(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの三官能性架橋剤であって、
【化１】
0005886324.tif 000054
前記式中、
Ｘは、下記式ＩＩのコア構造であり、
【化２】
0005886324.tif 000055
前記式中、
点線は、基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3へのＷ1、Ｗ2、Ｗ3の結合を表し、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、かつ
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、かつ
ｓは１〜１２であり、
Ａは、アフィニティー基であり、当該アフィニティー基は、特定の結合相手に対する結合アフィニティーにより、アフィニティー精製法を用いて三官能性架橋剤の分離及び単離を可能にするものであり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立に、
（ｉ）単結合、又は
（ｉｉ）直鎖又は分枝、置換又は非置換のＣ（１〜２４）アルキレン
から選択されるスペーサー基であり、
ここで１個又は複数の−ＣＨ2−基は、互いに独立に１個又は複数の架橋基により、及び／又は非置換の又は置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールにより置換されていてもよい；但し、ヘテロ原子は、互いに直接に結合しておらず、
Ｌは、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨから成る群から選択される反応性官能基と、アリール若しくはアルキル活性化カルボン酸エステルのうち以下に示されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるアミン反応基と、から選択されるリガンド反応基であり、
【化３】
0005886324.tif 000056
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、かつ
ＨＲN−ＮＨ−はヒドラゾニルであるヒドロラジン保護基か、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNは、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、及びフルオレニルメチルオキシカルボニルから選択されるヒドラジン保護基である、
前記三官能性架橋剤。
【請求項２】
Ｗ1及びＷ3は、−ＮＨ−であり、かつＷ2は、−ＣＯＮＨ−である、請求項１に記載の三官能性架橋剤。
【請求項３】
Ｌは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項１から２までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項４】
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立に
直鎖又は分枝、置換又は非置換のＣ（１〜２４）アルキレンであり、
ここで１個又は複数の−ＣＨ2−基は、互いに独立に１個又は複数の架橋基により、及び／又は非置換若しくは置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールにより置換されていてもよい；但し、ヘテロ原子は、互いに直接に結合していない、請求項１から３までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項５】
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立に、式（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）  −［Ｙ1−（ＣＨ2）n］p−
（ｂ）  −［Ｙ2−（ＣＨ2）m−Ｙ3］q−
の１つ又は複数の繰り返し単位、又はそれらの組合せを有する直鎖であり、
前記式中、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3は互いに独立に、−Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−から選択される基であり、
ここでＲ1は、Ｈ又はＣ（１〜６）−アルキルを表し、かつ
ｎ、ｍ、ｐ及びｑは、互いに独立に１〜１０の整数である、
請求項１から４までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項６】
ＨＲN−ＮＨ−がヒドラゾニルか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNがトリフルオロアセチルである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項７】
Ｚは、非置換若しくは置換フェニル、ナフチル、及びアントラセニルから選択されるアリール基、又は非置換若しくは置換ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリル、及びチアゾリルから選択されるヘテロアリール基である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項８】
Ａは、ビオチンであり、かつ／又は
ＨＲN−ＮＨ−がヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNがトリフルオロアセチルであり、かつ／又は
Ｌは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、
請求項１から７までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項９】
下記式：
【化４】
0005886324.tif 000057
を有する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤を有するキット。
【請求項１１】
リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの間の相互作用を特徴付け、かつ分析するための、請求項１から９までのいずれか１項に記載の三官能性架橋剤、又は請求項１０に記載のキットの使用。
【請求項１２】
標的の糖タンパク質レセプターは、細胞表面又は分泌された糖タンパク質である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
リガンドと、試料中の少なくとも１つの炭水化物残基を有する標的の糖タンパク質レセプターの間の特異的相互作用を同定する方法であって、ここで、リガンドは標的の糖タンパク質レセプター上のリガンド−特異的ドメインを認識し、次の工程：
ｉ）標的の糖タンパク質レセプターを有する試料を用意する工程、
ｉｉ）標的の糖タンパク質レセプターを酸化処理し、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能基を生じさせることにより、酸化された標的の糖タンパク質レセプターを得る工程、
ｉｉｉ）請求項１による下記式Ｉ
【化５】
0005886324.tif 000058
の三官能性架橋剤を用意し、前記式中、置換基は請求項１から９のいずれか１項で規定した通りであり、かつリガンド反応基を前記リガンドに共役させて、リガンド−架橋剤−複合体を得る工程、
ｉｖ）（ａ）リガンドが標的の糖タンパク質レセプター上のリガンド特異的ドメインに結合でき、及び（ｂ）保護されたヒドラジン基がその遊離型に変換され、かつ酸化された標的の糖タンパク質レセプターと反応できる条件下に、試料とリガンド−架橋剤−複合体を接触させ、ペプチド結合二重複合体を得る工程、
ｖ）ペプチド結合二重複合体を試料から単離し、かつ精製する工程、
ｖｉ）ペプチドを工程（ｉｖ）で得られた精製ペプチド結合二重複合体から遊離し、遊離ペプチドを得る工程、及び
ｖｉｉ）工程ｖ）で得られた遊離ペプチドを高い質量精度の質量分析法により分析及び定量化する工程、及び
ｖｉｉｉ）コントロール反応との定量的比較により、リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの間の相互作用を同定する工程
を有する、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
（ａ）糖タンパク質は、溶液中又は細胞の表面上にあり、かつ／又は
（ｃ）工程（ｖ）が、初めに試料を酵素消化し、処理された細胞試料を得て、引き続き処理された細胞試料のアフィニティー精製を行うことによる、試料からのペプチド結合二重複合体の単離及び精製を含み、かつ／又は
（ｄ）工程（ｖｉ）が、グリコシダーゼ処理を行い、遊離ペプチドを得ることによる、工程（ｖ）で得られた精製されたペプチド結合二重複合体からのペプチドの遊離を含む、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ）標的の糖タンパク質レセプター上に少なくとも１つの結合部位を有する対象のリガンドに共役するリガンド反応基、（ｉｉ）酸化されたレセプター−グリコペプチドを獲得する、場合により保護された芳香族ヒドラジン基、（ｉｉｉ）獲得したグリコペプチドを検出、単離及び精製するアフィニティー基を有する三官能性架橋剤、該製法ならびにリガンドと、生細胞上及び生体液中のそれらの相応する糖タンパク質標的レセプターとの間で検出、同定及び特徴付けするための方法におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明の背景
グリコシル化は、最も卓越したタンパク質変性のうちの１つであり、殆どでは無いにしても、ホ乳動物細胞により生産される分泌性でかつ膜結合性のタンパク質の多くは、共有結合したグリカンを有する（Ｖａｒｋｉ，Ａ．等、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００９）。複合生物の構築では、このようなオリゴ糖タンパク質は、分泌されたタンパク質及び細胞表面タンパク質のフォールディング、細胞内局在、ターンオーバー、活性及び相互作用の様々な構造及び機能的役割に役立つ。
【０００３】
分泌された糖タンパク質には、例えば、サイトカイン、ホルモン、増殖分化因子、酵素、神経ペプチド、血管拡張神経、抗原認識分子、免疫制御分子、構造的糖タンパク質及びその他の生理活性分子が含まれる。それらのタンパク質は、多くの認識事象、例えば、細胞から細胞へのシグナリング、免疫応答、アポトーシス、宿主−病原体相互作用及び多くの疾患の病原で重要である。それにより、特定の標的レセプターにとって、このような糖タンパク質の特異性は、細胞から細胞への伝達の制御において重要である。よって、分泌された糖タンパク質とそれらの標的のリガンド結合相互作用の同定及び特徴付けは、生物学的情報伝達の分子レベルの理解にとって重要である。
【０００４】
同様に、タンパク質、ペプチド、ホルモン、化学分子、医薬品又は毒物のようなリガンドによる細胞表面糖タンパク質レセプター（ＣＳＲｓ）の会合は、細胞微小環境から細胞への情報の伝送を可能にする。この細胞表面情報の出入り口は、細胞応答に重要であるにもかかわらず、多くの機能的リガンドに関するレセプターは未知のままである。これは、主に疎水性の膜レセプタータンパク質の同定の科学技術的限界ならびにそれらの相応するＣＲＳｓとのリガンドの一時的な低い親和性相互作用による。従って、多くのシグナルタンパク質及び分子は、公知の一次分子標的の無いオーファンリガンドのままであるが、シグナルトランスダクション、薬物作用、オフターゲット作用又は疾病関連シグナルネットワークの個々のメカニズムの分子レベルの詳細な理解にとって、現在は存在しない計り知れないほど貴重な情報である。
【０００５】
生物学的システムにおける一時的なリガンド−レセプター相互作用を同定する有望なアプローチは、相互作用する分子の化学架橋に続く、相互作用する相手の質量分析による同定である。現在公知で市販されている架橋剤は、一般的に溶液中の単離タンパク質と接触するタンパク質のマッピングでそれらを使用するために設計されてきた。例えば、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性架橋剤（切断可能な又はアイソトープコード化誘導体を含む）は、タンパク質の化学架橋、続いて架橋ペプチドの酵素消化及びタンパク質及びタンパク質複合体の三次元構造をマッピングするために質量分析による同定に使用されてきた（ＪＭＳ（２００３）第３８巻、（１２）１２２５〜３７頁）。しかし、このような分子で得られた架橋ペプチド種は、一般的に極めて低い相対存在度であり、及び架橋ペプチドにより生産されるマススペクトルのバイオインフォルマティック解析は困難な課題のままである。これは複雑な生物学的試料において架橋部位の同定、特にリガンドとそれらの相応するレセプターの一般的な一時的相互作用の検出を妨害する。
【０００６】
複合試料から架橋ペプチドを特異的に富化するために、相互作用するタンパク質を獲得するための２つの反応部位（一般的にアミン反応性、スルフヒドリル−反応性又は光反応性）と、引き続き獲得したペプチドを富化するアフィニティー基（通常はビオチン）の組み合せを有する三官能性架橋剤が開示されている（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（２００５）第１６巻（１２）１９２１〜３１頁）。これらの架橋剤が単離タンパク質及びタンパク質複合体の位相構造のマッピングに首尾よく使用されてきたのに対して、それらの化学的性質は、生細胞から由来する複合試料における一時的なタンパク質−タンパク質相互作用の検出にはそれらの架橋剤を不適切なものにする。
【０００７】
これは、生体液のような生物学的微小環境又は生細胞の原形質膜との会合において、標的の糖タンパク質レセプターと相互作用するリガンドのプロービング、同定及び特徴付けを特異的に補助できる適切な試薬の必要性を強調する。出願者の知り得る限りでは、現在のところ公知のどの架橋剤も、公知のリガンドと、複合体及び生細胞の表面のような自然環境における未知の糖タンパク質レセプター結合相手の間の特異的相互作用の共有結合安定化を可能にする構造的必要条件ならびに引き続く質量分析法による同定を満たすことができない。
【０００８】
出願者は、三官能性架橋剤の新規クラス（以後、本発明の架橋剤とも称される）が、従来技術の標的レセプターのリガンドベースの同定に特有の問題を克服できることを見出した。本発明の架橋剤は、リガンドと、生細胞上又は近い生理学的条件が当てはまる生体液中の高い感度及び特異性を有する標的の糖タンパク質レセプターの間のリガンド−レセプター相互作用を不偏検出、及び特徴付けするために使用できる。従って、この方法はオーファンリガンド、例えば、タンパク質、ペプチド、脂肪、エンジニアード・アフィニティー結合剤、化学分子、薬剤、ウイルス又は細菌のような未知の標的レセプターを同定するために利用できる。従って、新規架橋剤は複雑な情報の入り口としてヒトのサーフェソーム及びセクレトームの理解に科学技術的基礎ならびにそれらの固有の微小環境内で殆ど全ての記述のオーファンリガンドに関する標的の糖タンパク質レセプターを同定する方法を提供する。
【０００９】
本発明の要約
本発明は、第一の態様では３個の分枝を有するコア構造を有する三官能性架橋剤に関し、その際、各分枝は種々の官能基を有する（よって、前記架橋剤はヘテロ三官能性とも称される）。第一の分枝は、酸化された糖タンパク質と反応できる保護された又は保護されていない芳香族ヒドラジンを含む。第二の分枝は、選択したリガンドに共役してもよいリガンド反応基を含む。第三の分枝は、精製する目的のアフィニティー基を含み、有利には、第一と第二の官能性により獲得されたペプチドをアフィニティー精製する目的がある。これらのリガンドには特に関心がある。それというのも、１つの分子内での異なる３つの官能基の組合せがユニークであり、及び様々なバイオメディカル用途、例えば、リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの間の相互作用の検出及び特徴付けで使用できるからである。
【００１０】
より具体的には、本発明は式Ｉ：
【化１】
0005886324.tif 000002
［式中、
Ｘは、コア構造であり、
Ａは、アフィニティー基であり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｌは、リガンド反応基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、及び
ＨＲN−ＮＨ−がヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNがＨ又はヒドラジン保護基である］
の三官能性の架橋剤に関する。
【００１１】
有利な実施態様では、Ｘは、式ＩＩ
【化２】
0005886324.tif 000003
［式中、
点線は、基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3へのＷ1、Ｗ2、Ｗ3の結合を表し、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−及び
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、及びｓは１〜１２である］
の基である。
【００１２】
幾つかの実施態様では、Ｌは、（ｉ）反応性官能基、有利には−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨから成る群から選択される反応性官能基であり、又は
（ｉｉ）アミン反応基、ヒドロキシル反応基、チオール反応基、アルデヒド反応基又はケト反応基及びカルボキシ反応基から成る群から選択される活性化された官能基である。
【００１３】
他の実施態様では、Ａはビオチンのようなアフィニティー基である。
【００１４】
更なる実施態様では、スペーサー基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立に（ｉ）単結合又は（ｉｉ）直鎖又は分枝、置換又は非置換のＣ（１〜２４）アルキレンであり、その際、１個又は複数の、有利には隣接しない−ＣＨ2−基は、互いに独立に１個又は複数の架橋基により置換されていてもよい及び／又は非置換若しくは置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールにより置換されていてもよい；但し、Ｏ及びＮのようなヘテロ原子は、互いに直接に結合していない。
【００１５】
特定の実施態様では、本発明の三官能性架橋剤は式ＩＩＩ
【化３】
0005886324.tif 000004
［式中、
Ａは、アフィニティー基であり、
Ｌは、リガンド反応基であり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、
ＨＲN−ＮＨ−はヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNはＨ又はヒドラジン保護基であり、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、及び
ｓは、１〜１２である］
の構造を有する。
【００１６】
有利な実施態様では、本発明の三官能性架橋剤は式ＶＩＩ
【化４】
0005886324.tif 000005
［式中、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、
ＨＲN−ＮＨ−はヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNはＨ又はヒドラジン保護基であり、及び
ｓは、１〜１２である］
の構造を有する。
【００１７】
他の実施態様では、本発明はリガンドと標的の糖タンパク質レセプター（例えば、細胞表面又は分泌された糖タンパク質レセプター）の間の相互作用を特徴付け及び分析するための、本発明の三官能性架橋剤の使用にも関する。
【００１８】
