(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
（１）ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを細菌内に発現させるステップと、
（２）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
（３）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
（４）細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記（１）〜（４）のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であり、
前記ＤＮＡ構築物は、前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変である、作製方法。
【請求項２】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現する細菌に対して、
（５）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現させるステップと、
（６）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
（７）前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であり、
前記ＤＮＡ構築物は、前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変である、作製方法。
【請求項３】
前記細菌が、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡであって前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によってはアシル化されないｔＲＮＡを発現しており、
当該ｔＲＮＡをコードする遺伝子を欠損させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項４】
前記非天然タンパク質が非天然型アミノ酸あるいはα−ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項５】
前記細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項６】
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される任意の６つの遺伝子であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項７】
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ及びｈｅｍＡの遺伝子であることを特徴とする請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
前記１以上の遺伝子として、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項６または７に記載の作製方法。
【請求項９】
遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する上記遺伝子が、大腸菌のｓｕｃＢ遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の作製方法。
【請求項１０】
前記細菌が大腸菌であり、
前記ＤＮＡ構築物は、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される１以上の遺伝子の機能を発現するＤＮＡ構築物であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ構築物は、さらに大腸菌のｓｕｃＢ遺伝子の機能を発現するＤＮＡ構築物であることを特徴とする請求項１０に記載の作製方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ構築物は、細菌染色体にトランス及び／又はシスに補充されるバクテリア人工染色体、プラスミドあるいは直鎖状ＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１３】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのＤＮＡ構築物であって、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡ及び前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現し、
前記組換え細菌は、大腸菌由来または枯草菌由来であり、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌であって、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現することと、
前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現することと、
ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されていること、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていることと、
前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることと、
前記組換え細菌は、大腸菌由来または枯草菌由来であり、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であること、
前記ＤＮＡ構築物は、前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことと、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変であることと、
を特徴とする組換え細菌。
【請求項１５】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項１４に記載の組換え細菌。
【請求項１６】
組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法であって、
（ａ）非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸と結合可能な、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡと、
（ｃ）ランダムに、あるいは所望の位置に１つ以上のナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
を請求項１４に記載の組換え細菌又は当該組換え細菌の抽出液内で発現させることを特徴とする非天然タンパク質の製造方法。
【請求項１７】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項１６に記載の非天然タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、
前記組換え細菌が、
大腸菌由来または枯草菌由来であることと、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現することと、
前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現することと、
ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されていること、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていることと、
前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることと、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であることと、
前記ＤＮＡ構築物は、前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことと、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変であることと、
を特徴とする抽出物。
【請求項１９】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項１８に記載の抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのＤＮＡ構築物、非天然タンパク質製造用の組換え細菌、組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物に関する。特に、本発明は、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損した組換え細菌の作製方法、該遺伝子を欠損させるためのＤＮＡ構築物、該遺伝子が欠損した組換え細菌、該遺伝子が欠損した組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法、該遺伝子が欠損した組換え細菌の抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
非天然タンパク質（又は超タンパク質）と呼ばれる、所望の位置のアミノ酸残基を非天然型アミノ酸及び／又はα―ヒドロキシ酸で置換したタンパク質がある。この非天然タンパク質は、天然タンパク質に存在しない新しい生理活性、触媒活性、構造及び機能を有する。そのため、非天然タンパク質の合成は、従来のタンパク質工学における制約を乗り越える必要不可欠な基盤技術となる。【０００３】
近年では、大腸菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いて非天然タンパク質を合成することが可能である。このような合成システムにおいて、非天然型アミノ酸が非特異的な位置に導入されることは望ましくないため、一般的には、ストップコドンの一つであるアンバーコドン（ＵＡＧコドン）に非天然型アミノ酸が導入される。【０００４】
アンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入は、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子と競合することが知られており、非特許文献１、２では、大腸菌の翻訳終結因子であるＲＦ−１の活性を弱めることによって、非天然型アミノ酸の導入効率が改善されること、非特許文献３では、無細胞タンパク質合成系においてＲＦ−１の量を減らすことによって、アンバーコドンへ効率よく非天然型アミノ酸が導入されることが報告されている。【０００５】
さらに、ＲＦ−１をコードするｐｒｆＡ遺伝子を欠損させることで非天然型アミノ酸の導入効率をさらに改善できると考えられる。ここで、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させる方法として、非特許文献４では、ゲノム上の全ての遺伝子のアンバーコドンをオーカーコドン又はオパールコドンに置き換える方法が開示されている。また、非特許文献５、６では、アンバーコドンを全てオーカーコドンに置き換え、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた大腸菌が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３１７９１０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ryden,S.M., and Isaksson,L.A., Molecular and General Genetics,193,38-45 (1984)
【非特許文献２】Kleina,L.G., et al., Journal of Molecular Biology, 213, 705-717 (1990)
【非特許文献３】Short III,G.F., et al., Biochemistry, 38, 8808-8819 (1999)
【非特許文献４】Forster,A.C. et al., Genome Research,17,1-6 (2007)
【非特許文献５】Wang,H.H., et al., Nature，460, 894-898 (2009)
【非特許文献６】“Synthetic Biology Projects”、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成２１年４月３０日検索］、インターネット＜URL:http://arep.med.harvard.edu/SBP/＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、種々の細菌の翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損株に対するニーズがあるが、上記の従来技術には、欠損株の作製に手間がかかるという課題がある。例えば、特許文献５、６に開示の大腸菌は、非天然型アミノ酸導入タンパク質に用いる大腸菌としての汎用性が低く、この大腸菌よりも汎用性が高いｐｒｆＡ欠損株に対するニーズがある。しかしながら、非特許文献４に開示の技術を用いて欠損株を作製する場合には、ゲノム上の全ての遺伝子のアンバーコドン（３１４個）を置き換えることが必要であり、手間がかかるため、非天然タンパク質を合成する系としては好ましくない。【０００９】
従って、本発明の主な目的は、細菌の翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させる場合に好適に適用し得る、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の好適な実施形態を含む。【００１１】
（形態１）
第一の視点において、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
（１）ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを細菌内に発現させるステップと、
（２）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
（３）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
（４）細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、前記（１）〜（４）のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であることを特徴とする。【００１２】
（形態２）
第一の視点における別の作製方法として、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現する細菌に対して、
（５）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現させるステップと、
（６）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
（７）前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であることを特徴とする。【００１３】
（形態１５）
第二の視点において、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのＤＮＡ構築物であって、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡ及び前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現することを特徴とするＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする。【００１４】
（形態１６）
第三の視点において、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌であって、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現すること、前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現すること、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されていること、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること、及び、前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していること、を特徴とする。【００１５】
（形態１８）
第四の視点において、本発明は、組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法であって、（ａ）非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸と結合可能な、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡと、（ｃ）ランダムに、あるいは所望の位置に１つ以上のナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、を形態１６の組換え細菌又は当該組換え細菌の抽出液内で発現させることを特徴とする。【００１６】
（形態２０）
第五の視点において、本発明は、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、前記組換え細菌が、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現すること、前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現すること、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されていること、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること、前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、細菌の翻訳終結因子をコードする遺伝子欠損させる場合においても、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を容易に作製することができる。そのため、所望の細菌又は大腸菌を用いた非天然タンパク質の製造効率を容易に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ｐｒｆＡ欠損体におけるアンバーコドンの翻訳を示す図である。
【図２】図２は、ＢＡＣ７を導入したｐｒｆＡ欠損体の生育能力を示す図である。
【図３】図３は、ＢＡＣ７上の遺伝子配座を示す図である。
【図４】図４は、ｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す図である。
【図５】図５は、アンバーコドンへのグルタミン酸の導入を示す図である。
【図６】図６は、非天然タンパク質製造用の大腸菌の増殖速度を示す図である。
【図７】図７は、アンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入を示す図である。
【図８】図８は、グルタミン酸又はチロシンが導入されたタンパク質の質量分析結果を示す図である。
【図９】図９は、アンバーコドンへのアジドフェニルアラニンの導入を示す図である。
【図１０】図１０は、ＢＡＣ６を導入した大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す図である。
【図１１】図１１は、ＢＡＣ３を導入した大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す図である。
