(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡ構築物を、皮膚バリアを透過して送達するためのデバイスであって、
チャンネルを含むマイクロニードルのアレイと、
少なくとも１つの前記マイクロニードルの外表面に互いに離間して所定のパターン配列で形成された複数のナノ構造体と、
前記マイクロニードルの前記チャンネルに流体連通する貯蔵部と、
前記貯蔵部に保持されたｓｉＲＮＡ構築物とを含むことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のデバイスであって、
前記マイクロニードルの表面に所定のパターン配列で形成された複数のマイクロ構造体をさらに含み、
前記ナノ構造体が、前記マイクロ構造体の断面寸法よりも小さい断面寸法を有することを特徴とするデバイス。
【請求項３】
請求項２に記載のデバイスであって、
前記マイクロ構造体の断面寸法よりも小さい、かつ前記ナノ構造体の断面寸法よりも大きい断面寸法を有する別のナノ構造体をさらに含むことを特徴とするデバイス。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のデバイスであって、
前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約５〜５００ｎｍの断面寸法を有することを特徴とするデバイス。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のデバイスであって、
前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約５０ｎｍ〜１μｍの中心間距離で隣接配置されていることを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれかに記載のデバイスであって、
前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約１０ｎｍ〜２０μｍの高さを有することを特徴とするデバイス。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載のデバイスであって、
前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約０．１５〜３０のアスペクト比を有することを特徴とするデバイス。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、約２０〜３０対の二本鎖領域を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物の少なくとも１つの鎖が、２または３ヌクレオチドの３´オーバーハングを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項９のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、追加的なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、標的遺伝子の一部と相同なヌクレオチド配列を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１２】
請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、標的遺伝子の一部と比較して、挿入部分、欠失部分、または単一点突然変異を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、一本鎖ｓｉＲＮＡであることを特徴とするデバイス。
【請求項１４】
請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、該ｓｉＲＮＡ構築物に結合されたリガンドを含み、
該リガンドには、治療用調節物質、診断用化合物、レポーター基、架橋剤、核酸塩基、親油性分子、またはタンパク質等が含まれることを特徴とするデバイス。
【請求項１５】
請求項１ないし請求項１４のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、リポゾーム等の送達媒体に組み込まれていることを特徴とするデバイス。
【請求項１６】
請求項１ないし請求項１５のいずれかに記載のデバイスであって、
前記ｓｉＲＮＡ構築物が、ウイルスベクター等のベクターを含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１７】
ｓｉＲＮＡ構築物を、皮膚バリアを透過して送達するためのデバイスを製造する方法であって、
複数のマイクロニードルからなるマイクロニードルアレイを作製するステップと、
前記複数のマイクロニードルのうちの少なくとも１つのマイクロニードルの外表面に、互いに離間して配置される複数のナノ構造体を所定のパターン配列で形成するステップと、
貯蔵部を、前記マイクロニードルに流体連通するように前記マイクロニードルに関連付けるステップと、
前記貯蔵部内にｓｉＲＮＡ構築物を保持させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記貯蔵部が、前記マイクロニードルアレイが配置された基板に取り付けられていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、
前記貯蔵部が、前記マイクロニードルアレイに取り外し可能に取り付けられていることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記パターンが、１より大きいフラクタル次元を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
複数の前記ナノ構造体の少なくとも一部の断面寸法が１００〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】
複数の前記ナノ構造体は、互いに概ね等しい断面寸法を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
互いに隣接する２つの前記ナノ構造体の平均断面寸法の、その２つの前記ナノ構造体の中心間距離に対する比は、１：１から１：４であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記ナノ構造体間の距離は、少なくとも一部において等距離であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】
複数の前記ナノ構造体の少なくとも一部は、複数のピラーによって形成されたことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記チャンネルの断面寸法は、１〜１００μｍであることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記チャンネルの長さは、約１０〜８００μｍであることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記アレイは、開口部を有する基板を備え、前記開口部は、少なくとも部分的に前記マイクロニードルの前記チャンネルに整合していることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記貯蔵部は、前記アレイが配置される基板に取り付けられたことを特徴とする請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記貯蔵部は、前記アレイに取り外し可能に結合されることを特徴とする請求項２８に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡを送達するための医療デバイスに関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年４月２８日付けで出願された米国特許仮出願第61/328,723号、及び２０１０年１１月２２日付けで出願された米国特許仮出願第61/416,057号の優先権を主張するものである（両特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【背景技術】
【０００３】
様々な因子が、生物の遺伝子発現に影響を与える。例えば、一般的にヌクレオチドの長さが２０〜２５の小ＲＮＡは、真核遺伝子発現の重要な調節因子であることが分かっている。小ＲＮＡの１つのクラスは、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路、特にＲＮＡサイレンシング（二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によりトリガーされる配列特異的ＲＮＡ分解プロセス）に関与する。ｓｉＲＮＡは、小さい３´オーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡであり、サイレンシングを誘導する長いｄｓＲＮＡ前駆体に由来する。ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡを破壊に導くガイドとしての機能を果たし、細胞ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリマーゼ活性によるｄｓＲＮＡの増幅においてプライマーとして関与している。
【０００４】
ｓｉＲＮＡの発見以来、サイレンシング、または様々な遺伝子の転写を抑制する他の方法により、哺乳類細胞においてＲＮＡｉを誘導することができる合成ｓｉＲＮＡが製造されている。しかし、期待される結果にも関わらず、送達方法が大きな役割を果たすｓｉＲＮＡ技術の成功的な使用については依然として問題が存在する。一般的に、ｓｉＲＮＡは、直接注射、エレクトロポレーション、またはトランスフェクト薬と複合化させることにより送達される。しかし、ｓｉＲＮＡの活性は、送達後の数時間しか持続しない。より長い効果持続性を得るために、ｓｉＲＮＡの安定的な長期間送達を提供することができる改良された送達方法が求められている。
【０００５】
ｓｉＲＮＡを、活性状態で、効果的な安定濃度で、かつ長期間に渡って送達することができる経路を提供する薬物送達デバイスがあれば、大いに有益であろう。この目標を達成するためには、様々な問題を解決しなければならない。例えば、人間の体は、異物が体内に侵入するのを防ぐための様々な機能が発達しており、そのような機能としては、例えば、消化管での酵素分解、上皮を透過しての吸収を防止する構成成分、肝クリアランス、免疫応答、及び異物反応がある。
【０００６】
目まい、避妊及びタバコ中毒の治療用薬剤などの特定の薬剤を徐放するための経皮デバイスが開発されている。成功するためには、経皮デバイスは、異物の侵入を阻止する主要機能が発達している表皮を透過して薬剤を送達しなければならない。表皮の最外層である角質層は、積層された複数の角質細胞と、コルネオデスモソームによって互いに結合されかつ脂質マトリックス内に埋め込まれた架橋されたケラチン繊維とによって提供される構造的安定性を有しており、これら全てにより優れたバリア機能が提供される。角質層の真下には顆粒層があり、その内部では、ケラチノサイト間にタイトジャンクション（密着結合）が形成されている。タイトジャンクションは、隣接する原形質膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質ネットワーク（例えば、クローディン、オクルディン、接合部接着分子）、並びに、複数のプラーク・タンパク質（例えば、ＺＯ−１、ＺＯ−２、ＺＯ−３、シングリン、シンプレキン）を含むバリア構造である。タイトジャンクションは、体内上皮（例えば、腸上皮、血液脳関門）及び皮膚の顆粒層において見られる。角質層及び顆粒層の真下には、有棘層が存在する。有棘層はランゲルハンス細胞を含む。ランゲルハンス細胞は、十分に機能する抗原提示細胞になることができ、かつ侵入物質に対する免疫応答及び／または異物反応を担うことができる樹枝状細胞である。
【０００７】
残念ながら、従来の経皮送達方法は、中程度の親脂性を有し、かつ電荷を持たない低分子量薬剤の送達に限られている。皮膚の天然バリアの通過に成功したとしても、送達薬剤の活性レベルの維持、及び異物反応及び免疫応答の回避に関する問題が依然として存在する。
【０００８】
活性薬剤の経皮送達を促進する補助的な方法の利用により、この送達経路は改善された。例えば、皮膚内へのまたは皮膚を透過しての薬剤の輸送にマイクロニードルデバイスが有用であることが分かっている。一般的に、マイクロニードルデバイスは、皮膚の角質層を貫通してその下層に到達することができるマイクロニードルのアレイを含む。マイクロニードルデバイスの例は、Allen他による米国特許第６，３３４，８５６号明細書（特許文献１）及びPrausnitz他による米国特許第７，２２６，４３９号明細書（特許文献２）に記載されている（両特許文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【０００９】
当分野では上述したような改善がなされてきたが、さらなる改善の余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，３３４，８５６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２２６，４３９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ構築物を、皮膚バリアを透過して送達するためのデバイスが提供される。本発明のデバイスは、マイクロニードルと、該マイクロニードルの表面に所定のパターン配列で形成された複数のナノ構造体とを含む。ｓｉＲＮＡ構築物はマイクロニードルに流体連通される。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ構築物を、皮膚バリアを透過して送達するための方法が提供される。この方法は、マイクロニードルで角質層を穿刺するステップを含む。前記マイクロニードルは、該マイクロニードルの表面に所定のパターン配列で形成された複数のナノ構造体を含む。ｓｉＲＮＡ構築物はマイクロニードルに流体連通され、角質層を穿刺した後に、マイクロニードルによって角質層を透過して送達される。
【００１３】
本発明のさらなる別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ構築物を、皮膚バリアを透過して送達するためのデバイスを製造する方法が提供される。この方法は、複数のマイクロニードルからなるマイクロニードルアレイを作製するステップと、前記複数のマイクロニードルのうちの少なくとも１つのマイクロニードルの表面に、複数のナノ構造体を所定のパターン配列で形成するステップと、ｓｉＲＮＡ構築物が前記マイクロニードルに流体連通するように、ｓｉＲＮＡ構築物を前記マイクロニードルに関連付けるステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
当業者を対象にした本発明の完全かつ実現可能な開示（ベストモードを含む）は、以下の添付図面の参照を含む本明細書の残りの部分により詳しく説明される。
【００１５】
【図１】マイクロニードルデバイスの一実施形態を示す。
【図２】マイクロニードルデバイスの別の実施形態を示す。
【図３】細胞外マトリックスと相互作用し得るナノトポグラフィを画定する表面を有するマイクロニードルの一実施形態を示す。
【図４】マイクロニードル表面に形成され得る複雑なパターンの一実施形態を示す。
【図５】図４の複雑なパターンの複数の繰り返しを含むパターンを示す。
【図６】シェルピンスキーの三角形のフラクタルを示す。
【図７】７Ａ〜７Ｄからなり、複雑なフラクタルのナノトポグラフィとフラクタル様ナノトポグラフィを示す。
【図８】マイクロニードル表面に形成され得る別の複雑なパターンを示す。
【図９】本明細書で説明されるナノサイズ構造体に用いることができる例示的な充填密度を示す図であり、９Ａは正方充填配列、９Ｂは六方充填列、９Ｃは円充填列を示す。
【図１０】１０Ａ〜１０Ｃからなり、一実施形態において本デバイスの作製に用いられ得るナノインプリント法を概略的に示す。
【図１１Ａ】本デバイスの一実施形態を概略的に示す。
【図１１Ｂ】本デバイスの一実施形態を概略的に示す。
【図１２】経皮パッチの一実施形態の斜視図であり、薬剤化合物を送達する前の状態を示す。
【図１３】図１２のパッチの正面図である。
【図１４】図１２のパッチの斜視図であり、パッチからリリース部材を部分的に引き出した状態を示す。
【図１５】図１４のパッチの正面図である。
【図１６】図１２のパッチの斜視図であり、リリース部材を除去した後の使用時の状態を示す。
【図１７】図１６のパッチの正面図である。
【図１８】経皮パッチの別の実施形態の斜視図であり、薬剤化合物を送達する前の状態を示す。
【図１９】図１８のパッチの正面図である。
【図２０】図１９のパッチの斜視図であり、パッチからリリース部材を部分的に剥がした状態を示す。
【図２１】図２０のパッチの正面図である。
【図２２】図１８のパッチの斜視図であり、パッチからリリース部材を完全に剥がした状態を示す。
【図２３】図１８のパッチの斜視図であり、リリース部材を除去した後の使用時の状態を示す。
【図２４Ａ】本明細書で説明したいくつかのナノトポグラフィパターンを示す。
【図２４Ｂ】本明細書で説明したいくつかのナノトポグラフィパターンを示す。
【図２４Ｃ】本明細書で説明したいくつかのナノトポグラフィパターンを示す。
【図２４Ｄ】本明細書で説明したいくつかのナノトポグラフィパターンを示す。
【図２４Ｅ】本明細書で説明したいくつかのナノトポグラフィパターンを示す。
