(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉで表される化合物。
【化１】
0006007374.tif 000017
【請求項２】
下記式ＩＩで表される化合物。
【化２】
0006007374.tif 000018
【請求項３】
レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１４）を培地で培養し、培養物中請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物を蓄積せしめ、該培養物から請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１４）。
【請求項５】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物を有効成分とするトリパノソーマ原虫の増殖阻害活性物質。
【請求項６】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物を有効成分とする抗トリパノソーマ原虫薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリパノソーマ原虫の増殖阻害の分野に属する。具体的には、本発明は、動物薬、医薬品として有効な、トリパノソーマ原虫の増殖阻害活性を有する化合物、その製造法、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリパノソーマ症にはアフリカ地域で流行しているアフリカ睡眠病と南米地域で流行しているシャーガス病がある。アフリカ睡眠病またはヒトアフリカトリパノソーマ症と呼ばれるトリパノソーマ症は、再興原虫感染症であり、年間推定感染者が1830万人以上で年間死亡者が約５万人に及ぶとされている。特にヒトに寄生するトリパノソーマ原虫類はガンビアトリパノソーマ原虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）及びローデシアトリパノソーマ原虫（Ｔ．  ｂ．  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓ）の２種類に分類され、前者は慢性睡眠病、後者は急性睡眠病を引き起こす。感染末期には中枢神経系に原虫が移行し、トリパノソーマ原虫感染者の８０％以上が昏睡状態に陥り、死に至るという死亡率の高い感染症である。これらのトリパノソーマ原虫はアフリカにのみ生息するツェツェバエによって媒介される。【０００３】
さらに、ガンビアトリパノソーマ原虫及びローデシアトリパノソーマ原虫は人畜共通寄生種でもあり、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜及びガゼルやヌー等の野生動物にも寄生する。これらの動物は保有宿主となるが発症しない。またヒトに寄生せず、家畜動物に寄生するその他のトリパノソーマ原虫も存在する。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ亜属の原虫であるＴ．  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ（ナガナ病）、Ｄｕｔｔｏｎｅｌｌａ亜属の原虫であるＴ．  ｖｉｖａｘ  ｖｉｖａｘ（ズーマ病）等があり、これらの原虫が感染すると動物種により致死的な感染経過をたどる。これらもツェツェバエによって媒介される。【０００４】
ツェツェバエが生息する地域はアフリカ大陸のサハラ砂漠以南の東海岸から西海岸の３６カ国１，０００万平方ｋｍに及ぶ地域で１億５，０００万頭以上の家畜動物がこれらのトリパノソーマ症の脅威に曝されている現状である。さらに、アブ、サシバエ等の吸血昆虫の機械的伝搬等により動物に感染するツェツェバエ非媒介性トリパノソーマ原虫類として、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ亜属の原虫であるＴ．  ｅｖａｎｓｉ（スーラ病）、Ｔ．  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ（媾疫病）等がある。特にスーラ病はアフリカ、中南米、東南アジア、中国、中近東、インド等世界的流行がみられる。近年さらに流行が拡大傾向にあり、日本への侵入を警戒する最も高い動物トリパノソーマ症である。【０００５】
これらのトリパノソーマ原虫類に対する既存のヒトの抗トリパノソーマ原虫剤としては、過去半世紀の間、スラミン（１９２３年開発）、ペンタミジン（１９３９年開発）、メラルソプロール（１９５３年開発）等の古典的薬剤及びエフロニチン（１９７８年開発）等の化学合成医薬品が長く用いられていた。スラミンは、ガンビアトリパノソーマ原虫及びローデシアトリパノソーマ原虫の感染初期に有効であるが腎毒性がある。【０００６】
ペンタミジンは、ガンビアトリパノソーマ原虫の感染初期に有効であるがローデシアトリパノソーマ原虫には無効であり、血圧低下や血糖減少の副作用がある。砒素剤のメラルソプロールは血液脳関門を通過することにより、ガンビアトリパノソーマ原虫及びローデシアトリパノソーマ原虫の感染末期（中枢神経症）に有効であるが、中枢神経系への副作用が強いために脳症を起こす。また、メラルソプロールに対する耐性原虫株も出現している。【０００７】
エフロニチンは血液脳関門を通過することにより、メラルソプロールが効かない耐性のガンビアトリパノソーマ原虫の感染末期に有効であるが、ローデシアトリパノソーマ原虫には無効である。これらの薬剤は古く、有効性は徐々に低下している。また、動物のトリパノソーマ症の治療にはジミナゼン、スラミン、イソメタジウム、変異原性物質のホミジウム等が使用されてきた。特にこれらの薬剤が長期間大量に使用されてきたために、現在、薬剤耐性原虫が各地で出現し、これらの抗トリパノソーマ原虫剤としての有用性は著しく低下しており、大きな問題となっている。【０００８】
アフリカ睡眠病では新規な薬剤の開発の遅れから、古典的な副作用の強い既存薬剤が治療に用いられているのが現状であり、いずれも世界規模で有効な新規な薬剤等の開発が求められている。このように、既存のヒトの抗トリパノソーマ原虫剤は原虫の種類及び感染のステージによって有効性が異なるものや薬剤耐性原虫株の出現がみられるものがある。抗トリパノソーマ原虫剤として原虫の種類及び感染のステージを問わず有効な薬剤、ローデシアトリパノソーマ原虫や感染末期(中枢神経症)に特異性のある薬剤でしかも副作用の少ない新規な骨格を持った抗トリパノソーマ原虫剤の開発が地球規模で望まれている。【０００９】
これまでにこのような問題を解決すべくトリパノソーマ原虫の治療を目的とした治療薬が報告されているが、未だ効果的な化合物は見出されていなかった（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００９/００４８９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
