(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラフィン蛋白質又はエラフィン蛋白質の活性フラクションをコードする組換体遺伝子を含み、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉから選択される、組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項２】
前記乳酸細菌が欠損栄養要求性遺伝子を含み、これによって、前記乳酸細菌の生存が、特異的化合物の存在に厳密に依存する、請求項１に記載の組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項３】
前記欠損栄養要求性遺伝子がｔｈｙＡ遺伝子である、請求項２に記載の組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項４】
前記選択された遺伝子が、前記欠損栄養要求性遺伝子の代わりに挿入される、請求項３に記載の組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項５】
ｈｔｒＡ遺伝子が不活性化されたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓである、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項６】
過敏性腸症候群の治療において使用するための、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項７】
前記細菌が、被験者に粘膜投与、経口投与、鼻腔内投与または直腸投与されるよう意図されている、請求項６に記載の組換体食品グレード乳酸細菌。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の組換体食品グレード乳酸細菌を含む、過敏性腸症候群の治療において使用するための治療用組成物。
【請求項９】
前記組成物が、被験者に粘膜投与、経口投与、鼻腔内投与または直腸投与されるよう意図されている、請求項８に記載の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような腸管炎症性疾患、嚢胞性線維症及び気管支肺慢性閉鎖性疾患（ＢＰＣＯ）などのような肺疾患、炎症性関節疾患（骨関節炎など）、炎症性泌尿生殖器疾患、及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などのような慢性内臓痛症状に関連する疾患の治療の全般的分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ＩＢＤなどのような慢性炎症性疾患の治療は、それら疾患が数百万人の人々を冒すために、重要な医学的課題である。その高発生率が先進国で見られ、過去３０年間にわたり着実に増加した。ＩＢＤに関する最近の治療は、治療のいずれの型に対しても耐性がある患者の高いパーセンテージ（２０〜４０％）、重篤な副作用及び現在利用可能な医薬品（グルココルチコイド及びモノクローナル抗体療法）にも関連する高コストなどのために、大きく改善される必要がある。更に、ＩＢＤの病因に関係するメカニズムも未だ完全には理解されておらず、ＩＢＤのためのより有効な治療法又は治癒の開発もまた、炎症性反応の調節のより良い理解に依存する。いくつかの研究が、胃腸管（ＧＩＴ）の慢性炎症性反応の管理におけるプロテアーゼの重大な役割を立証した（Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ，Ｎ．著、２００５年；Ｃｅｎａｃ，Ｎ．ら著、２００７年；Ｈｙｕｎ，Ｅ．ら著、２００８年；Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ，Ｎら著、２００４年）。したがって、内因性プロテアーゼ阻害剤が、腸管炎症性反応の制御に重要であると思われる。
【０００３】
この知識に基づいて、発明者達は、これらプロテアーゼ阻害剤のＧＩＴへの送達が、ＩＢＤ及び／又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の治療のために使用され得ることを提案する。
【０００４】
ＩＢＤの治療のためのプロバイオティクスの使用は、ここ数年間提案されており、異なる研究で、単独又は併用して試験された、これらプロビオティック細菌のいくつかの有益な効果が報告されている（Ｈｅｄｉｎ，Ｃら著、２００７年；Ｓａｒｔｏｒ，Ｒ．Ｂ．著、２００４年）。組換体非病原性食品グレードの細菌を、粘膜レベルにて抗炎症分子の送達用ベヒクルとして使用する戦略は、既に抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を送達させるために使用されている（Ｓｔｅｉｄｌｅｒ，Ｌ．ら著、２０００年）。第１相臨床試験において、経口的に投与された、ＩＬ−１０を発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌａｃｔｉｓ（乳酸連鎖球菌）菌株が、これら患者において重篤な副作用を発症しないものとして安全であることを立証した（Ｂｒａａｔ，Ｈ．ら著、２００６年）。しかしながら、ＩＬ−１０組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓで処置されたクローン病患者では、疾患活性の低減はなぜか制限された。この制限された効果は、ＩＬ−１０送達が、結腸炎の進行に対して別個の有益な効果のみを有することが既に報告されている事実によって説明され得る（Ｂｒａａｔ，Ｈ．ら著、２００３年）。したがって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓによって送達される抗炎症分子の性質におけるより良い選択は、治療の効果を著しく改善し得る。本明細書では、発明者達は、抗プロテアーゼトラッピン−２を発現しかつ腸管送達させるために、食品グレードの細菌を使用することを提案する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、トラッピン−２などの抗炎症分子を送達するための食品グレードの細菌の使用が、既存の治療法に比べて安全性とより良好な効果をもたらすことの発見に基づいている。すなわち、本発明は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の治療のための、トラッピン−２蛋白質又はトラッピン−２蛋白質の活性フラクション、ＷＡＰ族蛋白質の構成員又はＷＡＰ族蛋白質の構成員の活性フラクション、若しくはセルピン族蛋白質の構成員又はセルピン族蛋白質の構成員の活性フラクションから選択される分子に関する。
【０００６】
本発明の他の目的は、トラッピン−２蛋白質又はトラッピン−２蛋白質の活性フラクションをコード化する遺伝子、ＷＡＰ族蛋白質の構成員又はＷＡＰ族蛋白質の構成員の活性フラクションをコード化する遺伝子、若しくはセルピン族蛋白質の構成員又はセルピン族蛋白質の構成員の活性フラクションをコード化する遺伝子から選択される遺伝子を含む組換体食品グレード細菌に関する。
【０００７】
本発明の別の態様は、上記で定義されたような組換体食品グレード細菌を含む治療用組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
用語の意味
本明細書で使用するとき、ＷＡＰ族の用語「トラッピン−２」（エラフィン、エラスターゼ特異的阻害剤（ＥＳＩ）又は皮膚抗−ロイコプロテアーゼに関するＳＫＡＬＰとしても知られる）とは、呼吸器官中で分泌される、ＨＮＥ（ヒト好中球エラスターゼ）及びプロテイナーゼ３の低分子量（９．９ｋＤａ）の阻害剤を指す（Ｓａｌｌｅｎａｖｅら著、１９９１年及び１９９３年）。（Ａ１−Ｐｉ；アルファ１−抗トリプシン）及びＳＬＰＩ（分泌型白血球ペプチダーゼ阻害剤）と共に、トラッピン−２は、肺における「抗エラスターゼシールド」の不可欠な部分を含む。ヒトトラッピン−２遺伝子に関する代表的配列は、データベースＧｅｎｂａｎｋに受託番号Ｓ５８７１７で寄託されている。
【０００９】
本明細書で使用するとき、「乳清酸性蛋白質」に関する用語「ＷＡＰ族」とは、トラッピン−２、及びｐｓ２０を含有する蛋白質の族を指す。
【００１０】
本明細書で使用するとき、ＳＥＲｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＩＮｈｉｂｉｔｏｒｓに関する「Ｓｅｒｐｉｎ族」とは、アミノ酸配列及び阻害のメカニズムでは同様であるが、蛋白質分解酵素に向けられるそれらの特異性で異なるセリンプロテイナーゼ阻害剤の族を指す。この族としては、アルファ１−抗トリプシン（Ａ１−Ｐｉ）、アンジオテンシノーゲン、オブアルブミン、抗プラスミン、アルファ１−抗キモトリプシン、チロキシン結合蛋白質、補体１不活性化因子、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、プラスミノーゲン不活性化因子、遺伝子Ｙ蛋白質、胎盤プラスミノーゲン活性化阻害因子、及び大麦Ｚ蛋白質などが挙げられる。この族は、分泌性白血球プロテイナーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）を含まない（Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｍｏｒｅａｕら著、２００８年）。セルピン族のいくつかの構成員は、セリンエンドペプチダーゼの阻害剤よりはむしろ基質であり得、いくつかのセルピンは、それらの機能が未だ知られていない植物中で発生する。
【００１１】
本明細書で使用するとき、「アルファ１−抗トリプシン蛋白質」とは、糖蛋白質を指す。アルファ１−抗トリプシンは、それが広範囲のプロテアーゼを阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）であるために、アルファ−１プロテイナーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）とも呼ばれる。それは炎症性細胞の酵素、特にエラスターゼから組織を保護する。ヒトアルファ１−抗トリプシン遺伝子に関する代表的配列は、受託番号ＮＣ００８２９０でデータベースＧｅｎｂａｎｋに寄託されている。
