(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出するための方法であって、
細胞周期停止状態モデル又は分裂終了細胞モデルとして、機能障害性テロメアを含む変異酵母の一種であるｃｄｃ１３−１を用いて、１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングしてそれらの抗老化作用を監視するものであり、
前記スクリーニングは、
(i)  テロメア機能不全により細胞周期が止められた条件のもとで化合物又は組成物を酵母細胞と培養する工程と、
(ii) 
(iii)  培養の温度を低下させることにより細胞周期が止められる条件を取り除き、生き残った細胞の数を測定する工程と、
(iv)  前記工程(iii)で得られた生き残った細胞の数を、前記工程(i)と同じ条件の下、しかし前記化合物又は組成物の不存在下の対照実験で得られた生き残った細胞の数と比較する工程と、
を含み、
前記対照実験との比較で、前記工程(iii)で得られた生き残った細胞の数の増加は、その培養された化合物又は組成物が抗老化剤の候補であることを示すものである、ことを特徴とする、加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出するための方法。
【請求項２】
抗老化作用が、
(a)老化細胞又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態の悪化を防ぐこと、
(b)ミトコンドリア機能を刺激、改善または維持すること、
(c)ミトコンドリア又はテロメアの機能喪失に関連する加齢に伴う病気を予防すること、又は、
(d)活性酸素種(ROS)の増大又はテロメア機能不全によって誘発されるアポトーシス死の増加を防ぐこと、
から選ばれるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、加齢に伴う病気（疾患または障害）が、異常増殖性疾患、変性疾患、または機能低下疾患である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
(v)  同定される化合物又は組成物を一定時間、哺乳類の老化細胞と培養する工程と、
(vi)  生き残った老化細胞の個体群を測定する工程と、
(vii)  前記(vi)の生き残った哺乳類の老化細胞の個体群を、対照実験で得られた生き残った老化細胞の個体群と比較する工程と、
を更に含み、
前記対照実験との比較で、生き残った哺乳類の老化細胞の個体群の増加は、前記哺乳類の老化細胞と共に培養された化合物又は組成物が抗老化剤の候補であることを確認するものである、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
(viii)  同定される化合物又は組成物を一定期間、正常増殖ヒト細胞と培養する工程と、
(ix)  ミトコンドリア質量、ミトコンドリアＤＮＡ含量、又はミトコンドリア転写因子の発現を測定することによってヒト細胞のミトコンドリア生合成を測定する工程と、
(x)  前記工程(ix)の結果を対照実験の結果と比較する工程と、
を更に含み、
対照実験と比べて前記工程(ix)で得られたミトコンドリア生合成の増進は、同定された化合物又は組成物が抗老化剤の候補であることを更に確認する、方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
(i)  前記化合物又は組成物を含む生物試料を溶媒で希釈する工程、
(ii)  テロメア機能不全により酵母細胞の細胞周期が止められた条件の下で前記希釈された試料を変異酵母細胞と培養する工程、
(iii)  細胞周期が止められる条件を取り除くと共に、生き残った酵母細胞の数を測定する工程、及び、
(iv)  工程(iii)で得られた生き残った細胞の数を、培養工程(ii)と同じ条件での対照実験（但し、その対照実験では前記の生物試料の化合物又は組成物を含まない）において生き残った細胞の数と比較する工程、を含み、
前記対照実験での生き残り細胞数と比較して前記工程(iii)で得られた生き残り細胞の数が増えていることは、前記生物試料が抗老化剤を内包することを示唆するものである、ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
(i)  前記化合物又は組成物を含む生物試料を溶媒で希釈する工程、
(ii)  テロメア機能不全により酵母細胞の細胞周期が止められた条件の下で前記希釈された試料を変異酵母細胞と培養する工程、
(iii)  細胞周期が止められる条件を取り除くと共に、生き残った酵母細胞の数を測定する工程、
(iv)  工程(iii)で得られた生き残った細胞の数を、培養工程(ii)と同じ条件での対照実験（但し、その対照実験では前記の生物試料の化合物又は組成物を含まない）において生き残った細胞の数と比較する工程、
(v)  対象となる生物試料を希釈するために使われた溶媒を用いて、異なる既知濃度の精製抗老化剤を有する複数の標準溶液を調製する工程、
(vi)  上記の（ii）から(iv)の各工程を繰り返す工程、
(vii)  工程(vi)で得られた生き残り細胞数をその対応する抗老化剤濃度に対してプロットして、標準方程式及び／又は標準曲線を得る工程、
(viii)  工程(iv)で得られた生き残った酵母細胞の数を、工程(vii)で得られた抗老化剤の濃度と生き残り酵母細胞の数との間の予め確立された標準方程式又は標準曲線にあてはめて、抗老化剤の生物学的濃度を計算する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、当該方法は更に、
栄養素、TOR、AMPK、ミトコンドリア、老化経路のうちの少なくとも一つの構成成分に対して当該方法で同定される薬剤の活性を測定すること、を含み、
但し、前記薬剤は、
(a)  老化もしくは分裂終了細胞において細胞周期停止状態を維持する、
(b)  ミトコンドリアの劣化を防止する、
(c)  老化もしくは分裂終了細胞において細胞周期停止状態の劣化を防止する、又は、
(d)  老化悪化に続く異常増殖もしくは細胞死を防止する、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は出願日が２００９年４月１０日である米国仮出願第６１/１６８,３１１号及び出願日が２００９年４月１０日である米国仮出願第６１/１６８,３３５号の３５U.S.C.§１１９(e)の権利を主張し、それら全体で参照として組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、新規抗老化剤、これら薬剤を検出又は同定する新規方法、及びそのように同定される抗老化剤の加齢に伴う病気の予防及び／又は治療への使用ｉに関する。また、本発明は、生物試料における抗老化剤の抗老化生物濃度を測定する新規方法を関する。特に、本発明は、各種の加齢に伴う病気を予防又は治療するためのカロリー制限を模倣する抗老化剤として低用量のラパマイシン又はその類似物、他のラパマイシンの標的(TOR)阻害剤の使用を紹介する。
【背景技術】
【０００３】
人間の老化過程に関する研究は重要なものであり、その理由の一つは老人では多くの疾患又は病気（例えば、いくつかの例を挙げてみると、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、心不全、及び心臓発作）がより顕著になるが、そのうちの多くには効果的な予防又は治療方法がない。そこで、動物老化過程に関する研究によって加齢に伴う病気へのより効果的な予防又は治療方法の探索は、この１０年間で科学界が行った最も重要な努力の一つになりました。豊かな文献が老化過程を理解するのに役立つが、この過程を完全に理解することがまだ人類にとって大きな科学的課題である。世界中の老人及び健康管理負担とそれに関連した費用の増加を考えると、加齢に伴う疾患又は病気の予防又は治療する抗老化剤を効果的に発見できる老化過程の系統的な研究が、ますます重要になっている。本発明は、加齢に伴う疾患又は病気を効果的に予防及び／又は治療する抗老化剤の発見への効果的な方法を提供することを目指している系統的方法を説明する。
【０００４】
加齢に伴う病気の治療に役立な理論に由来する、老化過程及び方法に関する各種の理論の中でも、栄養素シグナル伝達経路(カロリー制限)、糸粒体経路(活性酸素種、又はROSと呼ばれる)、及びテロメア機能不全理論が目立つ。
【０００５】
栄養素シグナル伝達経路(カロリー制限)及び老化。
カロリー制限(CR)は、酵母ないし哺乳類の老化速度を遅らせる最も実用的な方法として認められていました。カロリー制限は、加齢に伴う病気（例えば霊長類モデルにおけるパーキンソン病(Maswood,N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,１０１:１８１７１-６(２００４)、アルツハイマー病(Qin,W.等,J.Alzeheimer’s Dis.,１０:４１７-４２２(２００６)、Dahl-SSラットモデルにおける高血圧及び心臓障害(Seymour,E.M.等,J.Mol.Cell Cardiol.,４１:６６１-６６８(２００６)、線維症(Castello,L.等, FASEB J.,１９:１８６３-１８６５(２００５)、及び腎臓病(Yu, B.P.等/J.Gerontol.,３７:１３０-１４１(１９８２)）の発生率を低下させる又は発症を遅らせることが示されてきました。カロリー制限もさまざまな自然発生腫瘍を抑制するかつ人間乳房、結腸及び前立腺の癌の発生を減少させる(Platz,E.A.,J.Nutr.,１３２:３４７１S-８１S(２００２);Steinbach,G.等,Cancer Res.,５４:１１９４-１１９７(１９９４); Michels, K.B.等,JAMA,２９１:１２２６-３０(２００４)に概説された。
【０００６】
よく保存されたキナーゼTOR(ラパマイシンの標的)は、栄養素、細胞分裂増殖因子、エネルギー及びストレスからの信号統合し異化作用及び同化作用(Fingar,D.C,等, Oncogene,２３:３１５１-３１７１(２００４))を調節する。最適な成長因子及び栄養素に応えて、哺乳類のTOR(mTOR)は、細胞の合成能力(例えば、リボソーム生合成及びタンパク質翻訳開始)を刺激して細胞量とサイズの増加につながり、かつ増殖を加速させる(Kim,E.等,Hum.Gene Ther.,１４:１４１５-１４２８(２００３))。逆に、成長因子除去、栄養飢餓、又はストレスによるTORの抑制は、高エネルギー消費過程のダウンレギュレーション及び増殖の抑制につながる。
【０００７】
TOR経路は、出芽酵母、シノラブディス・エレガンスCaenorhabditis elegans）及びショウジョウバエ（Drosophila）におけてカロリー制限により引き起こされる寿命延長に重要な役割を果たす(Kaeberlein,M.等,Science,３１０:１１９３-１１９６(２００５);Powers,R.W.等,Genes Dev.,２０:１７４-８４(２００６); Vellai,T.等,Nature,４２６:６２０(２００３); Kapahi,P.等,Curr.Biol,１４:８８５-８９０(２００４);Jia,K.等,Development,１３１:３８９７-３９０６(２００４))。ラパマイシンの標的の機能がよく保存されるために、その老化への役割も人間に適用する。
【０００８】
糸粒体（ミトコンドリア）／活性酸素種及び老化。
糸粒体は酸化的リン酸化の過程により代謝燃料(例えば、グルコース及び脂肪酸)を利用可能な形のエネルギーであるアデノシン5’-三リン酸(ATP)に変換することに関与する細胞器官である。糸粒体は適切な細胞機能にとって重要な他の過程（カルシウム恒常性、細胞内情報伝達、及びアポトーシスの制御を含む）に関与する。
【０００９】
また、糸粒体にはATP産生の酸化的リン酸化の過程は細胞内活性酸素種(ROS)の主要な源(約９０%の細胞の総活性酸素種)(Balaban, R.S.,等,Cell,１２０:４８３-４９５(２００５))。正常な生理学的条件下で、酸化的リン酸化の過程の間１〜５%の酸素がROS産生に消費されることと推定する(Chance,B.,等, Physiol.Rev.,５９:５２７-６０５(１９７９))。ミトコンドリアDNA(mtDNA)の限られた修復能及び親酸性のために、糸粒体が特に損傷の蓄積を受けやすい。mtDNAにおける変異は酸化的リン酸化の機能障害をもたらしてROS産生の増加及び後続のより多くの変異の蓄積をなる。活性酸素種は高反応性の分子であり細胞への多様な傷害を起こすことができるため、活性酸素種の危険な周期が老化の間に酸化損傷の急激な増加の主な原因となると考えられている、老化過程を特徴付ける機能の減少を徐々にもたらす。
【００１０】
活性酸素種は多くの加齢に伴う病気（例えば、糖尿病、心血管疾患、癌及びパーキンソン病）と関係がある可能性がある(Kovacic, P.等,Curr.Med.Chem.,８:７７３-７９６(２００１);Aviram,M.等, Am.J.Clin.Nutr.,７１:１０６２-１０７６(２０００); Maassen,J.A.等,J.Endocrinol.Invest,２５:４７７-４８４(２００２))。真核生物宿主抗酸化防御系を発展させるのも、内因性活性酸素種産生に重要な役割 (Mates,J.M.,Toxicology,１５３:８３-１０４(２０００))及びキィロショウジョウバエ寿命を延長する面でスーパーオキシドジスムターゼとカタラーゼの過剰発見を支持する(Orr,W.C.等, Science,２６３:１１２８-１１３０(１９９４))。
【００１１】
先行研究は年齢の関数として測定してミトコンドリア膜電位の減少、ミトコンドリアの数、及びATP産生/酸素消費量を含むミトコンドリア機能完全性減少を提示する(Hagen,T.M.等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,９４:３０６４-３０６９,１９９７;Greco,M.等,FASEB J.,１７:１７０６-１７０８(２００３))。ミトコンドリア機能の変異が多くの失明、難聴、運動障害、認知症、心血管疾患、筋力低下、腎機能障害、及び内分泌疾患を含む臨床症状を持つ人間遺伝病をを引き起こし、また、劇的なミトコンドリアDNA変異のマウスは(mtDNA ポリメラーゼ PoIgA校正-欠損変異のために)若干の早期老化表現型と伴うより短い寿命を示すと報告していた(Trifunovic, A.等,Nature,４２９:４１７-４２３(２００４))。さらに、酵母の寿命延長(実際の寿命)はTORIの欠失により、シノラブディス・エレガンスはグルコース制限により達つことが、全部ミトコンドリア呼吸作用の経路として実現できて報告していた。(Bonawitz, N.D.等, Cell Metab. ５:２３３-２３５(２００７); Schulz,TJ.等,Cell Metab.,６:２８０-２９３(２００７))。これら結果は哺乳類の老化及び加齢に伴う病気におけるミトコンドリア機能の重要な役割を示唆する。しかし、反対の結果も報告されたことがあった。例えば、出芽酵母のグルコース制限による寿命延長がミトコンドリア機能に依存しないと報告された(Kaeberlein,M.等,PIoS Genet.,1, e６９(２００５))。そこで、老化過程における糸粒体の役割はまだ不明である。
【００１２】
テロメア、老化、加齢及び癌。
テロメアは染色体の端に多くのGを含む繰り返しDNA配列だ。テロメアはテロメア結合タンパク質を通じて固定して自然発生の二本鎖DNA切断(DSB)の過程に識別されない。
【００１３】
人間の多くの体細胞にテロメラーゼ活性欠損、DNAポリメラーゼによるDNA複製内部の問題発生のためにテロメア進行性短縮を起こしてから機能障害をもたらす。最後に顕著な短縮のテロメアはテロメア結合タンパク質により固定できなくなって自然発生のDSBとして暴露してからDNA損傷応答を活性化しRB及びp５３に依存する細胞周期停止を引き起こす。この過程は複製老化と呼ばれる。また、老化は同じDNA損傷応答を通じて癌遺伝子の活性化により誘発されて、腫瘍抑制に役立する(Di Micco, R.等, Nature,４４４:６３８-６４２(２００６); Bartkova,J.等,Nature,４４４:６３３-６３７(２００６))。また、DNA損傷薬剤も老化を引き起こすことが報告された。
【００１４】
テロメア結合タンパク質欠陥がある場合には、テロメア機能不全も発生する。例えば、優性−陰性のTTAGGG反復結合因子２(TRF２)の表現とテロメア1保護はかい(POTl)が同じ,テロメア機能不全及びDNA損傷信号をもたらす(Karlseder,J.等, Science,２８３:１３２１-１３２５(１９９９); Denchi, E.L.等, Nature,４４８:１０６８-１０７１(２００７); Guo, X.等,EMBO J.,２６:４７０９-４７１９(２００７))。
【００１５】
長いテロメアが人間の長寿と関係があり、短いテロメアが癌、特発性肺線維症及びさまざまな増殖性組織疾患と関係する。例えば、人間のテロメラーゼ変異が先天性角化異常症を引き起こす、患者は特に骨髄不全で早期死亡する。
【００１６】
癌細胞が限られた複製能を需要するから、複製老化は腫瘍進行にとって障壁であることが示されてきた。実に、マウスモデルにおける進行癌と人間癌の場合に老化のマーカーが癌前病変のスデージに顕著であるが進行癌に不可測定になった。(Braig, M.等,Nature,４３６:６６０-６６５(２００５); Collado,M.等, Nature ４３６:６４２(２００５); Michaloglou,C等, Nature,４３６:７２０-７２４(２００５))。すべての癌はテロメラーゼを活性化したり、組み換えにより選択的テロメアを通じて老化を回避する。(Shay,J.W.等,Exp.Cell.Res.,２０９:４５-５２(１９９３); Shay,J.W.等,Eur.J.Cancer,３３:７８７-７９１(１９９７); Kim,N.W.等, Science,６６:２０１１-２０１５(１９９４); Bryan,T.M.等, Nat.Med.,３:２７１-２７４(１９９７))。早期前立腺癌の悪性への進行は老化に阻まれている(Chen, Z.等, Nature,４３６:７２５-７３０(２００５))。また、テロメラーゼ変異体マウスTerc-/-にはテロメア機能不全により誘発される自然に腫瘍形成がp５３媒介老化によって抑制されることが示された(Cosme-Blanco,W.等,EMBO Rep.８:４９７-５０３(２００７))。老化が細胞周期を阻止しかつ修復を促進することが認められて、初期病変の進行を阻止する。
【００１７】
老化は年齢の主なインデックスと認められている。(Campisi, J., Nat. Rev.Cancer,３:３３９-４９; Faragher,R.G.,Biochem.Soc.Trans.,２８:２２１-２２６(２０００))。例えば、哺乳類の組織において老化細胞は年齢とともに増加する(Campisi,J.,Cell,１２０:１-１０(２００５))。老化細胞は加齢性の病理学病変、例えば変形性関節症及びアテローム性動脈硬化症にも発見される(Price,J.S.等,Aging Cell,１:５７-６５(２００２); Vasile E.等., FASEB J.,１５:４５８-４６６(２００１); Matthews,C等, Cir.Res.,９９:１５６-１６４(２００６))。さらに、マウスにおける慢性の活性p５３は細胞の老化を促進しても加齢に伴う表現も加速する。(Maier, B.等,Genes Dev.,１８:３０６-３１９(２００４); Tyner等.,Nature,４１５:４５-５３(２００２))。また、老化細胞が腫瘍進行及び炎症反応を促進するタンパク質を分泌することが示されていた(Coppe, J.P.等, PlosBiology,６:２８５３-２８６８(２００８))。プログラム老化が加齢に伴う病気及び限られた寿命につながることを提案された(Blagosklonny, M.V.,Cell Cycle,５:２０８７-２１０２(２００６))。そこで、テロメアを通じて抗老化研究は今、老化の阻止が重点になった。
【００１８】
すべての研究にもかかわらず、テロメアの老化過程における役割はまだ不明である。例えば、マウスは人間に比べて長いテロメアがあるが寿命が短いことを説明できない。テロメアは分裂終了細胞になんの役割を果すかがまだ不明である。
【００１９】
他の老化理論も提案された。例えば、タンパク質損傷蓄積理論、DNA変異蓄積理論、及び幹細胞消耗理論。それらの中のどの理論は老化過程の本質、及び／又は、どのようにして互いに関係するかがまだ不明である。そこで、まだ人間の老化過程は少なくともある程度までは謎である。
【００２０】
癌、心血管疾患、及び神経退行性疾患という加齢に伴う病気は、人間死亡の主な原因である。これらの加齢に伴う病気の治療ための医薬品は特定の疾患への現在の理解の上で検索されて、老化過程に関する理解も限られていた。その結果、今までこれら疾患に対する研究は互いにつながらなくて老化過程とも関連していないのだ。そこで、老化過程に基づいて加齢に伴う病気の予防及び治療ための新規抗老化剤の発見ための体系的アプローチを開発する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】特開２０００−１０９４０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明はこの前に述べた需要によって老化過程の新規機序及び新規方法を披露して新規機序により加齢に伴う病気の予防及び／又は治療効果がある抗老化剤を同定又は検出することを提供する。新規方法は各種よく理解された酵母変異体モデルにおいてハイスループット・スクリーニングを通じて速く新規抗老化剤を同定できることを本明細書に開示した。特に本発明は、各種の加齢に伴う病気の効果的な予防及び／又は治療のために低用量のラパマイシン又はその類似物、この開示した方法により多くの抗老化剤から同定されたものの使用を説明する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
一つの態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するための薬剤を同定又は検出する方法を提供し、老化のモデルシステムに対して１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングしそれらの抗老化作用を監視する。
【００２４】
もう一つ態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するための薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングしそれらのTOR/AMPK/糸粒体/老化経路の少なくとも一つの構成成分に対する活性を測定する。
【００２５】
もう一つの態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するための薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングするかつそれらのミトコンドリア生合成経路の少なくとも一つの構成成分に対する活性を検出する。
【００２６】
もう一つの態様において、本発明は老化又は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングしそれらのAMPK経路の少なくとも一つの構成成分に対する活性を検出する。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するための薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングしそれらの老化経路の少なくとも一つの構成成分に対する活性を検出し、薬剤が分裂終了細胞において老化又は細胞周期停止状態を維持し糸粒体の悪化又は細胞死を予防する。
【００２８】
もう一つの態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、この方法が必要な時に他の態様に述べたもの又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、又はそのプロドラッグが被験者に投与される。
【００２９】
