(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アレルゲンタンパク質を含むアレルゲンの天然源を抽出して抽出物を生成する工程、
ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程であって、前記抽出物の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シュードアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および透析濾過からなる群から選択される１つまたは複数を含む、工程、
ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程であって、前記精製変性抽出物はタンパク質を含み、単独で全タンパク質の６０％（ｗ／ｗ）以上となるタンパク質はなく、全タンパク質が前記精製変性抽出物の乾燥重量の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）に相当する工程、
ｄ）前記精製変性抽出物を加水分解してアレルゲン加水分解物を生成する工程、
ｅ）前記アレルゲン加水分解物を精製して１０，０００Ｄａ超の分子量を有するペプチドおよび１，０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドを除去して、７０％のペプチドが１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａである精製加水分解物を得る工程、
を含む、精製アレルゲン加水分解物の製造方法。
【請求項２】
上記工程ｂ）において、少なくとも１つの精製工程は上記工程ｃ）として変性剤を含む溶液を用いて行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法により得られる精製アレルゲン加水分解物。
【請求項４】
免疫寛容を誘導するための医薬組成物および／または食品組成物の調製のための請求項３に記載の精製アレルゲン加水分解物の使用。
【請求項５】
請求項３に記載の精製アレルゲン加水分解物を含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項３に記載の精製アレルゲン加水分解物を含む食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然アレルゲンの抽出物の製造方法、これら抽出物からのペプチド、およびこの新たな方法により得られるアレルゲン抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的なアレルゲンは花粉、ハウスダスト、ダニ、カビ、薬物、食物、ならびに動物の毛および鱗屑である。
【０００３】
最も一般的なアレルギー性疾患は鼻炎、喘息、およびアトピー性皮膚炎である。アレルギー性喘息は慢性炎症性疾患である。アレルギー性疾患の対症療法は抗ヒスタミン薬、β−アンタゴニスト、および副腎皮質ステロイドの使用により行われる。
【０００４】
さらに、いわゆる「特異的」免疫療法は減感作に基づいている。典型的には、患者は特定の原因アレルゲンを皮下注射により投与される。治療は少ないアレルゲン投与量から開始し、投与量を増加させる。治療は典型的には数年間続けられる。この種の治療には患者の完全な薬剤服用順守を要するという問題があり、また患者が重度のアナフィラキシー反応を被りうるという安全性の理由から問題視されてきた。
【０００５】
反復して皮下注射する方法に加え、経口減感作法もある。
【０００６】
米国特許第４，８２２，６１１号は、アレルゲンでの経口処置を含むアレルギー治療法を開示している。市販の「バルク」のアレルゲン抽出物を使用すると、バッチごとのばらつきや、異なる製造者由来の抽出物間における差異が見られることを記載している。これらの抽出物の調製については記載されていない。
【０００７】
英国特許第１ ２４７ ６１４号は、アレルゲンの抽出方法を開示している。この方法の目的は、アレルゲンの抽出可能な全ての成分を含めることにより、より完全で効果的なアレルゲン抽出物を得ることである。
【０００８】
米国特許第５，７７０，６９８号は、アレルゲンとして活性なタンパク質の抽出物を精製する方法を開示している。図２のスペクトルは２８０nmのピークを示していない。これは、該抽出物が非タンパク質不純物を相当量含んでいることを意味する。国際公開第９９／２２７６２号も同様な方法を開示しており、従って、この産物も大量の非タンパク質不純物を含んでいる。
【０００９】
一方、単一のエピトープに基づいた高度に特異的な調製物を開発する傾向もある。例えば、国際公開第００／５８３４９号は、チロシン／アルギニンペアからペプチド結合２個分離れて位置するロイシンを含む、単離精製されたペプチドを開示している。これらのペプチドは、特にイヌにおけるイヌ科アレルギーを対象とした、治療または予防を行うための医薬組成物の調製に用いられうる。
【００１０】
一方では、特異的に同定された単一のアレルゲン分子を精製する方法が用いられている。また、一方では、なるべく完全なアレルゲン抽出物を製造しようと試みられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，８２２，６１１号
【特許文献２】英国特許第１ ２４７ ６１４号
【特許文献３】米国特許第５，７７０，６９８号
【特許文献４】国際公開第９９／２２７６２号
