(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド保持CyaAベクターであって、当該ポリペプチドを保持する前記CyaAベクターは、前記ポリペプチドを哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、（i）前記ポリペプチドに含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態の免疫治療における使用のためのものであり、ここで、前記第1の群のエピトープは、HPV16のE7Δ30-42抗原及びHPV18のE7Δ32-42抗原から選択され；及び（ii）前記ポリペプチドに含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態に対する予防における使用のためのものであり、ここで、前記第2の群のエピトープは、（ii.1）前記第1の群のエピトープがHPV16のE7Δ30-42抗原からなるとき、HPV18のE7Δ32-42抗原であるか、もしくは、MAGE A3腫瘍抗原の残基97〜178からなるMAGE A397-178エピトープ及びMAGE A3腫瘍抗原の残基242〜295に融合された残基190〜221からなるMAGE A3190-295*エピトープからなるMAGE A397-178/190-295抗原であり、又は、（ii.2）前記第1の群のエピトープがHPV18のE7Δ32-42抗原からなるとき、HPV16のE7Δ30-42抗原であるか、もしくは、MAGE A3腫瘍抗原の残基97〜178からなるMAGE A397-178エピトープ及びMAGE A3腫瘍抗原の残基242〜295に融合された残基190〜221からなるMAGE A3190-295*エピトープからなるMAGE A397-178/190-295抗原であり、前記免疫応答が、前記ポリペプチド保持CyaAベクターの前記宿主への投与後に得られる、前記ポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項２】
（iii）前記ポリペプチドに含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態の再発の防止にさらに使用される、請求項1記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項３】
前記第2の群のエピトープが、前記第1の群のエピトープを含む前記ポリペプチドに含まれている、請求項1又は2記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項４】
前記第1の群のエピトープ及び前記第2の群のエピトープが、異なるポリペプチドに含まれている、請求項1又は2記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項５】
1つのCyaAベクター分子が、全ての前記ポリペプチドを保持する、請求項1〜4のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項６】
前記CyaAが、ボルデテラ種CyaAである、請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項７】
CyaAが、百日咳菌、パラ百日咳菌、又は気管支敗血症菌に由来する、請求項6記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項８】
前記CyaA断片が、CD11b発現細胞に特異的に結合することができ、かつ、細胞サイトゾルに前記ポリペプチドを送達することができる、請求項1〜7のいずれか1記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項９】
前記CyaA断片が、残基1〜224及び235〜1706からなる百日咳菌CyaA断片である、請求項8記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１０】
前記CyaAタンパク質又は前記CyaA断片が、無毒化されている、非毒性である、又は酵素活性が欠損している、請求項1〜9のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１１】
前記CyaA断片が、ジペプチドLeu-Glnが残基188〜189の間のフレームに挿入されている百日咳菌CyaAである、請求項10記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１２】
少なくとも1つの前記ポリペプチドが、遺伝子融合の結果として前記CyaAタンパク質又は前記CyaA断片によって保持されている、請求項1〜11のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１３】
全てのポリペプチドが、遺伝子融合の結果として前記CyaAタンパク質又は前記CyaA断片によって保持されている、請求項1〜12のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１４】
少なくとも1つの前記ポリペプチドが、CyaA遺伝子へのその許容部位における遺伝子挿入の結果として前記CyaAタンパク質又は前記CyaA断片によって保持されている、請求項12又は13記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１５】
全てのポリペプチドが、CyaA遺伝子へのその許容部位における遺伝子挿入の結果として前記CyaAタンパク質又は前記CyaA断片によって保持されている、請求項12又は13記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１６】
全ての抗原が、HPVタイプ種由来の抗原であり、且つHPV16のE7Δ30-42抗原及びHPV18のE7Δ32-42抗原から選択される、請求項1〜15のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１７】
前記ポリペプチド保持CyaAベクターが、百日咳菌CyaAからなり：
（1）MAGE A3の残基97〜178からなる第1のポリペプチドが、CyaAのコドン319〜320の間に挿入されており；かつ
（2）MAGE A3の残基242〜295に融合された残基190〜221からなる第2のポリペプチドが、CyaAのコドン224〜235の間に挿入されている、請求項1〜15のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１８】
（1）（i）哺乳動物宿主で診断される、HPV16による感染の後に起こる第1の病的状態の免疫治療、及び（ii）HPV18による感染の後に起こる第2の病的状態に対する予防に使用されるか；又は
（2）（i）哺乳動物宿主で診断される、HPV18による感染の後に起こる第1の病的状態の免疫治療、及び（ii）HPV16による感染の後に起こる第2の病的状態に対する予防に使用される、
請求項16記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項１９】
前記第1の病的状態の再発に対する予防におけるさらなる使用のための、請求項18記載のポリペプチド保持CyaAベクター。
【請求項２０】
医薬として許容し得るビヒクル又は製剤と組み合わせて、請求項1〜19のいずれか1項記載の少なくとも1つのポリペプチド保持CyaAベクターを含む組成物であって、（i）前記ポリペプチドに含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態の免疫治療、及び（ii）前記ポリペプチドに含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態に対する予防に使用され、前記免疫応答が、前記組成物の前記宿主への投与後に得られる、前記組成物。
【請求項２１】
少なくとも2つのポリペプチド保持CyaAベクターを含み、前記第1の群のエピトープが、第1のポリペプチド保持CyaAベクターに含まれ、かつ前記第2の群のエピトープが、別のポリペプチド保持CyaAベクターに含まれている、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
前記第1の群のエピトープが、前記第1のポリペプチド保持CyaAベクターに保持された別のポリペプチドに含まれ、かつ/又は前記第2の群のエピトープが、前記別のポリペプチド保持CyaAベクターに保持された別のポリペプチドに含まれている、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
（a）CyaAのコドン319〜320の間に挿入されたHPV16-E7の最初の29のアミノ酸残基、及びCyaAのコドン224〜235の間に挿入されたHPV16-E7の残基43〜98からなる第1のポリペプチド保持CyaAベクター；及び
（b）CyaAのコドン319〜320の間に挿入されたHPV18-E7の最初の31のアミノ酸残基、及びCyaAのコドン224〜235の間に挿入されたHPV18-E7の残基43〜105からなる別のポリペプチド保持CyaAベクター
を含む、請求項20〜22のいずれか1項記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも1つのアジュバントをさらに含む、請求項20〜23のいずれか1項記載の組成物。
【請求項２５】
抗腫瘍又は抗ウイルス活性化合物をさらに含む、請求項20〜24のいずれか1項記載の組成物。
【請求項２６】
請求項1〜19のいずれか1項記載のポリペプチド保持CyaAベクターの使用であって、(i) 前記ポリペプチドに含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態の免疫治療のため、及び（ii）前記ポリペプチドに含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態に対する予防のための薬剤の製造のためであり、前記免疫応答が、前記ポリペプチド保持CyaAベクターの前記宿主への投与後に得られる、前記使用。
【請求項２７】
請求項26に記載のポリペプチド保持CyaAベクターの使用であって、（iii）前記ポリペプチドに含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態の再発防止のためのさらなる使用のための薬剤の製造のための、前記使用。
【請求項２８】
請求項18に記載のポリペプチド保持CyaAベクターの使用であって、
（1）（i）哺乳動物宿主で診断される、HPV16による感染の後に起こる第1の病的状態の免疫治療のため、及び（ii）HPV18による感染の後に起こる第2の病的状態に対する予防のための薬剤の製造；又は
（2）（i）哺乳動物宿主で診断される、HPV18による感染の後に起こる第1の病的状態の免疫治療のため、及び（ii）HPV16による感染の後に起こる第2の病的状態に対する予防のための薬剤の製造
のための、前記使用。
【請求項２９】
請求項18に記載のポリペプチド保持CyaAベクターの使用であって、前記第1の病的状態の再発防止のためのさらなる使用のための薬剤の製造のための、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリペプチド（複数可）保持CyaAをベースとした手段に関し、この手段は、前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、及び前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防に使用され、前記免疫応答は、前記ポリペプチド（複数可）保持ベクターの前記宿主への投与後に得られ、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防は、前記第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。特定の実施態様では、本発明は、ポリペプチド（複数可）保持CyaAをベースとした手段に関し、この手段は、（i）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、（ii）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防、及び（iii）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止に使用され、前記免疫応答は、前記ポリペプチド（複数可）保持ベクターの前記宿主への投与後に得られ、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防は、前記第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
百日咳の原因となる病原菌である百日咳菌（Bordetella pertussis）によって産生される重要な毒素の1つは、アデニル酸シクラーゼ（CyaA）である。肺定着の初期段階中に該細菌がCyaAを必要とすることがマウスモデルを用いて示された（Goodwin及びWeissの文献、1990年）。CyaAは、その触媒ドメインを細胞サイトゾルに熱心に送達することによる真核細胞侵入のユニークな機序を有する（Simsova, Seboらの文献、2004年）。ワクチンベクターとして使用される無毒化及び組換えCyaAは、例えば、樹状細胞又はランゲルハンス細胞のように、CD11b/CD18を発現する抗原提示細胞（APC）を標的とする優れた能力を有する（Guermonprezらの文献、2001年）。これらの常在APCは、皮内免疫法の後の抗原特異的T細胞応答の開始における重要な自然の細胞である（Merad, Ginhouxらの文献、2008年）。CD11b+ APCへの特異的な結合の後、CyaAを保持するウイルス抗原又は腫瘍抗原が、その抗原カーゴ（antigenic cargo）を熱心に送達することができる（Preville, Ladantらの文献、2005年）。このユニークな技術に基づいて、本出願者は、HPV感染患者治療用の臨床段階の2価ワクチン：ProCervixを開発した。ProCervixは、一方がHPV16 E7タンパク質を包埋したCyaAワクチンであり、他方がHPV18 E7タンパク質を保持するCyaAワクチンである2つの異なるCyaAワクチンの混合物から調製された2価治療ワクチンである。
【０００３】
実際、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染、特に、高リスクHPV、例えば、HPV18及びHPV16感染は、長期間持続し、宿主の免疫応答の低下により、子宮頸癌が発生することがある。HPVのE7腫瘍性タンパク質はすべて、ウイルスの複製周期に発現されるため、T細胞性免疫療法の標的として選択される（Iwasakiの文献、2010年）。ウイルスカプシドタンパク質に対するB細胞性免疫は、HPV感染に対する予防的防御として十分であることが示されている（Stanleyの文献、2010年）。しかしながら、自然なT細胞性免疫は、ウイルスに既に感染している患者の治療にとって極めて重要である（Frazerの文献、2009年）。加えて、利用可能なHPV予防ワクチンは、既にHPVに感染している患者の治療及び疾患の治療には不十分であり、従って、HPV抗原に対する抗原特異的T細胞応答を誘発し得る治療ワクチンの開発の重要性が増している（Trimble及びFrazerの文献、2009年）。
