子、およびハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＲ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’（式中、Ｒ’は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である）から選択される１またはそれ以上の置換基を含むアリール官能基を表す）の形態である。Ｚは単環式または多環式であり得、複素環式であってもよい。Ｚは、好ましくはベンゼン誘導体であり、特にフェニル、ベンジルまたはフェノール基である。
【００６９】
Ｙは、好ましくは−Ｘ−ＣＯＮＨ−（式中、Ｘは、Ａｃ基に関して上記で与えたのと同じ意味を有する）の形態のアミド基である。
【００７０】
好ましい実施形態によれば、Ａｒ基は、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−Ｐｈ基（式中、Ｐｈはフェニル基である）または−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−Ｐｈ−パラＯＨ基である。
【００７１】
好ましくは、Ａｒ基はすべて同一であるが、異なるＡｒ基のグラフト化を考慮することも可能である。
【００７２】
多糖Ｐｓ上にＡｃ基をグラフトしてポリマーＰｓＡｃを得る段階は、多糖Ｐｓを、ハロゲン官能基、好ましくは塩素官能基を担持するカルボン酸化合物と反応させることによって実施できる。
【００７３】
例えば、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ形態の好ましいＡｒ基のグラフト化は、多糖Ｐｓをモノクロロ酢酸と反応させることによって得られ得る。好ましくは、反応はイソプロパノールの存在下で実施される。
【００７４】
ポリマーＰｓＡｃのＡｃ基の一部を修飾してポリマーＰｓＡｃＡｒを得る段階は、ポリマーＰｓＡｃをＲ−Ｚ型（式中、Ｚは上記と同じ意味を有し、およびＲは、カルボン酸官能基と反応性の官能基である）の化合物と反応させることによって実施できる。好ましくは、Ｒは、Ａｃ基とアミド結合を形成することができる、アミン官能基である。
【００７５】
例えば、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−Ｐｈ型の好ましいＡｒ基は、多糖ＰｓＡｃをベンジルアミンと反応させることによって入手できる。さらなる例として、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−Ｐｈ−パラＯＨ型の好ましいＡｒ基は、多糖ＰｓＡｃをパラヒドロキシベンジルアミンと反応させることによって入手できる。好ましくは、反応は１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドの存在下で実施される。
【００７６】
反応性Ｆ基を備えた本発明による結合ポリマー（「ＰｓＡｃＡｒＦ」型のポリマー）は、ＰｓＡｃ型のポリマー（上記で得られたような）から出発して、Ａｃ基の一部を、一方ではＦ基におよび他方ではＡｒ基に修飾することによって入手できる。これらの２つの修飾段階は任意の順序で実施することができる。
【００７７】
言い換えると、最初にＰｓＡｃＡｒ型のポリマーをポリマーＰｓＡｃから生成することができ（上述したように）、次にＰｓＡｃＡｒ型のこのポリマーを修飾してＰｓＡｃＡｒＦ型のポリマーを得ることができる。また、最初にポリマーＰｓＡｃから「ＰｓＡｃＦ」型のポリマーを生成し、次にＰｓＡｃＦ型のこのポリマーを修飾してＰｓＡｃＡｒＦ型のポリマーを得ることも可能である（この２番目の修飾のために使用される方法は、ＰｓＡｃ型のポリマーをＰｓＡｃＡｒ型のポリマーに修飾するために使用される方法と同じである）。
【００７８】
これらの様々な戦略の利点は、より高レベルのＡｒ基またはより高レベルのＦ基のいずれが必要とされるかに応じて置換度を調節できることである。
【００７９】
以下の一般式（Ｉ）：
【００８０】
【化５】
0006013342.tif 000006
を参照すると、ポリマーＰｓＡｃＦは、式（Ｉ）（式中、一部のＲ１、Ｒ２およびＲ３基は水素原子を表し、他のＲ１、Ｒ２およびＲ３基はカルボン酸基を表し、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３基の３番目で最後の部分は反応性基（カルボン酸基とは異なる）を表す）のポリマーであり；そしてポリマーＰｓＡｃＡｒＦは、式（Ｉ）（式中、一部のＲ１、Ｒ２およびＲ３基は水素原子を表し、他のＲ１、Ｒ２およびＲ３基はカルボン酸基を表し、さらなるＲ１、Ｒ２およびＲ３基は芳香族基を表し、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３基の４番目で最後の部分は反応性基（カルボン酸基とは異なる）を表す）のポリマーである。
【００８１】
反応性Ｆ基は、−Ｙ−Ｚ’（式中、Ｙは結合基（上記と同じ意味）を表し、およびＺ’は、以下でより詳細に述べる、捕捉エレメントに結合することができる、特に共有結合することができる基を表す）の形態である。好ましい実施形態によれば、Ｚ’基はポリペプチドと共有結合を形成することができる。
【００８２】
Ｙは、好ましくは−Ｘ−ＣＯＮＨ−（式中、Ｘは、Ａｃ基に関して上記で与えたのと同じ意味を有する（およびＸは、好ましくはＣＨ２である））の形態のアミド基である。
【００８３】
１番目の好ましい実施形態によれば、Ｚ’基はアジド基（特にアルキルアジド）であり、およびＦ基は、好ましくは−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｘ’−Ｎ３（式中、ＸおよびＸ’は各々、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表す）の形態の基であり、Ｆ基は、したがって、例えば−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ３基であり得る。そのような基は、中間体基として特に有用であり、例えばトリアゾール型の基を得ることを可能にする（以下の３番目の実施形態参照）。それらはまた、特定の捕捉エレメントに結合することができる。
【００８４】
２番目の好ましい実施形態によれば、Ｚ’基はヒドラジド基であり、およびＦ基は、好ましくは−Ｘ−ＣＯＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｘは、１〜６個の炭素原子を含む置換または非置換アルキル鎖を表す）の形態の基であり、Ｆ基は、したがって、例えば−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＮＨ２基であり得る。これらのＦ基は、例えばペプチドのアルデヒド官能基に結合することができる。それらはまた、ポリペプチドの吸着（非共有結合固定化）を促進することができる。
【００８５】
３番目の好ましい実施形態によれば、Ｚ’基は、好ましくは１またはそれ以上の、１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝の置換または非置換アルキル鎖で置換された、トリアゾール基であり、およびＦ基は、したがって、例えば式（ＩＩ）：
【００８６】
【化６】
0006013342.tif 000007
（式中、Ｒ４は、式（ＩＩＩ）：
【００８７】
【化７】
0006013342.tif 000008
の基を表す）
の基であり得る。
【００８８】
この型のＦ基は、一部の特定の捕捉エレメントに結合することができる。上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は−（ＣＨ２）３ＯＨを表す）のＦ基を実施例において陰性対照として使用する。
【００８９】
４番目の好ましい実施形態によれば、Ｚ’基は、以下の式（ＩＶ）：
【００９０】
【化８】
0006013342.tif 000009
（式中、Ｘ’は、ハロゲン置換基（特にＣｌまたはＢｒ）を備えていてもよい、１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝アルキル鎖を表す）
である。好ましくは、Ｘ’は（ＣＨ２）２である。この４番目の実施形態によれば、Ｆ基は、したがって、好ましくは以下の式（Ｖ）：
【００９１】
【化９】
0006013342.tif 000010
（式中、ＸおよびＸ’は上記で与えた意味を有する）
である。特に好ましい実施形態によれば、ＸはＣＨ２を表し、およびＸ’は（ＣＨ２）２を表す。
【００９２】
この４番目の実施形態に対応するＦ基は、β−アミノチオールまたはγ−アミノチオール官能基を担持する分子、例えばＮ末端位置にシステインまたはホモシステインを有するポリペプチドと反応して、アミド結合を形成することができる。したがって、この４番目の実施形態に対応する結合ポリマーは、Ｎ末端位置にシステインまたはホモシステインを有するポリペプチドによって形成される捕捉エレメントに結合することができる。
【００９３】
したがって、システインの場合は、捕捉エレメントに結合したＦ基が、Ｃ末端官能基（例えばＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２）を備えた、式（Ｖ’）：
【００９４】
【化１０】
0006013342.tif 000011
（式中、ＸおよびＸ’は上記の意味を有し、およびＰｅｐはペプチドフラグメントを表す、すなわちポリペプチドの一部は少なくとも１個のアミノ酸残基（好ましくは数個のアミノ酸残基の連続）を含む）
である、結合ポリマーが得られる。
【００９５】
Ｆ基はすべて同一であり得るか、またはさもなければ異なるＦ基のグラフト化を考慮することができる。
【００９６】
ポリマーＰｓＡｃ（それぞれポリマーＰｓＡｃＡｒの）のＡｃ基の一部を修飾してポリマーＰｓＡｃＦ（それぞれポリマーＰｓＡｃＡｒＦの）を得る段階は、ポリマーＰｓＡｃ（それぞれポリマーＰｓＡｃＡｒの）をＲ−Ｚ’型（式中、Ｚ’は上記と同じ意味を有し、およびＲは、カルボン酸官能基と反応性の官能基である）の化合物と反応させることによって実施できる。好ましくは、Ｒは、Ａｃ基とアミド結合を形成することができる、アミン官能基である。
【００９７】
最初に中間体反応性Ｆ’基をグラフトし、次に別途の反応段階後にＦ’基を化学修飾してＦ基を生成することにより、特定のＦ基をグラフトすることができる。
【００９８】
例えば、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＮＨ２型のＦ基は、多糖ＰｓＡｃ（またはポリマーＰｓＡｃＡｒ）をヒドラジンと（好ましくは１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドの存在下で）反応させることによって入手できる。
【００９９】
−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ３型のＦ基は、多糖ＰｓＡｃ（またはポリマーＰｓＡｃＡｒ）を３−アジドプロピルアンモニウム塩酸塩と（好ましくは１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドの存在下で）反応させることによって入手できる。
【０１００】
上記式（ＩＩＩ）のＦ基は、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ３型の反応性基を備えるポリマーＰｓＡｃＦ（またはポリマーＰｓＡｃＡｒＦ）を、式（ＶＩ）：
【０１０１】
【化１１】
0006013342.tif 000012
の化合物と（好ましくは銅（ＩＩ）イオンおよびアスコルビン酸ナトリウムの存在下で）反応させることによって入手できる。
【０１０２】
この場合は、Ｆ基がすべて上記式（ＩＩ）であるか、またはＦ基の一部が上記式（ＩＩ）であり、およびＦ基の一部が−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ３型である（式（ＶＩ）の化合物での不完全な置換の場合）、ポリマーＰｓＡｃＦ（またはポリマーＰｓＡｃＡｒＦ）が得られる。
【０１０３】
上記式（Ｖ）のＦ基は、多糖ＰｓＡｃ（またはポリマーＰｓＡｃＡｒ）を、式（ＶＩＩ）：
【０１０４】
【化１２】
0006013342.tif 000013
（式中、Ｘ’は上記で与えた意味を有する）
の化合物と（好ましくは１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドの存在下で）反応させることによって入手できる。式（ＶＩＩ）の化合物は、以下で述べる実施例で指示するように製造することができる。
【０１０５】
一般に、Ａｃ、ＡｒおよびＦによる置換度は、一方では基のグラフト化を実施する順序（Ａｃ、次にＡｒ、次にＦまたはさもなければＡｃ、次にＦ、次にＡｒ）に依存して、他方ではグラフト化の条件、特に多糖と問題の基をグラフト化する役割を担う試薬との間のモル比を変化させることによって調整できる。
【０１０６】
デキストランから誘導され、スルフェート基またはスルホネート基を反応性Ｆ基として備える、上記に示した結合ポリマーの一般式に対応するポリマー、ならびに治療目的のためのこれらのポリマーの使用は、国際公開第９９／２９７３４号、同第００／７６４５２号、同第００／７６５６２号、同第０１／９１７４２号およびフランス特許第２８９１１４９号の文書に記載されている。
【０１０７】
