(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式：
【化１】
0006014640.tif 000037
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を５０重量％〜９９．５重量％含む、レバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項２】
化学式：
【化２】
0006014640.tif 000038
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を５０重量％〜９９．５重量％含む、レバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項３】
レバウジオシドＡ誘導体化合物が化学式：
【化３】
0006014640.tif 000039
を有する請求項１に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項４】
レバウジオシドＡ誘導体化合物が化学式：
【化４】
0006014640.tif 000040
を有する請求項２に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項５】
レバウジオシドＡ誘導体化合物を７５重量％超含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項６】
レバウジオシドＡ誘導体化合物を８５重量％超含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項７】
レバウジオシドＡ誘導体化合物を９５重量％超含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項８】
レバウジオシドＡ誘導体化合物を９７重量％超含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項９】
レバウジオシドＡ誘導体化合物を９９重量％超含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のレバウジオシドＡ誘導体生成物と、少なくとも１つの天然の炭水化物甘味料、少なくとも１つのポリオール、少なくとも１つの天然の高甘味度甘味料、又はこれらの組み合わせを含む少なくとも１つの甘味料と、を含む甘味料組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの天然の炭水化物甘味料が、異性化糖、スクロース、フルクトース、グルコース、Ｄ−タガトース、トレハロース、イソマルト、デキストリン、シクロデキストリン、Ｄ−ガラクトース、ラムノース、プロピレングリコール、エチレングリコール、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の甘味料組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つのポリオールが、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の甘味料組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つの天然の高甘味度甘味料が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ダルコシドＡ、ダルコシドＢ、ルブソシド、ステビア、ステビオシド、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、ローハングオ甘味料、シアメノシド、モナチン及びその塩（モナチンＳＳ、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ）、クルクリン、グリチルリチン酸及びその塩、タウマチン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、ハーナンズルシン、フィロズルシン、グリシフィリン、フロリドジン、トリロバチン、バイユノシド、オスラジン、ポリポドシドＡ、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、ムクロジオシド、フロミソシドＩ、ペリアンドリンＩ、アブルソシドＡ、シクロカリオシドＩ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の甘味料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にレバウジオシドＡの誘導体生成物及びレバウジオシドＡの誘導体生成物を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レバウジオシドＡは、化学構造：
【化１】
0006014640.tif 000002
を有する強力なジテルペノイド配糖体甘味料である。
【０００３】
レバウジオシドＡは、日本、シンガポール、台湾、マレーシア、韓国、中国、イスラエル、インド、ブラジル、オーストラリア及びパラグアイで商業的に栽培される Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｂｅｒｔｏｎｉ）植物（「ステビア」）から、そのほかのステビオール配糖体と共に単離され、抽出される。それは、多数のほかのノンカロリー甘味料より優れた機能特性及び感覚特性を持つ天然のノンカロリー甘味料である。加工された形態のステビアは砂糖よりも７０〜４００倍強力でありうるが、ステビアはまた苦い成分も有する。ステビアに存在する４つの主なジテルペノイド配糖体甘味料のうちでレバウジオシドＡは、最も渋みが少なく、最も苦味が少なく、後味が最も持続しないと特定されている。しかしながら、レバウジオシドＡは依然として砂糖とは区別される風味や味の特徴を示す。従って、レバウジオシドＡを改変して甘味組成物として有用であるが、レバウジオシドＡよりも望ましい風味及び／又は時間的プロファイルを示す新規の化合物を得ることが望ましくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の例となる実施態様は、甘味組成物として有用なレバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法及びそれから製造されるレバウジオシドＡ誘導体生成物を提供することによって上記で特定されたニーズに対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
特に、本明細書で提供される実施態様は、無機酸を伴ったレバウジオシドＡの溶液を約５０℃〜約１１０℃にて十分な時間加熱して反応を完了し、それによってレバウジオシドＡ誘導体生成物を得ることによりレバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法を包含する。
【０００６】
ほかの実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物を含む甘味料が提供される。レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式Ｉ：
【化２】
0006014640.tif 000003
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシルであってもよく；Ｒ２は、水素、ヒドロキシル又はアルコキシであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよく；ｘは単結合又は二重結合であってもよく、ｎは０又は１であり；ｘが単結合である場合、ｎは１であり、Ｒ２は水素、ヒドロキシル又はアルコキシであってもよく；ｘが二重結合である場合、ｎは０である。
【０００７】
ｘが単結合であり、ｎが１である式ＩのレバウジオシドＡ誘導体生成物の特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は化学式ＩＡ：
【化３】
0006014640.tif 000004
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシルであってもよく；Ｒ２は、水素、ヒドロキシル又はアルコキシであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよい。
【０００８】
ｘが二重結合であり、ｎが０である式ＩのレバウジオシドＡ誘導体生成物の別の特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は化学式ＩＢ：
【化４】
0006014640.tif 000005
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシルであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよい。
【０００９】
別の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式：
【化５】
0006014640.tif 000006
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み、
式中、Ｒ４は単糖であってもよい。
【００１０】
さらに別の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式：
【化６】
0006014640.tif 000007
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよい。
【００１１】
さらに別の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式：
【化７】
0006014640.tif 000008
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００１２】
本発明のそのほかの目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかであろう。特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語及び略語のすべては、本発明が属する当該技術における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似する又はそれと同等の方法及び組成物を本発明の実践で使用することができるが、そのような方法及び組成物が本明細書で本発明を限定することを意図することなく、好適な方法及び組成物が記載される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ここで、現在提供されている本発明の実施態様に対して参照が詳細に行われるであろう。本発明の限定ではなく本発明の実施態様の説明を目的として各例が提供される。実際、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明において種々の改変及び変化を為すことができることは当業者に明らかであろう。たとえば、実施態様の１つの一部として説明された又は記載された特徴を別の実施態様で使用して一層さらなる実施態様を与えることができる。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内でそのような改変及び変化を含めることが意図される。
【００１４】
手短に記載すれば、本発明の実施態様は、レバウジオシドＡ誘導体生成物及びレバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法を包含する。特に本明細書で提供される実施態様は、甘味料としての使用に好適なレバウジオシドＡ誘導体生成物を包含する。
