(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質との結合を阻害し、
ＧＥＸＰモチーフ
【化７】
0005875190.tif 000014
［式中、ＸはＡｒｇであり、ｎは１０である］
を含む、ペプチド。
【請求項２】
左巻きヘリックスを形成する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
４０〜５００アミノ酸長を有する、請求項１又は２記載のペプチド。
【請求項４】
４０〜５０アミノ酸長を有する、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
タグ、ラベル、リンカー、および／または薬物を含む、請求項１〜４のいずれか記載のペプチド。
【請求項６】
【化８】
0005875190.tif 000015
［式中、
Ｘは、Ａｒｇであり、
ｍは、少なくとも１であり、
ｎは、１０である、
Ｎ’は、Ｎ−末端を意味し、
Ｃ’は、Ｃ−末端を意味する］で示される、請求項１〜５のいずれか記載のペプチド。
【請求項７】
ｍ＝１でタグ、Ｈｉｓタグと、
ポリグリシンリンカーと
を含み、
Ｘ＝Ａｒｇおよびｎ＝１０でＧＥＸＰモチーフ
を含む、請求項１〜６のいずれか記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
さらに、Ｎ−末端および／またはＣ−末端の修飾を含む、請求項１〜８のいずれか記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｎ−および／またはＣ−末端のアセチル化および／またはアミド化を含む、請求項７記載のペプチド。
【請求項１１】
医薬に使用するための、請求項１〜１０のいずれか記載のペプチド。
【請求項１２】
メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）のスカベンジャーとしての、請求項１〜１０のいずれか記載のペプチド。
【請求項１３】
アルギニン−含有タンパク質との結合に関するメチルグリオキサールのアンタゴニストとしての、請求項１〜１０のいずれか記載のペプチド。
【請求項１４】
タンパク質が、細胞性ナトリウムイオンチャンネルタンパク質である、請求項１３記載のペプチド。
【請求項１５】
メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏の予防および／または治療のための、請求項１〜１０のいずれか記載のペプチド。
【請求項１６】
予防および／または治療されるべき疼痛および／または痛覚過敏が、疾患と関連および／または疾患の経過中に発生し、該疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、白内障発生、慢性腎不全および慢性または急性尿毒症、嚢胞性線維症、レビー小体型認知症、糖尿病およびその合併症、虚血−再潅流、子癇前症、乾癬、リウマチ様関節炎および若年性慢性関節炎、重症敗血症、全身性アミロイドーシス、パーキンソン病、有痛性腸疾患、化学療法誘導疼痛、重症虚血肢、高血圧、骨痛、腫瘍疼痛より選択される、請求項１５記載のペプチド。
【請求項１７】
予防および／または治療されるべき疼痛が、異痛症である、請求項１６記載のペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか記載の少なくとも１種のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項１９】
さらに薬学的に許容されうる担体および／または賦形剤を含む、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
（ａ）スクリーニングされるべき化合物を提供すること、
（ｂ）請求項１〜１０のいずれか記載のペプチドを提供すること、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両者に対するメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）を提供すること、及び
（ｄ）（ａ）の化合物がメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）に結合し、（ａ）の化合物が疼痛および／または痛覚過敏に影響するか否かを評価すること
を含む、メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生またはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏に影響する化合物を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチルグリオキサール（ＭＧ）および／または他の反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン−またはリシン−含有細胞性タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物に関する。好ましいスカベンジャー化合物は、アミノ酸配列モチーフＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｐｒｏ（ＧＥＸＰ）［式中、ＸはＡｒｇまたはＬｙｓである］の数個または多数の繰り返しを含むペプチドおよびその薬学的組成物である。本発明は、さらに、メチルグリオキサールおよび／または関連する反応性カルボニル種（ＲＣＳ）のスカベンジャーまたはアンタゴニストとしてのその化合物の使用に関する。本発明は、さらに、疼痛、痛覚過敏および疼痛関連疾患、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する特定の疼痛および／または痛覚過敏の予防および／または治療のためのその化合物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ピルブアルデヒドまたは２−オキソ−プロパナール（ＣＨ３−ＣＯ−ＣＨ＝Ｏ）とも呼ばれるメチルグリオキサール（ＭＧ）は、アルデヒド型のピルビン酸である。それは、２個のカルボニル基を有することから、α−ジカルボニル化合物である。生物において、メチルグリオキサールは、数個の代謝経路の副生成物として形成される。ＭＧは、トレオニン異化の中間体である３−アミノアセトンから、ならびに脂質過酸化によって生成する可能性がある。しかしながら、最も重要な供給源は解糖であって、そこでメチルグリオキサールは、２種の解糖中間体であるグリセルアルデヒドリン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からの非酵素的リン酸脱離から生じる。メチルグリオキサールは高度に細胞毒性であるので、生体はいくつかの解毒メカニズムを発達させた。これらの一つはグリオキサラーゼ系である。メチルグリオキサールは、グルタチオンと反応してヘミチオアセタールを形成する。これは、グリオキサラーゼＩ（ＧＬＯ−Ｉ）によってＳ−Ｄ−ラクトイル−グルタチオンに変換され、次にグリオキサラーゼＩＩ（ＧＬＯ−ＩＩ）によってさらにＤ−乳酸に代謝される。
【０００３】
メチルグリオキサールがなぜ産生されるかは未知のままであるが、数報の論文は、メチルグリオキサールが終末糖化産物（ＡＧＥ）の形成に関与することを示している。実際にメチルグリオキサールは、最も重要な糖化剤（ＡＧＥを形成する）であることが証明されている。この過程において、メチルグリオキサールは、タンパク質のリシンおよびアルギニン残基の遊離アミノ基と反応してＡＧＥを形成する（図１参照）。他の糖化剤には、グルコース、ガラクトース、アロースおよびリボースのような還元糖が含まれる。
【０００４】
メチルグリオキサールおよび関連する反応性カルボニル種（ＲＣＳ）の形成は、解糖速度および解糖中間体の存在と密接な関係がある。したがって、解糖フラックスの増加および解糖へのエネルギー依存性の増加がある条件で、メチルグリオキサールおよびＲＣＳの形成速度も増加する。これは、腎症、神経障害および網膜症などの合併症が、終末糖化産物（ＡＧＥ）の細胞レベルの増加と関係がある糖尿病患者の場合に示されている。糖尿病は主な研究領域であったが、ＲＣＳ、特にメチルグリオキサールが、様々な疾患の進行および重症度に果たす中心的役割の新たな証拠が目下明らかになりつつある。（表１参照）
【０００５】
【表１】
0005875190.tif 000002
【０００６】
ナトリウムイオンチャンネルは、イオンチャンネルを形成する内在性膜タンパク質であって、ナトリウムイオンに細胞形質膜を通過させる。それらは、その種のイオンのためにチャンネルを開口するトリガー、すなわち電圧変化（電位開口型ナトリウムチャンネル）または物質（リガンド）とチャンネルとの結合（リガンド開口型ナトリウムチャンネル）のいずれかにより分類される。ニューロン、筋細胞、およびある種のグリアなどの興奮可能な細胞では、ナトリウムチャンネルは、活動電位の上昇相の原因となる。ナトリウムチャンネルは、多くの場合に２種類のタンパク質サブユニットαおよびβの複合体として細胞から単離することができる。α−サブユニットは、チャンネルのコアを形成する。α−サブユニットタンパク質が細胞によって発現される場合、たとえβ−サブユニットが発現されなくても電位開口式にＮａ＋を通過させるチャンネルを形成することができる。β−サブユニットがα−サブユニットと集合する場合、結果として生じる複合体は、電圧依存性および細胞局在の変化を示す可能性がある。α−サブユニットは、Ｉ〜ＩＶと表示される４個の繰り返しドメインを有し、各ドメインは、Ｓ１〜Ｓ６と表示される６個の膜貫通領域を含む。高度に保存されたＳ４領域は、チャンネルの電圧センサーとして作用する。チャンネルの電圧感受性は、３個毎に位置する正のアミノ酸が原因である。膜内外電圧の変化によって刺激されると、この領域は、細胞膜の細胞外側に向けて移動し、そのチャンネルをイオン透過性にさせる。イオンは小孔を通過し、その小孔は二つの領域に分解することができる。小孔より外側（細胞外）部分は、４個のドメインの「Ｐ−ループ」（Ｓ５とＳ６の間の領域）によって形成される。この領域は、小孔の最も狭い部分であって、そのイオン選択性を担っている。小孔の内側部分（細胞質側）は、４個のドメインのＳ５およびＳ６領域の組み合わせによって形成される。例えば図２Ｂを参照されたい。
【０００７】
電位開口型ナトリウムチャンネルは、３種類の状態：脱活性化（閉鎖）、活性化（開口）、および不活性化（閉鎖）を有する。活性解除状態のチャンネルは、「活性化ゲート」によってその細胞内側で遮断され、そのゲートは、チャンネルを開口する刺激に応答して除去されると考えられる。不活性化ゲートと呼ばれる付属栓（tethered plug）（αサブユニットのドメインＩＩＩおよびＩＶによって形成される）に起因する不活性化能力。不活性化ゲートは、チャンネルが不活性化されたすぐ後にチャンネルの内側を遮断する。脱分極後、活動電位の間に数ミリ秒間チャンネルは、不活性化されたままである。活動電位の降下相に続いて細胞の膜電位が再分極すると、不活性化は排除される。これにより、次の活動電位の間にチャンネルが再び活性化できるようになる。
【０００８】
ナトリウムチャンネルが正常に機能することを破壊し、生物にとってひどい結果を招くいくつかの化学物質および遺伝障害がある。ナトリウムチャンネルを遮断できる化学物質には、テトロドトキシン（フグによって産生される）、サキシトキシン（渦鞭毛藻類によって産生される）、コノトキシン（イモガイによって産生される）、ならびに合成局所麻酔薬リドカインおよびノボカインが含まれる。Ｓｋａｋｅｒ（Ｓｈ）遺伝子、ヒト高カリウム血症周期性四肢麻痺（ＨｙｅｒＰＰ）、発作性運動失調症（ＥＡ）、およびブルガダ症候群を含めた、ナトリウムチャンネルの機能に影響する遺伝障害。
【０００９】
糖尿病において、その疾患に関連する３種の主要な主合併症の一つである神経障害は、多くの場合に、侵害刺激に対する応答性増加（痛覚過敏）ならびに通常は非侵害の刺激に対する過剰応答性（異痛症）を含めた、刺激によって進展される１種または複数種の疼痛を示している患者で観察される。糖尿病患者の持続性疼痛の基礎をなすメカニズムは、ほとんど理解されていないままであり、それゆえに発症を遅延または予防することのできる有効な治療的処置はほとんどまたは全くない。
【００１０】
本発明は、メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）をスカベンジングする、および／またはそれと拮抗するための手段および方法を提供することを目的とし、その手段および方法は、疼痛、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏の予防および／または治療の改善を可能にする。
