(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）グラム陰性細菌細胞内でポリペプチドを産出するように、ポリペプチドをコード化する外因性ポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）溶菌-欠損ファージが、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージ化するようにする工程であって、前記溶菌-欠損ファージを細菌細胞内に保持する工程と、
ｃ）i)細菌細胞の外膜又はii)細菌細胞の内膜及び外膜、を透過処理する工程と、
ｄ）細菌細胞を標的分子と接触させる工程と、
ｅ）所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングする工程と、を含み、
前記ポリペプチドは、細菌細胞の細胞壁又は内膜によって細菌細胞内に保持される、及び／又は、前記ポリペプチドは、細菌細胞の細胞壁又は内膜に結合する、方法。
【請求項２】
前記細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、少なくとも第２ポリペプチドと結合することにより、透過処理された細菌細胞内に保持されるタンパク質複合体、及び／又は、細菌細胞壁に結合するタンパク質複合体を形成する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、第２ポリペプチド又はそのサブユニットに結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２ポリペプチドは、
ｉ）タンパク質複合体が透過処理された細菌細胞壁内に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド；
ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質
ｉｉｉ）細菌細胞壁結合タンパク質、及び／又は
ｉｖ）溶菌-欠損ファージのファージコートタンパク質から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌細胞の内膜及び外膜は、１以上の界面活性剤又は有機溶媒で透過処理される、請求項２から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、並びに、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）及びジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）の混合物から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒は、クロロホルムである請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌細胞の内膜及び外膜は、クロロホルム飽和水溶液中で細菌細胞を培養することによって透過処理される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記細菌細胞は、約２５℃で約１０分間、クロロホルム飽和水溶液中で培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｉ）前記細菌細胞の外膜は、透過処理され；
ｉｉ）前記細菌細胞壁は、少なくとも一部が加水分解され；
ｉｉｉ）前記ポリペプチドは、前記内膜に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌細胞は、少なくとも一部がリゾチームで加水分解される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、前記内膜に結合するタンパク質に結合する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、前記内膜の外表面に結合する、請求項１２から１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド、ファージミド又はファージＤＮＡである、請求項１から１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記溶菌-欠損ファージは、ラムダファージ、１８６、Ｐ２、１８６及びＰ２のハイブリッド、並びにＰ４から選択される溶原性ファージである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶菌-欠損ファージは、プロファージである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌細胞は、溶菌-欠損ラムダ、１８６、Ｐ２、１８２及びＰ２のハイブリッド、及び／又はＰ４プロファージを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌細胞は、Ｐ２及びＰ４プロファージを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶菌-欠損ファージがポリヌクレオチドをパッケージ化するようにする工程は、ファージを作製するように細菌細胞中のプロファージの活性を誘導する工程を含み、
前記ファージは、ポリヌクレオチドをパッケージする、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プロファージの活性を誘導する工程は、前記細菌細胞中の１以上のファージアクチベータ・タンパク質を作製する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌細胞は、Ｐ２及びＰ４プロファージを含み、
前記方法は、前記細菌細胞中にＰ２及び／又はＰ４活性タンパク質を作製する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｐ２及び／又はＰ４活性タンパク質は、１以上の、Ｐ２cox、Ｐ２ogr、Ｐ４δ及び／又はＰ４εから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロファージの活性を誘導する工程は、１以上のファージリプレッサー・タンパク質を培養する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌細胞は、Ｐ２及び／又はＰ４プロファージを含み、
前記Ｐ２プロファージの活性を誘導する工程は、前記細菌細胞中のＰ２タンパク質Ｃの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ファージは、リゾチーム遺伝子の不活性形への欠失若しくは変位株に起因して、又はホリン遺伝子及びリゾチーム遺伝子の不活性形への欠失若しくは変位株に起因して、溶菌欠損である、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｐ２プロファージリゾチーム遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を含むヌクレオチド配列を含み、
前記Ｐ２ホリン遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌細胞は、ラムダプロファージを含み、
前記プロファージの活性を誘導する工程は、前記細菌細胞中のタンパク質ｃＩの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌細胞は、ラムダプロファージを含み、
前記ラムダプロファージの活性を誘導する工程は、前記細菌細胞中のラムダファージリプレッサータンパク質ｃＩの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌細胞は、１８６プロファージを含み、
前記１８６プロファージの活性を誘導する工程は、前記細菌細胞中の１８６タンパク質ｃＩの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法は、グラム陰性細菌細胞中の標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドを追加スクリーニングする工程をさらに含み、
ｉ）前記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、溶菌-欠損ファージにパッケージされていない、及び／又は、
ｉｉ）前記ポリペプチドは、細菌細胞壁によって細菌細胞内に保持されておらず、及び／又は、細菌細胞壁に結合していない、請求項１から３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記追加スクリーニングは、請求項１から３１のいずれか一項の方法の前に実行される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記追加スクリーニングは、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージするために溶菌ファージ又は溶原性ファージを用いることによって実行される、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記追加スクリーニングにおける細菌細胞は、溶解してファージを放出する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記追加スクリーニングにおけるファージは、細菌細胞を溶解する溶菌ファージである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｉ）前記溶菌ファージは、ファージコート上の第１結合パートナーを含み、
ｉｉ）所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドは、第２結合パートナーを含む融合タンパク質であり、
前記第２結合パートナーを含む融合タンパク質は、溶菌ファージコート上の第１結合パートナーと結合する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶菌ファージは、ラムダファージである、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶菌ファージは、１８６、Ｐ２、１８６及びＰ２のハイブリッド、及び／又はＰ４である、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１結合パートナーは、カルモデュリンであり、
前記第２結合パートナーは、カルモデュリン結合ペプチドである、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）ポリペプチドを産出するように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）クロロホルムで細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理し、透過処理した細菌細胞の内側にポリペプチド及びポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを保持する工程と、
ｃ）透過処理した細菌細胞に標的分子が拡散するように、透過処理した細菌細胞を標的分子に接触させる工程と、
ｄ）所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングする工程とを含む方法。
【請求項４２】
標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）ポリペプチドが産出されて細菌細胞壁に結合するように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）クロロホルムで細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理し、透過処理した細菌細胞の内側にポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを保持する工程と、
ｃ）透過処理した細菌細胞を標的分子に接触させる工程と、
ｄ）所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングする工程とを含む方法。
【請求項４３】
工程ｄ）は、
ｉ）ポリペプチドが、標的分子に結合しているか、及び／又は、結合する程度、を確認する工程、及び／又は
ｉｉ）ポリペプチドが、標的分子を酵素修飾するか、及び／又は、酵素修飾の程度を、確認する工程、を含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドは、少なくとも第２ポリペプチドと結合し、
透過処理した細菌細胞壁の内側に保持するタンパク質複合体、及び／又は、細菌細胞に結合するタンパク質複合体を形成する請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドは、第２ポリペプチド又は第２ポリペプチドのサブユニットに溶解する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２ポリペプチドは、
ｉ）タンパク質複合体が透過処理された細菌細胞壁内に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド；
ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質
ｉｉｉ）細菌細胞壁結合タンパク質、及び／又は
ｉｖ）ファージコートタンパク質から選択される請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）請求項１から４６のいずれか一項記載の方法を用いてポリペプチドライブラリーをスクリーニングする工程と、
ｂ）所望の活性を有する１以上のポリペプチドを選択する工程とを含む所望の活性を有するポリペプチドを特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子に対する所望の活性に対して、ポリペプチドをスクリーニングするための方法に関する。特に、本発明は、グラム陰性細菌細胞中のポリペプチドを発現し、当該細胞を透過処理することにより、標的分子に対する所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングするための方法に関する。本発明は、細菌細胞中の遺伝子ライブラリをパッケージする方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最も初期のタンパク質ディスプレイの方法は、ファージディスプレイ（Smith,1985）であり、この方法は、対象のタンパク質を、タンパク質の野生型コピーとともに存在し得るファージの外皮タンパク質の１つに融合させる。例えば、ディスプレイ基本骨格は、ｇＩＩＩタンパク質に対する融合を用いたＭ１３繊維状ファージを基礎としていた。
【０００３】
他のディスプレイ法としては、「体外での」ディスプレイ法が挙げられ、この方法は、細胞翻訳抽出物を用いてタンパク質を発現し、物理的結合（例えば、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ）によるか、又は通常のスカフォールドへの付着若しくは膜内への封入により、例えば体外での区画化（ＩＶＣ）でタンパク質とコーディング核酸との間のカップリングを達成する。当該ＩＶＣにおいて、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ及びタンパク質両方のマイクロビーズ（磁気又はセファロース）キャプチャシステムも含み得るミセル懸濁液内で翻訳される。
【０００４】
タンパク質ディスプレイの別の方法としては、微生物表面ディスプレイがあり、これは、グラム陰性、グラム陽性真正細菌又は酵母のいずれかの微生物細胞外側に対して発現するタンパク質の標的配置を含む。当該タンパク質は、細胞表面にそれらを付着させるアンカードメインに融合される。アンカードメインは、脂質化若しくは細胞壁への共有結合を要求するモチーフを有してもよいし、露出したループ領域内の内在性膜タンパク質に対する融合物であってもよい。産生の拡張が原因で、微生物表面ディスプレイは、多様なライブラリから改善されたタンパク質変異体に対してスクリーニングするために用いるだけでなく、ワクチン接種用の抗原を提示するため、又は、工業バイオテクノロジーの酵素用細胞スカフォールドとして用いてもよい。
【０００５】
タンパク質ディスプレイ方法は、通常、抗体などの親和性タンパク質の進化に適用される。単一分子ディスプレイ法は、歴史的に最も普及しているが、バックグラウンドが高く、かつ親和性スケール間の分解能が低いことに悩まされている。たとえ、細胞質での発現に対して周辺質収量が非常に低くても、体外でのディスプレイ又はファージ系により同定するタンパク質は、通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）周辺質における発現に向けて再編成される。しかしながら、細胞質内で抗体が高収率で発現する場合、ほぼ全ての場合に、抗体は、活性に関して苦労して再度重畳及びテストしなければならない不溶性封入体を形成する。
【０００６】
このように、特に、親和性タンパク質ディスプレイライブラリ及び酵素ライブラリーをスクリーニングするためのタンパク質ディスプレイの方法の要請が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Smith (1985) Science, 228:1315-1317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、グラム陰性細菌細胞の細胞質中に作製されるポリペプチドを所望の活性に対してスクリーニングするタンパク質ディスプレイの方法を開発し、さらに、当該ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、細菌細胞内にも保持される溶菌-欠損ファージ内にパッケージされることを開発した。１以上の細菌細胞膜は透過処理され、それにより、細菌細胞は所望の活性に対してスクリーニングするために、標的分子と接触し得る。
【０００９】
したがって、本発明は、標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）ポリペプチドを産出するように、ポリペプチドをコード化する外因性ポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）溶菌-欠損ファージが、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージ化するようにし、前記溶菌-欠損ファージを細菌細胞内に保持する工程と、
ｃ）i)細菌細胞の外膜又はii)細菌細胞の内膜及び外膜、を透過処理する工程と、
ｄ）細菌細胞を標的分子と接触させる工程と、
ｅ）所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングする工程と、を含み、
前記ポリペプチドは、細菌細胞の外壁又は内膜によって細菌細胞内に保持される、及び／又は、前記ポリペプチドは、細菌細胞の外壁又は内膜に結合する方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、ポリペプチドは、細菌細胞壁によって細菌細胞の細胞質内に発現され、及び保持されていてもよい。このため、ある実施形態において、細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理する工程を含んでいてもよい。
【００１１】
ポリペプチドは、透過処理された内膜及び外膜を含む細菌細胞内に無傷細胞によって保持されるほど十分な大きさであってもよい。また、ポリペプチドが十分に小さい大きさである場合、無傷細胞を通じてポリペプチドが拡散してもよい。細菌細胞を通じたポリペプチドの拡散を防止するために、ある実施形態において、ポリペプチドは、透過処理された細菌細胞内に保持されるタンパク質複合体、及び／又は、細菌細胞壁に結合するタンパク質複合体を形成するために、少なくとも第２ポリペプチドと結合する。ある実施形態において、ポリペプチドは、第２ポリペプチド又はそのサブユニットに結合している。
【００１２】
ある実施形態において、第２ポリペプチドは、
ｉ）タンパク質複合体が透過処理された細菌細胞壁内に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド；
ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質
ｉｉｉ）細菌細胞壁結合タンパク質、及び／又は
ｉｖ）溶菌-欠損ファージのファージコートタンパク質、から選択される。
【００１３】
任意の適した方法としては、細菌細胞膜の内膜及び外膜を透過処理することを用いてもよく、ある実施形態において、細菌細胞の内膜及び外膜は、１以上の界面活性剤又は有機溶媒で透過処理される。
【００１４】
ある実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
【００１５】
別の実施形態において、非イオン性界面活性剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、並びに、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）及びジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）の混合物から選択される。
【００１６】
また別の実施形態として、細菌細胞の内膜及び外膜は、クロロホルムのような有機溶媒で透過処理されていてもよい。例えば、ある実施形態において、細菌細胞の内膜及び外膜は、クロロホルムで飽和した水溶液中で細菌細胞を培養することによって透過処理される。
【００１７】
ある実施形態において、細菌細胞は、約２５℃で約１０分間、クロロホルムで飽和した水溶液中で培養される。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、ポリペプチドは、細菌細胞中で作製され、細菌細胞の内膜に結合している。このため、細菌細胞の外膜は透過処理されており、細菌細胞壁は、少なくとも部分的に加水分解されている一方で、内膜は無傷のまま残されている。
【００１９】
したがって、本発明の方法の１つの実施形態においては、
ｉ）細菌細胞の外膜は、透過処理され；
ｉｉ）細菌細胞壁は、少なくとも一部が加水分解され；
ｉｉｉ）ポリペプチドは、内膜に結合している。
【００２０】
ある特定の実施形態において、細菌細胞は、少なくとも部分的にリゾチームで加水分解される。
【００２１】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、内膜に結合しているタンパク質に溶解している。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、内膜の外表面に結合している。
【００２２】
さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質に結合している。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、ラムダバクテリオファージカプシドタンパク質、ｇｐDのいずれかの端部に溶解している。別の実施形態において、ポリペプチドは、Ｐ２バクテリオファーカプシドタンパク質ｇｐＬのＮ端末側終端に溶解している。
【００２３】
ポリペプチドをコード化するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ及び／又はエピソームＤＮＡであってもよい。ある実施形態において、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド、ファージミド又はファージＤＮＡである。
【００２４】
ある実施形態において、溶菌-欠損ファージは、ラムダファージ、１８６、Ｐ２、１８６及びＰ２のハイブリッド、並びにＰ４から選択される溶原性ファージである。
【００２５】
溶菌-欠損ファージは、ファージとしてグラム陰性細菌細胞に存在してもよいし、プロファージとして宿主細胞ゲノムに取り込まれてもよい。このため、ある実施形態において、溶菌-欠損ファージは、プロファージである。
【００２６】
ある特定の実施形態において、細菌細胞は、溶菌-欠損ファージラムダ、１８６、Ｐ２、１８２並びにＰ２のハイブリッド、及び／又はＰ４を含む。
【００２７】
別の実施形態において、細菌細胞は、Ｐ２及びＰ４プロファージを含む。
ある特定の実施形態において、細菌細胞は、ラムダプロファージを含む。
さらに別の実施形態において、細菌細胞は、１８６及びＰ２のハイブリッドプロファージを含む。
【００２８】
ある実施形態において、溶菌-欠損ファージが、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージ化するようにする工程は、ファージを作製するように細菌細胞中のプロファージの活性を誘導する工程を含み、当該ファージは、ポリヌクレオチドをパッケージする。
【００２９】
ある実施形態において、プロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞中の１以上のファージアクチベータ・タンパク質を作製する工程を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態において、細菌細胞は、Ｐ２及びＰ４プロファージを含み、
方法は、細菌細胞中にＰ２及び／又はＰ４活性タンパク質を作製する工程を含む。
【００３１】
ある実施形態において、Ｐ２及び／又はＰ４活性タンパク質は、１以上の、Ｐ２cox、Ｐ２ogr、Ｐ４δ及び／又はＰ４εから選択される。
【００３２】
別の実施形態において、プロファージの活性を誘導する工程は、１以上のファージリプレッサー・タンパク質を培養する工程を含む。
【００３３】
ある実施形態において、細菌細胞は、Ｐ２及び／又はＰ４プロファージを含み、
Ｐ２プロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞中のＰ２タンパク質Ｃの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む。
【００３４】
ある実施形態において、細菌細胞は、ラムダプロファージを含み、
ラムダプロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞中のラムダファージリプレッサー・タンパク質ｃＩの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む。
【００３５】
別の実施形態において、細菌細胞は、１８６プロファージを含み、
前記１８６プロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞中の１８６タンパク質ｃＩの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む。
【００３６】
別の実施形態において、細菌細胞は、１８６及びＰ２プロファージのハイブリッドを含み、
前記プロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞中のハイブリッドファージの温度感性リプレッサー対立遺伝子を不活性にする工程を含む。
【００３７】
さらに別の実施形態において、プロファージは、リゾチーム遺伝子若しくはホリン遺伝子のいずれかの不活性形への欠失若しくは変位株に起因して、又は、ホリン遺伝子及びリゾチーム遺伝子の両方の不活性形への欠失若しくは変位株に起因して、溶菌欠損である。ある特定の実施形態において、Ｐ２プロファージリゾチーム遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を含むヌクレオチド配列を含み、Ｐ２ホリン遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含むヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、ラムダプロファージホリン遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含むヌクレオチド配列を含み、ラムダリゾチーム遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含むヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
