(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、
該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、
該オリゴヌクレオチドが、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得、該ヒトＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と相補的であり、
該架橋構造が、−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−、または−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し、そして
該オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、１３〜２５塩基である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ヒトＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列：
配列番号３で示される塩基配列；配列番号４で示される塩基配列；配列番号５で示される塩基配列；配列番号６で示される塩基配列；配列番号７で示される塩基配列；配列番号８で示される塩基配列；配列番号９で示される塩基配列；配列番号１０で示される塩基配列；配列番号１１で示される塩基配列；配列番号１２で示される塩基配列；配列番号１３で示される塩基配列；配列番号１４で示される塩基配列；配列番号１５で示される塩基配列；配列番号１６で示される塩基配列；配列番号１７で示される塩基配列；配列番号１８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、１３〜２０塩基である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの５’−末端または３’−末端に、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも１つが結合している、請求項１から３のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤。
【請求項６】
生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤である、請求項５に記載の治療剤。
【請求項７】
前記生体吸収性材料が、アテロコラーゲンまたはペプチドゲルである、請求項６に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＤＬ受容体の遺伝子に変異を有する家族性高コレステロール血症は、５００人に１人（国内で２５万人）の割合で発症する疾患であり、遺伝性代謝疾患の中で頻度が最も高い。患者の血清総コレステロール値は２３０〜５００ｍｇ／ｄＬを示し（健常者：２００ｍｇ／ｄＬ以下）、皮膚および腱の黄色腫、若年性動脈硬化症による冠動脈疾患などの症状がみられる。患者の平均寿命は男性で５４歳、女性で６９歳と全人口の平均寿命を大きく下回る。代表的な治療法としては、ＬＤＬアフェレーシス治療が挙げられるが、この治療法は患者に多大な負担を強いることが問題である。薬物療法としては、スタチンの投与が挙げられるが、家族性高コレステロール血症に対しては、スタチンは十分な効果を示さないという問題がある。【０００３】
一方、高脂血症は、癌に次ぐ死因の心筋梗塞や脳卒中の原因となる生活習慣病である。【０００４】
これらの高コレステロール血症に対する治療開発において、最近では、ＬＤＬ（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙリポタンパク質）受容体の代謝を調節しているＰＣＳＫ９を標的とした戦略が注目されている（非特許文献１）。ＬＤＬ受容体を分解するＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制することにより、ＬＤＬ受容体の発現量が上昇し、ＬＤＬの細胞内への取り込みや代謝を促進させることによって血中ＬＤＬ濃度を低下させる狙いがある。核酸医薬の一手法であるアンチセンス法を利用した治療実験も進められている。【０００５】
従来の核酸医薬は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞系においては有効であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏでは有効でないものがほとんどであった。その原因としては、体内に投与するとすぐに分解されること、標的の遺伝子への親和性、特異性が低いことなどが考えられるＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制する手法としてアンチセンス法が注目されている。【０００６】
非特許文献２に記載の２’ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾型オリゴヌクレオチドは、生体内での安定性は非常に優れているが、標的ＲＮＡとの結合親和性が低く、薬効の発揮には非常に高用量が必要であるという問題がある。非特許文献１に記載のＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含むオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡとの結合親和性の面でより優れており、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９のｍＲＮＡを抑制する効果も示されているが、生体内での安定性、安全性などにおいて改善の余地がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】N. Guptaら、PLoS ONE、2010年、第5巻、e10682
【非特許文献２】M. J. Grahamら、J. Lipid. Res.、2007年、第48巻、p. 763
【非特許文献３】S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1997年、第38巻、p. 8735-8738
【非特許文献４】S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1998年、第39巻、p. 5401-5404
【非特許文献５】S. K. Singhら、Chem. Commun.、1998年、第4巻、p. 455-456
【非特許文献６】A. A. Koshkinら、Tetrahedron、1998年、第54巻、p. 3607-3630
【非特許文献７】S.  Obikaら、Bioorg. Med. Chem.、2001年、第9巻、p. 1001-1011
【非特許文献８】S. M. A. Rahmanら、Angew. Chem. Int. Ed.、2007年、第46巻、p. 4306-4309
【非特許文献９】S. M. A. Rahmanら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids、2007年、第26巻、p. 1625-1628
【非特許文献１０】K. Miyashitaら、Chem. Commun.、2007年、第36巻、p. 3765-3767
【非特許文献１１】S. M. A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.、2008年、第130巻、p. 4886-4896
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＰＣＳＫ９遺伝子の特定の標的配列と結合し得るオリゴヌクレオチドに架橋型人工核酸を含有させることによって、ＰＣＳＫ９遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供できることを見出し、本発明を完成させた。さらに、生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤とすることにより薬剤を低用量化できることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
本発明は、糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供し、該糖修飾ヌクレオシドは、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドは、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得る。【００１１】
１つの実施態様では、上記ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、以下の塩基配列：配列番号３で示される塩基配列；配列番号４で示される塩基配列；配列番号５で示される塩基配列；配列番号６で示される塩基配列；配列番号７で示される塩基配列；配列番号８で示される塩基配列；配列番号９で示される塩基配列；配列番号１０で示される塩基配列；配列番号１１で示される塩基配列；配列番号１２で示される塩基配列；配列番号１３で示される塩基配列；配列番号１４で示される塩基配列；配列番号１５で示される塩基配列；配列番号１６で示される塩基配列；配列番号１７で示される塩基配列；配列番号１８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである。【００１２】
１つの実施態様では、上記架橋構造は、−ＣＨ２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲ１−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−ＮＲ１−Ｏ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す。【００１３】
１つの実施態様では、上記架橋構造は、−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−、または−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。【００１４】
１つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、１０〜２５塩基である。【００１５】
１つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの５’−末端または３’−末端に、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも１つが結合している。【００１６】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤を提供する。【００１７】
１つの実施態様では、上記治療剤は、生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤である。【００１８】
１つの実施態様では、上記生体吸収性材料は、アテロコラーゲンまたはペプチドゲルである。
【発明の効果】
【００１９】
本研究によれば、ＰＣＳＫ９遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＰＣＳＫ９の［γ−３２Ｐ］標識ｍＲＮＡとＤＮＡ−オリゴヌクレオチドとからなる２本鎖核酸のＲＮａｓｅＨ感受性を解析した結果を示す写真である。
【図２】ＰＣＳＫ９の［γ−３２Ｐ］標識ｍＲＮＡとＢＮＡ−オリゴヌクレオチドとからなる２本鎖核酸のＲＮａｓｅＨ感受性を解析した結果を示す写真である。
【図３】ＰＣＳＫ９の［γ−３２Ｐ］標識ｍＲＮＡとＢＮＡ−オリゴヌクレオチドまたはＮＣ−オリゴヌクレオチドとからなる２本鎖核酸のＲＮａｓｅＨ感受性を解析した結果を示す写真である。
【図４】ＰＣＳＫ９の［γ−３２Ｐ］標識ｍＲＮＡとＮＣ−オリゴヌクレオチドとからなる２本鎖核酸のＲＮａｓｅＨ感受性を解析した結果を示す写真である。
【図５】ＰＣＳＫ９の［γ−３２Ｐ］標識ｍＲＮＡとＢＮＡ−オリゴヌクレオチドとからなる２本鎖核酸のＲＮａｓｅＨ感受性を解析した結果を示す写真である。
【図６Ａ】ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドで処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図６Ｂ】ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドで処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図６Ｃ】ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドで処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図７】ＮＣ−オリゴヌクレオチドで処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図８】ＮＣ−オリゴヌクレオチドで処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図９】ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド（１３塩基）で処理したＨｕｈ−７細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１０】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡまたはＰＣＳＫ９−１−ＮＣのマウス腹腔内６週間投与後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１１】ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのマウス腹腔内３週間投与後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１２】ＰＣＳ９−１−ＢＮＡまたはＰＣＳ９−１−ＮＣのマウス腹腔内６週間投与後の血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を示すグラフである。
【図１３】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡまたはＰＣＳＫ９−１−ＮＣのマウス腹腔内６週間投与後の肝臓でのＬＤＬ受容体タンパク質の発現量を示すグラフである。
【図１４】ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣまたはＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡのマウス腹腔内３週間投与後の肝臓の病理写真（ＨＥ染色、４０倍）である。
【図１５】ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのマウス腹腔内２週間投与後の血清ＡＳＴ値（Ａ）、血清ＡＬＴ値（Ｂ）および血清ＢＵＮ値（Ｃ）を示すグラフである。
【図１６】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウス腹腔内６週間投与後の血清コレステロール値（画分別）を示すグラフである。
【図１７】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウス腹腔内６週間投与後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１８】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウス腹腔内６週間投与後の血清ＡＳＴ値（Ａ）、血清ＡＬＴ値（Ｂ）および血清ＢＵＮ値（Ｃ）を示すグラフである。
【図１９】ＰＣＳＫ９−１−ＮＣのマウス腹腔内４週間投与後の血清コレステロール値（画分別）を示すグラフである。
【図２０】ＰＣＳＫ９−１−ＮＣのマウス腹腔内４週間投与後の肝ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図２１】ＰＣＳＫ９−１−ＮＣのマウス腹腔内６週間投与後の血清ＡＳＴ値（Ａ）、血清ＡＬＴ値（Ｂ）および血清ＢＵＮ値（Ｃ）を示すグラフである。
【図２２】ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド、ＮＣ−オリゴヌクレオチドまたはＣＯＮ−オリゴヌクレオチドのマウス尾静脈投与前後の血清総コレステロール値を示すグラフである。
【図２３】ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐのモルモット腹腔内３日間投与後の血清総コレステロール値の経時変化を示すグラフである。
【図２４】ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐおよび／またはロバスタチンのモルモット腹腔内投与後の血清総コレステロール値の低下を示すグラフである。
