(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補薬剤が、対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進する場合に、当該候補薬剤をアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤と評価する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法であって、ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記発現及び／又は活性が有意に亢進していると判断され、ここでブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子MZF-1及び／又はSP-1の結合活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記転写活性が有意に亢進していると判断される、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法。
【請求項２】
皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性が、対照の皮膚のものと比べ有意に低下している場合に、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向があるとの指標とし、対照の皮膚のものと比べ同程度以上であるなら、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向がないとの指標とする、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の素因を判定する方法であって、ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記発現及び／又は活性が有意に低下していると判定され、ここで転写因子MZF-1及び／又はSP-1の結合活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記転写活性が低下していると判定される、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の素因を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥肌、特にアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法、さらにはアトピー性皮膚炎による乾燥肌の診断方法、を提供する。
【背景技術】
【０００２】
表皮の顆粒層のケラチン線維は、角化する際にフィラグリンと呼ばれるタンパク質に結合して凝集し、“ケラチンパターン”と称される特異的な形態をつくる。顆粒細胞内のケラトヒアリン顆粒にはフィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリン（フィラグリン単位が10乃至12個縦に並んだもの）が多量に存在するが、角化の際、フィラグリンモノマーが生成されるとともに脱リン酸化によりケラチン線維を凝集させる。その後、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）という酵素の作用によって脱イミノ化され、ケラチンと遊離した後、角層上層でアミノ酸などに分解される。これらのアミノ酸は天然保湿因子（natural moisturizing factor ； ＮＭＦ）と呼ばれ、角層水分量の保持に重要な役割を担い、また紫外線吸収能をもつことで知られる(Blank I.H. J.I. Dermatol., 18, 433 (1952); Blank I.H. J.I. Dermatol., 21, 259 (1953))。【０００３】
ＮＭＦの主成分であるアミノ酸がフィグラリンに由来することが明らかになって以来、乾燥肌を呈する病態とフィグラリンの関連性についての研究が進められている。近年、老人性乾皮症、アトピー性疾患などの乾燥肌において角層中のアミノ酸が減少していることが明らかになっている（Horii I. et al., Br. J. Dermatol., 121, 587-592(1989); Tanaka M. et al., Br. J. Dermatol., 139, 618-621(1989))。【０００４】
ＰＡＤはフィラグリンのアルギニン残基に作用して脱イミノ化させ、シトルリン残基に変換させる。このようにフィラグリンが脱イミノ化されることでフィラグリンとケラチン繊維との親和性が弱まり、ケラチン繊維が遊離し、その結果フィラグリンはプロテアーゼの作用を受け易くなり、最終的にＮＭＦにまで分解されるものと考えられる。【０００５】
本発明者は、ＰＡＤで脱イミノ化したフィラグリンを分解する酵素として、カルパイン−１を特定しており、その分解産物としての小さいペプチド断片がブレオマイシン水解酵素（ＢＨ）によってアミノ酸単位、即ちＮＭＦにまで分解されることを明らかにしている（Journal of Investigative Dermatology (2008), Volume 128, ABSTRACTS, S90, 539, 第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会  合同大会  講演要旨集、第５８３頁、JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284, NO. 19, pp. 12829-12836, 2009、３Ｐ−０２５１、及び特願２００８−１３５９４４号（以下第９４４号出願と称する））。【０００６】
最近の研究で、アトピー性皮膚炎の一部は、プロフィラグリン遺伝子の異常により生じることが知られており、アトピー性皮膚炎患者の5-50％程度で当該遺伝子の異常が見られる（Smith FJD, et al. Nat Genet 38:337-42 (2006); Aileen Sandilands1, et al., J. I. Dermatol., 127, 1282-1284 (2007) 及びNomura T, et al., J. I. Dermatol., 128(6):1436-41 (2008)）。しかしながら、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では、必ずしもフィラグリンの発現が劇的に低下しているわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Blank I.H. J.I. Dermatol., 18, 433 (1952)
【非特許文献２】Blank I.H. J.I. Dermatol., 21, 259 (1953)
【非特許文献３】Horii I. et al., Br. J. Dermatol., 121, 587-592(1989)
【非特許文献４】Tanaka M. et al., Br. J. Dermatol., 139, 618-621(1989)
【非特許文献５】Kamata et al., J. Biochem., 141, 69-76, 2007
【非特許文献６】Journal of Investigative Dermatology (2008), Volume 128, ABSTRACTS, S90, 539
【非特許文献７】第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会  合同大会  講演要旨集、第５８３頁、３Ｐ−０２５１
【非特許文献８】JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284, NO. 19, pp. 12829-12836, 2009
【非特許文献９】Smith FJD, et al. Nat Genet 38:337-42 (2006)
【非特許文献１０】Aileen Sandilands1, et al., J. I. Dermatol., 127, 1282-1284
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＮＭＦ産生酵素の発現の変動による新たな肌荒れメカニズムに基づいて、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する薬剤をスクリーニングする方法や、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を評価する方法、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法、さらには、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を診断する方法、を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記第９４４号出願において、本発明者は、ブレオマイシン水解酵素の活性亢進がＮＭＦの産生を介して皮膚バリアー機能を改善することを明らかにした。このように、ブレオマイシン水解酵素はＮＭＦ産生の最終段階で働いていると考えられる。しかし、興味深いことに、アトピー性皮膚炎により生じる乾燥肌に関しては、多くのアトピー性皮膚炎患者で依然としてフィラグリンの発現が見られることから、フィラグリン遺伝子の異常とは別の原因で生じることが予想される。【００１０】