もう一つの態様において、本発明はテロメア及び／又は糸粒体の悪化に関係し加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供する。この方法が必要な時に５'-アデノシンモノリン酸塩活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)活性化因子、又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグを含む組成物を被験者に投与する。それらはAMPKを直接的あるいは間接的に活性化させて、ミトコンドリア生合成を増えて、被験者の老化又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態を維持する。
【００３０】
もう一つの態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、この方法が必要なときにラパマイシンの標的(TOR)阻害剤、又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、又はそのプロドラッグを含む組成物を被験者に投与する、ただし、TOR阻害剤が(a)複製能を延長する、(b)分裂終了細胞における老化又は細胞周期停止状態を維持する、又は(c)老化悪化の次の糸粒体又は細胞死の悪化を阻止する。この態様の好適な実施態様において、上述TOR阻害剤は低用量のラパマイシン又はその類似物の一つである。
【００３１】
もう一つの態様において、本発明は酵母老化モデルを使用し生物試料において抗老化薬剤を検出する方法を提供する。
【００３２】
もう一つの態様において、本発明は生物試料における抗老化剤の生物濃度を測定する方法を提供し、この方法が酵母老化モデル及び事前準備された抗老化剤の標準方程式又は標準曲線を使用する。
【００３３】
もう一つの態様において、本発明はミトコンドリア機能がテロメア機能不全により誘発される老化を維持する上で重要な役割を果たしカロリー制限(CR)がTOR/AMPK/ミトコンドリア経路を通じて老化状態の悪化を阻止する、ことを開示する。この機序はテロメア機能不全の酵母及び人間モデルに見られる。であるから、この機序は酵母と人間の場合にテロメア機能不全を利用しミトコンドリア機能促進とさらに老化の悪化を予防又は治療する薬学的に容認されるものを検索することに役立つ。多くの加齢に伴う病気はミトコンドリア機能不全及び／又はテロメア機能不全と関係があるため、この方法で同定される薬剤が加齢に伴う疾患又は病気を予防するのに使用される可能性がある。であるから、今普及している抗老化戦略（主に老化過程に大きく貢献している老化障害に焦点）と対照的に、本発明は、老化維持により加齢に伴う病気を予防又は治療するための新規方策を紹介する。
【００３４】
本発明の他の態様及び特定的な好適な実施態様について、次の実施態様及び請求項によりさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、栄養素不足シグナリングがcdcl３-Ipの不活化により誘発される細胞死を抑制することを示す。(A)グルコース制限及び２-デオキシ-グルコースの治療は、コロニー形成アッセイされるCdcl３p 不活化により誘発される細胞消失を抑制する。テロメア機能不全を引き起こすためには、一夜培養した新鮮なcdcl３-lと指示濃度のグルコース又は２-デオキシグルコースは薄いYEPD培地に希釈した、３７℃で２４時間培養する。コロニー形成アッセイは、次にH２Oで処理した細胞を連続的に１０倍希釈された，５μLを取り出して正常なYEPD平板培地に付ける。この平板培地を２４℃で培養し生き残った細胞がコロニーを形成した。このコロニー形成アッセイにより生存細胞の開始数を数える。(B)窒素制限はコロニー形成アッセイしcdcl３-lp不活化により誘発される細胞死を抑制する。細胞を合成培地(SC)又はSC-N(アミノ酸なしのSC、及び、窒素源として(ＮＨ4)2ＳＯ４)には３７℃で ２４時間培養した。生き残った細胞はIAに説明したようにコロニー形成アッセイにより数を数える。(C-D)低用量のラパマイシン(ラパヌイとしてラベル付け)(以下、殖阻害濃度と言う)を使ってTORの抑制がcdcl３-lp不活化により誘発される細胞死を予防することができる。細胞は指示濃度のラパマイシンとYEPD培地、３７℃で２４時間培養する。IAに説明したようにコロニー形成アッセイにより生き残った細胞の数を測定する。増殖曲線は、新鮮な一夜培養物をYEPD培地に希釈した、２４℃で指示濃度のラパマイシンの存在下で培養した。指定の時点で細胞密度(OD５９５)を測定する。(E)低用量のラパマイシン(１ nM)及びグルコース制限(０．５%)を使って増殖が停止されたcdcl３-l細胞の悪化を遅延できる、コロニー形成アッセイを使って生存細胞を計数することにより測定されるように。データは三つの実験の平均値を表す。
【図２】図２は、栄養素シグナリングは細胞周期をG２/Mスデ−ジに停止できないが、G２/M-停止状態を維持するかつcdcl３-lpの不活化により誘発される細胞死を阻止することを示す。(A)cdcl３-lp不活化のため細胞をYEPD培地、YEPD+１ nM ラパマイシン又はYEPDで０.５%グルコースにて３７℃で培養する。指定の時点で、一定分量の細胞を取り出し、−２０℃にて５０%エタノールで約４時間固定をした後、３７℃で５０ mM Tris（pH＝７.６）０.２mg/mL リボヌクレァ−ゼで一夜消化をした。次に、細胞を５０mM Tris（pH７.６）で洗浄した、５５℃で４０μg/mL プロテイナーゼKで２時間処理をした。もう一度の洗浄後、FACS(蛍光活性化セルソーター)分析の前に、暗闇で１００μg/mLヨウ化プロピジウムで細胞を２０分染色した。(B)細胞生存率測定はラパマイシン及びグルコース制限を通じて２時間で、cdcl３-lpの不活化により誘発されるG２/M細胞の死が阻止できることを示す。まず、３７℃で細胞を２時間培養し、YEPD又はYEPDにラパマイシン最終濃度が１ nMの培地又は初期グルコースないが最終０.５%の培地で希釈し３７℃で２２時間の連続培養をした。コロニー形成アッセイにより生存細胞を数えた。
【図３】図３は、ラパマイシン(１nM)及び減らしたグルコース(０.５%)はジヒドロローダミン１２３(Invitrogene)に染色した後FACS分析で cdcl３-lpの不活化により活性酸素種産生を減少すること(A)と、アネキシンV-FITC 結合した後FACS分析でアポトーシスマーカーPSの回転を減少すること(B)を示す。図１A及び図１Cで記載の条件で細胞を処理した。活性酸素種レベルを測定するためには、FACS分析の前に処理した細胞を５μg/mLのジヒドロローダミン１２３を含むYEPDで１時間培養した。それぞれの試料は、１００００個細胞を分析した。PS回転を測定するためには、処理した細胞は１．１M ソルビトールと２mg/mLの細胞壁溶解酵素を含むPBS緩衝液に保存されて、３７℃で２０分間培養される。次に、細胞を１.１M ソルビトールを含むPBS(リン酸緩衝生理食塩水)でアネキシンV-FITC及びヨウ化プロピジウム(PI)(BD Biosciences Pharmingen)に染色してからFACS分析をした。それぞれの試料は、１００００個細胞を分析した。これらの条件下で、Pi陰性の集団が完璧な細胞を、PI陰性かつFITC陽性細胞がアポトーシスの集団を, PI-陽性かつFITC陽性細胞が後期アポトーシス又は壊死を提示する。
【図４】図４は、ラパマイシン及びグルコース制限がAMPK経路を通じてcdcl３-lpの不活化により誘発される細胞死を阻止することを示す。(A)AMPK調節性サブユニットSip２pの欠失がグルコース制限の予防効果を廃止する。(B)AMPK触媒的サブユニットSnflp及び調節性サブユニットSnf４pの欠失がラパマイシン(１nM)の予防効果を著しく低下させる。cdcl３-lsip２::Kan, cdcl３-lsnfl::Kan と cdcl３-lsnf４::Kan 二重変異体株は欠失ライブラリー(from Invitrogen, Carlsbad, CA)から単一欠失変異体とcdcl３-lの交配により生成した後、胞子形成2倍体と温度感受性かつG４１８(２００μg/mL)抵抗性コロニーを選択する。図１Ａ及び図１Ｃに示すように、細胞を処理した。コロニー形成アッセイにより生存細胞を測定した。
【図５】図５は、糸粒体が栄養素制限のcdcl３-l細胞死への予防効果で重要な役割を果たすことを示す。(A)糸粒体欠損がラパマイシン及びグルコース制限の予防効果を著しく低下させる。糸粒体のp°欠損変異体は説明されていたようにエチジウムブを含むYC培地で増殖細胞が二日間位相にいてcdcl３-lに生成された(Qi, H.等,J.Biol.Chem.,２７８:１５１３６-１５１４１(２００３))。図１Ａ及び図１Ｃに示すように、細胞を処理した。コロニー形成アッセイにより生存細胞を測定した。(B-C)グルコース制限及びラパマイシン処理がミトコンドリア質量を増やす。２４℃で新鮮な希釈された一夜培養物をYEPD、YEPD+ラパマイシン(B)又はYEPD、０.５%グルコースYEPD(C)で４時間培養する。ミトコンドリア質量を測定するために６０%エタノールで固定細胞後MitoTracker GreenFMで染色して、FACS分析する。
【図６】図６は、cdcl３-lモデルにおいて栄養素シグナリングがTOR、AMPK及び糸粒体を介して細胞周期停止状態維持する及びテロメア機能不全により誘発される細胞死を阻止するの機序を示す。
【図７】図７は、老化WI-３８細胞の減少(人間の一次の線維芽細胞)が５０pM ラパマイシン、２５０μM AICAR、２０μg/mL EGCG、１.６μg/mL GSE、減らされたグルコース(０．４%から０．２%まで)、２０μg/mL ビルベリー抽出物(BE)、１ μM AITC、及び１２.５μM ２-デオキシグルコースの処理により阻止することを示す。AICARと減らされたグルコースの処理は２日間on/８日間-off周期で、他の薬剤は３日間on/７日間off周期で細胞を培養する。この処理が通路２９から開始する。３日ごとに培地を更新する。通路３１(老化)から５６日後，細胞は一時に２%ホルムアルデヒド/０.２%グルタルァルデヒドに固定し，１ mg/mL ５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル β-D-ガラクトシド(X-gal)(４０mM クエン酸/リン酸ナトリウム、pH＝６.０、５mM カリウムフェロシアニド(ferrocyanide)、５mM フェリシアン酸カリウム、１５０mM NaCl、及び２mM MgCl２を含む緩衝液)で染色された。老化マーカー細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性(カラー写真ではブルー、白黒写真で濃い灰色を示す)のために３７℃で１８時間も染色していた。顕微鏡下で生存老化細胞を観察した。
【図８】図８は、低用量のラパマイシンがミトコンドリア質量を増加、ミトコンドリア膜電位を改善するかつ人間線維芽細胞において活性酸素種レベルを減少させることを示す。(A)WI-３８細胞は通路２４で各種用量のラパマイシンに２日間培養する。ミトコンドリア質量の測定のために、−２０℃で細胞を６０%エタノールで固定し、FACS分析の３０分の前にミト・トラッカー・グリーンＦＭ（MitoTracker Green FM(Invitrogene)）で染色した。(B)人間リンパ芽球様L４０細胞を各種用量のラパマイシンに２日間処理した。ミトコンドリア膜電位測定は、暗闇で処理した細胞を５μg/mL JC-I(Invitrogen)で１５分染色をした。次に、PBSで細胞を１回洗浄し、FACS分析する。光電子増倍管はフィルタ１(FL-I検出器)を使ってJC-Iモノマ-の緑色蛍光(λem=５２５nm)とフィルタ2(FL-I検出器)を使ってJC-I 凝集体 赤色蛍光(λem=５９０nm)を検出できるように設定される。凝集体とモノマーの比率(赤色/緑色又はFL２/FL１)は膜電位を示すものだ。データはそれぞれの試料につき正常細胞集団から取られた。試料は非処理コントロールに従って配対された。(C)活性酸素種測定のために、FACS分析３０分の前に、L４０処理した細胞を２μg/mLのジヒドロローダミン１２３で染色した。それぞれの上記実験において、少なくとも１００００回のイベントを分析した。データは重複実験の平均値を表す。
【図９】図９は、低用量のラパマイシンだけが(増殖阻害用量以下で)老化WI-３８細胞の減少を阻止することを示す。(A)図７に示すように、指示濃度のラパマイシンによりWI-３８細胞を処理した。この処理は通路29からだ。細胞が通路３１で老化に入った。老化６５日のあと、生存細胞をMTT(３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-yl)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド,テトラゾ-ル)により染色してから測定する。MTTの紫色はミトコンドリア還元酵素により生成してマイクロプレートリーダーを使って５７０nmで発見された。データは非依存的な三重実験の平均値である。(B)ラパマイシンのWI-３８細胞の増殖への影響。図７に示すように、細胞を培養する。矢印はラパマイシンを加える時点を示す。２５pMラパマイシンは成長率にほとんど影響ないが５.１８から６.８２に集団倍加(PD)を増加させる。次の式を使って個体群倍加を計算する：PD = log(Nf/N０)/log２、ただし、Nfは最終細胞数で、N０は最初播種した細胞の数である。データは非依存的な重複実験の平均値である。(C)低用量のラパマイシンがp５３、p２１及びd pRBのタンパク質レベルを上昇させる。最後の老化後第２０日めでラパマイシンでWI-３８細胞を１８時間処理した。細胞溶解物はウエスタンブロット法によりp５３、p２１又はpRBに対して特定的な抗体を使って分析する。
【図１０】図１０は、人間のリンパ芽球様 L４０におけるミトコンドリア質量の増加は(A)１０μM LY２９４００２(PI３K阻害剤の一つ)、２μM 二硫化ジアリル(DATS)、１μM ベンジルイソチオシアネート(BITC)、１μM フェニルイソチオシアナート(PITC)、２μg/mLレスベラトロール(RSV)と０.０３μM リコピン、及び(B)６.７μM PEITC、５mMシリビニン、１.２５mM 亜セレン酸塩、２.５mMゲニステイン、２５０μg/mLブドウ種子抽出物(GSE)、５０μg/mL EGCG、３mg/mL ビルベリー抽出物(BE)、１μM AITC ５０pM ラパマイシン２５０μM AICAR、と減らされたグルコース(０.４%〜０.２%)で２日間処理した結果である。ミトコンドリア質量をモニタするために６０%エタノールに固定された細胞がFACS分析の前にMitoTracker Green FMで染色される。
【図１１】図１１は、cdcl３-lpの不活化によって引き起こされる細胞死を抑制する多くの化学予防剤又は抗老化剤を示す。細胞を６.７μM PEITC、５mM シリビニン、１.２５mM 亜セレン酸塩、２.５mM ゲニステイン、２５０μg/mL ブドウ種子抽出物(GSE)、５０μg/mL EGCG、及び３mg/mLビルベリー抽出物(BE)により３７℃で約３０時間培養した。コロニー形成アッセイにより細胞生存率を許容温度２４℃で測定した。
【図１２】図１２は、低用量のラパマイシン及びAICARが１２-O-テトラデカノイルホルボール１３-アセタート(TPA)により誘発されるミトコンドリア質量減少を逆転することを示す。DMEM培地(DMEM with １０% FCS、１００ユニット/mL ペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシン及び２mMグルタミン)の存在下でNIH３T３細胞を培養するが、対照DMSOに１０μM TPA、１nM ラパマイシン、１０μM TPA+ InM ラパマイシン、４０μM AICAR、又は１０μM TPA+４０ μM AICAR含んで９５%空気と５%CO２の構成かつ加湿雰囲気下３７℃で２日間培養する。次に、トリプシンで細胞を採取し６０%エタノールで固定した。FACS分析の前に、暗闇でMitoTracker Greeen FMで細胞を３０分染色をした。データは３重実験の平均値を表す。
【図１３】図１３は、低用量のラパマイシンとAICARがTPAにより誘発されるNIH３T３腫瘍転換を阻止することを示す。(A)TPA(１０μM)とNIH３T３細胞は０.３９%軟寒天でDMSO、１ nM ラパマイシン又は２５０ nM AICARの存在下で７日間培養されてから顕微鏡下でコロニーを数える。(B)データは四つ実験の平均値を表す。
【図１４】図１４は、ラパマイシンが低用量で（０.２と２pM）培養したCGN細胞の寿命を延長すること(A)、かつCGN細胞における活性酸素種のレベルを低下させること(B)を示す。小脳顆粒神経細胞(CGN)は７日齢の仔ラットから準備されたものだ。簡単に言えば、小脳を大脳から除去して適切な細片に切って、３７℃で１５分トリプシン（化）をし、４０μm網目でろ過し遠心分離する。小脳顆粒神経細胞は２５mM KClを含むB２７補充基礎培地に保存している。それらの寿命延長のため、細胞は一つの２４穴平板培地(１平板培地/小脳)に播種されてB２７、２０mM KCl、０.５mMグルタミン、１００units/mL ペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシンを補充した神経細胞基礎培地(Invitrogen)で培養される。７日後ラパマイシンを平板培地に加える。３１日後、神経細胞の生存率をMTT試験で決める(A)。活性酸素種分析のために、神経細胞完全培地懸濁液培養液から新鮮な分離されたCGN細胞を１百万細胞/mL/管の密度で１２x７５mmの管に播種した。ラパマイシンで細胞が２０時間処理をした、次にFACS分析(B)の前に２μg/mLジヒドロローダミン１２３で３０分の染色をした。
【図１５】図１５は、低用量のラパマイシンが脳卒中のラットモデルにおける脳梗塞体積を減らすことを示す。(A)ラパマイシン(１０μg/kg)が脳損傷を減らす。虚血性脳卒中の中大脳動脈(MCA)閉塞モデルを使用する。SHR-SPラットがランダムに二つ群(n=８、それぞれの群)に分かれた：対照DMSO群とラパマイシン群である。MCA閉塞の１０分後で、ラパマイシン及び対照DMSOを投与する。MCA閉塞の２４時間後で大脳試料を採取した。冠状断面(厚さが２mm)はすぐに ２% ２,３,５- トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)により染色された。死細胞を含む梗塞領域は染色されないが白色を示し、正常領域の生存細胞は赤色に染色された。梗塞領域と半球領域のそれぞれのセクション(両側)をトレスし画像解析システム(Microsystems 型DM LB２,Leica,ドイツ)により定量した。大脳梗塞の体積を評価しているなかに大脳浮腫の可能の干渉を標準的な方法で修正できる。それが対側半球の体積から非虚血性同側半球の体積を引いたことだ。(B)低用量のラパマイシンが、虚血性梗塞により誘発される脳損傷を予防する。２０日MCA閉塞の前に、０、０.３、１、３及び１０μg/kgのラパマイシンをSHR-SPラットに投与した(それぞれの群に、n=８)。
【図１６】図１６は、人間の一次の線維芽細胞WI-３８細胞(２００ μM MPP+を使つて)において低用量のラパマイシンがMPP+により誘発される活性酸素種のレベルを減少することを示す。MPP+と各種濃度のラパマイシンを使つてWI-３８細胞を３日間培養した。FACS分析の前に、暗闇でジヒドロローダミン１２３で細胞を３０分染色した。
【図１７】図１７は、ラットモデルにおいて低用量（１０μg/kgで、１００μg/kgまではない）のラパマイシンが心筋梗塞(MI)の体積を減らすことを示す。２００〜２５０gのSprague-Dawley(SD)系雄性ラットを使用した(それぞれの群には、n=１０〜１２)。MI実験の前に、０、１０及び１００μg/kg/日の用量でラパマイシンを３日投与した。エーテル麻酔で、心臓を体外に出り出した、肺輸出道と左心房との間で左前下行動脈を結紮（連結）する。次に、打っている心臓を迅速にその正常な位置を返し、胸腔を閉め、空気を除去した。ラットをケージに返した。冠動脈結紮の５時間後、ラットをいけにえにした。左心室は心臓の長軸にそって４ないし５枚薄いスライスに切断した。ニトロブルーテトラゾリウムリン酸塩緩衝液で薄片を染色した。正常組織はブルーに染色されたが、壊死組織は染色されることができない。染色された組織と未染色された組織を分離し別々に量る。MIサイズは左心室の総重の分数として表した。
【図１８】図１８は、各種の組織においてグルコース又はTORがAMPK／活性酸素種／糸粒体経路を介して老化過程を調節するモデルを示し、それが加齢に伴う病気をもたらす。
【図１９】図１９は、酵母において細胞生存アッセイを使つてハイスループット・スクリーニングにより抗老化候補を同定及び検出する方法を説明する。
【図２０】図２０は、酵母において活性酸素種アッセイを使つてハイスループット・スクリーニングにより抗老化候補を同定及び検出する方法を説明する。
【図２１】図２１は、酵母変異体cdcl７-l又はcdcl７-２を使つて抗老化剤を検出する例を示す。変異細胞を０、１及び３nMのラパマイシンを含む新鮮なYEPD培地或いは０.５%グルコースYEPD培地に希釈し約３７℃で２２時間培養した。次に、細胞は連続的に１０倍希釈されてYEPD平板培地に付けた、生存細胞からコロニー形成のため平板培地を許容温度２４℃で培養する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
［発明の詳細説明］（英文ｐ１５）
本発明は抗老化剤を同定・検出・純化するための新規方法及び加齢に伴う病気の予防及び治療ための薬剤の使用を説明する。本発明は次の発見に基づいて:(１)酵母において、栄養素信号がAMPK後続のミトコンドリア経路でテロメア機能不全により誘発される細胞周期停止状態を延長することを抑制する;(２)第一のヒト線維芽細胞において、低用量のラパマイシン、グルコース制限及びAMPK活性化因子がミトコンドリア機能を刺激するかつテロメア機能不全により誘発される細胞周期停止状態を延長する;(３)いくつかの抗老化及び癌化学予防剤も酵母及びヒト細胞においてミトコンドリア機能を刺激するかつ老化細胞の減少を抑制する;(４)多くの加齢に伴う病気が糸粒体及び／又はテロメアの機能不全に関与する;及び(５)低用量のラパマイシンが急性心筋虚血性梗塞及びに虚血性脳損傷を予防する、MPP+により誘発されるROS増加を制される、培養された神経細胞の寿命と腫瘍細胞形質転換を抑制する。
【００３７】
第一態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出するを方法を提供する、この方法が細胞周期停止状態モデルによる１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングして、それらの抗老化作用を測定することを含む。
【００３８】
第一態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、抗老化作用が細胞周期停止状態又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態の悪化を予防することである。
【００３９】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、抗老化作用がミトコンドリア機能を刺激・改善・保存することである。
【００４０】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、抗老化作用がミトコンドリア又はテロメアの機能減少に関係する加齢に伴う病気を予防することである。
【００４１】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、抗老化作用が活性酸素種(ROS)の増加またはテロメア機能不全により誘発されるアポトーシス死を予防することである。
【００４２】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供するし、ただし、細胞周期停止状態モデルが機能障害性テロメアと変異酵母を含む。
【００４３】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、だだし、細胞周期停止状態モデルが不十分なテロメラーゼ活性を示す初代ヒト細胞系である。
【００４４】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供しただし、細胞周期停止状態モデルがテロメア結合タンパク質又はテロメラーゼにおける変異又は欠陥に起因するテロメア機能不全を示すヒト細胞系である。
【００４５】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、細胞周期停止状態モデルが化学薬剤に起因するテロメア機能不全モデルである。
