(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しかつインテグリン結合活性を有しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１か所にコラーゲン結合性分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン。
【請求項２】
ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の２か所以上にコラーゲン結合性分子が結合していることを特徴とする請求項１に記載の改変ラミニン。
【請求項３】
ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項１または２に記載の改変ラミニン。
【請求項４】
ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントが、α１〜α５から選択される１種のα鎖もしくはそのフラグメント、β１〜β３から選択される１種のβ鎖もしくはそのフラグメント、およびγ１〜γ３から選択される１種のγ鎖もしくはそのフラグメントからなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の改変ラミニン。
【請求項５】
ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントが、ラミニンα５β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β３γ２もしくはそのフラグメント、ラミニンα１β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα１β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα２β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα２β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα４β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα４β２γ１もしくはそのフラグメントまたはラミニンα５β２γ１もしくはそのフラグメントである請求項４に記載の改変ラミニン。
【請求項６】
コラーゲン結合性分子が、以下の（ａ）〜（ｒ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の改変ヒトラミニン。
（ａ）フィブロネクチンまたはそのコラーゲン結合活性部位を含むフラグメント
（ｂ）コラゲナーゼまたはそのコラーゲン結合活性部位を含むフラグメント
（ｃ）インテグリンα１鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｄ）インテグリンα２鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｅ）インテグリンα１０鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｆ）インテグリンα１１鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｇ）血小板グリコプロテインＶＩまたはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｈ）ディスコイディンドメイン受容体１またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｉ）ディスコイディンドメイン受容体２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｊ）マンノース受容体またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｋ）ホスホリパーゼＡ２受容体またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｌ）ＤＥＣ２０５またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｍ）Ｅｎｄｏ１８０またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｎ）フォンウィルブランド因子またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｏ）ＭＭＰ−２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｐ）ＭＭＰ−９またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｑ）白血球関連免疫グロブリン様受容体１またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｒ）白血球関連免疫グロブリン様受容体２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
【請求項７】
ラミニンおよびコラーゲン結合性分子がヒト由来である請求項１〜６のいずれかに記載の改変ラミニン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含むことを特徴とする細胞外マトリックス材料。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンがコーティングされていることを特徴とする培養基材。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含むことを特徴とするスキャフォールド。
【請求項１１】
哺乳動物細胞の培養方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンの存在下で培養することを特徴とする培養方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞または体性幹細胞である請求項１１に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニン、当該改変ラミニンを含む細胞外マトリックス材料、培養基材およびスキャフォールド、ならびに当該改変ラミニンを用いる細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞、特にＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。しかし、多分化能を保持したまま幹細胞を培養、維持するためには、通常幹細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）の共存下で培養される。しかしながら、ヒト幹細胞を臨床応用する段階では、これらフィーダー細胞の使用が大きな制約となっている。【０００３】
ヒト幹細胞を再生医療に応用するためには、フィーダー細胞を使用しないフィーダーフリー条件と、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー（Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）条件を満たす培養環境が必要である。本発明者らは、ヒトラミニン（特に、α３β３γ２からなるラミニン３３２およびα５β１γ１からなるラミニン５１１）の組換えタンパク質が、ヒトＥＳ細胞の多分化能維持に有効であることを見出し（非特許文献１参照）、多分化能を保持したまま幹細胞を維持培養可能な細胞外マトリックスとして、組換えヒトラミニンのＥ８フラグメント、または組換えヒトラミニンのＥ８フラグメントに細胞接着分子や増殖因子結合分子を付加した改変ラミニンを提案している（特許文献１、２、非特許文献２参照）。【０００４】
ヒト幹細胞の維持培養の次段階として、ヒト幹細胞を分化誘導して再生医療に応用するためには、ヒト幹細胞由来の三次元組織構造体を構築する必要がある。従来、組織から分離した細胞を利用して三次元組織構造体を構築する場合、基底膜成分を過剰産生するマウスＥＨＳ腫瘍から調製した粗抽出物（商品名：マトリゲル（登録商標））が、細胞外マトリックスとして用いられている。しかし、マトリゲルはマウス由来であるため、ヒトに対する安全性に問題がある。一方、三次元培養系で広く使われているコラーゲンゲルは幹細胞の維持活性が弱いため、コラーゲンゲルを単独細胞外マトリックスとして用いても、ヒト幹細胞から三次元組織構造体を構築することは困難である。すなわち、現状では、マトリゲル（登録商標）に代わる三次元組織構造体構築用の適当な細胞外マトリックス材料が存在しない。それゆえ、ヒトに対して安全な再生医療用三次元組織構造体を構築するための細胞外マトリックス材料を早期に開発することが強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−７８３７０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２−１３７９７０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi M, Kawase E, Sekiguchi K, Nakatsuji N, Suemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
【非特許文献２】Miyazaki T, Futaki S, Suemori H, Taniguchi Y, Yamada M,Kawasaki M, Hayashi M, Kumagai H, Nakatsuji N, Sekiguchi K, Kawase E. Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nature communications. DOI: 10.1038/ncomms2231, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マトリゲル（登録商標）に代わる細胞外マトリックス材料として、ヒトに対して安全な再生医療用三次元組織構造体を構築するために有用な細胞外マトリックス材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１か所にコラーゲン結合性分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン。
［２］ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の２か所以上にコラーゲン結合性分子が結合していることを特徴とする前記［１］に記載の改変ラミニン。
［３］ラミニンフラグメントが、インテグリン結合活性を有していることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の改変ラミニン。
［４］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである前記［３］に記載の改変ラミニン。
［５］ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントが、α１〜α５から選択される１種のα鎖もしくはそのフラグメント、β１〜β３から選択される１種のβ鎖もしくはそのフラグメント、およびγ１〜γ３から選択される１種のγ鎖もしくはそのフラグメントからなることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の改変ラミニン。
［６］ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントが、ラミニンα５β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β３γ２もしくはそのフラグメント、ラミニンα１β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα１β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα２β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα２β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα４β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα４β２γ１もしくはそのフラグメントまたはラミニンα５β２γ１もしくはそのフラグメントである前記［５］に記載の改変ラミニン。
