(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよび／またはその前駆体のレベルが低いオオムギベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的Ｓ−アデノシルメチオニン：メチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）の完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含むオオムギの植物またはその一部を供給する工程と；
（ｉｉ）該オオムギおよび／または麦芽になったオオムギをマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｉｉ）該ウォートを加熱する工程であって、最大で該ウォートの体積の４％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程と；
（ｉｖ）該加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含み、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよび／またはその前駆体のレベルが低い該オオムギ由来飲料を調製する、方法。
【請求項２】
工程（ｉｉ）の前に、前記オオムギの少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になったオオムギを得る工程、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉ）の前記オオムギおよび／または麦芽になったオオムギが、さらなる添加物をさらに含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）がさらなる成分の存在下で実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）が、オオムギ穀粒を供給する工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記オオムギを、
ａ）該オオムギをスティーピングする工程と；
ｂ）該オオムギを発芽させる工程と；
ｃ）該オオムギをキルン乾燥する工程と
を含む方法を用いて麦芽にし、
該オオムギをキルン乾燥する工程が、最大で８０℃の温度で実施される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウォートを、最大で９９．８℃の温度まで加熱する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｉｖ）が、前記ウォートを発酵させる工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
３０分超にわたり８０℃を超える温度まで加熱することを伴わない、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
オオムギ植物体またはその一部であって、該オオムギ植物体が、
ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、
ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、
ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含む、オオムギ植物体またはその一部。
【請求項１１】
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、開始コドンの最大で７０５コドン下流に位置する未熟終止コドンを含む、請求項１０に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１２】
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、開始コドンの最大で７０７コドン下流に位置する未熟終止コドンを含む、請求項１０から１１のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１３】
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が、イントロンの５’側スプライス部位内の変異である、請求項１０から１１のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１４】
前記ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が、イントロンの５’末端の塩基のＧ→Ａ変異である、請求項１３に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１５】
前記変異の結果として、野生型ＭＭＴのＮ末端断片を含むＭＭＴの切断形態をコードする遺伝子がもたらされ、ここで、該Ｎ末端断片が、配列番号１３の最大で５００のＮ末端アミノ酸残基を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１６】
前記ＭＭＴの切断形態が、野生型ＭＭＴにおいては見出されないさらなるＣ末端配列をさらに含む、請求項１５に記載のオオムギ植物体またはその一部。
【請求項１７】
加工オオムギ植物体、またはその一部を含む麦芽組成物であって、該オオムギ植物体は、請求項１０から１６のいずれかに記載のオオムギ植物体である、組成物。
【請求項１８】
オオムギベースの飲料であって、該飲料は、１０ｐｐｂ未満のジメチルスルホキシド（ＤＭＳ）のレベルおよび５０ｐｐｂ未満のＳ−メチルーメチオニン（ＳＭＭ）のレベルを含む、飲料。
【請求項１９】
２未満であるＴ２Ｎポテンシャルのレベルを含む、請求項１８に記載の飲料。
【請求項２０】
ビールである、請求項１８から１９のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項２１】
非アルコール性の麦芽飲料である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願で引用されるすべての特許参考文献および非特許参考文献は、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明はオオムギベースの飲料、例えば、ビールなどの麦芽ベースの飲料を調製するための、エネルギーを節約した方法に関する。本発明はさらに、本開示の方法において有用なオオムギ植物体に関する。具体的には、本発明は、本明細書に記載のオオムギベースの飲料を調製するための、エネルギーを節約した方法に特に有用な、１つの植物体においてヌルリポキシゲナーゼ−１（ヌルＬＯＸ−１）、ヌルリポキシゲナーゼ−２（ヌルＬＯＸ−２）およびヌルＳ−アデノシルメチオニン：メチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ヌルＳ−メチオニン（Ｍｅｔ）−Ｓ−メチルトランスフェラーゼまたはヌルＭＭＴとも称する）の形質の組合せを有するオオムギ植物体、すなわちヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体（本明細書では、互換的に二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴとも称する）について記載する。
【背景技術】
【０００３】
麦芽製造施設および醸造所
オオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，Ｌ．は、食物および飲料を生産するために、異なる気候において広範に栽培されている二倍体の穀類である。前記植物体ベースの飲料は、例えば、麦芽製造施設および醸造施設において、それぞれキルン乾燥操作およびウォート煮沸操作のために高度にエネルギーを消費する方法を用いて多量に生産される。
【０００４】
麦芽製造は、通常、オオムギ穀粒をスティーピングして発芽を促進した後で、これを高温でキルン乾燥することを伴い、これにより該プロセスが特にエネルギーを消費するものになる。キルン乾燥の重要な目的は、（ｉ）発芽を終結させること；（ｉｉ）発芽したオオムギ穀粒を乾燥させること；（ｉｉｉ）野生型のオオムギにおける酵素、特に、リパーゼおよびＬＯＸ酵素を変性させること；および（ｉｖ）主にＳ−メチル−Ｍｅｔ（ＳＭＭ）からなる硫化ジメチル（ＤＭＳ）前駆体（ＤＭＳＰ）を、揮発性ＤＭＳへと変換させることを含む［通常の淡色麦芽をキルン乾燥した後、ＤＭＳＰ含有量は、乾燥重量で平均４ｐｐｍである（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ、Ｋｕｎｚｅ、２００４年、ＶＬＢ  Ｂｅｒｌｉｎ、１５８〜１６２頁を参照されたい）］。特定の酵素活性（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼなど）は、キルン乾燥の間に保護される。
【０００５】
醸造所では、一般に、４８，０００〜８３，０００ｋＪ／ｈＬの範囲内のエネルギー荷重に相当する、醸造プロセスにおけるエネルギーの約半分が消費される期間がある（Ｍｏｄｅｒｎ  ｂｒｅｗｈｏｕｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｒａｕｗｅｌｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００４年、４１０〜４１２頁）。エネルギーの大部分は、ウォートを煮沸するプロセスにおいて消費され、そのプロセスの目的は、一般に、（ｉ）タンパク質の凝固；（ｉｉ）酵素の不活化；（ｉｉｉ）ウォートの滅菌；（ｉｖ）ホップ化合物の抽出；（ｖ）α酸の異性化；および（ｖｉ）望ましくない揮発性化合物、例えば、それぞれ硫黄様のおよび気のぬけた風味のＤＭＳおよびトランス−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）の蒸発をもたらすことである。
【０００６】
ウォートは、従来、少なくとも５０〜６０分間煮沸して、全体として少なくとも１０〜１５％を蒸発させる（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ、Ｋｕｎｚｅ、２００４年、ＶＬＢ  Ｂｅｒｌｉｎ、第１１章を参照されたい）が、現在は多くの場合、科学技術的な手段により、６〜８％に改善されている。例えば、望ましくない揮発性化合物を注入蒸気へと抽出するストリッピングプロセスと組み合わせて、蒸発をわずか３〜４％に最小化することにより、よりさらにエネルギーの消費を減らすことも試みられている（例えば、Ｂｏｎａｃｃｈｅｌｌｉら、２００７年を参照されたい）。ウォート中の望ましくない、揮発性化合物のレベルにより、蒸発をさらに減らす、またはさらには排除することが難しくなると考えられている。
【０００７】
Ｔ２Ｎ
１９７０年に、ビールに厚紙様のオフフレーバーをもたらす分子として、沸点が８８℃である揮発性のＣ９アルケナールであるＴ２Ｎが特徴付けられた（ＪａｍｉｅｓｏｎおよびＧｈｅｌｕｗｅ、１９７０年）。ヒトにおけるＴ２Ｎの味覚閾値レベルは極めて低く、既に、約０．７ｎＭまたは０．１ｐｐｂであると決定されている（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ、１９７５年）ので、微小なレベルであっても、アルデヒドを伴う生成物は、劣化していると認識される。しかし、新鮮なビールでは一般に、Ｔ２Ｎのレベルが極めて低く（Ｌｅｒｍｕｓｉｅａｕら、１９９９年）、これは、劣化する間のプロセスにより、対応する付加物からの遊離Ｔ２Ｎの放出が促進されることを示している（Ｎｙｂｏｒｇら、１９９９年）。その後の観察により、ウォートのＴ２Ｎポテンシャルと、生成物保存後の遊離Ｔ２Ｎの形成との間の相関が明らかになった（Ｋｕｒｏｄａら、２００５年）。
【０００８】
キルン乾燥およびウォート煮沸とは、オオムギベースの飲料中のＴ２Ｎのレベルの低下を実現するための操作の標的になり得る別々の加工工程を示す。高温でキルン乾燥することにより、リパーゼおよびＬＯＸなどのＴ２Ｎ形成に関与する酵素の不活化がもたらされるが（例えば、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ、Ｋｕｎｚｅ、２００４年、ＶＬＢ  Ｂｅｒｌｉｎ、１６２頁を参照されたい）、遊離Ｔ２Ｎはまた、ウォート煮沸によって除去することもできる。
【０００９】
オオムギ穀粒は、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２、およびＬＯＸ−３として公知である３つのＬＯＸ酵素を含有する（ｖａｎ  Ｍｅｃｈｅｌｅｎら、１９９９年）。ＬＯＸ−１の主要な活性により、リノール酸からの、Ｔ２Ｎおよびトリヒドロキシオクタデカン酸（ＴＨＡ）の両方の前駆体である９−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（９−ＨＰＯＤＥ；ＬＯＸ経路の部分的な概要については図１Ａを参照されたい）の形成が触媒される。ＬＯＸ−２は、１３−ＨＰＯＤＥへのリノール酸の変換を主に触媒し、１３−ＨＰＯＤＥは、味覚閾値が約０．４ｐｐｍと高いＣ６アルデヒドであるヘキセナールへとさらに代謝される（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ、上掲）。ＬＯＸ−２の９−ＨＰＯＤＥ形成活性が極めて低いことから、まず、ＬＯＸ−１により触媒されてリノール酸が９−ＨＰＯＤＥへと変換され、次いで、９−ヒドロペルオキシドリアーゼの作用を介して９−ＨＰＯＤＥが切断されることを伴う生化学経路を介してＴ２Ｎが生成されることに、複数の報告が言及している（例えば、Ｋｕｒｏｄａら、２００３年、２００５年；Ｎｏｏｄｅｒｍｅｅｒら、２００１年を参照されたい）。
【００１０】
上記のＬＯＸ−１の性質に関して、オオムギベースの生成物におけるＴ２Ｎレベルを低下させる試みにおいて、前記酵素が不活化の有用な標的になり、以下の２つの知見によって実際に実証されている：（ｉ）Ｋｕｒｏｄａら（２００５年）は、主に、ウォート中におけるＴ２Ｎポテンシャルの形成に関して、ＬＯＸ−２はそれほど重要でないと考えられていたので、ＬＯＸ−１活性とウォートのＴ２Ｎポテンシャルとの間の相関を示唆した。しかし、麦芽中における全体的なＬＯＸ活性とウォートのＴ２Ｎポテンシャルとの間には相関は見られないようである；（ｉｉ）オオムギ中におけるＬＯＸ−１の活性の低下を得るための方法が記載されている。
【００１１】
ＬＯＸ−１活性が部分的に、または完全に低下した特性を共有する複数の異なるオオムギ植物体が開発されてきた。例えば、Ｄｏｕｍａ，Ａ．Ｃ．らへのＰＣＴ出願第ＷＯ０２／０５３７２１号では、ＬＯＸ−１活性が低いオオムギ穀粒およびオオムギ植物体が開示され、Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．らへのＷＯ２００５／０８７９３４では、ＬＯＸ−１活性を欠損させた、２つの異なるオオムギの変異体（スプライス部位変異体、および未熟翻訳終止コドンを有する変異体）が注目された。さらに、Ｈｉｒｏｔａ，Ｎ．らへの、ＥＰ１６０９８６６において、オオムギ在来種のコレクションをスクリーニングすることにより同定された、ＬＯＸ−１活性を示さないオオムギ植物体について記載された。
【００１２】
ＤＭＳ
オオムギベースの飲料、さらには茶、ココア、乳、ワイン、蒸留酒（ラムなど）、スイートコーン、および多数の調理された野菜を含めた多くの野菜および食糧では、ＤＭＳにより生成物に顕著な匂いおよび風味の特徴が付加される。ビールの種類に応じて、ＤＭＳレベルは、一般には１５０ｐｐｂ（１５０μｇ／Ｌ）に到達し得、多くの場合、前記化合物が望ましくない「調理された野菜」の風味または「キャベツ様」の風味の一因となっている。この点について、知覚閾値が約３０〜４５μｇ／Ｌであることだけでなく（Ｍｅｉｌｇａａｒｄ、１９８２年）、ＤＭＳ由来の風味が、＜１０ｐｐｂのレベルにおいて気づかれないままであることも重要である。
【００１３】
上述のビール生産におけるキルン乾燥およびウォート煮沸の加工工程は、どちらも、主にＤＭＳへのＳＭＭの化学変換を誘導し得るので、オオムギベースの飲料中におけるＤＭＳレベルに影響を及ぼす（例えば、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ、Ｋｕｎｚｅ、２００４年、ＶＬＢ  Ｂｅｒｌｉｎ、１６０頁を参照されたい）。ＤＭＳの沸点はたった３７〜３８℃であるので、ＤＭＳの大部分は簡単に大気中に蒸発する。しかし、ウォート煮沸の持続時間または勢いが、残留するＳＭＭを変換するのに適していない場合、ウォートが冷めるにつれてＤＭＳが形成され続け、高確率でビールに移り得る。
【００１４】
ＳＭＭは、ＳＭＭサイクルの機能的成分の作用によって合成された、発芽しているオオムギ穀粒中におけるＤＭＳＰプールのほとんどすべて、おそらくすべてを表す（図１Ｂ）。ここで、ＭＭＴは、Ｓ−アデノシル−Ｍｅｔ（ＡｄｏＭｅｔ）からＭｅｔへのメチル基の転移を触媒し、ＳＭＭを形成する。次にＳＭＭが、酵素Ｈｃｙ−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）によって触媒される反応であるホモシステイン（Ｈｃｙ）からのＭｅｔ合成のためのメチル供与体として機能し得る。
【００１５】
科学文献において、例えば、アンチセンス技術を用いることによりＳＭＭ合成を調節する機会が研究されている（ＭｃＥｌｒｏｙおよびＪａｃｏｂｓｅｎ、１９９５年）。しかし、アンチセンスに対する関連性のある標的遺伝子についての手引きはもたらされなかった。それにもかかわらず、ＳＭＭレベルの大きな低下がオオムギの成長および発達に有害であり得るので、正の結果の可能性は疑わしいことが予測された。ＭｃＥｌｒｏｙおよびＪａｃｏｂｓｅｎ（上掲）はより低いレベルのＳＭＭを得るための代替の解決については論じなかった。また、本明細書において以下で詳細に論じられている通り、オオムギにおいて遺伝子発現を完全に無効にするために、アンチセンス技術は首尾よく適用されていない。
【００１６】
ビール中のＤＭＳレベルを低下させるための科学技術的方法が開発されてきた。したがって、ＡＵ３８５７８／９３では、麦芽を蒸気処理する工程を含む、麦芽中におけるＤＭＳレベルを低下させる方法が記載されている。Ｂｉｓｇａａｒｄ−Ｆｒａｎｔｚｅｎ，Ｈ．らへの特許出願第ＵＳ２００６／００５７６８４号には、マッシュを７０℃以上で加熱処理する工程を含む醸造方法が記載されている。また、Ｒｅｕｔｈｅｒ，Ｈ．への米国特許第５，２４２，６９４号では、ウォートを大規模に煮沸し、その後に前記ウォートを二酸化炭素（ＣＯ２）で洗浄する工程を含む、低炭水化物ビールを調製するための方法が特に言及された。しかし、上述の処理はすべて、高レベルのエネルギーを消費し、麦芽またはウォートの特性を変化させる可能性があることが公知である。
【００１７】
変異体オオムギ植物体
残念ながら、所与のタンパク質の発現を完全に欠くトランスジェニックのオオムギ植物体を調製するための利用可能な方法はない。オオムギの場合一般に、アンチセンス技術を適用すると、問題のタンパク質の一部を依然として発現するトランスジェニック植物が生成される（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら１９９８年；Ｓｔａｈｌら、２００４年；Ｈａｎｓｅｎら、２００７年を参照されたい）。また、オオムギ植物体において用いるための、キメラＲＮＡ／ＤＮＡまたは部位特異的変異誘発を用いて特定の変異を調製するのに有効な方法も開発されていない。これと一致して、また集中的な試みにもかかわらず、本出願の発明者らは、オオムギにおけるオリゴヌクレオチド指向の遺伝子標的化について、公表されたいかなる成功例も未だに見出していない。オオムギにおいては探究されていないが、ＩｉｄａおよびＴｅｒａｄａ（２００５年）は、トウモロコシ、タバコおよびコメにおいて、オリゴヌクレオチド指向の遺伝子標的化が試験されている（しかし、すべての場合において、除草剤耐性遺伝子アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）が標的とされている）ことに言及している。ＩｉｄａおよびＴｅｒａｄａ（上掲）による結論によると、上述の戦略が、適切な改変を伴って、ＡＬＳ遺伝子など、直接的に選択可能な遺伝子以外の遺伝子に適用可能であり得るかどうかは、未だに確立されていない。まだ実証されてはいないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる標的化変異誘発は、将来、基礎的な植物生物学を研究し、または作物植物を改変することを潜在的に可能にし得る別のツールを表す（Ｄｕｒａｉら、２００５年；ＴｚｆｉｒａおよびＷｈｉｔｅ、２００５年；Ｋｕｍａｒら、２００６年）。しかし、この場合もまた、オオムギでは、変異誘発が追及されていないし、有効に適用されてもいない。
【００１８】
それにもかかわらず、穀粒をアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）の溶液と共に１２時間から一晩の間インキュベートすることなど、照射または化学的処理を用いるランダム変異誘発により、オオムギ変異体を調製することができる。例は、低フィテート（ｐｈｙｔａｔｅ）の変異体を同定するために、ＮａＮ３を用いることによりオオムギ穀粒を変異誘発させ、その後、高レベルの遊離ホスフェートをスクリーニングすることに関し（ＲａｓｍｕｓｓｅｎおよびＨａｔｚａｃｋ、１９９８年）、スクリーニングされた２，０００個の穀粒から、計１０個の変異体が同定された。常に可能であることからは遠いが、ＮａＮ３処理後に特定の変異体を見出すことは、粘り強さおよび有効なスクリーニング方法次第である。
【００１９】
持続可能性
世界中が求めている、エネルギー問題、環境問題および食物問題に対する解決において、社会の１つの焦点は、大気中のＣＯ２濃度を制限するまたは低下させることであり、特に、産業上のシステムからのＣＯ２の放出が注目されている。主な理由は、温室ガスの濃度が上昇することにより、地球のエネルギー平衡に変化が引き起こされることであり、ＣＯ２はその最も大きな単一の原因である。気候の変化に対する広範にわたる懸念の結果として、かつ経済的な理論的根拠および制約にも基づいて、醸造所は、エネルギーをできるだけ効率的に用いることにより、操作からの温室ガスの放出をより有効に軽減することにより、積極的な役割を果たし得る。これまで、焦点は、持続可能性に対する上記の問題を解くための科学技術的な手段に置かれてきた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
ＬＯＸ活性およびＤＭＳレベルを低下させるための加熱処理方法が記載されている。前記処理は、一般に、麦芽製造の間および／またはウォートの調製の間においてなされ、つまり、オオムギでは、加熱処理を行うまで、ＬＯＸ活性を有する生成物の蓄積が可能となる。オオムギの解析により、麦芽製造の前であっても、オオムギ内には、著明量のＬＯＸ活性を有する生成物が存在することが明らかとなった（ＷａｃｋｅｒｂａｕｅｒおよびＭｅｙｎａ、２００２年）。加熱処理方法は高度にエネルギーを消費することが明らかである。
【００２１】
本発明は、エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低い（特にＤＭＳおよびＴ２Ｎおよびその前駆体のレベルが低い）穀類ベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含む穀類植物またはその一部を供給する工程と；
（ｉｉ）必要に応じて前記穀類の少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になった穀類を得る工程と；
（ｉｉｉ）前記穀類および／または麦芽になった穀類、ならびに必要に応じてさらなる添加物（ａｄｊｕｎｃｔ）をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）前記ウォートを、必要に応じてさらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程であって、最大でウォートの体積の４％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程と；
（ｖ）前記加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含み、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低い穀類由来飲料を調製する、方法を提供する。
【００２２】
特に、本発明は、エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低い（特に、ＤＭＳおよびＴ２Ｎおよびその前駆体のレベルが低い）オオムギベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含むオオムギ植物体またはその一部を供給する工程と：
（ｉｉ）必要に応じて前記オオムギの少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になったオオムギを得る工程と；
（ｉｉｉ）前記オオムギおよび／または麦芽になったオオムギ、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）前記ウォートを、必要に応じてさらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程であって、最大でウォートの体積の４％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程と；
（ｖ）前記加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含み、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低いオオムギ由来飲料を調製する、方法を提供する。
【００２３】
本開示の方法において用いるために適したオオムギ植物体を提供することもまた、本発明の目的である。したがって、農業に有用な、３つの異なる形質のすべてを含むオオムギ植物体、すなわちヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体（本明細書では、「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴ」とも表される）を提供することが本発明の目的である。有用なオオムギ植物体の選択は、植物体の成長力だけでなく、ＬＯＸ−１酵素活性、ＬＯＸ−２酵素活性およびＭＭＴ酵素活性の喪失の組合せにも関し、本明細書の下記に詳細に記載する生化学的アッセイを利用する。本発明によるオオムギ植物体は、自家受粉、戻し交配、集団への異種交配など、任意の適切な育種のスキームへと導入することができる。
【００２４】
植物育種のプロセスを加速化させる方法は、組織培養法および組織再生法を適用することにより、生成された変異体を初期繁殖させる工程を含む。実施例３において記載し、図３に概略的に示す通り、従来のオオムギ育種のスキームを用いて、二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体とヌルＭＭＴの植物体から、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質を有するオオムギ植物体を生成させた。したがって、本発明の別の態様は、増殖および分化すると二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質を有するオオムギ植物体を生成させる細胞を提供することである。例えば、育種は、従来の異種交配、葯培養などの組織培養を用いて葯に由来する繁殖力のある倍加半数体植物を調製すること、または小胞子の培養を伴い得る。
【００２５】
本発明は、ヌルＬＯＸの穀粒を適用することにより、内在性のＬＯＸ酵素を不活化する必要がなくなるので、キルン乾燥のためのエネルギー投入の低減が実現可能であることを開示している。本発明に記載されている二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの変異体は、対応する酵素活性を欠く原料を生成するために利用することができ、これにより、対象の変異体は、麦芽製造施設におけるキルン乾燥の間だけでなく、醸造所においても、ウォート煮沸の間の熱の投入が減るので、より低いエネルギーの消費が実現される。
【００２６】
ビールまたは飲料の品質の観点から、生成物におけるＴ２ＮレベルおよびＤＭＳレベルを機能的に排除するまたは徹底的に低下させるためにも、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの原料が必要である。
【００２７】
上記の、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽のポテンシャル特性に加えて、対応するオオムギは、本明細書において麦芽製造プロセスを省略するが、その代わりに多数の外部の酵素（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓにより生産された酵素混合物Ｏｎｄｅａ  Ｐｒｏ）からなるマッシュを供給することにより作製されたビールと定義される、オフフレーバーの少ないオオムギビールを作製するためにも有用であり得る。本明細書の下記の実施例７において取り組んでいる通り、本発明者らは、驚くべきことに、麦芽にしていない（ｕｎｍａｌｔｅｄ）二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ原料をマッシングすることにより生成されるウォートが含有するＴ２ＮオフフレーバーおよびＤＭＳオフフレーバーのレベルは極めて低いが、驚くべきことに、野生型のオオムギ由来のものは、オオムギ穀粒を発芽させていないにもかかわらずＤＭＳレベルが高いことを見出した。したがって、一部のＤＭＳ前駆体（ＤＭＳＰ）は、乾燥した成熟オオムギ穀粒に存在するに違いなく、新規の未だ記載されていない特性であり、本出願のビール生成物において調査する。したがって、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒は、オオムギ醸造ウォートおよびビールの生産において、新鮮なビール生成物および劣化したビール生成物におけるＴ２ＮレベルおよびＤＭＳレベルを最小限にするために有用である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよび／またはその前駆体のレベルが低い穀類ベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的Ｓ−アデノシルメチオニン：メチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）の完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含む穀類の植物またはその一部を供給する工程と；
（ｉｉ）必要に応じて該穀類の少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になった穀類を得る工程と；
（ｉｉｉ）該穀類および／または麦芽になった穀類、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）該ウォートを、必要に応じてさらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程であって、最大でウォートの体積の４％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程と；
（ｖ）該加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含み、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよび／またはその前駆体のレベルが低い該穀類由来飲料を調製する、方法。
（項目２）
エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよび／またはその前駆体のレベルが低いオオムギベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的Ｓ−アデノシルメチオニン：メチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）の完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含むオオムギ植物体またはその一部を供給する工程と：
（ｉｉ）必要に応じて前記穀類の少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になった穀類を得る工程と；
（ｉｉｉ）該穀類および／または麦芽になった穀類、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）該ウォートを、必要に応じてさらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程であって、最大でウォートの体積の４％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程と；
（ｖ）該加熱ウォートを飲料へと加工する工程と；
を含み、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよび／またはその前駆体のレベルが低い該穀類由来飲料を調製する方法である、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（ｉ）が、オオムギ穀粒を供給する工程を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記オフフレーバーが、硫化ジメチル（ＤＭＳ）およびトランス−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
低レベルの前記ＤＭＳが、３０ｐｐｂを下回る、好ましくは２５ｐｐｂ未満、より好ましくは２０ｐｐｂ未満のＤＭＳのレベルであり、Ｔ２Ｎのレベルが、０．０２４ｐｐｂを下回るなど、０．０２５ｐｐｂを下回る、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記オフフレーバーの前駆体がＳ−メチルメチオニン（ＳＭＭ）およびＴ２Ｎポテンシャルである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
低レベルの前記ＳＭＭおよびＴ２Ｎポテンシャルが、５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満のＳＭＭのレベルであり、Ｔ２Ｎポテンシャルのレベルが２未満、好ましくは１．５ｐｐｂ未満である、項目６に記載の方法。
（項目８）
低レベルの前記ＳＭＭが、５０ｐｐｂ未満、好ましくは４０ｐｐｂ未満、より好ましくは３０ｐｐｂ未満、なおより好ましくは２０ｐｐｂ未満のＳＭＭのレベルであり、低レベルの前記Ｔ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈから同じ方法で調製した飲料中におけるＴ２Ｎポテンシャルのレベルの６０％未満、好ましくは５０％未満のＴ２Ｎポテンシャルのレベルである、項目６に記載の方法。
（項目９）
供給される前記オオムギのすべてを麦芽にする、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記オオムギを、
ａ）該オオムギをスティーピングする工程と；
ｂ）該オオムギを発芽させる工程と；
ｃ）該オオムギをキルン乾燥する工程と
を含む方法を用いて麦芽にする、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記オオムギをキルン乾燥する工程が、最大で８０℃の温度で、さらにまたより好ましくは最大で７５℃の温度、例えば最大で７０℃の温度、例えば最大で６５℃の温度、例えば最大で６０℃の温度、例えば最大で５５℃の温度、例えば最大で５０℃の温度、例えば最大で４５℃の温度、例えば最大で４０℃の温度で実施される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記キルン乾燥する温度が、キルン乾燥の間のいずれの時間においても８０℃を超えない、好ましくは７５℃を超えない、項目１０から１１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
供給される前記オオムギのいずれも麦芽にしない、項目２から７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記オオムギおよび／または麦芽になった前記オオムギを前記マッシングの前に破砕する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ウォートの組成物が、６９℃を超えない温度でのマッシングを用いるマッシング工程を伴う方法によって生成されている、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
マッシング中の前記温度が、いずれの時間においても８０℃、好ましくは７８℃を超えない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
工程（ｉｉｉ）において、トウモロコシ、コメおよびオオムギ以外の麦芽にしていない穀類からなる群から選択されるさらなる添加物（複数可）を添加する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
工程（ｉｖ）において、ホップまたはその抽出物であるさらなる成分（複数可）を添加する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ウォートを、最大で９９．８℃、例えば最大で９９．５℃、例えば最大で９９℃の温度まで加熱する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ウォートの加熱にかかわる工程（ｉｖ）を、本質的に密閉された容器内の該ウォートを用いて、好ましくは密閉された容器内の該ウォートを用いて実施する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ウォートを、最大で３０分間、好ましくは最大で２０分間にわたり、８０℃を超える温度まで加熱する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
最大で３％、例えば最大で２％、例えば最大で１％、例えば最大で０．５％、例えば最大で０．１％、例えば最大で０．０１％の前記ウォートの体積を蒸発させる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
工程ｖ）が、前記加熱ウォートを冷却する工程を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
工程ｖ）が、前記ウォートを発酵させる工程を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
いずれの工程においても９９℃を超える温度まで加熱することを伴わない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
３０分超にわたり、好ましくは２０分超にわたり８０℃を超える温度まで加熱することを伴わない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、
ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、
ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含む、オオムギ植物体またはその一部。
（項目２８）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、フレームシフト変異、欠失、ナンセンス変異、挿入およびスプライス部位変異からなる群から選択される変異を含む、項目２７に記載のオオムギ植物体。
