(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の外部から該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
以下のアミノ酸配列：
ＷＲＲＱＡＲＦＫ（配列番号１）
から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程と、
を包含する方法。
【請求項２】
前記外来物質は、ペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外来物質はペプチドであり、前記外来物質導入用構築物は、該外来物質としてのペプチドのフラグメントと前記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
真核細胞の外部から該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物であって、
以下のアミノ酸配列：
ＷＲＲＱＡＲＦＫ（配列番号１）
から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物。
【請求項６】
前記外来物質は、ペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
前記外来物質はペプチドであり、該外来物質としてのペプチドのフラグメントと前記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである、請求項６に記載の構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞の外部から該細胞の内部に外来物質を導入（移送）する方法と該方法に用いられるキャリアペプチドフラグメントに関する。
なお、本出願は２００９年７月２９日に出願された日本国特許出願２００９−１７７１０１号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド等の外来物質、とりわけ生理活性物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換したり或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。
例えば、特許文献１には、ポリペプチド、ＤＮＡ等の外来物質を細胞内に導入するための細胞透過性キャリアペプチドが記載されている。この特許文献には、細胞透過性キャリアペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ等を連結したキャリアペプチドコンジュゲートを用いることによって、ポリペプチド、ＤＮＡ等の生理活性物質を高効率に細胞内に導入することができると記載されている。
また、導入したい外来物質（生理活性物質）として比較的分子量の大きいポリペプチド全体を特別な装置を用いることなく目的の細胞内に容易に導入して当該細胞の形質を転換したり機能を改善（若しくは向上）させたりする手法が求められている。【０００３】
或いはまた、ポリペプチドやタンパク質全体を導入することに代えて、当該ポリペプチドの有するある特定の機能に着目し、その機能を発現させ得る最小単位であるアミノ酸配列部分、即ちペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列（外来物質）を細胞内に効率よく導入する方法も求められている。
例えば、特許文献２には、ＳＯＣＳタンパク質及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するペプチド鎖（アミノ酸配列）の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」の全部又は一部を構成するアミノ酸配列が体性幹細胞に対する高い神経分化誘導活性を有するモチーフであることが開示されており、該モチーフを哺乳動物の体性幹細胞に導入することにより該導入細胞を神経細胞に分化誘導し得ることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特許第３８５４９９５号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０１０９８９号
【特許文献３】日本国特許出願公開第２００５−３３０２０６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＥＭＢＯレポート(EMBO reports)、１０巻（３号）、２００９年、ｐｐ．２３１−２３８
【非特許文献２】トラフィック−インターナショナル・ジャーナル・オブ・イントラセルラートランスポート(Traffic−International Journal ofIntracellular Transport)、７巻、２００６年、ｐｐ．８３３−８４８
【非特許文献３】ＰＮＡＳ、９５巻、１９９８年、ｐｐ．１１４−１１９
【非特許文献４】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１２巻、１９９８年、ｐｐ．３８７２−３８８１
【非特許文献５】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．２８６７−２８７２
【非特許文献６】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．３０５５−３０６５
【発明の概要】
【０００６】
ところで、上記の特許文献１に記載されるように、従来の細胞透過性キャリアペプチド（例えばＨＩＶやショウジョウバエ由来の細胞透過性キャリアペプチド）は、構成アミノ酸残基数が比較的多く、１０以下のアミノ酸残基数から構成されるような短い鎖長で効率よく合成し得且つ使用し得る外来物質導入用のペプチド（アミノ酸配列）が望まれる。
【０００７】
そこで本発明は、かかる要望に対応すべく創出された発明であり、１０以下のアミノ酸残基数で構成される短いアミノ酸配列のペプチドフラグメントであって外来物質を細胞（典型的には真核細胞、特に細胞壁を有さない哺乳動物細胞等の動物細胞）外から当該細胞内に導入するために用いられる短い鎖長のキャリアペプチドフラグメントを提供することを目的とする。また、本発明は、かかるキャリアペプチドフラグメントを使用して、種々の外来物質を細胞外から細胞膜を通過させて目的の細胞内に導入する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと外来物質とを含むように作製された当該外来物質を導入するための構築物を提供する。また、本発明は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと外来物質とを有する構築物が細胞質内（核内であることを含む）に導入された細胞、器官その他の生体組織を提供する。
