(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１の構造を有するペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
0006014240.tif 000003
【請求項２】
請求項１記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含むシワ改善および皮膚老化防止用化粧料組成物。
【請求項３】
前記化粧料組成物は、コラーゲン生合成促進機能があることを特徴とする請求項２記載の化粧料組成物。
【請求項４】
前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、アイエッセンス、エッセンス、クレンジングクリーム、クレジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ポディーエッセンス、ボディー洗浄剤、サンスクリーンクリーム、染毛剤、シャンプー、リンス、歯磨き粉、口腔清浄剤、整髪剤、養毛剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチおよび噴霧剤からなる群より選択される剤形を有するものであることを特徴とする請求項２記載の化粧料組成物。
【請求項５】
請求項１記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含むシワ改善および皮膚老化防止用薬学組成物。
【請求項６】
前記薬学組成物は、コラーゲン生合成促進機能があることを特徴とする請求項５記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチンの結合されたヘキサペプチド−２誘導体またはその薬学的に許容される塩およびその用途に関するものである。より具体的には、本発明は、ビオチンの結合されたヘキサペプチド−２誘導体またはその薬学的に許容される塩、その製造方法、それらを有効成分として含有する組成物、そして、それを用いたシワ改善および皮膚老化抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、保護機能、障壁機能、温度調節機能、排泄機能、呼吸機能などを果たす器官であり、表皮、真皮および皮下脂肪からなる。表皮は、最も薄い層で、角質形成細胞とメラニン細胞との有機的な結合からなっている。真皮は、皮膚の約９５％を占め、皮膚の保湿および保護を担当する層で、皮膚の弾力（シワ）に重要な役割を果たす代表的な蛋白質であるコラーゲンおよびエラスチンが網のように分布しており、血管と神経が存在し、アレルギー反応に関与する肥満細胞、およびＮａ−ＰＣＡまたはヒアルロン酸などの天然保湿因子も含有している。皮下脂肪は、表皮および真皮への栄養供給、体形決定、体温維持、外部的な衝撃吸収および皮下脂肪の下の細胞の保護などの役割を果たす。
【０００３】
このような皮膚は、年を取るにつれ、内因性または外因性の原因によって皮膚機能が急激に低下する老化が進む。老化が進むにつれ、皮膚の構成成分である表皮、真皮、および皮下脂肪の厚さが薄くなり、コラーゲンとエラスチンが細く緩くなって弾力が低下し、シワなどが生じる。また、年を取ったり、紫外線にさらされる場合、皮下脂肪細胞での脂肪合成が抑制され、皮膚の保護機能を失ってしまって急速な皮膚老化が現れ、顔、乳房および臀部では組織がたるんでシワが形成されるなど、美容上の美しさも追求できなくなる。
【０００４】
このような皮膚機能の低下を解決するための多くの手段が研究されているが、なかでも最も重要な部分は、皮膚細胞のコラーゲン生合成を促進させる方法を見出すことにある。このために、ビタミンＣおよびその誘導体、ＫＴＴＫＳペプチド、銅ペプチドおよび各種天然物抽出物が選別されて使用されているのが現状である。しかし、ビタミンＣおよびその誘導体は、安定性が低下し、長期的活性が低いという欠点があり、ＫＴＴＫＳペプチドおよび銅ペプチドは、コラーゲン生合成増進効果が低下するという欠点があり、天然物抽出物の場合には、活性も低下するだけでなく、試料の準備時点に対する活性度の差が非常に異なるという欠点がある。そのため、このようなすべての欠点を克服できる新概念のコラーゲン生合成増進素材の発掘が切実なのが実状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために先行資料を調べた結果、ヘキサペプチド−２（Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）が繊維芽細胞の成長を促進させ得るという実験結果を確認することができ（大韓民国公開特許第１０−２００８−００７５５３０号）、その多様な変形および接合を通じて新たな活性を付与する実験を行った結果、ビオチンが結合されているヘキサペプチド−２ペプチド誘導体の場合、繊維芽細胞におけるコラーゲン生成能に非常に優れていることを裏づけ、かかるペプチド誘導体を皮膚のシワ改善および皮膚老化改善の用途に使用できることを明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一目的は、繊維芽細胞におけるコラーゲン新生合成増進効果に非常に優れた新規ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩の製造方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を含むシワ改善および皮膚老化抑制用化粧料組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を含むシワ改善および皮膚老化抑制用薬学組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を個体の皮膚に塗布するステップを含む皮膚のシワ改善方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を個体の皮膚に塗布するステップを含む皮膚老化抑制方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチド誘導体は、シワ改善および皮膚老化防止効果に優れ、人体への適用時、皮膚刺激などの副作用なく本来の機能を効果的に発揮することができ、外用医薬品および化粧品の製造などの産業分野において非常に有用な物質である。また、本発明にかかるビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチド誘導体が含まれている化粧料および薬学的組成物の場合、皮膚内でコラーゲン生合成を増大させることによって皮膚の老化を抑制する既存の方法および施術をすべて代替できる製品として遜色がない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明にかかるビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチド誘導体の細胞毒性の測定結果を示すものである。
【図２】本発明にかかるビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチド誘導体のコラーゲン生合成増大効果に対する測定結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上記の目的を達成するための一態様として、本発明は、繊維芽細胞のコラーゲン生合成能力を極大化させる新規ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩に関するものである。
【００１５】
具体的には、本発明は、下記化学式１の構造を有するペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩に関するものである：
【化１】
0006014240.tif 000002
【００１６】
式中のペプチド誘導体は、ヘキサペプチド−２ペプチド（Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）にビオチンを結合させた新規なペプチド誘導体である。
【００１７】
本願において、用語「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。好適な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、三フッ化酢酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩は、ナトリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、およびアンモニウムなどを含むことができる。
【００１８】
他の態様として、本発明は、前記新規ペプチド誘導体を合成する方法に関するものである。
【００１９】
本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩は、当業界で知られた技術を用いて製造することができる。代表的な合成の方法を以下に説明しているが、本発明がこのような例に制限されるものではなく、当業界で知られた技術の範囲内で当業者が適切に変形して使用することができる。
【００２０】
本発明の具体的な実施例では、一般的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるＦｍｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ合成方法とｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ合成方法を利用し、保湿能のあるペプチド誘導体を合成した。
【００２１】
固相ペプチド合成方法は、１）レジンに保護化されたアミノ酸をローディングするステップと、２）アミノ酸の保護基を除去するステップと、３）アミノ酸のカップリング反応を誘導するステップと、４）反応の有無を確認するステップ（例えば、Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）と、５）レジンおよび保護基を除去するステップと、６）ペプチドを固形化するステップと、の計６つのステップによって合成を行った。
【００２２】
以下、前記合成方法をステップごとにより詳細に説明する。
【００２３】