好ましくは、本発明の結合ポリマーは、硫酸官能基またはスルホン酸官能基を有さない。実際に、そのような官能基は非常に多数のタンパク質と相互作用することができ、これは検出にとって有害である。さらに、硫酸官能基またはスルホン酸官能基が存在しないことは、捕捉エレメント自体が硫酸化される場合（特にオリゴ糖類）、特に有用である。
【０１０８】
表面の官能基化
基質の表面を官能基化するために、本発明による結合ポリマー（ＰｓＡｃＡｒまたはＰｓＡｃＡｒＦ型）を前記基質上に沈着させることができる。基質は、好ましくはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）およびポリプロピレンから選択される、プラスチック（一般に高温および加圧下で成形される、ポリマー性の固体材料）である。
【０１０９】
したがって、本発明は、例えば透明または不透明なプラスチックスライドガラス、またはさもなければポリスチレンマイクロタイタープレート（例えば９６穴）、ビーズ（磁気もしくは非磁気）、ポリスチレン培養プレート（例えば９６穴）、ポリスチレンストリップもしくはスティックの表面を官能基化することを可能にする。
【０１１０】
官能基化は一般に２つの段階を含む：基質の表面上に結合ポリマーを固定する第一段階および結合ポリマー上に捕捉エレメントを固定する第二段階。あるいは、結合ポリマーを捕捉エレメントに結合した後、結合ポリマーを基質の表面に固定することができる（特に結合ポリマーと捕捉エレメントとの間の結合が共有結合型である場合）。
【０１１１】
基質の表面への結合ポリマーの固定は、特に平らな表面に関しては、処理すべき表面を、ポリマーＰｓＡｃＡｒまたはＰｓＡｃＡｒＦを含有する溶液に液浸することによって実施する。液体を含有することができる成形された表面（例えば９６穴滴定プレート）については、単純な充填によって官能基化を実施できる。その後に洗浄および乾燥が一般に考慮される。一般に、ポリマー溶液は０．１〜５０μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬの濃度である。
【０１１２】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、発明人は、結合ポリマーは特にＡｒ基を介して基質の表面に非共有結合的に固定（吸着）されると考える。
【０１１３】
結合ポリマー上に固定される捕捉エレメントは、修飾および／またはコンジュゲートされていてもよい、ポリペプチド、糖類、オリゴ糖類またはリポ多糖類、ウイルスもしくはウイルスフラグメントまたはさらには細胞であり得る。例えば、捕捉エレメントは抗体であり得る。
【０１１４】
本出願に関連して、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基（２またはそれ以上の数）の任意の鎖を包含する。本出願の意味内での「ポリペプチド」は、したがって、例えばオリゴペプチド、ペプチドまたはタンパク質であり得、これらの用語は従来の意味に従う。本発明によるポリペプチド中に存在するアミノ酸残基は、タンパク質を構成するアミノ酸残基またはタンパク質を構成しないアミノ酸残基から選択され得る。好ましくは、それらは２０のタンパク質を構成するアミノ酸残基から選択される。
【０１１５】
結合ポリマーへの捕捉エレメントの固定は、反応性Ｆ基を有さない結合ポリマーを使用する場合は吸着によって実施できる。また、反応性Ｆ基との共有結合の確立によっても実施できる。また、反応性Ｆ基によって促進される吸着によっても実施できる。これは、例えばヒドラジド型の基によって促進される抗体の吸着の場合である。
【０１１６】
数個の部分を含む捕捉エレメントを考慮することも可能である。例えば、結合ポリマーに固定することができる中間体捕捉エレメント（例えばポリペプチドまたは糖化合物または糖ペプチド）および中間体捕捉エレメントに結合することができる最終捕捉エレメント（例えばウイルスもしくはウイルスフラグメントまたは細胞）を使用することが可能である。
【０１１７】
分析物検出のためのデバイスが、１つの分析物（または１つの型の分析物）を検出することだけを意図されている場合は、基質の有用な表面全体に結合ポリマー（および捕捉エレメント）を沈着させれば十分である。
【０１１８】
分析物検出のためのデバイスが、別々の捕捉エレメントを有する数個の分析物を検出することを意図されている場合は、数個の別々の検出領域を提供しなければならない。９６穴マイクロタイタープレートはこの目的のために特に有用な基質の一例である。
【０１１９】
この場合、結合ポリマーを基質の有用な表面全体に沈着させ、次に様々な捕捉エレメントを基質の区切られた領域に沈着させる（例えば基質の規定された位置に捕捉エレメントを含有する様々な溶液の小さな液滴を沈着させることによって）ことができるか；または捕捉エレメントに結合した結合ポリマーの様々な溶液を基質の区切られた領域に（例えばマイクロタイタープレートのウェルに）直接沈着させることができるか；または結合ポリマーの１もしくはそれ以上の溶液を基質の区切られた領域に（例えばマイクロタイタープレートのウェルに）直接沈着させ、次に捕捉エレメントを含有する様々な溶液を基質の同じ区切られた領域に沈着させることができる。
【０１２０】
結合ポリマーで被覆された基質の表面の領域は、好ましくは親水性であり、７０°またはそれ以下、好ましくは６５°またはそれ以下、および理想的には６０°またはそれ以下の水の接触角を特徴とする。結合ポリマーで被覆された基質の表面の親水性は、非常に多数の分析物（特にタンパク質）と基質との非特異的相互作用を最小限に抑えることを可能にする。また、バイオチップを調製するためにナノ液滴を沈着させることも可能にするが、この型の沈着は複雑であり、処理されていないプラスチック基質上に直接実施する場合は再現性が低い。
【０１２１】
本発明を用いて検出できる分析物は、あらゆる種類の化学的または生物学的材料であり得る：鉱物粒子、有機分子（特に農薬または他の汚染物質）、生体分子（特に糖化合物、修飾されたもしくは修飾されていない、コンジュゲートされたもしくはコンジュゲートされていない、ポリペプチド）、ウイルスもしくはウイルスフラグメント、細胞または生物（単細胞または多細胞）。
【０１２２】
特に、本発明は、血清型別、エピトープのスクリーニング、生物媒質中のタンパク質の定量化、またはさもなければリガンド−受容体型のペプチド分子間の比率の分析のために有用な、ポリペプチドを有するチップを製造することを可能にする。
【０１２３】
一般に、本発明による検出デバイスの使用は、結合ポリマーおよび捕捉エレメントで被覆された基質表面を、対象とする分析物（例えば環境からの水の試料、食品の試料、尿、血液または血液誘導体製品等のような生物学的試料）を含有する可能性がある１またはそれ以上の溶液または懸濁液と接触させることを含む。
【０１２４】
捕捉エレメントに特異的に固定される可能性がある分析物の検出は、トレーサ成分を用いて実施することができ、トレーサ成分は、例えば蛍光、放射性または化学的に標識することができ、本発明によるデバイス上に保持される分析物に結合することができるかまたは何らかの他の方法で分析物と反応することができる。その後、本発明によるデバイス上に保持されたトレーサ成分を、蛍光の検出、比色定量検出または放射能の検出のためのデバイスを用いて同定することができ、場合により定量化することもできる。
【０１２５】
また、トレーサ成分と分析物との間、またはさもなければトレーサ成分（分析物に固定された）と付加的な試薬との間の化学反応に起因する媒質の変化（例えば裸眼で見える着色）に基づく検出も可能である。
【０１２６】
例証として、トレーサ成分は、着色生成物の形成を触媒する酵素を含み得る。また、保持された分析物に結合することができる分子で被覆されたビーズも含み得る。また、分析物上に存在する抗原に結合することができる標識抗体（蛍光または放射性）を使用することも可能である。
【０１２７】
本発明によって可能となる分析物の検出および場合により定量化は、特に医学診断（人間医学または獣医学）に応用される。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は本発明を例証するが、本発明を限定するものではない。デキストランの多糖骨格を有する様々なポリマーを以下で述べる実施例において調製する。
【０１２９】
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基を含むポリマーＰｓＡｃ１；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基および−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ型のＡｒ基を含むポリマーＰｓＡｃＡｒ１；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基および−ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３Ｎ３型のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＦ１；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ型のＡｒ基および−ＣＨ２ＣＯＮＨＮＨ２型のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＡｒＦ１；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ型のＡｒ基および−ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３Ｎ３型のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＡｒＦ２；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基および上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は−（ＣＨ２）３ＯＨを表す）のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＦ２；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基および上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は上記式（ＩＩＩ）を有する）のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＦ３；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ型のＡｒ基および上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は−（ＣＨ２）３ＯＨを表す）のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＡｒＦ３；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ型のＡｒ基および上記式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は上記式（ＩＩＩ）を有する）のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＡｒＦ４；
−ＣＨ２ＣＯＯＮａ型のＡｃ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ型のＡｒ基および上記式（Ｖ）（式中、ＸはＣＨ２を表し、およびＸ’は（ＣＨ２）２を表す）のＦ基を含むポリマーＰｓＡｃＡｒＦ５。
【０１３０】
ＰｓＡｃ（ｘ）の形態は、ｘに等しいＡｃ基による置換度を含むポリマーを示す。
【０１３１】
ＰｓＡｃＡｒ（ｘ；ｙ）の形態は、ｘに等しいＡｃ基およびＡｒ基による全体的置換度ならびにｙに等しいＡｒ基による置換度を含むポリマーを示す。
【０１３２】
ＰｓＡｃＦ（ｘ；ｚ）の形態は、ｘに等しいＡｃ基およびＦ基による全体的置換度ならびにｚに等しいＦ基による置換度を含むポリマーを示す。
【０１３３】
ＰｓＡｃＡｒＦ（ｘ；ｙ；ｚ）の形態は、ｘに等しいＡｃ基、Ａｒ基およびＦ基による全体的置換度、ｙに等しいＡｒ基による置換度ならびにｚに等しいＦ基による置換度を含むポリマーを示す。
【実施例１】
【０１３４】
ポリマーＰｓＡｃ１の調製（一般的プロトコール）
デキストランＴ４０（２ｇ、１１．１ｍｍｏｌ、１当量）を脱イオン水６．４ｍＬに溶解する。イソプロパノール（３６ｍＬ）を、非常に激しく撹拌しながらこの溶液に緩やかに添加し、次にソーダ（２．４ｇ、６０ｍｍｏｌ、５．４当量）を添加して、反応混合物を６０℃で１時間撹拌する。最後にモノクロロ酢酸（３ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）を添加し、その後６０℃で一晩撹拌する。得られた白色ペーストを回収し、メタノールから３回沈殿させて、遠心分離する。得られた固体を脱イオン水に溶解し、凍結乾燥して、ポリマーＰｓＡｃ１を得る。典型的には、このプロトコールは１．２〜１．４のＡｃ基による置換度を与える。
【実施例２】
【０１３５】
カルボン酸基による置換度の測定
メチルカルボキシレート基による置換度の測定を、加水分解後に１Ｈ  ＮＭＲによって実施する。
【０１３６】
このために、生成物を以下のように加水分解する：
ポリマーＰｓＡｃ１（２００ｍｇ）をＤ２Ｏ  ２ｍＬに溶解し、次にＤ２ＳＯ４  ６６６μＬを緩やかに添加する。反応混合物を９０℃で４時間加熱する。混合物を１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚによって分析する。
