(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬並びにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定することを特徴とする、蛍光又は吸光度の検出方法。
【化１】
0005875096.tif 000015
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項２】
前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項１に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
【請求項３】
還元剤の共存下に、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応を下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬の存在下で行うことを特徴とする、バックグラウンド抑制方法。
【化２】
0005875096.tif 000016
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項４】
前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項３に記載のバックグラウンド抑制方法。
【請求項５】
グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、
前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、
を有することを特徴とするＡＤＰの測定方法。
【化３】
0005875096.tif 000017
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項６】
前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項５に記載のＡＤＰの測定方法。
【請求項７】
ＡＴＰの存在下、ＡＤＰを生成する酵素を基質に作用させてＡＴＰをＡＤＰに変換させる第１−１工程と、
グルコースに、前記第１−１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、
前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、
を有することを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
【化４】
0005875096.tif 000018
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項８】
前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項７に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
【請求項９】
前記ＡＤＰを生成する酵素が、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項７又は８に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
【請求項１０】
糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＭＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
グルコースに、前記第１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、
前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬存在下、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、
を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
【化５】
0005875096.tif 000019
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項１１】
前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項１０に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
【請求項１２】
前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１０又は１１に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
【請求項１３】
グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びに下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰの測定用キット。
【化６】
0005875096.tif 000020
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項１４】
前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項１３に記載のＡＤＰの測定用キット。
【請求項１５】
グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びに下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
【化７】
0005875096.tif 000021
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項１６】
前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項１５に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
【請求項１７】
ＡＴＰ及びＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ若しくはＣＭＰキナーゼを含む第１液と、
グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン、並びに下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬を含む第２液と、
を含むことを特徴とする糖転移酵素の活性測定キット。
【化８】
0005875096.tif 000022
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
【請求項１８】
前記第１液がさらに還元剤を含む請求項１７に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
【請求項１９】
前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである請求項１７又は１８に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、キナーゼ等のＡＤＰ産生酵素又は糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法、それを用いた糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性調節剤のスクリーニング方法、及びそれらのための測定キットに関する。
本願は、２０１３年１１月２１日に、日本に出願された特願２０１３−２４０９２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
糖転移酵素はグリコシル基を含む供与体（Ｇ）から受容体（Ａ）にグリコシル基を転移してＧ−Ａをつくる反応を触媒する酵素の総称である（非特許文献１）。動物では９種類の糖ヌクレオチド（ＧＤＰ−フコ-ス、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−キシロース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−シアル酸）が主な供与体分子である（非特許文献２）。
これら供与体分子からグリコシル基を転移させる糖転移酵素はそれぞれフコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれている。
ＧＤＰはグアノシン５’−ニリン酸、ＵＤＰはウリジン５’−ニリン酸、ＣＭＰはシチジン５’−一リン酸の略である。受容体分子としては単糖、オリゴ糖、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質等が挙げられる。【０００３】
生体分子の機能発現に糖鎖が重要な役割を果たしていることが知られており、糖転移酵素の活性異常は、がん、感染症、免疫疾患、炎症、神経疾患などの疾患と関連することが明らかにされている（非特許文献３）。従って、糖転移酵素の活性調節剤（阻害剤又は活性化剤）はこれらの疾患の新たな治療薬となることが期待される。【０００４】
糖転移酵素の活性調節剤を探索するには糖転移酵素の活性を測定することが必要である。糖転移酵素の活性を測定する方法としては従来、放射性標識や蛍光標識した糖分子を用いてアッセイする方法や、非標識糖分子を用いて反応後にＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析機）等の機器分析により分離定量する方法等が用いられてきた（非特許文献４）。
しかしながら、これらの方法は標識糖供与体の化学合成が必要であったり、測定に特殊な装置（液体シンチレーターやＬＣ−ＭＳ）が必要であったりと、簡便にアッセイすることが難しく、殊にマイクロプレートを用いて大量の数のアッセイ（ハイスループットスクリーニング）を行うことは難しかった。
また費用的にもコストのかかる方法であった。【０００５】
一方、糖転移酵素反応で生成したヌクレオチドを市販のアッセイキット（Ｂｅｌｌｂｒｏｏｋ  Ｌａｂｓ社製Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＧＤＰ  Ａｓｓａｙ、同ＵＤＰ２  Ａｓｓａｙ、同ＡＭＰ２／ＧＭＰ２  Ａｓｓａｙ）を用いて蛍光偏光法で定量する方法や、酵素カップリング反応によりＮＡＤＨの吸光度に導いて測定する方法（非特許文献５、６）、又はリン酸を遊離させてマラカイトグリーンの発色で定量する方法（非特許文献７）が知られているが、いずれも検出感度は低い。
また、酵素カップリングによりルシフェラーゼの化学発光に誘導して測定する方法も知られているが（特許文献１）、操作が煩雑であり感度は不明である。
また最近、蛍光標識された糖の転移を、蛍光偏光法を用いて高速にアッセイする方法も報告されたが（非特許文献８）、高分子性の基質にしか用いることはできず、全ての糖転移酵素に応用できる訳ではない。
このように、マイクロプレートを用いてあらゆる糖転移酵素を簡便かつ高感度にアッセイすることは従来の方法では難しく、糖転移酵素活性調節剤のハイスループットスクリーニングは困難なものであった。【０００６】
一方、キナーゼは、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）などヌクレオシド三リン酸の末端リン酸基を水以外の化合物に転移し、リン酸化合物を生ずる反応を触媒する酵素の総称であり、ＥＣ２．７群のホスホトランスフェラーゼに分類される（非特許文献９）。リン酸化を受ける基質分子としては、糖、有機酸、脂質、タンパク質などが挙げられる。キナーゼは生体内のシグナル伝達に関わる重要な酵素分子でもある。ある種のがん細胞ではキナーゼ活性が亢進していることが知られ、キナーゼの阻害剤はいわゆる分子標的薬としてがんの治療に用いられている。また、キナーゼは炎症や免疫反応、糖尿病などにも関わっていることが知られている。
従ってキナーゼは、がん、炎症、自己免疫疾患、糖尿病等の疾患に対する治療薬開発の恰好の標的分子であり、その新た阻害剤の探索研究が広く行われている（非特許文献１０）。【０００７】
キナーゼ活性調節剤（阻害剤又は活性化剤）を探索するには、キナーゼの活性を測定することが必要である。キナーゼ活性の測定方法としては、リン酸化された生成物を定量する方法、ＡＴＰの減少量を測定する方法、ＡＴＰから生じたＡＤＰ（アデノシン５’−ニリン酸）を定量する方法、が主な方法として挙げられる。
リン酸化された生成物を定量する方法としては、放射性ＡＴＰから生じる放射性生成物を放射能カウントで測定する方法、リン酸化された生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する方法、リン酸化された生成物を抗体で検出し時間分解蛍光法等により分光学的に定量する方法（例えば、カルナバイオサイエンス社製ＱＳＳ  Ａｓｓｉｓｔ（商標）ＴＲ−ＦＲＥＴ  アッセイキット）等が挙げられる。
ＡＴＰの減少量を測定する方法としては、キナーゼ反応液中の残存ＡＴＰ量を、ルシフェラーゼを用いて化学発光で定量する方法（例えば、東洋ビーネット社製『細胞の』ＡＴＰ 測定試薬（商標）が挙げられる。
ＡＴＰから生じたＡＤＰを定量する方法としては、１）ＡＴＰに再変換してルシフェラーゼと反応させ化学発光で定量する方法（例えば、プロメガ社製ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ）、２）抗ＡＤＰ抗体を用いて時間分解蛍光法または蛍光偏光法により分光学的に定量する方法（例えば、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ Ｌａｂｓ社製Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標） ＡＤＰ  ＴＲ−ＦＲＥＴ  Ａｓｓａｙ、同Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＤＰ  Ａｓｓａｙ）、３）ＡＤＰにホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素にさらに１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンとパーオキシダーゼを作用させて蛍光測定する方法（例えば、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社製ＡＤＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＨＳ  Ａｓｓａｙ）、４）ＡＤＰにグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ）を作用させてＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を生成させてＮＡＤＰＨの吸光度または蛍光で定量する方法（特許文献２〜３）、５）ＡＤＰにグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で定量する方法（特許文献４）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−４６０２９号公報
