(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の分析方法であって、前記ヘモグロビン類は、ヘモグロビンＳ、又は、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＳの両方であり、検体前処理液及び／又は溶離液に酸化剤と三価のヘム鉄への結合剤とを配合することにより、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理するものであり、前記検体前処理液又は溶離液中の酸化剤の濃度が０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌかつ三価のヘム鉄への結合剤の濃度が０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とするヘモグロビン類の分析方法。
【請求項２】
酸化剤は、ヘモグロビンをメト化させる物質であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項３】
酸化剤は、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項２記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項４】
酸化剤は、亜硝酸ナトリウムであることを特徴とする請求項３記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項５】
三価のヘム鉄への結合剤は、メトヘモグロビン中の三価の鉄に結合する物質であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項６】
三価のヘム鉄への結合剤は、アジ化物であることを特徴とする請求項５記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項７】
三価のヘム鉄への結合剤は、アジ化ナトリウムであることを特徴とする請求項６記載のヘモグロビン類の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を分離するヘモグロビン類の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるヘモグロビン類の分析は現在広く行われており、糖尿病診断ではグリコヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃの定量や異常ヘモグロビンの分析等に用いられている。例えば、血液検体を溶血希釈して調製した測定試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィーが知られている。近年の糖尿病患者の増加に伴い、ヘモグロビンＡ１ｃの測定件数も増加傾向にあり、ＨＰＬＣでの測定においても高精度測定と測定時間の短縮が求められている。【０００３】
生体内において、ヘモグロビン類には、酸素が結合したオキシヘモグロビン、二酸化炭素が結合したデオキシヘモグロビン、ヘムに含まれている鉄が酸化されて三価の鉄イオンとなったメトヘモグロビンが存在する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣでは、分離カラムにおける保持力の違いにより、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビンの溶出時間に違いが生じ、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりして分離精度の悪いものとなることがある。また、メトヘモグロビンとアジ化物やシアン化物とが共存している場合、アジ化物やシアン化物がメトヘモグロビンの三価の鉄イオンに結合し、アジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビン（以下、これらを安定化メトヘモグロビンともいう）となって安定化することが知られているが、この安定化メトヘモグロビンも、分離カラムにおける保持力が、オキシヘモグロビンやデオキシヘモグロビンとはわずかに異なるため、安定化メトヘモグロビンの存在により、検出される溶出ピークがブロード化したり、二峰性を示したりすることがある。【０００４】
ＨＰＬＣを用いたヘモグロビン類の分析は、糖尿病診断の他に主に貧血を引き起こす異常ヘモグロビン症やサラセミアといった診断にも使用されている。なかでも、ヘモグロビンＳは最も多くみられる異常ヘモグロビンであり、重篤な貧血症状を引き起こす鎌状赤血球症の原因物質であるため、分離、検知の需要は高い。また、糖尿病のマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃを測定する際には、ヘモグロビンＳをはじめとした異常ヘモグロビンをシャープな溶出ピークとして分離することが望ましい。ヘモグロビン類の溶出ピークがブロード化したり二峰性となっていたりすると異常ヘモグロビンと正常ヘモグロビンとの分離が困難となるとともに、測定値への悪影響が懸念される。
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性の溶出ピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。【０００５】
ヘモグロビン類の劣化や変性を防止するための方法としては、公知の抗菌剤を添加する方法や糖類を添加する方法が知られているが、この他にも、例えば、特許文献１にはアルブミンをヘモグロビン類と共存させる方法、特許文献２にはヘモグロビン類とカゼイン、ホウ酸等を共存させる方法、特許文献３にはヘモグロビン類とイミノカルボン酸及びその塩を共存させる方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１〜３に開示されている方法を用いても、血液検体にオキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン等の各種ヘモグロビン類が混在する状況においては、ＨＰＬＣで測定した場合に溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。【０００６】
また、一般的なＨＰＬＣ装置には溶離液中の気体を除去するためのデガッサーが組み込まれているが、デガッサーは立ち上げ後しばらくは気体除去能力が安定せず、ヘモグロビンの溶出時間が変動したり、分離に悪影響を及ぼしたりすることがある。特に、ＨＰＬＣ装置の立ち上げ直後や溶離液温度が不安定である場合にヘモグロビン類の溶出時間が変動したり、定量性が悪化し易くなったりする。これは迅速性が要求されるヘモグロビンＡ１ｃをマーカーとする糖尿病検査にて、ファーストレポートまでの時間が長くかかることにつながるため、ＨＰＬＣ装置の立ち上げ直後から安定した測定が可能な技術が必要とされている。
