(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体と、
−  １−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンと、
−  界面活性剤
からなる脂質粒子であって、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンの１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンに対するモル比が９９：１〜２５：７５である、脂質粒子。
【請求項２】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体が、３つの単量体を含む多量体であることを特徴とする、請求項１に記載の脂質粒子。
【請求項３】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉが、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号０６又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の脂質粒子。
【請求項４】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉのアミノ酸配列が、１以上の保存的アミノ酸変更を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項５】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉのアミノ酸配列が、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号０６又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％相同であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項６】
キュビリン、スカベンジャー受容体クラスＢ１型（ＳＲ−ＢＩ）、ＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣＡ−１）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、コレステリル−エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、又はリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）からなる群より選択される受容体に結合することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項７】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、４０〜１２０であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項８】
アポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、５０〜１１０であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項９】
アポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、５４〜１０２であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１０】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、６０〜９０であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１１】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、６０〜８８であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１２】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、６２〜８０であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１３】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、６４〜７０であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１４】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、６６〜８６であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１５】
脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、約６６であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
検出可能な標識を含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子を含む、組成物。
【請求項１８】
医薬として使用するための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１９】
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための医薬、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための医薬、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための医薬、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための医薬、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための医薬、あるいは
−  内毒素を除去するための医薬、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための医薬、
−  狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  心筋梗塞を処置するための医薬、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための医薬、あるいは
−  血管性認知症を処置するための医薬、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための医薬
として使用するための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２０】
医薬を製造するための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子の使用。
【請求項２１】
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための医薬、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための医薬、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための医薬、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための医薬、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための医薬、あるいは
−  内毒素を除去するための医薬、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための医薬、
−  狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  心筋梗塞を処置するための医薬、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための医薬、あるいは
−  血管性認知症を処置するための医薬、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための医薬
を製造するための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質及び脂質粒子の分野におけるものである。アポリポタンパク質、ホスファチジルコリン及び脂質を含む脂質粒子に加えて、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、及びこれらの使用について本明細書に報告する。
【０００２】
発明の背景
血漿リポタンパク質は、血液において脂質輸送及び代謝を行う可溶性のタンパク質−脂質複合体である。いくつかの主なクラスのリポタンパク質は、その密度、サイズ、化学組成及び機能に基づいて識別される。特に、高密度脂質粒子とも呼ばれる高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子は、１８０kDa〜３６０kDaの様々な平均分子量の幾つかのサブクラスで構成される。これらの脂質及びタンパク質の平均含有量は、各々５０重量％である。ホスファチジルコリン（ＰＣ）が脂質全体の３８％を占め、次いで、コレステロールエステル、ならびに遊離コレステロールを含む少量の他の極性及び無極性の脂質である。主なタンパク質構成要素は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Apo A-I）であり、これはヒトＨＤＬにおける総タンパク質重量の約６０％に相当する。
【０００３】
ＨＤＬ粒子及びその主なポリペプチドであるアポリポタンパク質Ａ−Ｉは、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）に関与する。コレステロール逆輸送において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、細胞、例えば血管壁の細胞からのコレステロールの流出、脂質の結合、及びレシチン−コレステロール−アセチル−トランスフェラーゼの活性化を増加させて、肝臓による血漿の流れを介してコレステロールを排泄する。これは、細胞膜タンパク質であるＡＴＰ−結合カセット輸送体−Ａ−Ｉ（ABCA-I）の関与する能動輸送プロセスである。
【０００４】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びアポリポタンパク質に基づく治療法、例えば再構成されたＨＤＬ粒子は、１９７０年代後半及び１９８０年代前半には既に同定されていた。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Milanoを含有する脂質粒子については、臨床的証拠（動脈硬化の患者におけるプラークの著しい減少を意味する）を示すことができた。野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの二量体型であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Milanoは、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の天然に存在する突然変異体に従って設計された。アミノ酸残基１７３（アルギニン）をシステインに置換してジスルフィド結合の形成を可能にすることにより、二量体が形成可能になる。
【０００５】
WO2009/131704では、無機物質を含むコアを含む、コレステロール及び他の分子を隔離するのに適切なナノ構造が報告されている。WO2006/125304では、冠動脈疾患を処置又は予防するための医薬組成物が報告されている。脂質代謝及び心血管疾患に関連するアポリポタンパク質をコードする組成物は、US2002/0142953に報告されている。WO2005/084642では、アポタンパク質−コキレート（cochelate）組成物が報告されている。WO2009/036460では、改変型のヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉポリペプチド及びその使用が報告されている。二量体型及び／又はオリゴマー型のヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉタンパク質突然変異タンパク質の植物による生産が、WO2008/017906に報告されている。WO2007/137400では、弁狭窄を処置するための方法及び化合物が報告されている。WO2006/100567では、帯電したリポタンパク質複合体及びその使用が報告されている。
【０００６】
US2002/0156007では、アポリポタンパク質類似体が報告されている。テトラネクチン三量体化ポリペプチドが、US2010/0028995に報告されている。Graversen, J.H.らによるJ. Cardiovascular Pharmacol. (51 (2008) 170-177)では、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの三量体化が、血漿クリアランスを遅らせ、そして抗アテローム動脈硬化特性を保つことが報告されている。心血管疾患を処置するための新規治療手段である高密度リポタンパク質投与は、Sirtori, C.R., et al. (Curr. Med. Chem. Immunol. Endocrine Metabol. Agents 5 (2005) 321-333に報告されている。
【０００７】
WO03/097696では、虚血再灌流を処置するための方法及び組成物が報告されている。ナノスケール結合型二重層、使用及び製造の方法が、WO2009/097587に報告されている。WO2007/098122では、黄プラーク変性及び関連する眼症状を処置するための方法が報告されている。アポリポタンパク質類似体は、WO02/38609に報告されている。WO2005/041866では、医薬製剤が報告されている。冠不全症候群を処置及び予防するための方法及び投与計画が報告されている。脂質異常症性（dislipidemic）障害を処置するための遺伝子治療、アポリポタンパク質Ａ−Ｉアゴニストを供給するアプローチ、及びその使用が、WO99/16409に報告されている。WO2008/106660では、単離されたリン脂質−タンパク質粒子が報告されている。アポリポタンパク質（APO A-I）模倣ペプチド／リン脂質複合体を使用する拡張機能障害を予防及び処置するための方法が、WO2010/083611に報告されている。WO2008/156873では、APO A-Iペプチド模倣体が報告されている。封入ＨＤＬ模倣ペプチドが、WO2008/094905に報告されている。WO98/56906では、三量体化モジュールが報告されている。
【０００８】
発明の概要
本明細書においては、１つの態様として、特に培養中の副生成物の形成が少ない改善された生成特性、及び改善された下流加工特性を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉについて報告する。
【０００９】
また、本明細書において、１つの態様として、アポリポタンパク質と、ホスファチジルコリンと、更なる脂質、例えば、リン脂質、リゾリン脂質、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、脂肪酸、トリグリセリドもしくはステロイド脂質、コレステロール、コレステロールエステル、又はこれらの類似体もしくは誘導体とを含む脂質粒子について報告する。
【００１０】
１つの実施形態では、脂質粒子は、アポリポタンパク質を１種のみ含む。
【００１１】
１つの実施形態では、脂質粒子は、１つのアポリポタンパク質、ホスファチジルコリン、更なる脂質及び界面活性剤からなる。
【００１２】
１つの実施形態では、更なる脂質は、ホスファチジルコリンであり、両ホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリンのホスホグリセロール骨格にエステル化される１つもしくは２つのカルボン酸部分又はカルボン酸部分誘導体において異なる。
【００１３】
更なる実施形態では、アポリポタンパク質は、ヒトのアポリポタンパク質Ａであり、別の実施形態では、多量体化ドメインにコンジュケートされたヒトのアポリポタンパク質であり、そして、更なる実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉである。１つの実施形態では、アポリポタンパク質は、配列番号０１、０２、０６、６６及び６７から選択されるアミノ酸配列を有するアポリポタンパク質であるか、又は選択された配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアポリポタンパク質の変異体である。
【００１４】
１つの実施形態では、脂質粒子は、
ａ）アポリポタンパク質と、
ｂ）ホスファチジルコリンと、
ｃ）更なる脂質とを含み、
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン、スフィンゴシンＩ−リン酸、コール酸（cholate）もしくはジミリストイルホスファチジルグリセロールである場合、前記アポリポタンパク質は、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉである、及び／又は
前記脂質が、小さなアルキル鎖リン脂質、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、セレブロシド、リゾレシチン、セファリン、カルジオリピン、リン酸ジセチル又はコレステロールである場合、前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉミラノではない。
【００１５】
別の実施形態では、脂質粒子は、
ａ）アポリポタンパク質と、
ｂ）ホスファチジルコリンと、
ｃ）更なる脂質とを含み、
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴシンＩ−リン酸もしくはコール酸である場合、前記アポリポタンパク質は、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉである、及び／又は
前記脂質が、小さなアルキル鎖リン脂質、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、セレブロシド、リゾレシチン、セファリン、カルジオリピン、リン酸ジセチル又はコレステロールである場合、前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉミラノではない。
【００１６】
１つの実施形態では、更なる脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸以外の任意の脂質である。
【００１７】
１つの実施形態では、更なる脂質は、第２のホスファチジルコリンである。１つの実施形態では、ホスファチジルコリンはＰＯＰＣであり、そして、第２のホスファチジルコリンはＤＰＰＣである。
【００１８】
１つの実施形態では、ホスファチジルコリンの脂質に対するモル比は、９９：１〜１：９９である。別の実施形態では、ホスファチジルコリンの脂質に対するモル比は、９９：１〜１０：９０である。更なる実施形態では、ホスファチジルコリンの脂質に対するモル比は、９９：１〜２５：７５である。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、ホスファチジルコリン及び脂質と非共有結合する。
【００１９】
１つの実施形態では、ＰＯＰＣのＤＰＰＣに対するモル比は、９９：１〜１：９９である。別の実施形態では、ＰＯＰＣのＤＰＰＣに対するモル比は、９９：１〜１０：９０である。更なる実施形態では、ＰＯＰＣのＤＰＰＣに対するモル比は、９９：１〜２５：７５である。
【００２０】
別の実施形態では、アポリポタンパク質は、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣと非共有結合する。
【００２１】
１つの実施形態では、アポリポタンパク質は、３つのアポリポタンパク質単量体を含む多量体である。別の実施形態では、多量体は、３つのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体を含む。
【００２２】
１つの実施形態では、脂質粒子は、０．７５重量％未満の界面活性剤を含む。１つの実施形態では、界面活性剤は、糖系界面活性剤、ポリオキシアルキレン系界面活性剤、胆汁酸塩系界面活性剤、合成界面活性剤及びこれらの組合せから選択される。別の実施形態では、界面活性剤はコール酸である。
【００２３】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのホスファチジルコリン分子及び脂質分子の合計数は、４０〜１２０、１つの実施形態では５０〜１１０、１つの実施形態では５４〜１０２、１つの実施形態では６０〜９０、１つの実施形態では６５〜７０である。
【００２４】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのホスファチジルコリン分子及び脂質分子の合計数は、６０〜９０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのホスファチジルコリン分子及び脂質分子の合計数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのホスファチジルコリン分子及び脂質分子の合計数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのホスファチジルコリン分子及び脂質分子の合計数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのホスファチジルコリン分子及び脂質分子の合計数は、約６６である。
【００２５】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの分子の合計数は、４０〜１１５、更なる実施形態では５０〜１１０、そして、別の実施形態では５４〜１０２である。
【００２６】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの分子の合計数は、６０〜９０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの分子の合計数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの分子の合計数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの分子の合計数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの分子の合計数は、約６６である。
【００２７】
１つの実施形態では、脂質粒子は、キュビリン、スカベンジャー受容体クラスＢ１型（ＳＲ−ＢＩ）、ＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣＡ−１）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、コレステリル−エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、又はリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）からなる群より選択される受容体に結合することができる。
【００２８】
本明細書に報告される更なる態様は、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質を含む医薬組成物である。
【００２９】
本明細書に報告される１つの態様は、医薬として使用するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質である。
【００３０】
本明細書に報告される１つの態様は、医薬を製造するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の使用である。
【００３１】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の医薬を製造するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の使用である：
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための医薬、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための医薬であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質が、被験体においてコレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量含まれる医薬、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための医薬、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための医薬、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための医薬、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための医薬、あるいは
