(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む複合アミノ酸配列を有する、少なくとも１つのポリペプチドを含むウイルス様粒子。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項４】
配列番号３で表される配列を有する、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
請求項３に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のウイルス様粒子を含むワクチン製剤。
【請求項８】
請求項１に記載のウイルス様粒子および第２のウイルス様粒子を含むワクチン製剤であって、前記第２のウイルス様粒子が、ノロウイルス由来のカプシドタンパク質を含む、ワクチン製剤。
【請求項９】
前記ノロウイルスが、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスである、請求項８に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
前記アジュバントが、トール様受容体（TLR）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（MPL）、合成脂質Ａ、脂質Ａの模倣体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（MDP）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（LPS）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロソーム、コクリエート（cochleate）、ポリ（ラクチドコグリコリド）（PLG）微小粒子、ポロキサマー粒子、微小粒子、リポソーム、水中油型エマルジョン、ＭＦ５９、およびスクアレンからなる群から選択される、請求項１０に記載のワクチン製剤。
【請求項１２】
送達物質をさらに含む、請求項１０に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
前記送達物質が、粘膜接着性物質である、請求項１２に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
前記粘膜接着性物質が、グリコサミノグリカン、炭水化物ポリマー、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、ポリイオン、セルロース誘導体、タンパク質、及びデオキシリボ核酸からなる群から選択される、請求項１３に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
前記グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びヒアルロン酸からなる群より選択され、
前記炭水化物ポリマーは、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、イヌリン、デキストリン、及びデキストランからなる群より選択され、
前記多糖は、ムコ多糖、又はアロエ植物から抽出される天然酸性多糖であるGelSite（登録商標）であり、
前記セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースであり、
前記タンパク質は、レクチン、又は線毛タンパク質である、
請求項１４に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
前記粘膜接着性物質が多糖である、請求項１４又は１５に記載のワクチン製剤。
【請求項１７】
前記多糖が、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基である、請求項１６に記載のワクチン製剤。
【請求項１８】
液体製剤である、請求項１０に記載のワクチン製剤。
【請求項１９】
乾燥粉末製剤である、請求項１０に記載のワクチン製剤。
【請求項２０】
１つまたは複数の用量の前記製剤を投与するための１つまたは複数のデバイスと組み合わせた、請求項１９に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の用量が単位用量である、請求項２０に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項２２】
前記デバイスが、使い捨ての経鼻投与デバイスである、請求項２０に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項２３】
粘膜経路、筋肉内経路、静脈内経路、皮下経路、皮内経路、真皮下経路、および経皮経路からなる群から選択される投与経路によって対象に投与される、請求項７に記載のワクチン製剤。
【請求項２４】
前記粘膜投与が、鼻腔内、経口、または経膣である、請求項２３に記載のワクチン製剤。
【請求項２５】
経鼻スプレー、点鼻薬、または乾燥粉末の形態である、請求項２４に記載のワクチン製剤。
【請求項２６】
請求項５に記載のベクターを含むワクチン製剤。
【請求項２７】
対象におけるウイルス感染に対する防御性免疫を誘導する医薬の製造のための、請求項７に記載のワクチン製剤の使用。
【請求項２８】
前記ウイルス感染がノロウイルス感染である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ワクチン製剤が、ノロウイルス感染の１つまたは複数の症状からの防御をもたらす、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
ウイルス様粒子を製造する方法であって、
請求項２に記載のポリペプチドを宿主細胞において発現させる工程と、
ウイルス様粒子が形成される条件下で細胞を増殖させる工程と、
ウイルス様粒子を単離する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]  関連出願への相互参照
この出願は、２００８年８月８日に出願された米国仮出願第６１／０８７，５０４号および２００９年６月１９日に出願された米国仮出願第６１／２１８，６０３号に基づく利益を主張するものであり、両仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[002]  本発明は、ワクチン、とりわけ、非エンベロープウイルスの２つ以上のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する複合アミノ酸配列を有するウイルス様粒子を含むワクチンの分野にある。さらに、本発明は、ワクチン組成物を調製する方法、および本発明のワクチン組成物を用いて防御性免疫応答を誘発する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[003]  季節性のまたは年ごとのパターンを有するウイルスに対するワクチンを調製するために普及しているアプローチは、市販のインフルエンザワクチンによってモデル化されており、これらのワクチンは、ウイルスが進化して異なる抗原プロフィールを示すようになると、新たなワクチンの予想、公表、およびその後の合成を要する。このアプローチでは、翌年のウイルス株を予想して新たな抗原が合成されるため、著しい時系列的な遅延および費用が生じる。さらに、２００８年のインフルエンザワクチンの失敗により証明されるように、予測株を誤ると、患者が防御下にあるほど、著しい疾患関連費用が生じ得る。したがって、疾患を引き起こすウイルスの複数の循環株に対して防御するためのワクチンを設計および調製するための改良された方法が望ましい。
【０００４】
[004]  ノロウイルスは、非細菌性胃腸炎の流行的発生の単一の最も重要な原因として出現している、培養不可能なヒトカリシウイルスである（Glass et al.（2000）J Infect Dis, Vol. 181（Sup 2）: S254-S261; Hardy et al.（1999）Clin Lab Med, Vol. 19（3）: 675-90）。これらのウイルスは、５つの異なる遺伝子群にグループ化されており、そのうち遺伝子群ＩおよびＩＩは、２５を超える遺伝子型にさらに分けられ、このウイルスに起因するヒトにおける病気の大部分についての作用物質である。ノロウイルスに対するワクチンを開発するために、培養物および急性胃腸炎の適切な動物モデルにおけるウイルスの繁殖の欠如を含む、多大なる挑戦がなされている。したがって、ウイルスの弱毒化またはインビトロでの中和アッセイを含む標準的なウイルス学的技術は今日のところ不可能である。
【０００５】
[005]  ノロウイルスは、３つのオープンリーディングフレームを含有する、７．５Ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを含有する。主要ウイルスカプシドタンパク質（VP1）はＯＲＦ２によってコードされており、このタンパク質が発現すると、ウイルスの構造を模倣するが複製能を有しないウイルス様粒子（VLP）が、自然発生的に組み立てられる。この構造は、ＶＰ１の１８０個のモノマーサブユニットからなり、急性胃腸炎を予防するためのワクチン候補である。ＶＰ１モノマーは、内部のウイルス核を形成するｓｈｅｌｌ（S）ドメイン、および柔軟なヒンジによって連結されている、突出したｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ（P）ドメインという、２つのドメインを有する。Ｐドメインは、Ｐ１およびＰ２という２つのサブドメインにさらに分けられ、Ｐ２は、最も表面にある露出した領域であり、重要な細胞認識部位および抗原部位を含有すると考えられている。相同性分析は、ＶＰ１の超可変アミノ酸領域の大部分がＰ２ドメイン内に位置することを示す（Allen et al.（2008）PLoS One, Vol. 1: 1-9）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[006]  近年の疫学的研究により、ノロウイルスの進化は、インフルエンザウイルスで観察されるのと同様に、停止期間とその後の新たな流行株の出現とを伴う点で画期的であるという仮定が導かれている。最近の発生は、およそ２年間の持続間隔でのＧＩＩ．４遺伝子型の変異ウイルスの出現に関連すると考えられる。当技術分野において、それぞれの現代の発生株に対するワクチンの構築の必要性をなくす、複数のノロウイルスまたは他の非エンベロープウイルス株に対して交差防御的である抗原性エピトープを提供するワクチン候補が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[007]  本発明は、多くの循環ウイルス株のエピトープを結合する、複合カプシド配列を含むポリペプチドを、複数のウイルス株に対するさらに強固な免疫学的応答を生じさせるために用いることができるという発見に一部基づいている。このようなポリペプチドは、ウイルスのいくつかの循環株に対して防御的であり、したがって、株ごとおよび年ごとの防御を向上させるワクチン製剤を調製するために用いることができる。
【０００８】
[008]  本発明は、複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを提供し、前記複合アミノ酸配列は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来し、少なくとも１つのポリペプチドは、宿主細胞において発現されるとウイルス様粒子を形成し、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する。一実施形態において、少なくとも１つの複合ポリペプチドを含むウイルス様粒子は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株の抗原特性を有する。別の実施形態において、複合ポリペプチドまたは複合ウイルス様粒子は、非エンベロープウイルスの１つまたは複数の循環株に対する抗血清交差反応性を、前記１つまたは複数の循環株から得られるタンパク質のみを含有するウイルス様粒子での免疫によって得られる抗血清交差反応性と比較して増大させる。
【０００９】
[009]  ウイルス様粒子は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことができ、非エンベロープウイルスは、カリシウイルス、ピコルナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスからなる群から選択される。一実施形態において、非エンベロープウイルスはカリシウイルスである。別の実施形態において、カリシウイルスはノロウイルスまたはサポウイルスである。ノロウイルスは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスであり得る。
【００１０】
[010]  コンセンサス配列は、同一の遺伝子群および遺伝子型に分類される２つ以上のノロウイルス株に由来し得る。一実施形態において、コンセンサス配列は、遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルス株、例えばＨｏｕｓｔｏｎ株、Ｍｉｎｅｒｖａ株、およびＬａｕｒｅｎｓ株に由来する。別の実施形態において、コンセンサス配列は、１つの遺伝子群内の少なくとも２つの異なる遺伝子型のノロウイルス株に由来する。さらに別の実施形態において、コンセンサス配列は、少なくとも２つの異なる遺伝子群のノロウイルス株に由来する。
【００１１】
[011]  本発明はまた、２つ以上の循環カリシウイルス株に由来する少なくとも１つの複合ポリペプチドと、ノロウイルスなどの、第２の非エンベロープウイルスから得られるカプシドタンパク質とを含むウイルス様粒子を包含する。カプシドタンパク質は、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスから得られるＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質であり得る。別の実施形態において、ウイルス様粒子は、カリシウイルスの２つ以上の循環株に由来する少なくとも１つの複合ポリペプチドと、第２のカリシウイルスの２つ以上の循環株に由来する第２の複合ポリペプチドとを含む。好ましくは、ウイルス様粒子は、第１のカリシウイルスの２つ以上の循環株および第２のカリシウイルスの２つ以上の循環株の抗原特性を有する。
【００１２】
[012]  本発明はまた、複合アミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントを提供し、前記複合アミノ酸配列は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来し、ポリペプチドは、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する。非エンベロープウイルスは、サポウイルスまたはノロウイルスなどのカリシウイルスであり得る。あるいは、非エンベロープウイルスはパピローマウイルスであり得る。
【００１３】
[013]  本発明は、本発明の１つまたは複数の複合ポリペプチドまたは複合ウイルス様粒子を含むワクチン製剤を企図とする。複合ウイルス様粒子のそれぞれは、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株から得られるカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。非エンベロープウイルスは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスであり得る。いくつかの実施形態において、ワクチン製剤はアジュバントをさらに含む。他の実施形態において、ワクチン製剤は送達物質をさらに含む。さらに他の実施形態において、ワクチン製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。ワクチン製剤は、液体製剤または乾燥粉末製剤であり得る。
【００１４】
[014]  本発明はまた、本明細書において開示されるワクチン製剤を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染に対する防御性免疫を誘発する方法を提供する。１つの実施形態において、ウイルス感染はノロウイルス感染である。別の実施形態において、ワクチン製剤は、ノロウイルス感染の１つまたは複数の症状からの防御をもたらす。
【００１５】
[015]  本発明はまた、複合ウイルス様粒子を作製する方法を対象とする。一実施形態において、本方法は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株から得られるカプシドタンパク質のアミノ酸配列をアラインすること、前記アラインされたアミノ酸配列からコンセンサス配列を決定すること、前記コンセンサス配列に基づいて、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する複合配列を調製すること、および宿主細胞において前記複合配列を発現させ、それによりウイルス様粒子を産生することを含む。非エンベロープウイルスは、カリシウイルス、ピコルナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[016]遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルスから得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸コンセンサス配列（配列番号２）を示す図である。コンセンサス配列は、Ｈｏｕｓｔｏｎ株、Ｍｉｎｅｒｖａ株、およびＬａｕｒｅｎｓ株のアラインメントから決定した。
【図２】[017]遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルスから得られる複合ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す図である。
【図３】[018]ショ糖勾配精製された複合ＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー分析を示す図である。
【図４】[019]ショ糖勾配によって精製された、複合物発現細胞の培養上清の、２２０ｎｍ（上部）および２８０ｎｍ（下部）で読み取った、ＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラムを示す図である。
【図５】[020]カラムクロマトグラフィーによって精製された複合配列ＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色分析を示す図である。
【図６】[021]複合ＶＬＰの、２８０ｎｍで読み取ったＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラムを示す図である。
【図７】[022]複合ＶＬＰ（CVLP）での免疫が抗原特異的ＩｇＧを引き起こすことを示す図である。０日目および７日目に、７頭のマウスからなる群を、様々な濃度のＣＶＬＰ（Ｘ軸上に示される）で免疫（腹腔内）した。１４日目に血清を回収し、ＣＶＬＰ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。水平な線は、それぞれの処理群の幾何平均を示す。