【００１２】
本明細書で使用するとき、用語「の活性フラクション」とは、完全な蛋白質の活性を備えた蛋白質のフラクションを指す。例えば、トラッピン−２蛋白質の活性フラクションとは、ＨＮＥを阻害する能力を保持している蛋白質のフラクションを指し、或いはセルピン族蛋白質の活性フラクションとは、阻害の能力を保持している蛋白質のフラクションを指す。
【００１３】
本明細書で使用するとき、用語「食品グレード細菌」とは、発酵食品中で広く使用され、並びに米国およびヨーロッパ共同体でそれぞれＧＲＡＳ（食品医薬品局合格証）及びＱＰＳ（安全性推定規格）ステータスによって認められた完全な安全性プロファイルを有する細菌を指す。このような細菌は、良好な健康及び安寧な状態又は疾病予防を維持することを主張する機能性食品又は食品添加剤中で安全であり得る。
【００１４】
本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティック菌」とは、適切な量で生きた状態で摂取された細菌が、人の健康に有益化効果を及ぼし得る細菌を指す。これらは、その健康促進効果のために食品添加剤として現在広く使用されている。プロビオティック細菌の多くが乳酸細菌（ＬＡＢ）であり、その中で、ラクトバチルス属とビフィドバクテリウム属の菌株が最も広範囲に使用されているプロバイオティック細菌である。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「ｔｈｙＡ遺伝子」とは、チミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）を産生する酵素であり、ＤＮＡ合成及び修復で使用されるチミジン三リン酸に順次リン酸化される、チミジル酸シンターゼをコード化する遺伝子を指す。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「過敏性腸症候群（ＩＢＳ）」とは、胃腸管の不快感をもたらす種々の病理学的症状に関する用語である。これは、慢性的腹痛、不快感、膨満感、及び器質的原因がない場合の排便習慣の変動などによって特性化される機能的腸疾患である。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）」とは、結腸及び小腸の炎症性疾患の一群である。ＩＢＤの主要な型は、クローン病、潰瘍性結腸炎及び回腸嚢炎である。
蛋白質及びその使用法
【００１８】
本発明の第一の目的は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の治療のための、トラッピン−２蛋白質又はトラッピン−２蛋白質の活性フラクション、ＷＡＰ族蛋白質の構成員又はＷＡＰ族蛋白質の構成員の活性フラクション、若しくはセルピン族蛋白質の構成員又はセルピン族蛋白質の構成員の活性フラクションから選択される分子に関する。
【００１９】
好適な実施形態において、セルピン族の構成員は、アルファ１−抗トリプシン蛋白質である。
【００２０】
好適な実施形態において、前述の蛋白質のフラクションは、前述の蛋白質全体にわたる７５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上の同一性を含む。
【００２１】
典型的には、前述の蛋白質又はその蛋白質のフラクションは、抗炎症剤と併用されて使用され得る。
【００２２】
本発明の蛋白質又はその蛋白質のフラクションは、限定するものではないが、任意の化学的、生物学的、遺伝学的又は酵素的技術などを単独又は組み合わせた、当該技術分野でそれ自体既知の任意の技術によって生成され得る。
【００２３】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることによって、当業者は、蛋白質の生成のための標準的技術によって、前述の蛋白質又は蛋白質のフラクションの関係個所を容易に生成できるであろう。例えば、周知の固相法を用いて、好ましくは市販の蛋白質合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって製造された装置）を用いて、並びに製造者の使用説明書に従って、それら蛋白質は合成され得る。
【００２４】
あるいは、本発明の蛋白質又はその蛋白質のフラクションは、当該技術分野で現在周知のような組換体ＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、所望のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の発現ベクターへの組み込み及びそのようなベクターの所望の蛋白質又は蛋白質のフラクションを発現すると予想される適切な真核又は原核宿主中への導入後に、これら断片はＤＮＡ発現生成物として取得され得、これら断片はその後周知の技術を使用され得る。
【００２５】
本発明の蛋白質又はその蛋白質のフラクションは、（例えば精製された）形又はベクターに封入されて、例えば膜又は脂質ベヒクル（例えばリポソーム）として使用され得る。
食品グレード細菌
【００２６】
本発明の他の目的は、トラッピン−２蛋白質又はトラッピン−２蛋白質の活性フラクションをコード化する遺伝子、ＷＡＰ族蛋白質の構成員又はＷＡＰ族蛋白質の構成員の活性フラクションをコード化する遺伝子、若しくはセルピン族蛋白質の構成員又はセルピン族蛋白質の構成員の活性フラクションをコード化する遺伝子から選択される遺伝子を含む組換体食品グレード細菌に関する。
【００２７】
好適な実施形態において、本発明による食品グレード細菌は、プロバイオティック細菌である。
【００２８】
好適な実施形態において、本発明によるプロバイオティック細菌は、欠損栄養要求性遺伝子を含み、これによって、前述の細菌の生存は、特異的化合物の存在に厳密に依存する。
【００２９】
別の好適な実施形態において、本発明による栄養要求性遺伝子は、チミジル酸シンターゼをコード化するｔｈｙＡ遺伝子である。
【００３０】
別の好適な実施形態では、本発明による栄養要求性遺伝子は、アラニンラセマーゼ（ａｌｒ）遺伝子（Ｂｒｏｎら著、２００２年）である。
【００３１】
本発明によるプロビオティック細菌のｔｈｙＡ遺伝子の不活性化は、胃腸管（ＧＩＴ）では不在であるチミジンに対してプロビオティック細菌を独立栄養性にさせる。この組換体ｔｈｙＡ変異体は、関心のあるその蛋白質を送達可能であるが、生存することは不可能であり、したがって、その播腫を制限すること並びに組換体細菌に関して要求された生物学的封じ込めを付与することで、ＧＩＴ中で存続するであろう。同様な結果が、ａｌｒ遺伝子によって得られる。
【００３２】
別の好適な実施形態では、選択された遺伝子が、ｔｈｙＡ遺伝子中に挿入される。
【００３３】
好ましくは、組換体遺伝子は、このようにして遺伝子破壊によって不活性化されるｔｈｙＡ遺伝子座へと向かう染色体中に位置している。本明細書で使用するとき、用語「遺伝子破壊」とは、ＤＮＡ断片の挿入による破壊、遺伝子又はその一部分の欠失による破壊、並びに別のＤＮＡ断片による遺伝子又はその一部分の置き換えを指し、この破壊は、組換体ＤＮＡ技術によって誘導され、自発的突然変異によるものではない。好ましくは、破壊は、別の機能的遺伝子による、遺伝子、又はその一部分の置き換えである。好ましくは、欠損組換体ｔｈｙＡ遺伝子は、非復帰突然変異体遺伝子である。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「非復帰突然変異体」とは、復帰突然変異頻度が１０−８より低い、好ましくは復帰突然変異頻度が１０−１０より低いことを指し、更に好ましくは、復帰突然変異頻度が１０−１２より低い、更により好ましくは、復帰突然変異頻度が１０−１４より低い、最も好ましくは復帰突然変異頻度が、当該技術分野の当業者に既知である慣用的方法を使用して検出することができないことを指す。
【００３５】
好適な実施形態において、本発明による遺伝子は、アルファ１−抗トリプシン蛋白質、又は抗プラスミン、アルファ１−抗キモトリプシンなどのようなセルピン族の別の構成員をコード化する。
【００３６】
好適な実施形態では、本発明による食品グレード細菌株は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ（乳酸連鎖球菌）株又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）菌株又はＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｈｔｒＡ菌株（Ｐｏｑｕｅｔら著、２０００年）又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（ビフィドバクテリウム・ロンガム）菌株のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタルム）菌株である。
【００３７】
好適な実施形態において、本発明による食品グレード細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ菌株である。
【００３８】
最も好適な実施形態では、本発明による遺伝子は、トラッピン−２に関してコード化する。
【００３９】
実際に、発明者達は、トラッピン−２が腸上皮細胞中での顕著な発現を伴って、ヒト結腸粘膜中で自然に発現されること（Ｍｏｔｔａら著）、並びにＩＢＤの患者が、健康な被験者と比較して組織内でのトラッピン−２のダウンレギュレーションを示すこと（Ｍｏｔｔａら著）を証明した。
【００４０】
更には、発明者達は、トラッピン−２の過剰発現が結腸炎の進行に対して保護的であること（構成的発現及び一過性発現で）を立証した。更に、結腸炎のモデルにおけるトラッピン−２の過剰発現が、結腸炎に関連するエラスターゼとトリプシン様活性の増加を完全に阻害することが可能であることを、結腸炎の異なるモデルにおいて立証した。
