(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性チオラーゼ；外因性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；外因性クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ；外因性ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、並びに外因性電子伝達フラビンタンパク質Ａ及びＢを含む組換え微生物であって、ガス状基質から１−ブタノール及びその前駆体の少なくとも一つを主要な発酵産物として産生し、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（クロストリジウム・リュングダリイ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ
からなる群から選択される、前記組換え微生物。
【請求項２】
ブチリル−ＣｏＡを産生する、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記微生物が、外因性ホスホトランスブチリラーゼ及び外因性酪酸キナーゼをさらに含み、酪酸を産生する、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記微生物が、内因性又は外因性フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素をさらに含み、ブチルアルデヒドを産生する、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記微生物が、外因性ブタノールデヒドロゲナーゼをさらに含み、１−ブタノールを産生する、請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記微生物が、発酵ブロスのリットル当たり少なくとも０．０７５グラムの１−ブタノールを産生する、請求項５に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記微生物が、発酵ブロスのリットル当たり少なくとも０．０７５〜２０グラムの１−ブタノールを産生する、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
チオラーゼが配列番号１の核酸配列によりコードされ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが配列番号２の核酸配列によりコードされ、クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼが配列番号３の核酸配列によりコードされ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが配列番号４の核酸配列によりコードされ、電子伝達フラビンタンパク質Ａが配列番号５の核酸配列によりコードされ、電子伝達フラビンタンパク質Ｂが配列番号６の核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍである、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
寄託番号ＤＳＭ２４１３８で、ＤＳＭＺに寄託された組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物発酵によるバイオ燃料の産生のための方法、及びこのような方法における使用のために適した遺伝的に改変された微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノールは、年間４５０−５５０万トンの世界的生産を有する広い範囲の工業的用途を伴う重要な原体化学物質である。これは、アクリル酸及びメタクリル酸エステル（被覆、プラスチック、織物、接着剤、等において使用される）、グリコールエーテル（被覆、電子工学）、及び酢酸ブチル（ペンキ、インク、被覆、合成果実芳香）、並びにブチルアミン（殺虫剤及び医薬品の製造）並びにアミン樹脂の製造のための前駆体として使用される。これは、更に溶媒（インク、染料等中の）、抽出剤（薬物並びにアルカロイド、抗生物質、ホルモン、及びビタミンのような天然物質の製造のための）として、並びに凍結防止流体、化粧品及びクロマトグラフィーにおける直接的用途を有する。
【０００３】
ブタノールは、更に第二世代のバイオ燃料としての潜在性を有し、そしてこの文脈において、バイオブタノール（Ｋｏｐｋｅ  ＆  Ｄｕｒｒｅ，２０１０）と呼ばれる。これは、ガソリンと類似の特性を、そしてエタノールより優れた特性を有する。具体的には、これは、高いエネルギー密度のために増加した総走行距離を有し、これは、いずれもの濃度でガソリンに混合することができ（一方、エタノールは８５％までしか混合することができない）、そして吸湿性でも腐食性でもない。
【０００４】
輸送機関のためのバイオ燃料は、ガソリンに対する魅力的な代替品であり、そして低濃度のブレンドとして燃料市場に急速に浸透している。天然の植物の供給源から誘導されるバイオ燃料は、化石供給源から誘導されるもの（ガソリンのような）より更に環境的に適しており、これらの使用は、燃料の燃焼の結果として大気に放出されるいわゆる化石二酸化炭素（ＣＯ２）ガスのレベルの減少を可能にする。更に、バイオ燃料は、多くの地域で現地的に産生することができ、そして輸入化石エネルギー源に対する依存性を減少するために役割を果たすことができる。
【０００５】
バイオ燃料の大部分は、伝統的な酵母による発酵法により産生され、これは、農作物由来の炭水化物を主たる炭素源として使用し、そして第一世代のバイオ燃料ととして知られている。然しながら、これらの農作物は、食料のために必要であり、そして多くの農作物は、更に肥料の形態の高い農業的入力を必要とする。これらの制約は、第一世代のバイオ燃料は、持続不可能であると考えられ、そして達成することができる温室ガスの減少は、制約されることを意味する。第二世代のバイオ燃料の目標は、温室ガス放出を減少し、そして化石燃料への依存性を減少するための、現時点の農作物の非食料部分又は他の工業廃棄物の持続可能な使用である。
【０００６】
最近の１−ブタノール産生は、主としてオキソ合成（Ｗｅｉｓｓｅｒｍｅｌ  ＆  Ａｒｐｅ，２００３）によっている。原油を含む石油化学製品は、分解されて、プロピレンを形成し、これはオキソ合成中で使用される。然しながら、合成法は、再生不能資源の使用を必要とし、そして高価であり、そして形成される産物中で非特異的であることに悩まされる。
【０００７】
ブタノールは、更に最も普通にはアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵である生物学的製造法によって産生することもでき、これは、１９１３年から工業的に使用されている（Ｋｏｐｋｅ  ＆  Ｄｕｒｒｅ，２０１０）。この方法は、アセトンの所望しない副産物を有し、これは、通常ブタノールの約半分の体積で産生され、従ってこれは収率を大幅に減少する。更にこの発酵の方法は、微生物に対するブタノールの毒性によって制約され、これは、増殖が、１．５％のように低いブタノール濃度において、殆ど完全に阻害される結果となる（Ｋｏｐｋｅ  ＆  Ｄｕｒｒｅ，２０１０）。更に、ＡＢＥ発酵法は、原料としてトウモロコシ、デンプン、キャッサバ、及びサトウキビからの糖を使用する。これは、食料ではなく燃料を産生するための耕作地の好ましくない使用をもたらす。これは、更に森林破壊及び砂漠化に関連する問題を悪化させる。
【０００８】
僅かな生命体のみがブタノールを天然に産生することが知られ、そしてそのいずれもが豊富な供給源（一酸化炭素−ＣＯのような）から高収率でブタノールを産生しない。ＣＯからブタノールを天然に産生することが知られた二つの生命体は、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（これは、ごく僅かのみのブタノールを合成する（Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７））、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（これは、主要な発酵産物のエタノール及び酢酸塩の副産物として、低収率の１−ブタノールを産生する（Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００５））である。
【０００９】
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓを含む多くの生命体が遺伝的に改変されて、１−ブタノールを産生する。然しながら、これらの生命体の全ては、なお原料としての糖に依存している（Ｋｏｐｋｅ  ＆  Ｄｕｒｒｅ，２０１０）。２５０種を超えるクロストリジウム種が知られているが、僅かなもののみが遺伝子的に利用可能である。クロストリジウムにおいて天然のコンピテンス（細胞の環境からの細胞外ＤＮＡの取込み）は知られていなく、そして電気的形質転換（electrotransformation）又は接合(conjugation)のみが、形質転換（トランスフォーメーション）のために利用可能な方法である。これらの問題点は、クロストリジウム種を有効に形質転換することにおける有意な困難さを与える。殆どのクロストリジウム種は、一つ又はそれより多い制限／メチル化系を有して、外来及びファージＤＮＡに対して保護し、これは、形質転換が特に困難であり、そして予測不可能であることを意味する。
【００１０】
本明細書中で言及される刊行物の文献的詳細は、本記載の末尾に収集されている。
従来の技術の一つ又はそれより多い不都合を克服すること、或いは少なくとも公共に既知の技術に対する有用な代替技術を提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｐｋｅ  ＆  Ｄｕｒｒｅ，２０１０；
【非特許文献２】Ｗｅｉｓｓｅｒｍｅｌ  ＆  Ａｒｐｅ，２００３；
【非特許文献３】Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７；
【非特許文献４】Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００５。
【発明の概要】
【００１２】
本発明によれば、遺伝的に改変された微生物が、ＣＯを使用して１−ブタノール又はその前駆体を主要な発酵産物として産生することが可能であることが見いだされている。
最初の側面において、本発明は、カルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）酢酸産生性組換え微生物を提供し、これは、１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。
【００１３】
関連する側面において、本発明は、酢酸産生性組換え微生物を提供し、これは、概略１ｍＭ又は発酵ブロスの１リットル当たり０．０７５ｇ／ｌより高い濃度でＣＯを含んでなる基質からの発酵によって、１−ブタノール及び／又はその前駆体を産生することが可能である。
【００１４】
好ましくは、微生物は、ブタノール生合成経路中の一つ又はそれより多い酵素を発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。
一つの態様において、一つ又はそれより多い酵素は：
チオラーゼ
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ
ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
電子伝達フラビンタンパク質Ａ
電子伝達フラビンタンパク質Ｂ
からなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、微生物は、一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。
好ましくは、一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い核酸は、配列番号１から番号６の核酸又は機能的に等価なこれらの変種から選択される。
【００１６】
好ましくは、微生物は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び電子伝達フラビンタンパク質Ｂのそれぞれをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。
【００１７】
好ましくは、微生物は、一つ又はそれより多い、或いは好ましくはそれぞれのチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び電子伝達フラビンタンパク質Ｂをコードするプラスミドを含んでなる。
【００１８】
一つの態様において、微生物は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ及びブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素のそれぞれをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。
【００１９】
好ましくは、微生物は、更に外因性ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含んでなる。好ましくは、プロモーターは、配列番号７又は機能的に等価なその変種に対応する。
【００２０】
好ましくは、プロモーターは、本明細書中で先に言及された一つ又はそれより多い酵素をコードする構築物上に含有される。
一つの態様において、微生物は：
ホスホトランスブチリラーゼ；
酪酸キナーゼ；
フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素；
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ；
ブタノールデヒドロゲナーゼ；
二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼ；
からなる群から選択される一つ又はそれより多い酵素を発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。
【００２１】
一つの態様において、微生物は、一つ又はそれより多いブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼを発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。好ましくは、微生物は、一つ又はそれより多いブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。
【００２２】
一つの態様において、微生物は、一つ又はそれより多いホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼを発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。好ましくは、微生物は、一つ又はそれより多いホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。特別な態様において、微生物は、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼのそれぞれを発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。
【００２３】
一つの態様において、一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い核酸は、本明細書中の以下の表７から１０中に概略示される核酸及び機能的に等価なその変種から選択される。
【００２４】
一つの態様において、微生物は、ブタノールの生合成経路中の酵素の少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、又は少なくとも１２種の酵素を発現するために適合された一つ又はそれより多い核酸を含んでなる。
【００２５】
一つの態様において、微生物は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ、電子伝達フラビンタンパク質Ｂ、並びにブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼ（又は二機能性酵素）の一つ又は両方を発現するために適合された一つ又はそれより多い核酸を含んでなる。
【００２６】
一つの態様において、微生物は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ、電子伝達フラビンタンパク質Ｂ、並びに少なくとも一つのホスホトランスブチリラーゼ及び酪酸キナーゼ、並びにフェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素及びブタノールデヒドロゲナーゼを発現するために適合された一つ又はそれより多い核酸を含んでなる。
【００２７】
好ましくは、微生物は、カルボキシド栄養性酢酸生成菌のグループから選択される。ある態様において、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（クロストリジウム・リュングダリイ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（クロストリジウム・カルボキシディボランス）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ（クロストリジウム・ドラケイ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（クロストリジウム・スカトロゲネス）、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉを含んでなる群から選択される。
【００２８】
好ましくは、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。
一つの態様において、本発明の組換え微生物は、寄託番号ＤＳＭ２４１３８でＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された微生物を定義する特徴を有する。
【００２９】
第２の側面において、本発明は、配列番号２７のヌクレオシド又は機能的に等価なその変種による組換えメチルトランスフェラーゼ遺伝子を提供する。
第３の側面において、本発明は、配列番号２８又は機能的に等価なそのアミノ酸変種によるメチルトランスフェラーゼを提供する。
【００３０】
関連する側面において、本発明は、第２の側面によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなる組換え微生物を提供する。メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、核酸構築物上に存在するか、又は微生物のゲノム中に組込まれることができる。
【００３１】
第４の側面において、本発明は、配列番号１から６をいずれもの順序で含んでなる核酸、又は機能的に等価なその変種を提供する。
好ましくは、核酸は、図２に示す順序で配列番号１から６を含んでなる。
【００３２】
好ましくは、核酸は、更にホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含んでなる。好ましくは、プロモーターは、配列番号７又は機能的に等価なその変種に対応する。
【００３３】
第５の側面において、本発明は、一つ又はそれより多い核酸配列を含んでなる発現構築物を提供し、ここにおいて、構築物は、酢酸産生性微生物中で発現した場合、主要な発酵産物として産生される１−ブタノール及び／又はその前駆体をもたらす。
【００３４】
好ましくは、一つ又はそれより多い核酸配列は、１−ブタノール生合成経路の一部である一つ又はそれより多い酵素をコードする。
好ましくは、核酸は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び／又は電子伝達フラビンタンパク質Ｂをコードする核酸から選択される。
【００３５】
好ましくは、一つ又はそれより多い核酸配列は、配列番号１から配列番号６又は機能的に等価なその変種から選択される。
一つの態様において、核酸は、更にホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸から選択される。
【００３６】
一つの態様において、核酸は、本明細書中の以下の表７から１０に概略示される核酸の群及び機能的に等価なこれらの変種から選択される。
