(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を導入可能なチャネルが形成され、チャネルの所定箇所に高分子ゲルが配され、チャネルの両端に電極が配され、
前記チャネルの少なくとも一部は、前記高分子ゲルを保持するゲル保持部により構成され、かつ、
前記高分子ゲルが、負極から正極に向かって凹となる形状とされた核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項２】
前記高分子ゲルが、アニオン性官能基を含有する請求項１記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項３】
前記ゲル保持部の前記高分子ゲルに対する接触部位は、親水化処理が施されている請求項１又は２記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項４】
前記ゲル保持部の前記高分子ゲルに対する接触部位は、シリカによって製膜されている請求項３記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項５】
前記高分子ゲルは、所定形状を有する前記ゲル保持部に嵌合されることで保持される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項６】
前記高分子ゲルと負極端との間のチャネル容積が、正極端と高分子ゲルとの間のチャネル容積に比して大きく形成されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項７】
前記電極は、スパッタまたは蒸着により形成された請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項８】
前記電極は、金または白金を含んでなる請求項７記載の核酸濃縮回収用カートリッジ。
【請求項９】
緩衝液が充填され、所定箇所に高分子ゲルが配されたチャネルの両端に電圧を印加し、
高分子ゲルと負極端との間に導入された核酸を電気泳動させ、正極端へ移動する核酸を高分子ゲルによって堰き止める手順を含む核酸濃縮回収方法。
【請求項１０】
前記手順において、前記高分子ゲルに、アニオン性官能基を含有させる請求項９記載の核酸濃縮回収方法。
【請求項１１】
前記手順において、前記高分子ゲルを、核酸の泳動方向に凹となる形状に前記チャネルに配する請求項９又は１０記載の核酸濃縮回収方法。
【請求項１２】
前記電気泳動の後、前記チャネルの両端に逆電圧を印加する手順を含む請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸濃縮回収方法。
【請求項１３】
基板上に形成されたチャネル内に導入されたモノマー溶液を光重合によって所定の形状にゲル化させて前記高分子ゲルを形成する工程を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法。
【請求項１４】
前記工程において、アニオン性官能基を有するモノマー溶液を用いる請求項１３記載の核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法。
【請求項１５】
前記工程において、前記高分子ゲルを、負極から正極に向かって凹となる形状にゲル化させる請求項１３又は１４記載の核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸濃縮回収用カートリッジ、核酸濃縮回収方法、及び該カートリッジの製造方法に関する。より詳しくは、チャネル内での電気泳動によって核酸を濃縮し、回収するカートリッジ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅反応はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている。例えば、医学分野では、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列に基づいた診断が行われており、農業分野では遺伝子組み換え作物の判定等でＤＮＡ鑑定が活用されている。
【０００３】
核酸増幅反応では、微量サンプル中の核酸を高効率に増幅して検出できる。しかし、サンプルに含まれる核酸が極めて微量である場合には、検出下限量未満となる場合がある。さらに、サンプル中の核酸濃度が極めて低い場合には、反応場へ導入可能な容積のサンプル中に増幅対象核酸が含まれなかったために検出が不能となる場合がある。これらの場合には、サンプル中の核酸を予め濃縮して反応場に導入することが有効となる。
【０００４】