【００４１】
最終的に、マウスにおけるトラッピン−２過剰発現もまた、炎症誘発性サイトカイン及びキモカイン（ＩＬ−６、Ｉｌ−１７Ａ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロン−ガンマ、ＭＣＰ−１及びＫＣ）の結腸炎に誘発された増加を著しく阻害することも可能である。
【００４２】
これら結果の全ては、トラッピン−２及びＩＢＤを治療するために同様な特質を有するＷＡＰ又はセルピン族からの他のプロテアーゼの送達を支持している。以下の結果で示されたように、食品グレード細菌は、このタイプのプロテアーゼを腸管に送達させるために、最も安全かつ有効な手段である。
【００４３】
別の好適な実施形態において、本発明による遺伝子は、アルファ１−抗トリプシン蛋白質をコード化する。
【００４４】
実際に、アルファ１−抗トリプシン蛋白質は、ＩＢＤ（結腸炎のような）に関連するトリプシン様活性を阻害し、これによって、トラッピン−２と同様な効果を有する。
【００４５】
別の好適な実施形態では、本発明による食品グレード細菌株は、トラッピン−２に関してコード化する遺伝子を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ菌種である。
【００４６】
別の好適な実施形態において、本発明による食品グレード細菌株は、ｔｈｙＡ遺伝子中に挿入されたトラッピン−２に関してコード化する遺伝子を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ菌種である。
【００４７】
別の実施形態において、本発明による食品グレード細菌は、腸炎症性疾患の治療のために有用である。
【００４８】
別の好適な実施形態では、本発明による食品グレード細菌は、ＩＢＤ及び／又はＩＢＳの治療のために有用である。
【００４９】
炎症性疾患は、ＩＢＤ、ＩＢＳ、炎症性肺疾患、炎症性関節疾患又は炎症性泌尿生殖器疾患から選択され得る。
組成物
【００５０】
本発明の別の目的は、本発明による食品グレード細菌を含む治療用組成物に関する。
【００５１】
好適な実施形態では、本発明による治療用組成物は、被験者に粘膜投与するよう意図されている。
【００５２】
別の好ましい投与形態においては、本発明による治療用組成物は、被験者に経口投与するよう意図されている。例えば、組成物は懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、顆粒又は粉剤の剤形であり得る。
【００５３】
液体治療用組成物においては、本発明による食品グレード細菌は、懸濁液中に遊離し、かつ固定化されない状態で存在する。懸濁液は、特に細胞内の浸透圧が細胞溶解に至らしめることがないように、プロバイオティック細菌のための生理学的条件を確保する組成を有する。
【００５４】
固体治療用組成物においては、本発明による食品グレード細菌は、遊離した、好ましくは凍結乾燥剤形、又は固定化剤形で存在し得る。例えば、本発明による食品グレード細菌は、細胞への保護を提供するゲルマトリックス中に封入され得る。
【００５５】
経口投与されるよう意図され並びに本発明による食品グレード細菌を固定化又は非固定化剤形で含有している固体治療用組成物は、胃液に対して抵抗性を示すコーティングが施されていることが好ましい。これによって、治療用組成物中に封じ込められた食品グレード細菌は、妨害されることなくかつ損傷されることなく胃を通過することができて、食品グレード細菌の放出が、上部腸領域で初めて起こる。
【００５６】
本発明の別の態様では、治療用組成物の複数の投与が、患者の状態、ＩＢＤ又はＩＢＳが治癒されている状態、ＩＢＤ又はＩＢＳの進行が停止している状態、及び／又はＩＢＤ又はＩＢＳの症状が軽減され得る状態に従うように、治療用組成物は、本発明による蛋白質を形成可能である食品グレード細菌の十分なコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する。本発明によると、特に治療用組成物は、本発明による食品グレード細菌の１×１０８〜１×１０１１、好ましくは１×１０１０ＣＦＵを含有するよう供給される。
【００５７】
本発明の他の好適な実施形態において、治療用組成物は直腸内投与される。直腸投与は、座薬、浣腸又はフォームの形で行われる。直腸内投与は、下部腸部分、例えば結腸を冒す慢性炎症性腸疾患のために特に好適である。鼻腔内投与はまた、嚢胞性繊維症及びＢＰＣＯなどの慢性肺疾患の治療のために適切である。
【００５８】
別の態様では、本発明は、本発明による食品グレード細菌を含む食品組成物に関する。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明による食品組成物は、被験者に経口投与するよう意図されている。例えば、組成物は懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、顆粒、粉末又はヨーグルトの形であり得る。
【００６０】
好ましい実施形態では、食品組成物は、本発明による食品グレード細菌の１×１０８〜１×１０１１、好ましくは１×１０９〜１×１０１０ＣＦＵを含有してよい。
【００６１】
好適な実施形態において、食品組成物は、１０１０細菌の毎日投与量にて、患者に投与され得る。
【００６２】
本発明は、以下の図及び実施例によって更に例示的に説明されるであろう。しかしながら、これら実施例及び図は、本発明の範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１Ａ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、若しくはエラフィン又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織重量差（Ａ）、肉眼的スコア（Ｂ）、壁厚さ（Ｃ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｄ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。ＩＬ−１０組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置群と比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはωで、ｐ＜０．０１についてはωωで、及びｐ＜０．００５についてはωωωで注記された。
【図１Ｂ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、若しくはエラフィン又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織重量差（Ａ）、肉眼的スコア（Ｂ）、壁厚さ（Ｃ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｄ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。ＩＬ−１０組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置群と比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはωで、ｐ＜０．０１についてはωωで、及びｐ＜０．００５についてはωωωで注記された。
【図１Ｃ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、若しくはエラフィン又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織重量差（Ａ）、肉眼的スコア（Ｂ）、壁厚さ（Ｃ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｄ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。ＩＬ−１０組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置群と比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはωで、ｐ＜０．０１についてはωωで、及びｐ＜０．００５についてはωωωで注記された。
【図１Ｄ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、若しくはエラフィン又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織重量差（Ａ）、肉眼的スコア（Ｂ）、壁厚さ（Ｃ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｄ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。ＩＬ−１０組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置群と比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはωで、ｐ＜０．０１についてはωωで、及びｐ＜０．００５についてはωωωで注記された。
