(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を含む気体が流入する微細孔が形成された導入板と、前記微細孔に対向配置され前記微細孔に対向する表面に微粒子を捕捉可能な捕集板と、前記導入板と前記捕集板とが付設され微粒子を含む気体を前記微細孔に導く流路が形成された本体とを備え、前記捕集板の捕集面を内側にして最外面側に配置しかつ前記捕集板を光透過性部材で構成したことを特徴とする気中物質検知装置用カートリッジ。
【請求項２】
対向配置される前記導入板と前記捕集板間には隙間が形成されており、前記本体に、液体を貯蔵する少なくとも１つの貯蔵容器と、前記貯蔵容器から流出した液体が前記導入板と前記捕集板間に形成される隙間を流動した後に貯留する廃液容器と、前記隙間と前記廃液容器を連結する流路及び前記隙間と前記貯蔵容器を連結する流路を形成したことを特徴とする請求項１に記載の気中物質検知装置用カートリッジ。
【請求項３】
前記捕集板の微粒子を捕捉する面に、粘着性物質もしくは微粒子と特異的に結合可能な物質を結合または吸着させたことを特徴とする請求項２に記載の気中物質検知装置用カートリッジ。
【請求項４】
捕捉可能な前記微粒子は、ウイルス、細菌、酵母、原生動物、菌類、胞子、花粉、動物の皮膚の破片、ダニの糞や死骸、ハウスダスト、排ガス粒子、鉱石粒子の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の気中物質検知装置用カートリッジ。
【請求項５】
前記導入板には複数の微細孔が形成されており、前記導入板が光透過性であることを特徴とする請求項２に記載の気中物質検知装置用カートリッジ。
【請求項６】
微粒子を含む気体が流入する微細孔が形成された導入板と、前記微細孔に対向配置され前記微細孔に対向する表面に微粒子を捕捉可能な捕集板と、前記導入板と前記捕集板とが付設され気体を前記微細孔に導く流路が形成された本体とを有するカートリッジと、前記捕集板に捕捉された前記微粒子を光学的に検知するための光学検出器を備え、前記捕集板を前記カートリッジの最外面側に配置しかつ前記捕集板を光透過性部材で構成し、前記光学検出器を前記捕集板の捕集面の背面側に配置したことを特徴とする気中物質検知装置。
【請求項７】
前記カートリッジ内の流路を、微粒子を含む気体が流動可能とするポンプを設けたことを特徴とする請求項６に記載の気中物質検知装置。
【請求項８】
液体を霧化する噴霧器を備え、前記噴霧器により発生した液体のミストを、前記ポンプにより前記微細孔を通過させて前記捕集板表面に衝突させることを特徴とする請求項７に記載の気中物質検知装置。
【請求項９】
前記噴霧器が噴霧する噴霧液体は、微粒子に特異的に結合する蛍光色素を含む液体であることを特徴とする請求項８に記載の気中物質検知装置。
【請求項１０】
対向配置される前記導入板と前記捕集板間には隙間が形成されており、前記本体に、液体を貯蔵する少なくとも１つの貯蔵容器と、前記貯蔵容器から流出した液体が前記導入板と前記捕集板間に形成される隙間を流動した後に貯留する廃液容器と、前記隙間と前記廃液容器を連結する流路および前記隙間と前記貯蔵容器を連結する流路とを形成し、前記ポンプは前記貯蔵容器内の液体を前記導入板と前記捕集板間に形成される前記隙間を経由して前記廃液容器まで流動させることを特徴とする請求項７に記載の気中物質検知装置。
【請求項１１】
前記貯蔵容器に貯蔵される液体は、微粒子に特異的に結合する蛍光色素を含む液体または前記捕集板に付着させた蛍光色素を前記捕集板から洗い流す液体の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載の気中物質検知装置。
【請求項１２】
患者の呼気を封じ込めた呼気バッグが接続可能な流路と、この流路に介在させた弁と、前記弁および前記ポンプを制御する制御手段とを設け、前記導入板には複数の微細孔が形成されており、前記制御手段は前記弁および前記ポンプを制御して呼気バッグ中の微粒子を、前記複数の微細孔に対向配置される前記捕集板の前記複数の微細孔に対向する表面に捕捉することを特徴とする請求項７に記載の気中物質検知装置。
【請求項１３】
環境中の空気を封じ込めた空気バッグが接続可能な流路と、この流路に介在させた弁と、前記弁および前記ポンプを制御する制御手段とを設け、前記制御手段は前記弁および前記ポンプを制御して空気バッグ中の微粒子を前記カートリッジの前記捕集板に捕集し検知することを特徴とする請求項７に記載の気中物質検知装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼気中または大気中に含まれる微粒子を検出する気中物質検知装置及びそれに用いるカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症の拡大を防止するために、医療現場ではさまざまな診断及び防止手法が使用されている。例えば、インフルエンザなどの呼吸器系の感染症の場合には、簡便・迅速に診断できることから、簡易キットが多用されている。簡易キットを用いた診断では、患者の鼻腔内に綿棒を挿入して鼻腔内の体液を採取したのち、免疫クロマトグラフィ法により体液に含まれるウイルスや菌などの微生物の抗原を検知する
上記簡易キットを用いた診断は簡便ではあるものの、患者の体内から直接微生物の抗原を採取する必要があるので医療診断技術として扱われ、医療従事者以外は作業を制限される。そこでより簡易的に微生物を検知する方法が求められている。この要求に対しては、空気中に漂うウイルスや菌などの微生物を呼気から直接捕集し、遺伝子増幅や画像処理により検知する方法が提案されている。【０００３】
呼気から微生物を検知する例が、特許文献１に記載されている。この公報に記載の微生物検知システムでは、微生物検知チップの捕集部表面に大気中の微生物をインパクション法により捕集し、捕集した微生物を液体中に溶離させている。その後、微生物を含む液体を別のチップに移し、遺伝子増幅法により微生物を検知する。【０００４】
