(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体活性化を阻害するための薬剤の製剤化のための、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分の使用、ここで、
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドプロテアーゼまたはＭＴ−ＳＰ１スカフォールドプロテアーゼの触媒活性部分において１以上のアミノ酸置換を含む；
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、配列番号２もしくは１０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２もしくは１０と少なくとも９５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む；
前記アミノ酸置換がキモトリプシン番号付けに基づいたI41DおよびQ175Lのうちの１つまたは両方に対応する修飾から選択される；
修飾されたアミノ酸残基が、補体タンパク質である標的基質についての特異性および標的基質への活性の一方または両方を増加させる；および
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、補体経路の１以上の標的基質を切断し、それにより前記標的基質を含む経路の補体活性化を阻害させる。
【請求項２】
補体活性化の阻害における使用のための、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む医薬組成物、ここで、
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドプロテアーゼまたはＭＴ−ＳＰ１スカフォールドプロテアーゼの触媒活性部分において１以上のアミノ酸置換を含む；
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、配列番号２もしくは１０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２もしくは１０と少なくとも９５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む；
前記アミノ酸置換がキモトリプシン番号付けに基づいたI41DおよびQ175Lのうちの１つまたは両方に対応する修飾から選択される；
修飾されたアミノ酸残基が、補体タンパク質である標的基質についての特異性および標的基質への活性の一方または両方を増加させる；および
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、補体経路の１以上の標的基質を切断し、それにより前記標的基質を含む経路の補体活性化を阻害させる。
【請求項３】
前記アミノ酸置換がI41Dである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記アミノ酸置換がQ175Lである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
補体活性化の阻害が、補体媒介性障害を有する対象の処置をもたらす、請求項１および３から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
補体活性化の阻害が、炎症性障害、神経変性障害、および心血管障害の中から選択される補体媒介性障害に関連する炎症性症状の低下につながる、請求項１および３から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記補体媒介性障害が、セプシス、関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、虚血再灌流傷害およびギラン−バレー症候群の中から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記補体媒介性障害が虚血再灌流傷害であり、前記虚血再灌流傷害が、心筋梗塞症（ＭＩ）、発作、血管形成術、冠動脈バイパス術、心肺バイパス（ＣＰＢ）、および血液透析の中から選択される事象または処置により引き起こされる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記補体経路が、古典経路、代替経路、およびレクチン経路のうちの１つまたは複数である、請求項１および３から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記標的基質が、Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ３、ｉＣ３、Ｃ４、ｉＣ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＢＬ、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｐ因子、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｂａ、Ｂｂおよびフィコリンのうちの１つまたは複数である、請求項１および３から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記標的基質が、配列番号２９８、２９９、３００、３０２、３０４、３０５、３０６、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、および３４４のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含む、請求項１および３から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記標的基質が、Ｃ２またはＣ３である、請求項１および３から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、キモトリプシン番号付けに基づいた位置１５１に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項１および３から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記標的基質がＣ２であり、前記基質認識部位が、ＳＬＧＲのアミノ酸の配列（配列番号３９２）を含む、請求項１および３から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、補体媒介性障害を処置するための第２の作用物質と組み合わせての投与用に製剤化される、請求項１および３から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記第２の作用物質が、抗炎症剤または抗凝固薬である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記第２の作用物質が、ＮＳＡＩＤ、代謝拮抗物質、コルチコステロイド、鎮痛薬、細胞毒性薬、炎症促進性サイトカイン阻害剤、抗炎症性サイトカイン、Ｂ細胞標的作用物質、Ｔ抗原を標的にする化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体拮抗薬、キナーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−γリガンド、補体阻害剤、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランのうちの１つまたは複数の中から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記アミノ酸置換がI41Dである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記アミノ酸置換がQ175Lである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
補体活性化の阻害が、補体媒介性障害を有する対象の処置をもたらす、請求項２、１８および１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
補体活性化の阻害が、炎症性障害、神経変性障害、および心血管障害の中から選択される補体媒介性障害に関連する炎症性症状の低下につながる、請求項２および１８−２０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記補体媒介性障害が、セプシス、関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、虚血再灌流傷害およびギラン−バレー症候群の中から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記補体媒介性障害が虚血再灌流傷害であり、前記虚血再灌流傷害が、心筋梗塞症（ＭＩ）、発作、血管形成術、冠動脈バイパス術、心肺バイパス（ＣＰＢ）、および血液透析の中から選択される事象または処置により引き起こされる、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記補体経路が、古典経路、代替経路、およびレクチン経路のうちの１つまたは複数である、請求項２および１８−２３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記標的基質が、Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ３、ｉＣ３、Ｃ４、ｉＣ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＢＬ、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｐ因子、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｂａ、Ｂｂおよびフィコリンのうちの１つまたは複数である、請求項２および１８−２４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記標的基質が、配列番号２９８、２９９、３００、３０２、３０４、３０５、３０６、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、および３４４のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含む、請求項２および１８−２５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記標的基質が、Ｃ２またはＣ３である、請求項２および１８−２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、キモトリプシン番号付けに基づいた位置１５１に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項２および１８−２７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記標的基質がＣ２であり、前記基質認識部位が、ＳＬＧＲのアミノ酸の配列（配列番号３９２）を含む、請求項２および１８−２８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、補体媒介性障害を処置するための第２の作用物質と組み合わせての投与用に製剤化される、請求項２および１８−２９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記第２の作用物質が、抗炎症剤または抗凝固薬である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記第２の作用物質が、ＮＳＡＩＤ、代謝拮抗物質、コルチコステロイド、鎮痛薬、細胞毒性薬、炎症促進性サイトカイン阻害剤、抗炎症性サイトカイン、Ｂ細胞標的作用物質、Ｔ抗原を標的にする化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体拮抗薬、キナーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−γリガンド、補体阻害剤、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランのうちの１つまたは複数の中から選択される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の利益が、２００５年１０月２１日に提出された、Ｅｄｗｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎの「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＲＯＴＥＡＳＥＳ  ＴＨＡＴ  ＩＮＨＩＢＩＴ  ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ」と題する米国仮出願第６０／７２９，８１７号に対して主張される。許可される場合、本出願の主題は参照によりその全体が組み入れられる。
【０００２】
本出願は、２００６年１０月２０日に提出された、Ｅｄｗｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｊａｃｋ  Ｎｇｕｙｅｎ、Ｓａｎｄｒａ  Ｗａｕｇｈ  Ｒｕｇｇｌｅｓ、およびＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｔｈａｎｏｓの「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＲＯＴＥＡＳＥＳ  ＴＨＡＴ  ＩＮＨＩＢＩＴ  ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ」と題する米国特許出願第（代理人整理番号１９０４９−００３００１／４９０３）に関するものであり、この米国特許出願もまた米国仮出願第６０／７２９，８１７号に対する優先権を主張する。
【０００３】
本出願は、２００３年１０月０２日に提出された、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙと題する米国出願第１０／６７７，９７７号、２００５年４月１２日に提出された、Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｗｉｌｄ−Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｎｔ  ＭＴＳＰ−１と題する米国出願第１１／１０４，１１０号、および２００５年４月１２日に提出された、Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｗｉｌｄ−Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅと題する米国出願第１１／１０４，１１１号に関するものである。
【０００４】
許可される場合、上述の出願のそれぞれの主題は、参照によりその全体が組み入れられる。
【０００５】
補体系を調節するための方法および化合物が提供される。特に、補体活性化を阻害する化合物が提供され、また補体活性化を促進する化合物が提供される。こうした化合物は、補体系に対して作用するので治療用物質となる。したがって、補体活性化を阻害する化合物は、心筋梗塞および発作を含む虚血再灌流障害、セプシス、自己免疫疾患、炎症性疾患、ならびにアルツハイマー病および他の神経変性障害を含む、炎症成分を有する疾患の処置のために使用することができる。
【背景技術】
【０００６】
補体（Ｃ）系は、免疫系の一部であり、侵入する病原体の排除および炎症応答の開始において役割を果たす。ヒトおよび他の哺乳動物の補体系は、補体活性化をもたらす順序立った一連の反応に関与する３０種を超える可溶性の膜結合タンパク質を必要とする。血液補体系は、抗微生物作用および抗ウイルス作用を含む広域スペクトルの宿主防御メカニズムに関連する広範な一連の機能を有する。Ｃ成分の活性化から誘導される産物は、非自己認識分子Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、およびＣ５ｂならびに様々な細胞性免疫応答に影響を及ぼすアナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａを含む。これらのアナフィラトキシンはまた、炎症促進性作用物質としても作用する。
【０００７】
補体系は、一連の酵素および非酵素タンパク質ならびに受容体から構成される。補体活性化は、「古典」経路、「代替」経路、および「レクチン」経路として知られている３つの主要な形態のうちの１つにより生じる（図１を参照されたい）。これらの経路は、補体活性化を開始するプロセスにより区別することができる。古典経路は、抗体−抗原複合体または免疫グロブリンの凝集形態により開始され、代替経路は、微生物表面および細胞表面上の構造の認識により開始され、レクチン経路は、抗体非依存的経路であり、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ、マンノース結合タンパク質とも命名される）の、細菌またはウイルスの表面上に示された炭水化物等の炭水化物に対する結合により開始される。カスケードの活性化は、タンパク質分解または細胞溶解に関与する複合体ならびにオプソニン化、アナフィラキシー、および走化性に関与するペプチドの産生をもたらす。
【０００８】
補体カスケードは、動物の免疫応答の中心的な成分であり、不可逆的カスケードである。多数のタンパク質補因子がプロセスを調節する。プロセスの不適切な調節、典型的には不適切な活性化は、急性および慢性の炎症性疾患において観察される炎症応答等の不適切な炎症応答を伴う様々な障害の一面であり、またはこのような障害において生じ得る。これらの疾患および障害は、関節リウマチおよび狼瘡等の自己免疫疾患、心障害、ならびにセプシスおよび虚血再灌流傷害等の他の炎症性疾患を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
補体経路は、様々な疾患および状態に関与しているので、補体経路の成分は、治療的介入のための、特に経路の阻害のための標的となる。上記治療用物質の例は、合成低分子治療用物質および自然低分子治療用物質、抗体阻害剤、ならびに膜補体調節因子の組換え可溶性形態を含む。上記治療用物質を調製するための戦略に対する制限がある。低分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで短い半減期を有し、補体阻害を維持するために継続的に注入する必要があり、それによって、とりわけ慢性疾患におけるそれらの役割を制限する。治療抗体は、対象における免疫応答をもたらし、したがって、処置、特に、免疫応答を調節するために設計された処置において合併症につながり得る。したがって、補体媒介性疾患および補体活性化が役割を果たす疾患の処置のための治療用物質に対して未だ対処されていない必要性が存在する。これらは、急性および慢性の炎症性疾患を含む。したがって、本明細書中の目的の中で、補体カスケードの活性化を標的にする上記治療用物質を提供することならびに治療用物質および疾患の処置の方法を提供することが目的となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
補体カスケードの活性化を標的にする治療用物質および方法ならびに急性および慢性の炎症性疾患を含む疾患の処置の方法が本明細書中に提供される。治療用物質は、補体経路基質を標的にする非補体プロテアーゼである。非補体プロテアーゼの中にはそれらの天然基質および補体基質を切断する無修飾プロテアーゼおよび標的基質についての選択性または基質特異性が増加するよう修飾されたプロテアーゼもまた含まれる。修飾プロテアーゼは、それらの天然基質に関する活性の低下または変更を呈することができる。
【００１１】
本明細書中に提供される方法の中には、非補体プロテアーゼを任意の１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０種、またはそれ以上の、補体経路の標的基質と接触させ、それにより、標的基質タンパク質が切断されて、標的基質を備える経路における補体活性化が変更されることによる、補体活性化を調節する方法がある。処置のためのおよび／または薬剤の製剤のためのプロテアーゼの使用もまた提供される。これらの方法のためのならびに本明細書中に提供される方法および使用のいずれかのための標的基質は、Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ３、ｉＣ３、Ｃ４、ｉＣ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＢＬ、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｐ因子、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｂａ、Ｂｂ、およびフィコリンを含めた補体タンパク質である。接触は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで達成することができる。例示的な標的は、配列番号２９８、２９９、３００、３０２、３０４、３０５、３０６、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４４、６６０〜６６２のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有する標的のいずれか、および補体経路活性を呈するそれらの標的のいずれかの断片、あるいはそれらの対立遺伝子変異体もしくは種変異体、または６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１２】
本明細書中に提供されるすべておよび任意の方法および使用のために、標的基質は、体液もしくは組織サンプル中に存在することができ、または標的基質の集合体もしくは上記基質を含有する任意の他の組成物とすることができる。標的基質（複数可）に依存して、補体活性化を阻害または活性化することができる。方法は、１つまたは複数の任意の補体経路を標的にする。したがって、調節される補体経路は、補体の古典経路、代替経路、およびレクチン経路のうちの１つまたは複数の中から選択することができる。非補体プロテアーゼは、無修飾プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼと比較して、任意の１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５個、またはそれ以上の残基のアミノ酸残基での修飾を含有する。修飾アミノ酸残基（複数可）は、標的基質についての特異性もしくは標的基質への活性の一方または両方を増加させる。例示的な無修飾プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼは、例えば、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グランザイムＭ、カテプシンＧ、ＭＴ−ＳＰ１、好中球エラスターゼ、キマーゼ、アルファ−トリプターゼ、ベータ−トリプターゼＩまたはＩＩ、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、ＣＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、プロテインＣ、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、プラスミン、血漿カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、カテプシン、パパイン、クルザイン（ｃｒｕｚａｉｎ）、金属プロテアーゼ、ならびにそれらの対立遺伝子変形物、アイソフォーム、および触媒活性部分等のセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、ならびにメタロプロテアーゼのいずれか１つを含む。例えば、スカフォールドプロテアーゼは、配列番号２、４、８、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９９、１１７、１１９、１２１、１２３、１３２、１３４、１３８、１４２、１４４、１４６、１４８、１６２、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２３８、２４８、２５０、２６０、２６２、２８０、２８２、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、５４７、５４９、および５５１のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列ならびにそれらの触媒活性部分、それらの対立遺伝子変異体および種変異体、ならびに６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを備える。それぞれ配列番号２および１０に記載されるポリペプチド配列等のＭＴ−ＳＰ１またはその断片は、スカフォールドプロテアーゼの例示である。補体経路（複数可）のＣ２タンパク質またはＣ３タンパク質は、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ、またはその触媒活性部分の例示的な標的基質である。
【００１３】
ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分の修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいた位置１４６、２２４、４１、および／または１５１での修飾（複数可）を含む。上記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは、キモトリプシン番号付けに基づいた以下の修飾：I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、およびI41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、およびI41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224Nのうちのいずれかを有するプロテアーゼを含む。特に、修飾ＭＴ−ＳＰ１は、アミノ酸修飾Ｉ４１Ｔ／Ｙ１４６Ｄ／Ｇ１５１Ｌ／Ｋ２２４Ｆを含有する。
【００１４】
例えば、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸位置９７、１４６、１９２、および２２４のうちの任意の１つまたは複数に対応する、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分における修飾等の修飾を、拡張された基質特異性または相互作用の二次的部位に寄与する任意の１つまたは複数のアミノ酸においてすることができる。上記修飾の例示は、Ｆ９７Ｄ、Ｆ９７Ｅ、Ｆ９７Ａ、Ｆ９７Ｗ、Ｙ１４６Ｎ、Ｙ１４６Ｄ、Ｙ１４６Ｅ、Ｙ１４６Ａ、Ｙ１４６Ｗ、Ｙ１４６Ｒ、Ｑ１９２Ｒ、Ｑ１９２Ｖ、Ｋ２２４Ａ、およびＫ２２４Ｆ等の、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのＦ９７、Ｙ１４６、Ｑ１９２、およびＫ２２４のうちの１つまたは複数である。上記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの例示は、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１４、３８、および４０ならびに４０５〜４１８のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するそれらのポリペプチドを含む。修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分の他の例は、配列番号１２、４０４、２８、または４１２に記載されるアミノ酸の配列を有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドに対応する修飾等の、アミノ酸修飾Ｙ１４６Ｄ／Ｋ２２４ＦまたはＹ１４６Ｅを含む。
【００１５】
ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼおよびその触媒活性部分は、キモトリプシン番号付けに基づいた以下の修飾：F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/ Q221aE/K224F、I41T/ Y146E/ G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/ Q175D/ K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/ K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、およびI41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224Nのうちの１つまたは複数を含有するポリペプチドを含む。上記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分の例示は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０〜６９、４０４〜４１８、４１９〜４４７、５２４〜５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するそれらのポリペプチドを含む。特に、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、配列番号５９６または６５０に記載されるアミノ酸の配列を有するものである。
【００１６】
本明細書に提供されるすべての方法および使用のために、修飾は、ＭＴ−ＳＰ１等の修飾プロテアーゼが標的基質の基質認識部位を切断するよう選択することができる。標的基質は、上述の補体経路ポリペプチドのいずれかであり、当業者に知られており、例えばＣ２および／またはＣ３を含む。例えば、標的基質がＣ２である場合、基質認識部位は、ＳＬＧＲ（配列番号３９２）のアミノ酸の配列を含む。
【００１７】
本明細書中に提供される方法および使用において標的にされる他の認識部位は、ＬＰＳＲ（配列番号３８８）、ＳＬＬＲ（配列番号３８９）、またはＨＲＧＲ（配列番号３９０）等の第Ｉ因子基質認識部位を含む。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは触媒活性部分における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸Ｑ１７４、Ｄ２１７、Ｄ９６、Ｑ１９２、Ｙ１４６、およびＦ９９のうちの任意の１つまたは複数等の、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸位置１７４、２１７、９６、１９２、１４６、または９９のうちの任意の１つまたは複数に対応することができる。上記修飾の例示は、Ｑ１７４Ｈ、Ｄ２１７Ｑ、Ｄ２１７Ｎ、Ｄ２１７Ｈ、Ｄ９６Ａ、Ｄ９６Ｖ、Ｄ９６Ｆ、Ｄ９６Ｓ、Ｄ９６Ｔ、Ｑ１９２Ｌ、Ｑ１９２Ｉ、Ｑ１９２Ｆ、Ｙ１４６Ｆ、Ｆ９９Ａ、Ｆ９９Ｖ、Ｆ９９Ｓ、およびＦ９９Ｇのうちの１つまたは複数の中から選択される修飾である（例えば、配列番号４１〜５７または４１９〜４３５のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するポリペプチドを参照されたい）。
【００１８】
他の認識部位はアミノ酸ＬＰＳＲの配列を含む。その認識のために修飾される修飾プロテアーゼの例示は、例えば、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸Ｑ１７４、Ｍ１８０、Ｗ２１５、Ｑ１９２、またはＦ９９等のうちの任意の１つまたは複数の、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸位置１７４、１８０、２１５、１９２、または９９のうちの任意の１つまたは複数に対応する部位での修飾を有するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは触媒活性部分である。上記修飾の例示は、Ｑ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｌ、Ｑ１７４Ｙ、Ｍ１８０Ｅ、Ｗ２１５Ｆ、Ｗ２１５Ｙ、Ｑ１９２Ｋ、Ｑ１９２Ｒ、Ｑ１９２Ｙ、およびＦ９９Ｙのうちの任意の１つまたは複数である（例えば、配列番号３６、５８、５９、６１、６２、６９、４１６、４３６、４３７、４３９、４４０、４４７、または５２４〜５３３のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを参照されたい）。
【００１９】
本明細書中の方法における使用のための他の基質認識部位はアミノ酸ＨＲＧＲの配列を含む。上記部位を認識するための修飾を有するプロテアーゼの例示は、例えば、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのＷ２１５、Ｑ１７４、Ｄ２１７、Ｑ１９２、およびＦ９９等の、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸位置２１５、１７４、２１７、１９２、および９９のうちの任意の１つまたは複数での修飾に対応する修飾を有するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分である。その例示は、Ｗ２１５Ｆ、Ｗ２１５Ｙ、ＱＩ７４Ａ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｒ、Ｑ１７４Ｋ、Ｄ２１７Ａ、Ｄ２１７Ｖ、Ｑ１９２Ｅ、Ｆ９９Ｗ、およびＦ９９Ｙのうちの任意の１つまたは複数の中から選択される修飾である。（例えば、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、配列番号５８〜６９および４３６〜４４７のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドに対応する）。
【００２０】
補体媒介性障害ならびに古典経路、代替経路、およびレクチン経路のうちの１つまたは複数を含む補体経路を調節することにより症状が寛解される障害の処置のための方法が提供される。方法の実施において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの投与等によって、１つまたは複数の非補体プロテアーゼを１つまたは複数の標的基質と接触させ、それにより、非補体プロテアーゼが補体経路の任意の１つまたは複数の標的基質を切断して、標的基質を備える経路における補体活性化が変更される。上記疾患および障害の処置のためのならびに／または上記処置のための薬剤の製剤のための非補体プロテアーゼの使用もまた提供される。調節は、補体活性化の阻害または増強（増加させること）を含む。補体活性化の阻害は、補体媒介性障害に関連する炎症性症状の低下につながり得る。炎症性障害の例示は、限定されるものではないが、セプシス、関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、虚血再灌流傷害、およびギラン−バレー症候群等の神経変性障害および心血管障害である。補体媒介性障害は対象の処置に起因し得る。虚血再灌流傷害は、心筋梗塞症（ＭＩ）、発作（stroke）、血管形成術、冠動脈バイパス術、心肺バイパス（ＣＰＢ）、および血液透析の中から選択される事象または処置により引き起こされ得る。
【００２１】
本明細書中に提供される処置の方法は、顕在化した障害に対する対象の処置の前に達成される、非補体プロテアーゼを対象に投与することにより達成することができる。記述されるように、投与は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏの体液または組織サンプルを非補体プロテアーゼと接触させることにより達成することができる。補体媒介性虚血再灌流傷害は、上記障害の例示である。上記障害を引き起こす処置は、血管形成術または冠動脈バイパス術である。
【００２２】
上述のように、本明細書中に提供される任意の方法および使用において、標的基質は、配列番号２９８、２９９、３００、３０２、３０４、３０５、３０６、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、もしくは３４４のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含有する基質等の、１つもしくは複数のＣ１ｑ、Ｃ２、Ｃ３、ｉＣ３、Ｃ４、ｉＣ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＢＬ、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｐ因子、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｂａ、Ｂｂ、およびフィコリンを含むまたは標的基質は、補体活性を呈するその断片である。
【００２３】
これらの方法および使用ならびに本明細書中に提供されるすべての方法および使用において、非補体プロテアーゼは、無修飾プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼと比較して、任意の１つまたは複数のアミノ酸残基での修飾を含むことができ、修飾アミノ酸残基（複数可）は、標的基質についての特異性もしくは標的基質への活性の一方または両方を増加させる。無修飾プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼは、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グランザイムＭ、カテプシンＧ、ＭＴ−ＳＰ１、好中球エラスターゼ、キマーゼ、アルファ−トリプターゼ、ベータ−トリプターゼＩもしくはＩＩ、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、ＣＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、プロテインＣ、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、プラスミン、血漿カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、カテプシン、パパイン、クルザイン、金属プロテアーゼ、ならびにそれらの対立遺伝子変形物、アイソフォーム、および触媒活性部分等のセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼのいずれか１つを含む。配列番号２、４、８、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９９、１１７、１１９、１２１、１２３、１３２、１３４、１３８、１４２、１４４、１４６、１４８、１６２、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２３８、２４８、２５０、２６０、２６２、２８０、２８２、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、５４７、５４９、および５５１のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列ならびにそれらの触媒活性部分を含有する、または有するものは例示である。ＭＴ−ＳＰ１は、本明細書中に提供される例示的なスカフォールドプロテアーゼであり、上記の通りである。切断を、上記の認識配列に対する標的にすることができる。本明細書中に記載される任意の修飾ＭＴ−ＳＰ１は、処置の方法において使用することができ、上記の任意のＭＴ−ＳＰ１等を含む。本明細書中に提供される処置における使用のための修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたはその触媒活性部分の例示は、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０〜６９、４０４〜４１８、４１９〜４４７、５２４〜５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するいずれかを含む。特に、本明細書中に提供される処置において使用されるＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたはその触媒活性部分は、配列番号５９６または６５０に記載されるアミノ酸の配列を有する。
【００２４】
本明細書中に提供される任意のまたはすべての方法および使用において、非補体プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、補体媒介性障害または任意の他の障害を処置するための第２の作用物質または処置剤と組み合わせて投与することができる。第２の作用物質または処置剤は、非補体プロテアーゼと同時に、連続的に、または断続的に投与することができる。第２の作用物質は、別々の組成物としてまたは同じ組成物中で非補体プロテアーゼとして投与することができる。第２の作用物質の例示は、限定されるものではないが、ＮＳＡＩＤ、代謝拮抗物質、コルチコステロイド、鎮痛薬、細胞毒性薬、炎症促進性サイトカイン阻害剤、抗炎症性サイトカイン、Ｂ細胞標的作用物質、Ｔ抗原を標的にする化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体拮抗薬、キナーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−γリガンド、補体阻害剤、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランのうちの任意の１つまたは複数等の抗炎症剤および抗凝固薬である。
【００２５】
非補体プロテアーゼならびに試薬、第２の作用物質、それらのプロテアーゼおよび／または作用物質を投与するためのデバイスならびに容器等の他の要素ならびに任意の他の要素の組合せもまた提供される。これらの組合せは、本明細書中に提供される方法および使用を実施または実行するためのものとすることができる。したがって、例えば、（ａ）補体経路の任意の１つまたは複数の補体標的基質を切断して、標的基質を備える経路における補体活性化が変更される非補体プロテアーゼと、（ｂ）限定されるものではないが、例えばＮＳＡＩＤ、代謝拮抗物質、コルチコステロイド、鎮痛薬、細胞毒性薬、炎症促進性サイトカイン阻害剤、抗炎症性サイトカイン、Ｂ細胞標的作用物質、Ｔ抗原を標的にする化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体拮抗薬、キナーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−γリガンド、補体阻害剤、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランのうちの１つまたは複数等の抗炎症剤（複数可）または抗凝固薬（複数可）等の補体媒介性障害を処置するための１つまたは複数の第２の作用物質とを含む要素の組合せが提供される。
【００２６】
記述されるように、組合せは、補体の１つまたは複数の古典経路、代替経路、またはレクチン経路等の補体経路を調節するために、本明細書中の方法のいずれかを実施または実行するためのものである。標的基質およびスカフォールドプロテアーゼは、上記のいずれかを含む。例えば、スカフォールドプロテアーゼは、表１４に記載されるいずれかならびに表１４に記載されるプロテアーゼの対立遺伝子変形物、アイソフォーム、および触媒活性部分を含む。上記プロテアーゼの例示は、配列番号２、４、８、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、５４４、５４５、５４７、５４９、および５５１のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を有する、または含有するいずれかあるいはその触媒活性部分またはその対立遺伝子変異体もしくは種変異体を含む。いくつかの実施例では、組合せにおいて使用されるプロテアーゼは、配列番号２もしくは１０に記載されるＭＴ−ＳＰ１等のＭＴ−ＳＰ１またはその触媒活性部分および上述の変異体である。上述のように、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼおよびその触媒活性部分は、キモトリプシン番号付けに基づいた以下の修飾：F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/ Q221aE/K224F、I41T/ Y146E/ G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/ Q175D/ K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/ K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F��I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、およびI41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224Nのうちの１つまたは複数を含有するポリペプチドを含む。上記修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分の例示は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０〜６９、４０４〜４１８、４１９〜４４７、５２４〜５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するそれらのポリペプチドを含む。特に、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、配列番号５９６または６５０に記載されるアミノ酸の配列を有するものである。いくつかの場合では、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分における修飾は、拡張された基質特異性または相互作用の二次的部位に寄与する任意の１つまたは複数のアミノ酸の修飾を含む。この例示は、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸位置９７、１４６、１９２、および２２４のうちの任意の１つまたは複数に対応するいずれかを含むが、これらに限定されない。上記修飾の例示は、Ｆ９７Ｄ、Ｆ９７Ｅ、Ｆ９７Ａ、Ｆ９７Ｗ、Ｙ１４６Ｎ、Ｙ１４６Ｄ、Ｙ１４６Ｅ、Ｙ１４６Ａ、Ｙ１４６Ｗ、Ｙ１４６Ｒ、Ｑ１９２Ｒ、Ｑ１９２Ｖ、Ｋ２２４Ａ、およびＫ２２４Ｆのうちの任意の１つまたは複数から選択されるＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分における修飾（複数可）等の、キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのアミノ酸Ｆ９７、Ｙ１４６、Ｑ１９２、およびＫ２２４のうちの任意の１つまたは複数における修飾である（例えば、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１４、３８、および４０ならびに４０５〜４１８のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドに対応するならびに／または配列番号１２、４０４、２８、もしくは４１２に記載されるアミノ酸の配列を有するそれらの修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド等の、位置Ｙ１４６ＤおよびＫ２２４ＦもしくはＹ１４６Ｅでの修飾を有するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼもしくはその触媒活性部分における）。
【００２７】
本明細書中に提供される組合せおよび方法および使用において、非補体プロテアーゼは、標的基質の基質認識部位を切断することができる。例示的な認識部位は上に記載される。
【００２８】
特定の修飾非補体プロテアーゼもまた提供される。例えば、スカフォールドプロテアーゼの任意の１つまたは複数のアミノ酸中に修飾を含有する非補体プロテアーゼが提供され、修飾アミノ酸残基（複数可）は、標的基質についての特異性もしくは標的基質への活性の一方または両方を増加させ、標的基質は、上記の任意の標的基質およびその混合物およびその源等の補体タンパク質である。修飾非補体プロテアーゼは、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グランザイムＭ、カテプシンＧ、ＭＴ−ＳＰ１、好中球エラスターゼ、キマーゼ、アルファ−トリプターゼ、ベータ−トリプターゼＩまたはＩＩ、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、ＣＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、プロテインＣ、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、プラスミン、血漿カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、カテプシン、パパイン、クルザイン、金属プロテアーゼ、ならびにその対立遺伝子変形物、アイソフォーム、および触媒活性部分の中から選択されるスカフォールドプロテアーゼ等の、上述のいずれかを含む任意の適したスカフォールドを含む。標的基質は、限定されるものではないがＣ２および／またはＣ３等の上記のいずれかを含む。
【００２９】