従来、核酸の濃縮方法としては、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法、核酸を吸着するカラムやフィルタ等を用いた方法、磁性シリカビーズを用いた方法等が知られている。例えば、特許文献１には、核酸吸着能を有する多孔質担体を用いた核酸の濃縮方法が開示されている。また、非特許文献１には、キャピラリー電気泳動によって核酸を濃縮する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−０８０５５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"On-line sample preconcentration in capillary electrophoresis: Fundamentals and applications." Journal of Chromatography A., Vol.1184 (2008)p.504-541
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のフェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法は、有害な有機溶媒を使用する必要があり、遠心分離操作等に手間がかかっていた。また、核酸を吸着するカラムやフィルタ等を用いた方法は、カラムやフィルタ等が目詰まりを起こしやすく、操作の簡便性からも課題があった。
【０００８】
そこで、本技術は、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を濃縮し回収できる核酸濃縮回収用カートリッジを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本技術では、液体を導入可能なチャネルが形成され、チャネルの所定箇所に高分子ゲルが配され、チャネルの両端に電極が配され、前記チャネルの少なくとも一部は、前記高分子ゲルを保持するゲル保持部により構成され、かつ、前記高分子ゲルが、負極から正極に向かって凹となる形状とされた核酸濃縮回収用カートリッジを提供する。
この核酸濃縮回収用カートリッジにおいて、前記高分子ゲルはアニオン性官能基を含有することが好ましい。
また、前記ゲル保持部の前記高分子ゲルに対する接触部位は、親水化処理が施されてもよい。このとき、前記ゲル保持部の前記高分子ゲルに対する接触部位は、シリカによって製膜されてもよい。さらに、前記高分子ゲルは、所定形状を有する前記ゲル保持部に嵌合されることで保持されていてもよい。
さらに、この核酸濃縮回収用カートリッジにおいて、前記高分子ゲルと負極端との間のチャネル容積が、正極端と高分子ゲルとの間のチャネル容積に比して大きく形成されていることが好ましい。
また、前記電極は、スパッタまたは蒸着により形成されていてもよい。このとき、前記電極は、金または白金を含んでなるものであってもよい。
【００１０】
また、本技術では、緩衝液が充填され、所定箇所に高分子ゲルが配されたチャネルの両端に電圧を印加し、高分子ゲルと負極端との間に導入された核酸を電気泳動させ、正極端へ移動する核酸を高分子ゲルによって堰き止める手順を含む核酸濃縮回収方法も提供する。
この核酸濃縮回収方法では、移動する核酸を高分子ゲルによって堰き止めることによって、核酸を高分子ゲル近傍に濃縮できる。
この核酸濃縮回収方法の前記手順において、前記高分子ゲルにはアニオン性官能基を含有させることが好ましく、また、前記高分子ゲルは核酸の泳動方向に凹となる形状に前記チャネルに配することが好ましい。
さらに、この核酸濃縮回収方法においては、前記電気泳動の後、前記チャネルの両端に逆電圧を印加する手順を行うことが好ましい。
【００１１】
さらに、本技術では、基板上に形成されたチャネル内に導入されたモノマー溶液を光重合によって所定の形状にゲル化させて前記高分子ゲルを形成する工程を含む、上記の核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法も提供する。
この製造方法の前記工程においては、アニオン性官能基を有するモノマー溶液を用いることが好ましく、また、前記高分子ゲルを負極から正極に向かって凹となる形状にゲル化させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本技術により、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を濃縮し回収できる核酸濃縮回収用カートリッジが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本技術の第１実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの構成と、該カートリッジを用いた核酸濃縮回収方法の手順を説明する模式図である。
【図２】同実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明する模式図である。
