(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、有効成分として、レチノイン酸類、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質及びキレート形成能を有する物質を含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法であって、前記キレート形成能を有する物質がラクトビオン酸又はその塩である、方法。
【請求項２】
細胞が継続的にウイルスベクターを産生する能力がある細胞である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質がトリコスタチンＡ及び酪酸ナトリウムから選択される少なくとも１種の物質である請求項１〜３いずれか記載の製造方法。
【請求項５】
（１）請求項１〜４いずれか記載の方法でウイルスベクターを製造する工程、ならびに
（２）工程（１）で製造されたウイルスベクターを用いて細胞を形質導入する工程、
を包含することを特徴とする形質導入された細胞集団の製造方法。
【請求項６】
有効成分として、レチノイン酸類、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質及びキレート形成能を有する物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地であって、前記キレート形成能を有する物質がラクトビオン酸又はその塩である、培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスベクターの製造方法、及びウイルスベクター製造のための培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性遺伝子疾患の治療のほか、癌や感染症の治療を目的としてウイルスベクターを用いた遺伝子治療が開発されていると共に、臨床的に多くの試験が実施されている。特に、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを利用した遺伝子治療について多くの試みがなされている。【０００３】
目的遺伝子を組み込むために使用される遺伝子組換えレトロウイルスベクター作製のために使用されるトランスファーベクターの例としては、野生型モロニー白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のゲノムからウイルス粒子構造タンパク質遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が除去されたｐＬＸＳＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ２８２４８）やｐＭＦＧ等がある。これらの他に更に改変したベクターがヒトを対象とした臨床試験に使用されている。【０００４】
遺伝子組換えレトロウイルスベクターの製造は、目的遺伝子を挿入したＤＮＡベクターのパッケージング細胞（Ｐｓｉ-Ｃｒｉｐ、ＧＰ＋Ｅ８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、ＰＧ１３等）へのトランスフェクションにより誘導されたウイルス産生細胞を培養し、目的のウイルスベクターを含有する上清を採取することにより実施される。更に、この上清を再度パッケージング細胞に感染させる等の方法で、感染細胞の中から目的遺伝子発現用のレトロウイルスベクターを安定に産生する産生細胞クローンを選択することも行われる。このような工程で、マスターセルバンク（ＭＣＢ）、そしてワーキングセルバンク（ＷＣＢ）が調製され、遺伝子治療用の遺伝子組換えレトロウイルスベクターが安定して製造される。【０００５】
レトロウイルス産生細胞が産生するウイルスの力価を向上させるためには、レトロウイルス産生細胞の培養は極めて重要である。つまり、高いウイルス力価（以下、ウイルスタイターと記載することもある）が得られる培養条件の検討が必要である。現在までに力価を上げる方法として、重複感染（例えば、非特許文献１）や、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、酪酸ナトリウム、又はＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａの添加（例えば、非特許分献２、３）がある。しかし、いずれもその顕著な効果は得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、第６巻、第１１９５−１２０２頁（１９９５）
【非特許文献２】ジーン  セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第３巻、第７５６−７６０頁（１９９６）
【非特許文献３】バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２９巻、第８８４−８９０頁（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ウイルスベクターの製造に使用される培地、特に高いウイルスタイターを維持することを可能にするウイルス産生細胞の培養に使用される培地を開発し、当該培地を用いたウイルスベクターの製造方法、及び当該方法で製造されるウイルスベクターを用いた形質導入細胞集団の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、有効成分として、レチノイン酸類、ヒストン脱アセチル化酵素（ヒストンデアセチラーゼとも呼ばれる）阻害物質及びキレート形成能を有する物質を含む培地を用い、ウイルス産生細胞を培養することで、長期間にわたって高いウイルス産生を継続することができ、驚くべきことに高いウイルス力価のウイルス上清が得られることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