例示的な修飾非補体プロテアーゼは、ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドに基づいたプロテアーゼを含む（完全長またはその触媒活性部分）。ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドは、１つもしくは少なくとも２つまたはそれ以上の修飾を含むことができ、キモトリプシン番号付けに基づいて、一方の修飾は位置１４６にあり、他方の修飾は位置２２４にあり、
（ｉ）プロテアーゼが２つの修飾のみを含む場合は、プロテアーゼは２つの修飾としてＹ１４６ＤおよびＫ２２４Ｆを含まず、（ｉｉ）プロテアーゼが３つの修飾を含有する場合は、プロテアーゼは、Ｙ１４６ＤおよびＫ２２４Ｆと共に、Ｆ９９ＶまたはＩまたはＬまたはＴを含まない。例えば、上記修飾非補体プロテアーゼは、少なくとも２つ以上の修飾を含有するプロテアーゼとすることができ、キモトリプシン番号付けに基づいて、一方の修飾は位置１４６にあり、他方の修飾は位置２２４にあり、ただし、（ｉ）プロテアーゼが２つの修飾のみを含む場合、プロテアーゼは２つの修飾としてＹ１４６ＤおよびＫ２２４Ｆを含まず、（ｉｉ）プロテアーゼが３つの修飾を含有する場合、プロテアーゼは、Ｙ１４６ＤおよびＫ２２４Ｆと共に、Ｆ９９ＶまたはＩまたはＬまたはＴを含まない。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分はまた、位置１４６および／または位置４１で１つもしくは少なくとも２つまたはそれ以上の修飾を含有する修飾タンパク質を含む。上記の修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分のいずれかの例示は、キモトリプシン番号付けに基づいたI41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、およびI41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、およびI41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224Nのいずれかの修飾を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１を含む。
【００３０】
上記修飾プロテアーゼの例示は、キモトリプシン番号付けに基づいたＤ９６Ａ、Ｄ９６Ｖ、Ｄ９６Ｆ、Ｄ９６Ｆ、Ｄ９６Ｓ、Ｄ９６Ｔ、Ｆ９９Ｓ、Ｆ９９Ｇ、Ｑ１７４Ｈ、Ｑ１７４Ａ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｒ、Ｑ１７４Ｋ、Ｑ１７４Ｌ、Ｑ１７４Ｙ、Ｑ１９２Ｌ、Ｑ１９２Ｉ、Ｑ１９２Ｅ、Ｑ１９２Ｋ、Ｑ１９２Ｙ、Ｄ２１７Ｑ、Ｄ２１７Ｎ、Ｄ２１７Ｈ、Ｋ２２４Ａのうちの任意の１つまたは複数から選択されるＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む。配列番号４１〜５１、５６、５７、６０〜６４、６７、４１９〜４２９、４３１、４３４、４３５、４３８〜４４２、または４４５のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含有する、または有するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは例示である。
【００３１】
例示的な修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分はまた、キモトリプシン番号付けに基づいた以下の修飾：Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/ Q221aE/K224F、I41T/ Y146E/ G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/ Q175D/ K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/ K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、およびI41T/Y146E/Q175D/K224L、、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、およびI41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224Nのいずれかを有するいずれかを含む。上記プロテアーゼの例示は、配列番号４１〜５１、５６、５７、６０〜６４、６７、６９、４１９〜４２９、４３１、４３４、４３５、４３８〜４４２、４４５、５２４、５２５、５２７〜５３０、５３２、５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するいずれかである。特に、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、配列番号５９６または６５０に記載されるアミノ酸の配列を有するものである。本明細書中に提供される修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分の中に含まれるのは、典型的に標的基質中の基質認識部位で標的基質を切断するものである。標的基質の例示はＣ２またはＣ３を含む。Ｃ２の切断を、Ｃ２中の基質認識部位ＳＬＧＲ（配列番号３９２）ですることができる。
【００３２】
スカフォールドプロテアーゼの任意の１つまたは複数のアミノ酸において修飾を含有し、修飾アミノ酸残基（複数可）が標的基質についての特異性または標的基質への活性の一方または両方を増加させ、標的基質が補体タンパク質である提供される修飾非補体プロテアーゼの中には、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲを切断しない、またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲのいずれの切断活性の低下をも呈する、または修飾がない場合と比較して、修飾を有する場合に、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲよりも補体タンパク質等の標的基質について高い基質特異性または活性を呈する上記修飾非補体プロテアーゼがある。例えば、非補体プロテアーゼは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを切断するよりも、少なくともまたは約１倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上高い特異性または活性で補体タンパク質を切断する。標的基質は、限定されるものではないが、Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ３、ｉＣ３、Ｃ４、ｉＣ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＢＬ、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｐ因子、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｂａ、Ｂｂ、およびフィコリンのうちの任意の１つまたは複数等の補体タンパク質を含む。例示的な標的基質は、配列番号２９８、２９９、３００、３０２、３０４、３０５、３０６、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、および３４４のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列または補体活性を呈するその断片を含有する標的基質を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
スカフォールドプロテアーゼは、表１４に記載されるいずれか等の、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼならびにその対立遺伝子変異体および種変異体、アイソフォーム、ならびに触媒活性部分、ならびに配列番号２、４、８、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、５４４、５４５、５４７、５４９、および５５１のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列ならびにその触媒活性部分を含有するスカフォールドプロテアーゼ等の表または本明細書中の他のところにおいて提供されるいずれかに対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するその修飾形態を含む任意のプロテアーゼを含む。スカフォールドは、修飾プロテアーゼの調製のためにおよび本明細書中の任意の方法または使用において使用することができる。上記に議論されるように、ＭＴ−ＳＰ１またはその触媒活性断片は、上記プロテアーゼの例示である。例示的なＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその部分は、配列番号２または１０に記載されるアミノ酸の配列を有する。修飾は、基質特異性または選択性を変更するいずれか、特に補体タンパク質についての基質特異性または選択性を増加させる修飾を含む。上記修飾の例示は、キモトリプシン番号付けに基づいた以下の修飾：D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F97D、F97E、F97A、F97W、F99A、F99S、F99G、F99W、F99Y、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、M180E、Q192R、Q192V、Q192L、Q192I、Q192F、Q192E、Q192K、Q192Y、W215F、W215Y、D217Q、D217N、D217H、D217A、D217V、K224A、 Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/ Q221aE/K224F、I41T/ Y146E/ G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/ Q175D/ K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/ K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、およびI41T/Y146E/Q175D/K224L、、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、およびI41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224Nのいずれかを有するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたはその触媒活性部分、ならびにそれらの対立遺伝子変異体および種変異体ならびにアイソフォーム、ならびにそれらと６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、対応する修飾を含む変異体である。例えば、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号４１〜５１、５６、５７、６０〜６４、６７、６９、４１９〜４２９、４３１、４３４、４３５、４３８〜４４２、４４５、５２４、５２５、５２７〜５３０、５３２、５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含有する。
【００３４】
本明細書中に提供される修飾非補体プロテアーゼのいずれかまたは組合せの要素を含有する医薬組成物もまた提供される。医薬組成物は、必要に応じて、薬学的に許容し得る賦形剤および他の成分を含む。組成物は、全身投与、経口投与、経鼻投与、経肺投与、局所投与、または局部投与を含むが、これらに限定されない任意の所望のまたは適した投与経路のために製剤される。
【００３５】
キットが提供される。キットは、方法の実施において使用することができる。組合せを含有するキットが提供される。医薬組成物を含有するキットもまた提供される。キットはまた、組成物および／またはプロテアーゼの投与のためのデバイスならびに所望により、方法において利用される投与のための使用説明書ならびに他の試薬および産物を含有することができる。
【００３６】
修飾非補体プロテアーゼのいずれかをコードする核酸分子もまた提供される。これらの中に含まれるのは、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０〜６９、４０４〜４１８、４１９〜４４７、５２４〜５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子またはそれらポリペプチドのいずれかをコードする任意の核酸分子に中もしくは高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸分子である。核酸分子の中には、
ａ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、４５１〜４５５、４５７〜４６２、４６４〜４７９、および５３４〜５３８のいずれかに記載されるヌクレオチドの配列を備える核酸分子、
ｂ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、４５１〜４５５、４５７〜４６２、４６４〜４７９、５３４〜５３８のいずれかに対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を備える核酸分子、
ｃ）中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、その完全長の少なくとも７０％に沿って、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、４５１〜４５５、４５７〜４６２、４６４〜４７９、５３４〜５３８のいずれかに記載されるヌクレオチドの配列を備える核酸分子にハイブリダイズする核酸、
ｄ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）の縮重コドンを備える核酸分子、または
ｅ）配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、４５１〜４５５、４５７〜４６２、４６４〜４７９、５３４〜５３８のいずれかもしくはａ）〜ｄ）のいずれかのスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体を備える核酸分子
の中から選択される核酸分子も含まれる。
核酸分子は、
ａ）配列番号４８０〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０６、５０８〜５２３、５３９〜５４３のいずれかに記載されるヌクレオチドの配列を備える核酸分子、
ｂ）配列番号４８０〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０６、５０８〜５２３、５３９〜５４３のいずれかに対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を備える核酸分子、
ｃ）中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、その完全長の少なくとも７０％に沿って、配列番号４８０〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０６、５０８〜５２３、５３９〜５４３のいずれかに記載されるヌクレオチドの配列を備える核酸分子にハイブリダイズする核酸、
ｄ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）の縮重コドンを備える核酸分子、または
ｅ）配列番号４８０〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０６、５０８〜５２３、５３９〜５４３のいずれかもしくはａ）〜ｄ）のいずれかのスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体を備える核酸分子
の中から選択される。
【００３７】
ベクターは、核酸分子を含有する。ベクターは、真核生物および原核生物の発現ベクターを含み、哺乳動物および酵母のベクターを含む。核酸分子および／またはベクターを含有する細胞もまた提供される。例示的な発現ベクターは、次のものを含むが、これらに限定されない：アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および人工染色体。コードされた非補体プロテアーゼの産生または調製のための方法が提供される。ベクターまたは核酸分子は、細胞中に導入され、プロテアーゼが発現する条件下で培養される。核酸分子は、分泌のためのシグナル配列等の、発現プロテアーゼの輸送を指示するためのシグナル配列をコードする配列を含むことができる。発現プロテアーゼは、当業者に知られているルーチン的な方法により精製することができる。
【００３８】
対象に核酸分子、ベクター、または細胞を投与することによる処置の方法が提供される。処置される疾患は、根底にある炎症の成分を有する疾患または病状等の、補体タンパク質または補体経路により媒介されるまたはそれを伴ういずれかを含む。ベクターは、宿主細胞の染色体中に統合される発現ベクターまたはエピソームのままのベクターを含む。投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏですることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ処置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を細胞中に投与することおよびその後に続く細胞の対象中への投与を含む。細胞は、適した（適合性のある）ドナーからのものまたはヒト等の処置されることになる対象からのものとすることができる。
【００３９】
非プロテアーゼポリペプチドに融合される、非補体プロテアーゼのいずれかの触媒活性部分を含有する融合タンパク質もまた提供される。融合は、非プロテアーゼポリペプチド中への挿入またはどちらかの端での連結によるものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】古典補体経路、レクチン補体経路、および代替補体経路、ならびに終末補体複合体である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の活性化の概要を表す図である。特に、図は、補体カスケードに参加する多くの３０種を超えるタンパク質、カスケード内でのそれらの作用、および該当する場合に補体経路間の集合のそれらのポイントを表す。例えば、３つの経路は、Ｃ３コンバターゼの生成の際に集まり、Ｃ３コンバターゼは、Ｃ５コンバターゼを形成するようＣ３を切断し、ＭＡＣ複合体の形成が得られる。図はまた、多くの補体切断産物の生成も表す。経路において表されたすべてのタンパク質は基質標的として働くことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
概要
Ａ．定義
Ｂ．標的：補体
１．命名法
２．補体開始の経路
ａ．古典
ｂ．代替
ｃ．レクチン
３．補体媒介性エフェクター機能
ａ．補体媒介性溶解：膜侵襲複合体
ｂ．炎症
ｃ．走化性
ｄ．オプソニン化
ｅ．体液性免疫応答の活性化
４．補体受容体
５．補体調節
ａ．第Ｉ因子
６．補体媒介性疾患
ａ．補体活性化により媒介される疾患
ｉ．関節リウマチ
ｉｉ．セプシス
ｉｉｉ．多発性硬化症
ｉｖ．アルツハイマー病
ｖ．虚血再灌流傷害
ｂ．補体欠損により媒介される疾患
Ｃ．プロテアーゼ
１．プロテアーゼのクラス
ａ．セリンプロテアーゼ
ｉ．ＭＴ−ＳＰ１
ｉｉ．グランザイムＢ
ｂ．システインプロテアーゼ
ｃ．アスパラギン酸プロテアーゼ
ｄ．金属プロテアーゼ
ｅ．トレオニンプロテアーゼ
Ｄ．スカフォールドプロテアーゼ
１．修飾スカフォールドプロテアーゼ
ａ．合理的な修飾
ｉ．位置スキャンライブラリーの合成および蛍光発光を使用したスクリーニング
ｂ．経験的な修飾
２．特異性を評価する方法
３．プロテアーゼポリペプチド
ａ．ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド
Ｅ．補体媒介性機能に関する修飾プロテアーゼ活性を評価するまたは監視するためのアッセイ
ａ．タンパク質検出
ｉ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ｉｉ．酵素免疫アッセイ
ｉｉｉ．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）
ｂ．溶血アッセイ
Ｆ．修飾プロテアーゼをコードする核酸を産生する方法および修飾プロテアーゼポリペプチドを産生する方法
１．ベクターおよび細胞
２．発現
ａ．原核生物
ｂ．酵母
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
３．精製技術
４．融合タンパク質
５．ヌクレオチド配列
Ｇ．使用の方法：製剤／パッケージング／投与
１．修飾プロテアーゼポリペプチドの投与
２．修飾プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子治療）
Ｈ．治療上の使用
１．免疫媒介性炎症性疾患
２．神経変性疾患
３．心血管疾患
Ｉ．併用治療
Ｊ．実施例
【００４２】
Ａ．定義
定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明（複数可）が属する当分野の技術者により共通して理解される同じ意味を有する。本明細書中の全開示の全体にわたり参照されるすべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト、ならびに他の出版物は、記述されていない限り、参照によりそれらの全体が組み入れられる。本明細書中の用語について、複数の定義がある場合、本セクション中の定義が優先される。ＵＲＬもしくは他の上記識別子またはアドレスに対して参照が成される場合、上記識別子は変化し得る、そしてインターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、等価な情報がインターネットを調査することにより見い出すことができることを理解されたい。インターネットへの参照は、上記情報の有用性および公的な普及を証明する。
【００４３】
本明細書中で使用されるように、ＭＢＬ（マンノース結合レクチン）はまた、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）とも命名されている。
【００４４】
本明細書中で使用されるように、補体活性化は、血清成分Ｃ１からＣ９の連続的な活性化を指し、任意の経路を介して炎症応答を産生する、例えば抗原−抗体複合体、リポ多糖、または微生物多糖類を含む様々な活性化因子により開始される。
【００４５】
本明細書中で使用されるように、「補体タンパク質」または「補体成分」は、感染に対する宿主防御においておよび炎症プロセスにおいて機能する補体系のタンパク質である。補体タンパク質は、本明細書中で提供されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼについての標的基質を構成する。
【００４６】
補体タンパク質は、すべての脊椎動物において見い出される相互作用する血液タンパク質および糖タンパク質のグループである。補体反応産物に結合し、炎症細胞および免疫系の細胞上に生じる細胞表面受容体の他に、少なくとも３０種の可溶性血漿タンパク質がある。さらに、偶発的な補体侵襲から宿主細胞を保護する調節膜タンパク質がある。補体タンパク質は、古典経路において機能する補体タンパク質、例えばＣ２、代替経路において機能する補体タンパク質、例えばＢ因子、およびレクチン経路において機能する補体タンパク質、例えばＭＡＳＰ−１を含む。補体タンパク質の中には補体経路に参加するプロテアーゼがある。さらに、本明細書中で使用されるように、補体タンパク質は、補体カスケードの活性化の際に形成される「切断産物」（「断片」とも称される）のいずれかを含む。補体タンパク質の中には、ｉＣ３およびＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ等の、補体タンパク質の不活性形態または変更形態もまた含まれる。
【００４７】
したがって、補体タンパク質は、次のものを含むが、これらに限定されない：Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｇ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｆ、ｉＣ３、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、ｉＣ４、Ｃ４ａ−ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＢＬ、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、第Ｉ因子、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、プロペルジン、Ｃ１Ｉｎｈ、Ｃ４ｂｐ、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＤ５９（ＭＩＲＬ）、クラステリン、およびＨＲＦならびに任意の補体タンパク質の対立遺伝子変異体および種変異体。
【００４８】
本明細書中で使用されるように、補体タンパク質の「天然」形態は、補体活性化の非存在下で脊椎動物等の生物から単離することができる、実験室において人により故意に修飾されていない形態である。天然補体タンパク質の例は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｂ因子、Ｄ因子、プロペルジン、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９を含む。
【００４９】
一般に、天然補体タンパク質は、不活性であり、活性化の際に活性を獲得する。活性化は、活性化切断、成熟切断、および／または他のタンパク質との複合体形成を必要とし得る。これに対する例外は、それらの天然形態において酵素活性を有する第Ｉ因子およびＤ因子である。いくつかの実施例では、天然補体タンパク質の活性化はタンパク質の切断の後に生じる。例えば、Ｃ２およびＢ因子等の補体チモーゲンは、プロテアーゼＣ１ｓによるＣ２の切断により、タンパク質分解性活性Ｃ４ｂ２ｂ（Ｃ３コンバターゼ）を形成するようＣ４ｂと会合するＣ２ｂを生成するようなおよびプロテアーゼＤ因子によるＢ因子の切断により、タンパク質分解性活性代替Ｃ３コンバターゼ、Ｃ３ｂＢｂを形成するようＣ３ｂと会合するＢｂを生成するようなプロテアーゼ切断によりそれら自体が活性化されるプロテアーゼである。他の実施例では、不活性の天然補体タンパク質の切断は、タンパク質の活性化をもたらす、タンパク質の構造の安定性における変化をもたらす。例えば、Ｃ３およびＣ４は、天然タンパク質において安定しているが、タンパク質の切断に起因するコンホメーション変化の後で高度に反応性になり、活性化され得る内部チオエステル結合を含む。したがって、Ｃ３およびＣ４の切断産物は生物学的に活性である。Ｃ３およびＣ４の活性化はまた、切断の非存在下では、自発的に生じ得る。補体の代替経路の開始事象は、天然Ｃ３中のチオエステル結合の自発的な変化である。他の実施例では、天然補体タンパク質の活性化は、他の場合であれば活性のある天然補体タンパク質の活性を阻害する、複合型調節分子の遊離の後で生じる。例えば、Ｃ１ｉｎｈは、Ｃ１ｓおよびＣ１ｒに結合して、それらがＣ１ｑと複合していなければ、それらを不活性化する。
【００５０】
本明細書中で使用されるように、成熟切断は、チモーゲンの活性化に必要な任意の切断を指す一般用語である。これは、コンホメーション変化をもたらす活性につながる切断を含む（つまり活性化切断）。それは、決定的な結合部位が露出する、立体障害が露出する、または阻害セグメントが除去されるもしくは移動する切断もまた含む。
【００５１】
本明細書中で使用されるように、補体タンパク質の変更形態は、その分子構造における修飾に起因する非天然形態で存在する補体タンパク質を指す。例えば、水とチオエステルのＣ３反応は、コンバターゼ切断の非存在下で生じ、ｉＣ３およびｉＣ４と呼ばれる、Ｃ３およびＣ４の加水分解された不活性形態を生じ得る。他の実施例では、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ４ａを含むアナフィラトキシンは、カルボキシペプチダーゼＮによりアルギニンが除去され、より安定した、それほど活性のない形態となることができる。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、補体タンパク質の「断片」または「切断産物」は、天然補体タンパク質のポリペプチド配列の部分を含有する補体タンパク質のサブセットである。補体タンパク質の断片は、補体カスケードのうちの任意の１つまたは複数、例えば、１、２、または３つの活性化の後で通常結果として生じる。一般に、断片は、天然補体タンパク質のタンパク質分解性の切断に起因する。例えば、Ｂ因子は、Ｄ因子により酵素的に切断され、２つの断片がもたらされる：ＢのＮ末端部分を構成するＢａおよびＣ末端部分を構成し、セリンプロテアーゼ部位を含有するＢｂ。補体タンパク質の断片はまた、補体タンパク質の他の断片のタンパク質分解性の切断にも起因する。例えば、Ｃ３ｂは、Ｃ３の切断から生成される断片であり、第Ｉ因子により切断され、断片ｉＣ３ｂおよびＣ３ｆが生成される。一般に、補体タンパク質の切断産物は、生物学的に活性の産物であり、補体系の切断エフェクター分子として機能する。したがって、補体タンパク質の断片または部分は、補体タンパク質の切断産物を含み、少なくとも１つの活性を保持するまたは呈するタンパク質の部分もまた含む。
【００５３】
本明細書中で使用されるように、「切断エフェクター分子」または「切断エフェクタータンパク質」は、補体系の誘発酵素カスケードの結果として生成された活性切断産物を指す。補体活性化に起因する切断エフェクター分子、断片、または切断産物は、オプソニン化、アナフィラキシー、細胞溶解、および炎症を含む補体媒介性の機能または活性のうちの１つまたは複数のいずれかに寄与し得る。切断分子またはエフェクター分子の例は、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ−９、およびＢｂを含むが、これらに限定されない。補体系の切断エフェクター分子は、カスケードへの参加のおかげで、炎症を刺激すること、抗原食作用を促進すること、およびいくつかの細胞を直接溶解させることを含む活性を呈する。補体切断産物は、補体経路の活性化を促進するまたは補体経路の活性化に参加する。
【００５４】
本明細書中で使用されるように、アナフィラトキシン（例えばＣ３ａ、Ｃ４ａ、またはＣ５ａ等）は、肥満細胞または好塩基球の脱顆粒（からの物質の遊離）を誘発する切断エフェクタータンパク質であり、アナフィラトキシンは、特に寄生生物に対する防御の一部として炎症応答に参加する。脱顆粒が強すぎる場合、脱顆粒はアレルギー反応を引き起こし得る。アナフィラトキシンはまた、平滑筋細胞の痙縮（気管支痙攣等）、毛細血管の透過性の増加、および走化性を間接的に媒介する。
【００５５】
本明細書中で使用されるように、走化性は、化学誘引物質への、典型的に、アナフィラトキシンの濃度が増加する方向への等の、化学誘引物質の濃度が増加する方向への白血球の受容体媒介性の移動を指す。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、オプソニン化は、貪食細胞により摂取することができるような病原体または他の粒子の表面の変更を指す。病原体の表面に結合するまたはその表面を変更するタンパク質はオプソニンと呼ばれる。抗体および補体タンパク質は、好中球およびマクロファージ等の貪食細胞による取り込みおよび破壊のために細胞外細菌をオプソニン化する。
【００５７】
本明細書中で使用されるように、細胞溶解は、その壁または膜の破壊による細胞の破裂を指す。赤血球の溶血は細胞溶解の基準となる。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」、および「ペプチダーゼ」は、共有結合性ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を指すために区別なく使用される。これらの名称は、それらのチモーゲン形態ならびに活性化された一本鎖形態、二本鎖形態、および複数鎖形態を含む。明確にするために、プロテアーゼへの言及はすべての形態を指す。プロテアーゼは、例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼをそれらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合を切断するメカニズムに依存して含む。
【００５９】
本明細書中で使用されるように、チモーゲンは、活性化切断等の成熟切断を含むタンパク質分解性の切断ならびに／または他のタンパク質（複数可）および／もしくは補因子（複数可）との複合体形成により活性化されるプロテアーゼを指す。チモーゲンはタンパク質分解酵素の不活性前駆体である。上記前駆体は、必ずしも多いというわけではないが、活性形態よりも一般に多い。セリンプロテアーゼに関して、チモーゲンは、触媒切断および自己触媒切断を含む特異的な切断によりまたは活性酵素を生成する活性化補因子の結合により活性酵素に変換される。したがって、チモーゲンは、活性化因子の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。切断は自己触媒的に達成することができる。多くの補体タンパク質はチモーゲンであり、それらは不活性であるが、感染の後での補体系の開始の際に切断され、活性化されるようになる。チモーゲンは、一般に、不活性であり、プロ領域のチモーゲンからの触媒切断または自己触媒切断により、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。
【００６０】
本明細書中で使用されるように、「プロ領域」、「プロペプチド」、または「プロ配列」は、成熟タンパク質を産生するために切断される領域またはセグメントを指す。これは、触媒機構を遮蔽し、したがって、触媒中間体の形成を予防することにより（つまり基質結合部位を立体的に閉塞することにより）、酵素活性を抑制するよう機能するセグメントを含むことができる。プロ領域は、成熟した生物学的に活性のポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であり、わずか少数のアミノ酸とすることができるまたは多重ドメイン構造とすることができる。
【００６１】
本明細書中で使用されるように、活性化配列は、活性プロテアーゼを形成するための活性化切断または成熟切断のために必要な部位である、チモーゲン中のアミノ酸の配列を指す。活性化配列の切断は、自己触媒的にまたはパートナーを活性化することにより触媒することができる。
【００６２】
活性化切断は、活性に必要とされるコンホメーション変化が生じる一種の成熟切断である。これは、切断により、触媒残基等の、触媒機構の保存領域と相互作用する新しいＮ末端を生成し、活性に必要なコンホメーション変化を誘起する、例えばセリンプロテアーゼについての古典活性化経路である。活性化は、プロテアーゼの多重鎖形態の産生をもたらし得る。いくつかの事例では、プロテアーゼの一本鎖形態は、一本鎖としてタンパク質分解性活性を呈することができる。
【００６３】
本明細書中で使用されるように、ドメインは、構造的におよび／または機能的に分子の他の部分とは別であり、同定可能な、タンパク質またはコード核酸等の分子の部分を指す。
【００６４】
本明細書中で使用されるように、プロテアーゼドメインはプロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインへの言及は、これらのタンパク質のいずれかの一本鎖形態、二本鎖形態、および多重鎖形態を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、そのタンパク質分解性活性のために必要とされる、例えばその触媒中心等の、そのタンパク質の必須の特性をすべて含有する。
【００６５】
本明細書中で使用されるように、プロテアーゼの触媒活性部分は、プロテアーゼドメインまたはプロテアーゼ活性を保持する任意のその断片または部分を指す。意義深いことには、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プロテアーゼおよびその触媒ドメインまたはタンパク質分解性活性部分の一本鎖形態（典型的にＣ末端で切り詰め）はプロテアーゼ活性を呈する。
【００６６】
本明細書中で使用されるように、「プロテアーゼのプロテアーゼドメインまたは触媒活性部分をコードする核酸」は、説明した一本鎖プロテアーゼドメインまたはその活性部分のみをコードし、継続配列としての、プロテアーゼの他の近接部分をコードしない核酸を指す。
【００６７】
本明細書中で使用されるように、ポリペプチドがプロテアーゼドメインから本質的になるという説明は、ポリペプチドの部分のみがプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分となるということを意味する。ポリペプチドは、アミノ酸の付加的な非プロテアーゼ由来の配列を所望により含むことができ、それらを一般に含むであろう。
【００６８】
本明細書中で使用されるように、「Ｓ１〜Ｓ４」は、基質のＰ１〜Ｐ４残基についての結合部位を形成するアミノ酸残基を指す［例えばＳｃｈｅｃｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ（１９６７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７：１５７〜１６２を参照されたい］。各Ｓ１〜Ｓ４は、非近接であり得る１、２、またはそれ以上の残基を含有する。これらの部位は、認識部位Ｎ末端からタンパク質分解の部位へ連続的に番号付けされ、切断結合とも称される。
【００６９】
本明細書中で使用されるように、用語「Ｐ１〜Ｐ４」および「Ｐ１’〜Ｐ４’」は、Ｓ１〜Ｓ４残基およびＳ１’〜Ｓ４’残基とそれぞれ特異的に相互作用し、プロテアーゼにより切断される、基質ペプチドにおける残基を指す。Ｐ１〜Ｐ４は、切断部位のＮ末端側の残基位置を指す；Ｐ１’〜Ｐ４’は、切断部位のＣ末端側の残基位置を指す。アミノ酸残基は、ポリペプチド基質のＮ末端からＣ末端まで標識される（Ｐｉ、．．．、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、．．．、Ｐｊ）。それぞれの結合サブサイトが標識される（Ｓｉ、．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、．．．、Ｓｊ）。切断は、Ｐ１およびＰ１’の間で触媒される。
【００７０】
本明細書中で使用されるように、「結合ポケット」は、基質上の１つまたは複数の特異的なアミノ酸と相互作用する１つまたは複数の残基を指す。「特異性ポケット」は、他よりも多くのエネルギーに寄与する結合ポケットである（最も重要なまたは主要な結合ポケット）。典型的に、結合工程は、触媒プロセスが生じるのに必要である遷移状態の形成に先行する。Ｓ１〜Ｓ４およびＳ１’〜Ｓ４’アミノ酸は、基質配列結合ポケットを構成し、ペプチド基質、ポリペプチド基質、またはタンパク質基質のＰ１〜Ｐ４およびＰ１’〜Ｐ４’アミノ酸との相互作用による基質認識をそれぞれ促進する。プロテアーゼが基質と相互作用するかどうかは、Ｓ１〜Ｓ４およびＳ１’〜Ｓ４’位置におけるアミノ酸の機能である。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、およびＳ４’サブサイトのうちの任意の１つまたは複数の中のアミノ酸が、基質中のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、およびＰ４’部位のアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数と相互作用するまたはそれらのアミノ酸を認識する場合、プロテアーゼは基質を切断することができる。結合ポケットは、ペプチド結合の触媒および基質の切断が達成されるように、標的アミノ酸をプロテアーゼに位置づける。例えば、セリンプロテアーゼは、基質中のＰ４〜Ｐ２’部位を典型的に認識し、他のプロテアーゼは、Ｐ４〜Ｐ２’を超えて拡張された認識を有し得る。
【００７１】
本明細書中で使用されるように、「拡張された基質特異性に寄与する」アミノ酸は、特異性ポケットの他に活性部位のくぼみにおけるそれらの残基を指す。これらのアミノ酸は、プロテアーゼ中のＳ１〜Ｓ４、Ｓ１’〜Ｓ４’残基を含む。
【００７２】
本明細書中で使用されるように、相互作用の二次的部位は、活性部位のくぼみの外側にある。これらは、基質認識および触媒に寄与し得る。これらのアミノ酸は、基質との第２および第３シェル相互作用に寄与し得るアミノ酸を含む。例えば、プロテアーゼの構造中のループはＳ１〜Ｓ４を包囲している。Ｓ１’〜Ｓ４’アミノ酸は、基質中のＰ１〜Ｐ４、Ｐ１’〜Ｐ４’アミノ酸の位置づけにおいて役割を果たし、それによって、プロテアーゼの活性部位に切断結合を位置合わせする。
【００７３】
本明細書中で使用されるように、プロテアーゼの活性部位は、基質の触媒が生じる基質結合部位を指す。活性部位の構造および化学的特性は、基質の認識および結合ならびに続く基質中の切断結合の加水分解および切断を可能にする。プロテアーゼの活性部位は、ペプチド切断の触媒メカニズムに寄与するアミノ酸および拡張された基質結合特異性に寄与するアミノ酸等の、基質配列認識に寄与するアミノ酸を含有する。
【００７４】
本明細書中で使用されるように、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼの触媒三連構造は、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼの活性部位中にあり、ペプチド切断の触媒メカニズムに寄与する３つのアミノ酸の組合せを指す。一般に、触媒三連構造はセリンプロテアーゼ中に見い出され、活性求核剤および酸／塩基触媒を提供する。セリンプロテアーゼの触媒三連構造は、３つのアミノ酸を含有し、キモトリプシン中では、Ａｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７、およびＳｅｒ１９５である。これらの残基は、セリンプロテアーゼの触媒効率にとって決定的なものとなる。
【００７５】
本明細書中で使用されるように、「基質認識部位」または「切断配列」は、プロテアーゼにより切断される、プロテアーゼの活性部位により認識される配列を指す。典型的に、例えばセリンプロテアーゼについては、切断配列は、基質中のＰ１〜Ｐ４およびＰ１’〜Ｐ４’アミノ酸から構成され、切断は、Ｐ１位置の後において生じる。典型的に、セリンプロテアーゼについての切断配列は、長さが６残基であり、多くのプロテアーゼの拡張された基質特異性にマッチするが、プロテアーゼに依存してより長くまたはより短くすることができる。例えば、自己触媒に必要なＭＴ−ＳＰ１の基質認識部位または切断配列はＲＱＡＲＶＶであり、ＲはＰ４位置にあり、ＱはＰ３位置にあり、ＡはＰ２位置にあり、ＲはＰ１位置にある。ＭＴ−ＳＰ１における切断は、配列ＶＶＧＧが後に続く位置Ｒの後において生じる。
【００７６】
本明細書中で使用されるように、標的基質は、プロテアーゼにより切断される基質を指す。典型的に、標的基質は、その基質認識部位でプロテアーゼにより特異的に切断される。最小限、標的基質は、切断配列を構成するアミノ酸を含む。所望により、標的基質は、切断配列および任意の他のアミノ酸を含有するペプチドを含む。プロテアーゼにより認識される切断配列を含有する完全長タンパク質、対立遺伝子変異体、アイソフォーム、またはその任意の部分は、そのプロテアーゼについての標的基質である。例えば、補体不活性化が意図される本明細書中の目的のために、標的基質は、任意の１つもしくは複数の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０種、もしくはそれ以上等の補体タンパク質、またはプロテアーゼにより認識される切断配列を含有する、補体タンパク質のその任意の部分もしくは断片である。上記標的基質は、精製タンパク質とすることができるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの混合物もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの混合物等の混合物中に存在することができる。混合物は、例えば、血液もしくは血清、または他の組織液を含むことができる。さらに、標的基質は、プロテアーゼによる基質の切断に影響を及ぼさない付加的な部分を含有するペプチドまたはタンパク質を含む。例えば、標的基質は、蛍光発生部分に化学的に連結させた４つのアミノ酸ペプチドまたは完全長タンパク質を含むことができる。プロテアーゼは、標的基質についてのより高い基質特異性を呈するよう修飾することができる。
【００７７】
本明細書中で使用されるように、切断は、プロテアーゼによりペプチド結合が壊れることを指す。プロテアーゼについての切断部位モチーフは、切断結合に対してＮ末端およびＣ末端の残基を必要とする（．．．Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’．．．と定義された、プロテアーゼのために切断部位を有する、それぞれプライム符号なしの側およびプライム符号ありの側、切断はＰ１残基およびＰ１’残基の間で生じる）。典型的に、基質の切断は、活性化切断または阻害切断である。活性化切断は、不活性形態から活性形態へのポリペプチドの切断を指す。これは、例えば、チモーゲンの活性酵素への切断および／または前成長因子の活性成長因子への切断を含む。例えば、ＭＴ−ＳＰ１は、ＲＱＡＲのＰ１〜Ｐ４配列で標的基質を切断することにより自己活性化することができる。活性化切断はまた、タンパク質が、それら自体が活性を有する１つまたは複数のタンパク質に切断される切断でもある。例えば、補体系は、炎症を刺激し、抗原食作用を促進し、いくつかの細胞を直接溶解させる複数のエフェクター分子の形成を最終的にもたらすタンパク質分解性切断事象の不可逆的カスケードである。したがって、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへのコンバターゼによるＣ３の切断は活性化切断である。
【００７８】
本明細書中で使用されるように、阻害切断は、機能的でない１つまたは複数の分解産物へのタンパク質の切断である。阻害切断は、タンパク質の活性の減少または低下をもたらす。典型的に、タンパク質の活性の低下は、タンパク質が関与する経路またはプロセスを低下させる。一実施例では、阻害切断である、任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断は、補体の古典、レクチン、または代替機能的経路のうちの任意の１つまたは複数の随伴性の低下または阻害をもたらす。阻害となるために、切断は、タンパク質の天然形態と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９．９％、またはそれ以上、活性を低下させる。切断が阻害となるために必要とされるタンパク質の切断パーセントは、タンパク質間で変動するが、タンパク質の活性についてアッセイすることにより決定することができる。
【００７９】
本明細書中で使用されるように、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを切断するプロテアーゼへの言及は、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲを切断するよう修飾されまたはその天然形態においてＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲを切断し、それによってＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲ複合体のシグナリング、特に、血管新生、特定の望まれない血管新生等の生物学的影響として顕在化され得る細胞増殖シグナリングを低下させるまたは不活性化するプロテアーゼを指す。プロテアーゼによるＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの切断は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの機能を評価するための当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用してＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの活性についてアッセイすることにより決定することができる。
【００８０】
本明細書中で使用されるように、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを切断しないプロテアーゼ（修飾または無修飾）への言及は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ複合体のシグナリングを低下させないまたは不活性化しないプロテアーゼを指す。特に、本明細書中の目的のために、プロテアーゼは、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲタンパク質または対応する切断配列（つまりＲＲＶＲ）を含有するペプチド基質についてよりも、１倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、またはそれ以上等の、標的基質（つまり補体タンパク質）に対する高い基質特異性または活性を有する。本明細書中の目的のために、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲタンパク質またはペプチド基質との補体タンパク質の切断の比較は、プロテアーゼが補体タンパク質を切断するのと同じ反応条件下とする。
【００８１】
本明細書中で使用されるように、「スカフォールド」または「プロテアーゼスカフォールド」は、その標的特異性を変更するよう修飾することができるプロトタイププロテアーゼを指す。スカフォールドは、野生型プロテアーゼ、対立遺伝子変異体、およびアイソフォームを含む。スカフォールドは、標的特異性を有するプロテアーゼを産生するために、修飾のための出発物質として働くことができる。
