(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補因子の非存在下において凝固活性を有することを特徴とする第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）または活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体であって、
前記補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）または活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）であり、
前記第ＩＸ因子または活性化第ＩＸ因子の変異体は、配列番号２の４７番目ないし４６１番目のアミノ酸配列を含み、２６５位のアミノ酸置換を、アミノ酸置換Ｖ１８１Ｉおよびアミノ酸置換Ｉ３８３Ｖと組み合わせて含み、
２６５位のアミノ酸置換は、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｅ、Ｋ２６５Ｆ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｈ、Ｋ２６５Ｉ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５ＳおよびＫ２６５Ｖから選択され、
前記第ＩＸ因子または活性化第ＩＸ因子の配列番号２の３０２番目ないし３１４番目のアミノ酸配列は、２６５位に対応する配列番号２の３１１番目のアミノ酸を除いてアミノ酸の変化はない、
変異第ＩＸ因子。
【請求項２】
Ｉ２９０Ｌ、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙ、Ｒ３５８Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択されたアミノ酸置換をさらに含む、請求項１の変異第ＩＸ因子。
【請求項３】
２６５位のアミノ酸置換が、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｖ、Ｋ２６５ＮおよびＫ２６５Ｄから選択される、請求項２の変異第ＩＸ因子。
【請求項４】
アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔを、Ｖ１８１ＩおよびＩ３８３Ｖの位置におけるアミノ酸置換と組み合わせて含み、さらに２９０、３８８、３４、２５、３５３および／または３５８から選択された位置におけるアミノ酸置換を含む、
請求項１〜３のいずれかの変異第ＩＸ因子。
【請求項５】
アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔを、Ｖ１８１ＩおよびＩ３８３Ｖの位置におけるアミノ酸置換と組み合わせて、そしてＩ２９０Ｌ、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙおよび／またはＲ３５８Ａから選択されたアミノ酸置換と組み合わせて含む、
請求項１〜４のいずれかの変異第ＩＸ因子。
【請求項６】
さらにＩ２９０Ｌ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択されたアミノ酸置換を含む、
またはアミノ酸置換Ｋ２６５Ｔを、Ｖ１８１ＩおよびＩ３８３Ｖのアミノ酸置換と組み合わせて含み、Ｉ２９０Ｌ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択されたアミノ酸置換と組み合わせて含む、
請求項１〜５のいずれかの変異第ＩＸ因子。
【請求項７】
変異体Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖまたは
変異体Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ
から選択される、請求項１の第ＩＸ因子変異体。
【請求項８】
補因子の非存在下において凝固活性を有することを特徴とする第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）または活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体であって、
前記補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）または活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）であり、
前記第ＩＸ因子または活性化第ＩＸ因子の変異体は、
配列番号２の４７番目ないし４６１番目のアミノ酸配列を含み、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｇ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｖ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｎ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｄ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｅ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｆ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｈ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｉ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、または
変異体Ｋ２６５Ｓ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ
から選択され、
前記第ＩＸ因子または活性化第ＩＸ因子の変異体の配列番号２の３０２番目ないし３１４番目のアミノ酸配列は、２６５位に対応する配列番号２の３１１番目のアミノ酸を除いてアミノ酸の変化はない、
変異第ＩＸ因子。
【請求項９】
タンパク質、ラベルおよび／またはポリマーを含む、請求項１〜８のいずれかの変異第ＩＸ因子。
【請求項１０】
前記タンパク質、ラベルおよび／またはポリマーが共有結合的に付着している、請求項９の変異第ＩＸ因子。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかの変異第ＩＸ因子をコードする核酸。
【請求項１２】
プロモーターおよび／または転写終結配列に作動可能に連結した、請求項１１の核酸。
【請求項１３】
発現プラスミド、遺伝子療法構築物、ウイルスもしくは非ウイルスベクターまたは遺伝子修復のための鋳型である、請求項１１または１２の核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかの第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）の少なくとも１つの変異体または請求項１１〜１３のいずれかの少なくとも１つの核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、請求項１４の薬学的組成物。
【請求項１６】
疾病の診断、予防および／または処置に使用する医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれかの第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体、請求項１１〜１３のいずれかの核酸または請求項１４または１５の薬学的組成物の使用。
【請求項１７】
前記疾病が出血性疾患または出血である、請求項１６の使用。
【請求項１８】
前記出血が、ハイリスクな手術、骨髄移植、大きな損傷、脳出血および血小板機能異常症に関連した失血に関連する、請求項１７の使用。
【請求項１９】
前記出血性疾患が、血友病Ａ、Ｆ．ＶＩＩＩ因子もしくはＦ．ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体によって引き起こされたかもしくは併発した血友病、血友病Ｂであり、
そして／または、出血性疾患が、重度の肝疾病；外傷性失血；血小板減少症および血小板機能異常症；経口抗凝血療法の速やかな是正；第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子および第ＸＩ因子の先天性欠損症；並びにフォンヴィルブランド因子に対するインヒビターによるフォンヴィルブランド病、大きな損傷に関連した失血、脳出血、血小板機能異常症を含む、バイパス剤が使用される出血性疾患である、請求項１７の使用。
【請求項２０】
前記バイパス剤が使用される出血性疾患は新生児凝固障害である、請求項１９の使用。
【請求項２１】
細胞療法、遺伝子療法またはタンパク質輸液療法のための、請求項１６〜１９のいずれかの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれかの変異第ＩＸ因子の使用を含む、抗凝血物質をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
前記抗凝血物質が、活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）を直接的に阻害する物質である、請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体、好ましくは第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体に関し、ここで、前記変異体は、その補因子の非存在下において凝固活性を有することを特徴とする。本発明はさらに、出血性疾患、特に血友病Ａおよび／または血友病ＢまたはＦ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体によって引き起こされたかもしくは併発した血友病の処置および／または予防のための、これらの変異体の使用に関する。本発明はまた、所望の特性を有し、従ってそれぞれの特定の治療適用のためにテーラーメイドできる、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）のさらなる変異体にも関する。
【０００２】
発明の背景
凝血第ＩＸ因子
凝血第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）は、凝血カスケードにおいて中心的な役割を果たしている。Ｆ．ＩＸは、単鎖の不活性なチモーゲンとして血漿中を循環するトリプシン様ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼである(DiScipio et al., 1977; Davie et al., 1991)。第ＩＸ因子は、Ｃａ２＋依存的に、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子−組織因子のいずれかによって活性化される。活性化には、活性化第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）−組織因子複合体または活性化第ＸＩ因子（Ｆ．ＸＩａ）のいずれかによる２つのペプチド結合の開裂により(Fujikawa et al., 1974; Lindquist et al., 1978）、３５残基の活性化ペプチドを除去することが必要である。
【０００３】
Ｆ．ＩＸはマルチドメインタンパク質である。Ｎ末端γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメインに、２つの表皮成長因子様（ＥＧＦ）反復配列、活性化ペプチド（ＡＰ）、およびトリプシン様活性部位を含むＣ末端セリンプロテアーゼドメインが続く(DiScipio et al., 1978)。このドメイン構造は、凝固因子のセリンプロテアーゼファミリーを規定し(Furie and Furie, 1988)、これには、第ＩＩ因子（Ｆ．ＩＩ）、第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩ）、第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）、第ＸＩ因子（Ｆ．ＸＩ）、第ＸＩＩ因子（Ｆ．ＸＩＩ）、およびプロテインＣ（ＰＣ）も含まれる。このファミリー内で、Ｆ．ＩＸａは、独特なタンパク質分解特性を有する。リン脂質表面上でのＦ．ＩＸａとＦ．ＶＩＩＩａの複合体の形成は、天然基質であるＦ．Ｘに対する反応性を１０６倍増加させるが(Duffy and Lollar, 1992)、対応するＦ．Ｘ配列を有するペプチドの開裂は全く観察されなかった(McRae et al., 1981)。
【０００４】
次いで、活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）は、カルシウムイオン、膜表面（リン脂質）、および非酵素的タンパク質補因子である活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）の存在に依存する反応において第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）を活性化する(Davie et al., 1991)。
【０００５】
止血におけるＦ．ＩＸａの重要性は、Ｆ．ＩＸ遺伝子に突然変異を有する個体における出血性疾患の血友病Ｂの発症によって反映される(Gianelli et al., 1998)。Ｆ．ＩＸａは、その補因子Ｆ．ＶＩＩＩａの非存在下では天然基質または合成基質に対して非常に僅かなタンパク質分解活性しか示さない。Ｆ．ＶＩＩＩａの結合により、Ｆ．Ｘに対するタンパク質分解活性は１０６倍増加するが、一方でペプチド基質を用いての活性はあまり影響を受けないままである(Duffy and Lollar, 1992; McRae et al., 1981)。Ｆ．ＩＸａモデュレーションの後者の基質依存性活性は、同じように、関連した凝血酵素である活性型ＰＣ（補因子はプロテインＳ）、Ｆ．Ｘａ（補因子は第Ｖａ因子）、Ｆ．ＶＩＩａ（補因子は組織因子）、およびＦＩＩａ（補因子はトロンボモデュリン）にも観察され、これらはその補因子の存在下で、その天然基質と共に有意な活性または特異的な変化を達成する(Mann et al. 2003)。全ての凝血セリンプロテアーゼは、広範な構造的および機能的相同性を共有する。
【０００６】
さらに、凝血第ＩＸａ因子（Ｆ．ＩＸａ）および第Ｘａ因子（Ｆ．Ｘａ）は両方共、リン脂質表面において補因子と共にある場合にのみ効果的に天然基質を開裂する。Hopfner et al. (1997)は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて切断短縮されたＦ．ＩＸａ（ｒｆ９ａ）およびＦ．Ｘａ（ｒｆ１０ａ）の変異体を調査して、Ｆ．Ｘａより１０４倍低いＦ．ＩＸａのアミド分解活性の差異の決定基を同定した。Ｆ．ＩＸａおよびＦ．Ｘａの結晶構造に基づいて、４つの特徴的な活性部位成分（すなわち、キモトリプシン番号付けに基づいて、Ｇｌｕ２１９、１４８−ループ、Ｉｌｅ２１３、９９−ループ）をその後、ｒｆ９ａとｒｆ１０ａとの間で交換した。さらに、４つ全ての突然変異を組み合わせることにより、本質的にＦ．Ｘａ特性がｒｆ９ａに導入され、すなわち、アミド分解活性は、Ｆ．Ｘａ基質選択性と共に１３０倍増加した。
【０００７】
