(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）乳酸菌を、果糖を添加した培地で培養し、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を選択する工程；および
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で選択された、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を、培地で培養する工程；
を含む、ヒアルロン酸の製造方法であって、
乳酸菌がラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に属する乳酸菌である、方法。
【請求項２】
乳酸菌が、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、請求項１に記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項３】
前記工程（ｉｉ）における培地が、果実、野菜、穀物、いも、海藻、豆、キノコおよびこれらの処理物からなる群から選択される１以上の食品原料を炭素源として含有する、請求項１または２に記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項４】
培養が、２０〜３０℃の温度下、嫌気的条件で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項５】
前記乳酸菌が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｂ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質；
あるいは、以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
を有する、請求項１または２に記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項６】
乳酸菌が、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）Ｋ３０４１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項７】
前記工程（ｉｉ）における培地が果糖を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項８】
果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）Ｋ３０４１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品原料に豊富に含まれる糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を用いるヒアルロン酸の製造方法ならびにそのような製造方法で得られるヒアルロン酸、ヒアルロン酸を含有する飲食品および組成物に関する。本発明は、ヒアルロン酸合成酵素および該酵素をコードする遺伝子にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸の２糖による繰り返し構造からなる直鎖の多糖であり、高保湿性、高粘弾性、高潤滑性等を示す素材である。それらの特徴を生かして、保湿剤として化粧品に配合するのみならず、関節症治療剤や眼科手術補助剤等の医療分野への利用も広がっている。また、近年は、ヒアルロン酸の機能への関心の高まりから、ヒアルロン酸が配合されたサプリメントや嗜好食品が多数販売されている。
【０００３】
食品や化粧品に利用されるヒアルロン酸として、鶏冠からの抽出物や、ストレプトコッカス属等の微生物を培地で培養・精製して得たものが一般的に用いられている（例えば、特許文献１参照）。そして、ヒアルロン酸の商品形態を拡大するために、食品原料を微生物を用いて発酵し、ヒアルロン酸含有組成物を提供する技術の開発にも注目が集まっている。このようなヒアルロン酸含有組成物は、食品原料や微生物等を分離せずに、そのまま飲食・塗布することもできると考えられる。近年、ヨーグルトやチーズの製造に利用されているストレプトコッカス  サーモフィルスの特定の菌株を、主たる炭素源を乳糖（ラクトース）とするスキムミルク含有培地で培養し、ヒアルロン酸を含有する培養物が得られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
一方、食品原料については、近年、植物性原料を乳酸菌で発酵させた原料を有する飲食品や化粧品が販売されており、例えば、果実や野菜の処理物に乳酸菌を接種し発酵して、飲食物に利用した例（例えば、特許文献２参照）が報告されている。
【０００５】
なお、これまでにラクトコッカス  ラクティス由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子に関する報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１１２２６０号公報
【特許文献２】特開２００６−７６９２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
食品原料を発酵し、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸含有飲食品およびヒアルロン酸含有組成物を得るためには、食品原料の糖組成に関する課題があると本発明者らは考えた。
【０００８】
トマト、リンゴ、ナシ、ブドウ等の果実や野菜の糖組成は、表１に示すとおり、半分以上が果糖（フルクトース）であるという報告がなされている（例えば、日本果汁協会監修，「最新 果汁・果実飲料事典」，朝倉書店，１９９７年，ｐ．２２３、伊藤三郎  編，「果実の科学」，朝倉書店，１９９１年，ｐ．６３および「ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ」，（米国），１９９０年，４巻，ｐ．２６５２−２６６０参照）。したがって、このような食品原料と微生物を利用してヒアルロン酸を生産する場合、果糖を炭素源としてヒアルロン酸を生産する微生物を利用することが有利である。さらに、果実や野菜には、ブドウ糖（グルコース）やショ糖（スクロース）も含まれるため、多様な食品原料と微生物を利用してヒアルロン酸を生産するためには、これらの糖も炭素源としてヒアルロン酸を生産できる微生物を利用することも有利である。
【表１】
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【０００９】
また、米、麦、とうもろこし等の穀物や、いも等の澱粉を豊富に含む食品原料については、澱粉を加熱等によってアルファ化した後に、アミラーゼ等の酵素類を用いて麦芽糖やブドウ糖溶液（液化糖）に変換することが行われる。この糖化液をさらにグルコースイソメラーゼで処理することによって、ブドウ糖から果糖への異性化も行われる（例えば、特開２００１−２００号公報参照）。したがって、このような食品原料の酵素処理物（例えば異性化糖）を原料として、微生物を利用してヒアルロン酸を生産するためには、果糖、麦芽糖、ブドウ糖等の糖を炭素源としてヒアルロン酸を生産できる微生物を利用することが有利である。
【００１０】
さらに、海藻、いも、豆等の食品原料は、ガラクタン、マンナン、ガラクトマンナン等の多糖を含んでいる。これらの多糖類を微生物発酵、各種酵素処理、化学処理等することによって、ガラクトースやマンノースが生成することが知られている（例えば、「Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），１９８５年，４９巻，ｐ．３４４５−３４５４、特開平５−２３１８３号公報および特表２０１０−５１８８５０号公報参照）。したがって、このような食品原料の酵素処理物を原料として、微生物を利用してヒアルロン酸を生産するためには、ガラクトースやマンノース等の糖を炭素源としてヒアルロン酸を生産できる微生物を利用することが有利である。
【００１１】
さらに、キノコ等の食品原料は、キチン等の多糖を含んでいる。また、キチンは、カニの甲羅、エビの殻、イカの腱等にも豊富に含まれている。キチンを粉砕処理、微生物発酵、各種酵素処理、化学処理等することによって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（以下、単にＮ−アセチルグルコサミンという）が生成することが知られている（例えば、特開２００７−１８９９４４号公報および特開２００８−２１２０２５号公報参照）。したがって、このような食品原料の処理物を原料として、微生物を利用してヒアルロン酸を生産するためには、Ｎ−アセチルグルコサミン等の糖を炭素源としてヒアルロン酸を生産できる微生物を利用することが有利である。
【００１２】
しかしながら、これまでに果実、野菜、穀物、いも、海藻、豆、キノコ等の食品原料を主たる原料として発酵し、ヒアルロン酸やヒアルロン酸含有飲食品、ヒアルロン酸含有組成物を得たという報告はなされていない。
【００１３】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、果糖、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン等、食品原料に豊富に含まれる糖を炭素源とする培地で乳酸菌を培養することにより、ヒアルロン酸を生産することを目的とする。本発明はまた、ヒアルロン酸ならびにヒアルロン酸を含有する飲食品および組成物の製造方法を提供することを目的とする。本発明は、新たなヒアルロン酸合成酵素遺伝子を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、乳酸菌の中に果糖を含む各種糖を炭素源として資化してヒアルロン酸生産能を示す株を見出した。
【００１５】
本発明者らは、また、上記のヒアルロン酸生産能を有する株として、ラクトコッカス属に属する乳酸菌を見出した。これまで知られている、ヒアルロン酸生産能を有する微生物は、ストレプトコッカス属等の微生物であり、得られる培養物の風味も限られていた。ラクトコッカス属に属する乳酸菌は、チーズやヨーグルトの製造に利用されており、独特の風味が醸し出すことが一般的に知られているが（例えば、乳酸菌研究集談会編，「乳酸菌の科学と技術」，株式会社学会出版センター，１９９６年，ｐ．３４４参照）、これまでにヒアルロン酸を生産するラクトコッカス属乳酸菌は報告されていない。ヒアルロン酸生産能を有するラクトコッカス属に属する乳酸菌を培養することにより、これまでとは異なる風味を示すヒアルロン酸含有培養物が得られた。また、本菌株からヒアルロン酸合成酵素遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は：
