(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）の過剰発現によって改質された酵母菌細胞であって、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼがさらに過剰発現され、かつペルオキシソームクエン酸シンターゼをコードする遺伝子又はサイトゾルリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母菌細胞ゲノムから欠失され、かつ前記アルコールデヒドロゲナーゼがＡＤＨ２であることを特徴とする、前記酵母菌細胞。
【請求項２】
前記酵母菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の酵母菌細胞。
【請求項３】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼがＡＬＤ６であり、前記アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼがＥＲＧ１０であり、前記ペルオキシソームクエン酸シンターゼがＣＩＴ２であり、かつ前記サイトゾルリンゴ酸シンターゼがＭＬＳ１であることを特徴とする、請求項２に記載の酵母菌細胞。
【請求項４】
前記ＡＣＳが、アセチル化による阻害から酵素を防ぐ点突然変異を含むことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の酵母菌細胞。
【請求項５】
前記ＡＣＳが、サルモネラ・エンテリカからの変異体Ｌ６４１Ｐであることを特徴とする、請求項４に記載の酵母菌細胞。
【請求項６】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）を過剰発現することを含む改質した酵母菌細胞を製造するための方法であって、該方法が、さらに、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現することを含み、前記方法が、さらに、ペルオキシソームクエン酸シンターゼをコードする遺伝子又はサイトゾルリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子を、酵母菌細胞ゲノムから欠失させることを含み、かつ前記アルコールデヒドロゲナーゼがＡＤＨ２であることを特徴とする、前記方法。
【請求項７】
前記酵母菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼがＡＬＤ６であり、前記アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼがＥＲＧ１０であり、前記ペルオキシソームクエン酸シンターゼがＣＩＴ２であり、かつ前記サイトゾルリンゴ酸シンターゼがＭＬＳ１であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＣＳが、請求項４又は５において定義されたものであることを特徴とする、請求項６から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の酵母菌細胞を培養することを含む、増大させたレベルのアセチル−ＣｏＡに由来する生成物を製造するための方法であって、かかる生成物を、該生成物を製造するために良い条件下で製造することができる、前記方法。
【請求項１１】
前記生成物が、アセトアセチル−ＣｏＡに由来することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生成物が、テルペノイド及び１−ブタノールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記テルペノイドがα−サンタレンであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高いレベルのアセチル−ＣｏＡ及びアセトアセチル−ＣｏＡを製造する酵母菌に関する。本発明は、かかる酵母菌細胞を製造するための方法、及びアセチル−ＣｏＡ由来の生成物の製造のための方法におけるかかる酵母菌細胞の使用にも関する。
【０００２】
背景技術
操作された宿主細胞（いわゆる細胞工場）における広範囲の産業的に関心のある天然生成物の生合成は、これらの天然源の実現されていない商業上の可能性を開発することができる。従って、安価な源の炭素をいわゆる前駆代謝物質に効率的に変換することができ、そしてさらに関心のある生成物に変換する、プラットフォーム細胞工場を開発することに大きく関心がある。これらの鍵となる代謝の１つは、イソプレノイド（フレーバー及びフレグランス、バイオディーゼル、抗マラリア薬及び抗ガン薬、抗体、ゴム、栄養補助食品、食品成分及びビタミンとして主に使用される）、ポリケチド（抗体、抗ガン薬及び免疫抑制剤）、脂質（例えば栄養補助食品、医薬品及びバイオディーゼル）、ポリヒドロキシアルカノエート、及び１−ブタノールを含む広範囲の産業上関心のある生成物の製造のための前駆体として使用されるアセチル−ＣｏＡである（図１）。
【０００３】
以前の研究において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ側路の設計は、アセチル−ＣｏＡの供給を高め、かつセスキテルペン化合物アモルファジエンの製造を増加したことを示している（Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ２００７、９：１６０；ＷＯ ２００７０２４７１８号）。これは、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰製造及び異種サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）アセチル−ＣｏＡシンターゼ変異体を宿主細胞に導入することによって得られた。
【０００４】
しかしながら、満たされる場合に、あらゆる所望のアセチル−ＣｏＡ由来の生成物の製造を増加する必要がある、アセチル−ＣｏＡ製造をさらに増加する必要性が残っている。本発明は、プッシュ−プル−ブロック戦略を使用し、従って、アセチル−ＣｏＡ由来の生成物の製造を向上するために使用されてよいプラットフォーム細胞工場を提供するこの問題点を扱う。これは、アセチル−ＣｏＡに由来する３種の異なる化合物を使用して例示される。
【０００５】
発明の要旨
第一の一態様において、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼをさらに過剰発現させることを特徴とする、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）の過剰発現によって改質させた酵母菌細胞を提供する。
【０００６】
他の態様において、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）を過剰発現することを含む改質した酵母菌細胞を製造するための方法を提供し、該方法は、さらに、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現することを含むことを特徴とする。
【０００７】