なお、各種ヘモグロビン類の検出、定量には一般的に分光光度計による吸光度が用いられるが、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、アジドメトヘモグロビン、シアンメトヘモグロビンはそれぞれの吸光スペクトルが異なっているため、これらが混在していると正確なヘモグロビン量を測定することができないことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１９４８２５号公報
【特許文献２】特開平１１−１６６９３２号公報
【特許文献３】特開２００９−９７９５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離できるヘモグロビン類の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の分析方法であって、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理するヘモグロビン類の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。【００１０】
本発明者らは、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理することで、検体中のヘモグロビン類を全て安定化メトヘモグロビンに変化させ、各ヘモグロビンのカラム固定相への保持力を均一にし、短時間で高精度にヘモグロビン類を分離できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
本発明のヘモグロビン類の分析方法においては、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理する。
酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で検体を処理することにより、ヘモグロビン類の分離能を向上させつつヘモグロビン類の溶出時間を短縮できる。更に、ＨＰＬＣ装置のデガッサーの立ち上げ直後の気体除去能力が安定しない場合においても、ヘモグロビン類の溶出時間の変動が発生しなくなるとともに、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがなく、ヘモグロビン類が高精度に分離される。
なお、本発明において、「予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理する」とは、ヘモグロビン類が分離カラムで分離される前に、検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理することを意味し、液体クロマトグラフィーでの測定開始前に処理することに限定されない。具体的には例えば、検体前処理液及び／又は溶離液に、表１に記載した組み合わせのいずれかで酸化剤と三価のヘム鉄への結合剤とを配合することにより、ヘモグロビン類が分離される前に検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理できる。表１中、「○」は配合することを意味し、「−」は配合しないことを意味する。【００１２】
【表１】
0005875160.tif 000002
【００１３】
本発明のヘモグロビン類の分析方法において、酸化剤は、ヘモグロビン類のヘム鉄を二価から三価に変化させ、メトヘモグロビンを形成する。
酸化剤としては、ヘモグロビン類のヘム鉄を二価から三価に変化させる効果があれば特に限定されず、例えば、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素等が挙げられる。なかでも、亜硝酸塩が好適であり、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウムがより好適である。これらの酸化剤を用いることで、酸化力が強すぎてヘモグロビン類が分解したりすることがなく、また、メトヘモグロビンと結合して溶出パターンが大きく変化したり、ヘモグロビン類を検出する波長と酸化剤の吸光スペクトルが干渉してＨＰＬＣ測定中にベースラインの変動が生じたりすることがなく、ヘモグロビン類の定量性により優れたものとなる。【００１４】
本発明のヘモグロビン類の分析方法において、三価のヘム鉄への結合剤は、メトヘモグロビンを安定化メトヘモグロビンにする。
三価のヘム鉄への結合剤としては、例えば、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。三価のヘム鉄への結合剤としてアジ化物又はシアン化物を用いることにより、メトヘモグロビンの構造を大きく変えてしまうことがなく、ヘモグロビン類の溶出挙動を大きく変化させてしまうこともない。従って、ヘモグロビン類の定量性により優れたものとなる。【００１５】
アジ化物としては、例えば、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４−ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４−アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。
シアン化物としては、例えば、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。
これらの三価のヘム鉄への結合剤のなかでも、アジ化ナトリウムが好適である。【００１６】
検体前処理液としては、例えば、有機酸又はその塩類、アミノ酸類、無機酸又はその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等が適宜添加されていてもよい。【００１７】
検体前処理液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こり、ＨＰＬＣ装置の流路を詰まらせる原因となることがある。緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。【００１８】
検体前処理液が酸化剤を含有する場合、検体前処理液中における酸化剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。検体前処理液中における酸化剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビン類のメト化が充分に行われず、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンが測定試料中に混在することで、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。検体前処理液中における酸化剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、メトヘモグロビンが分解されてしまい、溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがある。検体前処理液中における酸化剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。【００１９】
