(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を、以下の工程（１）〜（６）に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法：
（１）幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記（１）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（３）前記（２）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（４）前記（３）で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５）前記（４）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および塩基性線維芽細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
（６）前記（５）で得られた細胞を、培地で培養する工程。
【請求項２】
工程（３）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、
請求項１記載の製造法。
【請求項３】
工程（１）におけるＲｈｏキナーゼ阻害剤が（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩である、
請求項１記載の製造法。
【請求項４】
工程（２）および（３）におけるＧＳＫ３阻害剤が、
（ｉ）６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル、および／または
（ｉｉ）（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムである、
請求項１記載の製造法。
【請求項５】
工程（５）におけるレチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、
請求項１記載の製造法。
【請求項６】
工程（５）におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤がドーソモルフィンである、
請求項１記載の製造法。
【請求項７】
工程（５）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドである、
請求項１記載の製造法。
【請求項８】
工程（３）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンであり；
工程（１）におけるＲｈｏキナーゼ阻害剤が（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩であり；
工程（２）および（３）におけるＧＳＫ３阻害剤が、
（ｉ）６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル、および／または
（ｉｉ）（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムであり；
工程（５）におけるレチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸であり；
工程（５）におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤がドーソモルフィンであり；
工程（５）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドである、
請求項１記載の製造法。
【請求項９】
工程（１）〜（６）において、フィーダー細胞を実質的に用いない、請求項１記載の製造法。
【請求項１０】
工程（１）〜（６）における培地が、血清を実質的に含まない、請求項１記載の製造法。
【請求項１１】
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞、及びグレリン産生細胞からなる群より選択されるいずれかである請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵ホルモン産生細胞の製造法、および該製造法により得られた膵ホルモン産生細胞を含む医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、内分泌腺（内分泌細胞）と外分泌腺（外分泌細胞）を有し、両方で重要な役割を担っている器官である。外分泌細胞は主に膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する役割を果たしている。
内分泌細胞は膵ホルモンを分泌する役割を果たし、膵α細胞からグルカゴン、膵β細胞からインスリン、膵δ細胞からソマトスタチン、ＰＰ細胞から膵ポリペプチド（本明細書中、ＰＰと略記する場合がある）が分泌されることが知られている。また、近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓からも分泌されることが報告されている。【０００３】
インスリンは、ブドウ糖の利用、蛋白の合成、中性脂肪の形成及び貯蔵を促進し、血糖値を低下させ、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。膵グルカゴンは、肝糖原分解、糖新生作用などを介する血糖上昇ホルモンとしてインスリンと並び糖代謝調節機構において重要な役割を担っている。ソマトスタチンは、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現し、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制する。ＰＰは、食事に対応してランゲルハンス島の細胞から分泌されるホルモンであり、飽食因子として知られ、食物摂取や体重増加を低減させる働きがある。グレリンは食物摂取を刺激し、脂肪酸化を低下させることによって体重を増加させることが知られている。【０００４】
糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治するのが難しい疾患である。糖尿病は、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）とＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。
ＩＩ型糖尿病は、インスリンに対し抵抗性をもつために発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣との関わりで問題となっている糖尿病である。ＩＩ型糖尿病は中高年で発病することが多く、糖尿病患者の多くはこの型である。
Ｉ型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によってインスリン産生細胞が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる慢性疾患である。体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールでき、かつ、患者の負担を軽くできる治療法として、Ｉ型糖尿病患者に対し、膵臓移植又は膵島移植が行われている。これらの治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植技術は十分に確立しているとは言えず、また移植可能な膵臓又は膵島が不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を回避するために、患者は免疫抑制剤を一生服用し続ける必要があり、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。【０００５】
Ｉ型糖尿病について試みられている治療法の一つに、患者のインスリン産生細胞自体を再生し移植する方法がある。この方法によれば患者自身の体内でインスリンを作り出すことができる。また、患者由来の細胞であることから拒絶反応の問題が解消される等、安全性の面でも有利である。【０００６】
インスリン産生細胞を得る方法としては、ＥＳ細胞から分化させる方法、患者の膵臓の組織幹細胞から分化させる方法、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる方法等が知られている。例えば、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いてヒトＥＳ細胞から膵β細胞を分化誘導する方法（特許文献１、非特許文献１〜４）やヒトＥＳ細胞からグルカゴン産生細胞（α細胞）を分化誘導する方法（非特許文献８）、ヒトｉＰＳ細胞から膵β細胞を分化誘導する方法（非特許文献５〜７）、ＥＳ細胞に、膵臓の発生に関わる重要な転写因子であり、インスリン産生細胞の発生、機能維持の役割も担っていることが知られているＰＤＸ１を導入して培養することによって効率よくインスリン産生細胞を分化誘導する方法（特許文献２）などが知られている。【０００７】
しかし、これらの方法によって得られるインスリン産生細胞は、正常な膵β細胞と比較してインスリン産生効率がかなり低く、細胞医療の応用に適用可能なインスリン産生細胞を効率的に得る方法の開発が依然として求められている。さらに、得られる細胞数を糖尿病治療等のための実用化レベルまで増加させることが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２２５６６１号公報
【特許文献２】米国特許７５３４６０８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅ．Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４：４４３−４５２
【非特許文献２】Ｋ．Ａ  Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１１：１３９２−１４０１
【非特許文献３】Ｗ．Ｊｉａｎｇ，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：３３３−３４４
【非特許文献４】Ｊ．Ｈ．Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ．”，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００７）５０：１２２８−１２３８
【非特許文献５】Ｒ．Ｍａｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．”，ＰＮＡＳ（２００９），ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．３７：１５７６８−１５７７３
【非特許文献６】ＭＣ．Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ＷＮＴ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１１），１３８：８６１−８７１
【非特許文献７】Ａ．Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”，Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２０１１），６０：２３９−２４７
【非特許文献８】Ｔ．Ｔｈａｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ  Ｖ／ＧＬＰ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｙ．”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（２０１１），１８：２８３−２９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、細胞医療の応用により適した膵ホルモン産生細胞の製造法、該製造法により得られた膵ホルモン産生細胞を含む医薬、および該細胞を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、段階的に分化誘導因子の種類やその組合せを変えること、および内胚葉細胞から細胞塊を形成させた後に浮遊状態で培養すること等によって、幹細胞からより膵発生を模倣した形（三次元的な構造を維持した形）の膵ホルモン産生細胞を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］幹細胞を、以下の工程（１）〜（６）に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法：
（１）幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記（１）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（３）前記（２）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（４）前記（３）で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５）前記（４）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
（６）前記（５）で得られた細胞を、培地で培養する工程；
［２］工程（３）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、
上記［１］記載の製造法；
［３］工程（１）におけるＲｈｏキナーゼ阻害剤が（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩である、
上記［１］または［２］記載の製造法；
［４］工程（２）および（３）におけるＧＳＫ３阻害剤が、
（ｉ）６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル、および／または
（ｉｉ）（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムである、
上記［１］ないし［３］のいずれかに記載の製造法；
［５］工程（５）におけるレチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、
上記［１］ないし［４］のいずれかに記載の製造法；
［６］工程（５）におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤がドーソモルフィンである、
上記［１］ないし［５］のいずれかに記載の製造法；
［７］工程（５）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドである、
上記［１］ないし［６］のいずれかに記載の製造法；
［８］工程（５）における細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である、
上記［１］ないし［７］のいずれかに記載の製造法；
［９］工程（１）〜（６）において、フィーダー細胞を実質的に用いない、上記［１］ないし［８］のいずれかに記載の製造法；
［１０］工程（１）〜（６）における培地が、血清を実質的に含まない、上記［１］ないし［７］のいずれかに記載の製造法；
