(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化３】
0005860413.tif 000008
（式中、
Ｘは、少なくとも１つのアミノ酸を含むリーダーペプチドであり、
Ｂは、インスリン分子のＢ鎖またはその類似体のアミノ酸配列であり、
Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸を含むリンカーペプチドであり、
Ａは、インスリン分子のＡ鎖またはその類似体のアミノ酸配列である。）
によって表されるインスリン前駆体またはその類似体のグリコシル化を低下させる方法であって、
前記方法は、それぞれ、配列番号１、４、５によって表されるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子を含む群から選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子の不活化によって可能になったメタノール資化性酵母（シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が発現させられる酵母を除く）から、式Iで表されるインスリン前駆体またはその類似体を産生することを含み、
前記配列がタンパク質マンノシルトランスフェラーゼまたはその機能部分をコードする、前記方法。
【請求項２】
前記メタノール資化性酵母がピキア属の種に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メタノール資化性酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシル化がＯ−グリコシル化である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グリコシル化が、少なくとも１０％〜９９％低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシル化が少なくとも２５％低下する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコシル化が少なくとも６５％低下する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
それぞれ、配列番号１、４、５によって表されるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子を含む群から選択されるタンパク質マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子またはその機能部分を含み、メタノール資化性酵母（シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が発現させられる酵母を除く）からなる宿主細胞に前記遺伝子を形質転換させ、相同組換えにより前記宿主細胞内での前記遺伝子の破壊をもたらすためのベクター。
【請求項９】
前記メタノール資化性酵母がピキア属の種に属する、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記メタノール資化性酵母がピキア・パストリスである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
グリコシル化の低下したインスリン前駆体またはその類似体を得るためのメタノール資化性酵母（シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が発現させられる酵母を除く）からなる宿主細胞のノックアウト株の産生方法であって
（ａ）ベクターが、それぞれ、配列番号１、４、５によって表されるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６を含む群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする標的核酸配列と、選択マーカーをコードする核酸配列とを含む、相同組換えが可能な核酸配列を組み込み、
（ｂ）前記ベクター中の前記標的遺伝子をコードするＤＮＡと、前記宿主細胞内の前記標的遺伝子をコードするＤＮＡとの間の相同組換えが生じるのを可能にする条件下で細胞を培養し、それにより、前記宿主細胞内での前記標的遺伝子の破壊をもたらし、
（ｃ）グリコシル化の低下したインスリン前駆体またはその類似体を得るための前記メタノール資化性酵母のノックアウト株を産生するために、不活化された標的遺伝子を有する宿主細胞を選択する、
前記方法。
【請求項１２】
前記選択マーカーが、ゼオシン耐性マーカーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法から産生されるインスリン前駆体またはその類似体。
【請求項１４】
それぞれ、配列番号１、４、５によって表されるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６を含む群から選択される少なくとも１つの不活化遺伝子を有する、グリコシル化の低下したインスリン前駆体またはその類似体の得るためのメタノール資化性酵母（シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が発現させられる酵母を除く）のノックアウト株。
【請求項１５】
受託番号がＭＴＣＣ５５１５である、請求項１４に記載のＰＭＴ１遺伝子不活化株。
【請求項１６】
受託番号がＭＴＣＣ５５１７である、請求項１４に記載のＰＭＴ５遺伝子不活化株。
【請求項１７】
受託番号がＭＴＣＣ５５１８である、請求項１４に記載のＰＭＴ６遺伝子不活化株。
【請求項１８】
前記宿主株が、改変されていない宿主株内で発現されるインスリンタンパク質産物と比べてグリコシル化のレベルが低下したインスリン前駆体またはその類似体を産出する、請求項１４に記載のノックアウト株。
【請求項１９】
前記グリコシル化が少なくとも２５％低下しているインスリン前駆体またはその類似体を発現する、請求項１４に記載のノックアウト株。
【請求項２０】
前記グリコシル化が少なくとも６５％低下しているインスリン前駆体またはその類似体を発現する、請求項１４に記載のノックアウト株。
【請求項２１】
請求項１４に記載のノックアウト株から産生されるインスリン前駆体またはその類似体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の、ノックアウト株から産生されるインスリン前駆体またはその類似体であって、前記ノックアウト株が、ＭＴＣＣ  ５５１５、ＭＴＣＣ  ５５１７、またはＭＴＣＣ  ５５１８のうちの１つである、前記インスリン前駆体またはその類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ピキア属の種によって産生されるインスリン前駆体分子のＯ−グリコシル化レベルの低下をもたらす、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のタンパク質マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）遺伝子の破壊に関する。本開示は、グリコシル化が低下した異種タンパク質を産生することができる、ピキア、特にピキア・パストリスをはじめとするメタノール資化性酵母の遺伝子改変ノックアウト株を提供する。メタノール資化性酵母を形質転換するための、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、およびＰＭＴ６遺伝子のコード配列を含むベクターが本開示によって企図される。
【背景技術】
【０００２】
組換え型のインスリン、インスリン類似体および／または誘導体が、様々な微生物発現系で生産されている。現在、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの生物が、組換えヒトインスリンおよびその誘導体の商業生産に利用されている。低い発現レベル、終了段階の精製の困難などの、これらの系の特定のデメリットのために、メタノール資化性酵母ピキア・パストリスの使用がタンパク質発現系として好まれている。この発現系には、高発現、簡単な処理、低い生産コスト、高密度培養などのいくつかの利点がある（ＵＳ６８００６０６号）。