【００８２】
本明細書中で使用されるように、「修飾プロテアーゼ」または「ムテインプロテアーゼ」は、スカフォールドプロテアーゼと比較して、一次配列中に１つまたは複数の修飾を有するプロテアーゼポリペプチド（タンパク質）を指す。１つまたは複数の突然変異は、１つまたは複数のアミノ酸の交換（置換）、挿入、欠失、およびそれらの任意の組合せとすることができる。修飾プロテアーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の修飾位置を有するポリペプチドを含む。修飾プロテアーゼは、完全長スカフォールドプロテアーゼとすることができるまたは修飾プロテアーゼは、修飾プロテアーゼが、プロテアーゼの活性または基質特異性が変更される領域において修飾を含有し、プロテアーゼがタンパク質分解性活性である限り、修飾完全長スカフォールドプロテアーゼのその触媒活性部分とすることができる。一般に、これらの突然変異は、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数の切断のためのスカフォールドプロテアーゼの特異性および活性を変化させる。プロテアーゼの基質特異性を変更する領域において修飾を含有する他に、修飾プロテアーゼはまた、プロテアーゼの基質特異性に非必須である領域における他の修飾に耐容性を示すこともできる。したがって、修飾プロテアーゼは、野生型プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼのアミノ酸の対応する配列に対して、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を典型的に有する。修飾完全長プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼのその触媒活性部分は、融合自体がプロテアーゼの基質特異性を変更しない限り、融合タンパク質であるプロテアーゼを含むことができる。
【００８３】
本明細書中で使用されるように、キモトリプシン番号付けは、配列番号８の成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸番号付けを指す。例えばＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメイン等の他のプロテアーゼのプロテアーゼドメインのアラインメントは、キモトリプシンを用いて作製することができる。上記事例では、キモトリプシンのアミノ酸に対応する、ＭＴ−ＳＰ１のアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸の番号付けが与えられる。対応する位置は、マニュアルアラインメントを使用してまたは入手可能な多数のアラインメントプログラムを使用することにより（例えばＢＬＡＳＴＰ）、当業者による上記アラインメントにより決定することができる。対応する位置はまた、例えばタンパク質構造のコンピュータ模擬アラインメントを使用することによる構造のアラインメントに基づくものとすることができる。ポリペプチドのアミノ酸が開示される配列中のアミノ酸に対応するという説明は、ＧＡＰアルゴリズム等の標準的なアラインメントアルゴリズムを使用した、同一性または相同性を最大にするための、開示された配列を有するポリペプチドのアラインメント（保存アミノ酸が整列する）の際に同定されたアミノ酸を指す。例えば、成熟キモトリプシンを用いた、ＭＴ−ＳＰ１のセリンプロテアーゼドメイン（配列番号１０）のアラインメントの際に、ＭＴ−ＳＰ１中の位置１のＶは、キモトリプシン番号付けのＶ１６が与えられる。続くアミノ酸はそれに応じて番号付けされる。一実施例では、完全長ＭＴ−ＳＰ１（配列番号２）のアミノ酸位置７０８またはＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメイン（配列番号１０）の位置９４のＦは、キモトリプシン番号付けに基づいたＦ９９に対応する。残基が、プロテアーゼ中に存在するが、キモトリプシン中に存在しない場合、アミノ酸残基は文字表記が与えられる。例えば、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸６０を有するループの一部であるが、キモトリプシンと比較してＭＴ−ＳＰ１配列中に挿入された、キモトリプシン中の残基は、例えばＡｓｐ６０ｂまたはＡｒｇ６０ｃと称される。
【００８４】
本明細書中で使用されるように、「補体活性化を阻害すること」または「補体不活性化」は、プロテアーゼによる任意の１つもしくは複数の補体経路の補体媒介性の機能もしくは活性または経路のタンパク質のいずれかの活性の低下または減少を指す。補体の機能または活性はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。本明細書中に記載される、アッセイすることができる補体の例示的な機能は、溶血アッセイおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥとその後に続くウェスタンブロットもしくはクーマシーブリリアントブルー染色によるまたはＥＬＩＳＡによる等の補体エフェクター分子のうちの任意の１つまたは複数を測定するためのアッセイを含む。プロテアーゼは、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、補体活性化を阻害することができる。他の実施形態では、補体活性化は、プロテアーゼの非存在下での補体の活性と比較して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％、プロテアーゼにより阻害される。
【００８５】
本明細書中で使用されるように、標的基質についての特異性は、非標的基質と称される他の基質と比較した、プロテアーゼによる標的基質の切断についての選好を指す。特異性は、特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）で表され、特異性定数は、その基質についてのプロテアーゼのアフィニティーおよび酵素の効率の基準となる。
【００８６】
本明細書中で使用されるように、切断についての特異性定数は（ｋｃａｔ／Ｋｍ）であり、Ｋｍはミカエリスメンテン定数（２分の１のＶｍａｘでの［Ｓ］）であり、ｋｃａｔはＶｍａｘ／［ＥＴ］であり、ＥＴは最終酵素濃度である。パラメータｋｃａｔ、Ｋｍ、およびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数対基質切断の速度の逆数をグラフで表し、ラインウィーバー−バーク式［１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；式中、Ｖｍａｘ＝［ＥＴ］ｋｃａｔ］にフィットさせることにより算出することができる。切断の増加率を長い間にわたってそれぞれ異なる濃度の基質存在下で決定するための任意の方法が特異性定数を算出するために使用することができる。例えば、基質は蛍光発生部分に連結され、蛍光発生部分はプロテアーゼによる切断の際に遊離する。異なる酵素濃度での切断率を決定することにより、ｋｃａｔを、特定のプロテアーゼについて決定することができる。特異性定数は、位置スキャンコンビナトリアルライブラリー（ＰＳ−ＳＣＬ）等の当技術分野での標準的な方法を使用して、プロテアーゼのＳ１〜Ｓ４ポケットのうちの任意の１つまたは複数の中のアミノ酸の、基質中の随伴性のＰ１〜Ｐ４アミノ酸についての部位特異的選好を決定するために使用することができる。さらに、特異性定数はまた、ある標的基質についてのプロテアーゼの選好を、他の基質に関して決定するために使用することができる。
【００８７】
本明細書中で使用されるように、基質特異性は、他の基質に関する、ある標的基質についてのプロテアーゼの選好を指す。基質特異性は、特異性定数の比として測定することができる。
【００８８】
本明細書中で使用されるように、基質特異性比は特異性定数の比であり、２つ以上のプロテアーゼまたは２つ以上の基質についてのプロテアーゼの特異性を比較するために使用することができる。例えば、競合基質についてのプロテアーゼの基質特異性または基質についての競合プロテアーゼの基質特異性は、ｋｃａｔ／Ｋｍを比較することにより比較することができる。例えば、標的基質について２×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１および非標的基質について２×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１の特異性定数を有するプロテアーゼは、標的基質について、より特異的である。上述の特異性定数を使用すると、プロテアーゼは、標的プロテアーゼについて１００の基質特異性比を有することになる。
【００８９】
本明細書中で使用されるように、標的基質についての選好または基質特異性は、基質特異性比として表現することができる。選好を表す、比の特定の値は、問題となっている基質およびプロテアーゼの関数となる。１よりも大きな基質特異性比は、標的基質を選好することを示し、１未満の基質特異性は、非標的基質を選好することを示す。一般に、少なくともまたは約１の比は、プロテアーゼが治療用物質候補と考えられるのに十分な差異を表す。
【００９０】
本明細書中で使用されるように、特異性の変更は、出発スカフォールドプロテアーゼと比較した、修飾プロテアーゼの基質特異性の変化を指す。一般に、特異性における変化は、スカフォールドプロテアーゼの野生型基質（本明細書中で非標的基質と称される）と比較した、標的基質についての修飾プロテアーゼの選好の変化を表す。典型的に、本明細書中で提供される修飾プロテアーゼは、スカフォールドプロテアーゼの基質特異性と比較して、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数についての基質特異性の増加を呈する。例えば、標的基質対非標的基質について１００の基質特異性比を有する修飾プロテアーゼは、１０の基質特異性比を有するスカフォールドプロテアーゼと比較して、１０倍の特異性の増加を呈する。他の実施例では、１の基質特異性比を有する修飾プロテアーゼは、０．１の比と比較して、基質特異性において１０倍の増加を呈する。スカフォールドプロテアーゼと比較して増加した特異性を呈するために、修飾プロテアーゼは、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数について、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、またはそれ以上高い基質特異性を有する。
【００９１】
本明細書中で使用されるように、「選択性」は、競合基質の混合物の中からある標的基質を選択し、切断するプロテアーゼの能力を指す場合、特異性と区別なく使用することができる。任意の他の１つまたは複数の標的基質と比較した、標的基質についてのプロテアーゼの選択性の増加は、例えばプロテアーゼによる標的基質の切断の特異性定数を比較することにより決定することができる。例えば、プロテアーゼが、標的基質について２×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１および任意の他の１つまたは複数の基質について２×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１の切断の特異性定数を有する場合、プロテアーゼは前者の標的基質について、より選択的となる。
【００９２】
本明細書中で使用されるように、活性は、ポリペプチドまたは完全長（完全）タンパク質に関連するその部分の１つまたは複数の機能的活性を指す。機能的活性は、生物学的活性、触媒活性または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に対する結合についてポリペプチドと結合するまたは競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、および受容体またはリガンドに特異的に結合するポリペプチドについての能力を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
本明細書中で使用されるように、補体タンパク質に関する機能的活性は、アナフィラキシー、オプソニン化、走化性、または細胞溶解を含むが、これらに限定されない補体媒介性機能を指す。補体の活性を試験するための非限定的なアッセイは、赤血球の溶血およびＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる等の補体エフェクター分子の検出を含む。
【００９４】
本明細書中で使用されるように、触媒活性または切断活性は、選択された基質のタンパク質分解を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質分解性のアッセイにおいて評価されるプロテアーゼの活性を指す。切断活性は、プロテアーゼの触媒効率の評価により測定することができる。
【００９５】
本明細書中で使用されるように、標的基質への活性は、切断活性および／もしくは機能的活性または標的基質上でのもしくは標的基質へのプロテアーゼの活性を表す他の測定値を指す。プロテアーゼによる補体タンパク質標的基質の機能的活性は、赤血球溶解または当業者により知られているもしくは補体活性を評価するために本明細書中で提供される他の上記アッセイ等の、補体アッセイにおけるＩＣ５０を評価することにより測定することができる。切断活性は、プロテアーゼの触媒効率を評価することにより測定することができる。本明細書中の目的のために、プロテアーゼが、プロテアーゼの非存在下と比較して、標的基質のより高いタンパク質分解もしくは切断を呈するおよび／または補体タンパク質の機能的活性を調節する（つまり活性化もしくは阻害する）場合、活性は増加している。
【００９６】
本明細書中で使用されるように、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、ペプチダーゼのクラスを指し、それらは酵素の活性中心におけるセリン残基の存在により特徴づけられる。セリンプロテアーゼは、血液凝固および炎症ならびに原核生物および真核生物における消化酵素としての機能を含む、体内での幅広い範囲の機能に参加する。セリンプロテアーゼによる切断のメカニズムは、セリンによる、標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。システイン、トレオニン、またはアスパラギン酸に関連する水分子もしくは金属もまたこの役割を果たすことができる。セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸の整列した側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒三連構造を形成する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合するくぼみとして形づくられる。
【００９７】
本明細書中で使用されるように、補体プロテアーゼは、補体経路のいずれかにおける補体カスケード反応の生成および増幅に関与するプロテアーゼを指す。これらのプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ第Ｉ因子、Ｄ因子、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）−２、ＭＡＳＰ−１、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｒ、Ｂ因子、Ｃ２、ならびにコンバターゼおよび補体活性化が達成される補体経路において生じる任意の他のプロテアーゼを含む。特に、補体プロテアーゼは、第Ｉ因子、Ｄ因子、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−１、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｒ、Ｂ因子、およびＣ２を含む任意の無修飾補体プロテアーゼである。
【００９８】
本明細書中で使用されるように、非補体プロテアーゼは、普通は、補体経路のうちの任意の１つまたは複数の一部ではない任意のプロテアーゼである。
【００９９】
本明細書中で使用されるように、ＭＴ−ＳＰ１は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓ活性部位残基の場所に基づいた、セリンプロテアーゼのＳ１ペプチダーゼファミリー（トリプシンおよびキモトリプシンもまた含有する）の一部であるセリンプロテアーゼを指す。ＭＴ−ＳＰ１は、膜貫通ドメイン、２つのＣＵＢドメイン、４つのＬＤＬＲ反復配列、および例えばキモトリプシンで等の、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーのすべてのメンバーの中で高度に保存されているセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）により特徴づけられる。例示的なＭＴ−ＳＰ１の配列は、配列番号２に記載される。プロテアーゼドメインは、アミノ酸６１５〜８５４の間で生じ、アミノ酸６１５〜８５４を含む。
【０１００】
ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼへの言及は、完全長ＭＴ−ＳＰ１またはその任意の触媒活性部分を含み、対立遺伝子変異体および種変異体ならびにスプライス変異体によりコードされる変異体を含む。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは、一本鎖チモーゲンとしておよび活性化された二本鎖ポリペプチドとして生じる。ＭＴ−ＳＰ１への言及は、その活性一本鎖形態および活性二本鎖形態を含む。特に関心があるのは、ヒトを含む哺乳動物起源のＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼである。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼはまた、ラットまたはマウス起源のプロテアーゼを含むことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須の領域における単一アミノ酸の置換が生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えばＷａｔｓｏｎらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８７、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．、ｐ．２２４を参照されたい）。ヒト起源の例示的なＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼおよび／またはその触媒活性ドメインの、コード核酸分子の配列およびコードされたアミノ酸配列は、配列番号１、２、９、および１０に記載される。非ヒト起源の例示的なＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、マウス（ハツカネズミ、配列番号４４９）およびラット（ドブネズミ、配列番号４５０）における等のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本明細書中では、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼはスカフォールドＭＴ−ＳＰ１とすることができる。
【０１０１】
本明細書中で使用されるように、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの「その触媒活性部分」への言及は、プロテアーゼドメインまたはプロテアーゼ活性を保持するその任意の断片もしくは部分を指す。例えば、ＭＴ−ＳＰ１の触媒活性部分は、プロテアーゼドメインの単離一本鎖形態または活性化された二本鎖形態を含むＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインとすることができる。
【０１０２】
本明細書中で使用されるように、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは、スカフォールド形態または無修飾形態と比較して、変更された基質特異性等の変更された活性を呈するプロテアーゼを指す。上記プロテアーゼは、補体タンパク質を切断するためのＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの基質特異性または選択性等の活性が変更されるような、スカフォールドＭＴ−ＳＰ１と比較した、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の修飾（つまりアミノ酸における変化）を含む。修飾ＭＴ−ＳＰ１は、完全長スカフォールドＭＴ−ＳＰ１とすることができるまたは修飾ＭＴ−ＳＰ１は、修飾プロテアーゼが、プロテアーゼの活性または基質特異性を変更する領域において修飾を含有し、プロテアーゼがタンパク質分解性活性である限り、その完全長スカフォールドプロテアーゼの部分とすることができる。修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼはまた、プロテアーゼの基質特異性に影響を与えない領域において他の修飾を含むことができる。したがって、修飾ＭＴ−ＳＰ１は、野生型ＭＴ−ＳＰ１またはスカフォールドＭＴ−ＳＰ１のアミノ酸の対応する配列に対して、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を典型的に有する。修飾完全長ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは修飾ＭＴ−ＳＰ１のその触媒活性部分は、融合タンパク質が標的特異性を有する限り、融合タンパク質であるプロテアーゼを含むことができる。
【０１０３】
本明細書中で使用されるように、ヒトタンパク質は、ヒトのゲノム中に存在する、ＤＮＡ等の核酸分子によりコードされるタンパク質であり、そのすべての対立遺伝子変異体および保存的変形物を含む。タンパク質の変異体または修飾体は、修飾体が、ヒトタンパク質の野生型の配列または顕著な配列に基づく場合、ヒトタンパク質である。
【０１０４】
本明細書中で使用されるように、自然発生のα−アミノ酸の残基は、ヒトにおける、荷電ｔＲＮＡ分子のその同起源のｍＲＮＡコドンを用いた特異的認識によりタンパク質中に組み入れられる自然において見い出されるそれらの２０種のα−アミノ酸の残基である。
【０１０５】
本明細書中で使用されるように、非自然発生アミノ酸は、遺伝子的にコードされていないアミノ酸を指す。
【０１０６】
本明細書中で使用されるように、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの類似体を含み、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびそれらの混合物を含む。核酸は、単鎖または二重鎖とすることができる。プローブまたはプライマーを指す場合、それらは、蛍光または放射標識等の検出可能な標識で等で所望により標識され、単鎖分子が企図される。上記分子は、典型的に、それらの標的が統計的に特有となるような長さであるまたはライブラリーのプロービングまたはプライミングのために低コピー数（典型的に５未満、一般に３未満）のものとする。一般に、プローブまたはプライマーは、関心のある遺伝子と相補的なまたは同一の配列の少なくとも１４、１６、または３０個の近接ヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の核酸長とすることができる。
【０１０７】
本明細書中で使用されるように、ペプチドは、２〜４０のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。
【０１０８】
本明細書中で使用されるように、本明細書中で提供されるアミノ酸のそれぞれ異なる配列中に生じるアミノ酸は、それらの知られている３文字または１文字の略語に従って同定される（表１）。それぞれ異なる核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野でルーチン的に使用される標準的な単一の文字の名称を用いて命名される。
【０１０９】
本明細書中で使用されるように、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含有する。本明細書中の目的のために、アミノ酸は、２０種の自然発生のアミノ酸、非自然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（つまりα−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【０１１０】
本明細書中で使用されるように、「アミノ酸」は、本明細書中に出ているそれぞれ異なるアミノ酸配列中に生じ、それらのよく知られている３文字または１文字略語に従って同定される（表１を参照されたい）。ヌクレオチドは、それぞれ異なるＤＮＡ断片中に生じ、当技術分野でルーチン的に使用される標準的な単一文字の名称を用いて命名される。
【０１１１】
本明細書中で使用されるように、「アミノ酸残基」は、そのペプチド連結でのポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸を指す。本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であると仮定される。「Ｄ」異性体形態の残基は、そのように命名され、所望の機能的特性がポリペプチドにより保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２〜３５５９（１９６９）および適合する米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２に記載される標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基についての略語を表１に示す。
【０１１２】
【表１】
0005860789.tif 000002
【０１１３】
本明細書中で式により表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向に、左から右への配向を有することに留意されたい。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応の表（表１）に列挙されるアミノ酸を含むよう広く定義され、米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２に言及されるアミノ酸等の修飾アミノ酸および異常アミノ酸は、参照により本明細書に組み入れられる。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりのダッシュは、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対する、ＮＨ２等のアミノ末端グループに対する、またはＣＯＯＨ等のカルボキシル末端グループに対するペプチド結合を示すことに留意されたい。
【０１１４】
本明細書中で使用されるように、「自然発生のアミノ酸」は、ポリペプチド中に生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。
【０１１５】
本明細書中で使用されるように、「非自然アミノ酸」は、自然アミノ酸に類似する構造を有する有機化合物を指すが、自然アミノ酸の構造および反応性を模倣するよう構造的に修飾されている。したがって、非自然発生アミノ酸は、例えば、２０種の自然発生のアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これらに限定されない。例示的な非自然アミノ酸は、本明細書中に記載され、当業者に知られている。
【０１１６】
本明細書中で使用されるように、等速性混合物は、アミノ酸のモル比がそれらの報告された反応率に基づいて調節された混合物である［例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３４：１６８１を参照されたい］。
【０１１７】
本明細書中で使用されるように、ＤＮＡ構築物は、自然では見い出されない様式で組み合わせられ、並べられたＤＮＡのセグメントを含有する単鎖もしくは二重鎖、線状、または環状のＤＮＡ分子であり、ＤＮＡ構築物は、ヒトの操作の結果として存在し、クローンおよび操作された分子の他のコピーを含む。
【０１１８】
本明細書中で使用されるように、ＤＮＡセグメントは、特定の性状を有する、より大きなＤＮＡ分子の部分である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片等の、より長いＤＮＡ分子の部分であり、５’から３’方向に読み取られる場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【０１１９】
本明細書中で使用されるように、オルソログという用語は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、ある種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オルソログ間の配列差異は、種分化の結果である。
【０１２０】
本明細書中で使用されるように、用語ポリヌクレオチドは、５’から３’端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドベースの単鎖または二重鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、自然源から単離する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成する、または自然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）により本明細書中で与えられる。ヌクレオチドという用語は、状況が許可する場合、単鎖分子および二重鎖分子に使用される。この用語が二重鎖分子に適用される場合、用語は、全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であることが理解されるであろう。二重鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はわずかに長さが異なることがあり得、そしてその端がずれることがあり得、したがって、二重鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対になることができるとは限らないことが当業者により認識されるであろう。上記の対でない端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えないであろう。
【０１２１】
本明細書中で使用されるように、プロテアーゼポリペプチドは、本明細書中に記載されるスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの任意の１つに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１２２】
本明細書中で使用されるように、２つのタンパク質または核酸の間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびそこに含有される残基の同一性ならびに／または相同性の度合いに基づき得る。タンパク質または核酸の間の類似性の度合いを評価するための方法は当業者に知られている。例えば、配列類似性を評価するある方法では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、配列間で最大のレベルの同一性が得られる様式で整列される。「同一性」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が一様である程度を指す。アミノ酸配列のアラインメントおよびある程度のヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的な差異および／または頻繁な置換を考慮することができる。保存的な差異は、関与する残基の物理化学的特性を保存する差異である。アラインメントは、全体的（配列の全体の長さにわたるおよびすべての残基を含む比較される配列のアラインメント）または局所的（最も類似する１つまたは複数の領域のみを含む配列の部分のアラインメント）とすることができる。
【０１２３】
「同一性」はそれ自体、技術的に認識される意味を有し、公開された技術を使用して算出することができる［例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７、ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい］。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の同一性を測定する多くの方法が存在している一方、用語「同一性」は当業者によく知られている［Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８）］。
【０１２４】
本明細書中で使用されるように、相同性により（核酸配列および／またはアミノ酸配列に関する）は、２５％以上の配列相同性、典型的に２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列相同性について意味し、必要であれば正確な百分率を特定することができる。本明細書中の目的のために、用語「相同性」および「同一性」は、他に示されていない限り、区別なく使用されることが多い。一般に、相同性または同一性の百分率の決定については、配列は、最も高次のマッチが得られるよう整列される［例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７、ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１、Ｃａｒｒｉｌｌｏら（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３を参照されたい］。配列相同性により、保存アミノ酸の数は、標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムにより決定され、各サプライヤーにより確立されたデフォルトギャップペナルティーと共に使用することができる。実質的に相同の核酸分子は、典型的に中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、関心のある核酸の全長に沿ってハイブリダイズすると思われる。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子もまた企図される。
【０１２５】
任意の２つの分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％「同一の」または「相同の」ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するかどうかは、「ＦＡＳＴＡ」プログラム等の知られているコンピュータアルゴリズムを使用して、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４におけるデフォルトパラメータを使用して、決定することができる［他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９４、およびＣａｒｒｉｌｌｏら（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３）を含む］。例えば、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースのＢＬＡＳＴ機能は、同一性を決定するために使用することができる。他の商業的にまたは公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ社製「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（マディソン、ＷＩ）およびウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（マディソン、ＷＩ）を含む。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性のパーセントは、例えばＧＡＰコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することにより決定することができる［例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２により改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３］。手短に言えば、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうちの短い方の記号の総数で割った、類似した整列した記号（つまりヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは次のものを含むことができる：（１）単項比較マトリックス（同一の場合には１および同一でない場合には０という値を含有する）ならびにＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、ＡＴＬＡＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）により記載されるＧｒｉｂｓｋｏｖら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス（２）各ギャップに３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号にさらに０．１０のペナルティー、ならびに（３）エンドギャップにペナルティーなし。
【０１２６】
したがって、本明細書中で使用されるように、用語「同一性」または「相同性」は、試験および対照のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を表す。本明細書中で使用されるように、用語「〜に少なくとも９０％同一の」は、対照の核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列に比べて、９０〜９９．９９の同一性パーセントを指す。９０％以上のレベルでの同一性は、例証目的と仮定して、１００個のアミノ酸の試験および対照のポリペプチド長が比較され、試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の多くとも１０％（つまり１００のうち１０）が対照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。類似比較は、試験および対照のポリヌクレオチド間でなすことができる。上記差異は、ポリペプチドの全体の長さにわたり無作為に分布した点突然変異として表され得るまたは上記差異は、最大に許容できる、例えば１０／１００のアミノ酸差異（約９０％の同一性）まで、いろいろな長さの１つまたは複数の場所にクラスター形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットに非依存的であるはずであり、上記高度なレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなくマニュアルアラインメントにより、容易に評価することができることが多い。
【０１２７】
本明細書中で使用されるように、整列した配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列中の対応する位置を整列させるための相同性（類似性および／または同一性）の使用を指す。典型的に、５０％以上の同一性で関係する２つ以上の配列が整列する。配列の整列したセットは、対応する位置で整列し、ゲノムＤＮＡ配列に合わせられた、ＥＳＴ等のＲＮＡおよび他のｃＤＮＡ由来の整列配列を含み得る２つ以上の配列を指す。
【０１２８】
本明細書中で使用されるように、「プライマー」は、適切な条件下で（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素等の重合剤の存在下で）、適切な緩衝液中で、および適した温度で鋳型指示ＤＮＡ合成の開始のポイントとして作用することができる核酸分子を指す。ある種の核酸分子は、「プローブ」としておよび「プライマー」として働くことができることが十分に理解されるであろう。しかしながら、プライマーは、伸長のための３’水酸基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ＰＣＲ、ＬＣＲ、多重ＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ（ｐａｎｈａｎｄｌｅ  ＰＣＲ）、捕捉ＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ライゲーション媒介性ＰＣＲ、ならびに他の増幅プロトコールを含む様々な方法において使用することができる。
【０１２９】
本明細書中で使用されるように、「プライマー対」は、配列の５’端とハイブリダイズして増幅する（例えばＰＣＲにより）５’（上流）プライマーおよび配列の３’端の相補体とハイブリダイズして増幅するよう３’（下流）プライマーを含むプライマーのセットを指す。
【０１３０】
本明細書中で使用されるように、「特異的にハイブリダイズする」は標的核酸分子への核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合によるアニーリングを指す。当業者は、特定の分子の長さおよび組成等の、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのパラメータに精通している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションに特に関連するパラメータは、アニーリング温度および洗浄温度、緩衝液組成、ならびに塩濃度をさらに含む。非特異的結合核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、中ストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は当技術分野で知られている。当業者は、特定の用途に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータを容易に調節することができる。
【０１３１】
本明細書中で使用されるように、産物に実質的に同一であるは、十分に類似することを意味し、したがって実質的に同一の産物がその産物の代わりに使用することができるよう、関心のある特性が十分に不変である。
【０１３２】
本明細書中で使用されるように、用語「実質的に同一の」または「類似する」は、当業者により理解されるように、状況により変わることも理解される。
【０１３３】
本明細書中で使用されるように、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変形物は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかについて言及するものである。対立遺伝子変形物は、突然変異を通して自然に生じ、母集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントとすることができる（コードされたポリペプチド中の変化なし）またはアミノ酸配列が変更されたポリペプチドをコードすることができる。用語「対立遺伝子変異体」はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を表すためにも本明細書中で使用される。典型的に、遺伝子の対照形態は、種の母集団または単一の対照メンバーからのポリペプチドの野生型形態および／または優性形態をコードする。典型的に、対立遺伝子変異体は、種の間のおよび種の中での変異体を含み、同じ種からの野生型形態および／または優性形態と少なくとも８０％、９０％、またはそれよりも高いアミノ酸同一性を有し、同一性の度合いは、遺伝子および比較が種間または種内かどうかに依存する。一般に、種内の対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの野生型形態および／または優性形態と９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を含む、野生型形態および／または優性形態と少なくとも約８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはそれよりも高い同一性を有する。
【０１３４】
本明細書中で使用されるように、「対立遺伝子」は、「対立遺伝子変異体」と本明細書中で区別なく使用され、遺伝子またはその部分の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ座または位置を占める。対象がある遺伝子について２つの同一の対立遺伝子を有する場合、対象は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合であると表現される。対象がある遺伝子について２つの異なる対立遺伝子を有する場合、対象は、その遺伝子についてヘテロ接合であると表現される。特異的遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドにおいてお互いに異なり得る、そしてヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含有する遺伝子の形態とすることができる。
【０１３５】
本明細書中で使用されるように、スプライス変異体は、１つを超える種類のｍＲＮＡをもたらす、ゲノムＤＮＡの転写一次産物のディファレンシャルプロセシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）により産生された変異体を指す。
【０１３６】
本明細書中で使用されるように、修飾は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の修飾に関するものであり、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入、および交換をそれぞれ含む。
【０１３７】
本明細書中の目的のために、アミノ酸の置換、欠失、および／もしくは挿入は、結果としてのタンパク質がプロテアーゼ活性もしくは他の活性を呈する限り、プロテアーゼおよびそのプロテアーゼドメインのいずれかにおいてなすことができる（または、所望の場合、上記変化は活性を排除するためになすことができる）。修飾は、保存的なアミノ酸置換、さらに非保存的なアミノ酸置換をなすことにより作製することができる。例えば、タンパク質の特性を望ましくまたは有利に変更するアミノ酸置換をなすことができる。一実施形態では、ポリペプチドの分解を予防する突然変異をなすことができる。多くのプロテアーゼは、ＲおよびＫ等の塩基性の残基の後において切断し、上記切断を排除するために、塩基性残基は非塩基性残基と交換される。プロテアーゼと阻害剤の相互作用の部位での非保存的な変化を達成することにより触媒活性を保持しながら、阻害剤とプロテアーゼの相互作用をブロックすることができる。他の活性もまた変更することができる。例えば、受容体結合は、触媒活性を変更することなく変更することができる。
【０１３８】
企図されるアミノ酸置換は、表２に記載される置換等の保存的置換を含み、置換は、タンパク質分解性活性を排除しない。本明細書中で記載されるように、切断部位および他の上記部位の除去等の、タンパク質の特性を変更する置換もまた企図され、上記置換は、一般に非保存的であるが、当業者により容易に達成することができる。
【０１３９】
アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に知られており、結果としての分子の生物学的活性、例えば酵素活性を変更することなく一般になすことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須の領域における単一アミノ酸の置換が生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８７、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．、ｐ．２２４を参照されたい）。セリンプロテアーゼの触媒活性断片、特に一本鎖プロテアーゼ部分もまた定義内に含まれる。保存的なアミノ酸置換は、以下の表２に記載される置換に従って成される。
【０１４０】
【表２】
0005860789.tif 000003
【０１４１】
他の置換もまた許容可能であり、経験的にまたは知られている保存的置換に従って決定することができる。
【０１４２】
本明細書中で使用されるように、プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含有する遺伝子の部分を意味する。プロモーター配列は、共通して、しかし常にではないが、遺伝子の５’非コード領域において見い出される。
【０１４３】
本明細書中で使用されるように、単離されたもしくは精製されたポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する組織の細胞からの細胞性材料または他の混入タンパク質が実質的にないまたは化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。調製物は、さらなる精製が、物質の酵素活性および生物学的活性等の物理的特性および化学的特性を検出可能に変更しないような上記純度または十分に純粋であることを評価するために当業者により使用される薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の標準的な分析方法により決定される容易に検出可能な不純物がないと思われる場合、実質的に不純物がないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製のための方法は当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体の混合物となり得る。上記事例では、さらなる精製により化合物の特異的活性が増加する可能性がある。
