(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子の製造方法であって、
エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒から、５０℃における粘度が１０００ｍＰａ・ｓ以上６５００ｍＰａ・ｓ以下の原液を調製する原液調製工程と、
前記原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、５℃以上５５℃以下の、前記エチレン−ビニルアルコール共重合体の貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程と、
を経て、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である多孔質粒子を得る多孔質粒子の製造方法。
【請求項２】
前記成形工程で得られた粒子を次亜塩素酸で表面改質する表面改質工程をさらに備える、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体は、エチレン含量が２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記良溶媒は、ジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記貧溶媒は、水、又は前記良溶媒を含む水である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下であり、比表面積が１０ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下である、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子。
【請求項７】
請求項６記載の多孔質粒子からなる、直接体液灌流吸着材用担体。
【請求項８】
前記体液は血液又は血漿である、請求項７記載の担体。
【請求項９】
前記吸着材はＩｇＧ吸着材である、請求項７又は８に記載の担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、臨床検査法の進歩により、疾患の原因あるいは進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患に対する自己抗体や免疫複合体である。
【０００３】
体液中の悪性物質を除去する目的で従来知られている技術としては、（１）活性炭あるいは親水性高分子材料で表面を被覆した活性炭により血液から悪性物質を除去しようというもの、（２）血液を血球部分と血漿部分に分離し、自己免疫疾患における抗原、抗体、免疫複合体等の悪性物質を含む患者血漿を他の新鮮血漿と入れ替える血漿交換療法、（３）（２）と同様にして分離した血漿から、該血漿中に含まれる悪性物質を吸着材により吸着除去しようというもの、（４）（２）と同様にして分離した血漿を濾過器に通して、高分子量の悪性物質を除去しようとするもの等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、（１）の方法は直接血液を処理できるものの、活性炭は吸着選択性が悪く、また、細孔が小さいので高分子量の悪性物質をほとんど吸着できない。数多くの種類の疾患において、疾患の進行あるいは原因と密接な関係にある悪性物質が知られるようになり、この悪性物質を体液中より選択的に除去する要請が高まっているが、活性炭をベースとする吸着材では、この要求を満たすことができない。
【０００５】
また、（２）の方法は、（ｉ）多量の新鮮凍結血漿を必要とし、供給面の制約より一般的に普及できるものではない、（ｉｉ）他人の血漿を利用するため、ウィルスや未知の病原体、あるいはＨｂ抗原等の感染の危険が高い、といった欠点がある。
【０００６】
さらに、（３）の方法は、（２）が孕む欠点を克服するものではあるが、悪性物質の除去に用いる吸着材の存在により、（ｉｉｉ）プライミングボリュームが著しく増加せざるをえず、治療時の患者の生理的負担を増大させる、（ｉｖ）血液から血漿を分離する工程と、血漿から悪性物質を除去する工程とを同時に制御するための装置、及び高度に訓練された施術者を要する等の問題を内在している。
【０００７】
（４）の方法は高分子量の悪性物質を効果的に除去する目的においては重要な治療方法のひとつではあるが、技術要素の構成としては（３）の吸着除去工程が濾過工程に置き換わっているだけである。原理的には、濾過膜の孔径サイズを利用した分子篩効果で物質を分離しようとするものであり、ある特定の分子量範囲に限定した除去効果しか期待できず、選択的除去はできない。また、（３）が孕む問題を本質的に解決するものではない。
【０００８】
これらの問題点を解決する上で、直接血液灌流（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）により血液から悪性物質を直接除去しうる血液浄化器あるいは血液浄化装置は意義深い。例えば、特許文献１に見られるような中空繊維の内表面や外表面に、抗体、抗原、酵素等を固定して対応する抗原、抗体等の悪性物質を吸着除去する試みにおいては、血漿分離工程と悪性物質の吸着除去工程がひとつのデバイスで同時に行われるため、プライミングボリューム増加や治療技術難易度の増加といった問題が解決しうると期待されるが、中空糸の細孔部分をも含めた多孔体全表面を利用したものは少なく、また、吸着能力が低いために実用化されたものはない。
【０００９】
体液中の悪性物質を除去可能な実用的且つ汎用性の高い吸着材を提供するための担体に求められる要素は、（Ｉ）直接血液灌流を行うことができる、（ＩＩ）除去対象となる悪性物質の分子量領域で効果的に分子篩効果を発揮して、悪性物質を担体内部に浸透させうる細孔を有する、（ＩＩＩ）除去対象となる悪性物質を十分に吸着するだけの担体全表面積を有する、といった特徴である。
【００１０】
