(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物を、前老化ケラチン生成細胞の試料と接触させるステップと、
ｂ．前記前老化ケラチン生成細胞における、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置された前老化ケラチン生成細胞において、前記マイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％の阻害、または前記マイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％の阻害が、処置されていない前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｂ．をステップａ．の前および後に実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
ａ’．前老化ケラチン生成細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップと、
ａ．試料のうちの１つを、少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次いで、
ｂ．前記試料における、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置された前老化ケラチン生成細胞において、前記マイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％の阻害、または前記マイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％の阻害が、処置されていない前老化ケラチン生成細胞の試料と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マイクロＲＮＡが、ｐ６３  ｍＲＮＡまたはＴＰ６３遺伝子を標的とすることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前老化ケラチン生成細胞が、古典的な培養条件下における３７回の集団倍加の後に得られることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
古典的な培養条件が、ＨＫＧＳ増殖補充物を添加された１５４培地中で、常にサブコンフルエント状態に保持されるケラチン生成細胞の培養を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験化合物が、植物性抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｃ．において測定される前記マイクロＲＮＡの発現または活性の阻害が、少なくとも３０％の阻害であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ．において測定される前記マイクロＲＮＡの発現または活性の阻害が、少なくとも４０％の阻害であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ．において測定される前記マイクロＲＮＡの発現または活性の阻害が、少なくとも５０％の阻害であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ．において測定される前記マイクロＲＮＡの発現または活性の阻害が、少なくとも６０％の阻害であることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法に従って得ることが可能な、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの抗ｍｉＲの美容的使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための、マイクロＲＮＡの発現または活性を阻害する化合物の同定および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の老化とは、元来、培養における終末期の増殖細胞について記載される、増殖の不可逆的な停止の形態であるが、ＤＮＡの損傷、酸化ストレス、化学療法、および発癌性活性化などの有糸分裂性刺激の過剰など、複数の刺激により誘導されることが知られている（Serranoら、1997; Campisi、2001; Schmittら、2002）。細胞は、不可逆的な停止期に入ると、ベータ−ガラクトシダーゼ活性の増強、ならびにｐ５３、前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、およびｐ１９Ａｒｆを含めた重要なメディエーターの発現の増大を含め、異なる特徴を示す（Serranoら、1997; Naritaら、2003; Sharplessら、2004）。大半はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて研究されているが、細胞の老化は、全動物レベルにおける加齢過程と相関しており、したがって、老化を制御する多くの因子を、生物の加齢に寄与するものとして関与させている（SharplessおよびDePinho、2004; Campisi、2005）。
【０００３】
近年の知見は、ｐ５３の関連タンパク質であるｐ６３を、老化および加齢を連関させる重要な分子として同定している（Keyersら、2005; Sommerら、2006）。実際、ｐ６３のヘテロ接合マウスは、寿命が短く、加齢が加速される特徴を示す。ｐ６３を欠損させた生殖系列細胞および体細胞のいずれもが、ベータ−ガラクトシダーゼ活性、ＰＭＬ、およびｐ１６ＩＮＫ４ａの発現の増強を示すことから、ｐ６３の欠損が、加齢の表現型を加速したことが裏付けられる（Keyersら、2005）。加齢への関与のほか、転写因子ｐ６３は、上皮の増殖、分化、および細胞運命を制御するその能力のために、発生においても重要な役割を果たす。ｐ６３ノックアウトマウスは、皮膚、体毛、および外胚葉誘導体の欠如を含めた、複数の上皮欠損を示す（Yangら、1999; Millsら、1999）。一部の報告は、ｐ６３が、上皮の幹細胞プールを維持するのに不可欠であることを示す（Seenoら、2007）。近年、ｐ６３はまた、マイクロＲＮＡによっても制御されることが報告されている。特に、ｍｉＲ−２０３は、ｐ６３を標的とすることにより、基底層のケラチン生成細胞の増殖可能性を制御し（Lenaら、2008; Yiら、2008）、これにより、基底層と棘層との間の重要な移行が制御されることが示されている。
【０００４】
ＳｉｒＴ−１（またはＳｉｒｔ−１）もまた、老化および加齢を連関させる重要な分子である。ＳｉｒＴ−１は、ヒストン、転写因子、および共因子におけるリシン残基を脱アセチル化することにより、遺伝子の発現を制御する、ＮＡＤ＋依存性の脱アセチル化酵素である。ＳｉｒＴ−１機能が亢進した細胞は、代謝効率を改善させ、寿命および疾患に対する抵抗性を増進させる（Haigis MC、Guarente LP、Mammalian sirtuins-emerging roles in physiology, aging, and calorie restriction、Genes Dev、2006、1、20(21):2913〜21）。加えて、ＳｉｒＴ−１は、ストレス誘導性老化を防止することにより、内皮機能不全に対する防御効果を及ぼすことも知られている（Potente M、Ghaeni L、Baldessari D、Mostoslavsky R、Rossig L、Dequiedt F、Haendeler J、Mione M、Dejana E、Alt FW、Zeiher AM、Dimmeler S、SIRT1 controls endothelial angiogenic functions during vascular growth、Genes Dev、2007、21(20):2644〜58）。近年、ＳｉｒＴ−１は、内皮細胞の老化系において、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２１７により制御されることが示されている（Menghini R、Casagrande V、Cardellini M、Martelli E、Terrinoni A、Amati F、Vasa-Nicotera M、Ippoliti A、Novelli G、Melino G、Lauro R、Federici M、MicroRNA 217 modulates endothelial cell senescence via silent information regulator、1、Circulation、2009、120(15):1524〜32）。
【０００５】
ＣＤＫ６は、脊椎動物のｃｄｃ−２関連キナーゼファミリーにおける新たなメンバーとして同定された。この新規のキナーゼは、Ｄ型サイクリンとパートナーを形成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではｐＲｂキナーゼ活性を保有することが判明した。以来、細胞周期のＧ（１）期の制御において、もっぱらｐＲｂ（網膜芽腫）キナーゼとして機能することが理解されている。過去２年間において、複数の細胞型における複数の独立の研究が、分化におけるｃｄｋ６の新規の役割を示している。分化におけるｃｄｋ６機能の機構は理解されていないが、ｐＲｂキナーゼとしてのｃｄｋ６について確立された役割を超えて広がっている可能性がある。この経緯から明らかとなるとおり、ｐＲｂは、分化における細胞周期の退出を開始させ、維持することにおいて重要な因子として長く確立されているので、分化におけるｃｄｋ６の機能がｐＲｂ依存性であるのか、ｐＲｂ非依存性であるのかを解明することが重要となろう（Kohrt DMら、Cycle、2009、1、8(17):2837〜43; Grossel MJら、J Cell Biochem、2006、97(3):485〜93）。いまだかつて、ｃｄｋ−６が老化に関与していると説明されたことはない。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、メッセンジャーｍＲＮＡの発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲは、プレ−マイクロＲＮＡ転写物として生成し、細胞質内に移入され、そこで、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒにより切断される。哺乳動物におけるＤｉｃｅｒは、細胞の分化および組織の形態発生において重要な役割を果たしており、マウスにおいてＤｉｃｅｒを消失させると、発生期のＥ６〜Ｅ７において胚の致死性が誘導される（Bernsteinら、2003）。胚性線維芽細胞においてＤｉｃｅｒを消失させると、発生時の四肢および成体の皮膚においてＤｉｃｅｒを消失させた後のｉｎ  ｖｉｖｏにおいても観察された、早発性の老化表現型が誘導される（Mudhasaniら、2008）。成熟ｍｉＲは、切断または翻訳の抑制に特異的なメッセンジャーｍＲＮＡを標的とすることにより、遺伝子発現を負に制御する。増大する証拠は、ｍｉＲが、細胞の老化を含めた、広範囲にわたる生理学的経路の制御に関与していることを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、細胞の老化、特に、ケラチン生成細胞の老化を防止するか、低減するか、なおまたは阻害する生成物または活性作用剤（active agent）を提供することが望ましく、かつ、重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、このような有用な作用剤を同定する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
したがって、本発明は、皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与える（hydrating）ための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ（インビトロ）の方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物を、ケラチン生成細胞（keratinocyte）の試料と接触させるステップと、
ｂ．前記ケラチン生成細胞における少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置されたケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含む方法に関する。
【００１０】
ケラチン生成細胞は、前老化（pre-senescent）ケラチン生成細胞であることが好ましい。したがって、本発明は、皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物を、前老化ケラチン生成細胞の試料と接触させるステップと、
ｂ．前記前老化ケラチン生成細胞における少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置された前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、処置されていない前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含む方法に関する。
【００１１】
「前老化ケラチン生成細胞」とは、検出可能なレベル（このレベルは、ウェスタンブロットにより決定することができる）でｐ１６を発現するが、ベータ−ガラクトシダーゼは発現しない細胞を意味し、これらは、ベータ−ｇａｌ陰性である。これらの細胞は、若齢の（young）ケラチン生成細胞より増殖が緩慢である。
【００１２】
第１の実施形態によれば、ステップｂ．をステップａ．の前および後に実施する。この場合、ステップａ．の前に、ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において測定されるマイクロＲＮＡの発現または活性は、対照値（すなわち、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは処置されていない前老化ケラチン生成細胞）に対応する。したがって、ステップｃ．は、ａ．で処置されたケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、ステップａ．の前の同じケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物の選択を含む。
【００１３】
別の実施形態によれば、本方法が、ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料を調製する第１のステップａ’．を含む。したがって、本発明は、皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、以下のステップ：
ａ’．ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップと、
ａ．試料のうちの１つを、少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次いで、
ｂ．前記試料における少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置されたケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含む方法に関することが好ましい。
【００１４】
この第２の実施形態では、ステップａ．にかけられていないケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料において測定されるマイクロＲＮＡの発現または活性が、対照値（すなわち、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは処置されていない前老化ケラチン生成細胞）に対応する。
