(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補対象におけるアルツハイマー病の存在または不在を決定する方法であって、
ｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で候補対象由来の末梢細胞中の第１のＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定し、第１の比率を生成することと、
ここで、前記第１の比率は、Ａβペプチドの不在下での第１のＰＫＣアイソザイムのレベルの、Ａβペプチドの存在下での第１のＰＫＣアイソザイムのレベルに対する比率であり；
ｉｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で候補対象由来の末梢細胞中の第２のＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定し、第２の比率を生成することと、ここで、前記第２のＰＫＣアイソザイムは、非ＡＤ細胞と比較して、ＡＤ細胞中でＡβペプチドによって差次的に調節されることが知られておらず、
ここで、前記第２の比率は、Ａβペプチドの不在下での第２のＰＫＣアイソザイムのレベルの、Ａβペプチドの存在下での第２のＰＫＣアイソザイムのレベルに対する比率であり、；
ｉｉｉ）前記第１の比率を前記第２の比率で割ることによってＰＫＣアイソザイムインデックスを生じさせることと、ここで、約１．０または１．０未満のＰＫＣアイソザイムインデックスはアルツハイマー病の診断を示し、１．０よりも大きいＰＫＣアイソザイムインデックスはアルツハイマー病の不在を示す；を含み、
ここで、前記第１のＰＫＣアイソザイムはＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εから選択され、前記第２のＰＫＣアイソザイムはＰＫＣ−γであり、
前記末梢細胞が皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、血球または頬粘膜細胞である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＰＫＣアイソザイムインデックスが、次の式Ｉ：
【数１】
0006013184.tif 000015
ここで、「ｘ」は第１のＰＫＣアイソザイムを表し、「ｚ」は第２のＰＫＣアイソザイムを表し、ＡβはＡβペプチドと接触した細胞を表す；によって表されるＰＫＣアイソザイムの定常状態レベルを用いて生成される方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ＰＫＣアイソザイムインデックスが、次の式ＩＩ：
【数２】
0006013184.tif 000016
ここで、「ｘ」は第１のＰＫＣアイソザイムを表し、「ｚ」は第２のＰＫＣアイソザイムを表し、ＡβはＡβペプチドと接触した細胞を表し、ｐ−ＰＫＣ−ｘおよびｐ−ＰＫＣ−ｚはリン酸化されたＰＫＣアイソザイムを表す；によって表されるＰＫＣアイソザイムのリン酸化レベルを用いて生成される方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ＰＫＣ活性化因子の存在下で、ステップｉおよびｉｉにおける第１のＰＫＣアイソザイムおよび第２のＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定することをさらに含む方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ＡβペプチドがＡβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）である方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、末梢細胞が皮膚線維芽細胞である方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、Ａβペプチドが約１．０ｎＭから１０μＭの濃度で存在する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、Ａβペプチドが約１．０μＭの濃度で存在する方法。
【請求項９】
対象においてアルツハイマー病の進行をモニタリングする方法であって、
ｉ）請求項１に記載の方法に従って、第１の時点で、試験対象の末梢細胞からＰＫＣアイソザイムインデックスを生成して、対象について参照ＰＫＣアイソザイムインデックスを得ることと、ここで、対象は、アルツハイマー病であると診断されている；
ｉｉ）前記第１の時点の後の１または複数の時点で、同じ対象の末梢細胞から同じＰＫＣアイソザイムインデックスを生成することと；
ｉｉｉ）第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、前記第１の時点の後の１または複数の時点から得られたＰＫＣアイソザイムインデックスに減少があるか否かを決定することと；を含み、ここで、第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、第１の時点の後の１または複数の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスの減少は、アルツハイマー病の進行を示す方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、試験対象が、第１の時点で初期アルツハイマー病であると診断されている方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、試験対象が、第１の時点で軽度アルツハイマー病であると診断されている方法。
【請求項１２】
対象において非アルツハイマー病状態からアルツハイマー病への進行をモニタリングする方法であって、
ｉ）請求項１に記載の方法に従って、第１の時点で、試験対象の末梢細胞からＰＫＣアイソザイムインデックスを生成して、対象について参照ＰＫＣアイソザイムインデックスを得ることと、ここで、対象は、アルツハイマー病であると診断されていない；
ｉｉ）第１の時点の後の１または複数の時点で、同じ対象の末梢細胞から同じＰＫＣアイソザイムインデックスを生成することと；
ｉｉｉ）第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、第１の時点の後の１または複数の時点から得られたＰＫＣアイソザイムインデックスに減少があるか否かを決定することと；を含み、ここで、第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、第１の時点の後の１または複数の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスの減少はアルツハイマー病への進行を示す、対象における、非アルツハイマー病状態からアルツハイマー病への進行をモニタリングする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、非アルツハイマー病状態が軽度認識障害である方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、軽度認識障害が健忘性認識障害である方法。
【請求項１５】
１または複数のＡβペプチドと、
ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εから選択される、非ＡＤ細胞と比較してＡＤ細胞においてＡβペプチドによって差次的に調節されることが知られているＰＫＣアイソザイム、に特異的な少なくとも１つの抗体と、
非ＡＤ細胞と比較してＡＤ細胞において前記Ａβペプチドによって差次的に調節されることが知られていないＰＫＣ−γに特異的な少なくとも１つの抗体と、