他の微生物検知例が特許文献２に記載されている。この公報では、膜法により微生物を捕捉し検知するシステムを用いている。具体的には、上面パーツと底面パーツの２個の部材間に細孔を有する膜を配置し、この膜で細孔よりも大きな流体中に含まれる微生物を捕捉する。その後、捕捉した微生物を可視化試薬で染色して、ＣＣＤカメラで撮像し画像処理、または電子顕微鏡等を用いて観察及び分析している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−３４５７２７号公報
【特許文献２】特表２００５−５３３５０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
感染症の診断を簡便・迅速に実施するには、簡易キットは有効な方法である。しかしながら、簡易キットを用いる際には患者の鼻腔内に綿棒を挿入し体液を採取する必要があり、幼い患者では苦痛による拒否反応を示す場合もある。また、一般に簡易キットは感度が低く、感染初期の患者の場合には十分な微生物の抗原量を確保できない場合もある。さらに、採取した微生物の抗原量が少ないと陰性判定となる場合がある。これらにより、必ずしも予防効果を発揮し得ない。さらにまた、患者の鼻腔内に綿棒を挿入する行為は医療行為なので、医療従事者に制限される。【０００７】
これに対して、特許文献１や特許文献２に記載されたインパクション法やろ過捕集を用いて空気中の微生物を直接捕集する方法は、患者に苦痛を与えずに微生物を採取することが可能であり、また医療行為ではないため医療従事者以外も実施することができる。しかし、特許文献１記載の方法では、捕集と検知を異なるチップで実施するので、微生物を含む液体を移し替える必要がある。さらに、遺伝子増幅法を利用する検知方法であるので、微生物からの遺伝子の精製と遺伝子の増幅に数時間必要であり、検査結果を迅速に取得することが難しい。【０００８】
特許文献２に記載の微生物検知方法は、膜上に捕集した微生物を直接検知するので、捕集と検知を自動かつ連続的に実施することが可能である。また、対象物の大きさや形状、可視化試薬による染色、光強度の情報から微生物と埃などの微粒子を判別し、正確な測定をすることも可能である。【０００９】
しかしながらこの特許文献２に記載の方法は、上部パーツと空洞を介してフィルタ面に励起光を照射して画像を取得するので、上部パーツと空洞の境界間での屈折やフィルタ面での反射光もしくは散乱光の影響により、取得した画像が不鮮明になるおそれがある。また、大きさ数μｍの微生物の形状を判別するには高倍率で拡大した画像を取得する必要があるが、数ｍｍ２の膜面の全面の画像を取得し微生物を判別するには長時間必要になる。その結果、検査結果を迅速に取得することが困難になる。【００１０】
本発明は、上記従来技術の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、呼気バッグ等のガス密封体とカートリッジを着脱可能に取り付ける気中物質検知装置において、呼気中または大気中から微生物を、簡便にかつ高精度で検出することにある。また、他の目的は、気中物質検知装置に使用する使い捨てのカートリッジにより、上記微粒子検出を容易かつ高精度化することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明の特徴は、気中物質検知装置用カートリッジが、微粒子を含む気体が流入する微細孔が形成された導入板と、微細孔に対向配置され微細孔に対向する表面に微粒子を捕捉可能な捕集板と、導入板と捕集板とが付設され微粒子を含む気体を微細孔に導く流路が形成された本体とを備え、捕集板の捕集面を内側にして最外面側に配置しかつ捕集板を光透過性部材で構成したことにある。【００１２】
また本発明の他の特徴は、上記気中物質検知装置用カートリッジと、捕集板に捕捉された微粒子を光学的に検知するための光学検知器とを気中物質検知装置が備え、捕集板をカートリッジの最外面側に配置しかつ捕集板を光透過性部材で構成し、光学検出器を捕集板の捕集面の背面側に配置したことにある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、呼気バッグ等の密封体とカートリッジを着脱可能に取り付ける気中物質検知装置において、カートリッジが備える捕集板の背面から光学的に微粒子を検出するようにしたので、気中物質検知装置は呼気中から微生物を、簡便にかつ高精度で検出できる。また、カートリッジの捕集板を透光性としたので、上記背面からの検出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る呼気中微生物検知装置の原理を示す模式図である。
【図２Ａ】本発明に係るカートリッジの一実施例の斜視図であり、正面視図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示したカートリッジの斜視図であり、裏面視図である。
【図３Ａ】図２ＡのＡ−Ａ’線断面図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示したＢ部の拡大図である。
【図３Ｃ】図３Ｂに示したＣ部の拡大図である。
【図４】図２Ａに示したカートリッジの分解斜視図である。
【図５】図２Ａに示したカートリッジを有する呼気中微生物検知装置の斜視図である。
【図６】図５に示した呼気中微生物検知装置の配管系統図である。
【図７】呼気中微生物検知装置を用いた微生物検知のフローチャートである。
【図８Ａ】図２Ａに示したカートリッジの動作を説明する図であり、微生物を捕集する工程の図である。
【図８Ｂ】図２Ａに示したカートリッジの動作を説明する図であり、微生物を標識する工程の図である。
【図８Ｃ】図２Ａに示したカートリッジの動作を説明する図であり、洗浄工程の図である。
【図９】図５に示した呼気中生物検知装置が備える光学検出器の模式図である。
【図１０】本発明に係るカートリッジの他の実施例の斜視図である。
【図１１】図１０に示したカートリッジを有する呼気中微生物検知装置の配管系統図である。
【図１２Ａ】図１０に示したカートリッジの動作を説明する図であり、微生物を捕集する工程の図である。
【図１２Ｂ】図１０に示したカートリッジの動作を説明する図であり、微生物を標識する工程の図である。