【００１５】
「皮膚の加齢」という表現は、これが、例えば、皺および小皺、皮膚の干からび、皮膚のたるみ、皮膚の薄層化、ならびに弾力性および／または張りを失った皮膚など、時間生物学的なものであれ、かつ／または光誘導性のものであれ、加齢による皮膚の外見における任意の変化を意図し、また、例えば、紫外線放射に曝露された後における皮膚、特に、コラーゲンの任意の内的分解など、外見の変化により組織的に反映されるわけではない、皮膚における任意の内的変化も意図する。
【００１６】
「皮膚に潤いを与えること」とは、皮膚の天然湿潤性（natural humidity）を維持し、その乾燥を防止することを意味する。
【００１７】
ステップｂ．における対象のｍｉＲは、ｐ６３タンパク質および／もしくはｐ６３  ｍＲＮＡならびに／または対応する遺伝子（すなわち、ヒトにおけるＴＰ６３）を標的とすることが好ましい。したがって、ステップｂ．における対象のｍｉＲは、ＴＰ６３遺伝子またはｐ６３  ｍＲＮＡを標的とすることが好ましい。
【００１８】
ｍｉＲは、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａ、およびｍｉＲ−１９１からなる群から選択されることが好ましい。
ｍｉＲ−１３０ａとは、配列番号１である。配列番号１は、配列ＨＧＮＣ：３１５１４である。
ｍｉＲ−１３８とは、配列番号２である。配列番号２は、配列ＨＧＮＣ：３１５２４である。
ｍｉＲ−１８１ａとは、配列番号３である。配列番号３は、配列ＨＧＮＣ：３１５９０である。
ｍｉＲ−１９１とは、配列番号４である。配列番号４は、配列ＨＧＮＣ：３１５６１である。
これらの配列は、ＨＧＮＣデータベースに由来する。
【００１９】
調べる被験化合物は、任意の種類でありうる。被験化合物は、天然由来の場合もあり、または化学合成により生成させた場合もある。これは、構造的に明確な化合物、特徴づけされていない化合物もしくは物質、または化合物の混合物のライブラリーを含みうる。
【００２０】
天然の化合物には、植物および動物など、動物由来または植物由来の化合物が含まれる。被験化合物は、植物性であることが好ましく、植物性抽出物から選択されることが好ましい。
【００２１】
上記のステップａ’．およびステップａ．において用いられる前老化ケラチン生成細胞は、複製老化の細胞モデルである。これらの前老化ケラチン生成細胞は、古典的な培養条件（classical culture conditions）下における３７回の集団倍加（population doublings）の後に得られる。古典的な培養条件は、ＨＫＧＳ増殖補充物を添加したＥｐｉｌｉｆｅ培地中で、常に（constantly）サブコンフルエント（subconfluent）状態に保持されるケラチン生成細胞の培養（culture）を含む。
【００２２】
好ましくは、前老化ケラチン生成細胞は、以下の工程の結果得られる：
ヒト新生児初代上皮ケラチン生成細胞を、適切な培地中で培養する。このような培地は、ＨＫＧＳ増殖補充物を添加したＥｐｉＬｉｆｅ培地でありうる。細胞は、常にサブコンフルエント状態に保持する。細胞は、適切な時点、通常は毎週１回継代する。
【００２３】
各継代では、細胞の一部を回収および分析して、集団倍加、集団倍加時間、老化についての生化学的マーカー、および細胞周期を測定する。
【００２４】
ヒト初代ケラチン生成細胞の集団倍加は、４０日間にわたる培養期間において測定する。３７回の集団倍加の後、増殖曲線はプラトー状態となり、細胞が分裂を停止し、老化状態に達することが示される。増殖マーカー（ｐ６３）、分化マーカー（Ｋ１０）、および老化マーカー（ｐ１６／ＩＮＫ）の解析から、増殖マーカーが減少する間に細胞が分化していないことが示唆される。４代目の継代後、３７回の集団倍加で、細胞は、複製老化を起こす。加えて、老化中に、増殖細胞の百分率が低下する。
【００２５】
ステップａ．によれば、被験化合物を、ケラチン生成細胞の試料、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料と接触させる。
【００２６】
ステップｂ．によれば、前記ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現および／または活性を測定する。
【００２７】
「マイクロＲＮＡの発現」という用語は、生成するマイクロＲＮＡの量を意味することを意図する。
【００２８】
「マイクロＲＮＡの活性」という用語は、前記マイクロＲＮＡが、それがハイブリダイズするｍＲＮＡのレベルを阻害する能力を意味することを意図する。
【００２９】
当業者は、前記マイクロＲＮＡがハイブリダイズするｍＲＮＡを定量的または半定量的に検出し、したがって、前記マイクロＲＮＡの活性を決定する技法に精通している。ｍＲＮＡが特定のヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることに基づく技法は、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など、最も一般的な技法である。
【００３０】
当業者はまた、マイクロＲＮＡ、または前記マイクロＲＮＡがハイブリダイズするｍＲＮＡを定量的または半定量的に検出する技法にも精通している。特に、マイクロＲＮＡの発現は、リアルタイムＰＣＲにより測定することができる。マイクロＲＮＡの活性は、ｍＲＮＡ標的についてのリアルタイムＰＣＲにより測定することもでき、またはウェスタンブロットによって標的のタンパク質レベルを評価することにより測定することもできる。代替的に、標的が未知の場合は、ベータ−ｇａｌ染色または増殖に対する効果など、マイクロＲＮＡ自体の生物学的効果を評価することにより、マイクロＲＮＡの活性を調べることもできる。
【００３１】
マイクロＲＮＡの発現は、リアルタイムＰＣＲにより測定することが好ましい。
【００３２】
次いで、被験化合物による処置後におけるマイクロＲＮＡの発現または活性を、対照値と比較する、すなわち、処置前における同じケラチン生成細胞（好ましくは前老化ケラチン生成細胞）において得られた値、または処置されていないケラチン生成細胞（好ましくは前老化ケラチン生成細胞）の別の試料において得られた値と比較する。
【００３３】
ステップｃ．によれば、有用な化合物は、処置されたケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物である。前記マイクロＲＮＡの発現または活性の阻害は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％であることが好ましい。
【００３４】
本明細書で規定されるスクリーニング法により選択された化合物は、その後、皮膚の加齢および／または皮膚への水分補給（skin hydration）に対するそれらの効果について、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏモデル（動物またはヒトによるモデル）において調べることができる。本発明に従う有用な化合物は、標的とするマイクロＲＮＡの阻害剤である。
【００３５】
本発明の対象はまた、皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための、上記で説明した方法に従って同定される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ阻害剤の美容的使用（cosmetic use）でもある。
【００３６】
別の態様によれば、本発明の目的は、皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための治療組成物を作製するための、上記で説明した方法に従って同定される、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの阻害剤の使用である。したがって、本発明はまた、皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための、上記で説明した方法に従って同定される、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの阻害剤の使用にも関する。
【００３７】
阻害剤とは、マイクロＲＮＡの発現または活性を消失させるかまたは実質的に低減する化合物を指す。「実質的に」という用語は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％の低減を意味する。
【００３８】
マイクロＲＮＡ阻害剤は、組成物の０．００１〜１０重量％の比率で、好ましくは、組成物の０．０１〜５重量％の比率で用いることができる。
【００３９】
阻害剤は、アンチセンスＤＮＡポリヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドの場合もあり、またはｓｉＲＮＡの場合もある。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の阻害剤は、抗ｍｉＲであることが好ましい。
【００４０】
抗ｍｉＲとは、内因性ｍｉＲを特異的に阻害するｍｉＲ阻害剤である。抗ｍｉＲとは、内因性マイクロＲＮＡ分子に特異的に結合し、これを阻害するようにデザインされた一本鎖核酸である。抗ｍｉＲは、標的ｍｉＲの配列に相補的な核配列を有する。これらのすぐに使用できる阻害剤は、ｓｉＲＮＡに用いられるトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータと同様のトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータを用いて細胞内に導入することができ、ｍｉＲの生物学的効果についての詳細な研究を可能とする。抗ｍｉＲの使用は、ｍｉＲ活性の下方制御を介するｍｉＲについての機能的解析を可能とする。
【００４１】
抗ｍｉＲは市販されており、例えば、ＡｍｂｉｏｎまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを介して得ることができる。
【００４２】
文献に基づくと、ｍｉＲの発現を７０％阻害すると、ヒト正常細胞における老化の誘導／阻害に影響が及ぶ可能性がある（Menghini R、Casagrande V、Cardellini M、Martelli E、Terrinoni A、Amati F、Vasa-Nicotera M、Ippoliti A、Novelli G、Melino G、Lauro R、Federici M、MicroRNA 217 modulates endothelial cell senescence via silent information regulator、1、Circulation、2009、120(15):1524〜32）。
【００４３】
上記で説明したスクリーニング法により同定されるｍｉＲ阻害剤は、生理学的に許容される担体、好ましくは、美容的に許容される媒体、すなわち、毒性、非適合性、不安定性、またはアレルギー反応の危険性なしにヒトの皮膚と接触させて用いるのに適し、とりわけ、使用者に許容されない不快感（発赤、突っ張り、刺痛など）を引き起こすことのない媒体と組み合わせて、組成物中に調合することができる。これらの組成物は、例えば、経口投与することもでき、または局所投与することもできる。組成物は、局所適用することが好ましい。経口投与を介する場合、組成物は、錠剤、ゲル状カプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、制御放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態でありうる。局所投与を介する場合、組成物は、より具体的に、皮膚および粘膜の治療における使用のためであり、軟膏（salve）、クリーム、ミルク、軟膏（ointment）、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション、または懸濁液の形態でありうる。組成物はまた、制御放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質小胞もしくはポリマー小胞、またはポリマーパッチ、またはハイドロゲルの形態でもありうる。この局所適用のための組成物は、無水物形態の場合もあり、水性形態の場合もあり、またはエマルジョン形態の場合もある。局所適用のための組成物は、場合によってマイクロエマルジョンの場合もありナノエマルジョンの場合もある水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、または多重エマルジョン（Ｗ／Ｏ／ＷまたはＯ／Ｗ／Ｏ）の形態の場合もあり、または水性分散液、溶液、水性ゲル、または粉末の形態の場合もある。好ましい変化形では、組成物が、ゲル、クリーム、またはローションの形態である。
【００４４】
組成物の生理学的に許容される担体は一般に、水、および、場合によって、エタノールなど、他の溶媒を含む。
【００４５】
本組成物は、顔面および／または身体の皮膚のためのケア製品および／またはクレンジング製品として用いることが好ましく、とりわけ、例えば、ポンプ式のディスペンサーボトル、エアゾールまたはチューブ内でコンディショニングされた流体、ゲルまたはムースの形態の場合もあり、または例えば、ジャー内でコンディショニングされたクリームの形態の場合もある。変化形として、組成物は、メーキャップ製品の形態の場合もあり、特に、ファウンデーションまたはルースパウダーもしくはコンパクトパウダーの形態の場合もある。
【００４６】
組成物は、
・とりわけ、ポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）、およびポリアルキルフェニルシロキサン（フェニルジメチコン）など、直鎖状または環状の、揮発性または非揮発性のシリコーン油；フルオロ油、アルキル安息香酸、および、ポリイソブチレンなどの分枝状炭化水素など、合成油；植物油、および、とりわけ、ダイズ油またはホホバ油；ならびに液体石油ゼリーなどの鉱油から選択されうる油；
・オゾケライト、ポリエチレン蝋、蜜蝋、またはカルナウバ蝋などの蝋；
・とりわけ、触媒の存在下における、少なくとも１つの反応基（とりわけ、水素またはビニル）を含有し、末端位および／または側鎖位において、少なくとも１つのアルキル基（とりわけ、メチル）またはフェニルを保有するポリシロキサンの、有機水素ポリシロキサン（organohydrogenopolysiloxane）などの有機シリコーンとの反応により得られるシリコーンエラストマー；
・界面活性剤、好ましくは、非イオン性であれ、アニオン性であれ、カチオン性であれ、または両親媒性であれ、乳化性の界面活性剤であり、特に、グリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、およびスクロースの脂肪酸エステルなど、ポリオールの脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールの脂肪族アルキルエーテル；アルキルポリグルコシド；ポリシロキサン修飾されたポリエーテル；ベタインおよびその誘導体；ポリクォタニウム；エトキシル化された脂肪族アルキル硫酸塩；スルホサクシネート（sulfosuccinate）；サルコシネート（sarcosinate）；アルキルホスフェートおよびジアルキルホスフェートならびにこれらの塩；ならびに脂肪酸による石鹸；
・直鎖状脂肪族アルコール、ならびに、特に、セチルアルコールおよびステアリルアルコールなどの共界面活性剤；
・増粘剤（thickener）および／またはゲル化剤、および、特に、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および／またはアクリルアミドおよび／またはアクリル酸および／またはアクリル酸塩もしくはアクリル酸エステルの、架橋形成されるかまたは架橋形成されない、親水性または両親媒性のホモポリマーおよびコポリマー；キサンタンガムまたはグアルガム；セルロースの誘導体；ならびにシリコーンガム（ジメチコノール）；