他の一態様において、本発明は、本発明の酵母菌細胞を培養することを含む、増大させたレベルのアセチル−ＣｏＡに由来する生成物を製造するための方法を提供し、その際該生成物の製造するために良い条件下で、かかる生成物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】サッカロミセス・セレビシエにおけるアセチル−ＣｏＡ代謝の単純な概要。アセチル−ＣｏＡは、３種の異なる細胞内コンパートメント：サイトゾル（Ｃ）、ミトコンドリア（Ａ）、及びペルオキシソーム（Ｂ）において局在化した鍵となる一次代謝物質である。３種のコンパートメント間のアセチル−ＣｏＡの直接輸送はなく、かつ３種のコンパートメントにおけるアセチル−ＣｏＡの生合成は、異なる代謝経路を含む。ミトコンドリアにおいて、アセチル−ＣｏＡは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によってピルビン酸塩から形成される。サイトゾルにおいて、アセチル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡシンターゼによって酢酸塩から形成される。ペルオキシソームにおいて、アセチル−ＣｏＡは、（示されていないがアセチル−ＣｏＡによっても）酢酸塩から、及びβ−酸化によって脂肪酸から形成される。ミトコンドリアにおいて、アセチル−ＣｏＡの主な運命は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路による酸化である。ペルオキシソームにおけるアセチル−ＣｏＡは、グリオキシル酸回路（ＧＹＣ）によって、リンゴ酸酵素及びＴＣＡ回路による酸化のためにミトコンドリアに輸送されてよいＣ4有機酸（リンゴ酸塩及びコハク酸）に変換されてよい。サイトゾルにおけるアセチル−ＣｏＡの主な運命は、細胞内脂質（脂肪酸及びエルゴステロール）のための前駆体として働くことである。多くの産業上関心のある生物工学的な生成物は、アセチル−ＣｏＡに由来し、かつこれらのほとんどの生合成は、サイトゾルにおいて生じる。全てのこれらの生成物のためのプラットフォーム酵母菌細胞工場は、従って、サイトゾルにおけるアセチル−ＣｏＡに対して炭素のリダイレクションを有する。
【図２】サイトゾルにおけるアセチル−ＣｏＡの製造を向上するためのプッシュ−プル−ブロック代謝工学ストラテジーの図解。ＮＡＤＰに依存するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする内因性ＡＬＤ６、及びアセチル−ＣｏＡシンターゼをコードするサルモネラ・エンテリカからの異種ＡＣＳ変異体（ＡＣＳSE）を過剰発現することによって、流れが、サイトゾルにおいてアセトアルデヒドからアセチル−ＣｏＡに向かうことが確実となる（ストラテジーのプッシュ部分）。アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ２のさらなる過剰発現を経て、製造されたエタノールを、アセトアルデヒドに変換して戻し、及びここからさらにアセチル−ＣｏＡに変換すること（ストラテジーのプル部分）ができることがさらに確実である。所望の経路の方向においてアセチル−ＣｏＡを引き出すために、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＡｃＣｏＡ）への変換を触媒化するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１０を過剰発現し、この代謝物は、アセチル−ＣｏＡプラットフォーム株を評価するために使用したこれらの生成物のための通常の前駆体である。過剰発現に加えて、アセチル−ＣｏＡの消費を含む反応を、欠失させた（ストラテジーのブロック部分）。これは、グリオキシル酸回路（ＧＹＣ）、すなわちＣＩＴ２によってコードされたペルオキシソームクエン酸シンターゼ、及びＭＬＳ１によってコードされたサイトゾルリンゴ酸シンターゼの反応の２つの鍵を含む。図における経路図は、代謝の簡単な図であり、例えばペルオキシソームにおけるクエン酸シンターゼによって使用されたアセチル−ＣｏＡは、酢酸塩からＡｃｓ１ｐによってこれらに合成される。
【図３】プラスミドｐＩＹＣ０５及びｐＩＹＣ０８のマップ。
【図４】プラスミドｐＩＣＫ０１、ｐＡＫ０１及びｐＰＨＢ−ｐｈａのマップ、並びに生合成経路を再構築させたα−サンタレン（Ａ）、１−ブタノール（Ｂ）及びＰＨＢ（Ｃ）の略図。
【図５】酵母菌アセチル−ＣｏＡ代謝物質の遺伝子工学は、α−サンタレン（Ａ）、１−ブタノール（Ｂ）及びポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）（Ｃ）の製造を向上する。再構築させた生合成経路の略図を、上のパネルで示す。次の酵素は、他の生物由来である：Ｓｔｓ、ワンピ（Clausena lansium）；ＰｈａＡ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣ、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）；Ｈｂｄ、Ｃｒｔ、ＡｄｈＥ２、クロストリジウム・ベイジェンリキ（Clostridium beijerinckii）；Ｔｅｒ、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）。内因性ＨＭＧ１（ｔＨＭＧ１）の不完全版を、α−サンタレン製造のために過剰発現させる。全ての遺伝子操作したＳ．セレビシエ株を本記載内容において記載した。培養物を、炭素源として２０ｇ／Ｌグルコースを有する２０ｍｌの最少培地を含む１００ｍｌ撹拌フラスコ中で成長させ、α−サンタレンレベルを、ＧＣ−ＭＳによって定量し、１−ブタノール及びＰＨＢレベルをＨＰＬＣによって定量した。ｔＨＭＧｌ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ；Ｓｔｓ、α−サンタレンシンターゼ；ＰｈａＡ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；ＰｈａＢ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；ＰｈａＣ、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）ポリメラーゼ；Ｈｂｄ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；Ｃｒｔ、クロトナーゼ；Ｔｅｒ、トランスエノイル−ｃｏＡレダクターゼ；ＡｄｈＥ２、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼ。
【図６】Ａｄｈ２及びＥｒｇ１０の過剰発現を、ＡＣＳSE及びＡＬＤ６を過剰発現する酵母菌細胞におけるα−サンタレン価を更に向上する。以下を発現する酵母菌細胞におけるα−サンタレンの比較：（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧ１）遺伝子及びα−サンタレンシンターゼ遺伝子（Ｓｔｓ）（ＳＣＩＹＣ４０株）の不完全版；（ｉｉ）ＡＣＳSE及びＡＬＤ６遺伝子（ＳＣＩＹＣ４１株）と一緒にｔＨＭＧ１及びＳｔｓ遺伝子；Ａｄｈ２及びＥｒｇ１０（ＳＣＩＹ４２株）と一緒にｔＨＭＧｌ、Ｓｔｓ、ＡＣＳSE、ＡＬＤ６遺伝子。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の酵母菌細胞は、増加させたレベルのアセチル−ＣｏＡ及びアセトアセチル−ＣｏＡを製造し、従って増加させたレベルのそれらに由来する有用な生成物、例えばテルペノイド、１−ブタノール及びポリヒドロキシ酪酸の製造を可能にする、驚くべき利点を有する。
【００１０】
