(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質の活性が内在的活性よりも低下するように改変され、オルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であって、
該オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号１８のアミノ酸配列、又はそれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ
該グルタメート排出に関与するタンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列、又はそれと９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、
微生物。
【請求項２】
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質の活性低下が、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、２）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、及び４）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
さらに、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼＡｒｇＣ、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼＡｒｇＪ、アセチルグルタメートキナーゼＡｒｇＢ、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼＡｒｇＤの活性が内在的活性よりも増加したものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤが、それぞれ配列番号２３、２５、２７及び２９のアミノ酸配列、又はそれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
タンパク質の活性増加が、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、３）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び４）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、請求項３に記載の微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１１３７Ｐである、請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
（ｉ）請求項1記載の微生物を培養する段階と、
（ii）前記培養された微生物又は培養物からオルニチンを回収する段階とを含む、オルニチンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルニチン生産能が向上した微生物、及びそれを用いたオルニチンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オルニチン（ornithine）とは、アルギニン、プロリン及びポリアミンの生合成に用いられる前駆体であり、植物、動物、微生物で広く見出される物質である。また、非必須アミノ酸であり、タンパク質成分としては見出されず、チロシジン（tyrocidine）、グラミシジン（gramicidine）などのペプチド抗生物質に存在する。オルニチンは、高等動物の生体内代謝において、オルニチン回路によりアミノ酸又はアンモニアから尿素を生成して体外に排出する経路で重要な役割を果たす。
【０００３】
オルニチンは筋肉生成と体脂肪減少に効果があるので、栄養補給剤として用いられており、オルニチンとα−ケトグルタル酸が２：１の割合で含まれるオルニチンα−ケトグルタル酸（ＯＫＧ）は免疫増強物質として用いられている。また、オルニチンは肝臓から有害なアンモニアを除去するのを助けるので、肝硬変や肝機能障害を改善する医薬品として用いられている。このようなオルニチンを生産する方法としては、牛乳カゼイン（casein）を消化酵素で処理する方法と、形質転換された大腸菌や、アミノ酸、核酸、酵素、及び抗生物質類似体の生産に広く用いられる産業用微生物であるコリネバクテリウム属菌株を用いる方法とが知られている。
【０００４】
一方、コリネバクテリウム属菌株において、アルギニン（L-arginine）はグルタメートからａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ形態に形成されたアルギニンオペロン（operon）構造の遺伝子から発現した酵素により合成される。アルギニン生合成に最も重要な役割を果たすアルギニンオペロンの遺伝子は、細胞内で合成されたグルタメート（L-glutamate）を基質として用いてアルギニンを合成するが、前記アルギニンの合成過程の中間物質としてオルニチンを生成することが知られている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株においてグルタメートからアルギニンへの合成経路を概略的に示す図２から分かるように、アルギニン合成経路において、ａｒｇＪはグルタメートをＮ−アセチルグルタメート（N-acetylglutamate）に変換させ、ａｒｇＢはＮ−アセチルグルタメートをＮ−アセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に変換させ、ａｒｇＣはＮ−アセチルグルタミルホスフェートをＮ−アセチルグルタメートセミアルデヒド（Nacetylglutamate semialdehyde）に変換させ、ａｒｇＤはＮ−アセチルグルタメートセミアルデヒドをＮ−アセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換させ、ａｒｇＪはＮ−アセチルオルニチンをオルニチンに変換させ、ａｒｇＦはオルニチンをシトルリン（L-citrulline）に変換させ、ａｒｇＧはシトルリンをアルギニノスクシネート（argininosuccinate）に変換させ、ａｒｇＨはアルギニノスクシネートをアルギニンに変換させる酵素をコードすることが知られており、前記アルギニンの生産経路にオルニチンを生成する過程が含まれることが知られている。
【０００５】
従来から公知のアルギニン生産菌株は、アルギニンオペロンへの突然変異の導入、プロモーター（promoter）などの変異により、アルギニン生合成に関する酵素の発現量を増加させる方法が開発されている。そのうち、アルギニンオペロンの遺伝子の発現を調節して抑制するａｒｇＲと、アルギニン濃度により阻害されるａｒｇＢが、アルギニンの生産量を増加させる標的として広く研究されている（特許文献１）。
【０００６】
また、オルニチンの生産性を向上させる方法としては、プロリン（proline）を添加した培地でコリネバクテリウム属微生物を培養し、オルニチンシクロデアミナーゼ（ornithine cyclodeaminase, ocd）の作用によりオルニチンの生成量を増加させる方法、前記微生物の培養の際にインペラ（impeller）及び供給（feeding）条件の変更によりオルニチン生産性を向上させる方法などが知られており、形質転換された大腸菌を用いる場合は、ａｒｇＦとａｒｇＲが欠失した菌株を培養する際にグルタメートを培地に添加してオルニチンの生産性を向上させる方法、グルタメートからオルニチンへの経路以外に、グルタメートからプロリンを生成する経路の最初の段階に関与するガンマグルタミルキナーゼ（γ-glutamylkinase）をコードする遺伝子ｐｒｏＢを欠失させた形質転換菌株を用いてオルニチンの生産性を向上させる方法などが知られている。