【特許文献２】特開平９−２３４０９８号公報
【特許文献３】特開２０１１−１０３８２５号公報
【特許文献４】米国第特許７３３８７７５号公報明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】生化学辞典  第４版、p.931、東京化学同人、2007年
【非特許文献２】Essentials of Glycobiology、2nd edition、Part I、Chapter 4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2009年（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1929/）
【非特許文献３】「きちんとわかる糖鎖工学」、産業技術総合研究所、白日社、2008年
【非特許文献４】ChemBioChem、Vol.11、No.14、pp.1939-1949、2010年
【非特許文献５】Anal. Biochem.、Vol.102、No.2、pp.441-449、1980年
【非特許文献６】Anal. Biochem.、Vol.220、No.1、pp.441-449、1994年
【非特許文献７】Glycobiology、Vol.21、No.6、pp.727-733、2011年
【非特許文献８】Angew. Chem. Int. Ed. Vol.50、No.52、pp.12534-12537、2011年
【非特許文献９】生化学辞典  第４版、p.340、東京化学同人、2007年
【非特許文献１０】「分子標的薬開発への新たなる挑戦  有力な分子標的薬の創薬物語と新薬開発動向から次世代創薬テクノロジーまで」、岡野栄之、岩坪 威、佐谷秀行編、実験医学増刊、Vol.27、No.5、羊土社、2009年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このようにキナーゼの活性を測定する方法として各種の方法が知られているが、操作が煩雑である、特別の装置・施設が必要である、試薬が高価である、感度が十分でない等の理由により、大量のスクリーニングサンプルをアッセイするハイスループットスクリーニングに用いるには難点があった。
また、前記４）のＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼを用いて酵素カップリングによりＮＡＤＰＨに導いてＮＡＤＰＨの吸光度または蛍光で定量する方法は、検出感度が低いことに加え、スクリーニングサンプル化合物に由来する３４０ｎｍ波長付近の紫外・可視部吸収や自家蛍光が測定値に影響を与えるため正確な測定が行えないという問題があった。
また、前記５）のＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ、ジアホラーゼ、レサズリンを作用させて生成物レゾルフィンの蛍光で測定する方法の場合、反応液中にジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤が含まれると、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで蛍光のバックグランドが上昇するため正確な測定が行えなくなるという問題があった。
還元剤は、化合物の非特異的吸着を抑えるためや、酵素などの試薬の安定化剤としてなど、反応系に加えられる場合が少なくない。【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法、標的酵素の活性を簡便かつ高感度に測定することができる、糖転移酵素の活性測定方法、ＡＤＰの測定用キット、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット、及び糖転移酵素活性測定キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはレサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定する方法を種々検討した結果、ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素）によりレサズリンをレゾルフィンへと還元することにより生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定可能となることを見出した。
また、本発明者らは糖転移酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を種々検討した結果、糖転移酵素により生成するＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼ（ヌクレオシド５’−二リン酸キナーゼ）又はＣＭＰキナーゼ（シトシン５’−一リン酸キナーゼ）と反応させることでＡＤＰを生成させ、このＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ）、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを用いた酵素カップリングを行わせることにより、ほぼ全ての糖転移酵素の活性を簡便、高感度かつ定量的にマイクロプレートで、蛍光で定量することが可能であること、ＡＤＰをこの酵素カップリングにより蛍光定量する方法において反応液中にＤＴＴ等の還元剤が存在すると蛍光発色のバックグランドが高くなってＡＤＰの正確な定量が困難となるが、酵素カップリング反応の反応液中にＳＨ試薬を共存させるとバックグランドが下がる一方、ＡＤＰの酵素カップリング反応自体には影響しないのでＡＤＰを精度よく測定できること、このＳＨ試薬存在下のＡＤＰ蛍光定量法は広範なキナーゼの活性定量に用いることができること、を見出した。【００１３】
本発明は、かかる発見に基づきさらに検討を重ねて、蛍光又は吸光度の検出方法、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の簡便かつ高感度な活性測定方法として完成したものである。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ＡＤＰの測定方法、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法、糖転移酵素の活性測定方法、ＡＤＰの測定用キット、ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット、糖転移酵素の活性測定キットを提供する。【００１４】
（１）下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬並びにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定することを特徴とする、蛍光又は吸光度の検出方法。
【化１】
0005875096.tif 000002
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（２）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（１）に記載の蛍光又は吸光度の検出方法。
【００１５】
（３）還元剤の共存下に、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応を下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬の存在下で行うことを特徴とする、バックグラウンド抑制方法。
【化２】
0005875096.tif 000003
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（４）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（３）に記載のバックグラウンド抑制方法。
【００１６】
（５）グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、
前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、
を有することを特徴とするＡＤＰの測定方法。
【化３】
0005875096.tif 000004
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（６）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（５）に記載のＡＤＰの測定方法。
【００１７】
（７）ＡＴＰの存在下、ＡＤＰを生成する酵素を基質に作用させてＡＴＰをＡＤＰに変換させる第１−１工程と、
グルコースに、前記第１−１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、
前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、
を有することを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
【化４】
0005875096.tif 000005
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（８）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（７）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
（９）前記ＡＤＰを生成する酵素が、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記（７）又は（８）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法。
【００１８】
（１０）糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＭＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
グルコースに、前記第１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、
前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、
下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬存在下、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、
を有することを特徴とする糖転移酵素の活性測定方法。
【化５】
0005875096.tif 000006
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（１１）前記一般式［１］で表されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（１０）に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
（１２）前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である前記（１０）又は（１１）に記載の糖転移酵素の活性測定方法。
【００１９】
（１３）グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びに下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰの測定用キット。
【化６】
0005875096.tif 000007
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（１４）前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（１３）に記載のＡＤＰの測定用キット。
【００２０】
（１５）グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びに下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬を含むことを特徴とするＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
【化７】
0005875096.tif 000008
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（１６）前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（１５）に記載のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット。
【００２１】
（１７）ＡＴＰ及びＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ若しくはＣＭＰキナーゼを含む第１液と、
グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン、並びに下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物及び２−ヨードアセトアミドから選ばれるＳＨ試薬を含む第２液と、
を含むことを特徴とする糖転移酵素の活性測定キット。
【化８】
0005875096.tif 000009
（式［１］中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。）
（１８）前記第１液がさらに還元剤を含む前記（１７）に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
（１９）前記一般式［１］で示されるマレイミド化合物が、Ｎ−エチルマレイミド、マレイミド又はＮ−（２−スルホエチル）マレイミドである前記（１７）又は（１８）に記載の糖転移酵素の活性測定キット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができる。
本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性を簡便かつ高感度に測定する方法を提供することができる。
本発明は、マイクロプレートを用いるアッセイに適しているため、本発明によれば、糖転移酵素、又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性調節剤のハイスループットスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の方法の原理を表す反応経路である。
【図２】実施例におけるＧＤＰとＵＤＰの検量線である。
【図３】実施例におけるＣＭＰの検量線である。
【図４】実施例におけるＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰを測定した場合の蛍光発色の安定性を示したグラフである。
【図５】実施例におけるフコシルトランスフェラーゼ（ヒトＦＵＴ７）の活性を測定した結果である。
【図６】実施例におけるガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）の活性を測定した結果である。
【図７】実施例におけるシアリルトランスフェラーゼ（ヒトＳＴ６Ｇａｌ１）の活性を測定した結果である。