【特許文献５】国際公開第００／５８３４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記の選択肢のうちの最初のものにおいては、アレルゲン調製物が、決定された患者において免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を誘導するような関連エピトープを欠いているということが常にありうる。二番目のものにおいては、バッチごとにばらつくという欠点、およびＤＮＡ分子、炭水化物、その複合体の脂質類等の、免疫反応を誘発しうる化合物が存在するという欠点を有する。
【００１３】
本発明の一つの目的は、従来技術の欠点の少なくとも一部を克服することであり、特に、粗アレルゲン抽出物と比較してアレルギー性反応を誘発する能力が有意に少ないがＴ細胞を刺激しうる、天然アレルゲンからの抗原を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この問題は、アレルゲン抽出物のタンパク質含有部分のほとんどを含みながらも、核酸類、脂質類、糖類等の非タンパク質成分が少ない、好ましくは極めて少量しか含まない、アレルゲン抽出物の調製方法を提供することにより解決される。
【００１５】
本発明により調製される抽出物は従来技術の抽出物よりも優れており、特に本発明により調製される抽出物は再現性のあるタンパク質組成を示しながらも単一のエピトープまでには精製されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＩｇＧウェスタンブロットによる免疫反応性。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗タンパク質抽出物、レーン３：精製アレルゲン変性抽出物。メンブレンは５％ＢＳＡおよび３％ミルクでブロックした。患者の血清は１／２５０に希釈した。ＩｇＧの結合は、１／２，５００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰで検出し、ＴＭＢ基質により明らかにした。アレルゲン１：±６１〜５４ｋＤａ、アレルゲン２：±３６〜３１ｋＤａ。
【図２】ＩｇＥウェスタンブロットによる免疫反応性。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗タンパク質抽出物、レーン３：精製タンパク質。メンブレンは５％ＢＳＡおよび３％ミルクでブロックした。患者の血清は１／５に希釈した。ＩｇＥの結合は、１／１０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＥ  ＨＲＰで検出し、ＴＭＢ基質により明らかにした。アレルゲン１：±６１〜５４ｋＤａ、アレルゲン２：±３６〜３１ｋＤａ。
【図３】ＳＥＣ  Ｇ２５溶出プロファイルの排除ピーク。カラム体積／試料体積比は１２であった。樹脂は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１．５Ｍ  尿素、ｐＨ８．０を用いて流速９ｍｌ／分で平衡化した。溶出を、２８０ｎｍの吸光度で観察した。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイル。４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製アレルゲン変性抽出物。染色はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて行った。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質およびペプチドプロファイル。４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製アレルゲン変性抽出物（１３μｇ）、レーン３：加水分解物（１３μｇ）。染色はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて行った。
【図６】Ｇ５０  ＳＥＣ溶出プロファイル。カラムを尿素  ２Ｍ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ３．０を用いて平衡化した。流速は１５ｍｌ／分であった。カラム体積／試料体積比は１０であった。溶出を、２８０ｎｍの吸光度で観察した。
【図７】ＨＰＬＣ分析のための検量線。１０μｌの以下の標準物質（１ｍｇ／ｍｌ）をＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラム上に注入した：１．ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、２．β−ラクトグロブリン（１８．５ｋＤａ）、３．チトクロームＣ（１２ｋＤａ）、４．グルカゴン（３．５ｋＤａ）、５．１ｋＤａ合成ペプチド。
【図８】サイズ排除ＨＰＬＣプロファイル。カラム：ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ社）。溶出バッファー：Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ−ＳＤＳ  ０．５％（ｗ／ｖ）（ｐＨ６．８）。流速１ｍｌ／分。２１４ｎｍにおいて検出。１０μｌの試料を注入した。１０ｋＤａ〜１ｋＤａの区間の曲線の下の面積を用いて目的のペプチドの割合を算出した。