【００４６】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、細胞周期停止状態モデルが癌遺伝子活性化及び／又はDNA損傷応答によって作られるモデルである。
【００４７】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は 加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、細胞周期停止状態モデルがテロメア機能不全を示すマウス、ラット又は分裂酵母の細胞系である。
【００４８】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が次の段階（ステップ）を含む：
(i)テロメア機能不全又はDNA損傷による細胞周期が停止された条件で化合物又は組成物を酵母細胞で培養する;
(ii)アポトーシスアッセイを使って死亡酵母細胞の集団を測定する、あるいは、
(iii)細胞周期が停止された条件を取り除き、生き残った細胞の数を測定する、及び
(iv)段階(ii)で得られた死細胞の集団又は段階(iii)で得られた生き残った細胞の数を対照実験と比較する、対照実験で上述化合物又は組成物を含まない以外に、段階(i)と同じ条件である。
そのうち、対照実験に対して、(ii)で得られた死亡酵母細胞減少個体群あるいは、段階(iii)で得られた生き残った細胞数が、ただしこの化合物又は組成物が候補抗老化剤のであることを示した。
【００４９】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が次の段階を含む：
(i)検出した化合物又は組成物を培養を細胞周期停止状態にあった哺乳類細胞とある期間で培養して;
(ii)生き残った老化細胞の集団を測定する;及び
(iii)段階(vi)の生き残った哺乳類の老化細胞の集団を対照実験で得られた生き残った老化細胞の集団と比較する。
そのうち、対照実験に対して、生き残った老化細胞集団が増えると、ただし、この化合物又は組成物が候補抗老化剤のであることを確認する。
【００５０】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が次の段階を含む:
(i)出した化合物又は組成物を正常状態ヒト細胞株とある期間で培養して;
(ii)ミトコンドリア量、ミトコンドリアDNA含量、又はミトコンドリア 転写因子の発現を測定することによって、ヒト細胞のミトコンドリア生合成を測定する;及び
(iii)対照実験の結果と比較し、結果を得る、
そのうち、段階(ii)でのミトコンドリア生合成を増強すれば、ただし、さらに同定した化合物又は組成物が候補抗老化剤であることを確認する。
【００５１】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が上述三つ実施態様のいずれか組み合わせを含む。
【００５２】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、しだし、細胞周期停止状態モデルがcdcl３-l、cdcl３-２、stnl-１、cdcl７-l、cdcl７-２、hdfl、hdf２、estl、est２、及びest３を含むテロメアが機能障害あるいは欠乏しておる変異酵母である。
【００５３】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供する。ただし細胞周期停止状態モデルがテロメラーゼの欠乏しておる初代ヒト細胞系である、少なくとも線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞を含む。
【００５４】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、細胞周期停止状態モデルがTRF２、POTl、TERT、TERC、又はWRN遺伝子における変異を含むヒト細胞系である、テロメア機能不全を示す。
【００５５】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、しだし、細胞周期停止状態モデルが化学薬剤に起因するテロメア機能不全モデルで、そのうち、ブレオマイシン、アドリアマイシン及びG四重リガンドなどの化学薬剤を含む。
【００５６】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が細胞異常増殖性疾患、変性疾患又は機能低下性疾患である。
【００５７】
第一態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、上述方法の化合物又は組成物がそれぞれ同じ化合物及び／又は組成物のライブラリーに属する。従って、本発明のこの実施態様には、化合物又は組成物の高速大量スクリーニングの方法を包含する。
【００５８】
第二態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングする、かつそれらのTOR/AMPK/糸粒体/老化経路の少なくとも一つの構成成分に対する活性を測定するを含む、なお、ここでの化合物又は組成物が(a)複製能を延長する、(b)分裂終了細胞における老化又は細胞周期停止状態を維持する、或いは(c)糸粒体又は老化又は細胞周期停止状態が起因した細胞死を予防する。この態様が本発明の第一態様の上述抗老化作用とTOR/AMPK/糸粒体/老化経路のいずれかに関与して、且つ老化状態を維持する。
【００５９】
第二態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの加齢に伴う病気が老化又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態の悪化、及び次の細胞死に関係がある、さらに、加速したミトコンドリア悪化及び増加さた酸化的ストレス又はテロメア機能不全に関与する。
【００６０】
第二態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでのTOR/AMPK/糸粒体/老化経路の構成成分がインスリン/IGF、インスリン/IGF受容体、PI３K、PDKl、PTEN、TSCl、TSC２、AKT、Rheb、raptor、GβL、S６K、TOR、AMPK、STRAD、MO２５、LKBl、グルコース取込、アミノ酸取込、CaMKKβ、PGC- lα、PGC-lβ、NRF-I、NRF-２、TFAM、TFBlM、TFB２M、ERRs（例えば、ERRα、ERRβ及びERRγ)、PPARs（例えば、PPAra、PPARδ及びPPARγ)、SIRTl、RIP１４０、PRC、POLRMT、ATM、p５３、p２１、pl９ARF, WAF，p16INK4a、pRB、E２F、及びp２７KIP１を含む。
【００６１】
第二態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が細胞異常増殖性疾患、変性疾患、機能低下性疾患である。
【００６２】
第二態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、上述１種類以上の化合物又は組成物がそれぞれ同じない化合物及び/又は組成物のライブラリーに属することができる。
【００６３】
第三態様において、本発明は 加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングする、且それらのミトコンドリア生合成経路の少なくとも一つ構成成分に対する活性を検出すことを含む、ただし、ここでの化合物又は組成物が(a)複製能を延長する、(b)分裂終了細胞における老化又は細胞周期停止状態を維持する、或いは(c)糸粒体又は老化又は細胞周期停止状態が起因した細胞死を予防する。この態様が本発明の第一態様の上述抗老化作用と糸粒体生合成経路に関与して、且つ、それが老化状態を維持する。
【００６４】
第三態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの加齢に伴う病気が老化又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態の悪化、及び次の細胞死病気である、さらに、加速したミトコンドリア悪化及び増加さた酸化的ストレス又はテロメア機能不全に関与する病気である。
【００６５】
第三態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、この方法にミトコンドリア生合成経路の構成成分がAMPK、STRAD、MO２５、LKBl、CaMKKβ、PGC-lα、PGC-lβ、NRF-I、NRF-２、TFAM、TFBlM、TFB２M、ERRs(例えば、ERRα、ERRβ及びERRγ)、PPARs(例えば、PPAra、PPARδ及びPPARγ)、SIRTl、RIP１４０、PRC、及びPOLRMTを包む。
【００６６】
第三態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が細胞異常増殖性疾患、変性疾患、又は機能低下性疾患である。
【００６７】
第三態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、上述１種類以上の化合物又は組成物がそれぞれ同じない化合物及び／又は組成物のライブラリーに属することができる。
【００６８】
第四態様において、本発明は老化又は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が１種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングすることを含む、且それらのAMPK経路の少なくとも一つ構成成分に対する活性を検出する、ただし、ここでの化合物又は組成物が(a)複製能を延長する、(b)分裂終了細胞における老化又は細胞周期停止状態を維持する、あるいは細胞周期を障害する、或いは(c)糸粒体又は老化又は細胞周期停止状態が起因した細胞死を予防する。この態様が本発明の第一態様の上述抗老化作用と糸粒体生合成経路に関与して、且、それが老化状態を維持する。
【００６９】
第四態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの方法に加齢に伴う病気 が老化悪化、加齢性の細胞消失、腫瘍形成及び癌の悪性進行に関係がある。
【００７０】
第四態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの方法にAMPK経路の構成成分がAMPK, LKBl、STRAD、MO２５、グルコース取込、アミノ酸取込及びCaMKKβを含む。
【００７１】
第四態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの加齢に伴う病気が細胞異常増殖性疾患、変性疾患、又は機能低下症である。
【００７２】
第四態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出するための方法を提供し、ただし、上述１種類以上の化合物又は組成物がそれぞれ同じない化合物及び／又は組成物のライブラリーに属することができる。
【００７３】
第五態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、この方法が種類以上の化合物又は組成物をスクリーニングする、かつそれらの老化経路の少なくとも一つ構成成分に対する活性を検出することを含む１、ただし、この化合物又は組成物が老化又は細胞周期停止状態を維持する、あるいは糸粒体機能悪化や分裂終了状態悪化が起因した細胞死を予防する。この態様が本発明の第一態様の上述抗老化作用と分裂終了状態に関与する、且つ、それが老化状態を維持する。
【００７４】
第五態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの加齢に伴う病気が老化又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態の悪化、及び次の細胞死病気である、さらに、加速したミトコンドリア悪化及び増加さた酸化的ストレス又はテロメア機能不全病気に関与する。
【００７５】
第五態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出するための方法を提供し、ただし、老化経路の構成成分がATM、p５３、p２１、pl９ARF、WAF、p16INK4a、pRB、E２F、及びp２７KIP１を含む。
【００７６】
第五態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、ここでの加齢に伴う病気が細胞異常増殖性疾患、変性疾患、又は機能低下症である。
【００７７】
第五態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する薬剤を同定又は検出する方法を提供し、ただし、上述１種類以上の化合物又は組成物がそれぞれ同じない化合物及び／又は組成物のライブラリーに属することができる。
【００７８】
第六態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、この方法が必要なときに本発明に記載されているの第一〜第五態様の方法で同定される化合物、又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグを含むその組成物を被験者に投与することを含む。この方面には、本明細書に記載の方法により同定されるいずれかの抗老化の化合物又は組成物で調製した薬物を包含する、加齢に伴う病気の予防又は治療に用いられる。
【００７９】
第六態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が老化又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態、ミトコンドリア機能不全、又はテロメア機能不全の悪化に関係がある。
【００８０】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、この方法に化合物が有機分子、無機分子、天然化合物、ペプチド、タンパク質、DNAs、RNAs、及びその代謝中間体から選ばれるものである。
【００８１】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法提供し、ただし、薬剤がAICAR、低用量のラパマイシン又はその類似物、EGCG、ブドウ種子エキス、ビルベリー抽出物、亜セレン酸塩、ゲニステイン、ジアリルトリスルフィド、ベンジルイソチオシアネート、フェニルイソチオシアナート、イソチオシアン酸フェネチル、レスベラトロール、リコピン、及びイソチオシアン酸アリルから選ばれるものである。
【００８２】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するを方法を提供し、ただし、化合物又は組成物が酸化防止剤、抗高血圧薬、抗高脂血薬、抗卒中薬、抗癌剤、及び異なる抗老化剤から選ばれる第二種類化合物をさらに含む。
【００８３】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、化合物又は組成物がビタミンC、ビタミンE、β-カロテン及び他のカロチノイド、セレン、リポ酸、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチン、補酵素Q１０、グルタチオン、N-アセチルシステイン、メラトニン、ゲニステイン、エストラジオール、茶抽出物、及びブドウ種子エキスから選ばれる酸化防止剤をさらに含む。
【００８４】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、化合物又は組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００８５】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、経口、非経口、局所、経皮、或いは坐剤又はエアロゾルの投薬形態で組化合物又は組成物を投与する。
【００８６】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が細胞異常増殖性疾患、変性疾患又は機能低下性疾患である。
【００８７】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が腫瘍形成及び悪性癌進行, 神経変性疾患、心筋梗塞(心臓発作)、心不全、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、筋肉減少症、骨髄の減少、白内障、多発性硬化症、シェーグレン症候群, 関節リウマチ、免疫機能の低下、糖尿病、特発性肺線維症、及び加齢性黄斑変性、小脳梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病, 並びテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、IGF-I、又はエネルギー産生の減少に起因する疾患から選ばれるものである。
【００８８】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述被験者が哺乳類である。
【００８９】
第六態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述被験者がヒトである。
【００９０】
第七態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、この方法が必要な時に５'-アデノシンモノリン酸塩活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)活性化因子、又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグを含む組成物を被験者に投与する、それらはAMPKを直接的あるいは間接的に活性化させて、ミトコンドリア生合成を増えて、被験者の老化又は分裂終了細胞における細胞周期停止状態を維持する。この本発明の態様に加齢に伴う病気の予防又は治療のAMPK活性化因子薬剤で調製又は製造の薬剤を開示。この態様は本発明の第六態様に関係ある、即ち上述薬剤がAMPK活性化因子である。
【００９１】
第七態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気がミトコンドリア機能喪失, テロメア機能不全、老化悪化及び年代に依存した細胞消失、或いはミトコンドリア悪化又は分裂終了細胞における細胞周期−停止状態に関係がある。
【００９２】
第七態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述AMPK活性化因子がAICAR、メトホルミン、２-デオキシグルコース、３-O-メチルグルコース、LY２９４００２、ベルベリン、フェンホルミン、A-７６９６６２、チアゾリジンジオン系、デキサメタゾン、スタチン系、レプチン、アディポネクチン、シロスタゾール、EGCG、セネライト(senelite)、イソチオシアン酸アリル、又はイソチオシアン酸フェネチルから選ばれるものである。
【００９３】
第七態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、化合物又は組成物が酸化防止剤、抗高血圧薬、抗高脂血薬、抗卒中薬、抗癌剤、及び異なる抗老化剤から選ばれる第二薬剤をさらに含む。
【００９４】
第七態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００９５】
第七態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、経口、非経口、局所、経皮、或いは坐剤又はエアロゾルの投薬形態で化合物又は組成物を投与する。
【００９６】
第七態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気は異常増殖性疾患、変性疾患、又は機能低下性疾患である。
【００９７】
第七態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するを方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が腫瘍形成及び悪性癌進行、神経変性疾患、心筋梗塞(心臓発作)、心不全、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、筋肉減少症、骨髄の減少、白内障、多発性硬化症、シェーグレン症候群、関節リウマチ、免疫機能の低下、糖尿病、特発性肺線維症、及び加齢性黄斑変性、小脳梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、並びにテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、IGF-I、又はエネルギー産生の減少に起因する疾患から選ばれるものである。
【００９８】
第七態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述の被験者が哺乳類の動物である。
【００９９】
第七態様のもう一つの実施態様におけて、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述の被験者がヒトである。
【０１００】
第八態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、この方法が必要なときに低用量ｍTOR 阻害剤、又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグを含むその組成物を被験者に投与することを含み、ただし、TOR阻害剤(a)が複製能を延長する、(b)分裂終了細胞における老化又は細胞周期停止状態を維持する、或いは(c)糸粒体又は細胞死の悪化を予防する。この本発明の態様に加齢に伴う病気の予防又は治療の薬学的に容認される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグで調製又は製造した低用量ｍTOR 阻害剤を開示する。この態様は本発明の第六態様に関係ある、即ち上述組成物がｍTOR 阻害剤である。
【０１０１】
第八態様の一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療するを方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気がミトコンドリア機能喪失、テロメア機能不全、老化悪化及び年代に依存した細胞消失、或いは分裂終了細胞におけるミトコンドリア悪化又は細胞周期停止状態に関係がある。
【０１０２】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述低用量のｍTOR阻害剤がラパマイシン又はその類似物である。
【０１０３】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述TOR阻害剤が低用量の、ラパマイシン、又は、デホロリムス、AP-２３６７５、AP-２３８４１、ゾタロリムス、CCI７７９/テムシロリムス、RAD-００１/エベロリムス、７-エピ-ラパマイシン、７-チオメチル-ラパマイシン、７-エピ-トリメトキシ-ラパマイシン、２-脱メチル-ラパマイシン、４２-０-(２-ヒドロキシル)エチル-ラパマイシン、又は薬学的に容認される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグ、から選ばれるラパマイシン類似物である。
【０１０４】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述低用量のTOR 阻害剤がラパマイシン、又は薬学的に許容される塩、溶媒和物、或いはそのプロドラッグである。
【０１０５】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、ｍTOR阻害剤ラパマイシンが血清培地に約０.１〜約１００００pMまでの低用量で、動物に０.１〜約１００００ng/kg/日である。意外な発見は、ラパマイシンがこれら低用量で新規機能を示したことである。ラパマイシンが免疫抑制剤として、既知の治療量(１ mg/日から５ mg/日まで)で、細胞周期のGl期で細胞増殖も抑制する及びに他の標的タンパクに作用する可能である。その結果、治療量のラパマイシンは、血清コレステロールとトリグリセリドの増加、腎機能低下、貧血、創傷治癒遅延、下痢、無力症、低血圧、疼痛、悪性腫瘍進行、肝臓の悪性腫瘍、腹水、成長障害、精神状態変化、脾梗塞、及び大腸炎などを含む各種の副作用を示す。本発明によれば、低用量のラパマイシンを使用する場合、これらの副作用を避けることができる。