【図２Ａ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、又はエラフィン又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によって７日間経口処置を受けたマウスの結腸管腔内の洗浄液におけるトリプシン様活性（Ａ）及びエラスターゼ活性（Ｂ）を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてΨで注記された。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図２Ｂ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、又はエラフィン又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株によって７日間経口処置を受けたマウスの結腸管腔内の洗浄液におけるトリプシン様活性（Ａ）及びエラスターゼ活性（Ｂ）を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてΨで注記された。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図３Ａ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織における肉眼的スコア（Ａ）、壁厚さ（Ｂ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｃ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。
【図３Ｂ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織における肉眼的スコア（Ａ）、壁厚さ（Ｂ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｃ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。
【図３Ｃ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織における肉眼的スコア（Ａ）、壁厚さ（Ｂ）、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｃ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで、及びｐ＜０．００５についてはΨΨΨで注記された。
【図４Ａ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸管腔内の洗浄液におけるトリプシン様活性（Ａ）及びエラスターゼ活性（Ｂ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５について＊で、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図４Ｂ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸管腔内の洗浄液におけるトリプシン様活性（Ａ）及びエラスターゼ活性（Ｂ）を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５について＊で、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図５Ａ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図５Ｂ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図５Ｃ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図５Ｄ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図５Ｅ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図５Ｆ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図５Ｇ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＲＡＮＴＥＳ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＭＣＰ−１（Ｄ）、ＫＣ（Ｅ）、ＩＮＦガンマ（Ｆ）及びＩＬ−１７（Ｇ）の蛋白質濃度を示す図である。εは検出不能なレベルであることを意味している。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスと比較したｐ＜０．０５についての有意差を示した。ＰＢＳ＋ＤＳＳ処置群とＰＢＳ−水処置群との間の有意差は、ｐ＜０．０５については＃で、ｐ＜０．０１については＃＃で、及びｐ＜０．００５については＃＃＃で注記された。
【図６Ａ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−５（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）及びＩＬ−１３（Ｅ）の蛋白質濃度を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図６Ｂ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−５（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）及びＩＬ−１３（Ｅ）の蛋白質濃度を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図６Ｃ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−５（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）及びＩＬ−１３（Ｅ）の蛋白質濃度を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図６Ｄ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−５（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）及びＩＬ−１３（Ｅ）の蛋白質濃度を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図６Ｅ】本発明の、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、並びに野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、又はエラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株によって７日間、毎日経口処置を受けたマウスからの結腸組織において検出されたＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−４（Ｂ）、ＩＬ−５（Ｃ）、ＩＬ−１０（Ｄ）及びＩＬ−１３（Ｅ）の蛋白質濃度を示す図である。ＤＳＳを与えられたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で注記された。野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉ処置マウスと比較された有意差は、ｐ＜０．０５についてはΨで、ｐ＜０．０１についてはΨΨで注記された。
【図７Ａ】本発明の、ＰＢＳ（ｎ＝５）、又はカラシ油（エタノール７０％中０．０１％（ｖ／ｖ））を結腸内投与され、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ（ｎ＝８）、若しくはエラフィン（ｎ＝８）又はＩＬ−１０（ｎ＝５）のいずれかを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓで、ＰＢＳ（ｎ＝８）の経口給餌による前処置に先行する７日間で受けたマウスにおける、痛み関連行動の総数（Ａ）又は腹部の収縮及びなめ行動、伸張及び腹部押しつけ行動の総数（Ｂ）を示す図である。カラシ油を投与されたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差が、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓで処置されたマウスと比較された、ｐ＜０．０５についての有意差を示した。
【図７Ｂ】本発明の、ＰＢＳ（ｎ＝５）、又はカラシ油（エタノール７０％中０．０１％（ｖ／ｖ））を結腸内投与され、並びに野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ（ｎ＝８）、若しくはエラフィン（ｎ＝８）又はＩＬ−１０（ｎ＝５）のいずれかを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓで、ＰＢＳ（ｎ＝８）の経口給餌による前処置に先行する７日間で受けたマウスにおける、痛み関連行動の総数（Ａ）又は腹部の収縮及びなめ行動、伸張及び腹部押しつけ行動の総数（Ｂ）を示す図である。カラシ油を投与されたＰＢＳ処置マウスと比較された有意差が、ｐ＜０．０５については＊で、ｐ＜０．０１については＊＊で、及びｐ＜０．００５については＊＊＊で注記された。Ψは、野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓで処置されたマウスと比較された、ｐ＜０．０５についての有意差を示した。
【図８】本発明の、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ野生型及びｈｔｒＡ菌株によって分泌されたエラフィンを示す図である。野生型（ｗｔ）又はｈｔｒＡ（ｈｔｒＡ）菌株の細胞抽出液（Ｃ）及び上澄み抽出液（Ｓ）で、抗体抗−エラフィンを使用して、ウェスタンブロット実験が実施された。エラフィン生成が、ｗｔ又はｈｔｒＡ菌株（両者共にエラフィン遺伝子発現がナイシン添加によって誘導され得るような発現ベクターを含有する）の対数期培養からのナイシンによって誘導された。