【０１４４】
細胞性材料が実質的にないという用語は、タンパク質が単離されるまたは組換えで産生される細胞の細胞性成分からタンパク質が分離されるタンパク質の調製物を含む。一実施形態では、細胞性材料が実質的にないという用語は、約３０％未満（乾燥重量による）の非プロテアーゼタンパク質（本明細書中で混入タンパク質とも称される）、一般に約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質もしくは１０％の非プロテアーゼタンパク質、または約５％未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が組換えで産生される場合、それはまた、実質的に培地もない、すなわち、培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の２０％、１０％、または５％未満、それくらい、またはそれと等しい。
【０１４５】
本明細書中で使用されるように、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないという用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されるプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾燥重量による）、２０％、１０％、５％、またはそれ以下、未満の化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質もしくは成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。
【０１４６】
本明細書中で使用されるように、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え手段による産生は、クローン化ＤＮＡによりコードされたタンパク質を発現させるための、分子生物学のよく知られている方法の使用を指す。
【０１４７】
本明細書中で使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞中に異種核酸を導入するために使用される別個の要素を指す。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、ゲノムの染色体中への遺伝子またはその部分の統合を達成するために設計することができる。酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体等の人工染色体であるベクターもまた企図される。上記ビヒクルの選択および使用は当業者によく知られている。
【０１４８】
本明細書中で使用されるように、発現ベクターは、上記ＤＮＡ断片の発現を達成することができる、プロモーター領域等の調節配列と効果的に連結されたＤＮＡを発現することができるベクターを含む。上記付加的なセグメントは、プロモーター配列および終結配列を含むことができ、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を所望により含むことができる。発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに一般に由来するまたは両方の要素を含有することができる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞中への導入の際にクローン化ＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクター等の組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築物を指す。適切な発現ベクターは、当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能なベクターならびにエピソームのままのベクターまたは宿主細胞ゲノム中に統合するベクターを含む。
【０１４９】
本明細書中で使用されるように、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」も含む。ウイルス性ベクターは、細胞中に外因性遺伝子を移入する（ビヒクルまたはシャトルとして）よう、外因性遺伝子に効果的に連結された操作されたウイルスである。
【０１５０】
本明細書中で使用されるように、アデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を引き起こすＤＮＡ含有ウイルスのグループのいずれかを指す。本明細書中で使用されるように、裸のＤＮＡは、ワクチンおよび遺伝子治療に使用することができるヒストンなしのＤＮＡを指す。裸のＤＮＡは、形質転換と呼ばれる遺伝子移入プロセスの間に細胞から細胞へ通過する遺伝物質である。形質転換において、レシピエント細胞に新しい特徴または表現型を与えるであろう精製ＤＮＡまたは裸のＤＮＡはレシピエント細胞により吸収される。
【０１５１】
本明細書中で使用されるように、操作可能にまたは効果的に連結されたは、ＤＮＡセグメントを指す場合、セグメントが意図した目的に一致して機能するよう配置されることを意味し、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメントを通して終結に進む。
【０１５２】
本明細書中で使用されるように、タンパク質結合配列は、他のタンパク質またはペプチド配列に、一般に、タンパク質もしくはペプチド配列のセットにまたは特定のタンパク質もしくはペプチド配列に特異的に結合することができるタンパク質またはペプチド配列を指す。
【０１５３】
本明細書中で使用されるように、エピトープタグは、エピトープタグ付きタンパク質またはペプチドの続く生化学的および免疫学的分析を容易にするための、エピトープに対応するアミノ酸残基の短いストレッチを指す。エピトープタギングは、適切な発現ベクター中のタンパク質コード配列へエピトープタグの配列を追加することにより達成される。エピトープタグ付きタンパク質は、タグに対して産生された高度に特異的な抗体を使用してアフィニティー精製することができる。
【０１５４】
本明細書中で使用されるように、金属結合配列は、金属イオンに、一般に金属イオンのセットにまたは特定の金属イオンに特異的に結合することができるタンパク質またはペプチド配列を指す。
【０１５５】
本明細書中で使用されるように、評価するという用語は、サンプル中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性についての絶対値を得る、さらに指数、比、百分率、活性のレベルを示す視覚的値または他の値を得る意味での定量的および定質的な決定を含むことが意図される。評価は、直接的または間接的とすることができ、実際に検出された化学種は、もちろん、それ自体タンパク質分解産物である必要はないが、例えば、その誘導体またはいくらかのさらに進んだ物質とすることができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルーを用いたタンパク質染色による等の、補体タンパク質の切断産物の検出。
【０１５６】
本明細書中で使用されるように、生物学的活性は、化合物、組成物、または他の混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の際に結果として生じるｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の活性または生理応答を指す。したがって、生物学的活性は、上記化合物、組成物、および混合物の治療上の効果および医薬品の活性を包含する。生物学的活性は、上記活性を試験するまたは使用するために設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において観察することができる。したがって、本明細書中の目的のために、プロテアーゼの生物学的活性は、ポリペプチドが加水分解されるその触媒活性である。
【０１５７】
本明細書中で使用されるように、等価は、核酸の２つの配列を指す場合、問題の２つの配列が、同じ配列のアミノ酸または等価なタンパク質をコードすることを意味する。等価が、２つのタンパク質またはペプチドを指すのに使用される場合、等価は、２つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変更しないアミノ酸置換（限定されるものではないが、上記の表２に記載される変化等の保存的な変化等）のみを有する実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。等価が特性を指す場合、特性は、同じ程度まで存在する必要はないが（例えば、２つのペプチドは、同じ種類の酵素活性を異なる率で呈し得る）、活性は通常実質的に同じである。相補的は、２つのヌクレオチド配列を指す場合、ヌクレオチドの２つの配列が、向かい合ったヌクレオチドとの間の典型的に２５％、１５％、または５％未満のミスマッチで、ハイブリダイズすることができることを意味する。必要であれば、相補性の百分率は特定されるであろう。典型的に、２つの分子は、それらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするよう選択される。
【０１５８】
本明細書中で使用されるように、タンパク質の活性あるいは遺伝子または核酸の発現を調節する作用物質は、タンパク質の活性を減少させるもしくは増加させるまたは変更するあるいはいくつかの様式では、細胞における核酸の発現をアップレギュレートするもしくはダウンレギュレートするまたは変更する。
【０１５９】
本明細書中で使用されるように、「キメラタンパク質」プロテアーゼまたは「融合タンパク質」プロテアーゼは、異なるポリペプチドに効果的に連結されたポリペプチドを指す。本明細書中で提供されるキメラタンパク質または融合タンパク質は、１つまたは複数のプロテアーゼまたはその一本鎖プロテアーゼドメイン等のその部分ならびに転写／翻訳制御シグナル、シグナル配列、局在化のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部、および／または標的作用物質のうちの任意の１つまたは複数のための１つまたは複数の他のポリペプチドを含むことができる。これらのキメラタンパク質または融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段により産生されたタンパク質、例えばスルフヒドリル基へのカップリングを通した化学的カップリングによる等の化学的手段により産生されたタンパク質、および少なくとも１つのプロテアーゼまたはその部分が、リンカー（複数可）を介して直接的または間接的に他のポリペプチドに連結された任意の他の方法により産生されたタンパク質を含む。
【０１６０】
本明細書中で使用されるように、効果的に連結されたは、融合タンパク質を指す場合、インフレームで互いに融合されるプロテアーゼポリペプチドおよび非プロテアーゼポリペプチドを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【０１６１】
本明細書中で使用されるように、標的作用物質は、細胞表面受容体への抱合体の特異的な結合を提供する、タンパク質またはその有効な部分等の任意の部分であり、受容体は、いくつかの事例において、結合した抱合体またはその部分を内部移行することができる。標的作用物質はまた、例えば、抱合体のアフィニティー単離または精製、表面への抱合体の付着、あるいは抱合体もしくは抱合体を含有する複合体の検出を促進するまたは容易にする作用物質とすることができる。
【０１６２】
本明細書中で使用されるように、抗体抱合体は、標的作用物質が抗体である抱合体を指す。
【０１６３】
本明細書中で使用されるように、分子の誘導体または類似体は、分子から誘導された部分または分子の修飾バーションを指す。
【０１６４】
本明細書中で使用されるように、「疾患または障害」は、感染症、後天性状態、遺伝的状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状により特徴づけられる、生物における病的状態を指す。本明細書中の関心のある疾患および障害は、補体活性化により媒介されるものおよび補体活性化が病因または病状において役割を果たすものを含む補体活性化を伴うものである。疾患および障害はまた、免疫欠損等の、タンパク質の非存在下により引き起こされるものを含み、本明細書中で関心があるのは、補体活性化が補体タンパク質の欠損により生じないそれらの障害である。
【０１６５】
本明細書中で使用されるように、補体媒介性障害は、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数が、タンパク質の非存在または存在のいずれかによりその疾患において役割を果たす任意の障害である。補体媒介性障害は、補体タンパク質の欠損による障害である。補体媒介性障害はまた、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数の存在および補体経路の継続的な活性化による障害である。
【０１６６】
本明細書中で使用されるように、疾患または状態を有する対象を「処置する」は、対象の症状が、部分的にもしくは全面的に緩和されるまたは処置の後、静的なままであることを意味する。したがって、処置は、予防法、治療法、および／または療法を包含する。予防法は、起こりうる疾患の予防および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の予防を指す。処置はまた、修飾インターフェロンおよび本明細書中で提供される組成物の任意の医薬品の使用も包含する。
【０１６７】
本明細書中で使用されるように、治療剤、治療レジメン、放射線防護剤、または化学治療は、ワクチンを含む従来の薬物および薬物治療を意味し、それらは当業者に知られている。放射線治療作用物質は当技術分野でよく知られている。
【０１６８】
本明細書中で使用されるように、処置は、状態、障害、または疾患の症状が寛解されるまたは有益に変更される任意の様式を意味する。処置はまた、本明細書中の組成物の任意の医薬品の使用も包含する。
【０１６９】
本明細書中で使用されるように、医薬組成物または他の治療用物質の投与による等の処置による特定の疾患または障害の症状の寛解は、永久的または一時的、永続的または一過性にかかわらず、組成物または治療用物質の投与に帰するまたは関連し得る症状の任意の減少を指す。
【０１７０】
本明細書中で使用されるように、予防または予防法は、疾患または状態を発症する危険性を低下させる方法を指す。
【０１７１】
本明細書中で使用されるように、特定の疾患を処置するための化合物または組成物の有効量は、疾患に関連する症状を寛解させるまたはいくつかの様式では低下させるのに十分な量である。上記量は、単一投与量として投与することができるまたはレジメンに従って投与することができ、それによって、上記量は有効となる。その量は、疾患を治癒することができるが、典型的に、疾患の症状を寛解させるために投与される。典型的に、反復投与が、症状の所望の寛解を達成するために必要とされる。
【０１７２】
本明細書中で使用されるように、「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、治療上の効果をもたらすのに少なくとも十分な化合物を含有する作用物質、化合物、物質、または組成物を指す。有効量は、疾患または障害の症状を予防する、治癒する、寛解させる、阻止する、または部分的に阻止するために必要な治療剤の含量である。
【０１７３】
本明細書中で使用されるように、修飾非補体プロテアーゼ等の非補体プロテアーゼの投与は、非補体プロテアーゼをその基質と接触させる任意の方法を指す。投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成することができる。例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与については、血液等の体液は、対象から除去され、修飾非補体プロテアーゼと体の外部で接触させられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与については、局所経路、局部経路、全身経路、および／または導入の他の経路による等で、修飾非補体プロテアーゼを体内に導入することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与は、細胞培養法等の方法を包含する。
【０１７４】
本明細書中で使用されるように、抗凝固薬は、血液の凝固（凝結）を予防するのに役立つ薬物である。これらの薬物は、新しい血塊が形成されるのを予防するまたは既存の血塊が大きくなるのを予防する傾向がある。
【０１７５】
本明細書中で使用されるように、当技術分野で知られているように、単位用量形態は、ヒトおよび動物の対象に適した、個々にパッケージ化された物理的に別個の単位を指す。
【０１７６】
本明細書中で使用されるように、処置されることになる「患者」または「対象」は、ヒトおよびヒト動物または非ヒト動物を含む。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、およびサル等の霊長動物、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、雌ウシ等の家畜化された動物、ならびにマウス、ラット、ハムスター、およびアレチネズミ等のげっ歯類を含む。
【０１７７】
本明細書中で使用されるように、組合せは、２つのアイテムの間のまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連を指す。関連は、空間的とすることができるまたは共通の目的のための２つ以上のアイテムの使用を指すことができる。
【０１７８】
本明細書中で使用されるように、組成物は、２つ以上の産物または化合物（例えば作用物質、修飾因子、調節因子等）の任意の混合物を指す。組成物は、水剤、懸濁剤、液剤、散剤、ペースト剤、水性製剤もしくは非水性製剤、またはそれらの任意の組合せとすることができる。
【０１７９】
本明細書中で使用されるように、「製造製品」は、作製され、販売される産物である。本出願の全体にわたり使用されるように、この用語は、パッケージング製品に含有される修飾プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するよう意図される。
【０１８０】
本明細書中で使用されるように、液は、流動することができる任意の組成物を指す。したがって、液は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他の上記組成物の形態の組成物を包含する。
【０１８１】
本明細書中で使用されるように、「キット」は、パッケージ化された組合せを指し、組合せの要素を使用する方法を実施するための試薬および他の産物ならびに／または成分を所望により含む。例えば本明細書中で提供される修飾プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子ならびに投与、診断、および生物学的活性または生物学的特性の評価を含むが、これらに限定されない目的のための他のアイテムを含有するキットが提供される。キットは、使用のための使用説明書を所望により含む。
【０１８２】
本明細書中で使用されるように、細胞性抽出物は、溶解されたまたは破壊された細胞から作製される調製物または分画を指す。
【０１８３】
本明細書中で使用されるように、タンパク質のみの関連またはその関連する基質、結合パートナー、および／もしくは他の成分との関連に関与する特異的配列を考えることなく作用物質が無作為に選定される場合、作用物質は、無作為に選択されると表現される。無作為に選択された作用物質の例は、化学的ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリーまたは生物の成長ブロスもしくは条件培地の使用によるものである。
【０１８４】
本明細書中で使用されるように、プロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の際に、化合物の生物学的、薬学的、または治療的活性形態に代謝されるまたは変換される化合物である。プロドラッグを産生するために、薬学的活性化合物は、この活性化合物が代謝プロセスにより再生成されるように修飾される。プロドラッグは、薬物の代謝安定性もしくは輸送の特徴を変更するよう、副作用もしくは毒性を遮蔽するよう、薬物の香味を改善するよう、または薬物の他の特徴もしくは特性を変更するよう設計することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬力学的プロセスおよび薬物代謝についての知識のおかげで、当業者は、一度、薬学的活性化合物を知ると、化合物のプロドラッグを設計することができる［例えば、Ｎｏｇｒａｄｙ（１９８５）Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐａｇｅｓ３８８−３９２を参照されたい］。
【０１８５】
本明細書中で使用されるように、ペプチドミメティックは、特定のペプチドの生物学的活性形態のコンホメーションおよびある種の立体化学的特徴を模倣する化合物である。一般に、ペプチドミメティックは、化合物のある種の望ましい特性を模倣するよう設計されるが、生物学的活性コンホメーションの損失および結合崩壊につながる、柔軟性等の望ましくない特性を模倣するよう設計されない。ペプチドミメティックは、望ましくない特性の一因となるある種の基または結合を生物学的等価体と交換することにより、生物学的活性化合物から調製することができる。生物学的等価体は当業者に知られている。例えば、メチレン基生物学的等価体ＣＨ２Ｓは、エンケファリン類似体におけるアミド交換に使用されてきた［例えばＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、ｖｏｌｕｍｅ  ７、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋにおけるＳｐａｔｏｌａ（１９８３）ｐｐ．２６７−３５７を参照されたい］。モルヒネは、経口的に投与することができ、ペプチドエンドルフィンのペプチドミメティックである化合物である。本明細書中の目的のために、ポリペプチドのバックボーンを形成する１つまたは複数のペプチド結合が生物学的等価体と交換されるポリペプチドは、ペプチドミメティックである。
【０１８６】
本明細書中で使用されるように、抗体は、軽鎖および重鎖の可変領域から構成される、Ｆａｂ断片等の抗体断片を含む。
【０１８７】
本明細書中で使用されるように、受容体は、特定のリガンドについてのアフィニティーを有する分子を指す。受容体は、自然発生分子または合成分子とすることができる。受容体はまた、当技術分野で抗リガンドとも称され得る。
【０１８８】
本明細書中で使用されるように、プライマーは、２つ以上の、典型的に３つを超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを指し、プライマーから、プライマー伸長産物の合成を開始することができる。合成を促す実験条件は、ヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼ等の重合および伸長のための作用物質ならびに適した緩衝液、温度、およびｐＨの存在を含む。
【０１８９】
本明細書中で使用されるように、動物は、限定されるものではないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長動物、マウスおよびラット等のげっ歯類、ニワトリ等の家禽、ヤギ、雌ウシ、シカ、ヒツジ等の反芻動物、ブタ等の羊に近い動物、ならびに他の動物等の任意の動物を含む。非ヒト動物は企図される動物としてヒトを除外する。本明細書中で提供されるプロテアーゼは、任意の源、動物、植物、原核生物、菌類からのものである。ほとんどのプロテアーゼは、哺乳動物起源を含む動物起源のものである。
【０１９０】
本明細書中で使用されるように、遺伝的治療または遺伝子治療は、上記治療が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの標的細胞であるある種の細胞中へのＤＮＡ等の異種核酸の移入を必要とする。ＤＮＡ等の核酸は、直接的またはベクターもしくは他のデリバリービヒクルにおいて等でＤＮＡ等の異種核酸が発現し、それによって、コードされた治療産物が産生される様式で、選択された標的細胞中に導入される。代わりに、ＤＮＡ等の異種核酸は、いくつかの様式では、治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができる。または異種核酸は、いくつかの様式では、直接的または間接的に治療産物の発現を媒介するペプチドまたはＲＮＡ等の産物をコードすることができる。遺伝的治療はまた、欠損遺伝子を交換するまたは核酸が導入される哺乳動物もしくは細胞により産生される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用することもできる。導入された核酸は、哺乳動物宿主中で普通は産生されないまたは治療的有効量でもしくは治療的に有用な時に産生されない、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼ等の治療化合物をコードすることができる。治療産物をコードする、ＤＮＡ等の異種核酸は、産物またはその発現を増強するまたは変更するために、罹患した宿主の細胞中への導入の前に修飾することができる。遺伝的治療はまた、遺伝子発現の阻害剤またはリプレッサーまたは他の修飾因子のデリバリーを必要とし得る。
【０１９１】
本明細書中で使用されるように、異種核酸は、核酸が発現する細胞によりｉｎ  ｖｉｖｏで普通は産生されない、または細胞により産生されるが、異なる座にあるもしくは異なって発現する、または転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによりＤＮＡ等の内因性核酸の発現を変更する媒介物を媒介するもしくはコードする核酸である。異種核酸は、一般に、核酸が導入される細胞に内因性ではないが、他の細胞から得られてきたまたは合成的に調製されてきた。異種核酸は、内因性とすることができるが、異なる座から発現するまたはその発現が変更された核酸である。一般に、必ずではないが、上記核酸は、細胞によりまたは核酸が発現する細胞中での同じ方法で、普通は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。ＤＮＡ等の異種核酸はまた、ＤＮＡ等の外来性核酸と称することもできる。したがって、異種核酸または外来性核酸は、ＤＮＡ等の核酸分子対応物がゲノムにおいて見い出されるのとまったく同じ配向または位置に存在しない核酸分子を含む。それはまた、他の生物または種からの核酸分子を指すことができる（つまり外因性）。
【０１９２】
核酸が発現する細胞に対して異種または外来性であるとして当業者は認識するまたは考えるであろうＤＮＡ等の任意の核酸は、本明細書中で異種核酸により包含され、異種核酸は、内因的にも発現もする外因的に追加された核酸を含む。異種核酸の例は、薬物抵抗性を付与するタンパク質等の追跡可能マーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素、およびホルモン等の治療的に有効な物質をコードする核酸、ならびに抗体等の他の種類のタンパク質をコードする、ＤＮＡ等の核酸を含むが、これらに限定されない。異種核酸によりコードされる抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面上に分泌または発現され得る。
【０１９３】
本明細書中で使用されるように、遺伝子治療のための治療的に有効な産物は、異種核酸、典型的にＤＮＡによりコードされ、宿主中への核酸の導入の際に発現し、症状、遺伝性疾患もしくは後天性疾患の顕在化を寛解させるもしくは排除するまたは疾患を治癒する産物である。ＲＮＡｉおよびアンチセンス等の生物学的活性核酸分子もまた含まれる。
【０１９４】
本明細書中で使用されるように、コントロールは、コントロールが試験パラメータを用いて処置されない以外は、試験サンプルと実質的に同一のサンプルを指すまたはコントロールが血漿サンプルである場合、コントロールは、関心のある状態に冒されていない正常なボランティアからのものとすることができる。コントロールはまた、内部コントロールとすることもできる。
【０１９５】
本明細書中で使用されるように、ポリペプチドがアミノ酸の説明された配列から本質的になるという説明は、完全長ポリペプチドの説明された部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、他の源からの付加的なアミノ酸を所望により含むことができる、そして一般に含むであろうまたはポリペプチドは、他のポリペプチドに挿入することができる。例えば、本明細書中での目的のために、ポリペプチドがプロテアーゼドメインから本質的になるという説明は、ポリペプチドの部分のみがプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分となるということを意味する。ポリペプチドは、アミノ酸の付加的な非プロテアーゼ由来の配列を所望により含むことができる、そして一般に含むであろう。
【０１９６】
本明細書中で使用されるように、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、他に示されていない限り、略語と認識されるそれらの共通の使用法またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）［（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６を参照されたい］に従うものとする。
【０１９７】
Ｂ．標的：補体
補体系およびその成分は、本明細書中で提供される修飾プロテアーゼについての標的基質となる。プロテアーゼは、系の１つまたは複数の成分を切断し、それによって系の活性を調節するための方法を提供するよう修飾される、選択される、または同定される。上記プロテアーゼは、補体系の活性を調節するための治療用物質としてまたは治療用物質候補として働くことができる。
【０１９８】
補体系は、免疫系の一部であり、侵入する外来性生物の排除において役割を果たし、炎症応答を開始する。補体系の一部である、３０種を超える可溶性の細胞膜タンパク質がある。これらのタンパク質は、抗体媒介性免疫応答においてだけではなく、細菌、ウイルス感染細胞、および寄生生物等の病原体を認識し、殺す先天性免疫応答においても機能する。補体タンパク質は、マクロファージおよび肝細胞により恒常的に産生され、不活性分子として循環して存在する。数種の補体タンパク質は、それら自体、タンパク質分解性の切断により活性化され、他の補体タンパク質中のペプチド結合を切り、それらを順番に活性化するエフェクタープロテアーゼになるプロ酵素プロテアーゼ（チモーゲンと呼ばれる）である。各活性化されたプロテアーゼが多くの基質分子を活性化することができるので、初期の活性化は、何百万個ものエフェクター分子を産生するよう速やかに増幅する（カスケード）。補体系は、炎症を刺激し、抗原食作用を促進し、いくつかの細胞を直接溶解させる複数のエフェクター分子の形成を最終的にもたらすタンパク質分解性の事象の不可逆的カスケードを構成し、したがって、共通の病状を共有するまたは病因もしくは病状においてこの系を含む様々な障害の処置のための介入の治療上のポイントとして働くことができる。
【０１９９】
補体が病原体表面上で活性化することができる３つの別の経路：古典経路、代替経路、およびレクチン経路がある。これらの経路は、それらの開始に必要な成分が異なるという点で別であるが、経路は、同じセットのエフェクター分子を最終的に生成する（例えば図１を参照されたい）。同様に、各経路の早期事象は、不活性補体チモーゲンが切断されて２つの断片が得られ、その大きい方が活性セリンプロテアーゼである、誘発酵素カスケードの類似するメカニズムにより管理される。活性プロテアーゼは、続く補体チモーゲンが切断され、補体活性化のタンパク質分解性のカスケードを継続するために活性化されるよう病原体表面に保持される。チモーゲンの切断の際に生成された第２の断片は、オプソニンまたは炎症誘発性媒介物として、補体機能の可溶性媒介物として作用することができるより小さい方のペプチド断片である。
【０２００】
１．命名法
補体経路は、３０種を超える可溶性媒介物を含み（表３を参照されたい）、それらのうちのいくつかは、不活性タンパク質チモーゲンの切断から生成され、２つの断片が得られる。表３は、例示的な天然補体タンパク質を表し、コードされたその補体断片のポリペプチド中の場所を含む、それらのポリペプチド配列の説明を提供する。例えば、配列番号３１５は、Ｃ５補体タンパク質をコードし、Ｃ５の残基６７８〜７５１によりコードされ、Ｃ５コンバターゼによるＣ５の切断の後のＣ５ａ断片の生成の際に補体活性を呈する補体タンパク質のＣ５ａ断片もまたコードする。補体の天然成分は、Ｃ１、Ｃ２等．．．のような、Ｃとその後に続く番号により命名されている。補体成分の番号付けは、補体カスケード内の一連の反応の順番ではなく補体成分の発見の順番に基づく。その結果、補体カスケードの反応の順序は、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９となる。活性化の後では、切断反応の産物は、小文字を追加することにより命名され、大きい方の断片は「ｂ」、小さい方の断片は「ａ」と一般に命名されている（つまり、Ｃ４は切断して、Ｃ４ｂおよびＣ４ａを生成する）。いくつかの事例では、より一般に、Ｃ２ｂは、大きい方の切断産物と考えられているが、Ｃ２ａが、大きい方の切断産物として命名されている。結果的に、Ｃ３コンバターゼＣ３ｂ２ｂは、Ｃ３ｂ２ａと称されることがある。不活性補体切断産物は「ｉ」（つまりｉＣ３ｂ）と命名されている。補体の代替経路に特異的なタンパク質チモーゲン成分は、Ｃで命名されていないが、切断の際にＢｂまたはＢａになるＢ因子等の異なる大文字により、どちらかといえば命名されている。レクチン経路の２つの開始プロテアーゼチモーゲンは、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２と命名されている。
【０２０１】
【表３−１】
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【０２０２】
【表３−２】
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【０２０３】
２．補体開始の経路
補体の経路は、開始のための異なる分子およびメカニズムに経路が頼るという点で別となるが、経路は、経路が集まって同じセットのエフェクター分子を生成するという点で類似する。Ｃ経路が集まるポイントは、Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３活性化酵素）によるＣ３の切断である。コンバターゼは、不活性補体タンパク質を活性補体タンパク質に変換する補体酵素に使用される一般名である。例えば、Ｃ３コンバターゼは、不活性Ｃ３を活性Ｃ３ａおよびＣ３ｂに変換する。異なる酵素複合体がＣ３コンバターゼ活性を有する。例えば、古典経路では、Ｃ４ｂ２ｂが、Ｃ３コンバターゼとして作用するのに対して、代替経路では、Ｃ３ｂＢｂがＣ３コンバターゼとなる（表４を参照されたい）。Ｃ３の切断により、オプソニンとしておよび続く補体反応のための、補体系の主なエフェクター分子として作用するＣ３ｂならびに炎症のペプチド媒介物であるＣ３ａが生成される。各Ｃ３コンバターゼへのＣ３ｂの追加により、Ｃ５コンバターゼが形成され、Ｃ５ａおよびＣ５ｂが生成される。Ｃ５ａは、Ｃ３ａと同様に、炎症のペプチド媒介物となる。Ｃ５ｂは、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の生成に終わる一連の反応を開始する補体活性化の「後期」事象を媒介する。３つの経路は、異なるＣ３コンバターゼおよびＣ５コンバターゼを産生するが、すべての経路は、Ｃ３およびＣ５の分離産物を産生し、ＭＡＣを形成する。
【０２０４】
【表４】
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【０２０５】
ａ．古典経路
Ｃ１ｑは、補体の古典経路の第１の成分である。Ｃ１ｑは、全体的に共有される構造の相同性により、タンパク質のコレクチンファミリーに関連するカルシウム依存性結合タンパク質である［Ｍａｌｈｏｔｒａ  Ｒら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、９７（２）：４−９；ＨｏｌｍｓｋｏｖらＩｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１９９４、１５（２）：６７−７４］。マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）もまた、レクチン経路の第１の成分であり、コレクチンファミリーのメンバーである。コレクチンと名付けられるのは、コレクチンがコラーゲン様のレクチンドメインを含有するからである。コレクチン構造のアミノ末端コラーゲン様領域は、細胞表面受容体と相互作用し、タンパク質に対して構造の安定性を付与する。コレクチン構造のカルボキシ末端領域はカルシウム依存性のレクチン活性を有する。レクチンドメインは、病原体の表面上の炭水化物部分の認識により種々様々の病原体とのコレクチンの相互作用を媒介する。コレクチンは、パターン認識分子と呼ばれることが多く、オプソニンとして一般に機能し、免疫細胞による食作用のために病原体を標的にする。ＭＢＬ等の従来のコレクチンとは対照的に、Ｃ１ｑのカルボキシ末端球状認識ドメインはレクチン活性を有していないが、その球状ドメインの静電気表面電位における著しい差異により「荷電」パターン認識分子として働くことができる［Ｇａｂｏｒｉａｕｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３、２７８（４７）：４６９７４−４６９８２］。
【０２０６】
Ｃ１ｑは、２つの異なる方法で補体の古典経路を開始する。まず、古典経路は、免疫複合体（つまり抗原−抗体複合体または凝集したＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体）とのＣ１ｑの相互作用により活性化され、それにより、抗体媒介性体液性免疫応答を補体活性化と連結させる。ＩｇＭまたはＩｇＧのＦａｂ部分（可変領域）が抗原に結合すると、Ｆｃ（定常）領域のコンホメーションが変更され、Ｃ１ｑが結合するのを可能にする。Ｃ１ｑは、活性化されるために少なくとも２つのＦｃ領域に結合しなければならず、したがって、Ｃ１ｑは、Ｃ１ｑを活性化するために２つのＩｇＧ分子を要する。血清ＩｇＭは、５つのＦｃ領域を有する５つのＩｇＭ分子の五量体であり、したがって、ＩｇＭは最も効率的に補体を活性化する。ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤはＣ１ｑに結合せず、補体を活性化することができない。しかしながら、Ｃ１ｑはまた、抗体の非存在下においても補体を活性化することができ、それによって、感染に対する先天性または即時の免疫応答において機能する。抗体に加えて、補体活性化はまた、ポリアニオン（細菌リポ多糖、ＤＮＡ、およびＲＮＡ）、ある種の低多糖類、ウイルス膜、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、ならびに細菌、菌類、およびウイルスの膜成分等の非免疫分子とのＣ１ｑの相互作用により達成される。
【０２０７】
Ｃ１ｑは、チモーゲンＣ１ｒおよびＣ１ｓのそれぞれ２つの分子に結合した単一のＣ１ｑ分子を含有するＣ１複合体の一部である。標的表面（凝集した抗体または病原体等）への１つを超えるＣ１ｑ球状ドメインの結合により、（Ｃ１ｒ：Ｃ１ｓ）２複合体におけるコンホメーション変化が引き起こされ、Ｃ１ｒプロテアーゼの活性化をもたらし、Ｃ１ｓを切断し、活性セリンプロテアーゼが生成される。活性Ｃ１ｓは、続く補体成分Ｃ４およびＣ２を切断して、古典経路のＣ３コンバターゼを共に形成するＣ４ｂおよびＣ２ｂを生成する。Ｃ３コンバターゼは、病原体表面に共有結合的に付着し、オプソニンとして作用するＣ３ｂおよび炎症を刺激するＣ３ａにＣ３を切断する。いくつかのＣ３ｂ分子は、Ｃ４ｂ２ｂ複合体と会合して、古典カスケードＣ５コンバターゼであるＣ４ｂ２ｂ３ｂが得られる。表５は、補体の古典経路に関与するタンパク質を概説する。
【０２０８】
【表５】
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【０２０９】
ｂ．代替経路
代替経路は、抗体の非存在下での外来性病原体により開始される。その代わりとして、代替経路による補体の開始は、Ｃ３ｂへのＣ３の自発的な加水分解を通して生じる。少量のＣ３ｂは、血清および組織のプロテアーゼ活性により、体液中に常に存在する。宿主自己細胞は、結合するとＣ３ｂを不活性化する高度なレベルの膜シアル酸を普通含有するが、細菌は、外面のシアル酸の含有が低く、それによってＣ３ｂを不活性化することなくＣ３ｂに結合する。病原体表面上のＣ３ｂは、プロテアーゼチモーゲンＢ因子により認識される。Ｂ因子はＤ因子により切断される。Ｄ因子は、チモーゲンとしてではなく活性酵素として循環する、Ｃ系の唯一の活性化プロテアーゼであるが、Ｂ因子はＤ因子に対する唯一の基質であるので、正常血清中の低レベルの活性プロテアーゼの存在が、宿主にとって一般に安全である。Ｄ因子によるＢ因子の切断により、Ｃ３ｂと会合して、代替経路のＣ３コンバターゼであるＣ３ｂＢｂを形成することができる活性産物Ｂｂが得られる。古典経路に類似して、Ｃ３コンバターゼは、そのうえ、Ｃ３からＣ３ｂおよびＣ３ａを産生する。Ｃ３ｂは、病原体表面に共有結合的に付着し、オプソニンとして作用し、一方、Ｃ３ａは炎症を刺激する。いくつかのＣ３ｂは、複合体に加わり、代替経路Ｃ５コンバターゼであるＣ３ｂＢｂ３ｂを形成する。微生物表面に結合し、コンバターゼを安定化する血漿タンパク質プロペルジンまたはＰ因子によりＣ３ｂＢｂ３ｂは安定化される。表６は、補体の代替経路に関与するタンパク質を概説する。
【０２１０】
【表６】
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【０２１１】
ｃ．レクチン
レクチン経路（ＭＢＬ経路とも称される）は、レクチンタンパク質による病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ；つまり炭水化物部分）の認識および結合の後で開始される。補体のレクチン経路を活性化するレクチンタンパク質の例は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリン（つまりＬ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、およびＨ−フィコリン）を含む。上述のように、ＭＢＬは、タンパク質のコレクチンファミリーのメンバーであり、そのために、それぞれがシステインリッチドメイン、コラーゲン様ドメイン、ネックドメイン、および炭水化物認識ドメインまたはレクチンドメインを含有する、同一のポリペプチド鎖から構成されるサブユニットのオリゴマーとして存在する。ＭＢＬは、パターン認識分子として作用し、病原体の表面上の炭水化物部分、特に、マンノースまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）等の中性糖を、その球状レクチンドメインを介して、カルシウム依存性の様式で認識する。補体系における役割に加えて、ＭＢＬはまた、オプソニンとしても作用し、食細胞による、細菌病原体、ウイルス病原体、および菌類病原体の食作用を容易にする。さらに、レクチン経路の他の開始因子は、Ｌ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、およびＨ−フィコリンを含むフィコリンを含む［例えばＬｉｕら（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７５：３１５０−６を参照されたい］。ＭＢＬに類似して、フィコリンは、例えばＮ−アセチルグルコサミン構造およびマンノース構造等の炭水化物部分を認識する。
【０２１２】
ＭＢＬまたはフィコリンによる代替経路の活性化は、Ｃ１ｑによる古典経路の活性化と相似し、単一のレクチン分子が２つのプロテアーゼチモーゲンと相互作用する。レクチンタンパク質の場合には、チモーゲンは、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼであるＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２であり、古典経路のＣ１ｒおよびＣ１ｓチモーゲンに非常に相同性がある。例えば病原体表面に結合することによる等の、レクチンタンパク質によるＰＡＭＰの認識の際に、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２は、Ｃ４およびＣ２を切断するよう活性化され、ＭＢＬカスケードＣ３コンバターゼを形成する。次いで、Ｃ３ｂは、複合体に加わり、ＭＢＬカスケードＣ５コンバターゼを形成する。ＭＡＳＰ活性化は、微生物に対する応答だけではなく、器官移植において観察される組織傷害等の組織傷害を含むが、これに限定されない、中性糖を暴露することを伴う任意の応答にも関係する。代替カスケードと同様に、ＭＢＬカスケードは、抗体に非依存的に活性化される；古典カスケードと同様に、ＭＢＬカスケードは、Ｃ４およびＣ２を利用して、Ｃ３コンバターゼを形成する。表７は、補体のレクチン経路に関与するタンパク質を概説する。
【０２１３】
【表７】
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【０２１４】
３．補体媒介性エフェクター機能
どの開始経路が使用されるかにかかわらず、最終結果として補体タンパク質の活性化断片が形成される（例えばＣ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａのアナフィラトキシンならびにＣ５ｂ−９膜侵襲複合体）。これらの断片は、白血球走化性、マクロファージの活性化、血管透過性、および細胞溶解を含む数個の機能を媒介する［Ｐａｕｌ，Ｗ．（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９中のＦｒａｎｋ，Ｍ．およびＦｒｉｅｓ，Ｌ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ］。補体産物のいくつかのエフェクター機能の概説を表８に列挙する。
【０２１５】
【表８】
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【０２１６】
ａ．補体媒介性溶解：膜侵襲複合体
すべての３つの経路による補体カスケードの最終工程は、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成である（図１）。Ｃ５は、任意のＣ５コンバターゼによりＣ５ａおよびＣ５ｂに切断され得る。Ｃ５ｂは、Ｃ６およびＣ７と溶液中で組み合わさり、Ｃ５ｂ６７複合体は、Ｃ７上の疎水性部位を介して病原体脂質膜と会合する。疎水性部位を同様に有するＣ８およびＣ９の数個の分子が、加わり、Ｃ５ｂ６７８９またはＣ５ｂ−９とも呼ばれる膜侵襲複合体を形成する。Ｃ５ｂ−９は、水および溶質が通過することができる孔を膜中に形成し、浸透圧溶解および細胞死をもたらす。Ｃ５ｂ６７が付着することができる脂質膜なしで補体が抗原上で活性化される場合、Ｃ５ｂ６７複合体は、近傍の細胞に結合し、バイスタンダー溶解を開始することができる。単一のＭＡＣは、赤血球を溶解し得るが、複数のＭＡＣが存在しない限り、有核細胞が、ＭＡＣをエンドサイトーシスし、損害を修復することができる。それらの外膜が露出したグラム陰性細菌およびエンベロープウイルスは、補体媒介性溶解に対して一般に感受性である。それほど感受性でないのは、形質膜がそれらの厚いペプチドグリカン層により保護されているグラム陽性細菌、それらの細胞壁のまわりに莢膜または粘液層を有する細菌、または脂質エンベロープを有していないウイルスである。同様に、ＭＡＣは、連鎖球菌補体阻害剤（ＳＩＣ）およびクラステリン等の、膜挿入より前に複合体に結合するタンパク質により破壊され得る。典型的に、ＭＡＣは、グラム陰性菌および外来性抗原を示すヒト細胞（ウイルス感染細胞、腫瘍細胞等）を、それらの溶解を引き起こすことにより破壊するのに役立ち、エンベロープウイルスのエンベロープに損害を与えることもできる。
【０２１７】
ｂ．炎症
炎症は、血管が拡大して、より透過性になり、それにより、体防御細胞および防御化学物質が血液を出て、組織に入ることを可能にするプロセスである。補体活性化は、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａ等の数個の炎症誘発性媒介物の形成をもたらす。血清または血漿中の無傷のアナフィラトキシンは、カルボキシペプチダーゼＮにより、より安定した、それほど活性でないＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ４ａ−ｄｅｓＡｒｇ、またはＣ５ａ−ｄｅｓＡｒｇ形態に素早く変換される。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａならびにより程度が少ないがそれらのｄｅｓＡｒｇ誘導体は、それらの炎症活性のために、アナフィラトキシンと呼ばれる強力な生物活性ポリペプチドとなる。アナフィラトキシンは、それぞれ異なる細胞型上の受容体に結合し、平滑筋収縮を刺激し、血管透過性を増加させ、肥満細胞を活性化して、炎症媒介物を遊離する。３つのアナフィラトキシンの中で、Ｃ５ａは最も強力である。Ｃ５ａは、白血球、特に好中球上で主に作用する。Ｃ５ａは、白血球が、血管外遊出と呼ばれるプロセスである血管から組織中への通り抜けをできるよう、接着分子の発現の増加を刺激することにより感染の部位での血管壁に対する白血球粘着を刺激する。Ｃ５ａはまた、細胞外死滅のための活性酸素種、タンパク質分解酵素、およびロイコトリエンを産生するよう好中球を刺激する。Ｃ５ａはまた、ケモカイン、サイトカイン、および他の炎症誘発性媒介物の産生を誘起することにより、炎症プロセスを間接的にさらに増幅させることもできる。Ｃ５ａはまた、血管がより透過性になるように、ヒスタミン等の血管拡張剤を遊離するよう肥満細胞と相互作用もする。Ｃ３ａはまた、白血球と相互作用し、好酸球に対して主な効果があり、これは、アレルギー性炎症におけるＣ３ａの役割を示唆する。Ｃ３ａは、平滑筋収縮を誘起し、血管透過性を増強させ、好塩基球の脱顆粒ならびにヒスタミンおよび他の血管作動性物質の遊離を引き起こす。Ｃ２ａは、血管が拡大するのを引き起こすことにより、血圧を調節するＣ２キニンに変換され得る。
