(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶化促進方法であって、
前記結晶化装置は、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値である
ことを特徴とする生体高分子の結晶化促進方法。
【請求項２】
タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶化促進方法であって、
前記結晶化装置は、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の時間的強度ゆらぎに基づいて、前記結晶化溶液における前記凝集の遷移の状態を分析する
ことを特徴とする生体高分子の結晶化促進方法。
【請求項３】
タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶化解析方法であって、
前記結晶化装置は、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記結晶化溶液の生体高分子の凝集の遷移の状態を検知し、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が前記凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値である
ことを特徴とする生体高分子の結晶化解析方法。
【請求項４】
タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶の製造方法であって、
前記結晶化装置は、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、  
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して前記電場の印加を停止し、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が前記凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値である
ことを特徴とする生体高分子の結晶の製造方法。
【請求項５】
タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置により、生体高分子の結晶化促進方法を実行させる結晶化装置の制御プログラムであって、
前記結晶化装置は、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加させ、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定させ、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析させ、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値である
ことを特徴とする生体高分子の結晶化装置の制御プログラム。
【請求項６】
タンパク質を含む生体高分子を結晶化させるための結晶化装置により、生体高分子の結晶化促進方法を実行させる結晶化装置の制御プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、
前記結晶化装置は、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加させ、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定させ、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析させ、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値である
ことを特徴とする記録媒体。
【請求項７】
タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置であって、
前記生体高分子の結晶化溶液と、
前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、
前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、
前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、
前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、
前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、
前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、
前記制御解析部により、
前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、
前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、
散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、
前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値である
ことを特徴とする生体高分子の結晶化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶化促進方法、結晶化解析方法、結晶の製造方法、結晶化装置の制御プログラム、記録媒体、及び結晶化装置に係り、特に生体高分子に内部電場印加を行い光散乱計測による結晶化状態の分析を行う技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンパク質に代表される生体高分子の機能を解明するために、結晶構造解析の技術が必要不可欠となっている。
生体高分子の結晶構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定、Ｘ線回折測定、また中性子線回折測定等を用いて解析される。
解析された結晶構造のデータを用いて、生体高分子の高次構造や機能の解析を行うことができる。
このような結晶構造の解析及び評価は、いかに良質の生体高分子の結晶を作製するかに大きく依存している。
【０００３】
しかしながら、タンパク質結晶構造解析を行うにあたって、タンパク質の結晶化は主要な障害のままであった。
ここで、タンパク質の結晶作製は、通常、タンパク質の過飽和溶液に沈殿剤（結晶化剤）等を添加して行われる。
この際のタンパク質の結晶化条件は、タンパク質の溶液濃度、沈殿剤（結晶化剤）の種類や濃度、緩衝液の種類、ｐＨ値、溶液温度等の、物理的・化学的な結晶化要因を考慮する必要がある。
つまり、結晶化条件のスクリーニングは大変な努力を要する。
【０００４】
ところが、溶液中におけるタンパク質の結晶成長速度は、一般的には大変遅い。
これは、Ｘ線又は中性子回折に適している単結晶を得るため、長い時間が要求されることを意味する。
従って、結晶化する条件下であっても、光学顕微鏡等で結晶生成が確認できるまでには、少なくとも数日から数週間が必要である。