トリパノソーマ症はトリパノソーマ原虫が宿主細胞内で増殖することによって引き起こされる。トリパノソーマ原虫の増殖を阻害する物質はトリパノソーマ症の発症を抑えるもしくは症状を緩和する抗トリパノソーマ薬として期待される。よって、本発明は、上述の従来技術の問題を解決するために新規の抗トリパノソーマ薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは、微生物の生産する代謝産物を対象にトリパノソーマ原虫の増殖を阻害する物質を探索した結果、新たに土壌から分離した放線菌Ｋ１０-０２１６株の培養液中にトリパノソーマ原虫の増殖阻害作用を有する物質が産生されていることを見出した。本発明者らは、更に、該培養物を精製、単離した結果、トリパノソーマ原虫の増殖阻害作用を有する新規物質マングロマイシン（Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ）  Ａ、類縁のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ及びＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃを得て本発明を完成した。これらのＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎの化学構造を有する物質は従来全く知られていなかった。【００１３】
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであり、具体的には、新規化合物である、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａ、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ及びＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃ（以下、総称して「Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ」ということがある）に関するものである。本明細書において、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：白色粉末または淡黄色粉末
（２）分子量：４１０
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ７
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋  理論値（ｍ／ｚ）４１１．２３８３、実測値（ｍ／ｚ）４１１．２３７７
（５）比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝−１３．５６°（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２５１（２７４７）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４４０，１６３７ｃｍ−１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ  ＮＭＲ（重メタノール中）δ  ｐｐｍ：４．７３（１Ｈ，ｄ），２．１０（１Ｈ，ｄｄ），２．０５（１Ｈ，ｄｄｄ），２．８８（１Ｈ，ｄｄｄ），１．２５（１Ｈ，ｄｄｄ），２．４３（１Ｈ，ｄｄｄ），１．６２（１Ｈ），１．８５（１Ｈ，ｄｄ），２．５５（１Ｈ，ｍ），３．２０（１Ｈ，ｄ，ｂｒ），４．３０（１Ｈ，ｄ），３．３２（１Ｈ，ｄ），２．７５（１Ｈ，ｑ），２．５０（１Ｈ，ｄ），４．５５（１Ｈ，ｄｄ），１．６０（２Ｈ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．５２（１Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｔ），１．３５（３Ｈ，ｓ），１．０６（３Ｈ，ｄ），１．０３（３Ｈ，ｄ）
（９）１３Ｃ  ＮＭＲ（重メタノール中）δ  ｐｐｍ：７３．８，４４．４，１６７．９，１０３．４，１９．３，３７．４，８５．０，４８．９，３７．３，８０．２，７３．０，７２．３，５２．７，２２３．３，４４．４，１６９．３，３４．６，２１．３，１４．４，２４．８，１３．７，８．５
（１０）溶解性：クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、及びメタノールに易溶、水に難溶。【００１４】
または、本明細書におけるＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａは、以下式Ｉで表わされる構造を有する化合物であってもよい。【００１５】
【化１】
0006007374.tif 000002
【００１６】
また、本明細書においてＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：白色粉末または淡黄色粉末
（２）分子量：３９２
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３２Ｏ６
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋  理論値（ｍ／ｚ）３９３．２２７７、  実測値（ｍ／ｚ）３９３．２２７１
（５）比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝−２４．０８°（Ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２３６（８０３６）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４５０，１６７２ｃｍ−１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ  ＮＭＲ（重メタノール中）δ  ｐｐｍ：４．６１（１Ｈ，ｄ），２．２８（１Ｈ，ｄｄ），２．０５（１Ｈ，ｄｄｄ），２．９１（１Ｈ，ｄｄｄ），１．２７（１Ｈ，ｍ），２．５９（１Ｈ，ｍ），１．４１（１Ｈ，ｄｄ），１．９７（１Ｈ，ｄｄ），２．５３（１Ｈ，ｍ），３．６８（１Ｈ，ｄｄ），４．５４（１Ｈ，ｄｄ），６．７４（１Ｈ，ｄ），２．１８（１Ｈ，ｄｄ），４．０３（１Ｈ，ｄｄ），１．５６（１Ｈ，ｍ），１．５９（１Ｈ，ｍ），１．３６（１Ｈ，ｍ），１．４３（１Ｈ，ｄ），０．９４（３Ｈ，ｔ），１．３７（３Ｈ，ｓ），１．２２（３Ｈ，ｄ）
（９）１３Ｃ  ＮＭＲ（重メタノール中）δ  ｐｐｍ：７８．３，４３．５，１６７．４，１０４．０，２０．１，３３．８，８２．３，５０．４，３７．３，８４．８，６９．９，１５０．７，１３４．８，２０５．２，４３．３，１６８．３，３６．４，２０．７，１４．３，２４．９，１６．５
（１０）溶解性：クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノールに易溶、水に難溶。【００１７】
または、本明細書においてＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂは、以下式ＩＩで表わされる構造を有する化合物であってもよい。【００１８】
【化２】
0006007374.tif 000003
【００１９】
また、本明細書におけるＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃとは、以下の物性を有する化合物である：
（１）性状：白色粉末または淡黄色粉末
（２）分子量：３９４
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ６
（４）高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋理論値（ｍ／ｚ）３９５．２４３４、実測値（ｍ／ｚ）３９５．２４１３
（５）比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝２３．２４°（ｃ＝０．１、メタノール）
（６）紫外部吸収極大（メタノール中）λｍａｘ（ε）：２５１（５５９５）
（７）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４３０，１６５７ｃｍ−１に極大吸収を有する