【００１１】
発明の概要
本発明によると、この目的は、メチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物を提供することによって解決される。
【００１２】
アルギニン−またはリシン−含有タンパク質は、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン−またはリシン−含有細胞性タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８である。
【００１３】
好ましい化合物は、ＧＥＸＰモチーフの数個および／または多数の繰り返しを含むペプチドである。
【００１４】
本発明のペプチドのＧＥＸＰモチーフは、
【００１５】
【化１】
0005875190.tif 000003
［式中、Ｘは、アルギニン（Ａｒｇ）または（Ｌｙｓ）であり、
ＧＥＸＰ繰り返しの合計数であるｎは、少なくとも２であって好ましくは２≧ｎ≦１００の範囲内である］である。
【００１６】
本発明によるとこの目的は、さらに、医薬に使用するために本発明の化合物を提供することによって解決される。
【００１７】
本発明によるとこの目的は、さらに、メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）のスカベンジャーとして本発明の化合物を提供することによって解決される。
【００１８】
本発明によるとこの目的は、さらに、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン−またはリシン−含有細胞性タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８との結合に関するメチルグリオキサールのアンタゴニストとして本発明の化合物を提供することによって解決される。
【００１９】
本発明によるとこの目的は、さらに、疼痛および／または痛覚過敏、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏の予防および／または治療のために本発明の化合物を提供することによって解決される。
【００２０】
本発明によるとこの目的は、さらに、本発明の少なくとも１種の化合物と、場合により薬学的に許容されうる担体および／または賦形剤とを含む薬学的組成物を提供することによって解決される。
【００２１】
本発明によるとこの目的は、さらに、疼痛および／または痛覚過敏、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏に影響する化合物を同定／スクリーニングするための方法によって解決される。
【００２２】
該方法は、
（ａ）スクリーニングされるべき化合物を提供すること、
（ｂ）本発明による化合物を提供すること、
（ｃ）（ａ）のスクリーニングされるべき化合物が疼痛および／または痛覚過敏の発生および／または進行に及ぼす効果を判定すること
を含む。
【００２３】
本発明によるとこの目的は、さらに、本発明のスクリーニング法において同定された化合物を提供することによって解決される。
【００２４】
本発明の好ましい態様の説明
下記に本発明をより詳細に説明する前に、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコールおよび試薬が異なりうることから、本発明がこれらに限定されないことを了解されたい。本明細書に使用された用語が、特定の態様のみを説明するためであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するつもりはないことも了解されたい。特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明のために、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体で参照により組み入れられる。
【００２５】
メチルグリオキサール−スカベンジング化合物
上記に概要したように、本発明は、メチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質との結合、すなわちメチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、これらのタンパク質のアルギニンまたはリシン残基との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物を提供する。
【００２６】
アルギニン−またはリシン−含有タンパク質は、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン−またはリシン−含有細胞性タンパク質、より好ましくはアルギニン−含有細胞性タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８である。
【００２７】
本発明による化合物は、
−  in vivoおよびin vitroでメチルグリオキサールおよび他のＲＣＳに結合およびスカベンジングする、
ならびに／または
−  タンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有（細胞性）タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８などに結合するためにメチルグリオキサールおよび他のＲＣＳと拮抗および／または競合する、
ならびに／または
−  メチルグリオキサールおよび他のＲＣＳによるタンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有（細胞性）タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８などの改変を防止する、
ならびに／または
−  メチルグリオキサールおよび他のＲＣＳによる終末糖化産物（ＡＧＥ）の形成を阻害および／もしくは阻止する
ことができる。
【００２８】
本明細書に使用されるような化合物の「スカベンジング潜在能」は、本発明の化合物と反応できるメチルグリオキサールの量と見なすことができることから、メチルグリオキサールまたは類似の作用をする反応性代謝物（反応性カルボニル種（ＲＣＳ）など）が増加している任意の状態でアルギニン−またはリシン−含有（細胞性）タンパク質との結合から除去される、有効量のメチルグリオキサールまたは類似の作用をする反応性代謝物（反応性カルボニル種（ＲＣＳ）など）でありうる。
【００２９】
本発明者らは、後根神経節にのみ発現されるＴＴＸ耐性チャンネルであって、他の類似作用チャンネルの一例として本明細書に提示される電位開口型ナトリウムチャンネル１．８（Ｎａｖ１．８；Ｓｃｎ１０ａ）がメチルグリオキサールによって改変されることを見出した。したがって、ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８および他のチャンネルの機能は、メチルグリオキサールまたは類似の作用をする反応性代謝物（反応性カルボニル種（ＲＣＳ）など）によってモデュレーションされる可能性がある。本発明者らのこの発見は、例えば、糖尿病性神経障害の発生および進行についての新規なメカニズムを提供する。
【００３０】
本発明者らは、さらに、メチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、アルギニン（またはリシン）−含有タンパク質、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン（またはリシン）−含有細胞性タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８（すなわち本発明のメチルグリオキサール−スカベンジング化合物）との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物が、疼痛／痛覚過敏を発生させるまたはそれに関連する成分（すなわちメチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ））をターゲットとして、疼痛および／または痛覚過敏のための新規で特異的な処置／治療法に適することを見出した。より詳細には、さらに下記を参照されたい。
【００３１】
−  ＧＥＸＰペプチド／繰り返しＧＥＸＰモチーフを含むペプチド
本発明のスカベンジング化合物の好ましい一態様は、ＧＥＸＰモチーフの数個および／または多数の繰り返しを含むペプチドである。
【００３２】
本発明のペプチドのＧＥＸＰモチーフは、
【００３３】
【化２】
0005875190.tif 000004
［式中、Ｘは、塩基性アミノ酸残基、好ましくはアルギニン（Ａｒｇ）またはリシン（Ｌｙｓ）である］である。配列番号１も参照されたい。
【００３４】
ＧＥＸＰモチーフは、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｘ（ここでＸは、アルギニン（Ａｒｇ）またはリシン（Ｌｙｓ）である）およびプロリン（Ｐｒｏ）のテトラペプチドである。このモチーフ自体は、コラーゲンの構造に基づく。
【００３５】
コラーゲンが最も豊富に存在する成分である細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、メチルグリオキサールによる翻訳後修飾に関して大規模に研究されている。糖尿病におけるような高血糖および変化したグルコース代謝の条件下で、メチルグリオキサールの過剰生成があり、それが続いてコラーゲンの重要なアルギニン残基、具体的にはＧＦＯＧＥＲおよびＲＧＤインテグリン結合部位を修飾し、内皮細胞の剥離、アノイキスおよび血管形成阻害を発生させることが提唱されている。コラーゲンは、それぞれＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＹまたはＧｌｙ−Ｚ−Ｈｙｐ［式中、ＹおよびＺは、任意の他のアミノ酸残基でありうる］のいずれかの２個の繰り返しモチーフから成る３本のポリペプチド鎖を含む。高含量のプロリン（Ｐｒｏ）および／またはヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）は、それらが幾何学的に束縛されたカルボキシル基および（第二級）アミノ基を有することから、個別のポリペプチド鎖が鎖内水素結合を全く形成せずに左巻きヘリックスを自然に形成する傾向が生じる。したがって、コラーゲンは、その単純な構造およびその後の高い修飾潜在性を有することから、メチルグリオキサールの合成ペプチドスカベンジャーの構築のための理想的なモデルに相当する。
【００３６】
好ましい一態様では、ＧＥＸＰモチーフはＧＥＲＰモチーフであり、すなわちＸはＡｒｇである。
【００３７】
ＧＥＸＰモチーフの合計数（すなわちその繰り返し数ｎ）は、少なくとも２である。
【００３８】
好ましくは、少なくとも２個のＧＥＸＰモチーフが、相互に隣接／連続する。
【００３９】
好ましくは、ＧＥＸＰ繰り返しの合計数ｎは、２≧ｎ≦１００の範囲内である。
【００４０】
好ましくは、ｎは最大２５であり、より好ましくはｎは最大１５であり、なおさらに好ましくはｎは１０である。
【００４１】
好ましくは、本発明のペプチドは、左巻きヘリックスまたは類似の機能を有する任意の他の構造を形成する。ここで、その機能は、
−  in vivoおよびin vitroでメチルグリオキサールおよび他のＲＣＳと結合およびそれをスカベンジングする
ならびに／または
−  タンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有（細胞性）タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８などへの結合についてメチルグリオキサールおよび他のＲＣＳと拮抗するかおよび／もしくは競合する
ならびに／または
−  メチルグリオキサールおよび他のＲＣＳによる、タンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有（細胞性）タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８などの修飾を防止する、
ならびに／または
−  メチルグリオキサールおよび他のＲＣＳによる終末糖化産物（ＡＧＥ）の形成を阻害および／もしくは防止する
潜在能である。
【００４２】