（１）果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を、培地で培養することを特徴とする、ヒアルロン酸の製造方法；
（２）乳酸菌がラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌である、上記（１）に記載のヒアルロン酸の製造方法；
（３）乳酸菌がラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に属する乳酸菌である、上記（２）に記載のヒアルロン酸の製造方法；
（４）乳酸菌が、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
（５）培地が、果実、野菜、穀物、いも、海藻、豆、キノコおよびこれらの処理物からなる群から選択される１以上の食品原料を炭素源として含有する、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
（６）培養が、２０〜３０℃の温度下、嫌気的条件で行われる、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
（７）前記乳酸菌が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｂ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質；
あるいは、以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
を有する、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
（８）乳酸菌が、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）Ｋ３０４１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０）である、上記（３）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法により得られるヒアルロン酸；
（１０）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法により得られる、ヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物；
（１１）果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）Ｋ３０４１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０）；
（１２）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質であるヒアルロン酸合成酵素：
（ａ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｂ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質；ならびに
（１３）以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１若しくは数個のＤＮＡが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
に関する。
【００１７】
本発明はまた：
〔１〕培地が、果糖を炭素源として含有する、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔２〕培地が、果実、野菜、穀物、いも、豆およびこれらの処理物からなる群から選択される１以上の食品原料を炭素源として含有する、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔３〕培地が、果糖、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される１以上の糖を炭素源として含有する、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔４〕乳酸菌が、ブドウ糖およびショ糖からなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有し、培地が、果糖、ブドウ糖およびショ糖からなる群から選択される１以上の糖を炭素源として含有する、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔５〕乳酸菌が、ガラクトースおよびマンノースからなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有し、培地が、いも、海藻、豆およびこれらの処理物からなる群から選択される１以上の食品原料を炭素源として含有する、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔６〕乳酸菌が、Ｎ−アセチルグルコサミンを資化してヒアルロン酸を生産する能力を有し、培地が、キノコ、魚介類およびその残渣ならびにこれらの処理物からなる群から選択される１以上の食品原料を炭素源として含有する、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔７〕培養が、培地のｐＨの下限値をｐＨ６．５以上に制御して行われる、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔８〕培地が乳糖を含有する、上記（２）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法；
〔９〕上記（１２）に記載のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子；又は
上記（１３）に記載の遺伝子
を含有する組換えベクター；
〔１０〕上記（１４）に記載の組換えベクターを含有する形質転換体；
〔１６〕上記（１４）に記載の形質転換体を培地で培養し、ヒアルロン酸を含有する培養物を得る工程を含むヒアルロン酸の製造方法； 〔１７〕重量平均分子量（Ｍｗ）５０万〜８０万である、上記（９）に記載のヒアルロン酸；ならびに
〔１８〕重量平均分子量（Ｍｗ）６０万〜７０万である、上記（９）に記載のヒアルロン酸；
にも関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、食品原料に豊富に含まれる糖を炭素源として含む培地で乳酸菌を培養することによりヒアルロン酸を生産することができる。また、上記の培地でチーズやヨーグルトの製造に利用されているラクトコッカス属に属する乳酸菌を培養して、これまでとは異なる風味のヒアルロン酸含有飲食品およびヒアルロン酸含有組成物を提供することができる。さらに、本発明によれば、ヒアルロン酸合成酵素を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例２において、Ｋ１７８０株およびＫ３０４１株のＲＡＰＤ解析を行った結果を示す電気泳動図である。
【図２】実施例４において、Ｋ３０４１株を様々な温度で培養した場合のヒアルロン酸の生産量を示すグラフである。
【図３】実施例８において、市販のヒアルロン酸の酵素処理物（上）と、Ｋ３０４１株の培養物から得られた結晶の酵素処理物（下）についてＨＰＬＣ分析を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、乳酸菌とは、発酵によって糖類から乳酸を産生する菌であれば特に限定されない。本発明で用いられる乳酸菌（以下、「本発明菌」とも称する）は、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌である限り、特に制限されない。例えば、ラクトコッカス属細菌（例えば、ラクトコッカス  ラクティス等）、ストレプトコッカス属細菌（例えば、ストレプトコッカス  サーモフィルス等）、ラクトバチルス属細菌（例えば、ラクトバチルス  カゼイ、ラクトバチルス  アシドフィルス、ラクトバチルス  ガッセリ、ラクトバチルス  デルブルッキィ  サブスピーシズ  ブルガリカス、ラクトバチルス  デルブルッキィ  サブスピーシズ  デルブルッキィ等）、ロイコノストック属細菌（例えば、ロイコノストック  メセンテロイテス、ロイコノストック  ラクティス等）、エンテロコッカス属細菌（例えば、エンテロコッカス  フェカーリス、エンテロコッカス  フェシウム等）、ビフィドバクテリウム属細菌（例えば、ビフィドバクテリウム  ビフィダム、ビフィドバクテリウム  アドレッセンティス等）、ペディオコッカス属細菌（例えば、ペディオコッカス  ペントサセウス、ペディオコッカス  ハロフィルス等）等が挙げられる。
【００２１】
本発明の一態様において、本発明菌は、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有するラクトコッカス属に属する乳酸菌である。また、本発明の一態様において、本発明菌として、培地で培養した場合に、培養物にチーズやヨーグルトらしい独特の風味を与える、ラクトコッカス属に属する乳酸菌が好ましく用いられる。ラクトコッカス属に属する乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトコッカス  ラフィノラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）が挙げられ、ラクトコッカス  ラクティスが好ましく用いられる。亜種についても特に制限はなく、例えばラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ．  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。なかでもラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティスＫ３０４１株が好ましく用いられる。なお、このＫ３０４１株は、２０１０年６月１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０が付与されている。また、この菌株は、果糖、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、セロビオース、トレハロース、リボース、マンノース、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、アミグダリンまたはエスクリンのいずれの糖についても発酵性を有しており、このうち、果糖、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースまたはＮ−アセチルグルコサミンを炭素源とした培地におけるヒアルロン酸の生産能を調べた結果、これらのいずれの糖も炭素源として資化してヒアルロン酸を生産する能力を有することを本発明者らは確認している。