【図８】[023]複合ＶＬＰ／Ｎｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（CVLP/NVLP）の組合せでの免疫がＮＶＬＰ特異的ＩｇＧを引き起こすことを示す図である。０日目および１４日目に、７頭のマウスからなる群を、様々な濃度のＮＶＬＰのみ（紫のバー）または等量のＣＶＬＰと組み合わせたＮＶＬＰ（黒のバー）で免疫（腹腔内）した。２１日目に血清を回収し、ＮＶＬＰ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。データは、平均＋平均の標準誤差（SEM）として報告される。
【図９】[024]複合ＶＬＰ／Ｎｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（CVLP/NVLP）の組合せでの免疫がＣＶＬＰ特異的ＩｇＧを引き起こすことを示す図である。０日目および１４日目に、７頭のマウスからなる群を、様々な濃度のＶＬＰのみ（緑のバー）または等量のＮＶＬＰと組み合わせたＶＬＰ（黒のバー）のいずれかで免疫（腹腔内）した。２１日目に血清を回収し、ＣＶＬＰ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。データは、平均＋平均の標準誤差（SEM）として報告される。
【図１０】[025]ＣＶＬＰ特異的ＩｇＧが他のノロウイルス単離体と交差反応することを示す図である。複合ＶＬＰまたはＧＩＩ．４  ２００２ＶＬＰのいずれかでの単回免疫の２１日後に測定された抗体力価は、複合ＶＬＰが、ＧＩＩ．４  ２００２ＶＬＰと比較して約１０倍高い力価を引き起こすことを示す。全てのＧＩＩ．４  ＶＬＰで免疫された動物についての抗体力価は、ＧＩ．１  ＶＬＰに対して弱い交差反応性を示す。データは、幾何平均＋平均の標準誤差（SEM）として表される。
【図１１】[026]０日目および２１日目に、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてウサギを筋肉内で免疫した。２８日目に血清を回収し、ＶＬＰ特異的ＩｇＧを評価した。得られたデータをｌｏｇ変換し、線形回帰分析によって評価した。ＩｇＧの力価は、希釈の逆数として表され、幾何学的な平均力価として示される。
【図１２】[027]０日目および２１日目に、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてウサギを筋肉内で免疫した。７５日目に脾臓を回収し、断片化されていない細胞を、培養物内で５日間にわたりＮＶＬＰまたはＣＶＬＰで刺激し、チミジンの組込み量を測定した。平均およびＳＤが、Ｘ軸上に示される処理群におけるそれぞれのウサギについて示される。データは平均＋ＳＤとして表される。
【図１３】[028]０日目および２１日目に、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてウサギを筋肉内で免疫した。７５日目に脾臓および腸間膜リンパ節（LN）を回収し、ＶＬＰ特異的な記憶Ｂ細胞の存在についてＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。個別の応答が、ＮＶＬＰおよびＣＶＬＰについて示される。データは、１００万個の細胞存在量当たりのＶＬＰ特異的ＩｇＧ分泌細胞の数として表される。
【図１４】[029]０日目、１４日目、および２１日目に、説明文において示されているように、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてウサギを筋肉内で免疫した。２１日目および３５日目に血清を回収し、ＮＶＬＰ特異的なＩｇＧおよびＩｇＡをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、群の幾何平均＋ＳＥＭとして表される。
【図１５】[030]０日目、１４日目、および２１日目に、説明文において示されているように、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてウサギを筋肉内で免疫した。２１日目および３５日目に血清を回収し、ＣＶＬＰ特異的なＩｇＧおよびＩｇＡをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、群の幾何平均＋ＳＥＭとして表される。
【図１６】[031]０日目、１４日目、および２１日目に、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてウサギを筋肉内で免疫した。３５日目に脾臓を回収し、断片化されていない細胞をインビトロで５日間にわたり刺激した。脾臓細胞を、グラフの説明文において示される２つの遺伝子群の様々なＶＬＰで刺激した。結果は、群の幾何平均＋ＳＤとして表される。
【図１７】[032]０日目および７日目に、Ｘ軸上に示されているように、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてマウスを腹腔内で免疫した。１４日目に血清を回収し、ＶＬＰ特異的ＩｇＧの存在をＥＬＩＳＡによって分析した。個別の応答が示され、力価は希釈の逆数として表される。水平なバーは、群の幾何平均を表す。
【図１８】[033]０日目および７日目に、Ｘ軸上に示されているように、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いてマウスを腹腔内で免疫した。１４日目に血清を回収し、ヒト赤血球（Ｏ型プラス）の凝集を阻害し得る抗体の存在を分析した。個別の応答が示され、力価は希釈の逆数として表される。水平なバーは、群の幾何平均を表す。
【図１９】[034]０日目および２１日目に、ＶＬＰワクチン製剤（Norwalk VLP+複合GII. 4 VLP）５０μｇを用いて鼻腔内で免疫されたウサギにおける、血清の抗ＶＬＰ  ＩｇＧを示す図である。個別の応答が示され、３５日目に回収された血清からのμｇ／ｍＬで表される。バーは、群の幾何平均を示す。
【図２０】[035]遺伝子群ＩＩのノロウイルスから得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸コンセンサス配列（配列番号７）を示す図である。コンセンサス配列は、ＧＩＩ．１（受託番号：ＡＡＬ１３００１）株、ＧＩＩ．２  Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ（受託番号：ＡＡＢ６１６８５）株、およびＧＩＩ．３（受託番号：ＡＡＬ１２９９８）株のアラインメントから決定された。「ｘ」は、３株全ての間でアミノ酸が異なった位置を示す。
【図２１】[036]遺伝子群Ｉのノロウイルスから得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸コンセンサス配列（配列番号１２）を示す図である。コンセンサス配列は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（受託番号：Ｍ８７６６１）株、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（受託番号：Ｑ０４５４２）株、およびＣｈｉｂａウイルス（受託番号：ＢＡＢ１８２６７）株のアラインメントから決定された。「ｘ」は、３株全ての間でアミノ酸が異なった位置を示す。
【図２２】[037]ヒトパピローマウイルスから得られるＬ１タンパク質のアミノ酸コンセンサス配列（配列番号１７）を示す図である。コンセンサス配列は、ＨＰＶ−１１ウイルス株、ＨＰＶ−１６ウイルス株、およびＨＰＶ−１８ウイルス株のアラインメントから決定された。「ｘ」は、３株全ての間でアミノ酸が異なった位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[038]  本発明は、複合アミノ酸配列を有するポリペプチドを含むワクチン製剤を提供し、複合アミノ酸配列は、非エンベロープウイルスの循環株のカプシド配列に由来する。このようなポリペプチド配列から産生されるウイルス様粒子は、いくつかのウイルス株に対する抗原性エピトープを提供し、複数の株からのウイルス感染に対して防御的である免疫応答を誘発するために使用することができる。したがって、本発明は、複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むウイルス様粒子を提供する。本明細書において用いられる「複合アミノ酸配列」または「複合配列」は、少なくとも２つのウイルスタンパク質配列のコンセンサス配列に由来する配列である。一実施形態において、ウイルスタンパク質配列はカプシド配列である。複合アミノ酸配列は、コンセンサス配列内の可変的な位置で２つ以上のアミノ酸の１つを選択することにより、コンセンサス配列に由来し得る。
【００１８】
[039]  本明細書において用いられる場合、「コンセンサス配列」は、１つまたは複数の可変的なアミノ酸を含有する配列であり、２つ以上のウイルスのウイルスタンパク質配列をアラインおよび比較することによって決定される。コンセンサス配列はまた、２つ以上のウイルスのヌクレオチド配列をアラインおよび比較することによって決定され得る。コンセンサス配列は、非エンベロープウイルスの２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、７つ以上の、８つ以上の、または９つ以上の循環株のタンパク質配列またはヌクレオチド配列から決定され得る。
【００１９】
[040]  複合アミノ酸配列を有するポリペプチドは、コンセンサス配列を決定するために用いられる２つ以上の循環株のタンパク質配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なる、少なくとも２つの異なる、少なくとも３つの異なる、少なくとも４つの異なる、少なくとも５つの異なる、少なくとも６つの異なる、少なくとも７つの異なる、少なくとも８つの異なる、少なくとも９つの異なる、少なくとも１０個の異なる、少なくとも１５個の異なる、少なくとも２０個の異なる、少なくとも２５個の異なる、少なくとも３０個の異なる、少なくとも３５個の異なる、少なくとも４０個の異なる、少なくとも４５個の異なる、または少なくとも５０個の異なるアミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態において、複合アミノ酸配列を有するポリペプチドは、宿主細胞において発現されるとウイルス様粒子を形成し得る。
【００２０】
[041]  本発明の１つの実施形態において、ウイルス様粒子（VLP）は、複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み、前記複合アミノ酸配列は、エンベロープを有さない２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来し、少なくとも１つのポリペプチドは、宿主細胞において発現されるとウイルス様粒子を形成し、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する。好ましくは、ウイルス様粒子は、非エンベロープウイルスの２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、７つ以上の、８つ以上の、または９つ以上の循環株の抗原特性を有する。いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子は、非エンベロープウイルスの１つもしくは複数の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、７つ以上の、８つ以上の、または９つ以上の循環株に対する抗血清交差反応性を、１つまたは複数の循環株から得られるタンパク質のみを含有するウイルス様粒子での免疫によって得られる抗血清交差反応性と比較して増大させる。１つの実施形態において、ウイルス様粒子は、抗血清交差反応性を少なくとも２倍増大させる。
【００２１】
[042]  別の実施形態において、ウイルス様粒子は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み、非エンベロープウイルスは、カリシウイルス、ピコルナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスからなる群から選択される。本発明はまた、出願時には特徴付けも発見もされていない、非エンベロープウイルスの株も含む。いくつかの実施形態において、とりわけ、非エンベロープウイルスはカリシウイルスである。カリシウイルスは、ヒトにおける感染の原因となるノロウイルスおよびサポウイルス、ならびに動物の感染に関連するラゴウイルスおよびベシウイルスという４つの属に分けられる。好ましい実施形態において、カリシウイルスはサポウイルスまたはノロウイルスである。
【００２２】
[043]  ノロウイルス属は、２つの主要な遺伝子群（GIおよびGII）にまず分けられる。２つの他の遺伝子群（GIIIおよびGIV）が提案され、一般に認められている。ＧＩＩＩの代表はウシのＪｅｎａ株である。ＧＩＶは現時点では、Ａｌｐｈａｔｒｏｎという１つのウイルスを含有する。ＧＩ群およびＧＩＩ群はさらに、遺伝的分類に基づいて集団または遺伝子型に分離される（Ando et al.（2000）J. Infectious Diseases, Vol. 181（Supp2）:S336-S348; Lindell et al.（2005）J. Clin. Microbiol., Vol. 43（3）: 1086-1092）。本明細書において用いられる場合、遺伝集団という用語は、遺伝子型という用語とほぼ同じ意味で用いられる。遺伝子群Ｉにおいては、ＧＩ．１（Norwalk）、ＧＩ．２（Southhampton）、ＧＩ．３（Desert Shield）、ＧＩ．４（Cruise Shipウイルス/Chiba）、ＧＩ．５（318/Musgrove）、およびＧＩ．６（Hesse）という６つのＧＩ集団（プロトタイプウイルス株の名称を伴う）が存在する。遺伝子群ＩＩにおいては、ＧＩＩ．１（Hawaii）、ＧＩＩ．２（Snow Mountain/Melksham）、ＧＩＩ．３（Toronto）、ＧＩＩ．４（Bristol/Lordsdale）、ＧＩＩ．５（290/Hillingdon）、ＧＩＩ．６（269/Seacroft）、ＧＩＩ．７（273/Leeds）、ＧＩＩ．８（539/Amsterdam）、およびＧＩＩ．９（３７８）という９つのＧＩＩ集団（プロトタイプウイルス株の名称を伴う）が存在する。循環ノロウイルス株は、これらの遺伝集団に属するプロトタイプ株に対する比較を介して分類される。最も普及している循環株は遺伝子群ＩＩに属する。
【００２３】
[044]  多くのノロウイルス単離体についての核酸配列およびタンパク質配列が知られている。ノロウイルス単離体から得られるＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、およびそれらがコードするポリペプチドの配列を含む、さらなる代表的な非限定的な配列は、国立生物工学情報センター（NCBI）のデータベースにおいて列挙されている。本発明の１つの実施形態において、ノロウイルスは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスであり得る。複合アミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列は、既知のノロウイルス株のいずれかから決定され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録：ノロウイルス遺伝子群１の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ／２００１／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１６；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｂｒａｄｄｏｃｋ  Ｈｅｉｇｈｔｓ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１５；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｙｅｔｔｅ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１４；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１３；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｓａｎｄｕｓｋｙ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１２；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｃａｎｔｏｎ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１１；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｉｆｆｉｎ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１０；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｅ１／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００；ノロウイルス遺伝子群１の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００１／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００８；ノロウイルス遺伝子群１の株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−８４１／２００１／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００７；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｈｉｒａｍ／２０００／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００６；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｏｎｔｏｇａｎｙ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ．ｓｕｂ．−−００１９５９；ノロウイルスＨｕ／ＧＩ／Ｏｔｏｆｕｋｅ／１９７９／ＪＰゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１８７５１４；ノロウイルスＨｕ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１３３／２００３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ２１２３０６、ノロウイルスＳｙｄｎｅｙ２２１２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８１３２；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株ＳＮ２０００ＪＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９０４５７；Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルスの完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６５５７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス、ゲノムＲＮＡ、Ｇｉｆｕ’９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４５６０３；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株Ｖｉｅｔｎａｍ  ０２６、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５０４６７１；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ．４／２００４／Ｎ／Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８���３０９６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｈｏｋｕｓｈｉｎ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２７；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｋａｍｏ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２８；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｓｉｎｓｉｒｏ／９７／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｉｎａ／０２／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｎｅｕｓｔｒｅｌｉｔｚ２６０／２０００／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７７２７３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／ｐＵＳ−ＮｏｒＩＩ／１９９７／ＧＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７４１８１１；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ２Ｓ１６／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ４Ｓ７／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８７９８７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｗｉｔｎｅｙ／Ｂ７Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｂａｎｂｕｒｙ／Ｂ９Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＣｈｉｐｐｉｎｇＮｏｒｔｏｎ／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２８；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｉｄｃｏｔ／Ｂ９Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ８Ｓ５／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２６；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ４／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ５／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２４；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ５Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２３；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２２；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ６／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス単離体Ｂｏ／Ｔｈｉｒｓｋ１０／００／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４６８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス単離体Ｂｏ／Ｐｅｎｒｉｔｈ５５／００／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４７６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス単離体Ｂｏ／Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ２４／００／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４７５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス単離体Ｂｏ／Ｄｕｍｆｒｉｅｓ／９４／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４７４；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ２０３６／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６７５５５５；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ１９９８／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６７５５５４；ノロウイルスＮＬＶ／ＢＵＤＳ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６６０５６８；ノロウイルスＮＬＶ／Ｐａｒｉｓ  Ｉｓｌａｎｄ／２００３／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６５２９７９；Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１３４７４８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ／５６０／１９９８／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２６；Ｈｕ／Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ／ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／１９９９／ＪＰ（9912-02F）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４４３６６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株１１ＭＳＵ−ＭＷ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７４８２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株Ｂ−１ＳＶＤ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７４８１９；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ  Ｈｉｌｌｓ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２３；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ４／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２２；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ２／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２１；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ―Ｇ１２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２０；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ａｎｃｈｏｒａｇｅ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１９；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｄ１／２００２／ＣＡＮ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１８；ノロウイルス遺伝子群２の株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｔｏｎ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１７；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｌａｎｇｅｎ１０６１／２００２／ＤＥ、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ４８５６４２；マウスノロウイルス１ポリタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２２８２３５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６７５３６；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｍｅｘ７０７６／１９９９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５４２０９０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｎ  ４５５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３９４４０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｈｅｒｚｂｅｒｇ  ３８５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３９４３９；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｂｏｘｅｒ／２００１／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３８６７９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０８１７２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、単離体：Ｓａｉｔａｍａ  Ｕ２０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３９７８２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、単離体：Ｓａｉｔａｍａ  Ｕ１８、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３９７８１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、単離体：Ｓａｉｔａｍａ  Ｕ２５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３９７８０；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２５ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６７５４３；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２０１  ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６７５４２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株４１６／９７００３１５６／１９９６／ＬＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８０５５９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株４０８／９７００３０１２／１９９６／ＦＬ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８０５５８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｂｕｒｗａｓｈ Ｌａｎｄｉｎｇ／３３１／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ  Ｂｅａｃｈ／３２６／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２４；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｈｉｔｅ  Ｒｉｖｅｒ／２９０／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ／３０６／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｐｏｒｔ  Ｃａｎａｖｅｒａｌ／３０１／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｈｏｎｏｌｕｌｕ／３１４／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｒｉｃｈｍｏｎｄ／２８３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｅｓｔｏｖｅｒ／３０２／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／ＵＫ３−１７／１２７００／１９９２／ＧＢ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ／８１／１９８６／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１６；Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７００５９；Ｄｅｓｅｒｔ  ＳｈｉｅｌｄウイルスＤＳＶ３９５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０４４６９；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９３７９７；Ｈａｗａｉｉカリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０７６１１；Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７４１８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（SRSV-KY-89/89/J）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２３８２８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（SRSV-SMA/76/US）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２３８３１；Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４６５００；ヒトカリシウイルス株Ｍｅｌｋｓｈａｍ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８１８７９；ヒトカリシウイルス株ＭＸ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２２４９８；ミニレオウイルスＴＶ２４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０２０３０；およびＮｏｒｗａｌｋ様ウイルス
ＮＬＶ／Ｇｗｙｎｅｄｄ／２７３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４０９を参照されたく、これらの全ての配列（本出願の出願日までに加えられたものとして）は、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらなるノロウイルス配列が、ＷＯ２００５／０３０８０６、ＷＯ２０００／７９２８０、ＪＰ２００２０２０３９９、ＵＳ２００３１２９５８８、米国特許第６，５７２，８６２号、ＷＯ１９９４／０５７００、およびＷＯ０５／０３２４５７という特許刊行物において開示されており、これら刊行物の全ては、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。また、ノロウイルスの配列の比較ならびに遺伝的多様性および系統発生的な分析の議論については、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．１８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３２２−３３０；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８：５９８２−５９９０；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７８：６４６９−６４７９；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７９：５５４−５６８；Ｈａｎｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８７：９０９−９１９；Ｂｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，Ｖｏｌ．４４（２）：３２７−３３３；Ｓｉｅｂｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８１（１８）：９９３２−９９４１；およびＦａｎｋｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．１７８：１５７１−１５７８も参照されたい。
【００２４】