【０００８】
本発明者は、細胞内において何らかの機能を有するペプチドとしてアミノ酸配列が既に同定されているペプチド（若しくはペプチドの一部（即ち機能が特定されているモチーフ）を構成するアミノ酸配列）を種々検討し、従来よりも短い鎖長であるにもかかわらず、上記キャリアペプチド（フラグメント）として好ましく使用し得るアミノ酸配列を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明によって提供される方法の一つは、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部（即ち細胞膜の外側）から該細胞の細胞質内（さらに好ましくは核体）に目的とする外来物質を導入する（移送する）方法である。
即ち、ここで開示される外来物質導入方法は、ＷＲＲＱＡＲＦＫ（配列番号１）からなるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列の何れかから成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
上記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料（典型的には該細胞を含む培養物）中に供給する工程と、
上記外来物質導入用構築物が供給された上記試料をインキュベートして（即ち対象の細胞が生存可能な条件下に試料を一定期間保持して）、上記試料中の真核細胞内に上記構築物を導入する工程と、を包含する。
ここで「外来物質」は、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合可能な無機化合物及び有機化合物であって、真核細胞内に導入可能な分子サイズ及び化学的性質を有するものをいう。
【００１０】
本発明者は、上記非特許文献１や非特許文献２に記載されているコロナウイルス属に属するＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる８個のアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列「ＷＲＲＱＡＲＦＫ（配列番号１）」から構成されるペプチドフラグメントが対象細胞の細胞膜を容易に通過し得ること、そして該細胞膜の通過は、該ペプチドフラグメントに外来物質を結合した構築物でも同様に実現することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、上記構成の本発明の導入方法によると、目的とする外来物質（典型的にはペプチド、核酸、色素、薬剤等の有機化合物）を上記キャリアペプチド（フラグメント）のＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合させて構築した外来物質導入用構築物を、対象とする真核細胞を含む試料（典型的には該細胞を含む培養物）中に供給する（即ち生存する真核細胞に添加する）ことによって、当該目的の外来物質を真核細胞の外部（細胞膜の外側）から細胞膜を通過させて細胞質内（好ましくはさらに核膜を通過させて核内）に高効率に移送することができる。
【００１１】
ここで開示される外来物質導入方法の好ましい一態様では、上記外来物質がペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物であることを特徴とする。
ここで「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有する有機化合物をいい、ポリペプチド（典型的にはアミノ酸残基数が１０以上３００未満）やタンパク質（典型的には上記ポリペプチドよりも多い数（３００以上）のアミノ酸残基から成る高分子化合物）を包含する。
また、ここで「核酸」は、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
この種の有機化合物を含むように作製された構築物は、効率よく目的の細胞内に導入することができる。
【００１２】
また、ここで開示される外来物質導入方法の好ましい他の一態様では、上記外来物質はペプチドであり、上記外来物質導入用構築物は、該外来物質としてのペプチドから成るフラグメントと上記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである。
本態様の方法によると、上記合成ペプチドの状態で、目的のペプチド（即ち該ペプチドを構成するアミノ酸配列）を一つのペプチドモチーフとして標的とする細胞内に導入することができる。
【００１３】
ここで開示される外来物質導入方法の好ましい他の一態様では、上記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞（人工多能性幹細胞を包含する。以下同じ。）であることを特徴とする。
本発明によると、ヒトその他哺乳類の幹細胞（例えば体性幹細胞や人工多能性幹細胞）に所定の機能を有する目的の外来物質を導入することができる。このことにより、導入する外来物質（ペプチド等）に応じて当該幹細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
【００１４】
また、本発明は、上記目的を実現するべく、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物を提供する。
即ち、ここで開示される外来物質導入用構築物は、ＷＲＲＱＡＲＦＫ（配列番号１）からなるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列の何れかから成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質とを有する。
かかる構築物を利用して本発明の外来物質導入方法を実施することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入することができる。また、該外来物質が導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。