別の実施形態において、プロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞の培養温度を増加させる工程を含む。ある特定の実施形態において、プロファージの活性を誘導するために、細菌細胞の培養温度を約３０℃から約４２℃に増加させる。ある実施形態において、プロファージは、１８６、又は１８６及びＰ２プロファージのハイブリッドである。
【００３９】
当業者は、他の公知のファージディスプレイシステムとともに本発明の方法を使用してもよいことを理解してもよい。本発明とは反対に、公知のファージディスプレイシステムは、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージせず、及び／又は、公知のファージディスプレイシステムは、細菌細胞内、又は、細菌細胞壁若しくは細胞膜に結合するポリペプチドを保持しない。
【００４０】
したがって、ある実施形態において、本発明の方法は、グラム陰性細菌細胞中の標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドを追加でスクリーニングする工程を含み、
ｉ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、溶菌-欠損ファージにパッケージされていない、及び／又は
ｉｉ）ポリペプチドは、細菌細胞壁によって細菌細胞内に保持されておらず、細菌細胞壁に結合していない。
【００４１】
本発明の方法の前に、及び／又は、本発明の方法の後に、公知のファージディスプレイシステムを用いた追加のスクリーニングを実行するが、ある実施形態においては、本発明の前に、追加のスクリーニングを実行する。
【００４２】
ある実施形態において、追加のスクリーニングにおけるファージは、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージするために溶菌ファージ又は溶原性ファージを用いることによって行なわれる。別の実施形態において、追加のスクリーニングにおける細菌細胞は、ファージを解除して溶解する。
【００４３】
さらに別の実施形態において、追加のスクリーニングにおけるファージは、細菌細胞を溶解させる溶菌ファージである。
【００４４】
細菌細胞は、追加のスクリーニングの間に溶解する場合、ファージ粒子にポリペプチドを結合することが好ましい。
【００４５】
このため、ある実施形態において、
ｉ）前記溶菌ファージは、ファージコート上の第１結合パートナーを含み、
ｉｉ）所望の活性に対しスクリーニングされたポリペプチドは、第２結合パートナーを含む融合タンパク質であり、
前記第２結合パートナーを含む融合タンパク質は、溶菌ファージコート上の第１結合パートナーと結合している。
【００４６】
ある実施形態において、溶菌ファージは、ラムダファージである。
別の実施形態において、溶菌ファージは、１８６、Ｐ２、１８６及びＰ２のハイブリッドプロファージ、及び／又はＰ４である。
【００４７】
ある実施形態において、
第１結合パートナーは、カルモデュリンであり、
第２結合パートナーは、カルモデュリン結合ペプチドである。
【００４８】
さらに別の実施形態において、追加のスクリーニングにおける１以上のプロファージが、溶菌-欠損ファージであり、細胞は、化学的及び／又は酵素的に、溶解する。ある特定の実施形態において、細胞を酵素的に溶解させることは、細菌細胞をリゾチームで溶解させることを含む。溶菌-欠損ファージは、例えば、溶菌-欠損ラムダ、１８６、Ｐ２、１８６及びＰ２プロファージのハイブリッド、及び／又はＰ４であってもよい。
【００４９】
本発明の方法は、任意の遺伝子ライブラリをパッケージ化することに用いられてもよいし、一方で、ある実施形態において、ポリヌクレオチドのライブラリは、標的分子に対する所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドをコード化する。
【００５０】
本発明は、温度感性リプレッサタンパク質を備える溶菌-欠損ファージを含むグラム陰性細菌をさらに提供する。
【００５１】
本発明は、溶菌-欠損ファージと、１以上のファージアクチベータ・タンパク質をコード化するポリヌクレオチドと、を含むグラム陰性細菌を、さらに提供する。
【００５２】
ある実施形態において、溶菌-欠損ファージは、ラムダ、１８６、Ｐ２、１８６及びＰ２のハイブリッド、及び／又はＰ４から選択される。
ある実施形態において、ファージアクチベータ・タンパク質は、Ｐ２cox、Ｐ２ogr、Ｐ４δ及び／又はＰ４εから選択される。
本発明は、本発明のグラム陰性細菌を含むキットを、さらに提供する。
【００５３】
ある実施形態において、キットは、グラム陰性細菌細胞を透過処理することができる化学物質をさらに含む。ある特定の実施形態において、グラム陰性細菌細胞を透過処理することができる化学物質は、１以上の界面活性剤又は有機溶媒から選択される。
【００５４】
ある実施形態において、界面活性剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、並びに、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）及びジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）の混合物から選択される非イオン性界面活性剤である。
別の実施形態において、有機溶媒は、クロロホルムである。
【００５５】
本発明は、標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドをスクリーニングする方法を提供するものであり、その方法は、
ａ）ポリペプチドを産出するように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）クロロホルムで細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理し、透過処理した細菌細胞の内側にポリペプチド及びポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを保持する工程と、
ｃ）透過処理した細菌細胞に標的分子が拡散するように、透過処理した細菌細胞を標的分子に接触させる工程と、
ｄ）所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングする工程と、を含む。
【００５６】
本発明は、標的分子に対する所望の活性に対しポリペプチドをスクリーニングする方法を提供するものであり、その方法は、
ａ）ポリペプチドが産出されて細菌細胞壁に結合するように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、
ｂ）クロロホルムで細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理し、透過処理した細菌細胞の内側にポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを保持する工程と、
ｃ）透過処理した細菌細胞を標的分子に接触させる工程と、
ｄ）所望の活性に対してポリペプチドをスクリーニングする工程と、を含む。
【００５７】
ある実施形態において、工程ｄ）は、
ｉ）ポリペプチドが、標的分子に結合しているか、及び／又は、結合の程度、を確認する工程、及び／又は、
ｉｉ）ポリペプチドが、標的分子を酵素修飾するか、及び／又は、酵素修飾の割合を、確認する工程、を含む。
【００５８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、透過処理した細菌細胞壁の内側に保持するタンパク質複合体、及び／又は、細菌細胞に結合するタンパク質複合体、を形成するために少なくとも第２ポリペプチドと結合する。
【００５９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、第２ポリペプチド、又は第２ポリペプチドのサブユニットに溶解する。
【００６０】
本発明の方法において、第２ポリペプチドは、
ｉ）タンパク質複合体が透過処理された細菌細胞壁内に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド；
ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質
ｉｉｉ）細菌細胞壁結合タンパク質、及び／又は
ｉｖ）ファージコートタンパク質
から選択されてもよい。
【００６１】
本発明は、所望の活性を有するポリペプチドを特定する方法をさらに提供し、その方法は、
ａ）本発明の方法を用いてポリペプチドライブラリーをスクリーニングする工程と、
ｂ）所望の活性を有する１以上のポリペプチドを選択する工程と、を含む。
【００６２】
本発明は、クロロホルムで細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理することによって得られるグラム陰性細菌細胞を提供するものであり、その細菌細胞は、透過処理された細菌細胞内に保持されるタンパク質複合体を形成するための第２ポリペプチドと結合する外因性ポリペプチドを含む。
【００６３】
本発明は、クロロホルムで細菌細胞の内膜及び外膜を透過処理することによって得られるグラム陰性細菌細胞をさらに提供するものであり、その細菌細胞は、細菌細胞壁に結合する外因性ポリペプチドを含む。
【００６４】
本発明は、キットをさらに提供するものであり、そのキットは、
ａ）ｉ）第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入するサイト、及び
ｉｉ）透過処理したグラム陰性細菌細胞内に保持されるタンパク質複合体を形成するための第１ポリペプチドに結合する第２ポリペプチドをコード化する読み取り枠と、
を含むベクターと、
ｂ）細菌細胞を透過処理するためのクロロホルムと、を含む。
【００６５】
本発明は、キットをさらに提供するものであり、そのキットは、
ａ）ｉ）第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入するサイト、及び
ｉｉ）グラム陰性細菌細胞壁に結合するタンパク質複合体を形成するための第１ポリペプチドに結合する第２ポリペプチドをコード化する読み取り枠と、
を含むベクターと、
ｂ）細菌細胞を透過処理するためのクロロホルムと、を含む。
【００６６】
本発明の１つの形態の好ましい特徴及び特性は、本発明の多くの他の形態に適用可能であることが明らかとなるであろう。
【００６７】
本明細書全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含み）」という用語、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」などの変形は、記載の、要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の組合せを包含するが、任意の他の要素、整数若しく工程、又は要素、整数若しくは工程の組合せを除外しないことを意味するものと理解される。
【００６８】
添付の図面を参照して、以下の非限定的例により本発明を以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】大腸菌細胞の界面活性剤透過処理。ＧＦＰを発現する大腸菌細胞を界面活性剤で処理して、膜透過処理の有効性を測定した。細胞を明視野（第１列）又は蛍光顕微鏡法（第２列及び第３列）のいずれかにより観察した。透過処理は、膜不透過性ＤＮＡ結合色素ＧｅｌＲｅｄ（第３列）が吸収されると同時にＧＦＰ（第２列）が、細胞から放出される場合に有効であった。界面活性剤８ＴＧＰ（０．５％）及び０．５％のＭｅｇａ１０／０．５％のＡｐｏ８（「Ａｇｅｎｔ８６」）は大腸菌細胞の透過処理において最も有効であることが判明した。
【図２】界面活性剤上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。図１で示される大腸菌細胞の界面活性剤透過処理の上清を、９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードして、界面活性剤によるタンパク質放出を定性的に評価した（第１レーン）。界面活性剤透過処理細胞における細胞壁カプセルによる細胞タンパク質のサブセットの保持を示すために、界面活性剤透過処理細胞の試料をリゾチーム（２ｍｇ／ｍＬ）で処理して、細胞壁（第２レーン）を加水分解した。
【図３】テトラマー融合タンパク質発現。（Ａ）全細胞タンパク質に対して探査したαＨｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット法によりＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：テトラマー融合タンパク質の大腸菌内での発現を調べた。予想される分子量のバンドに加え、＞２５０ｋＤの高分子量バンドがＲｈｎＡテトラマー融合物（レーン４）で観察され、これはテトラマーとして移動した複合体の推定されるＳＤＳ耐性形態である。（Ｂ）ＢｅｔＢテトラマー融合タンパク質抽出物を、界面活性剤可溶性及び界面活性剤不溶性（細胞カプセルペレット）抽出物に分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。
【図４】テトラマー融合タンパク質のＳＮＡＰ標識。実施例１に記載されるように、Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：テトラマー融合タンパク質を大腸菌内で発現させ、８ＴＧＰで細胞を透過処理した。実施例３で記載されるように、融合タンパク質の発現を、膜不透過性ＳＮＡＰリガンドＢＧ−５４７で標識された透過処理細胞の蛍光顕微鏡検査（第２列）により検出した。細胞ＤＮＡを膜透過性色素ＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎで標識した（第１列）。ＳＮＡＰ及びＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎシグナルのオーバーレイを第３列に示す。
【図５】透過処理細胞におけるＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢテトラマーのαＨｉｓ抗体標識。実施例３に記載されるように、αＨｉｓ抗体でプローブされたＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢテトラマーを発現する透過処理細胞の蛍光顕微鏡検査（第１パネル）。ＳＮＡＰリガンドＢＧ−５４７で細胞を標識した（第２パネル）。αＨｉｓ及びＳＮＡＰ両方の共存（第３パネル）は、αＨｉｓ抗体が透過処理細胞の細胞壁を透過することを示す。
【図６】ＨＡＬＯ及びＳＮＡＰ発現レポーターとのＢｅｔＢ、ＲｈｎＡ及びＹｄｃＷテトラマー融合物。ＢｅｔＢ、ＲｈｎＡ及びＹｄｃＷテトラマーを別々に発現レポーターＨＡＬＯ及びＳＮＡＰと融合させた。融合タンパク質を発現する細胞を透過処理し、宿主ＤＮＡをＧｅｌＲｅｄで標識し、ＨＡＬＯ（Ｇ１００１）及びＳＮＡＰ（ＢＧ−４８８）の蛍光リガンドを用いて融合タンパク質を検出した。
【図７】ＧＦＰ５：：ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）融合物の発現。淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来の非特異的高親和性ＤＮＡ結合タンパク質であるＣｏｍＥをＧＦＰ５のＣ末端に融合させ、大腸菌で発現させた。細胞を透過処理し、ＧＦＰ（第１パネル）及びＧｅｌＲｅｄ（第２パネル）に関して蛍光顕微鏡法により観察した。蛍光の共存（第３パネル）は、融合タンパク質及び宿主ＤＮＡの両方が透過処理細胞カプセル内に保持されたことを示す。
【図８】透過処理細胞におけるＤＮＡの保持。ＧＦＰ５：：ＤＢＰ融合物、又はＨｉｓ６：：ｅＧＦＰ融合物を発現する大腸菌細胞を、未処理のまま放置するか（１行及び４行）或いは実施例１で記載されるように透過処理させるか（２、３、５及び６行）のいずれかであった。透過処理細胞を４℃で一晩保存するか、又はＴＢＳ中に再懸濁させ３７℃で一晩振盪した後、ＧＦＰ（第１列）又はＧｅｌＲｅｄ（第２列）に関して蛍光顕微鏡法により観察した。ＧＦＰ及びＧｅｌ Ｒｅｄの共存を第３列に示す。
【図９】透過処理細胞からのＤＮＡ抽出。（Ａ）ＧＦＰ５：：ＤＢＰ融合タンパク質又は（Ｂ）Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を実施例１で記載されるように透過処理した。透過処理細胞を一晩４℃で保存するか、又はＴＢＳ中に再懸濁させ、３７℃で一晩振盪した後、プラスミドＤＮＡを抽出し、エチジウムブロミド染色された１％アガロースゲル上、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動させた。レーン１は未処理細胞中の全プラスミドＤＮＡである。レーン２及び４は、それぞれ４℃で一晩保存し、３７℃で振盪した細胞カプセルの透過処理ステップからの上清であり、レーン３及び５は、それぞれ４℃で一晩保存し、３７℃で振盪した細胞カプセルからのプラスミド調製物である。
【図１０】ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質のＳＮＡＰ標識。ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を実施例１で記載されるようにして透過処理した。融合タンパク質局在化を、実施例３で記載されるようにＳＮＡＰリガンドＢＧ−４８８での標識により検出した。標識された細胞を明視野顕微鏡検査（第１パネル）及び蛍光顕微鏡検査（第２パネル）により観察した。第３パネルは明視野図及び蛍光図の両方のオーバーレイである。
【図１１】αＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合。αＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を実施例１で記載されるように透過処理した。精製されたｅＧＦＰタンパク質を実施例８で記載されるように細胞カプセルと結合させ、ｅＧＦＰを蛍光顕微鏡検査により視覚化した。第１パネル、明視野図；第２パネル、ｅＧＦＰ蛍光；第３パネル、明視野及び蛍光のオーバーレイ。
【図１２】αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合。αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を実施例１で記載されるように透過処理した。精製されたｅＧＦＰタンパク質を実施例８で記載されるようにして細胞カプセルと結合させ、実施例３で記載されているように、ｅＧＦＰを２つの方法、ウェットマウント及びドライマウントによる蛍光顕微鏡法で視覚化した。（Ａ）ウェットマウント細胞カプセルに結合させたｅＧＦＰ。挿入パネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質により結合したｅＧＦＰの細胞壁局在化を示す。（Ｂ）及び挿入パネル（Ａｉｉｉ）は、ＤＡＢＣＯ／グリセロール中でドライマウントによる顕微鏡検査のために調製された同じ細胞を示す。
【図１３】ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合。ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ又はＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を実施例１で記載されているように透過処理した。精製されたｅＧＦＰタンパク質を実施例８で記載されているように細胞カプセルと結合させ、実施例３で記載されているようにして、ｅＧＦＰをドライマウントによる蛍光顕微鏡法によって視覚化した。（Ａ）ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する細胞は、ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する細胞（第２パネル、下行）と異なり、ｅＧＦＰ蛍光がない（第２パネル、上行）。
【図１４】ＬＰＰ融合タンパク質による細胞壁に対する共有結合の証明。ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を実施例１で記載されているように透過処理した。融合タンパク質局在化を実施例３で記載されているようにしてＳＮＡＰリガンドＢＧ−４８８で標識することにより検出し、ＤＮＡをＧｅｌＲｅｄで染色した。５分間２２℃（Ａ）又は９５℃（Ｂ）で試料を加熱した後、ドライマウントし、蛍光顕微鏡検査により観察した。
【図１５】界面活性剤／Ｃａ2+緩衝液を用いた外膜透過処理。ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質（外部αＧＦＰ又はαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質（内部αＧＦＰ）を発現する大腸菌細胞を実施例１０で記載されているように透過処理した。大きなリガンドに対する外膜の透過処理は、細胞壁に付着したαＧＦＰドメインにｅＧＦＰを結合させることにより評価した。内膜の透過処理は、大きなリガンド（ｅＧＦＰ）及び小さなリガンド（ＧｅｌＲｅｄ）を用いて評価した。Ｃａ2+緩衝液中の界面活性剤Ａｐｏ８（Ａ）及びＴｗｅｅｎ２０（Ｂ）はいずれも、大きなリガンドに対する外膜の選択的透過性を示した。
【図１６】界面活性剤／ＥＤＴＡ緩衝液を用いた外膜透過処理。ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質（外部αＧＦＰ）又はαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質（内部αＧＦＰ）を発現する大腸菌細胞を実施例１０で記載されるように透過処理した。大きなリガンドに対する外膜の透過処理を、ｅＧＦＰを細胞壁に付着したαＧＦＰドメインに結合させることにより評価した。内膜の透過処理は、大きなリガンド（ｅＧＦＰ）及び小さなリガンド（ＧｅｌＲｅｄ）を用いて評価した。ＥＤＴＡ緩衝液中の界面活性剤Ａｐｏ８（Ａ）及びＴｗｅｅｎ２０（Ｂ）はいずれも大きなリガンドに対する外膜の選択的透過性を示した。
【図１７】ｅＧＦＰ及びＳＮＡＰ標識された細胞の混合群のＦＡＣＳ分析。ｅＧＦＰ（＃１矢印）；ＳＮＡＰリガンドＢＧ−４８８で標識されたαＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質（＃２矢印）；及びＳＮＡＰリガンドＢＧ−５４７で標識されたＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢ（＃３矢印）を発現する大腸菌細胞の３つの群を、ＦＡＣＳにより分類した。分類した群を初回分類の６０分後に純度及び細胞完全性について再分析した。
【図１８】αＧＦＰ及びＫｚＰＧドメイン間のペプチドリンカーは、αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞のセファロース支持体に対する結合を可能にする。１２−ｍｅｒリンカードメインＲＬ６をαＧＦＰ及びＫｚＰＧドメイン間に有するαＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する細胞を、Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰ中間体によりＣｏ2+−セファロース支持体Ｃｏ2+−セファロース支持体と結合させた。ＧＦＰ結合を左のパネルに示し（緑）；融合タンパク質のＳＮＡＰリガンド（赤）結合を中央のパネルに示し；それぞれのオーバーレイを右に示す。
【図１９】αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞のストレプトアビジン標識された磁気ビーズに対する結合。（Ａ）ビオチン標識されたｅＧＦＰ（中央及び右パネル）を、αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する細胞と結合させ、これを次にストレプトアビジン標識された磁気粒子と結合させた。（Ｂ）最初にビオチニル化ｅＧＦＰで標識されたストレプトアビジン標識磁気粒子に対するαＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する細胞の逆の結合。この実施例では、ビーズは緑色に標識され（ＧＦＰパネル）、細胞はＢＧ−５４７ＳＮＡＰリガンドで標識された（赤、ＳＮＡＰｒｅｄパネル）。（Ｃ）ドメインリンカー（ヒトタイチンの２７番目のＩｇドメイン）も結合スペーサーとして有効であった。αＧＦＰ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を、まずビオチニル化ｅＧＦＰと結合させ（緑、ＧＦＰパネル）、ＢＧ−５４７ＳＮＡＰリガンドで標識（赤、ＳＮＡＰｒｅｄパネル）した後、ストレプトアビジン標識磁気粒子と結合させる。
【図２０】大腸菌細胞質におけるｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質としてのマウスｓｃＦｖ遺伝子の発現。マウスｓｃＦｖライブラリーを構築し、本発明の方法にしたがって大腸菌細胞質でディスプレイした。検出可能な発現を有するクローンをＳＮＡＰリガンド結合により検出し、ミスフォールド（左パネル）、わずかに発現されるが可溶性（中央のパネル）、又は、高度に発現され、かつ可溶性（右パネル）に分類した。
【図２１】可溶性及び不溶性ｓｃＦｖ発現の大腸菌細胞質における検出。マウスｓｃＦｖ発現ライブラリーからの限定されたスクリーンにおいて高度に発現され可溶性であることが判明した、選択されたクローンを、ｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧ及びｓｃＦｖ：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧ融合タンパク質として発現構築物中にサブクローンした。タンパク質フラクションを可溶性又は不溶性のいずれかとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、ニトロセルロース膜に移し、αＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。可溶性（Ｓ）又は不溶性（Ｐ）フラクションについて、試料及び発現される各クローンをＩ２７：：ＲＬ６（Ｉ）又はＲＬ６（Ｒ）リンカーと対にする。ライブラリスクリーンから単離されるＩ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰディスプレイ構築物におけるオリジナルのｓｃＦｖクローンの蛍光顕微鏡画像も下のパネルに示す。
【図２２】有機溶媒を用いた大腸菌の透過処理。αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を、有機溶媒の水性混合物で懸濁した。膜透過処理は、（Ａ）低分子量ＤＮＡ結合蛍光リガンドＧｅｌＲｅｄ及び３０ｋＤのタンパク質ｅＧＦＰの結合によって示された。有機溶媒の試験中に、内膜及び外膜の両方が透過処理されたクロロホルムだけが高分子量のｅＧＦＰ（Ｂ）の細胞中に入ることができる。
【図２３】大腸菌中のαＧＦＰ：Ｉ２７：ｇｐＬ融合タンパク質の発現。αＧＦＰ：Ｉ２７：ｇｐＬ融合タンパク質は、実施例２０に示されるように、アラビノース誘導によって誘導された。溶解性タンパク質は、０．５％の８ＴＧＰとの透過処理によって大腸菌から放出され、サンプルの残りは不溶性と考えられた。サンプルは、電気泳動装置で沸騰させて、１５％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで電気泳動させた。タンパク質は、ニトロセルロース膜に転換され、αＧＦＰ：Ｉ２７：ｇｐＬ融合タンパク質を検出するαＦＬＡＧ単クローン抗体で探査した。（１）サンプル１：非誘導性αＧＦＰ：Ｉ２７：ｇｐＬ溶融クローン１；（２）誘導性αＧＦＰ：Ｉ２７：ｇｐＬ溶融クローン１；（３）誘導性αＧＦＰ：Ｉ２７：ｇｐＬ溶融クローン２。Ｓ＝可溶性成分、Ｉｎ＝不溶性成分
【図２４】ｍＡＧ１標識付のｇｐＤ：：α−ｍＡＧ１融合タンパク質を表示する封入ラムダファージを撮像した蛍光特性。ラムダプロファージを誘導し、ｇｐＤ：：α−ｍＡＧ１融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を透過処理して、ｍＡＧ１タンパク質及びＤＮＡ結合染色Ｇｅｌ  Ｒｅｄで染色した。透過処理した細胞内の点状のパターン（左パネル）で結合するために、ｍＡＧ１を蛍光顕微鏡検査法で観察した。