[045]  多くのサポウイルス単離体についての核酸配列およびタンパク質配列もまた知られている。サポウイルス単離体から得られるＯＲＦ１およびＯＲＦ２ならびにそれらがコードするポリペプチドの配列を含む、代表的なサポウイルス配列は、国立生物工学情報センター（NCBI）のデータベースにおいて列挙されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録：サポウイルスＭｃ１０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ．ｓｕｂ．−−０１０６２４；サッポロウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６５４２７；サポウイルスＭｃ１０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２３７４２０；サポウイルスＳａＫａｅｏ−１５／Ｔｈａｉｌａｎｄ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６４６８５５；サッポロウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ．ｓｕｂ．−−００６２６９；サポウイルスＣ１２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ．ｓｕｂ．−−００６５５４；サポウイルスＣ１２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６０３４２５；サポウイルスＨｕ／Ｄｒｅｓｄｅｎ／ｐＪＧ−Ｓａｐ０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６９４１８４；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／ｃｒｕｉｓｅ  ｓｈｉｐ／２０００／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８９８０４；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ａｒｇ３９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８９８０３；ブタ腸管カリシウイルス株ＬＬ１４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ４２５６７１；ブタ腸管カリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ．ｓｕｂ．−−０００９４０；ヒトカリシウイルス株Ｍｃ３７、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２３７４１５；ミンク腸管カリシウイルス株Ｃａｎａｄａ  １５１Ａ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１４４３３７；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ｈｏｕ７−１１８１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４３５８１４；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ｍｅｘ１４９１７／２０００、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４３５８１３；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ｍｅｘ３４０／１９９０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４３５８１２；ブタ腸管カリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８２７６０；サッポロウイルス−Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９５６４５；サッポロウイルス−Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６５６０；サッポロウイルス−Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９５６４３；サッポロウイルス−Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９５６４４；およびヒトカリシウイルス株ＨｕＣＶ／Ｐｏｔｓｄａｍ／２０００／ＤＥＵ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２９４７３９を参照されたく、これらの全ての配列（本出願の出願日までに加えられたものとして）は、参照することにより本明細書に組み込まれる。また、サポウイルスの配列の比較ならびに遺伝的多様性および系統発生的な分析の議論については、Ｓｃｈｕｆｆｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１４６（１１）：２１１５−２１３２；Ｚｉｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．５：２８１−２９０；Ｆａｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１４９：１３０９−１３２３も参照されたい。
【００２５】
[046]  複合アミノ酸配列およびコンセンサスアミノ酸配列は、少なくとも２つのノロウイルス遺伝子群Ｉ株または遺伝子群ＩＩ株のカプシド配列に由来し得る。１つの実施形態において、ＶＬＰは、２つ以上の遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルス株から得られるカプシドタンパク質のコンセンサス配列に由来する複合配列を有するポリペプチドを含む。遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルス株の非限定的な例には、Ｈｏｕｓｔｏｎ株、Ｍｉｎｅｒｖａ株、Ｌａｕｒｅｎｓ株、Ｂｒｉｓｔｏｌ株、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ株、Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ  Ｈｉｌｌｓ株、Ｈｕｎｔｅｒ株、Ｃａｒｌｏｗ株、ならびにＵＳ９５／９６−ＵＳ株、２００６ａ株、および２００６ｂ株が含まれる。
【００２６】
[047]  本発明の別の実施形態において、ウイルス様粒子は少なくとも１つの複合ポリペプチドからなるものであり、複合ポリペプチドの配列は、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｍｉｎｅｒｖａ、およびＬａｕｒｅｎｓのＶＰ１配列に由来する。別の実施形態において、複合配列は配列番号１である。さらに別の実施形態において、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｍｉｎｅｒｖａ、およびＬａｕｒｅｎｓに基づく複合配列は、配列番号２によって定義されるコンセンサス配列に由来し得る。
【００２７】
[048]  いくつかの実施形態において、コンセンサス配列は、少なくとも２つの異なる遺伝子型または少なくとも２つの異なる遺伝子群のノロウイルス株から決定され得る。本発明の１つの実施形態において、ウイルス様粒子は、複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドからなるものであり、複合アミノ酸配列は、１つの遺伝子群内の少なくとも２つの異なる遺伝子型のノロウイルス株のカプシドタンパク質のコンセンサス配列に由来する。例えば、コンセンサス配列は、遺伝子群ＩＩ、遺伝子型２、および遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルス株のカプシド配列に由来し得る。別の実施形態において、コンセンサス配列は、１つの遺伝子群遺伝子群内の３つ以上の遺伝子型のカプシド配列に由来し得る。
【００２８】
[049]  他の実施形態において、コンセンサス配列は、少なくとも２つの異なる遺伝子群のノロウイルス株から決定され得る。１つのこのような実施形態は、とりわけ、複合アミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＶＬＰであり、前記複合アミノ酸配列は、遺伝子群Ｉ、遺伝子型１、および遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルス株のカプシドタンパク質のコンセンサス配列に由来する。
【００２９】
[050]  本発明はまた、ノロウイルスの２つ以上の循環株から得られるカプシドタンパク質および第２のノロウイルスから得られるカプシドタンパク質のコンセンサス配列に由来する複合ポリペプチドを含むウイルス様粒子（VLP）を提供する。第２のノロウイルスは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスであり得る。第２のノロウイルスから得られるカプシドタンパク質は、ＯＲＦ２によってコードされている主要カプシドタンパク質であるＶＰ１、またはＯＲＦ３によってコードされている少量のカプシドタンパク質であるＶＰ２、またはＶＰ１およびＶＰ２の組合せであり得る。１つの実施形態において、第２のノロウイルスから得られるカプシドタンパク質は、遺伝子群Ｉのノロウイルスから得られるＶＰ１タンパク質である。
【００３０】
[051]  別の実施形態において、本発明は、カリシウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する複合ポリペプチドと、第２の複合アミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含むＶＬＰを提供するものであり、前記第２の複合アミノ酸配列は、第２のカリシウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する。好ましくは、ウイルス様粒子は、第１のカリシウイルスの２つ以上の循環株および第２のカリシウイルスの２つ以上の循環株の抗原特性を有する。
【００３１】
[052]  第２のポリペプチドは、第２のカリシウイルスの前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なる、少なくとも３つの異なる、少なくとも５つの異なる、少なくとも１０個の異なる、少なくとも１５個の異なる、少なくとも２０個の異なる、少なくとも２５個の異なる、少なくとも３０個の異なる、少なくとも３５個の異なる、少なくとも４０個の異なる、少なくとも４５個の異なる、または少なくとも５０個の異なるアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、宿主細胞において発現されるとウイルス様粒子を形成する。別の実施形態において、第２のカリシウイルスはノロウイルスである。別の実施形態において、ノロウイルスは、遺伝子群Ｉのノロウイルスである。遺伝子群Ｉのノロウイルスは、本明細書において開示される遺伝子群Ｉの株のいずれかであり得る。１つの実施形態において、遺伝子群Ｉのノロウイルスは、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス、Ｈｅｓｓｅウイルス、およびＣｈｉｂａウイルスからなる群から選択される。
【００３２】
[053]  本発明はまた、本明細書において定義される複合アミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント、およびそれをコードする核酸またはベクターを包含する。１つの実施形態において、単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントは複合アミノ酸配列を有するものであり、前記複合アミノ酸配列は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来し、ポリペプチドは、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する。別の実施形態において、複合配列は、非エンベロープウイルスの１つまたは複数の循環株のカプシド配列と比較して、少なくとも３つの異なるアミノ酸を含有する。別の実施形態において、複合配列は、非エンベロープウイルスの１つまたは複数の循環株のカプシド配列と比較して、５〜５０個の異なるアミノ酸を含有する。さらに別の実施形態において、コンセンサス配列は配列番号２である。
【００３３】
[054]  複合ポリペプチドは、本明細書において開示されるエンベロープを有さないあらゆるウイルスの２つ以上の循環株に由来する配列を有し得る。１つの実施形態において、非エンベロープウイルスはカリシウイルスである。別の実施形態において、カリシウイルスはノロウイルスまたはサポウイルスである。別の実施形態において、ノロウイルスは、遺伝子群Ｉもしくは遺伝子群ＩＩのノロウイルスまたはその組合せである。さらに別の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００３４】
[055]  １つの実施形態において、本発明は、複合アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供するものであり、前記複合アミノ酸配列は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来し、ポリペプチドは、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する。別の実施形態において、核酸は、配列番号３の配列を有する。別の実施形態において、本発明は、複合ポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、複合ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３５】
[056]  本発明の抗原性分子（例えば、VLP、ポリペプチド、およびそのフラグメント）は、それらが天然に生じる生物からの単離および精製によって調製され得るか、またはそれらは、組換え技術によって調製され得る。所望の粒子形成ポリペプチドについてのコード配列が単離または合成されると、それらは、発現のために、あらゆる適切なベクターまたはレプリコン内にクローニングされ得る。多くのクローニングベクターが当業者に知られており、適切なクローニングベクターの選択は、当業者の技術の範囲内である。次に、ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために用いられる。適切な組換え発現系には、限定はしないが、細菌（例えば、E.coli、Bacillus subtilis、およびStreptococcus）、バキュロウイルス／昆虫、ワクシニア、セムリキ森林熱ウイルス（SFV）、アルファウイルス（シンドビス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）など）、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HEK-293細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎（BHK）細胞、マウス骨髄腫（SB20）細胞、サル腎細胞（COS））、酵母（例えば、S. cerevisiae、S. pombe、Pichia pastori、および他のPichia発現系）、植物、およびアフリカツメガエルの発現系、ならびに当技術分野において知られている他の発現系が含まれる。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞系、細菌、昆虫細胞、および酵母の発現系である。
【００３６】
[057]  前述した抗原のそれぞれ（例えば、VLP、ポリペプチド、またはそのフラグメント）は、好ましくは、十分に純粋な状態で用いられる。選択される発現系および宿主に応じて、ＶＬＰは、粒子形成ポリペプチドが発現しＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖させることによって産生される。適切な増殖条件の選択は、当技術分野の技術の範囲内である。
【００３７】
[058]  好ましくは、ＶＬＰ抗原は、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＴｎｉＰｒｏ、ネッタイシマカ、オートグラファ・カリフォルニカ、カイコガ、キイロショウジョウバエ、ヨトウガ、およびイラクサギンウワバなどの昆虫細胞から調製される。昆虫細胞培養物においてＶＬＰを産生するための手順は、当技術分野において周知である（例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４２，８６５号を参照されたい）。簡潔に述べると、複合カプシド配列を有する組換えバキュロウイルスを、合成ｃＤＮＡから構築する。次に、組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞培養物（例えば、Sf9、High Five、およびTniProの細胞）を感染させ、複合ＶＬＰは、細胞培養物から単離することができる。「複合ＶＬＰ」は、非エンベロープ２つ以上の循環株のカプシドタンパク質に相当するコンセンサス配列に由来する複合アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＶＬＰである。
【００３８】
[059]  ＶＬＰが細胞内で形成されると、次に、細胞を、細胞を溶解させるがＶＬＰはほぼ無傷のまま維持する化学的、物理的、または機械的手段を用いて破壊する。このような方法は当業者に知られており、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990）において記載されている。
【００３９】
[060]  次に、粒子を、例えば、ショ糖勾配、ＰＥＧ−沈殿、ペレット化などの密度勾配遠心分離によるといった、粒子の完全性を保つ方法を用いて（例えば、Kirnbauer et al. J. Virol. （1993）67:6929-6936を参照されたい）、または、例えばイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術を用いて単離する（または十分に精製する）。
【００４０】
[061]  本発明に適用可能な、クローニング、突然変異などの分子生物学的技術を記載している全体的なテキストには、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（Berger）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００（「Sambrook」）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（「Ausubel」）が含まれる。これらのテキストは、突然変異生成と、ベクター、プロモーターの使用と、例えば、カリシウイルスなどの非エンベロープウイルスのカプシドタンパク質のクローニングおよび発現に関連する、多くの他の関連するトピックとを記載している。
【００４１】