【図９Ａ】本発明の、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおけるＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｗｔ及びｈｔｒＡ変異体菌株の保護効果を示す図である。肉眼的スコア（Ａ）、組織学的損傷（Ｂ）及びＭＰＯ活性（Ｃ）が、水（陰性対照）又はＤＳＳ５％のいずれかで処置された１０匹のマウスの異なる群で評価された。初めの対照群の２つは、ｉ）水とＰＢＳによる経口給餌（陰性対照群）及びｉｉ）ＤＳＳ５％とＰＢＳによる経口給餌（陽性対照群）で処置された。他の群は、全てがＤＳＳ５％で処置され、並びに野生型菌株（ＷＴ）、エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ）を発現する野生型菌株及びエラフィン（Ｅｌａｆｉｎ＋）を発現するｈｔｒＡ変異体菌株のうちのいずれかで処置された。
【図９Ｂ】本発明の、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおけるＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｗｔ及びｈｔｒＡ変異体菌株の保護効果を示す図である。肉眼的スコア（Ａ）、組織学的損傷（Ｂ）及びＭＰＯ活性（Ｃ）が、水（陰性対照）又はＤＳＳ５％のいずれかで処置された１０匹のマウスの異なる群で評価された。初めの対照群の２つは、ｉ）水とＰＢＳによる経口給餌（陰性対照群）及びｉｉ）ＤＳＳ５％とＰＢＳによる経口給餌（陽性対照群）で処置された。他の群は、全てがＤＳＳ５％で処置され、並びに野生型菌株（ＷＴ）、エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ）を発現する野生型菌株及びエラフィン（Ｅｌａｆｉｎ＋）を発現するｈｔｒＡ変異体菌株のうちのいずれかで処置された。
【図９Ｃ】本発明の、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおけるＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｗｔ及びｈｔｒＡ変異体菌株の保護効果を示す図である。肉眼的スコア（Ａ）、組織学的損傷（Ｂ）及びＭＰＯ活性（Ｃ）が、水（陰性対照）又はＤＳＳ５％のいずれかで処置された１０匹のマウスの異なる群で評価された。初めの対照群の２つは、ｉ）水とＰＢＳによる経口給餌（陰性対照群）及びｉｉ）ＤＳＳ５％とＰＢＳによる経口給餌（陽性対照群）で処置された。他の群は、全てがＤＳＳ５％で処置され、並びに野生型菌株（ＷＴ）、エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ）を発現する野生型菌株及びエラフィン（Ｅｌａｆｉｎ＋）を発現するｈｔｒＡ変異体菌株のうちのいずれかで処置された。
【図１０Ａ】本発明の、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおける、Ｌ．ｃａｓｅｉ野生型菌株並びにＳＯＤを発現する、エラフィンを発現する及びＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株の保護効果を示す図である。水（陰性対照）又はＤＳＳ５％で処置された１０匹のマウスの異なる群で、肉眼的スコア（Ａ）、組織学的損傷（Ｂ）及びＭＰＯ活性（Ｃ）が評価された。初めの対照群の２つは、ｉ）水とＰＢＳによる経口給餌（陰性対照群）及びｉｉ）ＤＳＳ５％とＰＢＳによる経口給餌（陽性対照群）で処置された。他の群は、全てがＤＳＳ５％で処置され、並びにＬ．ｃａｓｅｉ野生型菌株（ＷＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ）又はＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株のうちのいずれかで処置された。＊及び＊＊は、そのデータがＬ．ｃａｓｅｉ野生型から得られたデータから有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示唆している。
【図１０Ｂ】本発明の、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおける、Ｌ．ｃａｓｅｉ野生型菌株並びにＳＯＤを発現する、エラフィンを発現する及びＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株の保護効果を示す図である。水（陰性対照）又はＤＳＳ５％で処置された１０匹のマウスの異なる群で、肉眼的スコア（Ａ）、組織学的損傷（Ｂ）及びＭＰＯ活性（Ｃ）が評価された。初めの対照群の２つは、ｉ）水とＰＢＳによる経口給餌（陰性対照群）及びｉｉ）ＤＳＳ５％とＰＢＳによる経口給餌（陽性対照群）で処置された。他の群は、全てがＤＳＳ５％で処置され、並びにＬ．ｃａｓｅｉ野生型菌株（ＷＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ）又はＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株のうちのいずれかで処置された。＊及び＊＊は、そのデータがＬ．ｃａｓｅｉ野生型から得られたデータから有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示唆している。
【図１０Ｃ】本発明の、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおける、Ｌ．ｃａｓｅｉ野生型菌株並びにＳＯＤを発現する、エラフィンを発現する及びＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株の保護効果を示す図である。水（陰性対照）又はＤＳＳ５％で処置された１０匹のマウスの異なる群で、肉眼的スコア（Ａ）、組織学的損傷（Ｂ）及びＭＰＯ活性（Ｃ）が評価された。初めの対照群の２つは、ｉ）水とＰＢＳによる経口給餌（陰性対照群）及びｉｉ）ＤＳＳ５％とＰＢＳによる経口給餌（陽性対照群）で処置された。他の群は、全てがＤＳＳ５％で処置され、並びにＬ．ｃａｓｅｉ野生型菌株（ＷＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ）又はＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株のうちのいずれかで処置された。＊及び＊＊は、そのデータがＬ．ｃａｓｅｉ野生型から得られたデータから有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示唆している。
【図１１】本発明の、マウスからの結腸組織におけるミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｄ）を示す図である。ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｄ）は、飲用ボトル中の水又は水＋ＤＳＳ（３％）を飲み、更にｉ）野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、エラフィン又はＩＬ−１０のいずれかを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ及びＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｈｔｒＡ菌株、並びにｉｉ）Ｌ．ｃａｓｅｉ野生型菌株及びＳＯＤを発現する、エラフィンを発現する並びにＩＬ−１０を発現するＬ．ｃａｓｅｉ菌株で、７日間、毎日経口投与を受けたマウスからの結腸組織において測定された。＊及び＊＊は、そのデータがＬ．ｃａｓｅｉ野生型から得られたデータから有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示唆している。
【図１２】本発明の、ＥＤＴＡ誘導プロモーター（Ｌｌｕｌｌ  Ｄ及びＰｏｑｕｅｔ  Ｉ．著、２００４年；欧州特許第１５３７２１５号及び連邦広報第９８１６４６２号）の条件下で、エラフィン遺伝子が発現されるようなＬ．ｌａｃｔｉｓ野生型菌株におけるエラフィン分泌を示す図である。エラフィンを発現するＬ．ｌａｃｔｉｓ野生型菌株を、キレート剤であるＥＤＴＡの存在中（＋）又は不在中（−）で一夜増殖させた（この構成では、エラフィン遺伝子発現は、ＥＤＴＡ添加によって誘導され得る乳酸菌プロモーターによって制御され、染色体上では、このプロモーターは、亜鉛に特異的なＡＢＣ吸収システムをコード化する遺伝子の発現を制御し、並びにＥＤＴＡ添加によって模倣され得る亜鉛枯渇条件下で抑制される）。次いで蛋白質が抽出され、細胞（Ｃ）と上澄み液フラクション（Ｓ）との間で分取され、次いで抗体抗−エラフィンを使用して、ウェスタンブロット実験が実施された。実施例材料及び方法
【００６４】
組換体乳酸細菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ及びＬａｃｔｏｂｕｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）におけるエラフィンのクローニング
乳酸細菌におけるエラフィンのクローニング及び発現
【００６５】