【図２５】ナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図２６Ａ】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図２６Ｂ】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図２７】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図２８】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図２９】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図３０】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図３１】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図３２】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図３３】別のナノパターニングされた表面を有するフィルムのＳＥＭである。
【図３４】本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の透過率に対する影響を示すグラフである。
【図３５】本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の透過率に対する影響を示すグラフである。
【図３６Ａ】本明細書で説明したパターニングされたポリスチレン上の細胞単層を透過してのＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色画像である。
【図３６Ｂ】本明細書で説明したパターニングされたポリスチレン上の細胞単層を透過してのＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色画像である。
【図３７】本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層における、ＢＳＡの透過率に対する影響を示すグラフである。
【図３８】本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層における、ＩｇＧの透過率に対する影響を示すグラフである。
【図３９Ａ】本明細書で説明したパターニングされたポリプロピレン上の細胞単層を透過してのＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色画像である。
【図３９Ｂ】本明細書で説明したパターニングされたポリプロピレン上の細胞単層を透過してのＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色画像である。
【図４０】４０Ａ〜４０Ｄからなり、本明細書で説明したナノパターニングされた表面上で培養した細胞の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
【図４１】ナノ構造体のパターンを画定する表面層を含むマイクロニードルのアレイを示す。
【図４２】図４１のアレイのうちの１本のマイクロニードルを示す。
【図４３】本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層における、ｓｉＲＮＡの透過率に対する影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の様々な実施形態について詳細に説明し、１以上の実施例を以下に示す。各実施例は、説明のために与えられるものであり、本発明を限定するためのものではない。事実、本発明の様々な変更及び変形が、本発明の範囲及び要旨から逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明らかであろう。例えば、或る実施形態の一部として説明または図示された特徴を別の実施形態に適用することにより、さらなる別の実施形態を創出することができる。したがって、本発明は、このような変更及び変形を包含することを意図している。
【００１７】
本発明は、概して、ｓｉＲＮＡ構築物を送達するためのデバイスに関する。より具体的には、本発明のデバイスは、該デバイスの表面に設けられた複数のマイクロニードル（極微針）と、前記マイクロニードルの表面に形成された構造体のパターンとを含む。前記構造体の少なくとも一部は、ナノメータスケールで作製されている。本発明のデバイスはまた、例えば、マイクロニードルを含む表面と流体連通されたデバイスの層内または貯蔵部内に収容された１若しくは複数のｓｉＲＮＡ構築物に関連する。
【００１８】
何らかの特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明のデバイスのナノ構造体のパターン、すなわちナノトポグラフィは、異物反応及び免疫応答を最小限に抑えながら、ｓｉＲＮＡの送達を向上させることができると考えられる。本発明のデバイスを使用することにより、ｓｉＲＮＡを、特定部位（例えば、特定の送達領域における特定の組織または細胞種類）を目標にして送達するか、または、例えば心臓血管系を介して全身へ送達することができる。
【００１９】
本発明のデバイスのｓｉＲＮＡ薬剤は、通常の哺乳類細胞において有害な非特異的インターフェロン応答をトリガーしない程度に短い。したがって、１若しくは複数のｓｉＲＮＡ薬剤を含有する組成物の投与は、インターフェロン応答の回避及び異物反応の最小化しながら、標的遺伝子の転写に影響を与えるために用いることができる。本発明のデバイスのｓｉＲＮＡは、一般的に、５０未満、４０未満、３０未満のヌクレオチド対、例えば約２０〜２５のヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。一般的に、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むが、これに限定されるものではなく、一本鎖ＲＮＡを含むこともできる。
【００２０】
ｓｉＲＮＡは、任意の公知の方法に従って作製することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、合成的に、またはインビトロ若しくはインビボでのＤＮＡ構築物の転写によって合成することができる。一般的に、ｓｉＲＮＡ分子は、当業者が利用可能な方法、試薬及び装置を用いて合成することができる。例として、ｓｉＲＮＡは、例えばオリゴエンジン社（OligoEngine, Seattle, Wash.）、ダーマコン社（Dharmacon, Inc., Lafayette, Colo.）、アンビオン社（Ambion Inc., Austin, Tex.）、またはキアゲン社（QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.）などの様々なベンダーから市販されているコンピュータソフトウエアを用いて設計し、遺伝子工学的に作製することができる。Elbashir他による「2000 Genes & Development 15:188-200」、またはElbashir他による「2001 Nature 411:494-98」も参照されたい。
【００２１】
このような方法に従って、ＡＡジヌクレオチドを有する標的配列について、ｃＤＮＡ配列を走査することができる。例えば約３０〜５５％のＧ／Ｃ内容物を含むこれらの標的に対して、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成することができる。これらの配列はその後、他の公知のコード配列との相同性を最小化するために、別のヒトゲノムデータベースの配列と比較される（例えば、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な情報を用いてＢＬＡＳＴサーチを行うことによって）。
【００２２】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子は、インビトロまたはインビボでの適切なＤＮＡ配列（例えば、標的ポリペプチドまたはその所望部分をコードしているポリヌクレオチド配列）の転写によって生成することができる。ＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータ（例えば、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、またはＳＰ６。また、他のプロモータも同様に使用可能である）によってベクターに組み込むことができる。細胞内の内在性ＲＮＡポリメラーゼは、インビボでの転写を仲介することができる。または、クローン化ＲＮＡポリメラーゼが、インビボまたはインビトロでの転写に有用であり得る。導入遺伝子または発現構築物から転写するために、調節領域を用いてｓｉＲＮＡ鎖を転写することができる。
【００２３】
ベクターは、対象に、例えば、静脈注射、局所投与（Nabel他による米国特許第5,328,470号）、または定位注射（Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057, 1994参照）によって送達される。ＤＮＡテンプレートは、ｓｉＲＮＡ薬剤のセンス鎖を含む転写物を生成する転写ユニットと、ｓｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖を含む転写物を生成する転写ユニットとの２つの転写ユニットを含むことができる。送達後にテンプレートが転写されると、ｓｉＲＮＡ剤が生成される。
【００２４】
ｓｉＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド断片（例えば、約１８−３０オリゴヌクレオチド）及びその逆相補体（一般的にスペーサ配列により分離される）を含む一本鎖ポリヌクレオチドから得ることができる。スペーサを開裂することにより、一本鎖オリゴヌクレオチド断片及びその逆相補体を得ることができ、それらをアニールすることにより（任意選択で、一方または両方の鎖の３´末端及び／または５´末端に対する１、２、３個またはそれ以上のヌクレオチドを付加または除去するための追加的な処理ステップを含む）、二本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを生成することができる。前記スペーサの長さは、スペーサを開裂する前に前記断片またはその逆相補体をアニールして二本鎖構造体（例えばヘアピンポリヌクレオチドなど）を形成することができ、また、任意選択で、その後に、一方または両方の鎖の３´末端及び／または５´末端に対する１、２、３個またはそれ以上のヌクレオチドを付加または除去するための処理ステップを行うことができる長さであり得る。したがって、スペーサ配列は、二本鎖核酸へとアニールしたときにｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとなる２つの相補的なポリヌクレオチド配列領域間に配置される任意のポリヌクレオチド配列であり得る。
【００２５】
作製されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは平滑末端を有し得る。任意選択で、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖は、その３´末端に突出（オーバーハング）した１若しくは複数のヌクレオチドを有し得る。例えば、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド二本鎖の各鎖は、その３´末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを有し得る。この２つのヌクレオチドオーバーハングは、チミジンジヌクレオチド（ＴＴ）であってもよいし、あるいは、例えばＴＣジヌクレオチド、ＴＧジヌクレオチドまたは任意の他のジヌクレオチドなどの他の塩基を含んでもよい。このオーバーハングジヌクレオチドはまた、干渉の標的となるポリヌクレオチド配列の５´末端の２つのヌクレオチドに相補的であり得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの３´末端の議論については、Tuschl他による国際特許出願公開第WO 01/75164号を参照されたい（この特許文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。二本鎖ｓｉＲＮＡ構造は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖または２つの相補的ＲＮＡ鎖により形成することができる。
【００２６】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、他の天然発生型、組換え型、または合成型のヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ）及び／またはヌクレオチド類似体（例えば、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドなど。一般的に、５´〜３´ホスホジエステル結合において）の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含み得る。
【００２７】
ｓｉＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝子抑制の標的となるので、抑制は配列特異的である。したがって、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが、抑制に好適である。また、標的配列と比べて挿入部分、欠失部分、または単一点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列も抑制に有効であり、かつ本発明に含まれる。例えば、ｓｉＲＮＡは、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドに対する修飾を含み得る。
【００２８】
ｓｉＲＮＡ化合物は、特定の配列に対して１、２、３または４個のヌクレオチドが異なるようにすることにより（例えば、塩基転移または塩基転換を含むヌクレオチド置換により）、多様性を示し得る。これらの相違は、二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖またはアンチセンス鎖に位置している分子の長さに応じて、特定のｓｉＲＮＡの任意のヌクレオチド位置において生じ得る。このヌクレオチドの相違は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に見ることができ、それと、置換ヌクレオチドが典型的には水素結合塩基対を形成する相補的なヌクレオチドは、必ずしも対応して置換されないことがある。
【００２９】
配列同一性は、当分野で公知のアライメントアルゴリズムを用いてヌクレオチド配列間の差異の割合を計算することにより、最適化することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義され得る。
【００３０】
作製後、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドの発現を干渉する能力について、当分野で公知の方法に従って試験され得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの有効性の判断には、標的ポリペプチドの発現に対する干渉能力だけでなく、宿主細胞に対して有害であるかどうかも含まれる。例えば、ＲＮＡ干渉活性を示すが、不要な生物学的影響を示さないｓｉＲＮＡが望ましい。不要な生物学的影響の一例は、ｓｉＲＮＡを宿主細胞へ導入した結果生じる、細胞死が望ましくない細胞のアポトーシスである。
【００３１】
ｓｉＲＮＡ薬剤の特性（例えば薬理学的特性）は、例えば該ＳｉＲＮＡ薬剤にリガンド（例えば係留リガンド）またはベクター（ウイルスベクター）を導入することにより影響を与え、調整することができる。加えて、ｓｉＲＮＡ製剤が係留リガンドを有する場合、該ｓｉＲＮＡ製剤にリガンドを組み入れることにより該ｓｉＲＮＡ製剤の薬理学的特性を改善することができる。
【００３２】
様々なリガンドが、ｓｉＲＮＡ薬剤に係留されるか、または、例えばリガンド共役モノマーサブユニットの担体に対する製剤化用の共役体または添加物として用いることができる。リガンド共役モノマーサブユニットに関連する例を以下に記載するが、リガンドをｓｉＲＮＡ薬剤の他の部分に結合させてもよいことを理解されたい。
【００３３】
リガンドは担体に、共有結合または非共有結合により、直接的にまたは介在テザーを介して間接的に間接的に結合され得る。リガンドまたは係留リガンドは、リガンド共役モノマーを成長中の鎖に組み込む場合、該リガンド共役モノマー上に存在し得る。一実施形態では、「前駆体」リガンド共役モノマーサブユニットを成長中の鎖に組み込んだ後に、前記「前駆体」リガンド共役モノマーサブユニットにリガンドを組み込む。例えば、アミノ末端テザー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長中のセンス鎖またはアンチセンス鎖に組み込むことができる。その後の操作において、すなわち前駆体モノマーサブユニットを鎖に組み込んだ後、求電子基（例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）を有するリガンドは、該リガンドの求電子基を前駆体リガンド共役モノマーサブユニットテザーの末端求核基と結合させることによって、前駆体リガンド共役モノマーに付加することができる。
【００３４】
リガンドは、該リガンドを組み込んだｓｉＲＮＡ薬剤の分布、標的または寿命を変えることができる。例えば、リガンドは、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞種類、コンパートメント（例えば、細胞コンパートメントまたは器官コンパートメント）、組織、器官、または体の部位に対する親和性を高めることができる。リガンドは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、及び特異性を向上させることができ、また、得られた天然または修飾オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることもできる。