【図２５】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウス腹腔内単回投与後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図２６】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウス腹腔内連続投与後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図２７】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの投与量および投与後採血までの経過日数ごとの血清総コレステロール値の比（連続投与／単回投与）を示すグラフである。
【図２８】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ゲルのマウス腹腔内投与３日後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図２９】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ゲルのマウス腹腔内投与３日後の血清総コレステロール値を示すグラフである。
【図３０】ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ゲルのマウス腹腔内投与３日後および１４日後のＶＬＤＬ画分中コレステロール値を示すグラフである。
【図３１】ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルのマウス腹腔内または皮下投与３日後の肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図３２】ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルのマウス皮下投与後に残存するＡｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを経時的にＩｎ  ｖｉｖｏイメージャーにて解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００２２】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。
【００２３】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。
【００２４】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の任意の芳香族炭化水素および環構造にヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。
【００３０】
本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
【００３１】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、核酸塩基および糖を含むグリコシルアミンをいう。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに、擬似塩基および／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、核酸塩基と、糖にリン酸基が共有結合された糖とを含むグリコソミン（ｇｌｙｃｏｓｏｍｉｎｅ）をいう。ヌクレオチドは、任意の種々の置換基で修飾され得る。
【００３３】
本明細書において、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドをいう。デオキシリボヌクレオチドは任意の種々の置換基で修飾され得る。
【００３４】
本明細書において、用語「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。
【００３５】
本明細書において、用語「リボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドをいう。リボヌクレオチドは、任意の種々の置換基で修飾され得る。
【００３６】
本明細書において、用語「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、リボヌクレオチドを含む核酸をいう。
【００３７】
本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。好適には、糖部分が修飾された糖修飾ヌクレオシドが挙げられる。
【００３８】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」をいう。「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体も含む。そのような誘導体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
【００３９】
以下、本発明について詳述する。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含む。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、互いに、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更する。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更する。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得る。
【００４３】
ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔｍ）は特に限定されない。例えば、２本鎖核酸を形成する異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸は、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はない。
【００４４】
ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ_１７４９３６；コーディング領域、２０７９塩基）を含み、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＰＣＳＫ９遺伝子はＬＤＬ受容体の分解に関与する。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドが結合し得るヒトＰＣＳＫ９遺伝子の領域としては、好適には以下の塩基配列：
配列番号３で示される塩基配列；配列番号４で示される塩基配列；配列番号５で示される塩基配列；配列番号６で示される塩基配列；配列番号７で示される塩基配列；配列番号８で示される塩基配列；配列番号９で示される塩基配列；配列番号１０で示される塩基配列；配列番号１１で示される塩基配列；配列番号１２で示される塩基配列；配列番号１３で示される塩基配列；配列番号１４で示される塩基配列；配列番号１５で示される塩基配列；配列番号１６で示される塩基配列；配列番号１７で示される塩基配列；配列番号１８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなる領域である。さらに好適には、これらの塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドが含む糖修飾ヌクレオシドは、４’位と２’位との間に架橋構造を有する。
【００４７】
上記架橋構造の１つは、−ＣＨ２−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−Ｏ−で表される。このような架橋構造を、以下、ＢＮＡという場合がある。
【００４８】
ＢＮＡとしては、例えば、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＮＡヌクレオシド（モノマー）またはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、非特許文献３〜７に記載の方法により合成することができる。
【００４９】
上記架橋構造の他の１つは、−ＣＨ２−ＮＲ１−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−ＮＲ１−Ｏ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す。このような架橋構造を、以下、ＮＣという場合がある。
【００５０】
ＮＣとしては、例えば、オキシアミノ（４’−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−２’）、Ｎ−メチルオキシアミノ（４’−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＣヌクレオシド（モノマー）またはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、非特許文献８〜１１に記載の方法により合成することができる。
【００５１】
上記架橋構造の他の１つは、−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−、または−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。このような架橋構造を、以下、ＣＯＮという場合がある。
【００５２】
ＣＯＮとしては、例えば、無置換アミド（４’−ＣＯ−ＮＨ−２’）、Ｎ−メチルアミド（４’−ＣＯ−ＮＣＨ３−２’）、アセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−２’）、Ｎ−メチルアセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＣＨ３−２’）、Ｎ−オキシアセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｏ−２’）、Ｎ−メチル−Ｎ−オキシアセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＣＨ３−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＯＮヌクレオシド（モノマー）またはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の実施例に記載の方法により合成することができる。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、特に限定されないが、好適には１０〜２５塩基である。より好適には１３〜２０塩基である。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドの５’−末端または３’−末端の構造は、特に限定されない。例えば、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも１つが結合している。好適には５’−末端または３’−末端にコレステロールが結合している。コレステロールの結合により、オリゴヌクレオチドの生体内安定性の向上や標的臓器である肝臓への取り込み向上が期待できる。５’−末端または３’−末端にコレステロールを結合させる方法は、特に限定されない。例えば、コレステロールをアミダイト体として導入する方法、オリゴヌクレオチド合成の固相担体として導入する方法、オリゴヌクレオチドを合成した後にコンジュゲート化する方法が挙げられる。
【００５５】
糖修飾ヌクレオシド、特に糖修飾がＣＯＮである糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、上述のように、４’位と２’位との間の架橋構造、特にアミド結合を含む架橋構造により固定されているため、各種ヌクレアーゼにより分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。例えば、ｍＲＮＡと安定な２本鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害し（アンチセンス法）、あるいはゲノム中の２本鎖ＤＮＡとの間で３本鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。また、アミド結合を含む架橋構造は、生体適合性が高いことも期待され、さらにタンパク質などの生体成分を認識するためのアプタマーとしての機能も期待できる。
【００５６】
これらのことから、本発明のオリゴヌクレオチドは、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス核酸）としての有用性が期待される。
【００５７】
特に、アンチセンス法では、標的のヒトＰＣＳＫ９のｍＲＮＡに対する結合親和性および生体内ヌクレアーゼに対する耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、１本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ２本鎖に近い形と、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖やＲＮＡ２本鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。１本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と２本鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖部が予め２本鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と２本鎖を形成しやすく、安定に存在することができる。また、核酸２本鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。本発明のアミド結合を含む架橋構造は、親水性が高いため、より安定化され得る。さらに、糖部架橋のアミド結合は、生体酵素に認識されにくいため、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性に大きく寄与し得る。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス核酸として、ヒトＰＣＳＫ９のｍＲＮＡと結合して、ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制し得る。ヒトヒトＰＣＳＫ９の遺伝子発現の抑制により、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量が上昇し、ＬＤＬの細胞内への取り込みや代謝が促進することによって血中ＬＤＬ濃度が低下し得る。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドは、脂質異常症治療剤としての効果を奏する。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤とすることができる。好適には、徐放剤とすることができる。徐放剤の担体としては、特に限定されないが、好適には、生体吸収性材料である。生体吸収性材料としては、特に限定されず、例えば、アテロコラーゲン、ペプチドゲル、ヒアルロン酸ゲル、フィブリン糊、アルギン酸ゲル、ポリα−ヒドロキシ酸が挙げられる。好適には、アテロコラーゲン、ペプチドゲルである。本発明のオリゴヌクレオチドと生体吸収性材料とを、例えば、混練することにより、叙放剤が得られる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明が以下の実施例に限定されるものでないことは言うまでもない。【００６１】
（実施例１）ＣＯＮモノマー（アミダイト体）の合成
ヌクレオシド類縁体：２’−アミノ−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソメチレンチミジン（化合物１６）の合成【００６２】
【化１】
0005875006.tif 000002
【００６３】
（１）化合物２の合成【００６４】
【化２】
0005875006.tif 000003
【００６５】
窒素気流下、化合物１（１４．７ｇ，３６．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（８０ｍＬ）にトリエチルアミン（１５．１ｍＬ，１１０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下ジメチルアミノピリジン（０．９０ｇ，７．３６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（１５．１ｍＬ，５８．９ｍｍｏｌ）を加えて還流した。なお、化合物１は、A. A. Koshkinら、Tetrahedron、1998年、第54巻、p. 3607-3630およびS. K. Singhら、Chem. Commun.、1998年、p. 455-456に従って調製し得る。２０時間後、水を加え、塩化メチレンで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。得られた粗成積体をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１(v/v)）により精製し、化合物２（２０．４ｇ：収率８５．９％）を油状物質として得た。【００６６】