酵母菌細胞は、あらゆるタイプの酵母菌細胞であってよい。有利には、酵母菌細胞は、エタノールを製造できる。より有利には、サッカロミセス属（Saccharomyces）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、クリベロミセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ムコール属（Mucor）、ピチア属（Pichia）及びトルロプシス属（Torulopsis）の酵母菌から選択される。最も有利には、サッカロミセス・セレビシエである。
【００１１】
ストラテジーは、アセトアルデヒドによるエタノールからサイトゾルアセチル−ＣｏＡまでの炭素のプッシュを含む。これは、アルコールデヒドロゲナーゼ、例えばサッカロミセス・セレビシエにおける内因性ＡＤＨ２遺伝子、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばサッカロミセス・セレビシエにおけるＮＡＤＰ依存ＡＬＤ６遺伝子、及びアセチル−ＣｏＡシンターゼ、例えばサルモネラ・エンテリカからのＡＣＳ変異体（Ｌ６４１Ｐ）（ＡＣＳSE）を過剰発現することにより得られる。ＡＣＳSEは、酵素をアセチル化による阻害から防ぐ点突然変異を含み（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５， ２８０：２６２００）、かつこの変異体の使用は、及びサイトゾルにおけるアセトアルデヒドからアセチル−ＣｏＡへの流れを特に効率的に変える。
【００１２】
関心のある３種の生成物に対するアセチル−ＣｏＡの引き抜きを確実にするために、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＡｃＣｏＡ）への変換を触媒化するアセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼも過剰発現する。ＡｃＡｃＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡプラットフォーム株を評価するために使用される３種の生成物のための通常の前駆体である。Ｓ．セレビシエにおいて、ＥＲＧ１０遺伝子は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼをコードする。
【００１３】
本発明の好ましい一実施態様において、酵母菌細胞は、サイトゾルリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子、又は酵母菌細胞ゲノムからのペルオキシソームクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の欠失によってさらに改質される。かかる欠失は、グリオキシル酸回路におけるアセチル−ＣｏＡの消費を避け、その結果他の経路、例えばテルペノイド、１−ブタノール又はポリヒドロキシ酪酸を導く経路のためのアセチル−ＣｏＡの有用性を増加する利点を有する。
【００１４】
前駆体アセチル−ＣｏＡプールからの炭素の損失をさらに低減するために、従って、アセチル−ＣｏＡの消費を含む反応を有利には取り除く。これは、グリオキシル酸回路（ＧＹＣ）、すなわちそれぞれＳ．セレビシエにおいてＣＩＴ２及びＭＬＳ１によってコードされたペルオキシソームクエン酸シンターゼ及びサイトゾルリンゴ酸シンターゼの反応の２つの鍵を含む。
【００１５】
本発明の酵母菌細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現することを含む方法によって製造されてよい。
【００１６】
本発明の好ましい一実施態様において、前記方法は、サイトゾルリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子、又は酵母菌細胞ゲノムからのペルオキシソームクエン酸シンターゼをコードする遺伝子を欠失することをさらに含む。
【００１７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＣＳ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、サイトゾルリンゴ酸シンターゼ、ペルオキシソームクエン酸シンターゼ、及び酵母菌細胞は、酵母菌細胞に関連する本発明のあらゆる実施態様において前記で定義されている。
【００１８】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＣＳ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの過剰発現を、エピソームの酵母菌発現ベクターを使用して、又は当業者によく知られている方法を使用するゲノムの組込みによって実施してよい。これらの方法が標準であるが、しかし、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００５ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓにおいて記載されているように実施してよい。
【００１９】
リンゴ酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼの遺伝子欠失を、遺伝子欠失についての当業者によく知られているあらゆる方法、例えばＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９７， ７：１１７４において記載されているクローニングを有さないＰＣＲを基礎とした対立遺伝子置換法を使用して実施してよい。
【００２０】
適した条件下で本発明の酵母菌細胞を培養することにより、二次代謝物質を製造できる。有利には、前記代謝物質を、増加させたレベルで製造し、すなわち形質転換していない酵母菌細胞を培養する場合よりも、本発明の酵母菌細胞を培養する場合に、より二次代謝物質が製造される。
【００２１】
酵母菌細胞は、所望の二次代謝物質を製造できなければならない。これは、酵母菌細胞が、かかる二次代謝物質を自然に製造することができるか、又は代わりに、酵母菌細胞が、かかる代謝物質の製造のために必要である追加の遺伝子で形質転換されることを意味する。前記のような酵母菌細胞のさらなる改質は、改質されていない酵母菌細胞によって製造された二次代謝物質のレベルを増加する効果を有する。
【００２２】
例えば、二次代謝物質がテルペノイドである場合に、酵母菌細胞を形質転換して、非環式テルペン前駆体のかかるテルペノイドへの変換を触媒することができるテルペンシンターゼを発現又は過剰発現してよい。これは、全ての非環式テルペン前駆体、例えばゲラニルピロホスフェート、ファルネシルピロホスフェート及びゲラニルゲラニルピロホスフェートについて、製造されることを意図したテルペノイドに依存して適用する。テルペノイドは、それらのフレーバー及びフレグランス、化粧品、医薬品及び抗菌性について公知の天然生成物である。これらの化合物は、５個の炭素単位、いわゆるイソプレン単位から製造され、それらの構造に存在するこれらの単位の数によって分類される。従って、モノテルペン、セスキテルペン及びジテルペンは、それぞれ炭素原子１０個、１５個及び２０個を含むテルペンである。例えばセスキテルペンは、植物界において広く見いだせる。多くのモノテルペン、セスキテルペン及びジテルペン分子は、それらのフレーバー及びフレグランス特性、並びにそれらの化粧品効果、医薬品効果及び抗菌効果について公知である。３００を超えるセスキテルペン炭化水素及び３０００を超えるセスキテルペノイドが、同定されており、かつ多くの新たな構造が年ごとに同定されている。種々の方法、例えば蒸気蒸留又は溶媒抽出によって得られた植物抽出物は、テルペンの源として使用される。テルペン分子を通常それ自体で使用するが、しかしいくつかの場合に、化学反応物を、他の高い価の分子中にテルペンを形質転換するために使用する。今日の使用における主なテルペンは、多様な生物（植物、海洋生物、．．．）から抽出された天然生成物である。しかしながら、これらの源の生物のほとんどは、商業上生存可能な量を製造するために必要なラージスケール培養にも、それらの製造可能性を高めるための遺伝子操作にも従わない。さらに、多くのこれらの天然生成物は、複雑な構造を有し、かつ化学的方法によって現在は入手できない。
