(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域であって、但し、前記コード領域が、ヒストンタンパク質、ＥＧＦＰおよびルシフェラーゼから選択されるレポータータンパク質、ならびにαグロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）から選択されるマーカータンパク質または選択タンパク質をコードしないものとする、コード領域、
ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ、および
ｃ）ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナル
を含むかまたはコードする、核酸を含む、癌または腫瘍疾患、感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、または原生動物感染症、自己免疫疾患、アレルギーまたはアレルギー疾患、一遺伝子性疾患、遺伝性疾患、または遺伝病全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義された遺伝子欠損に原因し、メンデルの法則に従って遺伝する疾患、心血管疾患、ニューロン疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、皮膚疾患、筋骨格系障害、結合組織障害、新生物、免疫欠損、内分泌性疾患、栄養性疾患、および代謝性疾患、眼疾患、あるいは耳疾患の処置のための組成物であって、ｂ）とｃ）の組み合わせは、ａ）によって規定されるコード領域によってコードされる前記ペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増加させ、そして、前記核酸はＲＮＡである、組成物。
【請求項２】
前記核酸が、リボザイム、自己スプライシングリボザイム、ウイルス核酸、ヒストンステムループプロセシングシグナル、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列、Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、および不活化エンハンサー配列をコードする核酸からなる群の成分の１つ、または２つ、または少なくとも１つ、または１つを除く全て、または全てを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸が、リボザイムと、Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、不活化エンハンサー配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列からなる群のうちの１つとを含まない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記核酸が自己スプライシングリボザイムを含まない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）：
【化２２】
0005860464.tif 000044
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【化２３】
0005860464.tif 000045
から選択され、ここで、
ステム１またはステム２境界エレメントＮ１〜６は、１〜６個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０〜２ＧＮ３〜５］は、エレメントステム２と逆に相補的であるか、または部分的に逆に相補的であり、且つ５〜７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０〜２は、０〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３〜５は、３〜５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｇはグアノシンまたはそのアナログであり、シチジンまたはそのアナログによって必要に応じて置換することができ、但し、ステム２中のその相補的ヌクレオチドシチジンがグアノシンによって置換されるものとし、
ループ配列［Ｎ０〜４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０〜４］は、エレメントステム１とステム２との間に存在し、３〜５個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０〜４は、別のＮ０〜４とは独立した、０〜４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｕ／Ｔはウリジン、または必要に応じてチミジンを示し、
ステム２［Ｎ３〜５ＣＮ０〜２］は、エレメントステム１と逆に相補的であるか、または部分的に逆に相補的であり、且つ５〜７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３〜５は、３〜５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ０〜２は、０〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｃはシチジンまたはそのアナログであり、グアノシンまたはそのアナログに必要に応じて置換することができ、但し、ステム１中のその相補的ヌクレオチドグアノシンがシチジンに置換されるものとし、
ここで、
ステム１およびステム２が互いに塩基対合して、塩基対合がステム１とステム２との間で起こり得る逆相補配列を形成することができるか、または不完全な塩基対合がステム１およびステム２との間で起こり得る部分的に逆相補の配列を形成することができる、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
【化２４】
0005860464.tif 000046
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）
【化２５】
0005860464.tif 000047
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
のうちの少なくとも１つから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリ（Ａ）配列が、２５〜４００個のアデノシンヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮＵＡＮＡを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリアデニル化シグナルが、ＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記核酸が、治療的に活性なタンパク質またはペプチド、アジュバントタンパク質、抗原、腫瘍抗原、病原性抗原、動物抗原、ウイルス抗原、原生動物抗原、細菌抗原、アレルギー性抗原、自己免疫抗原、アレルゲン、抗体、免疫賦活性タンパク質もしくはペプチド、または抗原特異的Ｔ細胞受容体をコードする、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記核酸が、モノシストロン性核酸、バイシストロン性核酸、またはさらにマルチシストロン性核酸である、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
さらに薬学的に許容され得るキャリアを含む、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
抗原をコードするかまたは抗原を含む請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
【請求項１７】
前記抗原が、腫瘍抗原、アレルギー性抗原、自己免疫自己抗原、病原性抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、動物抗原、またはアレルギー性抗原から選択される、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
タンパク質発現を増加させるための、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物であって、前記組成物が、無細胞発現系、細胞、発現宿主細胞または体細胞、組織、または生物に適用または投与されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ヒストンステムループおよびポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含むかまたはコードするコード核酸配列、特に伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ならびにコードされたタンパク質の発現の増加のためのその使用を記載する。例えば、腫瘍および癌疾患、心血管疾患、感染症、自己免疫疾患、もしくは遺伝病の処置または遺伝子療法で用いる薬学的組成物、特にワクチンの調製のためのその使用も開示する。本発明は、さらに、インビトロ転写法、ヒストンステムループおよびポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含むかまたはコードする核酸を使用したタンパク質発現の増加のためのインビトロでの方法、ならびにエキソビボでの方法およびインビボでの方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患および感染症は別として、腫瘍および癌疾患の発症は、現代社会における最も多い死因の１つであり、ほとんどの場合、治療およびその後のリハビリテーション手段に多額の費用がかかる。腫瘍および癌疾患の処置は、例えば、発症する腫瘍の型、年齢、処置すべき患者内の癌細胞の分布などに非常に依存する。癌治療は、最近は、侵襲的手術に加えて放射線療法または化学療法の使用によって慣習的に行われる。しかし、かかる従来の治療は、典型的には、免疫系に異常なストレスを与え、いくつかの場合、制限された範囲のみに対してしか使用できない。さらに、これらの従来の治療のほとんどは、免疫系を再生させるために各処置の間に長い間隔をあける必要がある。
【０００３】
したがって、かかる「従来の処置」に加えて、かかる処置による免疫系に及ぼす影響を回避するか少なくとも軽減するための補助的ストラテジーが近年調査されている。１つのかかる補助的処置には、特に、遺伝子治療アプローチまたは遺伝子ワクチン接種が含まれ、これらは、処置またはかかる従来の治療の補助に非常に有望であることが見い出されている。
【０００４】
遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種は、疾患の治療および防止で既に証明されており、日常的な医療行為、特に上記疾患の処置に一般的に相当な影響を及ぼす分子医薬の方法である。遺伝子療法は、さらなる医学分野（例えば、遺伝病（すなわち、規定された遺伝子欠損によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する（遺伝性）疾患）の場合）でも使用される。かかる遺伝病の最も周知な代表には、とりわけ、膵線維症（嚢胞性線維症）および鎌状赤血球性貧血が含まれる。両方の方法（遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種）は、患者の細胞または組織への核酸の導入およびその後の細胞または組織に導入された核酸によってコードされる情報（すなわち、所望のポリペプチドの（タンパク質）発現）の処理に基づく。
【０００５】
遺伝子療法アプローチでは、最近の開発ではＲＮＡも公知であるが、典型的には、ＤＮＡを使用する。重要なことには、これら全ての遺伝子療法アプローチでは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはｍＲＮＡを使用することと無関係に、コードされたタンパク質の配列情報のためのメッセンジャーとして機能する。
【０００６】
一般に、ＲＮＡは、不安定な分子と考えられている。ＲＮアーゼは遍在性であり、不活化が困難であることが周知である。さらに、ＲＮＡはまた、ＤＮＡよりも化学的に不安定である。したがって、真核細胞内のｍＲＮＡの「規定状態」が相対的安定性によって特徴づけられ、各ｍＲＮＡの崩壊を促進するための特異的シグナルが必要であることはおそらく驚くべきことである。この所見についての主な理由は、細胞内でのｍＲＮＡ崩壊がエキソヌクレアーゼによってほとんど排他的に触媒されることのようである。しかし、真核生物ｍＲＮＡの末端は、特異的末端構造およびその関連タンパク質（５’末端のｍ７ＧｐｐｐＮ  ＣＡＰおよび典型的には３’末端のポリ（Ａ）配列）によってこれらの酵素から保護されている。したがって、これら２つの末端修飾の除去は、ｍＲＮＡ崩壊の律速と見なされる。安定化エレメントがαグロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中で特徴づけられているにもかかわらず、真核生物ｍＲＮＡの代謝回転に影響を及ぼすＲＮＡ配列は、典型的には、通常は脱アデニル化の促進による崩壊のプロモーターとして作用する（非特許文献１に概説）。
【０００７】
前述の通り、真核生物ｍＲＮＡの５’末端は、典型的には転写後に、メチル化ＣＡＰ構造（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ）を保有するように修飾される。ＲＮＡスプライシング、安定化、および輸送における役割は別として、ＣＡＰ構造は、翻訳開始中の４０ＳリボソームサブユニットのｍＲＮＡの５’末端への動員を有意に亢進する。後者の機能は、真核生物開始因子複合体ｅｌＦ４ＦによるＣＡＰ構造の認識を必要とする。ポリ（Ａ）配列は増加した４０ＳサブユニットのｍＲＮＡへの動員によって翻訳をさらに刺激する（ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）の介入を必要とする効果）。ＰＡＢＰは、同様に、ｅｌＦ４Ｇ（ＣＡＰ結合ｅｌＦ４Ｆ複合体の一部である）と物理的に相互作用することが最近証明された。したがって、キャッピングされたポリアデニル化ｍＲＮＡに関する翻訳開始の閉鎖されたループモデルが想定された（非特許文献２）。
【０００８】
ほとんど全ての真核生物ｍＲＮＡは、遍在性の切断／ポリアデニル化機構によってその３’末端に付加されたかかるポリ（Ａ）配列で終了する。３’末端のポリ（Ａ）配列の存在は、最も認識可能な真核生物ｍＲＮＡの特徴のうちの１つである。切断後、ほとんどのプレｍＲＮＡは、複製依存性ヒストン転写物を除いて、ポリアデニル化テールが必要である。この文脈では、３’末端プロセシングは、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、ｍＲＮＡの安定性および翻訳に影響を及ぼす核同時転写過程である。この３’末端の形成は、切断／ポリアデニル化機構によって指示される２工程反応で起こり、ｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）中の２つの配列エレメント（高度に保存されたヘキサヌクレオチドＡＡＵＡＡＡ（ポリアデニル化シグナル）および下流Ｇ／Ｕリッチ配列）の存在に依存する。第１の工程では、これらの２つのエレメントの間のプレｍＲＮＡが切断される。第１の工程に強く連関する第２の工程では、新規に形成された３’末端が、その後にｍＲＮＡ代謝の全ての局面（ｍＲＮＡの輸送、安定性、および翻訳が含まれる）に影響を及ぼす２００〜２５０個のアデニル化物からなるポリ（Ａ）配列の付加によって伸長される（非特許文献３）。
【０００９】
唯一公知のこの規則の例外は、ポリ（Ａ）配列の代わりにヒストンステムループで終結する複製依存性ヒストンｍＲＮＡである。例示的なヒストンステムループ配列は、Ｌｏｐｅｚら（非特許文献４）に記載されている。
【００１０】
ヒストンプレｍＲＮＡ中のステムループに、典型的には、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）として公知のプリンリッチ配列が続く。これらのプレｍＲＮＡは、Ｕ７  ｓｎＲＮＡのＨＤＥとの塩基対合によってＵ７  ｓｎＲＮＰによって触媒されるステムループのおよそ５ヌクレオチド下流の１つの内ヌクレオチド結合分解性切断によって核内でプロセシングされる。
【００１１】
新規に合成されたＤＮＡをクロマチン中にパッケージングするための要件により、ヒストン合成は細胞周期と協調して調節される。Ｓ期中のヒストンタンパク質合成は、ヒストン遺伝子の転写活性化およびヒストンｍＲＮＡレベルの転写後調節によって増加する。ヒストンステムループがヒストン発現調節の全転写後工程に必須であることが認められ得る。これは、効率的なプロセシング、細胞質内へのｍＲＮＡの輸送、ポリリボソーム上への負荷、およびｍＲＮＡ安定性の調節に必要である。
【００１２】
上記文脈では、核および細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端でのヒストンステムループに会合した３２ｋＤａタンパク質が同定された。このステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）の発現レベルによって細胞周期が調節され、このレベルはヒストンｍＲＮＡレベルが増加する場合にＳ期中に最高である。ＳＬＢＰは、Ｕ７  ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必要である。プロセシング完了後、ＳＬＢＰは、依然として成熟ヒストンｍＲＮＡの末端でステムループと会合しており、細胞質内でのヒストンタンパク質へのその翻訳を刺激する（非特許文献３）。興味深いことに、ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物および原生動物を通して保存されており（非特許文献４）、ヒストンステムループ配列へのその結合がステムループ構造に依存し、最小結合部位がステムループの少なくとも３つのヌクレオチド５’および２つのヌクレオチド３’を含むことが認められ得る（非特許文献５および非特許文献６）。
【００１３】
ヒストン遺伝子は、一般に、「複製依存性」（ヒストンステムループで終結するｍＲＮＡが生じる）または「置換型」（代わりにポリ（Ａ）テールを保有するｍＲＮＡが生じる）のいずれかとして分類されるにもかかわらず、ヒストンステムループおよびそのポリ（Ａ）またはオリゴ（Ａ）３’の両方を含む天然に存在するｍＲＮＡがいくつかの非常に稀なケースで同定されている。Ｓａｎｃｈｅｚらは、レポータータンパク質としてルシフェラーゼを使用したアフリカツメガエル卵子形成中のヒストンｍＲＮＡのヒストンステムループの３’側に付加した天然に存在するオリゴ（Ａ）テールの影響を試験し、オリゴ（Ａ）テールが卵子形成中にヒストンｍＲＮＡをサイレンシングする翻訳抑制機構の活性部分であり、その除去がヒストンｍＲＮＡの翻訳を活性化する機構の一部であることを見出した（非特許文献７）。
【００１４】
さらに、プレｍＲＮＡプロセシングおよびｍＲＮＡ安定性レベルでの複製依存性ヒストンの調節のための要件を、無イントロンヒストン遺伝子とは対照的にグロビン遺伝子がイントロンを含むという事実を活用してマーカータンパク質であるαグロビンをコードする人工構造物を使用して調査した。このために、αグロビンコード配列にヒストンステムループシグナル（ヒストンステムループにヒストン下流エレメントが続く）およびポリアデニル化シグナルが続く構築物を生成した（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。
【００１５】
別のアプローチでは、Ｌｕｅｓｃｈｅｒらは、組換えヒストンＨ４遺伝子の細胞周期依存性調節を調査した。Ｈ４コード配列にヒストンステムループシグナルおよびポリアデニル化シグナル（この２つのプロセシングシグナルはガラクトキナーゼコード配列によって同時に分離されている）が続く構築物を生成した（非特許文献１１）。
【００１６】
さらに、Ｓｔａｕｂｅｒらは、ヒストンＨ４  ｍＲＮＡレベルに細胞周期調節を付与するのに必要な最小の配列を同定した。これらの調査のために、選択マーカーであるキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）のコード配列がヒストンステムループシグナルに先行し、ポリアデニル化シグナルが続く構築物を使用した（非特許文献１２）。
【００１７】
ヒストンプレｍＲＮＡプロセシングの試験の際、Ｗａｇｎｅｒらは、万一ヒストンプレｍＲＮＡプロセシングが破壊した場合にＥＧＦＰが発現するようにヒストンステムループシグナルとポリアデニル化シグナルとの間にＥＧＦＰを配置したレポーター構築物を使用したヒストンプレｍＲＮＡの切断に必要な因子を同定した（非特許文献１３）。
【００１８】
ポリアデニル化ｍＲＮＡの翻訳には、通常、５’ＣＡＰの近傍に３’ポリ（Ａ）配列を配置する必要があることに留意すべきである。これは、ポリ（Ａ）結合タンパク質と真核生物開始因子ｅｌＦ４Ｇとの間のタンパク質−タンパク質相互作用によって媒介される。複製依存性ヒストンｍＲＮＡに関して、類似の機構が明らかとなっている。この文脈では、Ｇａｌｌｉｅらは、翻訳効率を向上させ、有効レベルの翻訳を確立するために５’−ＣＡＰと共依存関係にあるという点で、ヒストンステムループがポリ（Ａ）配列と機能的に類似することを示している。Ｇａｌｌｉｅらは、ヒストンステムループがトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるレポーターｍＲＮＡの翻訳の増加に必要十分であるが、最適に機能するためには３’末端に配置すべきであることを示した。したがって、他のｍＲＮＡ上のポリ（Ａ）テールと類似して、これらのヒストンｍＲＮＡの３’末端はインビボでの翻訳に必須であるようであり、ポリ（Ａ）テールと機能的に類似している（非特許文献１４）。
【００１９】
さらに、ＳＬＢＰが細胞質ヒストンｍＲＮＡに結合され、その翻訳に必要であることが認められ得る。ＳＬＢＰがｅｌＦ４Ｇと直接相互作用しないにもかかわらず、ヒストンｍＲＮＡの翻訳に必要なドメインは最近同定されたタンパク質ＳＬＩＰ１と相互作用する。さらなる工程では、ＳＬＩＰ１はｅｌＦ４Ｇと相互作用し、ヒストンｍＲＮＡを環状化してポリアデニル化ｍＲＮＡの翻訳に類似する機構によるヒストンｍＲＮＡの効率的な翻訳を支持する。
【００２０】
前述の通り、遺伝子療法アプローチは、通常、暗号情報を細胞に伝達するためにＤＮＡを使用し、次いで、コードされた治療タンパク質の発現を確実にするための天然に存在するｍＲＮＡエレメント（特に、５’−ＣＡＰ構造および３’ポリ（Ａ）配列）を保有するｍＲＮＡに転写される。
【００２１】
しかし、多くの場合、かかる核酸の患者の細胞または組織への導入およびその後のこれらの核酸によってコードされる所望のポリペプチドの発現に基づく発現系は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれを使用するかということと無関係に効率的に治療が可能な所望の、さらには必要な発現レベルを示さない。
【００２２】
先行技術では、今まで、特にインビトロおよび／またはインビボの両方での改良された発現系の使用によってコードされたタンパク質の発現量を増加させるための異なる試みが行われてきた。先行技術に一般に記載の発現の増加方法は、慣習的に、特異的プロモーターおよび対応する調節エレメントを含む発現ベクターまたは発現カセットの使用に基づく。これらの発現ベクターまたは発現カセットが典型的には特定の細胞系に限定されるので、これらの発現系は、異なる細胞系で用いられるように適合される必要がある。次いで、かかる適合させた発現ベクターまたは発現カセットを通常は細胞にトランスフェクトし、典型的には、特定の細胞株に応じて処理する。したがって、特定の細胞型に特異的なプロモーターおよび調節エレメントと無関係に細胞に固有の系によって標的細胞内にコードされたタンパク質を発現することができる核酸分子を主に優先する。この文脈では、ｍＲＮＡ安定化エレメントとｍＲＮＡの翻訳効率を増加させるエレメントとを区別することができる。
【００２３】