得られた化合物２の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 ＋84.8 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 1457, 1372, 1105, 1025cm-1；1H-NMR (270MHz, CDCl3)：δ1.03 (9H, s), 1.29 (6H, s), 3.62, 3.73 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.03, 4.08 (2H, AB, J = 11.3 Hz), 4.20 (1H, d, J = 5.1 Hz), 4.45, 4.55 (2H, AB, J = 11.9 Hz), 4.49, 4.66 (2H, AB, J = 12.2 Hz), 4.58 (1H, dd, J = 5.1 Hz, 4.1 Hz), 5.76 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.21-7.70 (20H, m)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ19.9, 26.9, 27.2, 27.5, 65.3, 72.6, 73.0, 74.2, 78.8, 80.2, 88.2, 104.8, 113.8, 128.2, 128.2, 128.3, 128.3, 128.8, 128.9, 130.1, 133.9, 134.1, 135.4, 136.3, 136.4, 138.5, 138.7；MS(FAB)：m/z 661 (MNa+)：計算値 C39H46O6Si：C, 73.32; H, 7.26，実測値 C, 73.44; H, 7.32。【００６７】
（２）化合物４の合成【００６８】
【化３】
0005875006.tif 000004
【００６９】
上記（１）で得た化合物２（１．００ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）の０．１％(v/v)濃硫酸酢酸溶液（１．１１ｍＬ）に、無水硫酸（１．７８ｍＬ，１８．８ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。３．５時間後、飽和重曹水に反応液を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物３の粗成積体（１．０７ｇ）を油状物質として得、続くチミン導入に用いた。【００７０】
窒素気流下、化合物３の粗成積体のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）にチミン（２９７ｍｇ，２．３６ｍｍｏｌ）を加え、４０℃の油浴中で溶解させた後、室温にてＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（１．３４ｍＬ，５．５０ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．２８ｍＬ，１．５７ｍｍｏｌ）を加えて１時間還流撹拌した。飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１→１：１(v/v)）により精製し、化合物４（３６７ｍｇ：収率４９％）を白色アモルファスとして得た。【００７１】
得られた化合物４の物性データは、以下のとおりであった：融点：55〜59℃； [α]D24 -11.7 (c 0.800, CHCl3)；IR (KBr)：1747, 1693, 1232, 1113 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.04 (9H, s), 1.52 (3H, s), 1.96 (3H, s), 3.71, 3.76 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.94, (2H, AB, J = 10.8 Hz), 4.41 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.54, 4.58 (2H, AB, J = 12.6 Hz), 4.54, 4.58 (2H, AB, J = 12.6 Hz), 5.38 (1H, t, J = 6.0 Hz), 6.16 (1H, d, J = 6.0 Hz), 7.18-7.63 (20H, m), 7.87 (1H,s)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ12.0, 19.2, 20.6, 26.9, 63.8, 72.2, 73.7, 74.6, 74.9, 77.7, 85.5, 87.9, 111.3, 127.6, 127.7, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.6, 129.7, 129.9, 132.6, 132.9, 135.5, 135.7, 135.7, 137.2, 137.5, 150.4, 163.6, 170.2；MS(FAB)：m/z 749 (MH+), 計算値 C43H48N2O8Si: C, 68.96; H, 6.46; N, 3.74. 実測値 C, 68.92; H, 6.45; N, 3.74。【００７２】
（３）化合物５の合成【００７３】
【化４】
0005875006.tif 000005
【００７４】
上記（２）で得た化合物４（３２６ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２．４ｍＬ）に４０％(v/v)メチルアミン溶液（１．１ｍＬ，１３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１(v/v)）により精製し、化合物５（３１２ｍｇ：収率１００％）を白色アモルファスとして得た。【００７５】
得られた化合物５の物性データは、以下のとおりであった：融点：61〜63℃；[α]D25 -12.2 (c 0.750, CHCl3)；IR (KBr): 3403, 3175, 1688, 1468, 1272, 1113 cm-1；1H-NMR (270MHz, CDCl3)：δ1.06 (9H, s), 1.60 (3H, s), 3.54, 3.63 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.64 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.73, 3.83 (2H, AB, J =10.5 Hz), 4.31 (1H, d, J = 4.9 Hz,) 4.41 (1H, ddd, J = 4.9 Hz, 4.9 Hz, 10.8 Hz), 4.50 (2H,s), 4.67, 4.73 (2H, AB, J = 11.1 Hz), 5.95 (1H, d, J = 4.9 Hz), 7.21-7.66 (20H, m), 8.12 (1H,s)；13C-NMR (67.80MHz, CDCl3)：δ12.1, 19.1, 26.8, 64.2, 72.2, 73.8, 74.2, 74.5, 77.2, 78.5, 88.1, 90.9, 110.9, 127.7, 127.8, 127.9, 128.0, 128.1, 128.2, 128.6, 130.0, 132.2, 132.2, 135.6, 135.7, 136.5, 137.2, 150.3, 163.4；MS(FAB): m/z 707 (MH+). 計算値 C41H46N2O7Si: C, 69.66; H, 6.56; N, 3.96. 実測値 C, 69.59; H, 6.59; N, 3.93。【００７６】
（４）化合物６の合成【００７７】
【化５】
0005875006.tif 000006
【００７８】
窒素気流下、上記（３）で得た化合物５（２６２ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７ｍＬ）に、ジメチルアミノピリジン（１８１ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホニルクロリド（０．１２ｍＬ，１．１１ｍｍｏｌ）を加え、緩やかに室温条件とした後、１時間撹拌した。飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物６（２４８ｍｇ：収率９７％）を白色アモルファスとして得た。【００７９】
得られた化合物６の物性データは、以下のとおりであった：融点：51〜54℃；[α]D26 -33.5 (c 1.000, CHCl3)；IR (KBr): 1667, 1650, 1563, 1482, 1112 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.03 (9H, s), 1.99 (3H, s), 3.29, 3.34 (2H, AB, J = 10.8 Hz), 3.68, 3.82 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.31 (1H, d, J =3.9 Hz), 4.32, 4.38 (2H, AB, J =12 Hz), 4.60, 4.81 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 5.50 (1H, dd, J =6.3, 3.9 Hz), 6.23 (1H, d, J = 6.3 Hz), 7.08-7.66 (21H, m)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ14.0, 18.9, 26.7, 64.0, 69.4, 73.4, 84.0, 87.1, 88.7, 89.9, 119.0, 127.4, 127.6, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.4, 128.5, 129.8, 129.8, 130.1, 131.9, 132.3, 135.3, 135.5, 136.4, 137.0, 159.2, 172.3；MS(FAB): m/z 689 (MH+), 計算値 C41H44N2O6Si: C, 71.48; H, 6.44; N, 4.07. 実測値 C, 71.38; H, 6.49; N, 4.08。【００８０】
（５）化合物７の合成【００８１】
【化６】
0005875006.tif 000007
【００８２】
上記（４）で得た化合物６（５１０ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１１ｍＬ）に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１．９０ｍＬ）を加え、室温にて１１．５時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液で中和後、溶媒留去ジクロロメタンで抽出し、飽和重曹水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１(v/v)）により精製し、化合物７（５２４ｍｇ：収率１００％）を白色アモルファスとして得た。【００８３】
得られた化合物７の物性データは、以下のとおりであった：融点：67〜70℃；[α]D26 +24.5 (c 0.840, CHCl3)；IR (KBr): 3347, 3184, 1690, 1471 cm-1；1H-NMR (270MHz, CDCl3)：δ1.02 (9H, s), 1.65 (3H, s), 3.48, 3.70 (2H, AB, J = 10.3 Hz), 3.50 (1H, d, J = 7.0 Hz), 3.62, 3.76 (2H, AB, J =10.8 Hz), 4.22 (1H, d, J = 7.0 Hz,) 4.51, 4.78 (2H, AB, J = 7.6 Hz), 4.54 (1H, d, J =11.6 Hz), 4.69 (1H, ddd, J = 5.1, 7.0, 7.6 Hz), 6.15 (1H, d, J = 5.1 Hz), 7.29-7.64 (20H, m), 8.10 (1H,s)；13C-NMR (67.80MHz, CDCl3)：δ12.0, 18.8, 26.5, 63.9, 69.7, 72.6, 73.6, 75.3, 81.9, 85.3, 85.5, 109.5, 127.5, 127.6, 127.8, 128.0, 128.2, 128.5, 129.5, 129.6, 132.4, 135.4, 135.5, 136.8, 137.2, 137.9, 151.1, 164.3；MS(FAB): m/z 707 (MH+), 計算値 C41H46N2O7Si: C, 69.66; H, 6.56; N, 3.96. 実測値 C, 69.42; H, 6.54; N, 3.97。【００８４】
（６）化合物９の合成【００８５】
【化７】
0005875006.tif 000008
【００８６】
窒素気流下、上記（５）で得た化合物７（２．８６ｇ，４．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）に、氷冷下、ピリジン（１．６５ｍＬ，２０．５ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．３７ｍＬ，８．２０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷条件で１時間撹拌した。水を加えて酸無水物を分解させた後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体を黄色油状物質として得、フラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→２：１(v/v)）により簡易精製し、化合物８の粗成積体を淡黄色アモルファスとして得た。【００８７】
次いで、窒素気流下、化合物８（１．９６ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）にアジ化ナトリウム（０．２３ｇ，３．６０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。４８時間後、溶媒留去し、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により精製し、化合物９（１．７１ｇ：収率１００％）を白色アモルファスとして得た。【００８８】
得られた化合物９の物性データは、以下のとおりであった：融点：53〜56℃；[α]D27 -32.7 (c 0.840, CHCl3)；IR (KBr): 3175, 2109, 1686, 1268, 1111 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ0.99 (9H, s), 1.58 (3H, s), 3.63, 3.69 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.91 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 7.2 Hz, 5.4 Hz), 4.23 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.47, 4.53 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.57, 4.75 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.03 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.23-7.60 (20H, m), 8.70 (1H,s)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ12.1, 19.1, 26.9, 64.0, 64.6, 72.4, 73.8, 74.6, 79.5, 85.2, 87.9, 111.3, 127.7, 127.7, 127.8, 128.0, 128.2, 128.4, 128.7, 129.7, 129.9, 132.5, 132.8, 135.1, 135.5, 135.7, 136.8, 136.9, 150.2, 163.4；MS(FAB): m/z 732 (MH+), 計算値 C41H45N5O6Si: C, 67.28; H, 6.20; N, 9.57. 実測値 C, 67.25; H, 6.27; N, 9.45。【００８９】
（７）化合物１０の合成【００９０】
【化８】
0005875006.tif 000009
【００９１】