【００２３】
好ましいセスキテルペンの例は、α−サンタレン、パチョロール、β−サンタレン、バレンセン、クベボール、ジザエン、アモルファ４，１１−ジエン、フムレン、アリストロチェン、ベルガモテン、ジンギベレン、ファルネセン、カリオフィレン、イソダウセン、セスキツジェン、アバミチロール、オイデスモール、ベチスピラジエン、ロンギホレン、シクロコパカムフェン、イソロンギホレン、ゲルマクレン、ビシクロゲルマクレン、ビサボロール、ゲルマクラジエノール、ヘディカリオール、バルバテン、エピ−セドロール、エピ−アリストロチェン、セスキサビネン、クプレン、セリネン、コパエン、マクロカルペン、カジノール、インターメデオール、ネロリドール、ムウロラ−３，５−ジエン、クルクメン及びエピ−ベータサンタレンを含む。より好ましいセスキテルペンは、α−サンタレン、パチョロール、β−サンタレン、バレンセン、クベボール、ジザエン、アモルファ４，１１−ジエンを含む。さらにより有利には、セスキテルペンは、パチョロール又はα−サンタレンである。
【００２４】
好ましいジテルペンの例は、スクラレオール、ラブデンジオール及びタキサジエンを含む。好ましいモノテルペンの例は、リモネン、ピネン、ミリセノール、カンフェン、フェランドレン、テルピノレン、オシメン、リナロール、シネオール、ゲラニオール、テルピネン、フェンコール、カレン、サビネンを含む。
【００２５】
本発明の方法を使用して製造されてよい代謝物質の他の例は、１−ブタノールである。１−ブタノールは、可能なガソリン置換として考えられている。それというのも、それは、より高いエネルギー密度を有する一方で、より少ない腐食性及びエタノールより少ない水溶性であるからである。
【００２６】
本発明の方法を使用して製造されてよい代謝物質のさらなる例は、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）である。ＰＨＢは、商業上関心のある生分解性バイオポリマーの１種である。
【００２７】
本発明の酵母菌細胞を、かかる酵母菌種に適応するあらゆるタイプの成長培地中で培養してよい。かかる培地は、当業者によく知られているが、本明細書のより完全な記載を保証せず、あらゆる場合に網羅的でない。成長培地は、有利には、前記遺伝子を過剰発現するために使用されるプロモーターのタイプにも適応する。例えば、過剰発現した遺伝子がグルコース調整プロモーターの制御下にある場合に、成長培地は、有利にはグルコースを含む。
【００２８】
実施例
本発明を、次の実施例の方法によってさらに詳細に記載する。
【００２９】
実施例１
酵母菌株及び培地
サッカロミセス・セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ１、Ｐ． Ｋｏｅｔｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された）を、バックグラウンド株として使用した。この研究において使用した全ての酵母菌株を表１において要約する。
【００３０】
【表１】
0006021941.tif 000002
【００３１】
遺伝子操作した酵母菌株を、適宜ウラシル及び／又はヒスチジンを有さない合成デキストロース（ＳＤ）（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００９、１１：３９１）培地上で選択した。Ｓ．セレビシエ株を、グルコース２０ｇ／Ｌを有する限定最少培地（Ｙｅａｓｔ １９９２、８：５０１）中で成長させた。
【００３２】
α−サンタレンの製造のために、１０％（ｖ／ｖ）ドデカンオーバーレイを、有機相中のα−サンタレンを捕らえるための１のＯＤ600で培養液に添加した。
【００３３】
実施例２
ＡＬＤ６、ＡＣＳSE、ＡＤＨ２及びＥＲＧ１０酵母菌発現プラスミド
グルコースを基礎とする培養において遺伝子発現を提供するために、全ての酵母菌発現プラスミドは、構成性プロモーターＰTEF1及びＰPGK1を有するｐＳＰ−Ｇ１及びｐＳＰ−Ｇ２を基礎とする（Ｙｅａｓｔ ２０１０、２７：９５５）（この研究において使用したプラスミドのリストについて表２を参照）。
【００３４】
【表２】
0006021941.tif 000003
【００３５】
それぞれのターミネーターの下流の追加の制限酵素認識部位（それぞれ、ＴADH1及びＴCYC1）を提供するために、全体の発現カセットを、プライマー１７及び１８（この研究において使用したプライマーのリストについて表３を参照）ＰＣＲによって増幅させ、ＰｖｕＩＩで切断し、そしてベクター骨格中に連結して、それぞれｐＳＰ−ＧＭ１及びｐＳＰ−ＧＭ２を生じた。ＰTEF1−ＰPGK1双方向プロモーターカセットを含むｐＳＰ−ＧＭ１からの２．１−ｋｂのＰｖｕｌｌフラグメントを、続いて、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＰｖｕｌｌ部位中にクローニングして、ｐＩＹＣ０４を得た。
【００３６】
【表３】
0006021941.tif 000004
制限部位に下線を引く。
【００３７】
ＡＬＤ６（配列番号：４２）を、プライマー対１及び２を使用してＳ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄの染色体ＤＮＡ標本（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｕｒａ３−５２）からＰＣＲ増幅した。これらのプライマーを使用して、核酸配列５’−ＡＡＡＡＣＡ−３’（コザック配列）を、ＡＬＤ６の出発コドンの上流に直ちに導入して、翻訳効率を向上した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８７、１５：３５８１）。このストラテジーを、この研究において使用した全ての他の遺伝子に適用した。Ｌ６４１Ｐ突然変異を有するサルモネラ・エンテリカアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳSE）遺伝子（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００５， ２８０：２６２００）、ＡＣＳSEは、最適化したコドンであり（配列番号：５２）、かつ酵母菌中での高いレベルの発現のためにＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ， ＵＳＡ）によって合成される。コザック配列を含み、ＡＬＤ６の配列をコードする１．５−ｋｂのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメント、及びコザック配列及びＡＣＳSEコード配列を含む２．０−ｋｂのＮｏｔＩ／ＰａｃＩフラグメントを、ｐＩＹＣ０４の対応する部位に連続して挿入し、プラスミドｐＩＹＣ０５を得た（図３）。