【０２１８】
実用上、アナフィラトキシンと考えられていないが、ｉＣ３ｂは、Ｃ３ｂの不活性誘導体であり、血管内皮に対する白血球接着を誘起するために機能し、その細胞表面インテグリン受容体に結合することを介して炎症促進性サイトカインＩＬ−１の産生を誘起する。Ｃ５ｂ−９もまた、Ｅ−セレクチン等の細胞接着分子の発現を誘起し、インターロイキン−８の分泌を誘起することにより、白血球の接着、活性化、および走化性を間接的に刺激する［Ｂｈｏｌｅら（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３１（１）：９７−１０４］。Ｃ５ｂ−９はまた、例えばプロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４、およびトロンボキサン等の、炎症の一因となる二次的媒介物の遊離を刺激する。
【０２１９】
それらのそれぞれのアナフィラトキシン産物を得るためのヒト補体成分Ｃ３およびＣ５の変換は、次のものを含むある種の自然発生の病的状況に関係してきた：全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性腫瘍、心筋梗塞、プルチャーの網膜症、セプシス、および成人呼吸窮迫症候群等の自己免疫障害。さらに、Ｃ３ａおよびＣ５ａの循環レベルの増加は、心肺バイパス手術、腎透析、およびナイロン繊維白血球搬出等の医原性の補体活性化に関連するある種の状態において検出されてきた。Ｃ４ａアナフィラトキシンのレベルの上昇は上述の自己免疫障害に関連する。
【０２２０】
ｃ．走化性
走化性は、細胞が、それらの環境における化学物質に応じて移動するよう指示されるプロセスである。免疫応答において、様々なケモカインは、感染の部位への食細胞等の細胞の移動を指示する。例えば、Ｃ５ａは、好中球を循環させるための主な走化性因子であるだけではなく、単球の走化性を誘起することができる。貪食細胞は、Ｃ５ａの濃度が増加する方に向かって移動し、引き続いて、それらのＣＲ１受容体を介して、抗原に付着したＣ３ｂ分子に付着するであろう。好塩基球、好酸球、好中球、および単核貪食細胞で観察されたＣ５ａの走化性効果は、１０−１０Ｍもの低い濃度で活性となる。
【０２２１】
ｄ．オプソニン化
補体の重要な作用は、食細胞による病原体の取り込みおよび破壊を容易にすることである。これは、標的細菌に結合した補体成分が、好中球またはマクロファージ等の食細胞の表面上の補体受容体と相互作用する、オプソニン化と呼ばれるプロセスにより生じる。この事例では、補体エフェクター分子はオプソニンと呼ばれる。病原体のオプソニン化はＣ３ｂおよびＣ４ｂの主要な機能である。ｉＣ３ｂもまたオプソニンとして機能する。Ｃ３ａおよびＣ５ａは、貪食細胞上のＣ３ｂ受容体の発現を増加させ、それらの代謝活性を増加させる。
【０２２２】
Ｃ３ｂおよびより少ない程度であるがＣ４ｂは、体から有害な免疫複合体を除去するのに役立つ。Ｃ３ｂおよびＣ４ｂは、赤血球上のＣＲ１受容体に免疫複合体を付着させる。次いで、赤血球は、破壊のために、脾臓および肝臓内の固定マクロファージに複合体を送達する。免疫複合体は、有害なＩＩＩ型過敏症につながり得る。
【０２２３】
ｅ．体液性免疫応答の活性化
Ｂ細胞の活性化は、抗原によるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のライゲーションを必要とする。しかしながら、補体は、抗原に対するＢ細胞応答についての閾値を１／１０００まで下げることに役割を果たすことが示された。これは、Ｃ３の崩壊断片から生成された補体産物であるＣ３ｄまたはＣ３ｄｇの、ＢＣＲと相互にライゲーションすることができるＢリンパ球上のＣＲ２受容体への結合により生じる。相互ライゲーションは、例えば免疫複合体等の、Ｃ３ｄでオプソニン化された抗原粒子がＣ３ｄを介してＣＲ２受容体に結合し、抗原を通してＢＣＲに結合する場合に生じる。抗原複合体の相互ライゲーションはまた、Ｃ３ｄが抗原に結合して、樹状細胞等の抗原提示細胞によるそれらの取り込みを増強させ、次いで、抗原提示細胞がＢ細胞に抗原を提示して、抗体応答を増強させ得る場合にも生じ得る。ＣＲ２が欠損したマウスは、自然抗体のレベルの低下および障害性体液性免疫応答をもたらすＢ細胞機能において欠陥を示す。
【０２２４】
４．補体受容体
走化性およびオプソニン化等のエフェクター機能の開始のための細胞による補体エフェクター分子の認識は、多様なグループの補体受容体により媒介される。補体受容体は、赤血球、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、および肥満細胞を含む幅広い範囲の細胞型上に分布する。受容体への補体成分の結合の際に、受容体は、細菌の食作用の刺激および細胞からの炎症分子の分泌等の細胞応答をもたらす細胞内シグナリングカスケードを開始する。例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、およびそれらの産物を認識する補体受容体ＣＲ１およびＣＲ２は、走化性の刺激にとって重要である。ＣＲ３（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）およびＣＲ４（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）は、食細胞応答において同じく重要なだけではなく、ｉＣ３ｂに応じて白血球の接着および移動に役割を果たすインテグリンである。Ｃ５ａおよびＣ３ａの受容体は、Ｃ５ａおよびＣ３ａのアナフィラトキシンの多くの炎症促進性媒介性の機能において役割を果たすＧタンパク質共役受容体である。例えば、Ｃ３ａに対する受容体、Ｃ３ａＲは、肥満細胞、好酸球、好中球、好塩基球、および単球上に存在し、Ｃ３ａの炎症促進性効果に直接関与する。
【０２２５】
５．補体調節
補体系は、外来性病原体に対して保護することで、宿主にとって有益となるが、炎症媒介物の産生は、有毒で、損害を与え、以下に論じられる種々様々な炎症性疾患状態につながり得る。同様に、補体系のほとんどの活性プロテアーゼは、切断の際に局所的に活性化されるようになるにすぎないチモーゲンであるが、補体のほぼすべての成分は、血清において低い率で自発的に活性化され、したがって、それらの活性は、最小限にする必要がある。結果的に、補体系の調節タンパク質が同定された。それらの主要な機能は、過剰な補体活性化および宿主組織の自己溶解破壊の予防のために、補体活性化分子の活性を調節することである。これらの補体調節因子は、可溶性血漿タンパク質または様々な細胞型上に発現した必須の膜タンパク質のいずれかである。前者は、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）およびＨ因子を含む。後者は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体（補体受容体１、ＣＲ１、ＣＤ３５）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、および崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）を含む。これらのタンパク質は多くの構造の類似性を持つ。それぞれは、保存されたシステイン残基、グリシン残基、およびプロリン残基を有する約６０アミノ酸長の複数の短いコンセンサス反復配列（ＳＣＲ）から構成される。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、染色体１に局在し、まとめて、補体活性化（ＲＣＡ）遺伝子クラスターの調節因子として知られている［Ｈｏｕｒｃａｄｅら（１９８９）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８１］。
【０２２６】
Ｃ１阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）は、複合体が活性している時間に限り、活性化されたＣ１ｒおよびＣ１ｓをＣ１ｑから解離させるセリンプロテイナーゼ阻害剤またはセルピンである。Ｃ１ＩＮＨはまた、血漿プロテアーゼによるＣ１の自発的な活性化をもブロックする。Ｃ１ＩＮＨにおける欠損は、血管神経性浮腫と呼ばれる重篤な突然の浮腫（腫脹）に関連する。数個の阻害のタンパク質は、Ｃ３コンバターゼおよびＣ５コンバターゼを解離させ、血漿プロテアーゼである第Ｉ因子によるＣ４ｂおよびＣ３ｂの分解を促進する。第Ｉ因子は、活性形態で循環するが、第Ｉ因子は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂが補因子タンパク質に結合した場合にＣ３ｂおよびＣ４ｂを切断することができるのみである。第Ｉ因子はＣ３ｂを切断し、これはｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｆ、およびＣ３ｄｇの産生につながり、それによって、例えばｉＣ３ｂはオプソニンとして作用するので、分解産物はエフェクター分子として作用することができるが、Ｃ３ｂは持続的に不活性化される。Ｃ４ｂは、Ｃ４ｃおよびＣ４ｄへの切断の際に不活性化される。第Ｉ因子のための補因子として働く阻害タンパク質は、古典Ｃ３コンバターゼを解離させる血漿タンパク質Ｃ４結合タンパク質および代替Ｃ３コンバターゼを解離させるＨ因子ならびに両経路の活性を阻害する膜タンパク質補体受容体１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、および膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）を含む。第Ｉ因子のための補因子は、第Ｉ因子の活性を調節する。例えば、ヒト細胞は、Ｃ３ｂに結合し、第Ｉ因子がＣ３ｂを不活性化することを可能にするＨ因子を産生する。他方で、細菌細胞上の、ＬＰＳ等の物質は、そうではなく、第Ｉ因子補因子を発現せず、Ｃ３ｂへのＢ因子の結合を容易にし、これは、第Ｉ因子による不活性化からＣ３ｂを保護する。
【０２２７】
他の膜タンパク質および血漿タンパク質は、膜中へのＭＡＣの不適切な挿入を予防するために宿主細胞上でのＭＡＣの形成をブロックする。可溶性タンパク質Ｃ８β等の数個の血漿タンパク質は、Ｃ５ｂ６７複合体に結合し、細胞膜中への複合体の挿入を阻害する。宿主細胞膜はまた、Ｃ５ｂ６７８へのＣ９の結合を阻害して、自己細胞または同種異系細胞上の膜侵襲複合体の形成を予防する、ＨＲＦ（ＣＤ５９、プロテクティン）と呼ばれる膜結合タンパク質を含有する。
【０２２８】
第Ｉ因子
第Ｉ因子（ｆＩ）は、補体カスケード反応の生成および増幅において役割を果たす、補体系の数個のセリンプロテアーゼ（Ｄ因子、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）−２、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｒ、Ｂ因子、およびＣ２もまた含む）の１つである。補体セリンプロテアーゼはすべて、トリプシンファミリーとドメイン相同性を共有し、基質特異性を決定する、構造の性状のいくつかを共有する。他のセリンプロテアーゼに対する相同性に基づきＨｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ触媒三連構造を形成する残基を含有するトリプシン様セリンプロテアーゼ軽鎖から第Ｉ因子のＣ末端は構成される。さらに、特異性ポケット（Ｄ５０１）ならびに拡張された基質結合部位Ｓ５２７、Ｗ５２８、およびＧ５２９を定義する残基が存在する［シグナルペプチド非存在下での成熟タンパク質の番号付けに基づく、例えば、Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：６２３９を参照されたい］。
【０２２９】
第Ｉ因子は、古典経路、代替経路、およびレクチン経路におけるＣ３コンバターゼの成分であるＣ３ｂおよびＣ４ｂの切断による補体活性化の調節に役割を果たし、それによって経路を不活性化する。ｆＩ基質、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの切断は、チオエステル結合の形成により引き起こされる基質におけるコンホメーション変化を必要とする。例えば、コンバターゼによるＣ３ｂへのＣ３のタンパク質分解性の活性化は、潜在型形態からＣ３ｂ形態へのコンホメーション変化をもたらし、これは、水等の求核剤との分子内チオールエステルの反応につながり、それによってＣ３ｂをｆＩ切断に対して感受性にする［Ｏｇａｔａら（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４７８５］。水とチオエステルの反応は、コンバターゼ切断の非存在下で生じ、ｉＣ３およびｉＣ４と呼ばれるＣ３およびＣ４の加水分解不活性形態を生じ得る。例えば、ｉＣ３種はＣ３ｂのミミックであり、ｉＣ３はｆＩ切断に敏感であり、Ｃ３コンバターゼおよびＣ５コンバターゼ中のＣ３ｂと置換することができる。一般に、第Ｉ因子によるＣ３ｂおよびＣ４ｂの基質の切断は、Ｈ因子またはＣ４結合タンパク質等の補因子タンパク質およびＭＣＰとの三元複合体の形成を必要とする。しかしながら、第Ｉ因子による合成基質の切断は、補因子の存在を必要としない［Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕら、（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：３６７−３７５］。ｆＩによる切断は、基質中のアルギニル結合の切断に限られる。Ｃ３中のｆＩ切断部位は、ＬＰＳＲ（配列番号３８８）およびＳＬＬＲ（配列番号３８９）であり、Ｃ４中の切断部位はＨＲＧＲ（配列番号３９０）である。
【０２３０】
６．補体媒介性疾患および障害
疾患および障害の病因における補体系の中心的な役割のおかげで、系は、上記疾患および障害における治療的介入のポイントとして働くことができる。本明細書中で提供されるプロテアーゼは、この系を標的にし、その調節を可能にする。
【０２３１】
当業者は、疾患プロセスにおける補体系の役割を理解し、様々な上記疾患を認識している。以下は、例示的な疾患およびそれらの病因および病状における補体系の役割の解説である。本明細書中で提供されるプロテアーゼによる補体系の調節は、上記疾患を処置するために働くことができる。疾患は、補体の活性化または阻害を伴い得る。
【０２３２】
ａ．補体活性化により媒介される疾患
補体カスケードは、諸刃の剣であり、食作用および炎症の促進により細菌およびウイルスの侵入からの保護を引き起こす。逆に、補体が正常に機能している場合でさえ、補体は、局所的炎症および組織に対する損害の促進により疾患の発症の一因となり得る。したがって、病的影響は、補体の保護的な役割を担う同じ媒介物により媒介される。例えば、アナフィラキシー性の走化性ペプチドＣ５ａは、好中球を動員し、活性化することにより炎症を駆動し、Ｃ３ａは、他の貪食細胞の病的活性化を引き起こし得る、そして膜侵襲複合体は、細胞を殺すまたは傷害を与え得る。多くの自己免疫疾患において等の一実施例では、補体は、宿主組織に対する抗体による等で不適切な状況下で活性化されるので、補体は組織損害をもたらす。他の場面では、補体は、敗血症による等で、正常に活性化され得るが、それでもなお、呼吸窮迫症候群において等の疾患進行の一因となる。病的に、補体は、補体が適切に制御されない場合、血管（脈管炎）、腎臓の基底膜ならびに付属的な内皮細胞および上皮細胞（腎炎）、関節滑膜（関節炎）、ならびに赤血球（溶血）の実質的な損害を引き起こし得る。
【０２３３】
補体は、関節リウマチ［例えば、Ｗａｎｇら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８９５５−８９５９、Ｍｏｘｌｅｙら（１９８７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ３０：１０９７−１１０４を参照されたい］、エリテマトーデス［Ｗａｎｇら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：８５６３−８５６８およびＢｕｙｏｎら（１９９２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３５：１０２８−１０３７］、ならびに急性糸球体腎炎［Ｃｏｕｓｅｒら（１９９５）Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．５：１８８８−１８９４］等の自己免疫疾患を含む多くの障害の免疫病原性における役割を有する。補体系の活性化を伴う他の病状は、セプシス［例えば、Ｓｔｏｖｅら（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：１７５−１８３、Ｈａｃｋら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８６：２０−２６を参照されたい］、呼吸窮迫症候群［例えば、Ｚｉｌｏｗら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：１５１−１５７およびＳｔｅｖｅｎｓら（１９８６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：１８１２−１８１６を参照されたい］、多臓器不全［例えば、Ｈｅｃｋｅら（１９９７）Ｓｈｏｃｋ  ７：７４およびＨｅｉｄｅｍａｎら（１９８４）Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ２４：１０３８−１０４３を参照されたい］、ならびに発作または心筋梗塞症等の心血管疾患において生じるような虚血再灌流傷害［Ａｕｓｔｅｎ  ＷＧら（２００３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍ  １６（１）：１−８］を含む。補体媒介性疾患のいくつかの例示的な例を以下に記載する。
【０２３４】
ｉ．関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は慢性炎症性疾病である。それは、あたかも正常組織成分が侵入病原体であるかのように、免疫系が正常組織成分を攻撃する自己免疫疾患である。関節リウマチに主に関連する炎症は関節の裏打ちを主に攻撃する。血管、心臓、および肺を裏打ちする膜もまた炎症を起こし得る。ＲＡは、炎症を起こした滑膜中ならびに慢性疾患のリンパ濾胞および胚中心中に存在する活性化されたＢ細胞および形質細胞により特徴づけられる。これは、高度なレベルの局所的な免疫グロブリン産生ならびに免疫複合体の沈着をもたらし、免疫複合体は、ＩｇＧリウマチ因子およびＩｇＭリウマチ因子を含むことができ、滑膜中でおよび関節軟骨に結びついて、補体カスケードの開始因子として働くことができる。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ５ｂ−９等の補体成分のレベルの上昇は、炎症を起こしたリウマチ関節内に見い出された。これらの補体成分は、例えば、血管透過性、白血球走化性、ならびに複数の細胞型の活性化および溶解における変更等の様々な炎症誘発性活性を誘起することにより、ＲＡに関連する炎症を増悪し得る。
【０２３５】
ｉｉ．セプシス
セプシスは、細菌感染等の重篤な感染により引き起こされる疾患であり、全身性炎症応答につながる。他の細菌感染、ウイルス感染、および菌類感染は、敗血症性の症状を刺激し得るが、細菌細胞壁成分であるリポ多糖がセプシスに関連することが多い。敗血症性ショックは、例えば、免疫応答の炎症促進性の事象が宿主組織に損害を与えており、体の自然免疫系が侵入微生物に対して防御することができない場合に、結果として生じることが多い。セプシスの早期段階は、血管透過性を増加させ、好中球からのスーパーオキシド産生を刺激し、ヒスタミン遊離を刺激するよう作用するＣ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａ等の補体アナフィラトキシンの産生の増加をもたらす過剰な補体活性化により特徴づけられる。Ｃ５ａの作用は、細菌感染に対する生産的な免疫応答に寄与することができるが、調節されずに放置されると、Ｃ５ａもまた激しく損害を与え得る。炎症のイー・コリ誘起モデルにおいて、Ｃ５ａの遮断は、好中球媒介性の組織傷害につながり得るＣ５ａ媒介性の好中球活性化の制限により、敗血症性の動物の予後を改善した。
【０２３６】
細菌感染に対する先天性免疫応答の継続的な障害は、慢性セプシスまたは敗血症性ショックにつながることが多く、生命を脅かし得る。セプシスの後期段階において、継続的な疾患の一因となるのは、早期において生じる活動過多とは対照的な、好中球の「休止状態の」活性である。後期段階において、走化性、呼吸バースト活性、および細菌死滅のための能力を含む好中球の主要な機能は低下する。補体、特にＣ５ａはまた、セプシスのより後期の段階においても役割を果たす。セプシスの間のＣ５ａの過剰な産生は、好中球上のそれ自体の受容体であるＣ５ａＲのＣ５ａ誘起性ダウンレギュレーションに連結するプロセスである、血中好中球の「非活性化」に関連する［Ｇｕｏら（２００３）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １３：１８８９］。好中球上のＣ５ａＲのレベルの低下は、血中好中球がＣ５ａに結合する能力の減少、走化性応答障害、スーパーオキシド産生の損失、および殺菌活性障害に相互に関連する。しかしながら、Ｃ５ａＲレベルは、セプシスのより後期の段階で「戻り」始め得る、そして有益な疾患の予後の事例と相互に関連する。
【０２３７】
ｉｉｉ．多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）およびその動物モデル実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症脱髄疾患である。ＭＳにおいて、神経組織の炎症は、脳および脊髄における神経繊維のための一種の保護的な絶縁体として作用する、脂肪質であるミエリンの損失を引き起こす。この脱髄は、神経細胞の被膜に沿って複数のエリアの瘢痕組織（硬化症）を残し、脱髄は、脳へのおよび脳からの電気インパルスを伝導する神経の能力を破壊し、ＭＳのそれぞれ異なる症状をもたらす。ＭＳは、活性化されたリンパ球、マクロファージ／ミクログリア、および補体系により媒介される。補体活性化は、次のようなその二重の役割を通してこれらの疾患の病原性の一因となり得る：活性化された終末複合体Ｃ５ｂ−９が脱髄を促進する能力およびオリゴデンドロサイト（ＯＬＧ）をアポトーシスから保護するための半溶解性のＣ５ｂ−９の性能。
【０２３８】
ｉｖ．アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳内の濃縮体（微小管に普通は結合するタンパク質タウの異常な対へリックスフィラメント）および班（ベータ−アミロイドタンパク質から主に構成される細胞外沈着物）により特徴づけられる。ＡＤの正確な原因は何かについては完全に明らかではないが、ＡＤ脳の冒された領域における慢性神経炎症は、炎症誘発性媒介物が役割を果たし得ることを示唆する。ＡＤ脳内の濃縮体および班は、例えばＣ４ｄおよびＣ３ｄ等の活性化された補体断片と共に沈着する。同様に、ＡＤ脳におけるジストロフィー性神経突起は、ＭＡＣについて免疫染色することができ、これは、ＡＤにおけるこれらの神経突起の自己触媒侵襲および随伴性の神経突起損失を示す。ＡＤにおける補体の活性化は、凝集したベータ−アミロイドタンパク質により誘起される抗体非依存的メカニズムにより生じる。さらに、補体カスケードは、ＡＤにおいてすべてアップレギュレートされるペントラキシン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびアミロイドＰ（ＡＰ）により活性化され得る［ＭｃＧｅｅｒら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８：５１９］。ＡＤにおける補体の活性化は、補体媒介物の増加により特色づけられ、例えばＣＤ５９等の補体調節タンパク質の代償性のアップレギュレーションにより適切に制御されることはない。したがって、補体活性化の炎症誘発性の事象としてＡＤ疾患進行を増悪し、おそらく、神経突起破壊の一因となっている。
【０２３９】
ｖ．虚血再灌流傷害
虚血再灌流傷害は、虚血性事象および続く血流の回復の後に被る傷害であり、低酸素性損傷に対する炎症応答に起因する。虚血再灌流損害は、例えば心臓切開手術もしくは血管形成術の後で等の心手術手技の間でのように急性または鬱血性心不全もしくは閉塞性の心血管疾患でのように慢性となり得る。虚血再灌流傷害を引き起こし得る傷害の例は、心筋梗塞症（ＭＩ）および発作を含む。炎症応答の開始は、おそらく、再灌流および免疫刺激性である酸素フリーラジカルを生成し得る代謝物の随伴性の蓄積と共に生じる、組織酸素レベルの増加により引き起こされる。それは、重症な心筋梗塞、大脳の虚血性事象、腸管虚血、ならびに血管手術、心手術、外傷、および移植の多くの側面を含む様々な事象に関連する。傷害は、非自己として新しく変更した組織に応じた、先天性免疫系の炎症事象、特に補体系の活性化により顕在化する。そのため、虚血再灌流傷害は、血管透過性の増加により引き起こされた組織浮腫および多形核白血球の流入により引き起こされた急性炎症細胞浸潤により特徴づけられる。
【０２４０】
補体系の活性化は、虚血再灌流傷害の炎症事象に役割を果たす。虚血傷害は、細胞膜の変更をもたらし、外側表面の脂質、炭水化物、またはタンパク質を、これらの露出したエピトープが変更され、新抗原（修飾自己抗原）として作用し得るように、冒す。循環するＩｇＭは、新抗原を認識し、結合して、傷害を与えられた細胞表面上で免疫複合体を形成する。すべての経路は、おそらく、傷害を増悪させる影響へのいくつかの方法に関与するが、形成された抗原−抗体複合体は、補体の古典経路の古典的活性化因子となる。虚血再灌流傷害への補体の古典経路の関与は、後肢における局所的傷害からの同等の保護を示すＣ３またはＣ４のいずれかが遺伝子的に欠損したマウスおよび傷害の動物モデルにより証明される［Ａｕｓｔｅｎら（２００３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ  Ｐｈａｒｍ  １６：１］。逆に、虚血傷害の腎臓モデルにおいて、Ｃ３、Ｃ５、およびＣ６欠損マウスは保護されたのに対して、Ｃ４欠損マウスは保護されず、これは、代替補体経路の重要性を示唆する。［Ｇｕｏら（２００５）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：８２１］。補体活性化の際に誘起された媒介物は、局所的傷害の部位の細胞膜で指示された炎症応答を開始する。
【０２４１】
虚血再灌流傷害における補体の主要なエフェクターメカニズムは、例えばＣ５ａ等の補体成分による、炎症を起こした組織への好中球の流入および活性化である。好中球の活性化は、局所的な傷害を与えられた器官における活性酸素種の産生の増加およびリソソーム酵素の遊離をもたらし、アポトーシス、壊死、および器官機能の損失を最終的にもたらす。終末ＭＡＣ、Ｃ５ｂ−９の生成もまた、虚血再灌流傷害における局所的組織傷害の一因となる。
【０２４２】
ｂ．補体欠損により媒介される疾患
疾患の発症はまた、感染の制御にとって重要な補体成分の非存在下でも生じ得る。補体欠損は、頻繁な感染症および免疫複合体病に連結する。欠損は、Ｄ因子およびプロペルジンを含むＣ９以外の補体因子のすべてにおいて同定された。欠損はまた、補体調節タンパク質Ｃ１ＩＮＨ、第Ｉ因子、Ｈ因子、ＤＡＦ、およびＨＲＦにおいても同定された。
【０２４３】
一般に、補体成分における欠損は、オプソニン化および食作用の低下による細菌感染症の増加をもたらす。典型的に、例えばＣ３ｂ等の、オプソニンとして機能する補体成分における欠損は、感染に対する感受性の増加をもたらす。例えば、補体の後期成分のいずれかが欠損した個人は比較的冒されにくいが、Ｃ３またはＣ３ｂ沈着を触媒する分子のいずれかを欠く個人は、幅広い範囲の細胞外細菌による感染に対する感受性の増加を示す。同様に、普通は伝統的なオプソニンとしておよび外来性病原体の認識の後での補体のレクチン経路の開始因子として機能するＭＢＬが欠損した人々は、特に幼児期の間に、感染に対する感受性が増加する。膜侵襲複合体の形成に関与する、Ｃ５〜Ｃ９を含む、補体の後期成分における欠損の、細菌感染に対する役割は、より限られたものである。Ｃ５〜Ｃ９における欠損は、淋病および細菌髄膜炎を引き起こす細菌であるナイセリア種による感染に対する感受性に関連することが示されたのみである。
【０２４４】
補体欠損の他の事象は免疫複合体病である。免疫複合体病は、循環および組織における持続性の抗原−抗体複合体に応じた補体媒介性炎症により引き起こされる。古典補体経路の早期成分が抗原−抗体複合体の認識に応じて補体を開始するので、例えばＣ１ｑ等のこれらの早期成分の欠損は、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患における深刻な病状を引き起こし得る。
【０２４５】
Ｈ因子、ＤＡＦ、およびＨＲＦ等の補体調節タンパク質における欠損もまた補体媒介性疾患をもたらし得る。例えば、補体活性化が制御されていないと、補体タンパク質の枯渇をもたらし、細菌、特に遍在性化膿菌による感染の増加をもたらし得る。これは、遺伝的第Ｉ因子欠損における症例であり、第Ｉ因子が存在せず、Ｃ３コンバターゼの活性化を阻害することができない。他の例は、補体調節タンパク質ＤＡＦまたはＨＲＦを含み、この補体調節タンパク質は、補体活性化からヒト自身の細胞表面を保護するよう普通は機能するが、欠損している場合、発作性夜間血色素尿症という疾患をもたらす、宿主赤血球の破壊をもたらす。Ｃ１阻害剤における欠損は、補体成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓを含むセリンプロテイナーゼ酵素ならびに第ＸＩＩａ因子およびカリクレイン等の他のセリンプロテイナーゼの非調節活性の結果である遺伝性血管神経症性浮腫という疾患を引き起こす。これらのセリンプロテイナーゼの非調節活性の結果は、Ｃ１ｓおよびＣ２ａの活性によりもたらされるＣ２キニン等の様々な血管作動性媒介物の産生であり、窒息につながり得る、組織における液蓄積および喉頭蓋腫脹をもたらす。
【０２４６】
Ｃ．プロテアーゼ
プロテアーゼおよび疾患プロセスに関与するタンパク質を切断する（それによって、不活性化する）ためにそれらのプロテアーゼを使用する方法が本明細書中で提供される。典型的に、本明細書中で提供されるプロテアーゼは、補体経路に普通は参加しない非補体プロテアーゼである。本明細書中で提供される例示的なプロテアーゼは、補体経路の任意の１つまたは複数のタンパク質または成分およびそれらの対立遺伝子変異体を切断する。補体タンパク質の切断は、活性化切断とすることができ、それによって補体経路の活性は、プロテアーゼの活性化された形態へのチモーゲンの切断または補体タンパク質のその切断エフェクター分子への切断等によって増強される。補体タンパク質の切断はまた、阻害切断とすることもでき、それによって、補体タンパク質の活性は減少する。阻害様式で補体タンパク質を切断し、それによって、補体経路のうちの任意の１つまたは複数の補体活性化が阻害されるプロテアーゼが本明細書中で提供される。本明細書中で提供されるプロテアーゼは、補体活性化を調節するために使用することができる。本明細書中で提供されるプロテアーゼは、任意の１つまたは複数の補体タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで切断することができ、それによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで補体活性化に影響を及ぼす。
【０２４７】
プロテアーゼの部分がタンパク質分解性活性を保持する限り、プロテアーゼは、完全長プロテアーゼの任意の部分とすることができる。例えば、プロテアーゼは、ポリペプチドのプロテアーゼドメインまたはその任意の触媒活性部分のみを含むことができる。プロテアーゼドメインは、その一本鎖プロテアーゼドメインを含むことができ、結果としての融合タンパク質または抱合体がタンパク質分解性活性を保持する限り、融合タンパク質または抱合体とすることができる。
【０２４８】
プロテアーゼまたはその部分が、例えば補体タンパク質等の１つまたは複数の標的タンパク質内の基質配列を認識する場合、（ｉ）プロテアーゼまたはその部分はその機能を変更する、すなわち、ペプチド結合加水分解の触媒の際の標的タンパク質（複数可）の不活性化により変更するおよび（ｉｉ）操作されたプロテアーゼがタンパク質分解媒介性不活性化事象を介した治療的効果を有する以外に、標的タンパク質（複数可）は特定の１つまたは複数の疾患のための分子介入のポイントとなる。変更することができる補体活性は、赤血球の溶血ならびに／または限定されるものではないがＣ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ−９、およびＢｂ等のエフェクター補体切断産物の生成を含むが、これらに限定されない。補体の生物学的活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで変更することができる。一般に、補体活性は、プロテアーゼの非存在下と比較して、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍、プロテアーゼにより変更される。典型的に、生物学的活性は、プロテアーゼ非存在下での活性と比較して、１０、２０、５０、１００、もしくは１０００倍またはそれ以上変更される。補体活性に関しての本明細書中の目的のために、プロテアーゼは、補体活性化または補体媒介性活性を調節する。
【０２４９】
本明細書中で提供されるプロテアーゼは、プロテアーゼの任意の１つまたは複数のセリンクラス、システインクラス、アスパラギン酸クラス、メタロクラス、またはトレオニンクラスからのものとすることができる。プロテアーゼは、プロテアーゼが、任意の１つもしくは複数の補体タンパク質を切断するかどうかならびに／または標的基質への特異性を調節するおよび／もしくは標的基質の活性を調節する任意の１つもしくは複数のアミノ酸残基における修飾をなすために、プロテアーゼがスカフォールドとして使用することができるかどうかを決定するために試験することができる。プロテアーゼの例示的なクラスおよび基質特異性に寄与するアミノ酸決定基を以下に記載する。
【０２５０】
１．プロテアーゼのクラス
プロテアーゼ（プロテイナーゼまたはペプチダーゼとも称される）は、標的タンパク質内のアミノ酸の配列またはポリペプチド基質を認識するタンパク質分解酵素である。アミノ酸の基質配列の認識の際に、プロテアーゼは、標的タンパク質内の加水分解またはペプチド結合の切断を触媒する。標的タンパク質の上記加水分解は、標的配列の完全長配列の構成内のペプチド結合の場所に依存して、標的を不活性化することができる。
【０２５１】
プロテアーゼは、プロテアーゼがタンパク質を攻撃する方法に基づいて、エキソプロテアーゼまたはエンドプロテアーゼのいずれかに分類される。プロテイナーゼまたはエンドペプチダーゼは、タンパク質の内部を攻撃し、大きなペプチドを産生する。ペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼは、タンパク質の端または断片を攻撃し、小さなペプチドおよびアミノ酸を産生する。ペプチダーゼは、それらの作用パターンについて分類される：アミノペプチダーゼは、アミノ端からアミノ酸を切断する：カルボキシペプチダーゼは、カルボキシル端からアミノ酸を切断し、ジペプチジルペプチダーゼは２つのアミノ酸を切断する；ジペプチダーゼはジペプチドを分離し、トリペプチダーゼはトリペプチドからアミノ酸を切断する。ほとんどのプロテアーゼは小さく、２１，０００から４５，０００ダルトンである。多くのプロテアーゼは、チモーゲンと呼ばれる不活性形態として合成され、分泌され、引き続いて、タンパク質分解により活性化される。これは、酵素の活性部位の構成を変化させる。
【０２５２】
数個の別の種類の触媒メカニズムがプロテアーゼにより使用される［Ｂａｒｒｅｔら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１８−６１、Ｂａｒｒｅｔら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２４４：４６１−４８６、Ｂａｒｒｅｔら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：１０５−１２０、Ｂａｒｒｅｔら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：１８３−２２８］。それらの触媒メカニズムに基づいて、カルボキシペプチダーゼは、セリン型、金属型、およびシステイン型のカルボキシペプチダーゼに細分され、エンドペプチダーゼは、セリン、システイン、アスパラギン酸、トレオニン、および金属エンドペプチダーゼに細分される。セリンペプチダーゼは、活性中心に関与するセリン残基を有し、アスパラギン酸ペプチダーゼは、触媒中心に２つのアスパラギン酸を有し、システイン型ペプチダーゼはシステイン残基を有し、トレオニン型ペプチダーゼはトレオニン残基を有し、メタロペプチダーゼは触媒メカニズムにおいて金属イオンを使用する。一般に、プロテアーゼは、プロテアーゼのクラスが、セリン、システイン、アスパラギン酸、トレオニン、またはメタロプロテアーゼを含むことができるように、それらの触媒活性に基づいてクラスに分けることができる。プロテアーゼの触媒活性は、標的基質を切断するために必要とされる。したがって、プロテアーゼの触媒活性を変更するためのプロテアーゼの修飾は、プロテアーゼが基質を切断する能力に影響を及ぼし得る（つまり特異性／選択性を増強させる）。
【０２５３】
各プロテアーゼは、活性部位ポケットに並び、基質と直接接触する一連のアミノ酸を有する。ペプチダーゼの結晶構造は、活性部位が、隣接した構造のドメイン間の分子の表面上の溝に共通して位置することを示し、基質特異性は、切断結合の加水分解を担う片側または両側の触媒部位上の溝に沿って配置された結合部位の特性により規定される。したがって、ペプチダーゼの特異性は、各サブサイトが単一のアミノ酸残基の側鎖を適応させる能力により記載される。部位は、触媒部位から、Ｓ１、Ｓ２．．．Ｓｎと、基質のＮ末端に向かっておよびＳ１’、Ｓ２’．．．Ｓｎ’と、Ｃ末端に向かって番号付けられる。それらが適応する残基は、Ｐ１、Ｐ２．．．ＰｎおよびＰ１’、Ｐ２’．．．Ｐｎ’とそれぞれ番号付けられる。標的タンパク質の切断は、Ｐ１およびＰ１’の間で触媒され、ポリペプチド基質のＮ末端からＣ末端までのアミノ酸残基が（Ｐｉ、．．．、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、．．．、Ｐｊ）と標識され、プロテアーゼ上のそれらの対応する結合認識ポケットは、（Ｓｉ、．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、．．．、Ｓｊ）と標識される［ＳｃｈｅｃｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ（１９６７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７：１５７−１６２］。したがって、Ｐ２はＳ２と、Ｐ１はＳ１と、Ｐ１’はＳ１’等のように相互作用する。結果的に、プロテアーゼの基質特異性は、活性部位におけるＳ１〜Ｓ４位置から生じ、プロテアーゼは、ペプチド基質配列のＰ１〜Ｐ４の残基に接する。いくつかの場合では、各ポケットは、他のポケットと非依存的に、ペプチド基質配列上の対応する残基を認識し、結合すると思われるので、活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケットの間の相互作用はほとんどない（たとえあるとしても）。したがって、特異性決定基は、他のポケットの特異性に影響を及ぼすことなく、１つのポケットにおいて変化させることができる。
【０２５４】
ファミリーメンバーの多数の構造およびモデリングに基づいて、拡張された基質特異性および基質との他の二次的相互作用に寄与する表面残基が、セリン、システイン、アスパラギン酸、メタロ、およびトレオニンのファミリーのプロテアーゼを含む多くのプロテアーゼについて明示された［例えばＷａｎｇら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（３４）：１００３８−４６、Ｈｏｐｆｎｅｒら、（１９９９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．７（８）：９８９−９６、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（３）：２１６０−８、Ｗａｕｇｈら、（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．７（９）：７６２−５、Ｃａｍｅｒｏｎら、（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１１７１１、Ｃａｍｅｒｏｎら、（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１１１７０を参照されたい］。プロテアーゼは、プロテアーゼが、任意の１つもしくは複数の補体タンパク質を切断するかどうかならびに／または補体タンパク質標的基質への特異性を調節するおよび／もしくは補体タンパク質標的基質の活性を調節する任意の１つもしくは複数のアミノ酸残基における修飾をなすために、プロテアーゼがスカフォールドとして使用することができるかどうかを決定するために試験することができる。変更された基質認識プロファイルを有する修飾プロテアーゼを作製するために、基質選択性（特異性決定基）に寄与する、三次元構造中のアミノ酸は、突然変異誘発のための標的にすることができる。例示的なプロテアーゼは、以下に記載され、本明細書中で提供されるセリン、システイン、アスパラギン酸、メタロ、またはトレオニンプロテアーゼ等の任意のプロテアーゼを含むが、これらに限定されない。
【０２５５】
ａ．セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ（ＳＰ）は、分泌酵素および細胞質内貯蔵細胞小器官に隔絶された酵素を含み、血液凝結、創傷治癒、消化、免疫応答、ならびに腫瘍の侵入および転移における役割を含む様々な生理学的役割を有する。例えば、キモトリプシン、トリプシン、およびエラスターゼは消化管において機能する；第１０因子、第１１因子、トロンビン、およびプラスミンは凝固および創傷治癒に関与する；Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、およびＣ３コンバターゼは、上記に論じられる補体活性化に役割を果たす。
【０２５６】
ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼと命名された細胞表面タンパク質のクラスは、細胞外ドメインを有する膜アンカータンパク質であるプロテアーゼである。細胞表面タンパク質として、それらは、細胞内シグナル伝達においておよび細胞表面タンパク質分解性の事象の媒介において役割を果たす。他のセリンプロテアーゼは、膜結合し、類似する様式で機能する。他のものは分泌される。多くのセリンプロテアーゼは、細胞表面受容体に結合する際にそれらの活性を発揮し、したがって、細胞表面で作用する。細胞表面タンパク質分解は、様々な細胞性機能を媒介する生物学的活性タンパク質の生成のためのメカニズムである。
【０２５７】
分泌セリンプロテアーゼおよび膜貫通セリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼは、新生物の発症および進行を含むプロセスに関与する。これらのプロテアーゼの正確な役割が完全に詳述されていない一方で、セリンプロテアーゼおよびその阻害剤は、癌細胞侵入および転移性の伝播における分解性作用ならびに腫瘍進行に関与する腫瘍の新血管新生を含む、多くの細胞内ならびに細胞外の生理学的プロセスの制御に関与する。プロテアーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解およびリモデリングに関与し、組織リモデリングの一因となり、癌の侵入および転移に必要である。いくつかのプロテアーゼの活性および／または発現は、腫瘍の進行および発症と相互に関連することが示された。
【０２５８】
セリンプロテアーゼファミリーにおけるプロテアーゼの活性は、それらの活性部位を形成するアミノ酸残基のセットに依存的である。残基の１つは、常にセリンである；したがってそれらの名称はセリンプロテアーゼという。例えば、キモトリプシン、トリプシン、およびエラスターゼは類似する構造を共有し、それらの活性セリン残基は、３つすべてにおいて同じ位置（Ｓｅｒ−１９５）にある。類似性にもかかわらず、それらは異なる基質特異性を有する；それらはタンパク質消化の間に異なるペプチド結合を切断する。例えば、キモトリプシンは、カルボニル炭素が、切断されることになるペプチド結合の一部（以下の青色のＲ基）である残基上の芳香族側鎖を選好する。トリプシンは、この位置での陽性荷電Ｌｙｓ残基またはＡｒｇ残基を選好する。セリンプロテアーゼは、それらの基質認識特性において著しく異なる：いくつかは高度に特異的である（つまり血液凝結および免疫補体系に関与するプロテアーゼ）；いくつかは部分的にのみ特異的である（つまり哺乳動物消化プロテアーゼであるトリプシンおよびキモトリプシン）；他のものは、細菌プロテアーゼであるサブチリシンと同様に完全に非特異的である。特異性におけるこれらの差異にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒メカニズムは十分に保存されている。
【０２５９】
セリンプロテアーゼによる標的タンパク質の切断のメカニズムは、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。システイン、トレオニン、またはアスパラギン酸に関連する水分子もしくは金属もまたこの役割を果たすことができる。多くの場合では、そのグループの求核特性は、ヒスチジンの存在により改善され、アスパラギン酸による「プロトンアクセプターの状況」において保持される。セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸が一列に並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通した触媒三連構造を構築する。例えば、キモトリプシンおよび例えばＭＴ−ＳＰ１等の、キモトリプシンと同じファミリーのメンバーであるセリンプロテアーゼの活性部位残基はＡｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７、およびＳｅｒ１９５である。セリンプロテアーゼの２０種を超えるファミリー（Ｓ１〜Ｓ２７と表される）が同定され、これらは、構造の類似性および他の機能的証拠に基づいて６つのクラン（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦ、およびＳＧ）にグループ化されている［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ＮＤら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１９−６１］。数個のセリンペプチダーゼの反応メカニズムに類似性がある。キモトリプシン、サブチリシン、およびカルボキシペプチダーゼＣのクランは、共通して、セリン、アスパラギン酸、およびヒスチジンの触媒三連構造を有する：セリンは求核剤として、アスパラギン酸は求電子剤として、ヒスチジンは塩基として作用する。異なるタンパク質の折りたたみにもかかわらず、触媒残基の幾何学的配向はファミリー間で類似する。触媒残基の線状配置は、共通してクランの関係を表す。例えば、触媒三連構造は、キモトリプシンクラン（ＳＡ）においてＨＤＳに配列するが、サブチリシンクラン（ＳＢ）においてＤＨＳに、カルボキシペプチダーゼクラン（ＳＣ）においてＳＤＨに配列する。
【０２６０】
セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリーの全体にわたって、基質および酵素の間のバックボーン相互作用は完全に保存されているが、側鎖相互作用はかなり変わる。活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケットを含有するアミノ酸の同一性は、その特定のポケットの基質特異性を決定する。一方のセリンプロテアーゼのアミノ酸を同じ折りたたみのもう一方のセリンプロテアーゼにグラフトすると、セリンプロテアーゼの特異性を他のものに修飾する。典型的に、Ｓ１〜Ｓ４ポケットを含有するプロテアーゼのアミノ酸は、基質の４〜５オングストローム内の側鎖を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸がプロテアーゼ基質と有する相互作用は、アミノ酸が基質と直接接触するので、「第１シェル」相互作用と一般に呼ばれる。しかしながら、最終的に第１シェルアミノ酸を位置づける「第２シェル」相互作用および「第３シェル」相互作用があり得る。第１シェルおよび第２シェルの基質結合効果は、ベータ−バレルドメインの間のループにより主に決定される。これらのループはタンパク質のコア要素ではないので、折りたたみの完全性が維持されるが、一方、分子レベルでの必要な代謝または調節のニッチを実現するために進化の経過の間に新規な基質特異性を有するループ変異体が選択され得る。典型的に、セリンプロテアーゼについては、一次配列における以下のアミノ酸が特異性の決定基となる：キモトリプシン番号付けに基づいた、１９５、１０２、５７（触媒三連構造）；１８９、１９０、１９１、１９２、および２２６（Ｓ１）；５７、５８および６４の間のループ、ならびに９９（Ｓ２）；１９２、２１７、２１８（Ｓ３）；Ｃｙｓ１６８およびＣｙｓ１８０の間のループ、２１５、ならびに９７〜１００（Ｓ４）；ならびに４１および１５１（Ｓ２’）、Ｓ１位置におけるアミノ酸がＰ１特異性に影響を及ぼし、Ｓ２位置におけるアミノ酸がＰ２特異性に影響を及ぼし、Ｓ３位置におけるアミノ酸がＰ３特異性に影響を及ぼし、Ｓ４位置におけるアミノ酸がＰ４特異性に影響を及ぼす。セリンプロテアーゼ中の位置１８９は、Ｓ１特異性を決定するポケットの下に埋められた残基である。それぞれ異なるセリンプロテアーゼについての構造の決定基を表９に列挙するが、番号付けは成熟キモトリプシンの番号付けに基づき、命名されたプロテアーゼのそれぞれのプロテアーゼドメインは、キモトリプシンのプロテアーゼドメインと合わせる。Ｃｙｓ１６８〜Ｃｙｓ１８２および６０のループの縦列項目の真下の数は、２つのアミノ酸の間のループ中およびループ中のアミノ酸の数を示す。Ｃｙｓ１９１〜Ｃｙｓ２２０縦列項目の下のあり／なしの指定は、ジスルフィド架橋がプロテアーゼ中に存在するかどうかを示す。これらの領域は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのファミリー内で可変であり、それら自体における構造の決定基に相当する。Ｓ１〜Ｓ４ポケットにおけるアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数を変更するためのプロテアーゼの修飾は、標的基質についてのプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