【図１２】図１２は、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）のｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す図である。
【図１３】図１３は、ＢＡＣ８上の遺伝子配座を示す図である。
【図１４】図１４は、ｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す図である。
【図１５】図１５は、ＵＡＧトリプレットを４−アジドフェニルアラニン又はＯ−スルホチロシンへ再定義した非天然タンパク質製造用の大腸菌の増殖を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｎａｐ３発現系が導入された非天然タンパク質製造用の大腸菌の増殖を示す図である。
【図１７】図１７は、ＨＳＴ０８由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における、ｓｕｃＢ遺伝子及びｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ（Ｄ２８６Ｒ）／Ｎａｐ３過剰発現系の大腸菌の増殖速度を示す図である。
【図１８】図１８は、ＢＷ２５１１３由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における、ｓｕｃＢ遺伝子及びｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ（Ｄ２８６Ｒ）／Ｎａｐ３過剰発現系の大腸菌の増殖速度を示す図である。
【図１９】図１９は、ＢＷ２５１１３由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における、アンバーコドンへの３−ヨード−Ｌ−チロシンの導入を示す図である。
【図２０】図２０は、ＢＷ２５１１３由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における、アンバーコドンへの３−ヨード−Ｌ−チロシンの導入を示す図である。
【図２１】図２１は、ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子の改変を説明する図であり、（ａ）は、改変前のｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子の二次構造を示しており、四角で囲った塩基がランダム化する部分であり。（ｂ）は、改変ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子を作製する３種のオリゴマーのアニーリング状態を示す模式図であり、（ｃ）は、ランダム化部位に出現した各塩基の頻度を表している。
【図２２】図２２は、改変ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子を導入した大腸菌における、アンバーコドンへのグルタミンの導入を示す図である。
【図２３】図２３は、改変ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子を導入した大腸菌の増殖を示す図であり、（ａ）〜（ｃ）は異なる条件下での増殖を示している。
【図２４】図２４は、ＢＷ２５１１３、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における増殖速度を示す図である。
【図２５】図２５は、ＢＷ２５１１３、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における、対応する非天然型アミノ酸の有無による増殖を示す図である。
【図２６】図２６は、数種の非天然型アミノ酸の構造を示す図である。
【図２７】図２７は、ＵＡＧコドンを３−ヨード−Ｌ−チロシン以外の非天然型アミノ酸に再定義したＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における増殖速度を示す図である。
【図２８】図２８は、ＵＡＧコドンを３−ヨード−Ｌ−チロシン以外の非天然型アミノ酸に再定義したＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における、対応する非天然型アミノ酸の有無による増殖を示す図である。
【図２９】図２９は、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株、およびＵＡＧコドンを３−ヨード−Ｌ−チロシン以外の非天然型アミノ酸に再定義した株における、アンバーコドンへの３−ヨード−Ｌ−チロシンまたは他の非天然型アミノ酸の導入を示す図である。
【図３０】図３０は、３−ヨード−Ｌ−チロシンが導入されたことを確認する質量分析の結果を示す図である。
【図３１】図３１は、ｐｒｆＡ＋株におけるアンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入効率を示す図である。
【図３２】図３２は、Ｈ４ヒストンにアセチルリジンが導入されたことを確認する質量分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製］
本発明に係る組換え細菌の作製方法は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
（１）ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを細菌内に発現させるステップと、
（２）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
（３）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
（４）細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記（１）〜（４）のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理である、構成、又は、
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現する細菌に対して、
（５）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現させるステップと、
（６）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
（７）前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理である、構成であればよい。
【００２０】
なお、上記（３）及び（６）のステップにおいて、さらに、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失し、これにより細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理が含まれていてもよい。
【００２１】
なお、本発明に係る非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法において、（１）ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを細菌内に発現させるステップと、（２）前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を細菌内に発現させるステップとを含む場合に、当該細菌は、ＵＡＧコドンを認識する別のｔＲＮＡをもともと発現している細菌であってもよい。例えば、詳しくは後述するが、ＵＡＧコドンを認識する大腸菌由来のｔＲＮＡを発現する大腸菌に対して、ＵＡＧコドンを認識する古細菌のｔＲＮＡと、この古細菌のｔＲＮＡを非天然型アミノ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素とを発現させるようにしてもよい。
【００２２】
また、上記（１）〜（４）又は上記（５）〜（７）のステップの処理を施される細菌が、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡであって上記（２）又は上記（５）のステップにおいて導入されるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によってはアシル化されないｔＲＮＡを発現している細菌である場合には、そのｔＲＮＡをコードする遺伝子を欠損させることが好ましい。例えば、詳しくは後述するが、内在性のアンバーサプレッサーｔＲＮＡを発現している大腸菌に対して、古細菌のｔＲＮＡを発現させ、かつ古細菌のｔＲＮＡをアシル化する古細菌のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（大腸菌のｔＲＮＡをアシル化することができない）を導入する場合には、大腸菌が保持する内在性のアンバーサプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子を欠損させることが好ましい。本遺伝子を欠損させることによって、ＵＡＧコドンにおいて、目的とする非天然型アミノ酸等によってアシル化されているｔＲＮＡとの競合を回避でき、非天然型アミノ酸等を効率良くタンパク質に導入することができる。本遺伝子を欠損させるステップは、上記（１）〜（４）又は上記（５）〜（７）のステップとの関係において、どの段階で実施されてもよい。
【００２３】
ＵＡＧコドンを認識する内在性のｔＲＮＡを発現している細菌に対して、このｔＲＮＡを非天然型アミノ酸等によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を導入する場合に、当該細菌が、このｔＲＮＡを天然型アミノ酸によってアシル化する内在性のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が発現している細菌であるときには、天然型アミノ酸を結合させる当該アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を欠損させることが好ましい。本遺伝子を欠損させることによって、ＵＡＧコドンにおいて、目的とする非天然型アミノ酸等によってアシル化されているｔＲＮＡとの競合を回避でき、非天然型アミノ酸等を効率良くタンパク質に導入することができる。
【００２４】
上記（１）〜（４）の各ステップの順序に特に制限はなく、例えば（１）のステップと（２）のステップとが同時に行なわれてもよい。しかしながら、翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損効率の観点から、上記（４）のステップよりも前に、上記（１）及び上記（２）のステップを行うことが好ましい。また、上記（１）及び（２）のステップが完了した後に、（３）のステップ及び（４）のステップをこの順で行うことが特に好ましい。
【００２５】
同様に、上記（５）〜（７）の各ステップの順序に特に制限はないが、翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損効率の観点から、上記（７）のステップよりも前に、上記（５）のステップを行うことが好ましい。また、上記（５）、（６）及び（７）のステップをこの順で行うことが特に好ましい。
【００２６】
本明細書では、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡのことを「アンバーサプレッサーｔＲＮＡ」ともいう。このｔＲＮＡは、非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化され得るものである。
【００２７】
本明細書において「非天然タンパク質」とは、天然型アミノ酸のみから生成されるタンパク質以外のタンパク質を意味している。非天然タンパク質としては、例えば、非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質が挙げられる。
【００２８】
また、「非天然型アミノ酸」とは、生物が普遍的に利用する２０種類の標準型アミノ酸以外のアミノ酸を意味する。非天然型アミノ酸としては、非限定的に、例えば、リジン誘導体、及びチロシン誘導体が含まれる。また、本明細書においては、上記標準型アミノ酸が例えばリン酸化等によって修飾されているアミノ酸もまた、非天然型アミノ酸に含まれることを意図している。
【００２９】
ここで、リジン誘導体としては、ε位の窒素原子に結合した水素原子が他の原子又は原子団に置換されたものが好ましい。このようなリジン誘導体には、例えば、ピロリジン、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン（Ｂｏｃ−リジン）、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−ｔ−ベンジルオキシカルボニルリジン（Ｚ−リジン）、及びＮε−（ｏ−アジドベンジルオキシカルボニル）リジン（アジドＺ−リジン）が含まれる。また、アミノ酸以外にも、α−ヒドロキシ酸を含むアミノ酸すなわち、Ｂｏｃ−リジン主鎖部分のアミノ基をヒドロキシ基に置換したＢｏｃＬｙｓＯＨなどが含まれる。
【００３０】
チロシン誘導体としては、チロシンのフェニル基の３位又は４位に置換基を有する３位置換チロシン及び４位置換チロシン、及び酸素原子に置換基を有するＯ−修飾チロシンが含まれる。３位置換チロシンとしては、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｌ−チロシン、３−クロロ−Ｌ−チロシン、３−アジド−Ｌ−チロシン及び３−ヒドロキ−Ｌ−シチロシンが含まれる。また、４位置換チロシンとしては、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン及び４−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが含まれる。Ｏ−修飾チロシンとしては、Ｏ−スルホチロシンが含まれる。以下、本明細書では、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｌ−チロシン及び３−クロロ−Ｌ−チロシンのことを、それぞれ、単に、３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシン及び３−クロロチロシンと称する。
【００３１】
翻訳終結因子は、終結因子又はポリペプチド鎖終結因子ともいい、ｍＲＮＡ上の終止コドンを認識し、ポリペプチド鎖をリボソームから遊離させる因子である。ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子（以下、単に、「ＵＡＧを認識する翻訳終結因子」ともいう）としては、例えば大腸菌及び枯草菌（Bacillus subtilis）等の細菌では、ＲＦ−１である。ＵＡＧを認識する翻訳終結因子をコードする遺伝子（以下、単に、「ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子」ともいう）としては、配列番号１に示す核酸配列からなる大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子等が含まれる。
【００３２】
本明細書において「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損」とは、当該遺伝子が細胞内に存在しないことを指す場合のほか、当該遺伝子のＯＲＦの大半が欠損している場合、当該遺伝子の主要部分が欠損している場合、当該遺伝子が発現しない場合、あるいは当該遺伝子に変異が含まれており翻訳終結因子がＵＡＧコドンを認識できないなど翻訳終結因子としての機能が阻害されている場合なども含むことを意図している。
【００３３】
ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子は、遺伝子の相同性組換えを利用した方法など、周知の遺伝子破壊方法によって欠損させることができるが、特に、Ｒｅｄ／ＥＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＱｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  ＢＡＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いることが好ましい。ここで、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを発現するように細菌を形質転換した後に、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子を欠損させることが、欠損効率の点で好ましい。
【００３４】
本明細書において「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する」とは、ある遺伝子の機能に関し、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を完全に喪失する場合のほか、機能の一部を喪失する場合、機能が阻害される場合、及び機能が低下する場合も含むことを意図している。ある遺伝子が、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する機構としては、例えば、ＵＡＧコドンで翻訳が終結せず、Ｃ末端に余分なペプチドが付加されることによって、タンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。あるいは、ＵＡＧコドンで翻訳が終結せず、染色体上その遺伝子の下流にある遺伝子の翻訳が適切になされなくなり、この下流の遺伝子のタンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。しかしながら機能を喪失する機構はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
本明細書において「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子」は、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子であって、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の上記定義の欠損によって、機能を喪失する遺伝子、及び、終止コドンがＵＡＧコドンではないが、染色体上、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子の下流にある遺伝子であって、終止コドンがＵＡＧコドンである上流の遺伝子の翻訳終結が適切になされないことによって、適切に翻訳されなくなる遺伝子を意図している。
【００３６】
本明細書において「遺伝子の機能を発現させる」とは、その遺伝子の正常に機能するタンパク質が翻訳されるようにすることを意図している。したがって、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させる」とは、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の正常なタンパク質が、当該翻訳終結因子の非存在下において発現するようにすることを意図している。
【００３７】
本発明に用いられる細菌としては、外来遺伝子の導入又は遺伝子の改変が可能な細菌であれば特に制限はない。なお、本発明は、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる遺伝子を発現させると、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた大腸菌は生育可能になるという、本発明者らが見出した知見に基づいて完成したものである。大腸菌以外においても、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる遺伝子を発現させると、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させても生育可能になると考えられる。そのため、本発明を適用できる細菌は、大腸菌に限定されず、枯草菌などの他の細菌を含むものである。
【００３８】
本明細書において「ＤＮＡ構築物」とは、細菌に導入できる形態であって、細胞内で自己複製が可能なもの、又は細胞の染色体内に組み込まれ得るものが意図される。ＤＮＡ構築物としては、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド及び直鎖状ＤＮＡの形態が可能である。
