(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、
前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、
前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、
を含み、
前記イソプロピルアルコール生産大腸菌は、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の増強は、該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化又はプラスミド上の各遺伝子により付与することで行い、かつ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性はプラスミド上の各遺伝子により付与された大腸菌Ｂ株であり、
前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０１５／ｈ以上１／ｈ以下となる条件であるイソプロピルアルコール製造方法。
【請求項２】
前記培養を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの酸素摂取速度で行う請求項１に記載のイソプロピルアルコール製造方法。
【請求項３】
前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０２／ｈ以上となる条件である請求項１又は請求項２に記載のイソプロピルアルコール製造方法。
【請求項４】
前記基質液の供給速度及び前記培養液の抜き取り速度が、培養槽中の液量１Ｌに対して０．０１５Ｌ／ｈ〜４Ｌ／ｈである請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のイソプロピルアルコール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で温室効果ガス排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する微生物は既に知られている。
例えば国際公開２００９／００８３７７号には、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを生産するように改変された大腸菌を用いて、基質液の逐次添加による半回分式培養を行いながらイソプロピルアルコールを生産することが開示されている。このイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールの選択性が高いことから工業生産用生体触媒として優れた性質を持つと記載されている。【０００４】
イソプロピルアルコールを培養法により工業レベルで生産するには、長時間の連続的な培養により効率的に生産することが求められている。
このために、例えば、生物化学工学会誌，７１（１），ｐｐ．９−１４，（１９９３）には、土壌から分離したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する微生物を用いたブタノール・イソプロピルアルコールの連続培養が報告されている。ここでは、３０日間の連続培養を行っているが、本微生物は遺伝子組換えによる改変を行っておらず、イソプロピルアルコールの選択率は約２５％と低い。【０００５】
Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１０（６），ｐｐ．６９６−７０１，（２０１０）には、イソプロピルアルコールを生産するように改変された大腸菌を用いた長時間の半回分培養によるイソプロピルアルコールの生産が報告されている。ここでは、生成したイソプロピルアルコールをガスストリッピングにより培養液中からガス中へ追い出し、ガスに含まれるイソプロピルアルコールは水を捕捉液として回収している。培養槽には三角フラスコを使用し、フラスコ容量の１／１０以下のごく少量の培養液を仕込むことで比表面積を大きくしており、逐次添加による半回分式培養でありながら、生成イソプロピルアルコールに加え培養液も蒸散させているため培養液量は低下しており２４０時間と長い運転時間が可能となっている。【０００６】
一方、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，ｐｐ．８３４−８４４，（２００６）では、生産物はエタノールを生産するための遺伝子組換え大腸菌を用いた無通気によるエタノール連続培養が報告されている。ここでは、液循環型固定床による連続培養で、滅菌培地の培養槽へのフィード、培養槽からの培養液の抜き取りという一般的な連続培養に加え、培養槽内の液を循環させる連続培養が実施されている。【０００７】
大腸菌を用いた酸素ガス又は酸素を含むガスを通気する好気培養では、酢酸が副生することが知られているが、酢酸の蓄積濃度が高くなると、大腸菌の増殖阻害や目的物の生産効率低下を招く。そこで、酢酸の高蓄積を抑制するため、通気または攪拌速度をコントロールし、培養槽内の溶存酸素濃度が枯渇しないよう、数ｐｐｍに制御するＤＯ−Ｓｔａｔ法がよく知られている。Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３６，ｐｐ．７５０−７５８，（１９９０）では、酢酸の蓄積は、通常の半回分培養では４８時間目における酢酸濃度が３５ｇ／Ｌ、ＤＯ−Ｓｔａｔ法による制御では３６時間目における酢酸濃度が１７ｇ／Ｌ、溶存酸素濃度の制御に加え、半回分培養における基質液の添加速度のコントロールにより培養槽中のグルコースの濃度も制御するＢａｌａｎｃｅｄ  ＤＯ−Ｓｔａｔ法では酢酸が生成しないと報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、長期間の培養のために比表面積を大きくする方法は、過大な培養槽を使用することにつながり、工業レベルの規模では現実的ではない。また、通常の半回分式培養では、運転時間が長くなるほどイソプロピルアルコールの生産量は多くなるが、培養液量は増加し続けるため大型培養槽が必要となり、工業化した場合設備費、維持費、運転費が著しく高くなるため、汎用化学品の製造には向かない。
菌体増殖の観点においても、半回分培養では１６時間から４８時間程度で菌体の増殖がほとんど停止し、培養時間が更に長くなるとイソプロピルアルコールの生産速度は低下することが知られている。Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１０（６），ｐｐ．６９６−７０１，（２０１０）に記載された技術においても、２４０時間以降は濃縮栄養培地を添加してもイソプロピルアルコールの生産が停止することが報告されている。【０００９】
一方、イソプロピルアルコールの生産には、酸素が必要であるが、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，ｐｐ．８３４−８４４，（２００６）に記載された技術では、液循環ラインに使用するチューブからの酸素透過により菌体の酸素摂取速度が1ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈになると、固定化されていない遊離菌体が保有するプラスミドは培養２日目以降脱落し始めることが記載されている。プラスミドが脱落し始めると、プラスミドを保有しない菌体の増殖が優位となることが一般的に知られており、増殖を長時間伴う培養には向いていない。また、酢酸の副生を抑制するためにＤＯ−ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ  ＤＯ−Ｓｔａｔ法で制御することは、複雑な制御のプログラムを組まなければならず、また、多くの場合にはコストの高い純酸素を使用しなければならない。【００１０】
このように、経済的に有利となる連続培養による効率の良いイソプロピルアルコールの製造が依然として望まれている。
本発明は、連続培養によってイソプロピルアルコールを簡便にかつ長時間安定的に高い生産性で製造するイソプロピルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の各態様は、以下のイソプロピルアルコール製造方法を提供する。
〔１〕  植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、を含み、
前記イソプロピルアルコール生産大腸菌は、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の増強は、該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化又はプラスミド上の各遺伝子により付与することで行い、かつ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性はプラスミド上の各遺伝子により付与された大腸菌Ｂ株であり、
前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０１５／ｈ以上１／ｈ以下となる条件であるイソプロピルアルコール製造方法。
〔２〕  前記培養を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの酸素摂取速度で行う〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕  前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０２／ｈ以上となる条件である〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕  前記基質液の供給速度及び前記培養液の抜き取り速度が、培養槽中の液量１Ｌに対して０．０１５Ｌ／ｈ〜４Ｌ／ｈである〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、連続培養によってイソプロピルアルコールを簡便にかつ長時間安定的に高い生産性で製造するイソプロピルアルコールの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に使用可能な連続培養槽の一例の概略構成図である。
