(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a1）〜（c1）のいずれか一である、DNAポリメラーゼ：
（a1）配列番号：8のアミノ酸配列において、736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に、
-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-
が挿入されたアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ
（配列中：
A737は、グリシン残基であり；
A738は、プロリン残基であり；
A739は、アルギニン残基であり；
A740は、アルギニン残基であり；
A741は、アラニン残基であり；
A742は、プロリン残基であり；
A743は、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、グルタミン酸残基、アラニン残基、グルタミン残基及びトレオニン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基であり；
A744は、アルギニン残基であり；
A745は、ロイシン残基である。）；
（b1）（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入されたアミノ酸配列を除く、1〜9個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ；及び
（c1）好熱性真正細菌由来のファミリーAに属するDNAポリメラーゼが有するアミノ酸配列において、配列番号：8のアミノ酸配列における736番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の間に-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-が挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ。
【請求項２】
配列番号：24で示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ。
【請求項３】
下記（A1）〜（D1）のいずれか一である、ポリヌクレオチド：
（A1）配列番号：23のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（B1）請求項1または２に記載のDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（C1）（A1）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつDNAポリメラーゼ（ただし、736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、請求項1の（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド；及び
（D1）（A1）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも95％同一である配列からなり、かつDNAポリメラーゼ（ただし、736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、請求項1の（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記（a2）〜（c2）のいずれか一である、DNAポリメラーゼ：
（a2）配列番号：8のアミノ酸配列において、117番のグルタミン酸残基、119番のアスパラギン酸残基、142番のアスパラギン酸残基及び144番のアスパラギン酸残基から選択される一以上が、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基に置換され、さらに736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に、
-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-
が挿入されたアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ
（配列中：
A737は、グリシン残基であり；
A738は、プロリン残基であり；
A739は、アルギニン残基であり；
A740は、アルギニン残基であり；
A741は、アラニン残基であり；
A742は、プロリン残基であり；
A743は、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、グルタミン酸残基、アラニン残基、グルタミン残基及びトレオニン残基からなる群より選択される１つのアミノ酸残基であり；
A744は、アルギニン残基であり；
A745は、ロイシン残基である。）；
（b2）（a2）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に挿入された部分を除く、1〜9個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ；及び
（c2）（a2）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも95％同一であり、そして117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に挿入された部分が同一である配列からなる、DNAポリメラーゼ。
【請求項５】
配列番号：14で示されるアミノ酸配列からなる、請求項4に記載のDNAポリメラーゼ。
【請求項６】
下記（A2）〜（D2）のいずれか一である、ポリヌクレオチド：
（A2）配列番号：13のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（B2）請求項4又は5に記載のDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（C2）（A2）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつDNAポリメラーゼ（ただし、117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、請求項6の（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド；及び
（D2）（A2）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも95％同一である配列からなり、かつDNAを鋳型としたプライマー伸長活性が、4.00 kb/U・min以上であるDNAポリメラーゼ（ただし、117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、請求項6の（a2）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項3または6に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項８】
請求項7に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
【請求項９】
請求項8に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1または2、及び4または5のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なDNAポリメラーゼに関する。本発明のDNAポリメラーゼは、特にPCRのために有用である。
【背景技術】
【０００２】
DNAポリメラーゼは、試験管の中で鋳型となるDNA鎖に添って新しくDNA鎖を合成することができる酵素であり、その反応には鋳型DNAの他にプライマーとなるオリゴヌクレオチドと4種のデオキシヌクレオチド（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）があれば、新しくDNA鎖が合成される。DNAポリメラーゼは塩基配列決定やPCRをはじめとする数多くの操作に利用されている。【０００３】
PCR法にとっては、耐熱性という性質は必須のものであるし、塩基配列決定においても現在では耐熱性DNAポリメラーゼを利用したサイクルシークエンス法が標準的な手法である。耐熱性の酵素を得るためには、通常、好熱性微生物の産生する酵素を調べる。好熱性細菌の中でも特に80℃以上を増殖至適温度とするものは超好熱性と呼ばれ、耐熱性酵素の優れた資源となる。PCRで汎用されるTaq DNAポリメラーゼ（「Taqポリメラーゼ」ということもある。）は、好熱性真正細菌Thermus aquaticusから単離された。【０００４】
DNAポリメラーゼは、アミノ酸配列の類似性から、ファミリーA、B、C、D、E、X及びYの7つのグループに分けられている。同じファミリーの酵素は、基本的にはよく似た性質を有している。実用的なのは、ファミリーA、Bに属する酵素である。【０００５】
ファミリーAの酵素は、基質としてのジデオキシヌクレオチドの認識性に優れ、塩基配列決定のために最も適している。そのため、シークエンスキットとして現在市販されているものに含まれているのは、すべてファミリーAに属する酵素であり、真正好熱細菌由来のものが利用されている。PCRには、ファミリーA及びBの酵素が目的に応じて使い分けられている。【０００６】
ファミリーBの酵素はジデオキシヌクレオチドの取込みが悪いために塩基配列決定には適さないが、鋳型鎖の配列に従ってDNA鎖合成を行う時の正確性に関わる3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、この活性を有しないTaqポリメラーゼなどのファミリーAの酵素よりも増幅時の間違いが少ない。ファミリーBの酵素として製品化されているのは、超好熱性アーキア由来のものである。より正確なPCRを行いたい場合にはファミリーBの酵素を用いればよく、長鎖DNAを増幅したい場合は、伸長性がよく、DNA合成効率のよいファミリーAの酵素を選択することができる。【０００７】