【０１０６】
ラパマイシン又はその類似物の有効量は、この特定の化合物、投与方法、特定の疾患及び受験者の背景などの各種の物理的要因に応じて変更可能である。本発明は、ラパマイシンを約０.０１〜約５０μg/日の毎日経口用量で投与すると満足の効果が得られる。この用量が既知の治療量(１mg/日〜５mg/日)の約０.００１%〜約５%と推定される。それと同時に、本発明の投与スケジュールが２〜４日投与期間をとし、後に、２〜５日の休薬期間をとし、こうしてさらに最良の結果を生じさせてラパマイシンの副作用を低下する。
【０１０７】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述低用量のラパマイシン又はその類似物の投与量が、認可される治療量の約１０%以下、約８%以下、約６%以下、約４%以下、約２%以下、約１%以下、約０.１%以下、約０.０１%以下、又は約０.００１%以下である。
【０１０８】
第八態様の一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約８%〜約１０%用量の範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１０９】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約６%〜約８%の用量範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１０】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約４%〜約６%の用量範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１１】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、だだし、認可される治療量の約２%〜約４%の用量の範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１２】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約１%〜約２%の用量範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１３】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約０．１%〜約１%の用量範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１４】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約０.０１%〜約０.１%の用量範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１５】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約０.０１%〜約０.１%の用量範囲内でラパマイシン、又はその類似物を投与する。
【０１１６】
第八態様もう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約０.００１%〜約０.０１%の用量範囲内でラパマイシン、又はその類似物を投与する。
【０１１７】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、認可される治療量の約０.０００１%〜約０.００１%の用量範囲内でラパマイシン又はその類似物を投与する。
【０１１８】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、低用量のラパマイシンを純化されている化合物として投与する。
【０１１９】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、低用量のラパマイシンを含む生エキスとして投与する。
【０１２０】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、低用量のラパマイシンをラパマイシンを含む純化されていない発酵液として投与する。
【０１２１】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、低用量のラパマイシンをラパマイシンを包む純化されていない微生物（Streptomyces hygroscopicus）として投与する。
【０１２２】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、化合物又は組成物は酸化防止剤、抗高血圧薬、抗高脂血薬、抗卒中薬、抗癌剤、又は異なる抗老化剤から選ばれる第二薬剤をさらに含む。
【０１２３】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、化合物又は組成物は細胞とミトコンドリアでの活性酸素種レベルをコントロールする酸化防止剤をさらに含む。
【０１２４】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、その化合物又は組成物がタミン C, ビタミンE、β-カロテン 及び他のカロチノイド、セレン、リポ酸、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチン、補酵素Q１０、グルタチオン、N-アセチルシステイン、メラトニン、ゲニステイン、エストラジオール、茶抽出物、及びブドウ種子エキスから選ばれる酸化防止剤をさらに含む。
【０１２５】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、化合物又は組成物を経口、非経口、局所、経皮、或いは坐剤又はエアロゾルの投薬形態で投与する。
【０１２６】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気は異常増殖性疾患、変性疾患、又は機能低下性疾患である。
【０１２７】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、加齢に伴う病気が腫瘍形成及び悪性癌進行、神経変性疾患、心筋梗塞(心臓発作)、心不全, アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、筋肉減少症、骨髄減少、白内障、多発性硬化症、シェーグレン症候群、関節リウマチ、免疫機能低下、糖尿病、特発性肺線維症、及び加齢性黄斑変性、小脳梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、並びテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、IGF-I、又はエネルギー産生の減少に起因する疾患から選ばれるものである。
【０１２８】
第八態様の一つの好適な実施態様において、本発明は加齢に伴う病気を予防又は治療する方法を提供し、ただし、上述薬剤が低用量のラパマイシン又はその類似物、及びに、加齢に伴う病気が腫瘍形成及び悪性癌進行、パーキンソン病、脳卒中、小脳梗塞、心筋梗塞(心臓発作)である。
【０１２９】
第八態様のもう一つの好適なな実施態様において、本発明は低用量ラパマイシンで細胞周期停止状態を維持する方法を提供する。年代に依存したテロメア機能不全、癌遺伝子活性化、又はDNA 損傷剤(例えば、活性酸素種、抗癌薬、UV又はイオン化照射)により誘発される老化を延長する, 同じ老化機序DNA損傷応答これら過程に関与する。従って、本発明の方法は各種良性腫瘍を治療する及びに悪性進行を予防できる。そのため、本発明の方法は癌になるリスクが高い集団に用いられる、例えば老年人、変異原と頻繁に接触する人、あるいは被験者常にUV又はイオン化照射に暴露集団。本発明の方法は癌を誘発する危険性が高い薬を服用する患者、例えばホルモン補充を服用する女性。また、本発明の方法は二次癌を引き起こす化学療法を受けている癌患者にも適用してよい。
【０１３０】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は低用量ラパマイシンで脳卒中により誘発される脳損傷を予防の使用を提供する。従って、低用量のラパマイシンが脳卒中を治療する救急用薬剤、虚血性や出血性脳卒中に適用する。最良の結果を得るためには、低用量のラパマイシンと虚血性脳卒中緊急用の薬剤を組み合わせ使用できる、例えば組織プラスミノゲン活性化因子(t-PA),血栓溶解薬である。
【０１３１】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は低用量のラパマイシンで 脳卒中、脳卒中再発を予防する方法を提供する。最良の予防結果を得るためには、方法のもう一つ実施態様において、本発明は提供する低用量のラパマイシンと脳卒中の危険性を減らす異なる機序薬剤との組み合わせ方法を提供する。後者には次の例を含めて、但しこの限りではない。これら薬剤が抗血小板薬(例えば、クロピドグレル、Agrrenox)、抗凝血薬(例えば、ワルファリン、ヘパリン)、脂質低下薬(例えば、スタチン系)及び高血圧薬(例えば、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)、Β遮断薬、利尿薬、及びカルシウムチャンネル遮断薬) を含む。
【０１３２】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は低用量のラパマイシンで神経変性疾患を予防する使用を提供する、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病をを含めて、但しこの限りではない。
【０１３３】
第八態様のもう一つの好適な実施態様において、本発明は低用量のラパマイシンで心筋梗塞により誘発される心臓障害を予防するの使用を提供する。従って、本発明ラパマイシンの低用量で心筋梗塞又は心臓発作を予防する使用の提供する。最良の結果を得るめには、低用量ラパマイシンと機序の薬剤を組み合わせ、心臓発作の危険性を予防する。これら薬は次の例を含むが、但しこの限りではない、抗血小板薬(例えば、クロピドグレル、Agrrenox)、抗凝血薬(例えば、ワルファリン、ヘパリン)、脂質低下薬(例えば、スタチン系)、高血圧薬(例えば、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)、Β遮断薬、利尿薬、及びカルシウムチャンネル遮断薬)、及び血糖コントロール薬(例えば、メトホルミン及びピオグリタゾン)。
【０１３４】
当業者は、異なる組織又は細胞種類におけるラパマイシンの分布が均一でないこと、及び、抗老化で同定されるそれぞれの化合物又は組成物が異なる組織又は細胞種類で特定の分布パターンを示すことを理解するであろう。この方法の一つ態様において、本発明は、低用量のラパマイシンと、少なくとも一つの他の抗老化剤との組合せによる使用を提供する。その少なくとも一つ他の抗老化剤には、AICAR, ２-デオキシグルコース、LY２９４００２、メトホルミン、EGCG、GSE、senelite、ゲニステイン, シリビニン、イソチオシアン酸アリル、イソチオシアン酸フェネチル、ビルベリー抽出物、ジアリルトリスルフィド、ベンジルイソチオシアネート、レスベラトロール、及びリコピンを含むが、但しこの限りではない。
【０１３５】
第八態様のもう一つの実施態様において、いずれかの有用な方式で低用量ラパマイシンを投与する、経口、非経口(静脈内、腹腔内及び皮下注射を含む)、局所、直腸、鼻腔内、経膣、吸入、エアロゾル、及び経皮の投薬形態を含む。経皮投与は全部の身体通路の内壁と上皮組織及び粘膜組織を通して投与することを含む。このような投与は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩及び有機ローション、クリーム製剤、泡沫、パッチ、懸濁剤、溶液、及び坐剤(直腸及び膣内)を用いて行われる。
【０１３６】
第八態様のもう一つの実施態様において、本発明は低用量ラパマイシンのもう一つ用途を提供する。即ち固形食、飲料又は流動食の成分とし、ただし、飲料又は流動食二はアルコール性或いは非アルコール性ものを含む、例えば、水、ワイン、及び果汁など。
【０１３７】
第九態様において、本発明は生物試料における抗老化薬剤を検出する方法を提供し、この方法が次の段階を含む：
(i)生物試料を溶媒で希釈する；
(ii)テロメア機能不全又はDNA損傷により酵母細胞の細胞周期が停止された条件で希釈された試料を変異酵母細胞で培養する;
(iii)細胞周期が停止された条件を取り除き、生き残った酵母細胞の数を測定する；及び、
(iv)段階(iii)で得られた生き残った細胞の数を培養段階(ii)と同じ条件で対照実験における生き残った細胞の数と比較する、ただし、対照実験には上述の生物試料を含まない。
そのうち、対照実験に対して段階(iii)で得られた生き残った細胞数が増加すると、生物試料が抗老化剤を含むことを示唆する。
【０１３８】
第十態様において、本発明は生物試料における抗老化剤の生物濃度を測定する方法を提供し、この方法が次の段階を含む:
(i)被験者の生物試料を溶媒で希釈する;
(ii)テロメア機能不全又はDNA損傷により酵母細胞の細胞周期が停止された条件で、希釈された生物試料を変異酵母細胞で培養する;
(iii)細胞周期が停止された条件を取り除き、生き残った酵母細胞の数を測定する;
(iv) 段階(iii)得られた生き残った細胞の数を培養段階(ii)と同じ条件で対照実験で生き残った細胞の数と比較する、ただし、対照実験には上述の生物試料を含まない；及び
(v)生き残った酵母細胞の数を抗老化剤の濃度と生き残った酵母細胞の数との事前準備された標準方程式又は標準曲線に代して、抗老化剤の生物濃度を計算する。
【０１３９】
第十態様の一つ実施態様において、本発明は標準方程式又は標準曲線で生物試料における抗老化剤の生物濃度の計算方法を提供する、この方法が次の段階を含む:
(vi)異なる既知濃度の精製抗老化剤を有する複数の標準溶液を調製する、この標準溶液が被験者の生物試料を培養する溶媒を用いられる;
(vii)テロメア機能不全又はDNA損傷を起こし、さらに細胞周期停止された条件で、標準溶液を変異酵母細胞と培養する。
(viii)細胞周期が停止された条件を取り除く、それぞれの培養した標準溶液で生き残った酵母細胞の数を測定する;及び
(ix)段階(viii)で得られた生き残った細胞の数をその対応する抗老化剤の濃度に対してプロットして、標準曲線を得る、及び／又は標準方程式を得る。
【０１４０】
この態様は本発明の第九態様に関係ある、即ち定量分析抗老化剤の生物濃度はともに上述した標準方程式又は曲線で計算する。従って、本発明は方法には二つの態様に記載されている段階のいずれか合理的な組み合わせを含む。
【０１４１】
第十態様のもう一つ実施態様におけて、本発明は生物試料における抗老化剤の生物濃度を測定する方法を提供し、ただし、抗老化剤が上記の実施態様におけるいずれか方式で得た化合物又は組成物である。
【０１４２】
第十態様のもう一つ実施態様におけて、本発明は生物試料における抗老化剤の生物濃度を測定する方法を提供し、ただし、抗老化剤がラパマイシン又はその類似物である。好適な実施態様において、ラパマイシン又は類似物が低用量である。
【０１４３】
第十態様のもう一つ実施態様において、本発明は生物試料における抗老化剤の生物濃度を測定するための方法を提供し、ただし、変異酵母がcdcl３-l、cdcl３-２、stnl-１、cdcl７-l、cdcl７-２、hdfl、hdβ、estl、est２、及びest３から選ばれるものである。
【０１４４】
本発明のその他の態様又は好適実施態様は、本明細書に開示された実施態様における適切な組み合わせを含むものである。ここで、その他の態様及び実施態様は本明細書の他の部分に見い出されてもよい。
【０１４５】
［定義］（英文ｐ３６）
本明細書で用いられている用語「a」、「an」及び「the」に対して、特別な注記がなければ、単数と複数も指す。
【０１４６】
本明細書で用いられている用語「optional（任意的な）」又は「optionally（任意的に）」とは、その次に記載されているイベント又は事情が発生する可能性、つまりその記載は、イベントの発生事例と発生しない事例とを含む意味である。
【０１４７】
本明細書で用いられている用語「加齢に伴う病気」とは老化が主な危険因子である疾患である。疾患の種類に基づいて、加齢に伴う病気は次の主な３種類を含む：(１)異常増殖性疾患、例えば癌；(２)変性疾患、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中)、心筋梗塞、心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧、変形性関節症、骨粗鬆症、筋肉減少症、骨髄の減少、関節リウマチ、d免疫機能、糖尿病、特発性肺線維症、加齢性黄斑変性；及び(３)機能低下性疾患、例えばテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、IGF-Iの減少、エネルギー産生減らされたなど。細胞の種類にとる、加齢に伴う病気が二つ主な種類に分類され、(１)分裂終了細胞において、ニューロン変性(アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中)、筋肉減少症(筋肉の減少)、心血管疾患(心不全、心筋梗塞)；及び(２)有糸分裂細胞において、癌、骨髄減少、免疫機能低下、糖尿病、特発性肺線維症、加齢性黄斑変性、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、及び高血圧。具体的には、加齢に伴う病気はミトコンドリア機能不全又は／及びテロメア機能不全を含む、癌、変形性関節症、加齢性の黄斑変性、特発性肺線維症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、皮膚の老化、白内障、多発性硬化症、シェーグレン症候群、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心不全、高血圧、脳卒中、糖尿病、骨粗鬆症、肥満、白髪、聴力損失などを含むが、それに限定されない。すべての上記病気が本発明に包含される。
【０１４８】
いくらかの好適な実施態様において、用語「加齢に伴う病気」とは腫瘍形成及び悪性癌進行、心筋梗塞(心臓発作)、小脳梗塞、脳卒中、パーキンソン病、心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧、白内障、加齢性黄斑変性、筋肉減少症、変形性関節症、骨粗鬆症、骨髄減少、多発性硬化症、シェーグレン症候群、関節リウマチ、免疫機能低下、糖尿病、特発性肺線維症、及び神経変性疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病疾患から選ばれる、並びにテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、IGF-I、又はエネルギー産生の減少に起因する疾患。
【０１４９】
本明細書で用いられている用語「抗老化効果」とは、ミトコンドリア生合成及び機能を増す、活性酸素種レベルを減らす、老化細胞及び分裂終了細胞（例えば神経細胞）の寿命を延長する、加齢に伴う病気（例えば腫瘍形成、癌の悪性進行、小脳梗塞及び心筋梗塞）を予防することを指す。
【０１５０】
本明細書で用いられている用語「加齢に伴う病気を予防すること」とは、発生率を減らされる、老化に関係している疾患を遅延又は逆転することを意味する。
【０１５１】
本明細書で用いられている用語「老化」とは、細胞周期停止状態の有糸分裂細胞が継続的に分裂できないことを意味する、テロメア機能不全、DNA損傷、又は癌遺伝子活性化により誘発される。出芽酵母に、テロメア機能不全に起因する老化細胞停止された細胞周期がG２/M期。哺乳類の細胞において、老化細胞をGO期で停止、GO細胞が細胞周期に逸する。ヒトの線維芽細胞WI-３８の細胞周期停止状態が顕微鏡下で１０日後まで細胞数が増えない、且β-ガラクトシダーゼ陽性染色を示すことを意味する。
【０１５２】
本明細書で用いられている用語「分裂終了細胞」とは、GO期停止状態の細胞群で、GO期は細胞周期以外で分裂と複製しない、然し、細胞は生物の生命活動にはそれらの主な機能を持つことになっている。分裂終了細胞は神経細胞、心筋細胞、及び筋細胞を含む。いくらかの細胞が成熟個体にはGO期に入る、分裂終了である、特定の場所に限り、誘導され再びに細胞周期に入る分裂する、例えば肝臓及び腎臓の実質細胞、これら種類の細胞はGO期には分裂終了細胞に考えられる。
【０１５３】
本明細書で用いられている用語「cdcl３-l」とは、遺伝子CDC１３には点変異が存在する酵母変異細胞をいう。用語「cdcl３-l」とは点突然変異遺伝子、Cdcl３pとは野生型タンパク質である。
【０１５４】
本明細書で用いられている用語「cdcl３-２」、「stn-１」、「cdcl７-l」及び「cdcl７-２」とは、酵母変異細胞、又は対応する突然変異遺伝子である。用語「estl」、「est２」、「est３」、「hdfl」及び「hdf２」とは、酵母変異細胞にはそれぞれに対応する遺伝子欠失を含むことを意味する、即ち遺伝子 ESTl、EST２、EST３、HDFl又はHDF２、対応する遺伝子欠失も指す。
【０１５５】
本明細書で用いられている用語「TOR 阻害剤」とは、老化を維持する能力を保持した、ラパマイシン及びその化学的又は生物学的に修飾された誘導体を含むところの、基本的なラパマイシン核を含有する免疫抑制化合物をいう。従って、用語「TOR 阻害剤」が、ラパマイシンのエステル、エーテル、ヒドラゾン、ヒドロキシルアミン、又はオキシム誘導体の投薬形態であってもよい。この用語は、ラパマイシン核上の官能基の修飾、例えば還元又は酸化反応を通じた、ラパマイシン類似体を含む。従って、用語「TOR阻害剤」は、ラパマイシン、及び、例えば、AP２３５７３(デホロリムス)、AP-２３６７５、AP-２３８４１、ABT-５７８(ゾタロリムス)、CCI７７９(テムシロリムス)、RAD-００１(エベロリムス)、７-エピ-ラパマイシン、７-チオメチル-ラパマイシン、７-エピ-トリメトキシフェニル-ラパマイシン、７-エピ-チオメチル-ラパマイシン、及び７-デメトキシ-ラパマイシン、３２-デメトキシ-ラパマイシン、２-desメチル-ラパマイシン、及び４２-O-(２-ヒドロキシル)エチルラパマイシン、のようなラパマイシン類似物を含むが、それに限定されない。
【０１５６】
本明細書で用いられている用語「治療量のラパマイシン」とは、約１mg/日〜約５mg/日の用量範囲のラパマイシンであり、多くは約０.１mg/日〜約１５mg/日、しかし４０mg/日までである。これら用量で、ラパマイシンはタンパク質翻訳及び細胞周期の進行を抑制する、Gl期に細胞周期を停止、自食作用も引き起こす可能。動物と組織培養において、マウス系モデルの治療量は０.１mg/kg/日、ヒト細胞に１０ng/mLを超える、マウス系細胞に１００ng/mL超える。当業者は治療量が特定の細胞系又は動物により異なることが知られている。
【０１５７】
本明細書で用いられている用語「低用量のラパマイシン」とは用量以下"治療量"を意味する。例えば、低用量が０.１〜１０００pMで血清培地細胞に用いられる時、０.０１〜１００μg/kg/日がマウス系モデルに適用、又は０.０１〜１００μg/日ヒトに適用。特定の濃度は特定型の細胞又は疾患による投与。これら低用量ラパマイシンの治療量の約０.００１%から約１０%。
【０１５８】
本明細書で用いられている用語「化合物又は組成物の抗老化生物濃度」は、抗老化生物活性化合物又は組成物の濃度、化合物又は組成物の濃度に相当する。cdcl３-l細胞における老化延長により抗老化生物活性を測定することができる。
【０１５９】
本明細書で用いられている用語「癌」は疾患状態である、正常細胞が異常細胞になるのは、例えばDNA損傷、癌遺伝子活性化、テロメア機能不全、初期障害細胞病変からである、次に隣接組織、領域に浸透する。癌は加齢性の癌、変異原による癌、抗癌治療又は単独の疾患に対する治療により誘発される二次癌、例えばホルモン補充、又は環境要素（例えばUV照射及び喫煙）により誘発される癌であってもよい。
【０１６０】
