(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式１で表されるグリカンを含むことを特徴とする甘味増強用組成物：
構造式１
0005860542.tif 000005
前記構造式１において、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮａｃはＮ−アセチルヘキソサミンである。
【請求項２】
前記構造式１のグリカンが、そのＮ−アセチルヘキソサミンを介してＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列を含むペプチドのＡｓｎアミノ酸残基のアミド窒素（ａｍｉｄｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に結合されている請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記グリカンが、醤油又は醤油画分に含まれている請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
下記構造式１で表されることを特徴とするグリカン：
構造式１
0005860542.tif 000006
前記構造式において、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮａｃはＮ−アセチルヘキソサミンである。
【請求項５】
前記組成物が、ヒト甘味受容体を活性化させる請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒト甘味受容体が、ｈＴ１Ｒ２（ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ２）、ｈＴ１Ｒ３（ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ３）、又はｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）請求項１から３のいずれかに記載の甘味増強用組成物；及び（ｂ）甘味料を含むことを特徴とする甘味料組成物。
【請求項８】
前記甘味料が、炭水化物甘味料、天然甘味料、合成甘味料又はこれらの組合せを含む請求項７に記載の甘味料組成物。
【請求項９】
前記炭水化物甘味料が、スクロース、フルクトース、グルコース、エリトリトール、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、Ｄ−タガトース、トレハロース、ガラクトース、ラムノース、シクロデキストリン、リブロース、トレオース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、イドース、ラクトース、マルトース、転化糖（ｉｎｖｅｒｔ  ｓｕｇａｒ）、イソトレハロース、ネオトレハロース、パラチノース、イソマルツロース、エリトロース、デオキシリボース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、キシルロース、プシコース、ツラノース、セロビオース、グルコサミン、マンノサミン、フコース、グルクロン酸、グルコン酸、グルコノラクトン、アベクオース、ガラクトサミン、キシロオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ソルボース、ニゲロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、マルトテトラオール、マルトトリオール、マルトオリゴ糖、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、ラムノース、リボース、異性化液糖（ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｕｇａｒ）及びこれらの組合せから構成された群より選択される請求項８に記載の甘味料組成物。
【請求項１０】
前記天然甘味料が、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビア、ステビオシド、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、羅漢果（Ｌｕｏ  Ｈａｎ  Ｇｕｏ）甘味料、シアメノシド、モナチン及びその塩（モナチンＳＳ、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ）、クルクリン、グリチルリチン酸及びその塩、タウマチン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、グリシフィリン、フロリジン、トリロバチン、バイユノシド、オスラジン、ポリポドシドＡ、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、ムクロジオシド、フロミソシドＩ、ペリアンドリンＩ、アブルソシドＡ、シクロカリオシドＩ及びこれらの組合せから構成された群より選択される請求項８に記載の甘味料組成物。
【請求項１１】
前記合成甘味料が、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、アリテーム、サッカリン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラメート、ネオテーム、Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル、Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−３−メチルブチル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル、Ｎ−［３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル、これらの塩及びこれらの組合せから構成された群より選択される請求項８に記載の甘味料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醤油由来のグリカンを含む甘味増強用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
甘味は、人間が最も好きな味であるが、甘味を出すスクロースのような糖を含有する物質は高カロリーであって、糖尿や肥満のような代謝性疾患を誘発する。したがって、近年、研究者らは、カロリーのない甘味料（ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ）を研究開発して、糖の攝取を減らそうと努力している。しかしながら、カロリーのない甘味料は、期待した甘味以外に苦味のような異味（ｏｆｆ  ｔａｓｔｅ）を呈し、本当の甘味を呈するか増強させる役割をしていない場合が多い。また、既存の甘味料は、高濃度で使用してこその効果を現し、そうでなければ甘味以外の不快な味、すなわち、苦味、金属味、冷たい味などのような味を含有するか、その味が短いか長く持続して問題があった。かかる問題点を無くして効能を増強させるために、その間研究者らは、既存の甘味料を組み合わせて糖の味に最も近い成分を開発すべく努力しているが、それには限界がある。このような理由から、既存の糖が呈する味を呈することができる甘味増強剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）を開発するために努力している。本来の甘味をもっと増強させる物質を開発すれば、低濃度の糖を使用しても高濃度の甘味を感じる効果を奏することができるからだ。このような甘味増強剤は、少ない量の甘味料や糖でも甘味の強度は増強させる役割を果たすことで、食べ物の糖の量を減らし、さらにはカロリーの少ない食べ物や飲み物に応用することができる。
【０００３】
舌において味覚は、味覚受容体を刺激できる化学物質がそれぞれリポタンパク結合受容体である甘味（ｓｗｅｅｔ）、苦味（ｂｉｔｔｅｒ）、うま味（ｕｍａｍｉ）受容体に結合して特別なＧα−ガストデューシン、Ｇβ３、Ｇγ１３からなるリポタンパク質を活性化させ、これによってＰＬＣβ２とＴＲＭＰ５カルシウム通路を介して細胞内カルシウムが流入し、これにより味覚受容体をもつ細胞から神経伝達物質が分泌して味に関与する神経を刺激し、脳で味を感じるようになることが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