もう１つの態様では、本発明はリガンドと、試料中の少なくとも１つの炭水化物残基を有する標的の糖タンパク質レセプターの間の特定の相互作用を同定する方法にも関し、その際、リガンドは標的の糖タンパク質レセプターにおいてリガンドに特異的なドメインを認識し、次の工程を有する：
ｉ）前記の標的の糖タンパク質レセプターを有する試料を用意する工程、
ｉｉ）標的の糖タンパク質レセプターを酸化処理し、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能性を生じさせることにより、酸化された標的の糖タンパク質レセプターを得る工程、
ｉｉｉ）３個の異なる分枝、（保護）ヒドラジン基、リガンド反応基、アフィニティー基を有する本発明による三官能性架橋剤（例えば、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸによる三官能性架橋剤）を用意し、かつリガンド反応基を前記リガンドに共役できるようにし、リガンド−架橋剤−複合体を得る工程、
ｉｖ）（ａ）リガンドが、標的の糖タンパク質レセプター上のリガンドに特異的なドメインに結合でき、及び（ｂ）保護されたヒドラジン基がその遊離型に変換され、かつ酸化された標的の糖タンパク質レセプターと反応できる条件下に、試料とリガンド−架橋剤−複合体を接触させ、ペプチド結合二重複合体を得る工程、
ｖ）ペプチド結合二重複合体を試料から単離かつ精製する工程、
ｖｉ）ペプチドを工程ｉｖ）で得られた精製ペプチド結合二重複合体から遊離し、遊離ペプチドを得る工程、及び
ｖｉｉ）工程ｖ）で得られた遊離ペプチドを高い質量精度の質量分析法により分析及び定量する工程、
ｖｉｉｉ）コントロール反応との定量比較により、リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの間の相互作用を同定する工程。
【００１９】
本発明の更なる実施態様では、３つの異なる分枝上に、（保護）ヒドラジン基、リガンド反応基及びアフィニティー基を有する本発明による三官能性架橋剤（例えば、本明細書中で定義したような三官能性架橋剤）を有するキットに関する。
【００２０】
本発明の詳細な説明
特記されない限り、説明を通して以下の定義を使用することにする：
本明細書中で使用されているような"１つの"という用語は、特記されない限り少なくとも１つを意味する。本明細書中で使用されているような"含む"とは、制限のない包含を意味する。"複数"という用語は、２つ又はそれより多い数を意味する。
【００２１】
"三官能性"という用語は、"３個の官能基を有する"ことを意味する。従って、三官能性（架橋）剤とは、３個の官能基を有する（架橋）剤を意味する。"ヘテロ三官能性"とは、"３個の異なる官能基を有する"ことを意味する。
【００２２】
"（相互）結合"又は"相互作用"という用語は、相互親和性又は結合能力を示す相応の分子対（例えば、リガンド／標的の糖タンパク質レセプター）の間の相互関係のいずれかのタイプを意味する。相互関係は、例えば、相互反応性を示す化学的反応基（ドナー／アクセプター、酸／塩基など）の相応する対の間で生じてもよい。模範的な結合事象には、これらに限定されるわけではないが、疎水性相互作用、親水相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電相互作用、共有結合及びそのようなものが含まれる。結合事象の性質により、相互作用は異なるレベル、すなわち、一時的又は永久的、弱い又は強い結合であってもよいことが解釈される。
【００２３】
本発明は、新規ヘテロ三官能性架橋剤ならびに標的の糖タンパク質レセプター（生細胞又は分泌された糖タンパク質上の原形質膜糖タンパク質を含む）とのリガンド相互作用を不偏検出するための、ダイレクトな定量的質量分析法によるワークフローにおけるそれらの使用にも関する。
【００２４】
従って、第一の態様では本発明は、３個の分枝を有するコア構造を有する三官能性架橋剤にも関し、その際、それぞれの分枝は、種々の官能基を有する（従って、該架橋剤はヘテロ三官能性とも称される）。第一の分枝は、酸化された糖タンパク質と反応できる保護された又は保護されていない芳香族ヒドラジンを含む。第二の分枝は、選択したリガンドに共役してもよいリガンド反応基を含む。第三の分枝は、精製目的のアフィニティー基を含み、有利には、第一と第二の官能基により獲得されたペプチドのアフィニティー精製の目的がある。１つの分子中でのこれらの３つの異なる官能基の組合せが独特であり、及びリガンドと標的タンパク質レセプターの間での検出及び特徴付けのような様々なバイオメディカルの用途で使用されているので、これらの試薬には特に関心がある。
【００２５】
より具体的には、本発明は式Ｉ：
【化５】
0005886324.tif 000006
［式中、
Ｘは、コア構造であり、Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は互いに独立に、スペーサー基であり、Ｌは、リガンド反応基であり、Ａはアフィニティー基であり、Ｚはアリール又はヘテロアリールであり、及びＲ1は、Ｈ又はヒドラジン保護基である］
の三官能性架橋剤を提供する。
【００２６】
本明細書中で使用されているような"アルキル"という用語は、１〜２４個、有利には１〜１２個の炭素原子を有する直鎖又は分枝の炭化水素を意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、i−プロピル、ｎ−ブチル、i−ブチル及びｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。"アルコキシ"という用語は、−ｏ−アルキル基を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用されているような"アルキレン"という用語は、例えば、−ＣＨＲ−（ＣＨＲ）n−（Ｒは、Ｈ又は選択された置換基である）のような炭化水素から誘導される二価のラジカルを意味する。通常は、アルキレン基は１〜２４個の炭素原子（すなわち、ｎ＝２４）、有利には１０〜２４個の炭素原子を有する。本明細書中で使用されているような"ヘテロアルキレン"という用語は、アルキルラジカル中に挿入された１個又は複数のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ、有利にはＯ又はＮを有するアルキレンを意味する。
【００２８】
本明細書中で使用されているような"アリール"という用語は、６炭素−単環芳香族環系、１０炭素−二環芳香族環系、１４炭素−三環芳香族環系を意味し、その際、各環は非置換であるか又は１〜４個の置換基を有していてもよい。アリール基の例には、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本明細書中で使用されているような"フェニレン"という用語は、有利には１，２−、１，３−又は１，４−フェニレン基を意味し、これは場合により置換されている。
【００２９】
"シクロアルキル"という用語は、３〜１２個の炭素を有する飽和の及び部分的に不飽和の環式炭化水素基を意味する。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３０】
"ヘテロアリール"という用語は、１個又は複数のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を有する芳香族５〜８員−単環系、８〜１２員−二環系、又は１１〜１４員−三環系を意味する。ヘテロアリール基の例には、ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリル及びチアゾリルが含まれる。ピリジルには、２−ピリジル、３−ピリジル及び４−ピリジル、有利には２−ピリジルが含まれる。"ヘテロアラルキル"という用語は、１個のヘテロアリール基で置換されたアルキル基を意味する。
【００３１】
"ヘテロシクロアルキル"という用語は、１個又は複数のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を有する非芳香族の５〜８員−単環系、８〜１２員−二環系、又は１１〜１４員−三環系を意味する。
【００３２】
ヘテロシクロアルキル基の例には、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル及びテロヒドロフラニル、グルコシルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールは、非置換であるか、又は１〜４個の置換基を有していてもよい。
【００３４】
置換基の例には、少なくとも１つのハロ、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、カルボキシ、又はアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノから選択されるヒドロカルビル基、又は１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３５】
模範的なヒドロカルビル置換シクロアルキル基には、２−メチルシクロプロピル、２−エチルシクロプロピル、２−メチルシクロブチル、３−メチルシクロブチル、２−メチルシクロペンチル、２，３−ジメチルシクロペンチル、３−イソ−プロピルシクロペンチル、２，６−ジメチルシクロヘキシル、４−（ｔ−ブチル）シクロヘキシル、２−ビニルシクロヘキシル、３−アリルシクロペンチル、３，４−ジアリルシクロペンチル、１−（４−ピリジニル）ピペリジニル、１−（４−ピリジニルメチル）ピペリジニル、４−（４−ピリジニル）ピペリジニル、４−（４−ピリジニル）ピペラジン−１−イル、及びビシクロヘキシル基が含まれる。
【００３６】
模範的なヒドロカルビル置換シクロアルケニル基には、３−メチル−３−シクロペンテン−１−イル、３，４−ジメチル−３−シクロペンテン−１−イル、２−イソ−プロピル−２−シクロペンテン−１−イル、２，３−ジエチル−２−シクロペンテン−１−イル、４−ビニル−１−シクロヘキセン−１−イル、３，４−ジエチル−３−シクロペンテン−１−イル及び３，４−ジアリル−３−シクロペンテン−１−イル基が含まれる。
【００３７】
模範的なヘテロカルビル置換アリール基には、トリル、メシチル、キシリル、クメニル、シメニル、３，５−ジ（ｔ−ブチル）フェニル、２−メチルナフチル、２−ビニルフェニル、２−ビニルベンジル、２−ビニルナフチル、４−シクロヘキシルフェニル、ビフェニル、４−（４−ピペリジニル）ピリジニル及びｐ−テルフェニル基が含まれる。
【００３８】
模範的なヒドロカルビル置換ヘテロアリール基には、２−メチルピリジン−１−イル、２−エチルピリジン−１−イル、３−ビニルイミダゾール−１−イル、２−メチルイミダゾール−１−イル、２−メチルキノキサリン−１−イル、１−アリルベンゾトリアゾリル、２，２’−ビピリジル、４，４’−ビピリジル、４−メチルピラジニル、４−（ピリジニルメチル）−ピリジニル、４−ベンジルピテジニル、ニコチンアミジル、２−メチルフラニル、５−メチルフルフリルアミノ、２−メチルチオフェニル、４−メチルオキサゾリル、２，５−ジフェニル−４−メチルオキサゾリル及び４−メチルチアゾリル基が含まれる。
【００３９】
"ハロゲン"という用語は、クロロ、フルオロ、ブロモ又はヨード置換基、有利にはクロロ又はフルオロ置換基を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用されているような"場合により置換された"という用語は、Ｈａｌ、−ＯＲ、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＲ、Ｃ（１〜８）アルキル、Ｃ（１〜８）アルキレン、Ｃ（１〜８）アルコキシ（ここで、Ｒは１〜８個の炭素原子である）による置換を意味する。
【００４１】
有利な実施態様では、架橋剤は水溶性であり、及び生物相溶性である。
【００４２】
"水溶性"という用語は、一般的に２４℃での材料と水の全質量に対する、１質量％よりも多い水中での材料の溶解度を意味する。水溶解性は、本発明の架橋剤の親水性の性質により、より具体的には、Ａ、Ｌ、Ｘ、Ｚ、Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3及びＲNの１つ又は複数の基の親水基の性質により与えられると解釈される。当業者は、どの化学基を選択すれば十分な親水性の架橋剤が得られるのかが分かるであろう。有利な実施態様では、スペーサー基Ｓ1、Ｓ2及びＳ3の１つ又は複数が、より親水性の特徴の官能基を有し、結果として得られる架橋剤の親水性を増してもよい。
【００４３】
"生物相溶性"という用語は、ヒト細胞、組織又は体液に関する化学的不活性さならびに生命体に対する架橋剤の最小毒性効果を意味する。
【００４４】
コア構造Ｘは、スペーサー基Ｓ1、Ｓ2及びＳ3ならびに官能基Ａ、Ｌ及び芳香族ヒドラジン基から成る３個の分枝上に形成することができるどの構造であってもよい。従って、コア構造は有利には以後定義するような、有利には、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールのような３個の反応性官能基、又は３個のスペーサー基の結合部位のようなものを有する。
【００４５】
通常は、コア構造及びスペーサー基は、３個の分枝の間（よって３個の官能基Ａ、Ｌ及び芳香族ヒドラジン基の間）で無視できるか又は立体干渉性が無いように設計される。
【００４６】
幾つかの実施態様では、コア構造Ｘは置換された炭化水素、例えば、置換されたアルキル基、例えば、トリ−又はテトラ−置換された炭素原子、例えば、α−アミノ酸Ｈ2Ｎ−ＣＨＲAA−ＣＯＯＨ（ＲAAは、アミノ酸側鎖である）のα−炭素である。従って、Ｘは反応基を有する側鎖ＲAAを有する天然又は非天然のアミノ酸であってもよい。天然アミノ酸の例には、例えば、リジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインなどが含まれる。非天然アミノ酸の例には、例えば、相応するＤ−アミノ酸、ホモセリン及びそのようなものが含まれる。これらの実施態様では、３つのスペーサー基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3はアミノ基及びカルボキシ基ならびに反応性側鎖基ＲAAに結合していてもよい。
【００４７】
従って、特定の実施態様では、Ｘは式ＩＩ
【化６】
0005886324.tif 000007
［式中、
点線は、基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3へのＷ1、Ｗ2、Ｗ3の結合を表し、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、及び
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、及びｓは１〜１２である］
の基であってもよい。
【００４８】
有利な１実施態様では、Ｗ1とＷ3は、−ＮＨ−であり、及びＷ2は、−ＣＯＮＨ−である。式ＩＶの基の中で、３つの官能基のいずれか１つは、３個のリンカーＳ1、Ｓ2、Ｓ3のいずれかに結合することができることが解釈される。有利な実施態様では、Ｗ1は、Ｓ1に結合し、Ｗ2はＳ2に結合し、及びＷ3はＳ3に結合する。
【００４９】
従って、他の特定の実施態様では、本発明の三官能性架橋剤は式ＩＩＩ
【化７】
0005886324.tif 000008
［式中、
Ａはアフィニティー基であり、
Ｌはリガンド反応基であり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、
ＨＲN−ＮＨ−はヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNはＨ又はヒドラジン−保護基であり、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、及び
ｓは１〜１２である］
の化合物である。
【００５０】
有利な実施態様では、ｓはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ネオ−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルである。
【００５１】
他の実施態様では、コア構造は置換アリール又はヘテロアリール基であることができ、これは少なくとも三回置換されている、有利には式ＩＶ
【化８】
0005886324.tif 000009
［式中、
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3は、互いに独立に官能基、例えば、カルボキシ、アミン、ヒドロキシル、チオールであり、及びＲa、Ｒb、Ｒcは、互いに独立にＯ又はＮである］
の三官能性６員環アリール又はヘテロアリール基である。
【００５２】
更に他の実施態様では、コア構造は線状又は環状グリセロールから、又は糖部分から誘導されていてもよい。本明細書で記載されている三官能性架橋剤の製造で使用できる選択的（及び特異的に除去可能な）保護基を有する様々な糖が入手可能である。
【００５３】
当業者は、他の様々なコア構造がスペーサー基及び官能基にとって必要な足場を提供できることに気付くであろう。
【００５４】
本発明の三官能性架橋剤の官能基Ｌは、リガンド反応基、例えば、反応性官能基又は活性化された官能基であり、これはスペーサーを選択したリガンドに結合するために使用され、かつこのように三官能性架橋剤を特定の標的の糖タンパク質レセプターに向ける。
【００５５】
本明細書中で使用されているような“反応性官能基”という用語は、本明細書では保護されていない遊離官能基を意味する（特記されない限り）。特定の実施態様では、反応性官能基は、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨから成る群から選択される。
【００５６】
本明細書中で使用されているような"活性化された官能基"という用語は、架橋剤を用いる標準の化学技術により相応の活性化された反応性官能基が得られる反応性官能基を意味する。反応性官能基又は活性化された官能基は、リガンド上に存在するそれらの対の反応基と反応できる。
【００５７】
活性化された官能基は、それらの特異的な反応性によって下位群に分けることができる。従って、特定の実施態様では、活性化された官能基は、アミン反応基、ヒドロキシル反応基、チオール反応基、アルデヒド反応基又はケト反応基ならびにカルボキシ反応基から成る群から選択される。
【００５８】
"アミン反応基"は、（第一又は第二）アミンと反応する活性化された官能基である。通常のアミン反応基には、例えば、アリール又はアルキル活性化カルボン酸エステル−ＣＯＯＲ、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はその誘導体（例えば、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、フェノールエステル又はその誘導体（例えば、ここでＲはフェノール、ｐ−ニトロフェノール、テトラフルオロフェノールである）が含まれる。他のアミン反応基には、アシルクロリド（−ＣＯＣｌ）、アリール及びアルキルイミデート−Ｃ（ＮＨ）ＯＭｅならびにアルキル又はアリールイソシアネート−ＮＣＯ又はイソチオシアネート−ＮＣＳが含まれる。
【００５９】
"ヒドロキシル反応基"は、ヒドロキシルと反応する活性化された官能基である。通常のヒドロキシル反応基には、例えば、アルキル又はアリールイソシアネート−ＮＣＯ、及びアリール又はアルキル活性化カルボン酸エステル−ＣＯＯＲが含まれる。
【００６０】
"チオール反応基"は、チオールと反応する活性化反応基である。通常のチオール反応基には、例えば、マレイミド又はα−ハロアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｈａｌ）が含まれる。
【００６１】
"アルデヒド反応基又はケト反応基"は、（第一又は第二）アルデヒド又はケトンと反応する活性化された官能基である。通常のアルデヒド反応基又はケト反応基には、例えば、アリール又はアルキルヒドラジン（−ＮＨＮＨ2）、アリール又はアルキルアシルヒドラジン（−ＣＯ−ＮＨＮＨ2）、アルキル又はアリールヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ2）が含まれる。
