(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のＡの工程を含む、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、センキュウ、オウレン、あるいはオンジから選ばれるいずれか一種以上の生薬の熱水抽出物を有効成分とする口腔扁平上皮癌由来の口腔癌細胞浸潤阻害剤の製造方法。
Ａ．オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、センキュウ、オウレン、あるいはオンジから選ばれるいずれか一種以上の生薬を熱水で抽出する工程
【請求項２】
次のＢの工程を含む、オウゴン、ケイヒ、ボウフウ、ゲンチアナ末、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンソウニン、シャクヤクあるいはソウジュツから選ばれるいずれか一種以上の生薬のメタノール抽出物を有効成分とする口腔扁平上皮癌由来の口腔癌細胞浸潤阻害剤の製造方法。
Ｂ．オウゴン、ケイヒ、ボウフウ、ゲンチアナ末、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンソウニン、シャクヤクあるいはソウジュツから選ばれるいずれか一種以上の生薬をメタノールで抽出する工程
【請求項３】
次のＣの工程を含む、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、オンジ、ケイガイ、ゴシュユ、サンショウあるいはセンコツから選ばれるいずれか一種以上の生薬の熱水抽出物を有効成分とする舌癌由来の口腔癌細胞浸潤阻害剤の製造方法。
Ｃ．オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、オンジ、ケイガイ、ゴシュユ、サンショウあるいはセンコツから選ばれるいずれか一種以上の生薬を熱水で抽出する工程
【請求項４】
次のＤの工程を含む、オウゴン、ケイヒ、オンジ、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、センコツ、ソウジュツあるいはシンイから選ばれるいずれか一種以上の生薬のメタノール抽出物を有効成分とする舌癌由来の口腔癌細胞浸潤阻害剤の製造方法。
Ｄ．オウゴン、ケイヒ、オンジ、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、センコツ、ソウジュツあるいはシンイから選ばれるいずれか一種以上の生薬をメタノールで抽出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オウゴン（黄ゴン）、ケイヒ（桂皮）またはサイシン（細辛）（以下、それぞれオウゴン、ケイヒ、サイシンと示す）等の生薬を有効成分とする口腔癌細胞浸潤阻害剤に関する。また、該口腔癌細胞浸潤阻害剤を有効成分とする口腔癌治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
オウゴン、ケイヒまたはサイシン等の生薬は、草根木皮から得られる天然由来のものであり、健胃、充血性疾患、発熱を伴う出血性疾患、駆風薬等、様々な用途に利用されている（例えば、非特許文献１参照）。
近年、このような生薬や、生薬から分離精製した化合物が前立腺癌、大腸癌等の様々な癌の治療に有効であることが示唆されている。
例えば、特許文献１では、ダイオウ（大黄）、サンシシ（山梔子、以下、サンシシと示す）、オウレン（黄連、以下、オウレンと示す）、オウゴン等の生薬を発癌抑制剤の有効成分として挙げており、これらの生薬を含む粉末飼料を用いてマウスを飼育したところ、大腸癌の前癌病変である大腸粘膜異常腺窩（ＡＣＦ）の発生が抑制されたことを確認している。
また、特許文献２では、オウギ（黄耆、以下。オウギと示す）の水抽出物またはアルコール抽出物が、前立腺癌細胞の活性を抑制すること確認しており、これらを有する組成物を前立腺癌の成長を効果的に抑制する組成物としている。
【０００３】
特許文献３では、キバナオウギの水性抽出物、エタノール性抽出物、分配抽出物等が、乳房腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、卵巣腫瘍、卵管腫瘍等の治療もしくは予防に有効であることが開示されており、特許文献４では、オウゴン、ゲンチアナ等の水、エタノール、メタノール等の抽出物がマウス線維肉腫細胞、黒色腫細胞および頸部上皮細胞癌細胞に対し、抗腫瘍作用を有することを確認している。
また、特許文献５では、ボウイ（防己）、サイシン、シンイ（辛夷、以下、シンイと示す）、オウレン、コウボク（厚朴、以下、コウボクと示す）から抽出される、マグノフロリン等の複素環化合物を含む抗腫瘍剤が開示されており、ヒト肝癌細胞株に対して抗腫瘍効果を生じることも確認されている。
さらに、特許文献６では、マオウ（麻黄）が癌細胞表面に発現している受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＴ）と肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）との結合を阻害することが開示されており、この結合によって引き起こされる癌細胞の増殖、浸潤及び転移等を抑制することが示唆されている。そして、乳癌細胞株において、培養系にマオウ等を添加した場合、ＨＧＦにおいて誘導される細胞運動が抑制されたことを確認している。
【０００４】