【図２５】ｇｐＤ：：α−ｍＡＧ１融合タンパク質を表示する封入ラムダファージの流入ＦＡＣＳ分析のスクリーンショット。〜１％のα陽性細胞の投入で１００Ｋでの流入ＦＡＣＳ（ＢＤ生命科学）の蛍光発光グラフを示している。細胞集団は、ＤＮＡ染料結合、ＧｅｌＲｅｄ（red;561nm）及び蛍光性のｍＡＧ１タンパク質（green; 488nm）でともに染色される。Ｐ２ゲート型集団は、α−ｍＡＧ１陽性であり、Ｐ２ゲート型集団は、α−ｍＡＧ１陰性である。
【００７０】
配列表の凡例
配列番号１−ｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰアラビノースベクターのヌクレオチド配列
配列番号２−ｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰベクターのヌクレオチド配列
配列番号３−ｐＡｒａ３：：ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰベクターのヌクレオチド配列
配列番号４−ｐＡｒａ３：：αＧＦＰ（Ｒ３５）：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡベクターのヌクレオチド配列
配列番号５−ランダム化ペプチドスペーサードメイン
配列番号６〜１２−ペプチドリンカースペーサー
配列番号１３−Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ
配列番号１４−Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰコーディング配列
配列番号１５−ライブラリスカフォールドベクター
配列番号１６−Ｉ２７スペーサー
配列番号１７−エンテロバクテリオファージのＰ２エンドリシン遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１８−エンテロバクテリオファージのＰ２ホリン遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１９−温度によって誘発されたＰ４δベクターのヌクレオチド配列
配列番号２０−αＧＥＰ：：Ｉ２７：：ｇｐＬ融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１−ｇｐＬ：：αＧＥＰ：：Ｉ２７融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２２−αＧＥＰ：：Ｉ２７：：ｇｐＬ融合タンパク質発現ベクターのヌクレオチド配列
配列番号２３−ラムダファージのホリン遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２４−ラムダファージのリゾチーム遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２５−ラムダ溶菌クラスター欠損部分のアミノ酸配列
配列番号２６−ラムダcosドメインのヌクレオチド配列
配列番号２７−ラムダＳＲ欠損（ΔＳＲ）ベクターのヌクレオチド配列
【発明を実施するための形態】
【００７１】
一般的技術及び一般的定義
別段の明確に定義されない限り、本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、（例えば、タンパク質化学、生化学、細胞培養、分子遺伝学、微生物学及び免疫学における）当業者により通常理解されるのと同じ意味を有すると解される。
【００７２】
他に示されない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫手法は、当業者に公知の標準的手順である。かかる技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)、R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994)、T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、及びF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、及びJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)等の出典の文献に記載及び説明されている。
【００７３】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」の用語は、本明細書中では通常相互交換可能に用いている。「外因性ポリペプチド」の用語は、本明細書中においては、外因性ポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドを指す。「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中においては、それが導入される細胞と異なるポリヌクレオチド、又はポリペプチドが通常見いだされない宿主細胞核酸内のある場所以外に導入される細胞における配列と配列が相同性であることを意味する。
【００７４】
本発明で用いる「抗体」の用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、多特異性抗体、ヘテロ結合抗体、キメラ抗体、例えばインタクト分子、及びそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ並びに他の抗体様分子が挙げられる。
本明細書中で用いる「約」の用語は、特定した値の±５％の範囲を指す。
【００７５】
本発明の一実施形態において、ポリペプチドは、グラム陰性細菌細胞中の所望の活性に対してスクリーニングされ、そのポリペプチドは、グラム陰性細菌細胞内で産出され、そのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、溶菌-欠損ファージにパッケージされる。「溶菌-欠損ファージ」により、そのライフサイクル内に溶菌状態を通常有する溶菌性ファージ又は溶原性ファージであって、かつ溶菌サイクルの他のあらゆる機能を発現させるが、パッケージされたファージを放出するためのグラム陰性細菌細胞を溶解させることができないように修飾された溶菌性ファージ又は溶原性ファージを意味する。このため、溶菌-欠損ファージは、ウイルスゲノムがプロファージとして宿主細胞ＤＮＡに融合される溶原性サイクル、又は、プラスミド（ファージミド）として複製する溶原性サイクル、を有する溶原性ファージを含む。その宿主細胞の状態が、プロファージを活性化させて、再生するサイクルを開始させるまで、プロファージは細菌細胞中で不活性のままである。プロファージの再生サイクルが始まると、通常は細菌性宿主細胞が溶菌するのに対して、本発明の方法の溶菌-欠損ファージは、細菌性宿主細胞が溶菌せずに細菌細胞中にファージが残るように修飾される。
【００７６】
本明細書で用いる「溶菌-欠損ファージ」の用語は、ファージのライフサイクルで溶菌の状態を通常有していないファージの具体例を含まないので、押出しによって細菌細胞から放出されるファージ、例えば、Ｍ１３、ｆ１若しくはｆ２のような線状ファージ、又は、出芽により細菌細胞から放出されたファージの具体例を含まないことを当業者は理解するだろう。
【００７７】
溶菌-欠損ファージを産出するために溶菌ファージのライフサイクルから溶菌状態を取り除くように修正してもよい溶菌ファージの例は、ｐｈｉＸ１７４、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６及びＴ７バクテリオファージを含む。溶原性ファージのライフサイクルから溶菌状態を取り除くように修正をしてもよい溶原性ファージの例は、ラムダファージ、Ｎ１５ファージ、Ｐ２２ファージ、Ｍｕファージ、Ｐ２ファージ、ファージ１８６、付随体ファージ及びＰ４を含む（Lindqvist et al., 1993; Ziermann et al., 1994; Liu et al., 1997; and Briani et al., 2001）。
【００７８】
細菌細胞中にポリヌクレオチドをパッケージすることができる溶原性ファージは、ポリヌクレオチドをパッケージするために、及び／又は、細菌細胞を溶菌するために、別のファージ、例えばヘルパーファージの存在を必要とすることを当業者は理解するだろう。この関係の一例は、Ｐ２ファージとそのサテライトファージＰ４である。ポリヌクレオチドをパッケージするための、及び／又は、細菌細胞を溶菌するための、ヘルパーファージの存在の必要性は、ヘルパーファージのシステムとして公知である。ヘルパーファージのシステムでは、ヘルパーファージの活性又はファージポリペプチド（例えば「活性化タンパク質」）の活性が、ポリヌクレオチドをパッケージするような、及び／又は、細菌細胞を溶菌させるような別のファージを誘導する。このため、ポリヌクレオチドが１つのファージ（つまり、１つのヘルパーファージシステム中の１つのファージ）にパッケージされてもよいし、別のファージ（つまり、ヘルパーファージ）の活性が、両ファージが存在する細菌細胞を溶菌するために必要であってもよいことを当業者は理解する。本発明の方法のいくつかの実施形態の使用において、溶菌作用を通常供給するファージは、細菌細胞を溶菌できなくなるように修飾される。したがって、本明細書中で用いられる「溶菌-欠損ファージ」の用語は、ポリヌクレオチドをパッケージされるファージにも言及し、そのファージは、通常、溶菌作用を供給するために第２ファージを頼りにするが、その第２ファージは、グラム陰性細菌細胞を溶菌できなくなるように修飾する。
【００７９】
当業者は、ポリヌクレオチドが溶菌-欠損ファージのゲノムから物理的に分離してもよいことを理解するだろう。例えば、ポリヌクレオチドは、ファージ構造的複製タンパク質によりポリヌクレオチドを十分パッケージし得る配列に可動結合してもよく、その複合タンパク質は、溶菌-欠損ファージの親株に形態学的に近似するか又は同一の感染単位を形成する。
【００８０】
非限定的な例として、適切なサイズのプラスミドベクターは、ラムダバクテリオファージにＤＮＡパッケージするために必要なcosドメイン周辺の配列を含んでいてもよい。これらのプラスミドベクターは、生体内でヘルパーファージによってパッケージされてもよいし、生体外でファージ構造的複製タンパク質を含む精製抽出物によってパッケージされてもよい。ラムダパッケージするための十分な配列は、配列番号２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）として供給される。これらのベクターは、コスミド（cos＋プラスミド）として知られており、コスミドが外因性ポリヌクレオチドを複製することができ、バクテリオファージ粒子としてそれらを繁殖することができることは当業者に公知である。コスミド内でポリヌクレオチドを複製するための市販キット及び生体外でパッケージするキットは、当業者に公知である。
【００８１】
典型的なヘルパーファージシステム：Ｐ２−Ｐ４システム
ヘルパーファージシステムの１つの非限定的な例は、Ｐ２−Ｐ４ファージシステムである。各ファージは、それ自身のＤＮＡ複製及び宿主細胞への融合を確保するために必要な遺伝子を提供する一方で、大腸菌Ｐ４ファージは、カプシド形成のための主要構造タンパク質（Kahn et al., 1991; Liu et al., 1997）と同様に、追跡機能及び溶菌機能に必要な遺伝子情報が不足している。それ故、Ｐ４は、Ｐ４ファージ構造単位を作るため、そのＤＮＡをパッケージするため、及び宿主細胞を溶菌するため、ファージ１８６のようなＰ２ファージ又はＰ２関連ファージに依存している。Ｐ４は、溶原性宿主細胞（例えば、ゲノム中にＰ２プロファージを含む大腸菌）に感化するとき、Ｐ２プロファージは、Ｐ４ε遺伝子によって活性化される。活性化は、Ｐ２早期及び末期遺伝子発現をもたらし、Ｐ４溶解サイクルの完了に十分である。
【００８２】
Ｐ４は、Ｐ２に似たファージ、例えばファージ１８６によってパッケージされてもよい。このファージは、Ｐ２（〜７５％単位）及びハイブリッドＰ２／１８６ファージに対するオーソロガス構造タンパク質を有し、このＰ２（〜７５％単位）及びハイブリッドＰ２／１８６ファージは、ファージ１８６転写因子によって調整されたＰ２構造遺伝子を含む構成である（Younghusband et al., 1975）。重要なことに、ファージ１８６初期領域及びＰ２／１８６ハイブリッド（Ｈｙ２及びＨｙ５）はＰ２に関係なく、それ故Ｐ４εタンパク質で抑制されない。しかしながら、１８６免疫リプレッサーの温度感性変種が、Ｐ４感染（sauer et al., 1982）又はＰ４活性と一致するファージ１８６機能を誘導するために使われる場合、ファージ１８６をＰ４ヘルパーファージとして使ってもよい。
【００８３】
当業者は、Ｐ２／Ｐ４バクテリオファージシステムが本発明の方法の使用に適していると理解する。Ｐ２／Ｐ４バクテリオファージシステムの優れた特徴として、以下が挙げられる。
ｉ）プラスミドへのＰ２ターミナーゼ酵素は、コンカテマー化をパッケージすることが好ましい他のバクテリオファージターミナーゼと違って、線状ポリヌクレオチドターミナーゼが好ましい。それ故、このシステムは、所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドをコード化するプラスミドを生体内でパッケージングすることがより好適である。
ｉｉ）Ｐ４サイズのカプシド（約１０〜１２ｋｂ）に効率的にパッケージングされるコスミド（つまり、パッケージングするバクテリオファージを記述するバクテリオファージのcos配列を含むプラスミド）は、ラムダ（４８．５ｋｂ）のようなより大型のバクテリオファージゲノムよりも、通常のクローン方法及び反復の突然変異誘導を受け入れる。
【００８４】
溶菌-欠損ファージを産出するための遺伝子組換
溶菌バクテリオファージのライフサイクルは、ゲノム複製及びファージ粒子としてのパッケージングの両方を含むだけでなく、再感染のための粒子の放出をする細胞分解をも含む。グラム陰性細菌の細胞分解は、２段階のプロセスであり、その２段階のプロセスとは、まず内膜を貫通し、次に細胞壁分解酵素（リゾチーム）を周辺質の空間にアクセスさせて、ペプチドグリカン細胞壁に作動させる。その細胞は、細胞質と周辺溶媒の間の浸透圧差で溶解し、それによりファージ粒子が媒体に放出される。
【００８５】
膜貫通（ホリン）とリゾチームの作用は、通常、ほとんどの溶解性又は溶原性ファージ中の２つの遺伝子によってコード化される。これらの遺伝子は、ほとんどのファージゲノムの減少により、同一のオペロン内で隣接する。細胞壁を無傷で維持するために、また、本発明の方法により機能的にスクリーニングされたファージ粒子及びタンパク質を放出されるのを避けるために、ファージリゾチームをコード化する遺伝子、又はリゾチーム及びホリンの両方は、ファージゲノムから取り除かれなければならない。読取り枠を重複して頻繁に使用するために、また、たくさんのファージ遺伝子で移送カップリングを導く遺伝暗号を停止／開始するために、これらの欠失を決めるときには下流遺伝子の感化を注意深く考慮しなければならない。溶解クラスターが下流側の構造的遺伝子と移送カップリングする場合、その欠失は、１つの遺伝子の開始領域と別の遺伝子の停止領域を有する遺伝子座に、切り捨てられたＯＲＦを残余の「痕跡」として残すだろう。
【００８６】
一実施形態において、本発明のタンパク質をスクリーニングする方法は、ペプチドグリカン細胞壁の構造的な完全性を維持する間、グラン陰性細菌の内膜及び外膜を透過処理することを用いる。このため、本実施形態では、リゾチーム遺伝子は、細胞壁の構造的な完全性を維持するために欠失される一方で、ホリン遺伝子は、バクテリオファージゲノム中で構造的に維持されてもよいし、内膜の透過処理に寄与することを助長してもよい。スクリーニングシステムに用いられる溶菌-欠損ファージであって、WO 2002/034886及びWO 2005/095988に記載されているような周辺質標的タンパク質、又は細胞壁結合融合タンパク質にカップリングするものの具体例において、ホリン機能、又はホリン／リゾチーム機能は、細胞又はスフェロプラストの内膜の完全性を維持するためにファージゲノムから欠失されなければならない。
【００８７】
リシン遺伝子機能及び／又はリゾチーム遺伝子機能は、ファージゲノムから分子をコード化する遺伝子を欠失することによって、あるいは、リシン及び／又はリゾチーム遺伝子に欠陥があり、機能的なリシン及び／又はリゾチームタンパク質をもはやコード化しないようにリシン及び／又はリゾチームを変異させることによって、欠失されてもよいことを当業者は理解するだろう。
【００８８】
Ｐ２及びP４サテライトシステムを用いる本発明の実施形態において、Ｐ２ゲノムは、Ｐ４に使用されるホリン（Ｙ）及びリゾチーム遺伝子（Ｋ）の両方を含む。このため、Ｐ２プロファージは、Ｋ、Ｙ、又はＹＫ遺伝子の欠失によって変更されていてもよい。溶菌-欠損Ｐ２ファージの構成は、実施例１６に記載されており、実施例１６は、大腸菌のＫ１２種のＰ２プロファージのゲノムからＹＫ遺伝子を欠失している。Ｐ４サイズのコスミドを運ぶＰ２ΔＹＫプロファージは、Ｐ４バクテリオファージに感化され、それによってコスミドのパッケージングを誘導する。コスミドは、機能的にスクリーンニングされた遺伝子発現のために誘導されてもよい。コスミドのパッケージング及び遺伝子発現の両方の誘導の結果、本発明の方法によってスクリーンされた細胞のカプシド及び細胞膜は透過処理してもよいし。大腸菌種中の溶菌-欠損Ｐ２ファージは、実施例１８に記載されており、Ｐ４ファージによるＰ２ΔＹＫプロファージを運搬する種の感化を用いている。
【００８９】
ラムダファージシステムを利用する発明の実施形態において、ラムダＳ及びＲ遺伝子はそれぞれ、ホリン及びエンドリシン（リゾチーム）をコード化する。Ｒ又はＳＲ遺伝子の欠失又は変異的不活性は、溶菌-欠損ラムダプロファージを産出するだろう。
【００９０】
溶菌-欠損ラムダファージの構成は、実施例２０に示されており、実施例２０では、大腸菌のＫ１２種のラムダプロファージのゲノムからＳＲ遺伝子を欠失している。大腸菌種中の溶菌-欠損ラムダファージによるコスミドのパッケージングは、実施例２１に記載されており、実施例２１では、熱不安定ｃＩリプレッサーの不活性を通じて誘導される。
【００９１】
溶解ファージを用いた本発明の実施形態において、Ｔ７ファージを実施例として用いる場合、溶菌-欠損ファージは、Ｔ７リゾチームをコード化する遺伝子３．５の変異的不活性によって産出されてもよい。Ｔ７リゾチームは、Ｔ７ＲＮＡＰとの阻害相互作用を通じたＴ７移送で制御性活性を有するので、リゾチームの欠失ができなくなる。それ故、酵素の細胞壁アミターゼ活性を明らかに不活性にする変異種は、Ｔ７複製を維持する溶菌-欠損変異種を作製するために必要とされる。
【００９２】
他の溶解性又は溶原性ファージのリシン／ホリンシステムは、公知のファージゲノムとの比較を通じて、又は遺伝子解析を通じて、特定されてもよいし、関連する溶菌-欠損変異種は、本発明の方法のパッケージングライブラリーで使用するために作製されてもよい。
【００９３】
溶菌-欠損ファージによってパッケージングするポリヌクレオチド
溶菌-欠損ファージを用いる本発明のスクリーニングの方法で、その方法は、グラム陰性細菌細胞内でポリペプチドを産出するように、ポリペプチドをコード化する外因性ポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、溶菌-欠損ファージが、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージ化するようにする工程とを含む。「溶菌-欠損ファージがポリヌクレオチドをパッケージ化する」という成句は、溶菌-欠損ファージがポリヌクレオチドをパッケージできるようなグラム陰性細菌細胞内の状態を提供することを意味する。
【００９４】
当業者は、ポリペプチドを産出するためにグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、溶菌-欠損ファージがポリヌクレオチドをパッケージ化する工程とが同時であってもよいことを理解するだろう。非限定の例の方法で、ヘルパープロファージを含むグラム陰性細菌細胞と、一部のポリペプチドをコード化するコスミドは、コスミドをパッケージングすることができる溶菌-欠損ファージを感化してもよく、その後ポリペプチドを産出するために培養される。
【００９５】
あるいは、ヘルパーファージ及びポリペプチドをコード化するコスミドを含むグラム陰性細菌細胞は、例えば、不安定リプレッサータンパク質の熱不活性化を通じて、又は活性タンパク質の共誘導を通じて、プロファージのパッケージング機能を誘導するために処方されてもよく、その後ポリペプチドを産出するために培養される。このようにして、グラム陰性細菌細胞中でポリペプチドが算出され、それと同時に、溶菌-欠損ファージにコスミドをパッケージングさせる。
【００９６】
一実施形態において、溶菌-欠損ファージは、透過処理したグラム陰性細菌細胞中に保持（つまり、カプセル化）され、本発明の方法によって、ポリペプチドは、所望の活性に対してスクリーニングする。具体的には、スクリーンされたポリペプチドをコード化する遺伝子ライブラリーは、溶菌-欠損ファージ又はコスミドに複製されるか、グラム陰性細菌細胞に導入される。グラム陰性細菌細胞の個体数がファージに沿って、細胞カプシド内で保持されるポリペプチドと洗剤又は有機溶媒を用いてが透過処理される適切な時点で、ファージパッケージング及びスクリーンされたポリペプチドの両方は、共誘導（つまり同時に誘導）されてもよい。そして、透過処理したグラム陰性細菌細胞の個体数は、所望のポリペプチド活性に対してスクリーンされる。
【００９７】
ポリペプチドを産出するためにグラム陰性細菌細胞を培養する工程と、溶菌-欠損ファージがポリペプチドをコード化したポリヌクレオチドをパッケージ化する工程とは、同時よりもむしろ順次実行されてもよい。このため、グラム陰性細菌は、まず初めにポリペプチドを産出するために培養してもよいし、次に、溶菌-欠損ファージがポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージさせてもよい。例えばポリペプチドが細菌細胞中のコスミドによってコード化された場合、ポリペプチドのパッケージングに従った細菌細胞中の連続的産出をしてもよいし、ヘルパーファージで細菌細胞を感化させることで、溶菌-欠損ファージがポリペプチドをコード化したポリヌクレオチドをパッケージさせてもよい。本発明の一例では、細菌細胞がＰ２及び／又はＰ４プロファージを含み、Ｐ２プロファージの活性を誘導する工程は、細菌細胞中のＰ２タンパク質Ｃの温度感性リプレッサ対立遺伝子、及び／又は、細菌細胞中のＰ４活性タンパク質の発現、を不活性にする工程を含む。
【００９８】
あるいは、グラン陰性細菌が、ポリペプチドの産出のために適した条件下で培養されてもよく、溶菌-欠損ファージがポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをパッケージ化する工程は、ファージを産出するための細菌細胞中でプロファージアクチベータを誘導する工程を含んでいてもよい。その場合、ファージは、ポリヌクレオチドをパッケージする。当業者に理解されるように、細胞中のプロファージを誘導する工程は、細胞内でポリペプチドを産出するグラム陰性細菌細胞を培養する工程と同時に実行してもよいし、順次実行してもよい。
【００９９】
本明細書において、当業者は、ポリヌクレオチドをパッケージするための溶菌-欠損ファージの活性を誘導することを達成する方法がいくつかある。例えば、溶菌-欠損ファージの活性を誘導する工程は、プロファージと同様に細菌細胞ゲノム中に存在する溶菌-欠損ファージを含むグラム陰性細菌細胞に、サテライトファージ又はヘルパーファージを誘導する工程を含んでもよい。
【０１００】
あるいは、活性化を誘導することは、細菌細胞中のプロファージの１以上の活性タンパク質を産出する工程を含む。例えば、グラム陰性細菌細胞は、Ｐ２及び／又はＰ４プロファージを含んでもよいし、Ｐ２及び／又はＰ４活性化タンパク質は、例えば、Ｐ２cox、Ｐ２ogr、Ｐ４δ及び／又はＰ４εの１以上から選択してもよい。活性化の結果として、細菌細胞中のプロファージは、ポリヌクレオチドをパッケージするファージを産出する。あるいは、ポリヌクレオチドをパッケージする溶菌-欠損ファージの活性化を誘導することは、細菌細胞中の１以上のファージリプレッサタンパク質を不活性化することを含んでもよい。本発明の特定の一実施形態において、活性化を誘導することは、細菌細胞中のラムダプロファージの温度感性対立遺伝子を不活性化することを含む。別の実施形態において、溶菌-欠損ファージの活性化を誘導することは、細菌細胞の培養温度を増加させることを含む。
【０１０１】
透過処理
本発明の方法のある実施形態では、グラム陰性細菌細胞の外側の細胞膜、又は内側及び外側の両方の細胞膜を透過処理し、このようにして可溶性細胞成分の少なくとも一部を、細胞壁を通して拡散させる。所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドは、細菌細胞壁内に保持されるか、又は細菌細胞壁に付着する。本明細書中で用いられる場合、「透過処理」、「透過処理された」又は「透過処理された細菌細胞」は、グラム陰性細菌細胞の外側の細胞膜、又は内側及び外側の両方の細胞膜に孔を生成させるか、又は外側の細胞膜、又は内側及び外側の両方の細胞膜を可溶化し、一方、ペプチドグリカン間の結合を加水分解せず、それにより細胞壁を無傷のままで保持する透過処理剤若しくは機械的処理又はその組合せの両方の使用を指す。細菌細胞を透過処理する透過処理剤の非限定的例としては、界面活性剤及び有機溶媒が挙げられる。細菌細胞を透過処理する機械的処理の非限定的例としては、エレクトロポレーションがある。
【０１０２】
透過処理は、小〜中程度のサイズ、例えば１２０ｋＤａまでのタンパク質、又は同等以下のサイズの他の分子であれば、無傷なままの細胞カプセル中に有利に侵入する。さらに、細菌細胞壁の完全性を維持することにより、透過処理された細菌細胞は、例えば細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−リゾチームで処理することにより産生されるスフェロプラストほど脆弱ではなく、スフェロプラストでは、細菌細胞壁が少なくとも部分的に加水分解される。本発明の方法のある実施形態で産生される透過処理された細菌細胞は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などの技術にかなり適している一方、スフェロプラストは高剪断フローシトメトリー環境により損なわれ、制御された浸透圧条件を必要とし、このため、それらの潜在的使用が限定される。
【０１０３】
透過処理は、好ましくは、細胞タンパク質をそれらの自然な状態及び相互関係で保存する。非イオン性界面活性剤は、一般にタンパク質の重畳及びタンパク質複合体に対してイオン性界面活性剤ほど破壊的でない。したがって、好ましい実施形態では、細菌細胞壁を透過処理するために非イオン性界面活性剤を用いる。非イオン性界面活性剤の非限定的例としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ５８、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ、オクチルβグルコシド、Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、ＢｉｇＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ ＢｉｇＣＨＡＰ、Ａｐｏ８、及び８ＴＧＰ（８−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド）が挙げられる。
【０１０４】
細菌細胞を透過処理するために、界面活性剤の混合物を用いてもよい。例えば、界面活性剤は、２以上の非イオン性界面活性剤の混合物であってもよい。１つの実施形態において、界面活性剤はＭｅｇａ １０とＡｐｏ８の混合物である。
【０１０５】
所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドが細菌細胞壁に付着しているか、又は内側細胞膜と一体化しているか若しくは付着している場合、必ずしも細菌細胞の内膜を透過処理する必要はない可能性があることを当業者は理解するであろう。このため、１つの実施形態では、細菌細胞は選択的に透過処理される。「選択的に透過処理される」とは、透過処理された細菌細胞の外膜が内膜よりもさらに透過処理され、それにより、内膜及び外膜の両方が、０．５％のＭｅｇａ １０及び０．５％のＡｐｏ８を含む溶液を用いることによる等で透過処理された透過性細胞に比して、膜不透過性物質、例えば膜不透過性ＤＮＡ結合リガンドＧｅｌ Ｒｅｄの５０％以下、より好ましくは４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下又は０％が選択的透過性細胞の内膜を透過することを意味する。
【０１０６】
