(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマメノキ抽出物またはクロマメノキ分画物を有効成分として含む、黄斑変性症の治療、予防または改善用薬剤学的組成物の製造方法であって、
クロマメノキを、水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはその混合溶媒によって抽出する工程、または
クロマメノキを、ポリフェノール成分分画法および／または色素成分分画法を用いて分画する工程
を含む製造方法。
【請求項２】
前記クロマメノキ分画は、固相抽出法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＳＰＥ）によって分画されたものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリフェノール成分分画法を用いて分画されたポリフェノール画分は、クロマメノキ抽出物からＨＣｌ溶液で炭水化物／酸画分を除去した後、エチルアセテートで溶出させて得られた分画物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記色素成分分画法を用いて分画された色素画分は、クロマメノキ抽出物からＨＣｌ溶液で炭水化物／酸画分を除去し、エチルアセテートでポリフェノール画分を溶出させた後、メタノール／ＨＣｌ溶液で溶出させて得られた分画物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
クロマメノキ抽出物またはクロマメノキ分画物を有効成分として含む、黄斑変性症の治療、予防または改善用薬剤学的組成物であって、前記クロマメノキ抽出物およびクロマメノキ分画物は、ピリジニウムビスレチノイド（Ａ２Ｅ）の蓄積および酸化の抑制活性を有することを特徴とする薬剤学的組成物。
【請求項６】
黄斑変性症は、加齢性黄斑変性症である、請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
点眼剤または眼軟膏剤である、請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマメノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）抽出物またはクロマメノキ分画物を有効成分として含む黄斑変性症の治療、予防または改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ヒトの眼の網膜の中心部近傍に位置する神経組職を黄斑と言い、視細胞の大部分が集中し、物体の像が結ぶ視野の中心に存在するので、視力に非常に重要な役目を担っている。さまざまな原因でこの黄斑部が変性して視力障害を引き起こす眼科疾患を黄斑変性（症）といい、黄斑変性は緑内障、糖尿病性網膜疾患とともに３大失明疾患の一つとして知られている。
【０００３】
このような黄斑変性症は中心視力に影響を与え、視野の中心のぼやけ、中心暗点、変視症における視覚歪みまたは中心視力の斑状喪失によって読書、運転などの日常生活活動の遂行が困難または不可能となり、ひどい場合は失明にまでつながる非常に深刻な疾病である。
【０００４】
黄斑変性を引き起こす最も代表的な原因としては加齢を挙げることができ、その他に家族歴、人種、喫煙などにも多少の連関性があると報告されている。特に、加齢性黄斑変性症（Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）は、西洋社会で５５歳以上の高齢者における失明の主な原因となって久しい。現在アメリカでは８百万人以上が加齢性黄斑変性症の一種である乾性加齢性黄斑変性（ｄｒｙ ＡＭＤ）に罹患しおり、毎年３百万人以上がこの疾患で視力を失うと報告されている。最近、国内でも黄斑変性症の患者数が幾何級数的に増加しているが、これは西洋化した食習慣とともにオゾン層の破壊による紫外線曝露の増加による結果であると考えられる。特に、黄斑変性症は元々高齢者層で主に発生する疾患であったが、近年になって国内でも、発病年齢層が６０代から４０代、５０代に若年化しており、中高年層の発病率も最近数年の間に急速に増加している。
【０００５】
黄斑変性症は大別して乾性及び湿性の２類型に分類することができ、黄斑変性を持つ人々の約９０％位は乾性黄斑変性症患者である。乾性黄斑変性は黄斑部組職が萎縮しまたは薄くなった結果、細胞外の老廃物が網膜細胞を死滅させる。湿性黄斑変性は、網膜細胞の死とともに黄斑下部に異常な新生血管が成長し、弱い新生血管が破裂して生じる。乾性黄斑変性症は慢性疾患で進行が遅く、初期には兆候がなくて自覚診断が難しい。乾性黄斑変性症では失明することはないが、失明の危険性が高い湿性黄斑変性に転換される可能性があるので、老眼が進む４０〜５０代からこの疾患を予防することが非常に重要である。
【０００６】
特に、乾性黄斑変性症はいまだに確立された治療法がないのが現状である。湿性黄斑変性症の場合、変性部位の境界が明確である場合は、レーザー光凝固術を施行する。その他にもビスダインを用いた光線力学療法が有効である。ＶＥＧＦ抑制剤の眼内注入による血管新生の抑制も、湿性黄斑変性症の治療法として示唆された。しかしながら、いまだに有望な治療法は開発されていないので、黄斑変性の予防の必要性が特に強調されている。
【０００７】