このように、生薬や、生薬から分離精製した化合物が前立腺癌、大腸癌等の様々な癌に有効であることは知られているものの、口腔癌を対象とする効果については、今のところ示唆も検討されてきていない。さらに、癌の死因の９割とされる転移を抑制する治療薬はほとんど得られておらず、この転移の元となる癌細胞の浸潤を阻害する薬剤の提供が望まれている。生薬や、複数の生薬を組み合わせた漢方薬は、副作用が比較的少ない安全な薬とされており、口腔癌の治療においても、このような薬の提供は有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−３３７５３５号公報
【特許文献２】特開２００６−１７６５０８号公報
【特許文献３】特表２０１０−５３９０８５号公報
【特許文献４】特開２００２−５３４７９号公報
【特許文献５】特開２００８−９４８１５号公報
【特許文献６】特開２０１０−２３５５２９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】天然医薬資源学、第４版、株式会社廣川書店発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、口腔癌の治療において有効な生薬を見出すことを課題とする。また、該生薬を有効成分とする口腔癌治療薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、オウゴン、ケイヒ、サイシン等の生薬が、口腔癌細胞に対し、浸潤阻害能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明において見出されたこれらの生薬は、口腔癌細胞浸潤阻害剤の有効成分として利用することができる。また、さらにこれらの生薬を有効成分として利用することにより、副作用の少ない安全性の高い口腔癌の浸潤阻害剤等を提供できるものと予測される。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（８）の口腔癌細胞浸潤阻害剤および口腔癌治療薬に関する。
（１）生薬を有効成分とする口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（２）熱水またはメタノールで抽出した生薬を有効成分とする上記（１）に記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（３）生薬が、シソ科、マメ科、クスノキ科、ウマノスズクサ科、ゴマノハグサ科、セリ科、リンドウ科、ケシ科、キンポウゲ科、ヒメハギ科、ショウガ科、ミカン科、スイレン科、マツブサ科、モクレン科、アカネ科、クロウメモドキ科、ボタン科、サトイモ科またはキク科に属する生薬である上記（１）に記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（４）生薬が、シソ科のオウゴンあるいはケイガイ（荊芥、以下、ケイガイと示す）、マメ科のカンゾウ（甘草、以下、カンゾウと示す）、オウギ、カッコン（葛根、以下、カッコンと示す）あるいはサンズコン（山豆根、以下、サンズコンと示す）、クスノキ科のケイヒ、ウマノスズクサ科のサイシン、ゴマノハグサ科のジオウ（地黄、以下、ジオウと示す）、セリ科のセンキュウ（川キュウ、以下、センキュウと示す）、ボウフウ（防風、以下、ボウフウと示す）、ウイキョウ（茴香、以下、ウイキョウと示す）、キョウカツ（キョウ活、以下、キョウカツと示す）あるいはサイコ（柴胡、以下、サイコと示す）、リンドウ科のリュウタン（竜胆、以下、リュウタンと示す）あるいはゲンチアナ末、ケシ科のエンゴサク（延胡索、以下、エンゴサクと示す）、キンポウゲ科のオウレン、ヒメハギ科のオンジ（遠志、以下、オンジと示す）、ショウガ科のカンキョウ（乾姜、以下、カンキョウと示す）、ミカン科のゴシュユ（呉茱萸、以下、ゴシュユと示す）あるいはサンショウ（山椒、以下、サンショウと示す）、スイレン科のセンコツ（川骨、以下、センコツと示す）、マツブサ科のゴミシ（五味子、以下、ゴミシと示す）、モクレン科のシンイ、アカネ科のサンシシ、クロウメモドキ科のサンソウニン（酸棗仁、以下、サンソウニンと示す）、ボタン科のシャクヤク（芍薬、以下、シャクヤクと示す）、サトイモ科のショウブコン（菖蒲根、以下、ショウブコンと示す）またはキク科のソウジュツ（蒼朮、以下、ソウジュツと示す）から選ばれるいずれか一種以上である上記（３）に記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（５）口腔癌細胞が口腔扁平上皮癌由来の細胞または舌癌由来の細胞である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（６）生薬が熱水あるいはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒあるいはセンキュウ、熱水で抽出したウイキョウ、オウレン、あるいはオンジ、またはメタノールで抽出したサイシン、ジオウ、ボウフウ、リュウタン、オウギ、カッコン、カンキョウ、ケイガイ、ゲンチアナ末、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤクあるいはソウジュツから選ばれるいずれか一種以上であり、口腔癌細胞が口腔扁平上皮癌由来の細胞である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（７）生薬が熱水あるいはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、オンジ、ケイガイ、サンショウあるいはセンコツ、熱水で抽出したウイキョウ、エンゴサク、カッコンあるいはゴシュユ、またはメタノールで抽出したセンキュウ、カンキョウ、ゲンチアナ末、