(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管上皮細胞におけるウィルス性の炎症性免疫作用を抑制するイムノバイオティクスをスクリーニングする方法であって、
（１）腸管上皮細胞を、イムノバイオティクスで刺激する工程、
（２）（１）で刺激した細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激する工程、
（３）（２）で刺激した細胞における１または２以上の炎症性免疫関連サイトカインの発現量を計測する工程、ここで該サイトカインが少なくともＩＦＮ−βまたはＭＣＰ−１を含む、
を含み、１または２以上の前記炎症性免疫関連サイトカインの発現量が、前記（１）の工程を行わなかったコントロールと比較して抗炎症的に変化した場合、前記イムノバイオティクスがウィルス性の炎症性免疫作用抑制性であるとする、前記方法。
【請求項２】
（１）と（２）との間に、
（１’）（１）で刺激した細胞を洗浄する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炎症性免疫関連サイトカインの発現量が、コントロールと比較して３０％以上抗炎症的に変化した場合、イムノバイオティクスを炎症性免疫作用抑制性であるとする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腸管上皮細胞が、ウシ、ブタまたはヒト由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
発現量を計測する炎症性免疫関連サイトカインが、ＩＦＮ−βおよびＭＣＰ−１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Lactobacillus jensenii  ＴＬ２９３７菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２）を含む炎症抑制剤組成物。
【請求項７】
腸内における炎症性疾患を予防および／または処置するための、請求項６に記載の炎症抑制剤組成物。
【請求項８】
請求項６または７に記載の炎症抑制剤組成物を含む、飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内において炎症性免疫作用を抑制することができるイムノバイオティクスのスクリーニング方法、該方法によってスクリーニングされた菌株、前記抑制作用を有する新規菌株および前記菌株を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日の医学の発展にとって、抗生物質（アンチバイオティクス）の発見と使用は重要であった。しかし近年、抗生物質の副作用や、突然変異による多剤耐性菌の出現などの問題が話題となっている。そこで「アンチバイオティクス」に対して「プロバイオティクス」という考え方が昨今世間に広く認知されてきた。プロバイオティクスとは、「消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用をもたらしうる有用な微生物と、それらの増殖促進物質」のことであり、これらプロバイオティクスを用いて消化管内（口腔内や腸内）のフローラ（細菌叢）に作用し、フローラの健常化をはかりながら、疾病の予防、改善を行う、という考え方が生まれてきている。【０００３】
哺乳類の消化管の中でも、体外の物質を体内に取り込む腸管には、体内で最大の免疫系が存在する。したがって腸管免疫を調節することは、哺乳類の健康にとって非常に重要である。近年、「プロバイオティクス」の中でも、腸管免疫系調節機能を有するものとして「イムノバイオティクス」という概念が生まれ、その利用性に注目が集まっている。【０００４】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、多くの免疫系細胞に存在し、細菌、真菌、寄生生物およびウィルスなどの病原体の特異な分子パターンを認識することで知られている。ＴＬＲファミリーは、ＴＬＲ１からＴＬＲ１１と呼ばれる１１のタンパク質からなり、それぞれ認識分子、すなわち細菌性モデュリンが異なると考えられている。イムノバイオティクスは、腸管免疫系に発現するＴＬＲに作用することにより、免疫を調節すると考えられている。【０００５】
最近になって、これらのイムノバイオティクスが腸管免疫系にどのような影響を与えるのかについての研究が始められ、イムノバイオティクスとして好適な菌株をスクリーニングする試みがなされている。例えば特許文献１には、特定のLactobacillus gasseri菌由来のオリゴヌクレオチドがＴＬＲ９を介して認識され、リンパ球幼若化において活性を示すことが記載されている。非特許文献１には、ブタＴＬＲ２を発現する形質転換細胞を乳酸菌で刺激し、該細胞中のサイトカイン発現を調べることでイムノバイオティクスとしての乳酸菌を評価する方法が記載されている。非特許文献２には、ヒトＣａｃｏ２細胞を大腸菌Ｋ８８株と共培養した場合、さらに特定の乳酸菌と共培養すると炎症性応答が抑制されることが記載されている。非特許文献３には、ブタ腸管上皮細胞において、毒素原性大腸菌により誘導される炎症を抑制するイムノバイオティクスについて、ＩＬ−６やＩＬ−８の産生抑制から、抗炎症性を発揮するイムノバイオティクスを選抜したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２３２７９０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tohno et al., Animal Science Journal (2007) 78, 195-205
【非特許文献２】Roselli et al., British Journal of Nutrition (2006), 95, 1177-1184
【非特許文献３】島津ら  「イムノバイオティクスのブタ腸管上皮細胞における抗炎症作用」  日本畜産学会第１１０回大会講演要旨  Ｘ２７−０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ウシの腸管上皮細胞を用いてイムノバイオティクスを研究する中で、評価にＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１を用いると、炎症性免疫抑制性イムノバイオティクスを有効に評価できることを新たに見出した。さらに鋭意研究を続ける中で、腸管上皮細胞を用いて、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１から選択される少なくとも２種を評価に用いる評価方法で優良な炎症性免疫抑制性イムノバイオティクスを単離することに成功し、かかる菌株を用いてその機能メカニズムを見出した。さらに鋭意研究を重ねた結果、かかる菌株を経口で摂取する組成物に含有せしめることで、個体の免疫能力を改善することができることを実証し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明は、腸管上皮細胞と２日間以上共培養することにより、炎症誘導因子に曝露された腸管上皮細胞におけるＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１からなる群から選択される２種以上の炎症性免疫関連サイトカインの発現量を、共培養しない腸管上皮細胞における前記炎症性免疫関連サイトカインの発現量と比較して抑制するという特徴を有するLactobacillus属菌に関する。