・ジベンゾイルメタン誘導体（ブチルメトキシジベンゾイルメタンを含む）、ケイ皮酸誘導体（エチルヘキシルメトキシケイ皮酸を含む）、サリチル酸、パラアミノ安息香酸、β，β’−ジフェニルアクリル酸、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファー誘導体、フェニルベンズイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾール、およびアントラニル誘導体などの有機スクリーニング剤；
・コーティングされるかまたはコーティングされない色素またはナノ色素の形態における鉱物酸化物に基づく無機スクリーニング剤、および、特に、二酸化チタンまたは酸化亜鉛に基づく無機スクリーニング剤；
・染料；
・防腐剤；
・ＥＤＴＡ塩などの封鎖剤（sequestrant）；
・芳香剤；
・ならびにこれらの混合物
から選択される少なくとも１つの化合物など、各種のアジュバントを含みうるが、この列挙を限定的とするものではない。
【００４７】
このようなアジュバントの例は、とりわけ、皮膚ケア業界で通常用いられる、限定なしに多種多様な美容成分および医薬成分であって、本発明に従う組成物中のさらなる成分として用いるのに適する美容成分および医薬成分を説明する、ＣＴＦＡによる辞典（International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook、The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association刊、第11版、2006）において言及されている。
【００４８】
組成物はまた、充填剤、色素、ナクレ、伸長剤、およびマッティングポリマー、ならびにこれらの混合物など、光学的効果を伴う少なくとも１つの化合物も含みうる。
【００４９】
「充填剤」という用語は、組成物体に、剛性および／または柔軟性、マット効果、ならびに、適用直後の均一性を与えるのに適する、無色もしくは白色、鉱物性もしくは合成性、層状もしくは非層状の粒子を意味するものとして理解されたい。とりわけ言及されうる充填剤には、滑石、雲母、シリカ、カオリン、Ｎｙｌｏｎ−１２（Ａｔｏｃｈｅｍ社により市販されているＯｒｇａｓｏｌ（登録商標））などのＮｙｌｏｎ（登録商標）粉末、ポリエチレン粉末、ポリウレタン粉末、ポリスチレン粉末、ポリエステル粉末、場合によって、修飾デンプン、Ｔｏｓｐｅａｒｌ（登録商標）の商標名でＴｏｓｈｉｂａ社により市販されているシリコーン樹脂マイクロビーズなどのシリコーン樹脂マイクロビーズ、ヒドロキシアパタイト、およびシリカ製中空マイクロスフェア（Ｍａｐｒｅｃｏｓ社製のＳｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ（登録商標））が含まれる。
【００５０】
「色素」という用語は、媒体中で不溶性の白色もしくは有色、鉱物性もしくは有機性の粒子であって、組成物を着色し、かつ／または不透明化させることを意図する粒子を意味するものとして理解されたい。色素は、標準サイズの場合もあり、ナノメートルサイズの場合もある。言及されうる鉱物性色素の中では、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、および二酸化セリウムがあり、また、酸化亜鉛、酸化鉄、および酸化クロムもある。
【００５１】
「ナクレ」という用語は、光を反射する虹色の粒子を意味するものとして理解されたい。想定されうるナクレの中では、天然の真珠層、酸化チタン、酸化鉄、天然色素、またはオキシ塩化ビスマスでコーティングした雲母について言及することができ、また、着色したチタン雲母についても言及することができる。
【００５２】
水性相におけるこれらの充填剤および／または色素および／またはナクレの質量濃度は一般に、組成物の総重量に対する比で、０．１重量％〜２０重量％、および好ましくは０．２重量％〜７重量％である。
【００５３】
「伸長剤」（tensioning agent）という用語は、皮膚を突っ張らせ、この伸長効果により、皮膚を滑らかにし、皺およびこれらに由来する小皺を軽減するか、なおまたはこれらを即時に消失させるのに適する化合物を意味するものとして理解されたい。言及されうる伸長剤には、天然由来のポリマーが含まれる。「天然由来のポリマー」という用語は、植物由来のポリマー、外皮に由来するポリマー、卵タンパク質、および天然由来のラテックスを意味する。これらのポリマーは、親水性であることが好ましい。とりわけ言及されうる植物由来のポリマーには、タンパク質およびタンパク質の加水分解物、ならびに、より具体的に述べると、トウモロコシ抽出物、ライムギ抽出物、コムギ抽出物、ソバ抽出物、ゴマ抽出物、スペルトコムギ抽出物、エンドウ抽出物、マメ抽出物、レンティル抽出物、ダイズ抽出物、およびルピン抽出物など、穀類抽出物、マメ科植物抽出物、および油産生植物の抽出物が含まれる。合成ポリマーは一般に、ラッテクスまたはシュードラテックスの形態にあり、重縮合体型ポリマーの場合もあり、またはフリーラジカルの重合化により得られる場合もある。とりわけ、ポリエステル／ポリウレタン分散液、およびポリエーテル／ポリウレタン分散液について言及しうる。伸長剤は、ＰＶＰ／アクリル酸ジメチコニルと親水性ポリウレタンとのコポリマー（Ｈｙｄｒｏｍｅｒ社製のＡｑｕａｍｅｒｅ  Ｓ−２００１（登録商標））であることが好ましい。
【００５４】
本明細書において、用語「マッティングポリマー」とは、溶液中、分散液中、または粒子形態中の任意のポリマーであって、皮膚のテカリを抑制し、肌の色を統一するポリマーを意味する。言及されうる例には、シリコーンエラストマー、樹脂粒子、およびこれらの混合物が含まれる。言及されうるシリコーンエラストマーの例には、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ社によりＫＳＧ（登録商標）の商標名で市販されている製品、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社によりＴｒｅｆｉｌ（登録商標）、ＢＹ２９（登録商標）、またはＥＰＳＸ（登録商標）の商標名で市販されている製品またはＧｒａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社によりＧｒａｎｓｉｌ（登録商標）の商標名で市販されている製品が含まれる。
【００５５】
本発明に従い用いられる組成物はまた、マイクロＲＮＡ阻害剤以外の活性作用剤も含む場合があり、特に、増殖因子の生成を刺激する作用剤；抗糖化剤または脱糖化剤；コラーゲンの合成を増大させるか、またはその分解を防止する作用剤（抗コラゲナーゼ剤、および、とりわけ、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤）；エラスチンの合成を増大させるか、またはその分解を防止する作用剤（抗エラスターゼ剤）；インテグリン、またはテンシンなど、焦点接着成分の合成を刺激する作用剤；グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンの合成を増大させるか、またはそれらの分解を防止する作用剤（抗プロテオグリカナーゼ剤）；線維芽細胞の増殖を増大させる作用剤；脱色素沈着剤または抗色素沈着剤；抗酸化剤もしくはフリーラジカルスカベンジャー、または抗汚染剤；ならびにこれらの混合物から選択される少なくとも１つの活性作用剤を含む場合があるが、この列挙を限定的とするものではない。
【００５６】
このような作用剤の例は、とりわけ、植物抽出物、特に、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）抽出物、テルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）抽出物、アラスカエンドウ（Pisum sativum）抽出物（Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ（登録商標）ＴＰ  ＬＳ）、ツボクサ（Centella asiatica）抽出物、イカダモ（Scenedesmus）抽出物、ワサビノキ（Moringa pterygosperma）抽出物、マンサク抽出物、セイヨウグリ（Castanea sativa）抽出物、ローゼル（Hibiscus sabdriffa）抽出物、ゲッカコウ（Polianthes tuberosa）抽出物、アルガンツリー（Argania spinosa）抽出物、アロエ・ベラ（Aloe vera）抽出物、フサザキスイセン（Narcissus tarzetta）抽出物、または甘草抽出物；ダイダイ（Citrus aurantium）のエッセンシャルオイル（ネロリ）；グリコール酸、乳酸、およびクエン酸などのα−ヒドロキシ酸、ならびにこれらのエステル；サリチル酸などのβ−ヒドロキシ酸、およびこれらの誘導体；植物タンパク質の加水分解物（とりわけ、ダイズの加水分解物、またはヘーゼルナッツの加水分解物）；アクリル化オリゴペプチド（Ｍａｘｉｌｉｐ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）３０００、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＣＬ、またはＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＥＬの商標名で、とりわけ、Ｓｅｄｅｒｍａ社により市販されている）；酵母抽出物、および、特に、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）抽出物；藻類抽出物、および、特に、コンブ抽出物；パルミチン酸レチニル、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウムまたはリン酸アスコルビルナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、ソルビン酸アスコルビル、トコフェロール、酢酸トコフェリル、およびソルビン酸トコフェリルなど、ビタミンおよびそれらの誘導体；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸；ならびにこれらの混合物である。
【００５７】
変化形として、または加えて、本発明に従い用いられる組成物は、とりわけＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｓｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ／Ｃｏｇｎｉｓ  Ｆｒａｎｃｅ社により、Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ  ＴＰ  ＬＳ（登録商標）の商標名で市販されている、アラスカエンドウ（Pisum sativum）種子抽出物など、少なくとも１つのエラスターゼ阻害剤（抗エラスターゼ剤）を含みうる。
【００５８】
組成物はまた、保湿剤、安定化剤、水分制御剤、ｐＨ制御剤、浸透圧調節剤、またはＵＶ−ＡスクリーンおよびＵＶ−Ｂスクリーンなど、不活性添加剤またはこれらの添加剤の組合せも含有しうる。
本願発明は以下の態様を含み得る。
［１］
皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物を、ケラチン生成細胞の試料と接触させるステップと、
ｂ．前記ケラチン生成細胞における少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置されたケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含む方法。
［２］
ステップｂ．をステップａ．の前および後に実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
［３］
以下のステップ：
ａ’．ケラチン生成細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップと、
ａ．試料のうちの１つを、少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次いで、
ｂ．前記試料における少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置されたケラチン生成細胞において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性のうちの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞の試料と比較して測定される化合物を選択するステップと
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
［４］
前記ケラチン生成細胞が、前老化ケラチン生成細胞であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
［５］
マイクロＲＮＡが、ｐ６３  ｍＲＮＡまたはＴＰ６３遺伝子を標的とすることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
［６］
マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
［７］
前老化ケラチン生成細胞が、古典的な培養条件下における３７回の集団倍加の後に得られることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
［８］
古典的な培養条件が、ＨＫＧＳ増殖補充物を添加された１５４培地中で、常にサブコンフルエント状態に保持されるケラチン生成細胞の培養を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
［９］
被験化合物が、植物性抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
ステップｃ．において測定されるマイクロＲＮＡの発現または活性の阻害が、少なくとも５０％の阻害、好ましくは少なくとも６０％の阻害であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることが可能な、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの阻害剤の美容的使用。
［１２］
皮膚の加齢を防止および／もしくは減弱し、並びに／または皮膚に潤いを与えるための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることが可能な、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの阻害剤。
［１３］
古典的な培養条件下における少なくとも３７回の集団倍加の後に得られるケラチン生成細胞。
【００５９】
以下の例は、本発明を、その範囲を限定することなしに例示する。これらの例は、以下に列挙される図面に基づく。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ヒト新生児初代ケラチン生成細胞における複製老化モデル（「前老化ケラチン生成細胞」）の確立を示す図である。  （Ａ）ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入った培地ＥｐｉＬｉｆｅ中で培養した。老化状態に到達するまで、細胞を培養し、連続的に継代した。グラフは、４０日間にわたる培養におけるヒト初代ケラチン生成細胞の集団倍加を示している。３７回の集団倍加の後、増殖曲線はプラトー状態となることから、細胞が分裂を停止し、老化状態に達することを示す。  （Ｂ）ｐ６３、サイトケラチン１０、およびｐ１６／ＩＮＫ４ａについてのウェスタンブロット解析を実施するため、表示される時点において細胞を回収した。ｐ６３の発現が低下し、ｐ１６／ＩＮＫ４ａのレベルが上昇することから、細胞は複製老化状態に入っていることが示されるが、初代継代〜４代目の継代において、サイトケラチン１０が検出されないことにより示されるとおり、分化しているわけではないことを示す。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。  （Ｃ）異なる継代のＢｒｄＵ陽性ヒト初代ケラチン生成細胞の百分率により示されるとおり、老化時には、増殖細胞の百分率が低下している。ＢｒｄＵの取込みは、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ法を用いて評価した。