検体前処理液が三価のヘム鉄への結合剤を含有する場合、検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、メトヘモグロビンの三価のヘム鉄への結合剤の結合が充分に行われず、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、メトヘモグロビンが分解されてしまい、溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがある。検体前処理液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２０】
検体前処理液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は４．０、好ましい上限は１０．０である。検体前処理液のｐＨが４．０未満もしくは１０．０を超えると、ヘモグロビン類の安定性が低下し、溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがある。検体前処理液のｐＨのより好ましい下限は６．０、より好ましい上限は８．５である。【００２１】
溶離液としては、例えば、有機酸又はその塩類、アミノ酸類、無機酸又はその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、緩衝液は、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等が適宜添加されていてもよい。【００２２】
溶離液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こりＨＰＬＣ装置の流路を詰まらせる原因となったり、溶離液の切り替え効率が低下して平衡化に時間がかかる原因となったりすることがある。緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２３】
溶離液が酸化剤を含有する場合、溶離液中における酸化剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液中における酸化剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビン類のメト化が充分に行われず、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンが測定試料中に混在することで、溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。溶離液中における酸化剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、溶出時間が早くなりすぎて分離能が悪化することがある。なお、溶出時間は、メトヘモグロビンが分解しない範囲内で溶離液中の緩衝剤濃度等を調整することで調節は可能である。溶離液中における酸化剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２４】
溶離液が三価のヘム鉄への結合剤を含有する場合、溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビン類のメト化が充分に行われず、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンが混在することで、溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、溶出時間が早くなりすぎて分離能が悪化することがある。なお、溶出時間は、メトヘモグロビンが分解しない範囲内で溶離液中の緩衝剤濃度等を調整することで調節は可能である。溶離液中における三価のヘム鉄への結合剤の濃度のより好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２５】
本発明のヘモグロビン類の分析方法において、溶離液にのみ酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤を配合する場合は、少なくともＨＰＬＣによる測定の最初に送液する溶離液に酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤を配合する。また、酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤は、ＨＰＬＣによる測定の最初に送液する溶離液以外の溶離液にも配合することが好ましく、測定に用いる全ての溶離液に配合することがより好ましい。【００２６】
溶離液は、ｐＨ調整剤として、公知の酸、塩基を含有してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。【００２７】
溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。【００２８】
溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は４．０、好ましい上限は１０．０である。溶離液のｐＨが４．０未満であると、検出される溶出ピークのリーディングが大きくなったり、溶出ピークがブロードになったり二峰性を示したりすることがある。溶離液のｐＨが１０．０を超えると、カラム固定相とヘモグロビン類との保持が弱まりヘモグロビン類の溶出時間が極端に早くなることに加え、検出される溶出ピークのテーリングが大きくなったり、また、溶出ピークがブロードになったり、二峰性を示したりすることがある。また、ｐＨを４．０以上１０．０以下とすることにより、測定試料中のヘモグロビン類の安定性が低下することがなく、ヘモグロビン類の溶出ピークが検出されなかったり、異なる溶出時間に溶出ピークが検出されたりすることがない。溶離液のｐＨのより好ましい下限は６．０、より好ましい上限は８．５である。【００２９】
本発明のヘモグロビン類の分析方法における液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換液体クロマトグラフィーを用いることが好適である。
イオン交換液体クロマトグラフィーとしては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポンプを用いて溶離液を分離カラムに送液する際に、溶離液を、デガッサーを通した後に測定試料を注入して分離カラムに送り、分離カラムでヘモグロビン類を分離させて、溶出してきた溶出液中の分離成分を検出器により検出する方法が挙げられる。【００３０】
分離カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられる。なかでも、充填剤粒子が好ましい。
充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。【００３１】