窒素気流下、上記（６）で得た化合物９（１．１０ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３０ｍＬ）に１Ｎテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（２．２０ｍＬ，２．２０ｍｍｏｌ）を加え、１２．５時間撹拌した。溶媒留去後、水および酢酸エチルを順次加え、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１(v/v)→酢酸エチルのみ）により精製し、化合物１０（６８２．２ｍｇ：収率９２％）を油状物質として得た。【００９２】
得られた化合物１０の物性データは、以下のとおりであった：融点：41〜45℃；[α]D25 +13.3 (c 0.950, CHCl3)；IR (KBr): 3435, 2113, 1694, 1459, 1268, 1097 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.63 (3H, s), 2.09 (1H, br), 3.73 (1H, s), 4.04 (1H, t, J = 6.3 Hz), 4.39 (1H, d, J = 6.3 Hz), 4.51, 4.55 (2H, AB, J = 10.2 Hz), 4.56, 4.91 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.18 (1H, d, J = 6.3 Hz), 7.26-7.44 (10H, m), 8.50 (1H,s)；13C-NMR (75.45Hz, CDCl3)：δ12.2, 63.4, 64.9, 71.8, 73.8, 74.8, 79.4, 86.4, 87.5, 111.5, 127.7, 128.2, 128.2, 128.6, 128.7, 128.8, 135.2, 136.5, 137.0, 150.3, 163.5；MS(FAB): m/z 494 (MH+), 高分解能MS(FAB): 計算値 C25H28N5O6 (MH+): 494.2040. 実測値 494.2045。【００９３】
（８）化合物１１の合成【００９４】
【化９】
0005875006.tif 000010
【００９５】
窒素気流下、上記（７）で得た化合物１０（０．２０ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド懸濁溶液（３．１ｍＬ）に、粉末モレキュラーシーブス４Å（０．３１ｇ）および二クロム酸ピリジニウム（１．５０ｇ，４．００ｍｍｏｌ）を順次加え、室温条件で撹拌した。４．５時間後、水を加えて数分間撹拌した後、酢酸（２ｍＬ）を加え、さらに１時間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、セライトで濾過し、酢酸エチルで抽出した。有機層を０．４Ｍシュウ酸水溶液（３０ｍＬ）および０．３Ｍシュウ酸アンモニウム水溶液（３０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去し、化合物１１（０．２０ｇ：収率１００％）を淡黄色固体として得た。【００９６】
得られた化合物１１の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.64 (3H, s), 3.83 (1H, dd, J = 8.4, 5.4 Hz), 3.84, 4.12 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.45 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.59, 4.65 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.75, 4.82 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 5.89 (1H, br), 6.54 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.28-7.44 (10H, m), 7.99 (1H, s), 9.31 (1H, br)；MS(FAB): m/z 508 (MH+),高分解能MS(FAB): 計算値 C25H25N5O7 (MH+): 508.1832. 実測値 508.1825。【００９７】
（９）化合物１３の合成【００９８】
【化１０】
0005875006.tif 000011
【００９９】
上記（８）で得た化合物１１（３８９．７ｍｇ，０．７７ｍｍｏｌ）を水：テトラヒドロフラン＝１：３の混合溶液（０．８ｍＬ）に溶解し、トリブチルホスフィン（０．９６ｍＬ，３．８５ｍｍｏｌ）を加えて室温下撹拌した。３．５時間後、溶媒留去したものをメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。溶媒留去後、化合物１２の粗成積体（３８０ｍｇ）を油状物質として得、続く閉環反応に用いた。【０１００】
窒素気流下、化合物１２のＤＭＦ溶液（１１ｍＬ）に、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２２１ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を加え、２１．５時間室温下撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成積体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１(v/v)→酢酸エチルのみ）により精製し、化合物１３（１９１．３ｍｇ：収率５３．６％）を油状物質として得た。【０１０１】
得られた化合物１３の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 +62.1 (c 0.400, CHCl3)；IR (KBr): 3186, 1692, 1469, 1455, 1272, 1112 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.61 (3H, s), 3.96, 4.11 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.13 (1H, s), 4.22 (1H, s), 4.56 (2H, s), 4.60, 4.67 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 5.45 (1H, s), 6.58 (1H, br), 7.21-7.56 (10H, m), 7.57 (1H, s), 9.24 (1H, br)；13C-NMR (67.80Hz, CDCl3): 12.3, 58.4, 63.0, 72.4, 74.0, 78.3, 86.2, 86.6, 110.9, 127.8, 127.8, 128.1, 128.3, 128.5, 128.6, 135.1, 136.2, 137.4, 142.0, 150.5, 163.8, 174.3；MS(FAB): m/z 464 (MH+)。【０１０２】
（１０）化合物１４の合成【０１０３】
【化１１】
0005875006.tif 000012
【０１０４】
窒素気流下、上記（９）で得た化合物１３（１０１ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液２．２ｍＬに２０％(v/v)水酸化パラジウムカーボン（１００ｍｇ）を加え、３時間撹拌した。熱時濾過を行い、温メタノール（１５０ｍＬ）で洗浄後、溶媒留去し、粗成積体を得た。メタノールで再結晶を行い、化合物１４（５７．２ｍｇ：収率９３％）を白色固体として得た。【０１０５】
得られた化合物１４の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 +31.6 (c 0.700, CH3OH)；IR (KBr): 3255, 2925, 2852, 1692, 1466, 1231, 1065 cm-1；1H-NMR (300MHz, CD3OD)：δ1.89 (3H, s), 3.88, 4.04 (2H, AB, J = 12.9 Hz), 4.12 (1H, s), 4.30 (1H, s), 5.38 (1H, s), 7.86 (1H, s)。【０１０６】
（１１）化合物１５の合成【０１０７】
【化１２】
0005875006.tif 000013
【０１０８】
窒素気流下、上記（１０）で得た化合物１４（２７．３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液０．８ｍＬに、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４８．８ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。飽和重曹水を加えて数分間撹拌し、溶媒留去した後、飽和重曹水／酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１(v/v)→酢酸エチルのみ）により精製し、化合物１５（４７．６ｍｇ：収率８５％）を白色泡状物質として得た。【０１０９】
得られた化合物１５の物性データは、以下のとおりであった：融点：79〜81℃；IR (KBr): 3342, 3063, 2928, 1690, 1509, 1270, 1253,1177, 1035 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.66 (3H, s), 3.61, 3.92 (2H, AB, J = 12.8 Hz), 3.78 (6H, s), 4.26 (1H, s), 4.46 (1H, s), 5.42 (1H, s), 6.86-7.45 (13H, m), 7.78 (1H,s)；MS(FAB): m/z 586 (MH+)。【０１１０】
（１２）化合物１６の合成【０１１１】
【化１３】
0005875006.tif 000014
【０１１２】
窒素気流下、上記（１１）で得た化合物１５（１００ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル−テトラヒドロフラン溶液（３：１(v/v)）２．０  ｍＬに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２２．２ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５４．０μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。１．５時間後、飽和重曹水を加えて数分間撹拌した後、水／酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール：トリエチルアミン＝５０：１：１(v/v/v)）により精製した。得られた粗成積体をｎ−ヘキサン中に溶解し、ジクロロメタンの添加により再沈殿を行い、化合物１６（２９．４ｍｇ，２２％）を白色粉体として得た。【０１１３】
得られた化合物１６の物性データは、以下のとおりであった：融点：110〜112℃ (CH2Cl2)；31P-NMR (202.35MHz, CDCl3)：δ149.74, 150.12；MS(FAB): m/z 786 (MH+), 高分解能MS(FAB): 計算値 C41H49N5O9 (MH+): 786.3268. 実測値 786.3266。【０１１４】
（実施例２）オリゴヌクレオチドの標的領域の選定
ヒトのＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列（配列番号１：コーディング領域、２０７９塩基）を、ＧｅｎＢａｎｋより入手した（アクセッション番号：ＮＭ_１７４９３６）。以下の４つの観点でこの塩基配列をコンピュータソフトで解析し、オリゴヌクレオチドの標的として適している領域の塩基配列を選定した。
（１）ソフトｍＦｏｌｄ（M. Zuker、Nucleic Acids Res.、 2003年、第31巻、p. 3406-3415）を用いて、マウスのＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡの折れ畳み構造を計算した。オリゴヌクレオチドが結合しやすいように、ｍＲＮＡ上でステムループ構造を形成しにくい領域を選択した。
（２）ソフトＪｕｓｔＢｉｏ（ＵＲＬ：http://www.justbio.com/）を用いて、ヒトとマウスのＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列を比較した。マウスで評価した結果に基づいてヒトへの適用を可能にするように、ヒトとマウスとの間で塩基配列が同じ領域を選択した。
（３）オリゴヌクレオチドと２本鎖核酸を形成した際に熱安定性が高くなるように、ＧＣ含量が多い領域を選択した。
（４）ソフトＢｌａｓｔ（S. F. Altschulら、J. Mol. Biol.、1990年、第215巻、p. 403-410）を用いて、標的領域の塩基配列と類似した塩基配列がゲノムの他の領域に存在するかどうかを探索した。他のｍＲＮＡにオリゴヌクレオチドが結合しないように、ゲノムの他の領域の塩基配列と類似性が低い塩基配列からなる領域を選択した。【０１１５】
以上の４つの条件に最も適したオリゴヌクレオチドの標的領域を選択し（配列番号３〜１８）、これに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計した（表１−１および表１−２）。なお、表１−１において、ＰＳ骨格とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）をいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にＳ−オリゴヌクレオチドという。表１−１に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてＳ−オリゴヌクレオチドである。【０１１６】
【表１−１】
0005875006.tif 000015
【０１１７】
【表１−２】
0005875006.tif 000016
【０１１８】
（実施例３）オリゴヌクレオチドの合成および精製
非特許文献３〜７に記載の方法によりＢＮＡモノマー（アミダイト体）を合成した。非特許文献８〜１１に記載の方法によりＮＣモノマー（アミダイト体）を合成した。これらおよび実施例１で合成したＣＯＮモノマー（アミダイト体）をＤＮＡ合成用モノマー体として用いて、ＤＮＡ合成機により必要に応じて１ｍｇから１００ｍｇ（ｉｎ  ｖｉｖｏグレード）のオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製、凍結乾燥処理に供した。得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認した。【０１１９】
表１−１および表１−２に記載のように、合成したオリゴヌクレオチド（ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチド）は、糖修飾ヌクレオシドを含まないＳ−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド：ＰＣＳＫ９−１−Ｓなど）、ＢＮＡ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド：ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡなど）、ＮＣ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（ＮＣ−オリゴヌクレオチド：ＰＣＳＫ９−１−ＮＣなど）およびＣＯＮ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（ＣＯＮ−オリゴヌクレオチド：ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＣＯＮ−Ａなど）である。【０１２０】
（実施例４）３’−末端にコレステロールが結合したオリゴヌクレオチドの合成および精製
コレステロールをアミダイト体として導入する手法により、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ−３Ｃの大量合成を行い、１０ｍｇのオリゴヌクレオチドを得た。【０１２１】
（実施例５）オリゴヌクレオチドの血清中におけるヌクレアーゼに対する耐性の評価
１ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドを１０μＬのＦＢＳ（牛胎児血清）と混合し、さらに滅菌水を加えて２０μＬに調製した。この溶液を３７℃にて所定時間インキュベートした後、１３μＬのホルムアミドを加えて、ホルムアミドの最終濃度が４０％となるようにして、ＦＢＳ中のヌクレアーゼを失活させた。このサンプルは、ＨＰＬＣによる解析まで−８０℃にて保存した。ＨＰＬＣによる解析のために、４００μＬのＡ  バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５％  ＣＨ３ＣＮ，ｐＨ７．０）をこのサンプルに加えて、ホルムアミドの最終濃度を３％にし、４ｍｍ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＨＶ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｄｒｉｖｅｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（ポアサイズ：０．４５μｍ；ミリポア社製）で２回ろ過したものを、ＨＰＬＣによる解析のためのサンプルとした。ＨＰＬＣには、ＪＡＳＣＯ  ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓシリーズ（日本分光株式会社製）を用い、ＨＰＬＣカラムには、ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）ＤＮＡ−ＮＰＲ（東ソー株式会社製）を用いた。Ａ  バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５％  ＣＨ３ＣＮ，ｐＨ７．０）とＢ  バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５％  ＣＨ３ＣＮ，１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，ｐＨ７．０）を用い、最初の１０分間は、Ａ  １００％，Ｂ  ０％とし、次の４５分間は、Ａ  １００％，Ｂ  ０％からＡ  ５０％，Ｂ  ５０％になるように変化させ、次の１０分間は、Ａ  ０％，Ｂ  １００％とした。以上の一連のＨＰＬＣによる検出のための波長は２６０ｎｍとした。オリゴヌクレオチドに相当するＨＰＬＣのピークの面積を、ＦＢＳと混合する前と、ＦＢＳと混合した後１２０分間後において測定し、これらの比より、ＦＢＳと混合した後１２０分間後のオリゴヌクレオチドの存在率［％（１２０分）］を求めた。結果を表２および３に示す。【０１２２】
【表２】
0005875006.tif 000017
【０１２３】
【表３】
0005875006.tif 000018
【０１２４】
表２および３から明らかなように、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドの方がＤＮＡ−オリゴヌクレオチドよりも、ＦＢＳと混合した後１２０分間後の存在率［％（１２０分）］が顕著に高かった。また、ＮＣ−オリゴヌクレオチドの方がＢＮＡ−オリゴヌクレオチドよりも、ＦＢＳと混合した後１２０分間後の存在率［％（１２０分）］が高かった。これより、ＮＣ−オリゴヌクレオチドが、血清中のヌクレアーゼに対する耐性が最も高いことがわかった。さらに、同じ長さのＢＮＡ−オリゴヌクレオチドでは、ＢＮＡ−ヌクレオシドの数が多いほどヌクレアーゼに対する耐性が高いことがわかった。ＢＮＡ−ヌクレオシドの数が同じＢＮＡ−オリゴヌクレオチドでは、長さと耐性に相関がなかった。これより、ＢＮＡ−ヌクレオシドの数の方がＢＮＡ−オリゴヌクレオチドの長さよりもヌクレアーゼ耐性に関係していることがわかった。【０１２５】
（実施例６）オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸の構造安定性の評価
緩衝液（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．２）中で、オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとを等モル混合し、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成した。紫外可視分光光度計ＤＵ８００（ベックマン社製）のペルチェ式ＵＶ  ｍｅｌｔｉｎｇ装置を用いて、この２本鎖核酸の熱安定性を解析した。２本鎖核酸の温度を２０℃から９５℃まで０．５℃／分の速度で加温していき、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）の温度（Ｔ）による変化を測定した。２本鎖核酸の濃度は１μＭとし、セルの光路長は１ｃｍとした。この測定結果よりｄＡ／ｄＴ  ｖｓ  Ｔのグラフを描き、ｄＡ／ｄＴの値が最も大きくなる温度、つまりＡのＴによる変化が最も大きくなる温度を、２本鎖核酸のＴｍとし、２本鎖核酸の熱安定性の指標とした。結果を表４および５に示す。【０１２６】
【表４】
0005875006.tif 000019
【０１２７】
【表５】
0005875006.tif 000020
【０１２８】
表４および５から明らかなように、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸の方が、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸よりも多くの場合で、Ｔｍが３０℃以上高かった。これより、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸の方が、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸よりも、構造安定性が高いことがわかった。また、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸と、ＮＣ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸とでは、Ｔｍがほとんど変わらなかった。これより、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸と、ＮＣ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸とでは、構造安定性がほとんど変わらないことがわかった。さらに、同じ長さのＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸では、ＢＮＡ−ヌクレオシドの数が多いほどＴｍが高かった。ＢＮＡ−ヌクレオシドの数が同じＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸でも、長さが長いほどＴｍが高かった。これより、ＢＮＡ−ヌクレオシドの数およびＢＮＡ−オリゴヌクレオチドの長さともに、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸の構造安定性に寄与していることがわかった。【０１２９】
（実施例７）オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸のＲＮａｓｅＨ感受性の評価
標的ＲＮＡの５’末端をγ−３２Ｐで標識した。具体的には、１０ｐｍｏｌのＲＮＡと１０ｐｍｏｌ相当の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（パーキンエルマー社製）を、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績株式会社製）で反応させた。［γ−３２Ｐ］標識ＲＮＡを含む反応後の産物は、スピンカラムで精製し、未反応の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを除去した。この［γ−３２Ｐ］標識ＲＮＡに、１０μＭの相補鎖オリゴヌクレオチド１μＬを加え、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成した。【０１３０】
次いで、１μＬの［γ−３２Ｐ］標識２本鎖核酸を９μＬの反応緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，４％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．００３％  ＢＳＡ）と混合した。ここから１μＬを採取し、９μＬの停止溶液（０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ，８０％ホルムアミド，ＢＰＢ）と混合した溶液をＲＮａｓｅＨ未処理のサンプルとした。残りの９μＬの反応溶液に０．６等量のＲＮａｓｅＨ（０．０００６  ｕｎｉｔ）を混合し、３７℃にて５分間インキュベートした。ここから１μＬを採取し、９μＬの停止溶液と混合した溶液をＲＮａｓｅＨ処理のサンプルとした。これらのサンプルは、電気泳動による解析まで−２０℃にて保存した。６Ｍ尿素を含む２０％変性ポリアクリルアミドゲルを用い、３００Ｖにて１２０分間、サンプルの電気泳動を行った。ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸を用いた場合の電気泳動は４℃にて行い、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸を用いた場合の電気泳動は室温にて行い、ＮＣ−オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとからなる２本鎖核酸を用いた場合の電気泳動は６０℃にて行った。電気泳動後のゲルをイメージングプレートに感光後、イメージアナライザーで解析した。結果を図１〜５に示す。【０１３１】
図１〜５から明らかなように、いずれにおいてもＲＮａｓｅＨの添加により［γ−３２Ｐ］標識ＲＮＡの分子量が低下しており、ＲＮａｓｅＨによる［γ−３２Ｐ］標識ＲＮＡの分解が起きていることがわかった。これより、いずれの２本鎖核酸もＲＮａｓｅＨ感受性であることがわかった。【０１３２】
（実施例８）オリゴヌクレオチドによるＰＣＳＫ９遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現抑制効果１
４．０×１０５個／ｍＬに調製したマウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉの細胞を、１ウェルあたり２ｍＬずつ６ウェルプレートに播き、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間培養した。最終濃度が１、３、１０、３０または５０ｎＭとなるように調製するために、１μＭオリゴヌクレオチド含有溶液を最終濃度１ｎＭの場合には２．２μＬ、３ｎＭの場合には６．６μＬ、１０ｎＭの場合には２２μＬ、３０ｎＭの場合には６６μＬ、そして５０ｎＭの場合には１１０μＬ各々とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１４．３μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を最終濃度１ｎＭの場合には５３３．５μＬ、３ｎＭの場合には５２９．１μＬ、１０ｎＭの場合には５１３．７μＬ、３０ｎＭの場合には４６９．７μＬ、そして５０ｎＭの場合には４２５．７μＬ各々とを混合し、混合液を室温にて２０分間インキュベートして、このうち５００μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ１５００μＬを各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチド添加４時間後に培地を交換した。さらに２０時間後に細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）で細胞を破砕し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを分光光度計で定量し、ＲＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。【０１３３】
４μｇ／１０μＬになるように調製したＴｏｔａｌ  ＲＮＡに０．５μｇ/μＬオリゴｄＴ（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）１μＬおよび１０ｍＭ  ｄＮＴＰ１μＬを加え、６５℃にて５分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに４０Ｕ/μＬのＲＮａｓｅ  ＯＵＴ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１μＬ、５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４μＬ、および０．１Ｍ  ＤＴＴ（和光純薬工業株式会社）２μＬを加え、４２℃にて２分間インキュベートし、これにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２００Ｕ/μＬ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２μＬと蒸留水６μＬとを混合した溶液）を１μＬ加えて４２℃にて５０分間インキュベートし、逆転写反応を行った。反応後、７０℃にて１５分間インキュベートしてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩを失活させた後、２Ｕ/μＬ  ＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１μＬを加えて３７℃にて２０分間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績株式会社）を用いてＭｉｎｉ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によりリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を評価した。【０１３４】
用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマーは以下のとおりである：
ＰＣＳＫ９−０−ＢＮＡ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー０：５’−ＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１９）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー０：５’−ＧＧＧＴＡＡＧＧＴＧＣＧＧＴＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号２０）
ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１−ＮＣ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣ、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ−３Ｃ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー１：５’−ＣＡＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー１：５’−ＣＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣ−３’（配列番号２２）
ＰＣＳＫ９−３−ＢＮＡ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー２：５’−ＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＧＡＣＴ−３’（配列番号２３）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー２：５’−ＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号２４）
ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−５−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−６−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−５−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−６−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−４−ｉ−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡ−Ａ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−Ａ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー３：５’−ＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２５）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー３：５’−ＣＧＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２６）