本発明を概説すれば、本発明は、
［１］ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、有効成分として、レチノイン酸類、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質及びキレート形成能を有する物質を含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法、
［２］細胞が継続的にウイルスベクターを産生する能力がある細胞である［１］記載の製造方法、
［３］ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである［１］又は［２］に記載の製造方法、
［４］ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質がトリコスタチンＡ及び酪酸ナトリウムから選択される少なくとも１種の物質である［１］〜［３］いずれか記載の製造方法、
［５］前記キレート形成能を有する物質が、ラクトビオン酸又はその塩である［１］〜［４］いずれか記載の製造方法、
［６］（１）［１］〜［５］いずれか記載の方法でウイルスベクターを製造する工程、ならびに
（２）工程（１）で製造されたウイルスベクターを用いて細胞を形質導入する工程、
を包含することを特徴とする形質導入された細胞集団の製造方法、
［７］［６］に記載の製造方法で得られた形質導入された細胞集団、
［８］医薬に使用するための［７］記載の細胞集団、
［９］医薬の製造に用いる［７］記載の細胞集団、
［１０］［７］記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬、
［１１］対象に有効量の［１０］記載の医薬を投与する工程を含む疾病の治療方法又は予防方法、
［１２］有効成分として、レチノイン酸類、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質及びキレート形成能を有する物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地を用いることにより、容易に高いウイルス力価のウイルス上清が得られることから、ウイルスベクター及び当該ベクターを含有する高力価組成物を容易に調製することが可能となる。本発明の培地を用いて得られたウイルスベクターや前記組成物は遺伝子治療の分野で非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培地Ｖ−１〜Ｖ−３、Ｗ−１〜Ｗ−３、Ｘ−１〜Ｘ−３、Ｙ−１〜Ｙ−３等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図２】培地Ｖ−１〜Ｖ−３、Ｗ−１〜Ｗ−３、Ｘ−１〜Ｘ−３、Ｙ−１〜Ｙ−３等を使用して得られたレトロウイルスベクターでの、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞へ導入した遺伝子発現強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、ウイルスベクターを産生する細胞の培養に適した培地を開示する。前記の培地は、細胞の培養に必要な成分を混合して作製された基本培地に、有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質及びキレート形成能を有する物質が含有されてなるものである。当該培地には、更に脂質類が含まれてもよい。
【００１４】
本発明において、「レチノイン酸」は、ビタミンＡ酸とも呼ばれ、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓのａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、又は９位がｃｉｓ構造をとる９−ｃｉｓ−レチノイン酸のいずれでもよい。また、その他のレチノイン酸異性体及びレチノイン酸誘導体、及び人為的に合成した合成レチノイドも本発明において使用することができる。前記のレチノイン酸、レチノイン酸異性体及びレチノイン酸誘導体、及び人為的に合成した合成レチノイド、又はそれらの塩を、本明細書ではレチノイン酸類と総称する。更に、本発明において、使用するレチノイン酸類は１種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００１５】
本発明に使用されるレチノイン酸類の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（以下、ＡＴＲＡと記載する）の場合、例えば、好適には１ｎＭ〜１０μＭ、より好適には５ｎＭ〜２００ｎＭであり、特に好適には１０ｎＭ〜１００ｎＭである。
【００１６】