ペプチド内に存在するＧＥＸＰモチーフの繰り返しユニット数（ｎ）は、達成されるべきスカベンジング潜在能に依存する。本明細書に使用されるような「スカベンジング潜在能」は、本発明のＧＥＸＰモチーフ−含有ペプチドと反応できるメチルグリオキサールの量、したがってメチルグリオキサールまたは類似の作用をする反応性代謝物（反応性カルボニル種（ＲＣＳ）など）が増加している任意の状況でアルギニン−またはリシン−含有（細胞性）タンパク質との結合から除去される、有効量のメチルグリオキサールまたは類似の作用をする反応性代謝物（反応性カルボニル種（ＲＣＳ）など）として見なすことができる。
【００４３】
本明細書に開示された実施例（ＧＥＲＰ００１と名付けたＧＥＸＰモチーフ−含有ペプチド）において、１ペプチド分子あたり合計１０個のアルギニン残基となるＸ＝ＲのＧＥＸＰモチーフの１０個の繰り返し（約４０個のアミノ酸）が利用された。メチルグリオキサール（７０μM）を注射する３０分前に、健康な野生型マウスに腹腔内注射することによる１mgのＧＥＲＰ００１（１mg≡１．０９６×１０１５個のアルギニン残基）の投与は、メチルグリオキサール誘導性痛覚過敏を約６０％減少させた。ＧＥＲＰ００１の長さは、第一に、１０個のアルギニン残基から供されうる相対スカベンジング潜在能によって、第二に、相対コストおよび合成の容易さによって決定された。ＧＥＲＰ００１は、これら二つの要因の間の好ましく効率的なバランスを表す。本発明のために、ペプチドについてのＧＥＸＰモチーフの合計数（ｎ）は、以下の範囲内でありうる：２≧ｎ≦１００。
【００４４】
好ましくは、本発明によるペプチドは、少なくとも８アミノ酸長を有し、好ましくは約８〜約５００アミノ酸長、より好ましくは約８〜約２５０、なおさらに好ましくは１０〜５０アミノ酸長を有する。一態様では、ペプチドは、８〜約５００個のアミノ酸、好ましくは１０〜約５０個のアミノ酸、１０、１１、１２、１３、…４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のアミノ酸などの範囲内の任意の長さから成る。「…」は、それぞれの範囲内の各整数を意味することに留意すべきである。
【００４５】
好ましい一態様では、本発明による化合物は、さらに
−  タグおよび／もしくはラベル、
ならびに／または
−  リンカー、
ならびに／または
−  メチルグリオキサール結合性ポケットを有する小分子などの薬物
を含む。
【００４６】
タグおよびラベル
本発明の文脈内で、「タグ」または「ラベル」は、以下を表す（が、それだけに限定されない）：
・  親和性タグまたは精製タグ：
Ｈｉｓタグまたはポリ（Ｈｉｓ）（例えば６×Ｈｉｓ）、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など
・  可溶化タグ
チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）など
・  細胞透過性タグ
・  クロマトグラフィータグ
ＦＬＡＧ−タグなど
・  エピトープタグ
Ｖ５−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、およびＨＡ−タグなど
・  抗体または抗体フラグメントタグ
好ましくは、例えばＧＥＸＰモチーフのＮ−末端がスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ−スクシンイミジル（succinimdyl）３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのクロスリンカーを経由して関心が持たれる抗体のスルフヒドリル基に連結することによる
・  蛍光タグまたはラベル
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその誘導体（ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰなど）、ｚｏａｎＦＰまたは赤色蛍光タンパク質ｄｒＦＰ５８３およびそれらの誘導体など
ならびに蛍光色素、
Ａｌｅｘａ色素、ロダミンおよびフルオレセインの誘導体、Ｃｙ−色素
・  放射性同位体
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング用、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、および２０１ＴＩなど；治療用、９０Ｙおよび１３１Ｉなど
・  造影剤
ガドリニウム（Ｇｄ）錯体、超常磁性（supramagnetic）鉄（Ｆｅ）の錯体および粒子、高原子番号の原子を含む化合物、すなわちコンピュータ断層撮影（ＣＴ）用ヨウ素、これらの造影剤を中に含むマイクロバブルおよびリポソームなどの担体など。
【００４７】
好ましいタグは、Ｈｉｓタグまたはポリ（Ｈｉｓ）、例えば６×Ｈｉｓまたは（Ｈｉｓ）６である。
【００４８】
好ましくは、本発明の化合物は、少なくとも１個のタグ（またはラベル）を含む。
【００４９】
タグ／ラベルは、好ましくは技術者に公知のin vivo医学的使用に適する。
【００５０】
技術者は、それぞれの適用に応じてそれぞれの適切なタグおよび／またはラベルを選択することができる。
【００５１】
リンカー
本発明の一態様では、特にその化合物がタグ、ラベル、薬物などのさらなる成分も含む場合、その化合物はリンカーまたはスペーサーを含む。
【００５２】
本発明の文脈内で「リンカー」は、選択された「タグ」／「ラベル」または本発明の化合物のさらなる成分のいずれかの機能に対して化学的に不活性な、短い配列の残基（アミノ酸残基などの天然または合成のもの）を表す。本質的に「リンカー」は、「タグ」／「ラベル」（またはさらなる成分）と化合物（ペプチドのＧＥＸＰモチーフなど）の間のスペーサーとして作用することによって、選択された「タグ」／「ラベル」（またはさらなる成分）および化合物（ペプチドのＧＥＸＰモチーフなど）に起因しうる任意のマイナスの相互作用を防止する。
【００５３】
好ましいリンカーには、ポリアラニン、ポリグリシン、糖質、（ＣＨ２）ｎ基が含まれるが、それだけに限定されるわけではない。したがって技術者は、それぞれの適用に応じてそれぞれ適切なリンカーまたはスペーサーを選択することができる。
【００５４】
好ましいリンカーは、（Ｇｌｙ）４などのＧｌｙリッチ配列である。
【００５５】
薬物
薬物は、好ましくは小分子であり、その小分子は、好ましくはメチルグリオキサールまたは他のＲＣＳと結合するポケットを含む。
【００５６】
本発明の好ましい一態様は、ＧＥＸＰモチーフと、場合によりタグおよび／またはリンカーとから成るペプチドである。
【００５７】
本発明の好ましい一態様は、以下：
【００５８】
【化３】
0005875190.tif 000005
［式中、
Ｘは、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
ｍは、少なくとも１であって、好ましくは１であり、
ｎは、少なくとも２であって、好ましくは１０であり、
Ｎ’は、Ｎ−末端を意味し、
Ｃ’は、Ｃ−末端を意味する］のペプチドである。
【００５９】
図５Ａも参照されたい。
【００６０】
本発明によるそのような好ましいペプチドは、
−  Ｎ−末端Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ）６；
−  Ｘ＝Ａｒｇの場合のＧＥＸＰモチーフの１０個の繰り返し（ＧＥＲＰ）１０；および
−  ＨｉｓタグとＧＥＸＰモチーフの間のリンカーまたはスペーサー（Ｇｌｙ）４；
を含み、すなわちそれは以下の一般式
【００６１】
【化４】
0005875190.tif 000006
を有する。
【００６２】
本発明によるそのような好ましいペプチド（ＧＥＲＰ００１とも呼ばれる）は、配列番号２
【００６３】
【化５】
0005875190.tif 000007
のアミノ酸配列を含むまたは有する。
【００６４】
好ましい一態様では、本発明の化合物は、Ｎ−末端および／またはＣ−末端の修飾を含む。
【００６５】
好ましくは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端の修飾は、それぞれＮ−および／またはＣ−末端の、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基のアセチル化および／またはアミド化を含むが、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目以上のアミノ酸残基などの、Ｎ−またはＣ−末端のいずれかに極めて近接した修飾も含む。
【００６６】
Ｎ−末端アセチル化には、好ましくはカルボン酸、脂肪酸（飽和または不飽和脂肪酸、分岐または非分岐脂肪酸、好ましくは８〜２２個の炭素原子を有するもの）、および親油性側鎖を有するアミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン）を用いたアシル化が含まれる。例は、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）によるアシル化である。
【００６７】
Ｎ−末端の疎水性修飾は、好ましくはコレステロール、コレステロール誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、および多環芳香族化合物の付加より選択されるが、それだけに限定されるわけではない。疎水性部分の付属は、好ましくは共有結合によるが、これは、カルバメート、アミド、エーテル、ジスルフィドまたは当業者の技術の範囲内の任意の他の連結を経由して達成することができる。
【００６８】
Ｃ−末端の修飾には、アミド、Ｄ−アミノ酸、改変アミノ酸、環状アミノ酸；ＰＥＧ、グリカンなどの天然および合成ポリマーが含まれるが、それだけに限定されるわけではない。
【００６９】
Ｎ−および／またはＣ−末端の一方または両方の修飾が好ましい。それは、Ｎ−およびＣ−末端修飾が、合成の間に生成した本発明のペプチドの遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端に由来する追加的な電荷を除去するからである。これを行うと、結果として生じたペプチドは天然ペプチドを模倣し、細胞透過性は増加するであろう。さらに、アミノペプチダーゼによる消化に対する安定性が高まり、シンセターゼによるさらなる修飾が阻害される。
【００７０】
技術者は、それぞれの適用に応じてそれぞれ適切なＮ−および／またはＣ−末端修飾を選択することができよう。
【００７１】
本発明のペプチドは、さらに、それらのアミノ酸配列に修飾アミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣体を含みうる。
【００７２】
本発明のペプチドは、当業者に容易に知られる多様な手順によって、一般に化学合成手順および／または遺伝子工学手順によって調製することができる。
【００７３】
化学合成手順には、より詳しくは固相連続合成およびブロック合成が含まれる［５１］。固相連続手順は、自動ペプチド合成装置の使用などによる確立された自動化法を用いて行うことができる。本発明のペプチドは、また、選択的に保護された（ポリ）ペプチドフラグメントをカップリングすることによって得ることができ、このカップリングは例えば溶液中で行われる。そのペプチドは、さらに、真核および／または原核生物発現系を利用して技術者に公知の遺伝子工学技法によって製造することができる。
【００７４】
上に述べたように、コラーゲンが最も豊富に存在する成分である細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、メチルグリオキサールによる翻訳後修飾に関して大規模に研究されている。糖尿病におけるような高血糖および変化したグルコース代謝の条件下で、メチルグリオキサールの過剰生成があり、それが続いてコラーゲンの主要なアルギニン残基、具体的にはＧＦＯＧＥＲおよびＲＧＤインテグリン結合部位を修飾し、内皮細胞の剥離、アノイキスおよび血管形成阻害を発生させることが提唱されている。
【００７５】
コラーゲンは、それぞれＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＹまたはＧｌｙ−Ｚ−Ｈｙｐ［式中、ＹおよびＺは、任意の他のアミノ酸残基でありうる］のいずれかの２個の繰り返しモチーフから成る３本のポリペプチド鎖を含む。高含量のプロリンおよび／またはヒドロキシプロリンは、それらの幾何学的に束縛されたカルボキシル基および（第二級）アミノ基を有するので、個別のポリペプチド鎖が鎖内水素結合を全く形成せずに左巻きヘリックスを自然に形成する傾向を招く。したがって、コラーゲンは、それが単純な構造およびその後の高い改変潜在能を有することから、メチルグリオキサールの合成ペプチドスカベンジャーの構築のための理想的なモデルに相当する。