【００２２】
菌株の同定は、例えば、当業者に公知の手法を用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分増幅産物の塩基配列解析および相同性検索により行うことができる。また、Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析（例えば「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，（米国），２００１年，３９巻，ｐ．３８６５−３８７０参照）を行い、増幅遺伝子断片を比較することによって種の鑑別を行うこともできる。
【００２３】
任意の菌株が、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有するか調べる方法を以下に説明する。まず、市販の果糖を添加した、乳酸菌が生育可能な一般的な培地を調製し、適量の培地に対象菌株を適量接種し、各培地について培養した後に、得られる培養物中のヒアルロン酸を測定することにより、調べることができる。
【００２４】
例えば、水道水に果糖１％、トリプトン１％、酵母エキス０．５％およびリン酸水素二カリウム０．２％を添加した、ｐＨ７．０程度の滅菌培地を、上記の一般的な培地として用いることができる。トリプトンは原料のタンパク質（例えばカゼイン等）を酵素トリプシンで加水分解したものであり、種類は特に限定されず、例えば、市販のトリプトンを用いることができる。酵母エキスの種類は特に限定されず、例えば市販の酵母エキスを用いることができる。培地のｐＨは、滅菌前に調整しても滅菌後に調整してもよい。例えば、３ｍＬ程度の上記の培地に、プレート培地に生育した菌株のコロニーをつまようじ等で採取して接種するか、またはあらかじめ培地で培養した任意の菌株を０．１％（ｖ／ｖ）程度接種し、３０℃で１日間培養した後に、得られる培養物中のヒアルロン酸を定量すればよい。
【００２５】
培養後、得られる培養物中のヒアルロン酸量の測定方法については特に限定されないが、例えば、サンドイッチ法（ヒアルロン酸結合タンパク質を固相に吸着させ、ついで検体ヒアルロン酸を添加して該タンパク質に結合させ、さらにビオチン等で標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質を添加して、検体ヒアルロン酸を固相に吸着した該タンパク質と標識された該タンパク質とで挟み、サンドイッチ状結合体を形成させて、該結合体の標識物質を測定する方法、例えば「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（蘭国），２００３年，３１９巻，ｐ．６５−７２参照）、競合法（固相に結合させたヒアルロン酸、検体ヒアルロン酸、およびビオチン等で標識したヒアルロン酸結合性タンパク質を競合反応させて、固相に結合させたヒアルロン酸と該標識したヒアルロン酸結合性タンパク質の複合体を形成させ、該結合体の標識物質を測定する方法、例えば「Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），１９９９年，６３巻，ｐ．８９２−８９５参照）等が挙げられる。競合法を利用したヒアルロン酸測定キットも販売されており、このようなキットを用いて測定することもできる。
【００２６】
なお、本発明において、「ヒアルロン酸」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＤ−グルクロン酸の２糖による繰り返し構造からなる直鎖の多糖であればよく、その特性、分子量、分子量分布等は特に制限されないが、一態様において、本発明は、重量平均分子量（Ｍｗ）５０万〜８０万、好ましくは６０万〜７０万のヒアルロン酸を提供する。このようなヒアルロン酸は、溶解性や吸収性が良好であり、また、水溶液粘度が低いため取り扱い容易であるという利点を有する。また、分子量分布の広がりを示す指標のひとつとして、多分散度があり、重量平均分子量（Ｍｗ）／数平均分子量（Ｍｎ）から、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。一態様において、本発明の製造方法で得られるヒアルロン酸は、Ｍｗ／Ｍｎで算出される多分散度が、１．０〜３．０であり、好ましくは１．５〜２．５である。
【００２７】
一態様において、本発明菌は、果糖、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する。したがって、さまざまな食品原料を用いてヒアルロン酸を生産することができる。任意の菌が各種糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有するかは、上記の果糖の場合の方法を参照し、果糖の代わりに各糖を添加した乳酸菌が生育可能な一般的な培地を調製し、適量の培地に対象菌株を適量接種し、各培地について培養した後に、得られる培養物中のヒアルロン酸を測定することにより、調べることができる。
【００２８】
一態様において、本発明菌は、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子または以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）を有する。
（ａ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｂ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２９】
（ａ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
上記配列番号１５に記載のアミノ酸配列は、ラクトコッカス  ラクティスに属する乳酸菌（より特定すれば、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  Ｋ３０４１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０））由来のヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列である。これまでラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスに属する特定の乳酸菌（ＩＬ１４０３株）が該配列を有することは知られていたが、ヒアルロン酸合成酵素との関係は全く知られていなかった。なお、後述の比較例５および６にも記載の通り、既知のヒアルロン酸合成酵素（ｈａｓＡ）との相同性（類似性）のみを指標とするだけでは、ヒアルロン酸生産菌を見出すことはできない。また、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティスに属する菌において、ヒアルロン酸合成能の有無の違いは、ヒアルロン酸合成酵素ホモログのアミノ酸配列のわずかな違いに基づく可能性があり、配列の相同性（類似性）からその機能を推定することは難しいと考えられる。
【００３０】
（ｂ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質
上記（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、ヒアルロン酸合成酵素活性に関与しない一部のアミノ酸を欠失、置換または付加させたアミノ酸配列が挙げられる。性質の似たアミノ酸への置換等であれば、変異後のアミノ酸配列からなるタンパク質の酵素活性に影響しないであろう。また、（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列に各種のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がヒアルロン酸合成活性を有するアミノ酸配列も挙げられる。そのようなアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列に、タグを付加した融合タンパク質等が挙げられる。一態様において、上記（ｂ）のタンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列と、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質である。
【００３１】
得られるアミノ酸配列からなるタンパク質がヒアルロン酸合成酵素活性を有する限り、上記の欠失、置換または付加等の変異は、適宜組み合わせることも可能である。任意のアミノ酸配列からなるタンパク質がヒアルロン酸合成酵素活性を有するか否かは、当業者に公知の手法により確認することができる。例えば、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子をトランスフェクトして得た形質転換体を培養し、培養物中のヒアルロン酸濃度を分析し、ヒアルロン酸生産量を測定することで確認することができる。
【００３２】
上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、容易に得ることができる。（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、配列番号１４に記載の塩基配列からなる遺伝子が例示される。
【００３３】
（ｃ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
上記（ｃ）のＤＮＡは、上記配列番号１５に記載のアミノ酸配列ラクトコッカス  ラクティスに属する乳酸菌（より特定すれば、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  Ｋ３０４１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０））由来のヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡである。
【００３４】
（ｄ）配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