【図１２Ｃ】図１０に示したカートリッジの動作を説明する図であり、洗浄工程の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して、本発明に係るいくつかの実施例を説明する。なお、本発明では、検知対象となる「空気中もしくは呼気中に含まれる微生物」は、一般的な定義の微生物より広い範囲であり、ウイルスや細菌、酵母、原生動物、菌類、胞子、花粉をも含む。
【００１６】
図１に、本発明に係る気中物質検知装置の一種である呼気中微生物検知装置１を、模式的に示す。呼気中微生物検知装置１は、部分断面図で示されている。呼気中微生物検知装置１では、箱状に形成された検知装置本体の一側面に、カートリッジ１０を着脱可能に付設している。呼気中微生物検知装置１が配設された場所または遠隔地で採取された患者の呼気を封入した呼気バッグ１２１を、カートリッジ１０に連結管１２８１を介して接続する。
【００１７】
カートリッジ１０は、扁平な直方体状または厚みのあるカード状をしており、直方体状の本体１１０内に、複数の微細孔１１５が形成された多孔板(導入板)１１２と、この多孔板１１２と僅かな間隔をおいてほぼ平行に配置された捕集板１１４とを保持している。本体１１０の扁平な側面の中央部には、呼気バッグ１２１に連結する連結管１２８１を着脱するために、吸気口１００が形成されている。
【００１８】
呼気中微生物検知装置１は、呼気バッグ１２１内の呼気を吸引するため図示しないポンプを備えており、ポンプは呼気バッグ１２１内の呼気を矢印１２２２のようにカートリッジ１０側へ吸引する。本体１１０の吸気口１００から導入された呼気バッグ１２１内の呼気は、多孔板１１２に形成された微細孔１１５を通過し、光透過性の捕集板１１４の表面に噴流として衝突し、捕集板１１４の表面付近で流れ方向を変える。このとき、呼気に含まれる微生物粒子１５０は、慣性力により気流から外れ、捕集板１１４の表面に衝突し捕集される。一方、微細孔１１５から流出して微生物粒子１５０を取り除かれた呼気は、捕集板１１４の端面と本体１１０の内周面間に形成された隙間を通気口１１６として流通し、カートリッジ１０の外部へ排出される。この方法は、インパクション法と呼ばれている。
【００１９】
捕集板１１４に捕集された微生物粒子１５０を光学的に検出するため、呼気中微生物検知装置１の本体内部であって捕集板１１４の背面側に、光学検出器１２４が配置されている。光学検出器１２４は、捕集板１１４の表面に捕集された微生物粒子１５０に励起光１２４１を照射する。その際、微生物粒子１５０が発生した蛍光１２４２を光学検出器１２４が検出して、呼気中の微生物粒子１５０の存在を検知する。ここで、光学検出器１２４と微生物粒子１５０の間には光透過性の捕集板１１４しか配置されていないので、光の屈折や反射、散乱の影響を可能な限り排除できる。その結果、微生物粒子１５０が発生する微弱な蛍光でも検出可能となる。
【００２０】
ここで、微生物粒子１５０が蛍光を発生できるように、呼気中微生物検知装置１は捕集した微生物粒子１５０を特定の蛍光色素で標識する。インフルエンザウイルスや結核などの特定の微生物を検知する場合、これらの特定の微生物に特異的に結合する蛍光色素を使用して、検知感度や判別性能を向上させている。例えばインフルエンザウイルスに対しては、蛍光標識した抗インフルエンザウイルス抗体を使用し、結核菌に対しては蛍光標識した抗結核菌抗体を使用する。
【００２１】
呼気バッグ１２１とカートリッジ１０の本体１１０間を接続する連結管１２８１の途中に液体を霧化する噴霧器１２３が連結している。噴霧器１２３には蛍光色素液が貯蔵されており、噴霧器１２３は貯蔵されている蛍光色素液を霧化して、蛍光色素を含むミスト１５３を発生させる。
【００２２】
捕集板１１４に微生物粒子１５０を捕集した状態で、噴霧器１２３で生成したミスト１５３を、複数の微細孔１１５から捕集板１１４の表面に噴射する。微細孔１１５から噴射され捕集板１１４に衝突したミスト１５３に含まれる蛍光色素と、捕集板１１４の表面に捕集された微生物粒子１５０は、特異的に結合して標識される。標識された微生物粒子１５０では、この微生物粒子１５０に特異的に結合した蛍光色素が、光学検出器１２４から発せられた励起光１２４１により励起されて蛍光１２４２を発生する。発生した蛍光１２４２は、光学検出器１２４で検知される。
【００２３】
ここで、呼気中微生物検知装置１には、カートリッジ１０と一体または別体で、試薬１０６１を貯蔵する試薬容器１０６と使用後の試薬１０６１を貯留する廃液容器１０３が設けられている。試薬１０６１は、例えば洗浄液や蛍光色素液である。洗浄液の場合には、微生物粒子１５０の標識に寄与せず捕集板１１４付近に残存した蛍光色素を取り除く、もしくは光学検出器１２４での検知を終え次のカートリッジ１０での検知作業を円滑に進めるのに使用される。試薬１０６１が蛍光液の場合には、微生物粒子１５０への蛍光色素の標識に使用される。
【００２４】
図示しないポンプを作動させて、試薬容器１０６から捕集板１１４の表面に試薬１０６１を供給して捕集板１１４の表面を洗浄もしくは微生物粒子への標識をした後、供給した試薬１０６１を廃液容器１０３に廃棄する。
【００２５】
本発明に係る呼気中微生物検知装置１を用いた微生物検知においては、検査者は、患者の呼気を収納した呼気バッグ１２１を呼気中微生物検知装置１に接続するだけで、以後の処理は自動的に実行される。つまり、呼気バッグ１２１を接続すると、ポンプが起動されて、呼気中の微生物粒子１５０が自動的にカートリッジ１０の捕集板１１４の表面に捕集される。捕集された微生物粒子１５０には噴霧器１２３または試薬容器１０６から蛍光色素が供給され、供給された蛍光色素が微生物粒子１５０に特異的に結合する。特異的に結合した蛍光色素からの蛍光を光学検出器１２４が自動的に検知して、微生物粒子１５０を検知する。
【００２６】
なお図１では、試薬１０６１の試薬容器１０６及び廃液容器１０３をカートリッジ１０と別体にし、ミスト１５３を発生する噴霧器１５３内に蛍光色素液を貯蔵している。しかし、後述するように試薬容器１０６に蛍光色素を貯蔵し、廃液容器１０３とともにカートリッジ１０内にこれらの容器１０６、１０３を形成してもよい。
【００２７】