一つの態様において、発現構築物は、ブタノール生合成経路中の少なくとも２種の酵素、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種又は少なくとも１２種の酵素をコードする。
【００３７】
好ましくは、発現構築物は、更にホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーター含んでなる。もう一つの態様において、発現構築物は、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（配列番号４８）、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター（配列番号４７）、Ｒｎｆオペロン（配列番号４９）又はＡＴＰシンターゼオペロン（配列番号５０）のプロモーターのようなもう一つの高度に活性なプロモーターを含んでなる。好ましくは、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターは、配列番号７又は機能的に等価なその変種に対応する。
【００３８】
第６の側面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物を提供する。
第７の側面において、本発明は、第５の側面の発現構築物及び第６の側面のメチル化構築物を含んでなる組成物を提供する。
【００３９】
好ましくは、組成物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する、組換え微生物を産生することが可能である。
第８の側面において、本発明は：
ａ．（ｉ）発現構築物及び（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなる第６の側面によるメチル化構築物のシャトル微生物への導入；
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；
ｃ．シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離；並びに
ｄ．目的微生物への少なくとも発現構築物の導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【００４０】
一つの態様において、工程ｂ．のメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は恒常的である。もう一つの態様において、工程ｂ．におけるメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は導入される。
【００４１】
一つの態様において、メチル化構築物及び発現構築物の両方が工程ｃにおいて単離される。もう一つの態様において、発現構築物が、工程ｃにおいて単離される。
一つの態様において、発現構築物のみが目的微生物に導入される。もう一つの態様において、発現構築物及びメチル化構築物の両方が目的微生物に導入される。
【００４２】
好ましくは、発現構築物は第５の側面において定義されたとおりである。
好ましくは、組換え微生物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
【００４３】
関連する側面において、本発明は：
ａ．配列番号２８又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの発現構築物のメチル化
ｂ．目的微生物への発現構築物の導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【００４４】
好ましくは、発現構築物は、第５の側面において定義したとおりである。
好ましくは、組換え微生物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
【００４５】
好ましくは、メチルトランスフェラーゼは、好ましくは配列番号２７又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現することによって微生物中で産生され、そしてメチルトランスフェラーゼ酵素は単離される。
【００４６】
更なる関連する側面において、本発明は：
ａ．好ましくは配列番号２７又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子のシャトル微生物のゲノムへの導入；
ｂ．シャトル微生物への発現構築物の導入；
ｃ．シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離；及び、
ｄ．目的微生物への少なくとも発現構築物の導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【００４７】
好ましくは、発現構築物は、第５の側面において定義されたとおりである。
好ましくは、組換え微生物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
【００４８】
更なる関連する側面において、本発明は：
ａ．メチルトランスフェラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの第５の側面による発現構築物のメチル化
ｂ．目的微生物への発現構築物の導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供する。
【００４９】
好ましくは、メチルトランスフェラーゼは、第２の側面で定義したとおりのメチルトランスフェラーゼ遺伝子又は第３の側面で定義されたとおりのメチルトランスフェラーゼによってコードされる。
【００５０】
好ましくは、組換え微生物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を、主要な発酵産物として産生する。
第９の側面において、本発明は：
ａ．（ｉ）第５の側面による発現構築物及び（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物のシャトル微生物への導入；
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；
ｃ．シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離；並びに
ｄ．目的微生物への少なくとも発現構築物の導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【００５１】
一つの態様において、工程ｂ．のメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は恒常性である。もう一つの態様において、工程ｂ．におけるメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は誘導される。
【００５２】
一つの態様において、メチル化構築物及び発現構築物の両方が工程ｃにおいて単離される。もう一つの態様において、発現構築物が、工程ｃにおいて単離される。
一つの態様において、発現構築物のみが目的微生物に導入される。もう一つの態様において、発現構築物及びメチル化構築物の両方が目的微生物に導入される。
【００５３】
好ましくは、組換え微生物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。
第１０の側面において、本発明は：
ａ．（ｉ）発現構築物及び（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物のシャトル微生物への導入；
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；
ｃ．シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離；並びに、
ｄ．目的微生物への少なくとも発現構築物の導入；
を含んでなる、１−ブタノール又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【００５４】
一つの態様において、工程ｂ．におけるメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は恒常性である。もう一つの態様において、工程ｂ．におけるメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は誘導される。
【００５５】
一つの態様において、メチル化構築物及び発現構築物の両方が工程ｃにおいて単離される。もう一つの態様において、発現構築物が、工程ｃにおいて単離される。
一つの態様において、発現構築物のみが目的微生物に導入される。もう一つの態様において、発現構築物及びメチル化構築物の両方が目的微生物に導入される。
【００５６】
好ましくは、発現構築物は第５の側面において定義されたとおりである。
好ましくは、メチル化構築物は第６の側面において定義されたとおりである。
第１１の側面において、本発明は、組換え微生物を使用して基質を発酵することを含んでなる、微生物発酵による１−ブタノール及び／又はその前駆体の産生の方法を提供する。
【００５７】
好ましくは、１−ブタノール及び／又はその前駆体は、主要な発酵産物である。
好ましくは、組換え微生物は、第８から第１０の側面のいずれかに記載したとおりである。
【００５８】
好ましくは、１−ブタノール及び／又はその前駆体は、発酵ブロスのリットル当たり概略０．０７５グラム（ｇ／ｌ）から概略２０ｇ／ｌまでの収率で産生される。一つの態様において、収率は、概略０．１５ｇ／ｌから概略１．５４ｇ／ｌまでである。他の態様において、収率は、概略１０ｇ／ｌ、概略５ｇ／ｌ、又は概略２ｇ／ｌである。好ましくは、１−ブタノールの収率は、ブタノールが周囲の媒体に対して毒性となる限度までである。
【００５９】
好ましくは、基質は、ＣＯを含んでなる。好ましくは、基質は、ＣＯを含んでなるガス状基質である。一つの態様において、基質は、工業排気ガスを含んでなる。ある態様において、ガスは、製鋼所排ガス又は合成ガスである。
【００６０】
一つの態様において、基質はＣＯを大部分含有し、典型的には少なくとも約２０％から約１００容量％のＣＯ、２０％から７０容量％のＣＯ、３０％から６０容量％のＣＯ、そして４５％から５５容量％のＣＯである。特別な態様において、基質は、約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％のＣＯ、又は約５５％のＣＯ、或いは約６０容量％のＣＯを含む。
【００６１】
基質が水素を含有することは必要ではないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法による産物形成に対して有害ではない筈である。特別な態様において、水素の存在は、アルコール産生の全体効率の改良をもたらす。例えば、具体的な態様において、基質は、概略２：１、又は１：１、或いは１：２の比のＨ２：ＣＯを含んでなることができる。一つの態様において、基質は、約３０容量％又はそれより少ないＨ２、２０容量％又はそれより少ないＨ２、約１５容量％又はそれより少ないＨ２或いは約１０容量％又はそれより少ないＨ２を含んでなる。他の態様において、基質の流れは、低い、例えば、５％より少ない、又は４％より少ない、又は３％より少ない、又は２％より少ない、又は１％より少ない濃度のＨ２を含んでなるか、或いは実質的に水素を含まない。基質は、更にある程度のＣＯ２を、例えば、約１％から約８０容量％のＣＯ２、又は約１％から約３０容量％のＣＯ２のように含有することができる。
【００６２】
好ましくは、先行する側面のいずれかの方法によって産生された前駆体は、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼの存在中で１−ブタノールに転換される。
【００６３】
好ましくは、微生物は、外因性核酸の導入の前及び後の両方で、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼを産生する。
【００６４】
好ましくは、先行する側面のいずれかの方法によって産生された前駆体は、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ及び／又は二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼの存在中で１−ブタノールに転換される。
【００６５】
好ましくは、微生物は、外因性核酸の導入の前及び後で、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ及び／又は二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼを産生する。
【００６６】
第１２の側面において、本発明は、第１１の側面の方法によって産生された場合、１−ブタノール又はその前駆体を提供する。
第１３の側面において、本発明は、本明細書中で定義されるとおりのメチル化構築物を含んでなるシャトル微生物を提供する。
【００６７】
好ましくは、シャトル微生物は、更に本明細書中で定義されるとおりの発現構築物を含んでなる。
好ましくは、シャトル微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓである。
【００６８】
好ましくは、上述の側面のいずれかのメチル化構築物は、ｌａｃプロモーター及びメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなり、そしてイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって導入される。メチルトランスフェラーゼの発現は、更にａｒａ、ｔｅｔ、又はＴ７のような他の誘導性プロモーター系によって制御することができる。
【００６９】
第１４の側面において、本発明は、配列番号８から１３からなる群から選択される配列を有する核酸を提供する。
第１５の側面において、本発明は、配列番号１６から２３からなる群から選択される配列を有する核酸を提供する。
【００７０】
第１６の側面において、本発明は、少なくとも配列番号７又は機能的に等価なその変種の核酸配列を含んでなる核酸、核酸構築物又は同一物を含んでなるベクター、並びに前記核酸又は核酸構築物或いはベクターを含んでなる微生物を提供する。
【００７１】
第１７の側面において、本発明は、配列番号２８によるメチルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。
第１８の側面において、本発明は、本明細書中の以下の表７から１０に記載される群及びこれらの機能的に等価ないずれもの一つ又はそれより多い変種から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸を提供する。
【００７２】
第１９の側面において、本発明は、本明細書中の以下の表７から１０に記載される群及びこれらの機能的に等価ないずれもの一つ又はそれより多い変種から選択される核酸を含んでなる核酸を提供する。
【００７３】
第２０の側面において、本発明は、本発明の第１８又は第１９の側面の核酸を含んでなる構築物及び微生物を提供する。
第２１の側面において、本発明は、配列番号３２から３８及び１２３から１３５からなる群から選択される配列を有する核酸を提供する。
【００７４】
第２２の側面において、本発明は、本明細書中の以下の表７から１０に記載された群及びこれらの機能的に等価ないずれもの一つ又はそれより多い変種から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提供する。
【００７５】
本発明は、更に広範には、本出願の明細書中で個別に又は集合的に言及され或いは示された部分、要素及び特徴、二つ若しくはそれより多い前記の部分、要素又は特徴のいずれもの或いは全ての組合せにもあると言うことができ、そして本発明が関係する技術における既知の当量を有する具体的な整数が記述された場合、このような既知の当量は、個別に記述されたかのように本明細書中に組込まれるとみなされる。
【００７６】
図面の簡単な説明
全てがその新規な側面と考えられるべき本発明のこれらの及び他の側面は、以下の説明から明白となり、これは、付属する図面を参照して実施例によって与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ＣＯからのブタノール生合成経路を示す。
【図２】図２は、１−ブタノール生合成に関係する遺伝子をコードする例示的な発現プラスミドを示す。
【図３】図３は、ｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄの配列決定の結果を示し、これは、発現プラスミド上に見出された１−ブタノール生合成遺伝子が変異を含まないことを示している。
【図４−１】図４ａ、４ｂ及び４ｃは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＣＡＵ）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＣＬＪ）、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ（ＣＲＡ）及び設計されたメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）遺伝子のヌクレオチド整列を示す。
【図４−２】図４ａ。
【図４−３】図４ａ続き。
【図４−４】図４ａ続き。
【図４−５】図４ｂ。
【図４−６】図４ｂ続き。
【図４−７】図４ｂ続き。
【図４−８】図４ｃ。
【図４−９】図４ｄは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＣＡＵ１＋２）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＣＬＪ）、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ（ＣＲＡ１＋２）及び設計されたメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）からのメチルトランスフェラーゼのアミノ酸整列を示す。
【図５】図５は、本発明の例示的なメチル化プラスミドを示す。
【図６】図６は、単離されたプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の画像を示す。レーン１、６、１１、１６、２１及び２６は、１００ｂｐプラスＤＮＡラダーを示す。レーン２−５は、次の順序：ｅｒｍＢ、ＣｏｌＥ１、ｔｈｌＡ、ｃｒｔのテンプレートとしての本来のメチル化プラスミド混合物によるＰＲＣを示す。レーン７−１０、１２−１５、１７−２０、２２−２５及び２７−３０は、それぞれ次の順序ｅｒｍＢ、ＣｏｌＥ１、ｔｈｌＡ、ｃｒｔのテンプレートとしての４種の異なったクローンから単離されたプラスミドによるＰＣＲを示す。レーン３２−３５は、４種の異なったクローンからのプラスミドプレップを示す。レーン３６は、本来のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３からのプラスミドプレップを示す。
【図７】図７は、ブタノールプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍによる、１−ブタノール産生を示すＨＰＬＣの結果を示す。
【図８】図８は、異種遺伝子の発現に対する適当なプロモーター領域を確認するための、リアルタイムＰＣＲを使用する標準的条件におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍによる典型的な発酵中の２００を超える遺伝子の発現の分析を示す。
【図９】図９は、配列番号１、２及び３の配列を示す。
【図１０】図１０は、配列番号４、５及び６の配列を示す。
【図１１】図１１は、配列番号７、４７、４８、４９及び５０によってコードされたプロモーター領域の配列を示す。
【図１２】図１２は、配列番号１４の配列を示す。
【図１３】図１３は、配列番号１５の配列を示す。
【図１４】図１４は、配列番号２４及び２５の配列を示す。
【図１５】図１５は、配列番号２６の配列を示す。
【図１６】図１６は、配列番号２７の配列を示す。
【図１７】図１７は、配列番号２８の配列を示す。
【図１８】図１８は、配列番号２９の配列を示す。
【図１９】図１９は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ｙ１８１７８，ＧＩ：７２７１１０９）の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を示す。
【図２０】図２０は、配列番号３１の配列を示す。
【図２１】図２１は、配列番号３１の配列を示す。