本発明者は、ヒト皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の発現低下が、ＭＭＦ産生機構の異常によって生じる皮膚バリアー機能の低下のみならず、主に免疫異常に起因するアトピー性皮膚炎や当該皮膚炎によって生じる乾燥皮膚等とも関係しているとの仮説のもと、乾燥肌ヒト試験による当該酵素の発現の変動を検証し、そしてその発現制御機構の解析等を行った。その結果、本発明者は、ブレオマイシン水解酵素の発現低下がアトピー性皮膚炎によって生じる乾燥肌と関連しており、且つ当該酵素をコードする遺伝子の５’フランキング領域内に当該酵素の発現を顕著に誘導する制御領域が存在することを見出した。詳しくは、本発明者は、ＢＨの５’‐フランキング領域をクローニングした。その欠失分析では、−２１６ｂｐ上流の中にＢＨプロモーター活性に重要な領域が同定された。電気泳動移動度シフト・アッセイでは、試験管内において、ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、及びインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）‐１／２がこの領域に結合できることを明らかにした。そのうえ、ＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１モチーフの部位特異的突然変異誘発では、ＢＨプロモーター活性が大きく低下した。これらのデータは、ＢＨ発現がＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１を介して上方制御されることを示唆した。興味深いことに、Ｔｈ１サイトカインであるインターフェロン（ＩＦＮ）‐γは、ＢＨの発現を有意に減少させた。部位特異的突然変異誘発と低分子干渉ＲＮＡを用いた分析では、ＢＨ発現に対するＩＦＮ‐γの抑制効果を立証した。その一方、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ‐４は、ＢＨ発現に対して直接的な作用を全く示さなかった。しかしながら、それは培養ケラチノサイトにおいてＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１を下方制御したので、ＩＬ‐４がＢＨ調整のサプレッサーとして働くことができることが示唆された。最後に、ＡＤを患っている患者の皮膚においてＢＨの発現を調べた。ＢＨ活性と発現はＡＤ病変皮膚において大きく減少していたので、ＡＤにおけるフィラグリン分解経路の欠陥が示唆された。以上にとおり、本発明者は、ＢＨの転写が分化中及び炎症中の両方で調節されているであろうことを見出し、本願発明を完成させるに至った。【００１１】
従って、本願は以下の発明を包含する。
（１）候補薬剤が、対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進する場合に、当該候補薬剤をアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤と評価する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法。
（２）ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記発現及び／又は活性が有意に亢進していると判断される、（１）の方法。
（３）ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び／又はGATA-1の結合活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記転写活性が有意に亢進していると判断される、（２）の方法。
（４）皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進させることによる、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法。
（５）ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性を亢進させることで前記発現及び／又は活性が有意に亢進される、（４）の方法。
（６）ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び／又はGATA-1の結合活性を亢進させることで前記発現及び／又は活性が有意に亢進される、（５）の方法。
（７）皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性が、対照の皮膚のものと比べ有意に低下している場合に、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向があると診断し、対照の皮膚のものと比べ同程度以上であるなら、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向がないと診断する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の素因を診断する方法。
（８）ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記発現及び／又は活性が有意に低下していると判断される、（７）の方法。
（９）転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び／又はGATA-1の結合活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記転写活性が低下していると判断される、（８）の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により確立された、ブレオマオシン水解酵素の発現の変動による新たな肌荒れメカニズム、特にブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を指標とするスクリーニング系に基づき、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の新規な改善剤の探索が可能となる。更に、本願発明の方法は、アトピー性皮膚炎によらない通常の乾燥肌の改善剤の探索にも適用可能であると考えられる。事実、本願の実施例では、ブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性が低い群では、有意にバリアー機能（経皮水分蒸散量：ＴＥＷＬ）が低下し、角層水分量も低下していた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】テープストリッピングにより得られたヒト皮膚抽出液中のブレオマイシン酵素量とテープストリッピングの回数との関係を示すウェスタンブロット図。
【図２】ヒト皮膚抽出液中のブレオマイシン酵素量と乾燥肌との関係を示すウェスタンブロット図。Ｔ，Ａ：乾燥を感じない被験者由来のサンプル；Ｎ：やや乾燥を感じる被験者由来のサンプル及び；Ｍ：乾燥を感じる被験者由来のサンプル。
【図３】ヒトの腕の角層抽出液中のブレオマイシン水解酵素量とその酵素活性との関係を示すグラフ。横軸の番号は被験者の識別番号を表す。
【図４】図３で得られたブレオマイシン水解酵素量と活性との関係についての最小二乗法による一次近似。
【図５】ヒトの腕の角層抽出液中のブレオマイシン水解酵素と皮膚パラメーター（Ａ：遊離アミノ酸、Ｂ：活性、Ｃ：ＴＥＷＬ）に関する統計的解析。BH low: ブレオマイシン水解酵素量＜１０、活性＜１．５（nmol/min/ml）; BH high: ブレオマイシン水解酵素量≧１０、活性≧１．５（nmol/min/ml）。
【図６】肌分類用アンケートフローチャート。
【図７】図６のフローチャートに従い分類された被験者の角層の皮膚パラメーター測定結果。
【図８】正常皮膚におけるブレオマイシン水解酵素及びフィラグリンの局在を示す組織染色図。
【図９】アトピー患者皮膚におけるブレオマイシン水解酵素及びフィラグリンの局在を示す組織染色図。
【図１０】定量的ＰＣＲを用いたケラチノサイトの分化とブレオマイシン水解酵素の発現量との関係を示すグラフ。縦軸の値は、８０％コンフルエントの発現量を１とした場合の相対量を表す。
【図１１】ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の５’フランキング領域を示す模式図。
【図１２】ヒト表皮ケラチノサイトを用いたＢＨプロモーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図１３】転写因子SP1, MZF1及びGATA1の発現とUV照射との関係を示すグラフ。
【図１４】正常ヒト表皮角化細胞におけるブレオマイシン水解酵素及びプロテアーゼの発現とUV照射との関係を示すグラフ。
【図１５】ＢＨの５’‐フランキング領域の連続的な５’‐欠失突然変異株をＰＣＲによって作成するために使用したプライマー。
【図１６】ＢＨ及び関連因子の転写レベルを定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって分析するために使用したプライマー。
【図１７】電気泳動移動度シフト分析に使用したプローブ。
【図１８】（Ａ）ヒトＢＨの５’−フランキング領域の模式図を示す。５’‐フランキング領域内の推定転写因子結合部位はＧｅｎｏｍｅ  Ｎｅｔ  ＭＯＴＩＦプログラムによる検索で明らかにした。（Ｂ）欠失分析で決定されたＢＨのプロモーター領域。（Ｃ）ＢＨの最小プロモーターの配列及び推定転写因子結合部位を含む−２１６／−１領域のヌクレオチド配列を示す推定転写因子結合部位に下線を付した。