本発明はまた、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の３種の発現量を抑制する、上記のLactobacillus属菌に関する。
本発明はさらに、炎症性免疫関連サイトカインの発現量が３０％以上抗炎症的に変化する、上記のLactobacillus属菌に関する。
本発明はさらにまた、Lactobacillus casei、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus jenseniiまたはLactobacillus gasseriである、上記のLactobacillus属菌に関する。【００１０】
本発明はさらにまた、Lactobacillus casei  ＯＬＬ２７６８菌株  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４４に関する。
また、本発明は、Lactobacillus jensenii  ＴＬ２９３７菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２）に関する。
さらに、本発明は、腸管上皮細胞における炎症性免疫作用を抑制する抑制剤をスクリーニングする方法であって、
（１）トール様受容体（ＴＬＲ）２および４を発現する細胞を、候補抑制剤で刺激する工程、
（２）（１）で刺激した細胞を、炎症誘導因子で刺激する工程、
（３）（２）で刺激した細胞における１または２以上の炎症性免疫関連サイトカインの発現量を計測する工程、
を含み、１または２以上の前記炎症性免疫関連サイトカインの発現量が、前記（１）の工程を行わなかったコントロールと比較して抗炎症的に変化した場合、前記候補抑制剤が炎症性免疫作用抑制性であるとする、前記方法に関する。【００１１】
さらにまた、本発明は、（１）と（２）との間に、
（１’）（１）で刺激した細胞を洗浄する工程
をさらに含む、上記の方法に関する。
本発明はまた、炎症性免疫関連サイトカインの発現量が、コントロールと比較して３０％以上抗炎症的に変化した場合、候補抑制剤を炎症性免疫作用抑制性であるとする、上記の方法に関する。
本発明はさらに、ＴＬＲ２および４が、ウシ、ブタまたはヒト由来である、上記の方法に関する。
本発明はさらにまた、炎症誘導因子が、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）である、上記の方法に関する。【００１２】
本発明はさらにまた、ＴＬＲ２および４を発現する細胞が、腸管上皮細胞である、上記の方法に関する。
また、本発明は、発現量を計測する炎症性免疫関連サイトカインが、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１である、上記の方法に関する。
さらに、本発明は、炎症性免疫作用抑制剤が、イムノバイオティクスまたはその派生物（イムノジェニクス）である、上記の方法に関する。【００１３】
さらにまた、本発明は、上記のスクリーニング方法によって単離されたイムノバイオティクスに関する。
本発明はまた、Lactobacillus属菌またはBifidobacterium属菌である、上記のイムノバイオティクスに関する。
本発明はさらに、上記の菌またはイムノバイオティクスを少なくとも１つ含む炎症抑制剤組成物に関する。【００１４】
本発明はさらにまた、腸内における炎症性疾患を予防および／または処置するための、上記の炎症抑制剤組成物に関する。
また、本発明は、上記の炎症抑制剤組成物を含む、食品組成物に関する。
さらに、本発明は、上記の炎症抑制剤組成物を含む、飼料組成物に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法により、腸内で誘発される炎症性免疫作用を効果的に抑制することができるイムノバイオティクスを効率的にスクリーニングすることができる。さらに、本発明のスクリーニング方法により選抜、単離されたイムノバイオティクスは、一度免疫細胞に認識されることで免疫細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルに影響を与え、該イムノバイオティクスの非存在下においても炎症性免疫作用を抑制可能なイムノバイオティクスである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、各供試乳酸菌で刺激したＢＩＥ細胞における、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の発現量を示した図である。ＥＴＥＣコントロールに対する２群間の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で解析した。各サイトカインの中でも特に発現量の高いＩＬ−６およびＩＬ−８の発現を抑制し、さらにＭＣＰ−１の発現をも抑制する菌株として、ＯＬＬ２７６８が選抜された。
【図２】図２はＯＬＬ２７６８株で刺激した後の、ＢＩＥ細胞における各サイトカインｍＲＮＡの発現量を表したグラフである。横軸は刺激開始後の時間を表し、縦軸は無刺激の発現を１としたときの相対強度を表す。
【図３】図３は、ＯＬＬ２７６８株刺激の４８時間後、さらにＥＴＥＣ刺激を与えたときの、ＢＩＥ細胞における各サイトカインｍＲＮＡの発現量の変化を表したグラフである。横軸はＥＴＥＣ刺激後の時間経過を表し、縦軸は無刺激の発現を１としたときの相対強度を表す。
【００１７】
【図４】図４ａ）は、ＢＩＥ細胞播種の３日後にＥＴＥＣで刺激し、刺激後１２時間における１２種のサイトカインのｍＲＮＡ発現量を計測したグラフである。縦軸は無刺激の発現を１としたときの相対強度を表す。コントロールに対する２群間の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で解析した。この結果ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１が強く誘導される候補サイトカインとして選択された。図４ｂ）は、ＢＩＥ細胞播種の５日後にＥＴＥＣで刺激し、刺激後１２時間における上記４種の候補サイトカインのｍＲＮＡ発現量を計測したグラフである。コントロールに対する２群間の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で解析した。この結果ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１が、実施例において計測すべきサイトカインとして選抜された。
