(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出することにより予後を予測する予後予測方法であって、
前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がん組織の細胞におけるα−アクチニン−４遺伝子（ＡＣＴＮ４）のコピー数を測定する工程、を含んでなり、
前記遺伝子のコピー数が４を超える場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると予測する、
ことを特徴とする肺腺がんの予後予測方法。
【請求項２】
前記遺伝子のコピー数の測定は、ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブを用いるＦＩＳＨ法によって行われる、ことを特徴とする請求項１に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項３】
前記特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなる、ことを特徴とする請求項２に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項４】
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出するための検出キットであって、細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定することのできる試薬を含んでなる、ことを特徴とする肺腺がんの検出キット。
【請求項５】
前記試薬は、ゲノム上の前記遺伝子に特異的なプローブである、ことを特徴とする請求項４に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項６】
前記特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなる、ことを特徴とする請求項５に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項７】
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出することにより予後を予測する予後予測方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がんの組織または細胞において、ＡＣＴＮ４遺伝子の発現量を測定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた発現量を、対応する正常な組織または細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子の発現量と比較する工程、を含んでなり、
前記正常な組織または細胞に対して前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞における前記遺伝子の発現が増強されていた場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると予測する、
ことを特徴とする肺腺がんの予後予測方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）では、前記組織または細胞内のα−アクチニン−４タンパク質を検出する、ことを特徴とする請求項７に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項９】
α−アクチニン−４タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１０】
α−アクチニン−４タンパク質の検出は、特異的抗体を用いる免疫組織化学染色によって行われる、ことを特徴とする請求項８に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１１】
前記工程（ａ）では、前記組織または細胞内のα−アクチニン−４のｍＲＮＡを検出する、ことを特徴とする請求項７に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１２】
α−アクチニン−４のｍＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（ただし、配列中のｔはｕに変換されている）を含む、ことを特徴とする請求項１１に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１３】
以下の工程：
（ｃ）前記哺乳動物から得られた血清において、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度を測定する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で得られた濃度を、正常な血清における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度と比較する工程、をさらに含んでなり、
前記正常な組織または細胞に対して前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞における前記遺伝子の発現が増強されており、かつ、前記正常な血清に対して前記哺乳動物から得られた血清における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）濃度が有意に高い場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると予測する、
ことを特徴とする請求項７に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１４】
前記工程（ｃ）で得られた濃度が５．０ｎｇ／ｍＬを超える場合に、前記正常な血清に対して有意に高いと判断される、ことを特徴とする請求項１３に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１５】
以下の工程：
（ｅ）前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がん組織の細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定する工程、をさらに含んでなり、
前記正常な組織または細胞に対して前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞における前記遺伝子の発現が増強されており、かつ、前記遺伝子のコピー数が４を超える場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると予測する、
ことを特徴とする請求項７に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１６】
前記遺伝子のコピー数の測定は、ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブを用いるＦＩＳＨ法によって行われる、ことを特徴とする請求項１５に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１７】
前記特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなる、ことを特徴とする請求項１６に記載の肺腺がんの予後予測方法。
【請求項１８】
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出するための検出キットであって、組織または細胞内のＡＣＴＮ４遺伝子の発現量を測定することのできる試薬を含んでいる、ことを特徴とする肺腺がんの検出キット。
【請求項１９】
前記試薬は、前記組織または細胞内のα−アクチニン−４タンパク質を定量するための試薬である、ことを特徴とする請求項１８に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２０】