【００７６】
好ましい一態様では、本発明の化合物は、４個のアミノ酸の繰り返しモチーフ；グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）およびプロリン（Ｐｒｏ）（ＧＥＲＰ）に基づくＧＥＸＰモチーフ−含有ペプチドである。コラーゲンについて上に記載したように、このモチーフの多数のユニットが連結された場合、それらは、左巻きヘリックスを生じる。ＧＥＲＰモチーフ内のＡｒｇ残基は、遊離メチルグリオキサールをスカベンジングして、もっと細かに言うと遊離アミノ（ＮＨ２−）基の相互作用によって、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）を形成する活性部位および残基として見なすことができる。
【００７７】
Ａｒｇがメチルグリオキサールと最も反応性であることを確実にするために、以下の規則がその位置決めに適用された：
−  複数のユニットのＧＥＲＰが連結された場合、メチルグリオキサールと相互作用するアルギニン側鎖内の相互作用性アミノ基の両方のｐＫａを減少させるように、繰り返しモチーフ内の各アルギニンが相互に極めて近接するように（３残基の距離）、アルギニンを配置した、
−  これを容易にするために、カルボキシレート側鎖がその後のメチルグリオキサールとの反応で触媒塩基として作用することができるように、アルギニンをグルタミン酸残基の隣に配置した
−  アスパラギン酸残基は脱水に非常に感受性で環状イミド中間体を形成し、それがペプチド鎖の切断を招くおそれがあることから、複数のアスパラギン酸塩基を有するペプチドの安定性が低いという理由から、アスパラギン酸よりもグルタミン酸を選択した。
【００７８】
好ましい一態様では、ＧＥＸＰモチーフ−含有ペプチドは、合計で５０個のアミノ酸からなり、次の配列を有する：
【００７９】
【化６】
0005875190.tif 000008
【００８０】
これらのうち、４０個のアミノ酸は、ＧＥＲＰモチーフの１０個の繰り返しに相当することから、ペプチド１分子あたり合計１０個のＡｒｇ残基となる（１ｍｇのＧＥＲＰペプチド≡１．０９６×１０１５個のＡｒｇ残基）。ペプチドの長さは、第一に、Ａｒｇ残基数振り返ってスカベンジング潜在能によって、第二に相対コストおよび合成の容易さによって決定される。したがって、ペプチドが含有する１０個のアルギニン残基の選択は、これら二つの要因の間の最も効率的なバランスを表す。
【００８１】
追加的な１０個のアミノ酸の存在は、ペプチドのコア構造（１０個のＧＥＲＰモチーフ）がＮ−末端でグリシンリンカーによってＨｉｓ−タグに連結した結果である。Ｈｉｓ−タグは、スカベンジング潜在能を高めも損ないもしないが、それは実際にペプチドを血漿、血清または培地などの生理学的試料から単離することができる手段、およびプロテオーム技法によって援助される、メチルグリオキサールによる改変状態を提供およびもたらす。
【００８２】
本発明のＧＥＸＰモチーフ−含有ペプチドへのさらなる修飾には、Ｎ−およびＣ−末端の修飾、好ましくはＮ−およびＣ−末端それぞれのアセチル化および／またはアミド化が含まれる。これらの修飾は、合成の間に生成した遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端に起因する追加的な電荷を除去するために行われる。これを行うと、そのペプチドは、天然ペプチドを模倣し、細胞透過性は増加する。さらに、アミノペプチダーゼによる消化に対する安定性は高まり、シンセターゼによるさらなる修飾が阻害される。
【００８３】
メチルグリオキサールスカベンジャーおよび／またはアンタゴニストとしての化合物の使用
上に概略したように、本発明は、メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）のスカベンジャーとしての本発明の化合物を提供する。
【００８４】
上に述べたように、メチルグリオキサールおよび／またはＲＣＳは、生理系においてタンパク質残基、特にアルギニンと反応して、終末糖化産物ＭＧ−Ｈ１を形成する。図１も参照されたい。この修飾の形成は、タンパク質のコンフォメーションおよび結果としてその機能を変化させるおそれがあり、それは、メチルグリオキサールによるコラーゲンのＧＦＯＧＥＲおよびＲＧＤインテグリン結合部位における翻訳後修飾によって例示され、その修飾は、内皮細胞の剥離、アノイキスおよび血管形成阻害を招く。
【００８５】
本発明の好ましい態様としてのＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドは、メチルグリオキサールと反応してＭＧ−Ｈ１を形成する潜在能を有するが、コラーゲンとは異なり、ＧＥＸＰモチーフ−含有ペプチドのＡＧＥ修飾は、有害な結果に全く至らないであろう。それは、この合成ペプチドが主としてＧＥＸＰモチーフのせいで単にメチルグリオキサールによる修飾のための代替的で高い反応性のプラットフォームを提供するに過ぎないからである。したがって、ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチド（本発明の化合物）は、生理学的に得られたＡＧＥの形成を防止する、生理系内で内因性産生されるメチルグリオキサールのための熱力学的トラップとして見なすことができる。本発明の化合物は、同様に機能する。
【００８６】
したがって、本発明の文脈内でメチルグリオキサールの「スカベンジャー」および／またはメチルグリオキサールを「スカベンジングする」という用語は、化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）が、高分子タンパク質構造および生理学的タンパク質の上および／または中においてメチルグリオキサール（または類似の作用をする反応性カルボニル種（ＲＣＳ）などの反応性代謝物）と、タンパク質残基、具体的にはタンパク質のアルギニン残基または同様にリシン残基との相互作用を防止する潜在能を表す。それらのタンパク質には、in vitroおよびin vivoの電位開口型ナトリウムチャンネル１．８（Ｎａｖ１．８）が含まれるが、それだけに限定されるわけではない。
【００８７】
本発明の化合物は、メチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）のin vitroおよびin vivoスカベンジャーとして適する。
【００８８】
ＭＧは、アルギニンおよびリシン残基と相互作用してタンパク質の安定な翻訳後修飾を形成することが知られている（４９）。したがって本発明者らは、有毒代謝物を消失できる分子スカベンジャーを設計することにより侵害性ＭＧレベルを低下させる可能性を探った。図５ＡおよびＢに示したように、本発明者らは、本明細書記載の、ＭＧと結合させるためのアルギニン−リッチペプチドＧＥＲＰおよび類似構造であるがアルギニンを欠如する対照ペプチド（ＧＥＡＰ）を構築した。ＧＥＲＰペプチドは、１０連のグリシン、グルタミン酸、アルギニンおよびプロリンの繰り返しのせいで、遊離ＭＧをスカベンジングするために独特な装備をされている。多数のアルギニン残基の存在は、触媒塩基として作用する隣接位置のグルタミン酸残基と共同で、ＭＧのための理想的な熱力学的トラップを提供し、ＭＧ−アルグピリミジン（ＭＧ−Ａｒｇｐｙｒ）、ＭＧ由来ヒドロイミダゾレン（ＭＧ−Ｈ１）およびＮｅ（カルボキシエチル）リシン（ＣＥＬ）などのＭＧ由来ＡＧＥの形成を可能にする。ＧＥＲＰは、全身投与された場合、ＭＧの３時間前に処置された健康な野生型マウス（図６Ａ参照）だけでなく、顕性の痛覚過敏を示している８週間の糖尿病後のマウス（図６Ｃ参照）でも熱痛覚過敏をうまく阻害した。対照的に、適切な対照としてのＧＥＡＰの適用は、ＭＧ処置マウス（図６Ａ）においても糖尿病マウス（図６Ｃ）においても熱痛覚過敏に効果を有さなかった。ＧＥＲＰの単回注射（１mg）の効果は、８０時間の半減期を有し、これは、ＭＧによる翻訳後タンパク質修飾が痛覚過敏を迅速に誘導するだけでなく、痛覚過敏記憶の持続性刷り込みも構成することを示している。したがって、スカベンジャー戦略は、糖尿病性神経障害の症状の処置に新しい治療選択肢を提供する。これらのデータは、さらに、ＭＧが侵害受容プロセシングに関与するタンパク質と相互作用して熱痛覚過敏を誘導することを示す。
【００８９】
上に概要するように、本発明は、アルギニン−含有タンパク質、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン−含有（細胞性）タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８への結合のための、メチルグリオキサールの拮抗剤としての本発明の化合物を提供する。
【００９０】
本発明者らは、ＴＴＸ耐性チャンネルであって、他の類似作用チャンネルの一例として本明細書に提示された電位開口型ナトリウムチャンネル１．８（Ｎａｖ１．８；Ｓｃｎ１０ａ）のメチルグリオキサールによる修飾を見出した。したがって、ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８および他のチャンネルの機能は、メチルグリオキサールまたは類似作用をする反応性代謝物（反応性カルボニル種（ＲＣＳ）など）によってモデュレーションすることができる。本発明者らのこの発見は、例えば、糖尿病性神経障害の発生および進行についての新規なメカニズムを提供する。
【００９１】
薬学的組成物および医学的使用
上に概要したように、本発明は、本明細書に規定された少なくとも１種の化合物、好ましくは本明細書に規定された少なくとも１種のＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドと、場合により薬学的に許容されうる担体および／または賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００９２】
本発明による薬学的組成物は、本明細書記載の全ての使用および方法に非常に良く適合する。
【００９３】
「薬学的に許容されうる担体または賦形剤」は、その中でまたはそれを用いて本発明による薬学的組成物が製剤化されうる任意のビヒクルを表す。それには、リン酸緩衝食塩水などの食塩水溶液が含まれる。一般に、希釈剤または担体は、投与様式および投与経路および標準的な薬学的診療に基づき選択される。
【００９４】
上に概要するように、本発明は、さらに本発明の化合物の最初の医学的使用を提供する。
【００９５】
したがって、本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）は、疾患の診断、予防および／または治療に適することから、そのために提供される。
【００９６】
上に概要するように、本発明は、さらにある種の疾患の診断、予防および／または治療のための本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）および／または本発明のそれぞれの薬学的組成物を提供する。
【００９７】
特に、本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）および／または本発明のそれぞれの薬学的組成物は、疼痛および／または痛覚過敏の予防および／または治療に適する。
【００９８】
本明細書に使用されるような「疼痛」（および／または「痛覚過敏」）は、好ましくはメチルグリオキサールならびに／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛（および／もしくは痛覚過敏）ならびに／または疼痛および／もしくは痛覚過敏に関連する疾患／状態を表す。
【００９９】
本発明者らは、メチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）と、アルギニン（またはリシン）−含有タンパク質、好ましくは、ナトリウムイオンチャンネルなどのアルギニン（またはリシン）−含有細胞性タンパク質、例えばナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８（本明細書に記載された特徴を有するメチルグリオキサール−スカベンジング化合物）との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物が、疼痛および／または痛覚過敏のための新規で特異的な処置／治療に適することを見出したが、ここで、疼痛／痛覚過敏を発生するかまたはそれに関連する成分（すなわちメチルグリオキサール（ＭＧ）および／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ））がターゲティングされる。