また、タンパク質の種類や作製条件によっては、数ヶ月以上を要することもある。
さらに、困ったことに、結晶化条件がよく同定されているタンパク質に対してさえ、結晶化プロセスの詳細は、まだ明確になっていない。
【０００５】
ここで、タンパク質結晶化は、過飽和になったタンパク質溶液に外部刺激を適用するいくつかの方法を使用して促進することができる。
この結晶化の促進方法として、磁場、超短パルス・レーザー、及び電場を加える外部刺激方法が知られている。電場印加法は、他の促進方法と比較すると、単純で廉価な装置を用いるため有利である。
典型的な電場印加法である外部電場印加法では、タンパク質結晶化を誘発するために、電気絶縁体を介して溶液に接している電極に高電圧（１〜１０ｋＶ）をかける必要がある。このため、結晶化溶液セルの小型化が防げられるという問題があった。
対照的に、内部電場印加法は、例えば、実効値で１Ｖ以下の低電圧での印加を行うため、溶液での微弱電流が伴うという問題があるものの、結晶化溶液セルの大きさを最小化できる。
【０００６】
従来の内部電場印加法の結晶化溶液セルとして、特許文献１を参照すると、内部電場を印加するタンパク質結晶化のための小さく透明な結晶化溶液セルが記載されている（以下、従来技術１とする。）。
この結晶化溶液セルでは、ガラス基板上のスズ含有のインジウム錫オキサイド（Ｉｎ2Ｏ3、ＩＴＯ）薄膜を用いた透明導電体薄膜を透明導電体電極として使用しており、透明導電体電極を通して、タンパク質結晶成長についての観察が可能になった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１００８４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来技術１において、電場が結晶化を引き起こすプロセスは不明瞭なままであった。
したがって、この技術を使用した殆どの成功例は、試行錯誤の結果によっていた。
つまり、従来技術１の電場印加では、タンパク質の結晶化促進ができるものの、最適化条件等について探索するには、未だ多大な労力と時間を必要とするという問題があった。
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の結晶化促進方法は、タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶化促進方法であって、前記結晶化装置は、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値であることを特徴とする。
本発明の結晶化促進方法は、タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶化促進方法であって、前記結晶化装置は、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の時間的強度ゆらぎに基づいて、前記結晶化溶液における前記凝集の遷移の状態を分析することを特徴とする。
本発明の結晶化解析方法は、タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶化解析方法であって、前記結晶化装置は、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記結晶化溶液の生体高分子の凝集の遷移の状態を検知し、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が前記凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値であることを特徴とする。
本発明の結晶の製造方法は、タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置による生体高分子の結晶の製造方法であって、前記結晶化装置は、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して前記電場の印加を停止し、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が前記凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値であることを特徴とする。
本発明の結晶化装置の制御プログラムは、タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置により、生体高分子の結晶化促進方法を実行させる結晶化装置の制御プログラムであって、前記結晶化装置は、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加させ、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定させ、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析させ、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値であることを特徴とする。
本発明の記録媒体は、タンパク質を含む生体高分子を結晶化させるための結晶化装置により、生体高分子の結晶化促進方法を実行させる結晶化装置の制御プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記結晶化装置は、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加させ、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定させ、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析させ、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値であることを特徴とする。
本発明の結晶化装置は、タンパク質を含む生体高分子の結晶化装置であって、前記生体高分子の結晶化溶液と、前記結晶化溶液に直接平行に接するように面状に形成された透明導電体電極と、前記透明導電体電極に挟持され、前記結晶化溶液を保持するための電気絶縁部材と、前方小角散乱光又は後方小角散乱光を検出する散乱光検出部と、前記散乱光検出部により検出された信号を分析する制御解析部とを備え、前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電場を印加し、前記散乱光検出部により、前記結晶化溶液に光を照射して前記結晶化溶液からの前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光を測定し、前記制御解析部により、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度に基づいて、前記結晶化溶液の状態を分析し、前記制御解析部により、前記透明導電体電極に、低電圧を印加させ、前記結晶化溶液が生体高分子の凝集の遷移の状態になったことを検知して、前記低電圧の印加を停止させ、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光の強度関数又は前記後方小角散乱光の強度関数であり、散乱角度１０°以下の前