【図８】実施例における没食子酸 (ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ) のヒトＦＵＴ７に対する阻害活性を測定した結果である。ＨＰＬＣを用いて測定した場合と比較して示した。
【図９】実施例におけるＡＤＰの検量線である。酵素カップリング反応時にＮ−エチルマレイミドを存在させた場合と存在させなかった場合とを比較して示した。
【図１０】実施例におけるＡＤＰを定量した場合の蛍光発色の安定性を示したグラフである。
【図１１】実施例における２ｍＭ  ＤＴＴを含有させたＡＤＰ溶液の検量線である。酵素カップリング反応液にＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を存在させた場合と存在させなかった場合とを比較して示した。
【図１２】ＤＴＴ含有／非含有のＡＤＰの検量線測定において、酵素カップリング反応液にヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を存在させた場合と存在させなかった場合を比較した実施例の結果である。
【図１３】実施例におけるヒトＣＭＰ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＣＭＰＫ１）の活性のＤＴＴ依存性を表す結果である。
【図１４】実施例における２ｍＭ  ＤＴＴ存在下でのＣＭＰＫ１の酵素活性の測定をＮ−エチルマレイミドを存在させて酵素カップリング反応をさせた場合と存在させずに測定した場合とを比較して示した結果である。
【図１５】実施例におけるヒトＣＭＰＫ１のキナーゼ活性を測定した結果である。。
【図１６】実施例におけるＡｐ５Ａ（Ｐ１，Ｐ５−Ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５'）ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ） のＣＭＰＫ１に対する阻害活性の測定結果である。ＨＰＬＣを用いて測定した場合と比較して示した。
【図１７Ａ】ＨＰＬＣで市販キナーゼ（ＵＭＰキナーゼ：ＵＭＰＫ）に夾雑するＡＴＰアーゼ活性を測定した結果である。
【図１７Ｂ】実施例における市販キナーゼ（ＵＭＰキナーゼ：ＵＭＰＫ）に夾雑するＡＴＰアーゼ活性を測定した結果である。ＨＰＬＣで測定した結果と比較して示した。
【図１８Ａ】実施例における市販化合物ライブラリー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標））を用いてガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）阻害剤をスクリーニングした結果である。化合物は１０μＭでアッセイした。Ｂ４ＧａｌＴ１反応に対する阻害率測定結果を図１８Ａに表した。各グラフとも横軸は１２８０個の化合物を表す。
【図１８Ｂ】実施例における市販化合物ライブラリー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標））を用いてガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）阻害剤をスクリーニングした結果である。化合物は１０μＭでアッセイした。本アッセイ系自体への阻害作用測定結果を図１８Ｂに表した。各グラフとも横軸は１２８０個の化合物を表す。
【図１８Ｃ】実施例における市販化合物ライブラリー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標））を用いてガラクトシルトランスフェラーゼ（ヒトＢ４ＧａｌＴ１）阻害剤をスクリーニングした結果である。化合物は１０μＭでアッセイした。前者阻害率から後者阻害率を差し引いた正味のＢ４ＧａｌＴ１阻害活性と考えられる阻害率を図１８Ｃに表した。各グラフとも横軸は１２８０個の化合物を表す。
【図１９Ａ】実施例におけるマレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量の結果である。
【図１９Ｂ】実施例におけるマレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量の結果である。
【図１９Ｃ】実施例におけるマレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量の結果である。
【図２０Ａ】実施例における還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量の結果である。
【図２０Ｂ】実施例における還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量の結果である。
【図２０Ｃ】実施例における還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の好ましい例を説明するが、本発明はこれら例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
＜蛍光又は吸光度の検出方法＞
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
図１中、第２−３工程として示すように、本発明の蛍光又は吸光度の検出方法は、ＳＨ試薬及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ジアホラーゼによりレサズリンをレゾルフィンに還元し、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する。
【００２５】
蛍光強度又は吸光度の測定は、例えば、ＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、レサズリンとの混合液（以下、第２−３工程用混合液という）を得て酵素カップリング反応させることで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。第２−３工程用混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
【００２６】
第２−３工程で用いられるジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
【００２７】
添加後の各成分の濃度は、ジアホラーゼが０．２〜２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが１〜５００μＭ、１０〜５００μＭ、レサズリンが５〜２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ〜１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、第２−３工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２−３工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２−３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ〜５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
【００２８】
第２−３工程用混合液には、ＳＨ試薬を添加して第２−３工程の反応を行う。例えば、反応液中に還元剤が存在したまま第２−３工程の反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２−３工程用混合液にＳＨ試薬が添加されていることで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
ＳＨ試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。１）５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２，２'(４，４')−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、２）ｐ−メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、ｐ−メルクリベンゼンスルホン酸（ＰＭＢＳ）などのメルカプチド形成剤、３） ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）などのアルキル化剤が挙げられる（生化学辞典 第４版、ｐ．１７３、東京化学同人、２００７年参照）。
本発明で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−（２−クロロフェニル）マレイミド、Ｎ−(４−カルボキシ−３−ヒドロキシフェニル)マレイミド等のマレイミド誘導体（マレイミド化合物）、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体（マレイミド化合物）が好適である。
【００２９】
本発明の蛍光又は吸光度の検出方法で用いるＳＨ試薬としては、下記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
【００３０】
【化９】
0005875096.tif 000010
【００３１】
（式［１］中、
Ｒ１は水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表す。
Ｒ２は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基を表す。
ｎはＲ２の数を表し、０又は１である。）
【００３２】
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれる水酸基で置換されているアルキル基である。Ｒ１及びＲ２の炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基のアルキル基としては、前記Ｒ１及びＲ２の炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基は、少なくとも一つの水素原子が独立して選ばれるスルホ基で置換されているアルキル基である。Ｒ１及びＲ２の炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基のアルキル基としては、前記Ｒ１及びＲ２の炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基で例示したものと同様のものが挙げられる。
Ｒ１の前記炭素数６〜１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
Ｒ２の前記ハロゲン原子は、Ｆ，Ｃｌ, Ｂｒ, Ｉ等の周期表において第１７族に属する元素である。
【００３３】
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、炭素数１〜４が好ましく、炭素数１〜３がより好ましい。
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、炭素数１〜４が好ましく、炭素数１〜３がより好ましい。
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のヒドロキシアルキル基としては、炭素数１〜４が好ましく、炭素数１〜３がより好ましい。
Ｒ１及びＲ２の前記炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のスルホアルキル基としては、炭素数１〜４が好ましく、炭素数１〜３がより好ましい。
【００３４】
Ｒ１及びＲ２のアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、又はスルホアルキル基が有していてもよい置換基は、炭化水素基中の水素原子（Ｈ）を置換しているものであり、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
Ｒ１のアリール基が有していてもよい置換基は、アリール基中の水素原子（Ｈ）を置換しているものであり、置換基としては、炭素数１〜６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
【００３５】
＜バックグラウンド抑制方法＞
以下、本発明のバックグラウンド抑制方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明のバックグラウンド抑制方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の活性測定を行う場合の反応経路である。
本発明のバックグラウンド抑制方法は、還元剤の共存下に、図１中の第２−３工程として示すような、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、レサズリン及びジアホラーゼを反応させて、当該反応により生じる蛍光強度又は吸光度を測定する際に、前記反応をＳＨ試薬の存在下で行うものである。
【００３６】
還元剤が存在したまま第２−３工程の反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２−３工程用混合液にＳＨ試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
【００３７】
バックグラウンド抑制する対象の反応系としては、例えば、ＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、レサズリンとの混合液（以下、第２−３工程用混合液という）に還元剤が添加された混合液が挙げられる。第２−３工程用混合液に還元剤が添加された混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるＳＨ試薬、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ジアホラーゼ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
当該混合液中で、第２−３工程として示す反応を進めることで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをレゾルフィンの蛍光発光が生じる。ここで当該混合液にＳＨ試薬が添加されているので、前記蛍光発光を定量する際、検出対象とすべきシグナル以外のバックグラウンドのシグナルの上昇を抑えることができる。
【００３８】
第２−３工程で用いられるジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
【００３９】
添加後の各成分の濃度は、還元剤が１μＭ〜５ｍＭ、ジアホラーゼが０．２〜２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが１〜５００μＭ、１０〜５００μＭ、レサズリンが５〜２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ〜１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、第２−３工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２−３工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２−３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ〜５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