【００３９】
形質転換させる細菌として大腸菌のＨＳＴ０８株を用い、ＤＮＡ構築物としてＢＡＣを用いる場合には、ＢＡＣとしては、ｍｉｎｉＦレプリコンを有するＢＡＣが好ましい。一方、Ｆプラスミドを保有する大腸菌を形質転換させる細菌として選択する場合には、他のオリジン、例えばＣｏｌｉｂＰ９オリジンを有するプラスミドに遺伝子を導入してＢＡＣを作製することが好ましい。
【００４０】
ＤＮＡ構築物は、細菌染色体にトランス及び／又はシスに補充（導入）されるものである。本明細書において「細菌染色体にトランスに補充（導入）される」とは、細菌の細胞内には導入されるものの、細菌染色体に組み込まれないことを意図している。また、本明細書において「細菌染色体にシスに補充（導入）される」とは、細菌の細胞内に導入され、さらに細菌染色体に組み込まれることを意図している。
【００４１】
ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物とは、具体的には、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えたこれらの改変型遺伝子を含むＤＮＡ構築物を指す。終止コドンをアンバーコドン以外のコドンとすることによって、ＵＡＧを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、本来の位置で翻訳を終止させることができ、これらの遺伝子の正常に機能するタンパク質を生成することができる。したがって、このＤＮＡ構築物を細菌内に導入することによって、ＵＡＧを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を細菌内において発現させることができる。
【００４２】
例えば、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、細菌から対象となる遺伝子又は当該遺伝子を含むオペロンをクローニングした後、ＰＣＲなどを用いて各遺伝子の終止コドンをＵＡＧからＵＡＡ又はＵＧＡに置換する変異を導入する。次いで、これら改変した遺伝子又はオペロンをＢＡＣ又はプラスミドに導入することにより、所望のＤＮＡ構築物を調製できる。あるいはこれらの遺伝子及びオペロンをつなぎ合わせて直鎖状ＤＮＡとすることもできる。
【００４３】
ほかにも、ＴａＫａＲａのＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬなどを用いたオーバーラップＰＣＲ法を用いて複数のオペロンをつないでフラグメントを作製し、そのフラグメントをＢＡＣプラスミドに導入してもよい。ここで、２０ｋｂｐ未満のフラグメントを作製する場合には、ＴａＫａＲａのＨＳＴ０８株を用いることが好ましい。また、２０ｋｂｐ以上のフラグメントを作製する場合には、Ｒｅｄ／ＥＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＱｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  ＢＡＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いることが好ましい。
【００４４】
ＤＮＡ構築物を細菌染色体に導入する場合、細菌染色体にトランスに導入してもよいし、細菌染色体にシスに導入してもよい。言い換えると、ＤＮＡ構築物に組み込まれた遺伝子をＤＮＡ構築物から発現させてもよいし、これらの遺伝子を大腸菌染色体にノックインして、発現させてもよい。大腸菌染色体に遺伝子をノックインする方法は、周知の方法を採用することができる。
【００４５】
また、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変の導入とは、具体的には、細菌の染色体上にある、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子に対して、当該遺伝子の終止コドンを、アンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変を導入することを指す。細菌の染色体上にあるこれらの遺伝子の終止コドンをアンバーコドン以外のコドンとすることによって、ＵＡＧを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、本来の位置で翻訳を終止させることができ、これらの遺伝子の正常に機能するタンパク質を生成することができる。したがって、このような改変を細菌の染色体に導入することによって、ＵＡＧを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を細菌内において発現させることができる。
【００４６】
染色体上の遺伝子の終止コドンに改変を導入する方法としては、周知の方法を用いて行うことができ、例えば、遺伝子の相同性組換えを利用する方法、あるいはランダムに細菌染色体上に生じる突然変異の中から該当する変異を選別する方法などが可能である。
【００４７】
遺伝子をトランスに導入して発現させる方法、遺伝子をシスに導入して発現させる方法、及び染色体上のアンバーコドンを改変して発現させる方法を組み合わせて採用することもできる。例えば、７つの遺伝子の機能を発現させる場合に、６つの遺伝子をＤＮＡ構築物によって細菌の細胞内に導入し、残りの１つの遺伝子について染色体上にある当該遺伝子のアンバーコドンを改変することによって、７つの遺伝子の機能を発現させるようにしてもよい。
【００４８】
ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、単独で遺伝子欠損させると致死になる遺伝子も含まれている。そのため、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によってこれらの遺伝子の機能が喪失することにより、細菌が生育しなくなる場合が考えられる。そのため、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子、すなわち、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される１以上の遺伝子には、これら単独で遺伝子欠損させると致死になる遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００４９】
ＵＡＧコドンで翻訳終結する、単独で欠損させると致死になる遺伝子としては、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｌｐｘＫ、ｈｅｍＡ及びｌｏｌＡが挙げられる。ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｌｐｘＫ、ｈｅｍＡ及びｌｏｌＡの遺伝子の核酸配列を、それぞれ、配列番号２、３、４、５、６、７及び８に示す。なお、各配列番号によって表されているこれら遺伝子の核酸配列は、大腸菌Ｋ−１２株のものであり、他の菌株においては塩基の置換が含まれる場合もあるが、それらも上記遺伝子として含まれる。
【００５０】
枯草菌における、ＵＡＧコドンで翻訳終結する、単独で欠損させると致死になる遺伝子としては、ａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの遺伝子が挙げられる。
【００５１】
また、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子のうち、終止コドンがＵＡＧコドンではないが、染色体上、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子の下流にある遺伝子であるｍｒｅＤ及びｈｅｍＫの遺伝子は、その上流の遺伝子（ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ）の翻訳が正しく終結しないと、自身の翻訳が影響を受けると考えられる。ｍｒｅＤ及びｈｅｍＫの遺伝子どちらも必須遺伝子である。そのため、これらの遺伝子も、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される１以上の遺伝子に含まれていることが好ましい。
【００５２】
大腸菌において、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子としては、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される１以上の遺伝子であることが好ましく、これらの中から選択される任意の６つの遺伝子であることがより好ましく、これら全ての遺伝子が選択されることが特に好ましい。
【００５３】
また、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、機能の喪失によって細菌が致死になるわけではないが、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下する遺伝子も含まれる。細菌の増殖速度が低下すると、得られるタンパク質の量が低下することが予想される。そのため、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される１以上の遺伝子には、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００５４】
大腸菌において、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失し、これにより細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子であって、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子としては、後述する実施例３に挙げられているｆｌｉＮ，ｆｌｉＰ，ｆｌｉＱ，ｓｕｃＢ，ｕｂｉＦ，ｕｌａＦ，ａｔｐＥ，ｆａｂＨが好ましく、中でもｓｕｃＢ遺伝子であることが特に好ましい。
【００５５】
［非天然タンパク質の製造方法］
非天然タンパク質の製造は、周知の製造方法を採用することができる。例えば、（ａ）非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）当該アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸と結合可能なアンバーサプレッサーｔＲＮＡと、（ｃ）ランダムに、あるいは所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子とを、所望の細菌、又は所望の細菌の細胞抽出液（抽出物）内で発現させる非天然タンパク質の製造方法を採用することができる。本製造方法において、細菌を培養する培地中、又は細胞抽出液内に、非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸を添加しておくことにより、この非天然型アミノ酸及びα−ヒドロキシ酸をタンパク質に導入することができる。ここで、培地及び細胞抽出液に添加すべき非天然型アミノ酸及びα−ヒドロキシ酸は、前記（ａ）におけるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に対応するもの、すなわち当該アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって活性化されるものである。
【００５６】
具体的には、メタノサルシナ・マゼイあるいはメタノサルシナ・バルケリのピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ、あるいはｐｙｌＳ遺伝子）とｔＲＮＡＰｙｌ（ｐｙｌＴ遺伝子）とを大腸菌に導入すればピロリジンをタンパク質に導入することができる。また、メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳのＨ６１Ｋ，Ｙ３８４Ｆ変異体（ＢｏｃＬｙｓＲＳ１）と、Ｋ６１Ｒ，Ｅ１３１Ｇ，Ｙ３８４Ｆ変異体（ＢｏｃＬｙｓＲＳ２）とを導入すれば、Ｂｏｃ−リジン及びＢｏｃＬｙｓＯＨを導入することができる。メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳのＹ３８４Ｆ，Ｙ３０６Ａ変異体（ＺＬｙｓＲＳ）を導入すれば、Ｚ−リジン、２−クロロ−Ｚ−リジン、２−ニトロ−Ｚ−リジン及び２−アジド−Ｚ−リジンを導入することができる。メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳのＨ６３Ｙ，Ｓ１９３Ｒ，Ｎ２０３Ｔ，Ｍ３００Ｆ，Ａ３０２Ｇ，Ｙ３８４Ｗ変異体を導入すれば、ＢｏｃＬｙｓＯＨを特異的に認識するので、ＢｏｃＬｙｓＯＨを導入することができる。メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳのＮ２０３Ｔ，Ｌ３０１Ｉ，Ｌ３０５Ｉ，Ｙ３０６Ｆ，Ｌ３０９Ａ，Ｃ３４８Ｆ変異体（ＡｃＬｙｓＲＳ２、未発表）を導入すれば、アセチルリジンを導入することができる。さらに、メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳのＡ３０２Ｆ、Ｙ３０６Ａ、Ｎ３４６Ｓ、Ｃ３４８Ｉ、Ｙ３８４Ｆ変異体を導入すれば、３−（３−ヨードフェニル）乳酸、３−（３−ブロモフェニル）乳酸、３−（４−アセチルフェニル）乳酸、３−（４−ベンゾイルフェニル）乳酸、３−（４−アジドフェニル）乳酸、３−（３−メチル−４−ヒドロキシフェニル）乳酸などの３置換乳酸を導入することができる。
なお、メタノサルシナ・バルケリのＰｙｌＲＳ変異体（ＡｃＫＲＳ−３，Neumann H et al. A method for genetically installing site-specific acetylation in recombinant histones defines the effects of H3 K56 acetylation. Chin et al., Mol Cell. 2009 Oct 9; 36(1):153-63.）を導入しても、アセチルリジンを導入することができる。このほかにも、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（Yanagisawa T. et al, Chem. Biol., 15, 1187-1197 (2008)）により報告されているメタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳ変異体を用いて、Ｎε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（ＡｌｏｃＬｙｓ）およびＮε−（ｏ−アジドベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＡｚＺＬｙｓ）を導入することができる。
【００５７】
また、以下のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体を大腸菌に導入し、対応する非天然型アミノ酸を培地中に添加することによって、非天然タンパク質を製造することができる。
・非天然型アミノ酸が３−ヨードチロシン及びアジドチロシン：アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体がｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊのＨ７０Ａ，Ｄ１５８Ｔ，Ｉ１５９Ｓ，Ｄ２８６Ｙ変異体（Sakamoto K, Murayama K, Oki K, Iraha F, Kato-Murayama M, Takahashi M, Ohtake K, Kobayashi T, Kuramitsu S, Shirouzu M, Yokoyama S. Genetic encoding of 3-iodo-L-tyrosine in Escherichia coli for single-wavelength anomalous dispersion phasing in protein crystallography. Structure. 2009 Mar 11;17(3):335-44.）。
・非天然型アミノ酸がヒドロキシチロシン：アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体がｍｕｔＤＨＰＲＳのＹ３２Ｌ，Ａ６７Ｓ，Ｈ７０Ｎ，Ａ１６７Ｑ変異体（Guo J, Wang J, Anderson JC, Schultz PG. Addition of an alpha-hydroxy acid to the genetic code of bacteria. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(4):722-5.）。
・非天然型アミノ酸がアセチルフェニルアラニン：アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体がＬＷ１のＹ３２Ｌ，Ｄ１５８Ｇ，Ｉ１５９Ｃ，Ｌ１６２Ｒ変異体（Wang L, Zhang Z, Brock A, Schultz PG. Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 7;100(1):56-61. Epub 2002 Dec 23.）。
・非天然型アミノ酸がベンゾイルフェニルアラニン：アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体がＭｊＢｐａＲＳ−１のＹ３２Ｇ，Ｅ１０７Ｓ，Ｄ１５８Ｔ，Ｉ１５９Ｓ変異体（Chin JW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20;99(17):11020-4. Epub 2002 Aug 1.）。
・非天然型アミノ酸がアジドフェニルアラニン：アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体がＡｚＰｈｅＲＳ−１のＹ３２Ｔ，Ｅ１０７Ｎ，Ｄ１５８Ｐ，Ｉ１５９Ｌ，Ｌ１６２Ｑ変異体（Chin JW, Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7;124(31):9026-7.）。
【００５８】
〔非天然タンパク質製造用の組換え細菌の抽出物、及び該抽出物を用いた非天然タンパク質の製造〕
非天然タンパク質の製造方法は、上述のように、無細胞タンパク質合成系を採用することもできる。例えば、Ｚｕｂａｙら（Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973)）、Ｐｒａｔｔら（Pratt,J.M.et al., Transcription and Translation - A practical approach, (1984), pp.179-209, Henes,B.D.et al. eds.,IRL Press, Oxford）、又はＫｉｇａｗａら（Kigawa, T. et al, J. Struct. Funct. Genomics, Vol.5, pp63-68 (2004)）に開示の方法に従って組換え細菌株の抽出液を調製し、該抽出液の中で、非天然タンパク質を製造してもよい。
【００５９】
したがって、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、前記組換え細菌が、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現すること、前記ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現すること、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されていること、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること、前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする抽出物もまた、本発明の範疇に含まれる。