【図２２】図２２は、配列番号３９：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図２３】図２３は、配列番号４０：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図２４】図２４は、配列番号４１：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号４２：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図２５】図２５は、配列番号４３：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号４４：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図２６】図２６は、配列番号４５：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図２７】図２７は、配列番号４６：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号１１９：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図２８】図２８は、配列番号１２０：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号１２１：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図２９】図２９は、配列番号１２２：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号５１：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図３０】図３０は、配列番号５２：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号５３：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図３１】図３１は、配列番号５４：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号５５：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図３２】図３２は、配列番号５６：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号５７：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図３３】図３３は、配列番号５８：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号５９：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号６０：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
【図３４】図３４は、配列番号６１：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからの酢酸／酪酸キナーゼのヌクレオチド配列；及び配列番号６２：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからの酢酸／酪酸キナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図３５】図３５は、配列番号６３：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のヌクレオチド配列；及び配列番号６４：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図３６】図３６は、配列番号６５：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のヌクレオチド配列；及び配列番号６６：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図３７】図３７は、配列番号６７：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図３８】図３８は、配列番号６８：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図３９】図３９は、配列番号６９：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図４０】図４０は、配列番号７０：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号７１：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図４１】図４１は、配列番号７２：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号７３：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；並びに配列番号７４：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図４２】図４２は、配列番号７５：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号７６：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号７７：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図４３】図４３は、配列番号７８：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号７９：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；並びに配列番号８０：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図４４】図４４は、配列番号８１：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号８２：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号８３：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図４５】図４５は、配列番号８４：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号８５：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列；及び配列番号８６：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号８７：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからの酢酸／酪酸キナーゼのヌクレオチド配列を示す。
【図４６】図４６は、配列番号８８：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからの酢酸／酪酸キナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号８９：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のヌクレオチド配列；及び配列番号９０：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図４７】図４７は、配列番号９１：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のヌクレオチド配列；及び配列番号９２：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図４８】図４８は、配列番号９３：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図４９】図４９は、配列番号９４：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図５０】図５０は、配列番号９５：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図５１】図５１は、配列番号９６：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからの二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号９７：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図５２】図５２は、配列番号９８：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；配列番号９９：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号１００：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図５３】図５３は、配列番号１０１：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号１０２：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号１０３：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図５４】図５４は、配列番号１０４：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号１０５：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；並びに配列番号１０６：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を示す。
【図５５】図５５は、配列番号１０７：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列；及び配列番号１０８：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号１０９：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのヌクレオチド酸配列を示す。
【図５６】図５６は、配列番号１１０：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列；及び配列番号１１１：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列；及び配列番号１１２：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号１１３：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからの酢酸／酪酸キナーゼのヌクレオチド配列を示す。
【図５７】図５７は、配列番号１１４：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからの酢酸／酪酸キナーゼのアミノ酸配列；並びに配列番号１１５：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のヌクレオチド配列；及び配列番号１１６：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図５８】図５８は、配列番号１１７：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のヌクレオチド配列；及び配列番号１１８：Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図５９】図５９は、配列番号１３６：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＣＰ００１６６６．１，ＧＩ：３００４３３３４７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を示す。
【図６０】図６０は、（Ａ）二機能性ブタノール／ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号３９）；（Ｂ）ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号４１）；（Ｃ）ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号４５）；（Ｄ）ブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号５３）；（Ｅ）ブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号５７）；（Ｆ）リン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼ（配列番号５７）；（Ｇ）酢酸／酪酸キナーゼ（配列番号５９）；（Ｈ）アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（配列番号６３）；（ＯＩ）アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（配列番号６５）の遺伝子発現パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下は、本発明の、一般的用語で与えられるその好ましい態様を含む説明である。本発明は、更に本明細書中で以下に“実施例”の表題で与えられる開示から明らかにされ、これは、本発明を支持する実験データ、本発明の各種の側面の具体的な実施例、及び本発明を行う手段を提供する。
【００７９】
特に、密接に関連する微生物Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（クロストリジウム・リュングダリイ）、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉは、一酸化炭素からのバイオ燃料としてのエタノールの産生のために有用であることが知られている。ガス状基質からバイオ燃料として１−ブタノールを産生するために、このような生命体のための普遍的なトランスフォーメーション系が開発され、そしてＣＯからの主要な発酵産物としての１−ブタノールの産生が示される。
【００８０】
本発明人等は、１−ブタノールの生合成経路（図１）中のタンパク質をコードする特定の遺伝子が、酢酸産生性微生物中に導入された場合、このような微生物が、ガス状基質を使用して、１−ブタノール又はその前駆体を主要な発酵産物として産生することが可能であることを見出してた。幾つかの改変されていない微生物が１−ブタノールを産生することが知られているが、このような改変されていない微生物によってＣＯから産生される１−ブタノールの収率は、非常に低い。結果として、ガス状基質からのバイオ燃料の産生のためのこれらの有用性は、その低い効率及びそれに続くの実用化の欠如のために、極めて制約される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍは、エタノール、酢酸、２，３−ブタンジオール及び乳酸を天然に産生するが、しかし１−ブタノールを産生することは知られていない。
【００８１】
図１に示すように、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯをアセチル−ＣｏＡに転換する。この化合物は、更に酢酸産生性微生物中で、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼ酵素の作用によって、１−ブタノールに転換することができる。本発明の特別な態様において、微生物は、配列番号１から４の核酸によってコードされ得る最初の四つの酵素又は機能的に等価なこれらの変種を発現する。本発明は、組換え核酸並びに天然に存在する酵素によってコードされる酵素の作用によるアセチル−ＣｏＡの１−ブタノールへの転換を促進する微生物を提供する。本発明は、更に、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路又はブタノール生合成経路の他の段階の酵素をコードする他の組換え核酸配列を発現する微生物の使用を提供する。本発明人は、更に多くの新規な酵素及び核酸を確認している。
【００８２】
天然のコンピテンス（形質転換受容性、細胞の環境からの細胞外ＤＮＡの取込み）がクロストリジウムにおいて知られていなく、そして電気的形質転換又は接合のみが形質転換のために利用可能な方法である。これらの問題点は、クロストリジウム種を有効に形質転換することにおける有意な困難さを与える。更に、クロストリジウムにおいて見いだされる制限／メチル化系は、外来及びファージＤＮＡに対して保護し、そしてその遺伝子的形質転換を特別に面倒にする。幾つかのクロストリジウム系（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ３５３１９、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（ボツリヌス菌）ＡＴＣＣ２５７６５、及びＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ディフィシレ菌）ＣＤ３及びＣＤ６）の形質転換は、ＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ中でｉｎ  ｖｉｖｏでメチル化されるか、又は形質転換の前に特異的パターンでｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化される場合にのみ可能であることが示された（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｊｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。然しながら、正確なメチル化のパターンの決定は、非特異的エキソヌクレアーゼ、等のためにしばしば不可能である。更に、多くのクロストリジウム種は、更に制限系を保有し、これは、ＤＮＡを消化し、これは、特異的な（“間違った”）位置でメチル化される。
【００８３】
上述の主要なハードルが、本発明の組換え微生物を開発することにおいて本発明人等によって克服された。新規なメチルトランセフェラーゼ遺伝子を含んでなる新規なメチル化系が、天然の酢酸産生性微生物中に存在する天然に存在する制限障害を回避するために開発された。従って、本発明のメチル化法及びメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、微生物中の所望の組換え核酸の有効な導入及び発現を阻害する制限障害を有する多くの適合性の微生物に適用することができる。
【００８４】
定義
本明細書中で言及する場合、“１−ブタノールの前駆体”は、ブチリルＣｏＡ、ブチルる−リン酸、酪酸、及びブチルアルデヒドを含む。
【００８５】
本明細書中で言及する場合、“発酵ブロス”は、少なくとも一つの栄養培地及び細菌細胞を含んでなる培養培地である。
本明細書中で言及する場合、“シャトル微生物”は、その中でメチルトランスフェラーゼ酵素が発現する微生物であり、そして目的微生物とは別個である。
【００８６】
本明細書中で言及する場合、“目的微生物”は、その中で発現構築物上に含まれる遺伝子が発現される微生物であり、そしてシャトル微生物とは別個である。
本明細書中で言及する場合、“主要な発酵産物”は、最高の濃度及び／又は収率で産生される一つの発酵産物を意味することを意図する。
【００８７】
用語“効率を増加すること”、“増加した収率”等は、発酵法に関して使用される場合、制約されるものではないが、発酵を触媒する微生物の増殖の速度、消費される基質（等のような）の体積当たりに産生される所望の産物（アルコールのような）の体積、所望の産物の産生の速度又は産生のレベル、及び発酵の他の副産物と比較した産生される所望の産物の相対比率の一つ又はそれより多くを増加することを含む。
【００８８】
語句“一酸化炭素を含んでなる基質”及び類似の用語は、その中で一酸化炭素が一つ又はそれより多い細菌の系にとって、例えば増殖及び／又は発酵のために利用可能であるいずれもの基質を含むと理解されるべきである。
【００８９】