一方、黄斑変性症の市場は大別して医薬品及び健康機能食品に分けられる。現在国内で加齢性黄斑変性症治療剤として承認されて発売開始された医薬品は湿性黄斑変性治療剤であるラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）だけであり、乾性黄斑変性症に対する治療剤はいまだにないのが実情である。ラニビズマブは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ Ａ）に強く結合して阻害するヒト化単クローン抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、湿性黄斑変性症により低下した視力を回復させ、または維持する効果があることが知られている。
【０００８】
しかし、アメリカのジェネテック社（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）により、ラニビズマブを投与された患者における脳卒中発症の危険性という臨床試験における副作用が警告された。さらにラニビズマブは高価であり、その眼内注射は不便である。
【０００９】
一方、健康機能食品の分野を調べると、ルテイン（ｌｕｔｅｉｎ）以外に有効であると認められた食品成分はない。ルテインは網膜の黄斑を保護する成分で、黄斑色素密度を維持させて黄斑の変性を予防することができるが、ルテインのようなカロテノイド系サプリメントを長期間使うと、肺癌の危険性が高くなり、特に喫煙者で危険性が高まるという研究結果がある。よって、喫煙者にとって、ルテイン関連製品を服用することは危険であることがある。
【００１０】
ルテインのように黄斑色素として作用するゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）、ベリー類に多量に含まれたるアントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）が、抗加齢性黄斑変性症効果を示すと報告されているが、食品医薬品安全局により機能性原料として承認されていない。さらに、黄斑変性に色素が及ぼす影響についての研究は、わずかになされているのみである。老年層だけではなく中高年層にも黄斑変性症が広がっているのみならず、それに対する満足な治療法も示されていない状況において、黄斑変性の予防に役立つ医薬品及び健康機能食品の開発が切実に要請されているのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前述したような黄斑変性症において、既存の治療及び予防方法の問題点を認識し、これを改善しようとしたもので、より具体的には、クロマメノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）の抽出物を活性成分として用い、長期間の使用時にも副作用がなく、治療及び予防の効果に優れた新規の黄斑変性症に対する治療または予防用組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、クロマメノキ抽出物を含む黄斑変性症改善用化粧料組成物、食品学的組成物及び薬学的組成物を提供することをも目的とする。
【００１３】
前記のような本発明の目的及び特徴は、本願の一部を形成する下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によって十分に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記のような目的を達成するために、本発明はクロマメノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）由来の抽出物を有効成分として含む黄斑変性症の改善または治療用組成物を提供する。
【００１５】
黄斑変性症の発生要因及びその進行についての知見によれば、Ａ２Ｅ（ピリジニウムビスレチノイド（ｐｙｒｉｄｎｉｕｍ ｂｉｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｄ））は黄斑変性症に最も対応し得る主要因子として作用する。Ａ２Ｅは体内で分解されず、加齢性黄斑変性症の進行と相関して網膜色素上皮に蓄積する。Ａ２Ｅは網膜色素上皮リポフスチン（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ）の主要な自己蛍光成分の一つとして発見され、網膜色素上皮細胞内に蓄積して該細胞を死滅させ、その結果光受容体細胞が死滅し、光受容体細胞が集中している黄斑の機能が喪失して、黄斑変性症が発病する。
【００１６】
また、紫外線は黄斑変性症の発病危険率を高め、またはその進行を加速させるが、これはＡ２Ｅが紫外線によって光酸化形態のＡ２Ｅに変わり、網膜色素上皮細胞の死滅を有意に増加させるからである。
【００１７】
故に、本発明者は黄斑変性症の根本的な治療及び予防のために鋭意検討した。その結果、クロマメノキから得られた抽出物が網膜色素上皮細胞内におけるＡ２Ｅの蓄積および紫外線によるＡ２Ｅの酸化を抑制し、網膜色素上皮細胞をＡ２Ｅから保護する効果があることを見いだし、該抽出物が黄斑変性症を治療及び予防し得ることを科学的に立証し、本発明を完成することになった。
【００１８】
