(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｇ２＋イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有さず、Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記ＲＮＡアプタマーが示す解離定数ＫＤは、ＫＤ≦１μＭであり、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−１−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−１−リン酸に対する結合能より有意に優っているＲＮＡアプタマーであり、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC−３’」の５’末端の固定領域、「５’−UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU−３’」の３’末端の固定領域、ならびに、前記二つの固定領域の間に配置される、３０塩基長のランダム配列部分に由来する領域により構成され、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1、I-2、I-4、I-6の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（I-1）  SPC-198:
5’- GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA 
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号：１)；
（I-2）  SPC-203:
5’- GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA 
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号：２)；
（I-4）  SPC-289:
5’- GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU 
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号：４)；
（I-6）  SPC-267:
5’ - GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGG 
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号：６)；
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
【請求項２】
Ｍｇ２＋イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有さず、Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記ＲＮＡアプタマーが示す解離定数ＫＤは、ＫＤ≦１μＭであり、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−１−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−１−リン酸に対する結合能より有意に優っているＲＮＡアプタマーであり、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のII-1〜II-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（II-1）  SPC-m009:
5’- GGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA 
UUCC -3’ (配列番号：１２)；
（II-2）  SPC-m010:
5’- GGAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU 
CC -3’ (配列番号：１３)；
（II-3）  SPC-m011:
5’- GGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA 
UUCC -3’ (配列番号：１４)；
（II-4）  SPC-m012:
5’- GGCGAAUUC 
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG 
CC -3’ (配列番号：１５)；
（II-5）  SPC-m013:
5’- GGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU 
CC -3’ (配列番号：１６)；
（II-6）  SPC-m014:
5’- GGACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU 
CC -3’ (配列番号：１７)；
（II-7）  SPC-m015:
5’- GGACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU 
CC -3’ (配列番号：１８)；
（II-8）  SPC-m016:
5’- GGCGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACG 
CC -3’ (配列番号：１９)；
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
【請求項３】
Ｍｇ２＋イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有さず、Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記ＲＮＡアプタマーが示す解離定数ＫＤは、ＫＤ≦１μＭであり、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−１−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−１−リン酸に対する結合能より有意に優っているＲＮＡアプタマーであり、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−GGCAACCACGACAUCCGG−３’」の５’末端の固定領域、「５’−CCGGAUGUCACACACAC−３’」の３’末端の固定領域、ならびに、前記二つの固定領域の間に配置される、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む「5’-N1N2N3N4N5N6UACCGUUAUUGGAG N’6N’5N’4N’3N’2N’1-3’」の３０塩基長の領域により構成される、下記のIII-1〜III-6とIII-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-1）  SPC-514:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
AAAGCC UACCGUUAUUGGAG AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２１)；
（III-2）  SPC-520:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
GAAGCC UACCGUUAUUGGAG AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２２)；
（III-3）  SPC-524:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
AAAGCC UACCGUUAUUGGAG UAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２３)；
（III-4）  SPC-562:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
CAGGCC UACCGUUAUUGGAG AAAAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２４)；
（III-5）  SPC-536:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
AAGGCC UACCGUUAUUGGAG AAUAUU
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２５)；
（III-6）  SPC-501:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
GCGGCC UACCGUUAUUGGAG UAAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２６)；
（III-8）  SPC-511:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG 
CGGGCC UACCGUUAUUGGAG AUAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号：２８)；
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
【請求項４】
Ｍｇ２＋イオンの存在下、Ｍｇ２＋イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記ＲＮＡアプタマーが示す解離定数ＫＤは、ＫＤ≦１μＭであり、
Ｍｇ２＋イオンの存在下、Ｍｇ２＋イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−１−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Ｍｇ２＋イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−１−リン酸に対する結合能より有意に優っているＲＮＡアプタマーであり、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC−３’」の５’末端の固定領域、「５’−UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU−３’」の３’末端の固定領域、ならびに、前記二つの固定領域の間に配置される、３０塩基長のランダム配列部分に由来する領域により構成され、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-10の塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（I-10）  SPC-213:
5’-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
GCAUUGUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA 
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号：１０)；
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するアプタマー分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性疾患、例えば、虚血性心疾患、虚血性脳卒中は、その直接の原因は、多くは、血栓、あるいは、動脈血管の攣縮である。虚血性心疾患の大半は、冠状動脈疾患であり、臨床的には、狭心症、心筋梗塞、さらには、突然心臓死の症状を伴う。
【０００３】
冠状動脈疾患を引き起こす、基礎疾患として、動脈硬化症、例えば、アテローム動脈硬化症、ならびに、高脂血症などの脂質代謝異常などが、指摘されている。前記の基礎疾患には、種々の内因性因子と環境因子（生活習慣など）が関与している。
【０００４】
虚血性疾患、例えば、急性の心筋梗塞においては、血液中に含まれる脂質代謝物、例えば、遊離脂肪酸の濃度の上昇が観測されることが報告されている。また、哺乳動物の細胞膜の構成成分の一つであるリン脂質の代謝物の血中濃度の上昇も観測されることも報告されている。
【０００５】
リン脂質は、脂質二重膜の構成を有する細胞膜の構成成分の一つであるとともに、生体内での信号伝達にも関与している。リン脂質は、グリセロリン脂質と、スフィンゴリン脂質に大別される。スフィンゴミエリン（Sphingomyelin:SPH）は、スフィンゴリン脂質の一種であり、ヒトにおいては、その体内に存在するスフィンゴ脂質全体量の８５％程度を占めるという報告もある。スフィンゴミエリンは、主に、哺乳動物の細胞膜の外膜に存在している。
【０００６】
【化１】
0005967687.tif 000002
【０００７】
哺乳動物の細胞膜には、脂質ラフトと呼ばれる膜ミクロドメインの一種が存在している。この脂質ラフトは、スフィンゴ脂質とコレステロールに富むドメインである。脂質ラフトは、膜タンパク質あるいは膜へと移行するタンパク質を集積し、膜を介したシグナル伝達、細菌やウィルスの感染、細胞接着あるいは細胞内小胞輸送、さらに細胞内極性などに重要な役割を有する機能ドメインであることが解明されてきている。
【０００８】
脂質ラフトは、脂肪酸として飽和脂肪酸を含むスフィンゴリン脂質あるいはスフィンゴ糖脂質を主成分としている。飽和脂肪酸は分子が直線状であるため、立体障害が少なく、スフィンゴ脂質は互いの分子が密に会合している。一方、折れ曲がった分子である不飽和脂肪酸で構成される脂質を多く含む他の領域は、比較的緩やかに会合している。その結果、脂質ラフトは、細胞膜の他の領域と比較して、流動性が比較的低くなっている。さらに、コレステロールはスフィンゴ脂質と親和性が高く、スフィンゴ脂質の間に挟み込まれる形で存在している。このコレステロールは、膜構造の高度なパッキングを保持しつつ、脂質ラフトに流動性を与えている。
【０００９】
シグナル伝達物質であるｓｒｃファミリーやＧタンパク質などは、Ｎ−アシル化を受けた状態では、そのアシル基を膜ドメインに突き刺す形態で、この脂質ラフトに局在する。その結果、これらのシグナル伝達物質は、同じく、脂質ラフトに局在している受容体と会合し、シグナルを中継する。一方、前記Ｎ−アシル化タンパク質のアシル基の半減期は、タンパク質自身の半減期よりも短く、アシル化と脱アシル化のサイクルを利用して、該脂質ラフトへの局在が調節されていると推測されている。
【００１０】
前記スフィンゴリン脂質であるスフィンゴミエリンは、細胞膜の構成成分の一つであるが、脱アシル化を受けたその代謝産物は、細胞膜に固定されず、水溶性のリン脂質として、血液中に含まれる。
【００１１】
スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC：Sphingosylphosphorylcholine）は、上記のスフィンゴミエリンにおいて、Ｎ−アシル化を行っている脂肪酸が脱アシル化を受けた構造を有している。
【００１２】
【化２】
0005967687.tif 000003
【００１３】
SPCは、カルシウム非依存性異常収縮を惹起することから、虚血性疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、さらには、脳卒中の要因との相関性が着目されている。すなわち、血栓、あるいは、動脈血管の攣縮に起因する、虚血性疾患、特には、狭心症、心筋梗塞、さらには、突然心臓死の発症リスクを推定する際に利用可能な、バイオマーカーの一つとなり得る。
【００１４】
スフィンゴシン−１−リン酸（Sphingosine-1-phosphate:S1P）は、スフィンゴミエリン中のリン酸エステルの加水分解により、コリン（H-CH2CH2-N+(CH3)3）が脱離し、さらに、Ｎ−アシル化を行っている脂肪酸が脱アシル化を受けた構造を有している。
【００１５】
【化３】
0005967687.tif 000004
【００１６】
スフィンゴシン−１−リン酸は、リゾリン脂質の一種である。細胞膜の外膜に存在する、スフィンゴミエリンから酵素により切り出されたS1Pは、細胞膜表面に発現しているＧタンパク質共役受容体に結合することによって、細胞遊走などを誘起する生活活性物質である。このS1Pによる細胞遊走の誘起は、１０〜１００ｎＭの低濃度でも引き起こされる。一方、循環血液中に存在するS1Pの大部分は、血中タンパク質である、ＨＤＬなどのリポタンパク質やアルブミンと結合している結果、前記の機能は抑制されていると報告されている。
【００１７】
S1Pは、S1Pホスファターゼ−１（SPP-1）あるいはS1Pホスファターゼ−２（SPP-2）による脱リン酸化反応を受けると、前記Ｇタンパク質共役受容体に対する結合能を失い、結果的に、その活性を失う。S1Pに対する受容体である、Ｇタンパク質共役受容体型のS1P受容体として、少なくとも５種のS1P受容体：S1P1〜S1P5の存在が報告されている。
【００１８】
S1Pの産生機構としては、前記のスフィンゴミエリンの代謝による機構に加えて、後述するスフィンゴシンのスフィンゴシン・キナーゼ（SphK）によるリン酸化により産生され、ABCトランスポーターを介して細胞外へ放出される機構も報告されている。
【００１９】
SphKにはSphK1とSphK2の２種類が存在しており、細胞に対してインターロイキン-1β（IL-1β）や血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、TNF-αなどの様々な刺激が加わった場合に、SphKが活性化し、S1Pの産生が促進される。前記の各種の因子による刺激を受ける、血小板やマクロファージ、赤血球などでは、SphKによるリン酸化の機構によって、S1Pが多く産生される。
【００２０】
その他、S1Pは、細胞外からカルシウムイオン流入を引き起こすセカンドメセンジャーの機能を有しており、そのため、様々な細胞内プロセスに関与することも知られている。S1Pは、例えば、細胞運動の制御、細胞増殖、細胞骨格の形成等を誘起する機能を有している。
【００２１】
スフィンゴシンは、スフィンゴミエリン中のリン酸エステルの加水分解により、ホスホリルコリン（HO-PO(OH)-O-CH2CH2-N+(CH3)3）が脱離し、さらに、Ｎ−アシル化を行っている脂肪酸が脱アシル化を受けた構造を有している。
【００２２】
【化４】
0005967687.tif 000005
【００２３】
スフィンゴシン自体は、細胞をアポトーシスに導く活性を有している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
上記の観点から、水溶性のリン脂質として、血液中に含有される、各種のスフィンゴミエリンの代謝産物の濃度と、虚血性疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、さらには、脳卒中の発症リスクとの相関性の研究が進められている。具体的には、虚血性疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、さらには、脳卒中を発症した患者から採取した血液中に含有される、各種のスフィンゴミエリンの代謝産物の濃度と、その患者の症状との相関性、その発症の直接的原因との相関性の研究が進められている。
【００２５】
例えば、健常者の血液中に含有されるSPCの濃度は、数ｎＭ程度と報告されている。そのため、現状、SPCの血中濃度の定量には、例えば、血漿中に含有されるSPCをクロマト法を適用して、分取した後、質量分析を利用して、その定量を行う方法が利用されている。
【００２６】
将来的に、SPCが、例えば、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、さらには突然心臓死の発症リスクを予測する際に、そのバイオマーカーとして利用可能であることが解明された場合には、臨床的に応用する上では、SPCの血中濃度をより簡便に測定する手法が必要となる。具体的には、血液中に含有されるSPCの濃度を、より簡便に測定可能なバイオセンサの開発が望まれている。
【００２７】
血液中に含有される生体物質を特異的に検出する手段としては、従来から、検出対象の生体物質に対して、特異的な反応性を有する抗体が利用されている。
【００２８】
例えば、哺乳動物が共通して有している、内因性の生体物質である、リン脂質に対する自己抗体ができることによる、自己免疫疾患である、抗リン脂質抗体症候群（Anti-phospholipid antibody syndrome; APS）は知られているが、通常、内因性の生体物質である、リン脂質に対する特異的抗体の創製は極めて困難である。
【００２９】
従って、特異的抗体の創製が極めて困難である、内因性の生体物質に対しては、特異的な結合能を示す核酸分子であるアプタマーの作製が広く応用されつつある。哺乳動物に共通する内因性の生体物質である、スフィンゴリン脂質の一種である、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に関しても、該SPCに対する特異的な結合能を示すアプタマーの創製と、該アプタマーを利用するバイオセンサの開発が望まれる。
【００３０】
その際、血液中には、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に加えて、類似の分子構造を有する、スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンが共存している。従って、これらスフィンゴシン−１−リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンに対する交差反応性は低く、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、特異的な結合能を示すアプタマーの創製が望まれる。
【００３１】
本発明は前記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、特異的な結合能を示すアプタマーを提供することにある。特には、本発明の目的は、スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンに対する交差反応性は低く、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、特異的な結合能を示すアプタマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、まず、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、一定以上の結合能を示す「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」が実際に存在するか否かの確認を行った。さらに、仮に、一定以上の結合能を示す「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」が存在する際には、その「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」を構成する一本鎖核酸分子の塩基配列を特定することを試みた。
【００３３】
スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、一定以上の結合能を示す「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」の探索に先立ち、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）、スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンは、ｐＨが７前後の水溶液中において、どのような形状で溶解しているかに関して、考察した。
【００３４】
加えて、「ＲＮＡアプタマー分子の探索」を進める際、これら水溶性化合物を固定化する必要があり、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）、スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンに、それぞれ、ビオチン化を施した誘導体を利用している。該ビオチン化を施した誘導体に関しても、ｐＨが７前後の水溶液中において、どのような形状で存在するかに関して、考察した。
【００３５】
対象分子であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）は、疎水性部分であるスフィンゴシンのヒドロキシル基（−ＯＨ）と、親水性部分であるホスホリルコリン（コリンリン酸）のリン酸基（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）2）とが、リン酸エステル結合（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−）を形成した構造を有している。このホスホリルコリン（コリンリン酸）に由来する親水的な原子団（−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）は、ｐＨによっては、そのリン酸エステル結合（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−）のイオン化が起こり、両性イオン構造（−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ（Ｏ-）−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）に変換可能である。従って、該スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）は、カチオン性、または、両性界面活性剤の機能を有していると推断される。
【００３６】
なお、スフィンゴシン骨格のアミノ基が、Ｎ−アシル化されている、スフィンゴミエリンにおいては、該リン酸エステル結合（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−）のｐＫは、約１３であると報告されている。従って、スフィンゴミエリン中に存在する、該ホスホリルコリン（コリンリン酸）に由来する親水的な原子団は、ある比率で、両性イオン構造（−Ｏ−ＰＯ（Ｏ-）−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）となっていると推断される。
【００３７】
スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、ビオチン化を施した、ビオチン化SPCでは、ビオチン（biotin：5-[(3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H- シエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル]ペンタン酸）を、スフィンゴシン骨格の末端に導入したアミノ基上にＮ−アシル化反応により結合している。従って、ビオチン化SPCの親水的な原子団は、SPCのかかる領域と、その部分構造は、実質的に同一である。すなわち、ビオチン化SPC中に存在する、該ホスホリルコリン（コリンリン酸）に由来する親水的な原子団は、ある比率で、両性イオン構造（−Ｏ−ＰＯ（Ｏ-）−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）となっていると推断される。
【００３８】
また、スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）は、疎水性部分であるスフィンゴシンの末端のヒドロキシル基（−ＯＨ）に対して、リン酸（ＨＯ−ＰＯ（ＯＨ）2）が、リン酸エステル結合（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）2）を形成した構造を有している。このリン酸エステル部分は、ｐＨが、６〜８程度の水溶液中では、イオン化し、例えば、アニオン性原子団（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ-）に変換される。その際、リン酸化されている部位は、−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−Ｏ−の部分構造を有しており、該部分のアミノ基（−ＮＨ2）は、プロトン受容部位としての機能を具えている。結果的に、かかる分子内のプロトン供与／受容が達成されると、両性イオン構造：−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−+ＮＨ3）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ-が構成される。あるいは、部分的に、さらにイオン化が進行すると、次の構造：−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−+ＮＨ3）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ32-に達する。
【００３９】
従って、該スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）は、疎水性部分と、前記両性イオン構造、あるいは、アニオン性の親水性部分を具えており、アニオン性界面活性剤の機能を有していると推断される。
【００４０】
スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）に対して、ビオチン化を施した、ビオチン化S1Pでも、ビオチンを、スフィンゴシン骨格の末端に導入したアミノ基上にＮ−アシル化反応により結合している。従って、ビオチン化S1P中においても、その親水的な原子団は、S1Pのかかる領域と、その部分構造は、実質的に同一である。すなわち、分子内のプロトン供与／受容が達成されると、両性イオン構造：−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−+ＮＨ3）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ-が構成される。あるいは、部分的に、さらにイオン化が進行すると、次の構造：−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−+ＮＨ3）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ32-に達する。
【００４１】
さらには、スフィンゴシン自体も、疎水性に富む直鎖の炭化水素基部分と、親水性基であるアミノ基（−ＮＨ2）とヒドロキシル基（−ＯＨ）を具える親水性原子団（−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−ＯＨ）を具えている。その際、水溶液中では、ｐＨによっては、該アミノ基（−ＮＨ2）はイオン化し、カチオン（−+ＮＨ3）に変換される。従って、該スフィンゴシンは、疎水性部分と、非イオン性、または、カチオン性の親水性部分を具えており、非イオン性、または、カチオン性界面活性剤の機能を有していると推断される。
【００４２】
一方、例えば、エタノールアミン（ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2）は、金属表面や金属カチオンに対するキレート配位子として機能する。このキレート配位子の機能を考慮すると、エタノールアミン（ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2）は、多くの場合、カチオン種の形状を示していないと推断される。同様に、該スフィンゴシン中の親水性原子団（−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−ＯＨ）も、多くの場合、カチオン種の形状を示していないと推断される。
【００４３】
スフィンゴシンに対して、ビオチン化を施した、ビオチン化スフィンゴシンでも、ビオチンを、スフィンゴシン骨格の末端に導入したアミノ基上にＮ−アシル化反応により結合している。従って、ビオチン化スフィンゴシンにおいても、その親水的な原子団は、スフィンゴシンのかかる領域と、その部分構造は、実質的に同一である。すなわち、該ビオチン化スフィンゴシン中の親水性原子団（−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−ＯＨ）も、多くの場合、カチオン種の形状を示していないと推断される。
【００４４】
従って、ビオチン化SPCを利用するスクリーニング過程で、選別される「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」中には、該ビオチン化SPC中の疎水性部分である、スフィンゴシンの炭化水素鎖部分との疎水的相互作用を行う部分と、ホスホコリンに由来する親水的な原子団（−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＮＨ2）−ＣＨ2−Ｏ−ＰＯ（Ｏ-）−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）との相互作用を有する部分を具えていると、推断される。
【００４５】
一般に、対象分子に対する「ＲＮＡアプタマー分子」の探索には、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製し、対象分子に対する結合能に関して、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングが利用される。
【００４６】
ビオチン化SPC中のSPC部分のサイズは、Ｃ−Ｃ結合距離は、１．５Å程度であることを考慮すると、３０Å以下である。この程度の分子サイズの化合物と分子間結合を形成する「ＲＮＡアプタマー分子」は、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、３０塩基長の部分（Ｎ30）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中に存在していると予測した。
【００４７】
本発明者らは、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、３０塩基長の部分（Ｎ30）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」として、
５’末端の固定領域：GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC；（２６塩基）
３０塩基長のランダム配列部分：（Ｎ30）；
３’末端の固定領域：UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU；（２４塩基）
を具える、全長８０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を選択した。
【００４８】
アガロース・ビーズ上に固定化したStreptavidinタンパク質、あるいは、Neutravidinタンパク質に、結合させたビオチン化SPCを利用して、アガロース・ビーズ上に固定化したStreptavidinタンパク質、あるいは、Neutravidinタンパク質には結合能を有さないが、前記ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を探索した。
【００４９】
バインディング・バッファ溶液として、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClを用いて、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング・ラウンドを延べ１２ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。
【００５０】
前記１２ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群に対して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能に関して、さらに、スクリーニングを行い、合計１３ラウンドの選別を行った、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の群を回収した。
【００５１】
前記合計１３ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」から、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能の評価を行って、少なくとも、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫDが、ＫD≦１μＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」を選択した。さらに、前記の選択条件を満足する「ＲＮＡアプタマー分子」について、その塩基配列を解析した。
【００５２】
塩基配列の解析結果に基づき、前記の選択条件を満足する「ＲＮＡアプタマー分子」の一群のクローンにおいて、その「ランダムな塩基配列」部分が一致しているクローン数が２以上存在する、クローン・ファミリーを選別した。さらに、選別されたクローン・ファミリーの「ランダムな塩基配列」部分と比較し、一塩基が相違するクローンを選別して、該クローン・ファミリーの一塩基変異型メンバーとした。
【００５３】
前記の選別されたクローン・ファミリーの間において、その「ランダムな塩基配列」部分を比較した結果、一つのクローン・ファミリーを除き、共通性を示す部位が存在していることを見出した。この共通性を示す部位は、実際に、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列が、全体の塩基配列上、同じ位置に存在しており、一つのクローン・ファミリーを除き、残るクローン・ファミリーは、相互に類似する二次構造を有すると、推断された。実際に、前記の選別されたクローン・ファミリーについて、その二次構造の推定を行った結果、一つのクローン・ファミリーを除き、相互に類似する二次構造を有すると推定された。
【００５４】
加えて、前記「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列中の“CGUUAUU”、“CCGUU”、“CGUUA”、“CCGUUAU”の部分配列に相当する、“CXUUXXU”、“CCXUU”、“CXUUA”、“CXXUXAU”のモチーフ配列は、選別された「ＲＮＡアプタマー分子」クローンの過半数以上が有していることも、確認された。また、前記「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を有していない、一つのクローン・ファミリーも、前記のモチーフ配列を有しており、類似する「５’−GCAUUAUUGT−３’」という部位を有していた。
【００５５】
前記「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を具えているクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸すと、速やかに解離することが確認された。従って、これらのクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、Ｍｇカチオンが含有されており、該ＭｇカチオンをＥＤＴＡにより除去すると、該複合体の解離がなされると推断された。一方、類似する「５’−GCAUUAUUGT−３’」の配列を有するクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸しても、全く、解離の促進はなされないことが確認された。従って、このクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、Ｍｇカチオンが含有されていない結果、ＥＤＴＡを作用させても、該複合体の解離は全く促進されないと、推断された。
【００５６】
前記の選別されたクローン・ファミリーについて、推定された二次構造中において、前記「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列は、“Hair pin”ループの形状を示す領域に含まれていた。また、前記の類似する「５’−GCAUUAUUGU−３’」という部位も、“Hair pin”ループの形状を示す領域に含まれていた。すなわち、各「ＲＮＡアプタマー分子」クローン・ファミリーの「ランダムな塩基配列」部分は、前記の“Hair pin”ループの形状を示す領域を内在していた。各選別されたクローン・ファミリーについて、推定された二次構造中、前記の“Hair pin”ループの形状を示す領域を中心とする部分的な二次構造を利用して、前記ビオチン化SPCに対する結合を達成していると、推断された。一方、５’末端の固定領域と３’末端の固定領域とで構成される、二次構造部分は、前記ビオチン化SPCに対する結合に直接関与していないと、推断された。
【００５７】
実際に、前記の“Hair pin”ループの形状を示す領域を中心とする部分的な二次構造が形成可能な、前記「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列、または、類似の「５’−GCAUUAUUGU−３’」の部分配列を含む、５５塩基長以下、３０塩基長以上の一本鎖ＲＮＡ分子を調製し、該一本鎖ＲＮＡ分子も、ビオチン化SPCに対する結合能を具えていることを検証した。
【００５８】
さらに、前記の“Hair pin”ループの形状を示す領域を内在し、全体として、“Hair pin”状の二次構造を形成可能な、下記の全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能を具えている「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。該全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」は、
５’末端の固定領域：GGCAACCACGACAUCCGG；（１８塩基）
６塩基長の第一ランダム配列部分：Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6；（６塩基）
「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の定常領域：UACCGUUAUUGGUG；（１４塩基）
６塩基長の第二ランダム配列部分：Ｎ’6Ｎ’5Ｎ’4Ｎ’3Ｎ’2Ｎ’1；（６塩基）
３’末端の固定領域：CCGGAUGUCACACACACG；（１８塩基）
を具えている。
【００５９】
前記全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能は低いが、ビオチン化SPCに対して、高い結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を探索した。
【００６０】
バインディング・バッファ溶液として、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClを用いて、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング・ラウンドを延べ５ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。
【００６１】
前記５ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群に対して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能に関して、さらに、２段階のスクリーニングを行い、合計７ラウンドの選別を行った、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能は低いが、ビオチン化SPCに対して、相対的に高い結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の群を回収した。
【００６２】
前記合計７ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」から、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能の評価を行って、少なくとも、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫDが、ＫD≦１μＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」を選択した。さらに、前記の選択条件を満足する、全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」について、その塩基配列を解析した。
【００６３】
解析された塩基配列に基づき、前記の選択条件を満足する、全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」の二次構造の推定を行った。その結果、選別された、前記全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」の二次構造は、前記「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む、“Hair pin”ループ形状を保持していると推定された。
【００６４】
選別された、前記全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」の塩基配列中、６塩基長の第一ランダム配列部分、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む“Hair pin”ループ形成用の定常領域、６塩基長の第二ランダム配列部分を含む、３０塩基〜３４塩基の部分配列を選択して、小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」を調製した。これらの小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」について、ビオチン化SPCに対する結合能の評価を行った。その結果、前記の小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」も、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫDが、ＫD≦１μＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」に相当することが確認された。
【００６５】