【００１５】
好ましくは、上述のとおり、上記外来物質は、ペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である。
また、特に好ましくは、上記外来物質はペプチドであり、上記外来物質導入用構築物は、該外来物質としてのペプチドのフラグメントと上記キャリアペプチドフラグメントとを有する合成ペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル１）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。
【図２】図２は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル１）を供給したヒト新生児包皮線維芽細胞を４時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。
【図３】図３は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル１）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。
【図４】図４は、一実施例に係る外来物質導入用構築物（サンプル２）を供給したヒトｉＰＳ細胞を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。写真中のスケールは１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成や細胞培養に関するような一般的事項）は、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
また、本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
【００１８】
ここで開示される「キャリアペプチドフラグメント」は、上記配列番号１のアミノ酸配列により規定（把握）される配列であって、真核細胞の細胞膜透過性（さらに好ましくは核移行性（核膜透過性））を発揮させるアミノ酸配列である。
ここで配列番号１に記載される具体的なアミノ酸配列は、上記ＩＢＶのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎプロテイン）の第７１番目〜第７８番目のアミノ酸残基までの合計８アミノ酸残基から成る配列部分（即ちモチーフ）に相当する核小体局在シグナル（Nucleolar localization sequence）であるところ、本発明者によって新たに優れた細胞膜透過性を示すことが見出された配列である。即ち、１０以下のアミノ酸残基（ここでは８アミノ酸残基）から成る極めて短い鎖長のペプチドフラグメントであるにもかかわらず外来物質を細胞外から細胞質内に導入することができる。
ここで開示される「キャリアペプチドフラグメント」は、典型的には配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一の配列であるが、当該同一配列の他に、細胞膜透過性を損なうことなく１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列を包含する。即ち、そのような軽微な改変配列は、ここで開示される情報に基づいて当業者にとって容易に利用されるものであり、ここで開示される技術的思想としての「キャリアペプチドフラグメント」に包含されるからである。典型例として、配列番号１のアミノ酸配列のうち１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列が挙げられる。
【００１９】
ここで開示される外来物質導入用構築物は、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望する外来物質を直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合（連結）することによって設計・構築され得る構築物である。例えば、外来物質がペプチドである場合には、該ペプチドを構成するアミノ酸配列と、キャリアペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を合成することによって、目的の外来物質導入用構築物を作製することができる。また、種々のＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、あるいは色素（例えばＦＩＴＣ等の蛍光色素化合物）や薬剤（例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗ガン剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤）として機能する有機化合物を従来公知の種々の化学的手法により、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的若しくは間接的に結合させて外来物質導入用構築物を構築することができる。
【００２０】
なお、外来物質がペプチドの場合、採用するペプチド（アミノ酸配列）としては特に限定されない。比較的アミノ酸残基数が多い、例えばアミノ酸残基数が１００〜１０００程度のポリペプチド若しくはタンパク質も外来物質として採用し得る。
典型的には、外来物質導入用構築物として作製する合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数が１０００以下が適当であり、好ましくは６００以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、特に３００以下（更には１００以下、例えば１０〜５０）が好適である。このような比較的短いペプチドは合成が容易であり、使用しやすい。
【００２１】
採用する外来物質としては、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、ガン化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるペプチド（ポリペプチド、タンパク質を包含する。）の成熟型或いは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）が好ましい。また、機能が従来知られていないペプチドを細胞内に導入して当該ペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明に本発明を実施することもできる。