【００３８】
グルコースを基礎とするＨＸＴ７プロモーターの制御下でＡＤＨ２遺伝子を発現するために、ＨＸＴ７の０．６−ｋｂのプロモーター領域を、プライマー対３及び４を使用してＣＥＮ．ＰＫ１１３−５ＤからＰＣＲ増幅した。増幅した生成物を、ＢａｍＨＩ／ＦｓｅＩで分割し、そしてｐＳＰ−ＧＭ１のＢａｍＨＩ及びＦｓｅＩ部位中に導入してＰＫＧ１プロモーターを置き換え、プラスミドｐＩＹＣ０６を得た。ＡＤＨ２（配列番号：４１）の１０４７−ｂｐの完全配列及びその天然ターミネーターを含む４３４−ｂｐの下流の配列を含む１．５−ｋｂのフラグメントを、プライマー５及び６を使用してＣＥＮ．ＰＫ１１３−５ＤからＰＣＲによって増幅した。同様に、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５ＤからのＥＲＧ１０（配列番号：４３）の１．２−ｋｂ領域を、プライマー７及び８を使用してＰＣＲ増幅した。コザック配列及びＡＤＨ２を含む１．５−ｋｂのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメント、及びコザック配列及びＥＲＧ１０を含む１．２−ｋｂのＳｐｅＩ／ＳａｃＩフラグメントを、ｐＩＹＣ０６の対応する部位に連続して挿入し、プラスミドｐＩＹＣ０７を得た。
【００３９】
単一のプラスミドからＡＬＤ６、ＡＣＳSE、ＡＤＨ２及びＥＲＧ１０を過剰発現するために、ｐＩＹＣ０８を構築した。ｐＩＹＣ０７からのＴＥＦ１プロモーター、ＥＲＧ１０及びＡＤＨ１ターミネーターを含む２．０−ｋｂフラグメントを、プライマー９及び１０を使用してＰＣＲ増幅して、ＭｒｅＩ／Ｋｐｎ２Ｉ部位を導入した。得られたＤＮＡを、ＭｒｅＩ／Ｋｐｎ２Ｉで分割し、ｐＩＹＣ０５のＭｒｅＩ／Ｋｐｎ２Ｉ部位中に挿入して、プラスミドｐＩＹＣ０５−１を得た。同様に、ｐＩＹＣ０７からのＨＸＴ７プロモーター、ＡＤＨ２及びその天然ターミネーターを含むカセットを、プライマー１１及び１２を使用してＰＣＲ増幅して２つのＡｓｃＩ部位を導入した。増幅した生成物を、ＡｓｃＩで消化し、続いてｐＩＹＣ０５−１のＡｓｃＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＩＹＣ０８を得た（図３）。
【００４０】
実施例３
α−サンタレン及びｔＨＭＧ１酵母菌発現ベクターの構築
（＋）−α−サンタレン発現ベクターを構築するために、サンタレンシンターゼ（Ｓｔｓ）ｃＤＮＡ（配列番号：４６）を、プライマー１９及び２０を使用して、プラスミドＣｏｎｔ２Ｂ−２７−ｐＥＴ１０１（ＷＯ ２００９１０９５９７号、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＨＱ４５２４８０）からＰＣＲによって増幅し、ＮｏｔＩ／ＰａｃＩで切断し、そしてＮｏｔＩ／ＰａｃＩを制限したベクターｐＳＰ−Ｇ１（Ｙｅａｓｔ ２０１０， ２７：９５４）中に連結した。続いて、ｔＨＭＧ１を、鋳型としてＳ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ１１３−５ＤのゲノムＤＮＡ並びにプライマー３１及び３２を使用してＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩで切断し、そしてＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩでの制限後に同様のベクター中に連結した（Ｎａｔｕｒｅ ２００６， ４４０：９４０）。これは、発現プラスミドｐＩＣＫ０１の形成をもたらした（図４）。
【００４１】
実施例４
ポリヒドロキシ酪酸経路発現ベクターの構築
ポリヒドロキシ酪酸生合成経路を、多コピー型プラスミドを使用することによってＳ．セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ中に導入した。ＰＨＢの生合成経路は、３種の酵素、ｐｈａＡによってコードされるβ−ケトチオラーゼ、ｐｈａＢによってコードされるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、及びｐｈａＣ遺伝子によってコードされるＰＨＡシンターゼを含む。ｐｈａＡ（配列番号：５３）、ｐｈａＢ（配列番号：５４）及びｐｈａＣ（配列番号：５５）を合成し、そしてラルストニア・ユートロファＨ１６からの元来のｐｈａ遺伝子の配列に基づくＤＮＡ２．０によってＳ．セレビシエにおける発現のためにコドンを最適化した。ｐｈａＡ及びｐｈａＢを、それぞれＰＧＫ１及びＴＥＦ１プロモーターの下流のｐＳＰ−ＧＭ２プラスミドのＳａｃＩ／ＳｐｅＩ及びＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングして、ｐＳＰ−ＧＭ２−ｐｈａＡＢを得た。ｐｈａＣを、ＴＥＦ１プロモーターの下流のｐＳＰ−ＧＭ２のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ部位中にクローニングした。ｐｈａＣ、ＴＥＦ１プロモーター及びＣＹＣ１ターミネーターのフラグメントを、プライマー１３及び１４を使用して増幅し、そしてＭｆｅＩ部位でｐＳＰ−ＧＭ２−ｐｈａＡＢに連結して、プラスミドｐＰＨＢ−ｐｈａを得た（図４）。
【００４２】
実施例５
ブタノール経路発現ベクターの構築
２つのプラスミドを使用して、ブタノール経路遺伝子を発現させた。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ及びトランスエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする４つの遺伝子を、１つのプラスミドから発現させた一方で、チオラーゼ遺伝子（ＥＲＧ１０）を、他のプラスミドから発現させた。
【００４３】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５ＤからのＥＲＧ１０を、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩを使用してＴＥＦ１プロモーター下でｐＩＹＣ０４中にｐＩＹＣ０７からクローニングして、ｐＣＳ０１を得た。
【００４４】
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ２）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）及びクロトナーゼ（ｃｒｔ）をコードする遺伝子は、クロストリジウム・ベイジェリンキからであった。トランスエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ｔｅｒ）は、トレポネーマ・デンディコラからであった。全てのこれらの遺伝子は、酵母菌中での高いレベルの発現のために最適化したコドンであり、ＤＮＡ２．０によって合成した。
【００４５】
ＡｄｈＥ２（配列番号：５０）を、ＴＥＦ１プロモーター下でＮｏｔＩ及びＰａｃＩを使用してｐＳＰ−ＧＭ１中にクローニングした。そしてＴｅｒ（配列番号：５１）を、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩを使用してＰＧＫ１プロモーター下で同様のプラスミド中にクローニングした。これは、プラスミドｐＡＫ０をもたらした。
【００４６】
Ｃｒｔ（配列番号：４８）を、ＴＥＦ１プロモーター下でＮｏｔＩ及びＰａｘＩを使用してｐＳＰ−ＧＭ１中にクローニングし、そして、ｈｂｄ（配列番号：４７）を、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩを使用してＰＧＫ１プロモーター下で同様のプラスミド中にクローニングした。そして、これらの遺伝子とそれらのプロモーターの双方を含むカセットを、Ｋｐｎ２Ｉ及びＭｒｅＩ制限部位を含んだプライマー１５及び１６を使用してこのプラスミドから増幅させた。そして、このカセットを、ｐＡＫ０中にクローニングして、ｐＡＫ１を得た（図４）。
【００４７】
実施例６
ｃｉｔ２及びｍｌｓ１の欠失
遺伝子欠失を、クローニングしていないＰＣＲを基礎とする対立遺伝子置換法を使用して実施した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９７， ７： １１７４）。ｃｉｔ２（配列番号：４４）の欠失のために、ｃｉｔ２オープンリーディングフレームの５’及び３’領域を、次のオリゴヌクレオチド：ＣＩＴ２−ＵＰ−フォワード、ＣＩＴ２−ＵＰ−リバース、ＣＩＴ２−ＤＯＷＮ−フォワード、ＣＩＴ２−ＤＯＷＮ−リバース（遺伝子欠失のために使用したプライマーのリストについて表４を参照）を使用して、ＰＣＲによってゲノムＣＥＮ．ＰＫ １１３−５Ｄから個々に増幅させた。ＫａｎＭＸ発現モジュールを、オリゴヌクレオチド：ＫａｎＭＸ−ＵＰ−フォワード、ＫａｎＭＸ−ＵＰ−リバース、ＫａｎＭＸ−ＤＯＷＮ−フォワード、ＫａｎＭＸ−ＤＯＷＮ−リバースを使用して、プラスミドｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６）から２つのオーバーラップ部位中で増幅させた。
【００４８】
【表４】
0006021941.tif 000005
下線を引いた配列は、オーバーラップしたヌクレオチドに対応する。
【００４９】
フラグメントＣＩＴ２−ＵＰ／ＫａｎＭＸ−ＵＰ及びＫａｎＭＸ−ＤＯＷＮ／ＣＩＴ２ ＤＯＷＮを、ＰＣＲによってそれぞれ融合した。２つの融合フラグメントを、相同組換えによってゲノム中に組込んだ。ＫａｎＭＸ発現モジュールのループ−アウト（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）について、手順を前記のように実施した（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。続いて、正しい形質転換体を、ＵＲＡ３マーカーでのプラスミドｐＳＨ４７のループアウトのための５−フルオロオロチン酸、及びウラシル補助栄養の再利用を含む培地上で、再度ストリーキングした。そして、株ＳＣＩＹＣ０６（ＭＡＴａ ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２ ｕｒａ３−５２ ｃｉｔ２Δ：：ｌｏｘ）を得た。
【００５０】
同様のアプローチを、ＭＬＳ１（配列番号：４５）欠失のために使用した。ＭＬＳ１遺伝子欠失を実施するために使用したオリゴヌクレオチドを表４において挙げる。
【００５１】
それぞれの遺伝子の欠失を、鋳型としてそれぞれの株からのゲノムＤＮＡを使用することによって実施し、そしてプライマーの２つの遺伝子対について、統合位置の１つの外側及び統合したフラグメントの内側を使用した、診断ＰＣＲによって検証した。株確認のために使用したすべてのプライマーを表５において挙げる。
【００５２】
【表５】
0006021941.tif 000006
【００５３】
最終的に、株ＳＣＩＹＣ３２（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ１ ｃｉｔ２Δ）を、株ＳＣＩＹＣ０６（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｕｒａ３−５２ ｃｉｔ２Δ）及びＣＥＮ．ＰＫ１１０−１０Ｃ（ＭＡＴα ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｈｉｓ３−Δ１、Ｐ． Ｋｏｅｔｔｅｒにより提供された種類）を交叉することによって構築し、続いて四分子解析（ｔｅｔｒａｄ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）した。同様に、株ＳＣＩＹＣ３３（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ１ ｍｌｓ１Δ）を、株ＳＣＩＹＣ０７（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２−８c ｕｒａ３−５２ ｍｌｓ１Δ）及びＣＥＮ．ＰＫ１１０−１０Ｃ）を交叉することによって構築し、続いて四分子解析した。
【００５４】
実施例７
α−サンタレン、１−ブタノール及びＰＨＢ製造のために遺伝子操作した酵母菌株の構築
全ての酵母菌株の形質転換を、標準酢酸リチウム法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２， ２０： １４２５）によって実施した。それぞれの形質転換からの３〜１０個のコロニーを、最良に製造した形質転換体の選別のためにスクリーニングした。
【００５５】
α−サンタレンを製造する株ＳＣＩＹＣ４０を、プラスミドｐＩＣＫ０１及びｐＩＹＣ０４を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ中に形質転換し、続いてＳＤ−ＵＲＡ−ＨＩＳプレート上で選別した。プラスミドｐＩＣＫ０１及びｐＩＹＣ０８を、株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ中に同時形質転換し、そしてＳＣＩＹＣ４２の構築のためにＳＤ−ＵＲＡ−ＨＩＳプレート上で選別した。同様に、これらの２つのプラスミドを、ＳＣＩＹＣ３２及びＳＣＩＹＣ３３中に同時形質転換し、それぞれＳＣＩＹＣ４５及びＳＣＩＹＣ４６を得た。
【００５６】
１−ブタノールを製造する株ｐＡＫＹ１、ｐＡＫＹ２及びｐＡＫＹ３を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ、ＳＣＩＹＣ３３及びＳＣＩＹＣ３２を（それぞれ）ｐＩＹＣ０８及びｐＡＫ１で形質転換することによって構築した。株ｐＡＫＹ４、ｐＡＫＹ５及びｐＡＫＹ６を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ、ＳＣＩＹＣ３３及びＳＣＩＹＣ３２を（それぞれ）ｐＣＳ０１及びｐＡＫｌで形質転換することによって構築した。株ｐＡＫＹ０を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１ＣをｐＩＹＣ０４及びｐＡＫ１で形質転換することによって構築した。株を、ＳＤ−ＵＲＡ−ＨＩＳプレートで選別した。
【００５７】
ＰＨＢを製造する株ＳＣＫＫ００５を、プラスミドｐＰＨＢ−ｐｈａ及びｐＩＹＣ０４を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ中に形質転換し、続いて対照としてＳＤ−ＵＲＡ−ＨＩＳプレート上で選別した。プラスミドｐＰＨＢ−ｐｈａ及びｐＩＹＣ０８を、ＳＣＫＫ００６の構築のために株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−１１Ｃ中に同時形質転換した。同様に、これらの２つのプラスミドを、ＳＣＩＹＣ３２及びＳＣＩＹＣ３３中に同時形質転換し、それぞれＳＣＫＫ００９及びＳＣＫＫ０１０を得た。