エラフィンをコード化する遺伝子が、プラスミドＤＫ６−エラフィン（１４）からＰＣＲ増幅された。使用されたプライマーの配列は、５’順方向エラフィンプライマー（ＣＣＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＡＧＴＴＣＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）及び３’逆方向−エラフィンプライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＡＡＣＡ  ＧＧＣＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）であった。プライマーは、シグナルペプチド（ＳＰ）をコード化するエラフィン領域の第１コドンを除去するように設計され、Ｌ．ｌａｃｔｉｓからの主要な分泌蛋白質であるＵｓｐ４５蛋白質（ＰＳＵｓｐ４５）のＳＰによって置き換えられた。その狙いのために、ＰＣＲ生成物を分解し、精製し、並びにＬ．ｌａｃｔｉｓ分泌ベクターであるｐＳＥＣ中にクローン化された。生成したプラスミドｐＳＥＣ：エラフィンでは、エラフィンがＰＢＳ及びＰＳＵｓｐ４５をコード化するＤＮＡ断片でフレームにて融合される。このカセットの発現は、その活性が、使用されるナイシンの濃度に依存する誘導プロモーターＰｎｉｓＡによって制御される。次いで、このプラスミドが、ナイシン調節遺伝子であるｎｉｓＲとｎｉｓＫを保持するＬ．ｌａｃｔｉｓ（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００）菌株中に導入され、組換体菌株ＮＺ（ｐＳＥＣ：エラフィン）を得る。使用されたツール（レプリコン、プロモーター、ＲＢＳ及びＳＰ）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ及びＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどの乳酸菌株で機能的である。これら２つの菌株（それぞれが、それらの染色体上に遺伝子ｎｉｓＲＫを保持している）は、それらの消化管における存続性能力（Ｌ．ｌａｃｔｉｓでは２４〜４８時間であるのに対し、４日間まで）のために選択された。更に、我々は、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ＢＬ２３菌株が、ＤＳＳ誘発結腸炎モデル（Ｒｏｃｈａｔら著、２００７年）において抗炎症性特性を有することを最近立証した。したがって、我々は１週間存続する（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）及び頑強に存続する（Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）非免疫調節性菌株、並びに頑強に存続する（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ）免疫調節性菌株を手元に所有し、このことが、使用された菌株の固有の抗炎症効果と過剰発現された分子の抗炎症効果の組み合わせの実現性を評価することを可能にしている。
【００６６】
ＰｎｉｓＡプロモーターの誘発に関して、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ組換体菌株を、ＯＤ６００＝０．４〜０．６にまで培養し、次いで１０ｎｇ／ｍｌのナイシン（Ｓｉｇｍａ）で１時間誘発させた。次に、この誘発の官能性が以下のように試験され、すなわち、ＮＺ（ｐＳＥＣ：エラフィン）培養（最終的にＯＤ６００＝〜１）がペレットと上澄み液に分離され、次いでエラフィン中の含有量が、ＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタンブロットによって測定された。
動物
【００６７】
Ｃ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）がＪａｎｖｉｅｒ（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ）から入手され、動物が、１２時間絶食処理された結腸炎誘発の前日以外は、１２時間の明所／暗所周期下で、餌と水に自由にアクセスさせて、室温にて保持された。全ての手順は、施設内動物実験委員会及び獣医サービスによって承認されたものである。
結腸炎の誘発及び研究設計
【００６８】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）での処置によって、結腸炎が誘発された。詳しくは、ＤＳＳが飲料水中に溶解され（３％又は５％ｗｔ／ｖｏｌ）、動物にこの溶液を自由に７日間飲ませた。ＤＳＳ処置群で水消費を測定し、水を飲むナイーブマウスの群と比較した。その結果、水を飲むマウスとＤＳＳを飲むマウスとの間で、消費された液体の容量で差は観察されなかった。マウスを、野生型、エラフィン−組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ又はＬｂ．ｃａｓｅｉの５×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）の１００μｌで、あるいは細菌培地単独で、経口的に毎日処置した。最初の処置が、ＤＳＳが飲料水に添加されるのと同時に開始され、最後の処置が致死された日に行われた（７日目）。結腸炎誘発後、体重及び生存率が毎日測定された。ＤＳＳを動物の飲料水に添加してから７日目に、マウスを致死させて、肉眼的スコア、腸管厚さ、ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性、蛋白質分解活性、サイトカイン発現などの炎症の数個のパラメータを測定するために、結腸を採取した。
炎症パラメータの測定
【００６９】
肉眼的損傷を、先に記載されたように（５；１５；１６）評価した。簡単に言うと、観察する場合、以下のパラメータに１のスコアが与えられ、これらは出血、浮腫、狭窄、潰瘍形成、糞便血、粘液、及び下痢である。紅斑は、冒された領域の長さに依存して（０：無、１：１ｃｍ未満、２：１ｃｍ以上）、最大２で採点評価された。癒着状態は、その重篤性に基づいて（０：無、１：中程度、２：重篤）、採点評価された。
【００７０】
致死の時点で採取された結腸組織において、先に記載されたように（５；１５；１６）、顆粒球侵入の指標として、ＭＰＯが測定された。組織サンプルを、リン酸塩緩衝液（ｐＨ６)中０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドの溶液中で、ホモゲナイズし、１３０００×Ｇで２分間、遠心分離した。上澄み液を、１％過酸化水素とＯ−ジアニシジン・ジヒドロクロライドを含有する緩衝液に添加した。酵素溶液についての光学密度測定値が、４５０ｎｍで２分間読み取られた。
【００７１】
サイトカイン及びケモカイン蛋白質測定に関して、致死の際に採取され凍結された結腸サンプルを、抗−プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）カクテルが補充された、細胞溶解緩衝液５００μｌ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ＥＧＴＡ  １ｍＭ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ピロリン酸ナトリウム２．５ｍＭ、β−グリセロリン酸１ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４  １ｍＭ、ロイペプチン１μｇ／ｍｌ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，Ｓｉｇｍａ）中、ポリトロンを使用して、４℃で３０秒間、ホモゲナイズした。遠心分離（１００００×ｇ、１０分間、４℃）後に、上澄み液をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム上で濾過し、このホモジェネートの５０マイクロリットルを、蛍光細胞選別機ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上のサイトメトリックビーズアレイを使用してのサイトカイン及びケモカインの同時計量のために使用した。未加工値を組織重量（３０〜５０ｍｇからの平均値）に対して正規化し、サイトカイン濃度が、ＦＣＡＰ  Ａｒｒａｙ（登録商標）ソフトウェアを使用して、標準曲線から外挿された。製造者の情報に従って、サイトカイン検出の限界より上の値が考慮された。
結腸組織及び管腔洗浄液中のセリンプロテアーゼ活性
【００７２】
先に記載したように（１７）、致死の際に、全結腸を切除し、ＰＢＳ  １ｍｌを注入し、管腔を通過させて２回洗浄した。蛋白質分解活性（トリプシン様活性及びエラスターゼ様活性）が、これら２回の管腔洗浄液の両方で測定された。トリプシン様活性及びエラスターゼ様活性は、トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（１５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）とＭｅＯ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリド（１００μＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）のそれぞれを基質として使用して、測定された。サンプル（トリプシン活性については２０μｌ又はエラスターゼ活性については１０μｌ）を、それらの対応する緩衝液中に再懸濁した（トリプシン活性については、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １００ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ＝８で、エラスターゼ活性については、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）。４０５ｎｍでの吸光度における変化を、マイクロプレートレーダーＮＯＶＯｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、３７℃で３０分間にわたって決定した。活性を、ブタの膵臓からのトリプシン（Ｓｉｇｍａ）又はヒト好中球エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ）の既知の標準希釈液と比較した。管腔洗浄液中の蛋白質濃度を、マイクロプレート（ＢＣＡ  ｋｉｔ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏｕｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）上、ビシンコニン酸の比色計量を使用して決定し、これが、それぞれのサンプルで蛋白質分解活性を標準化するために使用された。