請求項１に定義されたＰＫＣアイソザイムインデックスを決定するための使用説明書とを含むキット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、ＡβペプチドがＡβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）であるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１０月２日に出願された米国仮特許出願６１／２４８，３６１の利益を主張し、その開示は参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、対象におけるアルツハイマー病を診断するための方法、またはアルツハイマー病の存在もしくは不在を確認するための方法に関する。また、本発明は、アルツハイマー病の治療または予防に有用な治療薬の開発に用いることができるリード化合物をスクリーニングするための方法に関する。さらに、本発明は、定常状態のＰＫＣアイソザイムまたはリン酸化されたＰＫＣアイソザイムのレベルから構築されたアルゴリズム比を用いて、あるＰＫＣアイソザイムのプロセッシングの変化を検出することによって、対象におけるアルツハイマー病を診断するための方法に関する。本明細書に記載されている方法は、アルツハイマー病の診断のため、アルツハイマー病進行のモニタリングのため、およびリード化合物を同定するためのスクリーニング法においてに有用である。また、本発明は、アルツハイマー病の治療に対する高い反応性を有する患者を選択するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
β−アミロイドタンパク質（Ａβ）は、神経原線維変化とともに、アルツハイマー病（ＡＤ）の生理学的特徴である老人斑点の主要な構成物質である。Ｋａｔｚｍａｎ，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８６；３１４：９６４−９７３；Ｂｕｓｈら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９９２；５６：９７−１１７。様々な脳領域におけるＡβの過剰な放出は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の突然変異型によって促進され、老人斑内へのＡβの蓄積の一因となる。Ｗａｌｌａｃｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９４；１２２７：１８３−１８７。線維芽細胞を含む、ＡＤ組織由来の多数の細胞種において、カルシウムの恒常性、イオンチャネル透過性、サイクリックＡＭＰ、ホスホイノシチド代謝物を含むシグナル伝達系の変化が示されている。また、Ａβ産生の変化も示されている。さらに、Ａβ自体は、同じ伝達系に影響を及ぼす可能性がある。
【０００４】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）はプロテインキナーゼの最大の遺伝子ファミリーの１つである。ＬｉｕおよびＨｅｃｋｍａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．１９９８；１０（８）：５２９−４２。いくつかのＰＫＣアイソザイムは脳に発現し、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−βＩ、ＰＫＣ−βＩＩ、ＰＫＣ−δ、ＰＫＣ−ε、およびＰＫＣ−γを含む。ＰＫＣは、主に細胞質タンパク質であるが、刺激により細胞膜に転位置する。
【０００５】
ＰＫＣは、ＡＤに関連した多数の生化学的プロセスに関与することが示されている。ＰＫＣ活性化は学習と記憶の強化において重要な役割を有し、ＰＫＣ活性化因子は記憶と学習を増進することが示されている。ＳｕｎおよびＡｌｋｏｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５；５１２：４３−５１；Ａｌｋｏｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５；１０２：１６４３２−１６４３７。また、ＰＫＣ活性化は、ラットの海馬においてシナプス形成を誘導させることが示され、神経変性の状態中のＰＫＣ媒介性抗アポトーシスおよびシナプス形成の可能性を示唆する。ＳｕｎおよびＡｌｋｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８；１０５（３６）：１３６２０−１３６２５。ＰＫＣ活性化因子であるブリオスタチン−１による虚血後／低酸素治療は、シナプス形成、神経栄養活性、および空間学習と記憶における虚血誘導性の欠損を効果的に救済した。ＳｕｎおよびＡｌｋｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８。この効果は、シナプスタンパク質であるスピノフィリンおよびシナプロフィシンのレベルの増加と、シナプス形態の構造的変化とを伴う。ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７；１０４：１９５７１−１９５７６。また、長期連想記憶に対するブリオスタチン誘導性シナプス形成はＰＫＣ活性化によって調節される。ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ，ＰＮＡＳ  ２００７。さらに、ＰＫＣはニューロトロフィン産生を活性化する。ニューロトロフィン、特に脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）は、損傷されたニューロンおよびシナプスの修復と再成長をイニシエートする主要な増殖因子である。いくつかのＰＫＣアイソザイム、特にＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αの活性化は、恐らくはニューロトロフィンの産生を上方制御することによって、神経障害に対して保護する。Ｗｅｉｎｒｅｂら，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２００４；１８：１４７１−１４７３）。また、ＰＫＣ活性化因子は、チロシンヒドロキシラーゼの発現を誘導し、ニューロン生存と神経突起伸長を誘導することが報告されている。ＤｕおよびＩａｃｏｖｉｔｔｉ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９７；６８：５６４−６９；ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ，ＰＮＡＳ  ２００７；Ｌａｌｌｅｍｅｎｄら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００５；１１８：４５１１−２５。
【０００６】
ＰＫＣ遺伝子ファミリーは、現在１１個の遺伝子からなり、それらは４つのサブグループに分けられる：１）伝統的なＰＫＣ−α、−β１、−β２（β１およびβ２は同一遺伝子の選択的スプライシング形態である）および−γ、２）新規なＰＫＣ−δ、−ε、−ηおよび−θ、３）非定型ＰＫＣ−ζ、−λ、−η、−ι、および４）ＰＫＣ−μ。ＰＫＣ−μは、非定型ＰＫＣアイソザイムに似ているが、推定上の膜貫通ドメインを有することにより異なる。Ｂｌｏｈｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．１９９４；１３：４１１；Ｉｌｕｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９３；２９１：３２９；Ｋｉｋｋａｗａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９；５８：３１。−α、−β１、−β２、および−γアイソザイムは、Ｃａ2+、リン脂質およびジアシルグリセロール依存性であり、ＰＫＣの伝統的なアイソフォームを表し、一方、他のアイソザイムはリン脂質およびジアシルグリセロールによって活性化されるが、Ｃａ2+には依存しない。全てのアイソザイムは、５つの可変（Ｖ１〜Ｖ５）領域を包含し、α、β、γアイソザイムは４つ（Ｃ１〜Ｃ４）の構造ドメインを含み、これらは高度に保存されている。ＰＫＣ−α、−βおよび−γを除く全てのアイソザイムはＣ２ドメインを欠損し、−λおよび−ηアイソザイムは、ジアシルグリセロールが結合するＣ１の２つのシステインに富む亜鉛フィンガードメインの９つを欠損している。また、Ｃ１ドメインは、全てのアイソザイムの中で高度に保存され、および基質結合部位をブロックして酵素の不活性な立体構造を生ることによって自己調節機能の役割をする疑似基質配列を含む。Ｈｏｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８７；２３８：１７２６。