現在までにPCR酵素として広く利用されている二種類のThermus属由来のDNAポリメラーゼを比較すると、Taq DNAポリメラーゼには弱い逆転写活性しかないが、Thermus thermophilus由来のTth DNAポリメラーゼ（「Tthポリメラーゼ」ということもある。）は顕著に強い逆転写活性を有する。Tthポリメラーゼのこの性質は、一本の反応チューブで、一種類の酵素のみでmRNAから逆転写してcDNAを合成し、続いて増幅を行うという、簡便なRT-PCR技術に利用されている。この酵素は至適温度が高いので、逆転写反応を高温（60℃付近）で行うことができ、立体構造を形成しやすいRNAの逆転写にも有効である一方で、数kbに及ぶような長いcDNAの合成には適していない。【０００８】
PCRは世界中に普及し、日常的に利用されている遺伝子解析技術である。したがって、さらに便利で使い易く、信頼性のあるDNAポリメラーゼが望まれ、また鋳型や、伸長性、迅速性、正確性等の目的に応じ、種々のDNAを適切に増幅することができる様々なDNAポリメラーゼの提供が望まれている。【０００９】
これまで、Taqポリメラーゼの改変に関しては、ファミリーAのDNAポリメラーゼに高度に保存されているアミノ酸配列であって活性部位を含む部分をもとにプライマーを設計し、温泉土壌サンプルを鋳型とするPCR反応で得られた遺伝子断片を、野生型Taqポリメラーゼ遺伝子の相当する部分と入れ換えることにより、Taqポリメラーゼより伸長活性の高いキメラDNAポリメラーゼを得たとの報告がある（特許文献1及び2）。さらにメタゲノム解析やDNAポリメラーゼの立体構造情報をもとに、Taqポリメラーゼのアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加するような変異を導入し、プライマー伸長活性、鋳型DNAにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びPCR性能の少なくとも1つがTaqポリメラーゼよりも高い改変Taqポリメラーゼを得たとの報告がある（特許文献3）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2006-101791号公報
【特許文献２】特開2006-204267号公報
【特許文献３】特許4193997号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはTaqポリメラーゼとTthポリメラーゼとのアミノ酸配列同一性（約80％）と逆転写活性に関する性質の違いに着目し、両者の配列を詳細に比較した。しかしながら、それだけでは両者の性質の違いがどこに依存するのかは予想が付き難かった。【００１２】
一方、本発明者らは、各地の温泉土壌試料を採取し、そこから直接DNAを分離して、それ（メタゲノム）を基に、その中に含まれる様々な種類の生物が持つDNAポリメラーゼ遺伝子の一部をPCR法で増幅し、Taqポリメラーゼ遺伝子の相同な領域と試験管内で組換えることでキメラ酵素を作成するという手法を用いて、多種多様な生物由来DNAポリメラーゼの性質を、キメラTaqポリメラーゼの性質として反映させる実験結果を蓄積している。当然メタゲノムから獲得する遺伝子は、全長配列を含んでいることが理想であるが、環境中からメタゲノムDNAを調製すると、往々にして断片化していたり、損傷を受けていたりするので、完全長での遺伝子の獲得は非常に困難な作業である。したがって、メタゲノム中からDNAポリメラーゼの活性に大きな影響を与えている活性中心やその周辺の領域をコードする遺伝子部分を獲得し、Taqポリメラーゼ遺伝子の相同な領域と組換えて、キメラ酵素遺伝子とすることで、獲得した遺伝子断片がDNAポリメラーゼの基本的な性質に直接影響を与えると考えられる実験系を構築した。【００１３】
このようにして作製した多くのキメラTaqポリメラーゼの活性測定の結果を照らし合わせ、また野生型Taqポリメラーゼに組換えたメタゲノムDNA由来の遺伝子断片の配列を比較することで、系統樹を作成した（本出願には含まれていない。）。そして、キメラTaqポリメラーゼの活性を変化させた要因を予測した結果、野生型Taqポリメラーゼと比較して逆転写活性が顕著に強いキメラTaqポリメラーゼ8-16、18-7、1-8、3-7が見つかった。【００１４】
そこでまず、8-16、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼの配列比較を行うと、8-16とTthポリメラーゼで共通し、Taqポリメラーゼとは異なるアミノ酸残基は見つからなかった。しかし、TaqポリメラーゼとTthポリメラーゼの間で異なるアミノ酸残基十個のうち、この三種類のポリメラーゼの間で性質がまったく異なるアミノ酸残基が三箇所あった。そこで、このアミノ酸残基に注目して変異を導入することとした。【００１５】
次に18-7とTaqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼの配列比較により、逆転写活性を有する18-7とTthポリメラーゼでは共通し、Taqポリメラーゼとは一致しないアミノ酸残基を探すと四箇所のアミノ酸残基が見つかった。その中でも18-7とTthポリメラーゼの持つアミノ酸残基とTaqポリメラーゼの持つアミノ酸残基の性質が大きく異なるものが一箇所あり、このアミノ酸に変異を導入することにした。【００１６】
さらに、1-8、3-7に関しては、強いプライマー伸長活性と逆転写活性を示すのに対して、殆ど同じ配列を有するが極端に活性が弱いキメラ酵素1-20が存在した。この酵素1-20を含めて、1-8、3-7との三者の配列で完全に一致しない二箇所のアミノ酸のうち、活性が大きく異なる1-20だけが共通しない一箇所を選んで変異を導入することにした。【００１７】
前述の、メタゲノム情報を基にしてTaqポリメラーゼのある部分に9アミノ酸（GPRRAPRRL）を挿入した変異体は、逆転写活性そのものは弱いながらも逆転写反応に関して特に優れた伸長性を有することも見出した。このように本発明者らは、極めて有用だと考えられる性質を有する変異体DNAポリメラーゼを創製し、本発明を完成した。【００１８】
本発明は、以下を提供する：
［1］  下記（a1）〜（c1）のいずれか一である、DNAポリメラーゼ：
（a1）配列番号：8のアミノ酸配列において、736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に、
-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-
が挿入されたアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ
（配列中：
A737は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A738は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A739は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A740は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A741は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A742は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A743は、任意のアミノ酸残基であり；
A744は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A745は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基である。）；
（b1）（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入されたアミノ酸配列を除く、1〜9個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ；及び
（c1）好熱性真正細菌由来のファミリーAに属するDNAポリメラーゼが有するアミノ酸配列において、配列番号：8のアミノ酸配列における736番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の間に-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-が挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ；
［2］  （a1）のDNAポリメラーゼが有するアミノ酸配列
-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-中：
A737が、グリシン残基であり；
A738が、プロリン残基であり；
A739が、アルギニン残基であり；
A740が、アルギニン残基であり；
A741が、アラニン残基であり；
A742が、プロリン残基であり；
A743が、任意のアミノ酸残基であり；
A744が、アルギニン残基であり；及び
A745が、ロイシン残基である、
［1］に記載のDNAポリメラーゼ；
［3］  A743が、アルギニン残基、リシン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、またはトレオニン残基である、［1］または［2］に記載のDNAポリメラーゼ；
［4］  配列番号：24で示されるアミノ酸配列からなる、［1］〜［3］のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ；
［5］  下記（A1）〜（D1）のいずれか一である、ポリヌクレオチド：
（A1）配列番号：23のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（B1）［1］〜4］のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（C1）（A1）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつDNAポリメラーゼ（ただし、736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、［1］の（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド；及び
（D1）（A1）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも95％同一である配列からなり、かつDNAポリメラーゼ（ただし、736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、［1］の（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド；
［6］  下記（a2）〜（c2）のいずれか一である、DNAポリメラーゼ：
