(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）の細胞結合剤−薬物コンジュゲートであって、
【化１】
0006021963.tif 000079
［式中：
ＣＢは細胞結合剤を表し；
Ｄはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エステル、エーテル、カルバメート、またはアミド結合により細胞結合剤に連結した薬物を表し、但し当該薬物はマイタンシノイドではなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニル、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−から選択される陰イオン、ならびに窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３およびＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される陽イオンから選択される荷電した置換基、またはフェニルであり；ここで：
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同じまたは異なっており、それは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝または環状アルキルであり、Ｘはフェニルまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルを表し；
ｌ、ｍおよびｎは０または１から４までの整数であり；
Ａはフェニルまたは置換されたフェニルであり、ここでその置換基は、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、またはＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−から選択される陰イオン、ならびに窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３およびＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される陽イオンから選択される荷電した置換基であり、ここでＸは上記と同じ定義を有し、ここでｇは０または１であり；
Ｚは存在せず；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり、またはｇが１である場合、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり；
Ｙはカルボニル、チオエーテル、アミド、ジスルフィド、またはヒドラゾン基を表し；および
ｑは１から２０までの整数を表す］
である、前記コンジュゲート。
【請求項２】
薬物がチオテパ；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンから選択されるアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパから選択されるアジリジン類；エチレンイミン類；およびメチルアメラミン類（methylamelamines）；ブラタシンおよびブラタシノンから選択されるアセトゲニン類；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；ＣＣ−１０６５のアドゼレシン、カルゼレシンまたはビゼレシン合成類似体；クリプトフィシン類；ドラスタチン；デュオカルマイシン；デュオカルマイシンのＫＷ−２１８９またはＣＢＩ−ＴＭＩ合成類似体；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードから選択されるナイトロジェンマスタード類；ニトロソ尿素類（nitrosureas）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシンガンマ１およびカリケアマイシンシータＩを含むカリケアマイシン；ダイネマイシン、ダイネマイシンＡを含む；エスペラマイシン；ネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモモフォア類）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ナイトマイシン類（nitomycins）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）から選択される代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートから選択される葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン選択されるプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵから選択されるピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンから選択されるアンドロゲン類；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フロリン酸から選択される葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォ��ァミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォミチン（elfomithine）；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジンから選択されるトリコテセン類；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンから選択されるプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ファレストン）を含む抗エストロゲン薬；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンから選択される抗アンドロゲン薬から選択される抗ホルモン剤、ｓｉＲＮＡまたはその組み合わせ；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩類、酸類、または誘導体から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
薬物がＣＣ−１０６５類似体、モルホリノドキソルビシン、タキサン類、カリケアマイシン類、アウリスタチン類、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ｓｉＲＮＡまたはその組み合わせ、および上記のいずれかの医薬的に許容できる塩類、酸類、または誘導体から選択される、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
細胞結合剤が、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生生物感染細胞、自己免疫細胞、活性化された細胞、骨髄細胞、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、またはメラニン細胞、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２受容体、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ受容体類、ＥｐｈＢ受容体類、ＥＧＦｒ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、アルファｖベータ３インテグリン、アルファｖベータ５インテグリン、アルファｖベータ６インテグリン、Ａｐｏ２、およびＣ２４２抗原の内の１種類以上を発現する細胞；ならびにインスリン成長因子受容体、上皮成長因子受容体、または葉酸受容体を発現する細胞；から選択される標的細胞に結合する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
細胞結合剤が、抗体、単鎖抗体、標的細胞に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に結合するモノクローナル抗体断片、キメラ抗体、標的細胞に結合するキメラ抗体断片、ドメイン抗体、標的細胞に結合するドメイン抗体断片、抗体を模倣するａｄｎｅｃｔｉｎ類、ＤＡＲＰｉｎ類、リンフォカイン、ホルモン、ビタミン、成長因子、コロニー刺激因子、または栄養素輸送分子である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
抗体が表面再構成（resurfaced）抗体、表面再構成単鎖抗体、またはその表面再構成抗体断片である、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
抗体がそれらのモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体断片である、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
抗体がそれらのヒト抗体、ヒト化抗体もしくは表面再構成抗体、ヒト化単鎖抗体、またはヒト化抗体断片である、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
抗体がそれらのキメラ抗体、キメラ抗体断片、ドメイン抗体、またはドメイン抗体断片である、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
抗体がＭｙ９−６、Ｂ４、Ｃ２４２、Ｎ９０１、ＤＳ６、ＣＮＴＯ  ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、またはＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２受容体、ＣＤ３８、もしくはＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体である、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
腫瘍細胞が乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞肺癌細胞、および精巣癌細胞から選択される、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
式（ＩＶ）の化合物であって：
【化２】
0006021963.tif 000080
［式中：
Ｙ’は細胞結合剤との反応を可能にする官能基を表し；
Ｄはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エステル、エーテル、カルバメート、またはアミド結合により細胞結合剤に連結した薬物を表し、但し当該薬物はマイタンシノイドではなく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニル、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−から選択される陰イオン、ならびに窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３およびＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される陽イオンから選択される荷電した置換基、またはフェニルであり、ここで：
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同じまたは異なっており、それは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルであり、Ｘはフェニルまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルを表し；
ｌ、ｍおよびｎは０または１から４までの整数であり；
Ａはフェニルまたは置換されたフェニルであり、ここでその置換基は、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、またはＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、ここでＸは上記と同じ定義を有し、ここでｇは０または１であり；ならびに
Ｚは存在せず；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり、またはｇが１である場合、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基である］
である、前記化合物。
【請求項１３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９およびＲ１０の１つはＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３およびＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、その他はＨであり；ｌ、ｇ、及びｍはそれぞれ０であり；ｎは１である；請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９およびＲ１０の１つはＳＯ３−またはＸ−ＳＯ３−であり、その他はＨであり；ｌ、ｇ、及びｍはそれぞれ０であり；ｎは１である；請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
コンジュゲートが以下の式：
【化３】
0006021963.tif 000081
で表される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
細胞結合剤−薬物コンジュゲートであって、以下の式：
【化４】
0006021963.tif 000082
で表され、ここで前記細胞結合剤は抗体であり、
上記式中、
Ｄはチオエステル結合により細胞結合剤に連結した薬物を表し、但し当該薬物はマイタンシノイドではなく；
ｑは１から２０の整数を表す；
前記コンジュゲート。
【請求項１７】
癌の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜１１および１３〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１８】
請求項１〜１１および１３〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたはその医薬的に許容できる塩もしくは溶媒和物の有効量、および医薬的に許容できるキャリアー、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９およびＲ１０の１つはＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３およびＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、その他はＨであり；ｌ、ｇ、及びｍはそれぞれ０であり；ｎは１であり；Ｙ’はジスルフィド、マレイミド、ハロアセチル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである；請求項１２に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９およびＲ１０の１つはＳＯ３−またはＸ−ＳＯ３−から選択される荷電した置換基であり、その他はＨであり；ｌ、ｇ、及びｍはそれぞれ０であり；ｎは１であり；Ｙ’はマレイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである；請求項１２に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｙ’はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項２０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００８年４月３０日に出願された米国仮出願第６１／０４９，２９１号に対する、および２００９年１月２８日に出願された米国仮出願第６１／１４７，９６６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
[01]  本発明は、新規の荷電したクロスリンカーおよび標的細胞により処理されて荷電した部分を与えることができるクロスリンカーの合成に関する。本発明は、細胞結合剤（ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）のこれらのクロスリンカーを用いた修飾、それに続く薬物との反応、またはその薬物のこれらのクロスリンカーを用いた修飾、それに続く細胞結合剤との反応を含む、細胞結合剤−薬物コンジュゲートを作る方法にも関する。コンジュゲートを作るその向上した方法は、細胞結合剤ごとにより多い数の薬物分子を連結させ、結果的により大きな効力をもたらし、そのコンジュゲートにより大きな水溶性を与える能力を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[02]  二官能性修飾試薬Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、２個のタンパク質をジスルフィド結合を通して連結するために用いられてきた。その試薬は、修飾工程において第１のタンパク質と反応して活性なジスルフィドを含む基を導入する。次いでコンジュゲーション工程において遊離のチオール基を含む第２のタンパク質を添加して２個のタンパク質の間にジスルフィド結合を形成する。ＳＰＤＰの多くの誘導体およびＳＰＤＰのイミド型が記述されている(米国特許第４，５
６３，３０４号；J. Carlsson et al. 173 Biochem. J. 723-737 (1978)；Goff D. A., Carroll, S. F. 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990)；L. Delprino et al. 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993)；S. Arpicco et al., 8 BioConjugate Chem 327-337 (1997))。
【０００４】
[03]  細胞結合剤の、高度に細胞毒性の薬物とのコンジュゲートが記述されている(米
国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号；第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号、第６，４３６，９３１号、第６，３７２，７３８号、および第６，３４０，７０１号；R.V.J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992))。これら
のコンジュゲートでは、まず細胞結合剤を二官能性薬剤、例えばＳＰＤＰ、ＳＰＰまたはＳＭＣＣにより修飾して活性なジスルフィドまたはマレイミド部分を導入する。チオールを含む細胞毒性薬物との反応は、細胞結合剤、例えばモノクローナル抗体および薬物がジスルフィド結合またはチオエーテル結合を通して連結されたコンジュゲートを与える。
【０００５】
[04]  ニトロピリジルジチオ、ジニトロピリジルジチオ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミドピリジルジチオまたはジ−（Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド）ピリジルジチオ基および反応性カルボキシルエステル基、例えばＮ−スクシンイミジルエステル基またはＮ−スルホスクシンイミジルエステル基を含むヘテロ二官能性（Ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）クロスリンカーが記述されている（米国特許第６，９１３，７４８号）。Ｎ−スルホスクシンイミジル基の存在はこれらのクロスリンカーにより高い水溶性を与えると主張された。しかし、一度その細胞結合剤がこれらのクロスリンカーと反応すると、そのＮ−スルホスクシンイミジル基は置き換えられ、修飾された細胞結合剤およびその薬物コンジュゲートの両方に関して、水溶性の利点は失われる。細胞結合剤−薬物コンジュゲートにおいて用いられる細胞毒性薬物はしばしば水溶液中でごくわずかしか溶けないため、十分な数の薬物分子を細胞結合剤に連結させてなお水溶性を維持するのはしばしば困難である。加えて、反応は希釈溶液中で実施されなければならず、それは大量の溶液を用いる必要があるためスケールアップしにくい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，５６３，３０４号
【特許文献２】米国特許第５，２０８，０２０号
【特許文献３】米国特許第５，４１６，０６４号
【特許文献４】米国特許第５，４７５，０９２号
【特許文献５】米国特許第５，５８５，４９９号
【特許文献６】米国特許第６，４３６，９３１号
【特許文献７】米国特許第６，３７２，７３８号
【特許文献８】米国特許第６，３４０，７０１号
【特許文献９】米国特許第６，９１３，７４８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Carlsson et al. 173 Biochem. J. 723-737 (1978)
【非特許文献２】Goff D. A., Carroll, S. F. 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990)
【非特許文献３】L. Delprino et al. 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993)
【非特許文献４】S. Arpicco et al., 8 BioConjugate Chem 327-337 (1997)
【非特許文献５】R.V.J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992)
【発明の概要】
【０００８】
[05]  本発明は荷電したリンカーを提供し、ここでその電荷は細胞結合剤の修飾の後および結果として得られた薬物コンジュゲートの両方において保持される。より具体的には、本発明は薬物を細胞結合剤（例えば抗体）に連結させるための荷電したリンカーの使用に関する。本発明の１観点において、その荷電したリンカーは細胞結合剤を修飾してそれらを薬物に連結させるために用いられる。本発明の別の観点において、その荷電したリンカーは薬物を修飾してそれらを細胞結合剤に連結させるために用いられる。本発明のさらに別の観点において、その荷電したリンカーは薬物および細胞結合剤を同時に連結させるために用いられる。全ての場合において、好ましい最終結果は薬物−荷電したリンカー−細胞結合剤コンジュゲートであり、それは式ＣＢ−（−Ｌｃ−Ｄ）ｑにより表すことができ、ここでＣＢは細胞結合剤であり、Ｌｃは荷電したリンカーであり、Ｄは薬物分子であり、ｑは１から２０までの整数である。細胞結合剤−薬物コンジュゲート中のリンカー中の荷電した基（単数又は複数）の存在は、いくつかの利点、例えばｉ）最終産物のより大きな水溶性、ｉｉ）水溶液中でより高い濃度において作動する能力、ｉｉｉ）結果としてより高い効力をもたらす、細胞結合剤の分子ごとにより大きな数の薬物分子を連結させる能力、ｉｖ）結果としてより高い効力をもたらす、荷電したコンジュゲート種が標的細胞内部に維持される可能性、およびｖ）荷電した薬物種を細胞から排出することができないであろう、多剤耐性細胞の向上した感受性を提供する。本発明は、薬物および細胞結合剤に結び付けて、細胞内で代謝されて１個以上の荷電した部分を含む薬物代謝産物を生成することができるコンジュゲートを与えることができるリンカーも記述する。これらのリンカーをプロ荷電（ｐｒｏ−ｃｈａｒｇｅｄ）リンカーと呼ぶことにする。そのリンカーの、細胞による処理の後に荷電した状態になるであろう部分を、プロ荷電部分と呼ぶことにする。
【０００９】
[06]  本発明の１観点において、荷電またはプロ荷電クロスリンカーは式（Ｉ）により表され、ここでＹ’は細胞結合剤と反応することができ、Ｑは細胞毒性薬物と反応することができる：
【００１０】
【化１】
0006021963.tif 000002
【００１１】
ここで：
Ｙ’は細胞結合剤との反応を可能にする官能基を表し；
Ｑはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エーテル、エステル、カルバメートまたはアミド結合を通した細胞毒性薬物の連結を可能にする官能基を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニル、陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、および陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３、またはフェニルであり、ここで：
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルであり、Ｘはフェニルまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルを表し；
ｌ、ｍおよびｎは０または１から４までの整数であり；ならびに
Ａはフェニルまたは置換されたフェニルであり、ここでその置換基は、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、または陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、および陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、ここでＸは上記と同じ定義を有し、ここでｇは０または１であり；
Ｚは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、またはＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位であり、ここでＥ１およびＥ２は同じもしくは異なっており、それはＣ＝Ｏ、Ｏ、もしくはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニルであり；Ｐは２〜２０アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１もしくはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じもしくは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２では無いならば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり、またはｇが１である場合、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基である。
【００１２】
[07]  別の観点において、本発明は式（ＩＩ）の細胞結合剤−薬物コンジュゲートを提供し、ここでその細胞結合剤、ＣＢ、およびその薬物、Ｄ、はその荷電またはプロ荷電クロスリンカーの２つの末端において反応しており：
【００１３】
【化２】
0006021963.tif 000003
【００１４】
ここで：
ＣＢは細胞結合剤を表し；
Ｄはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エーテル、エステル、カルバメート、またはアミド結合により細胞結合剤に連結した薬物を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニル、陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３、またはフェニルであり、ここで：
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルであり、Ｘはフェニルまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルを表し；
ｌ、ｍおよびｎは０または１から４までの整数であり；ならびに
Ａはフェニルまたは置換されたフェニルであり、ここでその置換基は、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、または陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、ここでＸは上記と同じ定義を有し、ここでｇは０または１であり；
Ｚは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、またはＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位であり、ここでＥ１およびＥ２は同じもしくは異なっており、それはＣ＝Ｏ、Ｏ、もしくはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニルであり；Ｐは２〜２０アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１もしくはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じもしくは異なっており、それは式（ＯＣ
Ｈ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２では無いならば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり、またはｇが１である場合、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり；
Ｙはカルボニル、チオエーテル、アミド、ジスルフィド、またはヒドラゾン基を表し；ｑは１から２０までの整数を表す。
【００１５】
[08]  さらなる観点において、本発明は式（ＩＩＩ）の修飾された細胞結合剤を提供し、ここでその細胞結合剤、ＣＢは、細胞毒性薬物と反応することができる基であるＱをまだ有しているクロスリンカーと反応する：
【００１６】
【化３】
0006021963.tif 000004
【００１７】
ここでその置換基は上記で定義されたものである。
[09]  さらに別の観点において、本発明は式（ＩＶ）の修飾された薬物を提供し、ここで薬物、Ｄは、細胞結合剤と反応することができる基であるＹ’をまだ有しているクロスリンカーと反応する：
【００１８】
【化４】
0006021963.tif 000005
【００１９】
ここでその置換基は上記で定義されたものである。
[10]  本発明はさらに式（ＩＩ）の細胞結合剤薬物コンジュゲートを作る方法に関し、ここでその薬物は荷電またはプロ荷電リンカーを通して細胞結合剤に連結する。
【００２０】
[11]  本発明は式（ＩＩＩ）の修飾された細胞結合剤を作る方法にも関し、ここでその細胞結合剤は荷電またはプロ荷電リンカーと反応する。
[12]  本発明は式（ＩＶ）の修飾された薬物を作る方法にも関し、ここでその薬物は荷電またはプロ荷電リンカーと反応する。
【００２１】
[13]  本発明はコンジュゲートまたはその誘導体（および／またはそれらの溶媒和物、水和物および／または塩類）およびキャリヤー（医薬的に許容できるキャリヤー）を含む
組成物（例えば医薬組成物）を含む。本発明は、コンジュゲートまたはその誘導体（および／またはそれらの溶媒和物、水和物および／または塩類）およびキャリヤー（医薬的に許容できるキャリヤー）を含み、さらに第２の療法薬を含む組成物（例えば医薬組成物）も含む。本組成物は、哺乳類（例えばヒト）において異常な細胞増殖を阻害する、または増殖性障害を処置するのに有用である。
【００２２】
[14]  本発明は、哺乳類（例えばヒト）において異常な細胞増殖を阻害する、または増殖性障害を処置する方法であって、前記哺乳類に療法上有効量のコンジュゲートもしくはその誘導体（および／またはそれらの溶媒和物および塩類）またはそれらの組成物を、単独または第２の療法薬との組み合わせで投与することを含む方法を含む。
【００２３】
[15]  この発明の化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲート、およびそれらを含む組成物は、例えば細胞の異常な増殖により特性付けられる障害（例えば癌）を処置する、またはその重症度を和らげるのに有用である。この発明の化合物またはコンジュゲートに関する他の適用には、骨粗鬆症、抑うつ、不安、ストレス、恐怖症、パニック、精神不安、精神障害、ならびに痛みの処置、または抗てんかん薬、抗細菌薬、利尿薬および降圧薬、脂質低下薬、ならびに抗うつ薬としての適用が含まれるがそれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】[16]  図１は、ニトロピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。まずヒドロキシアルカノエートエステルを示したようにジブロモアルカノエートエステルに変換し、続いてα−ブロモ置換基をスルホン酸に変換する。