【０１００】
好ましい一態様では、本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）または薬学的組成物は、疼痛および／または痛覚過敏、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏の予防および／または治療のための医薬の製造のために使用される。
【０１０１】
好ましい一態様では、その化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど)が鎮痛薬として提供される。
【０１０２】
予防および／または治療されるべき疼痛および／または痛覚過敏は、疾患に関連し、および／または疾患の経過中に発生し、その際、該疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、白内障発生、慢性腎不全ならびに慢性および急性尿毒症、嚢胞性線維症、レビー小体型認知症、糖尿病およびその合併症（腎症、神経障害および網膜症など）、虚血−再潅流、子癇前症、乾癬、リウマチ様関節炎および若年性慢性関節炎、重症敗血症、全身性アミロイドーシス、パーキンソン病、有痛性腸疾患、化学療法誘導疼痛、重症虚血肢、高血圧、骨痛、腫瘍疼痛より選択される。
【０１０３】
糖尿病において、その疾患に関連する３種の主要な主合併症の一つである神経障害は、多くの場合に、侵害刺激に対する応答性増加（痛覚過敏）ならびに通常の非侵害刺激に対する過剰応答性（異痛症）を含めた、刺激によって進展する１種または複数種の疼痛を示している患者で観察される。糖尿病患者の持続性疼痛の基礎をなすメカニズムは、ほとんど理解されていないままであり、そうであるから、発症を遅延または予防することのできる有効な治療的処置はほとんどまたは全くない。
【０１０４】
上に述べたように、メチルグリオキサールおよび関連する反応性カルボニル種（ＲＣＳ）の形成は、解糖速度および解糖中間体の存在と密接な関係がある。したがって、解糖フラックスの増加および解糖へのエネルギー依存性の増加がある条件で、メチルグリオキサールおよびＲＣＳの形成速度も増加する。これは、腎症、神経障害および網膜症などの合併症が、終末糖化産物（ＡＧＥ）の細胞レベルの増加と関係している糖尿病患者にあてはまることが示されている。糖尿病は主な研究分野であったが、ＲＣＳ、特にメチルグリオキサールが様々な疾患の進行および重症度に果たす中心的役割の新たな証拠が、目下明らかになりつつある。（表１参照）
【０１０５】
例えば、Ｎａｖ１．８のメチルグリオキサール修飾は、侵害受容ニューロンの発火を促進し、代謝痛覚過敏を発生させる：
小径線維遠位多発神経障害は、糖尿病を患うヒトの１０％に持続性の痛覚過敏および疼痛を発生させる。代謝性痛覚過敏は、反応性解糖代謝物メチルグリオキサール（ＭＧ）に基づく。血漿中濃度が６００nMを超えるＭＧは、疼痛を有する糖尿病患者と疼痛を有さない糖尿病患者を区別し、マウスにおいて熱痛覚過敏を誘発し、皮弁におけるＣＧＲＰ放出を誘導する。ＭＧで処置された培養感覚ニューロンは、ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８におけるアルギニンの強いＭＧ改変ならびに電気興奮性および膜抵抗の増加を示す。活動電位起動器に及ぼすＭＧの効果は、侵害受容ニューロンにおける発火を促進するが、Ｎａｖ１．８の発現を欠如する自律神経系のニューロンを阻害する。実験的糖尿病においてＭＧ結合性ペプチドが痛覚過敏を軽減可能であり、それゆえに有痛性糖尿病性神経障害のための最初の病原ベースの処置選択肢を提供するので、代謝的に推進される疼痛の理解は、治療的介入に有用である。
【０１０６】
ある種の代謝性疾患ではニューロン機能障害の概念が存在する。主な見通しは、（本発明者らによる）反応性代謝物ＭＧの局所蓄積にとっての主要な役割の確認であり、ＭＧは、感覚ニューロンのナトリウムチャンネルＮａｖ１．８の翻訳後修飾によって興奮性を高め、Ｎａｖ１．７を含めた他のイオンチャンネルを遮断する。代謝性痛覚過敏の概念は、神経における構造変化に依存せず、むしろＮａｖ１．８の重大な領域内でのＭＧとアルギニンおよびリシン残基との分子相互作用に依存すると思われる。この観察は、ニューロン機能に作用するために必要とされる約６００nM ＭＧという閾値と矛盾せず、それは、ヒト、マウスおよび末梢神経終末で観察された。必要とされるＭＧ閾値に到達できる可能性はいくつかある。一つは、解糖またはペントースリン酸経路のいずれかを介した、糖尿病におけるグルコースの代謝フラックスの増加である（４７）。非糖尿病条件下で、生成した偶発量のＭＧは、保護酵素、特にグリオキサラーゼ系によって解毒される。ＭＧの生成増加へと導く他の病的状態は、アセトンおよび他のケトン体が蓄積する尿毒症などの障害または脂質過酸化が発生する再潅流中の酸化ストレスなどの状態である。図７および８も参照されたい。
【０１０７】
投与経路
好ましくは、本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）または薬学的組成物の投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐剤によるより選択される。
【０１０８】
経鼻投与または経鼻適用のための好ましい一態様は、化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）にとって好都合であろう吸入薬スプレーであるが、それは、吸入薬スプレーがより迅速な作用効果を可能にするだけでなく、経口投与に起因しうる悪心または腸管もしくは肝臓での分解のいずれかからの分解も制限するからである。
【０１０９】
治療有効量
本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）または薬学的組成物は、該薬学的組成物の治療有効量の該化合物（該ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）を含むように提供される。
【０１１０】
本発明の化合物（ＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）または薬学的組成物の「治療有効量」は、処置された疾患の臨床症状における≧５０％の軽減を誘導するのに十分な量を表す。本発明の文脈内で、これには、正常の臨床パラメーターによって決定されるような、患者内の疼痛レベルにおける≧５０％の軽減が含まれるが、それだけに限定されるわけではない。
【０１１１】
好ましい治療有効量は、１０μg〜１mg/kg体重、好ましくは１０μg〜１００μgの範囲内にある。
【０１１２】
好ましい治療有効量は、それぞれの適用、および阻害、治療または予防の所望の結果に依存する。
【０１１３】
技術者ならば、適切な治療有効量を決定することができよう。
【０１１４】
スクリーニング法
本発明は、さらに、スクリーニング法、特に疼痛および／または痛覚過敏、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏に影響する化合物を同定／スクリーニングするための方法を提供する。
【０１１５】
該方法は、好ましくは
（ａ）  スクリーニングされるべき化合物を提供すること
（ｂ）  本発明による化合物（本明細書において同義のＧＥＸＰモチーフ含有ペプチドなど）を提供すること、
（ｃ）  適切な試験モデルにおいて疼痛および／または痛覚過敏の発生および／または進行に及ぼす、（ａ）のスクリーニングされるべき化合物の効果を判定すること。
を含む。
【０１１６】
当業者ならば、適切な試験モデルを決定および適用することができよう。そのような試験モデルは、以下
−  アルギニン含有タンパク質、好ましくはアルギニン含有細胞性タンパク質、より好ましくはナトリウムイオンチャンネルＮａ（ｖ）１．８、ならびに／または
−  メチルグリオキサールおよび／もしくは反応性カルボニル種（ＲＣＳ）
の一つまたは複数を含みうる。
【０１１７】
試験モデルの一例を、実施例、すなわちマウスモデルにおいて説明する。
【０１１８】
そのような試験モデルにおいて、被験化合物は、メチルグリオキサールおよび／または別の反応性カルボニル種（ＲＣＳ）との結合について本発明の化合物と競合する可能性がある。
【０１１９】
好ましくは、本発明の化合物は、スクリーニングされるべき化合物の検出および決定を可能にする適切なタグおよび／またはラベルを含む。
【０１２０】
本発明は、さらに、上記スクリーニング法において同定された化合物を提供する。
【０１２１】
これらの化合物は、疼痛および／または痛覚過敏に、特にメチルグリオキサールおよび／または反応性カルボニル種（ＲＣＳ）によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および／または痛覚過敏に影響を及ぼすために適する。
【０１２２】
以下の実施例および図面は、本発明を例示するが、本発明をそれに限定することはない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】メチルグリオキサール（ＭＧ）および終末糖化産物（ＡＧＥ）の形成を示す図である。
【図２Ａ】Ｎａｖ１．８の糖化ホットスポットの分子モデル化を示す図である。（Ａ）レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を規定する電位開口型ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８についての疎水性モーメントプロット。この領域内に入る全ての残基、特にリシン（青色）およびアルギニン（緑色）残基は、糖化様反応に関与する潜在能を有する。
【図２Ｂ】Ｎａｖ１．８の糖化ホットスポットの分子モデル化を示す図である。（Ｂ）電位開口型ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８のサブユニット構造。ＲＤＢドメインに基づき、糖化されうるＮａｖ１．８の構造内に位置する１１個のアルギニン残基および１０個のリシン残基がある。
【図２Ｃ】Ｎａｖ１．８の糖化ホットスポットの分子モデル化を示す図である。（Ｃ）電位開口型ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８の糖化「ホットスポット」である１１個のアルギニン残基を示すが、ここで、それらのアルギニン残基は、関連する構造に近接する。
【図３Ａ】ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８が炎症性および神経障害性疼痛の原因となることを示す図である。（Ａ）Ｎａｖ１．８の不活性化ゲート、
【図３Ｂ】ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８が炎症性および神経障害性疼痛の原因となることを示す図である。（Ｂ）ナトリウムチャンネル：メカニズムと活動電位、
【図３Ｃ】ナトリウムチャンネルＮａｖ１．８が炎症性および神経障害性疼痛の原因となることを示す図である。（Ｃ）アルギニン残基の翻訳後修飾はＮａｖ１．８の閉鎖を阻害する。
【図４Ａ】痛覚過敏に外因性メチルグリオキサールが及ぼす効果を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）Ｎａｖ１．８はＰＣ１２細胞においてＭＧ由来付加物によって翻訳後修飾される：ＰＣ１２細胞（≧２０×１０６個細胞）を４０mMグルコースまたはＭＧ（５０、２００および５００μＭ）で３時間（Ａ）または４μＭの細胞透過性グリオキサラーゼ−Ｉ阻害剤Ｓ−ｐ−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルでそれぞれ４８時間および７２時間処置し（Ｂ）、その後、膜画分を調製し、Ｎａｖ１．８に対する抗体を使用して免疫沈降させた。次に、ＭＧ由来ＡＧＥについて免疫沈降物の免疫ブロットを行った。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図４Ｂ】痛覚過敏に外因性メチルグリオキサールが及ぼす効果を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）Ｎａｖ１．８はＰＣ１２細胞においてＭＧ由来付加物によって翻訳後修飾される：ＰＣ１２細胞（≧２０×１０６個細胞）を４０mMグルコースまたはＭＧ（５０、２００および５００μＭ）で３時間（Ａ）または４μＭの細胞透過性グリオキサラーゼ−Ｉ阻害剤Ｓ−ｐ−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルでそれぞれ４８時間および７２時間処置し（Ｂ）、その後、膜画分を調製し、Ｎａｖ１．８に対する抗体を使用して免疫沈降させた。次に、ＭＧ由来ＡＧＥについて免疫沈降物の免疫ブロットを行った。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図４Ｃ】痛覚過敏に外因性メチルグリオキサールが及ぼす効果を示す図である。（Ｃ）後根神経節における膜タンパク質のＭＧ改変：脊髄の腰部および胸部領域におけるＤＲＧを対照およびＭＧ処置（７０μM；ｉ．ｖ．、３時間）されたWistarラットから収集した。膜画分を調製し、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．７、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＡ１に対する抗体を使用して免疫沈降させた。次に、ＭＧ由来ＡＧＥを検出する抗体を用いて、ウエスタンブロットによって免疫沈降物を分析した。