ＰＣＳＫ９−７−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−８−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−７−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−８−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー４：５’−ＧＣＴＣＴＧＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴＧＧＴ−３’（配列番号２７）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー４：５’−ＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴ−３’（配列番号２８）
ＰＣＳＫ９−９−ＢＮＡ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー５：５’−ＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡ−３’（配列番号２９）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー５：５’−ＧＣＡＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号３０）
ＰＣＳＫ９−１０−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１０−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー６：５’−ＧＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号３１）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー６：５’−ＧＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号３２）
ＧＡＰＤＨ定量用
ＧＡＰＤＨ  Ｆｗプライマー：５’−ＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴ−３’（配列番号３３）
ＧＡＰＤＨ  Ｒｖプライマー：５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号３４）【０１３５】
各オリゴヌクレオチドで処理したＮＭｕｌｉ細胞で得られたＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルの結果を図６〜８に示す。図６は、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド（図６Ａ：ＰＣＳＫ９−０−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−３−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−５−ＢＮＡ；図６Ｂ：ＰＣＳＫ９−６−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−７−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−８−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−９−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１０−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ−３Ｃ；図６Ｃ：ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ））の結果を示し、図７および８は、ＮＣ−オリゴヌクレオチド（図７：ＰＣＳＫ９−１−ＮＣ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣ、ＰＣＳＫ９−４−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）；図８：ＰＣＳＫ９−５−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−６−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−７−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−８−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−１０−ＮＣ（Ｔ，Ｃ））の結果を示す。図６〜８から明らかなように、多くのオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの濃度依存的にＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現量は低下した。【０１３６】
オリゴヌクレオチド未処理の場合のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを１としたときの、５０ｎＭのＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ｉ−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡ−Ａ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡまたはＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−Ａで処理した場合のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルの結果を表６に示す。【０１３７】
【表６】
0005875006.tif 000021
【０１３８】
表６から明らかなように、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制については、ＰＣＳＫ９−４−ｉ−ＢＮＡ、ならびにより短い配列の中ではＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡおよびＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−Ａが優れた効果を示した。【０１３９】
（実施例９）オリゴヌクレオチドによるＰＣＳＫ９遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現抑制効果２
ＮＭｕｌｉに代えてヒト肝癌由来細胞株Ｈｕｈ−７を用いたこと以外は、実施例８と同様にして、オリゴヌクレオチドによるＰＣＳＫ９遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現抑制効果を調べた。【０１４０】
用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマーは以下のとおりである：
ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ−１３、ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ−１３
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー１：５’−ＣＡＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー１：５’−ＣＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣ−３’（配列番号２２）
ＰＣＳＫ９−３−ＢＮＡ−１３
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー２：５’−ＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＧＡＣＴ−３’（配列番号２３）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー２：５’−ＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号２４）
ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ−１３
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー３：５’−ＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２５）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー３：５’−ＣＧＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２６）【０１４１】
５０ｎＭのオリゴヌクレオチドを用いた場合の結果を図９に示す。図９から明らかなように、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ−１３などの短いオリゴヌクレオチド（１３塩基）はいずれもＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ（２０塩基）よりもＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制効果が高いことがわかった。【０１４２】
（実施例１０）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験１
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１，オリエンタル酵母工業株式会社製）負荷の後、０日目に採血して、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチドまたはＮＣ−オリゴヌクレオチドを腹腔内投与した（１０ｍｇ／ｋｇ／回）。１週間に２回、２週間〜６週間投与を行ない、その間、尾静脈より数回採血を行なった。３週間後または６週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、ＰＢＳで上腸間膜静脈より灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−８０℃にて保存した。【０１４３】
（肝臓からのｍＲＮＡの抽出および定量：リアルタイムＰＣＲ）
凍結した肝臓の切片を１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でホモジナイズし、クロロホルム２００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した。上清２２０μＬをイソプロパノール４００μＬに添加して転倒混和し、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した後、イソプロパノールを除去した。次いで、７５％エタノール８００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを含む沈殿をＲＮＡフリー水（Ｗａｔｅｒ，ＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ，ＲＮａｓｅ  ｔｅｓｔｅｄ；ナカライテスク株式会社）８０μＬに溶解した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを分光光度計で定量し、ＲＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。【０１４４】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１０μｇからＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡおよびＦａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を評価した。【０１４５】
用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマーは以下のとおりである：
ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１−ＮＣ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー７：５’−ＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号３５）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー１：５’−ＣＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣ−３’（配列番号２２）
ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣ
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー１：５’−ＣＡＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー１：５’−ＣＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣ−３’（配列番号２２）
ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−４−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）
ＰＣＳＫ９  Ｆｗプライマー３：５’−ＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２５）
ＰＣＳＫ９  Ｒｖプライマー３：５’−ＣＧＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２６）
ＧＡＰＤＨ定量用
ＧＡＰＤＨ  Ｆｗプライマー：５’−ＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴ−３’（配列番号３３）
ＧＡＰＤＨ  Ｒｖプライマー：５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号３４）【０１４６】
各オリゴヌクレオチドをマウス腹腔内投与して得られた肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルの結果を、図１０および１１に示す（図１０：ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−１−ＮＣ；図１１：ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）、ＰＣＳＫ９−４−ＮＣ（Ｔ，Ｃ））。図１０および１１から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）投与群に比べてＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現量は５％以下に低下した。【０１４７】
（血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値の定量）
マウス尾静脈より血液を採取して、室温にて２０分間静置した後、５０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心して血清を分離した。それぞれの血清について、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて血清総コレステロール値を定量した。血清１０μＬに発色試液を１．５ｍＬ加えて３７℃にて５分間加温し、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。【０１４８】
リポタンパク質分析は、スカイライトバイオテック株式会社において、ＨＰＬＣを用いたゲルろ過により、リポタンパク質を分子量によって３画分（ＶＬＤＬ：Ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙリポタンパク質、ＬＤＬ：Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙリポタンパク質およびＨＤＬ：Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙリポタンパク質）に分画して、それぞれのコレステロール値をコレステロールＥ−テストワコーを用いて定量した。結果を図１２に示す。【０１４９】
図１２から明らかなように、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡおよびＰＣＳＫ９−１−ＮＣのいずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて血清総コレステロール値（ＴＣ）、ＶＬＤＬ画分中コレステロール値（ＶＬＤＬ−Ｃ）、ＬＤＬ画分中コレステロール値（ＬＤＬ−Ｃ）、ＨＤＬ画分中コレステロール値（ＨＤＬ−Ｃ）が低下した。【０１５０】