最近１０年間、甘味を伝達して調節する甘味受容体が発見されてクローニングされることで、受容体に関連して、糖の甘味をもっと増強させる増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の研究が活発になりつつある。甘味とうま味、苦味を認知する受容体は、構造的にＧＰＣＲ（７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体：７−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｏｍａｉｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に属するが、全体的な構造においては明らかな差を示している。最近、分子生物学的研究によって明らかになったところによれば、哺乳類の味覚受容体は、大きく１型と２型とに分類することができる。１型の味覚受容体はＧＰＣＲタイプＣファミリーに属し、カルシウムセンシングと密接な関連があるｍＧｌｕＲ（代謝型グルタミン酸受容体：ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とＧＡＢＡＢ（γ−ａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ）受容体と同様に、Ｎ末端側にリガンドが結合する大きな細胞外部位を持つことが知られている（非特許文献２）。これらはＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の３つの遺伝子に分けられ、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３受容体は、共にアミノ酸受容体と作用することが明らかになっており、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３受容体は、甘味受容体と作用することが報告された。
【０００５】
Ｔ１Ｒ２  ヘテロダイマーはＶＦＴ（ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐ  ｄｏｍａｉｎ）が膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ，ＴＭＤ）と連結されており、Ｔ１Ｒ２にＣＲＤ（ｃｙｓｔｅｉｎ  ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）が連結されている。このような受容体の構造を調節する数十種の合成、自然甘味料が薬理学的に研究されたが、Ｔ１Ｒ３の膜貫通ドメインに作用する甘味料は、シクラメート及びネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）である。スクロース及びスクラロースは、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のＶＦＴに結合し、アスパルテームは、Ｔ１Ｒ２のＶＦＴに結合する（図１）。このように甘味受容体のクローニングによって甘味増強剤の開発方法が客観化かつ専門化した。
【０００６】
既存の甘味増強剤や甘味料は、このような受容体に多様な方法で結合してその効能を発揮するが、上述したように不快な味を持っているか、合成して作った甘味料として副作用を引き起こすことがある。
【０００７】
本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ  ＲＦ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１−４（２００２）
【非特許文献２】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、優れた甘味増強性、特に、従来の甘味料とほぼ同等かより優れた甘味効果を有すると共に、栄養学的な側面でカロリーの少ない甘味増強用組成物を開発すべく研究努力した。その結果、醤油又は醤油画分由来のグリカン又はグリコペプチドを含む組成物が甘味受容体を活性化させ、甘味を増強させるのに優れた効果を奏することを突き止めることで、本発明を完成するに至った。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、甘味増強用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明の甘味増強用組成物及び甘味料を含む甘味料組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のまた別の目的は、本発明の甘味増強用組成物を含む食品を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーの甘味受容体を示す図である。
【図２】図２は、醤油からクロマトグラフィーを通じて得た糖結合ペプチド画分（ＦＩＩ）を示すグラフである。
【図３】図３は、ＦＩＩのサブ画分であるＬＨｅのＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＬＨｅの分子量推定のために分子量標準物質と比較して示すクロマトグラムである。
【図５】図５は、Ｍｅｔ−Ａｓｎペプチドの官能検査の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＦＩＩ画分及び多様な甘味料に対するヒト甘味受容体発現細胞のカルシウム放出量の変化を確認したグラフである。Ｓｕｃ．：スクロース、Ａｃｅ−Ｋ．：アセスルファムカリウム、Ｓａｃｃ．：サッカリン、Ｃｙｃ．：サイクラミン酸。
【図７】図７は、ＦＩＩの５種類のサブ画分及び多様な甘味料に対するヒト甘味受容体発現細胞のカルシウム放出量の変化を確認したグラフである。Ｓｕｃ．：スクロース、Ａｃｅ−Ｋ．：アセスルファムカリウム、Ｓａｃｃ．：サッカリン、Ｃｙｃ．：サイクラミン酸。
【図８】図８は、ＬＨｅ画分のスクロース、アセスルファムカリウム、サッカリン及びサイクラミン酸濃度依存的な活性評価の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＦＩＩ、ＬＨｅ及びラクチゾールに対するヒト甘味受容体発現細胞のカルシウム放出量の変化を確認したグラフである。
【図１０ａ】図１０ａは、ＦＩＩ画分に対する定量的な官能検査の結果を示すグラフである。
【図１０ｂ】図１０ｂは、ＬＨｅ画分に対する定量的な官能検査の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、スクロース溶液及びＬＨｅ−スクロース溶液の甘味増強効果を確認したグラフである。
【図１２】図１２は、サイクラミン酸ナトリウム及びＬＨｅ−サイクラミン酸ナトリウムの甘味増強効果を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一様態によれば、本発明は下記一般式１で表されるグリカンを含む甘味増強用組成物を提供する：
（Ｈｅｘ）５−（ＨｅｘＮａｃ）１
上記一般式において、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮａｃはＮ−アセチルヘキソサミンである。
【００１６】
本発明者らは、優れた甘味増強性、特に従来の甘味料とほぼ同等かより優れた甘味効果を有すると共に、栄養学的な側面でカロリーの少ない甘味増強用組成物を開発すべく研究努力した。その結果、醤油又は醤油画分由来のグリカン又はグリコペプチドを含む組成物が甘味受容体を活性化させ、甘味を増強させるのに優れた効果を奏することを突き止めた。
【００１７】
本明細書に使用される用語「甘味増強用組成物（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、甘味の知覚（ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ）を増強させるか増大させることができる組成物を意味する。用語「甘味増強用組成物」は、用語「甘味強化剤（ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）」、「甘味性強化剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）」及び「甘味性増大剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ）」と同義語である。通常、本発明に提供された甘味増強用組成物は、収容可能な使用濃度でこれら自体による感知できるような甘味を提供しないものの甘味料の甘味を増強させるが、上記甘味増強用組成物はより高い濃度では甘味を提供することもできる。
【００１８】
本発明の好ましい実現例によれば、上記一般式においてヘキソースは、マンノース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、フコース又はこれらの組合せであり、最も好ましくはマンノースである。上記一般式において、Ｎ−アセチルヘキソサミンは、好ましくはＮ−アセチルグルコサミンである。