酵素的には、Ｆ．ＩＸａは、補因子である第ＶＩＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）の存在下でも向上しないその非常に低いアミド分解活性によって特徴付けられ、この点においてＦ．ＩＸａは全ての他の凝血因子と異なっている。Ｆ．ＩＸａ−Ｆ．ＶＩＩＩａ複合体の活性化は、その巨大分子基質である第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）を必要とする。活性部位の近くに位置する９９−ループが、一部には、Ｆ．ＩＸａの低い活性の原因であり、なぜならそれは、サブサイトＳ２−Ｓ４において正準な基質の結合に干渉するコンフォメーションを採っているからである。Sichler et al. (2003)は、残基Ｌｙｓ−９８およびＴｙｒ−９９（キモトリプシン番号付け）が、Ｆ．ＩＸａのアミド分解特性に決定的に連関していることを開示している。Ｔｙｒ−９９をより小さな残基と交換すると、全体的に活性が減少しただけでなく、Ｓ１における結合も損なわれた。Ｌｙｓ−９８をより小さく非荷電の残基と交換すると、活性は増加した。Ｌｙｓ−９８、Ｔｙｒ−１７７およびＴｙｒ−９４の同時突然変異誘発（ｒｆ９−Ｙ９４Ｆ／Ｋ９８Ｔ／Ｙ１７７Ｔ、キモトリプシン番号付け）は、７０００倍増加した活性および第Ｘａ因子に対して変化した特異性を有する酵素を産生した。Sichler et al. (2003)は、これらの残基が第ＩＸａ因子の低い活性を説明すると結論づけた。Sichler et al. (2003)は、この三重突然変異体のｒｆ９−Ｙ９４Ｆ／Ｋ９８Ｔ／Ｙ１７７Ｔ（キモトリプシン番号付け）がおそらく、補因子および基質の結合によって生理学的に誘導されるコンフォメーション変化を模倣するのだろうと結論づけた。
【０００８】
血友病
最もよく知られている凝血因子の疾患は血友病である。血友病は、生体が血液凝固または凝血を制御する能力を損なう、遺伝性の遺伝子疾患のファミリー名である。最もよく見られる形態である血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これによりＦ．ＶＩＩＩの欠損症が起こる。遺伝はＸ連鎖劣性であり；従って、男性は発症するが女性はキャリアであるかまたは非常に稀に軽度の表現型を示す。５，０００人に１人の男性が発症する。血友病Ｂは、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）欠損症としても知られ、これは二番目に最もよく見られるタイプの血友病であるが、血友病Ｂは血友病Ａよりもはるかに頻度が少ない。
【０００９】
これらの遺伝子欠損症は、正常な凝固過程に必要とされる凝血因子の血漿中凝固因子レベルを下げる可能性がある。血管が損傷されると、一次的な瘡蓋が形成されるが、欠乏している凝血因子が、血塊を維持するのに必要とされるフィブリンの形成を妨げる。従って、血友病患者は、健常人よりも強くは出血しないが、はるかにより長い時間出血する。重度の血友病患者は、小さな損傷でさえ何日間、何週間も続くか、またはもう二度と完全には治癒しない失血が生じる可能性がある。ここでの重大なリスクは、通常の小さな出血であり、これはＦ．ＶＩＩＩの欠乏に因り、治癒するのに長い時間かかる。脳または関節内などの領域では、これは致命的であるかまたは生命を衰弱させ得る。外部損傷による出血は正常であるが、後で起こる再出血または内出血、特に筋肉、関節への出血、または閉じた空間への出血の発生率は増加する。主な合併症は、関節血症、出血、消化管出血および月経過多を含む。
【００１０】
血友病の治癒法はないが、欠損している凝固因子の定期的な点滴、すなわち血友病ＡではＦ．ＶＩＩＩまたは血友病ＢではＦ．ＩＸを用いて制御することができる。
【００１１】
西洋諸国では、血友病の治療の一般的な標準は、２つのカテゴリーの１つに該当する：（ｉ）予防または（ｉｉ）オンデマンド。予防は、自発的な出血エピソードを予防するに十分に高い凝固レベルを保持するように、定期的なスケジュールでの凝固因子の点滴を含む。オンデマンド処置は、一旦、出血エピソードが発生したらそれらを処置することを含む。
【００１２】
しかしながら、幾人かの血友病患者は、彼らに投与された置換因子に対する抗体（インヒビター）を発達させるので、前記因子の量を増加しなければならないか、または非ヒト置換製品、例えばブタＦ．ＶＩＩＩもしくはその改変変異体を投与しなければならない、例えばWO 01/68109 A1 (Emory University)を参照。
【００１３】
患者が、循環中のインヒビターの結果として置換凝固因子に対して不応性となった場合、これを組換えヒト第ＶＩＩ因子(NovoSeven（登録商標）)を用いて克服し得る、EP 1 282 438 B1およびEP 1 282 439 B1 (Novo Nordisk)も参照。このアプローチのこれまでの限界は、それぞれそして製剤に応じて、第ＶＩＩＩ因子（１０〜１４時間）または第ＩＸ因子（１８〜３０時間）と比較して第ＶＩＩａ因子（２〜３時間）の短い半減期であり、これが第ＶＩＩａ因子を用いての予防療法を困難としている。さらに、より長い期間におよび第ＶＩＩａ因子のようなすでに活性化されたプロテアーゼを使用するリスクは、血栓リスク、血管内皮の定常的な活性化および血管傷害を通したリスク、腫瘍の成長または転移を促進し得る向凝血シグナル伝達のリスクなどを含む、リスクを有し得る。
【００１４】
WO 02/40544 A2は、ヘパリンに対する突然変異体ヒトＦ．ＩＸの親和性を野生型Ｆ．ＩＸと比較して減少させる、ヘパリン結合ドメインにおける突然変異を含む突然変異体ヒト第ＩＸ因子、および血友病Ｂの治療介入におけるその使用を開示する。
【００１５】
遺伝子療法
血友病は遺伝子療法アプローチに理想的である。なぜなら、必要とされる凝血は血流中を循環しており、それ故、生体中の基本的にどこにでも発現され得るからである。さらに、重度の形態の疾病を患う患者の予防処置を用いての研究は、循環中の凝血因子の１％超の最小限の上昇がすでに臨床結果を改善し得、そして疾病によって引き起こされる病変、すなわち関節破壊の大半を回避し得ることを実証した。いくつかの遺伝子療法アプローチが開発されたが、試験は依然として初期の臨床段階である。最も見込みあるアプローチは現在、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いての血友病Ｂの処置のためのものである。
【００１６】
血友病Ｂを患うヒトの骨格筋へのＡＡＶの筋肉内注射は安全であるが、第ＩＸ因子の治療レベルを達成するにはより高い用量が必要とされる。しかしながら、用量の漸増はこのアプローチでは可能ではない。なぜなら、阻害抗体形成のリスクは、１箇所の注射部位あたりの筋肉中に発現されるＦ．ＩＸ抗原の量に依存するからである。血友病Ｂイヌモデルにおける推定により、ヒトにおいて約１％のＦ．ＩＸ発現レベルを得るには４００回超の筋肉内注射が必要であろうという結論が得られた(Arruda et al., 2004)。それ故、この手順はヒトには適用できない。このアプローチの効力は、筋肉細胞外空間におけるＦ．ＩＸの保持によって、および高い発現率で完全に活性なＦ．ＩＸを合成する筋肉の能力が低いことによって妨げられる。これらの限界を克服するために、Schuettrumpf et al. (2005)は、血友病Ｂマウスにおける筋肉または肝臓に指向された発現のためのＦ．ＩＸ変異体をコードするＡＡＶベクターを構築した。細胞外マトリックスに対して低い親和性を有する変異体であるＡＡＶ−Ｆ．ＩＸ−Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ（Ｆ．ＩＸ番号付け）の筋肉内注射後の循環中のＦ．ＩＸレベルは、野生型（ＷＴ）Ｆ．ＩＸと比較して２〜５倍高かったが、一方で、タンパク質特異的活性は同じままであった。Ｆ．ＩＸ−Ｒ３３８Ａの発現は、それぞれ骨格筋または肝臓にベクターを送達した後、Ｆ．ＩＸ−ＷＴよりも２倍または６倍高い比活性を有するタンパク質を生成した。Ｆ．ＩＸ−ＷＴおよび変異体形は、テールクリッピングアッセイにより攻撃した場合にin vivoにおいて効果的な止血を提供する。重要なことには、ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸ変異体の筋肉内注射は、Ｆ．ＩＸ−ＷＴに認容性のあるマウスにおいて、Ｆ．ＩＸに対する抗体の形成は引き起こさなかった。最初にChang et al. (1998)によって記載された、言及したＲ３３８Ａ変異体の他に、より高いＦ．ＩＸ比活性を有する別の変異体であるＶ８６Ａが記載されている(Chang et al. 2002)。
【００１７】
血友病Ｂと比較して血友病Ａへの遺伝子療法戦略の適用は、Ｆ．ＩＸと比較してＦ．ＶＩＩＩのより高い免疫原性およびより大きなサイズによってさらに複雑化される。
【００１８】
従って、当技術分野において、出血性疾患、特に血友病Ａおよび／またはＢの処置および／または予防のための改良された手段および方法を提供する必要がある。
【００１９】
従って、本発明は、従来技術において存在しているような出血性疾患の処置および／または予防のための方法および手段を改良することを目的とし、従って、本発明の目的は、出血性疾患、特に血友病Ａおよび／またはＢの効果的で、特異的でおよび標的化された処置および／または予防を可能とする改良された方法および手段を提供することである。
【００２０】
本発明によると、この目的は、凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体を提供することによって解決され、ここで、前記変異体は、その補因子の非存在下において凝固活性を有することを特徴とする。
【００２１】
凝血第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩ)、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）および第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）並びに補因子インヒビターのプロテインＣ（補因子Ｆ．ＶａおよびＦ．ＶＩＩＩａを分解する）およびトロンビンは、凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼである。ビタミンＫは、第ＩＩ因子（トロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子、並びにプロテインＳ、プロテインＣおよびプロテインＺ上のグルタミン酸残基（Ｇｌａ−ドメイン）にカルボキシル基を付加する肝γ−グルタミルカルボキシラーゼに対して必須の因子である。
【００２２】
上記に考察したように、第ＩＩ因子（Ｆ．ＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）、第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）およびプロテインＣ（ＰＣ）を含む、凝固因子のセリンプロテアーゼファミリーは、特異的なドメイン構造によって規定される(Furie and Furie, 1988)。
【００２３】
セリンプロテアーゼは、酵素の活性部位におけるセリン残基の存在によって特徴付けられる。言及したタンパク質はチモーゲン形態で循環し、そして活性部位の開裂によって活性化される。全てのビタミンＫ依存性凝血プロテアーゼの間に大きな相同性が存在する。それらの中のいくつかは、プロテアーゼ、補因子およびリン脂質膜からなる複合体に会合された場合にのみ活性の増加を示す。補因子結合の分子的効果および結合部位はこれらのタンパク質間で類似している。Ｆ．ＩＸａモデュレーションの後者の基質依存性活性は、同じように、関連した凝血酵素である活性型ＰＣ（補因子はプロテインＳ）、Ｆ．Ｘａ（補因子は第Ｖａ因子）、Ｆ．ＶＩＩａ（補因子は組織因子）、およびＦＩＩａ（補因子はトロンボモデュリン）にも観察され、これらはその補因子の存在下で、その天然基質と共に有意な活性または特異的な変化を達成する(Hockin et al. 2002)。
【００２４】
従って、凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体は、好ましくは、第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩ）、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）、第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）、プロテインＣまたはトロンビンの変異体から選択される。
【００２５】
用語「変異体」は、好ましくは、天然に存在するタンパク質のアミノ酸の置換、付加（挿入）または欠失の変異体または誘導体をいう。変異体はさらに、改変アミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド骨格／構造を模倣することのできるペプチド模倣体もしくはさらなる化合物を含む、アミノ酸配列を含む。変異体はまた、他の分子の一部による置換もしくはカップリングまたは他の分子とのカップリングを含み得る。
【００２６】
アミノ酸置換は、他のアミノ酸によるまたはアイソスター（タンパク質アミノ酸に対して近い構造的および空間的類似性を有する改変アミノ酸）による保存的並びに非保存的な置換、アミノ酸の付加またはアイソスターの付加を含む。
【００２７】
保存的なアミノ酸置換は、典型的には、同じクラスのアミノ酸間での置換に関する。これらのクラスは、例えば、
−  非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシン；
−  塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリジン、アルギニンおよびヒスチジン；
−  酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；並びに
−  非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインを含む。
【００２８】
第ＩＸ因子の変異タンパク質
本発明の好ましい態様において、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）または活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体が提供され、ここで、Ｆ．ＩＸ変異体は、その補因子の非存在下において凝固活性を有することを特徴とし、ここで、前記補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）または活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
【００２９】
本特許出願内の第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）は、Kurachi and Davie, 1982により記載されたヒトＦ．ＩＸのタンパク質およびｃＤＮＡをいう。
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡについてはRefseq NM_000133（配列番号１）、および
タンパク質配列についてはRefseq NP_000124（配列番号２）。
配列番号２のアミノ酸配列は、Ｆ．ＩＸのシグナルペプチドおよびプロペプチドを含む。実際の番号付けは、−４６（Ｍｅｔ）から始まり；＋１はＴｙｒである。
【００３０】
Ｆ．ＩＸの遺伝子並びにアミノ酸配列においていくつかの天然に生じた多形が存在する。キングス・カレッジ・ロンドンの血友病Ｂ突然変異データベースからのリスト(http://www.kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.htmlを参照)を以下に示す。例えば、最も頻度の高い多形は１４７位であり、この位置においてトレオニンが個体群の６７％において、そしてアラニンが３３％において見い出され得る。興味深いことに、あまり頻度の高くないアラニンが、唯一入手できる組換えＦ．ＩＸ治療薬に存在する。
【００３１】
【表１】
0006029826.tif 000002
【００３２】
本特許出願内の活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）は、前記したような３５アミノ酸活性化ペプチドの開裂を通して活性化されたＦ．ＩＸ分子をいう。
【００３３】
凝血第Ｆ．ＩＸ因子および第Ｆ．ＶＩＩＩ因子は両方共に常に、その機能を示し得る前に活性化されなくてはならないので、Ｆ．ＩＸ／Ｆ．ＩＸａまたはＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの両方を同義語として使用することができる。
【００３４】
アミノ酸残基の番号付けのために、Ｆ．ＩＸ番号付けシステムが使用される（Kurachi and Davie, 1982による、特記した場合を除く）。当技術分野において幾人かの著者によって、キモトリプシノーゲンの番号付けが、セリンプロテアーゼのキモトリプシンに対して相同性がある特定のアミノ酸の記載に使用されている。本発明では、キモトリプシン番号付けを、本明細書において明示した場合にのみ使用する。
