(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−バリンを生産するコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の突然変異株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ。
【請求項２】
前記突然変異株が、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びその誘導体に対して耐性を有する
請求項１に記載の突然変異株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ。
【請求項３】
前記Ｌ−イソロイシン誘導体がα−アミノ酪酸（ＡＢＡ）であり、Ｌ−バリン誘導体がα−ヒドロキシバリン（ＡＨＶ）、チアゾールアラニン（ＴＡ）及びノルバリン（ＮＶ）からなる群から選択される
請求項２に記載の変異株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ。
【請求項４】
請求項１に記載のＫＣＣＭ１１２０１Ｐを培養培地で培養するステップを含む
Ｌ−バリンの製造方法。
【請求項５】
前記ＫＣＣＭ１１２０１Ｐの培養培地からＬ−バリンを回収するステップをさらに含む
請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記培養が、培養温度２０〜４５℃、好気的条件下で１０〜１６０時間行われる
請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−バリンの生産性が向上した微生物及びそれを用いたＬ−バリンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ヒトの医薬に用いられ、特に、医薬品産業、食品産業、家畜栄養などにも用いられる。特に、分枝鎖アミノ酸（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）は、９種の必須アミノ酸のうち、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの３種を示す。ほとんどのアミノ酸が肝臓で分解されるのに対して、分枝鎖アミノ酸は主に筋組織で代謝されて運動時のエネルギー源として働く。分枝鎖アミノ酸が運動時の筋肉維持及び筋成長に重要な役割を果たすことが知られるにつれ、それらの使用量が増加してきている。特に、Ｌ−バリンは、高い還元力を有することから、母ブタの泌乳成績を向上させることに役立つことが報告されたので、Ｌ−バリンは飼料成分として用いられている。Ｌ−バリンはまた、医薬用の輸液剤およびアミノ酸複合体として、並びに健康補助品及び飲料用添加剤として用いられている。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸を生産するために用いられる微生物は、コリネフォルム細菌（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、特にコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）で表される。工業生産においてコリネフォルム細菌は重要性が高いので、この微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造方法は、継続的に改良されている。例えば、改良は、攪拌及び酸素導入に関する方法、あるいは発酵中の糖濃度のような培養培地の組成を改良することに向かっている。これらの微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させるために、選択及び変異体選択法が広く利用されている。例えば、イソロイシン誘導体であるイソロイシンヒドロキサメート（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）（非特許文献１）、Ｌ−バリン誘導体である２−チアゾールアラニン（２−ｔｈｉａｚｏｌｅ  ａｌａｎｉｎｅ）（非特許文献２）、またはロイシン誘導体であるα−アミノブチラート（α−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ）（非特許文献３）などの代謝抵抗物質に対して抵抗性を有するか、又は調節性の関連を有する代謝物質に栄養要求性であり、Ｌ−アミノ酸を生産する微生物（非特許文献４）を選択し、使用する方法などがある。
【０００４】
一方、分枝鎖アミノ酸の１つであるＬ−バリンは、微生物において、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ）から出発してアセト乳酸（ａｃｅｔｏｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ジヒドロキシイソ吉草酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ケトイソ吉草酸（ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）を経て生合成される。このような代謝中間産物は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、トランスアミナーゼＢ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  Ｂ）の触媒活性により生成される。しかし、前記酵素は、ケト酪酸（ｋｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）とピルビン酸から出発するＬ−イソロイシン生合成にも関与し、Ｌ−ロイシンもまた、代謝中間産物であるケトイソ吉草酸から２−イソプロピルリンゴ酸（２−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−イソプロピルリンゴ酸（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ケトイソカプロン酸（ｋｅｔｏｉｓｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）を経て生合成される。したがって、前述したように、分枝鎖アミノ酸、すなわちＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンの生合成経路で用いられる酵素は同じであるので、工業的な発酵により、分枝鎖アミノ酸を１種類のみ製造することは困難である。さらに、最終産物であるＬ−バリン又はその誘導体によるフィードバック阻害が生じるので、その工業的な大量生産を困難にする。