［７］コラーゲン結合性分子が、以下の（ａ）〜（ｒ）から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の改変ラミニン。
（ａ）フィブロネクチンまたはそのコラーゲン結合活性部位を含むフラグメント
（ｂ）コラゲナーゼまたはそのコラーゲン結合活性部位を含むフラグメント
（ｃ）インテグリンα１鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｄ）インテグリンα２鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｅ）インテグリンα１０鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｆ）インテグリンα１１鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｇ）血小板グリコプロテインＶＩまたはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｈ）ディスコイディンドメイン受容体１またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｉ）ディスコイディンドメイン受容体２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｊ）マンノース受容体またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｋ）ホスホリパーゼＡ２受容体またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｌ）ＤＥＣ２０５またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｍ）Ｅｎｄｏ１８０またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｎ）フォンウィルブランド因子またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｏ）ＭＭＰ−２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｐ）ＭＭＰ−９またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｑ）白血球関連免疫グロブリン様受容体１またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｒ）白血球関連免疫グロブリン様受容体２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
［８］ヒト由来である前記［１］〜［７］のいずれかに記載の改変ラミニン。
［９］前記［１］〜［８］のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含むことを特徴とする細胞外マトリックス材料。
［１０］前記［１］〜［８］のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンがコーティングされていることを特徴とする培養基材。
［１１］前記［１］〜［８］のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含むことを特徴とするスキャフォールド。
［１２］哺乳動物細胞の培養方法であって、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンの存在下で培養することを特徴とする培養方法。
［１３］哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞または体性幹細胞である前記［１２］に記載の培養方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ヒトに対して安全な再生医療用三次元組織構造体を構築するために有用な改変ラミニンならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含む細胞外マトリックス材料、培養基材、スキャフォールドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個、２個または３個付加したラミニン５１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン５１１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図２】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個、２個または３個付加したラミニン５１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン５１１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図３】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個、２個または３個付加したラミニン５１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン５１１Ｅ８と、ゼラチンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図４】Ｉ型コラーゲンをコートしたプレートに３種類のコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）付加ラミニン５１１Ｅ８またはラミニン５１１Ｅ８を添加し、ヒトｉＰＳ細胞を培養した結果を示す図である。
【図５】ゼラチンをコートしたプレートに３種類のコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）付加ラミニン５１１Ｅ８またはラミニン５１１Ｅ８を添加し、ヒトｉＰＳ細胞を培養した結果を示す図である。
【図６】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン１１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン１１１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図７】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン１２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン１２１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図８】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン２１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン２１１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図９】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン２２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン２２１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図１０】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン３１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン３１１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図１１】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン３２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン３２１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図１２】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン４１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン４１１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図１３】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン４２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン４２１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図１４】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン５２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン５２１Ｅ８を非還元条件ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した結果を示す図である。
【図１５】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン１１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン１１１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図１６】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン１２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン１２１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図１７】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン２１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン２１１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図１８】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン２２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン２２１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図１９】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン３１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン３１１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図２０】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン３２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン３２１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図２１】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン４１１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン４１１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図２２】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン４２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン４２１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【図２３】コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）を１個または２個付加したラミニン５２１Ｅ８およびＣＢＤを付加していないラミニン５２１Ｅ８と、コラーゲンとの結合活性を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔改変ラミニン〕