−  内毒素を除去するための医薬、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための医薬、
−  狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  心筋梗塞を処置するための医薬、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための医薬、あるいは
−  血管性認知症を処置するための医薬、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための医薬。
【００３２】
本明細書に報告される１つの態様は、医薬の製造における、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の使用である。
【００３３】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の医薬を製造するための方法である：
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための医薬、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための医薬であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質が、被験体においてコレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量含まれる医薬、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための医薬、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための医薬、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための医薬、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための医薬、あるいは
−  内毒素を除去するための医薬、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための医薬、
−  狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  心筋梗塞を処置するための医薬、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための医薬、あるいは
−  血管性認知症を処置するための医薬、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための医薬。
【００３４】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の方法である：
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための方法、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質が、被験体においてコレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量含まれる方法、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための方法、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための方法、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための方法、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための方法、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための方法、あるいは
−  内毒素を除去するための方法、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための方法、
−  狭心症を処置するための方法、あるいは
−  心筋梗塞を処置するため、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための方法、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための方法、あるいは
−  血管性認知症を処置するための方法、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための方法。
【００３５】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の処置において使用するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質である：
−  急性冠動脈症候群、又は
−  アテローム動脈硬化、又は
−  被験体の血管におけるアテロームプラーク、又は
−  被験体における弁狭窄、又は
−  敗血症性ショック、又は
−  狭心症、又は
−  心筋梗塞、又は
−  不安定狭心症、又は
−  動脈狭窄、又は
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、又は
−  頸動脈狭窄、又は
−  大脳動脈狭窄、又は
−  冠状動脈動脈狭窄、又は
−  血管性認知症、又は
−  一過性黒内障。
【００３６】
本明細書に報告される１つの態様は、以下において使用するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質である：
−  コレステロール逆輸送の誘導、あるいは
−  プラーク軽減の誘導、あるいは
−  アテロームプラークの除去又は溶解又は安定化、あるいは
−  動脈壁から肝臓へのコレステロールの再分配、あるいは
−  ＨＤＬ粒子の数の増加、あるいは
−  内毒素の除去。
【００３７】
本明細書に報告される１つの態様は、急性冠動脈症候群、又はアテローム動脈硬化、又は血管におけるアテロームプラーク、又は弁狭窄、又は敗血症性ショック、又は狭心症、又は心筋梗塞、不安定狭心症、又は動脈狭窄、又は末梢動脈障害（ＰＡＤ）、又は頸動脈狭窄、又は大脳動脈狭窄、又は冠状動脈動脈狭窄、又は血管性認知症、又は一過性黒内障を有する個体を処置する方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の有効量を前記個体に投与することを含む方法である。
【００３８】
本明細書に報告される１つの態様は、個体においてコレステロール逆輸送を誘導するか、又はプラーク軽減を誘導するか、又はアテロームプラークを除去もしくは溶解もしくは安定化するか、又は動脈壁から肝臓へコレステロールを再分配するか、又はＨＤＬ粒子の数を増加させるか、又は内毒素を除去する方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の有効量を前記個体に投与して、コレステロール逆輸送を誘導するか、又はプラーク軽減を誘導するか、又はアテロームプラークを除去もしくは溶解もしくは安定化するか、又は動脈壁から肝臓へコレステロールを再分配するか、又はＨＤＬ粒子の数を増加させるか、又は内毒素を除去することを含む方法である。
【００３９】
１つの実施形態では、非正常な脂質レベルは、体液におけるレベルである。別の実施形態では、体液は、全血又は血清である。
【００４０】
１つの実施形態では、非正常な脂質レベルは、上昇したコレステロールレベルである。
【００４１】
１つの実施形態では、脂質含有沈着物は、血管におけるプラークである。
【００４２】
１つの実施形態では、疾患は心血管疾患である。
【００４３】
本明細書に報告される１つの態様は、非正常な脂質レベル又は身体の構成要素における脂質含有沈着物を特徴とする疾患又は症状を処置する方法であって、
ｉ）治療上有効量の本明細書に報告される脂質粒子を、処置又は人工系を必要とする被験体に投与することと、
ii）場合により、被験体の脂質レベル又は脂質含有沈着物の変化についてモニタすることとを含む方法である。
【００４４】
本明細書に報告される１つの態様は、急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質を、それを必要としている被験体に投与することを含む方法である。
【００４５】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質を含む診断用組成物であって、サンプル又は被験体内における標識アポリポタンパク質又は標識脂質粒子の検出を可能にするために前記アポリポタンパク質が標識されている組成物である。
【００４６】
本明細書に報告される１つの態様は、診断のための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の使用である。
【００４７】
本明細書に報告される１つの態様は、非正常な脂質レベル又は脂質含有沈着物の存在を特徴とする疾患又は症状に罹患している被験体の予防又は処置のための、本明細書に報告される脂質粒子の使用である。
【００４８】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又は本明細書に報告される融合タンパク質をコードする核酸、及び本明細書に報告される核酸を含む細胞である。
【００４９】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又はその薬学的に許容しうる塩もしくはそのプロドラッグである。１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、１以上の保存的アミノ酸変更を有する配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、１以上のアミノ酸が置換、付加、又は欠失されている配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有する。
【００５０】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉである。１つの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【００５１】
１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体又はテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体は、キュビリン、スカベンジャー受容体クラスＢ１型（ＳＲ−ＢＩ）、ＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣＡ−１）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、コレステリル−エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、又はリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）からなる群より選択される受容体に結合することができる。
【００５２】
本明細書に報告される１つの態様は、３つのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体を含む多量体であって、前記テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体が互いに共有結合していない多量体である。
【００５３】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号０１、配列番号０２又は配列番号６６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸、及び前記融合タンパク質をコードする核酸を含むプラスミドである。
【００５４】
１つの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ−末端から−Ｃ末端方向に以下を含む：
−  アミノ酸メチオニン（Ｍ）、
−  CDLPQTHSL（配列番号５５）のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列の断片、
−  ＧＳリンカー、
−  HHHHHH（配列番号５６）のアミノ酸配列を有するヘキサ−ヒスチジンタグ、
−  ＧＳリンカー、
−  VVAPPAP（配列番号６０）のアミノ酸配列を有するＩｇＡプロテアーゼ切断部位、及び
−  配列番号０２のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
【００５５】
１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する。
【００５６】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告される融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞である。１つの実施形態では、細胞は、CSPZ-2、K12株294(ATCC 31446)、Ｂ、X 1776(ATCC 31537)、W3110(ATCC 273325)、BL21、RM_82、SCS_110、Ｇ、XL-1_F-、SE_13009、LA_5709、C600、CSH_1、TG_1、UT400、及びUT5600等の大腸菌（E.coli）株から選択される。
【００５７】
本明細書に報告される１つの態様は、
ａ）配列番号０１、配列番号０２、配列番号６６及び配列番号６７のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉと、
ｂ）ホスファチジルコリンと、
ｃ）脂質とを含む脂質粒子である。
【００５８】
１つの実施形態では、脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン、スフィンゴシンＩ−リン酸、コール酸、又はジミリストイルホスファチジルグリセロールから選択される。
【００５９】
１つの実施形態では、脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸以外の任意の脂質である。
【００６０】
１つの実施形態では、脂質粒子は、
ａ）配列番号０１、配列番号０２、配列番号６６及び配列番号６７のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉと、
ｂ）第１のホスファチジルコリンと、
ｃ）第２のホスファチジルコリンとを含む。
【００６１】
１つの実施形態では、第１のホスファチジルコリンはＰＯＰＣであり、そして、第２のホスファチジルコリンはＤＰＰＣである。１つの実施形態では、脂質粒子を生成するための第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜１：９９である。１つの実施形態では、脂質粒子を生成するための第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜１０：９０である。１つの実施形態では、脂質粒子を生成するための第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜２５：７５である。１つの実施形態では、脂質粒子を生成するための第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜５０：５０である。１つの実施形態では、脂質粒子を生成するための第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、約７５：２５である。
【００６２】
１つの実施形態では、第１のホスファチジルコリンはＰＯＰＣであり、そして、第２のホスファチジルコリンはＤＰＰＣである。１つの実施形態では、脂質粒子における第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜１：９９である。１つの実施形態では、脂質粒子における第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜１０：９０である。１つの実施形態では、脂質粒子における第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜２５：７５である。１つの実施形態では、脂質粒子における第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、９９：１〜５０：５０である。１つの実施形態では、脂質粒子における第１のホスファチジルコリンの第２のホスファチジルコリンに対するモル比は、約７５：２５である。
【００６３】
１つの実施形態では、アポリポタンパク質は、第１のホスファチジルコリン及び脂質と非共有結合する。１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、第１のホスファチジルコリン及び第２のホスファチジルコリンと非共有結合する。
【００６４】
１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、３つのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体を含む多量体である。
【００６５】
１つの実施形態では、脂質粒子は、０．７５重量％未満の界面活性剤を含む。１つの実施形態では、界面活性剤は、糖系界面活性剤、ポリオキシアルキレン系界面活性剤、胆汁酸塩系界面活性剤、合成界面活性剤及びこれらの組合せから選択される。１つの実施形態では、界面活性剤は、コール酸又はツヴァイタージェント（Zwittergent）である。
【００６６】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の合計数は、４０〜１２０、更なる実施形態では５０〜１１０、そして、別の実施形態では５４〜１０２である。１つの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリンである。
【００６７】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質を含む医薬組成物である。
【００６８】
本明細書に報告される１つの態様は、医薬として使用するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質である。
【００６９】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の医薬を製造するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の使用である：
−  続発性主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）の予防のための医薬、
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための医薬、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための医薬であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質が、被験体においてコレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量含まれる医薬、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための医薬、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための医薬、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための医薬、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための医薬、あるいは
−  内毒素を除去するための医薬、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための医薬、
−  狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  心筋梗塞を処置するための医薬、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための医薬、あるいは
−  血管性認知症を処置するための医薬、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための医薬。
【００７０】
本明細書に報告される１つの態様は、医薬の製造における、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質の使用である。
【００７１】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の医薬を製造するための方法である：
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための医薬、あるいは
−  続発性主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）の予防のための医薬、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための医薬であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質が、被験体においてコレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量含まれる医薬、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための医薬、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための医薬、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための医薬、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための医薬、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための医薬、あるいは
−  内毒素を除去するための医薬、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための医薬、
−  狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  心筋梗塞を処置するための医薬、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための医薬、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための医薬、あるいは
−  血管性認知症を処置するための医薬、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための医薬。
【００７２】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の方法である：
−  急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための方法、あるいは
−  続発性主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）の予防のための方法、あるいは
−  アテローム動脈硬化を予防又は処置するための方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質が、被験体においてコレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量含まれる方法、あるいは
−  コレステロール逆輸送及び／又はプラーク軽減を誘導するための方法、あるいは
−  被験体の血管におけるアテロームプラークを除去／溶解／安定化するため、又は被験体の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するための方法、あるいは
−  被験体における弁狭窄を予防又は処置するための方法、あるいは
−  被験体におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるための方法、あるいは
−  被験体においてコレステロール逆輸送を開始させるための方法、あるいは
−  内毒素を除去するための方法、あるいは
−  敗血症性ショックを予防するための方法、
−  狭心症を処置するための方法、あるいは
−  心筋梗塞を処置するため、あるいは
−  不安定狭心症を処置するための方法、あるいは