【図３】同実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明する模式図である。
【図４】同実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明する模式図である。
【図５】同実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明する模式図である。
【図６】同実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明する模式図である。
【図７】同実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明する模式図である。
【図８】本技術の第２実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの構成と、該カートリッジを用いた核酸濃縮回収方法の手順を説明する模式図である。
【図９】高分子ゲル付近のチャネルの蛍光観察像を示す図面代用写真である（実施例２）。
【図１０】電気泳動開始後のゲル界面の蛍光強度の経時変化を示すグラフである（実施例２）。
【図１１】高分子ゲルに含有させるアニオン性官能基のｐＫａを変化させた核酸濃縮回収用チップの高分子ゲル付近のチャネルの蛍光観察像を示す図面代用写真である（実施例３）。
【図１２】高分子ゲル付近のチャネルの蛍光観察像を示す図面代用写真である（実施例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術の第１実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジと核酸濃縮回収方法
（１）核酸濃縮回収用カートリッジ
（２）核酸濃縮回収方法
２．本技術の第１実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法と核酸濃縮回収
用カートリッジの変形例
（１）核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法
（２）核酸濃縮回収用カートリッジの変形例
（３）核酸濃縮回収用カートリッジの他の変形例
３．本技術の第２実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジと核酸濃縮回収方法
（１）核酸濃縮回収用カートリッジ
（２）核酸濃縮回収方法
４．本技術の第２実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法
【００１５】
１．本技術の第１実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジと核酸濃縮回収方法
（１）核酸濃縮回収用カートリッジ
図１は、本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジの構成と、該カートリッジを用いた核酸濃縮回収方法の手順を説明する模式図である。
【００１６】
図１（Ａ）中、符号１で示す核酸濃縮回収用カートリッジは、基板上に形成されたチャネル１１と、チャネル１１の両端にそれぞれ配された正極１２と負極１３とを有する。チャネル１１内には液体が導入可能とされており、チャネル１１の正極１２と負極１３との間には高分子ゲル１４が配されている。また、正極１２と負極１３には電源Ｖが接続され、チャネル１１に導入された液体に電圧を印加／解除できるよう構成されている。
【００１７】
基板の材質は、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン）とできる。
【００１８】
正極１２及び負極１３については、好適にはスパッタ又は蒸着された金（Ａｕ）または白金（Ｐｔ）を含んでなるものが採用される。
【００１９】
高分子ゲル１４は、ポリアクリルアミドが好適に採用され、より好ましくはアニオン性官能基を含有するポリアクリルアミド、さらに好ましくは酸解離定数（ｐＫａ）が１〜５であるアニオン性官能基を含有するポリアクリルアミドが用いられる。なお、本技術において、アクリルアミドとは、アクリルアミド又は（メタ）アクリルアミドを意味するものとする。
【００２０】
アニオン性官能基としては、特に限定されないが、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸等のカルボン酸；シュウ酸、フタル酸等の多塩基酸；クエン酸、グリコール酸、乳酸等のヒドロキシ酸；アクリル酸、メタクリル酸等の不飽和酸または不飽和多塩基酸；グリシン等のアミノ酸、リン酸の部分エステル、硫酸の部分エステル、ホスホン酸、スルホン酸などが挙げられる。
【００２１】