【図２】[17]  図２は、ピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３】[18]  図３、４および５は、反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド置換基を有し、チオエーテル結合を通した連結を可能とする荷電したクロスリンク試薬の合成のための様々な経路を示す。
【図４】[18]  図３、４および５は、反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド置換基を有し、チオエーテル結合を通した連結を可能とする荷電したクロスリンク試薬の合成のための様々な経路を示す。
【図５】[18]  図３、４および５は、反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド置換基を有し、チオエーテル結合を通した連結を可能とする荷電したクロスリンク試薬の合成のための様々な経路を示す。
【図６】[19]  図６および７は、ピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図７】[19]  図６および７は、ピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図８】[20]  図８は、ニトロピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図９】[21]  図９および１０は、反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド置換基を有し、チオエーテル結合を通した連結を可能とする、ホスフェートを含む荷電したクロスリンク試薬の合成のための異なる経路を示す。
【図１０】[21]  図９および１０は、反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド置換基を有し、チオエーテル結合を通した連結を可能とする、ホスフェートを含む荷電したクロスリンク試薬の合成のための異なる経路を示す。
【図１１】[22]  図１１は、スルホネート置換基が分枝アルキル基に結合している、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。これらの試薬はピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルも有する。
【図１２】[23]  図１２は、スルホネート置換基が分枝アルキル基に結合している、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド基も有しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図１３】[24]  図１３は、ピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、第四級アミンを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図１４】[25]  図１４は、反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド置換基を有し、チオエーテル結合を通した連結を可能とする、第四級アミンクロスリンク試薬の合成を示す。
【図１５】[26]  図１５は、ピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。これらの化合物では、そのスルホネート置換基はカルボキシルエステルに対してβ位にある炭素原子上にある。
【図１６】[27]  図１６は、ピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルを含む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。これらの化合物では、そのホスフェート置換基はカルボキシルエステルに関してβ位にある。
【図１７】[28]  図１７、１８および１９は、ニトロピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルに加えてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、様々なスルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図１８】[28]  図１７、１８および１９は、ニトロピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルに加えてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、様々なスルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図１９】[28]  図１７、１８および１９は、ニトロピリジルジスルフィド基および反応性カルボン酸エステルに加えてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、様々なスルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２０】[29]  図２０および２１は、マレイミド基および反応性カルボン酸エステルに加えてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、様々なスルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２１】[29]  図２０および２１は、マレイミド基および反応性カルボン酸エステルに加えてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、様々なスルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２２】[30]  図２２は、ホスフェート置換基が芳香族基に結合している、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびニトロピリジルジチオ基も有しており、それはジスルフィド結合を通した連結を可能にする。
【図２３】[31]  図２３は、ホスフェート置換基が分枝アルキル基に結合している、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびニトロピリジルジチオ基も有しており、それはジスルフィド結合を通した連結を可能にする。
【図２４】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ）結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２５】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２６】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２７】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２８】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図２９】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３０】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３１】[32]  図２４〜３１は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、スルホネートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３２】[33]  図３２〜３６は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３３】[33]  図３２〜３６は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３４】[33]  図３２〜３６は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３５】[33]  図３２〜３６は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３６】[33]  図３２〜３６は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、ホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３７】[34]  図３７〜３８は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、第四級アミンを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３８】[34]  図３７〜３８は、酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分も組み込む、第四級アミンを含むクロスリンク試薬の合成を示す。
【図３９】[35]  図３９〜４２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分も組み込む、荷電したクロスリンク試薬の合成を示す。
【図４０】[35]  図３９〜４２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分も組み込む、荷電したクロスリンク試薬の合成を示す。
【図４１】[35]  図３９〜４２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分も組み込む、荷電したクロスリンク試薬の合成を示す。
【図４２】[35]  図３９〜４２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分も組み込む、荷電したクロスリンク試薬の合成を示す。
【図４３】[36]  図４３〜４４はホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示しており、そのホスフェート置換基は芳香族残基に、またはアルキル基に結合している。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびニトロピリジルジチオ基も有しており、それはジスルフィド結合を通した連結を可能にする。
【図４４】[36]  図４３〜４４はホスフェートを含むクロスリンク試薬の合成を示しており、そのホスフェート置換基は芳香族残基に、またはアルキル基に結合している。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびニトロピリジルジチオ基も有しており、それはジスルフィド結合を通した連結を可能にする。
【図４５】[37]  図４５〜４９は、反応性カルボン酸エステルおよびハロアセチル置換基を有する荷電したクロスリンク薬剤の合成を示しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図４６】[37]  図４５〜４９は、反応性カルボン酸エステルおよびハロアセチル置換基を有する荷電したクロスリンク薬剤の合成を示しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図４７】[37]  図４５〜４９は、反応性カルボン酸エステルおよびハロアセチル置換基を有する荷電したクロスリンク薬剤の合成を示しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図４８】[37]  図４５〜４９は、反応性カルボン酸エステルおよびハロアセチル置換基を有する荷電したクロスリンク薬剤の合成を示しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図４９】[37]  図４５〜４９は、反応性カルボン酸エステルおよびハロアセチル置換基を有する荷電したクロスリンク薬剤の合成を示しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図５０】[38]  図５０は、負に荷電したカルボキシレート代謝産物を生成するであろうプロ荷電リンカーの合成を示す。
【図５１】[39]  図５１は、リンカー１５８の薬物およびモノクローナル抗体へのコンジュゲートならびにそのコンジュゲートが標的細胞のリソソーム中でどのように処理されて負に荷電したカルボキシレートを有する薬物を含む代謝産物を与えるかを示す。
【図５２】[40]  図５２は、正に荷電したアミンを含む代謝産物を生成するであろうプロ荷電リンカーの合成を示す。
【図５３】[41]  図５３は、プロ荷電リンカーの薬物およびモノクローナル抗体へのコンジュゲートならびにそのコンジュゲートが標的細胞のリソソーム中でどのように処理されて正に荷電したアミンを有する薬物の代謝産物を与えるかを示す。
【図５４】[42]  図５４は、荷電したカルボキシレート代謝産物を生成するであろうプロ荷電リンカーの合成を示す。
【図５５】[43]  図５５は、リンカー１７２の薬物およびモノクローナル抗体へのコンジュゲートならびにそのコンジュゲートが標的細胞のリソソーム中でどのように処理されてカルボン酸およびリシン残基を有する薬物を含む代謝産物を与えるかを示す。
【図５６】[44]  図５６は、細胞結合剤の修飾および荷電したリンカーを有する細胞結合剤−薬物コンジュゲートの生成における荷電したリンカーの使用を示す。
【図５７Ａ】[45]  図５７（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、荷電したクロスリンカーが組み込まれている細胞結合剤−薬物コンジュゲートのインビトロでの効力を示す。
【図５７Ｂ】[45]  図５７（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、荷電したクロスリンカーが組み込まれている細胞結合剤−薬物コンジュゲートのインビトロでの効力を示す。
【図５７Ｃ】[45]  図５７（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、荷電したクロスリンカーが組み込まれている細胞結合剤−薬物コンジュゲートのインビトロでの効力を示す。
【図５８】[46]  図５８は、荷電したクロスリンカーを有する細胞結合剤−薬物コンジュゲートのインビトロでの効力および標的選択性を示す。
【図５９】[47]  図５９は、荷電したクロスリンカーを有する細胞結合剤−薬物コンジュゲートの質量スペクトルを示す。
【図６０】[48]  図６０は、抗ＣａｎＡｇ（ｈｕＣ２４２）−スルホネートリンカー−マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）コンジュゲートの、マイタンシノイドのロード（ｌｏａｄ）（Ｅ：Ａ）の増大に伴う、ＣＯＬＯ２０５細胞に対する細胞毒性を示す。
【図６１】[49]  図６１は、抗ＣａｎＡｇ（ｈｕＣ２４２）−スルホネートリンカー−マイタンシノイドコンジュゲートの、マイタンシノイドのロード（Ｅ：Ａ）の増大に伴う、多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性を示す。
【図６２】[50]  図６２は、リンカー中にスルホネート基を有する、または有しない抗ＣａｎＡｇ（ｈｕＣ２４２）−マイタンシノイドコンジュゲートの、多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性を比較する。
【図６３】[51]  図６３は、リンカー中にスルホネート基を有する、または有しない抗ＥｐＣＡＭ（Ｂ３８．１）−マイタンシノイドコンジュゲートの、多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性を比較する。
【図６４】[52]  図６４は、リンカー中にスルホネート基を有する、または有しない抗ＥｐＣＡＭ（Ｂ３８．１）−マイタンシノイドコンジュゲートの、多剤耐性ＨＣＴ１５細胞に対する細胞毒性を比較する。
【図６５】[53]  図６５は、リンカー中にスルホネート基を有する、または有しない抗ＥｐＣＡＭ（Ｂ３８．１）−マイタンシノイドコンジュゲートの、多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性を比較する。
【図６６】[54]  図６６は、抗ＥｐＣＡＭ抗体−マイタンシノイドコンジュゲートのＣＯＬＯ２０５  ｍｄｒ異種移植片（別個の腫瘍）に対するインビボでの抗腫瘍活性を示す。
【図６７】[55]  図６７は、抗ＥｐＣＡＭ抗体−マイタンシノイドコンジュゲートのＣＯＬＯ２０５異種移植片（別個の腫瘍）に対するインビボでの抗腫瘍活性を示す。
【図６８】[56]  図６８〜７０は、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成の方法を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド基を有しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図６９】[56]  図６８〜７０は、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成の方法を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド基を有しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図７０】[56]  図６８〜７０は、スルホン酸を含むクロスリンク試薬の合成の方法を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびマレイミド基を有しており、それはチオエーテル結合を通した連結を可能にする。
【図７１】[57]  図７１は、第四級アミンを含むクロスリンク試薬の合成の方法を示す。これらの試薬は反応性カルボン酸エステルおよびピリジルジチオ基も有しており、それはジスルフィド結合を通した連結を可能にする。
【図７２Ａ】[58]  図７２（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＤ−１マウスにおいてそれぞれ１２．９ｍｇ／ｋｇおよび７．９ｍｇ／ｋｇ（静脈内）で投与された、３．５ＤＭ４／Ａｂまたは６．４ＤＭ４／ＡｂでのｈｕＣ２４２抗体−スルホ−Ｍａｌ−［３Ｈ標識］−ＤＭ４コンジュゲートの血漿薬物動態を示す。Ａ．Ａｂ濃度（ＥＬＩＳＡにより、または３Ｈの計数により測定した）対投与後の時間。Ｂ．マイタンシノイド（ＤＭ４）／抗体（Ａｂ）比対投与後の時間。
【図７２Ｂ】[58]  図７２（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＤ−１マウスにおいてそれぞれ１２．９ｍｇ／ｋｇおよび７．９ｍｇ／ｋｇ（静脈内）で投与された、３．５ＤＭ４／Ａｂまたは６．４ＤＭ４／Ａｂを有するｈｕＣ２４２抗体−スルホ−Ｍａｌ−［３Ｈ標識］−ＤＭ４コンジュゲートの血漿薬物動態を示す。Ａ．Ａｂ濃度（ＥＬＩＳＡにより、または３Ｈの計数により測定した）対投与後の時間。Ｂ．マイタンシノイド（ＤＭ４）／抗体（Ａｂ）比対投与後の時間。
【００２５】
[59]  図１〜７１において、適用可能な場合、ｎは０または１から１０までの整数を表し、ｍは０または１から２０００までの整数を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[60]  本明細書で開示される新規コンジュゲートは、荷電またはプロ荷電クロスリンカーを用いる。いくつかの適切なクロスリンカーおよびそれらの合成の例を図１〜１０において示す。好ましくは、荷電またはプロ荷電クロスリンカーは、スルホネート、ホスフェート、カルボキシルまたは第四級アミン置換基を含むクロスリンカーであり、それは修飾された細胞結合剤および細胞結合剤−薬物コンジュゲートの溶解性を、特に２〜２０薬物／抗体が連結されたモノクローナル抗体−薬物コンジュゲートに関して、著しく増大させる。プロ荷電部分を含むリンカーから調製したコンジュゲートは、そのコンジュゲートが細胞内で代謝された後に１個以上の荷電した部分を生成するであろう。
【００２７】
クロスリンカー
[61]  本発明の荷電したクロスリンカーを生成するための合成経路を図１〜４９において示す。プロ荷電部分を有するリンカーを生成するための合成経路を図５０、５２、および５４において示す。図５１、５３および５５は、それぞれのプロ荷電リンカーと薬物とモノクローナル抗体のそれぞれのコンジュゲートおよびどのようにこれらのコンジュゲートが標的細胞内で代謝されて荷電した代謝産物を与えるであろうかを示す。そのクロスリンカーは３種類の要素を有する：ａ）荷電した、またはこれらのリンカーを用いているコンジュゲートが細胞内で代謝される際に荷電した状態になるであろう置換基。その電荷は陰イオン性、例えば、それらに限定されるわけではないが、カルボキシレート、スルホネートもしくはホスフェート、または陽イオン性、例えば、それらに限定されるわけではないが、第三級、第四級、もしくは第一級アミンもしくは窒素を含む複素環のどちらかであろう、ｂ）細胞結合剤と反応することができる基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｍｉｄｅ）エステル、マレイミド基、ハロアセチル基、およびヒドラジド、ならびにｃ）薬物と反応することができる基、例えば、それらに限定されるわけではないが、ジスルフィド、マレイミド、ハロアセチル、およびヒドラジド。その荷電またはプロ荷電置換基は、本明細書で記述される方法により導入することができる。例えば、スルホネートの電荷は、まず商業的に入手可能なハロエステル化合物をチオアセテートで処理してチオアセチル化合物を生成し、続いてそのチオアセチル基を過酸化水素を用いて酸化してスルホネート基にすることにより導入することができる。ホスフェートを含むクロスリンカーは、本明細書で記述される方法により合成することができる。まず、望まれる反応性の基、例えば、それらに限定されるわけではないが、チオール、マレイミド、ハロアセチルおよびヒドラジドを、図６〜１０において示した反応により導入し、続いてホスフェートエステルを加水分解してホスフェートを有する荷電したクロスリンカーを与える。正に荷電した第四級アミン置換基は、アミンのα，β−不飽和ケトンとの反応によりクロスリンカー中に導入することができる（例えば図１３および３７を参照）。あるいは、荷電したアミン置換基は、選択されたアミンまたは窒素を含む複素環を用いてハロゲンを置き換えることにより導入することができる。
【００２８】
[62]  好ましくは、そのクロスリンカーは下記の式（Ｉ）の化合物である：
【００２９】
【化５】
0006021963.tif 000006
【００３０】
ここで、Ｙ’は細胞結合剤との反応を可能にする官能基を表し；
Ｑはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エステル、エーテル、カルバメートまたはアミド結合を通した薬物の連結を可能にする官能基を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニル、陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３、またはフェニルであり、ここで：
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルであり、Ｘはフェニルまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルを表し；
ｌ、ｍおよびｎは０または１から４までの整数であり；
Ａはフェニルまたは置換されたフェニルであり、ここでその置換基は、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、または陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−
、ＣＯ２−、および陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、ここでＸは上記と同じ定義を有し、ここでｇは０または１であり；
Ｚは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、またはＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位であり、ここでＥ１およびＥ２は同じもしくは異なっており、それはＣ＝Ｏ、Ｏ、もしくはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニルであり；Ｐは２〜２０アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１もしくはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じもしくは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２では無いならば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり、またはｇが１である場合、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基である。
【００３１】
[63]  細胞結合剤との反応を可能にする官能基Ｙ’の例には、アミン反応性薬剤、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｍｉｄｅ）エステル類、ｐ−ニトロフェニルエステル類、ジニトロフェニルエステル類、ペンタフルオロフェニルエステル類；チオール反応性薬剤、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ピリジルジスルフィド類、ニトロピリジルジスルフィド類、マレイミド類、ハロアセテート類およびカルボン酸クロリド類が含まれる。
【００３２】
[64]  細胞毒性薬物の連結を可能にする官能基Ｑの例には、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エステル、カルバメート、またはアミド結合を通した連結を可能にする基が含まれる。その官能基には、チオール、ジスルフィド、アミノ、カルボキシ、アルデヒド類、マレイミド、ハロアセチル、ヒドラジン類、およびヒドロキシが含まれるが、それらに限定されない。
【００３３】
[65]  直鎖アルキル類の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが含まれる。３〜６個の炭素原子を有する分枝または環状アルキル類の例には、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれる。
【００３４】
[66]  ２〜６個の炭素原子を有する直鎖アルキル類の例には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルが含まれる。２〜６個の炭素原子を有する分枝または環状アルケニル類の例には、イソブテニル、イソペンテニル、２−メチル−１−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニルが含まれる。
【００３５】
[67]  ２〜６個の炭素原子を有する直鎖アルキニル類の例には、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルが含まれる。６個までの炭素原子を有する分枝または環状アルキニル類の例には、３−メチル−１−ブチニル、３−メチル−１−ペンチニル、４−メチル−２−ヘキシニルが含まれる。
【００３６】
[68]  好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネート、ホスフェートまたはトリアルキルアンモニウムから選択される荷電した置換基であり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、ＱおよびＹ’はそれぞれ独立してジスルフィド置換基、マレイミド、ハロアセチル基、またはＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。別のより好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｑはジスルフィド、マレイミドまたはハロアセチル部分であり、Ｙ’はマレイミド部分またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。さらにもっと好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｑはピリジルジチオまたはニトロピリジルジチオ基、マレイミドまたはハロアセチル部分であり、Ｙ’はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００３７】
[69]  式（Ｉ）の２−ジチオニトロピリジルおよび２−ジチオ−ジニトロピリジルを含むクロスリンカーの合成は、例えば図１、２において示されており、対応する式（Ｉ）の４−ジチオニトロピリジルおよび４−ジチオ−ジニトロピリジルを含むクロスリンカーの合成は、例えば図６において示されている。スルホネート基を有する式（Ｉ）のマレイミドを含む荷電したクロスリンカーの合成は、例えば図３、４および５において示されている。ホスフェート基を有する式（Ｉ）のマレイミドを含む荷電したクロスリンカーの合成は、例えば図９および１０において示されている。式（Ｉ）の第四級アミンを含む荷電したクロスリンカーの合成は、例えば図１３および１４において示されている。式（Ｉ）のポリエチレングリコールを含む荷電したクロスリンカーの合成は、例えば図１７〜２１において示されている。酸不安定性結合を通した連結を可能にするヒドラジド部分を有する式（Ｉ）の荷電したクロスリンカーの合成は、例えば図２４〜３６において示されている。
【００３８】
細胞結合剤薬物コンジュゲート
[70]  荷電またはプロ荷電クロスリンカーを用いて、高い数（＞６）の薬物分子を導入することができる。限定的で無い例において、図５７は、本発明の荷電したクロスリンカーを用いて調製された細胞結合剤−薬物コンジュゲートが高い効力を示すことを例証している。加えて、高い数の薬物分子の連結の後でさえもそのコンジュゲートは標的細胞に対して非常に効力が強いが非標的細胞に対しては遥かに効力が弱いため、その効力は標的選択的である（例えば図５８を参照）。図５９において例証されているように、質量スペクトル分析はその薬物が細胞結合剤に荷電したクロスリンカーを通して共有結合により連結されていることを示している。
【００３９】
[71]  本発明のコンジュゲートは次の式、ＣＢ−（−Ｌｃ−Ｄ）ｑにより表すことができ、ここでＣＢは細胞結合剤であり、Ｌｃは荷電またはプロ荷電リンカーであり、Ｄは薬物分子であり、ｑは１から２０までの整数である。
【００４０】
[72]  好ましくは、コンジュゲートは次の式（ＩＩ）を有する：
【００４１】
【化６】
0006021963.tif 000007
【００４２】
ここで、ＣＢは細胞結合剤を表し、
Ｄはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エステル、カルバメート、またはアミド結合により細胞結合剤に連結された薬物を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニル、陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３、またはフェニルであり、ここで：
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同じまたは異なっており、それはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝または環状アルキルであり、Ｘはフェニルまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキルを表し；
ｌ、ｍおよびｎは０または１から４までの整数であり；
Ａはフェニルまたは置換されたフェニルであり、ここでその置換基は、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、または３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、または陰イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−、陽イオン、例えば、それらに限定されるわけでは無いが、窒素を含む複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３から選択される荷電した置換基であり、ここでＸは上記と同じ定義を有し、ここでｇは０または１であり；