（項目２９）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、未熟終止コドンを含む、項目２７に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３０）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、開始コドンの最大で７０５コドン、好ましくは最大で６６５コドン下流に位置する未熟終止コドンを含む、項目２７から２９までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３１）
前記植物体のＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、配列番号２の塩基番号３５７２〜３５７４に対応するナンセンスコドンを含む、項目３０に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３２）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、フレームシフト変異、欠失、ナンセンス変異、挿入およびスプライス部位変異からなる群から選択される変異を含む、項目２７から３１までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体。
（項目３３）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が未熟終止コドンを含む、項目２７から３２までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３４）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、開始コドンの最大で７０７コドン、好ましくは最大で６８４コドン下流に位置する未熟終止コドンを含む、項目２７から３３までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３５）
前記植物体のＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、配列番号５の２６８９位のヌクレオチドにおいて変異を含み、終止コドンの形成をもたらす、項目３４に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３６）
前記植物体のＭＭＴをコードする遺伝子が、フレームシフト変異、欠失、ナンセンス変異、挿入およびスプライス部位変異からなる群から選択される変異を含む、項目２７から３５までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体。
（項目３７）
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が、スプライス部位内にある、項目２７から３６までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３８）
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が、イントロンのスプライス部位内にある、項目２７から３７までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目３９）
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が、イントロンの５’末端の塩基のＧ→Ａ変異など、イントロンの５’側スプライス部位内の変異である、項目２７から３８までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目４０）
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が、イントロン２および５からなる群から選択されるイントロンの５’側スプライス部位内の変異である、項目２７から３９までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目４１）
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が配列番号９の塩基番号３０７６のＧ→Ａ変異である、項目４０に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目４２）
ＭＭＴをコードする遺伝子における変異が配列番号１１の塩基番号１４６２のＧ→Ａ変異である、項目４０に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目４３）
前記変異の結果として、野生型ＭＭＴのＮ末端断片と、必要に応じて、野生型ＭＭＴにおいては見出されないさらなるＣ末端配列とを含むＭＭＴの切断形態をコードする遺伝子がもたらされ、ここで、該Ｎ末端断片が、配列番号１３の最大で５００、より好ましくは最大で４５０、なおより好ましくは最大で４００、さらにまたより好ましくは最大で３５０、なおより好ましくは最大で３２０、さらにまたより好ましくは最大で３１１、または最大で２８８のＮ末端アミノ酸残基を含む、項目２７から４２までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目４４）
「Ｂａｒｌｅｙ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ：８０６３系統」と称し、２００８年１０月１３日に番号ＰＴＡ−９５４３でＡＴＣＣへと寄託されたオオムギ植物体および「Ｂａｒｌｅｙ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．：Ａ６８９系統」と称し、寄託番号ＰＴＡ−９６４０でＡＴＣＣへと寄託されたオオムギ植物体の子孫である、項目２７から４３までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部。
（項目４５）
項目２７から４４までのいずれかに記載のオオムギ植物体である、加工オオムギ植物体、またはその一部を含む麦芽組成物。
（項目４６）
前記オオムギ植物体の前記一部が穀粒（複数可）である、項目４５に記載の麦芽組成物。
（項目４７）
緑麦芽およびキルン乾燥された麦芽からなる群から選択される、項目４５から４６までのいずれか一項に記載の麦芽組成物。
（項目４８）
破砕麦芽である、項目４５から４７までのいずれか一項に記載の麦芽組成物。
（項目４９）
最大で２μｇ／ｇ、好ましくは最大で１μｇ／ｇ、より好ましくは最大で０．５μｇ／ｇ、なおより好ましくは最大で０．２μｇ／ｇのＳＭＭを含む、項目４５から４８までのいずれかに記載の麦芽組成物。
（項目５０）
項目２７から４４までのいずれか一項に記載のオオムギ植物体またはその一部から調製されるオオムギベースの飲料。
（項目５１）
項目２から２６までのいずれか一項に記載の方法により調製される、項目５０に記載の飲料。
（項目５２）
麦芽飲料である、項目５０から５１までのいずれか一項に記載の飲料。
（項目５３）
発酵麦芽飲料である、項目５０から５２までのいずれか一項に記載の飲料。
（項目５４）
ビールである、項目５０から５３までのいずれか一項に記載の飲料。
（項目５５）
オオムギビールである、項目５０から５１まで、および５４のいずれか一項に記載の飲料。
（項目５６）
非アルコール性の麦芽飲料である、項目５０から５５までのいずれか一項に記載の飲料。
（項目５７）
野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈから同じ方法で調製された飲料と比較して、少なくとも１．５倍多い、好ましくは少なくとも２倍多い、さらにまたより好ましくは少なくとも３倍多い泡を６０〜８０分間に生成する、項目５０から５６までのいずれか一項に記載の飲料。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Ｔ２Ｎ（Ａ）およびＳＭＭ（Ｂ）の形成を導くオオムギの生化学的経路の簡略化した概説を示す図である。三重ヌルのオオムギにおいて欠如している酵素を黒色四角で強調する。酵素の略号は、本出願において定義されるものである。図１Ｂは、酵素Ｍｅｔ−Ｓ−メチル基転移酵素（ＭＭＴ）によって触媒されるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からメチオニン（Ｍｅｔ）へのメチル転移によってＳＭＭが合成される、ＳＭＭサイクルの選択された成分を示す図である。ＳＭＭは、今度は酵素Ｈｃｙ−Ｓ−メチル基転移酵素（ＨＭＴ）によって触媒される反応において、ホモシステイン（Ｈｃｙ）からのＭｅｔ合成用のメチルドナーとして作用することができる。図は、本質的に不可逆的な反応がどのように関係しているかを示す。サイクルの各回（ｔｕｒｎ）は、ＡＴＰをアデノシン、ＰＰｉおよびＰｉに変換する（図示せず）一方で２個のＭｅｔを消費し、次いで再生することから無益である。
【図２Ａ】図２は、変異体８０６３および変異体１４０１８のヌルＭＭＴ表現型を検証するためのＨＰＬＣ実験の結果を示す図である。（Ａ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの苗条（ｓｈｏｏｔ）由来の抽出物のＨＰＬＣに基づく分離についての例であり、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出を示す。オオムギ苗条のＯＰＡ誘導体化抽出物の蛍光は３４０ｎｍで励起され、発光は４５０ｎｍで測定された。（Ｂ）表示の変異体および野生型栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ由来の抽出物のＨＰＬＣに基づく分離。変異体抽出物における成分の分離は、ＳＭＭ特異的ピークを有さないクロマトグラムを示した。
【図２Ｂ】図２は、変異体８０６３および変異体１４０１８のヌルＭＭＴ表現型を検証するためのＨＰＬＣ実験の結果を示す図である。（Ａ）栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの苗条（ｓｈｏｏｔ）由来の抽出物のＨＰＬＣに基づく分離についての例であり、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出を示す。オオムギ苗条のＯＰＡ誘導体化抽出物の蛍光は３４０ｎｍで励起され、発光は４５０ｎｍで測定された。（Ｂ）表示の変異体および野生型栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ由来の抽出物のＨＰＬＣに基づく分離。変異体抽出物における成分の分離は、ＳＭＭ特異的ピークを有さないクロマトグラムを示した。
【図３】図３は、ヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２（二重ヌルＬＯＸ）とヌルＭＭＴのオオムギ植物体との異種交配から三重ヌルのオオムギへのワークフローを例示する図である。
【図４】図４は、表示の植物体由来の試料におけるＬＯＸ活性に注目する図である。成熟オオムギ穀粒における総ＬＯＸ活性測定の結果は灰色のバーで示され、黒色バーは発芽した胚におけるＬＯＸ−２活性を示す。極めて低いＬＯＸ活性がヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２および三重ヌルの植物体の両方において観察された。
【図５】図５は、発芽した三重ヌルの植物体がＳＭＭを合成できない（上パネル、ＵＰＬＣクロマトグラムにおいて対応するピークがない）一方で、発芽した野生型オオムギ栽培品種Ｑｕｅｎｃｈの抽出物においては対応するクロマトグラムピークとして前記化合物が容易に検出可能である（下パネル）ことを示す図である。選択されたアミノ酸の溶出位置が示されている。
【図６Ａ】図６は、（Ａ）マイクロモルティングおよびマッシングのワークフローを図解的に詳述する図であり、付加的に（Ｂ）野生型オオムギおよび（Ｃ）三重ヌルの変異体由来の穀粒のパイロットモルティング、マッシングおよび醸造を詳述する。個々の試料（灰色の四角で表す）の流れは矢印と共に例示される。開始、中間および最終の生成物は、太字でリストの最上部に表され、プロセスはイタリック字体で表される。（Ａ）においてフローリストの下のイタリックの数字は、遊離Ｔ２Ｎおよびその前駆体（２および４）ならびにＤＭＳＰおよびＤＭＳ（１、２、３）のレベル測定のための試料採取点を示し、ここで測定点４は冷却、加熱後ウォートを表す。オオムギフラワー（ｆｌｏｕｒ）のマイクロマッシングについては、試料は試料採取点２、３および４で測定された。（Ｂ）および（Ｃ）においてＤＭＳＰ、ＤＭＳ、Ｔ２Ｎ前駆体および遊離Ｔ２Ｎレベルは、すべての試料採取点で測定された。
【図６Ｂ】図６は、（Ａ）マイクロモルティングおよびマッシングのワークフローを図解的に詳述する図であり、付加的に（Ｂ）野生型オオムギおよび（Ｃ）三重ヌルの変異体由来の穀粒のパイロットモルティング、マッシングおよび醸造を詳述する。個々の試料（灰色の四角で表す）の流れは矢印と共に例示される。開始、中間および最終の生成物は、太字でリストの最上部に表され、プロセスはイタリック字体で表される。（Ａ）においてフローリストの下のイタリックの数字は、遊離Ｔ２Ｎおよびその前駆体（２および４）ならびにＤＭＳＰおよびＤＭＳ（１、２、３）のレベル測定のための試料採取点を示し、ここで測定点４は冷却、加熱後ウォートを表す。オオムギフラワー（ｆｌｏｕｒ）のマイクロマッシングについては、試料は試料採取点２、３および４で測定された。（Ｂ）および（Ｃ）においてＤＭＳＰ、ＤＭＳ、Ｔ２Ｎ前駆体および遊離Ｔ２Ｎレベルは、すべての試料採取点で測定された。
【図６Ｃ】図６は、（Ａ）マイクロモルティングおよびマッシングのワークフローを図解的に詳述する図であり、付加的に（Ｂ）野生型オオムギおよび（Ｃ）三重ヌルの変異体由来の穀粒のパイロットモルティング、マッシングおよび醸造を詳述する。個々の試料（灰色の四角で表す）の流れは矢印と共に例示される。開始、中間および最終の生成物は、太字でリストの最上部に表され、プロセスはイタリック字体で表される。（Ａ）においてフローリストの下のイタリックの数字は、遊離Ｔ２Ｎおよびその前駆体（２および４）ならびにＤＭＳＰおよびＤＭＳ（１、２、３）のレベル測定のための試料採取点を示し、ここで測定点４は冷却、加熱後ウォートを表す。オオムギフラワー（ｆｌｏｕｒ）のマイクロマッシングについては、試料は試料採取点２、３および４で測定された。（Ｂ）および（Ｃ）においてＤＭＳＰ、ＤＭＳ、Ｔ２Ｎ前駆体および遊離Ｔ２Ｎレベルは、すべての試料採取点で測定された。
【図７】図７は、三重ヌルの麦芽から作られたビールが、加圧または通常ウォート煮沸にかかわらず、野生型栽培品種Ｑｕｅｎｃｈの麦芽で醸造されたビールよりも約４倍多いビール泡を発生させることを示す図である。
【図８】図８は、ＮａＮ３変異誘発されたオオムギ穀粒が、どのように繁殖することができるかについての一例を示す。Ｍ０世代の穀粒は、Ｍ１世代の穀粒を発達させる植物体に成長する。これらの種子をまき、Ｍ２世代の新しい穀粒を生成するＭ１植物体に発達させることができる。次に、Ｍ２植物体が成長し、Ｍ３世代の穀粒を実らせる。例えば、Ｍ３世代の発芽した植物体の子葉鞘を解析するために、Ｍ３世代の穀粒を発芽させることができる。加えて、Ｍ３世代の植物体の穀粒に由来する花を、オオムギの系統または栽培品種との異種交配に用いて、Ｍ４世代の植物体を得ることができる。Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．らへのＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号の図１Ａと同様の図を示す。
【図９】図９は、好ましいビール生成プロセスの簡略化した図による概説を示す図である。生成プロセスは、オオムギ穀物をスティーピングする工程（１）と、麦芽にする工程（２）と、キルン乾燥する工程（３）と、乾燥麦芽を破砕する工程（４）と、マッシングする工程（５）と、濾過する工程（６）と、添加されたホップの存在下でウォートを煮沸する工程（７）と、酵母の存在下で発酵させる工程（８）と、ビールを熟成させる工程（９）と、ビールを濾過する工程（１０）と、詰める工程、例えば、瓶、缶などに詰める工程（１１）と、ラベルを貼る工程（１２）とを含む。個々のプロセスは、麦芽生成（１−３）と、ウォート生成（４−７）と、発酵（８−９）と、完成したビールの調製（１０−１２）とで構成されるセクションに分類することができる。好ましい方法を例示したが、示した工程の一部を省略する他の方法を想定することができる（例えば、濾過を省略してよく、またはホップを添加しなくてよい、あるいは、添加物、砂糖、シロップまたはカーボネートの添加など付加的な工程を加えることができる）。
【図１０】図１０は、ヌルＬＯＸ−１由来ＤＮＡ断片が、どのようにして、ヌルＬＯＸ−１原材料を使用して作製されたビール（５０％ヌルＬＯＸ−１を含む混合物）およびウォート試料（三重ヌル）においては同定され、一方、通常麦芽と野生型オオムギ（Ｔｕｂｏｒｇ）との混合物のフラワーを使用して作製されたビールにおいては同定されなかったかを例示する図である。最後のＰＣＲ増幅の鋳型容量は示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
以下の説明、図、および表では、多くの用語が用いられる。このような用語に与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲を記載する目的で、以下の定義を与える。
【００３０】
本明細書で用いられる「ある（ａ）」とは、それが用いられる文脈に応じて、１つ以上を意味し得る。
【００３１】
「農業形質」という用語は、植物体の生産力または経済的価値に寄与する、その植物体の表現型形質または遺伝形質について説明する。このような形質には、病害耐性、虫害耐性、ウイルス耐性、線虫耐性、干ばつ忍容性、高塩分忍容性、収量、草高、成熟日数、穀粒の粒ぞろい（すなわち、穀粒サイズの分画）、穀粒の窒素含量などが含まれる。
【００３２】
オオムギベースの飲料（例えば、ビール）の製造のプロセスに関して、特に、麦芽製造プロセスを記載するのに用いる場合の「オオムギ」という用語は、オオムギの穀粒を意味する。別段に指定しない限り、他のすべての場合、「オオムギ」が任意の育種系統または栽培品種または品種を含めたオオムギ植物体（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，  Ｌ．）を意味するのに対し、オオムギ植物体の一部とは、オオムギ植物体の任意の一部、例えば、任意の組織または細胞であり得る。
【００３３】
「オオムギの醸造」プロセスにおいて、ウォートは、麦芽にしていないオオムギの抽出物を、オオムギ成分を加水分解する酵素混合物と共にインキュベートすることにより調製する。オオムギの醸造により生成されるウォートは、「オオムギウォート」、または「オオムギ醸造」ウォートと称することができる。
【００３４】
「病害耐性」とは、植物体が、植物体−病原体間相互作用の結果である病害症状を回避することを意図する。このようにして、病原体が、植物病害、ならびに関連する病害症状を引き起こすことが予防される。代替的に、病原体により引き起こされる病害症状は、最小化または軽減されるか、またはなお予防される。
【００３５】
本明細書で用いられる「ＤＭＳＰ」とは、ＤＭＳ前駆体またはＤＭＳポテンシャル、すなわち、飲料の作製の間においてＤＭＳへと変換され得る分子の略号である。ＳＭＭが、ＤＭＳＰの全部ではないにせよ、その主要部分を占める。本明細書では、特定の植物材料またはその生成物において、アルカリ性の条件で１時間にわたり煮沸することによりＤＭＳＰから生成され得るＤＭＳの量として、ＤＭＳＰのレベルを定義する。本明細書で定義される場合、１ｐｐｂのＤＭＳＰは、１ｐｐｂのＤＭＳに変換され得る。
【００３６】
本明細書で用いられる「二重ヌルＬＯＸ」という用語は、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異および機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異を指す。したがって、「二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体」とは、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを含むオオムギ植物体である。  同様に、「二重ヌルＬＯＸの穀粒」とは、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異とを有する穀粒である。
【００３７】
「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴ」という用語は、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異、および機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異を指す。したがって、「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体」とは、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを含むオオムギ植物体である。同様に、「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒」とは、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを有する穀粒である。有用な二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの例は「三重ヌル」と称し、本明細書の下記の実施例に記載する。
【００３８】
本明細書で定義される「穀類」植物とは、主にそれらのデンプン含有種子または穀粒のために栽培される、イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ）植物のメンバーである。穀類植物には、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ属）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属）、コメ（Ｏｒｙｚａ属）、トウモロコシ（Ｚｅａ属）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ属）、オートムギ（Ａｖｅｎａ属）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ属）、ならびにライムギとコムギとの交配種であるライコムギが含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
特定の核酸との関連における「コードする」または「コードされる」とは、特定のタンパク質へと翻訳されるための情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、その核酸の翻訳領域において非翻訳配列、例えば、イントロンを含む場合もあり、例えば、ｃＤＮＡにおいて、かかる介在する非翻訳配列を欠く場合もある。タンパク質をコードする情報は、コドンを用いることにより指定される。
【００４０】
核酸と関連して本明細書で用いられる「発現」とは、核酸断片に由来するセンスｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの転写および蓄積として理解されるものとする。タンパク質との関連で用いられる「発現」とは、ｍＲＮＡがポリペプチドへと翻訳されることを指す。
【００４１】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡの断片を意味し、該コード領域に先行および後続する領域（プロモーターおよびターミネーター）を包含する。さらに、植物の遺伝子は一般に、イントロンが間に入るエクソンからなる。ＲＮＡへと転写されると、スプライシングによりイントロンが除去されて、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成される。エクソンとイントロンとの間の「スプライス部位」は、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの欠失と、切除されたイントロンの各側において残存するＲＮＡの端の接合または融合とからなる、スプライシングプロセスのためのスプライスシグナルとして作用するコンセンサス配列により決定されることが典型的である。場合によって、スプライシングの代替的であるかまたは異なるパターンは、同じ単一のＤＮＡの範囲（ｓｔｒｅｔｃｈ）から、異なるタンパク質を生成させ得る。天然の遺伝子を、「内因性遺伝子」と称することができる。
【００４２】
核酸との関連において本明細書で用いられる「異種」とは、外来種に由来するか、または、同じ種に由来する場合、意図的で人為的な介入により、組成および／または遺伝子座が、その天然形態から実質的に改変されている核酸である。
【００４３】
本明細書で用いられる「発芽」という用語は、天然で見出されるような通常の土壌など、各種の組成物において、オオムギ穀粒の成長が開始または再開されることを意味する。したがって、発芽している胚芽とは、発芽を経過しつつある胚芽である。発芽はまた、成長チャンバーなどの中に置いたポットの土壌中で生じる場合もあり、または、例えば、標準的な実験室用ペトリディッシュ内に置かれた湿らせた濾紙上で生じる場合もあり、あるいは、麦芽になる間において（例えば、麦芽製造工場のスティープタンクまたは発芽箱内において）生じる場合もある。発芽は一般に、穀粒の水和、穀粒の膨潤、および胚芽の成長の誘導を包含すると理解される。発芽に影響する環境因子には、水分、温度、および酸素レベルが含まれる。根および苗条の発育が観察される。
【００４４】
「穀粒」という用語は、また、内種子とも称する穀類の頴果、外花頴、および内花頴を含むものと定義される。大半のオオムギ品種では、外花頴および内花頴が頴果に付着し、脱穀後における穀粒の一部をなす。しかし、裸性のオオムギ品種もまた生じる。これらにおいては、頴果が、外花頴および内花頴から遊離しており、コムギの場合と同様に、脱穀により完全に遊離する。本明細書では、「穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）」および「穀粒（ｇｒａｉｎ）」という用語を互換的に用いる。
【００４５】
「穀粒の発生」とは、花粉細胞による卵細胞の受精で始まる期間を指す。受精の間、代謝による貯蔵物質、例えば、糖、オリゴ糖、デンプン、フェノール性物質、アミノ酸、およびタンパク質が、液胞の標的化を伴い、また、これを伴わずに、穀粒（穀粒）内の各種の組織、例えば、内乳、種皮、アリューロン、および胚盤へと蓄積され、これにより穀粒（穀粒）の拡大、穀粒（穀粒）の充実がもたらされ、穀粒（穀粒）の乾燥により終わる。
【００４６】
「機能的・・・の完全な喪失」という用語は、所与の酵素活性の欠如を指す。したがって、「機能的ＬＯＸ−１および機能的ＬＯＸ−２を完全に喪失」させたオオムギ植物体は、検出可能なＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を示さないオオムギ植物体である。ＬＯＸ−１酵素およびＬＯＸ−２酵素は他の活性も有し得るが、本発明の文脈におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性は、リノール酸からの９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成を決定するアッセイ手順により決定される。リノール酸からの９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの形成は、国際特許第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例４において記載されている通りに決定することが好ましい。活性は、発芽胚のタンパク質抽出物を用いて決定するものとする。本発明の文脈では、国際特許第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例４において記載されているアッセイを用い、リノール酸を基質として用いる場合に、国際特許第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の図５Ａに示される基準物質の９−ＨＰＯＤＥピークの５％未満、好ましくは３％未満に対応するクロマトグラムピーク、および／または、国際特許第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の図５Ａに示される基準物質の１３−ＨＰＯＤＥピークの５％未満、好ましくは３％未満に対応するピークが生成することにより、検出可能なＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性が存在しないと考えられる。機能的ＬＯＸの完全な喪失を得るための分子手法は、前記酵素の転写物の完全な非存在を引き起こすか、もしくは対応するコードされた酵素の完全な非存在を引き起こす変異か、またはコードされた酵素を完全に不活化する変異の発生を含む。同様に、「機能的ＭＭＴを完全に喪失させた」オオムギ植物体とは、ＭＭＴ酵素活性の欠如、すなわち、本明細書の下記の実施例２に記載するアッセイを用いた場合に検出可能なＭＭＴ活性を示さないオオムギ植物体を指す。あるいは、オオムギ植物体のＭＭＴ活性は、前記オオムギのＭＭＴ  ｃＤＮＡを単離し、前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、ＳＡＭからＭｅｔへのメチル基の転移を触媒し、これにより、ＳＭＭを形成することができるかどうかを決定することにより決定する。
【００４７】
「ＬＯＸ−１活性」という用語は、オオムギＬＯＸ−１酵素の酵素活性を指す。特に、本発明の関連において、「ＬＯＸ−１活性」とは、リノール酸から９−ＨＰＯＤＥをもたらし、これよりはるかに劣る程度で１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応を酵素により触媒することである。ＬＯＸ−１酵素は、他の反応を触媒することも可能であるが、本発明によるＬＯＸ−１の活性を決定する目的では、９−ＨＰＯＤＥ形成活性および１３−ＨＰＯＤＥ形成活性だけを考えるべきである。図１Ａは、リノール酸が９−ＨＰＯＤＥへと変換される生化学経路を概説する。
【００４８】
「ＬＯＸ−２活性」という用語は、オオムギＬＯＸ−２酵素の酵素活性を指す。特に、本発明の関連において、「ＬＯＸ−２活性」とは、リノール酸から１３−ＨＰＯＤＥをもたらし、これよりはるかに劣る程度で９−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応を酵素により触媒することである。ＬＯＸ−２酵素は、他の反応を触媒することも可能であるが、本発明によるＬＯＸ−２の活性を決定する目的では、１３−ＨＰＯＤＥ形成活性および９−ＨＰＯＤＥ形成活性だけを考えるべきである。図１Ａは、リノール酸が１３−ＨＰＯＤＥへと変換される生化学経路を概説する。
【００４９】
「麦芽飲料」という用語および「麦芽ベースの飲料」という用語は、麦芽を用いて調製される飲料、好ましくは麦芽を熱湯と共にインキュベートする工程を含む方法により調製される飲料を指す。この用語は、本明細書では互換的に使用される。麦芽飲料は、例えばビールまたはモルティナであり得る。本出願のビールは、「オオムギの醸造」（上記の定義を参照されたい）を用いて作製することもできる。
【００５０】
「発酵麦芽飲料」という用語は、発酵させた麦芽飲料、すなわち、酵母と共にインキュベートした麦芽飲料を指す。
【００５１】
「麦芽製造」とは、麦芽製造工場のスティープタンクおよび発芽箱を含むが、これらに限定されない、制御された環境条件下で生じるオオムギ穀粒の発芽の特殊な形態である。本発明のプロセスによれば、麦芽製造は、オオムギ穀粒がスティーピングされる間および／またはスティーピングされた後で生じ始める。麦芽製造プロセスは、例えば、キルン乾燥プロセスにおいてオオムギ穀粒を乾燥させることにより、停止させることができる。キルン乾燥は、通常は高温で実施されるが、本発明の利点は、キルン乾燥を、それよりも低い温度で実施することができることである。麦芽がキルン乾燥されていない場合は、「緑麦芽」と称する。二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから調製された麦芽組成物は、純粋の二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽、または二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽を含む任意の麦芽のブレンドなど、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽を含むものと理解される。好ましくは、前記組成物は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽のみから調製される。麦芽は、例えば、破砕することにより加工することができ、したがって、「破砕麦芽」または「フラワー」と称し得る。
【００５２】
「マッシング」とは、水中における破砕麦芽のインキュベーションである。マッシングは、特定の温度、および特定の体積の水で実施することが好ましい。温度および水の体積は、麦芽に由来する酵素活性の低下率に影響を及ぼし、このため、とりわけ、生じ得るデンプンの加水分解量に影響を及ぼすので重要であり、プロテアーゼ作用もまた重要であり得る。マッシングは添加物の存在下で行い得、これには、全穀粒として、または粗引き穀物、シロップ、もしくはデンプンなどの加工生成物としての、オオムギ（例えば、二重−ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギが挙げられる）、オオムギシロップ、またはトウモロコシ、またはコメなどであるがこれらに限定されない、麦芽以外の任意の炭水化物供給源が含まれるものと理解される。前述の添加物のすべてを、抽出物のさらなる供給源として主に用いることができる（ウォート加熱の間にはシロップを投与することが典型的である）。醸造における添加物を加工するための要件は、用いられる添加物の状態および種類、ならびに、特に、デンプンのゼラチン化温度または液化温度に依存する。該ゼラチン化温度が通常の麦芽の糖化のためのゼラチン化温度より高温である場合は、マッシュに添加する前に、デンプンをゼラチン化および液化させる。
【００５３】
「ＭＭＴ活性」という用語は、オオムギのメチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を指す。本発明の文脈における「ＭＭＴ活性」とは、ＳＭＭをもたらす、Ｍｅｔの硫黄原子におけるＭＭＴ触媒のメチル化である。ＭＭＴ酵素は、他の反応も触媒することが可能であり得るが、本発明によるＭＭＴの活性を決定する目的では、ＳＭＭ形成活性だけを考慮すべきである。図１Ｂは、メチル化により、ＭｅｔがＳＭＭへと変換される生化学反応を概説する。
【００５４】
「変異」には、遺伝子のコード領域および非コード領域における欠失、挿入、置換、トランスバージョン、および点変異が含まれる。欠失は、全遺伝子を対象とする場合もあり、遺伝子の一部だけを対象とする場合もあり、この場合、非コード領域は、プロモーター領域、またはターミネーター領域、またはイントロンであることが好ましい。点変異は、１塩基または１塩基対の変化に関する場合があり、その結果として、終止コドン、フレームシフト変異、またはアミノ酸置換をもたらし得る。本明細書の図８（この図は、変異したオオムギの穀粒が、育種プログラムにおいて、どのようにして繁殖し得るかについての概要を提示する）を参照すると、Ｍ３世代の穀粒、ならびにこれらから直接的に繁殖した穀粒、またはそれらの植物体を含めた、任意の後続世代の穀粒を、「生の変異体」と称することができる。さらに、なおも本明細書の図８を参照すると、「育種系統」という用語は、栽培品種の植物体との異種交配の結果の場合もあり、別個の特異的な形質を有する別の育種系統との異種交配の結果の場合もある、Ｍ４世代の穀粒、ならびにこれらの植物体を含めた任意の後続世代を指す。
【００５５】
「ヌルＬＯＸ」という用語は、ＬＯＸをコードする遺伝子内に変異が存在し、コードされるＬＯＸ酵素（ＬＯＸ−１もしくはＬＯＸ−２のいずれか、またはＬＯＸ−１とＬＯＸ−２の両方）の機能の完全な喪失を引き起こすことを指す。ＬＯＸをコードする遺伝子において未熟終止（ナンセンス）コドンを発生させる変異は、機能的ＬＯＸの完全な喪失を得ることができる１つの機構を表すに過ぎない。機能的ＬＯＸの完全な喪失を得る分子的手法は、前記酵素についての転写物の完全な非存在をもたらす変異、またはコードされる酵素の完全な不活化を引き起こす変異の発生を含む。植物体との関連における「ヌルＬＯＸ」とは、機能的ＬＯＸ酵素の完全な喪失を結果としてもたらす変異を有する植物体を指す。
【００５６】
本明細書で用いられる、「ヌルＭＭＴ」という用語は、機能的なＳ−アデノシルメチオニン：メチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ酵素（メチオニンＳ−メチルトランスフェラーゼ酵素とも称する）の完全な喪失を指す。したがって、「ヌルＭＭＴのオオムギ植物体」とは、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を含むオオムギ植物体である。同様に、「ヌルＭＭＴの穀粒」とは、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を含む穀粒である。
【００５７】
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が、他方により影響を受けるような、単一のポリヌクレオチド上における、２つ以上の核酸断片の会合を指すのに用いられる用語である。例えば、コード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合、そのプロモーターは、そのコード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向において制御配列と作動可能に連結される場合もあり、アンチセンス方向において制御配列と作動可能に連結される場合もある。
【００５８】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ断片を増幅するのに用いられる技法として、当業者により周知である（Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．らへの米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号）。
【００５９】
「植物体」または「植物材料」とは、植物細胞、植物プロトプラスト、ならびに、それからオオムギ植物体が再生され得る植物細胞組織の培養物（植物体のカルス（ｃａｌｌｉ）、および、胚、花粉、胚珠、花、穀粒、葉、根、根端、葯、または植物体の任意の部分もしくは生成物など植物体において完全である、または植物体の部分である植物細胞を含めた）を包含する。一実施形態では、植物材料は、それからオオムギ植物体が再生され得ない植物細胞であり得る。
【００６０】
「植物生成物」という用語は、植物体または植物材料を加工することの結果として得られる生成物を意味する。したがって、前記植物生成物は、例えば、麦芽、ウォート、発酵飲料もしくは非発酵飲料、食物生成物、または飼料生成物であり得る。
【００６１】
タンパク質との関連において本明細書で用いられる「組換え」とは、外来種に由来するか、または、同じ種に由来する場合、意図的で人為的な介入により、組成がその天然形態から実質的に改変されているタンパク質である。
【００６２】
本出願の意味の範囲内における「専門家によるビール試飲パネル」とは、アルデヒド、紙質の（ｐａｐｅｒｙ）風味、古い風味（ｏｌｄ  ｔａｓｔｅ）、エステル、高級アルコール、脂肪酸および硫黄成分に特別の焦点を当てて、ビールの風味を味わい、説明することにおいて広く熟練した専門家によるパネルである。風味成分を評価するための分析ツールは多数存在するが、風味活性成分の相対的重要性を分析的に評価することは難しい。しかし、風味の専門家によれば、このような複雑な特性を評価することができる。彼らの持続的な訓練には、標準的なビール試料の試飲および評価が含まれる。