α−アクチニン−４タンパク質を定量するための試薬は、α−アクチニン−４タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１９に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２１】
前記試薬は、前記組織または細胞内のα−アクチニン−４のｍＲＮＡを定量するための試薬である、ことを特徴とする請求項１８に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２２】
血清中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度を測定することのできる試薬をさらに含んでいる、ことを特徴とする請求項１８に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２３】
細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定することのできる試薬をさらに含んでいる、ことを特徴とする請求項１８に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２４】
前記試薬は、ゲノム上の前記遺伝子に特異的なプローブである、ことを特徴とする請求項２３に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２５】
前記特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなるものである、ことを特徴とする請求項２４に記載の肺腺がんの検出キット。
【請求項２６】
ヒト細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定するための検出キットであって、ＦＩＳＨ法に利用可能な、ゲノム上の前記遺伝子に特異的なプローブを含んでなり、該特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなる、ことを特徴とする肺腺がんの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺腺がんの予後予測方法、および、肺腺がんの検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺腺がんの臨床病期Ｉ期は、原発巣以外の部位への転移がみられない早期病変である。現在の分類では、Ｉ期肺腺がんはさらにＩＡ期（腫瘍径３ｃｍ未満）とＩＢ期（腫瘍径３ｃｍ以上）とに分類される。非特許文献１では、肺腺がんの臨床病期Ｉ期の術後五年生存率は８５％であり、術後化学療法(テガフール・ウラシル（ＵＦＴ）二年間内服)は、Ｉ期における予後の改善に有意に貢献することが報告されている。現在、Ｉ期肺腺がん症例に対して術後化学療法を行うことが推奨されているが、Ｉ期肺腺がんの全員が術後化学療法により恩恵を受けるわけではない。よってＩ期の術後予後予測をすることができれば、予後良好な患者群に不必要な化学療法を行うリスクを軽減できると考えられる。【０００３】
ここで、α−アクチニン−４は、癌細胞の浸潤・転移に関与するアクチン結合タンパク質として単離された分子である（非特許文献２参照）。また、α−アクチニン−４タンパク質の発現が細胞運動と浸潤性に関与することも報告されている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kato H. et al., N. Engl. J. Med., 2004 Apr 22; 350(17): 1713-21
【非特許文献２】Honda et al., J Cell Biol. 1998 Mar 23;140(6):1383-93
【非特許文献３】Honda et al., Gastroenterology. 2005 Jan;128(1):51-62
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、Ｉ期肺腺がん組織におけるα−アクチニン−４（ＡＣＴＮ４）タンパク質の発現が増強した症例は、そうではない症例に比べて統計学的な有意差をもって全生存期間（ＯＳ）が短いことを見出した。また、本発明者らは、Ｉ期肺腺がん組織の細胞におけるα−アクチニン−４遺伝子（ＡＣＴＮ４）のゲノム上のコピー数が増加している群は、非増加群に比べてＯＳが短いことを見出した。さらに、本発明者らは、ＡＣＴＮ４遺伝子のゲノムのコピー数とα−アクチニン−４タンパク質発現レベルとの組み合わせにより、遺伝子コピー数またはタンパク質発現それぞれの単独解析に比べてＩ期肺線がんのＯＳを厳密に予測できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。【０００６】
従って、本発明の目的は、肺腺がんの予後予測方法、および、肺腺がんの検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様による肺腺がんの予後予測方法は、
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出することにより予後を予測する予後予測方法であって、
前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がん組織の細胞におけるα−アクチニン−４遺伝子（ＡＣＴＮ４）のコピー数を測定する工程、を含んでなり、
前記遺伝子のコピー数が４を超える場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると予測する、ことを特徴とする。【０００８】
本発明の第二の態様による肺腺がんの検出キットは、
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出するための検出キットであって、細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定することのできる試薬を含んでなる、ことを特徴とする。【０００９】
本発明の第三の態様による肺腺がんの予後予測方法は、
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出することにより予後を予測する予後予測方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がんの組織または細胞において、ＡＣＴＮ４遺伝子の発現量を測定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた発現量を、対応する正常な組織または細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子の発現量と比較する工程、を含んでなり、
前記正常な組織または細胞に対して前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞における前記遺伝子の発現が増強されていた場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると予測する、ことを特徴とする。【００１０】
本発明の第四の態様による肺腺がんの検出キットは、
哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出するための検出キットであって、組織または細胞内のＡＣＴＮ４遺伝子の発現量を測定することのできる試薬を含んでいる、ことを特徴とする。【００１２】
本発明の第五の態様による肺腺がんの検出キットは、