Ｚは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、またはＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位であり、ここでＥ１およびＥ２は同じもしくは異なっており、それはＣ＝Ｏ、Ｏ、もしくはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝もしくは環状アルキル、２個から６個までの炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルケニルもしくはアルキニルであり；Ｐは２〜２０アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１もしくはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じもしくは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０もしくは２から約１０００までの整数であり、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２では無いならば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり、またはｇが１である場合、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０の内の少なくとも１個は荷電した置換基であり；
Ｙはカルボニル、チオエーテル、アミド、ジスルフィド、またはヒドラゾン基を表し；ｑは１から２０までの整数を表す。
【００４３】
[73]  下記でより詳細に記述するように、その薬物は多くの小さい分子の薬物の内のいずれかであることができ、それにはマイタンシノイド類、ＣＣ−１０６５類似体、モルホリノ類（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ）、ドキソルビシン類、タキサン類（ｔａｘａｎｅｓ）、クリプトフィシン類（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｓ）、エポチロン類（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）、カリケアマイシン類（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、アウリスタチン類（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、およびピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）二量体類が含まれるがそれらに限定されない。
【００４４】
[74]  好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネート、ホスフェート、カルボキシレートまたはトリアルキルアンモニウムから選択
される荷電した置換基であり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｄはマイタンシノイド、ＣＣ−１０６５類似体またはピロロベンゾジアゼピン二量体である。別のより好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｄはジスルフィド、チオエステル、もしくはチオエーテル結合を通して連結されたマイタンシノイド、ＣＣ−１０６５類似体またはピロロベンゾジアゼピン二量体である。さらにもっと好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｑはマイタンシノイド、ＣＣ−１０６５類似体、またはタキサンである。
【００４５】
[75]  好ましい態様において、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位である場合、Ｅ１およびＥ２は同じまたは異なっており、それはＣ＝ＯまたはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝または環状アルキルであり、Ｐは２〜８アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１またはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ、好ましいアミノ酸残基はグリシン（ｇｌｙ）、アラニン（ａｌａ）、ロイシン（ｌｅｕ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、またはリシン（ｌｙｓ）であり、それはあらゆる組み合わせまたはあらゆる順序（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙまたはａｌａ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｌｅｕ等）で用いることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じまたは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０または２から約１０００までの整数である。
【００４６】
[76]  より好ましい態様において、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位である場合、Ｅ１およびＥ２は同じまたは異なっており、それはＣ＝ＯまたはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキルであり、Ｐは２〜５アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１またはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じまたは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０または２から２４までの整数である。
【００４７】
[77]  好ましくは、それぞれの細胞結合剤に結合している薬物の数であるｑは１〜２０、より好ましくは２〜１８、さらにもっと好ましくは２〜１６、最も好ましくは２〜１０である。
【００４８】
[78]  そのコンジュゲートを合成するため、その細胞結合剤を本発明のクロスリンカーを用いて修飾して反応性ジスルフィド基、マレイミド、ハロアセチルまたはヒドラジド基を導入することができる。ジスルフィド結合を通して連結された細胞結合剤−薬物コンジュゲートの合成は、修飾された細胞結合剤中のジスルフィド結合と遊離のチオール基を含む薬物の間のジスルフィド交換により成し遂げられる。チオエーテルを通して連結された細胞結合剤−薬物コンジュゲートの合成は、マレイミドまたはハロアセチルで修飾された細胞結合剤と遊離のチオール基を含む薬物の反応により成し遂げられる。酸不安定性ヒドラゾン結合を有するコンジュゲートの合成は、当分野で既知の方法（例えば、P. Hamann et al., BioConjugate Chem., 13; 40-46, 2002; B. Laguzza et al., J.Med. Chem., 32; 548-555, 1959; P. Trail et al., Cancer Res., 57; 100-105, 1997を参照）により、カルボニル基とリンカー中のヒドラジド部分の反応により成し遂げることができる。
【００４９】
[79]  あるいは、その薬物は本発明のクロスリンカーを用いて修飾して細胞結合剤と反
応することができる官能性を有する式（ＩＶ）の修飾された薬物を与えることができる。例えば、チオールを含む薬物は、マレイミド置換基を有する式（Ｉ）の荷電またはプロ荷電クロスリンカーと水性緩衝液中で中性ｐＨにおいて反応して、チオエーテル結合を通してその荷電したリンカーにつながった薬物を与えることができる。チオールを含む薬物は、ピリジルジチオ部分を有する荷電したリンカーとのジスルフィド交換を経て、ジスルフィド結合を通してその荷電したクロスリンカーに結合した修飾された薬物を与えることができる。ヒドロキシル基を有する薬物は、ハロゲンを有する荷電またはプロ荷電クロスリンカーと穏やかな塩基の存在下で反応してエーテル結合を有する修飾された薬物を与えることができる。ヒドロキシル基を含む薬物は、カルボキシル基を有する式（Ｉ）の荷電したクロスリンカーと脱水剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で縮合してエステル結合を与えることができる。アミノ基を含む薬物は、同様に式（Ｉ）の荷電またはプロ荷電クロスリンカー上のカルボキシル基との縮合を経てアミド結合を与えることができる。
【００５０】
[80]  そのコンジュゲートは、標準的な生化学的手段、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５もしくはＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００カラム上でのゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、およびイオン交換により、または透析により、以前に記述されたようにして精製されてよい。ある場合（例えば葉酸、メラニン細胞刺激ホルモン、ＥＧＦ等）では、その細胞結合剤−薬物コンジュゲートはクロマトグラフィーにより、例えばＨＰＬＣ、中圧カラムクロマトグラフィーまたはイオン交換により精製することができる。
【００５１】
修飾された細胞結合剤
[81]  本発明のクロスリンカーとの反応により修飾された細胞結合剤は好ましくは式（ＩＩＩ）により表され：
【００５２】
【化７】
0006021963.tif 000008
【００５３】
ここで、その置換基は荷電またはプロ荷電リンカーおよび細胞結合剤薬物コンジュゲートに関して上記で記述されたものである。
[82]  好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネート、ホスフェート、カルボキシルまたはトリアルキルアンモニウムから選択される荷電した置換基であり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｑはジスルフィド置換基、マレイミド、ハロアセチル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、Ｙはチオエーテル、アミド、またはジスルフィドである。別のより好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｑはジスルフィド、マレイミドまたはハロアセチル部分であり、Ｙはチオエーテル、アミド、またはジスルフィドである。さらにもっと好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｑはピリジルジチオまたはニトロピリジルジチオ基であり、Ｙはチオエーテル、アミド、またはジスルフィドである。
【００５４】
[83]  好ましい態様において、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位である場合、Ｅ１およびＥ２は同じまたは異なっており、それはＣ＝ＯまたはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝または環状アルキルであり、Ｐは２〜８アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１またはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ、好ましいアミノ酸残基はグリシン（ｇｌｙ）、アラニン（ａｌａ）、ロイシン（ｌｅｕ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、またはリシン（ｌｙｓ）であり、それはあらゆる組み合わせまたはあらゆる順序（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙまたはａｌａ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｌｅｕ等）で用いることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じまたは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０または２から約１０００までの整数である。
【００５５】
[84]  より好ましい態様において、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位である場合、Ｅ１およびＥ２は同じまたは異なっており、それはＣ＝ＯまたはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキルであり、Ｐは２〜５アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１またはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じまたは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０または２から２４までの整数である。
【００５６】
[85]  修飾された細胞結合剤は、細胞結合剤を当分野で他のクロスリンカーに関して既知の方法により荷電したクロスリンカーと反応させることにより調製することができる（米国特許第６，３４０，７０１  Ｂ１号、第５，８４６，５４５号、第５，５８５，４９９号、第５，４７５，０９２号、第５，４１４，０６４号、第５，２０８，０２０号、および第４，５６３，３０４号；R.V.J. Chari et al. Cancer Research 52, 127-131, 1992; R.V.J. Chari et al. Cancer Research 55, 4079-4084, 1995; J. Carlsson et al. 173 Biochem. J. (1978) 723-737(1978); Goff, D. A., Carroll, S. F. 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990); L. Delprino et al. 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993); S. Arpicco et al., 8 BioConjugate Chem 327-337 (1997)）。好都合なことに、そのクロスリンカー基は水溶性であり、または水溶液中で可溶性を維持するのにごく小さな百分率の有機溶媒しか必要としないため、その細胞結合剤とそのクロスリンカーの間の反応は水溶液中で実施することができる。そのクロスリンク試薬を、場合により水と混和性の少量（典型的には＜１０体積％）の極性有機溶媒、例えば様々なアルコール類、例えばメタノール、エタノール、およびプロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、またはジメチルスルホキシドを含む水性緩衝液中で高濃度で、例えば１〜１００ｍＭで溶解させ、次いで適切な分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）を細胞結合剤の緩衝された水溶液に添加する。適切な分割量は、細胞結合剤あたり１〜１０個のクロスリンク基、好ましくは１〜５個の基を導入する溶液の量であり、添加される体積は細胞結合剤溶液の体積の１０％、好ましくは５％、最も好ましくは０〜３％を超えるべきでは無い。細胞結合剤のための水溶液は、ｐＨ６〜９、好ましくは６．５〜７．５で緩衝されており、これらのｐＨ範囲に関して有用なあらゆる非求核性緩衝塩類を含むことができる。典型的な緩衝液にはホスフェート、トリエタノールアミンＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、およびＭＯＰＳ緩衝液が含まれ、それは追加の構成要素、例えばスクロースおよび塩類、例えばＮａＣｌを含むことができる。添加の後、反応を４℃から４０℃までの温度で、好ましくは周囲温度で保温する。反応の進行は、４９５ｎｍまたは別の適切な波長における吸収の増大を測定することにより監視することができる。反応が完了した後、修飾された細胞結合剤の単離を、型にはまった方法で、例えばゲル濾過クロマトグラフィーまたは吸着クロマトグラフィーを用いて行うこ
とができる。
【００５７】
[86]  修飾の程度は、放出されたニトロピリジン  チオン、ジニトロピリジン  ジチオン、カルボキサミドピリジン  ジチオンまたはジカルボキサミドピリジン  ジチオン基の吸収を測定することにより評価することができる。限定的で無い例において、図５６は細胞結合剤であるＣ２４２抗体の本発明のスルホネートクロスリンカーを用いた修飾の結果を示す。リンカー／抗体（Ｌ／Ａ）組み込みの時間経過を、例えば連結された薬物／抗体（Ｄ／Ａ）と共に示す。本明細書で記述される荷電またはプロ荷電クロスリンカーは、適切な置換基を有するあらゆる細胞結合剤と反応することができる様々な官能基を有する。例えば、アミノまたはヒドロキシル置換基を有する細胞結合剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを有するクロスリンカーと反応することができ、チオール置換基を有する細胞結合剤はマレイミドまたはハロアセチル基を有するクロスリンカーと反応することができる。加えて、カルボニル置換基を有する細胞結合剤はヒドラジドを有するクロスリンカーと反応することができる。当業者は、細胞結合剤上の利用可能な官能基の既知の反応性に基づいて、どのクロスリンカーを使用すべきかをすぐに決定することができる。
【００５８】
[87]  正電荷を有するクロスリンカー（例えば化合物２１４、図７１）は、場合により有機性共溶媒（例えば１〜２０％ジメチルアセトアミドまたはエタノール）を含むｐＨ５〜９の水性緩衝液中で細胞結合剤と直接反応して正電荷およびチオール基を有する修飾された細胞結合剤を与えることができる。その細胞結合剤のチオール基は、マレイミド、ハロアセトアミドまたは活性なジスルフィド（例えばピリジルジチオ、ニトロピリジルジチオ基）のいずれかを有する細胞毒性薬物と反応してコンジュゲートを与えることができる。そのコンジュゲートは上記の方法により精製することができる。
【００５９】
[88]  あるいは、正電荷および反応性エステルを有するクロスリンカー（例えば化合物２１６、図７１）を細胞結合剤と（例えば、そのリシンのアミノ基を通して）直接反応させて正電荷および活性なジスルフィドを導入することができる。上記のようなチオールを含む細胞毒性薬物との反応は、正電荷を有するコンジュゲートを与えることができる。
【００６０】
修飾された細胞毒性薬物
[89]  本発明のクロスリンカーとの反応により修飾された細胞毒性薬物は、好ましくは式（ＩＶ）により表され：
【００６１】
【化８】
0006021963.tif 000009
【００６２】
ここで、その置換基は荷電またはプロ荷電リンカーおよび細胞結合剤薬物コンジュゲートに関して上記で記述されたものである。
[90]  好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネート、ホスフェート、カルボキシルまたはトリアルキルアンモニウムから選択される荷電した置換基であり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１
であり、Ｙ’はジスルフィド置換基、マレイミド、ハロアセチル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。別のより好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｙ’はマレイミド部分またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。さらにもっと好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０の内の１個はスルホネートであり、残りはＨであり、ｌ、ｇおよびｍはそれぞれ０であり、ｎ＝１であり、Ｙ’はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００６３】
[91]  好ましい態様において、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位である場合、Ｅ１およびＥ２は同じまたは異なっており、それはＣ＝ＯまたはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３個から６個までの炭素原子を有する分枝または環状アルキルであり、Ｐは２〜８アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１またはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ、好ましいアミノ酸残基はグリシン（ｇｌｙ）、アラニン（ａｌａ）、ロイシン（ｌｅｕ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、またはリシン（ｌｙｓ）であり、それはあらゆる組み合わせまたはあらゆる順序（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙまたはａｌａ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｌｅｕ等）で用いることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じまたは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０または２から約１０００までの整数である。
【００６４】
[92]  より好ましい態様において、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２単位である場合、Ｅ１およびＥ２は同じまたは異なっており、それはＣ＝ＯまたはＮＲ１４であり、ここでＲ１４はＨまたは１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキルであり、Ｐは２〜５アミノ酸長のペプチド単位であり、ここでＥ１またはＥ２は末端の窒素、末端の炭素を通して、またはペプチドのアミノ酸の内の１つの側鎖を通してペプチドに連結されていることができ；ならびにＦ１およびＦ２は同じまたは異なっており、それは式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐの任意のポリエチレンオキシ単位であり、ここでｐは０または２から２４までの整数である。
【００６５】
[93]  その修飾された薬物は、その薬物を本発明のクロスリンカーと反応させて、細胞結合剤と反応することができる官能性を有する式（ＩＶ）の修飾された薬物を与えることにより調製することができる。例えば、チオールを含む薬物は、マレイミド置換基を有する式（Ｉ）の荷電またはプロ荷電クロスリンカーと水性緩衝液中で中性ｐＨにおいて反応して、チオエーテル結合を通してその荷電またはプロ荷電リンカーにつながった薬物を与えることができる。チオールを含む薬物は、ピリジルジチオ部分を有する荷電またはプロ荷電リンカーとのジスルフィド交換を経て、ジスルフィド結合を通してその荷電またはプロ荷電リンカーに結合した修飾された薬物を与えることができる。ヒドロキシル基を有する薬物は、ハロゲンを有する荷電したクロスリンカーと穏やかな塩基の存在下で反応してエーテル結合を有する修飾された薬物を与えることができる。ヒドロキシル基を含む薬物は、カルボキシル基を有する式（Ｉ）の荷電したクロスリンカーと脱水剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で縮合してエステル結合を与えることができる。アミノ基を含む薬物は、同様に式（Ｉ）の荷電またはプロ荷電クロスリンカー上のカルボキシル基との縮合を経てアミド結合を与えることができる。その修飾された薬物は、標準的な方法、例えばシリカゲルもしくはアルミナ上でのカラムクロマトグラフィー、結晶化、分取薄層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより精製することができる。
【００６６】
細胞結合剤
[94]  本発明のコンジュゲートおよび修飾された細胞結合剤を構成する細胞結合剤は、
現在既知である、または既知になったあらゆる種類のものであってよく、ペプチド類および非ペプチド類を含む。その細胞結合剤は、特異的または非特異的な方式のどちらかで細胞に結合することができるあらゆる化合物であってよい。一般に、これらは抗体（特にモノクローナル抗体および抗体断片）、ａｄｎｅｃｔｉｎ類（米国公開番号：２００７００８２３６５）、インターフェロン類、リンフォカイン類、ホルモン類、成長因子類、ビタミン類、栄養素輸送分子類（例えばトランスフェリン）、またはあらゆる他の細胞結合性の分子または物質であることができる。
【００６７】
[95]  細胞結合剤が抗体（例えば、マウス、ヒト、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）またはキメラまたは当業者に既知のあらゆる他の抗体）である場合、それは抗原に結合し、それはポリペプチドであり、膜貫通型分子（例えば受容体）またはリガンド、例えば成長因子であってよい。代表的な抗原には、例えば次の分子が含まれる：レニン；ヒトの成長ホルモンおよびウシの成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質類；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば因子ｖｍｃ、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒトの尿もしくは組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化の際に制御される、通常Ｔ細胞で発現され、分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物のタンパク質、例えばベータラクタマーゼ；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ、これにはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５が含まれる；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質類、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ｃｒｉｐｔｏ、アルファｖベータ６（ａｌｐｈａｖｂｅｔａ６）、インテグリン類、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、トランスフェリン（ｔａｒｎｓｆｅｒｒｉｎ）受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ���１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２または米国公開番号２００８０１７１０４０もしくは米国公開番号２００８０３０５０４４において開示されている１種類以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体、それらをそのまま援用する；エリスロポエチン；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭ
Ｐ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマ；コロニー刺激因子類（ＣＳＦｓ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン類（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばＨＩＶのエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン類（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｓ）；調節タンパク質；インテグリン類、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＥｐＣＡＭおよびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；ならびに上記で列挙したポリペプチドの内のいずれかの断片。
【００６８】
[96]  本発明に含まれる抗体に関する好ましい抗原には、次のものも含まれる：ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４６；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、およびアルファｖ／ベータ３インテグリン、それらのアルファまたはベータサブユニットのどちらかを含む（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；アルファインターフェロン（アルファ−ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デスレセプター；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ等。用いることができる好ましい抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ受容体（例えば、ＥｐｈＡ２受容体）、ＥｐｈＢ受容体、ＥＧＦｒ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）  メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、アルファｖベータ６、インテグリン類、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、葉酸受容体（例えば、ＦＯＬＲ１）、トランスフェリン受容体、ＧＤ３、ＥｐＣＡＭに対する抗体、または米国公開番号２００８０１７１０４０もしくは米国公開番号２００８０３０５０４４において開示されている１種類以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体であり、それらをそのまま援用する。
【００６９】
[97]  用いることができる細胞結合剤の追加の例には次のものが含まれる：
−表面再構成抗体（米国特許第５，６３９，６４１号）；
−次のものから選択されるが、それらに限定されない、ヒト化、または完全なヒトの抗体：ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ｈｕＮ９０１、ＤＳ６、ＣＤ３８、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＮＴＯ  ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、およびリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（例えば米国特許第５，６３９，６４１号、第５，６６５，３５７号；および第７，３４２，１１０号、米国仮特許出願第６０／４２４，３３２号、国際特許出願ＷＯ  ０２／１６，４０１、米国特許公開番号２００６００４５８７７、米国特許公開番号２００６０１２７４０７、米国特許公開番号２００５０１１８１８３、Pedersen et al., (1994) J. Mol. Biol. 235, 959-973、Roguska et al., (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, 969-973、上記、Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001)、Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995)、Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994)、およびMaloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)を参照）；ならびに
−抗体のエピトープ結合断片、例えばｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２（Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960)）。
【００７０】
追加の細胞結合剤には、次のものにより例示される他の細胞結合タンパク質およびポリペプチドが含まれるが、それらに限定されない：
−アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ類；Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281, 46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268）または例えば米国特許公開番号２００７０２３８６６７；米国特許第７，１０１，６７５号；およびＷＯ／２００７／１４７２１３；ＷＯ／２００７／０６２４６６）において記述されているアンキリン様リピートタンパク質もしくは合成ペプチド；
−インターフェロン類（例えばα、β、γ）；
−リンフォカイン類、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
−ホルモン類、例えばインスリン、ＴＲＨ（サイロトロピン放出ホルモン類）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン類、例えばアンドロゲン類およびエストロゲン類；
−ビタミン類、例えば葉酸；
−成長因子類およびコロニー刺激因子類、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)）；ならびに
−トランスフェリン（O’Keefe et al, J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)）。
【００７１】
[98]  モノクローナル抗体の技法は、モノクローナル抗体の形の特異的な細胞結合剤の生産を可能にする。当分野で特によく知られているものは、マウス、ラット、ハムスターまたはいずれかの他の哺乳類を、興味のある抗原、例えば完全な標的細胞、標的細胞から単離した抗原、ウイルス全体、弱毒化したウイルス全体、およびウイルスタンパク質、例えばウイルスのコートタンパク質を用いて免疫することにより産生されるモノクローナル抗体を作るための技法である。感作したヒト細胞を用いることもできる。モノクローナル抗体を作る別の方法は、ｓＦｖ（単鎖可変領域）、特にヒトのｓＦｖのファージライブラリーの使用である（例えばＧｒｉｆｆｉｔｈｓら、米国特許第５，８８５，７９３号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ  ９２／０１０４７；およびＬｉｍｉｎｇら、ＷＯ  ９９／０６５８７を参照）。
【００７２】
[99]  適切な細胞結合剤の選択は、標的とする個々の細胞集団に依存する選択の問題であるが、一般には、適切なものが利用できるならば、モノクローナル抗体およびそのエピトープ結合断片が好まれる。
【００７３】
[100]  例えば、モノクローナル抗体Ｍｙ９は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上で見
つかったＣＤ３３抗原に特異的なマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Roy et al. Blood 77:2404-2412 (1991)）、ＡＭＬの患者を処置するのに用いることができる。同様に、モノクローナル抗体抗Ｂ４はマウスＩｇＧ１であり、それはＢ細胞上のＣＤ１９抗原に結合し（Nadler et al, J. Immunol. 131:244-250 (1983)）、標的細胞がＢ細胞、または非ホジキンリンパ腫もしくは慢性リンパ芽球性白血病におけるようなこの抗原を発現する罹病細胞である場合に用いることができる。同様に、抗体Ｎ９０１は、小細胞肺癌腫細胞上で、および神経内分泌由来の他の腫瘍の細胞上で見つかったＣＤ５６に結合するマウスのモノクローナルＩｇＧ１抗体であり（Roy et al. J. Nat. Cancer Inst. 88:1136-1145 (1996)）
、Ｃ２４２抗体はＣａｎＡｇ抗原に結合し、ペルツズマブ、トラスツズマブはＨＥＲ２／ｎｅｕに結合し、抗ＥＧＦ受容体抗体である。
【００７４】
[101]  加えて、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病からの罹病細
胞に対する細胞結合剤として用いることができる。活性化されたＴ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶の予防に、移植片対宿主疾患の療法および予防に、ならびに急性Ｔ細胞
白血病の処置に用いることができる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは、メラノーマの処置に用いることができる。卵巣癌および他の癌で発現している葉酸受容体を標的とする葉酸も適切な細胞結合剤である。
【００７５】
[102]  乳房および精巣の癌は、それぞれエストロゲン（またはエストロゲン類似体）
またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）を細胞結合剤として用いてうまく標的とすることができる。
【００７６】
薬物
[103]  本発明において用いることができる薬物には、化学療法薬が含まれる。“化学
療法薬”は、癌の処置において有用な化合物である。化学療法薬の例には次のものが含まれる：アルキル化剤、例えばチオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）およびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、インプロスルファン（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ）およびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；アジリジン類（ａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ）、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン類およびメチルアメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む；アセトゲニン類（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（合成類似体であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン類（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｓ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（その合成類似体であるＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む））；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード類、例えばクロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えばエネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質（例えばカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特に、カリケアマイシンガンマ１およびカリケアマイシンシータＩ、例えばAngew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)を参照；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシンＡを含む；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびに、ネオカルジノスタチンクロモフォア（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）および関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質クロ
モモフォア類）、アクラシノマイシン類（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン類（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）；クロモマイシン類（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｓ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、ナイトマイシン類（ｎｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン類（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；マイタンシノイド類、例えばマイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびアンサミトシン類（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）、（特にＴ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎ
ｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類（ｔａｘｏｉｄｓ）、例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）(ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）
、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、フランス、アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；アミノプテリン；ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩類、酸類、または誘導体。腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば次のものもこの定義に含まれる：例えばタモキシフェン、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）（ファレストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ））を含む抗エストロゲン薬；ならびに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、およびゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）；ｓｉＲＮＡならびに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩類、酸類、または誘導体。本発明と共に用いることができる他の化学療法薬が、米国公開番号２００８０１７１０４０または米国公開番号２００８０３０５０４４において開示されており、それらをそのまま援用する。
【００７７】
[104]  好ましい態様において、化学療法薬は本質的に小さい分子の薬物である。“小
さい分子の薬物”は、本明細書において、例えば１００〜１５００、より適切には１２０から１２００まで、好ましくは２００から１０００までの分子量を有していてよい、および典型的には約１０００未満の分子量を有する有機、無機、または有機金属化合物を指して広く用いられる。本発明の小さい分子の薬物は、約１０００未満の分子量を有するオリゴペプチドおよび他の生体分子を含む。小さい分子の薬物は当分野において、例えばとりわけＷＯ０５０５８３６７Ａ２、欧州特許出願第８５９０１４９５号および第８５９０３１９号において、ならびに米国特許第４，９５６，３０３号においてよく特性付けされており、それらをそのまま援用する。
【００７８】
[105]  好ましい小さい分子の薬物は、細胞結合剤への連結を可能にする小さい分子の
薬物である。本発明には、既知の薬物および既知になる可能性がある薬物が含まれる。特に好ましい小さい分子の薬物には細胞毒性薬剤が含まれる。
【００７９】
[106]  その細胞毒性薬剤は、結果として細胞の死をもたらす、または細胞死を誘導す
る、またはある方式で細胞の生存度を減少させるあらゆる化合物であってよく、ここでそれぞれの細胞毒性薬剤はチオール部分を含む。
【００８０】
[107]  好ましい細胞毒性薬剤はマイタンシノイド化合物、タキサン化合物、ＣＣ−１
０６５化合物、ダウノルビシン化合物およびドキソルビシン化合物、ピロロベンゾジアゼピン二量体類、カリケアマイシン類である。アウリスタチン類ならびにその類似体および誘導体、そのいくつかを下記で記述する。
【００８１】
[108]  必ずしも小さい分子では無い他の細胞毒性薬剤、例えばｓｉＲＮＡも、本発明
の範囲内に含まれる。例えば、ｓｉＲＮＡ類は本発明のクロスリンカーに、オリゴヌクレオチド類の修飾に関して一般的に用いられる方法により連結させることができる（例えば、米国特許公開２００５０１０７３２５および２００７０２１３２９２を参照）。従って、その３’または５’−ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｍｉｄｉｔｅ）の形のｓｉＲＮＡはヒドロキシル官能性を有するクロスリンカーの１つの末端と反応してｓｉＲＮＡとクロスリンカーの間にエステル結合を与える。同様に、ｓｉＲＮＡホスホラミダイトと末端アミノ基を有するクロスリンカーの反応は、結果としてそのクロスリンカーのｓｉＲＮＡへのアミンを通した連結をもたらす。ｓｉＲＮＡは米国特許公開番号：２００７０２７５４６５、２００７０２１３２９２、２００７０１８５０５０、２００７０１６１５９５、２００７００５４２７９、２００６０２８７２６０、２００６００３５２５４、２００６０００８８２２、２００５０２８８２４４、２００５０１７６６６７において詳細に記述されており、それらをそのまま本明細書に援用する。
【００８２】
マイタンシノイド類
[109]  本発明において用いることができるマイタンシノイド類は当分野で周知であり
、既知の方法に従って天然の源から単離する、または既知の方法に従って合成により調製することができる。
【００８３】
[110]  適切なマイタンシノイド類の例には、マイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎ
ｏｌ）およびマイタンシノール類似体が含まれる。適切なマイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香環を有するマイタンシノール類似体および他の位置に修飾を有するマイタンシノール類似体が含まれる。
【００８４】
[111]  修飾された芳香環を有するマイタンシノールの適切な類似体の具体的な例には
次のものが含まれる：
（１）Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２のＬＡＨ還元により調製される）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−脱メチル）＋／−Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いる脱メチルまたはＬＡＨを用いる脱塩素により調製される）；および
（３）Ｃ−２０−脱メトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−脱クロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシルクロリド類を用いるアシル化により調製される）。
【００８５】
[112]  他の位置の修飾を有するマイタンシノールの適切な類似体の具体的な例には次
のものが含まれる：
（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（マイタンシノールのＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により調製される）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（脱メトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製される）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ス
トレプトマイセスによるマイタンシノールの変換により調製される）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（トレビア・ヌーディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離された）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−脱メチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの脱メチルにより調製される）；
（７）４，５−脱オキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（マイタンシノールの３塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）。
【００８６】
[113]  本発明において有用なチオールを含むマイタンシノイド類の合成は、米国特許
第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および米国特許出願番号２００４０２３５８４０において完全に開示されている。
【００８７】
[114]  Ｃ−３位、Ｃ−１４位、Ｃ−１５位またはＣ−２０位においてチオール部分を
有するマイタンシノイド類は、全て有用であると予想される。Ｃ−３位が好ましく、マイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。Ｎ−メチル−アラニンを含むＣ−３チオール部分マイタンシノイド、およびＮ−メチル−システインを含むＣ−３チオール部分マイタンシノイド、ならびにそれぞれの類似体も好ましい。
【００８８】
[115]  本発明において有用なＮ−メチル−アラニンを含むＣ−３チオール部分マイタ
ンシノイド誘導体の具体的な例は、式Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ６およびＭ７により表される。
【００８９】
【化９】
0006021963.tif 000010
【００９０】
ここで：
ｌは１から１０までの整数であり；および
ｍａｙはマイタンシノイドである。
【００９１】
【化１０】
0006021963.tif 000011
【００９２】
ここで：
Ｒ１およびＲ２はＨ、ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３であり、同じまたは異なっていてよく；
ｍは０、１、２または３であり；ならびに
ｍａｙはマイタンシノイドである。
【００９３】
【化１１】
0006021963.tif 000012
【００９４】
ここで：
ｎは３から８までの整数であり；および
ｍａｙはマイタンシノイドである。
【００９５】
【化１２】
0006021963.tif 000013
【００９６】
ここで：
ｌは１、２または３であり；
Ｙ０はＣｌまたはＨであり；および
Ｘ３はＨまたはＣＨ３である。
【００９７】
【化１３】
0006021963.tif 000014
【００９８】
ここで：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はＨ、ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３であり、同じまたは異なっていてよく；
ｍは０、１、２または３であり；および
ｍａｙはマイタンシノイドである。
【００９９】
[116]  本発明において有用なＮ−メチル−システインを含むＣ−３チオール部分マイ
タンシノイド誘導体の具体的な例は、式Ｍ４およびＭ５により表される。
【０１００】
【化１４】
0006021963.tif 000015
【０１０１】
ここで：
ｏは１、２または３であり；
ｐは０〜１０の整数であり；および
ｍａｙはマイタンシノイドである。
【０１０２】
【化１５】
0006021963.tif 000016
【０１０３】
ここで：
ｏは１、２または３であり；
ｑは０から１０までの整数であり；
Ｙ０はＣｌまたはＨであり；および
Ｘ３はＨまたはＣＨ３である。
【０１０４】
好ましいマイタンシノイド類は、米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第６，３３３，４１０号；第６，４４１，１６３号；第６，７１６，８２１号；第ＲＥ３９，１５１号および第７，２７６，４９７号において記述されているマイタンシノイド類である。
【０１０５】
タキサン類
[117]  本発明に従う細胞毒性薬剤はタキサンであってもよい。
[118]  本発明において用いることができるタキサン類は、チオール部分を含むように
修飾されている。本発明において有用ないくつかのタキサン類は、下記に示した式Ｔ１を有する：
【０１０６】
【化１６】
0006021963.tif 000017
【０１０７】
[119]  これらの新規のタキサン類の４種類の態様を下記で記述する。
[120]  態様（１）、（２）、（３）、および（４）において、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ
１’’は同じまたは異なっており、それらはＨ、電子求引基、例えばＦ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃｌ、ＣＨＦ２、もしくはＣＦ３または電子供与基、例えば−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＲ７Ｒ８、−ＯＲ９であり、ここでＲ７およびＲ８は同じまたは異なっており、それらは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルキル基または１〜１０個の炭素原子を有する単純な、もしくは置換されたアリールである。好ましくは、Ｒ７およびＲ８に関する炭素原子の数は１〜４である。また、好ましくはＲ７およびＲ８は同じである。好ましい−ＮＲ７Ｒ８基の例には、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、およびジブチルアミノが含まれ、ここでそのブチル部分は第一級、第二級、第三級またはイソブチルのいずれかである。Ｒ９は１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルキルである。
【０１０８】
[121]  Ｒ１は好ましくはＯＣＨ３、Ｆ、ＮＯ２、またはＣＦ３である。
[122]  また、好ましくは、Ｒ１はメタ位にあり、Ｒ１’およびＲ１’’はＨまたはＯ
ＣＨ３である。
【０１０９】
[123]  態様（１）、（２）および（４）におけるＲ２は、Ｈ、１個から１０個までの
炭素原子を有する複素環式、直鎖、分枝、もしくは環状エステルまたは１個から１０個までの炭素原子を有する複素環式、直鎖、分枝、もしくは環状エーテルまたは式−ＣＯＮＲ１０Ｒ１１のカルバメートであり、ここでＲ１０およびＲ１１は同じまたは異なっており、それらはＨ、１個から６個までの炭素原子を有する直鎖アルキル、３〜１０個の原子を有する分枝もしくは環状アルキル、または６〜１０個の炭素原子を有する単純な、もしくは置換されたアリールである。エステル類に関して、好ましい例には−ＣＯＣＨ２ＣＨ３および−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３が含まれる。エーテル類に関して、好ましい例には−ＣＨ２ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３が含まれる。カルバメート類に関して、好ましい例には−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＯ−モルホリノ、−ＣＯ−ピペラジノ、−ＣＯ−ピペリジノ、または−ＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノが含まれる。
【０１１０】
[124]  態様（３）におけるＲ２はチオールを含む部分である。
[125]  態様（１）、（３）および（４）におけるＲ３はアリールであり、または１〜
１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝もしくは環状アルキルであり、好ましくは−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である。
【０１１１】
[126]  態様（２）におけるＲ３は−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２である。
[127]  ４種類全ての態様におけるＲ４は−ＯＣ（ＣＨ３）３または−Ｃ６Ｈ５である
。
【０１１２】
[128]  態様（１）および（２）におけるＲ５はチオールを含む部分であり、Ｒ６は上
記の態様（１）、（２）および（４）に関するＲ２に関するものと同じ定義を有する。
[129]  態様（３）におけるＲ５およびＲ６は同じまたは異なっており、上記の態様（
１）、（２）および（４）に関するＲ２に関するものと同じ定義を有する。
【０１１３】
[130]  態様（４）におけるＲ５は上記の態様（１）、（２）および（４）に関するＲ
２に関するものと同じ定義を有し、Ｒ６はチオール部分である。
[131]  チオールを含む部分の導入に好ましい位置はＲ２およびＲ５であり、Ｒ２が最
も好ましい。
【０１１４】
[132]  そのチオール部分を有する側鎖は直鎖または分枝、芳香族または複素環式であ
ることができる。当業者は適切な側鎖をすぐに同定することができる。チオール部分の具体的な例には次のものが含まれる：−（ＣＨ２）ｎＳＨ、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＣＨ３）ＳＨ、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＣＨ３）ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣ（ＣＨ３）２ＳＨ、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣ（ＣＨ３）２ＳＨ、−ＣＯＮＲ１２（ＣＨ２）ｎＳＨ、−ＣＯＮＲ１２（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＣＨ３）ＳＨ、または−ＣＯＮＲ１２（ＣＨ２）ｎＣ（ＣＨ３）２ＳＨ、−ＣＯ−モルホリノ−ＸＳＨ、−ＣＯ−ピペラジノ−ＸＳＨ、−ＣＯ−ピペリジノ−ＸＳＨ、および−ＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノ−ＸＳＨ、ここで
Ｘは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたは分枝アルキルである。
【０１１５】
Ｒ１２は１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、分枝アルキルもしくは環状アルキル、または１個から１０個までの炭素原子を有する単純な、もしくは置換されたアリールまたは複素環式であり、Ｈであることができ、
ｎは０〜１０の整数である。
【０１１６】
[133]  直鎖アルキル類の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよ
びヘキシルが含まれる。
[134]  分枝アルキル類の例には、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ．−ブチル、ｔ
ｅｒｔ．−ブチル、イソペンチルおよび１−エチル−プロピルが含まれる。
【０１１７】
[135]  環状アルキル類の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルお
よびシクロヘキシルが含まれる。
[136]  単純なアリール類の例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【０１１８】
[137]  置換されたアリール類の例には、アルキル基で置換された、ハロゲン類、例え
ばＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、カルボン酸基、ヒドロキシ基またはアルコキシ基で置換された、上記で記述したアリール類のようなアリール類が含まれる。
【０１１９】
[138]  複素環式化合物の例は、複素原子がＯ、Ｎ、およびＳから選択される化合物で
あり、それはモルホリノ、ピペリジノ、ピペラジノ、Ｎ−メチルピペラジノ、ピロリル（ｐｙｒｒｏｌｌｙｌ）、ピリジル、フリルおよびチオフェンを含む。
【０１２０】
[139]  チオール部分を有するタキサン類は、既知の方法に従って合成することができ
る。その合成のための出発物質は、商業的に入手可能である１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０−ｄｅａｃｅｔｙｌｂａｃｃａｔｉｎ  ＩＩＩ）である。様々な置換基を導
入するための化学がいくつかの刊行物において記述されている（Ojima et al, J. Med. Chem. 39:3889-3896 (1996); Ojima et al., J. Med. Chem. 40:267-278 (1997); Ojima et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96:4256-4261 (1999);米国特許第５，４７５，０１１
号および米国特許第５，８１１，４５２号）。
【０１２１】
[140]  フェニル環上の置換基Ｒ１およびその置換基Ｒ１の位置は、望まれる毒性の化
合物が得られるまで変更することができる。さらに、そのフェニル環上の置換の程度は、望まれる毒性を達成するために変更することができる。すなわち、そのフェニル環は、望まれる毒性を得るための別の手段を提供する１個以上の置換基（例えば、フェニル環のモノ−、ジ−、またはトリ−置換）を有することができる。当業者はＲ１に関する適切な化学的部分およびＲ１に関する適切な位置を、型にはまった実験のみを用いて決定することができる。
【０１２２】
[141]  例えば、メタ位にある電子吸引基は細胞毒性の効力を増大させ、一方でパラ位
における置換は親であるタキサンと比較してその効力を増大させるとは予想されない。典型的には、異なる位置（オルト、メタおよびパラ）に置換基を有する少数の代表的なタキサン類が最初に調製され、インビトロでの細胞毒性に関して評価されるであろう。
【０１２３】
[142]  そのチオール部分は、ヒドロキシル基が既に存在する位置の内の１箇所におい
て導入することができる。様々なヒドロキシル基を保護する一方で望まれる１個を反応させる化学は、以前に記述されている（例えば上記で引用した参考文献を参照）。その置換基は、単に遊離のヒドロキシル基をジスルフィドを含むエーテル、ジスルフィドを含むエステル、またはジスルフィドを含むカルバメートに変換することにより導入される。この変換は下記のようにして達成される。望まれるヒドロキシル基を、上記のOjima et al. (1999)において記述されたように、テトラヒドロフラン中での−４０℃における商業的に
入手できる試薬であるヘキサメチルジシラザンリチウム（１．２当量）を用いる処理により脱プロトン化する。次いで、得られたアルコキシド陰イオンを過剰量のジハロ化合物、例えばジブロモエタンと反応させてハロエーテルを得る。そのハロゲンのチオールによる置換（チオ酢酸カリウムとの反応および穏やかな塩基またはヒドロキシルアミンを用いる処理による）は、望まれるチオールを含むタキサンを与えるであろう。
【０１２４】
[143]  あるいは、望まれるヒドロキシル基をアシルハライド、例えば３−ブロモプロ
ピオニルクロリドとの反応により直接エステル化してブロモエステルを得ることができる。チオ酢酸カリウムを用いた処理および上記のようなさらなる処理によるそのブロモ基の置換は、チオールを含むタキサンエステルを与えるであろう。好ましいタキソイド類は、米国特許第６，３４０，７０１号；第６，３７２，７３８号；第６，４３６，９３１号；第６，５９６，７５７号；第６，７０６，７０８号；第７，００８，９４２号；第７，２１７，８１９号および第７，２７６，４９９号において記述されているタキソイド類である。
【０１２５】
ＣＣ−１０６５類似体
[144]  本発明に従う細胞毒性薬剤はＣＣ−１０６５類似体であってもよい。
[145]  本発明によると、ＣＣ−１０６５類似体はＡサブユニットおよびＢまたはＢ−
Ｃサブユニットを含む。Ａサブユニットは、その天然の閉環したシクロプロピル型である、もしくはその開環したクロロメチル型であるＣＰＩ（シクロプロパピロロインドール単位）であり、または閉環したシクロプロピル型もしくは開環したクロロメチル型の、密接に関連したＣＢＩ単位（シクロプロピルベンゾインドール単位）である。ＣＣ−１０６５類似体のＢおよびＣサブユニットは非常に類似しており、それらは２−カルボキシ−インドールおよび２−カルボキシ−ベンゾフラン誘導体である。活性のために、ＣＣ−１０６５の類似体は少なくとも１個のその２−カルボキシ−インドールサブユニットまたは２−