【００６３】
「スプライス部位」という用語は、遺伝子のエクソンとイントロンとの間の境界部位を意味する。したがって、スプライス部位は、エクソンからイントロンへと移行する境界部位（「ドナー部位」と呼ばれる）の場合もあり、イントロンをエクソンから隔てる境界部位（「アクセプター部位」と呼ばれる）の場合もある。植物体におけるスプライス部位は、コンセンサス配列を含むことが典型的である。イントロンの５’端は、一般に、保存的なＧＴジヌクレオチド（ｍＲＮＡではＧＵ）からなり、イントロンの３’端は、通常、保存的なＡＧジヌクレオチドからなる。したがって、イントロンの５’側スプライス部位は、イントロンの５’端を含み、該３’側スプライス部位は、イントロンの３’端を含む。本発明の文脈の範囲内では、イントロンのスプライス部位は、（一般にＧＴである）該イントロンの大半の５’側ジヌクレオチドからなる、５’側スプライス部位；または（一般にＡＧである）該イントロンの大半の３’側ジヌクレオチドからなる、３’側スプライス部位であることが好ましい。
【００６４】
別段に言及しない限り、「Ｔ２Ｎ」とは、遊離形態におけるｔｒａｎｓ−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）を意味する。Ｔ２Ｎはまた、場合によって、２−Ｅ−ノネナールも指すことがある。
【００６５】
「Ｔ２Ｎポテンシャル」という用語により、１つ以上の反応において、Ｔ２Ｎを放出するか、またはＴ２Ｎへと変換される能力を有する化学物質が記載される。本明細書の文脈において、Ｔ２Ｎポテンシャルは、１００℃、ｐＨ４．０で２時間にわたるインキュベーションの間、溶液、例えば、ウォートもしくはビール中へと放出されるＴ２Ｎの濃度として定義される。実用的に述べると、出発Ｔ２Ｎ濃度を決定し、その後、１００℃、ｐＨ４．０で２時間にわたり溶液をインキュベートした後で、Ｔ２Ｎ濃度を決定する。出発Ｔ２Ｎ濃度と、終末Ｔ２Ｎ濃度との差を、Ｔ２Ｎポテンシャルと称する。熱処理、酸処理により、Ｔ２Ｎポテンシャルから、例えば、「Ｔ２Ｎ付加物」（この用語は、タンパク質（複数可）、亜硫酸塩、細胞破砕物、細胞壁などが含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の物質にコンジュゲートしたＴ２Ｎを記載するのに用いられる）からＴ２Ｎを遊離させる。一般に、Ｔ２Ｎ付加物自体をオフフレーバーとして人が感知することはない。しかし、前記Ｔ２Ｎ付加物から放出されるＴ２Ｎは、オフフレーバーを発生させ得る。
【００６６】
「組織培養物」とは、種類が同じであるかもしくは異なる単離細胞、または、例えば、プロトプラスト、カルス、胚芽、花粉、葯などを含む植物体の一部へと組織化されたこのような細胞の集合体を含む組成物を指す。
【００６７】
本明細書で用いられる「トランスジェニック」とは、異種核酸を導入することにより改変された細胞への言及、または細胞が、このようにして改変された細胞に由来することへの言及を包含する。したがって、例えば、トランスジェニック細胞は、細胞の天然形態では同一の形態で見出されない遺伝子を発現するか、または意図的で人為的な介入の結果として、別の異常な形で発現するか、過小発現するか、またはまったく発現しない天然遺伝子を発現する。植物体、特に、オオムギ植物体との関連において本明細書で用いられる「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法による（例えば、ＮａＮ３ベースの変異誘発）、または意図的で人為的な介入を伴わない天然におこるイベントによる細胞の変化を包含しない。
【００６８】
「野生オオムギ」（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）は、現行のオオムギの栽培形態の先祖であると考えられる。野生状態から栽培状態へのオオムギの移行は、「オオムギ在来種」への該植物体の栽培化（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ）と符合したと考えられている。これらは、野生オオムギより、新型栽培品種との遺伝子的類縁性がより密接である。
【００６９】
「野生型」オオムギという用語は、従来の方法で生成されたオオムギ植物体を指す。好ましくは、該用語は、本発明のオオムギ植物体が由来するオオムギ植物体、すなわち、親植物体を指す。野生型オオムギ穀粒は、一般に、例えば、種子会社から、「栽培品種」または「品種」、すなわち、米国の国立植物育種機関により列挙される遺伝子的に類似の穀粒として入手可能である。複数のヌルＬＯＸ−１のオオムギ栽培品種（例えば、栽培品種ＣｈａｍｏｎｉｘおよびＣｈａｒｍａｙ）が入手可能であるが、本明細書では、本発明をよりよく理解する目的で、すべてのヌルＬＯＸ−１植物体、ヌルＬＯＸ−２植物体、二重ヌルＬＯＸ植物体、および二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの植物体を変異体の植物体と考え、野生型の植物体は変異体の植物体とは考えない。本明細書では、「栽培品種」および「品種」という表記法は、互換的に用いられる。
【００７０】
「ウォート」という用語は、麦芽、例えば、破砕麦芽もしくは緑麦芽、または破砕緑麦芽の液体抽出物を意味する。オオムギの醸造において、ウォートはまた、麦芽にしていないオオムギの抽出物を、オオムギ成分を加水分解する酵素の混合物と共にインキュベートすることによっても調製することができる。前記麦芽またはオオムギ由来の抽出物に加えて、該液体抽出物は、麦芽と、発酵性の糖へと部分的に変換されるさらなるデンプン含有材料など、さらなる成分とから調製することができる。ウォートは、一般に、マッシングにより得られるが、必要に応じて、マッシング後のビール粕から、残存する糖および他の化合物を熱湯により抽出するプロセスにおいて、「スパージング」を続いて実施する事によって得られる。スパージングは、濾過槽、マッシュフィルター、またはビール粕から抽出される水の分離を可能とする別の装置内で実施することが典型的である。マッシング後において得られるウォートを、一般に、「一番ウォート」と称するのに対し、スパージング後において得られるウォートを、一般に、「二番ウォート」と称する。指定しない限り、ウォートという用語は、一番ウォートの場合もあり、二番ウォートの場合もあり、両者の組合せの場合もある。従来のビール生産の間には、ウォートをホップと共に煮沸するが、本発明は、ウォートの煮沸を減らす、またはウォートの煮沸を回避するための方法を提供する。ホップを伴わないウォートは、「スイートウォート」とも称し得るのに対し、ホップと共に煮沸／加熱したウォートは、「煮沸ウォート」と称し得る。
【００７１】
オオムギベースの飲料を調製するための方法
本発明は、エネルギー投入の低減を伴う、オフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低いオオムギベースの飲料を調製するための方法に関する。オフフレーバーは本明細書の下記の通りであるが、オフフレーバーはＴ２ＮおよびＤＭＳであることが好ましい。方法は、好ましくは二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体であるオオムギ植物体の使用を包含する。このようなオオムギ植物体は、本明細書の以下でより詳細に記載する。
【００７２】
本発明によると、方法は、一般には、前記二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を麦芽にする工程を含むが、本発明のいくつかの実施形態では、オオムギベースの飲料は、麦芽にしていないオオムギを用いて調製する。麦芽製造については、本明細書の以下の節「麦芽製造」においてより詳細に記載する。
【００７３】
方法は、さらには、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギまたは二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽またはこれらの混合物を、必要に応じて、さらなる添加物の存在下で、マッシングすることによりウォートを調製する工程を含む。マッシングについては、本明細書の以下の節「マッシング」においてより詳細に記載する。
【００７４】
方法は、また、前記ウォートを、必要に応じてさらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程であって、ウォートの体積の最大で４％、例えば最大で２％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程も含む。この工程は、本明細書の節「加熱ウォート」においてより詳細に記載する。
【００７５】
最終的に、方法は、加熱ウォートを飲料へと加工する工程を含む。方法のその部分については、本明細書の以下の節「飲料の調製」においてより詳細に記載する。
【００７６】
麦芽製造
「麦芽製造」という用語により、制御された環境条件下で行なわれるプロセスにおける、スティーピングされたオオムギ穀粒の発芽（例えば、図９、工程２および３で示される）、それに続く乾燥工程が理解されるものとする。前記乾燥工程は、好ましくは発芽した穀粒を高温でキルン乾燥することであり得る。
【００７７】
乾燥させる前の、スティーピングされて発芽したオオムギ穀粒を「緑麦芽」と称するが、これもまた、本発明による植物生成物を表し得る。この上述の一連の麦芽製造イベントは、主に、死んだ内乳の細胞壁を解重合させ、穀粒の栄養物質を移動させ、他のデポリメラーゼを活性化するプロセスである、穀粒の改変を引き起こす多数の酵素を合成するのに重要である。その後の乾燥させるプロセスでは、化学褐変反応によって、風味および色が生成される。
【００７８】
麦芽製造とは、高度にエネルギーを消費するプロセスである。特にキルン乾燥もまた、高温が必要であるので、エネルギーを消費するプロセスである。キルン乾燥には、特に、（ｉ）発芽したオオムギ穀粒を乾燥させること；（ｉｉ）発芽を停止させること；（ｉｉｉ）Ｔ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルのレベルを低下させるためにリポキシゲナーゼを変性させること；および（ｉｖ）ＤＭＳを前駆体から生成し、ＤＭＳポテンシャルおよびＤＭＳのレベルを低下させるためにＤＭＳを除去することとを含めた、いくつかの目的がある。
【００７９】
本発明によると、キルン乾燥を低温で、かつ、上記の目的をなお実現しながら実施することができる。機能的ＬＯＸ−１および機能的ＬＯＸ−２が喪失したオオムギ植物体を用いることにより、リポキシゲナーゼを変性させる必要がなくなる。機能的ＭＭＴが喪失したオオムギ植物体を用いることにより、このようなオオムギ植物体においてはＤＭＳおよびＤＭＳポテンシャルのレベルは微小であるので、それらのレベルを低下させる必要がなくなる。したがって、低温においてさえもオオムギ穀粒を乾燥させることができ、発芽を停止させることができる。
【００８０】
したがって、本発明による麦芽製造は、
（ａ）二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギをスティーピングする工程と；
（ｂ）前記オオムギを発芽させる工程と；
（ｃ）前記オオムギを、好ましくはキルン乾燥により、乾燥させる工程と
を含むことが好ましい。
【００８１】
スティーピングは、当業者に公知の任意の従来の方法によって実施することができる。非限定的な一例は、１０〜２５℃の範囲内の温度で、乾燥条件と湿潤条件を交互に繰り返してスティーピングする工程を含む。スティーピングの間に、例えば、オオムギを、湿潤条件で３０分間〜３時間の範囲内でインキュベートし、その後に乾燥条件で３０分間〜３時間の範囲内でインキュベートし、必要に応じて、前記インキュベーションスキームを、２〜５回の範囲内で繰り返すことができる。スティーピング後の最終的な含水率は、例えば、４０〜５０％の範囲内であり得る。
【００８２】
発芽は、当業者に公知の任意の従来の方法によって実施することができる。非限定的な一例は、１〜４時間の範囲内で、１０〜２５℃の範囲内の温度で、必要に応じて温度変化を伴って発芽させることを伴う。
【００８３】
適切なスティーピングスキームおよび発芽スキームの非限定的な例は、本明細書の以下の実施例９において概説される。
【００８４】
キルン乾燥は、少なくとも７５℃、例えば、８０〜８５℃の範囲内など、８０〜９０℃の範囲内など、従来の温度で実施することができる。したがって、例えば、麦芽は、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）により記載される方法のうちのいずれかにより生成させることができる。しかし、麦芽を焙煎する方法が含まれるがこれらに限定されない、特殊麦芽（ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｍａｌｔ）を生成させるための方法など、麦芽を生成させるのに適する他の任意の方法もまた、本発明と共に用いることができる。非限定的な例については、実施例６および８および９に記載する。
【００８５】
しかし、前記キルン乾燥は、低温で、より好ましくは８０℃を下回る温度で、さらにより好ましくは、７０℃を下回る温度など、例えば、６５℃を下回る温度、６０℃を下回る温度など、例えば、５５℃を下回る温度、５０℃を下回る温度など、例えば、４５℃を下回る温度、４１℃を下回る温度など、７５℃を下回る温度で実施されることが好ましい。したがって、温度がキルン乾燥の間のいずれの時間においても８０℃を超えない、好ましくは７５℃を超えないことが好ましい。
【００８６】
前記乾燥が低温で実施される場合、発芽したオオムギ穀粒を十分に乾燥させるために、キルン乾燥の時間を増加させることができる。キルン乾燥は、発芽した穀粒の含水率を、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満まで減少させるために十分な時間にわたり実施されることが好ましい。したがって、従来のキルン乾燥温度である８５℃では、キルン処理時間（ｋｉｌｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ）は、１〜３時間の範囲内であり得るのに対して、７０℃〜８０℃の範囲内の温度におけるキルン処理では、１〜１０時間の範囲内のキルン処理時間が必要になり得；５０〜７０℃の範囲内の温度におけるキルン処理では、３〜５０時間の範囲内のキルン処理時間が必要になり得るのに対して、５０℃を下回る温度、例えば、４０〜５０℃の範囲内でのキルン処理では、４８時間など、４０〜６０時間の範囲内、例えば、４５〜５２時間の範囲内など、４０時間を超えるキルン処理時間が必要になり得る。
【００８７】
一態様では、本発明は、麦芽製造により、好ましくは本明細書のすぐ上に記載された麦芽製造により二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ穀粒から調製される麦芽組成物にも関する。
【００８８】
前記麦芽組成物は、上記の通り低キルン処理温度で調製した場合でさえ、低レベルのＴ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルを含む。特に、前記麦芽組成物は、低レベルのＴ２Ｎポテンシャル（およびＴ２Ｎ前駆体）を含む。
【００８９】
オオムギを高温処理および／または乳酸処理にかける場合がある浸漬プロセスにより、オオムギ穀粒内のＬＯＸ活性を低下させ得ることが記載されている。しかし、このような浸漬プロセスもまた、エネルギーを消費する。さらに、このような処理は、所望の酵素活性、例えば、フィターゼ活性を低下させるなど、他の有害作用を有し得る。加えて、このような処理は、ＬＯＸ活性を、加熱処理を行った時点と比べて低下させるだけであり、それ以前におけるＬＯＸ活性に由来する生成物の蓄積には影響を及ぼさない。
【００９０】
本発明による一実施形態では、オオムギ穀粒を少なくとも７０℃の温度での浸漬には供さない方法を用いて、植物生成物を調製する。オオムギ穀粒を、乳酸の存在下において、少なくとも５７℃の温度での浸漬には供さない方法を用いて、本発明による植物生成物を調製することも好ましい。
【００９１】
前記麦芽組成物は、含むＴ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した麦芽組成物と比較して６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満、例えば、２０％未満であることが好ましい。
【００９２】
前記麦芽組成物は、７０℃〜８０℃の温度の範囲でキルン乾燥した場合でさえ、含むＴ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した麦芽組成物と比較して６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満であることがさらに好ましい。
【００９３】
前記麦芽組成物は、５０℃〜７０℃の温度の範囲でキルン乾燥した場合でさえ、含むＴ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した麦芽組成物と比較して６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満であることがさらに好ましい。
【００９４】
前記麦芽組成物は、４０℃〜５０℃の温度の範囲でキルン乾燥した場合でさえ、含むＴ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した麦芽組成物と比較して６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満であることがさらに好ましい。
【００９５】
Ｔ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルのレベルが低いことに加えて、本発明による麦芽は、上記の低キルン処理温度で調製した場合でさえ、含むＤＭＳおよびＤＭＳ前駆体のレベルも低い。
【００９６】
興味深いことに、ＤＭＳは、沸点が３７℃〜３８℃の、どちらかといえば揮発性化合物であり（Ｉｍａｓｈｕｋｕ、上掲）、麦芽生成の間、例えば、キルン乾燥の間に、一般に、相当量のＤＭＳが蒸発するように、組成物を熱にかける。しかし、通常の麦芽組成物の冷却の間に、より多くのＤＭＳがＤＭＳ前駆体（ＤＭＳＰ）から生成し得る。本発明の１つの主要な利点は、麦芽組成物において生成されるＤＭＳＰ（特にＳＭＭ）がまったくない、または極めて少ないことである。
【００９７】
麦芽中におけるＤＭＳ濃度を低下させるための方法が記載されている。これらの方法の多くは、高度にエネルギーを消費する麦芽の加熱処理に依拠する。前記加熱処理は、例えば、キルン乾燥の間に単に麦芽を加熱することであり得る、または、蒸気をあてることにより遊離ＤＭＳを揮発させることおよび／または除去することを伴い得る。したがって、麦芽を蒸気処理することにより、麦芽中における遊離ＤＭＳのレベルを低下させ得るが、これはさらに、高エネルギーを消費するプロセスを意味する。さらに、これらの方法は、主に麦芽中における遊離ＤＭＳのレベルを低下させ、ＳＭＭのレベルに対する効果はほんの少しである。本発明の一実施形態では、本発明の麦芽組成物を、遊離ＤＭＳを蒸気により揮発させて除去することを伴う限定された処理のみに供しているか、あるいは、キルン乾燥の間に蒸気を用いて遊離ＤＭＳを揮発させて除去することを伴う処理に供していない。
【００９８】
本発明の一実施形態では、本発明による麦芽は、臭素酸カリウムまたは臭素酸カルシウムなどの臭素酸塩で処理されていないことが好ましい。
【００９９】
本発明の麦芽組成物は、含む遊離ＤＭＳが、最大で３μｇ／ｇ、好ましくは最大で２μｇ／ｇ、より好ましくは最大で１μｇ／ｇ、なおより好ましくは最大で０．５μｇ／ｇ、最大で０．２μｇ／ｇなどであることが好ましい。加えて、本発明の麦芽組成物は、含むＤＭＳＰが、好ましくは最大で２μｇ／ｇ、好ましくは最大で１μｇ／ｇ、より好ましくは最大で０．５μｇ／ｇ、なおより好ましくは最大で０．２μｇ／ｇであることが好ましい。好ましくはＳＭＭであり得るＤＭＳＰの濃度は、本文書の本箇所および他の箇所において、前記ＤＭＳＰから放出し得るＤＭＳの濃度で示される。
【０１００】
前記麦芽組成物は、７０〜８０℃の範囲内の温度でキルン乾燥した場合でさえ、含むＤＭＳＰ（好ましくはＳＭＭ）が、最大で２μｇ／ｇ、好ましくは最大で１μｇ／ｇ、より好ましくは最大で０．５μｇ／ｇ、なおより好ましくは最大で０．２μｇ／ｇであることがさらに好ましい。
【０１０１】
前記麦芽組成物は、５０℃〜７０℃の温度の範囲でキルン乾燥した場合でさえ、含むＤＭＳＰ（好ましくはＳＭＭ）が、最大で２μｇ／ｇ、好ましくは最大で１μｇ／ｇ、より好ましくは最大で０．５μｇ／ｇ、なおより好ましくは最大で０．２μｇ／ｇであることがさらに好ましい。
【０１０２】
前記麦芽組成物は、４０℃〜５０℃の温度の範囲でキルン乾燥した場合でさえ、含むＤＭＳＰ（好ましくはＳＭＭ）が、最大で２μｇ／ｇ、好ましくは最大で１μｇ／ｇ、より好ましくは最大で０．５μｇ／ｇ、なおより好ましくは最大で０．２μｇ／ｇであることがさらに好ましい。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、含むＤＭＳＰが最大で５０００ｐｐｂ、より好ましくは最大で２５００ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で１０００ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で５００ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で２５０ｐｐｂ、例えば最大で１５０ｐｐｂである緑麦芽組成物に関する。前記緑麦芽組成物は、含む遊離ＤＭＳが最大で２００ｐｐｂ、好ましくは最大で１５０ｐｐｂ、より好ましくは最大で１００ｐｐｂ、なおより好ましくは最大で５０ｐｐｂ、最大で２５ｐｐｂなどであることも好ましい。
【０１０４】
麦芽は主に、飲料を生産するのに用いられるが、それはまた、例えば、製パン業における酵素供給源として、または麦芽もしくは麦芽フラワーの形態で、食品産業における香味剤および着色剤として、あるいは間接的に、麦芽シロップなどとして、他の産業プロセスでも用いることができる。したがって、本発明による植物生成物は、上述の生成物のいずれであってもよい。
【０１０５】
別の態様では、本発明による植物生成物は、オオムギシロップまたはオオムギ麦芽シロップなどのシロップを含み、またはさらにそれからなる。植物生成物はまた、オオムギまたは麦芽の抽出物でもあり得る。
【０１０６】
麦芽は、例えば、破砕することにより、さらに加工することができる。したがって、本発明による植物生成物は、未加工麦芽、またはフラワーなどの破砕麦芽などの任意の種類の麦芽であり得る。破砕麦芽およびそのフラワーは、麦芽の化学成分および再発芽する能力を欠く死滅細胞を含む。
【０１０７】
破砕は、乾燥した状態で実施する、すなわち麦芽を乾燥しながら破砕することが好ましい。したがって、麦芽は、水中では破砕しないことが好ましい。
【０１０８】
マッシング
本発明による方法は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギおよび／または麦芽、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングすることによりウォートを生成する工程を含む。前記マッシング工程は、必要に応じて、スパージングすることも含み得、したがって、前記マッシング工程は、スパージング工程を含むマッシング工程またはスパージング工程を除いたマッシング工程であり得る。
【０１０９】
一般に、ウォート生成は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽および／または二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギを破砕することにより開始する。さらなる添加物を添加する場合、これらもまた、その性質に応じて破砕することができる。添加物が穀類の場合、それは、例えば、破砕することができるのに対して、シロップ、砂糖などは、一般に、破砕しない。破砕により、水が、マッシング相にある穀粒粒子に到達することが容易になる。マッシングの間には、麦芽製造の間に開始された酵素による基質の解重合が継続し得る。
【０１１０】
図９では、工程４〜６により、麦芽からウォートを調製するための一般的な方法を示す。一般に、ウォートは、破砕麦芽と水とを混合およびインキュベートすることにより、すなわち、マッシングプロセスにおいて調製される。マッシングの間、麦芽／液体組成物には、炭水化物に富む付加組成物、例えば、破砕したオオムギ添加物、トウモロコシ添加物、またはコメ添加物を補充することができる。麦芽にしていない穀類添加物は一般に、含有する活性酵素が少量であるか、または活性酵素を含有せず、このため、麦芽または外因性酵素を補充して、多糖の解重合に必要な酵素を供給することなどが重要となる。
【０１１１】
マッシングの間には、破砕された二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽および／または破砕された二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ、ならびに必要に応じてさらなる添加物を、水などの液体画分と共にインキュベートする。インキュベーション温度は、一般に、一定に保つ（等温マッシング）か、または段階的に上昇させる、例えば逐次的に上昇させる。いずれの場合も、麦芽／オオムギ／添加物中の可溶性物質は、前記液体画分中に放出される。その後の濾過により、ウォートと、残留する固体粒子との分離がなされ、後者をまた、「ビール粕（ｓｐｅｎｔ  ｇｒａｉｎ）」とも称する。こうして得られたウォートはまた、「一番ウォート」とも称する。スパージングとも称されるプロセスの間に、水などのさらなる液体をビール粕に添加することができる。スパージングおよび濾過後、「二番ウォート」を得ることができる。該手順を繰り返すことにより、さらなるウォートを調製することができる。ウォートを調製するのに適する手順の非限定的な例は、Ｂｒｉｇｇｓら（上掲）およびＨｏｕｇｈら（上掲）により記載されている。
【０１１２】
酵素を加熱処理することにより、ＬＯＸ活性を低下させ得ること、および加熱処理により、ＤＭＳレベルを低下させ得ることが記載されている。また、ウォートを加熱処理してＬＯＸ活性を低下させることができ、またＤＭＳのレベルを低下させることができること、および／または同じ目的に到達するために、マッシングを高温で実施する可能性のあることが記載されている。しかし、加熱処理は、他の酵素活性を低下させることなど、有害作用を有し得、また、加熱処理により、さらにエネルギーが消費される。加えて、加熱処理は、リポキシゲナーゼ活性およびＤＭＳレベルを、加熱処理を行った時点と比べて低下させるだけであり、したがって、それ以前におけるＬＯＸ活性に由来する生成物およびＤＭＳ前駆体の蓄積には影響を及ぼさない。
【０１１３】
したがって、本発明の一実施形態では、ウォートは、初期のマッシング温度が、７０℃を超えない、好ましくは、６９℃を超えない、したがって、例えば、初期のマッシング温度が、３５℃〜６９℃の範囲内、例えば３５℃〜６５℃の範囲内など、３０℃〜６９℃の範囲内、例えば、３５℃〜４５℃など、およそ４０℃など、３５℃〜５５℃の範囲内であり得る方法を用いて調製する。本発明によるウォートは、７０℃以上の温度に２５分間超にわたり供されていないこと、好ましくは、２０分間超にわたり供されていないことも好ましく、ウォートは、マッシングの間に、７８℃超の温度に、２０分間超にわたり供されていないこと、好ましくは１５分間超、より好ましくは、１０分間超にわたり供されていないことも好ましい。マッシング温度が高すぎると、マッシュ中における酵素活性に影響が及び、所望の酵素活性を低下させるか、またはさらに無効にし、この結果、ウォートの品質が変化する。本発明によるウォートは、マッシングの間に、６５℃以上の温度に、１００分間超にわたり供されていないこと、好ましくは９０分間超、より好ましくは８０分間超、さらにより好ましくは、７０分間超にわたり供されていないことがさらに好ましい。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、マッシング中の温度は、８０℃を超えず、好ましくは、７８℃を超えない。
【０１１５】
適切なマッシングの非限定的な一例は、
（１）およそ４０℃など、３５〜４５℃の範囲内の温度に、およそ２０分間など、１０〜３０分間の範囲内でマッシングすること；
（２）３０〜９０分間の範囲内で、好ましくは、およそ６０分間など、４５〜７５分間の範囲内で、６０〜７０℃の範囲内の温度、好ましくは、およそ６５℃など、６０〜６５℃の範囲内の温度まで加熱すること；
（３）およそ１０分間など、５〜１５分間の範囲内で７０〜８０℃の範囲内の温度、好ましくは、およそ７８℃など、７５〜７８℃の範囲内の温度まで加熱すること
である。
【０１１６】
適切なマッシングの別の非限定的な例は、
（４）およそ６０℃など、５５〜６５℃の範囲内の温度で、およそ２０分間など、１０〜３０分間の範囲内でマッシングすること
（５）３０〜９０分間の範囲内で、好ましくは、およそ６０分間など、４５〜７５分間の範囲内で、６０〜７０℃の範囲内の温度、好ましくは、およそ６５℃など、６０〜６５℃の範囲内の温度まで加熱すること；
（６）およそ１０分間など、５〜１５分間の範囲内で、７０〜８０℃の範囲内の温度、好ましくは、およそ７８℃など、７５〜７８℃の範囲内の温度まで加熱すること
である。
【０１１７】
上記の通り、ウォート組成物は、麦芽にしていない二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒、特に、破砕された、麦芽にしていない二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒、またはそれらの一部など、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体、またはそれらの一部をマッシングすることにより調製することができる。麦芽にしていないオオムギ穀粒は、細胞壁を分解することができる酵素またはデンプンを糖へと解重合することができる酵素など、ウォート生成に有益な酵素を欠く、またはそれを限られた量のみを含有する。したがって、マッシングするために麦芽にしていない二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴを用いる本発明の複数の実施形態では、１つ以上の適切な、外部の醸造用酵素をマッシュに添加することが好ましい。適切な酵素は、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼ）、グルカナーゼ［好ましくは（１−４）−β−グルカナーゼおよび／または（１−３，１−４）−β−グルカナーゼ］、および／またはキシラナーゼ（例えば、アラビノキシラナーゼ）、および／またはプロテアーゼ、または上記の酵素のうちの１つ以上を含む酵素混合物、例えば、Ｃｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）であり得る。麦芽にしていないオオムギから調製されたウォートから飲料を作製するための方法はまた、「オオムギ醸造」とも称し、これによるウォート組成物を、「オオムギウォート」または「オオムギ醸造」ウォートとも称することができる。
【０１１８】
ウォート組成物は、また、麦芽になった二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体および麦芽にしていない二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体、またはそれらの一部の混合物を用いることにより調製することもでき、その場合、調製の間に１つ以上の適切な酵素を添加することができる。より詳細には、マッシングするために、本発明のオオムギを、これらに限定されないが、オオムギ：麦芽＝およそ１００：０、またはおよそ７５：２５、またはおよそ５０：５０、またはおよそ２５：７５の割合などで外部の醸造用酵素を伴って、または伴わずに、麦芽と共に任意の組合せで用いることができる。
【０１１９】
本発明の他の実施形態では、マッシング前またはマッシングの間に、外部の酵素、特に、外部のプロテアーゼ、および／または外部のセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌｕａｓｅ）および／または外部のα−アミラーゼおよび／または外部のβ−アミラーゼおよび／または外部のマルトース生成（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）α−アミラーゼを加えないことが好ましい。
【０１２０】
マッシング後において得られるウォートはまた、「スイートウォート」とも称し得る。従来の方法では、スイートウォートをホップと共に、またはホップを伴わずに煮沸し、その後には、それは煮沸ウォートと称し得る。
【０１２１】
本明細書で用いられる「およそ」という用語は、±１０％、好ましくは±５％、さらにより好ましくは±２％を意味する。
【０１２２】
ウォートの加熱
本発明によるオオムギベースの飲料を調製するための方法は、本明細書の上記の節「マッシング」において記載したマッシング工程後において得られるウォートを加熱する工程を包含する。
【０１２３】
オフフレーバーおよびその前駆体、特に、Ｔ２ＮおよびＤＭＳおよびその前駆体のレベルが低いオオムギベースの飲料を、ウォートを大規模に加熱する必要なく調製することができることは、本発明の利点である。
【０１２４】
従来の醸造では、ウォートを、一般に、大規模な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）時間にわたり煮沸する。ウォート煮沸には、特に：（ｉ）酵素の不活化；（ｉｉ）タンパク質の凝固；（ｉｉｉ）ウォートの滅菌；（ｉｖ）ホップ化合物の抽出；（ｖ）α酸の異性化；（ｖｉ）ＤＭＳへのＤＭＳＰの変換；および（ｖｉｉ）ＤＭＳおよびＴ２Ｎの蒸発といういくつかの目的がある。
【０１２５】
これらの目的のいくつかは、大規模に煮沸することなく到達し得る。したがって、滅菌には、簡単な煮沸または加熱のみが必要である。ホップ化合物の抽出は、簡単な煮沸または加熱の間に行うこともできる。予め異性化されたα酸が市販されており、それをウォートに添加することができる。
【０１２６】
機能的ＬＯＸ−１および機能的ＬＯＸ−２が喪失したオオムギ植物体を用いることにより、ＬＯＸを変性させる必要がなくなる。さらに、機能的ＬＯＸ−１および機能的ＬＯＸ−２が喪失したオオムギ植物体を用いることにより、Ｔ２Ｎレベルを低下させる必要もなくなる。機能的ＭＭＴが喪失したオオムギ植物体を用いることにより、このようなオオムギ植物体においてはＤＭＳおよびＤＭＳポテンシャルのレベルは微小であるので、それらのレベルを低下させる必要がなくなる。加えて、低温においてさえもオオムギ穀粒を乾燥させることができ、発芽を停止させることができる。
【０１２７】
種々の手段により、例えば、望ましくない揮発性化合物を蒸気中に抽出するストリッピングプロセスと組み合わせて、蒸発をわずか３％まで減らすことにより、ウォート煮沸の間のエネルギー消費を減らすことが試みられている。しかし、蒸気の生成また、エネルギーを消費するプロセスである。
【０１２８】
典型的なウォート煮沸を伴わずにウォートを調製することが試みられている。しかし、これらの方法は、一般に、マッシングの間ならびにウォートを蒸気でストリッピングする間に９５℃に至るまでの高温を利用し、したがって、高エネルギーを消費するプロセスであると考えられる。
【０１２９】
本方法は、好ましくはストリッピングプロセスがなくてさえ蒸発を減らす可能性を提供する。したがって、本発明の方法によると、ウォートを、好ましくは最大で４％、より好ましくは最大で３％、さらにより好ましくは最大で２％、さらにより好ましくは最大で１．５％、さらにまたより好ましくは最大で１％、さらにより好ましくは最大で０．５％、さらにより好ましくは、最大で０．０１％など、最大で０．１％のウォートの体積が蒸発するようにして加熱する。なおより好ましくは、上記の蒸発の減少を、ウォートを蒸気処理せずに実施する。上記の蒸発の減少を、ウォートを、例えば、蒸気でストリッピングせずに実施することも好ましい。
【０１３０】
蒸発の減少は、本質的に密閉された容器において、または好ましくは密閉された容器においてウォートを加熱することにより実現することができる。
【０１３１】
該方法の他の工程のいずれにおいても、液体の大規模な蒸発を行わないことがさらに好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態は、エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体（好ましくはＴ２ＮおよびＤＭＳおよびその前駆体）のレベルが低いオオムギベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含むオオムギ植物体またはその一部を供給する工程と；
（ｉｉ）必要に応じて、前記オオムギの少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になったオオムギを得る工程と；
（ｉｉｉ）前記オオムギおよび／または麦芽になったオオムギ、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）前記ウォートを、必要に応じて、さらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程と；
（ｖ）前記加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含み、上記の工程（ｉｉ）が完了した後、または、さらには上記の工程（ｉｖ）が完了した後の上記方法の間に、最大で４％、例えば、最大で３％、最大で２％など、例えば、最大で１．５％、最大で１％などの液体体積を蒸発させ、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低いオオムギ由来飲料を調製する方法に関する。
【０１３２】
本明細書の上記の工程（ｉｖ）は、密閉された容器など、本質的に密閉された容器内にウォートを入れて実施することが好ましい。
【０１３３】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、エネルギー投入の低減を伴う、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体（好ましくはＴ２ＮおよびＤＭＳおよびその前駆体）のレベルが低いオオムギベースの飲料を調製するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含むオオムギ植物体またはその一部を供給する工程と：
（ｉｉ）必要に応じて、前記オオムギの少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になったオオムギを得る工程と；
（ｉｉｉ）前記オオムギおよび／または麦芽になったオオムギ、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）前記ウォートを、必要に応じて、さらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程と；
（ｖ）前記加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含み、液体／ウォート／飲料を、最大で３０分間にわたり、より好ましくは最大で２０分間にわたり８０℃を超える温度まで加熱し、これらにより、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低いオオムギ由来飲料を調製する方法を提供する。
【０１３４】
前記液体／ウォート／飲料は、前記方法の間に最大で３０分間にわたり、好ましくは、１０〜３０分間の範囲内、例えば１０〜２０分間の範囲内など、最大で２０分間にわたり、８０〜９９．８℃の範囲内の温度まで、好ましくは、８０〜９９℃の温度など、８０〜９９．５℃の範囲内の温度まで、さらにまたより好ましくは９０〜９９℃の範囲内の温度まで、さらにまたより好ましくは９５〜９９℃の範囲内の温度まで加熱することが好ましい。