【０００４】
予防ワクチンは、B細胞性免疫の獲得に基づいている。これに対して、治療ワクチンは、慢性感染（ウイルス、細菌など）又は癌の効率の良い治療のために強固で強力な炎症性CD4+及びCD8+ T細胞応答を引き起こすことを目的とする（Bachmann及びJenningsの文献、2010年）。多くの研究により、マウスモデル及びヒト患者の両方において、抗原特異的T細胞免疫の誘発が、感染細胞又は腫瘍細胞のいずれかである異常細胞に対する防御に相関し得ることが発表されている（Pulendran, Liらの文献、2010年; Sallusto, Lanzavecchiaらの文献、2010年）。担癌マウスにおいて、治療的ワクチン接種後に誘発されるCD8+ T細胞応答を質的側面及び量的側面から測定することにより、個々の動物における腫瘍の治療結果、すなわち進行又は退縮を予測することが可能である（Rosato, Zosoらの文献、2006年）。異常細胞を完全に排除する治療的ワクチン接種が成功したら、この免疫療法の重要な側面は、長期的に記憶Tリンパ球を産生して二次病原体感染から患者を防御するワクチンの潜在能力であろう。記憶Tリンパ球は、2つの主要な細胞サブセット：TEM（エフェクター記憶）及びTCM（セントラル記憶）に分類することができる。TEMは、病原体の除去に適した、免疫応答のクローン収縮期（clonal contraction phase）の後に産生される一次記憶T細胞である。TEMは、CD62L- CCR7-であり、末梢組織、例えば、皮膚、腸、及び肺に優先的に存在し、そこで、TEMは、宿主の防御の最前線に立つ（Woodland及びKohlmeierの文献、2009年）。時間が経つと、TEMは、TCM表現型: CD62L+ CCR7+に徐々に分化する。これらのTリンパ球は、二次リンパ器官に優先的に局在する（Kaech, Hembyらの文献、2002年; Ahmed, Bevanらの文献、2009年）。しかしながら、TEM及びTCMは共に、循環中に見られる。CD8記憶応答の効力の極めて重要な側面は、感染の広がり、そして関連する疾患の発生を防止するために、CD8+記憶Tリンパ球が溶解能を獲得して同じ病原体による新たな感染時に感染細胞を排除する速度である。抗原特異的CD8+ T細胞応答の発生によってリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）急性感染を免れることができたマウスはまた、感染細胞を迅速に除去することができる記憶CD8+ T細胞も産生した（Barberらの文献、2003年）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この知見に基づいて、本発明者らは、T細胞性免疫応答を伴う治療的ワクチン接種法まで拡大して、ベクター化されたエピトープを含む設計された多価免疫原性組成物に活性成分の投与を組み合わせることによって病的状態（複数可）の治療及び予防的治療の新しい概念を考案した。
【０００６】
特に、本発明者らは、1人の患者において、診断される病状に対する免疫治療を誘発する一方、前記治療される病状に関連していない抗原又はエピトープに対する強力な予防的応答をマウントし、かつ任意に、前記治療される病状の再発に対する防御的及び予防的応答をマウントするのに適した、多価治療ワクチンを設計した。
【０００７】
実際、CyaAをベースとした多価治療法の使用は、確定された感染又は癌を治療し、場合によっては根絶する一方、同じ患者において、予防的防御が求められる、ポリペプチド（複数可）保持CyaAに含まれる標的エピトープに対する強力な免疫応答、好ましくは、防御T細胞記憶応答を誘発し、かつ任意に、前記確定された感染又は癌の再発に対する防御的及び予防的応答を誘発する前記ポリペプチド（複数可）の潜在能力を際立たせる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、百日咳菌（B. pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、及び気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）のアデニル酸シクラーゼ（CyaA）のタンパク質配列（配列番号1〜3）、並びに百日咳菌、パラ百日咳菌、及び気管支敗血症菌のCyaAのヌクレオチド配列（配列番号4〜6）を示している。
【図２】図2は、百日咳菌、パラ百日咳菌、及び気管支敗血症菌のCyaAタンパク質のタンパク質アラインメントを示している。
【図３】図3は、CyaA-HPV16E7D30-42（A）及びCyaA-HPV18E7D32-42（B）の関連制限部位及び挿入配列が示されているpkTRACE5の模式的な遺伝子地図である。
【図４】図4（A）は、CyaA-CysOVAの関連制限部位及び挿入配列が示されているpTRACE5の模式的な遺伝子地図であり；図4（B）は、CyaA-MAGEA397-178/190-295の関連制限部位及び挿入配列が示されているpkTRACE5の模式的な遺伝子地図である。*MAGE-A3190-295は、MAGE A3の残基242〜295に融合された残基190〜221を表している。数字97、178、190、221、242、及び295は、全MAGE-A3配列のアミノ酸残基の位置を示し；図4（C）は、CyaA-MAGEA3ベクターのタンパク質配列（配列番号7）を示している。MAGEA3配列には下線が引かれている。制限部位：NheI（AS）、KpnI（GT）、AgeI（TG）、及びSpeI（TS）は、太字で示されている。
【図５】図5は、第11日目のアジュバント添加ProCervixによる治療的ワクチン接種により、定着した固形TC-1誘発腫瘍が根絶されている。監視の最後に：PBS+Aldara（商標）が接種されたマウスの群は、3/10のマウスが腫瘍の退縮を示し（A）、8μgのProCervixのみが接種されたマウスの群は、0/10のマウスが腫瘍の退縮を示している（B）。Poly-ICLC（C）又はAldara（商標）（局所イミキモド）（D）のいずれかがアジュバント添加されたProCervixを接種されたマウスは、7/10のマウスが腫瘍の退縮を示している。
【図６】図6は、アジュバント添加ProCervixによる治療的ワクチン接種が、第50日目におけるマウスの高い生存率と、腫瘍のないマウスの高い割合との両方をもたらすことを示している。第50日目に、ProCervix+Aldara（商標）又はProCervix+Poly-ICLCのいずれかが接種されたマウスは、腫瘍を示していない（A）。第50日目の生存率に関しては：第11日目にProCervix+Aldara（商標）が投与されたマウスの生存率が100％であり、ProCervix+Poly-ICLCが投与されたマウスの生存率が70％である（B）。
【図７】図7は、アジュバント添加ProCervixによる治療的ワクチン接種から60日後に、腫瘍のないマウスが、機能的HPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的記憶CD8+ T細胞を有することを示している。第60日目に、異なる群の腫瘍のないマウスに、CFSEhi HPV16E749-57パルス標的細胞、CFSEin非パルス標的細胞、及びCFSElo HPV18E7AS43-49パルス標的細胞を1：1：1の比で静注した。一晩置いてから、マウスを安楽死させ、脾臓を摘出し、抗原特異的in vivo細胞傷害性をFACS分析によって測定した。それぞれの点は、個々のマウスから得られた結果を表し；白丸は、HPV18 E7AS43-49パルス標的細胞の死滅率を表し、黒丸は、HPV16 E749-57パルス標的細胞の死滅率を表している。横線は、マウスの群の平均値を表している。
【図８】図8は、ワクチン接種の一般的な計画（Dは日数を意味する）を示し；表は、細胞接種及びワクチン接種（/：非接種）の種類及び部位をまとめたものである。
【図９】図9は、HPV16 E7抗原を包埋した、Aldara（商標）アジュバント添加CyaA二価ワクチンによる治療的ワクチン接種により、TC-1誘発固形腫瘍が排除されることを示している。1つの群が10匹であるマウスの右側腹部における腫瘍性TC-1細胞の体積（mm3）を、第0日目（D0）から第100日目（D100）まで観察した。群1のマウスには、プラセボを接種し、群2のマウスには、プラセボ+ Aldara（商標）を接種し、群3のマウスには、Aldara（商標）アジュバント添加CyaA-MAGEA397-178/190-295/CyaA-HPV16 E7を接種し、群4のマウスには、Aldara（商標）アジュバント添加CyaA-cysOVA/CyaA-HPV16 E7を接種し、群5及び群6のマウスには、Aldara（商標）アジュバント添加ProCervixを接種した。各グラフの右の番号は、各群の各マウスに割り当てられた番号に対応している。
【図１０】図10は、CyaAをベースとした二価ワクチン接種によりTC1誘発腫瘍が治癒したマウスが、抗原特異的に別の無関連の腫瘍の曝露から保護されていることを示している。TC1曝露されて第60日目に生存していたマウスの左側腹部における腫瘍性B16 MAGE A3細胞（a及びc）又は腫瘍性EG7-OVA細胞（b及びd）の体積を、第60日目（D60）から第100日目（D100）まで観察した。各グラフの右の番号は、TC1曝露された各マウスに予め割り当てられた番号に対応している（図9）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、（i）哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、（ii）同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止に使用される手段に関する。免疫応答は、（i）前記診断される病的状態（複数可）を治療するために活性成分（複数可）として設計されたポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによって、及び（ii）前記第2の確定される病的状態（複数可）の発症又は発生を防止するために活性成分（複数可）として設計されたポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによって、及び（iii）任意に、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発を防止する前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによって得られ、前記免疫応答は、前記ポリペプチド（複数可）保持ベクターの前記宿主への投与後に得られ、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。これらの手段は：
（1）活性成分としてのポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記ベクターが、哺乳動物宿主における免疫系に前記ポリペプチド（複数可）を提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなる、該ポリペプチド（複数可）保持ベクター；
（2）医薬として許容し得るビヒクル（vehicle）又は製剤と組み合わせて、（1）で定義されたポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物を含む、このような活性成分を構成する又は含む組成物；及び
（3）第1の群のエピトープを含む第1のポリペプチド（複数可）保持ベクター及び第2の群のエピトープを含む第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物を含む。
【００１０】
従って、第1の実施態様では、本発明は、ポリペプチド（複数可）保持ベクターに関し、ポリペプチド（複数可）を保持する前記ベクターは、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主における免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、（i）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止に使用され、前記免疫応答が、前記ポリペプチド（複数可）保持ベクターの前記宿主への投与後に得られ、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが、前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００１１】
本発明はまた、医薬として許容し得るビヒクルと組み合わせて、ポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物にも関し、ポリペプチド（複数可）を保持する前記ベクターは、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主における免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、（i）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止に使用され、前記免疫応答が、前記組成物の前記宿主への投与後に得られ、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが、前記投与される組成物のポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００１２】
本発明はまた、任意に、医薬として許容し得るビヒクルの組み合わせた、組成物にも関し、該組成物は：
（a）第1のポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記第1のベクターが、哺乳動物宿主における免疫系に前記ポリペプチド（複数可）を提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、第1の群のエピトープが、前記第1のベクターの前記ポリペプチド（複数可）に含まれている、該第1のポリペプチド（複数可）保持ベクター；
（b）第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記第2のベクターが、哺乳動物宿主における免疫系に前記ポリペプチド（複数可）を提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、第2の群のエピトープが、前記第2のベクターの前記ポリペプチド（複数可）に含まれている、該ポリペプチド（複数可）保持ベクター；及び
（c）任意に、（a）及び（b）のポリペプチド（複数可）保持ベクターとは異なる1つ以上の追加のポリペプチド（複数可）保持ベクターを含み、
（i）前記第1の群のエピトープに関連した病原体に対する併用免疫治療、及び（ii）前記第2の群のエピトープに関連した免疫学的予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の予防に使用され、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記投与される組成物のポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００１３】