【００４０】
本発明のバックグラウンド抑制方法で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
【００４１】
本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
【００４２】
＜ＡＤＰの測定方法＞
以下、本発明のＡＤＰの測定方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明のＡＤＰの測定方法に係る反応経路の一例であり、糖転移酵素の酵素反応により生成されたＡＤＰの測定を行う場合の反応経路である。
図１中、第２−１工程、第２−２工程、及び第２−３工程からなる第２工程として示すように、本発明のＡＤＰの測定方法は、グルコースに、ＡＤＰおよびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、を有する。
【００４３】
ＡＤＰの測定は、例えば、ＡＤＰを定量するための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ、及びレサズリンとの混合液（以下、第２工程用混合液という）にＡＤＰが添加された混合液を得て、酵素カップリング反応させることで、ＡＤＰをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。第２工程用混合液を得るにあたっては、当該測定のための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらの一部を混合したものを加えることも可能である。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが０．１〜１０ｍＭ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが５〜５００μｇ／ｍｌ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼが１〜１００μｇ／ｍｌ、ジアホラーゼが０．２〜２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰが１〜５００μＭ、１０〜５００μＭ、レサズリンが５〜２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ〜１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、第２−３工程用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２−３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ〜５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
【００４４】
また、第２工程で用いられるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
【００４５】
本発明のＡＤＰの測定方法では、第２工程用混合液にＳＨ試薬を添加して第２工程の反応を行わせる。例えば、還元剤が存在したまま第２工程の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２工程の酵素カップリング用混合液にＳＨ試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
還元剤存在下で本発明のＡＤＰの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ〜５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
【００４６】
本発明のＡＤＰの測定方法で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
【００４７】
本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
【００４８】
本発明のＡＤＰの測定方法は、ＡＤＰの他、ＡＤＰを反応で生成する酵素の広範囲な活性測定方法としても用いることが可能である。
【００４９】
＜ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法＞
一方、本発明の上記第２工程のＡＤＰの定量方法はキナーゼなどＡＤＰを反応で生成する酵素の広範な活性測定法としても用いることが可能である。
即ち、本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法は、ＡＤＰを生成する酵素反応で生じるＡＤＰをＳＨ試薬存在下にグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定する。
本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法は、図１中、第１−１工程、並びに第２−１工程、第２−２工程及び第２−３工程からなる第２工程として示すように、
ＡＴＰの存在下、ＡＤＰを生成する酵素を基質に作用させてＡＴＰをＡＤＰに変換させる第１−１工程と、グルコースに、前記第１−１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、ＳＨ試薬存在下、レサズリンに、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ、及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、を有する。
以下、本発明の好ましい実施形態について、キナーゼを例に説明する。
【００５０】
測定対象とするキナーゼは、動植物組織や細胞から抽出したもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも良いが、精製したものが好ましい。
前記キナーゼとしては、例えばプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、カルモジュリンキナーゼ、カゼインキナーゼ等が挙げられる。
本発明において、酵素活性を測定しようとするキナーゼ反応は、キナーゼ、リン酸ドナー分子（通常はＡＴＰ）およびリン酸アクセプター分子（キナーゼに応じた基質分子）を緩衝液中で混合して行う。それぞれの添加濃度は、キナーゼは酵素反応率が１〜５０％程度となる濃度で添加するのが好ましく、リン酸ドナー分子（主としてＡＴＰ）は１０〜１０００μＭで添加するのが好ましく、リン酸アクセプター分子は５〜５００μＭで添加することが好ましい。キナーゼ反応に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭが好ましく、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として必要に応じ、１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
【００５１】
また、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合や、酵素活性を上昇させる（活性化・賦活化させる）ための活性化剤（賦活化剤）として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ（トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩）等の還元剤を添加して反応させるのが好ましい。ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰの添加濃度は、測定しようとするキナーゼの還元剤要求性等にもよるが、０．１〜１０ｍＭの範囲内が好ましい。反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。キナーゼ反応後の反応液中のＡＤＰ濃度は０．１〜５０μＭの範囲にあることが好ましく、０．５〜２５μＭの範囲にあることがより好ましい。これより濃い反応液の場合は希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
【００５２】
キナーゼ反応で生成したＡＤＰはグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを加えて酵素カップリングングさせることでレゾルフィンの蛍光で定量する。これらは別々に添加することも可能だが、予め混合して（以下、酵素カップリング用混合液というが、組成は前述第２工程用混合液と同じ）キナーゼ反応後の反応液に一度に加えることも可能である。
キナーゼ反応後の反応液に添加する際のこれら成分の終濃度は、グルコースが０．５〜５ｍＭ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが５〜１００μｇ／ｍｌ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼが０．５〜１０μｇ／ｍｌ、ジアホラーゼが０．２〜２０μｇ／ｍｌ、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＰが２０〜４００μＭ、レサズリンが５〜２５０μＭ、１０〜２００μＭとなるように調製することが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ〜１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
添加に用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液等が用いられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。酵素カップリング反応の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２−３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ〜５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
【００５３】
多くのキナーゼで酵素活性の発揮には還元剤の添加が必要だが、還元剤が存在したままＡＤＰ定量の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。
本発明では、酵素カップリング用混合液に上記したＳＨ試薬を添加することで、還元剤を不活化させ、バックグランドの上昇を抑えた測定を可能としている。キナーゼ活性の測定で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物やＮ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が挙げられる。酵素カップリング反応に添加する量としては、キナーゼ反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
【００５４】
本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
【００５５】
本発明のＡＤＰ定量法はキナーゼ以外にも、ＡＤＰを産生する酵素の活性測定に用いることができる。キナーゼ以外にＡＤＰを産生する酵素としては、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルタチオンシンターゼ等が挙げられる。
【００５６】
糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性測定に用いる容器としては反応が進行するものであれば制限はないが、マイクロプレートが好適である。マイクロプレートとしては９６穴、３８４穴、１５３６穴等の種類があるが、何れも用いられる。
マイクロプレートを用いてまず糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の反応を行い、その反応液に対し、糖転移酵素の場合は第１工程用混合液を添加して第１工程の反応を行い、次に第２工程用混合液を添加して第２工程の反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで生成物（レゾルフィン）の蛍光を測定する。
キナーゼの場合は、キナーゼ反応液に酵素カップリング用混合液を添加して反応を行わせた後、マイクロプレートリーダーで同様にレゾルフィンの蛍光を測定する。レゾルフィンを蛍光測定する際の励起波長は５３０〜５７０ｎｍ、蛍光波長は５８０〜６１０ｎｍが好ましい。
本発明の方法でＡＤＰを蛍光発色させる反応は、反応温度２５℃の場合、３０分でほぼ終了し、その後約２時間は蛍光値が安定に保たれるため、蛍光測定時に反応を停止させる操作は特に必要ない。
【００５７】
＜糖転移酵素の活性測定方法＞
以下、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の好ましい形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明の糖転移酵素の活性測定方法の原理を表す反応経路である。
図１に示すように、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、前記ＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第２工程と、
を有する。
すなわち、本発明の糖転移酵素の活性測定方法は、
糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＮＭＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
グルコースに、前記第１工程により得られたＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコース-６-リン酸を生成させる第２−１工程と、前記第２−１工程により得られたグルコース-６-リン酸に、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを生成させる第２−２工程と、ＳＨ試薬存在下、前記第２−２工程により得られたＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ及びジアホラーゼを作用させ、生じた蛍光強度又は吸光度を測定する第２−３工程と、を有する。
【００５８】
測定対象の糖転移酵素は、動植物由来のもの、微生物由来のもの、生体由来のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
測定対象の糖転移酵素は、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００５９】
また、第１工程及び第２工程で用いられるＮＤＰキナーゼ、ＣＭＰキナーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼは動植物起源のもの、微生物起源のもの、遺伝子組換え技術により調製したもの、何れでも用いることができるが、精製したものが好ましい。