【図９】花粉由来産物のアレルゲン性特性。花粉アレルギーのボランティアからの血液試料を、花粉粗抽出物、花粉精製タンパク質および花粉精製ペプチドのいずれかの濃度を増加させて（０、１、１０、１００および１０００ｎｇ／ｍｌ）インキュベートした。ｇｐ５３タンパク質発現をフローサイトメトリーにより、ＩｇＥ−陽性白血球をゲーティングして測定した。結果は活性化細胞中のｇｐ５３陽性細胞の％で表す（２回の定量の平均±偏差）。
【図１０】花粉タンパク質および花粉ペプチドによるヒトＰＢＭＣ増殖の刺激。花粉アレルギーのボランティアから精製したヒトＰＢＭＣを、５日間、３７℃において、濃度を増加（１０、３０および９０μｇ／ｍｌ）させた花粉タンパク質または花粉ペプチドの存在下、インキュベートした。［3Ｈ］−チミジンを細胞培養物に１６時間添加し、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを液体シンチレーションの原理を利用してベータカウンターで測定した。結果は５回の測定の平均値で表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のアレルゲン抽出物を製造するための方法は、
ａ）アレルゲンタンパク質を含むアレルゲンの天然源を抽出して抽出物を生成し、
ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成し、
ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程
を含んでおり、前記精製変性抽出物はタンパク質を含み、合わせて全タンパク質の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を構成する最も豊富な（ｗ／ｗ）タンパク質群は少なくとも２種のタンパク質であり、全タンパク質が前記精製変性抽出物の乾燥重量の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）に相当する。
【００１８】
この方法を方法Ｉと呼ぶ。
【００１９】
従来技術の方法とは対照的に、本発明の方法により、抽出物を単一のペプチドまたはタンパク質に精製することなく、主にタンパク質を含むアレルゲン抽出物が製造される。
【００２０】
従来技術の産物とは対照的に、本発明の産物は以下の利点を有する：
・タンパク質以外の免疫原性物質が実質的に除去されている
・この天然アレルゲン抽出物はＴ細胞を刺激することができるが、即時型アレルギー反応（好塩基球の活性化、マスト細胞の脱顆粒）を誘発する能力が低い。
【００２１】
出発原料としては、様々な天然に存在するアレルゲンを用いることができる。典型的な天然原料はミルク、毒液、卵、雑草、牧草、樹木、灌木、花、野菜、穀物、菌類、果物、液果、ナッツ、種子、豆、魚類、甲殻類および／または貝類（ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ）、海産物、肉類、香辛料、昆虫、ダニ、カビ、動物、ハトダニ（ｐｉｇｅｏｎ  ｔｉｃｋ）、蠕虫、軟質珊瑚、動物の鱗屑、線虫、パラゴムノキ、およびこれらの混合物である。
【００２２】
材料の抽出後、抽出物を精製して糖類、脂質類、核酸類等の非タンパク質成分を除去する。典型的には、いくつかの異なるタンパク質が精製抽出物のタンパク質画分に存在する。
【００２３】
従来技術においては、１種のタンパク質が精製され、他の残りのタンパク質は「不純物」である。
【００２４】
これに対し、タンパク質群を合わせて精製することが本発明の目的である。精製抽出物中のタンパク質群の相対的な量はＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて濃度測定をする方法等により容易に測定される。
【００２５】
タンパク質総重量の６０％において、少なくとも２種類の最も主要なタンパク質を組み合わせる必要がある：すなわち単独で全タンパク質の６０％（ｗ／ｗ）以上となるタンパク質はない。より好ましくは、全タンパク質の６０％は少なくとも３種の主要なタンパク質により、好ましくは少なくとも４種の主要なタンパク質により、より好ましくは少なくとも５、６、７、８、９または１０種のタンパク質により構成される。
【００２６】
例えば、次のタンパク質が存在する：
タンパク質１：２７％
タンパク質２：１３％
タンパク質３：３４％
タンパク質４：１９％
タンパク質５：１７％
【００２７】
合わせて少なくとも６０％（約６０％以上）を構成する最も主要なタンパク質群はタンパク質３＋１（３４＋２７＝６１％）である。
【００２８】
さらに、精製抽出物の総タンパク質含有量は該精製抽出物の少なくとも６０重量％、好ましくは含有量は少なくとも７０重量％または８０重量％、より好ましくは９０重量％である。
【００２９】
抽出は好ましくは水溶液を用いて行われる。適した塩としては炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３０】
さらに、多くの他の抽出法とは対照的に、抽出媒体の量は比較的多いことが好ましい：すなわちアレルゲンの天然源の少なくとも２０倍の重量、好ましくは１００倍以上の重量である。
【００３１】
抽出物の精製は次のうちの１つまたは複数により行ってもよい：
・イオン交換クロマトグラフィー工程（陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーを含む）