（a2）配列番号：8のアミノ酸配列において、117番のグルタミン酸残基、119番のアスパラギン酸残基、142番のアスパラギン酸残基及び144番のアスパラギン酸残基から選択される一以上が、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基に置換され、さらに736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に、
-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-
が挿入されたアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ
（配列中：
A737は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A738は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A739は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A740は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A741は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A742は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A743は、任意のアミノ酸残基であり；
A744は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり；
A745は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基である。）；
（b2）（a2）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に挿入された部分を除く、1〜9個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ；及び
（c2）（a2）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも95％同一であり、そして117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基の間に挿入された部分が同一である配列からなる、DNAポリメラーゼ；
［7］  （a2）のDNAポリメラーゼが有するアミノ酸配列
-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-中：
A737が、グリシン残基であり；
A738が、プロリン残基であり；
A739が、アルギニン残基であり；
A740が、アルギニン残基であり；
A741が、アラニン残基であり；
A742が、プロリン残基であり；
A743が、任意のアミノ酸残基であり；
A744が、アルギニン残基であり；及び
A745が、ロイシン残基である、
［6］に記載のDNAポリメラーゼ；
［8］  A743が、アルギニン残基、リシン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、又はトレオニン残基である、［6］または［7］に記載のDNAポリメラーゼ；
［9］  配列番号：14で示されるアミノ酸配列からなる、［6］〜［8］のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ；
［10］  下記（A2）〜（D2）のいずれか一である、ポリヌクレオチド：
（A2）配列番号：13のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（B2）［6］〜［9］のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（C2）（A2）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつDNAポリメラーゼ（ただし、117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、［6］の（a1）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド；及び
（D2）（A2）に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも95％同一である配列からなり、かつDNAを鋳型としたプライマー伸長活性が、4.00 kb/U・min以上であるDNAポリメラーゼ（ただし、117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分はそれぞれ、［6］の（a2）に記載のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列の117番、119番、142番及び144番に対応するアミノ酸残基並びに736番に対応するのアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された部分と同一である。）をコードする、ポリヌクレオチド；
［11］  ［5］または［8］に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター；
［12］  ［11］に記載の組換えベクターを含む、形質転換体；そして
［13］  ［12］に記載の形質転換体を培養する工程を含む、［1］〜［4］、及び［6］〜［9］のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼを製造する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、Taq DNAポリメラーゼ変異体の精製に関する、SDS-PAGEゲルの写真である。SDS-PAGEでの分析によって、調製したTaq DNAポリメラーゼ変異体それぞれの純度を確認した（実施例1参照）。
【図２】図2は、ヌクレオチド取り込みアッセイによる酵素活性測定の実例を示したグラフである（実施例2参照）。この実験の条件では、Taqの活性は、3.9×105 U/mgであった。
【図３】図3は、プライマー伸長速度を求めるためのグラフの例である。酵素量一定でプライマー伸長反応のタイムコースをとり、直線に乗る領域で、単位時間あたりの伸長鎖長をアルカリアガロース電気泳動法により測定して伸長速度を求めることができる（実施例2参照）。この実験の条件では、Taq 4.67kb/min/U、Taq'（Taq変異体）6.67kg/min/U、キメラA（Taqの一部を、メタゲノムから得られた相同な領域と組換えたキメラ）11.20kb/min/Uであった。
【図４】図4は、プライマー伸長速度を比較するための、アルカリアガロース電気泳動ゲルの写真である。
【図５】図5は、配列番号：8のTaq WTアミノ酸配列、及び配列番号：7のTaq WTヌクレオチド配列を示した図である。
【図６】図6は、配列番号：10のTaq Exo-のアミノ酸配列、及び配列番号：9のTaq Exo-のヌクレオチド配列を示した図である。
【図７】図7は、配列番号：12のTaq 9aaのアミノ酸配列、及び配列番号：11のTaq 9aaのヌクレオチド配列を示した図である。
【図８】図8は、配列番号：14のTaq Exo- + 9aaのアミノ酸配列、及び配列番号：13のTaq Exo- + 9aaのヌクレオチド配列を示した図である。
【図９】図9は、実施例3におけるリアルタイムPCRの結果を示す図である。
【図１０】図10は、実施例4における各精製酵素を泳動したSDS PAGEゲルの写真である。
【図１１】図11は、実施例5におけるリアルタイムPCRの結果を示す図である。
【図１２】図12は、実施例8における各DNA polymerase粗精製液を泳動したSDS PAGEゲルの写真である。
【図１３】図13は、実施例8におけるリアルタイムPCRの結果を示す図である。
【図１４】図14は、実施例9におけるリアルタイムPCRの結果を示す図である。
【図１５】図15は、実施例9におけるリアルタイムPCRの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
1.  本発明のDNAポリメラーゼ：
本発明は、新規DNAポリメラーゼ、より詳細には、好熱性真正細菌由来のファミリーAに属するDNAポリメラーゼの変異体を提供する。
【００２１】
1-1.  野生型Taqポリメラーゼおよびその変異体であるTaq Exo-（Exo-WT）
本発明者らは、まず、野生型Taqポリメラーゼを改変して、より優れたPCR酵素を創製することを目的に、鋭意検討し、Taqポリメラーゼに付随する5'→3'エキソヌクレアーゼ活性にとって重要と予想されるアミノ酸残基を4カ所同時に変換した変異体Taq Exo-（E117A、D119A、D142A、D144A）が野生型Taqポリメラーゼに比べて伸長活性において優れていることを見出した。
【００２２】
野生型Taqポリメラーゼのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の一部である配列表の、配列番号：8及び7に示した。また、Taq Exo-のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の一部である配列表の、配列番号：10及び9に示した。
【００２３】
Taq Exo-においては、配列番号：8のアミノ酸配列において、117番のグルタミン酸残基、119番のアスパラギン酸残基、142番のアスパラギン酸残基及び144番のアスパラギン酸残基のすべてが置換されているが（配列番号：10）、これらから選択される1つ以上、好ましくは2つ、より好ましくは3つが、それぞれ独立に、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはアラニン残基に置換されているアミノ酸配列を有するホモログもまた、本願発明において使用することができる。
【００２４】
Taq Exo-及びそのホモログは、プライマー伸長活性が野生型のTaqより向上している。より詳細には、それらのDNAを鋳型としたプライマー伸長活性はいずれも、4.00 kb/U・min以上であり、好ましくは8.00 kb/U・min以上であり、より好ましくは9.00 kb/U・min以上である。
【００２５】
1-2.  Taq 9aaおよびTaq Exo- + 9aa（Exo-+ 9aa）