【０１３５】
一番ウォート、二番ウォートおよびさらなるウォートを混合し、その後、加熱にかけることができる、またはそれぞれの種類のウォートを加熱することができる。本発明の方法によると、必ずしもウォートを煮沸する必要はない。純粋の一番ウォートであれ、混合ウォートであれ、煮沸されていないウォートをまた「スイートウォート」とも称し、煮沸後のウォートは、「煮沸ウォート」と称する場合がある。ウォートをビールの生産に用いる場合、煮沸前にホップを添加することが多い。
【０１３６】
従来の醸造方法では、ウォートの体積の少なくとも５％、および時には２５％までをも蒸発させるために、ウォートを、一般に、６０分間〜１２０分間の範囲内の長時間煮沸する。しかし、長時間の煮沸は、いくつもの他の理由で、例えば、長時間の煮沸には著しいエネルギー供給が必要であるので、望ましくない。
【０１３７】
本発明によると、長時間煮沸することなしでさえも、Ｔ２Ｎ、Ｔ２Ｎポテンシャル、ＤＭＳおよびＤＭＳＰのレベルが低いウォートを二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから生成することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態によると、ウォートを最大で３０分間にわたり、より好ましくは最大で１５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１０分間にわたり、さらにまたより好ましくは最大で５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１分間にわたり煮沸し、さらにまたより好ましくはウォートをまったく煮沸しない。本発明による方法の工程ｉｉ）が完了した後、液体／ウォート／飲料を最大で３０分間にわたり、より好ましくは最大で１５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１０分間にわたり、さらにまたより好ましくは最大で５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１分間にわたり煮沸すること、さらにまたより好ましくは液体／ウォート／飲料をまったく煮沸しないことがさらに好ましい。ウォートの加熱は、本質的に密閉された容器、好ましくは密閉された容器内において行うことが好ましい。
【０１３８】
この文脈において、「煮沸」という用語は、液体またはウォートまたは飲料を水が蒸発する温度に至らせることを意味する。したがって、通常の圧力において、煮沸とは、ウォートなどの水性液体を１００℃またはそれをわずかに超える温度に至らせることを意味することになる。
【０１３９】
したがって、本発明の実施形態によるウォートを、少なくとも１００℃の温度で、最大で３０分間にわたり、より好ましくは最大で１５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１０分間にわたり、さらにまたより好ましくは最大で５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１分間にわたり保持することも好ましく、さらにまたより好ましくは、ウォートを少なくとも１００℃の温度まで加熱することはまったくしない。さらに、本発明による方法の工程（ｉｉ）が完了した後、液体／ウォート／飲料を少なくとも１００℃の温度で最大で３０分間にわたり、より好ましくは最大で１５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１０分間にわたり、さらにまたより好ましくは最大で５分間にわたり、さらにより好ましくは最大で１分間にわたり保持することが好ましく、さらにまたより好ましくは、液体／ウォート／飲料を少なくとも１００℃の温度まで加熱することはまったくしない。
【０１４０】
本発明によるオオムギベースの飲料を調製する方法全体が、９９．８℃超、好ましくは９９．５℃、さらにまたより好ましくは９９℃の温度まで加熱することを決して伴わないことも好ましい。
【０１４１】
どちらかといえば、方法は、ウォートを、限られた時間量にわたり、最大で９９．５℃、例えば、最大で９９℃など、最大で９８℃など、最大で９９．８℃の温度まで加熱する工程を伴い得る。前記限られた時間量は、最大で３０分間、より好ましくは最大で１５分間、さらに好ましくは最大で１０分間であることが好ましい。
【０１４２】
したがって、ウォートを、最大で３０分間にわたり、好ましくは、１０〜３０分間の範囲内、例えば、１０〜２０分間の範囲内など、最大で２０分間にわたり、８０℃を超える温度、好ましくは、８０〜９９．５℃の範囲内、例えば、８０〜９９℃の範囲内など、８０〜９９．８℃の範囲内、さらにまたより好ましくは、９０〜９９℃の範囲内の温度、さらにまたより好ましくは、９５〜９９℃の範囲内の温度まで加熱することが好ましい。
【０１４３】
本発明のさらなる実施形態では、ウォートの煮沸の後、および発酵させる前にウォートを（例えば、ＣＯ２を用いる洗浄）に供しないことが好ましい。
【０１４４】
ウォート
別の態様では、本発明は、ウォート組成物である植物生成物の種類に関する。前記ウォート組成物は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒に由来する麦芽組成物から調製されることが好ましい。前記麦芽は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒だけから調製することができ、他の穀粒も含む混合物から調製することもできる。本発明はまた、緑麦芽などの、単独で、または他の成分と混合された二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギまたはそれらの一部を用いて調製されるウォート組成物にも関する。
【０１４５】
本発明によるウォート組成物は、本明細書の上記の節「マッシング」に記載した通りにマッシングにより調製されることが好ましい。さらに、ウォート組成物は、本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通りに加熱されていてよい。
【０１４６】
前記ウォート組成物は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満、なおより好ましくは４０％未満であることが好ましい。
【０１４７】
前記ウォートは、一番ウォート、および／または二番ウォート、および／またはさらなるウォート、および／またはこれらの混合物であり得る。ウォート組成物は、スイートウォートの場合もあり、加熱ウォートの場合もあり、これらの混合物の場合もある。加熱ウォートは、本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通りに加熱されていることが好ましい。ウォート組成物はまた、オオムギウォートの場合もある。一般に、ウォート組成物は、高含有量のアミノ窒素と、発酵性炭水化物とを含有し、後者は主にマルトースである。
【０１４８】
一実施形態では、ウォートはスイートウォート、すなわち、加熱処理にかけられていないウォートであり得る。前記スイートウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、６０％未満、より好ましくは５０％未満であることが好ましい。前記ウォートを低温でキルン乾燥した麦芽から調製した場合、それが含むＴ２Ｎポテンシャルはさらに低くなり得る。したがって、前記スイートウォートが５０〜７０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートは、好ましくは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、５０％未満、なおより好ましくは、４０％未満など、４５％未満であることが好ましい場合がある。前記スイートウォートが４０〜５０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、５０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにまたより好ましくは３０％未満であることが好ましい場合がある。
【０１４９】
前記スイートウォートは、また、含むＤＭＳＰのレベルが低く、含むＤＭＳＰ（好ましくはＳＭＭ）が、好ましくは１５０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることが好ましい。たとえ前記ウォートを低温でキルン乾燥した麦芽から調製したとしても、それが含むＤＭＳＰのレベルはなお低い。したがって、前記スイートウォートが５０〜７０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートは、含むＤＭＳＰが、１５０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることが好ましい場合がある。前記スイートウォートが４０〜５０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートが含むＤＭＳＰは、１５０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることが好ましい場合がある。
【０１５０】
前記スイートウォートはまた、それが含むＤＭＳのレベルが低く、含むＤＭＳが、好ましくは９０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満であることが好ましい。
【０１５１】
ウォートはまた、９５〜９９．８℃の範囲内の温度または９５〜９９℃の範囲内の温度で１０〜３０分間の範囲内にわたるなど、短時間加熱処理しただけのウォートでもあり得る。この場合、前記ウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、最大で６０％、より好ましくは最大で５０％、なおより好ましくは最大で４５％、より好ましくは最大で４０％であることが好ましい。前記ウォートはまた、含むＤＭＳＰが、最大で１５０μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることも好ましい。前記ウォートはまた、含むＤＭＳが、最大で１５０μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満であることも好ましい。
【０１５２】
ウォートはまた、加熱ウォート（好ましくは本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通り加熱された）でもあり得、その場合、ウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、最大で６０％、より好ましくは最大で５０％、さらにまたより好ましくは最大で４０％であることが好ましい。
【０１５３】
前記加熱ウォートはまた、含むＤＭＳＰのレベルも低く、含むＤＭＳＰが、好ましくは１５０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることが好ましい。前記冷却ウォートが、５０〜７０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートは、含むＤＭＳＰが、１５０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることが好ましい場合がある。さらに、前記冷却ウォートが、４０〜５０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートは、含むＤＭＳＰが、１５０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは１００μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることが好ましい場合がある。前記加熱ウォートはまた、含むＤＭＳのレベルが低く、含むＤＭＳＰが、好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、より好ましくは２０μｇ／Ｌ未満であることが好ましい。
【０１５４】
ウォートはまた、加熱（好ましくは本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通りに加熱）され、その後冷却された（本明細書において、冷却ウォートとも称する）ウォートでもあり得、その場合、ウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、最大で６０％、より好ましくは最大で５０％、さらにまたより好ましくは最大で４０％であることが好ましい。前記冷却ウォートが、４０〜５０℃の範囲内の温度でキルン乾燥された麦芽から調製された本発明の複数の実施形態では、前記スイートウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したウォート組成物と比較して、５０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにまたより好ましくは３０％未満であることが好ましい場合がある。
【０１５５】
前記冷却ウォートはまた、含むＤＭＳＰのレベルが低く、含むＤＭＳＰが、好ましくは９０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは１５μｇ／Ｌ未満であることも好ましい。前記冷却ウォートはまた、含むＤＭＳのレベルが低く、含むＤＭＳが、好ましくは９０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５０μｇ／Ｌ未満、さらにまたより好ましくは３０μｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０μｇ／Ｌ未満であることも好ましい。
【０１５６】
本発明の特定の一実施形態では、本発明によるウォート組成物とは、加熱されたオオムギウォート、すなわち、麦芽にしていない（かつ、好ましくは破砕した）二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒を、水と共にインキュベートすることにより、好ましくはマッシングおよびスパージングすることにより調製されたウォートなど、オオムギウォートである。このようなオオムギウォートは、Ｔ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルのレベルが極めて低いことを特徴とする。前記オオムギウォートは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒから同じ方法で調製したオオムギウォート組成物と比較して、５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満であることが好ましい。前記オオムギウォートは、含むＴ２Ｎ前駆体が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したオオムギウォート組成物と比較して、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、なおより好ましくは３０％未満であることも好ましい。
【０１５７】
飲料
好ましい態様では、本発明は、飲料、より好ましくは二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから調製されるオオムギベースの飲料に関する。好ましい一実施形態では、前記飲料は、麦芽飲料、なおより好ましくは、発酵飲料、好ましくはビールなどのアルコール飲料など、発酵麦芽飲料であることが好ましい場合があり、前記飲料は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ、またはそれらの一部を用いて調製される。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、飲料を、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ、またはその一部、またはその抽出物を発酵させることにより、例えば、単独で、または他の成分と組み合わせた二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽からウォートを発酵させることにより調製することが好ましい。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態では、上記の飲料を、
（ｉ）
（ａ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と；
（ｂ）機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と；
（ｃ）機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異と
を含むオオムギ植物体またはその一部を供給する工程と：
（ｉｉ）必要に応じて、前記オオムギの少なくとも一部を麦芽にし、これにより、麦芽になったオオムギを得る工程と；
（ｉｉｉ）前記オオムギおよび／または麦芽になったオオムギ、ならびに必要に応じてさらなる添加物をマッシングし、これによりウォートを得る工程と；
（ｉｖ）前記ウォートを、必要に応じてさらなる成分（複数可）の存在下で加熱する工程であって、最大でウォートの体積の４％を蒸発させ、これにより、加熱ウォートを得る工程と；
（ｖ）前記加熱ウォートを飲料へと加工する工程と
を含む方法により調製する。
【０１５９】
しかし、他の実施形態では、本発明は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから調製される任意のオオムギベースの飲料に関する。したがって、本発明は、従来の醸造方法などの従来の方法を用いて、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから調製されるオオムギベースの飲料にも関する。
【０１６０】
本発明のいくつかの実施形態では、飲料とは、非発酵飲料、例えば、ウォート、好ましくは二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの麦芽から調製したウォートである。
【０１６１】
前記飲料を、麦芽にしていないオオムギ植物体、好ましくは麦芽にしていない二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体またはその一部から、例えば、オオムギの醸造により調製し得ることもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６２】
飲料は、非アルコール性ビール、またはモルティナなどの非アルコール性麦芽飲料など、他の種類の非アルコール性飲料などの非アルコール性飲料であり得る。
【０１６３】
しかし、前記飲料は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ穀粒から調製される麦芽組成物から調製することが好ましい。前記飲料は、ビールであることがより好ましい。これは、当業者に公知の任意の種類のビールであり得る。一実施形態では、ビールが、例えば、ラガービールである。ビールは、発芽した二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギを含む麦芽組成物を用いて醸造することが好ましく、発芽した二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギだけから調製した麦芽組成物を用いて醸造することがより好ましい。しかし、麦芽組成物はまた他の成分、例えば、野生型のオオムギ、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ、コムギおよび／またはライムギなどの、他の発芽させた穀類もしくは発芽させていない穀類、またはシロップ組成物を含め、麦芽になった原料もしくは麦芽にしていない原料に由来する糖もしくは組成物を含む、発芽させていない原料なども含み得る。しかし、前記ビールを調製するのに用いられる、すべての麦芽になったオオムギ、および／もしくは麦芽にしていないオオムギ、ならびに／または発芽させたオオムギ、および／もしくは発芽させていないオオムギなど、好ましくはすべてのオオムギが、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギであることが好ましい。
【０１６４】
したがって、本発明は、飲料を作製する方法であって、
（ｉ）発芽した二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒を含む麦芽組成物を供給する工程と；
（ｉｉ）前記麦芽組成物を飲料へと加工する工程と
を含む方法にも関する。
【０１６５】
好ましい実施形態では、本発明による飲料は、より好ましくは、キルン処理された麦芽（好ましくは本明細書の上記の節「麦芽製造」に記載した通りに調製された）から、前記キルン処理された麦芽をマッシングすることにより（好ましくは本明細書の上記の節「マッシング」に記載した通り）調製されたウォートから作製したビールであり、前記マッシングは、必要に応じて、スパージング工程を含有し得る。さらに、前記ウォートは、好ましくは本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通りに加熱されていることが好ましいが、本発明のある特定の実施形態では、ウォートを従来の方法において煮沸することにより加熱することができる。本明細書では、このように作製されたビールはまた、「麦芽で造られた（ｍａｌｔｅｄ）」とも称する。しかし、本発明による飲料はまた、オオムギウォートから調製されたビールでもあり得る。このようなビールはまた、「オオムギビール」とも称する。
【０１６６】
一般に述べると、アルコール飲料（ビールなど）は、麦芽になったオオムギ穀粒および／または麦芽にしていないオオムギ穀粒から製造することができる。ホップおよび酵母に加えて、麦芽が、ビールの風味および色に寄与する。さらに、麦芽は、発酵性糖および酵素の供給源として機能する。ビール生産の一般的なプロセスについての図式的表示を図９に示すが、麦芽製造および醸造に適切な方法の例についての詳細な記載は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１年）およびＨｏｕｇｈら（１９８２年）よる刊行物において見出すことができる。オオムギ生成物、麦芽生成物およびビール生成物の解析については、定期的に更新される多数の方法を用いることができ、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９５年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９２年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（１９９８年）、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ（１９９７年）があるが、これらに限定されない。所与の醸造所について、多くの特殊な手順が用いられており、その最も顕著な多様性は、各地の消費者の選好に関するものであると理解される。本発明と共に、ビールを生産する任意のこのような方法を用いることができる。
【０１６７】
ウォートからビールを生産する最初の工程は、前記ウォートを本明細書の上に記載した通りに加熱し、その後のウォート冷却の段階、必要に応じて、旋回休止（ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ  ｒｅｓｔ）が続くことが好ましい。冷却後、ウォートを、酵母を含有する発酵タンクへ移す。好ましくは、前記酵母は、ビール酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓである。ウォートは、任意の適切な期間、一般には１〜１００日間の範囲内で発酵させる。数日間にわたる発酵プロセスの間、糖はアルコールおよびＣＯ２に変換され、一部の風味物質の生成が相伴う。
【０１６８】
その後、ビールはさらに加工され、例えば、冷却され得る。それはまた、濾過および／またはラガリング（ｌａｇｅｒｅｄ）（快い芳香を生成させ、酵母風味を軽減するプロセス）を経る場合もある。また、添加物を添加する場合もある。さらに、ＣＯ２を添加する場合もある。最後に、ビールを低温殺菌および／または濾過してから、詰める（例えば、ボトルまたは缶に封入する）ことができる。好ましい実施形態では、本発明による飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎポテンシャルと比較して、７０％未満、好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満である。本発明による飲料が基礎をおく、元の抽出物中における°Ｐが、１０〜１２°Ｐの範囲内、より好ましくは１１°Ｐに調整される場合、該飲料は、含むＴ２Ｎポテンシャルが、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂであることも好ましい。
【０１６９】
好ましい実施形態では、本発明による飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料のＴ２Ｎ前駆体と比較して、７０％未満、好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満である。本発明による飲料が基礎をおく、元の抽出物中における°Ｐが、１０〜１２°Ｐの範囲内、より好ましくは１１°Ｐに調整される場合、該飲料は、含むＴ２Ｎ前駆体が、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂであることも好ましい。
【０１７０】
前記飲料、好ましくは、ビールは、含むＤＭＳが、最大で６０ｐｐｂ、より好ましくは５０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは４０ｐｐｂ未満、さらにまたより好ましくは３０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは２０ｐｐｂ未満、さらにまたより好ましくは１０ｐｐｂ未満であることも好ましい。
【０１７１】
本発明の特定の一実施形態では、該飲料は、オオムギビールであり、含むＴ２Ｎポテンシャルが、  野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種ＰｏｗｅｒまたはＱｕｅｎｃｈから同じ方法で調製したオオムギビールのＴ２Ｎポテンシャルと比較して、６０％未満、好ましくは５０％未満である。
【０１７２】
本発明の別の特定の実施形態では、好ましくはビールである飲料を、９５〜９９．８℃の範囲内の温度または９５〜９９℃の範囲内の温度で１０〜３０分間の範囲内にわたるなど、短時間加熱処理しただけの加熱ウォートから調製する。前記加熱ウォートは、本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通り加熱されていることが好ましい。飲料、好ましくは、ビールを、このような加熱ウォートから調製する本発明の複数の実施形態では、前記飲料、好ましくは、ビールは、含むＴ２Ｎポテンシャルが、野生型のオオムギ、好ましくは、栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したビールのＴ２Ｎポテンシャルと比較して、６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４５％未満である。この実施形態では、前記飲料、好ましくは、ビールは、含むＴ２Ｎ前駆体が、飲料、好ましくは、野生型のオオムギ、好ましくは、栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製したビールのＴ２Ｎ前駆体と比較して、６０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４５％未満であることも好ましい。この実施形態では、本発明によるビールは、含むＴ２Ｎポテンシャルが最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂであることも好ましい。この実施形態では、本発明によるビールは、基礎をおく、元の抽出物中における°Ｐが、１０〜１２°Ｐの範囲内、より好ましくは１１°Ｐに調整される場合、該飲料が含むＴ２Ｎ前駆体が、最大で２ｐｐｂ、より好ましくは最大で１．５ｐｐｂであることがさらに好ましい。前記飲料、好ましくは、ビールは、含むＤＭＳが、最大で６０ｐｐｂ、より好ましくは、５０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは、４０ｐｐｂ未満、さらにまたより好ましくは、３０ｐｐｂ未満、さらにより好ましくは、２０ｐｐｂ未満、さらにまたより好ましくは、１０ｐｐｂ未満であることも好ましい。
【０１７３】
「感覚刺激性の品質」とは、ヒトの嗅覚および味覚に訴える品質を意味する。前記品質は、例えば、専門家によるビール試飲パネルにより解析される。好ましくは、前記パネルは、アルデヒド、紙質の風味、古い風味、エステル、高級アルコール、脂肪酸および硫黄様の成分に特別の焦点を当てて、ビールの風味を味わい、説明することにおいて熟練している。
【０１７４】
一般に、試飲パネルは、３〜３０人の範囲内のメンバー、例えば、５〜１５人の範囲内のメンバー、好ましくは８〜１２人の範囲内のメンバーからなる。試飲パネルは、紙質のオフフレーバー、酸化によるオフフレーバー、劣化によるオフフレーバー、およびパンのオフフレーバーならびにエステル、高級アルコール、硫黄成分およびビールの本体の風味など、各種の風味の存在について評価し得る。本発明との関連では、紙質のオフフレーバーおよび／または劣化によるオフフレーバーを特に低下させることが好ましいが、一方、芳香性の風味、エステル様の風味、アルコール様の／溶媒の風味、花のような風味および／またはホップのような風味などの風味は、野生型のオオムギから同一の方法を用いて調製した飲料と比較して増すことが好ましい場合がある。飲料の「感覚刺激性の品質」を判定する方法は、国際特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号の実施例６に記載されている。飲料の「感覚刺激性の品質」を判定する別の方法については、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例８および９に記載されている。さらにまた別の例は、本明細書の下記の実施例９に記載する。好ましい実施形態では、安定的な感覚刺激性の品質が、少なくとも部分的には、Ｔ２ＮまたはＴ２Ｎポテンシャルのレベルが低いことの結果である。芳香性の風味、エステル様の風味、アルコール様の／溶媒の風味、花のような風味、および／またはホップのような風味は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例７に記載されている通り判定し得ることが好ましい。好ましい一実施形態では、本発明の飲料は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の４１頁、１５行目〜４４頁、９行目において記載されている通りの芳香性の風味、エステル様の風味、アルコール様の／溶媒の風味、花のような風味、および／またはホップのような風味についてのスコアを有する。
【０１７５】
本発明による飲料は、約３７℃など、３０〜４０℃の範囲内で少なくとも１週間にわたる保存後における紙質の風味が、野生型のオオムギ植物体（好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａ）から同じ方法で調製した同様の飲料と比較して弱いことを特徴とすることが好ましい。前記紙質の風味は、熟練の試飲パネルによる評価で９０％未満、より好ましくは、７０％未満など、８０％未満であることが好ましい。
【０１７６】
本発明による飲料は、高温での保存後における紙質の風味が、野生型のオオムギから調製した同様の飲料と比較して軽減されることも好ましい。熟練の専門家による試飲パネルが、「紙質の風味」の特性を判定し（上に記載した通り）、０を「なし」として５を「極めて強い」とする０〜５段階でスコア付けする場合、本発明の飲料は、紙質の風味についての以下のスコア：
（ｉ）３７℃で１週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料の紙質の風味についてのスコアより、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．７低い、紙質の風味についてのスコア；
（ｉｉ）３７℃で２週間にわたるインキュベーション後において、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料の紙質の風味についてのスコアより、少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．７、より好ましくは少なくとも０．８、少なくとも１低い紙質の風味についてのスコア
のうちの１つ、または好ましくは両方を有することが好ましい。
【０１７７】
興味深いことに、本発明は、本発明に従って製造した飲料の全体的な風味スコアが野生型のオオムギから調製した飲料と比較して改善されていることを開示している。これは、ＤＭＳにより特定の望ましい風味が遮蔽され得るという知見に一部起因し得る。
【０１７８】
したがって、本発明の飲料は、対応するウォートを煮沸せずに、好ましくは加圧加熱を用いて調製した場合、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料の風味スコアよりも少なくとも１、好ましくは少なくとも１．５、より好ましくは少なくとも２高い全体的な風味スコアを有することが好ましい。前記風味スコアは、専門家によるビール試飲パネルによりもたらされる、９が最高スコアを表す１〜９段階でスコア付けするものとする。
【０１７９】
飲料は、保存後においても、含む遊離Ｔ２Ｎレベルが極めて低い場合に、「安定的な感覚刺激性の品質」を有するという。したがって、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を用いて製造された飲料（安定的な感覚刺激性の品質を有するビールなど）を提供することが、本発明の目的である。
【０１８０】
したがって、本発明の飲料は、３０〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは３７℃で、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは少なくとも４週間にわたる保存後において、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製された飲料と比較して、８０％未満、好ましくは７０％未満、より好ましくは６５％未満、なおより好ましくは６０％未満、なおより好ましくは５５％未満であることが好ましい。本発明の飲料はまた、３７℃で２週間にわたる保存後において、含む遊離Ｔ２Ｎが０．０２５ｐｐｂ未満であることも好ましい。
【０１８１】
本発明の別の特定の実施形態では、飲料、好ましくはビールを、９５〜９９℃の範囲内の温度で１０〜３０分間の範囲内にわたるなど、短時間加熱処理しただけの加熱ウォートから調製する。前記加熱ウォートは、本明細書の上記の節「ウォートの加熱」に記載した通り加熱されていることが好ましい。飲料、好ましくはビールを、このような加熱ウォートから調製する本発明の複数の実施形態では、前記飲料、好ましくは、ビールは、３０〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは３７℃で、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、なおより好ましくは少なくとも４週間にわたる保存後において、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製された飲料と比較して、８０％未満、好ましくは７０％未満、より好ましくは６５％未満である。
【０１８２】
特に、前記加熱ウォートから調製したこのような飲料、好ましくは、ビールは、３０〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは３７℃で、１０ｐｐｍを超えないレベルのサルファイト、好ましくは１〜１０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１〜８ｐｐｍの範囲内、より好ましくは２〜６ｐｐｍの範囲内、さらにまた好ましくは３〜６ｐｐｍの範囲内のレベルのサルファイトの存在下で２週間にわたる保存後において、含むＴ２Ｎのレベルが極めて低く、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製された飲料と比較して、好ましくは８０％未満、好ましくは７０％未満、より好ましくは６５％未満であることが好ましい。
【０１８３】
ビール、例えばオオムギビールなどの本発明による飲料は、３７℃で８週間にわたる保存後において、含むＴ２Ｎのレベルが極めて低く、含む遊離Ｔ２Ｎが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製された飲料と比較して、好ましくは８０％未満、好ましくは７０％未満、より好ましくは６０％未満、なおより好ましくは５％未満であることも特に好ましい。
【０１８４】
一実施形態では、本発明は、特定のトリヒドロキシオクタデカン酸（ＴＨＡとも称する）のレベルが低いビールなどの飲料、特に、９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルが低い飲料に関する。ＴＨＡは、苦味の風味を特徴とし（ＢａｕｒおよびＧｒｏｓｃｈ、１９７７年；Ｂａｕｒら、１９７７年）、これにより前記化合物は飲料において望ましくないものとなる。
【０１８５】
したがって、９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルは、例えば、１．３ｐｐｍより低い、１ｐｐｍより低いなど、可能な限り低いことが望ましい。したがって、９，１２，１３−ＴＨＡのレベルは、例えば、１．３ｐｐｍより低い、１ｐｐｍより低いなど、可能な限り低いことが好ましい。９，１０，１３−ＴＨＡレベルも、例えば、１．３ｐｐｍより低い、１ｐｐｍより低いなど、可能な限り低いことが好ましい。しかし、ビールなどの麦芽に由来する飲料中における９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡの総濃度はまた、前記特定の飲料を調製するのに用いられる麦芽の量にも依存する。したがって、一般に、強いビールは、含む９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡが、より軽いビールより多く、このため、より強いビールでは、許容される９，１２，１３−ＴＨＡおよび９，１０，１３−ＴＨＡの総レベルがより高くなる。したがって、本発明による飲料は、含む９，１２，１３−ＴＨＡレベルおよび９，１０，１３−ＴＨＡレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料より低いことが好ましい。特に、本発明による飲料は、９，１２，１３ＴＨＡレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料中のレベルと比較して最大で５０％、好ましくは最大で４０％、より好ましくは最大で３０％であることが好ましい。本発明による飲料は、９，１０，１３ＴＨＡレベルが、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した飲料中のレベルと比較して、最大で７０％、好ましくは、最大で５０％、例えば最大で４０％など、最大で６０％であることがさらに好ましい。このような飲料は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギを用いることにより調製することができる。
【０１８６】