（ＬＤＬ受容体タンパク質の定量：ウェスタンブロッティング）
凍結した肝臓の切片（５０ｍｇ）を５００μＬ  ＲＩＰＡ  バッファーに入れてホモジナイズし、１０，０００ｒｐｍ、３分間冷却遠心し、上清をＢＩＯ  ＲＡＤ  ＤＣ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてタンパク定量を行なった。ポリアクリルアミドゲルＲｅａｄｙ  Ｇｅｌ  Ｊ（４％）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の各レーンにタンパク質量７μｇずつアプライし、２００Ｖにて４０分間電気泳動した。Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて１８０ｍＡにて９０分間ブロッティングを行ない、次いでＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ（ナカライテスク株式会社）を用いて１時間ブロッキングを行なった。得られたメンブレンに対し、１次抗体として、抗ＬＤＬ受容体ポリクローナルヤギ抗体（ＬＤＬＲ  Ｍ−２０，Santa Cruz Biotechnology社）を反応させ、二次抗体として、抗ヤギポリクローナル抗体（Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ，Santa Cruz Biotechnology社）を反応させた。次いで、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，GE healthcare社）を用いてメンブレンを発色させ、発色量を定量した。結果を図１３に示す。【０１５１】
図１３から明らかなように、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡおよびＰＣＳＫ９−１−ＮＣのいずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて１．７〜２倍にＬＤＬ受容体タンパク質の発現量が増加した。【０１５２】
（肝臓組織の病理組織学的観察）
オリゴヌクレオチドとして、ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣ、またはＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡを用い、これらを３週間に６回腹腔内投与した（２０ｍｇ／ｋｇ／回）こと以外は、上記と同様にして、オリゴヌクレオチドのマウスへの投与実験を行った。上記と同様にして、肝臓組織を採取して、１０％ホルマリン緩衝液に２４時間浸して固定した後６時間流水水洗し、パラフィン包埋した。薄切切片（５μｍ）を作製して、ヘマトキシリン染色を行ない、顕微鏡にて観察し、写真撮影した。結果を図１４に示す（４０倍）。【０１５３】
図１４から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて肝毒性を示さなかった。【０１５４】
（毒性評価）
オリゴヌクレオチド（ＰＣＳＫ９−２−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−２−ＮＣ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ、ＰＣＳＫ９−４−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）、またはＰＣＳＫ９−４−ＮＣ（Ｔ，Ｃ））投与後のマウス血清を用いて、ＡＳＴ値、ＡＬＴ値およびＢＵＮ値を定量した。ＡＳＴ値およびＡＬＴ値は、トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて定量した。血清１０μＬにＡＳＴ値測定用またはＡＬＴ値測定用基質酵素液２５０μＬを加えて３７℃にて５分間加温し、発色試液２５０μＬを加えて３７℃にて２０分間加温した。次いで、反応停止液１ｍＬを加えた後、分光光度計を用いて５５５ｎｍの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて各値を算出した。ＢＵＮ値は、血清１０μＬに発色試液Ａ  １ｍＬを加えて３７℃にて１５分間加温し、発色試液Ｂ  １ｍＬを加えて３７℃にて１０分間加温後、分光光度計を用いて５７０ｎｍの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。結果を図１５に示す（Ａ：ＡＳＴ値、Ｂ：ＡＬＴ値、Ｃ：ＢＵＮ値）。【０１５５】
図１５から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べてＡＳＴ値およびＡＬＴ値に有意な変化が見られず、肝毒性を示さなかった。【０１５６】
（実施例１１）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験２
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１：オリエンタル酵母工業）負荷の後、０日目に採血して、オリゴヌクレオチド（ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ）を腹腔内投与した。投与量は、０、１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇとした。１週間に２回、６週間投与を行ない、６週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例１０と同様にして血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を定量した。ＬＤＬ画分中コレステロール値およびＨＤＬ画分中コレステロール値の結果を図１６に示す（「ＬＤＬ」は、ＬＤＬ画分中コレステロール値を表し、「ＨＤＬ」は、ＨＤＬ画分中コレステロール値の結果を示す）。【０１５７】
図１６から明らかなように、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ投与群では生理食塩水投与群に比べてＨＤＬ−Ｃに変化が見られなかったものの、ＬＤＬ−Ｃは用量依存的に減少した。【０１５８】
（実施例１２）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験３
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１：オリエンタル酵母工業）負荷の後、０日目に採血して、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを腹腔内投与した。投与量は、０、１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇとした。１週間に２回、６週間投与を行ない、６週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、ＰＢＳで心臓より灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−８０℃にて保存した。実施例１０と同様にしてＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。結果を図１７に示す。【０１５９】
図１７から明らかなように、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ投与群では生理食塩水投与群に比べて肝臓におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現が、各用量でほぼ完全に（＞９７％）抑えられた。【０１６０】
（実施例１３）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験４
実施例１２のＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ投与後のマウス血清を用いて、実施例１０と同様にしてＡＳＴ値、ＡＬＴ値およびＢＵＮ値を定量した。結果を図１８に示す（Ａ：ＡＳＴ値、Ｂ：ＡＬＴ値、Ｃ：ＢＵＮ値）。【０１６１】
図１８から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて肝臓におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現量は、顕著に低下した。また、肝臓および腎臓の急性期毒性マーカーについては顕著な上昇は認められなかったが、ＢＵＮ値についてはわずかに用量依存的に上昇した。【０１６２】
（実施例１４）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験５
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１：オリエンタル酵母工業）負荷の後、０日目に採血して、ＰＣＳＫ９−１−ＮＣを腹腔内投与した。投与量は、０、１、５または１０ｍｇ／ｋｇとした。１週間に２回、６週間投与を行ない、４週間後または６週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例１０と同様にして血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を定量した。ＬＤＬ画分中コレステロール値およびＨＤＬ画分中コレステロール値の結果を図１９に示す（「ＬＤＬ」は、ＬＤＬ画分中コレステロール値を表し、「ＨＤＬ」は、ＨＤＬ画分中コレステロール値の結果を示す）。【０１６３】
図１９から明らかなように、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ＮＣ投与群では生理食塩水投与群に比べてＨＤＬ−Ｃには変化が見られなかったものの、ＬＤＬ−Ｃは用量依存的に減少した。【０１６４】
（実施例１５）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験６
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１：オリエンタル酵母工業）負荷の後、０日目に採血して、ＰＣＳＫ９−１−ＮＣを腹腔内投与した。投与量は、０、１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇとした。１週間に２回、６週間投与を行ない、４週間後または６週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、ＰＢＳで心臓より灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−８０℃で保存した。実施例１０と同様にしてＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。結果を図２０に示す。【０１６５】
図２０から明らかなように、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ＮＣ投与群では生理食塩水投与群に比べて肝臓におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現が、用量依存的に高効率（＞９７％）に抑えられた。【０１６６】
（実施例１６）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験７
実施例１５のＰＣＳＫ９−１−ＮＣ投与後のマウス血清を用いて、実施例１０と同様にしてＡＳＴ値、ＡＬＴ値およびＢＵＮ値を定量した。結果を図２１に示す。【０１６７】
図２１から明らかなように、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ＮＣ投与群では生理食塩水投与群に比べて肝臓および腎臓の急性期毒性マーカーの顕著な上昇は認められなかった。【０１６８】
（実施例１７）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験８
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数３匹となるように準備した。３週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１：オリエンタル酵母工業）負荷の後、０日目に採血して、９日後および１２日後に、オリゴヌクレオチド（ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡ−Ａ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＢＮＡ−Ａ２、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＮＣ−Ａ、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＮＣ−Ａ２、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉ−ＣＯＮ−Ａ）を尾静脈より投与した（３５ｍｇ／ｋｇ）。１４日後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例１０と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図２２に示す。【０１６９】
図２２から明らかなように、生理食塩水投与群では血清総コレステロール値に変化が見られなかったが、ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド、ＮＣ−オリゴヌクレオチドおよびＣＯＮ−オリゴヌクレオチドのいずれの投与群も血清総コレステロール値が低下した。【０１７０】
（実施例１８）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験９
被験動物として３週齢のモルモットＨａｒｔｌｅｙ（オス：日本ＳＬＣ）を各投与群で例数１匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１，オリエンタル酵母工業株式会社製）負荷の後、０日目に採血して、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐ（５’−ＣＡＴｇｇｇｃａｇｃｃｇＣＣ−３’；すべてＰＳ骨格、小文字：ＤＮＡ、大文字：ＢＮＡ、配列番号１１で示される塩基配列からなるヒトの標的領域のモルモットにおける対応領域を標的とする）を腹腔内に３日間連続投与した。投与量は、１日あたり０、２０または２５ｍｇ／ｋｇとした。投与後、３日後および７日後に各投与群１匹ずつ採血を行った。実施例１０と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図２３に示す。【０１７１】
図２３から明らかなように、オリゴヌクレオチドＰＣＳＫ９−１−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐを投与した結果、血清総コレステロール値は３日後に８％低下し、７日後には４０％低下した。【０１７２】
（実施例１９）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験１０
被験動物として３週齢のモルモットＨａｒｔｌｅｙ（オス：日本ＳＬＣ）を各投与群で例数１匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１，オリエンタル酵母工業株式会社製）負荷の後、０日目に採血して、生理食塩水、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐ、ロバスタチン＋生理食塩水、ロバスタチン＋ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐを腹腔内に投与した。投与量は、ロバスタチン約３０ｍｇ／ｋｇ／日を９日間連続投与、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐ  ２０ｍｇ／ｋｇを９日間で３回投与とした。投与後、７日後に各投与群１匹ずつ採血を行った。実施例１０と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図２４に示す。【０１７３】
図２４から明らかなように、ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐ投与群、ロバスタチン投与群、およびロスバスタチン＋ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐ投与群では、それぞれ生理食塩水投与群に比べて、４４％、４７％および５７％血清総コレステロール値が低下した。ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐはロバスタチンに比べて低用量にもかかわらずコレステロール低減効果を示し、併用においてさらに高い効果を示した。また、ロバスタチン投与を中止して３日後に採血を行った場合においては、ロバスタチン投与群は生理食塩水投与群と同程度にまで血清総コレステロール値が回復したが、ロスバスタチン＋ＰＣＳＫ９−４−ｉｉｉ−ＢＮＡ−ｇｐ投与群では生理食塩水投与群に比べて、約５０％血清総コレステロール値が低下し、持続してコレステロール低減効果を示した。【０１７４】