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、ソウジュツあるいはシンイから選ばれるいずれか一種以上であり、口腔癌細胞が舌癌由来の細胞である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の口腔癌細胞浸潤阻害剤を有効成分とする口腔癌治療薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の口腔癌細胞浸潤阻害剤を用いることにより、浸潤能を有する口腔扁平上皮癌や舌癌等の口腔癌に対し、生薬を有効成分とする、安全かつ有効な、新たな治療薬の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト歯肉線維芽細胞の違いによる癌細胞の浸潤の差を示した図である。
【図２−１】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における口腔上皮扁平癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図２−２】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における口腔上皮扁平癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図３−１】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における口腔上皮扁平癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図３−２】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における口腔上皮扁平癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図３−３】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における口腔上皮扁平癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図４】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における口腔上皮扁平癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦＡ９）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図５−１】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図５−２】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図５−３】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図５−４】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図６−１】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図６−２】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図６−３】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図６−４】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図６−５】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦ００）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図７−１】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦＡ９）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図７−２】各被験物質（生薬の熱水抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦＡ９）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図８−１】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦＡ９）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【図８−２】各被験物質（生薬のメタノール抽出物）における舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）のコラーゲンゲル（ヒト歯肉線維芽細胞：ＧＦＡ９）内への浸潤阻害能を示した図である（実施例１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」とは口腔癌細胞の浸潤を阻害する剤のことをいう。本発明における「口腔癌細胞浸潤阻害剤」は、歯肉線維芽細胞と口腔癌由来の細胞とを含むコラーゲンゲルをモデルとし、生薬を被験物質として加え、スクリーニングした場合に、口腔癌由来の細胞のコラーゲンゲル内への浸潤を阻害できる生薬を有効成分とする剤であればいずれのものも含まれる。