【００３５】
リガントは、とりわけ、例えば取り込みを高めるための治療用調節物質、例えば分布をモニタするための診断用化合物またはレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性を付与する部分、及び／または、天然若しくは異常核酸塩基としての役割を果たし得る。非限定的な例には、親油性分子、脂質、レクチン、ステロイド（ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、合成ポリマー（オリゴ乳酸１５ｍｅｒ）または天然ポリマー（低または中分子量）、インスリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合物質、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、またはペプチド疑似体が挙げられる。他の例には、葉酸または上皮細胞受容体リガンド、例えばトランスフェリンが挙げられる。
【００３６】
リガンドは、天然発生型、組換え型または合成型分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド疑似体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン部分、例えばカチオン脂質、カチオンポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαらせん状ペプチドが含まれる。
【００３７】
リガンドには、標的基、例えば、細胞または組織を標的とする物質、例えば、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスフォネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド若しくはＲＧＤペプチド疑似物が含まれ得る。
【００３８】
リガンドは、タンパク質（例えば糖タンパク質）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ））、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、ペプチド（例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子）、または抗体（例えば、がん細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの特定種類の細胞に結合する抗体）であり得る。リガンドは、ホルモンまたはホルモン受容体であり得る。また、リガンドには、非ペプチド性のもの、例えば、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースが含まれ得る。
【００３９】
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって（例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／または中間径フィラメントを破壊することによって）、細胞内へのｓｉＲＮＡ薬剤の取り込みを増大させることができる物質、例えば薬物であり得る。リガンドは、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン、ミオセルビン、またはテトラサイクリンであり得る。
【００４０】
リガンドは、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することができる脂質または脂質系分子であり得る。ＨＳＡ結合リガンドは、前記複合体の標的組織、例えば肝臓組織（肝臓実質細胞など）への分配を可能にし得る。ＨＳＡと結合することができる他の分子もリガンドとして用いることができる。たとえば、ネプロキシンまたはアスピリンを用いることができる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）前記複合体の分解耐性を増大させる、（ｂ）標的細胞または標的膜への標的化または輸送を増加させる、及び／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質との結合を調節するために用いることができる。脂質系リガンドは、前記複合体の標的組織との結合を調節（例えば制御）するために用いることができる。例えば、ＨＳＡと比較的強く結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的としにくいため、体から除去されにくい。
【００４１】
当分野で知られているように、ｓｉＲＮＡ構築物の送達において、ウイルス若しくは非ウイルスベクターがｓｉＲＮＡ構築物の送達ビヒクルとして用いることができる。本明細書で使用される「ベクター」なる用語は、それが結合した別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプはプラスミド、すなわち、追加的な核酸セグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループである。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加的な核酸セグメントをウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター、またはエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入したときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能可能に連結された遺伝子の発現を誘導可能である。そのようなベクターは、組換え発現ベクター、またはより簡単に発現ベクターと呼ばれる。一般的に、有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であり得る。本明細書では、プラスミドはベクターの最も一般的な使用形態なので、プラスミド及びベクターは相互互換的に使用される。なお、本発明は、等価な機能を果たす、他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ関連ウイルス）を含むことを意図している。一実施形態では、レンチウイルスが、１若しくは複数のｓｉＲＮＡ分子を細胞（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、樹枝状細胞、または造血幹細胞）へ送達するのに使用され得る。
【００４２】
構築物の様々な成分が、公知の方法に従って、互いに機能可能に連結される。ベクターにおいては、「機能可能に連結」とは、目的とするヌクレオチド配列が調節配列に、該ヌクレオチド配列の発現が可能な態様で連結されることを意味することを意図する（例えば、ベクターを標的細胞に導入する場合は標的細胞内で）。「調節配列」なる用語は、プロモータ、エンハンサー、または他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Goeddelによる「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)」に記載されている。調節配列には、様々な種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くものや、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、標的細胞の選択や、所望するｓｉＲＮＡ発現レベルなどの様々な要素に依存し得ることが理解できるであろう。
【００４３】
ｓｉＲＮＡ構築物は、送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノカプセル、またはマイクロカプセル）に組み込むことができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化することができる（Liposome Technology, Vol. II, Incorporation of Drugs, Proteins, and Genetic Material, CRC Press参照）。ｓｉＲＮＡは、その溶解度に応じて、水性層および脂質層の両方に存在するか、または、いわゆるリポソーム懸濁液中に存在することができる。疎水性層には、これらに限定しないが、一般的に、リン脂質（例えば、レクチンまたはスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えばコレステロール）、イオン性界面活性剤（例えば、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸）、及び／または疎水性を有する他の材料が含まれ得る。
【００４４】
用いられる特定配列及び送達される二本鎖ｓｉＲＮＡ薬剤の用量に応じて、ｓｉＲＮＡは、部分的または全体的な機能喪失を標的遺伝子にもたらす。例えば米国特許第6,506,559号（Fire他）の遺伝子では、標的細胞の遺伝子発現の少なくとも９９％の減少または喪失が示されている。送達薬剤の用量を少なくした場合や、選択されたｓｉＲＮＡの投与後の経過時間が長くなった場合は、細胞抑制の割合がより少なくなる。
【００４５】
本発明の送達デバイスは、遺伝子抑制のために、ｓｉＲＮＡを遺伝子へ送達するのに使用され得る。例えば、病原体の複製、病原体の伝播、または感染の維持に不可欠な遺伝子を、本発明の送達デバイスを用いて抑制することができる。別の例では、病原体に感染する危険性がある細胞、またはすでに感染した細胞の遺伝子を標的にすることができる。標的遺伝子は、宿主への病原体の侵入、病原体または宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製または組み込み、宿主における感染の確立または拡散、あるいは、次世代病原体の構築に関与する病原体または宿主遺伝子であり得る。予防方法（すなわち、感染の防止またはリスク減少）、並びに、感染に関連する症状の頻度または重篤度を減少させる方法も本発明に包含される。本発明のデバイスは、ウイルス抑制剤、ウイルス毒性薬、抗生物質製剤、抗真菌薬、抗炎症剤などの他の治療計画、あるいは併用療法などと組み合わせて使用することもできる。
【００４６】
本発明のデバイスは、癌関連遺伝子の発現を抑制するために使用することができる。例えば、本発明のデバイスのｓｉＲＮＡは、固形腫瘍や白血病を含む癌の遺伝子を沈黙させることができる。前記癌には、例えば、アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピアス癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、インサイチュー癌、クレブズ２癌、メルケル細胞癌、粘液性癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮細胞癌、及び移行細胞癌）、組織球性疾患、白血病（例えば、Ｂ細胞性、混合細胞性、ヌル細胞性、Ｔ細胞性、慢性Ｔ細胞性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連、急性リンパ球性、慢性リンパ球性、肥満細胞性、及び骨髄性）、悪性組織球増殖症、ホジキン氏病、免疫増殖性小腸疾患、非ホジキン氏リンパ腫、プラスマ細胞腫、細網内皮症、悪性黒色腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫,組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、肝細胞癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディヒ細胞腺腫、乳頭腫、セルトーリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、被角血管腫、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫症、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、ミキソ肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、実験肉腫、カポシ肉腫、及び肥満細胞肉腫）、新生物（例えば、骨、乳房、消化系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭、首、中枢神経系、聴覚系、骨盤、気道、及び泌尿生殖器）、神経線維腫症、または子宮頸部形成異常が含まれる。また、本発明のデバイスは、細胞が不死化または形質転換した他の症状を治療するために使用することができる。また、本発明のデバイスは、化学療法、寒冷療法、温熱療法、放射線療法などの他の治療法と組み合わせて使用することもできる。
【００４７】
本発明のデバイスは、任意の種類の標的遺伝子またはヌクレオチド配列に限定されない。しかし、可能性がある標的遺伝子の下記のクラスを、標的遺伝子の例示目的のために記載する。発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、ウイングドヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインまたはその受容体、成長／分化因子またはその受容体、神経伝達物質またはその受容体）、腫瘍遺伝子（例えば、ＡＢＬ１、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、及びＷＴ１）、及び酵素（例えば、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ＡＣＰデサチュラーゼ、ＡＣＰヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン合成酵素、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコース酸化酵素、顆粒結合性でんぷん合成酵素、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン合成酵素、オクトピン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、ペル酸化酵素、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼ、及びキシラナーゼ）。
【００４８】
本発明のデバイスは、ｓｉＲＮＡ構築物に加えて、マイクロニードルを含む。マイクロニードルの表面には、複数のナノサイズ構造体が形成されている。本明細書で使用される「形成される（fabricated）」なる用語は概して、本発明のデバイスの表面に存在するように特別に設計、加工、及び／または構成された構造を指し、本発明のデバイスの製造時に単に偶然に形成された表面特徴と同一ではない。つまり、マイクロニードルの表面には、ナノサイズ構造体の所定のパターンが存在し得る。
【００４９】
使用中は、本発明のデバイス、具体的には、マイクロニードル表面のナノサイズ構造体は、皮膚組織及びその成分と相互作用することができる。この相互作用は、細胞／細胞相互作用、エンドサイトーシス、炎症反応などに関連する細胞内及び／または細胞間シグナル伝達を調整または調節（すなわち変更）することができる。例えば、マイクロニードル表面のナノトポグラフィと、その周囲の生物学的物質または構造との間の相互作用により、本発明のデバイスは、膜電位、膜タンパク質、及び／または細胞間結合（例えば、タイトジャンクション（密着結合）、ギャップ結合、及び／またはデスモソーム（接着斑））を調整及び／または調節することができる。このことにより、ｓｉＲＮＡ構築物の経皮送達を向上させることができる。さらに、ｓｉＲＮＡ構築物を、異物反応や免疫応答を引き起こすことなく、皮膚バリアを透過して送達することができる。
【００５０】
本発明のデバイスは、金属、セラミック、半導体、有機体、ポリマー、またはそれらの複合材料などの様々な材料から作製することができる。例えば、医薬品グレードのステンレス鋼、チタン、ニッケル、鉄、金、スズ、クロム、銅、それらのまたは他の金属の合金、シリコン、二酸化ケイ素、またはポリマーが本発明のデバイスの作製に用いることができる。一般的に、本発明のデバイスのマイクロニードルは、その表面にナノサイズの構造体のパターンを持つことが可能な生体適合性材料から作製される。「生体適合性」なる用語は、一般的に、本発明のデバイスが適用される領域内の細胞または組織に対して実質的に悪影響を及ぼさない材料を指す。また、生体適合性材料は、本発明のデバイスが使用される生物の他の領域において、医療的に望ましくない影響を実質的に引き起こさないという意図もある。生体適合性料は、合成材料または天然材料であり得る。生分解性でもある好適な生体適合性料のいくつかの例には、乳酸やグリコール酸ポリラクチドなどのヒドロキシ酸のポリマー、ポリグリコリド、ポリラクチド−コ−グリコリド、ＰＥＧを有するコポリマー、ポリ無水物、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（バレリアン酸）、またはポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）が含まれる。他の適切な材料には、これらに限定しないが、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレン酢酸ビニール、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリエステルが含まれ得る。本発明のデバイスの様々な部品（例えば、マイクロニードル、基部、頂部、薬剤送達領域）は、実質的に無孔性または有孔性であり得、デバイスの全体に渡って材料、形状、硬さなどが同一または互いに異なり得、また硬い固形または半固形であり得る。
【００５１】