【０１３７】
置換度（ＤＳ）を以下の方程式から計算する：ＤＳ＝Ａ／Ｂ、Ａ：（１／２）×４〜４．５ｐｐｍのＣＨ２ＣＯ２Ｈのプロトンのシグナルの積分値；およびＢ：グルコース単位の炭素Ｃ１によって担持されるプロトンの積分値、または（１／６）×３〜４ｐｐｍの炭素Ｃ２〜６によって担持されるプロトンの積分値。
【実施例３】
【０１３８】
ポリマーＰＳＡｃＡｒ１の調製
ＰｓＡｃ１（１．１）１００ｍｇを脱イオン水２ｍＬに溶解し、次に１Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨを４．７４に調整する。１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）（２３３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、次に１Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨを再び４．７４に調整する。ベンジルアミンを添加し、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌する。その後試料を２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で７０時間、次に脱イオン水中で１００時間透析し、ポリマーＰｓＡｃＡｒ１を得る。
【実施例４】
【０１３９】
芳香族基による置換度の測定
芳香族基による置換度を、以下の方程式を用いて１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚスペクトルから計算する：ＤＳ＝（Ｂ／Ａ）／５、Ａ：Ｃ１によって担持されるプロトンの積分値；Ｂ：フェニル基に起因する芳香族プロトンの積分値。
【０１４０】
図１は、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ基による置換度（ｙ）と、反応において使用されるベンジルアミン当量（ｅｑ）の数（利用可能なカルボキシル基による置換度に対して０．３当量、０．６当量、１当量、２当量、５当量および１５当量）との関係を例証する。
【実施例５】
【０１４１】
２−（３−アジドプロピル）−イソインドール−１，３−ジオンの合成
Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（１５ｇ、５６．０２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２００ｍＬに溶解し、次に窒化ナトリウム（７．２５ｇ、１１２．０５ｍｍｏｌ、２当量）を添加する。７０℃で２時間、撹拌を維持する。次に反応混合物を蒸発乾固させ、その後トルエンと共蒸発させて、ジメチルホルムアミドの痕跡を除去する。得られた残留物をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に可溶化し、有機相を水（２×１５０ｍＬ）で洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を蒸発させて除去し、２−（３−アジドプロピル）−イソインドール−１，３−ジオンを白色粉末の形態で得る（１２．４４ｇ、５４．１ｍｍｏｌ、９７％）。
【０１４２】
【化１３】
0006013342.tif 000014
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００  ＭＨｚ）：δ  ｐｐｍ  ７．７８（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９  Ｈｚ），３．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９  Ｈｚ），１．９０（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９  Ｈｚ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ  ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  １６８．２８，１３４．０４，１３１．９６，１２３．３１，４９．０，３５．３５，２８．０；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｍ計算値＝２３０．０８（Ｃ１１Ｈ１０Ｎ４Ｏ２），実測値（ｍ／ｚ）２３１．１［Ｍ＋Ｈ］＋，２５３．１［Ｍ＋Ｎａ］＋．
【実施例６】
【０１４３】
３−アジドプロピルアミンの合成
２−（３−アジドプロピル）−イソインドール−１，３−ジオン（３ｇ、１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、次にヒドラジン（９．６ｍＬ、３２ｍｍｏｌ、２．６当量）を添加する。反応混合物を、撹拌しながら還流下で一晩加熱する。次に塩酸の１Ｎ水溶液（１００ｍＬ）を添加する。有機相を傾瀉し、次に水相をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で洗浄する。飽和炭酸ナトリウム溶液で水相のｐＨを１４に調整する。次に水相をジクロロメタン（３×４０ｍＬ）で抽出する。ジクロロメタン相を合わせ、塩酸の１Ｎ水溶液（３×５０ｍＬ）で抽出する。最後に酸性水溶液を冷凍し、凍結乾燥する。３−アジドプロピルアンモニウム塩酸塩を白色粉末の形態で得る（１．４９ｇ、１０．９７ｍｍｏｌ、８４％）。
【０１４４】
【化１４】
0006013342.tif 000015
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ  ｐｐｍ  ３．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６  Ｈｚ），３．１１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２  Ｈｚ），１．９６（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６  Ｈｚ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，７５  ＭＨｚ）：δ  ｐｐｍ  ３９．０２，２６．４８，１５．６７．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｍ計算値＝１００．０７（Ｃ３Ｈ８Ｎ４）：実測値ｍ／ｚ  １０１．０［Ｍ＋Ｈ］＋，１２３．０［Ｍ＋Ｎａ］＋，１３９．０［Ｍ＋Ｋ］＋，１０７．１［Ｍ＋Ｌｉ］＋．
【実施例７】
【０１４５】
ポリマーＰｓＡｃＦ１の調製
ＰｓＡｃ１（１．４）１００ｍｇを脱イオン水２ｍＬに溶解し、次に１Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨを４．７４に調整する。次に１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）（２９６．５ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、１Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨを再び４．７４に調整する。塩酸塩の形態の３−アジドプロピルアミンを添加し、次にｐＨを８．４に調整する。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌する。その後試料を２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で７０時間、次に脱イオン水中で１００時間透析する。最後に、このようにして得られた生成物ＰｓＡｃＦ１を冷凍し、凍結乾燥する。
【実施例８】
【０１４６】
反応性基による置換度の測定
アジド基による置換度を以下の方程式から計算する：ＤＳ＝（Ｂ／Ａ）／２、Ａ：炭素Ｃ１によって担持されるプロトンの積分値；Ｂ：（３−アジドプロピルアミンのプロトンのシグナルに起因する）強配位子場におけるプロトンの積分値。
【０１４７】
図２は、アジド基による置換度（ｙ）と、利用可能なカルボキシル基による置換度に対する、反応において使用される３−アジドプロピルアミンの当量（Ｅｑ）の数との関係を例証する。
【実施例９】
【０１４８】
ポリマーＰｓＡｃ１（１．１５）の調製
イソプロパノール９０ｍＬを、非常に激しく撹拌しながら、水１６ｍＬに溶解したデキストランＴ４０  ５ｇ（２７．７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に滴下する。ソーダ６ｇ（１５０ｍｍｏｌ、５．４当量）を反応混合物に添加し、次にそれを６０℃で１時間撹拌する。
【０１４９】
次にモノクロロ酢酸７．５ｇ（７９．３６ｍｍｏｌ、２．８当量）をこの混合物に添加する。その後６０℃で一晩撹拌する。白っぽいペーストを得て、それを水５０ｍＬに可溶化する。次に生成物を、非常に激しく撹拌しながら、０℃に冷却したＭｅＯＨ  ５００ｍＬから沈殿させる。遠心分離（２５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃）後に得られたペレットを最少量の水に可溶化し、生成物をＭｅＯＨ  ５００ｍＬからの２回目の沈殿に供する。２回目の沈殿後に得られたペレットをＭｅＯＨで２回洗浄し、次に最少量の水に可溶化して、凍結乾燥する。１．１５の置換度を有するＰｓＡｃ１、すなわちＰｓＡｃ１（１．１５）３ｇ（１５．７ｍｍｏｌ）を得る。
【実施例１０】
【０１５０】
ポリマーＰｓＡｃＡｒ１（１．１５；０．６４）の調製
水９．４ｍＬに溶解したＰｓＡｃ１（１．１５）４６８ｍｇ（２．４４ｍｍｏｌ、１当量）を含む溶液のｐＨを、１Ｎおよび０．１Ｎ  ＨＣｌを添加することによって４．７４に調整する。ＣＭＣ  １．１８７ｇ（２．８０６ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、ｐＨを再び４．７４に調整する。次にベンジルアミン２６６μＬ（２．４４ｍｍｏｌ、ｘに対して１当量）を反応混合物に添加し、それを、磁気撹拌機を用いて周囲温度で一晩撹拌する。溶液の最終的なｐＨは１０．２である。
【０１５１】
次に反応混合物を透析チューブ（３５００ｇ／ｍｏｌ；１ｍＬ／ｃｍ）に導入し、それを２Ｍ  ＮａＣｌ溶液３．５Ｌに液浸して、５日間溶液中に保持し、次に水３．５Ｌに液浸して、同じく５日間保持する。
【０１５２】
次にバッグの内容物をポットに入れ、冷凍して、その後凍結乾燥する。ＰｓＡｃＡｒ１（１．１５；０．６４）４７７ｍｇ（１．６７ｍｍｏｌ）を得る（ベンジルアミノ基による置換度０．６４）。
【実施例１１】
【０１５３】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１５；０．６４；０．２６）の調製
水２ｍｌに溶解したＰｓＡｃＡｒ１（１．１５；０．６４）２５６ｍｇ（０．８９５ｍｍｏｌ、１当量）を含む溶液のｐＨを、１Ｎおよび０．１Ｎ  ＨＣｌを添加することによって４．７４に調整する。ＣＭＣ  ２１２．５ｍｇ（０．５０２ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、ｐＨを再び４．７４に調整する。次に２４〜２６％のヒドラジンの水溶液８７０μＬ（４．５６ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、それを、磁気撹拌機を用いて周囲温度で一晩撹拌する。溶液の最終的なｐＨは１０．２８である。
【０１５４】
次に反応混合物を透析チューブ（３５００ｇ／ｍｏｌ；１ｍＬ／ｃｍ）に入れ、それを２Ｍ  ＮａＣｌ溶液３．５Ｌに液浸して、５日間溶液中に保持し、次に水３．５Ｌに液浸して、同じく５日間保持する。
【０１５５】
次にバッグの内容物をポットに入れ、冷凍して、その後凍結乾燥する。ＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１５；０．６４；０．２６）２３５ｍｇ（０．８１ｍｍｏｌ）をこのようにして得る（ヒドラジドによる置換度０．２６）。
【実施例１２】
【０１５６】
ポリマーＰｓＡｃＡｒ１（１．２；０．４９）の調製
脱イオン水１０ｍＬに溶解した、ＰｓＡｃ１（１．２）５１３．３ｍｇの溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸溶液で４．７４に調整する。Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドメチルスルホネート（９３１．８５ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を周囲温度で添加し、次に溶液のｐＨを同じ方法で４．７４に調整する。次にベンジルアミン（４２８．６ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ、２当量）を滴下し、溶液を周囲温度で１６時間撹拌する。反応混合物を２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で３日間、次に脱イオン水中で３日間透析することによって精製する。凍結乾燥後、ＰｓＡｃＡｒ１（１．２；０．４９）を無定形白色粉末の形態で得る（ベンジルアミノ基による置換度０．４９）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：７．２１（ｓ，ｌｓ，Ｈａｒ），５．０９（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８９（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．５３−３．３９（ｍ，ｌｓ）．