本明細書で用いられている用語「腫瘍形成を予防する」とは、正常細胞から異常細胞への形質転換を抑制する或いは良性腫瘍の形成を抑制することである。用語「悪性進行を予防する」とは、良性腫瘍の悪性腫瘍又は癌への進行を抑制することを意味する。用語「癌を予防する」又は「癌予防」とは、腫瘍形成を予防する及び／又は悪性進行を抑制することを意味する。
【０１６１】
本明細書で用いられている用語「癌化学予防剤」とは、腫瘍増殖を抑制するために使用し得る天然物質又は実験室で合成したもの、。
【０１６２】
本明細書で用いられている用語「薬学的に許容可能な担体」とは、当技術分野で一般に受け入れられた送達培地である、通常には生物活性剤を動物（特に哺乳類）に送達する、補助剤、賦形剤を含む、例えば希釈剤、保存剤、充填剤、流れ調整剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、香料、抗菌剤、抗真菌剤、滑沢剤、及び分散剤、選ばれるのは投与方法及び剤形で決まっている。薬学的に許容される担体は水性と非水性液体、及びさまざまな固体及び半固体剤形を含む。このような担体は活性薬剤以外に多くの異なる成分及び添加剤を含む、これらはさまざまな原因で製剤成分に入れる、例えば（活性薬剤の安定化）結合剤など、当業者が既知のもの。
【０１６３】
本明細書で用いられている用語「薬学的に許容される塩」とは、化合物の塩又は両性イオン状態をいい、水或いは油溶性又は分散性のものであり、適切な医学判定範囲において、患者組織に適用する、毒性、刺激性、アレルギー性、及び、合理的な利益／危険比においてほかの問題や併発症がない、且つある想定した使用に効果的であるもの。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、カンファースルホン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、よう化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２-ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルメイト（palmate）、ペクチン酸、過硫酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、p-トルエンスルホン酸塩を含む。薬学的に許容される付加塩を形成する酸の例は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、並びに、例えばシュウ酸、マレイン酸、コハク酸酸、及びクエン酸などの有機酸を含む。
【０１６４】
薬学的に容認される塩の陽イオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム、並び無毒第四級アミン陽イオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミンを含む。塩基付加塩の形成に有用である他の代表有機アミンは、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、及びピペラジンを含む。
【０１６５】
本明細書で用いられている用語「溶媒和物」とは、本発明の方法により同定される化合物の物理的結合する１種類以上、好ましくは１〜３の溶媒分子であり、有機或いは無機のいずれでもよい。この物理的結合は水素結合を含む。特定の場合には、溶媒和物が隔離される、例えば１種類以上の好ましくは１〜３の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれる。溶媒和物における溶媒分子が正常な配列及び／又は非正常な配列で存在してもよい。溶媒和物は化学量論又は非化学量論の量の溶媒分子を含んでよい。「溶媒和物」には可溶と非可溶溶媒和物を包含する。例示的な溶媒和物は、水和物、アルコール化合物、メタノール化合物、イソプロパナール化合物を含むが、それに限定されない。溶媒化の方法は当技術分野で既知である。
【０１６６】
加えて、本発明に係れる化合物は薬物前駆体形式であってもよい。体内に生物活性を有する化合物に転化できるいずれか化合物は薬物前駆体である。多くの薬物前駆体は当分野に周知されている。このような薬物の前駆体及び誘導体の例としては、前駆薬の設計、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ［Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５］編著；酵素学における方法、Ｖｏｌ．１１２，ａｔ ｐｐ．３０９−３９６，Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ等編著(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８５)；薬物の設計及び発展教材、Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編著、第５章、“前駆薬の設計及び応用、”ｂｙ Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ａｔ ｐｐ．１１３−１９１［１９９１］を参照する。
【０１６７】
説明的な例としては、ヒドロキシル基含有の化合物、例えばラパマイシン及びその類似物は、加水分解可能なエステル類、炭酸塩、またはカルバマート(carbomates)に形成されることができ、薬物前駆体として体内に加水分解して活性を有する化合物に形成する。そのため、本発明はラパマイシン類似物及びその対応するエステル、炭酸塩、またはカルバマート誘導体を使用して抗老化剤とすることを含む。これらの前駆体薬物は本分野の当業者によって普通の合成方法を使用して合成されることができる。例えば、エステル類としては、無水酢酸、塩化アセチル、酢酸、プロピオン酸クロライド、塩化ベンゾイル、ブチリルクロリド、無水コハク酸などのようなアシル化剤でヒドロキシル基をアシル化した誘導体が例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。炭酸塩としては、１つのＸ−Ｃ(Ｏ)ＯＲ構造を含有する化合物とヒドロキシル基との反応によって得られた誘導体（式中、Ｘが１つのハロゲンであり、Ｒが酸素原子に炭素が連接されているいずれの基、例えばアルキル基、アリール基、アリールアルキル基などであってもよい。）は例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。カルバマートも類似な方法で合成されることができる。
【０１６８】
それ以外に、ラパマイシンの薬物前駆体は例えば米国特許第４６５０８０３号及び米国特許第５１５１４１３号に主張されるように、またはいずれの出版又は出版待ちの文献に記載されるように、その他の形式であってもよい。ここで説明する多くの薬物前駆体は好ましくは経口投与であり、その原因は、多くの状況において、薬物前駆体は主に消化酵素によって加水分解されていることにある。前駆体薬物自身が活性を有し、または血液において加水分解可能であれば、注射投与してもよい。
【０１６９】
本発明の処方はいずれの適当なルート、例えば経口投与、局所投与、注射（皮下、筋肉内、静脈注射及び皮内）及び経肺吸収で投与してもよい。一部の実施例において、処方は単位服用量で表示され、いずれの方法で調製されてもよい。通常、処方は均一に調製され、活性成分（例えばラパマイシン又はその類似物）と密に関連しており、液体担体又は極細い固体担体、または両者を使用するものである。
【０１７０】
本発明の活性化合物を含む経口製剤は、錠剤、カプセル剤、口中錠、バッカル錠、ローゼンジ及び内用液剤、懸濁液、または溶液、または粉末又は顆粒剤、水溶液又は非水溶液における溶液又は懸濁液、水中油型乳剤、または油中水型乳剤を含む、通常に利用されたいずれの経口剤であってもよい。バッカル錠は活性化合物、不活性充填剤及び／または賦形剤を含有する混合物であってもよい。錠剤処方は従来の打錠成型、湿式造粒又は乾式造粒法で、且つ薬学的に許容される賦形剤、接合剤、崩壊剤、潤滑剤、表面修飾剤（界面活性剤を含む）、または沈殿防止剤または分解防止剤を用いて調製されてもよい。経口剤は溶出遅延剤又は徐放剤を使用して活性化合物の吸収を変えてもよい。
【０１７１】
場合によっては、エアゾール噴霧器で呼吸システム、耳、皮膚、または咽喉に直接投与してもよい。
【０１７２】
低用量のラパマイシンは局所投与されてもよい。局所製剤としてはクリーム剤、軟膏剤、乳剤、ゲル、ローション剤、スプレー剤などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の局所製剤の１つ実施態様において、処方には不活性物質（例えばオイル）を含み、もう１つの実施態様において、保湿クリーム基剤を含む。防腐剤は本発明の処方の有効期限の延長のために用いられることができる。本分野の当業者に周知されるように、有効成分又は不活性物質の添加によって処方を変更することができる。本発明の外用製剤は皮膚老化の防止及びガンなどの病気の早期段階の治療に用いられることができる。
【０１７３】
一部の実施例において、錠剤は少なくとも１つの活性成分と、それぞれの圧縮又は成形用の任意の１つ又は複数の薬学的に許容される担体と、を含む。好適な実施例において、圧縮錠剤は適当な設備を用いて、粉末又は顆粒のような自由流動状態になっている活性成分と、任意に、結合剤（例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えばカルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポビドン、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤又は分散剤と、を混合して圧縮することによって作られる。
【０１７４】
本発明の化合物または組成物は、単独投与または他の１つ以上（好ましくは１〜３）の薬物を併用して投与することができる。“併用投与”または“併合療法”とは、本発明の化合物または組成物を他の1つまたは１つ以上（好ましくは１〜３）の薬物と同時に治療対象の哺乳動物に投与することを指す。薬物併用投与する場合、各成分は同時に又は異なる時に任意の順序で異なる処に投与することができる。そのため、所望の治療効果を達するように、各成分は密接な時点で別々に投与してもよい。
【０１７５】
ここで、範囲は、「約」一特定値から、及び／又は、「約」別の一特定値までとして表現されることができる。このような範囲が表現された場合、他方面は１つの特定値から及び／又は他１つの特定値までを含む。同様に、これらのデータは前に「約」が付け加えられ、近似値によって表現された場合は、理解できるのは、特定値が他１つの方面を形成する。さらに理解すべきなのは、各の範囲のエンドポイントはその他のエンドポイントと顕著に関わっており且つ他１つのエンドポイントから独立している。さらに理解すべきなのは、本文には多くの値が開示され、且つ本文に開示された各々の値はこの値の自身以外に特定値と「約」に近似する値も含む。例えば、値「１０」が開示された場合、「約１０」も開示される。同時にこの出願においてデータは多くの異なる格式を有することも理解され、これらのデータは終点及び出発点を表し、範囲はデータ点の任意な組み合わせである。例えば、特定のデータ点「２%」及び特定のデータ点「４%」が公開された場合、より大きい、以上、より小さい、以下、２％及び４％であるは共に公開されたとみなされ、且つ共に２％〜４％の間にいる。さらに理解すべきなのは、２つの特定単位間の各の単位も公開している。用語「約」が計量を表すデータの前に現れた場合、この値は少なくとも±３０%の範囲内に変化できることを指し、好ましくは±２０%の範囲内、より好ましくは±１０%の範囲内である。該述語が温度を表すデータの前に現した場合、該値は少なくとも±２℃の範囲内に変化できることを指し、且つより好ましくは±１℃の範囲内に変化、時間を表す場合、該値の変化程度は少なくとも１５%、好ましくは１０%の範囲内、より好ましくは５%範囲内にを指す。
【０１７６】
［抗老化剤を同定・検出・純化する方法］（英文ｐ４４）
本発明は後述する各種の発見に基づくものである。
【０１７７】
Ａ．栄養素信号の抑制はＡＭＰＫ及び後続のミトコンドリア経路によって、酵母テロメア機能不全により誘発される細胞周期停止状態を延長する。
【０１７８】
Ａ−Ｉ．栄養素シグナルの抑制は細胞周期停止状態を維持し、且つそれによって後続のテロメア機能不全により誘発される細胞死を予防する。
【０１７９】
各種の原因によって、出芽酵母ｃｄｃｌ３−ｌは共にテロメア機能不全の好適なモデルである。例えば、第一に、ｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化により誘発されるテロメア機能不全はテロメラーゼの不活化により通じる同じ下流の経路に通じることもできる：Ｇ２／Ｍ処に依頼されたＭｅｃｌ（ＡＴＭ及びＡＴＲ同族体)の細胞周期停止、及びその後に発生する細胞死、且つ伴った細胞サイズの増大、活性酸素種産生の劇的な増加、アポトーシスマーカー、及び半数体細胞における２N以上のＤＮＡ含量。ラパマイシンによってＴＯＲに対して抑制することは、ｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化又はテロメラーゼの不活化により誘発される細胞死を予防する。興味深いことに、ラパマイシンはｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化によるＧ２／Ｍ 停止に対して影響するではなく、Ｇ２／Ｍ−停止状態を維持し、且つそれによって２Ｎ以上のＤＮＡ含量及び老化又は細胞死による悪化指標の出現を予防する（Ｑｉ，Ｈ．等，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３，ｅ３５２０（２００８））。第二に、酵母が人体に入る過程において、テロメア構造及び機能を保留する。ヒト細胞において、テロメア機能不全はＡＴＭ−／ＡＴＲに依頼する細胞周期停止を引き起こし、且つその後細胞サイズ増大、アポトーシスマーカー及び多倍体の大量の細胞死が発生する[Ｄｅｎｃｈｉ，Ｅ．Ｌ．等,Ｎａｔｕｒｅ，４４８:１０６８-７１(２００７)；Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．，等,発癌,２６:８６７-７４(２００５))、これはｃｄｃｌ３−ｌ 中の状況と類似する。従って、ｃｄｃｌ３−ｌはテロメア機能不全による下流のカスケードの研究に用いられることができる。
【０１８０】
本発明は、酵母培養基におけるグルコースを減少する、または、２００μＭの２-デオキシグルコース(グルコースの一つ類似物)を培養基に添加することによって、グルコース制限を行う。これはラパマイシン処理と類似し、且つコロニー形成実験に観察されたと同様で、窒素に対して制限しても、ｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化により誘発される細胞死を予防することができる。図１Ａに示すように、非許容温度(３７℃)で、ｃｄｃｌ３−ｌ細胞(半数体)を普通YEPD培地(１％ペプトン、２％酵母エキス及び２％グルコース)に入れて２２時間培養する場合、活細胞の大量減少が引き起こされ、コロニー形成アッセイに観測された結果と同様である。しかしながら、ＹＥＰＤ培地におけるグルコースを減少して(２%から１％、０.５％及び０％まで)及び２００μＭの２-デオキシ-グルコースを２%グルコース含有のＹＥＰＤ培地に添加すると、細胞死を効果的に予防することができ、グルコースが少なければ、生存細胞がより多い。また、ＳＣ−Ｎ培地(アミノ酸がない場合、０.６７％酵母窒素ベース、[ＮＨ４]２ＳＯ４、２％グルコースを含み、且つ該酵母菌株に用いられる各１００ｍｇ／Ｌのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシルの混合物を加える)によって窒素に対して制御を行い、細胞死も予防した（図１Ｂ）。また、濃度が０.３〜１ｎＭの間(図１Ｃ)である時、ラパマイシンは用量依存的様式でｃｄｃｌ３−ｌ細胞死を阻止する。濃度が０.５〜１ ｎＭ間であり、細胞死を予防するラパマイシンは細胞の増殖を抑制しなかった上、反対に、それに対して少しの促進作用を有し(図１Ｄ)、これは低用量でのラパマイシンの新規機能を示唆した。図１Ｅはラパマイシン及びグルコース制限がｃｄｃｌ３−ｌ 細胞死を遅延することを示す。３７℃で２０時間培養した後の大量の細胞死と比べ、低用量のラパマイシン及びグルコース対する制限は細胞死を減速させた。３７℃で６０時間培養した後、細胞生存率は処理されなかった細胞と比べ、少なくとも１００倍以上向上した。
【０１８１】
結果はさらに、ラパマイシン処理と類似するグルコース制限はＧ２／Ｍ−停止状態を維持し且つｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化により誘発される後続の細胞死を予防することを説明した。図２Ａに示すように、非許容温度(３７℃)でｃｄｃｌ３−ｌ細胞を２時間培養した後、９５％以上の細胞はグルコース制限(０.５％グルコース)及びＹＥＰＤ培地含有のラパマイシン(１ ｎＭ)の存在下でＧ２／Ｍ期の細胞周期に入り、これは対照実験の状況と類似する。ＹＥＰＤ培地において、グルコースが２％から０.５％まで減少され、それによって、２Ｎ以上のＤＮＡ含量の増加を抑制し、これは、ラパマイシン処理(１ｎＭ)と同様で、細胞周期停止状態を維持することを表明した。図２Ｂに示すように、３７℃でｃｄｃｌ３−ｌ細胞を２時間事前培養し、９５％以上の細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ期に進入させるが、グルコース制限及びラパマイシンの細胞生存率への予防効果を影響しない。従って、栄養素制限は、ラパマイシンによって実現されるＴＯＲ抑制と類似し、細胞周期停止状態(老化状態)を維持し、且つそれによって老化の悪化及びテロメア機能不全の発生時の細胞死を防止する。
【０１８２】
Ａ−２．グルコース制限はラパマイシンを介して実現されるＴＯＣ抑制と類似し、活性酸素種の誘発を抑制し且つｃｄｃｌ３−ｌ細胞死におけるアポトーシスマーカーの出現を阻止する。
【０１８３】
図３Ａにはｃｄｃｌ３−ｌ細胞死がＲＯＳ放出の劇的な増加と関わることを示す。ラパマイシン(１ｎＭ)処理と類似し、グルコースの２％から０.５％(０.５％ＧＩｃ)に減少することは、ＲＯＳ増長を、同様な温度下の野生型(ＷＴ)と比較することができるレベルまで有効に低減する。図３Ｂは、ホスファチジルセリン(ＰＳ)に測定されたと同様に、ｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化により誘発される細胞死も増加されたアポトーシスと関わり、且つグルコース制限(０.５％ＧＩｃ)またはラパマイシン(１ｎＭ)がこのアポトーシス死を効果的に抑制することを示した。
【０１８４】
Ａ−３．ＡＭＰＫ及びミトコンドリア機能はラパマイシン及びグルコース制限のｃｄｃｌ３−ｌ細胞死への予防効果に重要な役割を果たす。
【０１８５】
本発明はさらにＡＭＰＫの、ｃｄｃｌ３−ｌ細胞死に対する予防効果における重要な役割を開示する。図４Ａは、２ｐの欠失（酵母ＡＭＰＫの調節性サブユニットβ）がグルコース制限の予防効果を著しく抑制することを示す。また、ＳｎｆＩｐ及びＳｎｆ４ｐの欠失は（それぞれ触媒性サブユニットα及び調節性サブユニットγ）ラパマイシンの予防効果を大幅に減らす(図４Ｂ)。
【０１８６】
本発明はさらに、その機能は、ＡＭＰＫ活性化及び下流のミトコンドリア生合成によって改善された糸粒体の、ｃｄｃｌ３−ｌ 細胞死への予防効果に重要な役割を果たすことを開示する。すでに公開された論文(Ｑｉ，Ｈ，／Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８:１５１３６-１５１４１(２００３))に記載されるように、臭化エチジウム含有の培地に細胞を培養することによって、ｃｄｃｌ３−ｌ細胞においてミトコンドリア欠損変異を実現することができる。図５Ａは、糸粒体欠損がグルコース制限及びラパマイシン(１ｎＭ及び５ｎＭで)の予防効果を著しく消去することを示す。ミトコンドリア質量の増加を測定することによっても、グルコース制限(０.５％グルコース)およびラパマイシン(１ｎＭ)はミトコンドリア生合成の上方調節を実現することを説明した(図５Ｂ及び図５Ｃ)。
【０１８７】
図６は上記の結果の要約を示す。糸粒体はテロメア機能不全により誘発される増殖停止状態を維持することにおいて重要な役割を果たし、且つグルコース制限及びラパマイシンによって実現されるＴＯＲ抑制は、ＡＭＰＫ活性化によってミトコンドリア機能を刺激し、それによって老化の悪化及び後続の細胞死を予防する。
【０１８８】
Ｂ．同様に、低用量のラパマイシン、グルコース制限及びＡＭＰＫ活性化因子はミトコンドリア機能を刺激し、且つ第一のヒト線維芽細胞における老化を延長する。
【０１８９】
本発明はＣＲ又はラパマイシンも老化を延長し、且つヒト細胞おいてテロメア機能不全により誘発される細胞死を阻止することを開示する。第一のヒト胚性肺線維芽細胞ＷＩ−３８が採用された。これら細胞はテロメラーゼ活性が欠乏し、且つ通常はルーチン（定法）の培養条件下で、第３１回の継代する時に複製能を達し、それによってテロメア機能不全を表す。第２９回の継代する時に細胞は５０ｐＭラパマイシンで処理を行った。処理は１０日を１つの周期とし、そのうち３日は投与し、７日は投与しない（３日−ｏｎ／７日−ｏｆｆ周期とも呼ばれる)。細胞は第３１回の継代する時に分裂が停止し（顕微鏡下で測定）、且つラパマイシンの存在か否かに関わらず、共に老化状態が現れ、これは１ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌ、４０ｍＭのクエン酸／リン酸ナトリウム、ｐＨ＝６.０の５ｍＭフェロシアン化カリウム、５ｍＭのシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液で、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルβ-D-ガラクトシド(Ｘ−ｇａｌ)を使用してサイトゾルβ-ガラクトシダーゼ活性に対して測定することによって実現される。サイトゾルβ-ガラクトシダーゼ活性の増加によって、老化細胞が青色に染色された(白黒写真で濃い灰色として示されている)。図７は、老化状態になっていた５６日後、ＤＭＳＯ対照には大量の細胞消失が発生されることを示す。５０ｐＭラパマイシンが細胞消失に対して強い抑制作用を発生する。老化指標が依然存在しており且つ細胞増殖が観察されなかったため、ラパマイシンは細胞に対して転化しなかった。また、培養基(０.４%から０.２%まで)にグルコースを減らしまたは２-デオキシグルコース(１２.５μM)を添加することも老化細胞の消失を予防する(図７)。
【０１９０】
酵母に観察された状況と類似し、ＡＭＰＫもヒト細胞におけるラパマイシンまたはグルコース制限に媒介されるテロメア死の予防に重要な役割を果たす。図７に示すように、ＡＭＰＫ特定の活性化因子５-アミノイミダゾール-４-カルボキサミド-１-ｂｅｔａ−Ｄ−リボフラノシド(ＡＩＣＡＲ、２５０μＭ)(投与方式：１０-日を１つの周期とし、毒性を防止するように、２-日ＡＩＣＡＲ、８-日投与せず)で処理を行い、ＷＩ−３８老化細胞の減少を防止する。また、ウエスタンブロット法に観測されたように、ラパマイシン(５０ｐＭ)はＡＭＰＫキナーゼ活性を活性化し、ウエスタンブロット法はＴｈｒｌ７２(データが図示せず)処のリン酸化ＡＭＰＫを測定することに用いられる。また、低用量のラパマイシン、２-デオキシグルコース、グルコース制限及びＡＩＣＡＲはミトコンドリア質量を増加し且つ人体内のミトコンドリア機能を刺激する(図８及び図１０)。低用量のラパマイシンはヒト線維芽細胞(図８Ａ)及びリンパ芽球様 Ｌ４０細胞(データが図示せず)においては共にミトコンドリア質量を増加する。低用量のラパマイシンが線維芽細胞及びＬ４０細胞においても、ミトコンドリア膜電位を増加し且つＲＯＳレベルを減らす(図８Ｂ、図８Ｃ、データは示さず)。
【０１９１】
意外なのは、図９Ａに示すように、低用量のラパマイシン(１０ｐＭ〜１００ｐＭ)のみＷＩ−３８老化細胞の減少を阻止することができる。反対に、ラパマイシンは濃度が５００ｐＭより高い時に、細胞消失を促進する。例えば、２５ｐＭのラパマイシンは細胞消失を阻止する(図９Ａ)が、細胞増殖を抑制しない(図９Ｂ)。反対に、集団倍加に測定されたように、複製能を５.１２から６.８までに増加する。また、低用量のラパマイシン(５０ｐＭ及び１００ｐＭ)はキー老化タンパク質ｐ５３、p２１及びｐＲＢのレベルを増加するが、高用量(２０００ｐＭ)のラパマイシンは増加できない(図９Ｃ)。また、低用量のラパマイシンのみ、ヒト細胞におけるミトコンドリア質量及び膜電位を増加し、且つ活性酸素種レベルを下げることができ、１０ｎＭのラパマイシンがこの効果を失った(図８)。従って、低用量のラパマイシンの機能が治療量の機能と違っており、細胞周期Ｇ１期のタンパク質翻訳及び細胞増殖を抑制することではなく、ミトコンドリア機能を刺激し、且つ老化の悪化を予防する。