本発明の一実施形態では、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから調製した飲料の泡の品質が改善されている。これは、飲料がビールである場合、特に重要である。したがって、泡の品質が優れたビールなどの飲料を提供することが、本発明の目的である。好ましくは、本発明の飲料は、６０〜８０分間、好ましくは８０分間において生成させる泡が、野生型のオオムギ、好ましくは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈから同じ方法で調製された飲料と比較して、少なくとも１．５倍多く、好ましくは少なくとも２倍多く、さらにまたより好ましくは少なくとも３倍多いことが好ましい。前記泡の生成は、本明細書の下記の実施例８に記載する通りに決定される。
【０１８７】
植物生成物
１つ以上のオフフレーバーのレベルが低いことを特徴とする植物生成物、好ましくはオオムギ植物生成物を提供することが、本発明の目的である。特に、Ｔ２Ｎレベル、ＤＭＳレベルおよび対応するそれらの前駆体レベルが低い植物生成物、好ましくはオオムギ植物生成物を提供することが、本発明の目的である。本発明により説明されている通り、このような植物生成物は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギから有利に調製することができる。前記植物生成物は、麦芽、好ましくは本明細書の上記の節「麦芽製造」において記載した任意の麦芽であり得る。生成物は、ウォート、好ましくは本明細書の上記の節「ウォート」において記載した任意のウォートであり得る；生成物はまた、飲料、好ましくは本明細書の上記の節「飲料」において記載した任意の飲料でもあり得る。しかし、植物生成物はまた、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体またはその一部から調製した、Ｔ２Ｎ、Ｔ２Ｎポテンシャル、ＤＭＳおよびＤＭＳＰのレベルが低いことを特徴とする他の植物生成物でもあり得る。
【０１８８】
したがって、本発明は、植物生成物に関し、それは、本明細書の下記のオオムギ植物体またはその一部を含む組成物、または、前記オオムギ植物体またはその一部から調製した植物生成物など、前記オオムギ植物体またはその一部から調製した組成物であり得る。前記オオムギ植物体はＬＯＸ−１活性、ＬＯＸ−２活性およびＭＭＴ活性を欠くので、一般には、組成物は、極めて低いレベルのオフフレーバーおよびそれらの前駆体分子のレベル、特に、Ｔ２Ｎ、Ｔ２Ｎポテンシャル、ＤＭＳおよびＤＭＳＰを含む。機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを有するオオムギ植物体を含む、またはそれから調製した有用な植物生成物の例は、本明細書に記載されている。
【０１８９】
前記植物生成物は、野生型のオオムギ植物体、好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａから同じ方法で調製した同様の植物生成物と比較して、以下：
（ｉ）含む遊離Ｔ２Ｎが、６０％未満、さらにより好ましくは５０％未満、さらにまたより好ましくは、３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満など、４０％未満である；
（ｉｉ）含むＴ２Ｎポテンシャルが６０％未満、さらにより好ましくは５０％未満、さらにまたより好ましくは、３０％未満、好ましくは２５％未満など、４０％未満である；
（ｉｉｉ）含むＤＭＳが、３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、なおより好ましくは１０％未満である；
（ｉｖ）含むＳＭＭが、３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、なおより好ましくは、５％未満、例えば２％未満など、１０％未満である；
（ｖ）含むＤＭＳＰが、３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、なおより好ましくは１０％未満である；
のうちの１つ以上、好ましくはこの内の少なくとも２つ、さらにより好ましくはこのすべてであることが好ましい。
【０１９０】
本発明は、一態様では、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを有するオオムギ穀粒に関する。本発明は、前記穀粒を含む組成物、および前記穀粒から調製した組成物、ならびに前記穀粒から調製した植物生成物にも関する。
【０１９１】
別の態様では、本発明は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体またはその一部を含む、食物組成物、飼料組成物、および芳香の原料組成物であり得る植物生成物に関する。食物組成物は、例えば、麦芽になったオオムギ穀粒および麦芽にしていないオオムギ穀粒、破砕オオムギ、オオムギ粉末、パン、ポリッジ、オオムギを含む穀類混合物、オオムギを含む飲料などの健康製品、オオムギシロップ、およびフレーク状オオムギ組成物、破砕オオムギ組成物、微粒子化したオオムギ組成物、または押出し成形したオオムギ組成物であり得るがこれらに限定されない。飼料組成物には、例えば、オオムギ穀粒および／またはオオムギ粉末を含む組成物が含まれる。飼料組成物は、例えば、マッシュであり得る。芳香の原料組成物については、本明細書の下記に記載する。
【０１９２】
本発明はまた、本発明の種々の植物生成物の混合物にも関する。例えば、一態様では本発明が、
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを含むオオムギ植物体またはその一部を含む組成物；および
（ｉｉ）二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの穀粒から調製される麦芽組成物
の混合物により調製される組成物に関する。
【０１９３】
オオムギ植物体または植物生成物が、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２およびＭＭＴについての遺伝子における、それぞれ機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失および機能的ＭＭＴの完全な喪失を引き起こす変異を有するオオムギ植物体から調製されるかどうかを判定するには、各種の方法を利用することができる。植物生成物は、一般に、その生成のために用いられる植物体に由来する少なくとも一部のゲノムＤＮＡを含む。したがって、麦芽は、大量のゲノムＤＮＡを含有するが、ウォートなど、オオムギまたは麦芽の抽出物であっても、前記オオムギまたは麦芽に由来するゲノムＤＮＡまたはその断片を含み得る。ビールなど、オオムギベースの飲料もまた、前記植物体に由来するゲノムＤＮＡまたはその断片を含み得る。植物生成物中のＤＮＡを解析することにより、そこから植物生成物が調製される植物体が、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２およびＭＭＴの遺伝子における、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失および機能的ＭＭＴの完全な喪失を引き起こす変異を有するかどうかを確立することができる。前記変異は、例えば、本明細書の下記の節「機能的ＬＯＸの喪失」に記載する、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子における変異のうちのいずれかであり得る。ＭＭＴ遺伝子における前記変異は、例えば、本明細書の上記の節「機能的ＭＭＴの喪失」に記載した、ＭＭＴ遺伝子における変異のうちのいずれかであり得る。ゲノムＤＮＡは、配列決定などの任意の有用な方法により、またはＰＣＲベースの方法を含めた増幅ベースの方法により解析することができる。ＬＯＸ−１遺伝子および／またはＬＯＸ−２遺伝子および／またはＭＭＴ遺伝子における特定の変異が推定される場合は、例えば、ＳＮＰ解析などの多型解析を用いることができる。ＬＯＸ−１遺伝子および／またはＬＯＸ−２遺伝子における変異の決定に関して、有用なＳＮＰ解析の非限定的な例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例１０に記載されている。ＭＭＴ遺伝子における変異の決定に関して、有用なＳＮＰ解析の非限定的な例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例１３および１７に記載されている。当業者は、これらの実施例において記載されている特定のＳＮＰ解析を、他の変異または他の出発材料と共に用いるために適合させることができる。
【０１９４】
上述の植物生成物が、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴであるオオムギ植物体だけから調製される場合は、オオムギのＬＯＸ−１  ｍＲＮＡ、ＬＯＸ−２  ｍＲＮＡおよびＭＭＴ  ｍＲＮＡならびに／またはオオムギのＬＯＸ−１タンパク質、ＬＯＸ−２タンパク質およびＭＭＴタンパク質の存在対非存在も、前記植物生成物が、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体から調製されているかどうかを示し得る。植物生成物を、ウェスタンブロッティング解析または他のタンパク質解析により、あるいは、ＲＴ−ＰＣＲにより、またはノーザンブロット解析により、または他のｍＲＮＡ解析により植物生成物の試験を完成することもできる。このような解析は、植物生成物が麦芽である場合、特に有用である。
【０１９５】
オオムギ植物体
本発明は、穀類ベースの飲料に関する。穀類は、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、コメ、モロコシ、キビ、ライコムギ、ソバ、フォニオおよびキノア（ｑｕｉｎｏｎａ）からなる群から選択され得る。穀類は、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシおよびコメからなる群から選択されることがより好ましく、穀類はオオムギであることがより好ましい。
【０１９６】
したがって、本発明は、オオムギベースの飲料および本発明の飲料を調製するために有用なオオムギ植物体に関することが好ましい。
【０１９７】
オオムギとは、植物体のファミリーである。「野生オオムギ」、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍは、現行のオオムギの栽培形態の前駆体であると考えられる。野生状態から栽培状態へのオオムギの移行は、多数の遺伝子座における対立遺伝子頻度の根本的な変化と符合したと考えられている。希少な対立遺伝子、および新規の変異イベントは、「オオムギ在来種」と称する、栽培化された（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ）植物体集団において新規の形質を迅速に確立した農耕民により、肯定的に選択された。これらは、野生オオムギより、新型栽培品種との遺伝子的類縁性がより密接である。１９世紀後半まで、オオムギ在来種は、早期世代におけるランダム異種交配に由来する少数の植物体を含めた、近交系と交配分離種（ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）との高度にヘテロ接合型の混合体として存在した。該在来種の大半は、先進農業において、純粋系統の栽培品種により置き換えられている。中間レベルまたは高レベルの遺伝的多様性が、残りの在来種を特徴付けている。当初、「新型オオムギ」栽培品種は、在来種からの選択を表していた。これらは後に、地理的起源が多様な純粋系統など、確立された純粋系統間における異種交配の継続的サイクル（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｃｙｃｌｅ）に由来した。最終的な結果は、多くの、おそらくはすべての先進農業における遺伝的基盤の顕著な狭小化であった。在来種と比較して、新型オオムギ栽培品種は、例えば、（ｉ）穀粒が皮裸性（ｃｏｖｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｎａｋｅｄ）であること；（ｉｉ）種子の休眠；（ｉｉｉ）病害耐性；（ｉｖ）環境忍容性（例えば、干ばつまたは土壌ｐＨに対する耐性）；（ｖ）リシンおよび他のアミノ酸の量；（ｖｉ）タンパク質含量；（ｖｉｉ）窒素含量；（ｖｉｉｉ）炭水化物組成；（ｉｘ）ホルデニン（ｈｏｒｄｅｉｎ）含量および組成；（ｘ）（１−３，１−４）−β−グルカンおよびアラビノキシラン含量；（ｘｉ）収量；（ｘｉｉ）茎の堅さ；（ｘｉｉｉ）草高であるがこれらに限定されない１つ以上の多くの特性が改善されている（Ｎｅｖｏ、１９９２年；ｖｏｎ  Ｂｏｔｈｍｅｒら、１９９２年）。
【０１９８】
本発明の範囲内において、「オオムギ植物体」という用語は、オオムギ在来種または新型オオムギ栽培品種などの任意のオオムギ植物体を含む。したがって、本発明は、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを含む、任意のオオムギ植物体に関する。このようなオオムギ植物体の例は、本明細書の下記の実施例に記載し、「三重ヌル」または「三重ヌルのオオムギ」と称する。
【０１９９】
しかし、本発明により用いるのに好ましいオオムギ植物体は、新型オオムギ栽培品種または純粋系統である。本発明により用いられるオオムギ栽培品種は、例えば、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、アサヒ５号、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、カントウナカテゴールド、ハカタ２号、キリン直１号、関東後期品種ゴールド、フジニジョウ、ニューゴールデン、サツキオニジョウ、セイジョウ１７号、アカギニジョウ、アズマゴールデン、アマギニジョウ、ニシノゴールド、ミサトゴールデン、ハルナニジョウ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、ＲｏｓａｌｉｎａおよびＪｅｒｓｅｙからなる群から、好ましくは、ハルナニジョウ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、およびＰｏｗｅｒからなる群から、好ましくは、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、アサヒ５号、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、カントウナカテゴールド、ハカタ２号、キリン直１号、関東後期品種ゴールド、フジニジョウ、ニューゴールデン、サツキオニジョウ、セイジョウ１７号、アカギニジョウ、アズマゴールデン、アマギニジョウ、ニシノゴールド、ミサトゴールデン、ハルナニジョウ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、およびＪｅｒｓｅｙからなる群から、好ましくは、ハルナニジョウ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｐｏｗｅｒ、Ｑｕｅｎｃｈ、ＮＦＣ  Ｔｉｐｐｌｅ、Ｂａｒｋｅ、Ｃｌａｓｓ、およびＶｉｎｔａｇｅからなる群から選択することができる。
【０２００】
したがって、本発明の一実施形態では、オオムギ植物体は、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失を結果としてもたらす第１の変異と、機能的ＬＯＸ−２活性の完全な喪失を結果としてもたらす第２の変異と、機能的ＭＭＴの完全な喪失を結果としてもたらす第３の変異とを含む新型オオムギ栽培品種（好ましくは本明細書の上記で列挙されているオオムギ栽培品種の群から選択される栽培品種）である。したがって、この実施形態では、オオムギ植物体が、オオムギ在来種ではないことが好ましい。
【０２０１】
オオムギ植物体は、任意の適切な形態であり得る。例えば、本発明によるオオムギ植物体は、生存オオムギ植物体、乾燥植物体、ホモジナイズされた植物体、または破砕オオムギ穀粒であり得る。植物体は、成熟植物体、胚、発芽穀粒、麦芽になった穀粒、麦芽になった破砕穀粒、破砕穀粒などであり得る。
【０２０２】
オオムギ植物体の一部は、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、またはこれらの断片など、該植物体の任意の適切な部分であり得る。断片は、例えば、穀粒、胚芽、葉、茎、根、または花の切片であり得る。オオムギ植物体の一部はまた、ホモジネートの断片、または破砕オオムギ植物体もしくは破砕穀粒の断片でもあり得る。
【０２０３】
本発明の一実施形態では、オオムギ植物体の一部は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、組織培養物中で増殖させ得る生細胞など、前記オオムギ植物体の細胞であり得る。しかし、他の実施形態では、オオムギ植物体の一部は、完全オオムギ植物体へと成熟することが不可能な生細胞、すなわち、生殖物質ではない細胞であり得る。
【０２０４】
機能的ＬＯＸの喪失
本発明は、第１、第２の変異および第３の変異を有するオオムギ植物体（またはそれらの一部、またはそれらの植物生成物）に関し、該第１の変異は、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失をもたらし、該第２の変異は、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失をもたらす。該第３の変異は、本明細書の下記の節「機能的ＭＭＴの喪失」において記載される機能的ＭＭＴの完全な喪失をもたらす。
【０２０５】
機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失と機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失とは、異なる機構に独自に基づき得る。例えば、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の一方または両方の機能の完全な喪失は、オオムギ植物体において機能不全のタンパク質、すなわち、検出可能な９−ＨＰＯＤＥ形成活性（９−ＨＰＯＤＥは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例４に記載されている通りに決定され得ることが好ましい）を示さない、変異ＬＯＸ−１タンパク質、および／または検出可能な１３−ＨＰＯＤＥ形成活性（１３−ＨＰＯＤＥは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例４に記載されている通りに決定され得ることが好ましい）を示さない、変異ＬＯＸ−２タンパク質など、機能不全のＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質により引き起こされ得る。
【０２０６】
ＬＯＸ−１および／またはＬＯＸ−２の機能の完全な喪失は、ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質の欠如により引き起こされ得る。ＬＯＸ−１タンパク質の欠如が、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失をもたらし、ＬＯＸ−２タンパク質の欠如が、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失をもたらすことは明らかである。したがって、オオムギ植物体は、ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質を含まない（またはこれらをごく少量しか含まず、より好ましくは、検出可能なＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質を含まない）ことが好ましい場合がある。ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質（複数可）は、当業者に公知の任意の適切な手段により検出することができる。しかし、該タンパク質（複数可）は、ＬＯＸ−１タンパク質が、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２に対するポリクローナル抗体など、特異的なＬＯＸ−１抗体およびＬＯＸ−２抗体により検出される技法により検出されることが好ましい。前記技法は、例えば、ウェスタンブロット法の場合もあり、ＥＬＩＳＡ法の場合もある。前記抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。しかし、前記抗体は、ＬＯＸ−１タンパク質およびＬＯＸ−２タンパク質それぞれにおける複数の異なるエピトープを認識するポリクローナルの性質であることが好ましい。ＬＯＸ−１タンパク質および／またはＬＯＸ−２タンパク質はまた、例えば、ＬＯＸ−１活性を決定する方法によって、またはＬＯＸ−２活性を決定する方法によって間接的に検出することもできる。本発明の好ましい一実施形態では、ＬＯＸ−１タンパク質が、国際特許出願第ＷＯ２００５／０８７９３４号の実施例４で概説された方法を用いて検出される。ＬＯＸ−２タンパク質は、オオムギＬＯＸ−２に結合する抗体を用いて、同様の方法で検出することができる。
【０２０７】
ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性の一方または両方の機能の完全な喪失はまた、ＬＯＸ−１転写物および／またはＬＯＸ−２転写物の発現がないという結果の場合もあり、これらがごくわずかしかないという結果の場合もあるが、これらの発現がないという結果の場合が好ましい。当業者は、ＬＯＸ−１転写物および／またはＬＯＸ−２転写物の非存在がまた、それぞれ、翻訳されるＬＯＸ−１タンパク質またはＬＯＸ−２タンパク質の非存在も結果としてもたらすことを認める。代替的に、機能的ＬＯＸ−１および機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失はまた、異常なＬＯＸ−１転写物および／または異常なＬＯＸ−２転写物が発現する結果でもあり得る。異常なＬＯＸ−１転写物および／または異常なＬＯＸ−２転写物は、例えば、スプライス部位における変異に起因する、転写物の異常なスプライシングにより引き起こされ得る。したがって、本発明のオオムギ植物体は、５’側スプライス部位または３’側スプライス部位などのスプライス部位における、例えば、イントロンの最も５’側の１つまたは２つにおける、またはイントロンの最も３’側の１つにおける変異を有し得る。ＬＯＸ−１転写物の異常なスプライシングを有する変異体の例は、ＷＯ２００５／０８７９３４において、変異体Ａ６１８として記載されている。ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２をコードする転写物の発現は、例えば、ノーザンブロッティング実験により検出することもでき、ＲＴ−ＰＣＲ実験により検出することもできる。
【０２０８】
本発明のオオムギ植物体における機能的ＬＯＸ−１酵素および機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失は、変異により引き起こされる。したがって、本発明のオオムギ植物体は、一般に、ＬＯＸ−１遺伝子において変異を有する。前記変異は、制御領域内、例えば、プロモーター内またはイントロン内の場合もあり、コード領域内の場合もある。変異はまた、コード領域全体の欠失など、ＬＯＸ−１遺伝子またはその一部の欠失でもあり得る。同様に、本発明のオオムギ植物体は、一般に、ＬＯＸ−２遺伝子において変異を有する。前記変異は、制御領域内、例えば、プロモーター内またはイントロン内の場合もあり、コード領域内の場合もある。変異はまた、コード領域全体の欠失など、ＬＯＸ−２遺伝子またはその一部の欠失でもあり得る。したがって、機能的ＬＯＸ−１酵素および／または機能的ＬＯＸ−２酵素の完全な喪失の原因はまた、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子内、またはＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異を同定することによっても検出することができる。ＬＯＸ−１をコードする遺伝子内およびＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異は、例えば、前記遺伝子を配列決定することにより検出することができる。変異を同定した後で、ＬＯＸ−１活性および／またはＬＯＸ−２活性について調べることにより、機能の完全な喪失を確認することが好ましい。
【０２０９】
「ＬＯＸ−１タンパク質」という用語は、配列番号３（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３に対応する）、またはＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号７で示されるオオムギの全長ＬＯＸ−１タンパク質またはその機能的相同体を包含することを意図する。ＬＯＸ−１の活性部位は、該酵素のＣ末端部分に位置する。特に、アミノ酸残基５２０〜８６２の範囲の領域またはその一部（好ましくは、アミノ酸番号５２０〜８６２の領域全体）が、ＬＯＸ−１活性に関与すると予測される。したがって、一実施形態では、ヌルＬＯＸ−１のオオムギが、ＬＯＸ−１のアミノ酸５２０〜８６２のうちの一部または全部を欠く、ＬＯＸ−１の変異形態をコードする遺伝子を含むことが好ましい。前記変異ＬＯＸ−１はまた、野生型のＬＯＸ−１には存在する他のアミノ酸残基も欠く可能性がある。
【０２１０】
したがって、本発明の二重ヌルＬＯＸのオオムギは、機能的でないＬＯＸ−１の切断形態（Ｎ末端切断形態またはＣ末端切断形態など）を含み得る。前記切断形態は、含むＬＯＸ−１の連続アミノ酸が、８００以下、より好ましくは７５０以下、なおより好ましくは７００以下、さらにまたより好ましくは６９０以下、なおより好ましくは６８０以下、さらにまたより好ましくは６７０以下、たとえば、含む配列番号３（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３に対応する）のＬＯＸ−１の連続アミノ酸が、６６５以下、例えば、６５０以下、例えば、６００以下、例えば、５５０以下、例えば、５００以下、例えば、４５０以下、例えば、４２５以下、例えば、３９９以下であることが好ましい。前記切断形態は、ＬＯＸ−１のＮ末端断片だけを含むことが好ましく、含む配列番号３（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３に対応する）のＮ末端アミノ酸が、好ましくは最大で８００、より好ましくは最大で７５０、なおより好ましくは最大で７００、さらにまたより好ましくは最大で６９０、なおより好ましくは最大で６８０、さらにまたより好ましくは最大で６７０、さらにより好ましくは最大で６６５、たとえば、含む配列番号３（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３に対応する）のＮ末端アミノ酸が６６５以下、例えば、６５０以下、例えば、６００以下、例えば、最大で５５０、例えば、最大で５００、例えば、最大で４５０、例えば、最大で４２５、例えば、最大で３９９であることが好ましい。ＬＯＸ−１の断片に加えて、前記切断形態は、必要に応じて、野生型のＬＯＸ−１においては存在しないさらなるＣ末端配列を含み得る。これは、特に、該切断形態が異常なスプライシングから生じた場合にそうであり得る。前記さらなるＣ末端配列は、最大で５０、より好ましくは最大で３０、なおより好ましくは最大で１０、さらにまたより好ましくは、  最大で４、または最大で１のアミノ酸からなることが好ましい。
【０２１１】
極めて好ましい一実施形態では、切断形態が、配列番号３（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号３に対応する）のアミノ酸１〜６６５からなり得る。
【０２１２】
本発明の好ましい実施形態では、オオムギ植物体が、野生型ＬＯＸ−１  ｍＲＮＡの終止コドンの上流において、ナンセンスコドンまたは終止コドンを含むｍＲＮＡへと転写される、ＬＯＸ−１コード遺伝子を含む。本明細書では、このようなナンセンスコドンを、未熟ナンセンスコドンと表わした。前記植物体のｍＲＮＡへと転写されるすべてのＬＯＸ−１コード遺伝子は、未熟ナンセンスコドンまたは未熟終止コドンを含む。該ナンセンスコドンまたは終止コドンは、開始コドンの最大で８００コドン下流に位置することが好ましく、より好ましくは最大で７５０コドン、なおより好ましくは最大で７００コドン、さらにまたより好ましくは最大で６９０コドン、なおより好ましくは最大で６８０コドン、さらにまたより好ましくは最大で６７０コドン、なおより好ましくは最大で６６５コドン下流に位置する。ＬＯＸ−１をコードする野生型ゲノムＤＮＡの配列は、配列番号１（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号１に対応する）、またはＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号５において与えられる。
【０２１３】
好ましい一実施形態では、本発明のオオムギ植物体が、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子から転写される対応するプレｍＲＮＡが、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号２に対応する配列を含む。
【０２１４】
本発明の極めて好ましい実施形態では、本発明による二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体の変異体ＬＯＸ−１をコードする遺伝子が、ナンセンス変異を含み、前記変異が、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号１の３５７４位におけるＧ→Ａ置換に対応する。
【０２１５】
「ＬＯＸ−２タンパク質」という用語は、本公開の配列番号７（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の配列番号５に対応する）で示されるオオムギの全長ＬＯＸ−２タンパク質またはその機能的相同体を包含することを意味する。ＬＯＸ−２の活性部位は、ＬＯＸ−２のＣ末端部分に位置する。特に、アミノ酸残基５１５〜７１７の範囲の領域またはその一部が、ＬＯＸ−２活性に関与すると予測される。ダイズＬＯＸ−１の結晶構造についての検討に基づくと、オオムギのＬＯＸ−２酵素の活性部位のくぼみについて予測される配列の範囲は、アミノ酸残基５１５〜５２５および７０７〜７１７により表される。翻訳された、変異ＬＯＸ−２タンパク質、すなわち、二重ヌルＬＯＸのオオムギの変異体Ａ６８９のＬＯＸ−２のＣ末端切断形態が含有する残基は最大で６８４であり、したがって、活性部位のくぼみの第２の配列の範囲を欠く（これを不活性にする）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の二重ヌルＬＯＸのオオムギが、ＬＯＸ−２のアミノ酸５１５〜７１７のうちの一部または全部を欠く、好ましくはアミノ酸７０７〜７１７のうちの一部または全部を欠く、なおより好ましくはアミノ酸７０７〜７１７のうちの全部を欠く、ＬＯＸ−２の変異体形態をコードする遺伝子を含むことが好ましい。前記変異体のＬＯＸ−２はまた、野生型のＬＯＸ−２には存在する他のアミノ酸残基も欠く場合もある。
【０２１６】
したがって、二重ヌル−ＬＯＸのオオムギは、Ｎ末端切断形態またはＣ末端切断形態など、機能的でないＬＯＸ−２の切断形態を含み得る。前記切断形態は、含む配列番号７（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の配列番号５に対応する）のＬＯＸ−２の連続アミノ酸が、８００以下、より好ましくは７５０以下、なおより好ましくは７２５以下、さらにまたより好ましくは７００以下、なおより好ましくは６９０以下、さらにまたより好ましくは６８４以下であることが好ましい。前記切断形態は、ＬＯＸ−２のＮ末端断片だけを含むことが好ましい。よって、前記切断形態は、含む配列番号７（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の配列番号５に対応する）のＮ末端アミノ酸が、最大で８００、より好ましくは最大で７５０、なおより好ましくは最大で７２５、さらにまたより好ましくは最大で７００、なおより好ましくは最大で６９０、さらにまたより好ましくは最大で６８４であることが好ましい。ＬＯＸ−１２の断片に加えて、前記切断形態は、必要に応じて、野生型のＬＯＸ−２においては存在しないさらなるＣ末端配列を含み得る。これは、特に、該切断形態が異常なスプライシングから生じた場合にそうであり得る。前記さらなるＣ末端配列は、最大で５０、より好ましくは最大で３０、なおより好ましくは最大で１０、さらにまたより好ましくは、最大で４、または最大で１のアミノ酸からなることが好ましい。
【０２１７】
極めて好ましい一実施形態では、切断形態が、配列番号７（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の配列番号５に対応する）のアミノ酸１〜６８４からなり得る。
【０２１８】
本発明の好ましい実施形態では、オオムギ植物体が、野生型ＬＯＸ−２  ｍＲＮＡの終止コドンの上流において、ナンセンスコドンまたは終止コドンを含む、ＬＯＸ−２のｍＲＮＡへと転写される遺伝子を含む。本明細書では、このようなナンセンスコドンを、未熟ナンセンスコドンと称した。前記植物体のＬＯＸ−２をコードするｍＲＮＡへと転写されるすべての遺伝子は、未熟ナンセンスコドンまたは未熟終止コドンを含む。該ナンセンスコドンまたは終止コドンは、開始コドンの最大で８００コドン下流に位置することが好ましく、より好ましくは最大で７５０コドン、なおより好ましくは最大で７２５コドン、さらにまたより好ましくは最大で７００コドン、なおより好ましくは最大で６９０コドン、さらにまたより好ましくは最大で６８４コドン下流に位置する。ＬＯＸ−２をコードする野生型ゲノムＤＮＡの配列は、配列番号５（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の配列番号１に対応する）において与えられる。
【０２１９】
本発明の極めて好ましい実施形態では、二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体の変異ＬＯＸ−２をコードする遺伝子が、ナンセンス変異を含み、前記変異が、配列番号５（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の配列番号１に対応する）の２６８９位におけるＧ→Ａ置換に対応する。
【０２２０】
本発明によるオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法により、好ましくは、本明細書の下記の節  「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギの調製」で概説される方法のうちの１つにより調製することができる。
【０２２１】
機能的ＭＭＴの喪失
本発明は、第１、第２の変異および第３の変異を有するオオムギ植物体（またはそれらの一部、またはそれらの植物生成物）に関し、該第１の変異は、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失をもたらし、該第２の変異は、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失をもたらす（どちらも、本明細書の上記の節「機能的ＬＯＸの喪失」において詳述した）。第３の変異は、機能的ＭＭＴの完全な喪失をもたらす。
【０２２２】
機能的ＭＭＴの完全な喪失は、異なる機構に基づき得る。例えば、機能的ＭＭＴの完全な喪失は、前記植物体における機能不全のタンパク質、すなわち、検出可能な活性を示さない変異体ＭＭＴタンパク質など、機能不全のＭＭＴ酵素に起因し得る。例えば、変異体のＭＭＴタンパク質は、切断型タンパク質であり得る。ＭＭＴ活性の喪失は、同様に、異なる機構に基づき得、例えば、機能不全のＭＭＴタンパク質により引き起こされ得る。
【０２２３】
変異ＭＭＴタンパク質の活性は、ＳＡＭからＭｅｔへのメチル基の転移を触媒し、これにより、ＳＭＭを形成するその能力により決定することが好ましい。これは、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例４に記載されている通りに行うことができる。変異ＭＭＴのアミノ酸配列は、対応する、単離されたオオムギｃＤＮＡの翻訳される配列を決定することにより得ることが好ましい。これは、基本的に、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例８に記載されている通りに行うことができる。あるいは、本発明のオオムギ植物体の変異ＭＭＴは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例１１および実施例１２に記載されている通りに細菌の細胞培養物において異種性発現させることにより得、その後、組換えタンパク質がＭＭＴ酵素として不活性であることを検証する。
【０２２４】
機能的ＭＭＴの完全な喪失は、ＭＭＴタンパク質の欠如により実現することができる。ＭＭＴタンパク質の欠如は、ＭＭＴ機能の喪失をもたらす。したがって、オオムギ植物体は、検出可能なＭＭＴタンパク質を含まない場合もあり、ごくわずかだけ含む場合もあるが、検出可能なＭＭＴタンパク質を含まない場合が好ましい。ＭＭＴタンパク質の存在または非存在は、当業者に公知の任意の適切な手段により検出することができる。しかし、該タンパク質（複数可）は、ＭＭＴタンパク質が、ＭＭＴを認識する特異的抗体により検出される技法により解析されることが好ましい。前記技法は、例えば、ウェスタンブロッティングアッセイの場合もあり、酵素結合免疫吸着測定法の場合もあり、前記特異的抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。しかし、前記抗体は、ＭＭＴタンパク質における複数の異なるエピトープを認識するポリクローナル抗体であることが好ましい。これはまた、例えば、ＭＭＴ活性を決定する方法によって間接的に検出することもできる。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、オオムギ植物体においてＭＭＴタンパク質が検出可能でない場合、前記植物体が、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を有し、このため、ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こすという。特に、これは、質量が約１２０ｋＤ（±１０％）であるＭＭＴタンパク質が、ウェスタンブロット法による解析で、前記オオムギ植物体において（好ましくは、前記オオムギ植物体の穀粒において）検出されない場合である。
【０２２５】
機能的ＭＭＴの完全な喪失はまた、ＭＭＴ  ｍＲＮＡの転写がないという結果の場合もあり、これがごくわずかしかないという結果の場合もあるが、ＭＭＴ  ｍＲＮＡの転写がないという結果の場合であることが好ましい。当業者は、ＭＭＴ転写物の非存在もまた、その結果としてＭＭＴタンパク質の非存在をもたらすことを認める。
【０２２６】
しかし、機能的ＭＭＴの完全な喪失は、異常なＭＭＴ転写物が発現するという結果であることが好ましい。前記転写物は、例えば、スプライス部位における変異に起因する、好ましくは、一次転写物の異常なスプライシングイベントにより引き起こされ得る。ＭＭＴをコードする転写物の発現は、例えば、ノーザンブロット法により検出することもでき、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することもできる。
【０２２７】