カルボキシ−ベンゾフランサブユニットを必要とするが、２個のサブユニット（すなわちＢ−Ｃ）はその類似体をより強力なものにする。天然のＣＣ−１０６５から、および公表された類似体（例えば、Warpehoski et al, J. Med. Chem. 31:590-603 (1988), D. Boger et al., J. Org. Chem; 66; 6654-6661, 2001;米国特許第５，７３９，３５０号；第６，０６０，６０８号；第６，３１０，２０９号）から明らかであるように、ＢおよびＣサブユニットは、インドールまたはベンゾフラン環上の異なる位置に異なる置換基を有することもできる。
【０１２６】
[146]  チオール部分を含むＣＣ−１０６５類似体は、Ａサブユニットのピロール部分
の第２級アミノ基からのアミド結合を通して式Ｆ−１のＢサブユニットまたは式Ｆ−３もしくはＦ−７のＢ−ＣサブユニットのどちらかのＣ−２カルボキシ基に共有結合により連結された次の式Ａ−１｛ＣＰＩ（シクロプロピル型）｝、Ａ−２｛ＣＰＩ（クロロメチル型）｝、Ａ−３｛ＣＢＩ（シクロプロピル型）｝、およびＡ−４｛ＣＢＩ（クロロメチル型）｝のＡサブユニットの内のいずれかであることができる。
【０１２７】
Ａサブユニット
【０１２８】
【化１７】
0006021963.tif 000018
【０１２９】
【化１８】
0006021963.tif 000019
【０１３０】
Ｂならびに共有結合したＢおよびＣサブユニット
【０１３１】
【化１９】
0006021963.tif 000020
【０１３２】
【化２０】
0006021963.tif 000021
【０１３３】
ここで、それぞれのＷ１およびＷ２は同じまたは異なっていてよく、ＯまたはＮＨであってよく；ならびに
ここで、式Ｆ−１においてＲ４はチオール部分であり、式Ｆ−３においてＲまたはＲ４の一方はチオール部分であり、式Ｆ−７においてＲ’またはＲ４の一方はチオールを含む部分であり；ＲまたはＲ’がチオール部分である場合、同じまたは異なっていてよいＲ１〜Ｒ６は水素、Ｃ１〜Ｃ３直鎖アルキル、メトキシ、ヒドロキシル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、またはアミドであり；Ｒ４がチオール部分である場合、同じまたは異なっていてよいＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素、Ｃ１〜Ｃ３直鎖アルキル、メトキシ、ヒドロキシル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、またはアミドであり、Ｒ’はＮＨ２、アルキル、Ｏ−アルキル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、またはアミドである。加えて、Ａ−２およびＡ−４サブユニット中の塩素原子は別の適切なハロゲンで置き換えることができる。
【０１３４】
[147]  好ましい態様において、ＲおよびＲ’はチオール部分であり、Ｒ１およびＲ２
はそれぞれ水素である。別の好ましい態様において、ＲおよびＲ’はチオール部分であり、Ｒ１〜Ｒ６はそれぞれ水素である。
【０１３５】
[148]  特に好ましい態様において、ＲまたはＲ４は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｌＳＨ、−
ＮＨＣＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）ｌＳＨ、または−Ｏ（ＣＨ２）ｌＳＨであり、Ｒ’は−（ＣＨ２）ｌＳＨ、−ＮＨ（ＣＨ２）ｌＳＨまたは−Ｏ（ＣＨ２）ｌＳＨであり、ここでｌは１〜１０の整数である。
【０１３６】
[149]  第一級アミンの例には、メチルアミン、エチルアミンおよびイソプロピルアミ
ンが含まれる。
[150]  第二級アミンの例には、ジメチルアミン、ジエチルアミンおよびエチルプロピ
ルアミンが含まれる。
【０１３７】
[151]  第三級アミンの例には、トリメチルアミン、トリエチルアミン、およびエチル
−イソプロピル−メチルアミンが含まれる。
[152]  アミド基の例には、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチル−プロピオンアミド
、Ｎ−アセトアミド、およびＮ−プロピオンアミドが含まれる。
【０１３８】
[153]  Ｒ’により表されるアルキルの例には、Ｒ’が連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒ
ｏｕｐ）では無い場合、Ｃ１〜Ｃ５直鎖または分枝アルキルが含まれる。
[154]  Ｒ’により表されるＯ−アルキルの例には、Ｒ’が連結基では無い場合、アル
キル部分がＣ１〜Ｃ５直鎖または分枝アルキルである化合物が含まれる。
【０１３９】
[155]  上記のＣＣ−１０６５類似体は天然の源から単離することができ、それに続く
修飾を含むそれらの調製、合成での調製、または両方の組み合わせに関する方法は、十分
に記述されている（例えば米国特許第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号および第５，８４６，５４５号を参照）。好ましいＣＣ−１０６５類似体は、米国特許第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；第５，８４６，５４５号；６，５３４，６６０号；第６，５８６，６１８号；第６，７５６，３９７号および第７，０４９，３１６号において記述されているＣＣ−１０６５類似体である。
【０１４０】
ダウノルビシン／ドキソルビシン類似体
[156]  本発明に従う細胞毒性薬剤は、ダウノルビシン類似体またはドキソルビシン類
似体であってもよい。
【０１４１】
[157]  本発明のダウノルビシンおよびドキソルビシン類似体は、チオール部分を含む
ように修飾されていることができる。
[158]  本発明において有用な修飾されたドキソルビシン／ダウノルビシン類似体は、
下記に示した式Ｄ１を有する：
【０１４２】
【化２１】
0006021963.tif 000022
【０１４３】
ここで、
ＸはＨまたはＯＨであり；
ＹはＯまたはＮＲ２であり、ここでＲ２は１〜５個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルであり；
Ｒはチオール部分、Ｈ、または１〜５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝アルキルであり；および
Ｒ’はチオール部分、Ｈ、または−ＯＲ１であり、ここでＲ１は１〜５個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルであり；
ＲおよびＲ’は同時にチオール部分では無いという条件がある。
【０１４４】
[159]  好ましい態様において、ＮＲ２はＮＣＨ３である。別の好ましい態様において
、Ｒ’は−Ｏである。
[160]  特に好ましい態様において、チオール部分は−（ＣＨ２）ｎＳＨ、−Ｏ（ＣＨ
２）ｎＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＣＨ３）ＳＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＣＨ３）ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎＣ（ＣＨ３）２ＳＨ、または−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（ＣＨ３）２ＳＨであり、ここでｎは０〜１０の整数である。
【０１４５】
[161]  Ｒ、Ｒ１およびＲ２により表される、１〜５個の炭素原子を有する直鎖もしく
は分枝アルキルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、
イソブチル、ｓｅｃ．−ブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、およびその８種類の異性体の配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）のいずれかであるペンチルが含まれる。
【０１４６】
[162]  Ｒ１およびＲ２は好ましくはメチルである。
[163]  直鎖アルキル類の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよ
びヘキシルが含まれる。
【０１４７】
[164]  分枝アルキル類の例には、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ．−ブチル、ｔ
ｅｒｔ．−ブチル、イソペンチルおよび１−エチル−プロピルが含まれる。
[165]  ＲまたはＲ’のどちらも連結基ではない場合、その位置にある置換基は、望ま
れる毒性の化合物が得られるまで変更することができる。高い毒性は、７２時間の曝露時間の際に１×１０−１２〜１×１０−９Ｍの範囲の培養された癌細胞に対するＩＣ５０を有するものと定義される。置換基の代表的な例は、Ｈ、上記のようなアルキル、およびＯ−アルキルである。当業者は、ＲおよびＲ’に関する適切な化学的部分を、型にはまった実験のみを用いて決定することができる。
【０１４８】
[166]  例えば、メチルおよびメトキシ置換基は細胞毒性の効力を増大させると予想さ
れ、一方で水素は親であるダウノルビシンと比較してその効力を増大させるとは予想されず、様々な位置に置換基を有する類似体が最初に調製され、インビトロでの細胞毒性に関して評価されるであろう。
【０１４９】
[167]  チオール部分を有する本発明の修飾されたドキソルビシン／ダウノルビシン類
似体は、ＷＯ  ０１／３８３１８において記述されている。その修飾されたドキソルビシン／ダウノルビシン類似体は、既知の方法に従って合成することができる（例えば米国特許第５，１４６，０６４号参照）。
【０１５０】
[168]  アウリスタチンはアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリ
スタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含み、それらは米国特許第５，６３５，４８３号、Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3, No. 8, pp. 921-932 (2004); U.S. Application Number 11/134826、米国特許公開番号２００６００７４００８、２００６０２２９２５において記述されている。
【０１５１】
[169]  本発明に従う細胞毒性薬剤には、当分野で既知であるピロロベンゾジアゼピン
二量体類が含まれる（米国特許第７，０４９，３１１号；第７，０６７，５１１号；第６，９５１，８５３号；第７，１８９，７１０号；第６，８８４，７９９号；第６，６６０，８５６号。
【０１５２】
類似体および誘導体
[170]  細胞毒性薬剤の当業者は、本明細書で記述された細胞毒性薬剤のそれぞれを、
結果として得られる化合物が出発化合物の特異性および／または活性をなお維持しているような方式で修飾することができることをすぐに理解するであろう。当業者は、これらの化合物の多くを本明細書で記述された細胞毒性薬剤の代わりに用いることができることも理解するであろう。従って、本発明の細胞毒性薬剤には本明細書で記述された化合物の類似体および誘導体が含まれる。
【０１５３】
療法的使用
[171]  この発明の細胞結合剤薬物コンジュゲート（例えば免疫コンジュゲート類）は
、他の化学療法薬との組み合わせで用いることもできる。その化学療法薬は、上記で列挙されている、または米国特許第７，３０３，７４９号において記述されている。
【０１５４】
[172]  本発明の細胞結合剤薬物コンジュゲート（例えば免疫コンジュゲート類）は、
患者を処置するために、および／または選択された細胞集団の増殖を調節するために、インビトロ、インビボおよび／またはエキソビボで投与することができ、それは例えば次のものを含む：肺、血液、血漿、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌；自己免疫疾患、例えば全身性狼瘡、リウマチ性関節炎、および多発性硬化症；移植片拒絶、例えば腎移植片拒絶、肝移植片拒絶、肺移植片拒絶、心移植片拒絶、および骨髄移植片拒絶；移植片対宿主疾患；ウイルス感染症、例えばＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、およびＡＩＤＳ；ならびに寄生虫感染症、例えばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症および同様のもの。好ましくは、本発明の免疫コンジュゲート類および化学療法剤は、患者における癌を処置するために、および／または癌細胞の増殖を調節するためにインビトロ、インビボおよび／またはエキソビボで投与され、それは例えば次のものを含む：血液、血漿、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌；より好ましくは、肺、結腸、前立腺、血漿、血液または結腸癌。
【０１５５】
[173]  “選択された細胞集団の増殖を調節すること”には、選択された細胞集団（例
えば、多発性骨髄腫の細胞集団、例えばＭＯＬＰ−８細胞、ＯＰＭ２細胞、Ｈ９２９細胞、および同様のもの）の増殖を阻害すること、それが分裂してより多くの細胞を生じるのを阻害すること；例えば処置していない細胞と比較して細胞分裂の増大の速度を低減すること；選択された細胞集団を殺すこと；および／または選択された細胞集団（例えば癌細胞）が転移するのを防ぐことが含まれる。選択された細胞集団の増殖は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで調節することができる。
【０１５６】
[174]  本発明の方法において、細胞結合剤薬物コンジュゲート（例えば免疫コンジュ
ゲート類）は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで投与することができる。細胞結合剤薬物コンジュゲート（例えば免疫コンジュゲート類）は、適切な医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤、および／または賦形剤と共に用いることができ、それらは周知であり、当業者は臨床状況を根拠として（ａｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｔｕａｔｉｏｎ  ｗａｒｒａｎｔｓ）それらを決定することができる。適切なキャリヤー、希釈剤、および／または賦形剤の例には次のものが含まれる：（１）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約６．５、それは約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含むであろう、（２）０．９％生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース。
【０１５７】
[175]  本明細書で記述された化合物および組成物は、適切な形で、好ましくは非経口
で、より好ましくは静脈内で投与されてよい。非経口投与に関して、その化合物または組成物は水性または非水性の無菌の溶液、懸濁液または乳濁液であることができる。プロピレングリコール、植物油および注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルを溶媒またはビヒクルとして用いることができる。その組成物は、アジュバント、乳化剤または分散剤を含むこともできる
[176]  その組成物は、滅菌水またはいずれかの他の注射可能な無菌の媒体中で溶解ま
たは分散させることができる無菌の固体組成物の形であることもできる。
【０１５８】
[177]  本明細書で記述される細胞結合剤薬物コンジュゲート（例えば免疫コンジュゲ
ート類）の“療法上有効量”は、選択された細胞集団の増殖を調節する、および／または患者の疾患を処置するための投薬計画を指し、それは患者の年齢、体重、性別、食事および医学的条件、その疾患の重症度、投与の経路、ならびに薬理学的な考慮すべき事柄、例えば用いられる個々の化合物の活性、有効性、薬物動態学的および毒物学的プロフィールを含む様々な要素に従って選択される。“療法上有効量”は、標準的な医学的テキスト、例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００４を参照すること
により決定することもできる。患者は好ましくは動物、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。患者は男性または女性であり、乳児、小児または成人であることができる。
【０１５９】
[178]  細胞結合剤薬物コンジュゲート（例えば免疫コンジュゲート）の投与の適切な
プロトコルの例は、次のようなものである。そのコンジュゲートは、約５日間毎日、約５日間のそれぞれの日に静脈内、大量瞬時投与（ｂｏｌｕｓ）のどちらかとして、または約５日間の継続的な注入として与えることができる。
【０１６０】
[179]  あるいは、そのコンジュゲートは６週間以上の間週１回投与することができる
。別の代替案として、そのコンジュゲートは２または３週間ごとに１回投与することができる。大量瞬時投与量は、約５０〜約４００ｍｌの通常の生理食塩水中で与えられ、それに約５〜約１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加することができる。継続的な注入は、２４時間の期間ごとに約２５０〜約５００ｍｌの通常の生理食塩水中で与えられ、それに約２５〜約５０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加することができる。投薬量は１人あたり静脈内で約１０ｐｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであろう（約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲）。
【０１６１】
[180]  処置の約１〜約４週間後、その患者は処置の第２クールを受けることができる
。当業者は投与の経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、および時間に関する具体的な臨床プロトコルを臨床状況を根拠として決定することができる。
【０１６２】
[181]  本発明は、１種類以上の免疫コンジュゲートおよび１種類以上の化学療法薬を
含む本発明の医薬的化合物および／または組成物の成分の１種類以上が入った１個以上の入れ物を含む医薬的キットも提供する。そのキットは、例えば、他の化合物および／または組成物、その化合物および／または組成物を投与するための道具（単数又は複数）、および医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関により規定された形で書かれた説明書を含んでいることもできる。
【０１６３】
[182]  その化合物およびコンジュゲート類（例えば免疫コンジュゲート類は、例えば
細胞の異常な増殖により特性付けられる障害（例えば癌）を処置する、またはその重症度を低下させるのに有用な医薬の製造のために用いることもできるであろう。
【０１６４】
[183]  癌の療法およびそれらの投薬量、投与の経路および推奨される使用法は当分野
で既知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）のような文献において記述されている。ＰＤＲは様々な癌の処置において用いられてきた薬剤の投薬量を開示している。療法上有効であるこれらの前記の化学療法薬およびコンジュゲートの投与計画および投薬量は、処置される個々の癌、その疾患の程度および当分野の熟練した医師に馴染みの他の要素に依存すると考えられ、医師はそれを決定することができる。例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの２００６年版は、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ｐ２９４７参照）はチューブリン脱重合の阻害剤であり；ドキソルビシン（ｐ７８６参照）、Ｄｏｘｉｌ（ｐ３３０２参照）およびオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）（ｐ２９０８参照）はＤＮＡと相互作用する薬剤であり、イリノテカル（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｌ）（ｐ２６０２参照）はトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、Ｅｒｂｉｔｕｘ（ｐ９３７参照）およびＴａｒｃｅｖａ（ｐ２４７０参照）は上皮成長因子受容体と相互作用することを開示している。ＰＤＲの内容を、特にそのまま本明細書に援用する。当業者は、ＰＤＲを見直して、下記のパラメーターの内の１種類以上を用いて、この発明の教えに従って用いることができる化学療法薬およびコンジュゲートの投与計画および投薬量を決定することができる。これらのパラメーターは次のものを含む：
１．総合的な索引
ａ）製造業者による
ｂ）製品（会社の、または商標登録された薬物の名前による）
ｃ）カテゴリー索引（例えば、“抗ヒスタミン剤”、“ＤＮＡアルキル化剤”タキサン類等）
ｄ）属による／化学的な索引（商標ではない一般的な薬物名）
２．投薬の色のイメージ
３．ＦＤＡのラベル付け（ｌａｂｅｌｉｎｇ）と一致する製品情報
ａ）化学的な情報
ｂ）機能／作用
ｃ）適応および禁忌
ｄ）試験研究、副作用、警告。
【０１６５】
[184]  本明細書において、および下記の実施例において引用される全ての参考文献を
特にそのまま援用する。
【実施例】
【０１６６】
[185]  ここで、本発明を限定的で無い実施例を参照することにより記述する。別途明
記しない限り、全てのパーセントおよび比率は体積によるものである。
実施例１：材料および方法
メチル  ２−（アセチルチオ）−４−ブロモブタノエート
【０１６７】
【化２２】
0006021963.tif 000023
【０１６８】
[186]  ２０℃における１００ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１０．０ｇ（３８．４ｍｍｏｌ）
のメチル  ２，４−ジブロモブタノエートに、８．５ｍｌ（４８．９ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡおよび５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の２．７５ｍｌ（３８．５ｍｍｏｌ）のチオール酢酸の混合物を、１．５時間で滴加した。−２０℃で一夜、次いで０℃で２時間、Ａｒの下で攪拌した後、混合物を濃縮し、ＥｔＡｃ／ヘキサンで希釈し、１．０Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー（１：１２〜１：１０  ＥｔＡｃ／ヘキサン）で精製して、９．５ｇ（９６％）の表題化合物を得た。1H NMR (CDCl3) 4.38 (1H, t, J = 7.1Hz), 3.74 (s, 3H), 3.40 (m, 2H), 2.57
〜 2.47 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.36 〜 2.21 (m, 1H); 13C NMR 193.24, 171.36, 53.15, 44.45, 34.67, 30.46, 29.46; MS m/z+ 276.9 (M+Na), 278.9 (M+2+Na)。
【０１６９】
４−ブロモ−１−メトキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸
【０１７０】
【化２３】
0006021963.tif 000024
【０１７１】
[187]  ８０ｍｌの酢酸中の９．２ｇ（３６．３ｍｍｏｌ）のメチル  ２−（アセチル
チオ）−４−ブロモブタノエートに、４０ｍｌの過酸化水素（水中３５％）を添加した。
混合物を一夜攪拌し、次いで蒸発させ、水で希釈し、ＮａＨＣＯ３で中和し、１：１ヘキサン／ＥｔＡｃで洗浄した。水溶液を蒸発させ、メタノール中で溶解し、濃縮し、メタノール／トルエンを用いて結晶化すると、８．６ｇ（収率９０％）の表題化合物が得られた。ｍ．ｐ．＝２８８〜２９３（分解）；1H NMR (D2O) 4.12 (dd, 1H, J = 4.8, 9.3 Hz),
3.83 (s, 3H), 3.64 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 2.54 (m, 2H); 13C NMR 172.16, 66.73, 55.66, 33.39, 32.70; MS m/z- 260.8 (M-1)。
【０１７２】
４−（アセチルチオ）−１−メトキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸
【０１７３】
【化２４】
0006021963.tif 000025
【０１７４】
[188]  １００ｍｌのＴＨＦ中の５．０ｇ（１９．２ｍｍｏｌ）の４−ブロモ−１−メ
トキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸に、１００ｍｌのＴＨＦ中の３．０ｍｌのチオ酢酸および９．０ｍｌのＤＩＰＥＡを添加した。混合物を一夜攪拌し、次いで７０℃で１時間還流し、蒸発させ、ＮａＨＣＯ３でｐＨ７に中和した後３×１００ｍｌの水を用いて共蒸発させた（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）。混合物をメタノール中で再溶解し、セライトを通して濾過し、濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィーにより、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＣＯＯＨ  ３７．５：２５０：１〜５０：２５０：１）を用いて溶離して精製すると４．４ｇ（収率９０％）の表題化合物が得られた。1H NMR(D2O) 3.95 (dd, 1H, J = 4.1, 10.3 Hz), 3.83 (s, 3H), 3.74 (m, 2H), 3.22 (dd, 2H, J = 7.4, 14.9 Hz), 2.39 (s, 3H); 13C NMR 203.88, 172.91, 67.32, 56.17, 29.04, 20.61; MS m/z- 254.8 (M-H)。
【０１７５】
４−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）−２−スルホブタン酸
【０１７６】
【化２５】
0006021963.tif 000026
【０１７７】
[189]  １００ｍｌの水中の３．０ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）の４−（アセチルチオ）−
１−メトキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸に、５０ｍｌの３Ｍ  ＮａＯＨを添加した。Ａｒの下で３時間攪拌した後、混合物をＡｒの下で１Ｍ  Ｈ２ＰＯ４を用いてｐＨ７．２に中和した。混合物を、２００ｍｌのＤＭＡ中の１０．０ｇ（３２．２ｍｍｏｌ）の１，２−ビス（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファンの溶液に滴加した。Ａｒの下で４時間攪拌した後、混合物を濃縮し、水で希釈し、濾過し、蒸発させ、Ｃ−１８  ４．０×２０ｃｍカラムを用いて、水／メタノール（９５：５）で溶離して精製すると、３．１ｇ（収率７５％）の表題化合物が得られた。ｍ．ｐ．＝２８８〜２９１℃（分解）
1H NMR (DMF-d7) 9.29 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 8.63 (dd, 1H, J = 2.7, 8.9 Hz), 8.17
(d, 1H, J = 8.9 Hz), 3.73 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 3.22〜3.17 (m, 1H), 3.15〜3.10 (m, 1H), 2.41〜2.33 (m, 2H); 13C NMR 170.92, 169.10, 146.04, 143.67, 133.65, 120.72, 64.22, 37.82, 29.26; MS m/z- 352.8 (M-H)。
【０１７８】
１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−４−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）−１−オキソブタン−２−スルホン酸
【０１７９】
【化２６】
0006021963.tif 000027
【０１８０】
[190]  １５ＤＭＡ中の２２０ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）の４−（（５−ニトロピリジ
ン−２−イル）ジスルファニル）−２−スルホブタン酸に、１３０ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ）のＮＨＳおよび４８０ｍｇ（２．５０ｍｍｏｌ）のＥＤＣを添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上で、ＣＨ２ＣＨ２／ＣＨ３ＯＨ／ＨＣＯＯＨ（１００００：１０００：１〜１００００：１５００：１）で溶離して精製すると、２２７ｍｇ（収率８２％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMSO-d6) 9.25 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.57 (dd, 1H, J = 2.5, 8.9 Hz), 8.04 (t, 1H, J = 8.0 + 8.9 Hz), 3.86 (dd, 1H, J = 4.9, 9.7 Hz), 3.13〜3.12 (m, 2H), 2.76 (s, 4H), 2.36〜2.30 (m, 1H), 2.25〜2.21 (m, 1H); 13C NMR 166.96, 165.01, 144.93, 142.26, 132.63,
119.61, 61.00, 35.03, 29.30, 25.39; MS m/z- 449.8 (M-H)。
【０１８１】
メチル  ２−（アセチルチオ）−４−ブロモブタノエート
【０１８２】
【化２７】
0006021963.tif 000028
【０１８３】
[191]  −２０℃における１００ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１０．０ｇ（３８．４ｍｍｏｌ
）のメチル  ２，４−ジブロモブタノエートに、８．５ｍｌ（４８．９ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡおよび５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の２．７５ｍｌ（３８．５ｍｍｏｌ）のチオール酢酸の混合物を、１．５時間で滴加した。−２０℃で一夜、次いで０℃で２時間、Ａｒの下で攪拌した後、混合物を濃縮し、ＥｔＡｃ／ヘキサンで希釈し、１．０Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー（１：１２〜１：１０  ＥｔＡｃ／ヘキサン）で精製して、９．５ｇ（９６％）の表題化合物を得た。1H NMR (CDCl3) 4.38 (1H, t, J = 7.1Hz), 3.74 (s, 3H), 3.40 (m, 2H), 2.57〜2.47 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.36〜2.21 (m, 1H); 13C NMR 193.24, 171.36, 53.15, 44.45, 34.67, 30.46, 29.46; MS m/z+ 276.9 (M+Na), 278.9 (M+2+Na)。
【０１８４】
４−ブロモ−１−メトキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸
【０１８５】
【化２８】
0006021963.tif 000029
【０１８６】
[192]  ８０ｍｌの酢酸中の９．２ｇ（３６．３ｍｍｏｌ）のメチル  ２−（アセチル
チオ）−４−ブロモブタノエートに、４０ｍｌの過酸化水素（水中３５％）を添加した。混合物を一夜攪拌し、次いで蒸発させ、水で希釈し、ＮａＨＣＯ３で中和し、１：１ヘキサン／ＥｔＡｃで洗浄した。水溶液を蒸発させ、メタノール中で溶解し、濃縮し、メタノール／トルエンを用いて結晶化すると、８．６ｇ（収率９０％）の表題化合物が得られた。ｍ．ｐ．＝２８８〜２９３（分解）；1H NMR (D2O) 4.12 (dd, 1H, J = 4.8, 9.3 Hz),