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄、大脳動脈狭窄又は冠状動脈動脈狭窄等の動脈狭窄を処置するための方法、あるいは
−  血管性認知症を処置するための方法、あるいは
−  一過性黒内障を処置するための方法。
【００７３】
本明細書に報告される１つの態様は、以下の処置又は予防において使用するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質である：
−  急性冠動脈症候群、又は
−  続発性主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）、又は
−  アテローム動脈硬化、又は
−  被験体の血管におけるアテロームプラーク、又は
−  被験体における弁狭窄、又は
−  敗血症性ショック、又は
−  狭心症、又は
−  心筋梗塞、又は
−  不安定狭心症、又は
−  動脈狭窄、又は
−  末梢動脈障害（ＰＡＤ）、又は
−  頸動脈狭窄、又は
−  大脳動脈狭窄、又は
−  冠状動脈動脈狭窄、又は
−  血管性認知症、又は
−  一過性黒内障。
【００７４】
本明細書に報告される１つの態様は、以下において使用するための、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告されるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、又は本明細書に報告される融合タンパク質である：
−  コレステロール逆輸送の誘導、あるいは
−  プラーク軽減の誘導、あるいは
−  アテロームプラークの除去又は溶解又は安定化、あるいは
−  動脈壁から肝臓へのコレステロールの再分配、あるいは
−  ＨＤＬ粒子の数の増加、あるいは
−  内毒素の除去。
【００７５】
本明細書に報告される１つの態様は、急性心イベントを有するＥＲに存在する患者において介入後に適用されたときに続発性主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）を予防するための方法、あるいは急性冠動脈症候群を有するか又はアテローム動脈硬化を有するか又は血管にアテロームプラークを有するか又は弁狭窄を有するか又は敗血症性ショックを有するか又は狭心症を有するか又は心筋梗塞を有するか又は不安定狭心症を有するか又は動脈狭窄を有するか又は末梢動脈障害（ＰＡＤ）を有するか又は頸動脈狭窄を有するか又は大脳動脈狭窄を有するか又は冠状動脈動脈狭窄を有するか又は血管性認知症を有するか又は一過性黒内障を有する個体を処置するための方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告される多量体、又は本明細書に報告される融合タンパク質、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの有効量を前記個体に投与することを含む方法である。
【００７６】
本明細書に報告される１つの態様は、個体においてコレステロール逆輸送を誘導するか、又はプラーク軽減を誘導するか、又はアテロームプラークを除去もしくは溶解もしくは安定化するか、又は動脈壁から肝臓へコレステロールを再分配するか、又はＨＤＬ粒子の数を増加させるか、又は内毒素を除去する方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告される多量体、又は本明細書に報告される融合タンパク質、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの有効量を前記個体に投与して、コレステロール逆輸送を誘導するか、又はプラーク軽減を誘導するか、又はアテロームプラークを除去もしくは溶解もしくは安定化するか、又は動脈壁から肝臓へコレステロールを再分配するか、又はＨＤＬ粒子の数を増加させるか、又は内毒素を除去することを含む方法である。
【００７７】
１つの実施形態では、非正常な脂質レベルは、体液におけるレベルである。別の実施形態では、体液は、全血又は血清である。
【００７８】
１つの実施形態では、非正常な脂質レベルは、上昇したコレステロールレベルである。
【００７９】
１つの実施形態では、脂質含有沈着物は、血管におけるプラークである。
【００８０】
１つの実施形態では、疾患は心血管疾患である。
【００８１】
本明細書に報告される１つの態様は、非正常な脂質レベル又は身体の構成要素における脂質含有沈着物を特徴とする疾患又は症状を処置する方法であって、
ｉ）治療上有効量の本明細書に報告される脂質粒子を、処置又は人工系を必要とする被験体に投与することと、
ii）場合により、被験体の脂質レベル又は脂質含有沈着物の変化についてモニタすることとを含む方法である。
【００８２】
本明細書に報告される１つの態様は、急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告される多量体、又は本明細書に報告される融合タンパク質、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、それを必要としている被験体に投与することを含む方法である。
【００８３】
本明細書に報告される１つの態様は、続発性主要有害ＣＶイベント（ＭＡＣＥ）を予防するための方法であって、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告される多量体、又は本明細書に報告される融合タンパク質、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、それを必要としている被験体に介入後に投与することを含み、前記被験体が、急性ＣＶイベントを有するＥＲに存在する被験体である方法である。
【００８４】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告される脂質粒子、又は本明細書に報告される多量体、又は本明細書に報告される融合タンパク質、又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む診断用組成物であって、サンプル又は被験体内における標識アポリポタンパク質又は標識脂質粒子の検出を可能にするために前記アポリポタンパク質が標識されている組成物である。
【００８５】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告される脂質粒子の診断のための使用である。
【００８６】
本明細書に報告される１つの態様は、非正常な脂質レベル又は脂質含有沈着物の存在を特徴とする疾患又は症状に罹患している被験体の予防又は処置のための、本明細書に報告される脂質粒子の使用である。
【００８７】
本明細書に報告される１つの態様は、本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又は本明細書に報告される融合タンパク質をコードする核酸、及び本明細書に報告される核酸を含む細胞である。
【００８８】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号０１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号０１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体である。
【００８９】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号０２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体である。
【００９０】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号０６のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号０６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体である。
【００９１】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体である。
【００９２】
本明細書に報告される１つの態様は、配列番号６７のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体である。
【００９３】
本明細書に報告される１つの態様は、
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体と、
−  １−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとを含む脂質粒子であって、
前記脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が５０〜９０であり、そして、
前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉが配列番号０１のアミノ酸配列を有する脂質粒子である。
【００９４】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、約６６である。
【００９５】
本明細書に報告される１つの態様は、
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体と、
−  １−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとを含む脂質粒子であって、
前記脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が６０〜９０であり、そして、前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉが配列番号０２のアミノ酸配列を有する脂質粒子である。
【００９６】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、約６６である。
【００９７】
本明細書に報告される１つの態様は、
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体と、
−  １−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとを含む脂質粒子であって、
前記脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が６０〜９０であり、そして、
前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉが配列番号０６のアミノ酸配列を有する脂質粒子である。
【００９８】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、約６６である。
【００９９】
本明細書に報告される１つの態様は、
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体と、
−  １−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとを含む脂質粒子であって、
前記脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が６０〜９０であり、そして、
前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉが配列番号６６のアミノ酸配列を有する脂質粒子である。
【０１００】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、約６６である。
【０１０１】
本明細書に報告される１つの態様は、
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその変異体と、
−  １−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとを含む脂質粒子であって、
前記脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数が６０〜９０であり、そして、
前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉが配列番号６７のアミノ酸配列を有する脂質粒子である。
【０１０２】
１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６０〜８８である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６２〜８０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、６４〜７０である。１つの実施形態では、脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、約６６である。
【０１０３】
発明の詳細な説明
定義
用語「アポリポタンパク質」は、それぞれ脂質又はリポタンパク質の粒子に含まれるタンパク質を意味する。
【０１０４】
用語「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ」は、タンパク質−脂質及びタンパク質−タンパク質の相互作用特性を有する両親媒性の螺旋状ポリペプチドを意味する。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、２６７のアミノ酸残基のプレプロアポリポタンパク質として肝臓及び小腸によって合成され、これは、２４３のアミノ酸残基を有する成熟ポリペプチドに切断されるプロアポリポタンパク質として分泌される。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、多くの場合プロリンであり、場合によっては、幾つかの残基で構成される伸長からなるリンカー部分によって分離されている、各２２のアミノ酸残基からなる６〜８つの異なるアミノ酸反復からなる。例示的なヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉのアミノ酸配列は、GenPeptデータベースエントリNM-000039又はデータベースエントリX00566;GenBank NP-000030.1(gi 4557321)に報告されている。ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（配列番号０６）には、P27H、P27R、P28R、R34L、G50R、L84R、D113E、A-A119D、D127N、K131の欠失、K131M、W132R、E133K、R151C（アミノ酸残基１５１がArgからCysに変化している、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ-Paris）、E160K、E163G、P167R、L168R、E171V、P189R、R197C（アミノ酸残基１７３がArgからCysに変化している、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Milano）及びE222K等の天然の変異体が存在する。また、保存的アミノ酸変更を有する変異体も含まれる。
【０１０５】
１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、免疫グロブリンＡプロテアーゼ（ＩｇＡプロテアーゼ）の切断部位の断片を含む。ＩｇＡプロテアーゼから公知である認識部位は、以下の配列を含み、「↓」は切断される結合の位置を意味する：
【０１０６】
【表１】
0005860052.tif 000002
ここでは、最初の３つがより頻繁に選択され、そして切断される。
【０１０７】
用語「アポリポタンパク質ミミック」は、それぞれのアポリポタンパク質の機能を模倣する合成ポリペプチドを意味する。例えば、「アポリポタンパク質Ａ−Ｉミミック」は、コレステロールの除去、すなわちコレステロールの逆流出に関して、天然アポリポタンパク質Ａ−Ｉと同等の生物学的機能を示す合成ポリペプチドである。１つの実施形態において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉミミックは、疎水性−親水性界面に集合する正に帯電したアミノ酸残基と親水性面の中心に集合する負に帯電したアミノ酸残基とを有する少なくとも１つの両親媒性のα−ヘリックスを含む。アポリポタンパク質Ａ−Ｉの機能を模倣するために、アポリポタンパク質ミミックは、１５〜２９のアミノ酸残基、１つの実施形態では２２のアミノ酸残基の反復ポリペプチドを含む（PVLDEFREKLNEELEALKQKLK（配列番号０４）；PVLDLFRELLNELLEAL KQKLK（配列番号０５））。
【０１０８】
用語「心血管疾患」は、一般的に、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、脳血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患、虚血性心疾患又は末梢血管疾患等の心臓又は血管に関する疾患又は症状を意味する。このような疾患は、心筋梗塞、卒中、狭心症、一過性脳乏血発作、鬱血性心不全、大動脈瘤等の疾患の結果として有害事象に先立って発見することはできず、ほとんどの場合、被験体は死に至る。
【０１０９】
用語「コール酸」は、３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸又はその塩、特にナトリウム塩を意味する。
【０１１０】
用語「臨界ミセル濃度」及びその省略形「ＣＭＣ」（これらは互換的に使用することができる）は、それを超えると個々の界面活性剤分子（単量体）が、自発的にミセル（ミセル、球状、棒状、ラメラ構造等）に凝集する表面活性剤又は界面活性剤の濃度を意味する。
【０１１１】
用語「保存的アミノ酸変更」は、本発明に係る脂質粒子又はアポリポタンパク質の特性に影響を与えたり変化させたりしないアミノ酸配列の変更を意味する。変更は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発等の当技術分野において公知である標準的な技術により導入することができる。保存的アミノ酸変更としては、あるアミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換されているものが挙げられる。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、「変異体」タンパク質とは、本明細書において、１０以下、１つの実施形態では約２〜約５の付加、欠失、及び／又は置換により、「親」タンパク質のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列変更は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327, and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 (1989) 10029-10033に記載されているような分子モデリングに基づく突然変異誘発によって行うことができる。
【０１１２】
異なるアミノ酸配列の相同性及び同一性は、BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85又はBLOSUM90等の周知のアルゴリズムを使用して計算することができる。１つの実施形態では、アルゴリズムは、BLOSUM30である。
【０１１３】
脂質粒子の形成は、それぞれの転移温度において、界面活性剤で可溶化した脂質と共にアポリポタンパク質をインキュベートすることにより行うことができる。用語「界面活性剤」は、表面活性化学物質を意味する。「界面活性剤」は、一般に、無極性の疎水性部分と極性の親水性部分とを有する両親媒性分子である。用語「両性イオン性界面活性剤」は、全体としてゼロ電荷を有し、そして、同時に少なくとも１つの正に帯電した部分と少なくとも１つの負に帯電した部分とを含む表面活性化学化合物を意味する。１つの実施形態では、界面活性剤は、糖系界面活性剤、ポリオキシアルキレン系界面活性剤、胆汁酸塩系界面活性剤、合成界面活性剤又はこれらの組合せから選択される。用語「糖系界面活性剤」は、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−マルトピラノシド、又は５−シクロヘキシルペンチル−ベータ−Ｄ−マルトピラノシド、及びこれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。用語「胆汁酸塩系界面活性剤」は、コール酸ナトリウム、コール酸カリウム、コール酸リチウム、３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−イル−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、及びこれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。用語「ポリオキシアルキレン系界面活性剤」は、Tween20、Triton X-100、Pluronic F68、及びこれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。用語「合成界面活性剤」は、Zwittergent 3-6、Zwittergent 3-8、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12、及びこれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。
【０１１４】
剤、例えば医薬製剤の「有効量」は、ある投薬量で、そして、必要な期間、所望の処置又は予防の結果を得るのに有効な量を指す。
【０１１５】
用語「高密度リポタンパク質粒子」又はその省略形「ＨＤＬ粒子」（これらは互換的に使用することができる）は、主なタンパク質性の化合物としてアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質−タンパク質複合体を意味する。
【０１１６】
用語「ホスト細胞」、「ホスト細胞株」及び「ホスト細胞培養物」は、互換的に使用され、そして、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の後代も含む。ホスト細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、それに由来する一次形質転換細胞及び後代を含む。後代は、親細胞と核酸含有量において完全に同一ではなくてもよく、突然変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択したのと同じ機能又は生物活性を有する変異体後代も本明細書に含まれる。
【０１１７】
用語「脂質流出の増加」及びその文法的等価物は、細胞又はプラークからの脂質流出のレベル及び／又は割合の増加、脂質流出の促進、脂質流出の強化、脂質流出の補助、脂質流出のアップレギュレート、脂質流出の改善、及び／又は脂質流出の増大を意味する。１つの実施形態では、脂質流出は、リン脂質、トリグリセリド、コレステロール、及び／又はコレステロールエステルの排出を含む。
【０１１８】
「個体」又は「被験体」は、哺乳類である。哺乳類は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特定の態様では、個体又は被験体はヒトである。
【０１１９】
用語「ＤＰＰＣ」は、リン脂質１，２−ジ−パルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスファチジルコリンを指し、１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとも呼ばれる。
【０１２０】
用語「多量体」は、２以上の単量体からなる複合体を意味する。多量体は、単量体間の非共有相互作用によって形成される。各単量体は、多量体化ドメインを含む。１つの実施形態では、多量体は、２つ又は３つの単量体を含む。別の実施形態では、多量体化ドメインは、各単量体に含まれる個々の多量体化ドメイン間の非共有相互作用を介して相互作用する。用語「多量体化ドメイン」は、２以上の単量体分子を共有結合又は非共有結合させることができるアミノ酸配列を意味する。多量体化ドメインは、異なるか、類似するか、又は同一のアミノ酸配列の多量体化ドメインと相互作用することができる。１つの実施形態では、多量体化ドメインは、配列番号５３のコンセンサスアミノ酸配列と少なくとも６８％同一であるアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造エレメント又はその誘導体である。１つの実施形態では、配列番号５３の位置５０におけるシステイン残基は、異なるアミノ酸残基、別の実施形態では、セリン残基又はトレオニン残基又はメチオニン残基によって置換されている。多量体化ドメインを含むポリペプチドは、同じく多量体化ドメインを含む１以上の他のポリペプチドと結合することができる。多量体の形成は、適切な条件下でポリペプチドを混合することにより簡便に開始させることができる。別の実施形態では、多量体化ドメインは、アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端から１〜１０残基が欠失しているか又は付加されている配列番号５３のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態では、多量体化ドメインは、アミノ酸配列のＮ末端から６個又は９個のアミノ酸残基が欠失している配列番号５３のアミノ酸配列を有する。更に別の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｎ末端のアミノ酸残基Ｌ又はＮ末端のアミノ酸残基Ｃ及びＬが欠失している配列番号５３のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、多量体化ドメインは、テトラネクチン三量体化構造エレメントであり、そして、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。多量体は、１つの実施形態では、ホモマーである。