【図２】本発明の実施例１及び比較例１における培養槽内培養液中の菌体質量の経時変化を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１及び比較例１におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例２〜実施例４及び比較例２における培養槽内培養液中の菌体質量の経時変化を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２〜実施例４及び比較例２におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例２〜実施例４及び比較例２におけるプラスミド脱落率の経時変化を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例５〜実施例１０におけるＯＵＲとイソプロピルアルコール収率の相関関係を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例５〜実施例１０におけるＯＵＲとイソプロピルアルコール生産速度の相関関係を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例５、実施例７及び実施例９におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例５における培養槽内の溶存酸素の経時変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例７における培養槽内の溶存酸素の経時変化を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例９における培養槽内の溶存酸素の経時変化を示すグラフである。
【図１３】本発明の実施例１１における培養槽内培養液中の菌体質量の経時変化を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例１１におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施例１１におけるプラスミド脱落率の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のイソプロピルアルコール製造方法は、植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、を含むイソプロピルアルコール製造方法である。
【００１５】
本発明によれば、培養槽内への基質液の供給及び培養槽内からの生産物を含む培養液の抜き取りを連続的に行いながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体数を維持し、且つイソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する。即ち、菌体数を維持しつつ、所定の菌体増殖条件でイソプロピルアルコール生産大腸菌を連続培養しながら、イソプロピルアルコールを生産するので、イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いた連続培養であっても、簡便に且つ長時間安定的に高い生産性でイソプロピルアルコールを製造することができる。
【００１６】
これを更に説明すれば、例えば、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，ｐｐ．８３４−８４４，（２００６）に開示された技術では、大腸菌の安定的なプラスミド保持には、酸素摂取速度を０．６ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下に抑制しなければならないことと記載されており、また、大腸菌を用いた酸素摂取速度が高い好気培養による長期連続培養は、これまでに報告例がない。これらのことから、酸素を供給する好気培養で遺伝子組み換え大腸菌を用いると、固定化しない場合、プラスミドの脱落した菌体が経時的に増えるため、長時間の連続培養では目的物の生産速度が低下していくことが示唆される。また固定化した菌体を使用する場合は、酸素と菌体との接触性が低下するため、酸素を必要とするような好気培養では目的物の生産速度が低下することが示唆される。
また、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３６，ｐｐ．７５０−７５８，（１９９０）に開示された技術では、大腸菌を用いた運転時間２日の好気による半回分培養が行われている。酸素摂取速度に関する記載はないものの、ファーメンターを用いて空気又は純酸素を１ｖｖｍで通気、攪拌回転数は最大１３５０ｒｐｍであり、酸素摂取速度が高いことは当該業者であれば、容易に推測できる。培養２日程度ではプラスミドの脱落の影響はほとんどないものの、好気培養では酢酸の高蓄積による増殖阻害や目的物の生産速度が低下するため、ＤＯ−Ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ  ＤＯ−ｓｔａｔ法などにより溶存酸素濃度を制御しなければならないことが記載されている。
【００１７】
これに対して、本発明では、培養槽へのイソプロピルアルコール生産大腸菌の投入当初ではなく、培養開始からの所定時間後のイソプロピルアルコール生産期でのイソプロピルアルコール生産大腸菌の挙動に着目し、この時期の培養条件を、菌体が安定的に増殖する条件に調整するものである。これによりＤＯ−Ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ  ＤＯ−ｓｔａｔ法による培養槽内の溶存酸素濃度やグルコース濃度の複雑な制御を行わなくても、好気培養においてイソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールの生産性を低下させることなく、簡便な培養方法で長期間にわたってイソプロピルアルコールを製造することができる。
更に通気・攪拌条件をイソプロピルアルコール生産に適した範囲内に調整することによって、より効率よくイソプロピルアルコールを製造することができる。
【００１８】
本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１９】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールを生産するためのイソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌である。大腸菌は本来イソプロピルアルコールを生産する系を有していないため、本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌である。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。また、イソプロピルアルコール生産系の少なくとも一部が、遺伝子組み換えによる導入又は改変されていればよい。遺伝子組換えによる導入又は改変には公知の方法を用いることができ、例えばゲノムへの相同組換え、プラスミドによる導入等が挙げられる。
【００２０】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性を強化した大腸菌である。「遺伝子組換えにより」とは、生来の遺伝子の塩基配列に対して異なる配列を有する外来の塩基配列の挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
【００２１】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が、菌体外から付与され若しくは菌体内において発現増強され、又はこれら双方がなされていることが更に好ましい。
【００２２】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００２３】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ／Ｂ株又はｐＩａａａ／Ｂ株を例示できる。また、該大腸菌には、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素のうち、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性の増強は該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化することで行い、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性の増強は各遺伝子の発現をプラスミドで強化した株（ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と呼ぶことがある）を含む。
【００２４】
更に効果的にイソプロピルアルコール生産性を向上させた組換え大腸菌を使用してもよく、そのような例として不活化されたＧｎｔＲ活性、不活化されたグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、不活化されたホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性と強化されたグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性が挙げられる。これらの組み合わせにより、これ以外の各因子又は酵素の組み合わせと比してイソプロピルアルコールの生産性を驚異的に向上させることできる。
【００２５】
本発明におけるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号５．３．１．９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−フルクトース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００２６】
本発明におけるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−グルコノ−１，５−ラクトン−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００２７】
本発明において用いられるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。
【００２８】
本発明におけるホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４４に分類され、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸からＤ−リブロース−５−リン酸とＣＯ２を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００２９】
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌の好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ／Ｂ株又はｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性を不活化した株又はｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性を不活化し、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株又はｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性とホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性を不活化し、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株などが挙げられる。