【００６２】
"カルボキシ反応基"は、カルボキシル基と反応する活性化された官能基である。通常のカルボキシ反応基には、例えば、ハロゲン、アルキル−又はアリールスルホネート、ヒドロキシル、エポキシ、メルカプト、アミノ、イソシアナト及びカルボジイミド基が含まれる。
【００６３】
反応性官能基を活性化するために使用される活性化剤の例には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２−（１Ｈ−７−アザベンズトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン−３−オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＤＴＵ）、ベンゾチアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス−（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）、（３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン−３−オキシ）ジエチルホスフェート（ＤＥＰＢｔ）、３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン−３−オキシトリス（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＤＯＰ）、２−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−１，３−ジメチル−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスホネート（ＢＯＭＰ）、５−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−３，４−ジヒドロ−１−メチル２Ｈ−ピロリウムヘキサクロロアンチモネート（ＡＯＭＰ）、（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＡＯＰ）、５−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロ−１−メチル２Ｈ−ピロリウムヘキサクロロアンチモネート：Ｎ−オキシド（ＢＤＭＰ）、２−ブロモ−３−エチル−４−メチルチアゾリウムテトラフルオロボレート（ＢＥＭＴ）、２−ブロモ−１−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（ＢＥＰ）、２−ブロモ−１−エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモネート（ＢＥＰＨ）、Ｎ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルメチレン）−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサクロロアンチモネートＮ−オキシド（ＢＯＭＩ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、１−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロアンチモネート（ＢＰＭＰ）、１，１，３，３−ビス（テトラメチレン）フルオロウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＴＦＦＨ）、クロロ（４−モルホリノ）メチレンモルホリニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＭＭＭ）、２−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＭＢＩ）、２−フルオロ−１−エチルピリジニウムテトラフルオロボレート（ＦＥＰ）、２−フルオロ−１−エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモネート（ＦＥＰＨ）、１−（１−ピロリジニル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ；−ビス（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＰｉｐＵ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＰｙＵ）、（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯｐ）、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌＯＰ）、１，１，３，３−ビス（テトラメチレン）クロロウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌＵ）、テトラメチルフルオロマニジウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、トリホスゲン、トリアジンベース剤［シアヌル酸クロリド、シアヌル酸フルオリド、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）］、ビス（２−クロロフェニル）ホスホロクロリデート、ジフェニルホスホロクロリデート、ジフェニルホスホロアジド（ＤＰＰＡ）及びこれらのいずれかの組合せが含まれるが、しかしこれらに限定されるわけではない。
【００６４】
リガンド反応基と、リガンド上の反応基の多くの組合せは変化可能であることが理解され、かつ当業者は、どのリガンド反応基を選択して選択したリガンドと結合させるのか分かるであろう。
【００６５】
特定の実施態様では、活性化された官能基は有利にはアミン反応基であり、有利にはアリール又はアルキル活性化カルボン酸エステル−ＣＯＯＲであり、最も有利にはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００６６】
従って、特定の実施態様では本発明の三官能性架橋剤は式Ｖ
【化９】
0005886324.tif 000010
［式中、
Ｘは、コア構造であり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ａは、アフィニティー基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、及び
ＨＲN−ＮＨ−はヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNはＨ又はヒドラジン保護基である］
の化合物である。
【００６７】
コアＸがα−アミノ酸である場合には、本発明の三官能性架橋剤は式ＶＩ
【化１０】
0005886324.tif 000011
［式中、
Ａは、アフィニティー基であり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、
ＨＲN−ＮＨ−はヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNはＨ又はヒドラジン保護基であり、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、及び
ｓは１〜１２である］
の化合物であってもよい。
【００６８】
本発明の三官能性架橋剤の官能基Ａは、獲得したペプチドを検出、同定及び精製するための、有利にはアフィニティー精製するためのアフィニティー基である。
【００６９】
本明細書で使用されているような"アフィニティー基"という用語は、検出、同定及び精製する目的の他の組成物（場合により固体担体、例えばビーズ、フィルター、プレート、膜、クロマトグラフ樹脂等のようなものに結合又はリンクしている）により特異的に結合できる同定可能なタグ、基、又は部分を意味する。多くの様々な種類のアフィニティー基が当業者に周知であり、及び本発明の方法で個々に又は１つ又は複数の種々のアフィニティー基の組合せで使用されてもよいことが理解される。模範的なアフィニティー基には、発蛍光団、ラジオアイソトープ、色原体、酵素、抗原（エピトープタグを含むが、これに限定されるわけではない）、重金属、染料、燐光性基、化学発光基、電気化学的検出部分、結合タンパク質、リン光体、希土類金属キレート、近赤外染料、電気化学発光基及びそのようなものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
本発明の三官能性架橋剤で使用するために特に適切なアフィニティー基には、特定の結合相手（通常は固体担体、例えばビーズ、クロマトグラフ樹脂及びそのような物の上で不動態化される）に対する（可逆性）結合アフィニティーにより、アフィニティー精製法を用いて三官能性架橋剤の分離及び単離を可能にするアフィニティー基が含まれる。このようなアフィニティー基の例には、例えば、小さな化学化合物（例えば、ビオチン／アビジンならびにこれらの誘導体、グルタチオン／ＧＳＴ）及び短鎖アミノ酸配列、通常は２〜２０アミノ酸長さ、及び有利には４〜１２アミノ酸長さ（例えば、抗体断片又は（ヒスチジン）6タグ、（ロイシン）3タグ、ＦＬＡＧタグ又はｃ−Ｍｙｃタグ）、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ）、又は蛍光タグが含まれる。これらの全てのアフィニティータグは、当該分野ではよく確立していて、かつ市販されている。有利な実施態様では、アフィニティー基はビオチン及びそれらの誘導体、炭水化物及びグリカンから成る群から、最も有利にはビオチン及びその誘導体から選択される。
【００７１】
従って、更なる特定の実施態様では、本発明の三官能性架橋剤は式ＶＩＩ
【化１１】
0005886324.tif 000012
［式中、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、
ＨＲN−ＮＨ−がヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNが、Ｈ又はヒドラジン−保護基であり、及び
ｓは１〜１２である］
の化合物である。
【００７２】
コア構造へ結合するのは３個のスペーサー基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3であり、これらはコア構造を式Ｉの化合物による個々の官能基Ｌ、Ａ及び芳香族ヒドラジン基に結合する。
【００７３】
上記のように、３つのスペーサー基は、立体的クラウディングが最小化されるように及び３つの官能基Ａ、Ｌ及び芳香族ヒドラジン基の反応性が妥協しないように選択されてもよい。芳香族ヒドラジン基及びリガンド反応基Ｌを有するリンカーＳ2及び／又はＳ3のバリエーションは、結合部位の近接度を走査できるようにし、かつ対象の標的レセプタータンパク質上もしくは隣接する分子上に存在し得る種々の糖タンパク質を獲得できるようにする。
【００７４】
本明細書中で使用されているような"スペーサー"という用語は、通常は単結合又は直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換のＣ（１〜２４）アルキレンであり、その際、１個又は複数の、有利には隣接しない−ＣＨ2−基は、互いに独立に１個又は複数の架橋基及び／又は非置換若しくは置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールにより置換されていてもよい：但し、Ｏ及びＮのようなヘテロ原子は、互いに直接結合していない。架橋基は、アルキレン鎖中の−ＣＨ2−基又は末端の−ＣＨ2−基を置換してもよい。
【００７５】
本明細書中で使用されているような“架橋基”は、次のもの：
【化１２】
0005886324.tif 000013
［式中、
Ｒ１は、水素原子又はＣ（１〜６）アルキル、又はそれらの組合せを表す］
から選択される。有利な架橋基には、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ2（ＣＯ）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−ＮＲ1−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｃ（ＣＨ3）＝Ｎ−（式中、Ｒ1はＨ又はＣ（１〜６）アルキル、又はそれらの組合せを表す）が含まれる。より有利な架橋基には、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ2（ＣＯ）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−，−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−（式中、Ｒ1はＨ又はＣ（１〜６）アルキル、又はそれらの組合せを表す）が含まれる。
【００７６】
特定の実施態様では、スペーサー基は、６〜３０個の炭素原子を有する置換又は非置換ヘテロアルキレン基、有利にはポリエチレングリコール基（線状の配置で２〜２４個のエチレングリコールモノマーを有する）、ポリアルコール基、ポリアミン基（例えば、スペルミン、スペルミジン及びそれらのポリマー誘導体）、ポリエステル基（例えば、線状の配置で３〜１５個のエチルアクリレートモノマーを有するポリ（エチルアクリレート）、ポリアミノ酸基又はそれらの組合せであってもよい。
【００７７】
より有利には、スペーサー基は、１〜８個のアミノ酸を有するポリアミノ酸（すなわち、アミノ酸又はジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−、ヘプタ−又はオクタペプチド）、又はジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサエチレングリコールであるポリエチレングリコール基、又はこのようなポリアミノ酸とポリエチレングリコールの組合せであってもよい。有利な実施態様では、スペーサー基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立に、式（ａ）及び／又は（ｂ）
（ａ）  −［Ｙ1−（ＣＨ2）n］p−
（ｂ）  −［Ｙ2−（ＣＨ2）m−Ｙ3］q−
［式中、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3は、互いに独立に−Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は、Ｈ又はＣ（１〜６）アルキルを表す）から選択される基であり、ｎ、ｍ、ｐ及びｑは、互いに独立に１〜１０の整数である］
又はこれらの組合せを有する直鎖を表す。
【００７８】
上記の基の組合せ（“ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ”という語により示されるように）には、交互の形又はブロックの形の（ａ）と（ｂ）の組合せが含まれ、従って次の式のうちの１つを有していてもよい：
【化１３】
0005886324.tif 000014
［式中、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3は、互いに独立に−Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−（式中、Ｒ1はＨ又はＣ（１〜６）アルキルを表す）から選択される基であり、ｎ、ｍ、ｐ及びｑは、互いに独立に１〜１０の整数である］。
【００７９】
従って、有利な繰り返し単位には次のもの：
【化１４】
0005886324.tif 000015
［式中、
Ｒ1はＨ又はＣ（１〜６）アルキルを表し、及び
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、ｍ５、ｍ６、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に１〜１０の整数であり、有利には１、２、３、４、５又は６である］
が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８０】
上記の基の他の組合せも、例えば、以下の式を有する様々な繰り返し単位（ａ）の組合せを含んでいてもよい：
−［Ｙ1−（ＣＨ2）n］p−［Ｙ1’−（ＣＨ2）n’］q’−［Ｙ1’’−（ＣＨ2）n’’］ q’’−
［式中、
Ｙ1、Ｙ1’、Ｙ1’’は互いに独立に、−Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−（ここで、Ｒ1は、Ｈ又はＣ（１〜６）−アルキルである）から選択される基であり、及びｎ、ｎ’、ｎ’’は、互いに独立に１〜１０の整数である］。
【００８１】
従って、本発明の特定の実施態様は、
Ａがアフィニティー基であり、
Ｚがアリール又はヘテロアリールであり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3が互いに独立に、式（ａ）  −［Ｙ1−（ＣＨ2）n］p−、（ｂ）  −［Ｙ2−（ＣＨ2）m−Ｙ3］q−
［式中、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3は、互いに独立に−Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−（式中、Ｒ1はＨ又はＣ（１〜６）アルキルを表す）から選択される基であり、及びｎ、ｍ、ｐ及びｑは互いに独立に１〜１０の整数である］
の少なくとも１つの繰り返し単位、又はこれらの組合せを有する直鎖である、式Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩの化合物に関する。
【００８２】
最も有利な実施態様では、本発明は式ＶＩＩＩ
【化１５】
0005886324.tif 000016
［式中、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、
ＨＲN−ＮＨ−がヒドラゾニルであるか、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNが、Ｈ又はヒドラジン保護基であり、
ｎ１、ｎ５、ｐ２、ｐ３、ｐ４、ｐ５は、互いに独立に１、２、３、４、５又は６である］
の三官能性架橋剤に関する。
【００８３】
本発明の三官能性架橋剤の製造で使用するために、スペーサー基は、Ｘ又は官能基Ａ、Ｌ及び芳香族ヒドラジン基のうちの１つへの結合を選択的に保護又は活性化できる末端の官能基と一緒に有利に提供されることが理解される。従って、幾つかの実施態様では、スペーサー基は、架橋基を介して、有利には−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＲ1−、−Ｏ−、−ＮＲ1−、−ＮＲ1−ＣＯＯ−及び−Ｓ−Ｓ−結合から選択される基を介してＸ及び個々の官能基（Ａ、Ｌ又は芳香族ヒドラジン基）に結合してもよい。更に、コア構造、スペーサー及び３つの官能基Ａ、Ｌ及び芳香族ヒドラジン基のうち１つを組み立てる有利な順番は無いことが理解される。当業者は、様々な基の性質に応じて、ある１つの順番の組み立てが有利であることに気付くであろう。
【００８４】
本発明の三官能性架橋剤の更なる官能基は、保護された又は保護されていない芳香族ヒドラジン基であり、これは（その保護されていない形で）、細胞表面上又は分泌された糖タンパク質上のグリコペプチドの酸化された炭水化物基との共有結合を選択的に形成できる。前記の酸化グリコペプチドは、細胞表面上又はその分泌された糖タンパク質自体の上に存在するか、又は標的の糖タンパク質レセプターと相互作用する空間的に近い分子上に存在していてもよい。スペーサーＳ2とＳ3の長さは、リガンド結合部位と前記酸化グリコペプチドの間の距離を決定する。従って、様々な長さのスペーサーＳ2とＳ3は、リガンド結合部位の直接の又は広がった環境を走査又は試験することができる。
【００８５】