例えば、導入対象の真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞（体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：以下ｉＰＳ細胞という。）を包含する。）である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するペプチドの成熟型又はその前駆体の利用が好ましい。また、導入対象の真核細胞が癌細胞（腫瘍細胞）である場合、当該癌細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のペプチドの利用が好ましい。
【００２２】
或いはまた、従来、所定の細胞（例えばヒト又は他の哺乳動物の皮膚細胞その他の体細胞）に複数の遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８）を導入してｉＰＳ細胞を作製しているが、該手法に代えて、これら遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の産物（ペプチド）を本発明の導入方法により導入してもよい。これにより、上記遺伝子の直接的な導入に代えて当該遺伝子の産物（即ちペプチド）を細胞内（好ましくは核内）に導入することによってｉＰＳ細胞を作製することが可能となる。
従って、本発明の好適な一実施形態として、ｉＰＳ細胞の作製に関与する複数の遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子（例えばＳｏｘ２）がコードするペプチド（例えばＳＯＸ２タンパク質）を外来物質として本発明に係る外来物質導入用構築物を作製し、該構築物を所定の真核細胞（ヒト皮膚線維芽細胞等）に導入することを特徴とするｉＰＳ細胞作製方法が挙げられる。
【００２３】
また、従来知られた種々の配列モチーフ（ペプチドモチーフ）を利用することができる。例えば、導入対象の真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞（体性幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞を包含する。）である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々のペプチドモチーフの利用が好ましい。また、導入対象の真核細胞が癌細胞（腫瘍細胞）である場合、当該癌細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のペプチドモチーフの利用が好ましい。
【００２４】
本発明の実施に特に好ましく使用され得るペプチドモチーフの好適例として、上述の特許文献２に記載される、神経分化誘導性を発揮し得る種々のアミノ酸配列（モチーフ）が挙げられる。
即ち、特許文献２には、エロンジンＡ（ＥｌｏｎｇｉｎＡ）と複合体を形成して転写調節因子として働くことが知られているエロンジンＢＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ）コンプレックス（具体的にはＥｌｏｎｇｉｎＣの一部）に結合し得る領域（アミノ酸配列）であるＳＯＣＳ−ボックスを有する種々のＳＯＣＳタンパク質（サイトカイン情報伝達のサプレッサー）及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するアミノ酸配列の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」に包含されるアミノ酸配列が、体性幹細胞に対して高い神経分化誘導活性を有することが記載されている。
【００２５】
その典型例である配列番号２〜１９は、ＳＯＣＳ系タンパク質として同定された各種タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である（非特許文献３〜６参照）。
具体的には、ｍＳＯＣＳ−１（配列番号２），ｍＳＯＣＳ−２（配列番号３），ｍＳＯＣＳ−３（配列番号４），ｍＳＯＣＳ−４（配列番号５），ｍＳＯＣＳ−５（配列番号６），ｈＳＯＣＳ−６（配列番号７），ｈＳＯＣＳ−７（配列番号８），ｈＲＡＲ−１（配列番号９），ｈＲＡＲ−ｌｉｋｅ（配列番号１０），ｍＷＳＢ−１（配列番号１１），ｍＷＳＢ−２（配列番号１２），ｍＡＳＢ−１（配列番号１３），ｍＡＳＢ−２（配列番号１４），ｈＡＳＢ−３（配列番号１５），ＬＲＲ−１（配列番号１６），ｈＡＳＢ−７（配列番号１７），ｍＡＳＢ−１０（配列番号１８），ｈＡＳＢ−１４（配列番号１９），に含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を示している（非特許文献３〜６参照）。
また、特に詳細な説明は省略するが、配列番号２０〜８０は、ウイルス（ＨＩＶ、ＡｄＶ、ＳＩＶ等）や哺乳動物から同定された種々のＳＯＣＳ系タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列及び該配列から成るペプチドを示している。例えば、配列番号７５および配列番号７９は、ヒトから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質（ＭＵＦ１）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。また、配列番号８０は、マウスから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質ｍＣＩＳ（cytokine-inducible SH2-containing protein）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。
これらは例示であり、ＢＣ−ボックスの構成アミノ酸配列（モチーフ）をこれらに限定することを意図したものではない。ここに例示するまでもなく、様々なＢＣ−ボックスの構成アミノ酸配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それらアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
