(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0006029147.tif 000033
（式中、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表し、Ｘは硫黄原子又は酸素原子を表し、ｎは６〜６０の整数を表す。）で表される繰り返し構成単位（前記一般式中、Ｂ及びＸは、それぞれの繰り返し構成単位において独立に表される。）からなり、前記一般式で表される繰り返し構成単位の全てにおいて、Ｘが硫黄原子であるｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端に少なくとも１つのリガンドが結合している、
ことを特徴とする請求項１に記載のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体が、ｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなる、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ２１である、
ことを特徴とする請求項３に記載のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ１２２である、
ことを特徴とする請求項３に記載のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を含む治療用医薬組成物及び診断用医薬組成物、並びにｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見、トランスクリプトーム解析手法の進歩等により、ＲＮＡに関する研究が飛躍的に発展している。ＲＮＡが生物学的に重要な多くの機能を制御していることが明らかとなり、ＲＮＡと癌を含む様々な疾患との関連性が指摘されている。【０００３】
ＲＮＡの機能制御による疾患の治療に関する研究が盛んに行われ、ＲＮＡを標的にした医薬品の開発研究が広く行われるようになってきた。その中でも、核酸によるＲＮＡ制御法は、ワトソン−クリック型の塩基対形成を基盤としており、標的とするＲＮＡに配列特異的な核酸を用いたものである。このようなＲＮＡ制御法は、直接的にＲＮＡを制御することで、細胞機能の調節を可能とする。【０００４】
近年、核酸によるＲＮＡ制御法として、アンチセンス法やＲＮＡｉ法等の方法論が確立されている。また、マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡという）の機能抑制を狙った核酸医薬に関する研究が進んでいる（非特許文献１）。【０００５】
核酸によるＲＮＡ制御法を応用した核酸医薬においては、（１）細胞内外に存在するヌクレアーゼによる分解に起因する効果消失、（２）二本鎖高次構造の熱的不安定性、（３）細胞及び組織標的化、（４）自然免疫応答による副作用発現等の課題が存在する。【０００６】
これらの課題を克服するため、核酸医薬の創薬において、核酸に何らかの化学修飾を施すことで、ヌクレアーゼに対する抵抗性、二本鎖高次構造の熱的安定性、自然免疫応答の回避能等の機能を付与する研究が行われている。核酸の糖部２’位水酸基をメチル化した２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、ヌクレアーゼ抵抗性、熱的安定性、及び自然免疫応答の回避能を有することが報告されている（非特許文献２，３）。また、ヌクレオシド糖部フラノース環４’位酸素原子を硫黄原子に置換した４’−チオＲＮＡは、ヌクレアーゼ抵抗性及び熱的安定性を有することが報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｌａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７，１９８−２０１（２０１０）
【非特許文献２】Ｃｕｍｍｉｎｓ  Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２０１９−２０２４（１９９５）
【非特許文献３】Ｊｕｄｇｅ  Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，４９４−５０５（２００６）
【非特許文献４】Ｈｏｓｈｉｋａ  Ｓ．，Ｍｉｎａｋａｗａ  Ｎ．ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｄａ  Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，３８１５−３８２５（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献２及び３に記載の２’−Ｏ−メチルＲＮＡでは、生体内環境における安定性が十分であるとはいえず、また、効果の持続性という点で課題を残している。また、非特許文献４に記載の４’−チオＲＮＡは、ヌクレアーゼ抵抗性を有するが、核酸医薬として生体内で使用するには、よりヌクレアーゼ抵抗性に優れる修飾ＲＮＡの開発が望まれる。【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を含む治療用医薬組成物及び診断用医薬組成物、並びにｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るオリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式
【化１】
0006029147.tif 000002
（式中、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表し、Ｘは硫黄原子又は酸素原子を表し、ｎは６〜６０の整数を表す。）で表される繰り返し構成単位（前記一般式中、Ｂ及びＸは、それぞれの繰り返し構成単位において独立に表される。）からなり、前記一般式で表される繰り返し構成単位の少なくとも１つにおいてＸが硫黄原子である。【００１１】
前記一般式で表される繰り返し構成単位の全てにおいて、Ｘは硫黄原子であってもよい。【００１２】
前記オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端に少なくとも１つのリガンドが結合していてもよい。【００１３】
前記オリゴヌクレオチド誘導体は、ｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなっていてもよい。【００１４】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ２１であってもよい。【００１５】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ１２２であってもよい。【００１６】
本発明の第２の観点に係る治療用医薬組成物は、前記オリゴヌクレオチド誘導体を含む。【００１７】
前記治療用医薬組成物は、ｍｉＲＮＡの機能を抑制してもよい。【００１８】
本発明の第３の観点に係る診断用医薬組成物は、前記オリゴヌクレオチド誘導体を含む。【００１９】
本発明の第４の観点に係るｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式
【化２】
0006029147.tif 000003
（式中、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表し、Ｘは硫黄原子又は酸素原子を表し、ｎは６〜６０の整数を表す。）で表される繰り返し構成単位（前記一般式中、Ｂ及びＸは、それぞれの繰り返し構成単位において独立に表される。）からなり、前記一般式で表される繰り返し構成単位の少なくとも１つにおいてＸが硫黄原子である。【００２０】
前記一般式で表される繰り返し構成単位の全てにおいて、Ｘは硫黄原子であってもよい。【００２１】
前記オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端に少なくとも１つのリガンドが結合していてもよい。【００２２】
前記オリゴヌクレオチド誘導体は、ｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなっていてもよい。【００２３】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ２１であってもよい。【００２４】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ１２２であってもよい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を含む治療用医薬組成物及び診断用医薬組成物、並びにｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】各非コンジュゲート型ＡＭＯ２１の配列及びＴｍ値を示す図である。
【図２】各非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２の配列及びＴｍ値を示す図である。
【図３】各ＡＭＯによるｍｉＲＮＡ抑制効果の評価に用いるレポーターベクターを示した図である。
【図４】各ＡＭＯによるｍｉＲＮＡ抑制効果の評価プロトコールを示した図である。
【図５】非コンジュゲート型ＡＭＯ２１によるｍｉＲＮＡ２１抑制効果を示したグラフである。
【図６】非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（コトランスフェクション２４時間後）を示したグラフである。