【００５８】
実施例８
α−サンタレン、１−ブタノール及びＰＨＢの製造、精製、及び定量分析のための方法
前記の種々からの株α−サンタレン、１−ブタノール及びＰＨＢ製造を試験するために、２０ｍＬ培養液を、１００ｍｌの未調整フラスコ中で、６００ｎｍ（ＯＤ600）での最終工学密度０．０２をもたらす前培養の量を接種することによって開始した。その株を、３０℃で１８０ｒ．ｐ．ｍ．のオービタルシェイクで、次の組成物を有する限定最少培地中で成長させた：７．５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4；１４．４ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4；０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ；２ｍｌ／Ｌ微量金属溶液（１リットルあたり、ｐＨ４．０：ＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、１５．０ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４５ｇ；ＭｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１ｇ；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．３ｇ；ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．３ｇ；Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．４ｇ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．４５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｇ；Ｈ3ＢＯ3、０．１ｇ及びＫＩ、０．１０ｇ）。最少培地のｐＨを、２Ｍ ＮａＯＨを添加することによって６．５に調整し、そして炭素源溶液とは別々にオートクレーブした。グルコースを、濃度２０ｇ／Ｌで添加した。ビタミン溶液（１リットルあたり、ｐＨ６．５：ビオチン、０．０５ｇ；ｐ−アミノ安息香酸、０．２ｇ；ニコチン酸、１ｇ；Ｃａ−パントテン酸塩、１ｇ；ピリドキシン−ＨＣｌ、１ｇ；チアミン−ＨＣｌ、１ｇ及びミオイノシトール、２５ｇ）を、濾過滅菌し、そして１ｍｌ／Ｌの濃度でオートクレーブ後に培地に無菌で添加した。前培養液を製造するために、限定培地（前記したもの）の５ｍＬを含む培養管に、関心のある株の単コロニーを接種した。これらの接種材料を、３０℃で２２０ｒ．ｐ．ｍ．のオービタルシェイクで、１〜２のＯＤ600まで培養した。
【００５９】
α−サンタレンの製造のために、１０％（ｖ／ｖ）ドデカンを、１のＯＤ600で主培養液に添加して、有機相中のα−サンタレンを捕らえた。このドデカン層を、サンプリングし、そしてＧＣ−ＭＳによるα−サンタレン製造の測定のためにデカン中で希釈した。
【００６０】
α−サンタレンを、ＳＬＢ−５ ｍｓキャピラリーカラム（３０ｍ、０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍ膜厚；Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を備えたガスクロマトグラフィ−質量分光法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって分析した。キャリヤーガスは、１．２ｍＬ／分の一定流でのヘリウムであった。スプリット スプリットレス インジェクターを、スピリットレスモードで使用した。最初の炉温は８０℃であり、インジェクター温度は２５０℃であった。炉温を１２０℃まで１０℃／分の速度で上昇させ、続いて１６０℃まで３℃／分の速度で上昇させた。そして、温度を、１０℃／分の勾配で２７０℃まで上昇させ、そしてこの温度で５分間維持した。完全な質量スペクトルを、代謝物同定のために５０〜６５０の範囲内のｍ／ｚをスキャンすることによって生じた。α−サンタレンの定量化を、標準曲線を使用して実施した。
【００６１】
ＰＨＢを前記のように分析した（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８３， ４６： １３３９； Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６， ７２：３４１２）。１０ｍｇより多い細胞を、遠心分離（１０分、５０００×ｇ）によって培養液から採取した。得られた細胞ペレットを一度洗浄し、そして凍結乾燥させた。乾燥細胞を、１ｍｌの濃硫酸中で６０分間沸騰させ、そして４ｍｌの１４ｍＭ Ｈ2ＳＯ4で希釈した。試料を遠心分離（１５分、１６０００×ｇ）して、細胞片を取り出し、そしてその上澄みを、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＵＶ検出器を備えた高圧液体クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって分析した。試料と平行して加工した、市販のＰＨＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、標準として使用した。ＨＰＬＣを、６０℃及び５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4の０．６ｍｌ／分の流速で操作した。
【００６２】
１−ブタノールレベルを解析するために、異なる時点での試料を採取し、遠心分離し、そして濾過した。そして試料を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＲＩ検出器を備えた高圧液体クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって分析した。市販の１−ブタノールを標準として使用した。ＨＰＬＣを、４５℃及び５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4の０．６ｍｌ／分の流速で操作した。
【００６３】
実施例９
アセチル−ＣｏＡプラットフォーム株の評価
アセチル−ＣｏＡプラットフォーム株、セスキテルペンを自然に生じるα−サンタレン及びα−サンタレンの生合成前駆体を評価するために、ビャクダン油の重要な化成成分を評価した。図４Ａにおいて示されているように、サンタレンは、セスキテルペンのための生物学的前駆体、ファルネシルジホスフェート（ＦＰＰ）からの単独の酵素的工程において直接誘導される。ＦＰＰ製造を増加するために、酵母菌内因性メバロン酸経路を、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ１（ｔＨＭＧ１）（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９， ２７４：３１６１７１）の過剰発現によって調整解除して、酵母菌（Ｎａｔｕｒｅ ２００６， ４４０：９４０）におけるイソプレノイド製造の向上をもたらしたことを証明した。酵母菌における植物遺伝子を発現することにおける困難性を克服するために、α−サンタレンシンターゼをコードするＳｔｓ ｃＤＮＡは、Ｓ．セレビシエにおける高レベルの発現のために最適化したコドンであった。