【図５】図５は、ブタ腸管上皮細胞をイムノバイオティクス候補菌株による０、１２、２４および４８時間前刺激し、その後ｐｏｌｙＩ：Ｃで刺激した１２時間後のＩＦＮ−βの発現量を表したグラフである。
【図６】図６は、ブタ腸管上皮細胞をイムノバイオティクス候補菌株による０、１２、２４および４８時間前刺激し、その後ｐｏｌｙＩ：Ｃで刺激した１２時間後のＭＣＰ−１の発現量を表したグラフである。
【図７】図７は、各飼料区における、糞便中の病原性大腸菌の検出結果を表した図である。上図はＫ９９を、下図はＫ８８を表しており、矢印に示された位置のバンドが各抗原の検出を意味する。どちらも、抗菌剤の添加によっても１３〜１５週齢における毒素原性大腸菌の感染を予防することはできないことが示されている。
【図８】図８は、各飼料区における、血漿中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を表したグラフである。血漿中のＣＲＰ濃度は、体内における炎症性反応の指標として知られており、濃度が高いことは、体内で炎症反応が起こっていることを示唆する。
【図９】図９は、各飼料区における、リンパ球数に対する顆粒球数の比を表したグラフである。顆粒球の比率が高いほど、自然免疫が賦活されていることを意味する。
【図１０】図１０は、各飼料区における、糞便中の病原性大腸菌ＥＴＥＣ９８７の検出結果を表した図である。３区（抗菌剤なし、ＴＬ２９３７株投与）では、１３〜１５週齢においてもＥＴＥＣ９８７が検出されなかった。
【図１１】図１１は、各飼料区における、１３〜１５週齢時のＣＲＰ濃度を表下グラフである。３区において、他の区に比べて顕著にＣＲＰ濃度が低かった。
【図１２】図１２は、各飼料区における、補体第２経路活性を表したグラフである。ＣＲＰ濃度と同様、３区において有意に高い補体第２経路活性が認められた。
【図１３】図１３は、２２週齢時の対象の各飼料区における体重を表したグラフである。
【図１４】図１４は出荷時の枝肉重量を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、腸管上皮細胞における炎症性免疫作用を抑制する抑制剤をスクリーニングする方法であって、
（１）トール様受容体（ＴＬＲ）２を発現する細胞を、候補抑制剤で刺激する工程、
（２）（１）で刺激した細胞を、炎症誘導因子で刺激する工程、
（３）（２）で刺激した細胞における１または２以上の炎症性免疫関連サイトカインの発現量を計測する工程
を含み、１または２以上の前記炎症性免疫関連サイトカインの発現量が、前記（１）の工程を行わなかったコントロールと比較して抗炎症的に変化した場合、前記抑制剤が炎症性免疫作用抑制性であるとする、前記方法に関する。
【００１９】
本発明において、「炎症性免疫作用抑制性」は、炎症性免疫作用を抑制する性質を意味し、「炎症性免疫作用抑制剤」は炎症性免疫作用抑制性を有する剤を意味する。炎症性免疫作用抑制剤は、これに限定するものではないが例えば、イムノバイオティクスなどの微生物、ポリペプチドなどの化合物を含む。本発明において「イムノバイオティクス」とは、プロバイオティクスのうち、免疫調節機能を有するものを意味する。
【００２０】
本発明において「抗炎症的に変化した」とは、炎症誘導因子の刺激によって発現する炎症性免疫関連サイトカインの発現量が、炎症反応を抑制する方向に統計的誤差の範囲を超えて変化することを意味する。したがって、これに限定するものではないが、例えば、炎症反応を促進するサイトカインであれば、その発現量を低減させ、炎症反応を抑制するサイトカインであれば、その発現量を増大させたり、一過性の発現増強の後の発現低下を抑制する方向に変化する。統計的な解析は、当業者に知られたあらゆる統計解析手法を用いてよく、これに限定するものではないが、例えばＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定などが挙げられる。スクリーニングにおいては、１または２以上の炎症性免疫関連サイトカインにおいて、発現量が抗炎症的に変化している場合、候補剤を炎症性免疫作用抑制剤であると判定する。２以上の炎症性免疫関連サイトカインにおいて発現量が抗炎症的に変化していることが好ましく、３以上がより好ましい。計測した全ての炎症性免疫関連サイトカインの発現量が抗炎症的に変化していることが最も好ましい。
本発明の一態様において、発現量が３０％以上抗炎症的に変化した場合に、候補抑制剤を炎症性免疫作用抑制性であると判定する。
【００２１】
本発明において炎症性免疫関連サイトカインとは、炎症反応に関連する全てのサイトカインを包含する。炎症性免疫関連サイトカインは、炎症反応を促進する性質を有するサイトカインと炎症反応を抑制する性質を有するサイトカインとに大別することができる。炎症反応を促進する性質を有するサイトカインとしては、これに限定するものではないが、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＬＩＦなどの炎症性サイトカインなどが挙げられる。炎症反応を抑制する性質を有するサイトカインとしては、これに限定するものではないが、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなどの抗炎症性サイトカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなどの抗ウィルス性サイトカインなどが挙げられる。
【００２２】
トール様受容体（Toll like receptor：ＴＬＲ）は、パターン認識受容体としても知られ、その活性化により病原体に対する免疫応答シグナルカスケードが誘導されることが知られている。またＴＬＲファミリーは、脊椎動物において高度に保存されていることが知られている。ＴＬＲファミリーのうち、ＴＬＲ２は、リポタンパク質、グラム陽性菌のペプチドグリカン、リポテイコ酸、真菌の多糖、ウィルスの糖タンパク質などをリガンドとして認識し、ＴＬＲ４はリポ多糖、ウィルスの糖タンパク質などをリガンドとして認識するＴＬＲであることが知られている。このうち、毒素原性大腸菌は、ＴＬＲ４を介して炎症を誘導し、ウィルスはＴＬＲ３を介して炎症を誘導するが、イムノバイオティクスは、ＴＬＲ２を介して炎症応答を調節するものと考えられる。
【００２３】
ＴＬＲ２を発現する細胞は、どんな細胞でもよく、限定されずに、単離細胞、培養細胞、形質転換細胞を含む。ＴＬＲ２は、自然に発現していてもよいし、トランスフェクションによって強制発現させてもよい。上述のように、ＴＬＲファミリーは脊椎動物で高度に保存されているため、いかなる動物のものを用いてもよいが、好ましくは腸内細菌叢を有する動物、より好ましくは哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定するものではないが、ラット、マウスなどの齧歯類、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、ヤギ、ヒトなどを含む。