【００６０】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の抽出物は、以下の調製方法を用いて調製することができる。非天然型アミノ酸に特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を生成することができる組換え細菌を培養し、遠心分離により回収する。回収した細菌を、洗浄し、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。細菌の不溶分画を遠心分離で除去し、インキュベーションする。このインキュベーションによって内在性の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を分解することができる。内在性の核酸は、インキュベーション溶液に、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加することでさらに分解できる。インキュベーション後、透析によって内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシドなど除去して、抽出液を調製する。
【００６１】
組換え細菌の抽出物を用いた非天然タンパク質の製造は、以下の製造方法を採用することができる。インビトロで調製したアンバーサプレッサーｔＲＮＡと、市販のｔＲＮＡ画分と、鋳型ＤＮＡ／ＲＮＡとを、組換え細菌の抽出物に加える。ここで、タンパク質及び製造系の種類に応じて、非天然型アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸を加え、さらにエネルギー、イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類及び抗菌剤等を加えてもよい。また、鋳型としてＤＮＡを用いる場合には、ＲＮＡ合成系（基質、及びポリメラーゼなど）を加えることが好ましい。
【００６２】
上述のとおり、本発明は、以下の形態でもあり得る。
【００６３】
（形態３）
形態１または形態２の作製方法において、前記細菌が、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡであって前記アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によってはアシル化されないｔＲＮＡを発現しており、当該ｔＲＮＡをコードする遺伝子を欠損させるステップをさらに含む作製方法もまた可能である。
【００６４】
（形態４）
形態１または形態２の作製方法において、前記非天然タンパク質が非天然型アミノ酸あるいはα−ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質であることが好ましい。
【００６５】
（形態５）
また、前記細菌が大腸菌であることが好ましい。
【００６６】
（形態６）
また、前記１以上の遺伝子が、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で遺伝子欠損させると細菌が致死になる遺伝子であることが好ましい。
【００６７】
（形態７）
また、前記細菌が大腸菌であり、前記１以上の遺伝子が、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される１以上の遺伝子であることが好ましい。
【００６８】
（形態８）
また、前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される任意の６つの遺伝子であることが好ましい。
【００６９】
（形態９）
また、前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ及びｈｅｍＡの遺伝子であることが好ましい。
【００７０】
（形態１０）
また、前記１以上の遺伝子として、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する遺伝子をさらに含むことが好ましい。
【００７１】
（形態１１）
また、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する上記遺伝子が、大腸菌のｓｕｃＢ遺伝子であることが好ましい。
【００７２】
（形態１２）
また、前記細菌が大腸菌であり、前記ＤＮＡ構築物は、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される１以上の遺伝子の機能を発現するＤＮＡ構築物であることが好ましい。
【００７３】
（形態１３）
また、前記ＤＮＡ構築物は、さらに大腸菌のｓｕｃＢ遺伝子の機能を発現するＤＮＡ構築物であることが好ましい。
【００７４】
（形態１４）
また、前記ＤＮＡ構築物は、細菌染色体にトランス及び／又はシスに補充されるバクテリア人工染色体、プラスミドあるいは直鎖状ＤＮＡであることが好ましい。
【００７５】
（形態１７）
形態１６の組換え細菌において、前記組換え細菌が大腸菌由来であることが好ましい。
【００７６】
（形態１９）
形態１８の製造方法において、前記組換え細菌が大腸菌由来であることが好ましい。
【００７７】
（形態２１）
形態２０の抽出物において、前記組換え細菌が大腸菌由来であることが好ましい。
【００７８】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００７９】
〔実施例１〕
［コンディショナルｐｒｆＡ変異株の作製］
ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた大腸菌が生育するために必要な遺伝子を同定するために、本願発明者らは、コンディショナルｐｒｆＡ変異株を作製した（図１参照）。図１に示すようにｐｒｆＡ遺伝子を欠損させることにより、終止コドン部位におけるサプレッサーｔＲＮＡとの拮抗をなくすことができる。ここで、コンディショナルｐｒｆＡ変異株とは、Ｌ−アラビノースの存在下ではｐｒｆＡ遺伝子の発現が誘導され、Ｄ−グルコースの存在下ではｐｒｆＡ遺伝子の発現が抑制される変異株を意味する。【００８０】
コンディショナルｐｒｆＡ変異株のグルコース存在下での生育状態を図２のレーン１及びレーン２に示している。図２のレーン１及び２に示すように、コンディショナルｐｒｆＡ変異株は、グルコースの存在下では生育しなかったが（レーン１）、恒常的にｐｒｆＡ遺伝子を発現するプラスミドを導入したコンディショナルｐｒｆＡ変異株では、グルコースの存在下で生育した（レーン２）。【００８１】
次に、大腸菌のアンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎ遺伝子又はアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子をコンディショナルｐｒｆＡ変異株に導入して、アンバーコドンが翻訳されるようにした。しかしながら、図２のレーン４（アンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎを導入）及びレーン５（アンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒを導入）に示すように、何れのｔＲＮＡもグルコースの存在下でのコンディショナルｐｒｆＡ変異株の生育をサポートしなかった。一般的には、Ｃ末端に余分なペプチドを含むタンパク質は毒性を発揮しないが、余分なペプチドの付加がタンパク質の機能を欠損させることがある。そのため、アンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎ又はｔＲＮＡＴｙｒを導入したｐｒｆＡ変異株の成長は、アンバーコドンにおいて翻訳が終結せず、タンパク質に余分なペプチドが付加されたことによって、阻害されたと考えられる。【００８２】
この知見に基づいて、本発明者らは、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる７つの大腸菌の遺伝子（すなわち、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ、ｌｏｌＡ）のアンバーコドンを他の終止コドンに置き換えることによって、余分なペプチドの付加に起因する大腸菌の致死性を克服できると考えた。そして、アンバーコドンがオーカーコドン又はオパールコドンに置き換えられたこれら７つの遺伝子を発現するＢＡＣプラスミドであるＢＡＣ７を作製した。ＢＡＣ７の作製方法を以下に示す。【００８３】
［ＢＡＣ７の作製、及びＢＡＣ７の導入］
まず、ｍｉｎｉＦレプリコン及びゼオシン耐性遺伝子を有するＢＡＣプラスミドであるＢＡＣ０を、Ｍｏｔｏｈａｓｈｉら（Motohashi,T.,et al., Biochem Biophys Res Commun, Vol.326, pp.564-569 (2005)）に開示の方法に従って調製した。そして、ｆｔｓＩ遺伝子、ｍｕｒＥ遺伝子、ｍｕｒＦ遺伝子、ｗａａＡ−ｃｏａＤのオペロン、ｍｒｅＢ−ｍｒｅＣ−ｍｒｅＤのオペロン、ｙｃａＩ−ｍｓｂＡ−ｌｐｘＫのオペロン、ｈｄａ遺伝子、ｈｅｍＡ遺伝子、ｈｅｍＫ遺伝子、及びｌｏｌＡ遺伝子を、ＢＬ２１（ＤＥ３）からクローニングした。クローニングされたｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｌｐｘＫ、ｌｏｌＡ、ｈｅｍＡの各遺伝子のアンバーコドン（ＴＡＧ）をオーカーコドン（ＴＡＡ）に置き換える変異をＰＣＲを用いて導入した。変異を導入したオペロン（又は変異遺伝子）をＢＡＣ０に導入して、ＢＡＣ７を作製した。各オペロン及び各遺伝子の導入位置及び導入方向の概略を図３に示す。図３の「ｇｅｎｔ」は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を意味する。また、遺伝子名を囲んでいる矢印の向きは遺伝子の方向（５’から３’へ）を示しており、遺伝子名を含んでいない矢印は、転写プロモーターを示しており、その矢印の向きは転写の方向を示している。【００８４】
なお、ＢＡＣ７は、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ、ｌｏｌＡの遺伝子、及びｍｒｅＤ、ｈｅｍＫの遺伝子を発現すればよく、任意の方法を採用して作製することができる。例えば、ｈｅｍＡ−ｐｒｆＡ−ｈｅｍＫのオペロンをクローニングし、そのオペロンからｐｒｆＡを除去するようにしてもよい。オペロン又は遺伝子は、プロモーター領域からクローニングすることが好ましい。【００８５】
また、アンバーコドンがオーカーコドン又はオパールコドンに置き換えられたｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｌｐｘＫ、ｌｏｌＡの遺伝子及びｈｅｍＫの遺伝子を発現するプラスミドを大腸菌に導入し、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させるときに、ゲノム上のｈｅｍＡ遺伝子のアンバーコドンを、オーカーコドン又はオパールコドンに置き換えてもよい。【００８６】
作製したＢＡＣ７を、エレクトロポレーション法によってコンディショナルｐｒｆＡ変異株にトランスに導入した。【００８７】
ＢＡＣ７を導入したコンディショナルｐｒｆＡ変異株のグルコース存在下での生育状態を図２のレーン６−１０に示している。図２のレーン６−８に示すように、コンディショナルｐｒｆＡ変異株は、ＢＡＣ７のみを導入した場合には生育できなかったが（レーン６）、アンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎ遺伝子及びＢＡＣ７を導入した場合（レーン７）並びにアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子及びＢＡＣ７を導入した場合（レーン８）には、コンディショナルｐｒｆＡ変異株は生育できた。また、図２のレーン９及び１０に示すように、大腸菌のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の代わりに、３−ヨードチロシンをタンパク質に導入するための古細菌の遺伝子のペアを導入した場合であっても、コンディショナルｐｒｆＡ変異株は生育でき（レーン９）、培地への３−ヨードチロシンの添加によってコンディショナルｐｒｆＡ変異株の生育能力は改善された（レーン１０）。ここで、「古細菌の遺伝子のペア」とは、メタノカルドコッカス・ジャナシイ（Methanocardococcus jannaschii）由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子、及びチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）変異体（engineered tyrosyl-tRNA synthetase）をコードするＩＹＲＳ遺伝子のペアである（Sakamoto,K.,et al., Structure, Vol.17, pp.335-344 (2009)）。【００８８】
図２の結果は、アンバーコドンを有する３１４個の遺伝子の中で、２％の遺伝子のアンバーコドンを改変し、内在性又は直交性のアンバーサプレッサーｔＲＮＡを発現させることで、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させたことによる大腸菌の致死性を克服できることを示唆する。【００８９】
［ｐｒｆＡ遺伝子の破壊株の作製］
次に、大腸菌ＨＳＴ０８株にＢＡＣ７を形質導入し、ｐｒｆＡ遺伝子の主要部分（５１−８５８ｎｔ）をゼオシン耐性遺伝子で置き換えることによって、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。ここで、ＨＳＴ０８とは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎをコードするｓｕｐＥ４４遺伝子を有する大腸菌である。【００９０】
ｐｒｆＡ遺伝子は、以下の遺伝子破壊方法を用いて欠損させた。ゼオシン耐性遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５’末端及び３’末端に、それぞれ、ＲＦ−１のＮ末端に対応する５０塩基対のＤＮＡ配列及びＲＦ−１のＣ末端に対応する２２５塩基対のＤＮＡ配列をセンス方向で連結し組換え用フラグメントを作製した。得られたフラグメントを大腸菌ＨＳＴ０８の染色体に挿入した。ＢＡＣ７が導入されている大腸菌において、ｐｒｆＡ遺伝子とゼオシン耐性遺伝子を含む組換え用フラグメントとの相同性組み換えを行うことによって、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。このｐｒｆＡ遺伝子欠損株を、以下、ＲＦｚｅｒｏ−ｑと呼ぶ。なお、ｐｒｆＡ遺伝子の遺伝子破壊は、本破壊方法に限定されず、周知の遺伝子破壊方法によって欠損させればよい。【００９１】
ｐｒｆＡ遺伝子の欠損をＰＣＲによって確認した。結果を図４に示す。図４（ａ）は遺伝子の置き換えの概略及び確認のＰＣＲのためのプライマーの位置を示した図であり、図４（ｂ）は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。図４（ｂ）のレーン１は、ＨＳＴ０８における全長ｐｒｆＡのバンドを示し、図４（ｂ）のレーン２は、ＲＦｚｅｒｏ−ｑにおける全長ｐｒｆＡに対応するバンドを示す（図４（ａ）における矢印Ｐ１，Ｐ２に示されるプライマーセットを使用して増幅）。図４（ｂ）のレーン３は、ＨＳＴ０８のゲノムＤＮＡを用いてｐｒｆＡの中央領域を増幅した場合に検出されるバンドを示し、図４（ｂ）のレーン４は、ＲＦｚｅｒｏ−ｑのゲノムＤＮＡを用いてｐｒｆＡの中央領域を増幅した場合の検出結果を示す（図４（ａ）における矢印Ｐ３，Ｐ４に示されるプライマーセットを使用して増幅）。図４に示される結果から、ｐｒｆＡ遺伝子の欠損が確認できた。また、６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、各株の成長速度を測定した。その結果、ＢＡＣ７を導入した大腸菌ＨＳＴ０８株の増殖速度は、１．３ｈ−１であったのに対し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株の増殖速度は、０．９ｈ−１であった。【００９２】
ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株がアンバーコドンにグルタミン酸を導入できることを確認するために、ＯＲＦ内に３つのアンバーコドンを有するクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）の変異遺伝子（ｃａｔ（３Ａｍ）、と呼ぶ）でＲＦｚｅｒｏ−ｑ株を形質転換した。ｃａｔ（３Ａｍ）のアミノ酸配列を図５（ａ）に示す。図５（ａ）のアミノ酸配列中の「Ｘ」は、ｃａｔ（３Ａｍ）におけるアンバーコドンの位置を示し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株においてはグルタミン酸となる（配列番号１７）。図５（ｃ）は、ｃａｔ（３Ａｍ）形質転換体におけるクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性を調べた結果を示す図である。図５（ｃ）に示すように、野生型ｃａｔ、及びｃａｔ（３Ａｍ）で形質転換されたＲＦｚｅｒｏ−ｑ株は、培地中のクロラムフェニコール濃度が４００μｇ／ｍＬまで、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性を示した。【００９３】
さらに、ＯＲＦ内に１０個のアンバーコドンを有するｃａｔの変異遺伝子（ｃａｔ（１０Ａｍ）、と呼ぶ）でＲＦｚｅｒｏ−ｑ株を形質転換した。ｃａｔ（１０Ａｍ）のアミノ酸配列を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）に示す配列中の「Ｘ」は、ｃａｔ（１０Ａｍ）におけるアンバーコドンの位置を示し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株においてはグルタミン酸となる（配列番号１８）。図５（ｃ）に示すように、ｃａｔ（１０Ａｍ）で形質転換されたＲＦｚｅｒｏ−ｑ株は、培地中のクロラムフェニコール濃度が２００μｇ／ｍＬまでＣｍ耐性を示した。グルタミン酸コドンの翻訳効率が、アンバーコドンへのグルタミン酸の導入効率よりも優れるため、ｃａｔ（１０Ａｍ）を導入したＲＦｚｅｒｏ−ｑ株では、Ｃｍ耐性が落ちたと考えられる。一方では、図５（ｂ）に示すように、ｃａｔ（１０Ａｍ）を導入したＨＳＴ０８は、１０μｇ／ｍＬのＣｍが培地中に存在するだけで、生育できなかった。【００９４】
図５に示す結果は、複数のアンバーコドンにグルタミン酸が組み込まれたことを示唆する。また、ＨＳＴ０８にＢＡＣ７を導入し、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させることによって、アンバーコドンへのグルタミン酸の導入効率が劇的に改善されたことを実証する。【００９５】
［非天然タンパク質製造用の組換え大腸菌の作製］
ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株のｓｕｐＥ４４遺伝子を、大腸菌アンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子で置き換えて、ＲＦｚｅｒｏ−ｙ株を作製した。また、３−ヨードチロシンの存在下で、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株のｓｕｐＥ４４遺伝子を、上述の古細菌の遺伝子のペアで置き換えて、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株を作製した。具体的には、以下の形質転換方法を用いて、大腸菌を非天然タンパク質製造用の組換え大腸菌（ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ）に形質転換した。メタノカルドコッカス・ジャナシイのアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭＪＲ１変異体）と、この直交系アンバーサプレッサーｔＲＮＡに３−ヨードチロシンを付加するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との組合せを発現するプラスミド（ｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１）のカナマイシン耐性誘導体（ｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎ）（Sakamoto,K.,et al., Structure, Vol.17, pp.335-344 (2009)）をＲＦｚｅｒｏ−ｑに導入した。【００９６】