このスクリーニングにあたり、コラーゲンゲルに含まれる歯肉線維芽細胞は、歯肉上皮細胞と歯肉線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを用いた三次元培養において、コラーゲンゲル収縮率が大きく、コラーゲンゲル収縮後の残存コラーゲン量が約５００μｇ以下と少ない、コラーゲン分解能が高いヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）を用いることが特に好ましい。このようなヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）として、本発明者らが独自に得たＧＦ００またはＧＦＡ９を用いることができる。これらのヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）は、直径３５ｍｍのコラーゲンゲルを用いて三次元培養した場合、培養終了時には直径３ｍｍ以下位までにコラーゲンゲルを収縮することができる、重度歯周炎の患者から得られるヒト歯肉線維芽細胞であった。
【００１３】
また、これらのヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）は、図１に示されるように、健常な歯肉由来のヒト歯肉線維芽細胞（ＧＦ３：善玉線維芽細胞）と比べて、癌細胞の浸潤を促進させる作用を有することが確認されている。本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」のスクリーニングには、このような癌細胞の浸潤を促進させる作用を有するヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）を用いることが特に好ましい。
なお、図１は、悪玉線維芽細胞または善玉線維芽細胞を含むコラーゲンゲル用いた三次元培養における、口腔扁平上皮癌由来の細胞（Ｃａ９−２２と示す（独立行政法人理化学研究所細胞材料開発室より購入））のコラーゲンゲル内の浸潤細胞数を調べた図である。その結果、悪玉線維芽細胞を含むコラーゲンゲルでは、善玉線維芽細胞を含む場合と比べて、癌細胞の浸潤が３０倍以上促進されたことが確認されている。
【００１４】
本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」の有効成分となる生薬は、シソ科、マメ科、クスノキ科、ウマノスズクサ科、ゴマノハグサ科、セリ科、リンドウ科、ケシ科、キンポウゲ科、ヒメハギ科、ショウガ科、ミカン科、スイレン科、マツブサ科、モクレン科、アカネ科、クロウメモドキ科、ボタン科、サトイモ科またはキク科に属する生薬等が挙げられる。
さらに具体的には、シソ科のオウゴンあるいはケイガイ、マメ科のカンゾウ、オウギ、カッコンあるいはサンズコン、クスノキ科のケイヒ、ウマノスズクサ科のサイシン、ゴマノハグサ科のジオウ、セリ科のセンキュウ、ボウフウ、ウイキョウ、キョウカツあるいはサイコ、リンドウ科のリュウタンあるいはゲンチアナ末、ケシ科のエンゴサク、キンポウゲ科のオウレン、ヒメハギ科のオンジ、ショウガ科のカンキョウ、ミカン科のゴシュユあるいはサンショウ、スイレン科のセンコツ、マツブサ科のゴミシ、モクレン科のシンイ、アカネ科のサンシシ、クロウメモドキ科のサンソウニン、ボタン科のシャクヤク、サトイモ科のショウブコンまたはキク科のソウジュツ等が挙げられる。
本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」は、これらを熱水またはメタノールで抽出したものを一種以上有効成分として含む剤であることが好ましく、これらを複数組み合わせて含むものであっても良い。
【００１５】
本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」の対象となる口腔癌由来の細胞としては、従来知られているいずれの口腔癌由来の細胞であっても良いが、例えば、口腔扁平上皮癌由来の細胞または舌癌由来の細胞等を挙げることができる。
口腔扁平上皮癌由来の細胞の浸潤を阻害する「口腔癌細胞浸潤阻害剤」としては、熱水あるいはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒあるいはセンキュウ、熱水で抽出したウイキョウ、オウレンあるいはオンジ、またはメタノールで抽出したサイシン、ジオウ、ボウフウ、リュウタン、オウギ、カッコン、カンキョウ、ケイガイ、ゲンチアナ末、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤクあるいはソウジュツから選ばれるいずれか一種以上を含む剤であることが好ましく、これらを複数組み合わせて含むものであっても良い。
【００１６】
また、舌癌由来の細胞の浸潤を阻害する「口腔癌細胞浸潤阻害剤」としては、熱水あるいはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、オンジ、ケイガイ、サンショウあるいはセンコツ、熱水で抽出したウイキョウ、エンゴサク、カッコンあるいはゴシュユ、またはメタノールで抽出したセンキュウ、カンキョウ、ゲンチアナ末、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、ソウジュツあるいはシンイから選ばれるいずれか一種以上を含む剤であることが好ましく、これらを複数組み合わせて含むものであっても良い。
【００１７】
本発明の「口腔癌治療薬」は、本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。特に、オウゴン、ケイヒまたはサイシン等の口腔癌由来の細胞に対し浸潤阻害能を有する生薬、またはこれらを熱水またはメタノールで抽出したものを有効成分とする「口腔癌細胞浸潤阻害剤」を有効成分とするものであることが好ましい。