【００１５】
Ｉ．レバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法
特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法を提供する。
【００１６】
レバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法は、一般にレバウジオシドＡ化合物を含む粗精製の又は実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物と無機酸又は無機塩基との溶液を調製することと、レバウジオシドＡ誘導体生成物を得るのに十分な時間、レバウジオシドＡ化合物を反応させるのに十分な温度及び圧力に加熱し又は加圧し、又はこれらを組み合わせることと、レバウジオシドＡ誘導体生成物を回収することとを含む。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ化合物を反応させるのに十分な温度は、約５０℃〜約１１０℃、さらに特に約６５℃〜約９５℃、一層さらに特に約７５℃〜約８５℃の範囲内である。当業者に既知の任意の好適な加熱手段を使用して溶液を加熱してもよく、その非限定例には、日光及び高い周囲温度が挙げられる。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ化合物を反応させるのに十分な時間は、約０．５時間〜約２４時間の範囲内である。
【００１７】
本明細書の実施態様で使用するのに好適な無機酸の非限定例には、リン酸、亜リン酸、ポリリン酸、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸二水素ナトリウム及びこれらの組み合わせが挙げられる。本明細書の実施態様で使用するのに好適な無機塩基の非限定例には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びこれらの組み合わせが挙げられる。理論に束縛されることを望まないで、酸の使用がアルケンの水和及び／又はエステルの切断を結果的に生じる一方で、塩基の使用は無機酸の添加を必要とする鹸化反応を結果的に生じ、カルボン酸を再形成すると考えられる。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、粗精製のレバウジオシドＡ組成物は、無水ベースで約８０重量％未満のレバウジオシドＡ化合物、無水ベースで約７０重量％未満、又は無水ベースで約６０重量％未満のレバウジオシドＡ化合物の純度レベルを含む。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、実質的に純粋なレバウジオシドＡ化合物は、無水ベースで８０重量％以上のレバウジオシドＡ化合物から、無水ベースで１００重量％までの、無水ベースで９０重量％を超える、無水ベースで９７重量％を超える、無水ベースで９８重量％を超える、又は無水ベースで９９重量％を超えるレバウジオシドＡ化合物の純度レベルを含む。純度は、本明細書で使用されるとき、未加工の形態又は精製された形態にてレバウジオシドＡ化合物又はレバウジオシドＡ誘導体化合物の重量比率を表す。粗精製のレバウジオシドＡ化合物を精製して実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を得る方法を本明細書の以下に記載する。
【００２０】
得られるレバウジオシドＡ誘導体生成物は一般に上清と沈殿物の混合物を含む。特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物を回収する工程は、上清、沈殿物又はその組み合わせを単離することを含む。レバウジオシドＡ誘導体生成物は、好適な固液分離法を用いて回収してもよい。たとえば、上清と沈殿物の誘導体生成物は、容器を傾けて沈殿物から上清をほかに移すことによって互いに単離してもよい。ほかの分離法は、遠心力を利用してもよく、その非限定例には、縦横穴あきバスケット遠心分離機、固形ボウル遠心分離機、デカンター遠心分離機、皮むき型遠心分離機、押し込み型遠心分離機、ハインケル型遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、及びサイクロン分離が挙げられる。さらに、上清と沈殿物におけるレバウジオシドＡ誘導体生成物の分離は、限定しないでベルト、ドラム、ヌッチェ型、リーフ、プレート、ローゼンムンド型、スパークラー型、及び袋フィルター及びフィルター圧迫の使用を含むが、これらに限定されない加圧法、真空法及び重力濾過法のいずれかによって向上させてもよい。
【００２１】
上清から回収されたレバウジオシドＡ誘導体生成物は任意で水性有機溶液によって清澄化してもよい一方で、沈殿物から回収されたレバウジオシドＡ誘導体生成物は任意で水性有機溶液（たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール又は混合物）に溶解してもよい。
【００２２】
当業者は、レバウジオシドＡ誘導体生成物がその調製後、一般に精製された形態ではないことを十分に理解すべきである。従って、特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約０．５〜約５０重量％の量のレバウジオシドＡ誘導体化合物、又はその間（たとえば、約０．５％〜約４５％、約０．５％〜約４０％、約０．５％〜約３５％、約０．５％〜約３０％、約０．５％〜約２５％、約０．５％〜約１５％、約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約５％など）の量のレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み得る。
【００２３】
ほかの特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物を調製する方法は、レバウジオシドＡ誘導体生成物を精製することをさらに含む。たとえば、正相及び／又は逆相のカラムクロマトグラフィによってレバウジオシドＡ誘導体生成物を上清から又は沈殿物から精製してもよい。レバウジオシドＡ誘導体生成物を精製するために好適なカラムは過度な実験を行うことなく当業者によって決定されてもよい。特定の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物の得られた分画を処理して（たとえば、カラムクロマトグラフィ又はそのほかの精製方法を用いて）レバウジオシドＡ誘導体生成物をさらに精製してもよい。さらにそのほかの実施態様では、当業者に既知の好適な濃縮方法（たとえば、高速液体クロマトグラフィ）を用いてレバウジオシドＡ誘導体生成物の得られた分画を濃縮してもよい。
【００２４】
従って、特定の実施態様は、所望の純度レベルを有するレバウジオシドＡ誘導体生成物を含んでもよい。たとえば、実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜９９．５重量％のレバウジオシドＡ誘導体化合物（無水ベースで）、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％、約９７％〜約９９．５％、約９８％〜約９９．５％、又は約９９％〜約９９．５％のレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、語句「レバウジオシドＡ誘導体生成物」は、「レバウジオシドＡの分解生成物」と同義的であり、個々のレバウジオシドＡ誘導体化合物とレバウジオシドＡ誘導体化合物の組み合わせとの双方を包含する。たとえば、得られたレバウジオシドＡ誘導体生成物の特定の実施態様は、個々のレバウジオシドＡ誘導体化合物、２つのレバウジオシドＡ誘導体化合物の組み合わせ、３つのレバウジオシドＡ誘導体化合物の組み合わせ、４以上のレバウジオシドＡ誘導体化合物の組み合わせなどを含んでもよい。得られるレバウジオシドＡ誘導体生成物はまた残余のレバウジオシドＡ（すなわち、未分解のレバウジオシドＡ）も包含してもよい。
【００２６】
ＩＩ．レバウジオシドＡ誘導体生成物
特定の実施態様では、化学式Ｉ：
【化８】
0006014640.tif 000009
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物が提供され、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシルであってもよく；Ｒ２は、水素、ヒドロキシル又はアルコキシであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよく；ｘは単結合又は二重結合であってもよく、ｎは０又は１であり；ｘが単結合である場合、ｎは１であり、Ｒ２は水素、ヒドロキシル又はアルコキシであってもよく；ｘが二重結合である場合、ｎは０である。
【００２７】
本明細書で提供されるレバウジオシドＡ誘導体生成物が化学式Ｉを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物に関して説明されるとき、（Ｒ，Ｓ）によって示されるような複数の立体中心を有してもよいことを当業者は十分に理解すべきである。
【化９】
0006014640.tif 000010
【００２８】
１以上の立体中心を含むレバウジオシドＡ誘導体化合物の実施態様では、各立体中心は、空間における原子の配置及び配向によってＲ又はＳの立体配置のいずれかである。特に示されない限り、本明細書で提供されるレバウジオシドＡ誘導体化合物の実施態様は、好適な立体化学配置を含んでもよいことが理解されるべきである。たとえば、特定の実施態様では、化学式Ｉを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物は以下の化学構造を有する：
【化１０】
0006014640.tif 000011
【００２９】
ｘが単結合であり、ｎが１である式ＩのレバウジオシドＡ誘導体生成物の実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体化合物は化学式ＩＡ：
【化１１】
0006014640.tif 000012
を有し、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシルであってもよく；Ｒ２は、水素、ヒドロキシル又はアルコキシであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよい。
【００３０】
Ｒ１が３つの糖を含むオリゴ糖を含み、Ｒ２がヒドロキシルを含み、Ｒ３がカルボキシル置換された糖を含む式ＩＡのレバウジオシドＡ誘導体化合物の下位実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式ＩＩ：
【化１２】
0006014640.tif 000013
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００３１】
Ｒ１が３つの糖を含むオリゴ糖を含み、Ｒ２がヒドロキシルを含み、Ｒ３がカルボキシルを含む式ＩＡのレバウジオシドＡ誘導体化合物の別の下位実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式ＩＩＩ：
【化１３】
0006014640.tif 000014
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００３２】
ｘが二重結合であり、ｎが０である式ＩのレバウジオシドＡ誘導体化合物の実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体化合物は化学式ＩＢを有する：
【化１４】
0006014640.tif 000015
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシルであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよい。