【００３５】
Ｆ．ＩＸの「凝固活性」または「機能的活性」は、Ｆ．ＩＸ比活性ということができ、これは通常、ユニット/mg（Ｕ/mg）で測定される。Ｆ．ＩＸの１ユニット（１Ｕ）は１ミリリットル（ml）の正常なヒト血漿中のＦ．ＩＸの量（これは５０００ngのＦ．ＩＸに相当する）といわれるので、通常の比活性は約２００Ｕ/mgである。Ｆ．ＩＸの比活性は、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下における血漿中のプロテアーゼ活性として定義されるので、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における（凝固）活性についての当技術分野において使用されている定義は存在しない。それ故、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性、これを「Ｆ．ＶＩＩＩ様活性」とも呼ぶが、これは本明細書において等量の野生型Ｆ．ＩＸがＦ．ＶＩＩＩの存在下において示すであろう活性の比率として表現される。
【００３６】
従って、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが血液中の凝固性Ｆ．ＶＩＩＩの非存在によって引き起こされた凝血欠損症（これは、疾病の場合においては、Ｆ．ＶＩＩＩタンパク質の非存在、欠陥のあるＦ．ＶＩＩＩタンパク質の存在、またはＦ．ＶＩＩＩタンパク質の阻害、例えば阻害抗体による阻害のいずれかに起因し得る）を修正する場合、その補因子の非存在下において「凝固活性」を有する。
【００３７】
凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体、好ましくはＦ．ＩＸ変異体の「凝固活性」または「機能的活性」を決定するために本発明において使用されるアッセイシステムは、ａＰＴＴに基づいた一段アッセイである。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴまたはＡＰＴＴ）は、「内在性」凝血経路（現在では接触活性化経路といわれる）および共通凝血経路の両方の効力を測定する成績指標である。それは、血液凝固における異常の検出とは別に、主要な抗凝血剤であるヘパリンを用いての処置効果をモニタリングするためにも使用される。試料中のＦ．ＶＩＩＩまたはＦ．ＩＸの活性レベルの決定のために、試験は、それぞれＦ．ＶＩＩＩまたはＦ．ＩＸの活性の測定のためにＦ．ＶＩＩＩまたはＦ．ＩＸ欠損血漿中に試料を添加することによって行なわれる。この試験は、Ｆ．ＶＩＩＩまたはＦ．ＩＸの一段アッセイといわれる。現在、Ｆ．ＩＸ変異体のＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性を、一段アッセイによって、そしてＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿を使用して決定することができる。
【００３８】
簡潔には、血液を、カルシウムと結合することによって凝血を抑止するオキサレートまたはシトレートを用いて回収する。血漿を、遠心分離によって血液の血球部分から分離する。組換え発現されそして精製されたタンパク質の場合、前記タンパク質をイミダゾール緩衝液中で希釈する。試料を混合し、そして標準化した因子（ＶＩＩＩまたはＩＸ）欠損血漿に加える。内在性経路を活性化するために、リン脂質、アクチベーター（例えばシリカ、セライト、カオリン、エラグ酸）およびカルシウム（オキサレートの抗凝血作用を逆転するため）を血漿試料中に混合する。血栓（血塊）が形成されるまでの時間を測定する。試験は、反応混合物に組織因子が存在しないことに因り「部分」と呼ばれる(Langdell et al., 1953参照)。
【００３９】
好ましくは、本発明による第ＩＸ因子変異体は、臨床的に関連した凝固活性（または臨床的関連性を有する凝固活性）、すなわち、前記変異体を、本明細書において以下に開示したような臨床適用に適したものにさせる凝固活性を有する。
【００４０】
臨床的関連性を有する好ましい凝固活性は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において前記変異体の１％以上の凝固活性であり、ここで、１００％は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩまたはＦ．ＶＩＩＩａの存在下における野生型Ｆ．ＩＸの活性をいう。
【００４１】
約１％を維持した第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子のレベルは、重度の血友病患者における主要な出血性合併症を予防するための予防処置レジメンにおいて十分である。Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において「１％のＦ．ＶＩＩＩ様」活性を有する第ＩＸ因子変異体を用いて、重度の血友病Ａ患者において１％レベルに到達するためには、すでに生理的に存在するＦ．ＩＸに加えて、正常（約５０００ng/ml）の１００％のＦ．ＩＸ変異体レベルが必要となろう。このような処置は実行可能と思われ、それ故、臨床的に関連した「第ＶＩＩＩ因子様」活性は１％と推定される。
【００４２】
１つの態様において、本発明の変異第ＩＸ因子は、好ましくはアミノ酸の置換、挿入および／または欠失による、９９−ループの改変を含む。９９−ループの改変を、隣接するアミノ酸残基または別様に９９−ループと相互作用する残基のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失によりループ構造に影響を及ぼすことによっても達成することができる。
【００４３】
第ＩＸ因子の９９−ループまたは挿入ループ８０〜９０（キモトリプシノーゲン番号付けによる）は、アミノ酸残基２５６〜２６８（Ｆ．ＩＸ番号付け）を包含する。９９−ループは活性部位の近くに位置し、そしてＦ．ＩＸの活性化に役割を果たす。Sichler et al. (2003)によると、Ｔｙｒ−１７７は不活性なコンフォメーションで９９−ループを固定化し、これは生理的複合体において補因子Ｆ．ＶＩＩＩａによって解き放たれる。その後、Ｆ．Ｘは、固定化されていない９９−ループを再編成でき、その後、活性部位間隙に結合する。
【００４４】
本発明による変異第ＩＸ因子は、好ましくは、
２６５、４、３３８、３７７、２５９、３４５、１、１０、３７、５０、８５、１１６、１１９、１２０、１８１、２１７、２３５、２４５、２５３、２５９、３０１、３６０、３８３、３４０、８６、２５、３４、２９０、２９１、２７４、３５３、３５８、３７５、３８８、３５、
好ましくは、Ｋ２６５Ｔ、Ｇ４Ｙ、Ｒ３３８Ａ、Ｓ３７７Ｗ、Ｙ２５９Ｆ、Ｙ３４５Ｔ、Ｙ１Ａ、Ｖ１０Ｋ、Ｒ３７Ｔ、Ｑ５０Ｐ、Ｄ８５Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｒ１１９Ａ、Ｎ１２０Ａ、Ｖ１８１Ｉ、Ｖ２１７Ｌ、Ｅ２３５Ｋ、Ｅ２４５Ｖ、Ｖ２５３Ｉ、Ｙ２５９Ｆ、Ｋ３０１Ｉ、Ｓ３６０Ａ、Ｉ３８３Ｖ、Ｔ３４０Ｓ、Ｖ８６Ａ、Ｆ２５Ｙ、Ｎ３４Ｄ、Ｉ２９０Ｌ、Ａ２９１Ｐ、Ｅ２７４Ｋ、Ｆ３５３Ｙ、Ｒ３５８Ａ、Ｇ３７５Ｆ、Ｅ３８８Ｇ、Ｔ３５Ｄおよび／または９９−ループの改変、
あるいは好ましくは、２６５、４、３３８、３７７、２５９、３４５、１、１０、３７、５０、８５、１１６、１１９、１２０、１８１、２１７、２３５、２４５、２５３、２５９、３０１、３６０、３８３、３４０、８６、２５、３４、２９０、２９１、２７４、３５３、３５８、３７５、３８８、３５、２７７、
あるいは好ましくはＫ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｇ４Ｙ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｙ２５９Ｆ、Ｙ３４５Ｔ、Ｙ１Ａ、Ｖ１０Ｋ、Ｒ３７Ｔ、Ｑ５０Ｐ、Ｄ８５Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｒ１１９Ａ、Ｎ１２０Ａ、Ｖ１８１Ｉ、Ｖ２１７Ｌ、Ｅ２７７Ａ、Ｅ２３５Ｋ、Ｅ２４５Ｖ、Ｖ２５３Ｉ、Ｙ２５９Ｆ、Ｋ３０１Ｉ、Ｓ３６０Ａ、Ｉ３８３Ｖ、Ｔ３４０Ｓ、Ｖ８６Ａ、Ｆ２５Ｙ、Ｎ３４Ｄ、Ｉ２９０Ｌ、Ａ２９１Ｐ、Ｅ２７４Ｋ、Ｆ３５３Ｙ、Ｒ３５８Ａ、Ｇ３７５Ｆ、Ｅ３８８Ｇ、Ｔ３５Ｄおよび／または９９−ループの改変、
の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００４５】
好ましくは、本発明による変異第ＩＸ因子は、２５５〜２６９、３８３、１８１、２９０、３８８、３４、２５、３５３、３５８、３３８、３７７、４、８６、２１７、２７７および／または９９−ループの改変の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００４６】
より好ましくは、変異第ＩＸ因子は、Ｋ２６５Ｔ、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉ、Ｉ２９０Ｌ、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙ、Ｒ３５８Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌ、Ｅ２７７Ａおよび／または９９−ループの改変から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００４７】
好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、２６５位（キモトリプシノーゲン番号付けによると９８位）におけるアミノ酸置換、好ましくはＫ２６５Ｔ（キモトリプシノーゲン番号付けによるとＫ９８Ｔ）、または好ましくは、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｖ、Ｋ２６５ＮおよびＫ２６５Ｄから選択された２６５位におけるアミノ酸置換を含む。
【００４８】
好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、２６５位におけるアミノ酸置換（好ましくはＫ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｖ、Ｋ２６５ＮおよびＫ２６５Ｄから選択される）またはアミノ酸置換Ｋ２６５Ｔ（キモトリプシノーゲン番号付けによるとＫ９８Ｔ）を、さらなるアミノ酸置換と組み合わせて含む。
【００４９】
さらなるアミノ酸置換は、好ましくは、４、３３８、３７７、２５９、３４５、１、１０、３７、５０、８５、１１６、１１９、１２０、１８１、２１７、２３５、２４５、２５３、２５９、３０１、３６０、３８３、３４０、８６、２５、３４、２９０、２９１、２７４、３５３、３５８、３７５、３８８、３５および／または２７７の群から選択された、
より好ましくは、３８３、１８１、２９０、３８８、３４、２５、３５３、３５８、３３８、３７７、４、８６、２１７および／または２７７の群から選択された位置における１つの（より好ましくは少なくとも１つの）アミノ酸置換である。
【００５０】
より好ましくは、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉ、Ｉ２９０Ｌ、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙ、Ｒ３５８Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択された１つのアミノ酸置換とを含む。
【００５１】
より好ましくは、変異第ＩＸ因子は、２６５位におけるアミノ酸置換またはアミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉ、Ｉ２９０Ｌ、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙ、Ｒ３５８Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択されたアミノ酸置換（と組み合わせて）とを含む。
【００５２】
本発明のさらに好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸位置２６５、４、３３８、３７７、２５９、３４５、１、１０、３７、５０、８５、１１６、１１９、１２０、１８１、２１７、２３５、２４５、２５３、２５９、３０１、３６０、３８３、３４０、８６、２５、３４、２９０、２９１、２７４、３５３、３５８、３７５、３８８、３５、２７７の群からの複数のアミノ酸置換を含み、
ここで、「複数のアミノ酸置換」は、２、３、４またはそれ以上の位置における置換をいう。
【００５３】
基本Ｆ．ＩＸ変異体（グループＡ）
本発明者らは、出血性疾患のＦ．ＶＩＩＩ非依存性療法を可能とするＦ．ＩＸ変異体（２６５位においてアミノ酸置換を、好ましくはＫ２６５Ｔ（キモトリプシン番号付けによるとＫ９８Ｔ）を有する変異体）を発見した。Ｋ２６５Ｔは、Sichler et al. 2003において異なる脈絡で記載されている。Kolkman and Mertens (2000)はＫ２６５Ａ変異体を記載している。
【００５４】
本発明者らによって評価されたＦ．ＩＸの突然変異／変異は、Ｆ．ＩＸａが、Ｆ．Ｘａのような他のセリンプロテアーゼと比較して低い活性を有するという観察に基づく。事実、Ｆ．ＩＸの９９−ループに影響を及ぼすほんの僅かなアミノ酸を対応するＦ．Ｘ配列と交換することにより、ペプチド基質を使用した切断短縮組換えＦ．ＩＸａ変異体を用いての動態研究においてアミド分解活性が劇的に（数千倍まで）向上した(Hopfner et al., 1997 and Sichler et al., 2003参照)。同時に「Ｆ．Ｘ様の」機能に向けての特異性のシフトが観察された。これらの研究は、内因性テナーゼ複合体に会合していない形態のＦ．ＩＸａをモデルにしているので、本発明者らは、同じ突然変異を有する変異タンパク質は、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において血塊形成の内因性増殖を可能とし得ると仮定した。本発明者らは、これを試験するために、突然変異Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ（ＦＴＴ）をＦ．ＩＸに導入し、そして組織培養液中でタンパク質を発現させた。基本的にＦ．ＩＸ比活性に対する効果は全く見られなかった；しかしながら、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中の活性は劇的に増加した。
【００５５】
Kolkman and Mertens (2000)は、変異体Ｋ２６５Ａが、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性Ｆ．ＩＸ活性を２０倍増加させ得ることをすでに記載している。しかしながら、試験したＦ．ＩＸ Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔでは、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において正常（１００％）な抗原レベルにおいて２％の活性であった（図２）。Ｆ．ＶＩＩＩの存在がＦ．ＩＸ活性を１０６倍増加させることを考えると、三重突然変異体では、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性は２０，０００倍増加した。このことから、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における変異体の凝固活性は、血塊形成の瞬間においてまたは可能な治療薬として生理的重要性も有する範囲に置かれる。この活性は依然として、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下におけるＦ．ＩＸ比活性のほんの一部であるので（１００％のＦ．ＩＸ抗原は、２％の「Ｆ．ＶＩＩＩ様」活性、すなわち、「補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性」に相当する）、本発明者らは、他のセリンプロテアーゼの構造的特性および相同性の比較によって選択した追加の突然変異を含めた。彼らはさらに、互いに独立して突然変異Ｙ２５９Ｆ、Ｋ２６５ＴおよびＹ３４５Ｔを試験し、そして１９１％のＦ．ＩＸおよび６．７％の「Ｆ．ＶＩＩＩ様」凝固活性を有する酵素をもたらす単一のアミノ酸突然変異（Ｋ２６５Ｔ、すなわちキモトリプシン番号付けではＫ９８Ｔ）を同定でき、そして、他の単一突然変異は、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下および非存在下においてプロテアーゼ活性を減少させているだけであると決定した（表１参照）。