[062]  いくつかの実施形態において、本発明の抗原性分子（例えば、VLP、ポリペプチド、およびそのフラグメント）は、複合ポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターを投与することによって、インビボで産生される。適切なベクターには、限定はしないが、水庖性口内炎ウイルス（VSV）ベクター、ウマ脳炎ウイルス（EEV）ベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、ならびにｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬなどの発現プラスミドが含まれる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかとなろう。
【００４２】
[063]  本発明はまた、本明細書において記載されているＶＬＰ、ポリペプチド、または核酸を含むワクチン製剤を包含する。１つの実施形態において、ワクチン製剤は、複合ＶＬＰおよび第２のウイルス様粒子を含み、前記第２のウイルス様粒子は、ノロウイルスから得られるカプシドタンパク質を含む。第２のＶＬＰは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスから得られる天然のカプシドタンパク質を含み得る。第２のＶＬＰは、ＶＰ１および／もしくはＶＰ２タンパク質または特定のＶＰ１もしくはＶＰ２誘導体などの、完全長のノロウイルスカプシドタンパク質を含み得る。あるいは、第２のＶＬＰは、切断されたＶＰ１タンパク質などの、切断されたカプシドタンパク質を含む。切断は、Ｎ末端またはＣ末端の切断であり得る。切断されたカプシドタンパク質は、適切に機能的なカプシドタンパク質誘導体である。機能的なカプシドタンパク質誘導体は、完全長カプシドタンパク質からなるＶＬＰが免疫応答を高めるのと同様に免疫応答を高め得る。ＶＬＰの混合物を含むワクチン製剤は、ＷＯ２００８／０４２７８９において記載されており、これは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。単に例として、ワクチン製剤は、ノロウイルスの遺伝子群Ｉの１つまたは複数の株から得られるＶＬＰと、ノロウイルスの遺伝子群ＩＩの１つまたは複数の株から得られる複合タンパク質を含むＶＬＰとを含有し得る。好ましくは、ノロウイルスＶＬＰの混合物は、Ｎｏｒｗａｌｋおよび遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４のノロウイルスの株からなる。別の実施形態において、ワクチン製剤は、複合ＶＬＰおよびＮｏｒｗａｌｋのＶＬＰを含み、複合ＶＬＰは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらに別の実施形態において、ワクチン製剤は、第１の複合ＶＬＰおよび第２の複合ＶＬＰを含み、前記第１および第２の複合ＶＬＰは、異なるコンセンサス配列に由来する少なくとも１つのポリペプチドを含む。例えば、第１の複合ＶＬＰは、ノロウイルスの遺伝子群Ｉの１つまたは複数の株から得られる複合タンパク質を含み、第２の複合ＶＬＰは、ノロウイルスの遺伝子群ＩＩの１つまたは複数の株から得られる複合タンパク質を含む。１つの実施形態において、第１の複合ＶＬＰは、ノロウイルスの遺伝子群Ｉ、遺伝子型１（GI.1）の１つまたは複数の株から得られる複合タンパク質を含み、第２の複合ＶＬＰは、ノロウイルスの遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４（GII.4）の１つまたは複数の株から得られる複合タンパク質を含む。
【００４３】
[064]  いくつかの実施形態において、ワクチン製剤は、アジュバントをさらに含む。ほとんどのアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは鉱油などの、迅速な異化から抗原を保護するために設計された物質、および百日咳菌または結核菌に由来するタンパク質などの、免疫応答の刺激物質を含有する。適切なアジュバントは、例えば不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバント（Pifco Laboratories, Detroit, Mich.）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩およびカルシウム、鉄、または亜鉛の塩を含む無機塩；アシル化チロシンアシル化糖の不溶性懸濁液；陽イオン的または陰イオン的に誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；ならびにＱｕｉｌ  Ａとして市販されている。
【００４４】
[065]  適切なアジュバントにはまた、限定はしないが、トール様受容体（TLR）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（MPL）、合成脂質Ａ、脂質Ａの模倣体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（MDP）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（LPS）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチドコグリコリド）（PLG）微小粒子、ポロキサマー粒子、微小粒子、リポソーム、水中油型エマルジョン、ＭＦ５９、およびスクアレンが含まれる。いくつかの実施形態において、アジュバントは、細菌由来の外毒素である。他の実施形態において、３ＤＭＰＬまたはＱＳ２１などの、Ｔｈ１型の応答を刺激するアジュバントを用いることができる。特定の実施形態において、アジュバントは、ＭＰＬと水酸化アルミニウムとの組合せである。
【００４５】
[066]  いくつかの実施形態において、アジュバントは、モノホスホリル脂質Ａ（MPL）である。ＭＰＬは、サルモネラから得られる脂質Ａの非毒性誘導体であり、ワクチンアジュバントとして開発されている強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Evans et al.（2003）Expert Rev Vaccines, Vol. 2: 219-229）。臨床前のマウス研究において、鼻腔内ＭＰＬは、分泌応答および全身性の液性応答を増強させることが示されている（Baldridge et al.（2000）Vaccine, Vol. 18: 2416-2425; Yang et al.（2002）Infect Immun., Vol. 70: 3557-3565）。これはまた、１２万人を超える患者の臨床研究において、ワクチンアジュバントとして安全かつ効果的であることが証明されている（Baldrick et al.（2002）Regul Toxicol Pharmacol, Vol. 35: 398-413）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４受容体を介して先天性免疫の誘発を刺激し、したがって、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方、ウイルス、ならびに寄生生物を含む広範な感染性病原体に対する非特異的な免疫応答を引き起こし得る（Persing et al.（2002）Trends Microbiol, Vol. 10: S32-37）。鼻腔内製剤にＭＰＬを含ませると、先天性応答が迅速に誘発され、ウイルスチャレンジからの非特異的な免疫応答が引き起こされ、一方でワクチンの抗原性組成物により生じる特異的応答が増強される。いくつかの実施形態において、ＭＰＬは、１つまたは複数のさらなるアジュバントと組み合わせることができる。例えば、ワクチン製剤の筋肉内投与のための適切なアジュバントを作製するために、ＭＰＬを水酸化アルミニウムと組み合わせることができる。
【００４６】
[067]  他の実施形態において、アジュバントは、スクアレンなどの天然に生じる油である。スクアレンは、植物によって産生されるトリテルペノイドの炭化水素油（Ｃ３０Ｈ５０）であり、多くの食品内に存在する。スクアレンはまた、人間によって豊富に産生され、スクアレンは人間にとって、コレステロールおよびステロイドホルモンの前駆体として働く。スクアレンは肝臓および皮膚において合成され、超低密度リポタンパク質（VLDL）および低密度リポタンパク質（LDL）によって血液内に運ばれ、皮脂分泌腺によって大量に分泌される。
【００４７】
[068]  スクアレンは人体における天然の成分であり、生分解性であるため、ワクチンアジュバントの成分として用いられている。これらのスクアレンアジュバントの１つは、Ｃｈｉｒｏｎによって開発された、水中油型エマルジョンであるＭＦ５９である。ＭＦ５９は、様々な前臨床研究および臨床研究において、多種多様のワクチン抗原に対する免疫応答を顕著に増強させることが示されている。ＭＦ５９は、１９９７年から欧州の様々な国において認可されている、インフルエンザサブユニットワクチンの一部である。２０００万投薬を超えるこのワクチンが投与されており、このワクチンは、優れた安全性プロフィールを有することが示されている。ＭＦ５９アジュバントを有するワクチンの安全性はまた、１〜３日齢の新生児を含む様々な年齢群における、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、尿路疾患性大腸菌などから得られる組換え抗原を用いる様々な治験用臨床研究によっても示されている
【００４８】
[069]  「効果的なアジュバント量」または「効果的な量のアジュバント」という用語は、当業者によって十分に理解されるものであり、投与された抗原に対する免疫応答を刺激し得る１つまたは複数のアジュバントの量、すなわち、鼻の洗浄液におけるＩｇＡレベル、血清のＩｇＧもしくはＩｇＭレベル、またはＢ細胞およびＴ細胞の増殖という観点から測定される、投与された抗原性組成物の免疫応答を増大させる量を含む。免疫グロブリンレベルの適切に効果的な増大には、いずれのアジュバントも有さない同一の抗原性組成物と比較して５％を超える増大、好ましくは２５％を超える増大、特に５０％を超える増大が含まれる。
【００４９】
[070]  本発明の別の実施形態において、ワクチン製剤は送達物質をさらに含むことができ、この送達物質は、送達物質の物理的特性である、宿主のムコ多糖の部分的な脱水の単一のまたは組み合わされた効果による流体粘度の増大に基づいて（ただしそれに制限されるわけではない）、または堆積効果をもたらす、露出部位での送達物質と宿主組織との間のイオン性相互作用を介して、抗原の取込みを増強させるために機能する。あるいは、送達物質は、送達部位での抗原保持時間を増大させ得る（例えば、抗原の排出を遅らせる）。このような送達物質は、生体接着性物質であり得る。いくつかの実施形態において、生体接着性物質は、グリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸コンドロイチン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸）、炭水化物ポリマー（例えば、ペクチン、アルギン酸塩、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、スタキオース、イヌリン、デキストリン、デキストラン）、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖（ムチン、他のムコ多糖、および、アロエ植物から抽出される天然酸性多糖であるＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）を含む）、ポリイオン、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、タンパク質（例えば、レクチン、線毛タンパク質）、ならびにデオキシリボ核酸からなる群から選択される粘膜接着性物質であり得る。１つの実施形態において、ワクチン製剤は、キトサン、キトサン塩、キトサン塩基などの多糖、または天然の多糖（例えばGelSite（登録商標））を含む。
【００５０】
[071]  甲殻類の殻におけるキチンに由来する、正に帯電した線形多糖であるキトサンは、上皮細胞およびそれが覆う筋肉層に対する生体接着性物質である。キトサンと共に抗原を製剤すると、鼻粘膜とのそれらの接触時間が向上し、したがって、堆積効果による取込みが増大する（Illum et al.（2001）Adv Drug Deliv Rev, Vol. 51: 81-96; Illum et al.（2003）J Control Release, Vol. 87: 187-198; Davis et al.（1999）Pharm Sci Technol Today, Vol. 2: 450-456; Bacon et al.（2000）Infect Immun., Vol. 68: 5764-5770; van der Lubben et al.（2001）Adv Drug Deliv Rev, Vol. 52: 139-144; van der Lubben et al.（2001）Eur J Pharm Sci, Vol. 14: 201-207; Lim et al.（2001）AAPS Pharm Sci Tech, Vol. 2: 20）。キトサンは、動物モデルおよびヒトの両方において、インフルエンザ、百日咳、およびジフテリアを含むいくつかのワクチンについて、経鼻送達系として試験されている（Illum et al.（2001）Adv Drug Deliv Rev, Vol. 51: 81-96; Illum et al.（2003）J Control Release, Vol. 87: 187-198; Bacon et al.（2000）Infect Immun., Vol. 68: 5764-5770; Jabbal-Gill et al.（1998）Vaccine, Vol. 16: 2039-2046; Mills et al.（2003）A Infect Immun, Vol. 71: 726-732; McNeela et al.（2004）Vaccine, Vol. 22: 909-914）。これらの検査において、キトサンは、非経口ワクチン接種に等しいレベルまで全身性の免疫応答を増強させることが示された。さらに、顕著な抗原特異的ＩｇＡレベルもまた、粘膜からの分泌物において測定された。したがって、キトサンは、経鼻ワクチンの有効性を大きく増強させ得る。さらに、その物理的特徴のため、キトサンは、粉末として製剤された鼻腔内ワクチンに特に良く適している（van der Lubben et al.（2001）Eur J Pharm Sci, Vol. 14: 201-207; Mikszta et al.（2005）J Infect Dis, Vol. 191: 278-288; Huang et al.（2004）Vaccine, Vol. 23: 794-801）。
【００５１】
[072]  本発明の別の実施形態において、ワクチン製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。あらゆる適切な希釈剤または賦形剤を含む、薬学的に許容可能な担体には、ワクチン製剤を投与された対象に対して有害な免疫応答の生成をそれ自体では誘発しない、あらゆる薬学的作用物質が含まれ、それは不必要な毒性を伴わずに投与され得る。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容可能」という用語は、哺乳動物、より特定すればヒトにおける使用について、連邦政府の管理機関もしくは州政府によって承認されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般的に認識されている薬局方において列挙されていることを意味する。薬学的に許容可能な担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性緩衝液、およびその組合せが含まれる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および他の賦形剤の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Mack Pub. Co. N.J.最新版）において示されている。製剤は、投与様式に適しているべきである。好ましい実施形態において、製剤は、ヒトへの投与に適しており、好ましくは、製剤は、無菌で、非微粒子状および／または非発熱性である。ワクチン製剤はまた、必要であれば、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。
【００５２】
[073]  本発明のいくつかの実施形態において、とりわけ、ワクチン製剤は、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基を含む。キトサンの分子量は、１０ｋＤａ〜８００ｋＤａであり得、好ましくは１００ｋＤａ〜７００ｋＤａであり得、より好ましくは２００ｋＤａ〜６００ｋＤａであり得る。組成物におけるキトサンの濃度は、典型的には最大約８０％（w/w）であり、例えば、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、または８０％である。キトサンは、好ましくは少なくとも７５％脱アセチル化されているものであり、例えば、８０〜９０％、より好ましくは８２〜８８％脱アセチル化されているものであり、特定の例は、８３％、８４％、８５％、８６％、および８７％の脱アセチル化である。
【００５３】
[074]  本発明の組成物は、ワクチンまたは抗原性製剤としての投与のために製剤され得る。本明細書において用いられる場合、「ワクチン」という用語は、上記の本発明のＶＬＰまたは他の抗原を含有する製剤を言い、この製剤は、脊椎動物に投与され得る形態であり、感染を予防および／もしくは改善するため、ならびに／または感染の少なくとも１つの症状を低減させるため、ならびに／またはＶＬＰもしくは抗原の別の投薬の効力を増強させるために免疫を誘発するのに十分な防御性免疫応答を誘発する。本明細書において用いられる場合、「抗原性製剤」または「抗原性組成物」という用語は、脊椎動物、例えば哺乳動物に投与されると免疫応答を誘発する調製物を言う。本明細書において用いられる場合、「免疫応答」という用語は、液性免疫応答および細胞介在性免疫応答の両方を言う。液性免疫応答は、例えば感染物質を中和する、感染物質が細胞に侵入することを遮断する、前記感染物質の複製を遮断する、および／または感染および破壊から宿主細胞を防御する、Ｂリンパ球による抗体の産生の刺激を伴う。細胞介在性免疫応答は、感染を防御もしくは改善するかまたはその少なくとも１つの症状を低減させる、脊椎動物（例えばヒト）によって示される感染物質に対する、Ｔリンパ球および／またはマクロファージなどの他の細胞により介在される免疫応答を言う。特に、「防御性免疫」または「防御性免疫応答」は、感染を防御もしくは改善するかまたはその少なくとも１つの症状を低減させる、脊椎動物（例えばヒト）によって示される感染物質に対する免疫、または感染物質に対する免疫応答を引き起こすことを言う。具体的には、ワクチンの投与から得られる防御性免疫応答の誘発は、胃腸炎の１つもしくは複数の症状の存在の除去もしくは低減、またはこのような症状の期間もしくは重症度の低減により明白である。ノロウイルスにより生じる胃腸炎の臨床的症状には、吐き気、下痢、軟便、嘔吐、発熱、および全身の倦怠感が含まれる。疾患の症状を低減させるかまたは除去する防御性免疫応答は、集団におけるノロウイルスの発生の拡大を低減または停止させることができる。ワクチン調製物は、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（「The subunit and adjuvant approach」（Powell M. F. & Newman M. J.編）（1995）Plenum Press New York）において全体が記載されている。本発明の組成物は、例えば、粘膜経路または非経口経路（例えば、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、真皮下、または経皮）の投与によって対象に投与するために製剤され得る。このような粘膜投与は、限定はしないが、胃腸、鼻腔内、経口、または膣における送達を介したものであり得る。１つの実施形態において、ワクチン製剤は、経鼻スプレー、点鼻薬、または乾燥粉末の形態である。別の実施形態において、ワクチン製剤は、筋肉内投与に適した形態である。