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数の変化により前記凝集の遷移の状態を検知し、前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度は、それぞれ散乱角度に対する前記前方小角散乱光又は前記後方小角散乱光の強度関数から得られる、前記前方小角散乱光の強度の平均値又は前記後方小角散乱光の強度の平均値であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、電場印加の状態下で結晶化溶液の光散乱を効率良く計測して最適に生体高分子を結晶化できる結晶化促進方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘの制御構成と、入射光、透過光、前方小角散乱光、並びに後方小角散乱光との関係を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る測定試料部３の構成例を示す断面図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る測定試料部３の構成例を示す正面図である。
【図４】本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶成長促進方法に係る処理のフローチャートである。
【図５】本発明の実施の形態の実施例に係るリゾチームの電圧印加／電圧印加無しにおける前方小角散乱の静的光散乱（ＳＬＳ）分布を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態の実施例に係るリゾチームの電圧印加から適宜の時間経過後の前方小角散乱光の測定を示すグラフである。
【図７】本発明の実施の形態の実施例に係る静的光散乱強度の平均値と経過時間の関係を示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態の実施例に係る電圧印加停止後のタンパク質結晶化の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜実施の形態＞
〔タンパク質結晶化装置Ｘの構成〕
まず、図１を参照して、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘの構成について説明する。
本実施形態のタンパク質結晶化装置Ｘは、主な構成として、制御解析部１と、測定試料部３と、散乱光検出部５と、電源６とを備える。
タンパク質結晶化装置Ｘは、タンパク質結晶化溶液３１を含む試料セルである測定試料部３の前方／後方小角散乱を測定するコンピュータ制御の前方小角散乱／後方小角散乱測定システムである。
図１においては、溶液セルの概略構成と前方／後方小角散乱光の測定の配置についても示した。図１の点線の矢印は光信号の流れを、実線の矢印は制御信号及び電気信号の流れの例を示している。
タンパク質結晶化装置Ｘは、測定試料部３に内部電場印加法で、電圧を印加する。この上で、例えば、２．５°から３０°の間の角度において、０．０５°の分解能で静的な前方小角散乱の正確な測定ができる。たとえば、約１０分で２．５°から２０°まで０．１°のステップで前方小角散乱が測定可能である。
【００１４】
なお、本実施形態において、「前方小角光散乱」とは、測定対象となるタンパク質結晶化溶液へ入射する光の透過光に対する散乱角が１０°程度以下、特に６°以下における溶液からの散乱光であることを示す。
また、同様に「後方小角光散乱」とは、測定対象の溶液へ入射する光の反射光に対する散乱角が１０°程度以下、特に６°以下における溶液からの散乱光であることを示す。
【００１５】
制御解析部１は、ＰＣ／ＡＴ互換機やＭＡＣ互換機等のＰＣやハンドヘルドデバイス等である。制御解析部１は、タンパク質結晶化溶液の散乱光に関する計測・収集したデータを分析し、例えば補助記憶装置であるハードディスク等に記憶する機能を備える。
制御解析部１は、電源６を制御して測定試料部３の結晶化溶液３１に印加する電圧等を制御する。また、制御解析部１は、測定試料部３の２段回転ステージ等を制御する。また、制御解析部１は、タンパク質結晶化溶液３１から散乱光検出部５により検出された静的光散乱、及び動的光散乱の計測、特に前方小角光散乱又は後方小角光散乱の計測に基づいて、溶液中におけるタンパク質結晶化の状態を分析する。この上で、制御解析部１は、タンパク質の結晶化が進行する状態になった場合には、電圧の印加を止めるように制御することが可能である。
なお、制御解析部１は、計測したデータをグラフとして表示部（ディスプレイ）やプリンタ（図示せず）に画像として表示する機能を備えている。
【００１６】
測定試料部３は、測定対象のタンパク質結晶化溶液３１を収容し、電圧を印加し、散乱光を計測するための容器（溶液セル）を含む部位である。
測定試料部３には、タンパク質結晶化溶液３１からの散乱光、特に前方小角散乱光又は後方小角散乱光を測定するための適切な光学的配置が施されている。測定試料部３は、測定対象の溶液が微量で、高濃度であっても、溶液からの散乱光を効率良く放出させるように構成される。
測定試料部３には、更にこの溶液セルを支持する指示部材、及び溶液セルへ平行光を導くためのレンズやプリズム等の光学素子、入射光の角度を調整するステージ等を備えていてもよい。このため、測定試料部３は、例えば、θ回転ステージ上に固定される。この際、測定試料部３は、タンパク質結晶化溶液３１へ、ビーム光が平行状態になるよう光学調整を行ったコリメートビーム光等を入射させ、溶液セルの透過光や反射光の影響を少なくし、タンパク質結晶化溶液からの前方小角散乱光又は後方小角散乱光、特に前方小角散乱光を効率よく放射させ測定できるように構成されている。
また、測定試料部３は、電源６からの交流電圧を内部印加で印加することができる。
測定試料部３の溶液セルの具体的な構造について後述する。
【００１７】
散乱光検出部５は、タンパク質結晶化溶液から放射される散乱光を検出し、散乱光強度を測定するための光検出器である。
具体的には、散乱光検出部５は、タンパク質結晶化溶液による散乱光の検出に適した光検出器であり、各種の光センサを用いることができる。このため、散乱光検出部５は、θ回転ステージやスリット等の光学素子を含ませて、構成することができる。
タンパク質結晶化溶液の散乱光の時間的変化の測定（動的散乱光（ＤＬＳ、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）測定とも呼ぶ）を行う場合には、散乱光検出部５の応答性を考慮し、適切な検出器を選択する。
応答性に優れた光検出器としては、ｐｎ接合間に真性半導体層を持ったＰＩＮフォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、及びフォトマルチプライヤ（ＰＭＴ）等が挙げられ、測定する散乱光のゆらぎ時間やゆらぎ周波数に応じて光検出器を選択する。
散乱光検出部５からの散乱光の信号が増幅されたアナログの出力電圧信号は、例えば、増幅された上で、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器を介してデジタル信号に変換される。制御解析部１は、このデジタル信号を測定データとして取り込むことができる。
【００１８】