【０００７】
また、オルニチンの前駆体であるグルタメートの高収率生産に関する研究は、コリネバクテリウムグルタミカムを対象に長期間にわたって進められている。そのうち、コリネバクテリウムグルタミカムのグルタメート排出能は、ビオチン（biotin）欠乏条件やペニシリンＧ（penicillin G）又は脂肪酸エステル界面活性剤の処理時に増加することが知られており、さらに細胞壁が損傷している場合に細胞壁からのグルタメートの分泌がより活性化することが知られている。
【０００８】
コリネバクテリウムグルタミカム野生型菌株（Ｃｇｌ１３０３２）由来のＮＣｇｌ１２２１タンパク質はベタイン（betain）排出を促進し、大腸菌の機械受容チャネル（mechanosensitive channel）タンパク質であるｙｇｇＢとアミノ酸配列が類似することが知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１０−００６０９０９号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２０１０−００１７５８１号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２００９−００８２７０２号公報
【特許文献４】韓国登録特許第０６２００９２号公報
【特許文献５】韓国公開特許第２００８−００３４３３４号公報
【特許文献６】韓国公開特許第２００８−００７４２８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような背景から、本発明者らは有用な用途に広く活用されているオルニチンをより高収率で生産できる菌株を開発するために鋭意研究を重ねた結果、オルニチンからアルギニンへの生合成経路を遮断し、細胞内のグルタメートの量を増加させ、グルタメートからオルニチンを生産する生合成経路の活性を増加させることにより、オルニチン過剰生産菌株を開発し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、オルニチン生産能が向上した微生物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、前記微生物を用いてオルニチンを生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のオルニチン生産能が向上した微生物は、より効果的なオルニチン製造に広く活用することができる。
[本発明1001]
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ1221）の活性が内在的活性よりも低下するように改変され、オルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1002]
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号18のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1001のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1003]
前記グルタメート排出に関与するタンパク質が、配列番号20のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1001のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1004]
タンパク質の活性低下が、1）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、2）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、3）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、及び4）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、本発明1001のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1005]
さらに、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性よりも増加したものである、本発明1001のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1006]
前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤが、それぞれ配列番号23、25、27及び29のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1005のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1007]
タンパク質の活性増加が、1）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、2）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、3）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び4）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、本発明1005のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1008]
コリネバクテリウム属微生物である、本発明1001のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1009]
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである、本発明1008のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1010]
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカム（ＫＣＣＭ11137Ｐ）である、本発明1008のオルニチン生産能が向上した微生物。
[本発明1011]
（ｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ1221）の活性が低下するように改変され、オルニチン生産能が向上した微生物を培養する段階と、
（ii）前記培養された微生物又は培養物からオルニチンを回収する段階とを含む、オルニチンの生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の形質転換されたコリネバクテリウムグルタミカムにおけるオルニチン生合成経路及び関連遺伝子を示す図である。
【図２】公知のコリネバクテリウムグルタミカムのアルギニン生合成経路を示す図である。
【図３】コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入ベクターｐＤＺベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記本発明の目的を達成するための一実施形態として、本発明は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が内在的活性よりも低下するように改変され、オルニチン生産能が向上した微生物を提供する。
【００１６】