【００５６】
従って、好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において凝固活性を有し、そしてＫ２６５Ｔアミノ酸置換を有することを特徴とする。
【００５７】
本発明者らは、２６５位が、Ｆ．ＩＸ変異体のＦ．ＶＩＩＩバイパス活性のための主な決定基であることを示した。本発明者らは、２６５残基をＴから天然に存在するＫへと戻すことにより（Ｖ１８１Ｉ／２６５Ｋ／Ｉ３８３Ｖ、ＩＫＶ）、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性はほぼ完全に消失したことを示した。驚くべきことに、他のアミノ酸置換、特に変異体Ｋ２６５Ａ/Ｖ１８１Ｉ/Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｇ/Ｖ１８１Ｉ/Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｖ/Ｖ１８１Ｉ/Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｎ/Ｖ１８１Ｉ/Ｉ３８３Ｖ、またはＫ２６５Ｄ/Ｖ１８１Ｉ/Ｉ３８３Ｖにおけるアミノ酸置換により、Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖと類似したＦ．ＶＩＩＩバイパス活性が得られ、Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ１８３Ｖにおいて最も高かった。この結果は意外であった。なぜなら、以前に記載された単一のＫ２６５Ａ置換を有する第ＩＸ因子変異体のＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性は、はるかにより低い範囲だったからである(Kolkman and Mertens, 2000)。
【００５８】
それ故、さらに好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において凝固活性を有し、そして、好ましくはＫ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｖ、Ｋ２６５ＮおよびＫ２６５Ｄまたは他のアミノ酸から選択される、２６５位におけるアミノ酸置換を有することを特徴とする。
【００５９】
しかしながら、本発明は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ａのみを有する変異第ＩＸ因子は包含しない。本発明によると、アミノ酸置換Ｋ２６５Ａが変異第ＩＸ因子に存在するならば、これは、前記変異体が、Ｋ２６５Ａと組み合わせてさらなるアミノ酸置換を有する、すなわち、それが１８１位および／または３８３位などにおいてさらなるアミノ酸置換を含むことを包含する。
【００６０】
本発明者らは、Ｆ．ＩＸのタンパク質活性を、追加のアミノ酸置換をグループＡのアミノ酸置換に導入することによってさらに一層改変でき、これにより所望の特性を有するＦ．ＩＸ変異体を得ることができることをさらに発見した。
【００６１】
【表２】
0006029826.tif 000003
【００６２】
上記の好ましいアミノ酸位置の改変（例えばアミノ酸の置換による）を、好ましくは次の方法で互いに組み合わせることができる。しかしながら、さらなる組合せも可能である。
グループＡ単独
−補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
（Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性）
野生型と比較して増加
グループＤ単独
−補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において増加した凝固活性
（Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性）
野生型と比較して増加
グループＡ＋Ｂ
−補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性は、基本変異体（グループＡ）のそれぞれの凝固活性と比較して増加している
グループＡ＋Ｃ
−補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
および補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において減少した凝固活性
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性は、野生型と比較して、好ましくは基本変異体（グループＡ）のそれぞれの活性と比較して減少している
グループＡ＋Ｂ＋Ｃ
−補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
および補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において減少した凝固活性
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性は、基本変異体（グループＡ）のそれぞれの凝固活性と比較して増加し、そして
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性は、野生型と比較して、好ましくは基本変異体（グループＡ）のそれぞれの活性と比較して減少している
グループＡ＋Ｄ
−補因子の非存在下における凝固活性
および補因子の存在下において増加した凝固活性
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性は、野生型と比較して、好ましくは基本変異体（グループＡ）のそれぞれの活性と比較して増加している
グループＡ＋Ｂ＋Ｄ
−補因子の非存在下における凝固活性
および補因子の存在下において増加した凝固活性
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性は、基本変異体（グループＡ）のそれぞれの凝固活性と比較して増加し、
ここで、Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性は、野生型と比較して、好ましくは基本変異体（グループＡ）のそれぞれの活性と比較して増加している。
【００６３】
本発明者らは、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において可能な最も高い活性を有するＦ．ＩＸ変異体を生成する目的で、２つの追加のアミノ酸置換（グループＢ）をさらに追加して、１６７％Ｆ．ＩＸおよび１６％「Ｆ．ＶＩＩＩ様」活性を有するタンパク質（Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ）を得た。これにより、前記変異体は、野生型タンパク質と比較して、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において１６０，０００倍高い凝固活性を有する。これらの追加のアミノ酸置換は、Ｆ．ＩＸの比活性を途方もなく増加させることなく、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性Ｆ．ＩＸ活性を最大限に増加させるように選択された。このアプローチの後ろにある理論は、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下におけるあまりに高いＦ．ＩＸ比活性は、血栓合併症のリスクを高め得、それ故、治療薬として提案されたＦ．ＩＸ変異体を使用することに対する懸念を提示し得るというものであった。前記に列挙したアミノ酸置換の他の組合せも可能であり、例えば、グループＣからのアミノ酸置換は、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における活性にはほんの最小限にしか影響を及ぼすことなく、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下における変異タンパク質の活性をさらに制限することができる。同様に、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下および非存在下の両方における活性を、グループＤからのアミノ酸置換を使用して向上させることができる。このように、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下（野生型Ｆ．ＩＸの２２０，０００倍に相当する２２％の「Ｆ．ＶＩＩＩ様」活性）およびＦ．ＶＩＩＩの存在下（野生型Ｆ．ＩＸと比較して１６倍高い）において増加した活性を示す、５つの突然変異を有する変異体Ｖ１８１Ｉ/Ｋ２６５Ｔ/Ｒ３３８Ａ/Ｓ３７７Ｗ/Ｉ３８３Ｖを生成した。試験した変異体のＦＩＸおよび「ＦＶＩＩＩ様」活性が表１に説明されている。
【００６４】
これらのさらなる改変の可能性は、以下のような、特定の適用のためのＦ．ＩＸ変異体の設計およびテーラーメイドを可能とするので重要である。
（１）Ｆ．ＶＩＩＩの存在下においては低いＦ．ＩＸ活性（Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性）であるが、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下においては高いＦ．ＩＸ活性（Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性）（すなわち、グループＡ＋Ｃ）が、血友病ＡまたはＦ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する患者を処置するための治療薬の血栓形成性を減少させるのに望ましい。
（２）Ｆ．ＶＩＩＩまたはＦ．ＩＸの存在とは独立的に高いプロテアーゼ活性を有するタンパク質は、全てのタイプのＦ．ＩＸまたはＦ．ＶＩＩＩ欠損症を処置する可能性を有し得る（すなわちグループＡ＋Ｂ＋Ｄ）。
【００６５】
列挙した単一アミノ酸置換の効果は、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下または存在下におけるＦ．ＩＸ活性に対するその効果に関して種々の強度であるので、ここでも異なるグループからのアミノ酸置換を組み合わせて、特定の適用のためのＦ．ＩＸ活性に対する所望の全体的な効果を達成することができる。例えば、Ｋ２６５Ｔ変異体（グループＡ）をアミノ酸置換Ｖ１８１ＩおよびＩ３８３Ｖ（グループＢ）と組み合わせると、適用（１）に対応する、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下においては高い活性を有するが、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下においては基本的に通常の活性を有するタンパク質が得られる。詳細については表１を参照ください。
【００６６】
グループＡのおよびグループＡと組み合わせた全ての変異体が、血友病Ａ、阻害抗体および他の出血性疾患を患う患者の療法に並びに血友病Ｂの処置に特に適している。
【００６７】
より詳細には：
−  基本変異体と組み合わせてＦ．ＶＩＩＩの非存在下において凝固活性をさらに増加させるＦＩＸ変異体（グループＡをグループＢと組み合わせた）
【００６８】
本発明のこの好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において凝固活性を有し、２６５、３８３、１８１および２９０の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする。
【００６９】
好ましくは、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、３８３、１８１および／または２９０の群から選択された位置におけるアミノ酸置換（グループＢ）とを含み、より好ましくは、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉおよび／またはＩ２９０Ｌから選択されたアミノ酸置換とを含む。
【００７０】
好ましくは、変異第ＩＸ因子は、２６５位におけるアミノ酸置換またはアミノ酸置換Ｋ２６５Ｔを、３８３、１８１および／または２９０の群から選択された位置におけるアミノ酸置換（グループＢ）と組み合わせて含み、より好ましくは、２６５位におけるアミノ酸置換またはアミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉおよび／またはＩ２９０Ｌから選択されたアミノ酸置換とを含む。
【００７１】
２６５位におけるアミノ酸置換は、好ましくは、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｖ、Ｋ２６５ＮおよびＫ２６５Ｄから選択される。
【００７２】
グループＡ＋ＢのこれらのＦ．ＩＸ変異体は、基本変異体（グループＡ）のそれぞれの凝固活性と比較して増加したＦ．ＶＩＩＩ非依存性の凝固活性を有する。
【００７３】
−  基本変異体と組み合わせてＦ．ＶＩＩＩの存在下において凝固活性を制限するＦＩＸ変異体（グループＡをグループＣと組み合わせた）
【００７４】
本発明のこの好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下においては凝固活性を有するが、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下においては減少した活性を有し、そして２６５、３８３、３８８、３４、２５、３５３および／または３５８の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする。
【００７５】
好ましくは、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、３８８、３４、２５、３８３、３５３および／または３５８の群から選択された位置におけるアミノ酸置換（グループＣ）とを含み、より好ましくは、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙ、Ｉ３８３Ｖおよび／またはＲ３５８Ａから選択されたアミノ酸置換とを含む。
【００７６】
グループＡ＋ＣのこれらのＦ．ＩＸ変異体は、野生型と比較して、好ましくは基本変異体（グループＡ）のそれぞれの活性と比較して減少した（または好ましくはグループＡ＋Ｂの変異体と比較して減少した）、Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性を有する。従って、グループＡ＋ＣのこれらのＦ．ＩＸ変異体はＦ．ＶＩＩＩ依存性活性を制限し、そして可能性ある血栓形成リスクを最小限にする。
【００７７】
−  基本変異体と組み合わせてＦ．ＶＩＩＩの非存在下においては凝固活性をさらに増加させ、並びにＦ．ＶＩＩＩの存在下においては凝固活性を制限する、ＦＩＸ変異体（グループＡをグループＢおよびＣと組み合わせた）
【００７８】
本発明のこの好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下においては凝固活性を有するが、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下においては減少した活性を有し、そして２６５、３８３、１８１、２９０、３８８、３４、２５、３５３および／または３５８の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする。
【００７９】