［１１］幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒトの体性幹細胞である上記［１］ないし［１０］のいずれかに記載の製造；
［１２］膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞、及びグレリン産生細胞からなる群より選択されるいずれかである上記［１］ないし［１１］のいずれかに記載の製造法；
［１３］内胚葉細胞を、以下の工程（４’）および（５’）に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法；
（４’）内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５’）前記（４’）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程；
［１４］上記［１］ないし［１３］のいずれかに記載の製造法で得られた膵ホルモン産生細胞を含む、医薬；
［１５］以下の工程（１）〜（６）からなる群より選択されるいずれか１種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法：
（１）幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記（１）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（３）前記（２）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（４）前記（３）で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５）前記（４）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
（６）前記（５）で得られた細胞を、培地で培養する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の製造法によれば、幹細胞からより膵発生を模倣した形の膵ホルモン産生細胞を製造することができる。また、前記工程（１）〜（６）のいずれか１種以上の工程によって得られた細胞は、糖尿病等の膵ホルモン産生及び／又は分泌異常に起因する疾患の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニングに用いることができる。さらに本発明の細胞は、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができ、三次元的な構造を維持しているので、従来の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞と比較しても、細胞医療への応用により適した細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各種の因子を用いてヒトｉＰＳ細胞からの分化誘導を開始し、最初の４日間における原始線条マーカー（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）と内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲで１日ごとに測定した結果を示す。各遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示した。培養３日目においてＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現量が一過的に上昇し、４日目にはＳＯＸ１７の発現量が顕著に増加した。
【図２】ヒトｉＰＳ細胞からアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を用いて４日間分化誘導した細胞を、フィブロネクチンでコートした９６穴プレートに再播種して１日間培養し、抗ヒトＳＯＸ１７抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。ＳＯＸ１７陽性細胞の核はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し（図中、ＳＯＸ１７と示す）、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する（図中、Ｈｏｅｃｈｓｔを示す）。また、それぞれの染色像を合成した図をＭｅｒｇｅとして示す。大部分の細胞がＳＯＸ１７タンパクを発現している様子が観察された。
【図３】ヒトｉＰＳ細胞についてＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で２日間培養し、続いて、アクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１、およびアクチビンＡとＢＩＯを用いて培養を行ったときのＳＯＸ１７の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲで１日ごとに測定した結果を示す。遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示した。ＣＨＩＲ９９０２１およびＢＩＯのどちらを用いても、ＳＯＸ１７の発現は培養４日目から経時的に上昇し、同様の発現パターンを示した。ＤＭＳＯのみ添加のコントロールでは、ＳＯＸ１７の発現は上昇しなかった。
【図４】ヒトｉＰＳ細胞からアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を用いて４日間分化誘導した細胞を、９６穴スフェロイドプレートに播種して１日培養後、ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦを添加した１％Ｂ２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地で８日間培養し、その後１％Ｂ２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に交換してさらに培養を継続したときのインスリンの発現解析の結果を示す（図中、Ｉｎｓｕｌｉｎと示す）。遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示した。インスリンの発現は、１％Ｂ２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に培養１３日目で交換後、培養２３日目まで経時的に上昇した。
【図５】ヒトｉＰＳ細胞からアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を用いて４日間分化誘導した細胞を９６穴スフェロイドプレートに播種して１日培養後、ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦの組合せ、又はドーソモルフィン、レチノイン酸及びＳＢ４３１５４２の組み合わせを用いて８日間培養し、その後１％Ｂ２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地で培養して１９日目におけるインスリンの発現解析の結果を示す（図中、Ｉｎｓｕｌｉｎと示す）。遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示した。ドーソモルフィン、レチノイン酸及びＳＢ４３１５４２の組み合わせで培養した場合よりも、ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦの組み合わせで培養した方が、培養１９日目におけるインスリンの発現量が高かった。
【図６】図４の方法と同様に分化誘導した培養２１日目の細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）を用いて凍結切片を作製し、抗インスリン抗体と抗グルカゴン抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。インスリン陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を（図中、Ｉｎｓｕｌｉｎと示す）、グルカゴン陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し（図中、Ｇｌｕｃａｇｏｎと示す）、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する（図中、Ｈｏｅｃｈｓｔと示す）。また、それぞれの染色像を合成した図をＭｅｒｇｅとして示す。インスリンを発現している細胞が細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）内部に数多く認められ、グルカゴンを発現している細胞も一部認められた。
【図７】ＢＤマトリゲルまたはフィブロネクチンを基質として、ヒトｉＰＳ細胞からアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を用いて内胚葉を誘導した後、細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）を形成させ、その後、さらに膵ホルモン産生前駆細胞、続いて膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させたときの各種分化マーカーの発現解析の結果を示す。各遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示した。ＳＯＸ１７の発現は分化に伴い顕著に減少し、ＰＤＸ１とＮＧＮ３の発現は培養１７日目まで徐々に増加した。インスリン発現は培養１７日目から急激に増加した。これら各種分化マーカーの経時的な発現変動は、ＢＤマトリゲルまたはフィブロネクチンを基質として誘導した内胚葉細胞を用いた場合でほとんど同様であった。
【図８】内胚葉から細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）を形成させて分化誘導する工程［工程（４）］を含む、フィーダー細胞や血清を使用しない、膵ホルモン産生細胞の製造法の概略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
【００１６】
本発明において「膵ホルモン産生細胞」とは、膵ホルモンを産生する能力を有する細胞を意味する。該膵ホルモン産生細胞は常に膵ホルモンを産生している必要はなく、膵ホルモンの産生能力を有していればよい。従って、産生される膵ホルモン量は特に限定されない。膵ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、グレリンが挙げられる。膵ホルモン産生細胞としてはインスリン産生細胞（膵β細胞と同義）、グルカゴン産生細胞（膵α細胞と同義）、ソマトスタチン産生細胞（膵δ細胞と同義）、膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞、グレリン産生細胞が挙げられる。これらの中でも、インスリン産生細胞が好ましい。
【００１７】
本発明において「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化しうる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８，９５：１３７２６−３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４−９）、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）が挙げられ、好ましくは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞またはヒトの体性幹細胞、さらに好ましくはｉＰＳ細胞である。
【００１８】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ．ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８：７６３４−８）によって樹立されており、例えば大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）から購入可能である。
ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５−７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
【００１９】
ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
ｉＰＳ細胞の具体例としては、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞（例えば、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８；２６：１０１−１０６））等が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｊａｎ  ９；４（１）：１６−９、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｎｏｖ  ６；５（５）：４９１−５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｍａｙ  ８；４（５）：３８１−４）など、ｉＰＳ細胞の作製法については技術的な改良が鋭意行われているが、作製されたｉＰＳ細胞の基本的な性質、すなわち多分化能を有するという点は作出方法によらず同等であり、いずれも本発明の製造法に用い得る。
【００２０】
体性幹細胞としては、ヒトに由来するものが使用できる。ここで体性幹細胞とは、膵ホルモン産生細胞へと分化し得る細胞であり、例えば骨髄や脂肪由来の間葉系幹細胞や膵臓内に存在する幹細胞が挙げられる。
【００２１】
本発明の方法を用いれば、作製方法の異なるヒトｉＰＳ細胞株等、種々の幹細胞株からの膵ホルモン産生細胞の製造が可能となる。
【００２２】
１．膵ホルモン産生細胞の製造法
本発明の製造法は、幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法である。また、本発明の製造法は、より未分化な状態にある細胞（幹細胞）をより分化した状態（膵ホルモン産生細胞）へと分化誘導する方法でもある。
【００２３】
本発明の製造法は、以下の工程（１）〜（６）を含む。
（１）幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記（１）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（３）前記（２）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（４）前記（３）で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５）前記（４）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
（６）前記（５）で得られた細胞を、培地で培養する工程
【００２４】