本発明における「オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase, OCT）」という用語は、カルバモイルリン酸とオルニチンの反応を介してシトルリンとリン酸を生成する触媒活性を示す酵素を意味し、尿素排出動物の肝臓だけでなく、植物及び微生物にも存在し、微生物においてはアルギニンの合成過程に関与する。
【００１７】
前記酵素は触媒機能部位と調節機能部位を含むが、前記調節機能部位にオルニチンが結合すると酵素の活性が阻害される。大腸菌Ｋ１２株の場合は２種類（ａｒｇＦ，ａｒｇＩ）のＯＣＴを有し、大腸菌Ｂ及びＷ株を含む腸内微生物の場合はａｒｇＩに類似した１種類のＯＣＴを有する。ａｒｇＦ及びａｒｇＩによりコードされるＯＣＴは、アミノ酸配列は異なるが、同じ機能を有するアイソザイム（isoenzyme）であるといえ、コリネバクテリウム属微生物には、ａｒｇＦ遺伝子によりコードされるＯＣＴのみ存在する。
【００１８】
ＯＣＴはオルニチンからアルギニンを合成する経路で作用するので、ＯＣＴの活性を低下させると、細胞内のオルニチンの生成量を増加させることができる。
【００１９】
本発明においては、細胞内のオルニチンを蓄積するために、オルニチンからアルギニンに変換される経路が遮断されたコリネバクテリウム属微生物を提供するが、このために前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させた形質転換菌株を製造した。ここで、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号１８のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００２０】
本発明における「相同性」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列の類似程度を意味するが、相同性が十分に高いと、該当遺伝子の発現産物は同一又は類似の活性を有することができる。
【００２１】
本発明における「グルタメート排出に関与するタンパク質」という用語は、細胞内で生成されたグルタメートを細胞外に排出する役割を果たすタンパク質であり、機械受容チャネル（mechanosensitive channels）の一種を意味する。本発明においては、オルニチンの生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供するが、このために前記オルニチンの合成の原料となるグルタメートを細胞外に放出するタンパク質をコードする遺伝子を欠失させ、細胞内のグルタメートの濃度を高いレベルに維持できる形質転換菌株を製造した。
【００２２】
オルニチンの前駆体であるグルタメートの細胞内含有量を増加させると、オルニチン生合成経路を促進することができるが、本発明においては、ＮＣｇｌ１２２１タンパク質の活性を低下させることにより、グルタメートの排出を減少又は除去することができる。
【００２３】
ここで、欠失したグルタメート排出に関与するタンパク質は、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号２０のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するタンパク質である。
【００２４】
前記タンパク質の活性低下は、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、２）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、又は４）それらの組み合わせなどを用いて行うことができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２５】
前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全てを欠失させる方法は、細菌内の染色体に挿入されるベクターにより染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類により異なるが、具体的には１〜３００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個である。
【００２６】
また、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
【００２７】
また、本発明の酵素をコードする、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された核酸配列に置換することにより行うこともできる。
【００２８】
本発明における「内在的活性」という用語は、微生物が天然状態で有する酵素の活性状態を意味し、本発明においては微生物が天然に有するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性状態を意味し、本発明において「内在的活性よりも低下するように改変」されたとは、遺伝子の欠損又は突然変異により、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）が正常に作用せず、微生物が天然状態で有するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が低下した状態を意味する。
【００２９】
本発明における「オルニチンの生産能が向上した微生物」という用語は、母菌株よりオルニチンの生産能が増加した微生物を意味し、前記オルニチン生産能が向上した微生物は、特にこれらに限定されるものではないが、グルタメートからオルニチン合成までの生合成経路の強化のために、グルタメートをアセチルグルタメート（N-acetylglutamate）に変換するアセチルグルタメートシンターゼ、又はアセチルオルニチンをオルニチンに変換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートをアセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に変換するアセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタメートセミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に変換するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）などの活性が内在的活性よりも増加するようにさらに形質転換された微生物であってもよい。
【００３０】
前記形質転換された微生物は、従来のオルニチン生産菌株の開発、すなわちアルギニン生合成経路の転写抑制因子であるａｒｇＲの機能をなくすか、低下させてオルニチン生産を増加させ、さらにオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase）遺伝子を欠失させ、調節が解除されたＮ−アセチルグルタメートシンターゼ（N-acetylglutamate synthase）を導入してオルニチン生産を増加させる方法（特許文献１）とは異なるアプローチで製造された微生物である。
【００３１】
ここで、前記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）は、特にこれらに限定されるものではないが、それぞれ配列番号２３、２５、２７及び２９のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、これらの活性増加は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、３）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び４）それらの組み合わせにより増加するように改変する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法により行われる。