【００３３】
Ｒ１が３つの糖を含むオリゴ糖であり、Ｒ３がカルボキシル置換された糖を含む式ＩＢのレバウジオシドＡ誘導体生成物の下位実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式ＩＶ：
【化１５】
0006014640.tif 000016
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００３４】
Ｒ１が３つの糖を含むオリゴ糖であり、Ｒ３がカルボキシル基である式ＩＢのレバウジオシドＡ誘導体生成物の別の下位実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式Ｖ：
【化１６】
0006014640.tif 000017
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００３５】
上文に記載されたように、レバウジオシドＡ誘導体生成物は当業者に既知の好適な立体化学配置を有してもよい。たとえば、化学式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶを有する前述の化合物の特定の立体化学配置は、それぞれ、化学式ＩＩ’、ＩＩＩ’、ＩＶ’及びＶ’：
【化１７】
0006014640.tif 000018
の立体化学配置を有する化合物を含んでもよい。
【００３６】
別の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は化学式ＶＩ：
【化１８】
0006014640.tif 000019
を有する化合物を含み、
式中、Ｒ４は単糖であってもよい。
【００３７】
Ｒ４がグルコースである化学式ＶＩのレバウジオシドＡ誘導体生成物の下位実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は化学式ＶＩＩ：
【化１９】
0006014640.tif 000020
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００３８】
別の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、化学式ＶＩＩＩ：
【化２０】
0006014640.tif 000021
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含み、
式中、Ｒ１は単糖、２若しくは３の糖を含むオリゴ糖、アルキル又はヒドロキシであってもよく；Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換される又は非置換の直鎖、鎖状、分枝鎖又は環状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環又はアシルの基であってもよい。
【００３９】
Ｒ１がメチルであり、Ｒ３がグルコースである式ＶＩＩＩのレバウジオシドＡ誘導体生成物の下位実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は化学式ＩＸ：
【化２１】
0006014640.tif 000022
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００４０】
さらに別の実施態様では、レバウジオシドＡ誘導体生成物は化学式Ｘ：
【化２２】
0006014640.tif 000023
を有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含む。
【００４１】
上文に記載されたように、前述のレバウジオシドＡ誘導体生成物は当業者に既知の好適な立体化学配置を有してもよい。たとえば、化学式ＶＩＩ、ＩＸ及びＸを有する化合物の特定の立体化学配置は、それぞれ、化学式ＶＩＩ’、ＩＸ’及びＸ’：
【化２３】
0006014640.tif 000024
の立体化学配置を有する化合物を含んでもよい。
【００４２】
前に示したように、特定の実施態様は所望の純度レベルで前述のレバウジオシドＡ誘導体生成物を含んでもよい。たとえば、実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、好適な純度レベルの、化学式Ｉを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＩＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＩＶを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式Ｖを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＶＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＶＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＶＩＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式ＩＸを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、化学式Ｘを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００４３】
たとえば、実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式ＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式ＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式ＩＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式ＩＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式ＩＶを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式ＩＶを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式Ｖを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式Ｖを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式ＶＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式ＶＩＩを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式ＩＸを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式ＩＸを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ誘導体生成物は、約５０〜約９９．５重量％（無水ベースで）の化学式Ｘを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよく、約７５％〜約９９．５％、約８０％〜約９９．５％、約８５％〜約９９．５％、約９０％〜約９９．５％、約９５％〜約９９．５％又はその間の量の化学式Ｘを有するレバウジオシドＡ誘導体化合物を含んでもよい。
【００４４】
ＩＩＩ．レバウジオシドＡの精製
レバウジオシドＡ誘導体生成物は、ステビア植物から抽出された未加工の形態又は精製された形態での粗精製のレバウジオシドＡ組成物から得てもよい。特定の実施態様では、それらの開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる、２００６年６月１９日に出願された米国仮出願第６０／８０５，２１６号と２００７年２月１２日に出願された同第６０／８８９，３１８号に対して優先権を主張する２００７年５月２１日に出願された米国特許出願第１１／７５１，６２７号で開示された方法を用いた誘導体に先立ってレバウジオシドＡ組成物を精製する。
【００４５】
手短に説明すると、粗精製のレバウジオシドＡ組成物を再結晶化によって精製してもよい。ＨＰＬＣによって特定される主な不純物は、ダルコシドＡ、ステビオシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＦである。レバウジオシドＤ不純物は、水性有機再結晶化溶媒における水の量を増やすことによって取り除くことができるが、結晶化溶媒における過剰な水含量は結果的にレバウジオシドＡの回収をさらに低くする。レバウジオシドＢは、粗精製のレバウジオシドＡ組成物を水性有機溶液中でスラリーにするか、又は粗精製のレバウジオシドＡ溶液のアニオン交換樹脂による処理を介して十分に低減することができる。従って、精製の方法は、粗精製のレバウジオシドＡ出発物質に存在する不純物に左右される。
【００４６】
例となる実施態様では、粗精製のレバウジオシドＡ組成物を水性有機溶液と混ぜ合わせてレバウジオシドＡ溶液を形成することによってレバウジオシドＡ組成物を精製してもよい。水性有機溶液は、約１０〜約２５重量％の量での水と少なくとも１種の有機溶媒を含む。或いは、水性有機溶液は、約１５〜約２０重量％の量での水と少なくとも１種の有機溶媒を含む。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、水性有機溶液は水と少なくとも１種の有機溶媒の混合物を指す。有機溶媒の非限定例には、アルコール、アセトン及びアセトニトリルが挙げられる。本明細書で使用されるとき、アルコールは、少なくとも１つのヒドロキシル部分に連結された直鎖、分枝鎖又は環状の置換された又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニルを指す。アルコールの非限定例には、エタノール、メタノール、イソプロパノール、１−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール及びイソブタノールが挙げられる。
【００４８】
例となる実施態様では、水性有機溶液は水と少なくとも１種の有機溶媒の混合物を含む。別の例となる実施態様では、少なくとも１種の有機溶媒はアルコールを含み、該アルコールはエタノール、メタノール又はその混合物を含む。少なくとも１種の有機溶媒がエタノールとメタノールの混合物を含む例となる実施態様では、約１部のメタノールに対して約２０部〜約１部のエタノールに及ぶ重量比にて水性有機溶媒においてエタノールとメタノールを混ぜ合わせる。別の例となる実施態様では、約１部のメタノールに対して約３部〜約１部のエタノールに及ぶ重量比にて水性有機溶媒においてエタノールとメタノールを混ぜ合わせる。
【００４９】
例となる実施態様では、レバウジオシドＡ溶液は、約１部の粗精製レバウジオシドＡ組成物に対して約１０〜約４部の水性有機溶媒に及ぶ重量比にて水性有機溶媒と粗精製レバウジオシドＡ組成物を含む。別の例となる実施態様では、レバウジオシドＡ溶液は、約１部の粗精製レバウジオシドＡ組成物に対して約５〜約３部の水性有機溶媒に及ぶ重量比にて水性有機溶媒と粗精製レバウジオシドＡ組成物を含む。
【００５０】
例となる実施態様では、方法はほぼ室温にて実施される。別の実施態様では、方法はさらにレバウジオシドＡ溶液を加熱する工程を含む。実施態様では、レバウジオシドＡ溶液を加熱する工程は、約２０℃〜約７０℃の範囲での、さらに望ましくは約２０℃〜約５０℃の範囲での、一層さらに望ましくは約２０℃〜約４０℃の範囲での温度にレバウジオシドＡ溶液を加熱することを含む。別の実施態様では、レバウジオシドＡ溶液を加熱する工程は、レバウジオシドＡ溶液を還流温度に加熱することを含む。レバウジオシドＡ溶液を加熱する工程は約０．２５時間〜約８時間、レバウジオシドＡ溶液を加熱することを含む。レバウジオシドＡを精製する方法がレバウジオシドＡ溶液を加熱することを含む別の例となる実施態様では、方法はさらにレバウジオシドＡ溶液を冷却する工程を含む。実施態様では、レバウジオシドＡ溶液を冷却する工程は、約４℃〜約２５℃の範囲での温度にレバウジオシドＡ溶液を冷却することを含む。レバウジオシドＡ溶液を冷却する工程は、約０．５時間〜約２４時間、レバウジオシドＡ溶液を冷却することを含む。