次に、具体的なカートリッジ１０の詳細を、図２Ａないし図４を用いて説明する。  
図２Ａは、カートリッジ１０の正面側の斜視図であり、図２Ｂはカートリッジ１０の背面側の斜視図である。図３Ａは、図２ＡにおけるＡ−Ａ’線断面図であり、図３Ｂは図２ＡのＢ部拡大図、図３Ｃは図３ＢのＣ部拡大図である。
【００２８】
カートリッジ１０は、液体を内部に保持し、呼気中もしくは空気中の微生物を捕集および検知するのに必要ないくつかの工程を行うための機構を内部に備えている。カートリッジ１０の大部分を占める本体１１０の正面中央部には、呼気バッグ１２１に連通する連結管１２８１が着脱自在に接続される吸気口１００が形成されている。呼気バッグ１２１から微生物を含む呼気もしくは大気が吸気口１００へ流入する。カートリッジ１０の周縁部には、複数の通気口１０１１〜１０１４が形成されており、カートリッジ１０の内部に形成された詳細を以下に説明する複数の流路１０５１、１０５２、…内の圧力を変化させて、呼気や試薬、洗浄液等の流動を制御するのに用いられる。
【００２９】
本体１１０の背面側であって中央部には、図２Ｂに示すように、吸気口１００に対応する位置に、微生物粒子を捕集・検知するための捕集・検知部１０４が付設されている。本体１１０の一方の側(図２Ｂでは左側)には、捕集・検知部１０４を洗浄するのに用いる洗浄液１０２１が貯蔵された洗浄液容器１０２が形成されている。また、本体１１０の他方の側(図２Ｂでは右側)であって、捕集・検知部１０４を挟んで洗浄液容器１０２と反対側には、捕集・検知部１０４を通過した洗浄液１０２１を収容するための廃液容器１０３が形成されている。
【００３０】
洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４は、本体１１０に形成した洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４との連通流路１０５１により連結されている。また、廃液容器１０３と捕集・検知部１０４とは、本体１１０に形成した廃液容器１０３と捕集・検知部１０４との連通流路１０５２により連結されている。なお、以下の記載においては、洗浄液１０２１の流れに沿って洗浄液容器１０２の側を上流側、廃液容器１０３の側を下流側と呼ぶ。
【００３１】
本体１１０の上部中央に設けた通気口１０１２は、洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４とを連通する連通流路１０５１に連通している。同様に、通気口１０１３は、洗浄液容器１０２の上部に連通し、通気口１０１４は廃液容器１０３の上部に連通する。通気口１０１１は、本体１１０の下部中央に設けられており、廃液容器１０２と捕集・検知部１０４との連通流路１０５２に連通している。
【００３２】
洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４との連通流路１０５１の末端側は、２つに分岐した分岐流路１０４８を形成しており、一方は上記通気口１０１２を端部とし、他方は捕集・検知部１０４まで延びて捕集・検知部１０４への連結部１０４６を形成している。同様に、廃液容器１０３と捕集・検知部１０４との連通流路１０５２の末端側も２つに分岐した分岐流路１０４７を形成しており、一方が通気口１０１１を端部とし、他方が捕集・検知部１０４まで延びて捕集・検知部１０４への連結部１０４５を形成している。
【００３３】
図４に、カートリッジ１０を分解斜視図で示す。上述したように本体１１０には、各容器１０２、１０３および各流路１０４７、１０４８、１０５１、１０５２と通気口１０１１〜１０１４、１０４５、１０４６が形成されている。これら容器１０２、１０３および流路１０４７、１０４８、１０５１、１０５２等が作成容易なように、加工性や製造コストをも考慮して、本体１１０には耐水性の樹脂材料を用いる。耐水性樹脂材料として、ポリプロピレンやポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネイト、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチルエステル等を使用する。これら材料を用いて、容器１０２、１０３や流路１０４７、１０４８、１０５１、１０５２を本体１１０に射出成型で形成する。
【００３４】
本体１１０に多孔板１１２を接着するために、両面に接着剤が塗布されたシート状の粘着層１１１が、多孔板１１２の背面側に接着されている。これにより、密閉状の各容器１０２、１０３および各流路１０４７、１０４８、１０５１、１０５２が形成される。粘着層１１１の中央部には、吸気口１００に対応する位置に連通孔１００ｂが、連結部１０４５、１０４６に対応する位置に連通孔１０４３、１０４４が、それぞれ形成されている。
【００３５】
粘着層１１１は、本体１１０と多孔板１１２を接着させるための部品であるから、接着剤が塗布されたシートの代わりに、アクリル系やシリコーン系の粘着剤を使用することもできる。また、超音波溶着などの方法で本体１１０と多孔板１１２とを接合する場合には、不要である。
【００３６】
粘着層１１１の背面側には、複数の微細孔１１５が中央部に形成された多孔板１１２が接着されている。多孔板１１２の微細孔１１５よりも周辺部であって、粘着層１１１の連通孔１０４３、１０４４に対応する位置に、連通孔１０４１、１０４２が形成されている。
【００３７】
多孔板１１２には、微生物粒子１５０に標識した蛍光色素１５４からの蛍光検知の際のノイズとならないように、迷光や自家蛍光が発生しにくいポリエチレンテレフタレートやポリメタクリル酸メチルエステル、シクロオレフィンポリマーなどの光透過性の樹脂材料を使用する。多孔板１１２に形成する微細孔１１５は、機械加工や超音波加工、エッチング、レーザーなどの微細加工法により形成する。
【００３８】
インパクション法を用いて微生物粒子１５０を捕集するときは、捕集する微生物粒子１５０の粒径が小さくなるほど微細孔１１５の直径を小さくする。また、吸引量が多いほど、微細孔１１５の数を増やす必要がある。そのため、測定対象によって微細孔１１５の最適な直径や微細孔１１５の数は変化する。