本発明において、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質」としては、ヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有するものであれば良く、（１）脂肪族酸類、例えば酪酸ナトリウム、ブチラート、フェニルブチラート、バルプロ酸、これらの塩、誘導体等、（２）ヒドロキサム酸類、例えばトリコスタチン（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ）Ａ、オキサムフラチン、スベロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ）、これらの塩、誘導体等、（３）環状ペプチド、例えばトラポキシン（ｔｒａｐｏｘｉｎ）、アピシジン（ａｐｉｃｉｄｉｎ）、ＦＫ２２８、これらの塩、誘導体等、（４）ベンズアミド、その塩、誘導体等、が使用できる。更に、本発明において、使用するヒストン脱アセチル化酵素阻害物質は１種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００１７】
本発明を限定するものではないが、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質として、酪酸ナトリウム（以下、ＮａＢと記載する）又はヒストン脱アセチル化酵素のアイソフォーム阻害域の広いトリコスタチンＡ（以下、ＴＳＡと記載する）が好適に使用される。また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質とレチノイン酸を組み合わせたときの相乗効果について、本願発明者はＮａＢの他にＴＳＡについてもその効果を見出している。
【００１８】
本発明に使用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害物質の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、ＴＳＡの場合、例えば、好適には１０ｎＭ〜５０μＭ、より好適には２０ｎＭ〜１０μＭ、特に好適には１００ｎＭ〜３μＭである。ＮａＢの場合、例えば、好適には１ｎＭ〜５０ｍＭ、より好適には１ｍＭ〜１０ｍＭである。
【００１９】
本発明のレチノイン酸類及びヒストンデアシラーゼ阻害物質を含む培地に、更に脂質類を含有させても良い。脂質類としては、脂肪酸類（アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸やそれらの塩等）、コレステロール、デキサメタゾン等のステロイド類、トコフェロール酢酸、トリグリセリド、リン脂質類（グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、イノシトールリン脂質等）等を使用することができる。これらの成分は単独でもしくは複数のものを組み合わせて培地に添加してもよい。例えば、血清成分を代替することを目的に培地添加剤として市販されている脂肪酸濃縮液をそのまま含有させても良い。
【００２０】
本発明に使用される前記脂質類から任意に選択される脂質類の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、好適には脂質類の総量として０．０１ｍｇ／Ｌ〜８．０ｍｇ／Ｌ、より好適には０．０３ｍｇ／Ｌ〜５．０ｍｇ／Ｌ、特に好適には０．１ｍｇ／Ｌ〜４．０ｍｇ／Ｌである。例えば、脂肪酸濃縮液では容液比で、好適には１／１０，０００〜１／５０（Ｖ／Ｖ）、より好適には１／３，０００〜１／７５（Ｖ／Ｖ）であり、特に好適には１／１，０００〜１／１００（Ｖ／Ｖ）である。
【００２１】
本発明において、「キレート形成能を有する物質」は、金属イオンに配位して錯体を形成しうるものであれば良い。本発明には、アミノカルボン酸キレート剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸）等、また、ホスホン酸系キレート剤としてＨＥＤＰ（ヒドロキシエチリデンジホスホン酸）、ＮＴＭＰ（ニトリロトリス（メチレンホスホン酸））、ＥＤＴＭＰ（エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸））等、またその他の配位子として、ビピリジン、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル、サイクラム、ターピリジン、カテコラート、ＢＩＮＡＰ‘（２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（２，２‘−ｂｉｓ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）’−１，１‘−ｂｉｎａｐｈｔｈｙｌ））等が使用され、更にその他の物質として、ラクトビオン酸、グルコン酸、イノシトール６リン酸、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、ムギネ酸、グルタチオン、アルファリポ酸、Ｌ―カルニチン、Ｌ―メチオニン、Ｌ―シスチン、ＭＳＭ（メチルスルフォニルメタン）等が使用される。更に、上記物質の塩も使用される。更に、本発明において、使用するキレート形成能を有する物質は１種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００２２】
本発明を限定するものではないが、キレート形成能を有する物質としてラクトビオン酸、又はその塩（例えばラクトビオン酸カルシウム）が好適に使用される。
【００２３】
本発明に使用されるキレート形成能を有する物質の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、ラクトビオン酸カルシウムの場合、例えば、好適には終濃度２μＭ〜終濃度２００ｍＭ、より好適には終濃度２０μＭ〜終濃度２０ｍＭ、特に好適には終濃度２００μＭ〜終濃度２ｍＭである。
【００２４】