【図１９】（Ａ）部位特異的突然変異誘発によるＢＨプロモーターにおける転写因子結合部位の特性決定。推定転写因子結合部位の欠失構築体の模式図及び培養ケラチノサイトにおけるそのルシフェラーザ活性を示す。部位特異的突然変異誘発は−６１６／＋１領域のヌクレオチド配列をまたぐ構築体で実施した。（Ｂ）ＢＨプロモーターのcis-作用エレメントに対するＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、又はＩＲＦ‐１／２の結合を示す。実験は、培養ケラチノサイトからの核抽出物、及び推定転写因子結合部位ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、又はＩＲＦ‐１／２を含むビオチン化二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いる電気泳動移動度シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）で行った。レーン１は核抽出物でのビオチニル化プローブの結合プロフィール、レーン２は２倍過剰量の非ラベル化プローブと競合させた後のビオチニル化プローブの結合プロフィールを示す。
【図２０】（Ａ）ＢＨ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。ＢＨ遺伝子発現に対するＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインの効果を示す。（Ｂ）ＩＲＦ‐１／２結合部位の突然変異分析。ＩＦＮ‐γの存在下での培養ケラチノサイトにおけるＢＨプロモーター活性を示す。ケラチノサイトをＢＨプロモーター領域のインタクトＩＲＦ‐１／２結合部位を含むｐＧＬ３−２１６でトランスフェクションし、ＩＦＮ‐γで２４時間処理した（上パネル）。ケラチノサイトを△ｐＧＬ３−６１６（ＩＲＦ‐１／２欠失突然変異体）でトランスフェクションし、10ng/mlのＩＦＮ‐γ又はＩＬ−４の存在下又は不在下で２４時間処理した（下パネル）。（Ｃ）ＩＲＦ‐１／２がＢＨのＩＦＮ‐γ誘発性下方調節の必須メディエーターであるかどうか判断するための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２遺伝子発現の測定。ケラチノサイトをＩＲＦ‐１又はＩＲＦ‐２のｓｉＲＮＡ（40nM)でトランスフェクションし、２４時間培養し、10ng/mlのＩＦＮ‐γで処理し、さらに２４時間培養してからＲＮＡ単離を行った。右パネルにはＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２のサイレンシングの効果を示す。
【図２１】（Ａ）表皮における転写調節の機構を調査するためのリアルタイムＰＣＲ法による増殖型又は分化型細胞におけるＢＨ、カルパインＩ、及び推定転写因子の発現分析。（Ｂ）培養ケラチノサイトにおける転写因子ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２発現パターン分析。
【図２２】（Ａ）推定転写因子ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２の発現に対するＩＦＮ‐γの効果。（Ｂ）推定転写因子ＩＲＦ‐１、ＩＲＦ‐２、ＭＺＦ−１及びＳｐ−１の発現に対するＩＬ‐４の効果。
【図２３】（Ａ）正常表皮での、抗ＢＨ抗体と抗フィラグリン抗体での二重染色により示される、顆粒層におけるＢＨとフィラグリンの同時局在。（Ｂ）ＡＤ患者の病変皮膚と非病変皮膚からの抽出物のＢＨ活性。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は第一の観点において、候補薬剤が、対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進する場合に、当該候補薬剤をアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤と評価する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法、を提供する。
【００１５】
ブレオマイシン水解酵素は分子量250〜280kDa（六量体）の細胞質システインペプチド加水分解酵素であり、当初知られていた機能は、癌の組み合わせ化学療法に頻繁に使用される糖ペプチドブレオマイシンの代謝不活性化である。システインタンパク質分解酵素パパインスーパーファミリーの特徴的な活性部位残基を含み、コード遺伝子はヒトでは遺伝子座17ｑ11.2に存在する(Takeda et al., J Biochem., 119, 29-36, 1996)。あらゆる組織に存在し、皮膚におけるその存在も知られていたが(Kamata et al., J. Biochem., 141, 69-76, 2007)、フィラグリンとの関係については本発明者が明らかにするまで全く知られていなかった。
【００１６】
組織染色の結果から、ブレオマイシン水解酵素は、フィラグリンと同様に、正常皮膚では表皮上層で多く発現していることが明らかになった（図８）。一方、アトピー性皮膚炎患者では、アトピー皮疹部で当該酵素及びフィラグリンの発現が低下する（図９）。これは、プロフィラグリン遺伝子の異常ではなく、その分解酵素系の異常がアトピー性皮膚炎の原因となることを強く示唆するものである。また、アトピー皮膚炎患者の皮膚では、病変部のみならず、非病変部でもブレオマイシン水解酵素活性は有意に低い（データは示さない）。
【００１７】
更に、ブレオマイシン水解酵素の発現量の変動について培養ケラチノサイトを用いて検討した結果、当該酵素は、分化していないケラチノサイトではあまり発現していないのに対し、コンフルエントに達し分化が進んだケラチノサイトで高発現していること、基底細胞ではほとんど発現せず、分化が進み表皮細胞へと移行してから高発現することが分かった（図１０）。この結果は、上記細胞染色の結果を裏づけている。
【００１８】
本発明に係るブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性の測定は、当該酵素の発現及び／又は活性を測定することのできる任意の方法に従い、例えばブレオマイシン水解酵素に特異的な抗体を利用する免疫測定方法、例えば酵素ラベルを利用するＥＬＩＳＡ法、放射性ラベルを利用するＲＩＡ法、免疫比濁法、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法等に従い、定量的又は定性的に実施することができる。免疫測定法の方式には競合法やサンドイッチ法が挙げられる。より具体的には、上記活性の測定は、例えば、シトルリンがブレオマイシン水解酵素にほぼ特異的な基質であるという性質を利用し、その蛍光合成基質であるＣｉｔ−ＭＣＡの分解を蛍光分光光度計で評価することで行うことができる。ブレオマイシン水解酵素量の測定は、当該酵素をコードする遺伝子の発現量の測定により行うこともできる。この場合、好ましくは、ブレオマイシン水解酵素の発現量は細胞内のブレオマイシン水解酵素をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定する。ｍＲＮＡの抽出、その量の定量的又は定性的測定も当業界において周知であり、例えばＰＣＲ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法など、さまざまな周知の方法により実施することができる。他に、ブレオマイシン水解酵素はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて定性的に決定することができる。
【００１９】
本発明のアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法において、候補薬剤が、対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進する場合に、当該薬剤はアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤と評価される。本発明の方法に従いスクリーニングされる薬剤は、乾燥肌、特に、アトピー性皮膚炎に起因する乾燥肌に有効と考えられる。
【００２０】
日本皮膚科学会アトピー性皮膚炎診療ガイドラインによると、「アトピー性皮膚炎」とは、増悪・寛解を繰り返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患であり、当該疾患は、掻痒の有無、特徴的皮疹として、紅斑，湿潤性紅斑，丘疹，漿液性丘疹，鱗屑，痂皮等の急性病変や、浸潤性紅斑・苔癬化病変，痒疹，鱗屑，痂皮等の慢性病変の有無に基づいて診断することができる。本明細書で使用する場合、「アトピー性皮膚炎による乾燥肌」とは、フィラグリン遺伝子の異常を含め、上記定義により確定診断がなされたアトピー性皮膚炎を伴う乾燥肌を意味する。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法は、試験する薬剤の存在下でブレオマイシン水解酵素をコードするｍＲＮＡの発現が亢進するのを通常のＰＣＲにより測定する方法、当該酵素発現に関与するプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子ベクターに挿入し、プロモーターアッセイ系として発現の強弱を直接測定する方法などがある。後者の場合、ＢＨのプロモーター領域はＢＨ発現が最大となる-２１６bpから-８１６bpの領域を使用することが好ましい。また、発現量の測定には、ルシフェラーゼのみならず、業界で一般に使用されているアザミグリーンなどの蛍光蛋白を使用すること可能である。これらの融合遺伝子を含むベクターを細胞に導入し、薬剤の存在下で細胞を培養し、通常２４時間後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、薬剤のＢＨ発現に及ぼす作用を測定できる。用いる細胞は、市販の正常表皮細胞（ＮＨＥＫ：クラボーなど）や不死化したＨａＣａＴ細胞などが使用できるが、これに限定されるものではない。ルシフェラーゼ活性の測定には、ロッシュダイアグノスティカのリスフェラーゼアッセイキットなどを使用することにより実施することが好ましい。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進」とは、乾燥肌改善効果、特にアトピー性皮膚炎による乾燥肌に対し改善効果がない対照薬剤と比較して、測定されたブレオマイシン水解酵素の発現量又は活性、あるいはその両方が、例えば、それぞれ120％以上、又は150％以上、又は200％以上である場合をいう。