【００１９】
本発明の好ましい実現例によれば、上記一般式１のグリカンは下記構造式１で表される：
構造式１
0005860542.tif 000002
【００２０】
本発明の好ましい実現例によれば、構造式１のグリカンは、そのＮ−アセチルヘキソサミンを介してＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列を含むペプチドのＡｓｎアミノ酸残基のアミド窒素（ａｍｉｄｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に結合されている。
【００２１】
本発明の好ましい実現例によれば、上記構造式１において、ヘキソースは、マンノース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、フコース又はこれらの組合せであり、最も好ましくはマンノースである。上記一般式１において、Ｎ−アセチルヘキソサミンは、好ましくはＮ−アセチルグルコサミンである。
【００２２】
一般式１のグリカンに結合されたペプチドは、Ｍｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列を含み、好ましくはＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列から本質的に構成（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）され、より好ましくはＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列から構成（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）される。ペプチド配列を言及しながら使用される用語「本質的に構成」とは、Ｍｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端に追加的に１〜１０個、好ましくは１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸が結合されたペプチドを包括するために使用された用語である。
【００２３】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明で用いられるグリカンは、醤油又は醤油画分に含まれており、これより分離して得ることができる。
【００２４】
本発明の別の様態によれば、本発明は下記構造式１で表されるグリカンを提供する：
構造式１
0005860542.tif 000003
【００２５】
上記構造式において、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮａｃはＮ−アセチルヘキソサミンである。
【００２６】
下記の実施例で立証されたように、醤油（特に、熟成醤油）から分離したグリコペプチドにおいて甘味増強効果を現す部分（ｍｏｉｅｔｙ）はグリカン部分である。
【００２７】
本発明の別の様態によれば、本発明は、醤油のグリコペプチド画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含む甘味増強用組成物を提供する。
【００２８】
本発明の好ましい実現例によれば、醤油のグリコペプチド画分は、分子量５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａのグリコペプチド画分である。
【００２９】
より好ましい実現例によれば、本発明のグリコペプチド画分は、（ａ）醤油を遠心分離して沈殿物を除去するステップ；及び（ｂ）ステップ（ａ）の結果物を限外ろ過して分子量５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａのグリコペプチド画分を分離するステップを通じて得ることができる。
【００３０】
本発明の具体的な一実施例を参照して、グリコペプチド画分を得る方法を説明すれば、下記の通りである：醤油原液を遠心分離して沈殿物を除去した後、限外ろ過装置を用いて一定の圧力（例えば、６０ｐｓｉ）を加えてグリコペプチド画分を分離する。限外ろ過膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  １０，０００  ｄａｌｔｏｎ）で分子量１０，０００以上と分子量１０，０００以下の物質に分離した後、分子量１０，０００以上の物質は除去し、分子量１０，０００以下のグリコペプチドを含む溶液はさらに限外ろ過膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ５００  ｄａｌｔｏｎ）で限外ろ過して分子量５００以下の物質は除去し、分子量が５００より大きくて１０，０００より小さいグリコペプチド画分を分離する。
【００３１】
上記限外ろ過は、当業界に公知の多様な方法を通じて行うことができる。限外ろ過は、適合する分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔ−ｏｆｆ，ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過膜を用いて行う。例えば、分画分子量５００〜１０，０００の限外ろ過膜を使用して限外ろ過を行う。限外ろ過はろ過だけでなく、濃縮の効果も発生させることができる。
【００３２】
上記限外ろ過は、醤油原液を遠心分離した後、行うことができる。上記遠心分離は、５，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。
【００３３】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明の甘味増強用組成物は、ヒト甘味受容体を活性化させる。上記甘味受容体は、甘味化合物によって調節されることができる味受容体である。好ましくは、甘味受容体は、Ｇタンパク質が結合された受容体であり、より好ましくはｈＴ１Ｒ２（ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ２）／ｈＴ１Ｒ３（ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ３）である。
【００３４】
本発明の甘味増強用組成物は、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３）を調節して、Ｇタンパク質信号化カスケードを活性化する効果を有する。甘味受容体に対する本発明の組成物の効果は、味覚試験で認知される甘味の香味を増加させる。したがって、本発明の甘味増強用組成物は、スクロース、フルクトース、グルコース及び他の公知の天然サッカライドに基づく甘味料又は公知の甘味料（例：サッカリン、サイクラミン酸、アスパルテームなど）、又はこれらの混合物に対する代替品として用いることができる。
【００３５】
本発明の好ましい実現例によれば、糖が結合されていない状態のＭｅｔ−Ａｓｎペプチドは甘味効果を現わさない。Ｍｅｔ−Ａｓｎペプチド自体の甘味は、０．１３±０．０４の甘味強度を示し、標準試料である５％スクロースの甘味強度５．００±０．００に比べて甘味をほとんど呈さないことが分かった（図５）。本発明のＭｅｔ−Ａｓｎペプチドを含む分画物の甘味効果は、糖構造結合によるものであると言える。
【００３６】
下記の実施例で立証されたように、醤油から分離したグリコペプチド画分（ＦＩＩ）は細胞内のカルシウム濃度を増加させる。詳細には、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３が安定的に発現される細胞株に従来の甘味料であるスクロース、アセスルファムカリウム、サッカリン又はサイクラミン酸を処理してＦＩＩ画分を添加した結果、４種のリガンドにＦＩＩを添加したとき、カルシウムの放出が増加することが確認された。スクロースの場合、ＦＩＩを追加的に添加したとき、カルシウムの放出が約２．３倍、アセスルファムカリウム及びサッカリンではそれぞれ１．５倍及び１．２倍程度有意的に増加した（図６）。また、ＦＩＩの各サブ画分であるＬＨａ、ＬＨｂ、ＬＨｃ、ＬＨｄ及びＬＨｅに対するカリウム放出変化量を確認した結果、スクロース、アセスルファムカリウム及びサッカリンにサブ画分を追加的に添加したとき、ＬＨｄ及びＬＨｅ画分でリガンド選択的にカルシウム放出が増加した（図７）。ＬＨｅ画分は、アセスルファムカリウム又はスクロースを処理した細胞で濃度依存的にカルシウム放出を増加させた（図８）。
【００３７】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明の甘味増強用組成物は、甘味性増強剤のない甘味料組成物に対する甘味の知覚以上に甘味料組成物の甘味の強度を増加させるか又は増強させることができる。