【００３０】
本発明のイソプロピルアルコール製造方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いた連続培養により植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させるものである。
前記イソプロピルアルコール製造方法は、具体的には、植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養すること（以下、培養工程という）と、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産すること（以下、「生産工程」という）と、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収すること（以下、回収工程という）と、を含む。
【００３１】
前記製造方法におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌の培養は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を、菌体数を維持しつつ、安定的に増殖させる菌体増殖条件で行われる。菌体数の維持は、基質液の供給及び培養液の抜き取りと、菌体増殖条件下での培養とにより達成される。これにより、イソプロピルアルコール生産期でも前記大腸菌の増殖能が維持され、結果的に、連続培養であってもイソプロピルアルコールの生産を維持することができる。
【００３２】
前記製造方法では、イソプロピルアルコールの生産を連続培養によって行うため、培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させてイソプロピルアルコールを生産する前記生産工程は、前記培養工程と同時に進行する。ただし、前記菌体増殖条件によらないイソプロピルアルコール生産大腸菌の成育又は維持のための単なる培養は、前記生産工程と同時に行われなくてもよい。
また、前記回収工程は、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収するものであるため、前記培養工程及び生産工程と同時に行ってもよく、培養工程及び生産工程と同時でなくてもよい。
【００３３】
前記培養工程は、培養初期の菌体濃度が、安定的に菌体数を維持できる菌体濃度に達した後に行われる。
培養初期の「安定的に菌体数を維持できる菌体濃度」とは、連続培養開始後に前記大腸菌の増殖が維持できる菌体濃度であれば特に制限は無いが、例えば、乾燥質量として２．４ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌに相当する菌体濃度であれば十分である。
【００３４】
本発明における「連続培養」とは、「発酵工学の基礎」（Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ著、学会出版センター、１９８８年、ｐ１４〜ｐ１５、［Principles of Fermentation Technology (Stanbury,Peter F.;Whitaker,Allan)］）に記載されているように、上記基質液を培養槽へ連続的に供給（以下、「フィード」ということがある）し、生産物を含む培養液を連続的に抜取る方法により、菌体を培養し、該菌体により目的物を生産することを意味する。このとき、供給された基質液と等量の培養液を培養槽から抜取ることにより、培養槽内で液量はほぼ一定となる。
【００３５】
フィードの方法は、特に限定されるものではなく、一定速度でフィードするｃｈｅｍｏ  ｓｔａｔ法や、炭素源（植物由来原料）のロスを少なくするために断続的にフィードする方法などが挙げられる。断続的にフィードする方法としては、例えば、ｐＨｓｔａｔ法が挙げられる。このｐＨｓｔａｔ法は、炭素源（植物由来原料）をフィードして一旦停止したときに培養槽内の炭素源（植物由来原料）が枯渇すると生ずるｐＨの上昇及び溶存酸素濃度の上昇、排気二酸化炭素濃度の低下を指標として、フィードを再開する方法である。
本発明における「連続的な供給」又は「連続的な抜き取り」との用語には、培養槽内の液量がほぼ一定に維持されている限り、如何なる態様のフィード方法も包含される。なお、「培養槽内の液量がほぼ一定」とは、イソプロピルアルコール製造開始における培養槽内の液量と比較したときの液量の変動が０容量％〜１０容量％の範囲内を意味し、連続運転の安定性の観点から好ましくは０容量％〜５容量％の範囲内を意味する。
【００３６】
ここで、「イソプロピルアルコール生産期」とは、菌体増殖が定常状態に達した後にイソプロピルアルコールが生産される期間を指す。前記培養工程では、菌体の増殖状況に応じて、製造開始直後の菌体がほとんど生育しない誘導期と、その後の対数増殖期とに分けられる。本発明において「菌体増殖が定常状態に達する」とは、前記対数増殖期において、前記培養液の抜き取りに伴って抜取られる菌体量と新しく増殖した菌体量とがつりあった状態を意味する。このような菌体増殖が定常状態に達したときには、培養槽内の菌体濃度が一定となる。菌体増殖が定常状態に達するまでの時間は、培養開始時の菌体濃度及び菌の状態、培養液の容量並びに供給される炭素源の濃度によって異なるが、培養開始時の菌体濃度が０．０８ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ、炭素源の濃度が２ｇ／Ｌ、培養液の容量を０．５Ｌとしたとき、一般には培養開始後２４〜４８時間となるため、イソプロピルアルコール生産期は培養開始後２４時間以降とすることができ、好ましくは４８時間以降とすることができる。
【００３７】
菌体増殖条件とは、対数増殖期に達した後に菌体を増殖させるための条件を意味する。即ち、培養槽内の培養系において、少なくとも、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体密度、前記基質液濃度、及び前記生産物濃度のいずれもが、イソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖を阻害しない範囲に維持することが必要である。イソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体密度の過剰若しくは死滅数の増大、基質液濃度の過剰、及び生産物濃度の過剰の少なくとも１つが生じた場合には、イソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖が停滞又は阻害されるため、イソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖を維持することができない。この結果、培養系全体におけるイソプロピルアルコールの生産能が損なわれる。
【００３８】
前記菌体増殖条件としては、定常状態を維持する観点から、比増殖速度０．０１５／ｈ以上となる条件であることが好ましい。比増殖速度が０．０１５／ｈ以上であれば、イソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体密度、基質液濃度及び生産物濃度を簡便に且つ効果的に調整して、培養系内のイソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖能を維持できる傾向がある。前記比増殖速度としては、イソプロピルアルコールの生産速度を高める観点から、０．０２／ｈ以上であることがより好ましく、０．０２５／ｈ以上であることが更に好ましく、０．０３／ｈ以上であることが特に好ましい。い。また、比増殖速度の上限値はとくに制限されないが、大腸菌の世代時間を考慮すると４／ｈ以下であることが好ましく、１／ｈ以下であることがより好ましく、０．５／ｈ以下であることが更により好ましく、０．２／ｈ以下であることが特に好ましい。なお、上述した好ましい上限値及び好ましい下限値から構成される数値範囲としては、上述したいずれかの上限値と、いずれかの下限値とを組み合わせがものであればよい。
【００３９】
前記比増殖速度とは、菌体あたりの増殖速度（＝単位菌体質量、単位時間あたりに菌体が増える質量）であり、「発酵工学の基礎」（Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ著、１９８８年、ｐ１４〜ｐ１５）に記載されているように定常状態においては式１で表される。本発明における比増殖速度には、この式１を適用する。
（式１）
μ＝Ｆ／Ｖ
μ：比増殖速度（ｈ−１）
Ｆ：基質液の供給速度（Ｌ/ｈ）≒培養液の抜き取り速度（Ｌ／ｈ）
Ｖ：培養槽中の液量（Ｌ）
【００４０】
式１により、前記基質液の供給速度及び前記培養液の抜き取り速度としては、培養槽中の液量によって異なるが、例えば培養槽中の液量が１Ｌである場合には、０．０１５Ｌ／ｈ〜４Ｌ／ｈとすることができ、イソプロピルアルコールの生産速度を高める観点から０．０２Ｌ／ｈ〜４Ｌ／ｈであることが好ましく、０．０２５Ｌ／ｈ〜１Ｌ／ｈであることがより好ましい。同様に、例えば培養槽中の液量が１ｍ３である場合には、０．０１５ｍ３／ｈ〜４ｍ３／ｈとすることができ、イソプロピルアルコールの生産速度を高める観点から０．０２ｍ３／ｈ〜４ｍ３／ｈであることが好ましく、０．０２５ｍ３／ｈ〜１ｍ３／ｈであることがより好ましい。
前記培養槽の容量（大きさ）としては、特に制限はなく、物質生産に通常用いられる培養槽が適用可能である。また、培養槽に充填される液の液量は、用いられる培養槽の容量に応じて適宜設定可能である。
【００４１】
なお、比増殖速度は、イソプロピルアルコール生産期において上記範囲内になっていればよい。イソプロピルアルコール生産期以外の時期における比増殖速度は特に制限されず、上述した範囲と同一であってもよく、異なっていてもよい。上述した範囲と異なる範囲とする場合には、例えば、０．０１５／ｈ以下とすることができる。
また、定常状態を保つ比増殖速度以外の条件としては、基質液の糖濃度や培養槽内の温度、ｐＨなど挙げられるが、定常状態が維持できれば特に制限はなく、当該業者が容易に類推できる条件でよい。
【００４２】