なお、選別された、前記全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」と、その部分配列を含んでいる、３０塩基〜３４塩基長の、小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、それらとビオチン化SPCの複合体は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸すと、速やかに解離することが確認された。従って、これらの「一本鎖ＲＮＡ分子」では、該「一本鎖ＲＮＡ分子」とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、Ｍｇカチオンが含有されており、該ＭｇカチオンをＥＤＴＡにより除去すると、該複合体の解離がなされると推断された。
【００６６】
本発明者らは、以上に述べた一連の検討の結果に基づき、本発明を完成するに至った。
【００６７】
本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1〜I-11の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（I-1）  SPC-198:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA 
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：１)；
（I-2）  SPC-203:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：２)；
（I-3）  SPC-209:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGUU
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：３)；
（I-4）  SPC-289:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：４)；
（I-5）  SPC-261:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：５)；
（I-6）  SPC-267:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGG
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：６)；
（I-7）  SPC-215:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCUGUCGAUUUGCUGGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：７)；
（I-8）  SPC-219:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UCCCGUUAUUGGAGUCACGCGUAGUCCUCC
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：８)；
（I-9）  SPC-259:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGACGCUUAGAUGUCCGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：９)；
（I-10）  SPC-213:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
GCAUUGUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：１０)；
（I-11）  SPC-273:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC 
GUCCGUUAUUGGCGCCAGCGUACAUGCGGG
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号：１１)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【００６８】
本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの一例は、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のII-1〜II-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（II-1）  SPC-m009:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA 
UUCC -3' (配列番号：１２)；
（II-2）  SPC-m010:
5'-GGAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU 
CC -3' (配列番号：１３)；
（II-3）  SPC-m011:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCC -3' (配列番号：１４)；
（II-4）  SPC-m012:
5'-GGCGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG
CC -3' (配列番号：１５)；
（II-5）  SPC-m013:
5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
CC -3' (配列番号：１６)；
（II-6）  SPC-m014:
5'-GGACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU 
CC -3' (配列番号：１７)；
（II-7）  SPC-m015:
5'-GGACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU
CC -3' (配列番号：１８)；
（II-8）  SPC-m016:
5'-GGCGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACG 
CC -3' (配列番号：１９)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【００６９】
本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの他の例は、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列に類する「５’−GCAUUAUUGU−３’」の配列をその一部に含む、下記のII-9の塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（II-9）  SPC-m007:
5'-G G
GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA 
UUCACUGCAGACUUGAC C C -3' (配列番号：２０)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【００７０】
本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの一例は、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-1〜III-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-1）  SPC-514:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２１)；
（III-2）  SPC-520:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
GAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２２)；
（III-3）  SPC-524:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２３)；
（III-4）  SPC-562:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CAGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２４)；
（III-5）  SPC-536:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAUAUU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２５)；
（III-6）  SPC-501:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
GCGGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２６)；
（III-7）  SPC-569:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
GCGGCC
UACCGUUAUUGGAG
ACAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２７)；
（III-8）  SPC-511:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CGGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AUAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２８)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【００７１】
本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの他の例は、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-9〜III-12の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-9）  SPC-556:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CAAGCA
UACCGUUAUUGGUG
AAAAAC
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：２９)；
（III-10）  SPC-546:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGAC
UACCGUUAUUGGUG
CAAAAU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：３０)；
（III-11）  SPC-551:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAUUA
UACCGUUAUUGGUG
CAAACA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：３１)；
（III-12）  SPC-583:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CCAGCA
UACCGUUAUUGGUG
CAACAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：３２)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【００７２】
本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの他の一例は、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-13〜III-14の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-13）  SPC-548:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CACCUA
UACCGUUAUUGGUG
CGCAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：３３)；
（III-14）  SPC-547:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CAAACA
UACCGUUAUAGGUG
CGCAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号：３４)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【００７３】
本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの一例は、
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIV-1〜IV-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（IV-1）  SPC-m017:
5'- GGGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCCC -3' (配列番号：３５)；
（IV-2）  SPC-m018:
5'- GGG 
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCC -3' (配列番号：３６)；
（IV-3）  SPC-m019:
5'- GGG 
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CC -3' (配列番号：３７)；
（IV-4）  SPC-m020:
5'- GGG 
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
C -3' (配列番号：３８)；
ことを特徴とするアプタマーである。
【発明の効果】
【００７４】
本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、循環血液中に含まれる、遊離のリン脂質のうち、遊離のスフィンゴリン脂質の一種であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）と特異的な複合体形成が可能である。従って、本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、遊離のスフィンゴリン脂質の一種であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）について、特異的な複合体形成を利用して、その循環血液中の濃度を定量する目的に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」をＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して、選別する工程における、各ラウンドにおける選別試料中に含有される「ＲＮＡアプタマー分子」の濃縮程度を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図２】図２は、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」のクローンにおいて、複数のクローンが見出されたクローン・ファミリーに関して、そのｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の挙動について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図４−１】図４−１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図４−２】図４−２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２０３に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図４−３】図４−３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２１３に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図５−１】図５−１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２８９に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の挙動について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図５−２】図５−２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２６７に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の挙動について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図６−１】図６−１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。
【図６−２】図６−２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２０３に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。
【図６−３】図６−３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２８９に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。
【図６−４】図６−４は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２６７に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。
【図６−５】図６−５は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２１３に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。
【図７−１】図７−１は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０の推定される二次構造を示す図である。
【図７−２】図７−２は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２０３に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２の推定される二次構造を示す図である。
【図７−３】図７−３は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２８９に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４の推定される二次構造を示す図である。
【図７−４】図７−４は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２６７に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６の推定される二次構造を示す図である。
【図７−５】図７−５は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−２１３に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００７の推定される二次構造を示す図である。
【図８−１】図８−１は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図８−２】図８−２は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００７について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図９−１】図９−１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に関して、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動、ならびに、各解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図９−２】図９−２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に関して、ビオチン化S1Pに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動、ならびに、各解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図９−３】図９−３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に関して、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動、ならびに、各解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１０−１】図１０−１は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１０−２】図１０−２は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化S1Pに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１０−３】図１０−３は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、該複合体の解離過程の挙動に対する、バインディング・バッファ溶液中のＮａＣｌ濃度の影響を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６について、その塩基配列の対比を行った結果を示す図である。
【図１３】図１３は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６の塩基配列比較において、「ランダム配列」に由来する領域中に見出された、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む、特徴的な「ヘアピン」構造部分と、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の５’末端の固定領域、３’末端の固定領域に由来する部位を、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９の予測二次構造上に表示する図である。
