(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースからラクテートとグリオキシレートを生成する代謝経路を有する微生物が、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）をコードする遺伝子で形質転換されている、ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の生産能を有する組換え微生物。
【請求項２】
前記プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｃ．プロピオニカム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣ．プロピオニカム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼの変異酵素であるＰｃｔ５４０であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼまたは次から選択されるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼの変異酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物：
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ、及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される一つ以上の変異を含むアミノ酸配列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素；または、
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ、及びＱ４８１Ｍが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、及びＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１２）からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素。
【請求項４】
前記グリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子はパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記グリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
グルコースからラクテートとグリオキシレートを生成する代謝経路を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子が挿入され、イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）またはマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が欠失されているラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の生産能を有する組換え微生物。
【請求項７】
前記プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｃ．プロピオニカム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣ．プロピオニカム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼの変異酵素であるＰｃｔ５４０であることを特徴とする請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼまたは次から選択されるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼの変異酵素であることを特徴とする請求項６に記載の組換え微生物：
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ、及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される一つ以上の変異を含むアミノ酸配列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素；または、
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ、及びＱ４８１Ｍが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び
配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、及びＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１２）からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素。
【請求項９】
前記グリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子はパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）または大腸菌由来のものであることを特徴とする請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記グリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）及びマレートシンターゼをコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が両方とも欠失されている請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＡ）がさらに増幅されていることを特徴とする請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え微生物を培養してラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産する段階と、前記生産されたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を得る段階と、を含むラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項６〜１２のいずれか一項に記載の組換え微生物をグルコース含有培地で培養してラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産する段階と、前記生産されたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を得る段階と、を含むラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースからラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））を生産する能力を有する組換え微生物に関し、より詳細には、グリコレート前駆物質を外部から供給しなくてもラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産することができる組換え微生物、及びそれを用いたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクテート‐グリコレート共重合体［Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ‐ｃｏ‐ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、ＰＬＧＡ］は、ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）及びグリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）由来の代表的な生分解性高分子であって、汎用高分子又は医療用高分子として高い応用性を有する高分子である。現在、ＰＬＧＡは、ラクテートとグリコレートとの直接重合反応により製造されているが、前記反応では、主に低分子量（１，０００〜５，０００ダルトン）のＰＬＧＡのみが生成される。１００，０００ダルトン以上の高分子量のＰＬＧＡは、ラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）とグリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）の開環縮合反応により合成されることができる。ラクチド及びグリコリドはそれぞれ、ラクテート及びグリコレートの環状ジエステル（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｅｓｔｅｒ）であり、それぞれ、ラクテートオリゴマー及びグリコレートオリゴマーの熱分解により得られる。
【０００３】
開環縮合反応には、２‐エチルヘキサン酸スズ（ｔｉｎ（II）２‐ｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏａｔｅ）、スズアルコキシド（ｔｉｎ（II）ａｌｋｏｘｉｄｅ）、またはアルミニウムイソプロポキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｉｄｅ）などの触媒の使用が要求される。直接重合により得られた低分子量の高分子から鎖カップリング剤（ｃｈａｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いてより高い分子量の高分子を重合する方法があるが、このように高分子量のＰＬＧＡを製造する方法は、鎖カップリング剤を用いるため、有機溶剤（ｓｏｌｖｅｎｔ）や鎖カップリング剤の添加により工程が複雑になり、またそれらを除去することが容易ではないという短所がある。
【０００４】
現在商用化されている高分子量のＰＬＧＡの生産工程では、ラクテート及びグリコレートをそれぞれラクチド及びグリコリドに転換した後、ラクチド及びグリコリドの開環縮合反応によりＰＬＧＡを合成する方法が用いられている。
【０００５】
一方、ＰＨＡは、炭素源が過度に存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の栄養分が不足する際に、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵物質としてその内部に蓄積するポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）である。ＰＨＡは、既存の石油由来の合成高分子と同様の物性を有しながらも、完全な生分解性を示すため、既存の合成プラスチックの代替物質として認識されている。
【０００６】
従来知られているＰＨＡは、典型的には短い炭素鎖を有するＳＣＬ‐ＰＨＡ（ｓｈｏｒｔ‐ｃｈａｉｎ‐ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ）と長い炭素鎖を有するＭＣＬ‐ＰＨＡ（ｍｅｄｉｕｍ‐ｃｈａｉｎ‐ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ）とに分けられる。ＰＨＡを合成する遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などからクローニングされ、組換え微生物により様々な種類の単量体で構成されるＰＨＡが合成された（Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbachet al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624）。
【０００７】
グリコール酸が最も単純なヒドロカルボン酸であるため、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）のＰＨＡシンターゼと、基質としてβ酸化経路から生成されたグリコリル‐ＣｏＡを用いて、グリコール酸をＰＨＡ高分子に挿入することが試みられてきた。
【０００８】
本発明者らは、ラクテート及びグリコレートをそれぞれラクチル‐ＣｏＡ及びグリコリル‐ＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子であるクロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオネートＣｏＡ‐トランスフェラーゼ（Ｐｃｔ）遺伝子と、ラクチル‐ＣｏＡ及びグリコリル‐ＣｏＡを基質として使用できるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼ遺伝子で形質転換された組換え大腸菌を、グルコース及びグリコレート、またはグルコース、グリコレート、及びヒドロキシアルカノエートが含まれた生産培地で培養する場合、ポリラクテート−コ−グリコレート（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ‐ｃｏ‐ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））及びポリラクテート−コ−グリコレート−コ−ヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ‐ｃｏ‐ｇｌｙｃｏｌａｔｅ‐ｃｏ‐ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ））が生成されることを確認した（韓国特許出願第１０‐２００９‐００３０１３３号）。
【０００９】