【０００７】
これらの構造的特徴のため、多様なＰＫＣアイソザイムは、生理学的刺激に応答してシグナル伝達において非常に特化された役割を有すると考えられる。刺激に対する種々のＰＫＣアイソザイムの応答はＡＤにおいて研究されている。例えば、ＡＤ患者は、ＰＫＣの主要な下流基質であるＥｒｋ１／２のＰＫＣ−α／ε媒介性リン酸化のレベルが減少している。ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６；１０３：１３２０３−１３２０７。さらに、正常な線維芽細胞へのＡβペプチド適用はＰＫＣ活性を減少させ、これは、ＡβがＰＫＣα／εを直接に下方制御するためである。ＰＫＣ活性化因子、特にＰＫＣα／εに特異的な活性化因子は、Ａβの効果を中和し、それにより、Ａβ誘導による変化を逆転するかまたは妨げることが示されている。
【０００８】
また、ＰＫＣはＡＰＰプロセッシングを調節することが明らかにされている。ＰＫＣ活性化因子は、細胞により分泌された非アミロイド形成性の可溶性ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）の相対量を有意に増加することが示されている。また、ＰＫＣ活性化は、異常なＭＡＰキナーゼのリン酸化を逆転させ、同時にＡＤ線維芽細胞におけるＡβのレベルを上昇した。米国特許出願公開ＵＳ−２００７−００８２３６６を参照されたい。さらに、１つの強力なＰＫＣ活性化因子であるブリオスタチンは、ヒトＡＤ遺伝子を有するトランスジェニックマウスの脳においてＡβ（１−４２）レベルを減少することが見出された。
【０００９】
反対に、Ａβペプチドはまた、非ＡＤ線維芽細胞と比較して、ＡＤ線維芽細胞におけるＰＫＣアイソザイムに差次的に影響を及ぼすことが示されている。Ｆａｖｉｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１９９８．９５：５５６２−６７。ナノモル濃度のＡβ（１−４０）による非ＡＤ（ＡＣ）線維芽細胞の処理により、すでにＡＤ線維芽細胞において低下したＰＫＣ−αの７５％減少をもたらしたが、ＰＫＣ−γの免疫反応性は減少しなかった。対照的に、ＡＤ線維芽細胞において、Ａβ（１−４０）は、ＰＫＣ−γの７０％減少を引き起こしたが、ＰＫＣ−αの免疫反応性は減少しなかった。ＰＫＣ活性化因子による処理は、ＡＣ細胞においてＰＫＣ−αシグナルを回復したが、ＡＤ細胞におけるＰＫＣ−γにおける効果を逆転しなかった。タンパク質合成阻害剤を用いた処理は、ＡＤ細胞におけるＡβ（１−４０）の効果を阻害しなかったが、ＰＫＣ活性化因子を用いて処理されたＡＣ細胞における効果を阻害し、これは、ＰＫＣ活性化が、ＡＤ細胞ではなく、正常な細胞においてデノボのタンパク質合成を介した保護的役割を与えることを示唆した。
【００１０】
本発明は、末梢細胞における種々のＰＫＣアイソザイムのレベルにおけるＡβ誘導性の変化の効果を利用するための方法を提供する。定常状態のＰＫＣアイソザイムおよび／またはリン酸化されたＰＫＣアイソザイムのレベルの測定、ならびにＡβ誘導性の変化の測定は、ＡＤの診断、ＡＤの進行または非ＡＤ状態からＡＤへの進行のモニタリングのために、並びにＡＤを治療する治療薬を見つけるためのスクリーニング法において用いることができる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、対象におけるアルツハイマー病の存在もしくは不在を決定または確認するための方法に関する。１つの実施形態において、本方法は、ｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で候補対象由来の細胞において第１のＰＫＣアイソザイムの定常状態のタンパク質レベルを決定して、第１の比を生成することと；ｉｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で第２のＰＫＣアイソザイムの定常状態のタンパク質レベルを決定して、第２の比を生成することと、ここで、該第２のＰＫＣアイソザイムはＡβペプチドによって調節されることが知られていない；ｉｉｉ）第１の比を第２の比で割ることによってＰＫＣアイソザイムインデックスを生成することとを含む。
【００１２】
１つの実施形態において、ＡβペプチドはＡβ（１−４２）であるが、いずれのＡβペプチドを用いてもよい。
【００１３】
別の実施形態において、第１のＰＫＣアイソザイムはＰＫＣ−α、および／またはＰＫＣ−εであり、第２のＰＫＣアイソザイムはＰＫＣ−γである。
【００１４】
１つの特定の実施形態において、ＰＫＣアイソザイムインデックスは、定常状態のＰＫＣアイソザイムレベルの微分処理であり、以下の式：
【数１】
0006013184.tif 000002
【００１５】
に従って決定される。
【００１６】
さらなる実施形態において、試験対象からのＰＫＣ−αインデックスは、非ＡＤの対照対象由来の細胞のＰＫＣ−αインデックスと比較される。特定の実施形態において、対照対象の細胞は同じ細胞種のものであり、年齢が一致した非ＡＤの対照対象（ＡＣ）由来である。
【００１７】
１つの実施形態において、対照対象（ＡＣ）の細胞由来のＰＫＣ−αインデックスよりも低い、試験対象の細胞由来のＰＫＣ−αインデックスはＡＤを示す。
【００１８】
別の特定の実施形態において、対象は、ＰＫＣ−αインデックス値が約１．０よりも大きいときにＡＤであると診断される。
【００１９】
別の特定の実施形態において、定常状態のＰＫＣアイソザイムレベルの微分処理は、以下の式：
【数２】
0006013184.tif 000003
【００２０】
に従った比を用いて決定される。
【００２１】
さらなる実施形態において、試験対象からのＰＫＣ−εインデックスは、非ＡＤの対照対象由来の細胞のＰＫＣ−εインデックスと比較される。特定の実施形態において、対照対象由来の細胞は、同じ細胞種のものであり、年齢が一致した非ＡＤの対照対象（ＡＣ）由来である。
【００２２】
１つの実施形態において、対照対象（ＡＣ）由来の細胞からのＰＫＣ−εインデックスよりも低い、試験対象由来の細胞からのＰＫＣ−εインデックスはＡＤを示す。
【００２３】
別の特定の実施形態において、対象は、ＰＫＣ−εインデックス値が約１．０よりも大きいときにＡＤであると診断される。
【００２４】
別の特定の実施形態において、本方法は、ｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で候補対象由来の細胞における第１のリン酸化されたＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定して、第１の比を生成することと；ｉｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で第２のリン酸化されたＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定して、第２の比を生成することと、ここで、第２のＰＫＣアイソザイムはＡβペプチドによって調節されることが知られていない；ｉｉｉ）第１の比を第２の比で割ることによってリン酸化されたＰＫＣアイソザイムインデックスを生成することと、を含む。
【００２５】
特定の実施形態において、リン酸化されたＰＫＣ（ｐ−ＰＫＣ）アイソザイムインデックスは、リン酸化されたＰＫＣアイソザイムの微分処理であり、以下の式：
【数３】
0006013184.tif 000004
【００２６】
に従って決定される。
【００２７】
さらなる実施形態において、試験対象からのｐ−ＰＫＣ−αインデックスは、非ＡＤの対照対象由来の細胞のｐ−ＰＫＣ−αインデックスと比較される。特定の実施形態において、対照対象の細胞は同じ細胞種のものであり、年齢が一致した非ＡＤの対照対象（ＡＣ）由来である。
【００２８】