元来、上記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）のような特徴を有するものとしては、アフィニティクロマトグラフィ用の担体がよく知られるところであり、天然高分子系担体、ポリアクリルアミド系担体、ガラス系担体等がその代表例である。上記自己免疫疾患に深く関与していると考えられているＩｇＧ（分子量１５万Ｄａ）等、分子量２０万Ｄａ未満の分子を分離する技術としては、バイオプロセスにおける分離・精製工程で上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いる例が広く知られている。但し、バイオプロセスにおける分離・精製過程では、上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体からなる分離材に供されるＩｇＧ等の分子量２０万未満の分子を含む試料は、数段階の前処理工程を経て粗精製されており、微粒子等の不溶物並びに不要な分子が除去されていることが一般的である。こうした前処理工程によって、ＩｇＧ等の分子量２０万未満の分子を含む試料が上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体からなる分離材を流れる際の圧力損失等の問題は飛躍的に低減し、分離・精製の選択性は向上する。
【００１１】
一方、上記のようなアフィニティクロマトグラフィ用担体を体液中の悪性物質を吸着除去する体外循環治療に用いる場合には、次のような種々の問題点がある。すなわち、セルロースやデキストラン、あるいはアガロースに代表される天然系高分子担体は、ロイコペニア、スロンボサイトペニアを招来するといった化学的・生理学的な問題点の他、軟質ゲルであるためにゲル充填カラムに体液を高流速で流すことができないといった物理的問題がある。ポリアクリルアミド系担体は、物理的・化学的に比較的安定であるという長所を有するものの、血漿タンパクを非特異的に吸着し、アクリルアミドの残留毒性も無視し得ないという短所を有する。ガラス系担体も物理的・化学的安定性を有するものの、血漿タンパクの非特異吸着が著しく、また血液処理に用いる場合には血栓形成を引き起こすことから好ましくない。以上の問題点により、公知のアフィニティクロマトグラフィ用担体を体外循環治療用、とりわけ直接血液灌流用に使用することは困難であった。
【００１２】
他方、エチレン−ビニルアルコール共重合体は凝固・線溶系各因子や血小板に対する影響が軽度であり、優れた血液抗凝固性を有する材料であることが知られている。また補体・免疫系に対する影響も軽度であり、生体適合性の高い人工透析膜として実用化されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許２８１４３９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、これまでに、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含み、直接体液灌流に使用可能で、分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる、吸着材の担体、並びにその製造方法は実用化されていなかった。
【００１５】
そこで、本発明は、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材の担体及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供するものである。
【００１７】
［１］  エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子の製造方法であって、
エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒から、５０℃における粘度が１０００ｍＰａ・ｓ以上６５００ｍＰａ・ｓ以下の原液を調製する原液調製工程と、
前記原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、５℃以上５５℃以下の、前記エチレン−ビニルアルコール共重合体の貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程と、
を経て、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である多孔質粒子を得る多孔質粒子の製造方法。
［２］  前記成形工程で得られた粒子を次亜塩素酸で表面改質する表面改質工程をさらに備える、［１］記載の製造方法。
［３］  前記エチレン−ビニルアルコール共重合体は、エチレン含量が２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］  前記良溶媒は、ジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］  前記貧溶媒は、水、又は前記良溶媒を含む水である、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。なお、貧溶媒に添加可能な良溶媒は、上記原液に使用する良溶媒と同種類であるが、使用可能な良溶媒は多種存在するため、原液用の良溶媒と貧溶媒に添加する良溶媒は全く同一の溶媒である必要はない。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法で得ることのできる、多孔質粒子。
［７］  排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下であり、比表面積が１０ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下である、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子。
［８］  ［６］又は［７］記載の多孔質粒子からなる、直接体液灌流吸着材用担体。当該発明は、担体がリガンドを有する場合は、リガンドを有する直接体液灌流吸着材の担体を製造するための、［６］又は［７］記載の多孔質粒子の使用、と表現することもできる。
［９］  前記体液は血液又は血漿である、［８］記載の担体。
［１０］  前記吸着材はＩｇＧ吸着材である、［８］又は［９］に記載の担体。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を製造するための多孔質粒子及びその製造方法を提供することができる。また、本発明の多孔質粒子を担体として、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例２で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【図２】実施例１２で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【図３】比較例１で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、本発明を限定するものではない。