第１ステップは、レジンにアミノ酸及びビオチンをローディングするステップである。前記レジンとして、ワングレジン、クロロトリチルレジン、ポリスチレンレジンなどを使用することができ、合成の最適化のために、各反応残基にアミン基が優先的に結合されているレジンを使用し、このアミンレジンに適切な溶媒を添加してレジンを膨潤させる。前記溶媒として、例えば、ＭＣ（塩化メチレン）を使用することができるが、これに制限されるものではない。次に、減圧下で前記溶媒を除去し、適切な溶媒に溶かした保護化されたアミノ酸とＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）およびＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）の混合溶液を容器に添加して反応させる。前記溶媒としては、例えば、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）を使用することができ、アミノ酸の保護基として、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００２４】
第２ステップは、アミノ酸の保護基を除去するステップである。アミノ酸保護基の除去は、当業界で一般に知られた方法によって行うことができ、本発明の具体的な実施例では、レジンにローディングしたアミノ酸溶液を減圧下で除去し、洗浄した後、ピペリジンで希釈したＤＭＦ溶液で反応して保護基を除去した。
【００２５】
第３ステップは、アミノ酸のカップリング反応を誘導するステップである。アミノ酸のカップリング反応は、当業界で一般に知られた方法、例えば、ＨＯＢｔ−ＤＣＣ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール−ジシクロヘキシルカルボジイミド）方法、またはＨＯＢｔ−ＤＩＣ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールジイソプロピルカルボジイミド）方法などによって行うことができる（Wang C.Chan, Perter D.white, "Fmoc solid phase peptide synthesis", Oxford）。この他、カップリング試薬であるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ベンゾ−トリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾ−トリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、［Ｏ−７−アザベンゾトリ−アゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート］（ＨＡＴＵ）、ｌＨ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ｌＨ−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などを用いて合成を進行することができ、カップリング試薬に応じてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）などのような有機塩基を添加して反応を進行することができるが、これに制限されるものではない。
【００２６】
第４ステップは、反応の有無を確認するステップである。例えば、本発明の具体的な実施例では、アミノ酸のカップリング反応を確認するために、カイザーテスト（E.Kaiser et al., Anal. Biochem. (1970) 34, 595）を利用した。カイザーテストは、ニンヒドリンを用いて１次アミンの官能基の存在の有無を色変化の差によって確認する定性的な確認方法である。具体的には、アミノ酸のカップリング反応後、洗浄した少量のレジンにカイザーテスト溶液を２〜３滴添加した後、一定時間レジンの色変化を観察し、レジンの色変化がない場合、カップリング反応が進行したと見なして次の反応を進行し、レジンの色が青色を呈すると、未反応の部分が残っていると見なしてアミノ酸のカップリング反応を再進行することができる。
【００２７】
第５ステップは、レジンおよび保護基を除去するステップである。前記第３ないし第５ステップを繰り返して合成されたペプチドをレジンから除去し、アミノ酸側鎖保護基を脱保護化させるステップである。レジンおよびアミノ酸保護基の除去は、当業界で一般に知られた方法によって行うことができ、本発明の具体的な実施例では、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）、チオアニソール、Ｈ２Ｏ、ＥＤＴ（エタンジチオール）から構成されたクリーベイジカクテル溶液を添加してペプチド溶液を得た。前記溶液の構成は、当業者が実験条件に応じて適切に変形して使用することができる。
【００２８】
第６ステップは、ペプチドを固形化するステップである。例えば、ジエチルエーテル溶媒を過剰添加して沈殿した固形物を生成させることができるが、これに制限されるものではない。
【００２９】
本発明にかかるペプチド誘導体およびその薬学的に許容される塩は、皮膚繊維芽細胞に対する細胞毒性のような副作用がなく（図１）、皮膚繊維芽細胞において強力なコラーゲン生合成促進能力を示した。特に、ヘキサペプチド−２およびビオチンの単独または複合処理時には、ｔｙｐｅ１コラーゲンに対する生合成の増加が全く現れなかったが、ビオチンの結合されたヘキサペプチド−２の場合、優れたｔｙｐｅ１コラーゲンの生合成増加の効能を示した（図２）。