しかし、前記組換え大腸菌を用いてＰＬＧＡを生成するには、単量体の前駆物質となるグルコース及びグリコレートをそれぞれ添加しなければならない短所があった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、グリコレートを外部から添加しなくても、グリコレート分画の含量が高いＰＬＧＡを生産することができる組換え大腸菌を開発するために鋭意研究した結果、クロストリジウム・プロピオニカムのプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼで形質転換された大腸菌にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）または大腸菌のグリセレートデヒドロゲナーゼを発現させ、ｉｃｌＲ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）及びａｃｅＢ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子を欠失させ、ａｃｅＡ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ）遺伝子を増幅させる場合、グリコレートを添加しなくても、グルコースのみでグリコレート分画の含量が高い高濃度のＰＬＧＡを生産することができることを見出し、本発明を成すに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、グリコレートを外部から添加しなくても、高濃度のＰＬＧＡを生産することができる組換え微生物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、グリコレートを外部から添加しなくても、高濃度のＰＬＧＡを生産することができる組換え微生物を用いたＰＬＧＡの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）をコードする遺伝子で形質転換された変異体を提供する。
【００１４】
本発明は、また、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）をコードする遺伝子が挿入され、イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）またはマレートシンターゼをコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が欠失されている形質転換された変異体を提供する。
【００１５】
本発明は、また、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）をコードする遺伝子で形質転換された変異体を、グルコース含有培地で培養することで、ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産する段階と、前記生産されたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を得る段階と、を含むラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明は、また、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）をコードする遺伝子が挿入され、イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）またはマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が欠失され、イソシトレートリアーゼ（ａｃｅＡ）をコードする遺伝子が増幅されている形質転換された変異体を、グルコース含有培地で培養することで、ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産する段階と、前記生産されたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を得る段階と、を含むラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の特徴および具現例は、下記の詳細な説明および添付の特許請求の範囲より、さらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１のＡは、本発明で製造されたＰＬＧＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＡの化学式を示したものであり、Ｂは、本発明で行われた代謝操作によるＰＬＧＡ生産経路を示したものである。
【図２】大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅの染色体で、ＰＬＧＡの生産に係る遺伝子の地図を示したものである。
【図３】本発明で作製された組換え大腸菌ＪＬＸＦ５の染色体で、ＰＬＧＡの生産に係る遺伝子の地図を示したものである。
【図４】本発明で作製された組換え大腸菌ＪＬＸＦ８の染色体で、ＰＬＧＡの生産に係る遺伝子の地図を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
他の式で定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家により通常理解されているものと同じ意味を有する。通常、本明細書で用いられる名称は、本技術分野においてよく知られており、通常使用されるものである。
【００２０】
本発明は、一観点において、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）をコードする遺伝子で形質転換されて、ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の生産能を有する組換え微生物に関する。
【００２１】
本発明において、前記プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｃ．プロピオニカム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣ．プロピオニカム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼの変異酵素であるＰｃｔ５４０であってもよく、前記ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼまたはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼの変異酵素であってもよい。
【００２２】
本発明において、前記ＰＨＡシンターゼの変異酵素をコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ、及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される一つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列を有してもよく、前記ＰＨＡシンターゼの変異酵素をコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ、及びＱ４８１Ｍが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び配列番号１のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、及びＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１２）からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有してもよい。