【０１２１】
多量体化ドメインを含む異なるアポリポタンパク質を組み合わせて多量体に組み込むこともできるので、多量体は、ホモマーであってもヘテロマーであってもよい。１つの実施形態では、多量体は、ホモ三量体である。
【０１２２】
１つの実施形態によれば、多量体化ドメインはテトラネクチンから得られる。１つの実施形態では、多量体化ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造エレメントを含む。テトラネクチン三量体化構造エレメントの三量体化作用は、２つの他のテトラネクチン三量体化構造エレメントのコイルドコイル構造と相互作用して三量体を形成するコイルドコイル構造により引き起こされる。テトラネクチン三量体化構造エレメントは、ヒトのテトラネクチン、ウサギのテトラネクチン、マウスのテトラネクチン、又はサメ軟骨のＣ型レクチンから得ることができる。１つの実施形態では、テトラネクチン三量体化構造エレメントは、配列番号５３のコンセンサス配列と少なくとも６８％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８１％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも９２％の同一性を有する配列を含む。
【０１２３】
用語「非共有相互作用」は、イオン性相互作用力（例えば、塩橋）、非イオン性相互作用力（例えば、水素結合）又は疎水性相互作用力（例えば、ファンデルワールス力又はπスタッキング相互作用）等の非共有結合力を意味する。
【０１２４】
レファレンスポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」は、配列のアラインメントを作成し、そして、必要に応じて、配列同一性の割合を最大化するためにギャップを導入した後の、レファレンスポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義され、任意の保存的アミノ酸置換は配列同一性の一部として考慮されない。アミノ酸配列同一性の割合を決定するためのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して行うことができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントを作成するために適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性の割合（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して求められる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.によって開発され、そして、ソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559においてユーザ文書と共に登録されており、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であるか又はソースコードからコンパイルすることもできる。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルしなければならない。配列比較パラメータは全て、ALIGN-2プログラムによって設定されており、変化しない。
【０１２５】
アミノ酸配列比較のためにALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性の割合（％）（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一性の割合（％）を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下の通り計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によるＡ及びＢのアラインメントにおいて同一であると記録されたアミノ酸残基の数であり、そして、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性の割合（％）が、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性の割合（％）とは等しくならないことが理解されるであろう。特に別記しない限り、本明細書において使用されるアミノ酸配列の同一性の割合（％）の値は全て、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載の通り得られる。
【０１２６】
用語「医薬製剤」は、それに含有されている活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、そして、前記製剤が投与される被験体に対して許容し得ないほど毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。
【０１２７】
「薬学的に許容しうる担体」は、医薬製剤における活性成分以外の成分であって、被験体に対して無毒である成分を指す。薬学的に許容しうる担体は、バッファ、賦形剤、安定剤又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
用語「ホスファチジルコリン」は、１つのグリセロール部分、２つのカルボン酸部分、及び１つのホスホコリン部分からなる分子を意味し、前記グリセロール部分は、それぞれエステル結合、すなわち、２つのカルボン酸エステル結合及び１つのリン酸エステル結合により他の部分に共有結合し、前記リン酸エステル結合は、前記グリセロール部分の１−ヒドロキシル基又は３−ヒドロキシル基のいずれかに結合する。用語「カルボン酸部分」は、少なくとも１つのアシル基（Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ）を含む有機部分を意味する。ホスファチジルコリンは、任意の種類又は起源であってよい。１つの実施形態では、ホスファチジルコリンは、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ならびにこれらの類似体及び誘導体から選択される。
【０１２９】
本明細書において用いられるとき、リン脂質は全て、任意の起源、すなわち（適切な場合には）大豆、乳、卵又は更にはヒト以外の動物の内臓等に由来してよく、これらは、天然由来であっても、半合成であっても、更には完全に合成であってもよい。
【０１３０】
用語「ＰＯＰＣ」は、リン脂質１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスファチジルコリンを指し、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンとも呼ばれる。
【０１３１】
本明細書で使用するとき、「処置」（及び「処置する」又は「処置されている」等の文法上の変形）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、そして、予防のために又は臨床病理の間に行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患の進行の速度低下、病状の回復又は軽減、及び寛解又は予後の改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発現を遅らせるか又は疾患の進行を緩徐にするために使用される。
【０１３２】
用語「変異体」は、本明細書に報告されるアポリポタンパク質又はアポリポタンパク質ミミックの変異体も含み、前記変異体においては、それぞれのアポリポタンパク質又はアポリポタンパク質ミミックのアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含む。アミノ酸変更は、アポリポタンパク質受容体又はアポリポタンパク質転換酵素に対するアポリポタンパク質の親和性を増加させる場合も減少させる場合もあり、又はそれぞれのアポリポタンパク質に比べてアポリポタンパク質変異体の安定性を上昇させる場合もあり、それぞれのアポリポタンパク質に比べて水溶液中におけるアポリポタンパク質変異体の溶解度を上昇させる場合もあり、又はそれぞれのアポリポタンパク質に比べてホスト細胞におけるアポリポタンパク質変異体の組換え体生成を増加させる場合もある。
【０１３３】
脂質粒子
本明細書においては
ａ）テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉと、
ｂ）ホスファチジルコリンと、
ｃ）更なる脂質とを含む脂質粒子が報告される。
【０１３４】
１つの実施形態では、脂質粒子は、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉと、第１のホスファチジルコリンと、第２のホスファチジルコリンとを含む。１つの実施形態では、第１のホスファチジルコリンと第２のホスファチジルコリンとは、ホスホグリセロール骨格にエステル化される１つもしくは２つのカルボン酸部分又はカルボン酸部分誘導体において異なる。１つの実施形態では、第１のホスファチジルコリンはＰＯＰＣであり、そして、第２のホスファチジルコリンはＤＰＰＣである。１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉとホスファチジルコリンとは、脂質粒子において非共有結合している。１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、組み換えにより生成されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉである。
【０１３５】
脂質の組合せの選択により、アポリポタンパク質を含む脂質粒子の有効性及び肝臓安全性が決定される。ＤＭＰＣを含有する脂質粒子に関するウサギを使用したインビボ研究では、３０mg/kgで処理されたウサギは、重篤な副作用を示すが生き残り、一方、１００mg/kgで処理されたウサギが死亡することが見出された。
【０１３６】
インビトロにおける機能試験では、ＤＰＰＣ又はＰＯＰＣ等の単一のホスファチジルコリンを含有する脂質粒子がＬＣＡＴを活性化することが確認された。
【０１３７】
脂質粒子が異なるリン脂質の組合せを含む場合、コレステロール排出がより多いことも示された。
【０１３８】
【表２】
0005860052.tif 000003
【０１３９】
これら結果は、インビボデータによっても確認され、全ての組合せについてコレステロールの動員が実証された。しかし、単一のホスファチジルコリンＤＰＰＣのみ又はＤＰＰＣとスフィンゴミエリン（ＳＭ）との組合せを含有する脂質粒子については、肝酵素の増加を測定することができる（図１）。
【０１４０】
技術的な視点からみると、純粋なＰＯＰＣによる形成と比べて、純粋なＤＰＰＣを含む脂質粒子による形成の方が都合がよい。沈殿物形成のリスクは、異なるリン脂質の組合せを使用することにより低減される。また、純粋なＤＰＰＣは相転移温度が４１℃であるので、相転移温度が４℃である純粋なＰＯＰＣと比較して、脂質粒子の調製がより容易である。また、得られる生成物がより均質である。これは、タンパク質−脂質組成物の測定（タンパク質コンジュゲート分析）もできる分析ツールであるＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを介する脂質粒子の分析によって確認することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（UV280検出）において分割されたサンプルのクロマトグラムを図２に示す。分離されたピーク又は半ば離れたピークが複数発生したことからサンプルの不均質性が分かる。
【０１４１】
脂質粒子を生成するために純粋なＰＯＰＣを使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ分子の数は、１つの実施形態では４０〜８５、１つの実施形態では５０〜８０、１つの実施形態では５４〜７５である。
【０１４２】
脂質粒子を生成するために純粋なＤＰＰＣを使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのＤＰＰＣ分子の数は、１つの実施形態では５０〜１５０、１つの実施形態では６５〜１３５、１つの実施形態では７６〜１２３、そして、１つの実施形態では８６〜１０２である。
【０１４３】
脂質粒子を生成するために１：３のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、１つの実施形態では約５０〜約１２０、１つの実施形態では約６５〜約１０５、そして、１つの実施形態では約７２〜約９６である。
【０１４４】
脂質粒子を生成するために１：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では５０〜１２０、１つの実施形態では６０〜１００、１つの実施形態では７１〜９２、そして、１つの実施形態では約７１〜約８５である。
【０１４５】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では５０〜１０５である。
【０１４６】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では６０〜９５である。
【０１４７】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では６０〜９０である。
【０１４８】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では６０〜８８である。
【０１４９】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では６２〜８０である。
【０１５０】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では６６〜８６である。
【０１５１】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では６４〜７０である。
【０１５２】
脂質粒子を生成するために３：１のモル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子におけるアポリポタンパク質単量体１個当たりの脂質分子の数は、１つの実施形態では約６６である。
【０１５３】
アポリポタンパク質及びＰＯＰＣを含む脂質粒子を生成する場合、１つの実施形態ではアポリポタンパク質のＰＯＰＣに対するモル比１：４０〜１：１００を使用し、１つの実施形態ではモル比１：４０〜１：８０を使用し、そして、１つの実施形態ではモル比約１：６０を使用する。
【０１５４】
アポリポタンパク質及びＤＰＰＣを含む脂質粒子を生成する場合、１つの実施形態ではアポリポタンパク質のＤＰＰＣに対するモル比１：７０〜１：１００を使用し、１つの実施形態ではモル比１：８０〜１：９０を使用し、そして、１つの実施形態ではモル比約１：８０を使用する。
【０１５５】
アポリポタンパク質、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣを含む脂質粒子（ＰＯＰＣとＤＰＰＣとのモル比１：３）を生成する場合、１つの実施形態ではアポリポタンパク質のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣに対するモル比１：６０〜１：１００を使用し、１つの実施形態ではモル比１：７０〜１：９０を使用し、そして、１つの実施形態ではモル比約１：８０を使用する。
【０１５６】
アポリポタンパク質、ＤＰＰＣ及びＰＯＰＣを含む脂質粒子（ＰＯＰＣとＤＰＰＣとのモル比１：１）を生成する場合、１つの実施形態ではアポリポタンパク質のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣに対するモル比１：６０〜１：１００を使用し、１つの実施形態ではモル比１：６０〜１：８０を使用し、そして、１つの実施形態ではモル比約１：７０を使用する。
【０１５７】
アポリポタンパク質、ＤＰＰＣ及びＰＯＰＣを含む脂質粒子（ＰＯＰＣとＤＰＰＣとのモル比３：１）を生成する場合、１つの実施形態ではアポリポタンパク質のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣに対するモル比１：６０〜１：１００を使用し、１つの実施形態ではモル比１：５０〜１：７０を使用し、そして、１つの実施形態ではモル比約１：６０を使用する。
【０１５８】
１つの実施形態では、脂質粒子を生成するために脂質の混合物を使用する場合、前記混合物は、４℃〜４５℃、１つの実施形態では１０℃〜３８℃、そして、１つの実施形態では１５℃〜３５℃の相転移温度を有する。
【０１５９】
脂質粒子は、１つの実施形態では脂質粒子１個当たり平均数１〜１０個のアポリポタンパク質分子、１つの実施形態では脂質粒子１個当たり平均数１〜８個のアポリポタンパク質分子、そして、１つの実施形態では脂質粒子１個当たり平均数１〜４個のアポリポタンパク質分子を含む。
【０１６０】
１つの実施形態では、脂質粒子は、脂質粒子１個当たり平均数少なくとも１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０個のアポリポタンパク質分子を含む。１つの実施形態では、平均数は１である。
【０１６１】
１つの実施形態では、脂質粒子は、アポリポタンパク質に加えて１以上の更なるポリペプチドを含む。
【０１６２】
限定するものではないが、脂質粒子は、酵素の補因子として及び／又は脂質、特にコレステロールを取り込むためのキャリアとして機能し得る。
【０１６３】
１以上の界面活性剤が、本明細書に報告される脂質粒子中に存在し得る。このような界面活性剤は、任意の界面活性剤、すなわち、薬学的に許容しうる界面活性剤又は無毒な濃度の他の界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤又はイオン性界面活性剤等であってよい。非イオン性界面活性剤は、１以上のヒドロキシル基を含有する有機化合物のアルキレンオキシド誘導体であってよい。１つの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、エトキシル化及び／又はプロポキシル化されたアルコール、あるいはそのエステル化合物又は混合物から選択される。別の実施形態では、エステルは、ソルビトールと脂肪酸とのエステル、例えば、ソルビタンモノオレエート又はソルビタンモノパルミテート、油性ショ糖エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレン−ポリプロポキシアルキルエーテル、ブロック重合体及びセチルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油又は硬化ヒマシ油誘導体、及びポリグリセリン脂肪酸エステルから選択される。１つの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Pluronic（登録商標）、Poloxamer（登録商標）、Span（登録商標）、Tween（登録商標）、Polysorbate（登録商標）、Tyloxapol（登録商標）、Emulphor（登録商標）又はCremophor（登録商標）から選択される。
【０１６４】
イオン性界面活性剤は、胆管剤であってよい。１つの実施形態では、イオン性界面活性剤は、コール酸もしくはデオキシコール酸、又はこれらの塩及び誘導体から、あるいはオレイン酸、リノール酸等の遊離脂肪酸から選択される。
【０１６５】
１つの実施形態では、イオン性界面活性剤は、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルアミン又はアルカノールアミン等のカチオン性脂質、及びカチオン性コレステロールエステルから選択される。
【０１６６】
１つの実施形態では、脂質粒子は、０．７５重量％未満の界面活性剤を含む。
【０１６７】
１つの実施形態では、脂質粒子は、０．３重量％未満の界面活性剤を含む。
【０１６８】
１つの実施形態では、界面活性剤は、糖系界面活性剤、ポリオキシアルキレン系界面活性剤、胆汁酸塩系界面活性剤、合成界面活性剤又はこれらの組合せから選択される。１つの実施形態では、界面活性剤はコール酸である。
【０１６９】
コレステロールが血液へ動員される効率は、アポリポタンパク質をインビボで投与した後に、総コレステロール濃度とアポリポタンパク質濃度とのそれぞれの可動域を比較することにより測定することができる。定量的評価については、基準線補正された総コレステロールの濃度−時間曲線下面積及びアポリポタンパク質の濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）の指数を計算した。
【０１７０】
本明細書に報告される脂質粒子、特に配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質と３：１のモル比のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣとを含む脂質粒子は、インビボにおいてコレステロール動員の増強を示す。
【０１７１】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
上に概説した脂質粒子に加えて、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉも本明細書に報告される。
【０１７２】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、ヒトのテトラネクチン三量体化構造エレメントと野性型のヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉとの融合タンパク質である。ヒトのテトラネクチン部分のアミノ酸配列は、天然に存在する切頭部位である位置１０のイソロイシン残基から始まる最初の９アミノ酸だけ短くしてもよい。この切頭の結果として、位置４のトレオニン残基におけるＯ−グリコシル化部位が欠損する。テトラネクチン三量体化構造エレメントとヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉとの間で、５アミノ酸残基「SLKGS」（配列番号０３）が除去された。
【０１７３】
発現及び精製を改善するために、Ｎ末端精製タグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグとＩｇＡプロテアーゼ切断部位とを含むコンストラクトを作製してもよい。特異的な切断の結果として、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩのＮ末端において２個のアミノ酸（第１のアミノ酸としてアラニン又はグリシン又はセリン又はプロリン、そして、第２のアミノ酸としてプロリン）が維持される。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、配列番号０１のアミノ酸配列を有してよい。
【０１７４】
テトラネクチン三量体化構造エレメントは、個々のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体の各々の間の非共有相互作用により構成される、三量体のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体を形成することを可能にするドメインを備える。
【０１７５】
別の精製法を使用することにより、精製タグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を省略し、配列番号０２のアミノ酸配列のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを得ることもできる。
【０１７６】
１つの実施形態では、アポリポタンパク質は、保存的アミノ酸置換を含む変異体であってもよい。
【０１７７】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、酵素的に、NMR分光法を介して、又はモノクローナルもしくはポリクローナルな抗アポリポタンパク質Ａ−Ｉ抗体の使用によって測定することができる。したがって、本明細書に報告される他の態様は、本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉに特異的に結合するポリクローナル及びモノクローナルな抗体である。このような抗体は、当業者に公知の方法によって得ることができる。また、イムノアッセイで使用するための抗体の標識も、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。
【０１７８】