【図４Ｄ】痛覚過敏に外因性メチルグリオキサールが及ぼす効果を示す図である。（Ｄ）外因性メチルグリオキサールはin vivoで熱痛覚過敏を誘導する：異なる濃度のＭＧを０．９％ ＮａＣｌ溶液として健康な雄性野生型マウス（１０〜１２週）にi.v.注射することによって投与した。対照マウスには０．９％ ＮａＣｌだけを注射した。適用の３時間後に、熱痛覚過敏をホットプレートアッセイによって評価した（下）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）を表す。
【図４Ｅ】痛覚過敏に外因性メチルグリオキサールが及ぼす効果を示す図である。（Ｅ）外因性メチルグリオキサールが痛覚過敏に及ぼす効果：健康な野生型マウスおよびＮａｖ１．８−／−マウスにおいてホットプレートアッセイによって測定されたときの、外因性メチルグリオキサールが痛覚過敏に及ぼす効果。マウスをメチルグリオキサール（i.v.、７０μM）で処置した。痛覚過敏および足の引っ込めを注射の３時間後に評価した。データは、平均±ＳＤ（Ｎ＝５〜６）を表す。野生型（＋ＭＧ）に対して、＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳＰ＞０．０５。
【図５Ａ】Ｎａｖ１．８とのＭＧの結合に拮抗するアルギニン含有スカベンジングペプチドの設計を示す図である。メチルグリオキサールの効果的なin vivoスカベンジャーとして作用する、１分子あたり１０個のアルギニン残基を含む合成ペプチドＧＥＲＰ００１を設計した。（Ａ）本発明によるＧＥＸＰまたはＧＥＲＰモチーフを含むペプチドの好ましい一態様の一般構造（上部）およびその例（下部）、
【図５Ｂ】Ｎａｖ１．８とのＭＧの結合に拮抗するアルギニン含有スカベンジングペプチドの設計を示す図である。メチルグリオキサールの効果的なin vivoスカベンジャーとして作用する、１分子あたり１０個のアルギニン残基を含む合成ペプチドＧＥＲＰ００１を設計した。（Ｂ）ＧＥＲＰおよび対照ペプチド（ＧＥＡＰ）の一次アミノ酸配列。
【図６Ａ】糖尿病誘導性痛覚過敏にメチルグリオキサールスカベンジングペプチド（ＧＥＸＰ）が及ぼす効果。（Ａ）ＧＥＲＰペプチドのメチルグリオキサールスカベンジング潜在能：健康な野生型マウス（１０〜１２週）にメチルグリオキサール（ＭＧ；７０μM）を注射する３０分前に１mg ＧＥＲＰ（≡１．０９６×１０１５個のＡｒｇ残基）または対照ペプチドＧＥＡＰをi.p.注射した。痛覚過敏は、i.p注射の３時間後にホットプレートアッセイによって評価した。データは、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝１０）を表す。ＧＥＲＰは、健康な野生型マウスにおいてメチルグリオキサール誘導性痛覚過敏を約６０％減少させたが、一方で対照ペプチドは効果を有さず、メチルグリオキサールのスカベンジングが痛覚過敏を軽減したことを示している。
【図６Ｂ】糖尿病誘導性痛覚過敏にメチルグリオキサールスカベンジングペプチド（ＧＥＸＰ）が及ぼす効果。（Ｂ）メチルグリオキサールスカベンジングペプチド（ＧＥＲＰ）が糖尿病誘導性痛覚過敏に及ぼす効果：グラフに、ＧＥＲＰを用いた処置が中止された後の時点についてのデータを示す。＋２４時間時点についてのデータを０として採用した。回帰分析に基づくと、ＧＥＲＰの生理学的半減期は約８０時間である。データは、平均±ＳＤ（Ｎ＝４〜６）を表す。
【図６Ｃ】糖尿病誘導性痛覚過敏にメチルグリオキサールスカベンジングペプチド（ＧＥＸＰ）が及ぼす効果。（Ｃ）ＧＥＲＰおよびＧＥＡＰが糖尿病誘導性痛覚過敏に及ぼす効果：糖尿病性野生型マウス（雄；１８週）に１mgのＧＥＲＰまたはＧＥＡＰのいずれかをi.p注射した。いずれかのペプチドで１日処置後に、処置を中止し、その後、痛覚過敏の継続測定を行って、ペプチドの生物学的半減期を決定した。これは、約８０時間と決定された。データは、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝１０）を表す。それぞれの時点でＧＥＲＰまたはＧＥＡＰ対照に対して、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳＰ＞０．０５；０日目に対して、ｏｏｏＰ＜０．０００１、ＮＳＰ＞０．０５。ＧＥＲＰペプチドの生物学的に有効な半減期（すなわち治療効果を５０％低下させるために要する時間）は、予備実験に基づき約１３時間と推定され、指数崩壊にデータをあてはめることによって計算した（Ｒ２＝０．９７３４）。ＧＥＲＰペプチドの治療潜在能の妥当性を確認した最初の実験を繰り返した後に、ＧＥＲＰペプチドの生物学的に有効な半減期を再度計算した。データは、指数崩壊にあてはめられず（Ｒ２＜０．５００）、線形崩壊モデルによって最もよく説明された（Ｒ２＝０．９９７２）ことが見出され、線形崩壊モデルは、約８０時間の推定される生物学的に有効な半減期を与えた。
【図６Ｄ】糖尿病誘導性痛覚過敏にメチルグリオキサールスカベンジングペプチド（ＧＥＸＰ）が及ぼす効果。（Ｄ）糖尿病（上）および糖尿病誘導性痛覚過敏（下）においてメチルグリオキサールスカベンジングペプチド（ＧＥＲＰ）および対照ペプチド（ＧＥＡＰ）が血漿メチルグリオキサールに及ぼす効果。顕性の痛覚過敏（０日）を示している８週の糖尿病雄性野生型マウス（１８週齢）に１mgのＧＥＲＰまたはＧＥＡＰのいずれかのi.p.注射を受けさせた。いずれかのペプチドで１日処置後に、処置を中止し、その後に継続的なホットプレートアッセイ測定を行って、ＭＧスカベンジングが糖尿病誘導性熱痛覚過敏に及ぼす効果を決定した。選択されたマウスを各時点で屠殺し、血漿をＭＧのために単離し、ＭＧを１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼンによる誘導体化およびＨＰＬＣ分析によって決定した。データは、平均±ＳＥＭ（各時点あたりｎ＝３）を表す。
【図７Ａ】症候性糖尿病性神経障害の患者においてメチルグリオキサールの血漿中レベルが増加していることを示す図である。（Ａ）重症症状を有する糖尿病患者の血漿中で増加している可溶性メディエーターを同定している分析クロマトグラムの例：標準ジカルボニル（上）ならびに軽症（中）および重症症状（下）を有する患者からの血漿試料の分析ＨＰＬＣ。健康対象のクロマトグラムを淡い灰色の線として挿入する。血漿試料中のグルコース由来可溶性反応性ジカルボニル代謝物の、ＨＰＬＣに基づく特徴づけによると、健康な対照（黒線下側の灰色の線）に比べて糖尿病患者（黒線）の方が高いジカルボニルレベルを示した。
【図７Ｂ】症候性糖尿病性神経障害の患者においてメチルグリオキサールの血漿中レベルが増加していることを示す図である。（Ｂ）軽症（黒）および重症症状（白）を有する２型糖尿病患者におけるＭＧの血漿中濃度。灰色点線は、約６００nMのＭＧ閾値濃度を示す。データは、平均±ＳＥＭ（１群あたりｎ＝１０）を表す。患者におけるＭＧ血漿レベルをＨＰＬＣによって決定した場合、症状の不在または存在に応じて高度に有意な差が観察された。症状を有さない患者におけるＭＧレベルは平均５３１±４６nMであった一方で、重症感覚異常の患者は、８９５±５５nMのＭＧ血漿中レベルを示した（ｐ＜０．０００１）。これは、疼痛を誘導するためにＭＧに一定の増加が必要なことを意味し、それを超えると症状が発生する、事象のカスケードが活性化される閾値ＭＧレベルが必要であることを示している。
【図８Ａ】外因性メチルグリオキサールは、in vivoで熱痛覚過敏を誘導することを示す図である。（Ａ）健康な雄性野生型マウス（１０〜１２週齢）における細胞透過性阻害剤Ｓ−ｐ−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルによるグリオキサラーゼＩの阻害。０日目に阻害剤の適用前に痛覚過敏をホットプレートアッセイによって評価した。その後、選択された時点で熱痛覚過敏（黒丸）の継続評価を行い、その時点で一部のマウスの屠殺も行い、ＭＧ濃度（白丸）を決定するために血漿を単離した。データは、平均±ＳＤ（１時点あたりｎ＝３）を表す。異なるアプローチを利用してＭＧ／グリオキサラーゼ系が痛覚過敏に及ぼす仮説上の閾値依存性効果を検証した。第一に、中心的で律速性のＭＧ−解毒酵素グリオキサラーゼＩの細胞透過性阻害剤（Ｓ−ｐ−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステル）を２日毎に健康なＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに注射した。この処置は、血漿ＭＧ濃度（白四角）における時間依存的な増加を招いた。連続的な阻害剤投与の３日後にグリオキサラーゼ−Ｉ酵素活性が完全に阻害されるやいなや、ＭＧ濃度は増加した。これは、熱痛覚過敏（黒丸）における増加と平行した。処置の開始から６日後に、顕著な熱痛覚過敏が明らかとなったが、ＭＧの血漿中濃度は６００nMを超え、この濃度は灼熱痛およびピリピリした感覚異常を有する患者において測定されたＭＧの血漿中濃度に匹敵する。
【図８Ｂ】外因性メチルグリオキサールは、in vivoで熱痛覚過敏を誘導することを示す図である。（Ｂ）５μg（７０μmol）のＭＧを０．９％ ＮａＣｌ溶液として健康な雄性野生型マウス（１０〜１２週齢）にi.v.注射によって投与し、ＭＧの血漿中濃度を０時間、１０分、３０分、１時間および３時間の時点でＨＰＬＣによって決定した。データは、平均±ＳＤ（１時点あたりｎ＝３）を表す。上昇したＭＧレベルが痛覚過敏を直接誘導できることを確認するために、５μg（７０μmol）のＭＧを健康な野生型マウスにｉ．ｖ．注射によって投与した。これは、１０分以内に血漿ＭＧレベルの８００nMを超える濃度への即時増加を招いた（データは示さず）が、その濃度は、重症症状を有する患者でも見られた濃度であった。血漿ＭＧレベルは短時間で正常に戻ったが、ＭＧの全身投与は、ホットプレートによって評価されたように、ＭＧ注射の３時間後に明らかになった熱痛覚過敏の有意で用量依存的な誘導を引き起こした（図８Ｂ、Hargreaves試験（データは示さず）およびテールフリック試験（データは示さず）。最も重要には、ＭＧ適用後の用量依存性痛覚過敏は、血漿中ＭＧレベルが１５分で６００nMを超えた場合に限り発生し（図８Ｂ）、この濃度は、代謝性痛覚過敏を誘導するための閾値濃度を示唆している。痛覚過敏を招くＭＧ誘導性変化が３時間を超えて、そしてＭＧレベルが正常に戻った時点に持続したことから（データは示さず）これらのデータは、ＭＧによる用量依存性共有結合性タンパク質改変が熱痛覚過敏へと導く開始要因であることを示している。
【０１２４】
実施例
方法
マウスモデル
マウスは、１２時間／１２時間の明暗サイクルで、餌および水を自由摂取させて個別に飼育した。この研究の手順は、ドイツのチュービンゲンおよびカールスルーエ行政管区庁の動物実験委員会によって承認された。
【０１２５】
ＳＴＺを用いた糖尿病の誘導
糖尿病は、無菌クエン酸ナトリウム（０．０５Ｍ、ｐＨ４．５）に新鮮溶解された６０mg/kgのＳＴＺの連続６日間ｉ．ｐ．投与によって誘導した。対照動物には、クエン酸ナトリウムのみを与えた。糖尿病は、１６〜２５日後に尾静脈からの試料の血中グルコースレベルを、ACCU-CHEKグルコーススティックおよび従来のAccutrendグルコメーターを用いて測定することによって検証した。糖尿病の発症から最初の２週間に、血中グルコースを毎日測定した。ときとしてグルコースレベルが回復した場合、追加的なＳＴＺ注射を２５〜２７日目に行った。９０％を超えるマウスが最初の４週間以内に糖尿病になり、それを実験全体にわたり使用した。血中グルコースが３００mg/dlを超えて増加するやいなや、１〜２ＵのインスリンSemilenta（４０U/ml）の個別の補給を開始した。ひとたびグルコースレベルが安定になったならば、最初の２か月間は少なくとも週に１回、その後は２週間毎に血中グルコースを決定した。厳しい血中グルコースのコントロールは、実験全体にわたり個別の血中グルコースレベルを安定に保った。実験の終わりにマウスをＣＯ２で屠殺し、両方の坐骨神経を解剖し、秤量し、液体窒素中で急速凍結させた。