コード配列中で至適化され、一般にかかる目的に適切なｍＲＮＡは、特許文献１（ＣｕｒｅＶａｃ  ＧｍｂＨ）に記載されている。例えば、特許文献１は、一般的形態で安定化され、且つコード領域での翻訳のために至適化されたｍＲＮＡを記載している。特許文献１は、さらに、配列修飾の決定方法を開示している。特許文献１は、さらに、配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量を増加させるためにｍＲＮＡ配列中のアデニンおよびウラシルヌクレオチドを置換する可能性を記載している。特許文献１によれば、Ｇ／Ｃ含量を増加させるためのかかる置換および適合を、遺伝子治療への適用のために使用することができるが、癌または感染症の処置における遺伝子ワクチンのためにも使用することができる。この文脈では、特許文献１は、一般に、修飾されたｍＲＮＡが、例えば、全くないか不適切か不備があるかのいずれかである、処置すべき患者中で翻訳される少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするかかる修飾ための塩基配列としての配列を記載している。あるいは、特許文献１は、かかる修飾のための塩基配列として抗原（例えば、腫瘍抗原またはウイルス抗原）をコードするｍＲＮＡを提案している。
【００２４】
コードされたタンパク質の発現を増加させるためのさらなるアプローチでは、非特許文献２は、ｍＲＮＡの安定性および翻訳活性に及ぼす長いポリ（Ａ）配列（特に、１２０ｂｐ超）およびβグロビン遺伝子の少なくとも２つの３’非翻訳領域の組み合わせの正の効果を記載している。
【００２５】
しかし、全てのこれらの後者の先行技術文献が遺伝子療法アプローチならびにさらに改良されたｍＲＮＡの安定性および翻訳活性のために極めて有効なツールを提供することが既に試みられているにもかかわらず、ＤＮＡワクチンおよびＤＮＡベースの遺伝子治療アプローチに対してＲＮＡベースの適用の安定性が一般に低いという問題が依然としてある。したがって、例えば、好ましくは遺伝子療法のためにさらに改良されたｍＲＮＡの安定性および／または翻訳活性を介してインビボでコードされたタンパク質をより良好に提供することが可能な遺伝子療法アプローチおよび遺伝子ワクチン接種または上記で考察した従来の処置のための補助的治療のための改良されたツールを提供する必要が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】国際公開第０２／０９８４４３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０３６３６６号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．，Ｃ．Ｔｅｍｍｅら（２００４），Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９（４）：１９７−２１６
【非特許文献２】Ｍｉｃｈｅｌ，Ｙ．Ｍ．，Ｄ．Ｐｏｎｃｅｔら（２０００），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（４１）：３２２６８−７６
【非特許文献３】Ｄｏｍｉｎｓｋｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｚｌｕｆｆ（２００７），Ｇｅｎｅ  ３９６（２）：３７３−９０
【非特許文献４】Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８
【非特許文献５】Ｐａｎｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ら（１９９４），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（３），１７０９−１７２０
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｓ．，＆  Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．，（１９９５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（４），６５４−６６２
【非特許文献７】Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｒ．ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｚｌｕｆｆ（２００４），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４（６）：２５１３−２５
【非特許文献８】Ｗｈｉｔｅｌａｗ，Ｅ．ら（１９８６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４（１７），７０５９−７０７０．
【非特許文献９】Ｐａｎｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．，＆  Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．（１９８７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７（１２），４５５７−４５５９．
【非特許文献１０】Ｐａｎｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ら（１９９０）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８（１１），３１６１−３１７０
【非特許文献１１】Ｌｕｅｓｃｈｅｒ，Ｂ．ら（１９８５）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２（１３），４３８９−４３９３
【非特許文献１２】Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｃ．ら（１９８６）．ＥＭＢＯ  Ｊ，５（１２），３２９７−３３０３
【非特許文献１３】Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．Ｊ．ら（２００７）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２８（４），６９２−９
【非特許文献１４】Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｊ．，＆  Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．（１９９６），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４（１０），１９５４−１９６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、本発明の根底にある目的は、治療への適用（例えば、遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種）での使用のための先行技術から公知のかかる核酸に関する、好ましくはｍＲＮＡのさらなる安定化および／またはかかるｍＲＮＡの翻訳効率の増加を介したコードされたタンパク質の発現を増加させるためのさらなる方法および／または代替的方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
この目的は、添付の特許請求の範囲の主題によって解決される。特に、本発明の根底にある目的は、
ａ）好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域、
ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ、および
ｃ）任意選択的なポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナル（好ましくはコードされたタンパク質の発現レベルを増加させるため）
を含むかまたはコードする本発明の核酸配列であって、
コードされたタンパク質が、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、特にＥＧＦＰ）、およびマーカータンパク質または選択タンパク質（例えば、αグロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））を含まない核酸配列によって第１の実施形態にしたがって解決される。
【００３０】
この文脈では、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸がＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成によって少なくとも部分的に産生されるか、単離された核酸であることが特に好ましい。
【００３１】
本発明は、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせが、両者が天然で別の機構を示すにもかかわらず、この組み合わせが個別のエレメントのいずれかで認められるレベルを超える多様なタンパク質発現を増加させるように相乗的に作用するという本発明者らの驚くべき発見に基づく。ポリ（Ａ）およびヒストンステムループの順序と無関係に、ならびにポリ（Ａ）配列の長さと無関係にポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせの相乗効果が認められる。
【００３２】
したがって、本発明の核酸分子がａ）好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域；ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ、およびｃ）ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化配列（好ましくはコードされたタンパク質の発現レベルを増加させるため）を含むかまたはコードし、コードされたタンパク質が、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、特にＥＧＦＰ）および／またはマーカータンパク質または選択タンパク質（例えば、αグロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））を含まないことが特に好ましい。
【００３３】
本発明の第１の実施形態のさらに別の態様では、本発明の核酸はヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。
【００３４】
この文脈では、本発明の核酸は、５’→３’方向に、
ａ）好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域；
ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ（必要に応じて、ヒストンステムループの３’側にヒストン下流エレメントを持たない）
ｃ）ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナル
を含むかまたはコードすることが特に好ましい。
【００３５】
用語「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、ヒストンプレｍＲＮＡの成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７  ｓｎＲＮＡの結合部位を示す、天然に存在するステムループの３’側の約１５〜２０ヌクレオチドのプリンリッチポリヌクレオチドストレッチをいう。例えば、ウニでは、ＨＤＥはＣＡＡＧＡＡＡＧＡである（Ｄｏｍｉｎｓｋｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｚｌｕｆｆ（２００７），Ｇｅｎｅ  ３９６（２）：３７３−９０）。
【００３６】
さらに、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸はイントロンを含まないことが好ましい。
【００３７】
別の特定の好ましい実施形態では、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、５’→３’方向に、
ａ）好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域；
ｃ）ポリ（Ａ）配列、および
ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ
を含むかまたはコードする。
【００３８】
本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、例えば、任意の（一本鎖または二本鎖）ＤＮＡ（好ましくは、例えば、ゲノムＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子が含まれるがこれらに限定されない）から選択されるか、例えば、任意のＰＮＡ（ペプチド核酸）から選択することができるか、例えば、任意の（一本鎖または二本鎖）ＲＮＡ（好ましくは、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）など）から選択することができる任意の適切な核酸を含む。本発明の核酸分子はまた、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含むことができる。しかし、本発明の核酸配列は、ウイルスＲＮＡでなくてもよいか、ウイルスＲＮＡを含まなくてもよい。より具体的には、本発明の核酸配列は、ウイルス配列エレメント（例えば、ウイルスエンハンサーまたはウイルスプロモーター（例えば、不活化されていないウイルスプロモーターまたは配列エレメント、より具体的には、置換ストラテジーによって不活化されていない））、他のウイルス配列エレメント、またはウイルスもしくはレトロウイルス核酸配列を含まなくてよい。より具体的には、本発明の核酸配列は、レトロウイルスベクターもしくはウイルスベクターまたは修飾されたレトロウイルスベクターもしくはウイルスベクターでなくてよい。
【００３９】
どのような場合でも、本発明の核酸配列は、エンハンサーおよび／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、これらの配列は、修飾されてもされていなくてもよく、または活性化されていてもいなくてもよい。エンハンサーおよび／またはプロモーターは、植物で発現可能でも可能でなくてもよく、そして／または真核生物で発現可能でも可能でなくてもよく、そして／または原核生物で発現可能でも可能でなくてもよい。本発明の核酸分子は、（自己スプライシング）リボザイムをコードする配列を含んでも含まなくてもよい。
【００４０】
好ましくは、本発明の核酸分子はＲＮＡである。
【００４１】
本発明の第１の実施形態の特定の態様では、本発明の核酸は、インビトロ転写に適切な核酸、特に適切なインビトロ転写ベクター（例えば、インビトロ転写に特異的なプロモーター（Ｔ３、Ｔ７、またはＳｐ６プロモーターなど）を含むプラスミドまたは線状核酸配列）中に含まれる核酸配列である。
【００４２】
本発明の第１の実施形態のさらに特に好ましい態様では、本発明の核酸は、発現系（例えば、発現ベクターまたはプラスミド中）、特に原核生物（例えば、大腸菌などの細菌）または真核生物（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞、または植物もしくは動物などの生物全体）の発現系中での転写および／または翻訳に適切な核酸中に含まれる。
【００４３】
用語「発現系」は、ペプチド、タンパク質、またはＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の産生に適切な系（細胞培養物または生物全体）を意味する。
【００４４】
本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、少なくとも１つのヒストンステムループを含むかまたはコードする。本発明の文脈では、かかるヒストンステムループは、典型的にはヒストン遺伝子に由来し、２つの隣接する完全または部分的な逆相補配列の分子内塩基対合、それによるステムループの形成を含む。ステムループは、一本鎖ＤＮＡ、またはより一般的には、ＲＮＡで起こり得る。構造はまた、ヘアピンまたはヘアピンループとして公知であり、通常、連続配列内のステムおよび（末端）ループからなり、ステムは、ステムループ構造のループを構築するいわばスペーサーのような短い配列によって分離された２つの隣接する完全または部分的な逆相補配列によって形成される。２つの隣接する完全または部分的な逆相補配列を、例えば、ステムループエレメントステム１およびステム２と定義することができる。ステムループは、これらの２つの隣接する完全または部分的な逆相補配列（例えば、ステムループエレメントステム１およびステム２）が互いに塩基対合する場合に形成され、それにより、その末端に連続配列上のステムループエレメントステム１とステム２との間に存在する短い配列によって形成された不対ループを含む二本鎖核酸配列が得られる。それにより、不対ループは、典型的には、これらのステムループエレメントのいずれかと塩基対合することができない核酸領域を示す。得られたロリポップ形状の構造は、多数のＲＮＡ二次構造の重要な基本単位である。したがって、ステムループ構造の形成は、得られたステムおよびループ領域の安定性に依存し、その第１の必要条件は、典型的には、配列自体が折りたたまれて対合した二本鎖を形成することができる配列の存在である。対合したステムループエレメントの安定性は、長さ、ミスマッチ数またはバルジの含有数（少数のミスマッチは、典型的には特に長い二本鎖で許容され得る）、および対合した領域の塩基組成によって決定される。本発明の文脈では、至適ループ長は、３〜１０塩基、より好ましくは３〜８、３〜７、３〜６、またはさらにより好ましくは４〜５塩基、および最も好ましくは４塩基である。
【００４５】
本発明によれば、請求項１の構成要素（ｂ）のヒストンステムループ配列は、マウスヒストンタンパク質に由来しなくてよい。より具体的には、ヒストンステムループ配列は、マウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４に由来しなくてよい。また、本発明の核酸は、マウスヒストンステムループ配列やマウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４を含まなくてよい。さらに、本発明の核酸配列は、ステムループプロセシングシグナル、より具体的には、マウスヒストンプロセシングシグナルを含まなくてもよく、最も具体的には、マウスステムループプロセシングシグナルＨ２ｋＡ６１４を含まなくてよい。また、本発明の核酸（ｎｕｃｋｅｉｃ  ａｃｉｄ）分子は、少なくとも１つの哺乳動物ヒストン遺伝子を含むことができる。しかし、少なくとも１つの哺乳動物ヒストン遺伝子はＷＯ０１／１２８２４号の配列番号７でなくてよい。
【００４６】
第１の本発明の実施形態の１つの好ましい態様によれば、本発明の核酸配列は、好ましくは少なくとも１つの以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）：
【００４７】
【化１】
0005860464.tif 000002
【００４８】
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【００４９】
【化２】
0005860464.tif 000003
【００５０】
の少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むかまたはコードし、ここで、
ステム１またはステム２境界エレメントＮ１〜６は、１〜６個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜５個、さらにより好ましくは３〜５個、最も好ましくは４〜５個または５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０〜２ＧＮ３〜５］は、エレメントステム２と逆に相補的であるか、部分的に逆に相補的であり、且つ５〜７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０〜２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３〜５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｇはグアノシンまたはそのアナログであり、シチジンまたはそのアナログに必要に応じて置換することができ、但し、ステム２中のその相補的ヌクレオチドシチジンがグアノシンに置換されるものとし、
ループ配列［Ｎ０〜４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０〜４］は、エレメントステム１とステム２との間に存在し、３〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０〜４は、別のＮ０〜４とは独立した、０〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、Ｕ／Ｔはウリジン、または必要に応じてチミジンを示し、
ステム２［Ｎ３〜５ＣＮ０〜２］は、エレメントステム１と逆に相補的であるか、部分的に逆に相補的であり、且つ５〜７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３〜５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ０〜２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、またはＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｃはシチジンまたはそのアナログであり、グアノシンまたはそのアナログに必要に応じて置換することができ、但し、ステム１中のその相補的ヌクレオチドグアノシンがシチジンに置換されるものとし、
ここで、
ステム１およびステム２が互いに塩基対合して逆相補配列を形成することができ、塩基対合が（例えば、ヌクレオチドＡおよびＵ／ＴまたはＧおよびＣのワトソン−クリック塩基対合によって、または非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合）によって）ステム１とステム２との間で起こり得るか、互いに塩基対合して部分的に逆相補の配列を形成することができ、不完全な塩基対合は、一方のステム中の１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）の塩基が他方のステムの逆相補配列中の相補塩基を持たないことに基づいて、ステム１とステム２との間で起こり得る。
【００５１】
上記文脈では、ゆらぎ塩基対合は、典型的には、２ヌクレオチド間の非ワトソン−クリック塩基対合である。使用することができる本文脈における４個の主なゆらぎ塩基対は、グアノシン−ウリジン、イノシン−ウリジン、イノシン−アデノシン、イノシン−シチジン（Ｇ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ａ、およびＩ−Ｃ）およびアデノシン−シチジン（Ａ−Ｃ）である。
【００５２】
したがって、本発明の文脈では、ゆらぎ塩基は、上記のさらなる塩基とゆらぎ塩基対を形成する塩基である。したがって、非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合）は、本発明に従うヒストンステムループ構造のステム中で起こり得る。
【００５３】
上記文脈では、部分的に逆相補の配列は、ステム１およびステム２の塩基対合によって形成されたステムループ配列のステム構造中に最大で２個、好ましくはたった１個のミスマッチを含む。換言すれば、ステム１およびステム２は、好ましくは、ステム１およびステム２の全配列を通して相互に（完全に）塩基対合し（１００％の正確なワトソン−クリック塩基対合または非ワトソン−クリック塩基対合が可能）、それにより、逆相補配列を形成することができ、各塩基は相補性結合パートナーとしてその正確なワトソン−クリック塩基側鎖または非ワトソン−クリック塩基側鎖を有する。あるいは、ステム１およびステム２は、好ましくは、ステム１およびステム２の全配列を通して相互に部分的に塩基対合することができ、１００％のうちの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の正確なワトソン−クリック塩基対合または非ワトソン−クリック塩基対合が正確なワトソン−クリック塩基対合または非ワトソン−クリック塩基対合で占められ得、せいぜい約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％の残存塩基が不対である。
【００５４】