【００２１】
本発明の実施の形態に係る血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の病因物質を高い効率、かつ高い選択性で除去できる吸着材に使用できる多孔質粒子は、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンからなる組成物で製造される。エチレン−ビニルアルコール共重合体のエチレン含量は、２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下であることが好ましい。また、実施の形態に係る多孔質粒子は、９０μｍ以上６００μｍ以下の平均粒径を有し、空孔率が７０％以上の多孔質粒子であることが好ましい。実施の形態に係る多孔質粒子を担体として吸着材を製造すれば、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を高い効率、かつ高い選択性で除去し得る。この際、該粒子を一体型に加工してモノリス状にして用いてもよい。
【００２２】
ここでいう「エチレン−ビニルアルコール共重合体」とはエチレンとビニルアルコールとの共重合体であるが、一般的には酢酸ビニルモノマーとエチレンとを共重合させて得られるエチレン−酢酸ビニル共重合体を鹸化して製造される。エチレン−ビニルアルコール共重合体は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれのタイプの共重合体であってもよい。
【００２３】
なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体において、エチレン含量が２０％未満であると、親水性が高くなるため、製造時に使用する、凝固物を形成させるべき貧溶媒への溶解性が増してしまい、多孔質粒子の成形が困難になる。また、エチレン含量が５０ｍｏｌ％を超えると、球状に造粒するのが困難になる傾向が強くなると同時に、製造時に使用する、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンを溶解させる良溶媒への溶解性が低下してくる。エチレン−ビニルアルコール共重合体のエチレン含量は、２４ｍｏｌ％以上４８ｍｏｌ％以下がより好ましい。
【００２４】
エチレン−ビニルアルコール共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）の範囲は、１万Ｄａ以上３００万Ｄａ以下であることが好ましく、１万５千Ｄａ以上１５０万Ｄａ以下であることがより好ましい。Ｍｗが１万Ｄａ未満の場合、滅菌処理、特に放射線滅菌処理を実施した際にポリマーの分子量が低下し、水等の貧溶媒に対する溶出量が増加する傾向にある。またＭｗが３００万Ｄａを超えると、溶剤への溶解度が低下する傾向にあり、さらに重合の際、安定して製造できない傾向にある等の懸念がある。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体のＭｗは種々の公知の方法により求められるが、本発明の実施の形態においては、ポリエチレンオキサイドを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる測定を採用している。
【００２５】
エチレン−ビニルアルコール共重合体と共に多孔質粒子を構成するポリビニルピロリドンの重量平均分子量（Ｍｗ）は、２，０００Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲が好ましく、２，０００Ｄａ以上１００万Ｄａ以下の範囲がより好ましく、２，０００Ｄａ以上１０万Ｄａ以下の範囲がさらに好ましいほか、より大きい排除限界分子量を得る観点から、２万Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲がより好ましく、２０万Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲がさらに好ましい。重量平均分子量が２，０００Ｄａより小さいと、多孔質粒子がフィブリルを有する場合に、フィブリル内部に空隙を有する構造を発現させる効果が低くなる傾向にあり、２００万Ｄａを超えると、成形するときの粘度が上昇して、成形が難しくなる傾向にある。なお、ポリビニルピロリドンのＭｗは、エチレン−ビニルアルコール共重合体のＭｗと同様の方法により測定可能である。なお、原液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの比率（質量比）は、エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対してポリビニルピロリドン０．０１〜１００質量部、好ましくは０．１〜１００質量部、さらに好ましくは０．５〜１００質量部、最も好ましくは７．５〜１００質量部である。
【００２６】
本発明の実施の形態に係る、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である、多孔質粒子の製造は、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及び良溶媒の混合物からなる原液をノズルから吐出し、空走部を経た後（すなわち空走部を通過させた後）、貧溶媒の中に浸漬させ、溶媒交換によりポリマーのゲル化（粒子状の凝固）を行わせて多孔質体を形成する湿式相分離法を原理とする。これらの過程で良溶媒の比率が減少し、それにつれてミクロ相分離が生じ、ポリマーの小球が形成され、成長し、絡み合い、フィブリルが形成され、フィブリルの隙間が連通孔となり、多孔質粒子が形成される。
【００２７】
このように、多孔質粒子は複数のフィブリルから形成されているが、このフィブリルは内部に空隙を有し表面が開口していることが好ましい。フィブリルの平均径は通常０．０１μｍ〜５０μｍであり、フィブリル表面の開孔径は、通常０．００１μｍ〜５μｍである。また、フィブリル間の隙間は通常０．０１μｍ〜５μｍである。
【００２８】