【０００５】
このような問題を解決するために、Ｌ−バリンを生産するための、Ｌ−バリン又はその誘導体に耐性を有するＬ−バリン生産微生物を開発するために、多くの研究が行われており、Ｄ，Ｌ−アミノ酪酸（Ｄ，  Ｌ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）に耐性を有する微生物を用いる方法（特許文献１）、チアゾールアラニン（ｔｈｉａｚｏｌｅ  ａｌａｎｉｎｅ）に耐性を有し、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）又はトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）のための栄養要求性を有する微生物を用いる方法（特許文献２）、アミノエチルシステイン（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）に耐性を有する微生物を用いる方法（特許文献３）、酢酸添加培地でＬ−バリンに耐性を有し、ブドウ糖添加培地でピルビン酸に感受性を有する微生物を用いる方法（特許文献４，５）、ポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）に耐性を有する微生物を用いた方法（特許文献６）などが例示される。
【０００６】
しかし、これまで開発されたＬ−バリン生産微生物は、単一の物質またはＬ−バリン又はその誘導体の限られた物質に対してのみ耐性を有するので、Ｌ−バリン生合成のフィードバック調節に作用する様々な物質に耐性を有するＬ−バリン生産微生物を開発することが依然として要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６３−１６０５９２号公報
【特許文献２】特公昭５２−０００１１６号公報
【特許文献３】特公昭５８−００２６７８号公報
【特許文献４】米国特許第５，５２１，０７４号明細書
【特許文献５】韓国特許公告第１９９５−０００５１３３号公報
【特許文献６】韓国特許公告第１９９６−００１６８７１号公報
【特許文献７】韓国特許公告第１９９０−０００７９４８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｉｓｕｍｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １１０：  ７６１−７６３
【非特許文献２】Ｔｓｕｃｈｉｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７５）  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｊａｐａｎ  ３９：  １３１９−１３２２
【非特許文献３】Ａｍｂｅ−Ｏｎｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６０：  １３８６−１３８７
【非特許文献４】Ｅｖａ  Ｒａｄｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６８  ｐ．２２４６−２２５０
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｊａｍｅｓ  Ｍ．  Ｌｅｅ，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，  ｐｐ１３８−１７６，  １９９１
【非特許文献６】Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，  １９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、他の従来の菌株より高い収率でＬ−バリンを生産することができる微生物を開発するために鋭意努力している。その結果、彼らは、グルタミン酸生産微生物から得られた突然変異株が高い収率でＬ−バリンを生産し、この変異株が複数のＬ−イソロイシン誘導体及びＬ−バリン誘導体、特にα−アミノ酪酸（ＡＢＡ）、α−ヒドロキシバリン（ＡＨＶ）、チアゾールアラニン（ＴＡ）及びノルバリン（ＮＶ）に対して耐性を有することを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、Ｌ−バリン生産コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）突然変異株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐを提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、前記突然変異株を用いてＬ−バリンを製造する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のコリネ型微生物は、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びその誘導体に対する耐性を有するため、Ｌ−バリンのフィードバック阻害を受けないので、Ｌ−バリンの生産性を高める。したがって、本発明の微生物を用いるＬ−バリンの製造方法は、高効率かつ高収率でＬ−バリンを製造することに用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の最終産物であるＬ−バリンの生合成経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一つの実施態様は、Ｌ−バリン生産用コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）突然変異株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐを提供する。