・サイズ排除クロマトグラフィー工程（ゲル濾過とも呼ばれる）
・沈殿工程
・疎水性相互作用クロマトグラフィー工程
・シュードアフィニティー（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー、ならびに／または
・透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
【００３２】
ある好ましい態様においてはイオン交換クロマトグラフィーが用いられ、ここで陽イオン交換体の場合、ローディング溶液は、該陽イオン交換体の酸性官能基のｐＫａと抽出物中のタンパク質のうち最も低いｐＫａを有するタンパク質のｐＫａとの間のｐＨを有する。陰イオン交換体の場合、該ｐＨは、該陰イオン交換体の塩基性官能基のｐＫａと抽出物を構成するタンパク質のうち最も高いｐＫａを有するタンパク質のｐＫａとの間である。
【００３３】
この方法により、全てのタンパク質がイオン交換体に結合するが、中性の不純物およびイオン交換樹脂と同一の電荷を有する不純物は除去される。
【００３４】
ある好ましい態様において、少なくとも１つの精製工程は、１種または複数種の界面活性剤および／または変性剤を含む溶液を用いて行われる。界面活性剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性であってよい。適した変性剤は、カオトロピック剤、還元剤およびこれらの混合物である。適した変性剤は、例えば尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノールである。尿素の適した濃度は３Ｍ以上、好ましくは４Ｍ以上である。グアニジニウムの適した濃度は好ましくは２Ｍ、好ましくは３Ｍ以上である。エチレングリコールおよび／またはイソプロパノールの適した濃度は５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上であり、２０重量％以下である。
【００３５】
一部の例では、本発明の方法Ｉによる精製抽出物の製造で十分である。この種類の抽出物をアレルギー性疾患のｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断、予防的および治療的処置を行うために用いてもよい。本発明のさらなる態様は、方法Ｉによる抽出物、または任意の他の原料由来の抽出物のいずれかからアレルゲン加水分解物を製造するための方法である。抽出物が方法Ｉ以外の任意の他の精製アレルゲン原料に由来する場合、消化性を改善するために変性の予備工程が必要である。
【００３６】
前記方法（方法ＩＩ）は、以下の工程を含む
ａ）変性アレルゲンを加水分解してアレルゲン加水分解物を生成し、
ｂ）前記アレルゲン加水分解物を精製して１０，０００Ｄａ超の分子量を有するペプチドおよび１，０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドを除去して、７０％、より好ましくは８０％のペプチドが１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａである精製加水分解物を得る。
【００３７】
これにより得られた産物の利点は、ペプチドが変性タンパク質の消化産物であることである。特定サイズへの調整により、これらは即時型アレルギー反応を誘発する能力が少なく、また炎症誘発性反応を誘発する能力も少ない。
【００３８】
必要な場合は、好ましくはカオトロピック剤、還元剤またはこれらの混合物の存在下で変性が行われる。適したカオトロピック剤は、例えば尿素および塩化グアニジニウムである。典型的な還元剤は例えばジチオストレイトール、β−メルカプトエタノール、チオ−グリセロールおよびこれらの混合物である。
【００３９】
加水分解工程は典型的には酵素により行われる。適した酵素は例えばペプシン、トリプシン、キモトリプシンである。この加水分解工程もカオトロピック剤、好ましくは尿素または塩化グアニジニウムの存在下で行われうる。加水分解過程では尿素および塩化グアニジニウムの濃度は４Ｍ未満、好ましくは３Ｍ未満であるべきである。
【００４０】
方法ＩＩの工程ｂ）において、１０，０００Ｄａ超または１，０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドは除去される。
【００４１】
従って、精製加水分解物のペプチドは、１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ分子量を有するペプチドを含む。長いペプチドまたは短いペプチドを除去するための適した方法は限外濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーである。このサイズ排除クロマトグラフィーも、カオトロピック剤、例えば尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノールおよびこれらの混合物の存在下で行われてもよい。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法Ｉにより得ることができるアレルゲン抽出物である。典型的には、この抽出物においても、合わせてタンパク質全体の少なくとも６０重量％を構成する、重量基準で最も主要なタンパク質群は、少なくとも２種のタンパク質、好ましくは少なくとも３もしくは４種のタンパク質、またはより好ましくは少なくとも５、６、７、８、９もしくは１０種のタンパク質である。純度は光学濃度２６０nm：光学濃度２８０nmの比が１より小さく、好ましくは０．９より小さく、より好ましくは０．７５〜０．９の間であることにより確かめられる。