【図１４】図１４は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８の塩基配列に基づき設計された、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」の塩基配列と、「６塩基長の第一ランダム配列部分」と「６塩基長の第二ランダム配列部分」を含む期待される二次構造を示す図である。
【図１５】図１５は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能は相対的に低いが、ビオチン化SPCに対して、相対的に高い結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別する工程を模式的に示す図である。
【図１６】図１６は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の各クローンについて、そのｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を示す図である。
【図１７−１】図１７−１は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１７−２】図１７−２は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化S1Pに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１７−３】図１７−３は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１８−１】図１８−１は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８、SPCに対する結合能を有する小型化「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−ｍ０１２について、液温２５℃、３７℃の二温度条件における、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１８−２】図１８−２は、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−５２４、ＳＰＣ−５２０について、液温２５℃、３７℃の二温度条件における、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。
【図１９】図１９は、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」のクローンにおいて、複数のクローンが見出されたクローン・ファミリーに関して、そのｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を示す図である。
【図２０】図２０は、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−５２４の塩基配列から推定される二次構造と、該ＳＰＣ−５２４の推定二次構造に基づき設計された、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９、ＳＰＣ−ｍ０２０の塩基配列と、その期待される二次構造を示す図である。
【図２１】図２１は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−１９８、小型化された一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ−ｍ０１２、本発明の第三の実施態様にかかる、「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ−５２４と、小型化された一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９、ＳＰＣ−ｍ０２０について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する相対的な結合量を評価した結果の一例を示す図である。図２１には、ＳＰＣ−ｍ０１７に対して、該ＲＮＡ中に含まれる、Ｕ，Ｃの２’−ＯＨ基をＦ，Ｈ，−ＯＣＨ3に置換してなる、各種の修飾ＳＰＣ−ｍ０１７分子について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する相対的な結合量を評価した結果の一例も併せて示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明にかかるSPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」に関して、より詳細に説明する。
【００７７】
（第一の形態）
本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、水溶性のスフィンゴリン脂質である、下記のスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に代えて、ビオチン化スフィンゴシルホスホリルコリン（ビオチン化SPC）を利用して、該ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選別されたものである。
【００７８】
【化５】
0005967687.tif 000006
【００７９】
【化６】
0005967687.tif 000007
【００８０】
具体的には、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、３０塩基長の「ランダム配列部分（Ｎ30）」を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成される「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」から、ＳＥＬＥＸ法を適用して、前記ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選択されたものである。
【００８１】
５’末端の固定領域：GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC；（２６塩基）
３０塩基長のランダム配列部分：（Ｎ30）；
３’末端の固定領域：UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU；（２４塩基）
ＳＥＬＥＸ法を適用した、前記ビオチン化SPCとの複合体形成能に基づく、スクリーニング工程では、前記ビオチン化SPCとの複合体形成、ならびに、形成された複合体の解離は、下記の条件を採用している。
【００８２】
（ｉ）  「初回ラウンド」用の「ＲＮＡプール」の調製
上記の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」を構成する一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
【００８３】
「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、各二本鎖ＤＮＡ分子は、下記の「Ｔ７プロモーター領域」、５’末端の固定領域、３０塩基長のランダム配列部分、３’末端の固定領域からなる塩基配列Ｒcandidate0を有している。
【００８４】
５’末端の「Ｔ７プロモーター領域」：GATAATACGACTCACTATA；（１９塩基）
５’末端の固定領域：GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC；（２６塩基）
Ｎ30ランダム配列部分：NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN；
３’末端の固定領域：TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT；（２４塩基）
そのＮ30ランダム配列部分は、ＧＣの含有比率は、５０％に選択されている。
【００８５】
（ii）  ビオチン化SPCとの複合体形成条件
ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、ビオチン化SPCは、市販(PIERCE社)の「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（Streptavidin Agarose bead: SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（Neutravidin Agarose bead: NA bead）を利用して、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質による、ビオチンの結合によって、前記ビーズ上に固定化する。
【００８６】
前記ビーズ上に固定化されている、ビオチン化SPCに対して、下記の組成のバインディング・バッファ溶液中に溶解している一本鎖ＲＮＡ分子を作用させ、ビオチン化SPCとの複合体形成を行わせる。使用されるバインディング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClである。
【００８７】
一方、該バインディング・バッファ溶液中に溶解している、一本鎖ＲＮＡ分子は、予め、“folding”処理を施す。すなわち、各一本鎖ＲＮＡ分子は、その塩基配列に従って、内在する「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造を含む、二次構造の形成、ならびに、全体として、三次構造の形成がなされた状態とする。通常、“folding”処理を施すことにより、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。
【００８８】
なお、三次構造を形成する過程において、一本鎖ＲＮＡ分子は、場合によっては、該バインディング・バッファ溶液中に存在する二価の金属カチオン種：Ｍｇ2+に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合を形成することもある。すなわち、“folding”処理で形成される一本鎖ＲＮＡ分子の三次構造中に、二価の金属カチオン種：Ｍｇ2+に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合が形成されている部位が内在されていることもある。
【００８９】
バインディング・バッファ溶液を固液分離により除去し、該ビーズを回収する。回収されたビーズの表面に、非選択的に付着している、一本鎖ＲＮＡ分子は、前記バインディング・バッファ溶液を用いて、洗浄処理を行うことで、速やかに洗浄液中に再溶解する。一方、ビオチン化SPCとの複合体形成を介して、該ビーズ上に結合されている、一本鎖ＲＮＡ分子では、洗浄液中への溶出は相対的に緩やかに進行する。その結果、前記の洗浄処理後、固液分離によって回収されるビーズとともに、ビオチン化SPCとの複合体形成している一本鎖ＲＮＡ分子が回収される。
【００９０】
（iii）  ビオチン化SPCとの複合体の解離条件
ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、ビーズ上に固定化されている、ビオチン化SPCと複合体を形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を回収するため、下記の条件で、該複合体の解離を行う。
【００９１】
ビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質と、ビオチン部分との結合の解離を回避し、ビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子との複合体の解離のみが進行する条件を採用する。具体的には、下記の処理を施すことで、一本鎖ＲＮＡ分子の有する二次構造、ならびに三次構造を解消することで、該ビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子との複合体の解離を行っている。
【００９２】
ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドで回収されるビーズを、組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Ureaの溶出バッファ溶液、ビーズ量、カラムボリューム（ＣＶ）を基準として、その三倍容中に浸漬し、９０℃で５分間加熱し、一本鎖ＲＮＡ分子の“unfolding”処理を施す。該“unfolding”処理によって、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。
【００９３】
溶出された、一本鎖ＲＮＡ分子を含有する溶出バッファ溶液は、ビーズと固液分離され、回収される。この回収された溶出バッファ溶液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。
【００９４】
（iv）  表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の分離条件
ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返した後、最終的に、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールから、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を下記の条件で分離する。
【００９５】
表面プラズモン共鳴測定装置のセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質を固定化し、固定化されたStreptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させる。
【００９６】
このセンサ・チップ上に固定化された、ビオチン化SPCに、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールを作用させる。その結果、該ＲＮＡプール中に含まれる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、固定化されているビオチン化SPCと複合体を形成する。該ＲＮＡプール自体は、前記バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を溶解したものであり、前記「ＲＮＡアプタマー分子」と、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成は、該バインディング・バッファ溶液中において進行する。
【００９７】
複合体形成過程を終えた後、ＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液をセンサ・チップ上に流し、ＲＮＡプール液を流し出す。このＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液を用いた洗浄過程の間に、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」の一部も解離するが、大部分の「ＲＮＡアプタマー分子」は、複合体を形成した状態を維持している。
【００９８】
洗浄過程の終了後、下記の組成の溶出液をセンサ・チップ上に流し、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」を溶出させる。この溶出過程で使用される溶出液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。
【００９９】
該溶出過程では、液温度２５℃で、前記溶出液２μＬを、センサ・チップ上に満たし、５分間インキュベーションする間に、Ｍｇ2+イオンをＥＤＴＡ錯体として除去する。その結果、マグネシウムイオン依存的にビオチン化SPCと複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択的に解離させている。すなわち、該溶出液中には、ビオチン化SPCに対して、マグネシウムイオン依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が回収されている。
【０１００】
センサ・チップ上から、前記溶出液を回収し、該回収された溶出液から、含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。
【０１０１】
一方、マグネシウムイオン非依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子に関しては、Ｍｇ2+イオンをＥＤＴＡ錯体として除去する処理は、複合体の解離を促進しないが、上記の溶出過程の間に、若干解離が進む。そのため、回収される溶出液中には、マグネシウムイオン非依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子も僅かに含まれている。
【０１０２】
（v）  アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去条件
ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮も、不可避的に進行する。
【０１０３】
ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の濃縮を行う際、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避するため、「Pre-selection操作」を利用する。
【０１０４】
該「Pre-selection操作」は、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドで利用するＲＮＡプール溶液を、ビオチン化SPCの固定化に利用する、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）に予め作用させる操作である。
【０１０５】
「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）に作用させると、該ＲＮＡプール溶液中に含まれる、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、該ビーズ上に結合される。その結果、該ビーズと固液分離され、回収される、ＲＮＡプール溶液中に残余する、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃度は、大幅に低減されている。
【０１０６】
該「Pre-selection操作」を予め施した、ＲＮＡプール溶液を利用して、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを行うと、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は濃縮を受けるが、予め、ＲＮＡプール溶液中の含有濃度を低減している結果、回収される溶出バッファ溶液中に含まれる「一本鎖ＲＮＡ分子」中における、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の比率は、相対的に低い水準となっている。
【０１０７】
従って、該「Pre-selection操作」を利用することで、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返しても、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を実質的に回避することが可能となる。
【０１０８】
（vi）  「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」の調製
「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」より調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
【０１０９】
回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、下記のForward Primer とReverse Primerを利用して、RT-PCR法を適用する。
【０１１０】
Forward Primer：（配列番号：３９）
5'- GATAATACGACTCACTATA GGGAATGGATCCACATCTACGA -3'
Reverse Primer：（配列番号：４０）
5'- AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA -3'
前記Reverse Primerは、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の３’末端の固定領域と相補的な塩基配列である。
【０１１１】
5'- UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3'
3'- AAGTGACGTCTGAACTGCTTCGAA -5'
前記Forward Primerは、「Ｔ７プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域の大部分とで構成されている。
【０１１２】
「Ｔ７プロモーター領域」：5'- GATAATACGACTCACTATA -3'
５’末端の固定領域の大部分：5'- GGGAATGGATCCACATCTACGA -3'
その結果、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子の塩基配列は、５’末端にForward Primerに起因する領域、３’末端にReverse Primerに相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域の一部：AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。
【０１１３】
Forward Primerに起因する領域：
GATAATACGACTCACTATA GGGAATGGATCCACATCTACGA 
５’末端の固定領域の一部：AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域：
ATTC NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN
Reverse Primerに相補的な領域：
TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT
調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製される「一本鎖ＲＮＡ分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。
【０１１４】
調製された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応溶液から回収し、上記のバインディング・バッファ溶液中に、所定の濃度で溶解して、次段ラウンドで利用する「ＲＮＡプール」とする。なお、「一本鎖ＲＮＡ分子」に対して、“re-folding”処理を施す。その結果、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。
【０１１５】
（第一の実施態様）