【００５１】
レバウジオシドＡを精製する方法はさらに、無水ベースで約９５重量％を超える量でレバウジオシドＡ化合物を含む実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物をレバウジオシドＡ溶液から単一工程で結晶化させる工程を含む。別の例となる実施態様では、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物は、無水ベースで約９７％のレバウジオシドＡ化合物を超える、無水ベースで約９８重量％を超える、又は無水ベースで約９９重量％を超えるレバウジオシドＡの純度レベルを含む。単一の結晶化工程の間、レバウジオシドＡ溶液を撹拌してもよいし、撹拌しなくてもよい。
【００５２】
例となる実施態様では、方法はさらに、レバウジオシドＡの結晶化を促進して純粋なレバウジオシドＡを形成するのに十分なレバウジオシドＡの実質的に純粋な結晶と共に適当な温度にてレバウジオシドＡ溶液を蒔く工程（任意の工程）を含む。実質的に純粋なレバウジオシドＡの結晶化を促進するのに十分なレバウジオシドＡの量は、溶液に存在するレバウジオシドＡの約０．０００１〜約１重量％のレバウジオシドＡの量を含む。別の実施態様では、レバウジオシドＡの結晶化を促進して実質的に純粋なレバウジオシドＡの組成物を形成するのに十分なレバウジオシドＡの量は、約０．０１〜１重量％のレバウジオシドＡの量を含む。蒔く工程の適当な温度は、約１８℃〜約３５℃の範囲での温度を含む。
【００５３】
別の例となる実施態様では、方法はさらに、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を分離し、洗浄する工程を含む。実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物は、遠心力を利用する種々の固液分離法によって水性有機溶液から分離されてもよく、それには、限定しないで、縦横穴あきバスケット遠心分離機、固形ボウル遠心分離機、デカンター遠心分離機、皮むき型遠心分離機、押し込み型遠心分離機、ハインケル型遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、及びサイクロン分離が挙げられる。さらに、分離は、加圧、真空及び重力濾過法によって向上させてもよく、それには、限定しないでベルト、ドラム、ヌッチェ型、リーフ、プレート、ローゼンムンド型、スパークラー型、及び袋フィルター及びフィルター圧迫の使用が挙げられる。レバウジオシドＡの固液分離装置の操作は、連続的であってもよく、半連続的であってもよく又はバッチ方式であってもよい。種々の水性有機溶媒及びその混合物を用いて分離装置にて実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を洗浄してもよい。窒素及びアルゴンを含むが、これらに限定されないいくつもの気体を用いて分離装置にて実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を部分的に又は全体的に乾燥させて残りの液状溶媒を蒸発させることができる。固形物を溶解するか、又は固体形態を維持することによって液体、気体又は機械的な手段を用いて実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を分離装置から自動的に又は手動で取り出してもよい。
【００５４】
さらに別の例となる実施態様では、方法はさらに、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を乾燥させる工程を含む。そのような方法は当業者に既知であり、回転真空乾燥機、流動床乾燥機、回転トンネル乾燥機、プレート乾燥機、トレイ乾燥機、ナウタ型乾燥機、噴霧乾燥機、フラッシュ乾燥機、ミクロン乾燥機、パン乾燥機、高速低速パドル乾燥機、及びマイクロ波乾燥機の使用が挙げられるが、これらに限定されない。例となる実施態様では、乾燥させる工程は、約４０℃〜約６０℃の範囲の温度にて約５時間〜約１００時間、窒素又はアルゴンのパージを用いて実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を乾燥させて残りの溶媒を取り除くことを含む。
【００５５】
粗精製のレバウジオシドＡ混合物がレバウジオシドＤ不純物を実質的に含まない、さらに別の例となる実施態様では、方法はさらに、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を乾燥させる工程に先立って水性有機溶媒と共に実質的に純粋なレバウジオシドＡの組成物をスラリーにする工程を含む。スラリーは、固形物と水性有機溶媒又は有機溶媒の混合物であり、その際、固形物は実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を含み、水性有機溶媒又は有機溶媒にやや溶けにくい。実施態様では、約１部の実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物に対して約１５部〜約１部の水性有機溶媒に及ぶ重量比でスラリーにて実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物と水性有機溶媒が存在する。実施態様の１つでは、スラリーは室温で維持される。別の実施態様では、スラリーにする工程は、約２０℃〜約４０℃の範囲での温度にスラリーを加熱することを含む。約０．５時間〜約２４時間、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物をスラリーにする。
【００５６】
その上さらに別の実施態様では、方法はさらに、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を乾燥させる工程の前に、スラリーの水性有機溶媒から実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を分離し、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を洗浄する工程を含む。
【００５７】
さらなる精製が所望であれば、本明細書で記載されるレバウジオシドＡを精製する方法を繰り返してもよいし、又はたとえば、カラムクロマトグラフィのような代替精製法を用いて実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物をさらに精製してもよい。
【００５８】
純度は、本明細書で使用されるとき、未加工形態又は精製された形態にてレバウジオシドＡ組成物に存在するレバウジオシドＡの重量比率を指す。実施態様の１つでは、レバウジオシドＡ組成物が特定の純度でレバウジオシドＡを含み、組成物の残りはほかのステビオール配糖体、又はレバウジオシドＡではない成分の混合物を含む。組成物の純度は当業者に既知の方法を用いて測定してもよい。そのような方法の１つには高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が挙げられる。当業者は、試料中の湿気は純度測定の精度に影響しうることを十分に理解すべきである。よって、組成物が実質的に乾燥していることが特に望ましい。本明細書で使用されるとき、実質的に乾燥した組成物は約１０重量％までの水分を含む。
【００５９】
ＩＩＩ．レバウジオシドＡ誘導体生成物の用途
レバウジオシドＡ誘導体生成物は単独で使用してもよく、又はその開示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰｒａｋａｓｈらによって２００６年１１月２日に出願された米国特許出願第１１／５５５，９６２号に記載されるような適当なキャリア若しくは充填剤と組み合わせて使用してもよい。さらに、レバウジオシドＡ誘導体生成物を１以上の甘味改善組成物と組み合わせて風味や味の特徴をさらに砂糖のように改善することによってレバウジオシドＡ誘導体生成物の時間的な及び／又は風味のプロファイルを改変してもよい。甘味料及び甘味改善組成物の組み合わせは、その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰｒａｋａｓｈらによって２００６年１１月１７日に出願された米国特許出願第１１／５６１，１５８号に記載されている。さらに、レバウジオシドＡ誘導体生成物は単独で使用してもよく、又はそのほかの天然の及び／又は合成の甘味料及び任意で甘味化組成物中の甘味改善組成物と組み合わせて使用してもよい。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「経口摂取可能組成物」及び「甘味化組成物」は、同義的であり、口に入れられ、口から実質的に出される物質、及び飲まれ、食べられ、飲み込まれ又はさもなければ摂取され、一般に許容される範囲で使用した場合、ヒト又は動物の消費について安全である物質を含む、ヒト又は動物の口に接触する物質を意味する。これらの組成物には、食物、飲料、医薬品、タバコ、栄養製品、経口衛生／化粧製品などが挙げられる。これら製品の非限定例には、非炭酸飲料及び炭酸飲料、たとえば、コーラ、ジンジャーエール、ルートビール、サイダー、果実味の清涼飲料（たとえば、柑橘味の清涼飲料、たとえば、レモンライムやオレンジ）、粉末化清涼飲料など、果実や野菜を起源とするジュース、絞ったジュースなどを含む果実ジュース、果実粒子を含有する果実ジュース、果実飲料、果実ジュース飲料、果実ジュースを含有する飲料、果実風味を伴う飲料、野菜ジュース、野菜を含有するジュース、及び果実と野菜を含有するミックスジュース；スポーツ飲料、エネルギー飲料、水に近い飲料（たとえば、天然又は合成の風味を持つ水）；茶のタイプ又は好みのタイプの飲料、たとえば、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、ウーロン茶など；乳成分を含有する飲料、たとえば、乳飲料、乳成分を含有するコーヒー、カフェオーレ、ミルクティー、果実乳飲料、飲むヨーグルト、乳酸菌飲料など；乳製品；ベーカリー製品；デザート、たとえば、ヨーグルト、ゼリー、飲むゼリー、プリン、ババロア、ブラマンジェ、ケーキ、クルミ入りチョコケーキ、ムースなど、お茶の時間又は食後に食される甘味食品；冷凍食品；冷菓子、たとえば、アイスクリームのタイプ、たとえば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイスなど（甘味料及び種々の原料を乳製品に加え、得られた混合物を撹拌し、凍結する食品）、及び氷菓子、たとえば、シャーベット、デザートアイスなど（種々の原料を砂糖液に加え、得られた混合物を撹拌し、凍結する食品）；アイスクリーム；一般的な菓子、たとえば、焼き菓子又は蒸し菓子、たとえば、ケーキ、クラッカー、ビスケット、豆ジャムなどを詰めたロールパン；餅及びスナック；卓上製品；一般の砂糖菓子、たとえば、チューインガム（たとえば、実質的に水に不溶で噛むことができるゴム基剤、たとえば、ジェツロング、グッタカイゴム又は特定の食料品天然合成樹脂又はワックスを含むチクル又はその代替物を含む組成物を含む）、硬い飴、軟らかい飴、ミント、ヌガーキャンディ、ゼリービーンなど；果実味のソース、チョコレートソースなどを含むソース；食用ゲル；バタークリーム、小麦粉菓子、ホイップクリームなどを含むクリーム；イチゴジャム、マーマレードなどを含むジャム；菓子パンなど及びそのほかのデンプン製品を含むパン；スパイス；焼肉、焼き鳥、バーベキュー肉などに使用される風味つき醤油、並びにトマトケチャップ、ソース、麺類スープなどを含む一般の調味料；ペット、動物及び家畜の製品；加工した農業製品、家畜製品又はシーフード；加工した肉製品、たとえば、ソーセージなど；レトルト食品、ピクルス、醤油に入れた煮沸した保存食、珍味、副食；駄菓子、たとえば、ポテトチップ、クッキーなど；シリアル製品；経口投与される又は口腔で使用される薬剤又は医薬部外品（たとえば、ビタミン剤、咳シロップ、噛むことができる医用錠剤、アミノ酸、苦味のある薬剤又は医薬剤、酸味料など）、その際、薬剤は、固体、液体、ゲル又は気体の形態であってもよく、たとえば、丸薬、錠剤、スプレー、カプセル、シロップ、ドロップ、トローチ剤、散剤などであってもよい；パーソナルケア製品、たとえば、口腔で使用するそのほかの経口組成物、たとえば、口腔清涼剤、うがい剤、口すすぎ剤、練り歯磨き、歯磨き粉、歯磨き剤、口腔スプレー、歯白化剤など；栄養補助食品；煙付き及び煙なしのタバコ製品、たとえば、嗅ぎタバコ、紙巻きタバコ、パイプ及び葉巻タバコを含むタバコ製品、並びにあらゆる形態のタバコ、たとえば、寸断したフィルター、葉、葉柄、茎、均質化した保存した葉、タバコゴミから再構成した結合剤と再構成したタバコ、シートにおける微粒子又はエーテル供給源、ペレット又はそのほかの形態、非タバコ材料から処方されたタバコ代替物、浸漬タバコ又は噛むタバコ；動物飼料；並びに疾患（たとえば、循環器疾患及び血中コレステロールの高値、糖尿病、骨粗鬆症、炎症又は自己免疫疾患）の予防と治療を含む薬効のある利益又は健康利益を提供しうる食物又は食物の一部を含む栄養製品が挙げられる。