第１の本発明の実施形態の好ましい態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸配列の少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを有する）は、約１５〜約４５ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約４０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約３５ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約２０〜約３０の長さ、最も好ましくは約２４〜約２８ヌクレオチド長を含む。
【００５５】
第１の本発明の実施形態のさらなる好ましい態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸配列の少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを持たない）は、約１０〜約３０ヌクレオチド長、好ましくは約１０〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは約１２〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは約１４〜約２０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約１６〜約１７の長さ、最も好ましくは約１６ヌクレオチド長を含む。
【００５６】
第１の本発明の実施形態のさらなる好ましい態様によれば、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、少なくとも１つの以下の特定の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）：
【００５７】
【化３】
0005860464.tif 000004
【００５８】
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【００５９】
【化４】
0005860464.tif 000005
【００６０】
ここで、
Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵは上記定義の通りである）の少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むかまたはコードすることができる。
【００６１】
第１の実施形態のさらにより特に好ましい態様によれば、本発明の核酸配列は、少なくとも１つの以下の特定の式（Ｉｂ）または（ＩＩｂ）の少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むかまたはコードすることができる：
式（Ｉｂ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）：
【００６２】
【化５】
0005860464.tif 000006
【００６３】
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【００６４】
【化６】
0005860464.tif 000007
【００６５】
ここで、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵは上記定義の通りである。
【００６６】
第１の本発明の実施形態のさらにより好ましい態様によれば、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、実施例１に従って生成した少なくとも１つの以下の特定の式（Ｉｃ）〜（Ｉｈ）または（ＩＩｃ）〜（ＩＩｈ）の少なくとも１つのヒストンステムループ配列（そのステムループ構造およびヒストンステムループ配列を示す直鎖状配列として交互に示す）を含むかまたはコードすることができる：
式（Ｉｃ）：（ステム境界エレメントを持たない後生動物および原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【００６７】
【化７】
0005860464.tif 000008
【００６８】
式（ＩＩｃ）：（ステム境界エレメントを有する後生動物および原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【００６９】
【化８】
0005860464.tif 000009
【００７０】
式（Ｉｄ）：（ステム境界エレメントを持たない）
【００７１】
【化９】
0005860464.tif 000010
【００７２】
式（ＩＩｄ）：（ステム境界エレメントを有する）
【００７３】
【化１０】
0005860464.tif 000011
【００７４】
式（Ｉｅ）：（ステム境界エレメントを持たない原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）
【００７５】
【化１１】
0005860464.tif 000012
【００７６】
式（ＩＩｅ）：（ステム境界エレメントを有する原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）
【００７７】
【化１２】
0005860464.tif 000013
【００７８】
式（Ｉｆ）：（ステム境界エレメントを持たない後生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）
【００７９】
【化１３】
0005860464.tif 000014
【００８０】
式（ＩＩｆ）：（ステム境界エレメントを有する後生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）
【００８１】
【化１４】
0005860464.tif 000015
【００８２】
式（Ｉｇ）：（ステム境界エレメントを持たない脊椎動物のヒストンステムループコンセンサス配列）
【００８３】
【化１５】
0005860464.tif 000016
【００８４】
式（ＩＩｇ）：（ステム境界エレメントを有する脊椎動物のヒストンステムループコンセンサス配列）
【００８５】
【化１６】
0005860464.tif 000017
【００８６】
式（Ｉｈ）：（ステム境界エレメントを持たないヒトのヒストンステムループコンセンサス配列（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））
【００８７】
【化１７】
0005860464.tif 000018
【００８８】
式（ＩＩｈ）：（ステム境界エレメントを有するヒトのヒストンステムループコンセンサス配列（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））
【００８９】
【化１８】
0005860464.tif 000019
【００９０】
ここで、上記の式（Ｉｃ）〜（Ｉｈ）または（ＩＩｃ）〜（ＩＩｈ）のそれぞれにおいて、
Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＵは上記定義の通りであり、
各ＵをＴに置換することができ、
ステムエレメント１および２中のそれぞれの（高度に）保存されたＧまたはＣを、その相補ヌクレオチド塩基ＣまたはＧに置換することができ、但し、対応するステム中のその相補ヌクレオチドが並行してその相補ヌクレオチドに置換されるものとし、そして／または
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｂ、Ｖ、Ｄ、およびＮは、以下の表で定義のヌクレオチド塩基である：
【００９１】
【表１−１】
0005860464.tif 000020
【００９２】
この文脈では、本発明の少なくとも１つの式（Ｉ）もしくは（Ｉａ）〜（Ｉｈ）または（ＩＩ）もしくは（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のヒストンステムループ配列が、天然に存在するヒストンステムループ配列、より具体的に好ましくは原生動物または後生動物のヒストンステムループ配列、さらにより具体的に好ましくは脊椎動物、最も好ましくは哺乳動物ヒストンステムループ配列、特にヒトのヒストンステムループ配列から選択されることが特に好ましい。
【００９３】
第１の実施形態の特に好ましい態様によれば、本発明の少なくとも１つの特定の式（Ｉ）もしくは（Ｉａ）〜（Ｉｈ）または（ＩＩ）もしくは（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のヒストンステムループ配列は、図１〜５に示すように、後生動物および原生動物（図１）、原生動物（図２）、後生動物（図３）、脊椎動物（図４）、ならびにヒト（図５）において各ヌクレオチドの位置に天然に存在するヒストンステムループ配列の最も頻繁に生じるヌクレオチド、または最も頻繁もしくは２番目に最も頻繁に生じるヌクレオチドのいずれかを含むヒストンステムループ配列である。この文脈では、全ヌクレオチドの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、または最も好ましくは少なくとも９０％が天然に存在するヒストンステムループ配列の最も頻繁に生じるヌクレオチドに対応することが特に好ましい。
【００９４】
第１の実施形態のさらに特定の態様では、本発明の少なくとも１つの特定の式（Ｉ）または（Ｉａ）〜（Ｉｈ）のヒストンステムループ配列は、実施例１に従って生成したヒストンステムループ配列を示す以下のヒストンステムループ配列（ステム−境界エレメントを持たない）から選択される。
【００９５】
【化１９】
0005860464.tif 000021
【００９６】
さらに、この文脈では、特定の式（ＩＩ）または（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のうちの１つの実施例１に従って生成した以下のヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを有する）が特に好ましい。
【００９７】
【化２０】
0005860464.tif 000022
【００９８】
第１の本発明の実施形態のさらなる好ましい態様によれば、本発明の核酸配列は、少なくとも１つの特定の式（Ｉ）もしくは（Ｉａ）〜（Ｉｈ）または（ＩＩ）もしくは（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のヒストンステムループ配列中または天然に存在するヒストンステムループ配列を有する保存ヌクレオチドと少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性（１００％ではない）を示す少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むかまたはコードする。
【００９９】
本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、必要に応じて、ポリ（Ａ）配列を含むかまたはコードすることができる。存在する場合、かかるポリ（Ａ）配列は、約２５〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、さらにより好ましくは約５０〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列を含む。この文脈では、用語「約」は、これが付された値の±１０％の偏差をいう。
【０１００】
好ましくは、本発明の核酸は、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）、ウイルス核酸配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列）、Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、および不活化エンハンサー配列をコードする配列からなる群の成分の１つ、または２つ、または少なくとも１つ、または１つを除く全て、または全てを含まない。さらにより好ましくは、本発明の核酸は、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）、およびＮｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、不活化エンハンサー配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列）からなる群のうちの１つを含まない。したがって、核酸は、好ましい様式では、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）を含まなくてよく、Ｎｅｏ遺伝子も含まなくてもよいか、またはリボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）を含まなくてよく、いかなる耐性遺伝子（例えば、通常は選択のために適用される）も含まなくてもよい。別の好ましい様式では、本発明の核酸は、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）を含まなくてよく、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列）も含まなくてもよい。
【０１０１】
あるいは、本発明の第１の実施形態によれば、本発明の核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、必要に応じて、特異的タンパク質因子（例えば、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子ＩおよびＩＩ（ＣＦＩおよびＣＦＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によってポリアデニル化を（転写された）ｍＲＮＡに輸送するシグナルとして本明細書中で定義されるポリアデニル化シグナルを含む。この文脈では、ＮＮＵＡＮＡコンセンサス配列を含むコンセンサスポリアデニル化シグナルが好ましい。特に好ましい態様では、ポリアデニル化シグナルは、以下の配列のうちの１つを含む：ＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡ。
【０１０２】
本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸配列は、さらに、タンパク質またはペプチド（例えば、治療的に活性なタンパク質またはペプチド（アジュバントタンパク質が含まれる）、抗原（例えば、腫瘍抗原、病原性抗原（例えば、動物抗原、ウイルス抗原、原生動物抗原、細菌抗原から選択される）、アレルギー性抗原、自己免疫抗原、またはさらなる抗原）、アレルゲン、抗体、免疫賦活性タンパク質もしくはペプチド、抗原特異的Ｔ細胞受容体、または特異的（治療への）適用に適切な任意の他のタンパク質またはペプチドから選択することができるが、これらに制限されない）をコードし、本発明の核酸を細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物中に輸送することができ、タンパク質を、その後にこの細胞、組織、または生物中で発現させることができる。
【０１０３】
本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸のコード領域は、モノシストロン性、ジシストロン性、さらにはマルチシストロン性核酸（すなわち、１つ、２つ、またはそれを超えるタンパク質またはペプチドのコード配列を保有する核酸）として存在することができる。ジシストロン性、またはマルチシストロン性核酸中のかかるコード配列を、少なくとも１つの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列（例えば、本明細書中に定義）またはいくつかのタンパク質またはペプチドを含む得られたポリペプチドの切断を誘導するシグナルペプチドによって分離することができる。
【０１０４】
本発明の第１の実施形態の特に好ましい態様では、コードされたペプチドまたはタンパク質は、ヒト、ウイルス、細菌、原生動物のタンパク質またはペプチドから選択される。
【０１０５】
本発明の文脈では、本発明の核酸分子によってコードされる治療的に活性なタンパク質を、疾患、好ましくは本明細書中に定義の疾患の治癒、予防、または治療的な処置に影響を及ぼすタンパク質（制限されない）から選択することができるか、個体が必要とするタンパク質である。かかるタンパク質を、先行技術から当業者に公知の任意の天然に存在するか合成的にデザインされた組換えまたは単離されたタンパク質から選択することができる。これらに制限されないが、治療的に活性なタンパク質は、細胞内でシグナル伝達を刺激または阻害することができるタンパク質（例えば、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、成長因子、受容体、シグナル伝達分子、転写因子など；抗凝固薬；抗トロンビン；抗アレルギー性タンパク質；アポトーシス因子またはアポトーシス関連タンパク質、治療活性酵素、および任意の後天性疾患または任意の遺伝性疾患に関連する任意のタンパク質）を含むことができる。
【０１０６】
好ましくは、本発明の核酸分子によってコードされ得る治療的に活性なタンパク質はまた、アジュバントタンパク質であり得る。この文脈では、アジュバントタンパク質は、好ましくは、本明細書中に定義の先天性免疫応答を誘発することができる任意のタンパク質と理解される。好ましくは、かかる先天性免疫応答は、パターン認識受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリー（例えば、ヒトＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０またはマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３から選択されるＴｏｌｌ様受容体が含まれる）から選択される受容体など）の活性化を含む。より好ましくは、アジュバントタンパク質は、ヒトアジュバントタンパク質から選択されるか、細菌タンパク質、原生動物タンパク質、ウイルスタンパク質、または真菌タンパク質、動物タンパク質、特に、細菌アジュバントタンパク質からなる群から選択される病原性アジュバントタンパク質（これらに制限されない）から選択される。さらに、アジュバント効果に関与するヒトタンパク質（例えば、パターン認識受容体のリガンド、パターン認識受容体、シグナル伝達経路のタンパク質、転写因子、またはサイトカイン）をコードする核酸も使用することができる。
【０１０７】
本発明の核酸分子は、あるいは、抗原をコードすることができる。本発明によれば、用語「抗原」は、免疫系によって認識され、例えば、適応免疫応答の一部としての抗体または抗原特異的Ｔ細胞の形成によって抗原特異的免疫応答を誘発することができる物質をいう。
【０１０８】
この文脈では、抗原エピトープ（タンパク質のフラグメントまたはペプチド）は、Ｂ細胞、抗体、またはＴ細胞によってそれぞれ認識され得る、特にＢ細胞およびＴ細胞エピトープを意味する。
【０１０９】
本発明の文脈では、本発明の核酸分子によってコードされ得る抗原は、典型的には、上記定義に分類される任意の抗原、抗原エピトープ、抗原フラグメント、または抗原ペプチド、より好ましくはタンパク質抗原およびペプチド抗原（例えば、腫瘍抗原、アレルギー性抗原またはアレルゲン、自己免疫自己抗原、病原性抗原など）を含む。
【０１１０】
特に、本発明の核酸分子によってコードされる抗原は、細胞外で生成された抗原、より典型的には宿主生物（例えば、ヒト）自体に由来せず（すなわち、非自己抗原）、むしろ宿主生物外の宿主細胞に由来する抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、動物抗原、アレルギー性抗原など）であり得る。アレルギー性抗原（アレルギー抗原またはアレルゲン）は、典型的には、ヒトにおいてアレルギーを引き起こし、ヒトまたは他の供給源のいずれかに由来し得る抗原である。さらに、本発明の核酸分子によってコードされる抗原は、さらに、細胞内、組織内、または体内で生成される抗原であり得る。かかる抗原には、宿主生物（例えば、ヒト）自体（例えば、腫瘍抗原、自己抗原、または自己抗原（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）（例えば、自己免疫自己抗原など））に由来する抗原が含まれるが、元は宿主生物外の宿主細胞に由来していたが、例えば（プロテアーゼ）分解、代謝などによって、体内、組織内、または細胞内で断片化または分解される本明細書中に定義の（非自己）抗原も含まれる。
【０１１１】
本発明の核酸分子によってコードされ得る１つの抗原クラスは、腫瘍抗原を含む。「腫瘍抗原」は、好ましくは、（腫瘍）細胞の表面上に存在する。腫瘍抗原を、正常細胞と比較して腫瘍細胞中で過剰発現されるタンパク質から選択することもできる。さらに、腫瘍抗原には、それ自体は変性していない（していなかった）（または元はそれ自体ではない）が、予想される腫瘍に関連する細胞中で発現される抗原も含まれる。腫瘍を供給する血管またはその（再）形成に関与する抗原（特に、血管新生に関連する抗原（例えば、成長因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦなど））も本明細書中に含まれる。腫瘍に関与する抗原には、さらに、典型的には腫瘍が包埋している細胞または組織由来の抗原が含まれる。さらに、いくつかの物質（通常、タンパク質またはペプチド）は、癌疾患を罹患している（既知または未知）患者において発現し、これらの物質は、前記患者の体液中で濃度が増加する。これらの物質も「腫瘍抗原」というが、これらの物質は、免疫応答誘導物質の厳密な意味における抗原ではない。この腫瘍抗原クラスは、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）にさらに分類することができる。ＴＳＡは、腫瘍細胞のみが提示することができ、通常の「健康な」細胞は決して提示できない。ＴＳＡは、典型的には、腫瘍特異的変異に起因する。より一般的なＴＡＡは、通常、腫瘍細胞および健康な細胞の両方によって提示される。これらの抗原が抗原提示細胞によって認識され、細胞傷害性Ｔ細胞によって破壊することができる。さらに、腫瘍抗原はまた、例えば、変異受容体の形態で腫瘍の表面上に生じ得る。この場合、これらは抗体によって認識され得る。
【０１１２】
別の代替法によれば、本発明の核酸分子によってコードされ得る１つのさらなる抗原クラスはアレルギー性抗原を含む。かかるアレルギー性抗原を、異なる供給源（例えば、動物、植物、真菌、細菌など）に由来する抗原から選択することができる。この文脈におけるアレルゲンには、例えば、草、花粉、カビ、薬物、または多数の環境要因などが含まれる。アレルギー性抗原は、典型的には、異なる化合物クラス（核酸およびそのフラグメント、タンパク質またはペプチドおよびそのフラグメント、炭水化物、ポリサッカリド、糖、脂質、リン脂質など）に属する。本明細書中に定義の本発明の核酸分子によってコードされ得る抗原（すなわち、タンパク質またはペプチド抗原およびそのフラグメントまたはエピトープ）または核酸およびそのフラグメント、（特に、かかるタンパク質またはペプチド抗原およびそのフラグメントまたはエピトープをコードする核酸およびそのフラグメント）が本発明の文脈で特に興味深い。
【０１１３】
さらなる代替法によれば、本発明の核酸分子は、抗体または抗体フラグメントをコードすることができる。本発明によれば、かかる抗体を、任意の抗体（例えば、当該分野で公知の任意の組換え的に産生されたか天然に存在する抗体、特に、治療目的、診断目的、または科学的な目的に適切な抗体または特定の癌疾患に関して同定された抗体）から選択することができる。本明細書中で、用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、具体的には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および遮断抗体または中和抗体が含まれる）ならびに多エピトープ特異性を有する抗体種を対象とする。本発明によれば、用語「抗体」は、典型的には、当該分野で公知の任意の抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ抗体）（天然に存在する抗体、宿主生物における免疫化によって生成された抗体、天然に存在する抗体から単離されて同定された抗体、または宿主生物における免疫化によって生成され、当該分野で公知の生体分子法によって組換え的に産生された抗体、ならびにキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、細胞内抗体（すなわち、細胞内で発現し、必要に応じて特定の細胞区画内に局在した抗体））、ならびに上記抗体のフラグメントおよびバリアントを含む。一般に、抗体は、共に可変ドメインおよび定常ドメインを有する軽鎖および重鎖からなる。軽鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＬ）およびＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）からなる。対照的に、ＩｇＧ抗体の重鎖は、例えば、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）から構成される。