具体的には、例えばカルボン酸としては、蟻酸（ｐＫａ：３．５５）、酢酸（ｐＫａ：４．５６）、プロピオン酸（ｐＫａ：４．６７）、ブタン酸（ｐＫａ：４．６３）、ペンテン酸（ｐＫａ：４．６８）、ヘキサン酸（ｐＫａ：４．６３）、ヘプタン酸（ｐＫａ：４．６６）、パルミチン酸（ｐＫａ：４．６４）、ステアリン酸（ｐＫａ：４．６９）などの脂肪族モノカルボン酸；コハク酸（ｐＫａ1：４．００、ｐＫａ2：５．２４）、グルタル酸（ｐＫａ1：４．１３、ｐＫａ2：５．０３）、アジピン酸（ｐＫａ1：４．２６、ｐＫａ2：５．０３）、ピメリン酸（ｐＫａ1：４．３１、ｐＫａ2：５．０８）、スベリン酸（ｐＫａ1：４．３５、ｐＫａ2：５．１０）、アゼライン酸（ｐＫａ1：４．３９、ｐＫａ2：５．１２）、リンゴ酸（ｐＫａ1：３．２４、ｐＫａ2：４．７１）、テレフタル酸（ｐＫａ1：３．５４、ｐＫａ2：４．４６）などの脂肪族又は芳香族のジカルボン酸；クロトン酸（ｐＫａ：４．６９）、アクリル酸（ｐＫａ：４．２６）、メタクリル酸（ｐＫａ：４．６６）などの不飽和カルボン酸；アニス酸（ｐＫａ：４．０９）、ｍ−アミノ安息香酸（ｐＫａ1：３．１２、ｐＫａ2：４．７４）、ｍ−，ｐ−クロロ安息香酸（ｐＫａ1：３．８２、ｐＫａ2：３．９９）、ヒドロキシ安息香酸（ｐＫａ1：４．０８、ｐＫａ2：９．９６）等の置換安息香酸類；クエン酸（ｐＫａ1：２．８７、ｐＫａ2：４，３５、ｐＫａ3：５．６９）などのポリカルボン酸及びその誘導体を挙げることができる。
【００２２】
アニオン性官能基を含有するアクリルアミドモノマーは、特にアクリルアミドアルカンスルホン酸が好ましい。スルホン酸としては、例えば、スチレンスルホン酸（ｐＫａ＝−２．８）、ｍ−アニリンスルホン酸（ｐＫａ＝３．７４）、ｐ−アニリンスルホン酸（ｐＫａ＝３．２３）、２−（メタ）アクリルアミド−２−アルキル（炭素数１〜４）プロパンスルホン酸、より具体的には２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ｐＫａ＝−１．７）等の重合性の不飽和基を有するスルホン酸が挙げられる。
【００２３】
ポリアクリルアミドゲル中のアニオン性官能基の濃度（重量％）は、０〜３０％が好ましい。
【００２４】
（２）核酸濃縮回収方法
図１（Ｂ）〜（Ｄ）を参照して、核酸濃縮回収用カートリッジ１を用いた核酸濃縮回収方法の手順を説明する。
【００２５】
まず、チャネル１１の高分子ゲル１４と負極１３との間の領域１１３に核酸を含むサンプルを導入する（図１（Ｂ）参照）。このとき、チャネル１１内には電気泳動用の緩衝液を満たしておく。
【００２６】
次に、正極１２と負極１３との間に電圧を加えて緩衝液に電圧を印加し、核酸の電気泳動を行う。負に帯電した核酸はチャネル１１内を正極１２方向へ電気泳動される。この際、高分子ゲル１４が核酸の移動を阻み、核酸を堰き止めることによって、高分子ゲル１４の界面とその近傍に核酸が濃縮される（図１（Ｃ）参照）。電気泳動時間は、チャネル１１のサイズに応じて適宜設定されるが、例えば１０秒〜１０分程度でよい。なお、高分子ゲルの「界面」とは、高分子ゲル１４と領域１１３側に充填された緩衝液との接触面を指す。
【００２７】
最後に、領域１１３の高分子ゲル１４近傍の緩衝液をマイクロピペット２等によって吸引することによって、濃縮された核酸を回収する（図１（Ｄ）参照）。
【００２８】
このとき、高分子ゲル１４にアニオン性官能基を含有させておくことにより、負に帯電した核酸とアニオン性官能基との電気的反発力によって、核酸が高分子ゲル１４の内部にまで移動することを防止できる。核酸が高分子ゲル１４の内部にまで移動したり、さらに高分子ゲル１４内を通過して正極１２側の領域１１２にまで移動したりすると、回収される核酸量が減少してしまう。アニオン性官能基は酸解離定数（ｐＫａ）が１〜５であるものが好ましい。ｐＫａが低く負電荷が大きい官能基である程、電気的反発力によって核酸の高分子ゲル１４内への移動を阻止する効果が高い。
【００２９】
さらに、領域１１３の高分子ゲル１４近傍の緩衝液を吸引する際に、正極１２と負極１３に逆電圧を短時間印加することも、核酸の回収量を高めるために有効である。核酸の回収時に短時間逆電圧を印加することで、ゲル界面に存在する核酸や界面近くのゲル内部に存在する核酸を、領域１１３の高分子ゲル１４近傍に移動させ、マイクロピペット２によって吸引、回収できる。逆電圧を印加する時間は、チャネル１１のサイズに応じて適宜設定されるが、例えば１〜１０秒程度でよい。
【００３０】
２．核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法と核酸濃縮回収用カートリッジの変形例
（１）核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法
本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジ１は、基板上に形成されたチャネル１１内に導入されたモノマー溶液を光重合によって所定の形状にゲル化させて高分子ゲル１４を形成することによって製造することができる。