ＴＬＲ２を発現する細胞は、好ましくはさらに１種または２種以上の別のＴＬＲを発現している。別のＴＬＲとしては、これに限定するものではないが、例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９などが挙げられる。ウィルス性炎症に関与するＴＬＲとしては、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９が挙げられ、好ましくは、ＴＬＲ３である。細菌性炎症に関与するＴＬＲとしては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９などが挙げられ、好ましくはＴＬＲ４である。
本発明において「腸管上皮細胞」とは、脊椎動物の腸管管腔面に存在する細胞であり、腸管における栄養吸収や生体防御に関わる免疫応答に関与している細胞を指す。腸管上皮細胞にはＴＬＲをはじめとするパターン認識受容体が発現していることが知られており、したがって腸管における免疫応答には、ＴＬＲのシグナリング経路を介するものが含まれる。上述のとおりＴＬＲファミリーは脊椎動物で高度に保存されているため、脊椎動物としてはいかなる脊椎動物でもよいが、好ましくは腸内細菌叢を有する動物、より好ましくは哺乳動物である。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法は、まずＴＬＲ２を発現する細胞を候補抑制剤で刺激する。その後、炎症誘導因子で刺激する。刺激の方法は、当業者に知られたいかなる方法を用いてもよい。刺激の方法としては、これに限定するものではないが、例えば、細胞と候補抑制剤または炎症誘導因子とを共培養することなどが挙げられる。炎症誘導因子で刺激した後、前記細胞における炎症性免疫関連サイトカインの発現量を計測する。炎症性免疫関連サイトカインの発現量の計測方法は特に限定されず、当業者に知られたあらゆる方法を用いることができる。例えばｍＲＮＡの発現量を計測してもよいし、分泌されたタンパク量を計測してもよい。計測方法は、計測する炎症性免疫関連サイトカイン発現量の指標に依存して変化してもよい。例としては、ＲＮＡ量を計測する場合には定量的リアルタイムＰＣＲ法などが挙げられ、分泌タンパクを計測する場合には吸光度法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
炎症誘導因子による刺激は、候補抑制剤が炎症誘導因子そのものに作用する影響を排除するという観点から、好ましくは候補抑制剤の非存在下で行われる。したがって、好ましくは（１）の工程と（２）の工程の間に、（１）で刺激した細胞を洗浄する工程がさらに含まれる。これにより、候補抑制剤が炎症誘導因子そのものに与える影響を回避することが可能となり、ＴＬＲ発現細胞に直接的に作用する炎症性免疫作用抑制剤をより正確にスクリーニングすることが可能となる。
【００２６】
上述したように、本発明の細胞はいかなる細胞を用いてもよいが、腸内において効果を発揮する炎症性免疫作用抑制剤をスクリーニングするという観点から、好ましくはウシ、ブタまたはヒト由来の腸管上皮細胞を用いる。
炎症誘導因子としては、炎症性免疫を誘導することが可能なものであれば、当業者に知られたいかなるものを用いてもよい。これに限定するものではないが、例えば、リポ多糖、ウィルス性ｄｓＲＮＡ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（合成ｄｓＲＮＡ）などの化合物、大腸菌などの菌体などが挙げられる。腸内において炎症性免疫を誘導する観点から、好ましくは毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）である。
【００２７】
上述のように、ＴＬＲ２を発現する細胞は、形質転換細胞であっても単離細胞であってもよいが、細胞内のタンパク質発現プロファイルに鑑みると、天然にＴＬＲを発現する細胞を用いるのが好ましい。さらに、本発明の目的の一つとして、優良なイムノバイオティクスの発見にあることに鑑みれば、腸管上皮細胞、Ｃａｃｏ２細胞などの腸管の細胞を用いるのがより好ましく、最も好ましくは正常な腸管上皮細胞を用いる。
【００２８】
発現量を計測する炎症性免疫関連サイトカインは、炎症反応に関連するサイトカインであれば何を計測してもよいし、１または２以上の好ましい炎症性免疫関連サイトカインを選抜して計測してもよい。本発明に用い得る炎症反応に関連するサイトカインとしては、これに限定するものではないが、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＬＩＦなどが挙げられる。本発明者らの鋭意研究の結果、毒素原性大腸菌により腸管上皮細胞において試験した１２種のサイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ）のうち最も強く誘導される３種のサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１）が選抜された。したがって、計測する炎症性免疫関連サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の３つが好ましい。
【００２９】
上記選抜は、例えば以下のようにして行うことができるが、この方法に限定されるものではない。
ＢＩＥ細胞を以下に記載の実施例１と同様に播種して培養し、３日後にＥＴＥＣで刺激した。ＥＴＥＣ刺激の１２時間後に１２種のサイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ）について、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ｍＲＮＡの発現量を定量した。その結果刺激をしなかったコントロールと比較して、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の発現量が顕著に増大していたので、これを候補サイトカインとした。次に、ＢＩＥ細胞の播種３日後からさらに前刺激予定期間として２日間培養を続け、その後ＥＴＥＣで刺激した。ＥＴＥＣ刺激の１２時間後に、前記候補サイトカインについて、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ｍＲＮＡの発現量を定量した。その結果刺激をしなかったコントロールと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の発現量が顕著に増大していたので、この３種を計測する炎症性免疫関連サイトカインとして選抜した（図４参照）。
【００３０】
炎症性免疫作用抑制剤としては、腸管上皮細胞における炎症性免疫作用を抑制するものであるから、経口摂取可能であるものが好ましい。さらに好ましくは、炎症性免疫作用抑制剤はイムノバイオティクスまたはその派生物（イムノジェニクス）である。