【００３９】
例えば直径０．３μｍのウイルス粒子から直径数１０μｍの花粉を検知対象とし、０．００１ｍ３/ｍｉｎ〜１ｍ３/ｍｉｎの範囲の吸引量で検査を実施する場合には、微細孔１１５の直径は０．０１ｍ〜３ｍｍ、微細孔１１５の間隔は０．０５ｍｍ〜１５ｍｍ、微細孔１１５の数は１〜１０，０００個程度である。典型的には、直径０．３μｍ以上のウイルス粒子を含む呼気を、０．００３ｍ３/ｍｉｎの吸引量で吸引する場合に、微細孔１１５の直径を０．１ｍｍ、微細孔１１５の間隔を０．６ｍｍ、微細孔１１５の個数を１００個としている。
【００４０】
多孔板１１２の背面側であって微細孔１１５が形成された部分の周囲に、中央部に開口１１３１が形成されたリング状のスペーサ１１３を接着する。スペーサ１１３は、両面に接着剤が塗布されたシート状をしており、スペーサ１１３の表面にはスペーサ１１３とほぼ同外径の捕集板１１４が接着剤により接着されている。スペーサ１１３は、多孔板１１２と捕集板１１４間に介在して、これら２種の板１１２、１１４間に所定の隙間δを形成する (図３Ｂ参照)。
【００４１】
スペーサ１１３は耐水性の樹脂材料製であり、ポリプロピレンやポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチルエステル等の樹脂を使用可能である。インパクション法により微生物粒子を捕集する場合には、スペーサ１１３の厚さは微細孔１１５の直径の１〜１０倍程度であり、例えば微細孔１１５の直径が０．１ｍｍのときはスペーサ１１３の厚さを０．１ｍｍ〜１ｍｍとしている。
【００４２】
捕集板１１４は、微生物粒子１５０を捕集する際の受け板として機能するだけでなく、光学検出器１２４で蛍光検知をする際に、励起光１２４１および蛍光１２４２の光導通路としても作用する。そのため、近紫外から近赤外の波長域、すなわち３００ｎｍ〜８００ｎｍにおける一部波長域にて、光透過率が８０％以上でかつ自家蛍光が小さい材料を使用する。捕集板１１４には、ガラスや石英の他、ポリエチレンテレフタレート、ポリメタクリル酸メチルエステル、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサンなどの光透過性樹脂を用いる。もしくは、上記各材料で構成された部材を貼り合わせて使用してもよい。また、捕集板１１４の厚さは、０．１ｍｍ〜１０ｍｍ程度である。
【００４３】
衝突した微生物粒子１５０を確実に捕集するために、捕集板１１４の表面には粘着性の物質を塗布もしくは貼りつけてもよい。または、特定の微生物粒子と特異的に結合する抗体もしくは人工抗体などの物質を、物理的結合や化学的結合により修飾することも可能である。
【００４４】
このように構成したカートリッジ１０の幅方向（ｘ方向）及び高さ方向(ｚ方向)の長さＬｘ、Ｌｚは、ともに１０ｍｍ〜３００ｍｍ程度であり、厚さ方向(ｙ方向)の長さＬｙは３ｍｍ〜１００ｍｍ程度である。吸気口１００の直径φｄは、１ｍｍ〜１００ｍｍ程度である。また洗浄液容器１０２の容積Ｌｗは、０．１ｍｌ〜１００ｍｌ程度の洗浄液１０２１を内部に貯蔵できる大きさである。洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４との連結流路１０５１や捕集・検知部１０４と廃液容器１０３との連結流路１０１４の深さ及び流路幅は０．１ｍｍ〜１０ｍｍ程度である。典型的には、Ｌｘ、Ｌｚは６０ｍｍ程度であり、Ｌｙは１０ｍｍ程度である。
【００４５】
図５は、上記カートリッジ１０を収容した呼気中微生物検知装置１の斜視図である。呼気中微生物検知装置１では、患者の呼気を吹き込んだ呼気バッグ１２１を着脱自在とするために、呼気バッグ１２１の取付口１２８２が上面に形成されている。この取付口１２８２には、呼気中微生物検知装置１の内部を這うように設けられた連結管１２８１が連結されている。連結管１２８１の端部は、カートリッジ１０の中央部に形成した吸気口１００に嵌合可能になっている。
【００４６】
呼気中の微生物を捕集・検知するカートリッジ１０は、呼気中微生物検知装置１の一側面の上部に形成した窓部１２８３の近傍に設けたカートリッジホルダ１２７に収容される。カートリッジ１０をカートリッジホルダ１２７に収容した後に呼気中微生物検知装置１を封止するため、窓部１２８３には開閉可能なふた１２８が取り付けられている。ふた１２８には、連結管１２８１が取り付けられている。したがって、ふた１２８が窓部１２８３を閉じると、Ｌ字状に曲げられた連結管１２８１の先端がカートリッジ１０の吸気口１００に自動的に嵌合する。
【００４７】
呼気中微生物検知装置１の背面側には、カートリッジ１０に捕集された微生物粒子を蛍光検知するための光学検出器１２４が配置されている。光学検出器１２４の背面側には、カートリッジ１０に形成された各流路１０５１、１０５２等を減圧して、呼気バッグ１２１中の呼気や噴霧器１２８により霧化された蛍光色素のミストをカートリッジ１０に吸引するポンプ１２２が配置されている。
【００４８】
呼気中微生物検知装置１の内部であってカートリッジホルダ１２７の側部には、呼気中の微生物に特異的に結合する蛍光色素を含む液体を霧化する噴霧器１２３が配置されている。また、カートリッジホルダ１２７の下方には、呼気中微生物検知装置１の動作を制御する制御部１２５と、検査内容や検査結果を表示する表示部１２６とが配置されている。図５では、制御部１２５と表示部１２６を呼気中微生物検知装置１に組み込んでいるが、外部接続したパーソナル・コンピュータ等で代用してもよい。
【００４９】
図６は、呼気バッグ１２１及び噴霧器１２３からカートリッジ１０間に形成された各流路の配管系統図である。呼気バッグ１２１には、呼気を収集した後に収集した呼気が漏れるのを防止する図示しないバルブが形成されており、このバルブは呼気中微生物検知装置１に呼気バッグ１２１を取り付けると自動的に開放する。
【００５０】
呼気中微生物検知装置１では、呼気バッグ１２１の連結管１２８１にバルブ１３１１が、この連結管１２８１から分岐した噴霧器１２３用の配管の途中にバルブ１３１２が、それぞれ設けられている。上述したように、連結管１２８１の先端部は、カートリッジ１０の吸気口１００に連結する。
【００５１】