上記（ｄ）のＤＮＡは、上記（ｃ）のＤＮＡをもとに、当業者に公知の手法を用いて得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９））を行った際、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、この条件は使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。このような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより決定可能である。このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、ＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡであるため、一態様において、上記（ｄ）のＤＮＡは、配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００３５】
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
上記（ｅ）のＤＮＡは、上記（ｃ）のＤＮＡをもとに、当業者に公知の手法を用いて得ることができる。例えば、配列番号１４に記載の塩基配列と同一のアミノ酸をコードする塩基配列、上記（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列等が挙げられる。また、ヒアルロン酸合成酵素活性に関与しないアミノ酸に対応する一部の塩基を変異（欠失、置換または付加）させた塩基配列も挙げられる。変異の導入は、天然型のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子（例えば上記（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子）をもとに当業者に公知の遺伝子工学的技術や変異処理などを用いて行うことができる。
【００３６】
本発明の一態様において、ヒアルロン酸の生産は、上記の本発明菌を、培地に接種して培養することによって行う。ヒアルロン酸の生産に用いる培地の種類や培養条件については、用いる本発明菌が資化可能な炭素源が培地中に含まれ、ヒアルロン酸が生産される条件であれば特に限定されない。培地としては、天然培地、合成培地、半合成培地のいずれを用いてもよく、例えば、トマトジュース、果汁、野菜汁、豆乳、牛乳等の動物乳、肉汁、酵母エキス、スキムミルク、大豆由来タンパク質、乳由来タンパク質、穀物、いも、豆、海藻またはキノコの酵素消化物、コーンスティープリカー、廃糖蜜、糖類、アミノ酸類等の栄養源、各種塩類およびビタミン類を適宜組み合わせて含む培地を用いることができる。本発明の一態様において、培地は、本発明菌の培養後、そのまま飲食品等に使用する場合には、安全性を考慮して、食用可能な成分のみで構成されていることが好ましい。
【００３７】
本発明の一態様において、本発明菌の培養によりヒアルロン酸を生産する際、ヒアルロン酸生産量の観点から、培地に酵母エキスを添加することが好ましい。酵母エキスとしては、微生物培養の際に通常用いられるものであれば、その原料酵母の種類や製法は特に限定されない。簡便には、市販の酵母エキスを用いることができる。酵母エキスの培地への添加量は、本発明菌がヒアルロン酸を生産する量であればよいが、培地に対し、例えば０．１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜３％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．８〜２％（ｗ／ｖ）添加することができる。
【００３８】
一態様において、本発明菌は、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有するため、培地中に果実、野菜、穀物、いも、豆およびこれらの処理物からなる群から選択される１以上の食品原料が含まれる場合に、これらの食品原料の含有する果糖を資化してヒアルロン酸を生産することができ、従来にはなかったヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物を得ることができる。
【００３９】
このような食品原料としては、果糖を含有するか、その処理物が果糖を含有するもの（例えばデンプンを含むもの）であれば特に限定されないが、例えば、トマト、リンゴ、ナシ、ブドウ、柑橘類（ミカン、オレンジ等）、スイカ、ビワ、オウトウ、カキ、パイナップル、バナナ、イチゴ、ブルーベリー、米、小麦、大麦、とうもろこし、じゃがいも、さつまいも、さといも、小豆、平豆、緑豆等およびこれらの混合物が挙げられる。また、これらの処理物とは、上記の食品原料から、食品製造で一般的に用いられる工程（絞汁、ろ過、濃縮、加熱殺菌、酵素処理、発酵等）を経て得られる食品原料であり、例えば、ジュース状、ペースト状、乾燥粉末状のものを用いることができる。具体的な一例として、トマトジュースは、本発明においてヒアルロン酸を生産する良好な培地として好ましく用いられる。一態様において、上記の処理物は、好ましくは、上記の食品原料に含まれる多糖（例えばデンプン）に各種糖加水分解酵素や発酵、化学分解処理を行うことで、単糖（特に果糖）の含有量を高めたものである。これらの処理の副生成物として麦芽糖とブドウ糖の含有量が高まることもある。具体的な一例として、デンプンを含む穀物やいもから得られた各種異性化糖を上記の処理物として用いることができる。
【００４０】
さらに、一態様において、本発明菌が果糖以外にブドウ糖、ショ糖および麦芽糖からなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する場合、上記の食品原料の含有するブドウ糖、ショ糖または麦芽糖も資化してヒアルロン酸を生産することができる。また、上記の食品原料以外の、ブドウ糖、ショ糖および麦芽糖からなる群から選択される１以上の糖を含有する食品原料（処理物を含む）を培地に添加してヒアルロン酸を生産してもよい。このようにして、従来にはなかったヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物を得ることができる。
【００４１】
一態様において、本発明菌が、果糖以外に、ガラクトースおよびマンノースからなる群から選択される１以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する場合、培地にガラクトースまたはマンノースを添加して本発明菌を培養することにより、ヒアルロン酸を生産することができる。また、ガラクトース、マンノースおよびこれらの糖を構成糖とする多糖（例えば、ガラクタン、ガラクトマンナン、マンナン等）からなる群から選択される１以上の糖を含有する食品原料（その処理物を含む）を培地に添加して、本発明菌を培養してヒアルロン酸を生産させ、従来にはなかったヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物を得ることができる。そのような食品原料として、例えば、ガラクタンを含有するさといも、テングサ、ノリ等、ガラクトマンナンを含有するグァー豆等、マンナンを含有するこんにゃくいも等およびこれらの混合物ならびにこれらの処理物が挙げられる。これらの処理物の代表例は、上記の食品素材を微生物発酵、各種酵素処理、化学処理等することによって得られる、ガラクトースやマンノースを含む処理物である。
【００４２】
一態様において、本発明菌が、果糖以外に、Ｎ−アセチルグルコサミンを資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する場合、培地にＮ−アセチルグルコサミンを添加して本発明菌を培養することにより、ヒアルロン酸を生産することができる。また、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを構成糖とする多糖（例えば、キチン等）を含有する食品原料（その処理物を含む）を培地に添加して、本発明菌を培養してヒアルロン酸を生産させ、従来にはなかったヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物を得ることができる。そのような食品原料として、例えば、キノコ（エノキ、シイタケ、シメジ、ナメコ等）、魚介類およびその残渣（カニの甲羅やエビの殻、イカの腱等）等ならびにこれらの混合物ならびにこれらの処理物が挙げられる。これらの処理物の代表例は、上記の食品素材を粉砕処理、微生物発酵、各種酵素処理、化学処理等することによって得られる、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む処理物である。
【００４３】
一態様において、本発明菌は、チーズやヨーグルトの製造に用いられるラクトコッカス属に属する乳酸菌であり、好ましくは乳糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌であり、乳糖を含む培地で本発明菌を培養してヒアルロン酸を生産することにより、独特の風味を有するヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物を得ることができる。上記培地は、乳糖を含む食品原料を添加した培地でもよい。乳糖を含む食品原料としては、例えば、牛乳、山羊乳等の動物乳、スキムミルクのようなこれらの動物乳の加工品が挙げられる。
【００４４】
本発明菌の培養温度は、ヒアルロン酸が生産される限り限定されないが、ヒアルロン酸の生産量の観点から、好ましくは１０〜４０℃であり、さらに好ましくは２０〜３０℃である。
【００４５】
培養は、嫌気性条件、好気性条件のいずれの条件下で行ってもよいが、ヒアルロン酸生産量の観点から、嫌気性条件下で行うことが好ましい。培養は、静置培養、攪拌培養等、いずれの手法を用いてもよく、目的に応じて適宜培養方法を選択することができるが、嫌気性条件下で行う場合、静置培養が好ましい。
【００４６】
培地の初発ｐＨや培養中のｐＨについてもヒアルロン酸が生産される限り特に限定されないが、ヒアルロン酸生産量の観点から、ｐＨ３〜８が好ましく、ｐＨ６．５〜７．５程度がより好ましく、ｐＨ７．０〜７．５程度が特に好ましく、酸やアルカリを用いてこの範囲に調整することができる。本発明菌の培養中に乳酸が生成することによってｐＨが低下するため、培養中、アルカリで上記の範囲にｐＨを制御し続けることがより好ましい。
【００４７】