【０２６１】
【表９】
0005860789.tif 000011
【０２６２】
ｉ．ＭＴ−ＳＰ１
補体活性化の調節における使用のためにまたは補体経路の調節におけるその活性を増加させるためのさらなる修飾のためのスカフォールドとして企図されたスカフォールドプロテアーゼの例示は、膜型セリンプロテアーゼＭＴ−ＳＰ１（マトリプターゼ、ＴＡＤＧ−１５、腫瘍形成能の抑制因子１４、ＳＴ１４とも呼ばれる）である；配列番号１、２ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ１１８２２４およびＡＡＤ４２７６５を参照されたい；（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２３１−１８２３６；米国特許第５，７９２，６１６号；Ｔａｋｅｕｃｈｉ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１０５４−１１６１もまた参照されたい。例示的なスカフォールドとして本明細書中で命名されたタンパク質は、８５５個のアミノ酸のＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ（配列番号１および２を参照されたい）である。配列が配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ１１８２２４もまた参照されたい）に記載される核酸分子は、８５５個のアミノ酸のＭＴ−ＳＰ１（配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ４２７６５）をコードする。
【０２６３】
それは、Ｃ末端セリンプロテイナーゼドメインを有する多重ドメインプロテイナーゼである［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３）：２１６０］。６８３個のアミノ酸の、プロテアーゼの変異体が単離されたが、このタンパク質は、切断形態または外部ドメイン形態であると思われる。
【０２６４】
ＭＴ−ＳＰ１は、前立腺、乳房、および結腸直腸の癌において高度に発現するまたはそれらにおいて活性であり、ＭＴ−ＳＰ１は、乳房および前立腺の癌の転移に役割を果たす可能性がある。ＭＴ−ＳＰ１はまた、ヒト胃腸管および前立腺における高度なレベルの活性および／または発現と共に、様々な上皮組織中に発現する。他の種のＭＴ−ＳＰ１が知られている。例えば、ＭＴ−ＳＰ１のマウス相同体が同定されており、エピシン（ｅｐｉｔｈｉｎ）と呼ばれている。
【０２６５】
ＭＴ−ＳＰ１は、アミノ酸６１５〜８５４（配列番号９および１０として記載される）の間に、膜貫通ドメイン、２つのＣＵＢドメイン、４つのＬＤＬＲ反復配列、およびセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含有し、セリンプロテアーゼドメインは、キモトリプシン（配列番号７および８）で等で、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーのすべてのメンバーの中で高度に保存されている。ＭＴ−ＳＰ１は、チモーゲンとして合成され、切断により二本鎖形態に活性化される。さらに、一本鎖タンパク質分解性ドメインは、単独で、触媒的に活性で機能的である。
【０２６６】
ＭＴ−ＳＰ１は、キモトリプシンおよびトリプシンもまた含む、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリー（キモトリプシンファミリーとも称される）に属する。一般に、キモトリプシンファミリーメンバーはキモトリプシンと配列および構造の相同性を共有する。ＭＴ−ＳＰ１は、成熟キモトリプシンの番号付けに従って、本明細書中で番号付けられ、そのプロテアーゼドメインは、キモトリプシンのプロテアーゼドメインと合わせ、その残基はそれに応じて番号付けられる。キモトリプシン番号付けに基づいて、活性部位残基はＡｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７、およびＳｅｒ１９５である。線状アミノ酸配列は、キモトリプシンのアミノ酸配列に合わせることができ、キモトリプシンのβシートに従って番号付けられる。挿入および欠失がベータシートの間のループにおいて生じるが、構造のファミリーの全体にわたって、コアーシートは保存される。セリンプロテアーゼは、保存されたベータシートの様式で基質と相互作用する。６つまでの保存水素結合が基質および酵素の間に生じ得る。キモトリプシンファミリーのすべてのセリンプロテアーゼは、触媒活性に必要なプロテアーゼドメインのそれらのＮ末端で保存領域を有する（つまりＩＩＧＧ、ＶＶＧＧ、またはＩＶＧＧ、この四つ組中の第１のアミノ酸はキモトリプシン番号付けに従って番号付けられ、名称Ｉｌｅ１６が与えられる。この番号付けは、前駆体配列の長さを反映していない）。
【０２６７】
プロテアーゼドメイン中の、ＭＴ−ＳＰ１の基質特異性が、位置スキャン合成コンビナトリアルライブラリーおよび基質ファージディスプレイを使用してマッピングされた［Ｔａｋｅｕｃｈｉら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２６３３３］。ＭＴ−ＳＰ１により認識される基質における切断残基は、Ｐ４にＡｒｇ／ＬｙｓおよびＰ３に塩基性残基またはＧｌｎ、Ｐ２に小さな残基、Ｐ１にＡｒｇまたはＬｙｓ、ならびにＰ１’にＡｌａを含有する。有効な基質は、Ｐ４〜Ｐ１部位にＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇをそれぞれ含有する。一般に、ＭＴ−ＳＰ１についての基質特異性は、傾向を明らかにし、Ｐ３が塩基性の場合、Ｐ４は非塩基性である傾向があり、Ｐ４が塩基性の場合、Ｐ３は非塩基性である傾向がある。例えば、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）、一本鎖ｕＰＡ（ｓｃ−ｕＰＡ）、ＭＴ−ＳＰ１の前形態、および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む、ＭＴ−ＳＰ１についての知られている基質は、ＭＴ−ＳＰ１特異的基質についての切断配列に従う。
【０２６８】
ＭＴ−ＳＰ１は、選択された合成基質を、トリプシンと同じくらい効率的に切断することができるが、トリプシンよりも基質についての限られた特異性を呈し得る。ＭＴ−ＳＰ１の触媒ドメインは、（キモ）トリプシン様セリンプロテアーゼの全体的な構造の折りたたみを有するが、疎水性／酸性のＳ２／Ｓ４サブサイトおよび露出した６０ループ等の特有の特性を示す。同じく、ＭＴ−ＳＰ１は、接近可能なＬｙｓ残基またはＡｒｇ残基でペプチド基質を無差別に切断しないが、切断ペプチド結合を包囲する付加的な残基の認識を必要とする。拡張された一次配列についてのこの必要性は、その基質についてのＭＴ−ＳＰ１の特異性を目立たせる。例えば、ＭＴ−ＳＰ１は、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）（Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのＰ４〜Ｐ１の標的配列を示す）を切断するが、この酵素は、切断結合近くの拡張されたＭＴ−ＳＰ１特異性にマッチする標的配列を示さないＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３、およびＰＡＲ−４等のこの基質に非常に関係するタンパク質を活性化しない［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２１６０を参照されたい］。
【０２６９】
ＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメイン（例えば配列番号９および１０を参照されたい）はプロ領域および触媒ドメインから構成される。ポリペプチドの触媒活性部分は、成熟タンパク質のアミノ酸残基６１１の自己活性化部位の後から始まる（例えば配列番号１および２、残基ＶＶＧＧが後に続くＲＱＡＲを参照されたい）。ＭＴ−ＳＰ１およびトリプシンのＳ１ポケットは、ＬｙｓおよびＡｒｇ  Ｐ１残基についての好適な相補性で類似し、それによって、トリプシンでの基質切断におけるいくつかの類似性の説明となる。Ｐ１−Ｌｙｓ残基の適応は、埋められたα−アンモニウム基を安定化するよう側鎖が付加的な水素結合アクセプターを提供するＳｅｒ１９０により媒介される［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２１６０を参照されたい］。Ｓ２ポケットは、Ｐ２アミノ酸の小〜中サイズの疎水性側鎖に適応するよう形づくられ、一般に、Ｐ２位置で広い範囲のアミノ酸を受容する。基質結合に際し、Ｐｈｅ９９ベンジル基の回転により証明されるように、Ｓ２サブサイトは厳密なものではない。位置Ｐ３（Ｇｌｎまたは塩基性残基）およびＰ４（ＡｒｇまたはＬｙｓ残基）での基質アミノ酸の関連性は、酵素活性部位のくぼみに接近する時に、特異的な塩基性ペプチド基質を好都合にあらかじめ方向づけることができるＡｓｐ−２１７および／またはＡｓｐ−９６の酸性側鎖とのＳ３およびＳ４ポケットにおける静電的相互作用により媒介されると思われる。Ｐ３残基の側鎖はまた、Ｇｌｎ１９２のカルボキサミド基に水素結合することができるまたは、代わりに、Ｐｈｅ９７と水素結合を形成するために、Ｐ３側鎖はＳ４サブサイト中にわたることができ、それによって、Ｇｌｙ２１６との主鎖間水素結合を弱める。いずれのコンホメーションにおいても、塩基性Ｐ３側鎖は、陰性電位のＭＴ−ＳＰ１  Ｓ４ポケットと好都合に相互作用することができる。同じＳ４部位からの相互の電荷補償および電荷排除は、好適なＭＴ−ＳＰ１基質中のＰ３およびＰ４でＡｒｇ／Ｌｙｓ残基が同時に発生する可能性が低い説明となる。一般に、基質結合のために拡張された特異性に寄与する、ＭＴ−ＳＰ１のアミノ酸位置（キモトリプシン番号付けに基づく）は次のものを含む：１４６および１５１（Ｓ１’）；１８９、１９０、１９１、１９２、２１６、２２６（Ｓ１）；５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、９９（Ｓ２）；１９２、２１７、２１８、１４６（Ｓ３）；９６、９７、９８、９９、１００、１６８、１６９、１７０、１７０Ａ、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、２１５、２１７、２２４（Ｓ４）。表１０は、標的にされた基質との特異性相互作用にとって重要なアミノ酸位置のいくつかについて、ＭＴ−ＳＰ１中の残基を概説する。典型的に、拡張された特異性結合ポケットまたは相互作用の他の二次的部位におけるアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数を変更するための、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの修飾は、標的基質についてのプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
【０２７０】
【表１０】
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【０２７１】
ｉｉ．グランザイムＢ
グランザイムＢもまた、補体活性化の調節における使用のためにまたは補体経路の調節におけるその活性を増加させるためのさらなる修飾のために企図されたスカフォールドプロテアーゼの例示である。グランザイムＢは、細胞媒介性免疫応答における標的細胞溶解に必要なセリンプロテアーゼ（Ｓ１型）である。グランザイムＢは、アポトーシスの実行を担い、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−９、およびカスパーゼ−１０を切断し、活性酵素媒介アポトーシスを起こすカスパーゼ（アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼ）の活性化カスケードに連結している。グランザイムＢ（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ＃：Ｍ１７０１６）は２４７個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ＃：Ｐ１０１４４）をコードする。前駆体グランザイムＢポリペプチドは、アミノ酸１〜２０にシグナル配列およびプロペプチド活性化ペプチドを有する。成熟グランザイムＢタンパク質は、アミノ酸２１〜２４５のペプチダーゼＳ１またはプロテアーゼドメインにより特徴づけられる。
【０２７２】
グランザイムＢは、キモトリプシン折りたたみセリンプロテアーゼのファミリーのメンバーであり、グランザイムＣ〜Ｇ、カテプシンＧ、およびラット肥満細胞プロテアーゼＩＩを含む、グランザイムファミリーの他のメンバーに対して５０％を超える同一性を有する。タンパク質は、短いアルファ−ヘリックスによりつながれる２つの六重鎖の逆平行ベータ−バレルドメインのサンドイッチ状のものである。
【０２７３】
野生型グランザイムＢの基質切断部位は、Ｉ／Ｖ（Ｐ４）−Ｅ／Ｑ／Ｍ（Ｐ３）−Ｐ／Ｔ（Ｐ２）−Ｄ（Ｐ１）のコンセンサス認識部位を有する。これらのアミノ酸は、グランザイムＢによる認識および切断のための基質のＰ１〜Ｐ４ポケットに並ぶ。一般に、グランザイムＢは、そのコンセンサス認識においてＡｓｐの後の切断を選好する。
【０２７４】
グランザイムＢ基質切断のための構造の決定基は、基質様結合ループを有する高分子阻害剤であるエコチン（ｅｃｏｔｉｎ）（ＩＥＰＤ）と複合したラットグランザイムＢ（配列番号５および６）の三次元構造により同定された［Ｗａｕｇｈら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ  ７：７６２］。触媒三連構造は、Ａｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７、およびＳｅｒ１９５から構成される。表面ループは、アルファ−キモトリプシンと比較した追加および欠失に従って番号付けられ、この構造のファミリーのほとんどの可変領域に相当する。特異性の他の構造の決定基は、キモトリプシン番号付けによる、Ｌｙｓ４１、Ｉｌｅ９９、Ａｒｇ１９２、Ａｓｎ２１８、Ｔｙｒ２１５、Ｔｙｒ１７４、Ｌｅｕ１７２、Ａｒｇ２２６、およびＴｙｒ１５１を含む。セリンプロテアーゼのグランザイムファミリーの他のメンバーはこれらのアミノ酸のうちの２つだけをグランザイムＢと共有する。それらは、構造のファミリー全体にわたってごくわずかしか変わらない２つの残基、Ｔｙｒ２１５およびＬｅｕ１７２である。これは、グランザイムの配列同一性が高度である一方、それらの基質特異性がとても異なることを示す。グランザイムＢ基質特異性についての構造の決定基を、キモトリプシン番号付けを用いて表１１に列挙する。典型的に、拡張された特異性結合ポケットまたは相互作用の他の二次的部位におけるアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数を変更するためのグランザイムＢプロテアーゼの修飾は、補体タンパク質標的基質を含む標的基質についてのプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
【０２７５】
【表１１】
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【０２７６】
特異性に対するグランザイムＢ構造決定基の重要性が、拡張された特異性についての突然変異の影響を決定するためのコンビナトリアル基質ライブラリーを使用してプロファイリングされた。アミノ酸アラニンへのＩｌｅ９９、Ａｒｇ１９２、Ａｓｎ２１８、およびＴｙｒ１７４の突然変異は、Ｉｌｅ９９がＰ２特異性に、Ａｓｎ２１８およびＡｒｇ１９２がＰ３特異性に、Ｔｙｒ１７４がＰ４特異性に寄与することを示した。プロテアーゼのＰ１特異性は、その特異性の大多数を表しているので、修飾は、Ｐ１アスパラギン酸アミノ酸へのグランザイムＢの特有の特異性を破壊しないが、拡張されたＰ２〜Ｐ４部位における特異性を調節する。Ｐ３およびＰ４サブサイトについては、Ｔｙｒ１７４、Ａｒｇ１９２、およびＡｓｎ２１８での突然変異は、意義深いことには、特異性に影響を及ぼさなかった。Ｙ１７４Ａは、Ｐ４でのＬｅｕへの活性を増加させるが、残りのアミノ酸は選択されるには不十分にとどまる。Ｒ１９２ＡおよびＮ２１８Ａは両者ともＰ３での特異性を広げる。グルタミン酸を強く選好するものの代わりに、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎが修飾プロテアーゼ中に導入される。突然変異体の全体的な活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、理想的な野生型基質Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）（Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＡＭＣ）への野生型活性を下回る１０％未満である。より高い効果は、Ｐ２サブサイトで観察される。野生型グランザイムＢにおいて、Ｐｒｏ残基をわずかに選好し、選好は広い。Ｉ９９Ａは、Ｐｈｅ残基およびＴｙｒ残基に対するＰ２特異性を狭める。Ｐｈｅは、この位置の他のアミノ酸の平均的な活性に関してほぼ５倍まで特異性を狭める。セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリー内では、１ダースを超えるプロテアーゼが、この構造部位に、小さな残基、アスパラギン、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンのいずれかを有する。このグループから、２つのプロテアーゼが、コンビナトリアル基質ライブラリーを使用して、プロファイリングされ（血漿カリクレインおよびプラスミン）、両者ともＰｈｅおよびＴｙｒへの強い選好を示す。これらの２つの結果は、位置９９でＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａに突然変異した任意のセリンプロテアーゼが、血漿カリクレイン、プラスミン、およびＩ９９ＡグランザイムＢ突然変異体において見い出される同じ疎水性特異性を示すであろうということを示唆する。
【０２７７】
Ｐ２特異性決定基は、対照的な突然変異および基質選好まで拡張し得る。例えば、ほぼ２ダースのキモトリプシン折りたたみセリンプロテアーゼは、位置９９に芳香族アミノ酸を有する。これらのプロテアーゼのうちの４つがコンビナトリアル基質ライブラリーを使用してプロファイリングされた：ヒトグランザイムＢ、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、および膜型セリンプロテアーゼ１。グランザイムＢ以外は、基質Ｐ２位置で、セリン、グリシン、およびアラニンアミノ酸についての選好を有する。
【０２７８】
ｂ．システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼは、システインスルフヒドリル基を必要とする触媒メカニズムを有する。隣接したヒスチジン残基によるシステインスルフヒドリルの脱プロトン化の後に、ペプチドカルボニル炭素上のシステインの求核攻撃が続く。新しいカルボキシ末端をシステインチオールに連結しているチオエステルは、反応の中間体（セリンプロテアーゼのアシル酵素中間体に似ている）である。システインプロテアーゼは、パパイン、カテプシン、カスパーゼ、およびカルパインを含む。
【０２７９】
パパイン様システインプロテアーゼは、パパインとの構造類似性により関係するチオール依存的エンドペプチダーゼのファミリーである。それらは、ＲおよびＬ（右および左）と標識されたドメインを有する２ドメインタンパク質を形成し、両方のドメインからのループは基質認識のくぼみを形成する。それらは、アミノ酸Ｃｙｓ２５、Ｈｉｓ１５９、およびＡｓｎ１７５から構成される触媒三連構造を有する。基質のベータ−シートコンフォメーションに基づいて標的ペプチドを認識し、タンパク分解するセリンプロテアーゼとは違って、プロテアーゼのこのファミリーは、基質認識のための十分に定義されたポケットを有していない。主な基質認識は、Ｐ２アミノ酸で生じる（セリンプロテアーゼにおけるＰ１残基と比較して）。
【０２８０】
多くのシステインプロテアーゼ（ヒトカテプシンＬ、Ｖ、Ｋ、Ｓ、Ｆ、Ｂ、パパイン、およびクルザイン）の基質特異性が、完全な多様な位置スキャン合成コンビナトリアルライブラリー（ＰＳ−ＳＣＬ）を使用して決定された。完全なライブラリーは、１つの位置が保持され、固定されているが、他の３つの位置が、２０種の可能性として考えられるアミノ酸の等モル混合物でランダム化され、合計、多様な〜１６０，０００個のテトラペプチド配列が生じる、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４のテトラペプチド基質を含有する。
【０２８１】
全体的に、Ｐ１特異性は、カテプシン間でほぼ同一であり、ＡｒｇおよびＬｙｓが強く好まれ、小さな脂肪族アミノ酸は耐容性を示す。選択性の多くはＰ２位置に見い出され、ヒトカテプシンは、疎水性アミノ酸に対して厳密に選択的である。興味深いことには、疎水性残基についてのＰ２特異性は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ等の芳香族アミノ酸（カテプシンＬ、Ｖ）ならびにＶａｌまたはＬｅｕ等のかさ高い脂肪族アミノ酸（カテプシンＫ、Ｓ、Ｆ）に分けられる。Ｐ２位置と比較して、Ｐ３位置での選択性は、意義深いことにはそれほどストリンジェントではない。しかしながら、数個のプロテアーゼは、プロリン（カテプシンＶ、Ｓ、およびパパイン）、ロイシン（カテプシンＢ）、またはアルギニン（カテプシンＳ、クルザイン）について別に選好する。プロテアーゼは、他のアミノ酸に優先して選択されるアミノ酸がないので、Ｐ４位置で広い特異性を示す。
【０２８２】
Ｓ２ポケットは、プロテアーゼ基質認識部位の中で最も選択的で、最も特徴づけられている。それは以下の空間的位置でのアミノ酸により明示される（パパイン番号付け）：６６、６７、６８、１３３、１５７、１６０、２０５。位置２０５は、セリンプロテアーゼにおける位置１８９−特異性を決定するポケットの下に埋められた残基、に類似する役割を果たす。他の特異性決定基は、以下のアミノ酸を含む（パパインに従った番号付け）：６１および６６（Ｓ３）；１９、２０、および１５８（Ｓ１）。それぞれ異なるシステインプロテアーゼについての構造の決定基を表１２に列挙する。典型的に、拡張された特異性結合ポケットまたは相互作用の他の二次的部位におけるアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数を変更するための例えばパパインプロテアーゼ等のシステインプロテアーゼの修飾は、補体タンパク質標的基質を含む標的基質についてのプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
【０２８３】
【表１２】
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【０２８４】
ｃ．アスパラギン酸プロテアーゼ
アスパラギン酸プロテアーゼは、消化酵素ペプシン、リソソーム中に見い出されるいくつかのプロテアーゼ、腎臓酵素レニン、およびＨＩＶ−プロテアーゼを含む。２つのアスパラギン酸残基が、活性部位での酸／塩基触媒に参加する。初期反応において、一方のアスパラギン酸は、活性部位Ｈ２Ｏからプロトンを受容し、Ｈ２Ｏはペプチド連結のカルボニル炭素を攻撃する。同時に、他方のアスパラギン酸は、ペプチドカルボニル基の酸素にプロトンを供与する。アスパラギン酸プロテアーゼは、様々な特異性を呈し得るが、典型的に、２つの疎水性アミノ酸の間を切断することができる。基質のアミノ酸側鎖に対して十分に明示されたＳ４、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、およびＳ４’サブサイトポケットは、これらの酵素の特徴である［例えばＢｒｉｎｋｗｏｒｔｈら、（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：３８８４４を参照されたい］。
【０２８５】
例示的なアスパラギン酸プロテアーゼは、ヒト免疫不全ウイルス、１型（ＨＩＶ−１）ＰＲまたはトリ骨髄芽球症／ラウス肉腫ウイルス（ＡＭＶ／ＲＳＶ）ＰＲ等のレトロウイルスプロテアーゼを含む［Ｃａｍｅｒｏｎら、（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１１７１１］。ＰＲは、基質の７つのアミノ酸（Ｐ４〜Ｐ３’）と相互作用する少なくとも７つのサブサイト（Ｓ４〜Ｓ３’）を含有する基質結合ポケットを持つ［Ｃａｍｅｒｏｎら、（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１１７１１、Ｃａｍｅｒｏｎら、（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１１１７０］。ＡＭＶ／ＲＳＶ  ＰＲの基質特異性に寄与する残基は、Ｐ６２、Ｉ４２、Ｍ７３、Ｒ１０５’、Ｈ７’、Ｑ６３、Ｒ１０’、Ｄ４１、Ｉ６４（Ｓ４）；Ｈ６５、Ｖ１０４’、Ｒ１０５’、Ｇ１０６’、Ｑ６３、Ｒ１０’、Ｌ３５’、Ｄ３７’、Ｇ３９、Ｄ４１、Ｇ６６、Ｉ６７、Ｉ１０８’、Ｒ１１１（Ｓ３）；Ｉ４２、Ｉ４４、Ｈ６５、Ｍ７３、Ａ１００、Ａ４０、Ｄ４１、Ｉ６４、Ｇ６６、Ｉ６７’、Ｉ１０８（Ｓ２）；Ｈ６５、Ｖ１０４’、Ｒ１０５’、Ｇ１０６’、Ｓ１０７’、Ｒ１０’、Ｌ３５’、Ｄ３７’、Ｄ３７、Ｇ３９、Ｇ６６、Ｉ６７、Ｉ１０８’（Ｓ１）；Ｈ６５’、Ｖ１０４、Ｒ１０５、Ｇ１０６、Ｓ１０７、Ｒ１０、Ｌ３５、Ｄ３７、Ｄ３７’、Ｇ３９’、Ｇ６６’、Ｉ６７’、Ｉ１０８（Ｓ１’）、Ｉ４２’、Ｉ４４’、Ｈ６５’、Ｍ７３’、Ａ１００’、Ｖ１０４’、Ａ４０’、Ｄ４１’、Ｉ６４’、Ｇ６６’、Ｉ６７、Ｉ１０８’（Ｓ２’）；およびＳ３８’、Ｈ６５’、Ｖ１０４、Ｒ１０５、Ｇ１０６、Ｑ６３’、Ｒ１０、Ｌ３５、Ｇ３９’、Ｄ４１’、Ｉ６４’、Ｇ６６’、Ｉ６７’、Ｉ１０８、Ｒ１１１’（Ｓ３’）を含み、二量体の第２のサブユニットにおけるアミノ酸残基はプライム符号により示す。ＨＩＶ−１  ＰＲの基質特異性に寄与する残基は、Ｄ３０、Ｖ５６、Ｐ８１’、Ｒ８’、Ｄ２９、Ｉ４７（Ｓ４）；Ｇ４８、Ｔ８０’、Ｐ８１’、Ｖ８２’、Ｒ８’、Ｌ２３’、Ｄ２５’、Ｇ２７、Ｄ２９、Ｇ４９、Ｉ５０、Ｉ８４’、Ｒ８７（Ｓ３）；Ｄ３０、Ｖ３２、Ｇ４８、Ｖ５６、Ｌ７６、Ａ２８、Ｄ２９、Ｉ４７、Ｇ４９、Ｉ５０’、Ｉ８４（Ｓ２）；Ｇ４８、Ｔ８０’、Ｐ８１’、Ｖ８２’、Ｎ８３’、Ｒ８’、Ｌ２３’、Ｄ２５’、Ｄ２５、Ｇ２７、Ｇ４９、Ｉ５０、Ｉ８４’（Ｓ１）；Ｇ４８’、Ｔ８０、Ｐ８１、Ｖ８２、Ｎ８３、Ｒ８、Ｌ２３、Ｄ２５、Ｄ２５’、Ｇ２７’、Ｇ４９’、Ｉ５０’、Ｉ８４（Ｓ１’）；Ｄ３０’、Ｖ３２’、Ｇ４８’、Ｖ５６’、Ｌ７６’、Ｔ８０’（Ｓ２’）；およびＲ８、Ｌ２３、Ｇ２７’、Ｄ２９’、Ｉ４７’、Ｇ４９’、Ｉ５０’、Ｉ８４、Ｒ８７’（Ｓ３’）を含み、二量体の第２のサブユニット中のアミノ酸残基はプライム符号により示す。典型的に、拡張された特異性結合ポケットまたは相互作用の他の二次的部位におけるアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数を変更するための、例えばレトロウイルスプロテアーゼ等のアスパラギン酸プロテアーゼの修飾は、補体タンパク質標的基質を含む標的基質についてのプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
【０２８６】
ｄ．金属プロテアーゼ
金属プロテアーゼ（亜鉛プロテアーゼとも呼ばれる）は、消化酵素カルボキシペプチダーゼ、細胞により分泌されるそれぞれ異なるマトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよび金属プロテアーゼのドメイン）、およびリソソームプロテアーゼを含む。ＡＤＡＭならびにＭＭＰを含む酵素は、胚発生、細胞の成長および増殖、炎症応答、創傷修復、多発性硬化症、関節炎、ならびに癌の進行および転移において役割を有する［Ｍａｎｚｅｔｔｉら、（２００３）Ｊ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ、１７：５５１］。いくつかのＭＭＰ（例えばコラーゲナーゼ）は、組織リモデリングの間の細胞外マトリックスの分解に関与する。例えば、これらの酵素の多くは、基底膜および細胞外マトリックスの成分を切断することができる。いくつかのＭＭＰは、膜結合前タンパク質の切断により、細胞表面からＴＮＦα、ＴＧＦβ、およびインターロイキン等のサイトカインまたは成長因子を遊離するためのそれらの能力に関する、細胞シグナリングにおける役割を有する。
【０２８７】
金属プロテアーゼの活性部位での亜鉛結合モチーフは、イミダゾール側鎖がＺｎ＋＋に対するリガンドである２つのヒスチジン残基を含む。触媒の間に、Ｚｎ＋＋は、活性部位で水分子の酸素原子によるカルボニル炭素上での求核攻撃を促進する。活性部位塩基（カルボキシペプチダーゼ中のグルタミン酸残基）は、攻撃水分子からプロトンを取り出すことによりこの反応を容易にする。一般に、これらの酵素は、それらの活性部位中に共通の亜鉛結合モチーフ（ＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨ）をおよび活性部位の後に保存されたメチオニンターンを有する。ヒスチジンのいずれか１つの突然変異により触媒活性が取り除かれる。切断結合のまわりの、基質の異なるペプチドバックボーンに適応させるために、活性部位特異性は金属プロテアーゼ間で異なる。ＭＭＰ基質特異性の決定的な分子決定基は、Ｐ１’位置でのアミノ酸の側鎖である。したがって、Ｓ１’サブサイトは、切断についてのペプチド結合選好の決定において重要である。例えば、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−７の小さなＳ１’ポケットは、小さな疎水性残基についての選好を促進し、一方、他のＭＭＰは大きなＳ１’ポケットを有する［Ｏｖｅｒａｌｌら、（２００２）Ｍｏｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２：５１］。Ｓ２位置もまた、特異性の分子決定基である。例えば、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の間で、Ｓ２サブサイトは、ＭＭＰの触媒くぼみの間の少数の差異の１つであり、ＭＭＰ−９中のＡｓｐ４１０に対するＭＭＰ−２中のＧｌｕ４１２の存在が、基質特異性の変更において重要な役割を果たす。実際、より大きなＭＭＰファミリーの中で、Ｇｌｕ４１２位置は高度に可変であり、Ｇｌｕ４１２位置は、酸性残基、大きな疎水性残基、さらにはグリシンが占める。対照的に、Ｓ２サブサイトを包囲するほとんどの残基は、すべてのＭＭＰの間で厳密に保存されている［Ｃｈｅｎら、（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：１７１５８］。特異性の他の分子決定基を以下の表１３に記載する［例えばＭａｎｚｅｔｔｉら、（２００３）Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  １７：５５１を参照されたい］。典型的に、拡張された特異性結合ポケットまたは相互作用の他の二次的部位におけるアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数を変更するための、例えばＭＭＰまたはＡＤＡＭプロテアーゼ等の金属プロテアーゼの修飾は、補体タンパク質標的基質を含む標的基質についてのプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
【０２８８】
【表１３】
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【０２８９】
ｅ．トレオニン
トレオニンプロテアーゼはプロテアソーム加水分解酵素を含む。プロテアソームは、アルファサブユニットおよびベータサブユニットから構成される大きなバレル状タンパク質複合体である。ベータサブユニットは、複合体の２つの中心的な環内に見い出される触媒機構を供給する。典型的に、触媒活性ベータサブユニットの触媒のメカニズムは、保存Ｎ末端トレオニンを各活性部位で必要とする。ベータサブユニットは、Ｎ末端が切断され、触媒トレオニンが管腔表面に露出するようトレオニンをＮ末端残基にすると、活性化される。加水分解は、触媒機構でのヒドロキシル求核剤によるアミド結合の攻撃により開始される。プロテアソームのベータサブユニットの特異性の構造の決定基は、例えばプロテアソームのペプチドベースの共有結合性阻害剤のライブラリーを使用することによる等で決定された［例えばＧｒｏｌｌら、（２００２）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ９：６５５、Ｚｈａｎｇら、（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ、２２：１４８８］。
【０２９０】
Ｄ．スカフォールドタンパク質
スカフォールドタンパク質が提供される。スカフォールドタンパク質は、非補体プロテアーゼである限り、任意の野生型プロテアーゼを含み、それらの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または触媒活性部分もまた含む。スカフォールドプロテアーゼは、任意の１つまたは複数の補体経路基質を標的にする（つまり切断する）ために使用することができる。典型的に、上記切断は、補体経路の不活性化をもたらす。いくつかの事例では、上記切断は、補体の活性化をもたらすことができる。したがって、上記スカフォールドプロテアーゼは、例えばそれぞれ異なる疾患または障害の病因に関連する補体活性化を阻害するために、補体経路基質を標的にすることにより治療用物質として使用することができる。スカフォールドタンパク質はまた、標的基質を切断するために修飾することができる任意のタンパク質でもある。それらの中で、標的基質特異性を修飾することができるスカフォールドプロテアーゼがある。プロテアーゼを含むスカフォールドタンパク質は、結果としてのプロテアーゼが、補体経路の任意の１つもしくは複数のタンパク質成分についての変更された特異性もしくは選択性を呈するおよび／または補体タンパク質もしくは経路の活性を調節するように、任意の１つまたは複数のアミノ酸において修飾することができる。例えば、修飾プロテアーゼは、例えば野生型スカフォールドプロテアーゼの天然基質等の非標的基質と比較して、修飾プロテアーゼが、補体経路の標的にされた基質成分を選好的に切断するよう、変更された基質特異性を有することができる。一実施形態では、特異性は、標的にされた基質についての野生型プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼの特異性と比較して、増加させることができる。他の実施例では、修飾プロテアーゼは、修飾プロテアーゼが特定の基質を切断する能力が、修飾プロテアーゼもまた特異性を呈することができる任意の他の標的基質よりも大きいように、補体成分についての選択性を呈することができる。さらに、修飾プロテアーゼは、例えば補体経路の任意の１つまたは複数のタンパク質等の標的基質を切断することができ、補体経路の活性を調節することができる。
【０２９１】
任意の１つもしくは複数の補体タンパク質を切断するために使用することができるまたは任意の１つもしくは複数の補体タンパク質への基質特異性もしくは活性を増加させるためにプロテアーゼにおける修飾をなすために鋳型として使用することができる例示的なスカフォールドプロテアーゼが記載される。プロテアーゼスカフォールドは、プロテアーゼのセリンクラス、システインクラス、アスパラギン酸クラス、メタロクラス、またはトレオニンクラスのいずれか１つの任意の非補体プロテアーゼを含む。例示的なスカフォールドプロテアーゼを表１４および本明細書中に列挙する。プロテアーゼスカフォールドは、いずれか１つのタンパク質の対立遺伝子変異体およびアイソフォームを含み、配列番号２、４、８、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、５４４、５４５、５４７、５４９、および５５１のいずれかに例証されるスカフォールドプロテアーゼポリペプチドを含む。
【０２９２】
スカフォールドタンパク質またはスカフォールドプロテアーゼは、組換え法によりならびにインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）工程を含む方法、合成方法、および当業者に知られている任意の方法による、自然源からの単離、細胞、組織、および生物において組換えで生産されたタンパク質の単離を含む、当技術分野で知られている任意の方法により産生するまたは単離することができる。表１４は、例示的なスカフォールドプロテアーゼを記載する（例えばｗｗｗ．ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋもまた参照されたい）。例示的な候補プロテアーゼのそれぞれについてのヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸前駆体配列についての配列識別子（配列番号）を表に表す。成熟タンパク質を得るためのシグナルペプチドまたはプロペプチド配列に対応するコードされたアミノ酸もまた表に記述する。さらに、例えばそれぞれのプロテアーゼの触媒三連構造を構成する活性部位残基のように、プロテアーゼドメイン（つまりペプチダーゼユニット）を命名するアミノ酸もまた記述する。相互作用は動的であるので、記述したアミノ酸位置は参照および例証のためのものである。記述した位置は、２、３、４、５個、またはそれ以上のアミノ酸が変わる様々な座を表す。変形物はまた、対立遺伝子変異体および種変異体中にも存在する。当業者は、視覚的比較または容易に入手可能なアルゴリズムおよびソフトウェアを含む、他の比較により、対応する配列を同定することができる。
【０２９３】
【表１４−１】
0005860789.tif 000016
【０２９４】
【表１４−２】
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【０２９５】
【表１４−３】
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【０２９６】
【表１４−４】
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【０２９７】
【表１４−５】
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【０２９８】
【表１４−６】
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【０２９９】
【表１４−７】
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【０３００】
【表１４−８】
0005860789.tif 000023
【０３０１】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼスカフォールドは、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グランザイムＭ、カテプシンＧ、ＭＴ−ＳＰ１、好中球エラスターゼ、キマーゼ、アルファ−トリプターゼ、ベータ−トリプターゼＩまたはＩＩ、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、ＣＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、プロテインＣ、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、プラスミン、血漿カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、カテプシン、パパイン、クルザイン、金属プロテアーゼ、ならびにそれらの対立遺伝子変形物、アイソフォーム、および触媒活性部分である。上記プロテアーゼは、補体経路の１つまたは複数の標的基質を標的にするために本明細書中で提供される方法において使用することができる。上記プロテアーゼはまた、補体経路の任意の１つもしくは複数のタンパク質成分についての変更された特異性もしくは選択性を有するようおよび／または補体タンパク質もしくは経路の活性を調節するよう修飾することもできる。プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、補体活性化を調節するために本明細書中で提供される方法において使用することができ、したがって、任意の補体媒介性疾患または障害を処置するための治療用物質として使用することができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼスカフォールドはＭＴ−ＳＰ１である。ＭＴ−ＳＰ１中のアミノ酸の修飾は、補体タンパク質標的基質についての特異性および／または選択性を変更するようなすことができる。
【０３０２】
１．修飾スカフォールドプロテアーゼ
事実上、酵素基質配列特異性、熱安定性、ｐＨプロファイル、触媒効率、酸化安定性、および触媒機能を含む、プロテアーゼのすべての側面が再設計することができる。スカフォールドプロテアーゼと比較して、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性の増加を呈する修飾プロテアーゼが本明細書中で提供される。プロテアーゼは、タンパク質の修飾ための当技術分野で知られている任意の方法を使用して、修飾することができる。上記方法は、特定部位のランダム突然変異誘発を含む。本明細書中で提供されるおよび当技術分野で知られている、補体活性化の生物学的機能のためのアッセイ等のアッセイは、修飾プロテアーゼが切断および不活性化のために基質を標的にするかどうか決定するために、修飾プロテアーゼの生物学的機能を評価するために使用することができる。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼを同定するための例示的な方法が本明細書中で提供される。
【０３０３】
例えば、突然変異誘発に基づいたタンパク質定向進化のための任意の様々な一般のアプローチが利用することができる。これらのうちのどれも、標的基質に対する特異性および／または選択性の変更を達成するために、単独でまたは組み合わせて、プロテアーゼ等のポリペプチドを修飾するために使用することができる。上記方法は、ランダムな突然変異誘発を含み、出発タンパク質配列中のアミノ酸は、同じ分子上の異なるアミノ酸位置での単一の交換または複数の交換のいずれかにおいて、２０種のアミノ酸のすべて（またはグループ）と同時に交換される。他の方法の制限のあるランダム突然変異誘発は、２０種のアミノ酸またはＤＮＡが偏った残基のすべてまたはいくつかを導入する。偏りは、生物学的活性に関与することがあらかじめ知られているタンパク質の限られたまたはあらかじめ定められた領域が「進化する」範囲内での、それぞれ確率的または半確率的な様式での、ＤＮＡの配列に基づき、タンパク質の配列に基づかない。修飾プロテアーゼを生成するための例示的な方法は、関係する米国出願第１０／６７７，９７７号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、当技術分野で知られている任意の方法がプロテアーゼポリペプチド配列を修飾するまたは変更するために使用することができる。
【０３０４】
本明細書中で提供される修飾ポリペプチドの中で、スカフォールドプロテアーゼと比較して１つまたは複数の修飾を有するプロテアーゼがある。修飾プロテアーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の修飾位置を有するポリペプチドを含む。本明細書中で提供される修飾プロテアーゼは、それらのプロテアーゼ能力を保持するが、プロテアーゼの自然基質と比較して、任意の１つもしくは複数の補体タンパク質標的基質への変更された（つまり増強された）特異性を示し、および／または補体系の任意の１つもしくは複数のタンパク質に対して変更した選択性を示す。補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数に対して特異的な修飾プロテアーゼは、次のことにより合理的にまたは経験的に生成することができる：（ａ）例えば補体第Ｉ因子等の知られているプロテアーゼにより認識される標的補体基質の切断配列を補完する部位を合理的に標的にすることまたは（ｂ）補体カスケードの不活性化についての機能的アッセイにおいて修飾プロテアーゼのライブラリーを経験的に試験すること。
【０３０５】
ａ．合理的な修飾
任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する等の標的基質に対する特異性および／または選択性を増加させるよう合理的にプロテアーゼを修飾するための方法が提供される。上記方法において、標的基質の切断配列は知られている。標的タンパク質内の切断部位は以下の判定基準により同定される：１）切断部位は、タンパク質の露出表面上に位置する；２）切断部位は、原子構造または構造予測アルゴリズムにより決定されるように、二次構造が全然ない領域に位置する（つまりＰシートまたはヘリックス中にない）（これらの領域は、タンパク質の表面上のループまたは細胞表面受容体上の軸となる傾向がある）；３）切断部位は、その知られている機能に基づいてタンパク質をおそらく不活性化する部位に位置する。切断配列は、例えば、多くのプロテアーゼの拡張された基質特異性にマッチするよう長さが４残基であるが、より長くするまたはより短くすることができる。
【０３０６】
第Ｉ因子は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂを切断することにより補体活性化の自然調節因子として機能するセリンプロテアーゼである。第Ｉ因子は、Ｃ３およびＣ４それぞれのコンバターゼによる活性化ならびにＣ３ａおよびＣ４ａの遊離の後に、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂを切断し、不活性化する。第Ｉ因子により認識されるペプチド切断配列は、Ｃ３中のＬＰＳＲ（配列番号３８８）およびＳＬＬＲ（配列番号３８９）ならびにＣ４中のＨＲＧＲ（配列番号３９０）を含む［例えばＤａｖｉｓら、（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：５７４５）、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、（１９８０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７：９、Ｋａｉら、（１９８０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２４０９を参照されたい］。Ｃ３およびＣ４ならびにｉＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ４、およびＣ４ｂを含む第Ｉ因子基質を認識し、特異的に切断し、それによって補体活性化を阻害するようプロテアーゼの特異性結合ポケットを合理的に設計する方法が本明細書中で提供される。第Ｉ因子基質を切断する産物が提供される。
【０３０７】
例として、第Ｉ因子標的配列について変更された特異性を有する修飾プロテアーゼは、構造ベースの設計アプローチにより生成される。各プロテアーゼは、活性部位ポケットに並び、基質と直接接触する一連のアミノ酸を有する。プロテアーゼの活性部位ポケットに並ぶアミノ酸は、Ｓ１〜Ｓ４と命名され、それぞれの基質接触部位はＰ１〜Ｐ４と命名される。活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケットを含有するアミノ酸の同一性は、その特定のポケットの基質特異性を決定する。例示的なプロテアーゼの基質結合ポケットを形成するアミノ酸が本明細書中で記載される。一般に、プロテアーゼの基質特異性は、知られているまたは例えばプロテアーゼおよび基質の複合体の三次元構造に基づいた分子モデリングによる等で、決定することができる［例えばＷａｎｇら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（３４）：１００３８、Ｈｏｐｆｎｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．１９９９  ７（８）：９８９、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３）：２１６０、Ｗａｕｇｈら、（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．７（９）：７６２を参照されたい］。一実施例では、ＭＴ−ＳＰ１のＳ１〜Ｓ４基質結合ポケットに参加するアミノ酸は、以下の通りである（キモトリプシン番号付けに基づく）：１８９、１９０、１９１、１９２、２１６、および２２６（Ｓ１）；５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、９９（Ｓ２）；１４６、１９２、２１７、２１８（Ｓ３）；９６、９７、９８、９９、１００、１６８、１６９、１７０、１７０Ａ、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、２１５、２１７、２２４（Ｓ４）。他の実施例では、Ｐ２特異性に寄与する、パパインファミリープロテアーゼ中のアミノ酸（標準的なパパイン番号付け）は、アミノ酸６６〜６８、１３３、１５７、１６０、および／または２１５を含む。プロテアーゼのＳ１〜Ｓ４活性部位を構成するアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数の修飾は、そのプロテアーゼの基質特異性を変更するであろう。例えば、例えばＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ等のセリンプロテアーゼのＳ２ポケット中の位置９９でのより小さなアミノ酸への突然変異は、Ｐ２基質位置におけるより大きな疎水性残基についての選好を付与する。選択的な突然変異誘発のこのプロセスを使用して、第Ｉ因子切断配列に対する基質特異性を有するプロテアーゼを生成することができる。