本発明において「イムノジェニクス」とは、イムノバイオティクスに由来する、免疫調節因子のことをいう。イムノジェニクスに含まれるものとしては、これに限定するものではないが、例えば、菌体表層の成分として細胞壁を構成するペプチドグリカン、テイコ酸、リポテイコ酸および菌体外多糖（ＥＰＳ）、また、菌体内の成分では、染色体ＤＮＡ等の核酸成分、その制限酵素による加水分解断片であるオリゴＤＮＡあるいは各種酵素タンパク質などを含む細胞質成分などが挙げられる。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法によって、優良な炎症性免疫作用抑制剤をスクリーニング可能となる。したがって本発明には、本発明の方法によってスクリーニングされた炎症性免疫作用抑制剤、好ましくは炎症性免疫作用抑制性イムノバイオティクスが包含される。かかるイムノバイオティクスとしては、広義にはプロバイオティクスに属するという観点から、好ましくはLactobacillus属菌またはBifidobacterium属菌である。
【００３２】
本発明者らは、本発明のスクリーニング方法によって、多くのLactobacillus属菌から、本発明に包含される炎症性免疫作用抑制性を有するイムノバイオティクスを単離し、中でも好ましいイムノバイオティクスとして、ＯＬＬ２７６８株およびＴＬ２９３７株を単離した。
【００３３】
本発明に包含されるLactobacillus属菌は、腸管上皮細胞と２日間以上共培養することにより、炎症誘導因子に曝露された腸管上皮細胞における１または２以上の炎症性免疫関連サイトカインの発現量を、共培養しない腸管上皮細胞における前記炎症性免疫関連サイトカインの発現量と比較して抑制するという特徴を有する菌である。Lactobacillus属菌は、乳酸菌の代表的な属の一つで、グラム陽性の桿菌であり、種によって乳酸のみを産生（ホモ型乳酸発酵）するものと、乳酸以外のものを産生（ヘテロ型乳酸発酵）するものがある。
【００３４】
抑制する炎症性免疫関連サイトカインは、炎症反応の原因となるサイトカインであれば何でもよいが、好ましくは炎症誘導因子の刺激により、顕著に発現量が増大する炎症性免疫関連サイトカインである。ＢＩＥ細胞において、毒素原性大腸菌の刺激により顕著に発現量が増大するという観点から、好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−８またはＭＣＰ−１のいずれかであり、より好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１から選択される２種を抑制し、最も好ましくは、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の３種とも抑制する。
本発明の一態様において、本発明のLactobacillus属菌は、上記炎症性免疫関連サイトカインの発現量を３０％以上抑制する。
【００３５】
本発明に包含されるLactobacillus属菌としては、これに限定されるものではないが、例えばLactobacillus delbrueckii subsp. burgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus casei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus(以降、L. amylovorusともいう。)、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri(以降、L. gasseriともいう。)、Lactobacillus oris、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarumなどが挙げられ、好ましくはLactobacillus casei、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus gasseriなどが挙げられる。
【００３６】
本発明のＯＬＬ２７６８株は、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国  〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２０１０年３月１７日付、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４４として寄託されており、以下の特徴を有するLactobacillus casei菌である。
（ａ）形態的性質
桿菌
（ｂ）培養的性質
培地名：Lactobacilli MRS Broth (Difco, Ref. No. 288130)
ｐＨ：無調整
培養温度：３７℃
培養時間：１８時間
（１）形状：円形
（２）直径：１〜２ｍｍ
（３）色調：白色
（４）隆起状態：半球状
（５）周縁：全縁
（６）表面形状：スムーズ
（７）透明度：不透明
（８）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）乳酸発酵形式：ホモ乳酸発酵
（３）酸素要求性：通性嫌気
（４）発育温度：１５℃＋、４５℃−
【００３７】
本発明のＴＬ２９３７株は、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国  〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２０１０年５月１４日付、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２として寄託されており、以下の特徴を有するLactobacillus jensenii菌である。
（ａ）形態的性質
桿菌
（ｂ）培養的性質
培地名：Lactobacilli MRS Broth (Difco, Ref. No. 288130)
ｐＨ：無調整
培養温度：３７℃
培養時間：１８時間
（１）形状：円形
（２）直径：１〜２ｍｍ
（３）色調：白色
（４）隆起状態：半レンズ状
（５）周縁：全縁
（６）表面形状：スムーズ
（７）透明度：不透明
（８）粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）乳酸発酵形式：ホモ乳酸発酵、乳酸旋光性：Ｄ型
（３）酸素要求性：通性嫌気
（４）発育温度：１５℃−、４５℃＋
【００３８】
本発明の菌またはイムノバイオティクスは、腸管上皮細胞の炎症性免疫作用を抑制することが可能であり、したがって前記菌またはイムノバイオティクスを少なくとも１つ含む、炎症抑制剤組成物も本発明に包含される。かかる炎症抑制剤組成物は、イムノバイオティクスを含むため、経口で投与されることにより、投与された対象の腸内環境を改善し、その結果腸内の炎症性疾患を予防および／または処置することが可能である。したがって、好ましくは本発明の炎症抑制剤組成物は、かかる目的のための炎症抑制剤組成物である。
【００３９】
本発明の炎症抑制剤組成物は、経口で投与することができるため、食品組成物中に含有せしめることができる。かかる食品組成物は、含有する炎症抑制剤組成物の作用により、摂取個体の腸内環境を改善することが可能な食品組成物である。食品組成物としての形態は、菌が生存可能な形態であれば特に限定されない。かかる食品組成物の取りうる形態としては、これに限定されるものではないが、例えばヨーグルト、チーズなどの乳製品、粉末や錠剤、動物用飼料などが挙げられる。
【００４０】