１つの実施形態では、アポリポタンパク質は、保存的アミノ酸置換を含む変異体、又はアポリポタンパク質Ａ−Ｉミミックであってよい。１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘは、配列番号６８〜配列番号１０５から選択される。
【０１７９】
したがって、１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、以下のアミノ酸配列を有する：
【０１８０】
【表３】
0005860052.tif 000004
【０１８１】
１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、以下のアミノ酸配列を有する：
【０１８２】
【表４】
0005860052.tif 000005
【０１８３】
１つの実施形態では、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、以下のアミノ酸配列を有する：
【０１８４】
【表５】
0005860052.tif 000006
【０１８５】
式中、Ｘは、以下のアミノ酸配列：A、G、S、P、AP、GP、SP、PP、GSAP（配列番号６８）、GSGP（配列番号６９）、GSSP（配列番号７０）、GSPP（配列番号７１）、GGGS（配列番号７２）、GGGGS（配列番号７３）、GGGSGGGS（配列番号７４）、GGGGSGGGGS（配列番号７５）、GGGSGGGSGGGS（配列番号７６）、GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号７７）、GGGSAP（配列番号７８）、GGGSGP（配列番号７９）、GGGSSP（配列番号８０）、GGGSPP（配列番号８１）、GGGGSAP（配列番号８２）、GGGGSGP（配列番号８３）、GGGGSSP（配列番号８４）、GGGGSPP（配列番号８５）、GGGSGGGSAP（配列番号８６６）、GGGSGGGSGP（配列番号８７）、GGGSGGGSSP（配列番号８８）、GGGSGGGSPP（配列番号８９）、GGGSGGGSGGGSAP（配列番号９０）、GGGSGGGSGGGSGP（配列番号９１）、GGGSGGGSGGGSSP（配列番号９２）、GGGSGGGSGGGSPP（配列番号９３）、GGGGSAP （配列番号９４）、GGGGSGP（配列番号９５）、GGGGSSP（配列番号９６）、GGGGSPP（配列番号９７）、GGGGSGGGGSAP（配列番号９８）、GGGGSGGGGSGP（配列番号９９）、GGGGSGGGGSSP（配列番号１００）、GGGGSGGGGSPP（配列番号１０１）、GGGGSGGGGSGGGGSAP（配列番号１０２）、GGGGSGGGGSGGGGSGP （配列番号１０３）、GGGGSGGGGSGGGGSSP（配列番号１０４）、及びGGGGSGGGGSGGGGSPP（配列番号１０５）のいずれであってもよい。
【０１８６】
ポリペプチドが大腸菌株において組み換えにより生成される場合、Ｎ末端のメチオニン残基は、通常、大腸菌のプロテアーゼによって効率的には切断されないことに留意しなければならない。したがって、生成されるポリペプチドの一部には、Ｎ末端のメチオニン残基が存在する。
【０１８７】
特性：
本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又は本明細書に報告される脂質粒子は、非正常な脂質レベル、又は血管におけるプラーク等の身体の構成要素内における脂質の沈着物を特徴とする疾患又は症状を処置及び／又は診断するために使用することができる。
【０１８８】
ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を補助する本明細書に報告される脂質粒子の能力を測定するために、コレステロールのエタノール溶液を添加することにより、コレステロールを脂質粒子に組み込むことができる。純粋なＰＯＰＣを含有する脂質粒子は、野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ等のアポリポタンパク質成分とは無関係に、ＤＰＰＣを含有する複合体よりも優れたＬＣＡＴ基質である（図３）。
【０１８９】
様々なＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を含む脂質粒子におけるコレステロールのエステル化の初速度は、前記混合物が単一の純粋なホスファチジルコリンよりも優れたＬＣＡＴ基質であることを示す。このことは、コレステロールのエステル化の初速度から分かる（表２及び図４を参照されたい）。
【０１９０】
【表６】
0005860052.tif 000007
【０１９１】
ＴＨＰ−１単球性白血病細胞をホルボールミリスチン酸アセテートに曝露することにより得られ、そして、放射性標識されたコレステロールトレーサがロードされているマクロファージ（例えば、ヒトＴＨＰ１細胞）を、コレステロールアクセプター試験化合物に曝露してよい。
【０１９２】
アクセプター試験化合物によって誘導される流出速度を、上清におけるコレステロール放射活性の、細胞及びその上清における放射活性の合計に対する比として計算し、そして、アクセプターを含有しない媒体に曝露した細胞と比較し、そして、直線適合によって分析する。主にＡＢＣＡ−１をアップレギュレートし、そして、ＡＢＣＡ−１媒介輸送に流出を偏らせることが知られているＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストに曝露された細胞、及び曝露されていない細胞を用いて、並行実験を実施してよい。
【０１９３】
ＲＸＲ−ＬＸＲ脂質粒子で予め処理されない細胞では、脂質付加（lipidated）されていないテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉにより得られる流出に比べてコレステロール排出がより増加することが分かる。一連の試験において、流出に対する脂質混合の影響はほとんどみられない（図５）。ＲＸＲ−ＬＸＲで予め処理された細胞では、脂質付加されていないテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを用いても、コレステロール排出が同等に増加することが分かる。予め処理されていない細胞でみられた増加と比較して、全体的な増加はより多かった。一連の試験において、流出に対する脂質混合の影響はほとんどみられない（図６）。
【０１９４】
様々な脂質粒子をウサギにおいてインビボで試験した。静脈注射として脂質粒子を適用し、そして、適用後９６時間にわたって連続的に血液サンプリングを実施した。肝酵素、コレステロール及びコレステロールエステルの値を測定した。血漿中濃度は、全ての試験した脂質粒子について同等であり、血漿中濃度の初期分布相に続いて対数線形減少を含む（図７）。表３から分かる通り、薬物動態パラメータは、全ての試験した化合物について類似している。観察された半減期は、約１．５日である。
【０１９５】
【表７】
0005860052.tif 000008
【０１９６】
図８から分かる通り、血漿中においてコレステロールは動員され、そして、エステル化される。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの濃度が減少し始めた後でさえも、血漿コレステロールエステルレベルは上昇し続ける。血漿テトラネクチン−アポリポタンパク質レベルが約０．５mg/mL（正常な野性型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの約５０％）まで減少しても、依然としてコレステロールエステルレベルの増加を検出することができる。
【０１９７】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子は、図１及び９から分かる通り、ウサギに加えてマウスでも肝酵素を誘導しない。また、静脈適用の２時間後に得られた血漿サンプルにおいて、溶血を測定することはできない（図１０）。
【０１９８】
したがって、本明細書に報告される態様は、本明細書に報告される脂質粒子又は本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む医薬組成物及び診断用組成物である。
【０１９９】
本明細書に報告される脂質粒子は、以下の表４に示す通り、脂質付加されていないアポリポタンパク質及び他の脂質粒子に比べて、インビボにおける特性が改善された。
【０２００】
【表８】
0005860052.tif 000009
0005860052.tif 000010
【０２０１】
脂質粒子の形成
本明細書に報告される脂質粒子の形成については、凍結乾燥、凍結融解、界面活性剤可溶化に続いて透析、顕微溶液化、超音波処理、及びホモジナイズ等の様々な方法が公知である。
【０２０２】
例えば、リン脂質と界面活性剤との水性混合物を、精製されたアポリポタンパク質と共にインキュベートしてよい。アポリポタンパク質は、ネイティブな形態で添加すしてよい。界面活性剤は、透析又はダイアフィルトレーションによって後に除去される。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子の形成は、それぞれの転移温度において、単量体又は多量体の形態のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを界面活性剤可溶化脂質と共にインキュベートすることにより行うことができる。透析により界面活性剤を除去することにより、脂質粒子が形成される。アポリポタンパク質を含有する脂質粒子を形成するのための一般的な方法は、例えば、Jonas, A., Methods Enzymol. 128 (1986) 553-582又はExperimental Lung Res. 6 (1984) 255-270に記載されているようなコール酸法に基づく方法である。透析により界面活性剤を除去することにより、脂質粒子が形成される。
【０２０３】
脂質粒子を形成するために考慮しなければならない要点は、ｉ）生物活性についての要件、及びii）脂質粒子の製造可能性に対する技術的要件である。アポリポタンパク質を含む脂質粒子の形成については、これら要件は相反する。
【０２０４】
技術的な視点からは、炭素原子１６個以下の鎖を有するカルボン酸部分を含有する飽和リン脂質（例えば、ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＰＰＣ；ジミリストイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＣ等）が選択される。これとは対照的に、生物学的データからは、炭素原子が少なくとも１６個のカルボン酸部分を含有する非飽和リン脂質（例えば、パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ；ステアロイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン、SOPC）がより有効であり、そして、肝臓毒性を有しないと推測することができる。
【０２０５】
アポリポタンパク質を含有する脂質粒子を形成するために、ホスファチジルコリンＤＰＰＣ及びＰＯＰＣ、ならびにこれらの混合物を使用することができる。これら例示的なホスファチジルコリンは、１つのカルボン酸部分が異なり、そして、ホスホグリセロール骨格にエステル化される１つの同一のカルボン酸部分を有する。ＤＰＰＣを使用したとき、脂質粒子の製造がより容易であった。対照的に、ＰＯＰＣは、特に、動員されたコレステロールをコレステロールエステルに変換するために必要なレシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）酵素を活性化するための基質として、インビトロ機能アッセイにおいてより有効であった。例えばＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ等の２種のホスファチジルコリンの混合物を様々なモル比で含む脂質粒子は、ホスファチジルコリンを１種しか含まない脂質粒子に比べて特性が改善されることが見出されている（図４を参照されたい）。
【０２０６】
ヒトＨＤＬ粒子に由来する組換え型アポリポタンパク質又は脱脂型アポリポタンパク質から脂質粒子を再構成する様々な方法が報告されている（ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質）。例えば、リン脂質と界面活性剤との水性混合物を、精製されたアポリポタンパク質と共にインキュベートする。アポリポタンパク質は、ネイティブな形態で添加される。界面活性剤は、透析又はダイアフィルトレーションによって後に除去される。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子の形成は、それぞれの転移温度において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその多量体を界面活性剤可溶化脂質と共にインキュベートすることにより行うことができる。透析により界面活性剤を除去することにより、脂質粒子が形成される。
【０２０７】
脂質粒子は、沈澱及び／又はクロマトグラフィー工程の組合せによって精製することができる。例えば、過剰な界面活性剤、すなわち、脂質粒子の一部ではない界面活性剤は、疎水性吸着クロマトグラフィー工程で除去することができる。脂質粒子は、界面活性剤を含まない溶液を用いて疎水性吸着材から回収することができる。
【０２０８】
本発明についての理解を助けるために以下の実施例、配列表及び図面を提供し、その真の範囲を添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載されている手順を変更できることを理解されたい。
【０２０９】
配列表の説明
配列番号０１  テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（１）。
配列番号０２  テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（２）。
配列番号０３  切断されたペプチド。
配列番号０４  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ模倣体（１）。
配列番号０５  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ模倣体（２）。
配列番号０６  ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
配列番号０７  ヒトのアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ。
配列番号０８  ヒトのアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ。
配列番号０９  ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｖ。
配列番号１０  ヒトのアポリポタンパク質Ｃ−Ｉ。
配列番号１１  ヒトのアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ。
配列番号１２  ヒトのアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ。
配列番号１３  ヒトのアポリポタンパク質Ｃ−ＩＶ。
配列番号１４  ヒトのアポリポタンパク質Ｄ。
配列番号１５  ヒトのアポリポタンパク質Ｅ。
配列番号１６  ヒトのアポリポタンパク質Ｆ。
配列番号１７  ヒトのアポリポタンパク質Ｈ。
配列番号１８  ヒトのアポリポタンパク質Ｌ−Ｉ。
配列番号１９  ヒトのアポリポタンパク質Ｌ−ＩＩ。
配列番号２０  ヒトのアポリポタンパク質Ｌ−ＩＩＩ。
配列番号２１  ヒトのアポリポタンパク質Ｌ−ＩＶ。
配列番号２２  ヒトのアポリポタンパク質Ｌ−Ｖ。
配列番号２３  ヒトのアポリポタンパク質Ｌ−ＶＩ。
配列番号２４  ヒトのアポリポタンパク質Ｍ。
配列番号２５  ヒトのアポリポタンパク質Ｏ。
配列番号２６  ヒトのアポリポタンパク質ＯＬ。
配列番号２７  ヒトのアポリポタンパク質ｃｌｕｓ。
配列番号２８〜５２  アポリポタンパク質。
配列番号５３  ヒトのテトラネクチン三量体化ドメイン。
配列番号５４  短縮型のヒトのテトラネクチン三量体化ドメイン。
配列番号５５  ヒトのインターフェロン断片。
配列番号５６  ヘキサヒスチジンタグ。
配列番号５７  融合タンパク質。
配列番号５８  プライマーＮ１。
配列番号５９  プライマーＮ２。
配列番号６０〜６５  ＩｇＡプロテアーゼ切断部位。
配列番号６６  テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
配列番号６７  ｈｉｓ−タグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
配列番号６８〜１０５  リンカー。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】脂質組成の異なる５つの脂質粒子を用いて実施したウサギのインビボ研究の結果。上：調製した全てのバッチについて、コレステロール動員、ひいては有効性を示すことができた。下：単一のリン脂質としてＤＰＰＣを使用することによって作製された脂質粒子について、肝酵素の増加が認められた。
【図２】本発明に係るＰＯＰＣ及びアポリポタンパク質（モル比１：２０〜１：１６０）の脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図３】ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ及びＰＯＰＣの影響。
【図４】ＰＯＰＣ及び／又はＤＰＰＣを含有する脂質粒子におけるコレステロールのエステル化の初速度。
【図５】ＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストで刺激していない細胞における、ＴＨＰ−１に由来する泡沫細胞へのコレステロール排出。
【図６】ＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストを使用してＡＢＣＡ−Ｉ経路を活性化した後の、ＴＨＰ−１に由来する泡沫細胞へのコレステロール排出。
【図７】様々なアポリポタンパク質組成物の時間依存性血漿中濃度。
【図８】血漿における、コレステロール動員及びエステル化の時間及び濃度経過。
【図９】１００mg/kgの単回i.v注射後の、マウスにおける本発明に係るアポリポタンパク質を含む様々な組成物による肝酵素放出の比較。
【図１０】インビボにおけるウサギの研究−血漿における自発的溶血。
【図１１】２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．５を使用する脂質粒子の分析ＳＥＣ。
【図１２】pH７．５の５０mMのＫ２ＨＰＯ４、２５０mMの塩酸アルギニン、７．５％のトレハロースを使用する脂質粒子の分析ＳＥＣ。
【図１３】ＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（モル比１：２０〜１：３２０）の脂質粒子のネイティブＰＡＧＥ、（レーン１：ネイティブマーカー；レーン２：モル比１：３２０；レーン３：モル比１：１６０；レーン４：モル比１：８０；レーン５：モル比１：８０（f/t）；レーン６：モル比１：４０；レーン７：モル比１：２０；レーン８：アポリポタンパク質（六量体を形成））。
【図１４】ＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（モル比１：２０〜１：１６０）の脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図１５】ＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣクロマトグラム（ＵＶ２８０シグナル）の重ね合わせ。
【図１６】モル比１：４０で得られたＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図１７】モル比１：２０〜１：１００で得られたＤＰＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のネイティブＰＡＧＥ（１：分子量マーカー；２：脂質を含まないテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；３：１：２０；４：１：４０；５：１：６０；６：１：８０；７：１：１００）。
【図１８】モル比１：６０（一番上の曲線）〜１：１００（一番下の曲線）で得られた、ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ＝３：１の混合物及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析（ＵＶ２８０シグナル）。
【図１９】コール酸、Zwittergent 3-8、3-10及び3-12を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のネイティブPAGE SDS。各ゲル上のレーン１：純粋なアポリポタンパク質；各ゲル上のレーン２：レファレンスとしての０．１×ＣＭＣコール酸脂質付加サンプル。
【図２０】３×CMC Zwittergent 3-8及びＰＯＰＣ（モル比  アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパクコンジュゲート分析。
【図２１】２×CMC Zwittergent 3-10及びＰＯＰＣ（モル比  アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパクコンジュゲート分析。
【図２２】ＰＯＰＣを使用するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパクコンジュゲート分析。上：ネイティブなテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉから形成された脂質粒子；下：変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉから形成された脂質粒子。
【図２３ａ】ＤＭＰＣ（１：１００）（ジミリストイルホスファチジルコリン）で脂質付加されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａ）及びPBS中で脂質付加されなかったテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｂ）を用いて実施した、ウサギのインビボにおける研究の結果。
【図２３ｂ】ＤＭＰＣ（１：１００）（ジミリストイルホスファチジルコリン）で脂質付加されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａ）及びＰＢＳ中で脂質付加されなかったテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｂ）を用いて実施した、ウサギのインビボにおける研究の結果。
【図２４Ａ】５℃及び４０℃で保存した、野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａ）及び本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｂ）を含有する脂質粒子のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２４Ｂ】５℃及び４０℃で保存した、野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａ）及び本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｂ）を含有する脂質粒子のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【０２１１】
材料及び方法
サイズ排除ＨＰＬＣ：
クロマトグラフィーは、ASI-100 HPLCシステム（Dionex, Idstein, Germany）においてTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いて実施した。溶出ピークは、ＵＶダイオードアレイ検出器（Dionex）によって２８０nmでモニタした。濃縮サンプルを１mg/mLになるように溶解させた後、安定したベースラインが得られるまで、２００mMのリン酸二水素カリウム及び２５０mMの塩化カリウム、pH７．０からなるバッファでカラムを洗浄した。分析は、均一濃度条件下において０．５mL／分の流速を使用して３０分間室温にて実行した。クロマトグラムは、Chromeleon(Dionex, Idstein, Germany)を用いて手動で積分した。凝集率（％）は、高分子量形態の曲線下面積（AUC）を単量体ピークのAUCと比較することにより求めた。
【０２１２】
動的光散乱（ＤＬＳ）：
ＤＬＳは、典型的にはサブミクロンサイズ範囲で粒径を測定するための非侵襲性技術である。本発明では、温度制御された石英キュベット（２５℃）を備えるZetasizer Nano S装置（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を、１nm〜６μmの粒径範囲をモニタするために使用した。後方散乱レーザー光線の強度は、１７３°の角度で検出した。強度は、粒子拡散速度に依存する割合で変動し、前記粒子拡散速度は、粒径によって調節される。したがって、粒径データは、散乱光強度の変動を分析することにより得られる（Dahneke, B.E. (ed.), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)）。強度による粒度分布は、DTSソフトウェア（Malvern）の複数ナローモードを使用して計算した。実験は、未希釈のサンプルを用いて行った。