本発明者らは、上述した野生型Taq DNA（配列番号：8）およびTaq DNAポリメラーゼの変異体であるTaq Exo-（配列番号：10）に基づいて、さらに、温泉土壌試料から調製したメタゲノム解析より得られた情報をもとに、Taq DNAと同じファミリーに属すると思われる配列をコードする一部の遺伝子に見られた配列を得て、9アミノ酸（GPRRAPRRL（配列番号：16））を野生型Taqポリメラーゼに挿入した変異体Taq 9aaを得た。そしてTaq 9aa、およびこの挿入変異を上記の5’-3’エキソヌクレアーゼ活性残基の置換変異（Taq Exo-）と組み合わせることにより得られた変異体Taq Exo- + 9aaが、ともに野生型Taqポリメラーゼに比べて伸長活性において優れていることを見出した。したがって、本発明は、Taq 9aa及びそのホモログ、それらをコードするポリヌクレオチド及びそのホモログを提供する（上記［1］〜［5］）とともに、Taq Exo- + 9aa及びそのホモログ、それらをコードするポリヌクレオチド及びそのホモログを提供する（上記［7］〜［10］）。
【００２６】
Taq 9aaのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の一部である配列表の、配列番号：12及び11に示した。Taq Exo- + 9aaのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の一部である配列表の、配列番号：14及び13に示した。
【００２７】
Taq 9aa及びTaq Exo- + 9aaにおいては、野生型Taqポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号：8）またはTaq Exo-のアミノ酸配列（配列番号：10）において、736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に9アミノ酸からなるアミノ酸配列-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-が挿入される。
【００２８】
この挿入される9アミノ酸の配列中：
A737は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはグリシン残基であり；
A738は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはプロリン残基であり；
A739は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはリシン残基、アルギニン残基、及びヒスチジン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A740は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはリシン残基、アルギニン残基、及びヒスチジン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A741は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはアラニン残基であり；
A742は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはプロリン残基であり；
A743は、任意のアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン残基、リシン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、またはトレオニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A744は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはリシン残基、アルギニン残基、及びヒスチジン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A745は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、より好ましくはロイシン残基である。
【００２９】
挿入される9アミノ酸としては、もっとも好ましくは、GPGQAPRAL（Gly Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu：配列番号：15）またはGPRRAPRRL（Gly Pro ArgArg Ala Pro Arg Arg Leu：配列番号：16）である。
【００３０】
Taq Exo- + 9aa、Taq Exo- + 9aa、及びそれらのホモログは、プライマー伸長活性が野生型のTaqポリメラーゼより向上している。より詳細には、それらのDNAを鋳型としたプライマー伸長活性はいずれも、4.00 kb/U・min以上であり、好ましくは8.00 kb/U・min以上であり、より好ましくは9.00 kb/U・min以上、さらに好ましくは10.0 kb/U・minである。
1-3.  Taq 9aa + R743X（9aa + R743X）およびTaq Exo- + 9aa + R743X（Taq Exo- + 9aa R743X）
【００３１】
本発明者らはさらに、Taq 9aaおよびおよびTaq Exo- + 9aaが野生型のTaqポリメラーゼと比べて反応速度が速く、高速PCRに有用であることを見出した。また、前記の736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入された9アミノ酸のうちA743がアルギニンの場合には、製造過程においてTaq 9aaまたはTaq Exo- + 9aaの特定の部位でペプチド結合が切断され得ること、及びこの特定の部位でペプチド結合が切断されたTaq 9aaまたはTaq Exo- + 9aaは、元のTaq 9aaまたはTaq Exo- + 9aaと比較して反応速度が遅いことを見出した。そして、Taq 9aaまたはTaq Exo- + 9aaの743番目のアルギニン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、この問題を解消可能であることを見出した。したがって、本発明は、Taq 9aa + R743X及びそのホモログ、それらをコードするポリヌクレオチド及びそのホモログを提供する（上記［1］〜［10］）。
【００３２】
Taq 9aa + R743Xは、配列番号：8のアミノ酸配列における736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基との間に、そして、Taq Exo- + 9aa R743Xは、配列番号：14のアミノ酸配列における736番目のアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基との間に、それぞれ9アミノ酸からなるアミノ酸配列-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-が挿入されてなるアミノ酸配列からなる。
【００３３】
この挿入される9アミノ酸の配列中：
A737は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はプロリン残基であり、より好ましくはグリシン残基であり；
A738は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はプロリン残基であり、より好ましくはプロリン残基であり；
A739は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはリシン残基、アルギニン残基、又はヒスチジン残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A740は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはリシン残基、アルギニン残基、又はヒスチジン残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A741は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はプロリン残基であり、より好ましくはアラニン残基であり；
A742は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はプロリン残基であり、より好ましくはプロリン残基であり；
A743は、任意のアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン残基、リシン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基又はトレオニン残基であり、より好ましくは、リシン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、又はトレオニン残基であり、更により好ましくはトレオニン残基であり；
A744は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはリシン残基、アルギニン残基、又はヒスチジン残基であり、より好ましくはアルギニン残基であり；
A745は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はプロリン残基であり、より好ましくはロイシン残基である。
【００３４】
Taq 9aa + R743XまたはTaq Exo- + 9aa R743Xのホモログとしては、上記のTaq 9aa + R743Xのアミノ酸配列（配列番号：24）またはTaq Exo- + 9aa R743Xのアミノ酸配列（配列番号：26）において、736番に対応するアミノ酸残基と737番に対応するアミノ酸残基の間に挿入されたアミノ酸配列を除く1〜9個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼ、並びに好熱性真正細菌由来のファミリーAに属するDNAポリメラーゼが有するアミノ酸配列において、配列番号：8のアミノ酸配列または配列番号：10における736番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基と737番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の間にアミノ酸配列-A737-A738-A739-A740-A741-A742-A743-A744-A745-が挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ上記のTaq 9aa、又はTaq 9aa + R743Xのアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼが例示される。
