(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの検出を補助する方法であって、該方法は、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．（ｉ）ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合、前記対象がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩに罹患していると特定すること、または（ｉｉ）ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高くない場合、前記対象がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩに罹患していないと特定すること
を含み、
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる「ｍｉＲ−１３２ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４１およびｍｉＲ−１８１ａからなる群から選択されるか、あるいは
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる「ｍｉＲ−１３４ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７である、前記方法。
【請求項２】
対象においてｐｒｅ−ＭＣＩからＭＣＩへ進行する可能性を予測する方法であって、該方法は、
ａ．前記対象から採取した２つまたは３つ以上の体液サンプル中のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、ここで該サンプルは時間的な間隔を介して得られたものである、
ｂ．前記の対象から採取した各同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．前記対象から採取した２つまたは３つ以上の連続して得た体液サンプルにおいて、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合、前記対象における疾患がｐｒｅ−ＭＣＩからＭＣＩ進行するであろうと予測すること
を含み、
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる「ｍｉＲ−１３２ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４１およびｍｉＲ−１８１ａからなる群から選択されるか、あるいは
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる「ｍｉＲ−１３４ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７である、前記方法。
【請求項３】
対象における脳老化の検出を補助する方法であって、該方法は、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、（ｉ）過去に同一対象から得た対応するコントロール比か、または（ｉｉ）所定の若年スタンダード比と比較すること、および
ｅ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応するコントロール比（ｉ）または前記所定の若年スタンダード比（ｉｉ）と比較してより高い場合、前記対象が脳老化を受けやすいと特定すること
を含み、
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる「ｍｉＲ−１３２ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４１およびｍｉＲ−１８１ａからなる群から選択されるか、あるいは
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる「ｍｉＲ−１３４ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７である、前記方法。
【請求項４】
対象におけるｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの処置の有効性を決定する方法であって、該方法は、
ａ．前記処置を開始する前に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記処置を開始する前に得た、前記対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記処置を開始する前に得た、前記対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の処置中または処置後に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の同一のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｅ．前記の処置中または処置後に得た、前記対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｆ．前記の処置中または処置後に得た、前記対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｄ）および（ｅ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｇ．ステップ（ｃ）および（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を比較すること、および
ｈ．（ｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比がステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低い場合、前記処置が有効であると決定すること、（ｉｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比がステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低くない場合、前記処置が有効でないと決定すること
を含み、
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる「ｍｉＲ−１３２ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４１およびｍｉＲ−１８１ａからなる群から選択されるか、あるいは
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる「ｍｉＲ−１３４ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７である、前記方法。
【請求項５】
ｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用な化合物を特定する方法であって、該方法は、
ａ．ｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩを有する対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、ここで該体液サンプルはテスト化合物投与前に得られたものである、
ｂ．テスト化合物投与前に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．テスト化合物投与前に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．テスト化合物の投与の後に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の同一のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｅ．前記テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｆ．前記テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｄ）および（ｅ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｇ．ステップ（ｃ）および（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を比較すること、および
ｈ．（ｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低い場合、前記テスト化合物がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用であると特定すること、（ｉｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低くない場合、テスト化合物がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用でないと特定する
ことを含み、
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる「ｍｉＲ−１３２ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４１およびｍｉＲ−１８１ａからなる群から選択されるか、あるいは
シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる「ｍｉＲ−１３４ファミリー」から選択され、ノーマライザーｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７である、前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法を使用してＭＣＩに罹患していると特定された対象において、ＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行を予測またはモニタリングする方法であって、該方法は、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６の少なくとも１つのレベルを測定すること、
ｂ．前記同一体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの少なくとも１つの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合、前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤの認知症段階へ進行するであろうと決定すること
を含む、前記方法。
【請求項７】
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６の少なくとも１つのレベルを測定すること、
ｂ．前記同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．ステップ（ｃ）で計算した少なくとも１つの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合、前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤの認知症段階へ進行するであろうと決定すること
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ノーマライザーｍｉＲＮＡが、脳に濃縮されたノーマライザーｍｉＲＮＡであるか、または、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−１０ｂおよびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
（１）  （ｉ）ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１およびｍｉＲ−３７０からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含むか、あるいは
（２）  （ｉ）ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２およびｍｉＲ−８７４からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含むか、あるいは
（３）  （ｉ）ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−７およびｍｉＲ−１２５ｂからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含むか、あるいは
（４）  （ｉ）ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含むか、あるいは
（５）  （ｉ）ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７の少なくとも１つに特異的なプライマーまたはプローブを更に含むか、あるいは
（６）  （ｉ）ｍｉＲ−７に特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含むか、あるいは
（７）  （ｉ）ｍｉＲ−１２５ｂに特異的なプライマーまたはプローブを含み、任意に（ｉｉ）ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む、
請求項８に記載の方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年４月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／４７６、５９１号、２０１１年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／４７８、７６６号、および２０１１年１０月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／５４６、４３１号に基づく優先権を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、体液中の神経突起および／またはシナプスのｍｉＲＮＡを定量することによる軽度認知機能障害（ＭＣＩ）やアルツハイマー病（ＡＤ）の早期診断および進行モニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的な神経変性疾患であり、脳細胞における代謝変化、ニューロンのシナプスや他の部分の損失、そして最終的にはニューロン死により引き起こされる多数の病変からなる（Nerurodegenerative diseases: From Molecular Concepts to Therapeutic Targets. Editors: R. von Bernhardi, N.C. Inestrosa, Nova Publishers, 2008参照）。寿命の増加により、一般に神経変性疾患、特にＡＤは先進国では蔓延している。米国だけでも、現在５４０万人（世界では３千６百万人）以上の人々がＡＤに罹患しており、５５歳以上の約７〜８千万人の人々がＡＤを発症するリスクがあると推定されている。２０１１年に、米国におけるＡＤ患者のための保健医療の年間費用は、１８３０億万ドルと推定された（Rocca, W.A. et al. Alzheimer's & Dementia. 2011, 7:80-93; http://www.alz.org/downloads/Facts_Figures_2011.pdf）。ＡＤや他の神経変性疾患の薬剤開発や処置に成功することは、それらの早期診断やモニタリングのための有効な方法がないために大変複雑である。有効な診断方法の開発は、長期間における機能障害やニューロン損失を補償する脳の強力な潜在力によりさらに複雑化されている。このため、疾患の症状が臨床的に現れるのを遅らせる結果となり、すでにニューロンの多大な損失などの脳における重篤な形態変化のために、より良い結果をもたらす処置を施すことができない。このように、疾患の発症における早期現象の検出に基づいた診断方法が特に望まれている。
【０００４】
アルツハイマー病は、海馬や皮質などの脳の数箇所の疾患特異的部位におけるニューロン死により特徴付けられる。しかしながら、ニューロンの損失は、疾患の進行において比較的遅発性の現象であり、典型的にはシナプス性機能障害、シナプス損失、神経突起退縮や軸索伝達欠陥などの他の異常の出現の後に起こるものである（例、Crews, Masliah, Human Mol Gen., 2010, 19:R12-R20; Bredesen, Molecular Neurodegeneration 2009, 4:27; Nimmrich and Ebert, Rev Neurosci. 2009, 20:1-12; Yoshiyama et al., Neuron. 2007, 53:337-351; Wishartet al., J Neuropathol Exp Neurol. 2006, 65:733-739; Gylys et al., Neurochem Int. 2004;44:125-131; Conforti et al., Trends Neurosci. 2007, 30:159-166; Revuelta, et al. Am J Alzheimers Dis Other Demen 2008, 23: 97-102参照）。研究の多くは、シナプスの解体、軸索、樹状突起および棘突起の切断、膜に囲まれた「ａｘｏｓｏｍｅ（アクソサム）」の脱落を伴う軸索の破壊に関するものである（Goda, Davis, Neuron 2003, 40:243-264; Eaton, Davis, Genes Development, 2003, 17:2075-2082; Koirala, Ko, Neuron, 2004, 44:578-580; Bishop et al., Neuron, 2004, 44:651-661; Low, Cheng, Phil. Trans. R. Soc. B 2006 361, 1531-1544）。
【０００５】
現在、樹状棘突起密度やシナプスを再建可能な抗ＡＤ治療法の開発が試みられている（Adlard et al.、 PLoS ONE、 2011、 6:e17669）。
【０００６】