１つの実施形態において、対照対象（ＡＣ）由来の細胞のｐ−ＰＫＣ−αインデックスよりも低い、試験対象由来の細胞のｐ−ＰＫＣ−αインデックスはＡＤを示す。
【００２９】
別の特定の実施形態において、対象は、ｐ−ＰＫＣ−αインデックス値が約１．０より大きいときにＡＤであると診断される。
【００３０】
別の特定の実施形態において、リン酸化されたＰＫＣアイソザイムの微分処理は、以下の式：
【数４】
0006013184.tif 000005
【００３１】
に従った比を用いて決定される。
【００３２】
さらなる実施形態において、試験対象からのｐ−ＰＫＣ−εインデックスは、非ＡＤの対照対象由来の細胞のｐ−ＰＫＣ−εインデックスと比較される。特定の実施形態において、対照対象の細胞は同じ細胞種のものであり、年齢が一致した非ＡＤの対照対象（ＡＣ）由来である。
【００３３】
１つの実施形態において、対照対象（ＡＣ）由来の細胞のｐ−ＰＫＣ−εインデックスよりも低い、試験対象由来の細胞からのｐ−ＰＫＣ−εインデックスはＡＤを示す。
【００３４】
別の特定の実施形態において、対象は、ｐ−ＰＫＣ−εインデックス値が約１．０よりも大きいときにＡＤであると診断される。
【００３５】
またさらなる特定の実施形態において、対象細胞は、Ａβの不在下および存在下で第１および／または第２のＰＫＣアイソザイムのリン酸化を誘導するのに十分な濃度でＰＫＣ活性化因子と接触され、上記の式１、２、３および／または４に従ってＰＫＣインデックスが決定される。
【００３６】
さらなる実施形態において、上記の式によって決定されたインデックスは、非ＡＤの対照対象由来の細胞のインデックスと比較される。特定の実施形態において、細胞は同じ細胞種のものであり、年齢が一致した非ＡＤの対照対象（ＡＣ）由来である。
【００３７】
別の特定の実施形態において、本発明は、軽度認識障害（ＭＣＩ）などの前ＡＤ状態からＡＤへの進行、または初期状態ＡＤなどの当該疾患の初期状態からＡＤへの進行を上記した方法を用いてモニタリングするための方法を提供する。この実施形態において、本発明の方法は、時間間隔をおいて繰り返され、経時的なＰＫＣインデックスの減少は、非ＡＤからＡＤへの進行、または初期段階から後期段階へのＡＤの進行を示す。
【００３８】
本発明のある実施形態において、診断アッセイに用いられる細胞は末梢細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、血球または頬粘膜細胞である。
【００３９】
特定の実施形態において、細胞は皮膚線維芽細胞である。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、ＡＤの治療に有用なリード化合物を同定するための方法を提供し、それは、ＡＤであると診断された対象から単離された細胞と試験化合物とを接触させ、次に、ｉ）式１に従うＰＫＣ−αインデックスにおける効果；ｉｉ）式２に従うＰＫＣ−εインデックスにおける効果；ｉｉｉ）式３に従うｐ−ＰＫＣ−αインデックスにおける効果；および／またはｉｖ）式４に従うｐ−ＰＫＣ−εインデックスにおける効果；を決定することを含み、ここで、ＰＫＣインデックス（またはインデックスの組み合わせ）は、試験化合物の不在下で測定された同じインデックス（単数または複数）と比較して、試験化合物の存在下で増大する。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は、ＡＤの検出または診断に有用な試薬を含むキットまたは器具を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、Ａβ（１−４０）および／またはＡβ（１−４２）などの１つまたは複数のＡβペプチド；定常状態のＰＫＣアイソザイムおよびリン酸化されたＰＫＣアイソザイムに特異的な抗体；イムノアッセイにおける対照として用いるためのＰＫＣアイソザイムの１または複数のタンパク質試料；イムノアッセイを行うための使用説明書、結果を評価するための基準を含む使用説明書を含む。
【００４２】
さらなる実施形態において、キットはまた、皮膚のパンチ生検などの１つまたは複数の生検を行うために必要な使用説明書と、緩衝液と、保存容器とを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＡＤ細胞と、年齢が一致した対照細胞（ＡＣ）との間のＰＫＣ−αインデックス（式１）の比較を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、ある態様において、試験および診断のために同定された対象から採取されたヒト細胞におけるアルツハイマー病を診断するための方法に関する。この診断は、対象から採取された末梢細胞における定常状態のＰＫＣまたはリン酸化されたＰＫＣのいずれかの差次的なレベル、ならびにそれらにおけるＡβ誘導性の変化を使用してアルゴリズム比を構築し、対象がＡＤを有するか否かを決定することができるという発見に基づいている。
【００４５】
本方法は、候補対象由来の末梢細胞、任意に非ＡＤの対照対象（ＡＣ）由来の末梢細胞における定常状態のＰＫＣアイソザイムまたはリン酸化されたＰＫＣアイソザイムのレベルの測定に依存する。連続してまたは同時に、第１のＰＫＣアイソザイムの定常レベルは、Ａβペプチドの不在下と存在下の両方でＡＤ対象およびＡＣ対象由来の末梢細胞において測定され、ＰＫＣアイソザイムレベルの第１の比（Ａβペプチドの不在下でのＰＫＣアイソザイムレベル／Ａβペプチドの存在下でのレベル）を生じさせる。また、第２のＰＫＣアイソザイム比は、再度、Ａβペプチドの不在下および存在下で、対象由来の末梢細胞における第２のＰＫＣアイソザイムの定常状態レベルまたはリン酸化レベルを測定することによって得られる。次に、これらの測定の結果は第３の比を構築するために使用され、このとき、第１の比（Ａβペプチドと接触していない細胞において得られた第１のＰＫＣアイソザイムのレベル／Ａβペプチドと接触した細胞において得られた第１のＰＫＣアイソザイムのレベル）を第２の比（Ａβペプチドと接触していない細胞における第２のＰＫＣアイソザイムのレベル／Ａβペプチドと接触した細胞における第２のＰＫＣアイソザイムのレベル）で割り、ＰＫＣアイソザイムインデックスが生成される。このＰＫＣアイソザイムインデックスは、以下の一般式：
【数５】
0006013184.tif 000006
【００４６】
または
【数６】
0006013184.tif 000007
【００４７】
を用いて生成することができ、ここで、「ｘ」は対象のＰＫＣアイソザイムを表し、「ｚ」は第２のＰＫＣアイソザイムを表し、「ｐ−ＰＫＣ−ｘ」および「ｐ−ＰＫＣ−ｚ」はリン酸化されたＰＫＣアイソザイムを表し、ＡβはＰＫＣアイソザイムのレベルがＡβペプチドの存在下で決定される細胞を表す。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＰＫＣ−ｘおよびｐ−ＰＫＣ−ｘは、非ＡＤ細胞と比較して、ＡＤにおけるＡβペプチドによって差次的に影響を受けることが知られているＰＫＣアイソザイムを表し、ＰＫＣ−ｚおよびＰＫＣ−ｚは、非ＡＤ細胞と比較して、ＡＤにおいてＡβペプチドによって差次的に影響を受けることが知られていないＰＫＣアイソザイムを表す。具体的には、ＰＫＣ−ｘはＰＫＣ−αまたはＰＫＣ−εであり、ＰＫＣ−ｚはＰＫＣ−γであると考えられる。
【００４９】
１つの特定の実施形態において、本発明は、以下の式１：
【数７】
0006013184.tif 000008
【００５０】
に従ってＰＫＣ−αインデックスを生じることによって、ＡＤの存在または不在を診断するための方法を提供する。
【００５１】
予想外に、非ＡＤ対象からのＰＫＣ−αインデックスは、非ＡＤ認知症または健忘症を有する対象を含めて、ＡＤを有する患者からの同じＰＫＣインデックスよりも高くなることが発見された。
【００５２】
１つの実施形態において、ＰＫＣ−αインデックス値が約１．０またはそれ未満であるとき、これはＡＤであると診断される。
【００５３】
別の特定の実施形態において、本発明は、以下の式２：
【数８】
0006013184.tif 000009
【００５４】
に従ってＰＫＣ−εインデックスを生じることによって、ＡＤの存在または不在を診断するための方法を提供する。