したがって、本発明の炎症抑制剤組成物は、動物用の飼料組成物中に含有せしめることもできる。かかる飼料組成物も、摂取個体の腸内環境を改善することが可能である。本発明の飼料組成物は、腸内細菌叢を有する動物であれば、いかなる動物用の飼料でもよく、これに限定するものではないが、例えば、イヌ、ネコ、ネズミ、モルモットなどを含む愛玩動物用、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなどを含む家畜用などが挙げられる。
【００４１】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、かかる実施例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４２】
例１：ＢＩＥ細胞による抗炎症性イムノバイオティクスの選抜
子ウシ腸管上皮（ＢＩＥ）細胞を用い、炎症誘導因子としては腸管毒素原性大腸菌E.coli（ＥＴＥＣ  ９８７Ｐ株）を用い、以下の表１に記載の乳酸菌１８株について検討を行った。それぞれ５６℃で３０分間熱殺処理した。
【表１】
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【００４３】
（ａ）乳酸菌の調製
菌株はＭＲＳ培地 (Difco, Detroit, USA)で３回継代培養後（３７℃、１６ｈ）、十分にＰＢＳで洗浄した。洗浄後５６℃、３０分間熱殺菌に供した。さらにＰＢＳで２回洗浄後、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１％ストレプトマイシン／ペニシリン）に再懸濁した。【００４４】
（ｂ）ＢＩＥ細胞刺激
ＢＩＥ細胞を２４ウェルプレートに１．５×１０４個／ウェルで播種し、３日間培養した。培養３日目に供試乳酸菌（１００ＭＯＩ）で２日間刺激した。刺激後、ＰＢＳでウェルを３回洗浄し、ＥＴＥＣ５×１０７個／ｍＬで刺激した。【００４５】
（ｃ）ＢＩＥ細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
培地を除去・洗浄した後、TRIzol Reagentを用いた系によりＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ＴｏｔａｌＲＮＡよりQuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。【００４６】
（ｄ）定量的リアルタイムＰＣＲ法によるウシサイトカインｍＲＮＡの定量
得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液はPlatinumＴＭ SYBRＴＭ Green qPCR SuperMix-UDG with ROX（Invitrogen）を用いた系により行い、7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems, Lincoln, CDF, USA）を用いて分析及び解析を行った。得られた増幅曲線群より、指数関数的増幅領域の任意の蛍光値でのＣｔ（Threshold cycle：閾値サイクル）から標準曲線を算出した。この標準曲線より、各試料における各種サイトカインのｍＲＮＡ発現量を算出し、その値を各試料におけるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で割り、ＥＴＥＣコントロールを１としたときの相対発現強度として比較した。ＥＴＥＣコントロールに対する２群間の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で解析した。【００４７】
結果を図１に示す。ＥＴＥＣ刺激により誘導される３つのサイトカイン指標のうち、特に強く発現するＩＬ−６およびＩＬ−８の発現を抑制し、かつＭＣＰ−１の発現も抑制するＯＬＬ２７６８株が選抜された。【００４８】
例２：ＢＩＥ細胞におけるイムノバイオティクスによるトール様受容体シグナル抑制因子の発現
ＢＩＥ細胞を２４ウェルプレートに１．５×１０４個／ウェルで播種し、３日間培養した。培養３日目に化学合成トリアシル化リポペプチドであるＰａｍ３ＣＳＫ４（２００ｎｇ／ｍＬ）もしくはＯＬＬ２７６８株（５×１０７個／１ｍＬ）で１２，２４，３６，４８時間刺激し、トール様受容体シグナル抑制因子（ＭＫＰ−１（MAPK phosphatase 1：ＭＡＰＫホスファターゼ１）、ＩＲＡＫ−Ｍ（Interleukin-1 Recepter-Associated Kinase M：インターロイキン−１受容体関連キナーゼＭ）、ＳＩＧＩＲＲ（Single Ig IL-1-Related Recepter：シングルＩｇＩＬ−１関連受容体）、ＢＣＬ−３（B-cell CLL/Lymphoma 3：Ｂ細胞ＣＬＬ／リンフォーマ３）、Ｔｏｌｌｉｐ（Toll-Interacting Protein：トール相互作用タンパク質）、Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３（Tumor Necrosis Factor, Alpha-Induced Protein 3：腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３））の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。
また、ＢＩＥ細胞をＯＬＬ２７６８株で４８時間刺激後、ＰＢＳでウェルを３回洗浄し、ＥＴＥＣ５×１０７個／ｍＬで３、６、１２時間刺激を行った場合の抑制因子の発現についても解析した。
ＢＩＥ細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成は例１（ｃ）と同様に行い、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるウシサイトカインｍＲＮＡの定量は例１（ｄ）と同様に定量した。【００４９】
結果を図２および図３に示す。図２はＯＬＬ２７６８株刺激による各サイトカインの発現量を表したグラフであり、ＯＬＬ２７６８株でＢＩＥ細胞を４８時間刺激することにより、ＴｏｌｌｉｐおよびＢＣＬ３の発現が増強されたことを示している。また図３は、ＯＬＬ２７６８株刺激の４８時間後、さらにＥＴＥＣ刺激を与えたときの各サイトカイン発現量の変化を表したグラフである。さらにＥＴＥＣで６時間刺激することにより、Ｔｏｌｌｉｐの発現が増強されたことを示している。さらにＢＣＬ３についても発現上昇の傾向が認められた。【００５０】
これらの結果より、ＢＩＥ細胞を用いたＥＴＥＣによる炎症応答を緩和するイムノバイオティクスとしての候補菌株（ＯＬＬ２７６８株）をスクリーニングすることができた。そしてその活性発現機構が、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル抑制因子の発現増強によるＮＦ−κＢ転写活性の抑制であると推測することができる。【００５１】
例３：ブタ腸管上皮（ＰＩＥ）細胞における抗炎症性活性評価