【図２】ｍｉＲ−１３０ａが、３’−ＵＴＲにおいて、ｐ６３のｍＲＮＡを標的とすることを示す図である。  （Ａ）ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアにより、ｐ６３の３’−ＵＴＲにおける、ｍｉＲ−１３０ａの予測される標的部位を同定した。  （Ｂ）さらなる対照細胞にｍｉＲ−２０３をトランスフェクトしたとき、ルシフェラーゼレポーター遺伝子にｐ６３の３’−ＵＴＲを挿入すると、ｍｉＲ−１３０ａの存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する。  （Ｃ）ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａをトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞と対比して、ΔＮｐ６３タンパク質が顕著に減少することを示すウェスタンブロット。ｍｉＲ−１３０ａが過剰発現する結果として、ｍｉＲ−１３０ａを過剰発現させるケラチン生成細胞は、細胞老化のマーカーであるｐ１６／ＩＮＫ４ａの発現を増大させることを示す。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。
【図３】合成化合物によるｍｉＲ−１３０ａの調節を示す図である。  ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、濃度の異なる複数の化合物で処置した。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１３０ａレベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。被験化合物が、処置されていない細胞と対比して、ｍｉＲ−１３０ａレベルを著明に下方制御している。
【図４】ｍｉＲ−１３８が、３’−ＵＴＲにおいて、Ｓｉｒｔ−１のｍＲＮＡを標的とすることを示す図である。  （Ａ）ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアにより、Ｓｉｒｔ−１の３’−ＵＴＲにおける、ｍｉＲ−１３８の予測される標的部位を同定した。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＳｉｒｔ−１  ３’−ＵＴＲを挿入すると、ｍｉＲ−１３８の存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する。ｍｉＲ−２１７を、陽性対照として用いた。（Ｃ）ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３８をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞（Ctrl）と対比して、ＳｉｒＴ−１タンパク質が顕著に減少することを示すウェスタンブロット。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。
【図５】抗ｍｉＲ−１３８によるｍｉＲ−１３８の調節を示す図である。  ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、抗ｍｉＲ−１３８（Ａｍｂｉｏｎ）でトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１３８レベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１３８は、スクランブルトランスフェクト細胞と対比して、ｍｉＲ−１３８レベルを著明に下方制御している。
【図６】ｍｉＲ−１８１ａが、３’−ＵＴＲにおいて、Ｓｉｒｔ−１のｍＲＮＡを標的とすることを示す図である。  （Ａ）ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアにより、Ｓｉｒｔ−１の３’−ＵＴＲにおける、ｍｉＲ−１８１ａの予測される標的部位を同定した。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＳｉｒｔ−１  ３’−ＵＴＲを挿入すると、ｍｉＲ−１８１ａの存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する。ｍｉＲ−２１７を、陽性対照として用いた。（Ｃ）ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ａをトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞（Ctrl）と対比して、ＳｉｒＴ−１タンパク質が顕著に減少することを示すウェスタンブロット。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。
【図７】抗ｍｉＲ−１８１ａによるｍｉＲ−１８１ａの調節を示す図である。  ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、抗ｍｉＲ−１８１ａ（Ａｍｂｉｏｎ）でトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１８１ａレベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１８１ａは、スクランブルトランスフェクト細胞と対比して、ｍｉＲ−１８１ａレベルを著明に下方制御している。
【図８】ｍｉＲ−１９１が、３’−ＵＴＲにおいて、ＣＤＫ６のｍＲＮＡを標的とすることを示す図である。  （Ａ）ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアにより、ＣＤＫ６の３’−ＵＴＲにおける、ｍｉＲ−１９１の予測される標的部位を同定した。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＣＤＫ６の３’−ＵＴＲを挿入すると、ｍｉＲ−１９１の存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する。（Ｃ）ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８９１をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞（Ctrl）と対比して、ＣＤＫ６タンパク質が顕著に減少することを示すウェスタンブロット。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。
【図９】抗ｍｉＲ−１９１によるｍｉＲ−１９１の調節を示す図である。  ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、抗ｍｉＲ−１９１（Ａｍｂｉｏｎ）でトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１９１レベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１９１は、スクランブルトランスフェクト細胞と対比して、ｍｉＲ−１９１レベルを著明に下方制御している。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、増殖ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ１３０ａの過剰発現は、ｐ６３タンパク質のレベルを阻害するが、増殖および細胞老化の誘導に対する著明な効果を及ぼすものではないことを示す図である。  （Ａ）ｍｉＲ−１３０ａを過剰発現させても、増殖および老化に対する効果は検出されなかった。  （Ｂ）このことが、ＢｒｄＵの取込みおよびＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおりに確認される。これらの結果は、この特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下において、ｍｉＲ−１３０ａが、高レベルのｐ６３を阻害することが可能でないという事実に起因する。（Ｃ）において観察されるとおり、ｐ６３はなおも細胞内で発現しており、増殖および老化に対する効果を検出することはできない。
【図１１】増殖ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ１３８の過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導することを示す図である。  （Ａ）ＢｒｄＵの取込みにより評価されるとおり、ｍｉＲ−１３８を過剰発現させたときは、増殖が著明に低減される。  （Ｂ）ＳＡ−β−ガラクトシダーゼについての染色を介して老化を評価することにより、ｍｉＲ−１３８をトランスフェクトしたときの著明な増加が示される（±ｓ．ｄ．：スチューデントのｔ検定による＊ｐ値＜０．０１、＊＊ｐ値＜０．００５）。
【図１２】増殖ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ１８１ａの過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導することを示す図である。  （Ａ）ＢｒｄＵの取込みにより評価されるとおり、ｍｉＲ１８１ａを過剰発現させたときは、増殖が著明に低減される。  （Ｂ）ＳＡ−β−ガラクトシダーゼについての染色を介して老化を評価することにより、ｍｉＲ−１８１ａをトランスフェクトしたときの著明な増加が示される（±ｓ．ｄ．：スチューデントのｔ検定による＊ｐ値＜０．０１、＊＊ｐ値＜０．００５）。
【図１３】増殖ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ１９１の過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導することを示す図である。  （Ａ）ＢｒｄＵの取込みにより評価されるとおり、ｍｉＲ１９１を過剰発現させたときは、増殖が著明に低減される。  （Ｂ）ＳＡ−β−ガラクトシダーゼについての染色を介して老化を評価することにより、ｍｉＲ−１９１をトランスフェクトしたときの著明な増加が示される（±ｓ．ｄ．：スチューデントのｔ検定による＊＊ｐ値＜０．００５）。
【図１４】老化時において上方制御される、選択されたｍｉＲがまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける老化皮膚においても上方制御されることを示す図である。  （Ａ）皮膚生検は、以下の年齢：レーン１＝７歳、レーン２＝１０歳、レーン３＝７０歳、およびレーン４＝７６歳の患者から採取した。ｐ１６、ＳｉｒＴ１、およびｐ６３が、ヒト皮膚において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの複製老化モデル（Ｂ）における場合と同様に挙動することを示すウェスタンブロットが示される。（Ｃ〜Ｆ）年齢の異なるヒト皮膚における、選択されたｍｉＲレベルについてのＲＴ−ＰＣＲ。
【実施例１】
【００６１】
老化ケラチン生成細胞モデルの構築
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト新生児初代上皮ケラチン生成細胞（Ｈｅｋｎ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養した。分化過程の誘発を回避するため、細胞を、常にサブコンフルエント状態に保持した。細胞は通常、毎週１回継代し、継代間に生じる集団倍加および集団倍加時間を計算するため、各継代時に、採取した細胞数および播種した細胞数を記録した。各継代時に、異なる細胞アリコートを採取して、三連で（triplicate）ＲＮＡおよびタンパク質を抽出し、これらの細胞の老化状態または非老化状態をアッセイするために、アリコートを老化活性化β−ガラクトシダーゼ染色にかけた。
【００６２】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２、５ミリモル／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ミリモル／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ミリモル／Ｌのクエン酸、１２ミリモル／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。
【００６３】
細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時におけるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などのチミジン類似体の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００回のイベントを評価した。
【００６４】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。
【００６５】
抗ｐ６３（Ａｂ４、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５００とする）、ポリクローナル抗Ｋ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ、希釈率を１／１０００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）、抗ｐ１６体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１：１０００とする）を用いた。
【００６６】
結果
ヒト新生児初代ケラチン生成細胞における複製老化モデルの確立
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養した。老化状態に到達するまで、細胞を培養し、連続的に継代した。図１Ａは、４０日間にわたる培養におけるヒト初代ケラチン生成細胞の集団倍加を示している。３７回の集団倍加の後、増殖曲線はプラトーを有し、細胞が分裂を停止し、老化状態に達する（reaching）ことが示される。
【００６７】
ｐ１、ｐ３、ｐ４、およびｐ５において細胞を回収し、ｐ６３、サイトケラチン１０（Ｋ１０）およびｐ１６／ＩＮＫ４ａについてのウェスタンブロット解析を実施した。ｐ６３の発現が低下し、ｐ１６／ＩＮＫ４ａのレベルが上昇することから、細胞は複製老化状態に入っていることが示されるが、初代継代〜４代目の継代においてサイトケラチン１０が見られないことにより示されるとおり、分化しているわけではないことが示される。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。
【００６８】
ヒト初代ケラチン生成細胞は、４代目の継代後、３７回の集団倍加で、複製老化を起こす。異なる継代でのヒト初代ケラチン生成細胞においてＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色により染色すると、より老齢の細胞（ｐ４）における老化マーカーの発現が示される。
【００６９】
異なる継代でのＢｒｄＵ陽性ヒト初代ケラチン生成細胞の百分率により示されるとおり、老化時には、増殖細胞の百分率が低下している。ＢｒｄＵの取込みは、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ法を用いて評価した。本例で得られた細胞を、老化ケラチン生成細胞のモデルとし、前老化ケラチン生成細胞と称する。