【０３０８】
一実施形態では、点突然変異は、プロテアーゼの特異性結合ポケットに寄与するアミノ酸、特にＰ１〜Ｐ４基質特異性に寄与する、任意の１つまたは複数のＳ１〜Ｓ４アミノ酸残基においてなすことができる。一般に、プロテアーゼのＰ１〜Ｐ４特異性に寄与するアミノ酸残基は、第Ｉ因子により認識される標的基質切断部位が産生されるように、合理的に交換することができる。一実施例では、プロテアーゼは、標的切断配列ＬＰＳＲ／ＫＩを認識するために修飾することができ、Ｓ４位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ４位置でロイシンを認識するよう修飾することができ、Ｓ３位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ３位置でプロリンを認識するよう修飾することができ、Ｓ２位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ２位置でセリンを認識するよう修飾することができ、Ｓ１位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ１位置でアルギニンを認識するよう修飾することができる。他の実施例では、プロテアーゼは、標的切断配列ＳＬＬＲ／ＳＥを認識するよう修飾することができ、Ｓ４位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ４位置でセリンを認識するよう修飾することができ、Ｓ３位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ３位置でロイシンを認識するよう修飾することができ、Ｓ２位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ２位置でロイシンを認識するよう修飾することができ、Ｓ１位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ１位置でアルギニンを認識するよう修飾することができる。さらなる実施例では、プロテアーゼは、標的切断配列ＨＲＧＲ／ＴＬを認識するよう修飾することができ、Ｓ４位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ４位置でヒスチジンを認識するよう修飾することができ、Ｓ３位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ３位置でアルギニンを認識するよう修飾することができ、Ｓ２位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ２位置でグリシンを認識するよう修飾することができ、Ｓ１位置の任意の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｐ１位置でアルギニンを認識するよう修飾することができる。いくつかの場合では、セリンプロテアーゼにおける突然変異は、あるサブサイトでの特異性の修飾が隣接したサブサイトでの特異性にほとんど影響がないよう、活性部位（Ｓ１〜Ｓ４）を形成するサブサイトのそれぞれが互いに非依存的に機能することを示した。したがって、拡張された結合部位の全体にわたる、基質特異性および／または選択性の操作は、段階的様式で達成することができる。
【０３０９】
例えば、特定の結合部位での残基についてまたは特定の配列について低い特異性を有するプロテアーゼは、基質配列結合ポケットにおいて点突然変異をなすことにより、その特異性が変更される。いくつかの場合では、結果としての突然変異体は、特定の配列についての部位の特異性が増加して、野生型の１．５、２、５、８、１０倍、またはそれ以上を超える。他の実施形態では、結果としての突然変異体は、特定の配列についての部位の特異性が増加して、野生型の１００倍を超える。他の実施形態では、結果としての突然変異体は、部位でのまたは特定の配列についての特異性が増加して、野生型の１０００倍を超える。
【０３１０】
例示的な一実施形態では、Ｐ４のＡｒｇ／Ｌｙｓ、Ｐ３の塩基性残基またはＧｌｎ、Ｐ２の小さな残基、およびＰ１のＡｒｇまたはＬｙｓの標的切断配列についてＰ１〜Ｐ４選好を有する野生型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは、ＬＰＳＲ、ＳＬＬＲ、またはＨＲＧＲの第Ｉ因子切断配列が、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼにより認識されるように修飾することができる（表１５を参照されたい）。上記実施例では、修飾ＭＴ−ＳＰ１のＳ１位置は、Ｐ１部位のアルギニン残基が、ＭＴ−ＳＰ１の標的基質切断部位および第Ｉ因子切断部位の間で保存されているので、不変である。ＭＴ−ＳＰ１のＳ２〜Ｓ４サブサイトのうちの任意の１つまたは複数におけるアミノ酸残基は、第Ｉ因子切断配列についての特異性および／または選択性を増加するよう、単独でまたは組み合わせて修飾することができる。例えば、配列番号２または１０に記載されるＭＴ−ＳＰ１を修飾して、Ｃ３ｂ中のＳＬＬＲ第Ｉ因子切断配列についての特異性および／または選択性を増加させるために、基質のＰ４位置のセリンを認識するための、ＭＴ−ＳＰ１のＳ４位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｑ１７４Ｈ、Ｄ２１７Ｑ、Ｄ２１７Ｎ、Ｄ２１７Ｈ、Ｄ９６Ａ、Ｄ９６Ｖ、Ｄ９６Ｆ、Ｄ９６Ｓ、および／もしくはＤ９６Ｔを含むことができる；基質のＰ３位置のロイシンを認識するためのＭＴ−ＳＰ１のＳ３位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｑ１９２Ｌ、Ｑ１９２Ｉ、Ｑ１９２Ｆ、および／もしくはＹ１４６Ｆを含むことができる；ならびに／または基質のＰ２位置のロイシンを認識するためのＭＴ−ＳＰ１のＳ２位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｆ９９Ａ、Ｆ９９Ｖ、Ｆ９９Ｓ、および／もしくはＦ９９Ｇを含むことができる。他の実施例では、配列番号２または１０に記載されるＭＴ−ＳＰ１を修飾して、Ｃ３ｂ中のＬＰＳＲ第Ｉ因子切断配列についての特異性および／または選択性を増加させるために、基質のＰ４位置のロイシンを認識するための、ＭＴ−ＳＰ１のＳ４位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｗ２１５Ｆ、Ｗ２１５Ｙ、Ｑ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｌ、Ｑ１７４Ｙ、および／もしくはＭ１８０Ｅを含むことができる；基質のＰ３位置のプロリンを認識するためのＭＴ−ＳＰ１のＳ３位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｑ１９２Ｋ、Ｑ１９２Ｒ、Ｑ１９２Ｒを含むことができる；ならびに／または基質のＰ２位置のセリンを認識するためのＭＴ−ＳＰ１のＳ２位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｆ９９Ｙを含むことができる。さらなる実施例では、配列番号２または１０に記載されるＭＴ−ＳＰ１を修飾して、Ｃ４ｂ中のＨＲＧＲ第Ｉ因子切断配列についての特異性および／または選択性を増加させるために、基質のＰ４位置のヒスチジンを認識するための、ＭＴ−ＳＰ１のＳ４位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｗ２１５Ｆ、Ｗ２１５Ｙ、Ｑ１７４Ａ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｒおよび／もしくはＱ１７４Ｋを含むことができる；基質のＰ３位置のアルギニンを認識するためのＭＴ−ＳＰ１のＳ３位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｄ２１７Ａ、Ｄ２１７Ｖ、および／もしくはＱ１９２Ｅを含むことができる；ならびに／または基質のＰ２位置のグリシンを認識するためのＭＴ−ＳＰ１のＳ２位置における修飾は、キモトリプシン番号付けに基づいたアミノ酸修飾Ｆ９９Ｗ、Ｆ９９Ｙ、および／もしくはＦ９９Ｄを含むことができる。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼスカフォールドの例示的な修飾は、表１５に概説される。記述された位置の修飾の組合せもまた企図される。標的タンパク質における任意の１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を達成するための、当技術分野で知られている任意の方法を利用することができる。方法は、コード核酸分子の標準的な特定部位の突然変異誘発（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ等のキット等のキットを使用して）または固相ポリペプチド合成法によるものを含む。
【０３１１】
【表１５】
0005860789.tif 000024
【０３１２】
ｉ．位置スキャンライブラリーの合成および蛍光発光を使用したスクリーニング
Ｓ１〜Ｓ４サブサイトのうちの任意の１つまたは複数で修飾したプロテアーゼは、コンビナトリアル蛍光発生基質ライブラリーを含有する位置スキャン合成コンビナトリアルライブラリー（ＰＳ−ＳＣＬ）を使用して、任意の所与のサブサイトでのＰ１〜Ｐ４基質特異性について確認することができる［Ｈａｒｒｉｓら、（２０００）ＰＮＡＳ  ９７：７７５４、ＵＳ２００４／０１７５７７７、ＵＳ２００４／０１４６９３８］。ＰＳ−ＳＣＬ戦略は、任意の１つまたは複数のＳ１〜Ｓ４活性部位サブサイトでのタンパク質分解性基質特異性の速くて容易な決定を考慮に入れている。ＰＳ−ＳＣＬ戦略は、ペプチドのライブラリーの使用を必要とし、それによって、ライブラリーの１つの位置は一定に保持され、一方、残りの位置は、ライブラリーを調製するために使用されるアミノ酸のすべての組合せから構成される。例えば７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光発生ペプチド基質または７−アミノ−４−カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）蛍光発生ペプチド基質等のコンビナトリアル蛍光発生ペプチド基質ライブラリーは、蛍光発生部分がプロテアーゼの作用の際にペプチド基質から遊離する、修飾プロテアーゼの活性についてのアッセイに使用することができる。当業者は、これらの方法が、種々様々な代替ライブラリー方式を提供することを十分に理解するであろう。一実施例では、プロテアーゼは、Ｐ１−多様ライブラリーを用いてプロファイリングすることができる。Ｐ１−多様テトラペプチドライブラリーは、ＡＣＣ−またはＡＭＣ−蛍光発生テトラペプチドを含有し、それによって、Ｐ１位置は系統的に一定に保持され、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４位置は、２０種のアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数の等モル混合物を含有する。ＡＣＣ  Ｐ１固定ライブラリーは、修飾プロテアーゼのいずれか１つのＰ４、Ｐ３、およびＰ２特異性の確認を考慮に入れている。他の実施例では、大きな疎水性アミノ酸としてＰ２位置を固定することは、パパイン折りたたみプロテアーゼによる選好的な内部の切断を回避し、基質配列の適切な位置合わせにつながり得る。任意の特定の酵素に関連する特定の制限または基質配列特異性決定の方法の決定および考慮は当業者の能力の範囲内にある。
【０３１３】
当業者は、ペプチドを調製するための多くの方法が存在することを認識するであろう。例示的な実施形態では、基質ライブラリーは、蛍光発生タグ付き基質を固体担体に付着させることによりスクリーニングされる。一実施例では、基質ペプチドからの蛍光発生脱離基は、Ｎ−Ｆｍｏｃクマリン誘導体を酸に不安定なＲｉｎｋリンカーに縮合し、ＡＣＣ樹脂を準備することにより合成される［Ｂａｃｋｅｓら、（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１８７］。Ｆｍｏｃ除去により遊離アミンを産生する。自然アミノ酸、人為的アミノ酸、および修飾アミノ酸は、アミンにカップルすることができ、アミンは、さらなるアミノ酸のカップリングにより作り上げることができる。代替実施形態では、蛍光発生脱離基は、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）とすることができる［Ｈａｒｒｉｓら、（２０００）ＰＮＡＳ  ９７：７７５４］。ペプチドの合成が完了した後、ペプチド蛍光発生部分の抱合体は、固体担体から切断させることができる、または、代わりに、抱合体は、固体担体に繋ぎ止められたままとすることができる。
【０３１４】
典型的に、蛍光発生ペプチドまたは蛍光発生ペプチドを含む物質を調製する方法は、（ａ）固体担体に共有結合する蛍光発生部分を含有する第１の抱合体を提供すること、（ｂ）第１の抱合体を、第１の保護されたアミノ酸部分および活性化剤と接触させ、それによって、カルボキシル基および第１の抱合体のアミン窒素の間でペプチド結合を形成すること、（ｃ）脱保護し、それによって反応性アミン部分を有する第２の抱合体を形成すること、（ｄ）第２の抱合体を、第２の保護されたアミノ酸および活性化剤と接触させ、それによって、カルボキシル基および反応性アミン部分の間のペプチド結合を形成すること、ならびに（ｅ）脱保護し、それによって、反応性アミン部分を有する第３の抱合体を形成することを含む。例示的な実施形態では、方法は、（ｆ）第３の抱合体を第３の保護されたアミノ酸および活性化剤と接触させ、それによって、カルボキシル基および反応性アミン部分の間のペプチド結合を形成すること；ならびに（ｅ）脱保護し、それによって、反応性アミン部分を有する第４の抱合体を形成することをさらに含む。
【０３１５】
カップルするのが困難なアミノ酸については（例えばＩｌｅ、Ｖａｌ等）、遊離した未反応のアミンは、担体上に残存し、続く合成およびアッセイ作業を複雑にし得る。ＤＭＦ中の酢酸の３−ニトロトリアゾール活性エステルを利用する特殊なキャッピング工程により、残りのアニリンを効率的にアシル化する。未精製基質配列溶液中に存在し得る結果としての酢酸にキャッピングされたクマリンは、一般にプロテアーゼ基質配列ではない。
【０３１６】
配列のＣ末端アミノ酸が不溶性担体に付着され、配列における残りのアミノ酸の連続的な追加が後に続く固相ペプチド合成は本明細書中で提供されるポリペプチドのペプチドバックボーンを調製するための例示的な方法である。固相合成についての技術は、ＮａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｌｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２中のｐｐ．３−２８４、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐａｒｔ  Ａ．、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、（１９８０）、ならびにＳｔｅｗａｒｔら、（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ  ｅｔｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．により記載される。固相合成は、Ｆｍｏｃまたはｔ−ＢＯＣ化学を活用する市販で入手可能なペプチド合成機を用いて最も容易に達成される。
【０３１７】
例えば、ペプチド合成は、よく知られているＦｍｏｃ合成化学を使用して行うことができる。例えば、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒの側鎖は、ｔ−ブチルを使用して、Ｃｙｓ残基の側鎖は、Ｓ−トリチルおよびＳ−ｔ−ブチルチオを使用して保護され、Ｌｙｓ残基は、ｔ−Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、および４−メチルトリチルを使用して保護される。適正に保護されたアミノ酸試薬は市販で入手可能であるまたは技術的に認識された方法を使用して調製することができる。複数の保護基の使用は、任意の特定の所望の側鎖に対する蛍光体の選択的な脱ブロックおよびカップリングを可能にする。したがって、例えば、ｔ−Ｂｏｃ脱保護は、ジクロロメタン中のＴＦＡを使用することにより達成される。Ｆｍｏｃ脱保護は、例えば、ＤＭＦまたはＮ−メチルピロリドン中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使用して達成され、４−メチルトリチル脱保護は、例えば、水中１〜５％（ｖ／ｖ）のＴＦＡまたはＤＣＭ中１％ＴＦＡおよび５％トリイソプロピルシランを使用して達成される。ｔ−ブチルチオ脱保護は、例えば、水性メルカプトエタノール（１０％）を使用して達成される。ｔ−ブチル基、ｔ−ｂｏｃ基、およびＳ−トリチル基の除去は、例えばＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：エタンジチオール（８５：５：５：２．５：２．５）またはＴＦＡ：フェノール：水（９５：５：５）を使用して達成される。
【０３１８】
任意の特定の位置での多様性または位置の組合せを、ペプチド鎖を成長させるために少なくとも２、６、１２、２０種、またはそれ以上のアミノ酸の混合物を使用して、導入することができる。アミノ酸の混合物は、任意の有用な量の特定のアミノ酸を、任意の有用な量の１つまたは複数の異なるアミノ酸と組み合わせて含むことができる。一実施形態では、混合物は、アミノ酸の等速性混合物である（すべての成分の等モル反応性を考慮に入れるのに適切な比の混合物）。
【０３１９】
修飾プロテアーゼは、複数の修飾プロテアーゼの特異性を獲得するよう組み合わせることができる。スカフォールドのある残基での突然変異は、ある部位での特異性をもたらし、同じプロテアーゼ中で、スカフォールド上の他の部位の他の突然変異と組み合わせられ、特異性が組み合わせられたプロテアーゼを作製する。同じスカフォールド上の別個の部位での任意の数の突然変異は、特異性が組み合わせられたプロテアーゼを作り出すために使用することができる。
【０３２０】
所望の特異性プロファイルにマッチする、例えば修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ等の修飾プロテアーゼは、次いで、所望の切断配列に対応する個々の蛍光発生ペプチド基質を使用して、アッセイすることができる。第Ｉ因子切断配列のうちの任意の１つまたは複数を切断することができる修飾プロテアーゼのアッセイの方法は、（ａ）蛍光発生部分が、プロテアーゼの作用の際にペプチド基質配列から遊離し、それによって蛍光部分を産生する様式でペプチド蛍光発生サンプル（第Ｉ因子切断配列を含有する）をプロテアーゼと接触させることおよび（ｂ）サンプルが、蛍光発光における検出可能な変化を起こすかどうかを観察すること、検出可能な変化は、サンプルにおける酵素的活性プロテアーゼの存在の指標となる、を含む。上記実施例では、Ａｃ−ＳＬＬＲ−ＡＭＣまたはＡｃ−ＨＲＧＲ−ＡＭＣ等のＡＣＣ−またはＡＭＣ−テトラペプチドを作製することができ、修飾プロテアーゼと共にインキュベートし、プロテアーゼの活性は、蛍光発生部分の遊離についてのアッセイにより評価することができる。
【０３２１】
溶液中のプロテアーゼについてのアッセイは、プロテアーゼのある含量のストック溶液を、蛍光発生プロテアーゼ指示薬ペプチドに追加することおよび続く、蛍光発光における増加または吸収スペクトルにおける励起帯における減少を測定することを単純に必要とする。溶液および蛍光発生指示薬はまた、組み合わせて、プロテアーゼの活性を最適化する「消化緩衝液」中でアッセイすることができる。プロテアーゼ活性をアッセイするのに適した緩衝液は当業者によく知られている。一般に、緩衝液は、特定のプロテアーゼの最適Ｐｈに対応するＰｈを用いて選択される。例えば、エラスターゼ活性をアッセイするのに特に適した緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡをｐＨ８．９で含有する。測定は、蛍光体のための「励起」光源を提供し、次いで特定の波長で引き続いて発された光を測定する、機器である蛍光光度計において最も容易に成される。プロテアーゼを欠くコントロール指示薬溶液との比較は、プロテアーゼ活性の基準を提供する。活性レベルは、プロテアーゼ／指示薬の組合せについての標準曲線の生成により正確に定量化することができ、活性が知られているプロテアーゼ溶液により産生された蛍光発光における変化率が決定される。
【０３２２】
蛍光発生化合物の検出は、蛍光光度計を使用して達成することができる一方、検出はまた、当業者によく知られている様々な他の方法により達成することができる。したがって、例えば、蛍光体が可視波長で発する場合、検出は、単純に、光源による励起に応じた蛍光発光の視覚的判断によるものとすることができる。検出はまた、ディジタイザに接続されたビデオカメラを活用する画像解析システムまたは他の画像収集システムの手段によるものとすることができる。検出はまた、蛍光顕微鏡下でのように、フィルターを通した可視化によるものとすることができる。顕微鏡は、オペレーターにより単純に可視化されるシグナルを提供することができる。代わりに、シグナルは、写真フィルム上に、またはビデオ解析システムを使用して記録することができる。シグナルはまた、画像解析システムまたは光度計のいずれかを使用して、実時間で単純に定量化することもできる。
【０３２３】
したがって、例えば、サンプルのプロテアーゼ活性についての基礎的なアッセイは、サンプルを緩衝液中に懸濁させるまたは溶解すること（アッセイされている特定のプロテアーゼのｐＨ最適条件で）、緩衝液に、蛍光発生プロテアーゼペプチド指示薬を追加すること、および例えばＨａｒｒｉｓら、（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２７３６４中に示される分光蛍光光度計を使用して蛍光発光における結果としての変化を監視することを必要とする。分光蛍光光度計は、蛍光体の励起波長で蛍光体を励起するよう設定される。蛍光発生プロテアーゼ指示薬は、指示薬を切断するプロテアーゼにより蛍光発光において変化するプロテアーゼの基質配列である。
【０３２４】
修飾プロテアーゼはまた、修飾プロテアーゼが、完全長タンパク質の状況において提示された場合に、所望の配列を切断するであろうということを確かめるためにもアッセイされる。第Ｉ因子切断部位を含有する標的基質タンパク質は、Ｃ３およびＣ４の配列中、とりわけ、コンバターゼ活性化の後で、Ｃ３およびＣ４からそれぞれ生成されるＣ３ｂおよびＣ４ｂの中にある。第Ｉ因子はまた、Ｃ３およびＣ４の変更された種形態であるｉＣ３およびｉＣ４をも切断する。標的タンパク質の切断を評価するための方法は、本明細書中で記載されるおよび／または当技術分野でよく知られている。一実施例では、精製補体タンパク質、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ３、またはｉＣ４は、修飾プロテアーゼの存在または非存在下でインキュベートすることができ、切断事象は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後に続くタンパク質に対するクーマシーブリリアントブルー染色および濃度測定を使用する、切断産物の分析により監視することができる。標的タンパク質の活性はまた、例えば溶血アッセイにおいて等で、本明細書中で記載される方法または当技術分野でよく知られている方法を使用して、その機能が切断事象により破壊されたことを確認するためにアッセイされる。
【０３２５】
ｂ．経験的な修飾
修飾プロテアーゼのライブラリーは、プロテアーゼの任意の１つまたは複数のアミノ酸残基を、当技術分野で共通して知られている任意の方法を使用して突然変異させることにより生成することができる（公開された米国出願第２００４／０１４６９３８号もまた参照されたい）。修飾プロテアーゼのライブラリーは、修飾プロテアーゼが補体活性化の阻害について「ヒット」しているかどうかを決定するための補体活性化の機能的アッセイにおいて試験することができる。修飾プロテアーゼの標的補体基質は、同定することができ、ペプチド切断配列は、決定することができる。
【０３２６】
一実施例では、プロテアーゼの任意の１つまたは複数のアミノ酸は、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等の、任意の標準的な特定部位の突然変異誘発キットを使用して突然変異させる。他の実施例では、プロテアーゼの任意の１つまたは複数のアミノ酸は、活性部位残基の飽和突然変異誘発により突然変異させる。本実施例では、プロテアーゼのＳ１〜Ｓ４ポケットを形成する（プロテアーゼがペプチド基質のＰ１〜Ｐ４残基に接触する）および／または特異性の重要な決定基であることが示された残基は、すべての可能性として考えられるアミノ酸に、単独でまたは組み合わせて突然変異させる。いくつかの場合では、各ポケットは、他のポケットと非依存的に、ペプチド基質配列上の対応する残基を認識し、結合すると思われるので、活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケットの間の相互作用はほとんどない（たとえあるとしても）。したがって、特異性決定基は、一般に、他のポケットの特異性に影響を及ぼすことなく、１つのポケットにおいて変化させることができる。例示的な一実施形態では、飽和突然変異誘発技術が使用され、ポケットに並ぶ残基が突然変異して、２０種の可能性として考えられるアミノ酸になる（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ  Ｐａ．中のｔｈｅ  Ｋｕｎｋｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい）。上記技術では、所望のコドンでのＮＮＳまたはＮＮＫ−ランダム化のいずれかを含有する突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーが合成される。プライマーは、単鎖ＤＮＡ鋳型にアニールされ、鋳型の相補鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼが追加される。ライゲーションの後、二重鎖ＤＮＡ鋳型は、増幅のためにイー・コリに形質転換される。
【０３２７】
例示的なプロテアーゼの拡張された基質結合ポケットを形成するアミノ酸を本明細書中で記載する。一般に、プロテアーゼの基質特異性は、例えばプロテアーゼおよび基質の複合体の三次元構造に基づいた分子モデリングによる等で、知られている［例えばＷａｎｇら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（３４）：１００３８、Ｈｏｐｆｈｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．１９９９  ７（８）：９８９、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３）：２１６０、Ｗａｕｇｈら、（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．７（９）：７６２を参照されたい］。一実施例では、ＭＴ−ＳＰ１の突然変異は、基質特異性に寄与する、１９５、１０２、５７（触媒三連構造）；１８９、１９０、１９１、１９２、２１６、および２２６（Ｓ１）；５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、９９（Ｓ２）；１４６、１９２、２１７、２１８（Ｓ３）；９６、９７、９８、９９、１００、１６８、１６９、１７０、１７０Ａ、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、２１５、２１７、２２４（Ｓ４）を含む、任意の１つまたは複数の残基（キモトリプシン番号付けに基づく）中のものとすることができる。他の実施例では、パパインファミリープロテアーゼ中のアミノ酸残基の突然変異は、Ｐ２特異性に影響を及ぼす、６６〜６８、１３３、１５７、１６０、および／または２１５を含む、任意の１つまたは複数の残基中とすることができる（標準的なパパイン番号付け）。さらに、プロテアーゼ基質に直接接触しないが、接触残基（例えば上記に列挙された残基等）の位置および／またはコンホメーションに影響を及ぼす残基はまた、突然変異させて、プロテアーゼスカフォールドの特異性を変更することができる。
【０３２８】
補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数を標的にする修飾プロテアーゼを同定するために、例えばＭＴ−ＳＰ１スカフォールド等のプロテアーゼスカフォールドから生成された修飾プロテアーゼのライブラリーは、補体活性化の機能的アッセイにおいて試験される。補体活性化のためのアッセイは、本明細書中で記載され、任意の１つもしくは複数の溶血アッセイおよび／または１つもしくは複数の補体カスケードの活性化産物を検出するためのアッセイを含むことができる。例えば、酵素免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡは、例えばＣ４ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、およびＣ５−ｂ９等の、補体活性化の切断産物の存在を検出するために使用することができる。補体の活性化を阻害する修飾プロテアーゼ（溶血アッセイにより決定されるＣＨ５０レベルを増加させることまたは補体切断産物の検出を減少させることにより等）は、「ヒット」として同定することができる。一実施形態では、「ヒット」を組み合わせて、補体活性化を阻害するためのプロテアーゼの特異性および／または選択性をさらに増加させることができる。
【０３２９】
例えば修飾ＭＴ−ＳＰ１等の、機能的アッセイにおける補体活性化の阻害について「ヒット」と同定された修飾プロテアーゼは、補体タンパク質標的基質を決定するためにスクリーニングすることができる。補体タンパク質の切断を検出するためのアッセイは、本明細書中で記載される。一実施例では、精製補体タンパク質は、修飾プロテアーゼの存在または非存在下でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、分析し、分離することができ、タンパク質切断産物は、クーマシーブリリアントブルー等のタンパク質染色剤を用いて染色した後で検出することができる。切断産物は切り取ることができ、ペプチド切断配列は、Ｎ末端配列決定により決定することができる。修飾プロテアーゼのライブラリーを経験的に試験することにより決定されるように、同定されたペプチド切断配列を使用して、さらなる修飾プロテアーゼを、第Ｉ因子切断配列についての上記の合理的なアプローチを使用して、同定し、生成することができる。
【０３３０】
２．特異性を評価する方法
結果としてのスカフォールドまたは修飾プロテアーゼの基質特異性を評価する方法が本明細書中で提供される。一実施形態では、Ｓ１〜Ｓ４サブサイトのうちの任意の１つまたは複数の特異性は、上記に論じられるようなＡＣＣまたはＡＭＣ位置スキャンライブラリーを使用して決定することができる。他の実施形態では、非標的基質と比較した、標的基質についてのスカフォールドまたは修飾プロテアーゼの特異性は、単一基質カイネティックアッセイを使用して、決定することができ、例えばＨａｒｒｉｓら（２０００）ＰＮＡＳ、９７：７７５４を参照されたい。特異的な実施形態では、標的プロテアーゼおよびスカフォールドプロテアーゼの特異性の比較は、修飾プロテアーゼが、スカフォールドプロテアーゼと比較して、変更した、例えば増加した特異性を呈するかどうかを決定するために使用することができる。
【０３３１】
標的基質についてのプロテアーゼの特異性は、修飾プロテアーゼが、スカフォールドプロテアーゼと比較して、所与の活性でどれだけ多くの不同性の配列を切断するかを観察することにより、測定することができる。修飾プロテアーゼが、野生型プロテアーゼよりも少ない標的基質を切断する場合、修飾プロテアーゼは、スカフォールドプロテアーゼよりも高い特異性をそれらの標的基質について有する。標的基質についてのプロテアーゼの特異性は、非標的基質（つまりプロテアーゼの天然野生型基質配列）と比較した、標的基質の切断の特異性定数から決定することができる。標的基質対非標的基質についての修飾プロテアーゼの特異性定数の比により、プロテアーゼの切断の効率の比を決定することができる。修飾プロテアーゼおよびスカフォールドプロテアーゼの間の切断の効率の比の比較は、標的基質についての特異性において何倍変化したかを評価するために使用することができる。何倍変化したかは、補体活性化におけるまたは補体媒介性活性における所定の変更を達成するのに十分な、スカフォールドプロテアーゼと比較した、標的基質についての修飾プロテアーゼの特異性の増加である。標的基質対非標的基質についてのスカフォールドタンパク質の特異性と比較した場合、特異性は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、またはそれ以上とすることができる。
【０３３２】
一実施例では、所望の特異性プロファイルにマッチする修飾プロテアーゼは、位置スキャン基質ライブラリーを使用することにより決定されるように、非標的基質切断配列と比較して、所望の標的切断配列に対応する個々のペプチド基質を使用してアッセイし、特異性における大きさおよび変化を決定することができる。一実施形態では、個々のペプチド切断配列は、例えば本明細書中で記載されるＡＣＣまたはＡＭＣ蛍光発生脱離基等の蛍光発生タグ付き基質に付着させることができ、蛍光発生部分の遊離は、ペプチド切断配列についてのプロテアーゼの特異性の基準として決定することができる。非標的基質切断配列または標的切断配列の蛍光発光における増加率は、蛍光分光光度計の使用による等で測定することができる。蛍光発光における増加率は長い間にわたって測定することができる。ミカエリス−メンテン反応速度定数は、標準的な反応速度法により決定することができる。反応速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍ、およびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数対基質切断の速度の逆数をグラフで表し、ラインウィーバー−バーク式［１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；式中、Ｖｍａｘ＝［ＥＴ］ｋｃａｔ］にフィットさせることにより算出することができる。特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、基質が、特定のプロテアーゼによりどれくらい切られるかの基準となる。
【０３３３】
一実施形態では、非標的基質切断配列は、野生型ＭＴ−ＳＰ１により認識される切断配列等の天然基質切断配列とすることができる。例えば、ＭＴ−ＳＰ１の効率的な自己活性化は、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ  Ｐ４〜Ｐ１標的配列の認識および切断を必然的に伴う。ＭＴ−ＳＰ１はまた、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）、一本鎖ｕＰＡ、および肝細胞成長因子／分散因子を効率的に活性化することもできる。これらの細胞外表面局在タンパク質は、Ｐ４〜Ｐ１標的配列Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをそれぞれ示し、標的配列は、小さなペプチド基質について観察されたＭＴ−ＳＰ１切断特異性に必要なものに非常にマッチする。一実施形態では、ＲＱＡＲ（配列番号４０１）またはＳＬＧＲ（配列番号３９２）またはＰＲＦＫ（配列番号４０２）またはＫＱＧＲ（配列番号４０３）の蛍光発生タグ付きテトラペプチドは、非標的基質切断配列として使用することができる。
【０３３４】
他の実施形態では、補体タンパク質の切断配列のうちの任意の１つまたは複数は、決定し、所望の標的切断配列として使用することができる。例えば、ＳＬＬＲ（配列番号３８９）、ＬＰＳＲ（配列番号３８８）、およびＨＲＧＲ（配列番号３９０）等の第Ｉ因子切断配列のうちの任意の１つまたは複数は、蛍光発生タグ付きテトラペプチド標的切断配列として使用することができる。他の実施例では、任意の１つまたは複数の野生型プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼにより標的にされる補体タンパク質における所望の切断配列は、プロテアーゼによる補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数の切断の際に切断産物をＮ末端で配列決定することにより、経験的に決定することができる。上記実施例では、本明細書中で提供されるプロテアーゼの標的切断配列として同定された切断配列のうちの任意の１つまたは複数は、使用することができ、実施例３に記載される切断配列を含む。したがって、例えば、ＧＡＴＲ（配列番号３９１）、ＳＬＧＲ（配列番号３９２）、ＶＦＡＫ（配列番号３９３）、ＲＥＦＫ（配列番号３９４）、ＱＨＡＲ（配列番号３９８）、ＧＬＡＲ（配列番号３９５）、ＲＬＧＲ（配列番号３９６）、ＡＥＧＫ（配列番号３９７）、またはＨＲＧＲ（配列番号３９０）の蛍光発生タグ付きテトラペプチドは、標的基質切断配列として使用することができる。
【０３３５】
さらなる実施形態では、完全長補体タンパク質は、プロテアーゼの完全長天然標的基質と比較して、プロテアーゼ特異性をアッセイするための標的基質として使用することができる。さらに、完全長補体タンパク質は、基質特異性および完全長標的基質対標的基質内に含有される４つのアミノ酸Ｐ１〜Ｐ４基質切断配列のプロテアーゼによる切断の間の相互関係を評価するために使用することができる。一実施例では、完全長Ｃ２タンパク質は、特異性を評価するために、プロテアーゼのうちの任意の１つまたは複数の所望の切断標的として使用することができる。本実施例では、修飾プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼによるＣ２の切断は、他の完全長基質の切断と比較することができるまたは切断は、実施例１１に記載される切断配列（つまりＧＡＴＲ、ＳＬＧＲ、またはＶＦＡＫ）等のＣ２の蛍光発生テトラペプチド切断配列と比較することができる。プロテアーゼによる完全長タンパク質の切断の特異性定数は、プロテアーゼの存在下でインキュベートした完全長標的基質バンドの変化を長い間にわたり濃度測定において評価するゲル濃度測定を使用することにより、決定することができる。
【０３３６】
３．プロテアーゼポリペプチド
本明細書中で記載される方法を使用して、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数を切断するプロテアーゼが提供され、それによって、補体タンパク質の切断は、補体活性化を阻害する。本明細書中で提供されるように、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数を切断するプロテアーゼポリペプチドは、非補体プロテアーゼである。プロテアーゼポリペプチドは、配列が配列番号２、４、８、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、５４４、５４５、５４７、５４７、５４９、および５５１のいずれか１つまたはその触媒活性部分等の、本明細書中で提供される、スカフォールドプロテアーゼのアミノ酸配列を含むことができる。例えば、スカフォールドプロテアーゼは、プロテアーゼの野生型形態または顕著な形態とすることができる。他の実施形態では、スカフォールドプロテアーゼは、プロテアーゼの対立遺伝子変異体とすることができる。スカフォールドプロテアーゼポリペプチド配列はまた、ハムスター、マウス、ラット、雌ウシ、サル、オランウータン、ヒヒ、チンパンジー、マカク、テナガザル、またはゴリラ起源のうちの任意の１つまたは複数からのものとすることができるが、スカフォールドプロテアーゼは、哺乳動物起源、特にヒト起源とする。他の実施形態では、スカフォールドプロテアーゼは、植物または寄生生物から等の非哺乳動物起源からのものとすることができる。
【０３３７】
一実施形態では、プロテアーゼスカフォールドは、スカフォールドプロテアーゼと比較して、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性を増加させるよう修飾され、一方、プロテアーゼスカフォールドは、そのプロテアーゼ活性を維持するタンパク質をなおコードしている。修飾プロテアーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の修飾位置を有するものを含む。一般に、修飾プロテアーゼは、配列中の特定の位置の残基が、他のアミノ酸により置換された任意の変異体を含み、野生型プロテアーゼタンパク質の２つの残基の間に付加的な１つまたは複数の残基を挿入する可能性および野生型プロテアーゼ配列から１つまたは複数の残基を欠失させる可能性をさらに含む。野生型プロテアーゼ配列の任意のアミノ酸の置換、挿入、または欠失が本明細書中で提供される。
【０３３８】
スカフォールドプロテアーゼの完全長配列を含有するが、基質特異性および／または選択性に寄与する任意の１つまたは複数のアミノ酸中に修飾を含有する修飾ポリペプチドが本明細書中で提供される。一実施形態では、本明細書中で提供される修飾プロテアーゼポリペプチドは、スカフォールドプロテアーゼと比較して、任意の１つまたは複数の補体タンパク質についての基質特異性および／または選択性を増加させ、それによって、補体タンパク質の切断は補体活性化を阻害する。他の実施形態では、修飾プロテアーゼポリペプチドは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲと比較して、補体タンパク質の切断について、より高い特異性を有する。さらなる実施形態では、本明細書中で提供される修飾プロテアーゼは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを切断しない。さらに、基質特異性および／または選択性に寄与する任意の１つまたは複数のアミノ酸中に修飾を含有する、本明細書中で提供される修飾プロテアーゼポリペプチドはまた、プロテアーゼの基質特異性に非必須の領域において他の修飾を含有することもできる。
【０３３９】
本明細書中で提供される修飾プロテアーゼポリペプチドはまた、完全長スカフォールドまたは無修飾プロテアーゼの触媒活性部分を含有することができる。ポリペプチドが触媒活性部分を含む場合、結果としてのポリペプチドが、プロテアーゼ活性を、完全長ポリペプチドの少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、またはそれ以上呈する限り、ポリペプチドは、それに加えて他の非プロテアーゼ部分を含むことができる。さらに、触媒活性部分は、完全長よりも少なくとも１アミノ酸少なく、プロテアーゼ活性が保持される限り、完全長プロテアーゼドメインよりも少ないものとすることができる。基質特異性に寄与する任意の１つまたは複数のアミノ酸中に修飾を含有するプロテアーゼの触媒活性部分は、スカフォールドプロテアーゼの活性一本鎖形態または活性二本鎖形態とすることができる。いくつかの実施形態では、修飾プロテアーゼは、融合タンパク質中等でＮ−またはＣ末端のいずれかで他のポリペプチド中に置換することができる。さらなる実施形態では、例えば修飾プロテアーゼのその触媒活性部分等の修飾ポリペプチドプロテアーゼを挿入し、他のプロテアーゼからのプロテアーゼドメインと交換することができる。
【０３４０】
配列番号２９８、２９９、３００、３０２、３０４、３０５、３０６、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４４、６６０〜６６２のいずれか１つまたは補体活性を呈するその断片に包含されるアミノ酸の配列を有する任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性の増加を呈するプロテアーゼが本明細書中で提供される。
【０３４１】
ａ．ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド
補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数を切断し、それによって、補体タンパク質の切断は、補体活性化を阻害するＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供される。本明細書中で提供されるＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、完全長ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド（配列番号２）とすることができるまたは触媒活性を呈する完全長ＭＴ−ＳＰ１の断片または部分配列とすることができる。一実施例では、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、ＭＴ−ＳＰ１の一本鎖プロテアーゼドメインとすることができる（配列番号１０）。他の実施形態では、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号４４８に記載されるＭＴ−ＳＰ１の対立遺伝子変異体のうちの任意の１つまたは複数とすることができる。
【０３４２】
本明細書中で記載されるいずれか１つの方法を使用した、スカフォールドＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドの任意の１つまたは複数のアミノ酸中に修飾を含有する、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドもまた本明細書中で提供される。一実施形態では、修飾を、配列番号２に記載されるスカフォールドＭＴ−ＳＰ１においてすることができる、または例えば配列番号４４８に記載される対立遺伝子変異体のいずれか１つ等の、野生型ＭＴ−ＳＰ１の任意の対立遺伝子変異体においてすることができる。本明細書中で提供される修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドの完全長配列を構成することができるまたは完全長ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドプロテアーゼのその触媒活性部分を構成することができる。修飾ＭＴ−ＳＰ１は、ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドと比較して、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数に対して特異性および／または選択性における増加を呈し、それによってタンパク質の切断は補体活性化を阻害する。
【０３４３】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の修飾位置を有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供される。一実施形態では、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、ＭＴ−ＳＰ１の拡張された基質結合ポケット中に任意の１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を含み、例えば、キモトリプシン番号付けに基づいた、１９５、１０２、５７（触媒三連構造）；１８９、１９０、１９１、１９２、２１６、および２２６（Ｓ１）；５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、９９（Ｓ２）；１４６、１９２、２１７、２１８（Ｓ３）；９６、９７、９８、９９、１００、１６８、１６９、１７０、１７０Ａ、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、２１５、２１７、２２４（Ｓ４）の任意の１つまたは複数のアミノ酸残基の修飾を含む。基質特異性および／または選択性を変更するためのＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメイン中の修飾はまた、キモトリプシン番号付けに基づいた４１、６０ｃ、１４３、１４７、１５１、または２２１ａの任意の１つまたは複数のアミノ酸残基の修飾を含む。
【０３４４】