【０２１３】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ：
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、以下の３つの検出器システムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーの組合せである：ｉ）ＵＶ検出、ii）屈折率検出、及びiii）光散乱検出。サイズによる分離については、GE Healthcare製のSuperose 6カラム１０／３００  ＧＬカラムを使用する。方法は、０．４mL／分の流速を適用し、ＰＢＳバッファpH７．４を用いて均一濃度で実行する。３つの検出器システムは、直列に接続する。完全な脂質粒子（タンパク質−脂質粒子）のシグナルは屈折率検出器によってモニタされ、一方、２８０nmで測定されるＵＶ吸光度は、タンパク質部分によって誘導されるシグナルを測定する。脂質画分の比率は、完全なシグナルからタンパク質のＵＶシグナルを単に減じることによって得られる。光散乱の適用により、それぞれの種の分子量の検出し、ひいては脂質粒子を完全且つ詳細に説明することが可能になる。
【０２１４】
界面活性剤の測定：
残留界面活性剤の測定は、蒸発光散乱検出器に連結された逆相クロマトグラフィー（RP-ELSD）によって実施した。カラムとして、Phenomenex（Aschaffenburg, Germany）製のLuna C18 ４．６×１５０mm、５μm、１００Åを使用した。１０kDaの膜による遠心分離を行った後、９０μLのフロースルーをHPLC分離に使用した。溶出は、０．１％(v/v)のトリフルオロ酢酸を含有する７４％(v/v)のメタノール溶液を用いて均一濃度条件下で実施した。カラムの温度は、３０℃に設定した。検出は、３０℃の噴霧化温度、８０℃の蒸発温度、及び１．０Ｌ／分のガス流を適用して、蒸発光散乱検出器によって実施した。残留界面活性剤の定量は、０．２２μg〜７．５μgコール酸の範囲のコール酸の場合、検量線の確立によって実施した。
【０２１５】
タンパク質の定量：
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０nmにおける光学密度（ＯＤ）を測定することにより測定した。
【０２１６】
組換えＤＮＡ技術：
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の通り、標準分析法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示書に従って使用した。
【０２１７】
実施例１
大腸菌の発現プラスミドの作製及び説明
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを組換え型手段によって調製した。Ｎ末端からＣ末端方向における発現した融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである：
−  アミノ酸メチオニン（Ｍ）、
−  CDLPQTHSL（配列番号５５）のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列の断片、
−  ＧＳリンカー、
−  HHHHHH（配列番号５６）のアミノ酸配列を有するヘキサ−ヒスチジンタグ、
−  ＧＳリンカー、
−  VVAPPAP（配列番号６０）のアミノ酸配列を有するＩｇＡプロテアーゼ切断部位、及び
−  配列番号０２のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
【０２１８】
上記のようなテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、前駆体ポリペプチドであり、ＩｇＡプロテアーゼを使用して酵素的に切断することにより、前記前駆体ポリペプチドからテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドが放出された。
【０２１９】
前駆体ポリペプチドをコードする融合遺伝子は、適切な核酸セグメントを連結することによって、公知の組み換え法及び技術を用いて構築した。化学合成によって作製した核酸配列は、ＤＮＡシーケエンシングによって確認した。配列番号３１の融合タンパク質をコードする配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを生成するための発現プラスミドは、以下の通り調製した。
【０２２０】
大腸菌の発現プラスミドの作製
プラスミド４９８０（4980-pBRori-URA3-LACI-SAC）は、大腸菌においてコア−ストレプトアビジンを発現させるための発現プラスミドである。プラスミド４９８０は、プラスミド１９６６（1966-pBRori-URA3-LACI-T-反復；EP-B 1 422 237に報告されている）に由来する３１４２bp長のEcoRI/CelIIベクター断片と、コア−ストレプトアビジンをコードする４３５bp長のEcoRI/CelII断片とをライゲーションさせることにより作製した。
【０２２１】
コア−ストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
−  大腸菌における複製用のベクターpBR322由来の複製開始点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90に係る2517〜3160bpの位置に対応する）、
−  大腸菌のpyrF突然変異株（ウラシル栄養要求性）の補完によりプラスミドを選択することができる、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124）をコードする出芽酵母のURA3遺伝子、
−  以下を含むコア−ストレプトアビジン発現カセット
−  Stueber, D.ら（上記を参照されたい）に係る合成リボソーム結合部位を含むT5ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433及びStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152に係るT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモータ）、
−  コア−ストレプトアビジン遺伝子、
−  ２つのバクテリオファージに由来する転写ターミネーター：λ−T0ターミネーター（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）及びfd−ターミネーター（Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58）、
−  大腸菌に由来するlacI抑制因子遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。
【０２２２】
単一の隣接するEcoRI及びCelII制限酵素切断部位を用いてベクター４９８０からコア−ストレプトアビジン構造遺伝子を切り取り、そして、EcoRII/CelII制限部位に隣接している前記前駆体ポリペプチドをコードする核酸を、３１４２bp長のEcoRI/CelII-4980ベクター断片に挿入することにより、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体ポリペプチドを発現させるための最終的な発現プラスミドを調製した。
【０２２３】
実施例２
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの調製
実施例１に記載した融合タンパク質を発現させるために、大腸菌の栄養要求性（PyrF）の補完により抗生物質を用いずにプラスミドを選択することができる大腸菌ホスト／ベクター系を使用した（EP 0 972 838及びUS6,291,245）。
【０２２４】
発現プラスミドｐ（IFN−His6−ＩｇＡ−テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）のエレクトロポレーションによって、大腸菌のK12株CSPZ-2（leuB、proC、trpE、th-1、ΔpyrF）を形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、まず、寒天平板上で３７℃にて増殖させた。
【０２２５】
発酵プロトコール１：
予発酵については、約１g/LのＬ−ロイシン、約１g/LのＬ−プロリン及び約１mg/Lのチアミン−ＨＣｌを添加したSambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989)に係るＭ９培地を使用した。
【０２２６】
予発酵については、バッフルを備える１０００mLのエルレンマイヤーフラスコ中の３００mLのＭ９培地に、初代種子バンクアンプルのうちの２mLを接種した。１〜３の光学密度（５７８nm）が得られるまで、３７℃で１３時間回転振盪機において培養を実施した。
【０２２７】
発酵については、Riesenberg(Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27)に係るバッチ培地を使用した：２７．６g/Lのグルコース＊Ｈ２Ｏ、１３．３g/LのＫＨ２ＰＯ４、４．０g/Lの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７g/Lのクエン酸塩、１．２g/LのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、６０mg/Lのクエン酸鉄（III）、２．５mg/LのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１５mg/LのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、１．５mg/LのＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３mg/LのＨ３ＢＯ３、２．５mg/LのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、８mg/LのＺｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２Ｈ２Ｏ、８．４mg/LのTitriplex III、１．３mL/LのSynperonic １０％消泡剤。前記バッチ培地に、５．４mg/Lのチアミン−ＨＣｌ、ならびにそれぞれ１．２g/LのＬ−ロイシン及びＬ−プロリンを添加した。フィード１溶液は、７００g/Lのグルコースを含有しており、１９．７g/LのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏが添加されていた。pH調節用のアルカリ溶液は、それぞれ５０g/LのＬ−ロイシン及び５０g/LのＬ−プロリンを添加した１２．５％(w/v)のＮＨ３水溶液であった。構成要素は全て、脱イオン水に溶解させた。
【０２２８】
発酵は、１０ＬのBiostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）において実施した。予発酵から得られた３００mLの接種材料を添加した６．４Lの無菌発酵バッチ培地から始めて、３７℃、pH６．９±０．２、５００mbar、及び通気速度１０L／分でバッチ発酵を実施した。最初に添加したグルコースが枯渇した後、温度を２８℃に変化させ、そして、発酵は流加モードに入った。ここでは、一定に増加する撹拌機速度（１０時間以内は５５０rpm〜１０００rpm、１６時間以内は１０００rpm〜１４００rpm）及び通気速度（１０時間は１０L／分〜１６L／分、５時間は１６L／分〜２０L／分）と組み合わせてフィード１を添加することにより、溶存酸素の相対値（ｐＯ２）を５０％で維持した（DO-stat、例えば、Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2 (1987) 79-85を参照されたい）。約８時間培養した後にpHが調節下限（６．７０）に達したとき、アルカリ溶液を添加することにより更なるアミノ酸を供給した。光学密度７０で１mMのＩＰＴＧを添加することによって、組換え型治療用タンパク質の発現を誘導した。
【０２２９】
発酵の最後に、細胞質で可溶性発現したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に導入する。これは、収集前に１又は２時間、発酵槽中の全培養培地を５０℃に加熱する加熱工程を用いて行う（例えばEP-B 1 486 571を参照されたい）。その後、発酵槽の内容物を流水式の遠心分離機（１３，０００rpm、１３L/h）で遠心分離し、そして、更に処理するまで、収集したバイオマスを−２０℃で保存した。合成したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で、不溶性の細胞残屑画分においてのみ見出された。
【０２３０】
合成した融合タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で、不溶性の細胞残屑画分においてのみ見出された。
【０２３１】
一方はタンパク質発現の誘導前、そして、他方は誘導後の所定の時点において発酵槽から取り出したサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。全てのサンプルから、同量の細胞（ＯＤTarget＝５）を５mLのＰＢＳバッファに再懸濁させ、そして、氷上で超音波処理を介して破壊した。次いで、各１００μLの懸濁液を遠心分離し（１５，０００rpm、５分間）、そして、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性の発現した標的タンパク質と不溶性の発現した標的タンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分３００μL、及び各ペレット（＝不溶性）画分４００μLに、ＳＤＳサンプルバッファ（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を添加する。サンプルを振盪下で９５℃にて１５分間加熱して、サンプル中のタンパク質を全て可溶化及び還元する。室温に冷却した後、各サンプル５μLを４〜２０％のTGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）にロードする。更に、５μLの分子量標準（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）及び公知の生成物タンパク質濃度（０．１μg/μL）を有する３つの量（０．３μL、０．６μL及び０．９μL）の定量化標準をゲル上に配置する。
【０２３２】
２００Ｖで６０分間電気泳動し、その後、ゲルをGelDOC EZ Imager（Bio-Rad）に移し、そして、ＵＶ放射を用いて５分間処理した。Image Lab解析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用してゲル画像を分析した。３つの標準を用いて、係数が＞０．９９である直線回帰曲線を計算し、オリジナルサンプル中の標的タンパク質の濃度を計算した。
【０２３３】
発酵プロトコール２：
予発酵については、約１g/LのＬ−ロイシン、約１g/LのＬ−プロリン及び約１mg/Lのチアミン−ＨＣｌを添加したSambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989))に係るＭ９培地を使用した。
【０２３４】
予発酵については、バッフルを備える１０００mLのエルレンマイヤーフラスコ中の３００mLの改変Ｍ９培地に、寒天板から、又は初代種子バンクアンプルのうちの１〜２mLを接種した。１〜３の光学密度（５７８nm）が得られるまで、３７℃で１３時間回転振盪機において培養を実施した。
【０２３５】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発酵及び高収率発現については、以下のバッチ培地及びフィードを使用した：
８．８５g/Lのグルコース、６３．５g/Lの酵母抽出物、２．２g/LのＮＨ４Ｃｌ、１．９４g/LのＬ−ロイシン、２．９１g/LのＬ−プロリン、０．７４g/LのＬ−メチオニン、１７．３g/LのＫＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ、２．０２g/LのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２５．８mg/Lのチアミン−ＨＣｌ、１．０ml／LのSynperonic １０％消泡剤。フィード１溶液は、１．６７g/LのＬ−メチオニンならびにそれぞれ５g/LのＬ−ロイシン及びＬ−プロリンを添加した３３３g/Lの酵母抽出物及び３３３g/Lの８５％−グリセロールを含有していた。フィード２は６００g/LのＬ−プロリンの溶液であった。pH調節用のアルカリ性溶液は、１０％(w/v)のＫＯＨ溶液であり、そして、酸として７５％グルコース溶液を使用した。構成要素は全て、脱イオン水に溶解させた。
【０２３６】
発酵は、１０LのBiostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）において実施した。予発酵から得られた３００mLの接種材料を添加した５．１５Ｌの無菌発酵バッチ培地から始めて、２５℃、pH６．７±０．２、３００mbar、及び通気速度１０Ｌ／分で流加発酵を実施した。最初に添加したグルコースが枯渇する前に、培養物は、光学密度１５（５７８nm）に達し、そして、フィード１を７０g/hで始めたとき、発酵は流加モードに入った。培養物中のグルコース濃度をモニタすることにより、グルコース蓄積を回避し、そして、６．９の調節上限付近にpHを維持しながら、フィード１を最高１５０g/hに増加させた。光学密度５０（５７８nm）において、１０mL／ｈの一定の流加速度でフィード２を始めた。平行して撹拌機速度（５００rpm〜１５００rpm）、通気速度（１０Ｌ／分〜２０Ｌ／分）及び圧力（３００mbar〜５００mbar）を増加させることにより、溶存酸素の相対値（ｐＯ２）を５０％超で維持した。光学密度９０で１mMのＩＰＴＧを添加することによって、組換え型治療用タンパク質の発現を誘導した。
【０２３７】
一方はタンパク質発現の誘導前、そして、他方は誘導後の所定の時点において発酵槽から取り出した７つのサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。全てのサンプルから、同量の細胞（ＯＤTarget＝５）を５mLのＰＢＳバッファに再懸濁させ、そして、氷上で超音波処理を介して破壊した。次いで、各１００μLの懸濁液を遠心分離し（１５，０００rpm、５分間）、そして、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは可溶性の発現した標的タンパク質と不溶性の発現した標的タンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分３００μＬ、及び各ペレット（＝不溶性）画分２００μLに、ＳＤＳサンプルバッファ（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を添加する。サンプルを振盪下で９５℃にて１５分間加熱して、サンプル中のタンパク質を全て可溶化及び還元する。室温に冷却した後、各サンプル５μLを１０％のBis-Trisポリアクリルアミドゲル（Novagen）にロードする。更に、５μLの分子量標準（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）及び公知の生成物タンパク質濃度（０．１μg/μL）を有する３つの量（０．３μL、０．６μL及び０．９μL）の定量化標準をゲル上に配置する。
【０２３８】
２００Ｖで３５分間電気泳動を実施し、次いで、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（登録商標）染料で染色し、熱水で脱色し、そして、デジタル化のために光学式濃度計に移した（GS710、Bio-Rad）。Quantity One 1-D解析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用してゲル画像を分析した。３つの標準を用いて、係数が＞０．９８である直線回帰曲線を計算し、オリジナルサンプル中の標的タンパク質の濃度を計算した。
【０２３９】
発酵の最後に、細胞質で可溶性発現したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）に導入する。これは、収集前に１又は２時間、発酵槽中の全培養培地を５０℃に加熱する加熱工程を用いて行う（例えばEP-B 1 486 571を参照されたい）。加熱工程の後、合成したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体タンパク質は、ＩＢの形態で、不溶性の細胞残屑画分においてのみ見出された。
【０２４０】
発酵槽の内容物を４〜８℃に冷却し、フロースルー遠心分離機（１３，０００rpm、１３L/h）で遠心分離し、そして、更に処理するまで、収集したバイオマスを−２０℃で保存した。収集したバイオマス収量の合計は、発現したコンストラクトに依存して３９g/L〜９０g/L乾物であった。
【０２４１】
実施例３
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの調製
実施例２の収集した細菌細胞を、リン酸カリウム緩衝液又はTris緩衝液（０．１Ｍ、１mMのＭｇＳＯ４を添加、pH６．５）に再懸濁させることによって封入体の調製を実施した。DNAseを添加した後、９００barの圧力でホモジナイズすることによって細胞を破壊した。１．５ＭのＮａＣｌ及び６０mMのＥＤＴＡを含む緩衝液を、ホモジナイズされた細胞懸濁液に添加した。２５％(w/v)のＨＣｌを用いてpH値を５．０に調整した後、更なる遠心分離工程の後に最終的な封入体スラリーが得られた。スラリーは、更に処理するまで、使い捨て滅菌プラスチック袋中で−２０℃にて保存した。
【０２４２】
封入体スラリー（約１５kg）を、グアニジン塩酸塩溶液（１５０Ｌ、６．７Ｍ）で可溶化した。深層濾過により可溶化物の清澄化した後、溶液をＺｎ−キレートアフィニティークロマトグラフィー材に適用した。融合ポリペプチドをＺｎ−キレートクロマトグラフィー材によって精製し、そして、ＩｇＡプロテアーゼによって切断した。その後、陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び陽イオン交換クロマトグラフィー工程によってポリペプチドを更に精製した。これら工程は、尿素含有溶液（７Ｍ）中で、すなわち、変性条件下で実施した。これら工程は、ポリペプチド断片、内毒素及び更なる不純物の除去のために使用した。６．７Ｍのグアニジン塩酸塩含有溶液に対するダイアフィルトレーションを実施した。得られた最終溶液は、変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有する。
【０２４３】
実施例４
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのリフォールディング及び脂質付加
以下、前述の実施例１〜３において生成された配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを使用した。
【０２４４】
ａ）一般法
純粋な結晶質のＰＯＰＣ又はＤＰＰＣ（Lipoid, Switzerland）を、リン脂質：コール酸のモル比が１：１．３５になるように、コール酸を含有する水性緩衝液（脂質付加バッファ）に溶解させた。混合物を窒素雰囲気下でインキュベートし、透明な溶液が得られるまで、室温（ＰＯＰＣ）又は５５℃（ＤＰＰＣ）で光から保護した。透明な脂質−コール酸溶液を４℃に冷却するか（ＰＯＰＣ）、又は４１℃で保存する（ＤＰＰＣ）。精製されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、規定のアポリポタンパク質：リン脂質比で４℃（ＰＯＰＣ）又は４１℃（ＤＰＰＣ）にて添加した。脂質粒子を形成するために、反応混合物を窒素雰囲気下で４℃（ＰＯＰＣ）又は４１℃（ＤＰＰＣ）にて一晩インキュベートし、そして、光から保護した。最後に、脂質付加バッファに対する大規模な透析（４℃／４１℃）によりコール酸を除去した。最後に、サンプルを遠心分離して、沈殿した物質を除去した。
【０２４５】
純粋なＰＯＰＣ又は純粋なＤＰＰＣを含有するコール酸可溶化脂質溶液を、上記の通り調製した。望ましい比率で脂質溶液を合わせ、次いで、それぞれのＴｍ（Ｔｍ＝相転移温度）で保存することにより、脂質混合物を調製した。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子形成は、選択された脂質混合物のそれぞれのＴｍを除いて、純粋な脂質溶液について記載した通り実施した。
【０２４６】
以下の脂質付加バッファについて試験した：
１．  pH７．５の２５０mMの塩酸アルギニン、７．５％のスクロースを添加した５０mMのリン酸カリウムバッファ、