【００３８】
本発明によれば、本発明のＦＩＩ画分の基本味は、うま味（２．１３±０．３１）が最も高く、次に甘味（１．０８±０．２０）、塩味（０．７８±０．２０）であり、酸味と苦味はそれぞれ（０．１７±０．０６）、（０．１０±０．０５）と低かった（図１０ａのパネルＡ）。これを１００％に換算したときは、うま味、甘味、塩味、酸味、苦味の順にそれぞれ５０、２５．４９、１８．１４、３．９２、２．４５％で構成されていることを確認した（図１０ａのパネルＢ）。ＦＩＩのサブ画分であるＬＨｅはうま味（２．９２±０．５０）が最も高く、次に甘味が（１．１５±０．１５）であり、塩味（０．４６±０．２１）と苦味（０．３８±０．１９）は大きな差を示さず、酸味は（０．１５±０．０９）とほとんどなかった（図１０ｂ）。
【００３９】
また、ＬＨｅの甘味増強効果をより正確に調べるために、甘味標準試料として２、５、１０、１５％のスクロース溶液を使用して、ＬＨｅ溶液及び５％スクロース標準試料に添加されたＬＨｅ溶液を試料として提示し、甘味の強度を１５点尺度法で測定した結果、５％スクロース標準試料に添加されたＬＨｅ溶液の甘味強度（６．９１±０．６２）が５％スクロース標準試料の甘味強度（５．００±０．００）に比べて有意的に増加したことを確認した（図１１）。下記の実施例で立証されたように、ＬＨｅ溶液を従来の甘味料に添加すれば、甘味増強効果を奏する。
【００４０】
本発明の別の様態によれば、本発明は、本発明の甘味増強用組成物及び甘味料を含む甘味料組成物を提供する。
【００４１】
本発明に使用される用語「甘味料組成物（ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、上記甘味増強用組成物及び１種以上の甘味料を含む配合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を意味する。
【００４２】
本発明の甘味増強用組成物は、適切な任意の甘味料の甘味又は知覚を増加させるために使用されることができる。本発明の甘味料組成物は、炭水化物甘味料、天然甘味料、合成甘味料又はこれらの組合せを含むことができる。
【００４３】
本発明で提供される甘味料組成物は、甘味料組成物内に有効量の甘味増強用組成物を含む。甘味増強用組成物の有効量とは、甘味増強用組成物のない甘味料組成物に対する甘味の知覚以上に甘味料組成物の味の強度を増加させるか又は増強させるのに十分な量を意味する。例えば、甘味増強用組成物は、全体甘味料組成物に好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ含まれることができる。
【００４４】
本発明で用いられる炭水化物甘味料は、スクロース、フルクトース、グルコース、エリトリトール、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、Ｄ−タガトース、トレハロース、ガラクトース、ラムノース、シクロデキストリン、リブロース、トレオース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、イドース、ラクトース、マルトース、転化糖（ｉｎｖｅｒｔ  ｓｕｇａｒ）、イソトレハロース、ネオトレハロース、パラチノース、イソマルツロース、エリトロース、デオキシリボース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、キシルロース、プシコース、ツラノース、セロビオース、グルコサミン、マンノサミン、フコース、グルクロン酸、グルコン酸、グルコノラクトン、アベクオース、ガラクトサミン、キシロオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ソルボース、ニゲロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、マルトテトラオール、マルトトリオール、マルトオリゴ糖、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、ラムノース、リボース、異性化液糖（ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｕｇａｒ）（例えば、高フルクトースコーン／澱粉シロップ、カップリングシューガ（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）、大豆オリゴ糖及びグルコースシロップ）であり、好ましくはスクロース、フルクトース、グルコース、エリトリトール及びマルチトールであり、最も好ましくはスクロースである。
【００４５】
本明細書に使用される用語「天然甘味料（ｎａｔｕｒａｌ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ）」とは、天然から発見される甘味料を意味するが、これらは未加工型、抽出型、錠剤型、又はその他の別の任意の形態のいずれか一つ又はこれらの組合せで存在することができ、これらは特徴的にスクロース、フルクトース、又はグルコースより一層大きな甘味効能（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を持つが、カロリーはより少ない。
【００４６】
本発明で用いられる天然甘味料は、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビア、ステビオシド、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、羅漢果（Ｌｕｏ  Ｈａｎ  Ｇｕｏ）甘味料、シアメノシド、モナチン及びその塩（モナチンＳＳ、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ）、クルクリン、グリチルリチン酸及びその塩、タウマチン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、グリシフィリン、フロリジン、トリロバチン、バイユノシド、オスラジン、ポリポドシドＡ、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、ムクロジオシド、フロミソシドＩ、ペリアンドリンＩ、アブルソシドＡ、シクロカリオシドＩである。
【００４７】
本明細書に使用される用語「合成甘味料（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ）」とは、自然から発見されず、特徴的にスクロース、フルクトース、又はグルコースよりもっと大きな甘味効能を持つが、より少ないカロリーを有する任意の組成物を意味する。
【００４８】
本発明で用いられる合成甘味料は、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、アリテーム、サッカリン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラメート、ネオテーム、Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル、Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−３−メチルブチル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル、Ｎ−［３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル及びこれらの塩であり、好ましくはスクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、アリテーム及びサッカリンであり、より好ましくはスクラロース、アセスルファムカリウム及びサッカリンであり、最も好ましくはアセスルファムカリウム及びサッカリンである。
【００４９】
本発明の別の様態によれば、本発明は上述した本発明の甘味増強用組成物を含む食品を提供する。
【００５０】
本発明の食品は、上述した甘味料組成物を含むので、これら間で共通する内容は、繰り返し記載による明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００５１】