語句“一酸化炭素を含んでなるガス状基質”及び類似の語句及び用語は、一定のレベルの一酸化炭素を含有するいずれものガスを含む。ある態様において、基質は、少なくとも約２０％から約１００容量％のＣＯ、２０％から７０容量％までのＣＯ、３０％から６０容量％までのＣＯ、そして４０％から５５容量％までのＣＯを含有する。特別な態様において、基質は、約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％のＣＯ、又は約５５％のＣＯ、或いは約６０容量％のＣＯを含んでなる。
【００９０】
基質が何ら水素を含有することは必要ではないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法による産物形成に対して有害ではない筈である。特別な態様において、水素の存在は、アルコール産生の改良された全体効率をもたらす。例えば、特別な態様において、基質は、概略２：１、又は１：１、或いは１：２の比のＨ２：ＣＯを含んでなることができる。一つの態様において、基質は、約３０容量％又はそれより少ないＨ２、２０容量％又はそれより少ないＨ２、約１５容量％又はそれより少ないＨ２或いは約１０容量％又はそれより少ないＨ２を含んでなる。他の態様において、基質流は、低い、例えば、５％より少ない、又は４％より少ない、又は３％より少ない、又は２％より少ない、又は１％より少ない濃度のＨ２を含んでなるか、或いは実質的に水素を含まない。基質は、更にある程度のＣＯ２を、例えば、約１％から約８０容量％のＣＯ２、又は１％から約３０容量％のＣＯ２のように含有することができる。一つの態様において、基質は、約２０容量％より少ない又はそれに等しいＣＯ２を含んでなる。特別な態様において、基質は、約１５容量％より少ないか又はそれに等しいＣＯ２、約１０容量％より少ないか又はそれに等しいＣＯ２、約５容量％より少ないか又はそれに等しいＣＯ２含んでなるか、或いはＣＯ２を含まない。
【００９１】
以下の記載において、本発明の態様は、“ＣＯを含有するガス状基質”を供給し、そして発酵することに関して記載される。然しながら、ガス状基質が、別の形態で提供されることができることは認識されるべきである。例えば、ＣＯを含有するガス状基質は、液体中に溶解されて提供されることができる。本質的に、液体は、一酸化炭素を含有するガスで飽和され、そして次いでこの液体はバイオ反応器に加えられる。これは、標準的な方法論を使用して達成することができる。例として、マイクロバブル分散発生器（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，Ｎｕｍｂｅｒ  ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）を使用することができる。更なる例として、ＣＯを含有するガス状基質は、固体支持体上に吸着させることができる。このような別の方法は、用語“ＣＯを含有する基質”等の使用によって包含される。
【００９２】
本発明の特別な態様において、ＣＯを含有するガス状基質は、工業排気又は廃棄ガスである。“工業排気又は廃棄ガス”は、工業的過程によって産生されるＣＯを含んでなるいずれものガスを含み、そして鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力製造、カーボンブラック製造、及びコークス製造の結果として産生されるガスを含むために幅広く解釈されるべきである。更なる例は、本明細書中のどこかで提供されることができる。
【００９３】
文脈が他に要求しない限り、語句“発酵”、“発酵法”又は“発酵反応”等は、本明細書中で使用される場合、方法の増殖期及び産物生合成期の両方を包含することを意図している。本明細書中で更に記載されるものであるように、バイオ反応器の幾つかの態様は、最初の増殖反応器及び二番目の発酵反応器を含んでなることができる。このように、発酵反応への金属又は組成物の添加は、これらの反応器のいずれか又は両方への添加を含むと理解されるべきである。
【００９４】
用語“バイオ反応器”は、一つ又はそれより多い容器及び／又は塔或いは配管からなる発酵デバイスを含み、これは、連続式撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、バブルカラム、ガスリフト発酵器、静的ミキサー、或いはガス−液接触に適した他の容器又は他のデバイスを含む。本明細書中で以下に記載されるように、幾つかの態様において、バイオ反応器は、最初の増殖反応器及び二番目の発酵反応器を含んでなることができる。このように、バイオ反応器又は発酵反応への基質の添加に言及する場合、これらの反応器のいずれか又は両方への添加を適宜に含むと理解されるべきである。
【００９５】
“外因性核酸”は、これらが導入される微生物の外部に起源する核酸である。外因性核酸は、制約されるものではないが、これらが導入される微生物、これらが導入される生命体と異なった微生物の系又は種含むいずれもの適した供給源から誘導することができるか、或いはこれらは人工的に又は組換え的に作成することができる。一つの態様において、外因性核酸は、これらが導入される微生物内に天然に存在する核酸配列を表し、そしてこれらは、特定の遺伝子の発現又は過剰発現を増加するために導入される（例えば、配列（例えば遺伝子）のコピーの数を増加することによって）。もう一つの態様において、外因性核酸は、これらが導入される微生物内に天然には存在しない核酸配列を表し、そして微生物内に天然に存在しない産物の発現を可能にするか、又は微生物にとって天然の遺伝子の発現を増加する（例えば、プロモーターのような制御要素の導入の場合）。外因性核酸は、これが導入される微生物のゲノムに組込まれるために適合されることができるか、又は余分な染色体状態のままである。
【００９６】
本発明が、これらが実質的に同一の機能を行うことを条件に、本明細書中に具体的に例示される配列と異なった配列の核酸を使用して実施することができることは認識されるべきである。タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列に対して、これは、コードされたタンパク質又はペプチドが、実質的に同一の機能を有することを意味する。プロモーター配列を表す核酸配列に対して、変種の配列は、一つ又はそれより多い遺伝子の発現を促進する能力を有するものである。このような核酸は、本明細書中で“機能的に等価な変種”と呼ばれる。例として、核酸の機能的に等価な変種は、対立遺伝子の変種、遺伝子の断片、変異を含む遺伝子（欠失、挿入、ヌクレオチド置換等）及び／又は多形等を含む。酪酸又はブタノール発酵が可能な他の細菌からの相同遺伝子は、更に本明細書中に具体的に例示した配列の機能的に等価な変種の例と考えることができる。これらは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（クロストリジウム・アセトブチリカム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（クロストリジウム・ベイジェリンキイ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（クロストリジウム・テタニ / 破傷風菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（クロストリジウム・パステリアヌム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（クロストリジウム・クリュイベリ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ（クロストリジウム・セルロボランス）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ウェルシュ菌 / クロストリジウム・パーフリンゲンス）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（クロストリジウム・ボツリヌム / ボツリヌス菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（クロストリジウム・ブチリカム）ＤＳＭ１０７０２株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（クロストリジウム・チロブチリカム）ＡＴＣＣ２５７５５株、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｅｖｏｔｉｉ  ＤＳＭ２０５４８、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのような種の相同遺伝子を含み、これらの詳細は、遺伝子銀行又はＮＣＢＩのようなウェブサイトから公共的に入手可能である。語句“機能的に等価な変種”は、更にその配列が特別の生命体に対するコドン最適化の結果として変化する核酸を含むと解釈されるべきである。本明細書中の核酸の“機能的に等価な変種”は、好ましくは少なくとも概略７０％、好ましくは概略８０％、更に好ましくは概略８５％、好ましくは概略９０％、好ましくは概略９５％又はそれより多い確認された核酸との核酸配列の同一性を有するものである。特別な態様において、本明細書中で定義されるとおりのチオラーゼ遺伝子の機能的に等価な変種は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のａｔｏＡＢ遺伝子（ＮＣ＿０００９１３．２；ａｔｏＡ＝ＧｅｎｅＩＤ：９４６７１９；ａｔｏＢ＝ＧｅｎｅＩＤ：９４６７２７）であることが��きる。本明細書中で定義されるとおりのｅｆｔＡＢ遺伝子の機能的に等価な変種は、Ｔｓａｉ  ａｎｄ  Ｓａｉｅｒ（１９９５）中に見出すことができる。
【００９７】
本発明を、その配列が本明細書中に具体的に例示されるアミノ酸配列と異なる配列のポリペプチドを使用して実行することができることも更に認識されるべきである。これらの変種は、本明細書中で“機能的に等価な変種”と呼ばれることができる。タンパク質又はペプチドの機能的に等価な変種は、興味あるペプチド又はタンパク質と確認され、そして実質的に同一の機能を有するタンパク質又はペプチドと、少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％又はそれより大きいアミノ酸同一性を共有するタンパク質又はペプチドを含む。このような変種は、その範囲に、断片が、欠損が１から５、から１０、から１５、から２０、から２５アミノ酸であることができ、そしてポリペプチドのいずれかの末端において１から２５の残基から延長することができるポリペプチドの切断形態を含んでなるタンパク質又はペプチドの断片を含み、そして、ここにおいて欠損は、領域内のいずれもの長さであることができるか；又は内部部位であることができる。本明細書中の特異的なポリペプチドの機能的に等価な変種は、更に例えば先の段落で例示されたように、細菌の他の種中で相同遺伝子によって発現されたポリペプチドを含むと解釈されるべきである。
【００９８】
“実質的に同一の機能”は、本明細書中で使用される場合、核酸又はポリペプチドが、それが変種であるものの核酸又はポリペプチドの機能を行うことが可能であることを意味することを意図する。例えば、本発明の酵素の変種は、その酵素と同一の反応を触媒することが可能であるものである。然しながら、変種は、それが変種であるもののポリペプチド又は核酸と同一のレベルの活性を有することを意味すると解釈されるべきではない。
【００９９】
機能的に等価な変種が、それが変種であるものの核酸又はポリペプチドと同一の機能を実質的に有するか否かを、いずれもの多くの既知の方法を使用して評価することができる。然しながら、例として、Ｉｎｕｉ  ｅｔ  ａｌ（２００８）中に概略記載された方法を酵素活性を評価するために使用することができる。
【０１００】
“過剰に発現する”、“過剰発現”等の用語及び語句は、本発明に関して使用される場合、同一条件下の親微生物のタンパク質の発現レベルと比較した、一つ又はそれより多いタンパク質の発現のいずれもの増加を含むために幅広く解釈されるべきである。タンパク質が、いずれもの特定のレベルで発現することを意味すると解釈すべきではない。
【０１０１】
“親微生物”は、本発明の組換え微生物を発生するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在するもの（即ち野生型微生物）であるか、又は先に改変されたが、しかし本発明の主題の一つ又はそれより多い酵素を発現又は過剰発現しなかったものであることができる。従って、本発明の組換え微生物は、親微生物中で発現又は過剰発現しなかった一つ又はそれより多い酵素を発現又は過剰発現するために改変されている。
【０１０２】
用語核酸“構築物”又は“ベクター”及び類似の用語は、細胞に遺伝子材料を運搬するためのベヒクルとして使用するために適したいずれもの核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を含むために幅広く解釈されるべきである。この用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミド及び人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物又はベクターは、他の要素、部位及びマーカー間で、一つ又はそれより多い制御要素、複製開始点、マルチクローニング部位及び／又は選択可能なマーカーを含むことができる。一つの特別な態様において、構築物又はベクターは、構築物又はベクターによってコードされる一つ又はそれより多い遺伝子の発現を可能にするために適合される。核酸構築物及びベクターは、裸の核酸、並びに細胞への供給を容易にするための一つ又はそれより多い薬剤と共に処方された核酸を含む（例えば、リポソームと複合した核酸、核酸が含有された生命体）。
【０１０３】
本発明の核酸が、二本鎖及び一本鎖核酸を含むＲＮＡ、ＤＮＡ、又はｃＤＮＡを含むいずれもの適当な形態であることができることは認識されるべきである。
一つの側面において、本発明は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生するためにＣＯを使用することが可能な遺伝子組換え微生物を提供する。微生物は、好ましくは１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する酢酸産生性組換え微生物である。一つの特別な態様において、酢酸産生性組換え微生物は、概略１ｍＭ又は発酵ブロスのリットル当たり０．０７５ｇ／ｌより大きい濃度でＣＯを含んでなる基質からの発酵によって１−ブタノール又はその前駆体を産生することが可能である。
【０１０４】
一つの特別な態様において、微生物は、ブタノール生合成経路中の一つ又はそれより多い酵素を発現或いは過剰発現するために適合された一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。一つの態様において、微生物は、これが誘導される親微生物中には天然には存在しないブタノール生合成経路中の一つ又はそれより多い酵素を発現するか、或いは、親微生物中に天然に存在するブタノール生合成経路中の一つ又はそれより多い酵素を過剰発現するために適合される。
【０１０５】
微生物は、例えば、微生物内の天然の遺伝子の発現を増加する（例えば、遺伝子の発現を推進するためのより強力な又は恒常的なプロモーターを導入することによる）、酵素を発現するためにコードし、そして適合された外因性核酸を導入することによって特定の酵素をコードする遺伝子のコピーの数を増加する、親微生物内に天然には存在しない酵素をコードし、そして発現するために適合された外因性核酸を導入することを含む、多くの組換え法によって、一つ又はそれより多い酵素を発現又は過剰発現するために適合することができる。
【０１０６】
ある態様において、親微生物は、親微生物にとって天然の一つ又はそれより多い遺伝子の増加又は過剰発現、及び親微生物にとって天然ではない一つ又はそれより多い遺伝子の導入の組合せを提供するために形質転換することができる。
【０１０７】
好ましくは、微生物は：チオラーゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ；ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；電子伝達フラビンタンパク質Ａ；及び、電子伝達フラビンタンパク質Ｂからなる群から選択される一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。一つの態様において、一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い核酸は、配列番号１から配列番号６の核酸又は機能的に等価な変種から選択される。
【０１０８】
一つの態様において、組換え微生物は、チオラーゼ（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ：２．３．１．９）（ｔｈｌＡ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．１５７）（ｈｂｄ）、クロトナーゼ／クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ：１．１．１．１５７）（ｃｒｔ又はｃｃｈ）及び／又はブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ４．２．１．５５）（ｂｃｄ）酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を発現するために適合される。一つの態様において、微生物は、これらの酵素の全てを発現するために適合される。更なる態様において、遺伝子は、配列番号１から４又は機能的に等価なこれらの変種から選択される一つ又はそれより多い核酸配列に対応する。本発明の組換え微生物は、更に二つの電子伝達タンパク質を含有することができる。一つの態様において、電子伝達タンパク質は、配列番号５及び６、又は機能的に等価なその変種によってコードされる電子伝達フラビンタンパク質（ＥＣ１．３．９９．２）（ｅｔｆＡＢ）である。これらの電子伝達フラビンタンパク質の使用は、微生物の１−ブタノールを産生する効率を向上する。フラビンタンパク質は、Ｂｃｄの活性のために必要な安定した複合体を提供する。
【０１０９】
一つの特別な態様において、微生物は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び電子伝達フラビンタンパク質Ｂのそれぞれをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。
【０１１０】
一つの態様において、微生物は、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び電子伝達フラビンタンパク質Ｂの一つ又はそれより多くを、好ましくはそれぞれをコードするプラスミドを含んでなる。
【０１１１】
一つの態様において、微生物は別に又は更に：ホスホトランスブチリラーゼ；酪酸キナーゼ；フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素（又は言い換えればアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素）；ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ブタノールデヒドロゲナーゼ；二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される一つ又はそれより多い酵素を発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。
【０１１２】
一つの態様において、微生物は、一つ又はそれより多いブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼを発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。好ましくは、微生物は、一つ又はそれより多いブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。
【０１１３】
一つの態様において、微生物は、一つ又はそれより多いホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼを発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。好ましくは、微生物は、一つ又はそれより多いホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼをコードする一つ又はそれより多い外因性核酸を含んでなる。特別な態様において、微生物は、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼのそれぞれを発現するために適合された外因性核酸を含んでなる。