工程（１）：幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程
本工程は、後述する工程（２）の幹細胞から膵ホルモン産生細胞へと分化誘導を開始する工程の前段階、すなわち、幹細胞の前培養（播種）の段階に相当する。
【００２５】
本工程における幹細胞は、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物と共培養されたものであってもよい。ここでフィーダー細胞とは、共培養によって、他の種類の細胞が増殖できる環境を提供する細胞をいう。
本工程における幹細胞としては、分散細胞又は非分散細胞のいずれでもよいが、分散細胞であるのが望ましい。
分散細胞としては、単一細胞、及び数個（典型的に約２〜５００、２０〜２００、又は５０〜１００個）の細胞からなる細胞塊〔後述の工程（４）で説明するように、細胞塊とは、複数個の細胞が相互に接着等することによって一つの塊をなしている状態をいう〕を形成している細胞が挙げられるが、本工程においては、細胞塊であるのが望ましい。
分散細胞の調製は、自体公知の方法により行われ得る。このような方法としては、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、酵素（例、トリプシン、コラゲナーゼ）等による処理、機械的な分散（例、ピペッティング）などの操作が挙げられる。
分散細胞は、浮遊細胞〔浮遊細胞とは、培養器や基材に接着していない状態の細胞をいう〕、または接着細胞〔接着細胞とは、培養器や基材に接着している状態の細胞をいう〕であり得る。
本工程では、上述した幹細胞について、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物を除去（例えば、遠沈管に移して２〜１０分間静置し、上清を除くことによって、除去）した後に、後述するＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する（すなわち、播種時からフィーダー細胞を用いることなく、分化誘導を開始する）のが望ましい。
【００２６】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害する物質をいう。
Ｒｈｏキナーゼとは、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）の分解酵素であるＧＴＰアーゼの範疇に含まれる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）の１種で、アミノ末端にセリン／スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にＲｈｏ相互作用領域を有する（Ａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２６１，４４−５１（２０００））。
本工程で用いるＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−９）、Ｎ−［２−ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ−１１５２）、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）が挙げられる。
これらはいずれも商業的に入手可能（例えば、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社から購入可能）であり、なかでも特にＹ−２７６３２が好ましい。
本工程では、１種又は２種以上のＲｈｏキナーゼ阻害剤の組み合わせのいずれも使用可能である。
【００２７】
本工程において、幹細胞は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養される。
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の培地中での濃度は、幹細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常０．０１〜１０００μＭ、好ましくは０．１〜１００μＭ、特に好ましくは１．０〜５０μＭである。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としてＹ−２７６３２を用いる場合、好ましくは約１．０〜約３０μＭ、さらに好ましくは約２．０〜約２０μＭの濃度で用いられ得る。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としてＦａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７を用いる場合、Ｙ−２７６３２の上記濃度の約２倍の濃度で用いられ得る。
複数種のＲｈｏキナーゼ阻害剤を組み合わせて使用する場合は、各阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００２８】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地での培養時間は、幹細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような長さの時間である限り特に限定されない。例えば、幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である場合、ヒトｉＰＳ細胞を分散させた後に約１２時間以上の時間（例、１２〜７２時間）にわたり、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養すれば所望の効果を十分に得ることができる。
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地中の幹細胞の密度は、幹細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは約１．０×１０１〜１．０×１０７細胞／ｍｌ、より好ましくは約１．０×１０２〜１．０×１０７細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約１．０×１０３〜１．０×１０７細胞／ｍｌ、並びに最も好ましくは約３．０×１０４〜１．０×１０６細胞／ｍｌである。
【００２９】
本工程で用いる培地は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含有している限り、特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下、便宜上、基礎培地とも称する）にＲｈｏキナーゼ阻害剤を添加してなるものである。
本工程で用いる基礎培地としては、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。ただし、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。本工程では、特に霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル培地）を用いることが望ましい。
これらの培地は、リプロセル社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、コスモ・バイオ社などから購入可能である。
【００３０】
本工程で用いる培地としては、血清及び／又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。
本明細書中、血清を実質的に含まないとは、血清の含量で、約１容量％未満、好ましくは約０．１容量％未満、さらに好ましくは約０．０１容量％未満であることを意味する。無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当する。
【００３１】
本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、及びこれらの均等物が挙げられる。ノックアウトシーラムリプレースメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入可能である。その他の血清代替物については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能である。
培地中の濃度は、血清代替物がＢ２７サプリメントの場合、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％である。
【００３２】
本工程では、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましい。すなわち、本工程で用いる培地は、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に含まない培地であるのが好ましく、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を全く含まない培地であるのがより好ましい。
本明細書中、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に含まないとは、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物の培地中の含量が約５容量％未満、好ましくは約１容量％未満、さらに好ましくは約０．０１容量％未満であることをいう。
本工程においてフィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、本発明の製造法により製造された膵ホルモン産生細胞には拒絶反応の原因物質（例、動物由来の細胞）の混入が少ない。
【００３３】
本工程での培養は、通常、培養器を用いて行われる。このような培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば、特に限定されないが、接着培養の実施に際しては細胞接着性であるのが望ましく、浮遊培養の実施に際しては細胞非接着性であるのが望ましい。培養器の例としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものである。
接着培養の際の培養器としては、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、細胞培養シートなどが挙げられる。これらの培養器は細胞との接着性を向上させるために親水性を付与したり、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞支持用基質でコーティングされてもよい。なお、細胞培養シートとは、細胞をシート状に培養することを目的する支持体を指し、例えばＯｐｔｉＣｅｌｌ（Ｎｕｎｃ社）が市販されている。
本工程における細胞支持用基質は、Ｔｙｐｅ  Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社）、フィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが好ましく用いられるが、ＢＤマトリゲル、フィブロネクチンを用いるのがより好ましく、フィブロネクチンを用いるのがさらに好ましい。
浮遊培養の際の培養器としては、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、チューブ、ローラーボトルなどが挙げられる。これらの培養器は疎水性の材質を用いたものであったり、ハイドロゲルや脂質など、細胞やタンパク質の吸着を防止する素材をコーティングしたものである。細胞の凝集塊を効率的に形成させるためには、Ｕ字あるいはＶ字形状の底面を有する培養器を使用することが望ましい。
【００３４】
その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％であり得る。酸素分圧は、１〜１０％であり得る。
【００３５】
工程（２）：前記工程（１）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
本工程は、前記工程（１）に続いて実施する工程であり、後述する工程（３）とともに幹細胞から内胚葉細胞への分化を誘導する工程に相当する。
【００３６】
セリン／スレオニンプロテインキナーゼであるＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３には異なる遺伝子にコードされアミノ酸レベルで高い相同性を有するＧＳＫ３αとＧＳＫ３βのアイソフォームが存在する。また、ＧＳＫ３がＷｎｔシグナルにも関与し、ＧＳＫ３を阻害することによりＷｎｔシグナルが活性化されることが知られている。
ＧＳＫ３阻害剤として、ＧＳＫ３α阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤が挙げられるが、本工程では、ＧＳＫ３β阻害剤が望ましい。
ＧＳＫ３阻害剤として、具体的にはＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１、ケンパウロン、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＢＩＯ、ＴＷＳ−１１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール）及びＳＢ４１５２８６（２−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−３−（２−ニトロフェニル）マレインイミド［２−［２，５−ジヒドロ−４−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］フェニル］オキシラトオキソイミニウム）が例示される。これらはＡｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ  ＢＶ社、和光純薬工業社、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｓｉｇｍａ社などから購入可能である。
また、ＧＳＫ３のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＧＳＫ３阻害剤として使用することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか既報に従って合成することができる。
幹細胞から内胚葉細胞への分化誘導にＷｎｔ−３Ａペプチドを用いる方法が知られている（非特許文献１、２、５）。一方、本工程では、低分子化合物であるＧＳＫ３阻害剤を使用することで、優れた操作性、再現性、選択性を提供することができる。
ＧＳＫ３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）またはＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）である。
本工程では、１種又は２種以上のＧＳＫ３阻害剤の組み合わせのいずれも使用可能である。
ＧＳＫ３阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、通常、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭである。ＣＨＩＲ９９０２１の場合、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは１〜５μＭ、ＢＩＯの場合、通常０．０１〜５μＭ、好ましくは０．１〜２μＭである。