上記基本培地の成分としては、アミノ酸、糖類、有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、ｐＨ調整のための緩衝成分、無機塩類等があげられる。また、フェノールレッドのようなｐＨ指示薬を含有していてもよい。このような基本培地として、血清を含有しない公知の培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２培地等を使用してもよく、これらはインビトロジェン社、シグマ社等から市販品として入手することができる。Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ−ＳＦＭ、２９３ＳＦＭＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ（ハイクローン社製）等の市販の培地も使用することができる。前記の基本培地には血清添加培地を使用してもよいが、血清由来の未知のウイルスの混入を防ぐために、無血清培地の使用が好ましい。無血清培地を使用する場合は、ヒト血液より高度に精製された血清アルブミン（例えば医薬品として認可された血清アルブミン製剤）や動物由来の高度に精製された血清アルブミン、又は組換え血清アルブミンを含有する無血清培地が好適に使用される（特開２００７−１０５０３３号公報）。
【００２５】
本発明の培地により培養されるウイルス産生細胞には特に限定はないが、例えばレトロウイルス産生細胞が好適である。
【００２６】
本発明は、上記の培地を使用することを特徴とするウイルスベクターの製造方法に関する。
【００２７】
本発明により製造されるウイルスベクターには特に限定はない。例えば、レトロウイルスベクター（オンコウイルスベクター、レンチウイルスベクターやそれらの改変体を包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクター等が挙げられる。好適にはレトロウイルスベクター、遺伝子組換えレトロウイルスベクターが例示される。特に、無制限な感染、遺伝子導入を防止された複製能欠損レトロウイルスベクターが本発明に好適に使用される。通常、遺伝子組換えレトロウイルスベクターのウイルス粒子に封入される核酸は、プラスミドによって供給される。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターのウイルス粒子に封入される核酸を供給するプラスミドとしては、ＭＦＧベクターやα−ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［ヌクレイック  アシドズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、第３５８７−３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクタープラスミド、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター等］あるいはこれらを改変したベクタープラスミドが例示される。
【００２８】
前記のウイルス粒子に封入される核酸には任意の外来遺伝子を搭載させてもよい。搭載される外来遺伝子には特に限定はなく、下記記載の本発明により製造されたウイルスベクターにより形質導入される細胞集団の用途に応じて、任意の遺伝子［酵素、サイトカイン類、又はレセプター類等のタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするもの］が使用できる。これら外来遺伝子としては、例えば、細胞の医療への利用を目的とするものとして、配列特異的ＲＮＡ分解酵素であるＭａｚＦを発現する遺伝子（例えば、国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレット）、腫瘍抗原やウイルス抗原を認識する抗体可変領域又はＴ細胞レセプターをコードする遺伝子、患者において欠失もしくは機能喪失している遺伝子等が挙げられる。また、Ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒの細胞外ドメイン遺伝子（ΔＬＮＧＦＲ）、ネオマイシン耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等の、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に搭載させてもよい。
【００２９】
前記外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにウイルスベクターに搭載して使用することができる。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列、又はイントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
【００３０】
本発明では、前記のレトロウイルスベクターのウイルス粒子に封入される核酸を供給するＤＮＡをレトロウイルスパッケージング細胞株に導入して作製されたレトロウイルス産生細胞を本発明の培地中で培養し、レトロウイルスベクターの製造が実施される。
【００３１】
前記のパッケージング細胞株には特に限定はなく、公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ジ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第８５巻、第６４６０−６４６４頁（１９８８）］等を使用することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞にレトロウイルス粒子産生に必要な遺伝子が搭載されたパッケージングプラスミド（レトロウイルスパッケージングキット：タカラバイオ社製）を導入してパッケージング細胞を作製することもできる。