【０１１４】
本発明の文脈では、本発明の核酸分子によってコードされる抗体は、好ましくは、全長抗体（すなわち、上記のように完全な重鎖および完全な軽鎖から構成された抗体）を含むことができる。しかし、抗体の誘導体（抗体フラグメント、バリアント、または付加物など）を、本発明の核酸分子によってコードすることもできる。抗体フラグメントは、好ましくは、上記の（全長）抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｃｂ、ｐＦｃ’、Ｆｄ、およびＦｖフラグメントから選択される。一般に、抗体フラグメントは当該分野で公知である。例えば、Ｆａｂ（「フラグメント、抗原結合」）フラグメントは、各重鎖および軽鎖の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。２つの可変ドメインは、特異的抗原上のエピトープに結合する。２つの鎖は、ジスルフィド結合を介して連結している。ｓｃＦｖ（「単鎖可変フラグメント」）フラグメントは、例えば、典型的には、軽鎖および重鎖の可変ドメインからなる。ドメインは、人工的結合、一般にポリペプチド結合（１５〜２５個のグリシン、プロリン、および／またはセリン残基から構成されるペプチドなど）によって結合している。
【０１１５】
本文脈では、抗体または抗体フラグメントの異なる鎖がマルチシストロン性核酸分子によってコードされることが好ましい。あるいは、異なる系統の抗体または抗体フラグメントは、いくつかのモノシストロン性核酸（配列）によってコードされる。
【０１１６】
本発明の第１の実施形態によれば、本発明の核酸配列は、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含む。好ましくは、コードされたタンパク質はヒストンタンパク質を含まない。本発明の文脈では、かかるヒストンタンパク質は、典型的には、ヌクレオソームと呼ばれる構造単位にＤＮＡをパッケージングして規制する、真核細胞の核内に見い出される強アルカリ性タンパク質である。ヒストンタンパク質はクロマチンの主要なタンパク質成分であり、その周囲をＤＮＡが巻き付く糸巻きとして作用し、遺伝子調節で役割を果たす。ヒストンがなければ、染色体内の巻き戻されたＤＮＡは非常に長いであろう（ヒトＤＮＡにおける長さ：幅の比は、１０００万超：１である）。例えば、各ヒト細胞は、約１．８メートルのＤＮＡを有するが、ヒストン上に巻き付いて約９０ミリメートルのクロマチンとなり、有糸分裂中に分裂して凝縮した場合に、約１２０マイクロメートルの染色体になる。より好ましくは、本発明の文脈では、かかるヒストンタンパク質を、典型的には、以下の５つの主なヒストンクラス：Ｈ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４”のうちの１つ、好ましくは哺乳動物ヒストン、より好ましくはヒトのヒストンまたはヒストンタンパク質から選択される高度に保存されたタンパク質と定義する。かかるヒストンまたはヒストンタンパク質は、典型的には、コアヒストン（ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む）およびリンカーヒストン（ヒストンＨ１およびＨ５を含む）と定義される２つのスーパークラスに分類される。
【０１１７】
この文脈では、好ましくは係属中の発明の保護範囲から排除されたリンカーヒストン、好ましくは哺乳動物リンカーヒストン、より好ましくはヒトリンカーヒストンは、典型的には、Ｈ１（Ｈ１Ｆが含まれ，特にＨ１Ｆ０、Ｈ１ＦＮＴ、Ｈ１ＦＯＯ、Ｈ１ＦＸ、およびＨ１Ｈ１が含まれ、特にＨＩＳＴ１Ｈ１Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｔが含まれる）から選択される。
【０１１８】
さらに、好ましくは係属中の発明の保護範囲から排除されたコアヒストン、好ましくは哺乳動物コアヒストン、より好ましくはヒトコアヒストンは、典型的には、Ｈ２Ａ（Ｈ２ＡＦ、特にＨ２ＡＦＢ１、Ｈ２ＡＦＢ２、Ｈ２ＡＦＢ３、Ｈ２ＡＦＪ、Ｈ２ＡＦＶ、Ｈ２ＡＦＸ、Ｈ２ＡＦＹ、Ｈ２ＡＦＹ２、Ｈ２ＡＦＺ、およびＨ２Ａ１が含まれ、特にＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＭ、およびＨ２Ａ２が含まれ、特にＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＣが含まれる）；Ｈ２Ｂ（Ｈ２ＢＦが含まれ、特にＨ２ＢＦＭ、Ｈ２ＢＦＯ、Ｈ２ＢＦＳ、Ｈ２ＢＦＷＴ  Ｈ２Ｂ１が含まれ、特にＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、およびＨ２Ｂ２が含まれ、特にＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥが含まれる）；Ｈ３（Ｈ３Ａ１が含まれ、特にＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、およびＨ３Ａ２が含まれ、特にＨＩＳＴ２Ｈ３ＣおよびＨ３Ａ３が含まれ、特にＨＩＳＴ３Ｈ３が含まれる）；Ｈ４（Ｈ４１が含まれ、特にＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、およびＨ４４が含まれ、特にＨＩＳＴ４Ｈ４が含まれる）、ならびにＨ５から選択される。
【０１１９】
本発明の第１の実施形態によれば、本発明の核酸配列は、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含む。好ましくは、コードされたタンパク質は、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ）、およびマーカータンパク質または選択タンパク質（例えば、αグロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））を含まない。好ましくは、本発明の核酸配列は、（細菌）Ｎｅｏ遺伝子配列（ネオマイシン耐性遺伝子）を含まない。
【０１２０】
上記定義の本発明の核酸は、ａ）好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域；ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ、およびｃ）任意選択的なポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナル（好ましくは、コードされたタンパク質の発現レベルを増加させるため）を含むかまたはコードし、コードされたタンパク質は、好ましくは、上記定義のヒストンタンパク質、レポータータンパク質、および／またはマーカータンパク質または選択タンパク質を含まない。本発明の核酸のエレメントｂ）〜ｃ）は、本発明の核酸において任意の順序で存在することができ（すなわち、エレメントａ）、ｂ）、およびｃ）は、本発明の核酸配列において５’→３’方向でａ）、ｂ）、およびｃ）またはａ）、ｃ）、およびｂ）の順序で存在することができる）、本明細書中に記載のさらなるエレメント（５’−ＣＡＰ構造、ポリ（Ｃ）配列、安定化配列、ＩＲＥＳ配列など）も含まれ得る。本発明の核酸のａ）〜ｃ）の各エレメント、特にジシストロン性またはマルチシストロン性の構築物中のａ）および／またはｂ）およびｃ）の各エレメント、より好ましくはエレメントｂ）を、本発明の核酸中で少なくとも１回、好ましくは２回以上反復することもできる。例として、本発明の核酸は、例えば、以下の順序でその配列エレメントａ）、ｂ）、および必要に応じてｃ）を示すことができる。
５’−コード領域−ヒストンステムループ−３’；または
５’−コード領域−コード領域−ヒストンステムループ−３’；または
５’−コード領域−ＩＲＥＳ−コード領域−ヒストンステムループ−３’；または
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−３’；または
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；または
５’−コード領域−コード領域−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；または
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−３’；または
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−３’；または
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；または
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ−３’；または
５’−コード領域−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ−３’；または
５’−コード領域−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−３’など。
【０１２１】
この文脈では、本発明の核酸分子が、ａ）好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域；ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ、およびｃ）ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化配列（好ましくは、コードされたタンパク質の発現レベルを増加させるため）を含むかまたはコードし、コードされたタンパク質は、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、特にＥＧＦＰ）、および／またはマーカータンパク質または選択タンパク質（例えば、αグロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））を含まないことが特に好ましい。
【０１２２】
第１の実施形態のさらに好ましい態様では、本明細書中に定義の本発明の核酸分子はまた、修飾核酸の形態で生じ得る。
【０１２３】
第１の実施形態の１つの態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸分子を、「安定化核酸」として、好ましくは安定化ＲＮＡとして、より好ましくはインビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に本質的に耐性を示すＲＮＡとして提供することができる。
【０１２４】
この文脈では、本明細書中に定義の本発明の核酸分子は、ヌクレオチドアナログ／修飾（例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾）を含むことができる。本発明に関与する骨格修飾は、本明細書中に定義の本発明の核酸分子中に含まれるヌクレオチド骨格のリン酸が化学修飾される修飾である。本発明に関与する糖修飾は、本明細書中に定義の本発明の核酸分子のヌクレオチドの糖の化学修飾である。さらに、本発明に関与する塩基修飾は、本発明の核酸分子の核酸分子のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この文脈では、ヌクレオチドアナログまたは修飾は、好ましくは、転写および／または翻訳のために適用可能なヌクレオチドアナログから選択される。
【０１２５】
本発明の第１の実施形態の特定の好ましい態様では、本明細書中で定義したヌクレオチドアナログ／修飾は、コードされたタンパク質の発現を漸増する塩基修飾から選択され、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、２−アミノアデノシン−５’−三リン酸、２−チオシチジン−５’−三リン酸、２−チオウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモウリジン−５’−三リン酸、５−ヨードシチジン−５’−三リン酸、５−ヨードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、６−アザシチジン−５’−三リン酸、６−アザウリジン−５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、７−デアザアデノシン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、８−アザアデノシン−５’−三リン酸、８−アジドアデノシン−５’−三リン酸、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−三リン酸、プソイドウリジン−５’−三リン酸、またはピューロマイシン−５’−三リン酸、キサントシン−５’−三リン酸から選択される。５−メチルシチジン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、およびプソイドウリジン−５’−三リン酸からなる塩基修飾されたヌクレオチド群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。
【０１２６】
さらなる態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸分子は、脂質修飾を含むことができる。かかる脂質修飾された核酸は、典型的には、本明細書中に定義の核酸を含む。本明細書中に定義の本発明の核酸分子のかかる脂質修飾された核酸分子は、典型的には、この核酸分子と共有結合した少なくとも１つのリンカーおよび各リンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質をさらに含む。あるいは、脂質修飾された核酸分子は、少なくとも１つの本明細書中に定義の核酸分子およびこの核酸分子と共有結合した（リンカーなし）少なくとも１つの（二官能性）脂質を含む。第３の代替法によれば、脂質修飾された核酸分子は、本明細書中に定義の核酸分子、この核酸分子に共有結合した少なくとも１つのリンカーおよび各リンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質を含み、この核酸分子と共有結合した（リンカーなし）少なくとも１つの（二官能性）脂質も含む。この文脈では、脂質修飾が本発明の線状核酸配列の末端に存在することが特に好ましい。
【０１２７】
したがって、本発明の第１の実施形態の別の好ましい態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸分子を、特に（ｍ）ＲＮＡとして提供した場合、いわゆる「５’ＣＡＰ」構造の付加によってＲＮアーゼによる分解に対して安定化することができる。
【０１２８】
本発明の第１の実施形態のさらなる好ましい態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸分子を、少なくとも１０シチジン、好ましくは少なくとも２０シチジン、より好ましくは少なくとも３０シチジンの配列（いわゆる「ポリ（Ｃ）配列」）によって修飾することができる。特に、本発明の核酸分子は、典型的には約１０〜２００シチジンのヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００シチジンのヌクレオチド、より好ましくは約１０〜７０シチジンのヌクレオチド、またはさらにより好ましくは約２０〜５０、またはさらに２０〜３０シチジンのヌクレオチドのポリ（Ｃ）配列を含むかまたはコードすることができる。このポリ（Ｃ）配列は、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸に含まれるコード領域の３’側に位置することが好ましい。
【０１２９】
本発明の第１の実施形態の別の好ましい態様によれば、本明細書中に定義の本発明の核酸分子は、好ましくは、少なくとも１つの５’および／または３’安定化配列を有する。５’および／または３’非翻訳領域中のこれらの安定化配列は、サイトゾル中の核酸の半減期を増加させる効果がある。これらの安定化配列は、ウイルス、細菌、および真核生物中に生じる天然に存在する配列と１００％の配列同一性を有し得るが、部分的または完全に合成でもあり得る。例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓまたはＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ由来の（α−）グロビン遺伝子の非翻訳配列（ＵＴＲ）を、安定化核酸のために本発明で使用することができる安定化配列の例と言及することができる。安定化配列の別の例は、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮｘＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙｘＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣ（配列番号５５）を有し、これは、（α−）グロビン、（Ｉ）型コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼ、またはチロシンヒドロキシラーゼをコードする非常に安定なＲＮＡの３’−ＵＴＲ中に含まれる（Ｈｏｌｃｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４：２４１０〜２４１４を参照のこと）。かかる安定化配列を、勿論、個別または相互の組み合わせおよび当業者に公知の他の安定化配列との組み合わせで使用することができる。この文脈では、αグロビン遺伝子の３’ＵＴＲ配列が本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸中に含まれるコード配列の３’側に位置することが特に好ましい。
【０１３０】
塩基の置換、付加、または排除を、好ましくは、本明細書中に定義の本発明の核酸分子を使用し、周知の部位特異的変異誘発技術によるかオリゴヌクレオチドライゲーションストラテジーを用いた核酸分子調製用のＤＮＡマトリックスを使用して行う（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照のこと）。かかるプロセスでは、本明細書中に定義の本発明の核酸分子の調製のために、特に核酸がｍＲＮＡの形態である場合、対応するＤＮＡ分子をインビトロで転写することができる。このＤＮＡマトリックスは、好ましくは、インビトロ転写のための適切なプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター）を含み、その後に、調製すべき核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のための所望のヌクレオチド配列およびインビトロ転写のための終止シグナルが続く。少なくとも１つの目的のＲＮＡのマトリックスを形成するＤＮＡ分子を、細菌中で複製することができるプラスミドの一部としての発酵による増殖およびその後の単離によって調製することができる。本発明に適切であると言及することができるプラスミドは、例えば、プラスミドｐＴ７Ｔｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２６４０４；Ｌａｉら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９５，１２１：２３４９〜２３６０）、ｐＧＥＭ（登録商標）シリーズ（例えば、ｐＧＥＭ（登録商標）−１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６５３００；Ｐｒｏｍｅｇａから入手））、およびｐＳＰ６４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６５３２７）である（Ｍｅｚｅｉ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｔｓ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎ：Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ（ｅｄ．），ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００１も参照のこと）。
【０１３１】
本明細書中に定義の本発明に従って使用される核酸分子を、当該分野で公知の任意の方法（合成法（例えば、固相合成など）およびインビトロでの方法（インビトロ転写反応など）またはインビボ反応（細菌中でのＤＮＡプラスミドのインビボ増殖など）が含まれる）を使用して調製することができる。
【０１３２】
上記修飾のいずれかを、本明細書中に定義の本発明の核酸分子に適用することができ、本発明の文脈で使用される任意の核酸にさらに適用することができ、適切であるか必要である場合、任意の組み合わせで相互に組み合わせることができるが、但し、これらの修飾の組み合わせは各核酸において相互に干渉しないものとする。当業者は、しかるべく選択することができるであろう。
【０１３３】
本明細書中に定義の本発明の核酸分子およびこの核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドは、これらの配列のフラグメントまたはバリアントを含むことができる。かかるフラグメントまたはバリアントは、典型的には、核酸レベルまたはアミノ酸レベルのいずれかで、上記核酸のうちの１つまたは少なくとも１つの核酸分子によってコードされる場合はタンパク質もしくはペプチドまたは配列のうちの１つと全野生型配列に対して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらに９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
【０１３４】