【００６０】
糖転移酵素の働きでＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−キシロース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−シアル酸等の糖供与体分子から糖（それぞれ、フコース、マンノース、グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸）が糖受容体分子に転移すると、糖供与体分子からヌクレオチド（ＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰ）が遊離する。
本発明は、このＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰを、酵素カップリング反応を用いて蛍光で定量することで糖転移酵素活性を測定するものである。
【００６１】
従来、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの高感度かつ簡便な定量は困難であったが、本発明では、次の２つの工程から成る酵素カップリング反応によりＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの高感度かつ簡便な測定を可能にした。
【００６２】
第１工程：糖転移反応で糖供与体分子から生じるヌクレオチドがＧＤＰ又はＵＤＰである場合は、糖転移反応後の反応液にＡＴＰ存在下ＮＤＰキナーゼを作用させてＧＤＰ又はＵＤＰを、それぞれＧＴＰ、又はＵＴＰに変換するとともに、定量的にＡＤＰを産生させる。糖転移反応で糖供与体分子から生じるヌクレオチドがＣＭＰである場合は、糖転移反応後の反応液にＡＴＰ存在下ＣＭＰキナーゼを作用させてＣＭＰをＣＤＰに変換するとともに定量的にＡＤＰを産生させる。
【００６３】
第２工程：第１工程で生じたＡＤＰを、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤ、及びレサズリンを用いた酵素カップリング反応により蛍光性のレゾルフィンの蛍光発色へと導き、これを蛍光で定量する。
【００６４】
本発明において、酵素活性を測定しようとする糖転移反応は、糖転移酵素、糖供与体分子、及び糖受容体分子を緩衝液中で混合することで行わせる。糖転移酵素は、酵素反応率が１〜５０％程度となる濃度で添加することが好ましく、糖供与体分子は１０〜５００μＭで添加することが好ましく、糖受容体分子は１０〜５０００μＭで添加することが好ましい。
【００６５】
糖転移反応に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは６〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。糖転移反応後の反応液中の遊離ヌクレオチド濃度は０．１〜１００μＭの範囲にあることが好ましく、０．５〜５０μＭの範囲にあることがより好ましい。１００μＭより濃い反応液の場合は、希釈してこの範囲に収まるようにすることが好ましい。
【００６６】
糖転移反応の結果、糖供与体分子から遊離したヌクレオチド（ＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰ）を定量するため、第１工程では、糖転移反応後の反応液にＡＴＰ、及びＮＤＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼを添加してリン酸交換反応を行わせてＡＤＰを生成させる。
ＮＤＰキナーゼはＡＴＰ存在下、ＧＤＰ、又はＵＤＰをリン酸化してそれぞれＧＴＰ、又はＵＴＰに変換するとともにＧＴＰ、又はＵＴＰと等モル量のＡＤＰを生成する酵素である。
ＣＭＰキナーゼはＡＴＰ存在下、ＣＭＰをリン酸化してＣＤＰに変換するとともにＣＤＰと等モル量のＡＤＰを生成する酵素である。本発明において、ＡＴＰ存在下にＣＭＰをリン酸化してＣＤＰに変換するとともにＣＤＰと等モル量のＡＤＰを生成する酵素であればＣＭＰキナーゼとして用いることができ、例えば、ＮＭＰキナーゼ（ヌクレオシド５’−一リン酸キナーゼ）と称されている酵素も当該酵素活性を持つので、ＣＭＰキナーゼとして用いることができる。
【００６７】
第１工程で添加するＡＴＰと、ＮＤＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼとは、それぞれ単独で添加しても良く、あるいは混合液として添加しても良い。何れの場合もＡＴＰは糖転移反応液に存在する遊離ヌクレオチドよりも２倍モル濃度以上かつ１ｍＭ程度以内の濃度となるように添加することが好ましい。
ＮＤＰキナーゼ又はＣＭＰキナーゼは０．２〜２０μｇ／ｍｌの添加量が好ましい。これらの添加に用いる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。
反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。なお、ＣＭＰキナーゼは還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、第１工程でＣＭＰキナーゼを用いる場合は還元剤を同時に添加し、還元剤の存在下、ＡＤＰを生成させることが好ましい。なお、測定しようとするキナーゼに還元剤要求性がある場合以外にも、酵素活性を上昇させる（活性化・賦活化させる）ための活性化剤（賦活化剤）として、或いはスクリーニング時の化合物の非特異的吸着を抑えるため、酵素などの試薬の安定化剤として、還元剤を添加して反応させるのが好ましい。還元剤としてはジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。添加量は１μＭ〜５ｍＭが好ましく、０．１〜５ｍＭがより好ましい。
【００６８】
第２工程では、第１工程で得られた反応液に、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを加えて酵素カップリング反応させることで、ＡＤＰをレゾルフィンの蛍光発光へと導いて、これを蛍光定量する。ＡＤＰを定量するための酵素カップリング反応に用いるグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤ、及びレサズリンは、それぞれ単独で加えることも可能だが、予めこれらを混合しておいて（以下、第２工程用混合液という）、一度に加えることも可能である。
添加後の各成分の濃度は、グルコースが０．１〜１０ｍＭ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼが５〜５００μｇ／ｍｌ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼが１〜１００μｇ／ｍｌ、ジアホラーゼが０．２〜２０μｇ／ｍｌ、ＮＡＤＰが１０〜５００μＭ、レサズリンが５〜２５０μＭとなるように用いることが好ましい。ＳＨ試薬の濃度は、通常１μＭ〜１００ｍＭとなるように用いることが好ましく、酵素カップリング用混合液中に存在する還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
用いる緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッドバッファー、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液濃度は１０〜２００ｍＭ、ｐＨは７〜９が好ましい。添加物として１０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、５〜４０ｍＭ  ＮａＦ、１〜４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１〜２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００〜５００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４等の塩類、０．０１〜１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤、０．０１〜１％のアルブミン等のタンパク質を加えても良い。第２工程の酵素カップリング反応の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、反応時間は１０分〜３時間が好ましい。
還元剤存在下で第２−３工程を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。還元剤は１μＭ〜５ｍＭとなるよう添加されることが好ましい。
【００６９】
また、第１工程で還元剤を添加した場合は、第２工程用混合液にＳＨ試薬を添加して第２工程の反応を行わせることが好ましい。還元剤が存在したまま第２工程の酵素カップリング反応を行うと、還元剤の作用でレサズリンからレゾルフィンへの還元が進み、蛍光のバックグランドが高くなる。第２工程の酵素カップリング用混合液にＳＨ試薬を添加しておくことで、還元剤を不活化することができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
ＳＨ試薬はチオール基と反応する試薬で、タンパク質中のシステイン残基の定量や化学修飾に用いられる化合物である。１）５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２，２'(４，４')−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、２）ｐ−メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、ｐ−メルクリベンゼンスルホン酸（ＰＭＢＳ）などのメルカプチド形成剤、３） ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）などのアルキル化剤が挙げられる（生化学辞典 第４版、ｐ．１７３、東京化学同人、２００７年参照）。
本発明で用いるＳＨ試薬としては、中性ｐＨ域付近で還元剤との反応性があり、かつ、酵素カップリング反応で用いる酵素の活性には影響を及ぼさないものであれば何れでも良い。例として、ヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体、メチルビニルスルホン等のアリルスルホン酸誘導体等が挙げられるが、特にヨードアセトアミド等のα-ハロカルボニル化合物、Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド誘導体が好適である。
【００７０】
本発明で用いるＳＨ試薬としては、上記一般式［１］で表されるマレイミド化合物又は２−ヨードアセトアミドであることが好ましい。
【００７１】
第２工程の酵素カップリング反応に添加する量としては、第１工程の反応に用いた還元剤と等価となる量もしくはその２０倍程度までの量が好適である。
第１工程と第２工程の反応は、同時に行わせることもできる。同時に行わせることができるのは、ＧＤＰまたはＵＤＰを測定する場合である。ＣＭＰを測定する場合は、還元剤の添加とその不活化の操作が必要となるので、第１工程と第２工程を同時に行わせるのは好ましくない。
【００７２】
＜酵素活性調節剤のスクリーニング方法＞
上述した本発明の酵素の活性測定方法を用いて、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性調節剤をスクリーニングするには、好適にはマイクロプレートを用いて各ウェルに被験化合物を添加し、被験化合物の存在下、及び対照群として非存在下に、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の反応を行った後、上記したように酵素カップリング反応を行わせて蛍光測定することで糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性を定量する。
得られた糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の活性を被被験化合物の有無により比較することで、被験化合物の糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素に対する活性調節作用を求めることができる。
また、糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素の反応を行わずに、被験化合物存在下に酵素カップリング反応のみを行わせることで、被験化合物が酵素カップリング反応に影響したかどうかを知ることができ、被験化合物の活性が糖転移酵素又はキナーゼ等のＡＤＰ産生酵素に作用したものであるかを確認することができる。
本発明に係る酵素カップリング反応で生じる蛍光は、励起波長が５４０ｎｍ付近、蛍光波長が５９０ｎｍ付近であるため、係る波長域の場合、被験化合物の紫外・可視部吸収や自家蛍光の影響を受けにくい利点がある。
【００７３】
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、
被験化合物存在下または非存在下に糖転移酵素反応を行う糖転移酵素反応工程と、
前記糖転移酵素反応で生じるＧＤＰ若しくはＵＤＰをＡＴＰ存在下にＮＤＰキナーゼと反応させる、又は前記糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ存在下にＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる第１工程と、
前記ＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを用いて酵素カップリング反応により蛍光で定量する第２工程と、
前記被験化合物の有無による糖転移酵素の活性を比較することで前記被験化合物の糖転移酵素に対する活性調節作用を求める比較工程と、
を有する。
【００７４】
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、前記第１工程は、糖転移酵素反応で生じるＣＭＰをＡＴＰ及び還元剤存在下にＣＭＰキナーゼと反応させることで、ＧＤＰ、ＵＤＰ、又はＣＭＰの量に応じたＡＤＰを生成させる工程であり、前記第２工程は、ＳＨ試薬の存在下、酵素カップリング反応により蛍光で定量する工程であることが好ましい。
【００７５】
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態である糖転移酵素活性調節剤のスクリーニング方法は、前記糖転移酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか一種であることが好ましい。
【００７６】
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるＡＤＰを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、
ＡＤＰを生成する酵素反応を被験化合物存在下または非存在下で行った後、
ＡＤＰを生成する酵素反応で生じるＡＤＰをＳＨ試薬存在下にグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤＰ、及びレサズリンを作用させて生じるレゾルフィンの蛍光で測定し、