本発明において、イソプロピルアルコールの生産期における菌体数に特に制限はないが、イソプロピルアルコールを効率よく生産する観点から、培養槽内での菌総質量は１ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌ〜３０ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌが好ましく、３ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌ〜２０ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌがより好ましい。「菌体数の維持」とは、所定の菌体数となる定常状態に達した後において、菌体数の変動率が３０％以内であることを意味し、好ましくは２０％以内の変動率であることを意味する。菌体数は、後述するように、分光光度計で６６０ｎｍの波長で測定し、１  ＯＤ６６０＝０．３ｇ−ｄｒｙｃｅｌｌ／Ｌとして算出する菌体濃度を用いることができる。
【００４３】
本発明に製造方法では、イソプロピルアルコールを生産効率の観点から、好気培養であることが好ましい。本発明において好気培養とは、空気または酸素がある状態で行う培養を意味し、菌体の酸素摂取速度が１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上となる酸素がある状態を指す。酸素摂取速度（ｏｘｙｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｒａｔｅ：ＯＵＲ）とは、単位時間、単位培養液あたりに菌体が消費する酸素の量を示す。ＯＵＲは排ガス分析法によって以下の式２から求めたものを用いる。
（式２）
ＯＵＲ＝７．２２×１０６／Ｖ×（ＱｉＰｉｙｉ／Ｔｉ−ＱｏＰｏｙｏ／Ｔｏ）
Ｖ：培養槽中の液量（Ｌ）
Ｑｉ及びＱｏ：空気入り口及び出口における空気流量（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｐｉ及びＰｏ：空気入り口及び出口における空気圧（ＭＰａ）
Ｔｉ及びＴｏ：空気入り口及び出口における絶対温度（Ｋ）
ｙｉ及びｙｏ：空気入り口及び出口における酸素のモル分率
なお上記式２に基づいてＯＵＲを求める際に、空気流量、空気圧、絶対温度の値が空気入り口及び出口で無視できる程度の差しかないときには１カ所での測定値を適用してもよい。また、本発明でいう圧力及び空気圧は、絶対圧力を指す。
【００４４】
ＯＵＲは、菌体量や菌体あたりの酸素消費量が培養期間において変化するため、通気量、攪拌回転速度、温度、圧力、ｐＨなどによって変動する。従って、ＯＵＲを上述した範囲内に調整するには、空気流量、空気圧等を適宜調整すればよい。当業者であれば、上記式２に基づいて目的とするＯＵＲとなるように適宜調整可能である。
本発明において、ＯＵＲは１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることが好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることがより好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることがより好ましく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることが更に好ましい。ＯＵＲが１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上であれば、乳酸や有機酸などの有機酸やエタノールなどの副生物をより少なくでき、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下であれば、二酸化炭素などの副生物をより少なくできる傾向がある。結果として、ＯＵＲが１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下の範囲であれば、副生物の生成量の低減により、イソプロピルアルコール収率やイソプロピルアルコール生産速度が向上する傾向がある。
【００４５】
前記本発明では、イソプロピルアルコールをより効率よく生産するために、培養時のおける各条件を以下の条件とすることが好ましい：
（１）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜４Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上４／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
（２）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上１／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
（３）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜０．５Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．５／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（４）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜０．５Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．５／ｈ以下であり、ＯＵＲが５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（５）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜０．５Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．５／ｈ以下であり、ＯＵＲが１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（６）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜０．２Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（７）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜０．２Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（８）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ〜０．２Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（９）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２５Ｌ／ｈ〜１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２５／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（１０）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２５Ｌ／ｈ〜１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２５／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（１１）  培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２５Ｌ／ｈ〜１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２５／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
【００４６】
上記（１）の培養条件を、以下のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができる：
（ａ）ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ／Ｂ株、
（ｂ）ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性を不活化した株、
（ｃ）ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性を不活化し、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株、及び
（ｄ）ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性とホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性を不活化し、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株。
また同様に、上記（２）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（３）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（４）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（５）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができる。
また同様に、（６）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（７）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（８）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、（９）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（１０）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（１１）の培養条件を、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができる。
【００４７】
前記生産工程で用いられる前記植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
【００４８】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、及びこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など、並びに、これらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
【００４９】
