(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなり、かつ、各々のペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合で結合しているペプチドダイマーを有効成分として含有する、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖促進剤。
【請求項２】
前記ペプチドダイマーが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなる、請求項１に記載の増殖促進剤。
【請求項３】
前記ペプチドダイマーが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなる、請求項１に記載の増殖促進剤。
【請求項４】
前記ペプチドダイマーが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなる、請求項１に記載の増殖促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の増殖促進剤と、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌とを含む、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖促進用組成物。
【請求項６】
前記組成物が医薬である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が飲食品である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌の増殖促進剤とを含有させる工程を含む、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖促進用組成物の製造方法。
【請求項９】
ペプチドを動物（ヒトを除く）に投与することを含む、該動物中のビフィドバクテリウ
ム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖を促進する方法であって、
前記ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなり、かつ、各々のペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合で結合しているペプチドダイマーである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進剤に関する。本発明の増殖促進剤は、食品、飼料、及び医薬として利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
乳児の腸内細菌叢はビフィズス菌（ビフィドバクテリウム属細菌）が最優勢であることが知られており、このことは乳児の健康の維持と密接に関わっていると考えられている。ヒトの腸内に生息するビフィズス菌のパターンは加齢とともに変遷し、乳幼児期は主にビフィドバクテリウム・インファンティスとビフィドバクテリウム・ブレーベから構成され、成人期は主にビフィドバクテリウム・ロンガムとビフィドバクテリウム・アドレセンティスから構成される（非特許文献１）。このことから、ビフィズス菌の中でも特にビフィドバクテリウム・インファンティスとビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖を促進する食品を開発することは、乳児の健康を維持する上で重要な課題となる。【０００３】
ビフィズス菌増殖促進因子として、乳タンパク質ではラクトフェリンが知られており（非特許文献２）、ウシラクトフェリンは育児用粉乳、サプリメント等に広く使用されている。【０００４】
また、乳タンパク質を酵素消化したペプチドでは、カゼイングリコマクロペプチド（非特許文献３）やヒトラクトフェリンペプチド（非特許文献４）が知られている。ヒトラクトフェリンペプチドは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに対してビフィドゲニック（ビフィズス菌の成長を促進する性質）であることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは乳児期にも検出されるが、代表的な菌種ではない。【０００５】
ラクトフェリンペプチドに関しては、ウシラクトフェリンのペプシン消化物から生成されたいくつかのペプチドが抗菌活性を有することが報告されており（非特許文献５）、自然食品の保存料や、医薬、獣医学分野での抗菌剤としての可能性が示唆されている。しかしながら、これらのペプチドがビフィズス菌増殖促進作用を持つことは知られていなかった。【０００６】
ビフィドバクテリウム・ブレーベに対する増殖促進剤としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸及び／又はシアリルラクトースが知られているが（特許文献２）、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベに対して増殖促進効果のあるペプチドは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００１−５１６５７０号
【特許文献２】特開平７−２６７８６６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】光岡知足、腸内細菌学雑誌、19:179-192, 2005
【非特許文献２】Rahman, M.M. et. al., Int. J. Food Sci. Tech. 45:453-458, 2010
【非特許文献３】Azuma, N. et al., Agric. Biol. Chem. 48:2159-2162, 1984
【非特許文献４】Liepke, C. et al., Eur. J. Biochem. 269:712-718, 2002
【非特許文献５】Dionysius, D.A. et al., J. Dairy Sci. 80:667-674, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの増殖促進作用を有する乳タンパク質由来のペプチドは知られているが、乳児期に重要なビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベに対して増殖促進作用を有する乳タンパク質由来のペプチドは知られていない。
本発明は、乳タンパク質由来のペプチドを有効成分とする、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベに対する増殖促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、抗菌ペプチドとして報告されているペプチド（J. Dairy Sci. 80:667-674, 1997）の一つ、及びその類似ペプチドが、ビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ブレーベに対して増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなり、かつ、各々のペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合で結合しているペプチドダイマーを有効成分として含有する、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖促進剤である。【００１２】