２．  pH７．５の２５０mMの塩酸アルギニン、７．５％のスクロース、１０mMのメチオニンを添加した５０mMのリン酸水素二カリウムバッファ、
３．  pH７．５の１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニンを添加した、２５０mMのトリス−ヒドロキシルアミノメタン（ＴＲＩＳ）
４．  pH７．５の２５０mMの塩酸アルギニン、７％のトレハロース、１０mMのメチオニンを添加した５０mMのリン酸水素二カリウムバッファ。
【０２４７】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉサンプルから形成された脂質粒子の均質性を、分析ＳＥＣによって評価した（図１１及び１２）。全体として、脂質付加バッファの選択は、リン脂質の選択と比べてわずかな効果しか有しない。ＤＰＰＣ−脂質粒子は、１つのメインピークとして溶出し、一方、ＰＯＰＣ−脂質粒子は、２つのピークパターンを示す。脂質付加バッファの選択は、アポリポタンパク質の精製工程及び安定化した脂質を含まないアポリポタンパク質の供給によって影響を受けた。脂質粒子形成は、脂質付加バッファに関係なく実現可能であることが示された。試験した様々なバッファの中でも、最も適切な脂質付加バッファは、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、pH７．５であると同定された。
【０２４８】
脂質付加混合物は、それぞれ規定の量のアポリポタンパク質を含有しており、そして、リン脂質、例えばＰＯＰＣの量は、それに応じて計算された。脂質のモル量の計算は全て、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体に基いて行った。
【０２４９】
ｂ）ＰＯＰＣ及びコール酸
【０２５０】
【表９】
0005860052.tif 000011
【０２５１】
モル比１：４０〜１：１６０では、全工程にわたって透明なままである。過剰なリン脂質による混濁もタンパク質の沈殿による混濁も観察されなかった。
【０２５２】
脂質粒子のサンプルをネイティブＰＡＧＥによって分析した（図１３を参照されたい）。最も均質なバンドパターンは、サンプル１：８０（レーン４）でみられた。更に、１×凍結融解（−８０℃）によってサンプルの外観は変化しなかった（レーン５）。サンプル１：３２０及び１：１６０のバンドパターンは、不均質な生成物を示し、複数のバンドが生じた（レーン２及び３）。サンプル１：４０及び１：２０は、主生成物のバンドの下に更なるバンドを有する（レーン６及び７）。純粋なテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの移動パターンを、図１３のレーン８に示す。
【０２５３】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を用いて、脂質粒子の均質性及びそのアポリポタンパク質−リン脂質組成に関するより詳細な情報が得られた（タンパクコンジュゲート分析）。図１４は、ＳＥＣで分割されたサンプルのクロマトグラム（UV280検出）を示す。ここで、１：１６０サンプルは、３つの分離ピークに分割される。１：８０サンプルは、２つのピークとして示される通り、異なるサイズの少なくとも２つの種を含有すると思われる。サンプル１：２０から得られるピークは、最も均質な生産物を示す。
【０２５４】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（３．８４mg/mL；サンプル１個当たり１０mg）を用いて実験を行い、そして、アポリポタンパク質：リン脂質のモル比を５ずつ１：４０から１：８０に上昇させた。１：４０未満のモル比では、脂質粒子形成は不完全である。１：８０を超えるモル比は実験的に除外される：透析によりコール酸を除去した後、サンプルが混濁した。更に、脂質粒子は、より高い脂質比率においてより不均質になった。
【０２５５】
【表１０】
0005860052.tif 000012
【０２５６】
−３℃の転移温度でインキュベートしている間、サンプルは全て光学的に透明なままであった。透析によりコール酸を除去した後、サンプル１：４０〜１：６５で濁度上昇が観察された。遠心分離によって沈殿物を除去することができ、そして、その後サンプルは透明なままであった。
【０２５７】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を用いて、形成される脂質粒子の均質性及びそのアポリポタンパク質−リン脂質組成に関するより詳細な情報が得られた（タンパクコンジュゲート分析）。脂質粒子は全て、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；図１５）において同等に均質であり、低モル比でより明白な小さなポストピークを示した。更に、より高いモル比では、より高い分子量にピークパターンが顕著にシフトする。それぞれの保持時間を表７に記載する。
【０２５８】
【表１１】
0005860052.tif 000013
【０２５９】
タンパク質コンジュゲート分析（表８に要約）により、ＳＥＣカラムから溶出した各脂質粒子について、タンパク質の合計分子量（MWタンパク質）及び脂質成分の合計分子量（MW脂質）を計算することができる。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体（３２．７kDa）及びＰＯＰＣ（７６０Da）の分子量に基いて、脂質粒子の組成を計算することができる（ｎタンパク質及びｎＰＯＰＣ）。全てのモル比において脂質粒子メインピークでみられるアポリポタンパク質構成要素の分子量は約１００kDaであり、これは、脂質粒子１個当たりテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体に相当する。比率n(ＰＯＰＣ)/n（タンパク質単量体）から、脂質粒子におけるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体１個当たりのＰＯＰＣ分子の数が得られる。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体１個当たりのＰＯＰＣ分子の数は、１：４０〜１：８０までのモル比が適用されにもかかわらず、５４〜７５で変動する。タンパク質（％）の値は、脂質付加の程度のパラメータである。脂質粒子中のタンパク質の割合が低いほど、脂質付加の程度が高い。
【０２６０】
【表１２】
0005860052.tif 000014
【０２６１】
ｃ）ＤＰＰＣ及びコール酸
脂質付加の前に、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、pH７．５の５０mMのＫＨ２ＰＯ４、２５０mMの塩酸アルギニン、７％のトレハロース、１０mMのメチオニンに対して透析した。５ずつ脂質濃度を上昇させた１：６０〜１：１００のモル比を用いて、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（３．８４mg/mL、１サンプル当たり３mg）に脂質付加した。脂質付加バッファは、２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、pH７．５であった。
【０２６２】
【表１３】
0005860052.tif 000015
【０２６３】
脂質粒子形成中に、タンパク質の沈澱も過剰の脂質による混濁も観察されなかった。最終生産物におけるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの収率が高いほど、より多くのＤＰＰＣが脂質付加に使用された。
【０２６４】
残留脂質を含まないアポリポタンパク質は、ネイティブＰＡＧＥにおける１：２０サンプル（レーン３、図１７）でみられた。１：４０及び１：６０のサンプルが、ネイティブPAGEにおいて最も均質にみえるが（レーン４及び５）、一方、１：８０及び１：１００のサンプルは、主要な脂質粒子バンドの上方に更なるより高分子のバンドを含有する（レーン６及び７）。
【０２６５】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパクコンジュゲート分析を用いて、ＤＰＰＣ脂質粒子形成後に得られた脂質粒子の組成の特性評価を行った（MW ＤＰＰＣ：７３４Da）。均質なＳＥＣのピークは、１：８０以下のモル比で得られた。より高い脂質比率では、プレピークが出現した（例えば、表１０における１：９０サンプルを参照されたい）。
【０２６６】
【表１４】
0005860052.tif 000016
【０２６７】
最も高程度の脂質付加（タンパク質の割合が最低）は、モル比１：８０〜１：９０でみられる。更に、ＤＬＳにより、粒径１４〜１７nmにて比率１：８０〜１：９０（＞９８％）で最も均質な粒子が形成されることが明らかになった。
【０２６８】
ｄ）７５％ＤＰＰＣ／２５％ＰＯＰＣ
以下のパラメータを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告した通り、脂質粒子の形成を実施した：
タンパク質：３．８４mg/mLのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、１サンプル当たり３mg
脂質付加バッファ：２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、pH７．５
脂質付加：３４℃
透析：４℃
試験したモル比：１：６０〜１：１００（５ずつ脂質を増加させる）
【０２６９】
脂質粒子形成は、直接的であり、そして、純粋な脂質を使用するプロセスと同程度であった。サンプルは全て、工程及び透析の間、透明なままであった。脂質粒子の収率は、試験した全ての比率について類似していた（約８５％）。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析により、モル比１：８０から最も均質な脂質粒子（９０．９％メインピーク、プレピークなし、及び９．１％ポストピーク）が生じたことが示された。タンパクコンジュゲート分析により、全てのサンプルの主な種において、脂質粒子１個当たり１個のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体が存在することが明らかになった（図１８、ならびに表１１及び１２を参照されたい）。
【０２７０】
【表１５】
0005860052.tif 000017
【０２７１】
【表１６】
0005860052.tif 000018
【０２７２】
ｅ）５０％ＤＰＰＣ／５０％ＰＯＰＣ
以下のパラメータを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告した通り、脂質粒子の形成を実施した：
タンパク質：３．８４mg/mLのテトラネクチン−リポタンパク質Ａ−Ｉ、１サンプル当たり３mg
脂質付加バッファ：２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、pH７．５
脂質付加：２７℃
透析：室温
試験したモル比：１：６０〜１：１００（５ずつで脂質を増加させる）
【０２７３】
サンプルは全て、工程及び透析の間、透明なままであった。脂質粒子の収率は、試験した全ての比率について類似していた。
【０２７４】
【表１７】
0005860052.tif 000019
【０２７５】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子を形成するために５０％ＤＰＰＣ及び５０％ＰＯＰＣの脂質混合物を使用した場合、最も均質な生成物は、モル比１：７０で得られた（表１４を参照されたい）。生成物は、メインピークに関して８９．９％純粋であり、そして、１つの単一テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体を含有していた（表１４を参照されたい）。
【０２７６】
【表１８】
0005860052.tif 000020
【０２７７】
ｆ）２５％ＤＰＰＣ／７５％ＰＯＰＣ
以下のパラメータを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告した通り、脂質粒子の形成を実施した：
タンパク質：３．８４mg/mLのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、１サンプル当たり３mg
脂質付加バッファ：２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、pH７．５
脂質付加：１８℃
透析：室温
試験したモル比：１：６０〜１：１００（５ずつで脂質を増加させる）
【０２７８】
脂質粒子形成は、直接的であり、純粋な脂質を使用するプロセスと同程度であった。サンプルは全て、工程及び透析の間、透明なままであった。
【表１９】
0005860052.tif 000021
【０２７９】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子を形成するために２５％ＤＰＰＣ及び７５％ＰＯＰＣの脂質混合物を使用した場合、最も均質な生成物は、モル比１：６０で得られた（表１６を参照されたい）。生成物は、メインピークに関して９０．２％純粋であり、そして、１つの単一テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体を含有していた（表１５を参照されたい）。
【０２８０】
【表２０】
0005860052.tif 000022
【０２８１】
ｇ）Zwittergentを用いる脂質粒子形成
コール酸を合成界面活性剤Zwittergentに置換したことを除いて、以下のパラメータを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告した通り、脂質粒子の形成を実施した：
タンパク質：２３．５mg/mLのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
バッファ：５０mMのTris−ＨＣｌ、７．２Ｍのグアニジン塩酸塩、１４０mMのメチオニン、pH８
脂質付加バッファ：２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．５
１００％のＰＯＰＣ、アポリポタンパク質：リン脂質のモル比＝１：６０
【０２８２】
【表２１】
0005860052.tif 000023
0005860052.tif 000024
【０２８３】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子を、ネイティブPAGEで分析した。脂質を含まないテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、１４０kDaで移動し（図１９中のレーン１）、一方、脂質粒子は、２３２kDa〜４４０kDaのより高い分子量に対する特徴的なシフトを示す。
【０２８４】
それぞれの界面活性剤をわずか０．１×ＣＭＣだけ用いて調製された全てのサンプルにおいて、脂質を含まないテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは検出されたが、脂質粒子は検出されなかった（図１９、レーン２、８、１３及び１９）。しかし、０．５×CMCの界面活性剤濃度は、Zwittergent 3-8及び3-10について、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを用いて脂質粒子を形成させるのに十分であった（レーン３、９及び１４）。Zwittergent3-12では、２．０×CMCの濃度に到達するまで、脂質粒子は生じなかった（レーン２１）。
【０２８５】
図２０は、３×ＣＭＣのZwittergent 3-8及びＰＯＰＣ（モル比  アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳクロマトグラムを示す。タンパクコンジュゲート分析の結果を表１８に要約する。脂質粒子画分は、ＳＥＣのクロマトグラムにおける２つの重なりピークに示される通り、２つの異なる種からなる。しかし、これら２つの種は非常に類似しており、主に粒子１個当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の数で識別される（ピーク１については４．２、そして、ピーク２については３．２）。
【０２８６】
【表２２】
0005860052.tif 000025
【０２８７】
図２１は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析のクロマトグラムを示し、そして、図１９は、２×ＣＭＣのZwittergent 3-10及びＰＯＰＣ（モル比  アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子のタンパクコンジュゲート分析の概要を示す。両方のピークは、それぞれ、３．５個及び５個のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子を含む脂質粒子を含有する。
【０２８８】
【表２３】
0005860052.tif 000026
【０２８９】
Zwittergent 3-12及びＰＯＰＣ（モル比  アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子形成の結果を、表２０に要約する。脂質粒子画分は、ＳＥＣのクロマトグラムにおける２つの重なりピークに示される通り、２つの異なる種からなる。しかし、これら２つの種は非常に類似しており、主に粒子１個当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の数で識別される。
【０２９０】
【表２４】
0005860052.tif 000027
【０２９１】
コール酸及びＰＯＰＣ（モル比  アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子形成の結果を、表２１に要約する。脂質粒子画分は、ＳＥＣのクロマトグラムにおける２つの重なりピークに示される通り、２つの異なる種からなる。しかし、これら２つの種は非常に類似しており、主に粒子１個当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の数で識別される。
【０２９２】
【表２５】
0005860052.tif 000028
【０２９３】
実施例５
リフォールディング及び脂質粒子形成ための迅速希釈法
以下、前述の実施例１〜３において生成された配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを使用した。
【０２９４】
ａ）ＰＯＰＣ及びナトリウムコール酸
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを大腸菌で発現させ、そして、実施例１〜３（プロトコール１）に従って精製した。精製後、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH７．４を含有する溶液に対するダイアフィルトレーションによってバッファを交換した。タンパク濃度を２８mg/mLに調整した。
【０２９５】
室温で２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１３５mMのナトリウムコール酸、pH７．４を含有するバッファに１００モル／ＬのＰＯＰＣを溶解させることにより、脂質原液を調製した。脂質原液を室温で２時間インキュベートした。２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．４  １４７８mLで脂質原液混合物７７mLを希釈することにより、リフォールディングバッファを調製した。このバッファを室温で更に７時間撹拌した。
【０２９６】
２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH７．４中のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  １６２mLをリフォールディングバッファに添加することにより、リフォールディング及び脂質粒子形成を開始させた。これにより、グアニジン塩酸塩は１：１０に希釈される。常に撹拌しながら１６時間室温で溶液をインキュベートした。ダイアフィルトレーションによって、界面活性剤の除去を実施した。
【０２９７】
【表２６】
0005860052.tif 000029
【０２９８】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを大腸菌で発現させ、そして、実施例１〜３（プロトコール２）に従って精製した。精製後、５０mMのTris、１０mMのＬ−メチオニン、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH７．４を含有する溶液に対するダイアフィルトレーションによってバッファを交換した。タンパク濃度を２０．４mg/mLに調整した。
【０２９９】
室温で２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのＬ−メチオニン、１３５mMのナトリウムコール酸、pH７．４を含有するバッファに１００モル／Ｌのリン脂質（比率３：１のＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ）を溶解させることにより脂質原液を調製した。２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．４  ３５．６mLで脂質原液３．７mLを希釈することによりリフォールディングバッファを調製した。このバッファを室温で更に２時間撹拌した。
【０３００】
５０mMのTris、１０mMのＬ−メチオニン、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH８．０中のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  ９．８mLをリフォールディングバッファに添加することにより、リフォールディング及び脂質粒子形成を開始させた。これにより、グアニジン塩酸塩は１：５に希釈される。常に撹拌しながら一晩室温で溶液をインキュベートした。ダイアフィルトレーションによって、界面活性剤の除去を実施した。
【０３０１】
【表２７】
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【０３０２】
ｂ）ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ及びナトリウムコール酸
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを大腸菌で発現させ、そして、実施例１〜３に従って精製した。精製後、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH７．４を含有する溶液に対するダイアフィルトレーションによってバッファを交換した。タンパク濃度を３０mg/mLに調整した。
【０３０３】
２つの別々の脂質原液を調製した。室温で２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１３５mMのナトリウムコール酸、pH７．４を含有するバッファに１００モル／ＬのＰＯＰＣを溶解させることにより、溶液Ａを調製した。４１℃で２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１３５mMのナトリウムコール酸、pH７．４を含有するバッファに１００モル／ＬのＤＰＰＣを溶解させることにより、溶液Ｂを調製した。脂質原液Ａ及びＢを３：１の比率で混合し、そして、室温で２時間インキュベートした。２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．４  ６３６５mLで脂質原液混合物３８４mLを希釈することによりリフォールディングバッファを調製した。このバッファを室温で更に２４時間撹拌した。
【０３０４】
２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH７．４中のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ溶液７５０mLをリフォールディングバッファに添加することにより、リフォールディング及び脂質粒子形成を開始させた。これにより、グアニジン塩酸塩は１：１０に希釈される。常に撹拌しながら少なくとも１２時間室温で溶液をインキュベートした。ダイアフィルトレーションによって界面活性剤除去を実施した。
【０３０５】
【表２８】
0005860052.tif 000031
【０３０６】
ｃ）様々なグアニジン塩酸塩濃度
本発明に係るテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを大腸菌において発現させ、そして、封入体から金属キレート親和性クロマトグラフィ法で精製した（実施例１〜３を参照されたい）。精製後、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、pH７．４を含有する溶液に対するダイアフィルトレーションによってバッファを交換した。タンパク濃度を２８mg/mLに調整した。
【０３０７】