【００３０】
したがって、さらに他の態様として、本発明は、本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含むシワ改善および皮膚老化防止のための組成物に関するものである。本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有するシワ改善および皮膚老化防止のための組成物は、用途および所望の効果に応じて、化粧料組成物および薬学的組成物をすべて含む概念である。
【００３１】
好ましい態様として、本発明は、本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含むシワ改善および皮膚老化防止用化粧料および薬学的組成物に関するものである。
【００３２】
さらに他の態様として、本発明は、本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を個体の皮膚に塗布するステップを含む皮膚のシワ改善方法に関するものである。
【００３３】
さらに他の態様として、本発明は、本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を個体の皮膚に塗布するステップを含む皮膚老化抑制方法に関するものである。
【００３４】
シワ改善および皮膚老化防止のための化粧料および薬学的組成物として使用する場合、前記組成物を皮膚、頭皮または毛髪に適用することができ、皮膚老化防止、シワ改善、および肌荒れ改善のために使用することができる。
【００３５】
本発明のシワ改善、皮膚老化防止のための組成物に含まれるペプチド誘導体の含有量は、組成物の用途、適用形態、使用目的および所望の効果に応じて適切に調整可能であり、含有量対比の効果を考慮して、例えば、全体の組成物重量に対して０．０００１〜９９重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％、より好ましくは０．００１〜１重量％、最も好ましくは０．００５〜０．１重量％であることが良い。
【００３６】
本発明のシワ改善、皮膚老化防止のための組成物は、経口または非経口投与することができ、例えば、経口、経皮、皮下、または静脈投与が可能であり、好ましくは、非経口投与のうち、経皮投与、より好ましくは、塗布による局所投与方式で適用可能である。
【００３７】
前記組成物は、皮膚、頭皮または毛髪に経皮的に適用され、基礎化粧品、胸部および臀部専用クリーム、メーキャップ化粧品、ボディー製品、髭そり用製品、毛髪製品などのすべての化粧品製品の製造に使用可能な組成物を意味するもので、硬膏剤、スプレー剤、懸濁液、乳液、クリーム、ゲル、フォームなどの形態に製剤化されたものであり得るが、その形態に特別な制限がない。
【００３８】
好ましくは、前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、アイエッセンス、エッセンス、クレンジングクリーム、クレジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーエッセンス、ボディー洗浄剤、サンスクリーンクリーム、染毛剤、シャンプー、リンス、歯磨き粉、口腔清浄剤、整髪剤、養毛剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチおよび噴霧剤からなる群より選択される剤形を有するものを含む。
【００３９】
前記本発明の化粧料組成物および薬学組成物は、前記有効成分のほか、通常の製品化または製剤化に使用可能なすべての種類の成分、例えば、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、増粘剤、賦形剤、希釈剤、無機塩類および合成高分子物質などを追加的に含むことができ、その種類と含有量は、最終産物の用途および使用目的に応じて適切に調整することができる。
【００４０】
また、本発明の組成物は、適用される形態に通常含まれる溶媒を含むものであり得、例えば、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２，４−ブタントリオール、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサントリオール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、ブタンジオール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジメチルイソソルビド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、プロピレンカーボネート、グリセレス−２６、メチルグルセス−２０、イソセチルミリステート、イソセチルオクタノエート、オクチルドデシルミリステート、オクチルドデカノール、イソステアリルイソステアレート、セチルオクタノエートおよびネオペンチルグリコールジカプレートなどの中から選択された１種以上を含むことができる。これらの溶媒を用いて本発明の組成物を製造する場合、化合物の種類に応じて、または溶媒の混合比に応じて溶媒に対する化合物の溶解度が少しずつ異なるが、本発明の属する技術分野における当業者であれば、製品の特性に応じて溶媒の種類および使用量を適宜選択して適用することができる。