【００２３】
ブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性の亢進は、当該酵素をコードする遺伝子の転写活性を亢進することによっても達成することができる。ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の５’−フランキング領域、特に転写調節領域と、当該領域に結合する転写因子とを図１１に示す。ブレオマイシン水解酵素が発現するには、上記転写調節領域は当該酵素のコード配列から２１６ｂｐ〜１２１６ｂｐ下流までの領域を有していればよい。高いブレオマイシン水解酵素活性を得る観点から、当該転写調節領域は８１６ｂｐ下流までの領域を含んでいることが好ましい。
【００２４】
ブレオマイシン水解酵素の発現には、当該酵素のコード配列から少なくとも２１６ｂｐ下流までの領域を含んでいればよい。図１１に記載の転写因子の中でも、この領域に含まれるIRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, GATA-1の結合活性を亢進することで、ブレオマイシン水解酵素の発現は特に亢進すると考えられる。事実、ブレオマイシン水解酵素は、紫外線（ＵＶ）照射によってその発現が亢進されるところ（データは示さない）、MZF-1, GATA-1の発現亢進とＵＶの強度及び照射時間との間には相関関係が見られる（図１３）。
【００２５】
ここで、候補薬剤によりブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性、又は当該遺伝子の転写調節領域に対する転写因子の結合活性は、対照薬剤と比較して有意に、例えばそれぞれ120％以上、又は150％以上、又は200％以上亢進される場合、ブレオマイシン水解酵素の発現量及び／又は活性が有意に亢進されているとみなすことができる。
【００２６】
ブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性は、サイトカインによっても影響を受ける。例えば、アトピー性皮膚炎に関与していることが知られている、Th2サイトカインの一種であるインターロイキン−４(IL-4)は、ブレオマイシン水解酵素の発現をダウンレギュレートする。これは、アトピー性皮膚炎患者の皮膚で見られるブレオマイシン水解酵素の低発現を裏付けるものである。一方、IL-4と反対にIgE産生を抑制する働きを有するTh1サイトカインの代表、インターフェロンγは、ブレオマオシン水解酵素の発現を有意に亢進する。また、Th2サイトカインで炎症性サイトカインの代表である腫瘍細胞壊死因子アルファ(TNFα)も当該酵素の発現を有意に亢進させる。これらの物質のみならず、ブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性は、ＵＶ照射によっても亢進される。結果は示さないが、体表面の中でも、紫外線照射を受けやすい頬などの皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の活性は、ＵＶ照射によって亢進されることが確認されている。
【００２７】
本発明は第二の観点において、皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進させることによる、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法、を提供する。
【００２８】
本発明のアトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法においては、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性を、例えば当該処置方法を施す前の皮膚における発現及び／又は活性と比べ、有意に亢進させる。「有意に亢進」とは、例えばブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性を120％以上、又は150％以上、又は200％以上の値にする場合をいう。
【００２９】
本発明の方法では、ブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性を有意に亢進させる任意の薬剤が使用される。また、当該酵素の発現や活性を亢進するものであれば、薬剤に限定されない。本発明の方法で使用する薬剤等は、皮膚への適用が可能でかつ本発明の目的を達成できる限り、任意の形態で皮膚に適用することができ、また単独で適用しても、あるいは他の任意の成分と共に配合して適用してもよい。また適用する皮膚の場所も限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。
【００３０】
本発明は第三の観点において、皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性が、対照の皮膚のものと比べ有意に低下している場合に、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向があると診断し、対照の皮膚のものと比べ同程度以上であるなら、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向がないと診断する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の素因を診断する方法、を提供する。
【００３１】
被験者の肌が乾燥肌か否かは、被験者、医師等の主観により判断するか、皮表水分測定器を用いて皮膚の水分量を測定することで行うことで客観的に判断することができる。例えば、本明細書の実験３で説明するとおり、図６に記載のフローチャートに従い、脂っぽさ、かさつきやすさ等に基づいて被験者等の主観により「乾燥肌」か否かを判断することもできる。
【００３２】
乾燥肌の判定は容易に行うことができるが、被験者の肌が「アトピー性皮膚炎による乾燥肌」の素因を有するかの判断は困難なことがある。本発明の診断方法によれば、被験者の現在の肌状態だけではなく、アトピー性皮膚炎による乾燥肌に罹りやすいか否かを診断することが可能となる。
【００３３】
「ブレオマオシン水解酵素の発現及び／又は活性が、対照の皮膚のものと比べ有意に低下」とは、例えば皮膚医学的見地から潤い肌であると医師により判断された正常な「対照の皮膚」と比べ、測定されたブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性が80％以下、又は70％以下、又は60％以下、又は50％以下、又は30％以下、又は10％以下である場合をいう。「対照の皮膚のものと比べ同程度以上」とは、例えば皮膚医学的見地から潤い肌であると医師により判断された正常な「対照の皮膚」と比べ、測定されたブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性が例えば80％以上、又は90％以上、又は100％以上である場合をいう。
【００３４】
被検体となる皮膚角層試料の採取は任意の方法で実施することができるが、簡便性の観点からテープストリッピング法が好ましい。テープストリッピングとは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付し、剥がし、皮膚角層をその剥がした粘着テープに付着させることで角層試料を採取する方法である。テープストリッピング法を利用すれば、角層をテープ一枚採取するだけでブレオマイシン水解酵素の発現や活性の測定が可能となり、ブレオマイシン水解酵素を指標とした、アトピー性皮膚炎による乾燥肌についての非侵襲性の評価方法が可能となる。テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば5×5cm）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばScotch Superstrength Mailing Tape (3M社製）、セロファンテープ（セロテープ（登録商標）；ニチバン株式会社）等が使用できる。
【００３５】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
本実験では以下の材料を使用した。
カルパインＩは、EMD Bioscience社より購入した。ブレオマイシン水解酵素は、ヒト表皮角層より、非特許文献５に従い作製した。ヒトＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γは、PEPROTECH EC（London, England）から購入した。ヒトＩＬ‐１３及びＩＬ‐１７Ａ／Ｆは、R&D SYSTEM（MINNEAPOLIS, MN）製のものとした。シトルリン４‐メチルクマリル‐７‐アミド（Ｃｉｔ‐ＭＣＡ）をBachem Bioscience（Bubendorf, Switzerland）から入手した。使用される他のすべての化学物質は、試薬グレードのものであった。【００３７】
ケラチノサイトの培養