室温で２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１３５mMのナトリウムコール酸、pH７．４を含有するバッファに１００モル／ＬのＰＯＰＣを溶解させることにより、脂質原液を調製した。脂質原液を室温で２時間インキュベートした。２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．４で脂質原液を希釈することにより、リフォールディングバッファを調製した。このバッファを室温で更に１２時間撹拌した。様々な量のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉをリフォールディングバッファで希釈した：  １：５、１：７．５、１：１０、１：１２．５。これにより、リフォールディングバッファ中様々な残留濃度のグアニジン塩酸塩が得られる。その溶液を、一晩室温で撹拌して、リフォールディング及び脂質粒子形成を開始させた。透析によって界面活性剤除去を実施した。
【０３０８】
【表２９】
0005860052.tif 000032
【０３０９】
ｄ）尿素の存在下におけるＰＯＰＣ及びナトリウムコール酸
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを大腸菌で発現させ、そして、実施例１〜３に従って精製した。精製後、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍの尿素、pH７．４を含有する溶液に対するダイアフィルトレーションによってバッファを交換する。タンパク濃度を２８mg/mLに調整する。
【０３１０】
室温で２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１３５mMのナトリウムコール酸、pH７．４を含有するバッファに１００モル／ＬのＰＯＰＣを溶解させることにより、脂質原液を調製する。脂質原液を室温で２時間インキュベートする。２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、pH７．４  １４７８mLで脂質原液混合物７７mLを希釈することによりリフォールディングバッファを調製する。このバッファを室温で更に７時間撹拌する。
【０３１１】
２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Ｍの尿素、pH７．４中のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ溶液１６２mLをリフォールディングバッファに添加することにより、リフォールディング及び脂質粒子形成を開始させる。これにより、尿素は１：１０に希釈される。常に撹拌しながら１６時間室温で溶液をインキュベートする。ダイアフィルトレーションによって、界面活性剤の除去を実施する。
【０３１２】
ｅ）ＰＯＰＣ及びナトリウムコール酸及び野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
別の例示的な第２の方法では、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、５０mMのTris、１０mMのメチオニン、pH８．０中のヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ）を、脂質付加バッファで１：５(v/v)に希釈して、タンパク質濃度を０．６mg/mLにする。脂質付加バッファは、７mMのコール酸、４mMのＰＯＰＣ及び１．３mMのＤＰＰＣからなっており、これは、脂質のタンパク質に対する比２４０：１に相当する。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを使用して複合体形成を分析した。約２００の脂質分子からなる複合体において、およそ２個のアポリポタンパク質分子が見出された。
【０３１３】
【表３０】
0005860052.tif 000033
【０３１４】
実施例６
変性タンパク質又はネイティブなタンパク質から出発する脂質粒子形成
以下、前述の実施例１〜３において生成された配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを使用した。
【０３１５】
実施例４に報告した方法（第１の方法）は、脂質粒子を形成するためにネイティブなアポリポタンパク質を必要とするが、実施例５に報告する方法（第２の方法）は、脂質粒子を形成するために完全に変性されたアポリポタンパク質で出発する。
【０３１６】
例示的な第１の方法では、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、５０mMのTris、１０mMのメチオニン（pH８．０）中の変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、３．４６mg/mLのタンパク濃度の２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニンからなるバッファ（pH７．５）に対して大規模に透析した。次いで、ＰＯＰＣ及びコール酸の混合物を添加して、溶液中の最終濃度をＰＯＰＣ６mM及びコール酸８mMにした。これは、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体１分子当たりＰＯＰＣ６０分子の比率に相当する（６０：１）。次いで、ダイアフィルトレーションによって界面活性剤を除去した。形成されたタンパク−脂質複合体をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより分析した。この方法を使用したところ、形成された種のうちの約６０％が３超のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体を含む不均一な生成物が形成された。
【０３１７】
例示的な第２の方法では、６．７Ｍのグアニジン塩酸塩、５０mMのトリス、１０mMのメチオニン（pH８．０）中の変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、脂質付加バッファで１：１０(v/v)に直接希釈して、タンパク質濃度を２．５mg/mLにする。脂質付加バッファは、６mMのコール酸及び４．５mMのＰＯＰＣからなっており、これは、脂質のタンパク質に対する比６０：１に相当する。この方法を使用したところ、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ１分子当たり脂質６０分子が結合している、９０％超の単一形成種を含む均一な生成物が形成された（図２２を参照されたい）。
【０３１８】
【表３１】
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【０３１９】
実施例７
コール酸可溶化及びZwittergent可溶化ＰＯＰＣ／ＤＰＰＣを用いるインスリン−Ｆの脂質付加
脂質粒子形成のために選択したタンパク質は、市販のインスリン（Humalog（登録商標）, Insulin Lispro, Lilly）である。このタンパク質の分子量は、５８０８Daである。脂質粒子におけるインスリンの検出限界を上昇させるために、タンパク質をNHS−フルオレセイン（６−［フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド］ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Sigma Aldrich# 46940-5MG-F）で標識した。
【０３２０】
ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの１：１混合物を使用して、実施例４に報告した通り、NHS−フルオレセイン−標識インスリン（インスリン−Ｆ）のZwittergent−及びコール酸−媒介脂質付加を実施した。ＰＢＳ（pH７．４）中１×ＣＭＣのコール酸、２×ＣＭＣのZwittergent 3-8又は５×ＣＭＣのZwittergent 3-10のいずれかに０．５mMの脂質混合物を溶解させた。超音波浴中で１時間４５℃にて脂質の可溶化を行った。タンパク質：脂質モル比１：２（Zwittergent 3-8）又は１：１．２（Zwittergent 3-10及びコール酸）でインスリン−Ｆを可溶化脂質に添加した。脂質付加混合物を、室温で１時間インキュベートし、次いで、PBS（pH７．４）に対して大規模に透析して、界面活性剤を除去した。
【０３２１】
形成された脂質粒子及び対照サンプルを、蛍光検出（４９４nm ext.、５２１nm em.）を使用するSE-HPLC及びUV280吸光度で分析した。脂質付加アプローチ１つ当たり３つの異なるサンプルについてSE-HPLCで分析した：ＰＢＳに溶解したインスリン−Ｆ、ＰＢＳ中のインスリン−Ｆを含まないリポソーム、及びインスリン−Ｆを含む脂質粒子。脂質付加されていないインスリン−Ｆは、約４０分の溶出時間でカラムから溶出し、そして、ピークは、蛍光及びUV280検出によって検出される。脂質付加されたインスリン−Ｆサンプルは、２つの別々のピークとしてカラムから溶出し、蛍光及びUV280によって検出される。遅いピーク（およそ４０分でピーク最大値）は、インスリン−Ｆ対照サンプルと共に移動する。１５分の溶出時間における早いピークは、より高分子量、次いで、インスリン−Ｆを有し、そして、脂質付加されたインスリン−Ｆからなっていた。タンパク質を含まない脂質粒子は、１５分の溶出時間で溶出する。
【０３２２】
実施例８
アポリポタンパク質の応用
ａ）  ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ及びＰＯＰＣの影響
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のいずれかと、組換え型野性型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのいずれかとを含む脂質粒子を、ＬＣＡＴによるコレステロールのエステル化を支持する能力について試験した。
【０３２３】
コレステロールのエタノール溶液を添加することによって、トリチウムを含むコレステロール（４％；モルベースでホスファチジルコリン含量に対して）を脂質粒子に組み込んだ。ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を支持する生じるタンパク−脂質複合体の能力を、３７℃で１時間、１２５μL（１０mMのTris、１５０mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＮａＮ３；pH７．４；２mg/mLのＨｕＦＡＦアルブミン；４mMのベータメルカプトエタノール）中０．２μg/mLの組換え型ＬＣＡＴ酵素（ROAR biochemical）の存在下で試験した。クロロホルム：メタノール（２：１）を添加することによって反応を停止させ、脂質を抽出した。エステル化の「パーセント」は、ＴＬＣ及びシンチレーション計数により、コレステロール−コレステリルエステル分離後に計算した。形成されたエステルにトレーサの２０％未満しか組み込まれていなかったとき、反応速度が実験条件下で一定であるとみなすことができた。データは、XLfitソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、Michaelis Mentenの等式に適合させた。結果を視覚化するために、図３を参照されたい。
【０３２４】
ｂ）ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ／ＰＯＰＣの影響
組換え型野性型アポリポタンパク質Ａ−Ｉと３Ｈコレステロール、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物及びコール酸とをモル比１：４：８０：１１３で混合することにより、界面活性剤としてコール酸を使用して脂質粒子を調製した。ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物は、１００％のＰＯＰＣ；７５％のＰＯＰＣ；５０％のＰＯＰＣ；２５％のＰＯＰＣのいずれかを含有していた。
【０３２５】
透析によりコール酸を除去した後、ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を支持する生じるタンパク−脂質複合体の能力について試験した。コレステロールのエタノール溶液を添加することによって、３Ｈコレステロール（４％；モルベースでホスファチジルコリン含量に対して）を脂質粒子に組み込んだ。ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を支持する、生じるタンパク−脂質複合体の能力を、３７℃で１時間、１２５μL（１０mMのTris、１５０mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＮａＮ３；pH７．４；２mg/mLのＨｕＦＡＦアルブミン；４mMのベータメルカプトエタノール）中０．２μg/mLの組換え型ＬＣＡＴ酵素（ROAR biochemical）の存在下で試験した。クロロホルム：メタノール（２：１）を添加することによって反応を停止させ、脂質を抽出した。エステル化の「パーセント」は、ＴＬＣ及びシンチレーション計数により、コレステロール−コレステリルエステル分離後に計算した。エステルにトレーサの２０％未満しか組み込まれていなかったとき、反応速度が実験条件下で一定であるとみなすことができた。データは、XLfitソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、Michaelis Mentenの等式に適合させ、それを図４に示す。
【０３２６】
【表３２】
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【０３２７】
ｃ）ＴＨＰ−１に由来する泡沫細胞へのコレステロール排出
ホルボールミリスチン酸アセテートにＴＨＰ−１単球性白血病細胞を曝露することにより、マクロファージ（例えば、ヒトＴＨＰ−１細胞）を得た。次いで、３Ｈコレステロールトレーサを含有するアセチル化ＬＤＬの存在下で、細胞に更なる培養物をロードした。次いで、これらモデル泡沫細胞を４時間〜８時間コレステロールアクセプター試験化合物に曝露した（以下を参照されたい）。
【０３２８】
細胞培養上清を採取し、そして、細胞を５％のＮＰ４０に溶解させた。流出分率は、上清と細胞とにおける放射活性の合計に対する上清におけるコレステロール放射活性の比率として計算した。アクセプターを含有していない媒体に曝露された細胞からの流出を減じ、そして、線形適合によって流出速度を計算した。流出速度は、レファレンスとして細胞から１０μg/mLの野性型アポリポタンパク質Ａ−Ｉへの流出を使用して標準化した（相対的な流出速度）。コレステロールアクセプター濃度の関数として、２つの別々の実験において得られた相対的な流出速度をプロットし、そして、データをMichaelis Mentenの等式に適合させた。
【０３２９】
ＡＢＣＡ−１輸送体をアップレギュレートし、そして、コレステロール輸送をＡＢＣＡ−１媒介流出に偏らせることが知られているＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストに曝露された細胞を使用して、並行実験を実施した。
【０３３０】
一連の試験において、脂質混合の影響はわずかしかみられなかった（図５及び表２７）。
【０３３１】
【表３３】
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【０３３２】
泡沫細胞をＲＸＲ−ＬＸＲで前処理すると、脂質付加されていない物質に対する流出が大きく増加し、未処理細胞に対して最大速度が６倍増加した。脂質粒子に対する影響ははるかに小さく、２倍増加したのみであり、これは、コレステロール排出に対するＡＢＣＡ−１輸送体の寄与が小さいことを反映している（図６）。
【０３３３】
ｄ）インビボ研究
５つの脂質粒子変異体について試験した：
ｉ）ＰＯＰＣのみ
ii）ＤＰＰＣのみ
iii）ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  ３：１
iv）ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  １：１
ｖ）ＤＰＰＣ：ＳＭ  ９：１。
【０３３４】
８０mg/kgで０．５時間かけてウサギに静脈内注入を行い（ｎ＝３匹ウサギ／試験化合物）、次いで、注入後９６時間連続して血液をサンプリングした。
【０３３５】
ＥＬＩＳＡ用いるアポリポタンパク質レベルの分析：
−  薬物濃度
−  肝酵素、コレステロール、コレステロールエステルの血漿値に対するデータ。
【０３３６】
血漿中濃度は、試験した組成物全てについて非常に類似しており、それほど顕著ではない初期「分布」相に続いて、濃度の対数線形下降を示す（図７、表３）。
【０３３７】
【表３４】
0005860052.tif 000037
【０３３８】
測定した薬物動態学的（ＰＫ）パラメータは、試験した化合物全てについて類似していた。また、個体間差は低いことが見出された。測定された半減期は約１．５日であり、すなわち、野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉに比べて長かった。分布容積は、血漿容積（ウサギでは約４０mL/kg）に類似している。
【０３３９】
ｆ）コレステロール動員
血漿中においてコレステロールは動員され、そして、エステル化される。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉが減少し始めた後でさえも、血漿コレステロールエステルレベルは上昇し続ける。血漿テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉレベルが約０．５mg/mL（正常な野性型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの約５０％）まで減少しても、依然としてコレステロールエステルレベルの増加を検出することができる（図８）。
【０３４０】
ｇ）肝酵素放出
ＰＯＰＣを含有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子は肝酵素の放出を誘導しない（図１）。ウサギと同様に、ＰＯＰＣ又はＰＯＰＣ／ＤＰＰＣ混合物を含有する本発明に係るテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの単回i.v.注入は、マウスにおいて安全である。１：３のモル比でＤＰＰＣ：ＰＯＰＣを含有するアポリポタンパク質組成物は、ＰＯＰＣ単独と同等であった（図９）。
【０３４１】
５つの調製物のいずれにおいても、注入の２時間後まで著しい溶血は観察されなかった。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉをi.v.適用した２時間後に得られた血漿サンプルにおいて、溶血は測光法で赤色として測定された。全血（０．４４％のTriton X-100−最終濃度によって作製）の１００％の溶血を、キャリブレーションに使用した（図１０）。
【０３４２】
ｈ）ヒト臍帯静脈内皮細胞に対するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの抗炎症作用
５〜１０代継代したＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、１６時間それぞれのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ調製物中でインキュベートし、そして、最後の４時間TNFαで刺激した。ＶＣＡＭ１表面発現は、ＦＡＣＳによって特異的抗体で検出された。
【０３４３】
実施例９
脂質粒子の安定性
Ｎ末端ヒスチジンタグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含有する野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉを大腸菌において発現させ、そして、上記の実施例において報告した通りカラムクロマトグラフィーによって精製した。ヒスチジンタグは、ＩｇＡプロテアーゼによって切断して除去した。タンパク質のLipoid S100大豆リン脂質混合物に対する比１：１５０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した。粒子は、pH値７．３の５mMのリン酸ナトリウム及び１％のスクロースを含有するバッファ中で保存した。SE-HPLCにより、１０日間脂質付加及びインキュベートした後、インキュベート時に３つの別個のピークが明らかになった。４０℃でインキュベートした後、保持時間１０．８分において主なピークを検出することができ（総タンパク量の４７％）、これは、５℃で保存したサンプルでは存在しない。１０．８分のピークは、タンパク質の不安定化により可溶性の高分子量アセンブリが形成されたことを示す。
【０３４４】
ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ混合物（ＰＯＰＣのＤＰＰＣに対する比３：１）から出発して得られた本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有するＨＤＬ粒子も、５℃及び４０℃でインキュベートした。高温におけるインキュベートでは、わずかな程度のプレピーク形成が導かれるが、１０．８分の高分子量アセンブリにはそれほどシフトしない（１１分で＜２％の増加）。これは、野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有する粒子に比べてＨＤＬ粒子の安定性が改善されたことを示す。
【０３４５】
実施例１０
コレステロール動員
コレステロールが血液へ動員される効率は、アポリポタンパク質をインビボで投与した後に、総コレステロール濃度とアポリポタンパク質濃度とのそれぞれの可動域を比較することにより測定することができる。定量的評価については、基準線補正された総コレステロールの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）及びアポリポタンパク質の濃度−時間曲線下面積の指数を計算した。
【０３４６】
この実験では、以下の物質を分析した：
−  大腸菌において発現させ、そして、上記の実施例において報告した通りカラムクロマトグラフィーによって精製したＮ末端ヒスチジンタグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含有する野生型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ；ヒスチジンタグは、ＩｇＡプロテアーゼによって切断して除去した；タンパク質のLipoid S100大豆リン脂質混合物に対する比１：１５０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した、
−  アポリポタンパク質Ａ−ＩMilano変異体；タンパク質のＰＯＰＣに対する比１：４０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した、
−  本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；タンパク質のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣに対する比１：６０（ＰＯＰＣとＤＰＰＣとの比３：１）を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した。
【０３４７】
３つのＨＤＬ粒子をラットに適用した。それぞれのＡＵＣ比率について得られた値を表２９に示す。
【０３４８】
【表３５】
0005860052.tif 000038
【図２】
0005860052.tif 000039
【図１１】
0005860052.tif 000040
【図１２】
0005860052.tif 000041
【図１３】
0005860052.tif 000042
【図１４】
0005860052.tif 000043
【図１５】
0005860052.tif 000044
【図１６】
0005860052.tif 000045
【図１７】
0005860052.tif 000046
【図１８】
0005860052.tif 000047
【図２２】
0005860052.tif 000048
【図１】
0005860052.tif 000049
【図３】
0005860052.tif 000050
【図４】
0005860052.tif 000051
【図５】
0005860052.tif 000052
【図６】
0005860052.tif 000053
【図７】
0005860052.tif 000054
【図８】
0005860052.tif 000055
【図９】
0005860052.tif 000056
【図１０】
0005860052.tif 000057
【図１９】
0005860052.tif 000058
【図２０】
0005860052.tif 000059
【図２１】
0005860052.tif 000060
【図２３ａ】
0005860052.tif 000061
【図２３ｂ】
0005860052.tif 000062
【図２４Ａ】
0005860052.tif 000063
【図２４Ｂ】
0005860052.tif 000064
【配列表】
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