ヒト細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定するための検出キットであって、ＦＩＳＨ法に利用可能な、ゲノム上の前記遺伝子に特異的なプローブを含んでなり、該特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなる、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、Ｉ期肺腺がんの予後を予測し、適切な治療法を選択することが可能となる。例えば、本発明においてそのＩ期肺腺がんが予後不良であると判断された場合には、その摘出手術の後にテガフール・ウラシル配合剤、シスプラチンなどの薬剤を用いた化学療法を行うことが推奨される。一方で、本発明においてそのＩ期肺腺がんが予後不良でないと判断された場合には、不必要な化学療法を回避することができる。さらに、本発明によれば、Ｉ期肺腺がん、例えば予後不良のＩ期肺腺がんを治療する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】肺腺がん組織（Ｉ期およびＩＡ期）（コホート１）におけるα−アクチニン−４タンパク質発現亢進の陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【図２】肺腺がん組織（Ｉ期およびＩＡ期）（コホート２）におけるα−アクチニン−４タンパク質発現亢進の陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【図３】Ｉ期肺腺がん患者を次の３群：血清ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＬ以下かつアクチニン−４陰性の群；血清ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＬ超またはα−アクチニン−４タンパク質陽性の群；および血清ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＬ超かつα−アクチニン−４タンパク質陽性の群に分割し、それぞれの群についてKaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【図４】Ｉ期肺腺がん患者を次の３群：ＡＣＴＮ４増幅（−）かつα−アクチニン−４タンパク質発現陰性の群；ＡＣＴＮ４遺伝子増幅（−）かつα−アクチニン−４タンパク質発現陽性の群；およびＡＣＴＮ４遺伝子増幅（＋）かつα−アクチニン−４タンパク質発現陽性の群に分割し、それぞれの群についてKaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【図５】免疫組織化学染色による発現状態を示す肺腺がん細胞の顕微鏡写真である。
【図６】肺腺がん組織（Ｉ〜ＩＩＩ期およびＩ期）（コホート１及び２）におけるα−アクチニン−４タンパク質発現亢進の陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【図７】蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法により標識された肺腺がん細胞の顕微鏡写真である。
【図８】肺腺がん組織（Ｉ期）における組織マイクロアレイの陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【図９】肺腺がん組織（Ｉ期およびＩＡ期）（コホート１及び２）における、α−アクチニン−４タンパク質発現亢進、及び、組織マイクロアレイの陽性症例と陰性症例の群について、Kaplan-Meier法によって作成した生存曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の対象となる癌は、Ｉ期肺腺がんである。肺がんは非小細胞がんと小細胞がんとに大別される。肺腺がんは非小細胞がんに分類される。Ｉ期肺腺がんは、肺腺がんのうちの最も早期のがんであり、リンパ節や他の臓器への転移の無い肺腺がんである。本発明による方法によれば、哺乳動物が罹患したＩ期肺腺がんが予後不良のものであるか否かを判定することができる。また、本発明における治療の対象はＩ期肺腺がん、好ましくは予後不良のＩ期肺腺がんとされる。他の好ましい実施態様では、本発明における治療の対象は、その癌細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子の増幅または発現増強が見られるＩ期肺腺がん、特に、本発明による予後予測方法によって予後不良と判定されたＩ期肺腺がんとされる。
【００１６】
本明細書において「予後不良」との用語は、例えば、癌の切除の５年後における生存率が９０％未満、好ましくは８５％未満、より好ましくは７０％未満、最も好ましくは６０％未満であることを意味する。また、本明細書において「予後不良」とは、癌の切除後において化学療法を必要とすることを意味する。よって、本発明の他の態様によれば、本発明による方法は、哺乳動物において術後の化学療法を必要とするＩ期肺腺がんを検出する方法、あるいは、Ｉ期肺腺がんの患者が術後の化学療法を必要とするか否かを判定する方法である。
【００１７】
本発明において予測（診断）の指標とし、治療の標的とする「α−アクチニン−４」または「ＡＣＴＮ４」は、診断または治療の被検体となる哺乳動物に由来するα−アクチニン−４（ＡＣＴＮ４遺伝子産物）とすることができる。ＡＣＴＮ４遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１３０４０２およびＥＮＳＴ０００００２５２６９９）に示されるヒト由来ＡＣＴＮ４の配列が挙げられる。ヒト由来ＡＣＴＮ４の配列はまた、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）アクセス番号：ＮＭ＿００４９２４およびＮＰ＿００４９１５にも登録されている。また、ＡＣＴＮ４遺伝子の遺伝子座も当技術分野において周知であり、例えば、ヒトのＡＣＴＮ４遺伝子は、第１９染色体の第４３，８３０，１６７〜４３，９１３，０１０塩基に位置する。ヒト以外の哺乳動物についても、ヒト由来ＡＣＴＮ４に対応する同様の遺伝子およびタンパク質を利用することが可能である。
【００１８】
本明細書において、ＡＣＴＮ４遺伝子の増幅（ゲノム上でのコピー数増加）およびその転写産物であるα-アクチニン-４タンパク質の発現増強がＩ期肺腺がんの予後不良因子であることが実証されている。さらに、がん細胞内におけるＡＣＴＮ４遺伝子の増幅と同タンパク質の発現増強との組み合わせは、Ｉ期肺腺がんの予後をそれぞれ単独の予後予測に比べてより厳密に予後を予測しうる予後不良因子であることが実証されている。よって、被検体となる哺乳動物（ヒトまたはヒトを除く哺乳動物）から得られたＩ期肺腺がん組織の細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を調べることにより、そのＩ期肺腺がんが予後不良であるか否かを予測（診断）することができる。また、前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がんの組織または細胞におけるα-アクチニン-４タンパク質の発現増強を調べることにより、そのＩ期肺腺がんが予後不良であるか否かを予測（診断）することもできる。
【００１９】
診断の対象とするＩ期肺腺がんの組織または細胞は、患者から外科手術により摘出された手術サンプルであってもよいし、内視鏡などによって得られる生検サンプルであってもよい。
【００２０】
本発明の第一の態様による方法では、Ｉ期肺腺がん組織の細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を調べることにより、そのＩ期肺腺がんが予後不良であるか否かを判定し、これにより予後不良のＩ期肺腺がんを検出する。この方法は、Ｉ期肺腺がん組織の細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定する工程を含み、そのコピー数が４を超える場合には、被検体である哺乳動物のＩ期肺腺がんが予後不良であるものと判定（診断）する。
【００２１】
ＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数の測定には、当技術分野において公知の標準的な方法を用いることができる。ＡＣＴＮ４遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列については上述した通りであり、当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法を用いてＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定することができる。遺伝子のコピー数の測定法としては、とりわけ、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイが挙げられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイとしては、サザンブロッティング法がある。この方法では、ゲノムＤＮＡを断片化し、電気泳動で分離し、膜に転写し、ＡＣＴＮ４の特異的プローブにハイブリダイゼーションさせる。この特異的プローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、コピー数の増加のない同じゲノムの領域にハイブリダイズする対照プローブからのシグナル強度とを比較することにより、相対的なＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数が得られる。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数の測定は、ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブを用いる蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法（Angerer, Meth. Enzymol. 152, 649, 1987参照）によって行われる。一般的に、in situハイブリダイゼーションは、主に、分析される組織または細胞を固定化し、この組織または細胞をプレハイブリダイゼーション処理し、この組織または細胞の中の核酸に対して特異的プローブをハイブリダイズさせ、結合しなかった特異的プローブを除去するための洗浄を行い、ハイブリダイズした特異的プローブを検出することによって行われる。このような用途に用いられる特異的プローブは、蛍光レポーターで標識されている。１個の細胞核内における蛍光の数を計数することにより、その細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数が得られる。
【００２４】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、ＦＩＳＨ法に用いられる前記特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなるものとされる。ここで、この領域のヌクレオチド配列からなるプローブは、ゲノム上のＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定する上で特に有効であり、高感度で正確な測定を可能とするものである。よって、本発明の他の態様によれば、ヒト細胞におけるα−アクチニン−４遺伝子のコピー数を測定するためのキットが提供され、該キットは、ＦＩＳＨ法に利用可能な、ゲノム上の前記遺伝子に特異的なプローブを含んでなり、該特異的プローブは、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなるものである。この特異的プローブは、一本のヌクレオチド分子からなるものであってもよいが、ヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域をカバーする２本以上（好ましくは２本）のヌクレオチド分子の組み合わせであってもよい。
【００２５】
ハイブリダイゼーションに基づく他のアッセイとしては、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法も利用することができる。ＣＧＨ法では、分析される被験細胞と対照となる正常細胞からそれぞれＤＮＡを抽出し、それぞれのＤＮＡを異なる色の蛍光色素で標識し、これら標識ＤＮＡの等量からなる混合溶液を調製し、この混合溶液を３７℃で２〜３日間暗所で保管する。これにより、染色体の総ての部位に対して被験ＤＮＡと対照ＤＮＡとの間で競合的な結合が生じる。その結果、被験ＤＮＡ中に遺伝子コピー数の増加があれば、スライド上のその遺伝子に対応する位置において被験ＤＮＡを標識した色の蛍光が強く観察され、逆に、被験ＤＮＡ中に遺伝子コピー数の減少があれば、スライド上のその遺伝子に対応する位置において対照ＤＮＡを標識した色の蛍光が強く観察される。
【００２６】
増幅に基づくアッセイとしては、定量的な核酸増幅法がある。この方法では、ゲノム中のＡＣＴＮ４遺伝子が増幅反応の鋳型となるため、そのコピー数に応じた量の増幅産物が得られる。具体的な核酸増幅法としては、定量的ＰＣＲ法、例えば、リアルタイム定量的ＰＣＲ法などが挙げられる。
【００２７】
本発明の第二の態様による方法では、Ｉ期肺腺がんの組織または細胞におけるα-アクチニン-４タンパク質の発現増強を調べることにより、そのＩ期肺腺がんが予後不良のものであるか否かを判定し、これにより予後不良のＩ期肺腺がんを検出する。この方法は、前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子の発現量を測定する工程を含み、その発現量が対応する正常な組織または細胞のものよりも多い場合、すなわち、α-アクチニン-４タンパク質の発現が増強されていた場合には、被検体である哺乳動物のＩ期肺腺がんが予後不良であるものと判定（診断）する。
【００２８】
ＡＣＴＮ４遺伝子の発現量の測定には、当技術分野において公知の標準的な方法を用いることができる。一般的な遺伝子の発現量は、典型的にはｍＲＮＡ量またはタンパク質量を指標として測定される。本発明においても同様に、ＡＣＴＮ４のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を指標としてα-アクチニン-４タンパク質の発現量を測定することができる。ＡＣＴＮ４遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列については上述した通りであり、当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法を用いてα-アクチニン-４タンパク質の発現量を測定することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様によれば、遺伝子の発現量を測定する工程は、前記組織または細胞内のα-アクチニン-４タンパク質量を測定することを含んでなる。α-アクチニン-４タンパク質量は、当技術分野において周知の方法により測定することができる。例えば、α-アクチニン-４タンパク質のアミノ酸配列として配列番号２で表されるものを挙げることができ、当業者であればこの配列を参照することによって適切に同タンパク質の量を測定することが可能である。
【００３０】
α-アクチニン-４タンパク質の量は、例えば、同タンパク質に結合する抗体を用いることによって好適に測定することができる。このような抗体は、好ましくはα-アクチニン-４タンパク質に特異的な抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。α-アクチニン-４タンパク質の定量は、好ましくはこのような抗体を用いる免疫組織化学染色によって行われる。あるいは、前記組織または細胞から得られるタンパク質抽出物を電気泳動した後に抗体を用いてこれを定量するイムノブロット法等を用いてもよい。
【００３１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、遺伝子の発現量を測定する工程は、前記組織または細胞内のＡＣＴＮ４のｍＲＮＡを定量することを含んでなる。例えば、ＡＣＴＮ４のｍＲＮＡとして、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（ただし、配列中のｔはｕに変換されている）を含むものを挙げることができ、当業者であればこの配列を参照することによって適切にＡＣＴＮ４のｍＲＮＡを定量することが可能である。定量のための具体的な方法としては、例えば、特異的なプライマーペアを用いるＲＴ−ＰＣＲによる増幅の後に電気泳動を行なう方法等が挙げられる。
【００３２】
比較対照となる正常な組織または細胞は、被検体となる同一の個体からの正常な組織または細胞であってもよいし、異なる個体からの正常な組織または細胞であってもよい。また、異なる複数の個体からの正常な組織または細胞についてα-アクチニン-４タンパク質の発現量を測定し、その平均値を比較対照としてもよい。さらに、予め測定された複数の正常な組織または細胞における発現量のデータから、平均値＋標準偏差などの適正値を設定しておき、被験組織または細胞の発現量がその適正値よりも高い場合にＡＣＴＮ４遺伝子の発現増強があるものと判断してもよい。「対応する正常な組織または細胞」としては正常な肺組織または細胞が挙げられる。