本発明は、ラミニン、または、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１か所にコラーゲン結合性分子が結合している改変ラミニンを提供する。
ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体分子である。α鎖はα１〜α５の５種類、β鎖はβ１〜β３の３種類、γ鎖はγ１〜γ３の３種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも１２種類以上のアイソフォームが存在する（表１参照）。本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは、いずれのアイソフォームであってもよい。すなわち、本発明の改変ラミニンを構成するラミニンまたはヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントは、α１〜α５から選択される１種のα鎖もしくはそのフラグメント、β１〜β３から選択される１種のβ鎖もしくはそのフラグメント、およびγ１〜γ３から選択される１種のγ鎖もしくはそのフラグメントからなるものであればよい。具体的には、表１に記載の１２種類、およびこれら以外のすべてのアイソフォームおよびそのフラグメントを好適に用いることができる。好ましくはラミニンα５β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β３γ２もしくはそのフラグメント、ラミニンα１β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα１β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα２β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα２β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα３β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα４β１γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα４β２γ１もしくはそのフラグメント、ラミニンα５β２γ１もしくはそのフラグメントであり、より好ましくはラミニンα３β３γ２もしくはそのフラグメント、ラミニンα５β１γ１もしくはそのフラグメントである。
【００１２】
【表１】
0005858411.tif 000002
【００１３】
ラミニンの由来は特に限定されず、各種生物由来のラミニンを用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のラミニンである。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のラミニンを用いることが特に好ましい。ヒトの再生医療材料を得るためにヒト幹細胞を培養する場合には、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー条件を満たす培養環境が求められることから、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましい。
【００１４】
本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは全長であってもよく、そのフラグメントであってもよい。すなわち、全長α鎖、全長β鎖および全長γ鎖からなる全長ラミニンであってもよく、α鎖、β鎖およびγ鎖の少なくとも１つ以上が全長より短いフラグメントからなるラミニンフラグメントであってもよい。ただし、ラミニンフラグメントはヘテロ３量体を形成していることを要する。また、ラミニンフラグメントはインテグリン結合活性を有していることが好ましい。ラミニンフラグメントがヘテロ３量体を形成していることは、ラミニンフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。ラミニンフラグメントがインテグリン結合活性を有していることは、固相結合アッセイ等により確認することができる。
【００１５】
本発明の改変ラミニンを構成するラミニンフラグメントは、α鎖、β鎖およびγ鎖からなるヘテロ３量体を形成しているものであればよく、分子量等は特に限定されない。インテグリン結合活性の強さ、組換えタンパク質としての発現効率（全長ラミニンと比較して、組換えタンパク質として高収量で製造できること）の観点から、ラミニンのＥ８フラグメントが好ましい。ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下「マウスラミニン１１１」と記す）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H.The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。マウスラミニン１１１以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメントに相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン１１１以外のラミニンをエラスターゼで消化してＥ８フラグメントを分離・同定した報告はない。したがって、本発明に用いられるラミニンＥ８は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１のＥ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するラミニンのフラグメントであればよい。
【００１６】
ラミニンは天然型であってもよく、その生物学的活性を維持したまま、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。ラミニンの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニン高発現細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。ラミニンフラグメントの製造方法も特に限定されず、例えば、全長ラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、ラミニンおよびラミニンフラグメントの両者とも、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００１７】
組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントの製造方法としては、例えば、α鎖、β鎖およびγ鎖の各全長タンパク質または部分タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。組換えラミニン（全長）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada,Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004.）の方法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。組換えラミニンフラグメント（ラミニンＥ８）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
主要な哺乳動物のラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１に、ヒトを含む主な哺乳動物について、ラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。これら以外の各種生物由来のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
【００１９】
【表２】
0005858411.tif 000003
【００２０】
ラミニンＥ８は、α鎖のＣ末端フラグメントから球状ドメイン４および５が除かれたフラグメント（以下「α鎖Ｅ８」と記す）、β鎖のＣ末端フラグメント（以下「β鎖Ｅ８」と記す）およびγ鎖のＣ末端フラグメント（以下「γ鎖Ｅ８」と記す）が３量体を形成したフラグメントであり、３量体の分子量は約１５０〜約１７０ｋＤａである。α鎖Ｅ８は通常約７７０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側の約２３０アミノ酸が３量体形成に関わる。β鎖Ｅ８は通常約２２０〜約２３０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８は通常約２４０〜約２５０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８のＣ末端部から３番目のグルタミン酸残基はラミニンＥ８の細胞接着活性に必須である（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）。
【００２１】
本発明の改変ラミニンを構成するコラーゲン結合性分子は、コラーゲン結合ドメインを有する分子であれば特に限定されない。コラーゲン結合性分子は、コラーゲン結合ドメインを有する分子の全長であってもよく、コラーゲン結合ドメインを含むフラグメントであってもよい。結合対象のコラーゲンの種類は特に限定されず、各種コラーゲンを結合対象とすることができる。好ましくは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンである（Engvall et al., 1978, J. Exp. Med. 1584-1595、Woodley et al., 1983, Biochemica et Biophysica Acta.,761, 278-283）。
【００２２】
コラーゲン結合性分子としては、各種コラーゲンと結合可能な分子であれば特に限定されない。例えば、以下の（ａ）〜（ｒ）などが挙げられる。
（ａ）フィブロネクチンまたはそのコラーゲン結合活性部位を含むフラグメント
（ｂ）コラゲナーゼまたはそのコラーゲン結合活性部位を含むフラグメント
（ｃ）インテグリンα１鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｄ）インテグリンα２鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｅ）インテグリンα１０鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｆ）インテグリンα１１鎖またはそのコラーゲン結合ドメインを含むフラグメント
（ｇ）血小板グリコプロテインＶＩまたはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｈ）ディスコイディンドメイン受容体１またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｉ）ディスコイディンドメイン受容体２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｊ）マンノース受容体またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｋ）ホスホリパーゼＡ２受容体またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｌ）ＤＥＣ２０５またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｍ）Ｅｎｄｏ１８０またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｎ）フォンウィルブランド因子またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｏ）ＭＭＰ−２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｐ）ＭＭＰ−９またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｑ）白血球関連免疫グロブリン様受容体１またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