特定の実施態様では、（a）、（b）、及び（c）を含む前記組成物は、（i）第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止に使用され、前記免疫応答が、前記組成物の前記宿主への投与後に得られる。
【００１４】
用語「CyaA」は、ボルデテラ種（Bordetella species）、特に百日咳菌、パラ百日咳菌、又は気管支敗血症菌に由来するアデニル酸シクラーゼ（又はアデニルシクラーゼ）を意味する。百日咳菌のアデニル酸シクラーゼタンパク質は、400のアミノ酸残基のN末端触媒ドメイン及び1306の残基のC末端部を含む1706の残基（配列番号1）の毒素である。C末端部は、毒素の標的細胞膜への結合、及びこれに続く触媒部分の標的細胞サイトゾルへの送達に関与する。百日咳菌CyaAの配列は、図1に示されている。パラ百日咳菌及び気管支百日咳菌のCyaAタンパク質は、1740のアミノ酸残基を有し、それぞれの配列（配列番号2及び配列番号3）が、図1に開示されている。
【００１５】
表現「CyaA断片」は、CyaAタンパク質の一部分を意味し、任意に、完全長CyaAタンパク質のC末端部の全て又は一部を含む。但し、前記断片は、哺乳動物宿主の免疫系に前記ポリペプチド（複数可）を提示することができる、すなわちポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれるエピトープに対する特異的な免疫応答（複数可）の誘発をもたらす、又は前記応答に有利に働き得るものとする。特に、前記CyaA断片は、CD11b発現細胞に特異的に結合することができ、かつ任意に、前記ポリペプチド（複数可）を細胞サイトゾルに送達することができる。前記断片は、切断されたCyaAタンパク質（N終末端及び/又はC終末端の欠失）又はアミノ酸残基（複数可）が内部欠失した完全長タンパク質を包含する。従って、本発明によるCyaAタンパク質の特定の断片は、百日咳菌CyaAタンパク質のアミノ酸残基372〜1706（最初の371残基が切断されている）からなる。別の特定の断片は、アミノ酸残基225〜234が欠失した百日咳菌CyaAタンパク質であり、従って、残基1〜224及び235〜1706からなるCyaA断片（内部欠失）である。用語「特異的に」は、本発明の文脈においては、アデニル酸シクラーゼ又はその断片が、ベクター分子として使用されると、CD11b発現細胞に優先的に誘導され、それによって、他の細胞（CD11bを発現しない細胞）に対して選択的に前記細胞の表面又は前記細胞内にあるポリペプチド（複数可）を標的とする手段を提供する。
【００１６】
用語「CyaA」は、無毒化もしくは非毒性産物又は酵素（侵入性及び細胞傷害性）活性のない産物を生じさせるために、好ましくは、1つ以上のアミノ酸の置換（複数可）、アミノ酸（複数可）の内部挿入、又はアミノ酸（複数可）の内部欠失によって改変されたCyaAタンパク質又はその断片も包含する。従って、このようなCyaAタンパク質（又はその断片）は、触媒活性を有していないが、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主における免疫系に提示する能力を有し、かつ任意に、CD11b／CD18受容体への特異的な結合及び/又は元のCyaAタンパク質の触媒ドメインの転座のプロセスが影響を受けない。周知の非毒性CyaAタンパク質の例として、ジペプチドLeu-Glnが残基Asp188〜Ile189（触媒部位の不可欠な部分）のインフレームに挿入された百日咳菌CyaAが挙げられる。このCyaAタンパク質（又はその断片）に毒性又は酵素活性が存在しないことを、Ladantらの文献（1992）に開示されているようにアッセイすることができる。CyaAタンパク質（又はその断片）の標的CD11b／CD18細胞を標的とする能力を、特に欧州特許第03291486号又は国際公開第02/22169号に開示されている方法に従ってアッセイすることができる。さらに、抗原性ポリペプチドを標的細胞のサイトゾルに送達するCyaAタンパク質（又はその断片）の能力を、国際公開第02/22169号に開示されている方法を用いてアッセイすることができる。
【００１７】
さらなる特定の実施態様では、用語「CyaA」は、翻訳後修飾、例えば、その残基の少なくとも1つ、特に2つの内部リジン残基（リジン860及び983）の翻訳後パルミトイル化によって修飾されたCyaAタンパク質（又はその断片）も包含する。この（これらの）翻訳後修飾（複数可）は、cyaA遺伝子とcyaC遺伝子の同時発現によって得ることができる。従って、ポリペプチド（複数可）保持ベクター内のCyaAタンパク質又はその断片は、細胞、特に組み替え細胞でのcyaA遺伝子とcyaC遺伝子の両方の同時発現の結果として得られるCyaAタンパク質又はその断片であり得る。
【００１８】
本出願に使用される用語「ベクター」又は「ベクター分子」は、本明細書に詳述されるように、修飾された又は修飾されていない完全長CyaAタンパク質又はその断片を包含する。
【００１９】
「CD11b発現細胞」とは、CD11b/CD18受容体をその表面に発現する細胞（CD11b+）のことである。特に、これらの細胞は、顆粒球/好中球、マクロファージ、NK細胞、T CD8+のサブセット、B細胞のサブセット、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、及び骨髄樹状細胞である。
【００２０】
表現「ポリペプチド（複数可）保持ベクター」は、CyaAタンパク質（又はその断片）が、少なくとも1つのポリペプチドを保持することを意味し、このポリペプチドは、CyaAに対して異種であり、特に本明細書で定義されるCyaA断片ではなく、かつ特にCyaAと免疫学的に交差反応しない。表現「少なくとも1つ」は、1つ以上のポリペプチド、特に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のポリペプチド（複数可）、好ましくは、1、2、又は3のポリペプチド（複数可）である。
【００２１】
用語「保持する」は、本発明によるCyaAタンパク質又はその断片とポリペプチド（複数可）を結合する様々な構造を包含する。このような構造は、以下の結果として得ることができる：
・本発明による少なくとも1つのポリペプチド（複数可）のCyaA又はその断片に対する化学結合。ポリペプチドをCyaA又はその断片に化学的に結合する方法は、当分野では周知であり、好ましくは、N-ピリジルスルホニル活性化スルフヒドリルを用いた、例えば、ジスルフィド結合（複数可）を含む。天然のCyaAタンパク質は、その一次配列にシステイン残基を有していないため、システイン残基が、CyaAタンパク質、特にその触媒ドメイン、好ましくは、以下に定義される許容部位（例えば、位置235）又はCyaA末端の一方に遺伝子導入される；及び
・少なくとも1つのポリペプチド（複数可）のCyaA又はその断片に対する遺伝子結合又は遺伝子融合。遺伝子結合又は遺伝子融合は、本発明による少なくとも1つのポリペプチド（複数可）をコードする核酸の、CyaAタンパク質又はその断片をコードする核酸へのフレーム内への遺伝子挿入（すなわち、CyaAタンパク質のフレームワークをずらすことなく）、好ましくは、CyaAタンパク質の触媒ドメインの領域への遺伝子挿入を含み、結果として組換えタンパク質となる。従って、少なくとも1つのポリペプチド（複数可）は、CyaAタンパク質の任意の許容部位に挿入することができる（国際公開第93/21324号を参照）。本明細書で使用される用語「許容部位」は、アデニル酸シクラーゼの所望の機能特性に実質的に影響を与えることなく、すなわち、前記ポリペプチドを哺乳動物宿主の免疫系に提示するCyaAタンパク質の能力に影響を与えることなく、特にCD11b/CD18受容体への特異的な結合に影響を与えることなく、かつ任意に、ポリペプチド（複数可）の標的細胞のサイトゾルへの送達のプロセスに影響を与えることなく、ポリペプチド（複数可）を挿入することができる部位を指す。百日咳菌アデニル酸シクラーゼの許容部位は、限定されるものではないが、残基107-108（Gly-His）、132-133（Met-Ala）、137-138（Val-Ala）、224-225（Arg-Ala）、228-229（Glu-Ala）、232-233（Gly-Leu）、235-236（Arg-Glu）、317-318（Ser-Ala）、及び335-336（Gly-Gln）を含む（Seboらの文献、1985年; Glaserらの文献、1988年）。他のボルデテラ種では、対応する許容部位は、配列の比較及び対応する残基の決定によって確定することができる（図2）。別の実施態様によると、遺伝子結合は、CyaAタンパク質又はその断片の一方及び/又は他方の末端における少なくとも1つのポリペプチド（複数可）をコードする核酸の融合も含む。
【００２２】
CyaAタンパク質（又はその断片）が、2つ以上のポリペプチドを保持する場合、これらのポリペプチドは、全てが化学結合によって保持される、全てが遺伝子結合（好ましくは、全て遺伝子挿入される）によって保持される、又はそれらの一部（複数可）が化学結合によって保持され、残りが（複数可）が遺伝子結合によって保持されるようにしても良い。特定の実施態様では、全てのポリペプチドがCyaA、好ましくは、CyaAの許容部位に遺伝子挿入される場合、該ポリペプチドは、異なる部位、好ましくは、異なる許容部位に挿入される。別の実施態様では、全てのポリペプチドがCyaA、好ましくは、CyaAの許容部位に遺伝子挿入される場合、該ポリペプチドは、同じ部位、好ましくは、同じ許容部位に挿入される。
【００２３】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結を指し、少なくとも9のアミノ酸残基であり、特に9〜500残基、9〜200、9〜100、9〜50残基、又は30もしくは50〜500もしくは200残基、又は100〜500、又は100〜200残基の長さである。本発明の範囲内において、用語「ポリペプチド」は、ベクター分子によって保持されると、ポリペプチドに含まれるエピトープ（複数可）に対する免疫応答、特にT細胞免疫応答を誘発することができるこのポリペプチドを意味する。ベクター分子（複数可）に含まれるポリペプチド（複数可）は、腫瘍抗原、すなわち腫瘍又は癌性細胞によって発現されるペプチドに由来しても良く、腫瘍が自己のものであるか又は病原体によって誘導されるかにかかわらない；腫瘍抗原は、自己のもの（特にヒト起源）であっても良いし、又は腫瘍を含む病原体由来であっても良い。
【００２４】
用語「腫瘍抗原」は、以下の群の腫瘍抗原を包含し、本発明のベクター分子（複数可）に含まれるポリペプチド（複数可）は、以下の群の少なくとも1つから選択することができる：（a）腫瘍胎児抗原（oncofetal tumor antigen）、（b）腫瘍ウイルス抗原（oncoviral tumor antigen）、（c）様々な正常組織で発現され、腫瘍で過剰に発現される過剰発現/蓄積腫瘍抗原、（d）多くの腫瘍で発現されるが、正常組織では発現されない共通腫瘍特異的抗原又は精巣癌抗原（BAGEファミリー、GAGEファミリー、MAGEファミリー、SAGEファミリー、及びXAGEファミリー）、（e）系統限定腫瘍抗原、（f）遍在的に発現される遺伝子における点突然変異から生じる突然変異腫瘍抗原；及び（g）腫瘍が発生する正常組織で発現されるが、腫瘍特異的ではない分化腫瘍抗原。
【００２５】
特定の実施態様では、2つ以上のポリペプチドが、治療的免疫応答の誘発のための1つのベクター分子、又は予防的免疫応答の誘発のための1つのベクター分子に使用される場合、全てのポリペプチドは、腫瘍抗原に由来する。
【００２６】
別の実施態様では、ベクター分子（複数可）に含まれるポリペプチド（複数可）は、加えて又は別法として、病原体の抗原、すなわち感染した哺乳動物宿主で病原体によって産生され、場合によっては前記感染した哺乳動物宿主の細胞又は前記病原体の成分で処理される抗原に由来し得る。病原体抗原の例として、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原が挙げられる。これらの例では、特定の実施態様として、腫瘍形成に関与する病原体（腫瘍病原体（oncopathogen））と腫瘍形成に関与していない病原体を識別することができる。病原体の例として、細胞内病原体、特にそれらの宿主においてT細胞免疫応答（複数可）を誘発する病原体が挙げられる。従って、ポリペプチド（複数可）は、限定されるものではないが、クラミジア（Chlamydia）、プラスモディウム（Plasmodium）、リーシュマニア（Leishmania）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、HIV、HPV、HBV、HCV、アデノウイルス、EBV、ヘルペスウイルス、HTLV.1ウイルス、及びCMVに由来し得る。特定の実施態様では、ベクター分子（複数可）に含まれるポリペプチド（複数可）は、病原体の表面タンパク質（例えば、HIVのエンベロープタンパク質）に由来しても良いし、又は感染細胞の機構と相互作用するポリペプチド（例えば、HPVのE6又はE7）に由来しても良い。
【００２７】
特定の実施態様では、2つ以上のポリペプチドが、1つのベクター分子又はベクターの組み合わせに使用される場合、全てのポリペプチドは、場合によっては病原体、属、又は種が異なる病原体の抗原に由来する。
【００２８】
特定の実施態様では、ベクター分子（複数可）に含まれるポリペプチドは、すべて細菌抗原に由来する、全てウイルス抗原に由来する、全て真菌抗原に由来する、又は全て寄生虫抗原に由来する。別の実施態様では、本明細書に記載されるベクター分子（複数可）に含まれる異なるポリペプチドはそれぞれ、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原に由来する。別の実施態様では、1つのベクター分子又はベクターの組み合わせに含まれるポリペプチドは、腫瘍に由来するものも、病原体に由来するものもある。
【００２９】
ベクター分子によって保持されるポリペプチドに対する表現「由来する」は、完全長抗原タンパク質、又はこの抗原タンパク質の断片、又は互いに融合された抗原タンパク質のいくつかの部分からなるエピトープを保持する合成非天然ポリペプチド、又は互いに融合されたいくつかのタンパク質の1つ以上の部分（複数可）からなる合成非天然ポリペプチドを意味する。但し、その断片又は合成非天然ポリペプチドは、ベクター分子（複数可）によって保持されると、この断片又はポリペプチドに含まれる抗原決定基に対する免疫応答、特にT細胞免疫応答を誘発することができるものとする。この定義によると、ベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチド（複数可）は、ユニークなエピトープである、又はこのエピトープを含む、或いはエピトープの群である、又はこのエピトープの群を含む。表現「エピトープの群」は、少なくとも1つのエピトープ、すなわち1つ以上のエピトープ、特に、10〜500のエピトープ、50〜200のエピトープ、80〜150のエピトープを含む。特定の実施態様では、表現「エピトープの群」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のエピトープを意味する。特定の実施態様では、ベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチド（複数可）は、ポリペプチド、すなわち少なくとも2つのエピトープ、特に少なくとも2つのT細胞エピトープを備えたポリペプチドである、又はこのポリペプチドを含む。本発明の範囲内のエピトープは、線形又は高次構造のいずれかであり、好ましくは、線形であり、そして細胞性免疫応答、特にT細胞免疫応答の誘発に関与する任意のアミノ酸配列である。従って、本明細書に記載されるポリペプチド（複数可）保持ベクターにおけるエピトープは、宿主でAPC（抗原提示細胞）によって処理されるエピトープ、特に、MHC（主要組織適合複合体）クラスI分子に関連して認識されるTエピトープ、例えば、標的細胞がCD8+ Tリンパ球であるエピトープ、又はMHCクラスII分子に関連して認識されるTエピトープ、例えば、標的細胞がCD4+ Tリンパ球であるエピトープを含む。特定の実施態様では、ポリペプチド（複数可）は、液性応答に関与するBエピトープ（複数可）も含む。特定の実施態様では、ベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチド（複数可）は、いくつかの異なるエピトープ又はいくつかの同一のエピトープからなる、又はこれらを含む。