【００３３】
本明細書では、α-アクチニン-4タンパク質発現増強とともに、その被験哺乳動物の血清ＣＥＡ濃度の上昇が認められる場合に、より顕著な有意差をもってそのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであると判定できることが実証されている。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第二の態様による診断法は、以下の工程：（ｃ）前記哺乳動物から得られた血清において、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度を測定する工程、および（ｄ）工程（ｃ）で得られた濃度を、正常な血清における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度と比較する工程をさらに含んでなる。この診断法では、前記正常な組織または細胞に対して前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞におけるα-アクチニン-４タンパク質の発現が増強されており、かつ、前記正常な血清に対して前記哺乳動物から得られた血清における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）濃度が有意に高い場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであることが示される。
【００３４】
ＣＥＡの血清濃度を測定する方法には、当技術分野において公知の標準的な方法を用いることができる。ＣＥＡはよく知られた腫瘍マーカーであり、その血清濃度の測定法としては、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法など、様々な方法が知られており、それぞれの方法を実施するためのキットも市販されている。比較対照となる正常な血清は、被検体となる同一の個体からの正常な血清であってもよいし、異なる個体からの正常な血清であってもよい。また、異なる複数の個体からの正常な血清についてＣＥＡの濃度を測定し、その平均値を比較対照としてもよい。さらに、予め測定された複数の正常な血清におけるＣＥＡ濃度のデータから、平均値＋標準偏差などの適正値を設定しておき、被験血清のＣＥＡ濃度がその適正値よりも高い場合にＣＥＡ血清濃度の上昇があるものと判断してもよい。例えば、ヒト血清では、ＣＥＡ濃度が５．０ｎｇ／ｍＬを超える場合に、正常な血清に対して有意に高いと判断することができる。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第二の態様による方法は、本発明の第一の態様による方法と組み合わせて行われる。すなわち、この実施態様では、本発明の第二の態様による方法は、以下の工程：（ｅ）前記哺乳動物から得られたＩ期肺腺がん組織の細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のゲノム上のコピー数を測定する工程をさらに含んでなる。この方法では、前記正常な組織または細胞に対して前記Ｉ期肺腺がんの組織または細胞におけるα-アクチニン-４タンパク質の発現が増強されており、かつ、ＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数が４を超える場合に、前記哺乳動物からのＩ期肺腺がんが予後不良のＩ期肺腺がんであることが示される。
【００３６】
以上のような本発明による検出／診断法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出するためのキットが提供され、該キットは、細胞におけるＡＣＴＮ４のゲノム上のコピー数を測定することのできる試薬を含んでなる。このような試薬は、実施しようとする具体的方法に応じて選択され、好ましくは、ＦＩＳＨ法に用いることのできる、ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブとされる。前記特異的プローブは、好ましくはヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなるものである。
【００３７】
本発明の他の態様によるキットは、組織または細胞内のＡＣＴＮ４遺伝子やα-アクチニン-４タンパク質の発現量を測定することのできる試薬を含んでなる、哺乳動物において予後不良のＩ期肺腺がんを検出するためのキットである。このような試薬としては、前記組織または細胞内のα-アクチニン-４タンパク質を定量するための試薬、例えば、α-アクチニン-４タンパク質に特異的に結合する抗体を好適に用いることができる。あるいは、このような試薬は、前記組織または細胞内のＡＣＴＮ４のｍＲＮＡを定量するための試薬、例えば、ＡＣＴＮ４のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲに用いられる特異的プライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ用の他の試薬としてもよい。本発明の好ましい実施態様によれば、このキットは、血清中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度を測定することのできる試薬をさらに含んでなるものとされる。本発明の他の好ましい実施態様によれば、このキットは、細胞におけるＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定することのできる試薬をさらに含んでなるものとされ、このような試薬は、好ましくは、ＦＩＳＨ法に用いることのできる、ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブとされる。前記特異的プローブは、好ましくはヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域のヌクレオチド配列からなるものである。
【００３８】
本発明によるキットはさらに、実施しようとする具体的方法に応じて、他の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明によれば、治療上有効な量のＡＣＴＮ４阻害剤を被検者に投与することを含んでなる、Ｉ期肺腺がんを治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、Ｉ期肺腺がんを治療するための薬剤の製造における、ＡＣＴＮ４阻害剤の使用が提供される。
【００４０】
治療または予防の対象となる被検者は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＴＮ４阻害剤は薬物などの小分子とされる。このような小分子は、ＡＣＴＮ４の阻害活性を指標として、当技術分野において公知の方法によりスクリーニングすることによって得ることができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＴＮ４阻害剤は、α-アクチニン-４タンパク質に特異的に結合する抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＴＮ４阻害剤は、ＡＣＴＮ４遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子とされる。アンチセンス法は、特定の遺伝子の発現を抑制するための周知の技術である。一つの具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＡＣＴＮ４遺伝子の５’コード領域の配列に基づいて設計された、約１０〜４０塩基長のアンチセンスＲＮＡとされる。他の具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＡＣＴＮ４遺伝子の転写に関与する領域の配列に相補的となるように設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとされる。このようなアンチセンス核酸分子は、配列番号１に示されるようなＡＣＴＮ４遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＴＮ４阻害剤は、ＡＣＴＮ４遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子とされる。