当業者は、本発明の方法にしたがって細菌細胞を選択的に透過処理するための好適な条件を決定することができるが、１つの実施形態では、細菌細胞は、非イオン性界面活性剤で選択的に透過処理される。例えば、非イオン性界面活性剤は、Ａｐｏ８及びＴｗｅｅｎ２０から選択することができる。１つの実施形態において、細菌細胞を選択的に透過処理するための溶液は、約０．２％から約０．４％、又は約０．２％から約０．３％、又は約０．２％の濃度で界面活性剤を含む。好ましくは、細菌細胞を選択的に透過処理するための溶液は、Ｃａ2+又はＥＤＴＡを含む緩衝液中の浄化剤を含む。細菌細胞を選択的に透過処理するための好適な例示的緩衝液としては、２５ｍＭのＴｒｉｓ中０．２〜０．４％のＡｐｏ８若しくはＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、又は２５ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａ2+（ｐＨ８．０）が挙げられる。１つの実施形態において、細菌細胞の選択的透過は、細胞を好適な緩衝液中、約２５℃にて約１０分間培養することで達成できる。
【０１０７】
別の実施形態において、グラム陰性細菌細胞を透過処理し得る化学物質は、クロロホルムのような有機溶媒である。例として、細胞膜の内膜及び外膜は、親油性溶媒クロロホルムの飽和水溶液中で、グラム陰性細菌細胞を懸濁することによって透過処理することができる。クロロホルム相が微細液滴に懸濁されるまで、水相及び有機溶媒の混ざらない２相を、かき混ぜるか、通常は振動させるか、又は機械的攪拌することによってクロロホルムの飽和水溶液を作製する。その２相は沈殿してもよいし、相を分離させるために間欠延伸分離を用いられる。５体積％のクロロホルムの混合物は、飽和水溶液を作るのに十分である。実施例１９及び図２２は、有機溶媒クロロホルムを用いた大腸菌の内膜及び外膜の透過処理を記載し、実演している。
【０１０８】
ポリペプチド発現
所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドを、細菌細胞における発現の好適なベクター中に複製することができる。本明細書中で用いられる「ベクター」は、細菌細胞を形質転換するために好適であることが当該技術分野で知られている任意のベクターを指す。好ましくは、ベクターは宿主ゲノムから独立して、細菌細胞内で複製することもできる。ベクターは、プラスミド、ウイルス及びコスミド並びに線状ＤＮＡエレメント、例えば大腸菌の線状ファージＮ１５、及び／又は、細菌細胞ゲノムから独立して複製する染色体外ＤＮＡが挙げられる。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。当業者に理解されるように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドがファージにパッケージされる実施形態において、ベクターは、ポリヌクレオチドのファージへのパッケージに適した形になるだろうし、ポリヌクレオチドのファージへのパッケージに必要な配列（例えば、コスミド中のcos配列）を含む。
【０１０９】
本明細書中で用いられる「発現ベクター」は、細菌細胞における特定のポリヌクレオチド分子を発現させることができるベクターである。好ましくは、発現ベクターは、細菌細胞内で複製することもできる。好適な発現ベクターは、典型的には、調節配列、例えば転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、及び組換え細菌細胞と適合性であり、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長及び終止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列及びリプレッサー配列である。好適な転写制御配列は、細菌細胞で機能することができる任意の転写制御配列を含む。そのような種々の転写制御配列は、当業者に公知である。
【０１１０】
発現ベクターの細菌細胞への形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞中に挿入できる任意の好適な方法により達成することができる。形質転換技術としては、エレクトロポレーション及び化学変換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。形質転換されたポリヌクレオチド分子は、染色体外にとどまる可能性があるか、又はそれらの発現される能力が保持されるように形質転換された（つまり、組換）細胞の染色体内の１以上の部位に組み込まれてもよい。
【０１１１】
ＤＮＡ組換技術を用いて、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、それらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、結果として得られる転写物が翻訳される効率、及び翻訳後修飾の効率、を操作することによって、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を改善する。ポリヌクレオチド分子の発現を増大させるために有用な組換技術としては、ポリヌクレオチド分子を高コピー数のプラスミドに機能的に連結すること、ベクター安定性配列のプラスミドへの添加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換若しくは修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換若しくは修飾、宿主細胞のコドン使用に対応させるためのポリヌクレオチド分子の修飾、及び転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
当業者は、本発明の方法でポリペプチドを発現するために好適な細菌株を容易に決定することができる。当業者は、本発明の方法での使用に好適なグラム陰性菌には、サルモネラ属、大腸菌、赤痢菌、カンピロバクター属、フゾバクテリウム属、ボルデテラ属、パスツレラ属、アクチノバチルス属、ヘモフィルス属及びヒストフィルス属が含まれることを理解する。好ましい実施形態において、グラム陰性菌は大腸菌である。
【０１１３】
タンパク質複合体
所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドを少なくとも第２ポリペプチドと結合させて、タンパク質複合体が透過処理された細菌細胞の内部に保持されるような分子サイズを有するタンパク質複合体を形成することができる。ポリペプチドを例えば、ジスルフィド架橋などの共有結合によるか、又は非共有結合により、第２ポリペプチドと結合させることができる。「非共有結合」とは、原子間結合が関与しない分子相互作用を指す。例えば、非共有相互作用は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用及びファンデルワールス力が関与する。非共有結合力を用いて、別個のポリペプチド鎖をタンパク質又はタンパク質複合体中に一緒に保持することができる。このため、ポリペプチド及び第２ポリペプチドを同じか若しくは異なるベクターのいずれかから別のポリペプチドとして発現することができるか、又はポリペプチドの一方若しくは両方を、細菌細胞ゲノム中に組み入れられたポリペプチドをコード化するＤＮＡから発現することができる。
【０１１４】
また、タンパク質複合体と結合するポリペプチド及び第２ポリペプチドは融合タンパク質であってもよい。本明細書中で用いられる「融合タンパク質」とは、２つのポリペプチドのそれぞれの少なくとも一部をコード化するポリヌクレオチドの発現から生じる２以上のポリペプチド、又はそれらのフラグメントからなるハイブリッドタンパク質を指す。
【０１１５】
分子サイズにより透過処理された細菌細胞中に保持されるタンパク質複合体
第２ポリペプチドは、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドで形成された複合体の少なくともいくつかが、透過処理された細菌細胞から拡散することができないような十分な分子サイズ（すなわち十分な分子量又は十分な分子半径）の任意のポリペプチドであり得る。このため、タンパク質複合体は、細胞の透過処理後に細菌細胞内に保持される。分子量及び球状又は桿状（糸状）タンパク質であるかどうかを含む第２ポリペプチドの性質が、細菌細胞壁を通過するタンパク質複合体の拡散を防止又は阻害する第２ポリペプチドの能力を決めることを当業者は理解するだろう。一実施形態において、第２ポリペプチドの分子量は、少なくとも約３０ｋＤａ、又は少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０ｋＤａ若しくはそれ以上である。一実施形態において、第２ポリペプチドは少なくとも約１２０ｋＤａである。
【０１１６】
一実施形態において、第２ポリペプチドは、透過処理された細菌細胞の孔排除サイズよりも大きな分子サイズを有するマルチマーを形成する。本明細書中で用いる「マルチマー」という用語及びその文法的変形は、２以上の異なる分子間のマルチマー複合体の構造を指す。マルチマーは、例えば、同じタンパク質の２以上の分子（すなわち、ホモマルチマー）又は２以上の異なるか、若しくは非同一タンパク質（すなわち、ヘテロマルチマー）の混合物を含み得る。本発明の方法における使用に好適なマルチマーを形成するタンパク質としては、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、及び７以上のサブユニットを含むさらに高次のマルチマーが挙げられる。
【０１１７】
マルチマータンパク質は、ホモダイマー（例えばＰＤＧＦ受容体α及びβイソ型、エリスロポエチン受容体、ＭＰＬ、並びに−ＣＳＦ受容体）、サブユニットがリガンド結合及びエフェクター領域をそれぞれ有するヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソ型）、並びに異なる機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体）を含む。本発明の方法で用いてもよい他のマルチマータンパク質の非限定的例としては、ＤＮＡの合成又は複製に関与する因子、例えばＴＦＩＩＤ及びＴＦＩＩＨ等のｍＲＮＡの産生に関与するＤＮＡポリメラーゼタンパク質；細胞、核及び他の膜関連タンパク質、例えばホルモン及び他のシグナル伝達受容体、能動輸送タンパク質及びイオンチャンネル、ヘモグロビン、フィブリノゲン及びフォンウィルブランド因子を含む血液中のマルチマータンパク質；細胞内の構造を形成するタンパク質、例えばアクチン、ミオシン及びチューブリン並びに他の細胞骨格タンパク質；細胞外環境で構造を形成するタンパク質、例えばコラーゲン、エラスチン及びフィブロネクチン；細胞内外の輸送に関与するタンパク質、例えばキネシン及びダイニン、タンパク質のＳＮＡＲＥファミリー（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体）及びクラスリン；クロマチン構造の調節に役立つタンパク質、例えばヒストン及びプロタミン、Ｓｗｉ３ｐ、Ｒｓｃ８ｐ及びモイラ；マルチマー転写因子、例えばＦｏｓ、Ｊｕｎ及びＣＢＴＦ（ＣＣＡＡＴボックス転写因子）；マルチマー酵素、例えばアセチルコリンエステラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ；シャペロンタンパク質、例えばＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ（シャペロニン６０）及びＧｒｏＥＳ（シャペロニン１０）；抗毒素、例えばヘビ毒、ボツリヌス毒素、ストレプトコッカス超抗原；リシン（バクテリオファージ及びウイルス由来の酵素）；並びにほとんどのアロステリックタンパク質が挙げられる。一実施形態において、マルチマータンパク質は大腸菌タンパク質である。マルチマーを形成する大腸菌タンパク質の非限定的例としては、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ（ＲｈｎＡ；例えばＮＣＢＩ受入ＣＡＡ４３００２）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ；例えばＮＣＢＩ受入ＹＰ００１４６１５２０）、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｅｔＢ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＡＡ２３５０６）、グルタメート−５−キナーゼ（Ｇ５Ｋ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＡＢ０８６６２）、グルタチオンシンターゼ（ＧｓｈＢ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＰ＿００３５０４）、及び中鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ；例えばＮＣＢＩ受入ＡＰ＿００２０６７）が挙げられる。
【０１１８】
一実施形態において、所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドは、細菌細胞壁内にポリペプチドを保持するために十分な分子サイズを有する。このため、当業者は、透過処理された細菌細胞内にポリペプチドを保持するために、そのようなポリペプチドを第２ポリペプチドと必ずしも結合させる必要はないことを理解するであろう。
【０１１９】
溶融ファージ及び溶原性ファージのカプシドディスプレイ
別の実施形態において、ポリペプチドは、バクテリオファージ及び／又はファージコートタンパク質のような超高分子複合体に結合してもよい。ファージへのポリペプチドの結合は、ポリペプチドの遺伝子からファージコートタンパク質の遺伝子への直接融合によってであってもよいし、２つの異なる発現ポリペプチド間の強力な相互作用によってであってもよい。溶融バクテリオファージ及び溶原性バクテリオファージの頭表面へのタンパク質ライブラリの結合は、「カプシドディスプレイ」として公知である。ポリペプチドへの融合に適合してもよいファージコートタンパク質の例は、１１ｋＤのラムダＤタンパク質の遺伝子であり（Sternberg and Hoess, 1995; Mikawa et al., 1996）、その遺伝子は、ラムダバクテリオファージの先端、又は２５ｋＤラムダＶタンパク質の尾鞘タンパク質を有する（Maruyama et al., 1994）。他の溶融ファージは、Ｔ４のようなファージの９ｋＤのＳＯＣタンパク質への融合（Rao et al., 2007）、及び４２ｋＤのＴ７カプシドタンパク質、１０ＢのＣターミナスへの融合を用いてもよい（Dai et al., 2008）。Ｐ２／Ｐ４バクテリオファージシステムの例において、ペプチドは、２１ｋＤのＰ４Ｐｓｕタンパク質でディスプレイされている（Lindqvist及びNaderi, 1995）。
【０１２０】
カプシドディスプレイの典型的な方法は、ペプチド又はポリペプチドの、ラムダバクテリオファージのカプシドタンパク質、ｇｐＤへの溶融である。この方法は、米国特許番号7,732,150及び米国特許番号6,884,612等の文献に幅広く記載されている(Sternberg及びHoess, 1995; Mikawa et al., 1996; Gupta et al., 2003; Vaccaro et al., 2006; Levy et al., 2007)。
【０１２１】
先端あたりの融合タンパク質の５０％以上のローディングは、ファージの生存能力を減少させるが、ラムダｇｐＤタンパク質は、単位ファージあたり４００以上の価数で、Ｎ−又はＣ−末端のいずれかへのポリペプチドの融合を許容することを示している。フィラメント状のファージディスプレイに対するカプシドタンパク質の直接比較によると、標的抽出中に、優れた融合タンパク質発現及び優れた捕捉効率を示していた（Santini et al., 1998; Gupta et al., 2003）。ラムダカプシドディスプレイは、抗体ライブラリーのスクリーニングによく用いられるが、それは、３つのグループの使用を挙げるだけに過ぎない。Gupta et al. (2003)は、生産的重畳の単鎖抗体(scFv)が、ＥＬＡＳＡ試験による反応性において、フィラメント状のファージディスプレイ抗体の約１００倍であることを開示した。同様に、Vaccaro et al. (2006)は、ラムダがscFvの優れたプラットフォームディスプレイになることを見出した。しかしながら、Vaccaro et al. (2006)に示されるように、これは、選ばれたscFvの並外れた珍しい安定性によるものだった。この安定性は、細胞質内で重畳することができる。これらの著者は、他のscFv配列で生産的なディスプレイを得ることは困難であろうと述べた。Levy et al. (2007)は、細胞質内のscFvの生産的重畳を高める大腸菌細胞質タンパク質を選択する遺伝子検査としてラムダディスプレイを用いようとして、この事実を認識して用いた。これらの結果は、scFvの生産的重畳におけるほんのささやかな改善に過ぎなかった。本発明の方法は、溶菌-欠損ファージのカプシドディスプレイシステムにおいて、Gupta et al. (2003)及びVaccaro et al. (2006)に示されるような、安定したscFv骨格を利用することができる。
【０１２２】
ポリヌクレオチドをパッケージするため、及び、カプシド表面のコード化したポリペプチドをディスプレイするため、の両方で、溶菌-欠損ファージを用いることに大きな利点がある。まず、ファージカプシドは、安定なエンドヌクレアーゼで保護したカプセル封入として供給され、一旦放出されると、高収量の回復（ほぼ１００％のパッケージされたファージが回復し得る）が可能となる。第２に、ファージカプシドは、透過処理した細胞内のコード化したポリペプチドの安定な多数の結合部位として供給される。図２５は、この特性が、蛍光ターゲットへのscFv結合を直接視覚化するために用いることができることを示している。このscFv結合では、scFvが、ラムダgpDタンパク質に融合する。このため、溶菌-欠損ファージにパッケージされ、さらに透過処理した細胞に封入されたポリヌクレオチドライブラリは、本発明のタンパク質ディスプレイの方法で用いられてもよい。この実施形態で用いるディスプレイの例は、カプシドディスプレイされた抗体又は親和性骨格に対する蛍光識別した標的の結合をスクリーニングすることであり、その結合は、蛍光顕微鏡検査法又はＦＡＣＳのいずれかを用いて検出される。図２５は、ＦＡＣＳを用いたカプシド結合抗体をディスプレイするカプセル化ファージに結合する蛍光標的の同定を示している。
【０１２３】
ライブラリディスプレイ及び溶菌-欠損ファージを用いてパッケージすることの第３の利点は、誘導した宿主細胞からファージを開放しないことにより、宿主細胞の遠心分離を通じて洗剤又はクロロホルムのいずれかと、精製したリゾチームを用いた誘導溶菌することで、ファージの濃度を高力価にし得ることである。本発明者らの報告によると、溶菌-欠損変異体をファージのパッケージに用いるとき、ラムダ型ファージの力価が、溶菌ファージの液体培養力価に対し１００倍増加し得る。溶菌-欠損変異体を用いてファージをパッケージするとき、Ready-Lyse（Epicentre）溶菌細胞の単位ｍＬあたり、１０１１ファージ以上の力価を成し遂げることが通常である。このレベルの力価を達成するために、面倒な沈殿及びファージ溶解物の超遠心分離を必要とし、長い工程中で融合タンパク質の表面結合を損なうリスクがある。
【０１２４】
本発明の方法で可能となるカプシドディスプレイのさらなる増大により、カプセル化したファージ粒子に結合しない過量の可溶性カプシド融合タンパク質が細胞透過処理により簡単に取り除かれることもある。この特徴は、カプセル化したバクテリオファージ粒子に結合する標的に重要である。そうでなければ、その結合は、カプシド結合ではない通常超過の融合タンパク質に溶解する。カプシド結合と可溶性融合タンパク質を分離しない場合、親和性タンパク質をディスプレイするバクテリオファージの結合及び／又は捕獲は減少する。
【０１２５】
実施例２０及び２３はそれぞれ、Ｈｙ５ファージ（Ｐ２構造遺伝子とＰ２／１８６ハイブリッド）、及びラムダファージカプシドタンパク質（ｇｐＬ及びｇｐＤ）の両方への親和性タンパク質の溶解と、マトリクス結合した標的を通じた改良使用の実証と、を開示する。
【０１２６】
スクリーンされるポリペプチドは、ファージコートタンパク質に直接融合する必要はなく、むしろ、タンパク質ドメインの安定的な会合を通じて生体内のファージの外部に結合する分離ポリペプチドとして発現してもよい。このような会合の具体例は、タンパク質ドメインとペプチドリガンドとの間の高親和性、例えばカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰs）の間に見られるような親和性であってもよい。あるいは、上記会合は、２つのポリペプチド間の共有結合性の相互作用を通じて形成されてもよい。この具体例としては、ディスプレイタンパク質及びバクテリオファージコートタンパク質へのパートナーとして別々に溶解するＳＮＡＰタンパク質及びＣＬＩＰタンパク質（New England Biolabs）、並びに両タンパク質に共有結合するリガンドが挙げられる。
【０１２７】
ＤＮＡ結合タンパク質
本発明者らは、透過処理後の細菌細胞内にＤＮＡが保持されることを見出した。このため、一実施形態において、ポリペプチドをＤＮＡ結合タンパク質と結合させて、ＤＮＡと結合するタンパク質複合体を形成し、それは細菌細胞の内部に保持される。本明細書中で用いる「ＤＮＡ結合タンパク質」は、２本鎖又は１本鎖ＤＮＡを認識する１以上のモチーフを含むＤＮＡ結合領域を含む任意のタンパク質を意味する。ＤＮＡ結合領域は、当業者に公知であるように、ヘリックス・ターン・ヘリックス、亜鉛フィンガー、ロイシンジッパー、翼状ヘリックス、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、ＤＮＡを認識する免疫グロブリンフォールド、又はＢ３ドメインが挙げられる。ＤＮＡ結合タンパク質とポリペプチドを結合により、本発明のスクリーニング法においてポリペプチドをコード化するプラスミド等のＤＮＡの回収が有意に増大する。
【０１２８】
ＤＮＡ結合タンパク質の具体例としては、細菌コンピテンスタンパク質、例えば大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質、淋菌ＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣｏｍＥ、アデノウイルスＥ２タンパク質、ＡｒａＣ転写因子、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ブチラート反応因子、セントロメアタンパク質Ｂ、ＣＯＵＰ転写因子、初期増殖応答転写因子、Ｇボックス結合因子、ＧＡＴＡ転写因子、ＨＭＧＡタンパク質、ホメオドメインタンパク質、Ｉ−カッパＢタンパク質、組込宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン−刺激遺伝子因子３、Ｋｒｕｐｐｅｌ様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着ドメイン結合タンパク質、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質、ＭｕｔＳホモログ２タンパク質、骨髄性−リンパ性白血病タンパク質、ＮＦ−カッパＢ、ＮＦ１転写因子、核呼吸因子、ガン遺伝子タンパク質ｐ５５、起点認識複合体、対合ボックス転写因子、ＰＯＵドメイン因子、プロトオンコジーン因子、ラッド５１リコンビナーゼ、Ｒａｄ５２ＤＮＡ修復及び組換えタンパク質、複製タンパク質Ａ、複製タンパク質Ｃ、網膜芽細胞種タンパク質、Ｓｍａｄタンパク質、ＳＯＸ転写因子、Ｔボックスドメインタンパク質、ＴＣＦ転写因子、テロメア結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体９、トランス活性化因子、及び翼状ヘリックス転写因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質である。別の実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は淋菌タンパク質、例えばＣｏｍＥ又はそれらのドメインである。
【０１２９】
細胞壁結合タンパク質
所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドを、細菌細胞壁結合タンパク質と結合させてもよい。異なる細菌は異なる細胞壁組成を有するので、当業者は、細胞壁結合タンパク質の選択が宿主細胞種に依存することを理解するであろう。細菌は、ペプチドグリカン（ＰＧ）から構成される細胞壁を有するが、種間の化学修飾は、異種間結合に影響を及ぼし得る。当業者は、特定の細菌種における使用に適した細胞壁結合タンパク質を容易に決定することができる。
【０１３０】
細菌細胞壁結合タンパク質は、ドメイン構造を有することが知られているタンパク質を含み、そのドメイン構造によって天然の構造中のポリペプチド鎖の部分が細菌細胞壁上の特定の分子又は分子構造を認識し、結合する。それ故、「細菌細胞壁結合タンパク質」の用語は、細菌細胞壁に特異的に結合するタンパク質の部分であるタンパク質ドメインを含む。細菌細胞壁結合タンパク質の例としては、バクテリオファージによりコードされるような細胞壁ヒドロラーゼ、細菌細胞壁ヒドロラーゼ及び異なる自己溶菌酵素が挙げられる。さらに、バクテリオファージ及び他のウイルスのＤＮＡによりコードされる受容体分子も含まれる。細菌細胞壁結合タンパク質が、細菌に特異的に結合できるバクテリオファージ複製起点の加水分解酵素に由来する場合、細胞壁結合タンパク質はそれらの結合能力を保持するが、顕著な加水分解性は有さないことが好ましい。
【０１３１】
一実施形態において、細胞壁結合タンパク質は大腸菌の細胞壁に非共有結合する。例えば、大腸菌宿主細胞に対して、ＰＡＬ、ＯｍｐＡ、ＹｉａＤ、ＹｆｉＢ、及びＭｏｔＢに存在する、約１００の保存されたアミノ酸ＰＧ結合ドメインを有する内因性ＰＧ結合タンパク質がある（Parsons et al., 2006）。しかしながら、例えばシュードモナス属φＫＺファージ（ＫｚＰＧ）由来の約７０のアミノ酸ＰＧ結合ドメイン等の他の生物由来のタンパク質は、大腸菌で十分に発現され、高親和性で細胞壁に結合することが示されている（Briers et al., 2009）。したがって、本発明の方法において、ＰＧと結合するタンパク質由来のＰＧ結合ドメインを細菌細胞壁結合タンパク質として用いてもよい。
【０１３２】
典型的な実施形態において、所望の活性に対してスクリーニングされ、細菌細胞のサイトゾルで発現されるポリペプチドに、ＰＧ結合ドメインを融合させてもよい。膜透過処理により、ＰＧ結合ドメインは細胞壁にアクセスし、結合する。その結果、透過処理細胞内で関心対象のポリペプチドが保持される。細胞内の関心対象のポリペプチドの保持を潜在的にさらに増強するために、当業者は、ポリペプチドが細菌細胞壁結合タンパク質に加えてＤＮＡ結合タンパク質と結合できることを理解するであろう。
【０１３３】
あるいは、関心対象のポリペプチドは、細菌細胞壁に共有結合することができるタンパク質と結合することができる。好ましくは、タンパク質は周辺質を標的とするシグナルを含む。このため、ポリペプチドは細菌細胞のサイトゾル中で発現されるが、膜透過処理前に細胞壁に結合する周辺質を標的とする。
【０１３４】
非限定的な具体例として、細胞壁と共有結合する細菌細胞壁結合タンパク質は、細胞壁と結合することができ、外膜付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如したリポタンパク質であり得る。例えば、リポタンパク質は大腸菌ＬＰＰであり得る。ＬＰＰは、トリマーコイルドコイルを形成する多量の大腸菌タンパク質である。その天然の形態において、一端は脂質化により外膜に結合し、多端はＣ−末端リシンにより細胞壁に共有結合する。リポタンパク質は、リポタンパク質に周辺質を標的とさせる配列、例えばＯｍｐＦ周辺質ターゲティング配列をさらに含んでもよい。一実施形態において、リポタンパク質は、外膜への付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如した大腸菌リポタンパク質である。
【０１３５】
本明細書の教示を考慮すれば、当業者は、本発明の方法の使用に好適なタンパク質であって、細菌細胞壁と共有結合するタンパク質を同定又は設計し得る。
【０１３６】
本発明の一実施形態において、所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドは、ＫｚＰＧドメイン並びにスペーサー、ＳＮＡＰ及び／又はＤＢＰから選択される１以上の他のドメインを含む融合ポリペプチドである。特定の一実施形態において、融合ポリペプチドは、１以上スペーサー並びにＫｚＰＧ、ＳＮＡＰ及びＤＢＰドメインを含む。
【０１３７】
スペーサー