芳香族ヒドラジン基は、保護されているか又は保護されていなくてもよい。一般的に、どのアミン保護基もヒドラジン基を保護するために使用でき、かつこれらの保護基で保護及び脱保護するために適切である条件は、ヒドラジンで使用するためにも適切である。アミンの保護基ならびにこれらの保護基でアミン保護及び脱保護するための条件は当業者に公知であり、及び例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９１）に開示されている。適切なヒドラジン保護基の特定の例は、水素、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換アリール及び置換ヘテロアリールから選択される置換基を有するアルデヒド又はケトンヒドラゾンであることができるヒドラゾン（Ｒ’Ｒ’’Ｃ＝ＮＮＨ2）である。本発明で使用するための保護基の選択は、意図する架橋剤の使用による。生細胞上の標的細胞表面糖タンパク質、又は標的の分泌糖タンパク質に架橋剤を使用する際に適切な保護基は、ｉｎ  ｓｉｔｕの置き換えに従うべきである。すなわち、これらはいずれかの副反応を回避できる限り、ヒドラジン基を保護し、かつ温和な条件下、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ−又はタンパク質−両立性の条件下に除去可能でなくてはならない。更に、他の用途（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）では、ヒドラジンは、グリコペプチド捕獲剤として三官能性架橋剤を使用する前に置き換えることができる保護基を有していてもよいことが理解される。
【００８６】
有利なヒドラジン保護基には、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及びフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｓｕｌｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ−ＳＯ3Ｈ）、より有利にはトリフルオロアセチルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８７】
従って、より有利な実施態様では本発明はＨＲN−ＮＨ−中のＲNがトリフルオロアセチルである式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩの化合物に関する。
【００８８】
他の実施態様では、Ｚは、非置換若しくは置換フェニル、ナフチル及びアントラセニルから選択されるアリール基、又は非置換若しくは置換ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリル及びチアゾリルから選択されるヘテロアリール基、有利には、ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、ニコチンアミジルである。
【００８９】
従って、保護された芳香族ヒドラジン基は有利にはトリフルオロアセチル−保護ヘテロアリール−ヒドラジン、より有利にはトリフルオロアセチルニコチンアミドヒドラジン基である。
【００９０】
最も有利には、式Ｉの化合物は式ＩＸ
【化１６】
0005886324.tif 000017
［式中、
Ｗ1は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ2、Ｗ3は、互いに独立に−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される官能基であり、
ｎ１、ｎ５、ｐ２、ｐ３、ｐ４、ｐ５、ｓは、互いに独立に１、２、３、４、５又は６である］
の三官能性架橋剤であってもよい。
【００９１】
更なる態様では、本発明は、リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの相互作用を特徴付け及び分析するための本発明の三官能性架橋剤の使用に関する。
【００９２】
簡単に言えば、上記のように本発明の架橋剤は三官能性分子中で、２つの異なる化学反応基とアフィニティー基を組合せる。第一の化学反応基は、リガンド反応基、有利にはＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、架橋剤を対象のリガンドに結合するために使用され、これが次に対象の（細胞表面又は分泌した）標的の糖タンパク質レセプターに結合する。第二の化学反応基は、芳香族ヒドラジン、有利には酸化レセプターであるグリコペプチドを獲得するためのトリフルオロアセチル化芳香族ヒドラジンである。対象のリガンドに共役すると、本発明のアフィニティータグ化された架橋剤は、酸化した生細胞又は溶液中で相互作用する標的の糖タンパク質レセプターを炭水化物に向けて獲得することができ、及び引き続き、アフィニティー基、有利にはビオチンを介して獲得されたグリコペプチドの２工程のアフィニティー精製、引き続き質量分析による分析を可能にする。方向性のないコントロール試料との定量比較により、リガンドとそれらの相応する標的の糖タンパク質レセプターとの相互作用から生じるアフィニティータグ化事象（例えば、ビオチニル化）は、ランダムな（細胞表面又は分泌された）タンパク質の非特異的で確率的なアフィニティータグ化事象（例えば、ビオチニル化）とは明らかに区別できる。これは、より低いアフィニティー及び一時的なリガンドと標的の糖タンパク質レセプター相互作用の検出ならびに、それらの元の細胞環境中で膜結合した形で又は生液中に分泌された形で存在する低含量の糖タンパク質でリガンドのオフターゲット効果の検出を可能にする。
【００９３】
この事は細胞表面の標的糖タンパク質の場合を用いて、図１に図式的に説明されている：対象のリガンド（黒丸で示されている）をタンパク質両立性の緩衝液中で三官能性架橋剤と結合させる。別々のコントロール反応では、等モル量の架橋剤がコントロールタンパク質に結合するか、又は純粋な緩衝液中でクエンチされる（図１Ａ）。細胞表面の炭水化物上にアルデヒド基を生じるために、生細胞が酸化される（図１Ｂ）。次に、予め結合したリガンドを酸化細胞に添加し、酸化細胞表面の糖鎖構造の獲得を可能にする（工程２及び図１Ｃ）。これにより、ランダムな細胞表面糖タンパク質は、確率的事象によりラベルされ、かつ対象のリガンドへの標的細胞表面糖タンパク質レセプターは、ダイレクトなリガンド−レセプターの相互作用により、より効率的に獲得される。平行して、コントロール試料は、確率的ラベリング事象だけを生じる等しい数の細胞に添加される。全ての以下の工程では、両方の試料は平行して処理される。ラベリング反応の後に、細胞は溶解され、かつ核のフラクションが廃棄される（工程３）。残りのフラクションを洗浄し、還元し、アルキル化し、かつ引き続きトリプシンで消化する（工程３、図１Ｄ）。試料を完全に消化した後に、ビオチニル化された細胞表面糖タンパク質を、様々な緩衝液でよく洗浄することによりステレプトアビジンビーズ上でアフィニティー精製する（工程４、図１Ｅ）。洗浄後に、オリゴ糖構造の最内側の成分と、ペプチドのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフ（ここで、Ｎはアスパラギン、Ｘはプロリンを除くアミノ酸、及びＳ／Ｔはそれぞれセリン又はトレオミンをから成る）中のグリコペプチドのアスパラギンの間で切断するＰＮＧａｓｅＦを用いる酵素工程により、Ｎ−グリコペプチドをビーズから特異的に遊離する。そのようにすることにより、ＰＮＧａｓｅＦはアスパラギンを脱アミド化し、かつ予めグリコシル化されたペプチド中の特定のＮ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔサインが導入される（工程５、図１Ｆ）。遊離されたペプチドを脱塩し、かつ高い質量精度の質量分析計で分析するために適切な緩衝液中に再懸濁させる。分析に関しては、質量分析計はデータ依存モードで運転され、その際、所定の閾値より上のイオンシグナルは、装置をＭＳから、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルを生じるＭＳ／ＭＳモードに自動的に切り替える（工程６、図１Ｇ）。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準のタンパク質データベースに対して調査し、かつ同定されたペプチドはＮ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフの存在に関してフィルターされる（工程７、図１Ｈ）。細胞表面レセプターの特定の富化を検出するためにリガンド試料中の細胞表面ペプチドの濃度を、コントロール試料と定量的に比較する。細胞表面タンパク質から確率的にタグされたペプチドに関して、この割合は約１であるべきであり、及びリガンドベースのやり方で特異的に獲得された糖タンパク質レセプターペプチドは、リガンド試料：コントロールにおいてより高い値を取る。タンパク質が１つより多いペプチドで同定される場合には、存在度の情報を組合せることができる（工程８、図Ｈ）。
【００９４】
従って、更なる態様では、本発明はリガンドと、試料中の少なくとも１つの炭水化物残基を有する標的の糖タンパク質レセプターの間の特異的相互作用を同定する方法に関し、その際、リガンドは標的の糖タンパク質レセプター上のリガンド−特異的ペプチドドメインを認識し、次の工程：
ｉ）前記の標的糖タンパク質レセプターを有する試料を用意する工程、
ｉｉ）標的の糖タンパク質レセプターを酸化処理し、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能基を生じさせることにより、酸化された標的の糖タンパク質レセプターを得る工程、
ｉｉｉ）請求項１による式Ｉ
【化１７】
0005886324.tif 000018
［式中、
Ｘは、コア構造であり、
Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3は、互いに独立にスペーサー基であり、
Ｌは、リガンド反応基であり、
Ａは、アフィニティー基であり、
Ｚは、アリール又はヘテロアリールであり、及び
ＨＲN−ＮＨ−又は、ＨＲN−ＮＨ−中のＲNが、ヒドラジン保護基である］
の三官能性架橋剤を用意し、かつリガンド反応基を前記リガンドに共役させて、リガンド−架橋剤−複合体を得る工程、
ｉｖ）（ａ）リガンドが標的の糖タンパク質レセプター上のリガンド特異的タンパク質ドメインに結合でき、及び（ｂ）保護されたヒドラジン基がその遊離型に変換され、かつ酸化された標的の糖タンパク質レセプターと反応できる条件下に、試料とリガンド−架橋剤−複合体を接触させ、ペプチド結合二重複合体を得る工程、
ｖ）ペプチド結合二重複合体を試料から単離し、かつ精製する工程、
ｖｉ）ペプチドを工程（ｉｖ）で得られた精製ペプチド結合二重複合体から遊離し、遊離ペプチドを得る工程、及び
ｖｉｉ）工程ｖ）で得られた遊離ペプチドを高い質量精度の質量分析法により分析及び定量化する工程、及び
ｖｉｉｉ）方向性のないコントロール反応との定量的比較により、リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの間の相互作用を同定する工程、
を有する。
【００９５】
上記のように、標的の糖タンパク質レセプターは、溶液中又は細胞の表面上のどちらかにあって良いことが理解される。
【００９６】
コア構造Ｘ；スペーサー基Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3；リガンド−反応基Ｌ；アフィニティー基Ａ；ＨＲN−ＮＨ−またはＨＲN−ＮＨ−中のＲNならびに（ヘテロ）アリールＺの特定の実施態様は、先に定義した通りである。従って、有利な実施態様では、本発明の上記の方法は式ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸの化合物を用いて実施される。
【００９７】
従って、幾つかの実施態様では本発明は、リガンドと、細胞の集団を含む試料中で少なくとも１つの炭水化物残基を有する細胞表面レセプターの間の特定の相互作用を同定する方法に関し、その際、前記リガンドは標的の糖タンパク質レセプター上のリガンド−特異的ペプチドドメインを認識し、次の工程：
ｉ）細胞の集団（その１つ又は複数は少なくとも１つの糖タンパク質レセプターを示す）を有する試料を用意する工程、
ｉｉ）細胞表面レセプターを酸化処理し、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能性を生じさせることにより、酸化された細胞表面レセプターを得る工程、
ｉｉｉ）本発明の三官能性架橋剤を用意し、より具体的には式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸの三官能性架橋剤を用意し、かつ試薬を前記リガンドに共役できるようにし、リガンド−架橋剤−複合体を得る工程、
ｉｖ）（ａ）リガンドが細胞表面レセプター上のリガンド特異的ペプチドドメインに結合でき、及び（ｂ）保護されたヒドラジン基がその遊離型に変換され、かつ酸化された細胞表面レセプターと反応できる条件下に試料とリガンド−架橋剤−複合体を接触させ、ペプチド結合二重複合体を得る工程、
ｖ）ペプチド結合二重複合体を試料から単離し、かつ精製する工程、
ｖｉ）ペプチドを工程（ｉｖ）で得られた精製ペプチド結合二重複合体から遊離し、遊離ペプチドを得る工程、及び
ｖｉｉ）工程ｖ）で得られた遊離ペプチドを高い質量精度の質量分析法より分析及び定量化する工程、及び
ｖｉｉｉ）コントロール反応との定量的比較により、リガンドと細胞表面レセプターの間の相互作用を同定する工程、
を有する。
【００９８】
他の実施態様では、本発明はリガンドと、生体液中に含有される少なくとも１つの炭水化物残基を有する分泌された糖タンパク質レセプターの間の特異的相互作用を同定する方法に関し、その際、前記リガンドは、分泌された糖タンパク質レセプター上のリガンド−特異的ペプチドドメインを認識し、次の工程：
ｉ）分泌された糖タンパク質レセプターを含有する生体液から濃縮試料を用意する工程、
ｉｉ）分泌された糖タンパク質レセプターを酸化処理し、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能性を生じさせることにより、酸化された分泌された糖タンパク質レセプターを得る工程、
ｉｉｉ）本発明の三官能性架橋剤、より具体的には、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸの三官能性架橋剤を用意し、かつ試薬を前記リガンドに共役できるようにし、リガンド−架橋剤−複合体を得る工程、
ｉｖ）（ａ）リガンドが分泌された糖タンパク質レセプター上のリガンド特異的ペプチドドメインに結合でき、及び（ｂ）保護されたヒドラジン基がその遊離型に変換され、かつ酸化された分泌糖タンパク質レセプターと反応できる条件下に、試料をリガンド−架橋剤−複合体と接触させ、ペプチド結合二重複合体を得る工程、
ｖ）ペプチド結合二重複合体を試料から単離し、かつ精製する工程、
ｖｉ）ペプチドを工程（ｉｖ）で得られた精製ペプチド結合二重複合体から遊離し、遊離ペプチドを得る工程、及び
ｖｉｉ）工程ｖ）で得られた遊離ペプチドを高い質量精度の質量分析法により分析及び定量化する工程、及び
ｖｉｉｉ）コントロール反応との定量的比較により、リガンドと分泌された糖タンパク質レセプターの間の相互作用を同定する工程、
を有する。
【００９９】
他の有利な実施態様では、リガンド反応基は有利には活性化された官能基、より有利にはアミン反応基、最も有利にはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド基である（水溶性が増す）。
【０１００】
本明細書中で使用されているような"試料"又は"生物学的試料"とは、生細胞又は生物により抽出又は分泌されて得られる、組織培養、バイオリアクター、ヒト又は動物組織、植物、果物、野菜、単細胞微生物（例えば、細菌及び酵母）及び多細胞生物を含む固体又は液体試料を意味するがこれらに限定されるわけではない。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、精液、骨髄液、水性又はガラス体液、又は体分泌物、濾出液、浸出液（例えば、膿瘍又は感染もしくは炎症の他の部分から得られる液体）、又は関節から得られる液体（例えば、正常関節又はリウマチ性関節炎、骨粗しょう症、痛風又は化膿性関節炎のような疾患に冒された間接）から得られる生液体であることができる。生物学的試料は、例えば、いずれかの器官又は組織（生検又は検死試料を含む）から得られる試料であってもよく、細胞（一次細胞又は培養細胞）、いずれかの細胞によりコンディショニングされた培地、組織又は器官、組織培養を含むことができる。
【０１０１】
本明細書中で使用されているような"糖タンパク質"（又は"グリコペプチド"）という用語は、１つ又は複数の共有結合した炭水化物基又はオリゴ糖基を含有するタンパク質（又はペプチド）を意味する。炭水化物基は、通常は１つのアミン側鎖基、通常はアスパラギンアミノ酸のものを介して結合する（Ｎ−結合した炭水化物を生じる）か、又はヒドロキシル側鎖基、通常はセリン又はトレオニンアミノ酸のものを介して結合する（Ｏ−結合した炭水化物基を生じる）。酸化された糖タンパク質又はグリコペプチドとは、適切な酸化剤で処理を行い、それにより結合した炭水化物のビシナルジオール部分を切断し、アルデヒド基を生じる糖タンパク質又はグリコペプチドを意味する。このような（ジアルデヒド炭水化物を生じる）炭水化物の酸化は、通常の方法により、例えば、過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩、鉛（ＩＶ）塩又は過マンガン酸塩、有利にはメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて行ってもよい。二者択一的に、化学的アプローチは、バイオ直交型の基（例えば、アジド、アルキン、ケトン又はアルデヒド）を有するグリカン前駆体の類似体を用いて、糖タンパク質レセプター上の架橋剤にとって結合部位を生じる細胞のメタボリックラベリングを駆使できる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）、第１１巻、５２〜８頁）。
【０１０２】
本明細書中で使用されているような"タンパク質"、"ポリペプチド"、"オリゴペプチド"及び"ペプチド"という用語は、同じ意味を有し、かついずれかの長さを有するアミノ酸ポリマーを意味する（通常、ペプチドはタンパク質の断片とも称される）。このポリマーは、直鎖、分子又は環状鎖であってもよい。アミノ酸は、天然に生じるか、又は天然に生じないアミノ酸、又は変異体アミノ酸であってもよい。ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関する"断片"という用語は、参照のポリペプチド又はポリヌクレオチド（長さｎ）の全長に対して、１からｎ−１の範囲の配列長さを有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。断片の長さは、目的に応じて適切に変えることができる。
【０１０３】
本発明に関して、糖タンパク質は、天然に生じる糖タンパク質であってもよく、又は二者択一的に合成処理された配列を有していてもよい（但し、処理された糖タンパク質は、グリコシル化部位として作用する少なくとも１つのペプチド配列を有する）。糖タンパク質は、細胞内糖タンパク質、細胞表面糖タンパク質（すなわち、細胞の表面に結合した糖タンパク質）又は溶液中の糖タンパク質（すなわち、培地中に分泌された糖タンパク質）であってもよい。
【０１０４】
本発明の方法で使用される糖タンパク質は、有利な又は有効な生物活性又は化学活性を有する薬剤学的に又は商業的に関連のある糖タンパク質、例えば、レセプター、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などであってもよい。本発明の方法で使用してもよい以下の糖タンパク質のリストは、単に例示的なものであって列挙を制限する目的はない。当業者は、どの糖タンパク質も本方法で使用でき、かつ特定の糖タンパク質を各人の固有の必要に基づいて選択できることを理解するであろう。