【００２３】
本発明において、前記グリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子はパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）または大腸菌由来のものであることを特徴とし、前記グリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子は配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする。
【００２４】
他の観点で、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子が挿入され、イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）またはマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が欠失され、イソシトレートリアーゼをコードする遺伝子（ａｃｅＡ）が増幅されているラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の生産能を有する組換え微生物に関する。
【００２５】
本発明において「欠失」とは、遺伝子の置換、削除、変異により、遺伝子がコードするタンパク質が本来の機能を達成することができないように操作することを意味する。
【００２６】
本発明において、イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）及びマレートシンターゼをコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が両方とも欠失されていることを特徴とする。
【００２７】
本発明において、前記組換え微生物は、イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＡ）がさらに増幅されていることを特徴とする。
【００２８】
本発明において、前記変異体の親株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ５、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ７、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ８、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ１１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ１２、及びＥ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸ１３からなる群から選択されることを特徴とする。前記親株の特質を表１に示した。
【００２９】
他の観点で、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子で形質転換された組換え微生物を、グルコース含有培地で培養することで、ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産する段階と、前記生産されたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を得る段階と、を含むラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法に関する。
【００３０】
本発明では、自然状態では生産されない高分子であるＰＬＧＡを生産する大腸菌菌株を開発し、大腸菌の代謝経路を操作することにより、ＰＬＧＡの単量体であるグリコレートをさらに多く生産できるようにした。
【００３１】
本発明の一態様において、Ｐｃｔ５４０Ｃｐ、ＰｈａＣ１４３７Ｐｓ６‐１９及びＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＪＬＸＦ５菌株は、Ｐ（ＬＡ３５．２ｍｏｌ％‐ｃｏ‐ＧＡ６４．８ｍｏｌ％）の重合体を３３．６重量％生産した。これは、代謝工学的に組換えられた大腸菌でグルコースからラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産した最初の研究結果である。
【００３２】
他の観点で、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２６）をコードする遺伝子が挿入され、イソシトレートリアーゼ調節因子をコードする遺伝子（ｉｃｌＲ）またはマレートシンターゼをコードする遺伝子（ａｃｅＢ）が欠失されている組換え微生物を、グルコース含有培地で培養することで、ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を生産する段階と、前記生産されたラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を得る段階と、を含むラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体の製造方法に関する。
【００３３】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈してはならないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３４】
実施例１：使用菌株及び分析方法
下記実施例において使用した菌株、プラスミド、及びプライマーを表１に示した。
【００３５】
下記実施例における組換え大腸菌で、ＰＬＧＡ共重合体を生産するために使用されるＭＲ培地は、１Ｌ当たり、ＫＨ２ＰＯ４を６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を４ｇ、ＭｇＳＯ４Ｈ２Ｏを０．８ｇ、クエン酸を０．８ｇ、微量金属（ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ）溶液を５ｍｌ含有しており、前記微量金属（ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ）溶液は、１Ｌ当たり、ＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏを０．５Ｍ  ＨＣｌ：１０ｇ、ＣａＣｌ２を２ｇ、ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏを２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏを１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・Ｈ２Ｏを０．１ｇ、及びＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏを０．０２ｇ、炭素源、及びＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏを含有する。