参考株として、トランスジェニック酵母菌株ＳＣＹＣ０４０（表１）を、ｔＨＭＧ１及びＳｔｓを含むプラスミドｐＩＣＫ０１で形質転換した。撹拌フラスコ培養液中で、２．０８ｍｇ／Ｌのα−サンタレンを、成長の４８時間後に製造した（図５Ａ）。ＡＬＤ６、ＡＣＳSE、ＡＤＨ２及びＥＲＧ１０を発現するプラスミドｐＩＹＣ０８でｐＩＣＫ０１を同時発現することによって、α−サンタレン製造を、３．６５ｍｇ／Ｌ（図５Ａ、株ＳＣＹＣ０４２）まで増加させた。ＣＩＴ２欠失とプラスミドｐＩＹＣ０８での同時発現との組合せは、４．９８ｍｇ／Ｌのα−サンタレンを製造することができる株ＳＣＹＣ０４５をもたらした（図５Ａ）。さらに、プラスミドｐＩＹＣ０８を、株ＳＣＹＣ０４６をもたらすＭＬＳ１欠失で同時発現した場合に、α−サンタレン製造は、さらに、参考株と比較して４倍の向上を示す、８．２９ｍｇ／Ｌ（図５Ａ）まで増加した。さらに最新のストラテジーを評価するため、及びＡＣＳSE及びＡＬＤ６（Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ２００７， ９： １６０）の過剰発現に対する以前に発表された研究とそれを比較するために、これらの２つの遺伝子を、プラスミドｐＩＣＫ０１（図６、株ＳＣＩＹＣ４１）で同時発現させた。結果は、ＡＤＨ２及びＥＲＧ１０のさらなる過剰発現が、α−サンタレンの最終価（図６、株ＳＣＩＹＣ４２）における及びブロックストラテジーと共に、２５％の増加を導き、α−サンタレン製造における２〜４倍の増加を得た（図６Ａ）ことを示した。
【００６４】
次に、１−ブタノールの製造を、アセチル−ＣｏＡプラットフォーム株において評価した。１−ブタノールは、一般に、可能なガソリン置換として考えられているおり、それというのも、それは、より高いエネルギー密度を有する一方で、より少ない腐食性及びエタノールより少ない水溶性であるからである（Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１１， １１：２６２）。反応、及びアセチル−ＣｏＡからの１−ブタノール製造のために要求される対応する酵素を、図４Ｂにおいて概説する。合成経路を、補因子としてＮＡＤＨを使用する３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｈｂｄ）、クロトナーゼ（Ｃｒｔ）、並びにクロストリジウム・ベイジェンリキからの二官能ブチルアルデヒド及びブタノールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ２）（Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２００８， ７：８）、並びにトレポネーマ・デンティコラからのＮＡＤＨ−依存クロトニル−ＣｏＡ特異性トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｔｅｒ）（Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１１， ７：２２２）を選択することによって組み立てた。これらの酵素をコードする遺伝子を、化学的に合成して、コドンを最適化させ、そして１つのエピソームプラスミド中にクローニングして、１−ブタノールを製造するプラスミドｐＡＫ０１を得た（図４Ｂ）。１−ブタノールを製造するために組み立てた経路の能力を確認するために、これらの外因性遺伝子を発現するＳ．セレビシエ培養物を、２％グルコースを有する最少培地中で成長させた。Ｓ．セレビシエ（２１）において製造した前記の量と同様である２．１７ｍｇ／Ｌの１−ブタノールを観察した（図４Ｂ、株ＳＣＡＫ００）。そして、機能経路を、ＡＬＤ６、ＡＣＳSE、ＡＤＨ２及びＥＲＧ１０を有するｐＩＹＣ０８（図５Ｂ、株ＳＣＡＫ０１）を同時に同時発現させ、そしてアセチル−ＣｏＡ経路の遺伝子操作していない参考株に対して〜４倍増加している９．４０ｍｇ／Ｌの１−ブタノールの価に達した。これらの結果は、ブタノール製造のための前駆体アセチル−ＣｏＡの効率的な供給を確実にするために重要であることを証明する。ＭＬＳ１欠失株（図５Ｂ、株ＳＣＡＫ０２）この１つのプラスミドシステムのさらなる評価は、１４．０４ｍｇ／Ｌまでの１−ブタノール製造においてさらに１．７倍の増加をもたらした。過剰発現と１６．２６ｍｇ／Ｌの１−ブタノールを製造できる株（図５Ｂ、株ＳＣＡＫ０３）をもたらすＣＩＴ２欠失との組合せの場合に、製造レベルは、前記報告（Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２００８， ７：８）よりもほぼ８倍高い。
【００６５】
アセチル−ＣｏＡプラットフォーム株を、最終的に、商業上関心のある生分解性バイオポリマーの種類であるＰＨＢ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９９，６３：２１）の製造について試験した。Ｓ．セレビシエにおけるＰＨＢの製造のために、その合成経路を、モノマー生合成（ｐｈａＡ及びｐｈａＢ）及び重合化（ＰｈａＣ）のためのラルストニア・ユートロファからの３種の遺伝子経路の形質転換によって実施した（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９， ２６４： １５２９３； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９， ２６４： １５２９８； Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６， １２４：５６１）。ｐｈａＡ、ｐｈａＢ及びｐｈａＣをコードする合成した、最適化したコドンを、単一の発現ベクター中にクローニングして、ｐＰＨＡ−ｐｈａを得た（図４Ｃ）。参考株における合成経路の発現は、限定最少培地中で１２０時間の成長に１３．３９ｍｇ／ＬのＰＨＢ濃度をもたらした（図５Ｃ、株ＳＣＫＫ００５）。ＡＬＤ６、ＡＣＳSE、ＡＤＨ２及びＥＲＧ１０を含むプラスミドｐＩＹＣ０８をＰＨＢ製造ベクターで同時発現した場合に、ＰＨＢは、参考株（株ＳＣＫＫ００６）（Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６，１２４：５６１）と比較して１８倍の増加を示す２４０．９９ｍｇ／Ｌまで増大した（図５Ｃ）。ＣＩＴ２欠失又はＭＬＳ１欠失を有する株におけるこれらの２つのプラスミドの同時の同時発現は、しかしながら、さらにＰＨＢ製造を改良せず、ブロックストラテジーが、ＰＨＢの製造のために作用しなかったことを示した（図５Ｃ、株ＳＣＫＫ０９及びＳＣＫＫ１０）。これは、同様に、ＰＨＢ製造を評価するためにここで使用したバッチ発酵において、ＰＨＢが、ディオキシーシフトのエタノール相において主に製造される事実による。ＣＩＴ２又はＭＬＳ１の欠失をもたらす株は、唯一の炭素源としてＣ2化合物、例えばエタノール及びアセトンで成長することができず、従って、これらの株は、エタノール成長相におけるＰＨＢ製造のための必要なギブス自由エネルギー及び酸化還元当量を提供することができない。
【図１】
0006021941.tif 000007
【図２】
0006021941.tif 000008
【図３】
0006021941.tif 000009
【図４】
0006021941.tif 000010
【図５−１】
0006021941.tif 000011
【図５−２】
0006021941.tif 000012
【図６】
0006021941.tif 000013
【配列表】
0006021941000001.app