一実施形態において、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドを、１以上スペーサーを含む融合ポリペプチドとして発現してもよい。本明細書中で用いられる「スペーサー」は、融合ポリペプチド中に含まれ、かつ細菌細胞におけるポリペプチドの発現を増強するか、又は、立体障害を減少させて、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドがその所望の三次構造をとることができるか、及び／又は、その標的分子と適切に相互作用することができるペプチド若しくはポリペプチドを指す。したがって、融合タンパク質は、融合ポリペプチド中の１以上のポリペプチドドメインの前後又は中間に１以上スペーサーを含み得る。スペーサー及び所望のスペーサーの同定方法については、例えば、George, et al. (2003)参照。
【０１３８】
一実施形態において、スペーサーは、１〜５０のアミノ酸残基の長さ、又は約１〜２５残基又は約５〜１５残基の長さである１以上のアミノ酸配列を含む。例えば、スペーサーは、Ｉ２７、ＲＬ１、ＲＬ２、ＲＬ３、ＲＬ４、ＲＬ５及び／又はＲＬ６の１以上から選択することができる。当業者は、限定された数のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４又は５のアミノ酸置換を、スペーサーとして機能するその能力に影響することなくスペーサーに導入し得ることを理解するであろう。特定の１つの実施形態において、１以上スペーサーは、配列番号６〜１２又は１６のいずれか１つから選択される。したがって、１つの実施形態において、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドは、Ｉ２７、ＲＬ６、ＫｚＰＧ、ＳＮＡＰ及びＤＢＰを含む融合ポリペプチドである。
【０１３９】
別の実施形態において、スペーサーの領域は、タンパク質領域に対する高親和性の結合部位となるペプチド配列を含んでいてもよい。例えばカルモジュリンは、短ペプチド領域に位置づけられたタンパク質リガンドからの多数のペプチド配列へのＣａ2+依存親和性を有する。これらのＣＰＢs（ペプチド結合カルモジュリン）は、カルモジュリンに対してかなり高い親和性の結合（Ｋｄの１ｎＭから１ｐＭの間）に変異され（Montigiani et al., 1996）、Ｃａ2+切替可能な高親和性の２つのタンパク質間の相互作用を可能とし、一方のタンパク質がＣＢＰスペーサー領域を有し、他方のタンパク質がカルモジュリンに融合する。
【０１４０】
スクリーニング法及びタンパク質進化
本発明は、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。本明細書中で用いられる「所望の活性」という用語は、ポリペプチドの任意の潜在的に有用な活性を指し、結合、酵素修飾、重畳安定性及び／又は熱安定性を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
「標的分子」の用語は、ポリペプチドと結合する分子及び／又はポリペプチドにより修飾される分子を指し、例えば抗体、受容体、抗原、酵素等であってもよい。このため、「標的分子」は、酵素基質又は結合について評価される分子（例えば、リガンド、エピトープ、抗原、マルチマー化パートナー、例えばホモ若しくはヘテロダイマーパートナー等、又はそれらの任意の組み合わせ）を言及する際に使用することができる。
【０１４２】
ポリペプチド活性は、単一のポリペプチドを発現する単一種の細胞の関連であるか、又はそれぞれが異なるポリペプチド若しくはポリペプチド変異体を発現する細胞のライブラリーの関連で、スクリーニングあるいは選択することができると理解される。このため、本発明の方法は、生体外タンパク質進化に用いることができる。生体外タンパク質進化により、多数のタンパク質機能及び特性を調査することが可能になり、典型的には２つの主要ステップ、つまり多様化及び選択を含む。多様化は、ポリペプチドをコードする核酸の多様なライブラリーを生成する能力に依存する。選択は、所望の活性に対してライブラリーをスクリーニングし、活性を遺伝子型と結びつけることにより、例えば、観察された活性の原因となる遺伝子型を含むライブラリーの数を特定することにより達成することができる。
【０１４３】
ＤＮＡライブラリは、ポリペプチドをコード化するＤＮＡ挿入物（ＤＮＡフラグメント）を含む組換えベクターの収集物である。ＤＮＡ挿入物の複製起点は、ゲノム、ＤＮＡ、合成又は半合成であり得る。ポリペプチドは、所望の活性を有してもよく、例えば関心対象のポリペプチドは、結合タンパク質、例えば抗体又は酵素、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、トポイソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝性酵素、触媒酵素又は成長因子ホルモン、抗菌ペプチド、抗原、受容体、レポータータンパク質、免疫調節タンパク質、神経伝達物質、構造タンパク質、転写因子又はトランスポーターであり得る。一実施形態において、ポリペプチドは抗体又は酵素である。したがって、本発明の方法を、所望の活性を有するポリペプチドの変異体に対してスクリーニングするために用いることができる。
【０１４４】
例えば、結合タンパク質又は酵素のＤＮＡライブラリーのクローニング及び構築は、当該技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。例えば、Lutz and Patrick (2004)は、ライブラリー多様性を生成させる方法及びタンパク質工学で使用するための遺伝子組換えの方策を概説している。ディスプレイされたポリペプチド変異体のスクリーニングのために、表面ディスプレイされたライブラリーに用いられる方策を、本発明の方法に採用し、適応させることができる（Becker et al., 2004; Daugherty et al., 2000., Kenrick et al., 2007; Miller et al., 2006）。
【０１４５】
核酸のライブラリーを複数の細菌細胞に導入し、その結果、細菌細胞のそれぞれにおいてライブラリーのメンバーが発現される。発現に加え、ポリペプチドを、それらの機能又は特性を評価するために、透過処理された細菌細胞内で保持するか、又は細胞壁に付着させる。ポリペプチド、例えば抗体などの結合タンパク質の核酸ライブラリー、又は酵素の核酸ライブラリーを、種々の方法により、例えば点突然変異などの突然変異、欠失、及び挿入の導入によるか、又は組換え事象により、生成させることができる。変異体のライブラリを生成させる方法は、当該技術分野で公知であり、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡ修復不全細菌におけるＤＮＡの合成及びＤＮＡの化学修飾を含む。組換えによりライブラリーを生成させる方法は、当該技術分野で公知であり、遺伝子シャッフリング、高組換え誘導細菌におけるＤＮＡのアセンブリ、合成核酸ライブラリアセンブリなど、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。このように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのライブラリーを複数の細菌細胞に導入することができ、その結果、細菌細胞のそれぞれにおいてライブラリーの１つ又はメンバーが発現される。
【０１４６】
ある実施形態において、ライブラリーは、ポリペプチドの２以上の変異体を含み、この場合、それぞれの変異体は、アミノ酸配列において若干の変化を有する独特のポリペプチドを含む。他の実施形態において、ライブラリーは、２以上の無関係な配列を含む。例えば、酵素を阻害できる候補ポリペプチドを同定するために、ランダム配列又は所定の配列のライブラリーを調べることができる。ライブラリーは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０７又はそれ以上のメンバーを有し得る。
【０１４７】
結合タンパク質ディスプレイ
一実施形態において、本発明の方法を、例えば抗体などの結合タンパク質の発生に適用することができる。したがって、一実施形態において、所望の活性に対しスクリーニングされるポリペプチドは結合タンパク質であり、標的分子は、結合タンパク質が結合することができる任意の分子であり、所望の活性は、標的分子に対する結合、及び／又は結合の程度である。本発明の方法は、例えば、結合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、細胞においてタンパク質を産生することを含み得る。細胞を続いて透過処理し、透過処理された細胞を標的分子と接触させる。当該技術分野における任意の好適な方法を、ポリペプチドが標的分子と結合するかどうか、及び／又は標的分子と結合する程度を決定するために用いることができる。
【０１４８】
本発明の方法は、結合タンパク質ディスプレイライブラリのスクリーニングに特に適している。タンパク質の細胞外空間に対するターゲティングを絶対的に必要とする生体内表面ディスプレイの他の方法と異なり、細胞膜はディスプレイタンパク質に対して提示された標識された標的との相互作用を防止するので、本発明の方法は、宿主細胞の細胞質において親和性タンパク質を発現でき、重畳することができる。したがって、スクリーニングパラメータは、細菌の細胞質における親和性変異体タンパク質の高収率及び生産的重畳を含み得る。
【０１４９】
さらに、細胞質タンパク質発現及び重畳が還元環境にある場合、本発明の方法を適用して、抗体の変異体、又はそれらの自然の形態でジスルフィド結合を有し還元環境において生産的重畳が可能である他のタンパク質を選択することができる。選択された変異体は、重畳安定性に関してドメイン内又はドメイン間ジスルフィド結合に依存しないので、更に安定であることが予想される。このアプローチは、中和又は標識のいずれかのために標的の細胞内結合に使用できる抗体を開発するために応用される。
【０１５０】
それ故、本発明の方法は、当該技術分野で公知のスカフォールド、例えば１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、Ｆａｂ、及び非抗体スカフォールド、例えばリポカリン、ＦＮ３、ユビキチン、γ−Ｂ−クリスタリン等を含む種々の結合タンパク質のディスプレイ及び選択のためのプラットフォームとして用いることができる。
【０１５１】
ファージディスプレイと併用するペプチドスクリーニング
従来のファージディスプレイは、フィラメント状ファージの表面に結合したスクリーニングされたポリペプチドとともに、一般的に１又は数種の複製だけで、標的分子への親和性に平行して大多数のクローンのスクリーニングを可能としている。しかしながら、低い又は中程度の親和性のクローンのバックグラウンドは高いし、特有のクローンは、サブクローン及びシークエンシングなしで区別することはできない。そして、独特の各クローンの特性（例えば、発現レベル、溶解性及び親和性）の決定は、通常、発現の形式に変化が必要である。このため、先行技術の方法では、実質的作業量は、初期のファージディスプレイスクリーンの下流に位置する。
【０１５２】
一方、本発明の方法は、ＦＡＣＳを用いてグラム陰性細菌細胞の内部のポリペプチド又はグラム陰性細菌細胞内のポリペプチド、又はグラム陰性細菌細胞に結合するポリペプチドを特定する。ＦＡＣＳは、結合パラメータを高く増強された所望の特性を持つクローンにするように定義づける。しかしながら、個々のクローンのスクリーニングは、順次的であり、１つのスクリーンで進行してもよい個々の個体数に多少の上限下限があるが、１秒あたり１０4クローンのソート率でさえある。例えば２時間で１０8クローンを処理することができる。
【０１５３】
このため、ある状況においては、本発明で提供されるように、ＦＡＣＳで分析する細胞ディスプレイの複製の特徴を従来のファージディスプレイシステムの平行スクリーニングと組合せることが望ましいこともある。それ故、初期のスクリーンは、従来のファージディスプレイで実行し、続いて、ポリペプチドが、細菌細胞内、及び／又は、細胞壁に結合して、あるいは、カプセル化された溶菌-欠損ファージに結合して保持される本発明のディスプレイシステムによって出力クローンを分析する。
【０１５４】
このため、遺伝子ライブラリーは、ファージタンパク質への溶解を用いて、又は本明細書に記述されるような２つのポリペプチドの安定結合を通じて、溶菌ファージ又はフィラメント状ファージの表面に発現され、ディスプレイされることもある。これらのファージは、バクテリオファージの標準的技術を（取り出す）用いるフィラメント状のファージの活性に対してスクリーンされることもある。標的分子（例えば親和性基質）に付着する溶融タンパク質をディスプレイするファージは、プロファージ溶原菌を含むヘルパー種への感化によるコスミドのように、産出され、正常な状態に戻り得る。このサイクルは、ライブラリーが増強クローンに支配されるまで繰り返され得る。この時点で、ライブラリーは、本発明の方法によるカプセル化したディスプレイを実行するベクターシステムにサブクローンされ得る。
【０１５５】
したがって、本発明の一実施形態において、追加のスクリーニング工程は、本発明のスクリーニングの方法の前、及び／又は、後に実行される。上記で概要を述べたように、追加のスクリーニングは、従来のファージシステム、つまり、以下のファージシステムを含む。ｉ）所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドが溶菌-欠損ファージにパッケージされていない、及び／又は、ｉｉ）ポリペプチドが細菌細胞壁によって細菌細胞の内部に、及び／又は、細菌細胞壁に付着して、保持されていない。このような追加のスクリーニングは、溶融ラムダファージ又はフィラメント状Ｍ１３ファージを用いるような、ファージディスプレイの公知の方法に含んでもよい。
【０１５６】
本発明の別の実施形態において、従来のファージディスプレイの方法は、増強したライブラリーのＤＮＡをサブクローニングせずに、２つの形式のタンパク質ディスプレイの間で機敏に切り替えることを可能にするために、溶菌-欠損ファージ及びカプセル化した細胞のディスプレイを用いることを組合せてもよい。
【０１５７】
この実施形態において、ディスプレイされたタンパク質は、溶菌-欠損バクテリオファージ若しくはファージミドにクローンされたポリヌクレオチド、又は、プロファージによってパッケージ可能なコスミドにクローンされたポリヌクレオチドによって、ファージカプシドに溶融するようにコード化されてもよい。ラムダベクターのようなカプシドディスプレイのバクテリオファージベクターの構成方法は、Mikawa et al (1996)、Sternberg and Hoess (1955) 及びVaccaro et al. (2006)に記載されている。プラスミドベクター及びコスミドベクターの構成方法は、従来公知でもある。例えば、ｐＵＣ及びｐＢＲ３２２複製起点に基づくファージミドベクターはそれぞれ、Yankovsky et al. (1989)及び King et al. (1982)に記載されていた。ラムダコスミドに関するSambrook and Russell (2001)及びＰ２／Ｐ４／１８６コスミドに関するKahn et al. (1991)はいずれも、ベクターの優れた一般的記述及び詳細の記述を提供している。コスミドは、溶菌-欠損プロファージを含む細菌細胞株に移送され、カプシド溶融タンパク質の発現及びコスミドベクターのパッケージングの両方を誘導されるだろう。
【０１５８】
あるいは、溶菌-欠損バクテリオファージベクターは、宿主細胞に移送／感化され、同様に、カプシド溶融タンパク質及びバクテリオファージベクターゲノムの発現を誘発する。
【０１５９】
バクテリオファージ／コスミドベクターのパッケージングの後に、細胞は、洗剤又はクロロホルムのような有機溶媒と、Ready-Lyse (Epicentre)として商業的に使用可能な酵素リゾチーム活性とを用いた透過処理工程の複合処理によってパッケージされたファージを開放するように溶融してもよい。ディスプレイライブラリは、ファージディスプレイ選択に一般に用いる方法で標的に結合するために「取出」してもよい。取出の後に、ライブラリは、溶菌-欠損プロファージを含む細菌宿主への再感化により回復する。取出と再感化のサイクルは、結合ファージのライブラリ個体群が実質的に増強されるまで繰り返し私用されてもよい。そのファージ産出の次のサイクルの時点で、細胞が透過処理されるが、酵素溶融工程は除外され、このため、カプセル化したファージのサブライブラリを産出する。蛍光誘導体化表示された標的は、実施例２３に記載され、図２５で観察されるように、これらのカプセル化したファージに結合してもよく、そしてそのカプセル化したファージは、ＦＡＣＳによって分類されてもよい。
【０１６０】
当業者は、この実施形態がディスプレイの異なる２形態の間を動くディスプレイライブラリを提供することを理解するだろう。この２形態とは、１）低度の複製選択性で高平行なスクリーンである固定化した標的へのフリーファージの取出、及び、２）高い選択性である一方、低処理のスクリーンであるカプセル化個々のクローンのＦＡＣＳ特性及び精製である。このため、本発明の方法のこの実施形態は、本発明でない限り必要とされる再編成のためのユーザーが不在でも、各システムの最も強力な要素を用いることができるようにする。それ故、このような実施形態は、ロボットのように高処理な作業流れを簡単に受け入れる。
【０１６１】
本発明の方法の別の実施形態において、可溶性の抗体は、本発明の方法によるファージディスプレイとグラム陰性細菌細胞のディスプレイの間の切替を可能とする遺伝子ライブラリでスカフォールドとして特定され、使用されてもよい。
【０１６２】
酵素ディスプレイ
本発明の方法は、酵素及び酵素ライブラリーのディスプレイのため、そして酵素特性の発生のために用いることができる。このため、一実施形態において、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドは酵素であり、標的分子は酵素基質であり、所望の活性は標的分子に対する結合及び／又は標的分子の酵素修飾である。当業者は、他の表面ディスプレイ技術を用いる酵素活性に関する試験を開発するための方法を、本発明の方法に対する分析と同等に適用することができることを理解するであろう。
【０１６３】
本発明の方法は、透過処理され、次いで水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンとして懸濁された宿主細胞において発現された酵素ライブラリーの使用にも好適である。Aharoni et al. (2005)は、パラキソナーゼの改善のためにＦＡＣＳによりｗ／ｏ／ｗエマルジョン中で表面ディスプレイされた酵素ライブラリをを使用することの有用性を示した。非透過性油膜中に封入することの利点は、拡散性基質及び生成物を酵素活性及びコーディング核酸配列の近くに保持できることである。しかし、Aharoni et al. (2005)により記載されているスクリーンは、酵素が宿主細胞の外部でディスプレイされることを必要とする。本発明の方法を使用して、酵素ライブラリーの細胞内発現及び重畳を酵素機能における改善のために用いることができた。
【０１６４】
本発明の方法において、酵素を産生するために、酵素をコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養する。細菌細胞の透過処理後に、細胞を酵素の基質と接触させ、公知方法を用いて、酵素が基質を修飾するかどうか、及び／又は基質の酵素修飾率を測定することができる。
【０１６５】
数例において、標的分子（例えば酵素基質）を細菌細胞と結合させることが望ましい場合がある。当業者は、標的分子を透過処理された細菌細胞の任意の成分に、直接的又は間接的のいずれかで結合させることができることを理解するであろう。直接結合は、非限定的例として、標的分子を細菌細胞壁と結合させることにより達成することができる。標的分子の間接的結合は、標的分子を、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドと結合している第２ポリペプチドと結合してタンパク質複合体を形成することによって達成することができる。例えば、標的分子を、透過処理された細菌細胞の内部にタンパク質複合体を保持するために十分な分子サイズを有するポリペプチドと結合させることができるか、又はＤＮＡ結合タンパク質と、若しくは本発明の方法で用いられるような細菌細胞壁結合タンパク質と結合させることができる。標的分子を細菌細胞と結合させることにより、有利には、例えばＦＡＣＳ又は磁気ビーズ選択によるなどの技術を使用して、活性酵素を提示する細菌細胞の単離が可能になる。
【０１６６】
当業者は、標的分子を細菌細胞と結合させるために好適なカップリング化学を容易に決定することができるであろう。好適なカップリング化学としては、アクリダイト及びマレイミドなどのチオールカップリング試薬でのシステイン標識、アミン標識、並びにカルボキシル標識が挙げられ、これらはＰｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含む供給元から市販されている。
【０１６７】
フローサイトメトリー分析
本発明の細胞ディスプレイ技術は、関心対象のポリペプチドの数千もの分子を一度に提示することができ、リボソーム／ｍＲＮＡディスプレイ又はファージディスプレイ等の分子ディスプレイ技術と異なり、フローサイトメトリー技術を用いて、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）機械を用いてスクリーニングすることができる。ライブラリーにおける陽性事象を捉えることができるだけでなく、酵素活性又は親和性などのパラメーターを各陽性メンバーについて同時に定義することができ、これによりスクリーンのアウトプットを改善することができる。フローサイトメトリーを実施するための機器は当該技術分野で公知であり、ＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｅｐｉｃｓ Ｃ、並びにＭｏＦｌｏが挙げられる。フローサイトメトリー技術は、一般的に、液体試料中の細胞の分離を含む。典型的には、ＦＡＣＳの目的は、１以上の特性、例えば、標的分子の存在について細胞を分析することである。フローサイトメトリー分析を実施するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、酵素活性を分析するためのＦＡＣＳの使用法の概説は、Farinas(2006)により記載されている。
【０１６８】
本発明に関して、フローサイトメトリーは、連続して実施できる複数回のスクリーニングに有用である。細胞を初回の分類から単離することができ、直ちにフローサイトメーターに再導入し、再度スクリーニングして、スクリーンのストリンジェンシーを改善することができる。フローサイトメトリーは、本質的に粒子分類技術であるので、細胞を培養する能力は必要ではない。無生育性細胞から核酸を回収するための技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＲを含むテンプレート依存性増幅技術を挙げられる。
【０１６９】
所望の活性を有するポリペプチドを生成するグラム陰性細菌細胞を同定した後、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むＤＮＡを、任意の好適な公知技術を用いて細菌細胞から単離してもよい。このため、通常の手順を使用して、ポリペプチドをコード化するＤＮＡを単離し、配列決定してもよい。必要に応じて、ポリヌクレオチドは、所望の活性に対してスクリーニングされる変異体の別のライブラリーを生成するために、もう１ラウンドの多様化を実行してもよい。このようにして、ポリペプチドの所望の活性を最適化するために反復プロセスを使用することができる。
【０１７０】
ポリヌクレオチドが溶菌-欠損ファージによってパッケージされる実施形態において、所望の活性を有するライブラリーのポリペプチド部をコード化するポリヌクレオチドは、リゾチーム（例えば、Ready-Lyse (Epicentre)）で細胞壁を透過処理する処理によって、細胞壁を劣化させて、次の感化のファージを放出し、さらなる反復増強のため、又は、パッケージされたファージライブラリ又はコスミドライブラリの回復による複製の分析のため、post-ＦＡＣＳスクリーンから簡単に迅速に回復されてもよい。
【０１７１】
このため、本発明の本実施形態は、ファージパッケージ遺伝子ライブラリを容易に回復し、操作できるとともに、発現の共通特性及びＦＡＣＳスクリーニングとの結合パラメーターを考慮している。それ故、溶菌-欠損ファージライブラリーを用いるＦＡＣＳスクリーニングの反復ラウンドは、単純化されており、付随性突然変異エラー及び必要な操作の両方とともに陽性クローンのＰＣＲ増幅に依存していない。
【０１７２】
溶菌-欠損ファージを用いた遺伝子ライブラリーのパッケージング
本発明者らは、誘導可能な溶菌-欠損プロファージを用いることが、グラム陰性細胞中の遺伝子ライブラリーを高効率に複製し、パッケージングすることが可能となることを発見した。誘導可能なプロファージは、グラム陰性細菌細胞のゲノムに存在するプロファージであり、プロファージが細菌細胞中でファージとして活性化されるようにプロファージの活性を誘導する。そして、細胞中のファージは、ポリヌクレオチドをパッケージすることができてもよい。
【０１７３】
本発明の方法をディスプレイすることによってスクリーンされたタンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、溶解状態を有するファージ、あるいは溶菌-欠損ファージにパッケージされてもよい。溶解性及び溶原性ファージゲノムは、一般的にライフサイクルに欠失可能領域を有しており、複製遺伝子及び関連する調節領域で置換されてもよい。欠失可能領域は、ＤＮＡ再結合（例えば、ラムダバクテリオファージベット、及び外来性細胞及びＮｉｎ５領域）に関する遺伝子を含む領域、又は溶原菌（例えば、ラムダファージＥａ４７、Ｅａ３１、Ｅａ５９、ロム、及びbor遺伝子：旧Ｐ２ファージ、及びFun遺伝子）への宿主細胞生存機能を提供する領域を含んでいてもよい。あるいは、通常よりも部分的に大型のゲノムのパッケージングの許容範囲（例えば、ラムダバクテリオファージが野生型長４８．５ｋｂの１０５％以上にパッケージする）があってもよい。その許容範囲により、重要でない領域、例えば、Ｔ７選択ファージディスプレイシステム（Novagen）の置換なしで、ゲノムに直接に短領域を複製することができる。遺伝子ライブラリーが溶菌-欠損バクテリオファージベクターに複製されると、溶菌遺伝子も欠失可能領域を表す。
【０１７４】
もし可能なら、所望の活性に対してスクリーニングされるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、バクテリオファージの必須のオペロンの転写及び翻訳を中断させないように、ファージゲノムの領域に複製すべきである。このため、当業者は、ポリヌクレオチド自身の転写調節領域（例えば、そのプロモーター及び／又はターミネーター）を用いてポリヌクレオチドを発現してもよいことを理解するだろう。
【０１７５】
所望の活性に対してスクリーンされるポリペプチドの遺伝子ライブラリーもまた、伝染性ファージ粒子としてプラスミドをパッケージするヘルパーファージを指示する成分を用いて構成されていてもよい。例えばバクテリオファージ、ラムダ、Ｐ２、Ｐ４及び他のラムダ型のファージのcos領域が＜５００ｂｐの成分であり、その成分は、ターミナーゼ酵素のための結合部分及び卵割部分を有する。そのターミナーゼ酵素は、これらの領域を含むプラスミドをファージカプシドヘッド内の線素としてパッケージする。これらのcos領域は、従来技術でコスミドとして言及されるプラスミドに複製され得る。一般に、コスミドのサイズは、野生型ゲノムのサイズに近く、通常、野生型ファージゲノムの８０から１０５％以内で効率的にパッケージされる。あるいは、コスミドのサイズは、単一ファージヘッド内でパッケージされるコスミドのマルチマーと野生型ゲノムの単位分数（１／２、１／３、１／４）であってもよい。マルチマーは、recA+細胞内のコスミドの間での再結合によって細胞内で形成されてもよいし、バクテリオファージの複製サイクル（つまり、ラムダバクテリオファージによるローリングサークル複製）の中で形成されてもよい。
【０１７６】
Ｐ２ファージ、又は関連する１８６ファージ若しくは１８６及びＰ２のハイブリッド、及びその付随体、Ｐ４は、プラスミドに基づくクローン技術（〜１１ｋｂ）を有利に提供するし、Ｐ２ターミナーゼタンパク質は、ラムダターミナーゼが好ましいような、隣接cos領域との線状マルチマーよりもむしろ、単一cos領域を含むプラスミド基質をパッケージすることが好ましい。このため、コスミドライブラリーは、生体内で高効率にパッケージされ、簡単に構成され得る。Ｐ２ファージを用いた遺伝子ライブラリーのパッケージングの方法は、Kahn et al. (1991)に記述されている。