ＰＩＥ細胞を用い、例１と同様に抗炎症性活性を評価した。すなわち、ＰＩＥ細胞を３×１０４個／ウェルとなるように１２ウェルプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。各供試乳酸菌を１００ＭＯＩで、培地コントロールおよびＥＴＥＣコントロール以外のウェルに５００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。１２ｗｅｌｌプレートをＰＢＳで洗浄し、各ウェルにＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＳＰ）を５００μｌ加えた後、ＥＴＥＣ（９８７Ｐ株）の死菌体を培地コントロール区以外のウェルに５．０×１０７個／ウェル（１００ＭＯＩ）となるように播き、ＰＩＥ細胞を１２時間刺激した。刺激後、各ウェルにＴＲＩｚｏｌを５００μＬ添加し、ピペッティングにより細胞溶解液を回収した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法により各試料におけるＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を算出し、その値を各試料におけるβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量で割り、ＥＴＥＣコントロールを１００とした時の相対発現量として評価した。ＥＴＥＣコントロールに対する２群間の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で解析した。【００５２】
ＯＬＬ２７６８、ＴＬ２９３７、ＭＥＰ２２１１０２、ＭＥＰ２２１１０４、ＭＥＰ２２１１１１、ＭＥＰ２２１１１３、ＭＥＰ２２１１１５の７菌株において、ＩＬ−６の有意な抑制が観察された。これらの菌株はＭＣＰ−１の発現においてもある程度の抑制活性が観察され、ＩＬ−８の発現も他の供試乳酸菌と比較して低い傾向があった。中でもＴＬ２９３７株において、ポジティブコントロールに対して６０％以上のＩＬ−６抑制活性が見られ、例１の結果も考慮して、別の有用なイムノバイオティクス候補菌株と考えられた。【００５３】
例４：ブタ腸管上皮細胞における抗ウィルス性炎症活性評価
（ａ）ＰＩＥ細胞の調製および刺激
コラーゲンＴｙｐｅＩコート済み２４ウェルプレートに１×１０４個／ｍｌ濃度の細胞を１ウェルあたり５００μｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。ＰＩＥ細胞の培地交換を行なった後、表１に記載されているイムノバイオティック候補菌株を各々１００ＭＯＩで刺激し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で０〜４８時間培養した。乳酸菌による前刺激の後、ＰＢＳで３回洗浄し、光学顕微鏡でウェル内に供試乳酸菌が残っていないことを確認した。次に、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）添加ＤＭＥＭ（ＦＣＳ  １０％，ペニシリン−ストレプトマイシン  １％添加ＤＭＥＭにｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が１２．５μｇ／ｍｌとなるように希釈した）で各ウェルの培地を置換し１２時間培養した。コントロールとして、非刺激ウェルおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激のみのウェルを設定した。【００５４】
（ｂ）抗ウイルス性および抗炎症活性の評価
培養したＰＩＥ細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。例１（ｄ）と同様にリアルタイムＰＣＲ法により抗ウイルス性の指標として、Ｉ型インターフェロンであるＩＦＮ−β、抗炎症性の指標として、ＭＣＰ−１の発現誘導を解析した。すなわち、ｃＤＮＡを鋳型とし、作製したプライマーを用いて発現解析を行った。サイトカイン遺伝子の発現解析は、ABI PRISM 7300 リアルタイム PCR System（Applied Biosystem）により行った。検量線はプラスミドを段階希釈して分析した結果として得られた曲線から、指数関数的増幅領域の任意の蛍光値でのＣｔ（Threshold cycle）から標準直線を算出した。各サンプルにおけるＣｔと標準直線から、各条件で振り分けたサンプルにおけるサイトカインのｍＲＮＡ発現量を算出した。同サンプルのβ−アクチンの発現量を求め、各発現量の値を標準化し、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）コントロールを１００とした時の相対発現強度を比較した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）コントロールに対する２群間の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で解析した。【００５５】
ＰＩＥ細胞に対してＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激を行ったところ、ＩＦＮ−βおよびＭＣＰ−１において、遺伝子レベルで経時的な発現変化が見られた。特に、刺激１２時間後の顕著なＩＦＮ−βの発現減少およびＭＣＰ−１の発現増加が認められたため、これら二つのサイトカインを免疫パラメータとし、ＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激１２時間後を至適評価時間と決定した。本評価系を用いて、ＰＩＥ細胞をイムノバイオティクス候補菌株で前刺激したところ、１２時間前刺激によってＩＦＮ−βの発現増強を誘導する菌株としてＭＥＰ２２１１０６、ＭＥＰ２２１１０８が得られ、４８時間刺激によりＴＬ２９３７が比較的強い傾向を示した（図５）。また、１２時間前刺激により、ＭＥＰ２２１１０１、ＭＥＰ２２１１０２、ＭＥＰ２２１１１４、ＭＥＰ２２１１１５、ＭＥＰ２２１１１７の５菌株で、２４時間刺激によりＭＥＰ２２１１０１、ＭＥＰ２２１１０２、ＭＥＰ２２１１０３、ＯＬＬ２７６８、ＭＥＰ２２１１０４、ＭＥＰ２２１１０５、ＭＥＰ２２１１０６、ＭＥＰ２２１１０８、ＭＥＰ２２１１０９、ＭＥＰ２２１１１０、ＭＥＰ２２１１１１、ＭＥＰ２２１１１２、ＭＥＰ２２１１１４、ＭＥＰ２２１１１５、ＴＬ２９３７、ＭＥＰ２２１１１７の１６菌株でＭＣＰ−１の有意な発現抑制が認められた（図６）。以上の結果から、ＰＩＥ細胞を用いたin vitro評価系によって、抗ウイルス性サイトカインの増強およびウイルス性炎症の抑制を指標としたイムノバイオティクスの選抜・評価が可能と期待された。【００５６】
例５：生産性や免疫能に対する飼料中抗菌剤の効果
供試した豚計２０頭（雌）はＬＷＤ系統で、２週齢時に導入し５頭ずつ４区に分けて３週齢までは市販代用乳を給与し馴致した。４週齢以降の飼料には、成長段階に合わせ離乳用飼料を含めて基礎成分の異なる４種のものを用意し、それぞれ抗菌剤入り飼料を１００％として抗菌剤を含まない基礎成分同等飼料０％と混合することで、抗菌剤入り飼料５０％と２５％の計４飼料条件４区を設定し、それぞれ任意飽食とした（表２および３）。【００５７】