良溶媒は、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンとを共に溶解するものであればよい。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等であり、好ましくはジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである。これらの良溶媒は１種又は混合溶媒としてもよい。原液中の良溶媒の含有量は、原液の総質量を基準として、５０質量％以上９８質量％以下であることが好ましく、７０質量％以上９５質量％以下であることがより好ましい。
【００２９】
貧溶媒はエチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解しないがポリビニルピロリドンを溶解するものであればよい。例えば水、上記良溶媒を含む水等である。貧溶媒中に良溶媒を含有させることにより、凝固の速度を種々変化させることができ、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドン混合物からのポリビニルピロリドンの溶出の程度を制御することができる。
【００３０】
水溶性高分子であるポリビニルピロリドンは、上記相分離過程においてフィブリルの表面からその分子鎖を一部、あたかもヒゲのように伸ばすため、フィブリルの表面は親水性に保たれ、疎水的吸着の抑制効果が期待できる。
【００３１】
上記多孔質粒子の製造方法において、「空走部を通過させる」とは、ノズルから吐出された原液が、すぐに貧溶媒に接触しないように、一旦、空気中（又は不活性ガス等の気体中）を通過させることをいう。
【００３２】
また、多孔質粒子の製造において原液として使用するエチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及び良溶媒の混合物は、５０℃における粘度が１０００ｍＰａ・ｓ以上６５００ｍＰａ・ｓ以下でなければならない。５０℃における粘度は、より好ましくは、１０００ｍＰａ・ｓ以上５３００ｍＰａ・ｓ以下である。１０００ｍＰａ・ｓ未満の場合、吐出される原液中のポリマー濃度が低いために貧溶媒中での凝固の進行が遅く、貧溶媒の中に浸漬される際の気液界面において受ける衝撃により粒子が変形し易くなり、特に６００ｍＰａ・ｓ以下では液滴の凝固が極めて困難になる。一方、６５００ｍＰａ・ｓを超すとノズルからの吐出が困難となる。なお、原液の粘度は、回転粘度計を用いて、回転数２０ｒｐｍとしたときの測定値である。
【００３３】
多孔質粒子の製造方法において、原液を浸漬して相分離を行うための貧溶媒の温度は５℃以上５５℃以下でなければならない。貧溶媒の温度は、より好ましくは、１０℃以上４０℃以下であり、さらに好ましくは１０℃以上３０℃以下である。５℃未満であると、貧溶媒の凝固点に近づくため製造が困難になる傾向にある。また、５５℃よりも高い温度であると、得られる多孔質粒子の比表面積が１０ｍ２／ｇ未満となり、本発明の実施の形態に係る血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を高い効率、かつ高い選択性で除去できる吸着材に使用できる多孔質粒子を得ることが困難になる。
【００３４】
本発明の実施の形態に係る多孔質粒子の製造においては、上述した成形工程を経た後、エッチング、アニーリング等の処理によって粒子を改変させてもよい。改変方法としては、例えば、次亜塩素酸処理やポリマーのガラス転移温度以上結晶化温度未満の温度状況下でのインキュベート等がある。次亜塩素酸を用いる際の濃度については１００ｐｐｍ以上８０００ｐｐｍ以下が好ましい。多孔質粒子表面を次亜塩素酸処理にて改質させることにより、空孔径、空孔率、比表面積を増大させることができる。
【００３５】
多孔質粒子の「平均粒径」は、真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子の直径の平均値を指し、非真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子について、マイクロスコープで任意の方向の径を２回／個計測したときの平均値を指す。多孔質粒子の平均粒径は、好ましくは９０μｍ以上６００μｍ以下である。平均粒径が９０μｍより小さいと、粒子間の空隙が狭くなって血液が通りにくくなり、圧力損失が増加する傾向にある。平均粒径が６００μｍより大きいと、単位体積当たりの粒子表面積が小さくなり、吸着効率が低下しやすくなる傾向にある。
【００３６】
多孔質粒子の「比表面積」は、１０ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることが好ましく、より好ましくは２５ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であり、さらに好ましくは４５ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下である。比表面積が１０ｍ２／ｇ未満になると、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を十分に吸着するための表面積を確保できない。一方、６５ｍ２／ｇよりも大きい場合、上記多孔質粒子の空孔率が増大して血液、血漿をはじめとする体液を灌流した場合の圧力損失に耐えうるだけの強度を確保できなくなるか、あるいは排除限界分子量が２０万Ｄａ未満となる傾向がある。
【００３７】
比表面積は、乾燥粒子単位重量あたりに吸着した窒素ガスが占有する表面積で表される。つまり比表面積は単位重量の粒子を構成する物質が乾燥状態でいかに有効に表面を形成しているかを示している。多孔質粒子の比表面積は、高分子ゲルの比表面積を求める際に最も一般的な窒素ガスによるＢＥＴ法で求められる。一般に高分子ゲルは、そのゲルと親和性のある媒体中で膨潤し、乾燥すると収縮する。膨潤時に媒体が満たされているポアが架橋の網目のみで維持されている軟質ゲルの場合は、乾燥すると網目がつぶれてしまい、ポアはほとんど消失する。この場合の比表面積は、ほとんど粒子の外側だけの値になるため、一般に１ｍ２／ｇ以下の低い値を示す。従来アフィニティクロマトグラフィ用として知られているアガロースは軟質ゲルであるため、乾燥によってポアが消失してしまう。さらには、つぶれやすい軟質の網目を持っているために、カラムに充填し体外循環に用いる場合にも、体液を長時間、高流速で流すことはできない。一方、ポアがしっかりした構造を持ち、凍結乾燥に耐える硬質ゲルである場合には、乾燥した際にポアは多少収縮するものの膨潤時の状態をほとんど維持する。つまり、硬質ゲルはパーマネントポアを有し、比表面積は一般的に軟質ゲルよりも高い値を示す。