軽度の臨床的症状が現れるアルツハイマー病の初期症状は軽度認知機能障害（ＭＣＩ）であり、それは正常老化と認知症との中間の状態として通常定義される（DeCarli, Lancet Neurol., 2003, 2:15-21; Stephan et al., Alzheimer's Res Therapy, 2009, 1:1-9; Apostolova et al., Human Brain Mapping, 2010, 31:786-797）。平均して、ＭＣＩ患者は、年に１０〜１５％の比率で認知症へと移行する（Petersen et al., Arch Neurol. 2001, 58:1985-1992; Apostolova et al., Human Brain Mapping, 2010, 31:786-797）。しかしながら、現在のところ、ＭＣＩ予後は確実に予想できるものではない。第１に、ＭＣＩ患者の４０％までが正常な状態に戻り（Larrieu et al., Neurology, 2002, 59:1594-1599; Brooks, Loewenstein, Alzheimer's Res Therapy, 2010, 2:28-36）、死体解剖では相当な割合のＭＣＩ患者がＡＤ病変のエビデンスを有していないことが示されている（Jicha et al., Arch Neurol, 2006, 63:674-681; Khan, Alkon, Neurobiol. Aging, 2010, 31:889-900）。第２に、認知症に移行したＭＣＩ患者の約２０％が、ＡＤではなく、血管性、レビー小体、ハンチントン、パーキンソン、他の認知症などの他の神経変性疾患と診断されている（Jicha et al., Arch Neurol, 2006, 63:674-681; Stephan et al., Alzheimer's Res Therapy, 2009, 1:1-9）。第３に、病状の進行が、緩徐、中間、急速なものとＡＤ患者によって異なっている（Doody et al., Alzheimer's Res Therapy, 2010, 2:2-10）。臨床的にさえ、ＭＣＩは均一な病変ではなく、健忘性症状（ａＭＣＩ）を伴うものと健忘性症状を伴わない２つの病状として記述されている（Dlugaj et al., Dement Geriatr Cogn Disord., 2010, 30:362-373; Brooks, Loewenstein, Alzheimer's Res Therapy, 2010, 2:28-36）。いくつかの文献では、ａＭＣＩがより高い頻度で認知症に移行し、ＡＤの前兆としてより確実なものであると示している（Mariani et al., J Alzheimer's Dis., 2007, 12:23-35; Luck et al., Psychiatr Prax., 2008, 35:331-336; Koivunen et al., Neurology, 2011, 76:1085-1099）。しかしながら、他の著者たちは、２つのＭＣＩ形態の移行率に有意な差があることを見出していない（Rountree etal., Dement Geriatr Cogn Disord., 2007, 24:476-482）。
【０００７】
現在、ＡＤおよび他の形態の認知症の診断は、患者の認知機能の分析に基づいている。前述したように、脳における有効な補償機構のため、認知機能の低下は通常疾患の後期段階で認められるので、使用可能な処置はとても限られている。ニューロン間のアミロイド斑、神経原線維タウ変化および脳組織全体の萎縮がＡＤの特徴であり、これらの現象に基づいた診断テストの開発が多く試みられてきた。βアミロイド沈着の生体内検出（例、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、多光子画像法、脳磁気図検査（ＭＥＧ）、脳波記録法（ＥＥＧ）など）（Mucke, Nature, 2009, 461:895-897; Mistur et al., J. Clin. Neurol., 2009, 5:153-166; Miller, Science, 2009, 326:386-389; Perrin et al., Nature, 2009, 461: 916-922）を含む新たな画像技法がますます一般に使用されるようになってきているが、スクリーニングの目的では使用できない。
【０００８】
ＡＤおよび他の形態の認知症のための既存の診断的分子テストは２つのグループに別けることができる。１つ目のグループは、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の分析に基づいたものであり、疾患のリスクが高いことを予測するのに役立つが、診断には役立たない（Bettenset al., Hum Mol Genet. 2010, 19(R1):R4-R11）。２つ目のグループは、体液中のＡＤ発病に関与するタンパク質や、神経糸タンパク質（ＮＴＰ）などの脳特異的タンパク質の分析を用いる（Schipper, Alzheimer's & Dementia. 2007, 3:325-332）。しかしながら、これらのテストは十分な感度や特異度を有していない。最近公表されたデータは、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の３つのタンパク質バイオマーカー（βアミロイドタンパク質１−４２、全タウタンパク質、およびリン酸化タウ１８１Ｐタンパク質）の濃度を測定することによりＡＤ検出の感度が高くなることを示している（Meyer et al., Arch Neurol. 2010, 67:949-956; Fagan A.M. et al. Arch. Neurol. 2011, 68:1137-1144）。ＣＳＦの採取手順は侵襲性が高いので、このようなテストは日常の臨床での使用には実用的ではなく、困難を伴うものである。いくつかの研究グループが、ヒト血液中の多数のタンパク質または抗体の分析に基づいたＡＤ診断用測定法を報告している（Ray S. et al. 2007, Nat. Med. 13, 1359-1362; Reddy M.M. et al. 2011, Cell 144, 132-142; Nagele E. et al. 2011, PLoS One 6, e23112）。しかしながら、他の研究者はこれらの研究結果を確認することができなかった（Bjorkqvist M et al. 2012, PLoS One 7, e29868）。
【０００９】
２０１１年４月１９日に、米国国立老化／アルツハイマー病協会は、アルツハイマー病診断基準およびガイドラインを改定した（Khachaturian ZS, 2011 Alzheimer's and Dementia. 7, 253-256）。新しいガイドラインは以下の４つの論文で公表された：（ｉ）ＡＤの段階の分類、すなわち認知症の段階、症状のある前認知症の段階（ＭＣＩ）、無症状のＡＤ前臨床段階（ｐｒｅ−ＭＣＩ）（Jack et al., 2011, Alzheimer's and Dementia. 7, 257-262）;（ｉｉ）ＡＤによる認知症の診断に関するＮＩＡの推奨（McKhann et al., 2011, Alzheimer's and Dementia. 7, 263-269）；（ｉｉｉ）ＡＤによるＭＣＩの診断に関するＮＩＡの推奨（Albert et al., 2011, Alzheimer's and Dementia. 7, 270-279）；（ｉｖ）ｐｒｅ−ＭＣＩの定義に関してのＮＩＡの推奨（Sperling et al., 2011, Alzheimer's and Dementia. 7, 280-292）。新しいガイドラインは、ＭＣＩおよびＡＤと同様に、ｐｒｅ−ＭＣＩやＡＤの前駆症状の検出にも使用可能な信頼できるバイオマーカーが現在欠如していることおよびそれらの必要性が高いことを強調している。
【００１０】
このように、ＭＣＩまたはＡＤのさらに早期の無症状段階（ｐｒｅ−ＭＣＩ）を検出可能な非侵襲性または最小侵襲性分子テストが強く望まれている。更に、もしそのようなテストが疾患の予後の見通しや疾患や処置のモニタリングに使用できればより望ましいであろう。
【００１１】
ＡＤや他の神経変性疾患で起こる代謝変化は、棘突起、樹状突起、軸索の破壊およびシナプス損失を引き起こし、後者はニューロン死を誘発する可能性がある（Bredesen, Molecular Neurodegeneration 2009, 4:27; Crews, Masliah, Human Mol Gen., 2010, 19:R12-R20）。同様なプロセスは、胎児の脳の発達中にも起こっている。多数のニューロンが細胞間接着を確立しようと試み、それに成功したニューロンは残存し、他のニューロンは死滅する（Butts et al., Cell Death Differ. 2008, 15:1178-1186; Enokido and Hatanaka, Gan To Kagaku Ryoho. 1994, 21:615-620; Gasic and Nicotera, Toxicol Lett. 2003, 139:221-227）。
【００１２】
シナプスの解体、軸索、樹状突起および棘突起の切断、膜に囲まれた「ａｘｏｓｏｍｅｓ」の脱落を伴う軸索の破壊により、タンパク質、ＲＮＡやそれらの分解物などのニューロン、軸索、神経突起、棘突起およびシナプスの細胞質成分を含有する細胞外ベシクルを出現させる。これらの化合物の細胞外基質への放出を引き起こすプロセスは他にもあり、特に小疱形成（Charras et al., Biophys. J. 2008, 94:1836-1853; Fackler, Grosse, J. Cell Biol. 2008, 181:879-884）、エキサイトーシス（Skog et al. Nat Cell Biol., 2008, 10:1470-1476）および他の形態の能動分泌（Wang et al. Nucleic Acids Res., 2010, 38:7248-7259; Kosaka et al., J Biol Chem., 2010, 285:17442-17452; Pigati et al., PLoS ONE, 2010, e13515）が挙げられる。
【００１３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、その最終産物が約２２ｎｔの機能性ＲＮＡ分子である、ノンコーディングＲＮＡの一クラスである。それらは、メッセンジャートランスクリプトの相補領域に結合して翻訳を抑制したり、分解を制御することによる、標的遺伝子の制御に重要な役割を果す（Griffiths-Jones Nucleic Acids Research, 2006, 34, Database issue:D140-D144）。しばしば、ひとつのｍｉＲＮＡが複数のｍＲＮＡを標的とすることができ、ひとつのｍＲＮＡが、３’ＵＴＲの異なる領域を標的とする複数のｍｉＲＮＡにより制御されることが可能である。一度ｍＲＮＡに結合すると、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳および安定性に影響を与えて遺伝子発現およびタンパク質産生を調節することが可能となる（Baek et al., Nature 455(7209):64 (2008); Selbach et al., Nature 455(7209):58 (2008); Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; and Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28）。また、特徴のよくわかっていない他のクラスの小型ＲＮＡがある（Kim, Mol. Cells, 2005, 19：1-15参照）。
【００１４】
ｍｉＲＮＡの多くは、ある特定の器官/組織/細胞に特異的であるかあるいはそこで過剰発現している（例、Hua et al., BMC Genomics, 2009, 10:214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8:166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129:1401-1414; Lee et al., RNA. 2008, 14:35-42参照）。
【００１５】
細胞特異的なものも含めていくつかのｍｉＲＮＡは、特定の細胞区画、特に軸索、樹状突起、シナプスに濃縮されている（例、Schratt et al., Nature. 439:283-289, 2006; Lugli et al., J Neurochem. 106:650-661, 2008; Bicker and Schratt, J Cell Mol Med., 12:1466-1476, 2008; Smalheiser and Lugli, Neuro Molecule Med. 11:133-140, 2009; Rajasethupathy, Neuron. 63:714-716, 2009; Kye, RNA 13:1224-1234, 2007; Yu et al., Exp Cell Res. 314:2618-2633, 2008; Cougot, et al., J Neurosci. 28:13793-13804, 2008; Kawahara, Brain Nerve. 60:1437-1444, 2008; Schratt G. Rev Neurosci. 2009; 10:842-849; Pichardo-Casas et al. Brain Research. 1436:20-33, 2012参照）。
【００１６】
ＭｉＲＮＡの発現および濃度は、さまざまな生理学的および病変学的なシグナルにより調節されている。いくつかのｍｉＲＮＡの発現の変化は、アルツハイマーや他の神経変性疾患患者のニューロンに観察されている（Hebert and De Strooper, Trends Neurosci. 32:199-206, 2009; Saba et al., PLoS One. 2008; 3:e3652; Kocerha et al., Neuromolecular Med. 2009; 11:162-172; Sethi and Lukiw, Neurosci Lett. 2009, 459:100-104; Zeng, Mol Pharmacol. 75:259-264, 2009; Cogswell et al., Journal of Alzheimer's Disease. 14: 27-41, 2008; Schaefer et al., J. Exp. Med. 204:1553-1558, 2007; Hebert, Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:6415-6420; Wanget al., J Neurosci. 2008, 28:1213-1223; Nelson et al., Brain Pathol. 2008; 18:130-138; Lukiw, Neuroreport. 2007; 18:297-300）。
【００１７】
サイズが小さいために、ｍｉＲＮＡは、血液脳関門、胎盤バリア、腎臓バリアを通過可能である。ＭｉＲＮＡの放出は、病変、例えば悪性腫瘍により活性化可能である（Pigati et al., PLoS ONE, 2010, e13515）。体液中の細胞／組織特異的ｍｉＲＮＡの分析により生体内細胞死を検出することが提案されている（U.S. Patent Pub. No 20090081640; Laterza et al., Clin Chem. 2009, 55:1977-1983）。
【００１８】
ＡＤのような神経変性疾患の診断のための主要な方法として現在使用されている認知機能テストおよび脳画像法では、疾患の後期段階のみ検出が可能であり、十分に特異的ではない。当該分野では、主要な形態変化や大量のニューロン死の発生前に、ＭＣＩやＡＤを早期診断するための方法の開発が依然強く望まれている。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の概要
上記の発明の背景で特定したように、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、および先行する無症状の段階、ならびに他の神経変性疾患を早期検出およびモニタリングするための非侵襲性または最小侵襲性テストへの必要性は大きい。本発明は、体液中のシナプスおよび／または神経突起のｍｉＲＮＡの定量に基づいた、新規の高感度で非侵襲的または最小侵襲的診断方法およびモニタリング方法を提供することにより、上記必要性に対処するものである。本発明の方法は、主要な形態変化および大量のニューロン死が発生する前にｐｒｅ−ＭＣＩ、ＭＣＩ、ＡＤおよび他の神経変性疾患の診断およびモニタリングを可能とし、このように多数の臨床的意義を有する。例えば、本発明の方法の使用によれば、疾患のかなり早期の段階で処置を施すことが可能となるので、神経変性疾患に現在適用可能な処置の有効性を高めことが可能である。本発明の方法の使用によれば、新しい有効な治療的および／または予防的な処置の開発も可能となり、そのような開発に関連した治験の費用低減および効率向上が可能となる（例えば、患者の選択および階層化を簡易化しその確実性を向上することによる、および／または薬剤の効果を評価する方法を簡易化しその効率を向上することによる）。
【００２０】
ある側面では、本発明は、対象におけるｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの検出方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の対象から採取した体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを、該ｍｉＲＮＡの同年齢コントロールレベルと比較すること、および
ｃ．（ｉ）前記の対象から採取した体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルが同年齢コントロールと比較して増加している場合は前記対象がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩに罹患していると特定すること、または（ｉｉ）前記の対象から採取した体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルが同年齢コントロールと比較して増加していない場合は前記対象がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩに罹患していないと特定することを含む方法を提供する。
【００２１】
関連する側面において、本発明は、対象におけるｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの検出方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．（ｉ）ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合は、前記対象がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩに罹患していると特定すること、または（ｉｉ）ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高くない場合は、前記対象がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩに罹患していないと特定することを含む方法を提供する。
【００２２】
他の側面では、本発明は、対象においてｐｒｅ−ＭＣＩからＭＣＩへ進行する可能性を予測する方法であって、
ａ．前記対象から採取した２つもしくは３つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、ここで該サンプルは時間的な間隔を介して得られたものである、
ｂ．前記の対象から採取した各体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを、該ｍｉＲＮＡの同年齢コントロールレベルと比較すること、および
ｃ．前記対象から採取した２つまたは３つ以上の連続して得た体液サンプル中において、前記ｍｉＲＮＡのレベルが同年齢コントロールと比較して増加している場合は、前記対象における疾患がｐｒｅ−ＭＣＩからＭＣＩ進行するであろうことを予測することを含む方法を提供する。
【００２３】
ある実施態様では、前記体液サンプルは数ヶ月の間隔、例えば１、３、６、１２または２４ヶ月の間隔、好ましくは３〜６ヶ月の間隔で得ることが可能である。
【００２４】
関連する側面では、本発明は、対象においてｐｒｅ−ＭＣＩからＭＣＩへ進行する可能性を予測する方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のシナプスまたは神経突起ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、ここで該サンプルは時間的な間隔を介して得られたものである、
ｂ．前記の対象から採取した各同一体液サンプル中のノーマライザー（normalizer）ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．前記対象から採取した２つまたは３つ以上の連続して得た体液サンプルにおいて、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合は、前記対象における疾患がｐｒｅ−ＭＣＩからＭＣＩ進行するであろうと予測することを含む方法を提供する。