【図７】非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（コトランスフェクション４８時間後）を示したグラフである。
【図８】非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（コトランスフェクション７２時間後）を示したグラフである。
【図９】非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果の経時変化を示したグラフである。
【図１０】コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（コトランスフェクション２４時間後）を示したグラフである。
【図１１】コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（コトランスフェクション４８時間後）を示したグラフである。
【図１２】コンジュゲート型ＡＭＯ１２２によるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（コトランスフェクション７２時間後）を示したグラフである。
【図１３】ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳによるｍｉＲＮＡ１２２抑制効果（トランスフェクション４８時間後）を示したグラフである（リアルタイムＰＣＲ法）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
（１．オリゴヌクレオチド誘導体）
まず、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体の構造について、詳細に説明する。
【００２９】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式（１）で表される繰り返し構成単位からなる。本明細書において、オリゴヌクレオチド誘導体とは、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドが、下記一般式（１）で表されるように化学修飾されていることをいう。なお、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体には、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドが下記一般式（１）で表されるように化学修飾されたオリゴヌクレオチド誘導体も含まれる。この場合、オリゴヌクレオチドの全長中少なくとも５０％以上のヌクレオチドが下記一般式（１）で表されるように化学修飾されているオリゴヌクレオチド誘導体が、好適に用いられる。
【化３】
0006029147.tif 000004
【００３０】
上記一般式（１）中、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、又はウラシルを表す。それぞれ構造式とその略記号を下式に示す。
【化４】
0006029147.tif 000005
【００３１】
上記一般式（１）中、Ｘは硫黄原子又は酸素原子を表す。本明細書において、Ｘが硫黄原子の場合をＰＳ、Ｘが酸素原子の場合をＰＯと称する。ＰＳ及びＰＯは、それぞれ下式で表される。
【化５】
0006029147.tif 000006
【００３２】
上記一般式（１）中、ｎは、上記一般式（１）で表される繰り返し構成単位の数、つまり、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体のモノマー数を表し、６〜６０の整数である。モノマー数（＝ｎ）については、後述する。
【００３３】
上記一般式（１）中、Ｂ及びＸは、それぞれの繰り返し構成単位において独立に表される。つまり、オリゴヌクレオチド誘導体中に、Ｂ及びＸがそれぞれ異なる繰り返し構成単位が混在していてもよい。例えば、オリゴヌクレオチド誘導体中のある１つの繰り返し構成単位においてＢはアデニン、Ｘは硫黄原子であり、同じオリゴヌクレオチド誘導体中の他の繰り返し構成単位においてＢはグアニン、Ｘは酸素原子であり、同じオリゴヌクレオチド誘導体中のさらに他の繰り返し構成単位においてＢはシトシン、Ｘは酸素原子であってもよい。
【００３４】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前記一般式（１）で表される繰り返し構成単位の少なくとも１つにおいて、Ｘが硫黄原子である。つまり、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、Ｘが硫黄原子である前記一般式（１）で表される繰り返し構成単位、すなわちＰＳを少なくとも１つ含む。
【００３５】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前記一般式（１）で表される繰り返し構成単位の全てにおいて、Ｘが硫黄原子であってもよい。つまり、オリゴヌクレオチド誘導体に含まれる、上記一般式（１）で表される繰り返し構成単位の全てが、ＰＳであってもよい。ＰＳからなるオリゴヌクレオチド誘導体、つまりホスホロチオエートは、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体において好適に用いることができる。
【００３６】
次に、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体の機能について、詳細に説明する。
【００３７】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡを標的とした核酸（アンチセンス核酸化合物）として広く用いることができる。本明細書において、アンチセンス核酸化合物とは、標的とするＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド誘導体であって、オリゴヌクレオチド中の全て又は一部のヌクレオチドが化学修飾されているものをいう。本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体を、例えば、ｍＲＮＡの直接制御、ｍｉＲＮＡの機能制御等に用いることができる。
【００３８】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体をｍＲＮＡの直接制御に用いる場合、標的となるｍＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド誘導体を使用する。この場合、例えば、以下のようなメカニズムにより翻訳阻害が生じる。例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡからｍＲＮＡへのスプライシングにおいて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体がｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合することにより、Ｃａｐ形成阻害、スプライス阻害、ＲＮａｓｅによる切断、アデニル化阻害等が生じる。また例えば、ｍＲＮＡからの翻訳の過程において、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体がｍＲＮＡに結合することにより、リボソーム結合阻害（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｒｅｓｔ）が生じる。本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、ｍＲＮＡを効率的に直接制御することができる。
【００３９】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体をｍＲＮＡの直接制御に用いる場合、６〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド誘導体が好適に用いられ、１５〜２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド誘導体がさらに好適に用いられる。本発明の効果を奏するオリゴヌクレオチド誘導体の長さであれば、適宜選択され得る。なお、本発明には、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体を用いてｍＲＮＡを直接制御する方法の態様についても含まれると理解される。
【００４０】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ｍｉＲＮＡの機能制御に好適に用いることができる。
【００４１】
近年、ｍｉＲＮＡは、細胞増殖、生殖機能等の生物学的に重要な機能を制御しており、様々な疾患との関連性を有することが指摘されている。ｍｉＲＮＡによる調節を受ける生理的機能としては、分化、細胞増殖、稔性、アポトーシス、代謝、造血、心発生、形態形成、インスリン分泌、シグナル伝達等が知られている。このように、ｍｉＲＮＡは細胞の生存に重要な役割を果たしており、ｍｉＲＮＡの発現異常等による遺伝子発現の調節不全は、癌等の疾患の原因となることが知られている。
【００４２】
近年、約９００種のｍｉＲＮＡが同定されている。例えば、各種の癌においてアップレギュレーション及びダウンレギュレーションしているｍｉＲＮＡを下記に示す（表１）。
【表１】
0006029147.tif 000007
【００４３】
例えば、ｍｉＲＮＡ２１（配列番号１）は、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、肺癌といった多種の癌でアップレギュレーションしている（表１）。