【０１０５】
"標的の糖タンパク質レセプター"又は"糖タンパク質レセプター"という用語は、１つ又は複数の特定の種類のリガンド又はシグナル分子が結合してもよい糖タンパク質を意味する。このような（標的）糖タンパク質レセプターは、生液体中又は、いずれかの対象物から、有利には哺乳類の対象物、例えば、ヒト又は動物から誘導される細胞上に存在していてもよい。従って、"細胞表面"という用語（すなわち、細胞表面糖タンパク質レセプター）と組合せて使用される場合には、これは、１つ又は複数の特殊な種類のリガンド又はシグナル分子が結合していてもよい細胞の原形質膜と会合している糖タンパク質を意味する。"酸化された"という用語と組合せて使用される場合には、これは適切な酸化処理により、その炭水化物部分が酸化されてアルデヒド基を形成する糖タンパク質を意味する。
【０１０６】
糖タンパク質レセプターには、Ｖａｒｋｉ，Ａ等、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００９及びｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇに開示されているような、いずれかの細胞表面レセプター又は分泌されたレセプターが含まれる。糖タンパク質レセプターの非限定例には、例えば次のものを有するレセプターが含まれる：
線維芽細胞増殖因子レセプター１（ＦＧＦＲ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＱＺＭ７、Ｑ９９ＡＷ７、Ｑ９ＵＤ５０、Ｑ６３８２７）、
線維芽細胞増殖因子レセプター２（ＦＧＦＲ２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９６ＫＭ２、Ｐ２１８０２、Ｑ６３２４１）、
線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９５Ｍ１３、ＡＦ４８７５５４、Ｑ９９０５２）、
線維芽細胞増殖因子レセプター４（ＦＧＦＲ４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９１７４２）、
ニューロトロフィンチロシンキナーゼタイプ−２（ＮＴＲＫＴ−２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８ＷＸＪ５）、
ロイコサイト抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ−ＰＴＰＲＦ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＥＱ１７、Ｑ６４６０５、Ｑ６４６０４、Ｑ９ＱＷ６７、Ｑ９ＶＩＳ８Ｐ１０５８６）、
ネフリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９２５Ｓ５、Ｑ９ＪＩＸ２、Ｑ９ＥＴ５９、Ｑ９Ｒ０４４、Ｑ９ＱＺＳ７、Ｑ０６５００）、
タンパク質−チロシンホスファターゼレセプタータイプＳ（ＰＴＲＳ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ６４６９９、Ｑ１３３３２、Ｏ７５８７０）、
タンパク質−チロシンホスファターゼレセプタータイプκ（Ｒ−ＰＴＰ−κ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ１５２６２）、
タンパク質−チロシンホスファターゼレセプタータイプＤ（ＰＴＰＲＤ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：ＱＢＷＸ６５、Ｑ９ＩＡＪ１、Ｐ２３４６８、Ｑ６４４８７）、
エフリンタイプＡレセプター８（ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼレセプターＥＥＫ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｏ０９１２７、Ｐ２９３２２）、
エフリンタイプＡレセプター３（ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼレセプターＥＴＫ−１／ＧＥＫ４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ２９３１８）、
エフリンタイプＡレセプター２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８Ｎ３Ｚ２）、
インスリンレセプター（ＩＲ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＰＷＮ６）、
インスリン様成長因子−１レセプター（ＩＧＦ−１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＱＶＷ４、Ｐ０８０６９、Ｐ２４０６２、Ｑ６０７５１、Ｐ１５１２７、Ｐ１５２０８）、
インスリン関連レセプター（ＩＲＲ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ１４６１６）、チロシン−タンパク質キナーゼレセプターＴｉｅ−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：０６８０５、Ｐ３５５９０、Ｑ０６８０６）、
ラウンドアバウトレセプター−１（ｒｏｂｏ−１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｏ４４９２４、ＡＦ０４１０８２、Ｑ９Ｙ６Ｎ７）、
神経性ニコチンアセチルコリンレセプターα３サブユニット（ＣＨＲＮＡ３）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８ＶＨＨ６、Ｐ０４７５７、Ｑ８Ｒ４Ｇ９、Ｐ３２２９７）、
神経性アセチルコリンレセプターα６サブユニット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ１５８２５、Ｑ９Ｒ０Ｗ９）、
血小板由来増殖因子βレセプター（ＰＤＧＦＲＢ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８Ｒ４０６、Ｑ０５０３０）、
インターロイキン−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ００５６０）、
インターロイキン−２３レセプター（ＩＬ−２３Ｒ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：ＡＦ４６１４２２）、
ＩＬ−３、ＩＬ−５及びＧｍＣｓｆのβ−共通サイトカインレセプター（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ３２９２７）、
サイトカインレセプター様分子３（ＣＲＬＦ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＪＭ５８）、
クラスＩサイトカインレセプター（ＺＣＹＴＯＲ５）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＵＨＨ５）、
ネトリン−１レセプターＤＣＣ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ４３１４６）、
ロイコサイトＦｃレセプター様タンパク質（ＩＦＧＰ２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９６ＰＪ６、Ｑ９６ＫＭ２）、
マクロファージスカベンジャーレセプター２（ＭＳＲ２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９１ＹＫ７）、又は
顆粒状コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９９０６２）、又はその断片、又はその変異体。
【０１０７】
他の実施態様では、糖タンパク質レセプターはプロテオグリカンの群から選択される。より有利には、プロテオグリカンは、ヘパリンスルフェートプロテオグリカンを有する群から選択される。最も有利な実施態様では、プロテオグリカンはペルレカン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ９８１６０）、又はその断片、又はその変異体である。
【０１０８】
その他の実施態様では、糖タンパク質レセプターは、膜固着細胞表面酵素の群から選択されるレセプターである。例えば、細胞表面レセプターは、メタロプロテイナーゼのピトリリジンファミリー又はディスインテグリンのファミリー及びメタロプロテアーゼ（ＡＤＭＡｓ）から成る群から選択され、前記メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−８（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ０５９１０）、ＡＤＡＭ−１９（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９Ｈ０１３、Ｏ３５６７４）、ＡＤＡＭ−８（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ７８３２５）、ＡＤＡＭ−１２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｏ４３１８４、Ｑ６１８２４）、ＡＤＡＭ−２８（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＪＬＮ６、Ｑ６１８２４、Ｑ９ＸＳＬ６、Ｑ９ＵＫＱ２）、ＡＤＡＭ−３３前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８Ｒ５３３、Ｑ９２３Ｗ９）、ＡＤＡＭ−９（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ１３４３３、Ｑ６１０７２）、ＡＤＡＭ−７（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９Ｈ２Ｕ９、Ｏ３５２２７、Ｑ６３１８０）、ＡＤＡＭ−１Ａフェルチリンアルファ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８Ｒ５３３）、ＡＤＡＭ−１５（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＱＹＶ０、Ｏ８８８３９、Ｑ１３４４４）、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンドメイン含有タンパク質（ＴＥＣＡＭ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：ＡＦ１６３２９１）、メタロプロテイナーゼ１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｏ９５２０４、Ｑ９ＢＳＩ６）、又はその断片、又はその変異体を含む。
【０１０９】
幾つかの実施態様では、糖タンパク質レセプターは、酵素、例えば、加水分解酵素、転移酵素、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ及び酸化還元酵素であってもよい。加水分解酵素の例には、リパーゼ、コリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−アミラーゼデオキシリボヌクレアーゼ、グルコアミラーゼＡ及びＢ、α−ガラクトシダーゼＩ及びＩＩ、β−フルクトフラノシダーゼ、β−グルコウロニダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、オキシトシナーゼ、カリクレイン、ブロメライン、エンテロキナーゼ、プロテイナーゼａ、ｂ及びｃ、ペプシノゲン及びペプシンが含まれる。酸化還元酵素の例には、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びクロロペルオキシダーゼが含まれる。トランスフェラーゼの例には、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及リボヌクレアーゼが含まれる。当業者は本発明の方法に従い使用できる他の公知の酵素の例にも気付くであろう。
【０１１０】
更なる実施態様では、糖タンパク質レセプターは成長因子又は他のシグナル分子であってもよい。成長因子は、通常は細胞により分泌される糖タンパク質であり、及び他の細胞上のレセプターに結合し、かつ活性化し、レセプター細胞内で代謝又は成長上の変化を開始する。哺乳類の成長因子及び他のシグナル分子の非限定例には、サイトカイン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、例えば、ＦＧＦ−５、インスリン様成長因子−Ｔ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉブレイン）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８及びＣＤ−Ｉ９；エリスロポイエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、及びγ、コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ、殆どのインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）β、卵胞刺激ホルモン（ＣＳＦｓ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン、抗凝血因子、例えば、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性物質、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ又は人尿又は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、造血成長因子及びエンケファリナーゼが含まれる。通常の当業者のうち一人は、本発明の方法に従って使用できる他の成長因子又はシグナル分子にも気付くであろう。
【０１１１】
特定の標的の糖タンパク質レセプターに特異的な"リガンド"という用語は、本明細書中で広く使用され、かつ膜結合し、かつ細胞表面上に又は分泌された形で存在する標的の糖タンパク質レセプターと相互作用できる又は結合するいずれかの化合物を意味する。それぞれの標的の糖タンパク質レセプターは、１つ又は複数の特異的リガンド結合部位を有していてもよく、これは同じ又は異なるか又は種々のリガンドを重複することができ、かつこれはリガンド結合が起こる全体の標的の糖タンパク質レセプター内の特異的ペプチドドメイン（すなわち、タンパク質の特定の部分）である。
【０１１２】
リガンドとペプチドドメインの間の認識は、リガンド又は標的の糖タンパク質レセプターの配列特異性、三次元構造、又は翻訳後変性による。リガンドの例には、グリコペプチド、ポリペプチドを含むペプチド、糖タンパク質又はリンタンパク質を含むタンパク質、炭水化物、糖脂質、リン脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ビタミン、抗原及びその断片、ハプテン、レセプターアゴニスト、部分的アゴニスト、混合アゴニスト、アンタゴニスト、薬剤、ケモカイン、ホルモン（例えば、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＲＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＣＲＨ、ＰＲＨ、ＭＲＨ、ＭＳＨ、グルカゴン及びプロラクチン、トランスフェリン、ラクトフェリン、アンジオテンシン、ヒスタミン、インスリン、レクチン）、トランスミッター、オータコイド、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、ＴＢＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ボンベシン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、オンコスタチン及びエンドセリン１）、インターロイキン（例えば、インターロイキン１〜１５）、リンホカインを含むサイトカイン及び細胞シグナル分子、例えば、腫瘍壊死因子（例えば、腫瘍壊死因子α及びβ）ならびにインターフェロン（例えば、インターフェロンα、β及びｙ）、補欠分子族、コエンザイム、コファクター、制御因子、又はレセプターに特異的に結合するその他の天然に存在する有機分子、又は合成有機分子（その断片、類似体ならびに同じ結合特性を有するその誘導体を含む）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。特定の細胞表面の標的糖タンパク質レセプターに特異的なリガンドは、幅広い細胞のタイプ又は特異的な細胞タイプを標的にしてもよい。
【０１１３】
幾つかの実施態様では、リガンドは、ペプチド、炭水化物、脂質又はヌクレオチドを含む群から選択される。ヌクレオチドという用語には、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、ジ−、オリゴ−、又はポリ−ヌクレオチド、又はヌクレオチドを有する物質が含まれる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドベース又は変性ヌクレオチドベース、糖残基又は変性糖残基ならびにモノエステル、ジエステル、トリエステル、クアドラエステル又はペンタエステル基を有する分子として定義される。例えば、タンパク質の断片、すなわちペプチドが使用される場合には、これはいずれかの適切な長さであってよい。ペプチドの（最小）長さ及び組成物、すなわちアミノ酸の数及び種類は、結合相互作用の性質により決定づけられることが理解される。通常は、ペプチドは例えば３〜１００個のアミノ酸残基を有していてもよい。
【０１１４】
幾つかの実施態様では、リガンドは抗体であってもよい。抗体は、それらのアミノ酸残基の幾つかに加えられるオリゴ糖鎖を有する重い（〜１５０ｋＤａ）球状血漿タンパク質である。これらは、特定の抗原に特異的に結合する能力がある。現在のところ使用されているか、又は製剤又は他の市販薬として研究下にある多数の抗体を用いて、本発明の方法による特定のリガンドとの結合相互作用の分析には特に関心がある。幾つかの実施態様では、抗体は治療抗体であるトランスツズマブ及びベバシズマブのようなモノクロナール抗体であってもよい。幾つかの実施態様では、モノクロナール抗体はヒト化抗体である。他の実施態様では、抗体はポリクロナールであることができる。
【０１１５】
幾つかの実施態様では、エンジニアード・アフィニティー結合剤、例えば、アンキリンリピート結合剤、ファージディスプレイにより生じるアフィニティー結合剤、又はオリゴ核酸又はペプチドアプタマーを用いることができる。
【０１１６】
幾つかの実施態様では、リガンドは糖タンパク質、例えば、上記のような糖タンパク質レセプターであってもよい。幾つかの実施態様では、リガンドは細胞表面タンパク質のドメイン、例えば、上記の細胞表面糖タンパク質レセプターであってもよい。
【０１１７】
本発明によれば、リガンドはその結合部位を介して標的の糖タンパク質レセプターと相互作用し、前記結合部位は、標的の糖タンパク質レセプターの特異的ペプチド断片、例えば、特定のアミノ酸配列であるか、又は結合部位と称される標的の糖タンパク質レセプターの断片の三次元構造である。
【０１１８】
その（細胞表面又は分泌された）標的の糖タンパク質レセプター結合部位へのリガンド結合に関する"相互作用する"又は"相互作用"という用語には、（細胞表面又は分泌された）標的の糖タンパク質レセプターと、リガンドの間の一時的又は永久的な直接の又は間接的な接触が含まれ、かつその結合親和性、すなわちその解離平衡定数Ｋｄにより特徴付けられてもよい。リガンドの、その標的の糖タンパク質レセプターへの通常の結合親和性は、少なくとも１０-5Ｍ、有利には１０-7Ｍ及びそれ以上、例えば、約１０-8Ｍ〜約１０-12Ｍである。本発明の方法は、通常の結合アフィニティーならびに例えば１０-7Ｍ未満の値を有するＫｄにより特徴付けられる（細胞表面又は分泌された）標的の糖タンパク質レセプターとリガンドの間の低い親和性相互作用の検出の両方を可能にする。