3.83 (s, 3H), 3.64 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 2.54 (m, 2H); 13C NMR 172.16, 66.73, 55.66, 33.39, 32.70; MS m/z- 260.8 (M-1)。
【０１８７】
４−（アセチルチオ）−１−メトキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸
【０１８８】
【化２９】
0006021963.tif 000030
【０１８９】
[193]  １００ｍｌのＴＨＦ中の５．０ｇ（１９．２ｍｍｏｌ）の４−ブロモ−１−メ
トキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸に、１００ｍｌのＴＨＦ中の３．０ｍｌのチオ酢酸および９．０ｍｌのＤＩＰＥＡを添加した。混合物を一夜攪拌し、次いで７０℃で１時間還流し、蒸発させ、ＮａＨＣＯ３でｐＨ７に中和した後３×１００ｍｌの水を用いて共蒸発させた。混合物をメタノール中で再溶解し、セライトを通して濾過し、濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィーにより、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＣＯＯＨ  ３７．５：２５０：１〜５０：２５０：１）を用いて溶離して精製すると４．４ｇ（収率９０％）の表題化合物が得られた。1H NMR(D2O) 3.95 (dd, 1H, J = 4.1, 10.3 Hz), 3.83 (s, 3H), 3.74 (m, 2H), 3.22 (dd, 2H, J = 7.4, 14.9 Hz), 2.39 (s, 3H); 13C NMR 203.88, 172.91, 67.32, 56.17, 29.04, 20.61; MS m/z- 254.8 (M-H)。
４−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）−２−スルホブタン酸
【０１９０】
【化３０】
0006021963.tif 000031
【０１９１】
[194]  １００ｍｌの水中の３．０ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）の４−（アセチルチオ）−
１−メトキシ−１−オキソブタン−２−スルホン酸に、５０ｍｌの３Ｍ  ＮａＯＨを添加した。Ａｒの下で３時間攪拌した後、混合物をＡｒの下で１Ｍ  Ｈ２ＰＯ４を用いてｐＨ７．２に中和した。混合物を、２００ｍｌのＤＭＡ中の１０．０ｇ（３２．２ｍｍｏｌ）の１，２−ビス（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファンの溶液に滴加した。Ａｒの下で４時間攪拌した後、混合物を濃縮し、水で希釈し、濾過し、蒸発させ、Ｃ−１８  ４．０×２０ｃｍカラムを用いて、水／メタノール（９５：５）で溶離して精製すると、３．１ｇ（収率７５％）の表題化合物が得られた。ｍ．ｐ．＝２８８〜２９１℃（分解）
1H NMR (DMF-d7) 9.29 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 8.63 (dd, 1H, J = 2.7, 8.9 Hz), 8.17
(d, 1H, J = 8.9 Hz), 3.73 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 3.22〜3.17 (m, 1H), 3.15〜3.10 (m, 1H), 2.41〜2.33 (m, 2H); 13C NMR 170.92, 169.10, 146.04, 143.67, 133.65, 120.72, 64.22, 37.82, 29.26; MS m/z- 352.8 (M-H)。
【０１９２】
１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−４−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）−１−オキソブタン−２−スルホン酸
【０１９３】
【化３１】
0006021963.tif 000032
【０１９４】
[195]  １５ＤＭＡ中の２２０ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）の４−（（５−ニトロピリジ
ン−２−イル）ジスルファニル）−２−スルホブタン酸に、１３０ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ）のＮＨＳおよび４８０ｍｇ（２．５０ｍｍｏｌ）のＥＤＣを添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上で、ＣＨ２ＣＨ２／ＣＨ３ＯＨ／ＨＣＯＯＨ（１００００：１０００：１〜１００００：１５００：１）で溶離して精製すると、２２７ｍｇ（収率８２％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMSO-d6) 9.25 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.57 (dd, 1H, J = 2.5, 8.9 Hz), 8.04 (t, 1H, J = 8.0 + 8.9 Hz), 3.86 (dd, 1H, J = 4.9, 9.7 Hz), 3.13〜3.12 (m, 2H), 2.76 (s, 4H), 2.36〜2.30 (m, 1H), 2.25〜2.21 (m, 1H); 13C NMR 166.96, 165.01, 144.93, 142.26, 132.63,
119.61, 61.00, 35.03, 29.30, 25.39; MS m/z- 449.8 (M-H)。
【０１９５】
４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−２−スルホブタン酸
【０１９６】
【化３２】
0006021963.tif 000033
【０１９７】
[196]  １．５ｇ（５．８５ｍｍｏｌ）の４−（アセチルチオ）−１−メトキシ−１−
オキソブタン−２−スルホン酸を、１００ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液に添加した。Ａｒの下で３時間撹拌した後、混合物を約５０ｍｌまで濃縮し、Ａｒの下で１Ｍ  Ｈ２ＰＯ４を用いてｐＨ７．２に中和した。混合物を、６０ｍｌのＤＭＡ中の４．０ｇ（１８．１ｍｍｏｌ）の２，２’−ジチオジピリジンの溶液に滴加した。Ａｒの下で４時間撹拌した後、混合物を濃縮し、水で希釈し、濾過し、蒸発させ、Ｃ−１８  ４．０×２０ｃｍカラムを用いて、水／メタノール（９９：１〜９０：１０）で溶離して精製すると、１．３２ｇ（収率７３％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMF-d7) 8.39 (dd, 1H, J = 3.5, 4.8 Hz), 7.86 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 3.59 (dd, 1H, J = 5.2, 9.4 Hz), 2.90 (m, 2H), 2.28 (m, 2H); 13C NMR 172.60, 159.16, 148.93, 138.09, 121.03, 119.38, 67.49, 36.39, 28.666; MS m/z- 307.8 (M-H)。
【０１９８】
１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−１−オキソ−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン−２−スルホン酸
【０１９９】
【化３３】
0006021963.tif 000034
【０２００】
[197]  ５０  ＤＭＡ中の６８０ｍｇ（２．２０ｍｍｏｌ）の４−（ピリジン−２−イ
ルジスルファニル）−２−スルホブタン酸に、３００ｍｇ（２．６０ｍｍｏｌ）のＮＨＳおよび８００ｍｇ（４．１６ｍｍｏｌ）のＥＤＣを添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上で、ＣＨ２ＣＨ２／ＣＨ３ＯＨ／ＨＣＯＯＨ（１００００：１０００：１〜１００００：１５００：１）で溶離して精製すると、７２０ｍｇ（収率８０％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMSO-d6) 8.40 (dd, 1H, J
= 3.5, 4.7 Hz), 7.85 (m, 2H), 7.24 (m, 1H), 3.58 (dd, 1H, J = 5.1, 9.4 Hz), 2.94〜2.90 (m, 2H), 2.74 (s, 4H), 2.31〜2.27 (m, 2H); 13C NMR 168.16, 161.11, 147.91, 139.22, 121.63, 119.31, 66.80, 36.30, 28.36, 25.42; MS m/z- 404.9 (M-H)。
【０２０１】
３，６−エンドオキソ−Δ−テトラヒドロフタルヒド（３，６−ｅｎｄｏｘｏ−Δ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌｈｉｄｅ）
【０２０２】
【化３４】
0006021963.tif 000035
【０２０３】
[198]  エチルエーテル（２００ｍｌ）中のマレイミド（５．０ｇ，５１．５ｍｍｏｌ
）に、フラン（５．５ｍｌ，７５．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１Ｌのオートクレーブボンベ（ａｕｔｏｃｌａｖｅ  ｂｏｍｂ）の中で１００℃において８時間加熱した。ボンベを室温まで冷まし、中の固体をメタノールですすぎ、濃縮し、酢酸エチル／ヘキサン中で結晶化すると、８．４ｇ（９９％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMF-d7): 11.08 (s, 1H) (NH), 6.60 (m, 2H), 5.16 (m, 2H), 2.95 (m, 2H). 13C NMR 178.84, 137.69, 82.00, 49.92. MS m/z+ 188.4 (MW + Na)。
【０２０４】
メチル  ４−Ｎ−（３，６−エンドオキソ−Δ−テトラヒドロフタリド）−２−スルホ−ブチレート
【０２０５】
【化３５】
0006021963.tif 000036
【０２０６】
[199]  ＤＭＡ（２０ｍｌ）中の３，６−エンドオキソ−Δ−テトラヒドロフタルヒド
（３，６−ｅｎｄｏｘｏ−Δ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌｈｉｄｅ）（０．８０ｇ，４．８５ｍｍｏｌ）に、Ｋ２ＣＯ３（１．４ｇ，１０．１３ｍｍｏｌ）およびＫＩ（０．１９ｇ，１．１４ｍｍｏｌ）を添加した。Ａｒの下で１時間攪拌した後、ＤＭＡ（１０ｍｌ）中のメチル  ４−ブロモ−２−スルホ−ブチレート（０．９８ｇ，３．７７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、蒸発させ、メタノール中１％ＨＡｃ
中で再溶解し、濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィーにより、１：５：０．０１〜１：４：０．０１  ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃで溶離して精製すると、０．９８（７５％）ｇの表題化合物が得られた。1H NMR (DMF-d7): 6.59 (m, 2H), 5.16 (dd,
2H, J = 0.8, 7.8 Hz), 3.65-3.63 (m, 3H), 3.47 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 2.83 (m, 2H). 13C NMR 172.94, 162.86, 137.68, 81.98, 52.39, 49.91, 48.58, 36.01, 21.97. MS
m/z- 343.9 (MW - H)。
【０２０７】
メチル  ４−Ｎ−マレイミド−２−スルホ−ブチレート
【０２０８】
【化３６】
0006021963.tif 000037
【０２０９】
[200]  ふたの無い丸底フラスコ中で、２０ｍｌの１：１ＤＭＡ／１００ｍＭ  ＮａＨ
２ＰＯ４、ｐＨ７．０中のメチル  ４−Ｎ−（３，６−エンドオキソ−Δ−テトラヒドロフタリド）−２−スルホ−ブチレート（０．３０ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）を１２０〜１４０℃で４時間加熱した。反応時間の間、５×１０ｍｌの水を徐々に添加して反応体積をおよそ１５ｍｌに保った。混合物を濃縮して乾燥させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィーにより、１：５：０．０１〜１：４：０．０１  ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃで溶離して精製すると、０．２３０ｇ（９５％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMF-d7): 6.60 (s, 2H), 4.06 (d, 1H), 3.60 (m, 3H), 3.47 (m, 2H), 2.43 (m, 2H); 13C NMR 171.59,
164.96, 136.10, 66.20, 51.71, 34.82, 22.10. MS m/z- 276.6 (MW - H)。
【０２１０】
メチル  ４−アジド−２−スルホ−ブチレート
【０２１１】
【化３７】
0006021963.tif 000038
【０２１２】
[201]  ＤＭＦ（５０ｍｌ）中のメチル  ４−ブロモ−２−スルホ−ブチレート（１．
０７ｇ，４．１１ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（０．７０ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）を、一夜攪拌した。混合物を蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィーにより、１：５：０．０１  ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃで溶離して精製し、ＣＨ３ＯＨ／トルエン／ヘキサンを用いて結晶化すると、１．００ｇ（９５％）の表題化合物が得られた。ｍ．ｐ＝２６７〜２７２℃（分解）。1H NMR (DMF-d7): 12.06 (br, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H, J = 5.4, 8.9 Hz), 3.47 (m, 2H), 2.24 (m, 2H). 13C NMR 171.10, 64.29, 52.24, 50.64, 21.35. ESI MS m/z+ 267.9 (M + 2Na-H), m/z- 222.0 (M-H). HRMS m/z- (C5H9N3O5S -H) 計算値222.0185、実測値222.0179。
【０２１３】
４−アジド−２−スルホ−酪酸
【０２１４】
【化３８】
0006021963.tif 000039
【０２１５】
[202]  ＨＣｌ（５０ｍｌ，１．０Ｍ）およびＨＡＣ（５ｍｌ）の混合物中のメチル  
４−アジド−２−スルホ−ブチレート（１．００ｇ，４．０８ｍｍｏｌ）を、１００℃で８時間加熱した。混合物を蒸発させ、３×５０ｍｌの水で共蒸発させ、水／アセトンを用いて結晶化すると、１．０ｇ（９９％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMF-d7): 3.60 (m, 2H), 3.52 (m, 1H), 2.24 (m, 2H). 13C NMR 170.96, 63.04, 50.66, 29.12. ESI MS m/z- 207.7 (MW -H); HRMS m/z- (C4H7N3O5S -H) 計算値208.0028、実測値208.0021。
【０２１６】
４−アミノ−２−スルホ−酪酸
【０２１７】
【化３９】
0006021963.tif 000040
【０２１８】
[203]  ４−アジド−２−スルホ−酪酸（５００ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）、水（２０
ｍｌ）およびＰｄ／Ｃ（１１０ｍｇ，１０％Ｐｄ，５０％水に基づく）を、２５０ｍｌ水素化振とうボトルの中に入れた。ボトル中の空気をバキュームにより吸い出した後、２０ｐｓｉの水素をボトルの中に入れた。混合物を８時間振とうし、次いでセライトを通して濾過し、ＤＭＦで洗浄し、蒸発させ、乾燥ＤＭＦを用いて共蒸発させると、４７６ｍｇ（９１％  ＨＣｌ塩）の表題生成物が得られた。ESI MS m/z- 181.8 (MW -H)。この生成物
を、それ以上精製せずに直接用いた。
【０２１９】
（Ｚ）−４−（３−カルボキシ−３−スルホプロピルアミノ）−４−オキソブタ−２−エン酸
【０２２０】
【化４０】
0006021963.tif 000041
【０２２１】
[204]  乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の上記の４−アミノ−２−スルホ−酪酸、ＨＣｌ塩
（４７６ｍｇ，２．１６ｍｍｏｌ）に、無水マレイン酸（２３２ｍｇ，２．３６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、蒸発させ、自分で詰めた（ｓｅｌｆ  ｐａｃｋｅｄ）ｃ−１８、Φ１．０×２５ｃｍカラム上で、水で溶離して精製した。生成物を含んでいた画分を集め、蒸発させ、Ｈ２Ｏ／アセトンを用いて結晶化すると、５５２ｍｇ（９１％）の表題生成物が得られた。1H NMR (DMF-d7): 9.70 (br, 1H), 6.73 (d, 1H,
J = 12.8 Hz), 6.32 (d, 1H, J = 12.8 Hz), 3.69 (m, 1H), 3.47 (m, 2H), 2.27 (m, 2H). 13C NMR 171.47, 167.32, 165.87, 135.44, 133.07, 63.82, 39.13, 27.62. ESI MS m/z- 279.8 (MW -H); HRMS m/z- (C8H11NO8S -H) 計算値280.0127、実測値280.0121。
【０２２２】
４−Ｎ−マレイミド−２−スルホ−ブタン酸
【０２２３】
【化４１】
0006021963.tif 000042
【０２２４】
[205]  乾燥ＤＭＡ（５ｍｌ）および乾燥トルエン（２０ｍｌ）の混合物中の（Ｚ）−
４−（３−カルボキシ−３−スルホプロピルアミノ）−４−オキソブタ−２−エン酸（３１０ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ）を加熱した。温度が８０℃に達した後、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン）（１．４０ｍｌ，６．７１ｍｍｏｌ）およびＺｎＣｌ２（１．８５ｍｌ、ジエチルエーテル中１．０Ｍ、１．８５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１１５〜１２５℃まで続けて加熱し、ディーン・スタークトラップを通してトルエンを集めた。反応混合物を１２０℃で６時間流した（ｆｌｕｘｅｄ）。この期間の間、２×２０ｍｌの乾燥トルエンを添加して混合物の体積をおよそ８〜１０ｍｌに保った。次いで混合物を冷却し、１ｍｌの１：１０  ＨＣｌ（濃縮）／ＣＨ３ＯＨを添加し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上でＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃ（１：５：０．０１〜１：４：０．０１）で溶離して精製すると、２６０ｍｇ（９２％）の表題生成物が得られた。1H NMR (DMF-d7): 10.83(br, 1H), 6.95 (s, 2H) , 1H, J = 12.8 Hz), 3.65 (m, 1H), 3.54 (m, 2H), 2.27 (m, 2H). 13C NMR 173.61, 172.04, 135.47, 64.18, 37.1, 27.89. ESI MS m/z- 261.8 (MW -H). HRMS m/z- (C8H9NO7S -H) 計算値262.0021、実測値262.0027。
【０２２５】
スクシンイミジル  ４−Ｎ−マレイミド−２−スルホ−ブチレート
【０２２６】
【化４２】
0006021963.tif 000043
【０２２７】
[206]  ＤＭＡ（１０ｍｌ）中の４−Ｎ−マレイミド−２−スルホ−ブタン酸（２６０
ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）を、ＮＨＳ（２２０ｍｇ，１．９１ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５００ｍｇ，２．６０ｍｍｏｌ）に添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上でＣＨ２ＣＨ２／ＣＨ３ＯＨ／ＨＡｃ（１００００：１０００：１〜１００００：２０００：１）で溶離して精製し、次いでＤＭＡ／ＥｔＡｃ／ヘキサンを用いて結晶化すると、２８５ｍｇ（収率８１％）の表題化合物が得られた。1H
NMR (DMF-d7) 6.99 (s, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.64 (m, 2H), 2.75 (s, 4H), 2.34 (m, 2H); 13C NMR 171.97, 171.82, 166.64, 135.58, 62.00, 36.66, 26.62; ESI MS m/z- 358.9 (M-H); HRMS m/z- (C12H12N2O9S -H) 計算値359.0185、実測値359.0178。
【０２２８】
（Ｅ）−メチル  ４−アジドブタ−２−エノエート
【０２２９】
【化４３】
0006021963.tif 000044
【０２３０】
[207]  −２０℃における１００ｍｌのＤＭＦ中のＮａＮ３（２．８０ｇ，４３．０１
ｍｍｏｌ）の溶液に、メチル  ４−ブロモクロトネート（５．００ｍｌ，８５％，３６．１０ｍｍｏｌ）を添加した。−２０℃で３０分間攪拌した後、混合物を０℃で４時間攪拌
し、蒸発させ、ＥｔＡｃ／ヘキサン（１：１）で懸濁し、濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２カラム上でＥｔＡｃ／ヘキサン（１：２５〜１：１０）で溶離してクロマトグラフィー精製し、４．０８ｇ（８０％）の表題生成物に関するＨＲＭＳを得た。1H NMR (CDCl3) 6.88 (m, 1H), 6.06 (ddd, 1H, J -= 1.7, 3.4, 15.6 Hz), 3.97 (dd, 2H, J = 1.2, 4.96 Hz), 3.73 (s, 3H); 13C NMR 166.23, 140.86, 123.49, 51.95, 51.36; ESI MS m/z+ 182.5 (M+ Na + H2O); HRMS m/z+ (C5H7N3O2+ H2O + Na) 計算値182.0542、実測値182.0548。
【０２３１】
メチル  ３−（アセチルチオ）−４−アジドブタノエート
【０２３２】
【化４４】
0006021963.tif 000045
【０２３３】
[208]  ０℃における６０ｍｌのＴＨＦ中の（Ｅ）−メチル  ４−アジドブタ−２−エ
ノエート（４．００ｇ，２８．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、６０ｍｌのＴＨＦ中のチオール酢酸（３．０ｍｌ，４２．０９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８．０ｍｌ，４５．９２ｍｍｏｌ）の混合物を、２０分間で添加した。０℃で１時間攪拌した後、混合物を室温で一夜攪拌し、蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２中で再溶解し、ＮａＨＣＯ３（飽和）および１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＣｌ（飽和）、ｐＨ４でそれぞれ洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２カラム上でＥｔＡｃ／ヘキサン（１：８〜１：４）で溶離してクロマトグラフィー精製し、４．９８ｇ（８１％）の表題生成物に関するＨＲＭＳを得た。1H NMR (CDCl3) 3.66 (m, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.40 (dd, 1H, J = 7.5, 12.7 Hz), 3.31 (m, 1H), 2.78 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.32 (s, 3H); 13C NMR (DMF-d7) 192.20, 172.48, 56.56, 53.60, 51.31, 34.58, 30.56; ESI MS m/z+ 240.0 (M+ Na), 255.9 (M+ K); HRMS m/z+ (C7H11N3O3S+ Na) 計算値240.0419、実測値240.0415。
【０２３４】
アジド−４−メトキシ−４−オキソブタン−２−スルホン酸
【０２３５】
【化４５】
0006021963.tif 000046
【０２３６】
[209]  ７５ｍｌの酢酸中のメチル  ３−（アセチルチオ）−４−アジドブタノエート
（４．００ｇ，１８．４３ｍｍｏｌ）に、２５ｍｌのＨ２Ｏ２（３０％）を添加した。混合物を一夜攪拌し、蒸発させ、ＥｔＯＨ／トルエンを用いて共蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上でＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃ（１００：８００：１〜１００：５００：１）で溶離して精製すると、３．８５（９３％）ｇの表題化合物が得られた。1H NMR (CD3OD) 3.78 (dd, 1H, J = 5.0, 12.7 Hz), 3.62 (s, 3H), 3.44 (dd, 1H, J = 7.5,
12.7 Hz), 3.33 (m, 1H), 2.84 (dd, 1H, J = 5.6, 16.5 Hz), 2.57 (dd, 1H, J = 7.5,
16.5 Hz); 13C NMR (DMF-d7) 173.37, 57.31, 52.54, 52.49, 34.51; ESI MS m/z- 221.7 (M+ H)。
【０２３７】
４−アジド−３−スルホブタン酸
【０２３８】
【化４６】
0006021963.tif 000047
【０２３９】
[210]  １５０ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌ中のアジド−４−メトキシ−４−オキソブタン
−２−スルホン酸（３．８０ｇ，１７．０４ｍｍｏｌ）に、８．０ｍｌのＨＡｃを添加した。混合物を１２０℃で一夜還流し、蒸発させ、水、ＥｔＯＨ、ＥｔＯＨ／トルエンを用いてそれぞれ共蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上でＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃ（１００：５００：１〜１００：４００：１）で溶離して精製すると、３．０２（８５％）ｇの表題化合物が得られた。1H NMR (CD3OD) 3.77 (dd, 1H, J = 5.1, 12.8 Hz), 3.45 (dd, 1H, J = 7.0, 12.8 Hz), 3.31 (m, 1H), 2.86 (dd, 1H, J = 4.7, 16.7 Hz), 2.51 (dd, 1H, J = 8.4, 16.7 Hz); 13C NMR (DMF-d7) 173.98, 67.50, 59.78, 27.82;
ESI MS m/z- 207.7 (M -H)。
【０２４０】
４−アミノ−３−スルホブタン酸
【０２４１】
【化４７】
0006021963.tif 000048
【０２４２】
[211]  ５００ｍｌの水素化ボトル中に、４−アジド−３−スルホブタン酸（３．００
ｇ，１４．３５ｍｍｏｌ）、１５０ｍｌのメタノールおよび０．３２ｇのＰｄ／Ｃ（１０％Ｐｄ，５０％水（ｗｅｔ））を入れた。空気を吸い出した後、３０ｐｓｉのＨ２を導入し、混合物を一夜振とうし、セライトを通して濾過し、蒸発させ、乾燥ＥｔＯＨを用いて共蒸発させると、約２．５０ｇ（９５％）の４−アミノ−３−スルホブタン酸が得られた。1H NMR (CD3OD) 3.24 (m, 1H), 3.17 (m, 1H), 2.90 (dd, 1H, J = 2.6, 16.5 Hz), 2.33 (dd, 1H, J = 10.1, 16.5 Hz), ESI MS m/z- 181.60 (M-H)。得られた化合物は不安定であり、それ以上精製せずに直接用いた。
【０２４３】
（Ｚ）−４−（３−カルボキシ−２−スルホプロピルアミノ）−４−オキソブタ−２−エン酸
【０２４４】
【化４８】
0006021963.tif 000049
【０２４５】
[212]  １００ｍｌのＤＭＡ中の４−アミノ−３−スルホブタン酸（約２．５０ｇ，１
３．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、無水マレイン酸（１．４８ｇ，１５．１０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一夜攪拌し、蒸発させ、Ｃ−１８カラム（２×３０ｃｍ）上で、水中１％ＨＡｃで溶離して精製し、ＭｅＯＨ／アセトン／トルエンを用いて結晶化すると、３．３４ｇ（８３％）の（Ｚ）−４−（３−カルボキシ−２−スルホプロピルアミノ）−４−オキソブタ−２−エン酸が得られた。1H NMR (CD3OD) 6.33 (d, 1H, J = 12.6 Hz), 6.10 (d, 1H, J = 12.6 Hz), 3.64 (dd, 1H, J = 5.8, 14.0 Hz), 3.54 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 2.78 (dd, 1H, J = 4.9, 16.8 Hz), 2.39 (m, 1H); 13C NMR 173.52, 168.68, 167.98,
135.59, 127.79, 57.31, 40.56, 34.52; ESI MS m/z- 279.7 (M -H)。
【０２４６】
４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３−スルホブタン酸
【０２４７】
【化４９】
0006021963.tif 000050
【０２４８】
[213]  １０ｍｌの乾燥ＤＭＡおよび５０ｍｌの乾燥トルエンの混合物中の（Ｚ）−４
−（３−カルボキシ−２−スルホプロピルアミノ）−４−オキソブタ−２−エン酸（４５０ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）を加熱した。温度が８０℃に達した後、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン，１．８０ｍｌ，８．６３ｍｍｏｌ，）およびＺｎＣｌ２（３．２ｍｌ、ジエチルエーテル中１．０Ｍ）を添加した。混合物を１１５〜１２５℃まで続けて加熱し、ディーン・スタークトラップを通してトルエンを集めた。反応混合物を１２０℃で６時間流した。この期間の間、２×２０ｍｌの乾燥トルエンを添加して混合物の体積をおよそ８〜１０ｍｌに保った。次いで混合物を冷却し、１ｍｌの１：１０  ＨＣｌ（濃縮）／ＣＨ３ＯＨを添加し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上で１：５：０．０１  ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃで溶離して精製すると、３１５ｍｇ（７５％）の表題生成物が得られた。1H NMR (DMF-d7) 6.96 (s, 2H), 4.04 (dd, 1H, J = 4.3, 13.8 Hz), 3.47 (m, 1H), 3.23 (dd, 1H, J = 7.4, 14.7Hz), 2.99 (dd, 1H, J = 3.3 , 16.8 Hz), 2.35 (dd, 1H, J = 8.1, 16.9 Hz); 13C NMR 173.58, 172.18, 135.54, 54.61, 40.24, 32.43, ESI MS m/z- 261.70 (M -H)。
【０２４９】
１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−４−オキソブタン−２−スルホン酸
【０２５０】
【化５０】
0006021963.tif 000051
【０２５１】
[214]  ４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−