複数種のＧＳＫ３阻害剤を組み合わせて使用する場合は、各阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００３７】
本工程で用いる培地は、ＧＳＫ３阻害剤を含有している限り、特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（基礎培地）にＧＳＫ３阻害剤を添加してなるものである。
本工程で用いる基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。ただし、本工程で用いる基礎培地は、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能である。
本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、特に好ましくは、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。
【００３８】
本工程で用いる培地としては、血清及び／又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。
本工程では、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。
本工程においてフィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、本発明の製造法により製造された膵ホルモン産生細胞には拒絶反応の原因物質（例、動物由来の細胞）の混入が少ない。
【００３９】
本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。
血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、及びこれらの均等物などが挙げられる。本工程で用いる血清代替物としては、Ｂ２７サプリメントが好ましい。
培地中の濃度は、Ｂ２７サプリメントの場合、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％である。これらの血清代替物については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能である。
【００４０】
本工程における培養温度は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。
培養時間は、約３７℃の培養温度で、６〜１４４時間、好ましくは１２〜７２時間である。本工程における培養は、通常、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２を通気したインキュベーター内にて行われる。
【００４１】
工程（３）：前記工程（２）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
本工程は、前記工程（２）に続いて実施する工程であり、幹細胞からの内胚葉細胞への分化誘導を完了させる工程に相当する。
【００４２】
本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−４，７の活性化剤は、ＡＬＫ−４及び／またはＡＬＫ−７に対し活性化作用を有する物質から選択される。
本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の例としては、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎが挙げられ、いずれも商業的に入手可能である。なかでも、本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としてはアクチビンが好ましい。
上記アクチビンは、ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）ファミリーに属する大きさ２４ｋＤのペプチド性細胞増殖、分化因子であり、２個のβサブユニットがＳＳ結合を介して２量体を構成している（Ｌｉｎｇ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７９−７８２；Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７６−７７９）。本発明においてはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれでも、またヒト、マウス等いずれの動物由来のものをも使用でき、これらは商業的に入手可能である。このなかでも特にアクチビンＡが好適に用いられる。使用する幹細胞の由来する動物種と同じ動物種由来のアクチビンを用いるのが好ましく、例えばヒト由来の幹細胞を出発原料とする場合、ヒトアクチビンＡを用いるのが好ましい。
本工程における培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の濃度は、用いるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の種類によって適宜設定されるが、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としてアクチビンを使用する場合の培地中の濃度は通常０．１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌである。
本工程では、１種又は２種以上のアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の組み合わせのいずれも使用可能であり、複数種の活性化剤を組み合わせて使用する場合は、各活性化剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。また、本工程では、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とともにＧＳＫ３阻害剤を培地中に含めることを特徴とする。アクチビン及びＧＳＫ３阻害剤との存在下に幹細胞を培養すれば、より好適に内胚葉細胞へと分化させることができる。
【００４３】
本工程で使用するＧＳＫ３阻害剤として、ＧＳＫ３α阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤が挙げられる。本工程で使用するＧＳＫ３阻害剤としては、ＧＳＫ３β阻害剤が好ましい。
本工程で使用するＧＳＫ３阻害剤として、具体的には、前記工程（２）で例示したＧＳＫ３阻害剤と同様のものが列挙されるが、本工程においても、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯが好ましく用いられる。ＧＳＫ３阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＣＨＩＲ９９０２１の場合、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは１〜５μＭ、ＢＩＯの場合、通常０．０１〜５μＭ、好ましくは０．１〜２μＭである。
本工程では、１種又は２種以上のＧＳＫ３阻害剤の組み合わせのいずれも使用可能であり、複数種の阻害剤を組み合わせて使用する場合は、各阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。
【００４４】
本工程において、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とＧＳＫ３阻害剤とは、培地中に同時に添加されてもよく、また、幹細胞の内胚葉細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とＧＳＫ３阻害剤とは、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。
【００４５】
本工程で用いる培地は、前記工程（２）で例示した基礎培地に、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤及びＧＳＫ３阻害剤を添加することにより作製される。
本工程で用いる培地は、前記工程（２）で用いたものと同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、同種の基礎培地（例、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）を用いて作製されたものであることが好ましい。
本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、特に好ましくは、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。
【００４６】
本工程では、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。
本工程で用いる培地としては、血清及び／又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。
本工程においてフィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、本発明の製造法により製造された膵ホルモン産生細胞には拒絶反応の原因物質（例、動物由来の細胞）の混入が少ない。
本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、及びこれらの均等物などが挙げられるが、Ｂ２７サプリメントが望ましい。培地中の濃度は、Ｂ２７サプリメントの場合、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％である。
本工程における培養温度は、使用する細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。
培養時間は、約３７℃の培養温度で、６〜２８８時間、好ましくは１２〜１２４時間である。本工程における培養は、通常、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２を通気したインキュベーター内にて行われる。
【００４７】
本工程において、幹細胞が内胚葉細胞に分化誘導されたことの確認は、内胚葉マーカーを用いて行われる。具体的には、内胚葉細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（内胚葉マーカー）の発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、ＳＯＸ１７（性決定領域Ｙ、Ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、ＣＸＣＲ４（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）、ＦＯＸＡ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ａ２）等が挙げられる。
【００４８】
工程（４）：前記工程（３）で得られた細胞から、細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
本工程は、前記工程（３）で得られた、内胚葉細胞に分化した状態にある細胞、すなわち、内胚葉細胞について、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程（再播種する工程）である。
【００４９】
本明細書中、細胞塊とは、複数個の細胞が相互に接着等することによって、一つの塊をなしている状態（例えば、１０個以上の細胞が相互に接着した状態）をいい、単離細胞及びみなし単離細胞に相対する概念である。単離細胞とは、他の細胞と接着せずに独立した状態にある一つの細胞をいう。みなし単離細胞とは、１，２個の他の細胞と接着している、或いは接着力が弱く簡単に離れてしまう程度に集合している状態の数個の細胞の群をいう。
本工程において、細胞塊とは、前記工程（３）で得られた、複数個（例えば１０個以上）の細胞（内胚葉細胞）が、細胞間で相互に接着等することによって、一つの塊をなしている状態をいう。
細胞塊と単離細胞及びみなし単離細胞とは、集合している細胞数（例えば３個以上の細胞が集合していれば、細胞塊）によって区別されてもよいが、細胞懸濁液を光学顕微鏡などで拡大して観察した平面像において、細胞として一つのまとまりをなす領域の面積によって区別されてもよい。
例えば、細胞の大きさ（半径）が１０μｍ程度の場合、その断面積は約３００μｍ２となる。従って、例えば、細胞として一つのまとまりをなす領域の面積が３００μｍ２未満であれば単離細胞及びみなし単離細胞とし、９００μｍ２（すなわち細胞３個分）より広ければ細胞塊としてもよい。１０個以上の細胞が相互に接着した細胞塊を形成したとすれば、その断面積は３０００μｍ２以上になると想定される。
【００５０】
本明細書中、浮遊状態で培養するとは、培地中において、非接着性の条件下で培養することをいう。非接着性の条件下での培養とは、培養器や基材に接着させない状態（例えば、非接着性のマルチウェルプレートを利用）での培養をいう。
非接着性の条件下での培養は、自体公知の方法により行われ得る。このような方法としては、例えば、培養器の表面にポリ・ヒドロキシエチルメタアクリレート等の親水性の物質プロテオグリカンをコートし、細胞の基材への接着を阻害する方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ，１３，１７９（１９８８））や、冷却することにより培養液に溶解する合成高分子化合物を培養器の表面に塗布し、細胞を接着させた後、培養器を冷却して合成高分子化合物を溶解し、細胞のシートを作る方法（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，８５４（１９９０））があり、これらの方法は必要に応じて改良することができる。例えば、培養液交換時の細胞の損失を防ぐため、一旦、培養器に遠心操作を施し、細胞塊を培養器表面に強制的に付着させた後、培養液を交換することや、細胞ごと培養液を遠沈管に移し、遠心操作で細胞を落とした後、上清の培養液を交換することができる。
【００５１】
本工程では、細胞塊の形成前に、前記工程（３）で得られた細胞（内胚葉細胞）に、タンパク質消化酵素を添加して、細胞同士を分離させ、単一細胞の状態にしてもよい。
タンパク質消化酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ディスパーゼ、アキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商品名）等を用いることができるが、これらに限定されない。これらのタンパク質消化酵素は、典型的には、消化酵素の作用の阻害剤であるＣａ２＋やＭｇ２＋をキレートするためにＥＤＴＡを加えて、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（例：０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の様な形態で用いられる。
【００５２】
本工程において、前記工程（３）で得られた細胞から、細胞塊は、例えば、以下のようにして調製することができる。