また本発明は、前記増殖促進剤と、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌とを含む、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖促進用組成物を提供する。【００１３】
本発明の組成物は、医薬であることを好ましい態様としている。
また、本発明の組成物は、飲食品であることを好ましい態様としている。【００１４】
また本発明は、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖を促進するためのペプチドの使用であって、
前記ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなり、かつ、各々のペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合で結合しているペプチドダイマーである、使用を提供する。【００１５】
また本発明は、ペプチドを動物（ヒトを除く）に投与することを含む、該動物中のビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる細菌の増殖を促進する方法であって、
前記ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなり、かつ、各々のペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合で結合しているペプチドダイマーである、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１７】
本発明の増殖促進剤の有効成分であるペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドとからなり、かつ、各々のペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合で結合しているペプチドダイマーである。これらのペプチドダイマーの構造を、下記式（１）〜（３）に示す。式（１）の上段及び下段のペプチドのアミノ酸配列は、各々配列番号１及び配列番号２に相当する。式（２）の上段及び下段のペプチドのアミノ酸配列は、各々配列番号１及び配列番号３に相当する。式（３）の上段及び下段のペプチドのアミノ酸配列は、各々配列番号１及び配列番号４に相当する。本明細書においては、これらのペプチドダイマーを、「活性ペプチド」とも記載する。活性ペプチドは、上記ペプチドダイマーの塩類であってもよい。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
【化２】
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【００２０】
【化３】
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【００２１】
活性ペプチドは、ビフィズス菌増殖促進作用を有しており、特に、ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベに対して、選択的に、顕著な増殖促進作用を有している。活性ペプチドが持つ「増殖促進作用」とは、活性ペプチドを摂取したときに、活性ペプチドを摂取しない場合に比べて、腸内のビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの菌数が多いこと、又は、ビフィドバクテリウム・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ブレーベを培地で培養したときに、活性ペプチドを含む培地の方が、活性ペプチドを含まない培地よりも菌数が多いことを意味する。
【００２２】
活性ペプチドは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに対して増殖促進作用を有することが知られている下記式（４）の構造を有するヒトラクトフェリン由来ペプチド（Liepke, C. et al., Eur. J. Biochem. 269:712-718, 2002）と約50％の相同性を示しているが、活性スペクトルは全く異なっている。すなわち、活性ペプチドは、ビフィドバクテリウム・インファンティスとビフィドバクテリウム・ブレーベに対して、ウシラクトフェリンや式（４）で表されるヒトラクトフェリン由来ペプチドと比較して非常に強い増殖促進作用を有しているが、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに対しては、ウシラクトフェリンや式（４）のヒトラクトフェリン由来ペプチドと異なり、ほとんど増殖促進作用を有していない。尚、式（４）のヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００２３】
【化４】
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【００２４】
活性ペプチドは、同ペプチドを構成する各々のペプチドモノマーを化学合成し、それらのペプチドをジスルフィド結合によって結合させることによって、製造することができる。ペプチドの化学合成は、オリゴペプチドの合成に通常用いられている液相法または固相法によって行うことができる。合成されたペプチドは、必要に応じて脱保護され、未反応試薬、副生物等を除去する。このようなペプチドの合成は、市販のペプチド合成装置を用いて行うことができる。上記合成（混合）物から、好ましくは、目的のペプチドを単離、精製する。ペプチドの精製は、通常、オリゴペプチドの精製に用いられているのと同様の手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶媒沈殿、塩析、２種の液相間での分配等の方法を適宜組み合わせることによって、行うことができる。ペプチドの精製に際しては、目的のペプチドを含む画分は、それらをジスルフィド結合によって結合させ、得られたペプチドダイマーについて、実施例に記載した方法でビフィドバクテリウム・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ブレーベに対する増殖促進作用を指標として決定することができ、それらの画分の活性成分は質量分析法又は／およびプロテインシーケンサーにより同定することができる。
【００２５】
また、活性ペプチドを構成するペプチドモノマーは、それらのペプチドをコードする組換えＤＮＡを適当な宿主細胞で発現させることによっても、製造することができる。組換えＤＮＡの作製に必要なベクター、及び宿主は、通常タンパク質やペプチドの製造に用いられているものを使用することができる。
【００２６】
ペプチドモノマー同士をジスルフィド結合で結合させるには、例えば、ペプチドモノマーの混合液を適当な酸化条件に置けばよい。適当な酸化条件は、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン、又はシスチン等の還元剤と、酸化型グルタチオン、又はシステイン等の酸化剤を適当な比率で混合することにより、設定することができる。ジスルフィド結合で結合したダイマーには、ヘテロダイマーとホモダイマーが含まれ得るので、式（１）、（２）又は（３）の構造を有するヘテロダイマーを単離、精製することが好ましい。目的のヘテロダイマーの単離、生成は、上記の各種クロマトグラフィー等の方法で行うことができる。