【００３０】
本発明によると、ポリペプチド（複数可）保持ベクターは、少なくとも2つの異なるエピトープの群を含み、第1の群のエピトープは、T細胞免疫応答を誘発して、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療を可能にすることができ、第2の群のエピトープは、T細胞免疫応答を誘発して、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を可能にすることができる。特定の実施態様では、第1の群のエピトープは、任意に、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療を提供するT細胞応答に加えて、前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発して、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止を可能にすることができる。
【００３１】
本発明によると、前記ポリペプチド（複数可）保持ベクターに前記第2の群のエピトープが存在しないと、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防が観察されない。これは、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を達成するためには、本明細書に定義される第2の群のエピトープが必要であることを意味する。
【００３２】
特定の実施態様では、第2の群のエピトープ［ポリペプチド（複数可）保持ベクター中の］は、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を達成するために必要であり、かつ十分であり；この実施態様では、誘発された免疫応答における第2の群のエピトープのみの寄与が、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を達成するのに十分である。言い換えれば、前記第2の群のエピトープの投与と前記予防応答との間に因果関係が存在する。
【００３３】
別の実施態様では、第2の群のエピトープ［ポリペプチド（複数可）保持ベクター中の］は、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を達成するために必要であるが、第1の群の寄与では不十分である、又は第1の群の恩恵を受けない。すなわち、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防は、第2の群のエピトープに対して誘発される免疫応答と第1の群のエピトープに対して誘発される免疫応答との間の相乗効果により達成される。後者の場合には、両方の群のエピトープの寄与が、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を達成するために必要である。
【００３４】
第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防［用語、予防は以下に定義される］における第2の群のエピトープの必要な寄与は、以下の2つの群の哺乳動物、特に以下の2つの群のマウスにおける前記第2の確定される病的状態（複数可）に対する本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクターの投与の効果を比較することによって証拠を示すことができる：（1）本出願で定義される第2の群のエピトープを有していない本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクターが投与された哺乳動物、及び（2）本出願で定義される第2の群のエピトープを有する本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクターが投与された哺乳動物。
【００３５】
表現「ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない」から分かるように、本明細書で定義される第1の群のエピトープが、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を達成するのに十分であるとは言えない。
【００３６】
従って、特定の実施態様では、第1の群のエピトープ（又はこの第1の群のエピトープからなるポリペプチド（複数可））のアミノ酸配列は、第2の群のエピトープ（又はこの第2の群のエピトープからなるポリペプチド（複数可））のアミノ酸配列とは異なる。用語「異なる」は、両方の配列が、ポリペプチドの配列の全長に対して計算して（例えば、ニードルマン-ブンシュアルゴリズム（Needleman and Wunsch algorithm）によって計算されるグローバルアラインメント）、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％異なることを意味する。前記「異なる配列」の代替の定義又は特定の実施態様では、第1の群のエピトープの少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％が、第2の群のエピトープの配列と異なる配列を有する。さらなる特定の実施態様では、第1の群のエピトープ及び第2の群のエピトープ（又は第1の群のエピトープからなるポリペプチド（複数可）及び第2の群のエピトープからなるポリペプチド（複数可））は、共通のエピトープ配列を有していない。特定の実施態様では、第1の群のエピトープに対して得られるT細胞免疫応答は、前記第1の群のエピトープに関連した病的状態（複数可）に対して有効であり、前記第2の群のエピトープに関連した病的状態（複数可）に対して有効ではない、又は特異的に有効ではない。従って、特定の実施態様では、ある群のエピトープに対して得られるT細胞免疫応答は、この群に対して特異的である、すなわちこの群のエピトープに対する免疫応答に関与するT細胞は、他の群のエピトープを認識しない。
【００３７】
特定の実施態様では、ポリペプチド（複数可）は、HPV株、特に、アルファパピローマウイルス属、ベータパピローマウイルス属、ガンマパピローマウイルス属、デルタパピローマウイルス属、エプシロンパピローマウイルス属、ゼータパピローマウイルス属、イータパピローマウイルス属、シータパピローマウイルス属、アイオタパピローマウイルス属、カッパパピローマウイルス属、ラムダパピローマウイルス属、ミューパピローマウイルス属、ニューパピローマウイルス属、クサイパピローマウイルス属、オマイクロンパピローマウイルス属、及びパイパピローマウイルス属の中から選択されるHPV株に由来する少なくとも1つのエピトープを含む。特定の実施態様では、ヒト指向性（human tropism）を有するパピローマウイルス、例えば、アルファパピローマウイルス属、ベータパピローマウイルス属、ガンマパピローマウイルス属、ミューパピローマウイルス属、又はニューパピローマウイルス属由来の株が好ましい。より特定の実施態様では、ポリペプチド（複数可）は、アルファパピローマウイルス属由来のHPV株、特にアルファパピローマウイルス属のHPV種7及び9由来する株に由来する少なくとも1つのエピトープを含む（de Villiersらの文献、Virology 2004年）。従って、ポリペプチド（複数可）は、HPV高発癌性タイプ種、例えば、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、又はHPV58に由来する少なくとも1つのエピトープを含む。これらのタイプ種の中で、HPV18及びHPV16は、特に興味深い。一実施態様では、本明細書に記載されるベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチドは、上記の中から選択される異なるHPV株又は異なるHPVタイプ種に由来する。別の特定の実施態様では、どんなHPV株又はHPVタイプ種でも、ポリペプチドは、L1、L2、E1、E2、E4、E5、E6、又はE7タンパク質に由来し、HPV株又はHPVタイプ種のE6又はE7タンパク質に由来するエピトープを有するポリペプチドが特に興味深い。特定の実施態様では、本明細書に記載されるベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチドは、同じHPVタンパク質に由来するが、上記の中から選択される異なるHPV株又は異なるHPVタイプ種に由来する。本発明の特定の実施態様では、HPV16のE6又はE7タンパク質及びHPV18のE6又はE7タンパク質、より好ましくはHPV16及びHPV18HPVタイプ種のE7タンパク質が、ポリペプチドの設計に使用される。本発明の特定の実施態様によると、ベクター分子は、好ましくは遺伝子挿入によって、いくつかのポリペプチドを保持し、これらのポリペプチドはそれぞれ、少なくとも2つの異なるHPV株又は2つの異なるHPVタイプ種の1つ又は複数のHPVタンパク質の1つ又は複数のエピトープ含む又はこのエピトープからなる。従って、特定の実施態様は、HPV16及びHPV18HPVタイプ種の両方に由来するE6又はE7タンパク質に由来するエピトープを含む1つ又は複数のポリペプチドを保持するCyaAタンパク質又はその断片からなるポリペプチド（複数）保持ベクターである。別の実施態様では、本発明は、HPV16に由来するE6又はE7タンパク質に由来するエピトープを含む1つ又は複数のポリペプチドを保持する第1のベクター分子（第1の群のエピトープを含む第1のポリペプチド（複数）保持ベクター）、及びHPV18に由来するE6又はE7タンパク質に由来するエピトープを含む1つ又は複数の���リペプチドを保持する別のベクター分子（第2の群のエピトープを含む別のポリペプチド（複数）保持ベクター）を含む組成物に関する。いくつかのポリペプチドが、1つのベクター分子によって保持される場合、これらのポリペプチドは、ベクター分子の異なる部位、特に許容部位に挿入される、同じタンパク質、例えば、E7又はE6タンパク質の異なる断片からなっても良い。
【００３８】
従って、本発明に使用される組成物は、ポリペプチド（複数可）がHPV16のE7タンパク質に由来するポリペプチド（複数可）保持ベクター、及びポリペプチド（複数可）がHPV18のE7タンパク質に由来するポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む。このような組成物の例として：
（a）HPV16のE7の残基1〜29を含む断片又はこの残基1〜29からなる断片である第1のポリペプチド、及びHPV16のE7タンパク質の残基43〜98を含む断片又はこの残基43〜98からなる断片である第2のポリペプチドを保持する第1のベクター分子。好ましいは実施態様では、第1のポリペプチドは、HPV16-E7の最初の29のアミノ酸残基であり、CyaAのコドン319〜320の間に挿入され、第2のポリペプチドは、HPV16-E7の残基43〜98からなり、CyaAのコドン224〜235の間に挿入される（pKTRACE5-HPV16E7Δ30-42ベクターで表される）；及び
（b）HPV18のE7の残基1〜31を含む断片又はHPV18のE7の残基1〜31からなる断片である第1のポリペプチド、及びHPV18のE7の残基43〜105を含む断片又はHPV18のE7の残基43〜105からなる断片である第2のポリペプチドを保持する別のベクター分子。好ましいは実施態様では、第1のポリペプチドは、HPV18-E7の最初の31のアミノ酸残基であり、CyaAのコドン319〜320の間に挿入され、第2のポリペプチドは、HPV18-E7の残基43〜105からなり、CyaAのコドン224〜235の間に挿入される（pKTRACE5-HPV18E7Δ32-42ベクターで表される）。
【００３９】
別の実施態様では、ポリペプチド（複数可）は、MAGE A3腫瘍抗原に由来する少なくとも1つのエピトープを含み、例えば、MAGE A3の残基97〜178からなるポリペプチド（配列番号8）、又は、例えば、MAGE A3の残基242〜295に融合された残基190〜221からなるポリペプチド（配列番号9）である。特定の実施態様では、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター（又はそれを含む組成物）は、CyaAタンパク質、好ましくは、百日咳菌CyaAからなり、MAGE A3に由来する2つのポリペプチドが2つの異なる部位に挿入されている。このようなポリペプチド（複数可）保持ベクターは、百日咳菌CyaAからなり、（1）MAGE A3の残基97〜178からなる第1のポリペプチドが、CyaAのコドン319〜320の間に挿入され、かつ（2）MAGE A3の残基242〜295に融合された残基190〜221からなる第2のポリペプチドが、CyaAのコドン234〜235の間に挿入されている。CyaA- MAGE A3ベクターの特定の例は、図4Cに示されている（配列番号7）。
【００４０】
それ自体又は組成物中の、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクターは、同じ哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、（i）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）前記ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防、及び（iii）任意である、前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止を達成するために用いられ、前記免疫応答が、前記ポリペプチド（複数可）保持ベクターの前記宿主への投与後に得られ、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが、前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。本発明の一実施態様によると、ベクター分子によって保持される、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）は、以下の2つの群によって分類することができる、求められているエピトープの群によって選択される：