【０１１４】
一つの態様において、微生物は、１−ブタノール生合成経路中の酵素の少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、又は少なくとも１２種の酵素を発現するために適合された一つ又はそれより多い核酸を含んでなる。
【０１１５】
一つの態様において、微生物は、他のプロモーターも使用することができるが、更に外因性ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含んでなる。好ましくは、このプロモーターは、配列番号７又は機能的に等価なその変種に対応する。好ましくは、プロモーターは、本明細書中で先に言及された一つ又はそれより多い酵素をコードする構築物上に含有される。
【０１１６】
好ましくは、親微生物は、カルボキシド栄養性酢酸産生性細菌の群から選択される。ある態様において、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉを含んでなる群から選択される。
【０１１７】
一つの特別な態様において、親微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ種並びに関連する分離菌を含んでなるエタノール生産、酢酸産生性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、制約されるものではないが、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）［Ａｂｒｉｎｉ  Ｊ，Ｎａｖｅａｕ  Ｈ，Ｎｙｎｓ  Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９４，４：３４５−３５１］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）［Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＳＤ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  ＲＬ，Ｔｒａｎ  ＰＴ，Ｒｏｗｅ  ＭＪ，Ｗａｒｎｅｒ  ＩＬ：Ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ．国際特許２００９，ＷＯ／２００９／０６４２００］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ  ５５３８３）［Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＬＭ，Ｙａｎｇ  Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｒＲＮＡ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９３，４３：２３２−２３６］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）［Ｇａｄｄｙ  ＪＬ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔａｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｗａｓｔｅ  ｇａｓｅｓ．米国特許１９９７，５，５９３，８８６］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｃ−０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）［Ｇａｄｄｙ  ＪＬ，Ｃｌａｕｓｅｎ  ＥＣ，Ｋｏ  Ｃ−Ｗ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ．米国特許２００２，６，３６８，８１９］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｏ−５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）［Ｇａｄｄｙ  ＪＬ，Ｃｌａｕｓｅｎ  ＥＣ，Ｋｏ  Ｃ−Ｗ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ．米国特許２００２，６，３６８，８１９］、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ  Ｐ１１Ｔの系（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）［Ｈｕｈｎｋｅ  ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ  ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８，ＷＯ２００８／０２８０５５］、“Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ”［Ｚａｈｎ  ＪＡ，Ｓａｘｅｎａ  Ｊ，Ｄｏ  Ｙ��Ｐａｔｅｌ  Ｍ，Ｆｉｓｈｅｉｎ  Ｓ，Ｄａｔｔａ  Ｒ，Ｔｏｂｅｙ  Ｒ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈａｔ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ．Ｐｏｓｔｅｒ  ＳＩＭ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，２０１０］のような関連する分離菌、又はＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）のような変異された系を含む。これらの系は、クロストリジウムのｒＲＮＡクラスターＩのサブクラスターを形成し、そしてこれらの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、概略３０％の同様な低いＧＣ含有率と９９％より多く同一である。然しながら、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合及びＤＮＡフィンガープリント法の実験は、これらの系が個別の種に属することを示した［Ｈｕｈｎｋｅ  ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ  ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８，ＷＯ２００８／０２８０５５］。
【０１１８】
このクラスターの全ての種は、類似の形態及び大きさ（対数増殖期細胞は０．５−０．７×３−５μｍ間である）を有し、そして中温性（最適増殖温度は３０−３７℃間）で、そして厳密に嫌気性である［Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＬＭ，Ｙａｎｇ  Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｒＲＮＡ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９３，４３：２３２−２３６；Ａｂｒｉｎｉ  Ｊ，Ｎａｖｅａｕ  Ｈ，Ｎｙｎｓ  Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９４，４：３４５−３５１；Ｈｕｈｎｋｅ  ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ  ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８，ＷＯ２００８／０２８０５５］。更に、これらは全て、同一のｐＨ範囲（ｐＨ４−７．５、５．５−６の最適な初期ｐＨを伴う）、類似の増殖速度を持つＣＯを含有するガス上の強力な独立栄養性増殖、及び主要な発酵最終産物としてのエタノール及び酢酸との類似の代謝特性のような、同一の主要な系統的特色を共有し、そしてある条件下で少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸が形成される。［Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＬＭ，Ｙａｎｇ  Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｒＲＮＡ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９３，４３：２３２−２３６；Ａｂｒｉｎｉ  Ｊ，Ｎａｖｅａｕ  Ｈ，Ｎｙｎｓ  Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９４，４：３４５−３５１；Ｈｕｈｎｋｅ  ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ  ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ  ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８，ＷＯ２００８／０２８０５５］。インドールの産生が、全ての三つの種において同様に観察された。然しながら、種は、各種の糖（例えばラムノース、アラビノース）、酸（例えばグルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えばアルギニン、ヒスチジン）、又は他の基質（例えばベタイン、ブタノール）の基質の利用において違いが出た。更に、幾つかの種は、ある種のビタミン（例えばチアミン、ビオチン）に対して栄養要求体であることが見いだされたが、一方他はそうではなかった。
【０１１９】
一つの態様において、微生物は、外因性核酸の導入の前及び後の両方で、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、及びブタノールデヒドロゲナーゼを産生する。
【０１２０】
一つの態様において、微生物は、外因性核酸の導入の前及び後の両方で、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び／又はブタノールデヒドロゲナーゼを産生する。
一つの特別な態様において、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。
【０１２１】
一つの態様において、本発明の組換え微生物は、寄託番号ＤＳＭ２４１３８でＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された微生物を定義する特徴を有する。
【０１２２】
一つ又はそれより多い外因性核酸は、裸の核酸として親微生物に供給することができるか、又は形質転換過程を容易にするために一つ又はそれより多い薬剤と処方することができる（例えば、リポソームと複合された核酸、核酸が含有された生命体）。一つ又はそれより多い核酸は、適宜に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらに組合せであることができる。
【０１２３】
本発明の微生物は、親微生物及び一つ又はそれより多い外因性核酸から、組換え微生物を産生するための等技術において既知の多くの技術を使用して調製することができる。例のみとして、形質転換（形質移入又は遺伝子移入を含む）は、電気穿孔、共役、又は化学的及び天然の形質転換受容性によって達成することができる。適した形質転換技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９中に記載されている。
【０１２４】
ある態様において、形質転換される微生物中で活性である制限系のために、微生物中に導入するために核酸をメチル化することが必要である。これは、以下に記載され、そして本明細書中の以下の実施例のセクションで更に例示されるものを含む各種の技術を使用して行うことができる。
【０１２５】
もう一つの側面において、本発明は、以下の工程：
ａ．（ｉ）発現構築物及び（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなるメチル化構築物のシャトル微生物への導入；
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；
ｃ．シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離；並びに、
ｄ．一つ又はそれより多い構築物の目的微生物への導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【０１２６】
一つの態様において、工程Ｂのメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、恒常的に発現される。もう一つの態様において、工程Ｂのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、導入される。
【０１２７】
シャトル微生物は、微生物、好ましくは発現構築物を構成する核酸配列のメチル化を容易にする制限陰性の微生物である。特別な態様において、シャトル微生物は、制限陰性のＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓである。
【０１２８】
発現構築物及びメチル化構築物がシャトル微生物中に導入された後、メチル化構築物上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が発現する。一つの態様において、発現が導入されなければならない場合、導入は、本発明の一つの特別な態様において、メチル化構築物は、誘導性ｌａｃプロモーター（好ましくは配列番号２８によってコードされる）を含んでなり、そしてラクトース又はその類似体、更に好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって導入されるが、いずれもの適したプロモーター系によることができる。他の適したプロモーターは、ａｒａ、ｔｅｔ、又はＴ７系を含む。本発明の別の態様において、メチル化構築物プロモーターは、恒常性プロモーターである。
【０１２９】
一つの態様において、発現構築物プロモーターは、恒常性プロモーターであり、これは、好ましくは適当な発酵条件下で高度に活性である。然しながら、誘導性プロモーターを使用することができる。好ましい態様において、発現構築物プロモーターは、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーター、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（配列番号４８）、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター（配列番号４７）、Ｒｎｆオペロン（配列番号４９）又はＡＴＰシンターゼオペロン（配列番号５０）を含んでなる群から選択される。好ましくは、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターは、配列番号７又は機能的に等価なその変種に対応する。図８は、これらのプロモーターに操作可能に連結した遺伝子の発現が、標準的条件下で高いレベルのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ中の発現を有することを示す。
【０１３０】
特別な態様において、メチル化構築物は、シャトル微生物の確認のために特異的な複製開始点を有し、従ってメチル化構築物上に存在するいずれもの遺伝子は、シャトル微生物中に発現される。好ましくは、発現構築物は、目的微生物の確認のために特異的な複製開始点を有し、従って発現構築物上に存在するいずれもの遺伝子は、目的微生物中に発現される。
【０１３１】
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物上に存在する遺伝子のメチル化をもたらす。次いで発現構築物は、多くの既知の方法のいずれか一つによってシャトル微生物から単離されることができる。例のみとして、本明細書中で以下に記載される実施例のセクション中に記載される方法は、発現構築物を単離するために使用することができる。
【０１３２】
一つの特別な態様において、両方の構築物は同時に単離される。発現構築物は、多くの既知の方法を使用して目的微生物中に導入することができる。然しながら、例として、本明細書中の以下の実施例のセクションに記載される方法を使用することができる。発現構築物がメチル化されるため、発現構築物上に存在する核酸配列は、目的微生物中に組込まれ、そして好結果で発現されることが可能である。
【０１３３】
更なる態様において、本発明は：
ａ．好ましくは配列番号２８又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの発現構築物のメチル化；及び
ｂ．好ましくは第５の側面による発現構築物の目的微生物への導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【０１３４】
好ましくは配列番号２７又は機能的に等価なその変種による本発明のメチルトランスフェラーゼ遺伝子が、シャトル微生物中に導入され、そして過剰発現されることができることは意図されている。得られたメチルトランスフェラーゼ酵素は、既知の方法を使用して収集し、そして発現構築物をメチル化するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができ、好ましくは、発現構築物は、第５の側面において定義したとおりである。次いで発現高徳物は、発現のために目的微生物中に導入することができる。好ましくは、組換え微生物は、１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。
【０１３５】
更なる態様において、本発明は：
ａ．好ましくは配列番号２７又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子のシャトル微生物のゲノムへの導入；
ｂ．シャトル微生物への発現構築物の導入；
ｃ．シャトル微生物からの一つ又はそれより多い構築物の単離；及び、
ｄ．目的微生物への少なくとも発現構築物の導入；
を含んでなる組換え微生物を産生する方法を提供し、ここにおいて、発現構築物は、目的微生物中で発現されるべき酵素をコードする一つ又はそれより多い遺伝子を含んでなる。
【０１３６】
好ましくは、配列番号２７によるメチルトランスフェラーゼ遺伝子のシャトル微生物のゲノムへの導入のために、標準的な方法が使用される。メチルトランスフェラーゼは、微生物により恒常的に発現されることができ、そして好ましくは、配列番号２７又は機能的に等価なその変種によるメチルトランスフェラーゼ酵素の産生をもたらす。発現構築物はメチル化され、単離され、そして目的微生物中に導入され、これは、好ましくは、１−ブタノール及び／又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。
【０１３７】
本発明は、更に本明細書中に記載したような組換えメチルトランスフェラーゼ遺伝子又はメチル化構築物を含んでなる微生物を含む。
本発明は、更にＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉからのメチルトランスフェラーゼ核酸配列及び制限障害系の分析後に開発された、ハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号２８）を提供する。
【０１３８】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物中で発現され、これは、発現構築物の配列をメチル化するメチルトランスフェラーゼ酵素の産生をもたらす。メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物の構築物上に存在するか、又はそのゲノム中に組込むことができる。ハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉに対して最適化されたコドンであり、そしてメチル化構築物中に組込むことができる（図５）。メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、もう一つの種の微生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ中で適宜に使用するために最適化されたコドンであることができる。コドンの最適化のための方法は標準的であり、そして当業者にとって既知であるものである（Ｃａｒｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。更に本発明の範囲内に組込まれるものは、配列番号２８に対する、少なくとも７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％又はそれより大きい核酸配列同一性を有するメチルトランスフェラーゼ遺伝子であり、そしてＤＮＡをメチル化することが可能であるポリペプチドを発現する。