【０００３】
酵母発現系は、増殖させるのが簡単で、迅速で、かつ拡大縮小が可能なので、人気がある；しかしながら、いくつかの酵母発現系では、一貫性のない結果が得られており、高収量を達成するのが難しいこともある。大いに期待できる１つの酵母発現系は、メタノール資化性酵母のピキア・パストリスである。他の真核生物発現系と比べて、ピキアには、多くの利点があるが、それは、ピキアには、動物細胞培養で産生されるタンパク質の細菌またはウイルス汚染の問題と関連するエンドトキシン問題がないからである（Ｃｉｎｏ，Ａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌａｂ，Ｍａｙ  １９９９）。
【０００４】
様々な利点が、ピキア・パストリスなどの酵母ベースの発現系に帰せられるにも関わらず、この系の大きなデメリットの１つは、得られるタンパク質の翻訳後修飾であり、これは後に、精製が困難な最終産物中の不純物として存在する。タンパク質のいくつかの翻訳後修飾が知られているが、最も一般的な形態の翻訳後修飾は、グリコシル化である（Ｈａｒｔ  Ｇ．Ｗ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １９９２；４：１０１７）。グリコシル化は、発現系によって、Ｎ結合型またはＯ結合型のどちらかであることができる（Ｇｅｍｍｉｌｌ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎ−  ａｎｄ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｙｅａｓｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９９；１４２６：２２７）。グリコシル化は、タンパク質立体構造の安定性、免疫原性、クリアランス速度、タンパク質分解からの保護に影響を及ぼし、タンパク質の溶解度を向上させる（Ｗａｌｓｈ  Ｇ，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ  ２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６；２４：７６９）。
【０００５】
酵母では、ゴルジ装置における糖分岐の修飾は、様々なマンノシルトランスフェラーゼによる一連のマンノース残基付加（「外鎖」グリコシル化）を伴う。外鎖グリコシル化の構造は、生物に特異的である。そのようなグリコシル化は、タンパク質精製を複雑にし得る、炭水化物の組成と分子量の両方における組換えタンパク質産物の不均質性をもたらすので、望ましくないことが多い。それは、タンパク質を非常に免疫原性の高いものにすることもあるし、または望ましくないアレルギー反応を引き起こすこともある。
【０００６】
バイオテクノロジー的製造の向上に大きな進歩が見られるにも関わらず、あらゆるタンパク質に対する包括的な解決法は存在しない。特定の治療用タンパク質の製造方法は、そのタンパク質またはタンパク質ファミリーに特異的であり得る問題に対する新規でかつ革新的な解決法を必要としている。
【０００７】
したがって、タンパク質のグリコシル化を改変して、これを本質的に低下させことができ、かつ所望の最終産物の生産性に影響を及ぼすことなく、哺乳動物様の翻訳後パターンを有する組換え糖タンパク質を産生することができる、ピキア・パストリスなどのメタノール資化性酵母株を遺伝子改変することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本開示は、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子を含む群から選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子の不活化によって可能になったメタノール資化性酵母から産生されるタンパク質のグリコシル化を低下させる方法であって、該配列が、タンパク質マンノシルトランスフェラーゼまたはその機能部分をコードする、方法；それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子を含む群から選択されるタンパク質マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子またはその機能部分を含むベクターであって、このベクターの相同遺伝子座への組込みが、宿主、好ましくは、メタノール資化性酵母内での機能的なタンパク質マンノシルトランスフェラーゼの発現を阻害する、ベクター；（ａ）ベクターが、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６を含む群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする標的核酸配列と、選択マーカーをコードする核酸配列とを含む、相同組換えが可能な核酸配列を組み込み、（ｂ）ベクター中の標的遺伝子をコードするＤＮＡと、宿主細胞内の標的遺伝子をコードするＤＮＡとの間の相同組換えが生じるのを可能にする条件下で細胞を培養し、それにより、宿主細胞内での標的遺伝子の破壊をもたらし、（ｃ）不活化された標的遺伝子を有する宿主細胞を選択する、メタノール資化性酵母のノックアウト株の産生方法；上記の方法から産生されるタンパク質；メタノール資化性酵母のノックアウト株であって、該株が、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６を含む群から選択される少なくとも１つの不活化遺伝子を有する、ノックアウト株；上記のＰＭＴ１遺伝子不活化株；上記のＰＭＴ４遺伝子不活化株；上記のＰＭＴ５遺伝子不活化株；上記のＰＭＴ６遺伝子不活化株；上記のノックアウト株から産生されるタンパク質；請求項２３に記載のノックアウト株から産生されるタンパク質、ここで、このノックアウト株は、ＭＴＣＣ  ５５１５、ＭＴＣＣ  ５５１６、ＭＴＣＣ  ５５１７、ＭＴＣＣ  ５５１８またはそれらの任意の修飾株のうちの１つである；ならびに上記の内容のいずれかによるタンパク質、ここで、このタンパク質は修飾されたグリコシル化を示す、に関するものである。
【０００９】
本開示の概要
本開示は、グリコシル化が低下したタンパク質を産生する方法であって、該方法が、メタノール資化性酵母株を遺伝子改変し、その株がグリコシル化が低下したタンパク質を産生できるようにするベクターの使用を含む、方法に関する。
【００１０】
好ましい実施形態では、本開示の不活化ベクターは、タンパク質マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ、ドリチル−リン酸−マンノース−タンパク質マンノシルトランスフェラーゼタンパク質、Ｅ．Ｃ．２．４．１．１０９）またはその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含み、メタノール資化性酵母株のタンパク質マンノシルトランスフェラーゼまたはその機能部分を破壊または不活化することができる。好ましいヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０に示した遺伝子を破壊するために選択された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示したＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、ＰＭＴ６遺伝子およびそれらの機能部分をコードするヌクレオチド配列である。
【００１１】
本開示に示される方法に従って、異種タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、本開示のベクターの１つまたは複数で前もって段階的に形質転換されたメタノール資化性酵母株に導入することができる。そのような酵母株を、本開示の１つまたは複数のベクターで、連続的にまたは同時に形質転換することができる。さらに、メタノール資化性酵母株を、配列表に示したタンパク質マンノシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む本不活化ベクターの１つまたは複数で形質転換することができる。
【００１２】