【実施例１３】
【０１５７】
ポリマーＰｓＡｃＦ１（１．２；０．３８）の調製
ＰｓＡｃ１（１．２）５１３．３ｍｇを脱イオン水１０ｍＬに溶解する。溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌ溶液で４．７４に調整する。Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドメチルスルホネート（９３１．８５ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を溶液に添加し、ｐＨを再び４．７４に調整する。３−アジドプロピルアンモニウム塩酸塩（８１９．５ｍｇ、６ｍｍｏｌ、３当量）を反応混合物に添加し、次に１Ｎ  Ｎａ２ＣＯ３溶液でｐＨを８．４に調整する。反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌する。粗生成物を２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で３日間、次に脱イオン水中で３日間透析する。凍結乾燥してＰｓＡｃＦ１（１．２；０．３８）を無定形白色粉末の形態で得る（アジド基による置換度０．３８）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：５．０７（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８８（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．２８−３．２６（ｍ，ｌｓ），１．７７（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例１４】
【０１５８】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．３４；０．３８）の調製
脱イオン水５ｍＬに溶解したＰｓＡｃＦ１（１．２；０．３８）２７２．２ｍｇの溶液を１Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨ４．７４に調整する。Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドメチルスルホネート（３７２．８ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、反応混合物のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌ溶液で再び４．７４に調整する。ベンジルアミン（１７１．４ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液を周囲温度で１８時間撹拌する。２Ｎ  ＮａＣｌ中で３日間、次に脱イオン水中で３日間透析し、次いで凍結乾燥して、化合物ＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．３４；０．３８）を得る（ベンジルアミノ基による置換度０．３４）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：７．２３（ｓ，ｌｓ，Ｈａｒ），５．０５（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８４（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．３３−３．２６（ｍ，ｌｓ），１．６８（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例１５】
【０１５９】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．４９；０．６２）の調製
Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドメチルスルホネート（３７２．７ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、１．１当量）を、ｐＨ＝４．７４の脱イオン水５ｍＬ中のＰｓＡｃＡｒ１（１．２；０．４９）２２４．２ｍｇの溶液に添加する。溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌ溶液で４．７４に調整し、次に３−アジドプロピルアンモニウム塩酸塩（３２７．８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、３当量）を添加する。ｐＨを８．４に調整し、次に溶液を周囲温度で１７時間撹拌する。２Ｎ  ＮａＣｌ中で３日間、次に脱イオン水中で３日間透析し、最後に凍結乾燥して、ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．４９；０．６２）を得る（アジド基による置換度０．６２）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：７．２３（ｓ，ｌｓ，Ｈａｒ），５．０５（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８４（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．３３−３．２６（ｍ，ｌｓ），１．６８（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例１６】
【０１６０】
ペント−４−イニル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成
式（ＶＩＩＩ）の生成物を以下で述べるように合成する：
【０１６１】
【化１５】
0006013342.tif 000016
Ｄ−（＋）−グルコース（３６０．３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を４−ペンチン−１−オール（１．０１ｇ、１２．０ｍｍｏｌ、６．０当量）に溶解し、溶液を６５℃に加熱する。Ｈ２ＳＯ４−ＳｉＯ２  １２０ｍｇを添加し、溶液を６５℃で１０時間撹拌する。溶液を周囲温度に冷却し、次に化合物を、ＣＨ２Ｃｌ２からＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ；９：１までの勾配を溶離液混合物として用いるシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。所望生成物を無色の油の形態で、収率７９％およびα／βアノマー比１．６／１で得る。残留物（４０５．０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を周囲温度でピリジン（５ｍＬ）および無水酢酸（１．３３ｇ、１３．０ｍｍｏｌ、８当量）に溶解する。
【０１６２】
次に０℃でＤＭＡＰ（２０ｍｇ）を添加し、反応混合物を周囲温度で５時間撹拌する。反応混合物を、０℃でＭｅＯＨ  ５ｍＬを滴下することによって中和する。溶媒を回転蒸発器において減圧下で除去し、残留溶媒をトルエンと３回共蒸発させる。ペンタン−ＥｔＯＡｃ（８／２）溶離液混合物でのシリカゲルクロマトグラフィによって精製し、総収率９８％に相当する、α立体配座の所望テトラアセチル化生成物の白色結晶１９０ｍｇならびに２つのアノマーの混合物４５０ｍｇを得る：
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：５．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，９．６  Ｈｚ），５．０６（ｍ，２Ｈ），４．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．２，３．７  Ｈｚ），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．３，４．３  Ｈｚ），４．０７（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９，５．９  Ｈｚ），３．５４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９，６．１  Ｈｚ），２．３４（ｄｔ，２Ｈ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，２．７  Ｈｚ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．６  Ｈｚ），１．８２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．５  Ｈｚ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，７５  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：１７０．９，１７０．４，１７０．３，１６９．８，９６．１，８３．３，７１．０，７０．４，６９．４，６８．９，６８．７，６７．４，６６．９，６２．１，２８．４，２０．９，２０．９，２０．８，２０．８，１５．２．
Ｃ１９Ｈ２６Ｏ１０についてのＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：４３７．５；実測値ｍ／ｚ：４３７．１。
【実施例１７】
【０１６３】
ペント−４−イニル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成
式（ＩＸ）の生成物を以下で述べるように合成する：
【０１６４】
【化１６】
0006013342.tif 000017
ＭｅＯＨ中０．１ＭのＮａＯＭｅ  ４ｍＬを、ＭｅＯＨ  ３ｍＬに溶解した、実施例１６で得られたテトラアセチル化化合物（１８０ｍｇ、０．４３４ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で添加し、反応混合物を周囲温度で４時間撹拌する。次に反応混合物をＤｏｗｅｘ−５０Ｗ樹脂でｐＨ＝７に中和する。次に反応混合物をろ過し、減圧下で蒸発乾固させて、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ；９：１を溶離液として用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製し、定量的収率にてα−グルコースの誘導体を無色の油の形態で得る。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９  Ｈｚ），４．０８（ｍ，２Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｍ，３Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，７５  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：１００．０，８７．０，７５．１，７３．６，７３．３，７１．６，７１．４，６８．２，６２．４，２９．３，１６．５．Ｃ１１Ｈ１８Ｏ６についてのＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：２６９．１；実測値ｍ／ｚ：２６９．０
【実施例１８】
【０１６５】
ポリマーＰｓＡｃＦ２（１．２；０．４）の調製
ポリマーＰｓＡｃＦ１（１．２；０．４）（２４．８ｍｇ）および４−ペンチン−１−オール（水中９２．５ｍｇ／ｍＬの溶液２００μＬ、０．２２ｍｍｏｌ、２．２当量）を周囲温度にて脱イオン水１５０μＬ中で撹拌する。次にアスコルビン酸ナトリウム（水中２００ｍｇ／ｍＬの新鮮調製した溶液５０μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、０．５当量）および硫酸銅（ＩＩ）五水和物（水中２５ｍｇ／ｍＬの溶液５０μＬ、０．００５ｍｍｏｌ、０．０５当量）を反応混合物に添加し、周囲温度で２０時間混合する。２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で３日間、次に脱イオン水中で３日間透析して精製し、次いで凍結乾燥して、ポリマーＰｓＡｃＦ２（１．２；０．４）を無定形白色粉末の形態で得る。トリアゾールによる置換度は０．４である（すなわち基本的にすべての反応性Ａｒ基が変換された）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：７．６５（ｓ，ｌｓ，Ｈｔｒｉａｚｏｌｅ），５．０３（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８５（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．３０−３．３０（ｍ，ｌｓ），３．１３（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），２．６１（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），２．０１（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），１．７５（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例１９】