・第1の群のエピトープは、ポリペプチド（複数可）に関係し、このポリペプチドは、特定の腫瘍を発生させる又は第1の確定される病的状態（複数可）を引き起こす、特定の病原体によって発現される又はこの病原体に感染した哺乳動物宿主の免疫系によって提示されることが分かっている抗原に由来し、前記哺乳動物宿主が、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与の前に、前記特定の感染、前記特定の腫瘍、又は前記第1の確定される病的状態（複数可）と診断されている；及び
・第2の群のエピトープは、ポリペプチド（複数可）に関係し、このポリペプチドは、別の特定のタイプの腫瘍を発生させる又は第2の確定される病的状態（複数可）を引き起こす、別の特定の病原体によって発現される又はこの病原体に感染した哺乳動物宿主の免疫系によって提示されることが分かっている抗原に由来し、前記哺乳動物宿主が、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与の前には、前記別の特定の病原体に感染していない、前記別の特定のタイプの腫瘍を発生していない、又は前記第2の確定される病的状態（複数可）を引き起こしていない。
【００４１】
本発明は、以下の観察に基づいている：
（i）哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療を、ベクター分子によって保持されるポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによって達成することができる；
（ii）同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防を、ポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによって達成することができる；及び
（iii）任意に、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止を、ベクター分子によって保持される前記ポリペプチド（複数可）に含まれる前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによって達成することができる；
前記第2の群のエピトープが、同じベクター分子によって、又は別のベクター分子によって保持され、第1のベクター分子と同じ組成物に含められて、この第1のベクター分子と同時に投与される。
【００４２】
従って、本明細書で定義されるベクター分子自体もしくは組成物中のベクター分子、又は本明細書で定義される組成物のベクター分子は、第1の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つ、好ましくは1つのポリペプチド、及び第2の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチドを保持する。他の実施態様では、本明細書で定義されるベクター分子自体もしくは組成物中のベクター分子、又は本明細書で定義される組成物のベクター分子は、（a）第1の群のエピトープ（複数可）を含む1つのポリペプチド及び第2の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチド、（b）第1の群のエピトープ（複数可）を含む1つのポリペプチド及び1、2、3、4、5、又は6のポリペプチドの中から選択される、第2の群のエピトープを含む少なくとも1つのポリペプチド、（c）2又は3のポリペプチドの中から選択される、第1の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチド及び第2の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチド、及び（d）2又は3のポリペプチドの中から選択される、第1の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチド及び1、2、3、4、5、又は6のポリペプチドの中から選択される、第2の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチドを保持する。
【００４３】
1つのポリペプチド（複数可）保持ベクターが、それ自体で、又は組成物に含められて使用される場合、該ベクターは、第1の群のエピトープ（複数可）及び第2の群の（複数可）を含む、すなわち前記第2の群のエピトープが第1の群のエピトープと同じポリペプチド内に含められている、1つポリペプチドを保持することができる。
【００４４】
別の実施態様では、前記第1の群のエピトープ（複数可）と第2の群のエピトープ（複数可）は、異なるポリペプチドに含められる。第1の群のエピトープ（複数可）を含むポリペプチド及び第2の群のエピトープ（複数可）を含むポリペプチドは、同じベクター分子によって保持することができる。別の実施態様では、第1の群のエピトープ（複数可）を含むポリペプチド及び第2の群のエピトープ（複数可）を含むポリペプチドは、異なるベクター分子が保持することができ、同じ組成物に含めることができる。第1と第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物が使用される場合、第1のベクター分子は、第1の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチドを保持する、すなわち少なくとも第1の群のエピトープ（複数可）を含む1つのポリペプチドが、前記第1のベクター分子によって保持される。同じ組成物において、第2のベクター分子は、第2の群のエピトープ（複数可）を含む少なくとも1つのポリペプチドを保持する、すなわち少なくとも第2の群のエピトープ（複数可）を含む1つのポリペプチドが、前記第2の別のベクター分子によって保持される。最後に、任意の1つ以上（例えば、1、2、3、4、5、又は6）のポリペプチド（複数可）保持ベクターも、この/これらのポリペプチド（複数可）保持ベクターにどんなエピトープの群が含まれていても、前記組成物中に含めることができる。
【００４５】
「免疫応答」とは、細胞性免疫応答、特にT細胞性免疫応答のことである。特定の実施態様では、前記T細胞性免疫応答は、細胞性細胞傷害性免疫応答CTL、特にCD8+免疫応答である。腫瘍抗原に由来するポリペプチド（複数可）の場合、免疫応答は、好ましくは、腫瘍特異的細胞傷害性リンパ球が関与する腫瘍特異的細胞傷害性免疫応答である。特定の実施態様では、前記T細胞性免疫応答は、CD4+免疫応答、特にTヘルパー免疫応答である。特定の実施態様では、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与後の免疫応答、特に第2の群のエピトープ（本明細書で定義される）に対して誘発される免疫応答（複数可）は、記憶T細胞免疫応答である。表現「免疫応答」は、上記定義された細胞性免疫応答に加えて、液性免疫応答（抗体の生産）も含み得る。本出願の範囲内の説明された免疫応答は、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター自体又は組成物に含められた該ポリペプチド（複数可）保持ベクターの宿主への投与後に得られる。
【００４６】
表現「免疫治療」は、本明細書で定義される投与されるベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープに対して、特にT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される（第1の）確定される病的状態（複数可）の治療を指す。本明細書で定義されたポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の使用の目的は、病原体に感染している、又は病的状態、例えば、腫瘍に罹患していると診断された、臨床状態（複数可）の改善を必要とする哺乳動物宿主の臨床状態（複数可）を改善すること、又は疾患の原因となる物質又は生物を排除すること、又は前記物質もしくは生物を低減することである。病原体感染の状態では、免疫治療により、感染部位又は病原体の複製部位、特に宿主の血漿又は粘膜におけるこの病原体負荷が有意に減少し、場合によっては、病原体負荷、例えば、血漿負荷が、測定したときに検出され得る負荷よりも小さくなる、又は腫瘍が存在する場合にはその大きさが縮小する、又はその成長が低下する。
【００４７】
表現「免疫学的予防」又は「予防」は、本明細書で定義される投与されるベクター分子（複数可）によって保持されるポリペプチド（複数可）に含まれる第2の群のエピトープに対する、特にT細胞記憶免疫応答の誘発によって、同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）又は疾患の遭遇、感染、発症、もしくは進行、又はその臨床的結果を防止又は防御する応答を指す。本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物を使用すると、将来の感染、将来の悪性事象、又は疾患に対する予防的免疫応答が起こり、従って、前記哺乳動物宿主における病的状態の発生が防止される。
【００４８】
予防の実現における応答の有効性を、病的状態のマーカーを検出することによってアッセイすることができる。特定の実施態様では、有効性の基準は、統計学的に適切となるように選択される。
【００４９】
表現「再発の防止」は、第1の確定される病的状態（複数可）、すなわち本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与後に既に診断されて治療された状態の新たな将来の遭遇、新たな将来の感染、新たな将来の発症、又は新たな将来の進行を予防する免疫応答の誘発を指す。
【００５０】
表現「哺乳動物宿主」は、全ての哺乳動物、特に霊長類及びヒト（例えば、患者）を含む。
【００５１】
本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与（複数可）後に、第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答及び第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答の両方が誘発され、かつ任意に、前記第1の群のエピトープに対する応答が、特定の時間枠内で同じ哺乳動物宿主で誘発されることを理解されたい。従って、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の少なくとも1回の投与により、第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答、及び第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答が誘発され、かつ任意に、前記第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答が誘発され、これらは、投与から1ヶ月〜12ヶ月以上（特に、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、又は12ヶ月）後に証拠を得ることができ、かつ/又は測定することができるが、これら免疫応答の一方又は両方に関与するT細胞は、投与から数年後でも証拠を得ることができる。表現「少なくとも1回の投与」又は「1回投与する」は、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物を、哺乳動物宿主、特に患者に、1回以上、好ましくは1回又は2回投与することを意味する。各投与は、少なくとも1つのポリペプチド（複数可）保持ベクターからなる。ただし、少なくとも1つのベクター分子（複数可）によって保持される少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれる第1の群のエピトープ及び第2の群のエピトープが、前記第2の群のエピトープの少なくとも1つのエピトープと共に、同時に哺乳動物宿主に投与されるものとする。適切な場合には、2回目の投与及び場合によっては次の投与（プライムブースト）が、ポリペプチド（複数可）に関して最初の投与と同じポリペプチド（複数可）保持ベクター又は最初の投与と同じ組成物を用いて行われる。以下に報告する実験は、免疫治療及び予防、並びに任意である再発の防止を、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の単回投与で達成できることを示す。
【００５２】
特定の実施態様では、本発明は、（i）哺乳動物宿主で診断される、病原体感染の後、特に細菌感染又はウイルス感染の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）異なる病原体による感染の後、特に異なる細菌又は異なるウイルス（又は異なるそれらの株）による感染の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態（複数可）の再発の防止に使用される、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物に関し、前記第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記異なる病原体（例えば、異なる細菌又は異なるウイルス）に結合された第2の群のエピトープが、前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。異なるウイルス株、特に異なるHPV株又は異なるHPVタイプ種に感染した後に起こる特定の場合の病的状態（複数可）では、本発明は、（i）哺乳動物宿主で診断される、病原体感染後、第1のウイルス、第1のHPV株、又は第1のHPVタイプ株による感染の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）第2の異なるウイルス、第2の異なるHPV株、又は第2の異なるHPVタイプ株による感染の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態（複数可）の再発の防止に使用される、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物に関し、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の異なるウイルス、第2の異なるHPV株、又は第2の異なるHPVタイプ株に結合された第2の群のエピトープが、前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。好ましい実施態様では、本発明は、HPV16のE7タンパク質に由来するポリペプチド及びHPV18のE7タンパク質に由来するポリペプチドを含む、本明細書に定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物に関し、該ポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は：（1）（i）哺乳動物宿主で診断される、HPV16による感染の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）HPV18による感染の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態の再発の防止に使用され、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、HPV18のE7タンパク質に由来するポリペプチドが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない；又は（2）（i）哺乳動物宿主で診断される、HPV18による感染の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）HPV16による感染の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態の再発の防止に使用され、ここで、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、HPV16のE7タンパク質に由来するポリペプチドが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００５３】