【００３５】
Taq 9aa + R743X、Taq Exo- + 9aa R743X、及びこれらのホモログは、反応速度が野生型のDNAポリメラーゼと比較して速い。DNAポリメラーゼの反応速度は、例えば反応速度を確認したいDNAポリメラーゼを用いて、約600bpの核酸配列を標的配列として、5秒の変性工程及び8秒のアニーリング・伸長工程を１サイクルとするPCRを行い、この際にPCRをインターカレーティング色素等によりモニタリングし、増幅産物量が一定量を超えた時点の反応サイクル数を野生型のDNAポリメラーゼを用いた場合と比較することによって確認することができる。
【００３６】
2.  定義等：
本発明で「DNAポリメラーゼ」というときは、特に記載した場合を除き、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として、鋳型核酸（DNA又はRNA）と相補的なDNA鎖を伸長する活性を有するタンパク質をいう。本発明において「Taqポリメラーゼ」又は「Taq DNAポリメラーゼ」というときは、特に記載した場合を除き、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼをいう。このDNAポリメラーゼが有するアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：8及び7として、本明細書の一部である配列表に示されている。
【００３７】
本発明で変異体に関し、「X番に対応するアミノ酸」というときは、特に記載した場合を除き、Xは、由来する野生型、すなわち配列番号：8の野生型Taqポリメラーゼのアミノ酸配列のアミノ酸配列におけるＮ末端側から数えた場合のアミノ酸残基の番号を示しており、X番に「対応するアミノ酸」とは、配列番号：8の野生型Taqポリメラーゼのアミノ酸配列のアミノ酸配列とそのホモログ（変異体を含む）のアミノ酸配列をアラインメントした際の、ホモログのアミノ酸配列における、上記のX番に対応するアミノ酸残基を指す趣旨である。例えば、ある変異体がN末端より1〜239個の連続するアミノ酸からなる部分を欠失している場合、ヌクレオチドの「651番に対応するアミノ酸」は、その変異体の412番のアミノ酸を指す。このような意義は、当業者には明らかである。
【００３８】
本発明でDNAポリメラーゼに関し、「活性」というときは、特に記載した場合を除き、DNA合成活性と、プライマー伸長活性とを含む。DNA合成活性には、DNAを鋳型とするしてそれに相補的なDNAを合成する活性と、RNAを鋳型としてそれに相補的なDNAを合成する活性とが含まれる。DNA合成活性は、当業者にはよく知られているように、基質であるデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）の取り込み活性として測定することができる。より具体的には、仔牛胸腺DNAやサケ精子DNAなどをDNase Iで部分的に消化して、二本鎖DNAにニックやギャップを生じさせたものを鋳型とし、一方、基質となるdNTPに放射性同位体で標識されたものを混合しておき、対象となるDNAポリメラーゼを作用させ、ニックトランスレーションによるニック部分に、又はプライマー伸長活性によりギャップ部分にヌクレオチドが取り込まれる量、放射活性を指標に測定することができる。この方法はヌクレオチド取り込みアッセイと呼ばれ、DNAポリメラーゼ活性を測定するための標準的な方法でもある。
【００３９】
本発明で「DNA合成活性」又は「DNAポリメラーゼとしての基本活性」というときは、特に記載した場合を除き、DNAを鋳型とした場合のdNTPの取り込み活性をいう。本発明で「DNA合成活性」又は「DNAポリメラーゼとしての基本活性」について数値で表わすときは、特に記載した場合を除き、DNAポリメラーゼが72℃で30分間に10 nmolsのヌクレオチドを取り込む酵素量を1 unit（U）として定義し、比活性（タンパク質量あたりの活性）として表わした値であり、単位は、U/mg等である。その測定のための条件は、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例に記載したものである。
【００４０】
本発明で「逆転写活性」というときは、特に記載した場合を除き、RNAを鋳型とした場合のdNTPの取り込み活性をいう。本発明で「逆転写活性」について数値で表わすときは、特に記載した場合を除き、DNAポリメラーゼが72℃で30分間に10 nmolsのヌクレオチドを取り込む酵素量を1 unit（U）として定義し、比活性（タンパク質量あたりの活性）として表わした値であり、単位は、U/mg等である。その測定のための条件は、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例に記載したものである。
【００４１】
本発明で「プライマー伸長活性」というときは、特に記載した場合を除き、DNA又はRNAを鋳型として、基質dNTPに対象となるDNAポリメラーゼを作用させた場合に単位時間当たりに伸長した鎖長をいい、単位はkb/U/min、bp/pmol/min等とすることができる。その測定のための条件は、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例に記載したものである。
【００４２】
また、本発明で「1〜9個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列を有するタンパク質（DNAポリメラーゼ）が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度であるか、同一又は性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列を有するタンパク質を獲得するための手段は、当業者にはよく知られている。
【００４３】
アミノ酸残基の置換等は、静電的な変化をもたらさないような置換等、例えば、電荷及び／又は極性の似たアミノ酸残基への置換であってもよい。このような置換には、例えば、生理的pH（7.0）付近で側鎖（R基と表現されることもある。）が非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基（グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基及びプロリン残基等）どうしの置換、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸（セリン残基、トレオニン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基及びグルタミン残基等）どうしの置換、生理的pH付近で側鎖が正電荷を有するアミノ酸残基（リシン残基、アルギニン残基、及びヒスチジン残基等）どうしの置換、側鎖が負電荷を有するアミノ酸残基（アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基等）どうしの置換、極性アミノ酸残基どうしの置換、非極性アミノ酸残基どうしの置換がある。
【００４４】
本発明で「ストリンジェントな条件下」というときは、特に記載した場合を除き、中程度又は高程度にストリンジェントな条件をいう。
【００４５】
中程度にストリンジェントな条件は、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。基本的な条件は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6〜7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。典型的には、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH8.0）の前洗浄条件；約40〜50℃での、約50％ホルムアミド、2〜6×SSC（又は、約42℃での、約50％ホルムアミド中のStark's solutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件；及び約40℃〜60℃、0.5〜6×SSC、0.1％SDSの洗浄条件を含む。中程度にストリンジェントな条件は、好ましくは、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼーション条件を含み、前述の洗浄条件及び／又は洗浄条件を含んでいてもよい。
【００４６】
高程度にストリンジェントな条件（高ストリンジェントな条件）もまた、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。高ストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度がが含まれる。典型的には、約65℃、0.2〜6×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC、さらに好ましくは0.2×SSCのハイブリダイゼーション条件を含む。いずれの場合も、約65〜68℃、0.2×SSC、0.1％SDSの洗浄条件を含むことが好ましい。
【００４７】
いずれの場合も、ハイブリダイゼーション、前洗浄及び洗浄のための緩衝液として、SSC（1×SSCは、0.15 M NaCl及び15 mMクエン酸ナトリウムである。）の代わりにSSPE（1×SSPEは、0.15 M NaCl、10 mM NaH2PO4、及び1.25 mM EDTA、pH7.4である。）を代用することができる。いずれの場合も、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、約15分間行うことができる。
【００４８】
また、本発明のためにストリンジェントな条件下でハイブリダイズを行う場合、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキット、例えばECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用することができる。このキットを使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、典型的には、キット中のハイブリダイゼーションバッファーにブロッキング試薬を5％（w/v）、NaClを0.5 Mになるように加え、42℃で4時間ハイブリダイゼーション行い、続いて55℃、0.4％SDS、0.5×SSC中で20分間の洗浄を二回行い、さらに室温、2×SSC中で5分間の洗浄を一回行うことができる。