本発明の「口腔癌治療薬」は、本発明の「口腔癌細胞浸潤阻害剤」のみを含有するものであってもよく、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。
さらに、本発明の「口腔癌治療薬」は、液状、固形状、半固形状等のどのような形状であっても良く、経口、経粘膜、注射等によって投与できる薬であれば良い。たとえば、錠剤、散剤、トローチ、軟膏、粘膜貼付剤、うがい薬等としても用いることができる。
【００１８】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
＜口腔癌細胞浸潤阻害剤＞
口腔癌細胞浸潤阻害能を有する物質を、以下の方法によってスクリーニングした。
１．被験物質の調製
オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ボウフウ、リュウタン、ウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、センコツ、ソウジュツまたはシンイの３１種類の生薬（いずれも株式会社ウチダ和漢薬）を用いた。
【００２０】
１）熱水抽出
各生薬（ゲンチアナ末、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、ソウジュツおよびシンイを除く）を熱水で抽出し、熱水抽出物を得た。
即ち、各生薬約１０ｇを精秤し、ガラス製ティーポット型の容器（煎じ器：株式会社ウチダ和漢薬）にいれ、精製水２００ｍＬ（生薬重量の２０倍量）を加えた。電熱器で沸騰させ、水の量が半量になるまで加熱した（およそ沸騰から２０分）。熱時、カスを濾し、得られた熱水抽出液を室温にさましてから、遠心管に移し遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１０分、１５度）を行った。遠心分離後の上清を吸引ろ過し、ろ液を得た。ろ液を凍結乾燥し熱水抽出物とした。
【００２１】
２）メタノール抽出
各生薬（ウイキョウ、エンゴサク、オウレン、コウボクおよびゴシュユを除く）をメタノールで抽出し、メタノール抽出物を得た。
即ち、各生薬約１０ｇを精秤し、ナス型フラスコに入れ、１５０ｍＬの７０％メタノールを加え、４０分間還流抽出を行った。熱時ろ過し、残渣に新たに７０％メタノール１５０ｍＬを加え、再度４０分間還流抽出を行った。熱時ろ過し、先に得たろ液と合わせ、エバポレーターを用いて減圧濃縮した。メタノールが消失した後凍結乾燥し、メタノール抽出物とした。
【００２２】
２．コラーゲンゲルの調製
１）細胞の調製
歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片より組織を経て細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉線維芽細胞（ＧＦ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を、コラーゲン分解能を有する細胞として得た。本発明においては、このようにして得られたヒト歯肉線維芽細胞のうち、初代培養ヒト歯肉上皮細胞を含むコラーゲンゲルを用いた三次元培養において、コラーゲン分解能が特に高いことが確認されたヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）であるＧＦ００またはＧＦＡ９を用いた。ＧＦ００またはＧＦＡ９は、それぞれ異なる歯肉片を由来とするヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）であった。
また、口腔癌細胞として、独立行政法人理化学研究所細胞材料開発室より購入した口腔扁平上皮癌由来の細胞（Ｃａ９−２２と示す）または舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３と示す）を用いた。これらの口腔癌細胞はいずれも１０％血清を加えたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ2の環境下で前培養したものをコラーゲンゲルの構築に用いた。
【００２３】
２）コラーゲンゲルの構築
セルマトリックスｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作成した。このコラーゲン混合溶液に、スクリーニングに用いる被験物質を加えた。各被験物質は、オウレンまたはセンコツから調製したものは１０μｇ／ｍｌ、それ以外の生薬から調製したものは１００μｇ／ｍｌとなるように加えた。また、被験物質を加えないものをコントロールとした。
これらに上記１）で調製したコラーゲン分解能を有する細胞を懸濁した後、６穴プレート内に播種して３０分間硬化（ゲル化）させ、コラーゲン分解能を有する細胞を含むコラーゲンゲルを構築した。
次に、このコラーゲンゲル上に、上記１）で調製した口腔癌細胞をトリプシンで分散させた後播種し、口腔癌細胞の単層を形成させ、コラーゲン分解能を有する細胞と口腔癌細胞とを含むコラーゲンゲルを構築した。
【００２４】
３．口腔癌細胞浸潤阻害剤のスクリーニング