固定相としては、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。【００３２】
本発明のヘモグロビン類の分析方法における測定条件は、使用する測定試料、カラム等の種類によって適宜選択できるが、溶離液の流速の好ましい下限は０．０５ｍＬ／分、好ましい上限は５ｍＬ／分、より好ましい下限は０．２ｍＬ／分、より好ましい上限は３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出波長は４１５ｎｍが好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。
測定試料は、通常、界面活性剤等の溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された血液検体を希釈したものを用いる。測定試料の注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のヘモグロビン類の分析方法は、優れた分離能を示すとともに、分析を短時間で行うことができ、かつ、従来分離が困難であったヘモグロビン類も分離し易くなる。
即ち、本発明によれば、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離し、分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１及び比較例１における測定回数とヘモグロビンＳの溶出時間との関係を示した図である。
【図２】実施例２における第１溶離液と第２溶離液のグラジエント条件を示した図である。
【図３】実施例２において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例３において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例４において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図６】実施例５において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図７】実施例６において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例７において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図９】実施例８において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図１０】比較例２において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図１１】比較例３において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図１２】比較例４において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図１３】比較例５において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【図１４】比較例６において、（ａ）グリコヘモグロビンコントロールレベル２を含有する測定試料、及び、（ｂ）ヘモグロビンＳを含む血液を含有する測定試料を測定して得られたクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
【００３６】
（実施例１）
ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
分離カラムとして、粒子表面にスルホン酸基を導入した陽イオン交換樹脂充填剤をカラム本体に充填したカラムを用いた。
ＨＰＬＣ装置には、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）を用い、溶離液の流速を１．７ｍＬ／分、検出波長を４１５ｎｍ、測定試料注入量を１０μＬとした。
溶離液としては、０．５分までは溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））にて溶出し、０．５分を超え１．０分までは溶離液２（１０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定試料の測定を行った。
なお、ＨＰＬＣ装置の立ち上げ直後から連続して１５回測定を行った。
【００３７】
（比較例１）
測定試料は、実施例１と同様のものを用いた。
溶離液１を溶離液４（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））、溶離液２を溶離液５（１０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に変更したこと以外は、実施例１と同様にして測定試料の測定を行った。
【００３８】
実施例１及び比較例１における測定回数とヘモグロビンＳの溶出時間との関係を図１に示した。図１より、ヘモグロビンＳの溶出時間は、比較例１では測定回数の増加にともなって遅くなっていることが分かる。一方、実施例１では、ヘモグロビンＳの溶出時間は測定回数に関係なくほぼ一定であった。
【００３９】
（実施例２）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
分離カラムは実施例１と同様の分離カラムを用いた。
実施例１と同様のＨＰＬＣ装置を用い、流速を１．７ｍＬ／分、検出波長を４１５ｎｍ、測定試料注入量を１０μＬとした。
溶離液は、第１溶離液として溶離液６（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））と第２溶離液として溶離液７（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））とを用い、２液リニアグラジエントにて溶出して測定試料の測定を行った。第１溶離液と第２溶離液のグラジエント条件を図２に示した。図２は、第１溶離液と第２溶離液との合計量に対する第２溶離液の割合（重量％）を示している。また、得られたクロマトグラムを図３に示した。
【００４０】
（実施例３）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第２溶離液を、実施例１で用いた溶離液３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示した。
【００４１】
（実施例４）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液８（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液９（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図５に示した。
【００４２】