【００６１】
一般に、甘味付与組成物に存在する甘味料の量は、特定の種類の甘味化組成物及びその所望の甘さによって広く変化する。当業者は、甘味化組成物に入れる甘味料の適当な量を容易に識別することができる。特定の実施態様では、甘味化組成物のキログラム又はリットル当たり０．５ｍｇ〜５０ｍｇに及ぶ甘味料の量で甘味料を甘味付与組成物に加えてもよい。ほかの特定の実施態様では、当業者は、以下に添付の実施例で提供される例となる感覚データ及び算出された効能を用いて、レバウジオシドＡ誘導体生成物の量を決定し、所望の甘さを達成してもよい。
【００６２】
決してその範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によって本発明をさらに説明する。これに対して、手段は、種々のほかの実施態様、その中の説明を読んだ後、本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、当業者にそれ自体を提案してもよいその改変、及び均等物にあってもよいことが明瞭に理解されるべきである。特に特定されない限り、％は重量による。
【実施例】
【００６３】
実施例１
ｐＨ２の０．１Ｍのリン酸溶液（２００ｍＬ）にレバウジオシドＡ組成物（５ｇ、純度＞９７％）を溶解することによってレバウジオシドＡの溶液を調製した。調製した溶液を８０±５℃にて２４時間分解した。分解の際、残りの白色沈殿物から上清を静かにほかに移し、次いで２５〜５０ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）によって清澄化した。沈殿物を別に１００ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、水で前の総量２００ｍＬに希釈した。
【００６４】
５５℃で維持したＳｙｎｅｒｇ１Ｈｙｄｒｏカラムと三元移動相系を用いて上清と沈殿物の予備分析を行った。分析条件を表２に要約する。ウォーターズ９９６フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器又はＥＳＡコロナ充填エアゾール検出器（ＣＡＤ）に連結したウォーターズ２６９５アライアンスシステムを用いてＨＰＬＣ分析を行った。フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｓｙｎｅｒｇ１Ｈｙｄｒｏ（４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いて最終試料の分析を行った。
【表１】
0006014640.tif 000025
【００６５】
上述の予備分析から分解の際の標的成分の保持時間とその相対的濃度を割り出したが、それを表３に要約する。
【表２】
0006014640.tif 000026
【００６６】
２１５ｎｍに設定したＵＶ−Ｖｉｓ検出器に連結したウォーターズデルタプレップＬＣモデル２０００／４０００によって、誘導体レバウジオシドＡの上清と沈殿物から単離した上清と沈殿物を処理した。事前混合した移動相（Ａ）７５：２５の水／アセトニトリル（ＭｅＣＮ）と（Ｂ）６０：４０の水／ＭｅＣＮと共にウォーターズシンメトリーＣ１８（１０μｍ）のカラム（７７×２５０ｍｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣ分離を行い、正相の分離はＡｚｋｏノベルクロマシルシリカ（１０μｍ）カラム（７７×２５０ｍｍと７７×３００ｍｍ）を用いて実施した。方法は、流速１５０ｍＬ／分と共に１００％Ａから１００％Ｂへの６０分間の勾配から成った。上清及び沈殿物の溶解に続いて、インラインの２０μｍのステンレススチールのフィルターを用いて溶液を調製用カラムに直接注入した。検体の以下の組成を有する３つの調製用分画を精製において回収した：（１）誘導体生成物１、（２）誘導体生成物２及び３と残りのレバウジオシドＡの混合物、並びに（３）誘導体生成物４と残りのレバウジオシドＡの混合物。４つの誘導体の化学構造は以下のとおりである。最初の数字は試料の確認番号（たとえば、誘導体生成物１、２、３又は４）を表し、ローマ数字は上文で示した相当する化学式番号を表す。
【化２４】
0006014640.tif 000027
【００６７】
誘導体生成物４は主として沈殿物から単離されたが、残りの検体（１、２及び３）は主として上清から単離された。調製用精製から回収された分画を固相抽出（ＳＰＥ）によってさらに濃縮した。９５：５の水／ＭｅＣＮで平衡化した７７−ｍｍのシンメトリーＣ１８カラムに水溶液を直接充填した。１カラム容量の９５：５の水／ＭｅＣＮでカラムを洗浄し、次いで１５：８５の水／ＭｅＣＮで試料をカラムから溶出した。その後、Ｂｕｃｈｉ回転エバポレータＲ−１１４型を用いて３０〜３５℃にて真空で分画を濃縮した。ＫｉｎｅｔｉｃｓＦｌｅｘｉドライパーソナル又はＳａｖａｎｔＳｕｐｅｒＭｏｄｕｌｏフリーズドライヤーを用いて最低１２時間、試料を凍結乾燥した。
【００６８】
各誘導体生成物の精製後、１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ（相関分光法）、及びＨＳＱＣ（異核単一量子相関）核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）及び質量分光分析（ＭＳ）によって各化合物を特徴付けた。１０μｍのフローセルを持つ逆検出キャピラリープローブを伴ったブルカーＤＲＸ５００ＭＨｚ装置にてＮＭＲデータを生成した。１００μｇ〜０．５ｍｇのサイズ範囲に及ぶ各誘導体生成物の試料を０．５ｍＬのＣＤ３ＯＤに溶解し、残った溶媒のシグナル（ＣＤ３ＯＤについてδＨ３．３０、δＣ４９．０）に対してスペクトルを参照した。ＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙイオン化源を装備したＳｃｉｅｘＡＰＩ２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ三連四重極質量分析計によって質量分光分析のデータを生成した。１：１：０．０１のアセトニトリル−Ｈ２Ｏ−ＨＯＡｃによって各誘導体生成物を希釈し、搭載されたシリンジポンプを用いた注入によって導入した。試料を希釈して良好なｓ／ｎ、通常０．１ｍｇ／ｍＬを得た。
【００６９】
誘導体生成物１の精製
上記の逆相を用いて得られた検体の第１の分画は、＞９５％の純度（曲線下面積、ＡＵＣ）を持つ誘導体生成物１を提供した。その後、溶液を真空で濃縮し、凍結乾燥した。最終的な凍結乾燥に先立って、試料を８０：２０の水／エタノール（ＥｔＯＨ）２５０ｍＬに溶解し、ステンレススチールの篩を介して濾過して試料から粒状物を除いた。
【００７０】
誘導体生成物１は、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１６−ヒドロキシカウラン１８−酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルとして特定された。１Ｈ-ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、０．９０（ｍ，１Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、０．９８（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、１．０７（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．１０（ｍ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．２０（ｓ，３Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．２５（ｓ，３Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、１．３６（ｍ，１Ｈ、Ｃ７−Ｈ）、１．４２（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．５８（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．５８（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、１．６４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．７４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．７９（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．８０（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．９２（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．９７（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．９８（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、２．０２（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、２．０５（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、３．１５（ｍ，１Ｈ，Ｃ４０−Ｈ）、３．２７（ｍ，１Ｈ，Ｃ３４−Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ，Ｃ２２−Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ，Ｃ２８−Ｈ）、３．７３（ｍ，１Ｈ，Ｃ２９−Ｈ）、４．６７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３３−Ｈ）、４．７０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２７−Ｈ）、４．８８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３９−Ｈ）、５．３７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２１−Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１６．０，１９．８，２０．５，２２．１，２２．８，２８．６，３０．６，３８．７，４１．５，４２．３，４３．０，４４．７，５５．７，５６．１，５８．１，７５．１，７５．７，７８．７，７９．９，８７．５，８７．９，９５．４，９６．９，１０３．６，１０３．９，１７８．３；ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ４４Ｈ７２Ｏ２４についての計算値：９８５．０３、観察値：（［Ｍ］＋）９８５．５、（［Ｍ］−）９８３．６