【００５５】
予想外に、非ＡＤ対象からのＰＫＣ−εインデックスは、非ＡＤ認知症または健忘症を有する対象を含めて、ＡＤを有する患者からの同じＰＫＣインデックスよりも高くなることが発見された。
【００５６】
１つの実施形態において、ＰＫＣ−εインデックス値が約１．０またはそれ未満であるとき、これはＡＤであると診断される。
【００５７】
また、本発明の方法は、ＰＫＣ活性化因子との組み合わせにおいて用いることができる。この実施形態において、細胞は、Ａβの不在下または存在下でＰＫＣ活性化因子と接触し、上記の式ＩおよびＩＩに従うＰＫＣアイソザイムのレベルを用いて、本発明のＰＫＣインデックスを決定することになる。
【００５８】
本発明の診断方法、キット、および化合物を同定するためのスクリーニング法に使用することが具体的に意図されるプロテインキナーゼＣ活性化因子には、これらに限定するものではないが、大環状ラクトン、ベンゾラクタム、またはピロリジノン；ブラジキニン；ブリオスタチン１；ブリオスタチン２〜１８；ネリスタチン；ホルボールエステル；ブラジキニン、ボンベシン、コレシストキニン、トロンビン、プロスタグランジンＦ２αおよびバソプレッシンを含む。また、ブリオスタチンの誘導体である「ブリオログ（ｂｒｙｏｌｏｇ）」として知られている化合物も含まれる。ブリオスタチン−１は２つのピラン環と１つの６員環状アセタールを有するが、大部分のブリオログにおいては、ブリオスタチン−１のピランの１つが第２の６員アセタール環で置換されている。ＰＣＴ  ＷＯ２００８／１００４４９を参照されたい。最後に、エポキシ化され、シクロプロパン化された多価不飽和脂肪酸は、ＰＫＣ−ε選択的活性化因子として同定されている。２００９年７月２８日に出願された、係属中のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ  ＵＳ／２００９／０５１９２７を参照されたい。
【００５９】
本発明に従うと、用語「ＰＫＣアイソザイム」とは、−α、−β１、−β２、−γ、−δ、−ε、−η、−θ、−ζ、−λ、−η、−ι、および−μアイソザイムを意味する。特定の実施形態において、ＰＫＣアイソザイムなる用語は、−α、−β、−γ、−δ、および−εを意味する。
【００６０】
用語「Ａβペプチド」とは、膜タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来の３９〜４３アミノ酸長であるペプチドを意味し、それは、アルツハイマー病患者の脳におけるアミロイドプラークの主要な構成物質であると考えられる。特定の実施形態において、本発明の方法に使用されるＡβペプチドは、Ａβ（１−４０）および／またはＡβ（１−４２）である。用語「アミロイドベータペプチド」、「ベータアミロイドタンパク質」、「ベータアミロイドペプチド」、「ベータアミロイド」は互換可能に使用される。ＡＰＰの多数のイソフォームが存在し、例えば、ＡＰＰ695、ＡＰＰ751、およびＡＰＰ770が存在する。ヒトにおいて存在することが現在知られているＡＰＰの特定のイソタイプの例は、「正常な」ＡＰＰとして指定されている、Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ．１９８７；３２５：７３３−７３６によって報告されている６９５アミノ酸ポリペプチド；Ｐｏｎｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ．１９８８；３３１：５２５−５２７およびＴａｎｚｉら，Ｎａｔｕｒｅ．１９８８；３３１：５２８−５３０によって報告されている７５１アミノ酸ポリペプチド；ならびにＫｉｔａｇｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ．１９８８；３３１：５３０−５３２によって報告されている７７０アミノ酸ポリペプチドである。インビボまたはインサイチュにおける異なるα−およびβ−セクレターゼ酵素によるＡＰＰのタンパク質分解プロセッシングの結果として、Ａβは、長さにして４０アミノ酸である「短鎖型」と、長さにして４２〜４３アミノ酸の範囲である「長鎖型」の両方において見出される。
【００６１】
Ａβペプチドは、例えば、ｒＰｅｐｔｉｄｅｓ（Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡ）またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販されている。さらに、Ａβペプチドは、既知の方法に従った組換え工学技術を用いて合成または生成され得る。
【００６２】
また、本発明は、対象におけるＡＤの進行をモニタリングするための方法を提供する。初期ＡＤまたは軽度ＡＤから中程度ＡＤまたは重傷ＡＤへなどのＡＤ進行として、上記されるように決定されるＰＫＣアイソザイムインデックスは、初期段階のＡＤからのＰＫＣアイソザイムインデックス値、または前ＡＤ状態からのＰＫＣアイソザイムインデックス値と比較して、減少するか、またはマイナスにすらなることが期待される。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「初期段階のアルツハイマー病」とは疾患の段階を意味する。初期段階のＡＤおよび関連した認知症を有する人々は、この疾患の症状に起因して軽度の機能障害のみを有する。これらの人々はそれにも拘らず働き、運転し、日常生活のある活動に伴う最小限の支援のみを必要とする。この段階にある個体は、多くの場合、それらの診断および能力を自分で認識している。
【００６４】
「軽度のアルツハイマー病」とは、認知低下がより明らかとなった段階を意味する。軽度ＡＤを有する対象は、最近の出来事または個人的な詳細について忘れがちであるときがある。他の問題には、数学的能力の機能障害（例えば、１００から９ずつ差し引く計算の困難性）、パーティーを開くまたは財務管理のような複雑な課題を行う能力の低下、むら気、および社会的引きこもりが含まれる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「非ＡＤ認知症」とは、ＡＤを伴う症状を共有する状態を意味する。これらの状態には、軽度認識障害、血管性認知症、例えば脳卒中または頭部外傷によって引き起こされる血管性認知症、混合型認知症、レヴィー小体を伴う認知症、パーキンソン病、前頭側頭認知症、クロイツフェルト−ヤコブ病または別の感染病、ピック病、ハンチントン病、ウェルニッケ−コルサコフ症候群が挙げられる。
【００６６】
「軽度認識障害」とは、加齢に伴う通常期待されるよりも多い記憶障害によって特徴付けられる状態を意味するが、判断または推論の機能障害などの認知症の他の症状を示さないものを指す。正常な高齢者人口では１％であるのとは対照的に、ＭＣＩを患っている人々の１０〜１５％が毎年ＡＤを発症している。「健忘性ＭＣＩ」は、短期記憶喪失を伴うあるＭＣＩである。
【００６７】
本発明に従う「非ＡＤの対照対象」は、ＡＤであると診断されておらず、およびＡＤであることが疑われていない対象を意味する。このような対象は、非ＡＤ認知症または健忘症を有する対象を含んでもよい。
【００６８】
本発明の方法において、個体または患者から採取される末梢細胞は何れかの生存細胞であってもよい。１つの実施形態において、細胞は皮膚線維芽細胞であるが、何れかの他の末梢組織細胞（すなわち、中枢神経系を除く組織細胞）は、そのような細胞を得るまたは処理するのにより便利であるときには、本発明の試験に用いられてもよい。他の適切な細胞は、これらに限定するものではないが、赤血球およびリンパ球などの血球、頬粘膜細胞、嗅覚ニューロンなどの神経細胞、脳脊髄液、尿および何れか他の末梢細胞種を含む。さらに、比較の目的で使用される細胞は、必ずしも健常ドナー由来でなくてもよい。
【００６９】