本発明のオオムギ植物体における機能的ＭＭＴの完全な喪失は、１つ以上の変異により引き起こされる。したがって、本発明のオオムギ植物体は、一般に、ＭＭＴ遺伝子において少なくとも１つの変異を有する。前記変異（複数可）は、制御領域内、例えば、プロモーター内またはイントロン内の場合もあり、タンパク質コード領域内の場合もある。変異はまた、例えば、ＭＭＴ遺伝子のコード領域の欠失など、ＭＭＴ遺伝子またはその一部の欠失でもあり得る。したがって、機能的ＭＭＴの喪失はまた、ＭＭＴをコードする遺伝子における変異を解析することによっても検出することができる。ＭＭＴをコードする遺伝子における変異は、例えば、前記遺伝子について配列決定した後に、それを野生型の配列、好ましくは、配列番号９（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号において配列番号３で示される配列に対応する）で示される栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅの野生型の配列または栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号１６に対応する配列番号１１）の野生型の配列と比較することにより検出することができる。変異を同定した後、ＭＭＴ活性を、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例２または実施例４に記載されている通りに試験することにより機能の喪失を確認することが好ましい。
【０２２８】
ＭＭＴタンパク質という用語は、配列番号１３（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号６に対応する）で示されるオオムギの全長ＭＭＴタンパク質またはその機能的相同体を包含することを意味する。この文脈において、機能的相同体は、ＭＭＴ活性レベルが、配列番号１３で示されるオオムギのＭＭＴタンパク質のＭＭＴ活性レベルと±２５％で同じレベルのＭＭＴ活性を有するＭＭＴタンパク質であり、ここで、ＭＭＴ活性は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例２または実施例４に記載されている通りに決定する。
【０２２９】
ＭＭＴ活性の完全な喪失を引き起こす第３の変異を有するオオムギ植物体は、Ｎ末端切断形態またはＣ末端切断形態など、機能的でないＭＭＴの切断形態を含み得る。オオムギ植物体は、２つ、または例えば３つ、または３つ超の異なるＭＭＴの切断形態など、２つ以上のＭＭＴの切断形態を含み得、それは、異常にスプライシングされた転写物に起因し得る。前記切断形態は、ＭＭＴのＮ末端断片のみを含む。野生型ＭＭＴのＮ末端断片に加えて、前記ＭＭＴの切断形態は、野生型ＭＭＴにおいては見出されないさらなるＣ末端配列を含み得る。前記さらなるＣ末端配列は、例えば、異常なスプライシングによって変異体ｍＲＮＡ内に含まれるものなど、翻訳されるイントロン配列であり得る。前記ＭＭＴの切断形態は、含む配列番号１３（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号６に対応する）のＮ末端アミノ酸残基が、最大で５００、より好ましくは最大で４５０、なおより好ましくは最大で４００、さらにまたより好ましくは最大で３５０、なおより好ましくは最大で３２０、さらにまたより好ましくは最大で３１１、または最大で２８８であることが好ましい。これは特に、前記オオムギ植物体が、ＭＭＴ活性の完全な喪失を有する場合にそうである。しかし、ＭＭＴは、含む配列番号１３（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号６に対応する）のＮ末端アミノ酸が、３００以下、例えば、２５０以下、２００以下、例えば、最大で１５０、例えば、１４７以下、または１３３以下など、それよりも少なくてよい。
【０２３０】
極めて好ましい一実施形態では、ＭＭＴの切断形態は、配列番号１３（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号６に対応する）のアミノ酸１〜３１１またはアミノ酸１〜２８８、および、必要に応じて、野生型ＭＭＴにおいては存在しないさらなるＣ末端配列からなってよい。前記さらなるＣ末端配列は、最大で５０、より好ましくは最大で３０、なおより好ましくは最大で１０、さらにまたより好ましくは、最大で４、または最大で１のアミノ酸からなることが好ましい。極めて好ましい一実施形態では、ＭＭＴの切断形態は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号１１、または国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号１３、または国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号１５によるタンパク質であり得る。国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号１１、配列番号１３、および配列番号１５のタンパク質はいずれも機能的ＭＭＴ酵素を表さない。
【０２３１】
別の極めて好ましい実施形態では、ＭＭＴの切断形態は、配列番号１４（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号１８に対応する）のアミノ酸１〜１４７、またはアミノ酸１〜１３３、および必要に応じて、野生型ＭＭＴにおいては存在しないさらなるＣ末端配列からなってよい。前記さらなるＣ末端配列は、最大で５０、より好ましくは最大で４０、なおより好ましくは最大で３９、または最大で３３、または最大で３０のアミノ酸からなることが好ましい。極めて好ましい一実施形態では、ＭＭＴの切断形態は、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７（それぞれ、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号２２、または配列番号２４、または配列番号２６に対応する）によるタンパク質であり得る。配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７（それぞれ、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の配列番号２２、または配列番号２４、または配列番号２６に対応する）のタンパク質はいずれも機能的ＭＭＴ酵素ではない。
【０２３２】
上述のＭＭＴの切断形態は、例えば、ＭＭＴ遺伝子内に変異を有するオオムギ植物体において存在し得、前記変異により未熟終止コドンが導入されることにより、上述のＭＭＴの切断形態をコードする遺伝子がもたらされる。
【０２３３】
本発明の好ましい実施形態では、オオムギ植物体は介入を伴わずに一緒にスプライシングされる野生型ＭＭＴ遺伝子のすべてではないが一部を含む、ｍＲＮＡへと転写されるＭＭＴ遺伝子を含む（オオムギの野生型ＭＭＴ遺伝子のイントロン−エクソン構造は国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の図９に示されている）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴ  ｍＲＮＡが、最大で、介入を伴わずに一緒にスプライシングされるエクソン１、２、３、４、および５を含む、または例えば、最大で、介入を伴わずにスプライシングされるエクソン１および２を含むことが好ましい。前記一緒にスプライシングされるエクソンに加えて、本発明によるオオムギ植物体のＭＭＴ  ｍＲＮＡは、野生型のイントロンおよび／またはエクソンに由来するさらなる３’末端配列を含み得、ここで、イントロンによりエクソン配列が分離されている。ＲＴ−ＰＣＲによって決定され、したがって、断片の長さがｂｐ単位である、本発明によるオオムギ植物体の異常なＭＭＴ  ｍＲＮＡの好ましい例が、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の図１２および図１６に例示されている。本発明によるオオムギ植物体の異常なｍＲＮＡは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の図１２に例示されている、５’末端にエクソン１および２をさらに含むｍＲＮＡ、または、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の図１６に例示されている、５’末端にエクソン１をさらに含むｍＲＮＡであることがより好ましい。
【０２３４】
本発明の極めて好ましい実施形態では、ＭＭＴの遺伝子内に機能的ＭＭＴの完全な喪失を引き起こす第３の変異を有するオオムギ植物体は、ＭＭＴ遺伝子におけるスプライス部位において、異常にスプライシングされるｍＲＮＡをもたらす変異を含む。前記変異は、ＭＭＴ遺伝子のイントロン、なおより好ましくは、イントロン１（エクソン１と２を分離するイントロン）上の５’側スプライス部位など、イントロン２（エクソン２と３を分離するイントロン）上の５’側スプライス部位など、イントロン３（エクソン３と４を分離するイントロン）上の５’側スプライス部位など、イントロン４（エクソン４と５を分離するイントロン）上の５’側スプライス部位など、イントロン５（エクソン５と６を分離するイントロン）上の５’側スプライス部位など、イントロン６（エクソン６と７を分離するイントロン）上の５’側スプライス部位など、イントロンの５’側スプライス部位、最も好ましくは、イントロン２またはイントロン５の５’側スプライス部位に位置することがより好ましい。
【０２３５】
前記変異とは、前述のイントロンの５’末端の塩基のＧ→Ａ変異であることが好ましい。したがって、極めて好ましい変異とは、イントロン２の５’末端の塩基のＧ→Ａ変異、またはイントロン５の最も５’側の塩基のＧ→Ａ変異である。
【０２３６】
本発明によるオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法により、好ましくは本明細書の下記の節「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギの調製」で概説される方法により調製することができる。
【０２３７】
二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギの調製
本発明によるオオムギ植物体は、当業者に公知の任意の適切な方法によって調製できる。好ましくは本発明のオオムギ植物体は、オオムギ植物体またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒を変異誘発する工程に続いて、機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失および／または機能的ＭＭＴの完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択する工程を含む方法によって調製される。
【０２３８】
本発明によるオオムギ植物体は、少なくとも３個の変異を含む。したがって植物体は、変異の内の１つだけを含む別々のオオムギ植物体を調製し、続いて３つすべての変異を有するオオムギ植物体を得るために前記オオムギ植物体を異種交配する工程によって、もしくはオオムギ植物体に成功裏に変異を導入する工程によってまたはこれらの方法の組合せによって調製できる。
【０２３９】
したがって本発明によるオオムギ植物体は、オオムギ植物体またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒を変異誘発し、続いて機能的ＬＯＸ−１の完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択することによって、ならびに別のオオムギ植物体またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒を変異誘発し、続いて機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択することによって、ならびにさらにまた別のオオムギ植物体またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒を変異誘発し、続いて機能的ＭＭＴの完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択することによって調製され得る。選択されたオオムギ植物体は、３つすべての変異を有するオオムギ植物体を得るために最終的に数回異種交配できる。
【０２４０】
代替として本発明のオオムギ植物体は、オオムギ植物体またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒を変異誘発し、続いて機能的ＸＸの完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択することによって調製できる。前記選択されたオオムギ植物体を必要に応じて繁殖させることができ、次いでこれらのオオムギ植物体（またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒）は変異誘発されてよく、続いて機能的ＹＹの完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択することができる。前記選択されたオオムギ植物体またはそれらの一部を必要に応じて繁殖させることができ、次いで：
（ｉ）これらのオオムギ植物体（またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒）は変異誘発され、続いて、機能的ＺＺの完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択し得るか；あるいは
（ｉｉ）これらのオオムギ植物体は、機能的ＺＺの完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体と異種交配できる。
【０２４１】
上に記載の異種交配において、ＸＸ、ＹＹおよびＺＺそれぞれは、ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２またはＭＭＴのいずれかを意味し、ここでＸＸは、ＺＺとは異なるＹＹと異なる。
【０２４２】
好ましい一実施形態において、オオムギ植物体は、機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失を引き起こす変異を既に有しているオオムギ植物体またはそれらの一部、例えばオオムギ穀粒を変異誘発し、続いて、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を引き起こす変異をさらに有しているオオムギ植物体（すなわちヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２または二重ヌルＬＯＸの植物体）をスクリーニングおよび選択する工程を含む方法によって調製できる。本方法は、他のオオムギ植物体またはそれらの一部を変異誘発し、機能的ＭＭＴの完全な喪失を有するオオムギ植物体をスクリーニングおよび選択し、最終的にこれらのオオムギ植物体をヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２のオオムギ植物体と異種交配させることをさらに含む。
【０２４３】
適切なヌルＬＯＸ−１のオオムギ植物体は、例えば、国際特許出願ＷＯ２００５／０８７９３４に記載されている。
【０２４４】
スクリーニング方法が、機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失によって特徴付けられるオオムギ植物体の同定のための出発材料として発芽胚を利用することは好ましい。興味深いことに、本発明者らは、単一ヌルＬＯＸ−２のオオムギ変異体が明らかにならなかった２１，０００個もの成熟胚のスクリーニングに基づいて、ＬＯＸ−２活性に関するスクリーニングのための出発材料としての成熟胚を使用することがあまり好ましくないことを見出している。
【０２４５】
（ｉ）二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体を調製する工程と；（ｉｉ）ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を調製する工程と；（ｉｉｉ）前記二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体と前記ヌルＭＭＴのオオムギ植物体とを異種交配する工程と；（ｉｖ）二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を選択する工程とを含む、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を調製する方法を提供することが本発明の目的である。
【０２４６】
前記二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体の調製は；
（ｉ）機能的ＬＯＸ−１酵素の完全な喪失など、ＬＯＸ−１活性の機能を完全に喪失させたオオムギ植物体またはそれらの一部を供給する工程と；
（ｉｉ）前記オオムギ植物体、ならびに／または前記オオムギ植物体由来のオオムギ細胞、および／もしくはオオムギ組織、および／もしくはオオムギ穀粒、および／もしくはオオムギ胚を変異誘発し、これによりＭ０世代のオオムギを得る工程と；
（ｉｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、穀粒、および／または胚を少なくとも２世代にわたり育種し、これにより、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得る工程と；
（ｉｖ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体から胚を得る工程と；
（ｖ）前記胚を発芽させる工程と；
（ｖｉ）前記発芽させた胚またはそれらの一部におけるＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定する工程と；
（ｖｉｉ）発芽させた胚においてＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を完全に喪失させた植物体を選択する工程と；
（ｖｉｉｉ）ＬＯＸ−１遺伝子内およびＬＯＸ−２遺伝子における変異について解析する工程と；
（ｉｘ）ＬＯＸ−１遺伝子内およびＬＯＸ−２遺伝子内に変異を有する植物体（すなわち二重ヌルＬＯＸの植物体）を選択する工程と
を含む方法によって好ましくは行うことができ、これらにより、機能的ＬＯＸ−１および機能的ＬＯＸ−２の完全な喪失を引き起こす変異をＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２に対する遺伝子内に有するオオムギ植物体を得ることができる。
【０２４７】
前記ヌルＭＭＴのオオムギ植物体の調製は：
（ｉ）オオムギ植物体、および／またはオオムギ細胞、および／またはオオムギ組織、および／またはオオムギ穀粒、および／またはオオムギ胚を変異誘発し、これにより、Ｍ０世代のオオムギを得る工程と；
（ｉｉ）前記変異誘発されたオオムギ植物体、穀粒、および／または胚を、≧２世代、例えば育種によって繁殖させ、これによりＭｘ（ここで、ｘは、≧２の整数である）世代のオオムギ植物体を得る工程と；
（ｉｉｉ）前記Ｍｘ世代のオオムギ植物体の試料を得る工程と；
（ｉｖ）前記試料中のＳＭＭのレベルを決定する工程と；
（ｖ）試料が１０ｐｐｂ未満のＳＭＭを含む、好ましくは５ｐｐｂ未満のＳＭＭを含む、より好ましくは検出可能なＳＭＭを含まない植物体を選択する工程と；
（ｖｉ）ＭＭＴ遺伝子の少なくとも一部分を配列決定する工程と；
（ｖｉｉ）ＭＭＴ遺伝子内に変異を有する植物体を選択する工程と
を含む方法を使用することによって好ましくは行うことができる。
【０２４８】
ＬＯＸ−１活性を完全に喪失させた前述のオオムギ植物体は、例えば、ＷＯ２００５／０８７９３４において記載される、ＬＯＸ−１活性を完全に喪失させたオオムギ植物体のうちのいずれかであり得、変異体Ｄ１１２またはその子孫植物体であることが好ましい。
【０２４９】
前述の方法における変異誘発させる工程は、オオムギ植物体、オオムギ細胞、オオムギ組織、オオムギ穀粒、およびオオムギ胚芽からなる群から選択され、好ましくは、オオムギ植物体、オオムギ穀粒、およびオオムギ胚芽からなる群から選択される生存材料、より好ましくは、オオムギ穀粒を変異誘発する工程を伴い得る。
【０２５０】
変異誘発は、任意の適切な方法により実施することができる。一実施形態では、オオムギ植物体、またはその一部（例えば、オオムギ穀粒またはオオムギに由来する個々の細胞）を、変異誘発剤と共にインキュベートすることにより、変異誘発を実施する。前記剤は当業者に公知であり、例えば、アジドナトリウム（ＮａＮ３）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、およびマレインヒドラジド（ＭＨ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５１】
別の実施形態では、例えば、オオムギ植物体または穀粒などその一部を紫外線で照射することにより、変異誘発を実施する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書の下記の節「化学的変異誘発」において概説される方法のうちのいずれかにより、変異誘発を実施する。適切な変異誘発プロトコールの非限定的な例は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例２において与えられている。
【０２５２】
変異誘発は、Ｍ３世代のオオムギをスクリーニングするとき、所望の変異体の予測頻度が、穀粒１０，０００個当たり０．５〜５個の範囲内など、少なくとも０．５個、例えば、０．９〜２．３個の範囲内であるように実施することが好ましい。好ましい実施形態では、オオムギ穀粒に対して変異誘発を実施する。変異誘発物質に適用される穀粒を、Ｍ０世代と称する（図８もまた参照されたい）。
【０２５３】
ＬＯＸ活性は、発芽オオムギ胚芽からなる試料において、好ましくは、発芽しているオオムギ胚芽の液体抽出物において決定することができる。前記抽出物などの前記試料は、前記発芽している胚芽の任意の適切な一部から調製することができる。一般に、前記試料の抽出物を調製し、ＬＯＸ−２活性を決定する前に、任意の適切な方法を用いて、オオムギ試料をホモジナイズしなければならない。特に、発芽している胚芽またはその一部からタンパク質抽出物を調製し、前記抽出物を用いてＬＯＸ活性を決定することが好ましい。ホモジナイゼーションは、例えば、機械的な力を用いて、例えば、ガラスビーズまたは砂ビーズなど、ビーズの存在下において振とうすることによるなど、振とうまたは撹拌することにより実施することができる。
【０２５４】
好ましい実施形態では、発芽している胚芽が、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数であり；ｘは、好ましくは２〜１０の範囲内、より好ましくは３〜８の範囲内の整数である）世代のものである。極めて好ましい実施形態では、ＬＯＸ活性を、Ｍ３世代の発芽している胚芽、またはこのような胚芽に由来する試料において決定する。その実施形態では、変異誘発したＭ０世代のオオムギ穀粒を成長させてオオムギ植物体を得、これを異種交配させてＭ１世代の穀粒を得ることが好ましい。Ｍ３世代の穀粒が利用可能になるまで、この手順を反復する（図８も参照されたい）。
【０２５５】
ＬＯＸ活性の決定は、任意の適切なアッセイを用いて、好ましくは、本明細書の下記で概説する方法のうちの１つにより実施することができる。特に、アッセイは、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２により、リノール酸から、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応についてのデータを提供することが好ましい。したがって、一般に、アッセイする工程は、
（ｉ）発芽したオオムギ胚芽またはその一部から調製されるタンパク質抽出物を供給する工程と；
（ｉｉ）リノール酸を供給する工程と；
（ｉｉｉ）前記タンパク質抽出物を、前記リノール酸と共にインキュベートする工程と；
（ｉｖ）リノール酸から９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応を検出する工程と
を含む。
【０２５６】
該方法の工程（ｉｖ）は、前記発芽している胚芽において、好ましくは前記発芽している胚芽から調製されたタンパク質抽出物において、９−ＨＰＯＤＥレベルおよび１３−ＨＰＯＤＥレベルを決定する工程を含むことが好ましい。該工程は、９−ＨＰＯＤＥレベルおよび１３−ＨＰＯＤＥレベルを直接的または間接的に決定することを含み得る。全ＨＰＯＤＥの総レベルを決定することができるが、この場合は、確認のために９−ＨＰＯＤＥの特異的な測定および１３−ＨＰＯＤＥの特異的な測定を実施することが好ましい。例えば、１つの方法は、発芽している胚芽からのタンパク質抽出物を、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥを形成させるための基質としてのリノール酸と共にインキュベートする方法であり得る。その場合、前記ＨＰＯＤＥは、各種の方法により検出することができる。１つの方法は、色素など、検出可能な化合物の生成を伴い得る。例えば、該方法は、ヘモグロビンの存在下において、３−ジメチルアミノ安息香酸と、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとを酸化的に結合させ、形成されたＨＰＯＤＥによる触媒でインダミン色素を形成することであり得、これを、分光光度計を用いて、Ａ５９５で測定することができる。このような方法の例を、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５における実施例１および２に記載する。このアッセイを用いると、吸光度の読取り値が、０．２Ａ５９５単位未満であれば、ＬＯＸ−１活性の非存在およびＬＯＸ−２活性の非存在を示すものとして考えられる。しかし、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を決定するためのより正確な方法は、発芽している胚芽からのタンパク質抽出物を、リノール酸と共にインキュベートし、その後、９−ＨＰＯＤＥ含量および１３−ＨＰＯＤＥ含量を決定することである。９−ＨＰＯＤＥ含量および１３−ＨＰＯＤＥ含量は、例えば、ＨＰＬＣベースの解析を用いて決定することができる。
【０２５７】
リノール酸から９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす二原子酸素添加反応は、直接的に測定することもでき、間接的に測定することもできる。任意の適切な検出法を、本発明と共に用いることができる。本発明の一実施形態では、リノール酸ヒドロペルオキシドが検出される。９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５における実施例４に記載されるＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー法により直接的に検出することができる。
【０２５８】
本発明は、ＬＯＸ活性の決定について発芽している胚芽からタンパク質を抽出するための手順の特定の側面が極めて重要であることを開示する。したがって、酸性緩衝液、好ましくはｐＨが２〜６の範囲内、より好ましくは３〜５の範囲内、なおより好ましくは３．５〜５の範囲内、さらにまたより好ましくは４〜５の範囲内にある、なおより好ましくはｐＨが４．５の緩衝液を用いてタンパク質を抽出することが好ましい。抽出に用いられる緩衝液は、有機酸に基づくことが好ましく、乳酸緩衝液であることがより好ましい。タンパク質抽出物は、ｐＨ４．５の１００ｍＭ乳酸緩衝液を用いて調製されることが最も好ましい。
【０２５９】
本発明の一部の実施形態は、ヌルＬＯＸ−１およびヌルＬＯＸ−２植物体を検出するための方法であって、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥが、色素、例えば、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと反応することを伴う方法を開示する。前記色素、例えば、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンは、リノール酸を添加した後で、タンパク質抽出物に添加することが好ましい。該色素は、タンパク質抽出物を、リノール酸と接触させた後の、好ましくは少なくとも１分、より好ましくは少なくとも５分、なおより好ましくは少なくとも１０分、例えば、１〜６０分間の範囲内、例えば、５〜３０分間の範囲内、例えば、１０〜２０分間の範囲内に添加することが好ましい。
【０２６０】
本発明によるオオムギ植物体を選択するのに好ましい方法については、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５における実施例２で詳述する。
【０２６１】
選択手順を、マイクロ滴定プレートベースのアッセイ手順、または他の公知の反復的なハイスループットアッセイフォーマットについて調整して、多くの試料の迅速なスクリーニングを可能とすることができる。少なくとも５０００個、例えば、少なくとも７５００個、例えば、少なくとも１０，０００個、例えば、少なくとも１５，０００個、例えば、少なくとも２０，０００個、例えば、少なくとも２５，０００個の変異誘発したオオムギ植物体を、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性について解析することが好ましい。
【０２６２】
ＬＯＸ−１をコードする遺伝子における変異の決定は、複数の異なる方法により実施することができる。例えば、ＬＯＸ−１遺伝子を完全にまたは部分的に配列決定することができ、該配列を、配列番号１（ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号１に対応する）またはＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号５と比較することができる。特定の変異を検索する場合は、ＳＮＰ解析を適用することができる。当業者は、ＬＯＸ−１のコード配列において未熟終止コドン（例えば、本明細書の上に記載した未熟終止コドンのうちのいずれか）をもたらす変異など、所与の特定の変異を検出するのに有用なプライマーをデザインすることができる。ＬＯＸ−１遺伝子の３４７４位のヌクレオチドにおけるＧ→Ａ変異を検出するのに有用なプライマーによりＳＮＰ解析を実施する方法のうちの一例については、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例１０に記載する。
【０２６３】
ＬＯＸ−２をコードする遺伝子における変異の決定は、複数の異なる方法により実施することができる。例えば、ＬＯＸ−２遺伝子を完全にまたは部分的に配列決定することができ、該配列を、配列番号５（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の配列番号１に対応する）と比較することができる。特定の変異を検索する場合は、ＳＮＰ解析を適用することができる。当業者は、ＬＯＸ−２のコード配列において未熟終止コドン（例えば、本明細書の上に記載した未熟終止コドンのうちのいずれか）をもたらす変異など、所与の特定の変異を検出するのに有用なプライマーをデザインすることができる。ＬＯＸ−２の遺伝子の２６８９位のヌクレオチドにおけるＧ→Ａ変異を検出するのに有用なプライマーによりＳＮＰ解析を実施する方法のうちの一例については、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例１０に記載する。
【０２６４】
本明細書の上記の本節に詳述した、二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体を調製する方法の工程（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）を、工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の前に実施することができ、この場合、該方法は、工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉ）を、この順序で含む。特に、これは、例えば、既に同定された二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体の子孫植物体において特定の変異を検索する場合であり得る。
【０２６５】
好ましくは機能的ＭＭＴを完全に喪失させたオオムギ植物体の選択は、変異誘発されたオオムギ植物体から、好ましくは発芽させた変異誘発されたオオムギ植物体から、なおより好ましくは変異誘発された（４日間発芽させている）オオムギ植物体から、試料を得る工程を含む。試料が、子葉鞘および／または初生葉由来である、好ましくは葉由来であることは好ましい。したがって試料は例えば１ｃｍから３ｃｍの範囲内の葉組織であってよい。
【０２６６】
試料は、異なる溶媒および結合材料の継続的な使用を伴う、本明細書に記載される、新規に開発されたマルチプロセスのプロトコールに従い、抽出および解析することができる。一般に、試料は、例えば、溶媒または溶媒の混合物、好ましくは、水および／または有機溶媒により抽出することができる。有機溶媒は、例えば、アルコール、好ましくはメタノールであり得る（または、有機溶媒は、例えば、ハロゲン化アルキル、好ましくはクロロホルムであり得る）。好ましい一実施形態では、溶媒が、水、メタノール、およびクロロホルムの混合物である。前記抽出は、例えば、シェーカーまたはミキサーを用いて混合しながら実施すると有利であり得る。該溶媒／試料混合物には、固体支持体（例えば、ガラスビーズなどのビーズ）を添加することができる。
【０２６７】
好ましい実施形態では、ＭＭＴ活性を決定するための前述の葉試料を、Ｍｘ（ここで、ｘは、≧２の整数、好ましくは、２〜１０の範囲内の整数、より好ましくは、３〜８の範囲内の整数である）世代の穀粒から採取する。極めて好ましい実施形態では、Ｍ３世代の発芽植物体またはその試料（葉など）において、ＳＭＭのレベルを決定する。前記実施形態では、変異誘発したＭ０世代のオオムギ穀粒を成長させてオオムギ植物体を得、その後、これを異種交配させてＭ１世代の穀粒を得ることが好ましい。Ｍ３世代の穀粒が入手可能になるまで、この手順を反復する（図８を参照されたい）。
【０２６８】
ＳＭＭレベルの決定は、下記で説明される新規の手順に基づくことが好ましい。興味深いことに、この方法は、ハイスループットのスクリーニングを可能とし、これにより、機能的ＭＭＴの完全な喪失を特徴とするオオムギ植物体の同定が実行可能となる。
【０２６９】
一般的に述べると、該方法は、試料、または好ましくは、上に記載された通りに調製された前記試料の抽出物を、ＳＭＭに結合することが可能な化合物と反応させる工程を含む。本明細書の下記ではＯＰＡとだけ称するＯＰＡ試薬（Ｓｉｇｍａ社製、型番Ｐ７９１４；国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の図２を参照されたい）が、ＳＭＭレベルを決定するのに特に有用であることが判明した。ＯＰＡは、とりわけ、ＳＭＭと反応して、ＳＭＭ−ＯＰＡと称する分子を形成する（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の図２を参照されたい）。反応は、ＯＰＡを、上に記載した通りに調製された試料の抽出物と共にインキュベートする工程を含むことが好ましい。加えて、該反応混合物に、３−メルカプトプロピオン酸を添加することが好ましい。混合物は、アルカリ性のｐＨ、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１１の範囲内、より好ましくはｐＨ９〜ｐＨ１１の範囲内、なおより好ましくは、ｐＨ１０など、ｐＨ９．５〜ｐＨ１０．５の範囲内に保つことが好ましい。インキュベーションは、０℃〜１０℃の範囲内、好ましくは１℃〜８℃の範囲内、なおより好ましくは２℃〜６℃の範囲内、さらにまたより好ましくは、４℃など、３℃〜５℃の範囲内にある温度で実施することが好ましい。インキュベーション時間は、≧１０分間であることが好ましい。
【０２７０】
ＳＭＭ−ＯＰＡが、それぞれ、３４０ｎｍおよび４５０ｎｍの光を吸光および発光するという観察に基づき、蛍光分光分析を用いることにより、その検出が可能となった。検出の初期のプロセスは、カラムにより、好ましくは、３０×２ｍｍのＧｅｍｉｎｉ  ３μ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製、型番００Ａ−４４３９−８０；  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、２００６年）上において抽出物を分離した後で、ハイスループットの液体クロマトグラフィーシステム、好ましくは、３４０ｎｍの励起および４５０ｎｍの発光を有する分子の蛍光レベルを同定および測定するようにデザインされた、Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＵＰＬＣシステム）を用いる蛍光の検出を伴うことが好ましい。この方法を用いる場合、「検出可能なＳＭＭはない」とは、ＳＭＭと共に共溶出する検出可能な化合物が非存在であることを意味する。この文脈において、クロマトグラムピークにおける小さな「肩」は、アーチファクトのピークであると考えられる。したがって、Ａｓｎ／Ｓｅｒピークの右側における小さな肩（図２を参照されたい）は、ＳＭＭピークを表すとは考えられない。したがって、例として述べると、図２Ｂに示される上方の２つのクロマトグラムが、「検出可能なＳＭＭはない」を示すと考えられるのに対し、前記図中下方のクロマトグラムは、ＳＭＭを含む試料の分離を表す。
【０２７１】
ＳＭＭの検出は、実施例２または実施例４に記載する通りに行うことが好ましい。本発明によるオオムギ植物体を選択するのに好ましい方法は、本明細書の下記の実施例２に記載する。分析のための組織は、発芽しているオオムギ植物体、なおより好ましくは、発芽以来４日間が経過したオオムギ植物体から好ましくは採取される。上述のスクリーニング法が特に有用であることは、注目に値する。何よりもまず、該解析法は新規である。さらに、それが、発芽しているオオムギ植物体の葉など、発芽しているオオムギ植物体におけるＳＭＭレベルを決定するために確立されていることは、上記の方法の顕著な利点である。発芽しているオオムギから試料採取するタイミングにより、ＵＰＬＣベースでＳＭＭを検出するための、予測外に清明な調製物が作製される。他の試料、例えば、上に記載したのと同様の穀粒によるウォート試料は、組成が複雑に過ぎ、一般に、ＳＭＭレベルを決定するための、言及されたクロマトグラフィー法で用いることはできない。
【０２７２】
ＳＭＭが１０ｐｐｂ未満であり、好ましくは、検出可能なＳＭＭを有さないオオムギ植物体を同定した後で、対応するＭＭＴ遺伝子またはその一部を配列決定して、問題のオオムギ植物体が、該ＭＭＴ遺伝子における変異を有するものとして分類され得るかどうかを決定することが典型的である。次いで、検出可能なＳＭＭを有さないことを特徴とし、ＭＭＴをコードする遺伝子のうちの１つ以上の塩基が野生型配列と比較して異なるオオムギ植物体を選択する。この文脈で、野生型配列とは、対応する野生型オオムギ栽培種で見出される配列であることが好ましく、配列番号９（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の配列番号３に対応する）として示される配列であることが好ましい。好ましい変異は、本明細書の上に記載されている。
【０２７３】
選択されたオオムギ変異体は、さらに繁殖させることができ、続く世代の植物体はＳＭＭ含有量について再スクリーニングできる。有用なオオムギ植物体の選択後に、これらは、本明細書の下の「植物育種」の節に記載する従来法を利用する育種プログラムに含まれることができる。
【０２７４】
ＬＯＸ−１遺伝子内に特定の変異およびＬＯＸ−２遺伝子内に特定の変異およびＭＭＴ遺伝子内に特定の変異（上に述べた任意の変異など）を含有する二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体が一旦同定されると、同一の変異を有するさらなるオオムギ植物体を当業者に周知のものなどの従来の育種法によって作製できる。例えば前記二重ヌルＬＯＸのオオムギ植物体は、別のオオムギ栽培品種と戻し交配することができる。