【００４４】
例えば、ｍｉＲＮＡ１２２（配列番号２）は、肝臓に特異的に発現しているｍｉＲＮＡであり、マウスでは胚形成時に増加し、肝臓の発達を制御することが知られている。また、コレステロール、脂質のメタボリズムの制御やＨＣＶの複製にも関与していることがわかってきた。
【００４５】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、ｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなっていてもよい。この場合、ｍｉＲＮＡを標的としたアンチセンス核酸（ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；以下、ＡＭＯという）として用いることができる。本発明によるＡＭＯがｍｉＲＮＡの一部配列に相補的な配列からなる場合、本発明の効果を奏する配列であれば、適宜選択され得る。
【００４６】
ｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなる、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体（以下、本発明によるＡＭＯという）を、例えば生体内に投与すると、生体内で本発明によるＡＭＯがｍｉＲＮＡと二本鎖を形成し、ｍｉＲＮＡの機能抑制がもたらされる。本発明によるＡＭＯは、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、ｍｉＲＮＡの効率的な機能制御が可能となる。
【００４７】
本発明によるＡＭＯは、あらゆる種類のｍｉＲＮＡを標的とすることができる。各種のｍｉＲＮＡに相補的な配列を有するＡＭＯを合成することができるからである。本発明によるＡＭＯは、例えば、ｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ２２４、ｍｉＲＮＡ１０ｂ，ｍｉＲＮＡ２２１，ｍｉＲＮＡ２２２，ｍｉＲＮＡ２０，ｍｉＲＮＡ１８，ｍｉＲＮＡ２３ａ，ｍｉＲＮＡ１４１，ｍｉＲＮＡ２００ｂ，ｍｉＲＮＡ２７ａ，ｍｉＲＮＡ３４２，ｍｉＲＮＡ２６ａ，ｍｉＲＮＡ３０ｄ，ｍｉＲＮＡ２６ｂ，ｍｉＲＮＡ１０７，ｍｉＲＮＡ２０３，ｍｉＲＮＡ２０４，ｍｉＲＮＡ２１１，ｍｉＲＮＡ１０５，ｍｉＲＮＡ１８１ａ，ｍｉＲＮＡ１５５，ｍｉＲＮＡ１８１ｂ，ｍｉＲＮＡ２５，ｍｉＲＮＡ４２４，ｍｉＲＮＡ１５１，ｍｉＲＮＡ２２３，ｍｉＲＮＡ２５，ｍｉＲＮＡ１７−５ｐ，ｍｉＲＮＡ１２５ｂ，ｍｉＲＮＡ１０６ａ，ｍｉＲＮＡ９２，ｍｉＲＮＡ１０３，ｍｉＲＮＡ９３，ｍｉＲＮＡ１００，ｍｉＲＮＡ１０６ｂ，ｍｉＲＮＡ２０ａ，ｍｉＲＮＡ１９０，ｍｉＲＮＡ３３，ｍｉＲＮＡ１９ａ，ｍｉＲＮＡ１４０，ｍｉＲＮＡ１２３，ｍｉＲＮＡ１８８，ｍｉＲＮＡ１５４，ｍｉＲＮＡ２１７，ｍｉＲＮＡ１０１，ｍｉＲＮＡ１９６，ｍｉＲＮＡ１３４，ｍｉＲＮＡ１３２，ｍｉＲＮＡ１９２，ｍｉＲＮＡ１６，ｍｉＲＮＡ１５，ｍｉＲＮＡ２００ａ，ｍｉＲＮＡ２００ｃ，ｍｉＲＮＡ１９１，ｍｉＲＮＡ２１０，ｍｉＲＮＡ３２，ｍｉＲＮＡ１８２，ｍｉＲＮＡ３１，ｍｉＲＮＡ１４６ａ等を標的とすることができる。本発明によるＡＭＯが標的とすることができるｍｉＲＮＡとしては、例えば、「ｍｉＲＢａｓｅ：ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）」においてデータベース化されているｍｉＲＮＡを挙げることができる。本発明が効果を奏するｍｉＲＮＡであれば、適宜選択され得る。
【００４８】
なお、本明細書において、ｍｉＲＮＡの機能とは、前述のあらゆる種類のｍｉＲＮＡが有する、細胞増殖、生殖機能等の生物学的な機能をいう。本発明が効果を奏するｍｉＲＮＡの機能であれば、適宜選択され得る。
【００４９】
本発明によるＡＭＯは、ｍｉＲＮＡ−２１を標的とするように、ｍｉＲＮＡ−２１の全配列又は一部配列に相補的な配列からなっていてもよい。この場合、配列番号３の配列を有するＡＭＯ（例えば、ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ）が例示される。ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳの繰り返し構成単位の式を以下に示す。
【化６】
0006029147.tif 000008
【００５０】
本発明によるＡＭＯは、ｍｉＲＮＡ−１２２を標的とするように、ｍｉＲＮＡ−１２２の全配列又は一部配列に相補的な配列からなっていてもよい。この場合、配列番号５の配列を有するＡＭＯ（例えば、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ）が例示される。ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳの繰り返し構成単位の式を以下に示す。
【化７】
0006029147.tif 000009
【００５１】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体をＡＭＯとして用いる場合、６〜６０ｍｅｒのＡＭＯが好適に用いられ、１０〜４０ｍｅｒのＡＭＯがより好適に用いられ、１５〜２５ｍｅｒのＡＭＯがさらにより好適に用いられる。本発明の効果を奏するオリゴヌクレオチド誘導体の長さであれば、適宜選択され得る。
【００５２】
本発明によるＡＭＯにおいて、標的とするｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド誘導体に、さらに１〜２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド誘導体（以下、付加的配列という）が、５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方に結合されていてもよい。例えば、ｍｉＲＮＡ２１を標的とした、配列番号４の配列を有するＡＭＯ（３２ｍｅｒ）は、ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ（２２ｍｅｒ）の５’末端及び３’末端の各々に５ｍｅｒの付加的配列が結合している。本発明の効果を奏する付加的配列であれば、適宜選択され得る。
【００５３】
なお、本発明には、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体を用いてｍｉＲＮＡの機能を制御する方法の態様についても含まれると理解される。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体のｍｉＲＮＡ機能抑制の評価については、例えば、ｍｉＲＮＡ１２２を標的とする場合、細胞に本発明のオリゴヌクレオチド誘導体をトランスフェクションして細胞内のｍｉＲＮＡ１２２レベルを定量し、未処理の細胞と比較してｍｉＲＮＡ１２２レベルが低減していることを確認することで行うことができる。また、例えば、哺乳動物に本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を投与して肝臓におけるｍｉＲＮＡ１２２レベルを定量し、投与前に比べて投与後にｍｉＲＮＡ１２２レベルが低減していることを確認することで行うことができる。
【００５５】
次に、本発明によるコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体について、詳細に説明する。
【００５６】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも１つのリガンドが結合しているコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本明細書においてリガンドとは、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体の細胞標的化、組織標的化、機能性向上等を実現させることができる物質をいう。
【００５７】
コンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体において、オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方に、リガンドを結合させることができる。常法により、オリゴヌクレオチド誘導体にリガンドを結合させることができる。
【００５８】
コンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体においては、オリゴヌクレオチド誘導体に複数個のリガンドを結合させてもよい。この場合、２〜５個のリガンドが結合したコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体が好適に用いられ、３個のリガンドが結合したコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体がさらに好適に用いられる。リガンドが３個の場合、例えば、オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端に３個のリガンドを結合させてもよいし、３’末端に３個のリガンドを結合させてもよいし、例えば、５’末端に１個及び３’末端に２個のリガンドを結合させてもよい。本発明の効果を奏するリガンド数であれば、適宜選択され得る。
【００５９】
