(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナタマイシン、カナマイシン、胆汁酸塩、クリスタルバイオレット、検出可能な発色性遊離性基を有するβ−ガラクトシダーゼ基質、及び酸化還元指示薬を含有する多剤耐性アシネトバクター選択分離培地。
【請求項２】
さらに、クエン酸又はその塩を含有する請求項１記載の培地。
【請求項３】
さらに、非イオン界面活性剤を含有する請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
さらに、白糖を含有する請求項１〜３のいずれか１項記載の培地。
【請求項５】
検出可能な発色性遊離性基を有するβ−ガラクトシダーゼ基質が、色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトピラノシド又はその塩である請求項１〜４のいずれか１項記載の培地。
【請求項６】
酸化還元指示薬が、テトラゾリウム塩である請求項１〜５のいずれか１項記載の培地。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の培地に検体を接種して培養し、当該培地上の典型的コロニーの有無を観察することを特徴とする多剤耐性アシネトバクターの検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性アシネトバクターの選択分離培地及び当該培地を用いる多剤耐性アシネトバクターの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシネトバクターは、グラム陰性桿菌の真正細菌の１属であり、自然環境中に広く分布する。呼吸器系で感染が多くみられるが、抗生物質による治療で治癒する例が多く、通常は問題にならない。しかし、日和見感染を起こすことがあり、特に高齢者、慢性疾患をもつひと、免疫力が低下した患者では、髄膜炎や菌血症、敗血症をおこし、重篤な状態に陥ることもある。また、アシネトバクターは、変異しやすい特性を有し、多剤耐性アシネトバクター（ＭＤＲＡ）の出現により、多くの抗菌剤が有効でないため、大病院等で集団感染を生じることがある。
【０００３】
多剤耐性アシネトバクター（ＭＤＲＡ）は、日本感染症学会において、イミペネム、アミカシン及びシプロフロキサシンに耐性を有するアシネトバクターと定義されている。ＭＤＲＡ検出用培地としては、ＭＤＲアシネトバクター（HARDY DIAGNOSTICS社：非特許文献１）及びクロモアガー  アシネトバクター（関東化学社：非特許文献２）が市販されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＭＤＲアシネトバクター
【非特許文献２】クロモアガー  アシネトバクター
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、現在市販されているＭＤＲＡの選択培地の選択性は十分でなく、さらに選択性の高いＭＤＲＡ選択培地の開発が望まれていた。
従って、本発明の課題は、ＭＤＲＡに対する選択性の高いＭＤＲＡ選択分離培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、市販のＭＤＲＡ選択培地に比べてアシネトバクター及びＭＤＲＡに対する選択性のより高い培地を開発すべく種々検討した結果、カナマイシン、胆汁酸塩に加えてナタマイシン、クリスタルバイオレット、発色性β−ガラクトシダーゼ基質及び酸化還元指示薬を組み合わせることにより、ＭＤＲＡを選択的に検出できる培地が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の［１］〜［７］を提供するものである。
［１］ナタマイシン、カナマイシン、胆汁酸塩、クリスタルバイオレット、検出可能な発色性遊離性基を有するβ−ガラクトシダーゼ基質、及び酸化還元指示薬を含有する多剤耐性アシネトバクター選択分離培地。
［２］さらに、クエン酸又はその塩を含有する［１］記載の培地。
［３］さらに、非イオン界面活性剤を含有する［１］又は［２］記載の培地。
［４］さらに、白糖を含有する［１］〜［３］のいずれかに記載の培地。
［５］検出可能な発色性遊離性基を有するβ−ガラクトシダーゼ基質が、色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトピラノシド又はその塩である［１］〜［４］のいずれかに記載の培地。
［６］酸化還元指示薬が、テトラゾリウム塩である［１］〜［５］のいずれかに記載の培地。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の培地に検体を接種して培養し、当該培地上の典型的コロニーの有無を観察することを特徴とする多剤耐性アシネトバクターの検出法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の培地を用いれば、医療施設等の日和見感染源であるＭＤＲＡを簡便、かつ正確に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のＭＤＲＡ選択分離培地（以下、本発明培地ともいう）は、ナタマイシン、カナマイシン、胆汁酸塩、クリスタルバイオレット、検出可能な発色性遊離性基を有するβ−ガラクトシダーゼ基質、及び酸化還元指示薬を含有する。