（実施例５）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１０（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１１（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図６に示した。
【００４３】
（実施例６）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１２（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図７に示した。
【００４４】
（実施例７）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１４（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１５（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図８に示した。
【００４５】
（実施例８）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１６（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、実施例１で用いた溶離液３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図９に示した。
【００４６】
（比較例２）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１７（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、実施例１で用いた溶離液３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１０に示した。
【００４７】
（比較例３）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液１８（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液１９（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１１に示した。
【００４８】
（比較例４）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液２０（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液２１（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１２に示した。
【００４９】
（比較例５）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液２２（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液２３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１３に示した。
【００５０】
（比較例６）
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンＳを含む血液検体を検体前処理液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第１溶離液を、溶離液２４（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））に変更し、第２溶離液を、溶離液２５（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に変更したこと以外は、実施例２と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図１４に示した。
【００５１】
実施例２〜８、及び、比較例２〜６の測定で用いた検体前処理液と溶離液の組成を表２、３に示した。また、得られたクロマトグラムのヘモグロビン類の分離状況とピークパターンを表４に示した。
【００５２】
図３〜１４において、ピーク（Ａ）はヘモグロビンＡ０、ピーク（Ｂ）はヘモグロビンＡ２、ピーク（Ｃ）はヘモグロビンＳを示している。
図３〜７（実施例２〜６）において、ピーク（Ａ）、ピーク（Ｃ）はシャープな単一ピークとして分離していることが確認された。図８（実施例７）はクロマトグラムに少しドリフトが確認されたために定量性が若干低下したが、ピーク同定は可能なレベルであった。一方、図９（実施例８）のピーク（Ａ）、ピーク（Ｃ）はわずかに３峰性又は２峰性を示すピークとして検出されたが、問題の無い程度であった。
また、図３〜９（実施例２〜８）ではピーク（Ｂ）はピーク（Ａ）から分離していることが確認されたが、図１０（比較例２）ではグリコヘモグロビンコントロール２を含有する測定試料ではピーク（Ｂ）はピーク（Ａ）から全く分離できておらず、ヘモグロビンＳを含有する測定試料ではピーク（Ａ）の後ろにピーク（Ｂ）がわずかにショルダーとして確認できる程度であった。同様の現象は他のヘモグロビン種に対しても起こりえるものと考えられ、本発明を用いることで含有量の多いヘモグロビン種に隣接したピークを高精度に分離させ易くなる。
図１１、１２（比較例３、４）では亜硝酸ナトリウム又はフェリシアン化カリウムによりメト化されたヘモグロビンがピークとして検出されているが、ヘモグロビン類の分解物とみられるピークが検出された。
図１３、１４（比較例５、６）は亜硝酸ナトリウムとアジ化ナトリウムが共存していることから、単一ピークを形成しているものの、添加量が多過ぎるために溶出時間が早くなりすぎていた。しかしながら、単一ピークが形成されているので、緩衝剤濃度等の他の条件を調整することで、定量性を確保することが可能である。
【００５３】
【表２】
0005875160.tif 000003
【００５４】
【表３】
0005875160.tif 000004
【００５５】
【表４】
0005875160.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離できるヘモグロビン類の分析方法が提供される。
【図１】
0005875160.tif 000006
【図２】
0005875160.tif 000007
【図３】
0005875160.tif 000008
【図４】
0005875160.tif 000009
【図５】
0005875160.tif 000010
【図６】
0005875160.tif 000011
【図７】
0005875160.tif 000012
【図８】
0005875160.tif 000013
【図９】
0005875160.tif 000014
【図１０】
0005875160.tif 000015
【図１１】
0005875160.tif 000016
【図１２】
0005875160.tif 000017
【図１３】
0005875160.tif 000018
【図１４】
0005875160.tif 000019