【０１２６】
ＤＲＧ細胞の単離および神経節細胞の培養
Ｌ１−Ｌ６後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの単離および培養は、StuckyおよびLewin［３９］によって記載されたように行った。簡潔には、ＤＲＧを切除し、根および膜を取り出し、カルシウムおよびマグネシウム不含の無菌ＰＢＳ中に入れた。神経節を収集し、１０％ウマ血清、２％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、１％ Ｌ−グルタミンおよび０．８％ Ｄ−グルコース（w/v）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１、v/v）中に再懸濁した。０．１％コラゲナーゼを添加し、組織を３７℃で４５分間インキュベーションした。０．０５％トリプシンを含有する成長培地中で組織を３７℃でさらに４５分間インキュベーションした。次に、先端熱加工したパスツールピペットを通過させるトリチュレーションによって個別の細胞を解離させた。２５０ｇで５分間遠心分離後に、結果として生じたペレットを成長培地中で２回洗浄した。最終的に、マウス神経成長因子（１００ng/ml）を補充したポリ−Ｌ−オルニチン（１μg/ml）およびラミニン（２５μg/ml）を予めコーティングしておいた６ウェルプレートまたはカバーガラスのいずれかの上に、細胞を直ちに蒔いた。５％ ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター中で細胞を維持した。２４時間のインキュベーション後に、培地にシトシンアラビノシド（１０μM)を補充し、さらに１２時間インキュベーションし、その後７０〜８０％の集密度に達するまで２日毎に培地を交換した。
【０１２７】
痛覚過敏の測定
痛覚過敏は、電子コントロールされたホットプレート痛覚消失測定装置（Columbus Instructments, Columbus, Ohio）を用いたホットプレートアッセイで５０℃で検討した［４０，４１］。ジャンプ逃避応答が起こったときもしくは後足を舐めたとき、または６０秒の最大カットオフ時間が経過後に、各マウスをホットプレートから出した。マウスが最初の不快の徴候（後ろ足を上げる、舐める、または振り回す、およびジャンプする）を示すまでの潜時を二人の研究者が記録した。特定時点のそれぞれで動物毎に三つの測定値を採用し、平均した。対照と処置動物の間の潜時の差を痛覚過敏の尺度として計算した。
【０１２８】
マウスの足引っ込めの潜時もHargreaves装置（Ugo, Basile, Italy）を使用して測定した［４２］。この装置のカットオフ時間を、強度６０で３３秒に予備設定した。簡潔には、各マウスを試験用の囲いに入れ、測定を行う前に順応時間（約３０分）を見込んだ。交互の後足を使用して各動物で足引っ込めの潜時の３回の測定を行った。各試行は５分の間隔を開け、皮膚損傷および皮膚侵害受容器の感受性変化の可能性を減少させた。ホットプレートアッセイについて、マウスが不快の最初の徴候を示すまでの潜時を記録し、対照と処置動物の間の潜時の差を決定した。
【０１２９】
ＲＮＡの抽出および定量リアルタイムＰＣＲ
総ＲＮＡは、坐骨神経からTrizol（Invitrogen）を使用して、そして培養ＤＲＧからRNeasyミニキット（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して製造業者の説明書に従って抽出した。坐骨神経またはＤＲＧのいずれかからの合計２μgの総ＲＮＡを１μgのオリゴｄ（Ｔ）（Promega, Heidelberg, Germany）と６５℃で１０分間アニーリングさせ、次に、１５ユニットのトリ骨髄芽球症逆転写酵素（Promega, Heidelberg, Germany）を用いて４２℃で１時間逆転写のために使用した。ｃＤＮＡを直ちに使用するか、または−８０℃で保存した。リアルタイムＰＣＲをLightCycler（Roche, Mannhiem, Germany）で行った。２μlのｃＤＮＡを適切なプライマー（５pmol）およびSYBR Green試薬（Roche, Mannhiem, Germany）と混合し、最終体積を２０μlとした。使用したプライマーを表１にまとめる。サイクリング条件は、（９５℃、１０分）；（９５℃、１０秒；５７℃、５秒；７２℃、５秒）×４５回；（６５℃、１５分）であった。予想されるＰＣＲ産物は約１８０bpであった。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
総タンパク質抽出物の調製
坐骨神経について、液体窒素を使用して凍結組織試料を微粉末になるまで粉砕した。氷冷した溶解緩衝液（１０mM ＨＥＰＥＳ；１０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ２、１mM ＥＤＴＡ、０．６％ ＮＰ４０、０．５mM ＤＴＴ、０．２mM ＰＭＳＦ；ｐＨ７．９）中でホモジェネートを再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。次に組織ホモジェネートをボルテックスで撹拌し、遠心分離（１４０００rpm；１０分；４℃）し、分析のために上清を確保した。
【０１３２】
培養ＤＲＧについて、氷冷した０．９％ ＮａＣｌで細胞を２回洗浄し、氷上で１０分間インキュベーションしてから細胞を完全にかき取り、遠心分離（２５００rpm；１０分；４℃）によって収集した。細胞ペレットを０．１５mlの氷冷した溶解緩衝液（１００mMリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．５mM ＤＴＴ、０．２mM ＰＭＳＦ；ｐＨ７．４）中に再懸濁し、超音波処理（８０％；３×１５秒）によって溶解させた。次に、細胞ホモジェネートを遠心分離し（１４０００rpm；１０分；４℃）、分析のために上清を確保した。細胞および組織ホモジェネートについてのタンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを使用したBradfordアッセイによって決定した［４３］。
【０１３３】
グリオキサラーゼＩ活性のアッセイ
グリオキサラーゼＩ活性は、Ｓ−Ｄ−ラクトグルタチオンの形成によって発生する２４０nmでの吸光度の変化初速度をモニターする分光測定法を使用することによって決定した［４４］。ヘミチオアセタールからＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンへの変換について、モル吸光係数の変化は、Δε２４０＝２．８６mM-1cm-1である。標準アッセイ混合物は、リン酸ナトリウム緩衝液（５０mM、ｐＨ６．６、３７℃）中に２mMメチルグリオキサールおよび２mM ＧＳＨを含有した。反応混合物を１０分間放置させてから、細胞内可溶質タンパク質画分（２０μg）を添加してヘミチオアセタール形成が確実に平衡になるようにした。
【０１３４】
血漿中メチルグリオキサールの測定
マウス血漿試料中のメチルグリオキサール濃度は、以前に記載された方法を使用して１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼンを用いた誘導体化によって決定した［４５−４７］。屠殺時に球後血管から血液試料を抜き取り、ＥＤＴＡが入ったチューブに入れ、遠心分離（２０００ｇ；５分）した。血漿を取り出し、１０％ＴＣＡ（０．１ml）で酸性化した、試料を直ちに分析するか−８０℃で保存するかのいずれかとした。
【０１３５】
ウエスタンブロット
坐骨神経または培養ＤＲＧからの総タンパク質抽出物（２０μg）をLaemmliローディングバッファー中、９５℃で５分間インキュベーションし、１０％トリス−グリシンアクリルアミドゲル上にて変性条件下で分離し、ニトロセルロースメンブランに移行させ、５％脱脂粉乳を用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、メンブランを、ＰＢＳ含有０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）に入れた５％脱脂粉乳中でヤギポリクローナル抗グリオキサラーゼＩｇＧ抗体（１：５００希釈）（Santa Cruz, Santa Cruz, USA）と共にさらに１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、メンブランを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型ロバ抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：１０００）（Santa Cruz, Santa Cruz, USA）と共に４５分間インキュベーションした。ＥＣＬ検出試薬を製造業者の説明書に従って使用して、約１０分の照射時間で免疫反応性タンパク質をＸ線フィルム上に視覚化した。
【０１３６】
免疫組織化学検査
抽出および単離後に、ＤＲＧを高血糖条件（３０mMグルコース）下、カバーガラップ上で３日間培養し、グリオキサラーゼＩに関して染色した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後４％パラホルムアルデヒド中で固定した。スライドを３％過酸化水素のメタノール溶液中、室温で５分間処理した。ブロッキングは、３％正常ウマ血清を用いて室温で３０分間行ってから、マウス抗グリオキサラーゼモノクローナル抗体（SouthWestern Med. School, Dallas, USA）を一次抗体（１：１５０）として使用した。スライドをＰＢＳで３回２分間洗浄し、シグナルの検出は、マウスＩｇＧ用Vectastain ABCキット（Vector Laboratories Inc., Burlingham, CA, USA）を製造業者の説明書に従って使用して行った。ペルオキシダーゼ活性は、０．０５％ ３，３−ジアミノベンジジン−四塩酸（Vector Laboratories Inc.）を用いて視覚化してから、スライドをMayerのヘマトキシリン（Vector Laboratories Inc.）で対比染色した。坐骨神経組織もグリオキサラーゼＩについて染色した。組織を４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定した。凍結切片（４μm）を作製し、それに続くスライドを上記のように処理したが、例外として、使用した一次抗体は、ヤギ抗グリオキサラーゼポリクローナル抗体（Santa Cruz, Santa Cruz, USA）であり、シグナルの検出は、ヤギＩｇＧ用Vectastain ABCキット（Vector Laboratories Inc.）を使用して行った。一次抗体を省略し、それをＰＢＳに置き換え、血清濃度を一致させることによって、免疫特異性についての対照を全ての実験に加入させた。染色強度は以下のスコアに従って求めた：０、染色陰性；１、弱い染色強度；２、中等度の染色強度；３、強い染色強度。
【０１３７】
in vivoメチルグリオキサール処理
様々な濃度のメチルグリオキサール（０．７μM〜７００μM）を０．９％ ＮａＣｌ溶液として静脈内注射することによって、健康な野生型マウス（雄；１０〜１２週）を処置した。対照群には０．９％ ＮａＣｌ溶液を注射した。３時間のインキュベーション時間の後に痛覚過敏を評価した。
【０１３８】
体細胞遺伝子導入によるグリオキサラーゼＩのin vivo過剰発現
全長マウスグリオキサラーゼＩ ｃＤＮＡをサイトメガロウイルスプロモーターのコントロール下でｐＣＭＶ６−Ｎｅｏ発現ベクターにクローニングした。ｐＧＬ３−ルシフェラーゼベクターを対照として使用した。１．５μg/g濃度のベクターまたはＧＬＯ１プラスミドＤＮＡを１５０μlのリポソームトランスフェクション試薬（ＤＯＴＡＰ; Roche, Mannheim, Germany）中で懸濁し、室温で１５分間インキュベーションしてから、野生型（雄；１８〜２０週）マウスに４日毎に合計１０日間腹腔内注射することによって投与した。注射前に痛覚過敏を測定した。実験の終了時に、全てのマウスを屠殺し、メチルグリオキサール濃度の決定のために血漿を単離した。