【０１３９】
メチル化の方法及びメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、ある範囲の微生物にわたって有用性を有するものであることは当業者によって認識されるものである。一つの態様において、目的微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉを含んでなる群から選択される。一つの特別な態様において、目的微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される。一つの特別な態様において、目的微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。
【０１４０】
本発明は、更に本明細書中に先に記載した本発明の側面４、５、１４、１５、１６、１８、１９及び２１中で概略記載したとおりの各種の核酸又は核酸構築物を提供する。
本発明のもう一つの態様において、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及び電子伝達タンパク質又は機能的に等価なこれらの変種から選択される一つ又はそれより多い酵素をコードする一つ又はそれより多い核酸を含んでなる発現構築物が存在する。好ましくは、電子伝達タンパク質は、電子伝達フラビンタンパク質Ａ又は電子伝達フラビンタンパク質Ｂである。特別な態様において、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び電子伝達フラビンタンパク質Ｂの両方は、発現構築物上に含まれる。
【０１４１】
それぞれの遺伝子及び等価な酵素に対する例示的な配列の情報は、本明細書中の以下の表１中に詳細に記載されるように遺伝子銀行で提供される。当業者は、使用することができる別の遺伝子及び酵素を容易に認識するものである。一つの態様において、酵素は、構築物上にいずれもの順序で、又は図２に示す順序で存在することができる配列番号１から６の核酸によってコードされる。配列番号８から１３及び配列番号１６から２３は、直前の段落で言及された遺伝子をクローンし、そして配列決定するために使用された新規な配列である。
【０１４２】
前駆体から１−ブタノールを得るために、一つ又はそれより多い、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、ホスホトランスブチリラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＥＣ１．２．７．５）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）の活性を必要とすることができる。本発明のアルコールデヒドロゲナーゼは、ブタノールデヒドロゲナーゼである。ある態様において、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、又はホスホトランスブツリラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＥＣ１．２．７．５）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、或いは酵素の両方の組の組合せが必要である。一つの態様において、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼ活性は、二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼによって供給される。これらの各種の酵素は、図１に示したブタノール生合成経路中に示される。幾つかの微生物において、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、及び／又はアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素は、微生物によって天然に発現され、そして従ってブチリル−ＣｏＡの１−ブタノルへの転換を触媒する。
【０１４３】
従って、一つの態様において、発現構築物は、一つ又はそれより多いチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及び電子伝達タンパク質に加えて、或いはその代替として、一つ又はそれより多いホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、フェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、及び二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含んでなる。
【０１４４】
適当な酵素及びアミノ酸の例並びに核酸配列の情報は、制約されるものではないが：Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（ＡＢＲ３５９４７，ＧＩ：１４９９０５１１４）、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＣＡＱ５７９８３，ＧＩ：１８９３１０６２０）、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｕｃｍ（ＡＡＰ４２５６３，ＧＩ：３１０７５３８３）からのＡｌｄのようなブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ；Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＰ＿３４９８９１，ＧＩ：１５８９６５４２）からのＢｄｈＢのようなブタノールデヒドロゲナーゼ；Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＰ＿１４９３２５，ＧＩ：１５００４８６５）からのＡｄｈＥ１又はＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＰ＿１４９１９９，ＧＩ：１５００４７３９）、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ．ＹＰ＿００１３０７４４９，ＧＩ：１５００１５１９５）からのＡｄｈＥ２のような二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼ酵素；Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＰ＿３４８３６８）からのＰｔｂのようなホスホトランスブチリラーゼ；Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  （ＡＡＫ８１０１５．１）からのＢｕｋのような酪酸キナーゼ；Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＰ＿３４８６３７）からのアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素ＡＯＲを含む。本発明に関連する当業者は、本発明において使用する適当な酵素の別の例を容易に認識することができる。本発明人等は、更に本発明において使用することができる多くの新規な酵素及び遺伝子を確認しており、その詳細は、本明細書中の以下の実施例のセクション中に提供される（特に表７から１０を参照されたい）。本発明は、更にこれらの酵素及び遺伝子の機能的に等価な変種、並びに本発明の方法におけるこれらの使用を包含する。
【０１４５】
一つ又はそれより多いこれらの遺伝子の包含は、酪酸の同時産生を完全に回避することを援助し、１−ブタノール産生の効率を増加することができる。本発明は、更に一つ又はそれより多いこれらの酵素を発現し、或いは発現を増加するために適合された一つ又はそれより多い核酸を含んでなる組換え微生物を提供する。
【０１４６】
一つの態様において、核酸（類）は、本明細書中の以下の表７から１０に記載される酵素の群から選択される酵素及び一つ又はそれより多いいずれものこれらの機能的等価物をコードする。特別な態様において、核酸は、本明細書中の以下の表７から１０に記載される核酸の群及び一つ又はそれより多いいずれものこれらの機能的等価物から選択される。
【０１４７】
一つの態様において、発現構築物は、ブタノール生合成経路中の少なくとも２種の酵素、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種又は少なくとも１２種の酵素をコードする。
【０１４８】
好ましくは、発現構築物は、本明細書中で先に記載したような適したプロモーターを更に含んでなる。一つの態様において、プロモーターは、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターである。好ましくは、プロモーターは、配列番号７又は機能的に等価なこれらの変種に対応する。
【０１４９】
好ましい態様において、発現構築物は、前記酵素の全てをコードする核酸を含んでなる。発現構築物が、別の電子伝達タンパク質をコードする核酸を含んでなることができることは当業者によって認識されるものである。
【０１５０】
組換え微生物中で発現されるべき遺伝子は、発現構築物中にいずれもの適当なプロモーターの制御下で構築される。特別な態様において、プロモーターは、その制御下の遺伝子の実質的に恒常的な発現を可能にする。特別な態様において、プロモーターは、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼ（配列番号７）プロモーターである。本発明中で用途を見出すことができる他のプロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（又はＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）からのものを含む。本発明人等は、更にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（図８）中の典型的な発酵条件下で高度に発現される遺伝子に操作的に連結された多くの他のプロモーターを確認した。リアルタイムＰＣＲを使用する典型的な発酵条件中の２００種を超える遺伝子の発現の分析は、多くの適当なプロモーターを確認した。これらは、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（配列番号４８）、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター（配列番号４７）、Ｒｎｆオペロン（配列番号４９）及びＡＴＰシンターゼオペロン（配列番号５０）を含む。発現、好ましくは適当な発酵条件下の高いレベルの発現を指示することができる他のプロモーターが、本発明の好ましい態様に対する代替物として有効なものであることは当業者によって認識されるものである。
【０１５１】
一つの態様において、本発明は、図２に示した順序で配列番号１から６の核酸を含んでなる構築物、組換え微生物又は核酸配列を含んでなる。然しながら、本発明が、核酸配列がいずれもの順序で与えられ、そして一つ又はそれより多い配列が非存在である場合、所望の有用性をなお有することができることは当業者によって認識されるものである。
【０１５２】
もう一つの態様において、本発明は、配列番号７、又は機能的に等価なその変種によって表されるプロモーター配列、前記プロモーターを含んでなる構築物、及び同一物を含んでなる組換え微生物を含んでなる核酸を含んでなる。
【０１５３】
本発明の発現構築物が、プロモーターに加えていずれもの数の制御要素、並びに所望する場合、更なるタンパク質の発現のために適した更なる遺伝子を含有することができることは認識されるものである。一つの態様において、構築物は、一つのプロモーターを含む。もう一つの態様において、構築物は、二つ又はそれより多いプロモーターを含む。一つの特別な態様において、構築物は、発現されるべきそれぞれの遺伝子のために一つのプロモーターを含む。一つの態様において、構築物は、一つ又はそれより多いリボソーム結合部位、好ましくは発現されるべきそれぞれの遺伝子のためのリボソーム結合部位を含む。
【０１５４】
本明細書中で定義される核酸配列及び構築物配列が、リボソーム結合部位及び／又は制限部位のために必要なもののような標準的なリンカーヌクレオチドを含有することができることは当業者によって認識されるものである。このようなリンカー配列は、定義される配列に対して必要であり、そして制約を提供しないと解釈されるべきではない。
【０１５５】
本発明の発現構築物が、酢酸産生性微生物中で発現される場合、微生物は、１−ブタノール又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ又はブタノール生合成経路の異なった工程を触媒する酵素をコードする他の遺伝子も、更に１−ブタノールを主要な発酵産物として産生するための発現構築物中に組込むことができることは意図されている。
【０１５６】
先に定義したとおりの発現構築物及びメチル化構築物が組み合わされて、物質の組成物を提供することは意図されている。このような組成物は、幅広い種類の微生物中の制限障害機構を回避することに特別な有用性を有するが、しかし好ましい態様において、組成物の使用によって産生される組換え微生物は、１−ブタノール又はその前駆体を主要な発酵産物として産生する。
【０１５７】
本発明の発現構築物を含む核酸及び核酸構築物は、当技術において標準的ないずれもの数の技術を使用して構築することができる。例えば、化学的合成又は組換え技術を使用することができる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）中に記載されている。更なる例示的な技術は、本明細書中の以下の実施例のセクション中に記載されている。本質的に、個々の遺伝子及び制御要素は、遺伝子が所望のタンパク質を形成するために発現されることができるように互いに操作可能に連結されるものである。本発明に使用するために適したベクターは、当業者によって認識されるものである。然しながら、例として、次のベクター：ｐＭＴＬ８００００シャトルベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０及び本明細書中の以下の実施例のセクション中に例示されるプラスミドが適していることができる。
【０１５８】
本発明が、新規な核酸及び核酸ベクターを提供する範囲において、これは、更に本明細書中に記載される核酸の少なくとも一部にハイブリッド形成することが可能である核酸、そのいずれか一つに相補的である核酸、又は機能的に等価なこれらのいずれか一つの変種を提供する。このような核酸は、好ましくはこのような核酸、これらのいずれか一つに相補的である核酸、又はこれらのいずれか一つの機能的に等価な変種に、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するものである。“ストリンジェントなハイブリッド形成”は、核酸が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）中に記載されているもののような標準的なハイブリッド形成条件下で標的テンプレートにハイブリッド形成することが可能であることを意味する。このような核酸の最小の大きさが、与えられた核酸及びそれにハイブリッドするように設計された相補配列間で、安定したハイブリッドを形成することが可能な大きさであることは認識されるものである。従って、大きさは、核酸組成物並びに核酸及びその相補性配列間の相同性のパーセント、並びに使用されるハイブリッド形成条件（例えば、温度及び塩濃度）に依存する。一つの態様において、核酸は、少なくとも１０個のヌクレオチドの長さ、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さ、少なくとも、２０個のヌクレオチドの長さ、少なくとも２５個のヌクレオチドの長さ、又は少なくとも３０個のヌクレオチドの長さである。
【０１５９】
本発明の核酸が、二本鎖及び一本鎖核酸を含むＲＮＡ、ＤＮＡ、又はｃＤＮＡを含むいずれもの適当な形態であることができることは認識されるべきである。
本発明は、更に宿主生命体、そして特に、本明細書中に記載されるいずれか一つ又はそれより多い核酸を含んでなる、ウイルス、細菌、及び酵母を含む微生物を提供する。
【０１６０】
本発明は、組換え微生物を使用する、ＣＯを含んでなるガス状基質を発酵することを含んでなる、微生物発酵による１−ブタノール及び／又はその前駆体の産生の方法を提供する。ある態様において、１−ブタノール又はその前駆体は、もう一つの発酵産物（例えば、エタノール）と共に同時産生される。一つの態様において、１−ブタノール又はその前駆体は、主要な発酵産物である。一つの、態様において、組換え微生物は、本明細書中で先に記載されたとおりである。
【０１６１】
一つの態様において、１−ブタノール及び／又はその前駆体は、発酵ブロスのリットル当たり概略０．０７５グラム（ｇ／ｌ）から概略２０ｇ／ｌまでの収率で産生される。一つの態様において、収率は、概略０．１５ｇ／ｌから概略１．５４ｇ／ｌまでである。他の態様において、収率は、概略１０ｇ／ｌ、概略５ｇ／ｌ、又は概略２ｇ／ｌである。好ましくは、１−ブタノールの収率は、ブタノールが、細菌に対して毒性となる限度までである。
【０１６２】
好ましくは、発酵は、本明細書中に記載されるとおりの組換え微生物を使用して１−ブタノール及び／又はその前駆体を産生するために、バイオ反応器中の基質を嫌気的に発酵する工程を含んでなる。
【０１６３】
本明細書中で１−ブタノールの前駆体が言及された場合、これが、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、二機能性ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ／ブタノールデヒドロゲナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、及び／又はフェレドキシン依存性アルデヒド酸化還元酵素の存在中で、１−ブタノールに所望により転換されてもよいことは意図されている。好ましくは、微生物は、組換え核酸の導入の前及び後の両方で一つ又はそれより多いこれらの酵素を産生する。
【０１６４】
本発明の一つの態様において、微生物によって発酵されるガス状基質は、ＣＯを含有するガス状基質である。ガス状基質は、工業過程の副産物として得られるＣＯを含有する廃棄ガス、又は自動車の排気ガスからのような幾つかの他の供給源からであることができる。ある態様において、工業過程は、製鋼所のような鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、石炭のガス化、電力製造、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造及びコークス製造からなる群から選択される。これらの態様において、ＣＯを含有するガスは、いずれもの慣用的な方法を使用して、これが大気中に放出される前に工業過程から捕捉することができる。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素及び水素を含んでなるガス）の成分であることができる。工業過程から産生されるＣＯは、通常フレアで燃焼されて、ＣＯ２を産生し、そして従って本発明は、ＣＯ２温室ガスの放出を減少し、そしてバイオ燃料として使用するためのブタノールを産生することにおいて特別な有用性を有する。ガス状のＣＯを含有する基質の組成にもよるが、これを粉塵の粒子のようないずれもの好ましくない不純物を除去するために、これを発酵に導入する前に処理することも更に好ましいことであることができる。例えば、ガス状基質は、既知の方法を使用して濾過又は洗浄することができる。
【０１６５】
細菌の増殖及びＣＯから１−ブタノールへの発酵が起こるために、ＣＯを含有する基質ガスに加えて、適した液体栄養培地をバイオ反応器に供給する必要があるものであることは認識されるものである。栄養培地は、使用する微生物の増殖を可能にするために十分なビタミン及びミネラルを含有するものである。ＣＯを使用してブタノールを産生するための発酵のために適した嫌気性培地は、当技術において既知である。例えば、適した培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載されている。本発明の一つの態様において、培地は、本明細書中の以下の実施例のセクションに記載されるとおりである。
