(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号NITE P-1240で示されるMesorhizobium GN1株、または受託番号NITE P-1241で示されるBurkholderia sp.WN2株に属する微生物と水とを接触させる工程を含み、Ｈ−（ヒドリド）イオンが含まれる電離水素水を製造する方法。
【請求項２】
前記電離水素水に外部から水素ガスを吹き込み、前記微生物を活性化させ、当該吹きこんだ水素ガスを水中に溶存水素として溶解させる工程を含む、請求項１に記載の電離水素水の製造方法。
【請求項３】
受託番号NITE P-1240で示されるMesorhizobium GN1株、または受託番号NITE P-1241で示されるBurkholderia sp.WN2株に属する水素分子を分解してＨ−イオンを生成する微生物。
【請求項４】
受託番号NITE P-1240で示されるMesorhizobium GN1株、または受託番号NITE P-1241で示されるBurkholderia sp.WN2株に属する微生物と水とを接触させ、Ｈ−（ヒドリド）イオンが含まれる電離水素水を製造する工程、
前記工程で製造された電離水素水に、塩酸または酢酸などの酸を添加してＨ＋イオンを供給することにより水素ガスを生成する工程、とを含む水素ガスの生成方法。
【請求項５】
受託番号NITE P-1240で示されるMesorhizobium GN1株、または受託番号NITE P-1241で示されるBurkholderia sp.WN2株に属する微生物と水とを接触させ、Ｈ−（ヒドリド）イオンが含まれる電離水素水を製造する工程、
前記工程で製造された電離水素水に、炭化水素を添加し、当該炭化水素を分解させると同時に電離水素水中の溶存水素や溶存酸素と反応させることにより水素ガスを発生させる工程、とを含む水素ガスの発生方法。
【請求項６】
受託番号NITE P-1240で示されるMesorhizobium GN1株、または受託番号NITE P-1241で示されるBurkholderia sp.WN2株に属する微生物と水とを接触させ、Ｈ−（ヒドリド）イオンが含まれる電離水素水を製造する工程、
前記工程で製造された電離水素水をろ過または殺菌処理する工程、
とを含む還元性の飲料水の製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載の微生物を凍結乾燥標品とした食べる食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ−水素イオンを安定的にかつ豊富に含んだ水素イオン水を微生物により作製する方法であって、作製した水素水から水素を取り出したり、電子を取り出すことによる発電、水素の溶解による貯蔵法、還元力を利用した生体内の活性酸素消去や水質や大気などの環境浄化に応用する技術である。
【背景技術】
【０００２】
水素は、直接燃焼したり、燃料電池として応用することができるなどという利便性から、将来の再生可能エネルギーとして期待されている。しかし、水素は爆発性が高く、水素ボンベなどを用いなければ貯蔵できないため、その扱い方には注意が必要である。そこで、水素を水中に溶解させて水溶液として扱うことができれば、燃料としての扱いやすさが格段に高まり、再生可能エネルギーとしてのブレークスルーの技術となると考えられる。
【０００３】
水を分解して、水素を得る方法には電気分解、光触媒（特許文献１）、液中プラズマ(特許文献２)などの方法が知られる。また、Ｈ−イオンを水中に発生させる技術としては、アルカリ属類を用いる方法（特許文献３）、サンゴカルシウムを材料とした素焼きのセラミックボール用いる方法（特許文献４）、錯体（特許文献５）を用いた方法が知られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平２０１１−５４９４号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／０９４３０６号公報
【特許文献３】特開２００２−２４６０３９号公報
【特許文献４】特開２００４−１７４４８０号公報