本発明の方法は、一過性に組換えウイルスベクターを産生するよう作製されたウイルス産生細胞、継続的にウイルスを産生する能力を有するウイルス産生細胞株のいずれにも利用することができる。後者を使用する場合には、ウイルス産生細胞株のマスターセルバンク（ＭＣＢ）やワーキングセルバンク（ＷＣＢ）のような凍結保存物を適切な手段で解凍後、前記の培地に直接植えて培養を開始し、前記細胞を増殖させ、ウイルスを産生させる。組換えウイルスベクターの大量調製のためには、更に前記の培地にウイルス産生細胞株を適応させる馴化の工程を加えることが好ましい。
【００３２】
ウイルス産生細胞の培養は、通常の培養条件で行うことができる。例えば湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養は、例えば３０〜３７℃で実施できるが、所望の細胞の増殖、ウイルスベクターの産生が達成できる範囲で前記の範囲以外の温度で実施してもよい。本発明では、こうして得られる培養液より上清を採取し、レトロウイルスの製造が実施される。ウイルスベクターは前記の上清のまま、フィルターろ過されたろ液、公知の方法により濃縮もしくは精製されたウイルスベクターとして製造され、適切な方法、例えば凍結して使用するまで保存される。上記の、本発明の培地を用いたウイルス産生細胞の培養により、従来の方法より高タイターのウイルスベクターを得ることができる。
【００３３】
また、本発明は、本発明の方法により製造されたウイルスベクターにより標的細胞を形質導入することを特徴とする、形質導入細胞を含有する細胞集団の製造方法も提供する。なお、前記ウイルスベクターにより細胞に導入される所望の遺伝子の数に限定はなく、１個の遺伝子であっても良く、複数の遺伝子であっても良い。ウイルスベクターによる標的細胞の形質導入は当該ウイルスベクターに適した公知の方法で行えばよい。例えばレトロウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入の際にＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標、タカラバイオ社製）等の遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。
本発明では高いウイルス力価のウイルスベクターを得られることから、当該ベクターを使用することにより、所望の遺伝子を保持する細胞を高い比率で含む細胞集団を得ることができる。
【００３４】
本発明は、前記の本発明の細胞集団の製造方法により得られる細胞集団、並びに当該細胞集団の用途を提供する。本発明の方法により得られる細胞集団は種々の用途、例えば有用物質の生産に使用することができ、また、当該細胞自体を疾患の治療に使用することもできる。
【００３５】
本発明の方法により、治療用有用な外来遺伝子を保持する細胞を含有する細胞集団を得ることができる。前記の細胞集団は、保持する遺伝子により付与される形質に応じて種々の疾患、例えば、がん、白血病、悪性腫瘍、肝炎、又は感染症疾患（例えばインフルエンザ、結核、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ、ヒト免疫不全ウイルス）感染症、ＡＩＤＳ、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、もしくは深在性真菌症）等の治療に使用することができる。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体治療、温熱治療、他の免疫療法等、従来の治療法と組み合わせて利用できる。
【００３６】
本発明で得られる形質導入細胞を含有する細胞集団を疾病の治療又は予防に使用する場合には、当該細胞の有効量が治療又は予防の対象、すなわちヒト又は非ヒト動物に投与される。細胞の投与方法は疾病に応じて適切なものを選択すればよく、例えば注射又は点滴による静脈、動脈、皮下、又は腹腔内等への投与が例示される。
【００３７】
本発明で得られる細胞集団は医薬、すなわち疾病の治療剤又は予防剤となすことができる。当該医薬は製薬分野で公知の方法に従い、前記の細胞集団を製剤化して製造することができる。例えば、本発明の方法により製造された細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤又は安定剤等と混合し、点滴剤又は注射剤として調製することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００３９】
実施例１  ラクトビオン酸カルシウム一水和物（ＬａＣａ）（シグマ社製）添加培地の調製１
細胞培養用培地であるＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ  エスエーエフシー  バイオサイエンス社製）を溶液比（Ｖ／Ｖ）で１／１０加えた培地を基本培地（培地Ｖ）として、培地ＶにＬａＣａを添加した培地Ｖ−１（終濃度２０μＭ）、Ｖ−２（終濃度２００μＭ）、Ｖ−３（終濃度２ｍＭ）を調製した。更にこの培地Ｖ−１，Ｖ−２、Ｖ−３それぞれに、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）（和光純薬社製）を最終濃度１００ｎＭとなるように添加し、更に酪酸ナトリウム（ＮａＢ）（和光純薬社製）を最終濃度５ｍＭになるように添加して、培地Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３を調製した。また、比較群として、培地Ｖ−１，Ｖ−２、Ｖ−３にＮａＢのみ添加（終濃度５ｍＭ）した培地Ｘ−１、Ｘ−２、Ｘ−３、及びＡＴＲＡのみ添加（終濃度１００ｎＭ）した培地Ｙ−１、Ｙ−２、Ｙ−３を調製した。各培地の組成を表１に示す。【００４０】