特定の実施態様では、本発明は、（i）哺乳動物宿主で診断される、第1の腫瘍細胞の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）起源及び組織像が第1の腫瘍細胞とは異なる第2の腫瘍細胞の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態の再発の防止に使用される、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物に関し、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の腫瘍細胞に結合された第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００５４】
特定の実施態様では、本発明は、（i）哺乳動物宿主で診断される、病原体感染の後、特に細菌感染又はウイルス感染の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）腫瘍細胞の発生の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態の再発の防止に使用される、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物に関し、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記腫瘍細胞に結合された第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００５５】
特定の実施態様では、本発明は、（i）哺乳動物宿主で診断される、腫瘍細胞の発生の後に起こる第1の病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）病原体感染の後、特に細菌感染又はウイルス感染の後に起こる第2の病的状態（複数可）に対する予防に使用され、かつ（iii）任意に、前記第1の病的状態の再発の防止に使用される、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物に関し、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記異なる病原体（例えば、異なる細菌又は異なるウイルス）に結合された第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されない。
【００５６】
本発明はまた、（i）特に、第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、及び（ii）特に、第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防の両方を、同じ哺乳動物宿主で達成する方法にも関し、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されず、前記方法が、前記哺乳動物宿主に以下のいずれかを少なくとも1回投与するステップを含む：
（1）ポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記ベクターが、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、前記第1の群のエピトープ及び第2の群のエピトープが、前記ベクターによって保持された少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれており、前記第2の群のエピトープの少なくとも1つのエピトープが、第1の群のエピトープのエピトープとは異なる、該ポリペプチド（複数可）保持ベクター；
（2）医薬として許容し得るビヒクルと組み合わせた、（1）で定義されたポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物；又は
（3）（a）第1のポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記第1のベクターが、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、前記第1の群のエピトープが、前記第1のベクターによって保持された少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれている、該第1のポリペプチド（複数可）保持ベクター、及び（b）第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記第2のベクター分子が、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、前記第2の群のエピトープが、前記第2のベクターによって保持された少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれている、該第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物。
【００５７】
一実施態様では、本発明はまた、（i）特に、第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療、（ii）特に、第2の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防、及び（iii）任意である、特に第1の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、前記第1の確定される病的状態（複数可）の再発の防止を、同じ哺乳動物宿主で達成する方法にも関し、第2の確定される病的状態（複数可）に対する前記予防が、前記第2の群のエピトープが前記投与されるポリペプチド（複数可）保持ベクターに含まれていない場合には観察されず、前記方法が、前記哺乳動物宿主に以下のいずれかを少なくとも1回投与するステップを含む：
（1）ポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記ベクターが、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、前記第1の群のエピトープ及び第2の群のエピトープが、前記ベクターによって保持された少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれており、前記第2の群のエピトープの少なくとも1つのエピトープが、第1の群のエピトープのエピトープとは異なる、該ポリペプチド（複数可）保持ベクター；
（2）医薬として許容し得るビヒクルと組み合わせた、（1）で定義されたポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物；又は
（3）（a）第1のポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記第1のベクターが、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、前記第1の群のエピトープが、前記第1のベクターによって保持された少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれている、該第1のポリペプチド（複数可）保持ベクター、及び（b）第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターであって、ポリペプチド（複数可）を保持する前記第2のベクター分子が、前記ポリペプチド（複数可）を哺乳動物宿主の免疫系に提示するのに適したCyaAタンパク質又はその断片からなり、前記第2の群のエピトープが、前記第2のベクターによって保持された少なくとも1つのポリペプチド（複数可）に含まれている、該第2の別のポリペプチド（複数可）保持ベクターを含む組成物。
【００５８】
本明細書で定義される組成物は、特定の実施態様では、緩衝剤、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、水、及びエタノールなど、及びこれらの組み合わせの中から選択される、医薬として許容し得るビヒクルもしくは製剤、又は生理的に許容し得る希釈剤を含み得る。
【００５９】
さらに、免疫治療及び予防を達成する手段として本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、少なくとも1つの免疫増強物質、例えば、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント、及び/又は界面活性剤、及び/又は免疫調節物質（例えば、サイトカイン又はケモカイン）と併用しても良いし、又は混合しても良い。或いは、免疫治療及び予防を達成する手段として本明細書で定義される組成物は、少なくとも1つの免疫増強物質、例えば、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント、及び/又は界面活性剤、及び/又は免疫調節物質（例えば、サイトカイン又はケモカイン）をさらに含み得る。
【００６０】
様々なアジュバントが当分野で公知であり、その例として、フロイント完全アジュバント（CFA）、フロイント不完全アジュバント（IFA）、モンタニドISA（不完全セピックアジュバント（incompletre seppic adjuvant））、ムラミールペプチド、例えば、ムラミールジペプチド（MDP）MDP-Lys（L18）（Nα-アセチルムラミール-L-アラニル-D-イソグルタミニル-Neステオロイル-L-リジン（Nα-acetylemuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-Nesteoroyl-L-lysine））、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム、CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CPG ODN）、例えば、CPG ODN 1826及びCPG ODN 2007、水に溶解した5％スクアレン（w/v）、0.5％Tween（登録商標）80（w/v）、及び0.5％Span（w/v）を含む界面活性剤安定化水中油型エマルションであるMF59、TLR4リガンド（例えば、MPL、GLA）、TLR3リガンド（例えば、Hiltonol（登録商標））、多糖（例えば、イヌリン）、及びリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム、ISCOM）が挙げられる。
【００６１】
特定の実施態様では、少なくとも1つのアジュバントは、T細胞免疫応答、特にT細胞記憶応答を活性化する能力を有する分子の中から選択される。好ましいアジュバントは、免疫細胞（例えば、APC）におけるTLR（Toll様受容体）3、4、7、8、及び/又は9に結合するアジュバントであるか、又はこのTLR（Toll様受容体）3、4、7、8、及び/又は9に対するアゴニストである。特定の実施態様では、アジュバントは、TLRリガンド、特に、クラス3のTLRリガンド、例えば、poly-ICLC、クラス4のTLRリガンド、クラス9のTLRリガンド、例えば、CpG、及びクラス7/8のTLRリガンド、例えば、イミキモドからなる群から選択されるTLRリガンドである。アジュバントの例として、5％イミキモド（Aldara（商標））を含むクリームとして販売されているイミキモド、及びHiltonol（登録商標）としてOncovir社（WA, US）が販売しているPoly-ICLCが挙げられる。
【００６２】
「併用」は、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物と免疫増強物質の両方が、異なる時間に、かつ/又は異なる投与方式で、好ましくは同じ接触部位で宿主に接触させられることを意味する。特定の実施態様では、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、宿主に注射され、免疫増強物質（例えば、アジュバント）は、宿主に対して局所的に、例えば、皮膚に（皮膚上に）適用される。例えば、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、宿主に注射され、免疫増強物質（例えば、アジュバント）は、この注射後に、宿主の注射部位の皮膚に適用される。対照的に、「混合」は、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物と免疫増強物質が、投与されるときに同じ製剤中に存在する。
【００６３】
本出願では、免疫増強物質（例えば、アジュバント）が、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物と混合又は併用される場合、免疫増強物質は、少なくとも、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物が宿主に投与されるたびに使用されることに注目されたい。特定の実施態様では、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、2回投与され、免疫増強物質は、各投与日に、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与部位に、（混合又は併用のいずれかで、好ましくは皮膚に）適用される。別の特定の実施態様では、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、2回投与され、免疫増強物質は、各投与日及び各投与日の翌日に、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与部位に、（混合又は併用のいずれかで、好ましくは皮膚に）適用される。特定の実施態様では、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、2回投与され、免疫増強物質（好ましくはイミキモド、例えば、Aldara（商標））は、各投与日及び各投与日の翌日に、本発明のポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物の投与部位の皮膚に適用される。
【００６４】
免疫治療及び予防、及び任意である再発の防止を達成する手段として本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は本明細書で定義される組成物はさらに、投与計画において、病原体感染、腫瘍細胞、又はこの感染もしくは腫瘍に関連した病的状態（複数可）を治療するのに適した他の活性化合物、例えば、抗腫瘍化合物又は抗ウイルス活性化合物と併用又は混合しても良い。