図１は、一般的なマイクロニードル経皮デバイス１０を示す。図に示すように、本発明のデバイス１０は、個々のマイクロニードル１２のアレイを含む。各マイクロニードル１２は、個々のマイクロニードルが破損することなく皮膚バリアの全体または一部を貫通することができるようなサイズ及び形状に形成されている。マイクロニードルは、図１のような中実であり得、多孔質であるかまたは中空部分を含み得る。マイクロニードルは、マイクロニードルの方向と平行に延在し、必要に応じて分岐するかまたはマイクロニードルの側部へ出る中空部分、例えばマイクロニードルの全体または一部に渡って延在する円形ボアを含むことができる。例えば、図２は、マイクロニードル１４のアレイを示す。各マイクロニードル１４は、その側部に、ｓｉＲＮＡ構築物を皮下位置へ送達するために用いることができるチャンネル１６を有している。例えば、チャンネル１６は、チャンネル１６を介した薬剤の通過を可能にする接続部を基材１５の開口部とチャンネル１６との間に形成するように、基材１５の開口部と少なくとも部分的に整合されている。
【００５２】
チャンネル１６（存在する場合）の寸法は、薬剤化合物の毛細管流動を誘起するように特に選択され得る。毛細管流動は一般的に、流体のチャンネル壁部に対する接着力が液体分子間の凝集力よりも大きい場合に生じる。具体的には、毛細管圧は、チャンネル１６の断面寸法に反比例し、かつ、液体の表面張力に該液体のチャンネル形成材料との接触角度の余弦を乗じた値に正比例する。したがって、パッチにおける毛細管流動を促進するために、チャンネル１６の断面寸法（例えば、幅や直径など）が選択的に調節され得る。チャンネルの断面寸法を小さくすると、毛細管圧力は大きくなる。例えば、チャンネルの断面寸法は、約１〜１００μｍ、いくつかの実施形態では約５〜５００μｍ、いくつかの実施形態では約１０〜３０μｍである。チャンネルの断面寸法は、一定であってもよいし、またはチャンネル１６の長さに応じて変化してもよい。また、チャンネルの長さも、薬剤化合物の体積、流速、ドウェル時間に応じて変更可能である。例えば、チャンネルの長さは、約１０〜８００μｍ、いくつかの実施形態では約５０〜５００μｍ、いくつかの実施形態では約１００〜３００μｍであり得る。また、チャンネルの断面積も変更可能である。例えば、チャンネルの断面積は、約５０〜１０００平方μｍ、いくつかの実施形態では約１００〜５００平方μｍ、いくつかの実施形態では約１５０〜３５０平方μｍであり得る。さらに、チャンネルのアスペクト比（長さ／断面寸法）は、約１〜５０、いくつかの実施形態では約５〜４０、いくつかの実施形態では約１０〜２０の範囲で有り得る。チャンネルの断面寸法（例えば、幅や直径など）及び／または長さがチャンネルの長さに応じて変化する場合、チャンネルのアスペクト比はチャンネルの断面寸法及び／または長さの平均から求めることができる。
【００５３】
図示したマイクロニードルの数は、例示目的にすぎないことを理解されたい。マイクロニードルアセンブリに使用されるマイクロニードルの実際の数は、例えば、約５００〜１００００本、いくつかの実施形態では約２０００〜８０００本、いくつかの実施形態では約４０００〜６０００本の範囲であり得る。
【００５４】
個々のマイクロニードルは、直線状またはテーパ状のシャフトを有し得る。一実施形態では、マイクロニードルの直径は、マイクロニードルの基部において最大であり、マイクロニードルの先端（遠位端）に向かって先細のテーパをなす。マイクロニードルは、直線状（非テーパ状）部分とテーパ状部分の両方を含むシャフトを有するように作製してもよい。
【００５５】
マイクロニードルは、断面が円形または非円形のシャフトを有するように形成してもよい。例えば、マイクロニードルの断面は多角形（例えば、星形、正方形、三角形）、楕円形、または任意の他の形状であり得る。シャフトは、１若しくは複数のボア及び／またはチャンネルを有し得る。
【００５６】
個々のマイクロニードルのサイズは、所望する目標深さや、マイクロニードルが特定種類の組織において破損するのを避けるためのマイクロニードルの強度条件などに応じて最適化され得る。例えば、経皮マイクロニードルの断面寸法は、約１０ｎｍ〜１ｍｍ、または約１〜２００μｍ、または約１０〜１００μｍであり得る。ニードルの外径は、約１０〜１００μｍで有り得、中空ニードルの内径は、約３〜８０μｍで有り得る。ニードルの先端は、一般的に、約１μｍ以下の半径を有し得る。
【００５７】
マイクロニードルの長さは、一般的に、所望用途に依存する。例えば、マイクロニードルは、約１μｍ〜１ｍｍであり得、例えば、約５００μｍ以下、または約１０〜５００μｍ、または約３０〜２００μｍであり得る。
【００５８】
マイクロニードルアレイに含まれるマイクロニードルは互いに全て相同である必要はない。マイクロニードルアレイは、長さ、外径、内径、断面形状、ナノ構造表面、及び／またはマイクロニードル間の間隔が互いに異なる様々なマイクロニードルの組み合わせを含むことができる。例えば、マイクロニードルは、長方形または正方形グリッドまたは同心円などの一様な態様で、互いに離間配置することができる。マイクロニードル間の間隔は、マイクロニードルの高さまたは幅や、マイクロニードルを介して送達する薬剤の量または種類などの様々な因子に依存し得る。マイクロニードルの様々な配置を有用であるが、マイクロニードルの「先端同士間」の間隔が約５０μｍ以上、いくつかの実施形態では約１００〜８００μｍ、いくつかの実施形態では約２００〜６００μｍとなる配置が特に有用である。
【００５９】
図１を再び参照して、マイクロニードル１２は、基板２０上に、該基板に対して垂直にまたは所定の角度をなして延出している（すなわち、マイクロニードルは基板に取り付けられるか、または基板と一体的に形成される）。一実施形態では、マイクロニードルは、基板に対して垂直に配向されており、かつ基板の単位面積あたり高密度で設けられている。なお、マイクロニードルアレイは、配向方向、高さ、材料、または他のパラメータが互いに異なる様々なマイクロニードルの組み合わせを含み得る。基板２０は、金属、セラミック、プラスチックまたは他の材料からなる硬いまたは柔軟なシートから作製することができる。基板２０の厚さは、本発明のデバイスの要求を満たすために様々であり得、例えば、約１０００μｍ以下、いくつかの実施形態では約１〜５００μｍ、いくつかの実施形態では約１０〜２００μｍであり得る。
【００６０】
本発明のデバイスは、マイクロニードルの表面上に、ナノトポグラフィをランダムまたは規則的なパターンで画定し得る。本発明のデバイスは、マイクロニードルが延出する基板表面上にナノトポグラフィをさらに画定し得るが、これは必須ではない。図３は、２つの代表的なマイクロニードル２２の端部を概略的に示す。この特定の実施形態では、マイクロニードル２２は、マイクロニードル２２を介してｓｉＲＮＡ構築物を送達するために用いることができる中央ボア２４を画定する。マイクロニードル２２の表面２５は、ナノトポグラフィ２６を画定し得る。この特定の実施形態では、ナノトポグラフィ２６は、マイクロニードル２２の表面２５のランダムなパターンを画定する。
【００６１】
マイクロニードルは、その表面に形成された、互いに相同な複数の構造体、またはサイズ、形状またはそれらの組み合わせが互いに異なる複数の構造体を含むことができる。構造体の所定のパターンは、長さ、直径、断面形状及び／または構造体間の間隔が互いに異なる様々な構造体の組み合わせを含み得る。例えば、構造体は、長方形または正方形グリッドまたは同心円などの一様な態様で、互いに離間配置され得る。一実施形態では、構造体はサイズ及び／または形状が互いに異なり、それにより複雑なナノトポグラフィが形成され得る。例えば、複雑なナノトポグラフィは、フラクタルまたはフラクタル様形状を画定し得る。
【００６２】
本明細書で用いられる「フラクタル」なる用語は一般的に、最大スケール（尺度）と最小スケールとの間の全ての測定スケールで或る断片形状を有する幾何学的または物理的構造体であって、該構造体の特定の数学的または物理的性質、すなわち該構造体の次元が、空間次元よりも大きくなるようなものを指す。目的とする前記数学的または物理的性質には、例えば、多孔性媒体における曲線の周長すなわち流量が含まれ得る。フラクタルの幾何学的形状は、各々が自己相似性を画定する複数の部分に分割することができる。加えて、フラクタルは、再帰的定義（recursive definition）を有し、任意の小さいスケールにおいて微細構造を含む。
【００６３】
本明細書で用いられる「フラクタル様」なる用語は一般的に、フラクタルの特徴の１若しくは複数を有しているが、全ては有していない幾何学的または物理的構造体を指す。例えば、フラクタル様構造体は、自己相似的である複数の部分を有する幾何学的形状を含み得るが、任意の小さいスケールにおいて微細構造は含まない。別の例では、フラクタル様の幾何学的形状または物理的構造体は、幾何学的形状パターンを再帰的に繰り返す際に該構造体のスケールを拡大または縮小するが、フラクタルのように該構造体のスケールを均等に縮小（または拡大）しない。フラクタル様パターンは、フラクタルよりもより単純であり得る。例えば、フラクタル様パターンは、規則的であり、従来のユークリッド幾何学言語で比較的容易に記載することができるが、フラクタルはそうではない。
【００６４】
複雑なナノトポグラフィを画定するマイクロニードルの表面は、互いに同じ全体形状を有する構造体（例えばピラー）を含むことができ、前記ピラーは互いに異なるスケール寸法で形成することができる（例えば、ナノスケールのピラーと、マイクロスケールのピラーを形成することができる）。別の実施形態では、マイクロニードルはその表面に、スケールサイズ及び形状が両方とも異なる構造体、または同一のナノサイズスケールに形成されるが形状だけが異なる構造体を含み得る。加えて、構造体は、規則的な配列またはランダムな分布で形成され得る。一般的に、前記複数の構造体のうちの少なくとも一部の構造体は、例えば約５００ｎｍ以下（例えば、４００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下）の断面寸法を画定するナノサイズスケールで形成されたナノ構造体であり得る。ナノ構造体の断面寸法は、一般的に、約５ｎｍ以上、例えば、約１０ｎｍ以上、または約２０ｎｍ以上であり得る。例えば、ナノ構造体は、約５〜５００ｎｍ、約２０〜４００ｎｍ、または約１００〜３００ｎｍの断面寸法を画定し得る。ナノ構造体の断面寸法が長さ方向において異なる場合、断面寸法は、ナノ構造体の基部から先端までの間の平均として、あるいは構造体の最大断面寸法（例えば、円錐状ナノ構造体の基部の断面寸法）として求めることができる。
【００６５】
図４は、表面に形成され得る複雑なナノトポグラフィの一実施形態である。この特定のパターンは、中央大型ピラー１００と、それを取り囲むピラー１０２、１０４とを含む。ピラー１０２、１０４は中央大型ピラー１００よりも小型であり、規則的なパターンで配置されている。図に示すように、このパターンは、各々互いに同じ全体形状を有するが、水平寸法が互いに異なる複数のピラーの繰り返しを含む。この特定の複雑なパターンは、連続的に再帰的に繰り返す際にスケールの同一変更を含まないフラクタル様パターンの一例である。例えば、ピラー１０２は、マイクロ構造体である大型ピラー１００の約３分の１の水平寸法を画定する第１のナノ構造体であり、ピラー１０４は、ピラー１０２の約半分の水平寸法を画定する第２のナノ構造体である。
【００６６】
サイズが互いに異なる構造体を含むパターンは、大きい断面寸法を有する大型構造体（例えば、約５００ｎｍ以上の断面寸法を有するマイクロ構造体）と、小型構造体とを含み得る。一実施形態では、複雑なナノトポグラフィのマイクロ構造体は、約５００ｎｍ〜１０μｍ、約６００ｎｍ〜１．５μｍ、または約６５０ｎｍ〜１．２μｍの断面寸法を有し得る。例えば、図４の複雑なナノトポグラフィは、約１．２μｍの断面寸法を有するマイクロサイズのピラー１００を含む。
【００６７】
パターンが、例えば約５００ｎｍ以上の断面寸法（平均断面寸法または最大断面寸法）を有する１若しくは複数の大きなマイクロ構造体を含む場合、複雑なナノトポグラフィは、サイズや形状などが互いに異なる第１のナノ構造体及び第２のナノ構造体を含み得る。例えば、図４の複雑なナノトポグラフィのピラー１０２は、約４００ｎｍの断面寸法を有し、ピラー１０４は約２００ｎｍの断面寸法を有する。
【００６８】
ナノトポグラフィは、任意の数の様々な要素から形成され得る。例えば、要素のパターンは、２つの互いに異なる要素、３つの互いに異なる要素（図４に示した例）、４つの互いに異なる要素、あるいはそれ以上の互いに異なる要素を含み得る。互いに異なる各要素の繰り返し回数の相対的比率もまた異なり得る。一実施形態では、パターンの最も小さい要素は、それよりも大きい要素よりも多数存在し得る。例えば、図４のパターンでは、各ピラー１０２について８個のピラー１０４が設けられており、中央大型ピラー１００について８個のピラー１０２が設けられている。要素のサイズが大きくなると、一般的に、ナノトポグラフィにおけるその要素の繰り返し回数はより少なくなる。例として、第１の要素の断面寸法がそれよりも大きい第２の要素の約０．５（例えば０．３〜０．７）である場合、トポグラフィ内に、第１の要素は第２の要素の約５倍またはそれ以上の数で存在し得る。第１の要素の断面寸法がそれよりも大きい第２の要素の約０．２５（または約０．１５〜０．３）である場合、トポグラフィ内に、第１の要素は第２の要素の約１０倍またはそれ以上の数で存在し得る。
【００６９】
個々の要素間の間隔も様々であり得る。例えば、構造体間の中心間距離は、約５０ｎｍ〜１μｍ、例えば約１００ｎｍ〜５００ｎｍであり得る。例えば、構造体間の中心間距離は、ナノサイズスケールであり得る。例えば、ナノサイズ構造の間隔について考えると、構造体間の中心間距離は約５００ｎｍ以下であり得る。このことはトポグラフィの必須要件ではなく、個々の構造体はもっと離れていてもよい。構造体間の中心間距離は、構造体のサイズに応じて異なり得る。例えば、２つの互いに隣接する構造体の平均断面寸法の、該２つの構造体の中心間距離に対する比率は、約１：１（例えば接触状態）〜１：４、約１：１．５〜１：３．５、または約１：２〜１：３であり得る。例えば、中心間距離は、２つの互いに隣接する構造体の平均断面寸法の約２倍であり得る。一実施形態では、各々約２００ｎｍの断面寸法を有する２つの互いに隣接する構造体は、約４００ｎｍの中心間距離を有し得る。したがって、この場合は、平均直径の中心間に対する比率は１：２である。
【００７０】
構造体間の間隔は、同一、すなわち等距離にしてもよいし、または、パターン内で構造体によって異なるようにしてもよい。例えば、パターンにおいて最も小さい構造体は第１の距離で互いに離間し、最も小さい構造体とより大きい構造体との間の距離、または２つのより大きい構造体間の距離は第１の距離と同一であってもよいし、第１の距離と異なっていてもよい。
【００７１】
例えば、図４のパターンでは、最も小さい構造体１０４同士の中心間距離は約２００ｎｍである。より大きいピラー１０２とそれを取り囲むピラー１０４との間の中心間距離は約１００ｎｍ以下である。最大ピラー１００とそれを取り囲む各ピラー１０４との間の中心間距離は、最も小さいピラー１０４同士の中心間距離よりも小さく、約１００ｎｍである。当然ながら、これは必須ではなく、全ての構造体は互いに対して等距離で離間配置されていてもよいし、または任意の互いに異なる距離で離間配置されていてもよい。一実施形態では、別個の構造体が互いに対して接触して配置され、例えば、後述するように互いに積層するように、または、互いに隣接して接触するように配置され得る。
【００７２】
トポグラフィの構造体は全て同じ高さ、一般的に、約１０ｎｍ〜１μｍで形成され得る。しかし、これは必須ではなく、パターンの個々の構造体は、一次元、二次元、三次元において様々なサイズであり得る。一実施形態では、トポグラフィの構造体の一部または全体は、約２０μｍ以下、約１０μｍ以下、または約１μｍ以下の高さを有し、例えば、７５０ｎｍ以下、６８０ｎｍ以下、または５００ｎｍ以下であり得る。例えば、構造体は、約５０ｎｍ〜２０μｍ、または約１００ｎｍ〜７００ｎｍの高さを有することができる。例えば、ナノ構造体またはマイクロ構造体は、約２０〜５００ｎｍ、約３０〜３００ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍの高さを有することができる。なお、構造体は、断面寸法においてナノサイズであり得、マイクロサイズスケール（例えば５００ｎｍ以上）の高さを有し得ることを理解されたい。マイクロサイズ構造体は、同一のパターンのナノサイズ構造体と互いに同一のまたは異なる高さを有することができる。例えば、マイクロサイズ構造体は、約５００ｎｍ〜２０μｍ、または約１〜１０μｍの高さを有することができる。マイクロサイズ構造体は、約５００ｎｍ以上のマイクロスケールの断面寸法を有し得、約５００ｎｍ以下のナノサイズ寸法の高さを有し得る。
【００７３】
構造体のアスペクト比（構造体の高さの断面寸法に対する比）は、約０．１５〜３０、約０．２〜５、約０．５〜３．５、または約１〜２．５であり得る。例えば、ナノ構造体は、これらの範囲内に入るアスペクト比を有し得る。
【００７４】
本発明のデバイスの表面は、図４に示すような１種類のパターン、または、互いに同一または異なるパターンの複数の繰り返しを含み得る。例えば、図５は、表面全体に渡って、図４のパターンの複数の繰り返しを含む表面パターンを示す。
【００７５】
マイクロニードルの表面にナノトポグラフィを形成すると、マイクロニードルの体積を増大させることなく、マイクロニードルの表面積を増大させることができる。体積に対する表面積の比率（表面積対体積比）を高めると、マイクロニードルの表面とその周囲の生体物質との間の相互作用を向上させることができると考えられる。例えば、表面積対体積比を高めると、ナノトポグラフィとその周囲のタンパク質（例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質及び／または原形質膜タンパク質）との間の物理的相互作用を向上させると考えられる。本明細書で用いられる「タンパク質」なる用語は、一般的に、他のタンパク質、ポリペプチドまたは任意の他の有機または無機分子に対して、構造的に、酵素的に、または他の方法で相互作用可能なアミノ酸の分子鎖を指す。