なお、測定試料部３と散乱光検出部５とは、電動の回転ステージを用いて角度を調整するように構成可能である。この回転ステージとしては、例えば、２つの回転ステージの回転軸を一致させ、２段組に重ね合わせることによって一体化した、独立に回転移動できる２段回転ステージ（以下、θ−２θ回転ステージと呼ぶ。）を用いて入射光及び前方／後方小角散乱光の角度を調整するように構成できる。図１のタンパク質結晶化装置Ｘにおいて、制御解析部１が、入射角制御部の回転ステージにより入射光の角度を調整し、測定試料部３に導入する。そして、制御解析部１は、この溶液セル内のタンパク質結晶化溶液３１からの散乱光の角度を回転ステージにより角度を調整し、散乱光検出部５に導入させ、前方小角散乱／後方小角散乱を測定する。
このようなタンパク質結晶化溶液の静的／動的散乱光の検出については、例えば、特願２０１０−２８１５６２又は文献（Ｔ．Ｗａｋａｍａｔｓｕ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９８，２６３７０１（２０１１）、参照）に記載の技術を用いて構成することができ、本明細書ではこれを引用するものとする。
【００１９】
電源６は、多機能のファンクションジェネレータ等を用いた電源であり、測定試料部３に交流又は直流の電圧を印加する。
また、電源６は、測定試料部３に印加された電圧を、ストレージオシロスコープ等のように表示し、制御解析部１にてモニタリング可能である。
電源６は、測定試料部３の結晶化溶液セル内の導電性のタンパク質結晶化溶液３１に、直流に換算した場合、１．２Ｖ以下の電圧で０．１μＡ以下の微弱電流が流れる。
【００２０】
（本発明の実施の形態に係る測定試料部３の構成）
次に、図２の側断面図と図３の概正面図とを参照して、本発明の実施の形態に係る測定試料部３の溶液セルの構成の一例について説明する。
測定試料部３は、上述したように、光散乱計測のためにタンパク質結晶化溶液を収容するための溶液セルを含む部位である。この結晶化溶液セルの部位については、従来技術１の結晶化溶液セルと同様の構成を用いることができる。
具体的には、測定試料部３は、透明導電体薄膜の透明導電体電極３４、３５をそれぞれ形成した２つの平板状電極基板である透明基板３２、３３によって、電気絶縁部材として所定の厚さで平板状（面状）の絶縁スペーサーである電気絶縁部材３９を挟む。そして、電気絶縁部材３９内に、タンパク質結晶化溶液３１を注入し保持する。測定試料部３は、このように、いわゆる「サンドイッチ型」電極構造にて製造することができる。つまり、電気絶縁部材３９と透明基板３２、３３とは、タンパク質結晶化溶液３１を保持する容器になる。
透明基板３２、３３に平板状の電極を用いることで、結晶化溶液中に、ほぼ一様な電場が形成される。これにより、溶液中の生体高分子全体に、効率よく電場を印加できるという効果が得られる。
また、透明基板３２、３３と透明導電体電極３４、３５とを用いることで、前方小角散乱光の測定と解析による電圧印加と結晶化の促進制御／解析が可能となる。
【００２１】
タンパク質結晶化溶液３１は、測定・分析対象のタンパク質結晶化溶液である。タンパク質結晶化溶液３１は、タンパク質と、タンパク質を結晶化するための沈殿剤（結晶化剤）とを含む溶液、或いは、それらを含む各溶液の組み合わせ（混合）である。また、タンパク質結晶化溶液３１には、ｐＨを調整するために、タンパク質の結晶化に適した緩衝液（バッファー）を使用する。
また、タンパク質結晶化溶液３１としては、バッチ法及び蒸気拡散法のいずれのタンパク質結晶化方法に係る試料溶液も用いることができる。
ここで、バッチ法とは、例えば、タンパク質と沈殿剤（結晶化剤）とを混合させたタンパク質結晶化溶液を測定試料部３内に封止して、タンパク質を結晶化させる方法である。また、蒸気拡散法とは、タンパク質含有溶液と沈殿剤（結晶化剤）含有溶液、及び緩衝液等の必要な各溶液を測定試料部３の中に離した状態で注入し封止して、タンパク質を結晶化させる方法である。
【００２２】
透明基板３２、３３は、薄膜の透明導電体電極３４、３５を形成した平板状の透明な基板である。
透明基板３２は、測定試料部３に入射光が入射する側の部材である。また、反対側の透明基板３３は、測定試料部３から透過光が出射され、また散乱光が放射される側の部材である。同じ材料の透明部材で透明基板３２、３３を構成した場合には、測定試料部３において入射側と出射側の区別はなく、どちらから光を入射させてもよい。
透明基板３２、３３の材料としては、入射光側と散乱光放射側で、測定光領域で透過性に優れた光学材料が好ましい。これにより、前方小角散乱測定によって、電圧印加時のタンパク質凝集を測定できる。また、透明基板３２、３３を通して、実体顕微鏡などの光学顕微鏡やルーペ等により、結晶形成状態の光学的観察も可能である。
透明基板３２、３３は、薄い光学ガラス基板（厚さ約０．１〜０．５ｍｍ）を用いることが好適である。透明基板３２、３３として、例えば、２つの薄い光学ガラス板であるＢＫ−７（１８×３２×０．１５ｍｍ3）等を用いることができる。
なお、透明基板３２、３３としては、ガラス基板の他にも、耐熱性の樹脂（高分子、プラスチック）等であっても構わない。化学的に安定なプラスチック材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニリデン、及びポリエチレン等の重合高分子化合物が好ましい。
また、透明基板３２、３３は、所定の波長を透過しないようなフィルターやコーティング等を形成したり貼り付けたりすることもできる。また、偏光板等を形成することもでき、これにより位相差等により、結晶を観察しやすくなるという効果が得られる。
【００２３】
透明導電体電極３４、３５は、透明基板３２、３３の上に形成された透明導電体の薄膜である。透明導電体電極３４、３５は、生体高分子の結晶化溶液へ電圧を印加するための電極として、端子３６、３７を介して電源６に電気的に接続される。これにより、電源６の電圧発生器から供給される所定の直流又は交流の電圧が、タンパク質結晶化溶液３１に印加される。
透明導電体電極３４、３５は、透明導電体として、例えば、無機酸化物である、スズ含有の酸化インジウム（Ｉｎ2Ｏ3：Ｓｎ，ＩＴＯ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化錫（ＳｎＯ2）、酸化チタン（ＴｉＯ2）等を用いることができる。たとえば、スズを添加した酸化インジウム（ＩＴＯ）の薄膜を用いることが好適である。ＩＴＯ膜の酸化物電極自体は、タンパク質結晶化において、結晶の核生成を起こすといった影響が無いため好適である。
透明導電体電極３４、３５としてＩＴＯ膜を用いる場合、例えば、高周波マグネトロンスパッタリング法を用いることができる。この場合、厚さ１０ｎｍ〜５μｍ程度のＩＴＯ膜を用いることができる。膜厚が薄い方が光透過性で有利になるものの、結晶化溶液セルの耐久性等を考慮して最適な膜厚を選択することができる。たとえば、ＲＦ−ＤＣ結合形低圧マグネトロンスパッタ法を用いた場合、厚さ約１００ｎｍ程度のＩＴＯ膜電極を用いることが好適である。このような１００ｎｍのＩＴＯ膜の場合、固有抵抗は、約５×１０-4Ωｃｍで、光透過率は８０％程度以上になる。
透明導電体電極３４、３５は、薄膜の電極を結晶化溶液に直接接触させる。平板の電極をこのように平行に対応して配置することで、印加電圧によってタンパク質結晶化溶液３１内に、効率よく、均一な電場を印加することができる。