細胞は新鮮な細胞であっても、培養された細胞であってもよい（米国特許６，１０７，０５０を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。特定の実施形態において、皮膚のパンチ生検を用いて、対象由来の皮膚線維芽細胞を得ることができる。これらの線維芽細胞は、本明細書に記載される技術を用いて直接分析されるか、または細胞培養の状況に導入される。次に、得られた培養線維芽細胞は、実施例および本明細書を通して記載されるように、分析される。他の段階が、頬粘膜細胞、嗅覚細胞などの神経細胞、赤血球およびリンパ球などの血球などの、分析に用いられてもよい他の細胞種を調製するために必要とされてもよい。例えば、血球は、末梢静脈から採血することによって容易に得ることができる。次に、細胞は、標準的な手順（例えば、細胞ソーター、遠心分離などを用いて）によって分離され、その後、分析され得る。
【００７０】
本発明の方法に従うと、使用されるＡβペプチドの濃度は、約１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜１０μＭであってもよい。細胞は、処理されるときに約８０〜１００％コンフルエントでなければならない。
【００７１】
当業者に知られている慣用な方法によって、タンパク質を細胞から単離してもよい。好ましい方法において、患者から単離された細胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でペレットにする。次に、５０ｎＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、５０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４を含む「均質化緩衝液」でペレットを洗浄し、遠心分離によってペレットにする。上清を捨て、「均質化緩衝液」をペレットに添加し、次に、ペレットを超音波処理する。タンパク質抽出物を新鮮な状態で用いてもよく、または後の分析のために−８０℃で保存されてもよい。
【００７２】
本発明の方法において、開示されているイムノアッセイに用いられる抗体は、起源はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体を生成させるために使用される、リン酸化された、およびリン酸化されていないＰＫＣアイソザイム、タンパク質またはそれらの一部は、天然供給源もしくは組換え供給源由来であってもよく、または化学合成によって生成されてもよい。
【００７３】
本発明の診断法のある実施形態において、ＰＫＣアイソザイムタンパク質はイムノアッセイによって検出される。本発明のある実施形態において、イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫電気泳動アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイであってもよい。本発明の診断法のさらなる好ましい実施形態において、タンパク質アレイまたはペプチドアレイまたはタンパク質マイクロアレイが診断法に用いられてもよい。タンパク質定量は、例えば、密度測定法または分光光度法を用いて評価されてもよい。
【００７４】
さらに、本明細書に開示されている方法は、他の診断法との組み合わせにおいて用いることができ、例えば、アルツハイマー病を診断するための線維芽細胞増殖パターンに関して、２００９年１０月２日に出願された、「アルツハイマー病を診断するための線維芽細胞増殖パターン（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」と題する米国仮特許出願６１／２４８，３６８、６１／３４４，０４５、６１／３６２，５１８、および６１／３６５，５４５に基づく出願に記載されている診断法がある。本発明の方法との組み合わせにおいて使用することが考えられる他の方法は、Ａｌｋｏｎらによる米国特許７，６８２，８０７、ならびにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８１６０およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６０１４に記載されている。
【００７５】
また、本発明は、ある実施形態において、ＡＤの検出または診断に有用な試薬を含むキットまたは器具に関する。例えば、キットは、１つまたは複数のＡβペプチド、例えば、Ａβ（１−４０）および／またはＡβ（１−４２）；定常状態のＰＫＣアイソザイムおよびリン酸化されたＰＫＣアイソザイムに特異的な抗体；イムノアッセイにおける対照として使用するためのＰＫＣアイソザイムの１つまたは複数のタンパク質試料；ならびにイムノアッセイを行うための使用説明書および結果を評価するための基準を含む使用説明書を含む。また、キットは、本明細書に開示されているプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブラジキニンまたはブリオスタチン）の何れか１つまたは複数を含んでもよい。キットは、皮膚のパンチ生検などの１つまたは複数の生検を行うために必要な器具と、緩衝液と、保存容器とを含んでもよい。また、キットは、緩衝液、二次抗体、対照細胞などを含んでもよい。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、ＡＤの治療に有用なリード化合物を同定するためのスクリーニング法、およびそれを必要とする対象におけるＡＤの治療または予防のための医薬製剤においてこれらの化合物またはリード化合物の化学的誘導体を使用する方法に関する。治療物質を同定するためのこのようなスクリーニング法の１つは、ＡＤ患者由来の試料細胞と、本明細書においてスクリーニングされる物質とを接触させる工程と、次に、ＰＫＣインデックスを決定する工程とを含む。非ＡＤ対照細胞に見出されるレベルに戻るまで、ＡＤのＰＣＫインデックス値を逆転するかまたは改善する薬物は、ＡＤの治療または予防に潜在的に有用な物質として同定および選択される。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「リード化合物」は、本明細書において開示されている化合物をスクリーニングする方法を用いて同定される化合物である。リード化合物は、本明細書に開示されているアルツハイマー病特異的な分子バイオマーカー、すなわちＰＫＣインデックスを、本明細書に記載されているアッセイにおいて、非アルツハイマー病細胞について計算された値に対応する値にシフトさせる活性を有することができる。リード化合物は、続いて、化学的に修飾されて、アルツハイマー病の治療または予防用の医薬組成物に使用するために最適化されるかまたはそれらの活性を高められてもよい。
【００７８】
生きているヒトの脳におけるニューロンへの直接的なアクセスは不可能であるため、アルツハイマー病の早期診断は非常に困難である。本明細書に開示されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを測定することによって、本発明は、アルツハイマー病の早期診断のために非常に実践的な、非常に特異的な、非常に選択的な試験を提供する。さらに、本明細書に記載されているアルツハイマー病に特異的なＰＫＣインデックスは、疾患の進行を追跡し、アルツハイマー病の治療および予防を標的とする薬物を開発するための候補治療薬を同定するための基礎を提供する。
【００７９】
本発明の多大な利点は、本明細書に開示されているアッセイおよび方法に用いられる組織が、最小限の侵襲性の手順を用いて、すなわち脊椎穿刺を用いずに、対象から得ることができることである。
【００８０】
［例］
例１：アルツハイマー病末梢細胞における異常なＰＫＣアイソザイムプロセッシング
原理：ＰＫＣシグナル伝達経路は、アルツハイマー病（ＡＤ）の学習および記憶、並びに神経変性病理学における重要な分子イベントを制御する。ＰＫＣアイソザイムの因果的役割は、ＡＤ患者の死後脳、皮膚線維芽細胞および血液試料の欠損と関係している。Ｅｒｋのリン酸化を直接的または間接的に介するＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εが、α、βおよびγセクレターゼの翻訳後のプロセッシングに関与する全ての主要な経路を制御し、それはＡβの産生を制御する。ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εアイソザイムにおけるＡβ処理の効果は、ＰＫＣ−γと比較してより重大である。いくつかの診断法は、内部標準としてＰＫＣ−γを用いて調べられている。本発明は、末梢組織を用いて、年齢が一致した対照（ＡＣ）症例および他の非ＡＤ認知症症例からＡＤを診断する方法に関する。これらの方法は、ＡＤを治療または予防するための化合物についてスクリーニングするために使用することができる。