新生児期表皮由来の正常ヒト表皮ケラチノサイト（Kurabo、Osaka, Japan）を、低濃度（０．０３ｍＭ）のカルシウム、及びＨＫＧＳ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Cascade Biologics）を含むＥｐｉＬｉｆｅ培地（Cascade Biologics、Portland, OR）中で培養した。すべての細胞を５％のＣＯ2を加えながら３７℃にてインキュベートし、そして継代４代以内に使用した。ケラチノサイトを、コンフルエント７０％、コンフルエント１００％、コンフルエントの２日後、及び２ｍＭのカルシウム中コンフルエントの２日後に採取した。【００３８】
実験１
ブレオマイシン水解酵素は、ＮＭＦ産生の最終段階で働いていると考えられる。この場合、乾燥肌では本酵素の発現が低下している可能性がある。本実験では、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性の低下が、乾燥肌と関連しているか否かについて検討した。【００３９】
皮膚角層試料は、透明粘着テープ（セロテープ（登録商標）(NICHIBAN)）を腕の皮膚表面に貼付したのち剥離するテープストリッピングにより採取した。皮膚角層の付着したこのテープを裁断、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８．０), ０．１４Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ-２０, １ｍｌ）に浸漬、超音波処理（２０ ｓｅｃ ×４）にかけ、角層抽出液を作成した。当該抽出液をウェスタンブロットにかけた。使用した抗ブレオマイシン水解酵素（ＢＨ）抗体は、鎌田ら（Journal of Biological Chemistry 2009）により作製された抗体を用いた。具体的には、角層抽出液をＳＤＳ電気泳動後、Immobilon-P (Millipore社)に転写し、この転写された膜を洗浄後、抗ＢＨ抗体と室温で１時間反応させた。さらに洗浄により抗体を除去したのち、ＨＲＰ結合二次抗体を反応させた。洗浄後、ECL Plus Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare)により発光させたＢＨ蛋白バンドをＸ線フィルムに焼付け、バンドの濃淡により、発現量を推定した。結果を図１及び図２に示す。【００４０】
図１中、検体１は本人が乾燥肌と自分で思っている人の皮膚角層試料であり、検体２は乾燥肌ではないと考えている健康な学生の皮膚角層試料である。また、図２中の検体Ｔ及びＡは、乾燥を感じない被験者由来のものであり、検体Ｎはやや乾燥すると感じる被験者、そして検体Ｍは乾燥を感じる被験者由来のものである。検体１中のブレオマイシン水解酵素の発現量は少なく、一方、検体２中の当該酵素発現量は多い。この結果から、検体１、２は、それぞれ乾燥肌、潤い肌に由来するものであることがわかる。また、検体１を用いた結果からは、乾燥肌では、ＮＭＦ産生の場である表皮表面に近いほど、ブレオマイシン水解酵素量が低下していることがわかる。図２において、検体ＴおよびＡは、特に乾燥を感じない検体から得られた抽出液、検体ＮおよびＭは、乾燥を強く意識する検体から得られた抽出液のウェスタンブロット像を示す。【００４１】
実験２
本実験では、ヒト皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の量や活性の個体差と、当該酵素量と活性の相関とについて検討した。実験１に記載の方法に従い、２０〜２５才の女子学生４０名の腕の皮膚から角層抽出液を作成した。当該抽出液中のブレオマイシン水解酵素量とその酵素活性を、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)らの方法に従い測定した。発現量はウェスタンブロットにより、そして酵素活性は、当該酵素のアミノペプチダーゼ活性について、蛍光基質であるＣｉｔ−β−ＮＡの分解量を測定することで評価した。結果を図３に、そしてその相関図を図４に示す。図４の結果から明らかなように、ブレオマイシン水解酵素量とその活性との間には相関関係が存在している。【００４２】
続いて、上記角層抽出液について、ブレオマイシン水解酵素と様々な皮膚パラメーターに関して統計的な解析を行った。本実験では、４０人の角層抽出液を以下の２種類に分類した。ウェスタンブロットの結果から明らかとなったブレオマイシン水解酵素量をデンシトメーターで数値化した後、１を任意の単位として表示した場合にブレオマイシン水解酵素量が１０未満であり、且つ当該酵素の活性が１．５nmol/min/ml未満である抽出液：ブレオマイシン水解酵素のタンパク質量が少なく、且つ活性が低いもの(BH low)；それ以外のもの：タンパク質量が多く、且つ活性が高いもの(BH high)。【００４３】
遊離アミノ酸は、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)らの方法に従い測定した。具体的には、カルパインＩで分解したフィラグリンペプチドと各抽出液とを反応させ、フルオレサミンを用いてアミノ基を定量することで遊離アミノ酸量を測定した。遊離アミノ酸の測定結果を図５Ａに示す。図５Ａ中の縦軸の単位は、測定試料３ｍｌ中の総遊離アミノ酸量(nmol）を表す。【００４４】
ブレオマイシン水解酵素の活性は、上述のとおり、当該酵素のアミノペプチダーゼ活性を、蛍光基質であるＣｉｔ−β−ＮＡの分解量を測定することで評価した。ブレオマイシン水解酵素活性の測定結果を図５Ｂに示す。図５Ｂ中の縦軸の単位は、Ｃｉｔ−β−ＮＡの分解量(nmol/min/ml)）を表す。【００４５】
上記学生の皮膚のTEWL は、Vapometer (Delfin Technologies, Ltd, Finland)を用いて測定し、 g/m2/hとして表示した。ＴＥＷＬの測定結果を図５Ｃに示す。【００４６】
図５Ｃに示すとおり、ブレオマイシン水解酵素活性の低い群（２．５Ｕ＜）と高い群とでは、角層水分量に有意な差が存在していた。更に、当該酵素の量と活性の両方が低い群では、遊離アミノ酸が少なく、そしてＴＥＷＬも高い（図５Ａ及び５Ｃ）。【００４７】
データは示さないが、遊離アミノ酸の低い群（1000<)と高い群とでは、NMF、ウロカニン酸の量に有意な差が、そしてNMFの低い群（0.8<)と高い群とでは、ウロカニン酸に有意な差が存在していた。また、TEWLの低い群（2.5<)と高い群とでは、NMF、乳酸、尿素に有意な差が存在していた。ウロカニン酸がフィラグリンに多数含まれるヒスチジンより作られることを考慮すると、ブレオマイシン水解酵素がフィラグリン分解において重要であることが分かる。【００４８】
本実験の結果から、ブレオマイシン水解酵素の絶対量が少ない場合、遊離アミノ酸量及びバリアー機能が共に有意に低下することが分かる。データは示さないが、頬由来の角層抽出液を用いた場合でも、ブレオマイシン水解酵素量とバリアー機能との比例関係が確認されている。【００４９】
実験３
本実験では、図６に記載のフローチャートに基づいて上記女子学生にアンケートを行い、各学生の肌を潤い肌、乾燥肌、乾燥型脂性肌、脂性肌の４つ分類した。アンケート結果と、上記実験２で測定した皮膚パラメーターの結果との相関関係を図７に示す。図７からは、脂性乾燥肌と分類された学生のブレオマイシン水解酵素活性が有意に高いことが分かる。【００５０】
実験４
本実験では、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素とフィラグリンの局在について検討する。【００５１】
免疫組織化学染色
免疫組織化学染色は、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)に記載の方法により行った。材料は５μｍ厚のヒト皮膚の冷凍切片、そして抗ラットＢＨ  ＩｇＧを用いた。詳しくは、ヒト皮膚標本を、インフォームドコンセントの上で、東京医科大学のアトピー性皮膚炎を患っている患者から得た。本研究は、倫理（Human Ethics）に関する東京医科大学施設内審査委員会と資生堂特別部会によって承認された。
ヒト・アトピー性皮膚炎（病変皮膚と非病変皮膚）及び正常皮膚の切片を、抗ラットＢＨ  ＩｇＧ及び抗ヒト・フィラグリンＩｇＧと共に室温にて１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、そして蛍光結合二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５又は４８８（Molecular Probes Inc.、Eugene, OR）と共にさらにインキュベートした。ＤＡＰＩ（４’，６’‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール；Molecular Probes）を核の可視化に使用した。【００５２】
正常皮膚の組織染色結果を図８に、そして健常者由来の皮膚（正常皮膚）とアトピー性皮膚炎患者由来の皮膚（アトピー皮疹部）との対比結果を図９に示す。図８に示すとおり、ブレオマイシン水解酵素は、表皮上層で高発現しており、フィラグリンと同一局在を示した。一方、アトピー皮疹部では、正常皮膚と比較してブレオマイシン水解酵素及びフィラグリンの発現が低かった（図９）。【００５３】
定量的ＰＣＲ
ケラチノサイトにおけるブレオマイシン水解酵素の発現量は、以下の方法で、定量的ＰＣＲにより測定した。Light Cycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 試薬はLight Cycler FastStart DNA Master CYBR Green Iを用いた。SYBR Green I master miｘ  10 μｌに以下のブレオマイシン水解酵素プライマーをそれぞれ 0.6 μｌ、水を6.8 μｌ加え、全量を20 μｌとし、95℃  15秒、55℃  20秒、72℃  20秒で、45サイクルのＰＣＲを行なった。得られた結果は、ハウスキーピング遺伝子であるG3PDHの結果と比較して補正した。