一方、ポンプ１２２の吸気配管１３１は複数の配管系に分岐しており、その一つの配管系１３２はカートリッジ１０の廃液容器１０３に連通する通気口１０１４に、他の一つの配管系１３３は洗浄液容器１０２に連通する通気口１０１２及び廃液容器１０３に連通する通気口１０１１に連結する。配管１３２にはバルブ１３１５が、配管１３３にはバルブ１３１３が介在されている。カートリッジ１０の洗浄容器１０２に連通する通気口１０１３には、大気開放される配管１３４が連結する。この配管１３４には、バルブ１３１４が取り付けられている。なお、上記各バルブは、呼気中微生物検知装置１の内部に設けられている。
【実施例１】
【００５２】
図７〜図８Ｃを用いて、呼気中微生物検知装置１の各工程および各工程における各バルブ１３１１〜１３１５の開閉状態を説明する。ここで、図７は、呼気中微生物検知装置１を用いて呼気中の微生物粒子を検知するフローチャートであり、準備および捕集、標識、洗浄、検出の各工程を示す図である。また、図８Ａ〜図８Ｃは捕集および標識、洗浄の各工程におけるカートリッジ１０内の流動の状態と、捕集板１１４での微生物粒子１５０や蛍光色素１５４の流動状態を示す図である。
（０）準備工程
呼気中の微生物を検知する作業が開始されると、検査者は、患者の呼気を吹き込んだ呼気バッグ１２１とカートリッジ１０を呼気中微生物検知装置１に装着し、ふた１２８を閉じる。その後、制御部１２５に設けた入力手段から検査内容を指定し、検査する。これらの情報は、表示部１２６に表示される。呼気中微生物検知装置１に必要道具もしくはカートリッジ１０や呼気バッグ１２１が装着されているか否かを制御部１２５が、ステップＳ３１０でチェックする。必要道具が設置もしくは装着されていないときには、表示部１２６に警告が表示される(ステップＳ３００)。準備が完了したら捕集工程が開始される(ステップＳ３２０)。【００５３】
なお、本実施例では患者の呼気を検査対象としているが、呼気バッグ１２１の代わりに生活環境の大気等が封入されたバッグを用いれば、生活環境の大気中の微生物粒子や、動物の皮膚の破片、ダニの糞や死骸、ハウスダストなどのアレルゲンの他、排ガス粒子、アスベストなどの鉱石粒子を検知することも可能である。【００５４】
表１に、各工程における各バルブ１３１１〜１３１５及びポンプ１２２、光学検出器１２４の状態を示す。以下、この表１と図７、図８Ａ〜図８Ｃを参照しながら、捕集および標識、洗浄、検出の各工程について説明する。【００５５】
【表１】
0005860175.tif 000002
【００５６】
（１）捕集工程
捕集工程では、呼気バッグ１２１とカートリッジ１０の吸気口１００間を接続する連結管１２８１に設けたバルブ１３１１を開状態にする。また、カートリッジ１０の廃液容器１０３の流入側に連通する通気口１０１１及び洗浄液容器１０２の流出側に連通する通気口１０１２とポンプ１２２間を接続する配管１３３に設けたバルブ１３１３も開状態にする。これにより、ポンプ１２１が吸引動作をすると、図８Ａに示すように、呼気バッグ１２１中の呼気は、カートリッジ１０の吸気口１００と上記通気口１０１１、１０１２に流入する。【００５７】
また、洗浄液容器１０１３の上端部に形成した通気口１０１３に連結する配管１３４に設けたバルブ１３１４及び廃液容器１０３の上端部に形成した通気口１０１４に連結する配管１３２に設けたバルブ１３１５を閉状態にする。これにより、カートリッジ１０の洗浄液容器１０２内の洗浄液１０２１は、洗浄液容器１０２内に留まる。【００５８】
この状態では、呼気中に含まれる微生物粒子１５０は多孔板１１２の微細孔１１５を通過し、捕集板１１４に衝突する。衝突した微生物粒子１５０は、捕集板１１４の表面に結合している抗体１５１と特異的に結合し、捕集板１１４表面に捕集される。
（２）標識工程
設定した捕集時間ｔａ（ｍｉｎ）が経過したか否かを、制御部１２５が判断する（ステップＳ３３０）。捕集時間ｔａ（ｍｉｎ）が経過したら、標識工程を開始する(ステップＳ３４０)。【００５９】
標識工程では、連結管１２８１から分岐し噴霧器１２３に接続する配管に設けたバルブ１３１２を開状態にする。また、廃液容器１０３の流入側に連通する通気口１０１１及び洗浄液容器１０２の流出側に連通する通気口１０１２とポンプ１２２間を接続する配管１３３に設けたバルブ１３１３も開状態にする。【００６０】
その結果、ポンプ１２１を吸引動作させると、図８Ｂに示すように、噴霧器１２３で発生した蛍光色素１５４を含むミスト１５３は、カートリッジ１０の吸気口１００を経由してカートリッジ１０内に捕集される。このとき、ミスト１５３は多孔板１１２の微細孔１１５を通過して、捕集板１１４に衝突する。衝突したミスト１５３は、捕集板１１４の表面に捕集されている微生物粒子１５０と衝突し、ミスト１５３内の蛍光色素１５４と微生物粒子１５０は特異的に結合する。
（３）洗浄工程
設定した標識時間ｔｂ（ｍｉｎ）が経過したか否かを、制御部１２５が判断する(ステップＳ３５０)。標識時間ｔｂ（ｍｉｎ）が経過したら、洗浄工程を開始する（ステップＳ３６０）。【００６１】
洗浄工程では、洗浄液容器１０２の上端部に連通する通気口１０１３に接続する配管１３４に設けたバルブ１３１４と、廃液容器１０３の上端部に連通する通気口１０１４に接続する配管１３２に設けたバルブ１３１５を開状態にする。【００６２】
ポンプ１２２の吸引動作により、図８Ｃに示すように、洗浄液容器１０２内の洗浄液１０２１は、洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４を連結する流路１０５１を経て、捕集・検知部１０４へ流入する。次いで、捕集・検知部１０４と廃液容器１０３とを連結する流路１０５２を経由して廃液容器１０３に流入する。このとき、捕集板１１４に非特異的に吸着した蛍光色素１５４は、水流１５５(図８Ｃ参照)とともに除去される。捕集板１１４に非特異的に吸着した蛍光色素１５４は微生物検知の障害となるので、検知精度を向上させるために、非特異的に吸着した蛍光色素１５４を可能な限り除去する。  
（４）検出工程  