【０１９２】
要するに、１)酵母の人体に入る過程において、老化細胞における細胞周期停止状態に対して維持することを保留する；２)ＣＲ、グルコース制限又は低用量のラパマイシンがＡＭＰＫを介してミトコンドリア機能に対して刺激し、老化を延長し、且つそれによって後続の細胞死を抑制する；及び、３)ヒト細胞における老化状態を維持する方面において、低用量のラパマイシンのみが、カロリー制限を模倣する。
【０１９３】
Ｃ．いくつかの抗老化及び癌化学予防剤はミトコンドリア機能を刺激し、且つ酵母とヒト細胞における老化細胞の減少を抑制する。
【０１９４】
本発明は多くの加齢に伴う病気を予防でき、共にミトコンドリア質量を増加し且つ老化を延長することができる、２種の既知の薬剤、すなわち緑茶抽出物(ＧＴＥ)及びブドウ種子エキス(ＧＳＥ)におけるＥＧＣＧを開示する。
【０１９５】
報告によると、ＧＴＥは各種の癌を予防することができる(米国特許第７,１９２,６１２号と第７,３８４,６５５号、及び米国特許公報第２００４０１４２０４８号と第２００４００４７９２１号、及びＳｈｉｍｉｚｕ， Ｍ．等, Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．,１７:３０２０-３０２５(２００８)；Ｎａｋａｃｈｉ，Ｋ．等,Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８９:２５４-２６１(１９９８))。没食子エピガロカテキン(ＥＧＣＧ)がＧＴＥの最も効果的な成分である。報告によると、ＥＧＣＧは線虫の寿命を延長することができ(Ａｂｂａｓ，Ｓ．及びＷｉｎｋ， Ｍ．，Ｐｌａｎｔａ．Ｍｅｄ．，７５:２１６-２２１(２００９))、その他の報告によると、それはアミロイド前駆体タンパク分裂に対して調節を行い且つアルツハイマー病にかかる形質転換マウスの脳のアミロイドーシスを減少し(Ｒｅｚａｉ−Ｚａｄｅｈ，Ｋ．等,Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５(３８):８８０７-８８１４(２００５))、ラットの瞬間中大脳動脈閉塞後の脳損傷を予防する（Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｂ．等,Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１０１９:４７-５４(２００３))、分離されたラット心臓において、ミトコンドリアＫ (ＡＴＰ)チャンネルの活性化によって心筋細胞の虚血/再かん流によるアポトーシスを防止し、且つ梗塞のサイズを減少する (Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ｐ．Ａ．等，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１８:１６２１-１６２３(２００４); Ｓｏｎｇ， Ｄ．Ｋ．等,Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．ＳｃＬ，２５(３):３８０-３８６(２０１０))。また、さらに、それは分離された膵島においてアポトーシスを予防し（Ｈａｒａ，Ｙ．等,Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．，１４:４９３-４９７(２００７))、多発性低用量のストレプトゾトシンにより誘発されるマウス自己免疫性糖尿病を予防することができ(Ｓｏｎｇ，Ｅ．Ｋ．等,Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２６:５５９-５６３(２００３))、ヒトシェーグレン症候群のマウスモデルにおける自己免疫症状を減少し(ｈｓｕ，Ｓ．Ｄ．等,Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，４０:１３８-１４７(２００７))、且つラットモデルにおいてセレンにより誘発される白内障の形成を予防する(Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｋ．等，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓ．，３４:２５８-２６３(２００２))。興味深いことに、ＥＧＣＧはさらにＡＭＰＫを活性化する(Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｈ．等,Ｍｏｌ Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．,５３(９):１１５６-１１６５(２００９))。
【０１９６】
ＧＳＥも癌予防活性を持つことが示された(米国特許出願第２００４００４７９２１号及び２００５００１３８８０号)。例えば、没食子酸は、GSEの主要な成分として、ＴＲＡＭＰマウスモデルにおいて前立腺癌が晩期段階に進行することを緩め(Ｒａｉｎａ，Ｋ．等,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．,６７:５９７６-５９８２(２００７))、且つＧＳＥはさらにＮＮＫにより誘発される前癌ヒト乳房上皮細胞ＭＣＦｌＯＡの発癌を予防する (Ｓｉｒｉｗａｒｄｈａｎａ， Ｎ．等, Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．,１０９:４２７-４４１(２００８))。また、ＧＳＥはエストロゲン欠失した動物モデルにおける動脈圧及び食塩感受性高血圧を減らすことができることを示した(ｒｅｖｉｅｗ ｂｙ Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｓ．等,Ｇｅｎｄ．Ｍｅｄ．,５ Ｓｕｐｐｌ．Ａ，Ｓ７６-９０(２００８))。それはさらに、ヒト表皮の三次元組織培養モデルにおいてＵＶＢによる皮膚損傷を効果的に予防することができ(Ｔｏｍａｉｎｏ，Ａ.等,Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ.,２０:１３９５-１４０２(２００６))、アルツハイマー病のマウスモデルにおいてＡβオリゴマー形成を予防し且つ認知悪化を弱め(Ｗａｎｇ，Ｊ．等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２８:６３８８-６３９２(２００８))、マウス及びハムスターにおいて高脂肪食による肥満症を予防し(Ｐａｒｋ， Ｓ．Ｈ．,等,Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ，２:２２７-２３３(２００８)；Ｄｅｃｏｒｄｅ，Ｋ．等,Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．,５３:６５９-６６６(２００９))、ラットモデルにおいて老化による酸化損傷のＤＮＡの脊髄及び大脳における蓄積を抑制し(ＢａＩｕ， Ｍ．等,Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ．,６８:４６９-４７３(２００６))、及び老化の間に赤血球膜完全性のを維持する(Ｓａｎｇｅｅｔｈａ，Ｐ．等,Ｅｘｐ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌ.,４０:８２０-８２８(２００５))。
【０１９７】
図１０に示すように、２５０μg/ｍＬのＧＳＥ及びＧＴＥからの５０μg/mLのＥＧＣＧは共にヒト細胞におけるミトコンドリア質量を増加した。例えばリンパ芽球様Ｌ４０細胞。それらはさらに酵母及びヒト線維芽細胞ＷＩ−３８におけるテロメア死亡を予防する(図１１及び図７)。
【０１９８】
図１０は多くの癌化学予防剤、例えば、１０μＭのＬＹ２９４００２(ＰＩ３Ｋ阻害剤)、２μＭのジアリルトリスルフィド(ＤＡＴＳ)、１μＭのベンジルイソチオシアネート(ＢＩＴＣ)、１μＭのフェニルイソチオシアナート(ＰＩＴＣ)、２μg/ｍＬのレスベラトロール(ＲＳＶ)と０.０３μＭのリコピン、６.７μＭのイソチオシアン酸フェネチル(ＰＥＩＴＣ)、１μＭのイソチオシアン酸アリル(ＡＩＴＣ)、５ｍＭのシリビニン、１.２５ｍＭの亜セレン酸塩(Ｎａ２ＳｅＯ３)、２.５ｍＭのゲニステイン、及び３ｍｇ／ｍＬのビルベリー抽出物、がヒトリンパ芽球様細胞におけるミトコンドリア質量を増加することを示す。図７及び図１１は、イソチオシアン酸フェネチル(ＰＥＩＴＣ)、 シリビニン、亜セレン酸塩(Ｎａ２ＳｅＯ３)、ゲニステイン、及びビルベリー抽出物を含む多くの癌化学予防剤の、酵母及び／又はヒト細胞におけるテロメア死への各種程度の保護作用を示す。
【０１９９】
Ｄ．多くの加齢に伴う病気または障害が糸粒体又は／及びテロメアの機能不全に関わり、且つ低用量のラパマイシンは動物モデル又は組織培養モデルにおいて複数の加齢に伴う病気または障害を予防する。
【０２００】
癌。
ほとんどの癌細胞はミトコンドリア機能不全を示す。この現象がワーブルグ効果と呼ばれ、すなわち癌細胞において、６０％にも達するＡＴＰが好気条件下で解糖によって生成され、一方、正常細胞において、多数のＡＴＰがミトコンドリア酸化的リン酸化によって生成される。発癌性転化は酸化的リン酸化を抑制し且つ解糖を増加でき、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は酸化的リン酸化に対して上方調節し且つ解糖に対して抑制することがすでに示された。しかしながら、影響を受けたミトコンドリア機能が癌の原因か結果かはまだ明確されなかった。
【０２０１】
既知なのは、テロメアが徐々に短縮するため、テロメア機能不全は年代に依存しており、且つテロメア機能不全により誘発される老化を維持することは加齢性癌の進行を予防するキー機序である。癌遺伝子活性化及び変異原により誘発される老化もＤＮＡ損傷応答により、テロメア機能不全と同様であるため、老化維持は各種の癌を予防する内在機序である。
【０２０２】
本発明はミトコンドリア機能が老化を維持するに好適な役割を果たすことを開示する。従って、ミトコンドリア機能は老化を維持することによって癌を予防する方面においては重要であり、且つ影響を受けたミトコンドリア機能は老化悪化及び癌進行を進める早期段階である。そこで、テロメア機能不全モデルはミトコンドリア機能を刺激し、老化を延長し且つ癌を予防する候補を同定することに用いられることができる。実に、多くの既知の癌化学予防薬が老化を延長し及びミトコンドリア質量を増加することができる(図７、図１０及び１１)。また、図７に示すように、老化を延長する低用量のラパマイシン及びＡＩＣＡＲは、ミトコンドリア質量の減少を逆転し且つＮＩＨ３Ｔ３細胞において(図１２及び図１３)変異原ＴＰＡ(１２-０-テトラデカノイルホルボール１３-アセタート)により誘発される腫瘍形成を予防する(実施例１５を参照)。
【０２０３】
神経変性疾患。
広範囲な研究にもかかわらず、神経変性疾患の機序が不明である。ミトコンドリア機能不全は疾患に役割を果たすかもしれない。原因はＰａｋｉｎ(パーキンソン病に関わる)、Ｈｕｎｔｉｎｔｉｎ(ハンチントン病に関わる）及びアミロイド-β(アルツハイマー病を引き起こす老人斑)は共にトコンドリア機能に関与することにある。最近の研究も自食作用(タンパク質分解)がこれら疾患で役割を果たすことを示唆する。
【０２０４】
本発明は、高用量のラパマイシンではなく、低用量のラパマイシンが活性酸素種レベルを下げ、培養におけるラット小脳顆粒神経細胞(ＣＧＮ)細胞の寿命を延長し(図１４Ａ及び図１４Ｂ)且つラット脳卒中モデルにおいて小脳梗塞による脳損傷を予防する(図１５Ａ及び図１５Ｂ)ことを開示する(実施例１６-１８を参照)。ラパマイシンは低用量でさらに２００μＭ ＭＰＰ＋により誘発される活性酸素種レベルを下げ、一方、ＭＰＰ＋はドパミン作動性の神経毒素であり、マウスモデルにおいてパーキンソン病を引き起こすことができる(図１６)。また、報告によると、神経変性疾患を予防又は治療できるＥＧＣＧはさらに老化を延長することができる(図７及び図１１)。従って、低用量のラパマイシン及びＥＧＣＧは有糸分裂後と老化細胞の寿命を延長することがてき、ＧＯ期の有糸分裂後の神経細胞の維持はＧＯ期の老化細胞と類似する機序を有することを表明した。そこで、一つ態様において、本発明は以下の発見に基づくものであり、老化モデルは神経変性疾患を予防する薬剤候補の同定及び検出に用いられることができ、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含むが、それに限定されない。
【０２０５】
心不全、アテローム性動脈硬化症及び心筋梗塞
テロメア機能不全が慢性心不全に重要な役割を果たすことが示された。さらに、培養された心筋細胞において、ＴＲＦ２機能を干渉することはテロメア浸食及びアポトーシスを引き起こすことが示された。逆に、外因性ＴＲＦ２が保護され、酸化的ストレスを防止することができるが、それによって、例え有糸分裂後、非周期細胞においても、依然テロメア機能不全によって細胞死を発生することができることを表明した(Ｏｈ，Ｈ．等,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ，１００:５３７８-５３８３(２００３))。体内において、第５代ＴＥＲＣ−欠損マウス(Ｇ５ＴＥＲＣ−ＫＯ)(ＴＥＲＣ遺伝子コード化テロメラーゼＲＮＡの欠損によるテロメラーゼ変異体モデル)は心筋細胞における短いテロメア、心筋心室拡張、心筋の薄化、心臓の機能不全、及び突然死を著しく表した。Ｇ５ＴＥＲＣ−ＫＯマウスの心臓試片は、野生型マウスに比べて、ＤＮＡ損傷応答タンパク質ｐ５３の発現が増加され、アポトーシスが増加され、及び左心室筋細胞数が５０％減少されることを示した(Ｌｅｒｉ，Ａ．等,ＥＭＢＯ J.,２２:１３１-１３９(２００３))。
【０２０６】
アテローム性動脈硬化症は通常動脈硬化または動脈の垢を指し、これは動脈内に大量の斑の形成によって引き起こされる。動脈アテローム性の刺激による血管内皮細胞(ECs)の機能不全は、アテローム性動脈硬化症の病因に対して非常に重要である。ヒトのアテローム性動脈硬化症病変組織にはすでに加速させたテロメア浸食及び早老が観察され(Ｏｇａｍｉ，Ｍ．等,Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．，２４:５４６-５５０(２００４)；Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｔ．等,Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０５:１５４１-１５４４(２００２))、これは年代に依存したテロメア浸食によるＥＣの機能不全又は減少は斑の形成の早期ステップであるかもしれないことを表明する。
【０２０７】
冠状動脈アテローム性硬化は心筋梗塞(ＭＩ、普通に心臓発作と呼ばれる)を引き起こす冠循環の閉塞に至る。ＭＩは有糸分裂後の心筋細胞の消失、不適応な再構成、心収縮機能不全及び最終の鬱血性心不全を引き起こす。
【０２０８】
本発明は低用量のラパマイシンが（１０μｇ／ｋｇで、１００μｇ／ｋｇではない）ラットモデルにおいて心筋虚血性梗塞を著しく減らすことを開示する(図１７及び実施例１９)。また、報告によると、AMPK活性化因子メトホルミンもマウスモデルにおいて心筋梗塞を減らし且つ心筋細胞に糸粒体媒介の細胞死を防止することできる(Ｃａｌｖｅｒｔ，Ｊ．Ｗ．，糖尿病,５７:６９６-７０５(２００８))。これら結果はＴＯＲ／ＡＭＰＫ／糸粒体経路の、有糸分裂後心筋細胞における重要性、老化細胞における重要性と類似する、を表明した。従って、テロメア機能不全により誘発される老化モデルは、心筋梗塞を予防又は治療する薬剤候補を選択することに用いられることができる。
【０２０９】
加齢性黄斑変性。
加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)は老人(＞５０歳)の失明の主な原因である。それは網膜色素上皮細胞(ＲＰＥ)の退化から始め、且つ最終に視野の中心(黄斑)の視力喪失に至る。報告によると、テロメア浸食、ミトコンドリア機能喪失及び細胞消失が共にこの疾患と関わる(Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｈ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．ＳｃＬ，４０:１９７-２０２(１９９９);Ｌｉａｎｇ，Ｆ．Ｑ．等,Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，７６:３９７-４０３(２００３))。そこで、ミトコンドリア機能を改善し、それによって、テロメア浸食により誘発される細胞消失を予防することは、病気の初期段階を予防又は安定化することができる。興味深いことに、５０ｐＭの低用量のラパマイシンの、この疾患を治療する用途に対しては、すでに特許を出願した(米国特許第７,０８３,８０２号)。従って、テロメア機能不全により誘発される老化モデルは、ＡＭＤを予防又は治療する薬剤候補の選択に用いられることができる。
【０２１０】
変形性関節症。
変形性関節症(ＯＡ)の特徴は関節軟骨の進行性消失であり、老人個体群における最もよく見られる慢性の関節疾患であり、著しい疼痛及び身体障害を引き起こす。軟骨細胞の機能は適切な軟骨基質の維持にとって必要である。テロメア機能不全、ミトコンドリア変異及び軟骨細胞におけるアポトーシス式の細胞死はＯＡと関わることがすでに示された(Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ａ．等,Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．，８５−Ａ Ｓｕｐｐｌ．２:１０６-１１０(２００３); Ｒｕｉｚ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｃ等,ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．，８:１７２-１８９(２００９)；Ｄａｖｅ，Ｍ．等,関節炎Ｒｈｅｕｍ．，５８：２７８６-２７９７(２００８))、これは、軟骨細胞におけるテロメア機能不全による細胞消失が潜在の疾患発症の機序になっていることを表明する。そこで、ミトコンドリア機能を改善して、それによってテロメア機能不全により誘発される細胞消失を予防するのは、疾患の早期を予防又は安定させることができる。従って、テロメア機能不全により誘発される老化モデルはＯＡを予防又は治療する薬剤候補の選択に用いられることができる。
【０２１１】
特発性肺線維症。
特発性肺線維症(ＩＰＦ)は慢性の進行性間質性肺疾患であり、特徴は肺間質の線維性組織の異常及び過剰沈積にある。該疾患は通常５０歳以上年齢の患者に発生する。最近、テロメラーゼの変異が成人発症の肺間質線維症に至り(Ｔｓａｋｉｒｉ，Ｋ．Ｄ．等人,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４:７５５２-７５５７(２００７))、且つ短いテロメアがＩＰＦと関係がある(Ａｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．等, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５:１３０５１-１３０５６(２００８)；Ａｒｍａｎｉｏｓ，Ｍ．Ｙ．等，Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５６:１３１７-１３２６(２００７))ことが示された。証明によると、肺上皮細胞における糸粒体及びアポトーシスがIPFと関わる(Ｋｕｗａｎｏ，Ｐ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，４７：３４５−３５３(２００８))。これらの結果はテロメア機能不全による肺上皮細胞の減少は加齢性のＩＰＦの初期起因であるかもしれないことを表明する。そこで、ミトコンドリア機能を改善し、それによって肺上皮細胞におけるテロメア浸食より誘発される細胞減少を予防することは、病気の初期段階を予防または安定化させる可能性がある。従って、テロメア機能不全により誘発される老化モデルはＡＭＤを予防又は治療する薬剤候補の選択に用いられることができる。
【０２１２】
皮膚の老化。
線維芽細胞の老化が皮膚老化の兆候（例えば、しわ）に好適な役割を果たす。テロメアの進行性短縮及び活性酸素種又はＵＶによるＤＮＡ損傷の蓄積は、線維芽細胞老化及び後続の細胞消失を含む線維芽細胞老化を引き起こす。次に、線維芽細胞老化は、増殖性能減少(Ｍｉｎｅ，尾Ｓ．等,ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３［１２］：ｅ４０６６(２００８)；Ｈａｙｆｌｉｃｋ，Ｌ．／Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，７３:８−１４(１９７９))、細胞形態及び新陳代謝の変化、細胞外のマトリックスタンパク質（例えば１型及び３型膠原質）の産生の減少(Ｖａｒａｎｉ，Ｊ．等,Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６８:１８６１-１８６８(２００６))、及び細胞外基質の退化に関わるプロテアーゼの過剰発現(Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｄ．等,Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１８４：１３８-１４７(１９８９))を含む機能低下をもたらす。これらの体外変化は共に多少程度に加齢に伴う皮膚の体内変化と関与する。機能性のミトコンドリア個体群を維持することはテロメア短縮を遅延するだけでなく(図９Ｂ)、機能性を依然有する老化線維芽細胞の減少を予防し(図７及び図９Ａ)、且つそれによって皮膚の老化を遅延し、及び皮膚癌を予防する。
【０２１３】
関節リウマチ(ＲＡ)。
機能障害性テロメア及びミトコンドリア変異がＲＡにおける潜在的な病原因子である。関節リウマチ患者の造血前駆細胞(ＨＰＣｓ)及び骨髄間葉幹細胞(ＭＳＣｓ)は早過ぎのテロメア短縮及び減らされた複製能を表すことがすでに表明された(Ｃｏｌｍｅｇｎａ，Ｉ．等,関節炎 Ｒｈｅｕｍ．，５８:９９０-１０００(２００８)；Ｋａｓｔｒｉｎａｋｉ，Ｍ．Ｃ．等,Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，６７:７４１-７４９(２００８))。また、この疾患の主要な感受性遺伝子とするＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４対立遺伝子はテロメア短縮の過程に対して調節できることがすでに表明された(Ｓｃｈｏｎｌａｎｄ，Ｓ．Ｏ．等,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ，１００：１３４７１-１３４７６(２００３))。いくつかの研究も、ＲＡにおける炎症を起こした滑膜の組成及び構造方面の一部の特徴的な変化は、滑膜細胞がすでに変化したアポトーシス応答と関わることを表明した(Ｋｏｒｂ，Ａ．等,アポトーシス,１４：４４７-４５４(２００９))。また、対照に比べて、ＲＡによる滑膜細胞のｍｔＤＮＡの変異が大幅に増える(Ｄａ Ｓｙｌｖａ，Ｔ．Ｒ．等,関節炎 Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．，７：Ｒ８４４-８５１(２００５))。従って、ミトコンドリア機能を改善し、且つテロメア短縮により誘発される細胞死を予防する薬剤候補を研究・開発して、この疾患の治療に用いられることができる。
【０２１４】
糖尿病。