本発明の第１の実施形態のさらに好ましい態様では、本発明の核酸配列を、本発明の核酸配列のトランスフェクション効率を増加させるためのビヒクル、トランスフェクション剤、または複合体形成剤と組み合わせる。トランスフェクション効率の増加に適切な本文脈で特に好ましい薬剤は、カチオン性またはポリカチオン性の化合物（プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、もしくはスペルミジンが含まれる）、または他のカチオン性のペプチドまたはタンパク質（ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−アルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチドが含まれる）、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチドまたはアナログペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐｌｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、またはヒストンなど）である。さらに、好ましいカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質またはペプチドは、以下の全式：（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（ここで、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５、ｌ、ｍ、ｎ、またはｏは、相互に独立して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される任意の数であり得、但し、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、およびＯｒｎの全含有量はオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を表し、ＸａａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＯｒｎを除くネイティブ（＝天然に存在する）または非ネイティブアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり得、ｘは０、１、２、３、または４から選択される任意の数であり得るものとし、但し、Ｘａａの全含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないものとする）を有する以下のタンパク質またはペプチドから選択することができる。本文脈における特に好ましいカチオン性ペプチドは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、Ｙ（ＲＫＨ）２Ｒなどである。トランスフェクション剤として使用することができるさらに好ましいカチオン性またはポリカチオン性の化合物には、カチオン性ポリサッカリド（例えば、キトサン、ポリブレン）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノール−アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ��ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシル（ｇｌｉｃｙｌ）スペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチル塩化アンモニウム、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクトアミン）、またはカチオン性もしくはポリカチオン性のポリマー（例えば、修飾ポリアミノ酸（β−アミノ酸−ポリマーまたは逆ポリアミドなど）、修飾ポリエチレン（ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））など）、修飾アクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリラート））など）、修飾アミドアミン（ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など）、修飾ポリβアミノエステル（ＰＢＡＥ）（ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリラート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなど）、デンドリマー（ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭベースのデンドリマーなど）、ポリイミン（ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）など）、ポリアリルアミン、糖骨格ベースのポリマー（シクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサンなど）、シラン骨格ベースのポリマー（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなど））、１つ以上のカチオン性ブロック（例えば、上記のカチオン性ポリマーから選択される）と１つ以上の親水性または疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組み合わせからなるブロックポリマーなど）が含まれ得る。
【０１３５】
本発明の核酸配列は、裸の形態または複合体（例えば、任意の化学構造のポリカチオン性化合物、好ましくはポリカチオン性（ポリ）ペプチドまたは合成ポリカチオン性化合物による）のいずれかで提供されることが好ましい。好ましくは、核酸配列は、パッケージング細胞と共に提供されない。
【０１３６】
さらなる実施形態によれば、本発明はまた、例えば、ａ）本明細書中に定義の本発明の核酸を提供する工程、ｂ）本明細書中に定義のタンパク質またはペプチドをコードする本発明の核酸を発現系（例えば、無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物）に適用または投与する工程を含む、コードされたタンパク質／ペプチドの発現レベルの増加方法を提供する。本方法を、研究、調査、診断、ペプチドまたはタンパク質の商業的生産、および／または治療目的のために適用することができる。この文脈では、典型的には本明細書中に定義の本発明の核酸の調製後、典型的には、好ましくは裸の形態または本明細書中に記載の薬学的組成物もしくはワクチンとして、好ましくはトランスフェクションによるか本明細書中に記載の投与様式のいずれかの使用によって無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物に適用または投与する。本方法を、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで行うことができる。本方法を、さらに、好ましくは本明細書中に定義の特定の疾患の処置の文脈で行うことができる。
【０１３７】
この文脈では、インビトロは、本明細書中で、生物外での培養物中での本発明の核酸の細胞へのトランスフェクションまたは形質導入と定義し、インビボは、本明細書中で、生物または個体の全体への本発明の核酸の適用による細胞への本発明の核酸のトランスフェクションまたは形質導入と定義し、エキソビボは、本明細書中で、生物または個体外での細胞への本発明の核酸のトランスフェクションまたは形質導入およびその後の生物または個体へのトランスフェクトした細胞の適用と定義する。
【０１３８】
同様に、別の実施形態によれば、本発明はまた、例えば、無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物への本明細書中に定義のタンパク質またはペプチドをコードする本発明の核酸の適用または投与による、コードされたタンパク質／ペプチドの発現レベルを増加させるための、好ましくは診断または治療目的の本明細書中に定義の本発明の核酸の使用を提供する。本使用を、研究、調査、診断、ペプチドまたはタンパク質の商業的生産、および／または治療目的のために適用することができる。この文脈では、典型的には本明細書中に定義の本発明の核酸の調製後、典型的には、好ましくは裸の形態もしくは複合体化形態または本明細書中に記載の薬学的組成物もしくはワクチンとして、好ましくはトランスフェクションによるか本明細書中に記載の投与様式のいずれかの使用によって無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物に適用または投与する。本使用を、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで行うことができる。本使用を、さらに、好ましくは本明細書中に定義の特定の疾患の処置の文脈で行うことができる。
【０１３９】
さらに別の実施形態では、本発明はまた、本発明の第１の実施形態に従う本発明の核酸、または発現ベクター、またはプラスミドを含む本発明の発現系に関する。この文脈では、発現系は、無細胞発現系（例えば、インビトロ転写／翻訳系）、細胞発現系（例えば、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌のような細菌細胞）、またはペプチドもしくはタンパク質の発現のために使用される生物（例えば、植物またはウシのような動物）であり得る。
【０１４０】
さらに、別の実施形態によれば、本発明はまた、例えば、本明細書中に定義の疾患の処置（例えば、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物への本明細書中に定義の本発明の核酸の適用または投与）のための、好ましくは裸の形態もしくは複合体化形態または本明細書中に記載の薬学的組成物もしくはワクチンとして、より好ましくは本明細書中に記載の投与様式のいずれかの使用によるコードされたタンパク質／ペプチドの発現レベルを増加させるための薬学的組成物の調製のための本明細書中に定義の本発明の核酸の使用に関する。
【０１４１】
したがって、１つの特定の好ましい実施形態では、本発明はまた、本明細書中に定義の本発明の核酸および必要に応じて薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはビヒクルを含む薬学的組成物を提供する。
【０１４２】
第１の成分として、本発明の薬学的組成物は本明細書中に定義の本発明の核酸を含む。
【０１４３】
第２の成分として、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つのさらなる薬学的に活性な成分を含むことができる。これに関して、薬学的に活性な成分は、本明細書中に記載の特定の適応症または疾患、好ましくは癌疾患、自己免疫疾患、アレルギーまたは感染症、心血管疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、皮膚疾患、筋骨格系障害、結合組織障害、新生物、免疫欠損、内分泌性、栄養性、および代謝性の疾患、神経疾患、眼の疾患、耳の疾患、および遺伝性疾患を治癒、改善、または防止する治療効果を有する化合物である。かかる化合物には、好ましくは本明細書中に定義のペプチドまたはタンパク質、好ましくは本明細書中に定義の核酸、好ましくは本明細書中に定義の（治療的に活性な）低分子量の有機化合物または無機化合物（分子量５０００未満、好ましくは１０００未満）、糖、抗原または抗体、好ましくは本明細書中に定義の当該分野で既に公知の治療薬、抗原性細胞、抗原性細胞フラグメント、細胞画分；細胞壁成分（例えば、ポリサッカリド）、修飾、弱毒化、または不活化された（例えば、化学的または照射による）病原体（ウイルス、細菌など）、アジュバントなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
さらに、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはビヒクルを含むことができる。本発明の文脈では、薬学的に許容され得るキャリアには、典型的には、本発明の薬学的組成物の液体または非液体の基剤が含まれる。本発明の薬学的組成物が液体で提供される場合、キャリアは、典型的には、発熱性物質除去水；等張生理食塩水、または緩衝液（水溶液）（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）であろう。注射用緩衝液は、特定の基準媒質に関して高張性、等張性、または低張性であり得る（すなわち、緩衝液は、特定の基準媒体に関してより高いか、同一か、より低い塩含量であり得、好ましくは、浸透または他の濃度の影響によって細胞が損傷しないような上記塩のかかる濃度を使用することができる）。基準媒体は、例えば、「インビボ」での方法で生じる液体（血液、リンパ液、サイトゾル液など）または他の体液（例えば、「インビトロ」での方法で基準媒質として使用することができる液体（一般的な緩衝液または液体など））である。かかる一般的な緩衝液または液体は、当業者に公知である。リンゲル−乳酸液は、液体の基剤として特に好ましい。
【０１４５】
しかし、１つ以上の適合性の固体または液体の充填剤または希釈剤またはカプセル化化合物も、本発明の薬学的組成物のために使用することができ、これらは、処置すべき患者への投与に適切である。用語「適合性」は、本明細書中で使用する場合、典型的な使用条件下で本発明の薬学的組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が起こらない様式で、本発明の薬学的組成物のこれらの構成要素が本明細書中に定義の本発明の核酸と混合することができることを意味する。
【０１４６】
特定の態様によれば、本発明の薬学的組成物は、アジュバントを含むことができる。この文脈では、アジュバントを、先天性免疫系の免疫応答（すなわち、非特異的免疫応答）を開始または増加させるのに適切な任意の化合物と理解することができる。言い換えれば、投与した場合、本発明の薬学的組成物は、好ましくは、必要に応じて組成物中に含まれるアジュバントによって先天性免疫応答を誘発する。好ましくは、かかるアジュバントを、当業者に公知であり、且つこの場合（すなわち、哺乳動物における先天性免疫応答の誘導の支持）に適切なアジュバント（例えば、上記定義のアジュバントタンパク質または以下に定義のアジュバント）から選択することができる。
【０１４７】
貯蔵および送達に適切な特に好ましいアジュバントは、ビヒクル、トランスフェクション、または複合体化剤としての本発明の核酸配列のための上記定義のカチオン性またはポリカチオン性の化合物である。
【０１４８】
本発明の薬学的組成物は、さらに、必要に応じてその免疫原性または免疫賦活性能を増加させるための１つ以上の補助物質を含むことができる。本明細書中に定義の本発明の核酸と本発明の薬学的組成物中に必要に応じて含めることができる補助物質との相乗作用は、それにより達成されることが好ましい。種々の補助物質の種類に応じて、これに関する種々の機構を考慮することができる。例えば、樹状細胞（ＤＣ）を成熟させる化合物（例えば、リポ多糖、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０リガンド）は、第１の適切な補助物質クラスを形成する。一般に、「危険信号」の様式で免疫系に影響を及ぼす任意の作用因子（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）または免疫応答を標的様式で増強し、そして／または影響を及ぼすサイトカイン（ＧＭ−ＣＦＳなど）を補助物質として使用することが可能である。特に好ましい補助物質は、先天性免疫応答をさらに促進するサイトカイン（モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−βまたはＴＮＦ−α、成長因子（ｈＧＨなど）など）など）である。
【０１４９】
本発明の薬学的組成物中に含めることができるさらなる添加物は、乳化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）など）；湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）；着色剤；調味剤、薬学的キャリア；錠剤形成剤；安定剤；抗酸化剤；防腐剤である。
【０１５０】
本発明の薬学的組成物は、さらに、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対するその結合親和性（リガンドとして）またはマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、またはＴＬＲ１３に対するその結合親和性（リガンドとして）によって免疫刺激性であることが公知の任意のさらなる化合物を含むこともできる。
【０１５１】
本発明の薬学的組成物を、経口、非経口、吸入噴霧、局所、直腸、鼻腔、口腔内、膣内投与することができるか、インプラント型リザーバによって投与することができる。用語「非経口」には、本明細書中で使用する場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、および舌下への注射または注入技術が含まれる。
【０１５２】
好ましくは、本発明の薬学的組成物を、非経口注射、より好ましくは皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、および舌下への注射によるか、注入技術によって投与することができる。皮内注射および筋肉内注射が特に好ましい。本発明の薬学的組成物の滅菌注射形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液を、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方することができる。
【０１５３】
本明細書中に定義の本発明の薬学的組成物を、任意の経口的に許容され得る投薬形態（カプセル、錠剤、水性懸濁液、または水溶液が含まれるが、これらに限定されない）で経口投与することもできる。
【０１５４】
本発明の薬学的組成物を、特に処置標的が局所適用によって容易に接近可能な領域または器官（例えば、皮膚または任意の他の接近可能な上皮組織の疾患が含まれる）を含む場合、局所投与することもできる。適切な局所処方物は、これらの各領域または器官のために容易に調製される。局所適用のために、本発明の薬学的組成物を、１つ以上のキャリア中に懸濁または溶解された本明細書中に定義の本発明の核酸を含む適切な軟膏に処方することができる。
【０１５５】
本発明の薬学的組成物は、典型的には、「安全且つ有効な量」の本発明の薬学的組成物の成分、特に本明細書中に定義の本発明の核酸を含む。本明細書中で使用する場合、「安全且つ有効な量」は、本明細書中に定義の疾患または障害の正の改変を有意に誘導するのに十分な本明細書中に定義の本発明の核酸の量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、重篤な副作用を回避し、利点とリスクとの間の分別のある関係を可能にするのに十分に少ない量である。これらの限度の決定は、典型的には、分別のある医学的判断の範囲内にある。
【０１５６】
本発明の薬学的組成物を、薬学的組成物（通常）またはワクチンとして、ヒトのためおよび動物に対する医学的目的、好ましくはヒトに対する医学的目的のために使用することができる。
【０１５７】
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明の薬学的組成物（または本明細書中に定義の本発明の核酸）を提供するか、ワクチンとして使用することができる。典型的には、かかるワクチンは、薬学的組成物について上記定義の通りである。
【０１５８】
さらに、かかるワクチンは、典型的には、好ましくは上記定義の抗原をコードする本明細書中に定義の本発明の核酸を含む。あるいは、かかるワクチンは、本明細書中に定義の本発明の核酸およびさらなる抗原を、好ましくは例えば本明細書中に定義のタンパク質もしくはペプチドまたは抗原をコードする核酸としてか、本明細書中に定義の任意の抗原性形式または全ての可能なその組み合わせとして含むことができる。
【０１５９】
本発明のワクチンはまた、本発明の薬学的組成物のための本明細書中に定義の薬学的に許容され得るキャリア、アジュバント、および／またはビヒクルを含むことができる。本発明のワクチンの特定の文脈では、薬学的に許容され得るキャリアの選択は、原則として本発明のワクチンが投与される様式によって決定される。本発明のワクチンを、例えば、全身または局所に投与することができる。通常の全身投与経路には、例えば、経皮、経口、非経口経路（皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内および腹腔内注射、ならびに／または鼻腔内投与経路が含まれる）が含まれる。通常の局所投与経路には、例えば、局所投与経路が含まれるが、皮内、経皮、皮下、もしくは筋肉内注射または病巣内、頭蓋内、肺内、心臓内、および舌下注射も含まれる。より好ましくは、ワクチンを、皮内、皮下、または筋肉内経路によって投与することができる。したがって、本発明のワクチンを、好ましくは、液体（または時折固体）に処方する。
【０１６０】
本発明のワクチンは、さらに、必要に応じてその免疫原性または免疫賦活性能を増加させるために１つ以上の補助物質を含むことができる。薬学的組成物のための定義の補助物質または添加物としてのアジュバントが特に好ましい。
【０１６１】
本発明は、さらに、本明細書中に定義の本発明の核酸、本発明の薬学的組成物、本発明のワクチン（共に本明細書中に定義の本発明の核酸を含む）またはこれらを含むキットのいくつかの適用および使用を提供する。
【０１６２】
１つの特定の実施形態によれば、本発明は、医薬、好ましくは免疫刺激剤、アジュバント、またはワクチンとしてか、遺伝子療法分野での本明細書中に定義の本発明の核酸の第１の医学的使用に関する。
【０１６３】
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書中に定義の疾患の処置のための本明細書中に定義の核酸の第２の医学的使用、好ましくは、本明細書中に定義の種々の疾患の予防、処置、および／または改善のための医薬の調製のための本明細書中に定義の本発明の核酸、これを含む薬学的組成物またはワクチン、またはこれを含むキットの使用に関する。好ましくは、薬学的組成物またはワクチンを、この目的を必要とする患者に使用するか投与する。
【０１６４】
好ましくは、本明細書中で言及した疾患は、癌または腫瘍疾患、感染症、好ましくは（ウイルス、細菌、または原生動物）感染症、自己免疫疾患、アレルギーまたはアレルギー疾患、一遺伝子性疾患（すなわち、（遺伝性）疾患）、または遺伝病全般（遺伝的背景を有し、典型的には定義された遺伝子欠損に原因し、メンデルの法則に従って遺伝する疾患）、心血管疾患、ニューロン疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、皮膚疾患、筋骨格系障害、結合組織障害、新生物、免疫欠損、内分泌性疾患、栄養性疾患、および代謝性疾患、眼疾患、耳疾患、ならびに本発明によって影響を受け得る任意の疾患から選択される。
【０１６５】
上記癌または腫瘍疾患には、好ましくは、例えば、結腸癌腫、黒色腫、腎臓癌腫、リンパ腫、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、胃腸管腫瘍、肺癌腫、神経膠腫、甲状腺腫瘍、乳癌腫、前立腺腫瘍、肝細胞癌、種々のウイルス誘導性腫瘍（例えば、パピローマウイルス誘導性癌腫（例えば、子宮頸癌腫）、腺癌、ヘルペスウイルス誘導性腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎誘導性腫瘍（肝細胞癌腫）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２誘導性リンパ腫など）、聴神経腫／神経鞘腫、子宮頸癌、肺癌、咽頭癌、肛門癌腫、膠芽細胞腫、リンパ腫、直腸癌腫、星状細胞腫、脳腫瘍、胃癌、網膜芽細胞腫、基底細胞癌、脳転移、髄芽腫、膣癌、膵臓癌、睾丸癌、黒色腫、甲状腺癌腫、膀胱癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シェネーベルガー病、気管支癌腫、下垂体腫瘍、菌状息肉症、食道癌、乳癌、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞癌、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎臓癌、胸腺腫、子宮体部癌腫、骨癌、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭頸部腫瘍、乏突起膠腫、外陰癌、腸癌、結腸癌腫、食道癌腫、疣贅併発、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｅｏｍａ）、卵巣癌腫、軟組織腫瘍／肉腫、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌腫、子宮頸癌腫、子宮内膜癌腫、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆嚢癌、白血病、形質細胞腫、子宮癌、眼瞼腫瘍、前立腺癌などが含まれる。
【０１６６】