【０１６６】
ポリマーＰｓＡｃＦ３（１．２；０．３４）の調製
アスコルビン酸ナトリウム（水中２００ｍｇ／ｍＬの新鮮調製した溶液５０μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、０．５当量）および次に硫酸銅（ＩＩ）五水和物（水中２５ｍｇ／ｍＬの溶液５０μＬ、０．００５ｍｍｏｌ、０．０５当量）を、周囲温度で脱イオン水９００μＬ中のＰｓＡｃＦ１（１．２；０．３４）（２４．８ｍｇ）とペント−４−イニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４９．３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、２．０当量）の混合物に連続的に添加する。２０時間後、反応混合物を２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で３日間、次に脱イオン水中で２日間透析することによって精製する。凍結乾燥後、ポリマーＰｓＡｃＦ３（１．２；０．３４）を無定形白色粉末の形態で得る。トリアゾールによる置換度は０．２６であり、すなわち反応性Ｆ基の一部だけが変換された）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００  ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）：７．７４（ｓ，ｌｓ，Ｈｔｒｉａｚｏｌｅ），５．０６（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８８（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．７８（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．３４−３．１６（ｍ，ｌｓ），２．７１（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），２．０５（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），１．８９（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例２０】
【０１６７】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ３（１．２；０．４２；０．３８）の調製
アスコルビン酸ナトリウム（水中２００ｍｇ／ｍＬの新鮮調製した溶液５０μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、０．５当量）および次に硫酸銅（ＩＩ）五水和物（水中２５ｍｇ／ｍＬの溶液５０μＬ、０．００５ｍｍｏｌ、０．０５当量）を、周囲温度で脱イオン水７００μＬ中のＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．４２，；０．３８）（２８．７ｍｇ）と４−ペンチン−１−オール（水中９２．５ｍｇ／ｍＬの溶液２００μＬ、０．２２ｍｍｏｌ、２．２当量）の混合物に連続的に添加する。２０時間後、反応混合物を２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で３日間、次に脱イオン水中で２日間透析することによって精製する。凍結乾燥後、ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ３（１．２；０．４２；０．３８）を無定形白色粉末の形態で得る。トリアゾールによる置換度は０．２８である（反応性Ｆ基の変換度７４％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：７．６２（ｓ，ｌｓ，Ｈｔｒｉａｚｏｌｅ），７．２１（ｓ，ｌｓ，Ｈａｒ），５．０４（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８９（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．２９−３．５０（ｍ，ｌｓ），３．１３（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），２．５８（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），１．９６（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），１．７３（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例２１】
【０１６８】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ４（１．２；０．４２；０．３８）の調製
アスコルビン酸ナトリウム（ＰＢＳ中２００ｍｇ／ｍＬで１００μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、１当量）を、脱イオン水５００μＬ中のＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．４２；０．３８）（２８．７ｍｇ）およびペント−４−イニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４３．８ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１．８当量）の溶液ならびに０．１ＭのＰＢＳ  ４００μＬに添加する。硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＰＢＳ中２５ｍｇ／ｍＬで１００μＬ、０．００５ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で２０時間撹拌する。デキストランを０．５ＭのＥＤＴＡ−２Ｎａの水溶液（２ｍＬ）中に取った後、２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で３日間、次に脱イオン水中で２日間透析することによって精製する。凍結乾燥して、ＰｓＡｃＡｒＦ４（１．２；０．４２；０．３８）を無定形白色粉末の形態で得る。トリアゾールによる置換度は０．３４である（反応性Ｆ基の変換度８９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：７．６３（ｓ，ｌｓ，Ｈｔｒｉａｚｏｌｅ），７．２１（ｓ，ｌｓ，Ｈａｒ），５．００（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．９０（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．８５（ｓ，ｌｓ，Ｈａｎｏ），４．２３−３．２２（ｍ，ｌｓ），３．０９（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），２．６４（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），１．２２（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２），１．１９（ｓ，ｌｓ，ＣＨ２）．
【実施例２２】
【０１６９】
ポリスチレンプレートの官能基化および接触角の測定
あらかじめ水とエタノールで洗浄したポリスチレンプレート（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗプレート、１０ｃｍ×１０ｃｍ）を、１０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳ緩衝液中のポリマーの溶液またはＰＢＳ単独（対照）中に周囲温度で一晩、半液浸する（ポリマーの型につき１プレート）。試験するポリマーは上述したものであり、特にＰｓＡｃ１（１．２）、ＰｓＡｃＡｒ１（１．２；０．４２）、ＰｓＡｃＡｒＦ２（１．２；０．４２；０．３８）およびＰｓＡｃＡｒＦ４（１．２；０．４２；０．２７）（０．２７の値は、ここではトリアゾールによる置換度だけを表す）である。
【０１７０】
次に溶液と接触するポリスチレン表面を水浴に５分間ずつ２回液浸する。それを窒素下で１０分間乾燥させる。
【０１７１】
次にこれらの表面を接触角の測定のために使用する。溶液と接触しなかった基質の領域を対照として用いる。
【０１７２】
水１μＬの液滴１０滴を、処理した表面と処理していない（対照）表面の中央に沈着させる。結果（角の中央値および四分位範囲）を図３に示す。
【０１７３】
多糖ＰｓＡｃＡｒ１、ＰｓＡｃＡｒＦ２およびＰｓＡｃＡｒＦ４によるポリスチレン表面の処理は、未処理のポリスチレンと比較して水の接触角の有意の低下をもたらすことがわかる。これらポリマーは、したがって、ポリスチレンの官能基化を可能にする。
【実施例２３】
【０１７４】
リガンドによる９６穴ポリスチレンプレートの官能基化
この実施例では、ポリスチレンウェルの底部をＰｓＡｃ、ＰｓＡｃＡｒまたはＰｓＡｃＡｒＦの層で完全に覆い、その後リガンド（レクチン）と共にインキュベートする。次にタンパク質をリガンド官能基化表面と共にインキュベートする。最後に、蛍光検出システムによって標的タンパク質を捕捉したウェルを同定することができる。
【０１７５】
使用する９６穴プレートは、製造業者ＮｕｎｃからのＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ型である。
【０１７６】
１）ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中のポリマーの溶液（５０μｇ／ｍＬ〜０．１μｇ／ｍＬ）１００μＬをプレートのウェル中で周囲温度にて１６時間インキュベートする。
【０１７７】
２）次にウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）３×３００μＬで３×５分間洗浄する。
【０１７８】
３）次にウェルを、ＢＳＡ（３％、１％もしくは０．１％）またはカゼイン（０．１％）を含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）の溶液３００μＬと共に周囲温度で１時間インキュベートする。
【０１７９】
４）ウェルをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）３×３００μＬで３×５分間洗浄する。
【０１８０】
５）次にウェルを、最終濃度１ｍＭのＭｎＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）中のビオチン化レクチン（例えば１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬと共にインキュベートする。インキュベーションを、撹拌しながら周囲温度で１時間実施する。
【０１８１】
以下のレクチン（市販されている）を使用した：コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）およびエリスリナ・クリスタガリ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）レクチン（ＥＣＬ）。
【０１８２】
ＣｏｎＡは末端α−Ｄ−グルコースまたはα−Ｄ−マンノース残基と相互作用する。ＷＧＡはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを認識する。ＥＣＬは末端α−Ｄ−ガラクトース残基を認識する。
【０１８３】
６）ウェルをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）３×３００μＬで３×５分間洗浄する。
【０１８４】
７）次にウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）中のテトラメチルローダミン標識ストレプトアビジン（５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬと共に周囲温度で２時間インキュベートする。
【０１８５】
８）ウェルをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）３×３００μＬで３×５分間洗浄する。
【０１８６】
９）ウェルを脱イオン水３×３００μＬで３×５分間洗浄する。
【０１８７】
１０）プレートを遠心分離機において１０分間乾燥させ、次に窒素下で５分間乾燥させる。
【０１８８】
１１）ウェルの底部の蛍光を、共焦点蛍光スキャナーを用いて５３２ｎｍで測定する。
【０１８９】
結果を図４および５に示す。
【０１９０】
図４は、ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ４（１．２；０．４２、０．３４）（トリアゾールＦ基だけに関して０．３４の置換度）および上記の３つのレクチンで得られた蛍光の強度を示すヒストグラムである。ｘ軸上に示す比率はレクチン／ストレプトアビジン比である。
【０１９１】
予想されたようにＰｓＡｃＡｒＦ４はＣｏｎＡによって選択的に認識されることが認められ、ポリスチレンプレートの官能基化の品質および標的タンパク質に対するリガンドのアベイラビリティを示す。