カラシ油に反応する内臓痛行動の誘起及び測定
【００７３】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓの３菌株（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ野生型、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ−エラフィン、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ−ＩＬ−１０）の培養を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）追加グルコース（０．５％）で補充されたＭ１７培地（Ｏｘｏｉｄ）中、振盪なしに３０℃で実施した。一夜培養物からの細菌を、新鮮な培地中で、１／５０（ｖ／ｖ）にて、ＯＤ６００＝０．４〜０．６になるまで増殖させた。次いで、組換体蛋白質発現を可能にするために添加されたナイシン（１ｎｇ／ｍＬ）で、更に１時間細胞を培養した。４５０ｇでの遠心分離によって細菌を収穫し、無菌ＰＢＳで洗浄した。ペレットを、最終濃度５×１０１０ｃｆｕ／ｍＬで、無菌ＰＢＳ中に再懸濁させた。４〜８匹のマウスの群を、細菌懸濁液１００μＬ（５×１０９ｃｆｕ）で毎日、胃内投与によって７日間処置した。８日目に、ＰＢＳ又はカラシ油（７０％エタノール中０．０１％（ｖ／ｖ））５０μＬを、軽いイソフルラン麻酔下で、結腸内注入によってマウスに投与した。次いで、痛みに伴う行動反応（腹部収縮、腹部をなめる行動、伸張、床に対して下部腹部を押し付ける行動）の数が、２０分間計測された。
統計値
【００７４】
ボンフェローニ補正による両側スチューデントｔ検定を使用して、群間比較が行われた。データは平均値±ＳＥＭとして表され、並びに０．０５未満のＰ値が有意であるとみなされた。
結果
エラフィンを発現する組換体Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓが、マウスのＤＳＳ結腸炎の進行に対して保護すること
【００７５】
予想通りに、ＤＳＳ誘発結腸炎（５％ＤＳＳ）は、水を飲んだ対照マウスと比較して、全ての群において深刻な体重減少を引き起こした。乳酸細菌処置のいずれも、この体重減少を著しく修正しなかった（図１Ａ）。飲料水中のＤＳＳはまた、肉眼的損傷を引き起こし、壁厚さを増加させ、並びに結腸組織中のＭＰＯ活性を増加させた（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓで処置されたマウスは、結腸壁厚さ及びＭＰＯ活性の著しい減少を示さず、ＤＳＳ単独処置マウスと比較して、肉眼的損傷スコアにおける僅かな減少のみが観察された。これとは対照的に、エラフィンを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓによって処置されたマウスは、ＤＳＳ結腸炎の誘発後に、著しく低減された肉眼的損傷スコアと、結腸壁厚さの非常に少ない増加を示したが、ＭＰＯ活性はＤＳＳ単独群と差はなかった（図１Ｂ，Ｃ、Ｄ）。更に、ＩＬ−１０サイトカインを発現する組換体Ｌ．ｋａｃｔｉｓで処置されたマウスは、ＤＳＳ結腸炎の誘発後に、低減された肉眼的損傷スコア及びＭＰＯ活性を示したが、この処置によって、壁厚さは、ＤＳＳ単独処置と比較して修正されなかった（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。非炎症マウスでは、ナイーブ対照マウスと比較して、いずれの処置も炎症性パラメータを修正しなかった。
【００７６】
ＤＳＳに誘発されたトリプシン様活性における増加は、エラフィンを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓによって処置されたマウスでは顕著に減少されたが、野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ又はＩＬ−１０を発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓによって処置されたマウスでは変更されなかった（図２Ａ）。エラフィンを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓによる処置だけが、エラスターゼ活性でのＤＳＳ誘起による増加を著しく低減させることが可能であった。
エラフィンを更に発現する組換体Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉが、マウスのＤＳＳ結腸炎の進行に対して保護すること
【００７７】
野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉによるマウス処置が、ＤＳＳ結腸炎誘発後に観察された肉眼的スコアを有意に減少させたが、この処置は、ＤＳＳ単独処置と比較して、増大した壁厚さ及びＭＰＯ活性を低減することに失敗した（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。これとは対照的に、エラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉでの処置は、炎症の全てのパラメータ、すなわち肉眼的損傷スコア、結腸壁厚さ及びＭＰＯ活性を有意に減少させた（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【００７８】
トリプシン様活性でのＤＳＳに誘発された増加は、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスに比べて、エラフィンを発現する組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置されたマウスにおいて著しく低減された。エラスターゼ活性のレベルもまた、野生型Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置された炎症（結腸炎の）マウスと比較して、又はＰＢＳで処置された炎症マウスと比較しても、エラフィン発現組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉで処置された結腸炎（ＤＳＳ誘発）マウスで顕著に低減された（図４Ｂ）。
【００７９】
ケモカインＲＡＮＴＥＳの蛋白質発現は、観測された時点（ＤＳＳ処置の開始後７日目）において、ＤＳＳ結腸炎によって著しく増加されなかった。野生型又はエラフィン分泌性Ｌｂ．ｃａｓｅｉは、ＤＳＳ処置マウスにおいて、ＲＡＮＴＥＳ発現のレベルを修正することに失敗した（図５Ａ）。ＴＮＦアルファ、ＩＬ−６、ＭＣＰ１、ＫＣ、ＩＮＦγ及びＩＬ−１７Ａは全て、ＤＳＳ結腸炎の誘発後７日目にて、ＤＳＳ結腸炎によって増大された（図５Ｂ〜Ｇ）。エラフィン発現の組換体Ｌｂ．ｃａｓｅｉによるマウス処置は、ＩＬ−６、ＭＣＰ１、ＫＣ及びＩＬ−７の蛋白質発現を有意に減少させた（図５Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）が、ＴＮＦα及びＩＮＦγなどのような他の炎症性サイトカインの発現のレベルを減少させることに失敗した（図５Ｂ及びＦ）。興味深いことに、ＤＳＳ結腸炎はサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３でのいずれの増加ももたらさなかったが（図６Ａ〜Ｅ）、エラフィン発現Ｌｂ．ｃａｓｅｉ組換体によるマウスの処置は、これらサイトカインの発現を著しく上昇させて、しかしこれは結腸炎状況（ＤＳＳ処置後の）でのみ上昇させた。エラフィン発現Ｌｂ．ｃａｓｅｉ組換体に反応するＴｈ２サイトカインでの増加は、少なくとも部分的には、この組換体細菌の抗炎症効果で説明し得る。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３のレベルは、炎症（ＤＳＳ）マウス又は非炎症マウスのいずれでも、いかなる他の処置によっても修正されなかった。
エラフィンを発現する組換体Ｌａｃｔｏｃｕｃｃｕｓ  Ｌａｃｔｉｓが、内臓痛行動を低減すること
【００８０】
カラシ油の結腸内投与は、痛み行動の数で、すなわち、腹部収縮の数と、腹部なめ行動、伸張、及び床に下腹部を押しつける行動の総合された痛み行動の数の双方で、著しい増加を引き起こした（図７Ａ及びＢ）。全ての痛み行動を一緒に検討すると、野生型、ＩＬ−１０組換体又はエラフィン分泌性Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、効果を有しなかった（図７Ａ）。総合された痛み行動だけで検討する場合、ＩＬ−１０ではなくエラフィンを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓ又は野生型が、痛み行動を有意に低減させる（図７Ｂ）。更に、エラフィンを発現する組換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓだけが、ＰＢＳ処置又は野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ処置の両方と比較すると、痛み行動の数での注目すべき減少を誘導した。
ｈｔｒＡ菌株による結果