【００２５】
上記方法に使用したｍｉＲＮＡの同年齢コントロールレベルまたは同年齢コントロール比は、例えば所定のスタンダード（例えば、正常な認知機能を有する同年齢の集団を使用して決定された当該分野で容認されたレベルまたは比）であることができる。      
【００２６】
別の側面では、本発明は、対象における脳老化の検出方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の対象から採取した体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを、（ｉ）過去に同一対象から得た該ｍｉＲＮＡのコントロールレベルまたは（ｉｉ）所定の若年スタンダードと比較すること、および
ｃ．前記の対象から採取した体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルが、前記コントロール（ｉ）と比較して、または前記所定の若年スタンダード（ｉｉ）と比較して、増加している場合は、前記対象が脳老化を受けやすいと特定することを含む方法を提供する。
【００２７】
関連する側面では、本発明は、対象における脳老化の検出方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のシナプスまたは神経突起ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を、（ｉ）過去に同一対象から得た対応するコントロール比または（ｉｉ）所定の若年スタンダード比と比較すること、および
ｅ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、前記の対応するコントロール比（ｉ）または前記所定の若年スタンダード比（ｉｉ）と比較してより高い場合は、前記対象が脳老化を受けやすいと特定することを含む方法を提供する。
【００２８】
上記２つの方法で使用される所定の若年スタンダードは、例えば、正常な認知機能を有する関連する若年集団（例えば１０〜２０歳、２０〜３０歳、３０〜４０歳、２０〜５０歳）を使用して決定された当該分野で容認されたレベルまたは比であることができる。
【００２９】
更なる側面では、本発明は、対象におけるｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの処置の有効性を決定する方法であって、
ａ．前記処置を開始する前に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の処置中または処置後に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルを比較すること、および
ｄ．（ｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記の処置中または処置後に減少した場合は、前記処置が有効であると決定すること、（ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記の処置中または処置後に減少しなかった場合は前記処置が有効でないと決定することを含む方法を提供する。
【００３０】
関連する側面では、本発明は、対象におけるｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの処置の有効性を決定する方法であって、
ａ．前記処置を開始する前に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記処置を開始する前に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記処置を開始する前に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の処置中または処置後に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の同一のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｅ．前記の処置中または処置後に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｆ．前記の処置中または処置後に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｄ）および（ｅ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｇ．ステップ（ｃ）および（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を比較すること、および
ｈ．（ｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比がステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低い場合は前記処置が有効であると決定すること、（ｉｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比がステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低くない場合は前記処置が有効でないと決定することを含む方法を提供する。
【００３１】
別の側面では、本発明は、対象における脳老化を遅らせるための処置の有効性を決定する方法であって、
ａ．前記処置を開始する前に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記の処置中または処置後に得た、前記の対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルを比較すること、および
ｄ．（ｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記の処置中または処置後に減少した場合は前記処置が有効であると決定すること、（ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記の処置中または処置後に減少しなかった場合は前記処置が有効でないと決定することを含む方法を提供する。
【００３２】
関連する側面では、本発明は、対象における脳老化を遅らせるための処置の有効性を決定する方法であって、
ａ．前記処置を開始する前に得た、前記対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．前記処置を開始する前に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記処置を開始する前に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の処置中または処置後に得た、前記の対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の同一のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｅ．前記の処置中または処置後に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｆ．前記の処置中または処置後に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｄ）および（ｅ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｇ．ステップ（ｃ）および（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を比較すること、および
ｈ．（ｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低い場合は前記処置が有効であると決定すること、（ｉｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低くない場合は前記処置が有効でないと決定することを含む方法を提供する。
【００３３】
処置の有効性を決定する上記方法のある実施態様では、サンプルは、処置中または処置後に例えば１週間毎、２週間毎、１ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、１２ヶ月毎、２４ヵ月毎に得ることが可能である。
【００３４】
更なる側面では、本発明は、ｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用な化合物を特定する方法であって、
ａ．テスト化合物投与前に得た、ｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩを有する対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルを比較すること、および
ｄ．（ｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記化合物投与後に減少した場合はこのテスト化合物がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用であると特定すること、（ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記化合物投与後に減少しなかった場合はこのテスト化合物がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用でないと特定することを含む方法を提供する。
【００３５】
関連する側面では、本発明は、ｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用な化合物を特定する方法であって、
ａ．テスト化合物投与前に得た、ｐｒｅ−ＭＣＩまたはＭＣＩを有する対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．テスト化合物投与前に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．テスト化合物投与前に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の同一のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｅ．前記テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｆ．前記テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｄ）および（ｅ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｇ．ステップ（ｃ）および（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を比較すること、および
ｈ．（ｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低い場合は前記テスト化合物がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用であると特定すること、（ｉｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低くない場合はテスト化合物がｐｒｅ−ＭＣＩもしくはＭＣＩの進行を遅らせるか、または処置することに有用でないと特定することを含む方法を提供する。
【００３６】
別の側面では、本発明は、脳老化を遅らせることに有用な化合物を特定する方法であって、
ａ．テスト化合物投与前に得た、対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルを比較すること、および
ｄ．（ｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記化合物投与後に減少した場合はこのテスト化合物が脳老化を遅らせることに有用であると特定すること、（ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記化合物投与後に減少しなかった場合はこのテスト化合物が脳老化を遅らせることに有用でないと特定することを含む方法を提供する。
【００３７】
関連する側面では、本発明は、脳老化を遅らせることに有用な化合物を特定する方法であって、
ａ．テスト化合物投与前に得た、対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｂ．テスト化合物投与前に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．テスト化合物投与前に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した１つまたは２つ以上の体液サンプル中の同一のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｅ．前記テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｆ．前記テスト化合物の投与の後に得た、前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｄ）および（ｅ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｇ．ステップ（ｃ）および（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を比較すること、および
ｈ．（ｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低い場合は前記テスト化合物が脳老化を遅らせることに有用であると特定すること、（ｉｉ）ステップ（ｆ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比より低くない場合は前記テスト化合物が脳老化を遅らせることに有用でないと特定することを含む方法を提供する。
【００３８】
上記テスト化合物のスクリーニング方法は、前記テスト化合物を前記対象に投与するステップを含むことも可能である。
【００３９】
別の側面では、本発明は、ＭＣＩと診断された対象において、ＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行を予測する方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲ−４５１のレベルを測定すること、
ｂ．同一体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比が前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合は前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤの認知症段階へ進行するであろうと決定することを含む方法を提供する。
【００４０】
別の側面では、本発明は、ＭＣＩと診断された対象において、、ＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行を予測する方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲ−７、、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６の少なくとも１つのレベルを測定すること、
ｂ．同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡのレベルの比を対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．ステップ（ｃ）で計算した少なくとも１つの比が前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合は前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤの認知症段階へ進行するであろうと決定することを含む方法を提供する。
【００４１】
関連する側面では、本発明は、１つのテストで、バイオマーカー／ノーマライザーｍｉＲＮＡ比の２つの組み合わせ、すなわち、シナプスまたは神経突起ｍｉＲＮＡに対するｍｉＲ−４５１の比およびノーマライザーｍｉＲＮＡに対するｍｉＲ−７、１２５ｂまたはｍｉＲ−１６の比を含む、ＭＣＩを有すると診断された対象においてＭＣＩからＡＤの痴呆症段階へ進行を予測する方法を提供する。もし両比がそれぞれの同年齢コントロール比よりも高ければ、対象における疾患はＭＣＩからＡＤの痴呆症段階へ進行すると予期されるであろう。
【００４２】
別の側面では、本発明は、ＭＣＩと診断された対象において、ＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行をモニタリングする方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲＮＡ−４５１のレベルを測定すること、ここで該サンプルは時間的な間隔を介して得られたものである、
ｂ．前記の対象からの各体液サンプルｍｉＲＮＡ−４５１のレベルを対応する同年齢コントロールレベルと比較すること、および
ｃ．前記の対象からの各体液サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ−４５１のレベルが前記の対応する同年齢コントロールレベルより高い場合は前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤへ進行すると決定することを含む方法を提供する。
【００４３】
関連する側面では、本発明は、ＭＣＩと診断された対象においてＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行をモニタリングする方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲ−４５１のレベルを測定すること、ここで該サンプルは時間的な間隔を介して得られたものである、
ｂ．前記の対象から採取した各同一体液サンプル中の少なくとも１つのシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｃ）で計算したｍＲＮＡのレベルの比を対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｃ）で計算したｍｉＲＮＡの比が、前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合は前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤの認知症段階へ進行すると決定することを含む方法を提供する。
【００４４】
別の側面では、本発明は、ＭＣＩと診断された対象においてＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行をモニタリングする方法であって、
ａ．前記対象から採取した体液サンプル中のｍｉＲ−７、、１２５ｂおよびｍｉＲ−１６の少なくとも１つのレベルを測定すること、ここで該サンプルは時間的な間隔を介して得られたものである、
ｂ．前記の対象から採取した各同一体液サンプル中のノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定すること、
ｃ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ａ）および（ｂ）で測定したｍｉＲＮＡのレベルの比を計算すること、