（ｒ）白血球関連免疫グロブリン様受容体２またはそのコラーゲン結合部位を含むフラグメント
【００２３】
コラーゲン結合性分子の由来は特に限定されず、各種生物由来のコラーゲン結合性分子を用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のコラーゲン結合性分子である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のコラーゲン結合性分子を用いることが特に好ましい。ヒトの再生医療材料を得るためにヒト幹細胞を培養する場合には、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー条件を満たす培養環境が求められることから、ヒト由来のコラーゲン結合性分子を用いることが好ましい。
【００２４】
コラーゲン結合性分子の製造方法は特に限定されず、例えば、目的のコラーゲン結合性分子を発現している細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。組換えタンパク質は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。なお、ヒト由来の上記（ａ）〜（ｒ）のコラーゲン結合性分子をコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、それぞれ表３に記載したアクセッション番号で公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。ヒト以外の各種生物由来のコラーゲン結合性分子をコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
【００２５】
【表３】
0005858411.tif 000004
【００２６】
上記表３に記載の各コラーゲン結合性分子のアミノ酸配列中のコラーゲン結合部位と推定される位置は以下のとおりである。
フィブロネクチン：Ｖａｌ２７６−Ｔｈｒ６０４
インテグリンα１鎖：Ｌｅｕ１７１―Ｉｌｅ３５１
インテグリンα２鎖：Ｉｌｅ１７３―Ｌｙｓ３５３
インテグリンα１０鎖：Ｍｅｔ１６６―Ｉｌｅ３４６
インテグリンα１１鎖：Ｍｅｔ１６３―Ｉｌｅ３４１
血小板グリコプロテインＶＩ：Ｐｒｏ２６―Ｔｈｒ１０８
ディスコイディンドメイン受容体１：Ｌｙｓ３０―Ｃｙｓ１８５
ディスコイディンドメイン受容体２：Ｃｙｓ３０―Ｃｙｓ１８５
マンノース受容体：Ａｓｎ１６２―Ｃｙｓ２０９
ホスホリパーゼＡ２受容体：Ａｓｎ１７２―Ｃｙｓ２１９
ＤＥＣ２０５：Ａｓｎ１６３―Ｃｙｓ２０９
Ｅｎｄｏ１８０：Ａｓｎ１８１―Ｃｙｓ２２８
フォンウィルブランド因子：Ｌｅｕ１２７６―Ｇｌｎ１３８８およびＬｅｕ１６９０―Ｖａｌ１８４９の２箇所
ＭＭＰ−２：Ａｒｇ２２２―Ｓｅｒ３９６
ＭＭＰ−９：Ａｓｎ２２４―Ｃｙｓ３８８
白血球関連免疫グロブリン様受容体１：Ｐｒｏ２７―Ｖａｌ１２０
白血球関連免疫グロブリン様受容体２：Ｐｒｏ２７―Ｖａｌ１２０
【００２７】
本発明の改変ラミニンは、上記のコラーゲン結合性分子がラミニンまたはヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１か所に結合していればよいが、２か所以上に結合していることが好ましい。２か所または３か所にコラーゲン結合性分子が結合することにより、１か所にコラーゲン結合性分子が結合している場合と比較して、改変ラミニンのコラーゲンに対する結合活性が顕著に増加する。コラーゲン結合性分子が２か所に結合する場合、結合箇所は特に限定されず、α鎖のＮ末端とβ鎖のＮ末端、α鎖のＮ末端とγ鎖のＮ末端およびβ鎖のＮ末端とγ鎖のＮ末端のいずれでもよい。コラーゲン結合性分子が２か所以上に結合する場合、コラーゲン結合性分子は１種でもよく、２種以上でもよい。
本発明の改変ラミニンは、コラーゲン結合性分子が結合していない鎖のＮ末端およびα鎖のＣ末端にコラーゲン結合性分子以外の分子が結合していてもよい。コラーゲン結合性分子以外の分子としては、例えば、細胞接着分子や増殖因子結合分子等の細胞増殖制御分子が挙げられる（特許文献２参照）。
【００２８】
本発明の改変ラミニンは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより、組換え改変ラミニンとして製造することができる。例えば、ラミニンＥ８のα鎖のＮ末端にコラーゲン結合性分子を結合した改変ラミニンを製造する場合には、ラミニンのα鎖Ｅ８をコードするＤＮＡとコラーゲン結合性分子をコードするＤＮＡを連結し、ラミニンＥ８のα鎖のＮ末端にコラーゲン結合性分子を結合した融合タンパク質をコードする融合遺伝子を挿入した発現ベクターを作製する。これとラミニンのβ鎖Ｅ８発現ベクターおよびγ鎖Ｅ８発現ベクターの３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。他の箇所に細胞接着分子が結合した改変ラミニンや複数箇所に細胞接着分子が結合した改変ラミニンも、これに準じて製造することができる。また、本発明の改変ラミニンは、α鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１か所に、コラーゲン結合性分子を化学的に結合させてもよい。
【００２９】
〔細胞外マトリックス材料〕
本発明は、上記本発明の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含む細胞外マトリックス材料を提供する。本発明の細胞外マトリックス材料は、改変ラミニンおよびコラーゲンからなるものでもよく、改変ラミニンおよびゼラチンからなるものでもよく、改変ラミニン、コラーゲンおよびゼラチンからなるものでもよく、これら以外の成分を含むものでもよい。これら以外の成分としては、細胞培養に使用できる成分であれば特に限定されないが、例えば、コラーゲンおよびゼラチン以外の細胞外マトリックス成分が好ましい。コラーゲンおよびゼラチン以外の細胞外マトリックス成分としては、例えば、フィブロネクチン、マトリゲル、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、テネイシン、エラスチン、ラミニン、フィブリノーゲン（フィブリン）等が挙げられる。
【００３０】
本発明の細胞外マトリックス材料に用いるコラーゲンまたはゼラチンは特に限定されず、細胞培養用途に使用される公知のコラーゲンまたはゼラチンを好適に用いることができる。本発明の細胞外マトリックス材料は、液状、ゲル状、スポンジ状、シート状等の形態で提供することができ、プレートにコートしたり、三次元基質として利用することができる。
【００３１】
本発明の細胞外マトリックス材料は、幹細胞の足場として好適なラミニンの存在により、幹細胞を分化誘導して再生医療用三次元組織構造体を構築するための三次元培養基質として利用できる。また、本発明の細胞外マトリックス材料は、細胞の三次元培養のみでなく、生体埋め込み用の組織再生誘導デバイスとして用いることもできる。また、分化誘導させたい幹細胞に適した硬さを持つコラーゲンまたはゼラチンで構成された三次元基質に任意のラミニンアイソフォームを結合させることにより、当該幹細胞の分化誘導に最適化した三次元培養環境を提供することができる。
【００３２】
〔培養基材〕
本発明は、上記本発明の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンがコーティングされている培養基材を提供する。本発明の培養基材を用いて培養する細胞は特に限定されず、培養可能な細胞であればどのような細胞でもよい。好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物の幹細胞である。幹細胞には体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、小腸幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。本発明の培養基材は、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養する場合にも有用である。
【００３３】
本発明の培養基材を製造する方法は特に限定されず、例えば、コラーゲンおよび／またはゼラチンと、改変ラミニンとの混合溶液を培養器にコーティングしてもよく、コラーゲンまたはゼラチンまたは両者の混合物を培養器にコーティングした後、本発明の改変ラミニンをさらにコーティングしてもよい。後者の場合、本発明の改変ラミニンを適当な溶媒（例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水など）で希釈して、コラーゲンおよび／またはゼラチンがコーティングされた培養器に添加し、４℃〜３７℃程度で約１〜１２時間程度静置することにより、改変ラミニンがコラーゲンまたはゼラチンに結合してコーティングされる。コラーゲンをゲル状にコーティングした後に改変ラミニンをコーティングすれば、三次元培養用の培養基材を製造することができる。培養器は細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。
【００３４】
コーティングに用いるコラーゲンまたはゼラチンは特に限定されず、細胞培養用途に使用される公知のコラーゲンまたはゼラチンを好適に用いることができる。再生医療用の細胞培養に用いる場合は、医療用途の安全性が確認されているコラーゲンまたはゼラチンを用いることが好ましく、ヒト由来のコラーゲンまたはゼラチンを用いることが好ましい。医療用途の安全性が確認されているコラーゲンまたはゼラチンとしては、アテロコラーゲン（高研）、ブタ皮膚製コラーゲン溶液（ニッポンハム）、ニッピハイグレードゼラチン（ニッピ）、メディゼラチン（ニッピ）などが挙げられる。
【００３５】
〔スキャフォールド〕
本発明は、幹細胞を分化誘導して三次元組織構造体を構築するためのスキャフォールドを提供する。本発明のスキャフォールドは、上記本発明の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンを含むものであればよい。本発明のスキャフォールドを構成する材料は、細胞の足場としての役割を果たすものであればどのような材料でもよく、特に限定されない。例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、キチン、ペクチン酸等の天然高分子、自己組織化能を有する両親媒性ペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグルコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ε−カプロラクトンと乳酸あるいはグリコール酸との共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム等の無機材料などが挙げられる。スキャフォールドの形態は、ゲル状、スポンジ状、フィルム状、メッシュ状、不織布状、編織布状などの三次元構造であればいずれの形態であってもよい。なかでも密な網目構造で構成されるゲル状またはフィルム状のスキャフォールドが好ましい。
【００３６】
コラーゲン自身またはゼラチン自身がスキャフォールドを構成する場合（例えば、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ等）、これに本発明の改変ラミニンを結合させることにより、本発明のスキャフォールドを製造することができる。コラーゲンおよびゼラチン以外の材料を用いてスキャフォールドを構成する場合は、スキャフォールドの表面をコラーゲンおよび／またはゼラチンでコーティングし、その上に改変ラミニンを結合させることにより、本発明のスキャフォールドを製造することができる。なお、本発明のスキャフォールドに使用可能なコラーゲンおよびゼラチンは、上記本発明の培養基材と同様である。
【００３７】
本発明のスキャフォールドは、上記本発明の培養基材で培養される細胞の三次元培養に好ましく用いることができる。本発明のスキャフォールドは、幹細胞の足場として好適なラミニンの存在により、幹細胞を分化誘導して再生医療用の三次元組織構造体を構築するため三次元培養用スキャフォールドとして、非常に優れている。また、本発明のスキャフォールドは、細胞の三次元培養のみでなく、生体埋め込み用の組織再生誘導デバイスとして用いることができる。