本発明によるコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体に用いることができるリガンドの例としては、トコフェロール、コレステロール、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ポリエチレングリコール、ビタミンＡ、葉酸、脂肪鎖、ペプチド、トランスフェリン、アプタマー、マンノース、ＧａｌＮＡＣ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、アニスアミド、その他表面抗原を認識する低分子化合物若しくは高分子化合物等、又はこれらの組み合わせが挙げられる。複数個のリガンドが結合したコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体においては、同じ種類のリガンドを複数個結合させたものであってもよく、異なる種類のリガンドを組み合わせて結合させたものであってもよい。本発明の効果を奏するリガンドであれば、適宜選択され得る。
【００６０】
本発明によるコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体の例としては、例えば、以下のｍｉＲＮＡ１２２を標的としたコンジュゲート型ＡＭＯを挙げることができる。
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ（配列番号５）：ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳの５’末端にトコフェロールが結合
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ（配列番号５）：ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳの５’末端にコレステロールが結合
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌ（配列番号５）：ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳの３’末端にコレステロールが結合
ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’ＰＭＳＡ（配列番号３）：ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳの５’末端にＰＭＳＡ（前立腺膜抗原）が結合）
【化８】
0006029147.tif 000010
【化９】
0006029147.tif 000011
【化１０】
0006029147.tif 000012
【化１１】
0006029147.tif 000013
【００６１】
本発明によるコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体により、オリゴヌクレオチド誘導体の細胞標的化、組織標的化、機能性向上等が実現する。例えば、トコフェロールをリガンドとして用いたコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体により、肝組織標的化が可能となり、ＰＳＭＡをリガンドとして用いたコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体により、前立腺組織標的化が可能となる。例えば、ポリエチレングリコールをリガンドとして用いたコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体により、血中滞留性が向上する。また、複数個のリガンドが結合したコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体の場合、例えば、ある受容体に結合するリガンドを複数結合させることで、リガンドと受容体との間の相互作用を高めることができ、より確実な組織標的化が可能となる。さらに、例えば、トコフェロールとポリエチレングリコールとを組み合わせたリガンドを結合させたコンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体を用いることで、組織標的化及び血中滞留性向上が同時に可能となるため、より確実な肝組織標的化が実現し得る。
【００６２】
次に、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体の合成方法について、説明する。
【００６３】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて、アミダイト法により合成することができる。例えばＳＭｅ＿ＰＳで構成されるＡＭＯ（ホスホロチオエート）の場合、２’−ＯＭｅ−４’−チオ（核酸の糖部フラノース環２’位水酸基がメチル化され、糖部フラノース環４’位酸素原子が硫黄原子に置換されている）リボヌクレオシドが担持されたｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）、及び２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドのアミダイト体を用いて、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（ビューケージ試薬）によりリン酸を硫化させることにより、合成することができる。コンジュゲート型オリゴヌクレオチド誘導体、例えばＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃの場合、α−トコフェロールから合成したα−トコフェロールのアミダイト体を用いて、前述と同様に合成することができ、例えばＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’ＰＭＳＡの場合、Ｌ−リシンから合成した５’ＰＭＳＡのリガンドのアミダイト体を用いて、前述と同様に合成することができる。アミダイト法による縮合反応に用いる各種ＣＰＧ及びアミダイト体は、市販のものを用いてもよい。なお、本発明の効果を奏する合成方法であれば、適宜選択され得る。
【００６４】
（２．治療用医薬組成物）
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体を含む治療用医薬組成物は、例えば、ｍＲＮＡの直接制御、ｍｉＲＮＡの機能制御等を介して治療効果を発揮する。
【００６５】
ｍｉＲＮＡの機能制御を介する場合、例えば、ｍｉＲＮＡ２１は、前述の通り、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、肺癌といった多種の癌でアップレギュレーションしているため、ｍｉＲＮＡ２１を標的としたＡＭＯを投与することにより、生体内でｍｉＲＮＡ２１の機能が抑制され、上記の癌に対して治療効果を発揮することが可能である。また、例えば、ｍｉＲＮＡ１２２は、前述の通り、ＨＣＶの複製に関与しているため、ｍｉＲＮＡ１２２を標的としたＡＭＯを投与することにより、ｍｉＲＮＡ１２２の機能が抑制され、Ｃ型肝炎に対して治療効果を発揮することが可能である。本発明が効果を奏する適用疾患であれば、適宜選択され得る。
【００６６】
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、ｍｉＲＮＡの効率的な機能制御が可能であり、有効な治療効果が得られる可能性がある。
【００６７】
本発明による治療用医薬組成物を哺乳動物に投与する場合、例えば、注射、経口投与、舌下投与等により投与することができる。注射による投与の場合、例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射等により行うことができる。また剤型については、注射剤、舌下剤、錠剤、顆粒剤、散剤等に適宜調製することができ、注射剤の場合、例えば、注射剤用水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等に調製することができる。注射剤の場合、例えば、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤、保存剤、無痛化剤といった添加剤を含有させてもよい。経口剤の場合、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤等を適宜含有させることができる。さらに、治療用医薬組成物には他の活性成分を適宜含有させることができる。本発明の効果を奏する投与方法、剤型、添加剤等であれば、適宜選択され得る。
【００６８】
本発明による治療用医薬組成物を哺乳動物に投与する場合、例えば、オリゴヌクレオチド誘導体を、注射剤に一般的に用いられる溶媒に溶解させて投与してもよく、オリゴヌクレオチド誘導体をリポソームに包埋させたものを溶媒に溶解させて投与してもよい。本発明の効果を奏する投与方法であれば、適宜選択され得る。
【００６９】
（３．診断用医薬組成物）
本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体を含む診断用医薬組成物は、例えば、ｍｉＲＮＡの機能制御等を介して治療効果を発揮する。
【００７０】
例えば、ある癌のバイオマーカーであるｍｉＲＮＡを標的とするＡＭＯを生体内に投与する場合、ＡＭＯに体外から検出可能なトレーサーを結合させておくと、標的ｍｉＲＮＡにＡＭＯが結合することで、イメージング（例えばＰＥＴ）による癌の診断が可能となる。また、例えば、生体から採取した組織、血液等に、何らかの標識（例えば、蛍光標識、放射性同位元素標識等）でラベルしたＡＭＯを添加することで、標的ｍｉＲＮＡの細胞内発現の確認、機能解析が可能となり、さらには組織、血液等中の標的ｍｉＲＮＡの定量を行うこともできる。加えて、例えば、ＡＭＯを生体内に投与して標的ｍｉＲＮＡの発現を抑えることで、ｍｉＲＮＡ発現解析を行うことができる。本発明が効果を奏する診断用途であれば、適宜選択され得る。