【０２７５】
機能的ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２およびＭＭＴを完全に喪失させた有用なオオムギ植物体の選択に続いて、１つ以上のさらなるスクリーニングを必要に応じて実施できる。例えば選択された変異体をさらに繁殖させることができ、新世代の植物体を機能的ＬＯＸ−１、ＬＯＸ−２およびＭＭＴの完全な喪失について調べることができる。
【０２７６】
本発明の一実施形態において、本発明による二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体が野生型オオムギと同様の植物成長の生理学的特徴および穀粒の発生を有することは好ましい。したがって、二重ヌルＬＯＸ−１−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体が、草高、植物体あたりの分げつ（ｔｉｌｌｅｒ）数、開花の開始、および／または１穂当たりの穀粒数に関して野生型オオムギ（好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａ）と同様であることが好ましい。
【０２７７】
さらに、本発明による二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体が、草高、出穂日（ｈｅａｄｉｎｇ  ｄａｔｅ）、病害耐性、倒伏（ｌｏｄｇｉｎｇ）、穂切り（ｅａｒ−ｂｒｅａｋａｇｅ）、成熟期間、および収量に関して野生型オオムギと同様であること、詳細には栽培品種Ｐｏｗｅｒまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈと同様であることが好ましい。本文脈において「同様」は、数の場合、同一±１０％であるとして理解される。これらのパラメーターは本明細書で下の実施例５に記載する通りに決定することができる。
【０２７８】
本発明の非常に好ましい実施形態において、オオムギ植物体は、オオムギＡ６８９系統（ＡＴＣＣ特許寄託番号：ＰＴＡ−９６４０）とオオムギ８０６３系統（ＡＴＣＣ特許寄託番号：ＰＴＡ−９５４３）との異種交配によって調製され、必要に応じてさらなる育種が続く。
【０２７９】
オオムギＡ６８９系統の種子は、「オオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．：Ａ６８９系統」という名称で、２００８年１２月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓに寄託（寄託番号ＰＴＡ−９６４０）された。
【０２８０】
オオムギ８０６３系統の種子は、２００８年１０月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓに寄託（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９５４３）され、「オオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ：８０６３系統」と称された。
【０２８１】
化学的変異誘発
本発明による二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を作製するために、任意の適切な変異誘発法により、例えばオオムギ穀粒の化学的変異誘発の使用により極めて多数のオオムギ変異体が、典型的には複数回（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｕｎｄｓ）で、調製される。この方法は、無作為的に変異を誘導することが公知である。オオムギの変異誘発は、任意の変異誘発化学物質を使用して実施することができる。しかし穀粒をＮａＮ３で処理し、生存する穀粒を発芽させた後、子孫植物体を解析することにより実施することが好ましい。Ｍ０世代と称する、変異誘発させた穀粒から成長する植物体世代は、任意の所与の変異について、ヘテロ接合体のキメラを含有する。自己授粉後に回収された子孫植物体をＭ１世代と称するが、ここでは、所与の変異が、対応するヘテロ接合体およびホモ接合体へと分離する（図８を参照されたい）。
【０２８２】
処理後における穀粒は、一部の非変異体細胞と、ＤＮＡの変異を有する各種の細胞とを含有するので、穀粒をＮａＮ３で処理することは、単一の細胞を処理することと等価ではない。生殖細胞系列をもたらさない細胞系統では変異が失われるので、これは、生殖組織へと生育し、Ｍ１世代の発生に寄与する少数の細胞を、変異誘発物質の標的とすることが目的である。
【０２８３】
全体的な変異効率を評価するため、Ｍ０世代およびＭ１世代において、アルビノキメラおよびアルビノ植物体をカウントすることができる。変異体の数を生存植物体数の関数としてスコア化することにより、変異の効率についての推定値が得られる一方、変異体数を、処理した種子数の関数としてスコア化することにより、変異の効率と、穀粒死滅との両方についての組合せが測定される。
【０２８４】
細胞が、遺伝子発現のほとんどどの段階でも、変異の損傷的効果をおそらく緩和する、品質保証機構を有することは注目に値する。真核生物において十分に研究されている一例は、ＮＭＤと称し、潜在的に有害な、未熟の切断型タンパク質の合成を防止する、ナンセンス媒介性ｍＲＮＡ分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ）（ＭａｑｕａｔおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ、２００１年；Ｗｕ  ら、２００７年）である。ＮＭＤでは、終止コドンが、下流の不安定化エレメントに対するその位置により未熟であると同定される。未熟終止（ナンセンス）コドン（ＰＴＣ）を発生させる変異は、場合によって、原因となる変異をスキップし、これにより、タンパク質機能を潜在的に保全する、選択的スプライシングの転写物のレベルを上昇させることがある（ＭｅｎｄｅｌｌおよびＤｉｅｔｚ、２００１年）。
【０２８５】
植物体の育種
本発明の一実施形態では、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質を含む、農業的に有用なオオムギ植物体を提供することが目的である。作物の育成は、新規の形質の導入と共に始まる、長期間にわたる困難なプロセスであることが多い。しかし、植物育種家の視点からすると、この工程は、ほとんど常に、農業形質の全体的プロファイルの所望の程度が、市販される現行の品種より劣る植物体を結果としてもたらす。
【０２８６】
二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質に加えて、例えば穀粒収量および穀粒サイズである麦芽製造および／または醸造および／または飲料のベースとして有用な商業用オオムギ品種を作製する技術分野においても考慮される場合があるさらなる因子、ならびに麦芽製造生産力または醸造生産力に関する他のパラメーターも存在する。関連する多くの形質（すべてではないにせよ）が、遺伝子の制御下にあることが示されていることから、本発明は本公開で開示される二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体との異種交配から調製できる新しいホモ接合性で高収量の麦芽製造栽培品種も提供する。オオムギ育種の当業者は、（二重ヌルＬＯＸのオオムギ−ヌルＭＭＴのオオムギと異種交配させた後で）優れた栽培品種を結果としてもたらすオオムギ植物体を、選択および育成できる。代替的にオオムギの育種家は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギに由来する新規栽培品種を作製するためのさらなる変異誘発のために本発明の植物体を利用できる。
【０２８７】
二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質が後代系統において維持されることを確認する１つの方法は、ＬＯＸ−１遺伝子、ＬＯＸ−２遺伝子およびＭＭＴ遺伝子のＳＮＰ解析に関する。好ましくはＬＯＸ−１活性、ＬＯＸ−２活性およびＭＭＴ活性も決定される。
【０２８８】
本発明によるオオムギ植物体は、任意の適切な育種のスキームへ導入することができる。
【０２８９】
本発明の別の目的は、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質を含む、農業的に優良なオオムギ植物体を提供することである。したがって、本発明は、第１の親オオムギ植物体を、第２の親オオムギ植物体と異種交配させることにより、新規の二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体を作製するための方法であって、第１または第２の植物体が、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギである方法も対象とする。加えて、第１および第２の親オオムギ植物体は両方とも、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ品種に由来することができる。したがって、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ品種を使用する（自家受粉、戻し交配、集団への異種交配などの）任意のこのような方法は、本発明の一部である。二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ品種に由来する品種から発生した植物体を含め、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ品種を親として用いて作製されるすべての植物体は、本発明の範囲内にある。二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギは、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの植物体または植物体組織に外因性ＤＮＡを導入し、発現させる場合において遺伝子形質変換にも用いることができる。
【０２９０】
戻し交配法は、変異誘発したオオムギ植物体の二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質を、別の栽培品種、例えば栽培品種Ｓｃａｒｌｅｔｔまたは栽培品種Ｊｅｒｓｅｙまたは栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａ（これらは、新型の高収量の麦芽製造オオムギ栽培品種である）に導入するために本発明と共に用いることができる。標準的な戻し交配のプロトコールにおいては、問題の元の品種（すなわち反復親植物体）を移入される問題の変異ＬＯＸ遺伝子を有している第２の品種（非反復親植物体）と異種交配させる。この異種交配から得られる二重ヌルＬＯＸの子孫植物体を、続いて反復親植物体に異種交配させ、非反復親植物体の二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質に加えて生成された植物体において反復親によって特定される本質的にすべての特徴が回復しているオオムギ植物体が得られるまでこのプロセスが繰り返される。最終的に、最後に生成された戻し交配された植物体を純粋な二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの育種子孫植物体を得るために自家受粉させる。
【０２９１】
植物体育種のプロセスを加速化する方法は、組織培養および組織再生の技術を応用することによる生成された変異体の初期繁殖を含む。したがって、本発明の別の態様は、増殖および分化により二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴの形質を有するオオムギ植物体を生成する細胞を提供することである。例えば、育種は、伝統的異種交配、葯に由来する繁殖力のある植物体の調製、または小胞子培養の使用を伴うことができる。
【０２９２】
ＬＯＸ経路による生成物
各種の実施形態では、本発明は、低いレベルのＴ２ＮおよびＴ２Ｎポテンシャルを含む、オオムギ植物体およびそれらの生成物に関する。ＬＯＸ酵素は、ｃｉｓ−１，ｃｉｓ−４ペンタジエン系によるポリ不飽和脂肪酸の二原子酸素添加反応を触媒する。オオムギでは、Ｃ１８のポリ不飽和脂肪酸であるリノール酸（１８：２Δ９，１２）およびα−リノール酸（１８：３Δ９，１２，１５）が、主要なＬＯＸの基質である。脂肪酸代謝のリポキシゲナーゼ経路は、アシル鎖のＣ−９位（ＬＯＸ−１により大半が触媒される）またはＣ−１３位（ＬＯＸ−２により大半が触媒される）において分子状酸素を付加することにより開始され、対応する９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥをもたらす［基質がα−リノール酸の場合は、９−ヒドロペルオキシオクタデカトリエン酸および１３−ヒドロペルオキシオクタデカトリエン酸（ＨＰＯＴＥ）が生成物であるが、ＨＰＯＴＥは、Ｔ２Ｎの前駆体としては機能しない］。ＬＯＸ経路のヒドロペルオキシドリアーゼのブランチでは、９−ＨＰＯＤＥおよび１３−ＨＰＯＤＥの両方が、短鎖のオキソ酸およびアルデヒドへと切断され得る（図１Ａを参照されたい）。特に、９−ＨＰＯＤＥが切断されて、Ｔ２Ｎへと変換されるｃｉｓ−ノネナールを形成し得るのに対し、１３−ＨＰＯＤＥは、２−Ｅ−ヘキセナールの前駆体である。したがって、ＬＯＸ−２により触媒されるリノール酸の二原子酸素添加反応の主要な生成物である１３−ＨＰＯＤＥが、Ｔ２Ｎの劣化風味を形成させる該経路内の上流の成分であるとは予測されていなかった。
【０２９３】
本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２により触媒される反応の直接的な生成物として生成されるわけではないが、後続の一連の反応の結果として生成される、ＬＯＸ−１触媒およびＬＯＸ−２触媒による下流の代謝物の生成に影響を及ぼすことも包含することが認識される。これらには、自発性、因子誘導性、または酵素触媒性の異性化および変換が含まれる。したがって、これらの下流の代謝物の生成には、該経路の他の成分、例えば、ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＨＰＬ）の発現を調節することにより影響を及ぼし得る。
【０２９４】
Ｔ２ＮおよびＤＭＳならびにそれらの前駆体
本発明は、１つ以上のオフフレーバーおよびその前駆体のレベルが低い飲料を調製するための方法に関する。好ましくは、前記オフフレーバーは、Ｔ２ＮおよびＤＭＳであり、その前記前駆体はそれぞれＴ２ＮポテンシャルおよびＤＭＳＰである。
【０２９５】
したがって、本発明の１つの目的は、Ｔ２Ｎポテンシャルを低下させるまたは除去することである。したがって、Ｔ２Ｎ前駆体およびアルデヒド付加物の形成を低下させることは本発明の目的である。ビールの劣化に関連するいくつかの化学反応は解明されていないが、Ｔ２Ｎポテンシャルからの遊離Ｔ２Ｎの生成は、ビール生成物における劣化風味の発生の主な原因として認識されている（Ｋｕｒｏｄａら、上掲）。したがって、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルが低い飲料およびＴ２Ｎ前駆体のレベルが低い飲料を提供することは本発明の目的である。
【０２９６】
Ｔ２Ｎポテンシャルの大半は、ウォートから完成したビールへと移り、ここで、遊離Ｔ２Ｎが放出され得る（Ｌｉｅｇｅｏｉｓら、２００２年）が、このプロセスでは、酸性条件および温度条件が重要な因子である。本発明との関連では、Ｔ２Ｎポテンシャルを、本明細書の上の定義に記載した通りに定義する。Ｔ２Ｎポテンシャルレベルを決定するための他の方法もまた、用いることができる。混乱を避ける目的で、本文脈における「Ｔ２Ｎポテンシャル」の意味は、本明細書の上の定義に記載した通りである。本明細書では、Ｔ２Ｎを放出するか、またはＴ２Ｎへと変換される能力を有する化学物質を「Ｔ２Ｎ前駆体」と称し、Ｔ２Ｎポテンシャルを決定するための方法以外の代替的な方法により決定または測定されるＴ２Ｎ前駆体を、「Ｔ２Ｎ前駆体」と称する。Ｔ２Ｎ前駆体は、まず、Ｔ２Ｎを放出するか、またはＴ２Ｎへと変換される能力を有するその化学物質のうちの本質的にすべて（好ましくはすべて）が、実際に、それぞれ、Ｔ２Ｎを放出し、かつ／またはＴ２Ｎへと変換されるように、試料を最初に処理することにより、特に決定することができる。その後、Ｔ２Ｎレベルを決定する。
【０２９７】
本発明のオオムギ穀粒は、ＭＭＴ活性を含まないことに加えて、ＬＯＸ−１活性およびＬＯＸ−２活性を含まない。興味深いことに、そのようなオオムギ穀粒は極めて少量しかＴ２Ｎポテンシャルを含有しない。
【０２９８】
したがって、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ穀粒を用いて生産されるビールは、極めて低いレベルのＴ２Ｎを有するだけでなく、Ｔ２Ｎポテンシャルレベルも極めて低い。本発明の範囲内にあるのは、極めて低いレベルのＴ２Ｎポテンシャルを含有する、好ましくは野生型のオオムギ（好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒ）から同じ方法で生産した同様のビール生成物の６０％未満、より好ましくは５０％未満のレベルのＴ２Ｎポテンシャルを含有するビール生成物をもたらす二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ穀粒である。
【０２９９】
二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ穀粒に由来する植物生成物が極めて低いＴ２Ｎ前駆体レベルを有することも好ましい。本発明の範囲内にあるのは、二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ穀粒から調製され、野生型のオオムギ（好ましくは栽培品種Ｐｏｗｅｒ）から同じ方法で生産した同様の植物生成物の６０％未満、より好ましくは５０％未満のＴ２Ｎ前駆体を含有する植物生成物である。
【０３００】
マイクロモルティングされた原料の試料において、ならびにこれに由来する生成物において測定されるＴ２Ｎ値は、より大きなスケールで、例えば、３０ｋｇの大規模パイロットモルティングされた試料から作製された原料に由来するＴ２Ｎ値よりも高値であることが多いことは注目に値する。しかし、大スケールでの実験と、小スケールでの実験との間の相対的な、実験によるＴ２Ｎの値は、一般に同様である。
【０３０１】
同様に、マイクロモルティングされた原料の試料において、ならびにこれに由来する生成物において測定されるＴ２ＮポテンシャルおよびＴ２Ｎ前駆体は、より大きなスケールで、例えば、３０ｋｇの大規模パイロットモルティングされた試料から作製された原料に由来するＴ２ＮポテンシャルおよびＴ２Ｎ前駆体よりも高いことが多いことは注目に値する。しかし、大スケールでの実験と、小スケールでの実験との間の相対的な、実験によるＴ２Ｎポテンシャル値は、一般に同様である。
【０３０２】
ＤＭＳおよびＤＭＳＰを低下させるまたは除去することも本発明の目的であり、ここでＤＭＳＰは好ましくはＳＭＭである。
【０３０３】
植物生成物中のＳＭＭおよびＤＭＳの量は、任意の適切な方法によって決定できる。ＳＭＭは、オオムギ試料におけるＳＭＭレベルの決定が記載されている本明細書の上の節「二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ植物体の調製」において本質的に記載の通り決定できる。したがってＳＭＭは、ＯＰＡなどの化合物とカップリングさせる工程および例えばＵＰＬＣシステムを使用して蛍光を測定する工程によって決定できる。定量的測定のために、ＳＭＭピークに対応するクロマトグラム面積を決定できる。
【０３０４】
より正確な測定のために、ＤＭＳおよびＤＭＳＰ（ＳＭＭなど）両方の量（後者の化合物は活性化後にＤＭＳとして測定される）は、好ましくは高分解能キャピラリーガスクロマトグラフィーを使用して決定される。ウォートまたはビールの試料中の総ＤＭＳは、本明細書において遊離ＤＭＳと、ＤＭＳＰを意味するその前駆体形態との定量的合計として定義される。この定義を使用してウォートまたはビールの試料中のＤＭＳＰの量は、総ＤＭＳ（煮沸試料において、好ましくはアルカリ性条件下で１時間煮沸された試料において測定される）と遊離ＤＭＳ（非煮沸試料において測定される）との間の差として決定できる。実施例４は、総ＤＭＳおよび遊離ＤＭＳのレベルを測定するための好ましい方法を詳述する。
【０３０５】
本明細書においてＤＭＳＰの量およびＳＭＭの量は、アルカリ性条件下で１時間煮沸することによって前記ＤＭＳＰまたは前記ＳＭＭから遊離され得るＤＭＳの濃度として与えられる。
【実施例】
【０３０６】
本明細書における実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、本発明を限定するものとして考えるべきではない。
【０３０７】
別段に示さない限り、核酸および細菌を操作するためには、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（２００１年）において記載される基本的な分子生物学の技法を実施した。
【０３０８】
（実施例１）
発芽オオムギ胚内における低ＬＯＸ−２活性についてのスクリーニング
改良型スクリーニング材料  異種交配（ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２×Ｊｅｒｓｅｙ）×Ｓｅｂａｓｔｉａｎにより生成したヌルＬＯＸ−１系統Ｃａ２１１９０１のオオムギ植物体から採取した穀粒を、Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら（１９７８年）により示された詳細に従って変異誘発物質ＮａＮ３と共にインキュベートした。オオムギのヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２はＷＯ２００５／０８７９３４に記載され、２００３年９月１１日に番号ＰＴＡ−５４８７の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ．２０１１０、ＵＳＡに寄託された。
【０３０９】
この手順は、オオムギのゲノムＤＮＡにおいて点変異を誘導し、最終的に、変異誘発されたＤＮＡによりコードされるタンパク質におけるアミノ酸残基の置換、または切断をもたらすことが公知であるので、選択された。本刊行物の変異誘発実験では、Ｍ１世代の変異した穀粒を、後続する２世代にわたり圃場試験区において繁殖させることを選択し、これにより、最終的に、スクリーニングを目的とするための、高比率のホモ接合性植物体がもたらされた（図８を参照されたい）。Ｍ２世代の穀粒は、主に、比較的高比率のヘテロ接合性点変異を含有すると予測されたため、スクリーニングしなかったのに対し、Ｍ３世代の変異体穀粒をスクリーニング材料として用い、穀粒１０，０００個当たり、０．９〜２．３個の変異を予測した（Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら、上掲）。
【０３１０】
驚くべきことに、本発明者らは、発芽している胚芽の解析により、成熟胚芽の抽出物の解析（国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例１に記載される）と比較して、アッセイ結果がはるかに改善されることを見出した。これにより、その胚盤組織を含め、発芽している胚芽におけるＬＯＸ−２活性を測定するための、ハイスループットのスクリーニング手順を確立した。
【０３１１】
３５，１２５穂のオオムギ（ヌルＬＯＸ−１変異体Ｄ１１２のＭ４世代の２０，９７７系統、および、ヌルＬＯＸ−１系統であるＣａ２１１９０１系統のＭ３世代の１４，１４８系統）による成熟穀粒から胚芽２つずつを単離し、９６ウェル保存プレート（ＡＢｇｅｎｅ社製）へと移した。各ウェルに２０μｌの水を添加し、湿らせたＫｉｍｎｅｔｔティッシュおよびプラスチック製のふたによりこれを覆った後で、胚芽の発芽を開始させた。プラスチック製のバッグ内、２０℃で４８時間にわたり、プレートをインキュベートした。インキュベーション後、ＬＯＸ−２酵素を抽出した；まず、各ウェルに５ｍｍのガラスビーズおよび２００μｌの抽出緩衝液（ｐＨ４．５の１００ｍＭ乳酸溶液）を添加した後に、ＭＭ  ３００実験用ミル（Ｒｅｔｓｃｈ社製）において、３５秒間にわたり２７秒−１の振動数で破砕した。その後、プレートを、Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離機（Ｂｅｃｈｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）において、４℃で１０分間にわたり、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、不溶性物質を沈殿させた。ＬＯＸ−２活性は、基本的に、成熟胚芽抽出物のＬＯＸ−２活性の解析（国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例１を参照）について記載した通りに決定したが、アッセイ１回当たりに用いる抽出物が、４０μｌではなく、３０μｌに過ぎない点だけが異なった。
【０３１２】
潜在的な変異体の同定：上に記載した通り、上述の３５，１２５のオオムギ系統各々について、穀粒２つずつをＬＯＸ−２活性について解析し、前記活性が、ヌルＬＯＸ−１穀粒および野生型の穀粒と比較した場合に大きく低下する穀粒を同定することを目的とした。Ｃａ２１１９０１系統のＭ３世代では、合計７個の潜在的な原変異体（ｒａｗ  ｍｕｔａｎｔ）が同定された。これらを温室内でさらに繁殖させ、収穫し、次いで、極めて低度のＬＯＸ活性に関する形質について再スクリーニングした。最終的に、変異体Ａ６８９と称する、Ｃａ２１１９０１系統で唯一の変異体が、ＬＯＸ−２活性を本質的に示さないことが示された。ＬＯＸ活性がほぼＬＯＸ−２だけによりもたらされる発芽した胚芽の抽出物により、総ＬＯＸ活性の詳細な測定が実施された（Ｓｃｈｍｉｔｔおよびｖａｎ  Ｍｅｃｈｅｌｅｎ、１９９７年）。変異体Ａ６８９のＭ３世代の穀粒の発芽した胚芽では、総ＬＯＸ活性（比色分析によるＬＯＸアッセイにより決定された）が、発芽した胚芽１個あたりＡ５９５単位で０．１６３±５．５％であったのに対し、ヌルＬＯＸ−１母品種であるＣａ２１１９０１の総ＬＯＸ活性は、発芽した胚芽１個あたりＡ５９５単位で１．２２４±３．８％（ヌルＬＯＸ−１原変異体Ｄ１１２についての対応する値は、発芽した胚芽１個あたりＡ５９５単位で１．２１５±６．０％）であった。
【０３１３】
オオムギＡ６８９系統の種子は、「オオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．；Ａ６８９系統」という名称で、２００８年１２月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓに寄託された（寄託番号ＰＴＡ−９６４０）。
【０３１４】
変異体Ａ６８９におけるＨＰＯＤＥの解析は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例４に記載されている。
【０３１５】
変異体Ａ６８９の特性は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例５に記載されている。
【０３１６】
オオムギ変異体Ａ６８９におけるＬＯＸ−２についての遺伝子の配列決定は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例１０に記載されており、その表７は変異体Ａ６８９のＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子における変異を要約している。
【０３１７】
二重ヌルＬＯＸ変異体Ａ６８９を検出するための方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５の実施例１１に記載されている。方法は、ＬＯＸ−１内の変異およびＬＯＸ−２内の変異を検出するためのＳＮＰに基づく方法である。
【０３１８】
（実施例２）
ヌルＭＭＴのオオムギ変異体に関するスクリーニング
栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎのオオムギ植物体から採取した穀粒を、別々に、Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら（１９７８年）によって提供された実験の詳細に従って、変異誘発物質ＮａＮ３と一緒にインキュベートした。この手順を選択したのは、オオムギのゲノムＤＮＡにおいて点変異を誘発するその潜在力が公知であるからであった。
【０３１９】
本実験では、Ｍ１世代の変異した穀粒を、畑の小区画において次の２世代を通して繁殖させ、最終的に、スクリーニング目的ために、高比率のホモ接合性のＭ３世代の植物体を得た。Ｍ３世代の変異した穀粒は、穀粒１０，０００個当たり０．９〜２．３の頻度で遺伝子変異を含有することが予想された（Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓら、上掲）。Ｍ２の穀粒がスクリーニングされなかったことは注目に値する。
【０３２０】
興味深いことに、本発明は、麦芽製造の間の検出可能なＳＭＭ合成の喪失をもたらす、ＭＭＴ活性を喪失したＭ３の変異体オオムギ穀粒を検出するための高速ハイスループットスクリーニング手順を記載している。したがって、本発明により、ＳＭＭが、発芽しているオオムギの子葉鞘および初生葉に主に蓄積したこと、および４日齢の発芽した穀粒の押しつぶした葉組織からアミノ酸を抽出し、続いて抽出したアミノ酸をＯＰＡと反応させて高度に蛍光性の生成物を形成することによって、ＳＭＭの検出を行うことができることが見出された（図２参照）。
【０３２１】
実際的に述べると、各アッセイは、閉じたプラスチックの箱の中で、Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙（２９６×２０．９ｍｍ）１枚を用いて９４種の可能性のある変異体および２つの野生型植物体のそれぞれからの２つの穀粒を発芽させることによって行った。多数の、可能性のある変異穀粒に対してアッセイを繰り返した（下記を参照されたい）。発芽の開始のときに水道水２５ｍＬ、続いて発芽の２日目に付加的な水道水１５ｍＬを前記プラスチックの箱に加えた。発芽の４日後に、１〜３ｃｍの葉組織を、１．２ｍＬの９６ウェルのそれぞれが直径５ｍｍのガラスビーズおよび水：メタノール：クロロホルムの１２：５：６（ｖ／ｖ／ｖ）混合物５００μＬを含む、貯蔵プレート（ＡＢｇｅｎｅ）に移した。次いで、プレートを、ＭＭ３００ラボ用破砕器（Ｒｅｔｓｃｈ）内で３０Ｈｚの振動数で４５秒間振とうした。その後、プレートを遠心分離機（Ｒｏｔａｎｔａ４６０Ｒ、Ｈｅｔｔｉｃｈ）に移し、４，０００ｒｐｍで１５分間、室温で、不溶性物質が沈殿するまで回転させた。上清１０μＬを９６ウェル貯蔵プレート（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号１８６００２４８１）に移し、２００μＬのＨ２ＯおよびＯＰＡ試薬（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７９１４）：３−メルカプトプロピオン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ５８０１）の１５，０００：４５（ｖ／ｖ）混合物を含有する反応溶液６０μＬと混合した。混合物を４℃で少なくとも１０分間インキュベートしてＯＰＡによる試料アミノ酸の定量的誘導体化を得た。蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓに基づくＵＰＬＣシステムを使用して、誘導体化された混合物２μＬを２．１×３０ｍｍの、３μｍの粒子のＣ１８  Ｇｅｍｉｎｉカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ａ−４４３９−８０）において、移動相Ａ（４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．８に調整）と移動相Ｂ［記載されている通り（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、２００６年）、アセトニトリル：メタノール：水の４５：４５：１０（ｖ：ｖ：ｖ）溶液］を混合することによる勾配溶出を使用して分離した。溶出されたＯＰＡ誘導体の励起は３４０ｎｍであった、その一方で、光の放射は４５０ｎｍにおいて測定された。クロマトグラムの例を図２に示して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出プロファイルを例示している。後者の化合物は、全体的なプロジェクトの目的が、ＳＭＭを合成する能力を喪失したオオムギ植物体、すなわち、対応するクロマトグラムのピークが非常に小さいまたは好ましくはピークが存在しない植物体を同定することであったので、それを含めた。
【０３２２】
オオムギ栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅおよび栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎのそれぞれ１０，２４８個および３，８５８個のすべてのＮａＮ３変異誘発穀粒を、ＳＭＭ含有量に関して野生型穀粒と比較した場合に前記含有量が大きく低下しているものを同定する目的でスクリーニングした。Ｍ３世代の潜在的変異体２個だけ、すなわち試料番号８，０６３の穀粒（栽培品種Ｐｒｅｓｔｉｇｅ由来、本明細書の以下において変異体８０６３と記載し、名称は続く世代の穀粒に対しても使用する）および試料番号１４，０１８の穀粒（栽培品種Ｓｅｂａｓｔｉａｎ由来、本明細書の以下において変異体１４０１８と記載し、名称は続く世代の穀粒に対しても使用する）が同定された。各変異体の穀粒をＭ４世代に繁殖させ、次いで収穫し、最終的に再分析した。結果は、変異体８０６３および変異体１４０１８の穀粒は極めて低いＳＭＭ含有量であること、場合によってＳＭＭを完全に欠失していることを実証した。
【０３２３】
ウェスタンブロット解析は、変異体８０６３および変異体１４０１８がＭＭＴ酵素を欠失したことを実証している（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例３を参照されたい）。
【０３２４】
ＭＭＴ活性測定は、変異体８０６３がＭＭＴ活性を欠失していることも実証している（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例４を参照されたい）。
【０３２５】
国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例９に記載の通りオオムギ変異体８０６３におけるＭＭＴに関する遺伝子の配列決定は、イントロン５の最初の塩基におけるＧ→Ａ塩基の転移（配列番号１０のヌクレオチド番号３０７６、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の配列番号８に対応する）を明らかにした。国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１４に記載の通りオオムギ変異体１４０１８におけるＭＭＴに関する遺伝子の配列決定は、イントロン２の最初の塩基における、エクソン２のすぐ下流のスプライスドナー部位での、より詳細にはヌクレオチド番号１４６２番でのＧ→Ａ塩基の転移を明らかにした。
【０３２６】
ＭＭＴ  ｍＲＮＡが変異体８０６３では切断されていること（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１１を参照されたい）および、前記切断されたｍＲＮＡによってコードされている変異体ＭＭＴタンパク質がＭＭＴ活性を有さないこと（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１２を参照されたい）がさらに確認されている。ＭＭＴ  ｍＲＮＡが変異体１４０１８では切断されていること（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１５を参照されたい）および、前記切断されたｍＲＮＡによってコードされている変異体ＭＭＴタンパク質がＭＭＴ活性を有さないこと（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１６を参照されたい）も確認されている。
【０３２７】
変異体８０６３のＭＭＴ遺伝子における変異の存在を検出するための方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１１に記載されており、変異体１４０１８のＭＭＴ遺伝子における変異の存在を検出するための方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５の実施例１７に記載されている。
【０３２８】
（実施例３）
オオムギ異種交配
図３は、本発明の二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴのオオムギ系統が、オオムギ系統Ａ６８９（二重ヌルＬＯＸ、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号を参照されたい）と８０６３系統（ヌルＭＭＴ、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号を参照されたい）との最初の異種交配によってどのように育成されたのかを要約している。標準的育種技術を使用して倍加半数体系統を育成し、温室で繁殖させた。このうち農業生産力ならびにＬＯＸ−１活性の欠如（Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．らへの米国特許第７，４２０，１０５号の実施例２を参照されたい）、ＬＯＸ−２活性の欠如（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号の実施例２および本明細書の実施例１を参照されたい）ならびにＳＭＭ活性およびＭＭＴ活性の欠如（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５号の実施例２および４ならびに本明細書の実施例２を参照されたい）に関する最良の成績の（ｔｈｅ  ｂｅｓｔ−ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）系統をさらなる繁殖および解析のために選択した。これらの系統は、本明細書において「三重ヌル」と記載される。ＬＯＸ活性決定のために一般に、倍加半数体系統の種子を収穫し、次いで各系統および対照品種の穀粒１２個を解析し、測定に関する標準偏差は＜５％であった（図４）。
【０３２９】
（実施例４）
ＳＭＭレベルの決定
ＳＭＭの測定は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３１５に本質的に記載の通り実施した。最初にＳＭＭを、各ウェルが直径５ｍｍのガラスビーズおよび水：メタノール：クロロホルムの１２：５：６（ｖ／ｖ／ｖ）混合物５００μＬを含有するマイクロタイタープレートの１．２ｍＬウェル中に置いたオオムギ葉の１〜３ｃｍ長の切片から抽出した。次いでプレートを３０Ｈｚの振動数で振とうするように電子的に調整したＭＭ３００実験用ミル（Ｒｅｔｓｃｈ）で４５秒間インキュベートした。遠心分離後、上清１０μＬを９６ウェル保存プレート（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号１８６００２４８１）に移し、水２００μＬおよび反応溶液（ＯＰＡ試薬（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７９１４）：３−メルカプトプロピオン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ５８０１）の１５，０００：４５（ｖ／ｖ）の混合物を含有する）６０μＬと混合した。試料のアミノ酸を定量的にＯＰＡで誘導体化するために混合物を４℃で少なくとも１０分間インキュベートした。蛍光光度計を備えたＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、誘導体化混合物２μＬを３μｍ粒子の２．１×３０ｍｍ  Ｃ１８  Ｇｅｍｉｎｉカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ａ−４４３９−８０）上でｐＨ７．８に調製し、アセトニトリル：メタノール：水の４５：４５：１０（ｖ：ｖ：ｖ）溶液を含有した４０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液を移動相として使用して分離した（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ２００６）。ＯＰＡ誘導体の励起は３４０ｎｍであり、発光は４５０ｎｍで測定した。野生型由来および三重ヌルの変異体由来のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびＳＭＭの溶出プロファイルを例示するためにクロマトグラムの例を図５に示す。ＳＭＭを合成する能力の顕著な欠失が三重ヌルの変異体について観察された。