【００３８】
上述したような原液の調製（原液調製工程）、ポリマーのゲル化（粒子状の凝固）の工程（成形工程）、及び、必要に応じて粒子の改変、特に粒子を表面改質する工程（表面改質工程）を経る方法により、本発明の実施の形態に係る多孔質粒子が得られる。この方法では、原液調製工程において原液の粘度を上記特定の範囲とし、成形工程において貧溶媒の温度を上記特定の範囲とし、さらに必要に応じて適切な条件で表面改質工程を行うことによって、２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下という特定範囲の排除限界分子量を有する多孔質粒子を得ることが可能となる。
【００３９】
多孔質粒子には公知の方法を用いて様々なリガンドを結合させて、直接体液灌流吸着材を製造することができる。リガンドとしては、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド、低分子化合物が使用可能であり、目的に応じて適宜選択すればよい。多孔質粒子にリガンドを結合させることにより、分子量２０万Ｄａ未満の抗原、抗体等の悪性物質、特にＩｇＧを高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を得ることができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。なお、実施例においては、多孔質粒子の種々の物性を、以下の方法で測定した。
【００４１】
（平均粒径）
マイクロスコープ（株式会社キーエンス製、商品名：ＶＨ７０００）を用いて、多孔質粒子の粒径を測定した。多孔質粒子が真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子について直径を測定し、その平均値を平均粒径とし、他方、非真球の場合は任意に選んだ１０個の多孔質粒子について、マイクロスコープで任意の方向の径を２回／個計測し、その平均値を平均粒径とした。
【００４２】
（比表面積）
ＴｒｉＳｔａｒ３０００（株式会社島津製作所製）を用いて、窒素ガス吸着によるＢＥＴ法により、多孔質粒子の比表面積を求めた。測定に用いるサンプルは乾燥している必要があるため、本発明では水で膨潤させた多孔質粒子を凍結乾燥し、これをサンプルとして測定に用いた。
【００４３】
（排除限界分子量）
実施例及び比較例で得られる多孔質粒子を純水で膨潤させ、超音波処理による脱気泡操作の後、内径７．６ｍｍφ、カラム長５ｃｍの高速液体クロマトグラフィー用空カラム（ジーエルサイエンス株式会社製）に充填し、スパナを用いてこれを閉じ、排除限界分子量評価用カラムとした。該カラムを高速液体クロマトグラフィー装置（株式会社島津製作所製、商品名：ＬＣ２０Ａ）に接続した後、流速０．１ｍＬ／分にてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流し、ＲＩ検出器によるモニター画面にてベースラインが一定となるまで流し続けた。ベースラインが安定化した後、標準分子量物質としてプルランＰ８００（分子量７８８ＫＤａ）、Ｐ４００（分子量４０４ＫＤａ）、Ｐ２００（分子量２１２ＫＤａ）、Ｐ１００（分子量１１２ＫＤａ）、Ｐ５０（分子量４７．３ＫＤａ）、Ｐ２０（分子量２２．８ＫＤａ）、Ｐ１０（分子量１１．８ＫＤａ）、Ｐ５（分子量５．９ＫＤａ）（昭和電工株式会社製）、エチレングリコール（和光純薬工業株式会社製）、及びヒトＩｇＧ（シグマ・アルドリッチ株式会社製）を溶解させたＰＢＳ溶液を各々調製し、これら標準分子量物質溶液を順次注入して保持時間（分）を測定した。さらに、分子量に対し、下記式により算出される溶出容量（ｍＬ）を各々プロットして分画分子量曲線を得た。
溶出容量（ｍＬ）＝流速（ｍＬ／分）×保持時間（分）
【００４４】
上記分画分子量曲線中、グラフ縦軸に平行で且つプルランＰ８００の点を通る直線Ａと、直線Ａよりもグラフ右側に位置する点のうち最も溶出容量の小さな点における接線Ｂとの交点をＣとしたとき、交点Ｃの分子量を排除限界分子量とした。
排除限界分子量とは、一般にカラムに充填した充填剤の微細孔の中に入ることのできない最も小さな分子量の物質が有する分子量のことを言う。排除限界分子量以上の分子量の物質は上記充填剤の微細孔に入ることができず、また、分子量の高低によらず微細孔外の同一容積の空間を流れることになるので、同一の溶出容量を与える。一方、排除限界分子量未満の分子量の物質については、分子量の高低によって微細孔内への浸透し易さに差が生じるため、低分子量の物質ほど溶出容量が大きくなる。但し、ある分子量よりも低い分子量の物質になると、微細孔内に完全に浸透しきってしまうために同一の溶出容量を与える。
【００４５】
（実施例１）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（株式会社クラレ製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）２００ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））９０ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）１７１０ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
【００４６】
得られたポリマー原液をノズル（内径０．５５ｍｍ）から吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、５５℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４１０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００４７】
得られた多孔質粒子をカラムに充填し、室温でヘパリン加生理食塩水（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）を１０ｍＬ流し、プライミングを行った。その後、抗凝固剤としてヘパリンを添加したヒト新鮮血液（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）１０．３ｍＬを、室温下、流速１２．３ｍＬ／ｈでシリンジポンプにより流したところ、溶血することなく流れることを確認した。この際、カラムに接続された回路の内圧は２．１ＫＰａ以下で推移した。