【０１１９】
従って、発明の通常の方法では以下の工程が行われる：
第１の工程では、本発明の架橋剤のリガンド反応基、有利には活性化された官能基、より有利にはＮ−ヒドロスクシンイミド基は、タンパク質両立性の条件下に、かつヒドラジン機能を損失することなく、第一級アミンを介してリガンドへの十分なカップリングを可能にし、リガンド−架橋剤複合体を得る。別々のコントロール反応では、等モル量の架橋剤は、コントロールタンパク質に結合されるか、又は活性化された官能基、例えば、ＮＨＳエステルを加水分解するための純粋な緩衝液中でインキュベートされる。
【０１２０】
第２の工程では、リガンド−架橋剤複合体が細胞、組織を有する試料、又は標的の糖タンパク質レセプターを有する溶液に添加されるが、これらは、例えば、過ヨウ素酸塩（例えば、１〜２ｍＭＮａＩＯ4）を用いて酸化処理し、リガンド−架橋剤複合体中のリガンドが、その特異的結合部位に結合できる条件下に、標的の糖タンパク質レセプター上に存在する炭水化物上にアルデヒド基を生じるようにしておいたものである。
【０１２１】
上記に定義してあるように、細胞表面糖タンパク質レセプターの場合には、試料は細胞の集団を有し、そのうち少なくとも１つは、このような細胞表面糖タンパク質レセプターを示す。上記に定義したような分泌された糖タンパク質の場合には、試料は少なくとも１つの分泌された糖タンパク質を含んでいる生体液を有する。
【０１２２】
従って、本発明の方法の特定の実施態様では、上記の開示方法の工程（ｉｉｉ）で参照した酸化糖ペプチドは、標的の糖タンパク質レセプターの集団を有する試料（工程（ｉ）による）に、前記試料とリガンド−架橋剤複合体（工程（ｉｉｉ）による）を接触させる前に酸化処理を行い、レセプターペプチド側鎖上に存在する炭水化物を酸化することにより得られる。リガンド結合の際に、ヒドラジン基は、（その保護されていない形で）これらの酸化部位と反応することになる。グリコペプチド上の炭水化物の酸化は、通常は幾つかの潜在的な酸化結合部位を生じ、リガンド−架橋剤複合体のヒドラジン基により獲得されるグリコペプチドは同じままである。
【０１２３】
よって、上記の方法の工程（ｉ）には、有利には（ａ）分泌された形又は細胞表面上の少なくとも１つの標的の糖タンパク質レセプターを有する試料を用意し、及び（ｂ）試料に酸化処理を行い、少なくとも１つの酸化された標的の糖タンパク質レセプター、すなわち、少なくとも１つの酸化された炭水化物基を有する少なくとも１つの標的糖タンパク質レセプターを有する試料を得る工程が含まれる。
【０１２４】
第３の工程では、ヒドラジンの保護基を除去してもよい条件を試料に課す。トリフルオロアセチル基が芳香族ヒドラジンの保護基として使用される場合には、炭水化物を酸化する条件は、その除去にも作用し、かつ遊離ヒドラジンは酸化グリコペプチドのアルデヒド基を効率的に獲得し得る。ランダムな糖タンパク質が確率的な事象により獲得されるのに対して、レセプター上のリガンド結合部位に近いアルデヒド基は、リガンドと標的のタンパク質レセプターの直接的な相互作用により生じる局所的な富化によって、より効率的に獲得される。三官能性架橋剤あたりの二重ラベリング事象は、ペプチド結合二重複合体を生じる。同様に、コントロール試料（例えば、クエンチされた架橋剤、又は非特異的分子と共役する架橋剤、又は独自のレセプター特異性を有するリガンド分子と共役する架橋剤）は、等しい数の細胞に添加され、確率的なラベリング事象だけを生じる（以下の全ての工程に関して、コントロール試料を平行して加工してもよい）。
【０１２５】
第４の工程では、試料を加工し、かつ標準の方法により酵素消化を行う（Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００９）、第２７巻（４）、３７８〜８６頁）。
【０１２６】
リガンドと、標的の糖タンパク質レセプターの間の特異的相互作用を同定する方法（その際、この標的の糖タンパク質レセプターは、細胞表面糖タンパク質、例えば、細胞表面レセプターである）の場合には、まず該細胞を有する試料に溶解工程を行い、かつ引き続き細胞タンパク質をトリプシンのような酵素を用いて消化し、ペプチド結合二重複合体を有する加工された細胞試料が得られる。
【０１２７】
リガンドと、標的の糖タンパク質レセプターの間の特異的相互作用を同定する方法（その際、この標的の糖タンパク質レセプターは、分泌された糖タンパク質である）の場合には、生体液中に分泌された糖タンパク質を有する試料をトリプシンのような酵素を用いて消化し、ペプチド結合二重複合体を有する加工された細胞試料が得られる。
【０１２８】
次に、ペプチド結合二重複合体は、アフィニティー基であるその三番目の官能基を用いてアフィニティー精製される。例えば、ビオチンがアフィニティー基として使用される場合には、ペプチド結合二重複合体は、通常の方法によりストレプトアビジンビーズを用いてアフィニティー精製される（Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ等、ｉｂｉｄ）。
【０１２９】
上記の方法の工程（ｉｖ）には、初めに試料に酵素消化を行い、処理された試料を得て、引き続き獲得したペプチドを加工試料からアフィニティー精製することによる、ペプチド結合二重複合体を試料から単離及び精製することが含まれる。
【０１３０】
第５の工程では、Ｎ−グリコペプチドをプロテアーゼ又はグリカナーゼ処理することにより、例えば、ＰＮＧａｓｅＦ、ＰＮＧａｓｅＡなど、有利にはＰＮＧａｓｅＦに曝すことにより、特異的にビーズから遊離される。ＰＮＧａｓｅＦ処理は、オリゴ糖構造の最も内側の成分と、ペプチドのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフ中のグリコペプチドのアスパラギンの間で切断される（その際、Ｎは、アスパラギンであり、Ｘは、プロリンを除くアミノ酸であり、及びＳ／Ｔは、それぞれセリン又はトレオニンである）。それにより、ペプチドの遊離に作用する（及び同時にアスパラギンを脱アミノ化する）。
【０１３１】
Ｎ−結合したグリコシル化部位を用いて例示したが、本発明の方法は他のタイプの確実に同定されたグリコシル化部位、例えば、Ｏ−結合したグリコシル化部位又は可能性としては他のタイプの翻訳後修飾（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールのペプチドのＣ−末端への結合）を用いて、又はタンパク質以外の、例えば糖脂質などのグリコシル化有機化合物を用いて使用できることが理解される。
【０１３２】
従って、上記の工程（ｖ）は、グリコシダーゼ処理、有利には種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼで処理し、遊離ペプチドを得ることによる、工程（ｉｖ）で得られた精製されたペプチド結合二重複合体から獲得したペプチドを分離することを有利に含む。二者択一的に、切断可能なリンカー、例えば、それぞれ還元剤又は過ヨウ素酸塩で切断できるジスルフィド結合又はシスジオール含有リンカーを使用できる。
【０１３３】
第６の工程では、このように得られた遊離ペプチドを有利には質量分析法により分析する。質量分析の方法は当業者に周知である（例えば、Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔ．３３：１〜１９（１９８８）；Ｋｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９〜２９５（２００１）参照）。高解像度ペプチド断片分離には、液体クロマトグラフィーＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ又は自動化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（キャピラリー逆相クロマトグラフィーを分離法として利用する）を使用できる（Ｙａｔｅｓ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３〜５６９（１９９９））。有利には、動的排除を用いるデータに依存した衝突誘起解離（ＣＩＤ）は、選択的な質量分析法として使用されるであろう（Ｇｏｏｄｌｅｔｔ等、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１２〜１１１８（２０００））。このような分析には、質量分析計は一般的にデータ依存法で運転され、その際、所定の閾値より上のイオンシグナルは、装置をＭＳから、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルを生じるＭＳ／ＭＳモードに自動的に切り替える。
【０１３４】
全てのＭＳ／ＭＳスペクトルは、標準のアリゴリズム（ＳＥＱＵＥＳＴ，Ｍａｓｃｏｔ，  Ｘ！ｔａｎｄｅｍ，ＯＭＳＳＡ，・・・）を使用して標準のタンパク質データベースに対して調査され、かつ通常は偽陽性タンパク質同定率が１％を下回るように制限するためにフィルターされる。更に、全てのペプチドは予めグリコシル化されたペプチドのＮ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフについてフィルターされる。
【０１３５】
従って、上記の方法の工程（ｖｉ）は、リガンドと標的の糖タンパク質レセプターの間の相互作用を同定する定量的質量分析法による、工程（ｖ）で得られた遊離ペプチドの分析を有利に含む。
【０１３６】
リガンド試料中の糖タンパク質の濃度をコントロール試料と定量的に比較し、標的の糖タンパク質レセプターの特異的な富化を検出することができる。このラベルフリーの質量分析による定量に関しては、質量分析法の直前に逆相クロマトグラフィーをＭＳ特徴マップとして表示でき、その際、特徴の滞留時間は、それらの質量／電荷比に対してプロットされる。質量分析計により検出されるように、このようなマップ中のペプチドは、規定の時間にわたり固有のアイソトープパターン及び試料中のそれらの存在度により規定のイオン電流密度を示す。断片化及びＭＳ／ＭＳ分析によりペプチドが一度同定されると、この情報をＭＳマップ中の特定のペプチドの特徴に割り当てることができ、かつオープンソースのアルゴリズム又は市販のアルゴリズム、例えば、Ｓｕｐｅｒｈｉｒｎ（Ｍｕｅｌｌｅｒ等、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００７）第７巻、（１９）３４７０〜３４８０頁）、又はＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＬＣ−ＭＳ（非線形ダイナミックス）を用いて、半定量的データと組合せることができる。次に、種々の試料（例えば、試料対コントロール）のＭＳ特徴マップを重ね、かつ比較してペプチド存在度の比を得ることができる。糖タンパク質から確率的にタグされたペプチドに関しては、これらの比は約１であるべきであり、及びリガンドベースの方法で特異的に獲得された糖タンパク質レセプターペプチドは、リガンド対試料でより高い値を取る。タンパク質を１つ又は複数のペプチドで同定する場合には、存在度の情報を合わせることができる。
【０１３７】
他の実施態様では、二者択一的な質量分析法に基づく定量化法は、このような単反応モニタリング（ＳＲＭ）及び細胞培養液中のアミノ酸を用いた安定な同位体ラベリング（ＳＩＬＡＣ）を使用できる（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｒｅａｄｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｉｇ  ｔｉｍｅ.  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）、第７巻、６８１〜５頁）。
【０１３８】
もう１つの態様では、本発明は３つの異なる分枝上に（保護された）ヒドラジン基、リガンド反応基、アフィニティー基を有する本発明による三官能性架橋剤、例えば、本明細書中で定義した三官能性架橋剤を有するキットにも関する。
【０１３９】
更に、本発明は以下の非限定例により説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、細胞表面の標的の糖タンパク質レセプターのリガンドベースのレセプター獲得ワークフローを表す図である。
【図２】図２は、インスリンで獲得したリガンドベースのレセプターの相対定量による評価を表す図である。
【図３】図３は、ＣＤ４４抗体で獲得したリガンドベースのレセプターの相対定量による評価を表す図である。
【０１４１】
実施例：
材料及び方法
反応は、乾燥アルゴンの雰囲気下にフレーム乾燥したガラス器具中で実施した。全ての化学物質はＦｌｕｋａ，Ａｃｒｏｓ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｅｒｋ  ａｎｄ  Ｌａｎｃａｓｔｅｒから購入し、かつ更に精製せずに使用した。無水トリエチルアミン（ＴＥＡ）をＣａＨ2上で蒸留し、かつジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）をＫＯＨから蒸留し、かつメタノール（ＭｅＯＨ）を酸化マグネシウム上で蒸留した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を分子篩上で乾燥させた。アルゴン雰囲気（Ｈ2Ｏ含有量＜３０ｐｐｍ、カールフィッシャー滴定）下に活性アルミナを通すことによりＣＨ2Ｃｌを乾燥させた。反応物を磁気撹拌し、かつＭｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ254プレートを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニターし、かつＵＶ光下の蛍光クエンチングにより視覚化した。更に、ニンヒドリン（ｎ−ブタノール及び１０％硫酸中）及び過マンガン酸カリウムを用いてＴＬＣプレートを染色した。生成物のクロマトグラフィーによる精製は、Ｅ．Ｍｅｒｋ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（２３０〜４００メッシュ）又はセファデックスＬＨ−２０（Ａｌｄｒｉｃｈ）において実施した。減圧下での濃縮は、（特記されない限り）４０℃で適切な圧力下に回転エバポレーションにより実施した。ＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００分光計、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ４００及びＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ６００分光計において記録した。内部標準物として溶媒共鳴を用いて化学シフトをｐｐｍで表示してある。データは以下のように表示してある：ｓ＝シングレット、ｂｒｓ＝ブロードシングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝クアトレット、ｍ＝マルチプレット；Ｈｚでのカップリング定数。ＩＲスペクトルはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＲＸＩ  ＦＴ−ＩＲ分光光度計において記録した。吸光度は、波数（ｃｍ-1）で示されている。正確なマススペクトルは、チューリッヒ工業大学のＬＯＣ  ＭＳサービスによるＵｌｔｉｍａ  ４．７分光計ＭＡＬＤＩ−ＦＴのＩｏｎ  Ｓｐｅｃで得られた。ピークはパーセント（ｍ／ｚ）で得られる。
【０１４２】
略語について：Ｂｏｃ：ブトキシカルボニル；ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；ＥＤＣｌ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド；Ｅｔ2Ｏ：ジエチルエーテル；ＥｔＯＨ：エタノール；Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル；ＨＢＴＵ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡＡ：無水トリフルオロ酢酸；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ｉ−ＰｒＯＨ：イソプロパノール；ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；Ｈｅｘ：ヘキサン。
【０１４３】
定量アッセイ：分析に関して質量分析計をデータ依存法で運転し、その際、所定の閾値より上のイオンシグナルは、装置をＭＳから、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルを生じるＭＳ／ＭＳモードに自動的に切り替える。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準のタンパク質データベースに対して調査し、かつ同定したペプチドをＮ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフの存在に関してフィルターした。リガンド試料中の（細胞表面又は分泌された）ペプチドの濃度は、標的レセプターの特異的富化を検出するためにコントロール試料と定量的に比較した。（細胞表面又は分泌された）タンパク質から確率的にタグされたペプチドに関しては、割合は約１であるべきであり、及び特にリガンドベースのやり方で獲得された糖タンパク質レセプターペプチドは、リガンド試料：コントロールにおいてより高い値を取る。タンパク質が、１つよりも多いペプチドで同定される場合には、存在量の情報を合わせることができる。更なる詳細は、特定の実施例で見出すことができる。
【０１４４】
例１：架橋剤Ｊｏｙ−０６−１６の合成
【化１８】
0005886324.tif 000019
【０１４５】
（ａ）（２Ｓ）−２−［６−（６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサンアミド）ヘキサンアミド］−５−メトキシ−５−オキソペンタン酸の合成：
【化１９】
0005886324.tif 000020
【０１４６】
メタノール（１３０ｍＬ）中の（２Ｓ）−２−アミノ−５−メトキシ−５−オキソペンタン酸（９．８ｇ、２２ｍｍｏｌ；Ｇｌｅｎｎ，Ｍ．Ｐ．等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，６４０により合成）の溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−６−（６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサンアミド）ヘキサノエート（５．７ｇ、２９ｍｍｏｌ；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｂ．ａｎｄＨｕａｎｇ，Ｘ．Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ  ２００８，２０，２６５により合成）を添加し、かつ次に該溶液にＴＥＡ（９．４ｇ、６７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後に、反応混合物を減圧下に濃縮し、かつＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）中に溶かし、かつ次に１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄し、かつ塩水で洗浄し、かつＭｇＳＯ4上で乾燥させ、かつ減圧下に濃縮し、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝８５：１５：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）により精製し、白色の泡立つ固体として所望の化合物が得られた（９．５ｇ、８７％）。