【００７６】
一般的に、ナノパターニングされた表面の表面積対体積比は、約１０、０００ｃｍ−１以上、約１５０、０００ｃｍ−１以上、または約７５０、０００ｃｍ−１以上であり得る。表面積対体積比は、当分野で公知の任意の標準的な手法に従って求めることができる。例えば、マイクロニードル表面の比表面積は、吸着ガスとして窒素を使用した気体吸着法（ＢＥＴ法）によって求めることができる。このことは当分野では公知であり、「Brunauer, Emmet, and Teller (J. Amer. Chem. Soc., vol. 60, Feb., 1938, pp. 309-319)」に記載されている（参照により本明細書に組み込まれるものとする）。ＢＥＴ面積は、約５ｍ２／ｇ以下であり、一実施形態では、例えば、約０．１〜４．５ｍ２／ｇ、または約０．５〜３．５ｍ２／ｇである。また、表面積及び体積の値は、マイクロニードル表面の形成に使用したモールドの形状から、標準的な幾何学的計算法に従って推測することもできる。例えば、前記体積は、各パターン要素の体積の計算値と、所定領域（例えば、１つのマイクロニードルの表面）におけるパターン要素の総数とから推定することができる。
【００７７】
フラクタルまたはフラクタル様パターニングされたナノトポグラフィを画定するデバイスの場合は、ナノトポグラフィは、前記パターンのフラクタル次元の測定により特徴付けることができる。フラクタル次元は、再帰的な繰り返しを続けてスケールがだんだん小さくするに従ってフラクタルがどのくらい完全に空間を満たすかを示す指標となる統計的量である。二次元構造のフラクタル次元は、
【００７８】
【数１】
0005860033.tif 000002
【００７９】
として表すことができる。Ｎ（ｅ）は、物体を各空間方向に１／ｅだけ縮小したときに物体全体を覆うのに必要な自己相似的な構造体の数である。
【００８０】
例えば、シェルピンスキーの三角形（正三角形の各辺の中点を互いに結ぶことによりできる三角形を切り取る）として知られている図６に示す２次元構造フラクタルを考える場合、フラクタル次元は以下のように計算される。
【００８１】
【数２】
0005860033.tif 000003
【００８２】
したがって、シェルピンスキーの三角形のフラクタルは、最初の２次元の正三角形よりも線長さが増加する。加えて、このような線長さの増加は、面積の増加を伴わない。
【００８３】
図４に示したパターンのフラクタル次元は、約１．８４である。一実施形態では、本発明のデバイスの表面のナノトポグラフィは、約１以上、例えば、約１．２〜５、約１．５〜３、または約１．５〜２．５のフラクタル次元を示し得る。
【００８４】
図７（Ａ）及び（Ｂ）は、複雑なナノトポグラフィの別の例の拡大図である。図７（Ａ）及び（Ｂ）のナノトポグラフィは、基板上に位置する繊維様ピラー７０のアレイを含む。各ピラーの遠位端は、複数のより小さい繊維６０に分かれている。このような小さい繊維６０の遠位端は、さらに複数の細繊維に分かれている（図７（Ａ）及び（Ｂ）では見えない）。表面上に形成された約１以上のアスペクト比を有する構造体は、柔軟（図７（Ａ）及び（Ｂ）に示した構造体のように）、または硬くあり得る。
【００８５】
図７（Ｃ）及び（Ｄ）は、複雑なナノトポグラフィの別の例を示す。この実施形態では、円形の中空貫通部７１を各々有する複数のピラー７２が基板上に形成されている。各中空ピラー７２の遠位端には、複数の小型ピラー６２が形成されている。図に示すように、図７（Ｃ）及び（Ｄ）のピラーは、硬さ及び直立配向を維持している。加えて、また従来のパターンとは対照的に、この実施形態の小型ピラー６２は、大型ピラー７２とは形状が異なる。具体的には小型ピラーは、中空では〜たがって、互いに異なるスケールに形成された構造体を含むナノトポグラフィは、全ての構造体が同じ形状に形成されている必要はなく、スケールが互いに異なる構造体はサイズ及び形状の両方において互いに異なっていてもよい。
【００８６】
図８は、マイクロニードルの表面に形成され得るナノサイズ構造体を含む別のパターンを示す。図に示すように、この実施形態では、個々のパターン構造体は、同一の全体サイズで形成され得るが、配向及び形状は互いに異なり得る。
【００８７】
表面積対体積比及び／またはフラクタル次元を求めることに加えてまたはその代わりに、本発明のｓｉＲＮＡ送達デバイスのマイクロニードルは、他の方法、これらに限定しないが、表面粗さ、弾性係数、表面エネルギーなどによって特徴付けすることができる。
【００８８】
表面粗さを求めるための方法は、当分野では公知である。例えば、材料の表面粗さを求めるために、標準的技法に従って原子間力顕微鏡法を接触モードまたは非接触モードで用いることができる。マイクロニードルを特徴付けするために用いることができる表面粗さには、平均粗さ（ＲＡ）、二乗平均平方根粗さ、歪度、及び／または尖度が含まれ得る。一般的に、ナノトポグラフィを画定する表面の平均表面粗さ（表面の算術平均高さは、ISO 25178シリーズで規定された粗さパラメータである）は、約２００ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、または約５０ｎｍ以下であり得る。例えば、平均表面粗さは、約１０〜２００ｎｍ、または約５０〜１９０ｎｍであり得る。
【００８９】
マイクロニードルの表面は、該表面の弾性係数によって、例えば、前記表面にナノトポグラフィに追加した場合の弾性係数の変化によって特徴付けることもできる。一般的に、ナノトポグラフィを形成する複数の構造体をマイクロニードルの表面に追加すると、材料の弾性係数が減少し、ナノサイズ構造体を前記表面に追加すると、前記表面の連続性が減少し、それに伴い表面積が変化する。表面にナノトポグラフィを有するマイクロニードルは、同じ材料から同じ方法によって形成された、表面にナノトポグラフィパターンを有していないこと以外は同様のマイクロニードルと比べると、弾性係数の約３５〜９９％、例えば約５０〜９９％、または約７５〜８０％の低下を示し得る。例として、ナノパターニングされた表面の有効圧縮係数は、約５０ＭＰａ以下、または約２０ＭＰａ以下であり得る。一実施形態では、有効圧縮係数は、約０．２〜５０ＭＰａ、約５〜３５ＭＰａ、または約１０〜２０ＭＰａであり得る。有効せん断係数は、約３２０ＭＰａ以下、または約２２０ＭＰａ以下であり得る。例えば、有効せん断係数は、一実施形態では、約４〜３２０ＭＰａ、または約５０〜２５０ＭＰａ以下であり得る。
【００９０】
また、表面にナノトポグラフィを有するマイクロニードルは、表面にナノトポグラフィを有していない同様のマイクロニードルと比べると、表面エネルギーの増加を示し得る。例えば、表面にナノトポグラフィを有するマイクロニードルは、同じ材料から同じ方法によって形成された、表面にナノトポグラフィパターンを有していないこと以外は同様のマイクロニードルと比べると、表面エネルギーの増加を示し得る。例えば、ナノトポグラフィを有する表面の水接触角は、約８０°以上、約９０°以上、約１００°以上、または約１１０°以上であり得る。例えば、表面の水接触角は、一実施形態では、約８０〜１５０°、約９０〜１３０°、または約１００〜１２０°であり得る。
【００９１】
本発明のデバイスの表面にナノ構造体を形成する場合、構造体の充填密度は最大限にされ得る。例えば、マイクロニードル上に要素をパターン配置するのに、正方充填（図９（Ａ））、六方充填（図９（Ｂ））、またはそれらの変形例が用いられ得る。断面積がＡ、ＢまたはＣのサイズが互いに異なる要素をマイクロニードル上に互いに隣接するように配置するパターンをデザインする場合は、図９（Ｃ）に示すような円充填が用いられ得る。当然ながら、様々な充填密度及びそれに関連する表面特徴の改変の決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００９２】
表面にナノトポグラフィが形成されたマイクロニードルは、単一段階製造方法に従って形成することができる。すなわち、本発明のマイクロニードルは、形成時にその表面にナノ構造体を有するように作製される。あるいは、事前に作製されたマイクロニードルの表面にナノ構造体のパターンを形成する多段階製造方法を用いることもできる。例えば、まず、マイクロニードルのアレイを作製し、その後、作製されたマイクロニードルの表面にナノ構造体をランダムまたは非ランダムなパターンで形成する。単一段階製造方法または多段階製造方法のいずれでも、任意の適切なナノトポグラフィ作製方法に従って、マイクロニードル表面またはモールド表面にナノサイズ構造体を形成することができる。ナノトポグラフィ作製方法には、これらに限定しないが、ナノインプリンティング、射出成形、リソグラフィ、エンボス成形などが含まれる。
【００９３】
マイクロニードルのアレイは、任意の標準的な微細加工技術に従って作製することができる。そのような微細加工技術には、これらに限定しないが、リソグラフィ；エッチング技術、例えば、湿式化学エッチング、乾式エッチング、フォトレジスト除去；シリコンの熱酸化；拡散法、例えば、ホウ素、リン、ヒ素、またはアンチモン拡散；イオン注入；膜蒸着、例えば、蒸発（フィラメント、電子ビーム、フラッシュ、シャドーイング、ステップカバレッジ）、スパッタリング、化学蒸着（ＣＶＤ）、エピタキシー（気相、液相、分子ビーム）、電気めっき、スクリーン印刷、またはラミネート加工；ステレオリソグラフィ；レーザ加工；レーザ切断（投影アブレーションなど）が含まれる。
【００９４】
固体シリコンを電気エッチングして多孔質シリコンにすることにより、穿刺構造体として使用され得る極めて微細な（約０．０１ｍｍの）シリコンネットワークを形成する電気化学エッチング法を用いることもできる。この方法は、水性フッ化水素酸中におけるシリコンの電解陽極酸化によって、場合によっては光と組み合わせて、シリコンをエッチングしてチャンネルを形成する。エッチングするためのシリコンウェハのドープ濃度を変更することにより、最終的な多孔質構造体についての、エッチング中の電解電圧、入射光強度、または電解質濃度を制御することができる。エッチングされなかった材料（すなわち、残ったシリコン）が、マイクロニードルを形成する。
【００９５】
プラズマエッチングを用いることもでき、シリコンの深プラズマエッチングを行うことにより、約０．１ｍｍまたはそれ以上の直径を有するマイクロニードルを形成することができる。マイクロニードルは、（電気化学エッチングのように）電圧を制御することにより間接的に作製することもできる。
【００９６】
電子ビームリソグラフィやＸ線リソグラフィなどのリソグラフィ技術を、主要パターンの画定やマスターダイの作製に用いることもできる。その後、複製が行うことにより、マイクロニードルのアレイを有するデバイスが形成することができる。一般的な複製方法には、これらに限定しないが、溶媒補助微細成形及び鋳造、エンボス成形、射出成形などが含まれる。相分離性ブロックコポリマー、ポリマー脱混合、またはコロイドリソグラフィ技術を含む自己組織化技術を用いて、マイクロニードルの表面にナノトポグラフィを形成することもできる。
【００９７】
公知のように、複数の方法の組み合わせを用いることもできる。例えば、形成されたナノ構造体の特徴、例えばナノピラーの直径、外形、高さ、ピッチなどを微細化するために、コロイドでパターニングされた基板を反応性イオンエッチング（ＲＩＥ：乾式エッチングとも呼ばれる）に曝すこともできる。また、湿式エッチングを用いて、別の方法（例えば、ポリマー脱混合技術）により作製したナノ構造体の外形を、別の外形に変更することもできる。
【００９８】
構造体の直径、形状またはピッチは、適切な材料または方法を選択することにより制御することができる。例えば、コロイドでパターニングされた基板上に蒸着させた金属をエッチングした後にコロイドのリフトオフを行うことにより、角柱状のピラーが一般的に得られる。その後、所望に応じて、エッチング方法を用いて構造体を完成させることができる。ポリマーナノ粒子を選択的に溶解させた後に、コロイドの隙間に規則的に配列された様々な三方晶系ナノメータフィーチャ（要素）を形成する温度制御焼結技術により、規則的に配列された非球形のポリマー性ナノ構造体を製造することもできる。これらの及び他の適切な製造技術は当分野では公知である（例えば、「Wood, J R Soc Interface, 2007 February 22; 4(12): 1-17」を参照されたい。この文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【００９９】
表面にナノトポグラフィが形成されたマイクロニードルの製造に用いることができる他の方法には、超高精度レーザ加工技術を用いたナノインプリントリソグラフィ方法が含まれる。ナノインプリント技術の例は、米国特許第6,995,336号（Hunt他）及び米国特許第7,374,864号（Guo他）に記載されている（これらの特許文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。ナノインプリントリソグラフィは、ナノインプリントリソグラフィモールド及びフォトリソグラフィマスクの両方の役割を果たすハイブリッド型モールドを使用して行うナノスケールリソグラフィ技術である。ナノインプリントリソグラフィ技術の概要を図１０（Ａ）〜（Ｃ）に示す。作製中には、レジスト層上にフィーチャ（例えば、ナノトポグラフィを画定するマイクロニードル）を形成するために、圧力を加えることによりハイブリッド型モールド３０を基板３２上にインプリントする（図１０（Ａ））。通常、モールド３０に結合させる前に、基板３２の表面を、そのガラス転移温度Ｔｇよりも高い温度まで加熱する。ハイブリッド型モールド３０が基板３２に結合されている間、要素３４を形成するために、粘性ポリマー流をモールドキャビティ内に充填する（図１０（Ｂ））。その後、モールド及び基板を紫外線（ＵＶ）に曝す。ハイブリッド型モールドは一般的に、特定の遮光領域を除いて、ＵＶ放射を透過する。そのため、ＵＶ放射は透過部分を通過し、レジスト層に入射する。その後、基板及びポリマーのＴｇよりも低い温度で、ハイブリッド型モールド３０を冷却された基板３２から離型させる（図１０（Ｃ））。
【０１００】
図１０（Ｃ）に示すような、形成されたフィーチャ３４を含むナノインプリント基板３２をモールド３０から離型させるのを容易にするためには、モールド３０を低エネルギーコーティングで処理し、基板３２との接着力を低下させることが有益である。モールド３０の表面エネルギーを低くすると、モールド３０、基板３２及びポリマー間の表面エネルギー差が大きくなり、これらの材料間の離型が容易になる。例えば、トリデカ−（１，１，２，２−テトラヒドロ）−オクチルトリクロロシラン（Ｆ１３−ＴＣＳ）などのシリコンモールドコーティングを用いることができる。
【０１０１】
ナノプリンティング法は、モールドにポリマーを充填した後に、形成されたポリマーをモールドから離型することを含む動的な方法である。モールド要素に充填するために、ポリマー温度は、加えられた圧力で流動を開始させることができるような高い温度に昇温させるべきである。ポリマーの温度を高くすると、ポリマーの粘性は低下し、より迅速かつより容易にモールドに充填することができる。また、圧力を高くすると、充填速度及び全体充填を向上させることができ、モールド複製をより良好に行うことができる。ナノインプリントされた基板をモールドから離型させるためには、基板温度は、降伏強度がモールドによる接着力を超える温度よりも低くするべきである。温度を変更することにより、例えば図８に示した構造体などの別個の構造体を得るための離型中に、ポリマー要素を引き出すことが可能になる。
【０１０２】
ナノ構造体は、化学的方法によって、マイクロニードルの表面に形成することもできる。例えば、膜堆積、スパッタリング、化学蒸着（ＣＶＤ）、エピタキシー（気相、液相、分子ビーム）、電気めっきなどを用いて、マイクロニードルの表面に構造体を形成することができる。
【０１０３】
当分野で公知の自己組織化単分子層方法を用いて、マイクロニードルの表面上に構造体を形成することもできる。例えば、ブロックコポリマーの自己組織化能力を用いて、マイクロニードルの表面に単分子層パターンを形成することができる。単分子層パターンは、その後、該パターンに従って所望の構造体（例えば、コロイド）を成長させるためのテンプレートとして使用される。
【０１０４】
例として、２またはそれ以上の反応部位を有するモノマーから、二次元の架橋ポリマーネットワークを形成することができる。そのような架橋単分子層は、当分野で公知のように、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）技術（例えば、金／アルキルチオールシステム）またはラングミュアーブロジェット（Langmuir-Blodgett：ＬＢ）単分子層技術を用いて作製される（Ahmed他, Thin Solid Films 187: 141-153 (1990)）。単分子層は架橋結合され得、それにより、構造的によりロバストな単分子層が形成され得る。
【０１０５】
パターニングされた単分子層を形成するのに使用されるモノマーは、所望の重合技術及び／または単分子層形成技術や、全体溶解度、解離方法またはリソグラフィ方法などの性質に影響を与えるために必要な全ての構造的部分を含み得る。モノマーは、少なくとも１つ、大抵は少なくとも２つの反応性官能基を含み得る。
【０１０６】
有機単分子層の形成に用いられる分子には、メチレン基鎖が散在している様々な有機官能基が含まれ得る。例えば、前記分子は、パッキングを促進するためのメチレン鎖を含む長鎖炭素構造体であり得る。メチレン基間のパッキングは、弱いファンデルワールス結合を生じさせ、それにより、形成された単分子層の安定性を高め、秩序相の形成に関連するエントロピーペナルティに対抗する。加えて、重合可能な化学的部分が鎖の中間または反対側末端に位置する場合は、形成された単分子層上での前記構造体の成長を可能にするために、別の末端部分（例えば水素結合部分）が分子の他方の末端に存在し得る。前記アセンブリを形成するのに、任意の適切な分子認識化学が用いられ得る。例えば、前記構造体は、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、金属キレート化、結合配位（すなわち、ルイス酸塩基相互作用）、イオン結合、共有結合、または水素結合に基づいて、単分子層上に構築され得る。