【００７１】
誘導体生成物２及び３の精製
誘導体生成物２及び３と残りのレバウジオシドＡを含有する検体の第２の分画を凍結乾燥した。２５０ｍｇのアリコートを５０：５０の水／ＥｔＯＨ２５ｍＬに溶解することによって再処理のために凍結乾燥物を調製した。事前に詰めたウォーターズシンメトリーＣ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）と７３：２７の水／ＭｅＣＮの均一濃度の移動相条件を用いた逆相二次精製によって溶液を処理した。流速は７０ｍＬ／分で維持した。二次精製から３つの精製分画：（１）誘導体生成物３と、（２）未分解のレバウジオシドＡと、（３）誘導体生成物２を回収した。単離した誘導体生成物２及び３を真空で濃縮し、その後凍結乾燥した。最終的な凍結乾燥に先立って各試料を１５０ｍＬの水に溶解し、ステンレススチールの篩を介して濾過して試料から粒状物を除いた。
【００７２】
誘導体生成物２は、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−カウル−１５−エン−１８−酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルとして特定された。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、０．８６（ｍ，１Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、０．９７（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、１．０５（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．１１（ｍ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．２１（ｓ，３Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．４８（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．５０（ｍ，２Ｈ，Ｃ６−Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．６（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．６２（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．６６（ｍ，２Ｈ，Ｃ１１−Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．６７（ｍ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．９６（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、２．１３（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、２．２２（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、３．２５（ｍ，１Ｈ，Ｃ４０−Ｈ）、３．２７（ｍ，１Ｈ，Ｃ３４−Ｈ）、３．３５（ｍ，１Ｈ，Ｃ２２−Ｈ）、３．３８（ｍ，２Ｈ，Ｃ３０−Ｈ，Ｃ４１−Ｈ）、３．４６（ｍ，１Ｈ，Ｃ２３−Ｈ）、３．６１（ｍ，１Ｈ，Ｃ２８−Ｈ）、３．７３（ｍ，１Ｈ，Ｃ２９−Ｈ）、４．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２７−Ｈ）、４．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３３−Ｈ）、４．８０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３９−Ｈ）、５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、５．３９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２１−Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１２．１，１５．８，１９．９，２１．５，２８．７，３０．５，３８．８，４０．５，４１．６，４８．４，４８．９，５７．９，７５．２，７９．９，８７．２，９５．４，９６．９，１０３．４，１０４．０，１３６．９；ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３についての計算値：９６７．０１、観察値：（［Ｍ］＋９６７．４、（［Ｍ］−）９６５．８。
【００７３】
誘導体生成物３は、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１６−ヒドロキシカウラン−１８−酸して特定された。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、０．９３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、０．９８（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、１．０（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．０４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．０７（ｍ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．１７（ｓ，３Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．２７（ｓ，３Ｈ，Ｃｉ７−Ｈ），１．３７（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．４２（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、１．５８（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．６０（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、１．６５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ），１．８（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．８２（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．８５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．８６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．９４（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ），１．９７（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．９８（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、２．１２（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、３．１２（ｄｄ，Ｊ＝８．２及び８．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４０−Ｈ）、３．２５（ｍ，１Ｈ，Ｃ３４−Ｈ）、３．６４（ｍ，１Ｈ，Ｃ２８−Ｈ）、３．７４（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２９−Ｈ）、４．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３３−Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２７−Ｈ）、４．９１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３９−Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３８Ｈ６２Ｏ１９についての計算値：８２２．８９、観察値：（［Ｍ］＋）８２３．６、（［Ｍ］−）８２１．７。
【００７４】
誘導体生成物４の精製
誘導体生成物４と残りのレバウジオシドＡを含有する検体分画の濃縮の際、溶液に白色の沈殿が生じた。定性ワットマンＮｏ．１濾紙を用いて真空下で溶液を濾過した。濾過物を４０℃で約５時間乾燥させた。超音波処理によって１３：８７のジクロロメタン（ＤＣＭ）／ＥｔＯＨに２５０ｍｇのアリコートを溶解することによって再処理のために試料を調製した。注入に先立って、ヘプタンによって試料をさらに２５０ｍＬに希釈した。０．１％の酢酸を伴った７０：３０のヘプタン／ＥｔＯＨの均一濃度条件でＡｓｋｏノベルクロマシルシリカ（１０μｍ）カラム（７７ｍｍ）を用いて溶液をさらに処理した。流速は１４０ｍＬ／分で維持した。単離した誘導体生成物４の分画を真空で濃縮し、その後凍結乾燥した。最終的な凍結乾燥に先立って、１３：８７のＤＣＭ／ＥｔＯＨ３５０ｍＬに試料を溶解し、ステンレススチールの篩を介して濾過して試料から粒状物を取り除いた。
【００７５】