【０１７７】
溶解バクテリオファージを用いたファージライブラリー（例えば、Ｔ７選択）は、生体内での宿主細胞の感化に基づいてパッケージされてもよい。ファージが溶菌-欠損である場合、本発明の方法で透過処理され、スクリーンされるまで無傷のままである。そして、伝染性のファージは、ペプチドリカンを劣化させ、ファージ粒子を放出するリゾチームとの処理によって、選択した細胞から回復されてもよい。
【０１７８】
溶原性バクテリオファージ又はそのコスミドを用いて作製されるファージライブラリーは、ファージを産出するために、及び、溶菌経路に入るために、合成プロファージの活性を誘導することによって、又は、ヘルパーファージを感化することによって、生体内でパッケージされる。プロファージの誘導は、一般にファージ免疫リプレッサータンパク質の温度感性突然変異体を用いて達成される。ライブラリーは、宿主細胞内に低温で形成されてもよく、そして、パッケージングするバクテリオファージは、上向きの温度変化によって誘導される。例えば、ラムダファージのリプレッサー遺伝子のｃＩ８５７対立遺伝子は、３０℃での溶原性の作製及び維持をサポートするが、３７℃よりも高い温度では、プロファージを切除し、溶菌経路に入らせるので不活性である。しかしながら、非誘導性のファージとして公知のＰ２ファージは、ＵＶ又は温度感性リプレッサーのような標準的方法で誘導されることができない。一方、Ｐ２機能は、活性化Ｐ２の代わりに、Ｐ４付随体、特にＰ２／Ｐ４共溶原菌の作製を阻むvir変位株、の感化を用いることにより、コスミドパッケージングのヘルパーファージとして誘導させることができる。しかしながら、Ｐ２関連ファージ、１８６は、ファージ複製及び不活性化のパッケージングを誘導し得る温度感性リプレッサーｃＩｔｓを有していない(Woods and Egan (1974))。さらに、Ｐ２及び１８６のハイブリッドファージは、Ｐ２構造遺伝子とファージ１８６の温度によって誘発された複製制御を含む重感染によって得られた。このようなファージの１つは、Ｈｙ５として公知である(Younghusband et al., 1975)。
【０１７９】
Ｐ２溶菌経路を制限するＰ２及びＰ４の要素は、クローンされて、溶菌を始動するように誘導されてもよい。実施例１７は、溶解を誘導するための転写因子Ｐ４δ、Ｐ２cox及びＰ２ogr遺伝子、及び大腸菌株Ｐ２／Ｐ４共溶原菌でパッケージングするコスミド、の使用を詳述する。ラムダファージｃＩ８５７リプレッサーは、その内因性プロモーター及びＰ２及びＰ４転写因子の発現を制御するCro遺伝子のプロモーター及びオペレーター領域とともに使用された。δ遺伝子は、溶菌の最も急速なアクチベーターであり、ogr及びcox遺伝子がそれに続く。細胞溶菌は、伝染性のＰ４ファージ及びコスミド粒子の放出とともに生じた。
【０１８０】
Ｐ２活性化を誘導してもよい他のＰ２制御遺伝子は、全Ｐ４sid-δ-psuオペロン及びＰ４εアンチリプレッサ、又はこれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１８１】
共溶原性Ｐ４ヘルパーファージ及び／又は上述のＰ４制御領域とともにＰ２ヘルパーファージを含む細胞に移送されるコスミドライブラリーは、生体内でのＰ２活性の次の誘導でパッケージされてもよい。ファージが溶菌-欠損である場合、本発明の方法によって透過処理されスクリーンされるまで、細胞は無傷のままである。そして、ペプチドグリカンを劣化させてファージ粒子を放出するために、リゾチームで処理して選択した細胞から伝染性コスミドファージ粒子を回復してもよい。
【０１８２】
キット
本発明の方法の実施に必要な成分は、キットの形態で好適に提供することができる。当業者に理解されるように、キット中の種々の成分は、個々の容器中若しくはアリコートで供給することができるか、又は溶液成分を異なる組み合わせ、異なる濃度で組み合わせて、本発明の方法の最適な実施を達成することができる。使用するまで成分が安定な形態で維持されるように、キットのどの成分を組み合わせることができるかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。
【０１８３】
一実施形態において、本発明のキットは、典型的には、最低でも第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクター中に挿入するための部位、及び第１ポリペプチドと結合して、透過処理された細菌細胞の細胞壁の内部に保持されるか又は細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームを含むベクターを含む。キットは、細菌細胞を透過処理するための薬剤も含むことが好ましい。一実施形態において、キットは、細菌細胞、好ましくはグラム陰性細菌細胞をさらに含む。他のさらなる成分がキットとともに含まれていてもよいか、又は所望により他の成分を最終使用者が提供してもよい。
【０１８４】
本発明は、所望の活性に対してタンパク質をスクリーニングする方法であって、溶菌-欠損ファージを用いた方法の使用に適したキットをも提供する。このようなキットは、温度感性ファージリプレッサタンパク質、及び／又は、１以上のファージアクチベータ・タンパク質をコード化するポリペプチドとともに、最低でも、溶菌-欠損ファージを含むグラム陰性細菌を一般的に含む。一実施形態において、キットは、Ｐ２、１８６、Ｈｙ５、及び／又はＰ４から選択される溶菌-欠損ファージを含む。別の実施形態において、キットは、溶菌-欠損ラムダファージを含む。キットは、グラム陰性細菌細胞を透過処理するための添加剤を任意に含んでいてもよい。
【実施例】
【０１８５】
実施例１．大腸菌を透過性にする界面活性剤のスクリーニング
大腸菌細胞を透過処理する添加剤を同定するため、イオン性（ｎ−ドデシル−β−イミノジプロピオン酸；デシルトリメチルアンモニウムクロライド；ドデカノイルサルコシンナトリウム；アンゼルゲント３−１０）、及び非イオン性（ジメチルオクチルホスフィンオキシド［Ａｐｏ８］；ジメチルデシルホスフィンオキシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド［８ＴＧＰ］；スクロースモノドデカノアート；Ｍｅｇａ１０；Ｔｗｅｅｎ８０；ＴｒｉｔｏｎＸ１００；ＴｒｉｔｏｎＸ１１４）の両方の多くの界面活性剤を、膜−不透過性色素、ゲルレッド（Ｇｅｌ Ｒｅｄ）（Ｂｉｏｔｉｕｍ社、カタログ番号４１００２）の取り込み、及びＧＦＰの遊離の両方によってスクリーニングした。透過処理のテストを行った界面活性剤は、Ａｎａｔｒａｃｅから購入した。
【０１８６】
ここに述べる実験に用いた大腸菌宿主株は、全てＫ１２由来のＡｒｇｅｎｔｕｍ細胞株（ΔｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）ΔｅｎｄＡ ｌａｃＺΔＭ１５）（Ａｌｃｈｅｍｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）であった。しかしながら、本発明の方法は、Ｂ株由来のＢＬ２１（Ｆ−ｄｃｍ ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ）、及びＫ１２クローン株ＤＨ５α（Ｆ−ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ−１ ｒｅｃＡ１ ｒｅｌＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｄｅｏＲ ｎｕｐＧ Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｈｓｄＲ１７（ｒK-ｍK+），λ−）を用いてもテストを行い、同様な結果を得た。
【０１８７】
ＧＦＰを、アラビノース誘導性の高コピー数ベクター（ｐＡｒａ１：：ＧＦＰ５）にクローン化した。発現は、新たに画線したコロニーを含むシャーレから重度に播種した培養液より行った。培養液は、３７°Ｃで、アラビノースを最終濃度０．２％になるまで添加して発現を誘導するときに、ＯＤ６００が約０．３となるまで培養した。誘導培養液は、収穫まで２５°Ｃで２時間振盪した。
【０１８８】
１ｍＬの誘導培養液を遠心分離して細胞を沈殿させ、３００μＬの０．５％界面活性剤含有ＬＢ中に懸濁して透過性にした後、２５°Ｃで１０分間培養した。透過性にした細胞は、沈澱させ、再懸濁し１ｘゲルレッド（Ｇｅｌ Ｒｅｄ）を含む水に再懸濁し２分間置き、その後沈澱させ３００μＬのＴＢＳで１度洗浄した。細胞は、３００μＬのＴＢＳに懸濁し、蛍光顕微鏡検査のために、ＤＡＢＣＯ／グリセリン（０．０３２５ｇのＤＡＢＣＯを９００μＬのグリセリン＋１００μＬのＰＢＳ中に溶解）を加えて処理した。
【０１８９】
サンプルは、スライド式カメラ（ＳＰＯＴ ＲＴ ２．３．０ソフトウェアｖ４．６）を用いたオリンパスＰｒｏｖｉｓ ＡＸ７０光学顕微鏡、又はＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２共焦点レーザ走査顕微鏡／Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＥ２倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ共焦点ソフトウェアｖ２．０）のいずれかにより可視化した。
【０１９０】
図１は、界面活性剤によるＧＦＰ発現大腸菌の透過処理の結果を示す。未処理細胞は、緑色（ＧＦＰ）であるが、透過処理した細胞は、内部のＧＦＰを失い、ＤＮＡ結合性ゲルレッド（Ｇｅｌ Ｒｅｄ）色素を取り込み赤色に染色される。また、ノニデット−４０もいくらか透過処理を示すが、Ａｐｏ８とＭｅｇａ１０は、より高い割合の透過処理された細胞を示す。これら２種の界面活性剤の０．５％ずつの混合物は、活性剤８６と呼ばれ、別の界面活性剤ｎ-オクチル−β−Ｄ-チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）と同様に、ほとんど完全に透過処理することを示した。Ｍｅｇａ１０、Ａｐｏ８及び８ＴＧＰはいずれも非イオン性界面活性剤で、イオン性界面活性剤と比べ、タンパク質の重畳や機能に対し、破壊の程度が低い。
【０１９１】
細胞壁は、透過処理によっても無傷だったので、上述した界面活性剤での透過処理による上澄みの可溶性タンパク質の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。透過処理した細胞に、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社；８３７ ０５９）を最終濃度２ｍｇ／ｍＬまで、透過処理している細胞のサンプルに加え、細胞壁を除去し、全細胞タンパク質を遊離させた。β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング色素を、９５°Ｃで２分間変性したサンプルに加えた。２０μＬのサンプルを９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、クーマシー・ブリリアント・ブルー／メタノール／酢酸で染色／固定した。
【０１９２】
図２は、可溶性タンパク質の遊離は、顕微鏡検査で見られたＧＦＰの遊離及びＧｅｌ Ｒｅｄの取り込みと直接的に関連していることを示す。無傷な細胞壁を有する細胞からのタンパク質の遊離と、リゾチームを用いて細胞壁を除去した細胞からのそれとの間には、明白な差があったが、細胞壁に被包された細胞が遊離する可溶性タンパク質は、大きさが約１２０ｋＤまでであった。これは、球状タンパク質が、グラム陰性真正細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカン格子の細孔を通って、細胞から出ることができなくなる限界寸法であると思われる。
【０１９３】
実施例２．宿主ＤＮＡを保持する透過処理溶液のスクリーニング
本発明の方法を、改良した特性のタンパク質変異体を求めて遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに使用する場合、発現されるタンパク質と、それをコードする核酸との間に関連がなければならない。膜の透過処理工程で、ＤＮＡが、細胞壁を通って失われるのを防ぐ障壁が除去されるので、宿主ＤＮＡの損失を減少し、あるいは防止しうる、透過処理の条件を調べた。
【０１９４】
０．５％８ＴＧＰを用いて異なる培地中で細胞の透過処理を行い、ＤＮＡ結合色素、Ｇｅｌ Ｒｅｄを用いて、ＤＮＡの損失を蛍光顕微鏡検査法により調べた。
【０１９５】
テストした透過処理培地（全培地に０．５％８ＴＧＰを含む）の組成
ＬＢ培地（１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）
ＬＢ（塩）培地（１０ｇトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物）
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５
５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０
１７０ｍＭ−ＮａＣｌ
２５０ｍＭ−ＮａＣｌ
２５ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋１．５％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋３％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋１７０ｍＭ−ＮａＣｌ
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋２５０ｍＭ−ＮａＣｌ
【０１９６】
好適な透過処理培地は、ＬＢ細菌培地と確認された。したがって、以降、透過処理は、０．５％８ＴＧＰを含むＬＢ又は剤８６を含むＬＢ（０．５％Ｍｅｇａ１０及び０．５％Ａｐｏ８を含むＬＢ）のいずれかを用いて行った。
【０１９７】
実施例３．タンパク質のテトラマー骨格への融合
実施例１に記述した実験に示されるように、約１２０ｋＤより大きいタンパク質は、透過性にした大腸菌細胞の内部に細胞壁により保持された。したがって、１２０ｋＤより小さい所望のタンパク質も、タンパク質パ−トナーと融合することで合計寸法が１２０ｋＤを超えるようにできれば、細胞壁カプセル中に保持されるだろうと考えられた。
【０１９８】
このため、融合パートナーとして用いるため、大腸菌から６種の異なる四量体タンパク質をクローン化した。すなわち、β−ｇａｌ、ＢｅｔＢ、Ｇ５Ｋ、ＧｓｈＢ、ＲｈｎＡ、及びＹｄｃＷで、それぞれのモノマー寸法は１１６ｋＤ、５２ｋＤ、３９ｋＤ、３５ｋＤ、４７ｋＤ及び５０ｋＤであった。
【０１９９】
アラビノース誘導性高複製数ベクターを、四量体発現のために構築した。蛍光性基質と共有結合で結合する２０ｋＤ領域であるＳＮＡＰタグ（ＮＥＢ社／Ｃｏｖａｌｙｓ）が、テトラマー遺伝子の上流にクローン化され、発現レポーターとして使用された。精製と検知を容易にするため、６ｘＨｉｓエピトープも、融合タンパク質のＮ末端に挿入された。
【０２００】
前記アラビノースベクターｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰの配列が、SEQ ID NO:1（配列番号）として示される。
【０２０１】
融合タンパク質の発現は、０．２％アラビノースを加えて誘導し、培養液を２５°Ｃで２時間培養した。
【０２０２】
本発明の方法により、蛋白質ディスプレイのために細胞を透過性にするプロトコルは、以下のとおりであった：
１．遠心分離により細胞１ｍＬを沈澱させる。
２．３００μＬの０．５％８ＴＧＰ／ＬＢに細胞を再懸濁する。
３．２５°Ｃで１０分間培養する。
４．遠心分離により細胞を沈澱させる。
５．２００μＬのＴＢＳ又はＬＢに細胞を再懸濁する。
【０２０３】
ＳＮＡＰ発現レポーター領域を、膜不透過性ＳＮＡＰ色素（Ｃｏｖａｌｙｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で標識付けするプロトコルは、以下の通りであった：
１．２０ｎｍｏｌのＢＧ−４８８（緑色色素）又はＢＧ−５４７（赤色色素）を、３００μＬのＤＭＳＯに２００ｘ原液として溶解する。
２．１μＬの２００ｘ原液を２００μＬの透過性にした細胞を懸濁したＴＢＳ又はＬＢに加える。
３．２５°Ｃで１５分間培養する。
４．遠心分離により沈澱させ、また３００μＬのＴＢＳに再懸濁させて、細胞を２度洗浄する。
【０２０４】
四量体融合タンパク質が、透過性にした細胞カプセル中に保持されるのを蛍光顕微鏡検査法により観察するプロトコルは、以下の通りであった：
１．２０μＬの細胞懸濁液を顕微鏡用スライドガラス上に滴下し、カバーガラスで覆い、端部をマニキュア液でシールする（湿式プレパラート）；あるいは細胞の液滴をほぼ乾燥させて、その上に２０μＬのＤＡＢＣＯ／グリセリンを滴下し、カバーガラスで覆い、端部をマニキュア液でシールする（乾式プレパラート）。
２．オリンパス又はＬｅｉｃａ蛍光顕微鏡のいずれかを用いて可視化する。
【０２０５】
完全長融合タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに掛けてから、タンパク質抽出物のウェスタンブロット法でα−Ｈｉｓ６抗体をプローブに用い確認した。全ての四量体コンストラクトは、大腸菌中で検知可能なレベルで発現した（図３Ａ）。
【０２０６】
大腸菌内で発現した四量体融合タンパク質の蛍光顕微鏡検査によれば、β−ｇａｌ及びＧ５Ｋは、顕著な封入体を含み、恐らく前記融合タンパク質の折りたたみが困難であるために、蛍光レベルが低いことが分かった。しかしながら、図４によれば、ＳＮＡＰ蛍光により判定されるとおり、前記融合タンパク質の発現は、ＧｓｈＢでは良好、ＲｈｎＡ、ＢｅｔＢ及びＹｄｃＷでは、極めて良好であった。透過性にした宿主細胞中の融合タンパク質の分布は、明視野顕微鏡検査及び蛍光の両方から明らかなように複数のフォーカスを有し、均一でないことが注目された。しかし、蛍光性ＳＮＡＰ基質は、ミスフォールドされた領域には結合されていないであろうし、かつ信号が非常に強いことから、これらの物体は恐らく折り畳まれたタンパク質の凝集体であって、大腸菌中で過剰発現しているタンパク質においてしばしばみられる、折り畳まれていないタンパク質の封入体ではないと考えられる。
【０２０７】
ＳＮＡＰ：：テトラマー融合体は、Ｈｉｓ６-Ｎ末端エピトープをまた有していた。抗体といった大きな分子が、大腸菌細胞壁の格子構造を通り抜けられるかを調べるため、透過性にした細胞にＳＮＡＰ：：テトラマー融合体を検出するαＨｉｓ抗体をプローブとして設けた。
【０２０８】
１．前記Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢ骨格融合体の発現及び透過処理を上述のように実施した。
２．ＢＧ−５４７ ＳＮＡＰリガンドによる標識化を上述のように実施した。
３．２００μＬの透過性にしたＳＮＡＰ−標識化細胞をＬＢ中で３回洗浄し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）コートしたカバーガラス上に沈降させた。過剰な細胞培地を、吸引して除去し、前記スライドガラスを風乾させた。
４．細胞を、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、１％冷水魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社、Ｇ７７６５）、アジドの０．０２％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液）中で、１時間ブロックした。
５．細胞を、ブロッキング緩衝液で１：１０に希釈したαＨｉｓ一次抗体（Ａｂｃａｍ社、ＡＢ９１３６−１００）中で、一晩２５°Ｃで培養した。
６．細胞を３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した（各回１０分間）。
７．細胞を、ブロッキング緩衝液で１：２，０００に希釈した二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０１５）中、室温１時間培養した。
８．細胞を３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した。
９．ＤＡＢＣＯ／グリセリンを封入剤に用い、共焦点オリンパス顕微鏡で観察した。
【０２０９】
図５は、αＨｉｓ抗体が細胞壁カプセルの内部でＳＮＡＰ蛍光性リガンドと共存しており、細胞壁の細孔が、比較的大きなタンパク質が、カプセル内部空間中に拡散を許すのに十分な大きさであることを表わしている。このように、非常に大きなタンパク質リガンドも、本発明の方法により、細胞質中で発現する親和性タンパク質のための親和性基質として使用できる。
【０２１０】
細胞下物体の生成が変化するか否かを見るためにＳＮＡＰ融合パートナー及び発現レポーターをＨＡＬＯタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と比較した。前記ＨＡＬＯタンパク質は、ＳＮＡＰと同様に膜不透過性蛍光性基質（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８；Ｇ１００１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）と共有結合で結合する。ＨＡＬＯレポーター遺伝子は、四量体発現コンストラクト中のＳＮＡＰ遺伝子の位置にインフレームに直接クローン化した。ＨＡＬＯ：：四量体骨格タンパク質の発現を、ＳＮＡＰ変異体と比較した。透過性にしたＨＡＬＯ細胞の標識付けは、実質的にＳＮＡＰに対して記述したように、またメーカーの説明書に従い実施した。図６は、ＨＡＬＯ：：テトラマー及びＳＮＡＰ：：テトラマーの発現パターンは、同様であったが、例外的にＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質は、部分的にＳＮＡＰ：：ＲｈｎＡ融合体より溶解性で、複数の蛍光フォーカスを有する細胞がより少数であったことを示す。
【０２１１】
したがって、タンパク質を四量体骨格（ここでは、ＳＮＡＰ又はＨＡＬＯ）への融合体として発現させ、つづいて大腸菌宿主細胞を適当な界面活性剤で透過性にすると、目的のタンパク質が、細胞壁の内側に保持できる。
【０２１２】
実施例４．細胞骨格としてのＤＮＡ結合タンパク質
表現型を遺伝子型に結合するには、宿主細胞は、透過処理の後、また機能スクリーニングを通して、少なくともいくらかのエピソームＤＮＡを保持しなければならない。宿主ゲノムのＤＮＡならびにプラスミドＤＮＡを保持する透過処理条件を見出したことで、発現した目的のタンパク質の保持骨格としてＤＮＡが使用できると結論付けた。
【０２１３】
このため、小型（８０ａａ）の高親和性らせん−ヘアピン−らせんＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＣｏｍＥ遺伝子（Ｃｈｅｎ及びＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、２００１）からクローン化し、これをアラビノース誘導性コンストラクト（ｐＡｒａ３：：ＧＦＰ：：ＤＢＰ；ｓｅｑ２）中で、ＧＦＰのＣ末端に融合した。
【０２１４】
アラビノース誘導による発現を例１に記述したように実施した。細胞を透過性にし、例１及び３に記述したように蛍光顕微鏡検査のために調製した。
【０２１５】
図７は、ＧＦＰ：：ＤＢＰ融合体（緑色）が透過性にした細胞中に保持され、ＤＮＡ結合色素、Ｇｅｌ Ｒｅｄ（赤色）と共存したことを示す。
【０２１６】
したがって、タンパク質を、高親和性、非特異的ＤＮＡ結合タンパク質への融合体として発現させ、つづいて大腸菌宿主細胞を適当な界面活性剤で透過性にすると、目的のタンパク質が、細胞カプセルの内側に保持できる。
【０２１７】
実施例５．透過性にした細胞中へのＤＮＡ保持
ＤＮＡ、ゲノム及びエピソーム両方のプラスミドの、透過性にした細胞カプセル中への保持を実証するため、蛍光顕微鏡検査及びプラスミドＤＮＡ抽出のためにＧＦＰ５：：ＤＢＰ及びＨｉｓ６：：ｅＧＦＰを発現する細胞を調製した。
【０２１８】
誘導後、細胞を透過性にし、つづいて凍結するか、ＴＢＳ中で３７°Ｃにおいて一晩振盪した。次の日、全サンプルを、蛍光顕微鏡検査でＧＦＰ、及びＤＮＡ結合色素Ｇｅｌ ＲｅｄでカプセルＤＮＡ含量を見るために、又は、プラスミドＤＮＡ調製のために処理した。
【０２１９】
蛍光顕微鏡検査を例３に対して記述したように実施した。図８は、宿主細胞ＤＮＡ（赤色）及びＧＦＰ５：：ＤＢＰ（緑色）双方とも、細胞カプセル中に、透過処理直後も、一晩３７°Ｃで培養しても目立った減少もなく、保持されたことを示す。Ｈｉｓ６：：ＧＦＰ タンパク質は、透過処理直後に失われたが、宿主細胞ＤＮＡ（赤色）は、透過処理直後も、一晩後も、同じく目立った減少もなく、保持された。
【０２２０】
宿主ゲノムだけでなくプラスミドＤＮＡも透過性にした細胞内に保持されることを確認するため、同じように調製されたサンプルに対してプラスミド少量調製を行った。
【０２２１】
１ｍＬの界面活性剤処理又は無処理細胞から、プラスミド少量調製アルカリ溶解プロトコルによりプラスミドＤＮＡを調製した。界面活性剤抽出による上澄み中に遊離されたプラスミドＤＮＡを、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、９５５１５２０５１）コレム及び溶液を、メーカーのプロトコルに従って用いて、抽出した。
【０２２２】
各サンプルの全量を１％アガロースゲルにロードし、富士フィルム社ＬＡＳ−３０００インテリジェントダークボックス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｄａｒｋｂｏｘ）でイメージリーダー（Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ）ＬＡＳ−３０００ソフトウェア及びＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ｖ３．０ソフトウェアを使用して画像化した。
【０２２３】
図９は、両細胞株からのプラスミドＤＮＡをサンプルとした、ＴＡＥ緩衝液を用いた臭化エチジウム染色１％アガロースゲルを示す。
【０２２４】
図９のレーン１は、無処理細胞中の全プラスミドＤＮＡである。レーン２は、透過処理工程の上澄み、レーン３は、透過処理後に細胞カプセル中に保持されたプラスミドである。図８で観察された可溶性Ｈｉｓ６：：ＧＦＰ タンパク質の完全な消失に拘わらず、透過処理による上澄み中へのプラスミド遊離が殆どないことが観測された。したがって、プラスミドＤＮＡは、ほとんど完全に細胞壁により保持され、本発明の方法において改良されたタンパク質変異体の選別のために、遺伝子型を表現型に結合するために使用できる。
【０２２５】
顕微鏡検査のデータを確認するように、ＴＢＳに懸濁した透過性にした細胞の３７°Ｃでの一晩の培養後も、この培養でのプラスミドＤＮＡの消失は全く見られなかった（レーン５）。
【０２２６】
実施例６．ペプチドグリカン結合骨格
膜透過処理後も保持されるいま一つの細胞構造は、ペプチドグリカン（ＰＧ）の格子状ポリマーでなる細胞壁である。
【０２２７】
ＰＧを非共有結合で結合するために、大腸菌内で良好に発現し、細胞壁に高親和性（Ｋ＝３×１０7Ｍ-1）をもって結合することが既に知られている（Ｂｒｉｅｒｓら、２００９）、シュードモナスφＫＺファージ（ＫｚＰＧ）からの７０ａａＰＧ結合ドメインをクローン化した。親和性タンパク質の選別用に、ＰＧに対するＫｚＰＧ−結合ドメインの親和性より、より高い親和性を標的に対して有する変異体を見つけるため、骨格結合タンパク質の親和性を増す必要がある。骨格結合部分の親和性を増すため、ＣｏｍＥ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びＰＧ結合ドメインの両方を同一の融合タンパク質内で結合した。したがって、両骨格（ＰＧ又はＤＮＡ）からの融合タンパク質の最終解離定数は、それぞれの速度定数の倍数の近似値となる。
【０２２８】
このため、発現ベクターｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ（SEQ ID NO:2（配列番号２））を構築した。例１に記述したように発現を誘導し、細胞を例３に記述したように蛍光顕微鏡検査のために調製した。融合タンパク質の発現及び分布は、例３に記述したようにＳＮＡＰ標識化により観察した。
【０２２９】
蛍光は、細胞の辺縁で、細胞壁のドメインにおいて認められ、より軽度には、カプセルの細胞壁で囲まれる空間内の広汎なドメインにおいて認められた。
【０２３０】
本発明のさらなる態様では、目的のタンパク質を共有結合で、透過処理前の細胞骨格に付着させる。これを実現するため、周辺質内にコイルドコイル三量体を形成する、大腸菌に豊富なタンパク質ＬＰＰへのタンパク質融合体を用いた。その天然型においては、１端が脂質化により外膜と連結し、他端はＣ末端リジンにより共有結合で細胞壁に結合している。