このうち、ナタマイシンは、ポリエン系の抗真菌剤であり、ピマリシンとしても知られ、真菌類の生育を抑制する。ナタマイシンの含有量は、真菌の生育抑制及びＭＤＲＡの選択性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．０１〜０．２ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．２ｇ／Ｌがより好ましく、０．０２〜０．１ｇ／Ｌがさらに好ましい。なお、ナタマイシンは、５０質量％含有組成物として、DelvocidTM、デルボシドインスタント、PremiTM Nat、PrimiTM Coat、NataPTM 、NatadexTM 、NatalacTM 、NatanaclTM 、NatamaxTM 、Astro Pimaricin等の商品名で販売されているものを使用できる。
【００１０】
カナマイシンは、アミノグリコシド系抗生物質であり、広範囲のグラム陰性菌、グラム陽性菌及び多剤耐性でないアシネトバクターの生育を抑制する。カナマイシンの含有量は、多剤耐性でないアシネトバクターとＭＤＲＡとの分離性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．０１〜０．５ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５〜０．２ｇ／Ｌがさらに好ましい。
【００１１】
胆汁酸塩は、ＭＤＲＡと多剤耐性ではないアシネトバクターとの分離性の点で重要であり、デスオキシコール酸又はその塩、コール酸又はその塩が挙げられるが、デスオキシコール酸又はその塩とコール酸又はその塩を併用するのがより好ましい。ここで、デスオキシコール酸又はコール酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が好ましい。胆汁酸塩の含有量は、ＭＤＲＡと多剤耐性アシネトバクターの分離性の点から、本発明培地の検出時の濃度として５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌが好ましく、さらに７ｇ／Ｌ〜１２ｇ／Ｌが好ましい。さらには、デスオキシコール酸又はその塩の濃度は２〜８ｇ／Ｌが好ましく、３〜７ｇ／Ｌがより好ましい。またコール酸又はその塩の濃度は２〜８ｇ／Ｌが好ましく、３〜７ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１２】
クリスタルバイオレットは、グラム陽性菌の生育を抑制の目的で使用される。クリスタルバイオレットの含有量は、ＭＤＲＡの選択性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌが好ましく、０．０００１〜０．０００５ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１３】
検出可能な発色性遊離性基を有するβ−ガラクトシダーゼ基質は、β−ガラクトシダーゼを産生する腸内細菌、エロモナス属等を典型的な色に染色してＭＤＲＡと分離する目的で使用される。当該基質としては、青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトピラノシド又はその塩が挙げられ、例えば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられ、このうち青色の遊離基を有するβ−ガラクトピラノシドが好ましく、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）が特に好ましい。当該基質の含有量は、ＭＤＲＡの選択性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．００１〜０．１ｇ／Ｌが好ましく、０．００５〜０．０５ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１４】
酸化還元指示薬は、ＭＤＲＡのみを検出可能なコロニーとして検出するために使用される。酸化還元指示薬としては、赤色指示薬、紫色指示薬等が挙げられる。このうちβ−ガラクトシダーゼ基質と異なる色の指示薬が好ましく、赤色指示薬、例えばテトラゾリウム塩が好ましい。このうち、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドが特に好ましい。
酸化還元指示薬の含有量は、ＭＤＲＡのみを赤色等の検出可能な色に染色する点から、０．００５〜０．１ｇ／Ｌが好ましく、０．０１〜０．０８ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１５】