ｄ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｃ）で計算したｍＲＮＡのレベルの比を、対応する同年齢コントロール比と比較すること、および
ｅ．前記の対象から採取した各体液サンプルについて、ステップ（ｃ）で計算した少なくとも１つの比が前記の対応する同年齢コントロール比より高い場合は前記対象における疾患がＭＣＩからＡＤの認知症段階へ進行すると決定することを含む方法を提供する。
【００４５】
関連する側面では、本発明は、１つのテストにおいて、バイオマーカー／ノーマライザーｍｉＲＮＡ比の２つ、すなわち（ｉ）シナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲ−４５１の比および（ｉｉ）ノーマライザーｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、またはｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される２つまたは３つ以上のノーマライザーの平均）に対するｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６少なくとも１つの比を組み合わせることを含む、ＭＣＩと診断された対象においてＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行をモニタリングする方法を提供する。もし、対象から採取した各体液サンプルにおいて、比（ｉ）および比（ｉｉ）が共に対応する同年齢コントロール比よりも高いならば、前記対象における疾患は、ＭＣＩからＡＤ認知症へ進行すると予期されるであろう。
【００４６】
上記方法のある実施態様では、前記体液サンプルは、数ヶ月の間隔、例えば１、３、６、１２または２４ヶ月の間隔、好ましくは３〜６ヶ月の間隔で採取することが可能である。
【００４７】
本発明の方法に有用なシナプスまたは神経突起ｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、例えばｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−９３９が挙げられる。
【００４８】
本発明のｐｒｅ−ＭＣＩおよびＭＣＩ診断、予後およびスクリーニング方法に有用なシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡの好ましい例としては、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−７およびｍｉＲ−１２５ｂが挙げられる。
【００４９】
脳老化に関する診断、予後およびスクリーニング方法に有用なシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡの好ましい例としては、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２が挙げられる。
【００５０】
本発明の方法における確度を向上させるために、２つもしくは３つ以上のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルを使用することが好ましい。２つもしくは３つ以上の連続して採取した体液サンプルにおけるシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡのレベルの変化を確認することが更に好ましい。
【００５１】
本発明の方法に有用なノーマライザーｍｉＲＮＡには、脳に濃縮されたノーマライザーｍｉＲＮＡと、多数の組織で発現するが脳においては有意に発現しないｍｉＲＮＡとが含まれる（例えば、ｍｉＲ−１０ｂまたはｍｉＲ−１４１）。本発明の方法は、１つのノーマライザー（例えば、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−３７０など）および２つまたは３つ以上のノーマライザーの平均（例えばｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される２つまたは３つ以上のノーマライザー）の使用を含んでいる。
【００５２】
本発明の方法に有用な脳に濃縮されたノーマライザーｍｉＲＮＡとしては、例えば、神経体ｍｉＲＮＡ、評価される病変に関与しない脳の部位に主に発現しているｍｉＲＮＡ、グリア細胞に主に発現しているｍｉＲＮＡ、および評価される病変において発現、分泌または両方が下方制御され、脳に濃縮されたｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００５３】
本発明の方法に有用な脳に濃縮されたノーマライザーｍｉＲＮＡの例としては、限定することなく、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐが挙げられ、それらは単独または併用して使用可能である。
【００５４】
ある具体的な実施態様では（本発明の各方法に適用可能）、前記のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる群（まとめて「ｍｉＲ−１３２ファミリー」と呼ぶ）から選択され、前記ノーマライザーｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される。
【００５５】
他の具体的な実施態様では（本発明の各方法に適用可能）、前記のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２（まとめて「ｍｉＲ−１３４ファミリー」と呼ぶ）からなる群から選択され、前記ノーマライザーｍｉＲＮＡはｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７である。
【００５６】
他の具体的な実施態様では（脳老化に関する方法以外の本発明のすべての方法に適用可能）、前記のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７であり、前記ノーマライザーｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４９１−５ｐまたはこれらすべてのノーマライザーの血漿中濃度の平均である。
【００５７】
他の具体的な実施態様では（脳老化に関する方法以外の本発明のすべての方法に適用可能）、前記のシナプスまたは神経突起のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ｂであり、前記ノーマライザーｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４９１−５ｐまたはこれらすべてのノーマライザーの血漿中濃度の平均である。
【００５８】
本発明の方法で使用する対象としては、例えばヒト、家畜動物、神経変性疾患または他のニューロン症状の実験動物モデルが挙げられる。本発明の診断的、予後的および処置モニタリング方法のためには、前記対象はヒトであることが好ましい。スクリーニング方法のためには、前記対象は実験動物であることが好ましい。
【００５９】
本発明の方法で使用可能な体液の例としては、限定するものではないが、例えば血漿または血清、尿および唾液が挙げられる。いくつかの実施態様では、ｍｉＲＮＡは体液サンプルから精製される。
【００６０】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、（例えば最初のステップとして）対象から体液サンプルを採取するステップを含む。
【００６１】
本発明の方法では、ｍｉＲＮＡのレベルは、例えば、ハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、配列決定法などの任意の好適な技法を使用して決定することが可能である。
【００６２】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、前記ｍｉＲＮＡの分解を低減または阻止するステップを更に含むことが可能である。
【００６３】
いくつかの実施態様では、本発明の診断方法は、病状を有するまたはより重度の病状へ進行するリスクがあると診断された対象に治療的または予防的な処置を施すステップを更に含むことが可能である。
【００６４】
いくつかの実施態様では、本発明の診断方法は、対象を治験に募集するステップを更に含むことが可能である。
【００６５】
上記診断方法およびスクリーニング方法と組み合わせて、本発明は、標的ｍｉＲＮＡの検出に特異的なプライマーおよび／またはプローブのセットを１つもしくは２つ以上含む様々なキットも提供する。そのようなキットは、ノーマライザーｍｉＲＮＡの検出に特異的なプライマーおよび／またはプローブのセットを更に含むことが可能である。キットにおけるプライマーまたはプローブの組み合わせの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
【００６６】
１．ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３７０からなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００６７】
２．ｍｉＲ−４５１に特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−９３９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００６８】
３．ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−９３９からなる群から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００６９】
４．ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−７およびｍｉＲ−１２５ｂからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００７０】
５．ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００７１】
６．ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７の少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００７２】
７．ｍｉＲ−７に特異的なプライマーまたはプローブ(任意に、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む)。
【００７３】
８．ｍｉＲ−１２５ｂに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【００７４】
そのようなキットは、患者から単離した体液サンプル中におけるｍｉＲＮＡを直接検出するのに有用であり得るか、精製ＲＮＡサンプルに使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ−Ｅ】図１Ａ〜Ｅは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−８７４（Ｂ）、ｍｉＲ−９（Ｃ）、ｍｉＲ−１８１ａ（Ｄ）、ｍｉＲ−４９１−５ｐ（Ｅ）の濃度の比較を示すグラフである。すべての濃度は、スパイクされた（spiked）ａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａに対してノーマライズした。これらおよび他の箱ひげ図において、箱は、結果の５０％分布を示し、箱の上下のバーは結果の８０％を示す。点は８０％データの外側に位置する分析値を示す。分析の中央値は、箱の中の線により示される。ノーマライズしたｍｉＲＮＡ濃度は、相対単位で縦軸に示してある（対数尺度）。
【００７６】
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲ−８７４（Ａ）、ｍｉＲ−１３４（Ｂ）、びｍｉＲ−５３９（Ｃ）濃度の比較を示すグラフである。すべての濃度はｍｉＲ−１４１に対してノーマライズした。
【００７７】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−１２８（Ｂ）、ｍｉＲ−１３４（Ｃ）の濃度はｍｉＲ−１８１ａに対してノーマライズした。
【００７８】
【図４】図４は、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲ−１２５ｂ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−１２５ｂの濃度はｍｉＲ−９に対してノーマライズした。
【００７９】
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−１２８（Ａ）、ｍｉＲ−１３４（Ｂ）、ｍｉＲ−８７４（Ｃ）の濃度はｍｉＲ−４９１−５ｐに対してノーマライズした。
【００８０】
【図６】図６は、ＭＣＩ（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−１３４濃度はｍｉＲ−１２７に対してノーマライズした。
【００８１】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−１３２（Ａ）、ｍｉＲ−３２３−３ｐ（Ｂ）の濃度はｍｉＲ−１６に対してノーマライズした。
【００８２】
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、ＭＣＩ（ＭＣＩ）および同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−１３４（Ａ）、ｍｉＲ−８７４（Ｂ）、ｍｉＲ−５３９（Ｃ）の濃度はｍｉＲ−１０ｂに対してノーマライズした。
【００８３】
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａ〜Ｃは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）、ＡＤ患者（ＡＤ）、同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−１３２（Ｂ）、ｍｉＲ−８７４（Ｃ）の濃度はｍｉＲ−１４１に対してノーマライズした。
【００８４】
【図１０Ａ−Ｅ】図１０Ａ〜Ｅは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）、ＡＤ患者（ＡＤ）、同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中のｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−１２８（Ｂ）、ｍｉＲ−１３２（Ｃ）、ｍｉＲ３８２（Ｄ）、ｍｉＲ−８７４（Ｅ）の濃度はｍｉＲ−９に対してノーマライズした。
【００８５】
【図１１Ａ−Ｅ】図１１Ａ〜Ｅは、ＭＣＩ患者、ＡＤ患者、同年齢コントロールの血漿中のｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−１３２（Ａ）、ｍｉＲ−１３４（Ｂ）、ｍｉＲ−３２３−３ｐ（Ｃ）、ｍｉＲ−３８２（Ｄ）、ｍｉＲ−８７４（Ｅ）の濃度はｍｉＲ−１２７−３ｐに対してノーマライズした。
【００８６】
【図１２Ａ−Ｇ】図１２Ａ〜Ｇは、ＭＣＩ患者、ＡＤ患者、同年齢コントロールの血漿中のｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−１２８（Ｂ）、ｍｉＲ−１３２（Ｃ）、ｍｉＲ−１３４（Ｄ）、ｍｉＲ３２３−３ｐ（Ｅ）、ｍｉＲ−３８２（Ｆ）、ｍｉＲ−８７４（Ｇ）の濃度はｍｉＲ−１８１ａに対してノーマライズした。
【００８７】
【図１３Ａ−Ｈ】図１３Ａ〜Ｈは、ＭＣＩ患者、ＡＤ患者、同年齢コントロールの血漿中のｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−１２５（Ｂ）、ｍｉＲ−１２８（Ｃ）、ｍｉＲ−１３２（Ｄ）、ｍｉＲ−１３４（Ｅ）、ｍｉＲ３２３−３ｐ（Ｆ）、ｍｉＲ−３８２（Ｇ）、ｍｉＲ−８７４（Ｈ）の濃度はｍｉＲ−３７０に対してノーマライズした。
【００８８】
【図１４Ａ−Ｈ】図１４Ａ〜Ｈは、ＭＣＩ患者、ＡＤ患者、同年齢コントロールの血漿中のｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−１２５（Ｂ）、ｍｉＲ−１２８（Ｃ）、ｍｉＲ−１３２（Ｄ）、ｍｉＲ−１３４（Ｅ）、ｍｉＲ３２３−３ｐ（Ｆ）、ｍｉＲ−３８２（Ｇ）、ｍｉＲ−８７４（Ｈ）の濃度はｍｉＲ−４９１−５ｐに対してノーマライズした。
【００８９】
【図１５Ａ−Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、ｍｉＲ−４９１−５ｐに対してノーマライズしたｍｉＲ−１２８（Ａ）、ｍｉＲ−１３２（Ｂ）およびｍｉＲ−８７４（Ｃ）で得られた、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）と同年齢コントロール（ＡＭＣ）を区別するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を示す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。各バイオマーカー／ノーマライザーペアの感度、特異度、正確度は「カットオフ」ポイント（各プロット上の点で示される）で計算する；カットオフポイントは、サンプルがＡＭＣ群またはＭＣＩ群に属する可能性が等しくなるバイオマーカー／ノーマライザー比である。
【００９０】
【図１６Ａ−Ｃ】図１６Ａ〜Ｃは、ｍｉＲ−３７０に対してノーマライズされたｍｉＲ−１３４（Ａ）、ｍｉＲ−３２３−３ｐ（Ｂ）およびｍｉＲ−３８２（Ｃ）で得られた、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）と同年齢コントロール（ＡＭＣ）を区別するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を示す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。各バイオマーカー／ノーマライザーペアの感度、特異度、正確度は「カットオフ」ポイント（各プロット上の点で示される）で計算する；カットオフポイントは、サンプルがＡＭＣ群またはＭＣＩ群に属する可能性が等しくなるバイオマーカー／ノーマライザー比である。
【００９１】
【図１７Ａ−Ｆ】図１７Ａ〜Ｆは、ｍｉＲ１２８とｍｉＲ−１３２（Ａ）、ｍｉＲ−１２８とｍｉＲ−８７４（Ｂ）、ｍｉＲ−１３２とｍｉＲ−８７４（Ｃ）、ｍｉＲ−１３４とｍｉＲ−３２３−３ｐ（Ｄ）、ｍｉＲ−１３４とｍｉＲ−３８２（Ｅ）、ｍｉＲ−３８２とｍｉＲ−３２３−３ｐ（Ｆ）の間の関連の分析を示す。様々なバイオマーカーペアのＣｔ値を比較し、スピアマンの順位相関係数ｒを、９５％信頼区間（最大値と最小値）とともに計算した。
【００９２】
【図１８Ａ−Ｊ】図１８Ａ〜Ｊは、２１〜５０歳（ＣＹ）と７６〜８６歳（ＣＯ）のコントロールの血漿中におけるｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。バイオマーカーｍｉＲＮＡの濃度はさまざまなｍｉＲＮＡノーマライザーに対してノーマライズし、相対単位で示した（縦軸）。Ａ：ｍｉＲ−１２８／ｍｉＲ−１８１ａ；Ｂ：ｍｉＲ−１３２／ｍｉＲ−１８１ａ；Ｃ：ｍｉＲ−８７４／ｍｉＲ−１８１ａ；Ｄ：ｍｉＲ−１３４／ｍｉＲ−３７０；Ｅ：ｍｉＲ−３２３−３ｐ／ｍｉＲ−３７０；Ｆ：ｍｉＲ−３８２／ｍｉＲ−３７０；Ｇ：ｍｉＲ−１３２／ｍｉＲ−９；Ｈ：ｍｉＲ−３８２／ｍｉＲ−１２７−３ｐ；Ｉ：ｍｉＲ−１３２／ｍｉＲ−４９１−５ｐ；Ｊ：ｍｉＲ−８７４／ｍｉＲ−４９１−５ｐ。
【００９３】