本発明において、黄斑変性症の治療または改善のための成分として初めて使われるクロマメノキは、韓半島の漢拏山、金鋼山、白頭山などで自生するツツジ科落葉潅木植物で、６〜７月に花が咲いて８月に実を結ぶ植物である。クロマメノキの主要含有成分としては、糖分（８〜１１．８％）、フルーツ酸（２〜２．２５％）、タンニン（０．１５〜０．２５％）、線維素などをあげることができる。
【００１９】
元々クロマメノキに対する薬理学的利用は、中世ドイツの修道院長であったセイントヒルドガード（１０９８〜１１７９）という女性が、この実を女性生理に係わる薬として勧めたことから始まった。クロマメノキは、中国及び北朝鮮では健康酒として長年にわたって使われて来たが、その薬理作用については科学的根拠が小さく、成分分析も提供されていなかった。
【００２０】
このように、本発明では、主として食材として使われて来たクロマメノキを、黄斑変性症の改善、予防または治療剤の原料として採択している。本発明の黄斑変性症の予防または治療用組成物は、経口剤形のみでなく局所用剤形としても処方され、黄斑変性症を治療または改善するための目薬、眼軟膏などの剤形で眼に直接使うのに非常に適している。
【００２１】
特に、後述するように、ＡＲＰＥ−１９細胞を使い、本発明のクロマメノキから抽出された成分がＡ２Ｅの蓄積を阻害し、Ａ２Ｅの酸化を抑制する効果を有することを実験により立証した。本発明のクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物は、Ａ２Ｅの蓄積及びＡ２Ｅの酸化などの黄斑変性症の病因を根本的に治癒することができるので、黄斑変性症、特に、加齢性黄斑変性症の治療、予防及び改善に有用な薬学的組成物または機能性食品の活性成分として使用され得る。
【００２２】
従って、本発明は、他の側面として、クロマメノキ抽出物またはクロマメノキ分画物の黄斑変性症の治療、予防または改善のための用途に関する。好適な一実施形態において、本発明は黄斑変性症の治療、予防または改善用組成物、ないし黄斑変性症の治療、予防または改善方法を提供する。
【００２３】
本発明の一実施形態として、本発明は、活性成分としてクロマメノキ抽出物またはこれから分画した分画物を含む黄斑変性症治療、予防または改善用組成物を提供する。
【００２４】
前記クロマメノキ抽出物は、クロマメノキの花、実、葉または樹皮などから抽出される。
【００２５】
抽出方法としては、天然物を抽出する当業界に知られた通常の方法によって、つまり通常の温度、圧力、時間の条件の下で当該技術分野で通常に使われる溶媒で抽出することができる。本発明のクロマメノキ抽出物を分離するための抽出溶媒としては、抽出工程で一般的に使うことができる溶媒を使うことができるが、水、炭素数１〜４の無水または含水低級アルコールを使って抽出することが好ましいし、この外にも、アセトン、エチルアセテート、ブチルアセテート及び１，３−ブチルグリコールよりなる群から選ばれる溶媒を使って抽出することができる。
【００２６】
前記クロマメノキ分画物は、クロマメノキの花、実、葉または樹皮などから得ることができ、またクロマメノキ抽出物から得ることができる。本発明で特に有意な効果を示すクロマメノキ分画物はクロマメノキのポリフェノール画分、クロマメノキの色素画分またはこれらの混合物であり、好ましくはクロマメノキのポリフェノール画分である。
【００２７】
前記クロマメノキ分画物は、当該技術分野に広く知られた色素成分分画法、ポリフェノール成分分画法などの分画法、例えば本実施例に記載される固相抽出法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＳＰＥ）によって得ることができる。クロマメノキ分画物は、抽出しようとする成分に応じて選択した適切な溶出溶媒を用い、適切な工程で分離することができる。たとえば、炭水化物／酸成分を多量含む炭水化物／酸画分、ポリフェノール性化合物（フラボノールなど）を多量含むポリフェノール画分、色素成分（アントシアニンなど）を多量含む色素画分などが得られる。前記溶出溶媒の選択は当業者が適切に選択することができ、本実施例で示すように、ポリフェノール画分を得るためにエチルアセテートを使うことができ、色素画分を得るためにＨＣｌ／メタノール水溶液を用いることができる。前記クロマメノキ分画物のうち、ポリフェノール画分、クロマメノキの色素画分またはこれらの混合物のみが有意な効果を示し、ポリフェノール画分が最も好ましい。
【００２８】
本発明の一実施形態として、本発明の組成物は、クロマメノキ抽出物の薬剤学的有効量を含む薬剤学的組成物の形態として提供することができる。本明細書において、「薬剤学的有効量」の語は、上述した活性成分が黄斑変性症の治療または予防効果を奏するのに十分な量を意味する。
【００２９】
本発明の薬剤学的組成物は、クロマメノキ抽出物またはクロマメノキ分画物に加えて、さらに薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬剤学的に許容可能な担体は当業界で通常に使われるもの、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などを含むが、これらに限定されない。また、本発明の薬剤学的組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤、あるいはその他の薬剤学的に許容可能な添加剤を含むことができる。