【００１５】
本明細書における「Ｌ−バリン」という用語は、化学式（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨのＬ−アミノ酸を意味し、必須アミノ酸の１つであり、構造的にＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンと共に分枝鎖アミノ酸に該当する。
【００１６】
一方、微生物におけるＬ−バリンの生合成は、図１に示す生合成経路に示されるように、ピルビン酸からアセト乳酸、ジヒドロキシイソ吉草酸、ケトイソ吉草酸を経て生合成される。また、この生合成経路では、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、トランスアミナーゼＢなどの酵素により触媒される。しかし、これらの酵素は分枝鎖アミノ酸、すなわちＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンの生合成経路で同様に用いられるので、工業的な発酵により、１種類のみの分枝鎖アミノ酸を製造することは困難である。特に、最終産物であるＬ−バリン又はその誘導体によるフィードバック阻害が生じるので、Ｌ−バリンを工業的に大量生産することは困難である。本発明の突然変異株は、この問題を解決するものであり、最終産物であるＬ−バリン又はその誘導体に対する耐性を有するので、フィードバック阻害が解放され、Ｌ−バリン生産性が向上した新規な微生物である。
【００１７】
本発明の突然変異株は、バリン又はその誘導体、イソロイシン又はその誘導体に耐性を有することが好ましい。
【００１８】
ここで、用語「誘導体」とは、微生物においてＬ−バリンの生産性を低減させるように、最終産物であるＬ−バリンの生合成に関するフィードバック阻害を誘発する生産性公知の化合物を意味し、Ｌ−イソロイシンの誘導体の例としては、α−アミノ酪酸およびＬ−バリンの誘導体であるα−ヒドロキシバリン、チアゾールアラニン及びノルバリンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記突然変異株は、バリン、α−アミノ酪酸、α−ヒドロキシバリン、チアゾールアラニン及びノルバリンからなる群から選択される少なくとも１つの物質に耐性を有することが好ましい。バリン、α−アミノ酪酸、α−ヒドロキシバリン、チアゾールアラニン及びノルバリンの全てに耐性を有することが最も好ましい。
【００１９】
一般に、細胞内に所定濃度以上のＬ−バリンが蓄積されると、Ｌ−バリン生合成が阻害されることが知られている。よって、前記誘導体に対して耐性を有する菌株は、Ｌ−バリンによる阻害を解放するので、高濃度であってもＬ−バリンを生成できる。本発明の一実施態様によれば、本発明者らは、前記誘導体を用いることにより高濃度のＬ−バリン生産株を選別する方法を用いた。また、Ｌ−イソロイシンはＬ−バリンと同じ生合成経路を経て生成されるアミノ酸であるので、高濃度でＬ−バリンを生産できる菌株は、菌株がイソロイシン誘導体に対する耐性を得たかどうかを分析することにより、選別することができる。よって、イソロイシン誘導体もまた、高濃度でＬ−バリンを生産することができる株の選別に用いられる。
【００２０】
本発明によれば、Ｌ−バリンの生産性が向上した微生物突然変異株は、突然変異により、親株から選択される。ここで、微生物の突然変異は、その技術分野において周知の様々な手段により誘発することができ、物理的又は化学的な突然変異誘発要因のいずれか一つの方法を用いてもよい。本発明に適した化学的な突然変異誘発要因の例としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，  ＮＴＧ）、ジエポキシブタン、エチルメタンスルホネート、マスタード化合物、ヒドラジン及び亜硝酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、物理的な突然変異誘発要因の例としては、紫外線及びガンマ放射線が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
突然変異誘発の際に、親株は特定の大きさの生存する個体群を残すに十分な程度の突然変異誘発因子に作用させる。前記大きさは、突然変異誘発因子の種類によって変動し、生存する個体群内で所定の殺菌率を誘発する突然変異の総量に依存する。例えば、ＮＴＧの望ましい殺菌率は、初期個体群の約１０％〜５０％を残すべきである。亜硝酸による突然変異誘発では初期個体群の約０．０１％〜０．１％を残すべきであり、紫外線による突然変異誘発は約１．０％を残すべきである。本発明の一実施態様によれば、Ｌ−バリンの生産性が向上した微生物変異株を製作するために、ＮＴＧを親株の突然変異を誘発するために用いた。
【００２２】