【図１９】図１９は、２〜５年間の間における、最初に正常な認知機能を有した高齢対象の血漿中におけるバイオマーカーの濃度の分析を示す。ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４（バイオマーカー）のレベルを測定し、ｍｉＲ−４９１−５ｐに対してノーマライズした。患者は、これら３つのバイオマーカーの少なくとも２つの濃度が、ＲＯＣ曲線（図１５）からカットオフ点として設定したコントロール値より高い場合に、病変陽性とみなした。灰色および黒色は、それぞれコントロールおよび病変を示している。小さな四角形は血漿ｍｉＲＮＡテストの結果を示し、外側の色は臨床診断を示す；すなわち、２つの色が見られるのは、臨床診断が現行の方法での予測と違うケースにおいてのみである。
【００９４】
【数１】
0006021893.tif 000002
−血漿ｍｉＲＮＡテストによっても陰性と決定された認知機能テストにより診断されたＭＣＩフリー患者；
【数２】
0006021893.tif 000003
−血漿ｍｉＲＮＡテストにより陽性と決定されたＭＣＩフリー患者；
【数３】
0006021893.tif 000004
−血漿ｍｉＲＮＡテストにより陰性と決定されたＭＣＩの臨床症状を有する患者；
【数４】
0006021893.tif 000005
−血漿ｍｉＲＮＡテストにより陽性と決定されたＭＣＩの臨床症状を有する患者。時点０でＰａｔｉｅｎｔ１から採取されたサンプルから単離されたｍｉＲＮＡは、強度のＲＴ−ＰＣＲ阻害のため品質管理（ＱＣ）に合格しなかった；このサンプルは分析しなかった。
【００９５】
【図２０Ａ−Ｇ】図２０Ａ〜Ｇは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）、ＡＤ患者（ＡＤ）、同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中におけるｍｉＲ−４５１濃度の比較を示すグラフである。ｍｉＲ−４５１濃度は、ｍｉＲ−１４１（Ａ）、ｍｉＲ−９（Ｂ）、ｍｉＲ−１８１ａ（Ｃ）、ｍｉＲ−３７０（Ｄ）、ｍｉＲ−４９１−５ｐ（Ｅ）、ノーマライザーｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４９１−５ｐの平均（Ｆ）、ならびにこの研究で分析した１５個すべてのｍｉＲＮＡ（例３参照）の平均（ＡＶＥＲ）（Ｇ）に対してノーマライズし、相対単位で示した（縦軸）。
【００９６】
【図２１Ａ−Ｂ】図２１Ａ〜Ｂは、ＭＣＩ患者とＡＤ患者の血漿中におけるｍｉＲ−４５１と神経突起／シナプスｍｉＲ−１３２（Ａ）またはｍｉＲ−８７４（Ｂ）濃度の比を示すグラフである。
【００９７】
【図２２Ａ−Ｆ】図２２Ａ〜Ｆは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）と同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中における２つのｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。すべての濃度はｍｉＲ−４５１−５ｐに対してノーマライズし、相対単位で示した（対数スケール）。Ａ：ｍｉＲ−７とｍｉＲ−４５１；Ｂ：ｍｉＲ−１６とｍｉＲ−４５１；Ｃ：ｍｉＲ−１２５ｂとｍｉＲ−４５１；Ｄ：ｍｉＲ−７とｍｉＲ−１６；Ｅ：ｍｉＲ−７とｍｉＲ−１２５ｂ；Ｆ：ｍｉＲ−１６とｍｉＲ−１２５ｂ。
【００９８】
【図２３Ａ−Ｆ】図２３Ａ〜Ｆは、ＭＣＩ患者（ＭＣＩ）と同年齢コントロール（ＡＭＣ）の血漿中における２つのｍｉＲＮＡ濃度の比較を示すグラフである。すべての濃度は、５つのノーマライザー（ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐ）の平均に対してノーマライズし、相対単位で示した（対数スケール）。Ａ：ｍｉＲ−７とｍｉＲ−４５１；Ｂ：ｍｉＲ−１６とｍｉＲ−４５１；Ｃ：ｍｉＲ−１２５ｂとｍｉＲ−４５１；Ｄ：ｍｉＲ−７とｍｉＲ−１６；Ｅ：ｍｉＲ−７とｍｉＲ−１２５ｂ；Ｆ：ｍｉＲ−１６とｍｉＲ−１２５ｂ。
【００９９】
【図２４】図２４は、図２１、図１４、図２０に示したデータを比較する。「ＭＣＩとＡＤの比較」欄において、灰色の升目は、血漿中ｍｉＲ−４５１／ｍｉＲ−１３２比とｍｉＲ−４５１／ｍｉＲ−８７４比がＡＤ認知症患者に特徴的な範囲にあって臨床診断されたＭＣＩ患者を示す。「ＭＣＩとＡＭＣの比較」欄において、灰色の升目は、ｍｉＲ−４９１−５ｐ対してノーマライズしたｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４５１の血漿中濃度が同年齢コントロールや他のＭＣＩ患者とは異なる患者を示す。これらのアプローチは両方とも、同じＭＣＩ患者を明示しており、これらがＭＣＩ−認知症の進行を予測する能力を有していることを実証している。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明の詳細な説明
本発明は、神経突起（軸索および／または樹状突起および／または棘突起）の破壊やシナプスの損失および何らかの代謝的事象がＡＤ（ＭＣＩおよび先行する時間）や他の神経変性疾患の発症過程におけるニューロン死に先行しているので、これらの現象の検出に基づいた方法が、細胞死の検出に基づいたものよりも、より早期の疾患診断に使用できるであろうという発明者の認識に基づいている。更に、そのようなテストは、病変の発症における重要な事象を反映するので、疾患や処置のモニタリングに使用できるであろう。
【０１０１】
この発明は、シナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡのレベルが、それぞれの同年齢コントロールに比較して、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）を有する患者の体液中において上昇しており、これは過度の神経突起破壊および／またはシナプスの損失を反映しているという発明者の発見に更に基づいている。
【０１０２】
本発明の意味の範囲内で、「シナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡ」という用語は、（ｉ）「脳に濃縮された」すなわち、テストされる体液中の相当量のｍｉＲＮＡの供給源であり得る他の器官と比較して、脳に増加した量で存在しており（例えば少なくとも５倍の濃度）かつ（ｉｉ）シナプスおよび／または神経突起（すなわち、軸索および／または樹状突起および／または棘突起）に存在するｍｉＲＮＡを意味する。有望なｍｉＲＮＡバイオマーカーが脳に濃縮されていることは、スクリーニングや最初の診断の目的のために重要である。なぜならニューロンで発現する多くのｍｉＲＮＡは、他の組織や細胞タイプでも発現するからである。その結果、そのようなｍｉＲＮＡの血漿中濃度の変化は、他の器官の病変を反映するかもしれない。他方、疾患、例えばＭＣＩが既に検出されている場合は、ニューロンで発現するが脳に濃縮されていないｍｉＲＮＡは、特に脳に濃縮されたｍｉＲＮＡのバイオマーカーやノーマライザーとの組み合わせで、鑑別診断、疾患結果の予後およびモニタリングに使用可能である。例えば、いくつかのシナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡは、神経病変の発症中に異常細胞からはるかに有効に分泌されるので、そのようなシナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡは、脳に濃縮されていなくとも、本発明の方法において有望なバイオマーカーとしてテストすることが可能である。本発明の方法に有用であるためには、そのようなシナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡが、ニューロンから放出された結果として体液中で検出可能であるべきである（例えば、分泌、神経突起／シナプス破壊、ニューロン死による）。
【０１０３】
本発明は、対象からの体液サンプル（例えば血漿または血清、尿、唾液、他の体液）中の１つまたは２つ以上のシナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含む、対象における軽度認知機能障害（ＭＣＩ）およびそれが進行する可能性のあるさまざまな神経変性の症状（例えばアルツハイマー病（ＡＤ））を診断する、新規の高感度および非侵襲性または最小侵襲性方法を提供する。
【０１０４】
本発明の診断方法は、ＭＣＩおよびＡＤの先行する段階、他の神経変性疾患ならびに他の神経変性の障害の早期診断、例えばそのような疾患や障害に関連する主要な形態変化および／または大量のニューロン死が発生する前の診断を可能とする。
【０１０５】
更に、シナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡの分析は、シナプスおよび神経突起に存在しないまたは枯渇している神経体ｍｉＲＮＡの検出と比較して、ｍｉＲＮＡ検出の感度を有意に向上する。なぜなら、脳におけるシナプスおよび神経突起の量は、ニューロンの量より１０３倍高いからである。このアプローチは、ニューロンにおけるさまざまな特定の事象（例えば、ｍｉＲＮＡプロファイルの変化、それらの分泌、神経突起変性、シナプス損失および最終的なニューロン死）が検出・定量可能であるので、疾患の発症および処置の有効性をモニタリングするための詳細で網羅的な情報も提供する。
【０１０６】
より小さな規模ではあるが、同様のプロセスが正常老化にも特徴的であり、同様のアプローチを使用して検出やモニタリングが可能である。後述の例に示す実験データは、適切なノーマライズにより、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２の血漿中濃度が、高齢者コントロール群（７６〜８６歳）では、「若年」群コントロール（２０〜５０歳）より４０〜６０％高いことを示している。ＭＣＩ患者のそれぞれの数は、有意により高くなっている（「若年」コントロールと比較した場合、血漿中バイオマーカーｍｉＲＮＡ濃度が２００〜５００％増加）。
【０１０７】
発明の方法で検出可能な、同年齢の健常者と比較したＭＣＩ、ｐｒｅ−ＭＣＩ、他の神経変性障害を有する対象の体液中におけるシナプスおよび／または神経突起ｍｉＲＮＡのレベルの差は、（ｉ）疾患に関連した、神経突起および／またはシナプスの破壊、（ｉｉ）疾患に関連した、これらのｍｉＲＮＡの発現または代謝における変化、（ｉｉｉ）疾患に関連した、これらのｍｉＲＮＡの輸送および細胞内分布における変化、（ｉｖ）疾患に関連した、これらのｍｉＲＮＡの分泌における変化（Rabinowits et al. Clin Lung Cancer, 2009, 10:42-46; 例えば、miR-451，miR-1246 - Pigati et al., PLoS ONE, 2010, e13515参照）、（ｖ）疾患に関連した、血液脳関門透過性における変化、および他の原因によるものであろう。
【０１０８】
体液中のｍｉＲＮＡ濃度レベルは、多数の因子に依存するので、データノーマライズは大変重要な課題である。データノーマライズには、数種類のアプローチが使用可能である：（ｉ）スパイクされた非ヒトｍｉＲＮＡ（例えばａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａ）に対してのノーマライズは、抽出の間のｍｉＲＮＡ収率およびＲＴ−ＰＣＲ阻害の可能性についての情報を与える；（ｉｉ）発現、分泌などが疾患に関連して変化する可能性があることで制約されるが、遍在性ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１６）に対してのノーマライズ；（ｉｉｉ）多数の組織で発現するが脳で下方制御しているｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１）に対してのノーマライズ；（ｉｖ）血液供給、血液脳関門透過性などにおける変化などの因子を補償する、脳に濃縮されたｍｉＲＮＡに対してのノーマライズ。後者のアプローチは、以下の場合に特に生産的であろう：（１）ｍｉＲＮＡバイオマーカーが神経突起および／またはシナプスに濃縮され、ｍｉＲＮＡノーマライザー、例えばｍｉＲ−１２７が主にグリア細胞に存在する（Wu et al. 2009; Mol. Therapy, 17: 2058-2066）、（２）ｍｉＲＮＡバイオマーカーが神経突起またはシナプスに存在し、ｍｉＲＮＡノーマライザーが神経体に特異的である；この場合、ＡＤの早期段階でｍｉＲＮＡバイオマーカーは好ましくは軸索、神経突起、棘突起およびシナプス破壊により放出され、例えば主にニューロンの核周囲部分に存在する脳に濃縮されたｍｉＲ−９が、ノーマライザーとして使用可能であろう（Truettner et al. 2011. J. Cerebral Blood Flow & Metabolism, epub. April 20）、（３）ｍｉＲＮＡバイオマーカーがＡＤで最初に障害を受ける海馬に存在し、ｍｉＲＮＡノーマライザーが脳の他の部位に存在する、（４）ｍｉＲＮＡ「ノーマライザー」の発現または分泌が、ＡＤ発症のために抑制される；このため、バイオマーカー／「ノーマライザー」比の測定は、早期ＭＣＩおよびＡＤ検出に有用であり得る。さまざまな脳に濃縮されたｍｉＲＮＡをノーマライザーとして使用することの他の重要な利点は、それらが末梢血液の細胞において存在しないことあるいは発現が大変低いことで、それによって溶血が原因となるデータ歪曲が防止される、（ｖ）数種のノーマライザーの平均に対してのノーマライズ、例えば１５を超える多数のｍｉＲＮＡを分析する場合、すべてのテストした脳に濃縮されたｍｉＲＮＡの平均に対してのノーマライズ。
【０１０９】
後述の例で詳細に記載するように、最良のバイオマーカーおよびノーマライザーｍｉＲＮＡを選択するために、ＭＣＩ患者、ＡＤ患者、同年齢コントロール群の血漿中における、神経突起／シナプスのものも含めた、多数の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡの濃度をＲＴ−ＰＣＲで分析した。その後、分析したすべてのｍｉＲＮＡを有望なバイオマーカーおよびノーマライザーとしてテストし、ＭＣＩ患者および同年齢コントロールの間で統計的に有意な差を示した組み合わせを最も有望なものとして選択した。これらのデータにより、最も有望なバイオマーカーは神経突起／シナプスｍｉＲＮＡであり、最良のノーマライザーは他の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡであることが示された。ｍｉＲ−１３２ファミリーおよびｍｉＲ−１３４ファミリーの２つのバイオマーカーファミリーと数種類のノーマライザーがＭＣＩ検出に最も高い感度（８４〜９２％）と特異度（８４〜９０％）を示した。ｍｉＲ−１３４ファミリーのメンバー間の高い相関性は、このファミリーのすべてのメンバー、すなわちｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２が、同じクラスターに属しており、同じ細胞タイプに発現する事実により容易に説明可能である。ｍｉＲ−１３２ファミリーのメンバー、すなわちｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４間の密接な関係は、これ以前に記述されていない。ｍｉＲ−１３２バイオマーカーファミリーとｍｉＲ−１３４バイオマーカーファミリーが異なるノーマライザーとの組み合わせでより良い結果を与えることも興味深い。ｍｉＲ−１３２ファミリーは、ノーマライザーｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１４１との組み合わせでは、ｍｉＲ−１３４ファミリーよりもよく作用する。他方、ｍｉＲ−１３４ファミリーは、ノーマライザーｍｉＲ−３７０やｍｉＲ−１２７との組み合わせでは、ｍｉＲ−１３２ファミリーよりも良い結果を示す。
【０１１０】
ここに開示されるように、登録時に認知機能が正常な高齢患者におけるＭＣＩ発症の後向き長期研究では、血漿中ｍｉＲＮＡバイオマーカーの上昇は、ＭＣＩ臨床所見に１〜５年先行する無症状の疾患段階において検出可能であることが示された。
【０１１１】
ＭＣＩ／ＡＤ進行と正常老化は、例えば神経突起およびシナプス破壊ならびに最終的なニューロン死などのある共通のプロセスを共有するので、本発明者らはｍｉＲＮＡバイオマーカーおよびノーマライザーの同じ組み合わせを使用して正常老化も検出することが可能であるかどうか分析した。認知が正常な対象の２つのグループ、グループ１（２１〜５０歳）およびグループ２（７６〜８６歳）からの血漿サンプル中のｍｉＲＮＡを比較した。分析結果は、神経突起／シナプスｍｉＲ−１３２ファミリーおよびｍｉＲ−１３４ファミリーの濃度中央値がグループ１に比較してグループ２対象の血漿中において４０〜８０％高かったことを示した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１）。
【０１１２】
ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂなどの他の有望なバイオマーカーは、ＭＣＩ患者のより小さな分集団（約６０％の感度）を高い特異度（８６〜９３％）で検出する。これらのｍｉＲＮＡは、加齢性の脳の変化を検出しないが、これは、ＭＣＩおよびＡＤ発症中のこれらの血漿中濃度の増加が、あまり一般的ではないプロセス、おそらくＡＤに特徴なものによることを意味している。
【０１１３】
ＭＣＩからＡＤの認知症段階への進行の間、体液中のバイオマーカー／ノーマライザー比はさまざまな因子により変化している。第１に、ＭＣＩ進行の早期無症状の段階で多数のシナプスおよび神経突起が破壊されるので、ＡＤの後期段階ではシナプスおよび神経突起の数が少なく、シナプス／神経突起ｍｉＲＮＡの全放出量は減少する。第２に、ＡＤの後期段階ではニューロン死が増加するため、体液中の神経体ｍｉＲＮＡ濃度が増加する。第３に、疾患が進行するにつれて、新しい脳の部位およびグリア細胞が疾患進行による病変に関与し、その結果、体液中のそれぞれのｍｉＲＮＡノーマライザーの濃度が更に増加する。上に述べた現象はＡＤ発症中のＭＣＩ−認知症移行をモニタリングするために使用することが可能である。
【０１１４】
ＭＣＩ患者の血漿と比較した場合、ＡＤ患者の血漿中において、病変細胞からの分泌が有意に高いｍｉＲ−４５１のレベルの増加は統計的に有意である。ｍｉＲ−１３２ファミリーおよびｍｉＲ−１３４ファミリーのｍｉＲＮＡならびに他の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡに対するｍｉＲ−４５１の比により、ＭＣＩからＡＤを最も確実に区別することができる。しかしながら、ＭＣＩ症例の約４０〜５０％で、これらのパラメータはＡＤ患者に得られた数値と重なっている。これらの患者はＭＣＩからＡＤ認知症へ進行する可能性は高い。さまざまなｍｉＲＮＡに対してノーマライズした同年齢コントロールと比較すると、ｍｉＲ−７、１２５ｂ、ｍｉＲ−１６は、ｍｉＲ−４５１の分析によりＡＤとして特徴付けられた同じＭＣＩ症例を検出する。これは両方のアプローチがＭＣＩから認知症への進行を予測するために使用可能であることを示している。
【０１１５】
脳の異なる部位が、認知症の発症に導くさまざまな神経変性疾患に関与しており（Geldmacher & Whitehouse, Neurology. 1997, 48:S2-9; Levy & Chelune, J Geriatr Psychiatry Neurol. 2007 20:227-238; Gong & Lippa, Am J Alzheimer's Dis Other Demen, 2010, 25:547-555）、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは脳のさまざまな部位において異なっているので（Landgraf et al., Cell. 2007, 129:1401-1414;The miR-Ontology データ Base: http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/）、体液中の神経突起および／またはシナプスｍｉＲＮＡプロファイルの分析を使用して、ＡＤ認知症または他の神経変性疾患により起こる認知症へと発展するＭＣＩやｐｒｅ−ＭＣＩを区別することが可能である。
【０１１６】