（８）１Ｈ  ＮＭＲ（重メタノール中）δ  ｐｐｍ：４．７８（１Ｈ，ｄ），２．１４（１Ｈ），２．０２（１Ｈ，ｄｄ），２．８５（１Ｈ，ｄｄｄｄ），１．２５（１Ｈ，ｄｄｄ），２．４６（１Ｈ），１．６８（２Ｈ，ｍ），２．７４（１Ｈ，ｍ），１．７２（１Ｈ，ｄｄｄ），２．４３（１Ｈ），３．５６（１Ｈ，ｄｄｄ），３．３９（１Ｈ），２．４３（１Ｈ），２．３８（１Ｈ），４．４６（１Ｈ），１．６１（２Ｈ，ｍ），１．３８（１Ｈ），１．５２（１Ｈ），０．９６（３Ｈ，ｔ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．０６（３Ｈ，ｄ），１．０４（３Ｈ，ｄ）
（９）１３Ｃ  ＮＭＲ（重メタノール中）δ  ｐｐｍ：７４．０，４３．９，１６７．３，１０３．７，１９．５，３６．５，８３．７，４９．９，４４．４，３７．６，６９．５，８１．９，３７．０，２１２．６，４４．２，１６９．２，３５．０，２１．２，１４．４，２５．２，１５．４
（１０）溶解性：クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノールに易溶、水に難溶。【００２０】
または、本明細書においてＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃは、以下式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂのいずれかで表わされる構造を有する化合物であってもよい。【００２１】
【化３】
0006007374.tif 000004
【００２２】
【化４】
0006007374.tif 000005
【００２３】
前記Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓは水酸基を有することから、当業者に一般的に知られたアシル化反応を利用することによりエステル化合物であるプロドラッグを得ることができる。発明はこのようなＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓのエステル化合物をも包含する。具体的には、本発明は、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａ、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ又はＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃの水酸基と飽和又は不飽和の低級脂肪酸又は高級脂肪酸とがエステル結合したエステル化合物を包含する。本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓのエステル化合物を与える酸としては、酢酸、ペンタン酸などの脂肪族カルボン酸；安息香酸などのアリールカルボン酸；モノ又はジアルキルカルバミン酸；プロパンスルホン酸などの脂肪族スルホン酸；ベンゼンスルホン酸などのアリールスルホン酸；モルホリニルカルボン酸、オキサゾリジニルカルボン酸、アゼチジンカルボン酸などの複素環カルボン酸などを挙げることができる。また、本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓは、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの水和物及び溶媒和物をも含むものである。【００２４】
本発明はまた、前記Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中にＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを蓄積せしめ、該培養物からＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを採取することを備える、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの製造方法に関する。該製造方法において、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物として、好ましくは、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１４）株である。【００２５】
別の態様において、本発明は更に、新規放線菌である、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６株に関する。本明細書において、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６株とは、本発明者等によって沖縄県西表島マングローブ土壌より新たに分離された微生物であり、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６として、２０１１年７月２１日付にて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託された菌株のことである（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１４)。本発明のレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６株は、本明細書実施例１に記載の菌学的性状を有する。【００２６】
更にまた別の態様において、本発明は、前記Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａ、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ及び／又はＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃを有効成分として含有するトリパノソーマ原虫の増殖阻害剤及び医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物として好ましくは、抗トリパノソーマ原虫薬（トリパノソーマ原虫類の感染治療剤及び予防剤）である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓは、トリパノソーマ原虫の増殖を阻害することができることから、新規の抗トリパノソーマ薬となる。また、本発明のレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６株は、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを産生することから、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの製造に利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓは、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを蓄積せしめ、該培養物からＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを採取（分離・抽出・精製）することにより製造することができる。