本発明の一実施例においては、Ｌ−バリンの生産性が向上した変異株を製作するために、Ｌ−グルタミン酸を生産するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６６１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ  １０６６１，  特許文献７）を親株として用いたが、これはＬ−バリン生合成の際にグルタミン酸１分子を要求する性質による。そこで、グルタミン酸を生産するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６６１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ  １０６６１）を親株としてランダム突然変異を行い、次いでイソロイシン誘導体であるα−アミノ酪酸（ＡＢＡ）、バリン誘導体であるα−ヒドロキシバリン（ＡＨＶ）、チアゾールアラニン（ＴＡ）及びノルバリン（ＮＶ）が共に添加された最小培地に塗抹した。その後、誘導体それぞれに対して２０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ及び５０ｍＭの濃度で耐性を有する共通耐性変異株を選別してコリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０８−００７２と命名した。また、前記共通耐性を有する変異株のＬ−バリンの生産量は、親株に比べて４倍以上増加したことが確認された（表１参照）。前記コリネバクテリウムグルタミカム突然変異株ＣＡ０８−００７２菌株を２０１１年７月１３日付けで韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地所在の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１２０１Ｐが付与された。
【００２３】
また、本発明の他の実施態様は、前記突然変異株を培地で培養するステップを含むＬ−バリンの製造方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、Ｌ−バリンの製造方法は、前記突然変異株を培養した培養液からＬ−バリンを回収するステップをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本明細書において用語「培養」とは、微生物を人工的に制御した条件下で生育させることを意味する。本発明におけて、Ｌ−バリンを生産するためにコリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０８−００７２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＡ０８−００７２，  ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ）変異株を培養する方法には、当業界に広く知られているコリネバクテリウムグルタミカムの培養方法を用いることができる。具体的には、前記培養方法の例として、バッチ培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）及び流加バッチ培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を含むが、これらに限定されるものではない。これらの様々な方法は、例えば、非特許文献５などに開示されている。
【００２６】
培養に用いられる培地は、特定菌株の培養のための要件を満たさなければならない。コリネバクテリア菌株の培養培地は公知である（例えば、非特許文献６）。可能な炭素源としては、糖及び炭水化物（グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなど）、油脂類（大豆油、ヒマワリ油、落花生油、ココナッツ油など）、脂肪酸類（パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸など）、アルコール類（グリセリン、エタノールなど）、有機酸類（酢酸など）などが挙げられる。これらの物質は、単独で用いてもよく、混合物として用いてもよい。可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、大豆粉及び尿素、又は無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などが挙げられる。窒素源は、単独で用いてもよく、混合物として用いてもよい。可能なリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有しなければならない。前記物質以外にも、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に適切な前駆体を添加してもよい。前述した原料は、バッチ培養または培養過程における連続培養の培養培地適切に添加してもよい。
【００２７】
培養液のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸、硫酸などの酸性化合物を適切に添加することで、調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養液内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養培地の温度は、通常２０℃〜４５℃である。培養は、Ｌ−バリンの生成量が所望のレベルに達するまで続ければよい。この目的は通常１０〜１６０時間内で達成される。Ｌ−バリンは、培養培地中に排出されてもよく、細胞内に含まれていてもよい。
【００２８】
本発明のＬ−バリンの製造方法は、細胞又は培養培地からＬ−バリンを回収するステップを含む。細胞又は培養培地からＬ−バリンを回収する方法は、例えば遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、晶析およびＨＰＬＣなどの当業界で知られている従来の方法により行ってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施態様によれば、培養培地を低速で遠心分離し、バイオマスを除去して得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離した。
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：人工変異法による突然変異株の選別