さらに、上記文脈では、感染症は、好ましくは、インフルエンザ、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱病、ＡＩＤＳ、ライムボレリア症、リーシュマニア症、炭疽病、髄膜炎、ウイルス感染症（ＡＩＤＳ、尖圭コンジローマ、中空の疣贅、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（ＦＳＭＥ）、インフルエンザ、帯状疱疹、肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスＩＩ型、帯状疱疹、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、マールブルグウイルス、麻疹、口蹄疫、単核球症、ムンプス、ノーウォークウイルス感染、プファイファー腺熱、痘瘡、ポリオ（小児期跛行）、偽性クループ、第五病、狂犬病、疣贅、ウエストナイル熱、水疱、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）など）、細菌感染症（流産（前立腺炎）、炭疽病、虫垂炎、ボレリア症、ボツリヌス中毒、カンピロバクター（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、トラコーマ病原体（尿道炎、結膜炎）、コレラ、ジフテリア、ドノバン症（ｄｏｎａｖａｎｏｓｉｓ）、喉頭蓋炎、発疹チフス、ガス壊疽、淋病、野兎病、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、百日咳、気候性横痃、骨髄炎、レジオネラ症、癩病、リステリア症、肺炎、髄膜炎、細菌性髄膜炎、炭疽病、中耳炎、マイコプラズマホミニス、新生児敗血症（絨毛羊膜炎）、水癌、パラチフス、疫病、ライター症候群、ロッキー山紅斑熱、サルモネラパラチフス、サルモネラチフス、猩紅熱、梅毒、破傷風、トリッパー、ツツガムシ病、結核、チフス、膣炎（膣の炎症）、軟性下疳など）、および寄生虫、原生動物、または真菌に原因する感染症（アメーバ症、ビルハルツ住血吸虫症、シャーガス病、足白癬、酵母真菌斑、疥癬、マラリア、回旋糸状虫症（河川盲目症）、または真菌疾患、トキソプラズマ症、トリコモナス症、トリパソノーマ症（眠り病）、内臓リーシュマニア症、おむつ皮膚炎、住血吸虫症、魚中毒（シガテラ）、カンジタ症、皮膚リーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症（ランブル鞭毛虫症）、または眠り病など）、またはエキノコッカスに原因する感染症（魚類条虫症、キツネ条虫症、イヌ条虫症、シラミ、ウシ条虫症、ブタ条虫症、微小条虫症）から選択される。
【０１６７】
さらに、上記文脈では、アレルギーにより、通常、これらの抗原またはアレルゲンに対する局所性または全身性の炎症応答が生じ、体内でこれらのアレルゲンに対する免疫が生じる。この文脈におけるアレルゲンには、例えば、草、花粉、カビ、薬物、または多数の環境要因などが含まれる。理論に拘束されないが、いくつかの異なる疾患機構が、アレルギーの発症に関与すると予想される。Ｐ．ＧｅｌｌおよびＲ．Ｃｏｏｍｂｓによる分類スキームによれば、用語「アレルギー」は、古典的なＩｇＥ機構に原因するＩ型過敏症に制限されていた。Ｉ型過敏症は、ＩｇＥによる肥満細胞および好塩基球の過剰な活性化、それによる全身性の炎症応答によって特徴づけられ、この炎症反応により、症状は良性の鼻水から始まり、生命を危うくするアナフィラキシーショックおよび死亡に至り得る。周知のアレルギー型には、アレルギー喘息（鼻粘膜の腫脹を引き起こす）、アレルギー性結膜炎（結膜の発赤および掻痒を引き起こす）、アレルギー性鼻炎（「枯草熱」）、過敏症、血管浮腫（ａｎｇｉｏｄｅｍａ）、アトピー性皮膚炎（湿疹）、蕁麻疹（発疹）、好酸球増加症，虫刺されに対するアレルギー、皮膚アレルギー（種々の発赤（湿疹、発疹（蕁麻疹）および（接触）皮膚炎など）を引き起こし、これらを含む）、食物アレルギー、医薬品に対するアレルギーなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明に関して、例えば、タンパク質、上記定義の本発明の核酸と組み合わせたそのタンパク質アレルゲンをコードする核酸、または本発明の核酸のいずれかとしてのアレルゲン（例えば、ネコアレルゲン、粉塵アレルゲン、ダニ抗原、植物抗原（例えば、カバノキ抗原）などに由来）をコードするか含む本発明の核酸、薬学的組成物、またはワクチンを提供する。本発明の薬学的組成物は、（過剰な）免疫応答をより強力なＴＨ１応答にシフトさせ、それにより、望ましくないＩｇＥ応答を抑制または減弱することができる。
【０１６８】
さらに、自己免疫疾患を、各疾患の主な臨床病理学的特徴に応じて全身性および器官特異性または局在自己免疫障害に大きく分類することができる。自己免疫疾患を、全身性症候群（ＳＬＥ、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、および多発性筋炎が含まれる）または局所性症候群（内分泌学的（ＤＭ１型、橋本甲状腺炎、アジソン病など）、皮膚科学的（尋常性天疱瘡）、血液学的（自己免疫性溶血性貧血）、神経性（多発性硬化症）であり得るか、実質的に任意の体組織の限局性塊に関与し得る）のカテゴリーに分類することができる。処置すべき自己免疫疾患を、Ｉ型自己免疫疾患、またはＩＩ型自己免疫疾患、またはＩＩＩ型自己免疫疾患、またはＩＶ型自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性多発性関節炎、バセドウ病、自己免疫形態の慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛、脱毛、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リウマチ性多発筋痛、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、乾癬、ライター症候群、リウマチ性関節炎、乾癬、脈管炎など、またはＩＩ型糖尿病など）からなる群から選択することができる。免疫系が自己抗原に対して免疫反応を誘導する理由に関する正確な様式は今までのところ解明されていないが、病因学に関するいくつかの所見が存在する。したがって、自己反応はＴ細胞バイアスに起因し得る。正常な免疫系には、Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化が必要であり、その後に前者であるＢ細胞が抗体を大量に産生することができる。Ｔ細胞のこの要件は、稀な場合（非特異的様式でのＴ細胞受容体の１つのサブユニットへの直接結合によってＢ細胞の、さらにはＴ細胞のポリクローナル活性化を開始することができるスーパー抗原産生生物による感染など）で迂回することができる。別の説明では、分子擬態から自己免疫疾患が推定される。外因性抗原は、一定の宿主抗原と構造が類似し得るので、この抗原（自己抗原を模倣する）に対して産生された任意の抗体はまた、理論上は、宿主抗原に結合して免疫応答を増幅することができる。最も顕著な分子擬態の形態が、Ａ群（β）−溶血連鎖球菌で認められており、これは、ヒト心筋層と抗原を共有し、リウマチ熱の心臓の症状を担う。したがって、本発明により、例えば、典型的には免疫系を脱感作させる自己抗原（タンパク質、自己抗原タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡとして）をコードするか含む本明細書中に定義の核酸、または薬学的組成物、またはワクチンが提供される。
【０１６９】
さらなる実施形態によれば、本発明は、遺伝子療法による本明細書中に定義の疾患の処置のための本明細書中に定義の本発明の核酸の第２の医学的使用に関する。
【０１７０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の核酸を、特に本明細書中に定義の目的のための薬学的組成物またはワクチンの調製のために使用することができる。
【０１７１】
本発明の薬学的組成物またはワクチンを、さらに本明細書中に定義の疾患または障害の処置のために使用することができる。
【０１７２】
最後の実施形態によれば、本発明はまた、キット、特にキット・オブ・パーツを提供する。かかるキット、特にキット・オブ・パーツは、典型的には、単独の成分または本明細書中に定義のさらなる成分との組み合わせ、少なくとも１つの本明細書中に定義の本発明の核酸、本発明の核酸を含む本発明の薬学的組成物またはワクチンを含む。必要に応じて本明細書中に定義のさらなる成分と組み合わせた少なくとも１つの本明細書中に定義の本発明の核酸、本発明の薬学的組成物、および／または本発明のワクチンは、キットの１つまたは異なるパーツ中に存在し得る。例として、例えば、キットの少なくとも１つの部分は、少なくとも１つの本明細書中に定義の本発明の核酸およびキットの少なくとも１つのさらなる部分（少なくとも１つの本明細書中に定義の他の成分）を含むことができる。例えば、キットの少なくとも１つの他の部分は、少なくとも１つの薬学的組成物またはワクチンまたはその一部を含むことができる。例えば、キットの少なくとも１つの部分は、本明細書中に定義の本発明の核酸、キットの少なくとも１つのさらなる部分（少なくとも１つの本明細書中に定義の他の成分）、キットの少なくとも１つのさらなる部分（少なくとも１つの本発明の薬学的組成物もしくはワクチンの成分または全体としての本発明の薬学的組成物もしくはワクチン）、および少なくとも１つのキットのさらなる部分（例えば、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬学的キャリアまたはビヒクルなど）を含むことができる。例えば、キットをキット・オブ・パーツとして調製する場合、キットまたはキット・オブ・パーツは、さらに、本発明の核酸、本発明の薬学的組成物、または本発明のワクチン、または任意のその成分もしくは部分の投与および投薬量に関する情報を含む技術指示書を含むことができる。
【０１７３】
本発明では、他で記載のない限り、代替物および実施形態の異なる特徴を相互に組み合わせることができる。さらに、用語「〜を含む」は、具体的に示さない限り、「〜からなる」を意味すると解釈しないものとする。しかし、本発明の文脈では、必要に応じ、用語「〜含む」を、用語「〜からなる」に置換することができる。
特定の実施形態では、以下が提供される：
（項目１）
核酸配列であって、
ａ）コード領域であって、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードし、但し、前記コード領域が、ヒストンタンパク質、ＥＧＦＰおよびルシフェラーゼから選択されるレポータータンパク質、ならびにαグロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）から選択されるマーカータンパク質または選択タンパク質をコードしないものとする、コード領域、
ｂ）少なくとも１つのヒストンステムループ、および
ｃ）ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナル
を含むかまたはコードする、核酸配列。
（項目２）
前記核酸が、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）、ウイルス核酸配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列）、Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、および不活化エンハンサー配列をコードする配列からなる群の成分の１つ、または２つ、または少なくとも１つ、または１つを除く全て、または全てを含まない、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記核酸が、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）と、Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、不活化エンハンサー配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子由来のヒストンステムループプロセシング配列）からなる群のうちの１つとを含まない、項目１または２に記載の核酸。
（項目４）
前記核酸がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである、項目１〜３に記載の核酸。
（項目５）
前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）：
【化２２】
0005860464.tif 000023
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【化２３】
0005860464.tif 000024
から選択され、ここで、
ステム１またはステム２境界エレメントＮ１〜６は、１〜６個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜５個、さらにより好ましくは３〜５個、最も好ましくは４〜５個または５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０〜２ＧＮ３〜５］は、エレメントステム２と逆に相補的であるか、または部分的に逆に相補的であり、且つ５〜７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０〜２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３〜５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｇはグアノシンまたはそのアナログであり、シチジンまたはそのアナログによって必要に応じて置換することができ、但し、ステム２中のその相補的ヌクレオチドシチジンがグアノシンによって置換されるものとし、
ループ配列［Ｎ０〜４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０〜４］は、エレメントステム１とステム２との間に存在し、３〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０〜４は、別のＮ０〜４とは独立した、０〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｕ／Ｔはウリジン、または必要に応じてチミジンを示し、
ステム２［Ｎ３〜５ＣＮ０〜２］は、エレメントステム１と逆に相補的であるか、または部分的に逆に相補的であり、且つ５〜７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３〜５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ０〜２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｃはシチジンまたはそのアナログであり、グアノシンまたはそのアナログに必要に応じて置換することができ、但し、ステム１中のその相補的ヌクレオチドグアノシンがシチジンに置換されるものとし、
ここで、
ステム１およびステム２が互いに塩基対合して、塩基対合がステム１とステム２との間で起こり得る逆相補配列を形成することができるか、または不完全な塩基対合がステム１およびステム２との間で起こり得る部分的に逆相補の配列を形成することができる、項目１〜４のいずれかに記載の核酸。
（項目６）
前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
【化２４】
0005860464.tif 000025
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを持たないステムループ配列）
【化２５】
0005860464.tif 000026
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
のうちの少なくとも１つから選択される、項目５に記載の核酸。
（項目７）
前記ポリ（Ａ）配列が、約２５〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、さらにより好ましくは約５０〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列を含む、項目１〜６のいずれかに記載の核酸。
（項目８）
前記ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮＵＡＮＡ、好ましくはＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡを含む、項目１〜６のいずれかに記載の核酸。
（項目９）
前記核酸が、治療的に活性なタンパク質またはペプチド、アジュバントタンパク質、抗原、腫瘍抗原、病原性抗原、動物抗原、ウイルス抗原、原生動物抗原、細菌抗原、アレルギー性抗原、自己免疫抗原、アレルゲン、抗体、免疫賦活性タンパク質もしくはペプチド、または抗原特異的Ｔ細胞受容体をコードする、項目１〜８のいずれかに記載の核酸。
（項目１０）
前記核酸が、モノシストロン性核酸、バイシストロン性核酸、またはさらにマルチシストロン性核酸である、項目１〜９のいずれかに記載の核酸。
（項目１１）
コードされたペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増加させるための項目１〜１０のいずれかに記載の核酸の使用。
（項目１２）
医薬としての使用のための項目１〜１０のいずれかに記載の核酸。
（項目１３）
項目１〜１０のいずれかに記載の核酸および必要に応じて、薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
（項目１４）
抗原をコードするかまたは抗原を含む項目１〜１０のいずれかに記載の核酸を含むワクチン。
（項目１５）
前記抗原が、腫瘍抗原、アレルギー性抗原、自己免疫自己抗原、病原性抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、動物抗原、またはアレルギー性抗原から選択される、項目１４に記載のワクチン。
（項目１６）
癌または腫瘍疾患、感染症、好ましくは（ウイルス、細菌、または原生動物）感染症、自己免疫疾患、アレルギーまたはアレルギー疾患、一遺伝子性疾患（すなわち、（遺伝性）疾患）、または遺伝病全般（遺伝的背景を有し、典型的には、規定された遺伝子欠損によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患）、心血管疾患、ニューロン疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、皮膚疾患、筋骨格系障害、結合組織障害、新生物、免疫欠損、内分泌性、栄養性および代謝性の疾患、眼の疾患、または耳の疾患の処置におけるタンパク質発現の増加のための項目１〜１０のいずれかに記載の核酸の使用。
（項目１７）
タンパク質発現を増加させるためのインビトロまたはエキソビボでの方法であって、
ａ）項目１〜１０のいずれかに記載の核酸を提供する工程、
ｂ）該核酸を無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織、または生物に適用または投与する工程
を含む、方法。
【０１７４】
図面
以下の図面は、本発明をさらに説明することを意図し、本発明が図面に制限されると解釈されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、後生動物および原生動物のステムループ配列から生成したヒストンステムループコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：ｌ０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８で報告）。後生動物および原生動物由来の４００１個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列中のあらゆる位置についてのヌクレオチドの存在量を示す。分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す生成されたコンセンサス配列を、一文字ヌクレオチドコードを使用して示す。コンセンサス配列に加えて、分析した配列中に存在するヌクレオチドの少なくとも９９％、９５％、および９０％を示す配列を示す。
【図２】図２は、原生動物のステムループ配列から生成されたヒストンステムループコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８で報告）。原生動物由来の１３１個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列中のあらゆる位置についてのヌクレオチドの存在量を示す。分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す生成されたコンセンサス配列を、一文字ヌクレオチドコードを使用して示す。コンセンサス配列に加えて、分析した配列中に存在するヌクレオチドの少なくとも９９％、９５％、および９０％を示す配列を示す。
【図３】図３は、後生動物ステムループ配列から生成されたヒストンステムループコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８で報告）。後生動物由来の３８７０個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列中のあらゆる位置についてのヌクレオチドの存在量を示す。分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す生成されたコンセンサス配列を、一文字ヌクレオチドコードを使用して示す。コンセンサス配列に加えて、分析した配列中に存在するヌクレオチドの少なくとも９９％、９５％、および９０％を示す配列を示す。
【図４】図４は、脊椎動物ステムループ配列から生成されたヒストンステムループコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８で報告）。脊椎動物由来の１３３３個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列中のあらゆる位置についてのヌクレオチドの存在量を示す。分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す生成されたコンセンサス配列を、一文字ヌクレオチドコードを使用して示す。コンセンサス配列に加えて、分析した配列中に存在するヌクレオチドの少なくとも９９％、９５％、および９０％を示す配列を示す。
【図５】図５は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ステムループ配列から生成されたヒストンステムループコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８で報告）。ヒト由来の８４個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列中のあらゆる位置についてのヌクレオチドの存在量を示す。分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す生成されたコンセンサス配列を、一文字ヌクレオチドコードを使用して示す。コンセンサス配列に加えて、分析した配列中に存在するヌクレオチドの少なくとも９９％、９５％、および９０％を示す配列を示す。
【図６】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図６は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇのｍＲＮＡ配列（配列番号４３）を示す。αグロビン３’−ＵＴＲ（ａｇ）の直後の制限部位での元のベクターの線状化により、ポリ（Ａ）配列を欠くｍＲＮＡが得られる。
【図７】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図７は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のｍＲＮＡ配列（配列番号４４）を示す。Ａ６４ポリ（Ａ）−配列の直後の制限部位での元のベクターの線状化により、Ａ６４ポリ（Ａ）配列で終結するｍＲＮＡが得られる。
【図８】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図８は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−ヒストンＳＬのｍＲＮＡ配列（配列番号４５）を示す。Ａ６４ポリ（Ａ）配列をヒストンＳＬに置換した。実施例で使用したヒストンステムループ配列を、Ｃａｋｍａｋｃｉら（２００８）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２８（３），１１８２−１１９４から入手した。
【図９】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図９は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのｍＲＮＡ配列（配列番号４６）を示す。ヒストンＳＬは、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。