なお、透明導電体として、透明性のあるポリチオフェン系やポリピロール系などの導電性高分子も利用できる。
また、透明導電体電極３４、３５は、結晶形成の光学的観察が可能な程度の透過率があればよく、所定の波長を透過させなくてもよい。
【００２４】
端子３６、３７は、透明導電体電極３４、３５から電源６に接続するための金属配線と端子を含む部位である。
この金属配線は、ＩＴＯ膜製造後に、銀粒子ペースト等を使用して端子３６、３７に電気的に接続することができる。
【００２５】
電気絶縁部材３９は、透明導電体電極３４、３５の透明導電体電極に印加する電圧を絶縁するための電気絶縁スペーサー（以下、単に絶縁スペーサーと称す）である。
電気絶縁部材３９の絶縁スペーサーは、結晶化溶液を保持するシール材でもある。すなわち、この電気絶縁部材３９内に形成された溝孔等と、透明基板３２、３３の透明導電体電極３４、３５と絶縁スペーサーとで囲まれた空間が、タンパク質結晶化溶液３１を収容する容器として機能する。
電気絶縁部材３９の溝孔の大きさは、入射光のビームよりも大きくすることが好適である。これは、スペーサーから散乱光が生じると大きなノイズになるためである。
電気絶縁部材３９として、例えばシリコンゴムや各種プラスチックを用いることができる。シリコンゴムを用いると、密着性が良好であり、数週間程度は結晶化溶液からの蒸発を防止できる。
【００２６】
なお、測定試料部３へ前方小角散乱測定のため入射させる入射光としては、平行光、すなわちコリメート光が好ましい。これは、溶液からの散乱光の放射角強度分布を正確に測定するためである。
このため、狭いビームを生成する各種レーザーを用いることが好適である。たとえば、直径約０．７ｍｍ程度の狭いビームを生成するダイオード励起固体レーザー（λ＝４７３ｎｍ、２５ｍＷ）が好適である。
なお、入射光及び透過光の広がり角は、可能な限り低く抑えることが好ましい。
【００２７】
〔タンパク質結晶成長促進方法〕
次に、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶成長促進方法について説明する。
本発明者らは、小角（θsが８°程度以下）の前方光散乱（ＦＬＳ、ｆｏｒｗａｒｄ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）は、溶液が結晶化する際のタンパク質凝集に対して非常に敏感であることを発見した。本発明者らは、この前方小角散乱と電圧印加の制御とを組み合わせると、容易にタンパク質の結晶化促進の制御ができることを見いだし、鋭意実験と観察とを行い本発明を完成させた。
タンパク質の凝集は、タンパク質結晶化の核生成とその後の結晶成長にとって不可欠である。このため、前方小角散乱の測定は、タンパク質の結晶化を特徴づけることができる。
本発明者らは、内部電場印加によるタンパク質溶液の状態の推定に、この前方小角散乱の測定を用いることで、顕著にタンパク質結晶化させるタンパク質結晶化方法を完成させた。
すなわち、本実施形態に係るタンパク質結晶成長促進方法は、内部電場印加によるタンパク質溶液の状態の推定に、前方小角散乱の測定を用いる。これにより、顕著にタンパク質結晶化を促進させることができる。
以下で、図４を参照して、本実施形態のタンパク質結晶成長促進方法の処理の詳細について説明する。
【００２８】
（ステップＳ１０１）
まず、結晶化溶液を調製する。
このステップでは、タンパク質結晶化溶液３１に上述した結晶化させたい生体高分子、例えばタンパク質と、沈殿剤と、バッファーとを所定条件で調製する。この上で、透明導電体電極３５に電気絶縁部材３９を載せた状態で、タンパク質結晶化溶液３１を注ぐ。
そして、測定試料部３にタンパク質結晶化溶液３１を注入した後、蒸発を防止するために、例えばパラフィンオイル等でシールする。なお、液漏れ防止のために２枚の透明基板３２、３３と電気絶縁部材３９との間をシリコングリースやフッ素グリース等でシールすることも好適である。
また、測定試料部３から溶液が漏れ出ないように、スペーサーと基板とを強く密着させ、適宜、留め金具等でクリップすることもできる。
なお、このタンパク質結晶化溶液３１や各種バッファーの測定試料部３への導入について、制御解析部１が、タンパク質結晶化装置Ｘに備えられたマイクロパイプ等の輸液機構等を制御して実現するように構成できる。
【００２９】
（ステップＳ１０２）
次に、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘは、結晶化溶液への電圧の印加を行う。
具体的には、制御解析部１は、測定対象のタンパク質結晶化溶液３１を含む測定試料部３に、電場印加により電源６から所定の交流／直流電圧を印加してタンパク質の結晶化を促進する。
この時間としては、少なくとも数時間程度、特に１００分から１８０分間程度の電圧印加が好ましい。本実施形態では、低電圧を印加するため、電気分解は殆ど起こらず、微細結晶形成等の結晶化への悪影響が最低限に抑えられるという効果が得られる。
【００３０】
（ステップＳ１０３）
次に、タンパク質結晶化装置Ｘは、前方小角散乱測定／解析を行う。
具体的には、レーザー等の入射光を入射したタンパク質結晶化溶液３１の前方小角又は後方小角における散乱光を散乱光検出部５が測定し、制御解析部１に出力する。
制御解析部１は、この測定結果から、タンパク質結晶化溶液からの前方小角散乱光又は後方小角散乱光の放射角度の強度分布（ＳＬＳ）、又はその時間的強度変化（ＤＬＳ）を分析する。これにより、タンパク質結晶化溶液の状態を推定する。
ここでは、１００分から１８０分間程度の時間で電場を印加した際に、凝集についての大きな変化が現われたか否かについて解析をする。この「凝集についての大きな変化」を、以下で、「凝集の遷移」の状態という。この「凝集の遷移」の状態では、顕微鏡等でも確認困難なタンパク質結晶化の核生成が起き、タンパク質結晶化溶液３１の状態が変化していると考えられる。
この「凝集の遷移」の状態を検知するためには、前方小角の散乱角８°付近より小角、特に３°から６°付近の散乱角において、所定強度の散乱光が増加したことを検知する。この所定強度は、例えば、後述の実施例のように、リゾチームのような結晶化の性質がよく分かっているタンパク質の電圧印加と結晶化との関係から求めることができる。
【００３１】
（ステップＳ１０４）
次に、制御解析部１は、散乱強度が変化して、タンパク質結晶化溶液３１の状態が結晶化に向かっているか否か判定する。すなわち、「凝集の遷移」の状態になった場合、Ｙｅｓと判定し、それ以外の場合はＮｏと判定する。
Ｙｅｓの場合、制御解析部１は、処理をステップＳ１０５に進める。
Ｎｏの場合、制御解析部１は、処理をステップＳ１０２に戻す。
【００３２】
（ステップＳ１０５）
この上で、タンパク質結晶化装置Ｘの制御解析部１は、タンパク質結晶化溶液３１の状態が「凝集の遷移」の状態になった場合、電圧の印加を停止して、その旨を図示しない表示部の表示やブザー等で報知する。
この「凝集の遷移」の状態となった後は、下記の実施例で示すように、電場を印加しなくても結晶化が促進されるという効果が得られる。このため、電気分解等によるタンパク質結晶化溶液３１の劣化を最小限に抑えた上で、測定試料部３の結晶化溶液セルを回収できる。また、結晶化を促進するための電圧の印加時間、及び電圧と沈殿剤の最適容量等との関係を最低限の手間で把握できる。