好ましくは、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、３８３、１８１、２９０、３８８、３４、２５、３５３および／または３５８の群から選択された位置におけるアミノ酸置換（グループＢ＋Ｃ）とを含み、より好ましくは、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉ、Ｉ２９０Ｌ、Ｅ３８８Ｇ、Ｎ３４Ｄ、Ｆ２５Ｙ、Ｆ３５３Ｙおよび／またはＲ３５８Ａから選択されたアミノ酸置換とを含む。
【００８０】
グループＡ＋Ｂ＋ＣのこれらのＦ．ＩＸ変異体は、３つの群の特徴を組み合わせる：
−  それらはＦ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性を有する、
−  それらは、基本変異体（グループＡ）のそれぞれの凝固活性と比較して増加したＦ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性を有する、そして
−  それらは、野生型と比較して、好ましくは基本変異体（グループＡ）のそれぞれの活性と比較して減少した（または好ましくはグループＡ＋Ｂの変異体と比較して減少した）Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性を有する。
【００８１】
従って、グループＡ＋Ｂ＋ＣのこれらのＦ．ＩＸ変異体は、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性を増加させ、Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性を制限し、そして可能性ある血栓形成リスクを最小限にする。
【００８２】
−  補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において増加した凝固活性を有する第ＩＸ因子の変異タンパク質（グループＤ）
【００８３】
本発明のさらなる局面において、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体は、野生型と比較してその補因子の存在下において増加した凝固活性を有することを特徴とし、ここで、前記補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）または活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
【００８４】
本発明のこの局面による変異第ＩＸ因子は、３３８、３７７、４、８６、２１７および／または２７７の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、より好ましくはＲ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００８５】
グループＤの変異体およびグループＤと組み合わせた変異体は、血友病Ｂの処置に特に適している。
【００８６】
Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において類を見ない高いＦ．ＩＸ活性を有するタンパク質は、Ｆ．ＩＸ欠損症の処置のための良好な治療薬である。この目的のためには、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における高い活性、すなわち、グループＡ、例えば突然変異Ｋ２６５Ｔは全く必要とされない。グループＤのアミノ酸置換はまた、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において、上記のＫ２６５Ｔ突然変異（グループＡ）の非存在下において、Ｆ．ＩＸ活性を増加させる。Ｋ２６５Ｔ突然変異の導入を含まないこの目的のために試験した変異体のリストを表２に示す。
【００８７】
−  補因子の非存在下において凝固活性を有し、そして補因子の存在下において増加した凝固活性を有する、第ＩＸ因子の変異タンパク質（グループＡをグループＤと組み合わせた）
【００８８】
本発明のこの好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において凝固活性を、および補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において野生型と比較して増加した凝固活性を有し、そして２６５、３３８、３７７、４、８６、２１７および／または２７７の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする。
【００８９】
好ましくは、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、３３８、３７７、４、８６、２１７および／または２７７の群から選択された位置におけるアミノ酸置換（グループＤ）とを含み、より好ましくは、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｒ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択されたアミノ酸置換とを含む。
【００９０】
グループＡ＋ＤのこれらのＦ．ＩＸ変異体は、野生型の、好ましくは基本変異体（グループＡ）の、それぞれのＦ．ＶＩＩＩ依存性凝固活性と比較して増加したＦ．ＶＩＩＩ依存性凝固活性を有する。それらはまた、血友病Ｂの処置のための増加した効能も有する。
【００９１】
−  補因子の非存在下並びに存在下において増加した凝固活性を有する第ＩＸ因子の変異タンパク質（グループＡをグループＢおよびグループＤと組み合わせた）
【００９２】
本発明のこの好ましい態様において、変異第ＩＸ因子は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において（増加した）凝固活性を、および補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下において増加した凝固活性を有し、そして２６５、３８３、１８１、２９０、３３８、３７７、４、８６、２１７および／または２７７の群から選択された位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする。
【００９３】
好ましくは、変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、３８３、１８１、２９０、３３８、３７７、４、８６、２１７および／または２７７の群から選択された位置におけるアミノ酸置換とを含み、より好ましくは、アミノ酸置換Ｋ２６５Ｔと、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉ、Ｉ２９０Ｌ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｖ２１７Ｌおよび／またはＥ２７７Ａから選択されたアミノ酸置換とを含む。
【００９４】
グループＡ＋Ｂ＋ＤのこれらのＦ．ＩＸ変異体は、３つの群の特徴を組み合わせる：
−  それらはＦ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性を有する、
−  それらは、基本変異体（グループＡ）のそれぞれの凝固活性と比較して増加したＦ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性を有する、そして
−  それらは、野生型と比較して、好ましくは基本変異体のそれぞれの活性と比較して増加したＦ．ＶＩＩＩ依存性活性を有する。
【００９５】
本発明による変異第ＩＸ因子は、より好ましくは、
変異体Ｋ２６５Ｔ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ３８８Ｇ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ２９０Ｌ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ２９０Ｌ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ３８８Ｇ、
Ｒ３３８ＡおよびＳ３７７Ｗを含む変異体
から選択される。
【００９６】
より好ましくは、本発明による変異第ＩＸ因子は、
変異体Ｋ２６５Ｔ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、または
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ
である。
【００９７】
好ましい態様において、本発明による変異第ＩＸ因子は、
変異体Ｋ２６５Ｔ、あるいは、
好ましくは１８１位および／または３８３位におけるアミノ酸置換（好ましくはＶ１８１Ｉおよび／またはＩ３８３Ｖ）と組み合わせた、２６５位においてアミノ酸置換を有する変異体（好ましくは、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｖ、Ｋ２６５ＮおよびＫ２６５Ｄから選択される）から選択される。
【００９８】
より好ましくは、本発明による変異第ＩＸ因子は、
変異体Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｇ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｖ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、
変異体Ｋ２６５Ｎ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、または
変異体Ｋ２６５Ｄ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ
である。
【００９９】
例えば「Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ」という表現は、これらのアミノ酸置換を組み合わせて含む、すなわちＫ２６５ＴとＶ１８１ＩとＩ３８３Ｖとを組み合わせて含む変異体をいう。表現「Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ」は、これらのアミノ酸置換を組み合わせて含む、すなわちＫ２６５ＴとＶ１８１ＩとＩ３８３ＶとＲ３３８ＡとＳ３７７Ｗとを組み合わせて含む変異体をいい、以下同様である。
【０１００】
放棄事項：
本発明は、アミノ酸置換Ｋ２６５Ａのみを有する変異第ＩＸ因子は包含しない。本発明によると、アミノ酸置換Ｋ２６５Ａが変異第ＩＸ因子に存在するならば、これは、前記変異体が、Ｋ２６５Ａと組み合わせてさらなるアミノ酸置換を有する、すなわち、それが１８１位および／または３８３位などにおいてさらなるアミノ酸置換を含むことを包含する。
【０１０１】
さらに、本発明は、以下のアミノ酸置換のみを有する変異第ＩＸ因子は包含しない：
−  ＦＴＴ（Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ）；
−  Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ；
−  Ｖ１８１Ｆ；
−  Ｒ３３８Ａ。
【０１０２】
また、以下の第ＩＸ因子変異体は本発明によって包含されない：
−  Ｙ２５９Ｆ／Ａ２６１Ｋ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ
−  Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ３８８Ｇ
−  Ｙ２５９Ｆ／Ａ２６１Ｋ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ３８８Ｇ。
【０１０３】
９９−ループの改変は、Ｆ．ＩＸ活性を改変する戦略として繰り返し試みられてきた(Hopfner et al., 1997, Sichler et al., 2003)。最も見込みある変異体のＹ２５９Ｆ（／Ａ２６１Ｋ）およびＫ２６５Ｔが、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における可能性ある活性についてさらに調査されている(Hartmann et al., 2007並びにWO 2008/092644およびWO 2008/092643)。このアプローチの後にあるアイデアは、ループの両末端における残基を変化させることによって、Ｆ．ＩＸ特異的９９−ループのコンフォメーションを改変することであった。我々の調査における驚くべき所見は、Ｆ．ＩＸが真核細胞ではなく細菌細胞において部分的に切断短縮および／または産生された記載のＦ．ＩＸモデルとは対照的に、Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性は唯一、２６５位における突然変異に依存することであった。さらにまた、Ｙ２５９Ｆ位における突然変異はＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性および全体的な活性を妨げ、そしてＹ２５９Ｆ位における突然変異を除外するだけで、十分に高いＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性を得ることができ、これにより治療薬としてＦ．ＩＸ変異体を使用したアプローチをさらに探求することができた。
【０１０４】
突然変異Ｉ３８３ＶおよびＥ３８８Ｇの場合、事例は類似していた。両方の突然変異が、Hopfner et al. (1997)による最初の記載および後にBaxter (Hartmann et al., 2007並びにWO 2008/092644およびWO 2008/092643を参照)による記載においてユニットとして見られた。Hopfner et al. (1997)は、Ｉ３８３Ｖが細菌Ｆ．ＩＸ発現系において中程度の効果しか示さず、それ故、Ｅ３８８Ｇと組み合わせてのみ増殖させたと報告しさえした。我々の実験は反対を示唆する。突然変異Ｉ３８３ＶのみがＦ．ＶＩＩＩ非依存性Ｆ．ＩＸ活性を付与し、一方、Ｅ３８８Ｇは活性を妨害していた。我々は、これらの差異が、Ｆ．ＩＸに基づいた新たなバイパス剤（bypassing agent）の可能性ある開発のために非常に重要であると考える。まず第一に、止血を改善するために必要とされる活性は、これらの突然変異を除外すると数倍向上し、そして第二に、Ｆ．ＩＸに導入された突然変異の数は主要な安全性に関する懸念であろう。なぜなら、Ｆ．ＩＸに対する阻害抗体の形成のリスクはおそらく、タンパク質に導入される変化の量と共に増加するであろうからである。
【０１０５】
−コンジュゲート
好ましい態様において、本発明による第ＩＸ因子変異体は、前記変異体に好ましくは共有結合的に付着した、さらなる化合物または部分を含む（コンジュゲート）。
【０１０６】
好ましくは、さらなる化合物または部分は、
−  タンパク質、例えばアルブミン、
−  ラベル、例えば発色団、フルオロフォア、アイソトープ、および／または
−  ポリマー、例えばＰＥＧ
から選択される。
【０１０７】
Ｆ．ＩＸ変異体の核酸および薬学的組成物
本発明によると、前記の目的は、本発明による変異第ＩＸ因子をコードする核酸を提供することによってさらに解決される。
【０１０８】
「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその誘導体、改変したヌクレオチド／ヌクレオシドを含むＤＮＡおよび／またはＲＮＡをいう。
【０１０９】
好ましくは、核酸は、プロモーターおよび／または転写終結配列に作動可能に連結されている。好ましいプロモーターおよび／または転写終結配列は、ヒトα１抗トリプシンプロモーター、肝遺伝子座制御領域１、或いはサイトメガロウイルスプロモーター、およびヒトもしくはウシ成長ホルモンまたはシミアンウイルス４０に由来するポリアデニル化シグナルである。当業者は適切なプロモーターおよび／または転写終結配列を選択することができる。核酸は、例えばコードされたタンパク質を核酸から得ることができるように、核酸の転写／翻訳が、好ましくは細胞においてそれぞれのプロモーター／ターミネーターによって、および細胞性転写／翻訳機械によって制御されている場合に、プロモーターおよび／または転写終結配列に「作動可能に連結」されている。
【０１１０】
好ましくは、核酸は、発現プラスミド、遺伝子療法構築物、遺伝子導入ベクターにコードされる配列、ＤＮＡ改変もしくは修復のために使用される遺伝子配列、または類似物である。
【０１１１】