（実施例２０）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験１１
被験動物として５週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本ＳＬＣ）を各投与群で例数９匹となるように準備した。ＰＢＳに溶解したＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを腹腔内投与した。投与量は、０、０．０５、０．２５、０．５、１、２．５または５ｍｇ／ｋｇとした。投与後、３日後、７日後および１４日後に各投与群３匹ずつ麻酔薬ベトルファール（明治製菓株式会社製）、ドミトール（日本全薬工業株式会社）およびドルミカム（アステラス製薬株式会社製）の混合溶液で麻酔後、採血を行った。ＰＢＳで肝灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＫｉｔ（富士フィルム社製）に添付の組織溶解液４ｍＬにて肝臓すべてを溶解し、−８０℃で保存した。解凍した肝臓溶解液からＱｕｉｃｋＧｅｎｅＫｉｔを用いて、ｍＲＮＡの抽出を行った。その後のｃＤＮＡの作製、リアルタイムＰＣＲは、実施例１０と同様に行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。結果を図２５に示す。【０１７５】
図２５から明らかなように、肝臓におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現量は、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの投与量に依存して低下した。また、日数の経過に従って回復した。【０１７６】
（実施例２１）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験１２
被験動物として５週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本ＳＬＣ）を各投与群で例数９匹となるように準備した。ＰＢＳに溶解したＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを腹腔内に毎日連続投与した。投与量は、１日あたり０、０．００９、０．０１８、０．０３６、０．０７１または０．１８ｍｇ／ｋｇとした。これは２週間連続投与後の総投与量が０、０．１２５、０．２５、０．５、１または２．５ｍｇ／ｋｇになる値である。投与後、３日後および７日後に各投与群３匹ずつ麻酔薬ベトルファール、ドミトールおよびドルミカムの混合溶液で麻酔後、採血を行った。ＰＢＳで肝灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、組織溶解液４ｍＬにて肝臓すべてを溶解し、−８０℃で保存した。解凍した肝臓溶解液からＱｕｉｃｋＧｅｎｅＫｉｔを用いて、ｍＲＮＡの抽出を行った。その後のｃＤＮＡの作製、リアルタイムＰＣＲは、実施例１０と同様に行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。結果を図２６に示す。【０１７７】
図２６から明らかなように、肝臓におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現は、連続投与の場合も、実施例２０の単回投与の場合と同様に、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの投与量に依存して抑えられた。投与量の最も少ない場合（３日間で総投与量０．０２７ｍｇ／ｋｇ））、実施例２０の単回投与では明らかな抑制が見られなかったが、連続投与では抑制が見られた。このことは、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの徐放剤化によりｍＲＮＡの抑制効果を向上できることを示唆する。【０１７８】
（実施例２２）オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験１３
ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの投与量および投与後採血までの経過日数を表７に記載の条件にしたこと以外は、実施例２０と同様にして、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウスへの単回投与実験を行った。また、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの投与量および投与後採血までの経過日数を表７に記載の条件にしたこと以外は、実施例２１と同様にして、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのマウスへの連続投与実験を行った。実施例１０と同様にして血清総コレステロール値を定量した。ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの投与後所定経過日数での単回投与実験で得られた血清総コレステロール値に対する連続投与実験で得られた血清総コレステロール値の比を図２７に示す。【０１７９】
【表７】
0005875006.tif 000022
【０１８０】
図２７から明らかなように、投与後７日および１４日後の結果の多くでは、血清総コレステロール値の比（連続投与／単回投与）が１．０付近あるいは１．０を上回っている。これは、同じ投与量でコレステロール低減効果を比較した場合には、２週間程度の徐放化では十分な効果が得られないことを意味している。一方、投与後２１日およぎ２８日後の結果では、血清総コレステロール値の比（連続／単回）が１．０を大きく下回っている。図２５および２６の比較からは、同じＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ投与量では、単回投与と連続投与とで肝臓のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの抑制効果に大きな差がないことが示されているが、コレステロール低減効果については、低濃度のＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡに長時間暴露される徐放化の効果が大いに期待できることが示された。【０１８１】
（実施例２３）ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有アテロコラーゲンゲルの埋入による高脂血症ラット治療実験
３質量％アテロコラーゲン（株式会社高研製コーケンアテロコラーゲンインプラント）０．１ｍＬに０．１ｍｇのＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを練り込み、３７℃にて２４時間静置することによりＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有アテロコラーゲンゲルを作製した。【０１８２】
被験動物として５週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本ＳＬＣ）を各投与群で例数２〜５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＨＦＤ１：オリエンタル酵母工業）負荷の後、麻酔下、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有アテロコラーゲンゲルを腹腔内（Ｉ．Ｐ．）または皮下（Ｓ．Ｃ．）に埋入した（ＢＮＡ  ｉｎ  Ｇｅｌ群）。比較のため、未処理群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）およびＰＢＳ含有ゲルを埋入した群（ＰＢＳ  ｉｎ  Ｇｅｌ群）、ゲルを埋入して別にＰＣＳＫ９ＢＮＡを投与した群（Ｇｅｌ＋ＢＮＡ群）を設けた。【０１８３】
埋入または投与後、３日間および１４日間さらに高脂肪食を負荷した後、尾部より採血を行なった。次いで、マウスを麻酔薬ベトルファール、ドミトールおよびドルミカムの混合溶液で麻酔後、ゲルを採取し、ＰＢＳで肝灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、ホモジナイズし、−８０℃にて保存した。解凍した肝臓からＱｕｉｃｋＧｅｎｅＫｉｔを用いて、ｍＲＮＡの抽出を行った。その後のｃＤＮＡの作製、リアルタイムＰＣＲは、実施例１０と同様に行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。また、実施例１０と同様にして血清総コレステロール値およびＶＬＤＬ−Ｃを定量した。３日後のｍＲＮＡ量の結果を図２８に示し、血清総コレステロール値の結果を図２９に示す。また、３日後および１４日後のＶＬＤＬ−Ｃの結果を図３０に示す。【０１８４】
図２８から明らかなように、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの腹腔内投与または皮下投与にかかわらず、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現量は著しく低下した。一方、図２９から明らかなように、血清総コレステロール値の著しい低下は、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有アテロコラーゲンゲルを用いた群（ＢＮＡ  ｉｎ  Ｇｅｌ群）でのみ見られた。これより、ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの直接的な投与方法に比べてアテロコラーゲンゲルから徐放化させる投与方法が効率的な治療効果を奏する可能性が示された。図３０から明らかなように、ＶＬＤＬ−Ｃは３日後に著しく低下したが、１４日後には未処理群と同等にまで回復した。【０１８５】
（実施例２４）ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルからのＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの徐放治療実験
表８に示す２−ミクログロブリンを模倣したペプチド配列よりなるペプチド性インジェクタブルハイドロゲルをＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの徐放用担体として用いた（表８中のペプチド１〜４のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３６〜３９に対応する）。ペプチドは、Ｆｍｏｃ固相法によって合成し、１質量％の濃度でＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解させてオリゴヌクレオチドと複合させた。ペプチド３および４は１０％ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏを溶媒としたときに均一なゲルを形成した。特にペプチド４ハイドロゲルは、５分以内の速やかなゲル化特性を示し、表９に示すように濃度依存的に高い弾性率を示した。【０１８６】
【表８】
0005875006.tif 000023
【０１８７】
【表９】
0005875006.tif 000024
【０１８８】
ペプチド４水溶液（ペプチド濃度：１質量％；ＤＭＳＯ濃度：１０(v/v)％）０．１ｍＬに３μｇのＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを混合し、室温にて放置してＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。【０１８９】
被験動物として５週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本ＳＬＣ）を用いた。ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）に埋入した。埋入後、３日後にマウスをベトルファール、ドミトール、ドルミカムの混合溶液で麻酔後、ＰＢＳで肝灌流し、肝臓を採取、ＰＢＳで洗浄した後、組織溶解液４ｍｌにて肝臓すべてを溶解し、−８０℃で保存した。解凍した肝臓溶解液からＱｕｉｃｋＧｅｎｅＫｉｔを用いて、ｍＲＮＡの抽出を行った。その後のｃＤＮＡの作製、リアルタイムＰＣＲは、実施例１０と同様に行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。結果を図３１に示す。【０１９０】
図３１から明らかなように、いずれの場合も、肝臓におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現は、有意に抑えられた。【０１９１】
数分でゲル化し、２週間で完全に生体内で消失するペプチド性インジェクタブルハイドロゲルは、オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療徐放剤の担体として有用と考えられる。【０１９２】
（実施例２５）ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルからのＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの徐放化挙動
蛍光色素Ａｌｅｘａ７５０（モレキュラープローブ社製）で標識したＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ（Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ）２０ｍｇをペプチド４水溶液（ペプチド濃度：１質量％；ＤＭＳＯ濃度：１０(v/v)％）１００ｍＬに混合し、室温にて放置してＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。【０１９３】
被験動物として５週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本ＳＬＣ）を用いた。Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを皮下（ｓ．ｃ．）に埋入した。埋入後、Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージャー（Ｍａｅｓｔｒｏ）を用いて、ゲルに残存するＡｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを経時的に定量した。結果を図３２（Ａ）に示す。【０１９４】
図３２（Ａ）から明らかなように、埋入直後に、多くのＡｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡが局所から消失しており十分な徐放化効果が得られなかった。【０１９５】
そこで、Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡがゲル中により長期間保持されるように、Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡに代えて、Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡとポリカチオン（ポリ［メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル］：ＰＤＭＡＥＭＡ；Ｍｎ＝８６０００，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９）との複合体（［ＰＤＭＡＥＭＡの窒素原子数］：［Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡのリン原子数］＝４８：１、室温にて３０分間混合して調製した）を用いて、同様にしてＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡ含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。そして、ゲルを同様にしてマウスに埋入後、Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージャーを用いて、ゲルに残存するＡｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡを経時的に評価した。結果を図３２（Ｂ）に示す。【０１９６】
図３２（Ｂ）から明らかなように、Ａｌｅｘａ７５０−ＰＣＳＫ９−１−ＢＮＡの局所からの消失を大きく抑制することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本研究によれば、ＰＣＳＫ９遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、家族性高コレステロール血症、および心筋梗塞や脳卒中の原因となる高脂血症に対する有効な治療薬として利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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