本発明の食品は、経口攝取可能な組成物を意味し、食肉加工品、酪農加工製品、インスタント食品、発酵食品及び麺類を含むが、これに限定されるものではない。より具体的に、本発明の食品は、非炭酸及び炭酸飲料、例えば、コーラ、ジンジャーエール（ｇｉｎｇｅｒ  ａｌｅ）、サイダー、粉末性非アルコール性飲料；果物又は野菜由来のジュース、生フルーツジュースなどを含む果物ジュース；スポーツ飲料；水に類似する飲料（例えば、天然又は人工香料を持つ水）；ティータイプ又は嗜好飲料（例えば、コーヒー、ココア、ブラックティー、緑茶、ウーロン茶など）；乳成分含有飲料（例えば、乳飲料、乳成分含有コーヒー、カフェオレ、ミルクティー、フルーツ乳飲料、飲むヨーグルト、乳酸菌飲料など）；酪農製品；パン製品；デザート（例えば、ヨーグルト、ゼリー、飲むゼリー、プディング、バーバリアンクリーム、ブラマンジェ（ｂｌａｎｃｍａｎｇｅ）、ケーキ、ブラウニー（ｂｒｏｗｎｉｅ）、ムースなど）；冷凍食品；冷たい糖菓製品（ｃｏｌｄ  ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎ）（例えば、アイスクリーム、アイスミルク）；一般的な糖菓製品（例えば、ケーキ、クラッカー、ビスケットなど）；ライスケーキ及びスナック；フルーツ風味ソース、チョコレートソースなどのソース；食用ゲル；ストロベリージャム、マーマレードなどのようなジャム；加工農産品、家畜製品又は海産品；加工肉製品（例えば、ソーセージなど）；レトルト（ｒｅｔｏｒｔ）食品；スナック；及びシリアル（ｃｅｒｅａｌ）製品を含む。
【００５２】
本発明の別の様態によれば、本発明は、下記ステップを含む食品の甘味増強方法を提供する：（ａ）食品を選択するステップ；及び（ｂ）上記食品に本発明の甘味増強用組成物を適用するステップ。
【００５３】
本発明は、上述した本発明の甘味増強用組成物を含むので、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００５４】
本発明の食品は、当業界に公知のいずれの食品も含み、例えば、天然食品、肉加工食品、酪農食品、インスタント食品、発酵食品、麺類、肉類（生肉類、料理された肉類及び乾燥肉類を含む）、野菜類（生野菜類、ピクルス、料理された野菜類及び乾燥野菜類を含む）、果物（生の果物、料理された果物及び乾燥果物を含む）、穀物類（乾燥穀物及びパンを含む）、加工食品（乾燥、缶ソース及びスープを含む）及びスナック類を含むが、これに限定されるものではない．。
【００５５】
本発明の甘味増強用組成物を食品に適用する場合、食品の全体的な甘味を大きく改善させることで、食品の甘味を増強させるために使用される糖及び化学甘味料を代替又は低減させることができ、味と栄養学的な側面で優れた食品を提供することができる。
【００５６】
本発明の別の様態によれば、本発明は、下記一般式１で表されるグリカンを含む組成物を食品に適用するステップを含む食品の甘味増強方法を提供する：
（Ｈｅｘ）５−（ＨｅｘＮａｃ）１
上記一般式において、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮａｃはＮ−アセチルヘキソサミンである。
【００５７】
本発明の好ましい実現例によれば、上記一般式１のグリカンは下記構造式１で表される：
構造式１
0005860542.tif 000004
【００５８】
本発明の好ましい実現例によれば、構造式１のグリカンは、そのＮ−アセチルヘキソサミンを介してＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列を含むペプチドのＡｓｎアミノ酸残基のアミド窒素（ａｍｉｄｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に結合されている。
【００５９】
本発明の好ましい実現例によれば、上記構造式１において、ヘキソースは、マンノース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、フコース又はこれらの組合せあり、最も好ましくはマンノースである。上記一般式において、Ｎ−アセチルヘキソサミンは、好ましくはＮ−アセチルグルコサミンである。
【００６０】
一般式１のグリカンに結合されたペプチドは、Ｍｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列を含み、好ましくはＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列から本質的に構成（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）され、より好ましくはＭｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列から構成（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）される。ペプチド配列を言及しながら使用される用語「本質的に構成」とは、Ｍｅｔ−Ａｓｎアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端に追加的に１〜１０個、好ましくは１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸が結合されたペプチドを包括するために使用される用語である。
【００６１】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明で用いられるグリカンは、醤油又は醤油画分に含まれており、これより分離して得ることができる。
【００６２】
本発明の別の様態によれば、本発明は、醤油のグリコペプチド画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含む組成物を食品に適用するステップを含む食品の甘味増強方法を提供する。
【００６３】
本発明の好ましい実現例によれば、醤油のグリコペプチド画分は、分子量５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａのグリコペプチド画分である。
【００６４】
より好ましい実現例によれば、本発明のグリコペプチド画分は、（ａ）醤油を遠心分離して沈殿物を除去するステップ；及び（ｂ）ステップ（ａ）の結果物を限外ろ過して分子量５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａのグリコペプチド画分を分離するステップを通じて得ることができる。
【００６５】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明の甘味増強用組成物はヒト甘味受容体を活性化させる。上記甘味受容体は甘味化合物によって調節されることができる味受容体である。好ましくは、甘味受容体はＧタンパク質が結合された受容体であり、より好ましくはｈＴ１Ｒ２（ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ２）／  ｈＴ１Ｒ３（ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ３）である。
【００６６】
本発明の別の様態によれば、本発明は次を含む甘味料組成物を食品に適用するステップを含む食品の甘味増強方法を提供する：
（ａ）下記一般式１で表されるグリカンを含む組成物又は醤油のグリコペブタイド画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含む組成物；及び
（Ｈｅｘ）５−（ＨｅｘＮａｃ）１
上記一般式において、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮａｃはＮ−アセチルヘキソサミンである。
（ｂ）甘味料。
【００６７】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、下記の通りである：
（ａ）本発明は、醤油から分離したグリカンを含む甘味増強用組成物を提供する。
（ｂ）本発明の組成物は、優れた甘味増強性、特に従来の甘味料とほぼ同等かより優れた甘味効果を有すると共に、栄養学的な側面でカロリーの少ない甘味増強用組成物を提供する。
（ｃ）本発明は、甘味増強用組成物及び甘味料を含む甘味料組成物を提供する。
（ｄ）本発明は、甘味増強用組成物を含む食品及び食品の甘味増強方法を提供する。
（ｅ）本発明の甘味増強剤は天産物由来の物質であって、長期熟成の在来式醤油から分離したグリカン又はグリコペプチドを有効成分として含んでいるため、従来の化学合成甘味増強剤の問題点、例えば副作用の招来及び不快な味の誘発などの問題点を解決する。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００６９】
材料及び方法
長期熟成の在来式醤油から糖結合ペプチド画分ＬＨｅの分離方法