培養時間についても、特に限定されず、培地中のヒアルロン酸含有量の増加が緩やかになった時点で培養を終了することができる。本発明者らは、後述の実施例に示す種々の培養量および培養条件では、いずれも半日〜１日間の培養で培地中のヒアルロン酸含有量の増加が緩やかになることを確認している。培養中に糖などの培地中の成分や培地類を追加して、培養時間を延長することもできる。
【００４８】
本発明において、良好なヒアルロン酸の生産量は、本発明菌を上記の例示条件で培養後、得られる培養物中のヒアルロン酸量が、例えば０．５ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以上である。また、ｐＨ調整したトマトジュースのみを培地として用いて培養した場合に、得られる培養物中のヒアルロン酸量が、例えば１ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは５ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは１５ｍｇ／Ｌ以上である。さらに、培養中、培地のｐＨを制御できる場合（例えば実施例５に記載のように、培養中、培地のｐＨの下限をｐＨ６．５に制御した場合）、得られる培養物中のヒアルロン酸量が、例えば５ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは４０ｍｇ／Ｌ以上である。
【００４９】
また、本発明菌の培養の際には他の菌と共培養してもよい。各種飲食品等の製造において、乳酸菌と他の菌を共培養することが一般に行われている。他の菌としては、本発明菌のヒアルロン酸産生能を損なわない範囲であれば特に限定されず、培地に添加する原料や得ようとする飲食品または組成物に応じて、適切な菌を用いることができ、例えば、本発明菌以外のラクトコッカス属細菌（例えば、ラクトコッカス  ラクティス等）やストレプトコッカス属細菌（例えば、ストレプトコッカス  サーモフィルス等）、ラクトバチルス属細菌（例えば、ラクトバチルス  カゼイ、ラクトバチルス  アシドフィルス、ラクトバチルス  ガッセリ、ラクトバチルス  デルブルッキィ  サブスピーシズ  ブルガリカス、ラクトバチルス  デルブルッキィ  サブスピーシズ  デルブルッキィ等）、ロイコノストック属細菌（例えば、ロイコノストック  メセンテロイテス、ロイコノストック  ラクティス等）、エンテロコッカス属細菌（例えば、エンテロコッカス  フェカーリス、エンテロコッカス  フェシウム等）、ビフィドバクテリウム属（例えば、ビフィドバクテリウム  ビフィダムやビフィドバクテリウム  アドレッセンティス等）、ペディオコッカス属（例えば、ペディオコッカス  ペントサセウス、ペディオコッカス  ハロフィルス等）、ケフィア酵母（例えば、クルイベロミセス  マルキシアヌスやサッカロミセス  ユニスポラス等）等を使用することができる。これらは、１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。また、食品原料に含まれる多糖類を分解する酵素を産生する菌と共培養することもできる。
【００５０】
このようにして得られたヒアルロン酸含有培養物は、そのまままたは乾燥処理等を行うことによって、ヨーグルトや飲料、サプリメント等のヒアルロン酸含有飲食品として利用することができ、また化粧品等にヒアルロン酸含有組成物として配合することもできる。
【００５１】
例えば、トマトジュースを培地として、本発明菌を所望により他の菌と組み合わせて培養して得られたヒアルロン酸含有培養物は、ヒアルロン酸を含有する発酵トマト飲料とすることができる。また、牛乳を培地として、本発明菌を所望により他の菌と組み合わせて培養して得られたヒアルロン酸含有培養物は、チーズらしい香味の付与されたヒアルロン酸を含有する飲食品とすることができる。
【００５２】
あるいは、得られたヒアルロン酸含有培養物を加熱殺菌、各種ろ過処理または遠心分離することによって、菌体や培地由来の不溶性成分を除去してヒアルロン酸の粗精製物を得て、これを飲食品に添加したり化粧品等に配合したりすることもできる。また、エタノール等の溶媒沈殿等、ヒアルロン酸の精製法として一般的に行われる処理によって、純度を高めたヒアルロン酸を得ることもできる。
【００５３】
一態様において、本発明は、植物由来原料のみを培地として用いて本発明菌を培養することによってヒアルロン酸含有組成物である培養物を得ることができるため、得られた培養物について、特に精製工程を経ずに、そのまま飲食品や化粧品に利用して、アレルギー（例えば牛乳アレルギー）対応飲食品や、動物由来原料を含まない化粧品を製造することもできる。
【００５４】
本発明はまた、上記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質であるヒアルロン酸合成酵素および上記（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる遺伝子を提供する。これらのヒアルロン酸合成酵素および遺伝子は、ヒアルロン酸の製造に有用である。
【００５５】
遺伝子の取得方法としては、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法等を用いることができる。例えば、前述した本発明菌から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡを抽出する。ついで、上記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列または上記（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡに基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことができる。
【００５６】
本発明はまた、上記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質であるヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子あるいは上記（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡからなる遺伝子を含有する組換えベクターも提供する。そのような組換えベクターは、例えば、形質転換体において導入遺伝子を発現させるための発現ベクターに、上記の遺伝子を挿入して得ることができる。このような発現ベクターとしては、宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養した場合に、ヒアルロン酸合成酵素を含む培養物が得られるベクターであれば特に限定されず、ファージおよびプラスミドのいずれを用いることもできる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＴベクター等を使用することができる。
【００５７】
上記の遺伝子とともに、大腸菌ラクトースオペロンやトリプトファンオペロン等に由来するプロモーター、オペレーターおよびリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０を参照）をベクターに挿入することができる。
【００５８】
発現ベクターへの遺伝子の挿入は、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて常法により行うことができる。得られたベクターに目的の遺伝子が挿入されていることは、例えばＤＮＡシーケンスにより確認することができる。
【００５９】
本発明はまた、上記の組換えベクターを含む形質転換体も提供する。上述の組換えベクターを用いて、大腸菌のほか、乳酸菌や枯草菌等の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生物や動物細胞などの宿主を適宜形質転換し、それぞれの形質転換体を得ることができる。得られた形質転換体は、ヒアルロン酸の製造に有用である。
【００６０】
本明細書中において、形質転換とは、遺伝子を細胞（菌体）に導入し、形質転換体を得ることを意味する。そのような形質転換体には形質導入体も含まれる。形質転換の方法は当業者が一般に行うことができるものであれば特に限定されない。例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，ｐ．３２６−３３１，１９７９）、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが例示される。目的の遺伝子がトランスフェクトされた形質転換体の選択には、導入した発現ベクターに存在する選択マーカーを利用すればよい。
【００６１】
本発明はまた、上記の形質転換体を培地で培養し、ヒアルロン酸を含有する培養物を得る工程を含むヒアルロン酸の製造方法も提供する。
【００６２】
形質転換体の培養は、用いた宿主の生育に適した培養条件を用いて行うことができる。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、培地の種類や組成は大腸菌の生育に適する限り特に限定されないが、ＬＢ培地等が好ましく用いられる。培地には、酵素生産誘導基質として、適量のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を適宜添加してもよい。なお、培地の初発ｐＨは、例えば、７〜９に調整するのが適当である。また培養は、例えば、１０〜４２℃、好ましくは１５〜３７℃前後で、６〜１２０時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。上記の手法で形質転換体を培養して得られる培養物は、形質転換体内、培養液中またはその両方にヒアルロン酸を含有することができるが、回収容易性等の観点から、好ましくは、培養液中にヒアルロン酸を含む。培養終了後、該培養物よりヒアルロン酸を回収するには、通常のヒアルロン酸の回収手段を用いることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例および比較例（単に「実施例等」という場合がある）により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【００６４】
［実施例１］
〔果糖含有培地においてヒアルロン酸生産能を有する乳酸菌の探索〕