回収した測定試料部３の結晶化溶液セルを放置すると、タンパク質の結晶が成長する。成長した結晶のうち、Ｘ線や中性子線での解析に適した大きさで質の良い結晶を回収可能である。
以上で、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶成長促進方法の処理を終了する。
【００３３】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
まず、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘは、光学顕微鏡等でタンパク質の結晶形成確認を待たずに、電場印加下においてタンパク質の結晶化促進状態を分析できる。すなわち、稀少なタンパク質が溶解した数十μＬ以下の微量なタンパク質結晶化溶液３１に対して、低電圧の印加状態下で、結晶形成の前段階状態にある「凝集の遷移」のような状態を評価することができる。
また、電場の印加によって観察された前方小角散乱の増加は、タンパク質結晶化のための必要条件である。実際に、回収した結晶化溶液セルでは大きな凝集体の形成が起こり、容易に観察することができる。また、この大きな凝集体の形成は、結晶核生成と結晶成長の基本の過程であることが確かである。
つまり、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化促進方法では、準安定領域にあるタンパク質結晶化溶液３１の低電圧印加と前方小角散乱を用いた観察とにより、従来は、多大な労力と時間を要した結晶化条件の探索が効率良く行える。
また、電場に誘発されたタンパク質凝集を前方小角散乱により検出することで、従来は不明であった電場印加によるタンパク質結晶化促進のメカニズムを解明することができる。つまり、電場によるタンパク質の結晶化における好適な解析方法を提供することができる。これにより、タンパク質の結晶化についての詳細を知ることができる。
また、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化方法は、前方小角散乱を用いて、内部電場下のリゾチーム溶液のタンパク質の凝集が観察する。これにより、内部電場印加による「凝集の遷移」の存在を確認することができる。つまり、タンパク質溶液に１００分以上の所定時間の低電圧をかけ、「凝集の遷移」の状態を確認すると、その後のタンパク質結晶化溶液３１は凝集が著しく促進されることが期待できる。
これにより、必要十分な時間だけ電圧を印加することが可能になり、電気分解等の弊害を避けて、確実にタンパク質結晶化促進を行うことができる。
【００３４】
なお、上述の実施の形態においては、生体高分子としてタンパク質の結晶化の例について説明したが、本発明はこれに限られず、各種生体高分子の分子配向化促進等について用いることができる。たとえば、生体高分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、糖質、脂質等について用いることができる。
また、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）のような合成された生体高分子についても用いることができる。
【実施例】
【００３５】
以下で、図面に基づいて本発明を実施例により更に順次説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
【００３６】
（生体高分子のタンパク質結晶化溶液３１の調製）
本発明者らは、前方小角散乱を用いて、内部電場印加での凝集体の生成を示すために、タンパク質のニワトリ卵白リゾチームをモデル・タンパク質として使用した。ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ：以下、単にリゾチームと呼ぶ。）は、結晶化の諸条件が良く調査されている。実際に、リゾチームは、結晶化の諸条件の関係性を図示した「相図」も作成されており（例えば、「Ｗ．Ｉｗａｉ，Ｄ．Ｙａｇｉ，Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｉ．Ｔａｎａｋａ，ａｎｄ  Ｎ．Ｎｉｉｍｕｒａ，"Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｎ  ｅｇｇ−ｗｈｉｔｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｃｒｙｓｔａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐＨ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｓｔａｔｅ"，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．３１２−３１５（２００８）．」を参照）、分析対象として最適なタンパク質である。
本実施例においては、沈殿剤（結晶化剤）として、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む水溶液を用い、ｐＨ値を緩衝液（バッファー）である酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を用いて調製した。
具体的には、リゾチームは、再結晶によって６回精製されたものを、生化学工業株式会社から購入した。リゾチームはそれ以上の精製無しで使用された。また、リゾチーム溶液［ＣHEWL＝９０ｍｇ／ｍＬ（６．３ｍＭ）］と沈殿剤のＮａＣｌ［ＣNaCl＝１５％］（ｗ／ｖ）（２．５６Ｍ）とが５０ｍＭ濃度の酢酸−酢酸Ｎａ緩衝溶液（ｐＨ４．６）を用いて、タンパク質結晶化溶液３１として使用された。各実験においては、２０℃で保存溶液から各タンパク質結晶化溶液３１が別々に調製された。各溶液はフィルター（０．２μｍ孔径）を通し、２０℃において所定比で混合され、調製された。タンパク質結晶化溶液３１の導電率は約１〜５ｍＳ／ｃｍだった。導電率は、マイクロリットル単位の微量溶液を測定できる簡易導電率計により測定された。
その後、それぞれのタンパク質結晶化溶液３１（約１８μＬ）は、透明基板の両方の導電性フィルムと接触して面するように、測定試料部３の絶縁スペーサーの円孔に注がれた。
前方小角散乱測定は、溶液を混合してから５分以内に始められた。
【００３７】
（前方小角散乱の計測）
測定試料部３は、結晶化溶液セルへ電場を印加した状態で、電極を通してタンパク質溶液からの前方小角散乱の正確な測定ができるように、十分に薄く透明に構成した。
電気絶縁部材３９として、円孔（直径約６ｍｍ）のあるシリコンゴム絶縁体シート（厚さ約１ｍｍ）が、２枚のＩＴＯを形成したプレートである透明基板３２、３３の間に挟まれた。
電場を印加する実験は、すべて正弦波で低周波、７．１Ｖ／ｃｍの平均電場を与える２０Ｈｚの実効値０．７１Ｖ（Ｖｐｐ＝２．０Ｖ）のＡＣ電圧を使用した。
この印加電圧は必ずしも結晶化のための最適化された条件ではないが、結晶化促進に有効であると分かった。
泡の存在によって確認できる溶液の電気分解は、観察されなかった。なお、電気分解は、結晶化を妨害する溶存物質の迅速な濃度変異を誘発するため、好ましくない。
対照実験用に準備した測定試料部３（コントロール）は、電場を印加した測定試料部３と同条件で、電場を印加しないように調製された。
すべての実験で、ＮａＣｌとリゾチーム溶液は、既知の結晶化状態図による準安定領域中になるよう使用された。