【００３２】
具体的には、微生物におけるタンパク質の活性を増加させるために、一般に様々な方法を用いることができる。例えば、プラスミド導入、相同性組換え、接合、転位などを用いた形質転換によりポリヌクレオチドのコピー数を増加させたり、ポリヌクレオチドの発現調節配列を改変したり、ポリヌクレオチドの発現を増加させる調節因子をコードする遺伝子を増幅したり、ポリヌクレオチドの発現を減少させる調節因子をコードするポリヌクレオチドを破壊又は低減することにより、ポリヌクレオチドの発現量を増加させることができる。より具体的には、ポリヌクレオチドを含む遺伝子断片をコリネバクテリウム属微生物内で複製できる多重コピーベクターに作動可能に連結したり、染色体内に一つ又は複数のポリヌクレオチドのコピーを導入したり、ポリヌクレオチドのプロモーターを含む発現調節配列を活性が改良されたものに代替することができる。
【００３３】
例えば、ベクターｐＨＣ１３９Ｔを用いてａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群を微生物に形質転換し、野生型よりオルニチン生産能が非常に向上した微生物を製造するか、又は微生物の染色体内に存在するａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現を調節するプロモーター領域を改良して強化するか、もしくはより改良されたプロモーターに置換してオルニチンまでの生合成経路を強化した微生物を用いることができる。特に、プロモーター領域を改良する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、染色体内のプロモーター置換は、置換しようとする領域の両末端塩基配列と導入しようとするプロモーターを染色体内の本来の位置と同じ形態に作製し、その後公知のｐＤＺベクターを用いた遺伝子欠失方法（特許文献３）と同様に行う方法を用いることができる。ここで、前記改良されたプロモーターは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号３０の塩基配列を有するｐｃｊ７（又はＰ（ＣＪ７））プロモーター（特許文献４）を用いることが好ましく、前記ｐＤＺベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、図３の切断地図で表されるベクターを用いることが好ましい。
【００３４】
本発明における「ベクター」という用語は、好適な宿主内で目的遺伝子を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、及びｐＥＴ系などを用いることができる。使用可能なベクターが特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。ｐＤＺベクターなどを用いることが好ましい。
【００３５】
一方、前記微生物は、特にこれらに限定されるものではないが、本発明の微生物は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性を示す、エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）、セレノモナス属（Selenomonas sp.）又はビブリオ属（Vibrio sp.）に属する微生物を形質転換させた微生物であってもよい。
【００３６】
コリネバクテリウム属微生物であることが好ましく、コリネバクテリウムグルタミカムであることがより好ましい。具体的には、野生型菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はグルタメート過剰生産菌株であるＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ（特許文献５）であってもよいが、これらに制限されるものではない。前記ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ菌株は、ＮＴＧなどの変異誘発物質により選別したグルタメート生産菌株（ＫＦＣＣ−１１０７４）に基づいてｃｇ２６２４（ＮＣＢＩ ＬＯＣＵＳ ＩＤ ＹＰ＿２２６６３６）、ｃｇ２１１５（ＮＣＢＩ ＬＯＣＵＳ ＩＤ ＹＰ＿２２６１７３）を欠失させたグルタメート過剰生産菌株である。
【００３７】
ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５の欠損に伴うグルタメート過剰生産のメカニズムは前記文献以前に明らかにされていないが、ｃｇ２６２４はｐｃａＲによりＩｃｌＲファミリーの調節タンパク質（IclR family regulatory protein）と命名されており、ｃｇ２１１５はｓｕｇＲにより糖代謝メカニズムの発現因子調節タンパク質（transcriptional regulators of sugar metabolism）と命名されている。
【００３８】
本発明の一実施例によれば、ａｒｇＦ遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ）（実施例１）、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１）（実施例２）、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ））（実施例３−１）、並びにａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）（実施例３−２）をそれぞれ製造した。これらのオルニチン生産性を比較した結果、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）が優れたオルニチン生産性を示すことが確認された（表５及び表６）。
【００３９】
よって、本発明者らは、オルニチン生産能が向上したオルニチン生産菌株を「ＣＣ０１−００６１（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）」と命名し、ブダペスト条約に基づいてソウル市西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０１０年１１月２４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１１３７Ｐとして寄託した。
【００４０】
上記目的を達成するための本発明の他の態様によれば、本発明は、（ｉ）前記オルニチン生産能が向上した微生物を培養して培養物を得る段階と、（ii）前記培養された微生物又は培養物からオルニチンを回収する段階とを含むオルニチンの生産方法を提供する。
【００４１】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養方法、連続培養方法、半回分培養方法などで行われることが好ましく、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、最も好ましくはｐＨ６．８）に調整し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持し、培養温度を２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養することが好ましい。前記培養により生産されたオルニチンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留し得る。