【０１４７】
【化２０】
0005886324.tif 000021
（ｂ）５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）ペンタンアミド（２）の合成：
【化２１】
0005886324.tif 000022
【０１４８】
ビオチン（６．３ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５０mL）中に溶かし、かつ次に該溶液にＤＩＰＥＡ（３．２ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＨ（７．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０分間撹拌した。この反応混合物に、Ｎ−Ｂｏｃ−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン（５．９ｇ、１８ｍｍｏｌ）を添加し、かつ次に室温で１時間撹拌した。該混合物を減圧下に濃縮し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（５００ｍＬ）中に取り、かつ洗浄（１Ｎ  ＨＣｌ×２、飽和ＮａＨＣＯ3）し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、かつ濾過した。濾液を減圧下に濃縮し、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ビオチニル−４，７，１０−トリオキサ−トリデカン−１，１３−ジアミンが茶色い油として得られた。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ビオチニル−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミンを水（一滴）と一緒にＴＦＡ（２００ｍＬ）中で撹拌した。次に１時間後に、減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝１０：６：１＋ＴＥＡ）により精製し、所望の化合物が僅かに茶色い油として得られた（７．４ｇ、９０％）。
【０１４９】
【化２２】
0005886324.tif 000023
（ｃ）メチル（４Ｓ）−４−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル）−４−［６−（６−｛［ｔｅｒｔ−ブトキシ］カルボニル］アミノ｝ヘキサンアミド）ヘキサンアミド］ブタノエート（３）の合成：
【化２３】
0005886324.tif 000024
【０１５０】
化合物１（９．４ｇ、１９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（７．３ｇ、１９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３．４ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（９０ｍＬ）中に溶かし、かつ室温で撹拌した。１０分後に、化合物２（６．６ｇ、１５ｍｍｏｌ）を添加し、かつ該混合物を１時間撹拌した。粗混合物を減圧下に濃縮し、かつカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝１０：６：１）により精製し、所望の化合物が白色の粘性の泡として得られた（７．５ｇ、５５％）。
【０１５１】
【化２４】
0005886324.tif 000025
（ｄ）（４Ｓ）−４−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−４−［６−（６−｛［ｔｅｒｔ−ブトキシ］カルボニル］アミノ｝ヘキサンアミド）ヘキサンアミド］ブタン酸（４）の合成：
【化２５】
0005886324.tif 000026
【０１５２】
エステル化合物３（０．６２ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をi−ＰｒＯＨ：Ｈ2Ｏ（７：３）（１３．４ｍＬ）中のＣａＣｌ2（０．８Ｍ）中に溶かし、かつ次に０．５ＭＮａＯＨ（１．６ｍＬ）を室温で添加した。２時間後に、反応混合物を５ＭＨＣｌで中和し、かつ次にこれをＣＨＣｌ3で３回抽出し（１００ｍＬ）、次にＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、次に減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝８５：１５：１〜６５：２５：４）により精製し、所望の化合物が無色の粘性の泡として得られた（０．２４ｇ、３９％）。
【０１５３】
【化２６】
0005886324.tif 000027
（ｅ）ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛５−［（５−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（３−｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］ペンタンアミド｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−３−［（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）カルバモイル］プロピル］カルバモイル｝ペンチル）カルバモイル］ペンチル｝カルバメート（５）の合成：
【化２７】
0005886324.tif 000028
【０１５４】
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の４の溶液（３．４ｇ、３．８ｍｍｏｌ）に、ＨＢＴＵ（１．７ｇ、４．６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．８０ｍＬ、４，６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１０分間撹拌した後に、この反応混合物に、Ｎ−１−Ｆｍｏｃ−１，２−ジアミノエタンヒドロクロリド（１．３ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を添加し、かつ次に３０分間撹拌した。溶剤を減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）により精製し、所望の化合物が無色の粘性の泡として得られた（４．３ｇ、９７％）。
【０１５５】
【化２８】
0005886324.tif 000029
（ｆ）ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛５−［（５−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−３−［（２−｛［６−（２，２，２−トリフルオロアセトヒドラジド）ピリジン−３イル］ホルムアミド｝エチル）カルバモイル］プロピル］カルバモイル｝ペンチル）カルバモイル］ペンチル｝カルバメート（６）の合成：
【化２９】
0005886324.tif 000030
【０１５６】
ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の５の溶液（４．４ｇ、３．８ｍｍｏｌ）に、ピペリジン（溶剤の２０％、８ｍＬ）を添加し、かつ反応混合物を室温で２０分間撹拌し、かつＥｔ2Ｏ（５００ｍＬ）に添加した。ジエチルエーテルをデカントし、かつ粗化合物にジエチルエーテル（２５０ｍｌ）を２回注ぎ、かつ次にシロップ化合物をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中に溶かし、かつ減圧下に濃縮し、かつ生成物の２．４ｇを更に精製せずに繰り越した。この生成物（２．４ｇ、２．６ｍｍｏｌ）及び６−（２，２，２−トリフルオロアセトヒドラジド）ピリジン−３−カルボン酸（１．３ｇ、５．２ｍｍｏｌ；Ａｂｒａｍｓ，Ｍ．Ｊ．等，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９９０．３１，２０２２により合成）をＤＭＦ（３０ｍｌ）中に溶かし、かつＥＤＣｌ（１．１ｇ、５．２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（６３ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を該反応混合物に添加し、かつ室温で３時間撹拌した。溶剤を減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）により精製し、所望の化合物が黄色の粘性の泡として得られた（１．６ｇ、５３％）。
【０１５７】
【化３０】
0005886324.tif 000031
（ｇ）３−（｛５−［（５−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（３−｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］ペンタンアミド｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−３−［（２−｛［６−（２，２，２−トリフルオロアセトヒドラジド）ピリジン−３イル］ホルムアミド｝エチル）カルバモイル］プロピル］カルバモイル｝ペンチル）カルバモイル］ペンチル｝カルバモイル）プロピオン酸（７）の合成：
【化３１】
0005886324.tif 000032
【０１５８】
化合物６（２０ｍｇ、１８μｍｏｌ）をＴＦＡ（０．５ｍｌ）中に溶かし、かつ蒸発させ、真空中で乾燥させた。更に精製せずに、生成物（１８ｍｇ、１８μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶かし、次にＤＩＰＥＡ（４．３μｌ、１９μｍｏｌ）及び無水コハク酸（２．２ｍｇ、１９μｍｏｌ）を添加し、かつ室温で撹拌し、３時間後に粗混合物を減圧下に蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝１０：６：１）により精製し、所望の酸化合物が黄色の粘性の泡として得られた（定量的収率２０ｍｇ）。
【０１５９】
【化３２】
0005886324.tif 000033
（ｈ）２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−３−（｛５−［（５−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−３−［（２−｛［６−（２，２，２−トリフルオロアセトヒドラジド）ピリジン−３−イル］］ホルムアミド｝エチル）カルバモイル］プロピル］カルバモイル｝ペンチル）カルバモイル］ペンチル｝カルバモイル）プロピオネート（８）の合成：
【化３３】
0005886324.tif 000034
【０１６０】
生成物７（８４ｍｇ、７１μｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（３４ｍｇ、１８μｍｏｌ）及びＮＨＳ（１９ｍｇ、１６μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶かし、かつ次に反応混合物を室温で一晩撹拌した。得られた混合物を減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝１０：６：１）により精製し、所望の化合物が黄色の粘性の泡として得られた（５１ｍｇ、５６％）。
【０１６１】
【化３４】
0005886324.tif 000035
【０１６２】
例２：架橋剤Ｊｏｙ−０５−１２５の合成
【化３５】
0005886324.tif 000036
（ａ）ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（５Ｓ）−５−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンチル］カルバメート（９）の合成：
【化３６】
0005886324.tif 000037
【０１６３】
Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン（１．７ｇ、３．７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶かし、かつ次に該溶液にＤＩＰＥＡ（０．６３ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（１．７ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、かつ１０分後に該反応混合物にＤＭＦ（５ｍＬ）中の１−Ｎ−ビオチニル−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン（１．８ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、かつ室温で１時間撹拌し、かつ次に溶剤を減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝１０：６：１）により精製し、所望の化合物が白い粘性の泡として得られた（２．６ｇ、７８％）。
【０１６４】
【化３７】
0005886324.tif 000038
（ｂ）ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛５−［（５−｛［（５Ｓ）−５−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンチル］カルバモイル｝ペンチル）カルバモイル］ペンチル｝カルバメート（１０）の合成：
【化３８】
0005886324.tif 000039
【０１６５】
化合物９（２．６ｇ、２．９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（１：１、２０ｍＬ）の混合物中に撹拌して入れ、かつ次に０℃で３０分間撹拌し、かつ蒸発させ及び高真空下に乾燥させた。粗生成物（２．４ｇ、３０ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサンアミド）ヘキサノエート（１．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｂ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ  ２００８,２０，２６５により合成）をＭｅＯＨ（６ｍＬ）中に溶かし、かつ次に該混合物にＴＥＡ（０．８３ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を添加し、かつ室温で２０分間撹拌し、かつ次に溶剤を減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝９：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝８５：１５：１）により精製し、所望の化合物が白い粘性の泡として得られた（２．８ｇ、８４％）。
【０１６６】
【化３９】
0005886324.tif 000040
（ｃ）ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛５−［（５−｛［（５Ｓ）−５−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンチル］カルバモイル｝ペンチル）カルバモイル］ペンチル｝カルバメート（１１）の合成：
【化４０】
0005886324.tif 000041
【０１６７】
化合物１０（０．３９ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶かし、かつ次に該溶液にピペリジン（０．２ｍＬ）を室温で５分間添加し、かつ次に該反応混合物にＥｔ2Ｏ（１００ｍＬ）を添加し、かつ次にエーテル層をデカントし、かつ次に油性の粗混合物をＭｅＯＨ中に溶かし、かつ減圧下に濃縮し、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４〜１０：６：１）により精製し、所望の化合物が白い粘性の泡として得られた（０．２１ｇ、６７％）。
【０１６８】
【化４１】
0005886324.tif 000042
（ｄ）３−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−［６−（６−｛［ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサンアミド）ヘキサンアミド］ペンチル］カルバモイル｝プロピオン酸（１２）の合成：
【化４２】
0005886324.tif 000043
【０１６９】
化合物１１（２．１ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶かし、次に該溶液にＤＩＰＥＡ（０．４８ｍＬ、２．８ｍｍｏｌ）及び無水コハク酸（０．２８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を室温で１．５時間添加し、かつ次に溶剤を減圧下に蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４〜１０：６：１）により精製し、所望の化合物が白い粘性の泡として得られた（１．４ｇ、６１％）。
【０１７０】
【化４３】
0005886324.tif 000044
【０１７１】
（ｅ）６−（３−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−［６−（６−アミノヘキサンアミド）ヘキサンアミド］ペンチル］カルバモイル｝プロパンアミド）ヘキサン酸（１３）の合成：
【化４４】
0005886324.tif 000045
【０１７２】
化合物１２（１．３ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２７ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（０．６１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶かし、かつ５分後に該溶液に６−アミノカプロン酸（０．２１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を室温で添加し、かつ１．５時間撹拌し、かつ次に減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝８５：１５：１〜６５：２５：４）により精製し、所望の化合物が白い粘性の泡として得られた（１．５ｇ、定量的）。
【０１７３】
【化４５】
0005886324.tif 000046
【０１７４】
生成物（１．５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（１：１、２０ｍＬ）の混合物中に撹拌して入れ、かつ次に０℃で１０分間撹拌し、かつ次に蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ＝１０：６：１）により精製し、所望の化合物１３が白い粘性の泡として得られた（１．４ｇ、６１％）。
【０１７５】
【化４６】
0005886324.tif 000047
（ｆ）６−（３−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−［６−（６−｛［６−（｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝アミノ）ピリジン−３−イル］ホルムアミド｝ヘキサンアミド）ヘキサンアミド］ペンチル］カルバモイル｝プロパンアミド）ヘキサン酸（１４）の合成：
【化４７】
0005886324.tif 000048
【０１７６】