【０１９２】
図５は、同じポリマーＰｓＡｃＡｒＦ４（１．２；０．４２、０．３４）およびＣｏｎＡで得られた蛍光の強度を示すヒストグラムである。ｘ軸上に示す比率はレクチン／ストレプトアビジン比である。最後の結果（Ｔ）は多糖を含まない対照である。
【０１９３】
この実験は、蛍光シグナルの強度とウェルにおいて使用したＣｏｎＡの濃度との関係を例証する。ＣｏｎＡ、ストレプトアビジンまたはＰｓＡｃＡｒＦ４を与えられなかったウェルに関連する蛍光は非常に低い。
【実施例２４】
【０１９４】
多糖のプリンティングによる９６穴プレートのウェルの底部におけるマイクロドットの形成、レクチンとの相互作用
この実験では、様々なポリマーを未処理９６穴プレートの底部にプリントする。
【０１９５】
次にこのようにして作製されたバイオチップをタンパク質（レクチン）と共にインキュベートする。
【０１９６】
使用する９６穴プレートは、製造業者ＮｕｎｃからのＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ型である。ポリマー溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度）３００ｐＬを、以下の配置でＰａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐＡｒｒａｙｅｒ  ＢＣＡ−１装置を用いてプレート上に沈着させる：
【０１９７】
【化１７】
0006013342.tif 000018
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ４に関して、０．２７の置換度はトリアゾール基だけに対応する。ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ３については、０．２８の置換度はトリアゾール基だけに対応する。
【０１９８】
１）次にウェルを、ＢＳＡ（３％）を含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）の溶液１００μＬと共に周囲温度で１５分間インキュベートする。
【０１９９】
２）次にウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）３×１００μＬで３×５分間洗浄する。
【０２００】
３）次にウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）中のビオチン化レクチン（例えば２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬ）の溶液１００μＬと共に軌道撹拌しながら周囲温度で１時間インキュベートする。レクチン（ＣｏｎＡ、ＥＣＬおよびＷＧＡ）については、ＭｎＣｌ２およびＣａＣｌ２の塩を最終濃度１ｍＭになるように添加する。
【０２０１】
４）ウェルをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）３×１００μＬで３×５分間洗浄する。
【０２０２】
５）次にウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）中のストレプトアビジンテトラメチルローダミン（５μｇ／ｍＬ）の溶液１００μＬと共に周囲温度で２時間インキュベートする。
【０２０３】
６）ウェルをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）３×１００μＬで３×５分間洗浄する。
【０２０４】
７）ウェルを脱イオン水３×１００μＬで３×５分間洗浄する。
【０２０５】
８）プレートを遠心分離機において１０分間乾燥させ、次に窒素下で５分間乾燥させる。
【０２０６】
９）５３２ｎｍでスキャナーを用いて検出を実施する。
【０２０７】
図６は得られた結果を要約する。ＣｏｎＡがポリマーＰｓＡｃＡｒＦ４上に選択的に固定され、その他の２つのレクチンはいずれも固定されないことがわかる。
【実施例２５】
【０２０８】
ポリスチレンプレートの官能基化および接触角の測定、芳香族置換度の影響
ポリマーＰｓＡｃ１（１．２７）、ＰｓＡｃＡｒ１（１．２７；０．０３）、ＰｓＡｃＡｒ１（１．２７；０．３９）およびＰｓＡｃＡｒ１（１．２７；０．５４）をこの実験のために使用する。
【０２０９】
あらかじめ水とエタノールで洗浄した５つのポリスチレンプレート（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗプレート、１０ｃｍ×１０ｃｍ）を、１０μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ緩衝液中に溶解したＰｓＡｃ１もしくはＰｓＡｃＡｒ１の溶液またはＰＢＳ単独に周囲温度で一晩、半液浸する。
【０２１０】
次に溶液と接触するポリスチレン表面を水浴に５分間ずつ２回液浸する。次にそれを窒素下で１０分間乾燥させる。
【０２１１】
次にこれらの表面を接触角の測定のために使用する。溶液と接触しなかった基質の領域を対照として用いる。
【０２１２】
水１μＬの液滴１０滴を、処理した表面と処理していない（対照）表面の中央に沈着させる。
【０２１３】
結果（角の中央値および四分位範囲）を図７に示す。最初のバーは即時測定の結果であり、２番目のバーは部分的真空下で（デシケーター）２４時間保存した後の結果である。
【０２１４】
ＰｓＡｃＡｒ１（１．２７；０．５４）は接触角の有意の低下をもたらすことが認められ、未処理ポリスチレンについての８６°から、処理したポリスチレンについての５６°まで低下させる。ＰｓＡｃＡｒ１（１．２７；０．５４）によってポリスチレン表面にグラフトされた官能基は表面をより親水性にし、これは、未処理ポリスチレンと比較して、これらの表面上の水の接触角の低下に反映される。ポリマーＰｓＡｃＡｒ１（１．２７；０．５４）は、したがって、ポリスチレンの化学的官能基化を可能にする。
【実施例２６】
【０２１５】
９６穴ポリスチレンプレートの官能基化および蛍光ペプチドとのヒドラゾン結合
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）およびＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．７５）をこの実験のために使用する。ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）は、ヒドラジド官能基でウェルの底部を官能基化することを可能にする。この官能基を担持しないポリマーＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．７５）を対照として用いる。ヒドラジド官能基は、アルデヒド官能基を担持する分子と反応することが公知である。形成される結合はヒドラゾンである。反応の原理は以下のとおりである：
【０２１６】
【化１８】
0006013342.tif 000019
２つのペプチドを使用する：式Ｒｈｏ−ＫＲ−ＮＨ（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＨＯＣＯのペプチド１（配列番号：１）（テトラメチルローダミンおよびＣＨＯＣＯ官能基で官能基化される）ならびに式Ｒｈｏ−ＫＲ−ＮＨ２のペプチド２（配列番号：２）（テトラメチルローダミンおよびアミド官能基で官能基化される）。これらのペプチドの合成は、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｐｈａ−ｏｘｏ  ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｒ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４，４３０−９（２００３）に記載されている。
【０２１７】
プロトコール：
９６穴ポリスチレンマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）のウェルを、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの濃度のＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）またはＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．７５）の溶液１００μＬで処理する。処理は、撹拌しながら周囲温度で一晩実施する。
【０２１８】
次にプレート洗浄機を用いてプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％で洗浄する（３００μＬ／ウェル、６回洗浄）。
【０２１９】
ペプチド１および２の２つのシリーズの溶液を、酢酸緩衝液ｐＨ５．５／０．１％ＢＳＡ中１０−６、５×１０−７、２．５×１０−７、１．２５×１０−７および６．２５×１０−８Ｍの濃度で調製する。各溶液６０μＬをＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）またはＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．７５）で処理したウェルの底部に沈着させる（２ウェル／条件）。連結反応を周囲温度で２時間、撹拌しながら実施する。
【０２２０】
プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（３００μＬ／ウェル、６回洗浄）および次に脱イオン水（３００μＬ／ウェル、３回洗浄）で洗浄する。次に遠心分離機における乾燥を実施する（２５００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間、２０℃）。プレートをＴｅｃａｎ蛍光スキャナーで読み取る。
【０２２１】
結果を図８に示す。灰色のバーはペプチド１に対応し、白色のバーはペプチド２に対応する。Ｃｎは種々の濃度のＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）に対応し、Ｃ’ｎは種々の濃度のＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．７５）に対応し、１＝１０−６Ｍ；２＝５×１０−７Ｍ；３＝２．５×１０−７Ｍ；４＝１．２５×１０−７Ｍ；５＝６．２５×１０−８Ｍである。
【０２２２】
ＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）で処理し、次にアルデヒドペプチド１と共にインキュベートしたウェルに関連するシグナルの強度（ｙ軸）は高い（Ｃｎ、ペプチド１）。比較して、ＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．７５）で処理したウェル（ペプチド１のアルデヒド官能基に対して反応性であるヒドラジド官能基を有さない対照ウェル）に関連するシグナルの強度は非常に低い（Ｃ’ｎ、ペプチド１）。
【０２２３】
すべての場合に、アルデヒド官能基を有さない対照ペプチド２と共にインキュベートしたウェルに関連するシグナルの強度は非常に低い（ＣｎまたはＣ’ｎ、ペプチド２）。
【０２２４】
この実施例は、ＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１；０．７５；０．０３）で処理した、アクセス可能なヒドラジド官能基を有するウェルへのアルデヒドペプチド１の化学選択的結合を明らかにする。
【０２２５】
連結反応のｐＨを変化させることによって補足的な実験を実施した。この型の化学反応に関して予想されたように、反応のための好ましいｐＨは５である。
【実施例２７】
【０２２６】
９６穴ポリスチレンプレートの官能基化、ペプチドのプリンティングによるバイオチップの調製およびインサイチュでの反応
この実験では、ウェルを多糖ポリマーで官能基化する。ペプチドをプリントしてバイオチップを形成し、ペプチドはヒドラゾン共有結合の形成によって表面に結合する。
【０２２７】
この実験において使用するペプチドの合成は、Ｃａｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ８，３１５−３２２（２００７）に記載されている。
【０２２８】
使用するペプチドは：
−Ｓｅｒ−ＨＡ：Ｈ−ＳＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ−ＮＨ２（配列番号：３）；
−Ｓｅｒ−ＦＬＡＧ：Ｈ−ＳＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＳ−ＮＨ２（配列番号：４）；
−ＣＨＯＣＯ−ＨＡ：ＣＨＯＣＯ−ＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ−ＮＨ２（配列番号：５）；
−ＣＨＯＣＯ−ＦＬＡＧ：ＣＨＯＣＯ−ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＳ−ＮＨ２（配列番号：６）
である。
【０２２９】
プロトコール：
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ１（１０μｇ／ｍＬ）、ポリマーＰｓＡｃＡｒ１（１０μｇ／ｍＬ）、ＰＢＳ緩衝液で官能基化したまたは未処理の９６穴型のプレートへの、ｐＨ５．５のＰＢＳ緩衝液または酢酸緩衝液中１０−４Ｍの濃度のペプチドＳｅｒ−ＨＡ、ＣＨＯＣＯ−ＨＡ、Ｓｅｒ−ＦＬＡＧおよびＣＨＯＣＯ−ＦＬＡＧのプリンティング。