電場印加を行った前方小角散乱測定の実験は、すべて空調のある２０℃プラスマイナス０．５℃の部屋で、上述のセット・アップにより行なわれた。
【００３８】
（リゾチーム結晶化溶液の静的光散乱（ＳＬＳ）分布）
図５を参照して、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘによって測定された静的光散乱（ＳＬＳ）分布についての実施例について説明する。
図５は、タンパク質結晶化溶液３１としてリゾチーム結晶化溶液を用いた静的光散乱分布のグラフである。
縦軸は、散乱光強度として取得したＩs値を、入射モニター光検出部（図示せず）による入射モニター光の強度Ｉ0で割って得られたものであり、すなわち、Ｉs／Ｉ0である。横軸は、前方小角散乱角の角度θs（°）を示す。印加電圧ありのサンプルと、印加電圧の無いサンプルに対する静的光散乱（ＳＬＳ）パターン（Ｉs−θsカーブ）を示す。
【００３９】
この分析におけるタンパク質結晶化溶液３１として、リゾチーム濃度２０ｍｇ／ｍＬ、沈殿剤（結晶化剤）ＮａＣｌ濃度を３．０％（ｗ／ｖ）とし、溶液セルにリゾチーム結晶化溶液を封止したバッチ法の測定試料を用いた。
なお、ここで使用した結晶化溶液のリゾチーム及び結晶化剤の濃度条件は、相図によると、リゾチームの結晶作製に適する準安定条件の濃度領域に位置し、バッチ法では、核形成となる塵等や外部刺激（磁場、光、電場や音波等）によって結晶が形成・成長できる溶液状態である。
【００４０】
この実施例では、同じ構造で寸法も同じ２つの溶液セルを用意し、同一濃度条件のタンパク質結晶化溶液をほぼ同時刻にリゾチーム結晶化溶液を封止した。
そして、所定の時間経過後に本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘを用いて、それぞれＳＬＳ分布を測定した。
一方の溶液セルにおいては、電圧発生器のファンクションジェネレータで発生させた周波数２０Ｈｚ、実効値０．７１Ｖ（最大電圧値１Ｖ）の正弦波交流電圧を透明導体膜の透明導体電極に約３００分間印加した状態においてＳＬＳ分布を測定した。
もう一方の溶液セルでは、電圧を印加せずにそのまま静置し、約３６０分後にＳＬＳ分布を測定した。
【００４１】
タンパク質結晶化溶液３１を収容した溶液セルには、半径１０ｍｍのＢＫ−７ガラス製の半円柱形プリズムの側面平面部に、ガラス材料と同じ屈折率の屈折率整合オイルで貼り付け、測定試料を装着した半円柱形プリズムをθ回転ステージ上に設置した。
これに、焦点距離１３０ｍｍの円筒面平凸レンズ（シリンドリカルレンズ）と半円柱形プリズムとを用いて、球面部側面側からタンパク質結晶化溶液３１へ、波長４７３ｎｍの青色レーザ光を入射した。
この上で、タンパク質結晶化溶液からの散乱光を、透過光の方向（前方）からの散乱角度２０°から３°までの前方小角散乱角の範囲で測定した。
【００４２】
図５のリゾチーム結晶化溶液の散乱光強度の散乱角依存性によると、明らかに電圧印加したリゾチーム結晶化溶液の散乱光が、電圧印加せずにほぼ同一時間、静置した溶液の散乱光に比べて、その散乱光強度が著しく大きかった。
電圧印加無しの結晶化溶液でも、特に、散乱角８°付近より小角、特に３°から６°付近の散乱角において、ある程度の強度の散乱光が計測されているが、その強度は比較的弱かった。これに対し、電圧印加の結晶化溶液は、非常に大きな散乱光強度を示した。
このように低電圧（交流、実効値で１Ｖ未満）にもかかわらず、コントロールと比較した場合、散乱光強度は相当に高められた。ＳＬＳ信号は、特に１０°未満の前方小角で高くなっていた。
より大きなタンパク質凝集体は強度のＳＬＳを誘発した。電場の無い溶液のＳＬＳでは８°未満のθsで、散乱光強度が増加した。しかし、電場を印加した溶液に比べて、散乱光強度は低いままであった。ＳＬＳカーブにタンパク質凝集体の熱変動に起因する任意の小さな変異が現われた。これは、動的光散乱（ＤＬＳ）と強度の関係があった。
つまり、前方小角散乱データにより、内部の電場が結晶化溶液のリゾチームの凝集を促進することに対する影響が明らかとなった。
【００４３】
すなわち、電圧印加した場合、リゾチーム結晶化溶液中のリゾチームの凝集状態が大きく異なり、散乱光強度が顕著に増大していることから、リゾチームの凝集体形成や結晶核形成の促進等の結晶化が著しく進行していると判定できる。
したがって、この実施例により、タンパク質結晶化装置Ｘによって、タンパク質結晶化の状態分析に適した、前方小角散乱における散乱光の計測から、電場印加によるタンパク質結晶化の促進状態を高感度かつ高精度に測定できることがわかる。
なお、電圧印加したリゾチーム結晶化溶液の散乱光の曲線には、特に、散乱角１０°付近よりも小角において、変動が計測されている。この変動は、散乱光測定の際の迷光、及び散乱光計測の際の電気的ノイズ等に因るものではなく、結晶化溶液からの散乱光自身の揺らぎ、すなわち、溶液中のリゾチーム凝集体や微結晶等の散乱体の熱的揺らぎが原因で生じたものであった。
【００４４】
一方、電圧印加無しの状態で静置した溶液の散乱光曲線にも、このような小さな変動（ゆらぎ）が見られるが、電圧印加した溶液に比べそれらの変動も小さくなっている。このため、所定値を閾値として用いて、前方小角散乱の散乱強度からタンパク質の結晶化が促進されているか判定可能である。
検出部の光検出器として、高感度の光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて散乱光を検出し、ストレージ型（波形記録型）のオシロスコープでその散乱光による増幅電圧信号を観測したところ、散乱光が、数十Ｈｚ程度以下の低周波領域において時間的に複雑に揺らいでいることが分かった。この現象は、動的光散乱（ＤＬＳ）である。静的光散乱の強度が大きくなる、前方または後方の小角において、このようなＤＬＳも増大し、結晶化溶液のＤＬＳを感度良く測定でき、従って、タンパク質の凝集状態に関するより詳細な情報を得ることも可能である。
一方、結晶化溶液の散乱光強度が小さい、１２°〜２０°の比較的大きな散乱角では、散乱光の揺らぎは小さい。このため、この揺らぎを良好なＳＮ比で測定するには、低ノイズの高性能増幅器等が必要であり、微小計測技術を必要とする。
【００４５】
（電圧印加から適宜の時間経過後の前方小角散乱光の測定）
次に、図６を参照して、電圧印加から適宜の時間経過後の前方小角散乱光を測定した実施例について説明する。本実施例では、低電圧を印加して時間が経過した場合のイン・サイチュ（その場）前方小角散乱測定を行った。
すなわち、図６は、リゾチーム結晶化溶液に電圧を印加した状態において、本発明の実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘによって、電圧印加から適宜の時間経過後に、それぞれ測定されたＳＬＳ分布のグラフである。使用したリゾチーム結晶化溶液の濃度条件は、上述の実施例と同様に、リゾチーム濃度が２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ濃度が３．０％（ｗ／ｖ）であった。また、結晶化溶液に印加した電圧も同条件、すなわち、周波数２０Ｈｚ、実効値０．７１Ｖ（最大電圧値１Ｖ）の正弦波交流電圧であった。