【特許文献５】特開２００９−２３５０５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
光触媒による水素生成は、太陽光発電に比べエネルギー変換効率が悪く、実用化されていない。また、光触媒による水を分解して水素を発生させる方法は、水の電気分解によって水素を発生させる方法と反応は同じであり、Ｈ−イオンは発生しない。Ｎｉ−Ｒｕ錯体を用いたＨ−イオン生成法による燃料電池は、ルテニウムという希少金属（レアメタル）を使用している上に、従来のプラチナ触媒を用いた方法に比べ材料費は安価であるが、発電量は最大で１／２５であり、実用化には課題がある。
【０００６】
また、液中プラズマによる油や炭化水素を分解させて水素を発生させる方法は、特殊なマイクロ波発生機を用いる必要があり、さらにこの装置を稼働している間しか水素を発生させることができない。
【０００７】
アルカリ金属類を水素化金属として用いる方法は、安定的にＨ−イオンの生成が可能であるが、水素化するために２３００℃〜２７００℃の高温で処理する必要があり、特殊な化工技術が必要である。サンゴカルシウムを含む素焼きのセラミックボールは８００℃の高温燃焼が必要であることや高い磁界にかけて着磁させる必要がありコストがかかる。
【０００８】
本発明は、このような状況のもと、微生物を用いることにより、安価で容易にＨ−イオンを含む電離水素水を製造する方法を提供する。さらに本発明は、水素を分解してＨ−イオン生成できる微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはこのような課題を解決すべく、微生物の有する水に対する還元作用の強さを指標にして、環境中の湧き水から水に対する酸化還元電位を下げる作用を有した微生物の分離を行ったところ、複数の微生物を単離した。さらにこれらの強還元性微生物の培養液を遠心分離して、培養液を捨て、菌体を緩衝液に懸濁した菌溶液を透析チューブに入れ、これを蒸留水や水道水に入れ、水素ガスを注入し還元水を作製した。さらに、この還元水に酸、炭化水素、太陽光を照射し、その後に酸化還元電位、溶存水素、ｐＨの変化を分析した。この結果、酸添加、炭化水素添加、太陽光照射により溶存水素の上昇を検出し、また酸化還元電位の減少と上昇を繰り返すことによりプラズマ振動を検出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明で用いている微生物が電離水素水を作り出す反応は、ヒドロゲナーゼという酵素が水素分子を分解してＨ−イオンを生成する反応（Ｈ２→Ｈ−＋Ｈ＋）、またはＨ−イオンとＨ＋イオンから水素分子を合成する反応(Ｈ−＋Ｈ＋→Ｈ２)によるものと考えられる。
【００１１】
本発明の電離水素水の製造方法は、水と微生物を接触させる工程を含み、Ｈ−（ヒドリド）イオンが含まれる電離水素水を製造するものである。微生物は、Bradyrhizobium 属、Mesorhizobium 属、Burkholderia 属、Novosphingobium 属のいずれかに属する。また、この微生物は、Bradyrhizobium G+O-O株、受託番号NITE P-1240で示されるMesorhizobium GN1株、受託番号NITE P-1241で示されるBurkholderia sp.WN2株のいずれかに属する。
【００１２】
本発明の電離水素水の製造方法はさらに、前記電離水素水に外部から水素ガスを吹き込み、前記微生物を活性化させ、当該吹きこんだ水素ガスを水中に溶存水素として溶解させる工程を含む。
【００１３】
本発明に係る微生物は、Bradyrhizobium 属、Mesorhizobium 属、Burkholderia sp.属、Novosphingobium 属のいずれかに属する水素分子を分解してＨ−イオンを生成する。微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託し、受託番号を取得している。受託番号NITE P-1240、NITE P-1241のいずれかである。
【００１４】