誘導体生成物４は、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−カウル−１５−エン−１８−酸として特定された。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８６（ｍ，２Ｈ，Ｃ１−Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、０．９９（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、１．０２（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．１７（ｓ，３Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．５０（ｍ，２Ｈ，Ｃ７−Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．５２  （ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），１．５８（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．６８（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．６９（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．７２（ｓ，３Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．８６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．９０（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、２．１０（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、２．２３（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、３．１３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４０−Ｈ）、３．２６（ｍ，１Ｈ，Ｃ３４−Ｈ）、３．３５（ｍ，１Ｈ，  Ｃ４１−Ｈ）、３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｃ３０−Ｈ），３．６０（ｍ，１Ｈ，Ｃ２８−Ｈ）、３．７２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２９−Ｈ）、４．６５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３３−Ｈ）、４．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２７−Ｈ）、４．８２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３９−Ｈ）、５．１４（ｓ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１２．２，１６．１，１９．９，２１．６，２９．０，３０．４，３８．７，４０．４，４１．８，４１．２，４４．４，４７．９，４８．８，５７．４，７０．０，７５．１，７６．０，８０．１，８７．５，９１．４，９６．６，１０３．４，１０４．０，１３７．０，１４３．７，１８１．４；ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８についての計算値：８０４．８７、観察値：（［Ｍ］＋）８０５．６，（［Ｍ］−）８０３．６。
【００７６】
誘導体生成物の甘味の特徴付け
強力な甘くする効力を有するということでこれらレバウジオシドＡ誘導体生成物を特徴付けた。特に、５００、１，０００、及び５，０００ｐｐｍでのレバウジオシドＡ誘導体生成物３と４の甘味効力を測定し、同等の甘味レベルでのスクロースに比べて約１００〜約３００倍であることが分かったが、５００、１，０００、及び５，０００ｐｐｍでのレバウジオシドＡ誘導体生成物１と２は、同等の甘味レベルでのスクロースの甘味効力の約５〜２５倍を有することが分かった。さらに、レバウジオシドＡ誘導体生成物３と４は、砂糖に類似する甘くきれいな味を呈する。従って、レバウジオシドＡ誘導体生成物は甘味化組成物のための甘味料としての使用に好適である。
【００７７】
実施例２
ｐＨ２での０．１Ｍのリン酸水溶液（２００ｍＬ）によってレバウジオシドＡ（１００ｍｇ、純度＞９７％）の溶液を調製した。溶液を８０℃で２４時間加熱した。次いでＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分光分析）を用いて誘導体混合物の試料を分析した。陽イオンモードで操作し、イオンスプレーイオン化源を伴ったＳｃｉｅｘＡＰＩ１５０ＥＸ一連四重極と５０℃及び３．５バールで操作するセデレセデックス（Ｓｅｄｅｒｅ  Ｓｅｄｅｘ）７５ＥＬＳＤ（蒸発式光散乱検出器）を用いてＬＣ−ＭＳ分析を行った。表４に要約したＬＣ−ＭＳ法はウォーターズのｄＣ１８（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）のカラムを使用した。
【表３】
0006014640.tif 000028
【００７８】
ＥＬＳＤによって１０．５８分と１５．５２分と２０．２２分にて単一のピークが検出され、それらはそれぞれ、誘導体生成物１と４と５を表した。誘導体生成物２と３は、１２．８０分〜１３．００分にて幅のあるあまりはっきりしないピークを生じた。実施例１で記載されたＮＭＲ及びＭＳ法を含むその後の特徴づけによってこれらのピークの配置を確認した。
【００７９】
ＨＰＬＣによって各試料の精製を行った。フェノメネックスプロジギィ（Ｐｒｏｄｉｇｙ）のＣ１８（１０×２５０ｍｍ）のカラム（１０μｍ）を用いたが、表５はＨＰＬＣ法の条件を要約する。ＥＬＳＤオンラインと共に少量の注入は、ＬＣ−ＭＳによって認められたものに類似したクロマトグラフィのパターンを示した。単離するためにＥＬＳＤをオフラインにして分解混合物を１５ｍＬのＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）に溶解した。各２．０ｍＬの８回の注入にわたって分解混合物を分離した。
【表４】
0006014640.tif 000029
【００８０】
表５におけるＨＰＬＣ法によってたった４つのピークを生じ、それらは１１．４分と、１２．９分と、１４．６分と１８．２分に出現した。その後の特徴づけによって誘導体生成物１と４はそれぞれ１１．４分と１４．６分でのピークに相当することが示された。１０．６ｍｇの誘導体生成物１と４．６ｍｇの誘導体生成物４を回収した。誘導体生成物５は１８．２分に溶出し、４．２ｍｇを回収した。上文で記載したように、誘導体生成物５の構造はＮＭＲ及びＭＳによって解明された。誘導体生成物５の構造は以下のように特定された：
【化２５】
0006014640.tif 000030
【００８１】
誘導体生成物５は、１３−メチル−１６−オキソ−１７−ノルカウラン−１８−酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルとして特定された。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８１（ｓ，３Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、０．９４（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、０．９７（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．２２（ｍ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．２３（ｍ，４Ｈ，Ｃ１１−Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．２４（ｍ，１Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、１．３８（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．４５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．４９（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．５３（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．５６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．６８（ｍ，２Ｈ，Ｃ７−Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．７１（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、１．９０（ｍ，３Ｈ，Ｃ２−Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、２．１８（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、２．６３（ｄｄ，Ｊ＝３．３，１８．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、３．３３（ｍ，１Ｈ，Ｃ２２−Ｈ）、３．６８（ｄｄ，Ｊ＝３．０，１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２６−Ｈ）、３．８２（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２６−Ｈ）、５．３９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２１−Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１３．８，１９．６，１９．９，２１．２，２２．４，２８．８，３８．６，３８．４，４０．６，４２．２，４９．２，５４．９，５５．５，５８．３，６２．２，９５．３；Ｃ２６Ｈ４０Ｏ８について（［Ｍ］＋）４８０．５９；観察値：ＭＳ（ＥＳｌ）：（［Ｍ］＋）４８１．１、（［Ｍ］−）４７９．０。
【００８２】
１２．４分でのＨＰＬＣのピークは、誘導体生成物２及び３双方と未分解のレバウジオシドＡを表した。従って、第２のＨＰＬＣ法を用いて誘導体生成物２と３を単離した。第２のＨＰＬＣ法は、上述の第１の方法の改変であった。第２の方法は、４０分にわたって適用される８０：２０（Ａ：Ｂ）から７０：３０（Ａ：Ｂ）への非常に浅い勾配を用いた。第１のＨＰＬＣ法から１２．４分で回収した物質の１０ｍｇアリコートを２．０ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、試行当たりこの溶液１．０ｍＬを注入した。２回注入を行い、ＥＬＳＤとＵＶによって認められた２つのピークを回収し、乾燥させた。３２．４分と３５．４分におけるピークはそれぞれ、誘導体生成物３と２に相当する。この第２のＨＰＬＣ法によって３ｍｇの誘導体生成物３と３．３ｍｇの誘導体生成物２が得られた。ＮＭＲとＭＳを含む上文に記載されたその後の特徴づけ技法を用いてピークすべての配置を確認した。
【００８３】
実施例３
レバウジオシドＡによって模擬飲料試料を調製し、市販の清涼飲料で使用される処方を模倣した。プロペラミキサー付きのステンレススチール製のヤカンにて、事前に冷やした脱イオン水と、乾燥成分と、リン酸と、レバウジオシドＡ（５００ｍｇ／Ｌ）をｐＨ２．８に混ぜ合わせることによって模擬飲料を調製した。次いで模擬飲料を冷やして容器に詰め、炭酸ガスを飽和させ、フタをした。模擬飲料試料を４０℃にて１０週間保存した。模擬飲料試料の保存によって２つの追加の誘導体生成物６と７を得た。
【００８４】
先ず５バイアルの１０週模擬飲料溶液を合わせ（総体積：約２５０ｍＬ）、減圧下で操作する回転エバポレータによって試料を乾燥させることによって１０週模擬飲料溶液から誘導体生成物６と７を単離した。一連の液体クロマトグラフィ工程を用いて誘導体生成物６と７を単離した。ＨＰＬＣによる分離に先立って、濃縮した物質を６．０ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。フェノメネックスプロジギィのＣ１８（２５０×１０ｍｍ、１０μｍ）のカラムによってＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析の条件を表６に要約する。
【表５】
0006014640.tif 000031
【００８５】
誘導体生成物６は、２０．９分で溶出し、誘導体生成物７は２８．３分で溶出することが認められた。双方のＨＰＬＣピークを回収し、Ｎ２のもとで乾燥させた。各ピークをＬＣ−ＭＳで分析した。陰イオンモードで操作し、イオンスプレーイオン化源を伴ったＳｃｉｅｘＡＰＩ１５０ＭＣＡ一連四重極によってＬＣ−ＭＳ分析を実施した。５０℃及び３．５バールで操作するセデレセデックス７５ＥＬＳ検出器を用いた。フェノメネックスＳｙｎｅｒｇ１Ｈｙｄｒｏカラム（４．６×２５０ｍｍ、４μｍ）を用いて試料の分析を行った。表７はＬＣ−ＭＣ法を要約する。
【表６】
0006014640.tif 000032
【００８６】