【００４９】
本発明で、アミノ酸配列に関し、同一性が高いというときは、特に記載した場合を除き、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、最も好ましくは97％以上の配列の同一性を指す。本発明で、ヌクレオチド配列に関し、同一性が高いというときは、特に記載した場合を除き、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、最も好ましくは97％以上の配列の同一性を指す。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
【００５０】
アミノ酸配列においても、ヌクレオチド配列においても、本明細書では、意図した機能発揮のために重要な位置が説明されている。したがって、当業者であれば、そのような重要な位置を除く部分について配列を適宜変化させた種々の変異体を設計し、調製し、使用することができる。そのような変異体もまた、本発明の範囲に含まれうる。
【００５１】
本明細書で「好熱性真正細菌」というときは、至適生育温度が45℃以上、又は60℃以上の真正細菌のことを示す。好熱性真正細菌としては、例えば、Thermus aquaticusやThermus thermophilus等のサーマス（Thermus）属の細菌、Thermotoga maritima等のサーモトーガ（Thermotoga）属の細菌、Aquifex aeolicus等のアクイフェックス（Aquifex）属の細菌、及びThermodesulfobacterium commune等のサーモデスルフォバクテリウム（Thermodesulfobacterium）属の細菌が挙げられる。
【００５２】
本明細書で「高速PCR」というときは、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程を1サイクルとしたPCR、又は変性工程、アニーリング／伸長工程を１サイクルとしたPCRの１サイクルに要する時間が1分以下、好ましくは30秒以下、より好ましくは10秒以下の条件で行われるPCRのことを示す。現在市販されているPCR用の機器のうち、高速PCRに利用可能なものとしては、例えばChephid社のSmartCycler（登録商標）、及びBio-Rad社のCFX96 TouchリアルタイムPCR解析システムが挙げられる。
【００５３】
3.  製造方法、用途等：
本発明のDNAポリメラーゼは、当業者にはよく知られた方法によって、製造することができる。組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのDNA断片を調製するとよい。目的とするタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。次いで、上記DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製する。上記DNA断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（SD配列）等を含有することができる。目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体は、組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００５４】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）を使用することができ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。
【００５５】
宿主細胞としては、目的とするタンパク質をコードするDNAを発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。本発明でいう形質転換体は、これらのいずれかであり得る。
【００５６】
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具体的には、Escherichia coli BL21、Escherichia coliXL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coliK12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌、Bacillussubtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用することができる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用することができる。酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を使用することができる。
【００５７】
組換えベクターの宿主への導入方法としては、宿主にDNAを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にDNAを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。
【００５８】
目的とするタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５９】
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。目的とするタンパク質の生産のためには、培養系のみならず、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【００６０】
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。得られたタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００６１】
このようにして製造することができる本発明の変異体は、特にRNAを鋳型としたRT-PCRに有用である。また、優れたDNAポリメラーゼとしての基本活性と優れた逆転写活性とを併せ持つ変異体は、逆転写反応とPCRとを一の酵素で実現することができる。さらに、野生型に比べて反応速度が向上した変異体は、高速PCRに有用である。
【００６２】
本発明の変異体は、核酸増幅（特に、PCR）用キットの構成要素とすることができる。DNA増幅（特に、PCR）用キットは、本発明の変異体以外に、核酸増幅を行うために必要な試薬（例えば、4種類のdNTPs、Mg2+、バッファー、添加剤など）、容器、装置等を含むことができる。このようなキットは、核酸配列決定、遺伝子診断、個体識別、品種判定、体質調査のためのSNP（一塩基多型）解析、遺跡調査など、幅広い用途に適している。
【実施例】
【００６３】
〔実施例1：変異体の作製〕
1.  変異の導入：
Taqポリメラーゼのアミノ酸置換変異体を作製するため、目的の位置に変異が入るように配列を設計したプライマーと、Taqポリメラーゼ遺伝子が挿入された発現用プラスミドを鋳型として、PCR反応によるプライマー依存的な部位特異的変異の導入を行った。Taqポリメラーゼの部位特異的変異の導入には、以下に示すプライマーを用いた。それぞれの変異体作成におけるアミノ酸置換部位を下線で示した。【００６４】
【化１】
0005852650.tif 000002
【００６５】
【化２】
0005852650.tif 000003
【００６６】
PCR反応液50μl（20 ng pTV-Taq plasmid DNA、0.5μM各プライマーセット、0.2 mM dNTP、1 U PyrobestDNA polymerase（TAKARA Bio）をPyrobest用buffer中で98℃で10秒間、初期変性を行い、16サイクル（98℃10秒、55℃30秒、72℃8分）の条件でPCRを行った。得られたPCR産物に5 Uの制限酵素DpnIを加え、37℃で2時間保温した。その後反応液を大腸菌JM109株に導入して培養し、次項のようにして、得られた形質転換体クローンからプラスミドを抽出して、目的の位置に変異が入っていることを確認した。【００６７】
2.  プラスミドの調製と塩基配列の確認：
プラスミド中の薬剤耐性遺伝子をマーカーとして、大腸菌の形質転換体をアンピシリンを50μg/ml含んだLBプレート培地上に撒いて、37℃、15時間培養して選択した。生育したコロニーを50μg/mlのアンピシリンを含んだLB液体培地4 mlに植菌し、37℃、15時間培養した。集菌した菌体から、QIAprep spin Miniprep kit（QIAGEN）を用いて、kitのプロトコルに従ってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドDNAを鋳型にして、DTCS Quick Start Master Mix（Beckman Coulter）を用いてジデオキシ反応を行い、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000XL（BECKMAN COULTER）を用いて塩基配列を確認した。【００６８】
本研究で作製した新規DNAポリメラーゼの一覧を下表に示す。【００６９】
【表１】
0005852650.tif 000004
【００７０】
3.  DNAポリメラーゼの発現、及び精製：
野生型、及び変異型のTaqポリメラーゼの産生は、それぞれの遺伝子がpTV-118Nベクターに組込まれたプラスミドを用いて、JM109株を標準的な手法により形質転換し、その形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含んだLB液体培地500 mlで37℃、24時間培養する条件で行った。【００７１】
その後、6,000 rpmで15分間、遠心分離することで集菌した菌体を1 mMのPMSFを含むBuffer A（50 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.5 mM DTT、10％Glycerol）25 mlに懸濁し、超音波破砕して、14,500 rpm、15分間遠心分離して、細胞粗抽出液を得た。この粗抽出液を80℃で20〜30分間静置して耐熱性のないタンパク質を変性させ、14,500 rpmで15分間の遠心分離によって上清に耐熱性画分を得た。この画分に、氷上で0.15％濃度になるようにポリエチレンイミンを加え、沈殿物（核酸）を14,500 rpm、15分間の遠心分離によってを除いた。【００７２】