本方法およびベクターを用いて作製されるメタノール資化性酵母株、ならびにそのような遺伝子改変株から産生されるタンパク質も提供される。
【００１３】
本開示の方法を用いて産生される異種タンパク質産物、すなわち、Ｏ−グリコシル化が低下したタンパク質も本開示の一部である。
【００１４】
本開示の最も重要な態様によれば、所望の最終産物の生産性は、影響を受けないままである。
【００１５】
本開示のさらなる目的および利点は以下の記載に一部示されており、この記載から一部明らかとなるか、または本開示の実施から習得することができる。これらの目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている手段および組合せによって実現および達成することができる。
【００１６】
本明細書に組み込まれ、かつ本出願の一部を構成する添付の図面は、本開示において有用な様々な属性を例示しており、本記載とともに、本開示の最も重要な点を形成する様々な重要な属性を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＭＴ遺伝子をｐＰＩＣＺαにサブクローニングすることによって得られたクローン。レーン１＝制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化されたＰＭＢＬ１８４プラスミド（１７７５＋５７６ｂｐ断片）、レーン２＝制限酵素ＢｓｔＥＩＩで消化されたＰＭＢＬ１８４プラスミド（２３５１ｂｐ断片を線状化する）、レーン３＝制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化されたＰＭＢＬ１８５プラスミド（１９３０＋４３１ｂｐ断片）レーン４＝制限酵素ＫｐｎＩで消化されたＰＭＢＬ１８５プラスミド（２３６１ｂｐ断片を線状化する）、レーン５＝マーカー、λＤＮＡ  ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化物、レーン６＝制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化されたＰＭＢＬ１８６プラスミド（１９２３＋４２８ｂｐ断片）、レーン７＝制限酵素ＸｍｎＩで消化されたＰＭＢＬ１８６プラスミド（２３５１ｂｐ断片を線状化する）。レーン８＝制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化されたＰＭＢＬ１８７プラスミド（１９２９＋４３７ｂｐ断片）、レーン９＝制限酵素ＢｓｔＥＩＩで消化されたＰＭＢＬ１８７プラスミド（２３６６ｂｐ断片を線状化する）、レーン１０＝制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化されたＰＭＢＬ１８８プラスミド（１９２９＋４９７ｂｐ断片）ならびにレーン１１＝制限酵素ＮｄｅＩで消化されたＰＭＢＬ１８８プラスミド（２４２６ｂｐ断片を線状化する）。
【図２ａ】ｐＭＢＬ１８４は、ｐＰＩＣＺαにクローニングされたＰＭＴ１破壊遺伝子を表している。このプラスミドを線状化するために制限部位ＢｓｔＥＩＩを用いた。
【図２ｂ】ＰＭＴ１遺伝子が破壊されたノックアウトＢＩＣＣ＃９１０４、レーン１および１３＝λマーカー、レーン１８＝ＢＩＣＣ＃９１０４。
【図２ｃ】ゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰＭＴ１破壊断片をプローブとして用いることによるサザンブロット。レーンＭ＝１Ｋｂ  ＤＮＡマーカー、レーン１＝インスリン前駆体産生親クローン＃１１、レーン２＝ＰＭＴ１ノックアウトインスリン前駆体産生クローン＃１１、レーン３＝インスリン前駆体産生親クローン＃８、レーン４＝＃８のＰＭＴ１ノックアウトインスリン前駆体産生クローン、レーン５＝インスリン類似体前駆体産生親クローン、レーン６＝ＰＭＴ１ノックアウトインスリン類似体前駆体産生クローンおよびプラスミド対照。
【図３ａ】ｐＭＢＬ１８８は、ｐＰＩＣＺαプラスミドにクローニングされたＰＭＴ６破壊遺伝子を表している。このプラスミドを線状化するために制限部位ＮｄｅＩを用いた。
【図３ｂ】ＰＭＴ６遺伝子ノックアウトのＰＣＲ確認の結果。レーン１＝ＤＮＡマーカー、１ｋｂラダー、レーン２＝ＩｎｓｔｅＺＲＰおよびＰＭＴ６ＤＳＣＨＫを用いた親クローンＰＣＲ（産物なし）、レーン３＝ＩｎｓｔｅＺＲＰおよびＰＭＴ６ＤＳＣＨＫを用いたＢＩＣＣ＃９１０７  ＰＣＲ（８９５ｂｐ産物）、レーン４＝ＴＥＦＤＳＲＰおよびＳＰＭＴ６ＤＣＦＰを用いた親クローンＰＣＲ（産物なし）、レーン５＝ＴＥＦＤＳＲＰおよびＳＰＭＴ６ＤＣＦＰを用いたＢＩＣＣ＃９１０７  ＰＣＲ（６３９ｂｐ産物）、レーン６＝ＩＳＣＨＫＦＰおよびＰＭＴ６ＤＳＣＨＫを用いたＢＩＣＣ＃９１０７  ＰＣＲ（８３５ｂｐ産物）。
【図４ａ】ｐＭＢＬ１８６は、ｐＰＩＣＺαプラスミドにクローニングされたＰＭＴ４破壊遺伝子を表している。このプラスミドを線状化するために制限部位ＸｃｍＩを用いた。
【図４ｂ】破壊されたＰＭＴ４遺伝子のＰＣＲ確認の結果。レーン１＝ＩｎｓｔｅＺＲＰおよびＰＭＴ４ＤＳＣＨＫを用いた親クローンＰＣＲ（産物なし、陰性対照）、レーン２＝ＩｎｓｔｅＺＲＰおよびＰＭＴ６ＤＳＣＨＫを用いた陽性対照ＰＭＴ６  ＃７９（８９５ｂｐ産物）、レーン３＝ＩｎｓｔｅＺＲＰおよびＰＭＴ４ＤＳＣＨＫを用いたＢＩＣＣ＃９１０５  ＰＣＲ（９８１ｂｐ産物）（４次継代培養）、レーン４＝ＴＥＦＤＳＲＰおよびＳＰＭＴ４ＤＣＦＰを用いたＢＩＣＣ＃９１０５  ＰＣＲ（６４９ｂｐ産物）（４次継代培養）、レーン５＝１ｋｂラダーＤＮＡマーカー、レーン６＝ＩｎｓｔｅＺＲＰおよびＰＭＴ４ＤＳＣＨＫを用いたＢＩＣＣ＃９１０５  ＰＣＲ（９８１ｂｐ産物）（１次継代培養）、レーン７＝ＴＥＦＤＳＲＰおよびＳＰＭＴ４ＤＲＰを用いたＢＩＣＣ＃９１０５  ＰＣＲ（６４９ｂｐ産物）（１次継代培養）。
【図５ａ】ｐＭＢＬ１８７は、ｐＰＩＣＺαプラスミドにクローニングされたＰＭＴ５破壊遺伝子を表している。このプラスミドを線状化するために制限部位ＢｓｔＥＩＩを用いた。
【図５ｂ】ＰＭＴ５破壊クローンのＰＣＲスクリーニング。レーン１および１３＝ＤＮＡ分子量マーカーレーン２〜１２および１４〜２１は、スクリーニングされた様々なＰＭＴ５破壊クローンである。
【図６ａ】ｐＭＢＬ１８５は、ｐＰＩＣＺαプラスミドにクローニングされたＰＭＴ２破壊遺伝子を表している。このプラスミドを線状化するために制限部位ＫｐｎＩを用いた。
【図６ｂ】ＰＭＴ２遺伝子ノックアウト陽性スクリーニング。
【図７】ＰＭＴ１／インスリンクローンのグリコシル化の低下を示すクロマトグラムの重ね合わせ。
【図８】ＰＭＴ１遺伝子不活化前後のインスリン類似体１に関するグリコシル化プロファイルを示すＲＰＨＰＬＣプロファイル。
【図９】ＰＭＴ１遺伝子不活化前後のインスリン類似体２に関するグリコシル化プロファイルを示すＲＰＨＰＬＣプロファイル。
【００１８】
添付の配列表の表示
配列番号１：ＰＭＴ１のヌクレオチドコード配列
配列番号２：ＰＭＴ２のヌクレオチドコード配列
配列番号３：ＰＭＴ４のヌクレオチドコード配列
配列番号４：ＰＭＴ５のヌクレオチドコード配列
配列番号５：ＰＭＴ６のヌクレオチドコード配列
配列番号６：ＰＭＴ１の破壊された配列
配列番号７：ＰＭＴ２の破壊された配列
配列番号８：ＰＭＴ４の破壊された配列
配列番号９：ＰＭＴ５の破壊された配列
配列番号１０：ＰＭＴ６の破壊された配列
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子を含む群から選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子の不活化によって可能になったメタノール資化性酵母から産生されるタンパク質のグリコシル化を低下させる方法であって、該配列がタンパク質マンノシルトランスフェラーゼまたはその機能部分をコードする、方法に関する。
【００２０】
本開示の一実施形態では、メタノール資化性酵母はピキア属の種に属する。
【００２１】
本開示の別の実施形態では、メタノール資化性酵母はピキア・パストリスである。
【００２２】
本開示のさらなる実施形態では、タンパク質は、式Ｉによって表される。
【化１】
0005860413.tif 000002
（式中、
Ｘは、少なくとも１つのアミノ酸を含むリーダーペプチド配列であり、