フォワードプライマー：  TGTGGTTTGGCTGTGATGTT （配列番号１）
リバースプライマー：    GCACCATCCTGATCATCCTT （配列番号２）【００５４】
上記定量的ＰＣＲの結果を図１０に示す。図１０に示すとおり、ブレオマイシン水解酵素は、８０％コンフルエントのケラチノサイト、すなわち、分化していないケラチノサイトと比較して、コンフルエントに達した、すなわち、分化したケラチノサイトで高発現していた。言い換えると、本実験結果から、当該酵素が分化前の基底細胞ではあまり発現しないことが分かる。この定量的ＰＣＲの結果は、上記組織染色の結果を裏付けるものである。【００５５】
実験５
１）ヒト表皮ケラチノサイトを用いたＢＨプロモーターのルシフェラーゼアッセイ：
増殖期（約80％コンフルエント）もしくは、分化後（コンフルエント後、空気曝露し、2  ｍＭカルシウムを添加し、さらに2日培養を継続したもの）のケラチノサイトに、Lysis buffer(200 μｌを加え、細胞を溶解させる。測定には、Bright-Glo Luciferase assay System (Promega Co., Madison, WI, USA)を用いた。サンプル20 μｌを所定のチューブに移し、Auto Lumat Plus (LB953)8Berthhold GmbH & Co. KG. Bad Wildbad Germany)を用いて測定した。図１２の結果から、ブレオマイシン水解酵素が発現するには、上記転写調節領域は、当該酵素のコード配列から少なくとも２１６ｂｐ下流までの領域を有していればよいことが分かる。【００５６】
２）ＮＨＥＫへのＵＶ照射:
30 mJもしくは、60 mJのUVBを照射し(Torex Fl20S-E-30/DMR, 20W, Toshiba Medical Supply)、3時間後、24時間後、48時間後に所定の方法にてRNAを回収し、定量PCRにより、ブレオマイシン水解酵素及びカルパインのmRNA発現を測定した。測定の結果、30mJ照射後48時間で回収した試料が最もブレオマイシン水解酵素のmRNAを発現していた（図１３）。【００５７】
３）ブレオマイシン発現に及ぼすサイトカインの影響
IL-4 (終濃度：０．１, 1.0, 10 ng/ml)、TNFα(終濃度：０．１, 1.0, 10 ng/ml)、IFNγ(終濃度： 1.0, 10, 100 ng/ml)のそれぞれを、増殖期の培養ケラチノサイトに添加し、２４時間インキュベートした後、Isogenを用いてＲＮＡを採取した。定量PCRにより、ブレオマイシン水解酵素のmRNA発現を測定した。結果を図１４に示す。図１４の結果から、Th2サイトカインの一種であるインターロイキン−４(IL-4)は、ブレオマイシン水解酵素の発現をダウンレギュレートすることが分かる。【００５８】
実験６
ヒトＢＨ遺伝子の特性決定
１）ＢＨの５’‐フランキング領域のクローニング
ヒトＢＨ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、５’‐フランキング領域を、遺伝子特異的プライマー１（ＧＳＰ１）、５’‐tccctcgagtctgtatcagagcagctaca‐３’（配列番号３）と遺伝子特異的プライマー２（ＧＳＰ２）、５’‐tgaacacgcgtccgagctgctcatggcg‐３’（配列番号４）を使用して、製造業者の取扱説明書に従いＧｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ（Clontech、Mountain View, CA）を用いて増幅した。簡単に言えば、５％のジメチルスルホキシドの存在下、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Takara、Shiga, Japan）を用いる、製造業者によって推奨されるツーステップＰＣＲプロトコール：９４℃にて２５秒間、そして７２℃にて４分間を７サイクル、それに続いて９４℃にて２５秒間、そして６７℃にて４分間を３２サイクル、そして最後の伸長６７℃にて４分間、を使用して、ＧＳＰ１とアダプタープライマー（ＡＰ）１を用いた一次ＰＣＲを実施した。次いで、一次ＰＣＲ混合物を希釈し、そしてＧＳＰ２とＡＰ２を用いた二次ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。７サイクルの代わりに５サイクルの初回サイクルと、それに続く３２サイクルの代わりに２０サイクルの使用を除いて、二次ＰＣＲは一次ＰＣＲと同一であった。ＢＨの５’‐フランキング領域の連続的な５’‐欠失突然変異株を、図１５に列挙したプライマーを使用したＰＣＲによって産出した。増幅後に、すべてのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ‐Ｔ簡易ベクター（Promega、Madison, WI）内にクローン化し、そしてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems、Foster City, CA）を用いて配列決定した。【００５９】
レポーター・プラスミドｐＧＬ３‐１２１６／＋１を構築するために、ＰＣＲを、以下の条件下：最初の変性９４℃にて４分間、９４℃にて３０秒間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間を３０サイクル、そして最後に伸長７２℃にて４分間、鋳型としてのｐＧＥＭ‐Ｔ‐１２１６／＋１、並びに制限部位Ｋｐｎ  Ｉ及びＭｌｕ  Ｉを含む１組の特異的なＢＨプライマー（５’‐ccgggtaccatcagagttccttagaa‐３’（配列番号５）及び５’‐taaatacgcgttggcgcccacgctgccg‐３’）（配列番号６）を使用して実施した。得られたＰＣＲ産物を、Ｋｐｎ  Ｉ及びＭｌｕ  Ｉで消化し、そしてｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃベクター（Promega）内にクローニングした。なお、ｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃベクターは、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。構築物のすべてを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（QIAGEN、Duesseldorf, Germany）を使用することで調製した。【００６０】
２）部位特異的突然変異誘発
ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、及びＩＲＦ‐１／２結合部位の突然変異誘発を、製造業者の取扱説明書に従ってＱｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Stratagene、La Jolla, CA）を使用することによって実施した。Ｓｐ‐１に欠失変異を作製するために、５’‐ggaccccgtttcagcctccccgcc-３’ （配列番号７）（突然変異体Ｓｐ‐１部位の順方向プライマー）と５’‐ggcggggaggctgaaacggggtcc‐３’ （配列番号８）（突然変異体Ｓｐ‐１部位の逆方向プライマー）を使用した。ＭＺＦ‐１突然変異体については、５’‐gactcagcaacgcggttttgtccctccgc‐３’（配列番号９）（突然変異体ＭＺＦ‐１部位の順方向プライマー）と５’‐gcggagggacaaaaccgcgttgctgagtca‐３’（配列番号１０）（突然変異体ＭＺＦ‐１部位の逆方向プライマー）を使用した。ＩＲＦ‐１／２突然変異体については、５’‐gccgccgagcctccggcgctcc‐３’ （配列番号１１）（突然変異体ＩＲＦ‐１／２部位の順方向プライマー）と５’‐ggagcgccggaggctcggcggc‐３’ （配列番号１２）（ＩＲＦ‐１／２部位の逆方向プライマー）を使用した。【００６１】
３）トランスフェンクションとプロモーター活性の計測
ケラチノサイトを、５×１０4細胞／ウェルの密度にて１２ウェル組織培養プレート内で培養し、そしてＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Roche Diagnostics、Basel, Switzerland）を使用して、それぞれの構築物１μｇを用いてトランスフェンクションした。トランスフェンクション効率を補正するために、すべての細胞にＨＳＶ‐ＴＫプロモーターの制御下にあるウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ‐ＴＫ］ベクターPromega）を同時トランスフェンクションした。特に断りのない限り、細胞を、トランスフェンクションの２４時間後に採集し、そして１ウェルあたり２５０μｌのＰａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓバッファー（Promega）を用いて溶解した。ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）及びＡｕｔｏｌｕｍａｔ  ｐｌｕｓ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Berthold Technologies、Bad Wildbad, Germany）を用いて分析した。ホタル・ルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性について標準化した。各構築物について、３つのトランスフェンクションを独立に実施し、そして結果を平均値として表した。【００６２】