【００７１】
本発明によるＡＭＯは、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、生体内で安定的に標的ｍｉＲＮＡと結合するとともに、標的ｍｉＲＮＡの機能を抑制することができる。このため、ＡＭＯを用いた確実な診断が可能となる。
【００７２】
本発明による診断用医薬組成物の投与方法、剤型、添加剤等については、前述と同様である。
【００７３】
（４．ｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体）
本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体は、前述と同様に、下記一般式（１）
【化１２】
0006029147.tif 000014
（式中、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表し、Ｘは硫黄原子又は酸素原子を表し、ｎは６〜６０の整数を表す。）で表される繰り返し構成単位（上記一般式（１）中、Ｂ及びＸは、それぞれの繰り返し構成単位において独立に表される。）からなり、上記一般式（１）で表される繰り返し構成単位の少なくとも１つにおいてＸが硫黄原子である。また、本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体においては、前述と同様に、上記一般式（１）で表される繰り返し構成単位の全てにおいて、Ｘは硫黄原子であってもよい。このようなＰＳからなるｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体、つまりホスホロチオエートは、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、本発明において好適に用いることができる。
【００７４】
本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体は、前述と同様に、５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端に少なくとも１つのリガンドが結合していてもよい。このようなコンジュゲート型のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体により、オリゴヌクレオチド誘導体の細胞標的化、組織標的化、機能性向上等が実現する。
【００７５】
本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体は、生体内又は生体外におけるｍｉＲＮＡの機能を抑制させることができる。本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体は、前述と同様に、あらゆる種類のｍｉＲＮＡを標的とすることができる。
【００７６】
本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体のｍｉＲＮＡ機能抑制の評価については、前述と同様に、例えば、ｍｉＲＮＡ１２２を標的とする場合、細胞に本発明のｍｉＲＮＡ１２２機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体をトランスフェクションして細胞内のｍｉＲＮＡ１２２レベルを定量し、未処理の細胞と比較してｍｉＲＮＡ１２２レベルが低減していることを確認することで行うことができる。また、例えば、哺乳動物に本発明のｍｉＲＮＡ１２２機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体を投与して肝臓におけるｍｉＲＮＡ１２２レベルを定量し、投与前に比べて投与後にｍｉＲＮＡ１２２レベルが低減していることを確認することで行うことができる。
【００７７】
本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体は、前述と同様に、ｍｉＲＮＡの全配列又は一部配列に相補的な配列からなっていてもよい。この場合、ｍｉＲＮＡを標的としたＡＭＯとして用いることができる。本発明のｍｉＲＮＡ機能抑制用オリゴヌクレオチド誘導体を、例えば生体内に投与すると、生体内でオリゴヌクレオチド誘導体がｍｉＲＮＡと二本鎖を形成し、ｍｉＲＮＡの機能抑制がもたらされる。また、この場合のｍｉＲＮＡは、前述と同様に、ｍｉＲＮＡ２１であってもよく、ｍｉＲＮＡ１２２であってもよい。
【００７８】
なお、本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。
【実施例１】
【００７９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特にことわらない限り「％」は質量％を示す。【００８０】
（ＡＭＯの合成）
以下の方法で、各ＡＭＯを合成した。各ＡＭＯの名称及び配列番号を下記に示す。なお、以下の実施例において、ｍｉＲＮＡ２１と完全相補的なＡＭＯをＡＭＯ２１と称し、ｍｉＲＮＡ１２２と完全相補的なＡＭＯをＡＭＯ１２２と称する。
１．非コンジュゲート型ＡＭＯ２１
ＡＭＯ２１（３２）＿ＳＭｅ（配列番号４）
ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＯ（配列番号３）
ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ（配列番号３）
２．非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＯ（配列番号５）
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ（配列番号５）
３．コンジュゲート型ＡＭＯ１２２
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ（配列番号５）
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ（配列番号５）
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌ（配列番号５）
４．コンジュゲート型ＡＭＯ２１
ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’ＰＭＳＡ（配列番号３）
５．（比較例）非コンジュゲート型ＡＭＯ２１
ＡＭＯ２１（３２）＿Ｍｅ（配列番号４）
ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＯ（配列番号３）
ＡＭＯ２１＿ＦＭｅ＿ＰＯ（ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＯの２’位メトキシ基をフッ素に置換）（配列番号３）
ＡＭＯ２１＿ＳＦＭｅ＿ＰＯ（ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＯの２’位メトキシ基をフッ素に置換）（配列番号３）
６．（比較例）非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＯ（配列番号５）
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ（配列番号５）
７．（比較例）コンジュゲート型ＡＭＯ１２２
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ（配列番号５）
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ（配列番号５）
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌ（配列番号５）
８．（比較例）コンジュゲート型ＡＭＯ２１
ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’ＰＭＳＡ（配列番号３）【００８１】
非コンジュゲート型ＡＭＯ２１の繰り返し構成単位の式を下記に示す。
【化１３】
0006029147.tif 000015
【００８２】
非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２の繰り返し構成単位の式を下記に示す。
【化１４】
0006029147.tif 000016
【００８３】
コンジュゲート型ＡＭＯ１２２、及びコンジュゲート型ＡＭＯ２１の構造式及び繰り返し構成単位の式を下記に示す。
【化１５】
0006029147.tif 000017
【化１６】
0006029147.tif 000018
【化１７】
0006029147.tif 000019
【化１８】
0006029147.tif 000020
【化１９】
0006029147.tif 000021
【００８４】
比較例に用いる非コンジュゲート型ＡＭＯ２１の繰り返し構成単位の式を下記に示す。
【化２０】
0006029147.tif 000022
【００８５】
比較例に用いる非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２の繰り返し構成単位の式を下記に示す。
【化２１】
0006029147.tif 000023
【００８６】
比較例に用いるコンジュゲート型ＡＭＯ１２２、及びコンジュゲート型ＡＭＯ２１の構造式及び繰り返し構成単位の式を下記に示す。
【化２２】
0006029147.tif 000024
【化２３】
0006029147.tif 000025
【化２４】
0006029147.tif 000026
【化２５】
0006029147.tif 000027
【化２６】