【００４８】
（実施例２）
５０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径４３３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００４９】
得られた多孔質粒子１０ｍＬを、２．６ｍＬの水酸化ナトリウム水溶液（濃度１６．７Ｍ）、１４ｍＬのＤＭＳＯ及び１２ｍＬのエピクロロヒドリンからなる反応溶液に添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応後の多孔質粒子をグラスフィルター３Ｇで濾過回収し、純水で十分に洗浄した後、２−（２−アミノエチル）チオフェンを濃度５．９ｇ／Ｌで含むｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液２０ｍＬ中、５０℃で１７時間攪拌し、反応させた。反応後の多孔質粒子をグラスフィルター３Ｇで濾過回収し、５０℃の温水で洗浄した。反応前後の反応溶液の紫外吸光度変化から、１ｍＬの多孔質粒子あたり２−（２−アミノエチル）チオフェンは８７μｍｏｌ固定化されたことがわかった。
【００５０】
得られた２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子１ｍＬを、室温でヘパリン加生理食塩水（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）１０ｍＬで洗浄した後、ポリプロピレンチューブ中で抗凝固剤としてヘパリンを添加したヒト新鮮血液（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）２ｍＬと混合し、ミックスローターを用いて室温下２時間攪拌した。攪拌終了後、多孔質粒子をコマフィルターで濾過して除き、回収された血液から３５００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理で血漿を分離した。得られた血漿に対して、アルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの濃度測定を実施した。下記の式により定義される除去率は各々３４％、８２％、５％であった。
除去率（％）＝｛１−（処理後の濃度／処理前の濃度）｝×１００
【００５１】
（実施例３）
４０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５８７μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５２】
（実施例４）
３０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５９６μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５３】
（実施例５）
２０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５４９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５４】
（実施例６）
１０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５５０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５５】
（実施例７）
５℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５６２μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５６】
（実施例８）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）８０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））６ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４１４ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径５３１μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５７】
（実施例９）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）４０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））１８ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４４２ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径５３２μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５８】
（実施例１０）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｍ１００Ｂ（商品名）、エチレン含量２４ｍｏｌ％）３８．５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製  Ｌｕｖｉｔｅｃ、Ｋ８５（商品名））３８．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４２３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４６０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００５９】