設定した洗浄時間ｔｃ（ｍｉｎ）が経過したか否かを制御部１２５が判断する(ステップＳ３７０)。洗浄時間ｔｃ（ｍｉｎ）が経過したら、検出工程を開始する(ステップＳ３８０)。検出工程では、カートリッジ１０の捕集板１１４に光学検出器１２４から励起光を照射し、微生物粒子１５０に結合した蛍光色素１５４で発生した蛍光を検出することで、微生物粒子１５０を検知する。
【００６３】
図９に、光学検出器１２４の光学系の一例を、模式図で示す。光学検出器１２４は、光源１４３および励起光集光レンズ１４１２、ダイクロイックミラー１４２１、対物レンズ１４１１、バンドパスフィルタ１４２２、ミラー１４２３、蛍光集光レンズ１４１３、光検出器１４４を備える。【００６４】
光源１４３は、励起光を発生する。励起光集光レンズ１４１２は、光源１４３から発せられた励起光を集光する。ダイクロイックミラー１４２１は、励起光の波長域の光を反射し、微生物粒子１５０に結合した蛍光色素からの蛍光の波長域の光を透過する。対物レンズ１４１１は、励起光を捕集板１１４に照射し、微生物粒子１５０に結合した蛍光色素からの蛍光を集光する。バンドパスフィルタ１４２２は、蛍光の波長域の光のみを透過する。ミラー１４２３は、蛍光の光路を変えるために用いられる。蛍光集光レンズ１４１３は、蛍光を光検出器１４４に集光する。光検出器１４４は、蛍光の光エネルギーを電気エネルギーに変換する。【００６５】
光源１４３には、レーザーおよびＬＥＤ、水銀ランプ、ハロゲンランプのいずれかを使用する。光検出器１４４としては、光電子増倍管や半導体光センサを使用する。捕集板１１４に捕集された微生物粒子１５０の形状を知りたいときには、光検出器１４４の代わりにＣＣＤなどの画像取得装置を用いる。【００６６】
励起光には、波長３００ｎｍ〜８００ｎｍの光を利用する。長波長の励起光を使用するほど、捕集板１１４や多孔板１１２から発生する自家蛍光を抑えることができる。そのため、６００ｎｍ以上の波長の光を利用するのが好ましい。蛍光の波長は、使用する蛍光色素の種類にもよるが、励起光の波長よりも長波長である。【００６７】
検出工程では、捕集板１１４に捕集された微生物粒子１５０からの蛍光を、光検出器１４４が電圧値で取得する(ステップＳ３９０)。そして、光検出器１４４の出力値を予め定めた値Ｙ（ｍＶ）と制御部１２５が比較する(ステップＳ４００)。値Ｙは、捕集された微生物粒子がない状態で、捕集板１１４から発せられる蛍光を光検出器１４４で測定した電圧値である。この値Ｙを、捕集工程から標識工程に移行する直前のある時点で測定する。光検出器１４４の検出値が予め定めた値Ｙ（ｍＶ）より大きければ、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」を(ステップＳ４１０)、予め定めた値Ｙ（ｍＶ）以下であれば、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ」を、表示部１２６等に出力する。
【実施例２】
【００６８】
上記実施例１に記載の標識工程では、捕集した微生物粒子に蛍光色素を含むミストを衝突させて、微生物粒子と蛍光色素を結合させている。しかしながら、微生物粒子を捕集した捕集板表面に蛍光色素を含む液体を流動させても、微生物粒子と蛍光色素を結合させることが可能である。本実施例では、捕集板表面に蛍光色素を含む液体を流動させて、標識する場合を示す。【００６９】
図１０に、本発明に係るカートリッジの他の例を示す。カートリッジ２０は、液体を内部に保持し、呼気中もしくは空気中の微生物を捕集・検知するのに必要な工程を実行するための機構を内部に備える。図１０は、カートリッジ２０を背面側から見たときの斜視図であり、図２Ｂに対応する図である。【００７０】
本実施例では、実施例１に示したカートリッジ１０の構成に加え、試薬溶液としての色素液容器２０６、及びこの色素液容器２０６と洗浄液容器１０２とを接続する流路２０５１が、洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４を連結する流路１０５１から分岐して形成されている。色素液容器２０６は、捕集・検知部１０４の上方に配置されており、微生物に特異的に結合する蛍光色素液２０６１を貯蔵する。流路２０５１は、色素液容器２０６と捕集・検知部１０４を連通し、蛍光色素液２０６１が内部を流動する。
【００７１】
図１１は、本実施例に示した呼気中微生物検知装置１の配管系統図である。廃液容器１０３の流入側に連通する通気口１０１１に連結する配管１３３ａは、もはや洗浄液容器１０２の流出側に連通する通気口１０４６には連通していない。代わりに、色素液容器１２０６の上端部に連通する通気口１０１２に連結する配管１３５が設けられている。配管１３５にはバルブ１３１７が介在されており、配管１３５の端部は大気に開放されている。また、呼気バッグ１２１と吸気口１００を連結する配管１２８１は、噴霧器に分岐する分岐配管を有しておらず、吸気口１００に直接連結している。【００７２】
本実施例でも、実施例１と同様に、図７に示したフローチャートに従がって呼気中の微生物粒子を検知する。図１２Ａ〜図１２Ｃは、呼気中の微生物粒子を検出する上記フローにおいて、捕集および標識、洗浄の各工程を取り上げた図である。これらの図では、カートリッジ２０内の流動の状態と捕集板１１４での微生物粒子１５０や蛍光色素１５４の流動状態を示している。【００７３】
呼気中の微生物を検出する図７に示すフローの中で、捕集および標識、洗浄、検出の各工程におけるバルブ１３１１〜１３１７の開閉状態、およびポンプ１２２と光学検知器１２４の動作状態を、表２に示す。【００７４】
【表２】
0005860175.tif 000003
【００７５】
（１）捕集工程
呼気バッグ１２１とカートリッジ２０の吸気口１００を接続する配管１２８１に設けたバルブ１３１１は、開状態とする。廃液容器１０の流入側に連通する通気口１０１１とポンプ１２２を接続する配管１３３ａに設けたバルブ１３１２も、開状態とする。ポンプ１２１を吸引動作させると、図１２Ａに示すように、呼気バッグ１２１中の呼気は、カートリッジ２０の吸気口１００と通気口１０１１に流入する。【００７６】