【実施例２】
【００７０】
ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるｍｉＲ−１３０ａの発現
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
本例では、実施例１で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。
【００７１】
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）の入ったＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養し、分化過程を誘導するために、１．２ｍＭのＣａＣｌ２で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、処置の７日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、ＳｉＰＯＲＴ  ｎｅｏＦＸトランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａ、抗ｍｉＲ−１３０ａ、およびＣｙ３で標識した陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。
【００７２】
８００，０００個のヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、４８時間後に細胞を採取した。１０％のＦＢＳ、１００Ｕのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシンを伴うＤ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を増殖させた。
【００７３】
製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００により、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。Ｈｅｋｎ細胞を、４８時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しｍＲＮＡを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムＰＣＲを実施した。
【００７４】
ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析
全ＲＮＡ抽出のための製造元のプロトコールに従い、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｒＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、細胞または組織から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを定量化し、アガロースゲル上でＲＮＡの品質を調節した。マイクロＲＮＡを検出するため、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いてＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｍｉＲ−１３０ａに特異的なプライマーによりｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｕ１８（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を内部対照として用いた。各遺伝子およびｍｉＲの発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）から規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＵ１８の発現に照らして標準化した後に、２−ΔΔＣｔ法を用いることにより計算した。
【００７５】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２、５ミリモル／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ミリモル／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ミリモル／Ｌのクエン酸、１２ミリモル／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。
【００７６】
細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時におけるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などのチミジン類似体の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００回のイベントを評価した。
【００７７】
構築物
以下のプライマー：
ｐ６３ＵＴＲ−ＳｐｅＩＦ  ５’−ＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣ−３’；配列番号５
ｐ６３ＵＴＲ−ＳｐｅＩＲ  ５’−ＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’配列番号６
を用いて、ヒトゲノムＤＮＡに由来する、終止コドンの後の最初のヌクレオチドから、ポリアデニル化シグナルの前の最後のヌクレオチドまでのヒトｐ６３の３’ＵＴＲをＰＣＲにより増幅した。
【００７８】
２７７０ｂｐの断片（すなわち、ｐ６３  ３’ＵＴＲ  ｗｔ）を、ＳｐｅＩによる制限後、ＸｂａＩにより直鎖化した適合性のｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）にライゲーションした。
【００７９】
他方、以下の重複するプライマー：
Ｄｅｌ１３０Ｆ  ５’−ＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＧＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴ−３’；配列番号７
Ｄｅｌ１３０Ｒ  ５’−ＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡ−３’配列番号８
を用いるＰＣＲを介して、この野生型配列から、ｍｉＲ−１３０ａの予測される標的部位（７ｂｐ、ＵＵＧＣＡＣＵ）を欠失させた。
【００８０】
こうして、ｐ６３  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１３０ａ  ｄｅｌが得られる。
【００８１】
バイオインフォマティックス
http://www.targetscan.org/において入手可能なＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアを用いて、ｐ６３の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１３０ａ標的部位の解析を実施した。
【００８２】
ルシフェラーゼアッセイ
２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に１２ウェルディッシュに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１００ｎｇのｐＧＬ３ベクター（すなわち、ｐ６３  ３’ＵＴＲ  ｗｔまたはｐ６３  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１３０ａ  ｄｅｌ）、１２ピコモルのｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａまたはｐｒｅ−ｍｉＲのスクランブル配列（Ａｍｂｉｏｎ）、および１０ｎｇのウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼｐＲＬ−ＣＭＶベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることにより、トランスフェクションの２４時間後に測定し、発光は、ＯＰＴＯＣＯＭＰ  Ｉ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、１０秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。
【００８３】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。
【００８４】
抗ｐ６３（Ａｂ４、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）、抗ｐ１６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１：１０００とする）を用いた。
【００８５】
結果
老化および分化するケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３０ａレベル
ｐ１およびｐ４において、細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【００８６】
ｐ１〜ｐ４の間においてｍｉＲ−１３０ａレベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３０ａ発現の著明な増大が示される：ｐ４では、ｍｉＲ−１３０ａの発現が、ｐ１におけるその発現（１．００±０．０７に等しい）より約１．４８（±０．０８）高値である。
【００８７】
これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、０日目には１．００（±０．０７）であるのに対して、７日間にわたるカルシウム処置の後には、ｍｉＲ−１３０ａ発現が約０．３４７（±０．０４）である。
【００８８】
したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、ｍｉＲ−１３０ａの発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、ｍｉＲ−１３０ａの発現の増大と関連しない。
【００８９】
ｍｉＲ−１３０ａは、３’ＵＴＲにおいて、ｐ６３のｍＲＮＡを標的とする
バイオインフォマティックス解析は、ｐ６３が、ｍｉＲ−１３０ａの推定標的であることを示す（図２Ａ）。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にｐ６３  ３’ＵＴＲ  ｗｔを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａの存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する（対照に対して０．５０３±０．０５倍）。さらなる対照細胞には、陽性対照としてｐｒｅ−ｍｉＲ−２０３（ｐ６３  ３’ＵＴＲを標的とする既知のｍｉＲ）でトランスフェクトした：この場合におけるルシフェラーゼ活性は、対照に対して０．５８±０．００９６倍である（図２Ｂ）。
【００９０】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子にｐ６３  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１３０ａ  ｄｅｌを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａの存在下におけるルシフェラーゼ活性の低下は僅少となる（対照に対して０．８９±０．０５３７倍）。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０３でトランスフェクトしたさらなる対照細胞は、対照に対して０．５６±０．０１３倍のルシフェラーゼ活性を示す（図２Ｂ）。
【００９１】
図２Ｃに示すとおり、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａでトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列でトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞と対比して、ｐ６３タンパク質が顕著に減少する。ｍｉＲ−１３０ａが過剰発現する結果として、ｍｉＲ−１３０ａを過剰発現させるケラチン生成細胞は、細胞老化のマーカーであるｐ１６／ＩＮＫ４ａの発現の増大を示す。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。
【００９２】
これらの結果は、ｍｉＲ−１３０ａが、３’ＵＴＲにおいてｐ６３  ｍＲＮＡを標的とすることを示唆する。
【００９３】
合成化合物によるｍｉＲ−１３０ａの調節
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、濃度の異なる抗ｍｉＲ−１３０ａで処置した。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１３０ａレベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１３０ａは、処置されていない細胞と対比して、ｍｉＲ−１３０ａレベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるｍｉＲ−１３０ａの発現は、わずかに０．１３８±０．０３２である（対してスクランブルでは１．００±０．０１である）（図３）。
【実施例３】
【００９４】
ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるｍｉＲ−１３８の発現
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
本例では、実施例１で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。
【００９５】
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）の入ったＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養し、分化過程を誘導するために、１．２ｍＭのＣａＣｌ２で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、処置の７日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、ＳｉＰＯＲＴ  ｎｅｏＦＸトランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−１３８、抗ｍｉＲ−１３８、およびＣｙ３で標識した陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。
【００９６】
８００，０００個のヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、４８時間後に細胞を採取した。１０％のＦＢＳ、１００Ｕのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシンを伴うＤ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を増殖させた。
【００９７】