Ｂは、インスリン分子のＢ鎖、その誘導体または類似体のアミノ酸配列であり、
Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸を含むリンカーペプチドであり、
Ａは、インスリン分子のＡ鎖、その誘導体または類似体のアミノ酸配列であり、かつ
このＡ鎖およびＢ鎖は、アミノ酸の置換、欠失および／または付加によって修飾することができる。）
【００２３】
本開示の別の実施形態では、グリコシル化の様式はＯ−グリコシル化である。
【００２４】
本開示のさらに別の実施形態では、グリコシル化は、少なくとも１０％〜約９９％低下する。
【００２５】
本開示のまた別の実施形態では、グリコシル化は２５％低下する。
【００２６】
本開示のまた別の実施形態では、グリコシル化は６５％低下する。
【００２７】
本開示は、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子を含む群から選択されるタンパク質マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子またはその機能部分を含むベクターに関するものであり、このベクターの相同遺伝子座への組込みは、宿主、好ましくは、メタノール資化性酵母内での機能的なタンパク質マンノシルトランスフェラーゼの発現を阻害する。
【００２８】
本開示の一実施形態では、メタノール資化性酵母から産生されるタンパク質上のグリコシル化を低下させるかまたは修飾する方法であって、該酵母を上記のベクターで形質転換することを含む、方法である。
【００２９】
本開示の別の実施形態では、メタノール資化性酵母はピキア属の種に属する。
【００３０】
本開示のさらに別の実施形態では、メタノール資化性酵母はピキア・パストリスである。
【００３１】
本開示は、メタノール資化性酵母のノックアウト株の産生方法であって、
（ａ）ベクターが、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６を含む群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする標的核酸配列と、選択マーカーをコードする核酸配列とを含む、相同組換えが可能な核酸配列を組み込み、
（ｂ）ベクター中の標的遺伝子をコードするＤＮＡと、宿主細胞内の標的遺伝子をコードするＤＮＡとの間の相同組換えが生じるのを可能にする条件下で細胞を培養し、それにより、宿主細胞内での標的遺伝子の破壊をもたらし、
（ｃ）不活化された標的遺伝子を有する宿主細胞を選択する、
前記方法に関する。
【００３２】
本開示はさらに、該前述の項のいずれかに記載の方法から産生されるタンパク質に関する。
【００３３】
本開示はさらに、メタノール資化性酵母のノックアウト株であって、該株が、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を有するＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６を含む群から選択される少なくとも１つの不活化遺伝子を有するノックアウト株に関する。
【００３４】
本開示は、受託番号ＭＴＣＣ５５１５を有する、上記のＰＭＴ１遺伝子不活化株に関する。
【００３５】
本開示はさらに、受託番号ＭＴＣＣ５５１６を有する、上記のＰＭＴ４遺伝子不活化株に関する。
【００３６】
本開示は、受託番号ＭＴＣＣ５５１７を有する、上記のＰＭＴ５遺伝子不活化株に関する。
【００３７】
本開示はさらに、受託番号ＭＴＣＣ５５１８を有する、上記のＰＭＴ６遺伝子不活化株に関する。
【００３８】
本開示の一実施形態では、宿主株は、改変されていない宿主株内で発現されるタンパク質産物と比べてグリコシル化のレベルが低下したタンパク質を産出する。
【００３９】
本開示のさらに別の実施形態では、グリコシル化は、少なくとも２５％低下する。
【００４０】
本開示のまた別の実施形態では、グリコシル化は、少なくとも６５％低下する。
【００４１】
本開示は、上記のノックアウト株から産生されるタンパク質に関する。
【００４２】
本開示は、請求項２３に記載のノックアウト株から産生されるタンパク質に関するものであり、ここで、このノックアウト株は、ＭＴＣＣ  ５５１５、ＭＴＣＣ  ５５１６、ＭＴＣＣ  ５５１７、ＭＴＣＣ  ５５１８またはそれらの任意の修飾株のうちの１つである。
【００４３】
本開示の一実施形態では、選択マーカーはゼオシン耐性マーカーである。
【００４４】
本開示の別の実施形態では、タンパク質はインスリン／インスリン類似体／インスリン前駆体分子である。
【００４５】
本開示のまた別の実施形態では、産生されるタンパク質は異種タンパク質産物である。
【００４６】
本開示のまた別の実施形態では、タンパク質は、修飾されたグリコシル化を示す。
【００４７】
本開示のまた別の実施形態では、所望のタンパク質最終産物の生産性は、影響を受けないままである
【００４８】
これから、以下の実施例とともに、本開示の原則を説明するのに役立つ、本開示の現在好ましい実施形態に関して詳細に言及する。
【００４９】
以下の実施例は、本開示の理解を助けるために示されるが、決して、その範囲を限定することが意図されるものではなく、また、そのようなものと解釈されるべきではない。本実施例は、ベクターの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のそのようなベクターへの挿入または得られたプラスミドの宿主への導入に利用される従来法に関する詳細な説明を含まない。本実施例は、そのような宿主ベクター系によって産生されるポリペプチドをアッセイするのに利用される従来法に関する詳細な説明も含まない。そのような方法は当業者に周知であり、一例として挙げたものを含む、多くの刊行物に記載されている。
【００５０】
標準的な技術が、様々な組換えＤＮＡ技術、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）およびアッセイに用いられる。組換え技術および手順は、通常、当技術分野で周知であり、かつ本明細書を通じて引用および考察されている様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載されているような従来法によって実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））を参照されたい。
【００５１】
本開示を記載し、かつ特許請求する際には、本明細書に示す定義に従って、以下の専門用語を用いる。本明細書で特に定義しない限り、本開示と関連する科学用語および技術用語は、当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有するものとする。さらに、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数物を含むものとし、また、複数形の用語は単数物を含むものとする。本開示の方法および技術は、通常、当技術分野で周知の従来法に従って実施される。通常、本明細書に記載の分子細胞生物学、生化学、タンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関連で用いられる命名法、ならびに本明細書に記載の分子細胞生物学、生化学、タンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術は、当技術分野で周知であり、かつ一般に用いられているものである。本開示の方法および技術は、通常、当技術分野で周知の従来法に従って実施される。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」は、ペプチドもしくはタンパク質配列またはそれらの部分を指す。「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に用いられる。
【００５３】
本開示の好ましい実施形態による異種タンパク質は、インスリンまたはインスリン類似体前駆体分子である。
【００５４】
式Ｉによって表される異種タンパク質をコードするＤＮＡ。
【化２】
0005860413.tif 000003
（式中、
Ｘは、少なくとも１つのアミノ酸を含むリーダーペプチド配列であり、
Ｂは、インスリン分子のＢ鎖、その誘導体または類似体のアミノ酸配列であり、
Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸を含むリンカーペプチドであり、
Ａは、インスリン分子のＡ鎖、その誘導体または類似体のアミノ酸配列であり、かつ
このＡ鎖およびＢ鎖は、アミノ酸の置換、欠失および／または付加によって修飾することができる。）
【００５５】
本明細書で使用される「Ｃ−ペプチド」または「リンカーペプチド」という用語は、天然または合成のペプチドを含む、全ての形態のインスリンＣ−ペプチドを含む。そのようなインスリンＣ−ペプチドは、ヒトペプチドであってもよいし、または他の動物種および属、好ましくは哺乳動物由来のものであってもよい。したがって、天然のインスリンＣ−ペプチドの変異体および修飾物は、それらがインスリンＣ−ペプチド活性を保持する限り、含まれる。その有用な活性を保持しながら、タンパク質またはペプチドの配列を修飾することが当技術分野で知られており、これは、当技術分野において標準であり、かつ文献中に広く記載されている技術、例えば、核酸のランダムなまたは部位特異的な突然変異誘発、切断およびライゲーションなどを用いて達成することができる。したがって、天然のインスリンＣ−ペプチド配列の機能的に等価な変異体または誘導体は、当技術分野で周知の技術によって容易に調製され、かつ天然のインスリンＣ−ペプチドの機能的な、例えば、生物学的な活性を有するペプチド配列を含むことができる。インスリンＣ−ペプチドの全てのそのような類似体、変異体、誘導体または断片が、本開示の範囲に特に含まれており、かつ「インスリンＣ−ペプチド」という用語に包含されている。
【００５６】
リンカー配列は、少なくとも２つのアミノ酸を有する任意の配列であることができる。リンカー領域は、２〜２５、２〜１５、２〜１２または２〜１０アミノ酸残基を含むことができるが、その長さは重要ではなく、便宜を図ってもしくは選択肢に従って選択することができるか、またはそれは、リンカーを含まないものとすることができる。
【００５７】
リンカーペプチドは、最初の２つのアミノ酸が「ＲＲ」に相当する条件で少なくとも２つのアミノ酸を含む任意の配列であることができる。
【００５８】
本開示のさらに他の実施形態によるポリペプチドは、インスリングラルギンの活性を有すると本明細書でみなされ、例えば、ヒトインスリン構造の２つの変化：ヒトインスリンのＡ鎖の位置Ａ２１にある天然のアスパラギンのアミノ酸グリシンへの置換と、組換えＤＮＡ技術によって産生されたヒトインスリンＢ鎖のＣＯＯＨ末端への２つのアルギニン分子の付加とを有するアミノ酸配列を有することが理解されるインスリングラルギン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）である。インスリングラルギンを含む任意のインスリンの主な作用は、ブドウ糖代謝の調節である。インスリンおよびその類似体は、特に、骨格筋および脂肪内における末梢ブドウ糖摂取の刺激によって、および肝臓によるブドウ糖産生の阻害によって血糖値を低下させる。
【００５９】
「挿入による不活化」という用語は、遺伝子機能の喪失をもたらす、外因性ＤＮＡの挿入による遺伝子のコード領域の中断を意味する。これは、形質転換後の組換え体の容易な選択を可能にするために、遺伝子技術において広く用いられている。
【００６０】
「ノックアウト」という用語は遺伝子の破壊を指し、ここで、この破壊は、天然遺伝子の機能的不活化；天然遺伝子もしくはその一部の欠失、または天然遺伝子の突然変異をもたらす。特に、本開示との関連で、「ノックアウト」は、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、ＰＭＴ６遺伝子の破壊を指す。
【００６１】
ノックアウト株を、当技術分野で効果的であることが知られている様々な方法のいずれかによって調製することができる。例えば、所望の核酸欠失配列の５’および３’に相同な標的化遺伝子配列を含む相同組換えベクターを、宿主細胞に形質転換することができる。理想的には、相同組換えによって、所望の標的化酵素遺伝子ノックアウト体を産生することができる。
【００６２】
「相同組換え」は、同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列の部位での２つのＤＮＡ分子対合染色体間のＤＮＡ断片の交換を意味する。相同組換えでは、入ってくるＤＮＡが、実質的に相同なＤＮＡ配列を含むゲノム中の部位と相互作用し、その部位の中に組み込まれる。非相同組換えによる（「ランダムな」または「不正な」）組込みでは、入ってくるＤＮＡが、ゲノム中の相同配列ではなく、どこか別の、可能性がある多くの場所のうちの１つに組み込まれる。
【００６３】
例えば、内在性標的遺伝子に相同なＤＮＡが隣接する、機能的または非機能的な突然変異体遺伝子（例えば、標的遺伝子に隣接するコード領域）を、選択マーカーおよび／もしくは陰性選択マーカーとともに、またはこれらのマーカーなしで用いて、インビボで望ましくない形態の標的遺伝子をコードする細胞を形質転換することができる。標的相同組換えによるＤＮＡコンストラクトの挿入は、内在性遺伝子の不活化をもたらす。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「相同な」という用語は、ｉ）所与のもとのタンパク質もしくはペプチドの配列と実質的に（すなわち、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％）類似しているアミノ酸配列を有し、かつもとのタンパク質もしくはペプチドの所望の機能を保持するタンパク質もしくはペプチド、またはｉｉ）所与の核酸の配列と実質的に（すなわち、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％）類似している配列を有し、かつもとの核酸配列の所望の機能を保持する核酸のいずれかを意味する。本開示および開示の実施形態の全てにおいて、任意の開示されたタンパク質、ペプチドまたは核酸を、所望の機能を保持する相同または実質的に相同なタンパク質、ペプチドまたは核酸と置き換えることができる。本開示および開示の実施形態の全てにおいて、任意の核酸が開示される場合、本開示が、開示された核酸にハイブリダイズする全ての核酸も含むと考えられるべきである。
【００６５】
「機能部分」とは、全長タンパク質の酵素活性を実質的に保持しているＰＭＴ遺伝子の断片を意味する。「実質的に」とは、全長ＰＭＴの酵素活性の少なくとも約４０％、または好ましくは、少なくとも５０％またはそれより多くが保持されていることを意味する。
【００６６】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「機能的に連結されて」いる。したがって、制御配列と「機能的に連結された」コード配列は、コード配列をこれらの配列の制御下で発現することができ、かつ連結されているＤＮＡ配列が連続的である配置を指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生される方法を指す。この方法には、転写と翻訳の両方が含まれる。
【００６８】
一態様では、単離された核酸分子は、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、ＰＭＴ６遺伝子をコードするＤＮＡ分子との少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、およびあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
あるいは、比較のための配列の最適アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所同一性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御された履行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または目視によって実施することができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適であり得るアルゴリズムの一例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。
【００７０】