【００２６】
本発明の好適な一実施形態では、上述したいずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（典型的には配列番号２〜８０のうちの何れかのアミノ酸配列）を神経分化誘導に関与するペプチドモチーフ（配列モチーフ）として使用し、標的とする真核細胞（例えばヒトや哺乳動物由来の体性幹細胞）に導入する合成ペプチドを構築することができる。従って、上記説明から明らかなように、本発明によって、少なくとも一種の真核細胞を神経細胞に分化誘導する方法が提供される。即ち、本方法は、本発明に係る上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしていずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（典型的には配列番号２〜８０のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個（例えばＮ末端から少なくとも１０個）の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列）を備えるペプチド鎖を合成すること、および、該合成ペプチド（即ち外来物質導入用構築物である人工ペプチド）を対象である真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する試料（典型的には該細胞を含む培養物）に供給すること、を包含する。典型的には、さらに該合成ペプチドが供給された試料をインキュベートすること、を包含する。
【００２７】
また、上記説明から明らかなように、本発明によって、そのような神経細胞への分化誘導方法に利用する人工ペプチドとその製法が提供される。
即ち、かかる構成の人工ペプチド（神経分化誘導ペプチド）は、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしていずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（以下「ＢＣ−ボックス関連配列」ともいう。典型的には配列番号２〜８０のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個（例えばＮ末端から少なくとも１０個）の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列）を備えるように合成され得る。
或いはまた、配列番号８１に示す１５個の連続するアミノ酸配列もまた上記ＢＣ−ボックス関連配列と同様の目的に使用することができる。即ち、配列番号８１に示すアミノ酸配列は、特許文献３に記載されるように、神経分化誘導性を示すことが知られているＶＨＬ（フォン・ヒッペル・リンド）タンパク質のアミノ酸配列の第１５７番目〜第１７１番目までの１５個の連続するアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列（ＶＨＬ関連ペプチドモチーフ）である。
なお、上述した本発明に係るキャリアペプチドフラグメントの場合と同様、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしての機能を保持する限りにおいて、１個または数個（例えば５個以下典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列もまた神経分化誘導に関するペプチドモチーフ（外来物質）として使用し得ることは勿論である。
【００２８】
上記のような構成の外来物質導入用構築物は、神経分化誘導ペプチドとして少なくとも一種の細胞（典型的には幹細胞）に対して高い神経分化誘導活性を有する。このため、神経分化誘導剤の有効成分として好適に使用し得る。なお、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、神経分化誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、神経分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。
【００２９】
神経分化誘導剤は、有効成分である上記構成の神経分化誘導ペプチドの他、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。神経分化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、神経分化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
神経分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、神経分化誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
【００３０】
本発明によって提供される神経分化誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、ここで開示されるＢＣ−ボックス関連配列或いはＶＨＬペプチドモチーフと、キャリアペプチドフラグメントと、を含むように合成された神経分化誘導ペプチド(即ち該合成ペプチドを含む神経分化誘導剤）は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これにより、生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する体性幹細胞から、神経細胞を発生(生産)させることができる。このため、神経再生が有力な治療法となる種々の神経疾患を効果的に治療することが可能となる。例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することが実現される。
【００３１】
或いはまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生組織や細胞塊(例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を供給することによって、効率よく目的のペプチドモチーフ（ＢＣ−ボックス関連配列等）を細胞外から細胞質内（さらに好ましくは核体）に導入することができ、神経細胞を効率よく発生させることができる。このことは当該細胞材料中に所望する神経細胞を大量に生産し得ることを意味する。而して、大量に生産された神経細胞、或いは該生産された神経細胞を含む細胞材料（生組織や細胞塊）を再び生体内(典型的には神経再生が要求されている患部）に戻すことによっても、生体に直接神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を投与する場合と同様の治療効果が得られ得る。
以上の説明から明らかなように、本発明は別の側面として、ここで開示される上記構成の神経分化誘導ペプチドのいずれかを利用することによって、神経疾患治療に有用な、神経細胞に分化誘導された細胞、細胞塊又は生組織を提供することができる。
【００３２】
また、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、神経分化誘導ペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る神経分化誘導ペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、上述した患者等に対し、神経疾患を治療し又は予防する薬剤として有用である。
【００３３】
典型例として説明した上記神経分化誘導ペプチドのような、本発明によって提供される外来物質がペプチドである外来物質導入用構築物（即ち、人工的に合成されたペプチド）は、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されていてもよい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、当該ペプチドの細胞質内及び核内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させ得る。
人工ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１０００以下（好適には６００以下、特に好ましくは３００以下、例えば５０以下）であるものが望ましい。このような短鎖長のペプチドは化学合成手法によって容易に構築することができるため、目的とする真核細胞を含む試料に供給し易い。
なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。
なお、人工ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、内在するキャリアペプチドフラグメントならびにペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
また、内在するキャリアペプチドフラグメントならびに外来物質であるペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、これら配列に含まれ得ない付加的な配列を部分的に含み得る。例えばリンカーとして機能する数個のアミノ酸残基（例えばグリシン残基）をキャリアペプチドフラグメントと外来ペプチドモチーフとの間に配置した構成のアミノ酸配列を構築してもよい。
【００３４】
使用する人工ペプチド（外来物質導入用構築物）のうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機（例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００３５】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて人工ペプチド（外来物質導入用構築物）を生合成してもよい。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する人工ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のアミノ酸配列から成るペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のペプチド（即ち外来物質導入用構築物）を得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００３６】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の外来物質導入用構築物（人工ペプチド）を製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち目的とする人工ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
従って、細胞質内（好ましくは核内）への導入対象であるペプチドモチーフに対応するアミノ酸配列（例えば上述したＢＣ−ボックス関連配列）を決定し、上記配列番号１に示す細胞膜透過性のキャリアペプチドフラグメントと合わせてペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の人工ペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいてペプチドを容易に生産することができる。
【００３７】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００３８】
＜実施例１：外来物質導入用構築物の作製＞
計２種類のペプチド（サンプル１〜２）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列を列挙している。
【００３９】
【表１】
0005858283.tif 000002
【００４０】
表１に示すように、ペプチド１は、本発明に係る配列番号１のキャリアペプチドフラグメントからなるペプチドである。また、ペプチド２は、配列番号１に示すキャリアペプチドフラグメントのＣ末端側にリンカーとしてグリシン残基を一つ介在させ、そのＣ末端側に外来物質としてのペプチドフラグメントとして上記ＶＨＬペプチドモチーフ（配列番号８１）を有するように構築されている（なお表１に示すアミノ酸配列中のハイフンは当該アミノ酸配列の構成を理解容易にするために加えたものにすぎない。）。なお、いずれのペプチドも、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００４１】