探索には、各種乳製品、漬物、野菜、果物サンプル等から分離した乳酸菌保存株、および微生物保存機関から分与された乳酸菌保存株、合計約１，５００株を用いた。各菌をＭＲＳ寒天培地またはＭ１７寒天培地で、３０℃、１日間、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いた嫌気条件にて静置培養した。試験管に入った果糖含有滅菌培地［水道水に、果糖（Ｄ−フルクトース、和光純薬工業社製）１．０％（ｗ／ｖ）、トリプトンＮ１（オルガノテクニー社製）１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（べクトン・ディッキンソン社製）０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．２％（ｗ／ｖ）を添加。ｐＨ７．０］３ｍＬに寒天培地上に生育した各菌のコロニーをつまようじで接種し、３０℃、１日間、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いた嫌気条件にて静置培養した。ヒアルロン酸生産能については、全ての実施例等において、得られた培養液を採取し、ヒアルロン酸測定キット（生化学バイオビジネス社製）を用いてヒアルロン酸含有量を調べることで評価した。その結果、Ｋ３０４１株およびＫ１７８０株の２株がヒアルロン酸をそれぞれ６．２ｍｇ／Ｌ，０．７ｍｇ／Ｌ生産することがわかった。
【００６５】
［実施例２］
〔菌の同定〕
実施例１で見出された２株について、Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析で分類した。本発明菌から、Ｇｅｎｅｒｅｌｅａｓｅｒ（Ｂｉｏ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ社製）を用いて、染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型とし、プライマーとして、配列３’−ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  Ａ−５’（配列番号４）および３’−ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＣＡＡ  Ｃ−５’（配列番号５）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、Ｍｉｇｈｔｙ  ＡＭＰ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度プロファイルは、まず、９８℃，２分間処理し、次いで９８℃，１０秒−４７℃，１５秒−６８℃，２分のサイクルを３０回行った後、６８℃，７分間処理して、４℃で冷却した。得られたＰＣＲ増幅についてアガロースゲル電気泳動を行った（図１）。マーカーとして、Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ  ＤＮＡ−１３４（東洋紡社製）を用いた。ＲＡＰＤ解析の結果、実施例１で見出された２つの菌株は異なる菌であると考えられた。
【００６６】
実施例１で見出された２株について、さらに、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づく同定を実施した。先に抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ユニバーサルプライマー配列３’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＴＹＭ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ−５’（配列番号６）および３’−ＴＡＣ  ＧＧＹ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  Ｔ−５’（配列番号７）を用いて、Ｍｉｇｈｔｙ  ＡＭＰ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度プロファイルは、まず、９８℃，２分間処理し、次いで９８℃，１０秒−５５℃，１５秒−６８℃，２分のサイクルを３０回行った後、６８℃，７分間処理して、４℃で冷却した。得られたＰＣＲ産物についてＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。精製したＤＮＡについて、３’−ＧＷＡ  ＴＴＡ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＫＧ  ＣＴＧ−５’ （配列番号８）および３’−ＡＡＡ  ＣＴＹ  ＡＡＡ  ＫＧＡ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＧＧ−５’ （配列番号９）を用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡの３’側および５’側それぞれ約５００塩基の配列を決定した。２株の３’側の配列（配列番号１）および５’側の配列（配列番号２）はいずれも同一であった。得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をもとに、データベース（ＢＬＡＳＴ）に登録されている配列との比較を行った。その結果、Ｋ３０４１株およびＫ１７８０株はともにラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティスと同定された。
【００６７】
実施例１においてヒアルロン酸の生産量が高かったＫ３０４１株については、さらに１６Ｓ  ｒＤＮＡの全長を決定し（配列番号３）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティスのｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎであるＮＣＤＯ６０４Tの配列と比較したところ、１塩基の挿入が見られたが、それ以外は完全に一致した。Ｋ３０４１株を、２０１０年６月１日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７０）。
【００６８】
また、Ｋ３０４１株について、２９種類の糖の発酵性をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２の方法に基づいて調べた（表２）。
【表２】
0005858566.tif 000003
【００６９】
実施例１で見出された２株について顕微鏡観察を行ったところ、いずれも双球菌であった。さらにＫ３０４１株については、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ９th  ｅｄｉｔｉｏｎの方法に基づいて菌の性状を調べた（表３）。ラクトコッカス  ラクティスの２亜種との性状を比較した結果、Ｋ３０４１株はサブスピーシズ  ラクティスと同じ性状を示し、１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列および生理性状の両面での確認ができた。
【表３】
0005858566.tif 000004
【００７０】
［実施例３］
〔糖の種類によるヒアルロン酸の生産性への影響〕
試験管に入った各種糖含有滅菌培地[トリプトンＮ１（オルガノテクニー社製）１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（べクトン・ディッキンソン社製）１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．２％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．３に、炭素源として果糖（Ｄ−フルクトース、和光純薬工業社製）、ブドウ糖（Ｄ−グルコース、和光純薬工業社製）、ショ糖（スクロース、和光純薬工業社製）、乳糖（ラクトース、和光純薬工業社製）、麦芽糖（マルトース、和光純薬工業社製）、Ｄ−ガラクトース（和光純薬工業社製）、Ｄ−マンノース（和光純薬工業社製）、またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（シグマ社製）をそれぞれ１．０％（ｗ／ｖ）含む培地]３ｍＬずつ入れ、寒天培地上に生育した各菌のコロニーをつまようじで接種した。３０℃、１日間、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いた嫌気条件にて静置培養し、ヒアルロン酸生産量を調べた（表４）。
【表４】
0005858566.tif 000005
【００７１】
結果、Ｋ３０４１株はブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノース、またはＮ−アセチルグルコサミンのいずれを炭素源とする培地でもヒアルロン酸を生産したため、幅広い食品原料を用いたヒアルロン酸の製造に利用できると考えられた。
【００７２】
また、実施例３では、培地中の酵母エキス量を１．０％（ｗ／ｖ）、培養の初発ｐＨを７．３とした以外は、実施例１と同様の条件で培養を行った。果糖を炭素源とした培地におけるＫ３０４１株のヒアルロン酸生産量は、実施例１と比較して４倍以上増加した。
【００７３】
［比較例１］
微生物保存機関から分与された乳酸菌保存株ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＮＢＲＣ１００９３３を実施例３と同様に培養し、培養液中のヒアルロン酸量を調べたが、ヒアルロン酸は検出されなかった。
【００７４】
［比較例２］
乳製品から独自に見出した、ショ糖を含有する培地で微量のヒアルロン酸生産能を有するストレプトコッカス  サーモフィルス  Ｋ１２９６株をＭ１７寒天培地上に生育させて、コロニーをつまようじで採取し、実施例３に記載の培地に接種した。本菌株のヒアルロン酸生産の最適条件である、５０ｍｉｎ-1にて往復振とう下、好気条件で、３７℃にて１日間培養した。培養液中のヒアルロン酸量を調べた結果（表４）、本菌株は乳酸菌が資化する最も一般的な糖である乳糖、ショ糖、ブドウ糖およびガラクトースでしかヒアルロン酸を生産せず、生産量もＫ３０４１株よりも低かった。
【００７５】
［実施例４］
〔培養最適温度〕
試験管に入った滅菌培地［水道水に、乳糖（ラクトース、和光純薬工業社製）１．０％（ｗ／ｖ）、トリプトンＮ１（オルガノテクニー社製）１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（べクトン・ディッキンソン社製）０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．２％（ｗ／ｖ）を添加。ｐＨ７．０］３ｍＬにＭＲＳ寒天培地に生育させたＫ３０４１株のコロニーをつまようじで接種し、図２に示す各温度にて、実施例１と同様に培養し、ヒアルロン酸生産量を調べた（図２）。本菌株によるヒアルロン酸生産には、２０〜３０℃での培養が好適であることがわかった。
【００７６】
［実施例５］