すなわち、前記工程（３）で得られた細胞を、適当な媒体中、培養器上で浮遊培養する。例えば、低接着性の培養器として９６ウェルの丸底ディッシュを用いた場合には、１ウェルあたり２〜４０万細胞を播種し、形成した凝集体を低接着性の６ｃｍディッシュ等に移したりしながら、３７℃で、約６時間〜約１０日間、好ましくは約６時間〜約２日間、さらに好ましくは１日間、適当な培地中で培養する。低接着性の培養器としては、通常、当技術分野で用いられている培養器に低接着性となるような処理を施したものが例示される。培養器としては、培養ディッシュ、培養フラスコ、回転培養用器具（スピナーフラスコ等）等が挙げられ、具体的にはスフェロイドプレートが挙げられる。低接着性となるような処理としては、ハイドロゲルを共有結合させること（コーティング）によって蛋白質や細胞の接着を抑制するような処理が用いられる。
【００５３】
具体的には、本工程は、前記工程（３）で得られた細胞を、例えば、９６穴のスフェロイドプレートに１穴あたり２×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、１％のＢ２７サプリメントが添加されたＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地で１日間培養する。
【００５４】
本工程において、上記のようにして得られた細胞塊を、培地中において浮遊状態で培養する。浮遊状態での培養とは、上述のとおり、非接着性の条件下での培養、すなわち、培養器や基材に接着させない状態（例、非接着性のマルチウェルプレート）での培養をいう。
本工程で用いる培地（すなわち、再播種時の培地）としては、前記工程（２）で例示した基礎培地が挙げられる。本工程で用いる培地は、上記工程（２）〜（３）と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、膵ホルモン産生細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が、本工程での基礎培地として好適に用いられる。該培地は公知文献（Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（１９７２）４９，１７０５）に従って調製することも可能である。
【００５５】
本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、及びこれらの均等物などが挙げられる。本工程で用いる血清代替物としてはＢ２７サプリメントが好ましい。
【００５６】
本工程では、特に、Ｂ２７サプリメントが添加されたＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が好適に用いられる。培地中、Ｂ２７サプリメントの濃度は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。
【００５７】
本工程では、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。
本工程においてフィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、拒絶反応の原因物質（例、動物由来の細胞）の混入が少ない。
本工程で用いる培地としては、血清及び／又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。
【００５８】
培養温度は、使用する細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。
培養時間は、６〜３６０時間、好ましくは約１日間〜約１２日間、さらに好ましくは約８日間である。
浮遊状態で細胞塊を形成させた場合には、細胞塊を形成させた後、細胞塊を浮遊培養に付すことなく、工程（５）に付すこともできる。この場合、工程（５）に移る前に形成された細胞塊を、０〜４８時間、好ましくは０〜２４時間浮遊状態で培養してもよい。
本工程における培養は、通常、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２を通気したインキュベーター内にて行われる。
【００５９】
具体的には、本工程は、前記工程（３）で得られた細胞を、例えば、９６穴のスフェロイドプレートに１穴あたり２×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、１％のＢ２７サプリメントが添加されたＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地で１日間培養する。
【００６０】
本工程（４）は、前記工程（１）〜（３）を経て得られた内胚葉細胞以外の内胚葉細胞を出発材料としても、膵ホルモン産生細胞を製造することができる。従って、本発明は、本工程（４）により、内胚葉細胞を出発材料とする膵ホルモン産生細胞の製造法、すなわち、内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養することを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法（本明細書中、本発明の製造法２と略記する場合がある）も提供する。
なお、上記工程（１）〜（３）を経て得られた内胚葉細胞以外の内胚葉細胞を出発材料とした膵ホルモン産生細胞の製造法も、前記した工程（３）で得られた細胞を出発材料とした膵ホルモン産生細胞の製造法における工程（４）と同様に行うことができる。
具体的には、本発明の製造法２は、内胚葉細胞を、以下の工程（４’）および（５’）に付すことを特徴とする。
（４’）内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５’）前記（４’）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
工程（４’）は上記工程（４）と、工程（５’）は上記工程（５）とそれぞれ同様にして行うことができる。
【００６１】
本工程、より好ましくは、前記工程（１）〜（３）の後、本工程（４）を経ることによって、より膵発生を模倣した形の膵ホルモン産生細胞を製造することができる。該細胞は三次元細胞塊の構造を有するので、単層培養細胞に比べ、生体内における状態に近く、より機能的であると考えられる。さらに該細胞は三次元的な構造により、従来の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞と比較しても、細胞医療への応用により適した細胞であると考えられる。
【００６２】
工程（５）：前記工程（４）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
本工程は、前記工程（４）を経て得られた細胞、すなわち、浮遊状態で培養された内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導する工程に相当する。
【００６３】
本工程で用いるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストは、天然のレチノイドであっても、合成のレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニストや同等の活性を有する天然物であってもよい。天然のレチノイドの例は、レチノイン酸（立体異性体の全トランス−レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９−シス−レチノイン酸（９−シスＲＡ）が知られている）である。合成のレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第５，２３４，９２６号、米国特許第４，３２６，０５５号等）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニストとしては、Ａｍ８０、ＴＴＮＰＢ、ＡＣ−５５６４９などが挙げられる。天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールなどが挙げられる（生物機能開発研究所紀要  ９：５５−６１、２００９年）。本工程で用いるＲＡＲアゴニストは、好ましくはレチノイン酸である。ＲＡＲアゴニストの培地中の濃度は、用いるアゴニストの種類によって適宜設定されるが、レチノイン酸の場合、通常０．１〜１００μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭである。
【００６４】
本工程で用いるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）阻害活性を有する化合物、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−２，３，６阻害活性を有する化合物、及びＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害活性とアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６阻害活性とを併せ持つ化合物からなる群より選択される。
【００６５】
ＡＭＰＫ阻害活性を有する化合物としては、ドーソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ａｒａＡ（アデニン−９−β−ｄ−アラビノフラノシド）、Ｃ７５等が挙げられる。アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）は幾つかに分類されておりＡＬＫ−２，３，６はＢＭＰタイプＩ受容体型のキナーゼとして、後述するＡＬＫ−４，５，７はＴＧＦ−βスーパーファミリータイプＩの受容体型キナーゼとして、それぞれ知られている。ＡＬＫ−２，３，６阻害活性を有する化合物としては、ドーソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−ピペラジノフェニル）−３−（キノリン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）等が挙げられる。ドーソモルフィンは、ＡＭＰＫ阻害活性及びＡＬＫ−２，３，６阻害活性の両方の活性を有する。本工程で用いるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤としては、ドーソモルフィンが好ましい。
これらの化合物はＳＩＧＭＡ社、Ｔｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから購入可能である。
【００６６】
また、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよびＡＬＫ−２，３，６のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはＡＬＫ−２，３，６の阻害剤として使用することができる。また、本工程中において培養中の細胞から培地中にＢＭＰファミリーに属する分化因子の増殖、あるいは当該分化因子の分泌が確認された場合には、当該分化因子の活性を中和する抗体、あるいはＢＭＰに結合してその作用を阻害することが知られているＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ等もＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはＡＬＫ−２，３，６の阻害剤として使用することができる。
【００６７】
また、本工程において培養中の細胞から培地中に上記工程（３）でアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤として例示したアクチビンの増加、あるいは分泌が確認された場合には、アクチビンの活性を中和する抗体、あるいはアクチビンに結合してその作用を阻害することが知られているホリスタチンもＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはＡＬＫ−２，３，６の阻害剤として使用することができる。
【００６８】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ドーソモルフィンの場合、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは０．２〜５μＭである。
【００６９】
本工程で用いるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−４，５，７の阻害剤としては、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンヒドロクロリド）、ＳＢ−５２５３３４（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−キノキサリン）、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−チオカルボキサミド）、ＧＷ６６０４、ＬＹ−５８０２７６（２−（６−メチル−２−ピリジニル）−３−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール）及びＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン）等が挙げられる。
これらはＳＩＧＭＡ社、Ｔｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、和光純薬工業社などから購入可能である。また、ＡＬＫ−４，５，７のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＡＬＫ−４，５，７の阻害剤として使用することができる。
【００７０】
本工程で用いるＡＬＫ−４，５，７の阻害剤としては、ＳＢ−４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物）が好ましい。アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＳＢ−４３１５４２の場合、通常、０．１〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭである。
【００７１】
本工程で用いる細胞増殖因子として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、各種の線維芽細胞増殖因子（ａ／ｂＦＧＦ）等が挙げられるが、なかでも特に塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が好ましい。
細胞増殖因子の培地中の濃度は、用いる因子の種類によって適宜設定されるが、ｂＦＧＦの場合、通常、１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜１００ｎｇ／ｍｌである。
【００７２】
本工程は、上記したレチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、及び細胞増殖因子の４種類全ての成分を含む培地中で実施される。
本工程において、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、及び細胞増殖因子は培地中に同時に添加されてもよく、また、膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、及び細胞増殖因子は、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。