好ましい遺伝子療法構築物は、ウイルスおよび非ウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、プラスミドベクター、または例えば(Schuettrumpf et al., 2005)に記載のようなミニサークルベクターである。
【０１１２】
本発明によると、前記目的は、本発明の少なくとも１つの第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体または本発明の少なくとも１つの核酸と、場合により薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む薬学的組成物とを提供することによってさらに解決される。
【０１１３】
適切な薬学的に許容される担体および／または賦形剤は当技術分野において公知である。当業者は、薬学的組成物の目的とする適用、例えば処置しようとする疾患、処置しようとする患者、処置レジメンなどに依存して、好ましい薬学的に許容される担体および／または賦形剤を選択するだろう。
【０１１４】
医学用途
本発明によると、前記目的は、疾病の診断、予防および／または処置のために、本発明において開示したような、凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体、最も好ましくは第ＩＸ因子変異体、またはそれらをコードする核酸、または本発明の薬学的組成物を提供することによってさらに解決される。
【０１１５】
診断、予防およびまたは処置しようとする疾病は、好ましくは、出血性疾患または出血である。
【０１１６】
「出血性疾患」は、好ましくは血友病Ａおよび／または血友病Ｂ、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体によって、第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子の欠損によって、または非機能的第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸタンパク質の存在によって引き起こされたかもしくは併発した血友病、あるいは任意の他の出血または出血傾向である。
【０１１７】
好ましくは、出血性疾患は血友病Ａ、第Ｆ．ＶＩＩＩ因子または第Ｆ．ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体によって引き起こされたかまたは併発した血友病、血友病Ｂである。
【０１１８】
好ましくは、出血性疾患または出血は、例えば、新生児凝固障害；重度の肝疾病；ハイリスクな手術；外傷性失血；骨髄移植；血小板減少症および血小板機能異常症；経口抗凝血療法の迅速な逆転；第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子および第ＸＩ因子の先天性欠損症；並びにフォンヴィルブランド因子に対するインヒビターによるフォンヴィルブランド病、大きな損傷に関連した失血、脳出血、血小板機能異常症を含む、バイパス剤が使用される出血性疾患である。
【０１１９】
本発明によると、前記目的は、出血性疾患または出血の処置および／または予防のための医薬品の製造のための、本発明において開示したような、凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体、最も好ましくは第ＩＸ因子変異体、またはそれらをコードする核酸を使用することによってさらに解決される。
【０１２０】
好ましくは、本発明の第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体、核酸または薬学的組成物は、出血性疾患もしくは出血のタンパク質輸液療法、細胞療法、遺伝子療法および／または予防のために使用される。
【０１２１】
疾病が血友病Ａまたは第Ｆ．ＶＩＩＩ因子もしくは第Ｆ．ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体によって引き起こされたかもしくは併発した血友病である、
好ましくは、
−  グループＡの変異体、より好ましくは変異体Ｋ２６５Ｔ
−  グループＢおよび／またはＣおよび／またはＤと組み合わせたグループＡの変異体
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｃ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ＋Ｃ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｄ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ＋Ｄ
−  それぞれの核酸、薬学的組成物
による診断、予防および／または処置。
【０１２２】
本発明者らは、最初に、血友病Ａまたは第Ｆ．ＶＩＩＩ因子もしくは第Ｆ．ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体によって引き起こされたかもしくは併発した血友病の処置のために、グループＡの変異体、特にＫ２６５Ｔを適用する。
【０１２３】
Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下においてより高いプロテアーゼ／凝固活性を有する変異Ｆ．ＩＸ分子は、一般的なバイパス剤の代替物となり得、その利点は損傷部位において直接活性化されることである。これは生理的な血塊形成に似ており、現在のところ利用可能なバイパス剤においては通常であるすでに活性化されたプロテアーゼの点滴を避け、そして治療をより安全なものとするだろう。
【０１２４】
チモーゲンＦ．ＩＸ変異体はおそらくはるかにより長い半減期も有しており、インヒビター患者においても予防的補充療法を可能とするだろう。興味深いことに、Ｆ．ＶＩＩＩを欠失している患者さえ、より小さくそしてより免疫原性の低いＦ．ＩＸを使用した遺伝子導入アプローチに適し得、このためにこの遺伝子療法研究は、現在のところはるかにより見込みがある。比較的少数の患者および血友病の遺伝子療法を臨床的な実行に移すことに必要とされる多大な努力を考えると、提案されたＦ．ＩＸ変異体は、血友病Ａおよび血友病ＢまたはＦ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する患者のための療法を提供する努力を包括さえし得る。最終的に、前記変異体はまた、他の出血性疾患の処置にも有用であり得よう。
【０１２５】
記載した変異体の別の局面は、Ｆ．ＶＩＩＩａ、並びにＦ．Ｘ開裂および発色基質開裂の両方に向けてのより高い活性の必要性を伴わず、前記変異体を、診断試験システムにおいて、または抗凝血剤として昔から望まれていたが、テナーゼ複合体での会合を伴わないとＦ．ＩＸａの効力が低いために効果的なスクリーニングが不可能であった直接的なＦ．ＩＸａ阻害物質のための開発およびスクリーニングに使用し得ることである。
【０１２６】
疾病が血友病Ｂである、本明細書において記載した全ての変異体による、
好ましくは
−  グループＡの変異体、より好ましくは変異体Ｋ２６５Ｔ
−  グループＢおよび／またはＣおよび／またはＤと組み合わせたグループＡの変異体
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｃ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ＋Ｃ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｄ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ＋Ｄ
−  グループＤの変異体、より好ましくは変異体Ｋ２６５Ｔ
−  グループＡおよび／またはＢと組み合わせたグループＤの変異体
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｄ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ＋Ｄ
−  それぞれの核酸、薬学的組成物
による、診断、予防および／または処置。
【０１２７】
さらに血栓形成リスクが最小限である、
好ましくは
−  グループＣと組み合わせた変異体
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｃ
本明細書において定義したようなグループＡ＋Ｂ＋Ｃ
−  それぞれの核酸、薬学的組成物
による、出血性疾患または出血の診断、予防および／または処置。
【０１２８】
グループＤ単独を除外した本明細書において記載した全ての変異体による、血友病ＡおよびＢの両方の診断、予防および／または処置。
【０１２９】
グループＤ単独を除外した本明細書において記載した全ての変異体による、血友病Ａまたは第Ｆ．ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体によって引き起こされたかもしくは併発した血友病並びに血友病Ｂの診断、予防および／または処置。
【０１３０】
本発明の変異体は、タンパク質の投与、または細胞もしくは遺伝子の治療的投与（ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のベクター）を使用した、出血性疾患を患う患者を処置するために適したツールである。処置のための疾病は、出血の処置および予防療法のためのＦＶＩＩＩに対する阻害抗体によってもまた引き起こされたかまたは併発した、血友病ＡおよびＢである。
【０１３１】
本発明者らは、本発明の変異体が、
−  Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体の存在下において凝固時間を修正し（高力価のＦ．ＶＩＩＩインヒビターの存在下においても試験したＦ．ＩＸ変異体の機能を確認）、
−  in vivoにおける凝血を修正し（Ｆ．ＩＸ変異体がin vivoにおいて止血活性治療薬として作用できるという最初の証拠である）、
−  Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体の存在下において出血を停止する（Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体の存在下および非存在下の両方においてＦ．ＩＸ変異体の機能性を確認）ことを示した。さらなる詳細については、実施例６〜８および図４〜７を参照されたい。
【０１３２】
スクリーニング法
本発明によると、前記目的は、抗凝血化合物（抗凝血物質）、好ましくはＦ．ＩＸａを直接的に阻害する物質のスクリーニングのための方法を提供することによってさらに解決される。
【０１３３】
このような方法は、本明細書に置いて定義したような、本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子の使用を含む。
【０１３４】
このような方法において、テナーゼ複合体のさらなる成分は全く必要とされない（ここで、「テナーゼ」は活性型の凝血因子第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）と第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）との複合体をいう。それは、リン脂質表面上でカルシウムの存在下において形成し、そして第Ｘ因子の活性化に関与する）。
【０１３５】
記載した変異体の有益な局面は、Ｆ．ＶＩＩＩａ、並びにＦ．Ｘ開裂および発色基質開裂の両方に向けてのより高い活性の必要性を伴わず、前記変異体は、診断試験システムにおいて、または抗凝血剤として昔から望まれていたが、テナーゼ複合体での会合を伴わないとＦ．ＩＸａの効力が低いために効果的なスクリーニングが不可能であった直接的なＦ．ＩＸａ阻害物質のための開発およびスクリーニングのために適したツールであることである。
【０１３６】
本発明によるスクリーニング法は、好ましくは、本発明の変異第ＩＸ因子に結合し、そして／またはその活性をモデュレーションする化合物を同定するための方法であり、好ましくは以下のステップを含む：
−  試験しようとする化合物／物質を提供し、
−  本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子を提供し、
−  試験しようとする化合物／物質を、本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子と接触させ、
−  前記化合物／物質が、少なくとも１つの変異第ＩＸ因子に結合するかどうかを決定し、
−  場合により、前記化合物／物質が、少なくとも１つの変異第ＩＸ因子の活性をモデュレーションするかどうかを決定する。
【０１３７】
以下の実施例および図面は本発明を説明するものであるが、しかしながらそれを制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】第ＩＸ因子のアミノ酸およびヌクレオチド配列。導入した突然変異が強調されている。
【図２】Ｆ．ＩＸ−、Ｆ．Ｘ−およびＦ．ＶＩＩＩ−欠損血漿中における野生型第ＩＸ因子（ＷＴ）またはＦＴＴ置換を含むＦ．ＩＸ変異体（ＦＴＴ）の凝固活性：（Ａ）Ｆ．ＩＸ−欠損血漿。（Ｂ）Ｆ．Ｘ−欠損血漿。（Ｃ）Ｆ．ＶＩＩＩ−欠損血漿。数値は、Ｆ．ＩＸの抗原レベル（％）によって割った活性（％）（＋／−標準偏差）を示す。予期した通り、ＷＴ Ｆ．ＩＸは、活性をＦ．ＩＸ欠損血漿中で試験した場合には１の商を有するが（Ａ参照）、ＦＸ−またはＦ．ＶＩＩＩ−欠損血漿中では全く活性を有さない（ＢおよびＣ参照）。ＦＴＴ置換を含む変異体（ＦＴＴ）は、Ｆ．ＶＩＩＩ−欠損血漿中において１００％（５０００ng/ml）のＦ．ＩＸ抗原レベルで２％の活性を示すが（Ｃ参照）、Ｆ．Ｘ−欠損血漿中における活性は無視できる程度であった（Ｂ参照）。
【図３】組織培養液におけるＦ．ＩＸ発現（Ａ）またはマウスにおける肝特異的発現（Ｂ）のためのＦ．ＩＸ発現カセット。Ｆ．ＩＸ変異体を作製するための突然変異を、Ｋ２６５Ｔアミノ酸置換について強調したように部位特異的突然変異誘発によって導入した。
【図４】Ｆ．ＶＩＩＩに対する高力価の阻害抗体によって引き起こされた後天型の血友病Ａを患う患者の血漿中におけるａＰＴＴに基づいた一段Ｆ．ＶＩＩＩアッセイ。正常な対照血漿、Ｆ．ＩＸ ＷＴ、または変異体Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）もしくはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）を、等容量（１：１）で患者の血漿中へと混合した。混液を３７℃で２時間インキュベーションし、その後、凝固活性を、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中において決定した。正常な対照血漿は凝固時間を正常化しなかったかまたは不十分にしか正常化しなかったが、Ｆ．ＩＸ変異体ＴおよびＩＴＶは、それぞれ５０％または１００％の正常ヒトＦ．ＩＸ抗原レベルにおいて凝固時間の有意な短縮をもたらした。阻害性抗Ｆ．ＶＩＩＩ抗体の存在下において観察された凝血機能は、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中における以前に列挙された数値と良好に準拠している。グラフは、平均値を、エラーバーとしての平均の標準誤差と共に示す。＊Ｆ．ＩＸ ＷＴと比較したスチューデントｔ検定はｐ＜０．０５。
【図５】ＦＩＸ変異体は、Ｆ．ＶＩＩＩノックアウトマウスにおける凝固時間を部分的に修正する。１０〜５０μg/マウスの用量のＦ．ＩＸ、すなわちＷＴまたは変異体［Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）、Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）またはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＡＷＶ）］の肝臓由来発現のための非ウイルスミニサークルベクターを、Ｆ．ＶＩＩＩノックアウトマウスに水力学的注射技術によって注射した。注射から３日後に、血液を、マウス血漿中のＦ．ＩＸ抗原（ＥＬＩＳＡ）およびＦ．ＶＩＩＩバイパス活性（Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中における一段アッセイ）測定のためにマウスから採取した。Ｆ．ＩＸ ＷＴ発現マウスは、全発現レベルにおよび基線付近のバイパス活性を示したが、正常なＦ．ＶＩＩＩ活性の３５％以下のＦ．ＶＩＩＩバイパス活性が変異体において高い発現レベルで測定された（約２０μg/ml）。全ての変異体についてＦ．ＩＸ抗原レベルとＦ．ＶＩＩＩバイパス活性との間に良好な相関が存在し、Ｆ．ＩＸ ＩＴＡＷＶが最も高いＦＶＩＩＩバイパス活性を示し、Ｆ．ＩＸ Ｔが最も低いＦＶＩＩＩバイパス活性を示した。各データ点は、単一マウスの測定を示す。