ＬＣ−ＭＳによって誘導体生成物７の純度は確認されたが、誘導体生成物６は残余のレバウジオシドＡを含有した。従って、上述した同じカラムを用いた２回目のＨＰＬＣ分離を用いて誘導体生成物６の純粋試料を回収した。表８は、誘導体生成物６の純粋試料を単離するのに使用した第２のＨＰＬＣ法を要約する。
【表７】
0006014640.tif 000033
【００８７】
第２のＨＰＬＣ分析の間で、誘導体生成物６は２１．２分で溶出した。試料を回収し、分析のために乾燥させた。上文に記載されたようなＮＭＲ及びＭＳによって誘導体生成物６と７を特徴付けた。誘導体生成物６と７の構造を以下のように決定した：
【化２６】
0006014640.tif 000034
【００８８】
誘導体生成物６は、１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−カウル−１６−エン−１８−酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルとして特定された。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、０．９８（ｍ，１Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、０．９９（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、１．０６（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．１２（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．２１（ｓ，３Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．４６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．５４（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．５５（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．６７（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．８１（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．８７（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．９４（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ），２．０２（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、２．０５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、２．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、２．１４（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、２．１６（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、２．２７（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、３．１３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４０−Ｈ）、３．２６（ｍ，１Ｈ，Ｃ３４−Ｈ）、３．３５（ｍ，２Ｈ，Ｃ２２−Ｈ，Ｃ４１−Ｈ）、３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｃ３０−Ｈ）、３．７２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２９−Ｈ）、４．６５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３３−Ｈ）、４．８２（ｓ，１Ｈ，Ｃ１７−Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３９−Ｈ）、５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、５．３６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２１−Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１２．２，１６．１，１９．９，２１．６，２９．０，３０．４，３８．７，４０．４，４１．８，４１．２，４４．４，４７．９，４８．８，５７．４，７０．０，７５．１，７６．０，８０．１，８７．５，９１．４，９６．６，１０３．４，１０４．０，１３７．０，１４３．７，１８１．４；Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８について（［Ｍ］＋）８０４．８７；観察値：ＭＳ（ＥＳＩ）：（［Ｍ］＋）８０５．６、（［Ｍ］−）  ８０３１．６。
【００８９】
誘導体生成物７は、１３−ヒドロキシ−カウル−１６−エン−１８酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルとして特定された。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．８５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、０．９８（ｍ，１Ｈ，Ｃ９−Ｈ）、０．９９（ｓ，３Ｈ，Ｃ２０−Ｈ）、１．０６（ｍ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、１．１２（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ５−Ｈ）、１．２１（ｓ，３Ｈ，Ｃ１９−Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．４６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、１．５４（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、１．５５（ｍ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ）、１．６７（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．８１（ｍ，１Ｈ，Ｃ１１−Ｈ）、１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、１．８７（ｍ，１Ｈ，Ｃ１−Ｈ）、１．９４（ｍ，１Ｈ，Ｃ２−Ｈ）、２．０２（ｍ，１Ｈ，Ｃ１２−Ｈ）、２．０５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、２．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ）、２．１４（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１５−Ｈ）、２．１６（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３−Ｈ）、２．２７（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ１４−Ｈ）、３．２６（ｍ，１Ｈ，Ｃ３４−Ｈ）、３．３５（ｍ，１Ｈ，Ｃ２２−Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ，Ｃ２８−Ｈ）、４．５４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２７−Ｈ）、４．５６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３３−Ｈ）、４．８２（ｓ，１Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｃ１７−Ｈ）、５．３６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２１−Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１６．０，１９．９，２２．９，２８．６，３８．７，４１．６，４２．４，４５．０，４８．４，５４．８，５８．４，９５．５，９８．９，１０４．６，１０５．１；Ｃ３ＳＨ６０Ｏｌ８について（［Ｍ］＋）８０４．８７、観察値：ＭＳ（ＥＳＩ）：（［Ｍ］＋）８０５．３、（［Ｍ］−）８０３．５。
【００９０】
実施例４
特定量のスクロースを有する水試料の甘味強度を同一量のレバウジオシドＡ誘導体生成物を有する第２の水試料と比較することによって前述のレバウジオシドＡ誘導体生成物の甘味強度を分析した。得られた感覚データと算出された効力を以下の表９に提供する。
【表８】
0006014640.tif 000035
【００９１】
感覚データは、レバウジオシドＡ誘導体生成物がスクロースの少なくとも３０倍から１２０倍に及ぶ甘味強度を有することを示した。たとえば、３．６重量パーセントのレバウジオシドＡ誘導体生成物１（ＩＩ）の水溶液は同一重量比率のスクロースよりも少なくとも３０倍甘い。従って、誘導体生成物１（ＩＩ）、２（ＩＶ）、３（ＩＩＩ）及び４（Ｖ）をレバウジオシドＡ、ステビオシド、又はそのほかのステビオール配糖体と混合して甘味料の味を調節し得ると考えられる。誘導体生成物１（ＩＩ）、２（ＩＶ）、３（ＩＩＩ）及び４（Ｖ）はまた、そのほかの天然のノンカロリー甘味料、たとえば、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、ローハングオ(Lo Han Guo)甘味料、モナチン、タウマチン、ブラゼイン、ミラクリン、クルクリン又はこれらの混合物と混合してもよい。これらの甘味料とレバウジオシドＡ誘導体生成物を組み合わせることによって、これらの甘味料に一般に起因する所望ではない味又は後味を軽減し得る及び／又は排除し得る。
【００９２】
レバウジオシドＡ誘導体生成物１（ＩＩ）、２（ＩＶ）、３（ＩＩＩ）及び４（Ｖ）の甘味の質を評価し、室温にてレバウジオシドＡ，レバウジオシドＢ、レバウジオシドＦ、及びスクロースのそれと比較した。各特性について、１５ポイントの統一されていない目盛線に基づくスコアを甘味料に与えた。表１０は、甘味料当たり２回の反復の後、各特性について算出された平均スコアとＡＮＯＶＡの結果を示す。多重比較検定、フィッシャーのＬＳＤ５％はスコアの比較分析を助けた。特定の特性について同じ文字で印を付けた試料は、９５％の信頼レベルで有意差がなかった。
【表９】
0006014640.tif 000036
【００９３】
前述の結果によって説明されるように、レバウジオシドＡ誘導体生成物１（ＩＩ）、２（ＩＶ）、３（ＩＩＩ）及び４（Ｖ）は、スクロースと有意差がない多数の感覚特性を有する（すなわち、レバウジオシドＡ誘導体生成物２（ＩＶ）及び４（Ｖ）はスクロースと有意差がない８つの特性を有する）。最も顕著なことに、レバウジオシドＡ誘導体生成物２（ＩＶ）の全体的な風味と甘味がスクロースに匹敵するということは、それが、容易に受け入れられるノンカロリーの甘味料代替物でありうることを示している。
【００９４】
本発明をその特定の実施態様に関して詳細に記載してきたが、前述のことの理解を達成する際、当業者はこれら実施態様の代替物、変異物及び均等物を容易に考え出してもよいことが十分に理解されるであろう。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物のそれとして評価されるべきである。