上記得られたペプチド１および２のＮ末端側にさらに外来物質として蛍光色素を連結させ、本実施例に係る二つの外来物質導入用構築物を作製した。
具体的には、蛍光色素として一般的なＦＡＭ（即ち、Ｃ２１Ｈ１２Ｏ７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３）を常法に基づいて上記ペプチド１のＮ末端側に直接的に結合させ、ペプチド１に基づく外来物質導入用構築物である「(FAM)-WRRQARFK」を作製した。以下、サンプル１と呼称する。
他方、蛍光色素として一般的なＦＩＴＣ（即ち、Ｃ２１Ｈ１１ＮＯ５Ｓ：  Fluorescein isothiocyanate 、分子量３８９．４）をリンカーとしてよく知られているＡｃｐ即ち６−アミノヘキサン酸（６-Aminocaproic acid、分子量１３１．２）を介在させて常法に基づいて上記ペプチド２のＮ末端側に間接的に結合させ、ペプチド２に基づく外来物質導入用構築物である「(FITC)-(Acp)-WRRQARFKGTLKERCLQVVRSLVK」を作製した。以下、サンプル２と呼称する。
こうして得られた各サンプルペプチドをそれぞれＰＢＳ（Phosphate buffered saline）に希釈し、サンプル（ペプチド）濃度が１ｍＭのサンプル溶液を計２種類作製した。
【００４２】
＜実施例２：サンプル１およびサンプル２の細胞膜透過機能評価（１）＞
真核細胞としてヒト新生児包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−２０９７）を使用し、上記実施例１で得られた２種のサンプル（外来物質導入用構築物）の細胞膜透過機能を調べた。
即ち、９０％イーグルＭＥＭ培地（０．１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含む。）および１０％血清（ＦＢＳ）の混合液を培地として使用し、上記線維芽細胞を培養した。
培養細胞は、０．２５％トリプシン溶液で３７℃１分間のトリプシン処理を行った。上記処理後、ＦＢＳ含有培地にてトリプシンを失活させるとともに、当該培地により細胞濃度が凡そ５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した細胞懸濁液（外来物質導入用の試料）を調製した。
【００４３】
次いで、上記細胞懸濁液０．５ｍＬを所定の細胞培養容器（０．１％ゼラチンで表面コートしたカルチャースライド）に入れて５％ＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。その後、培地を新鮮なものに置換し、上記実施例１で調製した何れかの１ｍＭサンプル溶液を最終的にサンプル濃度（ペプチド濃度）が１μＭとなるように細胞培養容器に添加した。ここでは０．５μＬのサンプル溶液を容器に添加した。そして、５％ＣＯ２条件下、３７℃で１時間若しくは４時間インキュベートした。
１時間培養後の細胞、４時間培養後の細胞をそれぞれＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で洗浄し、該細胞をメタノールで固定した（氷上で１０分間）。
【００４４】
次いで、核染色剤であるＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を含むProlong（登録商標）Gold Antifade Reagent（Invitrogen社製品）を使用して該メタノール固定された試料（細胞）を封入した。そして、各試料（メタノール固定後に上記封入した試料）について、共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いて蛍光色素が結合した（即ち蛍光色素ラベル化された）ペプチドの細胞内の局在を確認した。
図１〜２は、上記サンプル１を添加した細胞懸濁液についての結果を示す顕微鏡写真であり、図１は１時間培養後、図２は４時間培養後の試料についての結果である。
これら顕微鏡写真から明らかなように、上記添加されたサンプル１は、添加後迅速に細胞外から細胞膜を透過して細胞内に導入されていることが確認された。更にＤＡＰＩによる核染色の結果から細胞質内に導入されたサンプル１の一部は核内にも移行していること（即ち核内に導入されたこと）が確認された。また、顕微鏡写真を添付していないが、サンプル２についても同様の結果であった。
即ち、上記実施例１で得られた計２種（サンプル１〜２）の外来物質導入用構築物は、上記キャリアペプチドフラグメントを含むことにより優れた細胞膜透過性を示すことが確認された。
【００４５】
＜実施例３：サンプル１およびサンプル２の細胞膜透過機能評価（２）＞
外来物質を導入する対象の細胞をヒト新生児包皮線維芽細胞からヒト由来のｉＰＳ細胞（Human induced pluripotent stem cells）に変更して上記実施例１で得られた２種のサンプル（外来物質導入用構築物）の細胞膜透過機能を調べた。なお、本実施例で使用するｉＰＳ細胞（細胞株：２０１Ｂ２−０８２００８ＫＵ）とフィーダー細胞であるマウス胎児線維芽細胞（細胞株：ＳＮＬ  ７６／７、以下「ＭＥＦ」という。）は、京都大学再生医科学研究所山中研究室（山中伸弥教授）から供与されたものを使用した。
先ず、入手したＭＥＦをマイトマイシンＣ処理（３時間）して不活性化し、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン溶液でトリプシン処理した。上記処理後、ＦＢＳ含有培地にてトリプシンを失活させるとともに、ＭＥＦ用培地（７％のＦＢＳ（Gibco社製品）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco社製品）、５０units／ｍＬのペニシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Gibco社製品）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）：Gibco社製品）を用いてＭＥＦを適当な細胞密度に調整し、０．１％ゼラチンで表面コートした培養容器（カルチャースライド形状又はプレート形状）に上記ＭＥＦを播種した。ここでは細胞密度は、約１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種した。次いで、上記容器をインキュベーターに入れ、５％ＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。