３−スルホブタン酸（１１０ｍｇ，０．４１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２４０ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５８ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌのＤＭＡ中で一夜攪拌し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー上でＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃ（１００：９００：１〜１００：６００：１）で溶離して精製すると、１１２ｍｇ（７５％）の表題生成物が得られた。1H NMR (DMF-d7) 6.93 (s, 2H), 4.06 (dd, 1H, J = 4.8, 13.1 Hz), 3.80 (dd, 1H, J = 10.7, 13.9 Hz), 3.35 (dd,
1H J = 3.3, 17.8 Hz), 3.25 (m, 1H), 3.10 (dd, 1H, J = 2.2, 16.4 Hz), 2.87 (m, 4H); 13C NMR 172.27, 170.88, 169.29, 135.55, 55.28, 40.22, 32.69, 26.66; ESI MS m/z- 261.70 (M -H)。
【０２５２】
エチル  ３−（アセチルチオ）−３−シアノプロパノエート
【０２５３】
【化５１】
0006021963.tif 000052
【０２５４】
[215]  −２０℃における８０ｍｌのＴＨＦ中の（Ｚ）−エチル  ３−シアノアクリレ
ート（５．０１ｇ，４０．００ｍｍｏｌ）に、２０ｍｌのＴＨＦ中のチオール酢酸（５．０ｍｌ，７０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１６．０ｍｌ，９２．０３ｍｍｏｌ）の溶液を３０分間で添加した。反応物を−２０℃で４時間、次いで室温で一夜保った。混合物を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２クロマトグラフィー（１：４  ＥｔＡＣ／ヘキサン）により精製すると、５．２２ｇ（６５％）の表題化合物が得られた。Ｒｆ＝０．２５（１：４  ＥｔＡＣ／ヘキサン）；1H NMR (CDCl3), 4.44 (m, 1H), 4.11 (dd, 2H, J = 7.1, 14.3 Hz), 3.38 (m, 1H), 3.15 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz); 13C
NMR 194.12, 173.21, 119.82, 61.35, 33.52, 30.08, 14.62; MS m/z+ 225.9 (MW + Na), m/z- 201.7 (MW-H)。
【０２５５】
シアノ−３−エトキシ−３−オキソプロパン−１−スルホン酸
【０２５６】
【化５２】
0006021963.tif 000053
【０２５７】
[216]  酢酸（４０ｍｌ）中のエチル  ３−（アセチルチオ）−３−シアノプロパノエ
ート（２．００ｇ，９．９５ｍｍｏｌ）に、Ｈ２Ｏ２（１２ｍｌ，３０％）を添加した。混合物を一夜攪拌し、蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー上でメタノール／ジクロロメタン／酢酸（１：８：０．０１〜１：５：０．０１）で溶離して精製すると、１．７２ｇ（８４％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMSO), 4.63 (m, 1H), 4.12 (dd, 2H,
J = 7.1, 14.3 Hz), 3.27 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 1.28 (t, 3H, J = 7.2 Hz); 13C NMR 173.15, 113.85, 61.38, 48.32, 26.33, 14.15; MS m/z- 205.7 (MW-H)。
【０２５８】
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−エトキシ−４−オキソブタン−２−スルホン酸
【０２５９】
【化５３】
0006021963.tif 000054
【０２６０】
[217]  水素化ボトル中に、シアノ−３−エトキシ−３−オキソプロパン−１−スルホ
ン酸（２．５０ｇ，１２．０６ｍｍｏｌ）、エタノール（８０ｍｌ）、新しく濾過したラネーニッケル（０．４０ｇ）およびＢＯＣ無水物（３．３０ｇ，１５．１２ｍｍｏｌ）を入れた。ボトル内部の空気をバキュームにより吸い出した後、２０ｐｓｉの水素をボトルに導入した。ボトルを一夜振とうし、セライトを通して濾過し、蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー上でメタノール／ジクロロメタン／酢酸（１：６：０．０１）で溶離して精製すると、３．１８ｇ（８５％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMSO), 6.82 (s, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.11 (dd, 2H, J = 7.1, 14.3 Hz), 3.53 (dd, 1H, J = 4.2, 13.4 Hz), 3.36 (m, 1H), 2.86 (m, 1H), 2.51 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.22 (t, 3H, J = 7.2 Hz); 13C NMR 173.35, 155.72, 80.44, 62.05, 52.55, 41.61, 34.50, 28.85, 14.52; MS m/z- 309.8 (MW-H)。
【０２６１】
４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−スルホブタン酸
【０２６２】
【化５４】
0006021963.tif 000055
【０２６３】
[218]  ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：２，６０ｍｌ）の混合物中の１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ
カルボニルアミノ）−４−エトキシ−４−オキソブタン−２−スルホン酸（４０２ｍｇ，１．２９ｍｍｏｌ）に、水酸化リチウム一水和物（２．０ｇ，４７．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＡｒの下で一夜攪拌し、濃縮し、Ｃ−１８カラム（２×３０ｃｍ）上で、１００％水から水中１０％メタノールまでで溶離して精製すると、３２８ｍｇ（９０％）の表題化合物が得られた。1H NMR (DMSO), 6.78 (s, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.57 (dd, 1H,
J = 4.2, 13.4 Hz), 3.41 (m, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.61 (m, 1H), 1.39 (s, 9H); 13C NMR 174.21, 155.82, 79.85, 59.95, 42.06, 32.52, 28.88, 14.55; ESI MS 281.8 (M-H)。
【０２６４】
（Ｚ）−４−（３−カルボキシ−２−スルホプロピルアミノ）−４−オキソブタ−２−エン酸
【０２６５】
【化５５】
0006021963.tif 000056
【０２６６】
[219]  ４−（Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−スルホブタン酸（３２１
ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）を、ＨＣｌ（濃縮）／ジオキサン（１：４，１５ｍｌ）の混合物中で３０分間攪拌し、蒸発させ、ＥｔＯＨ／トルエン（１：１，４×２０ｍｌ）を用いて共蒸発させ、乾燥させた。乾燥した物質に無水マレイン酸（１２１ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡ（２０ｍｌ）を添加し、混合物を一夜攪拌し、蒸発させ、Ｃ−１８カラムを通し、水で溶離し、ＥｔＯＨ／ヘキサンを用いて結晶化すると、２６３ｍｇ（８３％）の表題化合物が得られた。ESI MS 279.8 (M- H)。そのＮＭＲデータは、４−アジド
−３−スルホブタン酸を用いる経路を通ったものと同じである。
【０２６７】
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソテトラヒドロチオフェン−３−アミニウム
【０２６８】
【化５６】
0006021963.tif 000057
【０２６９】
[220]  ３−アミノジヒドロチオフェン−２（３Ｈ）−オン  塩酸塩（６．００ｇ，３
９．１ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（３．２８ｇ，３９．１ｍｍｏｌ）およびヨードメタン（１３ｍｌ，２０９ｍｍｏｌ）を、乾燥メタノール（１００ｍｌ）中で一夜攪拌し、セライトを通して濾過し、蒸発させ、ＳｉＯ２カラム上でＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＡｃ（１：５：０．０１）で溶離して精製し、ＥｔＯＨ／ヘキサンを用いて結晶化すると、５．２５ｇ（８４％）の表題生成物が得られた。ｍｐ  ２２８〜２３１℃。1H NMR (CD
3OD) 4.27 (m, 1H), 3.25 (s, 9H), 2.56 - 2.47 (m, 2H), 2.34 (m, 1H), 2.26 (m, 1H); 13C NMR 168.97, 75.06, 53.25, 30.85, 16.46; ESI MS m/z+ 160.0 (M+)。
【０２７０】
１−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン−１−アミニウム
【０２７１】
【化５７】
0006021963.tif 000058
【０２７２】
[221]  Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソテトラヒドロチオフェン−３−アミニウ
ムアセテート（２ｇ，９．１３ｍｍｏｌ）を、７５ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨ（７５ｍｌ  Ｈ２Ｏ中３ｇ  ＮａＯＨ）中で４５分間攪拌した。４Ｍ  Ｈ３ＰＯ４でｐＨ７．４に中和し、濃縮し、２００ｍｌのＭｅＯＨ中の１，２−ジ（ピリジン−２−イル）ジスルファン（１１ｇ，４９．９ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を一夜攪拌し、ＥｔＡｃで抽出した。水溶液を蒸発させ、ＭｅＯＨで懸濁し、塩を濾過し、蒸発させ、Ｃ−１８カラム（２ｃｍ×３０ｃｍ）上で水／メタノール（１００水〜２０％メタノール／水）で溶離して精製すると、２．６ｇ（７５％）の表題生成物が得られた。ESI MS m/z+ 309.1 (M +Na-H)。
【０２７３】
１．抗体のスルホリンカーによる修飾
[222]  ８ｍｇ／ｍＬ抗体、１５倍モル過剰のスルホリンカー（ＤＭＡ中約３０ｍＭの
ストック溶液）において、ｈｕＣ２４２をスルホリンカーにより修飾する。反応は、ＤＭＡを含む（５％  ｖ／ｖ）１００ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ８．０の緩衝液中で、２５℃において１５、３０、１２０、および２００分間実施する。修飾されたｈｕＣ２４２を、Ｇ２５カラムにより、５０ｍＭ  ＮａＰｉ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて精製して、過剰なスルホリンカーを除去した。
【０２７４】
２．修飾されたｈｕＣ２４２の放出可能なＳｐｙ−ＮＯ２および抗体の濃度の測定
[223]  そのアッセイおよびスペクトルの測定は、１００ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．５
中で室温において実施した。１モルのｈｕＣ２４２抗体につき放出されるＳｐｙ−ＮＯ２のモル比を、試料のＡ２８０、次いでＤＴＴ（５０μＬの１Ｍ  ＤＴＴ／試料のｍＬ）の添加の後の試料のＡ３９４の増大を測定することにより計算した。ＤＴＴにより放出された２−メルカプトピリジンの濃度は、１４，２０５Ｍ−１ｃｍ−１のε３９４ｎｍを用いて計算される。次いで、抗体の濃度は、ＤＴＴ添加の前に測定された全Ａ２８０ｎｍからＳｐｙ−ＮＯ２の２８０ｎｍにおける吸光度の寄与（ＤＴＴ後のＡ３９４ｎｍ×３３４４／１４２０５）を引算した後に２１７，５６０Ｍ−１ｃｍ−１のε２８０ｎｍを用いて計算することができる。次いで、Ｓｐｙ−ＮＯ２：Ａｂのモル比を計算することができる。ｈｕＣ２４２のｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は、１４７，０００ｇ／モルの分子量を用いて計算される。
【０２７５】
３．コンジュゲーション反応
[224]  修飾されたｈｕＣ２４２を、Ｓｐｙ−ＮＯ２に対して１．７倍モル過剰のＤＭ
４（ＤＭ４ストックのＳＨ濃度に基づく）と反応させた。反応は５０ｍＭ  ＮａＰｉ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５およびＤＭＡ（５％  ｖ／ｖ）中２．５ｍｇ／ｍＬ抗体で実施する。ＤＭ４の添加の後、反応物を２５℃で約２０時間保温した。最終的なコンジュゲートを、Ｇ２５カラムにより、１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭグリシン、５％スクロース、ｐＨ５．５を用いて精製して、過剰なＤＭ４薬物を除去した。
【０２７６】
４．ｈｕＣ２４２およびＤＭ４濃度の計算
[225]  ｈｕＣ２４２およびＤＭ４は共にそれぞれの構成要素を別々に測定するのに用
いられる２種類の波長、すなわち２８０および２５２ｎｍを吸収する。ｈｕＣ２４２に関する２８０ｎｍにおける吸光係数は２１７，５６０、ＤＭ４に関する２８０ｎｍにおける吸光係数は５１８０Ｍ−１である。ｈｕＣ２４２およびＤＭ４の２５２ｎｍ／２８０ｎｍの吸光度の比はそれぞれ０．３６８および５．０５である。濃度は次の方程式を用いて計算された：
【０２７７】
【数１】
0006021963.tif 000059
【０２７８】
結果
【０２７９】
【表１】
0006021963.tif 000060
【０２８０】
Ｃ２４２−スルホ−ＤＭ４リンカータイトレーション
【０２８１】
【表２】
0006021963.tif 000061
【０２８２】
コンジュゲーションのプロトコル：
[226]  修飾は、ｐＨ８．０、緩衝液Ａおよび５％  ＤＭＡにおいて室温で９０分間行
われ、抗体濃度は７ｍｇ／ｍＬである。修飾された抗体を、ＮＡＰカラムにより、緩衝液Ａ  ｐＨ６．５を用いて精製した。コンジュゲーションは、５〜１０％  ＤＭＡを含む緩衝液Ａ、ｐＨ６．５において、室温で一夜行った（ｄｏｗｎ）。薬物対リンカー比は、添加された薬物の総量に依存して１．３から１．７の範囲であった。
【０２８３】
実施例２：コンジュゲートの合成。
[227]  ＳＰＰまたはＳＳＮＰＰリンカーをエタノール中でおおよそ１０ｍＭの濃度で
溶解した。抗体を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＫＰｉ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ６．５）中に透析した。リンカー反応に関して、抗体は８ｍｇ／ｍｌであり、７当量のリンカーを５％（ｖ／ｖ）エタノールの存在下で攪拌しながら添加した。反応を周囲温度で９０分間進行させた。未反応のリンカーを抗体から、示したようにｐＨ６．５の緩衝液Ａまたは１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを用いるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５ゲル濾過により除去した。ＳＰＰリンカーに関して、修飾の程度は下記のような５０ｍＭ  ＤＴＴを用いるピリジン−２−チオンの放出および３４３ｎｍにおける吸光度の測定により評価された（遊離のピリジン−２−チオンに関してε３４３＝８０８０Ｍ−１ｃｍ−１）。ＳＳＮＰＰに関して、修飾は３２５ｎｍにおける吸光度の測定により直接評価された（抗体に連結された４−ニトロピリジル−２−ジチオ基に関してε３２５＝１０，９６４Ｍ−１ｃｍ−１）。コンジュゲーション反応のため、チオールを含む薬物（ＤＭ１またはＤＣ４のどちらか）をＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）中でおおよそ１０ｍＭの濃度で溶解した。薬物（示したように、抗体あたりのリンカー分子の数と比較して０．８〜１．７倍モル過剰）を、緩衝液Ａ（ｐＨ６．５またはｐＨ７．４）中２．５ｍｇ／ｍｌの濃度である抗体に、攪拌しながらゆっくりと添加し、ＤＭＡの終濃度は３％（ｖ／ｖ）であった。その反応を、周囲温度において示した時間の間進行させた。薬物とコンジュゲートした抗体を、緩衝液Ｂ（ＰＢＳ、ｐＨ６．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを用いて精製した。ＤＭＬに関して、抗体に対する薬物のコンジュゲーションの程度を、下記のようにコンジュゲートのＡ２５２およびＡ２８０を測定することにより評価した。類似のアプローチをＤＣ４に関して用いた（下記参照）。
【０２８４】
ＳＰＰで修飾されたＡｂの放出可能なピリジン−２−チオンおよびＡｂ濃度の測定。
[228]  抗体１モルにつき放出されるピリジン−２−チオンのモル比は、試料のＡ２８
０、次いでＤＴＴ（５０μＬの１Ｍ  ＤＴＴ／試料のｍＬ）の添加の後の試料のＡ３４３の増大を測定することにより計算される。ＤＴＴにより放出されたピリジン−２−チオンの濃度は、８０８０Ｍ−１ｃｍ−１のε３４３を用いて計算される。次いで、抗体の濃度は、ＤＴＴ添加の前に測定された全Ａ２８０ｎｍからピリジン−２−チオンの２８０ｎｍにおける吸光度の寄与（ＤＴＴ後のＡ３４３ｎｍ×５１００／８０８０）を引算した後に１９４，７１２Ｍ−１ｃｍ−１のε２８０を用いて計算することができる。次いで、ピリジン−２−チオン：Ａｂのモル比を計算することができる。Ａｂのｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は、１４７，０００ｇ／モルの分子量を用いて計算される。
【０２８５】
ＳＳＮＰＰで修飾されたＡｂの、抗体と連結された５−ニトロピリジル−２−ジチオ基およびＡｂ濃度の測定。
[229]  抗体１モルにつき連結された４−ニトロピリジル−２−ジチオ基のモル比は、
ＤＴＴ処理無しの試料のＡ２８０およびＡ３２５を測定することにより計算される。抗体に結合した４−ニトロピリジル−２−ジチオ基の数は、１０，９６４Ｍ−１ｃｍ−１のε３２５ｎｍを用いて計算される。次いで、抗体の濃度は、測定された全Ａ２８０ｎｍから５−ニトロピリジル−２−ジチオ基の２８０ｎｍにおける吸光度の寄与（Ａ３２５ｎｍ×３３４４／１０９６４）を引算した後に１９４，７１２Ｍ−１ｃｍ−１のε２８０ｎｍを用いて計算することができる。次いで、４−ニトロピリジル−２−ジチオ基：Ａｂのモル比を計算することができる。Ａｂのｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は、１４７，０００ｇ／モルの分子量を用いて計算される。
【０２８６】
Ａｂ−ＤＭ１のＡｂおよびＤＭ１構成要素の濃度の計算。
[230]  ＡｂおよびＤＭ１は共に、それぞれの構成要素を別々に測定するのに用いられ
る２種類の波長、すなわち２８０および２５２ｎｍを吸収する。その構成要素は、それぞれの波長におけるそれぞれの構成要素の寄与を説明する次の代数式を用いて定量される（ＣＡｂはＡｂのモル濃度であり、ＣＤはＤＭ１のモル濃度である）：
１）全Ａ２８０＝１９４，７１２ＣＡｂ＋５，７００ＣＤ
２）全Ａ２５２＝（１９４，７１２×０．３７）ＣＡｂ＋（４．７×５，７００）ＣＤ
それぞれの方程式をＣＡｂに関して解く：
【０２８７】
【数２】
0006021963.tif 000062
【０２８８】
【数３】
0006021963.tif 000063
【０２８９】
等式を立て（ａｎ  ｅｑｕａｌｉｔｙ  ｉｓ  ｓｅｔ  ｕｐ）（方程式１ａ＝方程式２ａ）、ＣＤに関して解く：
【０２９０】
【数４】
0006021963.tif 000064
【０２９１】
[231]  一度ＣＤを計算したら、その値を用いて上記の方程式１ａ（または２ａ）にお
いてＣＡｂに関して解く。次いで、ＤＭ１：Ａｂの比率を計算することができる。抗体のｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は、１４７，０００ｇ／モルの分子量を用いて計算され、ＤＭ１の濃度は７３６．５ｇ／モル（連結されたＤＭ１）の分子量を用いて計算される。
【０２９２】
ジスルフィド交換の効率がＳＳＮＰＰにより増大する。
[232]  表１において示されているように、コンジュゲーションの効率は、ＳＳＮＰＰ
がクロスリンカーとして用いられる反応において、ＳＰＰを用いる反応と比較して増進される。そのパーセント効率は、抗体あたりのＤＭ１に関する値を抗体あたりのリンカーに関する値により割った比を１００倍することにより計算された。ＳＳＮＰＰを用いたＮ９０１抗体のコンジュゲーションは、結果としてｐＨ６．５および７．４の両方において９３％のクロスリンク効率をもたらした。これらの実験におけるＳＰＰを用いたＮ９０１のコンジュゲーションの効率は、ｐＨ６．５において７０％およびｐＨ７．４において７７％であった。ＳＳＮＰＰによる効率の増大は、目標のＤＭ１対抗体比を、低減された数のリンカー分子を用いて修飾された抗体を用いて達成することができることを示している。事実、ＳＳＮＰＰを用いて導入された抗体あたり４．２個の（５−ニトロピリジル−２−ジチオ）−基を有する抗体調製物を用いた最終的なコンジュゲートにおいて、ＳＰＰを用いて導入された５．６個のピリジル−２−ジチオ基を有する抗体と比較して、類似の薬物対抗体比（４．３）が達成された（表２）。従って、同程度のコンジュゲーション結果を得るのに必要な薬物の量は、これらの条件下で、ＳＳＮＰＰで修飾された抗体に関して、ＳＰＰで修飾された抗体よりも２５％少なかった。ＳＳＮＰＰによる効率の増大の、さらなる利益の可能性は、低減されたモル過剰量のＤＭ１をコンジュゲーション反応において用いてよいことである。その反応におけるある範囲の薬物の当量（０．８〜１．７倍過剰）とのコンジュゲーション後の抗体あたりのＤＭ１の比率の比較は、１．１倍モル過剰はＳＳＮＰＰクロスリンカーを用いた１００％のコンジュゲーション効率を達成するのに十分であることを示している（図７）。ＤＭ１とＳＳＮＰＰまたはＳＰＰを用いて修飾された抗体の反応の時間経過の比較は、例えば図８において示されている。それぞれの場合において、修飾された抗体を、組み込まれたリンカー１モルあたり１．１倍モル過剰のＤＭ１で処理した。ＳＳＮＰＰで修飾された抗体を用いた反応は、ＳＰＰで修飾された抗体を
用いた反応よりもかなり速い（図８）。１．７倍のモル過剰ですら、ＳＰＰを用いて類似の効率を達成するのに十分ではない。ＳＰＰの代わりにＳＳＮＰＰをクロスリンカーとして用いる場合、１）より低いモル過剰のＤＭ１および２）抗体あたりより少ないリンカーを用いる能力は、目標のＤＭ１対抗体比を達成するのに必要な薬物の量を５０％も減らすことを可能にする。
【０２９３】
[233]  ＳＳＮＰＰリンカーを用いて増大したコンジュゲーションの効率は、コンジュ
ゲートの単量体的特徴における、およびその抗体コンジュゲートと関係するコンジュゲートしていない（遊離の）薬物の量における妥協無しに成し遂げられる。単量体、二量体、三量体、またはより高い分子量の集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）の量を決定するために、ＳＥＣ分析が用いられる。表１に示したように、どちらのリンカーを用いても、単量体が９０％を超える典型的な結果が得られた。コンジュゲートしていない薬物のレベルを、コンジュゲート試料の逆相ＨＰＣＬ分析により測定した。それぞれの反応に関する遊離の薬物のパーセントは２％未満であった。加えて、ＳＳＮＰＰを用いると、ＳＰＰと比較してより短いコンジュゲーション反応時間が可能であり（米国特許第６，９１３，７４８号）、それはコンジュゲーション反応において必要な有機溶媒に長くさらされることに影響を受けやすい一部の抗体の喪失を減少させる可能性がある。より短い反応時間は、コンジュゲーションの間の競合する副反応であるＤＭ１の二量体化による薬物の喪失も減少させるはずである。結果として得られる収率の増大および副反応の低減は、ＤＭ１の必要量の低減にさらに貢献するはずである。
【０２９４】
[234]  ＳＳＮＰＰを用いる場合の増進されたコンジュゲーションの速度および効率は
、異なる薬物をその抗体にコンジュゲートさせる際にも観察され、これはこの新規のリンカー試薬の広い適用可能性を示している。Ｎ９０１抗体をＤＮＡアルキル化剤、ＤＣ４、ＣＣ−１０６５類似体とコンジュゲートする際の、ＳＳＮＰＰおよびＳＰＰを用いたコンジュゲーション効率の比較が、例えば表３において示されている。２時間までにＳＳＮＰＰクロスリンク試薬を用いた反応は完了したが、一方でＳＰＰ試薬を用いた反応は２時間までに７３％の完了度しか示さず、２時間を過ぎても薬物のかなりの組み込みを示した（１８時間後に９１％）。大きく延長された反応時間のみが１００％の完了度に至る可能性がある。
【０２９５】
実施例３．スルホネート基を含むチオエーテル（切断可能で無い）およびジスルフィドリンカー類を有する抗体のマイタンシノイドコンジュゲートのインビトロ細胞毒性の評価：
[235]  スルホネート基を含むチオエーテルおよびジスルフィドリンカー類を有する抗
体−マイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性作用は、典型的には癌細胞をそのコンジュゲートと共に４〜５日間継続的に培養した後にＷＳＴ−８細胞生存度アッセイを用いて評価された。抗原を発現する癌細胞（ウェルあたり約１０００〜５０００細胞）を９６ウェルプレートにおいてウシ胎仔血清を含む通常の増殖培地中で、様々な濃度の抗体−マイタンシノイドコンジュゲートと共に約５日間培養した。次いでＷＳＴ−８試薬を添加し、約２〜５時間後に、プレートの吸光度を４５０ｎｍにおいて測定した。生存の割合をコンジュゲート濃度に対してプロットし、そのコンジュゲートのＩＣ５０値（５０％の細胞を殺す濃度）を決定した。
【０２９６】
[236]  図６０および６１は、６．０〜７．６マイタンシノイド／Ａｂを有する、スル
ホネートを含むジスルフィド結合したリンカーを有する抗ＣａｎＡｇ（ｈｕＣ２４２）−マイタンシノイドコンジュゲート（ｈｕＣ２４２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）の、３．３マイタンシノイド／Ａｂを有するコンジュゲートと比較した、ＣａｎＡｇ陽性ＣＯＬＯ２０５およびＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性の増進を示す。高いマイタンシノイド類のロードを有するコンジュゲートの効力は、８個までのマイタンシノイド分子
による抗体の装飾は標的のＣＯＬＯ２０５細胞へのそのコンジュゲートの結合に影響を与えなかったことを示している。
【０２９７】
[237]  図６４は、類似のマイタンシノイドのロードを有する抗ＣａｎＡｇ  Ａｂ−マ
イタンシノイドコンジュゲートの、ＣａｎＡｇ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性活性を示す。ジスルフィドリンカー中のスルホネート基の存在は、これらの多剤耐性細胞に対するコンジュゲートの効力を著しく増進させた。スルホネートで連結されたコンジュゲートのその増進された効力は新しい発見であり、療法的適用に関して非常に期待できる可能性がある。
【０２９８】
[238]  図６３は、類似のマイタンシノイドのロードを有する抗ＥｐＣＡＭ  Ａｂ−マ
イタンシノイドコンジュゲートの、ＥｐＣＡＭ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性活性を示す。ジスルフィドリンカー中のスルホネート基の存在は、これらの多剤耐性細胞に対するコンジュゲートの効力を著しく増進させた。スルホネートで連結されたコンジュゲートのその増進された効力は新しい発見であり、療法的適用に関して非常に期待できる可能性がある。
【０２９９】
[239]  図６４は、類似のマイタンシノイドのロードを有する抗ＥｐＣＡＭ  Ａｂ−マ
イタンシノイドコンジュゲートの、ＥｐＣＡＭ抗原陽性ＨＣＴ細胞に対する細胞毒性活性を示す。ジスルフィドリンカー中のスルホネート基の存在は、これらの多剤耐性細胞に対するコンジュゲートの効力を著しく増進させた。スルホネートで連結されたコンジュゲートのその増進された効力は新しい発見であり、療法的適用に関して非常に期待できる可能性がある。
【０３００】
[240]  図６５は、類似のマイタンシノイドのロードを有する抗ＥｐＣＡＭ  Ａｂ−マ
イタンシノイドコンジュゲートの、ＥｐＣＡＭ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性活性を示す。チオエーテルリンカー中のスルホネート基の存在は、これらの多剤耐性細胞に対するコンジュゲートの効力を著しく増進させた。スルホネートで連結されたコンジュゲートのその増進された効力は新しい発見であり、療法的適用に関して非常に期待できる可能性がある。
【０３０１】
実施例４．抗ＥｐＣＡＭ−マイタンシノイドコンジュゲート、Ｂ３８．１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＢ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の、結腸癌、ＣＯＬＯ２０５およびＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ、異種移植片に対するインビボでの抗腫瘍活性の比較：
[241]  Ｂ３８．１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＢ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
コンジュゲートの抗腫瘍作用を、ヒト結腸癌腫の異種移植片モデルであるＣＯＬＯ２０５およびＰ糖タンパク質を過剰発現するように設計されたＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲにおいて評価した。その細胞をＳＣＩＤマウスの右肩の下の領域中に皮下注射した。その腫瘍の体積がおおよそ２００ｍｍ３の大きさに達した時に、そのマウスを腫瘍の体積によりランダム化し、３個のグループに分けた。それぞれのグループをＢ３８．１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（１０ｍｇコンジュゲートタンパク質／ｋｇ）、Ｂ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（１０ｍｇコンジュゲートタンパク質／ｋｇ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ヒビクル対照）のいずれかの１回の静脈内大量瞬時投与で処理した。腫瘍の成長を、週に２回腫瘍の大きさを測定することにより監視した。腫瘍の大きさは、次の式により計算された：長さ×幅×高さ×１／２。
【０３０２】
[242]  個々のＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ腫瘍の体積の変化を図６６において示す。どち
らかのコンジュゲートを用いた処理は、結果として腫瘍の成長の有意な遅延をもたらした。Ｂ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はこのヒト結腸癌の異種移植片モデルにおいてＢ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４よりも有効であった。
【０３０３】
[243]  個々のＣＯＬＯ２０５腫瘍の体積の変化を図６７において示す。どちらかのコ
ンジュゲートを用いた処理は、結果として腫瘍の成長の有意な遅延をもたらした。Ｂ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理された６匹の動物の内の２匹は、完全な腫瘍の退縮を示した。従って、このモデルにおいてＢ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はＢ３８．１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４よりも有意に有効であった。
【０３０４】
実施例５．プロ荷電リンカー類（ＣＸ１−１）の合成：
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−ＯｔＢｕ