なお、メタノカルドコッカス・ジャナシイのｔＲＮＡＴｙｒは、上記で採用したＭＪＲ１変異体に限定されず、例えば、Ｊ１７変異体（Wang L, Schultz PG. A general approach for the generation of orthogonal tRNAs. Chem Biol. 2001 Sep; 8(9):883-90）を採用してもよい。【００９７】
ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の生育速度の測定結果を図６に示す。図６中、「＋ＩＹ」は、３−ヨードチロシン存在下での生育を、「−ＩＹ」は、３−ヨードチロシン非存在下での生育を示している。図６に示すように、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の生育速度は、３−ヨードチロシンの存在に依存した。図６の結果は、図２の結果と合致する。【００９８】
［非天然タンパク質の製造方法］
次に、６つのアンバーコドンをＮ端付近に導入したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子（ｇｓｔ（６Ａｍ）と呼ぶ）をｔａｃプロモーターの制御によって発現する変異ＧＳＴ発現システムを作製し、該変異ＧＳＴ発現システムをＲＦｚｅｒｏ−ｑ株、ＲＦｚｅｒｏ−ｙ株、及びＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株に導入した。図７（ａ）は、ｇｓｔ（６Ａｍ）のＮ端側の４５アミノ酸残基の配列を示している。図７（ａ）に示す配列中のアステリスクは、ｇｓｔ（６Ａｍ）におけるアンバーコドンの位置を示す。このアンバーコドンの位置にグルタミン酸、チロシン及び３−ヨードチロシンが導入されている各ｇｓｔ（６Ａｍ）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１９〜２１に示している。【００９９】
変異ＧＳＴ発現システムを導入した各株（３０μＬカルチャー）からｇｓｔ（６Ａｍ）タンパク質を取得し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＧＳＴ抗体を用いてウエスタンブロッティングした（図７（ｂ）参照）。【０１００】
また、取得したｇｓｔ（６Ａｍ）タンパク質をトリプシン処理し、質量分析によって解析した。ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株から取得したｇｓｔ（６Ａｍ）タンパク質の解析結果を図７（ｃ）に示し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株及びＲＦｚｅｒｏ−ｙ株から取得したｇｓｔ（６Ａｍ）タンパク質の解析結果をそれぞれ図８（ａ）及び（ｂ）に示す。図７（ｃ）に示すように、質量分析の結果から、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株は、５つの３−ヨードチロシンを含むペプチドＡ：ＤＰ＊Ｓ＊Ｓ＊Ｓ＊Ｓ＊ＳＮＳＧＶＴＫ（配列番号２２）と、１つの３−ヨードチロシンを含むペプチドＢ：ＮＰ＊ＳＳＰＩＬＧＹＷＫ（配列番号２３）を生産したことがわかった。ここで「＊」は、ｇｓｔ（６Ａｍ）タンパク質におけるアンバーコドンの位置を示し、３−ヨードチロシンが導入されている。また、図８に示すように、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株、及びＲＦｚｅｒｏ−ｙ株も、６つのアンバーコドンに対応する位置にグルタミン酸、及びチロシンを含むペプチドを各々生産したことがわかった。ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株から取得したタンパク質の解析により得られたアミノ配列を配列番号２４及び２５に示し、ＲＦｚｅｒｏ−ｙ株から取得したタンパク質の解析により得られたアミノ配列を配列番号２６及び２７に示す。【０１０１】
上述のように、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを大腸菌内で発現させ、このｔＲＮＡを非天然型アミノ酸である３−ヨードチロシンによってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現させ、ｐｒｆＡ遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を発現させるＤＮＡ構築物（例えば、ＢＡＣ７）を大腸菌に導入し、大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子を欠損させることによって、非天然タンパク質製造用の大腸菌が作製できることがわかった。【０１０２】
以上のように、本発明の非天然タンパク質製造用の大腸菌の作製方法を使用すれば、大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子を容易に欠損させることができるので、所望の大腸菌を用いた非天然タンパク質の製造効率を容易に向上させることができる。また、本発明の大腸菌は、効率よく非天然型アミノ酸をタンパク質に導入することができる。また、本発明の非天然タンパク質の製造方法を用いれば、効率よく非天然タンパク質を製造することができる。【０１０３】
本発明は、大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子を容易に欠損させることができるので、大腸菌株のライブラリーを利用して、多様なｐｒｆＡ欠損株を作製できる。それによって、非天然タンパク質を製造するときに、目的のタンパク質に応じて最適なｐｒｆＡ欠損株を選択することができる。そのため、本発明は、汎用性が低い大腸菌を使用する場合よりも、効率の良い非天然タンパク質の製造が期待できる。【０１０４】
〔実施例２〕
実施例１では、３−ヨードチロシンが導入された非天然タンパク質製造用の大腸菌の作製方法などについて説明した。しかしながら、本発明は、３−ヨードチロシンに限定されず、任意の非天然型アミノ酸を採用することができる。本実施例では、非天然型アミノ酸として４−アジドフェニルアラニンを導入する非天然タンパク質を製造する組換え大腸菌を作製し、この組換え大腸菌を用いて非天然タンパク質を製造した。【０１０５】
本実施例では、ＩＹＲＳ遺伝子の代わりに、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに４−アジドフェニルアラニン付加するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であるメタノコッカス・ジャナシイ（Methanococcus jannaschii）のＡｚＦＲＳ遺伝子（Chin JW, Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7;124(31):9026-7.）を導入して、ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ株を作製した。ＩＹＲＳ遺伝子の代わりにＡｚＦＲＳ遺伝子を導入した以外は実施例１と同様である。【０１０６】
変異ＧＳＴ発現システムを導入した各株（３０μＬカルチャー）からｇｓｔ（６Ａｍ）タンパク質を取得し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＧＳＴ抗体を用いてウエスタンブロッティングした。結果を図９に示す。【０１０７】
図９に示すように、ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ株は、全長のｇｓｔを発現している。したがって、ＩＹＲＳ遺伝子の代わりにＡｚＦＲＳ遺伝子を導入したＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ株は、アンバーコドンへ４−アジドフェニルアラニンを導入することができたことを示している。すなわち、本発明は、任意の非天然型アミノ酸を採用することができる。【０１０８】
〔実施例３〕
上述の実施例では、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる大腸菌の７つの遺伝子全てについて、その機能が発揮できるようにしていた。【０１０９】
本実施例では、ＢＡＣに導入する遺伝子を減らして、組換え細菌を作製した。具体的には、単独で欠損させると致死になる大腸菌の７つの遺伝子（ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ、ｌｏｌＡ）のうちのｈｄａを除く他の６つの遺伝子の何れかを含んでいないＢＡＣプラスミドを調製し、このＢＡＣプラスミドを導入した大腸菌について、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。使用した大腸菌はＨＳＴ０８株である。結果を図１０に示す。【０１１０】
図１０（ａ）は、遺伝子の置き換えの概略及び確認のＰＣＲのためのプライマーの位置を示した図であり、図１０（ｂ）は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のＰ７，Ｐ８のプライマーセット又はＰ９，Ｐ１０のプライマーセットで増幅した以下の株のフラグメント又はｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す、レーン１及び２：ＨＳＴ０８＋ＢＡＣ７、レーン３及び４：ＲＦｚｅｒｏ−ｑのみ、レーン５及び６：ＲＦｚｅｒｏ−ｑ＋ΔｍｕｒＦ（ｍｕｒＦを除く６種類の遺伝子を導入したＢＡＣ、以下同様）、レーン７及び８：ＲＦｚｅｒｏ−ｑ＋ΔｃｏａＤ、レーン９及び１０：ＲＦｚｅｒｏ−ｑ＋ΔｍｒｅＢＣＤ、レーン１１及び１２：ＲＦｚｅｒｏ−ｑ＋ΔｌｐｘＫ、レーン１３及び１４：ＲＦｚｅｒｏ−ｑ＋ΔｈｅｍＡＫ、レーン１５及び１６：ＲＦｚｅｒｏ−ｑ＋ΔｌｏｌＡ。奇数レーンは図１０（ａ）における矢印Ｐ５，Ｐ６に示されるプライマーセットを使用して増幅したものであり、偶数レーンは図１０（ａ）における矢印Ｐ７，Ｐ８に示されるプライマーセットを使用して増幅したものである。【０１１１】
図１０に示す結果から、ＢＡＣに導入する遺伝子（ｈｄａを除く）を減らしても、増殖可能なｐｒｆＡ欠損株を作製できることが示された。【０１１２】
また、ｗａａＡ−ｃｏａＤのオペロン、ｈｄａ遺伝子、ｍｒｅＢ−ｍｒｅＣ−ｍｒｅＤのオペロン（又は変異遺伝子）のみを含むＢＡＣ３を作製し、ＨＳＴ０８に導入した（図１１参照）。次いで、ｐｒｆＡ全長を除くように、ｐｒｆＡ遺伝子をゼオシン耐性遺伝子で置換して、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。なお、ｈｅｍＡ遺伝子はゲノム上でｐｒｆＡ遺伝子に隣接しているため、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させる組換えのときに、ゲノム上のｈｅｍＡ遺伝子のＴＡＧコドン（終止コドン）をＴＡＡに置き換えた。すなわち、単独で欠損させると致死になる遺伝子をトランスに導入する方法、及び染色体上の単独で欠損させると致死になる遺伝子のアンバーコドンを改変する方法を組み合わせている。【０１１３】
図１１（ａ）遺伝子の置き換えの概略及び確認のＰＣＲのためのプライマーの位置を示した図であり、図１１（ｂ）は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）の矢印Ｐ５，Ｐ６のプライマーセット又は矢印Ｐ７，Ｐ８のプライマーセットで増幅した、ＢＡＣ３を導入した以下の株のフラグメント又はｐｒｆＡ遺伝子の欠損を示す、レーン１：ＨＳＴ０８、レーン２：ＨＳＴ０８、レーン３：ＨＳＴ０８＋ＢＡＣ３＋ｐｒｆＡの欠損、レーン４：ＨＳＴ０８＋ＢＡＣ３＋ｐｒｆＡの欠損。奇数レーンは図１１（ａ）における矢印Ｐ５，Ｐ６に示されるプライマーセットを使用して増幅したものであり、偶数レーンは図１１（ａ）における矢印Ｐ７，Ｐ８に示されるプライマーセットを使用して増幅したものである。【０１１４】
図１１に示す結果から、ＢＡＣに導入する遺伝子（ｈｄａを除く）を減らしても、増殖可能なｐｒｆＡ欠損株を作製できることが示された。【０１１５】
また、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子として選択される１以上の遺伝子に、任意の遺伝子を付加することもできる。すなわち、ＢＡＣに導入する遺伝子を減らした株には、成長速度が減少した株があった。そのため、遺伝子の数を増やした場合には、さらに大腸菌の生育速度及び／又は非天然タンパク質の製造効率が改善されることは容易に理解でき、本発明は、遺伝子の数を増やした実施形態も含む。増やす遺伝子としては、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が極端に低下する事が知られている遺伝子である事が望ましい。大腸菌においては、ｆｌｉＮ，ｆｌｉＰ，ｆｌｉＱ，ｓｕｃＢ，ｕｂｉＦ，ｕｌａＦ，ａｔｐＥ，ｆａｂＨがこれに該当するがこれらに限らない。ｆｌｉＮ，ｆｌｉＰ，ｆｌｉＱ，ｓｕｃＢ，ｕｂｉＦ，ｕｌａＦ，ａｔｐＥ及びｆａｂＨの遺伝子の核酸配列を、それぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６に示す。なお、各配列番号によって表されているこれら遺伝子の核酸配列は、大腸菌Ｋ−１２株のものであり、他の菌株においては塩基の置換が含まれる場合もあるが、それらも上記遺伝子として含まれる。増やす遺伝子の数としては、好適には１〜３０個、更に好適には１〜２０個、最も好適には１〜１０個である事が望ましい。【０１１６】
〔実施例４〕
上述の実施例では、宿主細胞の細菌として大腸菌ＨＳＴ０８株を使用した。しかしながら、他の大腸菌を使用してもよい。本実施例では、大腸菌ＨＳＴ０８株の代わりに、Ｋ−１２株であるＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を使用して、非天然タンパク質製造用の組換え細菌（ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ）を作製した。また、メタノカルドコッカス・ジャナシイ由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子及びＩＹＲＳ遺伝子を含むペアの代わりに、ＧｌｎＲＳ及びｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡを導入した組換え細菌も作製した（ＲＦｚｅｒｏ−ｑ）。【０１１７】
まず、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）にＢＡＣ６−ΔｈｅｍＡＫをトランスに導入した。ここで、ＢＡＣ６−ΔｈｅｍＡＫは、ＢＡＣ７プラスミドからｈｅｍＡＫオペロンをＣＡＴで置換して除いたＢＡＣプラスミドである。次いで、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ及び対応アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のペアをコードしているプラスミドを導入した。次いで、ｐｒｆＡをゼオシン耐性遺伝子で置換することにより、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。なお、本実施例では、ｐｒｆＡ全長が取り除かれるように、ゼオシン耐性遺伝子で置換した（図１２（ａ）参照）。なお、本実施例においても、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させる組換えのときに、ゲノム上のｈｅｍＡ遺伝子のＴＡＧコドン（終止コドン）をＴＡＡに置き換えている。【０１１８】
なお、図２に示すように、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡ（言い換えると、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ）及びこのｔＲＮＡをアミノアシル化する酵素を発現しない大腸菌は、ＢＡＣ７を導入しただけでは、生育できない。そのため、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡ及びこのｔＲＮＡをアミノアシル化する酵素を発現するように形質転換した後に、大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子を欠損させることが好ましい。【０１１９】
図１２（ａ）は、ｐｒｆＡ遺伝子の置き換えの概略及び欠損確認のＰＣＲのためのプライマーの位置を示した図であり、図１２（ｂ）は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。各レーンにおける鋳型ＤＮＡとした菌株は次の通りである；レーン１：ＨＳＴ０８、レーン２：ＨＳＴ０８、レーン３：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）のＲＦｚｅｒｏ−ｑ、レーン４：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）のＲＦｚｅｒｏ−ｑ、レーン５：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ、レーン６：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ。奇数レーンは図１２（ａ）における矢印Ｐ５，Ｐ６に示されるプライマーセットを使用して増幅したものであり、偶数レーンは図１２（ａ）における矢印Ｐ７，Ｐ８に示されるプライマーセットを使用して増幅したものである。図１２に示される結果から、ｐｒｆＡ遺伝子の欠損が確認できた。【０１２０】
〔実施例５〕
本実施例では、ＵＡＧコドンで翻訳終結し、単独で遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が極端に低下することが知られている遺伝子の中から、非天然タンパク質製造用の組換え大腸菌の増殖速度を向上させる遺伝子の探索を行った。候補遺伝子の探索には、ＢＷ２５１１３株を使用した。ＢＷ２５１１３株はＫＥＩＯコレクションの親株であり（Baba et al., Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008 (2006)）、Ｋ−１２株の野生型とほぼ同等である。候補遺伝子の探索のために、ＢＷ２５１１３株からΔｐｒｆＡ株を作製した。具体的には、ｃａｔ遺伝子を持つＢＡＣ６−ΔｈｅｍＡＫを導入し、ｓｕｐＥとグルタミニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｎＲＳ）とを発現するｐＧｌｎＲＳ−ｓｕｐＥ−ｋａｎ、又はｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎをさらに導入した後に、ｐｒｆＡをゼオシン耐性遺伝子で置換することにより、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。なお、本実施例では、ｐｒｆＡ全長が取り除かれるように、ゼオシン耐性遺伝子で置換した。なお、本実施例においても、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させる組換えのときに、ゲノム上のｈｅｍＡ遺伝子のＴＡＧコドン（終止コドン）をＴＡＡに置き換えている。ＢＷ２５１１３は野生株に近いため抗生物質に対する耐性が強く、ゼオシン７５μｇ／ｍｌで組換えコロニーのセレクションを行った。【０１２１】
各候補遺伝子の終始コドンをＰＣＲによってＴＡＡに置換した後、ｐＡｐ１０２ベクターにクローニングして各発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを用いて、上記のΔｐｒｆＡ株を形質転換した。その結果、候補遺伝子の一つであるｓｕｃＢの発現系を導入した形質転換体は、３０℃の液体培地中でとりわけよく増殖した。表１は、ｓｕｃＢ発現プラスミド又はコントロールを、上記のΔｐｒｆＡ株であるＢＷ２５１１３［ＢＡＣ６−ΔｈｅｍＡＫ  ｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎ  ｐｒｆＡ：：ｚｅｏ  ｈｅｍＡ（ＴＡＧ→ＴＡＡ）］に導入し、単一コロニーを１晩３０℃で振とう培養したときの増殖を調べた結果を示している。ｓｕｃＢはクエン酸回路を構成するα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのＥ２サブユニットをコードする遺伝子である。野生型ｓｕｃＢ遺伝子のＵＡＧコドンは２つ連続しており、３−ヨードチロシンが連続して導入されることで、発現量あるいは活性が大幅に低下するものと考えられる。なお、プレート培養におけるコロニーはサイズがほとんど変わらなかったため、ｓｕｃＢの機能は、特に液性培地中での増殖能に寄与していると予想される。【０１２２】