【図６】Ｆ．ＩＸ変異体は、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスの出血を停止する。非ウイルス遺伝子導入後のＦ．ＩＸ ＷＴまたは変異体［Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）、Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）またはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＡＷＶ）］を発現しているＦ．ＶＩＩＩノックアウトマウスを、テールクリップアッセイによって攻撃した。簡潔には、マウスを麻酔し、尾を３７℃の食塩水溶液中で前加熱した。その後、尾を１．５mm（Ａ）または３mm（Ｂ）のいずれかの直径で切断し、血液を温食塩水溶液中に収集した。１０分後、マウスの尾を縫合し、そして焼灼して出血を止めた。失血を、食塩水溶液中に失われたヘモグロビンの吸光度（ＯＤ４９２nm）測定によって定量した。両方の出血モデルにおいて、Ｆ．ＩＸ ＷＴ発現マウスまたはベクターで処置していないマウスのいずれかと比較して、全てのＦ．ＩＸ変異体処置マウス群について失血の有意な減少があった。この改善は、止血の正常なＣ５７ＢＬ／６マウスと比較してより誘発的な３mmモデルにおいて見られるような部分的な修正であった。マウスの数および平均的発現レベルが、各マウス群についてグラフの下に示されている。各々の棒は、失血の平均値を、エラーバーとしての平均の標準誤差と共に示す。＊Ｆ．ＩＸ ＷＴと比較したスチューデントｔ検定は０．０５未満。
【図７】Ｆ．ＩＸ変異体は、Ｆ．ＶＩＩＩに対する高力価の阻害抗体を有するＦ．ＶＩＩＩノックアウトマウスの出血を停止する。Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体を、プラスミドベクターを用いたＦ．ＶＩＩＩ遺伝子導入を使用した肝臓への非ウイルス遺伝子導入によってＦ．ＶＩＩＩノックアウトマウスにおいて誘導した。遺伝子導入を、注射から３日後にＦ．ＶＩＩＩ測定によって決定した。我々は、６週間後、高力価（２０，０００〜１００，０００ng/ml）の抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在並びに残留Ｆ．ＶＩＩＩ抗原および活性の非存在を一段アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイによって確認した。その後、マウスを、Ｆ．ＩＸ ＷＴまたは変異体の発現のためにミニサークル遺伝子導入によって処理し、そして３日後にテールクリップアッセイによって攻撃した。各群のマウスの数および平均的Ｆ．ＩＸ発現レベルをグラフの下に示す。対照群間（ベクター無しおよびＦ．ＩＸ処置マウス）で失血にいくらかのばらつきが見られたが、３つ全ての変異体群［Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）、Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）またはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＡＷＶ）］における失血は有意に減少した。各々の棒は、失血の平均値を、エラーバーとしての平均の標準誤差と共に示す。＊スチューデントｔ検定＜０．０５。
【図８】２６５位は、Ｆ．ＩＸ変異体のＦ．ＶＩＩＩバイパス活性のための主要な決定基である。Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦ．ＩＸ変異体における２６５位の役割を調査するために、全てのタンパク新生アミノ酸を、追加のＶ１８１ＩおよびＩ３８３Ｖ置換を有していたＦ．ＩＸ分子中のこの位置に導入した。前記変異体をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、Ｆ．ＩＸ抗原レベルをＥＬＩＳＡによって決定し、そしてＦ．ＩＸ欠損およびＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ活性を前記したように一段アッセイによって決定した。各々の点は、単一変異体の平均を、エラーバーとしての平均の標準誤差と共に示す。実験を三重に行ない、そして少なくとも２回は繰り返した。野生型（ＷＴ）はＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５／Ｉ３８３をいい、ＩＴＶはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖをいい、ＩＡＶはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖをいう。Ｙ軸はＦ．ＩＸの比活性を示し（Ｆ．ＩＸ抗原で割ったＦ．ＩＸ活性％）、Ｆ．ＩＸ ＷＴを１００％と設定する。Ｘ軸は同じ比を示すが、今回は活性測定をＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿中で行なった。残基２６５をトレオニンから天然に存在するリジンへと戻すことにより（Ｖ１８１Ｉ／２６５Ｋ／Ｉ３８３Ｖ、ＩＫＶ）、ほぼ完全にＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性が消失した。驚くべきことに、他のアミノ酸置換、特に変異体Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｇ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｖ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｎ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３ＶまたはＫ２６５Ｄ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖにおけるアミノ酸置換では、Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖと類似したＦ．ＶＩＩＩバイパス活性が得られ、Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖにおいて最も高かった。この結果は意外であった。なぜなら以前に記載された単一Ｋ２６５Ａ置換を有する第ＩＸ因子変異体のＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性ははるかにより低い範囲であったからである(Kolkman and Mertens, 2000)。
【０１３９】
実施例
実施例１
本発明者らは、テナーゼ複合体で会合した場合においてより多く観察されそうな状態へのＦ．ＩＸの活性部位コンフォメーションの改変は、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において増加した活性を有するタンパク質を生じるだろうという仮説を探求した。
【０１４０】
突然変異は、文献において入手可能なＦ．ＸによってＦ．ＩＸの残基を比較および置換する構造研究に基づいて選択された(Hopfner et al., 1997; Sichler et al., 2003)。
【０１４１】
本発明者らは最初に突然変異Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ（ＦＴＴ）をＦ．ＩＸに導入し、そして組織培養液中でタンパク質を発現させた。基本的にはＦ．ＩＸ比活性に対する効果は全く見られなかったが；しかしながら、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中の活性は劇的に増加した。この活性は依然としてＦ．ＩＸ比活性のほんの一部であるので（１００％のＦ．ＩＸ抗原は、２％の「Ｆ．ＶＩＩＩ様」活性に相当する）、本発明者らは変異タンパク質を、２０，０００〜４０，０００ng/mlの濃度まで濃縮した（正常な血漿中濃度の４００〜８００％）。この濃度において３０％超までの「Ｆ．ＶＩＩＩ様」活性を測定できたが、ＷＴ Ｆ．ＩＸまたは陰性対照においては活性は全く検出されなかった。
【０１４２】
野生型タンパク質（ＷＴ）と比較したＦ．ＶＩＩＩ−、Ｆ．ＩＸ−またはＦ．Ｘ−欠損血漿中におけるＦＴＴ変異体の活性の比較を図２に示す。
【０１４３】
実施例２
本発明者らは、ＦＴＴ変異体の特性をさらに向上させるために、ＦＴＴ変異体をいくつかの他の突然変異と組み合わせて、異なる特性を有するＦ．ＩＸ分子を生成した。
【０１４４】
表１は、試験した突然変異の概観およびＦ．ＶＩＩＩ−またはＦ．ＩＸ−欠損血漿における変異体の活性を示す。
【０１４５】
実施例３
ＦＴＴ変異体の３つ全ての置換（Ｙ９４Ｆ、Ｋ９８ＴおよびＹ１７７Ｔキモトリプシン番号付け）が同時に存在する場合にのみ、（１３）は、発色基質に対する切断短縮Ｆ．ＩＸ（ｒｆ９）の増加した効果を記載したので、本発明者らは、最初に、実験のために組み合わせた変異体を使用した。
【０１４６】
しかしながら、本発明者らはまた、単一突然変異も試験し、そして驚くべきことに、必要な唯一の置換はＫ２６５Ｔ（すなわちＫ９８Ｔ）変異体であり、他はＦ．ＶＩＩＩの存在下および非存在下においてプロテアーゼ活性を悪化させてさえいることを発見した（表１）。
【０１４７】
実施例４
本発明者らはさらに変異体を試験し、そしてそれらを組み合わせてＦ．ＶＩＩＩの存在下において高いＦ．ＩＸ活性を有する分子を得た。
【０１４８】
表３は、１０倍を超えて活性の増加したいくつかの変異体を示す。この表からも明らかなのは、所望の増加した活性を有する突然変異を組み合わせることにより、最も高い活性レベルを有する組合せ変異体が得られるという事実である。Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗのような変異体のいくつかもまた、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下におけるその活性について試験した（表１）。しかしながら、Ｋ２６５Ｔ変異体と組み合わせた場合にのみＦ．ＶＩＩＩ非依存性Ｆ．ＩＸ活性に対する増強された効果を観察できた。
【０１４９】
実施例５
本発明者らは、所望の特性を有する変異体を構築するために、所望の効果を有する単一の突然変異を組み合わせて、さらに増加した所望の高い活性を有する変異体を得た。例えば、Ｋ２６５Ｔ変異体は、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において６．６％の活性を有し、そしてＦ．ＶＩＩＩの存在下において１９１％の活性を有する。本発明者らは、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下においては可能な最も高い活性を得るがＦ．ＶＩＩＩの存在下においては全くまたはほんの中程度の増加しか得ないようにするために、Ｋ２６５Ｔ突然変異を突然変異Ｉ３８３ＶまたはＶ１８１Ｉのいずれかと組み合わせた。得られた変異体Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５ＴおよびＫ２６５Ｔ／Ｉ３８３ＶはＦ．ＶＩＩＩの非存在下において９．０％および８．７％の活性を有し、そしてＦ．ＶＩＩＩの存在下においては２１９％および１３９％の活性を有した。Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下におけるこの中程度の活性の増加を、３つ全ての突然変異を変異体Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖへと組み合わせることにより、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下における活性を増加させることなく、それぞれ１６．４％および２０９％へと有意に向上させることができた。
【０１５０】
試験した組合せの要約を表１に示し、そして単一変異体の効果を表２に要約する。
【０１５１】
実施例６
Ｆ．ＩＸ変異体は、阻害抗体の存在下において凝固時間を修正する。
我々は、ＦＶＩＩＩに対して指向される阻害抗体の存在下においてＦ．ＩＸ変異体の機能性を確認するために、後天型血友病Ａを患う患者の血漿中においてａＰＴＴに基づいた一段Ｆ．ＶＩＩＩアッセイを行なった（図４）。正常な対照血漿、Ｆ．ＩＸ ＷＴまたは変異体Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）もしくはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）を等容量（１：１）で患者の血漿中に混合した。混液を３７℃で２時間インキュベーションし、その後、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中で凝固活性を決定した。正常な対照血漿は凝固時間を正常化しなかったかまたは不十分にしか正常化しなかったが、Ｆ．ＩＸ変異体ＴおよびＩＴＶは、それぞれ５０％または１００％の正常ヒトＦ．ＩＸ抗原レベルにおいて凝固時間の有意な短縮をもたらした。阻害性抗Ｆ．ＶＩＩＩ抗体の存在下において観察された凝血機能は、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中における以前に列挙された数値と良好に準拠している（表１）。それ故、結果は、高力価のＦ．ＶＩＩＩインヒビターの存在下においても、試験したＦ．ＩＸ変異体の機能を確認する。
【０１５２】
実施例７
Ｆ．ＩＸ変異体はin vivoにおいて凝血を修正する。
我々は、以下の実験において、Ｆ．ＩＸ変異体が実際にin vivoにおいて止血を改善でき、それ故、バイパス治療薬としてＦ．ＩＸ変異体を使用するアプローチの実行可能性についての概念実証を提供し得るかどうかを試験することを目標とした。我々は、試験のために、Ｆ．ＩＸの肝臓由来発現のための非ウイルスミニサークルベクター系を使用した。ＷＴまたは変異体Ｆ．ＩＸ［Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）、Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）またはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＡＷＶ）］のためのベクターを、Ｆ．ＶＩＩＩノックアウトマウスの尾静脈に水力学的注射技術を使用して注射した。注射から３日後に、血液を、マウス血漿中のＦ．ＩＸ抗原（ＥＬＩＳＡ）およびＦ．ＶＩＩＩバイパス活性（Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中における一段アッセイ）測定のためにマウスから採取した。Ｆ．ＩＸ ＷＴ発現マウスは、全発現レベルにおよび基線付近のバイパス活性を示したが、正常なＦ．ＶＩＩＩ活性の３５％以下のＦ．ＶＩＩＩバイパス活性が変異体において高い発現レベルで測定された（約２０μg/ml）。全ての変異体についてＦ．ＩＸ抗原レベルとＦ．ＶＩＩＩバイパス活性との間に良好な相関が存在し、Ｆ．ＩＸ ＩＴＡＷＶが最も高いＦ．ＶＩＩＩバイパス活性を示し、Ｆ．ＩＸ Ｔが最も低いＦ．ＶＩＩＩバイパス活性を示した（図５）。これらの結果は、マウス系においても変異体の機能性を確認する。その後、我々は、テールクリップアッセイによって異なるマウス群を攻撃した。その後、尾を１．５mm（図６Ａ）または３mm（図６Ｂ）の直径のいずれかで切断し、そして血液を収集した。１０分後、出血は停止し、そして失血を定量した。両方の出血モデルにおいて、Ｆ．ＩＸ ＷＴ発現マウスまたはベクターで処置していないマウスのいずれかと比較して、全てのＦ．ＩＸ変異体処置マウス群について失血の有意な減少があった。この改善は、血友病ではないＣ５７ＢＬ／６マウスと比較してより誘発的な３mmモデルにおいて見られるような部分的な修正であった。これは、Ｆ．ＩＸ変異体が実際にin vivoにおいて止血活性治療薬として作用できるという最初の証拠である。