在来式で作って４年熟成させた醤油原液を４℃で９，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿物を除去した後、Ａｍｉｃｏｎ社（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）の限外ろ過装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．８４００）を用いて圧力６０ｐｓｉを加えてペプチド画分を分離した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の限外ろ過膜ＹＭ−１０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔ−ｏｆｆ，１０，０００  Ｄａｌｔｏｎ）で分子量１０，０００以上と以下の物質に分離した後、１０，０００以上の物質は除去し、分子量１０，０００以下のペプチドを含む溶液はさらに限外ろ過膜ＹＣ−０５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔ−ｏｆｆ，５００  Ｄａｌｔｏｎ）で限外ろ過して、分子量５００以下の物質は除去することで、分子量が５００より大きく１０，０００より小さいペプチド画分を分離した。この画分は、凍結乾燥して粉末とした後、さらに２０％のエタノールに溶かしてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０カラム（Φ１．９×１５０ｃｍ）にクロマトグラフィーし、このとき溶出は２０％エタノールを使用して行った（図２）。本実験は、温度によるペプチドの変性を防ぐために低温室（４℃〜１０℃）で行い、凍結乾燥した粉末状の試料はデシケーターに保管して実験に使用した。
【００７０】
構造の分析
構造の分析のために、ＨＰＬＣから分離した各ピークをＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理した後、ペプチド、Ｎ−グリカンに画分し、Ｎ−グリカンをさらに中性グリカン及びＳ−グリカン（シアル酸）に分画した。
【００７１】
ヒトｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体安定発現細胞株
本発明に使用したｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３安定発現細胞株は、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造会社の指示に従って構築した。ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３、キメラＧ−タンパク質α−サブユニット及びｈＧα１６ｇｕｓｔ４４の全コード領域（ｅｎｔｉｒｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を６−ヌクレオチド突然変異を用いてｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターにクローニングし、このコンストラクトをＡＢＩ  １３０又は３１０  ＤＮＡ  ｇｅｎｅｒａｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でシーケンシングした。ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、３７℃で培養したＦｌｐ−Ｉｎ  ２９３細胞にコンストラクトプラスミド及びｐＯＧ４４をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションし、２４時間後に１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択的に処理して２〜３週間さらに培養した。その後、抗生物質耐性細胞だけを集めて甘味料の反応を測定した後、さらに培養して安定細胞株を作製した。
【００７２】
細胞内のカルシウム量の測定（ＦＬＩＰＲシステム利用）
ｈＴ１Ｒ２−ｈＴ１Ｒ３受容体は、ＧＰＣＲファミリーに属し、これは細胞における刺激時のカルシウムセンシングと関係深い。そこで、ＬＨｅがｈＴ１Ｒ２−ｈＴ１Ｒ３受容体に作用したのかを確認するために、ｈＴ１Ｒ２−ｈＴ１Ｒ３が安定的に発現したＨＥＫ２９３細胞を用いて細胞内のカルシウム量を測定した。ｈＴ１Ｒ２−ｈＴ１Ｒ３受容体に作用して甘味を呈する既存のリガンドであるサッカリン、スクロース、アセスルファムカリウムとＬＨｅ（１０μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬ）を同時に処理して、リガンドによって増加されるカルシウム量より、ＬＨｅが添加されることでカルシウム量がもっと増加したのかを確認した。
【００７３】
細胞内のカルシウムの測定は、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎＴＭＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。ｈＴ１Ｒ２−ｈＴ１Ｒ３受容体安定細胞株は、測定２４時間の前に１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに分注し、１６時間が経った後、緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  グルコース、５ｍＭ  ＫＣｌ）で細胞を洗浄した後、カルシウム量の変化を測定するためのマーカーとしてカルシウム４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を処理して２７℃で合計４５分間（３０分間＋１５分間）反応した。ＬＨｅ（１０μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬ）及び各リガンドを濃度別に共に処理して、４８５ｎｍ及び５２７ｎｍで蛍光吸光度を１２０秒間測定した。細胞内のカルシウム量の変化はΔＲＦＵで表示し、Ｓｏｆｔｍａｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【００７４】
官能検査
ＬＨｅを構成する基本味、すなわち、甘味、塩味、苦味、酸味及びうま味に対する官能的特性をより正確に示すために官能検査を行った。５つの基本味のうち甘味（スクロース、２％  ２点、５％  ５点）、塩味（塩化ナトリウム、０．２％  ２．５点、０．３５％  ５点）、苦味（カフェイン、０．０５％  ２点、０．０８％  ５点）、うま味（ＭＳＧ、０．０２％  ２点、０．０４％  ５点）、酸味（クエン酸、０．０５％  ２点、０．０８％  ５点）を標準試料とし、各標準試料の味の強度は、Ｍｅｉｌｇａａｒｄ等（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｐａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ．ｐ３９−１１２（１９８７））の描写分析のための強度階級（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｓｃａｌｅ）のスペクトルによってそれぞれ１５点のうち上記の尺度で規定して提示した。描写分析のためにＬＨｅ溶液（３００μｇ／ｍＬ）を使用し、試料内の基本味の強度を標準試料と比較して１５点尺度内で表示するようにした。
【００７５】
ＬＨｅの甘味増強効果をより正確に調べるために、甘味標準試料として２、５、１０、１５％スクロース溶液を使用し、ＬＨｅ溶液（３００μｇ／ｍＬ）及び５％スクロース標準試料に添加されたＬＨｅ溶液を試料と提示して、甘味の強度を１５点尺度法で測定した。このとき、甘味標準試料２、５、１０及び１６％スクロース溶液はＭｅｉｌｇａａｒｄなどの方法によってそれぞれ２、５、１０、１５点と提示した。
【００７６】
ＬＨｅの甘味増強効果の特異性を確認するために、甘味標準試料をスクロース以外の甘味料を使用した。本実験では、サイクラミン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｙｃｌａｍａｔｅ）を使用し、０．０５６％、０．１４％溶液を製造してそれぞれ２、５点と基準を提示した。試料はＬＨｅ（３００μｇ／ｍＬ）及び０．１４％サイクラミン酸ナトリウムにＬＨｅ（３００μｇ／ｍＬ）を添加した溶液とし、甘味の強度を１５点尺度法で測定した。実験には、基本味に訓練されたパネルを活用し、提示された試料は室温に維持した。基準試料を味わった後、水で口をすすぎ、試料を味わった後、各基本味の強度に対する評価を行った。
【００７７】
結果
長期熟成の在来式醤油から糖結合ペプチド画分ＬＨｅの分離
自然熟成された５年醤油を限外ろ過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって分子量５００＜Ｍ．Ｗ．＜１０，０００とろ過した後、ＦＩＩと名付け、これをゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＰＣ）によってさらに分子量別に分離して、分子量が大きい順に、ＬＨａ、ＬＨｂ、ＬＨｃ、ＬＨｄ及びＬＨｅと名付けた（図２）。