【００５４】
[075]  本発明のワクチン製剤は、液体製剤または乾燥粉末製剤であり得る。組成物が呼吸器（例えば鼻）の粘膜への送達を意図したものである場合、典型的には、組成物は、エアロゾルまたは点鼻薬としての投与のために水性溶液として製剤されるか、あるいは、例えば鼻道内で迅速に堆積するように乾燥粉末として製剤される。点鼻薬として投与するための組成物は、このような組成物内に通常含まれるタイプの１つまたは複数の賦形剤、例えば保存料、粘度調節剤、等張化剤、緩衝剤などを含有し得る。粘度調節剤は、微結晶セルロース、キトサン、デンプン、多糖などであり得る。乾燥粉末として投与するための組成物はまた、このような組成物内に通常含まれる１つまたは複数の賦形剤、例えば粘膜接着性物質、充填剤、ならびに適切な粉末流およびサイズの特徴をもたらすための作用物質を含有し得る。充填剤ならびに粉末流およびサイズのための作用物質には、マンニトール、ショ糖、トレハロースおよびキシリトールが含まれ得る。
【００５５】
[076]  １つの実施形態において、ワクチン製剤は、免疫原としての１つまたは複数の複合ＶＬＰ、ＭＰＬ（登録商標）などのアジュバント、スクアレンもしくはＭＦ５９（登録商標）、粘膜表面への接着を促進するためのキトサンもしくはＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）などのバイオポリマー、ならびにマンニトールおよびショ糖などの充填剤を含有する。
【００５６】
[077]  例えば、ワクチンは、ＧＩＩ．４複合ＶＰＬなどの、本明細書において論じられる１つまたは複数の複合ＶＰＬ、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント、キトサン粘膜接着性物質、ならびに充填剤としての、かつ適切な流れ特徴をもたらすための、マンニトールおよびショ糖を含有する、乾燥粉末１０ｍｇとして製剤され得る。製剤は、キトサン約７．０ｍｇ（２５〜９０％ｗ／ｗの範囲）、マンニトール約１．５ｍｇ（０〜５０％ｗ／ｗの範囲）、ショ糖約１．５ｍｇ（０〜５０％ｗ／ｗの範囲）、ＭＰＬ（登録商標）２５μｇ（０．１〜５％ｗ／ｗの範囲）、および複合ＶＬＰ抗原約１００μｇ（０．０５〜５％ｗ／ｗの範囲）を含み得る。
【００５７】
[078]  複合ＶＬＰ／抗原は、約０．０１％（w/w）〜約８０％（w/w）の濃度で存在し得る。１つの実施形態において、ＶＬＰは、両鼻孔内への投与では、乾燥粉末製剤１０ｍｇ当たり約５μｇ、約１５μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約５００μｇ、および約１ｍｇ（０．０５、０．１５、０．２５、０．５、１．０、２．０、５．０、および１０．０％ｗ／ｗ）の投与量で（鼻孔当たり１０ｍｇ）、または１つの鼻孔内への投与では、乾燥粉末製剤２０ｍｇ当たり約１０μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約４００μｇ、約１ｍｇ、および約２ｍｇ（０．１、０．３、０．５、１．０、２．０、４．０、１０．０、および２０．０％ｗ／ｗ）の投与量で製剤され得る。製剤は、それぞれの投与の間に、１つまたは両方の鼻孔内に投与され得る。免疫応答を向上させるために、初回投与の１〜１２週間後にブースター投与をしてもよい。ワクチンおよび抗原性製剤におけるそれぞれのＶＬＰ／抗原の含有量は、１μｇ〜１００ｍｇの範囲であり得、好ましくは１〜１０００μｇの範囲であり得、より好ましくは５〜５００μｇであり得、最も典型的には１０〜２００μｇの範囲であり得る。それぞれの投薬で投与される全ＶＬＰ／抗原は、約１０μｇ、約３０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、または約１０００μｇのいずれかであり得る。全ワクチン用量を１つの鼻孔内に投与することができるか、または両鼻孔に投与するために半分に分けることができる。乾燥粉末の特徴は、粒子の１０％未満において直径が１０μｍ未満となるようなものである。平均粒子サイズは、直径が１０〜５００μｍにわたる。
【００５８】
[079]  本発明の別の実施形態において、乾燥粉末製剤は、１つまたは複数の用量の製剤を投与するための１つまたは複数のデバイスと組み合わせることができる。このようなデバイスは、使い捨ての経鼻投与デバイスであり得る。別の実施形態において、１つまたは複数の用量は単位用量である。
【００５９】
[080]  いくつかの実施形態において、抗原性製剤およびワクチン製剤は、対象に後続の投与を行うための液体製剤である。鼻腔内投与を意図した液体製剤は、複合ＶＬＰ／抗原（１つまたは複数）、アジュバント、およびキトサンなどの送達物質を含む。非経口（例えば皮下、皮内、または筋肉内（i.m.））投与のための液体製剤は、複合ＶＬＰ／抗原（１つまたは複数）、アジュバント、および緩衝液を含み、送達物質（例えばキトサン）を有さない。
【００６０】
[081]  好ましくは、これまでに記載した抗原性製剤およびワクチン製剤は、凍結乾燥され、それらを使用する直前まで無水状態で保存され、それらを使用する直前の時点で、それらは希釈剤で戻される。あるいは、組成物の異なる成分をキット内で個別に保存することができる（いずれかのまたは全ての成分は凍結乾燥される）。成分は、乾燥製剤では凍結乾燥された形態のまま維持され得るか、または液体製剤では戻され、使用の前に混合されるか、または患者に個別に投与される。乾燥粉末の投与では、ワクチン製剤または抗原性製剤は、鼻腔内送達デバイス内に事前にロードされ、使用するまで保存され得る。好ましくは、このような鼻腔内送達デバイスは、その内容物の安定性を保護し、確保する。
【００６１】
[082]  本発明はまた、本明細書において記載される免疫原性の核酸、ポリペプチド、および／またはＶＬＰの１つまたは複数を含む組成物を包含する。複合ポリペプチドおよびカプシドポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、異なるポリペプチドを、単一の製剤内に共に混合することができる。このような組合せにおいて、免疫原性組成物の抗原は、２つ以上のポリペプチドまたは複数のエピトープポリペプチド内に存在し得る。
【００６２】
[083]  免疫原性組成物は、複合ポリペプチドと、複合ポリペプチドをコードする核酸との混合物を含むこともでき、これは次に、同一のまたは異なる媒体を用いて送達され得る。抗原は、独立して、または例えば予防的（すなわち、感染を予防するため）もしくは治療的（感染を治療するため）免疫原性組成物内に組み合わせて投与され得る。免疫原性組成物は、所望の効果を達成するために、２回以上（例えば、「プライム」投与の後に１回または複数回の「ブースト」を行う）投与することができる。同一の組成物を、１回または複数回のプライム投与工程、および１回または複数回のブースト投与工程において投与することができる。あるいは、異なる組成物をプライム投与およびブースト投与に用いることができる。
【００６３】
[084]  本発明はまた、本明細書において記載されるワクチン製剤のいずれかを投与することを含む、対象におけるウイルス感染に対する防御性免疫を誘発する方法を対象とする。１つの実施形態において、ウイルス感染はノロウイルス感染である。別の実施形態において、ワクチン製剤は、ノロウイルス感染の１つまたは複数の症状からの防御をもたらす。
【００６４】
[085]  本発明はまた、複合ポリペプチドを含むＶＬＰを作製するための方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株から得られるカプシドタンパク質のアミノ酸配列をアラインすること、前記アラインされたアミノ酸配列からコンセンサス配列を決定すること、前記コンセンサス配列に基づいて、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸を含有する複合配列を調製すること、および宿主細胞において前記複合配列を発現させ、それによりウイルス様粒子を産生することを含む。別の実施形態において、複合配列は、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも３つの異なるアミノ酸を含有する。別の実施形態において、複合配列は、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも５つの異なるアミノ酸を含有する。さらに別の実施形態において、複合配列は、前記２つ以上の循環株のカプシド配列のそれぞれと比較して、少なくとも９つの異なるアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態において、コンセンサス配列は、非エンベロープウイルスの２つ以上の循環株から得られるカプシドタンパク質のヌクレオチド配列をアラインすること、および前記コンセンサス配列に基づいて複合ヌクレオチド配列を調製することから決定され得る。本方法において用いるために適切な、非エンベロープウイルスの非限定的な例には、カリシウイルス、ピコルナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスが含まれる。いくつかの実施形態において、非エンベロープウイルスはカリシウイルスである。カリシウイルスは、ノロウイルスまたはサポウイルスであり得る。別の実施形態において、ノロウイルスは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルスである。
【００６５】
[086]  ここで、本発明は、以下の実施例において記載される具体的な実施形態を参照することによって、より詳細に説明される。実施例は、本発明を説明することのみを意図したものであり、いかなる様式でも本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）ノロウイルスＧＩＩ．４のコンセンサス遺伝子の設計
[087]  遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４（ＧＩＩ．４）のノロウイルスの主要カプシドタンパク質（VP1）についてのコンセンサスアミノ酸配列を、２つの近年循環しているＧＩＩ．４株であるＭｉｎｅｒｖａ、ＡＫＡ２００６−ａ、およびＬａｕｒｅｎｓ、ＡＫＡ２００６−ｂと、２００２年に得られたＧＩＩ．４のＨｏｕｓｔｏｎ株との相同性比較によって決定した。３つの異なるノロウイルスＧＩＩ．４単離体のアラインメントを以下に示す。３つのＧＩＩ．４株の相同性比較から決定されたコンセンサス配列（配列番号２）を図１に示す。
【００６７】
[088]  ３株全てが異なる、コンセンサス配列の可変的な位置で、Ｍｉｎｅｒｖａ配列から得られるアミノ酸を選択することによって、複合配列をコンセンサス配列から誘導した。選択されたアミノ酸は、提示された炭水化物結合ドメインに近接しているがそのドメインを含むわけではない抗原性領域内に存在した。複合ＧＩＩ．４配列を、複合ＧＩＩ．４ノロウイルスＶＰ１タンパク質（配列番号１）をコードする合成遺伝子を産生するために用いた。ＧＩＩ．４複合ＶＰ１アミノ酸配列（GII.4Comp）を、配列番号１として、Ｈｏｕｓｔｏｎウイルス、Ｍｉｎｅｒｖａウイルス、およびＬａｕｒｅｎｓウイルスから得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４、５、および６）と共に、以下のアラインメントにおいて示す。ＧＩＩ．４複合ＶＰ１をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を図２に示す。
【化１】
0005852883.tif 000002
【化２】
0005852883.tif 000003
【００６８】
（実施例２）複合ＶＬＰの精製
[089]  実施例１において記載されるカプシドドメインについてのノロウイルスＧＩＩ．４複合配列の合成遺伝子構築物を、組換えバキュロウイルス内にクローニングした。昆虫細胞の感染は、大量のＶＬＰ産生を示した。複合ＶＬＰ  ＶＰ１遺伝子についてのＰ２ｐＦａｓｔＢａｃ組換えバキュロウイルスストックのアリコート４０ｍＬをショ糖勾配で処理し、複合ＶＬＰの発現および組み立てを検証した。調整済媒質をまず３０％ショ糖のクッション上に層状にし、次に、１４０Ｋ×ｇで遠心分離してＶＬＰをペレット化した。ペレットを再懸濁させ、ショ糖勾配上に層状にし、次に１４０Ｋ×ｇで遠心分離した。遠心分離の後に、勾配内に可視的な白い層が観察された。勾配から得られる画分５００μＬを回収し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーゲルによって分析した（図３）。複合ＶＬＰについての約５６ｋＤａの予想されるバンドパターンが、ショ糖勾配画分内で観察された。
【００６９】
[090]  流速０．５ｍＬ／分の、Ｔｒｉs２０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７のランニング緩衝液を有する高圧液体クロマトグラフィー系を用いて、複合発現細胞培養上清のアリコート５０μＬをＳｕｐｅｒｏｓｅ−６サイズ排除カラムにロードした。無傷ＶＬＰのピークが、２８０ｎｍおよび２２０ｎｍで、約１５．３分で観察され、このことは、複合ＶＬＰの完全性を裏付けるものである（図４）。
【００７０】
[091]  複合ＶＬＰをまた、カラムクロマトグラフィーを用いて、調整済媒質から精製した。調整済媒質を、陽イオン交換クロマトグラフィーによって処理した。陽イオン交換溶出画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によってさらに精製した。ＨＩＣ溶出画分を濃縮し、接線流濾過によって緩衝液交換を行った。最終生成物を滅菌濾過し、４℃で保存した。精製複合ＶＬＰ５００ｎｇ（CM3ロット）を、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図５）。
【００７１】
[092]  流速１．０ｍＬ／分の、Ｔｒｉs２０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７のランニング緩衝液を有する高圧液体クロマトグラフィー系を用いて、精製ＣＭ３複合ＶＬＰのアリコート５０μＬをＳｕｐｅｒｏｓｅ−６サイズ排除カラムにロードした。無傷ＶＬＰのピークが、２８０ｎｍで、約７．５分で観察され、このことは、複合ＶＬＰの完全性を裏付けるものである（図６）。
【００７２】
（実施例３）複合物の免疫原性
[093]  およそ８〜１０週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇで始まり０．１９μｇまで２倍ずつ低下する低下濃度の複合ＶＬＰ（CVLP）を用いて、腹腔内で免疫した。ＣＶＬＰは、実施例１において記載される配列番号１の配列を有するポリペプチドを含有するものであった。ＰＢＳのみで免疫した動物の群を陰性対照として含めた。血清試料を回収し、ＣＶＬＰ特異的ＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによって分析した（図７）。この実験から得られる結果は、用量曲線の線形範囲がおよそ６μｇ〜０．２μｇであることを示す。６．２５μｇを超える用量のＣＶＬＰは、用量依存的な様式においては免疫応答を増強させないと考えられる。ＥＣ５０値（５０％の応答をもたらす効果的用量として定義される）は、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA）を用いて、およそ１．０μｇ／ｍＬであると計算された。
【００７３】
（実施例４）複合ＶＬＰの多重抗原結果
[094]  メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）を、様々な用量の、ＮｏｒｗａｌｋＶＬＰのみ（NVLP）、複合ＶＬＰ（CVLP）のみ、または組み合わせたもののいずれかを用いて、腹腔内で免疫した。ＰＢＳのみで免疫した動物の群を陰性対照として含めた。血清試料を回収し、抗原特異的ＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによって分析した（図８および図９）。結果は、ＣＶＬＰおよびＮＶＬＰの組合せでの免疫が免疫応答を増強させ、その結果、低用量の抗原で高いＩｇＧレベルが達成されることを示す。例えば、ＮＶＬＰおよびＣＶＬＰのそれぞれ１μｇでの免疫は、いずれかのＶＬＰのみを投与した場合よりも強固な免疫応答を引き起こす。ＣＶＬＰで免疫した動物から得られる抗体は、ＮＶＬＰと交差反応をせず、逆もまた同様であった（データは示さない）。
【００７４】
（実施例５）複合ＶＬＰは交差反応性抗体を引き起こす
[095]  およそ１０〜１２週齢のメスのＣ５７／ＢＬ６マウスを、それぞれ３０μｇのＨｏｕｓｔｏｎ  ＶＬＰまたは複合ＶＬＰと、アジュバントとしてのＭＰＬ（２０μｇ）とを製剤したものを用いて、腹腔内で免疫した。複合ＶＬＰは、実施例１において記載される配列番号１の配列を有するポリペプチドを含有するものであった。免疫の後２１日目にマウスを採血し、血清を抗原特異的ＥＬＩＳＡにおいてアッセイし、複合ＶＬＰ、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＶＬＰ、Ｌａｕｒｅｎｓ  ＶＬＰ、およびＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰについて抗体力価を決定した。データを図１０に示す。複合ＶＬＰでの免疫は、より多くの血清型にわたる、より広い応答を誘発し、これは、Ｌａｕｒｅｎｓ株に対する優れた応答を有する一方でＨｏｕｓｔｏｎ株に対する応答を維持することにより証明される。Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＶＬＰでの免疫もまた、複合ＶＬＰおよびＬａｕｒｅｎｓ  ＶＬＰに対する交差反応性抗体を誘発するが、応答の程度は、複合ＶＬＰで免疫した場合に観察されるものほどには優れていなかった。ＧＩ．１ノロウイルスであるＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰに対する検出可能な応答はなかった。
【００７５】
（実施例６）ウサギにおける二価ワクチンの効力
[096]  実施例２において記載されるノロウイルスＧＩＩ．４複合ＶＬＰ（CVLP）およびＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP、GI.1）を含む二価ノロウイルスワクチンの効力を評価するために研究を行った。０日目および２１日目に、ウサギを、この二価ワクチンを用いて筋肉内で免疫した。ＶＬＰの用量は、それぞれのタイプのＶＬＰ２０μｇ〜０．００２μｇの範囲であり、それぞれのワクチン製剤はＭＰＬ２５μｇおよびＡｌＯＨ２５０μｇを含有するものであった。２８日目に血清をそれぞれのウサギから回収し、ＶＬＰ特異的ＩｇＧを評価した。７５日目に脾臓および腸間膜リンパ節を回収し、抗原特異的細胞性免疫の存在について評価した。
【００７６】