【００８１】
細胞試料。本発明の方法に用いられる試料は、以下の通りであった：
（１）１０例のＡＤ、１０例のＣ、１０例の非ＡＤ認知症；
（２）９０％コンフルエントの皮膚線維芽細胞；
（３）処置：２４時間、１μＭのＡβ（１−４２）。
【００８２】
皮膚線維芽細胞は２種の異なる供給源から得られた：（Ａ）新たに得られた皮膚線維芽細胞  新鮮な皮膚線維芽細胞はＢＲＮＩ系統機関への登録、およびジョーンズホプキンス大学とその系統センターから得られた；および（Ｂ）コーリエル医学研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ニュージャージー州カムデン）から購入されたバンク保存のヒト皮膚線維芽細胞。新たに得られた皮膚組織からの線維芽細胞の回収および培養を以下の通りに行った：ＡＤ、非ＡＤ認知症患者、および年齢が一致した対照からの皮膚組織のパンチ生検試料は、有資格者によって採取された。即ち、皮膚組織の外側角質層（生検試料）は、冷却した生理食塩水溶液によって完全にすすがれた後に除去された。この組織の残りの部分を小片（約１ｍｍ）にミンスした。小片をＴ−２５（２５平方ｃｍ）の細胞培養フラスコに維持した。培養フラスコの表面に細胞を数時間付着させた。４５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含む３ｍＬのＤＭＥＭ培養液をフラスコに注意深く加え、５％ＣＯ2および３７℃のインキュベータ内に３日間配置した。３日後、５ｍＬの追加の培養培地を添加した。全てのフラスコは定期的に検査され、７〜１０日後にそれらはコンフルエントになった。細胞をトリプシン処理し、細胞の数に従って増殖させた。細胞継代の総数は１６を超えないようにした。ＡＤ患者のバンク保存された線維芽細胞および年齢が一致した対照は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培養培地を含むＴ２５／Ｔ７５培養フラスコ中に維持および培養された。細胞継代の総数は１６を超えないようにした。
【００８３】
Ａβペプチド処理。ＡＤおよび対照患者由来の線維芽細胞株は、９０〜１００％のコンフルエントに到達した後、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養培地中で５％ＣＯ2および３７℃のインキュベータ内で２４時間、１．０μＭのＡβ（１−４２）（アメリカンペプチドカンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カリフォルニア州サニーベール）で処理された。１．０μＭのＡβ（１−４２）とのインキュベーションの２４時間後、培地を取り除き、血清を含まない通常の培養培地で３回洗浄し、１６時間維持した。
【００８４】
ＰＫＣアイソザイムの検出：以下のアッセイに記載されているＰＫＣアイソザイムをウェスタンブロット（イムノブロット）によって検出した。
【００８５】
アッセイ１：ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−γおよびＰＫＣ−ε；
アッセイ２：ｐ−ＰＫＣ−α、ｐ−ＰＫＣ−γおよびｐ−ＰＫＣ−ε；
アッセイ３：ＰＫＣ転位置。
【００８６】
タンパク質抽出は従来報告されるように行われた（Ｆａｖｉｔら，ＰＮＡＳ，１９９８，上述）。即ち、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、０．０４ＭのＥＤＴＡ、０．８Ｍのスクロース、０．０１Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２．４単位／ｍｌのアプロチニン、および１％のＳＤＳを含む均質化緩衝液中にペレットを再懸濁し、超音波処理（ウルトラソニックホモジナイザー（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ），Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）した。決められた方法に従って、タンパク質濃度を決定した。イムノブロット分析を行う直前に粗抽出物を４℃に置いた。
【００８７】
ウェスタンブロット分析について、１．５ｍｍ厚の１０％アクリルアミド勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンディエゴ）内でＳＤＳ／ＰＡＧＥを行った。粗ホモジネートは、０．５ＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％のグリセロールおよび２％のＳＤＳ、０．５％の２−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液で平衡化し、最終体積を２０ｍｌとし、総タンパク質濃度を１０μｇ／ｍｌとした。試料を電気泳動し、ニトロセルロースペーパー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一晩転写した。ニトロセルロースを１％ＢＳＡ／９５％ＴＢＳ中で１時間ブロックし、次に、異なるＰＫＣアイソザイムモノクローナル抗体（ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−γ、およびＰＫＣ−ε；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ケンタッキー州レキシントン）と１時間インキュベートした。その後、ブロットを抗マウスアルカリホスファターゼと結合された抗体（Ｓｉｇｍａ）と１時間インキュベートした。最後に、０．１ＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９．６）、０．００１ＭのＭｇＣｌ、１％のニトロブルーテトラゾリウム（Ｐｉｅｒｃｅ）および１％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸トルイジン塩（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む溶液でニトロセルロースを染色した。全ての反応を室温で行った。イムノブロットは、フラットベットスキャナ上でデジタル化され、以下のように定量分析によって分析された。
【００８８】
アッセイ１；総ＰＫＣ
【数９】
0006013184.tif 000010
【００８９】
このアッセイの結果を図１に示す。ＡＤ患者の細胞中のＰＫＣ−αインデックスは、非ＡＤの対照対象から得られたＰＫＣ−αインデックスよりも有意に低いことが示される。
【数１０】
0006013184.tif 000011
【００９０】
アッセイ２：ホスホ−ＰＫＣ
【数１１】
0006013184.tif 000012
【００９１】
特許、特許出願、刊行物、製品説明書、およびプロトコールが本出願の全体に亘り引用され、それらの開示は全ての目的のためにその全体に亘り参照することにより本明細書に組み込まれる。
以下に、本願の出願当初の請求項を、実施の態様として付記する。
［１］  候補対象におけるアルツハイマー病の存在または不在を決定する方法であって、
ｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で候補対象由来の末梢細胞中の第１のＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定し、第１の比を生成することと；
ｉｉ）Ａβペプチドの不在下および存在下で候補対象由来の末梢細胞中の第２のＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定し、第２の比を生成することと、ここで、前記第２のＰＫＣアイソザイムは、非ＡＤ細胞と比較して、ＡＤ細胞中でＡβペプチドによって差次的に調節されることが知られていない；