【００８１】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、ｈｔｒＡと呼ばれる１種しかないハウスキーピング細胞外プロテアーゼを発現し、これは、全てのほどかれたエクスポート蛋白質を分解する（Ｐｏｑｕｅｔら著，２０００年及び米国特許出願第６，９９４，９９７号及びＦＲ第２７８７８１０号）。ｈｔｒＡ遺伝子が不活性化されたＬ．ｌａｃｔｉｓ変異体菌株が作製され、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいて数種の異種分泌された蛋白質の生成速度を増加させることが可能となった（Ｐｏｑｕｅｔら著、２０００年及びＭｉｙｏｓｈｉら著、２００２年）。本発明によると、エラフィン発現カセットが上記ｈｔｒＡ変異体にクローン化された。ｈｒｔＡ変異体におけるエラフィン生成レベルと野生型（ｗｔ）菌株におけるエラフィン発現レベルが、ウェスタンブロット実験によって比較された（図８）。分泌されたエラフィンの著しい増加が、ｗｔ菌株と比較して、ｈｔｒＡ変異体の上澄み液中で観測された。したがって、ｈｔｒＡ菌株は、エラフィンのより高い生成及び分泌レベルを可能にすることができるであろう。
【００８２】
次いで、これら２つの菌株が、ＤＳＳ誘発結腸炎モデルにおいて試験され、これによって我々は、ｈｔｒＡ変異体が、野生型菌株よりも良好に結腸炎損傷に対してマウスを保護することを、インヴィヴォにて確認した。
比較による結果
【００８３】
ＩＬ−１０、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びエラフィン生成Ｌ．ｃａｓｅｉ菌株の保護的効果が、ＤＳＳ５％誘発結腸炎モデルにおける評価と並行して評価された。Ｌ．ｃａｓｅｉが、Ｌ．ｌａｃｔｉｓと比較して２つの主な差異を有することを思い出すべきであり、すなわちｉ）ＧＩＴにおけるより高い存続性とｉｉ）固有の抗炎症性特性である（Ｒｏｃｈａｔら著、２００７年；Ｗａｔｔｅｒｌｏｔら著、２０１０年）。図１０Ａ／Ｂ／Ｃに示されたように、３つの基準（肉眼的、組織学的及びＭＰＯ活性）に及ぼす最高の保護効果が、エラフィン生成Ｌ．ｃａｓｅｉ菌株で得られ、それに続きＳＯＤ生成Ｌ．ｃａｓｅｉ菌株で得られ、ＩＬ−１０を生成するＬ．ｃａｓｅｉ菌株は、より低い効果のみをもたらした。
【００８４】
更には、エラフィン生成Ｌ．ｃａｓｅｉ菌株は、２つのＬ．ｌａｃｔｉｓ菌株（野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓとｈｔｒＡ菌株）よりも良好な保護効果をもたらした（図１１）。
【００８５】
エラフィンがインヴィトロ及びインヴィヴォにおいて、抗細菌活性を有するという事実を考慮すると（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＡＪら著、１９９９年）、これら結果は最も驚くべきことである。すなわち、当業者は、細菌ホストによる低いエラフィン生成又は細菌ホストでは全く生成されないことを推測されていたことだろう。これとは逆に、発明者達によって得られた結果は、プロバイオティックによるエラフィンの非常に良好な生成を示し、これゆえに治療的効果を示す。
【００８６】
更には、インヴィトロ研究とインヴィヴォ研究の双方（臨床研究を含む）が、ホストの抗微生物シールドの欠損が、結腸疾患において潜在的に有害であることを示した（Ｓａｌｚｍａｎ  ＮＨら著、２００３年及びＢｅｖｉｎｓ  Ｃｌら著、２００９年）。
【００８７】
このようなことから、エラフィンの多面的抗微生物／抗炎症活性が、ＩＬ−１０と比較して、エラフィンを非常に優れた治療用分子候補にする。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるプロモーター亜鉛（ＰＺｎ）ｚｉｔｔＲ制御発現のＥＤＴＡ誘導
【００８８】
ｐＺｎ  ｚｉｔＲによって操作されたＬ．ｌａｃｔｉｓにおけるエラフィンの生成（Ｌｌｕｌｌ  Ｄ及びＰｏｑｕｅｔ  Ｉ．２００４年）が、１ｍＭのＥＤＴＡによる１時間の誘導後に、ウェスタンブロット分析によって試験された。誘導培養がエラフィンの非常に高レベルの発現及び分泌をもたらす一方で、非誘導培養サンプル、細胞ペレット（Ｃ）及び上澄み液（Ｓ）が、エラフィンの非常に低レベルの発現及び分泌をもたらす（図１２）。
参照文献
【００８９】
本願の全体を通して、種々の参照文献が、本発明が関する技術現状を記載している。これら参照文献の開示は、参照によって本開示中に組み込まれる。
【００９０】
Ｂｅｖｉｎｓ  ＣＬ，Ｓｔａｎｇｅ  ＥＦ，Ｗｅｈｋａｍｐ  Ｊ．著，「Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｐａｎｅｔｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｌｅａｌ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｂｕｔ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＮＯＤ２  １００７ｆｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｇｕｔ．２００９年６月；５８（６）：８８２−３頁．
Ｂｒａａｔ，Ｈ．，Ｍ．Ｐ．ＰｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈとＤ．Ｗ．Ｈｏｍｍｅｓ著，２００３年．「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：７２５−７３１頁．
Ｂｒａａｔ，Ｈ．，Ｐ．Ｒｏｔｔｉｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．Ｈｏｍｍｅｓ，Ｎ．Ｈｕｙｆｈｅｂａｅｒｔ，Ｅ．Ｒｅｍａｕｔ，Ｊ．Ｐ．Ｒｅｍｏｎ，Ｓ．Ｊ．ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｓ．Ｎｅｉｒｙｎｃｋ，Ｍ．Ｐ．Ｐｅｐｐｌｅｎｂｏｓｃｈ，及びＬ．Ｓｔｅｉｄｌｅｒ著，２００６年．「Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４：７５４−７５９頁．
Ｂｒｏｎ  Ｐｅｔｅｒ  Ａ．，Ｍａｒｃｏｓ  Ｇ．Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌ，Ｊｏｌａｎｄａ  Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｅｍｍａｎｕｅｌｌｅ  Ｐａｌｕｍｂｏ，Ｍａｒｉｅ  Ｄｅｇｈｏｒａｉｎ，Ｊｅａｎ  Ｄｅｌｃｏｕｒ，Ｗｉｌｌｅｍ  Ｍ．ｄｅ  Ｖｏｓ，Ｍｉｃｈｉｅｌ  Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ，及びＰａｓｃａｌ  Ｈｏｌｓ著，「ＵＳＥ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｒ  Ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  Ｆｏｏｄ−Ｇｒａｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２年１１月，５６６３−５６７０頁．
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Ｍｏｔｔａ  Ｊｅａｎ−Ｐａｕｌ，Ｌａｕｒｅｎｔ  Ｍａｇｎｅ，Ｄｅｌｐｈｙｎｅ  Ｄｅｓｃａｍｐｓ，Ｃｏｒｉｎｎｅ  Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃａｍｉｌａ  Ｓｑｕａｒｚｏｎｉ−Ｄａｌｅ，Ｐｅｒｒｉｎｅ  Ｒｏｕｓｓｅｔ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｃｅｎａｃ，Ｖｉｖｉａｎｅ  Ｂａｌｌｏｙ，Ｍｉｃｈｅｌ  Ｈｕｅｒｒｅ，Ｄｉｅｔｅｒ  Ｊｅｎｎｅ，Ｊｕｌｉｅｎ  Ｗａｒｔｅｌｌｅ，Ａｚｚａｑ  Ｂｅｌａａｏｕａｊ，Ｅｍｍａｎｕｅｌ  Ｍａｓｌ，Ｊｅａｎ−Ｐｉｅｒｒｅ  Ｖｉｎｅｌ，Ｌａｕｒｅｎｔ  Ａｌｒｉｃ，Ｍｉｃｈｅｌ  Ｃｈｉｇｎａｒｄ，Ｎａｔｈａｌｉｅ  Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ，Ｊｅａｎ−Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓａｌｌｅｎａｖｅ著，「Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ａｎｔｉ−ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｂｙ  ｅｌａｆｉｎ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｏｌｉｔｉｓ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１１年、Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．
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【図１Ａ】
0006007106.tif 000002
【図１Ｂ】
0006007106.tif 000003
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
0006007106.tif 000024
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0006007106.tif 000026
【図８】
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【図９Ａ】
0006007106.tif 000028
【図９Ｂ】
0006007106.tif 000029
【図９Ｃ】
0006007106.tif 000030
【図１０Ａ】
0006007106.tif 000031
【図１０Ｂ】
0006007106.tif 000032
【図１０Ｃ】
0006007106.tif 000033
【図１１】
0006007106.tif 000034
【図１２】
0006007106.tif 000035
【配列表】
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