【００４２】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができ、窒素供給源として窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができ、リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができ、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、及びアミノ酸、ビタミンなどのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１：ａｒｇＦ遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株の作製
野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２と、ＮＴＧなどの変異誘発物質により選別したグルタメート生産菌株（ＫＦＣＣ−１１０７４）に基づいてｃｇ２６２４、ｃｇ２１１５を欠失させたグルタメート過剰生産菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ（特許文献５）から、オルニチンからアルギニンを合成する経路を防止するために、ａｒｇＦ欠失菌株を作製した。コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアルギニン生合成遺伝子はａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ形態のオペロン構造で構成され、欠失の標的であるａｒｇＦ遺伝子（配列番号１７）が染色体上でオルニチン合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子と並んで存在するので、外側の部分に位置するａｒｇＤとａｒｇＲの塩基配列に基づいてａｒｇＦ部分を欠失させるためのプラスミドを作製することを試みた。
【００４５】
具体的には、前記ＡＴＣＣ１３０３２菌株のａｒｇＤ及びａｒｇＲの塩基配列に基づいて、ａｒｇＦのＮ末端外部の相同組換え（homologous recombination）断片、及びａｒｇＦのＣ末端外部の相同組換え断片を得た。ここで、ａｒｇＦのＮ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１及び２）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、３０秒の伸長を２８サイクル）、ａｒｇＦのＣ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号３及び４）を用いた同一条件のＰＣＲを行うことにより得られた（表１）。
【００４６】
【表１】
0005860476.tif 000002
【００４７】
前記得られたａｒｇＦのＮ末端外部の相同組換え断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理して切断し、前記ａｒｇＦのＣ末端外部の相同組換え断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理して切断することにより、それぞれの断片を得た。また、これらの切断された各断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理して切断されたｐＤＺベクターに導入し、プラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）を得た。
【００４８】
前記得られたプラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）をＡＴＣＣ１３０３２とＫＣＣＭ−１０７８５Ｐに導入し、導入された菌株をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌ（5-ブロモ-4-クロロ -3-インドリン-β-D-ガラクシド）を含むＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ３７ｇ／ｌ，ソルビトール９１ｇ／ｌ，アガー２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成し、前記形成したコロニーから青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選抜した。
【００４９】
前記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース１０ｇ／ｌ，ポリペプトン１０ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／ｌ，牛肉エキス５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ  ２．５ｇ／ｌ，尿素２ｇ／ｌ，ｐＨ６．８）で振盪培養（３０℃，８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成した。形成したコロニーから比較的低い割合の白色のコロニーを選択し、ａｒｇＦが欠失した菌株を選抜した。
【００５０】
前記選抜された菌株から得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び４のプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、前記選抜された菌株に前記プラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）が導入されたことが確認され、前記選抜された菌株はａｒｇＦが欠失した菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ，ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ）であることが確認された。
【００５１】
実施例２：ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株の作製
実施例１で得られたＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ菌株とＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ菌株からグルタメートエクスポーター遺伝子であるＮＣｇｌ１２２１遺伝子をさらに欠失させることにより、オルニチンの前駆体であるグルタメートの細胞内含有量を増加させた。
【００５２】
具体的には、前記ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＮＣｇｌ１２２１の塩基配列（配列番号１９）に基づいて、ＮＣｇｌ１２２１のＮ末端外部の相同組換え断片、及びＮＣｇｌ１２２１のＣ末端外部の相同組換え断片を得た。ここで、ＮＣｇｌ１２２１のＮ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号５及び６）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ、ＮＣｇｌ１２２１のＣ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号７及び８）を用いた実施例１と同一条件でＰＣＲを行うことにより得られた（表２）。
【００５３】
【表２】
0005860476.tif 000003
【００５４】