【０１０７】
ＳＡＢをベースにしたシステムを用いる場合、テンプレートを作製するために追加的な分子が用いられ得る。この追加的な分子は、ＳＡＭを形成するために、その末端の１つにおいて適切な官能性を有し得る。例えば、金の面に、チオール端末が含まれ得る。様々な有機分子が、複製に影響を与えるために用いられ得る。ジエンやジアセチレンなどのトポケミカル重合可能部分が、重合可能成分として特に望ましい。これらには、様々な長さのメチレンリンカーが散在し得る。
【０１０８】
分子認識部分はＬＢ形成目的のための極性官能基としての役割も果たすので、ＬＢ単分子層には１つのモノマー分子だけが必要とされる。基板に転写されたＬＢ単分子層上に、または直接前記トラフ（trough）に、リソグラフィが行われ得る。例えば、ジアセチレンモノマーのＬＢ単分子層は、マスクを介したＵＶ露光または電子ビームパターニングによりパターニングすることができる。
【０１０９】
モノマー形成は、単分子層段階でトポケミカル重合される分子を用いて行われる。作製したフィルムを重合触媒に曝すことにより、前記フィルムはその場で成長し、動的分子アセンブリからよりロバストな重合アセンブリへ変化する。
【０１１０】
単分子層をパターニングするための当分野で公知の技術を用いることができる。単分子層のパターニングに有用な技術には、これらに限定しないが、フォトリソグラフィ、電子ビーム技術、集束イオンビーム技術、またはソフトリソグラフィが含まれる。フォトレジストなどの様々な保護スキームが、ＳＡＭをベースにしたシステムに有用であり得る。同様に、金の上にブロックコポリマーのパターンを形成し、選択的にエッチングすることにより、パターンを形成することができる。二成分系の場合、パターニングは、容易に利用可能な技術を用いて達成することもできる。
【０１１１】
紫外線及びマスクを使用してパターニングを行うソフトリソグラフィ技術を、単分子層のパターニングに用いることができる。例えば、パターニングされていないベース単分子層が、ＵＶ／粒子ビーム反応性モノマー単分子層を形成するためのプラットホームとして使用することができる。ベースＳＡＭがパターニングされていなくても、前記モノマー単分子層は、その後、ＵＶフォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ、またはイオンビームリソグラフィによってパターニングすることができる。
【０１１２】
パターニングされた単分子層の成長は、様々な成長機構によって実現することができ、例えば、金属塩の適切な還元化学を介して、または、シード若しくはテンプレート媒介核形成を用いて実現することができる。単分子層上の認識要素を用いることにより、この界面で様々な方法によって、無機成長を触媒することができる。例えば、パターニングされた有機単分子層の形状を支持するコロイド形態の無機化合物を形成することができる。例えば、炭酸カルシウムまたはシリカ構造体が、カルボン酸やアミドなどの様々な官能基によりテンプレート化することができる。結晶成長条件を制御することにより、金属成長の厚さや結晶形態を制御することが可能である。また、二酸化チタンをテンプレート化することもできる。
【０１１３】
テンプレート化された化学めっき技術を用いて、存在する有機官能基を使用して金属を合成することができる。具体的には、金属原子を有機パターンのカルボニル部分にキレートして無電解金属堆積を前記パターン上で触媒することによって、パターニングされた金属コロイドを形成することができる。例えば、Ｃｕ、Ａｕ、Ｎｉ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、または無電解めっき条件でめっき可能な他の様々な金属を用いて、前記有機単分子層の形状の金属構造体を形成することができる。無電解メッキ条件を制御することにより、メッキされる金属構造体の厚さを調節することが可能である。
【０１１４】
当分野で公知の他の「ボトムアップ（bottom-up）」型の成長方法、例えば、Tuominen他による米国特許第7,189,435号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載された方法などを用いることができる。この方法によれば、導体または半導体基板（例えば、金などの金属）をブロックコポリマー膜（例えば、メタクルル酸メチルとスチレンのブロックコポリマー）で被覆することにより、コポリマーの一方の成分がコポリマーの他方の成分のマトリックス内にナノスケールの円柱を形成することができる。その後、コポリマー上に導体層を配置することにより、複合構造体を形成することができる。前記複合構造体を垂直に配向にしたとき、例えば、ＵＶ放射線、電子ビームまたはオゾンへの曝露や、分解などにより第２の成分の領域にナノスケールの孔を形成することにより、第１の成分のいくつかを除去することができる。
【０１１５】
Nealey他による米国特許第6,926,953号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載された別の実施形態では、表面にイメージ層（例えば、アルキルシロキサンまたはオクタデトリクロロシラン自己組織化単分子層）を有する基板を、前記イメージ層の湿潤性を変更する干渉パターンを前記イメージ層に形成することができるように波長が選択された２またはそれ以上の光線に露光することにより、コポリマー構造体を形成することができる。選択されたブロックコポリマー（例えば、ポリスチレンとポリ（メタクリル酸メチル）とのコポリマー）の層をその後、露光されたイメージ層上に堆積させてアニールすることにより、前記湿潤性パターンに従ってコポリマー成分を分離し、イメージ層のパターンをコポリマー層に複製する。これにより、別々の成分のストライプまたは分離領域が、１００ｎｍまたはそれ以下の範囲の周期的寸法で形成することができる。
【０１１６】
マイクロニードルの表面は、作製されたナノ構造体のランダムな分布を含み得る。任意選択で、マイクロニードルの表面は、作製されたナノ構造体と共に別の材料を含み得る。例えば、マイクロニードルは、その表面に作製された電子スパン繊維層を有し得、この電子スパン繊維層上にナノ構造体のランダムまたは非ランダムなパターンが作製され得る。
【０１１７】
エレクトロスピニングは、個々のポリマー分子への帯電を引き起こすために、毛細管に保持されたポリマー融液または溶液に対して電界を印加する高電圧供給器の使用を含む。電解を加えると、空気‐表面界面で帯電及び／または双極性配向が誘起される。この誘起により、表面張力に対抗する力が生じる。臨界磁場強度では、静電気力は表面張力に打ち勝ち、ポリマー材料の噴流が毛細管から導電性のグランド面に向けて放出される。前記噴流は、毛細管から出るとき、外部電界によって引き伸ばされ、かつ加速させられる。前記噴流が空気中を通過するとき、前記溶媒の一部が、帯電したポリマー繊維を残して蒸発する。帯電したポリマー繊維は、前記表面に集められる。前記繊維が集められると、まだ濡れている個々の繊維は互いに接着し、表面上に不織ウェブを形成する。その後、例えば、所望のナノ構造体を画定するモールドを用いたエンボス技術によって、エレクトロスパン面上にナノ構造体のパターンが作製される。前記モールドをマイクロニードル表面に適切な温度及び圧力で適用することにより、マイクロニードルの表面にパターンを転写することができる。ランダムなエレクトロスパンのナノサイズ繊維の表面は、マイクロニードル表面の望ましい特徴、例えば、表面積対体積比、表面粗さ、表面エネルギーなどの１つまたは複数をさらに向上させることができ、それに伴う利益を提供することができる。
【０１１８】
ナノ構造体に加えて、組織または個々の細胞に対する相互作用を向上させるために、マイクロニードル表面を化学的に官能化することもできる。例えば、１若しくは複数の生体分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質全体、多糖類など）を、使用前のマイクロニードルの表面に結合させることもできる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、マイクロニードルの表面は、該表面の事前処理を必要とすることなく、該表面に追加的な望ましい官能基を自然発生的に結合させることができるような、適切な反応性を有し得る。なお、他の実施形態では、所望する化合物を結合させる前に、構造化表面の事前処理が行われ得る。例えば、構造体表面の反応性は、該表面上にアミン、カルボン酸、ヒドロキシル基、アルデヒド、またはエステル基を追加または生成することにより高めることができる。１つの代表的な実施形態では、ナノ構造体のパターンを含むマイクロニードル表面は、該表面のアミノ官能性を高めるために、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミン含有化合物と接触させることによりアミノ化することができ、追加されたアミノ官能性によって１若しくは複数の生体分子がマイクロニードル表面に結合される。
【０１２０】
パターニングされたデバイス表面に結合させるのに望ましい物質には、ラミニン、トロポエラスチン、またはエラスチンなどのＥＣＭタンパク質、トロポコラーゲンまたはコラーゲン、フィブロネクチンなどが含まれる。様々なＥＣＭタンパク質に対するインテグリン結合の認識配列の一部であるＲＧＤ配列などの短タンペプチド断片が、パターニングされたデバイス表面に結合され得る。したがって、ＲＧＤによるマイクロニードル表面の官能化は、本発明のデバイスのＥＣＭタンパク質との相互作用を高めることができ、さらには、本発明のデバイスの使用時の該デバイスに対する異物反応を制限することができる。
【０１２１】
本発明のデバイスを介して送達されるｓｉＲＮＡ構築物は、任意の適切な方法論に従って、本デバイスに関連付けすることができる。例えば、薬剤を角質層の真下へ、有棘層または基底層へ、あるいはさらに深く真皮内へ送達するために、経皮マイクロニードルパッチが使用され得る。ｓｉＲＮＡは、組成物内で自由な場合でも、または組成物内に保護状態で保持される場合でも、マイクロニードルによって角質層を透過して輸送するために、前記パッチに含有されるか、または前記パッチに供給される（例えば、マイクロニードル内に、またはマイクロニードルの表面に）。
【０１２２】
マイクロニードル経皮パッチは、ｓｉＲＮＡ構築物を収容し、かつ送達のためにｓｉＲＮＡ構築物を提供する貯蔵部（例えば、導管や多孔質マトリックスなど）を含むことができる。本発明のデバイスは、それ自体内に貯蔵部を含むことができる。例えば、本発明のデバイスは、送達するための１若しくは複数のｓｉＲＮＡ構築物を保持することができる中空部または複数の孔を含むことができる。ｓｉＲＮＡ構築物は、本発明のデバイスの一部または全体が分解することにより、あるいは、本発明のデバイスから薬剤を拡散させることにより、本発明のデバイスから放出することができる。
【０１２３】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、貯蔵部を含む本発明のデバイスの斜視図である。本発明のデバイス１１０は、不透過性バッキング層１１４及びマイクロニードルアレイ１１６により画定された貯蔵部１１２を含む。バッキング層１１４及びマイクロニードルアレイ１１６は、本デバイスの外縁部１１８付近で互いに結合されている。不透過性バッキング層１１４は、接着剤または熱融着などによって結合させることができる。本発明のデバイス１１０はまた、複数のマイクロニードル１２０を含み得る。本発明のデバイス１１０を使用する前に、マイクロニードル１２０を露出させるためにリリースライナ１２２を除去する。
【０１２４】
１若しくは複数のｓｉＲＮＡ構築物を含有する製剤を、貯蔵部１１２内に保持することができる。不透過性バッキング層１１４として使用するのに適した材料には、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、または他の合成ポリマーなどが含まれ得る。前記材料は、一般的に、貯蔵部内容物の横断流に対するバリアを提供するために、不透過性バッキング層に熱または他の方法でシール可能である。
【０１２５】
不透過性バッキング層１１４とマイクロニードルアレイ１１６との間の空間または隙間により画定される貯蔵部１１２は、投与されるｓｉＲＮＡ構築物の懸濁液を保持する貯蔵構造を提供する。前記貯蔵部は、該貯蔵部に収容される薬剤に適合する様々な材料から作製することができる。例えば、天然若しくは合成ポリマー、金属、セラミック、半導体材料、またはそれらの複合材料によって前記貯蔵部を作製することができる。
【０１２６】
一実施形態では、前記貯蔵部は、マイクロニードルが配置される基板に取り付けることができる。別の実施形態では、前記貯蔵部は別個に設けられ、マイクロニードルアレイに取り外し可能に結合させるか、または、例えば適切なチューブやルアーロックなどを介してマイクロニードルアレイに流体連通させることができる。
【０１２７】
本発明のデバイスは、送達される１若しくは複数の薬剤を収容するための貯蔵部を含むことができる。例えば、本発明のデバイスは、１若しくは複数のｓｉＲＮＡ構築物を含有する製剤を収容する１つの貯蔵部を含むか、または、マイクロニードルアレイの全てまたは一部に送達するための１若しくは複数の薬剤を各々収容する複数の貯蔵部を含むことができる。複数の貯蔵部は、各々、送達のために組み合わせられ得る互いに異なる薬剤を収容し得る。例えば、第１の貯蔵部にｓｉＲＮＡ構築物を収容し、第２の貯蔵部に媒体（例えば生理食塩水）または第２のｓｉＲＮＡ構築物を収容する。上記の互いに異なる薬剤は、送達前に互いに混合され得る。前記混合は、任意の手段、例えば、物理的崩壊（穿通、分解または破壊）、孔隙率の変化、またはチャンバ同士を隔てている壁や膜の電気化学分解のなどによってトリガーすることができる。複数の貯蔵部は、互いに異なり、同時または順次に送達される薬剤を収容することができる。
【０１２８】
一実施形態では、前記貯蔵部は、本発明の経皮デバイスの１若しくは複数のマイクロニードルと流体連通され、前記マイクロニードルは、前記貯蔵部から送達された薬剤をバリア層の真下へ輸送するための構造（例えば、中央ボアまたは側部ボア）を画定することができる。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明のデバイスは、本デバイスの使用前は互いに流体連通されない、マイクロニードルアセンブリと、貯蔵部アセンブリとを含む。例えば、本発明のデバイスは、貯蔵部またはマイクロニードルアレイの両方に隣接して配置されたリリース部材を含む。本デバイスの使用中に貯蔵部及びマイクロニードルアレイが互いに流体連通されるように、前記リリース部材は、本デバイスの使用前に本デバイスから除去される。前記除去は、本デバイスからリリース部材を部分的または完全に除去することにより実現され得る。例えば、図１２〜１７は、薬剤化合物の流動を開始するために、経皮パッチから除去されるように構成されたリリース部材の一実施形を示す。より具体的には、図１２〜１３は、薬剤送達アセンブリ３７０とマイクロニードルアセンブリ３８０とを含む経皮パッチ３００を示す。薬剤送達アセンブリ３７０は、流速制御膜３０８に隣接して配置された貯蔵部３０６を含む。
【０１３０】
流量制御膜は、薬剤化合物の放出時に、該薬剤化合物の流速を遅くするのに役立つ。具体的には、薬剤貯蔵部からマイクロニードルアセンブリへマイクロ流体チャンネルを介して送達される流体薬剤化合物は圧力降下を受けて流速が低下する。圧力差が非常に大きい場合は、マイクロ流体チャンネルを流れる化合物の流れを妨げ、毛細菅圧に打ち勝つ背圧が生じる可能性がある。したがって、流速制御膜３０８を使用することにより、この圧力差を改善し、薬剤化合物をマイクロニードルへより良く制御された流速で導入することが可能となる。流速制御膜の材料や厚さなどは、薬剤化合物の粘性や所望される送達時間などの様々な因子に基づいて変更され得る。
【０１３１】
流速制御膜は、薬剤化合物の流速を制御することができ、かつ透過エンハンサーに対する透過率が薬剤貯蔵部の透過エンハンサーに対する透過率よりも低いことが当分野で知られている、透過性、半透過性、または多孔性材料から製造され得る。例えば、流速制御膜の作製に使用される材料は、約５０ｎｍ〜５μｍ、一実施形態では約１００ｎｍ〜２μｍ、または一実施形態では約３００ｎｍ〜１μｍ（例えば約６００ｎｍ）の平均孔径を有し得る。適切な膜材料には、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアセテート、エチレンｎブチルアセテート、及びエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマーから作製した、繊維ウェブ（例えば、織布ウェブまたは不織布ウェブ）、開口部を有するフィルム、発泡体、スポンジなどが含まれる。このような膜材料はまた、米国特許第3,797,494号、同第4,031,894号、同第4,201,211号、同第4,379,454号、同第4,436,741号、同第4,588,580号、同第4,615,699号、同第4,661,105号、同第4,681,584号、同第4,698,062号、同第4,725,272号、同第4,832,953号、同第4,908,027号、同第5,004,610号、同第5,310,559号、同第5,342,623号、同第5,344,656号、同第5,364,630号、及び同第6,375,978号により詳細に記載されている（これらの特許文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。特に好適な膜材料は、ローマン・テラピーシステーメ（Lohmann Therapie-Systeme）社から入手可能である。
【０１３２】
図１２〜１３を参照して、任意選択ではあるが、アセンブリ３７０は、貯蔵部３０６に隣接して設けられた接着層３０４を含むことができる。また、マイクロニードルアセンブリ３８０は支持体３１２を含み、支持体３１２からは、上述したようなチャンネル３３１を有する複数のマイクロニードル３３０が延出している。薬剤送達アセンブリ３７０及び／またはマイクロニードルアセンブリ３８０の両層は、所望に応じて、接着結合、熱結合、超音波結合などの任意の公知の結合技術を用いて互いに結合される。