【００７８】
ＨＰＬＣからＬＨｅのクロマトグラムパターンを確認し、これの分子量を推定するためにシトクロムＣ、アプロチニン、ビタミンＢ１２、（Ｇｌｙ）３、グライシンから分子量の範囲を確認した（図３）。ＬＨｅの分子量は１，８５５よりは小さく１８９よりは大きい範囲であることを確認した。
【００７９】
在来式醤油から分離した活性成分の構造分析
ＦＩＩの活性画分から確認されたＬＨｅを、ＨＰＬＣを通じてピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク５、ピーク６、ピーク７、ピーク８に分離し（図３）、各ピークに対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＴＯＦ−ＭＳ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．）分析を行った。分析の結果、ピーク３、ピーク６、ピーク７及びピーク８からグリカン成分の存在を確認した。ピーク３及びピーク６の構造分析のために各ピークをＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理した後、ペプチド、Ｎ−グリカンに分画し、Ｎ−グリカンはさらに中性グリカン及びＳ−グリカン（シアル酸）に分画した。Ｓ−グリカンは確認されず、主に中性Ｎ−グリカンが確認され、各グリカンピークに対してＧｌｙｃｏｓｕｉｔｅ  ｐｒｏｇｒａｍ−ＧＭＦ（２００５年アップデート、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で植物由来のグリカンを調査した結果、分子量１，０５４のピークが大豆（ｓｏｙｂｅａｎ）由来と確認され、この結果はピーク３及びピーク６で同一に確認された。ピーク３（分子量１，０５４）の試料［ピーク３／ＬＨｅ＿１０５４（１０３１）］をＭＳＭＳ分析（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．）した結果、構造式１を有するＨｅｘ５ＨｅｘＮＡＣ１のグリカンを同定し、この場合、ヘキソース（ｈｅｘｏｓｅ）５個はいずれもマンノース、ＨｅｘＮＡＣはＮ−アセチルグルコサミンであることを突き止めた。一方、ピーク３の他の試料に対してＭＳＭＳ分析した結果、Ｐｅｎｔ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡＣ２のグリカン、Ｐｅｎｔ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡＣ２Ｈｅｘ１のグリカン及びＨｅｘ４ＨｅｘＮＡＣ１のグリカンなどの、いくつかのモノサッカライドが結合されたグリカンが同定され、この場合、ヘキソース（ｈｅｘｏｓｅ）は大体マンノースであり、少ない割合でグルコース、ガラクトース、フルクトース及びフコース（ｆｕｃｏｓｅ）が同定され、ＨｅｘＮＡＣはＮ−アセチルグルコサミンであり、ペントース（ｐｅｎｔｏｓｅ）は主にキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）であり、少ない割合でアラビノースなどが同定された。
【００８０】
ピーク６に対して分析した結果、ピーク３（分子量１，０５４）の試料［ピーク  ３／ＬＨｅ＿１０５４（１０３１）］に対するＭＳＭＳの分析結果と同様に、主なグリカンとしてＨｅｘ５ＨｅｘＮＡＣ１のグリカンが同定された。
【００８１】
ペプチド分析
ＨＰＬＣを通じて分離された各ピークに対してペプチド分析を行った。図３に示される主ピーク３番及び６番のペプチド分析のために各ピークにＰＮＧａｓｅ  Ｆを処理した後、糖の結合を除去してそれぞれのＬＣ−ＭＳクロマトグラムを比較分析した。分析の条件は下記の通りである。まず、ＬＣ条件は下記の通りである：ＨＰＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ  １００  ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、カラムはＺｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ  １８（（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、移動相は（Ａ：Ｈ２Ｏ／ＦＡ＝１００／０．２（ｖ／ｖ）、Ｂ：アセトニトリル／ＦＡ＝１００／０．２（ｖ／ｖ））、流速３５μＬ／ｍｉｎ。ＭＳ条件は下記の通りである：ＭＳ機器：Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．）、流速３５μＬ／ｍｉｎ、スキャン範囲：ｍ／ｚ  ２００−２０００、スキャン速度１ｓｅｃ／ｓｃａｎ。
【００８２】
ピーク３及び６のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを比較した結果、共通に差のあるピークが確認され、これの分子量は２９３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］と確認された。また、共通に現われた２９３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］はＭＳ／ＭＳを通じてシーケンシグした結果、ＭＤ＋□（Ｍ：Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｄ：Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）（□は、ペプチドに結合されている糖構造物と予想されるが、糖構造は特定できない。ペプチドシーケンシグの結果、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  １個＋Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  １個と分析されたが、ペプチド鎖がより長いものと予想される）と思われ、ＰＮＧａｓｅ−Ｆで糖を除去した後に出た結果であるため、実際にはＭＮ（Ｍ：Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｎ：Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）のアミノ酸配列であるものと判断される（Ａｓｎに糖が離れＨ＋が結合して１Ｄａが増加したＡｓｐと認識される）。分析されたペプチドの分子量とシーケンシグされた結果とは一致しなかったが（２９３Ｄａ≠２６４Ｄａ）、この物質は、ＭＮアミノ酸に未知の化合物（あるいは先に分析された糖構造物質）が結合したものと解釈されることができる。
【００８３】
Ｍｅｔ−Ａｓｎペプチドの官能検査
糖が結合されていない状態のＭｅｔ−Ａｓｎペプチド自体の甘味効果に対する役割を調べるために官能検査を行った。その結果、Ｍｅｔ−Ａｓｎペプチド自体の甘味は、０．１３±０．０４の甘味強度を示し、これは標準試料である５％スクロースの５．００±０．００に比べて甘味をほとんど呈さないことが分かった（図５）。５％スクロース標準試料に添加されたＭｅｔ−Ａｓｎペプチド溶液を試料と提示したとき、５．００±０．２３の甘味の強度を示すものと確認され、これは５％スクロース溶液と有意な差を示さないことから、Ｍｅｔ−Ａｓｎペプチドは甘味効果を奏しないものと判断される。したがって、Ｍｅｔ−Ａｓｎペプチドを含む分画物の甘味効果は、糖構造の結合によるものと言える。
【００８４】
ＦＩＩ及び多様な甘味料に対するヒト甘味受容体発現細胞内のカルシウム量の変化
長期熟成の在来式醤油から分離した糖結合ペプチド画分ＦＩＩ  １００μｇ／ｍＬ（最終濃度）にアセスルファムカリウム（３ｍＭ）、アスパルテーム（３ｍＭ）、サイクラミン酸（１０ｍＭ）、サッカリン（１ｍＭ）及びスクロース（２００ｍＭ）を添加したとき、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３が安定的に発現する細胞株におけるカルシウム濃度の変化を、細胞分析法を用いて測定した。
【００８５】
４種のリガンドにＦＩＩ  １００μｇ／ｍＬを添加した際にカルシウム放出が増加することが確認されたが、スクロースの場合、リガンドだけ存在するときよりＦＩＩを加える場合、約２．３倍、アセスルファムカリウムとサッカリンではそれぞれ１．５倍、１．２倍程度、有意的にカルシウムの放出が増加することが確認された（図６）。
【００８６】
ＦＩＩの５種類のサブ画分及び多様な甘味料に対するヒト甘味受容体発現細胞内のカルシウム量の変化