より具体的には、本開示は、少なくとも配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）かもしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）核酸配列、好適には、単離された核酸配列、それらの変異体もしくはそれらの部分、または変異体もしくは部分を含む、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、ＰＭＴ６遺伝子のうちの少なくとも１つに関する。本開示はまた、ストリンジェントな条件下でこれらの核酸配列とハイブリダイズすることができる単離された核酸配列に関する。
【００７１】
本開示は、本明細書に記載の遺伝子のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供する。例として、宿主細胞は、細菌、真菌、または哺乳動物であってもよい。
【００７２】
本開示はまた、上で定義した核酸配列の少なくとも一部が破壊されて、対応するもとの組換え宿主細胞と比べて、グリコシル化のレベルが低下したインスリン前駆体を産生する組換え宿主細胞を生じさせる組換え宿主細胞に関する。組換え発現系は、原核生物および真核生物宿主から選択される。真核生物宿主としては、酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス）、哺乳動物細胞または植物細胞が挙げられる。細菌細胞および真核生物細胞は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）などの、市販供給源を含むいくつかの異なる供給源から当業者に入手可能である。組換えタンパク質発現に用いられる細胞の市販供給源は、細胞の使用のための指示書も提供する。発現系の選択は、発現されるポリペプチドに望ましい特徴によって決まる。
【００７３】
最も好ましくは、本開示に対する態様に関連して、最も好ましい宿主細胞は、メタノール資化性酵母である。本開示を用いて修飾することができるメタノール資化性酵母の株としては、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属、またはトルロプシス属の酵母などの、メタノールで増殖することができる酵母株が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいメタノール資化性酵母は、ピキア属のものである。本方法を用いて修飾することができるメタノール資化性酵母株には、目的の１以上の異種タンパク質を発現するように改変されているメタノール資化性酵母株も含まれる。これらの前もって遺伝子改変された株から発現された異種タンパク質上のグリコシル化は、そのような株を本開示のベクターの１つまたは複数で形質転換することによって低下させることができる。
【００７４】
宿主細胞または生物を、標準的な技術を用いて、組換えタンパク質またはペプチドを発現するように改変することができる。例えば、組換えタンパク質を、ベクターから、または宿主のゲノム中に挿入された外因性遺伝子から発現させることができる。
【００７５】
外因性タンパク質を発現させるために用いることができるベクターは当技術分野で周知であり、以下に記載されている。組換えタンパク質またはペプチドを発現させるための遺伝子を、本開示に記載されているように、相同組換えまたは異種組換えなどの技術を用いてゲノム中に挿入することもできる。タンパク質マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する本開示の好ましいベクターとしては、ｐＰＩＣＺαおよびｐＴＺ５７Ｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
別の態様では、本開示は、メタノール資化性酵母株に導入され、遺伝子を不活化または破壊し、それにより、最終産物の生産性に影響を及ぼすことなく、メタノール資化性酵母株で産生される所望のタンパク質最終産物のグリコシル化の低下を促進する不活化ベクターを提供する。
【００７７】
組換えタンパク質またはペプチドは、化学化合物による誘導後、または内在性遺伝子もしくは遺伝子産物の発現により発現されることができる。組換えタンパク質は、宿主細胞が特定の環境に置かれたときに発現されることもできる。特定のプロモーターエレメントを以下に記載する。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「形質転換された」および「安定に形質転換された」という用語は、少なくとも２世代の間維持されるエピソーム性プラスミドの中に組み込まれた非天然（異種）ポリヌクレオチド配列を組み込むように作製された細胞を指す。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「組換え」は、異種核酸配列の導入によって修飾されている細胞もしくはベクター、または細胞が、そのように修飾された細胞に由来することに対する言及を含む。
【００８０】
ベクターは、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、直接的なマイクロインジェクション、ＤＮＡをローディングしたリポソームおよびリポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃または本明細書に記載のもしくは当技術分野で公知の任意の他の手段を含むが、これらに限定されない、手段によって宿主細胞に形質転換することができる。
【００８１】
本開示はまた、所望のタンパク質を産生する方法であって、所望の最終産物の産生を導くのに十分なポリペプチドをコードする遺伝子が組み込まれている、ピキア属の種などの生物内で、そのようなタンパク質化合物またはその類似体を産生するのに好適な条件下および培地中で発酵させることを含む、方法に関する。
【００８２】
タンパク質マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＰＭＴ）は、小胞体中のタンパク質のセリンおよびトレオニン残基のＯ−グリコシル化を触媒することが分かっている。本開示では、ＰＭＴ遺伝子の破壊によって、産生されるインスリン前駆体分子のＯ−グリコシル化レベルが劇的に減少することが示されている。ＰＭＴ１遺伝子の破壊によって、約６５％のマンノシル化の減少を示すインスリン前駆体が生じた。ＰＭＴ５およびＰＭＴ６遺伝子の個々の破壊によって、それぞれ、３１％および２８％のインスリン前駆体グリコシル化レベルの低下が生じた。ＰＭＴ２およびＰＭＴ４の破壊は、マンノシル化に影響を及ぼさなかった。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「低下した発現」という用語は、目的のタンパク質の低下した産生を含むものと広く解釈される。低下した発現とは、本明細書中の教示によって改変されていないが、本質的に同じ増殖条件の下で増殖した対応する宿主株内での通常の発現レベルを下回る発現のことである。本開示との関連において、目的の酵素またはタンパク質は、インスリン／インスリン類似体前駆体分子のマンノース残基のグリコシル化において重要な役割を果たすマンノシルトランスフェラーゼである。
【００８４】
本開示の一態様によれば、グリコシル化の低下は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも６５％および最も好ましくは少なくとも７０％であることができる。本開示のまた別の態様によれば、得られるグリコシル化の低下は、約１００％である。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「プライマー」という用語は、精製された制限消化物と同様に天然に見られるものであれ、合成によって産生されたものであれ、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導作用物質の存在下、かつ好適な温度およびｐＨに）置かれたときに、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。
【００８６】