【００３６】
各菌株培養において、種菌培養は、１０ｍＬのＬＢ培地が添加された２５ｍＬチューブで３０℃で一晩振盪培養した後、１ｍＬの培養液を、２０ｇ／Ｌのグルコースを含有する１００ｍＬのＭＲ培地が満たされた２５０ｍＬフラスコに接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。ｐ（３ＨＢ‐ｃｏ‐ＬＡ‐ｃｏ‐ＧＡ）を合成する場合、２ｇ／Ｌの３ＨＢを培養培地に添加した。
【００３７】
宿主細胞としてＪＬＸ１０菌株（Jung et al., 2010）を使用する場合、ｐｐｃ遺伝子の欠失によって発生する成長制限を克服するために、４ｇ／Ｌのコハク酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を培養培地に添加した。また、ｔｒｃプロモーターにより調節されるｌｄｈＡ及びａｃｓ遺伝子の発現のために、ＯＤ６００数値が０．５である時に、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。必要に応じて、１００μＭ／ｍＬのアンピシリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び１０μｇ／ｍＬのチアミンを培地に添加した。
【００３８】
本発明で使用された組換え菌株及びプラスミドの遺伝的特徴を表１に示し、本発明で組換え菌株及びプラスミドの作製に使用されたプライマーを表２に示した。
【００３９】
本発明で使用された組換え菌株を製造するにあたり、染色体において、ｉｃｌＲ遺伝子及びａｃｅＢ遺伝子を欠失させ、ａｃｅＡ遺伝子のプロモーターをｔｒｃプロモーターに入れ替えることは、表２に記載のプライマーを使用したｏｎｅ‐ｓｔｅｐ不活性化方法を用いた（Datsenko and Wanner, Proc Natl AcadSci U S A. 6;97:6640, 2000）。
【００４０】
【表１】
0005842230.tif 000002
【００４１】
【表２】
0005842230.tif 000003
0005842230.tif 000004
【００４２】
細胞成長及び代謝産物の分析
グルコース、ピルビン酸、酢酸、ギ酸、ラクテート、及びコハク酸を含む代謝産物は、ＵＶ／ＶＩＳ（Ｖａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ３２０、ＵＳＡ）及び屈折率検出器（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ‐７１、日本）が装着されたＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ２１０、ＵＳＡ）によりＭｅｔａＣａｒｂ  ８７Ｈ  カラム（３００ｘ７．８ｍＭ）を用いて分析した。細胞成長は、６００ｎｍの吸光度でＵｌｔｒａｓｐｅｃ  ３００  スペクトロメータ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、スウェーデン）を用いて測定した。
【００４３】
実施例２：ＰＨＡシンターゼ、プロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼ及びグリセレートデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌を用いたＰ（ＬＡ‐ｃｏ‐ＧＡ）の生合成
本実施例では、グリコレート分画が増加されたＰ（ＬＡ‐ｃｏ‐ＧＡ）を生産する組換え大腸菌を製造するために、挿入される遺伝子を選択した。
【００４４】
クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼでＶ１９３Ａ変異及びＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ、Ｔ１１５８Ｃの４種のサイレント変異を有する酵素（Ｐｃｔ５４０）と、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼでクォッドルプル変異（４重変異）ＰｈａＣ１４３７（Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｋ）を有する酵素で形質転換された大腸菌が、高いラクテート分画を有するＰ（ＬＡ‐ｃｏ‐ＧＡ）共重合体を生産することを、以前の研究（韓国特許公開第２０１０‐０１１１７６６号）により確認し、Ｐ（ＬＡ‐ｃｏ‐ＧＡ）共重合体の合成のために前記二つの変異酵素を選択した。
【００４５】
先ず、グリコレート含有高分子を製造するために、グリコリル‐ＣｏＡの前駆物質としてグルコール酸ナトリウムを２ｇ／Ｌ濃度で培地に添加した。グリコレートが大腸菌で単独の炭素源として用いられると報告されているが、培地におけるグリコレートの濃度は、培養期間の間に減少しなかった。３ＨＢとグリコレートをそれぞれ２ｇ／Ｌの濃度で培地に添加した際に、Ｐ（３ＨＢ‐ｃｏ‐ＬＡ）の合成にグリコレートは用いられなかった。これは、本実験条件で、グリコレートパーミアーゼ（ＧｌｃＡ）により媒介されるグリコレート輸送システムが作動しないことを意味する。
【００４６】
したがって、グリコレートが細胞内に輸送されない問題を解決するために、グリオキシレートレダクターゼ／グリセレートデヒドロゲナーゼによりグリオキシレートからグリコレートを生産した（図１Ｂ）。
【００４７】
グリセレートをグリコレートに転換する反応は、ＥＣ（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）Ｎｏｓ．１．１．１．７９（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ‐依存性グリオキシレートレダクターゼ）、１．１．１．２９（ＮＡＤＨ‐依存性グリオキシレートレダクターゼ）、または１．１．１．２６（グリセレートデヒドロゲナーゼ）により行われる。ＡＴＣＣ及びＫＣＴＣから購入した菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０、及びＰ．ムルトシダの染色体から増幅されたＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５のＮＡＤＰＨ‐依存性グリオキシレートレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．７９）の遺伝子、Ｐ．プチダＫＴ２４４０及びＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）遺伝子を用いてグルコースからＰＬＧＡ共重合体を合成するためのグリコレートの生産能を確認した。