【表１】
0006014119.tif 000002
【００４１】
実施例２  レトロウイルス産生細胞の培養１
１．レトロウイルス産生細胞の培養
蛍光レポータータンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）遺伝子を搭載したマウス由来組換えレトロウイルスベクターを産生するレトロウイルス産生細胞（ＰＧ１３：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６：をパッケージング細胞とした）のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を３７℃のウォーターバスにて解凍した。解凍された細胞液を１５ｍＬ遠心チューブに移し、完全培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）を１０ｍＬ加え、遠心（５００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。遠心後、上清を除去し、１０ｍＬの完全培地に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、完全培地を用いて、細胞懸濁液を７８．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、細胞培養用の１００ｍｍディッシュ（イワキ社製）に前記の細胞懸濁液１ｍＬ、及び完全培地１４．７ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。継代間隔は３日とし、１継代目の播種細胞密度を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、液量を０．２ｍＬ／ｃｍ２として継代操作を行った。２継代目は播種細胞密度を０．９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、液量を０．２ｍＬ／ｃｍ２として、細胞培養用の６穴トリートメントプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに２ｍＬずつ添加した。２継代目実施の３日後、培養上清液を取り除き、実施例１に記載の培地Ｖ−１、Ｖ−２、Ｖ−３、Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３、Ｙ−１、Ｙ−２、Ｙ−３にそれぞれ置換した（液量は０．１ｍＬ／ｃｍ２）。その翌日に、各培地を回収し、それぞれ新しい同じ培地に交換した。なお、２継代の３日後からは、３２℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％にて培養を行った。上記の培地の交換と回収を３日間連続で計３回行い、３回目は培地の添加を行わず培地の回収のみ行った。回収した培養上清液（１回目、２回目、３回目）を、混合した後０．２２μｍのポアサイズのフィルター（ミリポア社製）でろ過して回収し、それらをレトロウイルス上清液とした。【００４２】
２．レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価
上記のように培地Ｖ−１〜Ｙ−３を用いて回収した各レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。培地Ｖ−１〜Ｙ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて２０倍及び４０倍のウイルス希釈液を調製した。このとき希釈には、ＡＣＤ−Ａ（テルモ社製）を全体の容積の５％となるように、また、ヒト血清アルブミン「アルブミナー２５％」（ＣＳＬベーリング社製）をアルブミンの終濃度が２％になるように生理食塩水にそれぞれ添加したものを用いた。遺伝子導入用の容器は２４穴ノントリートメントプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）を用いた。２４穴ノントリートメントプレートは、予めＡＣＤ−Ａで最終濃度２０μｇ／ｍＬになるように希釈したＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標、タカラバイオ社製）を各ウェルに０．５ｍＬ添加して４℃で一晩処理し、プレートからレトロネクチン溶液を取り除いた後、ＡＣＤ−Ａを各ウェルに０．５ｍＬ添加して取り除くという洗浄作業を２回行ったものを使用した。このプレートの各ウェルに各ウイルス希釈液を１ｍＬ添加し、遠心（３２℃、２０００×ｇ、２時間）した。遠心後、各ウェルよりウイルス希釈液上清を取り除き、ヒト血清アルブミン「アルブミナー２５％」をアルブミンの終濃度が１．５％になるように生理食塩水で希釈したもの０．５ｍＬずつで各ウェルを３回洗浄した。ヒトＴ細胞系白血病細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）を、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ用の培養用培地［１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）］に、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。