[097]  血清ＩｇＧ力価を、捕捉物としてのＮＶＬＰまたはＣＶＬＰのいずれかで被覆したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡによって測定した。力価は希釈の逆数として表す（図１１）。抗原特異的Ｔ細胞の応答性を、ＮＶＬＰまたはＣＶＬＰのいずれか５μｇを用いた５日間のインビトロでの刺激後のトリチウム化チミジンの取込みによって評価した（図１２）。記憶Ｂ細胞を、ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＰＯＴによって評価し、結果は細胞１００万個当たりの抗体分泌細胞として表す（図１３）。
【００７７】
[098]  この研究の結果は、アジュバントＭＰＬおよびＡｌＯＨと製剤されたＩＭ二価ノロウイルスワクチンが、高いＶＬＰ特異的ＩｇＧ応答、ＮＶＬＰおよびＣＶＬＰの両方での刺激に応答し得る応答性Ｔ細胞および記憶Ｂ細胞を引き起こすことを示す。
【００７８】
（実施例７）ウサギにおける高用量二価ワクチンの接種
[099]  この実施例は、二価ワクチンにおける高用量の複合ＶＬＰおよびＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰが何らかの有害事象をもたらすかどうかを決定するために設計された実験を概説するものである。０日目、１４日目、および２１日目に、ウサギを、二価ワクチン（実施例６を参照されたい）を用いて筋肉内で免疫した。ＶＬＰの用量は、それぞれのＶＬＰ（Norwalkおよび複合）１５０μｇ〜５μｇの範囲であり、それぞれの製剤はＭＰＬ５０μｇおよびＡｌＯＨ５００μｇを含有するものであった。免疫したウサギの全身の健康状態、被毛の状態、および注入部位を、最初の７２時間にわたり１２時間ごとにモニタリングし、その後は毎日モニタリングした。２１日目および３５日目に血清をそれぞれのウサギから回収し、Ｎｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）特異的な（図１４）、および複合ＶＬＰ（CVLP）特異的な（図１５）ＩｇＧおよびＩｇＡを評価した。３５日目に脾臓も採取し、抗原特異的細胞性免疫の存在について評価した（図１６）。
【００７９】
[0100]  血清ＩｇＧ力価を、捕捉物としてのＮＶＬＰまたはＣＶＬＰのいずれかで被覆したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡによって測定した。力価は希釈の逆数として表す。抗原特異的Ｔ細胞の応答性を、示された抗原（例えば、複合VLP、GII.4（2002）VLP、GII.4（2006 VLP、およびNorwalk VLP）を用いた５日間のインビトロでの刺激後のトリチウム化チミジンの取込みによって評価した。
【００８０】
[0101]  この研究から得られる結果は、ノロウイルス二価ワクチンが試験用量で安全であることを示し、これは、全てのウサギが研究期間を通して健康であると考えられること、および注入部位の反応が観察されなかったことから証明される。ワクチン接種したウサギから測定された免疫応答は、二価ノロウイルスワクチンがＶＬＰ特異的抗体およびＶＬＰ応答性Ｔ細胞の両方を引き起こすために効果的であることを裏付けるものである。
【００８１】
（実施例８）ノロウイルスワクチンの効力についてのマウス効能アッセイ
[0102]  この実施例は、二価ノロウイルスワクチンの効能を評価するためのマウス効能アッセイの開発を概説するものである。０日目および７日目に、マウスを、０．００２μｇ〜３０μｇにわたる等濃度のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ（NVLP）および複合ＶＬＰ（CVLP）を用いて腹腔内で免疫した。１４日目に血清をそれぞれのマウスから回収し、ＶＬＰ特異的ＩｇＧを評価した（図１７）。抗体の中和活性もまた、Ｏ型プラスのヒト赤血球を用いて、血球凝集阻害アッセイ（HAI）によって測定した（図１８）。ＧＩＩ．４遺伝子型は赤血球を凝集させないため、Ｎｏｒｗａｌｋ特異的ＨＡＩの力価のみが評価され得た。
【００８２】
[0103]  血清ＩｇＧ力価を、捕捉物としてのＮＶＬＰまたはＣＶＬＰのいずれかで被覆したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡによって測定した。力価は希釈の逆数として表す。ＨＡＩ力価を、標準的な血球凝集アッセイを用いることによって測定した。
【００８３】
[0104]  この研究から得られる結果は、二価ノロウイルスワクチンでのワクチン接種が、ヒト赤血球の凝集を阻害し得るような強力なおよび機能的なＩｇＧ力価を引き起こすことを示す。これらの結果は、ワクチン接種に応じて引き起こされる抗体が、感染の間の実際のウイルスの中和をもたらし得る機能性を有することを示すため、特に重要なものである。
【００８４】
（実施例９）ノロウイルス二価ワクチンのキトサン製剤
[0105]  二価ノロウイルスＶＬＰワクチンを用いて、このワクチン製剤におけるキトサンの役割を評価するために、ウサギにおいて研究を行った。製剤は、等量のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＰ１  ＶＬＰおよび複合ＧＩＩ．４  ＶＬＰを含有するものであった（実施例２を参照されたい）。０日目および２１日目に、ウサギを、乾燥粉末製剤を用いて鼻腔内で免疫した。ＶＬＰの用量は、それぞれのタイプのＶＬＰ１５０μｇ〜５μｇの範囲であり、それぞれの製剤はＭＰＬ５０μｇを含有するものであった。キトサン濃度は、免疫原性におけるその役割を決定するために、それぞれの用量範囲で異なるものであった（７ｍｇ、０．７ｍｇ、および０ｍｇ）。血清をそれぞれのウサギから回収し、ＶＬＰ特異的ＩｇＧを評価した（図１９）。
【００８５】
[0106]  血清ＩｇＧ力価を、捕捉物としてのＶＬＰで被覆したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡによって測定した。独占的な社内のウサギ抗ＶＬＰ血清の連続希釈物を用いて、標準曲線を作成した。力価は、抗ＶＬＰ／ｍＬの単位で表す（１単位は１μｇにほぼ等しい）。
【００８６】
[0107]  これらの実験から得られる結果は、最大の免疫原性を達成するためには最高用量（７ｍｇ）のキトサンが必要であることを示す。５０μｇの用量についてのＩｇＧデータを図１９に示し、結果はＵ／ｍｌとして表す。ＩｇＡ抗体の応答を以下の表１に示す。
【００８７】
【表１】
0005852883.tif 000004
【００８８】
（実施例１０）ノロウイルスＧＩＩコンセンサス遺伝子の設計
[0108]  本発明の方法はまた、異なるＧＩＩ遺伝子型、すなわちＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３から得られるノロウイルスＧＩＩ単離体の間でカプシドコンセンサス配列を得るために用いられ得る。３つの異なるノロウイルスＧＩＩ単離体から得られるＶＰ１配列から、以下のアラインメントを得た。３つのＧＩＩ株の相同性比較から決定されたコンセンサス配列（配列番号７）を図２０に示す。
【００８９】
[0109]  ２つ以上の株が異なる、コンセンサス配列の可変的な位置について、複数の株のうちの１つの株の配列からアミノ酸を選択することによって、複合配列をコンセンサス配列から誘導する。好ましくは、アミノ酸を選択する元となる配列は、近年循環している株であるか、または、より一般に疾患に関連しているか、もしくは評価される株の間でより一般に生じる株である。この実施例において、複合ＶＰ１  ＧＩＩ配列を得るために、３株全てが異なる、コンセンサス配列の可変的な位置で、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎの配列からアミノ酸を選択した。複合ＧＩＩ配列は、ＧＩＩノロウイルス単離体の間での交差免疫の誘発のために、複合ＧＩＩ  ＶＰ１タンパク質をコードする合成遺伝子を産生するために用いられる。
【００９０】
[0110]  複合ＧＩＩ  ＶＰ１アミノ酸配列（複合）を、配列番号１１として、ＧＩＩ．１ウイルス（受託番号：ＡＡＬ１３００１）、ＧＩＩ．２  Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス（受託番号：ＡＡＢ６１６８５）、およびＧＩＩ．３ウイルス（受託番号：ＡＡＬ１２９９８）（それぞれ配列番号８、９、および１０）から得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と共に、以下のアラインメントにおいて示す。
【化３】
0005852883.tif 000005
【化４】
0005852883.tif 000006
【００９１】
（実施例１１）ノロウイルスＧＩコンセンサス遺伝子の設計
[0111]  本発明の方法はまた、ノロウイルスＧＩ単離体の間でカプシドコンセンサス配列を得るために用いられ得る。３つの異なるノロウイルスＧ１単離体から得られるＶＰ１配列から、以下のアラインメントを得た。３つのＧＩ株の相同性比較から決定されたコンセンサスＧ１配列（配列番号１２）を図２１に示す。
【００９２】
[0112]  ２つ以上の株が異なる、コンセンサス配列の可変的な位置について、複数の株のうちの１つの株の配列からアミノ酸を選択することによって、複合配列をコンセンサス配列から誘導する。好ましくは、アミノ酸を選択する元となる配列は、近年循環している株であるか、または、より一般に疾患に関連しているか、もしくは評価される株の間でより一般に生じる株である。この実施例において、複合ＶＰ１  ＧＩ配列を得るために、３株全てが異なる、コンセンサス配列の可変的な位置で、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎの配列からアミノ酸を選択した。複合ＧＩ配列は、ＧＩノロウイルス単離体の間での交差免疫の誘発のために、複合ＧＩ  ＶＰ１タンパク質をコードする合成遺伝子を産生するために用いられる。
【００９３】
[0113]  複合ＧＩ  ＶＰ１アミノ酸配列（複合）を、配列番号１６として、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（受託番号：Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス（受託番号：Ｑ０４５４２）、およびＣｈｉｂａウイルス（受託番号：ＢＡＢ１８２６７）（それぞれ配列番号１３、１４、および１５）から得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と共に、以下のアラインメントにおいて示す。
【化５】
0005852883.tif 000007
【００９４】
（実施例１２）Ｌ１についてのヒトパピローマウイルスコンセンサス遺伝子の設計
[0114]  本発明の方法はまた、他の非エンベロープウイルスの間でコンセンサス配列を得るために用いられ得る。ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、およびＨＰＶ−１８という３つのヒトパピローマウイルス（HPV）から、以下のアラインメントを得た。３つのＨＰＶ株の相同性比較から決定されたコンセンサスＬ１カプシドタンパク質配列（配列番号１７）を図２２に示す。
【００９５】
[0115]  ２つ以上の株が異なる、コンセンサス配列の可変的な位置について、複数の株のうちの１つの株の配列からアミノ酸を選択することによって、複合配列をコンセンサス配列から誘導する。好ましくは、アミノ酸を選択する元となる配列は、近年循環している株であるか、または、より一般に疾患に関連しているか、もしくは評価される株の間でより一般に生じる株である。この実施例において、複合Ｌ１  ＨＰＶ配列を得るために、３株全てが異なる、コンセンサス配列の可変的な位置で、ＨＰＶ−１８の配列からアミノ酸を選択した。複合ＨＰＶ配列は、様々なＨＰＶ株の間での交差免疫の誘発のために、複合Ｌ１ポリペプチドをコードする合成遺伝子を産生するために用いられる。
【００９６】
[0116]  複合ＨＰＶ  Ｌ１アミノ酸配列（複合）を、配列番号２１として、ＨＰＶ−１１ウイルス、ＨＰＶ−１６ウイルス、およびＨＰＶ−１８ウイルス（それぞれ配列番号１８、１９、および２０）から得られるＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と共に、以下のアラインメントにおいて示す。
【化６】
0005852883.tif 000008
【化７】
0005852883.tif 000009
【００９７】
（実施例１３）ヒトにおける複合ＶＬＰワクチン製剤の用量増加の安全性の研究
[0117]  ノロウイルスワクチンの安全性および免疫原性の、二重盲検の、制御された、用量増加第Ｉ相研究を行う。ワクチンは、鼻腔内投与のために設計された乾燥粉末マトリクス内の複合ノロウイルス様粒子（VLP）からなる。複合ＶＬＰは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する。被ワクチン接種者には、１型Ｈ抗原分泌者である健康な成人のボランティアが含まれる。１型Ｈ抗原分泌者の登録についての根拠は、１型Ｈ抗原分泌者がノロウイルス感染に感染しやすい一方で、非分泌者は耐性があることである。対照として、それぞれの投与量レベルの２人のさらなるボランティアに、マトリクスのみを与える。乾燥粉末マトリクスはＭＰＬ（登録商標）アジュバント２５μｇ、キトサン７ｍｇ、マンニトール１．５ｍｇ、およびショ糖１．５ｍｇを含む。ボランティアは０日目および２１日目に投薬され、それぞれの投薬の後に、症状について７日間日記を書き続けることが求められる。血清学のために血液を、また粘膜抗体の評価のために抗体分泌細胞（ASC）、便試料、および唾液試料を回収する。
【００９８】
[0118]  ワクチンの成分を表２に列挙する。ワクチンは、鼻腔内送達デバイス内にパッケージする。複合ＶＬＰワクチンの単回投与を、単回投薬Ｂｅｓｐａｋ（Milton Keynes, UK）ＵｎｉＤｏｓｅ  ＤＰ乾燥粉末鼻腔内送達デバイス内にパッケージする。それぞれのデバイスは乾燥粉末ワクチン製剤１０ｍｇを送達する。ワクチンのそれぞれの投薬は、１つがそれぞれの鼻孔内にある２つの送達デバイスから構成される。全ワクチン用量は、乾燥粉末２０ｍｇである。アジュバント／賦形剤の製剤は、複合ＶＬＰ抗原が製剤内に含まれていないことを除いて、複合ＶＬＰワクチンと同一である。アジュバント／賦形剤の製剤（乾燥粉末マトリクスとも呼ばれる）を表３にまとめる。
【００９９】
【表２】
0005852883.tif 000010
【０１００】
【表３】
0005852883.tif 000011
【０１０１】
[0119]  具体的には、ワクチンの用量増加は以下のように行った。良好な健康状態についての適切なスクリーニングの後、３人のボランティアからなる群を、鼻腔内経路によって複合ＶＬＰワクチン５μｇに乾燥粉末マトリクスを加えたもの（ｎ＝２）または乾燥粉末マトリクスのみ（ｎ＝１）のいずれかを与えるようにランダム化する。これらの３人のボランティアを２１日間にわたり安全性について追跡し、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（ISM）がそれらの安全性データを再検討する。ＩＳＭの認定の後、２１日目に、これらの個体にワクチンまたはマトリクスの第２投薬を行い、４人のさらなるボランティアを、鼻腔内経路によってＶＬＰタンパク質５μｇに乾燥粉末マトリクスを加えたもの（ｎ＝３）またはマトリクスのみ（ｎ＝１）のいずれかを与えるためにランダム化する。ＩＳＭがこの第２の群から得られる安全性データを再検討し、ＩＳＭの認定の後、初回投薬の２１日後に第２の鼻腔内投薬を行う。ボランティアは、それぞれの投薬の後に、症状について７日間日記を書き続ける。次に高い用量までの増加が許容可能であるとＩＳＭが決定した後、７人のボランティアからなる別の群を、０日目および２１日目に鼻腔内経路によってＶＬＰタンパク質１５μｇを含有する複合ＶＬＰワクチン（ｎ＝５）または乾燥粉末マトリクスのみ（ｎ＝２）のいずれかを与えるためにランダム化する。同様に、７日間の症状の日記が記録され、ＩＳＭにより再検討され、その後、２１日目に第２の投薬が行われる。最後に、最初の２回の投与量コホートから得られる安全性データの再検討の後、ＩＳＭは用量増加が許容可能であるかどうかを決定し、７人のボランティアからなる最終群を、０日目および２１日目に鼻腔内経路によってＶＬＰタンパク質５０μｇを含有する複合ＶＬＰワクチン（ｎ＝５）または乾燥粉末マトリクスのみ（ｎ＝２）のいずれかを与えるためにランダム化する。同様に、ＩＳＭが７日間の症状の日記および他の安全性データを再検討し、その後、２１日目に第２の投薬が行われる。
【０１０２】
[0120]  ボランティアは、複合ＶＬＰワクチンまたは乾燥粉末マトリクスのみを与えられた後に、７日間にわたり、症状（鼻分泌物、鼻の痛み／不快、鼻詰まり、鼻水、鼻のかゆみ、鼻血、頭痛などの局所的症状、ならびに毎日の口腔体温、筋肉痛、吐き気、嘔吐、腹部けいれん、下痢、および食欲不振などの全身症状を含む）について毎日日記を書き続ける。それぞれの追跡訪問（７±１日目、２１±２日目、２８±２日目、５６±２日目、および１８０±１４日目）で暫定的な病歴を得、ボランティアは、暫定的な病気、薬剤、および医師の訪問について質問される。ボランティアは、追跡訪問の際には問われない事象を含む全ての重大なまたは重症な有害事象を報告するように求められる。ボランティアは、７日目および２８日目（それぞれの免疫の７日後）にＣＢＣおよび血清クレアチニン、グルコース、ＡＳＴ、ならびにＡＬＴを評価され、異常である場合、試験が正常となるかまたは安定するまで、異常についての実験的試験が続いて行われる。
【０１０３】
[0121]  免疫の前、ならびに７±１日目、２１±２日目、２８±２日目、５６±２日目、および１８０±１４日目に、血液を回収して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって複合ＶＬＰワクチンに対する血清抗体を測定する。それぞれの用量のワクチンまたは乾燥粉末マトリクスのみを投与する前、および投与した後７日目に、末梢血リンパ球を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって抗体分泌細胞を検出する。ワクチン接種の前、ならびにワクチン接種後２１±２日目、５６±２日目、および１８０±１４日目に、全血を得て、複合ＶＬＰ抗原に応じたサイトカインの産生およびリンパ球増殖を含む、細胞介在性免疫のさらなる研究のために、細胞を分離し、凍結する。免疫の前、ならびに７±１日目、２１±２日目、２８±２日目、５６±２日目、および１８０±１４日目に、抗複合ＶＬＰ  ｓＩｇＡのスクリーニングのために全便試料を回収する。免疫の前、ならびに７±１日目、２１±２日目、２８±２日目、５６±２日目に、市販のデバイス（Salivette, Sarstedt, Newton, NC）を用いて唾液を回収し、５６日目に粘膜抗体について陽性であれば、１８０±１４日目の試料を回収し、抗複合ＶＬＰ  ｓＩｇＡについてスクリーニングする。最後に、０日目、２１日目、５６日目、および１８０日目に、最高用量の複合ＶＬＰ（５０μｇ、上記の第３のコホート）を与えたボランティアから得られる血液を、記憶Ｂ細胞についてスクリーニングする。
【０１０４】
[0122]  以下の方法を用いて、免疫された個体または乾燥粉末マトリクスのみを与えられた個体から回収される血液、便、および唾液の試料を分析する。
【０１０５】
Ａ．ＥＬＩＳＡによる血清抗体の測定