製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００により、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。Ｈｅｋｎ細胞を、４８時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しｍＲＮＡを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムＰＣＲを実施した。
【００９８】
ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析
全ＲＮＡ抽出のための製造元のプロトコールに従い、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｒＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、細胞または組織から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを定量化し、アガロースゲル上でＲＮＡの品質を調節した。マイクロＲＮＡを検出するため、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いてＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｍｉＲ−１３８に特異的なプライマーによりｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｕ１８（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を内部対照として用いた。各遺伝子およびｍｉＲの発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）から規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＵ１８の発現に照らして標準化した後に、２−ΔΔＣｔ法を用いることにより計算した。
【００９９】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２、５ミリモル／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ミリモル／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ミリモル／Ｌのクエン酸、１２ミリモル／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。
【０１００】
細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時におけるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などのチミジン類似体の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００回のイベントを評価した。
【０１０１】
構築物
以下のプライマー：
ｐＳｉｒＴ１ＵＴＲ−ＳｔｙＩＦ  ５’−ＧＡＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣ−３’；配列番号９
ｐＳｉｒＴ１ＵＴＲ−ＳｔｙＩＲ  ５’−ＧＣＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴ−３’配列番号１０
を用いて、ヒトゲノムＤＮＡに由来する、終止コドンの後の最初のヌクレオチドから、ポリアデニル化シグナルの前の最後のヌクレオチドまでのヒトＳｉｒｔ−１の３’ＵＴＲをＰＣＲにより増幅した。
【０１０２】
１９４０ｂｐの断片（すなわち、ｐＳｉｒＴ１  ３’ＵＴＲ  ｗｔ）を、ＳｐｅＩによる制限後、ＸｂａＩにより直鎖化した適合性のｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）にライゲーションした。
【０１０３】
他方、以下の重複するプライマー：
Ｄｅｌ１３８Ｆ  ５’−ＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＴＣＣＴＴＡＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＴＧＴＣ−３’；配列番号１１
Ｄｅｌ１３８Ｒ  ５’−ＧＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣ−３’配列番号１２
を用いるＰＣＲを介して、この野生型配列から、ｍｉＲ−１３８の予測される標的部位（７ｂｐ、ＣＡＣＣＡＧＣＡ）を欠失させた。
【０１０４】
こうして、ＳｉｒＴ１  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１３８  ｄｅｌが得られる。
【０１０５】
バイオインフォマティックス
http://www.targetscan.org/において入手可能なＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアを用いて、Ｓｉｒｔ−１の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１３８標的部位の解析を実施した。
【０１０６】
ルシフェラーゼアッセイ
２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に１２ウェルディッシュに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１００ｎｇのｐＧＬ３ベクター（すなわち、Ｓｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｗｔまたはＳｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１３８  ｄｅｌ）、１２ピコモルのｐｒｅ−ｍｉＲ−１３８またはｐｒｅ−ｍｉＲのスクランブル配列（Ａｍｂｉｏｎ）、および１０ｎｇのウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼｐＲＬ−ＣＭＶベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることにより、トランスフェクションの２４時間後に測定し、発光は、ＯＰＴＯＣＯＭＰ  Ｉ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、１０秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。
【０１０７】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。
【０１０８】
抗Ｓｉｒｔ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、希釈率を１／５００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）を用いた。
【０１０９】
結果
老化および分化するケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３８レベル
ｐ１およびｐ４において、細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｐ１〜ｐ４の間においてｍｉＲ−１３８レベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３８発現の著明な増大が示される：ｐ４では、ｍｉＲ−１３８の発現が、ｐ１におけるその発現（１．００±０．０５に等しい）より約２．７６（±０．０６）高値である。
【０１１０】
これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、０日目には１．００（±０．０２）であるのに対して、７日間にわたるカルシウム処置の後には、ｍｉＲ−１３８発現が約０．２１（±０．０２）である。
【０１１１】
したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、ｍｉＲ−１３８の発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、ｍｉＲ−１３８の発現の増大と関連しない。
【０１１２】
ｍｉＲ−１３８は、３’ＵＴＲにおいて、Ｓｉｒｔ−１のｍＲＮＡを標的とする
バイオインフォマティックス解析は、ＳｉｒＴ１が、ｍｉＲ−１３８の推定標的であることを示す（図４Ａ）。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＳｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｗｔを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３８の存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する（対照に対して０．３９±０．０１４倍）。さらなる対照細胞には、陽性対照としてｐｒｅ−ｍｉＲ−２１７（Ｓｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲを標的とする既知のｍｉＲ）でトランスフェクトした：この場合におけるルシフェラーゼ活性は、対照に対して０．３５±０．００９倍である（図４Ｂ）。
【０１１３】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＳｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１３８  ｄｅｌを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３８の存在下におけるルシフェラーゼ活性の低下は僅少となる（対照に対して０．７８±０．０３倍）。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１７をトランスフェクトしたさらなる対照細胞は、対照に対して０．４±０．００８倍のルシフェラーゼ活性を示す（図４Ｂ）。図４Ｃに示すとおり、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３８をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞（Ctrl）と対比して、ＳｉｒＴ１タンパク質が顕著に減少する。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらのデータは、ＳｉｒＴ１がｍｉＲ−１３８標的であることを裏付ける。
【０１１４】
合成化合物によるｍｉＲ−１３８の調節
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、濃度の異なる抗ｍｉＲ−１３８で処置した。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１３８レベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１３８は、処置されていない細胞と対比して、ｍｉＲ−１３８レベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるｍｉＲ−１３８の発現は、わずかに０．０３２±０．０２６である（図５）。
【実施例４】
【０１１５】
ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるｍｉＲ−１８１ａの発現
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
本例では、実施例１で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）の入ったＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養し、分化過程を誘導するために、１．２ｍＭのＣａＣｌ２で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、処置の７日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、ＳｉＰＯＲＴ  ｎｅｏＦＸトランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ａ、抗ｍｉＲ−１８１ａ、およびＣｙ３で標識した陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。
【０１１６】
８００，０００個のヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、４８時間後に細胞を採取した。１０％のＦＢＳ、１００Ｕのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシンを伴うＤ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を増殖させた。
【０１１７】
製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００により、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。Ｈｅｋｎ細胞を、４８時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しｍＲＮＡを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１１８】
ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析
全ＲＮＡ抽出のための製造元のプロトコールに従い、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｒＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、細胞または組織から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを定量化し、アガロースゲル上でＲＮＡの品質を調節した。マイクロＲＮＡを検出するため、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いてＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｍｉＲ−１８１ａに特異的なプライマーによりｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｕ１８（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を内部対照として用いた。各遺伝子およびｍｉＲの発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）から規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＵ１８の発現に照らして標準化した後に、２−ΔΔＣｔ法を用いることにより計算した。
【０１１９】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２、５ミリモル／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ミリモル／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ミリモル／Ｌのクエン酸、１２ミリモル／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。
【０１２０】