【図１０】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１０は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ１２０のｍＲＮＡ配列（配列番号４７）を示す。Ａ６４ポリ（Ａ）配列を、Ａ１２０ポリ（Ａ）配列に置換した。
【図１１】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１１は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ａｇのｍＲＮＡ配列（配列番号４８）を示す。第２のαグロビン３’−ＵＴＲは、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。
【図１２】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１２は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ａＣＰＳＬのｍＲＮＡ配列（配列番号４９）を示す。ステムループは、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。ステムループを、αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択した（Ｔｈｉｓｔｅｄら（２００１），Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６（２０），１７４８４−１７４９６）。αＣＰ−２ＫＬはαＣＰ−２のイソ型（最も強力に発現するαＣＰタンパク質（αグロビンｍＲＮＡポリ（Ｃ）結合タンパク質）（Ｍａｋｅｙｅｖら（２０００），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６７（３），３０１−３１６），αグロビン３’−ＵＴＲに結合するＲＮＡ結合タンパク質群（Ｃｈｋｈｅｉｄｚｅら（１９９９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９（７），４５７２−４５８１））である。
【図１３】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１３は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ポリオＣＬのｍＲＮＡ配列（配列番号５０）を示す。ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフは、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。
【図１４】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１４は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｇ３０のｍＲＮＡ配列（配列番号５１）を示す。一続きの３０個のグアニル化物は、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。
【図１５】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１５は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｕ３０のｍＲＮＡ配列（配列番号５２）を示す。一続きの３０個のウリジル化物は、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。
【図１６】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１６は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ＳＬのｍＲＮＡ配列（配列番号５３）を示す。ステムループは、Ａ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加していた。ステムおよびループの上部を、（Ｂａｂｅｎｄｕｒｅら（２００６），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１２（５），８５１−８６１）から入手した。ステムループは、１７塩基対長（ＣＧリッチステムおよび６塩基長ループ）からなる。
【図１７】図６〜１７は、インビトロ転写由来のｍＲＮＡを示す。インビトロ転写によって得たｍＲＮＡの命名および配列を示す。以下の略語を使用する。ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＧＣ富化ｍＲＮＡ配列。ａｇ：αグロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。Ａ６４：６４個のアデニル化物を有するポリ（Ａ）−配列。Ａ１２０：１２０個のアデニル化物を有する（ｗｉｔ）ポリ（Ａ）−配列。ヒストンＳＬ：ヒストンステムループ。ａＣＰＳＬ：αＣＰ−２ＫＬタンパク質のその特異的結合についてライブラリーから選択したステムループ。ポリオＣＬ：ポリオウイルスゲノムＲＮＡ由来の５’クローバーリーフ。Ｇ３０：３０個のグアニル化物を有するポリ（Ｇ）配列。Ｕ３０：３０個のウリジル化物を有するポリ（Ｕ）配列。ＳＬ：非特異的／人工ステムループ。Ｎ３２：３２ヌクレオチドの非特異的配列。配列内で、以下のエレメントを強調している：ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦ（大文字）、ａｇ（太字）、ヒストンＳＬ（下線）、試験したさらなる特徴的な配列（斜字）。図１７は、ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｎ３２（配列番号５４）を示す。別の制限部位での元のベクターの線状化により、ポリ（Ａ）が続く３２個のさらなるヌクレオチドを有するｍＲＮＡを得る。
【図１８】図１８は、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせが相乗様式でｍＲＮＡからのタンパク質発現を増大させることを示す。ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に及ぼすポリ（Ａ）配列、ヒストンＳＬ、およびポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を試験した。したがって、異なるｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼレベルを、トランスフェクションから６、２４、および４８時間後に測定した。ポリ（Ａ）配列やヒストンＳＬを持たないｍＲＮＡからルシフェラーゼはほとんど発現されない。ポリ（Ａ）配列またはヒストンＳＬの両方により、ルシフェラーゼレベルが増加する。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルをさらに種々に強力に増加させるので、相乗的に作用する。データを、三連のトランスフェクションについての平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位＋標準偏差）としてグラフ化する。比ＲＬＵを実施例１１．２にまとめている。
【図１９】図１９は、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがその順序と無関係にｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることを示す。ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に及ぼすポリ（Ａ）配列、ヒストンＳＬ、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせ、およびその順序の影響を試験した。したがって、異なるｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にリポフェクションした。ルシフェラーゼレベルを、トランスフェクション開始から６、２４、および４８時間後に測定した。Ａ６４ポリ（Ａ）配列またはヒストンＳＬの両方から類似のルシフェラーゼレベルが得られる。Ａ６４〜Ａ１２０またはＡ３００までのポリ（Ａ）配列の長さの増加により、ルシフェラーゼレベルが中程度に増加する。対照的に、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせにより、ポリ（Ａ）配列の延長よりもはるかにルシフェラーゼレベルが増加する。ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々に増加させるので、相乗的に作用する。ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの相乗効果は、ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの順序ならびにＡ６４−ヒストンＳＬまたはヒストンＳＬ−Ａ２５０  ｍＲＮＡを有するポリ（Ａ）の長さと無関係に認められる。データを、三連のトランスフェクションについての平均ＲＬＵ±ＳＤとしてグラフ化する。比ＲＬＵを実施例１１．３にまとめている。
【図２０】図２０は、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせによるタンパク質発現の上昇が特異的であることを示す。ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に及ぼすポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせまたはポリ（Ａ）と別の配列との組み合わせの影響を試験した。したがって、異なるｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼレベルを、トランスフェクションから６、２４、および４８時間後に測定した。ポリ（Ａ）配列またはヒストンＳＬの両方から類似のルシフェラーゼレベルが得られる。ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせにより、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々に強力に増加させるので、相乗的に作用する。対照的に、ポリ（Ａ）と任意の他の配列との組み合わせは、ポリ（Ａ）配列のみを含むｍＲＮＡと比較してルシフェラーゼレベルに影響を及ぼさない。したがって、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、特異的且つ相乗的に作用する。データを、三連のトランスフェクションについての平均ＲＬＵ±ＳＤとしてグラフ化する。比ＲＬＵを実施例１１．４にまとめている。
【図２１】図２１は、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがインビボにて相乗様式でｍＲＮＡからのタンパク質発現を増大させることを示す。インビボでのｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に及ぼすポリ（Ａ）配列、ヒストンＳＬ、およびポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を試験した。したがって、異なるｍＲＮＡを、マウスに皮内注射した。注射から１６時間後にマウスを屠殺し、注射部位のルシフェラーゼレベルを測定した。ルシフェラーゼは、ヒストンＳＬまたはポリ（Ａ）配列のいずれかを有するｍＲＮＡから発現される。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々に強力に増加させるので、相乗的に作用する。データを、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±平均値の標準誤差）としてグラフ化する。比ＲＬＵを実施例１１．５にまとめている。
【図２２】図２２は、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがｍＲＮＡからのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質発現を増加させることを示す。ｍＲＮＡからのＮＹ−ＥＳＯ−１発現に及ぼすポリ（Ａ）配列およびポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を試験した。したがって、異なるｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。ＮＹ−ＥＳＯ−１レベルを、トランスフェクションから２４時間後にフローサイトメトリーによって測定した。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、ポリ（Ａ）配列のみを有するｍＲＮＡから発現する。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、ポリ（Ａ）配列のみを使用して認められるレベルを超えてＮＹ−ＥＳＯ−１レベルを種々に強力に増加させる。データを、蛍光強度に対するカウントとしてグラフ化する。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を、実施例１１．６にまとめている。
【図２３】図２３は、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがｍＲＮＡを使用したワクチン接種によって誘発される抗体レベルを増加させることを示す。ｍＲＮＡを使用したワクチン接種によって誘発される抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体の誘導に及ぼすポリ（Ａ）配列およびポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を試験した。したがって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、プロタミンと複合体化した異なるｍＲＮＡを皮内にワクチン接種した。ワクチン接種マウスおよびコントロールマウスにおけるＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体レベルを、血清の系列希釈を使用したＥＬＩＳＡによって分析した。抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＩｇＧ２ａ［ｂ］は、ポリ（Ａ）配列のみを有するｍＲＮＡによって誘導される。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、ポリ（Ａ）配列のみを使用して認められるレベルを超えて抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＩｇＧ２ａ［ｂ］レベルを種々に強力に増加させる。データを、平均エンドポイント力価としてグラフ化する。平均エンドポイント力価を、実施例１１．７にまとめている。
【発明を実施するための形態】
【０１７６】
以下の実施例は、本発明をさらに例証することを意図し、本発明が実施例に制限されると解釈されないものとする。
【実施例】
【０１７７】
１．ヒストンステムループコンセンサス配列の生成
実験前に、ヒストンステムループコンセンサス配列を、後生動物および原生動物のヒストンステムループ配列に基づいて決定した。ゲノム配列および発現配列タグの検索によって多数の天然ヒストンステムループ配列を同定したＬｏｐｅｚら（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８）によって提供された付録から配列を取った。第１に、後生動物および原生動物由来の全配列（４００１配列）、または原生動物由来の全配列（１３１配列）、あるいは、後生動物由来の全配列（３８７０配列）、または脊椎動物由来の全配列（１３３３配列）、またはヒト由来の全配列（８４配列）をグループ化し、整列させた。次いで、各位置のヌクレオチドの存在量を決定した。このようにして得た表に基づいて、分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す５つの異なる配列群のコンセンサス配列を生成した。さらに、保存ヌクレオチドを段階的に強調したより制限のあるコンセンサス配列も得た。
【０１７８】
２．ＤＮＡ−テンプレートの調製
Ｔ７プロモーターにＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）をコードするＧＣ富化配列、αグロビン（ａｇ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の中心部分、およびポリ（Ａ）配列が続くインビトロ転写用ベクターを構築した。ポリ（Ａ）配列の直後に、Ａ６４ポリ（Ａ）配列で終結するｍＲＮＡを得るためのインビトロ転写前のベクターの線状化のために使用される制限部位が続いた。したがって、インビトロ転写によってこのベクターから得たｍＲＮＡを、「ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４」と命名する。
【０１７９】
インビトロ転写前の別の制限部位でのこのベクターの線状化により、Ａ６４のさらなるヌクレオチド３’によって伸長されたかＡ６４を欠くｍＲＮＡを得た。さらに、元のベクターを、別の配列を含むように修飾した。要約すれば、インビトロ転写によってこれらのベクターから以下のｍＲＮＡを得た（ｍＲＮＡ配列を図６〜１７に示す）：
【０１８０】
【化２１】
0005860464.tif 000027
【０１８１】
３．インビトロ転写
実施例２のＤＮＡ−テンプレートを線状化し、インビトロでＴ７−ポリメラーゼを使用して転写した。次いで、ＤＮＡ−テンプレートを、ＤＮアーゼ処理によって消化した。全ｍＲＮＡ転写物は、過剰なＮ７−メチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシンの転写反応物への付加によって得た５’−ＣＡＰ構造を含んでいた。このようにして得たｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁した。
【０１８２】
４．ｍＲＮＡの酵素的アデニル化
以下の２つのｍＲＮＡを酵素的にアデニル化した：
ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４およびｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−ヒストンＳＬ。
この目的を達成するために、製造者の説明書にしたがって、ＲＮＡを大腸菌ポリ（Ａ）−ポリメラーゼおよびＡＴＰ（ポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリングキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）とインキュベートした。伸長されたポリ（Ａ）配列を有するｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁した。ポリ（Ａ）配列の長さを、アガロースゲル電気泳動によって決定した。出発ｍＲＮＡをおよそ２５０個のアデニル化物によって伸長し、得られたｍＲＮＡを、それぞれｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ３００およびｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−ヒストンＳＬ−Ａ２５０と命名する。
【０１８３】
５．ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるルシフェラーゼ発現
ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した。２００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の１×１０５細胞を、それぞれ０．５μｇのｐｐＬｕｃコードｍＲＮＡを使用してエレクトロポレーションした。コントロールとして、ｐｐＬｕｃをコードしないｍＲＮＡを個別にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、２４ウェルプレート中の１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地に播種した。トランスフェクションから６、２４、または４８時間後、培地を吸引し、細胞を、２００μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ＨＣｌ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で溶解した。ｐｐＬｕｃ活性を測定するまで、溶解物を−２０℃で保存した。
【０１８４】
６．ｍＲＮＡリポフェクションによるルシフェラーゼ発現
ＨｅＬａ細胞を、２×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞をｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄し、次いで、１５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ中にて０．２５μｇのリポフェクチン複合体化ｐｐＬｕｃコードｍＲＮＡでトランスフェクションした。コントロールとして、ｐｐＬｕｃをコードしないｍＲＮＡを個別にリポフェクションした。いくつかのウェルでは、ｏｐｔｉ−ＭＥＭを吸引し、トランスフェクション開始から６時間後に細胞を２００μｌの溶解緩衝液中で溶解した。残りのウェルでは、その時点でｏｐｔｉ−ＭＥＭをＲＰＭＩ  １６４０培地と交換した。これらのウェルでは、培地を吸引し、トランスフェクション開始から２４時間後または４８時間後に細胞を２００μｌの溶解緩衝液中で溶解した。ｐｐＬｕｃ活性を測定するまで、溶解物を−２０℃で保存した。
【０１８５】
７．ルシフェラーゼ測定
ｐｐＬｕｃ活性を、５０μｌの溶解物および２００μｌのルシフェリン緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７．８）（ＮａＯＨ）、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  ＡＴＰ、７５μΜルシフェリン）を使用して、測定時間５秒でＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴプレートリーダーにて相対光単位（ＲＬＵ）として測定した。比ＲＬＵを、総ＲＬＵからコントロールＲＮＡのＲＬＵを引くことによって計算した。
【０１８６】
８．皮内ｍＲＮＡ注射によるルシフェラーゼ発現（インビボでのルシフェラーゼ発現）
マウスを、ＲｏｍｐｕｎとＫｅｔａｖｅｔとの混合物で麻酔した。各ｐｐＬｕｃコードｍＲＮＡを皮内注射した（０．５μｇのｍＲＮＡを含む５０μｌ／注射）。コントロールとして、ｐｐＬｕｃをコードしないｍＲＮＡを個別に注射した。注射１６時間後、マウスを屠殺し、組織を採取した。組織サンプルを液体窒素中で急速凍結し、組織溶解剤（Ｑｉａｇｅｎ）を含む８００μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ＨＣＩ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に溶解した。その後、サンプルを、１３５００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離した。ｐｐＬｕｃ活性を測定するまで、溶解物を−８０℃で保存した（７．ルシフェラーゼ測定を参照のこと）。
【０１８７】
９．ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＮＹ−ＥＳＯ−１発現
ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した。２００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の２×１０５細胞を、１０μｇのＮＹ−ＥＳＯ−１コードｍＲＮＡを使用してエレクトロポレーションした。３つのエレクトロポレーション由来の細胞を合わせ、６ウェルプレート中の２ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地に播種した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を採取し、９６ウェルＶ底プレート（２ウェル／ｍＲＮＡ）に移した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２００μｌ／ウェルのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））で透過処理を行った。１５分後、細胞をＰｅｒｍＷａｓｈ（ＢＤ）で洗浄した。次いで、細胞を、マウス抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＩｇＧ１またはアイソタイプコントロール（２０μｇ／ｍｌ）のいずれかと室温で１時間インキュベートした。細胞をＰｅｒｍＷａｓｈで再度２回洗浄した。次に、細胞を、５００倍希釈のＡｌｅｘａ−６４７カップリングヤギ抗マウスＩｇＧと４℃で１時間インキュベートした。最後に、細胞をＰｅｒｍＷａｓｈで２回洗浄した。細胞を、２００μｌの緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。ＮＹ−ＥＳＯ−１発現を、フローサイトメトリーによって蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として定量した。
【０１８８】
１０．ｍＲＮＡでのワクチン接種による抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体の誘導
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、プロタミンと複合体化したＮＹ−ＥＳＯ−１コードｍＲＮＡで皮内にワクチン接種した（１４日間で５回）。コントロールマウスを緩衝液で処置した。ワクチン接種マウスおよびコントロールマウスにおけるＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体レベルを、以下のようにＥＬＩＳＡによって最後のワクチン接種後８日間分析した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍｌ組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質にて４℃で１６時間コーティングした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄した。非特異的結合をブロッキングするために、次いで、プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡ）と３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング後、１００μｌ／ウェルの系列希釈したマウス血清を添加し、室温で４時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルのビオチン化ラット抗マウスＩｇＧ２ａ［ｂ］検出抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ブロッキング緩衝液で６００倍希釈）を、室温で１時間結合させた。プレートを、洗浄緩衝液で再度３回洗浄し、その後、１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼカップリングストレプトアビジンと室温で３０分間インキュベートした。洗浄緩衝液で４回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。変色の際、１００μｌ／ウェルの２０％硫酸を添加した。４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１８９】
１１．結果
１１．１  ヒストンステムループ配列：
ヒストンステムループ配列を特徴づけるために、後生動物および原生動物（４００１配列）、または原生動物（１３１配列）または代わりに後生動物（３８７０配列）、または脊椎動物（１３３３配列）またはヒト（８４配列）由来の配列をグループ分けし、整列させた。次いで、各位置のヌクレオチドの存在量を決定した。このようにして得た表に基づいて、分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示す５つの異なる配列群のコンセンサス配列を生成した。組み合わせた後生動物および原生動物のコンセンサス配列内で、３つのヌクレオチドが保存され（ループ中の１つのＴ／Ｕおよびステム中の１つのＧおよび１つのＣ）、塩基対を形成する。構造的に、典型的には、６塩基対ステムおよび４ヌクレオチドのループを形成する。しかし、逸脱した構造が共通している：８４のヒトのヒストンステムループのうち、２つが４塩基対および１つのミスマッチを含むたった５ヌクレオチドのステムを含む。別のヒトのヒストンステムループは、たった５塩基対のステムを含む。４つ以上のヒトのヒストンステムループは６ヌクレオチド長のステムを含むが、３つの異なる位置にそれぞれ１つのミスマッチを含む。さらに、４つのヒトヒストンステムループは、２つの異なる位置にそれぞれ１つのゆらぎ塩基対を含む。ループに関して、５ヌクレオチドのループがＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍで同定されているので、４ヌクレオチド長は厳格に必要でないようである。
【０１９０】
分析した配列中に存在する全ヌクレオチドを示すコンセンサス配列に加えて、保存ヌクレオチドが段階的に強調された、より制限されたコンセンサス配列も得た。まとめると、以下の配列を得た。
（Ｃｏｎｓ）：全ヌクレオチド存在量を示す。
（９９％）：全ヌクレオチド存在量の少なくとも９９％を示す
（９５％）：全ヌクレオチド存在量の少なくとも９５％を示す
（９０％）：全ヌクレオチド存在量の少なくとも９０％を示す
ヒストンステムループ配列の分析結果を、以下の表１〜５にまとめる（図１〜５も参照のこと）。
【０１９１】
【表１−２】
0005860464.tif 000028
【０１９２】
【表２】
0005860464.tif 000029
【０１９３】
【表３】
0005860464.tif 000030
【０１９４】
【表４】
0005860464.tif 000031
【０１９５】
【表５−１】
0005860464.tif 000032
【０１９６】
ここで、使用した略語を以下のように定義した。
【０１９７】
【表５−２】
0005860464.tif 000033
【０１９８】
１１．２  ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせが相乗様式でｍＲＮＡからのタンパク質発現を増大させる。
【０１９９】
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に及ぼすポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を調査するために、αグロビン３’−ＵＴＲの３’側に異なる配列を有するｍＲＮＡを合成した。ｍＲＮＡは、３’−ＵＴＲのちょうど３’側で終結しており、それによってポリ（Ａ）配列およびヒストンＳＬの両方を欠くか、３’−ＵＴＲの３’側にＡ６４ポリ（Ａ）配列または代わりにヒストンＳＬのいずれかを含むか、Ａ６４ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの両方を含んでいた。ルシフェラーゼコードｍＲＮＡまたはコントロールｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼレベルを、トランスフェクションから６、２４、および４８時間後に測定した（以下の表６および図１８を参照のこと）。
【０２００】
【表６】
0005860464.tif 000034
【０２０１】
ポリ（Ａ）配列およびヒストンＳＬのいずれも持たないｍＲＮＡからルシフェラーゼはほとんど発現されなかった。ポリ（Ａ）配列またはヒストンＳＬの両方は、ルシフェラーゼレベルを類似の範囲に増加させた。いずれかのｍＲＮＡにより、ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの両方を欠くｍＲＮＡよりもはるかに高いルシフェラーゼレベルを得た。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々にさらに強力に増加させた。同一のｍＲＮＡ中でのポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせに起因するルシフェラーゼレベルの上昇規模は、これらが相乗的に作用していることを証明している。
【０２０２】
ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの間の相乗作用を、ポリ（Ａ）−ヒストンＳＬ  ｍＲＮＡ（＋／＋）由来のシグナルをヒストンＳＬ  ｍＲＮＡ（−／＋）およびポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（＋／−）由来のシグナルの和で割ることによって定量した（以下の表７を参照のこと）。
【０２０３】
【表７】
0005860464.tif 000035
【０２０４】
このようにして計算された因子により、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとを組み合わせたｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼレベルがポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの効果が純粋に足された場合に予想されるレベルよりもどの程度高いか特定される。ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとを組み合わせたｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼレベルは、これらの効果の純粋な和の１６．６倍までであった。この結果により、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがタンパク質発現を顕著に相乗的に増加させることが確認される。
【０２０５】
１１．３  ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせが、その順序と無関係にｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させる。
【０２０６】
ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの効果は、ポリ（Ａ）配列の長さならびにポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの順序に依存し得る。したがって、ポリ（Ａ）配列の長さが増加したｍＲＮＡおよび順序が逆のポリ（Ａ）およびヒストンＳＬを有するｍＲＮＡを合成した。２つのｍＲＮＡは、３’−ＵＴＲの３’側にＡ１２０またはＡ３００ポリ（Ａ）配列のいずれかを含んでいた。１つのさらなるｍＲＮＡは、３’−ＵＴＲの３’側に最初にヒストンＳＬを含み、その後にＡ２５０  ポリ（Ａ）配列を含んでいた。ルシフェラーゼコードｍＲＮＡまたはコントロールｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にリポフェクションした。ルシフェラーゼレベルを、トランスフェクション開始から６、２４、および４８時間後に測定した（以下の表８および図１９を参照のこと）。
【０２０７】
【表８】
0005860464.tif 000036
【０２０８】
Ａ６４ポリ（Ａ）配列またはヒストンＳＬの両方から類似のルシフェラーゼレベルが得られた。前述の実験と一致して、Ａ６４とヒストンＳＬとの組み合わせが個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々に強力に増加させた。同一のｍＲＮＡ中でのポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせに起因するルシフェラーゼレベルの上昇規模は、これらが相乗的に作用していることを証明している。Ａ６４とヒストンＳＬとの間の相乗作用を、Ａ６４−ヒストンＳＬ、Ａ６４、およびヒストンＳＬ  ｍＲＮＡのルシフェラーゼレベルに基づいて前述のように定量した（以下の表９を参照のこと）。Ａ６４とヒストンＳＬとを組み合わせたｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼレベルは、ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの効果が純粋に足された場合の６１．７倍までであった。
【０２０９】
【表９】
0005860464.tif 000037
【０２１０】
対照的に、Ａ６４〜Ａ１２０またはＡ３００までのポリ（Ａ）配列の長さの増加により、ルシフェラーゼレベルを中程度にしか増加させなかった（表８および図１９を参照のこと）。最も長いポリ（Ａ）配列（Ａ３００）を有するｍＲＮＡを、類似の長さのポリ（Ａ）配列をヒストンＳＬ（ヒストンＳＬ−Ａ２５０）と組み合わせたｍＲＮＡとも比較した。長いポリ（Ａ）配列を有することに加えて、ヒストンＳＬおよびポリ（Ａ）の順序は、このｍＲＮＡ中でＡ６４−ヒストンＳＬ  ｍＲＮＡと比較して逆である。Ａ２５０とヒストンＳＬとの組み合わせが、ヒストンＳＬまたはＡ３００のいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々に強力に増加させた。また、Ａ２５０とヒストンＳＬとの間の相乗作用を、ヒストンＳＬ−Ａ２５０  ｍＲＮＡ由来のＲＬＵとＡ３００  ｍＲＮＡ＋ヒストンＳＬ  ｍＲＮＡ由来のＲＬＵとを比較して前述のように定量した（以下の表１０を参照のこと）。Ａ２５０とヒストンＳＬとを組み合わせたｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼレベルは、ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの効果が純粋に足された場合の１７．０倍までであった。
【０２１１】
【表１０】
0005860464.tif 000038
【０２１２】
まとめると、ｍＲＮＡからのタンパク質発現に及ぼすヒストンＳＬとポリ（Ａ）との組み合わせの高い相乗効果により、ポリ（Ａ）の長さが実質的に異なることおよびポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの順序が無関係であることを証明した。
【０２１３】
１１．４  ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせによるタンパク質発現の上昇は特異的である。
【０２１４】
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に及ぼすポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響が特異的であるかどうかを調査するために、ポリ（Ａ）と組み合わせた別の配列を有するｍＲＮＡを合成した。これらのｍＲＮＡは、Ａ６４の３’側に７つの異なる配列のうちの１つをそれぞれ含んでいた。ルシフェラーゼコードｍＲＮＡまたはコントロールｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼレベルを、トランスフェクションから６、２４、および４８時間後に測定した（以下の表１１および図２０を参照のこと）。
【０２１５】
【表１１】
0005860464.tif 000039
【０２１６】
ポリ（Ａ）配列またはヒストンＳＬの両方から類似のルシフェラーゼレベルが得られた。また、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々に強力に増加させるので、相乗的に作用した。対照的に、ポリ（Ａ）と任意の別の配列との組み合わせは、ポリ（Ａ）配列のみを含むｍＲＮＡと比較してルシフェラーゼレベルに影響を及ぼさなかった。したがって、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせが相乗様式でｍＲＮＡからのタンパク質発現を増大させ、この影響は特異的である。
【０２１７】
１１．５  ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがインビボにて相乗様式でｍＲＮＡからのタンパク質発現を増大させる。
【０２１８】
インビボでのｍＲＮＡからのタンパク質発現に及ぼすポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を調査するために、αグロビン３’−ＵＴＲの３’側に異なる配列を有するルシフェラーゼコードｍＲＮＡまたはコントロールｍＲＮＡをマウスに皮内注射した。ｍＲＮＡは、３’−ＵＴＲの３’側にＡ６４ポリ（Ａ）配列または代わりにヒストンＳＬのいずれかを含むか、Ａ６４ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの両方を含んでいた。ルシフェラーゼレベルを、注射から１６時間後に測定した（以下の表１２および図２１を参照のこと）。
【０２１９】
【表１２】
0005860464.tif 000040
【０２２０】
ルシフェラーゼは、ヒストンＳＬまたはポリ（Ａ）配列のいずれかを有するｍＲＮＡから発現された。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、個別のエレメントのいずれかを使用して認められるレベルを超えてルシフェラーゼレベルを種々にさらに強力に増加させた。同一のｍＲＮＡ中でのポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせに起因するルシフェラーゼレベルの上昇規模は、これらが相乗的に作用していることを証明している。
【０２２１】
ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの間の相乗作用を、ポリ（Ａ）−ヒストンＳＬ  ｍＲＮＡ（＋／＋）由来のシグナルをヒストンＳＬ  ｍＲＮＡ（−／＋）およびポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（＋／−）由来のシグナルの和で割ることによって定量した（以下の表１３を参照のこと）。
【０２２２】
【表１３】
0005860464.tif 000041
【０２２３】
このようにして計算された因子により、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとを組み合わせたｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼレベルがポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの効果が純粋に足された場合に予想されるレベルよりもどの程度高いか特定される。ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとを組み合わせたｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼレベルは、これらの効果の純粋な和の８倍であった。この結果により、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがインビボでのタンパク質発現を顕著に相乗的に増加させることが確認される。
【０２２４】
１１．６  ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがｍＲＮＡからのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質発現を増加させる。
【０２２５】
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に及ぼすポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を調査するために、αグロビン３’−ＵＴＲの３’側に異なる配列を有するＮＹ−ＥＳＯ−１コードｍＲＮＡを合成した。ｍＲＮＡは、３’−ＵＴＲの３’側にＡ６４ポリ（Ａ）配列またはＡ６４ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの両方のいずれかを含んでいた。ＮＹ−ＥＳＯ−１コードｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。ＮＹ−ＥＳＯ−１レベルを、トランスフェクションから２４時間後にフローサイトメトリーによって測定した（以下の表１４および図２２を参照のこと）。
【０２２６】
【表１４】
0005860464.tif 000042
【０２２７】
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、ポリ（Ａ）配列のみを有するｍＲＮＡから発現された。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、ポリ（Ａ）配列のみを使用して認められるレベルを超えてＮＹ−ＥＳＯ−１レベルを種々に強力に増加させた。
【０２２８】
１１．７  ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせがｍＲＮＡを使用したワクチン接種によって誘発される抗体レベルを増加させる。
【０２２９】
ｍＲＮＡを使用したワクチン接種によって誘発される抗体の誘導に及ぼすポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせの影響を調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、プロタミンと複合体化した、αグロビン３’−ＵＴＲの３’側に異なる配列を有するＮＹ−ＥＳＯ−１コードｍＲＮＡを皮内にワクチン接種した。ｍＲＮＡは、３’−ＵＴＲの３’側にＡ６４ポリ（Ａ）配列またはＡ６４ポリ（Ａ）およびヒストンＳＬの両方のいずれかを含んでいた。ワクチン接種マウスおよびコントロールマウスにおけるＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体レベルを、血清の系列希釈を使用したＥＬＩＳＡによって分析した（以下の表１５および図２３を参照のこと）。
【０２３０】
【表１５】
0005860464.tif 000043
【０２３１】
抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＩｇＧ２ａ［ｂ］は、ポリ（Ａ）配列のみを有するｍＲＮＡによって誘導された。しかし、顕著には、ポリ（Ａ）とヒストンＳＬとの組み合わせは、ポリ（Ａ）配列のみを使用して認められるレベルを超えて抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＩｇＧ２ａ［ｂ］レベルを種々に強力に増加させた。
【図１】
0005860464.tif 000048
【図２】
0005860464.tif 000049
【図３】
0005860464.tif 000050
【図４】
0005860464.tif 000051
【図５】
0005860464.tif 000052
【図６】
0005860464.tif 000053
【図７】
0005860464.tif 000054
【図８】
0005860464.tif 000055
【図９】
0005860464.tif 000056
【図１０】
0005860464.tif 000057
【図１１】
0005860464.tif 000058
【図１２】
0005860464.tif 000059
【図１３】
0005860464.tif 000060
【図１４】
0005860464.tif 000061
【図１５】
0005860464.tif 000062
【図１６】
0005860464.tif 000063
【図１７】
0005860464.tif 000064
【図１８】
0005860464.tif 000065
【図１９】
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【図２０】
0005860464.tif 000067
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
0005860464.tif 000070
【配列表】
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