【表１】
0005858543.tif 000002
【０１２３】
〔実施例６〕
本実施例では、大腸菌ＨＳＴ０８株の代わりに、ＢＷ２５１１３、Ｋ−１２株であるＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及びＢ株由来のＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して、かつＢＡＣ７プラスミドにｓｕｃＢ遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて、非天然タンパク質製造用の組換え細菌（ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ、ＨＭＳ１７４ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ）を作製した。【０１２４】
まず、終始コドンをＴＡＡに置換したｓｕｃＢをＢＡＣ７プラスミドへクローニングした。また、このプラスミドにおいてセレクションマーカーをｃａｔに置換した。このプラスミドをＢＡＣ８プラスミドとした。ＢＡＣ８における各オペロン及び各遺伝子の導入位置及び導入方向の概略を図１３に示す。図１３に示すとおり、ｃａｔの終止コドンのすぐ下流にｓｕｃＢがクローニングされている。そのため、ｓｕｃＢはｃａｔプロモーターにより転写されることとなる。【０１２５】
次に、ＢＷ２５１１３、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）にＢＡＣ８を導入した。さらに、マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子からゲンタマイシン耐性遺伝子に変更している以外はｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎと同じであるｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｇｅｎｔを、ＢＡＣ８を導入した株に導入した。次いで、実施例５と同様にしてｐｒｆＡをゼオシン耐性遺伝子で置換して、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損させた。それぞれのＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においてｐｒｆＡ遺伝子の欠損をＰＣＲによって確認した結果を図１４に示す。図１４（ａ）は遺伝子の置き換えの概略及び確認のＰＣＲのためのプライマーの位置を示した図であり、図１４（ｂ）は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。コロニーＰＣＲを行った結果、ｐｒｆＡ遺伝子の欠損が確認できた（図１４（ｂ）参照）。以上から、ＢＡＣ８を用いて、Ｋ−１２株及びＢ株由来の大腸菌株において、容易にｐｒｆＡ遺伝子を欠損させることが可能であることが示された。【０１２６】
得られたＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ、ＨＭＳ１７４ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ、及びＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙに関し、３−ヨードチロシンを含む培地における増殖速度を測定した。結果を図２４に示す。その結果、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ及びＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙは、ｐｒｆＡ＋であるこれらの親株とほとんど同程度の速度で増殖した（図２４（ａ）及び（ｃ））。一方、ＨＭＳ１７４ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙは、ｐｒｆＡ＋であるこの親株よりも緩やかに増殖した（図２４（ｂ））。【０１２７】
さらに、各ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖における非天然型アミノ酸の依存性について確認した。１晩培養した細胞培養物を希釈して、３−ヨードチロシンを含む非選択ＬＢ培地上、および３−ヨードチロシンを含まない非選択ＬＢ培地上にスポットしてさらに培養した。結果を図２５に示す。図２５に示されるように、いずれのＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖も、３−ヨードチロシンの存在に完全に依存していた。このことは、ｐｒｆＡノックアウトにおける致死性を回避するためには細胞内におけるＵＡＧ翻訳活性が必要であることと整合している。【０１２８】
〔実施例７〕
本実施例では、実施例６で作製したＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の性質を調べた。【０１２９】
まず、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の微量のグリセロールストックをＬＢ液体培地、及び、３−ヨードチロシン（ＩＹ）、３−ブロモチロシン（ＢｒＹ）又は３−クロロチロシン（ＣｌＹ）のいずれかを添加したＬＢ液体培地に加えて３７℃で一晩振とう培養して、その増殖を調べた。結果を表２に示す。【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
表２に示すとおり、非天然型アミノ酸を含まないＬＢ液体培地では細胞増殖が全く見られなかった。一方、非天然型アミノ酸を加えた場合は、いずれの非天然型アミノ酸であっても、培養液の濁度がＯＤ６００＝約１．４になり、十分に増殖することができた。すなわち、ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊは３−ヨードチロシン以外にも、３−ブロモチロシン及び３−クロロチロシンを認識することができた。【０１３２】
以上から、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においては、ＵＡＧコドンを３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシン及び３−クロロチロシンのいずれにも割り当てることが可能であることが示された。ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙにおいても同様であると予想される。【０１３３】
〔実施例８〕
上記の実施例２では、ＨＳＴ０８株を宿主細胞の細菌として、３−ヨードチロシン以外の非天然型アミノ酸（４−アジドフェニルアラニン）を導入する非天然タンパク質製造用の組換え細菌（ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ）を作製した。本実施例では、宿主細胞の細菌としてＢＬ２１（ＤＥ３）を使用するとともに、３−ヨードチロシン以外の非天然型アミノ酸として、４−アジドフェニルアラニンのほかにＯ−スルホチロシンの導入も試みた。【０１３４】
４−アジドフェニルアラニン又はＯ−スルホチロシンを導入する場合には、それぞれに特異的なアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素である、メタノコッカス・ジャナシイのＡｚＦＲＳ遺伝子（ＡｚＦＲＳ−ｍｊ）又はメタノコッカス・ジャナシイのＳｆＹＲＳ遺伝子（ＳｆＹＲＳ−ｍｊ）（Liu, C.C. and Schultz, P.G., Nat. Biotechnol., 2006, 24, 1436-1440.）を発現させる必要がある。【０１３５】
まず、ｐＥＴ２１ｂベクターにｇｓｔ（６Ａｍ）がクローニングされたプラスミドｐＥＴＧＳＴ（６Ａｍ）に、ＡｚＦＲＳ−ｍｊ又はＳｆＹＲＳ−ｍｊの発現系をクローニングすることで、ｐＥＴＧＳＴ（６Ａｍ）−ＡｚＦＲＳ−ｍｊ又はｐＥＴＧＳＴ（６Ａｍ）−ＳｆＹＲＳ−ｍｊを作製した。なお、ＡｚＦＲＳ−ｍｊ及びＳｆＹＲＳ−ｍｊの活性を高めるために、新たにＤ２８６Ｒ変異（Kobayashi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 4678-4683.）を導入した。【０１３６】
次いで、実施例６で作製したＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙを、ｐＥＴＧＳＴ（６Ａｍ）−ＡｚＦＲＳ−ｍｊ又はｐＥＴＧＳＴ（６Ａｍ）−ＳｆＹＲＳ−ｍｊによって形質転換し、４−アジドフェニルアラニン又はＯ−スルホチロシンを含むＬＢプレートにまき、コロニー形成を観察した。ＵＡＧコドンの割り当てを４−アジドフェニルアラニンに変更した株を、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆとし、Ｏ−スルホチロシンに変更した株をＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙとする。結果、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆのＡｚＦプレート上での増殖速度は、ＩＹプレート上でのＲＦｚｅｒｏ−ｉｙの増殖速度より遅く、ＳｆＹプレート上でのＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙの増殖速度は、ＩＹプレート上でのＲＦｚｅｒｏ−ｉｙの増殖速度以上であった。なお、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ及びＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙは３−ヨードチロシンを含むＬＢプレート上ではほとんど増殖できない。これはＡｚＦＲＳ−ｍｊ及びＳｆＹＲＳ−ｍｊが中程度コピープラスミドから発現するとともに、Ｄ２８６Ｒ変異によりＭ.  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ分子を強く認識するため、低コピープラスミドから発現する弱いｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊからｔＲＮＡが奪われてしまうためだと考えられる。【０１３７】
〔実施例９〕
実施例８において、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙの増殖速度はＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆの増殖速度よりも優れていた。ＡｚＦＲＳ−ｍｊの活性は他の変異体よりも弱いため、ＵＡＧコドンの翻訳効率とＲＦｚｅｒｏ株の増殖速度とが相関している可能性が高い。そこで、過剰量のメタノコッカス・ジャナシイＴｙｒＲＳ変異体に対してメタノコッカス・ジャナシイｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ分子が不足していると予想されるため、さらにメタノコッカス・ジャナシイｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡの過剰発現系を導入することを試みた。ＡｚＦＲＳ−ｍｊの基質ｔＲＮＡとして、ｐＡｚＰｈｅ１変異体が報告されており、アンバーサプレッション効率が３．６倍増加することが知られている（Guo et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48, 9148-9151.）。そこで、ｐＥＴＧＳＴ（２５Ａｍ）にＡｚＦＲＳ−ｍｊ及びｐＡｚＰｈｅ１の両方の発現系をクローニングした、ｐＥＴＧＳＴ（２５Ａｍ）−ＡｚＦＲＳ−ｍｊ−ｐＡｚＰｈｅ１を作製した。ｐＡｚＰｈｅ１はｌｐｐプロモーターから発現させた。ｌｐｐプロモーターは強力なプロモーターとして知られている。【０１３８】
実施例６で作製したＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株をｐＥＴＧＳＴ（２５Ａｍ）−ＡｚＦＲＳ−ｍｊ−ｐＡｚＰｈｅ１によって形質転換し、４−アジドフェニルアラニン又は３−ヨードチロシンを含むＬＢプレートにまいた。結果を表３に示す。４−アジドフェニルアラニン入りプレート上において、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ（ＡｚＦＲＳ−ｍｊ−ｐＡｚＰｈｅ１）株はＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ（ＡｚＦＲＳ−ｍｊ）株よりもはるかに生育がよく（表３中、カラム１ｖｓ３）、かつＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株よりも生育がよかった（表３中、カラム１ｖｓ２）。また、ＢＬ２１ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ（ＡｚＦＲＳ−ｍｊ−ｐＡｚＰｈｅ１）株は３−ヨードチロシンを含むＬＢプレート上でも、増殖することができた（表３中、カラム４）。したがって、メタノコッカス・ジャナシイのＴｙｒＲＳ変異体／ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡペアを中程度コピー数のプラスミドに載せてＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株に導入することにより、ＵＡＧコドンを、さらに他の非天然型アミノ酸に再定義できることが示された。【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
次に、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株を用いて確認実験を行った。ｇｓｔをｔａｃプロモーター下流につないだｐＴａｃＧＳＴプラスミドに、それぞれｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３発現系、ＡｚＦＲＳ−ｍｊ−ｐＡｚＰｈｅ１発現系、及びＳｆＹＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３発現系を載せた、ｐＴａｃＧＳＴ−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３、ｐＴａｃＧＳＴ−ＡｚＦＲＳ−ｍｊ−ｐＡｚＰｈｅ１、及びｐＴａｃＧＳＴ−ＳｆＹＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を作製した。Ｎａｐ３は後述するように、ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡの高活型変異体である。また、いずれのａａＲＳもＤ２８６変異を有するものである。ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株をこれら３種類のプラスミドのいずれかによって形質転換し、得られた形質転換体のコロニーを１０倍ずつ段階希釈して、それぞれ非天然型アミノ酸有り、及び非天然型アミノ酸無しのＬＢプレートにスポットした。結果を図１５に示す。【０１４１】
図１５に示されるように、いずれの形質転換体も、非天然型アミノ酸を含むプレート上でのみ増殖が見られ、非天然型アミノ酸を含まないプレート上では一切増殖しなかった。以上から、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においても、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株と同様に、ＵＡＧコドンをさらに他の非天然型アミノ酸に再定義できることが示された。【０１４２】
〔実施例１０〕
上述の実施例から、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖速度を向上させるためには、ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡペアを改良すればよいことが示唆される。そこで、本実施例では、ｐＡｚＰｈｅ１変異体のように高活性であり、多くのメタノコッカス・ジャナシイＴｙｒＲＳ変異体に対して優れた基質であると予想されるＮａｐ３変異体を採用した。なお、ｐＡｚＰｈｅ１はＮａｐ３のＣ１６が欠損したものである（Guo et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48, 9148-9151.）。【０１４３】
まず、ｇｓｔ（７３Ａｍ）変異体がクローニングされたｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）プラスミドに、ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ（Ｄ２８６Ｒ）及びＮａｐ３の発現系を組み込んだ、ｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を作製した。次いで、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株にｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）又はｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を導入し、３−ヨードチロシンを含むＬＢプレート上でのコロニー形成を観察した。結果を図１６に示す。【０１４４】
図１６に示されるように、ｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を導入したＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株（図１６（ｂ））はｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）を導入したＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株（図１６（ａ））と比較して圧倒的に増殖能が高かった。以上より、ＵＡＧコドンの翻訳効率を高めることにより、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖速度を向上させることができることが示された。【０１４５】
〔実施例１１〕
上述の実施例から、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖速度を高めるには、ｓｕｃＢを正常に発現させ、ＵＡＧコドンの翻訳効率を高めればよいことが明らかとなった。そこで、本実施例では、これらの要素が増殖速度に与える効果を確認した。具体的には、増殖曲線を観察することで、増殖速度に与えるそれぞれの効果を見積もった。【０１４６】
まず、ＨＳＴ０８株由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における効果を調べた。終止コドンをＵＡＡに置換したｓｕｃＢ遺伝子を、アンピシリン耐性遺伝子の直下につなぎ、ｐＢＲ３２２ベクターにクローニングした。同様に、ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３ペアを、ｐＢＲ３２２に、単独あるいはｓｕｃＢ発現系と共にクローニングした。次いで、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株をｐＢＲ３２２（ｖｅｃｔｏｒ）、ｓｕｃＢ発現系プラスミド、ｓｕｃＢ／ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３発現系プラスミドによって形質転換した。得られた形質転換体の増殖速度を測定した。比較として、ＨＳＴ０８［ＢＡＣ７ｇｅｎｔ  ｓｕｐＥ４４：：ｃａｔ  ｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎ］株にｐＢＲ３２２又はａａＲＳ／ｔＲＮＡ発現系プラスミドを導入し、同様にして増殖速度を測定した。結果を図１７に示す。【０１４７】