本発明の方法は、ｐｒｅ−ＭＣＩおよびＭＣＩの診断や、ｐｒｅ−ＭＣＩおよびＭＣＩからさまざまなより重度の神経変性疾患、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体認知症、ハンチントン病（ＨＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、血管性認知症、ＨＩＶ関連認知神経科学疾患（ＨＡＮＤ）、混合型認知症などへの進行の予測および／またはモニタリングに使用することが可能である。
【０１１７】
本発明の方法に有用な脳に濃縮されたｍｉＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、例えば７、９、９６、９８、９９ａ、１０３、１０７、１２４ａ、１２５ａ、１２５ｂ、１２７、１２８ａ、１３２、１３４、１３７、１３８、１４９、１５３、１５４、１８１ａ、１８１ｂ、１８１ｃ、１８２、１８３、２０４、２１２、２１３、２１８、２１９、２２１、２２２、２９９−３ｐ、２９９−５ｐ、３２３−３ｐ、３２４−５ｐ、３２８、３２９、３３０、３３１、３３５、３３７、３３８、３４２、３４６、３６９−３ｐ、３６９−５ｐ、３７０、３７９、３８１、３８２、３８３、４０９−３ｐ、４１１、４２５、４３２、４３３−５ｐ、４８５−３ｐ、４８５−５ｐ、４８７ｂ、４８８、４９１−５ｐ、４９４、４９５、４９６、５０４、５３９、５４１、５４３、５８４、６５６、６６８、７５８、８７４、８８９、９３５、９３９、１１９３、１１９７、９＊が挙げられる。
【０１１８】
本発明の方法に有用な神経突起および／またはシナプスのｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９３９が挙げられる（Schratt et al., Nature 439:283-289, 2006; Lugli et al., J Neurochem. 106:650-661, 2008; Bicker and Schratt, J Cell Mol Med. 12:1466-1476, 2008; Smalheiser and Lugli, Neuromolecular Med. 11:133-140, 2009; Rajasethupathy, Neuron, 63:714-716, 2009; Kye, RNA, 13:1224-1234, 2007; Yu, et al., Exp Cell Res. 314:2618-2633, 2008; Cougot et al., J Neurosci. 28:13793-13804, 2008; Kawahara, Brain Nerve, 60:1437-1444, 2008; http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/参照）。本発明の方法に有用な他のｍｉＲＮＡは、例えば、それらのニューロン（および疾患によっては脳の異なる特定領域）での濃縮や、軸索および／または樹状突起および／または棘突起および／またはシナプス中の細胞内局在化に基づいて特定することが可能である。本発明の診断方法を行うために尿サンプルを選択する場合、検出のために好ましいｍｉＲＮＡは、泌尿器系の細胞中に有意に発現しないｍｉＲＮＡである。同様に、もし血液サンプル（例えば血清または血漿）が本発明の診断方法を行うために使用される場合、検出のために好ましいｍｉＲＮＡは、血液細胞中に発現しないかその存在レベルがとても小さいｍｉＲＮＡである。
【０１１９】
本発明の方法は、体液中の特定のｍｉＲＮＡのレベルの測定に基づいている。非侵襲的または最小侵襲的技法（例えば、脳またはＣＳＦにおける検出と比べて）により採取可能な体液の使用により、対費用効果の高い、最小侵襲性または非侵襲性の診断手順が可能となる。本発明の方法に使用するのに好ましい体液は、血漿、血清、尿、唾液である。しかしながら、他の任意の体液も使用することが可能である。
【０１２０】
体液中のｍｉＲＮＡのレベルを測定するために有用な方法の例としては、選択的なプローブとのハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロッティング、ビーズによるフローサイトメトリー、オリゴヌクレオチド・マイクロチップ［マイクロアレイ］、Ａｍｂｉｏｎ・ｍｉｒＶａｎａ・ｍｉＲＮＡ検出キットなどの溶液ハイブリダイゼーションアッセイを使用）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による検出（例えばステムループ逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応［ＲＴ−ＰＣＲ］、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるアレイ法［ｑＰＣＲアレイ］）、または次世代配列決定技術の１つによる直接配列決定法（例えばＨｅｌｉｃｏｓ低分子ＲＮＡ配列決定法、ｍｉＲＮＡビーズアレイ（イルミナ社）、ロシュ社４５４（ＦＬＸチタニウム）、ＡＢＩ社ＳＯＬｉＤ）が挙げられる。他の適用可能な技法は、例えばChen et al., BMC Genomics, 2009, 10:407; Kong et al., J Cell Physiol. 2009; 218:22-25を参照できる。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、定量する前にｍｉＲＮＡを精製する。ｍｉＲＮＡは、市販のキットの使用（例えば、ｍｉＲＮｅａｓｙキット［キアゲン社］、ＭｉｒＶａｎａＲＮＡ単離キット［Ａｍｂｉｏｎ／ＡＢＩ社］、ｍｉＲＡＣＬＥ［アジレント社］、ハイピュアｍｉＲＮＡ単離キット［ロシュ社］、ｍｉＲＮＡ精製キット［ノルゲンバイオテク社］）、トリゾール抽出（以下の例１参照）、陰イオン交換体での濃縮・精製濃度、ＲＮＡ結合物質により被覆された磁性ビーズ、または相補オリゴヌクレオチドへの特定ｍｉＲＮＡの吸着などのさまざまな方法により体液から単離・精製することが可能である。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、体液サンプル中のおよび／またはｍｉＲＮＡ精製中のｍｉＲＮＡの分解を低減または阻止する。ｍｉＲＮＡの分解を低減または阻止する有用な方法としては、限定するものではないが、ＲＮａｓｅ阻害剤（例えばＲＮａｓｉｎ・Ｐｌｕｓ［プロメガ社］、ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ［ＡＢＩ社］など）の添加、塩化グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の使用、またはそれらの組み合わせが挙げられる。体液サンプル中のｍｉＲＮＡの分解を低減することは、ｍｉＲＮＡ定量の前にサンプルの保存や輸送が必要とされる場合には特に重要である。
【０１２３】
精製の間に任意のｍｉＲＮＡが損失する可能性、ＲＴ−ＰＣＲ阻害の可能性、サンプルの単離や処理の間に死滅したり損傷した血液細胞または尿細胞に由来するｍｉＲＮＡ不純物、腎臓濾過における変動などを考慮するために、実験データノーマライズのさまざまな付加的な方法を用いることが可能である。例えば、以下のノーマライズ方法が、本発明で使用可能である：
ａ）標的ｍｉＲＮＡの濃度は、遍在性ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１６）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｕ６核小体低分子ＲＮＡ（Ｕ６ＲＮＡ）その他）の１つに対してノーマライズすることが可能である。
【０１２４】
ｂ）合成低分子ＲＮＡ（例えば非ヒトｍｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドは、（ＲＮＡ精製前に体液サンプルに添加することにより）精製中の損失およびＲＴ−ＰＣＲ阻害のコントロールとして合成・使用可能である。
ｃ）（尿サンプルを使用する場合は）腎臓濾過における変動を考慮するために、尿中のｍｉＲＮＡ濃度を、クレアチニンおよび／またはアルブミンレベルに対してノーマライズ可能である。
【０１２５】
ＭＣＩおよびＡＤの早期検出のためのｍｉＲＮＡバイオマーカーを選択するために以下のアプローチを、本発明において開発した：
１．公知の神経突起／シナプスに濃縮されたｍｉＲＮＡに追加して、他の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡを予備的な研究に含め、ＡＤおよびＭＣＩ患者からの血漿中で分析し、同年齢コントロールと比較した。
２．各ｍｉＲＮＡのデータはすべての他の個々のｍｉＲＮＡ対してノーマライズし、ＭＣＩ検出に最も有望なｍｉＲＮＡバイオマーカーおよびノーマライザーを選択した。
【０１２６】
３．これらのｍｉＲＮＡは、若年および同年齢のドナー、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者からの血漿サンプルを含む、より大規模な研究に使用した。
４．最後に、後向き長期研究を、登録時にＭＣＩまたはＡＤの症状がなく、その後数年間追跡した個人から採取された血漿を使用して行った。後に、何人かのドナーはＭＣＩを発症し、何人かはＡＤを発症し、何人かはＡＤやＭＣＩに罹患しなかった。
５．脳に濃縮されたｍｉＲＮＡに追加して、病変細胞からはるかに有効に分泌されるｍｉＲ−４５１も研究に含めた。
【０１２７】
上記の診断方法およびスクリーニング方法と組み合わせて、本発明は、標的ｍｉＲＮＡの検出に特異的なプライマーおよび／またはプローブセットを１つまたは２つ以上含むさまざまなキットを提供する。そのようなキットは、ノーマライザーｍｉＲＮＡの検出に特異的なプライマーおよび／またはプローブセットを更に含むことができる。キットに含まれるプライマーまたはプローブの組み合わせの例として、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：
【０１２８】
１．ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１６からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３７０からなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【０１２９】
２．ｍｉＲ−４５１に特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−９３９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを含む）。
【０１３０】
３．ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−９３９からなる群から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【０１３１】
４．ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−７およびｍｉＲ−１２５ｂからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【０１３２】
５．ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−８７４からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【０１３３】
６．ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐおよびｍｉＲ−３８２からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−３７０またはｍｉＲ−１２７の少なくとも１つのノーマライザーに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【０１３４】
７．ｍｉＲ−７に特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
【０１３５】
８．ｍｉＲ−１２５ｂに特異的なプライマーまたはプローブ（任意に、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０およびｍｉＲ−４９１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのノーマライザーｍｉＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを更に含む）。
そのようなキットは、患者から単離された体液サンプル中でのｍｉＲＮＡの直接検出に有用であり得、または精製したＲＮＡサンプルに使用することが可能である。
【０１３６】
本発明のキットは、プライマーの伸長および増幅反応用の試薬を提供することも可能である。例えば、いくつかの実施態様では、キットはさらに以下の成分の１つまたは２つ以上を含んでもよい：逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなど）、ポリメラーゼ連鎖反応バッファー、逆転写バッファー、およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）。その代わりに（または、それに追加して）、キットは、ハイブリダイゼーションアッセイを行うための試薬を含むことができる。検出剤としては、ヌクレオチド類似体および／または標識部分、例えば、フルオロフォア（蛍光色素）や放射性同位元素などの直接検出可能部分やビオチンなどの結合ペアのひとつなどの関接検出可能部分、または不溶比色または発光反応を触媒作用可能な酵素が挙げられる。また、キットは、電気泳動した核酸を検出するための試薬を含む少なくとも１つの容器をさらに含むことができる。そのような試薬としては、蛍光挿入剤または銀染色試薬などの核酸を直接検出するもの、限定するものではないが、ＥＣＬ試薬などの標識された核酸を検出するための試薬が挙げられる。キットは、さらにｍｉＲＮＡの単離手段または精製手段、および正または負のコントロールをさらに含むことができる。キットは、それと関連する情報を、診断キットの製造、使用、販売を規制する政府機関により定められた形態で含んでもよい。使用、保管、問題解決法などの詳細な説明書も、キットに含むことができる。キットは、好ましくは高処理設定でのロボット操作に有用な適切な収納ケースで提供することも随意可能である。
【０１３７】
キットの構成要素は、乾燥粉末として提供することもできる。試薬および／または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、粉末は適切な溶媒を添加することにより再構成可能である。溶媒は他の容器で提供できることも考えられる。容器としては、一般には、一定分量が計量してあってもよい溶媒が入っている、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器および／または他の容器手段が挙げられる。キットは、また、滅菌した、医薬上許容し得るバッファーおよび／または他の溶媒を含む２つめの容器手段を含んでもよい。
【０１３８】
キットが２つ以上の構成要素を含む場合は、キットは、一般に、追加の構成要素を別々に入れる２番目、３番目、あるいは他の追加の容器を含むであろう。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせを１つの容器に含むこともできる。
【０１３９】
そのようなキットには、核酸分解を阻止する試薬などのＤＮＡまたはＲＮＡを保存または維持する構成要素を含むこともできる。そのような構成要素は、例えば、ヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼを含まないか、リボヌクレアーゼに対して保護するものでもよい。ここに記載した組成物または試薬はいずれも、キットの構成要素であることができる。
【０１４０】
定義
ここで使用される「アルツハイマー病」または「ＡＤ」という用語は、認知症を特徴とするｐｏｓｔ−ＭＣＩ・ＡＤの段階を意味する。
「ｐｒｅ−軽度認知機能障害」または「ｐｒｅ−ＭＣＩ」という用語は、将来認知症となるＡＤや他の神経変性疾患の無症状前臨床段階を意味する（Jack et al.、 Alzheimer's and Dementia. 2011、 Epub April 19）。
【０１４１】
「神経細胞体」という用語は、細胞膜と細胞質により囲まれた神経核を含むが樹状突起または軸索を含まない神経細胞の部分を意味する。
ここで使用される「神経突起」という用語は、ニューロンの細胞体からのすべての突起を意味する。この突起は軸索、樹状突起または棘突起であってもよい。
【０１４２】
「軸索」という用語は、ニューロンの細胞体、すなわち神経細胞体から活動電位を伝達するニューロンの長細い突起を意味する。軸索は、形状（樹状突起はしばしば先が細くなっているが、軸索は通常一定の半径を維持する）、長さ（樹状突起は細胞体の周りの小さな領域に限られているが、軸索ははるかに長い場合もありうる）および機能（樹状突起は通常シグナルを受け取るが、軸索は通常それらを伝達する）などのいくつかの特徴により樹状突起から区別される。軸索および樹状突起はシナプスと呼ばれる結合部で他の細胞（通常は他のニューロンであるが、筋細胞や腺細胞のこともある）と接触する。
【０１４３】
「樹状突起」という用語は、他の神経細胞から受け取った電気化学的刺激を、その樹状突起が突出するニューロンの細胞体へ伝導するニューロンの枝状の突起を意味する。
【０１４４】
「棘突起」または「樹状棘突起」という用語は、一般に軸索の単一のシナプスからの入力を受け取る、ニューロンの樹状突起からの小さな膜状の突起を意味する。樹状棘突起は、シナプス強度の貯蔵サイトとして働き、電気シグナルを神経細胞体へ伝達する手助けをする。ほとんどの棘突起は、球状頭部（棘突起頭部）と、棘突起の頭部を樹状突起の軸へ結合する細い頸部とを有する。単一のニューロンの樹状突起には、数百から数千の棘突起が含まれ得る。棘突起は、記憶の保存およびシナプス伝達のための解剖学的基質を提供することに加えて、ニューロン間の可能な接触数を増加するように作用することもできる。
【０１４５】
「シナプス」という用語は、それによってニューロンが相互におよび筋肉または腺におけるような非神経細胞にシグナル送る特化した結合点を意味する。典型的なニューロンは、数千のシナプスを生じる。ほとんどのシナプスは軸索を樹状突起に接続するが、軸索−細胞体、軸索−軸索、樹状突起−樹状突起などの他のタイプの接続もある。脳において、各ニューロンは他の多くのものと共にシナプスを形成し、同様に、それぞれ他の多くのものからシナプス入力をそれぞれ受け取る。その結果、あるニューロンの出力は、他の多くのものの入力に依存しており、その各々は、そのニューロンとのシナプスの強度に依存して異なるレベルの影響を与える。シナプスには２つの主要タイプ、すなわち化学シナプスおよび電気シナプスがある。電気シナプスでは、細胞は約３．５ｎｍ以内で相互に近接しており、化学シナプスでは細胞間の距離は２０〜４０ｎｍである。化学シナプスでは、シナプス後電位は、化学伝達物質によるイオンチャンネルの開口により起こり、一方、電気シナプスでは、２つのニューロン間が電気的に直接結合することにより起こる。したがって、電気シナプスは、化学シナプスよりも速度が速い。
【０１４６】
本発明の意味の範囲内で、「シナプスおよび／または神経突起のｍｉＲＮＡ」という用語は、（ｉ）「脳に濃縮された」、すなわち、テストする体液中の相当量のｍｉＲＮＡの供給源となりうる他の器官と比較して脳に増加した量で存在し（例えば少なくとも５倍高い濃度）かつ（ｉｉ）シナプスおよび／または神経突起（すなわち、軸索および／または樹状突起および／または棘突起）に存在するｍｉＲＮＡを意味する。
【０１４７】
シナプスおよび／または神経突起のｍｉＲＮＡのいくつかのは、神経病変の発症中に異常細胞からはるかに有効に分泌されるので、そのようなシナプスおよび／または神経突起のｍｉＲＮＡも、たとえそれらが脳に濃縮されていないとしても、本発明の方法における有望なバイオマーカーとしてテストすることが可能である。本発明の方法に有用であるためには、そのようなシナプスおよび／または神経突起のｍｉＲＮＡは、ニューロンから（例えば、分泌、神経突起／シナプス破壊またはニューロン死により）放出された結果として体液中で検出可能であるべきである。