【００３１】
基板上へのチャネル１１の成形は、例えば、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。なお、チャネル１１はカートリッジ１上に１あるいは２以上形成することができる。
【００３２】
モノマー溶液には、アクリルアミドモノマーが好適に採用され、より好ましくはアニオン性官能基を含有するアクリルアミドモノマー、さらに好ましくは酸解離定数（ｐＫａ）が１〜５であるアニオン性官能基を含有するアクリルアミドモノマーが用いられる。モノマー溶液は、具体的には、特にアクリルアミドアルカンスルホン酸が好ましい。
【００３３】
正極１２及び負極１３については、好ましくは金（Ａｕ）または白金（Ｐｔ）をスパッタまたは蒸着することにより作製される。この点、関連技術に係るカートリッジでは、電極に白金線を用いるものがある。この場合、実験を行う度に白金線を核酸濃縮回収用カートリッジ内に配置する必要が生じ、更に白金線が高価である点等も鑑みると、カートリッジを使い捨てにすることができないでいた。一方、上述したように、本実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジ１では、金または白金をスパッタまたは蒸着することにより正極１２及び負極１３を作製し、予めカートリッジ１に電極を作製しておくので、カートリッジ１を簡便に取り扱うことができる。また、このような核酸濃縮回収用カートリッジ１については、関連技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジに比し、使い捨てにすることも可能である。従って、核酸濃縮回収用カートリッジ１では、サンプルの濃縮の際にサンプルのコンタミを防止することができる。
【００３４】
（２）核酸濃縮回収用カートリッジの変形例
図２〜図４は、本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジの変形例の構成を説明するための模式図である。
【００３５】
本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジにおいて、高分子ゲル１４は、核酸の泳動方向に凹となる形状にチャネル１１に配することが好ましい。具体的には、高分子ゲル１４を、上面視において負極１３から正極１２に向かって三角形（図２（Ａ））あるいは半円形（図２（Ｂ））に陥凹する形状として配置する。
【００３６】
正極１２と負極１３との間に電圧を印加し、負に帯電した核酸を正極１２方向へ電気泳動すると、移動する核酸が高分子ゲル１４によって堰き止められ、高分子ゲル１４近傍に濃縮される（図１（Ｃ）参照）。このとき、高分子ゲル１４を負極１３から正極１２に向かって陥凹する形状とすることで、凹部に濃縮される核酸を集めることができ、核酸の濃縮率を高めて効率良く回収することが可能となる。
【００３７】
高分子ゲル１４を核酸の泳動方向に凹となる形状とするためには、チャネル１１内に導入されたモノマー溶液を光重合によってゲル化させる際に、フォトマスクを用いた露光やレーザ光の走査などによって当該形状に併せた光照射を行う。
【００３８】
また、本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジにおいて、核酸を含むサンプルが導入される領域１１３（チャネル１１の高分子ゲル１４と負極１３との間の領域）のチャネル容積は、正極端と高分子ゲルとの間の領域１１２のチャネル容積に比して大きく形成してもよい（図３参照）。この場合、領域１１３の負極側を円弧状に形成し、負極１３についても円弧状に形成して配することが好適となる（図４参照）。図４に示す形状で核酸濃縮用回収用カートリッジが形成される際、円弧形状の中心角は、０〜３０度とすることが好適である。また、上記中心角を３０〜６０度とすることも好適である。更に、上記中心角を６０〜９０度とすることも好適である。更に、また、上記中心角を９０〜１２０度とすることも好適である。
【００３９】
領域１１３をより大きく形成することで、導入可能なサンプル溶液が増加するため、得られる濃縮核酸の量を増やすことができる。このとき、領域１１３の負極側及び負極１３を円弧状とすることで、より均一な電界を形成でき、核酸の濃縮効率を高めることができる。
【００４０】
（３）核酸濃縮回収用カートリッジの他の変形例
図５〜図７は、本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジの他の変形例の構成を説明するための模式図である。なお、以下、図５〜図７を参照しながら説明する本変形例では、図３に示す核酸濃縮用回収用カートリッジ１に基づいて、チャネル１１にゲル保持部１５が設けられる例を挙げるが、本技術はかかる例に限定されるものではない。例えば、図１、図２（Ａ）、図２（Ｂ）、図３を参照しながら説明した各核酸濃縮用回収用カートリッジ１にゲル保持部１５が設けられていてもよい。