糖尿病とは高血糖値を至ることができる疾患を指し、原因はインスリン産生の減少(１型糖尿病)またはインスリンの効果に対して生成した抵抗性(２型糖尿病及び妊娠期間)にある。テロメア機能不全又はミトコンドリア機能不全によって、β-細胞機能が早すぎて消失することは糖尿病の初期段階であるかもしれない。広範に受け取られる観点としては、ｍｔＤＮＡ欠陥が糖尿病の病因の１つのよくある要因であり、且つｍｔＤＮＡの再配列(Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ， Ｓ．Ｗ．等,Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．,７:４５８-４５９(２００４)；Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｗ．等,Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．, １：１１-１５(１９９２))及びｔＲＮＡの変異(ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．等,糖尿病,４３:７４６-７５１(１９９４))は糖尿病と関わる。また、マウスの膵臓β細胞において、ミトコンドリア生合成のそのうちの１つのの主要タンパク質のミトコンドリア転写因子ＴＦＡＭに対して不活化を行うことは、血清インスリンの激しい減少及び空腹及び非空腹状態での血中グルコースの増加をもたらす(Ｋｏｓｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．等,Ｃｅｌｌ，１００：６４５-６５４(２０００)；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，Ａｍ．J．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，１０６:７１-９３(２００１))。それ以外に、ヒト膵島におけるβ-細胞は体外においてテロメア浸食及びテロメアによる老化を受けることを表明した(Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ，Ｔ．Ｌ．／Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１６６:１０３-１０９(２０００))。そこで、ミトコンドリア機能を改善し且つテロメア浸食により誘発される細胞消失を予防することができる薬剤候補はこの疾患の予防に用いられることができる。
【０２１５】
上記の加齢に伴う病気はミトコンドリア悪化及び／又はテロメア機能不全に関わる実例である。さらに、この種類に属する多くの他の疾患があり、例としては、肥満、骨粗鬆症、高血圧、老年性筋肉減少症、白内障、多発性硬化症、シェーグレン症候群、加齢性の聴力損失、グレーイング、加齢性の免疫調節異常、及びテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉ、又はエネルギー産生の減少に起因する疾患を含むが、それに限定されない。従って、本発明はさらに将来に発見されるいずれかの加齢に伴う病気または障害を含む。
【０２１６】
要するに、本発明は糸粒体が老化細胞及び有糸分裂終了細胞（例えば神経細胞及び心筋細胞）において増殖停止状態を維持する方面に重要な役割を果たし、且つ多くの加齢に伴う病気に関わることを開示する。また、糸粒体機能不全及びテロメア機能不全も加齢に伴う病気に関わる。これらの原理は老化細胞を使用して加齢に伴う病気に対する薬剤候補を検索する根拠である。
【０２１７】
図１８は加齢に伴う病気の機序を要約し、且つ如何にして栄養素／ＴＯＲ経路を制御することによって加齢に伴う病気を予防することを説明する。つまり、糸粒体は各種の細胞及び組織における加齢に伴う病気に極めて好適な役割を果たす。神経細胞、筋細胞、心筋細胞のような有糸分裂終了後の細胞において、糸粒体が有糸分裂後の状態を維持することに用いられ、それによって細胞が改めて細胞周期に入ることを防止し及び後続の細胞死を防止する。増殖性組織において、ミトコンドリア機能に対して改善を行うことは、酸化的ストレスの減少及びそれらの複製能の増加ができる。老化に入った後、糸粒体は有糸分裂終了後の細胞におけるのように、該老化状態を維持し且つ後続の細胞消失を予防する。細胞消失は修復カスケード、例えば関節リウマチにおける炎症反応及び特発性肺線維症における線維症を引き起こすことができる。細胞消失はさらに組織の機能低下及び変性疾患、例えば骨髄不全、ニューロン変性及び心不全を引き起こすことができる。もう一つ状況において、老化悪化が腫瘍形成及び癌の進行に至る。グルコース制限を含むカロリー制限、および低用量のラパマイシンはミトコンドリア機能を刺激し、且つ各種の加齢に伴う病気を予防する。
【０２１８】
要するに、本発明はすでに、(i)ミトコンドリア機能が老化状態を維持する；(ii)有糸分裂後状態の維持は老化状態を維持することと類似する；(iii)ＣＲはミトコンドリア機能によって老化及び分裂終了細胞を維持する、且つそれによって、老化モデルはミトコンドリア機能を刺激する、及び各種加齢に伴う病気を予防する候補を同定することに用いられることができる；(iv)多くの癌化学予防薬、グルコース摂取阻害剤及びＡＭＰＫ活性化因子は共に老化を延長することができ、このように加齢に伴う病気を治療するための薬剤候補として開発されることができる；及び(v)ＣＲの模倣体としての低用量のラパマイシンが老化細胞及び有糸分裂終了後の細胞を維持することができ、且つ癌、脳卒中による脳損傷、心筋虚血性梗塞、及びその他の加齢に伴う病気又は表現型を予防することができることを開示した。
【０２１９】
最近、優先権を主張する該仮出願を提出した後、いくつかの研究者により、治療量のラパマイシンはさらにタンパク質翻訳の抑制及び分解(自食作用)刺激によって老化及び加齢に伴う病気に対して一定の効果を有することを報告した。例えば、報告によると、治療量のラパマイシン(７.５ｍｇ／ｋｇ)はマウスモデルにおいてタンパク質翻訳抑制によってパーキンソン病に対して効果的な作用を有し、特にＲＴＰ８Ｏ１／ＲＥＤＤ１／Ｄｄｉｔ４タンパク質に対して、該タンパクはパーキンソン病患者の影響された神経細胞から誘導され、且つ神経細胞死を引き起こす(Ｍａｌａｇｅｌａｄａ， Ｃ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３０(３):１１６６-１１７５(２０１０))。もう一つの報告は、治療量のラパマイシン(２.２４ ｍｇ／ｋｇ)はアルツハイマー病のマウスモデルにおいて、自食作用によって認知障害を改善し且つＡβ 及びｔａｕ タンパク病理を改善したことを称した(Ｃａｃｃａｍｏ，Ａ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０年２月２３日)。また、さらに、寿命に対するＣＲの延長効果（約３０〜４０％）と比べ、治療量のラパマイシンの、マウス及びミバエの寿命に対する延長効果がより少ない(約１０％)(Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．等, Ｎａｔｕｒｅ，４６０(７２５３)：３９２-３９５(２００９))。興味深いことに、ラパマイシンのこのようにミバエの寿命を延長することはＡＭＰＫ／ミトコンドリア経路を経由することではなく、タンパク質翻訳の抑制及び/又は自食作用刺激によるものである(Ｂｅｊｄｏｖ，Ｉ．等,Ｃｅｌｌ Ａｆｅｔａｆｅ．，１１［１］：３５-４６(２０１０))。
【０２２０】
これら結果は、治療量のラパマイシンはタンパク質翻訳/増殖の抑制及び自食作用の刺激によって、いくらかの加齢に伴う病気と寿命及び寿命延長に対して一定の機能を果たすことができることを表明した。しかしながら、各種の副作用のため、治療量のラパマイシンを加齢に伴う病気を予防することに長期使用することが適切ではない。他方、Ｃｒの模倣体とする低用量のラパマイシンは(事実上、形成する副作用が非常に少ないため、ＣＲより優れている)、ＡＭＰＫ／ミトコンドリア経路を通じて、老化及び加齢に伴う病気を予防することに用いられることができ、一方、前記治療量のラパマイシンを使用することに比べ、低用量のラパマイシンはより各種の明らかな利点、例えばより高い有効性及びより小さい副作用を有する。
【実施例】
【０２２１】
＜EXAMPLES＞（英文ｐ５８）
Ａ．テロメア機能不全モデルを使用してハイスループット・スクリーニングを行って加齢に伴う病気を予防又は治療する抗老化候補を同定及び検出する。
【０２２２】
本発明の一つの態様において、酵母テロメア機能不全モデルｃｄｃｌ３−ｌを使用してハイスループット・スクリーニングを行い、加齢に伴う病気の予防又は治療ための有用な抗老化剤を発見する。ｃｄｃｌ３−ｌモデルがすでによく研究され、一旦ｃｄｃｌ３−ｌｐが不活化された後、直ちにＧ２／Ｍ期細胞周期停止及びその後の細胞死亡が発生する。このモデルを使用することによって、本発明はテロメア機能不全による細胞死を予防することができる候補を同定する速い方法を提供する。その他の、テロメア機能不全を有し、且つ快速な成長停止及びその後の細胞死を表すモデルも使用することができ、例えば、Ｓｔｎｌｐ(酵母におけるキャッピングテロメア)及びＣｄｃｌ７ｐ(酵母ＤＮＡポリメラーゼの触媒サブユニットにおけるα-プライマーゼ複合体)におけるｓｔｎｌ−１、ｃｄｃｌ７−ｌ及びｃｄｃｌ７−２温度感受性変異株。また、テロメア機能不全及びアポトーシスを示す酵母細胞も使用することができ、Ｅｓｔｌｐ、Ｅｓｔ２ｐ、Ｅｓｔ３ｐ、Ｈｄｆｌｐ、Ｈｄｆ２ｐ又はｃｄｃｌ３−２変異体における変異を含むが、それに限定されない。ＷＩ３８ヒト第一の線維芽細胞はヒトテロメア機能不全モデルであり、薬剤候補を確認又は検出することに用いられることができる。以下、(実施例１〜実施例６)は、ｃｄｃｌ３−ｌモデルを使用する。
【０２２３】
［実施例１］  細胞生存アッセイを用いてｃｄｃｌ３-lモデルにおける細胞死を予防する薬剤を同定すること（図１９に示すように）
【０２２４】
ｃｄｃｌ３-lモデルにおいてミトコンドリア機能を改善し、細胞周期の停止状態を延長し、且つ細胞死を予防する化合物又は組成物をハイスループット・スクリーニングするため、ｃｄｃｌ３-l細胞が−８０℃の保存条件から活性化され、まず新鮮なＹＥＰＤ又は酵母完全培地（ＹＣ）平板培地に画線し、その後単一のコロニーが形成するまで許容温度（約２４℃）で３〜５日培養する。複数の酵母コロニーを選択して同様な液体培地に入れて許容温度（２４℃）で一夜培養して、その後、新鮮な培地で一夜の培養物を１：２〜１：２０に希釈する（ｃｄｃｌ３-l菌株に対して、最適は約１：１０である）。
【０２２５】
酵母細胞液を９６穴の平板培地又はいずれかの適切な平板培地に分注する。対象化合物又は組成物、例えば、Ｈ２Ｏ、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はその他の有機溶媒で段階希釈された薬物、化合物、ペプチド・ライブラリー又はその他のライブラリーが、細胞混合物の総体積の５％より小さい体積で細胞に加えられる。この混合物において、対応する溶媒を添加するのは陰性対照とし、同じ溶媒に１ｎＭラパマイシン溶液を含むのは陽性対照とする。酵母細胞を非許容温度(約３７℃)で２日、又は陰性対照の生存細胞が検出されないまで培養する。
【０２２６】
小さい体積の細胞（例えば、５μl）を取って事前に準備した寒天平板培地の他１つの９６穴又はいずれか他のパターンの平板培地(細胞はさらに希釈してから移すことができる)に移し、許容温度(約２４℃)で平板培地を少なくとも３日、又は陽性対照にコロニーが形成するまで培養する。コロニー形成を促進する化学物質は第一の候補とみなされる。また、数マイクロリットル(μl)の細胞をＹＥＰＤ液体培地の他１つの９６穴の平板培地又はいずれか適切なパターンの平板培地に移し、平板培地を許容温度(約２４℃)で培養する、ＯＤ５９５(５９５ｎｍでの吸光度)を例えば１日１回、周期的に読み取る。陰性対照に比べ細胞密度を増やすことができる化学物質が第一の候補とみなされる。図１９はこの方法を説明する。
【０２２７】
実施例２及び実施例３にアポトーシスアッセイ及び活性酸素種アッセイにより第一の候補を確認することがそれぞれ記載されている。第一の候補薬物がＧ１期に細胞増殖を抑制するか否かは、図１に示される許容温度下の生長曲線のモニタリング及び図２Ａに示されるＦＡＣＳ分析装置で分析したＤＮＡ含有量の分布によってさらに測定することができる。候補によって変異細胞が形成され、それによって、非許容温度下でコロニーが形成する可能性を防止するように、ｃｄｃｌ３−ｌ細胞は候補薬物と一緒に約３７℃で培養してコロニーを形成させることができる。もう１つの重要な方面は、候補はミトコンドリア機能の改善、及び老化哺乳類の細胞（例えばＷＩ３８線維芽細胞）の細胞消失の抑制の可能性が測定され、それらの特定の加齢に伴う病気の予防の有効性は特定の疾患モデル、例えば、腫瘍形成の抑制の可能性、及び／又は動物モデルにおける脳梗塞サイズの縮小の可能性、によって測定される。
【０２２８】
ハイスループット・スクリーニングに適切な平板培地の種類としては、３８４穴の平板培地を例として挙げられるが、それに限定されない。また、この方法は、候補の検出及び確認するための他種類の平板培地、例えば６穴の、１２穴の平板培地などにも適用され得る。
【０２２９】
［実施例２］  アポトーシスマーカーでｃｄｃｌ３−ｌ細胞死を予防する薬剤を同定すること
【０２３０】
ｃｄｃｌ３−ｌ細胞死はアポトーシスマーカーが現れる。実施例１の細胞生存実験より必要な時間が短いため、この特徴をハイスループット・スクリーニングに用いることができる。これは実施例１のハイスループット・スクリーニングから同定された陽性候補の確認にも用いられることができる。また、該実験はアポトーシスを抑制する薬剤のスクリーニングにも用いられることができる。
【０２３１】
非許容温度(約３７℃)で１日（約１８〜２４時間）培養した後、ｃｄｃｌ３−ｌ細胞及び化合物はＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｚ−ＶＡＤ− ＦＭＫ(活性化カスパーゼのみを結合する自殺基質)、又はその他の適切なアポトーシスの検出薬剤を用いて暗闇で２０分染色された。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄して、平板が蛍光マイクロプレートリーダーにより読み取られた。細胞死によって、陰性対照群（細胞にスクリーニングされた化合物又は組成物がない）は高いＦＩＴＣシグナルを有し、ＦＩＴＣシグナルを減少する化合物又は組成物が陽性又は第一の候補と認められる。それらは実施例１の細胞生存実験によって確認されることができ、さらにＲＯＳの減少及びミトコンドリア機能の改善における能力が測定された。これら活性はこれからヒトテロメア機能不全モデル、例えば、ＷＩ−３８老化細胞でも測定する。癌及び他の加齢に伴う病気を予防するそれらの活性がさらに適切なモデルで試験される。
【０２３２】
アポトーシスマーカーとして、ホスファチジルセリンフリッピングを測定するアネキシン−Ｖ結合定量法はすでに図３Ｂにおいて説明され、これはハイスループット・スクリーニングにも用いられることができる。
【０２３３】
［実施例３］  ＲＯＳ（図２０に示すように)を測定することにより、ｃｄｃ１３−１細胞死を予防する薬剤を同定すること
【０２３４】
ｃｄｃｌ３−ｌの細胞死は劇的高いＲＯＳレベルを示す。このような特徴はｃｄｃｌ３−ｌ細胞死を抑制する分子の発見に用いられることができる。ＲＯＳ測定法は実施例１の細胞生存実験と比べ、必要な時間が少なく、ハイスループット・スクリーニングに用いられることができる。これは実施例１及び実施例２のハイスループット・スクリーニングから同定された第一の候補の確認にも用いられることができる。また、このアッセイが酸化防止剤のスクリーニングにも用いられることができる。
【０２３５】
図２０はこの過程を説明する。非許容温度(約３７℃)で１日培養した後、処理された細胞はデヒドロローダミン１２３(又は他の適切なＲＯＳ検出試薬)を用いて暗闇で約１時間染色された。蛍光マイクロプレートリーダーにより平板培地を読み取る。陰性対照(細胞にスクリーニングされた化合物又は組成物がない)は細胞の死亡において高いレベルのＲＯＳを放出する。ＲＯＳを減らす化合物又は組成物は第一の候補と認められ、さらに細胞死の予防及びミトコンドリア機能の改善が酵母及びヒトモデルにおいて測定された。癌、ニューロン変性及び他の加齢に伴う病気又は老化症状を予防するそれらのの活性がさらに適切なモデルで試験される。
【０２３６】
［実施例４］  ミトコンドリア集団の測定によって、テロメア機能不全モデルにおける老化細胞の悪化を予防する薬剤を同定すること
【０２３７】
ｃｄｃｌ３−ｌ細胞死に伴ってミトコンドリア集団（ｍｉｔｏ ｍａｓｓ）の劇的な増加が発生する。このような特徴はｃｄｃｌ３−ｌ細胞死を抑制する分子の発見に用いられることができる。ミトコンドリア集団アッセイは実施例１に記載された細胞生存実験に比べ、必要な時間が少なく、ハイスループット・スクリーニング、及び実施例１、２及び３に記載されているハイスループット・スクリーニングからの陽性候補の同定にも用いられることができる。
【０２３８】
非許容温度(約３７℃)で１日培養した後、処理されたｃｄｃｌ３−ｌ細胞はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（又はいずれの適切なミトコンドリア集団染色剤）を用いて暗闇で２０分染色された。蛍光マイクロプレートリーダーにより平板培地を読み取る。死亡細胞はより多くの、膜電位を失った悪化されたミトコンドリアを含有するため、ミトコンドリア集団染色が劇的に現れる。ミトコンドリア機能を改善し、細胞の死亡を防止する化合物又は組成物は、ミトコンドリアの悪化を減らし、ミトコンドリア集団シグナルを減少できるため、陽性候補と認められる。陽性候補はさらに老化の遅延能力の測定が酵母及びヒトモデルにおいて行われる。
【０２３９】
［実施例５］  ＤＮＡ又は核酸ライブラリーから老化細胞の死を予防する生物分子を同定すること
【０２４０】
ここではＬｉ−ＰＥＧトランスフェクション法を例として挙げるが、その他のトランスフェクション法も用いられることができる。対数期の新鮮な酵母細胞(ｃｄｃｌ３−ｌ)を蒸留水で十分に洗浄して、その後DNAライブラリー又は核酸ライブラリーと一緒にトランスフェクション緩衝液（２ｍＭ  ＴＲＩＳ ｐＨ７.５、１００ｍＭ  ＬｉＡＣ、０.５ｍＭ  ＭｇＡＣ２、０．１ｍＭ  ＣａＡＣ２、１５%グリセロール、４０%ＰＥＧ−４０００，２４ ｕｇ／ｍＬ ｓｓ ＤＮＡ）に、２４℃で１〜４時間培養する。約４２℃でこの混合物を１５分熱ショックして、さらに３倍の体積の富栄養培地ＹＥＰＤを加えて、室温(約２４℃)で１時間の培養を行う。遠心分離して液体を除去した後、細胞を蒸留水Ｈ２Ｏに浮遊させて、その後特定のライブラリーの要求に基づいて選択する培地平板に画線する。許容温度２４℃で少なくとも４日培養した後、転換体コロニーが得られて且つ許容温度(約２４℃)で液体培地に培養され、対数期における細胞を非許容温度(約３７℃)に移されて２日培養され、ｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化によって細胞死を誘発させる。この細胞を適切的に希釈し、ＹＥＰＤ培地に画線して、約２４℃で４日以上、または生存細胞がコロニーを形成するまで培養する。各のコロニーが単独に取られ、ＤＮＡがそれぞれのコロニーからそれぞ分離され、ＰＣＲ（ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅されて且つ配列されてＤＮＡシーケンスを同定する。精製したＤＮＡを改めてｃｄｃｌ３−ｌ細胞に導入することによって、不活化により誘発される細胞死を予防することができるＤＮＡが確認される。陽性ＤＮＡはさらに、老化ヒト線維芽細胞の悪化の予防及びミトコンドリア機能と酸化的ストレスの調節の測定が行われる。
【０２４１】
［実施例６］  破壊又は遺伝子欠失ライブラリーから細胞死を促進することができるタンパク質を同定すること
【０２４２】
テロメア機能不全によって発生された細胞死を促進する機能を有するタンパク質をスクリーニング又は同定するため、遺伝子破壊ライブラリー、例えば酵母トランスポゾン挿入ライブラリーをｃｄｃｌ３−ｌ菌株に導入することができる。あるいは、ｃｄｃｌ３−ｌを酵母欠失菌株ライブラリーに導入することができ、そのうち、いずれの菌株も特定の遺伝子欠失を有する。欠失又は破壊がｃｄｃｌ３−ｌｐの不活化により誘発される細胞死を予防できるタンパク質は候補と認められる。
【０２４３】
［実施例７］  哺乳類の細胞においてミトコンドリア生合成を刺激する薬剤を同定すること
【０２４４】
この実験はヒト細胞を直接使用できる。細胞系が加齢に伴う特定の病気に基づいて選択される。９６穴平板培地における細胞を約１日処理し、ミトコンドリア膜電位の影響を消去するようにエタノール（最終約６０％）で固定し、その後、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ｄｙｅ（インビトロジェン）で染色を行い、蛍光信号が蛍光プレートリーダーによって読み取られた。対照と比べ、２０％以上のミトコンドリア蛍光信号増があるのは陽性と認められ、陽性はさらに、ｃｄｃｌ３−ｌ及びＷＩ−３８モデルにおいてテロメア機能不全によって誘発される細胞消失の阻止、及びミトコンドリア膜電位とＲＯＳレベルにおける効果が測定される。
【０２４５】
ミトコンドリア生合成を刺激する候補物をスクリーニングする他の１つの方法は、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（すなわちｑＲＴ−ＰＣＲ)を使用することによってミトコンドリア生合成の転写因子が発現上昇したか否かを測定する。ミトコンドリア生合成の転写因子は、ＴＦＡＭ、ＮＲＦ−Ｉ、ＮＲＦ−２、ＰＧＣ−ｌα、ＰＧＣ−ｌβ、ＴＦＢｌＭ、ＴＦＢ２Ｍ、ＥＲＲｓ(ＥＲＲα、ＥＲＲβ、ＥＲＲγ)、ＰＲＣ、ＰＯＬＲＭＴ、ＰＰＡＰｓ（ＰＰＡｐａ，ＰＰＡＰγ、ＰＰＡＰδ)、及びＲＩＰ１４０を含む。ここではＴＦＡＭが例として挙げられ、好ましくはヒト初代細胞を使用する。ＷＩ−３８細胞を９６穴の平板培地(又は他のパターンの平板)に接種して、化合物ライブラリーと所望の時間（例えば約１８時間）を培養する。細胞をＰＢＳで洗浄して及びＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で平板に溶解させて、ＤＮＡを除去することができ、細胞溶解液にＲＴ−ＰＣＲを行わせる。細胞溶解液をＱｉａｇｅｎｅのｏｎｅｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキット及びＱｕａｎｔｉＦａｓｔマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲで１つの新しい９６穴の平板培地に希釈する。ＴＦＡＭのプライマー・プローブセット
ＡＣＡＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＴＣ−３’及び
５’−ＧＴＡＧＡＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＴ ＡＡＣＡＡＣＣＧＴ−３’、
並びに、βアクチン（対照群）のプライマー・プローブセット
５’−ＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴ−３’及び
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧ５−３’
は、５０ｐＭラパマイシン及びその他の薬剤によるＴＦＡＭ ｍＲＮＡの向上を測定するのに成功裏に使用されてきたものだが（データ示さず、Ｆｕ Ｘ， ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３（４）：ｅ２００９，２００８参照）、これらもまた使用され得る。ＴＦＡＭ ｍＲＮＡを約２倍増加させることができる化合物又は組成物は陽性と認められ、さらにｃｄｃｌ３−ｌ又はＷＩ−３８テロメア機能不全モデルにおいて老化維持が測定される。
【０２４６】
［実施例８］  化合物又は組成物のＷＩ−３８線維芽細胞における老化減少を予防する活性の試験
【０２４７】
以下のような場合があり、既知の薬物、天然エキスもしくは天然物、既知のペプチド、または酵母モデルにおけるライブラリースクリーニングから得られた候補物である化合物又は組成物は、抗老化効果があるか否かはヒト細胞において測定される必要がある。これらの実験は図７に示されるように、ヒトのＷＩ−３８線維芽細胞を用いて完成される。
【０２４８】
［実施例９］  ｃｄｃｌ３−ｌ酵母細胞を使ってラパマイシン及びその誘導体の抗老化生物濃度を決定すること
【０２４９】