【０１５３】
実施例８
Ｆ．ＩＸ変異体は、阻害抗体の存在下において出血を停止する。
次に、Ｆ．ＶＩＩＩに対する高力価の阻害抗体の存在下におけるＦ．ＩＸ変異体の機能性を確認した。この理由から、抗Ｆ．ＶＩＩＩ抗体をＦ．ＶＩＩＩノックアウトマウスに、C.Miaoおよび共同研究者(Ye et al., 2004)によって導入されたインヒビター誘導モデルを使用して誘導した。最初のＦ．ＶＩＩＩ発現は、プラスミドベクターを使用した肝臓への非ウイルスＦ．ＶＩＩＩ遺伝子導入を使用して得られた。我々は、６週間後、高力価（２０，０００〜１００，０００ng/ml）の抗Ｆ．ＶＩＩＩ抗体の存在並びに残留Ｆ．ＶＩＩＩ抗原および活性の非存在を一段アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイによって確認した。その後、マウスを、Ｆ．ＩＸ ＷＴまたは変異体の発現のためにミニサークル遺伝子導入によって処理し、そして３日後にテールクリップアッセイによって攻撃した（図７）。対照群間（ベクター無しおよびＦＩＸ ＷＴ処置マウス）の失血は、３つ全ての変異体処置群［Ｋ２６５Ｔ（Ｔ）、Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＶ）またはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ（ＩＴＡＷＶ）］における出血と比較して有意により高かった。それ故、Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体の存在下および非存在下の両方におけるＦ．ＩＸ変異体の機能性を確認した。
【０１５４】
実施例９
本発明者らは、さらなる実験において、２６５位における異なるアミノ酸を試験し、ここで、使用した構築物はさらに１８１位および３８３位における突然変異を含んだ（すなわちＶ１８１ＩおよびＩ３８３Ｖ）。使用したベクター構築物はｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ｈＦ．ＩＸであった。変異体をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、Ｆ．ＩＸ抗原レベルをＥＬＩＳＡによって決定し、そしてＦ．ＩＸ欠損およびＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ活性を前記したように一段アッセイによって決定した。残基２６５をトレオニンから天然に存在するリジンへと戻すことにより（Ｖ１８１Ｉ／２６５Ｋ／Ｉ３８３Ｖ、ＩＫＶ）、ほぼ完全にＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性が消失した。驚くべきことに、他のアミノ酸置換、特に変異体Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｇ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｖ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖ、Ｋ２６５Ｎ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３ＶまたはＫ２６５Ｄ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖにおけるアミノ酸置換では、Ｋ２６５Ｔ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖと類似したＦ．ＶＩＩＩバイパス活性が得られ、Ｋ２６５Ａ／Ｖ１８１Ｉ／Ｉ３８３Ｖにおいて最も高かった。結果を表４および図８に示す。見て分かるように、２６５位に小さなアミノ酸残基を有する突然変異体は、より高い凝固活性を示し、一方、突然変異Ｋ２６５ＴおよびＫ２６５Ａは最も高い凝固活性の増加を示す。この結果は意外であった。なぜなら、以前に記載された単一Ｋ２６５Ａ置換を有する第ＩＸ因子変異体のＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性ははるかにより低い範囲であったからである(Kolkman and Mertens, Biochemistry 2000, 39, 7398-7405)。
【０１５５】
材料および方法
プラスミド構築物および非ウイルスベクター
ＦＩＸ変異体のための２つの異なる発現ベクターを実験に使用した。組織培養のためのベクター（図３Ａ）は、以前に記載(Schuettrumpf et al., 2005)されたようなＣＭＶプロモーターによって駆動される１．４kbの切断短縮イントロン１を有するＦ．ＩＸからなっていた。所望の変異体をコードするヌクレオチド変化を、このプラスミドに、標準的な部位特異的突然変異誘発によって導入した。
【０１５６】
肝臓に指向される遺伝子導入のための発現ベクター（図３Ｂ）は、肝遺伝子座制御領域１、ヒトα−１抗トリプシンプロモーター、切断短縮１．４kbイントロン１を含むＦ．ＩＸミニ遺伝子、および小さな改変を加えた記載(Miao et al., 2000)のようなウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＨＣＲ／ｈＡＡＴ−Ｆ．ＩＸ）からなっていた。発現カセットを、Mark Kay (Chen et al., 2005)によって親切にも提供されたミニサークル生産プラスミドに導入した。このシステムにより、環状ＤＮＡベクターのための細菌プラスミド骨格配列の削除が可能となる。簡潔には、インテグラーゼ認識配列によってフランキングされるＦ．ＩＸのための発現カセットを含む全プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細菌中で増殖させる。誘導性ファージΦＣ３１インテグラーゼおよび誘導性エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩはその認識部位と共に、プラスミドの他方（親）部分に位置している。一晩増殖させた後、インテグラーゼはアラビノースの添加により活性化される。インテグラーゼの活性化により２つのサークルが形成され、一方は発現カセットのみを含み、他方はプラスミドの残り全てを含む。その後、条件（ｐＨ、温度およびナトリウム含量）をエンドヌクレアーゼのために調整し、このエンドヌクレアーゼも同様にアラビノースによって誘導された。この酵素は細菌プラスミド骨格中で切断するが、ミニサークル中に含まれる発現カセットは切断せず、よってミニサークルは細菌中に留まり、一方、プラスミドの残りは分解される。その後、ミニサークルを通常のワンステップアフィニティーカラムで精製し、そして調製物中の残留細菌ＤＮＡ混入物を、ＮｒｕＩ制限酵素消化を用いて細菌骨格を線状化し、その後、プラスミド−セーフＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI)を用いてエキソヌクレアーゼ分解することによって除去した。最後に、我々は、フェノール−クロロホルム抽出を介して消化物からエピソームＤＮＡを単離し、これにより高純度のミニサークル(ＭＣ−ＨＣＲ／ｈＡＡＴ−Ｆ．ＩＸ)が回収された。
【０１５７】
マウスにおける肝臓指向遺伝子の導入後のインヒビター誘導のためのＦ．ＶＩＩＩ発現ベクターを、ＨＣＲ／ｈＡＡＴ−Ｆ．ＩＸ構築物と同じように構築し、差異は、Ｆ．ＩＸをＢ−ドメイン欠失Ｆ．ＶＩＩＩ遺伝子と交換したことであった。さらに、ミニサークルベクターの代わりにｐＳＬ１１８０骨格を含むプラスミドベクターを使用した。
【０１５８】
変異体試験のためのin vitroにおけるＦ．ＩＸの発現
ＨＥＫ−２９３を、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法によってＣＭＶ−Ｆ．ＩＸプラスミドを用いてトランスフェクションし、そして１０μg/mlのビタミンＫを添加した無血清培地中に維持した。トランスフェクションから４８時間後に、細胞の上清を回収し、そして細胞を収集した。上清のアリコートを採取し、そしてＦ．ＩＸ抗原レベルおよび活性について試験した。Ｆ．ＶＩＩＩ活性の疑われる突然変異体のために、上清の残りを、Vivaspin 20(登録商標）(Viva Science AG, Hannover, Germany)濃縮法を使用して濃縮した。この方法を用いると２５，０００ng/mlの濃度（正常な血漿活性の５００％）が容易に得られる。これによりＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿中のプロテアーゼ活性の正確な試験が可能となった。毎回実験を行ない、ＷＴ Ｆ．ＩＸ、Ｆ．ＩＸ Ｓ３６５Ｒ（活性無し）およびトランスフェクションしていない細胞を対照として使用する。全ての実験を少なくとも１回は繰り返し、そして３重に行なった。
【０１５９】
Ｆ．ＶＩＩＩ、Ｆ．ＩＸおよびＦ．ＶＩＩＩインヒビターアッセイ
Ｆ．ＩＸ濃度を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定し、ここで、ヒトＦ．ＩＸに対するモノクローナル抗体であるクローンＨＩＸ−１(Sigma, St Louis, MO)を、１：８００の希釈度で捕獲抗体として使用し、そして検出抗体として、ペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗ヒトＦ．ＩＸ(Affinity Biologicals, Hamilton, ON)を、１：１０００の希釈度で使用した。Ｆ．ＩＸの機能的活性を、２５μlのヒトＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ欠損血漿を２５μlの自動活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試薬(Dade Behring, Marburg, Germany)および合計で２５μlの希釈していない試験試料（または必要である場合には、試料をイミダゾール緩衝液中で３分間３７℃で希釈した）と共にインキュベーションする改変された一段因子アッセイによって決定した。その後、２５μlの２５mM ＣａＣｌ２を加え、そして血塊形成までの時間をフィブロメーターを使用して測定した。ＦＶＩＩＩに対する抗体を、プレートを１μg/mlの精製組換えＦＶＩＩＩ(Cogenate, Bayer HealthCare, Leverkusen, Germany)を用いてコーティングすることによって、小さな改変を加えて記載(Schuettrumpf et al., 2005)のように、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラス（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）に対する特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｆ．ＶＩＩＩインヒビターマウスの血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、発色性ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ(Haemochrom Diagnostica, Essen, Germany)を使用することによって決定した。ＦＶＩＩＩ抗原レベルの決定を、American Diagnostica (Pfungstadt, Germany)からのＥＬＩＳＡキットを使用して行なった。
【０１６０】
マウスモデル
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護および使用の当局によって認可された。ＦＶＩＩＩの欠損したマウスは、The Jackson Laboratory (Bar Harbour, Maine, USA)から得られた。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはHarlan (Indianapolis, Indiana)から購入した。非ウイルス遺伝子導入のために、ベクターを水力学的注射技術によって以前に記載(Schuettrumpf et al., 2008)されているように投与した。簡潔には、マウス１匹あたり２mlの容量の生理食塩水溶液中１０〜５０μgの用量の非ウイルスベクターを５〜８秒間でマウスの尾静脈に注射した。以下の実験の間、次いで、血液をマウスから、後眼窩出血によって、または尾切断後の出血によってのいずれかにより採取した。
【０１６１】
失血アッセイ
尾出血は、注射したベクターに対してブラインドで行なった。マウスを麻酔し、そして遠部の尾（１．５または３mmの直径）を切断し、そして直ちに３７℃の食塩水溶液に浸漬した。失血を、報告されているように、尾を入れた食塩水溶液中におけるヘモグロビンの吸光度（Ａ４９２nm）を測定することによって決定した。Schuettrumpf et al., 2005。
【０１６２】
表１
Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下および存在下における第ＩＸ因子変異体の凝固活性。数値は％で示し、Ｆ．ＩＸおよびＦ．ＶＩＩＩの両方の正常なヒトレベルを有する正常なヒトプール血漿中の野生型第ＩＸ因子の活性を１００％とする。平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）。
【０１６３】
【表３】
0006029826.tif 000004
【０１６４】
表２
血友病Ｂの処置のための第ＩＸ因子変異体。タンパク質は、変化した第ＩＸ因子比活性を示す（野生型Ｆ．ＩＸと比較した％）。
【０１６５】
Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下におけるＦ．ＩＸ活性は、一段アッセイ法によって検出限界より下である。平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【０１６６】
【表４】
0006029826.tif 000005
【０１６７】
表３
Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下または存在下におけるＦ．ＩＸ凝固活性に対するＫ２６５Ｔへの突然変異付加の効果。
Ｕ：凝固活性上昇；Ｄ：凝固活性下降；
Ｎ：凝固活性に変化無し、ここで、Ｎ（Ｕ）：傾向上昇またはＮ（Ｄ）：傾向下降。
【０１６８】
【表５】
0006029826.tif 000006
【０１６９】
表４
Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下および存在下における第ＩＸ因子変異体の凝固活性。数値は％で示し、Ｆ．ＩＸおよびＦ．ＶＩＩＩの両方の正常なヒトレベルを有する正常なヒトプール血漿中の野生型第ＩＸ因子の活性を１００％とする。平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）。
【０１７０】
【表６】
0006029826.tif 000007
【０１７１】
野生型（ＷＴ）はＶ１８１／Ｋ２６５／Ｉ３８３をいい、ＩＴＶはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖをいい、ＩＡＶはＶ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖをいい、以下同様である。
Ｆ．ＩＸ活性は、Ｆ．ＶＩＩＩを伴う活性をいう；
Ｆ．ＶＩＩＩバイパス活性は、Ｆ．ＶＩＩＩを伴わない活性をいう。
【０１７２】
前記、特許請求の範囲および／または添付の図面に開示した特徴は、別々におよびその任意の組合せの両方において、その多様な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【０１７３】
【表７】
0006029826.tif 000008
0006029826.tif 000009
0006029826.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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