【００６５】
本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、異なる経路を介して患者に注入することができる：皮下（s.c.）、皮内（i.d.）、筋肉内（i.m.）、又は静脈内（i.v.）注射、経口投与、及び粘膜投与、特に鼻腔内投与又は吸入。特定の実施態様では、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は皮内投与される。
【００６６】
特定の実施態様では、本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、投与経路に関わらず、少なくとも1つの免疫増強物質と混合又は併用されて、又は混合も併用もされずに、哺乳動物宿主で診断される（第1の）確定される病的状態（複数可）とは別の部位に投与される、すなわち腫瘍の場合は、腫瘍発生の部位以外の部位（例えば、粘膜以外）に投与され、及び病原体の場合は、病原体複製部位以外の部位に投与される。
【００６７】
本明細書で定義されるポリペプチド（複数可）保持ベクター又は組成物は、固形（カッシュ剤、粉末、ゲルール（gelule）、ピル、座薬、速放性錠剤、胃腸耐性錠剤（gastro-resistant tablet）、遅延放出錠剤）、好ましくは、注射の前に、例えば、希釈剤（複数可）で戻す必要がある凍結乾燥された粉末形態（凍結乾燥形態又は凍結乾燥粉末形態）、液体形態、例えば、注射用溶液もしくは注射用懸濁液とすることができる。
【００６８】
投与されるべきポリペプチド（複数可）保持ベクターの量（投与量）は、患者の状態、個人の免疫系の状態、投与経路、及び宿主の大きさを考慮することを含め、治療するべき対象によって異なる。従来の投与量は、1〜1200μg、100〜1000μg、200〜1000μg、500〜1000μgの範囲である。特定の投与量が、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、及び1000μgからなる群から選択される。別の実施態様では、従来の投与量は、ポリペプチド（複数可）保持ベクター1〜100μg、1〜50μg、及び1〜10μgの範囲である。これらの例は、状況によって、当業者が変更することができる。
【００６９】
それぞれの特定の実施態様は、任意の特定の実施態様と組み合わせることができる。
【実施例】
【００７０】
（実施例）
A.材料及び方法
マウス
6週齢の雌C57BL/6マウス（H-2b）をCharles River Laboratoriesより購入する。マウスを、病原体が存在しない条件下で、水及び餌を自由に摂取できる状態で飼育する。動物及びその世話を含む手順は、国内法及び国際法並びに政策を遵守した、地方倫理委員会によって再検討されたGenticel社の指針に適合している。
【００７１】
腫瘍細胞株
TC-1（組織培養番号1）腫瘍細胞（Lin, Guarnieriらの文献、1996年）を、C57BL/6一次マウス肺細胞をHPV16 E6及びE7癌遺伝子並びに活性化ヒトc-Ha-Ras癌遺伝子で形質転換して調製した。この研究に使用した細胞は、ATCCから入手した。TC1細胞を、各実験の前に解凍し、次いで、注射の少なくとも10日前の内にin vitroで培養して増殖させる。
【００７２】
EG7、OVA-トランスフェクトEL4リンパ腫マウス細胞株（C57BL/6遺伝的背景）を使用して、オボアルブミンタンパク質を発現する固形腫瘍を誘発する。このモデルは、広く記載されており、癌のマウス腫瘍モデルとして使用されている（Schreiber, Deyevらの文献、2009年）。EG7細胞を、各実験の前に解凍し、次いで、注射の少なくとも10日前の内にin vitroで培養して増殖させる。
【００７３】
腫瘍細胞接種
第0日目に、C57BL/6マウスに、側腹部の皮下経路を介して100μLの1X PBSで希釈したTC-1細胞（HPV_TUR008では0.5x106細胞/マウス、他の研究では1x106細胞/マウス）を注射する。一部の実験では、第60日目に、マウスに、側腹部の皮下経路を介して100μLの1X PBSで希釈したEG7細胞を注射する。
【００７４】
ベクターの調製
・組換えCyaA-HPV16E7Δ30-42（C16-1）及びCyaA-HPV18E7Δ32-42（C18-1）（図3A及び図3B）の構築及び精製は、欧州特許第1576967B1号に既に説明されている。CyaA-HPV16E7Δ30-42（C16-1）及びCyaA-HPV18E7Δ32-42（C18-1）の2つの最終バルクが、1：1の比でGenticel社で混合されてProCervixが生産され、このProCervixがアリコートで-80℃で保存される。
・CyaA-CysOVAは、オボアルブミン（OVA）タンパク質のOVA257-264（SIINFEKL）H-2b制限エピトープを組み込んでいる。これは、BTpr_103、Genticel社で精製されたバッチHPV043_Cova_PB_8Mとしてコード化されている。CyaA-CysOVAのこのバッチは、Genticel社において、マウスにおけるその免疫原性によって特徴付けられた（内部結果）（図4）。
・CyaA-MAGEA397-178/190-295ベクター（図4C及び配列番号7）は、以下の2つのポリペプチドを含む：
（1）百日咳菌CyaAの残基319〜320の間に挿入されたMAGE A397-178エピトープ：
【化１】
0006014604.tif 000002
（2）CyaAの残基224〜235の間に挿入された、MAGE A3配列の残基242〜295に融合された残基190〜221に対応するMAGE-A3190-295*エピトープ：
【化２】
0006014604.tif 000003
【００７５】
ワクチン投与
第11日目に、腫瘍測定後、検出可能な固形腫瘍を有するマウスに、耳真皮への皮内（id）注射（両耳に注射）によってワクチン接種する。一部の実験では、TC-1腫瘍細胞の接種から第11日目及び第39日目に、マウスに2回のワクチン接種を行う。ProCervixについては、5μgのCyaA-HPV16E7Δ30-42及び5μgのCyaA-HPV18E7Δ32-42と共にマウスに投与した。
【００７６】
アジュバント分子
Aldara（商標）は、例えば、APCである免疫細胞におけるTLR7に優先的に結合することにより自然免疫を活性化する分子の医薬製剤である。この活性分子は、イミキモドという小さい合成化合物である。Aldara（商標）は、250mgの1回使用量のパケットに入った5％イミキモド（12.5mgの活性イミキモド）を含むクリームとして販売されている。ProCervixマウスワクチン接種のアジュバント効果を誘発する用量は、1つの免疫化部位に対して25mgのAldara（商標）であり、従って、1つの注射部位に付き1.25mgの活性イミキモドである（1匹のマウスに対して50mg）。Aldara（商標）の局所適用（皮膚）を、免疫化の日及び免疫化の24時間後に行う。それぞれが耳の皮膚に適用するAldara（商標）25mgを含む個々の管を用意する（1匹のマウスに対して2本の管）。各ProCervix注射部位（個々のマウスの各耳に対応する）に適用されるAldara（商標）クリームの実際の量を精密に測定するために；各エッペンドルフ管を、この管の中にクリームを入れる前後で計量する。Aldara（商標）クリームを耳の皮膚に適用したら、エッペンドルフ管の重量を再度測定して、皮膚に塗り込んだクリームの量を近似的に算出する。どの管についても、クリームの全量を、少なくとも15秒間、完全に皮膚内に浸透するまで塗り込む。
【００７７】
2mg/mLの乳白色の滅菌溶液1mLを含むバイアルに入れられたPoly-ICLC（TLR3アゴニスト）が、Oncovir社（WA, US）によって供給された。Poly-ICLCは、元の容器に入れたまま、+4℃で保管する。注射用Poly-ICLCは、0.9％塩化ナトリウム溶液中、1.5mg/mLのpoly-L-リジン及び5mg/mLのカルボキシメチルセルロースナトリウムで安定化され、水酸化ナトリウムでpH7.6〜7.8に調整された2mg/mLのpoly-ICを含む。
【００７８】
腫瘍測定
マウスの腫瘍発生を評価するために様々なパラメータを考慮する：
・腫瘍サイズ：腫瘍を、腫瘍細胞の接種の5日後から第60日目まで週2回、キャリパーを用いて手動で測定する。次いで、腫瘍の体積を次のように計算する：体積=（長さ×幅2）/2；
・マウスの生存：倫理的な理由から、非常に重要な腫瘍（限界サイズ：2000mm3）及び/又は壊死した腫瘍が発生した、又は腫瘍誘発性運動障害を伴うマウスは安楽死させる：及び
・腫瘍のないマウスの数：この情報は、治療的ワクチン接種が完全な腫瘍退縮を誘発したことを示唆する（触診可能な腫瘍の非存在）。
【００７９】
CD8 T細胞記憶細胞傷害性応答の測定
in vivoでのCD8+ T細胞の細胞傷害性を測定する方法が、広く記載されている（Barchet, Oehenらの文献、2000年; Ingulliの文献、2007年）。簡単に述べると、未処置マウス由来の同系脾細胞を、異なる濃度のCFSE（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、Molecular Probes Invitrogen）で標識し、in vitroで関連H-2b制限ペプチドでパルスするか、又はパルスしない。ペプチドパルス及び非パルス標的細胞集団の両方を、同系ワクチン接種宿主に静脈養子導入し、ペプチドパルス標的の減少を、脾臓のフローサイトメトリー（BD FACSCalibur）によって測定する。死滅の割合を、パルス標的細胞の非パルス細胞に対する割合の比の低下から推定し、最初の比で修正する（以下を参照）。細胞調製物を、異なる標的細胞のCFSE添加をチェックする注射の前にフローサイトメトリーによって分析し、in vivo死滅の計算のための基準値（各細胞集団の実際の割合）を得る。次いで、3つの標的細胞集団を、各ワクチン接種マウスに1：1：1で静脈注射する。in vivo死滅の割合を、以下の式（Barber, Wherryらの文献、2003年）を用いて、本明細書の他の部分で説明されているように計算する。
【数１】
0006014604.tif 000004
【００８０】
IFN-γ ELISpot（酵素結合免疫スポット）アッセイ
特定のCD8+ T細胞を産生するHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49 IFN-γの周波数範囲を、IFN-γ ELISpotアッセイによりex vivo再刺激脾細胞に対して調べる：
・ELISpotを、プールした脾臓ではなく個々のマウスに対して行う。
・静脈注射の前日に、マウスに同系CFSE添加標的脾細胞が投与された（in vivo死滅アッセイのために、上記参照）。
・簡単に述べると、ワクチン接種マウスから得た全ての脾細胞を刺激しないでおくか、又は以下に示すように1μg/mlの各ペプチドで、37℃、5％CO2で20時間再刺激する：
・HPV16 E749-57ペプチド（H-2b制限された関連エピトープ）を含む1ウェルに付き1×106細胞
・OVA257-264（H-2b制限された無関連エピトープ）を含む1ウェルに付き1×106細胞
・HPV18E7AS43-49（H-2b制限された関連エピトープ）を含む1ウェルに付き0.25×106細胞
【００８１】
IFN-γの分泌を、サンドイッチ法をベースとしたELISpotによって監視し、ストレプトアビジン-AKPを用いてBCIP/NBTにより検出する。データを、バイオリーダー5000-Pro S（Bioreader 5000-Pro S）（Biosys）で分析した。
【００８２】
治療的/予防的ワクチン接種
以下に詳述される治療計画は図8に要約されている。
【００８３】
第0日目に、2つの群のマウス（群1及び群2）の右側腹部に、TC-1細胞（1×106細胞/マウス）を接種した。次いで、マウスに対して、プラセボ（1×PBS+尿素）（群1）又はプラセボ+Aldara（商標）（群2）を用いて、1回目を第11日目、2回目を第39日目として2回のワクチン接種を行った。群1及び群2は、陰性対照群である。
【００８４】
第0日目に、4つの群のマウス（群3〜群6）の右側腹部に、TC-1細胞（1×106細胞/マウス）を接種し（群3〜群6）；次いで、マウスに対して、Aldara（商標）の存在下でCyaA-MAGEA397-178/190-295/CyaA-HPV16 E7（それぞれ5μgのCyaAベースのベクター）を用いて（群3）、Aldara（商標）の存在下でCyaA-cysOVA/CyaA-HPV16 E7（それぞれ5μgのCyaAベースのベクター）を用いて（群4）、又はAldara（商標）アジュバント添加ProCervixを用いて（群5及び群6、TC-1腫瘍除去の陽性対照として）、1回目を第11日目、2回目を第39日目として2回のワクチン接種を行った。これらのマウスの右側腹部を第100日目まで監視した（図9）。第60日目に、生存マウスに、MAGE A3タンパク質を発現するB16腫瘍細胞（群3及び群5）又はEG7腫瘍細胞（オブアルブミンを発現する悪性同系細胞）（群4及び群6）のいずれかの第2の腫瘍細胞系を接種した。これらのマウスの左側腹部を第100日目まで監視した。
【００８５】
Aldara（商標）が使用される場合は、Aldara（商標）を、ワクチン接種の日及びワクチン接種の後日（すなわち第12日目及び第40日目）にワクチン接種部位に局所（皮膚）適用する。
【００８６】
B.結果
（ProCervixが接種された、HPV16 E7を発現する固形腫瘍を有するマウスは、高い腫瘍退縮率及び生存の改善を示す）
第11日目にPBSが接種され、Aldara（商標）が適用されたマウスは、第50日目の前に腫瘍が完全に除去された、10匹のうちの2匹を除いて、腫瘍の成長の抑制を示さなかった（図5A及び図6A）。この群の4匹のマウスが、第50日目（図6B；腫瘍サイズの監視の最後）に生存していた。PBSのみで処置した群がこの研究に含まれていなかったため、腫瘍に対するマウスの自然の応答に比べて、Aldara（商標）の影響の明確な見解を有することは困難である。しかしながら、Aldara（商標）のみで観察された効果が、Aldara（商標）アジュバント添加ProCervixで観察された効果よりも遥かに弱いことは明らかである（以下を参照）。これは、たとえAldara（商標）が腫瘍の進行に対してある程度のバイスタンダー効果を有し得るとしても、恐らく、自然の免疫活性化及びその結果として生じる炎症プロセス（炎症性サイトカインなど（Schon及びSchonの文献、2008年））によるものであり、固形HPV誘発腫瘍の治療としてこの治療計画に単独で使用するには十分な効力がないことを示唆している。
【００８７】