【０１４８】
ここで使用する「ノーマライザーｍｉＲＮＡ」という用語は、血漿中の神経突起／シナプスのｍｉＲＮＡの出現および安定性に影響するさまざまな因子を考慮するために、神経突起／シナプスのｍｉＲＮＡ濃度のノーマライズに使用するｍｉＲＮＡを意味する。
【０１４９】
ここで使用する「神経体ｍｉＲＮＡ」という用語は、（ｉ）「脳に濃縮された」、すなわち、テストする体液中の相当量のｍｉＲＮＡの供給源となりうる他の器官と比較して脳に増加した量で存在し（例えば少なくとも５倍高い濃度）かつ（ｉｉ）神経突起またはシナプスに存在しないか、神経細胞体においてよりも有意に低い濃度で存在するｍｉＲＮＡを意味する。
【０１５０】
「神経病変」および「ニューロンにおける病変変化」という用語は、ここでは、神経突起および／またはシナプス機能障害および／または神経突起破壊および／またはシナプス損失に関連するニューロンにおける代謝変化および／または構造変化を意味するように使用される。
「に関連する」という用語は、任意の相関、共起および任意の因果関係を含むよう使用される。
【０１５１】
「神経病変の発症」という用語は、ここでは、個々のニューロンにおける代謝変化および／または構造変化の程度／重症度における任意の負の変化および／または影響を受けたニューロンの数の任意の増加を意味するように使用される。「神経病変の改善」という語句および同様の用語は、個々のニューロンにおける代謝変化および／または構造変化の程度／重症度における任意の正の変化および／または影響を受けたニューロンの数の任意の減少を意味する。
【０１５２】
ここで使用する、「低分子ＲＮＡ」という用語は、一般に、クロマチン構築／後成的記憶、転写、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ編集、ｍＲＮＡ翻訳およびＲＮＡ代謝回転などの、様々な調節機能を有した非翻訳領域のＲＮＡの異種グループを意味する。本発明の診断方法は、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）や脳細胞質ＲＮＡＢＣ１／ＢＣ２００など、体液中で検出可能な神経突起および／またはシナプス低分子ＲＮＡの検出に基づくものである。本発明の方法に有用であるかもしれない、あまり特徴付けられていない低分子ＲＮＡのクラスが他にもある（Kim, Mol. Cells, 2005, 19:1-15に概説されている）。
【０１５３】
ここで使用する「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、低分子の約２２ｎｔ長のノンコーディングＲＮＡ分子のクラスを意味する。それらは、メッセンジャートランスクリプト（ｍＲＮＡ）の相補領域に結合してそれらの翻訳を阻止するか分解を制御することにより、標的遺伝子を制御するという重要な役割を担っている（Griffiths-Jones Nucleic Acids Research, 2006, 34, Database issue:D140-D144）。しばしば、１つのｍｉＲＮＡが、複数のｍＲＮＡを標的とし、１つのｍＲＮＡが、３’ＵＴＲの異なる領域を標的とする複数のｍｉＲＮＡにより制御される。ｍｉＲＮＡはいったんｍＲＮＡに結合すると、例えば、ｍＲＮＡの翻訳と安定性に影響を与えて、遺伝子発現およびタンパク質産生を調節することが可能である（Baek et al., Nature 455(7209):64 (2008); Selbach et al., Nature 455(7209):58 (2008); Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; and Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28）。本発明の方法に有用な神経突起および／またはシナプスｍｉＲＮＡの例としては、限定するものではないが、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２９２−５ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３５０、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６９−３、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−４４６、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−８８９、ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−９３９が挙げられる。最近見つかったｍｉＲＮＡの情報は、ｍｉＲＮＡデータベースｍｉＲＢａｓｅで見つけることが可能である（mirbase.orgのワールドワイドウェブで入手可能）。Burside et al., BMC Genomics 9:185 (2008); Williams et al., BMC Genomics 8:172 (2007); Landgraf et al., Cell 129:1401 (2007)も参照することができる。
【０１５４】
「ｍｉＲＮＡアレイ」という用語は、分子生物学および医学で使用されるマルチプレックス技術を意味する。それは、特定の標的ｍｉＲＮＡに相補的な特定の配列（プローブ）をそれぞれ含有するオリゴヌクレオチドの多数の（例、数千の）微小点の並んだ列からなる。ストリンジェントの高い条件下でのプローブ標的ハイブリダイゼーションの後に、得られた複合物は通常、フルオロフォア、銀または化学発光で標識された標的物を定量してｍｉＲＮＡの相対量を決定することで検出・定量される。本発明の方法においては、特別注文製と市販の両方のｍｉＲＮＡアレイを使用することが可能である。有用な市販ｍｉＲＮＡアレイ（様々な標的標識化、複合物検出・分析の様々な方法に基づく）の例として、アジレント社、イルミナ社、インビトロゲン社、フェビット社、エル・シー・サイエンス社により製造されたアレイが挙げられる。
【０１５５】
「次世代配列決定技術」という用語は、多数の配列決定反応を並行して起させる配列決定法を広く意味する。これにより、データの処理量および収量が大幅に増加される。限定するものではないが、一般に使用される次世代配列決定プラットフォームの例として、Ｈｅｌｉｃｏｓ低分子ＲＮＡ配列決定法、ｍｉＲＮＡビーズアレイ（イルミナ社）、ロシュ社４５４（ＦＬＸチタニウム）、ＡＢＩ社ＳＯＬｉＤが挙げられる。
【０１５６】
ここで使用される、「個体」または「対象」または「動物」は、ヒト、家畜動物（例、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）および神経変性疾患または他の神経病変実験用動物モデルを意味する。好ましい実施態様では、前記対象はヒトである。
「泌尿器」という用語は、尿の身体からの分泌・排除に関与する器官および管を意味する。
【０１５７】
ここで使用される「精製された」という用語は、目的の物質をそれから得る天然物を含む、無関係な物質である不純物の存在を低減または除去する条件において単離された物質を意味する。例えば、ＲＮＡの精製には、体液中に含有されるタンパク質、脂質、塩、他の無関係な化合物の除去が含まれる。更に、いくつかの分析方法のために、精製したｍｉＲＮＡには、体液サンプル中に含まれる他のＲＮＡオリゴヌクレオチドが、好ましくは実質的に存在しない（例えばｒＲＮＡやｍＲＮＡ断片、ほぼすべての組織で高いレベルで発現する遍在性ｍｉＲＮＡ［例えば、ｍｉＲ−１６］など）。
【０１５８】
ここで使用される「実質的にない」という用語は、物質の分析テストを行うという文脈で、操作に関して使用される。好ましくは、不純物が実質的にない精製した物質は、純度が少なくとも５０％である；より好ましくは、少なくとも９０％の純度、さらに好ましくは少なくとも９９％の純度である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、組成分析、生物アッセイ、当該分野の他の公知の方法により評価可能である。
【０１５９】
ここで使用される「同様に処理された」という用語は、同じ手順を使用して得られたサンプル（例、体液サンプル、精製したＲＮＡ）を意味する。
「約」または「およそ」という用語は、統計的に有意な範囲の値を意味する。そのような範囲とは、ある値または範囲の１０分の１から１０倍以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらに好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であることが可能である。「約」または「およそ」という用語に含まれる許容される変動量は、研究中の特定の系に依存しており、当業者には用意に理解されるであろう。
【０１６０】
本発明によれば、当該技術の範囲内で、従来の分子生物学的技法、微生物学的技法および組換えＤＮＡ技法を用いることができる。そのような技法は文献で詳細に説明されている。例えば、以下の文献を参照できる：Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cell And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F.M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994. These techniques include site directed mutagenesis as described in Kunkel, Proc. Natl.  Acad.  Sci. USA 82:488-492 (1985), U. S. Patent No. 5,071,743, Fukuoka et al., Biochem.  Biophys. Res. Commun. 263:357-360 (1999); Kim and Maas, BioTech. 28:196-198(2000); Parikh and Guengerich, BioTech. 24:4 28-431 (1998); Ray and Nickoloff, BioTech. 13:342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19:556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26:680-682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26:639-641 (1999), U.S. Patents Nos. 5,789,166 and 5,932,419, Hogrefe, Strategies l4. 3:74-75 (2001),  U. S. Patents Nos. 5,702,931, 5,780,270 and 6,242,222, Angag and Schutz, Biotech.30:486-488 (2001), Wang and Wilkinson, Biotech. 29:976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20:44-46 (1996), Ogel and McPherson,  Protein Engineer. 5:467-468 (1992), Kirsch and Joly, Nucl. Acids. Res. 26:1848-1850 (1998),  Rhem and Hancock, J. Bacteriol. 178:3346-3349 (1996), Boles and Miogsa,  Curr. Genet. 28:197-198(1995), Barrenttino et al.,Nucl. Acids. Res. 22:541-542 (1993), Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57:229-237, and Pons et al., Meth. Molec. Biol. 67:209-218。
【０１６１】
例  本発明を、以下の例により記載・実証する。しかしながら、本明細書におけるこれらおよび他の例の使用は、単に例示であり、本発明や例示する用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載する特定の好ましい実施態様のいずれにも限定されるものではない。実際、本発明は多様に修正・変更できることは、本明細書から当業者には自明であり、そのような変更は本発明の要旨を逸脱しない範囲で可能である。従って、本発明は、添付の請求の範囲が主張する均等物の全範囲とともに、請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
【０１６２】
例１：血清または血漿からのｍｉＲＮＡの精製に使用される様々な方法の比較
多数のｍｉＲＮＡ単離用キットが市販されており、例えばｍｉＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）、ＭｉｒＶａｎａＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ／ＡＢＩ社）、ｍｉＲＡＣＬＥ（アジレント社）、ハイピュアｍｉＲＮＡ単離キット（ロシュ社）、ｍｉＲＮＡ精製キット（ノルゲン・バイオテック社）がある。更に、トリゾール（インビトロゲン社）の使用に基づいた社内技術も使用することが可能である。この技法（インビトロゲン社のプロトコール）では、トリゾールＬＳ除タンパク法の後、ＲＮＡをイソプロピルアルコールで析出させるか、またはさらにシリカカラムで精製する。いくつかの実験では、精製したＲＮＡをＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅ（キアゲン社、ＡＢＩ社、インビトロゲン社、その他）で処理する。
【０１６３】
異なる方法で得たｍｉＲＮＡ調製物は、ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して比較した。トリゾールＬＳ（インビトロゲン社のプロトコール）およびＭｉｒＶａｎａＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ／ＡＢＩ社プロトコール）を使用して、ｍｉＲＮＡを、同一の５人の健常提供者から得られた血漿および血清サンプルから精製した。ｍｉＲＮＡ収量の評価のためにグアニジン含有溶液をスパイクした後、血漿または血清１ｍＬに付き１０７コピーのシロイヌナズナｍｉＲ−１５９ａ（ａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａ）をスパイクした。ＭｉｒＶａｎａＰａｒｉｓキット（Ａｍｂｉｏｎ／ＡＢＩ社）に基づいた方法、トリゾール（インビトロゲン社）除タンパクとその後のシリカカラム精製に基づいた方法の２つの技法を比較した。ＲＮＡ精製の後、最終調製物のスパイクされたｍｉＲＮＡおよびヒト内在性ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１３４の濃度を、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。ＭｉｒＶａｎａＰａｒｉｓキットおよびトリゾール／シリカろ過に基づく技法は共にｍｉＲＮＡ単離に有効であり、この後の実験で使用した。すべての分析したｍｉＲＮＡは、血清および血漿で検出可能であり、両サンプルタイプともｍｉＲＮＡテストに好適であるが、最終的なＰＣＲＣｔ値は血漿で約２サイクル低く、後者を以下の実験に使用した。スパイクされたａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａの定量測定に基づいて、血漿からのｍｉＲＮＡの平均収率は約７０％であった。
【０１６４】
同様の分析を、血漿サンプルおよびｍｉＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を使用して行った。ｍｉＲＮＡ収率を算出するためにグアニジン添加後、合成非ヒトｍｉＲＮＡをスパイクした。
【０１６５】
例２：テストのためのｍｉＲＮＡの選択
テストしたｍｉＲＮＡは、最初に、脳区画中のそれらの濃縮、神経突起（すなわち、軸索および／または樹状突起および／または棘突起）および／またはシナプス（Hua et al., BMC Genomics 2009, 10:214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8:166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129:1401-1414; Lee et al., RNA. 2008, 14:35-42; Schratt et al., Nature. 439:283-289, 2006; Lugli et al., J Neurochem. 106:650-661, 2008; Bicker and Schratt, J Cell Mol Med., 12:1466-1476, 2008; Smalheiser and Lugli, Neuromolecular Med. 11:133-140, 2009; Rajasethupathy, Neuron. 63:714-716, 2009; Kye, RNA 13:1224-1234, 2007; Yu et al., Exp Cell Res. 314:2618-2633, 2008; Cougot, et al., J Neurosci. 28:13793-13804, 2008; Kawahara, Brain Nerve. 60:1437-1444, 2008; Schratt G. Rev Neurosci. 2009;10:842-849; Pichardo-Casas et al. Brain Research. 1436:20-33, 2012）における存在、ならびに神経突起やシナプス関連プロセスにおける示唆された関与（ｍｉＲ−Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベース: http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/）に関する文献データに基づいて選択した。ノーマライズのために、スパイクされたｍｉＲＮＡの他にも、ｍｉＲ−１６などの遍在性ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４１などの脳以外の多数の組織で発現するｍｉＲＮＡを使用した。
【０１６６】
例３：ｍｉＲＮＡバイオマーカーとノーマライザーの実験的前選択
血漿サンプルは、健忘性症状を伴うＭＣＩ（ａＭＣＩ）と診断された患者から取得した（Dlugaj et al., Dement Geriatr Cogn Disord., 2010, 30:362-373; Brooks, Loewenstein, Alzheimer's Res Therapy, 2010, 2:28-36）。これらの患者の血漿から得た脳に濃縮されたｍｉＲＮＡのプロファイルを、個々のｍｉＲＮＡ用プライマーおよびプローブ（ＡＢＩ社）でＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。３０μＬ血漿に相当するＲＮＡ量を、各ＲＴ反応で使用し、ＲＴ生成物の１／１５を最後のＰＣＲで使用した。このように、２μＬ血漿に相当するｍｉＲＮＡの量を検出した。有望なノーマライザーｍｉＲＮＡのそれぞれに対してノーマライズした各ｍｉＲＮＡについて得た結果を、ＡＢＩ社プロトコール（２−Ｃｔ）に従ってｍｉＲＮＡの相対濃度（ＲＣ）に換算し、同年齢コントロール（ＡＭＣ）のｍｉＲＮＡプロファイルと比較した。実際には、分析したｍｉＲＮＡのすべてを、有望なバイオマーカーおよびノーマライザーとしてテストし、ＭＣＩ患者と同年齢コントロールとの間で統計的に有意な差を与える組み合わせを更なる研究のために選択した。以下に示したデータから、２つの明らかな結論が得られる。第１は、最も有望なバイオマーカーは神経突起／シナプスｍｉＲＮＡであり、第２は、最良のノーマライザーは他の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡであることである。