本発明に係る水素ガスを生成する方法は、上記の製造方法により製造された電離水素水に、塩酸または酢酸などの酸を添加してＨ＋イオンを供給することにより水素ガスを生成するものである。
【００１５】
本発明に係る水素ガスを発生させる方法は、上記の製造方法により製造された電離水素水に、エタノール等の炭化水素を添加し、当該炭化水素を分解させると同時に電離水素水中の溶存水素や溶存酸素と反応させることにより水素ガスを発生させるものである。
【００１６】
本発明に係る飲料水は、上記の製造方法により製造された電離水素水をろ過または殺菌処理して作った還元性の飲料水である。
【００１７】
本発明に係る食品は、上記の微生物を凍結乾燥標品とした食べるマイナス水素発生食品である。
【００１８】
本発明に係る水素ガスに改質する方法は、上記の製造方法により製造された電離水素水にメタンガスや硫化水素を添加して、水素ガスに改質する方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の微生物を用いた方法は、微生物へ栄養を与えるだけでＨ−イオンを含む電離水素水を容易にかつ簡単に作ることができる。排水を栄養としても増殖可能であるため、より安価にＨ−イオンを含む電離水素水の製造ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の電離水素水に酢酸を添加することで水素が発生されたことを示す実験結果である。
【図２】本発明の電離水素水にエタノールおよびリモネンを添加することで水素が発生されたことを示す実験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の微生物は、水中の水素を分解することによって生成するＨ−（ヒドリド）イオンが豊富な水である電離水素水を作り出すことができ、電離水素水は、この微生物と蒸留水や水道水を接触させることにより作製される。本発明では、微生物へ栄養を与えるだけで、Ｈ−イオンを含む電離水素水を作ることができ、栄養としては排水でも微生物の増殖が可能であるため、より安価にＨ−イオンを含む電離水素水を得ることができる。
【００２２】
また、本発明は、生物や酵素を用いて蒸留水や水道水中に安定的に一定の溶存水素濃度を与えると同時にＨ−ヒドリドイオンを豊富に含んだ電離水素水を作製することで、常温常圧下の水中で安定的に水素を溶解させることができると伴に、溶解させた電離水素水に酸や炭化水素の添加をすることによって容易に水素ガスを発生させる。従って、安全で安価な水素貯蔵媒体を提供することも可能になる。
【実施例】
【００２３】
山形県山形市八森（蔵王山中腹）の湧水は、“長寿の水”と言われ、地元の住民を中心に親しまれている。この湧水は酸化還元電位が低い(還元力がある)ことが知られており、この還元作用は水中に生息する微生物による作用ではないかと考えたことから、湧き水中から微生物の分離を行なった。この結果、寒天培地にコロニーを形成した２９株の微生物を単離し、２１株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列から分類した。これらの内４株について電離水素水が作製できることを確認した。
【００２４】
これらの微生物はBradyrhizobium 属、Mesorhizobium 属、Burkholderia 属, Novosphingobium 属の微生物であった。
【００２５】
［実施例1］湧水から微生物の分離
山形県山形市八森の湧水から１．５Ｌの水を採水した。この水の一部を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、寒天培地を作製した。この寒天培地に滅菌してない湧き水を加え、３２Ｗの蛍光灯４本を照射しながら、３０℃で２週間から１カ月間程度静置培養した。目で確認できたコロニーを従属栄養細菌用のＰＢ寒天培地または２種類の藍藻類用寒天培地（Ｃ培地およびＣＴ培地）に画線して植菌し、さらに２週間から１カ月の間蛍光灯を照射しながら、３０℃で静置培養した。
【００２６】