６−（｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝アミノ）ピリジン−３−カルボン酸（０．４３ｇ、１．７ｍｍｏｌ、Ａｂｒａｍｓ，Ｍ．Ｊ．等、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９９０，３１，２０２２により合成）、ＨＢＴＵ（０．５１ｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２３ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に室温で５分間溶かし、かつ次に該混合物にＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物１３の溶液（１．１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を添加し、かつ次に室温で４０分間撹拌し、次に減圧下に蒸発させ、かつフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１〜ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）により精製し、所望の化合物が僅かに黄色い粘性の泡として得られた（０．９６ｇ、６８％）。
【０１７７】
【化４８】
0005886324.tif 000049
（ｆ）６−（３−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−［６−（６−｛［（６−（２，２，２−トリフルオロアセトヒドラジド）ピリジン−３−イル］ホルムアミド｝ヘキサンアミド）ヘキサンアミド］ペンチル］カルバモイル｝プロパンアミド）ヘキサン酸（１５）の合成：
【化４９】
0005886324.tif 000050
【０１７８】
化合物１４（０．１６ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（４ｍＬ）中に溶かし、かつ次に室温で３０分間撹拌し、かつ次に蒸発させ、かつセファデックスＬＨ−２０を通して濾過し、かつ真空下に乾燥させた（紫色）。紫色の非晶質固体をＤＭＦ（１．５ｍＬ）中に溶かし、かつ次に該溶液にＴＦＡＡ（２１μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、かつ次に該混合物を室温で３０分間撹拌した（紫−＞黄緑）。粗混合物を減圧下に蒸発させ、かつセファデックスＬＨ−２０（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝９５：５）により精製し、所望の化合物が僅かに黄色い粘性の泡として得られた（０．１４ｇ、９０％）。
【０１７９】
【化５０】
0005886324.tif 000051
（ｇ）２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−６−（３−｛［（１Ｓ）−１−［（３−｛２−［２−（｛９−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリジン−４−イル］−５−オキソノニル｝オキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］−５−［６−（６−｛［（６−（２，２，２−トリフルオロアセトヒドラジド）ピリジン−３−イル］ホルムアミド｝ヘキサンアミド）カルバモイル｝プロパンアミド）ヘキサノエート（１６）の合成：
【化５１】
0005886324.tif 000052
【０１８０】
化合物１５（２８ｍｇ、２３μｍｏｌ）、ＮＨＳ（３．１ｍｇ、２７μｍｏｌ）及びＥＤＣｌ（５．６ｍｇ、２７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３ｍＬ）中に溶かし、かつ次に反応混合物を一晩撹拌し、かつ粗混合物を減圧下に濃縮し、かつセファデックスＬＨ−２０（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝９５：５）により精製し、所望の化合物が僅かに緑色の粘性の泡として得られた（１９ｍｇ、６２％）。
【０１８１】
【化５２】
0005886324.tif 000053
【０１８２】
例３：インスリンで獲得したリガンド−ベースのレセプター
（ａ）三官能性架橋剤Ｊｏｙ−０５−１２５（例２により得られたもの）へのリガンドカップリング
Ｊｏｙ−０５−１２５（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）５０μｇを、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）１０μｌ中のインスリン（Ｉ９２７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μｇに加え、架橋剤：リガンド＝約２：１の割合が得られた。コントロール試料には、Ｊｏｙ−０５−１２５（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）５０μｇをクエンチング溶液（ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）１０μｌ中の１０ｍＭグリシン）に添加した。反応を室温で約１時間実施した。
（ｂ）細胞の回収及び細胞表面糖タンパク質の酸化
２×１０8細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ）を５０ｍｌ試験管中に回収し、かつリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄した。引き続き、ラベリング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．５）中、１．５ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で細胞を暗所にて４℃で１５分間酸化した。細胞ペレットを５０ｍｌラベリング緩衝液で一回洗浄し、殆どのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、かつ死細胞／断片を減らした。
（ｃ）リガンド−ベースのレセプターの獲得
細胞ペレットを２つの分離管中のラベリング緩衝液中に再懸濁させた（全ての後続の工程は、それぞれリガンド及びコントロール反応に平行して実施した）。Ｊｏｙ−０５−１２５及びクエチ剤に結合したインスリンを、ラベリング緩衝液１０ｍｌ中の１０8細胞に添加し、かつ４℃で遅い回転機中で６０分間インキュベートした。獲得に際し、細胞ペレットを５０ｍｌＰＢＳで洗浄した。
（ｄ）細胞分解及びトリプシン消化
細胞ペレットを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１ｍＬ中に再懸濁させた。間接的なソニケーション（１００％振幅／０．８サイクル）により、Ｖｉａｌ  Ｔｗｅｅｔｅｒ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）中に細胞を溶かし、かつ溶解物を４℃、２５０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞核をペレットにした。上澄み液を新たな管に移し、かつ酸に不安定な界面活性剤Ｒａｐｉ  Ｇｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ）を添加して、０．１％の最終濃度にし、続いて５分間の間接的な超音波処理により、透明な溶液を得た。試料を５ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間室温で還元し、続いて１０ｍＭヨードアセトアミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でアルキル化した。トリプシン（ウシの膵臓から、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μｇを添加し、かつ試料を遅い回転機で一晩消化させた。消化の際に、ペプチド混合物を９６℃で１０分間加熱し、プロテアーゼを不活性化し、かつ未消化の粒子を１３０００ｇで１０分間の遠心分離により除去した。
（ｅ）グリコペプチドの獲得と遊離
ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  ストレプトアビジン・プラス・ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２×５０μｌをモビコール（Ｂｏｃａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで２回洗浄した。洗浄したストレプトアビジンビーズをペプチド溶液に添加し、かつ遅い回転機上で１時間インキュベートした。獲得したグリコペプチドを５Ｍの塩化ナトリウム１０ｍｌでよく洗浄し、続いて５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｌで、続いて５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１０ｍｌで、続いて１００ｍＭ炭酸ナトリウム１０ｍｌ（ｐＨ１１）で、続いて６０℃に加熱しておいた１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム１０ｍｌで洗浄した。洗浄は、Ｖａｃ−ＭａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＶａｃｕｕｍＭａｎｉｆｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結されたモビコール中で実施された。洗浄したビーズを２μｌＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）含有の炭酸水素アンモニウム４００μｌ中で、３７℃で遅い回転機中、一晩インキュベートした。インキュベーションの際に、ビーズを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム５００μｌで一度洗浄し、かつ溶出液を合わせ、かつ引き続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用にスピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）中で乾燥させた。
（ｆ）ＬＣ−ＭＳデータ獲得
ペプチドを２％アセトニトリル、０．１％ギ酸中で再可溶化し、かつクロマトグラフにより分離するためのＮａｎｏ  ＬＣ  ＵｌｔｒａＩＤ  Ｐｌｕｓ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ）系に連結したナノエレクトロスプレーイオン源を備えたＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において分析した。ペプチドをキャピラリー逆相Ｃ１８カラム上に載せた（内径７５μｍ及び床長さ１０ｃｍ；２００Ａ、３μｍＣ１８ビーズ、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）。逆相クロマトグラフィーを３００ｎｌ／分の流量で実施し、かつＢ２〜４０％の直線勾配溶出を４０分間行った。（Ａ）０．１ギ酸、２％アセトニトリル、及び（Ｂ）０．１％ギ酸、９８％アセトニトリル。ＭＳ装置をデータ依存法で運転し、それにより５つの衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳスペクトルがＦＴ−ＭＳスキャン当たりリニアイオントラップで獲得され、後者は６００００ＦＷＨＭ解像設定で獲得された。ＭＳ／ＭＳアテンプトを引き起こす全ての多価帯電イオンを含み、単一に帯電した全ての前駆イオンならびに電荷状態を決定できないイオンを除く電荷状態スクリーニングを用いた。２５０イオンカウントの閾値を超えるペプチドイオンだけがＭＳ／ＭＳ−スキャンを引き起こすことができ、引き続いて５秒間の動的排除を行った。
【０１８３】
（ｇ）データベースの検索及びペプチド／タンパク質の定量化
ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムを用いて全てのＭＳ／ＭＳスペクトルをＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（Ｖｅｒｓｉｏｎ５７．１５）に対して検索した。ＩＳＢオープンソースソフトウェアツール（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｐｈｅｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｐｈｐ））の組合せを用いてデータの統計的分析を実施し、かつ少なくとも０．８のＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔの傾向スコアを使用して、データをフィルターした。コンセンサスＮ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフを含むペプチドに関しては、ＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓＬＣ−ＭＳソフトウェア（非線形ダイナミック）を用いてラベルフリー定量データ分析を行った。自動的保持時間アライメントを手動で確認し、かつ試料の間で正確な相対定量を保証する必要のある場合には、予めグリコシル化したペプチドの特徴的概要を修正した。予めグリコシル化したペプチドの未処理の存在度を抽出及び標準化し、それぞれリガンド中とコントロール試料中で全体のグリコペプチドの特徴的強さに等しい量が得られた。
【０１８４】
データの相対量評価（図２（ａ）と（ｂ）参照）は、インスリンレセプターだけが、タンパク質レベル（ａ）とペプチドレベル（ｂ）それぞれにおけるＪｕｒｋａｔ細胞上のインスリンにとって特定のレセプターとして同定されるタンパク質であることが明らかになった。図２（ａ）と（ｂ）では、タンパク質又はペプチド存在度がｙ軸に沿って、より高い存在度のｌｏｇ１０として示されている（インスリン試料又はコントロール試料）。ｘ次元では、インスリン試料：コントロール試料の存在度の比のｌｏｇ２は、特定の富化を明らかにした（インスリンレセプタータンパク質／ペプチドは、黒く塗りつぶされたデータ要素で、他のタンパク質／ペプチドは空のデータ要素で示されている）。それにより、ペプチド存在度は、所定のグリコペプチド特徴のアイソトープ境界内のピーク面積の合計である。タンパク質存在度は、同じタンパク質から由来することが同定された全ての糖タンパク質イオンの存在度の合計である。とりわけ、インスリンレセプターは、３つの異なるペプチドで同定され、これは平均化した高いタンパク質の富化比に多くの信頼度を与える。
【０１８５】
例４：ＣＤ４４抗体でのリガンド−ベースのレセプター獲得
（ａ）三官能性架橋剤Ｊｏｙ−０５−１２５（例２により得られた）へのリガンドカップリング
Ｊｏｙ−０５−１２５（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）５０μｇをＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）５０μｌ中のモノクロナールＣＤ４４抗体（マウスＩｇＧＩ、クローンＤＢ１０５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）１００μｇに加え、約５０：１の架橋剤：リガンドの比が得られた。コントロール試料には、Ｊｏｙ−０５−１２５（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）５０μｇをクエンチング溶液（ＨＥＰＲＳ（ｐＨ８．２）５０μｌ中グリシン１０ｍＭ）に添加した。反応を室温で約１時間実施した。
（ｂ）細胞の回収及び細胞表面糖タンパク質の酸化
Ｕ−２ＯＳ細胞を６個のペトリ皿（１４０×２０ｍＭ）で培養し、約５０％の培養密度を達成し、かつＰＢＳで洗浄した。引き続き、細胞を暗所で４℃にて、ラベリング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．５）中、１．５ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５分間酸化した。１プレート当たり、細胞を２０ｍｌラベリング緩衝液で洗浄し、殆どのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、かつ死細胞／断片を減らした。
（ｃ）リガンドベースのレセプター獲得
細胞ペレットを２つの分離管内のラベリング緩衝液中で再懸濁させた（全ての後続の工程は、それぞれリガンド及びコントロール反応に平行して実施した）。Ｊｏｙ−０５−１２５に結合したＣＤ４４及びクエンチング剤を、１枚の皿当たり５ｍｌのラベリング緩衝液の入った３枚の皿にそれぞれ添加し、かつ遅い振盪器中、４℃で６０分間インキュベートした。獲得に関して、細胞を１プレート当たりＰＢＳ２０ｍｌで洗浄した。
（ｄ）細胞分解及びトリプシン消化
ＰＢＳ中１０ｍＭ  ＥＤＴＡを有するペトリ皿から細胞を外し、かつＰＢＳで一度洗浄した。細胞ペレットを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１ｍｌ中に再懸濁させた。間接的な超音波処理（１００％振幅／０．８サイクル）により、Ｖｉａｌ  Ｔｗｅｅｔｅｒ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）中に細胞を溶かし、かつ溶解物を４℃、２５０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞核をペレットにした。上澄み液を新たな管に移し、かつ酸に不安定な界面活性剤ＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ）を添加して、０．１％の最終濃度にし、続いて５分間の超音波処理により、半透明の溶液が得られた。試料を５ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間室温で還元し、続いて１０ｍＭヨードアセトアミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でアルキル化した。トリプシン（ウシの膵臓から、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μｇを添加し、かつ試料を遅い回転機で一晩消化させた。消化の際に、ペプチド混合物を９６℃で１０分間加熱し、プロテアーゼを不活性化し、かつ未消化の粒子を１３０００ｇで１０分間の遠心分離により除去した。
【０１８６】
プロトコールの残りの工程は、例３に記載したように実施した。
【０１８７】
また、データの相対定量評価（図３参照）は、ＣＤ４４細胞表面の糖タンパク質だけが、Ｕ−２ＯＳ細胞上のＣＤ４４抗体にとって特異的な標的として同定されたタンパク質であったことを明らかにした。
【０１８８】
結果を図３に記載したが、その際ペプチド存在度はｙ軸に沿って、より高い存在度のｌｏｇ１０として示されている（ＣＤ４４抗体試料：コントロール試料）。ｘ次元では、抗体試料：コントロール試料存在度の比のｌｏｇ２は、特異的な富化を明らかにしている（ＣＤ４４ペプチドは、黒く塗りつぶされたデータ要素で、他のタンパク質から誘導されるペプチドは空のデータ要素で示されている）。よって、ペプチド存在度は、所定のグリコペプチド特徴のアイソトープ境界内のピーク面積の合計である。とりわけ、ＣＤ４４を３つの異なるペプチドで同定し、これは平均化された高いタンパク質の富化比に多くの信頼度を与える。
【図１】
0005886324.tif 000059
【図２（ａ）】
0005886324.tif 000060
【図２（ｂ）】
0005886324.tif 000061
【図３】
0005886324.tif 000062