第一の実施態様では、本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを選別する一連の工程の一例を以下に説明する。
【０１１６】
第１の実施態様では、下記の表１に記載する条件を採用して、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの選別を行っている。
【０１１７】
【表１】
0005967687.tif 000008
【０１１８】
表１に示す選択条件では、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１２ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃縮を行っている。最終的に、濃縮されたビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子から、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１ラウンド行って、ビオチン化SPCに加えて、遊離のSPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子を選別している。
【０１１９】
また、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）にビオチン化SPCを結合させたものを、交互に使用している。このビーズの種類を変更することによって、初回ラウンドと、２回目のラウンドでは、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を抑制している。
【０１２０】
３回目のラウンド以降では、二種類のビーズを交互に使用することに加えて、その回のラウンドで使用するビーズの種類に合わせて、該ビーズを用いる「Pre-selection操作」を実施することで、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避している。
【０１２１】
「Pre-selection操作」に利用する、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）あるいは「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）の量は、ビーズの量として、各回のラウンドで使用される「ビオチン化SPCを結合させているビーズ」の量を基準として、表１に示す量比としている。ラウンドが進むとともに、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、徐々に濃縮される傾向があることを考慮し、ラウンドが進むとともに、「Pre-selection操作」に利用するビーズの量を増している。
【０１２２】
各回のラウンドにおける、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させる際、その液温度は、２５℃とし、その時間：「Incubation Time」は、表１に示す。
【０１２３】
なお、「Pre-selection操作」を実施する際も、その液温度は、２５℃とし、その時間は、前記「Incubation Time」と等しい時間を選択している。
【０１２４】
各回のラウンドにおける、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させた後、固液分離により、「ＲＮＡプール」を除去する。次いで、該ビーズに非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を洗浄除去するため、洗浄工程を設けている。該洗浄工程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を利用して、その液温度は、２５℃とし、ビーズ量、カラムボリューム（ＣＶ）を基準として、表１に記載する、合計液量（回数）を用いて、洗浄を行っている。
【０１２５】
最終の１３回目のラウンドは、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドである。具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
【０１２６】
この１３回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液は、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を５μＭ含有している。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡプール」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡプール」液を流通させる時間は、５分間としている。
【０１２７】
洗浄過程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で、５分間流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡプール」液を除去する。該洗浄過程において、その液温度は、２５℃としている。
【０１２８】
洗浄過程の終了後、下記の組成の溶出液をセンサ・チップ上に満たし、インキュベーションすることで、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を溶出させる。この溶出過程で使用される溶出液の組成は、HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。
【０１２９】
該溶出過程では、該溶出液２μＬを、センサ・チップ上に満たし、５分間インキュベーションする間に、Ｍｇ2+イオンをＥＤＴＡ錯体として除去する。その結果、マグネシウムイオン依存的にビオチン化SPCと複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択的に解離させている。すなわち、該溶出液中には、ビオチン化SPCに対して、マグネシウムイオン依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が回収されている。
【０１３０】
回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。該１３回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。
【０１３１】
調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙへ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。
【０１３２】
次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。
【０１３３】
一方、調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、「一本鎖ＲＮＡ分子」を調製し、「ＲＮＡプール」を作製する。
【０１３４】
該１３回目のラウンドを終了した時点の「ＲＮＡプール」、ならびに、８回目〜１２回目の各ラウンドを終了した時点の「ＲＮＡプール」に関して、実際に、ビオチン化SPCと複合体形成する一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率の上昇（濃縮）がなされていることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０１３５】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。上記１３回目、ならびに、８回目〜１２回目の各ラウンドを終了した時点の「ＲＮＡプール」から、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を２μＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。
【０１３６】
１３回目、ならびに、８回目〜１２回目の各ラウンドの「ＲＮＡ試料」液を、センサ・チップ上に、１２０秒間の間、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。次いで、センサ・チップ上に、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているビオチン化SPCと複合体を形成している一本鎖ＲＮＡ分子を解離させる。前記複合体の形成過程と、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間経過を、図１に纏めて示す。
【０１３７】
８回目〜１２回目の各ラウンド、さらには、１３回目のラウンドと進む間に、ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率は、回を追う毎に、上昇していることが確認された。
【０１３８】
上記１３回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子から作製したクローンのうち、無作為に８５クローンを選び、各クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を解析した。解析された８５クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を対比したところ、同じ塩基配列を有するクローンが複数存在している塩基配列が、９種類存在していた。また、前記９種類の塩基配列に対して、一塩基が相違する塩基配列も見出され、それを含め、下記の９種類のクローン・ファミリーが存在することが判明した。図２に、該９種類のクローン・ファミリーで見出される、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を纏めて示す。
【０１３９】
更に、表２に、該９種類のクローン・ファミリーで見出される、一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、５’末端側のForward Primerに起因する領域と３’末端側Reverse Primerに相補的な領域を除いた部分の部分塩基配列を示す。
【０１４０】
【表２】
0005967687.tif 000009
【０１４１】
「ランダム配列部分」を比較すると、上記の９種類のクローン・ファミリーＡ〜Ｉのうち、クローン・ファミリーＨを除く、８種のクローン・ファミリーにおいて、「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列が、同じ部位に存在している。
【０１４２】
該「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列と類似する部分塩基配列が、８５クローンの一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、その「ランダム配列部分」中に存在する可能性を調べた。
【０１４３】
具体的には、先ず、「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列中に含まれる、塩基長５〜７の「部分配列」の群に関して、
５’末端の固定領域：GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC；（２６塩基）
３’末端の固定領域：UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU；（２４塩基）
の部分には、類似性を示す部分配列が存在しないものを、「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列に特徴的な「モチーフ配列」として、選択した。
【０１４４】
その結果、少なくとも、「CXUUXXU」、「CCXUU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の４種のモチーフが、「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列に特徴的な「モチーフ配列」として選択された。
【０１４５】
クローン・ファミリーＨの一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、その「ランダム配列部分」中には、「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列と類似性を示す、「５’− GCAUUAUUGU−３’」の部分塩基配列が存在している。該「５’− GCAUUAUUGU−３’」の部分塩基配列中にも、「CXUUXXU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の３種のモチーフが内在されている。
【０１４６】
８５クローンの一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、その「ランダム配列部分」中に、「CXUUXXU」、「CCXUU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の４種のモチーフが存在しているクローンを選別した。
【０１４７】
その「ランダム配列部分」中に、「CXUUXXU」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、５３クローン存在していた。
【０１４８】
その「ランダム配列部分」中に、「CCXUU」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、５２クローン存在していた。
【０１４９】
その「ランダム配列部分」中に、「CXUUA」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、４９クローン存在していた。
【０１５０】
その「ランダム配列部分」中に、「CXXUXAU」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、４９クローン存在していた。
【０１５１】
以上の「CXUUXXU」、「CCXUU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の４種のモチーフの存在頻度をも考慮し、「５’−CCGUUAUUGG−３’」の部分塩基配列は、ビオチン化SPCとの複合体形成に関与する、コンセンサス配列と推断した。
【０１５２】
上記の９種類のクローン・ファミリーＡ〜Ｉに分類される、各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の表３に記載するＩＤを付したものである。
【０１５３】
【表３】
0005967687.tif 000010
【０１５４】
上記の９種類のクローン・ファミリーＡ〜Ｉに分類される、各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子について、実際に、ビオチン化SPCに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０１５５】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
【０１５６】
クローン・ファミリーＡ〜Ｉに分類される、各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を５００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
【０１５７】
次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で、４分間流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。
【０１５８】
ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を４分間流した時点で、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液に代えて、下記の組成のＥＤＴＡ溶液をセンサ・チップ上に、流速６０μＬ/分で流し、残余している一本鎖ＲＮＡ分子の溶出を行った。ＥＤＴＡ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。該ＥＤＴＡ溶液の流入によって、センサ・チップ上に残余している、固定化されたビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子の複合体から、金属カチオン種（Ｍｇ2+）は、ＥＤＴＡとの複合体を形成する結果、除去される。
【０１５９】
この金属カチオン種（Ｍｇ2+）の除去に伴って、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子を除き、残る８種のクローン・ファミリーＡ〜Ｇ，Ｉに属する各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、速やかに溶出された。一方、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、金属カチオン種（Ｍｇ2+）の除去によっても、固定化されたビオチン化SPCと複合体を形成した状態に保たれている。
【０１６０】
上記の測定を終了した後、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子と固定化されたビオチン化SPCとの複合体を解消する手段としては、該一本鎖ＲＮＡ分子の立体構造を解消することで、ビオチン化SPCに対する結合能を喪失させる処理を採用する。具体的には、センサ・チップ上に、組成50 mM NaOH + 1 M NaClの液２０μＬを、流速１００μＬ/分で流し、前記一本鎖ＲＮＡ分子の「アルカリ変性処理」を施す。
【０１６１】
図３に、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198, SPC-243, SPC-256, SPC-203, SPC-209, SPC-289, SPC-261, SPC-267, SPC-215, SPC-216, SPC-219, SPC-259, SPC-213, SPC-273, SPC-242, SPC-246について、前記の検証を行った結果を併せてしめす。
【０１６２】
クローン・ファミリーＡに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図４−１に、液温度２５℃における、該SPC-198に対する測定結果を示す。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａを算出した。算出された値は、ｋａ＝（2.04±0.01）×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝（4.27±0.03）×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=20.9±0.2  （ｎＭ）であった。
【０１６３】
クローン・ファミリーＢに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図４−２に、液温度２５℃における、該SPC-203に対する測定結果を示す。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａを算出した。算出された値は、ｋａ＝1.41±0.01×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝4.67±0.01×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=33.2±0.2  （ｎＭ）であった。
【０１６４】
クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図４−３に、液温度２５℃における、該SPC-213に対する測定結果を示す。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａを算出した。算出された値は、ｋａ＝5.93±0.15×１０3  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝5.36±0.02×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=90.4±2.4  （ｎＭ）であった。
【０１６５】
クローン・ファミリーＣに分類されるクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図５−１に、液温度２５℃における、該SPC-289に対する測定結果を示す。
【０１６６】
図５−１に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化では、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要があることが判明した。すなわち、ｋｄが、１０-2  (ｓ-1)以上の「速い解離過程」と、ｋｄが、１０-3  (ｓ-1)以下の「遅い解離過程」が存在するとして、解析する必要があることが判明した。図５−１には、複合体の解離過程に関して、単一の解離過程を仮定した場合（1:1 model）と、二種の解離過程を仮定した場合（1:2 model）について、それぞれ、カーブ・フィッティングを試みた結果を示している。
【０１６７】
クローン・ファミリーＤに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図５−２に、液温度２５℃における、該SPC-267に対する測定結果を示す。
【０１６８】
図５−２に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化でも、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要があることが判明した。すなわち、ｋｄが、１０-2  (ｓ-1)以上の「速い解離過程」と、ｋｄが、１０-3  (ｓ-1)以下の「遅い解離過程」が存在するとして、解析する必要があることが判明した。図５−２には、複合体の解離過程に関して、単一の解離過程を仮定した場合（1:1 model）と、二種の解離過程を仮定した場合（1:2 model）について、それぞれ、カーブ・フィッティングを試みた結果を示している。
【０１６９】
少なくとも、上記の結果を総合すると、表３に示す各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、ビオチン化SPCならびにSPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー」として、利用可能であると判断される。
【０１７０】
（第二の形態）
表３に示す各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、固有の三次構造にfoldingされた状態で、ビオチン化SPCならびにSPCと複合体を形成していると、推断される。三次構造の推定は困難であるため、該三次構造を構成する際、その基本的な構造要素となる二次構造の推定を試みた。この一本鎖ＲＮＡ分子における、二次構造の推定には、特開２００８−２８３９４３号公報に開示される手法を適用し、二次構造推定プログラム：ＶＡＬＦＯＬＤを利用した。