【０２３１】
ＯｍｐＦ周辺質標的シグナル配列をＳＮＡＰ発現レポーターに融合し、さらにＮ末端シグナル配列を欠く５７ａａ大腸菌ＬＰＰ配列、外膜付着に必要なシステインが続く発現コンストラクトを構築した。発現ベクター、ｐＡｒａ３：：ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ（SEQ ID NO:3（配列番号））は、実施例１に記述されるようにアラビノースで誘導され、細胞を蛍光顕微鏡検査のため、実施例３に記述されるように、調製した。融合タンパク質の発現及び分布は、実施例３に記述したようにＳＮＡＰ標識化により観察した。
【０２３２】
図１０が示すように、ＬＰＰ融合タンパク質の分布は、細胞壁の表面にわたって不均一で、強い蛍光の場所と、蛍光のない場所があった。しかし、ほとんどのケースで細胞の極が、標識化された。
【０２３３】
実施例７．四量体タンパク質骨格を用いたαＧＦＰ親和性タンパク質のディスプレイ
親和性タンパク質に適用する本発明の方法を実証するため、ｅＧＦＰに対して免疫したラマから生成した単一領域抗体を細胞骨格ベクター中にクローン化した。ここに、αＧＦＰ抗体に対する特許出願に（ＷＯ２００７／０６８３１３）挙げられている２配列の内、Ｒ３５変異体のみが機能することを指摘したい（αＧＦＰ−Ｒ３５；タンパク質データベースＩＤ ３Ｋ１Ｋ）。したがって、この配列を全実験において使用した。
【０２３４】
前記αＧＦＰ−Ｒ３５遺伝子を、ｐＡｒａ３：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ四量体骨格のＮ末端融合体として、ｐＡｒａ３：：αＧＦＰ（Ｒ３５）：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡベクター（SEQ ID NO:4（配列番号））を製作するためクローン化した。
【０２３５】
前記抗体の標的基質としてＨｉｓ６：：ｅＧＦＰ融合タンパク質を製造するため、ｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰベクターも、構築した。実施例１に記述されるように、Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰタンパク質を誘導した。可溶性タンパク質が、０．５％８ＴＧＰを用いて細胞から遊離され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社；３０２３０）を用いてＩＭＡＣにより精製された。Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂からＮＴＴＷ緩衝液＋イミダゾール（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋２００ｍＭイミダゾール）に溶出された。
【０２３６】
抗体::四量体融合タンパク質の発現及び宿主細胞の透過処理は、実施例１及び３に記述されるように実施した。
【０２３７】
透過性にした細胞カプセル内で、αＧＦＰをｅＧＦＰに結合するため、カプセル沈殿物を３００μＬのｅＧＦＰ中に懸濁し、２５°Ｃで２０分間平衡化させてから、カプセルを遠心分離で沈澱させ、３００μＬのＴＢＳ中で１度洗浄した後、ＴＢＳ中に再懸濁させた。αＧＦＰ／ｅＧＦＰカプセルに対する蛍光顕微鏡検査を、実施例３に記述されるように、実施した。
【０２３８】
図１１は、ＨＡＬＯリガンド標識化した図５で観察されるフォーカスと関係があるかもしれない、より強く染色された複数のフォーカスが生じているが、透過性にしたαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質を発現しているカプセルが、細胞の全域でｅＧＦＰに結合したのを示している。
【０２３９】
したがって、ラマαＧＦＰ抗体の機能は細胞質内で発現し、さらに界面活性剤透過処理後も、カプセル内に保持される。
【０２４０】
実施例３で記述され、また図５で観察されたαＨｉｓ抗体の標識化は、すでに約１５０ｋＤと大きめなタンパク質が、透過性にした細胞壁を拡散して通り、カプセルの内部に入ることができることを実証した。しかし、未変性の抗体は、柔軟なヒンジ領域で分けられた、３つのほぼ同じ大きさの領域を有する変則的な形状のタンパク質である。したがって、これらのタンパク質の示す有効半径は、はるかに小さな球状タンパク質に相応すると思われる。しかし、βバレル構造と約２７ｋＤの分子の大きさを有するＧＦＰは、半径がその大きさに比例する、対称性のタンパク質であり、内部のαＧＦＰ抗体と結合するために、透過性にしたカプセルの細胞壁を通過することができた。
【０２４１】
したがって、本発明の方法は、大腸菌細胞質中で親和性タンパク質を発現して、少なくとも３０ｋＤの対称性の標的に結合する親和性ライブラリーのディスプレイに使用できる。
【０２４２】
実施例８．ＰＧ−及びＤＮＡ結合タンパク質骨格を用いるαＧＦＰ親和性タンパク質のディスプレイ
本発明の方法は、ＰＧ−及びＤＮＡ結合領域と融合したαＧＦＰラクダ抗体を用いてさらに実証された。
【０２４３】
抗体：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質の発現、宿主細胞の透過処理、及びＨｉｓ６：：ｅＧＦＰによる標識付けは、実施例６に記述されるように実施した。
【０２４４】
αＧＦＰ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合の画像化には、湿式及び乾式プレパラートの両方が用いられた。図１２は、ＧＦＰ蛍光において、両方の画像化法で有意な差があったことを示している。乾式プレーパラート（ＤＡＢＣＯ／グリセリン）にされた細胞は、ほとんどが内部蛍光で、明視野とｅＧＦＰ標識の間の混合があり、細胞壁の周囲の領域は内部空間より光が強くない（図１２Ｂ）。しかしながら、ＴＢＳ中で直接プレパラートにされた細胞は、細胞壁に結合したｅＧＦＰと思われる強い蛍光の外部境界のはっきりした形状と、より弱い内部信号を有していた（図１２Ａ）。理論に縛られることなく、推測するならば、ＤＡＢＣＯ／グリセリン溶媒環境は、粘度が高くまた水性でないので、ＫｚＰＧ領域とペプチドグリカン細胞壁の間の相互作用を抑止したが、αＧＦＰのｅＧＦＰとの、あるいはＤＢＰのＤＮＡとの結合は抑止しなかった。
【０２４５】
しかしながら、親和性タンパク質又は酵素のスクリーニング操作は、通常は水系環境で行われるので、親和性融合タンパク質の分布は、図１２Ａに観測された細胞壁結合湿式プレパラートに近いであろう。
【０２４６】
実施例９．細胞壁への共有結合性付着によるαＧＦＰ親和性タンパク質のディスプレイ
本発明の方法は、αＧＦＰ抗体の共有結合による細胞壁への結合によりさらに実証された。
【０２４７】
αＧＦＰ抗体は、アラビノース誘導性融合体として、ＯｍｐＦシグナル配列の下流、かつＳＮＡＰ及びＬＰＰ配列の上流にクローン化された。
【０２４８】
アラビノースで発現を誘導した後、ＯｍｐＦシグナル配列は、新生タンパク質を、内部細胞膜を通して周辺質に送り、これが膜細孔を通るときに分裂される。
【０２４９】
周辺質において、ＬＰＰ領域は、２つの別のパートナー、野生型ＬＰＰ又は他のαＧＦＰ融合タンパク質とともに、三量体コイルドコイルを形成すると思われる。ＬＰＰ領域のＣ末端の残基はリジンで、共有結合により、εアミン基を介して、恐らくはＹｂｉＳ Ｌ，Ｄ−トランスペプチダーゼにより（Ｍａｇｎｅｔら、２００７）、大腸菌細胞壁に結合する。
【０２５０】
ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質の発現、細胞透過処理、及びｅＧＦＰ標識付けは、実施例８に記述のように実施した。
【０２５１】
図１３は、ｅＧＦＰは、細胞壁の周りに不均一に、しかし強力に結合したことを示す（図１３Ｂ）。ｅＧＦＰは、ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合体をαＧＦＰ領域無しに発現している細胞に結合されなかった（図１３Ａ）。
【０２５２】
ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合体の細胞壁への共有結合性付着は、最初に、前記融合タンパク質を発現している透過性にした細胞をＳＮＡＰリガンドで標識化し、その後標識化細胞カプセルのサンプルを９５°Ｃで５分間加熱して実証した。図１４は、細胞壁を標識化するＳＮＡＰリガンドからの蛍光は、加熱処理されたサンプルと、加熱されていないコントロールとの間で差が生じなかったことを示す。Ｇｅｌ Ｒｅｄ染色でも、加熱処理されたサンプルにおいても、ゲノムＤＮＡは、細胞中に保持され続けることを実証した。
【０２５３】
実施例１０．外膜透過処理実験
本発明のさらなる態様においては、外膜は、リガンド標的、例えば酵素基質、あるいはポリペプチド等に対して選択的に透過性にしてもよいが、このとき、スクリーンされた前記ポリペプチドは、細胞壁の内部に、又はこれに付着して保持される。
【０２５４】
外膜を選択的に透過性にする条件を見出すため、一連の界面活性剤及び緩衝液を選別した。大型リガンド（ｅＧＦＰ）及び小型リガンド（Ｇｅｌ Ｒｅｄ）の両方を用いて、外／内膜の透過処理で大きな、又は小さな膜細孔が生成したかを調べた。
【０２５５】
アラビノース誘導性ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ（細胞壁に付着）又はαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ（細胞質内性）を発現する大腸菌株を培養し、実施例１に記述されるように誘導した。
【０２５６】
誘導された培養液１ｍＬを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）で１回洗浄し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）又は２５ｍＭ Ｔｒｉｓ＋２ｍＭ Ｃａ2+（ｐＨ８）のいずれかの中に０．２〜０．４％の界面活性剤をいれた透過処理緩衝液変種中に懸濁し、２５℃で１０分間培養した。
【０２５７】
透過性にした細胞は、適当な緩衝液で１回洗浄してから、Ｇｅｌ Ｒｅｄ（１ｘ水中）で染色し、ＴＢＳで洗浄した。これを、精製したＨｉｓ６：：ｅＧＦＰとともに２５℃で１時間培養し、遠心分離で沈殿させ、ＴＢＳ中に再懸濁させ、湿式プレパラートとして蛍光顕微鏡検査法により観察した。
【０２５８】
図１５及び１６は、Ｔｒｉｓ／Ｃａ2+又はＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中の０．２％のＡｐｏ８（Ａ）又はＴｗｅｅｎ２０（Ｂ）が、外膜を選択的に透過性にし、大きなリガンド（ｅＧＦＰ）に、外膜を通させるが、内膜は通させないことを実証している。より小さな、膜不透過性のＤＮＡ結合リガンドＧｅｌ Ｒｅｄは、大部分のサンプルで、細胞質まで部分的に透過性であって、いくつかの細胞において内膜にある程度の細孔形成が起きたことを示している。しかしながら、０．５％の８ＴＧＰ又は剤８６である界面活性剤で処理され、外膜及び内膜ともにｅＧＦＰに対して完全に透過性であるサンプルに比べて、Ｇｅｌ Ｒｅｄ結合の程度は著しく減少した。
【０２５９】
実施例１１．蛍光選別及び被包性ディスプレイの解析
細胞ディスプレイプラットフォームとして、リガンド結合クローンを識別するのに、本発明の方法は、蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）に非常に向いている。透過性にした大腸菌細胞のＦＡＣＳによる選別での安定性を試験するため、３群：ｉ）ｅＧＦＰ、ｉｉ）αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ、及びｉｉｉ）Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢを誘導して発現させた。
【０２６０】
ｅＧＦＰ発現細胞は、透過性にせず、無傷の大腸菌細胞での蛍光のポジティブコントロールとした。αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ発現細胞は、本発明の方法により透過性にし、ＳＮＡＰ ＢＧ−４８８リガンド（緑色）で標識付けした。Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢ発現細胞は、本発明の方法により透過性にし、ＳＮＡＰ ＢＧ−５４７リガンド（赤色）で標識付けした。
【０２６１】
細胞はＰＢＳ中に懸濁し、混合群の選別のために、ほぼ同数を混合し、あるいは信号の較正のため、別々に選別した。細胞選別は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ Ｉｎｆｌｕｘ ＦＡＣＳにより実施した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより実施した。大腸菌選別のためのパラメーターは、操作者が決定した。
【０２６２】
図１７は、蛍光により３群が識別できたことを示している。選別された群の再分析は、前記選別がそれぞれの比較的純粋な群をもたらすことを示した。グラフの低蛍光領域にある信号は、信号の内部雑音であることが後で判明したので、後に操作者により装置の修正により除去した。
【０２６３】
実施例１２．固体サポート結合のためのスペーサー領域選定
αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現している細胞を、８ＴＧＰ培地を用いて透過性にし、中間体Ｈｉｓ６−タグ化ｅＧＦＰを経由してＨｉｓＰｕｒ Ｃｏ2+セファロース・ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に結合した。細胞又はビーズは、最初に過剰のＨｉｓ６−ｅＧＦＰとともに培養し、ＴＢＳ中で洗浄し、一緒に２５℃で３０分間培養した。結合しなかった細胞は、ビーズから洗い流し、つぎに蛍光顕微鏡検査法でビーズの結合の程度を評価した。
【０２６４】
最初は、αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質のセファロース・ビーズへの結合は検知されなかった。αＧＦＰ結合領域が、細胞壁に近すぎて、セファロース樹脂上のコバルト錯化ｅＧＦＰに到達できないためと理論を立てた。このため、ランダムコドンによる１２残基ペプチド・スペーサー領域を、αＧＦＰ結合領域及びｋｚＰＧペプチドグリカン結合領域の間にクローン化した（GGT ACC gcy gcy gkk wtb gck wtb gkk gkk gck gkk gcy gcy GGT CTG（SEQ ID NO:5（配列番号）））。
【０２６５】
スペーサー変異体の小型ライブラリー（約２，０００要素）を発現し、上述のようにＣｏ2+セファロースに結合した。前記ライブラリーの一部は、ビーズに結合することが観測された。これらのクローンはＰＣＲで増幅し、再クローン化し、十余のクローンの個別の結合性を試験し、配列を調べた。種々のペプチド・スペーサーが、タンパク分解に耐性があり（αＧＦＰを高度に融合タンパク質中に保持する）、また、図１８に示されているように、界面活性剤処理細胞をセファロース・ビーズに結合できることが判明した。サポート結合に機能することが判明したスペーサー配列を表１に挙げる。
【０２６６】
表１．固体サポート結合のためのランダムリンカー（ＲＬ）スペーサー
【表１】
0006013470.tif 000002
【０２６７】
スペーサー配列の一つＲＬ６を選んで、後の結合の検討に用いた。固体サポート・マトリックスへの強い結合に寄与する他の要素を調べた。細胞のマトリックスとの培養時間、及び結合溶液の塩（ＮａＣｌ）の濃度は、両方とも結合に対してポジティブな効果を有することが分かった。培養時間３０分と、ＮａＣｌ濃度の範囲約２００ｍＭ〜５００ｍＭが、効果的であることが判明したが、３００ｍＭが最適と考えられる。結合は、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、ＭＯＰＳの３００ｍＭの塩含有緩衝溶液を含む一連の緩衝液中で効率的である。
【０２６８】
αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現している細胞を、ビオチン化ｅＧＦＰを介してストレプトアビジン磁性ナノ粒子（ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に結合する条件は、図１９に明示されるセファロース・ビーズ結合に対して求められた範囲内にあることも判明した。
【０２６９】
１２残基スペーサーに加えて、タンパク質領域をも、スペーサー領域として用いることが考えられた。ヒトのタイチン遺伝子（Ｉ２７）からの小型で安定な高度に発現した２７番目のイムノグロブリン領域をＲＬ６スペーサーの上流にクローン化した。この領域も、Ｎ末端のαＧＦＰ領域の高度かつ安定的な発現と、同時に非常に良好な固定マトリックス結合をも可能にすることが分かった（図１９）。
【０２７０】
実施例１３．被包性ディスプレイ用のマウスｓｃＦｖライブラリーの構築
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリーの細胞内ディスプレイ用の最後の領域構造は、ｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰであった。ｓｃＦｖ領域を除いた、融合タンパク質のタンパク質及びＤＮＡの配列は、SEQ ID NO:13（配列番号）及びSEQ ID NO:14（配列番号）に与えられている。このタンパク質融合体は、Ｎ末端にｓｃＦｖ、続いて２つのスペーサー領域であるＩ２７及びＲＬ６、次にペプチドグリカン結合領域のＫｚＰＧ、ＳＮＡＰレポーター領域、最後にＤＮＡ結合領域（ＤＢＰ）を有する。
【０２７１】
ランダムプライマーを用いたｃＤＮＡを、酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、マウス脾臓全ＲＮＡから製造した。このｃＤＮＡから、Ｓｃｈａｅｆｅｒら（２０１０）が記述するように、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、及びマウス抗体ファミリー配列用変性オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ｓｃＦｖ軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域を増幅した。ライブラリー・クローン化に用いたオリゴヌクレオチド・プライマーは、Ｓｃｈａｅｆｅｒらの記述したものと、Ｂｓｍ ＢＩを介して我々のライブラリー骨格ベクター（SEQ ID NO:15（配列番号））内にクローン化するのに適当な末端を有する点で相違している。ＶＬ及びＶＨ領域は、オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて加えられる。最終的ｓｃＦｖバンドは、合計６０回のＰＣＲ増幅サイクル（１回目３０回、２回目３０回）にかけられた。
【０２７２】
ライブラリー・クローン化のために、ディスプレイ・コンストラクト９００ｎｇを、ＢｓｍＢＩで切断し、メーカーの説明書にしたがいＳｕｒｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）を用い沈澱させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、同様に処理されたｓｃＦｖ生成物４００ｎｇに連結した。リガーゼを６５°Ｃ、１０分間の培養で不活性化し、連結体を大腸菌Ａｒｇｅｎｔｕｍ株（Ａｌｃｈｅｍｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中に電気穿孔で入れた。電気穿孔された細胞は、ＳＯＣ培地中に回収し、３７°Ｃで１時間培養し、プール後、７５μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２０×１５０ｍｍＬＢ寒天シャーレに拡げた。このシャーレを一晩３０°Ｃで培養した。ライブラリーの大きさは４×１０5独立クローン程度と推定された。２０クローンの内、２０クローンに予想された大きさの挿入断片が含まれていることが判明した。
【０２７３】
実施例１４．被包性ディスプレイ・マウスｓｃＦｖライブラリーのスクリーニング
ファージディスプレイ・ライブラリーから単離される一本鎖抗体は、多くの場合大腸菌中での発現が困難で、周辺質での発現レベルが低く、あるいはβシートとＩｇ群の間にジスルフィド結合形成を欠くために、細胞質中で完全に不溶性である。大腸菌細胞質中で可溶性のマウスｓｃＦｖ骨格を選別するのに被包性ディスプレイを用いることができるか否かを決定するには、ｓｃＦｖの溶解性が融合タンパク質の性質と相関しているか否かを決定する必要があった。
【０２７４】
有用な可溶性ｓｃＦｖは、凝集のレベルが低く、発現レベルが少なくとも中程度であることが予想された。これは、透過性にした細胞中のＫｚＰＧ領域を、細胞壁に結合させる（したがって、細胞中の封入体に局在しない）、かつＳＮＡＰレポーター領域の少なくとも中程度の発現を示すクローンとして、視覚的に判断できた。
【０２７５】
これらのパラメーターを選別するため、単一のコロニーを採取し、すでに実施例１に記述したようにアラビノースを用いて融合タンパク質の発現を誘導した。透過処理後、これらをＳＮＡＰリガンドで標識付けし蛍光顕微鏡検査法を用いて観察した。ライブラリー・クローンを、発現、及び、図２０に例が示されるような、ＳＮＡＰレポーターの細胞での分布に基づき、４類に分類した。
１．ＳＮＡＰの発現なし。
２．凝集した封入体中でのＳＮＡＰの中〜高程度の発現（図２０、左図）
３．細胞壁に局在してのＳＮＡＰの弱程度の発現（図２０、中央図）
４．細胞壁に局在してのＳＮＡＰの高程度の発現（図２０、右図）
【０２７６】
発現と溶解性の両方が高いクローンのみを、さらに分析した。しかしＳＮＡＰレポーターの発現の弱かったのは、大腸菌発現に最適化されなかったタンパク質の非効率な発現のためでありうるので、こうしたクローンのうちのある部分は、コドンの使用が適性化されたならば、可溶性細胞質ライブラリー・ディスプレイに対して非常に適していると判明することがあり得る。
【０２７７】
ＳＮＡＰレポーターの発現レベルが高く、透過性にした細胞の細胞壁の周りに均一に分布したクローンの配列を調べ、残りの融合タンパク質に対して正しい翻訳枠にあるｓｃＦｖ挿入断片の存在を確認した。分析した２１クローンの全てで、ｓｃＦｖ挿入断片は、全長で、正しい長さのグリシン／セリン・リンカー領域を有し、全融合タンパク質の翻訳のために正しい読み枠中にあることが判明した。このことは、本発明のスクリーニング方法は、大腸菌細胞の細胞質中で、溶解状態で発現したマウスｓｃＦｖ遺伝子を正しく識別していることを示唆した。前記ライブラリーから単離されたｓｃＦｖタンパク質が、大腸菌細胞質中で可溶であることを確認するため、これを、ライブラリー・コンストラクトから、介在性のスペーサー領域Ｉ２７−ＲＬ６又はＲＬ６のいずれかを含むＣ末端のＦＬＡＧエピトープを有するアラビノース誘導性発現ベクターにシャトルした。
【０２７８】
アラビノースによるタンパク質発現の誘導後、可溶性のｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧ又はｓｃＦｖ：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧ融合タンパク質を、０．５％８ＴＧＰで抽出した。不溶性の細胞物質は沈澱させ、β-メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に、サンプルに超音波をかけ９５℃で５分間加熱して、再懸濁した。各画分の等量ずつを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、電気泳動した。分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に移し、５％脱脂粉乳でブロックした。組換えタンパク質発現体に、１：１０００に希釈したヒツジαＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社）、つづいて、抗マウスＨＲＰ抱合二次抗体でプローブ付けを行った。化学発光を用いて検出した。
【０２７９】
図２１は、本発明の方法は、ほとんどが溶解した状態で、細菌細胞質内で発現するｓｃＦｖ遺伝子を識別することができることを明らかにしている。ウェスタンブロット法による発現プロフィールは、各サンプルで、ｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧコンストラクトについてＳＮＡＰリガンドで検知した蛍光顕微鏡検査法と一致している。
【０２８０】
実施例１５．アルジェントン株大腸菌でのＰ２溶原菌生成
アルジェントンのＰ２溶原菌（Ｋ１２；ΔｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）ΔｅｎｄＡｌａｃＺΔＭ１５）は、アルジェントン細胞のローンのＰ２の単一プラークから派生して作成された。ファージ感化は、Kahn et al. (1991)に記載されるように行なった。
【０２８１】
実施例１６．Ｐ２ ΔＹＫノックアウト
ａ．相同の再結合による生成
Ｐ２バクテリオファージは、多くの溶解性及び溶原性バクテリオファージで特定された溶解システムと同様に、理論上のホリン及び溶解システムに関する遺伝子を有する。ホリンは、内膜を通過してムレイン細胞壁を劣化するリシン酵素のペリプラスム空間に接近する。
【０２８２】
Ｐ２Ｋ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）及びＹ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）はそれぞれ、想定されるリゾチーム及びホリンをコード化する。これらの遺伝子は、Hamilton et al. (1989) に記載されるのと同様の相同的組換を用いて欠失された。隣接の相同の領域は、Ｐ２ゲノム（ジェンバック配列  NC_001895.1）から選択され、ＦＲＴ−隣接のカナマイシン選択カセット間に複製された。Ｐ２ゲノムの交換の領域は、６７２１ｂｐから７４８７ｂｐだった。
【０２８３】
標的ＹＫ遺伝子の交換の後に、Cherepanov and Wackernagel (1995)に記載されるように、ｐＣＰ２０プラスミドから発現されたＦＬＰ組換酵素によってカナマイシンカセットを除去した。その合成株は、ＯＲＦだけのものとして保持する短い２０回ペプチドとともにＹＫ遺伝子を欠失した。
【０２８４】
Ｐ４バクテリオファージとの感化によって、Ｋ１２  Ｐ２  ΔＹＫ株を機能的に試験した。Ｐ４バクテリオファージの１０３pfuで、アルジェントン（Ｐ２）及びアルジェントン（Ｐ２  ΔＹＫ）培養を感化し、上部寒天プレートに注いだ。プラークは、アルジェントン（Ｐ２  ΔＹＫ）ではなく、アルジェントン（Ｐ２）のローンに形成されるのが観察された。
【０２８５】
ｂ．Ｐ４vir1及び準備溶解を用いた試験
感化するＰ４バクテリオファージを複製し、パッケージするためのＰ２バクテリオファージＹＫ欠失（Ｐ２  ΔＹＫ）の機能性を試験するために、Ｐ４変位株のＰ４virlでＰ２ΔＹＫ株を感化した。Ｐ４変位株は、Ｐ４制御領域の転写を増やす変位株を有し、明確なプラーク表現型を有する。
【０２８６】
Ｐ２ΔＹＫ細胞は、早期のログフェーズで成長し、１ｍＭのＣａＣｌ2で補完した。Ｐ４virlバクテリオファージ１０9ｐｆｕ／ｍＬを含む溶解物上澄み１μＬを、Ｐ２ ΔＹＫ培養の１ｍＬｎｉ加えて、３７℃で８０分間培養した。懸濁液を遠心分離して細胞をペレット化して、上澄み液を廃棄し、未結合のＰ４virlを除去するために、０．０８ｍＭのＥＧＴＡ及び２．５ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＬＢ媒体で３回洗浄した。細胞は、１ｍＬのＬＢ媒体中で再懸濁し、そして３つのサンプルに分割した。１つのサンプルは、さらなる処理をせずにそのまま維持した（Sample 1：未透過処理）。サンプル２及び３は、内膜及び外膜の両方を透過処理するために、０．５％の洗剤８ＴＧｐを追加して、ペレット化して、ＬＢ中で再懸濁によってさらに処理した。そして、細胞をペレット化して、追加なしのＬＢ媒体中で２回洗浄した。透過処理及び洗浄した細胞ペレットは、ＬＢ媒体中で再懸濁した。（透過処理した）サンプル２は、さらなる処理をせずにそのままに保持した。（リゾチームで透過処理した）サンプル３は、０．５μＬのReady-Lyse (Epicentre, USA)でさらに処理した。Ready-Lyse (Epicentre, USA)は、組み換え型のリゾチームである。濁度が急速に減少したことは、ペプチドグリカン細胞壁がReady-Lyseによって劣化したこと、及びあらゆるパッケージされたＰ４virl粒子が溶解物に放出されたことを示していた。