【０３０５】
【化５８】
0006021963.tif 000065
【０３０６】
[244]  １．３ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ、０．５８
３ｇ（４．０ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル−３−アミノプロピオネート、０．６５１ｇ（４．２５ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾールおよび０．８１ｇ（４．２３ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を、５０ｍＬフラスコの中に量り取り、次いで２０ｍＬのジメチルホルムアミド中で窒素雰囲気下での電磁式攪拌により溶解した。３時間後、反応混合物を５ｍＬ部分において５．０ｃｍ×２５ｃｍ  Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムを１００ｍＬ／分で、０．３％ギ酸、５％アセトニトリルを含む脱イオン水で１０分間、続いて５％アセトニトリルから９０％アセトニトリルまでの１５分間の直線勾配を用いて流した（ｒｕｎ）。生成物の画分（１９分の保持時間）を合わせ、真空下でのロータリーエバポレーションにより溶媒を除去すると、１．３５ｇ（７５％）の表題化合物が得られた。1H NMR
(d6-DMSO) 8.16 (t, J = 5.2 Hz,1H), 8.10 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.82 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.25 - 7.4 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 3.74 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.67 (t, J =
6.4 Hz, 4H), 3.25 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.39 (s, 9H). 13C NMR (d6-DMSO) 170.45, 169.61, 169.00, 168.63, 156.49, 136.94, 128.30, 127.76, 127.69, 79.89, 65.51, 43.56, 42.10, 41.90, 34.89, 34.78, 27.70. HRMS ( M +Na+)
計算値473.2012  実測値473.1995。
【０３０７】
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−ＯｔＢｕ
【０３０８】
【化５９】
0006021963.tif 000066
【０３０９】
[245]  １．３ｇ（２．８９ｍｍｏｌ）のＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−
ＯｔＢｕを、２５０ｍＬパールシェーカー（ｐａｒｒ  ｓｈａｋｅｒ）フラスコ中で８０ｍＬの９５：５  メタノール：脱イオン水中で溶解し、それに０．１２ｇの炭素上１０％パラジウムを添加した。そのフラスコを水素雰囲気下（４２ＰＳＩ）で７時間振とうした。混合物をセライト濾過助剤を通して真空濾過し、濾液を真空下でのロータリーエバポレーションにより濃縮すると、０．８８ｇ（９６％）の表題化合物が得られた。1H NMR (d6-DMSO) 8.12 (t, J = 1.6Hz 2H), 8.08 (t, J =1.6 Hz, 1H), 3.75 (s,2H), 3.64 (d, J = 5.9 2H), 3.28 (bs, 2H), 3.24 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.13 (s, 2H), 2.35 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.39 (s, 9H). 13C NMR (d6-DMSO) 173.38, 170.46, 169.18, 168.70, 79.8
9, 44.65, 41.95, 34.88, 34.78, 27.71. HRMS (M + H+) 計算値317.1825、実測値317.1801。
【０３１０】
Ｍａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−ＯｔＢｕ
【０３１１】
【化６０】
0006021963.tif 000067
【０３１２】
[246]  ５１３ｍｇ（２．８ｍｍｏｌ）の４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ
−１Ｈ−ピロール−１−イル）ブタン酸、８００ｍｇ（０．２．８ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−（２−アミノアセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）プロパノエートおよび５８３ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を、１２ｍＬのジメチルホルムアミド中で溶解し、３時間攪拌した。反応混合物を、４つの同量の部分において、５．０ｃｍ×２５ｃｍ
Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムを１００ｍＬ／分で、０．３％ギ酸および５％アセトニトリルを含む脱イオン水で１０分間、続いて５％アセトニトリルから３３％アセトニトリルまでの１３分間の直線勾配により溶離した。生成物の画分（２１分の保持時間）を合わせ、真空下でのロータリーエバポレーションにより溶媒を除去すると、８３２ｍｇ（６２％）の表題化合物が得られた。1H NMR (d6-DMSO) 8.10-8.16
(m, 2H), 8.07 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 7.0 - 7.15(m, 1H), 3.747 (t, J = 6.0 Hz, 3H), 3.64 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.8, 2H), 3.1-3.33 (m, 1H), 3.19-3.26 (m, 2H), 2.348 (t, J = 6.8, 2H), 2.132 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.67 - 1.76 (m, 2H), 1.39 (s, 9H). 13C NMR (d6-DMSO) 171.80, 170.98, 170.39, 169.48, 168.96, 168.56, 134.37, 79.83, 42.05, 41.83, 37.38, 34.82, 34.71, 32.26, 27.83, 23.95. HRMS (M +
Na+) 計算値504.2070  実測値504.2046。
【０３１３】
Ｍａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−ＯＨ
【０３１４】
【化６１】
0006021963.tif 000068
【０３１５】
[247]  ８２０ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＭａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−β−Ａｌａ−ＯｔＢｕを、９．０ｍｌの９５：５  トリフルオロ酢酸：脱イオン水中で溶解し（ｄｉｓｏｌｖｅｄ）、３時間電磁式攪拌した。真空下でのロータリーエバポレーションにより溶媒を除去すると、７３０ｍｇ（１００％）の表題化合物が得られた。1H NMR (d6-DMSO) 12.1 (bs, 1H), 8.05-8.20 (m, 3H), 7.82 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.65 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.26 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H,), 2.14 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 1.67-1.77 (m, 2H). 13C NMR (d6-DMSO) 172.70, 171.83, 171.01, 169.50, 168.99,
168.51, 134.38, 42.07, 41.84, 36.75, 34.70, 33.69, 32.28, 23.97 HRMS (M + Na+) 計算値448.1444  実測値448.1465。
【０３１６】
Ｍａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−ＯＮＨＳ（ＣＸ１−１）
【０３１７】
【化６２】
0006021963.tif 000069
【０３１８】
[248]  ７６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＭａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−β−Ａｌａ−ＯＨ、７２ｍｇ（０．３７６ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩および６６ｍｇ（０．５７５ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、１．０ｍＬのジメチルホルムアミド中で、電磁式攪拌により溶解した（ｄｉｓｏｌｖｅｄ）。２時間後、反応混合物を２つの同量の部分において１．９ｃｍ×１０ｃｍ  Ｃ８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムを１８ｍＬ／分で、０．３％ギ酸および５％１，４−ジオキサンを含む脱イオン水で３分間、続いて５％１，４−ジオキサンから３０％１，４−ジオキサンまでの１５分間の直線勾配により溶離した。生成物の画分（保持時間６．５分）をフラスコ中に集め、ドライアイスアセトン浴中で急速凍結させた。周囲温度における凍結乾燥により溶媒を除去すると、４０ｍｇ（４２％）の表題化合物が得られた。1H NMR (d6-DMSO) 8.08-8.11 (m, 3H), 7.99 (t, J = 6.4 Hz,1H), 7.00 (s, 2H), 3.6-3.75 (m, 6H), 3.0-3.2 (m, 4H), 2.84 ( s, 4H), 2.13 (t, J = 7.6 Hz), 1.83-1.93 (m, 2H), 1.69-1.72 (m, 2H). HRMS (M + Na+) 計算値545.1608  実測値545.1638。
【０３１９】
Ｚ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
【０３２０】
【化６３】
0006021963.tif 000070
【０３２１】
[249]  ４０ｍｌのジメチルホルムアミドを、２．５２ｇ（７．４７ｍｍｏｌ）のＺ−
Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１．３ｇ（８．４９ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール、１．３ｇ（７．７６ｍｍｏｌ）のＨ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＮＨ２、および１．５２ｇ（７．９３ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩に添加した。２．５ｍｌ（１４．３ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンを添加し、反応物を一夜攪拌した。反応混合物を、３つの同量の部分において、分取５ｃｍ×２５ｃｍ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムへの直接注入により精製した。カラムを１００ｍＬ／分で、０．３％ギ酸および５％アセトニトリルを含む脱イオン水で１０分間、続いて５％アセトニトリルから９０％アセトニトリルまでの１５分間の直線勾配を用いて流した（ｒｕｎ）。生成物の画分（保持時間１８〜２０分）を合わせ、真空下でのロータリーエバポレーションにより溶媒を除去すると、２．９ｇ（８３％）の表題化合物が得られた。1H
NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 - 7.68 (m, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.27 (q, J = 4.9, 5H), 6.90 (s, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (d, J = 6.8, 1H), 5.08 (d, J = 12.0, 1H), 4.98 (d, J = 12.2, 1H), 4.20 (dd, J = 12.9, 7.6, 1H), 3.84-3.95 (m, 2H), 3.83 (d, J = 5.0, 2H), 2.42 - 2.19 (m, 2H), 2.07 (d, J = 6.9, 1H), 1.96 - 1.83 (m, 1H), 1.39 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 171.79, 171.65, 170.82, 168.87, 163.04, 156.08, 136.86, 128.31, 127.74, 79.64, 65.58, 53.96, 42.17, 41.81, 31.25, 27.73,
27.01。
【０３２２】
Ｈ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
【０３２３】
【化６４】
0006021963.tif 000071
【０３２４】
[250]  ９４０ｍｇ（２．０９ｍｍｏｌ）のＺ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
ＮＨ２を、２５０ｍＬガラスＰＡＲＲ水素化シェーカーフラスコ（ｆｌａｋ）中の４０ｍｌの９５：５  メタノール：脱イオン水中で溶解した。２２２ｍｇの１０％炭素上パラジウムをフラスコに添加し、内容物を水素（４０ＰＳＩ）の下で４時間振とうして水素化した。混合物をセライト濾過助剤を通して真空濾過し、ロータリーエバポレーションにより溶媒を濾液から除去すると、６４０ｍｇ（９４％）の表題化合物が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 4.03 (s, 1H), 3.75 (d, J = 3.3, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.30 - 3.22 (m, J = 3.6, 1H), 3.14 - 3.10 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.9, 2H), 1.84 (td, J = 13.6,
7.4, 1H), 1.63 (td, J = 15.0, 7.5, 1H), 1.39 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, MeOD) 
δ 176.53, 174.24, 172.00, 170.32, 81.82, 55.21, 43.64, 43.16, 40.44, 32.31, 30.45, 28.41. HRMS (M + H+) 計算値317.1825  実測値317.1800。
【０３２５】
Ｅ００１００８−２８  Ｍａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
【０３２６】
【化６５】
0006021963.tif 000072
【０３２７】
[251]  ６０３ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）のＨ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
ＮＨ２、３７２ｍｇ（２．０３ｍｍｏｌ）のＭａｌ−Ｇａｂａ−ＯＨおよび４３０ｍｇ（２．２４ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を、４．５ｍｌのジメチルホルムアミドおよび８００μＬのジクロロメタン中で溶解した。反応物を周囲温度で３時間攪拌した。反応混合物を、２つの同量の部分において、分取５ｃｍ×２５ｃｍ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムへの直接注入により精製した。カラムを１００ｍＬ／分で、０．３％ギ酸および５％アセトニトリルを含む脱イオン水で１０分間、続いて５％アセトニトリルから９０％アセトニトリルまでの１５分間の直線勾配を用いて流した（ｒｕｎ）。生成物の画分（保持時間１７．４〜１９．２分）を合わせ、真空下でのロータリーエバポレーションにより溶媒を除去すると、２．９ｇ（８３％）の表題化合物が得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.16 (t, J = 5.7, 1H), 8.06 (d, J
= 7.4, 1H), 7.99 (t, J = 5.8, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.06 (s, 2H), 4.18 (dd, J = 13.4, 7.9, 1H), 3.70 (d, J = 5.7, 2H), 3.62 (d, J = 5.8, 2H), 3.42 - 3.37 (m, 2H),
2.23 (t, J = 8.0, 2H), 2.12 (dd, J = 8.1, 6.4, 2H), 1.87 (dt, J = 14.2, 7.9, 1H), 1.70 (dt, J = 13.7, 6.8, 2H), 1.38 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 173.12, 171.77, 171.65, 171.03, 170.79, 168.89, 134.43, 79.62, 52.02, 42.14, 41.81, 36
.80, 32.29, 31.22, 27.73, 26.95, 24.02. HRMS (M + Na+) 計算値504.2070  実測値504.2053。
【０３２８】
Ｍａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
【０３２９】
【化６６】
0006021963.tif 000073
【０３３０】
[252]  １０５ｍｇ（０．２１８ｍｍｏｌ）のＭａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を、５ｍｌの９５：５トリフルオロ酢酸：脱イオン水中で溶解し、２時間電磁式攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、残留物を６ｍＬアセトニトリル＋１．５ｍＬトルエン中で回収して（ｔａｋｅｎ  ｕｐ）懸濁液を得た。溶媒を懸濁液から真空下でのロータリーエバポレーションにより蒸発させると、９２ｍｇ（１００％）の表題化合物が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 6.99 (s, 2H), 4.18 (dd, J = 8.2, 5.7, 1H), 3.70 (s, 2H), 3.61 (s, 2H), 3.40 (t, J = 6.8, 2H), 2.26 (t, J = 7.8, 2H), 2.19 - 2.05 (m, 2H), 1.90 (dt, J = 13.7, 7.4, 1H), 1.73
(dt, J = 14.2, 7.5, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 173.76, 171.72, 170.99, 170.70, 168.81, 134.37, 52.00, 41.97, 41.63, 36.75, 32.19, 29.95, 26.79, 23.93。
【０３３１】
Ｍａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｕ（ＯＮＨＳ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
【０３３２】
【化６７】
0006021963.tif 000074
【０３３３】
[253]  ９４ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＭａｌ−Ｇａｂａ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−ＮＨ２、７５ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１１０ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を、１ｍｌのジメチルホルムアミド中で３時間電磁式攪拌した。粗製の反応混合物を、３つの同量の部分において、１．９ｃｍ×１０ｃｍ  Ｃ８カラムへの直接注入により精製した。カラムを１８ｍＬ／分で、０．３％ギ酸および５％１，４−ジオキサンを含む脱イオン水で３分間、続いて５％１，４−ジオキサンから３０％１，４−ジオキサンまでの１８分間の直線勾配を用いて流した。生成物の画分（保持時間７．３分）をフラスコ中に集め、ドライアイス／アセトン浴中で急速凍結させた。凍結した物質を合わせて凍結乾燥すると、８０ｍｇ（７０％）の表題化合物が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.20 (t, J = 5.4, 1H), 8.13 (d, J = 7.3, 1H), 8.03 (t, J = 5.6, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.01 (s, 2H), 4.29 (dd, J = 13.7, 6.5, 1H), 3.84 - 3.69 (m, 2H), 3.63 (d, J = 5.7, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.41 (t, J = 6.8, 2H), 2.81
(s, 3H), 2.78 - 2.69 (m, 2H), 2.15 (dd, J = 9.1, 6.2, 1H), 2.10 - 1.95 (m, 1H),
1.88 (dt, J = 17.0, 7.5, 1H), 1.73 (dd, J = 14.0, 6.9, 2H). HRMS (M + Na+) 計算値545.1608  実測値545.1627。
【０３３４】
実施例６．正に荷電したリンカーの合成
【０３３５】
【化６８】
0006021963.tif 000075
【０３３６】
３−（ジメチルアミノ）ジヒドロチオフェン−２（３Ｈ）−オン（２１７）．
[254]  メタノール中の３−アミノジヒドロチオフェン−２（３Ｈ）−オン塩酸塩（２
１３）（１．０ｇ，６．５１ｍｍｏｌ）およびホルムアルデヒド（３ｍｌ，４０．３ｍｍｏｌ）に、シアノ水素化ほう素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｙｎｏｂｏｒｏｎｈｙｄｒｉｄｅ）（０．４０９ｇ，６．５１ｍｍｏｌ）を５つの部分で１時間で添加した。２時間攪拌した後、混合物を蒸発させ、ＥｔＡｃ中で再溶解し、１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、ＳｉＯ２カラムにより、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：３０）で溶離して精製すると、０．８１２ｇ（８６％）の表題化合物が得られた。1H
NMR (CDCl3) 3.49 (dd, 1H, J = 6.3, 12.1 Hz), 3.24 (m, 2H), 2.42 (s, 6H), 2.38 (m, 1H), 2.21 (m, 1H); 13C NMR 206.58, 73.24, 41.62, 27.47, 25.51; ESI MS m/z+146.0 (M +H), 168.0 (M +Na)。
【０３３７】
２−（ジメチルアミノ）−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸（２１８）．
[255]  ３−（ジメチルアミノ）ジヒドロチオフェン−２（３Ｈ）−オン（２１７）（
０．９５ｇ，６．５４ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび１０ｍｌのメタノール溶液中で３０分間攪拌し、Ｈ３ＰＯ４でｐＨ７．２に中和し、５０ｍｌのメタノール中の１，２−ジ（ピリジン−２−イル）ジスルファン（５．７６ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を一夜攪拌し、濃縮し、ＥｔＡｃで洗浄し、水溶液をＣ−１８カラム上に入れ、０．０１％ギ酸中５％メタノールから０．０１％ギ酸中３０％メタノールまで溶離して表題生成物を得た（３６８ｍｇ，収率２０．６５％）。1H NMR (CDl3OD) 8.31 (dd, 1H, J = 0.7, 4.7 Hz), 7.77 (m, 2H), 7.15 (dd, 1H, J = 0.8, 5.8 Hz), 3.22
(m, 1H), 2.85 (m, 2H), 2.51 (s, 6H), 2.05 (m, 2H); 13C NMR 175.00, 161.28, 150.46, 139.40, 122.60, 121.49, 71.20, 42.46, 36.29, 29.88; ESI MS m/z+ 272.9 (M + H), 295.0 (M+Na)。
【０３３８】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（ジメチルアミノ）−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート（２１９）
[256]  ２−（ジメチルアミノ）−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン
酸（２１８）（９２ｍｇ，０．３３８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（６５ｍｇ，０．５６５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１８５ｍｇ，０．９６５ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのＤＭＡ中で５０℃において一夜攪拌した。混合物を蒸発させ、ＳｉＯ２カラム上で１：１０〜１：４のメタノール／ＣＨ２Ｃｌ２で溶離して精製すると、４３ｍｇ（３５％）の表題生成物が得られた。1H NMR (CDl3OD) 8.40 (m, 1H), 7.83 (m, 2H), 
7.22 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 2.82 (m, 2H), 2.75 (s, 4H), 2.66 (s, 6H), 1.98 (m, 2H); 13C NMR 177.21, 161.78, 161.12, 150.68, 139.37, 122.70, 121.66, 70.80, 44.16, 43.15, 36.06, 27.38; ESI MS m/z+ 369.2 (M + H)。
【０３３９】
実施例７．ｈｕＭｙ９−６−ＣＸ１−１−ＤＭ１プロ荷電リンカーコンジュゲートの調製：
[257]  次のストック溶液を用いた：ＤＭＡ中３９．６ｍＭ  ＤＭ１；（２）ＣＸ１−
１リンカーのＤＭＡ中１７．８ｍＭ溶液；（３）２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２００ｍＭコハク酸緩衝液、ｐＨ５．０。抗体に対して８、１２または１６の間の当量のリンカーを含む反応混合物を、９０％リン酸緩衝液ｐＨ６．５）／１０％ＤＭＡ中４ｍｇ／ｍｌの抗体の溶液に添加し、２５℃、ｐＨ５．０で２時間反応させ、続いてＤＭ１と反応させた。
【０３４０】
[258]  Ａｂコンジュゲートを、過剰な低分子反応物から、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で平
衡化したＧ２５カラムを用いて分離した。精製されたコンジュゲートを２５℃で２日間保ち、あらゆる不安定な薬物の連結を加水分解させ、次いでそのコンジュゲートを、ＰＢＳ中で一夜、次いで１０ｍＭヒスチジン／１３０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ５．５（１×ｏ／ｎ）中で透析して遊離の薬物からさらに精製した。透析したコンジュゲートを０．２ｕｍフィルターを用いて濾過し、ＵＶ／Ｖｉｓにより分析して、マイタンシノイドおよび抗体に関する２５２および２８０ｎｍにおける既知の吸光係数を用いてＡｂあたりのマイタンシノイドの数を計算した。回収率は約７０％であり、それぞれのコンジュゲートに関して測定されたマイタンシノイド／抗体の数は、用いられたリンカーの過剰度に依存して３．７から６．８までの範囲であった。
【０３４１】
実施例８．インビボでの薬物動態：
[259]  ヒト化抗体Ｃ２４２の、３Ｈ標識ＤＭ４との荷電したスルホ−Ｍａｌリンカー
コンジュゲート（３．５および６．４ＤＭ４／Ａｂ）の、ＣＤ−１マウスにおける血漿薬物動態を、抗体ＥＬＩＳＡにより、および３Ｈの計数により分析した（図７２）。３．５および６．４Ｄ／Ａを有するＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−［３Ｈ］−ＤＭ４コンジュゲートを、それぞれ１２．９および７．９ｍｇ／ｋｇ（抗体の用量）で静脈内投与した。血漿試料の抗体価を（ヤギ抗ｈｕＩｇＧ抗体を用いた捕捉およびロバ抗ｈｕＩｇＧ抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた検出に基づく）ＥＬＩＳＡにより、および３Ｈの計数（シンチレーション計数）により測定した。図７２Ａは、ＥＬＩＳＡによる、および３Ｈの計数による、コンジュゲート濃度のこれら２種類の測定が、それぞれのコンジュゲートに関して類似の値を示したことを示している。３．５および６．４Ｄ／Ａの抗体−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートは両方とも４週間にわたって優れた血漿安定性を示し、半減期はそれぞれおおよそ１４．９日および９．７日であり、それはコンジュゲートしていない抗体に関するおおよそ１１．８日の半減期に類似している。２種類のＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートのＤＭ４／Ａｂ比（最初は３．５および６．４Ｄ／Ａ）も、血漿循環中での４週間にわたって、重要なことに比較的高い６．４Ｄ／Ａのロードにおいてさえも安定であった（図７２Ｂ）。１２ｍｇ／ｋｇで投与された、類似した４．２Ｄ／Ａのロードを有する、ＳＭＣＣで連結されたｈｕＣ２４２  Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートに関する半減期の１２．６日（ＡＵＣ＝２５９１０時間μｇ／ｍＬ）と比較して、１２．９ｍｇ／ｋｇで投与された、３．５Ｄ／Ａのロードを有する、スルホ−Ｍａｌで連結されたｈｕＣ２４２  Ａｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートの半減期は１４．９日（ＡＵＣ＝３８４４９時間μｇ／ｍＬ）であり、このようにＳＭＣＣコンジュゲートのそれを超えて大きく向上した（図３８Ｂ）。
【０３４２】
表１．Ｎ９０１抗体のＤＭ１とのコンジュゲーションにおけるＳＳＮＰＰおよびＳＰＰリンカーの比較。コンジュゲーションは、示したｐＨにおいてリンカーあたり１．７倍モル過剰のＤＭ１を用いて２時間実施した。
【０３４３】
【表３】
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【０３４４】
表２．ＳＳＮＰＰをリンカーとして用いて低減された、目標のＤＭ１対抗体比に達するのに必要なリンカー対抗体比。コンジュゲーションは、ｐＨ７．４においてリンカーあたり１．１倍モル過剰のＤＭ１を用いて２時間実施した。
【０３４５】
【表４】
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【０３４６】
表３．Ｎ９０１抗体のＤＣ４とのコンジュゲーションにおける、ＳＳＮＰＰおよびＳＰＰリンカーの比較。コンジュゲーションは、ｐＨ７．４においてリンカーあたり１．４倍モル過剰のＤＣ４を用いて示した時間実施した。
【０３４７】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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