ここで、ＰＢ培地とは、１Ｌの蒸留水に１０ｇのポリペプトン、２ｇの酵母エキス、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加えて調整した培地である。Ｃ培地とは、１００ｍＬの蒸留水に１５ｍのＣａ(ＮＯ３)２・４Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＫＮＯ３、５ｍｇのβ-グリセロリン酸ナトリウム、４ｍｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１μｇのビタミンＢ１２、０．０１μビオチン、１μｇのチアミン塩酸、０．３ｍｌのＰＩＶメタルズ(１００ｍｌの蒸留水に１９．６ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、３．６ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏを加え調整した溶液である)、５０ｍｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを加えｐＨ７．５に調整した培地である。
【００２７】
ＣＴ培地とは、Ｃ培地のトリスヒドロキシアミノメタンの代わりに、５０ｍｇのＴＡＰＳを加え、ｐＨを７．０に調整した培地である。寒天培地は、いずれも寒天を１．５％になるように加えて調整した。目で確認できるコロニーをＰＢ液体培地または２種類の藍藻類用液体培地（ＣおよびＣＴ培地）に植え継ぎ、１週間〜１カ月間培養した。ここで、従属栄養細菌においても、藍藻類においても、単一のコロニーを植え継いだはずでも始めに増殖した微生物のコロニーに、明らかに別の微生物が重なって出現したり、あるいは重ならないが、すぐ近くに別の微生物のコロニーが数週間後に出現したりする現象が確認された。このため、単一の微生物とするために、さらに、コロニー色の違いで単一のコロニーと確認できるまで、画線して寒天培地による分離培養を行った。藍藻類の寒天培地に藍藻類ではないと考えられる白いコロニーも確認され、このコロニーをさらにＰＢ寒天培地で分離した。また、従属栄養細菌が増殖した後にこのコロニーの表面に藍藻類か藻類と考えられる微生物の増殖が確認された。この微生物はさらに藍藻類用の培地で分離した。さらに、ある一つコロニーからの微生物の培養液を遠心分離したところ、比重の違いによるものと考えされるが、遠心チューブの上方と下方で異なる色が確認された。この分離された色の微生物をそれぞれ新しい寒天培地に植えたところ、それぞれの色の微生物の増殖が確認され（Ｇ＋Ｏ−Ｇ株とＧ＋Ｏ−Ｏ株）、これらの１６ＳｒＲＮＡに基づく分類を行ったところ、異なる微生物であることが示された。これらの単一のコロニーを液体培地に植え継ぎ、濁りが確認できた培養液にグリセロールを加え、−８５℃で保存した。
【００２８】
［実施例２］電離水素水の作製と水質分析
２−１：実験装置および器具
（１）透析膜チューブ(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette G2、Thermo SCIENTIFIC社)、（２）蒸留水入りビーカー、（３）ｐＨ計(HM-31P、GSF-2739C、(株)東亜DKK社)、（４）酸化還元電位(ＯＲＰ)計(HM-31P、 PST-2729C、(株)東亜DKK社)、（５）溶存水素(ＤＨ)計(KM2100 DH、(株)共栄電子研究所)、（６）デジカメ内蔵パソコン(Apple社 iMac)、録画ソフトウエア（ＱＴＲｅｘ)、（７）恒温槽、（８）夜間測定のための２７Ｗ蛍光灯（なお、蛍光灯の照射は水素生成の誘導に影響しなかった）。
【００２９】
２−２：実験手順
（１）−８５℃に凍結保存しておいた各菌株を白金耳でかきとり、ＰＢ寒天培地へ画線植菌し、３０℃で７日〜１０日間静置培養した。（２）出現した単一のコロニーを白金耳でかき取り、１００ｍＬのＰＢ液体培地を加えた２００ｍＬ容の三角フラスコに植え継ぎ、３０℃、７０ｒｐｍで７日〜１０日間の振とう培養を行った。（３）この２０ｍｌまたは５０ｍＬの培養液を２００ｍＬまたは５００ｍＬのＰＢ液体培地を加えた１Ｌの三角フラスコに植え継ぎ、３０℃、７０ｒｐｍで７日〜１０日間の振とう培養を行った。