上記で構築した被験物質を含むコラーゲンゲルを、２４時間後にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始した（培養１日目）。浮遊培養開始時点に、再度被験物質を加えた。浮遊培養開始後５日目にゲルの上部を空気に曝し、口腔癌細胞を重層化させるためにさらに５日間培養後、１０％ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、ＨＥ染色を施した。その後、顕微鏡下にて、もとの基底膜の位置よりコラーゲンゲル内に浸潤している口腔扁平上皮癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）または舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）の細胞数を数え、各被験物質における口腔癌細胞浸潤阻害能を特定した。
【００２５】
各被験物質における口腔癌細胞浸潤阻害能は、被験物質を加えていないコラーゲンゲル（コントロール）内に浸潤した口腔癌細胞の数を数え、これに対して各被験物質を加えたコラーゲンゲル内に浸潤した口腔癌細胞の数の割合を求めることで判断した。
この割合が０．１未満であった被験物質は浸潤を顕著に抑制するもの、０．１以上０．５未満の被験物質は浸潤をかなり抑制するもの、０．５以上０．８未満の被験物質は浸潤をわずかに抑制するものであり、高い口腔癌細胞浸潤阻害能を有するものと判断された。一方、この割合が０．８以上１．２５未満の被験物質はコントロールと同程度の浸潤を示すものであり、１．２５以上３．０未満の被験物質は浸潤をわずかに促進するもの、３．０以上のものは浸潤を顕著に促進するものであり、口腔癌細胞浸潤阻害能を有さないものと判断された。
【００２６】
例えば、口腔扁平上皮癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）とヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）としてＧＦ００を含むコラーゲンゲルにおいて、コントロールの浸潤細胞数は１７７個であったが、オンジの熱水抽出物を被験物質とした場合の浸潤細胞数は３１個であり、コントロールに対して０．１８の割合で、口腔扁平上皮癌由来の細胞（Ｃａ９−２２）の浸潤を抑制していることが確認された。
また、舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）とヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）としてＧＦ００を含むコラーゲンゲルにおいて、コントロールの浸潤細胞数は３３２個であったが、オンジの熱水抽出物を被験物質とした場合の浸潤細胞数は１０５個であり、コントロールに対して０．３２の割合で、舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）の浸潤を抑制していることが確認された。
さらに、舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）とヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）としてＧＦＡ９を含むコラーゲンゲルにおいて、コントロールの浸潤細胞数は１８５個であったが、オンジの熱水抽出物を被験物質とした場合の浸潤細胞数は２２個であり、コントロールに対して０．１２の割合で、舌癌由来の細胞（ＨＳＣ−３）の浸潤を抑制していることが確認された。
以下、同様に、各被験物質における口腔癌細胞浸潤阻害能を調べ、各被験物質における口腔癌細胞浸潤阻害能の結果を表１にまとめて示した。また、コントロールおよび各被験物質を加えた場合のコラーゲンゲル内への口腔癌細胞の浸潤の様子（ＨＥ染色像）を図２−１〜図８−２に示した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
４．結果
表１に示したように、口腔扁平上皮癌由来の細胞に対し、熱水またはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒおよびセンキュウ、熱水で抽出したウイキョウ、オウレンおよびオンジ、またはメタノールで抽出したサイシン、ジオウ、ボウフウ、リュウタン、オウギ、カッコン、カンキョウ、ケイガイ、ゲンチアナ末、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤクおよびソウジュツのいずれもが、浸潤抑制能を有することが確認できた。
また、舌癌由来の細胞に対し、熱水またはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、オンジ、ケイガイ、サンショウおよびセンコツ、熱水で抽出したウイキョウ、エンゴサク、カッコンおよびゴシュユ、またはメタノールで抽出したセンキュウ、カンキョウ、ゲンチアナ末、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウブコン、ソウジュツおよびシンイのいずれもが、浸潤抑制能を有することが確認できた。
【００２９】
５．口腔癌細胞浸潤阻害剤の製造
上記において確認された口腔癌細胞の浸潤阻害能を有する生薬を有効成分とする口腔癌細胞浸潤阻害剤を製造した。
【実施例２】
【００３０】
＜口腔癌治療薬＞
実施例１において製造された口腔癌細胞浸潤阻害剤を有効成分として、口腔癌治療薬を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の生薬を有効成分とする口腔癌細胞浸潤阻害剤は、浸潤能を有する口腔扁平上皮癌や舌癌等の口腔癌を対象とする、安全かつ有効な、新たな治療薬の提供に利用できる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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