前記の洗浄後の２４穴ノントリートメントプレートの各ウェルにこの懸濁液１ｍＬ（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）を添加し、遠心（３２℃、１０００×ｇ、１０分）した。遠心後、プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）に移して１日間培養を行った。次の日、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ用の培養用培地を各ウェルに１ｍＬずつそれぞれ添加し、更に１日間培養した。培養後、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、ＺｓＧｒｅｅｎの発現を調べた。感染培養後の細胞０．５×１０６ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬチューブに移し、遠心（４℃、５００×ｇ、５分間）にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞は終濃度が０．５％となるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ社製）を添加したリン酸バッファー（ギブコ社製）（以下、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）９５０μＬに懸濁し、遠心（４℃、５００×ｇ、５分間）にて再度細胞を沈殿させた。上清を再度取り除いた後、４００μＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、この懸濁液をフローサイトメトリー測定に供した。【００４３】
３．フローサイトメトリー測定
フローサイトメトリー測定はＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  フローサイトメーター（ベクトン  ディッキンソン社）を用いて機器の指示書に従い行った。まず、前述の懸濁液をフローサイトメーターに供し、前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）の２パラメータヒストグラム（ｘ軸：ＦＳＣ、ｙ軸：ＳＳＣ）上で、測定対象とする細胞集団をゲートでくくった。次に、ゲート中の細胞のＺｓＧｒｅｅｎ蛍光強度を測定し、ヒストグラム（ｘ軸：ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光強度、ｙ軸：細胞数）に展開した。そして、アイソタイプコントロールと比較してＺｓＧｒｅｅｎ蛍光強度の高い細胞をＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞と定義し、下記の式により、前述のゲート中の細胞数に対する比率［遺伝子導入効率（ＧＴ％：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）］及び平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を求めた。【００４４】
ＧＴ％  ＝  （ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞数／ゲート中の細胞数）×１００
ＭＦＩ  ＝  ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞の蛍光強度の平均値【００４５】
遺伝子導入効率を図１に示す。
図１に示されるように、培地Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、対応する比較培地Ｖ−１、Ｖ−２、Ｖ−３よりも１．５〜２倍程度高い遺伝子導入効率を示した。つまり、キレート形成能を有するラクトビオン酸のカルシウム塩のみを添加した培地よりも、ラクトビオン酸カルシウム、レチノイン酸、及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を組み合わせた培地の方が、遺伝子導入効率が高いことを意味している。なお、図中、「ＮＧＭＣ」は非遺伝子導入細胞を意味し、陰性対照を示す。以下も同様の意味である。【００４６】
蛍光強度の平均値を図２に示す。
図２に示されるように、培地Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液での蛍光強度は、培地Ｖ−１、Ｖ−２、Ｖ−３よりも１．５〜２倍程度高い蛍光強度を示した。前記と同様に、ラクトビオン酸カルシウムと、レチノイン酸及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を組み合わせた培地を用いて得られたウイルスは、ラクトビオン酸カルシウムのみを添加した培地を用いて得られたウイルスに対してＺｓＧｒｅｅｎの蛍光強度の高い細胞集団を得ることができ、高い遺伝子導入効率が示された。【００４７】
実施例３  ラクトビオン酸カルシウム一水和物（ＬａＣａ）（シグマ社製）添加培地の調製２
実施例１と同様の方法で、培地Ｖ−１，Ｖ−２、Ｖ−３培地それぞれに、ＡＴＲＡを最終濃度１００ｎＭとなるように添加し、更にＮａＢを最終濃度５ｍＭになるように添加して、培地Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３を調製した。この際、ＬａＣａを添加しない培地Ｗも調製した。各培地の組成を表２に示す。【００４８】