色素液容器２０６の上端部に連通する通気口１０１２に連結する配管１３５に設けたバルブ１３１７を、閉状態にする。洗浄液容器１０２の上端に連通する通気口１０１３に連結する配管１３４に設けたバルブ１３１４も、閉状態にする。さらに、廃液容器１０３の上端に連通する通気口１０１４に連結する配管１３２に設けたバルブ１３１５も、閉状態にする。これにより、カートリッジ２０の色素液容器２０６内の色素液２０６１と洗浄液容器１０２内の洗浄液１０２１は、それぞれの容器２０６、１０２内に留まる。【００７７】
このとき、呼気中に含まれる微生物粒子１５０は、多孔板１１２の微細孔１１５を通過して捕集板１１４に衝突する。衝突した微生物粒子１５０は、捕集板１１４の表面に結合している抗体１５１と特異的に結合し、捕集板１１４の表面に捕集される。
（２）標識工程
設定した捕集時間ｔａ（ｍｉｎ）が経過したら、標識工程に移行する。標識工程では、色素液容器２０６の上端に連通する通気口１０１２に連結する配管１３５に設けたバルブ１３１７と、廃液容器１０３の上端に連通する通気口１０１４に連結する配管１３２に設けたバルブ１３１５を開状態にする。【００７８】
ポンプ２２２が吸引動作すると、図１２Ｂに示すように、カートリッジ２０の色素液容器２０６内の色素液２０６１は、色素液容器２０６と捕集・検知部１０４とを連結する流路２０５１を経て捕集・検知部１０４に流入する。そして、捕集・検知部１０４と廃液容器１０３とを連結する流路１０５２を経由して、廃液容器１０３に流入する。このとき、蛍光色素１５４を含む液体は捕集板１１４上を水流２５５として流れる。その際、捕集板１１４の表面に捕集されている微生物粒子１５０と蛍光色素１５４が、特異的に結合する。
（３）洗浄工程
設定した捕集時間ｔｂ（ｍｉｎ）が経過したら、洗浄工程に移行する。洗浄工程では、洗浄液容器１０２の上端に連通する通気口１０１３に連結する配管１３４に設けたバルブ１３１４と、廃液容器１０３の上部に連通する通気口１０１４に接続する配管１３２に設けたバルブ１３１５の双方を開状態にする。【００７９】
ポンプ２２２が吸引動作すると、図１２Ｃに示すように、洗浄液容器１０２内の洗浄液１０２１は、洗浄液容器１０２と捕集・検知部１０４とを連結する流路１０５１を経由して、捕集・検知部１０４に流入する。そして、捕集・検知部１０４と廃液容器１０３とを連結する流路１０５２を経由して廃液容器１０３に流入する。このとき、捕集板１１４に非特異的に吸着した蛍光色素１５４は、水流２５６とともに除去される。
（４）検出工程
設定した洗浄時間ｔｃ（ｍｉｎ）が経過したら、検出工程に移行する。検出工程では、光学検出器１２４からカートリッジ１０に取り付けた捕集板１１４に励起光を照射する。励起光により、微生物粒子１５０に結合した蛍光色素１５４は蛍光を発生する。光学検出器１２４は発生した蛍光を検出して、微生物粒子１５０を検知する。【００８０】
以上説明したように本発明の各実施例によれば、ディスポーザブルなカートリッジにインパクタとなる多孔板及び捕集板を設けているので、呼気中微生物検知装置の本体側の汚染を極力低減できる。これにより、多数回の使用においても誤検出が少なくなる。また、カートリッジのインパクタとして使用する捕集面側と反対側に検出面を構成し、検出面側を透明にしたので、背面側からの光学的検出が可能になり、呼気中微生物検知装置のコンパクト化が可能になる。さらに、検査者は呼気バッグを取り付けるだけであり、医療行為に該当せず、短時間で自動的に微生物を検出できる。
【００８１】
なお、上記実施例では多孔板を使用しているが、検出対象物質が比較的大きな物質の場合には微細孔を１個にして検出対象物質を検出するようにしてもよい。この場合、検出対象物質をより正確に特定できる。
【符号の説明】
【００８２】
１…呼気中微生物検知装置(気中物質検知装置)、１０、２０…カートリッジ、１００…吸気口、１０２…洗浄液容器、１０３…廃液容器、１０４…捕集・検知部、１０６…試薬容器、１１０…本体、１１１…粘着層、１１２…多孔板(導入板)、１１３…スペーサ、１１４…捕集板、１１５…微細孔、１１６…通気口、１２０…筐体、１２１…呼気バッグ、１２２…ポンプ、１２３…噴霧器、１２４…光学検出器、１２５…制御部、１２６…表示部、１２７…カートリッジホルダ、１２８…ふた、１３１…吸気配管、１３２〜１３５…配管、１４３…光源、１４４…光検出器、１５０…微生物粒子、１５１…抗体、１５３…ミスト、１５４…蛍光色素、１５５…水流、２０６…色素液容器(試薬容器)、２５５、２５６…水流、１０１１〜１０１４…通気口、１０２１…洗浄液、１０４１〜１０４４…連通孔、１０４５、１０４６…連結部、１０５１、１０５２…連絡流路、１０６１…試薬、１１０１…溝、１１３１…開口、１２２２…矢印、１２４１…励起光、１２４２…蛍光、１２８１…連結管、１２８２…取付口、１２８３…窓、１３１１〜１３１７…バルブ、１４１１…対物レンズ、１４１２…励起光集光レンズ、１４１３…蛍光集光レンズ、１４２１…ダイクロイックミラー、１４２２…バンドバスフィルタ、１４２３…ミラー、２０５１、２０５２…連結流路、２０６１…色素液、ｔａ〜ｔｃ…時間、Ｌｘ〜Ｌｚ…寸法。
【図１】
0005860175.tif 000004
【図２Ａ】
0005860175.tif 000005
【図２Ｂ】
0005860175.tif 000006
【図３Ａ】
0005860175.tif 000007
【図３Ｂ】
0005860175.tif 000008
【図３Ｃ】
0005860175.tif 000009
【図４】
0005860175.tif 000010
【図５】
0005860175.tif 000011
【図６】
0005860175.tif 000012
【図７】
0005860175.tif 000013
【図８Ａ】
0005860175.tif 000014
【図８Ｂ】
0005860175.tif 000015
【図８Ｃ】
0005860175.tif 000016
【図９】
0005860175.tif 000017
【図１０】
0005860175.tif 000018
【図１１】
0005860175.tif 000019
【図１２Ａ】
0005860175.tif 000020
【図１２Ｂ】
0005860175.tif 000021
【図１２Ｃ】
0005860175.tif 000022