【００４３】
さらなる態様は、方法ＩＩにより得ることができるアレルゲン加水分解物である。これは、以下のために用いることができる。
・アレルギー性疾患のｉｎ  ｖｉｖｏ診断：プリック試験、皮内注射、結膜試験、嗅ぎ（ｓｎｉｆｆ）試験および吸入試験
・アレルギー性疾患のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断：ＥＬＩＳＡキットまたは試験に用いられる標準物質
・アレルギー性疾患の予防的処置および治療的処置：脱感作／減感作療法および免疫反応調節のための、アジュバントと組み合わせた／組み合わせないワクチン
【００４４】
本発明のアレルゲン抽出物は、免疫寛容を誘導する医薬組成物および／または食品組成物の調製に使用できる。免疫寛容の誘導はアレルギー反応を治療または予防することに利用できる。
【００４５】
本発明のさらなる態様は本発明のアレルゲン抽出物を完全型または加水分解型のいずれかで含む医薬組成物である。さらに、医薬組成物は以下の物質のうち１種以上を含んでいてもよい：ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド一リン酸、核酸、ペプチド核酸、ヌクレオシドもしくはその類似体、免疫抑制性サイトカイン、免疫プロテアソームの発現を誘導する化合物、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３もしくはその類似体、リポ多糖類、エンドトキシン、熱ショックタンパク質、ＮＡＤＰＨ−チオレドキシン還元酵素もしくはＮＡＤＰ−チオレドキシン還元酵素のいずれかと組み合わせたチオレドキシン、ジチオスレイトール、サルブタモール等のアドレナリン受容体アゴニスト、ブトキサミン等のアドレナリン受容体アンタゴニスト、接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元型Ｌ−グルタチオン）、アルファ−２−マクログロブリン、Ｆｏｘｐ３遺伝子発現の誘導因子、フラボノイド、イソフラボノイド、プテロカルパノイド（ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎｏｉｄｓ）、レスベラトロール等のスチルベン、タキキニン受容体アンタゴニスト、キマーゼ阻害剤、ＣｐＧもしくはＭＰＬのようなワクチンアジュバントまたはザイモサンのような寛容原性アジュバント、ベータ−１，３−グルカン、制御性Ｔ細胞誘導因子、腸管粘膜内層に粒子を付着させるための植物レクチン等の粘膜付着剤、亜鉛、亜鉛塩、多糖類、ビタミン、および細菌溶解物。
【００４６】
天然アレルゲン源により、前記組成物は、花粉アレルゲン、ミルクアレルゲン、毒液アレルゲン、卵アレルゲン、雑草アレルゲン、牧草アレルゲン、樹木アレルゲン、灌木アレルゲン、花アレルゲン、野菜アレルゲン、穀物アレルゲン、菌類アレルゲン、果物アレルゲン、液果アレルゲン、ナッツアレルゲン、種子アレルゲン、豆アレルゲン、魚類アレルゲン、甲殻類および／または貝類アレルゲン、海産物アレルゲン、肉類アレルゲン、香辛料アレルゲン、昆虫アレルゲン、ダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物アレルゲン、ハトダニアレルゲン、蠕虫アレルゲン、軟質珊瑚アレルゲン、動物の鱗屑アレルゲン、線虫アレルゲン、パラゴムノキのアレルゲンから選択されるアレルゲンを含んでいてもよい。
【００４７】
好ましい態様において、前記医薬組成物は経口投与用、舌下ドラッグデリバリー用、または経腸ドラッグデリバリー用に調製される。
【００４８】
本発明の方法をさらに以下の限定されない実施例により例示する。
【実施例】
【００４９】
実施例１：抽出
１％（ｗ／ｖ）花粉（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ、ＡＬＬＥＲＧＯＮ社）を炭酸水素ナトリウム（１２．５ｍＭ）に加え、２時間、撹拌下でインキュベートした。次に、セライト（ＡＣＲＯＳ社）を２％（ｗ／ｖ）添加し、０．２μｍフィルターを通すことにより、清澄化および濾過した。この試料を粗抽出物とする。
【００５０】
抽出物中におけるアレルゲンの存在を花粉アレルギー患者の血清を用いたウェスタンブロットにより分析した。ＩｇＧおよびＩｇＥエピトープは抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＥ抗体により可視化した。
【００５１】
図１および図２に示すとおり、前記抽出物中には２種の主要なアレルゲンが存在する。
【００５２】
前記粗抽出物をｐＨ３．０まで酸性化し、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％、ｖ／ｖ）を添加した。この試料を酸性化抽出物とする。
【００５３】
実施例２：アレルゲンタンパク質の精製
アレルゲン抽出物を以下により精製した：
・陽イオン交換クロマトグラフィー
ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ-メンブレン（ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ社）を、カラム容量（Ｂｖ