さらに、本発明培地には、Acinetobacterの発育促進の目的でクエン酸又はその塩、脂肪酸などの供給源および膜透過性に干渉させ栄養分の取り込みを良くさせる目的で非イオン界面活性剤、Acinetobacterの促進および白糖分解菌との鑑別の目的で白糖を含有させることができる。クエン酸又はその塩としてはクエン酸ナトリウムが好ましく、その含有量は本発明培地の検出時の濃度として０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２〜０．８ｇ／Ｌがより好ましい。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートが好ましく、その含有量は本発明培地の検出時の濃度として１〜５０mL／Ｌが好ましく、５〜３０mL／Ｌがより好ましい。白糖の含有量は、本発明培地の検出時の濃度として１〜１０ｇ／Ｌが好ましく、２〜８ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１６】
本発明の培地には、さらに培地に通常用いられる成分、例えばカゼインペプチド、大豆ペプチド、酵母エキス等の栄養素、ビタミン類、無機塩類、微量元素、アミノ酸、プリン、ピリミジン、ヘミン、NAD等を配合することができる。
【００１７】
本発明の培地の形態は、特に限定されず、寒天培地、液体培地、特開平８−１４０６６４号記載の簡易培地等とすることができる。
【００１８】
本発明のＭＤＲＡ検出法は、本発明培地に検体を接種して培養し、当該培地上の赤色のコロニーの有無を観察することにより行うことができる。なお、培養は、35℃、1日間行えばよい。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２０】
試験例１
市販のMDR Acinetobacter培地（HARDY DIAGNOSTICS社）、CHROMagarTM Acinetobacter培地（CHROMagar Microbiology社）及びLeeds培地を用い、Acinetobacter株３９株（臨床分離株６株を含む）と他菌種２６株をミクロプランターで接種し、３５℃、２４時間培養後に発育の有無を確認した。
その結果、ＭＤＲＡの選択性が十分でなかったので、種々の抗生物質の添加、クエン酸ナトリウムの添加、クリスタルバイオレットの添加を検討し、下記表１の組成の培地を作製した。
【００２１】
【表１】
0005860727.tif 000002
【００２２】
表１の培地を用い、下記表２の菌株を接種し、ＭＤＲＡ選択性についてさらに検討した。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
その結果、Acinetobacter以外の菌種に着目すると、Burkholderia capaciaとStenotrophomonas maltophila（臨床分離株）に対する抑制性が弱いことを認めた。サルモネラおよび腸内細菌分離用培地へ、これらの株を接種すると、Ｘ−ＳＡＬとＳＳ寒天培地でBurkholderia capaciaを抑制することを認めた。そこで、胆汁酸に着目して、ＡＫＢ７培地へセフスロディン１５mg／Ｌとオキシテトラサイクリン０．３mg／Ｌを添加した培地へデスコキシコール酸ナトリウムとコール酸ナトリウムの濃度を組み合わせて、１２１種類の培地を作製して、Acinetobacter １８株、その他の菌種９株を接種した。その結果、デスオキシコール酸ナトリウム５ｇ／Ｌとコール酸ナトリウム４．５ｇ／Ｌを加えた培地（ＡＫＢ８）で、Burkholderia capaciaとStenotrophomonas maltophila（臨床分離株）の発育を抑制した。
【００２５】
再度、ミューラーヒントン培地での感受性ディスク試験を行い、カナマイシンがAcinetobacter耐性株で抵抗性を示したのに対して、Burkholderia capaciaとStenotrophomonas maltophila（臨床分離株）は、感受性であった。
【００２６】
さらに、ＭＩＣを測定した結果、Acinetobacter耐性株は１００μｇ／mL以上であり、Burkholderia capaciaとStenotrophomonas maltophila（臨床分離株）は１００μｇ／mLで抑制できることを確認した。ＡＫＢ８へ選択物質としてセフスロディン０．００５ｇ／Ｌとオキシテトラサイクリン０．０００３ｇ／Ｌを添加した培地へカナマイシン（５０〜１５０mg／Ｌ）を加えて、Acinetobacter １８株、その他の菌種９株で検討すると、耐性Acinetobacter菌株の発育も抑制した。そこで、（表１）とＡＫＢ８の培地組成へ５種類の抗生物質（シプロフロキサシン０．２mg／Ｌ、メロペネム０．３mg／Ｌ、カナマイシン１００mg／Ｌ、セフスロディン２５mg／Ｌ、オキシテトラサイクリン１．５mg／Ｌ）を１種類ずつ添加して、同じ菌株で検討した。その結果、ＡＫＢ８培地とカナマイシン１００mg／Ｌの組合せで、薬剤耐性Acinetobacterの発育を阻害せずに、Burkholderia capaciaとStenotrophomonas maltophila （臨床分離株）を抑制できることを見出した。デスオキシコール酸ナトリウム５ｇ／Ｌとコール酸ナトリウム４．５ｇ／Ｌを培地に加えたため、ＴＴＣの発色が弱まる傾向を認めたため、ＡＫＢ８培地へカナマイシン１００mg／Ｌを添加した培地で、ＴＴＣ濃度の検討をした結果、ＴＴＣ濃度が従来の倍量（０．０３ｇ／Ｌ）添加することにより、明瞭な赤桃色のコロニーを形成した。
以上の検討から、下記表３の本発明培地を作製した。表３の培地を用いれば、ＭＤＲＡを選択的に赤色のコロニーとして検出できた。
【００２７】
【表３】
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