アジュバント非添加ProCervixが第11日目に接種されたマウスも、第50日目に、腫瘍のないマウスが存在せず、重要な腫瘍の成長を示した（図5B及び図6A）。この群では、第50日目に2匹のマウスのみが生存していた（図6B）。局所イミキモド（Aldara（商標））によってアジュバント添加されたProCervixでの治療的ワクチン接種は、有意な腫瘍の退縮をもたらし（図5D）、高い生存率であり（図6B）、研究の最後で大部分のマウスに腫瘍がなかった（図6A）。Aldara（商標）アジュバント添加ProCervix群は、10匹の内の3匹のマウスで、一定期間の明らかな抑制（サイズが50mm3未満に減少）の後に腫瘍エスケープが観察された。このエスケープは、第30日目と第40日目との間に起こり、第50日目まで重要な成長が続いた。この現象は、腫瘍が構築するエスケープ機構によるものであり得、この場合、治療計画の改善のために考慮されるべきであるが、TC-1細胞について既に説明されたように腫瘍細胞の表面のMHCクラスI分子の減少による可能性のほうが高い（Zwaveling, Ferreira Motaらの文献、2002年）。Poly-ICLCアジュバント添加ProCervixでの治療的ワクチン接種は、腫瘍退縮及び生存率について同様の結果をもたらした（図5C及び図6）。これらの結果は、Poly-ICLC又は局所イミキモド（Aldara（商標））のいずれかによってアジュバント添加されたProCervixでの、HPV16 E7を発現する固形腫瘍を有するマウスの治療的ワクチン接種が、強い治療効果をもたらすことを示している。
【００８８】
（ProCervix治療的ワクチン接種は、HPV16 E7及びHVP18 E7の両方に特異的な機能的記憶CTLの誘発を促進する）
LCMVによる急性ウイルス感染のマウスモデルにおいて、記憶CD8+ T細胞がin vivoで迅速溶解性を示すことができることが、Rafi Ahmed及びその同僚らによって記載されている（Barber, Wherryらの文献、2003年）。これらの観察に基づいて、我々は、第11日目のProCervixの投与後に、TC-1誘発固形腫瘍が完全に除去されたマウスが、腫瘍根絶後に機能的抗原特異的記憶CD8+ T細胞を有するか否かを調べることにした。
【００８９】
このために、次の2つのH-2b制限エピトープ：HPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49に対する記憶CD8+ T細胞のin vivo細胞傷害性（材料及び方法の節で既に説明）を平行に測定するために、TC-1細胞接種から60日目に、各群に残った腫瘍のないマウスにCFSE添加同系脾細胞を養子導入した。Aldara（商標）又はPoly-ICLCのいずれかでアジュバント添加されたProCervixが接種されたマウスの群において、5匹の腫瘍のないマウスを選択（群の中から無作為に選択）して、in vivo死滅アッセイを行った。それぞれ腫瘍が完全に根絶された、試験した全てのマウスでは、HPV16 E749-57パルス標的細胞に対して強い細胞傷害性を検出した（図7）。群間に相違は認められなかった。プラセボとAldara（商標）が接種された群におけるHPV16E7特異的細胞傷害性応答の検出は、この試験に腫瘍のない2匹のマウス（他のマウスは全て、第60日目には腫瘍の成長により死んでいた）を使用したことによるものである。このデータは、これらの2匹のマウスが、TC-1誘発固形腫瘍を排除するほど強いHPV16 E7特異的免疫応答を起こすことができることを示唆している。興味深いことに、アジュバント添加ProCervixが接種されたマウスのみが、HPV18E7パルス標的細胞も有していた。これらのデータは、TC-1細胞がHPV18抗原を発現しないためより有益であり、従って、報告されたHPV18特異的細胞傷害性が、ワクチン誘発記憶T細胞のみによるものであることを示唆している。実際、HPV18E7パルス標的細胞に対するin vivo細胞傷害性は、Aldara（商標）のみで処置されたマウスでは全く観察されなかった（図7）。
【００９０】
総合すると、我々のデータは、1回のみの注射で、HPV16 E7抗原及びHPV18 E7抗原の両方に対する機能的CD8依存性記憶応答を誘発するときのProCervixの優れた効率を実証している。1回のProCervix接種は、集まった抗原特異的記憶CD8+ Tリンパ球の分化を誘発することができ、これにより、ワクチン接種されたマウスに、HPV16 E7（腫瘍によって発現される抗原）を発現する同系移植細胞の二次曝露に対する長期保護、及びこれと平行した、HPV18 E7（腫瘍によっては発現されず、CyaA-HPV18E7Δ32-42ベクターによってのみ送達される抗原）を発現する同系移植細胞での新たな曝露に対する保護の両方が付与される。
【００９１】
（二価CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3治療的ワクチン接種は、HPV16 E7発現固形腫瘍を根絶し、かつMAGE-A3誘発腫瘍の発生を防御する）
CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3+経皮アジュバントとしてのAldaraが接種されたマウス（群3）及びAldaraアジュバント添加ProCervixが接種されたマウス（群5及び6）は、40日以内にTC-1誘発固形腫瘍を排除した：群3の10匹のマウスの内の9匹（図9c）；群5の10匹のマウスの内の8匹、及び群6の10匹のマウスの内の9匹（図9e及び図9f）。腫瘍の強力な排除が、第100日目まで確認された。これに対して、陰性対照である、アジュバントを用いて（群1）又はアジュバントを用いずに（群2）プラセボが接種されたマウスに、TC-1誘発固形腫瘍が発生した：群1で9/10のマウス（図9a）及び群2で8/10のマウス（図9b）。
【００９２】
第60日目に、群3及び群5の生存マウスの左側腹部に、MAGE A3タンパク質を発現するB16腫瘍細胞を接種した。Aldara（商標）の存在下でCyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3が接種され、TC1誘発腫瘍が排除されたマウスはいずれも、曝露後にB16-MAGEA3腫瘍の発生を示さず（9匹のマウスのいずれにもB16-MAGEA3腫瘍が発生しなかった；図10a）、これらのマウスが、B16-MAGE A3誘発固形腫瘍の曝露から保護されていたことを示唆している。
【００９３】
これに対して、Aldara（商標）アジュバント添加ProCervixが接種され、TC1誘発腫瘍が排除されたマウスに、B16-MAGEA3腫瘍が発生し（8匹のマウスの内の6匹にB16-MAGEA3腫瘍が発生した；図10c）、Procervix（HPV16E7/HPV18E7）が、B16-MAGEA3腫瘍細胞による曝露に対する防御記憶T細胞免疫を付与しなかったことを示唆している。従って、群3のマウスで観察されたMAGE A3誘発腫瘍の発生に対する防御が、CyaA-MAGEA3が接種されたマウスにおけるMAGE A3特異的T細胞性記憶応答の誘発の結果として達成される一方、群5のマウスで誘発されたT細胞性記憶応答は、B16-MAGEA3腫瘍細胞の性質に無関連である抗原（HPV18 E7）に対して生じた。
【００９４】
結論として、これらの実験は、二価CyaAを使用して、1回の投与後に、TC-1細胞（HPV18E7特異的免疫応答）を根絶し、かつB16-MAGEA3腫瘍細胞の発生を防止し得る（MAGE A3特異的T細胞性記憶応答）ことを実証している。さらに、第60日目の後に得られた結果は、B16-MAGEA3腫瘍細胞に対して得られる予防効果が、TC-1細胞に対して得られる治療効果を妨げないことを示した（第100日目までのTC1細胞の根絶；図9c）。
【００９５】
（二価CyaA-HPV16E7Δ30-42/ CyaA-CysOVA治療的ワクチン接種は、HPV16 E7発現固形腫瘍を根絶し、かつEG7-OVA誘発腫瘍の発生を防御する）
経皮アジュバントとしてのAldara（商標）の存在下でのCyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVAが接種されたマウス（群4）及びAldaraアジュバント添加ProCervixが接種されたマウス（群5及び6）は、40日以内にTC-1誘発固形腫瘍を排除した：群4の10匹のマウスの内の9匹（図9d）、及び群5の10匹のマウスの内の8匹、及び群6の10匹のマウスの内の9匹（図9e及び図9f）。腫瘍の強力な排除が、第100日目まで確認された。これに対して、陰性対照である、アジュバントを用いて（群1）又はアジュバントを用いずに（群2）プラセボが接種されたマウスに、TC-1誘発固形腫瘍が発生した：群1で9/10のマウス（図9a）及び群2で8/10のマウス（図9b）。
【００９６】
第60日目に、群4及び群6の生存マウスの左側腹部に、EG7-OVA腫瘍細胞（オボアルブミンを発現する悪性同系細胞）を接種した。群6では、第60日目の後に、マウス6004に腫瘍が発生したが（図9f）、このマウス6004は、腫瘍が発生しなかったこの群の他の9匹のマウスと同様にEG7-OVA腫瘍細胞が接種された。Aldara（商標）の存在下でCyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVAが接種され、TC1誘発腫瘍が排除されたマウスはいずれも、曝露後にEG7-OVA腫瘍の発生を示さず（9匹のマウスのいずれにもEG7-OVA腫瘍が発生しなかった；図10b）、これらのマウスが、EG7-OVA腫瘍細胞の曝露から保護されていたことを実証している。対照的に、Aldara（商標）アジュバント添加ProCervixが接種され、TC1誘発腫瘍が排除されたマウスに、EG7-OVA腫瘍が発生し（10匹のマウスの内の8匹にEG7-OVA腫瘍が発生した；図10d）、Procervix（HPV16E7/HPV18E7）が、EG7-OVA腫瘍細胞による曝露に対する防御記憶T細胞免疫を付与しなかったことを示唆している。従って、群4で観察されたEG7-OVA誘発固形腫瘍の発生に対する防御が、CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVAが接種されたマウスにおけるOVA特異的T細胞性記憶応答の誘発の結果として達成される一方、群6のマウスで誘発されたT細胞性記憶応答は、EG7-OVA腫瘍の性質に無関連である抗原（HPV18 E7）に対して生じた。
【００９７】
結論として、これらの実験は、二価CyaAを使用して、1回の投与後に、TC-1細胞（HPV18E7特異的免疫応答）を根絶し、かつEG7-OVA誘発固形腫瘍の発生を防止し得ることを実証している。さらに、第60日目の後に得られた結果は、EG7-OVA腫瘍細胞に対して得られる予防効果が、TC-1細胞に対して得られる治療効果を妨げないことを示した（第100日目までのTC1細胞の根絶；図9d）。
【００９８】
C.結論
本出願に取り入れられた新たな概念では、二価ProCervix治療的ワクチン接種が、例えば、HPV16感染患者を治療し、かつ感染を根絶する一方、HPV16 E7抗原及びHPV18 E7抗原の両方に対するT細胞性記憶応答を発生させ、従って、ProCervixが接種された患者に対して、潜在的なHPV16の再感染及び後のHPV18の感染に対する長期の防御を確立する。
【００９９】
これは、HPV16感染マウスを治療する（TC1細胞の根絶）一方、B16-MAGE A3腫瘍又はEG7-OVA腫瘍のそれぞれの発生を防御することが示された2つの他の二価ワクチン接種（CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3及びCyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVA）で確認された。
【０１００】
子宮頸癌［TC-1腫瘍細胞（Lin, Guarnieriらの文献、1996年; Zwaveling, Ferreira Motaらの文献、2002年）］の前臨床マウスモデルの使用により、アジュバント分子［Aldara（商標）（Johnston及びBystrynの文献、2006年; Heib, Beckerらの文献、2007年; Schon及びSchonの文献、2008年）又はPoly-ICLC（Longhi, Trumpfhellerらの文献、2009年）であるTLRアゴニスト］と併用されるProCervixでの、HPV16 E7発現固形腫瘍を有するマウスの治療的ワクチン接種が、有効な腫瘍退縮をもたらすことが示された。
【０１０１】
さらに、ワクチン誘発腫瘍排除が、腫瘍が完全に根絶されたマウスにおける持続性のHPV16 E7特異的CTL記憶応答の存在に相関し得ることが示された。また、予想外に、これらの腫瘍のないマウスでは、ProCervix治療的ワクチン接種が、平行して、機能的HPV18 E7特異的CTL記憶応答を発生させることも証明された。HPV16 E7及びHPV18 E7記憶CTLの両方が、in vivoでの溶解能を示した。
【０１０２】
ポリペプチド（複数可）保持CyaAが、哺乳動物宿主において第2の群のエピトープに対する予防的T細胞記憶応答（複数可）を発生させることができ、しかも、第1の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、前記哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療を行うことができるという知見は驚きである。実際、APCへのアクセス、APCによる処理及び提示、並びにサイトカインの利用可能性に関して、異なるエピトープ間に競合が存在することが良く知られている。この現象は、優性及び準優性（subdominant）エピトープの階層化につながり、T細胞免疫応答を活性化することができ、かつ他のT細胞免疫応答（複数可）を抑制することができる。この現象は、第1の群のエピトープを認識するT細胞が、ポリペプチド（複数）保持ベクターの投与前に患者に既に存在する一方で（第1群の1つ又はいくつかのエピトープが、宿主免疫系に既に提示されたため）、天然T細胞が、エピトープの第2の群に対して活性化されるはずである現在の状態では予期された。興味深いことに、本発明は、予期されることに反して、ポリペプチド（複数）保持CyaAに含まれる第2の群のエピトープに対する予防的免疫応答が、第1の群のエピトープに対する治療的免疫応答に対して不利ではないであろうことを示した。これらの結果は、第1の群のエピトープに対して誘発される免疫応答と第2の群のエピトープに対して誘発される免疫応答との間に競合が認められないことを意味する。結果として、本発明者らは、ポリペプチド（複数可）保持CyaAが、哺乳動物宿主で診断される第1の確定される病的状態（複数可）の免疫治療の範囲内でT細胞免疫応答を十分に効率的に誘発し、かつ同じ哺乳動物宿主における第2の確定される病的状態（複数可）に対する予防の範囲内でT細胞記憶免疫応答を十分に効率的に誘発することを示した。
【０１０３】
（参考文献）
【化３−１】
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【化３−２】
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【図１Ａ】
0006014604.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ−ｂ】
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【図９ｃ−ｄ】
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【図９ｅ−ｆ】
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【図１０ａ−ｂ】
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【図１０ｃ−ｄ】
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【配列表】
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