）の２８倍の、炭酸水素ナトリウム  １２．５ｍＭ、クエン酸塩  ３０ｍＭ、ｐＨ３．０、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％（ｖ／ｖ）を用いて平衡化した。前記酸性化抽出物を平衡化したメンブレン上にロードした。カラムをまず３５×Ｂｖの、炭酸水素ナトリウム  １２．５ｍＭ、クエン酸  ３０ｍＭ、ｐＨ３．０、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％（ｖ／ｖ）を用いて洗浄し、次いで４２×Ｂｖの、炭酸水素ナトリウム  １２．５ｍＭ、クエン酸塩  ３０ｍＭ、ｐＨ３．０、を用いて洗浄した。タンパク質を炭酸塩  ０．１Ｍ、塩化ナトリウム  ０．５Ｍ、ｐＨ９．１５を用いて溶出した。タンパク質の存在は２８０ｎｍにおけるＯＤにより観察した。目的の画分をプールした。
・硫酸アンモニウム沈殿
この工程は０〜４℃において行った。
硫酸アンモニウムを飽和量の９０％となるように撹拌下で産物に加えた。塩が完全に溶解した後、撹拌を止めた。懸濁液を一晩インキュベートし、１５分間１０，０００ｇで２回遠心分離した。毎回注意しながら上清を捨てた。
・変性
ペレットを、尿素  ６Ｍ、ＤＴＴ  １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ０．１Ｍ、ｐＨ８．０中で９ｍｇ／ｍｌに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。
・Ｇ２５樹脂（ｆｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ社）によるサイズ排除クロマトグラフィー
変性した試料をカラム上にロードし、タンパク質をＴｒｉｓ．ＨＣｌ  ２５ｍＭ、尿素
１．５Ｍ、ｐＨ８．０を用いて溶出した。
【００５４】
タンパク質の存在を２８０ｎｍでのＯＤ測定により観察した。目的の画分をプールし、精製変性アレルゲン抽出物とした。
【００５５】
精製アレルゲン抽出物をさらに分析した。タンパク質純度を評価するため、タンパク質含有量（ＢＣＡアッセイ）および乾燥重量を測定した。精製効率は炭水化物の除去（オルシノール試験）およびＯＤ260／ＯＤ280比の減少によっても確認した。
【００５６】
表１：非タンパク質成分の除去による精製抽出物の生成
【表１】
0006014100.tif 000002
【００５７】
表１に示すように、前記精製工程により、以下のことが可能となる。
・抽出物中のタンパク質の割合が約１５％から８０％へと増加させる。
・ＯＤ260／ＯＤ280の比を、純粋なタンパク質の特徴となる０．５に近づかせる。
・炭水化物を相当程度に除去する（残存含有量はタンパク質の炭水化物部分を表しうる）。
【００５８】
図４は、精製変性アレルゲン抽出物に対して得られる典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。図に示されるように、６種のタンパク質が、精製抽出物中のタンパク質の総重量の少なくとも６０％に相当する。
【００５９】
実施例３：変性アレルゲン抽出物の加水分解
抽出物を次のプロトコルを用いて加水分解した：
前記の精製アレルゲン抽出物をｐＨ２．０に酸性化した。消化は、２．５ｍｇ／ｍｌの花粉タンパク質および３３７ｍｇのタンパク質に対して１Ｅｕ．Ｐｈ．Ｕのペプシン（ＭＥＲＣＫ社）を用いて、３７℃で２時間行った。
【００６０】
図５は精製抽出物（レーン２）と加水分解抽出物（レーン３）との比較を示す。図に示されるように、変性未消化タンパク質に相当する高分子量のタンパク質が、ペプシンとのインキュベーション後に消失した。
【００６１】
実施例４：精製
ＭＷ≧１０，０００ＤａおよびＭＷ≦１，０００Ｄａのペプチドを排除するために、加水分解産物を以下により精製した：
・Ｇ５０樹脂（ｆｉｎｅ Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＡＭＥＲＳＨＡＭから入手）によるサイズ
排除クロマトグラフィー
イソプロパノール  １６．５％（ｖ／ｖ）およびＮａＣｌ  ０．１Ｍを加水分解物に加えた。この試料をすぐにＧ５０カラム上にロードした。ペプチドを溶出し、ペプチド（ＭＷ≦１０ｋＤａ）を含む画分を図６に示すようにプールした。
・１ｋＤａメンブレン（限外濾過カセットＯｍｅｇａ ＰＥＳ、ＰＡＬＬ社）による透析
濾過
ペプチドを１０倍濃縮し、１０倍容量のＴｒｉｓ．ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４に対して透析濾過し、最終的に２．５倍濃縮にする。この試料を精製アレルゲン加水分解物とする。
【００６２】
精製の効率はサイズ排除ＨＰＬＣにより調節した。Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ−  ＳＤＳ
０．５％（ｗ／ｖ）  ｐＨ６．８を用いてＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラム（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ社）を流速１ｍｌ／分で平衡化した。ペプチドは２１４ｎｍで検出した。
【００６３】
１０ｋＤａおよび１ｋＤａの範囲を図７に例示するように検量線から算出した。
【００６４】
図８に示すように、１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの分子量を有するペプチドは精製加水分解物中の全ペプチドの約７５％に相当する。