【００３０】
本発明の薬剤学的組成物の有効投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、健康状態、食事、投与時間、投与経路、排泄速度及び薬物感受性のような要因に依存する。一般に、１日に０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの用量を、１日に１回投与することができ、１日に数回に分けて投与することが好ましい。
【００３１】
本発明の薬剤学的組成物は経口でも、非経口でも投与することができる。投与剤形としては点眼剤、眼軟膏剤、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などを挙げることができる。これらは汎用される技術を用いて製剤化することができる。
【００３２】
例えば、点眼剤は、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウムなどの安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベンなどの防腐剤などを必要に応じて使用して調製することができる。点眼剤のｐＨは、一般的に眼科製剤に許容される範囲内にあれば良いが、４〜８の範囲が好ましい。
【００３３】
また、眼軟膏は白色ワセリン、流動パラフィンなどの汎用の基剤を使って調製することができる。一方、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの経口剤は、乳糖、結晶セルロース、澱粉、植物油などの増量剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの崩壊剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール（ｍａｃｒｏｇｏｌ）、シリコン樹脂などのコーティング剤、ゼラチン皮膜などの皮膜剤などを必要に応じて添加して調製することができる。
【００３４】
本発明の一実施形態として、本発明の組成物は、食品組成物、特に機能性食品組成物の形態として提供され得る。本発明の機能性食品組成物は、食品の製造において通常に添加される成分を含み、例えばタンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素及び調味剤を含む。一例として、天然炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース、フルクトースなど）；二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）；オリゴ糖；多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）；及び糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなど）を含む。また、香味剤として、天然香味剤（例えば、タウマチン、ステビア抽出物など）及び合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。
【００３５】
本発明の一実施形態として、本発明は、上述した薬剤学的組成物または食品組成物を黄斑変性症を患う対象または前記組成物を必要とする対象に投与、あるいは組成物の剤形によっては、適用することを含む黄斑変性症の治療、予防または改善方法を提供する。前記対象は人間を含む哺乳動物である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の有効成分であるクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物は、網膜色素上皮細胞内におけるＡ２Ｅの蓄積を阻害し、Ａ２Ｅの酸化を抑制して、黄斑変性症の病因に対抗する効果を有する。よって、本発明の組成物は、医薬、機能性健康食品など、黄斑変性症の治療または改善に有用な多様な製品として、開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＵＶＡにより誘導されるＡ２Ｅの酸化に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の抑制活性を示すグラフである。
【図２】Ａ２Ｅが蓄積したＡＲＰＥ−１９細胞においてＵＶＡによる細胞死に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の細胞保護活性を示すグラフである。
【図３】ＡＲＰＥ−１９細胞において、クロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物のＡ２Ｅ及びｉｓｏＡ２Ｅの細胞内蓄積に対する抑制活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例に制限されないというのは当業界で通常の知識を持った者に明らかであろう。
【００３９】
［実施例１］クロマメノキ抽出物の製造
クロマメノキの実のうち、状態の良いものを選別してきれいに洗浄した後、１００ｇのクロマメノキに水２０００ｍｌを加え、９０℃で１６時間２回熱水抽出して１０％クロマメノキ抽出物を得た。このように収得されたクロマメノキ抽出物は凍結乾燥してパウダー状とした後、使用前まで−４０℃で保管して、クロマメノキ分画物の製造及び後述の実験に使用した。