続いて、上清に対して氷上で80％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて1時間以上撹拌して塩析した。14,500 rpm、15分間遠心分離にかけ、タンパク質を沈殿させ、その沈殿を0.8 Mの硫酸アンモニウムを含んだBuffer Aに懸濁した後、AKTA Explorer（GE Healthcare）を用いてHi Trap Phenylカラム（5 ml）に供してクロマトグラフィーを行った。試料を供した後、硫酸アンモニウムの濃度を1 Mから0 Mまで勾配させ、さらにカラム内に超純水を通す事で目的の酵素を溶出させた。この画分を回収し、Hi Trap Heparinカラム（1 ml）に供した。溶出は、Buffer Aに溶解させた塩化ナトリウムの濃度を0 Mから800 mMの濃度勾配で行った。得られた目的酵素は、SDS-PAGEでの分析によってそれぞれの純度を確認した。【００７３】
〔実施例2：変異体の評価〕
1.  ＤＮＡ合成活性：
精製された各酵素のDNAポリメラーゼとしての基本活性を求めるために、世界標準となっている方法を用いた。すなわち、DNA鋳型鎖上でデオキシリボヌクレオチドを取り込む活性の強さを測定し、単位タンパク質量あたりの活性をユニットで計算した。ヌクレオチド取り込み反応は、反応液中は、0.2 mg/ml活性化DNA（これは仔牛胸腺DNAをDNase Iで処理して二本鎖DNAに、部分的にニックやギャップを入れたもの）、0.2 mM dNTP、440 nM [3H]-dTTP、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl、0.1％TritonX-100、100μg/ml BSA、1 nM DNAポリメラーゼを加え、72℃で反応させた後、10μlをDE81ペーパーにスポットした。【００７４】
10分間風乾した後、5％リン酸水素二ナトリウム水溶液で未反応のヌクレオチドを洗い落とした。洗浄は10分間、3回行った．DE81ペーパーを乾燥させた後、液体シンチレーションカウンターによって放射線量を測定することにより、DNAポリメラーゼ活性によって、活性化DNA中に取り込まれた[3H]-dTMP量を計算し、酵素活性（unit）を求めた。1 unitはDNAポリメラーゼが72℃で30分間に10 nmolsのヌクレオチドを取り込む酵素量として定義し、それぞれの酵素について比活性を算出した。【００７５】
2.  伸長活性（伸長速度）：
得られた比活性の値を基に、単位unitあたりのプライマー伸長活性を求めた。プライマー伸長反応は、M13ファージ一本鎖DNA（7 kb）に32Pで放射標識したオリゴヌクレオチドをアニーリングさせたもの（primed DNA）を基質として用いた。反応液10μl（5 nM M13 primed DNA、0.2 mM dNTP、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1.5 mM MgCl、50 mM KCl、0.1％TritonX-100、100μg/ml BSA）を72℃で5分間反応させた後、2.5μlの6×Loading buffer（300 nM NaOH、6 mM EDTA、18％Ficol 400、0.15％BCG、0.25％XC）を加えて反応を停止させた。反応産物をアルカリ条件下でのアガロースゲル電気泳動（50 mM NaOH、1 mM EDTA中1％濃度でアガロースゲルを作製）に供して分離し、泳動後オートラジオグラフィーで産物を検出した（イメージアナライザーFLA-5000（FUJIFILM）を使用した）。【００７６】
得られた像から、サイズマーカーと比較して、反応産物の鎖長を求め、単位時間（1分）あたりに得られる合成産物の鎖長を計算した。その結果、野生型のTaqポリメラーゼが3.89 kb/minであるのに対して、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性残基を部位特異的に置換した変異体Exo-が9.17 kb/minであった。そして、9アミノ酸を挿入したExo- + 9aa は11.3 kb/minであった。【００７７】
3.  逆転写活性：
DNAポリメラーゼがRNA鋳型鎖上でデオキシリボヌクレオチドを取り込む活性の強さを、精製した各DNAポリメラーゼで測定した。反応は、20 ng/μl Poly(rA)・p(dT)、10μM dTTP、440 nM [3H]-dTTP、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM MnCl2、50 mM KCl、0.1％TritonX-100、100μg/ml BSAを含む溶液に、DNAポリメラーゼを加え、60℃で10分間反応させ、10μlをDE81ペーパーにスポットした。風乾後、5％リン酸水素二ナトリウム水溶液未反応のヌクレオチドを洗い落とした。洗浄は10分間、3回行った。【００７８】
DE81ペーパーを乾燥させた後、液体シンチレーションカウンターによって放射線量を測定することにより、DNAポリメラーゼ活性によって、Poly(rA)・p(dT)中に取り込まれた[3H]-dTMP量を計算し、酵素活性（unit）を求めた。1 unitはDNAポリメラーゼが72℃で30分間に10 nmolsのヌクレオチドを取り込む酵素量として定義し、それぞれの酵素について比活性を算出した。【００７９】
発明者らによって精製された野生型のTaq DNAポリメラーゼの逆転写活性は4.24×103 U/mgであることが明らかとなった。【００８０】
同じ条件を用いて、本発明で作製した変異体の逆転写活性を、ヌクレオチド取り込み活性により測定した結果、Taq 9aaは2.78×103 U/mgであった。この結果は、野生型 Taq DNAポリメラーゼが持つ逆転写活性を1とした時に、Taq 9aaは0.66倍の活性を示したことになる。【００８１】
変異Taqポリメラーゼの性質を下記の表にまとめる。【００８２】
【表２】
0005852650.tif 000005
【００８３】
〔実施例3：変異体の反応速度の評価〕
500 ngのHuman HL60 cell Total RNAを鋳型にPrimeScript（登録商標）RT reagent Kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）を用いてcDNA合成を行った。【００８４】
得られたcDNAのうち10 ng RNA相当量を鋳型として用い、Actin, beta cDNA領域の186 bp、381 bp、及び533 bpの領域を標的配列としたリアルタイムPCRにより、実施例1で作成したTaq 9aaの反応速度を評価した。Actin, beta cDNA領域の186 bpを増幅するためのプライマー対としては配列表の配列番号：17のヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列表の配列番号：18のヌクレオチド配列からなるプライマーを、Actin, beta cDNA領域の381 bpを増幅するためのプライマー対としては配列表の配列番号：17のヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列表の配列番号：19のヌクレオチド配列からなるプライマーを、Actin, beta cDNA領域の533 bpを増幅するためのプライマー対としては配列表の配列番号：17のヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列表の配列番号：20のヌクレオチド配列からなるプライマーを、それぞれ用いた。【００８５】
PCR反応液としては、10 ng RNA相当量のcDNA、0.4μM eachのプライマー、1×PCR buffer〔TaKaRa Taq（タカラバイオ社製）に添付の10×PCR bufferを使用〕、0.2 mM each dNTP、0.3×SYBR Green I（Invitrogen社製）、及び1.25 UのTaq 9aaを含む25μLを計３種類、氷上にて調製した。また、対照として、1.25 UのTaq 9aaの代わりに1.25 UのTaKaRa Taq DNA polymerase（タカラバイオ社製）を含む以外は上記と同様の反応液を計３種類、氷上にて調製した。次に、これらのPCR反応溶液を、95℃、30secの初期変性を行った後に、95℃、5秒〜60℃、10秒を1サイクルとする40サイクルのリアルタイムPCRに供した。また、リアルタイムPCR後に融解曲線分析を行うことにより、増幅反応の特異性を確認した。なお、上記のリアルタイムPCRには、反応装置としてThermal Cycler Dice（登録商標）Real Time System（タカラバイオ社製）を用いた。【００８６】
各反応液の増幅産物をモニタリングした結果、及び融解曲線分析の結果を図9に、各反応液でのリアルタイムＰＣＲにより算出されたCt値を表3に示す。【００８７】
【表３】
0005852650.tif 000006
【００８８】
その結果、TaKaRa Taq DNA Polymeraseを用いた場合には、381 bp、533 bpを標的配列としたPCRにおいて標的配列よりも短い鎖の非特異的なプライマーダイマーと予想される増幅産物が増幅したのに対し、Taq 9aaを用いた場合には、381 bp、533 bpを標的配列としたPCRにおいても標的配列からなる特異的な増幅産物が得られた。また、Taq 9aaを用いた場合、381 bp、533 bpを標的配列としたリアルタイムPCRにより算出されたCt値は、186 bpを標的配列としたリアルタイムPCRにより算出されたCt値と同等であった。このことは、Taq 9aaの反応速度（ポリメラーゼ合成速度）が、野生型のTaq DNA Polymeraseと比べて速いことを示している。【００８９】
〔実施例4：Taq 9aaおよびTaq Exo- + 9aaの作製と評価〕
実施例1の3と同様の方法で、Taq 9aa及びTaq Exo-+ 9aaのタンパク質発現及びタンパク質精製を複数回行った。得られた精製酵素を製造ロットごとにそれぞれTaq 9aa 1st lot、Taq 9aa 2nd lot、Taq 9aa 3rd lot、Taq Exo- + 9aa 1st lotとした。各精製酵素を15％SDS Poly-Acrylamid gelを用いて電気泳動し、CBB染色した結果を図10に示す。その結果、Taq 9aa及びTaq Exo- + 9aaは、製造lotによってはペプチド結合が切断され、SDS PAGEで全長に相当するポリペプチド断片（large unit）とは異なる２つの断片（middle unit、small unit）が検出される場合があることが示された（Lane 4、5、6、7、8、9）。【００９０】