【０２３０】
ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ  ３００μＬでのウェルの飽和を撹拌下で３０分間実施する。
【０２３１】
ウェルを手作業にてＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄する。
【０２３２】
抗ＨＡおよび抗ＦＬＡＧ抗体のインキュベーションを、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬの濃度で撹拌下に１時間半実施する（１００μＬ／ウェル）。ウェルを手作業にてＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄する。
【０２３３】
テトラメチルローダミン標識抗ＩｇＧマウス抗体のインキュベーションを、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中２μｇ／ｍＬの濃度で撹拌下に１時間実施する（１００μＬ／ウェル）。
【０２３４】
ウェルを手作業にてＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、水で３回洗浄して、遠心分離によって乾燥させる（２５００ｒ．ｐ．ｍ、５分間、２０℃）。
【０２３５】
プレートをＴｅｃａｎスキャナーで読み取る（焦点オフセット：−１０００／ＭＴＰゲイン：９０／分解能：４μｍ）。
【０２３６】
抗ＨＡ抗体とのインキュベーションの結果を図９に示し、抗ＦＬＡＧ抗体とのインキュベーションの結果を図１０に示す（ｙ軸に蛍光の強度）。
【実施例２８】
【０２３７】
ビス（｛２−［トリフェニルメチル）スルファニル］エチル｝）アミンの調製
ビス（２−クロロエチル）アミン（８．４ｍｍｏｌ）１．５０ｇおよびトリフェニルメタンチオール（２当量、１６．８０ｍｍｏｌ）４．６５ｇをフラスコに導入し、不活性雰囲気下に置く。無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５ｍＬを磁気撹拌しながら添加し、反応混合物を氷浴中で冷却する。１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）４当量を混合物に滴下する。混合物を周囲温度で３時間撹拌し、反応を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）（溶離液：シクロヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン：８／２／０．１）によって観測する。この時間後、溶媒を回転蒸発器で蒸発させて除去する。次に得られた白色固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）５０ｍＬに溶解し、生成物を５％ＫＨ２ＰＯ４水溶液で３回抽出する。次に生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶離液：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ／トリエチルアミン（ＴＥＡ）：８／２／０．１）によって精製し、無定形白色固体１．４６ｇを得る（収率２８％）。
【０２３８】
生成物の分析は以下のとおりである：
Ｒｆ＝０．３７（シリカゲル、シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＴＥＡ：８／２／０．１）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．４１−７．３７（ｍ，１２Ｈ，Ｔｒｔ），７．１５−７．２９（ｍ，１８Ｈ，Ｔｒｔ），２．２３−２．３６（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），１．２６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
１３Ｃ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１５４．１；１２９．８；１２８．１；１２６．９；４７．９；３２．６；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：２４３．１［Ｔｒｔ＋］，６２２．３［Ｍ＋Ｈ＋］＋，６４４．３［Ｍ＋＋Ｎａ＋］．
【実施例２９】
【０２３９】
Ｂｏｃ−βＡｌａ−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＳＴｒｔ）２の合成
Ｂｏｃ−βアラニン（１．９０８ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５０ｍｌに溶解し、次に溶液を０℃に冷却して、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（５ｍｍｏｌ）を添加する。周囲温度で３０分間撹拌を維持する。ろ過後、ビス（｛２−［（トリフェニルメチル）スルファニル］エチル｝）アミン（２．５ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を周囲温度で２時間撹拌する。反応混合物を蒸発乾固させる。得られた残留物にソーダ水溶液（１Ｎ）１００ｍＬを添加し、それをジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させる。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（シクロヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン：８０／２０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製する。生成物Ｂｏｃ−βＡｌａ−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＳＴｒｔ）２を白色粉末の形態で得る（３．１ｇ、３．９ｍｍｏｌ、９７％）。
【０２４０】
反応の概略図は以下のとおりである：
【０２４１】
【化１９】
0006013342.tif 000020
融点：５３℃。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  １．４３（９  Ｈ，ｓ，ＣＨ３）；１．９４（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２Ｓ）；２．１４（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２Ｓ）；２．３１（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２ＣＯＮ）；２．７３（４  Ｈ，ｍ，ＣＯＮＣＨ２）；３．２３（２  Ｈ，ｍ，ＯＣＯＮＣＨ２）；５．２３（Ｈ，ｍ，ＣＯＮＨ）；７．１０−７．５０（３０  ＨＡｒ，ｍ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  ２８．５０（ＣＨ３）；２９．５０（ＣＨ２）；３０．０（ＣＨ２）；３３．０（ＣＨ２）；３６．０（ＣＨ２）；４５．０（ＣＨ２）；４７．０（ＣＨ２）；１２６．７（ＣＨ）；１２７．０（ＣＨ）；１２８．０（ＣＨ）；１２９．５（ＣＨ）；１３０．０（ＣＨ）；１４３．０（Ｃｑｕａｔ）；１４４．５（Ｃｑｕａｔ）；１４５．０（Ｃｑｕａｔ）；１５６．０（Ｃｑｕａｔ）；１７１．０（Ｃｑｕａｔ）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢ  ｍａｔｒｉｘ）：Ｍ計算値＝７９２．３（Ｃ５０Ｈ５２Ｎ２Ｏ３Ｓ２）；ｍ／ｚ＝８１５．４［Ｍ＋Ｎａ］＋；ｍ／ｚ＝８３１．３［Ｍ＋Ｋ］＋．
【実施例３０】
【０２４２】
Ｂｏｃ−βＡｌａ−ジチアゼパンの合成
生成物Ｂｏｃ−βＡｌａ−ジチアゼパン（３ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、ヨウ素（２．８７ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）を添加する。周囲温度で３０分間撹拌を維持する。過剰のヨウ素をチオ硫酸ナトリウム水溶液（３Ｍ、１００ｍｌ）で中和する。ジクロロメタン（４×１００ｍＬ）で抽出を実施する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させる。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン、４０／６０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製する。生成物Ｂｏｃ−βＡｌａ−ジチアゼパンを白色ペーストの形態で得る（１．１ｇ、３．６ｍｍｏｌ、９５％）。
【０２４３】
反応の概略図は以下のとおりである：
【０２４４】
【化２０】
0006013342.tif 000021
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  １．３９（９  Ｈ，ｓ，ＣＨ３）；２．４８（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２ＣＯＮ）；２．８７（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２Ｓ）；３．０４（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２Ｓ）；３．３９（２  Ｈ，ｍ，ＯＣＯＮＣＨ２）；３．７６（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＯＮＣＨ２）；３．８６（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＯＮＣＨ２）；５．２５（Ｈ，ｍ，ＮＨ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  ２８．５（ＣＨ３）；３３．０（ＣＨ２）；３６．０（ＣＨ２）；３７．０（ＣＨ２）；３９．５（ＣＨ２）；５０．０（ＣＨ２）；５３．０（ＣＨ２）；１４３．０（Ｃｑｕａｔ）；１５６．０（Ｃｑｕａｔ）；１７２．０（Ｃｑｕａｔ）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢマトリックス）：Ｍ計算値＝３０６．１（Ｃ１２Ｈ２２Ｎ２ＯＳ２）；ｍ／ｚ＝３０７．１［Ｍ＋Ｈ］＋；ｍ／ｚ＝３２９．１［Ｍ＋Ｎａ］＋；ｍ／ｚ＝３４５．１［Ｍ＋Ｋ］＋．
【実施例３１】
【０２４５】
ＮＨ２−βＡｌａ−ジチアゼパンの合成
生成物Ｂｏｃ−βＡｌａ−ジチアゼパン（１ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加する。周囲温度で３０分間撹拌を維持する。反応混合物を蒸発乾固させる。得られた残留物にソーダ水溶液（１Ｎ）を添加し、それをジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させる。生成物ＮＨ２−βＡｌａ−ジチアゼパンを半透明の油の形態で得る（６２８ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ、９４％）。
【０２４６】
反応の概略図は以下のとおりである：
【０２４７】
【化２１】
0006013342.tif 000022
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  ２．４４（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＨ２ＣＯＮ）；２．６０（Ｈ，ｍ，ＮＨ２）；２．９０（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＮＨ２ＣＨ２）；３．０（４  Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｓ）；３．７７（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＯＮＣＨ２）；３．８４（２  Ｈ，ｔ，Ｊ＝４  Ｈｚ，ＣＯＮＣＨ２）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ｐｐｍ  ３５．０（ＣＨ２）；３５．５（ＣＨ２）；３７．５（ＣＨ２）；３９．０（ＣＨ２）；５０．０（ＣＨ２）；５２．０（ＣＨ２）；１７２．０（Ｃｑｕａｔ）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢマトリックス）：Ｍ計算値＝２０６．０５（Ｃ７Ｈ１４Ｎ２ＯＳ２）；ｍ／ｚ＝２０７．０［Ｍ＋Ｈ］＋；ｍ／ｚ＝２２９．０［Ｍ＋Ｎａ］＋．
【実施例３２】
【０２４８】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ５の合成
ポリマーＰｓＡｃＡｒ１（１．１；０．４９）（０．２０ｍｍｏｌ）５０ｍｇをフラスコ中の脱イオン水１ｍＬに溶解し、次に１Ｎ  ＨＣｌ溶液でｐＨを４．７４に調整する。１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）（１００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、その後ｐＨを４．７４に調整する。アミンＨ２Ｎ（ＣＨ２）２ＣＯＮ（ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（７５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１．８当量）を添加する。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌する。