その後、ＭＥＦ用培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することによってフィーダー細胞を作製した。
【００４６】
一方、入手したｉＰＳ細胞株にＣＴＫ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Gibco社製品）、１ｍＭの塩化カルシウム、２０％のＫＳＲ（KnockOut（商標）Serum Replacement）を含む０．２５％トリプシン溶液）を添加してＭＥＦを剥がし、ＰＢＳで洗浄した。
次いで、１ｍＬのｈＥＳＣ培地（即ちヒトＥＳ細胞培地、ここでは２０％のＫＳＲ（Gibco社製品）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco社製品）、０．１％の非必須アミノ酸（Gibco社製品）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Gibco社製品）、５０units／ｍＬのペニシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Invitrogen社製品、４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Basic Fibroblast Growth Factor）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco社製品））を添加し、セルスクレーパを用いてｉＰＳ細胞を剥がし、軽くピペッティングを行ってコロニーを崩した。
こうして得られたｉＰＳ細胞の懸濁物を上記のように作製しておいた培養容器中のフィーダー細胞上に播種した。そして上記ｈＥＳＣ培地を添加し、培養容器をインキュベーターに入れ、５％ＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４７】
一晩のインキュベート後、培養容器から培地を除去し、最終的にサンプル濃度（ペプチド濃度）が１μＭとなるように上記実施例１で調製した何れかの１ｍＭサンプル溶液を添加した上記ｈＥＳＣ培地を培養容器に添加した。そして、５％ＣＯ２条件下、３７℃で１時間若しくは４時間インキュベートした。
１時間培養後の細胞、４時間培養後の細胞をそれぞれＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で洗浄し、該細胞をメタノールで固定した（氷上で１０分間）。
【００４８】
次いで、実施例２と同様の処理を行って、共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いて蛍光色素が結合した（即ち蛍光色素ラベル化された）ペプチドのｉＰＳ細胞内の局在を確認した。なお、図３は上記サンプル１を添加した細胞懸濁液について１時間培養後の結果を示す顕微鏡写真であり、図４は上記サンプル２を添加した細胞懸濁液について１時間培養後の結果を示す顕微鏡写真である。
これら顕微鏡写真から明らかなように、上記添加されたサンプル１およびサンプル２は、いずれも添加後迅速に細胞外から細胞膜を透過して細胞内に導入されていることが確認された。更にＤＡＰＩによる核染色の結果から細胞質内に導入されたサンプル１およびサンプル２の一部は核内にも移行していること（即ち核内に導入されたこと）が確認された。即ち、上記実施例１で得られた計２種（サンプル１〜２）の外来物質導入用構築物は、上記キャリアペプチドフラグメントを含むことにより優れた細胞膜透過性を示すことが確認され、蛍光色素のみならず、外来物質たるペプチド（ここでは配列番号８１に示すＶＨＬペプチド）を効率よく細胞の外部から細胞膜を通して細胞質内、更には核内に導入（移送）し得ることが確かめられた。
【００４９】
このことから明らかなように、本発明は、ここで開示される外来物質導入方法の特に好適な一態様として、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞（特にＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいは体性幹細胞）の外部から該細胞の細胞質内（より好ましくは更に核内）に目的とする外来物質を導入する方法であって、上記キャリアペプチドフラグメントとして配列番号１のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成された改変アミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントを使用することを特徴とする方法を提供する。上記配列番号のアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントは、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞にタンパク質（典型的にはアミノ酸残基数：３００〜１０００程度（例えば３００〜６００程度））若しくはアミノ酸残基数が３００未満のポリペプチド、或いはアミノ酸残基数が１００以下（特に５０以下）のペプチドモチーフを導入する目的に好適である。
【００５０】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によると、ヒトその他哺乳類の幹細胞（例えば体性幹細胞や人工多能性幹細胞）、その他の目的の細胞に所定の機能を有する目的の外来物質を導入することができる。このことにより、導入する外来物質（ペプチド等）に応じて当該目的の細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
また、本発明によって、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入させ、該外来物質が導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１〜配列番号８２  合成ペプチド
【図１】
0005858283.tif 000003
【図２】
0005858283.tif 000004
【図３】
0005858283.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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