【００４０】
［実施例２］クロマメノキ分画物の製造
前記実施例１で製造されたクロマメノキ抽出物パウダーを蒸留水に溶かした。また別に、二つのＣ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを連結し、１０ｍｌエチルアセテート、無水メタノール（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ）で調整（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）した後、０．０１Ｎ  ＨＣｌ水溶液をカートリッジに流した。
抽出物をカートリッジ内にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）し、０．０１Ｎ  ＨＣｌ水溶液 ６ｍｌで炭水化物、酸（ａｃｉｄ）及びその他の水溶性化合物を溶出した。この溶出物を集めて炭水化物／酸画分とし、後の実験で比較対象として用いた。
次いで、前記カートリッジの乾燥のため、前記連結されたＣ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジに窒素ガスを１０分間通した。続いて、乾燥したカートリッジに２０ｍｌエチルアセテートを流してフェノール性化合物（ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を溶出し、試験管にポリフェノール画分を収集した。
次に、０．１％ＨＣｌを含む無水メタノール１０ｍｌでアントシアニンを溶出し、色素画分を得た。
全分画物は４０℃で濃縮し、残留溶媒を除去した。
上記過程を経た後、炭水化物／酸画分と色素画分はそれぞれ蒸留水に溶解し、クロマメノキポリフェノール画分は５０％エタノール水溶液に溶解した後、−７０℃で保管し、後述する実験及び分析に用いた。
【００４１】
［実施例３］細胞培養方法
本発明の実験及び分析に用いたヒト成人のＡＲＰＥ細胞（ＡＲＰＥ−１９；ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ． ＣＲＬ−２３０２）は、韓国カトリック医科大学視科学研究所から分譲された。前記ＡＲＰＥ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２、３７℃で維持され、５×１０４個／ウェルの細胞数で６ウェルプレートに接種された。
【００４２】
［実施例４］Ａ２Ｅ合成方法
本発明の実験及び分析に用いるＡ２Ｅは、次のようにして合成した。まず、エタノールに溶解したａｌｌ−トランス−レチナールとエタノールアミン（２：１モル比）の混合物を暗室条件下で酢酸と２日間反応させた後、反応混合物を４０℃で真空濃縮し、次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、純粋なＡ２Ｅを得た。合成されたＡ２Ｅは２０ｍＭのストック濃度でＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解し、実験時まで−２０℃で保管した。
【００４３】
［実験例１］ＵＶＡによるＡ２Ｅの光酸化に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の抑制活性
Ａ２Ｅの光酸化は、３５５ｎｍ〜３７５ｎｍの照射波長を有するＵＶＡランプ（Ｓａｎｋｙｏ Ｄｅｎｋｉ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）により行った。ＵＶＡの照射前に、細胞をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、細胞が乾かない程度にＰＢＳを除去した。ウェルプレートから蓋を除去し、強度２．３５±０．３ｍＷ／ｃｍ２、エネルギー３Ｊ／ｃｍ２でＵＶＡを照射した。
Ａ２Ｅの酸化に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の抑制活性は、次の通り評価した。すなわち、９６−ウェルプレートに１ｍＭ Ａ２Ｅ ２０μｌ（２０ｍＭ Ａ２Ｅ貯蔵液をＰＢＳに希釈して得た）とクロマメノキ抽出物又はクロマメノキ分画物２０μｌを０．０１％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が添加されたＰＢＳ １６０ｕｌ中で混合した。次いで、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにて４３０ｎｍにおける吸光度を測定した後、ＵＶＡ（３Ｊ／ｃｍ２）を照射し、前記と同様に吸光度を測定した。試験試料の吸光度値をＡ２Ｅ対照の吸光度値と比較し、酸化されたＡ２Ｅの濃度はＵＶＡの照射前後の吸光度差で表した。
【００４４】
［実験例２］Ａ２Ｅの蓄積したＡＲＰＥ−１９細胞のＵＶＡによる細胞死に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の細胞保護活性