〔実施例5：実施例4で得られた精製酵素の反応速度の評価〕
実施例4で得られた精製酵素のうち、Large unitの比率が高いTaq 9aa 1st lotとLarge unitの比率が低いTaq 9aa 3rd lotの反応速度を比較した。反応速度の比較は、1.25 Uの実施例１で調製したTaq 9aaの代わりに1.25 UのTaq 9aa 1st lot又は1.25 UのTaq 9aa 3rd lotを用い、Actin, beta cDNA領域の533 bpを標的配列とするPCR反応液のみを調製する以外は、実施例3と同様の方法により行った。【００９１】
各反応液の増幅産物をモニタリングした結果、及び融解曲線分析の結果を図11に、各反応液でのリアルタイムＰＣＲにより算出されたCt値を表4に示す。【００９２】
【表４】
0005852650.tif 000007
【００９３】
その結果、Large unit比率が高いTaq 9aa 1st lotを用いた反応の方がLarge unit比率が低いTaq 9aa 3rd lotを用いた反応と比較して、Ct値が小さかった。この結果は、ペプチド結合が一部切断されたTaq 9aaよりも、ペプチド結合が切断されていないTaq 9aaの方が反応速度（ポリメラーゼ合成速度）が速いことを示している。【００９４】
〔実施例6：midle unit及びsmall unitの解析〕
実施例4で作製したTaq 9aa 3rd lotよりmiddle unitとsmall unitとを分離し、これらのポリペプチドについてN末端アミノ酸配列解析を行った。解析の結果、middle unitのN末端アミノ酸配列はMRGML（配列番号：21）、small unitのN末端アミノ酸配列はRLVKS（配列番号：22）であることが判明した。これを配列表の配列番号：12に示すアミノ酸配列と比較すると、middle unitのN末端アミノ酸配列はTaq 9aaのN末端に相当し、small unitのN末端のアミノ酸残基であるアルギニン残基はTaq 9aaの743番目のアルギニン残基に相当する。この結果は、Taq 9aaやTaq Exo- + 9aaは、その製造過程においてN末端から742番目のプロリン残基と743番目のアルギニン残基の間のペプチド結合が切断され得ることを示している。【００９５】
〔実施例7：Taq 9aa R743Xの作製〕
Taq 9aaのアミノ酸配列（配列番号：12）のうち、743番目のR（アルギニン残基）をそれぞれK（リジン）、H（ヒスチジン）、E（グルタミン酸）、A（アラニン）、Q（グルタミン）、又はT（トレオニン）に変更したTaq 9aa R743K、Taq 9aa R743H、Taq 9aa R743E、Taq 9aa R743A、Taq 9aa R743Q、及びTaq 9aa R743Tの発現プラスミドを構築した。配列表の配列番号：24に、Taq 9aaのアミノ酸配列のうち743番目のアルギニン残基を任意のアミノ酸残基として表したアミノ酸配列を示す。また、これをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号：23に示す。【００９６】
こうして構築した発現プラスミド、及び実施例１により構築したTaq 9aaを発現する発現プラスミドにより大腸菌JM109を形質転換し、タンパク質発現を行った。タンパク質発現を行った大腸菌JM109の形質転換体を集菌後超音波破砕し、次に、破砕液を70℃、20分の加熱処理に供した後、遠心分離により分画し、上清画分をDNA polymerase粗精製液とした。【００９７】
〔実施例8：Taq 9aa R743Xの評価〕
実施例7により得られたDNA polymerase粗精製液を15％SDS Poly-Acrylamid gelを用いて電気泳動し、CBB染色した（図12）。その結果、Taq 9aaの743番目のアルギニン残基をグルタミン酸以外のアミノ酸残基に置換することにより、製造過程におけるペプチド結合の切断を回避可能であることが示された。次に、実施例7により得られたDNA polymerase粗精製液、を用いて、各DNA Polymeraseの反応速度を比較した。反応速度の比較は、1.25 UのTaq 9aa 3rd lotの代わりに上記により得られたTaq 9aa R743Xを1.25 U用いる以外は実施例5と同様の方法により行った。【００９８】
増幅産物をモニタリングした結果、及び融解曲線分析の結果を図13に、各反応液でのリアルタイムＰＣＲにより算出されたCt値を表5に示す。【００９９】
【表５】
0005852650.tif 000008
【０１００】
図13及び表5に示す通り、どの変異体を用いた反応においても、野生型ののTaq DNA Polymeraseを用いた反応と比較してCt値が小さかった。【０１０１】
〔実施例9：Taq 9aa R743T、Taq Exo- + 9aa R743Tを用いた高速PCR〕
1.  Taq 9aa R743T、Taq Exo- + 9aa R743Tの発現、精製
Taq Exo- + 9aaのアミノ酸配列（配列番号：14）のうち、743番目のR（アルギニン残基）をT（トレオニン）に変更したTaq Exo- + 9aa R743Tの発現プラスミドを構築した。こうして構築した発現プラスミドと、実施例7で作製したTaq 9aa R743Tの発現プラスミドを用いて、実施例1の3と同様の方法でTaq 9aa R743T、及びTaq Exo-+ Taq 9aa R743Tのタンパク質発現およびタンパク質精製を行った。
2.   Taq 9aa R743T、Taq Exo-+ 9aa R743Tを用いた高速PCRの評価
500 ngのHuman HL60 cell Total RNAを鋳型にPrimeScript（登録商標）RT reagent Kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）を用いてcDNA合成を行った。得られたcDNAのうち10 ng RNA相当量のcDNA、0.4μMの配列表の配列番号：17のヌクレオチド配列からなるプライマー、0.4μMの配列表の配列番号：18のヌクレオチド配列からなるプライマー、1×PCR buffer〔TaKaRa Taq（タカラバイオ社製）に添付の10×PCR bufferを使用〕、0.2 mM each dNTP、0.3×SYBR Green I（Invitrogen社製）、及び1.25 UのTaq 9aa R743T、Taq Exo- + 9aa R743T、Taq 9aa 3rd lot、Taq Exo-+ 9aa 1st lot、又はTaKaRa Taq DNA polymerase（タカラバイオ社製）を含む25μLのActin, betaの186 bpの領域を標的配列とするPCR反応液を計４種類、氷上にて調製した。これらのPCR反応溶液について、CFX96 TouchTMリアルタイムPCR解析システム（Bio-Rad社製）を用いて95℃、30 secの初期変性後、95℃、5秒〜60℃、1秒を1サイクルとする40サイクルのPCRを実施した。また、リアルタイムPCR後に融解曲線分析を行うことにより、増幅反応の特異性を確認した。【０１０２】
増幅産物をモニタリングした結果、及び融解曲線分析の結果を図14、及び図16に、各反応液でのリアルタイムＰＣＲにより算出されたCt値を表6に示す。【０１０３】
【表６】
0005852650.tif 000009
【０１０４】
その結果、Taq 9aaでは標的配列よりも短い鎖の非特異的なプライマーダイマーと予想される増幅産物が増幅したのに対し、Taq 9aa R743Tでは標的配列からなる増幅産物を得ることができた。この結果は、Taq 9aa R743TはTaq 9aaよりも反応速度（ポリメラーゼ合成速度）が速くなっていることを示す。また、Taq Exo-+ 9aa R743Tでは、Taq Exo-+ 9aaと比較してCt値が小さく、Taq Exo- + 9aa R743TはTaq Exo- + 9aaよりも反応速度（ポリメラーゼ合成速度）が速くなっていることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号：1  PCRプライマーTaq117119A-F
配列番号：2  PCRプライマーTaq117119A-R
配列番号：3  PCRプライマーTaq142144A-F
配列番号：4  PCRプライマーTaq142144A-R
配列番号：5  PCRプライマーTaq-9AAin-F R2
配列番号：6  PCRプライマーTaq-9AAin-R R2
配列番号：7  Taq WTヌクレオチド配列
配列番号：8  Taq WTアミノ酸配列
配列番号：9  Taq Exo-のヌクレオチド配列
配列番号：10  Taq Exo-のアミノ酸配列
配列番号：11  Taq 9aaのヌクレオチド配列
配列番号：12  Taq 9aaのアミノ酸配列
配列番号：13  Taq Exo- + 9aaのヌクレオチド配列
配列番号：14  Taq Exo- + 9aaのアミノ酸配列
配列番号：15  挿入配列
配列番号：16  挿入配列
配列番号：17  PCRプライマーhACTB-F
配列番号：18  PCRプライマーhACTB-R186
配列番号：19  PCRプライマーhACTB-R381
配列番号：20  PCRプライマーhACTB-R533
配列番号：21  middle unitのN末端のアミノ酸配列
配列番号：22  small unitのN末端のアミノ酸配列
配列番号：23  Taq 9aa R743Xのヌクレオチド配列
配列番号：24  Taq 9aa R743Xのアミノ酸配列
配列番号：25  Taq Exo- + 9aa R743Xのヌクレオチド配列
配列番号：26  Taq Exo- + 9aa R743Xのアミノ酸配列
【図２】
0005852650.tif 000010
【図３】
0005852650.tif 000011
【図５】
0005852650.tif 000012
【図６】
0005852650.tif 000013
【図７】
0005852650.tif 000014
【図８】
0005852650.tif 000015
【図１】
0005852650.tif 000016
【図４】
0005852650.tif 000017
【図９】
0005852650.tif 000018
【図１０】
0005852650.tif 000019
【図１１】
0005852650.tif 000020
【図１２】
0005852650.tif 000021
【図１３】
0005852650.tif 000022
【図１４】
0005852650.tif 000023
【図１５】
0005852650.tif 000024
【配列表】
0005852650000001.app