【００４１】
本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジにおいて、チャネル１１の少なくとも一部は、高分子ゲル１４を保持するゲル保持部１５により構成されていることが好ましい（図５参照）。ゲル保持部１５は、例えば、高分子ゲル１４に対する接触部位に親水化処理が施されている。この場合、上記接触部位は、シリカによって製膜されていることが好ましい。
【００４２】
このように、ゲル保持部１５の高分子ゲル１４に対する接触部位が親水化処理されていることで、当該接触部位と高分子ゲル１４との親和性が向上し、電気泳動による核酸濃縮の際に高分子ゲル１４がずれ動くことを防止することができる。従って、本変形例に係る核酸濃縮用回収用カートリッジ１では、ゲル保持部１５が設けられていることで、より安定に核酸を濃縮し回収することができる。
【００４３】
また、本技術に係る核酸濃縮用回収用カートリッジ１では、ゲル保持部１５が所定の形状を有し、高分子ゲル１４はゲル保持部１５に嵌合されていてもよい。例えば、図６に示すように、ゲル保持部１５は、核酸の泳動方向と垂直な方向に、高分子ゲル１４の収容領域を広げるように陥凹した形状を有することで、高分子ゲル１４と嵌合することが可能である。また、例えば、図７に示すように、ゲル保持部１５は、微細な刻み目が複数形成された形状を有することでも、高分子ゲル１４と嵌合することが可能である。
【００４４】
このように、核酸濃縮用回収用カートリッジ１では、高分子ゲル１４がゲル保持部１５に嵌合可能であっても、電気泳動による核酸の濃縮の際に高分子ゲル１４がずれ動くことを防止することができる。従って、核酸濃縮用回収用カートリッジ１では、ゲル保持部１５が設けられていることで、より安定に核酸を濃縮し回収することができる。
【００４５】
３．本技術の第２実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジと核酸濃縮回収方法
（１）核酸濃縮回収用カートリッジ
図８は、本技術の第２実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの構成と、該カートリッジを用いた核酸濃縮回収方法の手順を説明する模式図である。
【００４６】
図８（Ａ）中、符号１で示す核酸濃縮回収用カートリッジは、カートリッジ内に形成されたチャネル１１と、チャネル１１の両端にそれぞれ配された正極１２と負極１３とを有する。チャネル１１内には液体が導入可能とされており、チャネル１１の正極１２と負極１３との間には高分子ゲル１４が配されている。また、正極１２と負極１３には電源Ｖが接続され、チャネル１１に導入された液体に電圧を印加／解除できるよう構成されている。
【００４７】
チャネル１１における、液体が導入される領域１１３は、円錐形状のチャンバを例に挙げて説明するが、かかる形状に限定されるものではない。例えば、角錐形状、角柱形状、円柱形状等、多様な形状を採用することが可能である。
【００４８】
また、核酸濃縮回収用カートリッジの外部の形状は、円柱形状を例に挙げて説明するが、かかる形状に限定されるものではない。例えば、角錐形状、角柱形状等、多様な形状を採用することが可能である。
【００４９】
また、高分子ゲル１４は、上述した第１実施形態に係る核酸濃縮用回収用カートリッジと同様の材質及び組成を選択することが可能である。
【００５０】
なお、ここでは図示して説明はしないが、図５〜図７を参照しながら説明した第１実施形態に係る核酸濃縮用回収用カートリッジに設けられたゲル保持部１５が、本実施形態に係る核酸濃縮用回収用チャンバに設けられることで、高分子ゲル１４がずれ動くことを防止してもよい。
【００５１】
（２）核酸濃縮回収方法
図８（Ｂ）〜（Ｄ）を参照して、本実施形態に係る核酸濃縮用回収用カートリッジを用いた核酸濃縮回収方法の手順を説明する。
【００５２】
まず、チャネル１１の高分子ゲル１４と負極１３との間の領域１１３に核酸を含むサンプルを導入する（図８（Ｂ）参照）。このとき、チャネル１１内には電気泳動用の緩衝液を満たしておく。
【００５３】
次に、正極１２と負極１３との間に電圧を加えて緩衝液に電圧を印加し、核酸の電気泳動を行う。負に帯電した核酸はチャネル１１内を正極１２方向へ電気泳動される。この際、高分子ゲル１４が核酸の移動を阻み、核酸を堰き止めることによって、高分子ゲル１４の界面とその近傍に核酸が濃縮される（図８（Ｃ）参照）。電気泳動時間は、チャネル１１のサイズに応じて適宜設定されるが、例えば１０秒〜１０分程度でよい。
【００５４】
最後に、領域１１３の高分子ゲル１４近傍の緩衝液をマイクロピペット２等によって吸引することによって、濃縮された核酸を回収する（図８（Ｄ）参照）。
【００５５】