前記得られたＮＣｇｌ１２２１のＮ末端外部の相同組換え断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理して切断し、前記ＮＣｇｌ１２２１のＣ末端外部の相同組換え断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理して切断することにより、それぞれの断片を得た。また、これら切断された各断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理して切断されたｐＤＺベクターに導入し、プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）を得た。
【００５５】
前記得られたプラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ菌株とＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦに導入し、導入された菌株をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成し、前記形成したコロニーから青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選抜した。
【００５６】
前記選抜された菌株をＣＭ培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成した。形成したコロニーから比較的低い割合の白色のコロニーを選択し、ＮＣｇｌ１２２１が欠失した菌株を選抜した。
【００５７】
前記選抜された菌株から得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び８のプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、前記選抜された菌株に前記プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）が導入されたことが確認され、前記選抜された菌株はＮＣｇｌ１２２１が欠失した菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１，ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１）であることが確認された。
【００５８】
実施例３：ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株の作製
実施例３−１：ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子のクローニング及び形質転換体の製造
グルタメートからオルニチンを合成する経路に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤオペロン（プロモーター領域を含む，配列番号２１）のコピー数を増加させてオルニチン生成経路を強化するために、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ及びａｒｇＤ遺伝子（それぞれ配列番号２２、２４、２６及び２８）が導入されたベクターを製造し、これを導入した形質転換体を製造した。
【００５９】
まず、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、プライマー（配列番号９及び１０）を用いたＰＣＲを行うことにより（９５℃、４０秒の変性、５５℃、４０秒のアニーリング、及び７２℃、１５０秒の伸長を３０サイクル）、４，９００ｂｐの大きさの遺伝子断片を得た（表３）。
【００６０】
【表３】
0005860476.tif 000004
【００６１】
前記得られた遺伝子断片を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望の大きさのバンドを溶出し、溶出したバンドに制限酵素であるＫｐｎＩ及びＸｂａＩを処理して断片を得た。前記得られた断片をｐＨＣ１３９Ｔ−ｇｆｐベクター（特許文献６）にクローニングし、発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）を製造した。
【００６２】
次に、菌株内のオルニチン生成量を増加させるために、前記製造した発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株とＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株に電気穿孔法で導入し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して形質転換体を選抜し、前記選抜された形質転換体をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ））、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）と命名した。
【００６３】
実施例３−２：染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーター置換
グルタメートからオルニチンを合成する経路に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の調節解除により発現量を増加させるために、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ自体のプロモーターを本出願人が新規開発したＣＪ７プロモーターに置換することを試みた。
【００６４】
まず、ＣＪ７プロモーターを含み、前記プロモーターの両末端部位は染色体上の本来の配列を有する相同組換え断片を得た。
【００６５】
具体的には、ＣＪ７プロモーターの５'末端部位はＡＴＣＣ１３０３２菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１１及び１２）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、３０秒の伸長を２８サイクル）、ＣＪ７プロモーターの部位はプライマー（配列番号１３及び１４）を用いた同一条件でＰＣＲを行うことにより得られ、ＣＪ７プロモーターの３'末端部位はプライマー（配列番号１５及び１６）を用いた同一条件でＰＣＲを行うことにより得られた（表４）。
【００６６】
【表４】
0005860476.tif 000005
【００６７】
前記得られたプロモーターの５'末端部位（ａｒｇＣ−Ｌ）を制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理し、ＣＪ７プロモーター領域を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで処理し、プロモーターの３'末端部位（ａｒｇＣ−Ｒ）を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで処理し、これら制限酵素で処理された各ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングし、プロモーターが置換された発現ベクターｐＤＺ−ＣＪ７（ａｒｇ）を製造した。
【００６８】
前記製造した発現ベクターｐＤＺ−ＣＪ７（ａｒｇ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株に電気穿孔法で導入し、形質転換体を製造した。前記製造した形質転換体をＣＭ培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、前記培養物を１０−４から１０−１０まで順次希釈し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンとＸ−ｇａｌを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成した。
【００６９】