４）定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ分析
ＢＨ及び関連因子の転写レベルを、定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって分析した。全ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene、Tokyo, Japan）を用いて培養細胞から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを、製造業者の取扱説明書に従ってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Roche Diagnostics）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｒａｉｄ  ｃｙｃｌｅｒシステムにより実施した。使用したプライマーに関する情報を、図１６に示す。グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を基準遺伝子として使用した。増幅した断片の特異性を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ分析ソフトウェアによる融解曲線の定量分析によって確認した。ｍＲＮＡの量を、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して標準化し、そして最終的に未処理対照のｍＲＮＡに対する比として示した。【００６３】
５）ＩＲＦ‐１及び‐２のｓｉＲＮＡベースの抑制
培養ケラチノサイトを、製造業者の取扱説明書に従って、４０ｎＭのｓｉＩＲＦ‐１、ｓｉＩＲＦ‐２、及びｓｉＣｏｎｔｒｏｌ  Ａ（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz, CA）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を使用してトランスフェンクションした。その細胞を、抗生物質不含培地中で２４時間培養し、その後、全ＲＮＡを抽出し、そして上記したように、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって分析した。【００６４】
６）電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖ビオチン化オリゴヌクレオチドと一本鎖未標識オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した（図１７）。核の抽出とＥＭＳＡを、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット及びＥＭＳＡ  ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔキット（Panomics、Santa Clara, CA）を使用することで実施した。核抽出物（４μｇ）を、１×結合バッファー及び１μｇのポリｄ（Ｉ‐Ｃ）、並びにＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＩＲＦ‐１／２、及びＧＡＴＡ‐１結合部位に対応するビオチン化プローブ（５０ｐｍｏｌ）と共に１５℃にて３０分間インキュベートした。競合アッセイのために、２倍の過剰の未標識プローブを、ビオチン化プローブの添加前に結合反応に加えた。これらのインキュベーション混合物を、次に、０．５×ＴＢＥバッファーと共に８％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてＢｉｏｄｙｎｅ  Ｂナイロン膜（Pall、Port Washington, NY）に転写した。ＥＭＳＡ  ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔキットの中の化学発光検出試薬を使用することで、バンドを可視化した。【００６５】
７）結果
ヒトＢＨ遺伝子プロモーターの単離と特性決定
Ｇｅｎｏｍｅ  Ｎｅｔ  ＭＯＴＩＦプログラムによる検索で、ヒトＢＨの５’‐フランキング領域内の多数の推定転写因子結合部位が明らかになった（図１８Ａ）。特に、転写開始部位の位置に近い−２１６／＋１領域の中に、ＭＺＦ１、Ｓｐ‐１、ＩＲＦ‐１／２、及びＧＡＴＡ‐１／２によって認識されるコンセンサス配列によく合致した配列が存在したので、これらの転写因子がＢＨプロモーター活性の調整にかかわっていることが示唆された。より厳密にＢＨのプロモーター領域を決定するために、欠失分析を実施した（図１８Ｂ）。最高レベルのルシフェラーゼ活性を、ｐＧＬ３‐８１６でトランスフェンクションした分化型ケラチノサイトにおいて検出した。しかしながら、欠失プラスミドの相対ルシフェラーゼ活性は、欠失がｐＧＬ３‐２１６に進むまで高いままで残っていた。構築体の中で、（ｐＧＬ３‐４４４と表示）断片−４４４／＋１を含むプラスミドは、培養ケラチノサイトにおいて有意に低い活性を示し、−６１６／−４４４領域における上流サプレッサー活性の存在が示唆された。これらの結果が−２１６／−１領域がＢＨ遺伝子転写のための最小プロモーターを含んでいることを実証したので、そのヌクレオチド配列を図１８Ｃに示す。この配列はＴＡＴＡ‐又はＣＣＡＡＴ‐ボックスを含んでいなかったので、この遺伝子のハウスキーピング性質が示唆された。その一方で、いくつかの転写性因子結合部位、例えばＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＩＲＦ‐１／２、及びＧＡＴＡ‐１／２などがこのコア・プロモーター領域に存在していた。【００６６】
ＢＨ遺伝子調節に関与する潜在的ｃｉｓ‐エレメントの同定
ＢＨ遺伝子発現の転写調節に関与する最小プロモーターの潜在的ｃｉｓ‐エレメントを決定するために、各ｃｉｓ‐エレメントを標的とした新しい一連の欠失突然変異株を構築した。ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、及びＩＲＦ‐１／２の結合部位を欠失した場合、プロモーター活性が大きく下方制御された（図１９Ａ）。
さらに、これらの転写因子が推定結合部位のそれぞれに実際に結合できるかどうか調査した。このために、電気泳動移動度シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）を培養ケラチノサイトからの核抽出物、及びＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、又はＩＲＦ‐１／２結合部位を含むビオチン化二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いて実施した。図１９Ｂに示されているように、Ｓｐ‐１、ＭＺＦ‐１、及びＩＲＦ１／２は、ＢＨプロモーターの対応する標的部位に結合したが、ＧＡＴＡ‐１／２は結合しなかった。これらの結果は、−２１６〜−１０５ｂｐのプロモーター領域のこれらの結合部位が、ＢＨ転写のためのｃｉｓ‐エレメントに不可欠であることを示している。【００６７】
ＢＨ遺伝子発現のサイトカイン媒介性調節
ＢＨはＮＭＦ産出酵素であるので、それがＡＤの病態生理に関与する可能性もある。よって、ＢＨ遺伝子発現に対するＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインの効果を調べた。図２０Ａは、増殖型ケラチノサイトにおいて、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ‐γが、用量依存的様式でＢＨ  ｍＲＮＡ発現を下方制御したことを示した。その一方、Ｔｈ２及びＴｈ１７サイトカインは、ＢＨの発現に対して有意な効果を全く示さなかった。同様の結果が分化型ケラチノサイトによって得られた（データ未掲載）。ＢＨ遺伝子発現の調整におけるＩＦＮ‐γの役割を解明するために、プロモーターアッセイを実施して、サイトカイン応答要素を特定した。図２０Ｂに示されているように、ＩＦＮ‐γは、−１３１〜−１２０の間にＩＲＦ‐１／２結合配列を含んだｐＧＬ３‐ＢＨ‐６１６でトランスフェンクションした培養ケラチノサイトにおいてＢＨプロモーター活性を下方制御した。この配列の欠失後には、ＩＦＮ‐γがプロモーター活性を抑制することはもうなかった（図２０Ｂ）。加えて、ＩＲＦ‐１／２がＢＨのＩＦＮ‐γ誘発性下方調節の必須メディエーターであるかどうか判断するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２遺伝子発現を抑制した。ＩＦＮ‐γの活性は、ＩＲＦ‐１又は‐２  ｓｉＲＮＡ（４０ｎＭ）のいずれかでトランスフェンクションした培養ケラチノサイトにおいて有意に抑制された（図２０Ｃ）。これらの結果は、ＩＲＦ‐１／２結合配列がＢＨ遺伝子発現のＩＦＮ‐γ誘発性下方調節に不可欠であることを強く示唆している。【００６８】
培養ケラチノサイトにおけるＢＨ及び関連因子の発現