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、及びこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
【００５０】
イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及びイソプロピルアルコールを生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
本発明の培養に際して、ｐＨ、温度条件は特別の制限はなく、例えばｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃、圧力０〜５ＭＰａ、好ましくは０〜３ＭＰａの範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。
【００５１】
培養槽へ供給される基質液は、炭素源となる植物由来原料を含む溶液のみであってもよく、また、炭素源となる植物由来原料を含む溶液と前記培地との混合液であってもよい。より効率的な培養を行うためには、前記植物由来原料を含む培地を基質液として供することが好ましい。本発明では、連続培養が行われる培養槽内の溶液を、単に「培養液」と総称する場合がある。
培養槽へ供給される場合、基質液における植物由来原料の量は、該原料の溶解度の観点から、炭素源として６０質量％以下とすることができ、イソプロピルアルコール生産性の観点から５質量％〜５０質量％とすることができる。
【００５２】
前記培養液中への気体の通気量は、特に制限はないが、通気攪拌槽で培養し、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜３．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）であり、好ましくは０．１ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍである。培養装置の種類により、適したＯＵＲに調整するための通気量は異なるが、例えば気泡塔で培養する場合の通気量の一例として、０．０２ｖｖｍ〜１０．０ｖｖｍに調整することが挙げられる。
【００５３】
なお、本発明のイソプロピルアルコールの製造方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
【００５４】
前記回収工程では、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液（以下、「抜取り液」ともいう）から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収する。これにより、抜き取り後の前記生産物を含む培養液から、生産物であるイソプロピルアルコールを回収することができる。
前記抜取り液中に含まれるイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば、前記抜取り液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの製造方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
【００５５】
また、前記培養工程は、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養し、該大腸菌を用いてイソプロピルアルコールを生成する工程であってもよい。この場合の回収工程は、気体の供給により前記培養液から揮発したガス中のイソプロピルアルコールを収集するガス状イソプロピルアルコール収集工程と、収集されたガス状イソプロピルアルコールからイソプロピルアルコールを単離する回収工程と、の双方を含む。
【００５６】
ガス状イソプロピルアルコールの収集方法の例としては、コンデンサーによる冷却凝縮やスクラバーやトラップ管での捕捉、イソプロピルアルコールの吸着能の高いフィルター、例えば活性繊維フィルターなどによる吸着などが挙げられる。収集後にイソプロピルアルコールを単離する回収方法の例としては、前述した回収方法をそのまま利用することができ、収集方法に基づいて適宜選択することができる。
なお、この形態においては、ガス状イソプロピルアルコールを収集工程と共に、液状イソプロピルアルコールを収集する工程を含めてもよい。この場合には、前記回収工程は、ガス状イソプロピルアルコールのみならず液状イソプロピルアルコールを回収することを含むものであってもよい。
【００５７】
前記混合物に気体を供給しながらイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養するために適用可能な装置としては、培養槽と、培養槽に連結されて培養槽内の混合液の内部に気体を供給する供給路と、前記培養槽に連結されて培養槽内の気体を回収する回収路を備えてものを挙げることができる。
このような装置としては、例えば、国際公開第２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
【００５８】
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に捕捉される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
【００５９】
また、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、イソプロピルアルコールの前駆体であるアセトンも同時に生産される。得られたアセトンは、公知の方法で精製後に、公知の方法（例えば特許第２７８６２７２号公報記載の方法）を用いることによって、イソプロピルアルコールに変換することが好ましい。これにより、糖原料からイソプロピルアルコールへの変換効率を更に高めることができる。
【００６０】
図１には、本発明に適用可能な製造装置の一例を示す。なお、図１において、１０は製造装置、１２は発酵槽、４８は基質液槽、５０はポンプ、５４はコントローラ、５６は抜取り液槽、５８はポンプ、６２はトラップ槽である。
製造装置１０には、菌体及び植物由来原料を収容してイソプロピルアルコールの生産を行うための、通気攪拌槽としての培養槽１２が備えられている。製造装置１０には、空気入り口から空気を培養槽１２の内部に供給するためのマスフローメータ１４と、槽内の空気を排気口から排出するためのコンデンサ１６が備えられている。コンデンサ１６と排気口との間には、槽内圧力計１８及び排ガス分析計２０が連結され、槽内の圧力及び出口の酸素モル分圧をそれぞれ測定可能になっている。また、排気口は、トラップ槽６２の内部に誘導されて、トラップ槽６２の内部に収容されたトラップ液中で開口している。培養槽１２には、温度センサ２２、溶存酸素センサ２４及びｐＨセンサ２６がそれぞれ配置されている。また、培養槽１２には、攪拌機としてのディスクタービン翼２８が配置されており、ディスクタービン翼２８はマグネッティックスターラ４４で攪拌・制御される。
【００６１】
また、培養槽１２の周囲にはバンドヒータ３８、内部には冷却棒３６が備えられており、冷却棒３６には循環冷却装置４０、冷却水路制御用電磁弁４２が接続されている。培養槽１２の外側には、ｐＨ調整剤を充填した中和剤槽３０が設けられている。中和剤槽３０には天秤３４が備えられている。中和剤槽３０は、ポンプ３２を介して培養槽１２へｐＨ調整剤を供給可能となっている。
培養槽１２には、全体を制御するコントローラ５４が備えられている。コンロトーラ５４は、温度センサ２２、溶存酸素センサ２４及びｐＨセンサ２６に連結されて、それぞれのセンサから、培養槽１２内の反応液中の温度、ＤＯ（溶存酸素）及びｐＨの各情報が入力可能になっている。また、コントローラ５４は、バンドヒータ３８と冷却水路制御用電磁弁４２に連結されている。コントローラ５４は、各種センサからの情報に応じて、バンドヒータ３８、冷却水路制御用電磁弁４２を作動させて温度を制御すると共に、ポンプ３２を作動によりｐＨ制御するようになっている。
【００６２】
また製造装置１０には、基質液槽４８及び抜取り液槽５６が備えられている。基質液槽４８及び抜取り液槽５６にはそれぞれ天秤５２、６０が備えられている。基質液槽４８には、基質液が収容されており、ポンプ５０を介して基質液槽４８が培養槽１２に連結されている。基質液は基質液槽４８からポンプ５０を介して培養槽１２へフィードされる。フィードの方法はコントローラ５４の設定により、ｃｈｅｍｏ  ｓｔａｔ、ｐＨ  ｓｔａｔなど各種フィード制御が可能であり、コントローラ５４からの信号により、ポンプ５０が作動する。
【００６３】
抜取り液槽５６は、ポンプ５８を介して培養槽１２に連結されており、ポンプ５８の作動によって、培養槽１２から培養液が抜き取られ、抜取り液槽５６へ誘導されて収容される。抜取り口は培養槽内で定位置に固定されており、培養槽内の液面が一定となるように制御されている。
トラップ槽６２には水（トラップ液）が充填されており、気化したイソプロピルアルコールが液化するための所定の温度、例えば５℃に維持されている。通気・攪拌により培養槽１２内に揮発するイソプロピルアルコールは、コンデンサ１６が作動することにより培養槽１２からトラップ槽６２に誘導されて、トラップ槽６２でトラップされる。
【００６４】
本発明では、イソプロピルアルコール生産期に菌体を安定的に増殖させる条件下で且つ菌体数を維持して連続培養するので、長時間でのイソプロピルアルコールの生産が可能となり、半回分式培養によるイソプロピルアルコールの生産よりも効率よくイソプロピルアルコールを生産することができる。本発明のイソプロピルアルコールの生産性は、例えば、２４０ｈ以上の連続培養が可能となる。この場合、例えば、０．７ｇ／Ｌ／ｈ以上の生産速度が可能であり、好ましくは１．０ｇ／Ｌ／ｈ以上の生産速度が可能となる。
【実施例】
【００６５】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。イソプロピルアルコールを生産する大腸菌についても実施例に使用した菌体に限定されず、イソプロピルアルコールを生産する大腸菌であれば、特に制限はない。
なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。【００６６】
［イソプロピルアルコール生産大腸菌の作製］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ  αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。【００６７】
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。【００６８】
得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。【００６９】
さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号３）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００７０】
上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号５）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号６）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【００７１】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号７）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号４のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。【００７２】
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００７３】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢと命名した。
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００７４】
＜プラスミドｐＩ＊ａ＊ｚの作製＞
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。【００７５】
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号８）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。【００７６】
コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ＊）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号１０）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＧＴＡＴＧＡＴＧＣＧＡＴＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＴＡＴＣＧＴＴＧＡＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡ【００７７】
作成したＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ａｃａｔｇｃａｔｇｃａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔｇ（配列番号１１）、及びａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａ（配列番号１２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＳａｌＩで消化することで約１．１ｋｂｐのコドン改変イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収して、コドン改変したＩＰＡｄｈ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＵＣ−Ｉ＊と命名した。【００７８】
プラスミドｐＵＣ−Ｉ＊を制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるＩＰＡｄｈ＊を含むフラグメント、とプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しコドン改変したＩＰＡｄｈ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉ＊と命名した。【００７９】
コドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ＊）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号１３）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＣＧＣＧＣＧＧＴＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＧＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＴＡＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＡＣＧＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＴＣＡＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＴＡＴＣＴＣＡＡＧＴＡＡ【００８０】
作成したＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｃｔｇａａａｇａｔｇａａｇｔｇａｔｔａ（配列番号１４）、及びｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｃｔｔｇａｇａｔａａｔｃｇｔａｔａｔｇａ（配列番号１５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩで消化することで約７００ｂｐのコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-Ｉ＊を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩ＊ａ＊と命名した。【００８１】
グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてｇｃｔｃｔａｇａｃｇｇａｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇｇｃｇｇｔａａｃｇｃａａａｃａｇｃｃｃａｇｇ（配列番号１６）、及びｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｃａａａｃｔｃａｔｔｃｃａｇｇａａｃｇａｃ（配列番号１７）を用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＩ＊ａ＊を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚを回収した。【００８２】
＜プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉの作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ１５１９６）。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃａｇｇａａｔｔｃｇｃｔａｔａｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｇ（配列番号１８）、ｃａｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔａｃｔｃｔｔｃｔｇａｔｔｔｔｇａｇ（配列番号１９）、ｃａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｃｇｔｃｇａｔａｔｇｔａｇｇｃｃ（配列番号２０）及びｇａｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃｃｇｔｃａｇｃｔｇｔａｃｇｃ（配列番号２１）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１８のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号１９および２０のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号２１のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【００８３】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８と配列番号１９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２０と配列番号２１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉとした。【００８４】
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉ株の作製＞
作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢにプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００８５】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜し、得られた株をＢ株aｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８６】
＜プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲの作製＞
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）、ＧｎｔＲをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９に記載のエシェリヒア・コリＢ株ゲノム配列の３５０９１８４〜３５１０１７９に記載されている。ＧｎｔＲをコードする塩基配列（ｇｎｔＲ）の近傍領域をクローニングするため、ｇｇａａｔｔｃｇｇｇｔｃａａｔｔｔｔｃａｃｃｃｔｃｔａｔｃ（配列番号２２）、ｇｔｇｇｇｃｃｇｔｃｃｔｇａａｇｇｔａｃａａａａｇａｇａｔａｇａｔｔｃｔｃ（配列番号２３）、ｃｔｃｔｔｔｔｇｔａｃｃｔｔｃａｇｇａｃｇｇｃｃｃａｃａａａｔｔｔｇａａｇ（配列番号２４）、ｇｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｇｃａａｇｇｃｃｇａｔｇｇｃ（配列番号２５）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２２および２５のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。【００８７】