【００２９】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの製造方法において、「Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」は、放線菌に属する菌であって、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの製造方法に用いることのできる菌株には、上記菌株の他、その変異株をはじめ、放線菌に属するＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する菌のすべてが含まれる。微生物が「Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」であるか否かは、例えば、以下の方法により決定することができる。スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン０．３％、カツオエキス０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ  ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに、液体培地で培養した被験微生物１ｍＬを植菌し、２７℃で３日間振盪培養後、得られた種培養液を、スターチ２．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽１．０％、カツオ肉エキス０．３％、ドライ酵母０．３％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに、１ｍＬ植菌し、２７℃で７日間振盪培養することにより得られた培養物の中に、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓが存在すれば当該微生物はＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物であると決定することができる。好ましくは、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物は、上述のレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ．）Ｋ１０−０２１６株である。
【００３０】
本明細書において、「変異株」とは、人工的又は自然界における変異誘発刺激によりレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ．）Ｋ１０−０２１６株とは異なる菌学的性状又は遺伝子を有する株のことであり、このような変異株にはレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ．）Ｋ１０−０２１６株から派生した菌株の他、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ．）Ｋ１０−０２１６株を派生させた元の菌株も含まれる。本明細書において、変異株は実際の派生の痕跡の有無を問うものではなく、例えば、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ．）Ｋ１０−０２１６株遺伝子（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１））と高い相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上など）を有する遺伝子を有する菌株もまた変異株に含まれる。また、このような変異株は、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの産生能を維持している限り、人工的に作製したものであるか、天然から採取したものであるかを問わない。
【００３１】
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培養するための培地には、栄養源として、放線菌の栄養源として使用し得るものを含有することができる。例えば、市販のペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの水和物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、グリセリン、スターチ、グルコース、ガラクトース、マンノース等の炭水化物、あるいは脂肪等の炭素源、及び食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を単独あるいは組み合わせて使用することができる。その他、培地には、必要に応じて微量の金属塩、消泡剤として動・植・鉱物油等を添加することもできる。これらのものは生産菌を利用したＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの生産の役だつものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
【００３２】
また、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産する能力を有する放線菌に属する微生物の培養は、生産菌が発育しＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓを生産できる温度範囲（例えば、１０℃〜４０℃、好ましくは、２５〜３０℃）で数日〜２週間振盪培養することにより行うことができる。培養条件は、本明細書の記載を参照しながら、使用するＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ生産菌の性質に応じて適宜選択して行なうことができる。
【００３３】
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの採取は、培養液より酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒を用いて抽出することにより行うことができる。本抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーよりのかき取り、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組合わせあるいは繰返すことによって純粋になるまで精製することができる。
【００３４】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓは医薬組成物として使用することができる。具体的には、本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓはトリパノソーマ原虫の増殖抑制作用を有することから、抗トリパノソーマ原虫薬（トリパノソーマ原虫の感染に由来する疾患の治療薬又は予防薬）として用いることができる。本明細書において、「トリパノソーマ原虫」とは、ガンビアトリパノソーマ原虫、ローデシアトリパノソーマ原虫、及びトリパノソーマ原虫の亜属であるトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔ．  ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・コンゴレンス（Ｔ．  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、トリパノソーマ・バイバックス（Ｔ．  ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・エバンシ（Ｔ．  ｅｖａｎｓｉ）、トリパノソーマ・タイレリ（Ｔ．  ｔｈｅｉｌｅｒｉ）トリパノソーマ・エキパーダム（Ｔ．  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ）を含む。また、トリパノソーマ原虫の感染に由来する疾患としては、一般にトリパノソーマ症として知られる疾患が含まれ、例えば、ナガナ病、アフリカトリパノソーマ症等が含まれる。