被験化合物の有無による活性を比較することで被験化合物のＡＤＰを生成する酵素に対する活性調節作用を求める。
【００７７】
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるＡＤＰを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、前記ＡＤＰを生成する酵素が、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、ニトロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタチオンシンターゼからなる群から選ばれる少なくともいずれか一種であることが好ましい。
【００７８】
酵素活性調節剤のスクリーニング方法の一実施形態であるＡＤＰを生成する酵素の活性調節剤のスクリーニング方法は、前記ＳＨ試薬がＮ−エチルマレイミド又はヨードアセトアミドであることが好ましい。
【００７９】
＜ＡＤＰの測定用キット＞
本発明は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン及びＳＨ試薬を含むＡＤＰの測定用キットを提供する。
【００８０】
本発明のＡＤＰの測定用キットに含まれるＳＨ試薬としては、上記ＡＤＰの測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
【００８１】
本発明のＡＤＰの測定用キットによれば、試料中のＡＤＰを簡便に測定することができる。
前記ＡＤＰの測定用キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のＡＤＰの測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。
【００８２】
＜ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キット＞
本発明は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン並びにＳＨ試薬を含むＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットを提供する。
【００８３】
本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットに含まれるＳＨ試薬としては、上記ＡＤＰを生成する酵素の活性測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
【００８４】
本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットによれば、ＡＤＰを生成する酵素の活性を簡便に測定することができる。
前記ＡＤＰを生成する酵素の活性測定キットは、還元剤を含有していてもよく、還元剤存在下で本発明のＡＤＰを生成する酵素の活性の測定方法を行う場合の還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール又はＴＣＥＰが好適である。
【００８５】
＜糖転移酵素の活性測定キット＞
本発明は、ＡＴＰ及びＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ若しくはＣＭＰキナーゼを含む第１液と、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰ、レサズリン、並びにＳＨ試薬を含む第２液と、を含む転移酵素の活性測定キットを提供する。
【００８６】
一実施形態として、本発明の糖転移酵素の活性測定キットは、前記第１液がさらに還元剤を含むことが好ましい。
例えば、ＣＭＰキナーゼ等のある種の酵素は還元剤の添加により酵素活性が上昇することから、前記第１液がさらに還元剤を含むことにより、ＣＭＰキナーゼの酵素活性を上昇させることができる。尚且つ、本発明の転移酵素の活性測定キットは、前記第２液にＳＨ試薬を含んでいるため、還元剤を不活化することができ、レサズリンからレゾルフィンへの還元を抑えることができ、蛍光のバックグランドの上昇を抑えることができる。
【００８７】
本発明の糖転移酵素の活性測定キットに含まれるＳＨ試薬としては、上記糖転移酵素の活性測定方法で説明したものと同様のものが挙げられるため、説明を省略する。
【００８８】
本発明の糖転移酵素の活性測定キットによれば、糖転移酵素の活性を簡便に測定することができる。
【実施例】
【００８９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９０】
［実施例１］
本発明の方法を用いたＧＤＰ、ＵＤＰの検量線
本発明に係る第１工程、第２工程の反応を用いてＧＤＰ、ＵＤＰの検量線を作成した。
材料として、ＧＤＰ（和光純薬工業社カタログ番号０７８−０４７４１）、ＵＤＰ（和光純薬工業社カタログ番号２１２−００８６１）、ＡＴＰ（和光純薬工業社カタログ番号１８−１６９１１）、パン酵母由来ＮＤＰキナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ｎ０３７９）、グルコース（和光純薬工業社カタログ番号０４５−３１１６２）、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（旭化成ファーマ社カタログ番号Ｔ−９３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母工業社カタログ番号４６８５７００３）、ジアホラーゼ（ユニチカ社カタログ番号Ｂ１Ｄ１１１）、ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業社カタログ番号４４２９００００）、レサズリン（和光純薬工業社カタログ番号１９１−０７５８１）を用いた。ＧＤＰ、ＵＤＰは緩衝液Ｃ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に溶解して０〜５０μＭ溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。【００９１】
第１工程用混合液Ａ
ＡＴＰ                           ２００μＭ
ＮＤＰキナーゼ                   ２μｇ／ｍｌ
緩衝液組成                        Ｃ
第２工程用混合液Ｂ
グルコース                         ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ(３８μｇ／ｍｌ)
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ（２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２Ｕ／ｍｌ（１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         １００μＭ
緩衝液組成                         Ｃ【００９２】
３８４穴マイクロプレート（少容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に４μｌの０〜５０μＭ  ＧＤＰ又はＵＤＰ溶液と、４μｌの第１工程用混合液Ａを添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。これに８μｌの第２工程用混合液Ｂを添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。
これをＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ社製プレートリーダーＰＨＥＲＡｓｔａｒを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて蛍光測定した。結果を図２に示す。これより、ＧＤＰ、ＵＤＰとも濃度に応じた蛍光強度が確認され、両ヌクレオチドを本発明の方法で定量できることが確認された。【００９３】
［実施例２］
本発明の方法を用いたＣＭＰの検量線
本発明に係る第１工程、第２工程の反応を用いてＣＭＰの検量線を作成した。
材料として、ＣＭＰ（和光純薬工業社カタログ番号０３４−０５３６１）、ＣＭＰキナーゼ（ヒトＣＭＰＫ１、Ｐｒｏｓｐｅｃ社カタログ番号ＰＫＡ−００２）、ＤＴＴ（和光純薬工業社カタログ番号０４０−２９２２３）、Ｎ−エチルマレイミド（和光純薬工業社カタログ番号０５４−０２０６１）を用いた。ＣＭＰは緩衝液Ｆ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ９）、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解して０〜４０μＭ溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。
ＣＭＰキナーゼは還元剤要求性があるため第１工程では還元剤としてＤＴＴを用い、第２工程ではその不活化のためＳＨ試薬としてＮ−エチルマレイミドを用いた。【００９４】
第１工程用混合液Ｄ
ＡＴＰ                           ２００μＭ
ＣＭＰＫ１                       ３μｇ／ｍｌ
ＤＴＴ                           ４ｍＭ
緩衝液組成                       Ｆ
第２工程用混合液Ｅ
グルコース                         ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ)
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ (２．６μｇ／ｍｌ)
ジアホラーゼ                ２Ｕ／ｍｌ (１．１μｇ／ｍｌ)
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                          １００μＭ
Ｎ−エチルマレイミド        ２０ｍＭ
緩衝液組成                          Ｃ【００９５】
実施例１と同様の操作でＣＭＰ溶液について上記の混合液を用いて第１工程と第２工程の反応を行い、蛍光測定を行ってＣＭＰの検量線を得た。結果を図３に示す。ＣＭＰ濃度に応じた蛍光強度が観測され、ＣＭＰを本発明の方法で定量できることが確認された。【００９６】
［実施例３］
蛍光発色の経時変化
４０μＭのＧＤＰ又はＵＤＰを用い、実施例１と同様に反応を行った後、第２工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し蛍光測定を行った。また、４０μＭのＣＭＰを用い、実施例２と同様に反応を行い、第２工程の反応時のみ経時的にプレートを取り出し、蛍光測定を行った。結果を図４に示す。これより、ＧＤＰ又はＵＤＰの定量の場合、第２工程の反応は２５分以内に終了し、以後少なくとも１２０分まで蛍光値は安定に保たれること、ＣＤＰの定量の場合は第２工程の反応は２５分でほぼ終了し、６０分以降少なくとも１２０分まで蛍光値はほとんど変化しないことが分かった。
従って、ＧＤＰ又はＵＤＰ定量の場合は第２工程開始後２５分〜１２０分に、ＣＭＰ定量の場合は同６０分〜１２０分に蛍光を測定することで安定した測定結果が得られることが分かった。【００９７】
［実施例４］
糖転移酵素活性の測定（１）
糖転移酵素としてフコシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。フコシルトランスフェラーゼとしてヒトＦＵＴ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号６４０９−ＧＴ）、基質としてＧＤＰ−フコース（ヤマサ醤油社カタログ番号７２２９）とフェツイン（ウシ胎児血清由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ｆ３００４）を用いた。
３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの１００μＭ  ＧＤＰ−フコース、６ｍｇ／ｍｌフェツインと、２．５μｌの０〜４μｇ／ｍｌ  ＦＵＴ７を添加し（緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、プレートシール（アズワン社カタログ番号１−６７７４−０１）で蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに５μｌの第１工程用混合液Ａを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これに１０μｌの第２工程用混合液Ｂを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。これを実施例１と同様に蛍光測定した。結果を図５に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。【００９８】
［実施例５］
糖転移酵素活性の測定（２）
糖転移酵素としてガラクトシルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。
ガラクトシルトランスフェラーゼとしてヒトＢ４ＧａｌＴ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号３６０９−ＧＴ）、基質としてＵＤＰ−ガラクトース（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社カタログ番号１９５９０５）とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（和光純薬工業社カタログ番号０１３−１２１８１）を用いた。３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの１００μＭ  ＵＤＰ−ガラクトース、１０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと、２．５μｌの０〜０．３μｇ／ｍｌＢ４ＧａｌＴ１を添加し（緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。
室温に放冷後、これに５μｌの第１工程用混合液Ａと１０μｌの第２工程用混合液Ｂの混合液１５μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これを実施例１と同様に蛍光測定した。結果を図６に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認され、第１工程と第２工程を同時に行わせる測定が可能であることが示された。【００９９】
［実施例６］
糖転移酵素活性の測定（３）
糖転移酵素としてシアリルトランスフェラーゼの活性を本発明の方法で測定した。シアリルトランスフェラーゼとしてヒトＳＴ６Ｇａｌ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号５９２４−ＧＴ）、基質としてＣＭＰ−シアル酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号２３３２６４）とＮ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ａ７７９１）を用いた。