（４）培養液を５００ｍＬ容の遠心管に移し、４℃、５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心して、培地を捨て集菌した。（５）菌体を２ｍｌのＴＮＥｂｕｆｆｅｒ (２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))に懸濁した。（６）全量を１５ｍＬ容の透析膜カチューブに注入した。（７）この菌溶液を加えた。透析チューブを、２００ｍＬの蒸留水を加えた５００ｍＬのビーカーまたは４００ｍＬの蒸留水を加えた１Ｌのビーカーに静置した。（８）この後の実験は５分間の水素ガスの添加あるいは添加しない条件で行い、さらに計測は装置を太陽光が射し込むようにブラインドを開いた状態にした実験室の窓際に設置した場合と暗室に設置した場合の２パターンで行った。
【００３０】
夜間や暗室での計測は、２７Ｗの蛍光灯を点灯して行った（蛍光灯の灯りは水素発生に影響しないことが示されている）。酸による水素生成を調べる実験は、１７ｍｏｌ／Ｌの酢酸または６ＮＨＣｌを１〜２％(ｖ／ｖ)添加して行った。炭化水素の分解による水素生成実験は、９９．５％エタノールＣ２Ｈ６ＯまたはリモネンＣ１０Ｈ１６を１〜２％(ｖ／ｖ)添加して行った。なお、炭化水素は、エタノールやリモネンに限定されたものではなく、重油や食用油、水素を含むメタンＣＨ４や硫化水素Ｈ２Ｓでも良い。（９）透析チューブを静置したビーカーを恒温槽に静置し、３０℃で１週間から３週間インキュベートした。（１０）１０分〜２時間間隔でパソコンに付属しているデジタルビデオカメラを用いてｐＨ、ＯＲＰ、ＤＨ、水温の値を記録した。
【００３１】
［実施例３］酸添加による水素生成
電離水素水である水と電離水素水でない水の最も簡便な識別法は、酢酸や塩酸などの酸を添加することによって、水素が生成することを確認する方法である。水素が生成されなければ電離水素水ではない。そこで、ＧＮ１株を用いて作製した還元水に水素を添加し、溶存水素濃度が一定となった後に１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸を２％(ｖ／ｖ)添加し、溶存水素濃度の上昇が検出されるか調べた。ここで、水素の添加は微生物のヒドロゲナーゼ酵素を活性化させる目的と水素ガスを溶かすためである。水素ガスを添加しない場合は電離水素水の活性が弱い水ができることを確認している。この結果を図１に示す。酢酸添加後に、５時間にわたって溶存水素濃度が２μｇ／Ｌから３μｇ／Ｌに上昇し、水素が発生していることが確認できる。この結果より、電離水素水の性質の一つを確認できたと考察する。なお、酸を添加した直後に急激に酸化還元電位が上昇しているが、これは、酸を加えた場合には酸化還元電位が上昇し、塩基を加えた場合には酸化還元電位が下降する性質があるため、正しい反応である。データは示していないが、ポジティブコントロールのセラミックボールによる還元水には１μｇ／Ｌの溶存水素が検出されたが、蒸留水や水道水では溶存水素は検出されなかったことも、この考察を裏付けている。
【００３２】
［実施例４］炭化水素の添加による水素ガスの生成
図２は、該微生物を用いて98%エタノールおよびリモネンを終濃度が2%になるように添加したときに水素ガスが発生する様子を示している。エタノール等の炭化水素を添加して、炭化水素を分解させると同時に、電離水素水中の溶存酸素や溶存酸素と反応することで、水素ガスが発生されることが確認された。水素ガスを添加後の１００時間目に1回目のエタノール添加後し、さらに１５０時間過ぎに２回目のエタノールを添加したところ、最大２μｇ/Ｌの溶存水素濃度の上昇が検出された。また、約２００時間目にリモネンを添加した際も１μｇ/Ｌの水素濃度上昇が検出された。これらの結果より、電離水素水の性質である、炭化水素添加により水素の生成が確認できた。蒸留水にエタノールを添加するコントロールの実験も行ったが、この際は酸化還元電位の低下は検出されたが、溶存水素濃度の上昇は検出されなかった。
【００３３】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【図１】
0006052655.tif 000002
【図２】
0006052655.tif 000003