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２２と配列番号２３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２４と配列番号２５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｔＲ−ＬとｇｎｔＲ−Ｒ断片を鋳型に配列番号２２と配列番号２５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このｇｎｔＲ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｔＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲとした。【００８８】
＜プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄの作製＞
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇｎｄ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃｇｃｃａｔａｔｇａａｔｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｇｔｇｇ（配列番号２６）、ｔｇｇａｇｃｔｃｔｇｔｔｔａｃｔｃｃｔｇｔｃａｇｇｇｇｇ（配列番号２７）、ｔｇｇａｇｃｔｃｔｃｔｇａｔｔｔａａｔｃａａｃａａｔａａａａｔｔｇ（配列番号２８）、ｃｇｇｇａｔｃｃａｃｃａｃｃａｔａａｃｃａａａｃｇａｃｇｇ（配列番号２９）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２６のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を有し、配列番号２７および配列番号２８のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位を有している。また、配列番号２９のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。【００８９】
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、配列番号２６と配列番号２７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２８と配列番号２９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｄ−Ｌ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで、ｇｎｄ−Ｒ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｄをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄとした。【００９０】
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株の作製＞
作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株にプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００９１】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｄ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株と命名した。【００９２】
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞  
作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株コンピテントセルにプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株と命名した。【００９３】
＜ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルにプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリＢ株  ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【００９４】
［実施例１］イソプロピルアルコールの連続培養
＜前培養＞
ＬＢ培地（ＤｉｆｃｏＴＭ ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｍｉｌｌｅｒ）を、三角フラスコにフラスコ容量の１／５量入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行った。オートクレーブ殺菌後の培地に、ＷＯ２００９／００８３７７に記載のエシェリヒア・コリ  ｐＧＡＰＩａａａ／Ｂ株を０．１ｖｏｌ％接種した。３５℃の恒温室にて１６ｈｒ振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。【００９５】
＜培養＞
次いで、図１に示される製造装置１０を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽１２は５Ｌ容のものを、基質液槽４８、抜取り液槽５６は２０Ｌ容のものを使用した。トラップ槽６２には、２０Ｌの水を充填し、５℃に保温した。
表１に示す組成でオートクレーブ殺菌済みの培地７５０ｍＬが入った培養槽に、上記の前培養液３８ｍＬを接種した。培養は常圧、攪拌回転速度７００ｒｐｍ、空気通気量１．０ｖｖｍ、培養温度３０℃、ｐＨ＝７．０（アンモニア水で調整）に制御した。
表２に示す組成の基質液を培養開始後８時間目までは１１ｇ／ｈでフィードし、それ以降はフィード速度２２．５ｇ／ｈでフィードした。培養槽１２内の培養液の抜き取り速度はフィード速度と同一とし、培養槽１２内の培養液量は７５０ｍＬに制御した。基質液の比重は１ｇ／ｃｍ３であり、定常状態の比増殖速度は０．０３／ｈである。
なお、培養開始後４８時間目は、菌数をＯＤ６６０による濁度に基づいて測定した場合に菌数が一定状態となったことから、イソプロピルアルコール生産期であると判断された時間である。【００９６】
【表１】
0005886292.tif 000002
【００９７】
【表２】
0005886292.tif 000003
【００９８】
得られた培養液中のイソプロピルアルコール濃度をガスクロマトグラフィーで定法に従って測定した。菌体濃度は分光光度計で６６０ｎｍの波長で測定し、１  ＯＤ６６０＝０．３ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌとして菌体濃度を算出し、これに培養槽内の液量［Ｌ］を積した値を菌体質量［ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ］として算出した。結果を図２、図３、表３に示す。【００９９】
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
カラム温度：３５℃７分、１２℃／ｍｉｎで昇温、２４０℃５分、インジェクション温度：２２０℃、検出器温度：２４０℃、検出器：ＦＩＤ、キャリアーガス：窒素、流速：６ｍＬ／ｍｉｎ、スプリットレス【０１００】
［比較例１］  イソプロピルアルコールの半回分培養
図１のポンプ５８を停止して抜取らないようにし、それ以外は実施例１と同様に培養を行った。１４４時間目の培養液量は３．８Ｌであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得た。結果を図２、図３、表３に示す。【０１０１】
【表３】
0005886292.tif 000004
【０１０２】
図２及び図３において、黒丸は実施例１、白丸は比較例１を示す。図２より、半回分培養（比較例１）では４８時間目以降、培養槽内の菌体質量は一定であり菌体は増殖していないことがわかる。一方、連続培養（実施例１）では連続的に培養液を抜き取っているにも関わらず４８時間目以降槽内の培養槽内の菌体質量は一定であり、菌体増殖が定常状態に達していることが明らかである。その結果、図３より、半回分培養（比較例１）ではイソプロピルアルコールの生産が９６時間でほぼ止まり、イソプロピルアルコール生産量は５５ｇ／９６ｈであるのに対し、連続培養（実施例１）では、イソプロピルアルコール生産量は７６．６ｇ／９６ｈと半回分培養より生産量が高く、１７４時間でもイソプロピルアルコールを生産し続け、イソプロピルアルコール生産量は１２５ｇ／１７４ｈであった。以上より、半回分培養と比較して連続培養の方が長時間安定的にイソプロピルアルコールを生産できることが明らかである。【０１０３】
［実施例２］
上記［イソプロピルアルコール生産大腸菌の作製］ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を用いて、実施例１と同様に前培養を行った。次いで、図１に示される製造装置１０を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽１２は１Ｌ容のものを、基質液槽４８、抜取り液槽５６は４Ｌ容のものを使用した。トラップ槽６２には、４Ｌの水を充填し、５℃に維持した。【０１０４】
表１に示す組成でオートクレーブ殺菌済みの培地５００ｍＬが入った培養槽に、上記の前培養液２５ｍＬを接種した。培養は常圧、攪拌回転速度９００ｒｐｍ、空気通気量２．０ｖｖｍ、培養温度３０℃、ｐＨ＝７．０（アンモニア水で調整）に制御した。ここでは、培養液量が５００ｍＬとなるよう制御した。
表４に示す組成の基質液を培養開始後８時間目までは５ｇ／ｈでフィードし、それ以降はフィード速度６０．６ｇ／ｈでフィードした。基質液の比重は１ｇ／ｃｍ３であり、定常状態の比増殖速度は０．１２１２／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得た。結果を図４、図５、及び表５、表６に示す。
また、プラスミドの脱落率を調べるため、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ寒天培地１と、１００μＬ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ寒天培地２を作製し、希釈した培養槽内培養液を塗布し、３０℃にて保温した。２４時間後のコロニー数をカウントした。アンピシリン耐性を持つプラスミドを保持した大腸菌はアンピシリン含有寒天培地でも生育できるが、プラスミドが脱落した大腸菌はアンピシリン含有寒天培地では生育できないことが知られている。これより、各寒天培地におけるコロニー数から、プラスミド脱落率を下記の式３に従って算出した。結果を図６に示す。
（式３）
プラスミド脱落率＝［（寒天培地１でのコロニー数）−（寒天培地２でのコロニー数）]／（寒天培地１でのコロニー数）【０１０５】
【表４】
0005886292.tif 000005