このとき、本実施形態に係る核酸濃縮用回収用カートリッジにおいては、核酸を含むサンプルが導入される領域１１３（チャネル１１の高分子ゲル１４と負極１３との間の領域）のチャネル容積が、正極端と高分子ゲルとの間の領域１１２のチャネル容積に比して非常に大きく形成されている。そのため、非常に効率的に多量の核酸を濃縮し回収することができる。特に、図８に示すように、核酸が泳動する方向に向かうに従い、領域１１３が閉口する形状である場合には、短時間で、より効率的に多量の核酸を濃縮し回収することができる。
【００５６】
また、第１実施形態に係る核酸濃縮用回収用カートリッジと同様に、高分子ゲル１４にアニオン性官能基を含有させておくことにより、負に帯電した核酸とアニオン性官能基との電気的反発力によって、核酸が高分子ゲル１４の内部にまで移動することを防止できる。核酸が高分子ゲル１４の内部にまで移動したり、さらに高分子ゲル１４内を通過して正極１２側の領域１１２にまで移動したりすると、回収される核酸量が減少してしまう。アニオン性官能基は酸解離定数（ｐＫａ）が１〜５であるものが好ましい。ｐＫａが低く負電荷が大きい官能基である程、電気的反発力によって核酸の高分子ゲル１４内への移動を阻止する効果が高い。
【００５７】
さらに、領域１１３の高分子ゲル１４近傍の緩衝液を吸引する際に、正極１２と負極１３に逆電圧を短時間印加することも、核酸の回収量を高めるために有効である。核酸の回収時に短時間逆電圧を印加することで、ゲル界面に存在する核酸や界面近くのゲル内部に存在する核酸を、領域１１３の高分子ゲル１４近傍に移動させ、マイクロピペット２によって吸引、回収できる。逆電圧を印加する時間は、チャネル１１のサイズに応じて適宜設定されるが、例えば１〜１０秒程度でよい。
【００５８】
４．本技術の第２実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジの製造方法
本技術に係る核酸濃縮用回収用カートリッジは、チャネル１１内に導入されたモノマー溶液を光重合によって所定の形状にゲル化させて高分子ゲル１４を形成することによって製造することができる。
【００５９】
モノマー溶液には、アクリルアミドモノマーが好適に採用され、より好ましくはアニオン性官能基を含有するアクリルアミドモノマー、さらに好ましくは酸解離定数（ｐＫａ）が１〜５であるアニオン性官能基を含有するアクリルアミドモノマーが用いられる。モノマー溶液は、具体的には、特にアクリルアミドアルカンスルホン酸が好ましい。
【００６０】
正極１２及び負極１３については、好適には金（Ａｕ）または白金（Ｐｔ）を含んでなるものが採用される。この場合、正極１２及び負極１３は、金または白金をスパッタまたは蒸着することにより作製される。核酸濃縮回収用カートリッジ１では、金または白金をスパッタまたは蒸着することにより正極１２及び負極１３を作製し、予めカートリッジ１に電極を作製しておくので、カートリッジ１を簡便に取り扱うことができる。更に核酸濃縮回収用カートリッジ１では、ディスポーザブルにすることもできる。従って、核酸濃縮回収用カートリッジ１では、サンプルのコンタミを防止することができる。
【００６１】
以上、本技術に係る核酸濃縮回収用カートリッジについて説明してきた。各実施形態に係る核酸濃縮回収用カートリッジでは、高分子ゲル１４を用いるものを例に説明したが、高分子ゲル１４の代わりに市販されている透析膜、逆浸透膜、半透膜、イオン交換膜などの多孔質膜、又はセルロース、ポリアクリルニトリル、セラミック、ゼオライト、ポリスルホン、ポリイミド、パラジウムなどの多孔質膜等を用いてもよい。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞
１．核酸濃縮回収用カートリッジの製造
ＰＭＭＡ製基板に、幅５ｍｍ、長さ６０ｍｍ、深さ２ｍｍのチャネルを形成した。チャネルの両端には、白金線（径０．５ｍｍ、長さ１０ｍｍ、株式会社ニラコ）により形成した正極及び負極を配した。このチャネルに、「表１」及び「表２」に従って調製したアクリルアミド溶液（溶液２）を充填した。共焦点レーザ走査顕微鏡（オリンパス、ＦＶ１０００）を用いてアクリルアミドの光重合を行い、チャネル内に幅５ｍｍ、長さ３ｍｍの高分子ゲルを形成した。その後、重合していないアクリルアミド溶液を電気泳動用緩衝液（１×ＴＢＥ）に置換した。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
【表２】
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【００６５】
＜実施例２＞
２．核酸の濃縮回収
実施例１で作製した核酸濃縮回収用カートリッジを用いて核酸の濃縮を行った。チャネルの高分子ゲルと負極側との間に、サンプル（Ｃｙ３修飾オリゴヌクレオチド、２０ｍｅｒ、１μｇ／ｍＬ）を５００μｌ導入した。電極に電圧を印加し、７５Ｖ，１ｍＡにて電気泳動を行い、移動するサンプルを共焦点レーザ走査顕微鏡により観察した。
【００６６】