【００４８】
その結果、前記遺伝子のうち、大腸菌のグリセレートデヒドロゲナーゼ（配列番号５１）及びＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼ（配列番号２）のみがＰＬＧＡ共重合体を生産することができたが、高分子のＧＡ分率がＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを用いた場合により高かったため、以下の実験ではＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを用いた。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
Ｐｃｔ５４０Ｃｐ、ＰｈａＣ１４３７Ｐｓ６‐１９及びＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ‐１  Ｂｌｕｅは、高分子濃度１２．３重量％のＰ（ＬＡ４７．８ｍｏｌ％‐ｃｏ‐ＧＡ５２．２ｍｏｌ％）を生産した（表３）。
【００５１】
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡシンターゼは、高分子の合成において、最も高い親和性を有する単量体である３ＨＢなしには、ラクテートを含有する高分子を効率的に生産することができなかった。これは、ラクチル‐ＣｏＡに対する低い基質特異性、及び野生型大腸菌株中の制限されたラクチル‐ＣｏＡ含量のためであり、３ＨＢ‐ＣｏＡが、ラクテート含有高分子の合成においてイニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）としての役割をすると考えられる（Yang et al., Biotechnol Bioeng., 105:150, 2010）。しかし、ＰＬＧＡの合成では、３ＨＢを添加しなくても、ラクテート単量体がＰＬＧＡに５０ｍｏｌ％以上に効率的に含有されており、グリコリル‐ＣｏＡがＰｈａＣ１４３７Ｐｓ６‐１９に非常に親和的な基質であって、グリコリル‐ＣｏＡがラクテート含有高分子の合成において３ＨＢのようなイニシエータとして用いられることができることを確認した。グリコリル‐ＣｏＡは、表２に記載のＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを発現する組換え大腸菌により生成された。
【００５２】
上記の結果から、Ｐ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼの酵素活性が、グリセレートからグリコレートを合成するにあたり重要な役割をすることが分かる。
【００５３】
前記酵素活性の測定において、１ｍＭのＩＰＴＧを誘導して１０時間及び７０時間後に組換え大腸菌をサンプリングし、１０，０００ｘｇで５分間遠心分離することで細胞ペレットを得た。次いで、得られた細胞ペレットをＴＤＭバッファー（Ｔｒｉｓ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、及びＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ  １ｍＭ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、同じバッファーに懸濁させた。その後、超音波ホモジナイザー（ＶＣＸ‐６００、Ｓｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）のチタンプローブ４０Ｔ（直径：４ｍｍ、長さ：１２７ｍｍ）で細胞を破砕し、４℃及び１６，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、その上澄液を酵素活性の測定に使用した。前記酵素活性を測定するための細胞抽出物のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法により測定した。
【００５４】
ここで、酵素活性は実験を３回繰り返して得られた平均値であり、組換えＪＬＸ１０菌株は、グルコース２０ｇ／Ｌ及びコハク酸４ｇ／Ｌを添加したＭＲ培地を用いて３０℃で７２時間培養した。組換えＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株は、グルコース２０ｇ／Ｌのみを添加したＭＲ培地で培養した。
【００５５】
酵素活性を分析するためのサンプルは、１ｍＭのＩＰＴＧを誘導して１０時間及び７０時間後に採取した。酵素活性１ユニットは、３０℃で１分間、１ｍｍｏｌｅの基質を特定産物に転換する量と定義した。活性の単位は、ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質と定義した。
【００５６】
酵素活性は、温度調節スペクトロフォトメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて３０℃で分析した。酵素活性は、実験を３回繰り返して分析し、分析に使用された細胞抽出液の量は１６．５μＬ／ｍＬであった。反応の分析は３４０ｎｍでＮＡＤ（Ｐ）Ｈをモニタリングすることで行われ、３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）として６．２３／ｍＭ／ｃｍを使用し、酵素活性１ユニットは、３０℃で１分間、１ｍｍｏｌｅの基質を特定産物に転換する量と定義した。活性の単位は、ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質と定義した。
【００５７】
Ｐ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼの活性はＲｉｎｔａｌａなどの方法により分析した（Rintalla et al., Yeast 24: 129-136 2007）。リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０ｍＭ、細胞抽出物、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  ０．２ｍＭを含有する反応混合物に、濃度が２５ｍＭになるようにグリオキシレートを添加して反応させた。また、グリオキシレートを添加していない反応混合物を対照群として用いた。
【００５８】
野生型大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅは、０．０６Ｕ／ｍｇの非常に低いグリセレートデヒドロゲナーゼ活性を示したことに対し、Ｐ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを過発現するプラスミドで形質転換された組換え菌株は、１．４Ｕ／ｍｇの、タンパク質以上のグリセレートデヒドロゲナーゼ活性を示して、野生型大腸菌より２３倍高い活性を示した（表４）。
【００５９】