【０２８７】
サンプル１及び２をそれぞれ１０μＬとサンプル３（未処理の溶解物の希釈）０．１μＬを、１ｍＭのＣａＣｌ2を追加した未使用のＫ１２（Ｐ２）細胞２００μＬに添加した。３７℃で２０分間細胞を培養し、上部寒天（ＬＢ媒体、％寒天）７ｍＬを追加し、予備過熱したＬＢプレートに注ぎ入れた。プレートは、３７℃で一晩中培養し、Ｋ１２ローン中のＰ４virlプラークの存在を翌朝に決定した。
【０２８８】
透過処理していないＰ４感染細胞を示すサンプル１には、上部寒天プレートに８３のプラークが産出された。洗剤で透過処理したＰ４感染細胞を示すサンプル２には、３４のプラークが産出された。洗剤で透過処理してからリゾチームで細胞壁を劣化させたＰ４感染細胞を示すサンプル３には、１６８のプラークが産出された。
【０２８９】
サンプル希釈を調整し、透過処理し、リゾチーム処理したＰ２ ΔＹＫ細胞（サンプル３）は、サンプル１よりも２００フォルド多いＰ４virlバクテリオファージを有し、サンプル２よりも５００フォルド多いＰ４virlバクテリオファージを有していた。
【０２９０】
感染したＫ１２ Ｐ２ΔＹＫ細胞中の複製能力のあるＰ４virlバクテリオファージが存在することにより、ＹＫ溶融遺伝子の欠失がＰ４virlゲノムの複製又は機能的バクテリオファージ粒子の組換えを妨げないことが実証される。しかしながら、ＹＫ溶融遺伝子の欠失により、感染細胞からの組換えバクテリオファージ粒子の放出が妨げられる。洗剤処理によってなされた細菌細胞の内膜及び外膜の透過処理によって、バクテリオファージが溶液に放出されるわけではない。しかしながら、リゾチームで透過処理された細胞によって、伝染性のバクテリオファージが溶液に放出された。
【０２９１】
実施例１７．誘導酵素とＰ２ΔＹＫ／Ｐ４共溶原菌
ａ．Ｃ１ａ細胞中のＰ２／Ｐ４共溶原菌の生成
長年、Ｐ２バクテリオファージ及びその付随体Ｐ４との実験に用いられる株は、大腸菌のＣ株である（Wiman et al., 1970）。我々は、Ｃ株、Ｃ１ａ(Sasaki and Bertani, 1965)の起源を用いることで、上述のように、Ｐ２プラークから溶原化した細胞のサブクローンを通じてＰ２溶原を作製した。同様に、Ｃ１ａＰ２株のＰ４共溶原菌を作製した。
【０２９２】
Ｐ２／Ｐ４共溶原菌株は、転写抑制下で両方のプロファージを有している。この株を使ってコスミドライブラリープラスミド両ファージを誘導的にパッケージすることは、アクチベートさせるのに必要である。他のうまく特定した溶原性ファージ、ラムダに関して、抑制の開放は、ＲｅｃＡ／ＬｅｘＡ媒介分裂を通じて、又は、熱不安定性突然変異リプレッサー、ｃI８５７を用いて、リプレッサータンパク質、ｃＩの不活性とともに起こる。しかしながら、Ｐ２のリプレッサーの不活性による抑制に無反応であるため、Ｐ２は、非誘導ファージとして知られている。この理由は、恐らく複製及び構造的遺伝子転写とともに、ゲノムからの欠失を調整できないからである（Bertani, 1968）。しかしながら、感化したＰ４付随体ファージは、エントリーを抑制されたＰ２プロファージをアクチベートするメカニズムを有している。Ｐ４ε（イプシロン）タンパク質は、Ｐ２リプレッサータンパク質へ結合してアンチリプレッサーとして行動する。さらに、Ｐ４δ（デルタ）タンパク質は、Ｐ２構造的オペロンの有効な活性剤である。Ｐ２構造的オペロンは、Ｐ２ogr転写アクチベーターの融解縦列重複である。しかしながら、Ｐ４プロファージは、それ自体及びＰ２アクチベーターの両方の複雑で厳重な制御を有する。
【０２９３】
Ｐ４プロファージは、それ自体のプロモーターの転写リプレッサー、Ｖｉｓタンパク質と、ｃＩＲＮＡに基づく抑制複合体を産出するための転写及び翻訳カップリングに頼る下流Ｅｔａ及びｃＩ遺伝子との間の相互作用を用いる。
【０２９４】
Ｐ４及びＰ２プロファージの抑制解除は、Ｐ４εタンパク質によるＰ２リプレッサの抑制を必要とする。アクチベーターＰ２は、Ｐ４δ遺伝子の転写を促進するトランスのＣｏｘ及びＯｇｒ転写アクチベーターを次々に生み出す。Ｐ４δ遺伝子は、さらにＶｉｓプロモーターを通じてＰ４をアクチベートし、Ｐ２構造遺伝子オペロンにトランスで作用する。
【０２９５】
このような複合体システムにおいて、抑制されたプロファージ、Ｐ２及びＰ４の両方を含む細胞は、その組み合わせの影響を強める相互作用のある多くの要因で、有利なフィードバック効果をもたらすことを抑制するあらゆるアクチベーター遺伝子の発現を厳密に制御しなければならない。プロファージの潜在的アクチベーターは、Ｐ２cox、Ｐ２ogr及びＰ４δ転写アクチベーター、並びにＰ４εアンチリプレッサーを含んでいる。
【０２９６】
３つの転写アクチベーターは、λファージリプレッサーｃＩ８５７の温度感性対立遺伝子によって提供される厳密な転写制御下で複製された。ｐＵＣ起源と両立する複製の低コピーｐＡＣＹＣ１８４プラスミド起源は、ｐＵＣベースのライブラリプラスミドとともに、誘導性アクチベーターを維持することができる。
【０２９７】
Ｃ１ａ  Ｐ２／Ｐ４共溶原菌は、誘導性発現構造で変形させて、３０℃で成長させた。その培養は、分解が生じるまで３７℃成長させる前の、４２℃に温度を変えて２０分間誘導の前に、早期ログフェーズに成長させた。
【０２９８】
Ｐ４δ遺伝子は、早期溶解を示し、次にogr、そしてcoxが続くが、全ての３つのアクチベーターは、共溶原菌内で溶解を誘導することができる。温度誘導Ｐ４δのポリヌクレオチドシーケンスはSEQ ID NO:19（配列番号）で提供される。
【０２９９】
伝染性バクテリオファージＰ４粒子の産出は、Ｃ１ａ Ｐ２溶原菌の培養に対する溶菌液の滴定によって確かめられた。Ｐ４滴定量は、＞１０9ｐｆｕ／ｍｌで決められた。
【０３００】
実施例１８．コスミド伝送とＰ２  ΔＹＫ
遺伝子ライブラリースクリーニング及び伝送に関するＰ２／Ｐ４システムを使用するために、Ｐ４cos領域を含むベクターを構築した。ｐｓｕ遺伝子から始まるＰ４からcos卵割サイトに亘ってgop遺伝子までの３８９ｂｐ領域（Ｐ４ゲノムの11461ｂｐ〜225ｂｐ; NCBI 受入番号NC_001609）は、ＰＣＲによって増幅され、高複製ｐＵＣ起源プラスミドベクターに複製された。Ｐ４cos領域の特定は、配列によって検証された。ベクターは、特許出願PCT/AU2010/001702に記載されるようなライブラリー細胞内のディスプレイスクリーンシステムのaraＣ遺伝子及びアラビノース誘導プロモーター制御発現も含んでいた。
【０３０１】
Ｐ２、Ｐ４、又はλバクテリオファージにかかわらず、あらゆるコスミドベクターと同様に、生存能力のある遺伝されるユニットを産出するためのカプシドヘッドにパッケージングするための最小のサイズがある。Ｐ４に関して、これは、約９．２ｋｂ（Kim and Song, 2006）と決定される。このＰ４カプシドヘッドにパッケージするための最小サイズを達成するために、大腸菌ゲノムのＤＮＡの４．３ｋｂの「stuffer」フラグメントで複製によって、コスミドベクターの合計サイズが１０．７ｋｂまで増量され、１１．６ｋｂの野生型Ｐ４ゲノムサイズ近くになる。
【０３０２】
Ｃ１ａ Ｐ２ ΔＹＫ／Ｐ４共溶原菌でのコスミドベクターレジデントのコパッケージングを示すために、温度感性Ｐ４δ遺伝子とｐＵＣ主鎖の抗アンピシリンコスミドベクター及びｐＡＣＹＣ１８４主鎖の抗クロラムフェニコールベクターで株を変換した。
【０３０３】
両共溶原菌及び両プラスミドを有する株が３０℃で早期ログフェーズに成長させて、Ｐ４δタンパク質が４２℃に温度を変更して２０分間で誘導し、その後３７℃で１時間の成長させた。制御として、Ｐ４カプシドパッケージングのためにＰ４cos領域なしのライブラリープラスミドを含む株及びシェッファーフラグメントを誘導した。
【０３０４】
パッケージされたコスミド及びＰ４バクテリオファージを放出するために、透過処理媒体（LB媒体 + 0.5% 8TGP）中、室温（〜２５℃）で１０分間、誘導細胞をペレット化して再懸濁した。透過処理後、ＬＢ及び細胞壁を消化するために追加したReady-Lyseリゾチーム０．５μＬ中でペレット化し、再懸濁した。液滴の濁度によって溶解を確認した。細胞壁のReady-Lyseの作用のためにクロロホルムが細胞の透過処理に有効であることも確認した。Ｃ１ａ及びＣ１ａＰ２溶原菌の感染によって、パッケージされたコスミド及びＰ４バクテリオファージをそれぞれ滴定した。
【０３０５】
ライブラリーコスミドは、誘導Ｐ２ΔＹＫ細胞中の固有Ｐ４プロファージとほぼ同レベルで、Ｐ４プラークと比較して得られるコスミド復活からの抗生物質固有コロニーとほぼ同数をパッケージすることを確認した。コロニーは、Ｐ４cos領域及びシェッファーフラグメントを欠くライブラリープラスミドを運搬する株から調整された溶解物との感染から得られなかった。
【０３０６】
（Ｍｇ／ＥＧＴＡとのＬＢ媒体中に４℃で保管された）Ｃ１ａ Ｐ２溶解細胞からの未処理の溶解物中のＰ４バクテリオファージ又はパッケージされたコスミドの低安定性とは違って、溶解物中の細胞タンパク質分解酵素の作用によるものと推測されるが、初めに透過化され、洗浄されたＰ２ΔＹＫ細胞から放出された、Ｐ４バクテリオファージ及びパッケージされたコスミドは、外部から加えたリゾチーム（Ready-Lyse）の作用によって溶解する前に、２日以上の期間、わずか一滴だけの滴定でも安定であることもわかった。これは、ペレット化工程及び媒体変更工程の間に細胞壁に保持される感染性粒子から洗い落とされた透過化細胞からの上述のタンパク質分解酵素の放出によるものと推測される。このため、温度誘導、透過化及び媒体変更により容易に高滴定量のコスミド粒子を産出し得るし、標準的なバクテリオファージのプロトコルのように、長時間の超遠心分離工程を必要とせずとも安定した滴定を維持し得る。
【０３０７】
実施例１９．有機溶媒を用いた大腸菌の透過処理
洗剤を用いたグラム陰性細胞の透過処理に加えて、膜完全性を破壊する他の化学物質は、脂肪親和性の有機溶媒であってもよい。有機溶媒は、先行技術で細胞の透過処理及び顕微鏡検査の免疫標識の固化に実質的に用いられている(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988)。本発明の方法において、細胞内の標的に結合する大型免疫グロブリン複合体を流入するために細胞膜を透過処理する。
【０３０８】
特に、有機溶媒クロロホルムは、おそらく細胞膜の透過処理を通じて、細胞／バクテリオファージ懸濁液中の細菌細胞を選択的に破壊するためにも用いられる(Sambrook et al. 2001)。クロロホルムは、ホリン変異株を救出するために、溶解バクテリオファージ遺伝子中で使用されることもある。当該ホリン変異株は、バクテリオファージを放出するための細胞質からリゾチームを放出する内膜を透過処理することができなかった(Ziermann et al., 1994)。同様に、クロロホルムは、リゾチーム変異株を救出するために使用されることもある。このリゾチーム変異株は、外因性活性リゾチームをペリプラズムに導入し得るたの、外膜を透過処理することによって、ペプチドグリカン細胞壁を加水分解することができなかった(Ziermann et al., 1994)。それ故、クロロホルムは、グラム陰性大腸菌細胞の内膜及び外膜の両方を通過して、少なくとも小さいリゾチーム通路（〜１５ｋＤ）を通過することができることが明らかであった。
【０３０９】
本発明の方法で記載される細胞内のディスプレイに使用する細胞膜の透過処理するための有機溶媒を試験するために、αGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP融合タンパク質を発現する大腸菌（実施例８に記載されるような誘導発現）を、有機溶媒の水性混合物中で懸濁した。膜の透過処理は、小分子量ＤＮＡ結合蛍光性リガンド、ＧｅｌＲｅｄ及び３０ｋＤタンパク質、ｅＧＦＰ、の結合によって示された。
【０３１０】
いくつかの有機溶媒は、水中で混和性を維持するけれども（つまり、短鎖アルコール）、他は、大部分は混和せずに、混合が水相と非水相に分離する（例えば、クロロホルム及びブタノール）。分離している相は、水相中での有機溶媒の溶解性が低い飽和状態を表している。
【０３１１】
αGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP融合タンパク質を表す細胞を、遠心分離によって回収し、２５℃で１０分間、下記の溶媒組成の１つで透過処理をした。ＬＢ培養基は、水性の混合物の組成で用いた。トリス緩衝制御も実行した。
【０３１２】
１０％エタノール；２０％エタノール；３０％エタノール
１０％メタノール；２０％メタノール；３０％メタノール
１０％イソプロパノール；２０％イソプロパノール；３０％イソプロパノール
１０％ＤＭＳＯ；２０％ＤＭＳＯ；３０％ＤＭＳＯ
１０％アセトン；２０％アセトン；３０％アセトン
ブタノール（１：５）
クロロホルム（１：５）
５０ｍＭ トリス/ＬＢ（ｐＨ７．０）；１Ｍ トリス/ＬＢ（ｐＨ７．０）
【０３１３】
溶媒処理後、細胞は、遠心分離によりペレット化し、懸濁液によってＬＢ媒体とともに１回洗浄し、遠心分離でペレット化し、さらに低分子量ＤＮＡ結合蛍光色素分子ＧｅｌＲｅｄ（１：１０，０００水希釈）又はｅＧＦＰのいずれかを含むＬＢ媒体中で懸濁した。識別した媒体中において、２５℃で２０分培養した後に、遠心分離により細胞をペレット化し、ＬＢ中で再懸濁によって洗浄し、そして蛍光顕微鏡検査法によって観察した。図２２は、有機溶媒で試験したものを示しており、低分子量リガンドを細胞質（Ａ）に導入してもよい大腸菌細胞膜を透過化するクロロホルム及びブタノールであるが、クロロホルムだけが大型の分子量タンパク質（〜３０ｋＤ）の導入できている。
【０３１４】
実施例２０．Ｐ２ｇｐＬ装飾タンパク質を用いたカプシドディスプレイ
Ｐ２バクテリオファージｇｐＬタンパク質を、成熟したビリオンの構成成分として検出し(Chang et al., 2008)、たとえ、２つのタンパク質が対合ＢＬＡＳＴアライメント（ＮＣＢＩ）による重要な相同領域を全く記述していなくても、ラムダバクテリオファージのｇｐＤカプシドタンパク質の機能的に同一であると推定される。ラムダｇｐＤタンパク質は、長さに１１０残余がある一方で、Ｐ２ｇｐＬタンパク質は長さに１６９残余がある。
【０３１５】
Ｐ２ ｇｐＬタンパク質がカプシドディスプレイに機能するかどうかを試験するために、αGFP:I27配列を、SEQ ID NO:20（配列番号）及びSEQ ID NO:21（配列番号）としてリストされた融合タンパク質を作製するためのＰ２ ｇｐＬのＮ−及びＣ−終端に溶解させた。融合タンパク質は、ｇｐＬ及びαGFP:I27領域の間に空間を設けるＦＬＡＧエピトープ標識を含んでもよい。上流側のaraC転写制御因子とaraBADプロモーターからの下流遺伝子配列を複製することによるアラミノーゼ誘導で融合タンパク質を発現した。αGFP:I27:gpL発現ベクターのＤＮＡ配列は、SEQ ID NO:22としてリストされる。
【０３１６】
αGFP:I27:gpL融合タンパク質をコード化するプラスミドを、Ｈｙ５プロファージを含む大腸菌Ｋ１２宿主に転写した。Ｈｙ５ファージは、１８６転写制御下でＰ２項増遺伝子を含む関連ファージＰ２及び１８６のハイブリッドである(Bradley et al., 1975; Younghusband et al., 1975)。さらに、Ｈｙ５（１８６） ｃＩリプレッサーは、温度感性であり、ファージ成長の温度誘導を許容している。
【０３１７】
アラビノーゼによるαGFP:I27:gpL融合タンパク質の発現及びSDS-PAGEによる分析は、
予想サイズ４４ｋＤよりも大きい、約５５ｋＤの上側バンドを作製した。その上側バンドは、溶解性成分及び不溶解性成分の両方にあり、より低いバンドは、単独で溶解性成分にある（図２３）。
【０３１８】
αGFP:I27:gpL融合タンパク質が、ファージカプシドに結合し、ファージディスプレイ上で機能的に結合することを実証するために、発現構築とのプロファージ株を４５℃に加熱して１５分間熱し、Ｈｙ５複製を開始した。熱ショックの後に、サンプルを成長させるための温度の３２℃に下げた。アラビノーセを添加して０．２％の濃度にして温度を下げてから３０分後に、融合タンパク質発現を誘導した。最大ファージ放出のために３２℃で合計７０分間培養物を培養した。
【０３１９】
Ｈｙ５ファージディスプレイαGFP:I27:gpL融合タンパク質の捕獲に関し、ストレプトアビジンで被覆したDynalビーズ（M-270, cat. no. 653-05; Life Technologies）をビオチン化抗体His6-GFPでまず標識付し、ＴＢＳで完全に洗浄した。eGFPでのDynalビーズの標識付は、蛍光顕微鏡検査法で確かめた。
【０３２０】
表２は、DynalビーズによるＨｙ５ファージキャプチャのｇｐＬ融合タンパク質発現を表している。これらのデータは、野生型ｇｐＬタンパク質を用いてパッケージされたファージ上のDynalビーズにより、αＧＦＰ抗体のＰ２ｐｇＬカプシドタンパク質への融合を８２フォルド増強したことを表している。さらに、誘導していないサンプルが融合タンパク質の発現を検出できない水準であっても（図２３、サンプル１）、そのサンプルを上記制御の重要な水準まで親和純正化した。このことは、かなり低水準のディスプレイでもファージ捕捉される結果となることを示唆している。
【０３２１】
表２．Ｈｙ５制御上のｇｐＬカプシド融合タンパク質をディスプレイするＨｙ５ファージの増強
【表２】
0006013470.tif 000003
【０３２２】
実施例２１．ラムダファージＳＲ溶菌遺伝子の欠失
ラムダファージ溶菌遺伝子は、S’/S (ホリン(SEQ ID NO:23)/抗ホリン), R (エンドリシン (SEQ ID NO:24)), Rz/Rz1 (ある媒体で必要な溶解)遺伝子の右腕に位置する。溶解クラスターは、あらゆるラムダ構造遺伝子及び溶解遺伝子の転写の原因となるｐRプロモーターから転写したより大きな転写ユニット内にある。それ故、ｐRのｍRNAは、ラムダゲノムの約半分をカバーする単一の転写産物である。溶解遺伝子を不活性化するために、相同組換を用いる遺伝子を削除することを決定した。ラムダ変異種を迅速に選択し得るために、溶解遺伝子をカナミシン耐性遺伝子（KanR）に置換した。しかしながら、細胞の生存に有害かもしれないプロファージ構造遺伝子発現をもたらす、プロモーター配列又は転写ターミネーター配列をいずれも挿入しないことを確実にするために、隣接する非本質的なbor遺伝子も削除された。bor遺伝子は、宿主大腸菌への血清耐性を与えるものであり、それ自身のプロモーター下で、ｐR’への反対方向にプロファージ中で構造的に発現される（Barondess and Beckwith, 1995）。合成のｇBlockフラグメント（IDT）を用いて、我々はKanR遺伝子の開始コドンのBor遺伝子の開始コドンへの溶着で溶解クラスターの切断を設計した。この欠失からラムダ溶解クラスターを保持する配列だけが、MKMPEKQLEGTQKYINEQCR配列の切断ペプチドだった。溶菌-欠損のDNA配列は、人工腕と構築し、KanRカセットは、SEQ ID NO:27としてリストされる。
【０３２３】
人工相同腕及びKanRカセットは、ｐUCに基づくPCRクローニングベクター、ｐAcquire（Alchemy Biosciences, Melbourne, Australia）に複製され、配列によって検証された。
【０３２４】
ラムダ溶融クラスターの欠失を発効するために、その構造は、大腸菌株ED8739(F-, metB, hsdS, supE, supF)のラムダcI857sam7の溶原菌に転送され、ファージ溶解は温度誘導し（４２℃、１０分）、その後、３７℃で１時間成長によって誘導させた。ファージを含む上澄みの１ｍLを遠心分離で洗浄し、クロロホルムを１滴加えた。そして、追加のマグネシウム（１０ｍM）及びマルトース（０．１％）とED８７３９の培養物をファージ溶解物で希釈して感染させて、３０℃で１６時間成長させたＬＢ+カナミシン（１５μｇ／ｍL）寒天プレート上に載せる前に、３０℃で２時間溶原菌を副産物で回復させた。
【０３２５】
標的プラスミドは十分小さかったので、ラムダ：：コスミド組換型が成長するファージとしてパッケージされることができ、そして、カナミシン抵抗プロファージコロニーは、アンピシリン抵抗遺伝子（つまり、KanR／AmpS）不足のためにスクリーンされ、このアンピシリン抵抗遺伝子は標的構造の相同両腕の間の相同再結合の事象、溶融クラスターを切除し、それを所望のカナミシンカセットと置換することを示しているだろう。望まない変異株なしでも欠失が有効であることを確認するためにKanR／AmpSプロファージを特定し、その領域は、PCR及びその配列決定によって詳述された。全ての複製が計画通りに正しいことを見出された。
【０３２６】
実施例２２．ラムダΔSRゲノムのパッケージング
溶融クラスターの欠失が、細胞単位あたりの存続能力のあるパッケージされたファージの同一の数を産出したこと（つまり、修正したｐR’転写産物は、ファージ構造タンパク質の産出をもたらさなかったこと）を実証するために、ラムダｃI８５７sam７ΔSRプロファージは、３０℃でラムダｃI８５７sam７プロファージと平行して特定の細胞密度に成長したし、ファージ産出は、温度誘導（４２℃、１０分）で誘導し、続いて３７℃で１時間成長させた。期待しているように、ラムダｃI８５７sam７培養は終了まで溶解し、その一方で、ラムダｃI８５７sam７ΔSRは溶解し損ねた。ラムダｃI８５７sam７ΔSR培養は、遠心分離によって回収され、LB＋０．５％ ８TGP中で再懸濁し、２５℃で１０分間培養した。そして、透過処理した細胞は、遠心分離によって回収され、LB＋１０ｍM MgSO4で一度洗浄し、元の１ｍLの体積のLB+１０ｍM MgSO4で再懸濁し、０．５μLのReadyLyse(Epicentre)を使って溶解させた。各溶解物にクロロフロムを１滴加えて、保持される存続可能な細胞を始末し、ファージはED8739に影響した連続希釈法を用いて滴定され、１０ｍMのMgSO4と０．１％マルトースを追加したLB上部寒天上にプレートした。プラークを数える前に、３７℃で１６時間プレートを培養した。ラムダｃI８５７sam７及びラムダｃI８５７sam７ΔSRプロファージの両方は、〜１×１０9ｐfu／ｍLのファージ滴定をして、ラムダΔSR溶融クラスターの欠失及び反対の転写方向にカナミシン遺伝子の関連挿入は、構造的遺伝子の転写及び翻訳を混乱させない。
【０３２７】
実施例２３．ΔSRファージのカプシドディスプレイ
ラムダｇｐD遺伝子を用いるカプシドディスプレイは、文献によく寄稿されるように、ｇｐDディスプレイを用いた標的結合へのファージを取る方法を有している。しかしながら、カプシドディスプレイと溶菌-欠損ファージの組合せの使用は、この出願以前には提案されていなかった。さらに本発明の方法により透過処理した細胞のカプシドディスプレイと溶菌-欠損ファージの組合せは、ＦＡＣＳ欠失によるファージカプシドへの標的結合に対してスクリーニングすることができるものであり、そのＦＡＣＳ欠失は、複製特性の高効率な方法である。
【０３２８】
透過処理した細胞内に保持される溶菌-欠損ファージへの標的の結合を実証するために、我々は、GFPに関する蛍光タンパク質、ｍAG１（Kurosawa et al., 2003）に結合する単結合抗体（ｓｃFｖ）をコード化する配列を、ラムダｇｐD遺伝子の３’−ターミナスに溶解させた。低減状態での細菌細胞質で発現するとき、α−ｍＡＧ１のｓｃFｖは、可溶性及び安定な抗体の希少な分類である。FLAG抗原決定基は、ｇｐD：：α−ｍＡＧ１融合タンパク質のC末端に溶解し、そして全長の溶解性タンパク質は、αＦＬＡＧ単クローン抗体を用いて大腸菌細胞の細胞質に発現されることが実証された。
【０３２９】
ラムダコスミドは、araCタンパク質による抑制及びアラビノーセによる誘導の下で、araBADプロモーターからｇｐD：：α−ｍＡＧ１融合タンパク質を発現し、構成された。コスミドは、ラムダcos領域（SEQ ID NO:26（配列番号））、複製の細菌プラスミド起源、及び抗生物質の抗体遺伝子（AmｐR及びChlR）の、個別的に、及び商業的に使用可能な他のコスミドベクターに共通する特徴を含んてもいた。コスミドベクターは、生体内でのファージのパッケージングを可能とするシェッファーフラグメントも含んでいる。商業的に使用可能なコスミドベクターの例は、ｐFOS1（New England VBioLabs(NEB)）である。
【０３３０】
ｇｐD：：α−ｍＡＧ１コスミドは、λｃI８５７ΔSRプロファージを含む大腸菌ＥD８７３９株に転写され、３０℃の栄養増殖で成長させた。ファージ機能を誘導するために、株は、低密度のLB媒体で培養され、３１℃で７５分成長させる前に４２℃で１５分間加熱した。０．２％w／ｖのアラビノーセの添加、続く４２℃の培養によってｇｐD：：α−ｍＡＧ１融合タンパク質の誘導をすぐに開始した。ファージ成長の感性及びパッケージングで、２５℃で１０分間のLB＋０．５％  ８TGPの０．３×体積で遠心分離及び再懸濁により本発明の方法を用いて細胞を透過処理した。そして、細胞を再度遠心分離し、１×ＴＢＳの体積＋１０ｍＭＭｇＳＯ4（TBS/Mg）で洗浄した。ペレット化する前に、ＴＢＳ/Ｍｇ中の過剰のｍＡＧ１タンパク質で２０分間懸濁した。ｍＡＧ１結合の後に、顕微鏡によって観察するため、又はＦＡＣＳ分析のために懸濁し、細胞をＴＢＳ／Ｍｇと未結合のｍＡＧ１をきれいに洗浄した。
【０３３１】
図２４は、多価のラムダディスプレイを描くものであり、透過処理した細胞内にカプセル化され、蛍光標的で探査したときに、蛍光顕微鏡法による視覚の検出において特に強いシグナルが発生した。各細菌細胞は、１０巣と３０巣の間に点状の標識で表されていた。これらの巣は、ｇｐD：：α-ｍＡＧ１融合タンパク質を発現する細胞中にのみ観察され、ファージで誘導されていた。巣は、融合タンパク質を発現していない細胞内では観察されなかったし、ｍＡＧ１タンパク質で探査したときにファージで誘導されなかった。同様に、gpD::α-ｍＡＧ１で標識したファージは、関連する蛍光タンパク質、GFPに結合しなかった。野生型ラムダファージ放出量は、細胞１つあたり１００〜２００コピーであることがわかり、細胞のほんの少しの領域でファージが濃縮しているものと推察され、各巣は、３ファージ及び２０ファージの間で含まれている。この見積もりは、控えめであるかもしれず、融合の標準的なタイミングで複製が許容される溶菌-欠損ファージからの放出量はもっと大きいかもしれない。それ故、多価のカプセル化したディスプレイ、溶菌-欠損ファージは、本発明の方法で記載されるように、光学顕微鏡によって蛍光標識したタンパク質結合を直接検出してもよい。
【０３３２】
ＦＡＣＳ装置の感度は、従来の顕微鏡の画像よりも優れているので、光学顕微鏡でシグナルの強度を容易に観察し得ることにより、標識されていないファージから標識したファージを含む細胞を検出及び回収し得ることが期待される。図２５は、〜１％のα−ｍＡＧ１陽性細胞とInflux ＦＡＣＳ(ＢＤ Biosciences)の１００K事象での蛍光グラフを描いている。細胞集団は、DNA結合色素Gel Red及び蛍光ｍＡＧ１タンパク質との共染色されている。Ｐ２ゲート集団は、α-ｍＡＧ１陽性であり、またＰ３ゲート集団は、α−ＭＡＧ１陰性である。
【０３３３】
ED8739 λ cI857ΔSR細胞への感染に続き、ReadyLyse酵素の添加によりPost-ＦＡＣＳ出力を回復した。好ましい一事象あたり約１０ファージ粒子の回復を記録した。
【０３３４】
それ故、カプセル化したカプシドディスプレイファージの高速処理ＦＡＣＳスクリーニングは、本発明の方法を用いることによって可能とされる。
【０３３５】
広く記述された本発明の範囲を逸脱することなく、特定の態様において示したように、多くの変化形及び／又は改良が可能であることを当業者は理解するであろう。本実施態様は、したがって、いかなる点においても説明のためであって、制限を課すものと考えてはならない。
【０３３６】
本明細書において、議論され、及び／又は参照された公刊物は、その全体を参照のため本明細書に組み入れる。
【０３３７】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等々に関するいかなる議論もひとえに本発明の状況を提供することを目的としている。これらの事項のいずれか、又は全てが、当出願の各請求項の優先日より以前に存在していたことを理由として、それが先行技術の基盤の一部を形成すること、あるいは本発明に関連する分野において普通の一般的な知識であったことを是認するとして取られるべきでない。
【０３３８】
参考文献
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【図１】
0006013470.tif 000004
【図２】
0006013470.tif 000005
【図３】
0006013470.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006013470.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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