（実施例１１）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｇ１５６Ｂ（商品名）、エチレン含量４８ｍｏｌ％）２８．５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））２８．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬株式会社製）４４３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４９５μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６０】
（実施例１２）
実施例２と同様の工程を経て得られた多孔質粒子１０ｍＬをファルコンチューブに移し入れ、５０００ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加した後、５０℃で２時間振盪した。振盪後の多孔質粒子を回収し、純水にて洗浄を行い、平均粒径４３３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図２に各々示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
上記で得られた多孔質粒子を用いて、実施例２と同様の方法にて２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子を作製し、血液中のアルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの除去率を求めたところ、各々４０％、９０％、１０％であった。
【００６１】
（実施例１３）
内径０．１５ｍｍのノズルを用いて吐出した以外は実施例５と同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径１０１μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６２】
（比較例１）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にてポリマー原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径４００μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、分画分子量曲線を図３に示す。
上記で得られた多孔質粒子を用いて、実施例２と同様の方法により、２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子を得、同様の洗浄操作を行った。粒子１ｍＬ当たり、８０μｍｏｌの２−（２−アミノエチル）チオフェンが固定化された。この粒子を用いて、実施例２と同様の方法で血液中のアルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの除去率を求めたところ、各々１０％、７％、５％であった。
【００６３】
（比較例２）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）５０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））１３．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４３６．５ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、６０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径３９９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００６４】
（比較例３）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）５０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））６ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４４４ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、６０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径３９８μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００６５】
（比較例４）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）６０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））２７ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４１３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出しようとしたが、ポリマー原液の粘度が高く吐出することができなかった。物性を表１に示す。
【００６６】
（比較例５）
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％）２５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ  Ｋ８５（商品名））１１．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４６３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一なポリマー原液（混合液）を得た。
得られたポリマー原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、５０℃の水からなる凝固浴槽中に着液させたところ、ポリマー原液は凝固しなかった。物性を表１に示す。
【００６７】
【表１】
0005875779.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の多孔質粒子の製造方法は、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去する直接体液灌流吸着材の担体の製造方法として有用である。
【図１】
0005875779.tif 000003
【図２】
0005875779.tif 000004
【図３】
0005875779.tif 000005