本明細書において、「ｓｉＲＮＡ核酸分子」とは、ｓｉＲＮＡそのものだけでなく、標的細胞中にｓｉＲＮＡを導入しうる、より長い二本鎖ＲＮＡ分子をも意味する。ｓｉＲＮＡ核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって特定遺伝子の発現を抑制することができる、周知のツールである（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001参照）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、１９〜２１塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる。上記の二本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、より長いヌクレオチド配列を含んでなる。このようなｓｉＲＮＡ核酸分子は、配列番号１に示されるようなＡＣＴＮ４遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。さらに、前記ｓｉＲＮＡ核酸分子は、細胞中に送達された適切なベクターによって発現させることもできる。従って、ＡＣＴＮ４阻害剤は、ＡＣＴＮ４遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターとしてもよい。このようなベクターは、当技術分野において周知の標準的な手順により、容易に構築することができる（Bass, B.L., Cell 101, 235-238, 2000；Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet. 24, 180-183, 2000；Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998；Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000参照）。
【００４５】
ＡＣＴＮ４阻害剤は、局所、静脈内、皮下、筋肉内、経口、直腸、粘膜など、適切な経路で投与することができる。また、その治療上の有効量は、症状の重篤度、被検者の年齢、用いられる具体的な薬物の有効性、投与経路、投与の頻度などに従って、医師または獣医によって適宜決定される。一般的には、前記治療上有効量は、一日当たり、約０．００１〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。
【００４６】
ＡＣＴＮ４阻害剤は、医薬上許容される担体とともに投与することができる。従って、本発明によれば、ＡＣＴＮ４阻害剤および医薬上許容される担体を含んでなる、Ｉ期肺腺がんを治療するための医薬組成物が提供される。
【００４７】
医薬上許容される担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、投与経路、用いられる具体的な薬物の性質などに応じて、当業者により適宜選択される。
【００４８】
さらに、本発明によれば、本発明の第一の態様による方法もしくは第二の態様による方法、またはこれらの方法の組み合わせによって、予後不良と判定されたＩ期肺腺がんの患者に、治療上有効な量の化学療法剤を投与する工程を含んでなる、Ｉ期肺腺がんを治療する方法が提供される。この化学療法剤としては、上述のＡＣＴＮ４阻害剤を用いてもよいし、あるいはテガフール・５−フルオロウラシル配合剤やシスプラチンなどの他の抗癌剤を用いてもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。【００５０】
（実施例１：Ｉ期肺腺がんとα−アクチニン−４遺伝子の発現亢進との関連）
サンプルとして、１９９７年１２月から２００１年３月までに国立がんセンター中央病院（日本国）においてＩ期肺腺がんの切除手術を施行された３７２名の患者からの、ホルマリン固定パラフィン包埋された切除検体を用いた（以下「コホート１」という）。これらのサンプルについて、α−アクチニン−４タンパク質の発現を免疫組織化学分析によって検討した。免疫組織化学分析に用いた一次抗体は、国立がんセンター研究所（日本国）で作製された抗ヒトα−アクチニン−４ウサギポリクローナル抗体とした。免疫染色は、アビジン・ビオチン複合体（Avidin-Biotin Complex）を用いるＡＢＣ法によって行った。【００５１】
α−アクチニン−４タンパク質発現の評価として、同一切片上の血管内皮と比べて、がん部で発現が亢進しており、かつ、その亢進部分の面積が腫瘍全体の面積の３０％以上を占めるサンプルを陽性例と定義し、それ以外のサンプルを陰性例と定義した。【００５２】
次いで、α−アクチニン−４タンパク質発現についての上記の分類と、Ｉ期肺腺がん患者の生存期間に対する各種臨床病理学的因子の危険率とを、Ｃｏｘ比例ハザードモデルの単変量解析および多変量解析によって分析した。変数としては、α−アクチニン−４タンパク質発現（陽性／陰性）の他に、性別（男性／女性）、年齢（６５以上／６５未満）、喫煙（無／有）、ステージ（ＩＡ／ＩＢ）、血清ＣＥＡ（５ｎｇ／ｍＬを超える／５ｎｇ／ｍＬ以下）、リンパ管浸襲（陽性／陰性）および静脈浸襲（陽性／陰性）を用いた。その結果を以下の表１に示す。【００５３】
【表１】
0005858405.tif 000002
【００５４】
表１の左側に示す単変量解析の結果によれば、上記の全ての項目が予後不良の危険因子になり得ることが示された。【００５５】
さらに、表１の右側には、多変量解析によって分析した結果を示している。この結果によれば、年齢、ステージ、血清ＣＥＡ、リンパ管浸襲およびα−アクチニン−４タンパク質発現が統計学的な有意差を示し、これらが予後不良の危険因子であることが示された。すなわち、Ｉ期肺腺がん細胞でのα−アクチニン−４タンパク質の発現強度は、今回調べた他の臨床病理学的因子とは独立した予後因子であることが示された。【００５６】
次いで、上述のようにして分類されたα−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって生存曲線を作成し、Log-rank検定により検討した。得られた生存曲線を図１に示す。図１のパネルＡはＩ期全体の生存曲線を示している。Ｉ期全体についての陰性症例の５年生存率は９２．７％であったのに対し、陽性症例の５年生存率は８２．１％であった。図１のパネルＢはＩＡ期のみの生存曲線を示している。ＩＡ期についての陰性症例の５年生存率は９４．４％であったのに対し、陽性症例の５年生存率は８６．５％であった。また、パネルＡおよびＢの双方において、陰性症例と陽性症例の生存率の差は、術後５年以降においてより大きくなることがわかる。よって、図１によれば、α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例に比べて、陽性症例は統計学的な有意差をもって予後が不良であったことがわかる。【００５７】
さらに、サンプルとして、２００１年３月から２００３年１月までに国立がんセンター中央病院（日本国）においてＩ期肺腺がんの切除手術を施行された２１４名の患者からの、ホルマリン固定パラフィン包埋された切除検体を用いて、上記と同様の検討を行った（以下「コホート２」という）。結果を表２および図２に示す。【００５８】
【表２】
0005858405.tif 000003
【００５９】
表２の左側に示す単変量解析の結果によれば、血清ＣＥＡ、リンパ管浸襲、静脈浸襲およびα−アクチニン−４タンパク質発現が、予後不良の危険因子になり得ることが示された。【００６０】
さらに、表２の右側には、単変量解析によって予後不良因子になり得ることが示された血清ＣＥＡ、リンパ管浸襲、静脈浸襲およびα−アクチニン−４タンパク質発現についてのみ、多変量解析によって分析した結果を示している。この結果によれば、血清ＣＥＡおよびα−アクチニン−４タンパク質発現が統計学的な有意差を示し、これらが予後不良の危険因子であることが示された。すなわち、Ｉ期肺腺がん細胞でのα−アクチニン−４タンパク質の発現強度は、今回調べた他の臨床病理学的因子とは独立した予後因子であることが示された。【００６１】