ＰＣＲの技術は、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、およびＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）をはじめとする、多くの刊行物に記載されている。
【００８７】
ＰＣＲは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号；第４，８８９，８１８号；第５，０７５，２１６号；第５，０７９，３５２号；第５，１０４，７９２号、第５，０２３，１７１号；第５，０９１，３１０号；および第５，０６６，５８４をはじめとする、多くの米国特許にも記載されている。
【００８８】
本開示の最も重要な態様によれば、（ａ）ベクターが、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、およびＰＭＴ６からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列と、選択マーカーをコードする核酸配列とを組み込み、（ｂ）相同組換えが起こる条件下で細胞を培養し、それにより、宿主細胞内の標的核酸配列を破壊し、それにより、（ｃ）相同組換えが起こった細胞を選択し、かつ（ｄ）改変された株におけるグリコシル化の減少のレベルを評価する、メタノール資化性酵母の「ノックアウト」株の産生方法。
【００８９】
ピキア・パストリス宿主に対する形質転換は全て、エレクトロポレーションにより行なわれた。ゼオシン耐性遺伝子を有するベクターの形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤプレート上で選択した。
【００９０】
したがって、本開示の方法は、目的のタンパク質を産生することができる改変された酵母株（ここで、該株は、それぞれ、配列番号１、２、３、４および５によって表されるＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５、およびＰＭＴ６を含む群から選択される少なくとも１つの不活化遺伝子を有する）を生じさせ、かつ（ｂ）該改変された株を、改変されていない宿主株内で産生されるタンパク質産物と比較して、グリコシル化された最終産物のレベルを低下させるような条件下での増殖をもたらす。
【００９１】
記載された特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター、種または属、および培地成分は、様々に異なり得るので、本開示は、そのようなものに限定されないことが理解されるべきである。本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものであるに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本開示の範囲を限定することを意図したものではないことも理解されるべきである。上の記載は、本開示の実施の仕方を当業者に教示するためのものであり、この記載を読めば当業者には明らかになるその全ての明白な修飾および変化形を詳述することを意図したものではない。
【００９２】
ＰＭＴ遺伝子不活化株の寄託
全面開示の要求に応じて、本開示の株を、（ブダペスト条約に基づく国際寄託に準拠して）ＩＭＴＥＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｏｒ  ３９−Ａ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ  １６００３６，Ｉｎｄｉａに寄託した。これらの株は、（括弧内に示す受託番号）である：
【表１】
0005860413.tif 000004
【００９３】
本開示は、以下の実施例を参照しながら、より完全に説明され、かつ理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供されるのであって、決して、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例１：
ＰＭＴ１の破壊：
ピキア・パストリスＰＭＴ１コード領域の一部を含む約４７７ｂｐのコード配列を、以下のＰＭＴ１プライマーを用いて増幅させた。
ＰＭＴ１ＦＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ３’
ＰＭＴ１ＲＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ３’
【００９５】
ベクター中の潜在的な早期の翻訳開始部位からのいかなる読み飛ばしも避けるために、２つの終止コドンをフォワードプライマー中にインフレームで含めた。ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒベクターにクローニングし、Ｍ１３ＦＰおよびＭ１３ＲＰを用いて配列決定し、クローンを確認した。ＰＭＴ１断片をＢａｍＨＩを用いて切り出し、ｐＰＩＣＺαのＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。１７７５ｂｐと５７６ｂｐの断片を生じるクローンを選択した。
【００９６】
ＰＭＴ１破壊カセットをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。エレクトロポレーションによってピキア株に形質転換されるＰＭＴ１破壊断片のほぼ中央にあるＢｓｔＥＩＩ部位を用いて、プラスミドを線状化した。形質転換したクローンを、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを用いて選択する。数百個のコロニーを取得し、個々のコロニーをＹＰＤプレート上にストリークした。各々のクローンからゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを行なって、正確に破壊されたクローンを調べた。ノックアウトされたＰＭＴ１をＰＣＲ（図２ｂ参照）、さらにサザンブロッティング（図２ｃ参照）で確認した。選択されたクローンをＭＴＣＣ５５１５として寄託した。
【００９７】
プライマー配列：
ＩｎＳＴＥｚＲＰ：５’ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ３’
ＴＥＦＤＳＲＰ：ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ３’
ＩＳＣＨＫＦＰ：５’ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ３’
ＳＰＭＴ１ＤＣＦＰ：５’ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ３’
【００９８】
実施例２：
ＰＭＴ６の破壊：
ＰＭＴ６コード領域の一部を含む約５１５ｂｐのコード配列を、以下のプライマーを用いて増幅させた。
ＰＭＴ６ＦＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡ  ３’
ＰＭＴ６ＲＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ３’
【００９９】
ベクター中の潜在的な早期の翻訳開始部位からのいかなる読み飛ばしも避けるために、２つの終止コドンをフォワードプライマー中にインフレームで含めた。ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒベクターにクローニングし、Ｍ１３ＦＰおよびＭ１３ＲＰを用いて配列決定し、クローンを確認した。
【０１００】
ＰＭＴ６破壊カセットをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。エレクトロポレーションによってピキア株に形質転換されるＰＭＴ６破壊断片のほぼ中央にある固有のＮｄｅＩ部位を用いて、プラスミドを線状化した。形質転換したクローンを、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを用いて選択する。数百個のコロニーを取得し、個々のコロニーをＹＰＤプレート上にストリークした。各々のクローンからゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを行なって、正確に破壊されたクローンをスクリーニングした（図３ｂ参照）。選択されたクローンをＭＴＣＣ５５１８として寄託した。