ほとんどのコロニーが青色であるのに対して低い割合で出現する白色のコロニーを選別することにより、２次交差により最終的にａｒｇプロモーターがＣＪ７に置換された菌株を選抜し、前記菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１３及び１６）を用いたＰＣＲを行うことにより（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、６０秒の伸長を２８サイクル）、前記導入された発現ベクターｐＤＺ−ＣＪ７（ａｒｇ）により染色体内のａｒｇＣＪＢＤプロモーターが置換されていることが確認され、前記確認された菌株をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤと命名した。
【００７０】
実施例４：ａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子欠失、並びにａｒｇＣＪＢＤ発現量増加によるオルニチン生産性の向上効果
実施例４−１：ＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウムグルタミカム菌株ベースのオルニチン生産能の確認
ＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウムグルタミカムベースの菌株において、ａｒｇＦ遺伝子欠失、ＮＣｇｌ１２２１遺伝子欠失及びａｒｇＣＪＢＤ発現量増加がオルニチンの生産に及ぼす効果を確認するために、実施例２及び３で製造した各菌株を対象にオルニチン生産能を比較した。
【００７１】
具体的には、実施例２及び３で製造された各菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１，ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ），ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）を１ｍＭのアルギニンを含むＣＭＡ平板培地に塗抹して３７℃で２４時間培養し、前記培養した各菌株を１ｍＭのアルギニンを含む２５ｍｌの力価培地（２％（ｗ／ｖ）のグルコース、１％（ｗ／ｖ）のポリペプチン、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５％（ｗ／ｖ）の尿素、０．４％（ｗ／ｖ）のＫＨ２ＰＯ４、０．８％（ｗ／ｖ）のＫ２ＨＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４、１００μｇ／ｌのビオチン及び１ｍｇ／ｌのチアミン）に接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養し、各培養物から生産されたオルニチンの濃度を測定して比較した（表５）。ここで、対照群としては遺伝的に改変されていない菌株ＡＴＣＣ１３０３２を用いた。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
表５から分かるように、ａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失した場合、野生型菌株からは生産されないオルニチンが６．０ｇ／ｌの濃度で生産された。ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現量増加については、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子をベクター形態で導入した場合に生産されたオルニチン濃度は６．４ｇ／ｌであることが確認され、ａｒｇＣＪＢＤの染色体上のプロモーターをＣＪ７に置換した場合に生産されたオルニチンの濃度は７．７ｇ／ｌと多少増加したことが確認された。
【００７４】
実施例４−２：グルタメート生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ菌株ベースのオルニチン生産能の確認
オルニチンの前駆体であるグルタメートを過剰生産するコリネバクテリウムグルタミカム菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐに基づいて、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子欠失並びにａｒｇＣＪＢＤ発現量増加がオルニチンの生産に及ぼす効果を確認するために、実施例２及び３で製造した各菌株を対象にオルニチン生産能を比較した。
【００７５】
具体的には、実施例２及び３で製造された各菌株（ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１，ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ），ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）を実施例４−１と同一条件で接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養し、各培養物から生産されたオルニチンの濃度を測定して比較した（表６）。ここで、対照群としては遺伝的に改変されていない菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐを用いた。
【００７６】
【表６】
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【００７７】
表６から分かるように、グルタメート過剰生産菌株ベースでも、ａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失した場合、野生型菌株からは合成されないオルニチンが７．６ｇ／ｌの濃度で生成された。ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現量増加については、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子をベクター形態で導入した場合に生産されたオルニチン濃度は７．９ｇ／ｌであることが確認され、ａｒｇＣＪＢＤの染色体上のプロモーターをＣＪ７に置換した場合に生産されたオルニチンの濃度は９．０ｇ／ｌと多少増加したことが確認された。
【００７８】
よって、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現量増加によりオルニチンまでの合成経路を強化するとオルニチンの生産量が増加することが確認された。
【００７９】
よって、本発明者らはオルニチン生産能に最も優れることが確認された実施例３−２で製造された菌株を「ＣＣ０１−００６１（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）」と命名し、ブダペスト条約に基づいてソウル市西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０１０年１１月２４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１１３７Ｐとして寄託した。
【００８０】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関して、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【００８１】
0005860476.tif 000008
【図１】
0005860476.tif 000009
【図２】
0005860476.tif 000010
【図３】
0005860476.tif 000011
【配列表】
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