図２のパネルＡはＩ期全体の生存曲線を示している。Ｉ期全体についてのα−アクチニン−４タンパク質陰性症例の５年生存率は９５．９％であったのに対し、α−アクチニン−４タンパク質陽性症例の５年生存率は８７．９％であった。図２のパネルＢはＩＡ期のみの生存曲線を示している。ＩＡ期についてのα−アクチニン−４タンパク質陰性症例の５年生存率は９５．９％であったのに対し、α−アクチニン−４タンパク質陽性症例の５年生存率は８９．７％であった。また、パネルＡおよびＢの双方において、α−アクチニン−４タンパク質陰性症例とα−アクチニン−４タンパク質陽性症例の生存率の差は、術後５年以降においてより大きくなることがわかる。よって、図２によれば、α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例に比べて、α−アクチニン−４タンパク質陽性症例は統計学的な有意差をもって予後が不良であったことがわかる。【００６２】
（実施例２：α−アクチニン−４タンパク質の発現亢進と血清ＣＥＡ濃度との組み合わせによるＩ期肺腺がんの予後予測）
実施例１に記載のコホート１およびコホート２のそれぞれについて、α−アクチニン−４タンパク質の発現亢進と血清ＣＥＡ濃度との組み合わせと、Ｉ期肺腺がんの予後との関連を調べた。具体的には、コホート１およびコホート２のそれぞれを、次の３群：血清ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＬ以下かつα−アクチニン−４タンパク質陰性の群；血清ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＬ超またはα−アクチニン−４タンパク質陽性の群；および血清ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＬ超かつα−アクチニン−４タンパク質陽性の群に分割し、それぞれの群についてKaplan-Meier法によって生存曲線を作成し、Log-rank検定により検討した。【００６３】
得られた生存曲線を図３に示す。図３によれば、α−アクチニン−４タンパク質の発現亢進と血清ＣＥＡ濃度との組み合わせはより厳密な予後不良の危険因子であり、すなわち、Ｉ期肺腺がんの細胞においてα−アクチニン−４タンパク質の発現亢進が認められ、かつ血清ＣＥＡ濃度が５ｎｇ／ｍＬを超える患者では、術後の予後が顕著に不良であることがわかる。【００６４】
（実施例３：Ｉ期肺腺がんにおけるＡＣＴＮ４遺伝子のゲノムコピー数の増加）
ＡＣＴＮ４遺伝子のゲノム上のコピー数を調べるため、１９番染色体の長椀上に存在するＡＣＴＮ４遺伝子に対する特異的プローブを作製し、Ｉ期肺腺がん切除標本のパラフィン切片に対してＦＩＳＨ（Fluorescence in Situ Hybridization）法による分析を行った。【００６５】
実施例１に記載のコホート１のパラフィン切片について、ＦＩＳＨ法を用いてＡＣＴＮ４遺伝子のコピー数を測定した。ＦＩＳＨ法は、PathVysion DNAプローブキット（Abbott Molecular, Des Plaines, IL）を用いて行った。ハイブリダイゼーションに用いた特異的プローブは、ＡＣＴＮ４（ＲＰ１１−１１８Ｐ２１）遺伝子座を含むヒト第１９番染色体上の第４３．８１Ｍｂ〜第４４．０２Ｍｂの領域を含有する変性させたバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）プローブ（赤）とした。また、１９番染色体傍セントロメアコントロールクローン（緑）も用いた。これらのプローブは、SpectrimOrange（Abbott Molecular, Des Plaines, IL）を用いて標識化した。ハイブリダイゼーションは、３７℃において１４〜１８時間行った。ハーセプチンテストの方法に準じ、２０細胞核中の赤と緑の蛍光シグナルを計測し、赤シグナル数を緑シグナル数で除して得た数値が２を超えるサンプルをＡＣＴＮ４増幅（＋）（ＦＩＳＨ陽性）と定義し、該数値が２以下のものをＡＣＴＮ４増幅（−）（ＦＩＳＨ陰性）と定義した。【００６６】
次いで、ＡＣＴＮ４遺伝子増幅についての上記の分類と、Ｉ期肺腺がん患者の生存期間に対する各種臨床病理学的因子の危険率とを、Ｃｏｘ比例ハザードモデルの単変量解析および多変量解析によって分析した。変数としては、ＡＣＴＮ４増幅（陽性／陰性）の他に、性別（男性／女性）、年齢（６５以上／６５未満）、喫煙（無／有）、ステージ（ＩＡ／ＩＢ）、血清ＣＥＡ（５ｎｇ／ｍＬを超える／５ｎｇ／ｍＬ以下）、リンパ管浸襲（陽性／陰性）および静脈浸襲（陽性／陰性）を用いた。その結果を以下の表３に示す。【００６７】
【表３】
0005858405.tif 000004
【００６８】
表３の左側に示す単変量解析の結果によれば、性別、年齢、ステージ、リンパ管浸襲およびＡＣＴＮ４増幅が、予後不良の危険因子になり得ることが示された。【００６９】
さらに、表３の右側には、単変量解析によって予後不良因子になり得ることが示された性別、年齢、ステージ、リンパ管浸襲およびＡＣＴＮ４増幅についてのみ、多変量解析によって分析した結果を示している。この結果によれば、性別、年齢、ステージ、リンパ管浸襲およびＡＣＴＮ４増幅が統計学的な有意差を示し、これらが予後不良の危険因子であることが示された。すなわち、Ｉ期肺腺がん細胞でのＡＣＴＮ４増幅は、今回調べた他の臨床病理学的因子とは独立した予後因子であることが示された。【００７０】
（実施例４：α−アクチニン−４タンパク質の発現亢進とＡＣＴＮ４遺伝子増幅との組み合わせによるＩ期肺腺がんの予後予測）
実施例１に記載のコホート１について、α−アクチニン−４タンパク質の発現亢進とＡＣＴＮ４遺伝子増幅との組み合わせと、Ｉ期肺腺がんの予後との関連を調べた。具体的には、サンプルを次の３群：ＡＣＴＮ４遺伝子増幅（−）かつα−アクチニン−４タンパク質発現陰性の群；ＡＣＴＮ４増幅（−）かつアクチニン−４発現陽性の群；およびＡＣＴＮ４遺伝子増幅（＋）かつα−アクチニン−４タンパク質発現陽性の群に分割し、それぞれの群についてKaplan-Meier法によって生存曲線を作成し、Log-rank検定により検討した。【００７１】
得られた生存曲線を図４に示す。図４によれば、α−アクチニン−４タンパク質の発現亢進とＡＣＴＮ４遺伝子増幅との組み合わせはよりそれぞれ単独の因子にくらべ厳密な予後不良の危険因子であり、すなわち、Ｉ期肺腺がんの細胞においてα−アクチニン−４タンパク質の発現亢進が認められ、かつＡＣＴＮ４遺伝子増幅が認められる患者では、術後の予後が顕著に不良であることがわかる。【００７２】
（実施例５：肺腺がんとα−アクチニン−４遺伝子の発現亢進との関連）
実施例１と同様に、α−アクチニン−４タンパク質の発現を免疫組織化学分析によって検討した。サンプルとして、実施例１におけるコホート１に加えて、１９９７年から２００１年までに国立がんセンター中央病院（日本国）において、ＩＩ及びＩＩＩ期肺腺がんの切除手術を施行された１６８名の患者からの、ホルマリン固定パラフィン包埋された切除検体（計５４０＝３７２＋１６８）を用いた（以下「コホート１」という）。また、実施例１におけるコホート２に加えて、１９９３年から２００５年までに国立がんセンター東病院（日本国）において、Ｉ期肺腺がんの切除手術を施行された４４７名の患者からの、ホルマリン固定パラフィン包埋された切除検体（計６６１＝２１４＋４４７）を用いた（以下「コホート２」という）。免疫組織化学分析に用いた一次抗体、免疫染色法、陽性（IHC-positive）及び陰性（IHC-negative）の定義は、実施例１と同様である。【００７３】
α−アクチニン−４タンパク質発現について、実施例１と同様に、性別や年齢等の分類と、肺腺がん患者の生存期間に対する各種臨床病理学的因子の危険率とを、Ｃｏｘ比例ハザードモデルの単変量解析および多変量解析によって分析した。その結果を以下の表１に示す。【００７４】
【表４】
0005858405.tif 000005
【００７５】
表４の左側に示す単変量解析の結果によれば、上記の全ての項目が予後不良の危険因子になり得ることが示された。【００７６】
さらに、表４の右側は、多変量解析によって分析した結果を示している。この結果によれば、ステージ、血清ＣＥＡ、およびα−アクチニン−４タンパク質発現が統計学的な有意差を示し、これらが予後不良の危険因子であることが示された。すなわち、Ｉ〜ＩＩＩ期肺腺がん細胞でのα−アクチニン−４タンパク質の発現強度は、今回調べた他の臨床病理学的因子とは独立した予後因子であることが示された。【００７７】