【００２７】
活性ペプチドは、そのまま、又は製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせて、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベに対する増殖促進剤（以下、「本発明の薬剤」とも記載する。）として使用することができる。活性ペプチドは、１種を単独で用いてもよく、２又は３種の混合物として用いてもよい。
【００２８】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されず、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む。）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コーティングしたものを含む。）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の経口薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、溶剤等の添加剤を使用できる。また、本発明の効果を損わない限り、活性ペプチドと、公知の、もしくは将来的に見出されるビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベに対する増殖促進作用を有する薬剤、又は医薬組成物とを併用してもよい。併用する医薬組成物は、本発明の薬剤中に有効成分の一つとして含有させてもよいし、本発明の薬剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。
【００２９】
上記の製剤に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を例示することができる。
【００３０】
また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を、それぞれ例示することができる。
【００３１】
更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を、それぞれ例示することができる。
【００３２】
錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
【００３３】
本発明の一態様は、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進剤の製造における、活性ペプチドの使用である。また、本発明の他の態様は、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進に用いられる活性ペプチドである。また、本発明の他の態様は、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖を促進するための活性ペプチドの使用である。
【００３４】
また、本発明の他の態様は、活性ぺプチドを動物に投与することを含む、該動物中のビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖を促進する方法である。動物としては、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられ、中でもヒトまたはウシであることが好ましい。
【００３５】
本発明の薬剤中に含まれる活性ペプチドの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、製剤中に０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜３質量％、特に好ましくは０．１〜１質量％とするのがよい。本発明の薬剤が活性ペプチドを複数種含む場合は、前記ペプチドの量は、ペプチドの合計量である。
【００３６】
本発明の薬剤は、腸内細菌叢の改善、免疫調節、下痢、便秘、肥満、炎症性腸疾患等の予防又は治療に有用である。
【００３７】
本発明の薬剤の投与時期は特に限定されず、投与対象の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、例えば１回／３日〜５回／１日である。本発明の薬剤の投与量も、投与対象の年齢、性別、状態、その他の条件等により適宜選択されるが、例えば、活性ペプチドの量（複数種の場合は合計量）として、好ましくは１０μｇ／ｋｇ／回〜５０００μｇ／ｋｇ／回、より好ましくは、５０μｇ／ｋｇ／回〜５００μｇ／ｋｇ／回での範囲となる量を目安とするのが良い。
【００３８】
投与対象は、ヒト、特に乳幼児が好ましい。また、投与対象が、腸内細菌叢においてビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベが優性でない場合、例えば乳幼児以外の者の場合は、活性ペプチドと共にビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベを投与することが好ましい。活性ペプチドと、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベは、本発明の薬剤中に同時に含有させてもよいし、別個の薬剤として組み合わせてもよい。薬剤中の活性ペプチドに対するビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの量は特に制限されないが、好ましくは１０〜１０５ＣＦＵ（colony forming unit:コロニー形成単位）／μｇ活性ペプチド、より好ましくは１０２〜１０４ＣＦＵ／μｇ活性ペプチドである。
【００３９】
本発明の薬剤、又はその有効成分である活性ペプチドは、飲食品（飲料又は食品）に含有させることもできる。また、活性ペプチド又は本発明の薬剤を有効成分として飲食品に含有させ、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベに対する増殖促進剤の一態様として、これらの細菌の増殖促進作用を有する飲食品として加工することも可能である。
飲食品としては、活性ペプチドの効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、活性ペプチドを含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
【００４０】
上記のような食品としては、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食等のほか、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類； 農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品； 水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。
【００４１】
さらに、活性ペプチド又は本発明の薬剤を有効成分として飼料中に含有させ、ビフィズス菌増殖促進剤の一態様として、ビフィズス菌増殖促進作用を有する飼料として加工することも可能である。