【０２４９】
次に反応混合物を透析チューブ（３５００ｇ／ｍｏｌ；１ｍＬ／ｃｍ）に入れ、２Ｍ  ＮａＣｌ溶液２．５Ｌに液浸して、５日間溶液中に保持し、次に水２．５Ｌに液浸して、同じく５日間保持する。
【０２５０】
次にバッグの内容物をポットに入れ、凍結乾燥して、ＰｓＡｃＡｒＦ５  ４７ｍｇを得る。反応の概略図は以下のとおりである：
【０２５１】
【化２２】
0006013342.tif 000023
【実施例３３】
【０２５２】
９６穴ポリスチレンプレートの化学的官能基化、蛍光ペプチドとのアミド結合
ポリマーＰｓＡｃＡｒ１およびＰｓＡｃＡｒＦ５をこの実施例で使用した。
【０２５３】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ５は、ＣＯＮ（ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２官能基でウェルの底部を官能基化することを可能にする。この官能基を担持しないポリマーＰｓＡｃＡｒ１を対照として用いる。ＣＯＮ（ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２官能基は、例えばペプチドのＮ末端位置に存在するシステインなどの、β−アミノチオール官能基を担持する分子と反応することができる。形成される結合はアミド結合である。
【０２５４】
ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ５による固定化の化学を以下の概略図に示す：
【０２５５】
【化２３】
0006013342.tif 000024
２つのペプチドを本実施例において使用する：
１）Ｈ−ＣＩＬＫ（ローダミン）ＥＰＶＨＧＶ−ＮＨ２（配列番号：７）；
２）Ｈ−ＳＩＬＫ（ローダミン）ＥＰＶＨＧＶ−ＮＨ２（配列番号：８）。
【０２５６】
これらの２つのペプチドを以下のプロトコールに従って合成する：
ペプチドＨ−ＩＬＫ（Ｍｔｔ）Ｅ（ｔＢｕ）ＰＶＨ（Ｔｒｔ）ＧＶ−ＮＨ２（配列番号：９）を、Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＣＥＭ）およびＦｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル戦略を用いてＮｏｖａｓｙｎ  ＴＧＲ（登録商標）樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．２５ｍｍｏｌ、０．２３ｍｍｏｌ／ｇ）上に構築する。ＣＨ２Ｃｌ２中の１％ＴＦＡ溶液（１７×１５ｍｌ）でＭｔｔ基の脱保護を実施する。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＤＩＥＡ溶液で中和し（５×２分間）、次にＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して（３×２分間）、その後ＤＭＦで洗浄する（３×２分間）。次に樹脂をＤＭＦ中の５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（１５０．６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（４７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１３２．７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２１７．８μｌ、１．７５ｍｍｏｌ、５当量）と２時間反応させる。その後樹脂をＤＭＦで洗浄する（４×２分間）。Ｆｍｏｃ末端基をＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液で脱保護する（５および１５分間）。樹脂をＤＭＦで洗浄する（４×２分間）。樹脂を２つの部分に分け、それぞれＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまたはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨと反応させる。保護されたアミノ酸基４当量、ＨＢＴＵおよびＨＯＢＴ  ４当量ならびにＤＩＥＡ  １２当量を用いて手作業でカップリングを実施する。樹脂をＤＭＦで洗浄する（４×２分間）。Ｆｍｏｃ末端基をＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液で脱保護する（５および１５分間）。次に樹脂をＤＭＦ（４×２分間）、ＣＨ２Ｃｌ２（６×２分間）、エチルエーテルで洗浄し、その後減圧下で乾燥させる。次にペプチドの脱保護および切断を、ペプチド１）に関してはＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＳ：体積比で９４／２．５／２．５／１およびペプチド２）に関してはＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ：体積比で９５／２．５／２．５の溶液で１時間実施する。次にペプチドをＥｔ２Ｏ／ｎ−ヘプタン溶液：体積比で１／１から沈殿させ、水に可溶化して、凍結乾燥する。ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ペプチド１）および２）に関してそれぞれ４１ｍｇ（２０％）および２８ｍｇ（１４％）を得る。
【０２５７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢマトリックス）ペプチド１）：Ｍ計算値＝１５０５．７（Ｃ７４Ｈ１０４Ｎ１６Ｏ１６Ｓ）；ｍ／ｚ＝１５０６．８［Ｍ＋Ｈ］＋；ｍ／ｚ＝１５２８．８［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２５８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢマトリックス）ペプチド２）：Ｍ計算値＝１４８８．７（Ｃ７５Ｈ１０５Ｎ１５Ｏ１７）；ｍ／ｚ＝１４８９．７［Ｍ＋Ｈ］＋；ｍ／ｚ＝１５１１．７［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２５９】
ポリマーＰｓＡｃＡｒ１およびＰｓＡｃＡｒＦ５を９６穴ポリスチレンプレートにおいてＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬの濃度で撹拌下に周囲温度で一晩インキュベートする（１００μＬ／ウェル）。
【０２６０】
次にウェルをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０の溶液で６回洗浄する。プレートを遠心分離機において乾燥させる。
【０２６１】
ペプチド１）および２）を、ｐＨ７．６で、メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）２００ｍＭおよびトリス（カルボキシエチル）ホスフィン８０ｍＭの存在下でリン酸緩衝液２００ｍＭに１０−４Ｍの濃度で可溶化する。これらの溶液を官能基化されたウェルにおいて３７℃で撹拌しながら１０分間インキュベートする（６０μＬ／ウェル）。
【０２６２】
次にウェルをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０の溶液で６回および脱イオン水で３回洗浄する。プレートを遠心分離機において乾燥させる（２５００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間、２０℃）。プレートをＴｅｃａｎ蛍光スキャナーで分析する。
【０２６３】
結果を図１１に示す（ｙ軸に蛍光の強度）。この実施例は、ポリマーＰｓＡｃＡｒＦ５によって官能基化されたポリスチレンプレートのウェルは、システインペプチド１）の結合を可能にするが、対照セリンペプチド２）には結合しないことを明らかにする。２つのペプチドに関して対照ポリマーＰｓＡｃＡｒ１で得られた非常に弱いシグナルは、システインペプチド１）の結合のためにポリスチレン表面に２，５−ジチアゼパン官能基を有することの重要性を示す。
【実施例３４】
【０２６４】
９６穴ポリスチレンプレートの底部における、抗体を有するバイオチップの調製
この実施例では、ウェルを多糖によって官能基化し、次に抗体をプリントしてバイオチップを形成する。これらのタンパク質は非共有結合の形成によって表面に結合する。次にバイオチップを標的タンパク質と共にインキュベートする。
【０２６５】
９６穴ポリスチレンマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ）の８つのウェルを、緩衝液中１０μｇ／ｍＬの濃度のＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１５；０．６４；０．２６）１００μＬで処理する（条件Ａ）。８つのウェルを緩衝液だけで処理する（条件Ｂ）。撹拌下に周囲温度で一晩処理を実施する。
【０２６６】
次にプレートを、プレート洗浄機を用いて緩衝液で洗浄し（２００μＬ／ウェル、撹拌下で３回洗浄）、次にプレート洗浄機を用いて脱イオン水で洗浄する（２００μＬ／ウェル、撹拌下で３回洗浄）。
【０２６７】
次に抗ストレプトアビジン抗体（ウサギ抗ストレプトアビジンポリクローナル抗体、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎ  ｌｉｎｅ、参照番号ＡＢＩＮ１０７０９１）を、緩衝液に可溶化したウェルの底部にプリントする（ウェルにつき３スポット、合計２４スポットに対して８ウェル）。
【０２６８】
２％ＢＳＡを含む緩衝液２００μＬでウェルの飽和を２時間実施する。
【０２６９】
ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加した緩衝液を使用して自動洗浄機で洗浄する（撹拌下で３サイクル）。
【０２７０】
次にストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ、参照番号Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ  ２１１３０）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．２％ＢＳＡを添加した緩衝液中１：１０，０００希釈で１時間インキュベートする（１００μＬ／ウェル）。
【０２７１】
補足的な実験を対照タンパク質：同じ溶液に１：６０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈに関して実施する。
【０２７２】
ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む緩衝液を使用して自動洗浄機で洗浄する（３サイクル）。次にＴＭＢ（３，３’，５，５”−テトラメチルベンジジン）の不溶性溶液と共に周囲温度で１２分間インキュベートする。ウェルを脱イオン水２００μＬで洗浄する。
【０２７３】
濃淡画像を作成することを可能にするＣＣＤカメラ（解像度：３μｍ）を用いて各々のウェルの底部の画像を得る。次にマイクロアレイの定量化のための標準的なソフトウェアによってスポットを定量化する。
【０２７４】
ストレプトアビジン−ＨＲＰとのインキュベーション後のすべてのスポットに関する強度の結果を図１２に示す（ｙ軸に任意単位の強度；Ａ：ＰｓＡｃＡｒＦ１（１．１５；０．６４；０．２６）で処理したウェル；Ｂ：未処理対照ウェル）。対照タンパク質であるヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートとのインキュベーションは、いかなる検出可能なシグナルも生じなかった。
【０２７５】
この図は、ウェルＡ中の抗ストレプトアビジン抗体のスポットに関して得られた平均強度がウェルＢのものよりも有意に高いことを示す。
【０２７６】
各スポットについてのピクセルの標準偏差についての結果（白い円）、ならびにすべてのスポットについての平均および四分位偏差を図１３に示す。スポッティングの質を特徴づける、スポット内のこの標準偏差は、条件Ｂと比較すると条件Ａに関してはるかに低い。
【０２７７】
全体として、これらの結果はバイオチップを調製するための処理Ａの優位性を示す。
【図１】
0006013342.tif 000029
【図２】
0006013342.tif 000030
【図３】
0006013342.tif 000031
【図４】
0006013342.tif 000032
【図５】
0006013342.tif 000033
【図６】
0006013342.tif 000034
【図７】
0006013342.tif 000035
【図８】
0006013342.tif 000036
【図９】
0006013342.tif 000037
【図１０】
0006013342.tif 000038
【図１１】
0006013342.tif 000039
【図１２】
0006013342.tif 000040
【図１３】
0006013342.tif 000041
【配列表】
0006013342000001.app