【００４１】
さらに、本発明の組成物は、経皮投与時の経皮透過を強化するための多様な物質を含むことができる。例えば、ラウロカプラム誘導体およびオレイン酸、モノオレート誘導体のエステル誘導体、アダパレン、トレチノイン、レチンアルデヒド、タザロテン、サリチル酸、アゼライン酸、グリコール酸、エトキシジクリコール、ツイーン８０、レシチンオルガノゲルなどを含むことができる。なお、本発明の組成物は、付加的な機能を付与するために、本発明の保湿効果を付与する組成物の効果を害しない範囲内で共界面活性剤、界面活性剤、ふけ防止剤、角質軟化剤、血行促進剤、細胞活性剤、清凉剤、保湿剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、精製水などの補助成分を添加することができ、適用される形態に応じて、適切な香料、色素、防腐剤、賦形剤などの添加剤を含有することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
実施例１．ペプチド誘導体の製造
本発明では、一般的なペプチド合成方法として、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）をＮα−アミノ酸の保護基として用いる固相合成法を利用してペプチド誘導体を得ており、その具体的な実施例は、次のとおりである。
【００４４】
まず、Ａｍｉｎｅレジン（１．１ｍｍｏｌ／ｇ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の１ｍｍｏｌに対する量を測量して反応容器に入れた後、ＭＣ３０ｍｌを添加し、１０分間レジンを膨潤させた。減圧下で溶媒を除去し、ＤＭＦ溶媒に溶かしたＦｍｏｃ−リシン（４ｅｑ．）、ＤＩＣ（２ｅｑ．；ジイソプロピルカルボジイミド）＆ＤＭＡＰ（０．１ｅｑ．；４−ジメチルアミノピリジン）の混合溶液を容器に添加し、４時間反応させた。次に、Ａｍｉｎｅレジンにローディングしたアミノ酸溶液を減圧下で除去し、レジンをＤＭＦとＭＣでそれぞれ３０ｍｌ×５回洗浄した。Ｆｍｏｃ−リシンがローディングされたレジンを２０％（ｖ／ｖ％）ピペリジンで希釈したＤＭＦ溶液で１０分間反応して脱保護させた後、ＤＭＦとＭＣでそれぞれ３０ｍｌ×５回洗浄した。次に、Ｆｍｏｃ保護基が除去されたレジンに、ＤＭＦ溶媒に溶かしたＦｍｏｃペプチドおよびビオチン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−トリプトファン、Ｆｍｏｃ−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｄ−トリプトファン、Ｆｍｏｃ−ヒスチジン、ビオチンの順に使用）（それぞれ４ｅｑ．）、ＤＩＣ（４ｅｑ．；ジイソプロピルカルボジイミド）、ＨＯＢｔ（４ｅｑ．；Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）カップリング溶液を添加し、それぞれ４時間室温で反応させ、アミノ酸のカップリング反応を誘導した。アミノ酸のカップリング反応後、洗浄した少量のレジンに、カイザーテスト溶液Ａ、Ｂ、Ｃ［試薬Ａ：エタノール（１００ｍｌ）内のニンヒドリン（５ｇ）、試薬Ｂ：エタノール（２０ｍｌ）内のフェノール（８０ｇ）、試薬Ｃ：ピリジン（９８ｍｌ）内の０．１Ｍ  ＫＣＮ（２ｍｌ）］を２〜３滴添加した後、１００℃を維持しながら、１０分間レジンの色変化を観察した。レジンの色変化がない場合、カップリング反応が進行したと見なして次の反応を進行し、レジンの色が青色を呈すると、未反応の部分が残っていると見なしてアミノ酸のカップリング反応を再進行した。
【００４５】
このような過程で合成されたペプチドをレジンから除去し、アミノ酸側鎖保護基を脱保護化させるために、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）、チオアニソール、Ｈ２Ｏ、ＥＤＴ（エタンジチオール）から構成された混合物を９０：２．５：２．５：２．５：２．５の割合で添加して沈殿した固形物を生成させ、こうして得られた沈殿物を遠心分離させ、濾液のＴＦＡ、ＴＩＳ、チオアニソール、Ｈ２Ｏ、ＥＤＴなどを除去し、３回以上繰り返して固形化されたビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチドを得た。
【００４６】
得られたビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチドの分析のために、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【００４７】
ＲＰ−ＨＰＬＣの場合に、Ａ  ｂｕｆｆｅｒを０．１％ＴＦＡが含まれている水、Ｂ  ｂｕｆｆｅｒを０．１％ＴＦＡが含まれているアセトニトリルとし、３０分にわたってＢ  ｂｕｆｆｅｒの濃度を５％から６５％に引き上げる濃度勾配によって分析した。その結果、Ｒｔは約２５．８０８分であった。
【００４８】
ＬＣ−ＭＳの場合には、予測値１０９９．３Ｄａ、実測値１０９９．１Ｄａの結果を得ることができた。
【００４９】
実施例２．ビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチド誘導体の細胞毒性の測定