細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時におけるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などのチミジン類似体の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００回のイベントを評価した。
【０１２１】
構築物
以下のプライマー：
ｐＳｉｒＴ１ＵＴＲ−ＳｔｙＩＦ  ５’−ＧＡＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣ−３’；配列番号１３
ｐＳｉｒＴ１ＵＴＲ−ＳｔｙＩＲ  ５’−ＧＣＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴ−３’配列番号１４
を用いて、ヒトゲノムＤＮＡに由来する、終止コドンの後の最初のヌクレオチドから、ポリアデニル化シグナルの前の最後のヌクレオチドまでのヒトＳｉｒｔ−１の３’ＵＴＲをＰＣＲにより増幅した。
【０１２２】
１９４０ｂｐの断片（すなわち、ｐＳｉｒＴ１  ３’ＵＴＲ  ｗｔ）を、ＳｐｅＩによる制限後、ＸｂａＩにより直鎖化した適合性のｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）にライゲーションした。
【０１２３】
他方、以下の重複するプライマー：
Ｄｅｌ１８１ａＦ  ５’−ＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＧＡＡＣＴＣＧＡＴＡＧＡ−３’；配列番号１５
Ｄｅｌ１８１ａＲ  ５’−ＴＣＴＡＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＣ−３’配列番号１６
を用いるＰＣＲを介して、この野生型配列から、ｍｉＲ−１８１ａの予測される標的部位（７ｂｐ、ＵＧＡＡＵＧＵ）を欠失させた。
【０１２４】
こうして、ＳｉｒＴ１  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１８１ａ  ｄｅｌが得られる。
【０１２５】
バイオインフォマティックス
http://www.targetscan.org/において入手可能なＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアを用いて、Ｓｉｒｔ−１の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１８１ａ標的部位の解析を実施した。
【０１２６】
ルシフェラーゼアッセイ
２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に１２ウェルディッシュに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１００ｎｇのｐＧＬ３ベクター（すなわち、Ｓｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｗｔまたはＳｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１８１ａ  ｄｅｌ）、１２ピコモルのｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ａまたはｐｒｅ−ｍｉＲのスクランブル配列（Ａｍｂｉｏｎ）、および１０ｎｇのウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼｐＲＬ−ＣＭＶベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることにより、トランスフェクションの２４時間後に測定し、発光は、ＯＰＴＯＣＯＭＰ  Ｉ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、１０秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。
【０１２７】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。抗Ｓｉｒｔ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、希釈率を１／５００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）を用いた。
【０１２８】
結果
老化および分化するケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１８１ａレベル
ｐ１およびｐ４において、細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｐ１〜ｐ４の間においてｍｉＲ−１８１ａレベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１８１ａ発現の著明な増大が示される：ｐ４では、ｍｉＲ−１８１ａの発現が、ｐ１におけるその発現（１．００±０．０３に等しい）より約１．３（±０．０５）高値である。
【０１２９】
これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、０日目には１．００（±０．０２９）であるのに対して、７日間にわたるカルシウム処置の後には、ｍｉＲ−１８１ａ発現が約０．９３（±０．０２９）である。
【０１３０】
したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、ｍｉＲ−１８１ａの発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、ｍｉＲ−１８１ａの発現の増大と関連しない。
【０１３１】
ｍｉＲ−１８１ａは、３’ＵＴＲにおいて、Ｓｉｒｔ−１のｍＲＮＡを標的とする
バイオインフォマティックス解析は、ＳｉｒＴ１が、ｍｉＲ−１８１ａの推定標的であることを示す（図６Ａ）。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＳｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲ  ｗｔを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ａの存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する（対照に対して０．６４８±０．１倍）。さらなる対照細胞には、陽性対照としてｐｒｅ−ｍｉＲ−２１７（Ｓｉｒｔ−１  ３’ＵＴＲを標的とする既知のｍｉＲ）でトランスフェクトした：この場合におけるルシフェラーゼ活性は、対照に対して０．３５±０．００９６倍である（図６Ｂ）。
【０１３２】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＳｉｒｔ  ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１８１ａ  ｄｅｌを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ａの存在下におけるルシフェラーゼ活性の低下は僅少となる（対照に対して０．９３±０．０９倍）。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１７をトランスフェクトしたさらなる対照細胞は、対照に対して０．３±０．０７倍のルシフェラーゼ活性を示す（図６Ｂ）。図６Ｃに示すとおり、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ａをトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞（Ctrl）と対比して、ＳｉｒＴ１タンパク質が顕著に減少する。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらのデータは、ＳｉｒＴ１がｍｉＲ−１８１ａ標的であることを裏付ける。
【０１３３】
合成化合物によるｍｉＲ−１８１ａの調節
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、濃度の異なる抗ｍｉＲ−１８１ａで処置した。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１８１ａレベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１８１ａは、処置されていない細胞と対比して、ｍｉＲ−１８１ａレベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるｍｉＲ−１８１ａの発現は、わずかに０．０７５±０．０５２である（対してスクランブルでは１．００±０．０２９である）（図７）。
【実施例５】
【０１３４】
ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるｍｉＲ−１９１の発現
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
本例では、実施例１で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）の入ったＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養し、分化過程を誘導するために、１．２ｍＭのＣａＣｌ２で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、処置の７日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、ＳｉＰＯＲＴ  ｎｅｏＦＸトランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−１９１、抗ｍｉＲ−１９１、およびＣｙ３で標識した陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。
【０１３５】
８００，０００個のヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロＲＮＡレベル解析を行うために、４８時間後に細胞を採取した。１０％のＦＢＳ、１００Ｕのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシンを伴うＤ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を増殖させた。
【０１３６】
製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００により、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。Ｈｅｋｎ細胞を、４８時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しｍＲＮＡを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１３７】
ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析
全ＲＮＡ抽出のための製造元のプロトコールに従い、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｒＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、細胞または組織から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを定量化し、アガロースゲル上でＲＮＡの品質を調節した。マイクロＲＮＡを検出するため、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いてＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｍｉＲ−１９１に特異的なプライマーによりｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｕ１８（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を内部対照として用いた。各遺伝子およびｍｉＲの発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）から規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＵ１８の発現に照らして標準化した後に、２−ΔΔＣｔ法を用いることにより計算した。
【０１３８】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２、５ミリモル／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ミリモル／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ミリモル／Ｌのクエン酸、１２ミリモル／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。
【０１３９】
細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時における３Ｈチミジンまたはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などのチミジン類似体の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００回のイベントを評価した。
【０１４０】
バイオインフォマティックス
http://www.targetscan.org/において入手可能なＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ５．１ソフトウェアを用いて、ＣＤＫ６の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１９１標的部位の解析を実施した。
【０１４１】
ルシフェラーゼアッセイ
２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に１２ウェルディッシュに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１００ｎｇのｐＧＬ３ベクター、１２ピコモルのｐｒｅ−ｍｉＲ−１９１、またはｐｒｅ−ｍｉＲのスクランブル配列（Ａｍｂｉｏｎ）、および１０ｎｇのウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼｐＲＬ−ＣＭＶベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることにより、トランスフェクションの２４時間後に測定し、発光は、ＯＰＴＯＣＯＭＰ  Ｉ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、１０秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。
【０１４２】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。
【０１４３】
ポリクローナル抗ＣＤＫ−６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１７７、希釈率を１：２０００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）を用いた。
【０１４４】
結果
老化および分化するケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１９１レベル
ｐ１およびｐ４において、細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１４５】