【００６５】
実施例５：アレルゲン性の減少
花粉粗抽出物（実施例１による）、精製花粉タンパク質（実施例２による）および精製花粉ペプチド（実施例４による）のアレルゲン性特性を、それらが好塩基球脱顆粒を誘発する能力を測定することにより試験した。
【００６６】
試験は、花粉アレルギーのボランティアからの新鮮なヒト血液試料に対して、花粉粗抽出物、精製タンパク質および精製ペプチドの濃度を増加させながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
行った。好塩基球脱顆粒は、フローサイトメトリー法により、活性化細胞（すなわちＩｇＥ陽性細胞）の細胞膜上のｇｐ５３タンパク質マーカーの発現を測定することで試験した。このタンパク質は通常、休止細胞中では顆粒の膜内に存在し、細胞活性化の際に（顆粒膜と細胞膜との融合により）細胞表面上に現れる。従って標識された特異的抗ｇｐ５３抗体により検出可能になる。図９に示すように、精製ペプチドは精製タンパク質よりも約３０倍アレルゲン性が低く、花粉粗抽出物よりも１００倍アレルゲン性が低い。
【００６７】
実施例６：花粉タンパク質および花粉ペプチドの免疫原性
アレルゲンタンパク質およびアレルゲンペプチドの免疫原性は、それらがヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を刺激する能力を測定することにより調べた。
【００６８】
「花粉アレルギーの」ボランティア由来の血液試料から密度勾配遠心分離により精製したＰＢＭＣを、５日間、９６ウェルプレート中で、増加する種々の濃度の花粉タンパク質および花粉ペプチドの存在下で培養した。５日目に、［3Ｈ］−チミジンを細胞培養物に
添加し、プレートをさらに３７℃で１６時間インキュベートした。［3Ｈ］−チミジンの
取り込みを液体シンチレーションの原理を利用してベータカウンターを用いて測定した。
【００６９】
花粉タンパク質（実施例２による）および花粉ペプチド（実施例４による）は、投与濃度依存的にヒトＰＢＭＣの増殖を刺激する。アレルゲンペプチドにより誘導された増殖は、タンパク質に反応して観察されたものよりもわずかに少ない。これらの結果は、ペプチド産生の工程において、Ｔ細胞活性化に関わるアレルゲンのエピトープの大部分が保存されていることを示す。
＜付記＞
＜１＞
ａ）アレルゲンタンパク質を含むアレルゲンの天然源を抽出して抽出物を生成し、
ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成し、
ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程を含み、
前記精製変性抽出物はタンパク質を含み、合わせて全タンパク質の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を構成する最も豊富な（ｗ／ｗ）タンパク質群は少なくとも２種のタンパク質であり、全タンパク質が前記精製変性抽出物の乾燥重量の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）に相当する
天然アレルゲンの精製抽出物の製造方法。
＜２＞
塩を含まない溶液中、または炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳから選択される塩を含む溶液中で抽出が行われる＜１＞に記載の方法。
＜３＞
抽出が抽出媒体を用いて行われ、前記抽出媒体の重量が前記アレルゲンの天然源の重量の少なくとも２０倍、好ましくは１００倍である＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
前記精製がイオン交換クロマトグラフィー工程、ゲル濾過クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィー工程、沈殿工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、シュードアフィニティークロマトグラフィー（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）もしくはアフィニティークロマトグラフィー工程、または透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程のうちの１つ以上を含む＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜５＞
少なくとも１つの精製工程が界面活性剤および／または変性剤を含む溶液を用いて行われる＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜６＞
変性がカオトロピック剤、還元剤およびこれらの混合物の群から、好ましくは尿素、塩化グアニジニウム、ジチオストレイトール、チオグリセロール、β−メルカプトエタノールおよびこれらの混合物から選択される変性剤を用いて行われる＜５＞に記載の方法。
＜７＞
尿素の濃度が４Ｍ超、好ましくは５Ｍ超、および／または塩化グアニジニウムの濃度が３Ｍ超、好ましくは４Ｍ超である＜６＞に記載の方法。
＜８＞
ａ）変性アレルゲンを加水分解してアレルゲン加水分解物を生成し、