【０１７１】
図６−１に、クローン・ファミリーＡに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
【０１７２】
図６−２に、クローン・ファミリーＢに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
【０１７３】
図６−３に、クローン・ファミリーＣに分類されるクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
【０１７４】
図６−４に、クローン・ファミリーＤに分類されるクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
【０１７５】
図６−５に、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５’− GCAUUAUUGU−３’」の部分は、「ヘアピン・ループ」状の構造を構成している。
【０１７６】
本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーにおいて、対象物質のSPCとの複合体形成に関与する部位は、それぞれ、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その三次構造の形成に関与している領域に存在していると、推断される。具体的には、その三次構造を構成する際に、その構成要素として使用される二次構造のうち、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域に、対象物質のSPCとの複合体形成に関与する部位が存在すると、推断される。
【０１７７】
本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、上記の本発明の第一の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子中、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域部分と、実質的に同じ二次構造を形成することで、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を保持している。
【０１７８】
（第二の実施態様）
第二の実施態様では、本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを設計する工程の一例を以下に説明する。
【０１７９】
図６−１に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198の推定される二次構造中、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７−１に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０を作製した。
（II-1）  SPC-m009:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA 
UUC C -3' (配列番号：１２)；
（II-2）  SPC-m010:
5'-GGAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU 
CC -3' (配列番号：１３)；
一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０の推定される二次構造は、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５’−末端と３’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
【０１８０】
図６−２に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203の推定される二次構造中、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７−２に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２を作製した。
（II-3）  SPC-m011:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCC -3' (配列番号：１４)；
（II-4）  SPC-m012:
5'-GGCGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG
CC -3' (配列番号：１５)；
一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２の推定される二次構造は、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５’−末端と３’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
【０１８１】
図６−３に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289の推定される二次構造中、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７−３に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４を作製した。
（II-5）  SPC-m013:
5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
CC -3' (配列番号：１６)；
（II-6）  SPC-m014:
5'-GGACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU 
CC -3' (配列番号：１７)；
一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４の推定される二次構造は、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５’−末端と３’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
【０１８２】
図６−４に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267の推定される二次構造中、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７−４に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６を作製した。
（II-7）  SPC-m015:
5'-GGACAUCUACGAAUUC 
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU
CC -3' (配列番号：１８)；
（II-8）  SPC-m016:
5'-GGCGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACG 
CC -3' (配列番号：１９)；
一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６の推定される二次構造は、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５’−末端と３’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
【０１８３】
図６−５に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213の推定される二次構造中、“AUUC”と「ランダム配列部分（Ｎ30）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７−５に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００７を作製した。
（II-9）  SPC-m007:
5'-GG 
GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA 
UUCACUGCAGACUUGAC C C -3' (配列番号：２０)；
一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ００７の推定される二次構造は、「５’− GCAUUAUUGU−３’」を含む「ヘアピン・ループ」状の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５’−末端と３’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
【０１８４】
上記の一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６が、実際に、ビオチン化SPCと複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０１８５】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
【０１８６】
各一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を５００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
【０１８７】
次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で、３．５分間流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。
【０１８８】
ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を５分間流した時点で、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液に代えて、下記の組成のＥＤＴＡ溶液をセンサ・チップ上に、流速６０μＬ/分で流し、残余している一本鎖ＲＮＡ分子の溶出を行った。ＥＤＴＡ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。該ＥＤＴＡ溶液の流入によって、センサ・チップ上に残余している、固定化されたビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子の複合体から、金属カチオン種は、ＥＤＴＡとの複合体を形成する結果、除去される。
【０１８９】
この金属カチオン種、特には、Ｍｇ2+カチオン種の除去に伴って、一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６は、速やかに溶出された。
【０１９０】
図８−１に、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６について、前記条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した結果を併せて示す。
【０１９１】
図８−１に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ−ｍ０１３、ＳＰＣ−ｍ０１４、ＳＰＣ−ｍ０１５、ＳＰＣ−ｍ０１６に関しては、上述のＳＰＣ−２８９、ＳＰＣ−２６７と同様に、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要があることが判明した。すなわち、ｋｄが、１０-2  (ｓ-1)以上の「速い解離過程」と、ｋｄが、１０-3  (ｓ-1)以下の「遅い解離過程」が存在するとして、解析する必要があることが判明した。
【０１９２】
図８−１に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２に関しては、上述のＳＰＣ−１９８、ＳＰＣ−２０３と同様に、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断された。
【０１９３】
一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ−ｍ００９、ＳＰＣ−ｍ０１０、ＳＰＣ−ｍ０１１、ＳＰＣ−ｍ０１２に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａを算出した。
【０１９４】
ＳＰＣ−ｍ００９に対して、算出された値は、ｋａ＝1.24±0.33×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝23.1±0.08×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=186±5.05  （ｎＭ）であった。
【０１９５】
ＳＰＣ−ｍ０１０に対して、算出された値は、ｋａ＝（1.17±0.33）×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝29.5±0.09×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=252±7.04  （ｎＭ）であった。
【０１９６】
ＳＰＣ−ｍ０１１に対して、算出された値は、ｋａ＝1.13±0.25×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝24.9±0.06×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=221±4.84  （ｎＭ）であった。
【０１９７】
ＳＰＣ−ｍ０１２に対して、算出された値は、ｋａ＝1.11±0.17×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝21.8±0.04×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=196±2.98  （ｎＭ）であった。
【０１９８】
複合体の解離過程の類似性を考慮すると、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009、SPC-m010と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通している判断される。さらに、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009、SPC-m010と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
【０１９９】
また、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m011、SPC-m012と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通している判断される。さらに、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-203とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m011、SPC-m012と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
【０２００】
従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009、SPC-m010、およびSPC-198ならびに、SPC-m011、SPC-m012、およびSPC-203においては、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、それぞれ、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m010、SPC-m012において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
【０２０１】
また、複合体の解離過程は、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014と、ビオチン化SPCとの複合体でも、互いに共通している判断される。すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通していると判断される。さらには、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-289とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
【０２０２】
従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014、ならびに、SPC-289においては、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m014において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
【０２０３】
また、複合体の解離過程は、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016と、ビオチン化SPCとの複合体でも、互いに共通している判断される。すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通している判断される。さらには、少なくとも「速い解離過程」を与える、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-267とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
【０２０４】
従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016、ならびに、SPC-267においては、少なくとも「速い解離過程」を与える、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m016において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
【０２０５】
加えて、一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ−ｍ００７が、実際に、ビオチン化SPCと複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０２０６】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
【０２０７】
該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m007に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図８−２に、液温度２５℃における、該SPC-m007に対する測定結果を示す。
【０２０８】
なお、クローン・ファミリーＨの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213と同様に、該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m007も、ＥＤＴＡ溶液を利用して、金属カチオン種、特には、Ｍｇ2+カチオン種の除去を行った際、固定化されたビオチン化SPCと複合体を形成した状態に保たれていた。
【０２０９】
図８−２に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ−ｍ００７に関しては、上述のＳＰＣ−２１３と同様に、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断された。
【０２１０】
図８−２に示す測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａを算出した。
【０２１１】
ＳＰＣ−ｍ００７に対して、算出された値は、ｋａ＝5.18±0.26×１０3  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝1.23±0.03×１０-3  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=238±11.8  （ｎＭ）であった。
【０２１２】
複合体の解離過程の類似性を考慮すると、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-213とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m007とビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると判断される。従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m007、ならびに、SPC-213においては、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m007において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
【０２１３】
さらに、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、ビオチン化SPCと類似する構造を有する、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンも複合体形成可能であると推測される。
【０２１４】
実際に、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198は、ビオチン化SPCと同様に、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとも複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０２１５】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質に、下記のビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンを結合させている。
【０２１６】
【化７】
0005967687.tif 000011
【０２１７】
【化８】
0005967687.tif 000012
【０２１８】
【化９】
0005967687.tif 000013
【０２１９】
該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。
【０２２０】
図９−１、図９−２、図９−３に、液温度２５℃における、該SPC-198の、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の測定結果を、対比させて示す。
【０２２１】
図９−１、図９−２、図９−３に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ−１９８に関しては、上述のビオチン化SPCとの複合体と同様に、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断された。
【０２２２】