次に、上述のようにして分類されたα−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例と陰性症例の２群について、肺腺がん組織の顕微鏡写真を図５に示す。図５の左側と中央は陽性症例（IHC-positive）、図５の右側は陰性症例（IHC-negative）の結果を示している。図５の下段の顕微鏡写真は、上段の顕微鏡写真の枠内を拡大した写真である。同図に示すように、アクチニン-４タンパク質（図中の「Ｖ」）は、肺胞隔壁に沿って広がり、線維間質に浸潤しているがん細胞の細胞膜と細胞質とに局在化していた。【００７８】
次いで、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって生存曲線を作成し、Log-rank検定により検討した。得られた生存曲線を図６に示す。図６のパネルＡはＩ〜ＩＩＩ期の生存曲線を示している。Ｉ〜ＩＩＩ期についての陰性症例の５年生存率は８２％であったのに対し、陽性症例の５年生存率は６９％であった。図６のパネルＢはＩ期の生存曲線を示している。Ｉ期についての陰性症例の５年生存率は９２％であったのに対し、陽性症例の５年生存率は８４％であった。また、パネルＡおよびＢの双方において、陰性症例と陽性症例の生存率の差は、術後５年以降においてより大きくなることがわかる。よって、図６によれば、α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例に比べて、陽性症例は統計学的な有意差をもって予後が不良であったことがわかる。【００７９】
（実施例６：Ｉ期肺腺がんにおけるＡＣＴＮ４遺伝子のゲノムコピー数の増加）
実施例３と同様に、ＡＣＴＮ４遺伝子のゲノム上のコピー数を調べるため、１９番染色体の長椀上に存在するＡＣＴＮ４遺伝子に対する特異的プローブを作製し、Ｉ期肺腺がん切除標本のパラフィン切片に対してＦＩＳＨ（Fluorescence in Situ Hybridization）法による分析を行った。サンプルとして、１９９７年から２００９年までに国立がんセンター中央病院（日本国）においてＩ〜ＩＶ期肺腺がんの切除手術を施行された５４３名の患者からの、ホルマリン固定パラフィン包埋された切除検体を用いた。５４３の切除検体のうち、２８８検体は上皮成長因子受容体（ＦＧＦＲ）遺伝子の変異があり、２５５検体は変異がない。そして、これら５４３検体は、実施例５のコホート１及び２とは重複していない。使用した特異的プローブ、陽性（FISH-positive）及び陰性（FISH-negative）の定義は、実施例３と同様である。【００８０】
蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法により標識された肺腺がん細胞の顕微鏡写真を図７に示す。図７の左側は陽性症例（FISH-positive）、図７の右側には陰性症例（FISH-negative）の結果を示している。同図に示すように、肺腺がん細胞中に、赤（図７中の○部）と緑（図７中の□部）の蛍光標識（蛍光シグナル）を付すことができた。そして、ＦＩＳＨ陽性・陰性の定義に基づいて、Ｉ〜ＩＶ期の５４３切除検体から、ＦＩＳＨ陽性の７９切除検体（１５％）を検出した。【００８１】
次いで、ＦＩＳＨ法により分類された陽性症例と陰性症例の２群について、Kaplan-Meier法によって生存曲線を作成し、Log-rank検定により検討した。得られた生存曲線を図８に示す。図８のパネルＡはＩ期の生存曲線を示している。Ｉ期についての陰性症例の５年生存率は９５％であったのに対し、陽性症例の５年生存率は５７％であった。図８のパネルＢはＩ期の生存曲線を示している。Ｉ期についての陰性症例の５年生存率は８６％であったのに対し、陽性症例の５年生存率は３７％であった。また、パネルＡおよびＢの双方において、陰性症例と陽性症例の生存率の差は、術後５年以降においてより大きくなることがわかる。よって、図８によれば、ＦＩＳＨ法分析による陰性症例に比べて、陽性症例は統計学的な有意差をもって予後が不良であったことがわかる。【００８２】
（実施例７：免疫組織化学分析とＦＩＳＨ法分析との組み合わせ）
サンプルとして、実施例５おいて用いたコホート１のうち、Ｉ期肺腺がんの２０６切除検体、及び、実施例５おいて用いたコホート２のうち、Ｉ期肺腺がんの６４５切除検体、を用いた。これらのサンプルについて、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例及び陰性症例と、ＦＩＳＨ法分析の陽性症例及び陰性症例と、を組み合わせて、Kaplan-Meier法によって生存曲線を作成し、Log-rank検定により検討した。得られた生存曲線を図９に示す。図９のパネルＡはコホート１のＩ期の生存曲線を示している。α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例の５年生存率は９５％であり、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陰性症例の５年生存率は８７％であった。これに対し、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陽性症例の５年生存率は５８％であった。また、図９のパネルＢはコホート１のＩＡ期の生存曲線を示している。α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例の５年生存率は９６％であり、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陰性症例の５年生存率は９２％であった。これに対し、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陽性症例の５年生存率は５７％であった。このため、図９のパネルＡおよびＢによれば、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性・陰性症例に比べて、ＦＩＳＨ法分析の陽性・陰性症例は統計学的な有意差をもって予後が不良であったことがわかる。【００８３】
次に、図９のパネルＣはコホート２のＩ期の生存曲線を示している。α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例の５年生存率は９２％であり、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陰性症例の５年生存率は８９％であった。これに対し、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陽性症例の５年生存率は５９％であった。また、図９のパネルＤはコホート２のＩＡ期の生存曲線を示している。α−アクチニン−４タンパク質発現の陰性症例の５年生存率は９５％であり、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陰性症例の５年生存率は９１％であった。これに対し、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性症例、かつ、ＦＩＳＨ法分析の陽性症例の５年生存率は７４％であった。このため、図９のパネルＣおよびＤによれば、α−アクチニン−４タンパク質発現の陽性・陰性症例に比べて、ＦＩＳＨ法分析の陽性・陰性症例は統計学的な有意差をもって予後が不良であったことがわかる。【００８４】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。【００８５】
本出願は、２０１０年３月３０日に出願された日本国特許出願２０１０−７８７７２号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の肺腺がんの予後予測方法、及び、肺腺がんの検出キットは、Ｉ期肺腺がんの予後を予測し、適切な治療法を選択するのに有用である。また、本発明の腺がんの治療のための医薬組成物は、予後不良のＩ期肺腺がんを治療するのに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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