ｉｉｉ）前記第１の比を前記第２の比で割ることによってＰＫＣアイソザイムインデックスを生じさせることと、ここで、約１．０または１．０未満のＰＫＣアイソザイムインデックスはアルツハイマー病の診断を示し、１．０よりも大きいＰＫＣアイソザイムインデックスはアルツハイマー病の不在を示す；を含む方法。
［２］  ［１］に記載の方法であって、ＰＫＣアイソザイムインデックスが、次の式Ｉ：
【数１２】
0006013184.tif 000013
ここで、「ｘ」は第１のＰＫＣアイソザイムを表し、「ｚ」は第２のＰＫＣアイソザイムを表し、ＡβはＡβペプチドと接触した細胞を表す；によって表されるＰＫＣアイソザイムの定常状態レベルを用いて生成される方法。
［３］  ［１］に記載の方法であって、ＰＫＣアイソザイムインデックスが、次の式ＩＩ：
【数１３】
0006013184.tif 000014
ここで、「ｘ」は第１のＰＫＣアイソザイムを表し、「ｚ」は第２のＰＫＣアイソザイムを表し、ＡβはＡβペプチドと接触した細胞を表し、ｐ−ＰＫＣ−ｘおよびｐ−ＰＫＣ−ｚはリン酸化されたＰＫＣアイソザイムを表す；によって表されるＰＫＣアイソザイムのリン酸化レベルを用いて生成される方法。
［４］  ［１］に記載の方法であって、ＰＫＣ活性化因子の存在下で、ステップｉおよびｉｉにおける第１のＰＫＣアイソザイムおよび第２のＰＫＣアイソザイムのタンパク質レベルを決定することをさらに含む方法。
［５］  ［１］に記載の方法であって、第１のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−αであり、第２のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
［６］  ［１］に記載の方法であって、第１のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−εであり、第２のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
［７］  ［２］に記載の方法であって、第１のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−αであり、第２のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
［８］  ［２］に記載の方法であって、第１のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−εであり、第２のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
［９］  ［３］に記載の方法であって、第１のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−αであり、第２のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
［１０］  ［３］に記載の方法であって、第１のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−εであり、第２のＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
［１１］  ［１］に記載の方法であって、ＡβペプチドがＡβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）である方法。
［１２］  ［１］に記載の方法であって、末梢細胞が皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、血球または頬粘膜細胞である方法。
［１３］  ［１２］に記載の方法であって、末梢細胞が皮膚線維芽細胞である方法。
［１４］  ［１］に記載の方法であって、Ａβペプチドが約１．０ｎＭから１０μＭの濃度で存在する方法。
［１５］  ［１４］に記載の方法であって、Ａβペプチドが約１．０μＭの濃度で存在する方法。
［１６］  対象においてアルツハイマー病の進行をモニタリングする方法であって、
ｉ）［１］に記載の方法に従って、第１の時点で、試験対象の末梢細胞からＰＫＣアイソザイムインデックスを生成して、対象について参照ＰＫＣアイソザイムインデックスを得ることと、ここで、対象は、アルツハイマー病であると診断されている；
ｉｉ）前記第１の時点の後の１または複数の時点で、同じ対象の末梢細胞から同じＰＫＣアイソザイムインデックスを生成することと；
ｉｉｉ）第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、前記第１の時点の後の１または複数の時点から得られたＰＫＣアイソザイムインデックスに減少があるか否かを決定することと；を含み、ここで、第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、第１の時点の後の１または複数の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスの減少は、アルツハイマー病の進行を示す方法。
［１７］  ［１６］に記載の方法であって、試験対象が、第１の時点で初期アルツハイマー病であると診断されている方法。
［１８］  ［１６］に記載の方法であって、試験対象が、第１の時点で軽度アルツハイマー病であると診断されている方法。
［１９］  対象において非アルツハイマー病状態からアルツハイマー病への進行をモニタリングする方法であって、
ｉ）［１］に記載の方法に従って、第１の時点で、試験対象の末梢細胞からＰＫＣアイソザイムインデックスを生成して、対象について参照ＰＫＣアイソザイムインデックスを得ることと、ここで、対象は、アルツハイマー病であると診断されていない；
ｉｉ）第１の時点の後の１または複数の時点で、同じ対象の末梢細胞から同じＰＫＣアイソザイムインデックスを生成することと；
ｉｉｉ）第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、第１の時点の後の１または複数の時点から得られたＰＫＣアイソザイムインデックスに減少があるか否かを決定することと；を含み、ここで、第１の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスと比較したとき、第１の時点の後の１または複数の時点からのＰＫＣアイソザイムインデックスの減少はアルツハイマー病への進行を示す、対象における、非アルツハイマー病状態からアルツハイマー病への進行をモニタリングする方法。
［２０］  ［１９］に記載の方法であって、非アルツハイマー病状態が軽度認識障害である方法。
［２１］  ［２０］に記載の方法であって、軽度認識障害が健忘性認識障害である方法。
［２２］  １または複数のＡβペプチドと、非ＡＤ細胞と比較してＡＤ細胞においてＡβペプチドによって差次的に調節されることが知られているＰＫＣアイソザイムに特異的な少なくとも１つの抗体と、非ＡＤ細胞と比較してＡＤ細胞において前記Ａβペプチドによって差次的に調節されることが知られていないＰＫＣアイソザイムに特異的な少なくとも１つの抗体と、ＰＫＣアイソザイムインデックスを決定するための使用説明書とを含むキット。
［２３］  ［２２］に記載のキットであって、ＡβペプチドがＡβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）である方法。
［２４］  ［２２］に記載のキットであって、ＡＤ細胞においてＡβペプチドによって差次的に調節されることが知られているＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−αである方法。
［２５］  ［２２］に記載のキットであって、ＡＤ細胞においてＡβペプチドによって差次的に調節されることが知られているＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−εである方法。
［２６］  ［２２］に記載のキットであって、ＡＤ細胞においてＡβペプチドによって差次的に調節されないことが知られているＰＫＣアイソザイムがＰＫＣ−γである方法。
【図１】
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