0006029147.tif 000028
【００８７】
（Ａ．Ｍｅ＿ＰＯで構成されたＡＭＯ、及びＳＭｅ＿ＰＯで構成されたＡＭＯの合成方法）
ＡＢＩ  ３４００  ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｉｔｅｍ社製）を用いて、通常のＤＮＡの固相合成法に従って合成した。
Ｍｅ＿ＰＯで構成されたＡＭＯの縮合反応においては、１μｍｏｌの２’−ＯＭｅ（核酸の糖部フラノース環２’位水酸基がメチル化されている）ヌクレオシドが担持されたＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、及び２’−ＯＭｅヌクレオシドのアミダイト体（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。２’−ＯＭｅヌクレオシドのアミダイト体を０．１Ｍのアセトニトリル溶液に調製して縮合反応に用いた。
ＳＭｅ＿ＰＯで構成されたＡＭＯの縮合反応においては、１μｍｏｌの２’−ＯＭｅ−４’−チオ（核酸の糖部フラノース環２’位水酸基がメチル化され、糖部フラノース環４’位酸素原子が硫黄原子に置換されている）リボヌクレオシドが担持されたＣＰＧ、及び２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドのアミダイト体を用いた。２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドが担持されたＣＰＧ、及び２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドのアミダイト体は、２’−ＯＭｅヌクレオシドが担持されたＣＰＧ、及び２’−ＯＭｅヌクレオシドのアミダイト体から各々常法に従って合成した。２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドのアミダイト体を０．１Ｍのアセトニトリル溶液に調製して縮合反応に用いた。
３％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）により、２’−ＯＭｅヌクレオシドが担持されたＣＰＧ又は２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドが担持されたＣＰＧのＤＭＴｒ基を除去後、活性化剤として１Ｈ−テトラゾールを用いて、各々を２’−ＯＭｅヌクレオシドのアミダイト体又は２’−ＯＭｅ−４’−チオリボヌクレオシドのアミダイト体に縮合させた。なお、縮合時間は６００秒とした。次に、未反応の水酸基に対して無水酢酸を反応させてキャップした後、酸化剤としてヨウ素を用いて水存在下でリン酸を酸化した。このサイクルを繰り返すことにより、固相（ＣＰＧ）に担持されたＡＭＯを合成した。ＳＭｅ＿ＰＯで構成されたＡＭＯの合成スキームを下記に示す。
【化２７】
0006029147.tif 000029
【００８８】
（Ｂ．Ｍｅ＿ＰＳで構成されたＡＭＯ，及びＳＭｅ＿ＰＳで構成されたＡＭＯの合成方法）
前述のＡにおける、酸化剤としてのヨウ素に換えて、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（ビューケージ試薬）を用いてリン酸を硫化し、前述のＡと同様にＡＭＯを合成した。ＳＭｅ＿ＰＳで構成されたＡＭＯの合成スキームを下記に示す。
【化２８】
0006029147.tif 000030
【００８９】
（Ｃ．コンジュゲート型ＡＭＯの合成方法）
α−トコフェロールのアミダイト体を０．１Ｍの１０％ＴＨＦ／アセトニトリル溶液に調製して、前述のＢと同様の縮合反応により、ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ，ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃを得た。α−トコフェロールのアミダイト体は、下記の通りα−トコフェロールから合成した。
【化２９】
0006029147.tif 000031
５’−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＴＥＧ（トリエチレングリコール）のアミダイト体（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を０．１Ｍの１０％ＴＨＦ／アセトニトリル溶液に調製して、前述のＢと同様の縮合反応により、ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ，ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌを得た。
１μｍｏｌの３’−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＴＥＧが担持されたＣＰＧ樹脂（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、前述のＢと同様の縮合反応により、ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌ，ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌを得た。
５’−ＰＭＳＡリガンドのアミダイト体を０．１Ｍのアセトニトリル溶液に調製して、前述のＢと同様の縮合反応により、ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’ＰＭＳＡ，ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’ＰＭＳＡを得た。５’−ＰＭＳＡリガンドのアミダイト体は、下記の通りＬ−リシンから合成した。
【化３０】
0006029147.tif 000032
【００９０】
（Ｄ．ＡＭＯ２１＿ＦＭｅ＿ＰＯ及びＡＭＯ２１＿ＳＦＭｅ＿ＰＯの合成方法）
比較例のＡＭＯ２１＿ＦＭｅ＿ＰＯ，ＡＭＯ２１＿ＳＦＭｅ＿ＰＯは、常法に従い、前述のＡと同様に合成した。【００９１】
合成終了後、ＡＭＯが担持されたＣＰＧをバイアルに移し、２８％アンモニア水／エタノール（３：１，２ｍＬ）を添加して５５℃で１６時間静置し、ＡＭＯの切り出し、脱保護を行った。反応液をガラスフィルターでろ過し、溶媒を減圧下留去した。５’末端にＤＭＴｒ基を残した状態で合成した非コンジュゲート型のＡＭＯは、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ｍ８０，１５０×４．６ｍｍ，５−５０％  アセトニトリル  ｉｎ  ０．１Ｎ  ＴＥＡＡバッファー，ｐＨ７．０）で粗精製を行い、ＤＭＴｒ基をもつ完全鎖長のＡＭＯを含むフラクションを回収して溶媒を減圧下留去した。Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて残渣の脱塩を行った後、塩酸（ｐＨ２．０）を加えて２０分間室温で処理して５’末端のＤＭＴｒ基を除去した。その反応液を希釈したアンモニア水溶液で中和した後、溶媒を減圧下留去した。コンジュゲート型及び非コンジュゲート型の完全鎖長のＡＭＯを含む残渣をＣ１８逆相ＨＰＬＣ（Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ｍ８０，１５０×４．６ｍｍ，５−５０％  アセトニトリル  ｉｎ  ０．１Ｎ  ＴＥＡＡバッファー，ｐＨ７．０）で精製した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８を用いて脱塩を行うことで、高純度の各ＡＭＯを得た。【００９２】
精製した各ＡＭＯの構造については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＡＳＳ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）により解析して、その分子量を求めた。その解析結果を以下に示す。
ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＯ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２３１Ｈ３０２Ｎ８２Ｏ１５０Ｐ２１  ７２７６．３（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，７２７３．８０．
ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＯ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２３１Ｈ３０２Ｎ８２Ｏ１２８Ｐ２１Ｓ２２  ７６２７．８０（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，７６２６．５０．
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＯ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２４０Ｈ３１８Ｎ８５Ｏ１５４Ｐ２２  ７５３９．４０（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，７５３８．５２．
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２４０Ｈ３１８Ｎ８５Ｏ１３２Ｐ２２Ｓ２２  ７８９１．８９（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，７８８６．６４．