ｐ１〜ｐ４の間においてｍｉＲ−１９１レベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１９１発現の著明な増大が示される：ｐ４では、ｍｉＲ−１９１の発現が、ｐ１におけるその発現（１．０±０．０４に等しい）より約１．９（±０．０７）高値である。これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、０日目には１．０（±０．０２）であるのに対して、７日間にわたるカルシウム処置の後には、ｍｉＲ−１９１発現が約０．４１（±０．０１９）である。
【０１４６】
したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、ｍｉＲ−１９１の発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、ｍｉＲ−１９１の発現の増大と関連しない。
【０１４７】
ｍｉＲ−１９１は、３’ＵＴＲにおいて、ＣＤＫ６のｍＲＮＡを標的とする
バイオインフォマティックス解析は、ＣＤＫ６が、ｍｉＲ−１９１の推定標的であることを示す（図８Ａ）。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にＣＤＫ６  ３’ＵＴＲ  ｗｔを挿入すると、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１９１の存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する（対照に対して０．７８±０．１倍）（図６Ｂ）。図８Ｃに示すとおり、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１）１をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞（Ctrl）と対比して、ＣＤＫ６タンパク質が顕著に減少する。β−アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらのデータは、ＣＤＫ６がｍｉＲ−１９１標的であることを裏付ける。
【０１４８】
合成化合物によるｍｉＲ−１９１の調節
ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物の入ったＥｐｉＬｉｆｅへと播種し、濃度の異なる抗ｍｉＲ−１９１で処置した。リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１９１レベルの相対的定量化を行うために、４８時間後に細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１９１は、処置されていない細胞と対比して、ｍｉＲ−１９１レベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるｍｉＲ−１９１の発現は、わずかに０．０６１±０．０４９である（対してスクランブルでは１．００±０．０１９である）（図９）。
【実施例６】
【０１４９】
増殖ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１の過剰発現
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
本例では、実施例１で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）の入ったＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養した。製造元のプロトコールに従い、ＳｉＰＯＲＴ  ｎｅｏＦＸトランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−１３０ａ、−１３８、−１８１ａ、−１９１およびＣｙ３で標識した陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。
【０１５０】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレートに播種し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２、５ミリモル／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ミリモル／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ミリモル／Ｌのクエン酸、１２ミリモル／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。
【０１５１】
細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時におけるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００回のイベントを評価した。
【０１５２】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。
【０１５３】
抗ｐ６３（Ａｂ４、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）、抗ｐ１６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１：１０００とする）を用いた。
【０１５４】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件において、ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ１３０ａの過剰発現は、増殖および細胞老化の誘導に対する著明な効果を及ぼすものではない
ＢｒｄＵの取込みおよびＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、ｍｉＲ−１３０ａを過剰発現させても、増殖および老化に対する効果は検出されなかった（図１０）。これらの結果は、この特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下において、ｍｉＲ−１３０ａが、ｐ６３の発現を完全には阻害することが可能でないという事実に起因する。ｍｉＲ−１３０ａをトランスフェクトしても、ｐ６３はなおも細胞内で発現しており（図１１Ｃを参照されたい）、増殖および老化に対する効果を検出することはできない。しかし、ｍｉＲ−１３０ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏである老齢対象のケラチン生成細胞において上方制御され（以下、図１４を参照されたい）、複製誘導性老化において上方制御されている（実施例２を参照されたい）ことから、細胞の老化におけるその関与が裏付けられる。
【０１５５】
ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３８の過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導するのに十分である
ＢｒｄＵの取込みおよびＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、増殖ケラチン生成細胞においてｍｉＲ−１３８を過剰発現させたときは、増殖の阻害に対する強力な効果が検出された（図１１）ことから、ｍｉＲ−１３８は、それ自体で老化を誘導するのに十分であることが示される。ｍｉＲ−１３８をトランスフェクトすると、増殖および老化の誘導のいずれにおいても、統計学的評価により有意な変化が示される（±ｓ．ｄ．：スチューデントのｔ検定による＊ｐ値＜０．０１、＊＊ｐ値＜０．００５）（図１１）。
【０１５６】
ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１８１ａの過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導するのに十分である
ＢｒｄＵの取込みおよびＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、増殖ケラチン生成細胞においてｍｉＲ−１８１ａを過剰発現させたときは、増殖の阻害に対する強力な効果が検出された（図１２）ことから、ｍｉＲ−１８１ａは、それ自体で老化を誘導するのに十分であることが示される。ｍｉＲ−１８１ａをトランスフェクトすると、増殖および老化の誘導のいずれにおいても、統計学的評価により有意な変化が示される（±ｓ．ｄ．：スチューデントのｔ検定による＊ｐ値＜０．０１、＊＊ｐ値＜０．００５）（図１１）。
【０１５７】
ケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１９１の過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導するのに十分である
ＢｒｄＵの取込みおよびＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、ｍｉＲ−１９１を過剰発現させたときは、増殖の阻害に対する強力な効果が検出された（図１３）ことから、ｍｉＲ−１９１は、それ自体で老化を誘導するのに十分であることが示される。ｍｉＲ−１９１をトランスフェクトすると、増殖および老化の誘導のいずれにおいても、統計学的評価により有意な変化が示される（±ｓ．ｄ．：スチューデントのｔ検定による＊ｐ値＜０．０１、＊＊ｐ値＜０．００５）（図１３）。
【実施例７】
【０１５８】
若齢および老齢の対象により得られるケラチン生成細胞におけるｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ１８１ａおよびｍｉＲ−１９１の発現
材料および方法
皮膚生検に由来する細胞および培養条件、ウェスタンブロット法およびｍｉＲ解析
若齢個体および老齢個体のヒト皮膚ケラチン生成細胞からのタンパク質抽出物は、Cordiscoら、JID、130：1048〜1062 (2010)において説明されている手順に従い、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（ＩＤＩ−ＩＲＣＣＳ）を介して得た。ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１の相対的定量化は、それぞれ、実施例２〜５において既に説明されているとおりに実施した。
【０１５９】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。
【０１６０】
抗ｐ６３（Ａｂ４、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５００とする）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ、希釈率を１／５０００とする）、抗ｐ１６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、希釈率を１：１０００とする）、抗Ｓｉｒｔ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、希釈率を１／５００とする）を用いた。
【０１６１】
結果
ヒト対象における本発明者らの知見を検証するため、若齢対象（７および１０歳）および老齢対象（７０および７６歳）により単離されたケラチン生成細胞におけるｐ６３およびＳｉｒＴ１の発現について調べた。ウェスタンブロット解析は、若齢対象に由来するケラチン生成細胞において、ｐ６３およびＳｉｒＴ１いずれの発現レベルも、老齢対象に由来するケラチン生成細胞における場合と比較して高いことを示す（図１４Ａ）。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける複製誘導性老化と同様であった（図１４Ｂ）。リアルタイムＰＣＲにより、選択された対象の細胞におけるｍｉＲの発現レベルを評価した（図１４Ｃ〜Ｆ）。ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９１はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏである老齢対象のケラチン生成細胞においても（図１４を参照されたい）、若齢対象のケラチン生成細胞における場合と比較して上方制御されていることから、これらのマイクロＲＮＡはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける老化皮膚においても老化に関与していることが裏付けられる。
【実施例８】
【０１６２】
活性化合物
材料および方法
細胞培養
ヒト新生児初代上皮ケラチン生成細胞（Ｈｅｋｎ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を、ＨＫＧＳ増殖補充物（Ｃａｓｃａｄｅ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養した。分化過程の誘発を回避するため、細胞を、常にサブコンフルエント状態に保持した。細胞は通常、毎週１回継代し、継代間に生じる集団倍加および集団倍加時間を計算するため、各継代時に、採取した細胞数および播種した細胞数を記録した。２代目の継代において、３００，０００個のケラチン生成細胞を、６０ｍｍのディッシュに播種した。翌日、細胞を、表示される濃度の化合物で、４８時間にわたり、培地を交換せずに処置した。培地内で擦り取ることにより、細胞を回収した。細胞を、８００ｇで５分間にわたり遠心分離し、ＲＮＡを抽出した。
【０１６３】
ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析
全ＲＮＡ抽出のための製造元のプロトコールに従い、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｒＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、細胞から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを定量化し、アガロースゲル上でＲＮＡの品質を調節した。マイクロＲＮＡを検出するため、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いてＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｍｉＲ−１３０ａ、−１３８、−１８１ａおよび−１９１に特異的なプライマーによりｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｕ１８（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を内部対照として用いた。各遺伝子およびｍｉＲの発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）から規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＵ１８の発現に照らして標準化した後に、２−ΔΔＣｔ法を用いることにより計算した。
【０１６４】
本発明の工程に従い、以下の化合物について調べ、以下の結果を得た。
【０１６５】
【表１】
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【実施例９】
【０１６６】
化粧組成物（Ｏ／Ｗセラム（serum））
当業者は、以下の組成物を、古典的な方法により調製することができる。
【０１６７】
【表２】
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（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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