【００７３】
本工程で用いる培地は、前記工程（２）で例示した基礎培地に、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、及び細胞増殖因子を添加することにより作製される。
本工程で用いる培地は、前記工程（４）と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよい。膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が、本工程での基礎培地として好適に用いられる。
【００７４】
本工程では、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。
本工程においてフィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、拒絶反応の原因物質（例、動物由来の細胞）の混入が少ない。
本工程で用いる培地としては、血清及び／又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。
【００７５】
本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。
血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール及びこれらの均等物などが挙げられる。本工程で用いる血清代替物としてはＢ２７サプリメントが望ましい。
血清代替物の培地中における濃度は、Ｂ２７サプリメントの場合、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％である。
【００７６】
本工程は、使用する内胚葉細胞の培養に適した培養温度、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で７２〜２８８時間、好ましくは１２０〜２１６時間、１〜１０％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて培養することによって実施される。
【００７７】
本工程において、内胚葉細胞が膵ホルモン産生前駆細胞に分化誘導されたことの確認は、膵ホルモン産生前駆細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（膵ホルモン産生前駆細胞マーカー）の発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、ＮＧＮ３、ＨＮＦ６（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ６、別名：ｏｎｅ  ｃｕｔ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）等が挙げられる。
【００７８】
工程（６）：前記工程（５）で得られた細胞を、培地で培養する工程
本工程は、膵ホルモン産生前駆細胞から膵ホルモン産生細胞への分化を誘導する工程に相当する。
【００７９】
本工程で用いる基礎培地としては、前記工程（２）で例示した基礎培地が挙げられる。本工程で用いる培地は、前記工程（５）と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよい。膵ホルモン産生細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が、本工程での基礎培地として好適に用いられる。
【００８０】
本工程では、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。
本工程においてフィーダー細胞及び／又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、拒絶反応の原因物質（例、動物由来の細胞）の混入が少ない。
本工程で用いる培地としては、血清及び／又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。
【００８１】
本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などが挙げられる。なかでも、Ｂ２７サプリメントが好ましい。特に、Ｂ２７サプリメントが添加されたＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が好適に用いられる。培地中、Ｂ２７サプリメントの濃度は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。また、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地へは、細胞の生存率を向上させる添加剤を添加してもよい。そのような添加物として、例えば、ノックアウトシーラムリプレースメント、Ｎ２サプリメント等の血清代替物等が挙げられる。培地中の前記添加剤の濃度は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。
【００８２】
好ましくは、本工程で用いる培地には、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、及び細胞増殖因子は含まれない。従って、工程（５）と工程（６）との間に培地交換を行うことが好ましい。
【００８３】
本工程は、使用する膵ホルモン産生前駆細胞の培養に適した培養温度、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で２４〜２４０時間、好ましくは７２〜１９２時間、１〜１０％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて培養することによって実施される。
本工程において膵ホルモン産生前駆細胞が膵ホルモン産生細胞に分化誘導されたことの確認は、膵ホルモン産生細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（膵ホルモン産生細胞マーカー）の発現、あるいは培地中に分泌される膵ホルモンの量を測定することによって行うことができる。該マーカーとしては、インスリン、グルカゴン、パンクレアティンクポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、ＰＣＳＫ１（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ  １）、ＳＵＲ１（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、別名：ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  Ｃ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ），ｍｅｍｂｅｒ  ８）、ＮＫＸ６．１（ＮＫ６  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）、ＰＡＸ６（ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ６）、ＮＥＵＲＯＤ（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １）、ＡＲＸ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）等が挙げられる。
【００８４】
上記した通り、本発明は、幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法を提供するが、同様の方法、すなわちより未分化な状態にある細胞をより分化した状態へと分化誘導する方法によって、幹細胞から、多様な分化状態にある細胞（内胚葉細胞、膵管細胞、膵内分泌細胞、膵外分泌細胞やそれらに共通する前駆細胞等）へと分化誘導することができる。誘導された分化の程度は各細胞に特異的に発現しているタンパク質や遺伝子の発現の有無を確認することによって知ることができる。
【００８５】
本発明の製造法では、幹細胞を膵ホルモン産生細胞へ効率的に分化誘導することにより、高い膵ホルモン分泌能を有する膵ホルモン産生細胞を大量に供給できる。この膵ホルモン産生細胞は、医薬（特に細胞医療の為の医薬）や、糖尿病治療薬を開発するためのツールとして利用することができる。
【００８６】
２．本発明の細胞を含む医薬
本発明は、上記した本発明の製造法又は本発明の製造法２により製造された膵ホルモン産生細胞（本発明の細胞）を含む、医薬を提供する。
さらに、本発明は、上記した本発明の製造法（好ましくは工程（１）〜（５））又は本発明の製造法２により製造された膵ホルモン産生前駆細胞を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある。）を提供する。
【００８７】
本発明の医薬において、膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞はそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、膵ホルモン産生細胞としての機能又は膵ホルモン産生前駆細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。また、膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞が必要量以上に増殖することを防止するために、上記処理と組み合わせて、マイトマイシンＣ前処理等による増殖の抑制や、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を当該細胞に導入して、その後、必要に応じて未活性型の薬を投与し、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を導入した細胞の中だけでその薬を毒物に変化させて細胞を死滅させる方法（自殺遺伝子療法）等の処理に付してもよい。
【００８８】
本発明の医薬は、安全で低毒性であり、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル等、好ましくは、ヒト）に投与（移植）することができる。
本発明の医薬の投与量（移植量）は、例えば、１×１０５〜１×１０１０細胞／個体、好ましくは、５×１０７〜１×１０１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０９〜１×１０１０細胞／個体である。本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作成された膵ホルモン産生細胞を用いることが好ましいが、年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。そのような場合には、腹腔内や皮下への移植も可能である。また、本発明の医薬の投与量（移植量）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。
【００８９】
本発明の医薬のうち、膵ホルモン産生細胞を含む医薬は、それ自体の投与（移植）により、患者の体内で膵ホルモンの産生（分泌）が可能となり、膵ホルモンの産生（分泌）の低下に起因する疾患の治療に有用である。例えばインスリン産生細胞を含む医薬は、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型、好ましくはＩ型またはインスリン産生量が低下したＩＩ型、特に好ましくはＩ型）の治療に有用である。一方、本発明の医薬のうち、膵ホルモン産生前駆細胞を含む医薬は、患者に投与（移植）された後、適当な条件下で膵ホルモン産生細胞に分化誘導されることによって、膵ホルモンが産生（分泌）される。
【００９０】
３．スクリーニング方法
本発明は、以下の工程（１）〜（６）からなる群より選択されるいずれか１種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、医薬（好ましくは糖尿病治療薬）のスクリーニング方法（本明細書中、本発明のスクリーニング方法と略記する場合がある）を提供する。
（１）幹細胞を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記（１）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（３）前記（２）で得られた細胞を、ＧＳＫ３阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（４）前記（３）で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程
（５）前記（４）で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼおよび／またはアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程
（６）前記（５）で得られた細胞を、培地で培養する工程
【００９１】
上記工程（１）〜（６）は、上記した本発明の膵ホルモン産生細胞の製造法における工程（１）〜（６）と同様にして実施され得る。
本スクリーニングに用いられる細胞としては、上記工程（１）〜（６）を経て得られる膵ホルモン産生細胞；上記工程（１）〜（５）を経て得られる膵ホルモン産生前駆細胞；上記工程（１）〜（４）または上記工程（１）〜（３）を経て得られる内胚葉細胞；上記工程（１）〜（２）を経て得られる細胞；上記工程（１）を経て得られる細胞が挙げられる。
【００９２】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には以下のようにして実施される（態様１）。（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞内の膵ホルモン発現量又は該細胞外への膵ホルモン分泌量をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
膵ホルモンの発現量としては、膵ホルモンタンパク質の発現量、膵ホルモンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ｍＲＮＡ）の発現量などが挙げられる。膵ホルモンの発現量及び分泌量の測定は、公知の方法、例えば、膵ホルモンを認識する抗体を用いて、細胞抽出液中や培地中などに存在する前記膵ホルモンを、ウエスタンブロッティング解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法又はそれに準じる方法に従って行われる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、Ｓ１マッピング法、ＰＣＲ法、ＤＮＡチップあるいはアレイ法又はそれに準じる方法に従って行われる。