結果の確認のために、ＦＩＩの各サブ画分であるＬＨａ、ＬＨｂ、ＬＨｃ、ＬＨｄ及びＬＨｅ（各３０μｇ／ｍＬ）の効能を、同一実験系を用いて確認した（図７）。サイクラミン酸を除くスクロース、アセスルファムカリウム、サッカリンでＬＨｄとＬＨｅはリガンド選択的にカルシウム放出が増加することが確認された。また、ＬＨａはスクロースでのみ活性を示した。本発明で活性を示したＬＨｄは、ＬＨｅと同じく活性を示すものと見られるが、ＬＨｄは試料自体に蛍光を帯びる性質がＬＨｅより強いので、実験ではＬＨｅにより焦点を置いて実験を進行した。
【００８７】
スクロース、アセスルファムカリウム、サッカリン及びサイクラミン酸の濃度依存的活性の評価
スクロース、アセスルファムカリウム、サッカリン及びサイクラミン酸の濃度依存的活性を評価し、それぞれ１０、３０μｇ／ｍＬのＬＨｅを添加した際に生じるカルシウム反応を確認した。スクロースとアセスルファムカリウムの場合、０．０３、０．１、０．３、１、３ｍＭ（最終濃度）の濃度でＬＨｅによって濃度依存的なカルシウム増加傾向を示し、サッカリンの場合には０．００１、０．００３、０．０１、０．３及び１ｍＭの濃度に対する濃度依存的な傾向は見られるが、ＬＨｅ  １０μｇ／ｍＬでは効果が現われなかった。前の結果と同様に、サイクラミン酸ではリガンドによる濃度依存的な反応は確認されたが、ＬＨｅの添加による有意的な差は確認されなかった（図８）。
【００８８】
ＦＩＩ、ＬＨｅ及びラクチゾールに対するヒト甘味受容体発現細胞内のカルシウム量の変化
ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３阻害剤であることが知られているラクチゾール（ｌａｃｔｉｓｏｌｅ）を使用して、ＦＩＩ画分とＬＨｅ画分が直接的にｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３と相互作用して作用するのかを確認するために、ＦＩＩとＬＨｅ（それぞれ３、１０又は１００μｇ／ｍＬ）にラクチゾール１ｍＭを処理した際のカルシウム濃度の変化を、細胞分析法を用いて測定した。アッセイバッファーのみ添加したときより、ＦＩＩとＬＨｅを添加したときに、濃度別にカルシウム放出が増加することが確認され、ＦＩＩ  １０、３０又は１００μｇ／ｍＬにラクチゾールを処理した場合、それぞれ７９％、５７％、５０％とＦＩＩの活性が依然に存在することが有意的に確認され、ＬＨｅ  １０、３０又は１００μｇ／ｍＬにラクチゾールを処理したときは、１０、３０μｇ／ｍＬ濃度のＬＨｅはラクチゾールによって減少せず、１００μｇ／ｍＬでのみ５５％とＬＨｅの活性が一部減少したことが確認された（図９）。
【００８９】
ＦＩＩと高濃度のＬＨｅの甘味増強作用が甘味受容体阻害剤であるラクチゾールによって一部減少することは、これらの機能に遊離糖のような甘味物質が混じっている可能性もあることを意味する。ところが、ＦＩＩにはラクチゾールによって影響されない活性が５０〜７９％存在し、低濃度のＬＨｅではラクチゾールに全然影響されないことから、ＦＩＩには甘味受容体に反応する小分子を含むサブ画分が含まれているためと判断される。
【００９０】
ＦＩＩの官能検査
細胞分析法で行った甘味増強の効果と共に、ＦＩＩ及びＬＨｅを構成する基本味、すなわち甘味、塩味、苦味、酸味及びうま味に対する官能的特性をより正確に示すために、官能検査を行った。描写分析のためにＦＩＩ及びＬＨｅはそれぞれ３ｍｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ溶液を使用し、試料内の基本味の強度を標準試料と比較して１５点尺度内で表示するようにした。
【００９１】
ＦＩＩのプロフィールテストの結果、３ｍｇ／ｍＬ  ＦＩＩの基本味は、うま味（２．１３±０．３１）が最も高く、次に甘味（１．０８±０．２０）、塩味（０．７８±０．２０）であった。酸味と苦味はそれぞれ（０．１７±０．０６）、（０．１０±０．０５）であった（ｎ＝１８）（図１０ａ）。これを１００％に換算したときは、うま味、甘味、塩味、酸味、苦味の順にそれぞれ５０、２５．４９、１８．１４、３．９２、２．４５％と構成されていることを確認した（ｎ＝１８）（図１０ａ）。３ｍｇ／ｍＬ  ＦＩＩはうま味、甘味、塩味が主な味であることが確認された。
【００９２】
ＬＨｅの官能検査
ＬＨｅの基本味は、うま味（２．９２±０．５０）が最も高く、次に甘味が（１．１５±０．１５）であった。塩味（０．４６±０．２１）と苦味（０．３８±０．１９）は大きな差はなく、酸味は（０．１５±０．０９）とほとんど呈さなかった、本実験を通じて、ＬＨｅがうま味と甘味の特性を大きく有することを確認した（図１０ｂ）。
【００９３】
ＬＨｅの甘味増強効果をより正確に調べるために、甘味標準試料として２、５、１０、１５％スクロース溶液を使用し、３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ溶液と５％スクロース標準試料に添加された３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ溶液を試料として提示し、甘味の強度を１５点尺度法で測定した。このとき、甘味標準試料２、５、１０、１６％スクロース溶液は、Ｍｅｉｌｇａａｒｄなどの方法（１９８７）によってそれぞれ２、５、１０、１５点と提示した。
【００９４】
３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ液は、基本味の描写分析結果と同様に、１．０５±０．２３の甘味強度を示し、これは２％スクロース標準試料の甘味強度（２．００±０．００）に比べて低い強度の甘味である。一方、５％スクロース標準試料に添加された３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ溶液の甘味強度は、６．９１±０．６２であり、５％スクロース標準試料の甘味強度（５．００±０．００）に比べて有意的に増加したことを確認した（図１１）。スクロース標準曲線と比較したとき、３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅは、０．９２％スクロースの甘味の強度と同一であり、５％スクロース標準試料に添加された３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ溶液は、７．１４％スクロースの甘味の強度と同一であった。これは５％スクロース標準試料に添加された３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅは、３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅと５％スクロースが有する甘味の単純な添加ではない増強効果を奏するものと見られる。これより、ＬＨｅが食品に添加されて甘味を増加させる効果を奏することができるものと推定される（図１１）。
【００９５】
ＬＨｅの甘味増強効果の確認
ＬＨｅの甘味増強効果の特異性を確認するために、甘味標準試料としてスクロース以外の甘味料を使用した。本実験では、サイクラミン酸ナトリウムを使用し、０．０５６％、０．１４％溶液を製造してそれぞれ２、５点と基準を提示した。試料は、３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅと０．１４％サイクラミン酸ナトリウムに３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅを添加した溶液とし、甘味の強度を１５点尺度法で測定した。標準試料である０．０５６％サイクラミン酸溶液と０．１４％サイクラミン酸溶液は、２．００±０．００と５．００±０．００の甘味強度で提示し、これと比較したとき、３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ溶液は０．９±０．３３の甘味強度を示した。また、０．１４％サイクラミン酸標準試料に添加された３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅ  溶液の甘味強度は、５．００±０．５４を示した。０．１４％サイクラミン酸標準試料と同じ甘味の強度を有することから、３００μｇ／ｍＬ  ＬＨｅは、サイクラミン酸に添加されたときは甘味の増加効果を奏しないことと確認された。これを通じて、ＬＨｅは、スクロースでのみ特異的に甘味増加の効果を有するものと思われる（図１２）。食品産業で甘味調節食品としての活用度が高いものと期待される。
【００９６】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は、単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるのではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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