【００３５】
本発明のトリパノソーマ原虫の増殖阻害剤及び医薬組成物は、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で用いることができる。本化合物を哺乳動物等に投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、疾患の種類等により異なるが、通常成人１日当たり５０ｍｇ〜５００ｍｇを１日１〜数回に分けて投与する。
【００３６】
本発明のトリパノソーマ原虫の増殖阻害剤及び医薬組成物は、通常の薬学的に許容される担体を用いて、常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は日本国特許出願２０１１−１９１４０４の優先権を主張して出願されたものであり、当該日本国特許出願２０１１−１９１４０４に記載の内容はその全てが参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００３８】
（実施例１）  レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ．）  Ｋ１０−０２１６株の菌学的性状
本発明者等によって沖縄県西表島マングローブ土壌より新たに、レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６株を分離した。レシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６株の菌学的性状は以下の通りであった。
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はスターチ無機塩寒天でわずかに着生し、ホワイトの色調を呈する。約０．３〜０．４μｍの気菌糸は織り交ざり凝集塊を形成する。胞子のう及び遊走子は見出されない。
（ＩＩ）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１９６６年）によって調べた本菌株の培養性状を表１に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定することができ、色票名は括弧内のコードと併せて記されている。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。【００３９】
【表１】
0006007374.tif 000006
【００４０】
（ＩＩＩ）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天              ：陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天：陰性
（ハ）トリプトン・イースト液          ：陰性
（２）ゼラチンの液化（単純ゼラチン培地）（２０℃）：陰性
（３）スターチの加水分解：陽性
（４）脱脂乳の凝固（３７℃）：陽性
（５）脱脂乳のペプトン化（３７℃）：陽性
（６）生育温度範囲：１２〜４０℃
（７）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、ｍｙｏ−イノシトール、シュークロース
やや利用する：ラフィノース、Ｌ−ラムノース、
（８）セルロースの分解：陰性【００４１】
（ＩＶ）細胞の化学組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はメソ型である。主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ４）でＭＫ−８（Ｈ４）およびＭＫ−１０（Ｈ４）を少量有する。
（Ｖ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち約１４００塩基配列を決定した（配列番号１）。ＤＮＡデータベースに登録され公開されているレシェバリエリア属に属する菌株およびその他の放線菌のデータを用いた近隣結合法による系統解析の結果から、本菌株はレシェバリエリア属に分類することが妥当であり、レシェバリエリア  アエロコロニゲネス（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）に最も近縁である。【００４２】
（ＶＩ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はメソ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ４）である。わずかに着生する気菌糸は織り交ざり凝集塊を形成する。コロニーは淡黄色を呈し、メラニン色素は産生しない。これらの結果および１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の解析結果から、本菌株は２００１年にインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・アンド・エボリューショナリー・ミクロバイオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）に発表されたレシェバリエリア属に属する１菌種であると判断された。本菌株はレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６として、２０１１年７月２１日付にて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した(受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１４)。【００４３】
（実施例２）  Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣの取得
スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン（極東製薬工業株式会社製）０．３％、カツオエキス（極東製薬工業株式会社製）０．３％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業株式会社製）０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ  ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに６０本に、液体培地で培養したレシェバリエリア・エスピー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ  ｓｐ.）Ｋ１０−０２１６（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１４）を各１ｍｌずつ植菌し、２７℃で３日間振盪培養した。得られた種培養液を、スターチ２．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽（日清ファルマ株式会社製）１．０％、カツオ肉エキス（極東製薬工業株式会社製）０．３％、ドライ酵母（ＪＴフーズ株式会社製）０．３％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに６０本に、各１ｍＬずつ植菌し、２７℃で７日間振盪培養した。【００４４】