【０１３９】
グリオキサラーゼＩのin vivo阻害
健康な野生型マウス（雄；１０〜１２週）を５０μg/g（i.p）の細胞透過性グリオキサラーゼＩ阻害剤Ｓ−ｐ−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルで４８時間、前処置した。４８時間後に痛覚過敏を評価した。次に、マウスを２日毎に１５日間処置し、その間に痛覚過敏の継続評価を行った。選択された時点でマウスを屠殺し、メチルグリオキサール濃度の決定のために血漿を単離した。
【０１４０】
電位開口型ナトリウムチャンネルの阻害
健康な野生型マウス（１２週；雄）に９０分間静脈内注射することによってメチルグリオキサール（７０μM）を投与し、その後に皮下注射によるテトロドトキシン（ＴＴＸ；５〜７．５ng/g）または経口投与によるアンブロキソール（ＡＭＸ；１％メチルセルロース中に５００μg/g）のいずれかでマウスを処置した。追加的な９０分後に、痛覚過敏を評価した。アンブロキソールが糖尿病誘導性疼痛に及ぼす効果を判定するために、前記のように糖尿病野生型マウス（１８週、雄）にアンブロキソールを投与した。投与の前および後（３時間）に痛覚過敏を測定した。
【０１４１】
in vivo ｓｉＲＮＡ処置
マウス電位開口型ナトリウムチャンネル１．８、１．９（それぞれＳｃｎ１０ａおよびＳｃｎ１１ａ）についての設計済みｓｉＲＮＡであるＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１は、Ambion（登録商標）（Applied Biosystems）から購入した。濃度１．５μg/gのｓｉＲＮＡを１５０μlのリポソームトランスフェクション試薬（ＤＯＴＡＰ; Roche, Mannheim, Germany）中に懸濁し、室温で１５分間インキュベーションしてから、健康な野生型マウス（雄；１０〜１２週）に静脈内注射によって３日毎に１０日間投与した。１０日目に、マウスにメチルグリオキサール（７０μM）または対照としてのＰＢＳのいずれかを注射した。３時間後に、痛覚過敏を評価し、マウスを屠殺した。処置されたマウスのノックダウンを確認するために、坐骨神経およびＤＲＧを取り出し、前記のように総ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１４２】
メチルグリオキサールのin vivoスカベンジング
メチルグリオキサールの効果的なin vivoスカベンジャーとして作用する、１分子あたり１０個のアルギニン残基を含有する合成ペプチドＧＥＲＰ００１を研究室内で設計し、合成した（GenWay Biotech, Inc. San Diego, CA, USA）。健康な野生型マウス（雄；１０〜１２週）に、０．９％ ＮａＣｌ（対照）またはメチルグリオキサール（７０μM）のいずれかを注射する３０分前に１mgのＧＥＲＰ００１または（アルギニン残基をアラニンに代えた）対照ペプチドＧＥＡＰのいずれかを腹腔内注射した。メチルグリオキサールを投与した３時間後に痛覚過敏を評価した。ＧＥＲＰが糖尿病誘導性痛覚過敏に及ぼす効果を判定するために、ＳＴＺ誘導性糖尿病の野生型マウス（雄；１８週）に１mgのＧＥＲＰ００１またはＧＥＡＰのいずれかを腹腔内注射した。２４時間後に、ホットプレートアッセイによって痛覚過敏を評価した。
【０１４３】
免疫沈降（ＩＰ）およびウエスタンブロット分析
ＰＣ１２細胞を１７５cm2培養皿に蒔き、１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清および１％ストレプトマイシン／ペニシリン溶液を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。細胞をＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養し続けた。ひとたび細胞が集密状態（約２０×１０６個）に達したならば、細胞を３０mM Ｄ−グルコースまたはメチルグリオキサール（５０〜５００μM）で３時間またはグリオキサラーゼＩ阻害剤（４μM）で２４〜７２時間処理した。
【０１４４】
メチルグリオキサール（７０μM）を０．９％ ＮａＣｌ溶液として静脈内注射することによって健康な野生型Sprague-Dawleyラット（１２週；雄）を処置した。対照群に０．９％ ＮａＣｌ溶液を注射した。３時間後に、ラットをＣＯ２で屠殺し、Ｌ４−Ｌ５腰部ＤＲＧを取り出し、直ちに処理するか、または液体窒素中で急速凍結させるか、または−８０℃で保存するかのいずれかとした。
【０１４５】
組織試料および細胞試料の両方をガラス製ダウンス型の氷冷溶解緩衝液（０．３Ｍスクロース、１０mM Ｔｒｉｓ、２mM ＥＤＴＡ；ｐＨ８．１）中で３０μl/mg細胞でホモジェナイズした。ホモジェネートを氷上に１時間放置してから遠心分離し（２５００rpm、４℃、７分）、核およびインタクトな細胞を除去した。次に、ペレットを再ホモジェナイズし、同条件で再びスピンさせた。２回の低速スピンからの上清を合わせ、４５，０００rpmで、４℃で２時間遠心分離した。膜総画分を含むペレットを０．２Ｍ ＫＣｌおよび１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で再懸濁した。次に、等体積の５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００および１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の添加によって膜を可溶化し、その懸濁液を氷上で１時間放置した。不溶性の物質を１２０００rpmで、４℃で１０分間遠心分離することによってペレットにし、可溶性物質を保持し、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイによって決定した［４３］。
【０１４６】
膜粗画分（５００μg）を正常血清＋プロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズ（Santa Cruz, Santa Cruz, USA）によって１時間予備透明化し、５μgの、Ｎａｖ１．８に対する抗体（Sigma, St. Louis, Missouri, USA）、ＴＲＰＡ１に対する抗体またはＴＲＰＶＡに対する抗体（Santa Cruz, Santa Cruz, USA）のいずれかと共に上清を４℃で一晩静かに撹拌しながら免疫沈降させた。プロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズ（Santa Cruz, Santa Cruz, USA）を添加し、さらに６時間インキュベーションした。ビーズを遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間、４℃）によって収集し、２０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、０．２％ ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１mM ＰＭＳＦ、１U/mlアプロチニンを含む緩衝液で３回洗浄した。変性緩衝液（１２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％ ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％β−メルカプトエタノール；ｐＨ６．８；５０μl）中、９５℃で１０分間インキュベーションすることによって、タンパク質をアガロースビーズから放出させた。ビーズを遠心分離によって収集し、結果として生じた上清を保持し、さらなる分析のために−８０℃で保存した。
【０１４７】
ドットブロットまたはウエスタンブロット分析のいずれかにより免疫沈降物を分析した。ドットブロット分析のために、２μlの免疫沈降物をニトロセルロースメンブランにブロッティングし、５％脱脂粉乳で、室温で１時間ブロッキングした。次に、ＰＢＳ含有０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）に入れた５％脱脂粉乳中で、メチルグリオキサール誘導体化ＡＧＥ（BioLogo, Kronshagen, Germany）、Ｎａｖ１．８、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のいずれかに対する抗体（１：５００）と共に室温で４５分間メンブランをインキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型二次抗体（１：１０００; Santa Cruz, Santa Cruz, USA）と共に室温で１時間メンブランをインキュベーションした。ＥＣＬ−検出試薬を製造業者の説明書に従って使用して、免疫反応性タンパク質をＸ線フィルム上に約５分の照射時間で視覚化した。ウエスタンブロット分析のために、免疫沈降物を４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロースメンブランに移行させた。メチルグリオキサール改変タンパク質の視覚化は、メチルグリオキサール由来ＡＧＥに対する抗体（BioLogo, Kronshagen, Germany;１０μg）を使用して、One-Step（商標）Complete IP-Western Kit（GeneScript Corp, NJ, USA）を製造業者の説明書に従って使用して達成した。免疫反応性タンパク質は、ＥＣＬ−検出試薬を製造業者の説明書に従って使用してＸ線フィルム上に約１０分の照射時間で視覚化した。
【０１４８】
分子モデリング
ヒト、ラットおよびマウス由来のＮａｖ１．８におけるメチルグリオキサール改変の有望な部位を決定するためのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）分析。簡潔には、Ｎａｖ１．８についてのアミノ酸配列（アクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｙ９、ヒト；アクセッション番号Ｑ６２９６８、ラット；アクセッション番号Ｑ６ＱＩＹ３、マウス）をUniProtKB/Swiss-Protデータベース（http://www.expasy.org）から得た。残基の疎水性をProtscale（http://us.expasy.org/tools/protscale.html）を使用して計算し、Embosswin（http://perso.wanadoo.fr/ablavier/embosswin/embosswin.html）を使用して平均疎水性モーメントを計算した。疎水性および平均疎水性モーメントの値の両方を配列番号と共にアライメントし、疎水性対平均疎水性モーメントのプロットを生成させ、Galletら［４８］によって記載されたように区分した。次に、ＲＢＤ内に見出されたアルギニンおよびリシン残基をメチルグリオキサールによる改変についての潜在的ホットスポットとしてクローズアップした。残基のｐＫａにおける差に基づきより高い改変潜在能を有するアルギニンおよびリシン残基を同定する試みは、不可能であった。それは、Ｎａｖ１．８についての結晶構造がたとえ入手可能であっても不完全であったからである。その代わりに、メチルグリオキサールと最も反応性のアルギニンおよびリシン残基は、双方の相互作用性アミノ基のｐＫａを減少させる近接したアルギニンおよびリシン残基を有する残基であって、配列のもう一方の側に塩基触媒として作用するグルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシレート側鎖を有するという基準に基づき、アミノ酸配列を参照して同定を行った［４８，５０］。この選択基準を使用して、糖化ホットスポットの合計数を確定した。ClustWが組み込まれているBioeditを使用して多配列アライメントを行った。
【０１４９】
統計
対照および処置についての平均潜時の間の有意差は、Studentのｔ検定を使用して判定し、Microsoft Excelの統計パッケージを使用して行った。
【０１５０】
前述の説明、特許請求の範囲および／または添付の図面に開示された特徴は、別々におよびその任意の組み合わせの両方で本発明をその多様な形態で実現するための材料でありうる。
【０１５１】
【表３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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