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＯ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２４０Ｈ３１８Ｎ８５Ｏ１３１Ｐ２２Ｓ２３  ７９０６．８７（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，７９０６．７２．
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２４０Ｈ３１８Ｎ８５Ｏ１０９Ｐ２２Ｓ４５  ８２６１．３６（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，８２６１．６６．
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２７５Ｈ３７８Ｎ８６Ｏ１３８Ｐ２３Ｓ２３  ８５４３．２８（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，４５４６．７８．
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２７５Ｈ３７８Ｎ８６Ｏ１１５Ｐ２３Ｓ４６  ８９１３．７５（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，８９１６．８１．
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２８１Ｈ３９０Ｎ８６Ｏ１４０Ｐ２３Ｓ２３  ８６６１．３６（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，８６６２．１７．
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２８１Ｈ３９０Ｎ８６Ｏ１１７Ｐ２３Ｓ４６  ９０３０．８３（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，９０３３．７７．
ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２８１Ｈ３９０Ｎ８６Ｏ１４０Ｐ２３Ｓ２３  ８６６１．３６（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，８６６２．０４．
ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２８１Ｈ３９０Ｎ８６Ｏ１１７Ｐ２３Ｓ４６  ９０３０．８３（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，９０３２．１３．
ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’ＰＳＭＡ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２５２Ｈ３３８Ｎ８５Ｏ１４３Ｐ２２Ｓ２２  ８２３１．９９（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，８２３１．９９．
ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’ＰＳＭＡ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ，Ｃ２５２Ｈ３３８Ｎ８５Ｏ１２１Ｐ２２Ｓ４４  ８５８５．４９（Ｍ−Ｈ）；ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｍａｓｓ，８５８５．４９【００９３】
図１に、非コンジュゲート型ＡＭＯ２１（２２ｍｅｒシリーズ：配列番号３，３２ｍｅｒシリーズ：配列番号４）の配列及び５０％融解温度（Ｔｍ値）を示す。Ｔｍ値を測定した結果（測定条件：１０  ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ塩化ナトリウム，３μＭ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、本発明の実施例による非コンジュゲート型ＡＭＯ２１は、相補鎖ＲＮＡであるｍｉＲＮＡ２１と熱的に安定な二本鎖形成能を有することが示された。【００９４】
図２に、非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２（配列番号５）の配列及びＴｍ値を示す。Ｔｍ値を測定した結果（測定条件は前述と同様）、本発明の実施例による非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２は、相補鎖ＲＮＡであるｍｉＲＮＡ１２２と熱的に安定な二本鎖形成能を有することが示された。
【実施例２】
【００９５】
（ｍｉＲＮＡのレポーターベクターの構築）
ｐｍｉｒＧＬＯベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入）のホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域部（３’ＵＴＲ）にｍｉＲＮＡ−２１の完全相補の配列（配列番号６）又はｍｉＲＮＡ−１２２の完全相補の配列（配列番号７）を２つ直列に並べた配列をクローニングして、ｍｉＲＮＡのレポーターベクターを構築した（図３）。ｐｍｉｒＧＬＯベクターは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）とウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を発現する。
【実施例３】
【００９６】
（ＡＭＯのアッセイ）
図４に示すように、ｍｉＲＮＡ２１用としてＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、又はｍｉＲＮＡ１２２用としてＨｕｈ−７細胞（ｍｉＲＮＡ１２２が高発現している細胞）を９６ｗｅｌｌプレート（ＬｕｍｉＮｕｎｃ  ９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の各ウェルに１０，０００細胞ずつ播種して３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベーションした。２４時間後、ＡＭＯ及び前述のレポーターベクター（０．１μｇ／ｗｅｌｌ）をリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用いて、コトランスフェクションしてインキュベーションした。この際、培地にはＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用いた。６時間後、完全培地（１０％ＦＢＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ）に培地交換して再びインキュベーションした。コトランスフェクション２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に、細胞をＬｙｓｉｓバッファーを用いて溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比（％）（図５〜１２）は、ホタルルシフェラーゼ活性の値をウミシイタケルシフェラーゼの活性で補正し、ｍｉｒＧＬＯを投与した細胞の活性を１００％としたときの、各ＡＭＯ投与細胞の活性の相対値である。各実験を３回以上行い、その平均値と標準偏差をとった値とした。【００９７】
（非コンジュゲート型ＡＭＯ２１活性の評価）
コトランスフェクション２４時間後の結果を図５に示す。ｍｉｒＧＬＯは、レポーターベクターのみを添加したコントロールである。ｍｉｒＧＬＯ  ｍｉＲ２１  Ｓｃｒ（スクランブル）は、３’ＵＴＲの配列を変えたレポーターベクターのみを添加したものであり、ｍｉＲＮＡ２１が３’ＵＴＲに結合できないため、Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比は高くなる。ｍｉｒＧＬＯ  ｍｉＲ２１は、レポーターベクター及びｍｉＲＮＡ２１を添加したものであり、ｍｉＲＮＡ２１が３’ＵＴＲに結合するため、Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比は低くなる。また、図５において、各ＡＭＯの濃度は、各ＡＭＯの３つのカラムの左側から順に、５０ｎＭ，５ｎＭ，０．５ｎＭである。
比較例であるＡＭＯ２１（３２）＿Ｍｅ、ＡＭＯ２１＿Ｍｅ＿ＰＯ、ＡＭＯ２１＿ＦＭｅ＿ＰＯ、及びＡＭＯ２１＿ＳＦＭｅ＿ＰＯに比して、ＡＭＯ２１（３２）＿ＳＭｅ、ＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＯ、及びＡＭＯ２１＿ＳＭｅ＿ＰＳでは用量依存的にＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比が高いことが示された。これは、本発明の実施例による非コンジュゲート型ＡＭＯ２１がｍｉＲＮＡ２１に結合することで、ｍｉＲＮＡ２１がレポーターベクターの３’ＵＴＲに結合できず、Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比が高くなったものである。このことから、本発明の実施例によるＡＭＯ２１は、ｍｉＲＮＡ２１を抑制することが示された。【００９８】
（非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２活性の評価）
コトランスフェクション２４時間後の結果を図６に、４８時間後の結果を図７に、７２時間後の結果を図８に示す。図６〜８において、各ＡＭＯの濃度は、各ＡＭＯの４つのカラムの左側から順に、１０ｎＭ，５ｎＭ，１ｎＭ，０．５ｎＭである。