図１７に示されるとおり、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株にｐＢＲ３２２ベクターを導入した場合には，図６に示す増殖曲線を再現し、ＯＤ６００が０．４を超えるあたりで増殖速度を落とし、その後、そのままの速度で増え続けた。なお、２０時間後には野生型よりも濁度が高くなるが、死滅細胞が多いようであり、正常に分裂を休止できないようであった。一方、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株にｓｕｃＢ発現系を導入すると、ＯＤ６００が０．４を超えるあたりでも増殖速度が落ちず、最終的には野生型ＨＳＴ０８株と同程度に増殖した。なお、ｓｕｃＢ発現系に加えてｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３発現系を導入した場合（図１７中、「sucB & aaRS & tRNA」）には、ＢＷ２５１１３株とは異なり、増殖速度をさらに高めることはなかった。形質転換コロニーの形状にも変化が見られないことから、ＨＳＴ０８株のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においては、ＵＡＧの翻訳効率は既に十分に高いことが予想される。【０１４８】
ところで、野生型のＨＳＴ０８株においてｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３ペアを過剰発現させた場合には、わずかながら増殖速度が低下するものの、報告されている通り（Guo et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48, 9148-9151.）、Ｎａｐ３変異体は大量発現させても細胞毒性がでにくいことが確認された。【０１４９】
次に、ＨＳＴ０８株由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株と同様にして、ＢＷ２５１１３由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株における効果を確認した。具体的には、ＢＷ２５１１３［ＢＡＣ６−ｈｅｍＡＫ  ｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎ  ｐｒｆＡ：：ｚｅｏ  ｈｅｍＡ（ＴＡＧ→ＴＡＡ）］株をｐＢＲ３２２、ｓｕｃＢ発現系プラスミド、又はｓｕｃＢ／ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３発現系プラスミドによって形質転換し、それぞれの増殖速度を測定した。比較として、ＢＷ２５１１３［ＢＡＣ６−ｈｅｍＡＫ  ｐｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ＭＪＲ１−ｋａｎ］株に、ｐＢＲ３２２又はｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３発現系プラスミドを導入し、同様にして増殖速度を測定した。結果を図１８に示す。【０１５０】
図１８に示されるとおり、ＢＷ２５１１３由来のＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においてｓｕｃＢを発現させたところ、増殖速度が速まるのではなく、増殖速度は維持されていた。一方、ｓｕｃＢ発現系に加えてｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ／Ｎａｐ３発現系を導入した場合（図１８中、「sucB & aaRS & tRNA」）には、ＨＳＴ０８株とは異なり、劇的な増殖速度の回復が見られ、ΔｐｒｆＡ株でありながら、野生株に近い増殖曲線が観察された。また、形質転換コロニーの形状も、野生株における形状に非常に類似していた。【０１５１】
ＨＳＴ０８から作製したＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株とＢＷ２５１１３から作製したＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株とを比較すると、ＨＳＴ０８ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においては、ＵＡＧの翻訳効率ではなく、ｓｕｃＢの低活性化が増殖を妨げており、一方、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株においては、ｓｕｃＢの低活性化に加え、ＵＡＧの翻訳が間に合っていないことが増殖を妨げていたことが明らかとなった。さらに、ＢＬ２１（ＤＥ３）株においては、ＢＡＣ７を用いてＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株を作製でき、プレート培養が可能であるものの、液体培養を含む通常の遺伝子作業に用いるには、ＢＡＣ８を用いたり、トランスにｓｕｃＢ発現系を導入したりするなど、ｓｕｃＢ発現系を補充することがより望ましいことが明らかとなった。【０１５２】
〔実施例１２〕
本実施例では、ＯＲＦ中にＵＡＧコドンを含むｇｓｔ変異体の発現を確認した。【０１５３】
まず、ｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３上のｇｓｔ（７３Ａｍ）変異体において、さらに２２、５７、１４１、１５５及び１６３残基目のいずれかのチロシンコドンをＵＡＧに置換し、ＵＡＧコドンが２か所に導入されたシリーズを作製した。比較として、野生型ｇｓｔを同様にクローニングして、ｐＴａｃＧＳＴ−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を作製した。ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株に、上記シリーズのうちのいずれか、又はｐＴａｃＧＳＴ（７３Ａｍ）−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３、又はｐＴａｃＧＳＴ−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を導入し，全長ＧＳＴの発現を、抗ＧＳＴ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。結果を図１９に示す。【０１５４】
図１９に示されるように、野生型ｇｓｔの発現と比較し、ｇｓｔ（７３Ａｍ）変異体も、さらなるＵＡＧコドンを導入した各変異体も同程度に発現していた。すなわち、ＵＡＧコドンが３−ヨードチロシンとして効率良く翻訳されていることが示された。さらに、ＵＡＧの位置で翻訳終結した断片は検出されなかったため、ＵＡＧは完全なセンスコドンになっていることが明らかとなった。【０１５５】
次に、ｇｓｔの１（ｇｓｔ（２５Ａｍ）に相当）、２２、５７、７３、１４１、１５５、１６３残基目のアミノ酸のコドンを全てＵＡＧコドンに置換した、ｐＴａｃＧＳＴ（７Ａｍ）−ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｍｊ−Ｎａｐ３を作製した。当該コンストラクトをＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株に導入し、ｇｓｔの発現を調べた。結果を図２０に示す。【０１５６】
図２０に示されるように、野生型ｇｓｔ及びｇｓｔ（７Ａｍ）の発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較したところ、同程度の大量発現が観察された。したがって、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株は、増殖速度において野生株に匹敵し、ＵＡＧの翻訳効率においてもチロシンコドンに匹敵し、ＵＡＧコドンが完全に３−ヨードチロシンに再定義された生物種であることが明らかとなった。【０１５７】
〔実施例１３〕
本実施例では、ＢＷ２５１１３株におけるＵＡＧコドンを種々のチロシン誘導体およびリジン誘導体に割り当てることによって、非天然型アミノ酸の導入を試みた。具体的には、実施例６で作製したＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株において、ＵＡＧコドンを種々のチロシン誘導体およびリジン誘導体に再定義することにより、非天然型アミノ酸の導入を試みた。【０１５８】
本実施例において使用される古細菌のＴｙｒＲＳおよびＰｙｌＲＳは、大腸菌において、所望の非天然型アミノ酸を、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡと結合させるように改変されている。具体的には、実施例８におけるＡｚＦＲＳ−ｍｊ、実施例８におけるＳｆＹＲＳ−ｍｊ、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジン（ＡｃＬｙｓ）をペアとなるアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（Methanosarcina mazei ｔＲＮＡＰｙｌ）に結合させるＰｙｌＲＳ誘導体（上述のＡｃＫＲＳ−３）、Ｎε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（ＡｌｏｃＬｙｓ）またはＮε−（ｏ−アジドベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＡｚＺＬｙｓ）をペアとなるアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（Methanosarcina mazei ｔＲＮＡＰｙｌ）に結合させるＰｙｌＲＳ誘導体（Yanagisawa T.et al, Chem, Biol, 15, pp1187-1197 (2008)）を使用した。本実施例で使用した非天然型アミノ酸の構造を図２６に示す。【０１５９】
ＲＳ誘導体のそれぞれを、ペアとなるアンバーサプレッサーｔＲＮＡとともに、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙにおいて発現させた。なお、ＵＡＧコドンを３−ヨードチロシンに翻訳するＲＦｚｅｒｏ−ｉｙの内在性の系は、３−ヨードチロシンの非存在下においては機能しない。そのため、別のＲＳ誘導体ペア−ｔＲＮＡをコードするコンストラクトを導入してこれらを発現させ、対応する非天然型アミノ酸を添加することにより、ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙにおけるＵＡＧコドンを３−ヨードチロシンから所望の非天然型アミノ酸に再定義することができる。【０１６０】
各ＲＳ誘導体−ｔＲＮＡペアを発現している株を、対応する非天然型アミノ酸を含む培地において増殖させ、その増殖速度を測定した。結果を図２７に示す。その結果、４−アジドフェニルアラニン、Ｏ−スルホチロシン又はＮε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リジンを導入するＲＳ誘導体−ｔＲＮＡペアを有しているＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株（図２７中、それぞれＢＷ−ａｚｆ、ＢＷ−ｓｆｙ、及びＢＷ−ＡｌｏｃＬｙｓ）は、それぞれに対応する非天然型アミノ酸を含む培地において、親株のＢＷ２５１１３とほとんど同じ速度で増殖した。一方、Ｎε−（ｏ−アジドベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンまたはアセチルリジンを導入するＲＳ誘導体−ｔＲＮＡペアを有しているＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株（図２７中、それぞれＢＷ−ＡｚＺＬｙｓ及びＢＷ−ＡｃＬｙｓ）は、それぞれに対応する非天然型アミノ酸を含む培地において、親株のＢＷ２５１１３に比べ緩やかに増殖した。【０１６１】
さらに、各ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖における非天然型アミノ酸の依存性について確認した。１晩培養した細胞培養物を希釈して、対応する非天然型アミノ酸を含む非選択ＬＢ培地上、および対応する非天然型アミノ酸を含まない非選択ＬＢ培地上にスポットしてさらに培養した。結果を図２８に示す。図２８に示されるように、いずれのＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株の増殖も、対応する非天然型アミノ酸の存在に完全に依存していた。このことから、ＵＡＧコドンに割り当てられたアミノ酸が３−ヨードチロシンから４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジン、Ｎε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、またはＮε−（ｏ−アジドベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンに切り替えられていることが示された。【０１６２】
以上の結果から、様々な遺伝的バックグラウンドにおいて、および種々の非天然型アミノ酸を用いて、コドンの迅速な再割り当てを行うことが可能であることが示された。また、製造されたＲＦｚｅｒｏ株の増殖は、大規模なタンパク質生産にあたって十分な増殖速度であることが示された。【０１６３】
〔実施例１４〕
本実施例では、ＢＷ２５１１３のＲＦｚｅｒｏ株におけるＵＡＧコドンの割り当てを３−ヨードチロシン、４−アジドフェニルアラニン、またはＯ−スルホチロシンに変更した株（以下、それぞれを、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆおよびＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙと称する）において、非天然型アミノ酸が導入されたタンパク質が実際に合成されていることを確認した。【０１６４】
まず、ＧＳＴ遺伝子における１５のチロシンコドンのうちの３つまたは７つのチロシンコドンをＵＡＧコドンに変更した改変ＧＳＴ遺伝子（ｇｓｔ（３×ａｍｂ）、ｇｓｔ（７×ａｍｂ））を発現させる発現プラスミド作成した。この改変ＧＳＴ遺伝子は、Ｎ末端に２５の追加のアミノ酸が付加されている。ｇｓｔ（３×ａｍｂ）においては、この２５の追加アミノ酸を含めて数えて、２５位、４７位、および９８位のチロシンコドンがＵＡＧコドンに変更されている。また、ｇｓｔ（７×ａｍｂ）においては、ｇｓｔ（３×ａｍｂ）における変更位置に加えて、さらに８２位、１６６位、１８０位、および１８８位のチロシンコドンがＵＡＧコドンに変更されている。各改変ＧＳＴ遺伝子は、ｔａｃプロモータの制御下におかれている。また、各発現プラスミドには、ＵＡＧコドンの割り当てを３−ヨードチロシン、４−アジドフェニルアラニン、またはＯ−スルホチロシンに変更する発現ユニット（ＲＳ誘導体−ｔＲＮＡペア）が組み込まれている。【０１６５】
各発現プラスミドを、実施例６で作製したＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙに導入した。各株からタンパク質を取得し、ＳＧＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＣＢＢ染色するとともに、抗ＧＳＴ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図２９に示す。図２９において、ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆ及びＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙは、それぞれＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙに対して、ＵＡＧコドンの割り当てを４−アジドフェニルアラニンに変更する発現ユニット及びＵＡＧコドンの割り当てをＯ−スルホチロシンに変更する発現ユニットを導入した株である。図２９中、上側の写真はＣＢＢ染色の結果を示しており、下側の写真はウエスタンブロッティングの結果を示している。図２９に示すように、全ての株において、改変ＧＳＴ遺伝子の全長（図２９中、矢印）が発現していることが確認された。なお、本実施例における「野生型のＧＳＴ（ＷＴ）」は、Ｎ末端に２５の追加のアミノ酸が付加されているＧＳＴを指す。各レーンの下部にある数値は、見積もられた生成量（１Ｌの培養物あたりのｍｇ）を示している。ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙにおけるｇｓｔ（３×ａｍｂ）およびｇｓｔ（７×ａｍｂ）の発現量は、野生型ＧＳＴの発現量とほぼ等しい発現量であった。ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ａｚｆおよびＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙにおけるｇｓｔ（３×ａｍｂ）およびｇｓｔ（７×ａｍｂ）の発現量は、野生型ＧＳＴの発現量よりも低下していた。しかしながら、このうち最も発現量が低かった、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｓｆｙにおけるｇｓｔ（７×ａｍｂ）でさえも、培養物１Ｌにつきミリグラム単位の量の目的タンパク質を生成することができた。【０１６６】
さらに、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙにおけるｇｓｔ（７×ａｍｂ）産物を用いて、７つのヨードチロシンが確かにタンパク質内に導入されていることを、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって確認した。結果を図３０に示す。確認の結果、ＢＷ２５１１３ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ由来のＧＳＴタンパク質の推定質量（２８８４６．０Ｄａ）は、野生型のＧＳＴタンパク質の推定質量（２７９６６．０Ｄａ）よりも８８０Ｄａ大きい値であった。これは、７つの水素原子がヨウ素原子に置き換わったときの値に相当する。したがって、７つのチロシンがいずれも３−ヨードチロシンに置き換わっていることが確認された。【０１６７】
翻訳機構または順応機序は、種々の非天然型アミノ酸に対して、異なる効率でもって機能することが知られている（Liu, C.C. and Schultz, P.G., Annu. Rev. Biochem., 79, 413-444 (2010)）。そのため、タンパク質の生成量の低下は、４−アジドフェニルアラニンおよびＯ−スルホチロシンを用いたタンパク質合成の速度が３−ヨードチロシンを用いたタンパク質合成よりも緩やかであったためと考えられる。このことは、以下のｐｒｆＡ＋の株を用いた実験によっても確認された。【０１６８】
ここでは、Ｎ末端近傍にＵＡＧコドンを含むＧＳＴ遺伝子を、非天然型アミノ酸を導入するための発現ユニットとともに、ｐｒｆＡ＋株であるＢＷ２５１１３に導入し、その翻訳効率を確認した。Ｎ末端近傍にＵＡＧコドンを含むＧＳＴ遺伝子は、チオレドキシン（ＴＲＸ）との融合タンパク質となるようにプラスミドに組み込まれている（図３１（ａ）参照）。結果を図３１（ｂ）に示す。図３１（ｂ）は、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示している。図３１（ｂ）中、レーン２は、インフレームのＵＡＧコドンを含んでいないＧＳＴ遺伝子を導入した株であり、レーン１、４〜６は、Ｎ末端近傍にＵＡＧコドンを含む融合ＧＳＴ遺伝子を導入した株である。また、レーン１は、非天然型アミノ酸を導入するコンストラクトが含まれていない株である。レーン４〜６に示されるように、ＵＡＧコドンを３−ヨードチロシン、４−アジドフェニルアラニン、またはＯ−スルホチロシンに割り当てるためのコンストラクトが導入された株は、対応する非天然型アミノ酸の存在下において、全長の融合タンパク質を生成することが示されている（図中、矢印Ａ）。また、これらの株においては、ＵＡＧコドンにおける翻訳の中断により生じたタンパク質も生成されている（図中、矢印Ｂ）。各レーンの下部の括弧内に示した数字は、この翻訳中断により生じたタンパク質および生成された全長融合タンパク質の総量に対する全長融合タンパク質の割合（％）を示している。すなわち、ＵＡＧコドンにおける非天然型アミノ酸の導入効率を示している。２つのチロシン誘導体（４−アジドフェニルアラニン、およびＯ−スルホチロシン）に関しては、ｐｒｆＡ＋の条件においても、３−ヨードチロシンよりも導入の効率が低いことが明らかとなった。なお、より多くの部位に非天然型アミノ酸を導入することによってタンパク質が不安定化した場合にも、タンパク質の生産量は低下するものと考えられる。【０１６９】