【０１６７】
血漿１ｍＬ当りのｍｉＲＮＡ相対濃度を与える、スパイクされた非ヒトｍｉＲＮＡ（ａｔｈ−ｍｉＲ−１５９ａ）に対してのノーマライズを行った場合、ＭＣＩ患者からの血漿サンプルのいくつかはより多くの神経突起および／またはシナプスｍｉＲＮＡを含んでいた（図１、ｍｉＲ−７（Ａ）、ｍｉＲ−８７４（Ｂ））。
【０１６８】
同時に、他の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡの濃度は、ＭＣＩ患者の血漿中において変化していなかった（図１、ｍｉＲ−９（Ｃ）、ｍｉＲ−１８１ａ（Ｄ）、ｍｉＲ−４９１−５ｐ（Ｅ））。
【０１６９】
同様の結果は、血漿中のｍｉＲＮＡ濃度を、脳以外の多数の器官に発現するｍｉＲ−１４１やｍｉＲ−１０ｂに対してノーマライズした場合にも得られた（図２Ａ〜Ｃ、８Ａ〜Ｃ）。遍在性ｍｉＲ−１６は、ＡＭＣからＭＣＩを区別可能なノーマライザーとしては好適ではなかった（図７）。
【０１７０】
同時に、血漿中の神経突起／シナプスｍｉＲＮＡ濃度を、他の脳に濃縮されたｍｉＲＮＡに対してノーマライズすることにより、いくつかの有望なノーマライザーが明らかとなった。これらのノーマライザーｍｉＲＮＡのいくつかは神経体ｍｉＲＮＡであり、他は病変に関与しない脳の部位またはグリア細胞に主に発現している。それらのいくつかは、病変で下方制御している可能性もある。
【０１７１】
図３Ａ〜Ｃ、４、５Ａ〜Ｃ、６は、それぞれ脳に濃縮されたｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２７に対してノーマライズした、コントロールに対するＭＣＩ患者およびＡＤ患者の血漿中におけるさまざまな神経突起／シナプスｍｉＲＮＡ濃度についての結果の例を示す。得られたデータに基いて、８つの神経突起／シナプスｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−８７４）を、最も有望なバイオマーカーとして選択し、７つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４９１−５ｐ）を有望なノーマライザーとして選択した。
【０１７２】
例４：血漿中のｍｉＲＮＡの分析によるＭＣＩ検出
健忘性ＭＣＩ患者、ＡＤ患者、同年齢コントロール（ＡＭＣ）の各群２０の血漿を研究に使用した。ＲＮＡを、２つの２００μＬ分量の血漿サンプルからアスラゲン社の手順に従ってトリゾール−シリカ法により単離した。神経突起／シナプスｍｉＲＮＡバイオマーカーの濃度および例３に記載したように選択したノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定するために、シングルターゲットＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（アプライド・バイオシステム社）を、ＰＣＲ最終反応量１０μＬとして２μＬ血漿等量を使用して３回行った。ｍｉＲ−４５１も、ニューロンに存在し、異常細胞から有意に高濃度で分泌され（Pigati et al., PLoSOne, 2010, 5:e13515）、無脳症胎児の脳における発現が上昇する（Zhang et al., Int. J.Biochem. Cell Biol. 2010; 42:367-374）ために研究に含めた。
【０１７３】
図９〜１４に示すデータは、同年齢コントロールと比較して、ＭＣＩ患者とＡＤ患者の血漿中における神経突起／シナプスｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−８７４）の濃度中央値が２〜５倍増加していることを示している。ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４９１−５ｐなどの脳に濃縮されたｍｉＲＮＡに対してノーマライズした場合、効果はより顕著である。
【０１７４】
バイオマーカーの２つのファミリーであるｍｉＲ−１３２ファミリーとｍｉＲ−１３４ファミリーと数種のノーマライザーが、最も高い感度と特異度を示した。バイオマーカーｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉｒ−８７４（「ｍｉＲ−１３２ファミリー」）は、ｍｉＲ−４９１−５ｐに対してノーマライズした場合、８４〜９２％の感度および８４〜９０％の特異度を示した（図１５Ａ〜Ｃ）。これらのバイオマーカーとノーマライザーの組み合わせの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、図１５Ａ〜Ｃに示す。ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）はそれぞれ０．９５、０．９３、０．９５である。２番目に有望なバイオマーカーのセットは、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２（「ｍｉＲ−１３４ファミリー」）からなり、ｍｉＲ−３７０に対してノーマライズした場合、７８〜９１％の感度および８５〜８７％の特異度を示した（図１６Ａ〜Ｃ）。ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２のＡＵＣはそれぞれ０９１、０．９４、０．９２である。
【０１７５】
図１７Ａ〜Ｆに示す相関分析は、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４がバイオマーカーのひとつのファミリーを形成し（ペア比較ひおけるスピアマンテストｒ値は、０．９３〜０．９５範囲である）、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−ｐ、ｍｉＲ−３８２がバイオマーカーの他のファミリーを形成することを示した（ペア比較におけるスピアマンテストｒ値は０．８７〜０．９３の範囲である）。ｍｉＲ−１３４ファミリーのメンバー間の高い相関性は、このファミリーのすべてのメンバー、すなわちｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２が、同じクラスターに属し、同じ細胞タイプで発現するという事実により容易に説明可能である（http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Cluster.cgi）。ｍｉＲ−１３２ファミリーのメンバー、すなわちｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４間の密接な関係は、これ以前に記述されていない。ｍｉＲ−１３２バイオマーカーファミリーとｍｉＲ−１３４バイオマーカーファミリーが異なるノーマライザーとの組み合わせでより良い結果を与えることも興味深い。ｍｉＲ−１３２ファミリーは、ノーマライザーｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１４１との組み合わせでは、ｍｉＲ−１３４ファミリーよりもよく作用する。他方、ｍｉＲ−１３４ファミリーは、ノーマライザーｍｉＲ−３７０やｍｉＲ−１２７との組み合わせでは、ｍｉＲ−１３２ファミリーよりも良い結果を示す。ｍｉＲ−１３２バイオマーカーファミリーとｍｉＲ−１３４バイオマーカーファミリー間の相関は比較的低く（ペア比較スピアマンテストでのｒ値が０．５６〜０．７９の範囲である）、それらが異なる病変プロセスを反映しているか、あるいは脳の異なる部位に存在していることを示唆している。
【０１７６】
他の２つの神経突起／シナプスｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−７およびｍｉＲ−１２５ｂの濃度は、任意のノーマライザーとともに分析した場合、ＭＣＩ患者の約４０〜５０％の血漿中において増加していた。
【０１７７】
例５：神経突起／シナプスｍｉＲＮＡの血漿中濃度の加齢性変化の検出
小規模であったり、異なる因子により引き起こされるものであるが、例えば神経突起およびシナプス破壊や最終的なニューロン死など、正常老化とＭＣＩ／ＡＤ発症には特徴的な多数の共通プロセスがある。ＭＣＩは本発明で提案したアプローチにより検出可能であるので、正常老化が同じｍｉＲＮＡバイオマーカーおよびノーマライザーを使用して分析・モニタリングできるかどうか調べることは興味深いことであった。
【０１７８】
研究には、正常認知機能を有するグループ１（２１〜５０歳）およびグループ２（７６〜８６歳）の対象から得た血漿サンプルを各グループ２０サンプルずつ使用した。ＲＮＡを、２つの２００μＬ分量の血漿サンプルからアスラゲン社の手順に従ってトリゾール−シリカ法により単離した。神経突起／シナプスｍｉＲＮＡバイオマーカーの濃度および例３に記載したように選択したノーマライザーｍｉＲＮＡのレベルを測定するために、シングルターゲットＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（アプライド・バイオシステム社）を、最終ＰＣＲ反応量を１０μＬとして、２μＬ血漿等量を使用して３回行った。
【０１７９】
図１８Ａ〜Ｊに示したデータは、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４９１−５ｐなどのさまざまな脳に濃縮されたｍｉＲＮＡノーマライザーに対してのノーマライズ後の、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−３２３−３ｐ、ｍｉＲ−３８２などの例４に記載の神経突起／シナプスｍｉＲＮＡバイオマーカーの濃度中央値が、グループ２の対象の血漿中では、グループ１からのものに比較して４０〜６０％高かったことを示している。このように、対象の体液中の神経突起／シナプスｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡノーマライザーの前向きな長期分析は、正常老化に関連する脳のプロセスについての重要な情報を提供するであろうことが期待できる。これは、これら２つのバイオマーカーファミリーが、神経突起やシナプスの破壊などの正常老化とＭＣＩ発症に共通の神経プロセスを検出することも意味する。
【０１８０】
神経突起／シナプスｍｉＲ−７およびｍｉＲ−１２５ｂ（図１８）ならびにｍｉＲ−４５１は、使用したｍｉＲＮＡノーマライザーにかかわらず、加齢の間に増加せず、２つのグループ間を区別しなかった。
【０１８１】
例６：登録時に正常認知機能を有した高齢患者におけるＭＣＩ発症の後ろ向き長期研究
正常認知機能を有する７０歳以上の対象が、研究に登録された。認知機能障害の動態を調査し、血漿サンプルを４〜５年間定期的に採取した。この期間中何人かの対象はＭＣＩを発症せず、他はＭＣＩへ進行した。ｍｉＲＮＡを例４に記載したように抽出・分析した。神経突起および／またはシナプスｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−８７４の濃度を測定し、ｍｉＲ−４９１−５ｐ対してノーマライズした。患者は、３つのバイオマーカーの少なくとも２つの濃度が所定のコントロール値より高い場合に、ＭＣＩ陽性とみなした。図１９に示したデータは、７０％の症例で、ＭＣＩ診断に１〜５年先行する、患者登録時以降に開始した疾患の前駆症状段階で、血漿中バイオマーカーｍｉＲＮＡの増加が検出できることを示している。
【０１８２】
例７：ＭＣＩのＡＤ認知症段階への移行の検出
脳に濃縮されていないけれども神経突起およびシナプスに存在し病変細胞から有意により有効に分泌されるｍｉＲ−４５１も検討した。
図２０は、ｍｉＲ−４５１の濃度中央値は、同年齢コントロールと比較してＭＣＩ患者の血漿中においてわずかに高く、ＡＤ患者の血漿中において有意に（２〜４倍）上昇していることを示している。ｍｉＲ−４５１と神経突起／シナプスｍｉＲＮＡバイオマーカー濃度の比により、ＭＣＩ集団およびＡＤ集団をよりよく差別化する（図２１）。同時に、約４０〜５０％のＭＣＩ患者で、このパラメータは、ＡＤ患者のものと区別することができず、これらのＭＣＩ患者はＡＤ認知症に進行するであろうことを示している。このように、血漿中のｍｉＲ−４５１濃度の連続した測定、特に、神経突起／シナプスｍｉＲＮＡと組み合わせた場合、ＭＣＩ−ＡＤ進行のマーカーとして使用可能である。
【０１８３】
ｍｉＲ−７やｍｉＲ−１２５ｂもＭＣＩ患者の約４０〜５０％を病変として検出し（例４）、ｍｉＲ−４５１のように若年対象と高齢対象の区別をしないので（例５）、これらのバイオマーカーをｍｉＲ−４５１と比較した。驚くべきことにすべての実験においてｍｉＲ−７と類似した挙動を示したｍｉＲ−１６も、研究に含めた。図２２の２Ｄグラフは、ｍｉＲ−４９１−５ｐに対してノーマライズした後のＭＣＩ患者および同年齢コントロールの血漿中におけるこれらのｍｉＲＮＡの濃度を比較するものである。すべての例で、２つの比較したｍｉＲＮＡの血漿中濃度が高いＭＣＩ患者のグループがある。同様のデータが、バイオマーカーｍｉＲＮＡを５つの脳に濃縮されたノーマライザーｍｉＲＮＡの平均に対してノーマライズしたときに得られた（図２３）。図２４は、図２１〜２３に示すデータをまとめて示すもので、記述したアプローチにより実際に同じ患者に病変があると検出される（ＡＤ認知症に進行するであろうＭＣＩ）ことを示している。
＊  ＊  ＊
【０１８４】
本発明の範囲は、ここに記載した具体的な実施態様により限定されるものではない。実際、ここに記載されたもの以外にも本発明が様々に修正できることは、前記の記述より当業者には明らかであろう。そのような修正は、添付の請求項の範囲内に含まれることが意図される。
【０１８５】
ここに言及したすべての特許、出願、広報、テスト方法、文献および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全開示を参照によりここに援用するものである。
【図１Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000006
【図１Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000007
【図１Ｅ】
0006021893.tif 000008
【図２Ａ】
0006021893.tif 000009
【図２Ｂ−Ｃ】
0006021893.tif 000010
【図３Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000011
【図３Ｃ】
0006021893.tif 000012
【図４】
0006021893.tif 000013
【図５Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000014
【図５Ｃ】
0006021893.tif 000015
【図６】
0006021893.tif 000016
【図７Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000017
【図８Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000018
【図８Ｃ】
0006021893.tif 000019
【図９Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000020
【図９Ｃ】
0006021893.tif 000021
【図１０Ａ】
0006021893.tif 000022
【図１０Ｂ−Ｃ】
0006021893.tif 000023
【図１０Ｄ−Ｅ】
0006021893.tif 000024
【図１１Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000025
【図１１Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000026
【図１１Ｅ】
0006021893.tif 000027
【図１２Ａ】
0006021893.tif 000028
【図１２Ｂ−Ｃ】
0006021893.tif 000029
【図１２Ｄ−Ｅ】
0006021893.tif 000030
【図１２Ｆ−Ｇ】
0006021893.tif 000031
【図１３Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000032
【図１３Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000033
【図１３Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000034
【図１３Ｇ−Ｈ】
0006021893.tif 000035
【図１４Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000036
【図１４Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000037
【図１４Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000038
【図１４Ｇ−Ｈ】
0006021893.tif 000039
【図１５Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000040
【図１５Ｃ】
0006021893.tif 000041
【図１６Ａ】
0006021893.tif 000042
【図１６Ｂ−Ｃ】
0006021893.tif 000043
【図１７Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000044
【図１７Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000045
【図１７Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000046
【図１８Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000047
【図１８Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000048
【図１８Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000049
【図１８Ｇ−Ｈ】
0006021893.tif 000050
【図１８Ｉ−Ｊ】
0006021893.tif 000051
【図１９】
0006021893.tif 000052
【図２０Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000053
【図２０Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000054
【図２０Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000055
【図２０Ｇ】
0006021893.tif 000056
【図２１Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000057
【図２２Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000058
【図２２Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000059
【図２２Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000060
【図２３Ａ−Ｂ】
0006021893.tif 000061
【図２３Ｃ−Ｄ】
0006021893.tif 000062
【図２３Ｅ−Ｆ】
0006021893.tif 000063
【図２４】
0006021893.tif 000064