膵ホルモン産生細胞の培養は、膵ホルモンが発現および／または分泌される条件下であれば特に限定されず公知の方法に従って行えばよい。培地としては、例えば、約１〜２０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）等〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕が用いられる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５時間〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿が挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸や塩基（例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩）などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられる。
例えば、上記（ａ）の場合における膵ホルモンの発現量又は分泌量を、上記（ｂ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上抑制（阻害）する試験化合物を、膵ホルモン産生細胞における膵ホルモン発現を抑制（阻害）する化合物として選択することができる。
上記（ａ）の場合における膵ホルモンの発現量又は分泌量を、上記（ｂ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、膵ホルモン産生細胞における膵ホルモンの発現又は分泌を促進する化合物として選択することができる。
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、インスリン発現を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生細胞がグルカゴン産生細胞である場合、グルカゴン発現を抑制（阻害）する化合物は糖尿病治療薬として有用である。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞の増殖能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる（態様２）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。細胞の増殖能を測定する方法としては、通常、当技術分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や３Ｈ、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）等の取り込み、ＡＴＰ量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。
例えば、膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、有意にインスリン産生細胞の増殖を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生細胞がグルカゴン産生細胞である場合、有意にグルカゴン産生細胞の増殖を抑制（阻害）する化合物は糖尿病治療薬として有用である。
【００９４】
本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生前駆細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生前駆細胞を培養した場合における、該細胞の分化の程度をそれぞれ調べ、比較する方法が挙げられる（態様３）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。膵ホルモン産生前駆細胞の分化の程度は、例えば膵ホルモン産生前駆細胞及び／又は膵ホルモン産生細胞の特異マーカーの発現の有無によって調べられる。膵ホルモン産生前駆細胞の特異マーカーとしては、ＮＧＮ３（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ  ３）、ＰＡＸ４（ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ４）が、膵ホルモン産生細胞の特異マーカーとしてはインスリン、グルカゴン、パンクレアティックポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、ＰＣＳＫ１（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ  １）、ＳＵＲ１（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、別名  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  Ｃ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ），ｍｅｍｂｅｒ  ８）、グルコキナーゼ、ＭＡＦＡ（ｖ−ｍａｆ  ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ａ）、ＩＡＰＰ（ｉｓｌｅｔ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）等がそれぞれ例示される。
例えば、膵ホルモン産生前駆細胞がインスリン産生前駆細胞である場合、有意にインスリン産生前駆細胞の分化を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生前駆細胞がグルカゴン産生前駆細胞である場合、有意にグルカゴン産生前駆細胞の分化を抑制（阻害）する化合物は糖尿病治療薬として有用である。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で内胚葉細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で内胚葉細胞を培養した場合における、該細胞の増殖あるいは分化能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる（態様４）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。細胞の増殖能を測定する方法としては、通常、当技術分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や３Ｈ、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）等の取り込み、ＡＴＰ量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。内胚葉細胞の分化能は、例えば内胚葉系細胞の特異マーカーの発現の有無によって調べられる。内胚葉系細胞の特異マーカーとしては、アルファフェトプロテイン、アルブミン、ペプシン、肺サーファクタントプロテインなどが挙げられる。一般に内胚葉系細胞の分化誘導や培養は中胚葉あるいは外胚葉系細胞に比べて技術的に困難であり、当該スクリーニング系によって得られた化合物を利用して作製した細胞自体及び／又は内胚葉の分化誘導系は、新たな医薬のスクリーニング系に利用し得る。
【００９６】
膵ホルモン産生細胞の機能を保護する（維持する）医薬等も本発明のスクリーニング方法に準じた方法で得ることができる。本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞の生存数あるいは機能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる（態様５）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。細胞の生存数を測定する方法としては、通常、当技術分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や３Ｈ、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）等の取り込み、ＡＴＰ量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。また、アポトーシスが誘発された細胞の数は、形態的な特徴（クロマチンの凝縮、核の断片化、細胞の収縮など）を呈する細胞の計数の他に、ＴＵＮＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）法による断片化ＤＮＡの検出や活性カスパーゼの有無の検出、７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）など生細胞不透過性色素による核染色、ホスファチジルセリンの細胞表面への露出やミトコンドリアメンブレンの脱分極化、特定の細胞内タンパク質の切断や分解などの測定によって定量化し得る。また、細胞の機能を測定する方法としては、グルコース濃度に応じたインスリンあるいはＣペプチドの分泌量や細胞膜電位の変動を測定する方法などが挙げられる。本態様では、膵ホルモン産生細胞に対して障害を与えることが知られている因子（例えば、炎症性サイトカインや活性酸素およびその産生誘導物質、高濃度の脂肪酸やグルコース）を細胞の培養時に添加し、該細胞の生存数あるいは機能を測定し、比較する方法が挙げられる。
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、膵ホルモン産生細胞に対して障害を与えることが知られている因子に対して有意にインスリン産生細胞の生存あるいは機能維持を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる医薬は、常套手段に従って、生理学的に許容し得る添加剤（例、担体、香味剤、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤）を用いて製剤化することができる。
このようにして得られる製剤の剤形としては、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などの経口剤；注射剤などの非経口剤が挙げられる。これら製剤における有効成分の含量は例えば、０．１〜９０重量％である。
【００９８】
前記添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムなどの結合剤；結晶性セルロースなどの賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの膨化剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、アカモノ油、チェリーなどの香味剤；油脂、注射用水、植物油（例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）などの液状担体；溶解補助剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）；非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）；溶解補助剤（例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）；無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）；安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）；保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール）；酸化防止剤が挙げられる。
前記注射用水としては、例えば、生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどを含む等張液が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法によって得られる医薬（好ましくは糖尿病治療薬）は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
該医薬の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより適宜設定される。
【実施例】
【００９９】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。【０１００】
実施例１（１）：
ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導〔工程（１）〜（３）〕
ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導は次の方法で行った。
まず、細胞塊の状態でフィーダー細胞とともに培養・維持していたヒトｉＰＳ細胞（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞：Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８；２６：１０１−１０６参照）を、霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液（リプロセル社）を用いて細胞塊の状態で剥離させ、１５ｍｌ遠沈管に移して５分間静置し、上清を除くことによってフィーダー細胞を除去した。
次に、遠沈管に沈んだヒトｉＰＳ細胞に０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたヒトｉＰＳ細胞を、ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社）をコートした１００ｍｍディッシュ１枚あたり１５×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養した。１００ｍｍディッシュは、ＢＤマトリゲルを無血清のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて４０倍希釈し、室温で３時間以上コートしたものを用いた。また、分散時および播種時の培地としては、１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）を使用した。播種１日後に、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）と２％Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換して２日間培養した。続いて、アクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換して２日間培養した。【０１０１】
ヒトｉＰＳ細胞培養時の内胚葉分化マーカーの発現変動を調べるため、分化誘導した細胞を経時的に回収し、ＲＮｅａｓｙ９６（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡ画分を精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した後、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して、原始線条マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙ、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７の遺伝子発現量を測定した。発現解析の結果を図１に示す。培養３日目においてＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現量が一過的に上昇し、４日目にはＳＯＸ１７の発現量が顕著に増加した。