【０１３３】
用いられる特定の構造に関わらず、パッチ３００はまた、薬剤送達アセンブリ３７０とマイクロニードルアセンブリ３８０との間に配置されるリリース部材３１０を含む。リリース部材３１０は、任意選択で、該リリース部材に隣接する支持体３１２及び／または速度制御膜３０８に結合させることができるが、その場合でも、パッチ３００から容易に除去することができるように、軽く結合させることが一般的に望ましい。所望に応じて、リリース部材３１０はまた、ユーザがリリース部材を掴んで所望の方向に引き出すのを容易にするために、パッチ３００の外周部を少なくとも部分的に超えて延在するタブ部分３７１（図１２〜１３）を含むことができる。図１２〜１３に示すような「インアクティブ（inactive）」形態では、パッチ３００の薬剤送達アセンブリ３７０は、薬剤化合物３０７がマイクロニードル３３０に流入しないように、薬剤化合物３０７をしっかりと保持する。リリース部材に対して単純に力を加えてパッチから除去することにより、パッチは「アクティブ（active）」になる。
【０１３４】
図１４〜１５を参照して、パッチ３００をアクティブにするための一実施形態が示されており、リリース部材３１０は長手方向に引っ張られている。リリース部材３１０は、図１６〜１７に示すように完全に除去されるか、または、図１４〜１５に示すように単に部分的に除去される。どちらの場合でも、リリース部材３１０と支持体３１２の開口部（図示せず）との間に事前に形成されたシールは破壊される。このようにして、薬剤化合物３０７は薬剤送達アセンブリ３７０から流出し、支持体３１２を介してマイクロニードル３３０のチャンネル３３１へ流入することが開始される。薬剤化合物３０７が貯蔵部３０６からチャンネル３３１へどのように流れるかについての例示的な説明は、図１６〜１７に示されている。とりわけ、薬剤化合物３０７の流動は、受動的に開始され、能動的な送達機構（例えばポンプ）は必要としない。
【０１３５】
図１２〜１７に示した一実施形態では、リリース部材を除去すると、薬剤送達アセンブリがマイクロニードルアセンブリと流体連通されるので、薬剤化合物のマイクロニードルへの流動が即座に開始される。なお、いくつかの実施形態では、薬剤化合物の放出タイミングについてのより多様な制御をユーザに提供することが望ましい。このことは、最初はマイクロニードルアセンブリが薬剤送達アセンブリと流体連通されていないパッチ構造を使用することにより実現される。このようなパッチを使用することを望む場合、ユーザは、物理的に操作して、前記両アセンブリを互いに流体連通させる。リリース部材は、そのような物理的操作を行う前または後に除去される。
【０１３６】
図１８〜２３を参照して、例えば、パッチ２００の特定の一実施形態が示されている。図１８〜１９は、パッチ２００の使用前の状態を示し、マイクロニードルアセンブリ２８０から作製された第１の部分２５０と、薬剤送達アセンブリ３７０から作製された第２の部分２６０とを示す。薬剤送達アセンブリ２７０は、上述したように、流速制御膜２０８に隣接して配置された貯蔵部２０６を含む。任意選択ではあるが、薬剤送達アセンブリ２７０は、貯蔵部２０６に隣接して配置された接着層２０４を含むことができる。また、マイクロニードルアセンブリ２８０は支持体２１２を含み、支持体２１２からは、上述したようなチャンネル２３１を有する複数のマイクロニードル２３０が延出している。
【０１３７】
この実施形態では、支持体２１２及び流速制御膜２０８は、最初は、水平方向に互いに隣接して配置されており、リリース部材２１０は支持体２１２及び流速制御膜２０８の上側に延在している。この特別な実施形態では一般的に、リリース部材２１０は、接着剤（例えば感圧接着剤）によって、支持体２１２及び流速制御膜２０８に取り外し可能に結合されていることが望ましい。図１８〜１９に示すような「インアクティブ」形態では、パッチ２００の薬剤送達アセンブリ２７０は、薬剤化合物２０７がマイクロニードル２３０に流入しないように、薬剤化合物２０７をしっかりと保持する。パッチを「アクティブ」にすることが所望されたときは、図２０〜２１に示すように、リリース部材２１０を引き剥がして除去し、リリース部材２１０と支持体２１２の開口部（図示せず）と間に事前に形成されたシールを破壊する。その後、流速制御膜２０８が支持体２１２に対して垂直方向に積層配置され、かつ支持体２１２と流体連通されるように、図２２の矢印方向で示すように、第２の部分２６０を折り畳み線「Ｆ」に沿って折り畳む。あるいは、第１の部分２５０を折り畳む。いずれの場合でも、第１の部分２５０及び／または第２の部分２６０を折り畳むことによって、支持体２１２（図２３）を介しての薬剤送達アセンブリ２７０からマイクロニードル２３０のチャンネル２３１への薬剤化合物２０７の流動が開始される。
【０１３８】
本発明のデバイスは、薬剤を治療上有用な速度で送達させることができる。この目的のために、本発明の経皮デバイスは、プログラムされたスケジュールに従って、あるいは、患者、医療専門家、または生体センサとのアクティブインターフェースを通じて送達速度を制御するために、マイクロエレクトロニクスまたは他のマイクロ加工構造体を有するハウジングを含む。本発明のデバイスは、本発明のデバイス内に収容されているｓｉＲＮＡ構築物の放出を制御するために、所定の分解速度を有する材料を含むことができる。送達速度は、送達される製剤の特徴（例えば、粘性、電荷及び／または化学組成）、本発明のデバイスの寸法（例えば、開口部の外径または容積）、経皮パッチに設けられるマイクロニードルの数、担体マトリックスにおける個々のデバイスの数、適用する駆動力（例えば、濃度勾配、電圧勾配、圧力勾配）、バルブの使用などの様々な因子を操作することにより制御することができる。
【０１３９】
本発明のデバイスを介した薬剤の輸送は、例えば、バルブ、ポンプ、センサ、アクチュエータ、またはマイクロプロセッサの様々な組み合わせを使用して制御または監視することができる。これらの部品は、一般的な製造または微細加工技術を用いて作製することができる。本デバイスに有用なアクチュエータには、マイクロポンプ、マイクロバルブ、またはポジショナーが含まれ得る。例えば、マイクロプロセッサは、送達速度を制御するために、ポンプまたはバルブを制御するようにプログラムすることができる。
【０１４０】
本発明のデバイスを通じた薬剤の流動は、拡散または毛細管現象に基づいて引き起こすか、あるいは、従来の機械的ポンプ若しくはナノ機械的駆動力（電気浸透や電位泳動）または対流を用いて引き起こすことができる。例えば、電気浸透の場合、逆帯電したイオン種及び／または中性分子を送達部位へ向けてまたは送達部位内に運ぶための対流を発生させるために、生体表面（例えば皮膚表面）、マイクロニードル、及び／または、マイクロニードルに隣接する基板に電極が配置される。
【０１４１】
薬剤の流動は、マイクロニードル表面を形成する材料を選択することにより調節することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ構築物を送達するのに、本デバイスのマイクロニードルの表面に隣接する１若しくは複数の大きな溝が用いることができる。あるいは、ナノ構造化された面を形成する材料を、例えば親水性または疎水性を制御することにより、前記面に沿った薬剤の輸送を促進または抑制するように調節することができる。
【０１４２】
薬剤の流動は、当分野で公知のバルブまたはゲートを使用して調節することができる。バルブは、繰り返し開閉することができるバルブ、または単回使用バルブであり得る。例えば、破壊可能なバリアまたは一方向ゲートが、本発明のデバイスの貯蔵部とパターニングされた表面との間に設けることができる。すぐに使用できる状態のとき、前記バリアを破壊するか、またはゲートを開くことにより、薬剤のマイクロニードル表面への流動を可能にすることができる。本発明のデバイスに使用される他のバルブまたはゲートは、本デバイスによる分子の流動を選択的に開始、調節または停止するために、熱的、電気化学的、機械的、または電磁的に駆動することができる。一実施形態では、前記流動は、流速制御膜を「バルブ」として使用することにより制御される。
【０１４３】
一般的に、貯蔵部、流れ制御システム、センサシステムなどの当分野で公知の任意の送達制御システムを、本デバイスに組み込むことができる。例えば、米国特許第7,250,037号、同7,315,758号、同7,429,258号、同7,582,069号、同7,611,481号に、本デバイスに組み込むことができる貯蔵部及び制御システムが記載されている。
【０１４４】
使用中は、マイクロニードルのナノ構造化された表面の皮膚内での存在により、タイトジャンクション（密着結合）及びデスモソームを含む細胞／細胞結合の形成及び維持に影響を及ぼすことができる。上述したように、顆粒層において見られるタイトジャンクションと、該タイトジャンクションの開口部とにより、ｓｉＲＮＡ構築物の送達を向上させるための細胞間経路を提供することができる。
【０１４５】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より良く理解できるであろう。
【実施例】
【０１４６】
実施例１
【０１４７】
電気回路の設計及び製造に用いられるものと同様のフォトリソグラフィ技術を用いて、いくつかの互いに異なるモールドを作製した。個々の工程ステップは、当分野で公知であり、すでに説明されている。
【０１４８】
まず、アセトン、メタノール及びイソプロピルアルコールで洗浄することにより、シリコン基板を作製した。次に、化学蒸着法により、前記シリコン基板に２５８ｎｍの二酸化ケイ素層をコーティングした。
【０１４９】
続いて、日本電子（ＪＥＯＬ）製のＪＢＸ−９３００ＦＳ電子線描画（ＥＢＬ）装置を使用して、当分野で公知の電子ビームリソグラフィパターニング法により各基板上にパターンを作製した。工程条件は、以下の通りであった。
ビーム電流＝１１ｎＡ
加速電圧＝１００ｋＶ
ショットピッチ＝１４ｎｍ
ドーズ量＝２６０μＣ／ｃｍ２
レジスト＝ＺＥＰ５２０Ａ，厚さ〜３３０ｎｍ
現像液＝酢酸ｎ−アミル
現像＝２分間浸漬した後、イソプロピルアルコールで３０秒間リンスした
【０１５０】
次に、ＳＴＳ社製の改良型酸化物エッチング（Advanced Oxide Etch：ＡＯＥ）装置を使用して二酸化ケイ素エッチングを行った。エッチング時間は５０秒間であり、４ｍＴｏｒｒで５５標準立方センチメートル毎分（ｓｃｃｍ）のＨｅ、２２ｓｃｃｍのＣＦ４、２０ｓｃｃｍのＣ４Ｆ８、４００Ｗのコイル、２００ＷのＲＩＥ、４０４〜４１１ＶのＤＣバイアスを用いた。
【０１５１】
続いて、ＳＴＳ社製の酸化ケイ素エッチング（silicon oxide etch：ＳＯＥ）装置を使用してシリコンエッチングを行った。エッチング時間は２分間であり、５ｍＴｏｒｒで２０ｓｃｃｍのＣｌ２及び５ｓｃｃｍのＡｒ、６００Ｗのコイル、５０ＷのＲＩＥ、９６〜１０２ＶのＤＣバイアスを用いた。シリコンエッチング深さは５００ｎｍであった。
【０１５２】
残留酸化物を除去するために、緩衝酸化物エッチング液（buffered oxide etchant：ＢＯＥ）を用いた。３分間のＢＯＥ浸漬の後、脱イオン水でリンスした。
【０１５３】
オブデュキャット社（Obducat）製のナノインプリンタNIL-Eitre（登録商標）６を使用して、様々なポリマー基板上にナノパターンを作製した。外部水を冷却剤として用いた。ＵＶモジュールは、単一パルスランプを、１．８Ｗ／ｃｍ２で２００〜１０００ｎｍの波長で用いた。２５０〜４００ｎｍのＵＶフィルタを使用した。最大温度２００℃及び圧力８０Ｂａｒで露光面積は６平方インチであった。ナノインプリンタは、半自動式分離ユニット及び自動制御式デモールディングを含む。
【０１５４】
モールドからのナノインプリントフィルムの離型を容易にするために、モールドをトリデカ−（１，１，２，２−テトラヒドロ）−オクチルトリクロロシラン（Ｆ１３−ＴＣＳ）で処理した。モールドを処理するために、まず、前記シリコンモールドをアセトン、メタノール及びイソプロピルアルコールの洗浄液で洗浄し、その後、窒素ガスによって乾燥させた。窒素雰囲気中でペトリ皿を熱板上に置き、その後、ペトリ皿に１〜５ｍｌのＦ１３−ＴＣＳを加えた。シリコンモールドをペトリ皿に入れ、１０〜１５分間蓋をしてＦ１３−ＴＣＳ蒸気でシリコンモールドを湿潤させた。その後、ペトリ皿からシリコンモールドを取り出した。
【０１５５】
下記の表１に記載した５つの互いに異なるポリマーを用いて、様々なナノトポグラフィ構造体を作製した。
【０１５６】
【表１】
0005860033.tif 000004
【０１５７】
いくつかの互いに異なるナノトポグラフィパターンを作製した。それらの概略図を図２４Ａ〜図２４Ｄに示す。図２４Ｅに示すナノトポグラフィパターンは、日本国東京都のＮＴＴアドバンステクノロジ株式会社から購入した平坦基板の表面である。これらのパターンを、ＤＮ１（図２４Ａ）、ＤＮ２（図２４Ｂ）、ＤＮ３（図２４Ｃ）、ＤＮ４（図２４Ｄ）及びＮＴＴＡＴ２（図２４Ｅ）と名付けた。前記モールドのＳＥＭ画像を図２４Ａ、図２４Ｂ及び図２４Ｃに示し、前記フィルムのＳＥＭ画像を図２４Ｄ及び図２４Ｅに示した。図８は、図２４Ａ（ＤＮ１）のモールドを用いて作製したナノパターニングされたフィルムを示している。この特定のフィルムでは、前述したように温度変化によって前記ポリマーフィーチャ（polymer feature）。図２４Ｅのパターンの表面粗さは、３４ｎｍであった。
【０１５８】
また、このナノインプリンティング法に従って、図７（Ｃ）及び図７（Ｄ）に示したパターンも作製した。このパターンは、図示したような複数の柱状物７２及び柱状物６２を含んでいる。より大きい柱状物７２は、直径３．５μｍ、高さ３０μｍ、中心間距離６．８μｍであった。柱状物６２は、高さ５００ｎｍ、直径２００ｎｍ、中心間距離２５０ｎｍであった。
【０１５９】
ポリプロピレンフィルムに用いたナノインプリンティングの工程条件を下記の表２に示す。
【０１６０】
【表２】
0005860033.tif 000005
【０１６１】
実施例２
【０１６２】
様々なパターンを含み、かつポリスチレン（ＰＳ）またはポリプロピレン（ＰＰ）のいずれかからなるフィルムを、実施例１で説明したようにして作製した。前記下地基板は、様々な厚さのものを用いた。用いたパターンは、実施例１で説明した作製方法を用いて作製したＤＮ２、ＤＮ３またはＤＮ４のいずれかであった。このように名付けられたパターンを有し、かつ様々なサイズを有するフィーチャを作製するために、孔の深さ及びフィーチャ間隔が互いに異なるパターンモールドを用いた。０．６μｍの細孔性ポリカーボネートフィルタをモールドとして使用して、サンプル８番（ＢＢ１と名付けた）を作製した。前記フィルタ上に２５μｍのポリプロピレンフィルムを載置した後、前記ポリプロピレンが前記フィルタの孔に流れ込むことができるように、ポリプロピレンを加熱して融解させた。そして、前記モールドを冷却した後、塩化メチレン溶媒を用いて前記ポリカーボネートモールドを溶解させた。
【０１６３】
作製されたフィルムのＳＥＭを図２５〜図３３に示し、作製されたフィルムの特徴を下記の表３に要約する。
【０１６４】
【表３】
0005860033.tif 000006
【０１６５】
各サンプルについて、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して前記フィルムを特徴付けした。特徴付けには、走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）の撮影、表面粗さの測定、フィーチャの最大高さの測定、及びフラクタル次元の算出が含まれる。
【０１６６】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）プローブとして、マイクロマッシュ社（μMasch）製のシリーズ１６シリコンプローブ及びカンチレバーを使用した。カンチレバーは、共振周波数１７０ｋＨｚ、バネ定数４０Ｎ／ｍ、長さ２３０±５μｍ、幅４０±３μｍ、厚さ７．０±０．５μｍであった。プローブチップはリンドープのｎ型シリコンプローブであり、プローブチップ半径は１０ｎｍ、チップ全体の円錐角は４０°、チップの全高は２０〜２５μｍ、バルク抵抗率は０．０１〜０．０５Ω・ｃｍであった。
【０１６７】
表３に記載されている表面粗さの値は、ＩＳＯ２５１７８シリーズにおいて定義された表面領域粗さパラメータの算術平均高さである。
【０１６８】
フーリエ振幅スペクトルを解析することによって、様々な角度についてのフラクタル次元を計算した；様々な角度についての振幅フーリエプロファイルを抽出し、周波数及び振幅座標の対数を計算した。その後、各方向についてのフラクタル次元Ｄを次式により計算した。
【０１６９】
Ｄ＝（６＋ｓ）／２
【０１７０】
ここで、ｓは、両対数曲線の（負の）傾きである。得られたフラクタル次元は、全方向の平均である。
【０１７１】
また、フラクタル次元は、両対数関数を適用することによって、２Ｄフーリエスペクトルから評価することもできる。表面がフラクタルである場合、両対数グラフは、負の傾きを有する高線形であるはずである（例えば、Fractal Surfaces, John C. Russ, Springer-Verlag New York, LLC, July, 2008を参照）。
【０１７２】
実施例３
【０１７３】
ＨａＣａＴヒト皮膚上皮細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ内で成長させた（３７℃、５％ＣＯ２、２４時間、２５，０００細胞／ｃｍ２の濃度、６ウェルプレート）。プレートは、ウェルの底部に、ポリプロピレンフィルム（実施例１で前述したようにして形成され、ＤＮ１、ＤＮ２（表３のサンプル４）、ＤＮ３と名付けられたもの）、または未処理表面のいずれかを有していた。フィルムをシアノアクリレートによって適所に接着した。
【０１７４】
１ウェル当たり１ｍＬのトリプシンを用いて細胞を前記表面から１０分間分離し、１ｍＬの成長培地（同上）によりクエンチし、その後、マイクロ遠心チューブに移して１２００ｒｐｍで７分間遠心分離してペレット状にした。
【０１７５】