図９−１、図９−２、図９−３に示す測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａを算出した。
【０２２３】
SPC-198とビオチン化S1Pとの複合体形成・解離に対して、算出された値は、ｋａ＝1.13±0.04×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝7.88±0.07×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=69.9±2.84  （ｎＭ）であった。
【０２２４】
SPC-198とビオチン化スフィンゴシンとの複合体形成・解離に対して、算出された値は、ｋａ＝4.97±0.04×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝4.91±0.04×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=9.88±0.11  （ｎＭ）であった。
【０２２５】
なお、SPC-198とビオチン化SPCとの複合体形成・解離に対して、算出された値は、ｋａ＝1.29±0.02×１０4  (Ｍ-1ｓ-1)、ｋｄ＝2.94±0.02×１０-4  (ｓ-1)、ＫD＝ｋｄ／ｋａ=22.8±0.33  （ｎＭ）であった。
【０２２６】
複合体の解離過程に関して、SPC-198とビオチン化SPCとの複合体、SPC-198とビオチン化S1Pとの複合体、SPC-198とビオチン化スフィンゴシンとの複合体は、実質的に同じであると、判断される。すなわち、SPC-198とビオチン化SPCとの複合体、SPC-198とビオチン化S1Pとの複合体、SPC-198とビオチン化スフィンゴシンとの複合体において、該複合体中における、分子間の相互作用は、実質的に差違が無いと推断される。
【０２２７】
さらに、SPC-198に加えて、SPC-203, SPC-267, SPC-289, SPC-213,ならびに、SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016においても、そのビオチン化SPCとの複合体形成部位には、ビオチン化SPCと類似する構造を有する、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンも複合体形成可能であると推測される。
【０２２８】
実際に、前記一本鎖ＲＮＡ分子のいずれもが、ビオチン化SPCと同様に、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとも複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０２２９】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質に、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンを結合させている。
【０２３０】
一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198, SPC-203, SPC-267, SPC-289, SPC-213に関しては、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、４００ｎＭとし、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。また、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016に関しては、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、８００ｎＭとし、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。
【０２３１】
図１０−１、図１０−２、図１０−３に、液温度２５℃における、SPC-198, SPC-203, SPC-267, SPC-289, SPC-213,ならびに、SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016の各一本鎖ＲＮＡ分子について、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の測定結果を、対比させて示す。
【０２３２】
各一本鎖ＲＮＡ分子において、ビオチン化S1Pとの複合体の解離過程と、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の解離過程とを比較すると、その時間的変化は、実質的に同じであると判断される。すなわち、各一本鎖ＲＮＡ分子において、一旦形成された、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体中おける、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1P分子間の相互作用と、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシン分子間の相互作用は、実質的に差違が無いと推断される。
【０２３３】
一方、複合体の形成過程において、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量には、顕著な差違が存在している。この結果は、ビオチン化S1Pのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率と、ビオチン化スフィンゴシンのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率とが、顕著に異なっていることを示唆していると、解釈される。
【０２３４】
具体的には、ビオチン化S1Pでは、そのリン酸基（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）2）は、一価のアニオン（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ-）と二価のアニオン（−Ｏ−ＰＯ32-）の二つのイオン化状態を取り得るが、その一方のみが、一本鎖ＲＮＡ分子と複合体形成可能であると、推測される。さらには、ビオチン化S1Pのリン酸基は、一価のアニオンとなった際、遊離のアニオン種（−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ-）と、金属カチオン種が配位した状態（例えば、−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ-：Ｍｇ2+）が想定され、また、二価のアニオンとなった際、遊離のアニオン種（−Ｏ−ＰＯ32-）と、金属カチオン種が配位した状態（例えば、−Ｏ−ＰＯ32-：Ｍｇ2+）が想定され、これらの形状の一つが、複合体形成可能であると、推測される。その場合、ビオチン化S1Pのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率は、液温度、液の組成に依存して、変動すると推断される。
【０２３５】
それ対して、ビオチン化スフィンゴシンは、イオン化状態は存在していないので、ビオチン化スフィンゴシンのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率は、高い状態となっている。
【０２３６】
一方、各一本鎖ＲＮＡ分子において、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程と、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の解離過程とを比較すると、その時間的変化は、類似しているが、若干の差違が見出される。
【０２３７】
特に、複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要かあると判断される、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-267, SPC-289ならびに、SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016において、「速い解離過程」と「遅い解離過程」の寄与の比率は、ビオチン化SPCとの複合体とビオチン化スフィンゴシンとの複合体との間で、有意な差違がある。
【０２３８】
一方、複合体の解離過程が、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断される、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198, SPC-203, SPC-213に関しては、複合体の解離過程は、ビオチン化SPCとの複合体とビオチン化スフィンゴシンとの複合体との間で、実質的に同じであると見做すことが可能である。従って、これらの一本鎖ＲＮＡ分子においては、一旦形成される複合体では、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPC分子間の相互作用と、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシン分子間の相互作用は、実質的に差違が僅かであると推断される。
【０２３９】
実際に、液の組成によって、複合体の形成過程において、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量が変動することを示唆する結果が得られている。
【０２４０】
具体的には、複合体の形成過程に使用される、バインディング・バッファ溶液の組成として、
１×buffer：50 mM HEPES(pH 7.4) + 150 mM NaCl + 5 mM MgCl2
0.１×buffer：5 mM HEPES(pH 7.4) + 15 mM NaCl + 5 mM MgCl2
上記の二種を使用して、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198について、複合体の形成過程において、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量の相違を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測した。
【０２４１】
表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質に、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンを結合させている。
【０２４２】
該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198に関して、上記の二種類のバインディング・バッファ溶液を用いて、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、４００ｎＭとして、二種の「ＲＮＡ試料」液を調製する。ランニング・バッファ溶液にも、上記の二種のバインディング・バッファ溶液を用い、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。
【０２４３】
図１１に、上記の二種のバインディング・バッファ溶液を用いた際に測定された、液温度２５℃での、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を併せて示す。
【０２４４】
１×bufferを用いた場合と0.１×bufferを用いた場合の間で、複合体の形成過程において、
一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量の比は、40/320;
一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量の比は、510/800；
一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量の比は、240/860
となっている。
【０２４５】
すなわち、形成された複合体の解離過程の速度定数ｋｄは、実質的に等しいと見做せ、
また、複合体の形成過程の速度定数ｋaも、僅かに相違するのみであるが、
複合体の生成量は、有意な相違が生じている。
【０２４６】
その理由として、二種のバインディング・バッファ溶液の組成の相違に起因して、ビオチン化S1P、ビオチン化SPCにおいては、複合体の形成に関与する分子種の存在比率が有意に変化していることが推測される。
【０２４７】
（第三の形態）
上記の本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマー：SPC-m009, SPC-m010,ならびに、SPC-m011, SPC-m012における、ビオチン化SPCとの複合体形成部位の推定結果から、SPC-m010あるいはSPC-m012の推定二次構造と類似する二次構造を有する一本鎖ＲＮＡ分子は、同様にビオチン化SPCに対する結合能を有すると推断される。
【０２４８】
実際に、SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016の各一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を、図１２に示す。その対比から、ビオチン化SPCとの複合体形成に大きな寄与を示す部分、“Critical region”が、特定された。
【０２４９】
例えば、SPC-m009の推定二次構造において、この“Critical region”を示すと、図１３に示す部位となっている。
【０２５０】
上記推断に基づき、本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを、図１４に示す、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を適用して選別している。
【０２５１】
該全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、ビオチン化SPCとの複合体形成に大きな寄与を示す部分、“Critical region”に相当する部分配列として、SPC-198, SPC-m009, SPC-m010の推定二次構造において、“Hair pin”ループを構成する“UACCGUUAUUGGUG”を採用している。また、二本鎖構造を構成可能な部位として、５’末端側に“GACAUCCGG”、３’末端側に“CCGGAUGUC”を設けている。
【０２５２】
（第三の実施態様）
第三の実施態様では、本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを選別する工程の一例を以下に説明する。
【０２５３】
上記のように、本発明の第一の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子と、それから設計される、本発明の第二の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子においては、そのビオチン化SPCとの複合体形成部位は、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体形成部位としても、機能していると推断される。
【０２５４】
特に、上記の本発明の第一の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子と、本発明の第二の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子では、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測された、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰSph、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰS1Pは、通常、ＰSph＞ＰSPC≫ＰS1Pとなっていた。
【０２５５】
第三の実施態様では、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、前記三種の複合体の生成量が、ＰSPC＞ＰSph≫ＰS1Pの関係を満たす、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの選別を試みている。
【０２５６】
具体的には、ビオチン化SPCとの複合体形成に大きな寄与を有する、“Hair pin”ループの形状を示す領域を内在し、全体として、“Hair pin”状の二次構造を形成可能な、下記の全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能を具えている「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。該全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」は、
５’末端の固定領域：GGCAACCACGACAUCCGG；（１８塩基）
６塩基長の第一ランダム配列部分：Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6；（６塩基）
「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の定常領域：UACCGUUAUUGGUG；（１４塩基）
６塩基長の第二ランダム配列部分：Ｎ'6Ｎ'5Ｎ'4Ｎ'3Ｎ'2Ｎ'1；（６塩基）
３’末端の固定領域：CCGGAUGUCACACACACG；（１８塩基）
を具えている。
【０２５７】
第三の実施態様では、下記の表４に記載する条件を採用して、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの選別を行っている。
【０２５８】
【表４】
0005967687.tif 000014
【０２５９】
表４に示す選択条件では、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを５ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃縮を行っている。最終的に、濃縮されたビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子から、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを２ラウンド行って、ビオチン化SPCに加えて、遊離のSPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子を選別している。
【０２６０】
また、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）にビオチン化SPCを結合させたものを、交互に使用している。このビーズの種類を変更することによって、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を抑制している。
【０２６１】
さらに、各ラウンドで使用される「ＲＮＡプール」に対して、S1Pビーズを用いる「S1P-bead-selection操作」とスフィンゴシン・ビーズを用いる「Sphingosine-bead-selection操作」を施すことで、ビオチン化S1Pと複合体形成する一本鎖ＲＮＡ分子、ならびに、ビオチン化スフィンゴシンと複合体形成する一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率を予め低減している。
【０２６２】
図１５に、「S1P-bead-selection操作」、「Sphingosine-bead-selection操作」ならびに「SPC-bead-selection工程」とで構成される、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドの工程フローを模式的に示す。
【０２６３】
該S1Pビーズは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）にビオチン化S1Pを結合させたものである。「S1P-bead-selection操作」では、該S1Pビーズ２５μｌに、２５μｌの「ＲＮＡプール」液を加え、１０〜２０分間インキュベーション後、遠心分離装置によりスピンダウンさせる。その上清を、素通り画分として、回収する。
【０２６４】
該スフィンゴシン・ビーズは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）にビオチン化スフィンゴシンを結合させたものである。「Sphingosine -bead-selection操作」では、該スフィンゴシン・ビーズ２５μｌに、「S1P-bead-selection操作」で回収した、２５μｌの「素通り画分」を１０〜２０minインキュベーション後、遠心分離装置によりスピンダウンさせる。その上清を、素通り画分として、回収する。
【０２６５】
「SPC-bead-selection工程」は、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA bead）にビオチン化SPCを結合させた「SPCビーズ」を利用して、「Sphingosine-bead-selection操作」で回収される「素通り画分」をスクリーニングする。
【０２６６】
なお、利用されるバインディング・バッファ溶液の組成は、50 mM HEPES(pH 7.4) + 150 mM NaCl + 5 mM MgCl2 + 0.005％ Tween20である。
【０２６７】
「初回ラウンド」用の「ＲＮＡプール」の調製は、下記の手順で実施している。
【０２６８】
上記の全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」を構成する一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の「二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
【０２６９】
「二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、各二本鎖ＤＮＡ分子は、下記の「Ｔ７プロモーター領域」、５’末端の固定領域、３０塩基長のランダム配列部分、３’末端の固定領域からなる塩基配列Ｒcandidate1を有している。
【０２７０】
５’末端の「Ｔ７プロモーター領域」：GATAATACGACTCACTATA；（１９塩基）
５’末端の固定領域：GGCAACCACGACATCCGG；（１８塩基）
６塩基長の第一ランダム配列部分：Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6；（６塩基）
「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の定常領域：TACCGTTATTGGTG；（１４塩基）
６塩基長の第二ランダム配列部分：Ｎ'6Ｎ'5Ｎ'4Ｎ'3Ｎ'2Ｎ'1；（６塩基）
３’末端の固定領域：CCGGATGTCACACACACG；（１８塩基）
各回のラウンドの「SPC-bead-selection工程」では、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させる際、その液温度は、２５℃とし、その時間：「Incubation Time」は、表４に示す。