培養の終了した５００ｍＬ容三角フラスコ６０本にそれぞれ１００ｍＬのエタノールを加えて１時間激しく撹拌した。次にその抽出液中のエタノールを減圧留去し、得られた水溶液に３Ｌの酢酸エチルを加えよく撹拌後、酢酸エチル層を回収した。エバポレーターを用い、濃縮乾固して５．３６ｇの粗精製物１を得た。次に脂質を取り除く目的で、ヘキサン／メタノールにより液・液分配を行い、メタノール層を回収し、エバポレーターでメタノールを留去し、粗精製物２を４．２６ｇ得た。これを少量のメタノールに溶解し、シリカゲル（ＭＥＲＣＫ社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、クロロホルム−メタノール溶媒系で段階溶出（１００：０，１００：１，５０：１，１０：１，１：１，０：１００）させ、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  ＡおよびＣを含む１０：１画分（粗精製物３）を３０７．４ｍｇ、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  ＡおよびＢおよびＣを含む５０：１画分（粗精製物４）を２２１．８ｍｇ、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  ＢおよびＣを含む  １００：１画分（粗精製物５）を２５１．９ｍｇ得た。【００４５】
粗精製物３および／または粗精製物４を少量のメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーを用いて、メタノール−水溶媒系で段階溶出（２０：８０，４０：６０，５０：５０，６０：４０，８０：２０，１００：０）し、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａを含む６０：４０画分（粗精製物６）を得た。粗精製物６をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４，φ１０×２５０ｍｍ，流速４．５ｍＬ／ｍｉｎ，検出２５４ｎｍ）に注入し、メタノール−水（５０：５０）で溶出した。保持時間２５分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａを白色粉末または淡黄色粉末として９ｍｇ得た。【００４６】
粗精製物４および／または粗精製物５を少量のメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーにて、メタノール−水溶媒系で段階溶出（２０：８０，４０：６０，５０：５０，６０：４０，８０：２０，１００：０）し、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ  を含む６０：４０画分（粗精製物７）を得た。粗精製物７をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４,φ１０×２５０ｍｍ，流速４．５ｍＬ／ｍｉｎ，検出２５４ｎｍ）に注入し、メタノール−水（６０：４０）で溶出した。保持時間２０分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂを白色粉末または淡黄色粉末として１０．３ｍｇ得た。【００４７】
粗精製物３および／または粗精製物４および／または粗精製物５を少量のメタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社社製）オープンカラムクロマトグラフィーにて、メタノール−水溶媒系で段階溶出（２０：８０，４０：６０，５０：５０，６０：４０，８０：２０，１００：０）し、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃを含む６０：４０画分（粗精製物８）を得た。粗精製物８をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィーにてオクタデシルシリルカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４，φ１０×２５０ｍｍ，流速４．５ｍＬ／ｍｉｎ，検出２５４ｎｍ）に注入し、メタノール−水（６０：４０）で溶出した。保持時間１５分付近のピークを分取し、減圧濃縮によりＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃを白色粉末または淡黄色粉末として２１．７ｍｇ得た。【００４８】
得られたＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａ，Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ及びＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃの理化学的性状を測定した結果、次の通りであった。
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａ
（１）性状：白色粉末または淡黄色
（２）分子量：４１０
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ７
高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋理論値（ｍ／ｚ）４１１．２３８３、実測値（ｍ／ｚ）４１１．２３７７
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝−１３．５６°（ｃ＝０．１、メタノール）
（５）紫外部吸収極大λｍａｘ（メタノール中）：２５１（２７４７）（括弧内はε）
（６）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４４０，１６３７ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表２に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（８）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表２に示す。
（９）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノールに易溶。水に難溶。【００４９】
【表２】
0006007374.tif 000007
【００５０】
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂ
（１）性状：白色粉末または淡黄色
（２）分子量：３９２
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３２Ｏ６
高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋理論値（ｍ／ｚ）３９３．２２７７、実測値（ｍ／ｚ）３９３．２２７１
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝−２４．０８°（ｃ＝０．１、メタノール）
（５）紫外部吸収極大λｍａｘ（メタノール中）：２３６（８０３６）（括弧内はε）
（６）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４５０，１６７２ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表３に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（８）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表３に示す。
（９）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノールに易溶。水に難溶。【００５１】