キアゲン（Qiagen）社製のRneasyミニプレップ・キットを使用して、かつ製造業者のプロトコルに従って、ペレット状の細胞からＲＮＡを単離した。簡単に説明すると、細胞を溶解した後、エタノールと混合し、カラム内に遠沈した。その後、溶解物を３回洗浄し、ＤＮａｓｅで処理して容量４０ｍｌで溶出した。
【０１７６】
ＳＡバイオサイエンス社（SA Biosciences）製のＲＴ用ファーストストランド・キットを使用して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。簡単に説明すると、ＲＮＡをＤＮａｓｅで再び処理した（４２℃、５分間）。次に、ランダムプライマー及び逆転写酵素を加え、４２℃で１５分間培養し、その後９５℃で５分間培養した後に反応を停止させた。
【０１７７】
その後、ＳＡバイオサイエンス社製のＲＴプロファイラ（RT profiler）カスタムＰＣＲアレイを使用し、ＩＬ１−β、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ−１、ＰＤＧＦＡ、ＧＡＰＤＨ、ＨＤＧＣ、ＲＴＣ及びＰＰＣについてのプライマーを用いて、ｃＤＮＡサンプルに対してｑＰＣＲを行った。簡単に説明すると、ｃＤＮＡをサイバーグリーン（SYBR green）及び水と混合し、次に、対象の遺伝子についての適切なセンス及びアンチセンス・プライマー対を、予め固定したＰＣＲプレートに加えた。その後、９５℃に加熱したＡＢＩ社製StepOnePlus（登録商標）ＰＣＲ装置上で前記プレートについて１０分間実行し、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４５サイクル行った。
【０１７８】
内部対照（internal control）としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣｔ解析を行った。活性及びゲノムＤＮＡ混入のための追加内部対照として、ＨＤＧＣ、ＲＴＣ及びＰＰＣレベルを用いた。
【０１７９】
その後、一元配置分散分析法（One-way ANOVA）及びテューキー２点法（Tukey's 2-point test）を用いて、表面間の差異の統計的有意性を判定した。
【０１８０】
下記の表４は、ポリプロピレンフィルム上に作製されたナノインプリントされた構造体における発現の倍率変化（fold change）として得られたタンパク質発現と、非構造化フィルムにおける発現とを比較して表している。
【０１８１】
【表４】
0005860033.tif 000007
【０１８２】
実施例４
【０１８３】
ＨａＣａＴヒト皮膚上皮細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ内で成長させた（３７℃、５％ＣＯ２、２４時間、２５，０００細胞／ｃｍ２の濃度、６ウェルプレート）。プレートは、ウェルの底部に、ポリプロピレンフィルム（実施例１で前述したようにして形成され、ＤＮ１、ＤＮ２（表３のサンプル４）、ＤＮ３と名付けられたもの）、または未処理表面のいずれかを有していた。フィルムをシアノアクリレートによって適所に接着した。
【０１８４】
各ウェルから培地を採取し、ミリポア社（Millipore）製のミリプレックス・マップ・キットによって、サイトカイン産生について解析した。ＩＬ１−β、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＧＧＦ−ＡＢ／ＢＢ及びＴＮＦ−αを検出するためにビーズを用いた。測定は、バイオ・ラッド社（BioRad）製バイオプレックス（BioPlex）装置を用いて行った。簡単に説明すると、前記培地を、フィルタを備えたマイクロプレートウェル内に入れた。プライマリービーズを加えた、振盪しながら室温で１時間培養した。次に、プレートを洗浄し、検出抗体を加えた、振盪しながら室温で３０分間培養した。続いて、ストレプトアビジン−フィコエリスリンを加え、室温でさらに３０分間培養した。その後、プレートを洗浄し、ビーズをアッセイ緩衝液中に再懸濁した後、バイオプレックスを使用して蛍光強度の中央値を解析した。
【０１８５】
実施例５
【０１８６】
本明細書で説明したようにしてパターニングしたフィルムのＣａｃｏ−２細胞単層（ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞）に対する透過効果を調べた。
【０１８７】
実施例１で説明したようにして作製したフィルム（ＤＮ２、ＤＮ３及びＤＮ４と名付けられたパターンが形成されたフィルムを含む）を使用した。ＢＢ１と名付けられた第４のフィルム（実施例２で説明したもの）も使用した。フィルムの種類毎に複数の例についてプロトコルを実行した。
【０１８８】
各フィルムについて行われた概略プロトコルは以下の通りである。
【０１８９】
材料
細胞培養インサート０．４ｕｍ孔径ＨＤＰＥＴメンブレン（BD Falcon）
２４ウェルプレート（BD Falcon）
Ｃａｃｏ−２培地
上述したようなナノ構造化メンブレン（薄膜）
ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Sigma Aldrich）
ＢＳＡ−ＦＩＴＣ（Sigma Aldrich）
フェノールレッドを含まないＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地（Invitrogen）
ＴＥＥＲ電圧計
加温したＰＢＳ
黒色９６ウェルプレート
アルミ箔
【０１９０】
プロトコル
１．透過性アッセイを行う２週間前に、コラーゲンコーティングしたウェルインサート上にＣａｃｏ−２細胞を播く。コラーゲンコーティングプレートは、１００％エタノールとコラーゲンとの体積比を１：１にすることによって作製する。無菌フード内で表面を乾燥するまで一晩乾燥させる。
２．フェノールレッドを含まないα−ＭＥＭ培地内で、目的のＦＩＴＣ共役分子（ＢＳＡ、ＩｇＧなど）の溶液を０．１ｍｇ／ｍＬ調製する。光から保護するためにアルミ箔で包む。
３．抵抗を測定することによって、Ｃａｃｏ−２細胞の密集度をチェックする。密集度の抵抗は〜６００Ω以上であるべきである。
４．頂端側及び基底外側の細胞培養インサートから古い培地を吸引する。ＰＢＳでリンスし、残りのフェノールレッド色素を除去する。
５．各インサートの頂端側に０．５ｍＬのＦＩＴＣ共役溶液を加える。
６．細胞培養インサートを含む別の２４ウェルプレートに、０．５ｍＬの加温ＰＢＳを加える。
７．ＰＢＳを含むプレートにインサートを移す。キムワイプでインサートの底部を拭き取り、残留フェノールレッドを除去する。
８．ｔ＝０の時点：インサートの基底外側から７５ｍＬを採取し、底部が黒色の９６ウェルプレートに移す。上記体積を７５ｍＬの加温ＰＢＳで置き換える。「チョップスティック型」電極を使用して各ウェルの抵抗を記録する。
９．適切にラベルを付けたウェルに前記メンブレンを注意深く加える。インプリントされていないメンブレン及び細胞単独を対照とする。顕微鏡によって、前記メンブレンが細胞と直接接触することを確認する。細胞との接触を示すはっきりした円を見ることができるはずである。
１０．ｔ＝０の時点：ステップ７を繰り返す。その後、インキュベータ内に１時間静置する。
１１．ｔ＝１の時点：ステップ７を繰り返す。その後、インキュベータ内に１時間静置する。
１２．ｔ＝２の時点：ステップ７を繰り返す。
１３．分光蛍光光度計プレートリーダーを使用して蛍光シグナルを測定する。ＦＩＴＣ（励起＝４９０ｎｍ、発光＝５２０ｎｍ）
【０１９１】
結果
使用したフィルム及び得られた結果を下記の表５に要約する。
【０１９２】
【表５】
0005860033.tif 000008
【０１９３】
弾性率は、Schubert他による「Sliding induced adhesion of stiff polymer microfiber arrays: 2. Microscale behaviour, Journal Royal Society, Interface, Jan. 22, 2008. 10.1098/rsif.2007.1309」に記載されているような当分野で既知の標準方法に従って測定した。
【０１９４】
標準的技法（例えば、Woodward, First Ten Angstroms, Portsmouth, VAを参照）に従って、前記表面上に水滴を垂らすことによって接触角を測定した。
【０１９５】
図３４は、本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の透過率に対する影響をグラフで示している。フィルムパターンは、図示のように、ＤＮ２パターン（サンプル３番）、ＤＮ３パターン（サンプル５番）及びＤＮ４パターン（サンプル６番）を含む。パターニングされていないフィルムの結果（図３４にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムを含まない細胞層についての結果（図３４に「細胞」と示されている）も示されている。
【０１９６】
図３５は、本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の透過率に対する影響をグラフで示している。フィルムパターンは、図示のように、ＤＮ２パターン（サンプル３番）、ＤＮ３パターン（サンプル５番）及びＤＮ４パターン（サンプル６番）を含む。パターニングされていないフィルムの結果（図３５にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムを含まない細胞層についての結果（図３５Ａ及び図３５Ｂに「細胞」と示されている）も示されている。
【０１９７】
ＢＳＡシグナルは蛍光光度計で読み取り、ＩｇＧシグナルは分光光度計で読み取った。
【０１９８】
図３６（Ａ）及び（Ｂ）は、ＤＮ４がパターニングされたポリスチレン表面（サンプル６番）上での細胞単層を透過してのＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別（3D live/dead）蛍光染色画像である。
【０１９９】
図３７は、本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層における、ＢＳＡの透過率に対する影響をグラフで示している。パターンは、図示のように、ＢＢ１（サンプル８番）、ＤＮ２（サンプル４番）及びＤＮ４（サンプル７番）を含む。パターニングされていないフィルムの結果（図３７にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムを含まない細胞層の結果（図３７に「細胞」と示されている）も示されている。
【０２００】
図３８は、本明細書で説明したナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層における、ＩｇＧの透過率に対する影響をグラフで示している。パターンは、図示のように、ＢＢ１（サンプル８番）、ＤＮ２（サンプル４番）及びＤＮ４（サンプル７番）を含む。パターニングされていないフィルムの結果（図３８にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムを含まない細胞層の結果（図３８に「細胞」と示されている）も示されている。
【０２０１】
図３９（Ａ）及び（Ｂ）は、ポリプロピレンＤＮ２がパターニングされた表面（サンプル４番）上での細胞単層を透過してのＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色画像である。
【０２０２】
図４０（Ａ）〜（Ｆ）は、ナノパターニングされた表面で培養されたＣａｃｏ−２細胞の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。具体的には、図４０（Ａ）及び（Ｂ）は、平坦なポリスチレン対照フィルム上のＣａｃｏ−２細胞を示している。図４０（Ｃ）及び（Ｄ）は、上述したようなＤＮ２パターン（サンプル３番）がパターニングされたポリスチレンフィルム上のＣａｃｏ−２細胞を示しており、図４０（Ｅ）及び（Ｆ）は、上述したようなＤＮ３（サンプル５番）パターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上のＣａｃｏ−２細胞を示している。
【０２０３】
実施例６
【０２０４】
ナノパターニングされた表面を含むマイクロニードルのアレイを作製した。まず、フォトリソグラフィ法を用いて、シリコンウェハ上に、図２に示すようなマイクロニードルアレイを作製した。各マイクロニードルは、互いに対向配置された２つの側面チャンネルを有している。前記２つの側面チャンネルは、マイクロニードルの基部に設けられた１つのダイ貫通孔（図２には見えない）と整合されている。
【０２０５】
標準的なマイクロマシニング技術によって、シリコンベースウェハ上にマイクロニードルを作製した。前記ウェハにレジスト層及び／または酸化物層を積層させた後、標準的な方法によって、選択的エッチング（酸化物エッチング、ＤＲＩＥエッチング、ＩＳＯエッチング）、レジスト除去、酸化物除去、及びリソグラフィ技術（例えば、ＩＳＯリソグラフィ、ホール（孔）リソグラフィ、スリットリソグラフィ）を行い、マイクロニードルアレイを作製した。
【０２０６】
マイクロニードルアレイの作製後、実施例１で説明したＤＮ２パターンが表面に形成された５μｍのポリプロピレンフィルム（その特徴は、表３のサンプル２に記載されている）をマイクロニードルアレイ上に載せた。このウェハ／フィルム構造体を、加熱した真空箱（３インチ、Ｈ２Ｏ真空）内に高温（１３０°Ｃ）で１時間入れ、前記フィルムのナノパターニング表面を維持しながら、前記フィルムをマイクロニードルの表面上に徐々に引き伸ばした。
【０２０７】
図４１は、マイクロニードルアレイの表面上のフィルムを示しており、図４２は、前記ナノパターニングフィルムで表面が覆われたマイクロニードルアレイのうちの１本のマイクロニードルの拡大図である。
【０２０８】
実施例７
【０２０９】
実施例５で説明した方法を用いて、ｓｉＲＮＡの細胞層の透過性を考慮した場合の、単層に本明細書で説明したようにしてパターニングされたフィルムのＣａｃｏ−２細胞に対する透過効果を調べた。
【０２１０】
使用したｓｉＲＮＡは、Invitrogen社製のBLOCK-iT（商標）Fluorescent Oligoであった。このｓｉＲＮＡは、蛍光標識されたｄｓＲＮＡオリゴマーである。実施例５で説明したプロトコルを用いた。使用した構造化フィルムは、ポリプロピレンフィルム上のＤＮ２パターン（表３のサンプル４）、未パターン化フィルム（ＰＰＵＩ）、フィルムを含まない細胞層であった。透過性の経時的な結果を図４３に示す。
【０２１１】
本明細書において、本発明の主題をその具体的な実施形態に関して詳細に説明してきたが、当然のことながら、当業者は、上記記載を理解して、これらの実施形態の代替形態、変形形態及び等価形態を容易に考え出すことができる。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれと等価なものとして判断されるものとする。
【図１】
0005860033.tif 000009
【図２】
0005860033.tif 000010
【図３】
0005860033.tif 000011
【図４】
0005860033.tif 000012
【図５】
0005860033.tif 000013
【図６】
0005860033.tif 000014
【図７】
0005860033.tif 000015
【図８】
0005860033.tif 000016
【図９】
0005860033.tif 000017
【図１０】
0005860033.tif 000018
【図１１Ａ】
0005860033.tif 000019
【図１１Ｂ】
0005860033.tif 000020
【図１２】
0005860033.tif 000021
【図１３】
0005860033.tif 000022
【図１４】
0005860033.tif 000023
【図１５】
0005860033.tif 000024
【図１６】
0005860033.tif 000025
【図１７】
0005860033.tif 000026
【図１８】
0005860033.tif 000027
【図１９】
0005860033.tif 000028
【図２０】
0005860033.tif 000029
【図２１】
0005860033.tif 000030
【図２２】
0005860033.tif 000031
【図２３】
0005860033.tif 000032
【図２４Ａ】
0005860033.tif 000033
【図２４Ｂ】
0005860033.tif 000034
【図２４Ｃ】
0005860033.tif 000035
【図２４Ｄ】
0005860033.tif 000036
【図２４Ｅ】
0005860033.tif 000037
【図２５】
0005860033.tif 000038
【図２６Ａ】
0005860033.tif 000039
【図２６Ｂ】
0005860033.tif 000040
【図２７】
0005860033.tif 000041
【図２８】
0005860033.tif 000042
【図２９】
0005860033.tif 000043
【図３０】
0005860033.tif 000044
【図３１】
0005860033.tif 000045
【図３２】
0005860033.tif 000046
【図３３】
0005860033.tif 000047
【図３４】
0005860033.tif 000048
【図３５】
0005860033.tif 000049
【図３６Ａ】
0005860033.tif 000050
【図３６Ｂ】
0005860033.tif 000051
【図３７】
0005860033.tif 000052
【図３８】
0005860033.tif 000053
【図３９Ａ】
0005860033.tif 000054
【図３９Ｂ】
0005860033.tif 000055
【図４０】
0005860033.tif 000056
【図４１】
0005860033.tif 000057
【図４２】
0005860033.tif 000058
【図４３】
0005860033.tif 000059