ｂ）前記アレルゲン加水分解物を精製して１０，０００Ｄａ超の分子量を有するペプチドおよび１，０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドを除去して、７０％、より好ましくは８０％のペプチドが１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａである精製加水分解物を得る
工程を含む天然アレルゲンの精製抽出物の製造方法。
＜９＞
加水分解が酵素、好ましくはペプシン、トリプシンまたはキモトリプシンを用いて行われる＜８＞に記載の方法。
＜１０＞
加水分解が、カオトロピック剤、好ましくは尿素および塩化グアニジニウムから選択されるカオトロピック剤の存在下で行われる＜８＞または＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞
前記ペプチドの除去がサイズ排除クロマトグラフィーおよび／または限外濾過により行われる＜８＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１２＞
前記サイズ排除クロマトグラフィー工程が、カオトロピック剤、好ましくは尿素、塩化グアニジニウム、エチレングリコール、イソプロパノールおよびこれらの混合物から選択されるカオトロピック剤の存在下で行われる＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
加水分解に先立ち、未変性アレルゲンを変性して変性アレルゲンを生成する＜８＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１４＞
変性がカオトロピック剤、還元剤およびこれらの混合物の存在下で行われる＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞
＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の方法により得られる天然アレルゲンの精製変性抽出物。
＜１６＞
＜８＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の方法により得られる精製アレルゲン加水分解物。
＜１７＞
免疫寛容を誘導するための医薬組成物および／または食品組成物の調製のための＜１５＞に記載のアレルゲン抽出物または＜１６＞に記載のアレルゲン加水分解物の使用。
＜１８＞
免疫寛容の誘導がアレルギー反応を治療または予防するために用いられる＜１７＞に記載の使用。
＜１９＞
＜１５＞に記載のアレルゲン抽出物または＜１６＞に記載のアレルゲン加水分解物を含む医薬組成物。
＜２０＞
ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド一リン酸、核酸、ペプチド核酸、ヌクレオシドもしくはその類似体、免疫抑制性サイトカイン、免疫プロテアソームの発現を誘導する化合物、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３もしくはその類似体、リポ多糖類、エンドトキシン、熱ショックタンパク質、ＮＡＤＰＨ−チオレドキシン還元酵素もしくはＮＡＤＰ−チオレドキシン還元酵素のいずれかと組み合わせたチオレドキシン、ジチオスレイトール、サルブタノール（ｓａｌｂｕｔａｎｏｌ）等のアドレナリン受容体アゴニスト、ブトキサミン等のアドレナリン受容体アンタゴニスト、接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元型Ｌ−グルタチオン）、アルファ−２−マクログロブリン、Ｆｏｘｐ３遺伝子発現の誘導因子、フラボノイド、イソフラボノイド、プテロカルパノイド（ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎｏｉｄｓ）、レスベラトロール等のスチルベン、タキキニン受容体アンタゴニスト、キマーゼ阻害剤、ＣｐＧもしくはＭＰＬのようなワクチンアジュバントまたはザイモサンのような寛容原性アジュバント、ベータ−１，３−グルカン、制御性Ｔ細胞誘導因子、腸管粘膜内層に粒子を付着させるための植物レクチン等の粘膜付着剤、亜鉛、亜鉛塩、多糖類、ビタミン、および細菌溶解物の群から選択される少なくとも１種の物質をさらに含む＜１９＞に記載の医薬組成物。
＜２１＞
前記アレルゲンが、花粉アレルゲン、ミルクアレルゲン、毒液アレルゲン、卵アレルゲン、雑草アレルゲン、牧草アレルゲン、樹木アレルゲン、灌木アレルゲン、花アレルゲン、野菜アレルゲン、穀物アレルゲン、菌類アレルゲン、果物アレルゲン、液果アレルゲン、ナッツアレルゲン、種子アレルゲン、豆アレルゲン、魚類アレルゲン、甲殻類および／または貝類（ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ）アレルゲン、海産物アレルゲン、肉類アレルゲン、香辛料アレルゲン、昆虫アレルゲン、ダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物アレルゲン、ハトダニ（ｐｉｇｅｏｎ  ｔｉｃｋ）アレルゲン、蠕虫アレルゲン、軟質珊瑚アレルゲン、動物の鱗屑アレルゲン、線虫アレルゲン、パラゴムノキのアレルゲンから選択される＜１９＞または＜２０＞に記載の医薬組成物。
＜２２＞
経口投与用、舌下ドラッグデリバリー用、または経腸ドラッグデリバリー用の＜１９＞〜＜２１＞のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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