【０１０６】
［実施例３］
８時間目以降のフィード速度を２３．５ｇ／ｈに変更する以外は実施例２と同様に連続培養を行った。このとき定常状態の比増殖速度は０．０４７０／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得て、また実施例２と同様にしてプラスミド脱落率を得た。結果を図４、図５、図６、表５及び表６に示す。【０１０７】
［実施例４］
８時間目以降のフィード速度を１２．４ｇ／ｈに変更する以外は実施例２と同様に連続培養を行った。このとき定常状態の比増殖速度は０．０２４７／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得て、また実施例２と同様にしてプラスミド脱落率を得た。結果を図４、図５、図６、表５及び表６に示す。【０１０８】
［比較例２］
８時間目以降のフィード速度を７．４ｇ／ｈに変更する以外は実施例２と同様に連続培養を行った。このとき式１から算出される比増殖速度は０．０１４７／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得て、また実施例２と同様にしてプラスミド脱落率を得た。結果を図４、図５、図６、表５及び表６に示す。
なお表６中、イソプロピルアルコール積算質量とは、記載の運転時間までの単位液量あたりのイソプロピルアルコールの生産量の総和、つまり培養槽内の培養液、抜取られた培養液、トラップ槽に含まれる全イソプロピルアルコール質量の総和を該運転時間における培養槽内の培養液量（ここでは０．５Ｌ）で除した値である。生産速度は、イソプロピルアルコール積算質量から算出した平均イソプロピルアルコール生産速度であり、以下、同様である。【０１０９】
【表５】
0005886292.tif 000006
【０１１０】
【表６】
0005886292.tif 000007
【０１１１】
図４、及び図５及び図６において、黒丸は実施例２、白丸は実施例３、黒三角は実施例４、及び白三角は比較例２を示す。
比較例２（比増殖速度０．０１４７［ｈ−１］）では４８時間目以降、培養槽内の菌体数は維持又は増殖されておらず（図４）、定常状態には至らなかった。また、イソプロピルアルコールの生産は９６時間で停止することが判明した（図５）。このときのプラスミドの脱落率が８０％以上であることが、図６より明らかである（図６参照）。
一方、比増殖速度が０．０１４７［ｈ−１］より高い条件で培養を行った実施例２〜実施例４では、菌体増殖は定常状態に至り、長時間の連続運転が可能であり、イソプロピルアルコールは安定的に生産できた。【０１１２】
［実施例５］
表７に示す基質液組成に変更、攪拌回転速度を５００ｒｐｍに変更し、それ以外は実施例２と同様に連続培養を行った。
ＯＵＲの算出には、空気入り口の空気流量はマスフローメータ１４の値を、また出口の空気流量も、酸素消費による減少分は無視できる範囲としてマスフローメータ１４の値を採用した。同様に空気入り口及び出口の空気圧は共に槽内圧力計１８の値を採用した。また空気入り口及び出口における絶対温度は共に槽内の温度センサ２２の値を採用した。空気入り口の酸素モル分率は０．２０９とし、出口の酸素モル分率は排ガス分析計２０の値を採用した。溶存酸素濃度は、槽内の溶存酸素センサ２４の値を採用した。【０１１３】
本実施例では、空気入り口及び出口の空気流量は１．０Ｌ／ｍｉｎ、空気入り口及び出口の空気圧は常圧、空気入り口及び出口の温度は３０℃とした。ここでは１分ごとに記録した各値を用いて、上述した式２に従って算出した値の２４時間目以降の定常状態の平均値をＯＵＲとした。本実施例の算出ＯＵＲは５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８、図９、図１０、表８及び表９に示す。比増殖速度は０．１２００／ｈであった。【０１１４】
【表７】
0005886292.tif 000008
【０１１５】
［実施例６］
攪拌回転速度を６００ｒｐｍに変更し、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。
このとき算出ＯＵＲは１０７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８及び表８に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２０３／ｈであった。【０１１６】
［実施例７］
攪拌回転速度７００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは１５３ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求め、また溶存酸素濃度を得た。結果を図７、図８、図９、図１１、表８及び表９に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２００／ｈであった。【０１１７】
［実施例８］
攪拌回転速度８００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは１８７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８、表８に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２１０／ｈであった。【０１１８】
［実施例９］
攪拌回転速度９００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは１９６ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求め、また溶存酸素濃度を得た。結果を図７、図８、図９、図１２及び表８及び表９に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２１０／ｈであった。【０１１９】
［実施例１０］
攪拌回転速度４００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８、及び表８に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２００／ｈであった。【０１２０】
【表８】
0005886292.tif 000009
【０１２１】
【表９】
0005886292.tif 000010
【０１２２】
低いＯＵＲでは副生物である乳酸が生成する傾向にあるため、イソプロピルアルコール生産速度が低下する傾向にある。また高いＯＵＲでは、グルコースは完全酸化に利用される割合が高くなる傾向にあるため、イソプロピルアルコール収率は低下する傾向にある。
図７及び表８より、ＯＵＲを２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの範囲に制御することにより、イソプロピルアルコール収率がより一層高くなることがわかる。また、図８及び表８よりＯＵＲを２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの範囲に制御することにより、イソプロピルアルコール生産速度もより一層高くなることが判明した。
また、図には示さないものの、実施例５〜１０のいずれにおいても酢酸生産速度は０．６ｇ／Ｌ／ｈ以下、エタノール生産速度は０．１ｇ／Ｌ／ｈ以下であった。【０１２３】
また、イソプロピルアルコールの積算質量の経時変化を図９に示す。図９において黒丸は実施例５、黒菱形は実施例７、黒三角は実施例９を示す。
いずれの実施例の結果から明らかなように、１１日間の連続運転でも、生産速度は低下することなく連続的にイソプロピルアルコールを生産できることがわかる。
培養槽内の溶存酸素濃度の経時変化を実施例５は図１０に、実施例７は図１１に、実施例９は図１２に各々示す。これにより、培養槽内の溶存酸素濃度が０ｐｐｍであっても、また、溶存酸素濃度が０〜１ｐｐｍ付近で変動していても、酢酸生産速度は低く、かつ、イソプロピルアルコールの生産速度は高く維持されており、特に溶存酸素濃度を制御するＤＯ−Ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ  ＤＯ−ｓｔａｔ法などの複雑な制御方法を採らなくても副生物の生成を抑制できることが分かった。
また、図には示さないものの、実施例５〜実施例１０において、培養槽内の菌体質量は２４時間目以降一定であり、定常状態に達していた。【０１２４】
［実施例１１］
基質液の組成を表１０に変更し、基質液を培養開始後８時間目までは５ｇ／ｈでフィードし、それ以降は平均フィード速度４２ｇ／ｈでフィードした。ここでは基質が抜取り液へ流出するのを最小限にするため、ｐＨｓｔａｔ法を採用した。それ以外は実施例２と同様に連続培養を実施した。このときＯＵＲは２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度及び菌体質量を得て、また、実施例２と同様にプラスミド脱落率を得た。結果を図１３、図１４、表１１及び表１２に示す。比増殖速度は０．０８３／ｈであった。【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
【表１１】
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【０１２７】
【表１２】
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【０１２８】
図１３より、培養槽内の菌体質量は２４時間以降一定であり、２４時間目〜８４０時間目までの平均菌体濃度は１２ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌであった。図１４より、発酵条件を最適化することにより３５日間の連続運転が可能となることがわかる。このとき、表１１より、イソプロピルアルコール積算質量は１３１５ｇ／Ｌ／８４０ｈ、生産速度は１．５７ｇ／Ｌ／ｈであった。更に６日目までにおいては２．４０ｇ／Ｌ／ｈ、１０日目までにおいては、２．１５ｇ／Ｌ／ｈという高い生産速度であった。また、図１５より組換え大腸菌のプラスミド脱落率は２７日目までは２０％以下という低い値で、２９日目で４７％、３５日目で７７％であり、長時間プラスミドが保持されていることが判明した。【０１２９】
このように本発明によれば、イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて連続培養により、簡便に且つ長時間安定的に高い生産効率でイソプロピルアルコールを製造することができる。【０１３０】
２０１１年８月１１日に出願された日本国特許出願第２０１１−１７６４０２号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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