【０３３０】
（実施例５）
農業生産力
商業用栽培品種ＱｕｅｎｃｈおよびＰｏｗｅｒならびにヌルＬＯＸ−１、ヌルＭＭＴ、ヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２（二重ヌルＬＯＸ）、ヌルＬＯＸ−１−ヌルＭＭＴおよび三重ヌルの植物体をこれらの農業生産力を比較するために野外試験で検査した。データは、草高、出穂日、病害耐性、倒伏、成熟期間および収量について定期的に得た（表１を参照されたい）。
【０３３１】
試験は、野外試験についての標準的手順に従って実施した。したがって商業品種および変異体系統の等量の穀粒を２カ所にそれぞれ３回反復で７．８８ｍ２区画内に播種した。農業形質に関しては、変異体と商業用品種の間に大きな差異は観察されなかった。異なる変異体系統および品種のオオムギ品質解析は、麦芽製造および醸造に関しては収穫したすべての穀粒が優良で許容可能な特性を有していたことを実証した。
【０３３２】
（実施例６）
マイクロモルティングおよびマイクロマッシング
実験設定
マイクロモルティングおよびマイクロマッシング実験は、次の６つの異なるオオムギ系統および栽培品種で実施した（図６Ａ）、（本明細書の以下に記載する実験ワークフローも例示する）：（１）三重ヌル；（２）ヌルＬＯＸ−１−ヌルＭＭＴ；（３）ヌルＬＯＸ−１−ヌルＬＯＸ−２（オオムギＡ６８９系統）；（４）ヌルＭＭＴ（オオムギ８０６３系統）；（５）ヌルＬＯＸ−１（オオムギＤ１１２系統）；（６）栽培品種Ｐｏｗｅｒ。
【０３３３】
マイクロモルティング実験は、前述の系統または栽培品種のそれぞれ由来の３種の２２５ｇオオムギ試料で実施した。スティーピングおよび発芽は：
（ｉ）１６℃でのスティーピング；３時間、湿らせる；２１時間、乾燥させる；３時間、湿らせる；２１時間、乾燥させる；３時間、湿らせる；２１時間、乾燥させる；最終含水率４５％；
（ｉｉ）発芽；１６℃で４８〜７２時間、＞９５％改変まで
の通り実施した。
【０３３４】
発芽後、３種の試料を異なる乾燥管理に供した（図６Ａのキルン乾燥に記載）：
（ｉ）８５℃−乾燥：１２．５時間で３０℃開始から５５℃への勾配に続いて７．５時間で８５℃への勾配；８５℃、１．５時間
（ｉｉ）７５℃−乾燥：１２．５時間で３０℃開始から５５℃への勾配に続いて７．５時間で７５℃への勾配；７５℃、１．５時間
（ｉｉｉ）４０℃−乾燥：４０℃、４８時間。
【０３３５】
８５℃および４０℃で乾燥した試料は、発芽の直後に処理したが残りの試料は２日間凍結し、融解し、次に７５℃で上に概説の通り乾燥した。
【０３３６】
マイクロマッシングは、破砕した麦芽試料９０ｇを水道水２７０ｍＬと混合し、続いて５００ｍＬボトル中で、４０℃、２０分間インキュベーションすることによって実施した。温度は２５分間で６５℃へ勾配させ、６０分間６５℃での糖化休止が続いた。次に７８℃での１０分間のマッシングオフ段階の前に温度を１３分間で７８℃へ勾配させた。得られたウォートを次いで氷上で冷却し、氷冷水道水７００ｍＬで希釈し、保持されたＭＮ−６１６  １／４フィルター（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して濾過した。ウォート４００ｍＬを５００ｍＬボトルに移し、蓋をきつく締め、６０分間沸騰水浴中で加熱した。さらなる加熱は行わずにボトルを追加的に６０分間水浴中に置いた。
【０３３７】
ＤＭＳＰレベルについてのデータ
野生型麦芽および本出願の変異体麦芽において種々のキルン乾燥温度がＤＭＳＰ含有量にどのような影響を与えるかについて試験するために、穀粒を最初にマイクロモルティングし、続いて３種の異なる温度４０℃、７５℃および８５℃でのキルニングの前に一定分量に分けた。
【０３３８】
野生型ＭＭＴ遺伝子を含有するオオムギ系統の穀粒は、最終麦芽中の高レベルのＤＭＳＰによって特徴付けられた。しかしより高い温度でのキルニング後では低下したレベルが測定された（表２）。対照的にヌルＭＭＴ遺伝型のすべての麦芽においては顕著に低いレベルのＤＭＳＰが測定された。
【０３３９】
ＤＭＳＰレベルは、上述の麦芽から作製されたウォートにおいても測定され、その麦芽において測定されたものと一致するＤＭＳＰレベルを与えた。この発見は、麦芽とウォートとの間でのＤＭＳＰ含有量の密接な関係を記載したＤｉｃｋｅｎｓｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９８１年）の以前の結果と一致する。麦芽が作製されたキルン乾燥温度とは関係なくすべてのヌルＭＭＴ遺伝型について、対応するウォートにおける顕著に低いＤＭＳＰレベルが測定された。
【０３４０】
Ｔ２Ｎ前駆体および遊離Ｔ２Ｎのレベルについてのデータ
種々のキルン乾燥温度が遊離Ｔ２ＮおよびＴ２Ｎ前駆体のレベルにどのような影響を与えるかについて試験するために、本明細書の上に記載のマイクロモルティングおよびマイクロマッシングによって作製されたスイートウォートおよび冷却ウォートにおいて前記化合物の濃度を決定した。結果を表３に示す。
【０３４１】
野生型麦芽のウォートについてキルン乾燥温度はＴ２ＮおよびＴ２Ｎ前駆体の濃度に顕著に影響した。野生型麦芽を使用する場合にはＴ２Ｎ前駆体の高い生成を回避するために高いキルニング温度が不可欠であった。
【０３４２】
キルニング温度は、ヌルＬＯＸ−１−ヌルＭＭＴの麦芽ではＴ２Ｎおよびその付加物の生成にあまり影響しなかった。
【０３４３】
三重ヌルの麦芽のウォートについて、遊離Ｔ２Ｎおよびその前駆体の濃度がキルン乾燥温度と関係なく対応するすべての上記試料において低かったことも注目に値する。
【０３４４】
（実施例７）
麦芽にしていないオオムギでのマイクロマッシング
麦芽にしていない栽培品種Ｐｏｗｅｒおよび三重ヌルのオオムギのマイクロマッシングを、破砕したオオムギ試料９０ｇを水道水２７０ｍＬおよびオオムギ醸造用酵素混合物Ｏｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）０．１２ｇと混合し、続いて５００ｍＬボトル中で、５４℃、３０分間インキュベーションすることによって達成した。温度を１０分間で６４℃へ勾配させ、４５分間６４℃での糖化休止が続いた。これに１４分間での７８℃への勾配が続き、その後前記温度での１０分間のマッシングオフ段階が続いた。次に冷却、希釈、濾過および加熱手順をマイクロモルトマッシングについての記載の通り（実施例４を参照されたい）実施した。
【０３４５】
栽培品種Ｐｏｗｅｒおよび三重ヌルのオオムギフラワーから作製したウォートにおいてＤＭＳＰレベルを測定した（表４）。三重ヌルのオオムギから作製したウォートにおけるＤＭＳＰ含有量が野生型栽培品種Ｐｏｗｅｒのそれよりも顕著に低いことは明らかであった。これは、オオムギがＤＭＳＰを含有すると考えられていないことから、驚くべき発見であった（Ｙａｎｇ，  Ｂ．ら、Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｌｔｉｎｇ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｂｒｅｗ．  Ｃｈｅｍ．５６巻：８５〜９２頁、１９９８年）。
【０３４６】
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３５５号に示される通り（前記出願の図１２および実施例９を参照されたい）、煮沸されたオオムギ醸造物および通常ウォートのＴ２Ｎ前駆体のレベルは二重ヌルＬＯＸ由来の試料において顕著に低かった。したがって同様の特性が三重ヌルのオオムギのウォートを特徴付け、三重ヌルのオオムギをＴ２ＮおよびＤＭＳオフフレーバーが少ないまたはそれを完全に欠いているオオムギ醸造飲料のための高品質な原材料にすることが期待される。
【０３４７】
（実施例８）
パイロット規模での麦芽製造および醸造
実験設定
三重ヌルおよび栽培品種Ｑｕｅｎｃｈ（対照麦芽）の麦芽での麦芽製造および醸造解析は以下の：（ｉ）麦芽にする工程；（ｉｉ）ウォートを調製する工程；（ｉｉｉ）ウォートを分離する工程；（ｉｖ）ウォートを煮沸する工程；（ｖ）ウォートを酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓを用いて発酵させる工程；（ｖｉ）ビールのラガリング工程；（ｖｉｉ）ブライトビールを濾過する工程；および（ｖｉｉｉ）ビールをボトル詰めする工程（図６Ｂ、Ｃを参照されたい）、を含んだ。
【０３４８】
麦芽製造実験は、２０ｋｇの大規模で三重ヌルおよび栽培品種Ｑｕｅｎｃｈの穀粒について実行し、麦芽製造所内で以下：
（ｉ）１６℃でのスティーピング：１時間、湿らせる；１時間、乾燥させる；１時間、湿らせる；１時間、乾燥させる；１時間、湿らせる；最終含水率４５％；
（ｉｉ）発芽、１６℃で開始、１２０時間で１４℃への勾配；
（ｉｉｉ）乾燥：６５℃で開始、１４時間で８５℃への勾配、；８５℃で３時間
の通り実施した。
【０３４９】
三重ヌルおよび栽培品種Ｑｕｅｎｃｈ（後者を対照として使用）の両方のマッシングのために麦芽試料２５ｋｇを使用した。個々の麦芽試料の破砕に続いて水道水を容量１４６Ｌとなるように加えた。マッシングインを４０℃、２０分間実施し、２５分間で４０℃から６５℃への勾配が続いた。６５℃での糖化休止は６０分間であり、１３分間の７８℃への加熱段階および１０分間、７８℃でのマッシングオフが続いた。
【０３５０】
野生型栽培品種Ｑｕｅｎｃｈのウォート試料１個および三重ヌルの１個は、別に１０１℃で６０分間煮沸し（６．７％の蒸発を生じた）、一方残りの２個のウォート試料は９８℃、６０分間加熱した（３．９％の蒸発を生じた）。本明細書の上に参照される残りの醸造工程（すなわち濾過、旋回分離、発酵、ラガリングおよび緑色ガラスボトルへの封入）は、標準的醸造実施のための仕様に従った。
【０３５１】
ＤＭＳＰおよびＤＭＳレベルは、３５０Ｂ  硫黄化学発光検出器（Ｓｉｅｖｅｒｓ）上の静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを使用する硫黄特異的検出で、本質的にＨｙｓｅｒｔら（１９８０年）により記載された通り測定した。ヘッドスペース試料採取はＨＳ−４０  自動化装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して実施した。
【０３５２】
ＤＭＳの総レベル（すなわち、ウォートならびに緑麦芽およびキルン処理された（ｋｉｌｎｅｄ）麦芽の抽出物における遊離ＤＭＳとＤＭＳＰとの合計）は、それぞれの試料をアルカリ性条件下で１時間煮沸することによって得た。次に、煮沸および非煮沸試料をＤＭＳレベルの決定のためにヘッドスペース解析に供した。総ＤＭＳ（煮沸試料において測定）と遊離ＤＭＳ（非煮沸試料において測定）との間の差異が試料中に存在するＤＭＳＰの量と等しいと定義した。ビール中の遊離ＤＭＳの量は、本質的にウォートにおいてと同様に決定した（Ｈｙｓｅｒｔら、上掲）。
【０３５３】
ウォート試料中のＤＭＳＰ／ＤＭＳおよびＴ２Ｎ前駆体／遊離Ｔ２Ｎのレベルについてのデータ
現在の醸造用装置を使用すると、対応する完成したビールにおいて良好なＤＭＳレベル（すなわち、オフフレーバーのヒト味覚閾値レベルである［ＤＭＳ］＜５０ｐｐｂ）を達成するために６〜１０％のウォートの蒸発が通常必要である。これらの事実に基づいてパイロット醸造試験を上に記載の通り設計した。目的は、加圧インキュベーションによる非煮沸などのエネルギー投入量削減の、ウォートおよび最終ビール（ｆｉｎａｌ  ｂｅｅｒ）におけるＤＭＳレベルへの影響を検査することであった。したがって実験設定は標準的条件によるウォート煮沸との比較を含んだ。
【０３５４】
高レベルのＤＭＳＰおよび遊離ＤＭＳが栽培品種Ｑｕｅｎｃｈのウォートの加熱中に、加圧ウォートで時間と共に観察された遊離ＤＭＳレベルの増大を伴って測定された。対照的に、煮沸、蒸発ウォートは煮沸の最後までＤＭＳをあまり蓄積せず、その後遊離ＤＭＳが再度蓄積した。本明細書の上に記載のマイクロマッシングに続く結果と並行して、パイロット規模の三重ヌルの麦芽のウォートは、栽培品種Ｑｕｅｎｃｈ由来の同様の試料と比較して極めて低いレベルのＤＭＳＰおよび遊離ＤＭＳによって特徴付けられた（表５を参照されたい）。ウォートにおいてさえ三重ヌルの麦芽の前記ＤＭＳレベルが５０ｐｐｂの味覚閾値レベルを十分に下回ったことは注目に値する。
【０３５５】
野生型麦芽栽培品種Ｑｕｅｎｃｈおよび三重ヌルの麦芽由来のウォートおよびビール中のＴ２Ｎ前駆体および遊離Ｔ２Ｎの濃度は、本質的にＧｒｏｎｑｖｉｓｔら（１９９３年）によって記載されたようにカルボニルのＯ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンでの誘導体化に続くＧＣ−ＭＳによって決定した。
【０３５６】
高い濃度のＴ２Ｎ前駆体が栽培品種Ｑｕｅｎｃｈのウォートの加熱中に測定され、煮沸／加熱処理の開始のときに最大が見出された（表６）。三重ヌルの麦芽から作製されたウォートについては、顕著に低いレベルのＴ２Ｎ前駆体（野生型原材料を使用した場合のおよそ４０％）が見出され、それはやはり煮沸／加熱処理の開始のときが最大であった。低エネルギー加熱管理（すなわち加圧加熱処理を適用）は、両方の麦芽型についてＴ２Ｎ前駆体のレベルにあまり影響しなかった。すべてのウォート試料において低レベルの遊離Ｔ２Ｎが決定された。
【０３５７】
ヌルＬＯＸ−１およびヌルＬＯＸ−２の変異の有益な効果が、エネルギー投入量削減がウォート加熱中に適用された場合においてさえも明確に現れることは重要である。
【０３５８】
ビール試料中のＤＭＳおよびＴ２Ｎ前駆体／遊離Ｔ２Ｎのレベルについてのデータ
三重ヌルの麦芽および野生型麦芽栽培品種Ｑｕｅｎｃｈから本明細書の上に記載のような２種の異なる煮沸／加熱管理を使用して作製された新鮮ビールにおいて、ＤＭＳの濃度を測定した。結果を表７に要約する。
【０３５９】
栽培品種Ｑｕｅｎｃｈの野生型麦芽から標準的煮沸管理を使用して作製したビールは、ＤＭＳ  ６５ｐｐｂ（すなわち５０ｐｐｂの味覚閾値をわずかに上回る）を含有する。本明細書の上に記載の「加圧インキュベーションによる非煮沸」などの省エネルギー手順を野生型麦芽に使用すると、最終ビール中で非常に高濃度のＤＭＳ（１５１ｐｐｂ）を生じた。
【０３６０】
対照的に三重ヌルの麦芽から作製されたビールは、加熱手順に関係なく極めて低いレベルのＤＭＳを含有した。
【０３６１】
適用されたウォート調製方法にかかわらず、三重ヌルの麦芽から作製されたビールは、煮沸方法にかかわらず野生型麦芽栽培品種Ｑｕｅｎｃｈから作製されたビールよりもさらに少ないＴ２Ｎ前駆体（５６から５８％低減になる）を含有していた（表７）。
【０３６２】
新鮮なビール中の遊離Ｔ２Ｎレベルは、検査した４つすべての新鮮なビール（すなわち栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは三重ヌルの麦芽を、蒸発が許容されたまたは加圧のウォート調製と組み合わせて使用）において低かったが、３７℃、２週間の強制エイジング（ａｇｉｎｇ）後には顕著な差異が見られた。標準的煮沸または加圧加熱で野生型麦芽から作製された両方のビールが、０．０４１ｐｐｂおよび０．０６１ｐｐｂのＴ２Ｎをそれぞれ含有した一方で、三重ヌルの麦芽から作製したビールについての対応する値はより低かった（すなわちそれぞれ９５％および６４％に低減した）（表７）。
【０３６３】
ビール泡についてのデータ
栽培品種Ｑｕｅｎｃｈ（図６Ｂを参照されたい）および三重ヌル（図６Ｃを参照されたい）の麦芽のウォート加熱において蒸発または加圧のいずれかで作製されたパイロット醸造ビールを比較した。ビールは、試料採取ポイント９（図６Ｂ、Ｃを参照されたい）で採取し、５０ｍＬ  Ｈ２Ｏを１５０ｍＬビールに加える前に超音波浴中で２０分間脱気した。長さ１６ｃｍ、幅７ｃｍのガラス管（底部および上端部に、それぞれガラスフィルターおよびコネクターを伴う）からなる発泡タワー中に、混合物をゆっくり注入した。流速４００ｍＬ／分のＮ２ガスを、ビール泡を生成するために底部から混合物に通した。これを管内に導き、秤の上に置いた計量沈降コーン内に回収した。
【０３６４】
４種のビールそれぞれの泡の総重量を、泡の発生が止まるまで５分間隔で記録した（図７）。蒸発または加圧手順にかかわらず泡のレベルは同様であった。しかし泡の発生は三重ヌルの麦芽を原材料として使用したビールにおいて顕著に改善していた。
【０３６５】
ビール試飲
熟練の試飲パネルは４つの（すなわち栽培品種Ｑｕｅｎｃｈまたは三重ヌルの麦芽を、蒸発が許容されたまたは加圧のウォート調製と組み合わせて使用して）作製したビールを、新鮮作製ビールならびに３７℃、１週間および２週間での強制エイジング後に評価した（表８）。
【０３６６】
三重ヌルの麦芽から作製した新鮮ビールが、煮沸方法にかかわらず最も高い合計風味スコアを得た。対照的に、わずかに低い合計風味スコアが野生型麦芽から標準的煮沸管理を使用して作製されたビールについて得られ、「わずかにＤＭＳ」と見なされた。加圧加熱技術の適用は、非常に低い合計風味スコアのビールを生じ、「強くＤＭＳ」と見なされた。
【０３６７】
３７℃、１週間または２週間での強制エイジング後に、三重ヌルの麦芽から作製したビールは、特にエイジング成分Ｔ２Ｎの低い濃度に由来して生じる「紙質の風味」についての低いスコアにより、野生型麦芽から作製したビールよりも顕著に低い合計エイジングスコアを得た。
【０３６８】
（実施例９）
パイロット規模での麦芽製造および醸造
実験設定
三重ヌル（二重ヌルＬＯＸ−ヌルＭＭＴ）および栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａ（参照用野生型）の麦芽での麦芽製造および醸造解析は以下の：（ｉ）麦芽にする工程；（ｉｉ）ウォートを調製する工程；（ｉｉｉ）ウォートを分離する工程；（ｉｖ）ウォートを煮沸する工程；（ｖ）ウォートを酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓを用いて発酵させる工程；（ｖｉ）ビールのラガリング工程；（ｖｉｉ）ブライトビールを濾過する工程；および（ｖｉｉｉ）ビールをボトル詰めする工程、を含んだ。
【０３６９】
麦芽製造実験は、２１ｋｇの大規模で三重ヌルおよび栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａの穀粒について実行し、麦芽製造所内で以下：
（ｉ）１６℃でのスティーピング：１時間、湿らせる；１時間、乾燥させる；１時間、湿らせる；１時間、乾燥させる；１時間、湿らせる；最終含水率４５％まで３６時間にわたる水の滴下、；
（ｉｉ）発芽、１６℃で開始、１２０時間で１４℃への勾配；
（ｉｉｉ）発芽穀粒の乾燥／キルニングは、パイロットキルンにおいて通常温度プログラムまたは低温プログラムのいずれかであった；
（ｉｖ）通常乾燥／キルニングプログラム、４５℃で開始、１４時間で８５℃への勾配、続いて８５℃、２時間インキュベーション；
（ｖ）低温乾燥／キルニングプログラム、４５℃で開始、１２時間で７５℃への勾配、続いて７５℃、２時間インキュベーション；
の通り実施した。
【０３７０】
三重ヌルおよび栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａの両方のマッシングのために麦芽試料３４ｋｇを使用した。個々の麦芽試料の破砕に続いて水道水を容量１８０Ｌとなるように加えた。マッシングインを６０℃、２０分間実施し、５分間で６０℃から６５℃への勾配が続いた。６５℃での糖化休止は６０分間であり、１３分間の７８℃への加熱段階および７８℃での１０分間のマッシングオフが続いた。
【０３７１】
野生型栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａおよび三重ヌルのウォート試料は、別々に開放容器で６０分間、１００℃で煮沸した（４．５％の蒸発を生じた）または、密閉容器中で９９．５℃に加熱し、６０分間、９９．５℃に保った（０％の蒸発を生じた）。
【０３７２】
６つの異なるウォートを栽培品種、キルニング条件および煮沸条件のさまざまな組合せで作製した（表９を参照されたい）。
【０３７３】
本明細書の上に参照される残りの醸造工程（すなわち旋回分離、発酵、ラガリング、濾過および緑色ガラスボトルへの封入）は、標準的醸造実施のための仕様に従った。
【０３７４】
ＤＭＳＰおよびＤＭＳレベルは、本明細書の上の実施例８に記載の通り測定した。
【０３７５】
麦芽試料中のＤＭＳＰ／ＤＭＳレベルについてのデータ
現在の麦芽製造プラントでは、キュアリング温度８５℃で少なくとも２時間の穀粒の乾燥が、十分なＤＭＳレベルであるウォートを得ることができる麦芽を得るために、麦芽中のＤＭＳＰを低レベル（すなわち麦芽１ｋｇあたり４．５ｍｇ未満）に低減するために通常必要である（下を参照されたい）。
【０３７６】
これらの事実に基づいてパイロット麦芽製造試験を上に記載の通り設計した。目的は、低温乾燥などのエネルギー投入量削減の、麦芽、ウォートおよび最終ビールにおけるＤＭＳおよびＤＭＳＰレベルへの影響を検査することであった。したがって実験設定は標準的条件による穀粒乾燥との比較を含んだ。
【０３７７】
８５℃での標準的乾燥を使用して栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａで作製した麦芽において、ＤＭＳＰを麦芽１ｋｇ当たり４．７ｍｇと測定した。７５℃での乾燥を使用して作製した栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａの麦芽において、ＤＭＳＰを１６．２ｍｇ／ｋｇと測定した（表１０）。三重ヌルの穀粒で作製した麦芽においては、極めて低いＤＭＳＰレベル（実際には検出限界以下）を乾燥温度にかかわらず得た。
【０３７８】
ウォート試料中のＤＭＳＰ／ＤＭＳのレベルについてのデータ
現在の醸造技術を使用すると、対応する完成したビールにおいて良好なＤＭＳレベル（好ましくは［ＤＭＳ］＜５０ｐｐｂ）を達成するために４．５〜１０％のウォートの蒸発を伴う少なくとも１時間の煮沸が通常必要である。これらの事実に基づいて醸造試験を上に記載の通り設計した。目的は、低温穀粒乾燥または密閉容器中での蒸発を伴わない加熱処理などのエネルギー投入量削減の、ウォートおよび最終ビールにおけるＤＭＳレベルへの影響を検査することであった。したがって実験設定は標準的条件による穀粒乾燥およびウォート煮沸との比較を含んだ。
【０３７９】
高レベルのＤＭＳＰおよび遊離ＤＭＳが通常の乾燥で作製された栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａのウォートの加熱中に測定された。遊離ＤＭＳレベルにおける増大が密閉容器中において時間とともに観察された。対照的に、煮沸、蒸発ウォートは煮沸の最後までＤＭＳをあまり蓄積せず、その後遊離ＤＭＳが再度蓄積した（表１１）。栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａで低温乾燥を使用すると、ＤＭＳＰおよびＤＭＳレベルは通常乾燥よりもさらに高かった。栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａで作製した３つすべてのウォートにおいて最終ウォートは５０ｐｐｂより高いＤＭＳレベルを有していた。
【０３８０】
本明細書の上に記載の他の結果と並行して、三重ヌルの麦芽のウォートは、栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａ由来の同様の試料と比較して極めて低いレベルのＤＭＳＰおよび遊離ＤＭＳによって特徴付けられた。ウォートにおいてさえ三重ヌルの麦芽の前記ＤＭＳレベルがキルニングおよび煮沸管理にかかわらず５０ｐｐｂを十分に下回ったことは注目に値する。
【０３８１】
ウォート試料中のＴ２Ｎ前駆体／遊離Ｔ２Ｎレベルについてのデータ
野生型麦芽栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａおよび三重ヌルの麦芽由来のウォートおよびビール中のＴ２Ｎ前駆体および遊離Ｔ２Ｎの濃度は、本質的にＧｒｏｅｎｑｖｉｓｔら（１９９３年）によって記載されたようにカルボニルのＯ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンでの誘導体化に続くＧＣ−ＭＳによって決定した。
【０３８２】
高濃度のＴ２Ｎ前駆体が栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａのウォート中で測定された（表１２）。三重ヌルの麦芽から作製されたウォートについては、顕著に低いレベルのＴ２Ｎ前駆体（野生型原材料を使用した場合のおよそ４０％）が見出された。低エネルギー加熱管理（すなわち低温キルニングまたは密閉容器中での蒸発を伴わないウォートの加熱処理）は、両方の麦芽型についてＴ２Ｎ前駆体のレベルにあまり影響しなかった。すべてのウォート試料において低レベルの遊離Ｔ２Ｎが決定された。
【０３８３】
ヌルＬＯＸ−１およびヌルＬＯＸ−２の変異の有益な効果が、削減されたエネルギー投入量が適用された場合においてさえも明確に現れることは重要である。
【０３８４】
ビール試料中のＤＭＳおよびＴ２Ｎ前駆体／遊離Ｔ２Ｎのレベルについてのデータ
三重ヌルの麦芽および栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａの野生型麦芽から本明細書の上に記載のように２つの異なる穀粒乾燥および煮沸／加熱管理を使用して作製された新鮮ビールにおいて、ＤＭＳの濃度を測定した。結果を表１３に要約する。
【０３８５】
標準的乾燥条件を使用して作製した栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａの野生型麦芽から、標準的煮沸管理を使用して作製したビールは、ＤＭＳ  １１７ｐｐｂ（すなわち５０ｐｐｂを上回る）を含有した。本明細書の上に記載の「密閉容器中での非蒸発」などの省エネルギー手順を野生型麦芽に使用するとＤＭＳ  １７４ｐｐｂ（すなわち最終のビール中でオフフレーバーの非常に高い濃度）を生じた。
【０３８６】
対照的に三重ヌルの麦芽から作製されたビールは、煮沸およびキルニング手順に関係なく非常に低いレベルのＤＭＳを含有した。
【０３８７】
新鮮なビール中の遊離Ｔ２Ｎレベルは、検査したすべてのビール（すなわち栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａまたは三重ヌルの麦芽を、蒸発が許容された煮沸または密閉容器中での蒸発を伴わない加熱処理と組み合わせて使用）において低かったが、３７℃、２週間の強制エイジング後には顕著な差異が見られた。野生型麦芽から標準的煮沸で作製されたビールおよび密閉容器中での蒸発を伴わない加熱処理で作製されたビールは、それぞれ０．０５５ｐｐｂおよび０．０３５ｐｐｂのＴ２Ｎを含有した一方で、三重ヌルの麦芽から作製したビールについての対応する値は顕著により低かった（すなわちそれぞれ６７％および５１％に低下していた）（表１３を参照されたい）。
【０３８８】
ビール試飲
熟練の試飲パネルは６通りの（すなわち栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａまたは三重ヌルの麦芽を、蒸発が許容された煮沸または密閉容器中での蒸発を伴わない加熱処理または標準温度もしくは低温乾燥と組み合わせて使用して）作製したビールを、新鮮作製ビールについておよび３７℃、２週間での強制エイジング後に評価した（表１４）。
【０３８９】
三重ヌルの麦芽から作製した新鮮ビールが、キルニングおよび煮沸方法にかかわらず最も高い合計風味スコアを得た。対照的に、より低い合計風味スコアが８５℃でキルン処理された野生型麦芽から標準的煮沸管理を使用して作製したビールについて得られ、「顕著にＤＭＳ」と見なされた。ウォート調製における密閉容器中での蒸発を伴わない加熱処理の適用は、さらに低い合計風味スコアのビールを生じ、それは「強くＤＭＳ」と見なされた。
【０３９０】
３７℃、２週間での強制エイジング後に、８５℃でキルン処理された三重ヌルの麦芽から通常の煮沸で作製したビールは、野生型麦芽から作製した対応するビールよりも顕著に低い合計エイジングスコアを、特にエイジング成分Ｔ２Ｎのより低い濃度に由来する「紙質の風味」属性についての低いスコアに起因して得た。
【０３９１】
野生型麦芽から作製したビールについての劣化特徴の評価は、主に顕著に強いＤＭＳオフフレーバーのため実際には不可能だった。
【０３９２】
（実施例１０）
オオムギ醸造と通常のビールとの比較−ＴＨＡ
リノール酸由来のビール特異的ＴＨＡは、既に数十年前に記載された（Ｄｒｏｓｔら、１９７４年）。それ以来、種々の報告がビール中のＴＨＡの総含有量はおよそ５〜１２ｐｐｍの範囲内であることを実証している（Ｈａｍｂｅｒｇ、１９９１年；およびその参考文献）。一方９，１２，１３−ＴＨＡは、ビール中のＴＨＡの通常７５〜８５％を構成し、９，１０，１３−ＴＨＡ量は１５〜２５％であり、他の異性体は痕跡量で検出される。
【０３９３】
オオムギ三重ヌルの麦芽から調製されたウォートから作製されたビールにおいて（実施例９を参照されたい）、９，１２，１３−ＴＨＡの濃度は栽培品種Ｒｏｓａｌｉｎａの麦芽から作製された対照ビールと比較して８０〜８７％低下していた（表１５）。９，１０，１３−ＴＨＡ異性体については６５〜７２％の低下が観察された。これらの測定は、標準的ＨＰＬＣ−質量分析を使用して実行された（Ｈａｍｂｅｒｇ、上掲）。
【０３９４】
（実施例１１）
ビール中の原材料由来ＤＮＡの増幅
麦芽フラワー混合物中の種特異的ＤＮＡ配列の存在または非存在を確立するためにＰＣＲ法を使用できる場合、ビール試料の認証はより挑戦的になる。ビール生産において原材料由来ヌクレアーゼの組合せ効果、温度上昇および濾過は、植物体遺伝子断片の増幅のための無傷なＤＮＡをほんの低レベル含むビール生成物を提供する。本明細書において、（可視化のために十分な量のＤＮＡを生成する）ＤＮＡ抽出および増幅の組合せのための効果的で新規の方法が記載される。
【０３９５】
新規の４工程プロトコールは、ビール試料の原材料認証のために開発された。それは、３つの生体分子キットの試薬およびプロトコールを連続的に利用し、最終的に可視化のためのＤＮＡ断片の増幅をもたらした：
（ｉ）磁気ビーズへの結合を介したビールからのＤＮＡの抽出（ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ（Ｔｅｐｎｅｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．、カタログ番号９０１０４０Ｎ）の液体試料用の指示における推奨に従った）；
（ｉｉ）等温鎖置換によるＤＮＡの増幅（Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２５−６６００−３０）；
（ｉｉｉ）ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  ＰＣＲ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＸＮＡＰ−１ＫＴ）を使用する、特異的ＤＮＡ変異の検出用プライマーを用いたＰＣＲ；
（ｉｖ）増幅産物を分離するためのアガロースゲル電気泳動に続く、これらを可視化するための臭化エチジウムでの染色。
【０３９６】
上の工程（ｉ）は、以下の試料：  
（ａ）Ｔｕｂｏｒｇ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｉｌｓｎｅｒ、野生型麦芽：オオムギの７５％：２５％混合物のフラワーを使用して生産した（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｂｒｅｗｅｒｉｅｓ  Ａ／Ｓ；ラベル銘字２６．１１．１１  ７０４）；
（ｂ）ヌルＬＯＸ−１の麦芽を５０％含む混合物（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ試験名２Ｃ１００８４）を使用してパイロット規模で生産したビール；
（ｃ）三重ヌルのオオムギから作製した麦芽（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ試験名２Ｃ１１００１）を使用してパイロット規模醸造した非煮沸ウォート；
（ｄ）三重ヌルの麦芽（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ試験名２Ｃ１１００１）を使用してパイロット規模醸造した煮沸ウォート、すなわち上の（ｃ）において記載されたものから処理したウォート
の４００μＬ一定分量からのＤＮＡの精製に関係した。
【０３９７】
上に述べた試料（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のそれぞれから精製したＤＮＡを最終的に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．４  ５０μＬに再懸濁した。
【０３９８】
上の工程（ｉｉ）において、ウォートまたはビール由来ＤＮＡ（（ｉ）において詳述の通り精製した）の１μＬ一定分量の試料を増幅に供した。ＤＮＡは短時間熱変性し、次いでＤＮＡに非特異的に結合するランダムヘキサマーを含有する試料緩衝液中で冷却した。ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムヘキサマー、ヌクレオチド、塩および緩衝剤を含有するマスターミックスを添加し、等温増幅を３０℃で２時間、最終反応容量２０μＬを使用して実施した。続いて６５℃での１０分間のインキュベーションでポリメラーゼを熱不活性化した。
【０３９９】
上の工程（ｉｉｉ）に関して、１４μＬ  ＰＣＲ増幅のパラメーター（上の（ｉｉ）において記載の通り調製した試料の、１．０または４．２μＬいずれかの鋳型一定分量、およびヌルＬＯＸ−１の変異を検出するためのプライマーＦＬ８２０（ＷＯ２０１０／０７５８６０の配列番号１０）およびＦＬ８２３（ＷＯ２０１０／０７５８６０の配列番号１１）の各々７ｐｍｏｌを含む；Ｓｋａｄｈａｕｇｅ，Ｂ．らへのＷＯ２０１０／０７５８６０中の図１８Ｂを参照されたい）は：
（ｉ）９６℃で、２分間の変性を１サイクル；
（ｉｉ）（ａ）９５℃で、１分間の変性
（ｂ）６８℃で、１分間のアニーリング
（ｃ）７２℃で、１分間の伸長
を３０サイクル；
（ｉｉｉ）７２℃で、１０分間の最終伸長
（ｉｖ）ホールド
の通りであった。
【０４００】
上の工程（ｉｖ）は、臭化エチジウムを混合した２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中でのＰＣＲ混合物全体の電気泳動分離からなる。電気泳動に続いてゲルにＵＶ光を照射し、写真撮影する（図１０）。
【０４０１】
図１０に示すＤＮＡバンドパターンの解析は、Ｔｕｂｏｒｇビールの一定分量からの増幅産物が無く、その原材料が野生型由来のものである（すなわちヌルＬＯＸ−１のオオムギに由来しない）という予想された結果を明らかにした。しかし予想された長さの増幅産物がヌルＬＯＸ−１の麦芽を５０％含む混合物で醸造したビール由来の試料で検出できた。同様に、しかしより明白に、染色が三重ヌルの麦芽から調製した非煮沸ウォートにおいて得られた。おそらく加熱損傷および続く沈殿のために、三重ヌルの原材料の煮沸ウォート試料においてＰＣＲ産物はあまり増幅されなかった。
【０４０２】
上の（ｉｉ）に記載の増幅産物をプライマー対ＦＬ１０３４−ＦＬ１０３９（ＷＯ２０１０／０７５８６０のそれぞれ配列番号９および配列番号８；ＳｋａｄｈａｕｇｅらへのＷＯ２０１０／０７５８６０中の図１８も参照されたい）、プライマーセット２０（ＷＯ２０１０／０６３２８８の配列番号７７および配列番号８１）およびプライマーセット２１（ＷＯ２０１０／０６３２８８の配列番号７８および配列番号８２；ＫｎｕｄｓｅｎらへのＷＯ２０１０／０６３２８８Ａ２中の図１５も参照されたい）を別々のＰＣＲ（しかし、本実施例において上に詳述したものと同様の条件）において利用して、ウォートまたはビール試料が三重ヌルの原材料の使用によって作製されるかどうかが確かめられる。
【０４０３】
【表１】
0006007174.tif 000002
【０４０４】
【表２】
0006007174.tif 000003
【０４０５】
【表３】
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【０４０６】
【表４】
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【０４０７】
【表５】
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【０４０８】
【表６】
0006007174.tif 000007
【０４０９】
【表７】
0006007174.tif 000008
【０４１０】
【表８−１】
0006007174.tif 000009
【０４１１】
【表８−２】
0006007174.tif 000010
【０４１２】
【表９】
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【０４１３】
【表１０】
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【０４１４】
【表１１−１】
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【０４１５】
【表１１−２】
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【０４１６】
【表１１−３】
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【０４１７】
【表１２】
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【０４１８】
【表１３】
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【０４１９】
【表１４−１】
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【０４２０】
【表１４−２】
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【０４２１】
【表１５】
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【０４２２】
【表１６−１】
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【０４２３】
【表１６−２】
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【０４２４】
【数１】
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【０４２５】
【数２】
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【０４２６】
【数３】
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【０４２７】
【数４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006007174.tif 000034
【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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