実施例１で合成したビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチドの細胞毒性を調べるために、下記のように実験を進行した。細胞毒性は、ＭＴＴ分析を用いて測定し、対照群として試料を添加しなかったものを１００％とし、相対的な細胞毒性を計算した。詳細な実験方法は、次のとおりである。
【００５０】
ヒトの正常繊維芽細胞（Human Dermal Fibroblast neonatal）を細胞培養用の９６ウェルプレートに３，０００個の細胞数に一定に分注し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）が含まれているＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベータで培養した。試験物質をそれぞれ１０ｍＭの濃度で水に溶かして濃縮液とし、これを０．５％ＦＢＳが含まれているＤＭＥＭで希釈して２００ｕＭ、２０ｕＭ、２ｕＭの濃度で希釈した後、各ウェルに１００ｕｌの培地が優先的に入っている状態で各稀釈液を１００ｕｌずつ入れて処理した後、４８時間培養し、培養終了後、上層液はｔｙｐｅ１コラーゲン生合成量を測定（実施例３）するのに使用し、細胞は細胞毒性を測定するのに使用した。
【００５１】
細胞毒性測定のためのＭＴＴ分析の場合には、培養液の除去された各ウェルに１０％ＦＢＳが含まれているＤＭＥＭ培地を９０ｕｌ添加し、５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶かされている３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）をそれぞれ１０ｕｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３時間反応させた。以降、上層液を注意深く除去し、細胞内の沈澱したＭＴＴホルマザンを１００ｕｌのＤＭＳＯに溶かした後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いてＯＤ５７０での吸光度を測定した。
【００５２】
前記で得られた結果を、図１に示した。図１から分かるように、本発明の化合物であるビオチンの結合されたヘキサペプチド−２は、ヘキサペプチド−２およびビオチンの単独あるいは複合処理と同様に、細胞に対する毒性が全くなかった。
【００５３】
実施例３．ビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチド誘導体のｔｙｐｅ１コラーゲン生合成促進能力の測定
実施例１で合成したビオチンの結合されたヘキサペプチド−２ペプチドのｔｙｐｅ１コラーゲン生合成の促進能力を調べるために、下記のように実験を進行した。生合成されたｔｙｐｅ１コラーゲンの測定は、ＥＬＩＳＡ分析方法を利用してコラーゲン生合成促進効果を測定し、対照群として試料を添加しなかったものを１００％とし、相対的なｔｙｐｅ１コラーゲン生成能を計算した。詳細な実験方法は、次のとおりである。
【００５４】
まず、ｔｙｐｅ１コラーゲンに対する抗体を９６ウェルプレートにコーティングし、ブロッキングバッファーを用いて十分にブロッキングした。以降、実施例２に記載の繊維芽細胞培養上層液をｔｙｐｅ１コラーゲン抗体がコーティングされている９６ウェルプレートに処理し、常温で２時間反応させた。反応が終わった後、上層液を除去し、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０が含まれているＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いて洗浄し、ビオチンが結合された２次抗体を９６ウェルプレートに処理し、常温で１時間反応させた。反応が終わると、前と同様の方法で残っている上層液を除去し、ＰＢＳＴを用いて洗浄し、結合されたコラーゲンを測定するために、ＳＡ−ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ）を結合させた。発色反応を確認するために、基質としてＴＭＢ（３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）を処理し、光が遮断された常温で１５分間反応させた後、２Ｎ塩酸で反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。効果の比較のために、ヘキサペプチド−２単独処理群、ビオチン単独処理群、ヘキサペプチド−２およびビオチンの複合処理群（mixture）に対するｔｙｐｅ１コラーゲン生合成の程度も測定した。
【００５５】
前記で得られた結果を、図２に示した。図２から分かるように、ヘキサペプチド−２およびビオチンの単独あるいは複合処理時には、ｔｙｐｅ１コラーゲンに対する生合成の増加が全く現れなかったが、ビオチンの結合されたヘキサペプチド−２の場合、優れたｔｙｐｅ１コラーゲンの生合成増加の効能を示している。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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