６−ウェルプレートに、ウェル当たりＡＲＰＥ−１９細胞を５×１０４個ずつ分株した後、２０μｌ Ａ２Ｅを５日間蓄積させた。その後、種々の濃度のクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物（クロマメノキ抽出物：１００、２５０、５００ｍｇ／ｍｌ；クロマメノキ分画物：１２．５、２５、５０、１００ｍｇ／ｍｌ）で処理し、ＵＶＡ（３Ｊ／ｃｍ２）を照射した後、２４時間インキュベートし、ＭＴＴ法を用いてＵＶＡにより誘導されたアポトーシスを測定した。ＭＴＴ法によるアポトーシスの測定は、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを添加したＤＭＥＭにて、光を遮断して３７℃で２時間培養した後、細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に充分に溶解し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍで吸光度を測定して、細胞生存率を、Ａ２Ｅを蓄積せずＵＶＡを照射しない群（正常対照群：ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）の吸光度に対するパーセンテージ（％）で示すことにより行った。
【００４５】
［実験例３］ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅの蓄積に対するクロマメノキ抽出物及び分画物の抑制活性
６−ウェルプレートにウェル当たりＡＲＰＥ−１９細胞を５×１０４個ずつ分株した後、種々の濃度のクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物と２日間インキュベートした後、前記と同様にＡ２Ｅを蓄積させた。その後、プロテアーゼ抑制剤（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファに細胞を懸濁し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、細胞のＡ２Ｅ蓄積量を定量分析した。定量分析には、濃度既知のＡ２Ｅ溶液を用い、Ａ２Ｅ量はブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）でタンパク質量を測定して補正した。試料は、ＨＰＬＣ定量分析の前にＡＲＰＥ−１９細胞からＣＨＣｌ３によってＡ２Ｅを抽出した後に用いた。ＨＰＬＣ定量分析の条件及び具体的な実験方法は下記に示した。
【００４６】
［ＨＰＬＣ定量分析法］
ウォーターズ９９６フォトダイオードアレイデテクターＡ（Ｗａｔｅｒｓ ９９６ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａ）が取り付けられ、逆相Ｃ１８カラム（２５０４．６ｍｍ、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いたウォーターズ６００Ｅ ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅ ＨＰＬＣ）を使用した。Ａ２Ｅは、アセトニトリルとともに０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に溶解され、分離される。Ａ２Ｅは分離後、４３０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ａ２Ｅが蓄積されなかった群における吸光度に対する％で示した。
【００４７】
［実験結果１］ＵＶＡによるＡ２Ｅの酸化に対するクロマメノキ抽出物及び分画物の抑制活性
本発明のクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物のＡ２Ｅの酸化に対する抑制活性を検討するために、実験例１と同様の方法で、細胞にＵＶＡを照射し、酸化されたＡ２Ｅの濃度を測定した（図１）。
【００４８】
図１（ａ）に示されるように、１２５、２５０、５００μｇ／ｍｌの濃度のクロマメノキ抽出物で処理した場合に、酸化されたＡ２Ｅ量は、非処理細胞に比べてそれぞれ２０、３２、４１％低減した。これから、クロマメノキ抽出物が濃度依存的にＡ２Ｅの光誘導性の酸化を抑制することを確認することができた。
【００４９】
また、図１（ｂ）に示すように、２５、５０、１００μｇ／ｍｌのポリフェノール画分は、酸化されたＡ２Ｅ量を、対照（非処理細胞）に比べてそれぞれ３３、７１、８５％まで低減することから、Ａ２Ｅの酸化に対し最も強い抑制活性を示すことが分かった。また、色素画分は、前記ポリフェノール画分と同じ濃度で、それぞれ非処理細胞に比べて３２、５３、６６％酸化されたＡ２Ｅ量を低減した。一方、炭水化物／酸画分には、酸化抑制活性は見られなかった。よって、クロマメノキ分画物は、ポリフェノール画分＞色素画分＞＞炭水化物／酸画分の順にＡ２Ｅ酸化抑制活性を示すことを確認することができた。
【００５０】
［実験結果２］Ａ２Ｅを蓄積したＡＲＰＥ−１９細胞のＵＶＡによる細胞死に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の細胞保護活性
本発明のクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の細胞保護能を検討するために、前述した実験例２と同様に、ＵＶＡを照射した後、ＭＴＴ法により細胞のアポトーシスを測定した（図２）。
【００５１】