３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの１００μＭ  ＣＭＰ−シアル酸、５００μＭ Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミンと、２．５μｌの０〜１０μｇ／ｍｌ  ＳＴ６Ｇａｌ１を添加し（緩衝液は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに５μｌの第１工程用混合液Ｄを添加し、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに１０μｌの第２工程用混合液Ｅを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これを実施例１と同様に蛍光測定した。結果を図７に示す。酵素濃度に応じた蛍光値が確認された。【０１００】
［実施例７］
糖転移酵素阻害活性の測定
没食子酸 (ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ) のヒトＦＵＴ７に対する酵素阻害活性を本発明の方法で測定した。没食子酸は、ヒトＦＵＴ７に対する阻害活性が報告された化合物である（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４２５，Ｎｏ．１，ｐｐ．５１−５７，２００４年参照）。
実施例４で示した方法でＦＵＴ７の酵素活性の測定を行う際、没食子酸存在下にＦＵＴ７（糖転移反応液中の濃度１μｇ／ｍｌ）の反応を行い、他は実施例４と同様に操作を行って没食子酸のＦＵＴ７に対する阻害作用を調べた。没食子酸を含まない群を阻害率０％コントロールとし、ＦＵＴ７を含まない群を阻害率１００％コントロールとして、各濃度の没食子酸のＦＵＴ７に対する阻害率を算出した。
また、１００μＭ  ＧＤＰ−フコースの代わりに５０μＭ  ＧＤＰを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体への没食子酸の影響も調べた。また、ＦＵＴ７酵素反応後の反応液の一部を使って、ＨＰＬＣ分析により生成ＧＤＰ量を定量し、ＨＰＬＣ法による阻害活性も求めた。
ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８ (ワイエムシー社製、粒系５μｍ、直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ)、溶出液：５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｋ２ＨＰＯ４（１０：１）、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ ２６０ｎｍとした。これらの測定結果を図８に示す。
本発明の方法で測定した没食子酸の阻害活性とＨＰＬＣにより測定した阻害活性とが一致することが分かった（ＩＣ５０値が約１０μＭ）。さらに、没食子酸は、酵素カップリング反応自体を全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はＦＵＴ７の阻害によるものであることが確かめられた。
また、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４２５，Ｎｏ．１，ｐｐ．５１−５７，２００４年には、ヒトＦＵＴ７に対する没食子酸のＩＣ５０値が５．４μＭと報告されており、実施例７において測定されたＩＣ５０値は、上記文献値に近いことが確認された。
以上より、本発明の方法で糖転移酵素阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。【０１０１】
［実施例８］
糖転移酵素活性測定キット（１）
以下の組成で、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。【０１０２】
第１工程用混合液
ＡＴＰ                           ２００μＭ
ＮＤＰキナーゼ                   ２μｇ／ｍｌ
緩衝液組成                       １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２【０１０３】
第２工程用混合液
グルコース                         ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ （２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２ Ｕ／ｍｌ （１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         １００μＭ
緩衝液組成                         １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２【０１０４】
［実施例９］
糖転移酵素活性測定キット（２）
以下の組成で、シアリルトランスフェラーゼ用活性測定キットを作製した。【０１０５】
第１工程用混合液
ＡＴＰ                           ２００μＭ
ＣＭＰＫ１                       ３μｇ／ｍｌ
ＤＴＴ                           ４ｍＭ
緩衝液組成                       １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００【０１０６】
第２工程用混合液
グルコース                         ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ （３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ  ２Ｕ／ｍｌ （２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２Ｕ／ｍｌ （１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         1００μＭ
Ｎ−エチルマレイミド        ２０ｍＭ
緩衝液組成                         １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２【０１０７】
［実施例１０］
本発明の方法よるＡＤＰの検量線
ＡＤＰ（オリエンタル酵母工業社カタログ番号４５１２００００）を緩衝液Ｃ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に溶解して０〜３７．５μＭ溶液を調製した。酵素カップリング用混合液は以下の組成で調製した。Ｎ−エチルマレイミドを添加する場合は、この酵素カップリング用混合液に２０ｍＭで添加した。【０１０８】
酵素カップリング混合液組成
Ｄ−グルコース              ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ  ２ Ｕ／ｍｌ（２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                ２ Ｕ／ｍｌ （１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                    ２００μＭ
レサズリン                  １００μＭ
Ｎ−エチルマレイミド        ２０ｍＭまたは無添加
緩衝液組成                  Ｃ【０１０９】
３８４穴マイクロプレート（少容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に７．５μｌの０〜３７．５μＭ  ＡＤＰ溶液（緩衝液組成はＣ）と７．５μｌの酵素カップリング用混合液を添加し、２５℃にて暗所で１時間インキュベートした。
その後、蛍光強度をＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ社製マイクロプレートリーダーＰＨＥＲＡｓｔａｒを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて測定した。結果を図９に示す。ＡＤＰ濃度依存的な蛍光強度が確認され、ＡＤＰ濃度２５μＭまでは良好な直線性が得られることが分かった。
また、Ｎ−エチルマレイミドが存在しても、蛍光値にほとんど変化は見られなかった。これより、本発明に係るＳＨ試薬存在下の酵素カップリング反応でＡＤＰの蛍光定量が可能であることが示された。【０１１０】
［実施例１１］
ＡＤＰの酵素カップリングによる蛍光発色の安定性の検討
２５μＭのＡＤＰを用い、実施例１０と同様に反応を行った。ただし、酵素カップリング反応時、経時的にマイクロプレートを取り出し蛍光測定を行った。結果を図１０に示す。これより、ＡＤＰ定量の酵素カップリング反応は１０〜２０分で終了し、その後２時間は、蛍光値は安定であることが分かった。【０１１１】
［実施例１２］
還元剤ＤＴＴ存在下のＡＤＰの検量線
ＤＴＴ存在下のＡＤＰの検量線を実施例１０と同様に測定した。結果を図１１に示す。ＤＴＴの存在により蛍光のバックグランドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め２０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を混合しておくとバックグランドの上昇が抑えられ、ＡＤＰの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル／バックグランドのカウントの比率（Ｓ／Ｂ比、この値が大きいほど高感度である）で表わすと、２０μＭのＡＤＰの定量において、ＤＴＴが存在しなければＳ／Ｂ比は５７．４の高い値を示したが、２ｍＭのＤＴＴが存在するとＳ／Ｂ比は４．２と１／１０以下に低下した。しかしながら、２０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドを添加することでＳ／Ｂ比は３６．７と、未添加に比べ約９倍改善した。【０１１２】
［実施例１３］
ヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの検量線
実施例１２において、２０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドの代わりに８ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて、他は実施例１２と同様にしてＡＤＰの検量線の測定を行った。結果を図１２に示す。２０μＭのＡＤＰの定量において、Ｓ／Ｂ比は２ｍＭ  ＤＴＴが存在すると３．７であったが、８ｍＭヨードアセトアミドを用いた場合は１８．６と約５倍改善した。これより、酵素カップリング用混合液に予めヨードアセトアミドを混合しておくことで測定の特異性が改善されることが確かめられた。【０１１３】
［実施例１４］
キナーゼ活性の測定
還元剤要求性のキナーゼとしてヒトＣＭＰＫ１（ＣＭＰ  ｋｉｎａｓｅ１、Ｐｒｏｓｐｅｃ社カタログ番号ｐＫａ−００２−ｂ）を用い、最初にＣＭＰＫ１のＤＴＴ依存性を調べた。
１．５ｍｌ容マイクロ遠心チューブに１０μｌの４００μＭ  ＡＴＰ、８０μＭ  ＣＭＰ（緩衝液組成は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と５μｌの０〜８ｍＭ ＤＴＴ水溶液及び５μｌの４μｇ／ｍｌ  ＣＭＰＫ１（緩衝液組成は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣＬ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、この反応液１５μｌをＨＰＬＣに注入することで、ＣＭＰＫ１酵素反応で生成したＣＤＰ（シトシン５'−二リン酸）とＡＤＰを定量した。ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８(ワイエムシー社製、粒系５μｍ、直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ)、溶出液：５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｋ２ＨＰＯ４（１０：１）、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ ２６５ ｎｍとした。結果を図１３に示す。
ＣＭＰＫ１の酵素活性はＤＴＴ濃度に依存すること、同モル量のＣＤＰとＡＤＰが生成していることが確認された。これより、１ｍＭ以上のＤＴＴ濃度があればＣＭＰＫ１は十分な活性を示すことが分かった。【０１１４】
次にＤＴＴ存在下でのＣＭＰＫ１の酵素活性を本発明の方法で測定した。３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの０又は４０μＭ ＣＭＰと、２．５μｌの２００μＭ  ＡＴＰ、０〜３μｇ／ｍｌ ＣＭＰＫ１、４ｍＭＤＴＴ（緩衝液組成は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ９)、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）と、を加え、プレートシール（アズワン社カタログ番号１−６７７４−０１）で蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした。室温に放冷後、これに５μｌの酵素カップリング用混合液（組成は実施例１０と同じ）を加え、２５℃でインキュベートした。インキュベート開始開始後０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の計５回、蛍光測定を行い、実施例１２と同様にＳ／Ｂ比を求めた。ＣＭＰＫ１濃度を３μｇ／ｍｌとした時のＳ／Ｂ比の測定結果を図１４に示す。
酵素カップリング反応をＮ−メチルマレイミドなしで行った場合はＳ／Ｂ比は３〜４であったのに対し、Ｎ−エチルマレイミドを存在させてアッセイした場合はＳ／Ｂ比は１３〜１４となり、ＳＨ試薬存在下で酵素カップリングを行わせることでキナーゼ活性の定量性が大きく向上することが示された。
また、蛍光測定時間６０分におけるＮ−エチルマレイミド存在下でのＣＭＰＫ１の濃度依存性定量結果を図１５に示す。ＣＭＰＫ１酵素濃度に応じたキナーゼ活性が確認された。【０１１５】
［実施例１５］
キナーゼ阻害活性の測定