〔Ｋ３０４１株のトマトジュース培地におけるヒアルロン酸の生産〕
無塩トマトジュース（日本デルモンテ社製，ｐＨ４．５）を、無菌条件下で滅菌した８Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、滅菌した試験管に分注した。ＭＲＳ寒天培地上に生育させたＫ３０４１株のコロニーをつまようじで接種してシリコン栓をし、これを３０℃で１８時間、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いた嫌気条件にて静置培養した。得られた培養液を十分に混合した後に採取し、ヒアルロン酸含有量を調べた。なお、ヒアルロン酸の生産量については、Ｋ３０４１株非接種のブランクのヒアルロン酸含量も同時に測定し、これを差し引くことで求めた。本菌株はトマトジュース培地において、ヒアルロン酸を２１．６ｍｇ／Ｌ生産していることがわかった。
【００７７】
［比較例３］
比較例２で用いたストレプトコッカス  サーモフィルス  Ｋ１２９６株をＭ１７寒天培地上に生育させて、コロニーをつまようじで採取し、実施例５に記載のトマトジュース培地（ｐＨ７．４）に接種した。本菌株のヒアルロン酸生産の最適条件である、５０ｍｉｎ-1にて往復振とう下、好気条件で、３７℃にて間培養した。培養液中のヒアルロン酸量を調べた結果、Ｋ１２９６株はトマトジュース培地にて、ヒアルロン酸を０．８ｍｇ／Ｌしか生産していなかった。
【００７８】
［実施例６］
〔Ｋ３０４１株のスキムミルク培地におけるヒアルロン酸の生産〕
スキムミルク（べクトン・ディッキンソン社製、糖として主に乳糖を含有）１０％（ｗ／ｖ）の培地３ｍＬを試験管に分注して滅菌し、ＭＲＳ寒天培地上に生育させたＫ３０４１株のコロニーをつまようじで接種した。アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気条件とし、３０℃で１日間培養した。得られた各培養液を採取し、ヒアルロン酸含有量を調べた。なお、ヒアルロン酸の生産量については、Ｋ３０４１株非接種のブランクのヒアルロン酸含量も同時に測定し、これを差し引くことで求めた。本菌株はスキムミルク培地にて、ヒアルロン酸を８．３ｍｇ／Ｌ生産していることがわかった。培養物はチーズらしい香味を呈していた。
【００７９】
［比較例４］
比較例２で用いたＫ１２９６株をＭ１７寒天培地上に生育させて、コロニーをつまようじで採取し、実施例６に記載の培地に接種した。本菌株のヒアルロン酸生産の最適条件である、５０ｍｉｎ-1にて往復振とう下、好気条件で、３７℃にて１日間培養した。培養液中のヒアルロン酸量を調べた結果、Ｋ１２９６株はスキムミルク培地にて、ヒアルロン酸を２．９ｍｇ／Ｌ生産しており、Ｋ３０４１株よりも生産量が低かった。本培養物はＫ３０４１株の培養物と比較するとチーズらしい香味が弱く感じられた。
【００８０】
［実施例７］
〔Ｋ３０４１株のミニジャーによるヒアルロン酸の生産と精製１〕
乳糖（ラクトース、和光純薬工業社製）１．０％（ｗ／ｖ）、トリプトンＮ１（オルガノテクニー社製）１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（べクトン・ディッキンソン社製）１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．２％（ｗ／ｖ）の培地（ｐＨ７．０）２Ｌを１２１℃にて１５分間滅菌し、Ｋ３０４１株の前培養液を０．１％接種した。回転数５０ｒｐｍにて攪拌し、窒素ガスを通気して嫌気条件として、２７℃で１日間培養した。ｐＨは１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で、下限６．５となるように調整しつづけた。得られた各培養液を採取し、ヒアルロン酸含有量を調べた結果、ヒアルロン酸を４０ｍｇ／Ｌ生産していることがわかった。
【００８１】
得られた培養液を遠心処理して上清を回収後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ウシ脾臓由来、和光純薬工業社製）２ｍｇを添加し、撹拌し、室温で２時間処理した。これに終濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるようにトリクロロ酢酸を添加し、４℃で２時間静置した。これを遠心処理して上清を回収し、上清にエタノールを等量加えて、４℃で一晩静置した。次いで、遠心処理により沈殿を得て、エタノール１００ｍＬで再懸濁して遠心処理を行い、沈殿を回収した。これに純水を３００ｍＬ添加し、撹拌して、沈殿を再溶解した。これにセチルトリメチルアンモニウムブロミド（和光純薬工業社製）２％（ｗ／ｖ）水溶液を３００ｍＬ、さらに各種アルコール混合液［エタノール９０％（ｖ／ｖ）、メタノール５％（ｖ／ｖ）、２−プロパノール５％（ｖ／ｖ）］を６００ｍＬ添加し、混合して、沈殿を形成させた。次いで、混合液を遠心処理し、沈殿を回収し、沈殿に１Ｍ  食塩水２００ｍＬを添加し、撹拌して、沈殿を再溶解した。得られた液をろ過して不溶性物質を除去し、ろ液にエタノールを４００ｍＬ添加して、沈殿を形成させた。これをろ過し、固形分を減圧乾燥して、無色の結晶を３５０ｍｇ得た。
【００８２】
得られた結晶について、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−６０００，日本分光社製）分析を行い、市販のヒアルロン酸サンプルとスペクトルを比較した結果、ヒアルロン酸を含む混合物であることがわかった。
【００８３】
得られた結晶および市販のヒアルロン酸サンプル（フードケミファ社製）をそれぞれ１％（ｗ／ｖ）となるように純水で溶解した。別途、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、８０１ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｓｏｌｉｄ）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、これを上記１％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸溶液と等量ずつ混合し、３７℃にて１日間インキュベートした。各サンプルを膜ろ過し、市販のオリゴヒアルロン酸（フナコシ社製）とともに、ＨＰＬＣ分析も行った。
【００８４】
＜分析条件＞
カラム：ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（東ソー社製）
溶離液：水  〜  水−０．５Ｍ  塩化ナトリウム  ６：４（８０分間のグラデーション）
検出：２１０ｎｍ
カラム槽温度：４０℃
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：０．１ｍＬ
分析時間：８０ｍｉｎ
【００８５】
培養物から得られた結晶の酵素処理物、市販のヒアルロン酸の酵素処理物、および市販のオリゴヒアルロン酸において、同じ保持時間でピークが検出された。以上の結果から、培養物から得られた結晶にはヒアルロン酸が含まれていることが確認された。
【００８６】
［実施例８］
〔Ｋ３０４１株のミニジャーによるヒアルロン酸の生産と精製２〕
実施例７と同様の手法でＫ３０４１株を培養してヒアルロン酸含有培養液を得た。Ｋ３０４１株を培養して得られた培養液を遠心処理して上清を回収後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ウシ脾臓由来、和光純薬工業社製）およびリボヌクレアーゼ（ウシ膵臓由来、和光純薬工業社製）をそれぞれ２ｍｇずつ添加した以外は実施例７と同様に処理し、無色の結晶を３５０ｍｇ得た。
【００８７】
得られた結晶について、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−６０００，日本分光社製）分析を行った結果、市販のヒアルロン酸サンプル（ＦＣＨ−２００，キッコーマンバイオケミファ社製）とスペクトルが一致し、ヒアルロン酸が得られたことが確認された。以下に分析結果を示す。
ＩＲ  νmax（ｃｍ-1）＝１６０７，１４０７，１３７６，１１４８，１０３２，９４５
【００８８】
得られた結晶および市販のヒアルロン酸サンプル（キッコーマンバイオケミファ社製）をそれぞれ１％（ｗ／ｖ）となるように純水で溶解した。別途、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、８０１ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｓｏｌｉｄ）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、これを上記１％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸溶液と等量ずつ混合し、３７℃にて１日間インキュベートした。各サンプルを膜ろ過し、実施例７と同様の条件で市販のオリゴヒアルロン酸（フナコシ社製）とともに、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００８９】
培養物から得られた結晶の酵素処理物、市販のヒアルロン酸の酵素処理物において、同じ保持時間でピークが検出された（図３）。以上の結果から、培養物から得られた結晶はヒアルロン酸であることが確認された。
【００９０】
［実施例９］
〔Ｋ３０４１株が生産するヒアルロン酸の平均分子量測定〕
実施例８で得られたヒアルロン酸の無色結晶および下記に示す平均分子量の異なる市販のヒアルロン酸標品を、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱検出法）により分析した。装置および分析条件を下記に記す。
＜装置＞
ＨＰＬＣ：ＧＰＣ−１０１（ポンプ、デガッサ、オーブン、示差屈折計一体型，昭和電工社製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ（昭和電工社製）
ＭＡＬＳ
光散乱検出器：ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ  ８（Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
解析ソフト：ＡＳＴＲＡ  Ｖｅｒ  ５．３．４（Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
ＨＡ水溶液の屈折率増分ｄｎ／ｄｃ：０．１５２
第２ビリアル定数Ａ２：０．０００ｃｍ3・ｍｏｌ／ｇ
（文献値は０．００２ｃｍ3・ｍｏｌ／ｇであるが、高分子域で数万程度の分子量差しか与えないので、今回は無視した。）