【表２】
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【００５８】
【表３】
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【００５９】
体重測定、鼻汁採取および採血を２週間に１回行い、採取した血液の一部からは速やかに血漿分離し、鼻汁とともに全てを分析時まで−８０℃で凍結保管した。血漿は代謝成分（総タンパク質、グルコース、総コレステロール、硝酸態窒素、トリアシルグリセロール、カルシウム）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度の測定に用いた。全血では、採取直後に総白血球数、リンパ球数に対する顆粒球数比、マクロファージ活性、抗体産生能そして補体第２経路活性をそれぞれ評価した。更には、各区から新鮮な糞便を採取した。鼻汁はマイコプラズマへの、糞便は病原性大腸菌（Ｋ８８およびＫ９９）への感染検査にそれぞれ用いた。体重が１１５ｋｇ到達時に出荷し、屠殺解体後に枝肉成績を調査した。【００６０】
結果を図７〜９および表４に示す。抗菌剤添加の有無とは無関係に８週齢までは病原性大腸菌への感染が弱く、１３週齢から１５週齢の間は強い感染がみとめられた。１７週齢以降は、抗菌剤添加割合は高い方では感染が弱く、低い方で強い感染がみとめられた（図７）。血漿中ＣＲＰ濃度は、１３週齢以降、抗菌剤１００％の第４区は正常範囲内にあった（図８）。代謝成分濃度には週齢間と区間に大きな差異はみとめられなかった。１３週齢以降の免疫能評価では、特にリンパ球数に対する顆粒球数比において抗菌剤を添加した区が有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図９）。鼻汁中のマイコプラズマ感染は、抗菌剤添加の有無に関わらずみとめられた。どの枝肉成績に対しても出荷日齢の効果には有意性がみとめられなかった。出荷時体重および枝肉重量には区間で有意な差はみとめられなかった一方で、背脂肪厚は抗菌剤を添加した方が有意に薄かった（Ｐ＜０．０５）（表４）。【００６１】
【表４】
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【００６２】
例６：生産性や免疫能に対する炎症抑制剤の効果
供試した豚計４０頭（雌あるいは去勢雄）はＬＷＤ系統で、３週齢時に導入し５頭ずつ８区に分けて４週齢までは離乳用飼料を給与し馴致した。３６日齢以降の飼料には成長段階に合わせ基礎成分の異なる３種のものを用意し（表１）、それぞれ抗菌剤入り飼料１００％の３種、抗菌剤を含まない基礎成分同等飼料０％の３種、計６種を調整し任意飽食とした。更には、３週齢から１５週齢までは抗菌剤の代替物として２種類のイムノバイオティック乳酸菌（Ｌ１：L. jensenii  ＴＬ２９３７，Ｌ２：L. plantarum  ＭＥＰ２２１１１８）も別容器にて培養液とともに給与した（表５）。培養液中の菌数は３×１０８ｃｆｕ／ｇとした。給与量は１日１頭当り３ｇ／体重ｋｇとした。培養液にはホエーを酵素分解処理したものを用いた。８区への給与体制は表５に示した。
サンプル採取は全て例５と同様に行った。検討項目として例５から抗体産生能評価は削除し、また検査した病原性大腸菌の種類にＥＴＥＣ９８７Ｐを追加した。出荷および枝肉成績調査は例５と同様に行った。【００６３】
【表５】
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【００６４】
結果を図１０〜１４に示す。４週齢から８週齢までの間は抗菌剤添加の有無に関わらず、強弱はあるものの病原性大腸菌への感染がみとめられた。特に抗菌剤無添加でＬ１給与区では１３週齢から１５週齢の間で病原性大腸菌への感染が消失していた。一方、抗菌剤添加区では強弱があるものの１５週齢までは感染がみとめられた（図１０）。血漿中ＣＲＰ濃度は、１３週齢から１５週齢において菌体無添加の対照区に比べて抗菌剤無添加でＬ１給与区が正常範囲内にあって有意に低く（Ｐ＜０．０５）、また抗菌剤添加であってもＬ１給与区は正常範囲内で低い傾向がみられた（図１１）。免疫能評価として、特に１３週齢から１５週齢の補体第２経路活性が抗菌剤無添加のＬ１給与区において有意に最も高かった（Ｐ＜０．０５）（図１２）。体重については、抗菌剤無添加でＬ１給与区において有意に最も増体が良く２２週齢時で既に平均１１５ｋｇに達し（Ｐ＜０．０５）、また同週齢時でＬ１、Ｌ２および培地給与区が無給与区に比較して大きくなる傾向がみられた（図１３）。一方、枝肉重量は抗菌剤無添加区内、抗菌剤添加区内のそれぞれで有意な差異はみとめられず、両者を比較すると抗菌剤添加区の方が平均的に小さい傾向がみられた（図１４）。【００６５】
例５および例６の結果から、８週齢までは母性移行抗体の効果が持続し、病原性大腸菌への感染が弱いと考えられた。しかしながら、１３週齢から１５週齢は抗菌剤添加とは無関係に強い感染がみとめられ、それ以降は抗菌剤添加割合の高い方が低くなる傾向がみられたことから病原性大腸菌に対する抗菌剤の効果が期待できない時期があると推察された。また抗菌剤添加割合が高い方の血漿中ＣＲＰ濃度が低く、正常範囲にあったことから炎症応答を有意に抑制することが明らかとなった。さらには、抗菌剤添加によってリンパ球数に対する顆粒球数比が低くなったことから、抗菌剤の効果によって病原性大腸菌進入が抑制され、結果的に自然免疫系応答を正常状態に保ったと考えられた。【００６６】
イムノバイオティクス乳酸菌の給与実験の結果から、給与とは無関係に８週齢までは強弱ある感染状態であったが、抗菌剤の無い環境下でのＬ１給与が１３週齢から１５週齢までの病原性大腸菌感染を強く抑制した。また、抗菌剤無添加のＬ１給与によって血漿中ＣＲＰ濃度が有意に低く、正常範囲に抑えられ、補体第２経路活性も有意に高まったことからＬ１は病原性大腸菌感染を抑制し、免疫賦活および炎症応答を抑制する効果が期待できると考えられた。さらには、抗菌剤無添加でＬ１給与区の体重は２２週齢時で既に出荷適期１１５ｋｇに達しており、標準よりも２週間も早く仕上がった。また枝肉重量は他の区と差異がなかったことから生産性が向上したと考えられた。【００６７】
以上のことから、生産性を維持する抗菌剤の代替物として、イムノバイオティクス乳酸菌Ｌ１は病原性大腸菌感染を抑制し、免疫賦活作用が期待できるだけでなく、増体を高め早期出荷による生産性向上に貢献すると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、腸内の炎症性免疫応答を抑制することができる優良なイムノバイオティクスをスクリーニングすることができ、さらに本発明の方法によりスクリーニングされた菌株であるＯＬＬ２７６８株およびＴＬ２９３７株は、優良なイムノバイオティクスであり、抗菌剤代替としての利用性が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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