Ｄａｃｔｉｏｓｔｅｒｉｕｍ（キイロタマホコリカビ）のＣＭＰキナーゼに対する阻害活性が報告された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．１１，ｐｐ． ６３３９−６３４５，１９９０年）Ａｐ５Ａ（Ｐ１，Ｐ５−Ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５'）ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のＣＭＰＫ１に対する酵素阻害活性を、本発明の方法で測定した。３８４穴マイクロプレートに１μｌの０〜３ｍＭ  Ａｐ５Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ番号Ｄ４０２２）溶液と２μｌの５０μＭ  ＣＭＰを添加し、これに２μｌの２００μＭ  ＡＴＰ、３μｇ／ｍｌ  ＣＭＰＫ１、４ｍＭ  ＤＴＴを添加した（緩衝液組成は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）。プレートシールで蓋をして３７℃で１時間インキュベート後、室温に放冷し、２０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドを含む酵素カップリング用混合液を５μｌ添加し、２５℃で暗所にて６０分間インキュベートした後、プレートリーダーで蛍光を測定した。Ａｐ５Ａを含まない群を阻害率０％コントロールとし、ＣＭＰＫ１を含まない群を阻害率１００％コントロールとして、各濃度のＡｐ５ＡのＣＭＰＫ１に対する阻害率を算出した。
また、５０μＭ  ＣＭＰの代わりに２５μＭ  ＡＤＰを用いて同様に操作を行い、酵素カップリング自体へのＡｐ５Ａの影響も調べた。また、ＣＭＰＫ１のキナーゼ反応後の反応液の一部を使って、実施例１４に記載したＨＰＬＣ分析法によっても生成ＣＤＰ量を測定し、ＨＰＬＣ法による阻害活性を求めた。これらの結果を図１６に示す。
本発明の方法で測定したＡｐ５ＡのＣＭＰＫ１に対する阻害活性とＨＰＬＣ法により測定した阻害活性とが一致することが分かった。さらに、Ａｐ５Ａは酵素カップリング反応自体は全く阻害しておらず、酵素カップリングにより測定された阻害活性はＣＭＰＫ１を阻害したことによるものであることが確かめられた。
以上より、本発明の方法でキナーゼ阻害活性の正確な測定が可能であることが示された。【０１１６】
［実施例１６］
キナーゼ活性測定キット
以下の組成でキナーゼ活性測定キットを作製した。【０１１７】
キナーゼ活性測定キット組成
Ｄ−グルコース                     ２ｍＭ
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ         ２Ｕ／ｍｌ（３８μｇ／ｍｌ）
Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ         ２Ｕ／ｍｌ（２．６μｇ／ｍｌ）
ジアホラーゼ                       ２Ｕ／ｍｌ（１．１μｇ／ｍｌ）
ＮＡＤＰ                           ２００μＭ
レサズリン                         １００μＭ
Ｎ−エチルマレイミド               ２０ｍＭ
緩衝液組成                         １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２【０１１８】
［実施例１７］
ＡＴＰアーゼ活性の測定
市販キナーゼに夾雑するＡＴＰアーゼ活性を本発明の方法で測定した。３８４穴マイクロプレートに２．５μｌの４００μＭ  ＡＴＰと２．５μｌの０〜１６μｇ／ｍｌヒトＵＭＰキナーゼ（Ｎｏｖｏｃｉｂ社カタログ番号Ｅ−ＮＯＶ−４）を添加し（緩衝液組成は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ ｍＭ  ＤＴＴ、２００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、３０℃で１〜２時間インキュベートした。これに実施例１６に記載のキット液５μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、実施例１０と同様にプレートリーダーで蛍光を測定した。また、酵素カップリング前の酵素反応液を実施例７で用いたＨＰＬＣ条件で分析し、ＡＤＰを直接ＨＰＬＣで定量した。これらの結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。リン酸アクセプターがない状態で市販ヒトＵＭＰキナーゼ（ＵＭＰＫ）はＡＴＰアーゼ活性を示しＡＴＰからＡＤＰを生成すること、このＡＴＰアーゼ活性を本発明の方法で定量できること、両者の測定結果は一致することが示された。なお、ヒトＵＭＰキナーゼはタンパク質をリン酸化しないので、自己リン酸化活性はない。ここで示されたＡＴＰアーゼ活性は、酵素の精製過程で取り除けなかったＡＴＰアーゼが残存したものと考えられる。【０１１９】
［実施例１８］
糖転移酵素（ガラクトシルトランスフェラーゼ）阻害剤のスクリーニング
化合物ライブラリーとして、１２８０種類の既知生理活性物質で構成されるＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーを用いた。３８４穴マイクロプレートにＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーの各化合物（１ｍＭ濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解）をプレート１枚当たり３２０化合物ずつ、微量分注機（Ｌａｂｃｙｔｅ社製Ｅｃｈｏ  ５５５）を用いて５０ｎｌずつ分注した。
これに２．５μｌの１０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、１００μＭ  ＵＤＰ−ガラクトースと、２．５μｌの０．０５μｇ／ｍｌヒトＢ４ＧａｌＴ１を連続分注機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  ｃｏｍｂｉ）を用いて添加し（緩衝液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、プレートシールで蓋をして、３７℃で１時間インキュベートした（反応液中のライブラリー化合物濃度は１０μＭ）。
ライブラリー化合物の代わりにＤＭＳＯを添加したウェルを反応率１００％コントロールウェルとし、酵素も加えないウェルを反応率０％のコントロールウェルとした（両コントロールを各プレートに１６ウェルずつ設置）。室温に放冷後、５μｌの第１工程用混合液Ａを加え２５℃で１時間インキュベートした後、１０μｌの第２工程用混合液Ｂの混合液１０μｌを添加し、さらに２５℃で１時間インキュベートし、蛍光を定量した。
一方、上記と同様にライブラリー化合物およびＤＭＳＯをプレートに添加後、基質液と酵素液に代えて２０μＭ ＵＤＰを5μlずつ添加したプレートを作製し、同様に第１工程と第２工程の反応を行わせ、ＵＤＰ定量反応自体への影響を調べた。この場合、反応率０％のコントロールウェルは２０μＭ  ＵＤＰを加えないウェルとした。両アッセイとも、反応率１００％と０％のコントロールウェルの蛍光定量値、ライブラリー化合物が入ったウェルの蛍光定量値をそれぞれａ、ｂ、ｃとして、阻害率を次式により計算した。【０１２０】
【数１】
0005875096.tif 000011
【０１２１】
１２８０個のライブラリー化合物の測定結果を図１８Ａ〜Ｃに示す。Ｂ４ＧａｌＴ１反応を行った場合は阻害率が５０％以上を示した化合物数は２４個であった（図１８Ａ）。
一方、ＵＤＰ定量アッセイの場合は５０％以上阻害した化合物数は１０個であった（図１８Ｂ）。両アッセイの阻害率の差を計算することで（Ａ−Ｂ）、Ｂ４ＧａｌＴ１反応の正味の阻害率を見積もることができる。その差が５０％以上であった化合物数は１２個であった（図１８Ｃ）。
従ってこのスクリーニングにより、ヒトガラクトシルトランスフェラーゼＢ４ＧａｌＴ１を阻害する化合物をＬＯＰＡＣ１２８０（商標）ライブラリーから１２個得ることができ、本発明がハイスループットなスクリーニング法として有用であることが示された。
また、従来のスクリーニング方法におけるウェル単価は、１ウェルあたり約１００円であったのに対し、本発明のスクリーニング方法におけるウェル単価は、１ウェルあたり２〜８円と安価である。
従って、本発明のスクリーニング方法は、コスト面においても非常に優れていることが確認された。【０１２２】
［実施例１９］
マレイミド類、又はヨードアセトアミド存在下のＡＤＰの定量
ＡＤＰ（和光純薬工業社カタログ番号０１９−２５０９１）を１０ｍＭの濃度になるように純水に溶解し、５Ｍの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号１９６−０５３７５)でｐＨ７のＡＤＰ溶液を調製した。
ＤＴＴ（和光純薬工業社カタログ番号０４０−２９２２３）を１Ｍの濃度になるように純水で調製し、ＤＴＴ溶液を調製した。
１０ｍＭ  ＡＤＰ溶液、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液（プロメガ社Ｖ９１５Ｂ）、１Ｍ  ＤＴＴ溶液を緩衝液１（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  ＢＳＡ）で希釈し、下記表１に記載の組成の溶液１〜６をそれぞれ調製した。【０１２３】
【表１】
0005875096.tif 000012
【０１２４】
ＳＨ試薬として、マレイミド（和光純薬工業社カタログ番号１３３−１３１１１）、Ｎ−エチルマレイミド（和光純薬工業社カタログ番号０５８−０２０６１）、及びヨードアセトアミド（ＩＡＡ）（和光純薬工業社カタログ番号０９５−０２１５１）をジメチルスルホキシド（和光純薬工業社カタログ番号０４１−２９３５１）にそれぞれ８００ｍＭの濃度で調製した。Ｎ−（２−スルホエチル）マレイミド（サンタクルズ社カタログ番号ＳＣ−２０７９０７）は純水に２５０ｍＭの濃度で調製した。【０１２５】
酵素カップリング用混合液を下記表２に記載の組成となるようにそれぞれ調製した。酵素カップリング用混合液中、ＳＨ試薬を用いる場合には、４０ｍＭとなるようにそれぞれ添加した。【０１２６】
【表２】
0005875096.tif 000013
【０１２７】
３８４穴マイクロプレート（小容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に、下記表３に記載のとおり、溶液１〜６をそれぞれ５μｌと溶液Ａ〜Ｅの酵素カップリング用混合液をそれぞれ５μｌとを添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。【０１２８】
【表３】
0005875096.tif 000014
【０１２９】
その後、前記表３に記載の各溶液についてそれぞれ蛍光強度をＴＥＣＡＮ社製マイクロプレートリーダーＳａｆｉｒｅを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて測定した。
上記の実験をそれぞれ2回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図１９Ａ〜Ｃに示す。【０１３０】
ＤＴＴの存在により蛍光のバックグラウンドが上昇するが、酵素カップリング用混合液に予め４０ｍＭマレイミド類（マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（２−スルホエチル）マレイミド）と４０ｍＭＩＡＡを混合しておくとバックグラウンドの上昇が抑えられ、ＡＤＰの定量性が良好になることが確認された。これをアッセイ系の検出感度の特異性の指標であるシグナル／バックグラウンドのカウントの比率（Ｓ／Ｂ比、この値が大きいほど高感度である）で表すと、２０μＭのＡＤＰの定量において、ＤＴＴが存在しなければＳ／Ｂ比は２３．３の高い値を示したが、３ｍＭまたは６ｍＭのＤＴＴが存在するとＳ／Ｂ比はそれぞれ４．０、２．９に低下した。しかしながら、４０ｍＭのマレイミド類（マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（２−スルホエチル）マレイミド）を添加することで、３ｍＭのＤＴＴ添加時にＳ／Ｂ比はそれぞれ２３．６、２３．８、２４．０、６ｍＭのＤＴＴ添加時に２１．７、２２．５、２１．０と改善した。４０ｍＭのＩＡＡを添加することで、３ｍＭのＤＴＴ添加時にＳ／Ｂ比は１８．２、６ｍＭのＤＴＴ添加時に１３．３と改善した。これによりマレイミド類、及びＩＡＡいずれも蛍光のバックグラウンドの抑制効果があり、特にマレイミド類は抑制効果が高いことが示された。【０１３１】
［実施例２０］
還元剤ＤＴＴ、２―メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰ存在下のＡＤＰの定量
実施例１９と同様の方法により、還元剤として６ｍＭのＤＴＴ、６ｍＭの２−メルカプトエタノール（和光純薬工業社カタログ番号１３５−０７５２２）、６ｍＭのＴＣＥＰ（和光純薬工業社カタログ番号２０９−１９８６１）を添加してＡＤＰの定量を行った。
ＴＣＥＰは１Ｍの濃度になるように純水に溶解し、５Ｍの水酸化ナトリウム(和光純薬工業社カタログ番号１９６−０５３７５)でｐＨ７に調製し、６ｍＭとなるように希釈して用いた。
ＡＤＰとＡＴＰ、各還元剤を緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  ＢＳＡ）に溶解し、各還元剤６ｍＭ、ＡＤＰ０μＭまたは２０μＭ溶液（ＡＤＰ０μＭとＡＴＰ１００μＭ、又はＡＤＰ２０μＭとＡＴＰ８０μＭ）を調製した。酵素カップリング用混合液は実施例１９と同組成のものを使用し、マレイミド類（マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド）またはＩＡＡを４０ｍＭの濃度で添加した。【０１３２】
３８４穴マイクロプレート（小容量、非結合タイプ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社カタログ番号７８４９００）に５μｌの還元剤６ｍＭ、ＡＤＰ０μＭ、２０μＭ溶液（ＡＤＰとＡＴＰの合計は１００μＭ、緩衝液は４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２-、０．０１％ ＢＳＡ）と５μｌの酵素カップリング用混合液を添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。【０１３３】
その後、蛍光強度をＴＥＣＡＮ社製マイクロプレートリーダーＳａｆｉｒｅを用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにて測定した。
上記の実験をそれぞれ３回行い、それぞれ得られた蛍光強度の平均を求めた。結果を図２０Ａ〜Ｃに示す。【０１３４】
２０μＭのＡＤＰの定量において、６ｍＭのＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰが存在する場合、ＳＨ試薬を添加しないとＳ／Ｂはそれぞれ１．２、１４．０、３．４であったが、マレイミドを添加するとそれぞれ１６．１、１９．１、１９．４、Ｎ−エチルマレイミドを添加すると１８．２、１９．６、１９．９、ＩＡＡを添加すると９．０、１８．８、１２．１に改善した。これにより、マレイミド類、ＩＡＡによる蛍光のバックグラウンドの抑制効果は、還元剤ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰを添加した場合において有効であり、特にマレイミド類が効果が高いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明は、レサズリンからレゾルフィンへの還元が進んで生じた蛍光強度又は吸光度を高感度に測定することができるので、化学、医薬、生化学分野等に幅広く利用可能である。
【図１】
0005875096.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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