【０２７１】
なお、「S1P-bead-selection操作」、「Sphingosine-bead-selection操作」を実施する際も、その液温度は、２５℃としている。
【０２７２】
各回のラウンドの「SPC-bead-selection工程」における、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させた後、固液分離により、「ＲＮＡプール」を除去する。次いで、該ビーズに非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を洗浄除去するため、洗浄工程を設けている。該洗浄工程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を利用して、その液温度は、２５℃とし、「ＲＮＡプール」の液量（ＣＶ）を基準として、表４に記載する、合計液量（回数）を用いて、洗浄を行っている。
【０２７３】
洗浄工程を終えた後、固液分離により、ビーズを回収する。回収された、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している一本鎖ＲＮＡ分子を、高濃度Urea溶液を利用して、溶出させ、一本鎖ＲＮＡ分子のみを回収する。このUrea溶出工程で利用する、高濃度Urea溶液の組成は、７ＭUreaを含むHBS（50 mM HEPES(pH 7.4) + 150 mM NaCl）溶液であり、該高濃度Urea溶液中において、液温度９０℃の加熱処理（boiling 処理）を、５分間行っている。該“boiling”処理を施す際、該温度条件下では、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される（“unfolding”される）結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。
【０２７４】
「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」より調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
【０２７５】
回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、下記のForward Primer 2 とReverse Primer 2を利用して、RT-PCR法を適用する。
【０２７６】
Forward Primer 2：（配列番号：４１）
5'- GATAATACGACTCACTATA GGCAACCACGACATCCGG -3'
Reverse Primer 2：（配列番号：４２）
5'- GTGTGTGTCACATCCGG -3'
前記Reverse Primer 2は、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の３’末端の固定領域と相補的な塩基配列である。
【０２７７】
5'- CCGGAUGUCACACACACG-3'
3'- GGCCTACACTGTGTGTG -5'
前記Forward Primer 2は、「Ｔ７プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域の大部分とで構成されている。
【０２７８】
「Ｔ７プロモーター領域」：5'- GATAATACGACTCACTATA -3'
５’末端の固定領域の大部分：5'- GGCAACCACGACATCCGG -3'
その結果、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子の塩基配列は、５’末端にForward Primer 2に起因する領域、３’末端にReverse Primer 2に相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」の「６塩基長の第一ランダム配列部分」、“Hair pin”ループ形成用の定常領域、「６塩基長の第二ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。
【０２７９】
Forward Primer 1 に起因する領域：
GATAATACGACTCACTATA GGCAACCACGACATCCGG
「６塩基長の第一ランダム配列部分」、“Hair pin”ループ形成用の定常領域、「６塩基長の第二ランダム配列部分」に由来する領域：
Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6UACCGUUAUUGGUG Ｎ'6Ｎ'5Ｎ'4Ｎ'3Ｎ'2Ｎ'1
Reverse Primer 2 に相補的な領域：
CCGGAUGUCACACACAC 
調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製される「一本鎖ＲＮＡ分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。
【０２８０】
調製された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応溶液から回収し、上記のバインディング・バッファ溶液中に、所定の濃度で溶解して、次段ラウンドで利用する「ＲＮＡプール」とする。なお、「一本鎖ＲＮＡ分子」に対して、“folding”処理を施す。その結果、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。
【０２８１】
回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。該７回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。
【０２８２】
調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  へ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。
【０２８３】
次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。
【０２８４】
上記７回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子から作製したクローンのうち、無作為に４１クローンを選び、各クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を解析した。解析された４１クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を対比したところ、同じ塩基配列を有するクローンが複数存在している塩基配列が、３種類存在していた。また、前記３種類の塩基配列に対して、「６塩基長の第一ランダム配列部分」、「６塩基長の第二ランダム配列部分」の部分塩基配列が類似している、塩基配列も見出された。それらを含め、３種類のクローン・ファミリーが存在することが判明した。図１６に、３種類のクローン・ファミリーに分類される、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列、ならびに、いずれのファミリーにも分類されない、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を纏めて示す。
【０２８５】
なお、上記の選別工程において、ＥＤＴＡ溶出によって、ビオチン化SPCとの複合体から速やかに解離されており、選別された一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体中には、Ｍｇ2+カチオン種が含まれていると、判断される。また、Ｍｇ2+カチオン種を除去することで、選別された一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体は、速やかに解離可能な形態であると推断される。
【０２８６】
図１６に示す、クローン・ファミリー１に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-514, SPC-520, SPC-524, SPC-556, SPC-546, SPC-562, SPC-536, SPC-551, SPC-583、クローン・ファミリー２に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-501, SPC-569, SPC-511、クローン・ファミリー３に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-548, SPC-547について、実際に、ビオチン化SPCに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０２８７】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
【０２８８】
各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を４００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
【０２８９】
次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、50 mM HEPES(pH 7.4) + 150 mM NaCl + 5 mM MgCl2である。
【０２９０】
対比のため、SPC-198，SPC-m012に関しても、同じ条件で測定を行っている。
【０２９１】
さらには、ビオチン化S1Pに対する結合能、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能に関して、同様の条件で測定を行った。
【０２９２】
図１７−１〜図１７−３には、上記の３種のクローン・ファミリーの分類された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、液温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を併せて示す。
【０２９３】
SPC-198，SPC-m012に関して、液温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測された、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰSph、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰS1Pは、ＰSph＞ＰSPC≫ＰS1Pとなっている。
【０２９４】
それに対して、第三の実施態様で選別された一本鎖ＲＮＡ分子においては、液温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰSph、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰS1Pが、ＰSPC≧ＰSph≫ＰS1Pの関係を満たすものが、相当の比率で見出されている。
【０２９５】
特に、複合体の解離過程の挙動に着目すると、第三の実施態様で選別された一本鎖ＲＮＡ分子においては、ビオチン化SPCとの複合体解離の速度定数ｋｄSPC、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体解離の速度定数ｋｄSph、ビオチン化S1Pとの複合体解離の速度定数ｋｄS1Pは、見掛け上、ｋｄSPC≪ｋｄSph≒ｋｄS1Pの関係となっている。
【０２９６】
一般に、複合体の解離過程は、液温度が上昇するとともに、複合体解離の速度定数ｋｄは増加する。この液温度の上昇に伴う、複合体解離の速度定数ｋｄの増加の程度について、SPC-198，SPC-m012と、第三の実施態様で選別された、SPC-520, SPC-524に関して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価を行った。
【０２９７】
図１８−１と図１８−２に、SPC-198、SPC-m012、ならびに、SPC-524、SPC-520について、液温２５℃、３７℃の二温度条件における、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を対比して示す。
【０２９８】
SPC-524、SPC-520においては、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰSph、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰS1Pは、液温度３７度においても、ＰSPC＞ＰSph≫ＰS1Pの関係を満たしている。
【０２９９】
クローン・ファミリー１に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-514, SPC-520, SPC-524, SPC-556, SPC-546, SPC-562, SPC-536, SPC-551, SPC-583、クローン・ファミリー２に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-501, SPC-569, SPC-511、クローン・ファミリー３に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-548, SPC-547について、そのｃＤＮＡの塩基配列の対比を行った結果を、図１９に示す。
【０３００】
その対比の結果、“Hair pin”ループ形成用の定常領域の塩基配列が、本来の塩基配列である“TACCGTTATTGGTG”ではなく、“TACCGTTATTGGAG”に変異しているものが、過半数を超えていることが判る。また、“TACCGTTATTGGTG”に保持されているクローンに比べて、“TACCGUUATTGGAG”に変異しているクローンでは、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPCが相対的に高くなっていることも判明した。
【０３０１】
（第四の形態）
上記の本発明の第三の形態にかかる一本鎖ＲＮＡ分子において、図１４に示す推定二次構造において特徴的な“Hair pin”ループ形成に適する、“UACCGUUAUUGGUG”が“UACCGUUAUUGGAG”に変異すると、当該部分の二次構造は、異なっていると推断される。実際に、SPC-524について、その二次構造の推定を行った結果を、図２０に示す。「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列は、“Hair pin”ループを形成しているが、二重鎖構造を構成すべき部分が、部分的に異なる構造を形成すると推定された。
【０３０２】
本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、上記の本発明の第三の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子中、“Hair pin”ループ形成に関与する部分として、本来の“UACCGUUAUUGGUG”に代えて、“UACCGUUAUUGGAG”を用いて形成される二次構造と、実質的に同じ二次構造を形成することで、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を保持している。
【０３０３】
（第四の実施態様）
第四の実施態様では、本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを設計する工程の一例を以下に説明する。
【０３０４】
SPC-573は、その３’末端の固定領域の一部が欠損しているにも拘わらず、ビオチン化SPCに対する結合能を有している。従って、６塩基長の第一ランダム配列部分と６塩基長の第二ランダム配列部分とで構成される、「バルジ」部分が保持可能である限り、ビオチン化SPCに対する結合能に対して、大きな影響を及ぼさないと推断される。
【０３０５】
図２０に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-524の推定される二次構造中、少なくとも、
６塩基長の第一ランダム配列部分：AAAGCC；（６塩基）
「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の領域：UACCGUUAUUGGAG；（１４塩基）
６塩基長の第二ランダム配列部分：UAAAAA；（６塩基）
の部分により構成される部分構造に関して、実質的に同じ部分構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図２０に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９、ならびにＳＰＣ−ｍ０２０を作製した。
（IV-1）  SPC-m017:
5'- GGGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCCC -3' (配列番号：３５)；
（IV-2）  SPC-m018:
5'- GGG 
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCC -3' (配列番号：３６)；
（IV-3）  SPC-m019:
5'- GGG 
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CC -3' (配列番号：３７)；
（IV-4）  SPC-m020:
5'- GGG 
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
C -3' (配列番号：３８)；
一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９の推定される二次構造は、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-524の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５’−末端と３’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
【０３０６】
上記の一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９、さらには、ＳＰＣ−ｍ０２０が、実際に、ビオチン化SPCと複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
【０３０７】
具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
【０３０８】
各一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を４００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
【０３０９】
次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。
【０３１０】
複合体形成過程の終了直後（「ＲＮＡ試料」液の流通開示後、１３０秒経過した時点）の表面プラズモン共鳴シグナル強度の測定値から、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPCを見積もった。具体的には、表面プラズモン共鳴シグナル強度を、各一本鎖ＲＮＡの塩基長（分子量に相当する）で除した値を算出し、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC（分子数）の指標とした。
【０３１１】
図２１に、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９、ＳＰＣ−ｍ０２０に関して、評価された、前記のビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC（分子数）の指標値を示す。
【０３１２】
また、同じ測定条件で、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−１９８、ＳＰＣ−ｍ０１２、ＳＰＣ−５２４に関して評価を行った、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC（分子数）の指標値も、併せて、図２１に示す。
【０３１３】
その結果、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ−ｍ０１７、ＳＰＣ−ｍ０１８、ＳＰＣ−ｍ０１９、ＳＰＣ−ｍ０２０は、実際に、ビオチン化SPCとの複合体を形成可能であることが検証された。
【０３１４】
さらに、上記の一本鎖ＲＮＡ分子中のＵ、ならびに、Ｃに対して、そのヌクレオチドのリボース骨格の２’−ヒドロキシル基（−ＯＨ）に種々の修飾を施した、修飾ＲＮＡ分子を作製し、同じ測定条件で評価を行った、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC（分子数）の指標値も、図２１に示す。
【０３１５】
前記修飾の種類は、各修飾ＲＮＡ分子に付す名称の末尾に、Ｆ、ＦＵ、ＦＣ、ＯＭｅ、ＯＭｅＵ、ＯＭｅＣ、ｄ、ｄＵ、ｄＣの符号を付して示してある。表５に、それぞれの修飾の内容を示す
【０３１６】
【表５】
0005967687.tif 000015
【０３１７】
各修飾ＲＮＡ分子において、“Hair pin”ループ形成に関与する「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列において、当該部位のＵを修飾塩基へと変換する、Ｆ、ＦＵ、ＯＭｅ、ＯＭｅＵ、ｄ、ｄＵの修飾を施すと、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC（分子数）の指標値は、顕著に減少している。
【０３１８】
一方、“Hair pin”ループ形成に関与する「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列において、当該部位のＵに修飾がなされない、ＦＣ、ＯＭｅＣ、ｄＣの修飾を施した場合は、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰSPC（分子数）の指標値は、減少するが、その減少の程度は、相対的に僅かであると、判断される。
【０３１９】
この結果は、「５’−CCGUUAUUGG−３’」のコンセンサス配列によって構成される“Hair pin”ループの部分構造は、当該部位のＵに対する修飾の影響を受け、その結果、ビオチン化SPCに対する結合能の顕著な変化が引き起こされることを暗示している。
【産業上の利用可能性】
【０３２０】
本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、遊離のスフィンゴリン脂質の一種であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）について、その循環血液中の濃度を定量する目的に利用可能である。
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７−１】
0005967687.tif 000050
【図１７−２】
0005967687.tif 000051
【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【配列表】
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