【０１０１】
実施例３：
ＰＭＴ４の破壊：
ＰＭＴ４コード領域の一部を含む約５１６ｂｐのコード配列を、以下のプライマーを用いて増幅させた。
ＰＭＴ４ＦＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  Ａ  ３’
ＰＭＴ４ＲＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＧＧＴ  Ｔ  ３’
【０１０２】
ベクター中の潜在的な早期の翻訳開始部位からのいかなる読み飛ばしも避けるために、２つの終止コドンをフォワードプライマー中にインフレームで含めた。ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒベクターにクローニングし、Ｍ１３ＦＰおよびＭ１３ＲＰを用いて配列決定し、クローンを確認した。
【０１０３】
ＰＭＴ４破壊カセットをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。エレクトロポレーションによってピキア株に形質転換されるＰＭＴ４破壊断片のほぼ中央にある固有のＸｃｍＩ部位を用いて、プラスミドを線状化した。形質転換したクローンを、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを用いて選択する。数百個のコロニーを取得し、個々のコロニーをＹＰＤプレート上にストリークした。各々のクローンからゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを行なって、正確に破壊されたクローンをスクリーニングした（図４ｂ参照）。選択されたクローンをＭＴＣＣ５５１６として寄託した。
【０１０４】
実施例４：
ＰＭＴ５の破壊：
ＰＭＴ５コード領域の一部を含む約４５５ｂｐのコード配列を、プライマーを用いて増幅させた。
ＰＭＴ５ＦＰ＝５’ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＣＴ  ３’
ＰＭＴ５ＲＰ＝５’ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ３’
【０１０５】
ベクター中の潜在的な早期の翻訳開始部位からのいかなる読み飛ばしも避けるために、２つの終止コドンをフォワードプライマー中にインフレームで含めた。ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒベクターにクローニングし、Ｍ１３ＦＰおよびＭ１３ＲＰを用いて配列決定し、クローンを確認した。
【０１０６】
ＰＭＴ５破壊カセットをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。エレクトロポレーションによってピキア株に形質転換されるＰＭＴ５破壊断片のほぼ中央にある固有のＢｓｔＥＩＩ部位を用いて、プラスミドを線状化した。形質転換したクローンを、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを用いて選択する。数百個のコロニーを取得し、個々のコロニーをＹＰＤプレート上にストリークした。各々のクローンからゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを行なって、正確に破壊されたクローンをスクリーニングし、クローンをＰＣＲで確認した（図５ｂ参照）。選択されたクローンをＭＴＣＣ５５１７として寄託した。
【０１０７】
実施例５：
ＰＭＴ２の破壊：
ＰＭＴ２コード領域の一部を含む約４３９ｂｐのコード配列を、以下のプライマーセットを用いて増幅させた。
ＰＭＴ２ＦＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ３’
Ｐｍｔ２ＲＰ＝５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＡ  ３’
【０１０８】
ベクター中の潜在的な早期の翻訳開始部位からのいかなる読み飛ばしも避けるために、２つの終止コドンをフォワードプライマー中にインフレームで含めた。ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒベクターにクローニングし、Ｍ１３ＦＰおよびＭ１３ＲＰを用いて配列決定し、クローンを確認した。
【０１０９】
ＰＭＴ２破壊カセットをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。エレクトロポレーションによってピキア株に形質転換されるＰＭＴ２破壊断片のほぼ中央にある固有のＫｐｎＩ部位を用いて、プラスミドを線状化した。形質転換したクローンを、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを用いて選択する。数百個のコロニーを取得し、個々のコロニーをＹＰＤプレート上にストリークした。各々のクローンからゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを行なって、正確に破壊されたクローンをスクリーニングした（図６）。
【０１１０】
実施例６：
ＰＭＴノックアウトによるインスリンのグリコシル化の低下
ピキア・パストリスＧＳ１１５をインスリン発現コンストラクトで形質転換して、グリコシル化レベルの対照としてのクローンＢＩＣＣ＃７７４３を取得し；分泌されたインスリンは、１．９０〜２．０（１００％とみなす）のグリコシル化レベルを有していた。また、このインスリン発現コンストラクトを用いて、ＰＭＴノックアウト株のＭＴＣＣ  ５５１５、ＭＴＣＣ  ５５１７およびＭＴＣＣ  ５５１８をクローニングし、分泌されたインスリンのグリコシル化レベルを対照と比較した。対照のＢＩＣＣ＃７７４３によって産生されたインスリンと比較した場合、それぞれ、６１％、３１％および２８％の顕著なグリコシル化の低下が見られた（図７参照）。
【表２】
0005860413.tif 000005
【０１１１】
実施例７：
ＰＭＴノックアウトによるインスリン類似体１のグリコシル化の低下
ピキア・パストリスＧＳ１１５をインスリン発現コンストラクトで形質転換して、グリコシル化レベルの対照としてのクローンＢＩＣＣ＃７７４４を取得し；分泌されたインスリンは、１．６６（１００％とみなす）のグリコシル化レベルを有していた。また、このインスリン発現コンストラクトを用いて、ＰＭＴノックアウト株のＭＴＣＣ  ５５１５をクローニングし、分泌されたインスリンのグリコシル化レベルを対照と比較した。対照のＢＩＣＣ＃７７４４によって産生されたインスリン類似体１と比較した場合、４６％の顕著なグリコシル化の低下が見られた（図８）。
【表３】
0005860413.tif 000006
【０１１２】
実施例８：
ＰＭＴノックアウトによるインスリン類似体２のグリコシル化の低下
ピキア・パストリスＧＳ１１５をインスリン発現コンストラクトで形質転換して、グリコシル化レベルの対照としてのクローンＢＩＣＣ＃７９９６を取得し；分泌されたインスリンは、１．９２（１００％とみなす）のグリコシル化レベルを有していた。また、このインスリン発現コンストラクトを用いて、ＰＭＴノックアウト株のＭＴＣＣ  ５５１５をクローニングし、分泌されたインスリンのグリコシル化レベルを対照と比較した。対照のＢＩＣＣ＃７９９６によって産生されたインスリン類似体１と比較した場合、６５％の顕著なグリコシル化の低下が見られた（図９）。
【表４】
0005860413.tif 000007
【図１】
0005860413.tif 000009
【図２ａ】
0005860413.tif 000010
【図２ｂ】
0005860413.tif 000011
【図２ｃ】
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【図３ａ】
0005860413.tif 000013
【図３ｂ】
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【図４ａ】
0005860413.tif 000015
【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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