図９に、高分子ゲル付近のチャネルの蛍光観察像を示す。（Ａ）は電気泳動開始前、（Ｂ）は電気泳動開始３分後の観察像である。図９（Ｂ）では、電気泳動により負極側から正極側へ移動するサンプルが高分子ゲルによって堰き止められ、ゲル界面及びその近傍に濃縮されていることがＣｙ３の蛍光によって確認できる（図中矢印参照）。
【００６７】
図１０には、電気泳動開始後のゲル界面の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。電気泳動の開始後、ゲル界面の蛍光強度が増加し、電気泳動により負極側から正極側へ移動するサンプルが高分子ゲルによって堰き止められ、ゲル界面及びその近傍に濃縮されていることが分かる。蛍光強度に基づきサンプルの濃縮倍率を算出した結果、電気泳動開始３分後において４４倍の濃縮倍率が達成された。
【００６８】
電気泳動終了後、電極に逆電圧（７５Ｖ，１ｍＡ）を１０秒間印加し、濃縮されたサンプルをゲル界面から遊離させた。内部を陰圧にしたマイクロピペット用チップをゲル界面に接触させるようにして、１０μｌの濃縮サンプルを回収した。
【００６９】
＜実施例３＞
３．高分子ゲルの酸解離定数（ｐＫａ）の検討
本実施例では、高分子ゲルに含有させるアニオン性官能基のｐＫａと、核酸の濃縮効率との関係を検討した。実施例１で用いたアクリルアミド溶液（溶液２）中のアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸（ｐＫａ：１．０）を、アクリルアミドメチルプロパンカルボン酸（ｐＫａ：３．６）あるいはアクリルアミドメチルカルボン酸（ｐＫａ：４．６）として高分子ゲルを形成し、核酸濃縮回収用チップを作製した。各核酸濃縮回収用チップを用いて、実施例２に記載の方法により核酸の濃縮を行った。
【００７０】
図１１に、各核酸濃縮回収用カートリッジの高分子ゲル付近のチャネルの蛍光観察像を示す。アクリルアミドメチルプロパンカルボン酸（ｐＫａ：３．６）あるいはアクリルアミドメチルカルボン酸（ｐＫａ：４．６）を含有する高分子ゲルを形成した核酸濃縮回収用カートリッジでは、蛍光が広域に検出されており、サンプルの一部が高分子ゲル界面からゲル内にまで移動している。これに対して、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸（ｐＫａ：１．０）を含有する高分子ゲルを形成した核酸濃縮回収用カートリッジでは、蛍光がより狭い領域に帯状に検出され、サンプルがゲル界面及びその近傍に高効率に濃縮されていることが分かる。
【００７１】
＜実施例４＞
４．チャネル容量の検討
本実施例では、図４に示す形状の核酸濃縮回収用カートリッジを用いて核酸濃縮を行う条件で調製したものとした。高分子ゲルを境に負極側の円弧形状のチャネルは、半径：４０ｍｍ、中心角：９０度の扇形とし、深さ：２ｍｍとした。すなわち、上記チャネルの容量を２５１２（＝［４０×４０×３．１４×２］／４）μｌとした。また、正極及び負極には、金（Ａｕ）でスパッタしたものを用いた。ここで、核酸が高分子ゲル１４に堰止められる領域を幅２ｍｍ、長さ０．１ｍｍ、深さ２ｍｍとすると、理論上、核酸は６３００倍に濃縮される。
【００７２】
そして、実際にサンプルの電気泳動を行った結果を図１２及び表３に示す。図１２に、高分子ゲル付近のチャネルの蛍光観察像を示す。（Ａ）は電気泳動開始前、（Ｂ）は電気泳動開始３０秒後の観察像である。また、表３に電気泳動開始前及び電気泳動開始３０秒後の蛍光強度の測定結果を示す。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
このように、図４に示す形状の核酸濃縮回収用カートリッジを用いることで、電気泳動開始３０秒後において１２３０倍の濃縮倍率が達成された。図１０に示した結果と比しても、図４に示す形状の核酸濃縮回収用カートリッジでは、電気泳動開始３０秒後における濃縮倍率を大幅に向上させられることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本技術に係る核酸濃縮回収方法は、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を濃縮し回収できる。従って、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅反応のための核酸濃縮処理に適用され、核酸が微量あるいは極低濃度でしか含まれないサンプル中の核酸を検出するために用いられ得る。
【符号の説明】
【００７６】
１：核酸濃縮回収用カートリッジ、１１：チャネル、１２：正極、１３：負極、１４：高分子ゲル、１５：ゲル保持部、２：マイクロピペット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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