〔実施例１５〕
本実施例では、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株を利用して、特定の複数の部位にアセチルリジンを有しているヒストンを生成することを試みた。ヒストンＨ４は、１０のリジン残基のうち、最大４つの特定のリジンが翻訳後にアセチル化されている。特定の位置において修飾されている均質なヒストンを合成する方法は、エピジェネティックの研究、および染色体の再構築に作用する治療薬の開発に有用である。【０１７０】
具体的には、実施例６で作製したＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙ株から細胞抽出物を調製して、これを用いた無細胞タンパク質合成系により、目的タンパク質の合成を試みた。無細胞タンパク質合成系においては、ニコチンアミドを高濃度で直接添加することができる。そのため、無細胞タンパク質合成系においては、脱アセチル化を防ぐことができ、これによりアセチル化に関して均質なヒストンを得ることができるためである。また、ＢＬ２１株の細胞抽出物は、高いタンパク質生産性を示すことが知られている（Kigawa, T. et al, J. Struct. Funct. Genomics, Vol.5, pp63-68 (2004)）。【０１７１】
まず、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＦｚｅｒｏ−ｉｙから細胞抽出物を調製した後、３−ヨードチロシンを取り除くために透析を行った。ついで、アセチルリジンをｔＲＮＡに結合させる、メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳ誘導体、およびこの誘導体のペアとなる、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを、細胞抽出物に添加した。また、終濃度１０ｍＭのニコチンアミドを添加した。【０１７２】
ヒトのヒストンＨ４においてアセチル化される４つの部位（５位、８位、１２位および１６位）に対応するコドンを全てＵＡＧに置換したヒトのヒストンＨ４改変遺伝子を用いて、発現用プラスミドを構築した。なお、この改変遺伝子においては、生成されるタンパク質のＮ末端にペプチドタグ（ＭＫＤＨＬＩＨＮＨＨＫＨＥＨＡＨＡＬＶＰＲＧＳＨ：配列番号３１）が付加されている。この発現用プラスミドを上記細胞抽出物に添加した。【０１７３】
合成されたＨ４ヒストンタンパク質は不溶性画分として得られた。これを尿素を用いて溶解させた後、クロマトグラフィーにより精製した。【０１７４】
その結果、Ｈ４ヒストン全長が生成されたことが確認できた。その収量は、反応液１ｍｌにつき０．３ｍｇであった。さらに、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、Ｈ４ヒストンにおけるアセチルリジンの導入を確認した。結果を図３２に示す。その結果、得られたＨ４ヒストンの推定質量（１４３５６．０Ｄａ）は、未修飾のＨ４ヒストンの推定質量（１４１８８．０Ｄａ）よりも１６８．０Ｄａ大きい値であった。これは、４つのアセチル基（計１６８．１Ｄａ）の追加に対応するものである。したがって、ヒストンＨ４に４つのアセチルリジンが導入されていることが示された。【０１７５】
〔参考例〕
本参考例では、ＵＡＧコドンを翻訳するｔＲＮＡ分子の改変によってＲＦｚｅｒｏ−ｑ株の増殖能力を向上させる方法を示す。【０１７６】
（ＵＡＧ翻訳効率を高めたｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子の作製）
実施例１で示された通り、ｃａｔ（１０Ａｍ）を導入したＲＦｚｅｒｏ−ｑ株は、野生型のｃａｔで形質転換したＲＦｚｅｒｏ−ｑ株と比べＣｍ耐性が落ちていた。これは、グルタミンのアンバーサプレッサー変異型ｔＲＮＡによるＵＡＧコドンの翻訳効率が、通常のグルタミンｔＲＮＡによるグルタミンコドン(ＣＡＡ、ＣＡＧ)の翻訳効率より低かったためと考えられる。ところで、ｓｕｐＥ４４変異に対応するｔＲＮＡＧｌｎのアンチコドンの三番目に変異を入れるとアミノアシル活性が低下することが知られている。ＨＳＴ０８株由来のＲＦｚｅｒｏ−ｑ株は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡＧｌｎ（ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ）をコードするｓｕｐＥ４４遺伝子を有しているが、ｔＲＮＡＧｌｎのアンチコドン（ＣＵＧ）の三番目（３６位）に変異（Ｇ→Ａ）が入っている。そこで、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を改変するのではなく、ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ分子のＵＡＧ翻訳効率を改善することによってＲＦｚｅｒｏ−ｑ株の増殖能力を向上させることを試みた。【０１７７】
図２１（ａ）に示すように、ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ遺伝子の３０位〜４０位（アンチコドン部位（３４〜３６位）を除く）にランダムに変異を入れてｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ変異体のライブラリーを構築した。３種類のＤＮＡオリゴマーＯＬＧ１（配列番号２８）、ＯＬＧ２（配列番号２９）及びＯＬＧ３（配列番号３０）を用意し、以下の工程を経て２本鎖ＤＮＡを形成させた。【０１７８】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、４．７ｍＭ  ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕｎｉｔｓ）を含む反応混合物（２０ｍｌ）に、ＯＬＧ１又はＯＬＧ２（それぞれ２００ｐｍｏｌ）を加えて、３７℃３０分間処理し、それぞれ別々に５末端のリン酸化反応を行った。これらのオリゴマーを混合してから、ＯＬＧ３（２００ｐｍｏｌ)を加えて、アニーリングを行った。アニーリングは、９４℃で３０秒間、８０℃で１分間、７４℃で１分間、６５℃で３０秒間、及び５５℃で１分間の条件で行った。アニールしたオリゴマーの溶液から、簡易ゲルろ過法によってＡＴＰを除去した。【０１７９】
アンチセンス鎖にはギャップが入っており、このギャップはセンス鎖のアンチコドン部位（ＣＴＡ）と８箇所のランダム化した配列部位に対応する（図２１（ｂ）参照）。このギャップは形質転換後に細胞内のＤＮＡポリメラーゼによって埋められる。【０１８０】
ｔｙｒＴプロモーターの下流に当該変異体遺伝子を組み込み、ｃａｔの変異遺伝子（ｃａｔ（３Ａｍ））及び３つのインフレームのＵＡＧコドンを持つｐＫＳ３ｃａｔ(３ａｍｂ)−ｋａｎにクローニングした。得られたプラスミドによってサプレッサーｔＲＮＡを含まないＤＨ１０Ｂ株を形質転換し、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地でコロニーのセレクションを行った。その結果、２×１０７のコロニー（ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ変異体遺伝子ライブラリー）が得られた。２３個のクローンのシーケンシングを行ったところ、１５個のクローン（６５％）が完全長のｔＲＮＡ配列を有しており、残りはｔＲＮＡ配列全体が欠失しているか、ランダム化した領域のヌクレオチドが欠失していた（図２１（ｃ）参照）。【０１８１】
次に、１５０μｇ／ｍｌのＣｍを含むＬＢ培地上でｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ変異体遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、１８個のクローンを得た。これらのクローンについて１５０−５００μｇ／ｍｌのＣｍを含むＬＢ培地上でＣｍ耐性能力を調べた。１８個のクローンの配列についてシーケンシングしたところ、１３種類の異なるｔＲＮＡ塩基配列が認められた。ｓｕｐＥ−ｔＲＮＡ変異体は全てもとのｓｕｐＥ  ｔＲＮＡと比較して高いＣｍ耐性を示した。この結果は、これらの変異体がもとのｓｕｐＥ  ｔＲＮＡと比較してＵＡＧの翻訳効率が高いことを示している。また、これらの変異体全てにおいて、３３位にＵ、３７位にＡ、そして３０位−４０位間塩基対を有していた。これら３つの要素はＵＡＧの効率的な翻訳に必要な要素と考えられる。【０１８２】
上記の１３種類のクローンのうち、クローン２、３、４、５、７、９、及び１１が最も高いＣｍ耐性を示した。クローン３は３８位がＵからＡに置き換わっている以外はｓｕｐＥ  ｔＲＮＡと同じであった。この置換は、高いＣｍ耐性を示した上位７クローンのうち、クローン２を除く全てに見られたことから、ＵＡＧの翻訳効率を更に向上させる働きがあると考えられる。【０１８３】
クローン４及び７はもとのｔＲＮＡとは最も異なった配列を有していた（ランダム化した８箇所のうち、６箇所が置き換わっていた）。そこで、置換の数が最も少なかったクローン３（以下、「ｓｕｐＥ３  ｔＲＮＡ」と呼ぶ）、及び最も多かったクローン７（以下、「ｓｕｐＥ７  ｔＲＮＡ」と呼ぶ）を用いてＲＦｚｅｒｏ−ｑ株のＵＡＧ翻訳効率のさらなる向上を試みた。これらの変異体は３８位がＵからＡに置き換わっている。しかし、２種類の大腸菌ｔＲＮＡＧｌｎの３８位はＵで不変部位であり、グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素によるｔＲＮＡＧｌｎの認識に関わっている。実際、大腸菌ｔＲＮＡＧｌｎにおいてこの部位をＵからＧへ置換した結果、アミノアシル活性が低下したことが報告されている。このことから、ｓｕｐＥ３  ｔＲＮＡ及びｓｕｐＥ７  ｔＲＮＡの高いＵＡＧ翻訳効率は、ＵＡＧを認識する能力がアミノアシル活性低下を十分打ち消す程度まで高められたことによるものと考えられる。【０１８４】
（ｓｕｐＥ３  ｔＲＮＡ又はｓｕｐＥ７  ｔＲＮＡを有するＲＦｚｅｒｏ−ｑ株の開発）
ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株の親株であるＨＳＴ０８株において、ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡをコードする配列をｓｕｐＥ３又はｓｕｐＥ７に置き換えた、ＨＳＴ０８−３株及びＨＳＴ０８−７株を作製した。相同性組み換えは、ＲＴ／ＥＴキット（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ社）を用いて行った。ゲンタマイシン耐性のＢＡＣ７であるＢＡＣ７ｇｅｎｔをＨＳＴ０８−３及びＨＳＴ０８−７株に導入してｐｒｆＡ遺伝子のノックアウトを行い、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ７を作製した。なお、本実施例では、ｐｒｆＡ遺伝子は全長のうちの大部分をゼオシン耐性遺伝子で置換した。最後に、ＨＳＴ０８−３及びＨＳＴ０８−７株のゲノム上のｐｒｆＡ領域についてシーケンシングして、ゲノム中にｐｒｆＡが残存していないことを確認した。【０１８５】
（ＵＡＧコドンの翻訳効率の比較）
ｃａｔ遺伝子にある１３箇所のグルタミンコドンを全てＵＡＧに置換したｃａｔ（１３Ａｍ）をＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株それぞれに導入し、ＵＡＧコドンの翻訳効率が向上しているか確認した。ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株は２００μｇ／ｍｌのＣｍに対して耐性を示した。これは、野生型ｃａｔ遺伝子の入ったｐＡＣＹＣ１８４によって形質転換したＨＳＴ０８株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ株におけるＣｍに対する耐性（４００μｇ／ｍｌ）よりも低かった。一方、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株では４００μｇ／ｍｌに近いＣｍ濃度で耐性を示した。この結果は、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株におけるＵＡＧコドンの翻訳効率が劇的に向上したことを示している。【０１８６】
次に、グルタミンコドンへの再定義を行ったＵＡＧとグルタミンコドン(ＣＡＧ)との翻訳効率を比較した。まず、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子のＮ末端に６つのＵＡＧコドンを導入し（ｇｓｔ（６ａｍｂ））、ｔａｃプロモーター下流につないで作製したｐＴａｃＧＳＴ（６Ａｍ）によってＲＦｚｅｒｏ−ｑ株、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株、及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株を形質転換した。比較対象として、ＵＡＧコドンの代わりにＣＡＧコドンの入ったｐＴａｃＧＳＴ（６ｇｌｎ）によって形質転換したＲＦｚｅｒｏ−ｑ株、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株を用意した。ｇｓｔ（６ａｍｂ）及びｇｓｔ（６ｇｌｎ）の発現量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタブロットによって確認した。結果を図２２（ａ）に示す。ｇｓｔ（６ａｍｂ）を発現させたＲＦｚｅｒｏ−ｑ株はｇｓｔ（６ｇｌｎ）を発現させた同株と比べて、その発現量が著しく低下していた。この結果は、ＵＡＧコドンの翻訳効率が、通常のグルタミンｔＲＮＡによるグルタミンコドン（ＣＡＡ、ＣＡＧ）の翻訳効率より低いという上述の見解を裏付けるものであった。一方、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株では、ｇｓｔ（６ａｍｂ）及びｇｓｔ（６ｇｌｎ）の発現量はほとんど同じであったのに対し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株では、ｇｓｔ（６ａｍｂ）の発現量がｇｓｔ（６ｇｌｎ）と比較して若干低下していた。また、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株のｇｓｔ（６ｇｌｎ）発現量はＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株における発現量より低かった。これは、後述の通り、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株の増殖速度がＲＦｚｅｒｏ−ｑ株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株と比較して速いことに起因するものと思われる。【０１８７】
次に、細胞抽出液のＧＳＴ活性を測定し、ｇｓｔ（６ｇｌｎ）に対するｇｓｔ（６ａｍｂ）の相対収量を調べた。結果を図２２（ｂ）に示す。【０１８８】
図２２（ｂ）に示されるとおり、ｐｒｆＡ遺伝子をノックアウトしていない親株のＨＳＴ０８株では、ｓｕｐＥ  ｔＲＮＡ遺伝子が発現していたにも関わらず、ｇｓｔ（６ａｍｂ）遺伝子がほとんど発現していなかった。一方、ｐｒｆＡ遺伝子をノックアウトしているＲＦｚｅｒｏ−ｑ株、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株においては、ｇｓｔ（６ａｍｂ）収量が劇的に増加した。相対収量は、２９％（ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株）、５９％（ＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株）、及び８９％（ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株）であった。また、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株では、ｇｓｔ（６ａｍｂ）の収量とｇｓｔ（６ｇｌｎ）の収量とはほとんど同じであった。これらの結果は、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株においてＵＡＧ翻訳効率が劇的に向上し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株ではグルタミンコドン（ＣＡＡ、ＣＡＧ）の翻訳効率とほぼ同程度まで向上したことを示している。【０１８９】
（ＨＳＴ０８株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ株の増殖率の比較）
ＨＳＴ０８株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ株をそれぞれＬＢ培地（抗生物質なし）中、３７℃で培養し、増殖速度を比較した。結果を図２３（ａ）に示す。ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株は親株であるＨＳＴ０８株と比べて増殖は遅かった。ＲＦｚｅｒｏ−ｑ７株の増殖速度はＲＦｚｅｒｏ−ｑ株とほぼ同じであった。一方、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株はＨＳＴ０８株と同程度の増殖速度を有しており、ｓｕｐＥ３変異が大腸菌の増殖に好ましい影響を与えていることが示された。【０１９０】
ＲＦｚｅｒｏ株では、ｐｒｆＢ遺伝子にコードされているＲＦ−２が唯一の終結因子であり、ＵＧＡコドン及びＵＡＡコドンを認識する。ＲＦ−２に変異を入れることにより、ＵＧＡ及びＵＡＡに加えてＵＡＧを翻訳させることが可能であるとの報告がされている。もし、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ株のＲＦ−２に変異が入っている場合、欠失したＲＦ−１の働きをＲＦ−２が補ってしまう可能性がある。そこで、増殖速度の向上がＲＦ−２の変異によるものではないことを確認するため、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株のゲノム上のｐｒｆＢ領域についてシーケンシングを行った。その結果、ｐｒｆＢに変異が入っていないことが確認された。【０１９１】
さらに、ＨＳＴ０８株及びＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株をより厳しい条件下で培養し、増殖速度を比較した。結果を図２３（ｂ）及び（ｃ）に示す。ＬＢ培地中、３７℃では対数増殖していた両株を、４２℃の条件下に移して増殖率を比較したところ、最初の１時間は増殖率をほとんど変化させずに対数増殖したが、２時間後は両株の増殖率にほとんど差が見られなくなった（図２３（ｂ）参照）。一方、Ｍ９塩、グリセロール及びマグネシウム塩のみを含む栄養欠乏培地では、ＨＳＴ０８株はゆっくり増殖したのに対し、ＲＦｚｅｒｏ−ｑ３株はほとんど増殖しなかった（図２３（ｃ）参照）。これらの結果は、ＵＡＧコドンの読み飛ばしによって、飢餓状態での成長に重要な遺伝子の活性が低くなったことが原因と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
本発明によれば、非天然タンパク質の合成を日常的な基礎技術に採用することができ、それによって、医薬品生産、タンパク質の機能解析、酵素の改変、大腸菌の改変などの発展が期待される。
【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
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【図３２】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【配列表】
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