【０１６６】
発酵は、好ましくはＣＯからブタノールへの発酵が起こるために適当な条件下で行われなければならない。考慮すべき反応条件は、圧力、温度、ガス流量、液体流量、培地ｐＨ、培地レドックス電位、撹拌速度（連続式撹拌タンク反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のＣＯが限度にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び産物の阻害を回避するための最大産物濃度を含む。
【０１６７】
更に、基質流のＣＯ濃度（又はガス状基質中のＣＯ分圧）を増加し、そして従って発酵反応の効率を増加することが、ＣＯが基質である場合しばしば好ましい。増加した圧力で操作することは、ガス相から、ブタノール産生のための炭素源として微生物によってこれが取込まれることができる液相への、ＣＯの移動の速度の有意な増加を可能にする。これは、同様にバイオ反応器が常圧ではなく高圧に維持される場合、滞留時間（供給ガス流量によって割られたバイオ反応器中の液体体積として定義される）を減少することができることを意味する。最適な反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に一部依存する。然しながら、一般的に、発酵が周囲圧力より高い圧力で行われることが好ましい。更に、与えられるＣＯからブタノールへの転換速度が部分的に基質の滞留時間の関数であり、そして所望の滞留時間を達成することは、同様にバイオ反応器の必要な体積を指示するために、加圧系の使用は、必要なバイオ反応器の体積を、そして従って、発酵機器の資本コストを大幅に減少することができる。米国特許第５，５９３，８８６号に与えられた実施例によれば、反応器の体積は、反応器の操作圧力の増加に直線的に比例して減少することができ、即ち、１０気圧の圧力で操作される反応器は、１気圧の圧力で操作されるものの僅か１０分の１の体積を必要とする。
【０１６８】
高圧においてガスからエタノールへの発酵を行う利点は、他で記載されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は、約２．１ｋｇ／ｃｍ２（３０ｐｓｉｇ）及び約５．３ｋｇ／ｃｍ２（７５ｐｓｉｇ）の圧力下で行われるガスからエタノールへの発酵を記載し、それぞれ１５０ｇ／ｌ／日及び３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性を得ている。然しながら、類似の培地及び挿入ガス組成を使用して常圧で行われた発酵の例は、一日当たりリットル当たり１０及び２０倍間の少ないエタノールを産生することが見いだされた。
【０１６９】
発酵反応に供給するために使用されるガス流の組成は、この反応の効率及び／又は費用に有意な影響を有することができる。例えば、Ｏ２は、嫌気性発酵法の効率を減少することができる。発酵法の発酵の前又は後の段階における好ましくない又は不必要なガスの加工は、このような段階の負荷を増加することができる（例えば、ガス流がバイオ反応器に入る前に圧縮される場合、発酵において必要ないガスを圧縮するために不必要なエネルギーを使用することがあり得る）。従って、基質流、特に工業的供給源から誘導される基質流を、好ましくない成分を除去するために処理し、そして所望の成分の濃度を増加することが好ましいことであり得る。
【０１７０】
ある態様において、本発明の細菌の培養物は、水性培養培地中で維持される。好ましくは水性培養培地は、最小嫌気性微生物増殖培地である。適した培地は、当技術において既知であり、そして例えば、米国特許第５，１７３，４２９号及び５，５９３，８８６号並びにＷＯ０２／０８４３８中に記載され、そして本明細書中の以下の実施例のセクションに記載されるとおりである。
【０１７１】
ブタノール、或いはブタノール及び一つ又はそれより多い他のアルコールを含有する混合されたアルコール流は、分別蒸留又は蒸発、浸透気化法、及び例えば液体−液体抽出を含む抽出発酵のような当技術において既知の方法によって発酵ブロスから回収することができる。酪酸を含む酸のような副産物も、更に当技術において既知の方法を使用して発酵ブロスから回収することができる。例えば、活性炭フィルター又は電気透析を含む吸収系を使用することができる。別の方法として、連続式ガスストリッピングも、更に使用することができる。
【０１７２】
本発明のある好ましい態様において、ブタノール及び副産物は、バイオ反応器からブロスの一部を連続的に除去することによって発酵ブロスから回収され、ブロスから微生物細胞を分離し（好都合には濾過によって）、そしてブロスからブタノール及び所望により酸を回収する。アルコールは、好都合には、例えば蒸留によって回収することができ、そして酸は、例えば活性炭上の吸着によって回収することができる。分離された微生物細胞は、好ましくは発酵バイオ反応器に戻される。アルコール（類）及び酸（類）が除去された後に残った細胞を含まない透過物も、更に、好ましくは発酵バイオ反応器に戻される。これがバイオ反応器に戻される前に、栄養物培地を補充するために更なる栄養分（ビタミンＢのような）を細胞を含まない透過物に加えることができる。
【０１７３】
更に、活性炭への酢酸の吸着を向上するために先に記載したようにブロスのｐＨが調節された場合、バイオ反応器に戻される前に、発酵バイオ反応器中のブロスのそれと同様なｐＨに、ｐＨを再調節しなければならない。
【０１７４】
本発明の一つの態様において、ブタノールは、抽出発酵法を使用して発酵反応物から回収され、ここにおいて、ブタノールは、反応器中の油相中に回収される。当業者は、これを達成するための技術を容易に認識するものである
【実施例】
【０１７５】
本発明は、ここに以下の非制約的実施例を参照して更に詳細に記載されるものである。
遺伝子組換えは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、及び２種の電子伝達フラビンタンパク質遺伝子を制御する、強力な天然のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍプロモーターからなる合成オペロンを含有するプラスミドを使用して行った（図１−２）。このプラスミドを、新規なメチルトランスフェラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでメチル化し、そして次いでＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３に形質移入した。主要な発酵産物としての１−ブタノールの産生を、異なった工業ガス流（製鋼所廃棄ガス、合成ガス）に対して示した。
【０１７６】
発現プラスミドの構築
標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術を、本発明において使用し、そしてこれらは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８７によって記載されている。使用されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のブタノール生合成遺伝子のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩから得られた（表１）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ１００６１のホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを配列決定し、そして標的遺伝子の発現のために使用した（表１）。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、このプロモーターが、高いレベルで恒常的に発現することを示した（図８）。
【０１７７】
【表１】
0006014042.tif 000002
【０１７８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４及びＣｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ１００６１からのゲノムＤＮＡを、Ｂｅｒｔｒａｍ及びＤｕｒｒｅ（１９８９）による改良された方法を使用して単離した。１００ｍｌの一晩の培養物を回収し（６，０００×ｇ、１５分、４℃）、リン酸カルシウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、そして１．９ｍｌのＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース；ｐＨ８．０）中に懸濁した。３００μｌのリゾチーム（約１００，０００Ｕ）を加え、そして混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて２８０μｌの１０％（重量／容量）のＳＤＳ溶液を加え、そして更に１０分間インキュベートした。ＲＮＡを、室温で２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、及び１０μｌのＲＮアーゼＡ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の添加によって消化した。次いで、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を加え、そしてタンパク質分解を１−３時間３７℃で行った。最後に、６００μｌの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を加え、続いてフェノール−クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの量及び品質を分光光学的に検査した。
【０１７９】
ブタノール生合成遺伝子及びホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを、ｉＰｒｏｏｆの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）並びに次のプログラム：９８℃で３０秒間の最初の変性、続いて３２サイクルの変性（９８℃で１０秒間）、アニーリング（５０−６２℃で３０−１２０秒間）及び伸長（７２℃で４５秒間）、それから最後の伸展工程（７２℃で１０分間）を使用して、表２中のオリゴヌクレオチドと共にＰＣＲによって増幅した。
【０１８０】
【表２】
0006014042.tif 000003
【０１８１】
ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）の増幅された４９８ｂｐのプロモーター領域を、Ｅ．ｃｏｌｉ−ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのシャトルベクターｐＭＴＬ８５１４１（配列番号１４；ＦＪ７９７６５１．１；Ｎｉｇｅｌ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）に、ＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位並びにＤＨ５α−Ｔ１Ｒ種（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローン化した。作成したプラスミドｐＭＴＬ８５１４５及びチオラーゼ遺伝子の１，１９４ｂｐのＰＣＲ産物を、両方ともＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。核酸連結をＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質移入し、プラスミドｐＭＴＬ８５１４５−ｔｈｌＡを得た。その後、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４からのｃｒｔ−ｂｃｄ−ｅｔｆＢ−ｅｔｆＡ−ｈｂｄオペロンの増殖された４，７６４ｂｐのＰＣＲ断片を、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ並びにＥ．ｃｏｌｉ  ＡＢＬＥ  Ｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してこのベクター中にクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８５１４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを作成した。最後に、抗生物質耐性カセットを、クロラムフェニコールからクラリスロマイシンに交換した。従って、ｅｒｍＢカセットを、ベクターｐＭＴＬ８２２５４（配列番号１５；ＦＪ７９７６４６．１；Ｎｉｇｅｌ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）から、制限酵素ＰｍｅＩ及びＦｓｅＩを使用して開放し、そしてプラスミドｐＭＴＬ８５１４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄのｃａｔＰカセットと交換した。得られた発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄ（配列番号３１の挿入は、表３に与えられたオリゴヌクレオチドを使用して完全に配列決定され、そして結果は、ブタノール生合成遺伝子が変異を含まないことが確認された（図３）。
【０１８２】
【表３】
0006014042.tif 000004
【０１８３】
ＤＮＡのメチル化
誘導性ｌａｃプロモーターに融合されたハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号２８）を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（配列番号２４）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（配列番号２５）、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ（配列番号２６）（図４ａ、４ｂ及び４ｃ）からのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の整列によって設計した。メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、配列番号２８によるメチルトランスフェラーゼ酵素の産生をもたらした。メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の整列データを図４ｄに示す。
【０１８４】
ハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号２７）を化学的に合成し、そしてベクターｐＧＳ２０（配列番号２９；ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、ＥｃｏＲＩを使用してクローン化した（図５）。得られたメチル化プラスミドｐＧＳ２０−メチルトランスフェラーゼを、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄと共に制限陰性Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に二重形質移入した。Ｉｎ  ｖｉｖｏのメチル化を、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、そしてメチル化されたプラスミドをＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。得られたメチル化されたプラスミド組成物を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３の形質転換のために使用した。
【０１８５】
トランスフォーメーション
完全なトランスフォーメーション実験中に、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３及びＣ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉ（ＤＳＭ１３５２８）を、１０ｇ／ｌのフルクトース及び炭素源としての３７℃の約２．１ｋｇ／ｃｍ２（３０ｐｓｉ）の製鋼所廃棄ガス（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺのＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌの現場から収集；組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）を伴うＰＥＴＣ培地（表４）中で、Ｈｕｎｇａｔｅ（１９６９）及びＷｏｌｆｅ（１９７１）によって記載された標準的な嫌気性技術を使用して増殖した。
【０１８６】
【表４ａ】
0006014042.tif 000005
【０１８７】
【表４ｂ】
0006014042.tif 000006
【０１８８】
【表４ｃ】
0006014042.tif 000007
【０１８９】
【表４ｄ】
0006014042.tif 000008
【０１９０】
コンピテント細胞を製造するために、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３の５０ｍｌの培養物及びＣ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８の５０ｍｌの培養物を、連続３日間新しい培地で継代培養した。４０ｍＭのＤＬ−トレオニンを含有する５０ｍｌのＰＥＴＣ培地に、０．０５のＯＤ６００ｎｍで接種するために、これらの細胞を使用した。培養物が０．４のＯＤ６００ｎｍに達した時点で、細胞を嫌気チャンバーに移し、そして４，７００×ｇ及び４℃で回収した。培養物を氷冷の電気穿孔緩衝液（２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、そして最後に、６００μｌの体積の新しい電気穿孔緩衝液中に懸濁した。この混合物を、１μｇのメチル化されたプラスミド混合物（及びＣ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉの場合、１μｌのタイプ１制限阻害剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有する０．４ｃｍの電極ギャップを持つ予備冷却された電気穿孔キュベットに移し、そして次の設定値：２．５ｋＶ、６００Ω、及び２５μＦを持つＧｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ電気穿孔装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して直ちにパルスを加えた。３．７−４．０ｍｓの時定数を達成した。培養物を５ｍｌの新しい培地に移した。細胞の再生を、試験管保持器を備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅｌｉｏｓ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、６００ｎｍの波長でモニターした。バイオマスの最初の１滴後、細胞は再び増殖を開始した。バイオマスがこの時点から倍になった時点で、細胞を回収し、２００μｌの新しい培地に懸濁し、そして選択的ＰＥＴＣプレート（１．２％のＢａｃｔｏＴＭ寒天（ＢＤ）を含有）上に４μｇ／μｌのクラリスロマイシンと共に置いた。約２．１ｋｇ／ｃｍ２（３０ｐｓｉ）の３７℃の製鋼所ガスとの４−５日の接種の後、プレート当たり１５−８０のコロニーが明確に見られた。
【０１９１】
このコロニーを、４μｇ／μｌのクラリスロマイシンを含有する２ｍｌのＰＥＴＣ培地を接種するために使用した。増殖が起こった時点で、培養を４μｇ／μｌのクラリスロマイシン及び唯一の炭素源としての約２．１ｋｇ／ｃｍ２（３０ｐｓｉ）の製鋼所ガスを含有する５ｍｌのＰＥＴＣ培地に、そしてその後５０ｍｌにスケールアップした。
【０１９２】
好結果なトランスフォーメーションの確認