【表２】
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【００４９】
実施例４  レトロウイルス産生細胞の培養２
実施例３で作製した４種の培地を使用し、実施例２と同様の方法でレトロウイルス上清液を取得し、更に各レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率ならびに遺伝子導入細胞における平均蛍光強度を求めた。【００５０】
遺伝子導入効率を表３に示す。【００５１】
【表３】
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【００５２】
表３に示されるように、培地Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、ＬａＣａを含まない培地Ｗを用いて回収したレトロウイルス上清液よりも１．５〜２倍程度高い遺伝子導入効率を示した。つまり、レチノイン酸、及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を組み合わせた培地において、更にキレート形成能を有するＬａＣａを添加した培地を用いると、遺伝子導入効率が高いレトロウイルス上清液が得られることを意味する。【００５３】
蛍光強度の平均値を表４に示す。【００５４】
【表４】
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【００５５】
表４に示されるように、培地Ｗ−１、Ｗ−２、Ｗ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液で形質導入された細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎ由来蛍光の平均強度は、ＬａＣａを含まない培地Ｗを用いて回収したレトロウイルス上清液よりも１．６〜２．６倍程度高い値を示した。前記平均蛍光強度の向上は、細胞に導入されたＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子のコピー数が向上したことに起因すると考えられる。つまり、前記と同様に、レチノイン酸、及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を組み合わせた培地に、更にキレート形成能を有するＬａＣａを添加した培地を用いると、遺伝子導入効率が高いレトロウイルス上清液が得られることを意味する。【００５６】
比較例  ラクトビオン酸カルシウム一水和物（ＬａＣａ）（シグマ社製）添加培地の評価
実施例１に記載された、培地ＶにＬａＣａのみを添加した培地Ｖ−１（終濃度２０μＭ）、Ｖ−２（終濃度２００μＭ）、Ｖ−３（終濃度２ｍＭ）を調製した。各培地の組成を表５に示す。【００５７】
【表５】
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【００５８】
これら４種の培地を使用し、実施例２と同様の方法でレトロウイルス上清液を取得し、各レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率ならびに遺伝子導入細胞における平均蛍光強度を求めた。【００５９】
遺伝子導入効率を表６に示す。【００６０】
【表６】
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【００６１】
表６に示されるように、培地Ｖ−１、Ｖ−２、Ｖ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、ＬａＣａを含まない培地Ｖを用いて回収したレトロウイルス上清液と同程度の遺伝子導入効率を示した。つまり、キレート形成能を有するＬａＣａをのみを添加した場合（レチノイン酸、及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が共存しない場合）には、得られるレトロウイルス上清液の遺伝子導入効率は向上しないことを意味する。【００６２】
蛍光強度の平均値を表７に示す。【００６３】
【表７】
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【００６４】
表７に示されるように、培地Ｖ−１、Ｖ−２、Ｖ−３を用いて回収したレトロウイルス上清液で形質導入された細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎ由来蛍光の平均強度は、ＬａＣａを含まない培地Ｖを用いて回収したレトロウイルス上清液と同程度であった。このことからも、キレート形成能を有するＬａＣａを培地に添加するのみでは、得られるレトロウイルス上清液の遺伝子導入効率は向上しないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により、細胞、特にウイルス産生細胞の培養に適した培地が提供される。本発明の培地によれば、従来に比べ長期間ウイルス産生を継続することでき、それにより高いウイルスタイターが得られることによって、一回の培養調製でウイルス量を多く回収することができ、また標的細胞への感染効率が向上すること等が実現可能となる。
【図１】
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【図２】
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