【００３８】
〔哺乳動物細胞の培養方法〕
本発明は、上記本発明の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンの存在下で哺乳動物細胞を培養する培養方法を提供する。本発明の改変ラミニンが結合したコラーゲンまたはゼラチンを哺乳動物細胞の足場となる細胞外マトリックスとして用いることにより、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養することが可能となる。また、コラーゲンに親和性の低い幹細胞を、コラーゲン上で培養することが可能となり、幹細胞を分化誘導して再生医療用の三次元組織構造体を効率よく構築することが可能となる。
【００３９】
本発明の培養方法は、どのような哺乳動物細胞の培養にも適用できるが、幹細胞の培養に適用することが好ましい。幹細胞は、自己複製能と多分化能を持った細胞を意味し、体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、小腸幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。すなわち、本発明の培養方法は、ヒト幹細胞の培養に用いることが好ましい。また、本発明の培養方法を用いてヒト幹細胞の培養を行う場合には、ヒト由来の改変ラミニンを用いることが好ましい。
【００４０】
本発明の培養方法は、本発明の改変ラミニン、ならびにコラーゲンおよび／またはゼラチンの存在下で哺乳動物細胞を培養する方法であれば、どのような方法でもよい。本発明の改変ラミニンとコラーゲンおよび／またはゼラチンをそれぞれ培地に添加して培養する方法でもよく、本発明の改変ラミニンとコラーゲンの複合体、または本発明の改変ラミニンとゼラチンの複合体を培地に添加して培養する方法でもよく、コラーゲンおよび／またはゼラチンをコーティングした培養器を用いて本発明の改変ラミニンを培地に添加して培養する方法でもよい。好ましくは、上記本発明の培養基材または本発明のスキャフォールドを用いて培養する方法である。
【００４１】
本発明の培養方法を用いてヒトｉＰＳ細胞を培養する場合の一実施形態を以下に示す。本発明の培養方法はこれに限定されるものではなく、ヒトｉＰＳ細胞以外の哺乳動物細胞の培養にも好適に用いることができる。
（１）フィーダー細胞との共培養系からヒトｉＰＳ細胞を回収する
以下の方法１または方法２のいずれかの方法で、フィーダー細胞との共培養系からヒトｉＰＳ細胞を回収する。
方法１：
フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒトｉＰＳ細胞の培養ディッシュ（３〜５日目）に０．２５％トリプシン／ＤＭＥＭ−Ｆ１２を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で２〜３分間恒温処理し、培養ディッシュをＤＭＥＭ−Ｆ１２で洗浄してフィーダー細胞を除去する。培養液を加えて全体細胞を物理的に剥離した細胞懸濁液をＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー１００μｍ（BD Falcon #352460）に通した後、ストレーナーを洗浄することでヒトｉＰＳ細胞のコロニーのみを分離し、回収する。
【００４２】
方法２：
フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒトｉＰＳ細胞の培養ディッシュ（３〜５日目）に細胞剥離液（例えば、ＥＳ／ｉＰＳ細胞用剥離液（リプロセル ＲＣＨＥＴＰ００２）、１ｍｇ/ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ/ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０ｍｇ/ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２など）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理し、ヒトｉＰＳ細胞とＭＥＦを剥離する。細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移し、培養液を約１０ｍｌ入れて細胞を懸濁した後、５分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を２回以上繰り返して、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
【００４３】
（２）ヒトｉＰＳ細胞を本発明の培養基材へ移行する
回収したヒトｉＰＳ細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えば、トリプシン処理する方法、Ｐ−１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりコロニーを砕く方法等が挙げられる。単一細胞に分散させた後、適切な培養液（例えばＴｅＳＲ２など）に懸濁し、例えばコラーゲンおよび改変ラミニンをコーティングした培養ディッシュに播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
【００４４】
（３）継代培養
拡大エリアの不足あるいはコロニー内に死細胞の出現が目立つようになるのを目安に、継代操作を行う。本発明の培養方法では、従来の方法と同様にヒトｉＰＳ細胞を適度な大きさのコロニー形態を維持した状態で播種する方法で継代培養を行ってもよく、ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞に分散させて播種する方法で継代培養を行ってもよい。ここで、単一細胞に分散された状態は、細胞懸濁液中の全細胞が単一細胞に分散されていることを要するものではなく、単一細胞に分散された細胞以外に数個〜十数個程度が接着した状態の細胞が細胞懸濁液中に含まれている状態も単一細胞に分散された状態に含まれる。
【００４５】
単一細胞に分散する場合：
ヒトｉＰＳ細胞を培養している培養ディッシュに、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Invitrogen #12563011）を添加して（例えば１ｍｌ／１００ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理する。例えばＰ−１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトｉＰＳ細胞のコロニーを砕き、単一細胞に分散させる。培養液を加えて細胞を懸濁し、遠心チューブに回収する。遠心（１０００×ｇ、３分）と同培養液による洗浄操作を２度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング（例えば１．０μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュに、例えば約４００００細胞／ｃｍ２の播種密度で単一細胞に分散したヒトｉＰＳ細胞を播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
【００４６】
単一細胞に分散しない場合：
ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞に分散しない場合は、細胞の剥離にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ、Ｄｉｓｐａｓｅ、Ａｃｃｕｔａｓｅ等の酵素を用いる。ヒトｉＰＳ細胞を培養している培養ディッシュに、１０ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２、または２ｍｇ／ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（Millipore #SCR005）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理する。酵素液を除いて培養液を加え、例えばＰ−１０００のピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトｉＰＳ細胞が約５０〜約１００個のコロニーを維持する程度に小さく砕く。細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、遠心（２００×ｇ、３分）と同培養液による洗浄操作を２度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング（例えば１．５μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュに２分の１〜４分の１希釈量を播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
【００４７】
本発明の培養方法を用いることにより、幹細胞を各種体細胞に分化誘導することができる。分化誘導の方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。以下に多能性幹細胞から分化誘導する方法および体性幹細胞から分化誘導する方法の一例を示すが、分化誘導方法はこれらに限定されない。
【００４８】
(i) ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞からの肝臓細胞誘導方法
ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Millipore）で単一細胞まで分散した後、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む分化誘導用ｈＥＳＦ−ＤＩＦ培地（ｈＥＳＦ−ＤＩＦ培地（Cell Science & Technology Institute）に１０μｇ／ｍｌのヒト組換えインスリン、５μｇ／ｍｌのヒトアポトランスフェリン、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０μＭのセレン酸ナトリウム、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを添加したもの）を含むマトリゲル上で２日間培養する。ここで誘導された中内胚葉細胞にＦＯＸＡ２遺伝子を発現させるアデノウィルスベクターを導入し、上記のマトリゲル上で６日目まで培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。これにＦＯＸＡ２遺伝子を発現させるアデノウィルスベクターとＨＮＦ１α遺伝子を発現させるアデノウィルスベクター導入し、３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４を添加したｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＨＣＭ、Ｌｏｎｚａ）を含むマトリゲル上でさらに３日間培養して、肝芽細胞へ分化させる。この肝芽細胞にＦＯＸＡ２遺伝子を発現させるアデノウィルスベクターとＨＮＦ１α遺伝子を発現させるアデノウィルスベクター導入し、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０を添加したＨＣＭ培地を含むマトリゲル上で３日間培養し、肝細胞方向へ分化させる。この細胞を肝細胞として成熟させるため、細胞を８．３％ ｔｒｙｐｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｒｏｔｈ（BD）、１０％ＦＢＳ、１０μＭのｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、１μＭインスリン、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭおよび１０μＭのデキサメタゾンを添加したＬ１５培地（Invitrogen）中のマトリゲル上で８日間培養する。この分化誘導方法で、薬物代謝が可能な肝様細胞へ誘導できることが報告されている（参考文献：Takayama et al., J. Hepatology, 2012, 57, 628-636）。マトリゲルに代えて本発明の改変ラミニンとコラーゲンゲルとを組み合わせた三次元基質を用いることにより、ヒトに対して安全な再生医療用肝臓細胞を提供することができる。
【００４９】
(ii) 体性幹細胞からの肝臓細胞誘導方法
Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｋｉｎａｓｅ（ＤＩＫ）陽性のマウス胎児肝臓細胞をＥＨＳ−ラミニン上で培養した細胞（hepatic progenitor cells proliferating on laminin; HPPL）を２×１０５細胞／ウェルで６穴プレートに播種し、コンフルエントになるまで培養する。その後、２０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し、５日間培養する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で６倍希釈した３００μｌのマトリゲルに培地を交換すると、細胞層の上にゲルが形成される。さらに５日間培養すると、多糖を産生するようになり、ＰＡＳ染色陽性の肝臓細胞へと分化することが報告されている（参考文献：Tanimizu et, al., J. Cell Sci., 2004, 117, 6425-6434）。この方法において、ＨＰＰＬ細胞に代えてヒト由来の幹細胞を用い、ＥＨＳゲルに代えて本発明の改変ラミニンとコラーゲンゲルとを組み合わせた三次元基質を用いることにより、ヒトに対して安全な再生医療用肝臓細胞を提供することができる。
【００５０】
(iii) 体性幹細胞からの胆管細胞分化誘導方法
上記ＨＰＰＬ細胞を、１ｃｍ直径のカルチャーインサートの上面に作製した２０％マトリゲルを含むＩ型コラーゲンゲル上で２日間培養し、その後同組成のゲルをのせて３７℃で２時間ゲル化させる。そこに５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦとＨＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地５００μｌを、カルチャーインサートの上面と下面に添加する。２〜３日間培養すると管様の構造を形成し、胆管マーカーのサイトケラチン１９を発現するようになることが報告されている（参考文献：Tanimizu et al., Mol. Biol. Cell, 2009, 20, 2486-2494）。この方法はサンドウィッチ培養法と呼ばれている。このサンドウィッチ培養法において、ＨＰＰＬ細胞に代えてヒト由来の幹細胞を用い、マトリゲルに代えて本発明の改変ラミニンとコラーゲンゲルとを組み合わせた三次元基質を用いることにより、ヒトに対して安全な再生医療用胆管細胞を提供することができる。
【００５１】
(iv) 小腸幹細胞の三次元培養
マウス小腸の陰窩からＬｇｒ５陽性細胞をｃｒｙｐｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（１０−５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５００ｎｇ／ｍｌのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、１００ｎｇ／ｍｌのｎｏｇｇｉｎを添加したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中に回収し、１μＭのＪａｇｇｅｄ−１ペプチド（Anaspec）を含むマトリゲル５μｌ中に１細胞ずつ埋め込む。そのあとに１０μＭのＹ−２７６３２を含むｃｒｙｐｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍを１００μｌ添加する。成長因子は一日おきに添加し、培地全体は４日ごとに交換して１−２週間培養すると陰窩構造を再形成することが報告されている（参考文献：Sato et al., Nature, 2009, 459, 262-265）。ヒト由来細胞を用い、マトリゲルに代えて本発明の改変ラミニンとコラーゲンゲルとを組み合わせた三次元基質を用いることにより、ヒトに対して安全な再生医療用小腸細胞の三次元培養が可能となる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５３】
〔実施例１：ヒトフィブロネクチンコラーゲン結合ドメイン付加ラミニン５１１Ｅ８組換えタンパク質の作製〕
ヒトフィブロネクチンコラーゲン結合ドメイン（以下「ＣＢＤ」と記す）付加ラミニン５１１Ｅ８組換えタンパク質は、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８の発現ベクター、ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８の発現ベクター、ヒトラミニンγ１鎖Ｅ８の発現ベクター、Ｎ末端にＣＢＤを付加したヒトラミニンα５鎖Ｅ８の発現ベクター、Ｎ末端にＣＢＤを付加したヒトラミニンβ１鎖Ｅ８の発現ベクターおよびＮ末端にＣＢＤを付加したヒトラミニンγ１鎖Ｅ８の発現ベクターをそれぞれ作製し、これらを組み合わせて宿主細胞にトランスフェクションし、発現させることにより作製した。【００５４】
（１）発現ベクターの構築
ヒトラミニンα５Ｅ８（アクセッション番号：ＮＰ＿００５５５１（表２参照）のＡｌａ２５３４−Ａｌａ３３２７）のｃＤＮＡの５’末端に６×ＨｉｓタグをコードするＤＮＡを付加した断片、ヒトラミニンβ１Ｅ８（アクセッション番号：ＮＰ＿００２２８２（表２参照）のＬｅｕ１５６１−Ｌｅｕ１７８６）のｃＤＮＡの５’末端にＨＡタグをコードするＤＮＡを付加した断片、ヒトラミニンγ１Ｅ８（アクセッション番号：ＮＰ＿００２２８４（表２参照）のＡｓｎ１３６４−Ｐｒｏ１６０９）のｃＤＮＡの５’末端にＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡを付加した断片をそれぞれＰＣＲで増幅した。この断片をｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Invitrogen）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶサイト（α５Ｅ８）あるいはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩサイト（β１Ｅ８、γ１Ｅ８）に挿入して、ｐＳｅｃ−ＬＮα５Ｅ８、ｐＳｅｃ−ＬＮβ１Ｅ８およびｐＳｅｃ−ＬＮγ１Ｅ８を作製した（Ido H. et al., J.Biol.Chem. 2007, 282, 11144-11154）。ＣＢＤ（アクセッション番号：ＮＰ＿９９７６４７（表３参照）のＶａｌ２７６−Ｔｈｒ６０４）のｃＤＮＡの５’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加してＰＣＲで増幅した。ヒトラミニンα５Ｅ８のｃＤＮＡの５’末端に６×ＨｉｓタグをコードするＤＮＡを付加した断片、ヒトラミニンβ１Ｅ８のｃＤＮＡの５’末端にＨＡタグをコードするＤＮＡを付加した断片、ヒトラミニンγ１Ｅ８のｃＤＮＡの５’末端にＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡを付加した断片をそれぞれＰＣＲで増幅し、ＣＢＤをコードするＤＮＡ断片とそれぞれをＰＣＲで連結し、ｐＳｅｃ−ＬＮα５Ｅ８のＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩサイト（α５Ｅ８）あるいはｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Invitrogen）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩサイト（β１Ｅ８、γ１Ｅ８）に挿入して、ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮα５Ｅ８、ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮβ１Ｅ８およびｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮγ１Ｅ８を構築した。【００５５】
ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮα５Ｅ８により発現されるタンパク質（ＣＢＤ−ＬＮα５Ｅ８）のアミノ酸配列を配列番号１に、当該タンパク質をコードするＤＮＡ（ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮα５Ｅ８に含まれる）の塩基配列を配列番号２に示した。ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮβ１Ｅ８により発現されるタンパク質（ＣＢＤ−ＬＮβ１Ｅ８）のアミノ酸配列を配列番号３に、当該タンパク質をコードするＤＮＡ（ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮβ１Ｅ８に含まれる）の塩基配列を配列番号４に示した。ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮγ１Ｅ８により発現されるタンパク質（ＣＢＤ−ＬＮγ１Ｅ８）のアミノ酸配列を配列番号５に、当該タンパク質をコードするＤＮＡ（ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮγ１Ｅ８に含まれる）の塩基配列を配列番号６に示した。【００５６】
（２）組換えＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８の発現および精製
組換えＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８または組換えラミニン５１１Ｅ８は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて作製した。２９３ｆｅｃｔｉｎ（Invitrogen）を用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３−Ｆ細胞に３種類の発現ベクターを組み合わせてトランスフェクションし（表１参照）、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地で７２時間培養した。馴化培地を回収し、遠心分離により浄化した。最初は馴化培地をＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した。カラムをＴＢＳで洗浄し、結合したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含むＴＢＳで溶出した。続いてイミダゾール溶出フラクションを抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースカラムにアプライし、結合したタンパク質を１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドを含むＴＢＳで溶出した。溶出タンパク質をＰＢＳに対して透析した。透析後の精製物を０．２２μｍのディスクシリンジフィルター（Millipore、＃SLGV033RS）でろ過滅菌し、―８０℃で保存した。組換えＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８および組換えラミニン５１１Ｅ８の作製に使用した発現ベクターの組み合わせを表４に示す。【００５７】
【表４】
0005858411.tif 000005
【００５８】
（３）組換えＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
精製タンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードに用いるＢＣＡ法で定量した。精製タンパク質の純度は非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色して確認した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示した。いずれの組換えラミニン５１１Ｅ８およびＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８も、非還元条件ではα５鎖Ｅ８の単量体とβ１鎖Ｅ８−γ１鎖Ｅ８二量体の２つのバンドが検出され、ヘテロ三量体タンパク質として精製できていることが確認された。【００５９】
〔実施例２：ＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８とコラーゲンまたはゼラチンとの結合活性の検討〕
（１）結合活性の測定
Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチンtype I-A：豚由来）またはゼラチン（Sigma G1890-100G：豚由来）を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３で１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴イムノプレート（Nunc Maxisorp）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して４℃で一晩コーティングした。プレート中のコーティング液を捨て、１％ＢＳＡを含むＴＢＳを添加し、室温で２時間インキュベートしてブロッキングを行った。その後、プレートを０．１％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（以下、「ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ」と記す)で２回洗浄した。続いてｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ中に濃度を変えて希釈した各ＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８溶液を添加し、室温で３時間振とうさせた。プレートをｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、抗ラミニンα５抗体５Ｄ６抗血清をｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３０００倍希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。室温で１時間振とうさせた後、プレートをｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体をｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３０００倍希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で１時間振とうした。プレートをｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ溶液５０μｌ／ｗｅｌｌを添加して発色させた。２．５Ｍ硫酸を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加して発色を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。【００６０】
（２）実験結果
Ｉ型コラーゲンに対する結合活性の結果を図２に示した。ＣＢＤを付加していないラミニン５１１Ｅ８（図中ＬＮ５１１−Ｅ８）はほとんどＩ型コラーゲンに結合しないのに対し、ＣＢＤをβ１鎖またはγ１鎖に１つだけ付加したＣＢＤ−Ｅ８（β）とＣＢＤ−Ｅ８（γ）は顕著にＩ型コラーゲンに結合していた。また、ＣＢＤをβ１鎖とγ１鎖の２つに付加したＣＢＤ−Ｅ８（βγ）と、ＣＢＤをαβγの３鎖すべてに付加したＣＢＤ−Ｅ８（αβγ）は、ＣＢＤが一つだけ付加されたものにくらべてさらに低濃度でＩ型コラーゲンと結合し、１０ｎＭで飽和に達した。この結果から、ＣＢＤの付加数が１つ（１価）よりも２つ（２価）以上の方がＩ型コラーゲンに対する結合活性が、概ね１桁高いことがわかった。ただし、２価と３価の間には違いは認められなかった。なお、示していないが、ＣＢＤをα５鎖とβ１鎖の２つに付加したＣＢＤ−Ｅ８（αβ）、ＣＢＤをα５鎖とγ１鎖の２つに付加したＣＢＤ−Ｅ８（αγ）も、ＣＢＤ−Ｅ８（βγ）と同等の結合活性を有していた。【００６１】
ゼラチンに対する結合活性の結果を図３に示した。Ｉ型コラーゲンに対する結合活性と同様に、ＣＢＤを付加していないＬＮ５１１−Ｅ８はほとんどゼラチンに結合しなかったが、ＣＢＤを付加したＬＮ５１１−Ｅ８はゼラチンに顕著に結合し、ＣＢＤ１価より２価以上の方が概ね３倍結合が強いことがわかった。【００６２】
〔実施例３：ＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養〕
（１）ヒトｉＰＳ細胞
ヒトｉＰＳ細胞は独立行政法人医薬基盤研究所生物資源バンクより購入した株（クローン名：ｔｉｃ（ＪＣＲＢ１３３１））を使用した。ｔｉｃ細胞は、独立行政法人医薬基盤研究所生物資源バンクが推奨する方法に従い、マウスフィーダー細胞との共培養で維持した。共培養ディッシュに、１Ｕ／ｍｌディスパーゼ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２を添加し、ｔｉｃ細胞のコロニーをスクレーパーでかき集めた。このｔｉｃ細胞コロニーとマウスフィーダー細胞を含む溶液をＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー１００μｍに通し、ストレーナーを洗浄することでｔｉｃ細胞コロニーを分離した。残留したコロニーをｍＴｅＳＲ１（商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES社）培地で回収し、Ｐ−１０００ピペットマンで細かく砕いた後、ｍＴｅＳＲ１培地に再懸濁し、マトリゲルをコートした培養器に播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下、毎日培養液交換を行い、４〜５日まで拡大培養を行った。このように拡大培養された細胞を実験に供した。【００６３】
（２）培養方法
Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチンtype I-C：豚由来）をＰＢＳで２００μｇ／ｍｌに希釈したもの、あるいは０．１％ゼラチン（Sigma）を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ１２穴プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、コラーゲンコート条件ではコラーゲン溶液をアスピレートして０．１％ゼラチンを１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った。その後ゼラチン液を除き、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。各ラミニンＥ８を８ｎＭになるようＰＢＳで希釈して１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。
マトリゲルコートディッシュ（10cm）上で培養していた上記ｉＰＳ細胞の培地をアスピレートし、４．８ｍＭ ＥＤＴＡ入りＰＢＳを添加して室温で３分間インキュベートした。ＥＤＴＡ液を除いてＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Gibco）１ｍｌを添加して３７℃で１分間インキュベートし、ｉＰＳ細胞を剥がした。細胞をサプリメント添加ｍＴｅＳＲ１培地（STEMCELL TECHNOLOGIES社）で懸濁し、１５ｍｌチューブに移した後、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清をアスピレートした後、細胞をサプリメント添加ｍＴｅＳＲ１培地で７．６×１０４個／ｍｌになるように懸濁した。プレート中のＰＢＳをアスピレートして吸引除去した後、ｉＰＳ細胞を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種した。プレートは３７℃５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培地交換を毎日行い、３日間培養した。【００６４】
（３）実験結果
Ｉ型コラーゲンコート条件における培養３日目のｉＰＳ細胞の写真を図４に示した。図４から明らかなように、Ｉ型コラーゲンコートのみ（図中Col I only）ではほとんどｉＰＳ細胞の増殖が認められなかった。ＣＢＤを付加していないＬＮ５１１−Ｅ８（図中+511E8）を添加した場合も同様に、ほとんどｉＰＳ細胞の増殖が認められなかった。一方、ＣＢＤが１価のＬＮ５１１−Ｅ８（図中+CBD-E8(β)および+CBD-E8(γ)）を添加した条件では、わずかにｉＰＳ細胞の増殖が認められた。ＣＢＤが２価のＬＮ５１１−Ｅ８（図中+CBD-E8(βγ)）を添加した条件では、ＣＢＤが１価のＬＮ５１１−Ｅ８よりｉＰＳ細胞の数が多くなっている様子が観察された。【００６５】
ゼラチンコート条件における培養３日目のｉＰＳ細胞の写真を図５に示した。図５から明らかなように、ゼラチンコート条件ではＩ型コラーゲンコート条件よりさらに顕著な差が観察された。ゼラチンのみ（図中Gelatin only）やＣＢＤを付加していないＬＮ５１１−Ｅ８（図中+511E8）を添加した条件では、わずかにｉＰＳ細胞の増殖が認められ、ＣＢＤが１価のＬＮ５１１−Ｅ８（図中+CBD-E8(β)および+CBD-E8(γ)）を添加した条件ではｉＰＳ細胞の増殖が確認され、ＣＢＤが２価のＬＮ５１１−Ｅ８（図中+CBD-E8(βγ)）を添加した条件では、さらに細胞数が増えている様子が観察された。【００６６】
〔実施例４：ラミニン５１１以外のラミニンアイソフォームに由来する組換えＣＢＤ付加ラミニンＥ８の作製〕
実施例１で作製した各鎖Ｅ８発現ベクター以外に、α５鎖以外のラミニンα鎖に由来するヒトラミニンＥ８フラグメントの発現ベクター（α１鎖Ｅ８、α２鎖Ｅ８、α３鎖Ｅ８、α４鎖Ｅ８）、ラミニンβ２鎖Ｅ８およびＣＢＤ付加ラミニンβ２鎖Ｅ８の発現ベクターをそれぞれ作製した。γ鎖については、実施例１で作製したラミニンγ１鎖Ｅ８およびＣＢＤ付加ラミニンγ１鎖Ｅ８の発現ベクターを使用した。これらの発現ベクターを組み合わせて宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ラミニン５１１以外のラミニンアイソフォームに由来する組換えラミニンＥ８およびＣＢＤ付加ラミニンＥ８を作製した。【００６７】
（１）発現ベクターの構築
（１−１）ヒトラミニンα１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
クローニング用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（Stratagene社）を鋳型として、以下のプライマーセット（i）を用いてＰＣＲを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＶの５’側に制限酵素ＡｓｃＩ認識配列と６×ＨｉｓタグをコードするＤＮＡが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）を作製した。
(i) ６×Ｈｉｓタグ・ＡｓｃＩサイト導入用プライマー
5’-ATGATGATGGGCGCGCCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号７）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGC-3’（reverse、配列番号８）
次に、ヒトラミニンα１鎖のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 279, 10946-10954, 2004）を鋳型としてＰＣＲを行い、α１鎖（アクセッション番号：ＮＰ＿００５５５０（表２参照）のＰｈｅ１８７８−Ｇｌｎ２７００）に相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＢａｍＨＩ認識配列が付加されている。
増幅したｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ認識配列と６×Ｈｉｓタグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩ部位に挿入した。この後、５’側の６×Ｈｉｓタグとα１鎖Ｅ８フラグメントをコードする配列を含むｃＤＮＡを制限酵素ＡｓｃＩとＢａｍＨＩとで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Invitrogen）の当該部位に挿入し、ヒトα１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）の発現ベクターｐＳｅｃ−ＬＮα１Ｅ８を作製した。【００６８】
（１−２）ヒトラミニンα２鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