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ：ＤＮＡの移動を確認するために、プラスミドのミニプレップを、１０ｍｌの培養体積からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のために（Ｂｕｒｃｈｈａｒｄｔ  ａｎｄ  Ｄｕｒｒｅ，１９９０）、４種の分析されたクローンから単離されたプラスミドＤＮＡは、部分的に分解され、そしてアガロースゲル上にスメアのみをもたらし、一方、本来のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３種からのプラスミドの単離は、全くシグナルをもたらさなかった（図６）。然しながら、単離されたプラスミドＤＮＡの品質は、プラスミドの全ての関連する異なった領域を包含する４組のプライマーを使用する対照ＰＣＲを行うために十分であった（表５）。ＰＣＲは、ｉｌｌｕｓｔｒａのＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、標準的な条件（９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３２サイクル；７２℃で１０分間）を使用して行った。全ての４種の分析された形質転換体のＰＣＲは、テンプレートとしての本来のメチル化されたプラスミド混合物と同じシグナルをもたらした（図６）。更なる対照として、それぞれ１μｌの部分的に分解された単離されたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に再度形質転換し、これからプラスミドが明確に単離され、そして制限消化によって確認することができた。
【０１９３】
４種のクローンの同一性を確認するために、４０ｍｌのそれぞれの培養物からゲノムＤＮＡを単離し（上記参照）、そして１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して、ｉｌｌｕｓｔｒａ  のＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び標準的な条件（９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３２サイクル；７２℃で１０分間）を使用してＰＣＲを行った（表５；Ｗｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。それぞれのＰＣＲ産物を精製し、そして配列決定した。全てのクローンの配列は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号３０；Ｙ１８１７８，ＧＩ：７２７１１０９）に対して少なくとも９９．９％の同一性を示した。
【０１９４】
それぞれの株は、２０１０年１０月２６日に寄託番号ＤＳＭ２４１３８下で、ＤＳＭＺ  （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された。
【０１９５】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの形質転換体は、同じ方法及びプライマーの組を使用して確認された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（配列番号１１９；ＣＰ００１６６６，ＧＩ：３００４３３３４７）の１６Ｓ遺伝子との１００％の一致をもたらした。
【０１９６】
【表５】
0006014042.tif 000009
【０１９７】
１−ブタノールの産生
唯一のエネルギー及び炭素源としてのＣＯからの１−ブタノールの産生を示すために、酵母抽出物及びフルクトースを含まないＰＲＴＣ培地を調製し、そして新規なブタノールプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ及びＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ系と共にインキュベートした。ボトルを、二つの工業的供給源、製鋼所廃棄ガス（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺのＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌの現場から収集；組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）及び合成ガス（Ｒａｎｇｅ  Ｆｕｅｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ，ＣＯ；組成：２９％ＣＯ、４５％Ｈ２、１３％ＣＨ４、１２％ＣＯ２、１％Ｎ２）からの、約２．１ｋｇ／ｃｍ２（３０ｐｓｉ）のＣＯを含有するガス流で加圧した。１−ブタノールの産生は、数代の継代培養期間にわたる両方の系及び両方のガス混合物で証明することができた。酪酸の同時形成が同様に観察された。１−ブタノール又は酪酸のいずれもは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３及びＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８の組換えされていない系の試料中では同一の条件下で検出されなかった。
【０１９８】
代謝産物の分析を、３５℃で操作されるＲＩＤ（屈折率検出器）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＳｅｒｉｅｓのＨＰＬＣ装置を使用するＨＰＬＣ、及び６０℃に保たれたＡｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒子の大きさ５μｍ）によって行った。僅かに酸性化された水（０．００５ＭのＨ２ＳＯ４）を移動相として、０．７ｍｌ／分の流速で使用した。タンパク質及び他の細胞残留物を除去するために、４００μｌの試料を１００μｌの２％（重量／容量）の５−スルホサリチル酸と混合し、そして１４，０００×ｇで３分間遠心して、沈殿した残留物を分離した。次いで１０μｌの上清を分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【０１９９】
血清ボトル実験において、最高の１−ブタノール産生は、ブタノールプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの二つの静置培養物において観察された。これらの培養物において、１−ブタノールは、１．５４ｇ／ｌ（２５．６６ｍＭ）と観察された主要な発酵最終産物であった（表６、図７）。他の代謝産物の産生は、エタノール、酢酸、及び２，３−ブタンジオールのみを産生する本来のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３系と比較して減少した。炭素の流束は、１−ブタノール産生に向かって移動したが、代謝最終産物中に組込まれた全炭素の量は、ほとんど同じままである（表６）。２０％の僅かな増加は、エタノール及び酢酸とそれぞれ比較して、１−ブタノール及び酪酸を産生することによって余分な減少した当量をオフロードした結果である可能性がある。通常電子の吸込み系として作用する２，３−ブタンジオールの産生は、完全に減少した。
【０２００】
【表６】
0006014042.tif 000010
【０２０１】
１−ブタノールの産生は、更にブタノールプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８の培養物中で、同じプラスミドを保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３と比較して低いが、０．３６ｇ／Ｌ（６ｍＭ）までの有意な量で観察された。これは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３が、改良されたアルコール産生を持つ系であり、そして同様に、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３の組換えされない系が、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８の組換えされない系より多いエタノールを産生し、そしてより少ない酢酸を産生する（両方の系は、ブタノールも酢酸も産生しない）として説明することができる。
【０２０２】
ブタノールプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍより低い１−ブタノール：酪酸比を有していた。然しながら、１−ブタノールと酪酸の比は、過程条件によって変更することができる。これは、主要な発酵産物としての１−ブタノールの産生を、しかし更に主要な発酵産物としての酪酸の産生も、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ及びＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの両方の系において可能にする。血清ボトル実験において、５０：１から１：３０間の１−ブタノール：酪酸のモル比がＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで、そして２０：１から１：３０間がＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉで観察された。振盪下でインキュベートされた培養物は、一般的に、静置培養と比較してより高い酪酸及びより低いレベルの１−ブタノールを産生した。上部空間中のＣＯ（及びＨ２）の濃度は、同様に１−ブタノール：酪酸比に影響を有することが見いだされた。上部空間により少ないＣＯを伴う培養物において、酪酸の産生がより好ましく、そして主要な発酵産物として産生されることができる。同様に、血清ボトル実験において行われたＣＯの薄い合成ガス（２９％ＣＯ）より高い１−ブタノールの力価が、ＣＯに富んだ製鋼所ガス（４４％ＣＯ）において観察された。最大１．０８ｇ／ｌ（１２．８ｍＭ）の酪酸が、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで、そして１．０３ｇ７Ｌ（１２．５ｍＭ）のレベルが、同じプラスミドを保有するＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉで観察された。この効果は、系に入る余分な炭素、そして更に一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）によるＣＯ酸化から発生される更なる還元力によって説明することができる。
【０２０３】
ブチリル−ＣｏＡの酪酸及びブタノールへの転換
発現プラスミドは、アセチル−ＣｏＡからのブチリル−ＣｏＡの産生のために必要な遺伝子のみを含有する。次いでブチリル−ＣｏＡは、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼの作用によってブタノールに直接転換することができる（図１）。第２の可能性は、ブチリル−ＣｏＡが、ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼにより酪酸に転換されることであり（図１）、この場合、ＡＴＰは、基質レベルのリン酸化（ＳＬＰ）により得られる。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の操作は、ＡＴＰを必要とするために、酢酸産生性細胞は、ＳＬＰからのＡＴＰに依存し、これは、更に既知のことごとくの酢酸産生性細菌が酢酸を産生するという事実を反映する（Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。然しながら、組換え細胞は、今やＳＬＰにより、更に酪酸を産生することによってＡＴＰを発生することができる。次いで酪酸は、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＡＯＲ）により、ブチルアルデヒドに更に還元することができる（図１）。この反応は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の初期の工程の、一酸化炭素デヒドロゲナーゼによるＣＯの酸化によって提供される還元されたフェレドキシンによって促進することができる（ＣＯ＋Ｆｄｒｅｄ→ＣＯ２＋Ｆｄｏｘ）。次いでブチルアルデヒドは、ブタノールデヒドロゲナーゼによりブタノールに転換することができる（図１）。外部的に加えられた酪酸の、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの培養によるブタノールへの転換は、証明されている（ＷＯ２００９／１１３８７８）。
【０２０４】
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼ、及びアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素活性を伴うそれぞれの遺伝子／酵素は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉにおいて本発明人等によって確認されている（表７−１０）。潜在的な遺伝子及び酵素は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）、ＣＯＧ（Ｔａｔｕｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ，２００３）、及びＴＩＧＲＦＡＭ（Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ，２００２）データベースを使用する特徴づけられた遺伝子及び酵素との比較によって予測された。モチーフのスキャンは、ＰＲＯＳＩＴＥ（Ｈｕｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）Ｐｆａｍ（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）データベースに対して行われた。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉのゲノムは、アルコール及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を持つ酵素をコードする幾つかの遺伝子を含有する。表７から１０に示すように、これらの幾つかは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、又はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの特徴付けられたブチルアルデヒド及びブタノールデヒドロゲナーゼと７０％を超える高い相同性を有し、一方、他は、これらの酵素に対して少なくとも概略４０％の同一性を有することが見いだされた。全ての三つのゲノムは、正確に一つのリン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素を、そして酢酸／酪酸キナーゼ活性を持つものをコードする。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及びＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉは、それぞれ２種のアルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素遺伝子を保有する。
【０２０５】
【表７】
0006014042.tif 000011
【０２０６】
【表８】
0006014042.tif 000012
【０２０７】
【表９】
0006014042.tif 000013
【０２０８】
遺伝子発現研究
遺伝子発現研究を、ブタノールプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｔｈｌＡ−ｃｒｔ−ｈｂｄを内部に持つＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ中の導入されたチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質Ａ及び電子伝達フラビンタンパク質Ｂ遺伝子の好結果な発現を確認するために行った。更に、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（表７）のゲノム中で確認された推定上のブチルアルデヒド（ｂｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、ブタノールデヒドロゲナーゼ、リン酸アセチル／ブチリルトランスフェラーゼ  酢酸／酪酸キナーゼ、アルデヒド；フェレドキシン酸化還元酵素遺伝子の選択されたものは、更に標準的な発酵条件下で発現することが見いだされた（図６０）。
【０２０９】
試料を、遠心（６，０００×ｇ、５分、４℃）によって回収した。ＲＮＡを、細胞ペレットを、１００μＬのリゾチーム溶液（５０，０００Ｕのリゾチーム、０．５μＬの１０％ＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ８）中に懸濁することによって単離した。５分後、３５０μＬの溶菌緩衝液（１０μＬの２−メルカプトエタノールを含有）を加えた。細胞懸濁液を、１８−２１ゲージの針を５回通すことによって機械的に破壊した。次いでＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離し、そして１００μＬのＲＮアーゼを含まない水で溶出した。ＲＮＡを、ＰＣＲ及びゲル電気泳動により点検し、そして分光光学的に定量し、そして必要な場合ＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。ＲＮＡの品質及び整合性を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して点検した。逆転写工程を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＭｙｉＱ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）で、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭのそれぞれのプライマー（表１１）、及び１ｘｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７，ＵＳＡ）を伴う１５μＬの反応体積で行った。グアニル酸キナーゼ及びギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼを、ハウスキーピング遺伝子として使用し、そして非テンプレート対照を含めた。反応条件は、９５℃で３分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間及び７２℃で３０秒間であった。溶融曲線分析を、ＲＴ  ＰＣＲ（３８サイクルの１℃／秒で５８℃から９５℃へ）の完了の直後に、プライマーの二量体化又は増幅の他の人工産物の検出のために行った。
【０２１０】
全ての異種遺伝子のｍＲＮＡは、成功裏に検出することができ、遺伝子が発現されることを示した。全ての遺伝子のシグナルは、同様なレベルであった。
【０２１１】
【表１０】
0006014042.tif 000014
【０２１２】
本発明は、読者が過度の実験を行わずに本発明を実行することを可能にするために、ある種の好ましい態様を参照して、本明細書中に記載されてきた。然しながら、当業者は、多くの構成要素及びパラメータを、ある程度変更または改変するか、又は本発明の範囲から逸脱することなく既知の等価物と置き換えることができることを容易に認識するものである。このような改変及び等価物が、個別に記載されているかのように本明細書中に組込まれることは認識されるべきである。表題、見出し、等は、読者のこの文書の理解を高めるために提供され、そして本発明の範囲を制約するものとして解釈されるべきではない。
【０２１３】
上記に又はもしあれば以下に引用される全ての特許出願、特許及び刊行物の全ての開示は、本明細書中に参考文献として援用される。然しながら、本明細書中のいずれもの特許出願、特許及び刊行物に対する言及は、これらが、有効な従来の技術を構成するか、又は世界中のいずれかの国の普通の一般的知識の一部を形成することの承認若しくはいずれもの形態の示唆として理解されるものではなく或いはそのように理解されるべきではない。
【０２１４】
本明細書及びいずれもの以下の特許請求の範囲を通して、文脈が他に要求しない限り、用語“含んでなる”、“含んでなり”等は、排他的な意味に対抗する包括的な意味で、即ち、“制約されるものではないが、…を含む”の意味で解釈されるべきである。
【０２１５】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図６０】
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【図１】
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【図４−８】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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