【表３】
0006007374.tif 000008
【００５２】
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃ
（１）性状：白色粉末または淡黄色
（２）分子量：３９４
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ６
高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋理論値（ｍ／ｚ）３９５．２４３４、実測値（ｍ／ｚ）３９５．２４１３
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝２３．２４°（ｃ＝０．１、メタノール）
（５）紫外部吸収極大λｍａｘ（メタノール中）：２５１（５５９５）（括弧内はε）
（６）赤外部吸収極大νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：３４３０，１６５７ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表４に示す。（表中、ｓは一重線、ｄは二重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数を示す。）
（８）カーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を表４に示す。
（９）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノールに易溶。水に難溶。【００５３】
【表４】
0006007374.tif 000009
【００５４】
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａの各種理化学的性状やスペクトルデータを検討した結果、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａは下記式Ｉで表される構造であることが決定された。【００５５】
【化５】
0006007374.tif 000010
【００５６】
また、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂの各種理化学的性状やスペクトルデータを検討した結果、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｂは下記式ＩＩで表される構造であることが決定された。【００５７】
【化６】
0006007374.tif 000011
【００５８】
また、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃの各種理化学的性状やスペクトルデータを検討した結果、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ｃは下記式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂのいずれかで表される構造であることが決定された。【００５９】
【化７】
0006007374.tif 000012
【００６０】
【化８】
0006007374.tif 000013
【００６１】
以上のとおり各種理化学的性状が得られたＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣに一致する化合物はこれまで報告されていないことから、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣは新規物質であると考えられる。【００６２】
（実施例３）トリパノソーマ原虫増殖阻害活性
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａ，Ｂ及びＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトリパノソーマ原虫の増殖を阻害する活性を以下の通り調べた。
試験原虫として、トリパノソーマ原虫のナガナ病の起因原虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ  ＧＵＴａｔ  ３．１株（名古屋市立大学医学部藪義貞講師より分与可能）を用いた。原虫の維持継代は藪らの方法［Ｙａｂｕ  Ｙ，  Ｋｏｉｄｅ  Ｔ，  Ｏｈｏｔａ  Ｎ，  Ｎｏｓｅ  Ｍ，  Ｏｇｉｈａｒａ  Ｙ．  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ  ｉｎ  ａｘｅｎｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｌｏｗ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ．  Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ．  Ｔｒｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，２９：５９１−５９５（１９９８）］を若干改変して行った。すなわち、２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ内で、１０％非動化牛胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質及び種々の補給剤添加イスコフ改変ダルベッコ（ＩＭＤＭ）培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２−９５％  ａｉｒ下で培養を行い、１〜３日毎に培地交換して連続培養を行った。【００６３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの本化合物の抗トリパノソーマ原虫活性の測定は、乙黒らの方法［Ｏｔｏｇｕｒｏ  Ｋ，Ｉｓｈｉｙａｍａ  Ａ，  Ｎａｍａｔａｍｅ  Ｍ，  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ａ，  Ｆｕｒｕｓａｗａ  Ｔ，  Ｍａｓｕｍａ  Ｒ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，  Ｓｈｉｏｍｉ  Ｋ，  Ｙａｍａｄａ  Ｈ，  Ｏｍｕｒａ  Ｓ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｅｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ６１：３７２−３７８（２００８）］  に従って行った。すなわち、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに前培養された原虫浮遊液  （原虫数２．０−２．５×１０４個／ｍＬに調整)  ９５μＬ  と化合物溶液  (５０％エタノール水溶液)５μＬを添加し、混和後、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で７２時間培養を行った。【００６４】