図２（ａ）を参照すれば、Ａ２Ｅを蓄積させないでＵＶＡを照射した細胞（Ｎｏｎ Ａ２Ｅ−ＵＶ）及びＡ２Ｅの蓄積後にＵＶＡを照射しなかった細胞（Ａ２Ｅ−ｎｏｎ ＵＶ）では、Ａ２Ｅを蓄積させないでＵＶＡも照射しなかった細胞（正常対照群：ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）と生存率において有意差がなく、Ａ２Ｅの蓄積後にＵＶＡを照射した細胞（陰性対照群：ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と正常対照群（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）の間には、生存率に有意な差が現れることが確認された。
【００５２】
また、図２（ａ）に示すように、１２５、２５０、５００μｇ／ｍｌ濃度のクロマメノキ抽出物で処理した細胞の生存率が、陰性対照群の細胞生存率に比べてそれぞれ６３、１３４、１６７％増加することから、クロマメノキ抽出物がＡＲＰＥ−１９細胞を濃度依存的に保護することが立証された。
【００５３】
また、図２の（ｂ）に示すように、ポリフェノール画分は、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理した細胞の生存率が陰性対照群の細胞生存率に比べてそれぞれ６３、８０、１６１、２０７％増加することから、クロマメノキ分画物の中で最も強い細胞保護活性を示すことがわかった。同濃度の色素画分で処理した細胞の生存率は、陰性対照群に比べて１４、２６、４４、７５％増加した。一方、炭水化物／酸画分には保護活性が見られないことが示された。従って、クロマメノキ分画物は、ポリフェノール画分＞＞色素画分＞炭水化物／酸画分の順で、ＡＲＰＥ−１９細胞をＵＶＡによる酸化から保護することを確認することができた。
【００５４】
［実験結果３］ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＡ２Ｅ及びｉｓｏＡ２Ｅの蓄積に対するクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物の抑制活性
本発明のクロマメノキ抽出物及びクロマメノキ分画物のＡ２ＥとｉｓｏＡ２Ｅに対する蓄積抑制活性を評価するために、実験例３と同じ方法で実験した後、Ａ２Ｅ及びｉｓｏＡ２Ｅの濃度を測定して図３に示した。
【００５５】
図３（ａ）に示すように、５０、１００、２５０、５００μｇ／ｍｌの濃度のクロマメノキ抽出物で処理したＡＲＰＥ−１９細胞では、蓄積したＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅ濃度は、クロマメノキ抽出物で処理しなかった細胞に比べてそれぞれ１８、２６、３７、３４％／８、１１、１８、１３％（Ａ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅ）低減することから、クロマメノキ抽出物が濃度依存的にＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅの蓄積を抑制することを確認することができた。
【００５６】
また、図２（ｂ）に示すように、クロマメノキ分画物では、２５、５０、１００μｇ／ｍｌの濃度の色素画分で処理したＡＲＰＥ−１９細胞に蓄積したＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅ濃度が、クロマメノキ分画物で処理しなかった細胞に比べてそれぞれ３６、４５、５１／１３、１４、４０％低減したことから、最も強いＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅ蓄積抑制活性を示し、同濃度のポリフェノール画分で処理した細胞に蓄積したＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅ濃度は、１９、２０、４０／０．１、３．３、１５％低減した。一方、炭水化物／酸画分にはＡ２Ｅ／ｉｓｏＡ２Ｅ蓄積抑制活性が見られないことが示された。従って、クロマメノキ分画物は、色素画分＞ポリフェノール画分＞＞炭水化物／酸画分の順で、ＡＲＰＥ−１９細胞内における２Ｅ及びｉｓｏＡ２Ｅの蓄積を抑制する効果があることが立証された。
【００５７】
以上のような実験結果から見ると、本発明のクロマメノキ抽出物及びこれから分画された分画物は、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＡ２Ｅの蓄積を抑制し、紫外線によるＡ２Ｅの酸化を抑制することにより、ＡＲＰＥ−１９細胞を保護する効果を示すことが分かった。
【００５８】
従って、このような本発明の組成物によれば、黄斑変性症の病因を根本的に予防することができ、本発明の組成物は黄斑変性症の改善または緩和に非常に有用に用いられるものとして期待される。
【００５９】
以上、本発明の特定の部分を詳細に説明したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術はただ好適な実施例だけで、これらに本発明の範囲が制限されるものではないのは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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