表皮における転写調節の機構を調査するために、リアルタイムＰＣＲ法によって増殖型又は分化型細胞におけるＢＨ、カルパインＩ、及び推定転写因子の発現を分析した。図２１Ａに示されているように、ＢＨ  ｍＲＮＡは、例えば、増殖型ケラチノサイトと比較した、集密期の２日後のもの（３．６倍）、及び高カルシウム濃度にて培養したもの（８．６倍）などのように、分化型ケラチノサイトにおいて上方制御された。これらの結果は、プロモーターアッセイデータと一致している（図１８Ｂ）。同様の結果を、カルパインＩ（約２．５倍の上方制御）に関して得た。また、培養ケラチノサイトにおいて、様々な転写因子、例えば、ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２などの発現パターンを調べた。図２１Ｂに示されているように、これらの転写因子は、ＢＨの発現に沿って、分化型ケラチノサイトにおいて上方制御された。しかしながら、ＧＡＴＡ‐１  ｍＲＮＡ発現は、他の因子と比較して有意に低かった（＜１／３２）。ＧＡＴＡ‐１はケラチノサイトにおいて重要な役割を担っていないように思われる。よって、ＢＨがＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１を介して分化依存的様式で合成されることを示唆する。ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２がまた、分化刺激によっても上方制御されたという事実は、ＢＨ発現がＩＦＮ‐γに対して非常に感受性であることを示している。【００６９】
推定転写因子の発現に対するＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの効果
これらの転写因子のサイトカイン依存性調節についてさらに調査した。図２２Ａは、ＩＦＮ‐γが、用量依存式にＩＲＦ‐１  ｍＲＮＡ発現を強く上方制御したことを示す。同様に、ＩＲＦ‐２発現は、ＩＦＮ‐γの存在下で上方制御された。対照的に、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２の発現は、１００ｎｇ／ｍｌにおいてのみＩＬ‐４の存在下で有意に増強された（図２２Ｂ）。興味深いことに、ＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１は共に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐４の存在下で最も効果的に下方制御された（図２２Ｃ）。これらの結果は、ＢＨ発現が、それぞれ、直接的及び間接的にＴｈ１及びＴｈ２サイトカインによって調節されていることを示唆している。【００７０】
アトピー性皮膚炎皮膚においてＢＨは下方制御される
ＦＬＧの機能喪失型突然変異はＡＤの発症機序に関連するが、遺伝子欠損だけではなく、分解経路の障害もまたＡＤの病理に関連する可能性がある。そのため、ＡＤ患者の病変皮膚及び非病変皮膚におけるＢＨ及びフィラグリンの局在、並びにＢＨ活性を次に調べた。正常表皮では、抗ＢＨ抗体と抗フィラグリン抗体での二重染色は、上面表皮における、特に、先に報告されたように、顆粒層におけるＢＨとフィラグリンの同時局在を示した（図２３Ａ）。より高い倍率では、ＢＨが顆粒層から角化層までに局所している一方で、フィラグリンが顆粒細胞に限定されていることが明確に示された。対照的に、ＢＨ発現は、この研究で診察したＡＤ患者（ｎ＝７）の病変皮膚及び非病変皮膚において劇的に減少した。これらの患者のすべては、有意な染色が常に検出されたにもかかわらず、比較的弱いフィラグリン染色を示した（図２３Ａ）。免疫組織化学に加えて、ＢＨ活性を１８人のＡＤ患者及び３０人の健常ボランティアから得たテープ剥離サンプルからの角質細胞抽出物において計測した。ＡＤ患者の病変皮膚と非病変皮膚からの抽出物は、健常人からのそれと比較して、（それぞれ２７．１と８．８％まで）実質的に低いＢＨ活性を示した（図２３Ｂ）。これらの結果は、ＢＨがフィラグリンと同時局在化され、そしてその活性がＡＤを患っている患者の皮膚において劇的に低減されることを実証した。【００７１】
考察
この研究では、ＢＨ遺伝子発現の調節機序を、プロモーター領域のクローニング及び機能の特徴づけによって研究した。プロモーター解析では、−２１６ｂｐ上流の中にＢＨプロモーター活性にとって重要な領域を同定した（図１８Ｂ）。この領域では、推定ＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１結合部位が、ＢＨプロモーター活性に対して有意な効果を示した（図１８Ｃ及び１９Ａ）。興味深いことに、Ｓｐ‐１及びＭＺＦ‐１もまた、フィラグリン分解の開始にとって重要な酵素であるＰＡＤ１の調整に関与することが報告されている。Ｓｐ‐１は、哺乳動物細胞において転写因子として機能するジンク・フィンガー・タンパク質のＳｐ／Ｋｒｕｐｐｅｌ様ファミリーの典型的なメンバーである。増殖、アポトーシス、分化、及び腫瘍性形質転換を含めた細胞機能のほとんどすべての面に関与すると考えられる。ヒト表皮において、Ｓｐ‐１は、インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ、ＰＡＤ１、２、及び３のそれを含めて、表皮分化に参加する遺伝子の重要な調節因子である。ＭＺＦ‐１は、ジンク・フィンガー・タンパク質のＫｒｕｐｐｌｅファミリーに属する転写因子であり、分化全能性造血性細胞、並びに骨髄始原細胞において発現される。しかしながら、哺乳動物表皮における転写調節でのＭＺＦ‐１の機能は報告されていない。増殖型ケラチノサイトと比較して、分化型ケラチノサイトにおいてＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１、並びにＢＨを同時に上方制御することを見つけ（図２１Ｂ）、ハウスキーピング的な役割よりむしろ分化におけるＢＨの役割を示した。我々の結果は、これらの転写因子がケラチノサイト最終分化中のＢＨの基本的な転写調節のための活性化因子として機能することを明確に示した。
その一方で、ｃｉｓ作用エレメントの調査は、この領域内のＩＲＦ‐１／２結合部位をさらに規定した。ＥＭＳＡを使用して、ＢＨプロモーター領域へのＩＲＦｓの直接結合を確認した（図１９Ｂ）。この結合配列の部位特異的突然変異誘発は、ＢＨプロモーター活性の有意な減少をもたらした（図１９Ａ）。そのため、ＩＲＦ‐１／２転写因子もまた、基本条件の下、ＢＨ遺伝子の最小プロモーター活性に必要であろう。ＩＲＦファミリーは転写因子の群であり、今までのところ、９つのＩＲＦメンバー（ＩＲＦ‐１〜‐９）が様々な細胞型及び組織で同定された。これらのＩＲＦ分子は、ＩＦＮ‐α、β、及びγによる刺激の下で、抗ウイルス防御、免疫応答／調節、及び細胞成長調節において役割を果たしている。ＩＲＦ‐１及び‐２は、多くのＩＦＮ‐γ誘導性遺伝子の調整に関与する作動薬‐拮抗薬対として機能することが示されている。興味深いことに、ＩＦＮ‐γは、ＢＨ  ｍＲＮＡ発現を顕著に抑制した（図２０Ａ及びＢ）。ノックダウン及び部位特異的突然変異誘発分析では、ＩＲＦ‐１／２結合部位がＢＨ発現のＩＦＮ‐γ媒介性抑制に関与することを確認した（図２０Ｂ及びＣ）。これらの結果は、ＩＲＦ‐１／２がヒトケラチノサイトにおけるＢＨ遺伝子のＩＦＮ‐γ媒介性下方調節のメディエーターであることを明確に示している。その一方で、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ‐４及びＩＬ‐１３は、２４時間のインキュベーションの間、直接的な作用をまったく示さなかった（図２０Ａ）。しかしながら、これらのＴｈ２サイトカインは、アクチベーター分子であるＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１の発現を有意に抑制した。よって、Ｔｈ２サイトカインがＢＨ発現を負に調節するのは妥当なことである。【００７２】
また、ＢＨが病変及び非病変ＡＤ皮膚において劇的に下方制御されたことも示した（図２３Ａ及びＢ）。フィラグリン突然変異はＡＤなどのバリアー障害関連疾患の主な危険因子であるが、突然変異分析では、アイルランドでの発生の５０％未満、そして日本での〜２０％の割合しか占めていないことが指摘された。フィラグリン合成不全だけではなく、フィラグリンの分解傷害もバリアー機能の崩壊に関与すると仮定した。ＮＭＦの減少が乾燥肌をもたらし、それがバリアーの崩壊を進行させることは明確である。ＡＤがＴｈ２極性化疾患であることは周知である。しかしながら、最近の報告は、Ｔｈ１サイトカインもまたＡＤにおいて役割を担っていることを示唆している。例えば、「内因性ＡＤ」は、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、及びＩＬ‐１３の低い発現、及びＩＦＮ‐γの高い発現によって免疫学的に特徴づけられる。加えて、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトが、ＡＤ皮膚における急性相から慢性相への間に起こる。我々の結果は、ＡＤにおいて、ＩＦＮ‐γが考えられていたより重要な役割を担っている可能性もあることを示している。【００７３】
結論として、我々の結果は、ヒト表皮におけるＢＨ転写が二重様式で調節されることを示している。一方の経路はケラチノサイト最終分化の制御下にあり、そして、もう一方はＴｈ１及びＴｈ２サイトカインに依存している。これらの経路は、相互に関連しているので、バランスがＢＨ発現の下方調節に向かって容易にシフトするであろう。ＢＨの低下がＮＭＦの不足をもたらし、それを受けて乾燥肌か、さらにはバリアーの崩壊につながる。これらの結果は、ＢＨ調整とＡＤの発症機序への新しい見識を提供する。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図１９】
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【図２３】
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【配列表】
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