[0123]  コード化された標本をスクリーニングするための標的抗原として精製組換え複合ＶＬＰを用いて、ＥＬＩＳＡによって複合ＶＬＰに対する抗体を測定するために、ワクチン接種の前およびワクチン接種後の複数の時点で、血液２０ｍＬを回収する。簡潔に述べると、ｐＨ９．６の被覆用炭酸塩緩衝液における複合ＶＬＰを用いて、マイクロタイタープレートを被覆する。被覆されたプレートを洗浄し、ブロックし、試験血清の２倍連続希釈物と共にインキュベートし、その後、洗浄し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡに特異的な酵素結合二次抗体試薬と共にインキュベートする。適切な基質溶液を添加し、発色させ、プレートを読み取り、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの終点力価を、それぞれの抗体クラスについて、参照標準曲線と比較して決定する。正の応答は、ワクチン接種後に力価が４倍上昇することとして定義される。
【０１０６】
Ｂ．抗体分泌細胞アッセイ
[0124]  複合ＶＬＰに対する抗体を分泌する細胞を検出するためのＡＳＣアッセイのために、末梢血単核球（PMBC）を、ヘパリン化した血液３０ｍＬから回収する。これらのアッセイを、複合ＶＬＰワクチンまたは乾燥粉末マトリクスのみを投与した後０日目、７±１日目、２１±２日目、および２８±２日目に行う。正の応答は、ＰＢＭＣ１０６個当たりのワクチン接種後のＡＳＣ数が、全ての対象および少なくとも８個のＡＳＣスポットについてのワクチン接種前の数の平均（log尺度）よりも少なくとも３標準偏差（SD）大きいこととして定義され、これは、類似のアッセイにおいて決定される、媒質で刺激した陰性対照ウェル（２スポット）の平均＋３ＳＤに対応する。
【０１０７】
Ｃ．複合ＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞の測定
[0125]  ワクチン接種後０日目、２１日目、５６日目、および１８０目に、ヘパリン化した血液をコホート３から回収して（０日目および２１日目は３０ｍＬ、５６日目および１８０日目は５０ｍＬ）、インビトロでの抗原刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて記憶Ｂ細胞を測定する。類似のアッセイが、ウサギにおいてＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ製剤によって引き起こされる記憶Ｂ細胞の頻度を測定するために、成功裏に使用された（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０４２７８９を参照されたい）。末梢血単核球（５×１０６個細胞／ｍＬ、２４ウェルプレートにおいて１ｍＬ／ウェル）を４日間にわたり複合ＶＬＰ抗原（２〜１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、抗原特異的記憶Ｂ細胞のクローン性増殖および抗体分泌細胞への分化を可能にする。対照には、抗原の不存在下で同一の条件下でインキュベートされた細胞および／または関連しない抗原と共にインキュベートされた細胞が含まれる。刺激の後、細胞を洗浄し、計数し、複合ＶＬＰで被覆されたＥＬＩＳｐｏｔプレートに移す。全Ｉｇ分泌Ｂリンパ球当たりのＶＬＰ特異的記憶Ｂ細胞の頻度を決定するために、増殖したＢ細胞をまた、抗ヒトＩｇＧ抗体および抗ヒトＩｇＡ抗体で被覆されたウェルに添加する。結合した抗体を、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＡで明らかにし、その後、Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅ基質によって明らかにする。ＩｇＡおよびＩｇＧのサブクラス（IgA1、IgA2、およびIgG1-4）への結合をまた、特徴的なエフェクターメカニズムおよび免疫プライミングの位置に関連し得る抗原特異的サブクラス応答を決定するために用いることができる。スポットはＥＬＩＳｐｏｔリーダーを用いて計数する。それぞれのボランティアについての増殖した細胞集団をフローサイトメトリーによって調べ、それらの記憶Ｂ細胞の表現型、すなわちＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＩｇＧ＋、ＩｇＭ＋、ＣＤ３８＋、ＩｇＤ−を確認する。
【０１０８】
Ｄ．細胞性免疫応答
[0126]  ヘパリン化した血液（コホート１および２では５０ｍＬ、コホート３では２５ｍＬ）を、コード化された標本として回収し、今後行い得る複合ＶＬＰ抗原に対する細胞介在性免疫（CMI）応答の評価のために、ＰＢＭＣを単離し、液体窒素内で凍結保存する。行われ得るアッセイは、複合ＶＬＰ抗原に対するＰＢＭＣ増殖性およびサイトカイン応答を含み、確立された技術に従ってインターフェロン（IFN）−γおよびインターロイキン（IL）−４のレベルを測定することによって決定され得る。
【０１０９】
Ｅ．抗複合ＶＬＰ  ｓＩｇＡのための便および唾液の回収
[0127]  抗複合ＶＬＰ  ＩｇＡを便試料および唾液試料において測定する。唾液標本をプロテアーゼ阻害剤（すなわち、AEBSF、ロイペプチン、ベスタチン、およびアプロチニン）（Sigma, St. Louis, MO）で処理し、−７０℃で保存し、これまでに記載されているアッセイ（Mills et al.（2003）Infect. Immun. 71: 726-732）の変型を用いてアッセイする。ワクチン接種後の複数の日に便を回収し、分析するまで標本を−７０℃で保存する。標本を解凍し、プロテアーゼ阻害剤緩衝液を添加して１０％ｗ／ｖ便懸濁液を調製する。以下に記載するように、便浮遊物を、ＥＬＩＳＡによって、複合ＶＬＰ特異的粘膜ＩｇＡについてアッセイする。
【０１１０】
[0128]  ワクチン接種前およびワクチン接種後の複数の時点で、全唾液およそ２〜３ｍＬを回収する。唾液は市販のデバイス（Salivette, Sarstedt, Newton, NC）によって回収し、ここで、Ｓａｌｉｖｅｔｔｅスワブは噛まれるか、または唾液で飽和するまで３０〜４５秒間にわたり舌の下に置かれる。唾液は遠心分離によってスワブから回収される。
【０１１１】
Ｆ．便および唾液における抗複合ＶＬＰの測定
[0129]  抗ヒトＩｇＡ抗体試薬または標的複合ＶＬＰ抗原被覆のいずれかで被覆されたプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施し、それぞれの標本について、全ＩｇＡを決定し、かつ特異的抗ＶＬＰ  ＩｇＡ応答を滴定する。全ＩｇＡまたは特異的ＩｇＡを、上述のように、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＡで明らかにする。内部全ＩｇＡの標準曲線が、ＩｇＡ含有量の定量に含まれる。応答は、特異的抗体が４倍上昇することとして定義される。
【０１１２】
（実施例１４）ヒトにおける２つの投与量の鼻腔内複合ＶＬＰワクチンの安全性および免疫原性の研究
[0130]  健康な成人におけるランダム化された二重盲検の研究を行い、２つの投与量レベルの複合ノロウイルス様粒子（VLP）ワクチンの安全性および免疫原性を、アジュバント／賦形剤およびプラセボ対照（空のデバイス）と比較する。ワクチンは、実施例１３において記載される、鼻腔内投与のために設計された、乾燥粉末マトリクス内の複合ノロウイルス様粒子（VLP）からなる。被ワクチン接種者には、１型Ｈ抗原分泌者である健康な成人のボランティアが含まれる。ヒトボランティアを４つの群の１つにランダムに振り分け、それぞれの群に、複合ＶＬＰワクチン５０μｇ用量、複合ＶＬＰワクチン１００μｇ用量、アジュバント／賦形剤、またはプラセボという処理の１つを行う。ボランティアは０日目および２１日目に投薬され、それぞれの投薬の後に、症状について７日間日記を書き続けることが求められる。血清学のために血液を、また粘膜抗体の評価のために抗体分泌細胞（ASC）、便試料、および唾液試料を回収する。
【０１１３】
[0131]  ワクチンの成分を実施例１３の表２に列挙する。ワクチンは、鼻腔内送達デバイス内にパッケージする。複合ＶＬＰワクチンの単回投与を、単回投薬Ｂｅｓｐａｋ（Milton Keynes, UK）ＵｎｉＤｏｓｅ  ＤＰ乾燥粉末鼻腔内送達デバイス内にパッケージする。それぞれのデバイスは乾燥粉末ワクチン製剤１０ｍｇを送達する。ワクチンのそれぞれの投薬は、１つがそれぞれの鼻孔内にある２つの送達デバイスからなる。全ワクチン用量は、乾燥粉末２０ｍｇである。したがって、ワクチン用量５０μｇは、それぞれが乾燥粉末製剤１０ｍｇを送達する２つのデバイスからなり、それぞれの乾燥粉末製剤１０ｍｇは、複合ＶＬＰ２５μｇ、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント２５μｇ、キトサン７ｍｇ、マンニトール１．５ｍｇ、およびショ糖１．５ｍｇからなる。同様に、ワクチン用量１００μｇは、それぞれが乾燥粉末製剤１０ｍｇを送達する２つのデバイスからなり、それぞれの乾燥粉末製剤１０ｍｇは、複合ＶＬＰ５０μｇ、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント２５μｇ、キトサン７ｍｇ、マンニトール１．５ｍｇ、およびショ糖１．５ｍｇからなる。アジュバント／賦形剤の製剤は、複合ＶＬＰ抗原が製剤内に含まれていないことを除いて、複合ＶＬＰワクチンと同一である。アジュバント／賦形剤の製剤（乾燥粉末マトリクスとも呼ばれる）を実施例１３の表３にまとめる。プラセボ群には２つの空のデバイスを与える。
【０１１４】
[0132]  ボランティアは、複合ＶＬＰワクチンの２つの用量のいずれか、乾燥粉末マトリクスのみ、またはプラセボを与えられた後に、７日間にわたり、症状（鼻分泌物、鼻の痛み／不快、鼻詰まり、鼻水、鼻のかゆみ、鼻血、頭痛などの局所的症状、ならびに毎日の口腔体温、筋肉痛、吐き気、嘔吐、腹部けいれん、下痢、および食欲不振などの全身症状を含む）について毎日日記を書き続ける。それぞれの追跡訪問（７＋１日目、２１＋２日目、２８＋２日目、５６＋２日目、および１８０＋１４日目）で暫定的な病歴を得、ボランティアは、暫定的な病気、薬剤、および医師の訪問について質問される。ボランティアは、追跡訪問の際には問われない事象を含む全ての重大なまたは重症な有害事象を報告するように求められる。ボランティアは、７日目および２８日目（それぞれの免疫の７日後）にＣＢＣおよび血清クレアチニン、グルコース、ＡＳＴ、ならびにＡＬＴを評価され、異常である場合、試験が正常となるかまたは安定するまで、異常についての実験的試験が続いて行われる。
【０１１５】
[0133]  免疫の前、ならびに７＋１日目、２１＋２日目、２８＋２日目、５６＋２日目、および１８０＋１４日目に、血液を回収して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって複合ＶＬＰワクチンに対する血清抗体を測定する。それぞれの用量のワクチン、乾燥粉末マトリクスのみ、またはプラセボを投与する前、および投与した後７日目に、末梢血リンパ球を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって抗体分泌細胞を検出する。ワクチン接種の前、ならびにワクチン接種後２１＋２日目、５６＋２日目、および１８０＋１４日目に、全血を得て、複合ＶＬＰ抗原に応じたサイトカインの産生およびリンパ球増殖を含む、細胞介在性免疫のさらなる研究のために、細胞を分離し、凍結する。免疫の前、ならびに７＋１日目、２１＋２日目、２８＋２日目、５６＋２日目、および１８０＋１４日目に、抗複合ＶＬＰ  ｓＩｇＡのスクリーニングのために全便試料を回収する。免疫の前、ならびに７＋１日目、２１＋２日目、２８＋２日目、５６＋２日目に、市販のデバイス（Salivette, Sarstedt, Newton, NC）を用いて唾液を回収し、５６日目に粘膜抗体について陽性であれば、１８０±４日目の試料を回収し、抗複合ＶＬＰ  ｓＩｇＡについてスクリーニングする。血液はまた、０日目、２１日目、５６日目、および１８０日目に、記憶Ｂ細胞についてスクリーニングする。
【０１１６】
[0134]  免疫された個体または乾燥粉末マトリクスのみもしくはプラセボを与えられた個体から回収される血液、便、および唾液の試料を分析するために用いられる方法は、実施例１３において詳細に記載される。
【０１１７】
（実施例１５）複合ノロウイルスＶＬＰワクチンでのワクチン接種の後の感染性ノロウイルスでの実験的ヒトチャレンジ研究
[0135]  複合ノロウイルスＶＬＰワクチンで免疫された８０人のヒトボランティアにおいて、多部位の、ランダム化された、二重盲検の、プラセボ制御された、第１〜２相のチャレンジ研究を行う。適格対象には、１８〜５０歳の、健康な、１型Ｈオリゴ糖を発現し（正の唾液分泌状態によって測定される）、かつ血液型がＢ型でもＡＢ型でもない対象が含まれる。１型Ｈ分泌者ではないかまたはＢ型もしくはＡＢ型の血液を有する対象は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルスでの感染に対してより耐性があることが報告されており、研究から排除される。少なくとも８０％のボランティアが、これらの２つの基準に基づいて適格であると予想される。
【０１１８】
[0136]  スクリーニングの後、全ての許容可能な基準を満たす適格なボランティアを、それぞれがおよそ４０人のボランティアを有する、２つの等しいサイズのコホートの１つにランダム化する（１：１）。コホート１は複合ＶＬＰで免疫し、コホート２にはプラセボを与える。ボランティアは、それぞれの鼻孔において複合ＶＬＰワクチン１０ｍｇ（全乾燥粉末２０ｍｇ）で免疫するか、またはプラセボを与える。複合ＶＬＰワクチン１０ｍｇのそれぞれは、複合ＶＬＰ５０μｇ、キトサン７ｍｇ、ＭＰＬ（登録商標）２５μｇ、ショ糖１．５ｍｇ、およびマンニトールおよそ１．５ｍｇを含有する。したがって、コホート１におけるそれぞれのボランティアには、それぞれの免疫で、複合ＶＬＰ抗原１００μｇの全用量を与える。ボランティアには、研究０日目および２１日目に、ワクチンまたはプラセボを与える。
【０１１９】
[0137]  プラセボと比較した、複合ウイルスＶＬＰワクチンの安全性を評価する。ボランティアは、ワクチンまたはプラセボでのそれぞれの免疫の後に、７日間にわたり日記を書き続け、有害事象の重症度および期間を文書記録する。重症な有害事象（SAE）およびあらゆる顕著な新たな病状の発生を、ワクチンまたはプラセボの最後の投薬後６ヶ月にわたり、および感染性ウイルスでのチャレンジ後４ヶ月にわたり追跡する。
【０１２０】
[0138]  全てのボランティアを、ワクチンまたはプラセボの第２投薬の後２１〜４２日後（研究４２日目〜５６日目）に感染性ノロウイルスでチャレンジする。それぞれのボランティアには、５０％ヒト感染用量（HID50）以上を、すなわちプラセボ群において少なくとも５０％のボランティアに疾患を生じさせると予想される感染性ウイルスの量を与える。ＨＩＤ５０は、チャレンジウイルス株約４８〜約４８０ウイルス当量である。チャレンジノロウイルスは、滅菌水と混合し、経口的に投与する。胃酸およびペプシンによるウイルスの分解を防ぐために、水中の重炭酸ナトリウム５００ｍｇを摂取してから接種を行う。重炭酸ナトリウム溶液（水中の重炭酸ナトリウム５００ｍｇ）の第２の摂取を、感染性ウイルスの経口接種の５分後に行う。ボランティアは、急性胃腸炎の症状／兆候（嘔吐、下痢、軟便、腹痛、吐き気、および発熱）が消えた後、少なくとも４日間および少なくとも１８時間にわたり、チャレンジ施設内に残る。
【０１２１】
[0139]  ウイルスチャレンジによって誘発される急性胃腸炎の症状／兆候の予防または低減における複合ＶＬＰワクチンの効力を決定するために、いくつかの判断基準をモニタリングする。全てのボランティアは急性胃腸炎の自らの臨床症状を記録し、これらの症状は、研究所においてリサーチスタッフによって文書記録される。ワクチンを与えたコホート１から得られる疾患の症状／兆候を、コホート２のプラセボレシピエントと比較する。
【０１２２】
[0140]  ワクチンまたはプラセボでの免疫の前、およびチャレンジ後に、血清および便の試料を全てのボランティアから通常通りに回収する。血清試料を、チャレンジＶＬＰに対するＩｇＡおよびＩｇＧの力価について、ＥＬＩＳＡによって分析する。便試料において、チャレンジウイルス抗原およびチャレンジウイルスＲＮＡを、それぞれＥＬＩＳＡおよびＰＣＲによって試験し、これは、ウイルスの存在、腸から排泄されたウイルスの量、およびウイルス排泄の期間を示すものである。チャレンジ後に病気になる対象は、症状／兆候がなくなるまで、血清化学、ＢＵＮ、クレアチニン、および肝機能の試験を含むさらなる実験的研究に供される。
【０１２３】
[0141]  ワクチン群（コホート１）およびプラセボ群（コホート２）から得られる結果を比較して、ノロウイルス疾患の全体に対するワクチンの防御的効力（最初の終点）、かつ／あるいは、症状／兆候（重症度および病気の日数）の改善ならびに／またはウイルス排泄の存在、量、および／もしくは期間の低減におけるその効力（第２の終点）を評価する。
【０１２４】
[0142]  本発明は、記載される具体的な実施形態によってその範囲を限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の個別の態様を単に説明するものとして意図されており、機能的に等しい方法および構成要素が本発明の範囲内である。実際、本明細書において示され記載されるものに加え、本発明の様々な変型が、通常の実験以上のものを用いることなく、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなろう。このような変型および同等物は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【０１２５】
[0143]  この明細書において述べる全ての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書において、参照することにより明細書内に組み込まれ、その組込みは、それぞれの個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照することにより本明細書に組み込まれることが具体的にかつ個別に指示される場合と同程度のものである。
【０１２６】
[0144]  本明細書における参考文献の引用または議論は、これらの参考文献が本発明の先行技術であることを認めることであると解釈されるべきではない。
【図１】
0005852883.tif 000012
【図２】
0005852883.tif 000013
【図３】
0005852883.tif 000014
【図４】
0005852883.tif 000015
【図５】
0005852883.tif 000016
【図６】
0005852883.tif 000017
【図７】
0005852883.tif 000018
【図８】
0005852883.tif 000019
【図９】
0005852883.tif 000020
【図１０】
0005852883.tif 000021
【図１１】
0005852883.tif 000022
【図１２】
0005852883.tif 000023
【図１３】
0005852883.tif 000024
【図１４】
0005852883.tif 000025
【図１５】
0005852883.tif 000026
【図１６】
0005852883.tif 000027
【図１７】
0005852883.tif 000028
【図１８】
0005852883.tif 000029
【図１９】
0005852883.tif 000030
【図２０】
0005852883.tif 000031
【図２１】
0005852883.tif 000032
【図２２】
0005852883.tif 000033
【配列表】
0005852883000001.app