Ｐ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨをコファクターとして使用した場合に酵素活性が測定され、ＮＡＤＰＨをコファクターとして使用した場合には酵素反応が行われなかった。このことから、Ｐ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨに対しては酵素活性を有しないことが分かった。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
組換え菌株でラクテート含有高分子を生産するにあたり、ラクチル‐ＣｏＡの生成が高分子の生成効率を阻害する速度制限段階であるため、菌株中のラクテート含量を増加させるために、大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅの染色体でラクテート前駆物質を競合的に用いる幾つかの代謝経路を欠失させたＪＬＸＦ５菌株を作製した。また、ｔｒｃプロモーターの調節下でのｌａｃＩｑ遺伝子も欠失させた（表１及び図１〜４参照）。
【００６２】
表５に示したように、Ｐｃｔ５４０、ＰｈａＣ１４３７及びＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌ＪＬＸＦ５菌株は、ＩＰＴＧの誘導がなくても、高分子濃度２０．３重量％以上のＰ（ＬＡ５７．２ｍｏｌ％‐ｃｏ‐ＧＡ４２．８ｍｏｌ％）を生産した。
【００６３】
菌株中のラクテート濃度を増加させた結果、ＰＬＧＡにおけるラクテート分画が増加した。ＩＰＴＧを添加すると、高分子濃度が２０．３重量％から２６．９重量％に増加し、単量体の組成はほとんど変化しなかった。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
１ｔｒｃプロモーターの調節下での染色体のｌｄｈＡ及びａｃｓ遺伝子の発現、及びプラスミドのｔａｃプロモーターの調節下でのＰ．ムルトシダのグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現のために、培養液の濃度がＯＤ６００が０．５になった時に、１ｍＭのＩＰＴＧを処理した。
【００６６】
実施例３：大腸菌の代謝操作による高いグリコレート含量を有するＰＬＧＡの生産
実施例２で組換えＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株及び組換えＪＬＸＦ５菌株を用いてグルコースからＰＬＧＡを成功的に生産したが、生産された高分子の濃度が低かった。組換え菌株でＰＬＧＡの生合成を向上させるために、グルコースからラクテートを効率的に生産するように操作されているＪＬＸＦ５菌株でグリコレート合成経路を強化させた。また、グリコレート含量を増加させることが、グリコリル‐ＣｏＡが高分子の合成を開始するにあたりさらに有利である。グリコレートの合成を増加させるために、グリオキシレートシャント（ｓｈｕｎｔ）に関与するａｃｅＢ遺伝子及びｉｃｌＲ遺伝子を欠失させ、ａｃｅＡ遺伝子を増幅させた。
【００６７】
グリオキシレート経路を増加させるために、染色体ＤＮＡでｉｃｌＲ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）及びａｃｅＢ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子を欠失させ、ａｃｅＡ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ）遺伝子のプロモーターをｔｒｃプロモーターに入れ替ることは、ｏｎｅ‐ｓｔｅｐ不活性化方法（Datsenko and Wanner, 2000）を用いた。
【００６８】
ｉｃｌＲ遺伝子を欠失させた際に、組換え菌株で生成されるＰＬＧＡの濃度は１４．２重量％から２３．９重量％に増加し、ＰＬＧＡ高分子中のグリコレート単量体の分画は４２．８ｍｏｌ％から５６．２ｍｏｌ％に増加した。さらに、ａｃｅＢ遺伝子を欠失させ、ａｃｅＡ遺伝子を増幅させた際に、組換え菌株で生産されたＰＬＧＡの濃度は、ＪＬＦＸ５菌株で生産された量より２．３倍も高い３２．６重量％であった。また、グリコレート単量体は６１．６ｍｏｌ％以上に増加した。
【００６９】
実施例４：組換え大腸菌で合成されたＰＬＧＡの特質
本発明で合成された共重合体の単量体の成分はガスクロマトグラフィーにより分析した。また、重合体は、有機溶媒抽出法（Jacquel et al., Biochem Eng J 39:15-27, 2008）により細胞から精製した。高分子の分子量は、ＮＭＲスペクトロスコピー及びＧＰＣ（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて測定した。
【００７０】
大腸菌ＪＬＸＦ５により生産されるＰＬＧＡは、化学的に合成されるＰＬＧＡと同一の構造を有していた（図１のＡ参照）。ＰＬＧＡの５００ＭＨｚ１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで、ＬＡのオキシメチン（ｏｘｙｍｅｔｈｉｎｅ）プロトン（−ＯＣＨ−）は５．２ｐｐｍで示され、ＧＡのメチルプロトン（−ＣＨ３）はそれぞれ４．６〜４．９ｐｐｍで示された（図５のＡ）。
【００７１】
１Ｈ‐１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルでプロトンの内部３結合カップリングを確認し、これからＰＬＧＡの構造が明らかになった。ＬＡのオキシメチンプロトンとオキシメチンプロトンに隣合うメチレンプロトンとの間のカップリングは、５．１ｐｐｍ／１．６ｐｐｍのクロスピークが確認された（図５のＢ）。ＧＡのメチレンプロトンの間のカップリングは、４．６〜４．９ｐｐｍに存在するクロスピークが確認された。ＰＬＧＡの１２５ＭＨｚ  １３Ｃ  ＮＭＲスペクトルで、ＧＡ*‐ＧＡ配列のカルボニル炭素ピークは１６９．４ｐｐｍ、ＬＡ*‐ＬＡ及びＬＡ‐ＬＡ*配列のカルボニルピークは１６９．６３ｐｐｍ、ＬＡ*‐ＧＡ＋ＧＡ‐ＬＡ*配列のカルボニルピークは１６９．８０ｐｐｍで示された（図５のＣ）。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
上述したように、本発明によると、グリオキシレートを外部から供給しなくても、グリコレート分画の濃度が高いラクテート‐ｃｏ‐グリコレート共重合体を高い濃度で製造することができる。
【００７３】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界において通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は、単に好ましい実施態様にすぎず、これによって本発明の範囲が制限されないということは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求範囲とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図５（Ｃ）】
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【配列表】
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