培養終了後、原虫増殖の測定は９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌにＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製、米国）１０μＬを添加、混和し、３７℃にて５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で３−６時間培養後、原虫の酸化還元電位を蛍光マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）にて励起波長５２８／２０ｎｍ、蛍光波長５９０／３５ｎｍでの蛍光強度を測定することにより、原虫の増殖の有無を比色定量した。本化合物の５０％原虫増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）は蛍光マイクロプレートリーダー付属ソフトウェアのＫＣ−４（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）の化合物濃度作用曲線より求めた。【００６５】
比較対象として培養トリパノソーマ原虫に対する効果を測定した既知の抗トリパノソーマ原虫剤として、スラミン及びエフロニチン［（Ｐｒｏｆ．  Ｒ．  Ｂｒｕｎ，  Ｓｗｉｓｓ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｂａｓｅｌ，  スイス国)  より分与］を用いた。【００６６】
本化合物と既知の抗トリパノソーマ原虫剤の培養トリパノソーマ原虫に対する抗トリパノソーマ原虫活性は以下の表５に示す通りであった。【００６７】
【表５】
0006007374.tif 000014
【００６８】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣのＴ．ｂ．ｂ．  ＧＵＴａｔ３．１株に対する抗トリパノソーマ原虫活性（ＩＣ５０値）は各々２．４４，４３．３９及び８．９０μｇ／ｍＬであり、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓの中でＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  Ａが最も優れた抗トリパノソーマ原虫活性を示した。その活性は既存の抗トリパノソーマ原虫剤と比較すると、スラミン及びエフロニチンと同等か若干劣る抗トリパノソーマ原虫活性であった。また、Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ｂ及びＣはスラミン及びエフロニチンの１/１９〜１/２８倍及び１/４〜１/６倍の抗トリパノソーマ原虫活性を示した。【００６９】
（実施例４）  細胞毒性試験
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣの細胞毒性試験は乙黒らの方法［Ｏｔｏｇｕｒｏ  Ｋ，  Ｋｏｈａｎａ  Ａ，  Ｍａｎａｂｅ  Ｃ，  Ｉｓｈｉｙａｍａ  Ａ，  Ｕｉ  Ｈ，  Ｓｈｉｏｍｉ  Ｋ，  Ｙａｍａｄａ  Ｈ，  Ｏｍｕｒａ  Ｓ．  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，  Ｘ−２０６．  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５４：６５８−６６３，（２００１）］に準じて行った。すなわち、宿主細胞のモデルとしてヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞［Ｄｒ．  Ｌ．  Ｍａｅｓ（Ｔｉｂｏｔｅｃ  ＮＶ，Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，ベルギー国)より分与可能］を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質添加ＭＥＭ培地にて維持、継代培養を行ったものを用いた。【００７０】
ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞を１０％ＦＣＳ−ＭＥＭにて１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように浮遊液を調整し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに該浮遊液を１００μＬ添加し混和後、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で２４時間培養を行った。その後、各ｗｅｌｌに１０％ＦＣＳ−ＭＥＭ９０μＬと本化合物の溶液（５０％エタノール水溶液）１０μＬを添加し、混和後、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で７日間培養を行った。ＭＲＣ−５細胞の増殖の有無はＭＴＴ法にて比色定量することにより測定した。本化合物の５０％細胞増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）を化合物濃度作用曲線より求めた。また、選択毒性比（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ：ＳＩ）は、（細胞毒性のＩＣ５０値）／（抗トリパノソーマ原虫活性のＩＣ５０値）により計算して求めた。【００７１】
ＩＣ５０と選択毒性比について計算した結果を下記の表６に示す。【００７２】
【表６】
0006007374.tif 000015
【００７３】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣのヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞に対する細胞毒性（ＩＣ５０値）は各々順に１６．０２，９２．６０及び＞１００μｇ／ｍＬであり、抗トリパノソーマ原虫活性との選択毒性比（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ：ＳＩ）は各々順に６．６，２．１及び＞１１．２であった。Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎ  ＡのＳＩは既存の抗トリパノソーマ原虫剤と比較すると、ペンタミジンの＞１／９．５倍、スラミンの＞１／６．７倍の選択毒性を示した。【００７４】
（実施例５）  抗菌活性
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣの抗菌活性は以下の方法で測定した。濾紙円板（アドバンテック社製、直径６ｍｍ）にＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣの１ｍｇ／ｍＬのメタノール溶液をそれぞれ１０μＬ浸漬し、一定時間風乾して溶媒を除去後、表７に記載の試験菌含菌寒天平板に張り付け、３５℃で２４時間培養後、濾紙円板の周りにできた生育阻止円の直径測定した。【００７５】
Ｍａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣの試験菌に対する抗菌として測定した阻止円径の結果を表７に示す。【００７６】
【表７】
0006007374.tif 000016
【００７７】
本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣは、表７に列挙された微生物に対してほとんど抗菌活性を示さなかった。よって、本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣはトリパノソーマ原虫に特異的であると考えることができる。【００７８】
以上の結果から本発明のＭａｎｇｒｏｍｉｃｉｎｓ  Ａ，Ｂ及びＣは、トリパノソーマ原虫の増殖を阻害する効果を有する一方、細胞毒性が低く、また他の微生物に対しては増殖抑制作用を示さないことから、トリパノソーマ原虫抑制物質又は抗トリパノソーマ原虫剤などの薬剤として非常に優れた効果を有することが示された。
【配列表】
0006007374000001.app