【００４２】
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００４３】
本発明の飲食品（飼料を含む）中に含まれる活性ペプチドの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、活性ペプチドの量（複数種の場合は合計量）として、飲食品中に０．００００１〜１質量％、好ましくは０．０００１〜０．１質量％、特に好ましくは０．００１〜０．０１質量％とするのがよい。
【００４４】
飲食品についても、活性ペプチドと共にビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベを含有させることが好ましい。活性ペプチドに対する、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベの量は、本発明の薬剤について記載したのと同様である。
【実施例】
【００４５】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４６】
〔実施例１〕
前記式（１）の構造を有する本発明ペプチド（以下、「活性ペプチド１」と記載することがある）、及び前記式（４）のヒトラクトフェリン由来ペプチド（以下、「ヒトラクトフェリンペプチド」と記載することがある）の化学合成を、株式会社東レリサーチセンターに委託した。合成された各々のペプチドの純度はいずれも95％以上であった。また、ウシラクトフェリンは、特開昭６３−１５２４００号公報、実施例８に記載の方法により製造したもの（純度96％以上）を使用した。
【００４７】
9.375μMの各ペプチド水溶液のpHを、HCl水溶液でpH 6.5に調整し、0.22μｍのメンブレンを用いてろ過滅菌した。これらのペプチド溶液を希釈水で希釈し、9.375μM、3.125μM、0.9375μM、及び、0.3125μMのサンプル溶液を得た。希釈水は、純水をHCl溶液でpH 6.5に調整し、115℃で15分間滅菌したものを用いた。【００４８】
上記各ペプチドについて、以下のようにしてビフィズス菌増殖促進活性を評価した。
試験に用いたビフィズス菌は、以下のとおりである。これらの菌株は、ATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、http://www.atcc.org/）から入手することができる。
ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ATCC 15697Ｔ
ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ATCC 15700Ｔ
ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）ATCC 29521Ｔ【００４９】
10％脱脂乳培地で凍結保存された各菌株の菌液100μLをMRS液体培地3mLに添加し、37℃で16時間、嫌気培養した。これらの培養液100μLをMRS液体培地3mLに添加した。MRS液体培地は、Difco Lactobacilli MRS Broth（BD社、「Difco」はディフコラボラトリーズインコーポレーテッド社の登録商標）5.5 g、及び、L-Cysteine Monohydrochloride, Monohydrate（和光純薬工業社製）50 mgを、100 mLとなるように純水に溶解させ、HCl水溶液でpH6.5に調整し、115℃で15分間滅菌することによって調製した。また、Difco Lactobacilli MRS Broth 11 g、及び、L-Cysteine Monohydrochloride, Monohydrate 100 mgを用いた以外は上記と同様にして、２倍濃度の濃縮培地を調製した。【００５０】
上記培養液を、波長630 nmでの濁度が0.8となるように、MRS液体培地で希釈した。さらに、この希釈液を、MRS液体培地で100倍希釈した。この希釈液を、1％培養希釈液と呼ぶ。【００５１】
96穴プレート（FALCON 353072）で、前記２倍濃縮培地100μL、サンプル溶液または希釈水80μL、及び、1％培養希釈液（植菌量0.1％）またはMRS液体培地20μL（植菌量0％）を混合し、37℃で16時間嫌気培養した。混合液中のペプチドの終濃度は、3.75μM、1.25μM、0.375μM、0.125μM、又は、0μMである。
培養後、各培養液について、波長630 nmでの濁度を測定し、増殖促進率（％）を下記の式で算出した。【００５２】
増殖促進率（％）＝（ODＳ１−ODＳ０）/（ODＣ１−ODＣ０）×100−100
ODＳ１：サンプル濃度3.75〜0.125 μM, 植菌量0.1 ％で16時間後の濁度
ODＳ０：サンプル濃度3.75〜0.125 μM, 植菌量0 ％で16時間後の濁度
ODＣ１：サンプル濃度0 μM, 植菌量0.1 ％で16時間後の濁度
ODＣ０：サンプル濃度0 μM, 植菌量0 ％で16時間後の濁度
結果を表１に示す。【００５３】
【表１】
0005875603.tif 000006
【００５４】
ビフィドバクテリウム・インファンティス、及び、ビフィドバクテリウム・ブレーベに対して、本発明の活性ペプチド１は、ウシラクトフェリン、及び、ヒトラクトフェリンペプチドに比べて、著しい増殖促進効果を示した。
一方、活性ペプチド１は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに対しては増殖促進効果を示さなかった。【００５５】
ウシラクトフェリンの分子量が約８万、ヒトラクトフェリンペプチドの分子量が5757.7であるのに対し、活性ペプチド１の分子量は2673.1であり（それぞれ約1/30、約1/2）、少量で高い効果が期待できる。【００５６】
〔実施例２〕
前記式（２）及び（３）に示す構造を有する本発明ペプチド（以下、各々「活性ペプチド２、活性ペプチド３」と記載することがある）の化学合成を、株式会社東レリサーチセンターに委託した。
上記各ペプチドについて、実施例１と同様にしてビフィズス菌増殖促進活性を評価した。結果を表２に記載する。【００５７】
【表２】
0005875603.tif 000007
【００５８】
ビフィドバクテリウム・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ブレーベに対して、本発明の活性ペプチド２及び３のいずれも、著しい増殖促進効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の増殖促進剤は、ビフィドバクテリウム・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ブレーベに対して増殖促進作用を有しているので、これを摂取することにより、これらの細菌が優勢な腸内環境を形成することができる。本発明の増殖促進剤の有効成分であるペプチドは、乳タンパク質由来であり、安全性が期待できる。
また、乳幼児以外でも、本発明の増殖促進剤と、ビフィドバクテリウム・インファンティス及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベを含む組成物は、これらの細菌が持つ機能を高めた形で摂取することができるため、医薬又は飲食品等として有用である。
【配列表】
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