これにより、原始線条への分化を経由して内胚葉マーカーが効率的に発現誘導されたことが明らかとなった。【０１０２】
次に、ＳＯＸ１７タンパク質の発現を調べるため、抗ＳＯＸ１７抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。１００ｍｍディッシュを用いて内胚葉細胞へと分化誘導した細胞を、アキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（商品名）を用いて単一細胞へと解離させ、フィブロネクチンコートした９６穴プレートに４×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養した。フィブロネクチンコートは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いてフィブロネクチン（ＢＤ）を２０倍希釈し、室温で３時間静置することによって行った。播種時の培養液としては、１％  Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。培養後、４％パラホルムアルデヒドを添加して室温で３０分間インキュベートし、細胞の固定を行った。培養後の細胞を、１次抗体として抗ヒトＳＯＸ１７抗体（ＡＦ１９２４、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、細胞の核をヘキスト３３３４２を用いて染色し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。結果として、大部分の細胞がＳＯＸ１７タンパクを発現している様子が観察された。以上の検討により、ＣＨＩＲ９９０２１とＢ２７サプリメントを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２日間、さらにアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２日間培養することによって、フィーダー細胞や血清を使用せず、効率的に内胚葉細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。【０１０３】
実施例１（２）：
工程（２）におけるＣＨＩＲ９９０２１以外のＧＳＫ３阻害剤（ＢＩＯ）による内胚葉誘導について検討した。
ヒトｉＰＳ細胞の播種１日後に、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）と２％Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換して２日間培養した。
次に、一方は、ＧＳＫ３阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）とアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）および２％Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し、培養を継続した（図３では「Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ＋ＣＨＩＲ９９０２１」と標記）。
もう一方は、ＧＳＫ３阻害剤としてＢＩＯ（０．５μＭ）とアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）および２％Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し、培養を継続した（図３では「Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ＋ＢＩＯ」と標記）。
ヒトｉＰＳ細胞培養時のＳＯＸ１７の遺伝子発現量を経時的に測定した。発現解析の結果を図３に示す。ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯのどちらを用いても、培養４日目からＳＯＸ１７の発現量が顕著に増加し、同様の発現パターンを示した。この結果から、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＧＳＫ３阻害剤を用いても内胚葉を誘導できることが明らかとなった。【０１０４】
実施例２：
内胚葉細胞から膵ホルモン産生細胞への分化誘導〔工程（４）〜（６）〕
内胚葉細胞へ分化させた細胞から細胞塊を形成させ、その後さらに膵ホルモン産生前駆細胞、続いて膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させた。
１００ｍｍディッシュを用いて分化誘導した内胚葉細胞をアキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商品名）を用いて、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させた内胚葉細胞を９６穴スフェロイドプレート（住友ベークライト）に１穴あたり２×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養して細胞塊を形成させた。分散時および播種時の培地としては、１％Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地を使用した。内胚葉細胞を播種して１日後に、ドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）及びｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた１％  Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で８日間培養した。培地交換は４日目の時点で一度行った。８日間培養後、１％  Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換してさらに培養を行った。その後の培地交換は３日〜４日ごとに行った。
内胚葉を播種して１日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦの組み合わせで８日間培養後、１％Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に交換してさらに培養を継続したときのインスリンの発現解析の結果を図４に示す。１％Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に交換した培養１３日目の時点では、インスリンの発現はほとんど認められなかったが、培養１５日目以降から急激に増加した。
比較例として、内胚葉細胞を播種して１日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２の組み合わせを用いて８日間培養した後、さらに１％  Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換してさらに培養を行った。培養１９日目の発現解析の結果を図５に示す。ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２の組み合わせで培養した場合よりも、ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦの組み合わせで培養することで、培養１９日目においてインスリンの発現は高い値を示した。【０１０５】
次に、インスリンとグルカゴンのタンパク質の発現について調べるため、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。内胚葉細胞を播種して１日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦを添加して８日間培養した後、さらに１％  Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換して８日間培養した。培養後、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３時間固定を行い、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ）に、培養後の細胞を包埋後、厚さ１０μｍの凍結切片を作製した。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）又は抗グルカゴン抗体（Ｇ２６５４、ＳＩＧＭＡ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）又はＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、細胞の核をヘキスト３３３４２を用いて染色し、蛍光顕微鏡で観察した。免疫蛍光染色の結果を図６に示す。インスリンを発現している細胞がｓｐｈｅｒｅ内部に数多く認められ、グルカゴンを発現している細胞も一部認められた。【０１０６】
実施例３：ヒトｉＰＳ細胞から膵ホルモン産生細胞への分化誘導
〔工程（１）〜（６）；ＢＤマトリゲルまたはフィブロネクチンを使用した内胚葉細胞への分化誘導と、膵ホルモン産生細胞への分化誘導〕
ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導は次の方法で行った。
まず、細胞塊の状態で維持していたヒトｉＰＳ細胞を実施例１と同様の方法で、単一細胞になるまで解離させた。
次に、一方は、培地に分散させたヒトｉＰＳ細胞を、フィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をコートした１００ｍｍディッシュ１枚あたり６０×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養した。１００ｍｍディッシュは、フィブロネクチンを無血清のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて４０倍希釈し、室温で３時間以上コートしたものを用いた。（図７では「フィブロネクチン」と標記）
もう一方は、培地に分散させたヒトｉＰＳ細胞を、ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社）をコートした１００ｍｍディッシュ１枚あたり１５×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養した。１００ｍｍディッシュは、ＢＤマトリゲルを無血清のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて４０倍希釈し、室温で３時間以上コートしたものを用いた。（図７では「マトリゲル」と標記）
また、分散時および播種時の培地としては、１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）を使用した。播種１日後に、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）と２％  Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換して２日間培養した。続いて、アクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換して２日間培養した。【０１０７】
内胚葉細胞へ分化させた細胞から実施例２と同様に細胞塊を形成させ、その後さらに膵ホルモン産生前駆細胞、続いて膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させた。
実施例２と同様に、内胚葉細胞を播種して１日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦの組み合わせで８日間培養後、１％  Ｂ２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換して分化誘導させ、各種分化マーカーの経時的な発現解析を行った。発現解析の結果を図７に示す。
内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７の発現は分化に伴い顕著に減少し、膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）と膵ホルモン産生前駆細胞マーカー（ＮＧＮ３）の発現は培養１７日目まで徐々に増加した。インスリンの発現は培養１７日目から急激に増加した。これら各種分化マーカーの経時的な発現変動は、ＢＤマトリゲルまたはフィブロネクチンを基質として誘導した内胚葉細胞を用いた場合でほとんど同様であった。ＢＤマトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から抽出した基底膜調製品である。一方、本実施例で使用したフィブロネクチンはヒト血漿からアフィニティークロマトグラフィーによって抽出したものである。このことから、フィブロネクチンを使用した場合であっても、ＢＤマトリゲル（実施例１および２）の場合と同様、膵ホルモン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。【０１０８】
以上の実施例１〜３の検討により、内胚葉細胞を用いてｓｐｈｅｒｅを形成させ、ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦを添加した１％  Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地で８日間培養し、その後、１％Ｂ２７サプリメントを含むＩｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地に交換して培養する図８に示した膵臓分化誘導系を用いることで、膵ホルモン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。
本発明の方法により製造された膵ホルモン産生細胞は、他の方法で製造された膵ホルモン産生細胞よりもインスリン産生量に優れている。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明の製造法によれば、幹細胞からより膵発生を模倣した形の膵ホルモン産生細胞を製造することができる。また、本発明の細胞は、糖尿病等の膵ホルモン産生及び／又は分泌異常に起因する疾患の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニングに用いることができる。さらに本発明の細胞は、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができるが、三次元的な構造を維持しているので、従来の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞と比較しても、細胞医療への応用により適した細胞であるといえる。
本出願は、日本で出願された特願２０１０−１７８５２３を基礎としており、その内容は本出願にすべて包含されるものである。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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