Ｌ−バリンの生産性が向上した微生物突然変異株を得るために、下記の方法を用いて微生物の突然変異を誘導した。
【００３１】
具体的には、活性化培地で１６時間培養し、活性化したグルタミン酸を生産する親株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６６１（特許文献７）を１２１℃で１５分間滅菌した種培地で１４時間培養した。次に、培養培地５ｍｌを回収し、１００ｍＭのクエン酸緩衝液で洗浄した。それに、最終濃度が２００ｍｇ／ＬとなるようにＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を添加した。２０分間経過後に、培地を１００ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄した。ＮＴＧで処理した菌株を最小培地に塗抹して死亡率を測定した。その結果、死亡率は８５％であった。
【００３２】
α−アミノ酪酸（ＡＢＡ）、α−ヒドロキシバリン（ＡＨＶ）、チアゾールアラニン（ＴＡ）及びノルバリン（ＮＶ）に対する共通耐性を有する突然変異株を得るために、それぞれの最終濃度が２０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ及び５０ｍＭとなるようにＡＢＡ、ＡＨＶ、ＴＡ及びＮＶを含む最小培地に、ＮＴＧで処理した菌株を塗抹した。次に、菌株を３０℃で５日間培養して、ＡＢＡ、ＡＨＶ、ＴＡ及びＮＶの共通耐性を有する突然変異株を得た。
【００３３】
得られた突然変異株は、コリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０８−００７２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＡ０８−００７２）と命名し、２０１１年７月１３日付けで韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１２０１Ｐが付与された。
【００３４】
実施例１及び２で用いた培地の組成は下記の通りである。
＜活性化培地＞
牛肉エキス  １％，ポリペプトン１  ％，塩化ナトリウム  ０．５％，酵母エキス  １％，寒天  ２％，ｐＨ７．２
＜種培地＞
ブドウ糖  ５％，バクトペプトン  １％，塩化ナトリウム  ０．２５％，酵母エキス１  ％，尿素  ０．４％，ｐＨ７．２
＜最小培地＞
ブドウ糖  １．０％，硫酸アンモニウム  ０．４％，硫酸マグネシウム  ０．０４％，リン酸二水素カリウム  ０．１％，尿素  ０．１％，チアミン  ０．００１％，ビオチン  ２００μｇ／Ｌ，寒天  ２％，ｐＨ７．０
【００３５】
実施例２：  Ｌ−バリンを生産する突然変異株のＬ−バリン生産性の検査
実施例１で得られた高濃度のＡＢＡ、ＡＨＶ、ＴＡ及びＮＶに共通耐性を有する突然変異株であるコリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０８−００７２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＡ０８−００７２，  ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ）を、そのＬ−バリン生産性を調べるために、下記の方法で培養した。
【００３６】
親株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６６１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ  １０６６１）及び前記突然変異株を、種培養液を得るために、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに親株を植え付け、３０℃、２０時間、２００ｒｐｍで振盪しながら培養して種培養液を得た。その後、それぞれの種培養液１ｍｌを、下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに植え付け、３０℃、７２時間、２００ｒｐｍで振盪しながら培養してＬ−バリンを製造した。
【００３７】
本実施例２で用いた生産培地の組成は下記の通りである。
＜生産培地＞
ブドウ糖  ５％，硫酸アンモニウム  ２％，リン酸二水素カリウム  ０．１％，硫酸マグネシウム７水和物  ０．０５％，ＣＳＬ（コーンスティープリカー）  ２．０％，ビオチン  ２００μｇ／Ｌ，ｐＨ７．２
【００３８】
培養終了後、液体高速クロマトグラフィーを用いてＬ−バリンの生産量を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のＬ−バリン濃度を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0005852738.tif 000002
【００４０】
表１に示すように、親株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６６１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ  １０６６１）は０．５ｇ／ＬのＬ−バリンを生産したが、本発明による突然変異株のコリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０８−００７２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＡ０８−００７２）は２．１ｇ／ＬのＬ−バリンを生産しており、親株に比べてＬ−バリン生産性が約４倍以上向上したことが確認された。
【００４１】
前記結果は、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びそれらの誘導体に対する耐性を有する突然変異株はフィードバック阻害を受けないので、Ｌ−バリンを高効率及び高収率で生産できることを意味した。
【図１】
0005852738.tif 000003