ヒトラミニンα２鎖のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 283, 28149-28157, 2008）を鋳型としてＰＣＲを行い、α２鎖（アクセッション番号：ＮＰ＿０００４１７（表２参照）のＬｅｕ１９００−Ａｌａ２７２２）に相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＢａｍＨＩ認識配列（GGATCC）が付加されている。
増幅したｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ認識配列と６×Ｈｉｓタグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩ部位に挿入した。この後、５’側の６×Ｈｉｓタグとα１鎖Ｅ８フラグメントをコードする配列を含むｃＤＮＡを制限酵素ＡｓｃＩとＢａｍＨＩとで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Invitrogen）の当該部位に挿入し、ヒトα２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）の発現ベクターｐＳｅｃ−ＬＮα２Ｅ８を作製した。【００６９】
（１−３）ヒトラミニンα３鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
ヒトラミニンα３鎖（ラミニン球状ドメインの４番目と５番目を除く）のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型としてＰＣＲを行い、α３鎖（アクセッション番号：ＮＰ＿０００２１８（表２参照）のＡｌａ５７９−Ａｌａ１３６４）に相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＸｂａＩ認識配列が付加されている。
増幅したｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ認識配列と６×Ｈｉｓタグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶとＸｂａＩ部位に挿入した。この後、５’側の６×Ｈｉｓタグとα３鎖Ｅ８フラグメントをコードする配列を含むｃＤＮＡを制限酵素ＡｓｃＩとＮｏｔＩとで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Invitrogen）の当該部位に挿入し、ヒトα３鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）の発現ベクターｐＳｅｃ−ＬＮα３Ｅ８を作製した。【００７０】
（１−４）ヒトラミニンα４鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
５’側から、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・６×Ｈｉｓタグ・α４鎖Ｅ８フラグメントを順にコードするｃＤＮＡ断片を獲得するために、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・６×ＨｉｓタグをコードするｃＤＮＡ断片とα４鎖Ｅ８をコードするｃＤＮＡ断片をそれぞれ取得し、エクステンションＰＣＲによってそれら２種類の断片を連結・増幅した。
まず、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８発現ベクター（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型として、以下のプライマーセット（ii）を用いてＰＣＲを行い、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・６×Ｈｉｓタグに相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(ii) シグナルペプチド配列・６×Ｈｉｓタグ配列増幅用プライマー
5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’（forward、配列番号９）
5’-CATTGGCTTCATCATGATGATGATGATGATGAAGC-3’（reverse、配列番号１０）【００７１】
次に、ヒトラミニンα４鎖のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Hayashi et al., Biochem Biophys Res Commun., 299, 498-504, 2002）を鋳型としてＰＣＲを行い、α４鎖（アクセッション番号：ＮＰ＿００２２８１（表２参照）のＧｌｕ６２９−Ｈｉｓ１４４９）に相当する領域を増幅した。なお、フォワード（forward）プライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＥｃｏＲＩ認識配列がそれぞれ付加されている。
得られた２種類のｃＤＮＡ断片を、エクステンションＰＣＲにより連結・増幅させ、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・６×Ｈｉｓタグ・α４鎖Ｅ８をコードするｃＤＮＡ断片を得た。増幅したｃＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Invitrogen）の当該部位に挿入し、ヒトα４鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）の発現ベクターｐＳｅｃ−ＬＮα４Ｅ８を作製した。【００７２】
（１−５）ヒトラミニンβ２鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
ヒトラミニンβ２鎖のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 283, 28149-28157, 2008）を鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトラミニンβ２Ｅ８（アクセッション番号：ＮＰ＿００２２８３（表２参照）のＬｅｕ１５７３−Ｇｌｎ１７９８）に相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＥｃｏＲＩ認識配列が付加されている。ｃＤＮＡの５’末端にＨＡタグをコードするＤＮＡを付加した断片をそれぞれＰＣＲで増幅した。
増幅したｃＤＮＡを、ＨＡタグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、５’側のＨＡタグとβ２鎖Ｅ８フラグメントをコードする配列を含むｃＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩとで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Invitrogen）の当該部位に挿入し、ヒトβ２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）の発現ベクターｐＳｅｃ−ＬＮβ２Ｅ８を作製した（Taniguchi Y. et al., J.Biol.Chem. 2009, 284, 7820-7831）。【００７３】
（１−６）ＣＢＤ付加ヒトラミニンβ２鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
ＣＢＤ（アクセッション番号：ＮＰ＿９９７６４７（表３参照）のＶａｌ２７６−Ｔｈｒ６０４）のｃＤＮＡの５’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加して断片をＰＣＲで増幅した。ヒトラミニンβ２Ｅ８のｃＤＮＡの５’末端にＨＡタグをコードするＤＮＡを付加した断片をＰＣＲで増幅し、ＣＢＤをコードするＤＮＡ断片とＰＣＲで連結し、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Invitrogen）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮβ２Ｅ８を作製した。
ｐＳｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮβ２Ｅ８により発現されるタンパク質（ＣＢＤ−ＬＮβ２Ｅ８）のアミノ酸配列を配列番号１１に、当該タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｓｅｃ−ＣＢＤ−ＬＮβ２Ｅ８に含まれる）の塩基配列を配列番号１２に示した。【００７４】
（２）組換えラミニンＥ８およびＣＢＤ付加ラミニンＥ８の発現および精製
組換えラミニンＥ８およびＣＢＤ付加ラミニンＥ８は、実施例１に記載の方法に従い、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて作製した。培地中に分泌された組換えタンパク質は、実施例１に記載の方法に従い、馴化培地からＮｉ−ＮＴＡアガロースと抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースを用いる２段階のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製した組換えタンパク質はＰＢＳに対して透析した後、２２μｍのディスクディスクシリンジフィルター（Millipore, ＃SLGV033RS）でろ過滅菌し、―８０℃で保存した。組換えＣＢＤ付加ラミニンＥ８および組換えラミニンＥ８の作製に使用した発現ベクターの組み合わせを表５に示す。【００７５】
【表５】
0005858411.tif 000006
【００７６】
（３）組換えラミニンＥ８およびＣＢＤ付加ラミニンＥ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
精製タンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードに用いるＢＣＡ法で定量した。精製タンパク質の純度は非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色して確認した。
各アイソフォームの組換えラミニンＥ８およびＣＢＤ付加ラミニンＥ８ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図６〜１４に示した。いずれの組換えラミニンＥ８およびＣＢＤ付加ラミニンＥ８も、非還元条件ではα鎖Ｅ８の単量体とβ鎖Ｅ８−γ１鎖Ｅ８二量体の２つのバンドが検出され、ラミニン５１１Ｅ８およびＣＢＤ付加ラミニン５１１Ｅ８と同様のヘテロ三量体タンパク質として精製できていることが確認された。【００７７】
〔実施例５：ラミニン５１１以外のラミニンアイソフォームに由来する組換えＣＢＤ付加ラミニンＥ８のコラーゲン結合活性の検討〕
（１）結合活性の測定
実施例２（１）の「抗ラミニンα５抗体５Ｄ６抗血清をｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３０００倍希釈したもの」に代えて「抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Sigma）をｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２０００倍希釈したもの」を用いた以外は、実施例２（１）の方法と同じ方法でコラーゲン結合活性を測定した。【００７８】
Ｉ型コラーゲンに対する結合活性の結果を図１５〜２３に示した。ＣＢＤを付加していないラミニンＥ８（図中ＬＮ１１１Ｅ８、ＬＮ１２１Ｅ８、ＬＮ２１１Ｅ８、ＬＮ２２１Ｅ８、ＬＮ３１１Ｅ８、ＬＮ３２１Ｅ８、ＬＮ４１１Ｅ８、ＬＮ４２１Ｅ８、ＬＮ５２１Ｅ８）はほとんどＩ型コラーゲンに結合しないのに対し、ＣＢＤをβ鎖に１つだけ付加した１１１β、１２１β、２１１β、２２１β、３１１β、３２１β、４１１β、４２１β、５２１βは顕著にＩ型コラーゲンに結合していた。また、ＣＢＤをβ鎖とγ１鎖の２つに付加した１１１βγ、１２１βγ、２１１βγ、２２１βγ、３１１βγ、３２１βγ、４１１βγ、４２１βγ、５２１βγは、ＣＢＤが一つだけ付加されたものにくらべてさらに低濃度でＩ型コラーゲンと結合した。この結果から、ＣＢＤの付加数が１つ（１価）よりも２つ（２価）の方がＩ型コラーゲンに対する結合活性が、１０倍以上高いことがわかった。【００７９】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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