【００９１】
＜分析条件＞
カラム槽温度：４０℃
溶離液：０．２Ｍ  硝酸ナトリウム
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．０１ｇ／ｄＬ
注入量：０．１ｍＬ
分析時間：３０ｍｉｎ
【００９２】
＜試料＞
実施例７で調製したサンプル
標品（キッコーマンバイオケミファ社製）
標品Ａ（極限粘度より換算した平均分子量  ２，０４０，０００）
標品Ｂ（極限粘度より換算した平均分子量  １，０４０，０００）
標品Ｃ（極限粘度より換算した平均分子量      １００，０００）
【００９３】
Ｋ３０４１株が生産するヒアルロン酸の重量平均分子量は重量平均分子量（Ｍｗ）で約６３万であり、また、分子量分布は、重量平均分子量（Ｍｗ）／数平均分子量（Ｍｎ）で算出した多分散度が約２．１であった。
【００９４】
［実施例１０］
〔Ｋ３０４１株のヒアルロン酸合成酵素のクローニング〕
（１）Ｋ３０４１株  染色体ＤＮＡの調製
Ｋ３０４１株をＭＲＳ寒天培地に接種し、３０℃、１日間、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いた嫌気条件にて静置培養した。培地表面に生育した菌体を集菌し、抽出液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）２ｍｌに懸濁させた。ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍｇ添加し、１時間室温で放置した。次いでプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１ｍｇ添加し、５５ ℃にて４時間処理した。ＴＥ飽和フェノール（和光純薬工業社製）０．５ｍｌで２回処理し、上清をクロロホルム０．５ｍｌで処理して上清を回収した。これに等量のイソプロピルアルコールを添加し、遠心処理して沈殿を得た。これを滅菌水に溶かして、染色体ＤＮＡ溶液を得た。
【００９５】
（２）Ｋ３０４１株のヒアルロン酸合成酵素のクローニング
ストレプトコッカス  ズーエピデミカス  ＡＴＣＣ３５２４６株のヒアルロン酸合成酵素（ｈａｓＡ）のアミノ酸配列（日本ＤＮＡデータバンク  アクセッションナンバー  ＡＦ３４７０２２）の配列情報を利用して、日本ＤＮＡデータバンクの国際塩基配列データベースを用いて、アミノ酸相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行った結果、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティスの中では、ＩＬ１４０３株のタンパク質（Ｑ９ＣＨ６３、Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（糖転位酵素））のアミノ酸配列と２１％同一性、４４％類似性であることがわかった。
【００９６】
上記２つのタンパク質（ｈａｓＡおよびＱ９ＣＨ６３）について、相同性が高い領域の部分配列を基に、コドンが縮重している箇所を混合塩基とした、以下の４種のｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ用プライマーを作製した。
［センスプライマー１：５’−ＧＴＮＡＴＨＷＳＮＧＣＮＴＡＹＡＡＹＧＡＲＧＡ’（配列番号１０、２３ｍｅｒ，Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｎはアデニン、シトシン、グアニンまたはチミン、Ｈはアデニン、シトシンまたはチミン、Ｗはアデニンまたはチミン、Ｓはシトシンまたはグアニン、Ｙはチミンまたはシトシン、Ｒはアデニンまたはグアニンを示す。）；
センスプライマー２：５’−ＧＡＲＡＴＨＴＴＹＡＴＨＧＴＮＧＡＹＧＡ−３’（配列番号１１、２０ｍｅｒ）；
アンチセンスプライマー１：５’−ＣＣＡＮＣＫＮＣＫＮＣＫＹＴＧＹＴＴＮＡ−３’（配列番号１２、２０ｍｅｒ，Ｋはグアニンまたはチミンを示す。）；
アンチセンスプライマー２：５’−ＣＫＲＴＴＮＣＫＮＡＣＤＡＴＮＧＧＮＣＫＮＣＣＮＧＴ−３’（配列番号１３、２６ｍｅｒ，Ｄはアデニン、グアニンまたはチミンを示す。）］
【００９７】
実施例１０中（１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記４種のプライマーとＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲマスターサイクラーグラジエント（エッペンドルフ社製）にて、熱変性９４℃，２分、アニール５０℃，３０秒、伸長反応７２℃，１分の条件下、３０サイクル行った結果、０．３ｋｂｐ程度に相当する遺伝子断片が増幅した。得られた遺伝子断片について、ダイレクトシーケンスで塩基配列を解読した結果、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＩＬ１４０３株のタンパク質（Ｑ９ＣＨ６３）の塩基配列の一部と完全に一致することが明らかになった。このＱ９ＣＨ６３の塩基配列の上流と下流の塩基情報を利用してＰＣＲを行い、Ｋ３０４１株のヒアルロン酸合成酵素をコードすると推定される遺伝子の全長を取得した（配列番号１４）。配列番号１４の塩基配列でコードされる推定アミノ酸配列を配列番号１５に示す。配列番号１５のアミノ酸配列はラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＩＬ１４０３株のタンパク質（Ｑ９ＣＨ６３）の塩基配列と完全に一致した。
【００９８】
［比較例５］
ヒアルロン酸非生産株である、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＮＢＲＣ１００９３３株について、実施例１０中（１）に記載の方法で染色体ＤＮＡを取得し、実施例１０中（２）に記載の方法で同プライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った結果、０．３ｋｂｐ程度に相当する遺伝子断片が増幅した。得られた遺伝子断片についてダイレクトシーケンスで塩基配列を解読した結果、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＩＬ１４０３株のタンパク質（Ｑ９ＣＨ６３）の塩基配列の一部と高い相同性（９５％類似性）が確認された。ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＩＬ１４０３株の配列情報を利用して、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  ＮＢＲＣ１００９３３株のＱ９ＣＨ６３に対応する部分をコードする遺伝子の全長を取得した（配列番号１６）。配列番号１６の塩基配列でコードされる推定アミノ酸配列は配列番号１７に示す。配列番号１７のアミノ酸配列は、実施例８で得られたラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス  Ｋ３０４１株由来の配列番号１５のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なり、さらにＣ末端側に５２アミノ酸が挿入されていることがわかった。配列番号１７のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴ検索した結果、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  クレモリスの細胞内接着タンパク質様タンパク質（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（３３０８２２３ＡＦＨ））のアミノ酸配列と最も高い相同性を示すことがわかった（８１％同一性、８７％類似性）。
以上、ヒアルロン酸非生産株であるラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス属する菌においても、Ｑ９ＣＨ６３の塩基配列の一部と高い類似性（相同性）を有する遺伝子が存在すること、該遺伝子と類似し、異なる機能を有する遺伝子が確認されたことから、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティスに属する菌において、ヒアルロン酸合成能の有無の違いは、ヒアルロン酸合成酵素ホモログのアミノ酸配列のわずかな違いに基づく可能性が示唆され、配列の類似性からその機能を推定することは難しいと考えられた。
【００９９】
［比較例６］
ストレプトコッカス  ズーエピデミカス  ＡＴＣＣ３５２４６株のヒアルロン酸合成酵素（ｈａｓＡ）のアミノ酸配列について、日本ＤＮＡデータバンクの国際塩基配列データベースを用いて、ラクトバチルス属とのアミノ酸相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行った。その結果、Ｋ３０４１株のヒアルロン酸合成酵素と推定されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５、ｈａｓＡと２１％同一性、４４％類似性）よりも高い相同性（類似性）を示すタンパク質（Ｑ８８ＷＵＯ、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（糖転位酵素）、ｈａｓＡと２４％同一性、４５％類似性）を有する乳酸菌  ラクトバチルス  プランタラム  ＮＣＩＭＢ８８２６株が見つかった。そこで、ラクトバチルス  プランタラム  ＮＣＩＭＢ８８２６株を実施例１と同様に炭素源の異なる複数種の培地で培養したが、いずれの培地中でもヒアルロン酸の生産は確認できなかった。ストレプトコッカス  ズーエピデミカス  ＡＴＣＣ３５２４６株のヒアルロン酸合成酵素（ｈａｓＡ）との相同性（類似性）のみを指標とするだけでは、ヒアルロン酸生産菌を見出すことができないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば、食品原料に豊富に含まれる糖を炭素源とする培地で乳酸菌を培養することにより、ヒアルロン酸を製造することができる。従って、多様な食品原料を用いてヒアルロン酸を生産することができる。また、本発明の製造方法で得られたヒアルロン酸含有組成物は、食品原料や乳酸菌等を分離せずに、そのまま、飲食・塗布することができる。さらに、本発明によれば、ヒアルロン酸合成能を有する形質転換体、該形質転換体を得るための組換えベクターも提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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