結果として、ＳＬＳ強度はリゾチーム溶液内に電圧を加えた時間に依存して増加した。大きな散乱角（例えば、θs＝２０°）では、初期のＳＬＳカーブと比較すると、散乱強度の差異は小さかった。しかし、より小さな角度では、差異がより明白になった。２７０分後に、ＳＬＳ強度及び変動の増加は顕著だった。これらから、タンパク質凝集体が内部の電場により大きくなっていたことが分かる。
より具体的に説明すると、リゾチーム結晶化溶液に電圧を印加して１００分の経過時間では、未だ結晶化溶液の散乱光分布にはあまり変化が見られないが、１８０分の経過後には、結晶化溶液の散乱光強度が増大し、その後の経過時間２７０分及び３２０分では散乱光の増大が著しくなっている。また、特に、経過時間２７０分及び３２０分では、結晶化溶液からの散乱光自身の揺らぎも顕著に増大していることから、リゾチームの凝集体形成が進行している様子が判る。
結晶化溶液への電圧印加時間が１００分間では、溶液の散乱光があまり変化していないことから、ある程度の電圧印加時間、例えば１００分程度から１８０分程度以上の時間を経て、溶液中におけるリゾチームの状態の変化、例えば凝集体形成や微結晶形成の促進などの結晶化の進行が起こることが容易に推定できる。
【００４６】
（静的光散乱強度の平均値と経過時間の関係）
次に、図７を参照して、上述の実施例におけるリゾチーム結晶化溶液の静的光散乱強度の平均値と経過時間の関係についての実施例について説明する。
図７は、リゾチーム濃度２０ｍｇ／ｍＬ及び３０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ濃度３．０％（ｗ／ｖ）のリゾチーム結晶化溶液に対し、上述の実施例と同様に電圧を印加した際の、ＳＬＳ強度の時間依存性を示すグラフである。図７の横軸は、結晶化溶液に電圧を印加して経過した時間を示している。また、図７の縦軸は、静的光散乱強度の平均値を散乱光強度の値として示している。この静的光散乱強度の平均値は、上述の図６のようなリゾチーム結晶化溶液の静的光散乱分布（θs−Ｉs）を基に、散乱角θsを波数ベクトルｑに変換し、ｑ−Ｉsのデータにおいて、測定範囲のｑに関して散乱光強度Ｉsを平均した値である。この値は、各溶液試料の静的光散乱強度を相対的に簡単に比較できる指標となる。
図７に示すように、リゾチーム濃度２０ｍｇ／ｍＬ及び３０ｍｇ／ｍＬとも、リゾチーム結晶化溶液に電圧印加し始めてからの経過時間に対し、経過時間１００分程度までは、溶液の散乱光強度はほとんど変化しない。しかしながら、継続して電場を印加すると、タンパク質の凝集についての大きな変化、つまり「凝集の遷移」がｔ＝１００分付近で現われた。その後、散乱光強度は単調に増加した。３０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液は、２０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液より散乱光強度の上昇が早い。
このことから、電圧印加によるタンパク質凝集体形成の促進は、時間の経過のみでは進行しないことが分かる。つまり、結晶化溶液に電圧印加してすぐにタンパク質の凝集体形成が促進されるのではなく、むしろタンパク質の凝集体形成や結晶核形成には、ある程度の電圧印加の時間、例えば、１００分間程度から１５０分間程度以上が必要であった。したがって、低電圧の内部電場印加によるタンパク質結晶化は、少なくとも１００分程度以上の時間を要する。
【００４７】
また、準安定域でリゾチーム溶液の濃度がより高いと、より大きな前方小角散乱を示し、結晶化の可能性がより高くなることも分かった。実際に電圧を印加した際、３０ｍｇ／ｍＬの溶液は、２０ｍｇ／ｍＬの溶液よりも早く視認できるリゾチーム結晶が現われた。リゾチーム濃度から、この差異は容易に理解できる。
本実施の形態に係るタンパク質結晶化装置Ｘでは、入力電力が非常に低いため、電圧印加によって誘発された溶液の温度増加が、タンパク質結晶化に影響を及ぼすことが殆どない程小さいことに注目すべきである。
【００４８】
（電圧印加停止後のタンパク質結晶化）
最後に、図８を参照して、凝集を促進するのに十分な時間、電圧が印加されて止められた後の、タンパク質凝集プロセスについての実施例について説明する。
図８は、リゾチーム濃度が２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ濃度が３．０％（ｗ／ｖ）のタンパク質結晶化溶液３１についての光散乱強度の典型的な変化の結果を示すグラフである。図８において、「０ｍｉｎ」は、溶液に電圧を加える前に測定されたタンパク質結晶化溶液３１のＳＬＳ強度を示す。また、「３３０ｍｉｎ」は、３３０分間、上述の例と同様の電圧を印加した同一のタンパク質結晶化溶液３１の散乱光強度である。また、「１，３４０ｍｉｎ」は、３４０分後に電圧印加を停止した後、１，３４０分後に測定された同一のタンパク質結晶化溶液３１の散乱光強度である。
図８の結果によれば、前方小角の散乱光強度は、タンパク質結晶化溶液に電場を加えると高められる。その後、印加した電場が切られても、この散乱光強度は増加し続ける。
これは、電圧印加によりタンパク質結晶化溶液が「凝集の遷移」の状態を経て、形成されたタンパク質凝集体が、電場無しで成長し続ける能力があることを示す。
逆に、印加電圧が「凝集の遷移」の状態になる前に止められた場合、ＳＬＳは印加電圧無しでは増加しなかった（図示せず）。
したがって、電場印加法では、電場が制限された時間のみ印加されても、タンパク質結晶の形成を促進する。
【００４９】
以上のように、本実施例において、タンパク質結晶化装置Ｘを使用して、薄型で小型の低電圧駆動の結晶化溶液セルである測定試料部３を用いて、高精度のレーザ光散乱計測を行うことで、偶然に依らないタンパク質の結晶化促進が可能となった。
具体的に、測定試料部３のタンパク質結晶化溶液セルを使用して、ニワトリ卵白リゾチームの結晶化溶液に電場を印加した状態で、開発のタンパク質結晶化分析装置で測定したところ、電場印加が結晶化溶液に与える明確な効果が見られた。
ここで、測定試料部３の溶液セルは、薄型かつ小型であるため、微量の溶液を収容して、タンパク質結晶化溶液３１からの散乱光の高精度計測を行うことができる。
すなわち、タンパク質結晶化装置Ｘを使用して、電場印加の状態下で結晶化溶液の光散乱を効率良く計測し、電場印加下で結晶化溶液状態を分析できる。よって、電場印加による結晶化促進の各種パラメータの最適化に資することができ、良質な結晶を容易に得ることが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、タンパク質結晶化溶液の結晶化を効率的に促進／分析する方法及び装置を提供するため、産業上利用することができる。
【符号の説明】
【００５１】
１  制御解析部
３  測定試料部
５  散乱光検出部
６  電源
３１  タンパク質結晶化溶液
３２、３３  透明基板
３４、３５  透明導電体電極
３６、３７  端子
３９  電気絶縁部材
Ｘ  タンパク質結晶化装置
【図１】
0005858274.tif 000002
【図２】
0005858274.tif 000003
【図３】
0005858274.tif 000004
【図４】
0005858274.tif 000005
【図５】
0005858274.tif 000006
【図６】
0005858274.tif 000007
【図７】
0005858274.tif 000008
【図８】
0005858274.tif 000009