一部の場合、抗老化生物活性ラパマイシンの量又は濃度、例えば、異なるロットで精製されたラパマイシン、精製過程におけるサンプル、粗抽出液、投与後血液、組織におけるラパマイシン又は化学修飾ラパマイシン誘導体など、を確定する必要がある。各種の源のラパマイシンの抗老化生物活性を確定するため、ラパマイシン含有材料が適切な溶媒で要求に応じて階段希釈（例えば、３倍又は１０倍の階段希釈）される。５％培養総体積より小さい希釈物は、ＹＥＰＤ培地で１０倍に希釈された新鮮なｃｄｃｌ３−ｌ細胞に加えられる。非許容温度（約３７℃）で約２４〜３６時間培養することによって細胞死を引き起こさせ、生存細胞の数量は図１に示されるコロニー形成実験によって測定される。ラパマイシンの標準濃度を得るため、精製ラパマイシンをDMSOで１μＭに希釈する。ｃｄｃｌ３−ｌの一夜培養物をＹＥＰＤ培地で１０倍希釈する。１μＭラパマイシンを細胞含有培地で１０ｐＭまで連続的に３倍又は２倍希釈し、その後混合物を約３７℃で約２４〜３６時間培養を行って、不活性化されたｃｄｃｌ３−ｌｐにより誘発され細胞死させる。異なる濃度の標準ラパマイシンが得た生存細胞数はコロニーの形成によって測定され、且つ対応の濃度に対して標準曲線を作る。異なる源のラパマイシンから得られた生存細胞数を標準曲線と比べることによって、ラパマイシンの抗老化活性濃度を確定する。ラパマイシン誘導体の活性濃度を測定するため、標準曲線がまず同様な誘導体から作られる。コロニーの形成以外に、ｃｄｃｌ３−ｌ細胞死によるアポトーシスアッセイ及びＲＯＳ放出もラパマイシンの抗老化生物濃度の決定に用いられることができる。
【０２５０】
この方法はその他の抗老化化合物又は組成物の抗老化生物濃度（例えばＥＧＣＧ）を決めることに用いられることができる。また、この方法は生物試料の抗老化活性を検出するためのアッセイとして用いられることができる。
【０２５１】
［実施例１０］  ｃｄｃｌ７−ｌ及びｃｄｃｌ７−２酵母変異体を用いて抗老化剤を検出すること
【０２５２】
ラパマイシン(１及び３ｎＭ)及び減らされたグルコースで抗老化剤の例として使用される。−８０℃で保存されたｃｄｃｌ７−ｌ及びｃｄｃｌ７−２酵母細胞を活性化するように、新鮮なＹＥＰＤ平板培地に培養し、その後単一のコロニーが形成するまで許容温度(約２４℃)で５日培養する。複数の酵母コロニーを採取してＹＥＰＤ液体培地に入れて許容温度の約２４℃で一夜培養をした。一夜培養物を、０、１及び３ｎＭ含有の新鮮なＹＥＰＤ培地、または０.５%グルコースＹＥＰＤで希釈し（１０倍希釈）、その後非許容温度(約３７℃)で混合物を２２時間培養し、不活性化ＤＮＡポリメラーゼ-αで成長停止及びその後の細胞死を引き起こす。コロニー形成アッセイにより生存細胞数を測定した。つまり、混合物を連続的に希釈し(１０倍)、その後少量の細胞(５μl)をＹＥＰＤ平板培地に付け、さらに許容温度(約２４℃)で少なくとも４日培養して、生存細胞にコロニーを形成させる。図２１Ａに示すように、ラパマイシンはｃｄｃｌ７−ｌ及びｃｄｃｌ７−２変異酵母における、ＤＮＡポリメラーゼ-αにより誘発される細胞不活化を防止する。
【０２５３】
［実施例１１］  ｅｓｔ１−ｔｓ酵母変異体で抗老化剤を検出すること
【０２５４】
このモデルではラパマイシンが抗老化剤の例として使用される。ラパマイシンは、文献(Ｑｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ，ＰｌｏｓＯｎｅ，２００８)に記載されるように、ｅｓｔ１−ｔｓ酵母細胞(ｅｓｔ１−ｔｓ ｒａｄ５２：：ＵＲＡ３)において、テロメラーゼの不活化により誘発されるＲＯＳ誘導及びアポトーシス細胞死を防止することができる。この実験はラパマイシン含有の平板培地を用いて行った。この方法は液体培地において細胞を培養して、高速大量スクリーニングに適応させることもできる。つまり、ｅｓｔ１−ｔｓ細胞は−８０℃の保存から活性化され、すなわち、菌を新鮮なＹＥＰＤ平板培地に画線した後さらに許容温度(約２４℃)で、単一のコロニーが形成したまで５日培養する。複数個の酵母コロニーをＹＥＰＤ液体培地に入れて、許容温度の約２４℃で一夜培養した。一夜培養物は０又は１ｎＭのラパマイシン含有の新鮮なYEPD培地で約１００〜３００倍希釈した。混合物を非許容温度の約３７℃で約２日培養する。細胞をさらに１ｎＭラパマイシン含有の新鮮なYEPD培地又は対照溶媒で約１００〜３００倍希釈して、非許容温度の約３７℃で２日程度の培養をする。非許容温度でテロメラーゼの不活化はテロメアの進行性短縮及び最終のテロメア機能不全に至り、それによってＲＯＳ誘導及びアポトーシス細胞死を引き起こす。ポトーシスアッセイ又はＲＯＳアッセイにより細胞死を測定することができる。ＲＯＳ誘導の測定は細胞をジヒドロローダミン123溶液(約５μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液で)と暗闇で培養してＦＡＣＳによって分析される。細胞死は実施例２と同様にカスパーゼ活性によって測定される。
【０２５５】
Ｂ．加齢に伴う病気又は老化症状を予防及び治療するための栄養素／ＴＯＲ／ＡＭＰＫ／糸粒体／老化経路
【０２５６】
［実施例１２］  哺乳類のモデル系において老化経路の構成成分を測定すること
【０２５７】
この例はウエスタンブロット法を用いて、抗老化剤により誘発される哺乳類の細胞の老化経路における主要タンパク質の増加を確定する。ラパマイシンが例として用いられた。最後に分離された（老化）、第２０日のＷＩ−３８細胞を図に示される指定量のラパマイシンで１８時間処理を行い、細胞溶解液をウエスタンブロット法により分析した。老化経路における主要タンパク質ｐ５３、ｐ２１及びｐＲｂは、高い用量２０００ｐＭによってではなく、低用量のラパマイシン(５０及び１００ｐＭ)によって増加される（図９ｃ）。
【０２５８】
［実施例１３］  加齢に伴う病気の予防又は癌化学予防活性を有する薬剤はミトコンドリア機能と老化延長を刺激する
【０２５９】
実験は図７、１０及び１１に示すようになされた。図１０に示すように、５０ｐＭラパマイシン、２５０μＭ ＡＩＣＡＲ、２０μｇ／ｍｌ ＥＧＣＧ、１.６μｇ／ｍｌ ＧＳＥ、減らされたグルコース(０.４%から０.２%まで)、２０μｇ／ｍｌ ビルベリー抽出物(ＢＥ)、１μＭ ＡＩＴＣ、及び１２.５μＭ ２-デオキシグルコースはミトコンドリア質量（ミトコンドリア生合成の増加の指標）を増加し、老化ＷＩ−３８線維芽細胞における細胞消失も予防する（図７）。また、イソチオシアン酸フェネチル(ＰＥＩＴＣ)、シリビニン、亜セレン酸塩（Ｎａ２ＳｅＯ３）及びゲニステインはミトコンドリア質量を増加し、酵母細胞においてテロメア死亡に対する各種程度の保護作用も表した(図１０及び図１１)。
【０２６０】
［実施例１４］  ＡＭＰＫ活性化因子がＴＰＡによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換を抑制する
【０２６１】
この実験は実施例１９と同様に行われる。簡単に言うと、１５００ ＮＩＨ３Ｔ３細胞を５０μＬの０.４%アガロース培養基(１０%ウシ胎児血清基礎培地)と混合して、事前に５０μLの０.８%アガロース培養基がすでに敷かれた９６穴の平板培地に敷き、凝固後１００μＬの薬物を含む液体培養基を加え、薬物の最後濃度は図に示されるように、ＤＭＳＯ、１０μＭ ＴＰＡ、４０μＭ ＡＩＣＡＲ、又は１０μＭ ＴＰＡ＋４０μＭ ＡＩＣＡＲであり、細胞を５％ＣＯ２、３７℃の培養器で７日以上培養する。５日ごとに新鮮培地５０μＬを加え、その後、顕微鏡下でコロニーを計数する。図１２に示すように、ＴＰＡはＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるミトコンドリア質量を劇的に減少し、ＡＭＰＫ活性化因子ＡＩＣＡＲはこの減少を逆転する(図１２)。また、ＡＩＣＡＲはＴＰＡにより誘発されるＮＩＨ３Ｔ３の形質転換も減少する(図１３Ａ及び図１３Ｂ)。
【０２６２】
Ｃ．ＣＲの模倣体としてＴＯＲ阻害剤を使用して加齢に伴う病気を予防及び治療する
【０２６３】
ＴＯＲ阻害剤及びラパマイシン。
特定のＴＯＲ阻害剤ラパマイシン(シロリムス)は、ＣＣＩ７７９(テムシロリムス)、ＲＡＤ−００１(エベロリムス)、ＡＰ−２３５７３(デホロリムス)、ＡＰ−２３６７５、ＡＰ−２３８４１、ＡＢＴ−５７８(ゾタロリムス)、７-エピ-ラパマイシン、７-チオメチル-ラパマイシン、７-エピ-トリメトキシフェニル-ラパマイシン、７-エピ-チオメチル-ラパマイシン、７-デメトキシ-ラパマイシン、３２- デメトキシ-ラパマイシン、２-デスメチル-ラパマイシン、及び４２-Ｏ-(２-ヒドロキシル)エチル−ラパマイシンを含む大環状トリエン分子の初期成員である。ラパマイシンは抗真菌活性を有することが一番早めに発見された(Ｖｅｚｉｎａ， Ｃ．等,Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，２８:７２１(１９７５);Ｓｅｈｇａｌ，Ｓ．Ｎ．等，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，２８:７２７(１９７５)；Ｂａｋｅｒ，Ｈ．Ａ．等,Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．,３１:５３９(１９７８)；米国特許第３,９２９,９９２号、及び米国特許第３,９９３,７４９号)。
【０２６４】
ラパマイシンが免疫抑制剤として使用され(Ｓａｎｔｏｓ，Ｅ．及び Ｎｅｂｒｅｄａ，Ａ．Ｒ．，ＦＡＳＥＢ，３:２１５１-２１６３(１９８９))：全身性紅斑性狼瘡(米国特許第５,０７８,９９９号)、肺炎(米国特許第５,０８０,８９９号)、臓器移植の拒絶反応、関節炎(Ｃａｒｌｓｏｎ等,Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．,２６６:１１２５-１１３８(１９９３)；Ｆｏｒｏｎｃｅｗｉｃｚ 等,Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．，１８:３６６-３６８(２００５))、眼の炎症(米国特許第５,３８７,５８９号)、及び心臓の炎症性疾患(米国特許第５,４９６,８３２号)を予防又は治療し、血管損傷後の平滑筋細胞増殖及び内膜肥厚を予防し(米国特許第５,２８８,７１１号及び第５,５１６,７８１号)、ステントの再狭窄も予防する(米国特許第６,５８５,７６４号)。それはまた、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)(米国特許出願第２００６０１８２７７１号、２００６０２４７２６５号、２００６０２６３４０９号、及び２００７０１０５７６１号、２００６０２６４４５３号)、脈絡膜新生血管(CNV)、並びに滲出型加齢黄斑変性症(米国特許出願第２００５０１８７２４１号)を含むところの、眼疾患の治療にも特許されている(米国特許第７,０８３,８０２号)。
【０２６５】
ラパマイシンが抗増殖及び抗腫瘍活性を持つことはすでに示された。ラパマイシンの単独使用、又はその他の薬物と組み合わせて使用することは、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫に対する抗腫瘍活性(米国特許第４,８８５,１７１号及び第４,４０１,６５３号；欧州特許出願５２５,９６０Al)、及び悪性腫瘍(米国特許第５,２０６,０１８号)、及び貧血(米国特許第５,５６１,１３８号)に対する作用がすでに現れた。ラパマイシンは転移性乳癌(米国特許出願第２００７０１０４７２１号)、腫瘍(米国特許出願第２００４０１７６３３９号及び２００６００３５９０４号)、並びに早期のＢ細胞による急性リンパ性白血病(米国特許第７,０２６,３３０号)の治療に用いられることができ、それは結節性硬化症の治療(米国特許出願第２００５００７０５６７号)、哺乳類における異常な細胞増殖の抑制(米国特許出願第２００６００３５９０７号)、増殖の低減及び腫瘍細胞のアポトーシスの促進(米国特許出願第２００６００９４６７４号)、並びに、増殖性及び炎症性疾患(米国特許出願第２００６０１３５５４９号)や慢性ウイルス感染(米国特許出願第２００７００９９８４４号)の治療にも特許されている。
【０２６６】
ラパマイシン／ｍＴＯＲ阻害剤の単独使用又はその他の薬物と組み合わせて使用してその他の各種の疾患を治療することも報告されている、例えば糖尿病(米国特許第５,３２１,００９号)、皮膚疾患(米国特許第５,２８６,７３０号)、腸疾患(米国特許第５,２８６,７３１号)、神経疾患、神経変性疾患(米国特許第６,１８７,７５６号)、骨量減少(米国特許出願第２００６０１７３０３３号)、抗血管新生の徐放性眼内植込み(米国特許出願第２００７００５９３３６号)、及び自食作用によるタンパク質構造混乱(米国特許出願第２００７０１５５７７１号)。
【０２６７】
ラパマイシンがＴＯＲ及びＦＫＢＰと複合物を形成して、ＴＯＲとその正常の基質タンパク質と複合物例えばＴＯＲ−ｒａｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＴＯＲＣｌ）を形成することを抑制することが発見された。ＴＯＲＣｌ形成の抑制はタンパク質翻訳及びリボソーム生合成が抑制されることを引き起こすため、Ｇｌ期細胞周期の生長も抑制される。ＴＯＲＣｌ抑制は栄養素のためのタンパク質及び細胞小器官の自食作用の増加にも引き起こす。今まで、各種の疾患に対する治療量のラパマイシンの用途が主にＴＯＲＣｌ破壊及び後続の細胞周期Ｇｌの抑制及び自食作用に基づく。対照的に、本発明において、ラパマイシン及びその類似物は低用量でカロリー制限の模倣体として使用され、AMPK／糸粒体／老化経路を通じて加齢に伴う病気の予防又は治療を行う。
【０２６８】
［実施例１５］  低用量のラパマイシンがＴＰＡによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の転換を抑制する
【０２６９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換は１つの良い体外腫瘍形成アッセイであり、軟寒天でコロニー形成を測定する（足場非依存性増殖と呼ばれる）。変異原ＴＰＡ(１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボールアセタート１３−酢酸塩)はタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を刺激し、発癌遺伝子を活性化し、及びマウス胎児繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を転換することが知られている。興味深いことに、１０μＭＴＰＡはミトコンドリア 質量を劇的に減少し、１ｎＭラパマイシンがこの減少を逆転する、図１２に示すように。また、１ｎＭラパマイシンは１０μＭ ＴＰＡにより誘発されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換を防止する(図１３)。１５００ ＮＩＨ３Ｔ３細胞を５０μＬの０.４%アガロース培養基(１０%ウシ胎児血清基礎培地)と混合して、事前に５０μＬの０.８%アガロース培養基がすでに敷かれた９６穴の平板培地に敷き、凝固後１００μＬの薬物を含む液体培養基を加え、薬物は図に示されるように、DMSO、１０μＭ ＴＰＡ、1ｎＭラパマイシン、又は１０μＭ ＴＰＡ＋１ｎＭラパマイシンであり、細胞を５%CO２、３７℃の培養器で７日以上培養する。５日ごとに新鮮培地５０μＬを加え、その後、顕微鏡下でコロニーを計数する。図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、１ｎＭラパマイシンがこの過程を全く阻止する。１ｎＭラパマイシンは、ＮＩＨ３Ｔ３の増殖速度を少し遅延したため、成長が遅いコロニーを待つするように、続けて２１日培養した後、計数を行った。結果、７日培養と同様である。そのため、１ｎＭラパマイシンが生長を遅延させるのはコロニー形成を削除する原因ではなく、老化を維持することによって足場非依存性増殖又は腫瘍形成を防止してミトコンドリア機能を支持する。対照的に、治療量のラパマイシンは腫瘍形成を促進し、それによってヒトのリンパ腫、皮膚癌及び他の癌の危険性を増加することが報告された。最近発見された治療量ラパマイシンの抗増殖活性は、Ｇｌ細胞周期及びタンパク質合成の抑制作用によると思われる既存の腫瘍の成長を制限することにある。
【０２７０】
更には、ＡＩＣＡＲ(４０μＭ)はＡＭＰＫを活性化し且つヒト老化第一の線維芽細胞の寿命を延長することができ(図７)、ＴＰＡに影響されるミトコンドリア質量の減少を逆転する(図１２)、及び足場非依存性増殖を抑制することもできる(図１３Ａ及び図１３Ｂ)。それらのデータはさらにミトコンドリア機能が足場非依存性増殖の防止及び腫瘍の形成における役割を支持する。結論としては、低用量のラパマイシンとＡＩＣＡＲは、少なくとも変異原ＴＰＡにより誘発される場合、腫瘍形成を予防する。
【０２７１】
［実施例１６］  低用量のラパマイシンは活性酸素種を減らし及び培養されたＧＣＮ神経細胞の寿命を延長する
【０２７２】
７日齢のラット仔から小脳顆粒神経細胞(CGN)の培養物が準備された。簡単に言うと、大脳から除去された小脳を、ＢＭＥＭ及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(ＢＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ)を含有する１つのペトリ皿に入れる。内皮細胞からの最小汚染を確保するように、小脳の脳膜及び血管が捨てられ、次に小脳/大脳皮質を解剖刀で細かく切って、３７℃で１５分間トリプシン処理し、さらに０.０２５%大豆トリプシン阻害剤及び０.０５%ＤＮａｓｅ Ｉを含有する１ｍＬのＢＭＥを添加することによってトリプシン処理を抑制し、組織は均一な懸濁液に分散されるまで、炎加工されたパスツールピペットによって倍散される。懸濁液をエタノール消毒された４０μｍ網目によってろ過して、さらに遠心沈殿を行う。小脳顆粒神経細胞は２５ｍＭ ＫＣｌ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ)を含むＢ２７補足ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に懸濁される。細胞はその後２４穴平板培地(１平板培地／小脳)に播種し、且つＢ２７,２０ｍＭ ＫＣｌ、０.５ｍＭグルアミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)に培養された。７日培養した後ラパマイシンを加え、３１日培養した後、ＭＴＴ法で神経細胞の生存率を決める。図１４Ａに示すように、大多数のＣＧＮ細胞は３１日培養した後、死亡した。しかし、低用量のラパマイシンは該ロスを防止し、ＧＣＮ細胞の寿命を延長することができるが、高用量のラパマイシンは該効果が認められなかった。
【０２７３】
活性酸素種分析について、新鮮な分離されたＣＧＮ細胞をＮｅｕｒｏｂａｌ完全培地に入れ、１百万細胞／ｍＬ／管の密度で１２×７５ｍｍ管に播種し、細胞がラパマイシンで２０時間処理された後、２μｇ／ｍＬデヒドロローダミン１２３で３０分染色をし、ＦＡＣＳ分析を行った。図１４Ｂに示すように、ラパマイシンが懸濁液におけるＣＧＮ細胞の正常な活性酸素種レベルを減らす。
【０２７４】
［実施例１７］  低用量のラパマイシンがラット脳卒中モデルにおける小脳梗塞サイズを縮小する
【０２７５】
この例には虚血性脳梗塞の中大脳動脈(ＭＣＡ)閉塞モデルを使用した。脳卒中易発症性自然発症高血圧（ＳＨＲ−ＳＰ）ラットをランダムに、対照ＤＭＳＯ群及びラパマイシン群の、２群(それぞれの群は、ｎ＝８)に分ける。ラットを１５%抱水クロラール(３００ ｍｇ／ｋｇ,ｉ．ｐ．)で麻酔をかける。電気凝固ＭＣＡによる永久局所脳虚血は、改善された田村及びＭｃＧｉＩｌ法(Ｔａｍｕｒａ，Ａ．等,Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，１：５３-６０(１９８１)を使用する。つまり、嗅索と下大脳静脈との間の右ＭＣＡの部分は電気凝固された。凝固された動脈を精密剪刀で切断して血液供給の完全停止を確保する。
【０２７６】
ＭＣＡ閉塞の１０分後に、ラパマイシン及び対照ＤＭＳＯを投与する。ＭＣＡ閉塞の２４時間後に大脳試料を採取した。２％ ２,３,５-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(ＴＴＣ)で厚さが２ｍｍの冠状断面を直ちに染色した。梗塞領域が白色で、正常領域が赤色である。梗塞領域及び半球領域のそれぞれの断面(両面)の面積が画像分析系によって記載及び量化分析された(Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ型ＤＭ ＬＢ２，Ｌｅｉｃａ，ドイツ)。大脳浮腫は梗塞の体積の評価において干渉する恐れがあるが、これは標準方法によって校正されることができ、すなわち対側半球の体積から非虚血同側半球の体積を減らす。梗塞の体積は対側半球の体積に占める百分比によって示される。同じような方法で、梗塞組織及び半球の重量を測定する。図１５Ａに示すように、ラパマイシンは低用量である１０μｇ／ｋｇでＭＣＡ閉塞により誘発される梗塞の体積を著しく減らす。対照的に、ラパマイシンが通常量の１ｍｇ／ｋｇでこの効果を有しない、これは文献に報告されている(Ｓｈａｒｋｅｙ，ＪＪ．とＢｕｔｃｈｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ,３７１：３３６-３３９(１９９４))。また、ＭＣＡ閉塞の２０日前に０、０．３、１、３及び１０μｇ／ｋｇの用量でラパマイシンの投与も脳損傷を予防することができる(図１５Ｂ)。
【０２７７】
［実施例１８］  低用量のラパマイシンはＭＰＰ＋誘導ＲＯＳを低減する
【０２７８】
ＭＰＰ＋は、ミトコンドリア呼吸鎖複合物Ｉ(ＮＡＤＨ ＣｏＱ１還元酵素)の阻害剤であり、ドパミン作動性の神経毒素でもある。通常マウス類においてパーキンソン病を引き起こすことに用いられる。２００μＭ ＭＰＰ＋でヒト第一の線維芽細胞ＷＩ−３８細胞を３日間処理した。図１４に示されるように、各種濃度のラパマイシンも細胞と共に３日培養する。次に、暗闇で細胞をデヒドロローダミン１２３で３０分染色をした。さらにＦＡＣＳによって細胞を分析した。デヒドロローダミン１２３を活性酸素種レベルに比例してローダミン(蛍光を示す)に酸化することができる。図１６に示すように、ＭＰＰ＋は、活性酸素種レベルを大幅に増加した。低用量のラパマイシンはピコモル(ｐＭ)の範囲でこの増加を著しく減らす。
【０２７９】
［実施例１９］  低用量のラパマイシンがラットモデルにおける心筋梗塞サイズを縮める
【０２８０】
ラットの心筋梗塞(ＭＩ)を決めるためには、重量が２００〜２５０gであるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄性ラットを使用した(それぞれの群は、ｎ＝１０〜１２)。ＭＩ実験の３日前に、ラパマイシンを０、１０又は１００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与した。エーテル麻酔状態で心臓を左開胸によって体外に出し、肺動脈流出路と左心房との間の左前下行動脈を６-０ポリプロピレン縫合線で結紮し、その後打っている心臓をその正常な位置に迅速に返し、胸腔を閉鎖し、空気を除去した。ラットを前述の条件を有するケージに返す。冠動脈結紮の５時間後で、ペントバルビタールの過剰投与によりラットを殺した。左心室を分離して且つ心臓の長軸に沿って垂直に４〜５枚の薄片を切断する。３７℃で薄片をニトロブルーテトラゾリウムリン酸塩緩衝液の０.１%溶液で３０分染色をし、文献に記載されている方法によってＭＩサイズを測定する(Ｌｉｎ，Ｌ．Ｌ．等,Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．，５０:３２７-３３２(２００７))。正常組織が青い色で染色され、一方、壊死組織が未染色のままであった。染色された組織及び未染色の組織を分離して且つ重量を測る。ＭＩサイズが左心室の総重量の分数として表される。図１６に示すように、１０μｇ／ｋｇ／日での低用量のラパマイシンは心筋梗塞サイズを著しく減らすが、１００μｇ／ｋｇ／日の高投与量は減らさない。
【０２８１】
本件明細書で引用された特許公報及び非特許公報はすべて、各公報が参照により個別に組み込まれるが如く参照により本件明細書に組み込まれて同じ参照効果をもたらす。本願でのいかなる文献の引用又は特定も、当該文献が本発明の先行技術たり得ることを自認するものではない。
【０２８２】
理解すべきなのは、前述の詳細な説明及び添付例は説明するためのものであり、本発明の範囲への制限ではない。本分野の当業者が本発明の内容に基づいて多くの変更例を工夫し得ることができるのは明白であり、クレーム、その全均等範囲、明細書および前述の変更例に基づいて、本発明の全範囲が決定されるべきである。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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