図６〜８において、比較例であるＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＯ及びＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳに比して、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＯ及びＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳでは、用量依存的にＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比が高いことが示された。
また、図９にＡＭＯ濃度５ｎＭでの非コンジュゲート型ＡＭＯ１２２活性の経時的変化を示す。比較例であるＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＯ及びＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳに比して、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＯ及びＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳでは良好にＡＭＯ１２２活性が維持されており、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳでは、時間の経過とともにＡＭＯ１２２活性が向上した。このことから、本発明の実施例によるＡＭＯ１２２は、ｍｉＲＮＡ１２２を持続的に抑制することが示された。【００９９】
（コンジュゲート型ＡＭＯ１２２活性の評価）
コトランスフェクション２４時間後の結果を図１０に、４８時間後の結果を図１１に、７２時間後の結果を図１２に示す。図１０〜１２において、各ＡＭＯの濃度は、各ＡＭＯの４つのカラムの左側から順に、１０ｎＭ，５ｎＭ，１ｎＭ，０．５ｎＭである。
図１０〜１２において、比較例であるＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ、ＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ、及びＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌに比して、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｔｏｃ、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿５’Ｃｈｏｌ、及びＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ＿３’Ｃｈｏｌでは、用量依存的にＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ相対比が高いことが示され、それは非コンジュゲート型のＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳと同程度であった。このことから、本発明の実施例によるコンジュゲート型ＡＭＯは、非コンジュゲート型ＡＭＯと同様に、ｍｉＲＮＡを抑制することが示された。
【実施例４】
【０１００】
（リアルタイムＰＣＲ法による分析）
Ｈｕｈ−７細胞にＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ、又は比較例としてＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳを各々トランスフェクションし、トランスフェクション４８時間後のｍｉＲＮＡ１２２発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ法により定量した。【０１０１】
以下、リアルタイムＰＣＲの手順について、説明する。【０１０２】
Ｈｕｈ−７細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ社）（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ  ｍＬ−１ペニシリン、及び１００μｇ  ｍＬ−１ストレプトマイシン含有）において、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。【０１０３】
ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）（１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１００ｕｎｉｔｓ  ｍＬ−１ペニシリン、及び１００μｇ  ｍＬ−１ストレプトマイシン含有）中で、細胞を６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに１．５×１０５細胞ずつ播種した。２４時間後、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳ又はＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、添付の使用説明書に従ってトランスフェクションし、３７℃でインキュベーションした。この際、培地にはＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。トランスフェクション６時間後、完全培地（前述同様のＤＭＥＭ）で培地交換して、再び３７℃でインキュベーションした。トランスフェクション４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗い、ＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を加えて細胞を溶解した。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、トータルＲＮＡを抽出した。【０１０４】
抽出したＲＮＡサンプル１０ｎｇを用い、逆転写反応を行った。逆転写反応には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のｍｉＲＮＡ１２２特異的なＲＴ−プライマー、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った（１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間）。【０１０５】
前述で得られた逆転写反応液１.３３μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ｍｉＲＮＡ１２２特異的なフォワードプライマー、ｍｉＲＮＡ１２２特異的なリバースプライマー、及びｍｉＲＮＡ１２２特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを混合させたもの）（Ａｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１.０μＬ、及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ（Ａｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬを混合して、リアルタイムＰＣＲ法により細胞のｍｉＲＮＡ１２２発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、そして９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル行った。この際、内部標準遺伝子としてのＲＮＵ６Ｂ発現量をもって、ｍｉＲＮＡ１２２発現量を標準化した。【０１０６】
結果を図１３に示す。図１３では、「ＮＴ」（ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ：未処理の細胞）のｍｉＲＮＡ１２２発現量を１００とした場合の、「ＮＴ」に対する各ＡＭＯのｍｉＲＮＡ１２２発現量の割合で表される。また、各ＡＭＯの濃度は、各ＡＭＯの２つのカラムの左側から順に、５ｎＭ、２５ｎＭである。
比較例であるＡＭＯ１２２＿Ｍｅ＿ＰＳに比して、ＡＭＯ１２２＿ＳＭｅ＿ＰＳでは、より低くｍｉＲＮＡ１２２発現レベルが抑えられた。また、ｍｉＲＮＡ１２２発現レベル抑制は、用量依存的であった。このことから、リアルタイムＰＣＲ法よる定量においても、本発明の実施例によるＡＭＯ１２２は、ｍｉＲＮＡ１２２を抑制することが示された。【０１０７】
以上説明したように、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、生体内使用に耐え得る良好な効果持続性、及び熱的安定性を有するため、ｍｉＲＮＡの効率的な機能制御が可能である。【０１０８】
なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１０９】
本発明は、２０１１年６月３日に出願された日本国特許出願２０１１−１２５７３４号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１１−１２５７３４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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