以下のアミノ酸残基が、ＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメイン中で、任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断についての特異性および／または選択性を増加させるとして同定され、それによって補体活性化を阻害した修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供される：キモトリプシン番号付けに基づいた４１、６０ｃ、９７、１４３、１４６、１４７、１５１、１７２、１７５、１９２、２１７、２２１ａ、および２２４。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号２の野生型ＭＴ−ＳＰ１または配列番号１０に記載されるその触媒活性部分と比較して、任意の１つまたは複数の補体成分への特異性および／または選択性の増加を呈する。したがって、任意の１つまたは複数の補体成分への特異性および／または選択性の増加を呈し、キモトリプシン番号付けに基づいた配列番号２または配列番号１０に記載されるＭＴ−ＳＰ１中のＩ４１、Ｒ６０ｃ、Ｆ９７、Ｈ１４３、Ｙ１４６、Ｇ１４７、Ｇ１５１、Ｌ１７２、Ｑ１７５、Ｑ１９２、Ｄ２１７、Ｑ２２１ａ、またはＫ２２４の中から選択される任意の１つまたは複数のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置で修飾を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供される。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸交換は、以下の位置のいずれかに対応する：キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメインのＩ４１Ｔ、Ｉ４１Ａ、Ｉ４１Ｌ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｄ、Ｉ４１Ｅ、Ｒ６０ｃＤ、Ｒ６０ｃＷ、Ｆ９７Ｄ、Ｆ９７Ｅ、Ｆ９７Ａ、Ｆ９７Ｗ、Ｈ１４３Ｖ、Ｙ１４６Ｎ、Ｙ１４６Ｄ、Ｙ１４６Ｅ、Ｙ１４６Ａ、Ｙ１４６Ｗ、Ｙ１４６Ｒ、Ｙ１４６Ｆ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１５１Ｌ、Ｌ１７２Ｎ、Ｑ１７５Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｑ１７５Ｈ、Ｑ１７５Ｌ、Ｑ１７５Ｆ、Ｑ１７５Ｗ、Ｑ１７５Ｙ、Ｑ１７５Ｒ、Ｑ１７５Ｋ、Ｑ１９２Ａ、Ｑ１９２Ｒ、Ｑ１９２Ｖ、Ｑ１９２Ｆ、Ｄ２１７Ｆ、Ｑ２２１ａＤ、Ｑ２２１ａＬ、Ｑ２２１ａＥ、Ｋ２２４Ａ、Ｋ２２４Ｌ、Ｋ２２４Ｒ、Ｋ２２４Ｎ、Ｋ２２４Ｔ、Ｋ２２４Ｙ、Ｋ２２４Ｓ、およびＫ２２４Ｆ。表１６は、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性を増加させるアミノ酸交換の非限定的な例を提供し、例示的なポリペプチド配列およびコード核酸配列についての配列番号を含む。
【０３４５】
【表１６】
0005860789.tif 000025
【０３４６】
以下のアミノ酸残基が、ＭＴ−ＳＰ１の基質結合部位Ｓ１〜Ｓ４中で、ＳＬＬＲ／ＳＥ第Ｉ因子切断配列を含有する、任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断についての特異性および／または選択性を増加させるとして同定され、それによって補体活性化を阻害した修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドもまた本明細書中で提供される：キモトリプシン番号付けに基づいた９６、１７４、２１７、１４６、１９２、および９９。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号２の野生型ＭＴ−ＳＰ１または配列番号１０に記載されるその触媒活性部分の天然標的基質と比較して、Ｃ３ｂまたはｉＣ３補体タンパク質基質への特異性および／または選択性の増加を呈する。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸交換は、以下の位置のいずれかに対応する：キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメインのＤ９６Ａ、Ｄ９６Ｖ、Ｄ９６Ｆ、Ｄ９６Ｓ、Ｄ９６Ｔ、Ｑ１７４Ｈ、Ｄ２１７Ｑ、Ｄ２１７Ｎ、Ｄ２１７Ｈ、Ｑ１９２Ｌ、Ｑ１９２Ｉ、Ｑ１９２Ｆ、Ｆ９９Ａ、Ｆ９９Ｖ、Ｆ９９Ｓ、またはＦ９９Ｇ。表１７は、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性を増加させるアミノ酸交換の非限定的な例を提供し、例示的なポリペプチド配列およびコード核酸配列についての配列番号を含む。
【０３４７】
【表１７】
0005860789.tif 000026
【０３４８】
以下のアミノ酸残基が、ＭＴ−ＳＰ１の基質結合部位Ｓ１〜Ｓ４中で、ＬＰＳＲ／ＫＩ第Ｉ因子切断配列を含有する、任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断についての特異性および／または選択性を増加させるとして同定され、それによって、補体活性化を阻害した修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドもまた本明細書中で提供される：キモトリプシン番号付けに基づいた１７４、１８０、２１５、１９２、および９９。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号２の野生型ＭＴ−ＳＰ１または配列番号１０に記載されるその触媒活性部分の天然標的基質と比較して、Ｃ３ｂまたはｉＣ３補体タンパク質基質への特異性および／または選択性の増加を呈する。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸交換は、以下の位置のいずれかに対応する：キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメインのＱ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｌ、Ｑ１７４Ｙ、Ｍ１８０Ｅ、Ｗ２１５Ｆ、Ｗ２１５Ｙ、Ｑ１９２Ｋ、Ｑ１９２Ｒ、Ｑ１９２Ｙ、またはＦ９９Ｙ。表１８は、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性を増加させるアミノ酸交換の非限定的な例を提供し、例示的なポリペプチド配列およびコード核酸配列についての配列番号を含む。
【０３４９】
【表１８】
0005860789.tif 000027
【０３５０】
以下のアミノ酸残基が、ＭＴ−ＳＰ１の基質結合部位Ｓ１〜Ｓ４中で、ＨＲＧＲ／ＴＬ第Ｉ因子切断配列を含有する、任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断についての特異性および／または選択性を増加させるとして同定され、それによって、補体活性化を阻害した修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドもまた本明細書中で提供される：キモトリプシン番号付けに基づいた１７４、２１５、１９２、２１７、および９９。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号２の野生型ＭＴ−ＳＰ１または配列番号１０に記載されるその触媒活性部分の天然標的基質と比較して、Ｃ４ｂまたはｉＣ４補体タンパク質基質への特異性および／または選択性の増加を呈する。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸交換は、以下の位置のいずれかに対応する：キモトリプシン番号付けに基づいたＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメインのＷ２１５Ｆ、Ｗ２１５Ｙ、Ｑ１７４Ａ、Ｑ１７４Ｖ、Ｑ１７４Ｆ、Ｑ１７４Ｒ、Ｑ１７４Ｋ、Ｄ２１７Ａ、Ｄ２１７Ｖ、Ｑ１９２Ｅ、Ｆ９９Ｗ、およびＦ９９Ｙ。表１９は、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性を増加させるアミノ酸交換の非限定的な例を提供し、例示的なポリペプチド配列およびコード核酸配列についての配列番号を含む。
【０３５１】
【表１９】
0005860789.tif 000028
【０３５２】
一実施形態では、修飾プロテアーゼは、例えば複数のプロテアーゼの特異性を獲得するために等で組み合わせることができる。プロテアーゼスカフォールドのある残基での突然変異は、基質配列のある部位での特異性をもたらし、プロテアーゼスカフォールド配列の他の部位で他の突然変異と同じプロテアーゼ中で組み合わせ、特異性が組み合わせられたプロテアーゼを作製することができる。同じプロテアーゼスカフォールド上の別個の部位での任意の数の突然変異は、特異性が組み合わせられたプロテアーゼを作り出すために使用することができる。修飾プロテアーゼは、プロテアーゼの基質特異性および／または選択性に寄与することが同定された任意の２つ以上の突然変異を組み合わせることにより、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の突然変異を含有することができる。
【０３５３】
例えば、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは、上記の任意の２つ以上の突然変異等の任意の２つ以上の突然変異を含有し、組合せプロテアーゼを生成することができる。キモトリプシン番号付けに基づいた位置４１、６０ｃ、９６、９７、９９、１４３、１４６、１４７、１５１、１７２、１７４、１７５、１９２、２１５、２１７、２２１ａ、および２２４のいずれかに対応する２つ以上の修飾を有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供される。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号２のスカフォールドＭＴ−ＳＰ１もしくは野生型ＭＴ−ＳＰ１または配列番号１０に記載されるその触媒活性部分と比較して、任意の１つまたは複数の補体成分に対する特異性および／または選択性の増加を呈する。したがって、任意の１つまたは複数の補体成分への特異性および／または選択性の増加を呈し、キモトリプシン番号付けに基づいた配列番号２または配列番号１０に記載されるＭＴ−ＳＰ１中のＩ４１、Ｒ６０ｃ、Ｄ９６、Ｆ９７、Ｆ９９、Ｈ１４３、Ｙ１４６、Ｇ１４７、Ｇ１５１、Ｌ１７２、Ｑ１７４、Ｑ１７５、Ｑ１９２、Ｗ２１５、Ｄ２１７、Ｑ２２１ａ、またはＫ２２４の中から選択される任意の２つ以上のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置で２つ以上の修飾を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供される。いくつかの実施例では、２つ以上の修飾を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１は、位置Ｙ１４６およびＫ２２４の一方または両方で修飾を含有する。他の実施例では、２つ以上の修飾を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１は、位置Ｇ１５１で修飾を含有する。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、本明細書中で開示される方法のいずれかを使用して生成することができる。表２０は、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性を増加させるアミノ酸交換の非限定的な例を提供し、例示的なポリペプチド配列およびコード核酸配列についての配列番号を含む。
【０３５４】
【表２０−１】
0005860789.tif 000029
【０３５５】
【表２０−２】
0005860789.tif 000030
【０３５６】
修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが本明細書中で提供され、交換（複数可）は、配列番号２に記載されるアミノ酸の配列を有するＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドスカフォールド中で成され、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、無修飾タンパク質と比較して、任意の１つまたは複数の補体成分に対する特異性および／または選択性の増加を呈する。配列番号１０に記載されるアミノ酸の配列を有するＭＴ−ＳＰ１スカフォールド中に交換（複数可）を含有する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドもまた本明細書中で提供され、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、無修飾タンパク質と比較して、任意の１つまたは複数の補体成分に対する特異性および／または選択性の増加を呈する。上記ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドポリペプチドは、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドのその触媒活性部分である。完全長ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドのその触媒活性部分の修飾（複数可）を含有する、本明細書中で提供される例示的な修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０〜６９、５２４〜５２８、５５２〜６０５、６７２〜６８０、または６９６〜７１０のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を有する。完全長ＭＴ−ＳＰ１スカフォールドの修飾（複数可）を含有する、本明細書中で提供される例示的な修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号４０４〜４１８〜４４７、５２９〜５３３、６０６〜６５９、６６３〜６７１、または６８１〜６９５のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を有する。
【０３５７】
Ｅ．補体媒介性機能に関する修飾プロテアーゼ活性を評価するまたは監視するためのアッセイ
修飾プロテアーゼは、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性の変更を呈し、それによって、補体タンパク質の対応する完全長形態、スカフォールド形態、または野生型形態と比較して、任意の１つまたは複数の補体タンパク質を不活性化することができる。修飾プロテアーゼは、それらのプロテアーゼ活性を保持するが、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性の増加を呈することができる。例示的なプロテアーゼは、任意の１つまたは複数の補体タンパク質をとりわけ切断し、それによって、補体タンパク質の活性を変更する。任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性の増加を有するすべての上記スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、治療用物質候補となる。
【０３５８】
プロテアーゼが、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対する特異性および／または選択性の増加を呈する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、補体媒介性機能上の効果についてプロテアーゼを監視するまたはスクリーニングするために使用することができる。上記アッセイは、当業者によく知られている。当業者は、任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断について特定のスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを試験することができるおよび／または、プロテアーゼの非存在下と比較して、補体媒介性活性に対するプロテアーゼの効果における任意の変化を評価するために試験することができる。いくつかの上記アッセイは本明細書中で例示される。
【０３５９】
例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、任意の１つまたは複数の標的にされた補体タンパク質の機能に対するスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの活性の比較のために本明細書中で提供される。アッセイの多くが、他のプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼに適用可能である。さらに、補体活性化を測定するためのアッセイ等の多数のアッセイが当業者に知られている。補体の活性のためのアッセイは、例えばＣ５ｂ−９ＭＡＣ複合体等の補体活性化の活性化産物ならびにＣ４ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂ、およびＣ３ｄ等の補体切断産物のうちの任意の１つまたは複数の生成を測定するアッセイを含むが、これらに限定されない。補体活性化を測定するためのアッセイはまた、古典経路、レクチン経路、または代替経路のいずれか１つの活性化を測定するために使用される、例えば溶血アッセイ等の、補体経路の特異的成分の機能的活性を測定する機能的アッセイも含む。補体タンパク質に対するプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼの効果および／または補体媒介性機能を評価するためのアッセイは、ＳＤＳ分析とその後に続くウェスタンブロットまたはクーマシーブリリアントブルー染色、酵素免疫アッセイ、および溶血アッセイを含むが、これらに限定されない。一実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、精製補体タンパク質を使用して行うことができる。他の実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、哺乳動物またはヒト種を含む種の血清を補体の機能的活性化について試験することにより行うことができる。例示的なアッセイを以下に記載する。
【０３６０】
ａ．タンパク質検出
タンパク質検出は、サンプル中の個々の補体成分を測定するための手段である。補体タンパク質は、タンパク質の切断の際のスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの効果を直接評価するために検出することができるまたは、代わりに、補体タンパク質は、補体活性化について評価するための手段として測定することができる。スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの存在下または非存在下で処置された補体タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後に続くクーマシー染色またはウェスタンブロット、酵素免疫アッセイ、免疫組織化学、フローサイトメトリー、比濁法、寒天ゲル拡散法、または放射状免疫拡散法を含む任意の１つまたは複数のアッセイにより分析することができる。タンパク質検出のための例示的なアッセイを以下に記載する。
【０３６１】
ｉ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
濃度が増加するスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの存在下または非存在下での補体タンパク質の分析は、それらのタンパク質の検出が後に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質の分析により行うことができる。上記実施例では、補体タンパク質は、クーマシーブリリアントブルー染色、銀染色による等の全タンパク質について染色することによりまたは当業者に知られている任意の他の方法によりまたは特定のタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより検出することができる。典型的に、例えば補体経路に関与するタンパク質のうちの任意の１つまたは複数等の精製補体タンパク質はスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼ存在下または非存在下でインキュベートすることができる。処置した補体タンパク質は、ゲル中でタンパク質を検出するための方法、例えばクーマシーブリリアントブルーを用いた染色が後に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離することができる。処置したタンパク質は、その同起源の完全長タンパク質と比較することができ、タンパク質のプロテアーゼ切断により形成された分解産物を決定することができる。
【０３６２】
他の実施形態では、例えばヒト血清もしくは血漿等のサンプルは、スカフォールドプロテアーゼもしくは修飾プロテアーゼの存在下もしくは非存在下で処置することができるまたはプロテアーゼありもしくはなしでの動物もしくはヒトの処置の後に、収集することができる。プロテアーゼ処置サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析することができ、例えばＣ１ｑ、ＭＢＬ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＢ因子等の特異的な補体タンパク質は、タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより検出することができる。補体タンパク質の切断は、プロテアーゼで処置しなかったサンプルと比較することができる。さらに、サンプルは、古典経路の活性化を刺激するＩｇＧを用いたインキュベーションによりまたは代替経路の活性化を刺激するＬＰＳによる等で、補体活性化を開始するよう刺激することができる。サンプルは、天然補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数の検出のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、プロテアーゼで処置していないタンパク質のサンプルと比較した、特定のタンパク質の切断産物の存在または非存在を決定することができる。上記実施例では、天然補体タンパク質の切断エフェクター分子もまた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより分析し、補体経路のうちの１つまたは複数の活性化を評価することができる。補体エフェクター分子の例は、Ｃ３ａ、Ｃ３ｄ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４ｄ、Ｂｂ、およびＣ５−ｂ９を含むことができるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ４ｄの、サンプル中での発現の減少により、スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼが、補体の古典経路またはレクチン経路のうちの１つまたは複数の活性化を阻害したということを示すことができる。他の実施例では、Ｂｂの、サンプル中での発現の減少により、スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼが、補体の代替経路の活性化を阻害したということを示すことができる。エフェクター分子の切断産物はまた、補体エフェクター分子自体の切断に対する、濃度が増加するスカフォールドまたは修飾プロテアーゼの効果を評価するために決定することができる。
【０３６３】
ｉｉ．酵素免疫アッセイ
酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ；酵素連結免疫吸着アッセイ；ＥＬＩＳＡとも呼ばれる）は、サンプル中のタンパク質の存在を測定するために使用されるアッセイである。典型的に、タンパク質の測定は、抗体に対するタンパク質の結合の間接的な測定であり、抗体自身は、化学的に、酵素または蛍光化合物等の検出可能な基質を用いて標識される。ＥＩＡアッセイは、補体活性化の後で生成される補体エフェクター分子の存在について測定することにより、補体活性化に対するスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの効果を測定するために使用することができる。上記実施例では、例えばヒト血清または血漿等のサンプルは、濃度が増加するスカフォールドまたは修飾プロテアーゼの存在下または非存在において前処置し、引き続いて、開始分子を用いたインキュベーションにより、活性化し、補体活性化を誘起することができるまたはプロテアーゼを用いた動物またはヒトの処置の後で収集することができる。例えば、古典経路は、ＩｇＧを用いたインキュベーションにより活性化することができ、代替経路は、ＬＰＳを用いたサンプルのインキュベーションにより活性化することができる。レクチン経路に特異的な補体活性化アッセイは、レクチン経路のＣ４／Ｃ２切断活性は補体の古典経路と共有されるので、補体の古典経路が阻害されることが必要とされる。古典経路の阻害は、免疫複合体に対するＣ１ｑの結合を阻害し、Ｃ１複合体を破壊する高イオン強度緩衝液を使用して達成することができるのに対して、高イオン強度緩衝液は、ＭＢＬの炭水化物結合活性に影響を及ぼさない。結果的に、レクチン経路の活性化は、１Ｍ  ＮａＣｌの存在下でのマンナンコーティング表面を用いた、ヒト血清または血漿等のサンプルのインキュベーションにより誘起することができる。
【０３６４】
活性化の後で、サンプルは、経路の継続的な活性化を最小限にするためにペファブロック（Ｒｏｃｈｅ社）およびＥＤＴＡの追加で止めることができる。サンプルは、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡアッセイにより、補体エフェクター分子の存在について分析することができる。補体タンパク質を測定するためのＥＩＡアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイは当業者によく知られている。任意の補体活性化産物を評価することができる。補体活性化の測定のための例示的な補体活性化産物は、ｉＣ３ｂ、Ｂｂ、Ｃ４ｄ、Ｃ５ｂ−９、Ｃ３ａ、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ４ａ−ｄｅｓＡｒｇ、およびＣ５ａ−ｄｅｓＡｒｇを含む。活性化された補体経路は、測定された補体活性化産物に依存して決定することができる。例えば、Ｂｂ切断産物の測定は代替経路の特有のマーカーである。
【０３６５】
いくつかの実施例では、ＥＩＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後に続く特異的な補体成分の同定のためのウェスタンブロット分析によるプロテアーゼ処置の補体刺激サンプルの分析による切断された補体タンパク質の検出と対とすることができる。濃度測定ソフトウェアを使用して、補体産物の切断は、アッセイを通して切断された完全長補体成分と比較することができ、すべての主要な分解産物の出現および切断百分率を決定することができる。
【０３６６】
ｉｉｉ．放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）
放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）は、注がれた時にアガロースゲル中に組み入れられた抗体および試験サンプル中に存在する抗原の間で形成され、サンプルウェルのまわりに円形の沈降素ラインをもたらす免疫複合体の沈降に頼る技術である。沈降素の輪の直径は、試験サンプル中に存在する抗体（または抗原）の濃度に比例する。知られている標準物質と試験体の沈降素の輪の直径を比較することにより、特異的な抗体または抗原の濃度の推定を、比較的感度が低いが、達成することができる。ＲＩＤは、サンプル中の補体タンパク質の量を測定するために使用することができる。例えば、例えばヒト血清または血漿等のサンプルは、濃度が増加するスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの存在下または非存在下で処置することができる。プロテアーゼ処置サンプルは、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、またはＢ因子を含むが、これらに限定されないような補体タンパク質のいずれか１つに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を組み入れるために作製された、アガロースゲルのウェルに追加することができる。０．１５ＭのＮａＣｌに対する暴露による非沈降タンパク質の除去の後に、沈降タンパク質の輪は、例えばクーマシーブリリアントブルー等のタンパク質染料を用いて染色することによりまたはクラウル二重染色（Ｃｒｏｗｌｅｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔａｉｎ）により評価することができる。
【０３６７】
ｂ．溶血アッセイ
機能的溶血アッセイは、全体としての補体機能についての情報を提供する。この種のアッセイは、抗体感作または抗体非感作ヒツジ赤血球を使用する。溶血アッセイは、完全溶血性補体アッセイ（ＣＨ５０）を含み、完全溶血性補体アッセイは、古典経路およびＭＡＣがヒツジＲＢＣを溶解させる能力を測定する。それは、細胞性抗原−抗体複合体を作製するために最適な量のウサギ抗ヒツジ赤血球抗体を用いて感作されたヒツジ赤血球を溶解するための古典経路成分（Ｃ１〜Ｃ９）の連続的な活性化に依存する。溶血アッセイはまた、代替経路ＣＨ５０アッセイ（ウサギＣＨ５０またはＡＰＣＨ５０）を含むことができ、代替経路ＣＨ５０アッセイは、代替経路およびＭＡＣがウサギＲＢＣを溶解する能力を測定する。ＣＨ５０および／またはＡＰＣＨ５０の１ユニットは、試験中の赤血球の５０％を溶解させるのに必要とされる血清の含量または希釈度として定義される。典型的に、補体活性化を評価するために、例えばヒト血清またはヒト血漿等のサンプルは、濃度が増加するスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの存在下または非存在で処置することができるまたはプロテアーゼの存在下または非存在下で動物またはヒトの処置の後で収集することができる。プロテアーゼ処置サンプルは、引き続いてＩｇＧを用いて活性化されたまたは感作されたヒツジの赤血球と混合することができる。ヒツジ赤血球と混合した水のみのサンプルは、分析されたサンプルの溶解パーセントを厳密に評価するために、完全溶解コントロールとして役割を果たすことができる。０．１５Ｍ  ＮａＣｌは、溶解反応を停止させるためにサンプルに追加することができる。補体経路の終末成分の活性化により誘起された赤血球の溶解は、ヘモグロビンの遊離を測定することにより評価することができる。測定は、４１５ｎｍのＯＤで分光光度計を使用した、サンプルの光学密度（ＯＤ）読み取りによるものとすることができる。
【０３６８】
一実施形態では、限界希釈溶血アッセイは、いずれの経路の特異的成分の機能的活性をも測定するために使用することができる。上記アッセイでは、全補体成分を過剰に有するが、サンプル中で測定されている補体が欠損した血清源が使用される、つまり、培地または血清源は、特異的なタンパク質についての補体が欠乏している。したがって、溶血の程度は、試験サンプル中の測定された成分の存在に依存的である。上記アッセイでは、例えば、Ｃ１ｑ、ＭＢＬ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５を含むが、これらに限定されない天然補体タンパク質のいずれか１つ等の精製補体タンパク質は、濃度が増加するスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの存在下または非存在下でインキュベートすることができる。次いで、プロテアーゼ処置精製補体タンパク質は、補体欠乏培地または血漿およびＩｇＧ活性化ヒツジ赤血球と混合することができ、サンプルの溶血を、上記のように評価することができる。他の実施形態では、プロテアーゼ処置サンプルの溶血活性についてのアッセイおよび引き続いて、例えばクーマシーブルー等のタンパク質染色剤を用いた染色が後に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのサンプルの分析により、プロテアーゼ切断は補体活性化と相互に関連させることができる。プロテアーゼを用いて処置した精製補体タンパク質は、切断およびアッセイを通して切断された完全長補体成分の百分率について評価することができ、すべての主要な分解産物の出現を算出することができる。代わりに、プロテアーゼ処置補体タンパク質の分析はウェスタンブロットによるものとすることができる。
【０３６９】
溶血アッセイの代替は、リポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）と呼ばれ、古典経路の活性化を評価するために使用することができる。ＬＩＡ（Ｗａｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ社、リッチモンド、Ｖａ．）は、酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有するジニトロフェニル（ＤＮＰ）コーティングリポソームを活用する。血清が、リポソームならびに抗ＤＮＰ抗体、グルコース−６−リン酸、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含有する基質と混合されると、活性化されたリポソームが溶解し、全古典補体活性に比例する、酵素による比色反応が生じる。
【０３７０】
Ｆ．プロテアーゼをコードする核酸を産生する方法およびプロテアーゼポリペプチドを産生する方法
修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含むプロテアーゼポリペプチドまたはそのドメインは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現についての、当技術分野で知られている方法により得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。当技術分野で入手可能な任意の方法が、細胞または組織源から等のプロテアーゼタンパク質をコードする完全長（つまり全コード領域を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得るために使用することができる。修飾プロテアーゼは、本明細書中で記載されるように、スカフォールドプロテアーゼまたは野生型プロテアーゼから、特定部位の突然変異誘発による等で操作することができる。
【０３７１】
プロテアーゼは、核酸分子のクローニングおよび単離についての、当技術分野で知られている任意の入手可能な方法を使用してクローン化するまたは単離することができる。上記方法は、核酸のＰＣＲ増幅ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング、および活性ベースのスクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングを含む。
【０３７２】
核酸の増幅のための方法は、プロテアーゼをコードする核酸分子を単離するために使用することができ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む。核酸含有物質が、プロテアーゼコード核酸分子を単離することができる出発物質として使用することができる。例えばＤＮＡおよびｍＲＮＡの調製物、細胞抽出物、組織抽出物、液サンプル（例えば血液、血清、唾液）、健常および／または病気の対象からのサンプルは、増幅方法において使用することができる。核酸ライブラリーもまた、出発物質の源として使用することができる。プライマーは、プロテアーゼを増幅させるよう設計することができる。例えば、プライマーは、プロテアーゼが生成される発現配列に基づいて設計することができる。プライマーは、プロテアーゼアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅により生成された核酸分子は、配列を決定し、プロテアーゼをコードすることを確認することができる。
【０３７３】
付加的なヌクレオチド配列は、プロテアーゼコード核酸分子に加えることができ、ベクター、例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクター中に合成遺伝子をクローニングする目的で制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含む。さらに、機能的ＤＮＡ要素を特定する付加的なヌクレオチド配列を、プロテアーゼコード核酸分子に効果的に連結させることができる。上記配列の例は、細胞内タンパク質発現を容易にするよう設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を容易にするよう設計された分泌配列を含むが、これらに限定されない。タンパク質結合領域を特定する配列等の付加的なヌクレオチド配列もまた、プロテアーゼコード核酸分子に連結させることができる。上記領域は、特異的標的細胞中へのプロテアーゼの取り込みを容易にするまたはその他の場合では合成遺伝子の薬物動態を増強させる配列を含むが、これらに限定されない。
【０３７４】
次いで、同定され、単離された核酸は、適切なクローニングベクター中に挿入することができる。当技術分野で知られているたくさんのベクター宿主系を使用することができる。可能性として考えられるベクターは、プラスミドまたは修飾ウイルスを含むが、これらに限定されない、しかしベクター系は、使用される宿主細胞と適合性がなければならない。上記ベクターは、ラムダ誘導体等のバクテリオファージまたはｐＢＲ３２２プラスミド誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体等のプラスミドまたはブルースクリプトベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡ断片をライゲーションすることにより達成することができる。挿入はＴＯＰＯクローニングベクターを使用して達成することができる（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社、カールズバッド、ＣＡ）。ＤＮＡを断片化するために使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の端は酵素的に修飾することができる。代わりに、所望される任意の部位は、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることにより産生することができる；これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。代替方法では、切断されたベクターおよびプロテアーゼタンパク質遺伝子は、ホモポリマーのテーリングにより修飾することができる。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔、および超音波穿通を介して宿主細胞中に導入することができ、遺伝子配列の多くのコピーが生成される。
【０３７５】
特異的な実施形態では、単離プロテアーゼタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列が組み入れられた組換えＤＮＡ分子を用いた宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。したがって、遺伝子は、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要な場合には単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、多量に得ることができる。
【０３７６】
１．ベクターおよび細胞
プロテアーゼタンパク質のうちの１つまたは複数の組換え発現については、プロテアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を含有する核酸は、適切な発現ベクター、つまり、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、プロテアーゼ遺伝子のための天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング領域により供給することもできる。
【０３７７】
プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコードする核酸を含有するベクターもまた提供される。ベクターを含有する細胞もまた提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、それらの中での使用に適した任意のベクターである。
【０３７８】
ベクターを含有する、内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞が提供される。上記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含む。細胞は、コードされたプロテアーゼタンパク質が細胞により発現する条件下で上記細胞を成長させ、発現プロテアーゼタンパク質を回収することにより、プロテアーゼまたはその修飾プロテアーゼタンパク質を産生するために使用される。本明細書中の目的のために、プロテアーゼは、培地中に分泌させることができる。
【０３７９】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有し、プロテアーゼドメインのすべてもしくは一部分を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列またはその複数のコピーを含有するベクターが提供される。完全長プロテアーゼタンパク質までの、プロテアーゼタンパク質のプロテアーゼドメインおよび付加的な部分をコードするヌクレオチドの配列ならびにその複数のコピーを含有するベクターもまた提供される。ベクターは、細胞中でのスカフォールドプロテアーゼタンパク質もしくは修飾プロテアーゼタンパク質またはそのプロテアーゼドメインの発現について選択することができるあるいはプロテアーゼタンパク質が分泌タンパク質として発現するよう選択することができる。プロテアーゼドメインを発現させる場合、核酸は、サッカロマイセスセレビシエα−接合因子シグナル配列もしくはその部分等の分泌シグナルまたは天然シグナル配列をコードする核酸に連結される。
【０３８０】
様々な宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現させるために使用することができる。これらは、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルス）を用いて感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母等の微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡを用いて形質転換された細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性において変わる。使用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適した転写要素および翻訳要素のいずれか１つを使用することができる。
【０３８１】
ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入について当業者に知られている任意の方法が、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え体（遺伝的組換え）を含むことができる。スカフォールドプロテアーゼもしくは修飾プロテアーゼまたはそのドメイン、誘導体、断片、もしくは相同体のタンパク質をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、組換えＤＮＡ分子（複数可）を用いて形質転換された宿主中で発現するように、第２の核酸配列により調節することができる。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で知られている任意のプロモーター／エンハンサーにより制御することができる。特異的な実施形態では、プロモーターは、プロテアーゼタンパク質についての遺伝子に固有のものではない。使用することができるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター［ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１）］、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列中に含有されるプロモーター［Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７（１９８０）］、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター［Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５（１９８１）］、メタロチオネイン遺伝子の調節配列［Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２（１９８２）］；β−ラクタマーゼプロモーター［Ｊａｙら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５５４３］またはｔａｃプロモーター［ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３）］等の原核生物発現ベクター；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７９−９４（１９８０）中の「Ｕｓｅｆｕｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」もまた参照されたい］；ノパリン合成酵素プロモーター［Ｈｅｒｒａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３（１９８４）］またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター［Ｇａｒｄｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１（１９８１）］を含有する植物発現ベクターおよび光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター［Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０（１９８４）］；Ｇａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター等の、酵母および他の菌類からのプロモーター要素、ならびに組織特異性を呈し、形質転換動物中で使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域［Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５（１９８７）］；膵臓ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域［Ｈａｎａｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２（１９８５）］、リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域［Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４（１９８７）］、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域［Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５（１９８６）］、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域［Ｐｉｎｃｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６（１９８７）］、肝臓中で活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域［Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８  １９８７）］、肝臓中で活性なアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域［Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１（１９８７）］、骨髄性細胞中で活性なベータグロビン遺伝子制御領域［Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４（１９８６）］、脳のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域［Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２（１９８７）］、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域［Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６（１９８５）］、および視床下部の性腺刺激細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域［Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８（１９８６）］を含むが、これらに限定されない。
【０３８２】
特異的な実施形態では、スカフォールドプロテアーゼタンパク質もしくは修飾プロテアーゼタンパク質またはそのドメイン、断片、誘導体、もしくは相同体をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーター、１つまたは複数の複製起点、および所望により１つまたは複数の選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性遺伝子）を含有するベクターが使用される。プロテアーゼタンパク質のプロテアーゼドメインの発現のためのベクターおよび系は、よく知られているピキアベクター（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、ＣＡから入手可能）、特にコードされたタンパク質の分泌のために設計されたベクターを含む。イー・コリ細胞の形質転換のための例示的なプラスミドベクターは、例えば、ｐＱＥ発現ベクターを含む（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡから入手可能；Ｑｉａｇｅｎ社により出版され、系について記載する文献もまた参照されたい）。ｐＱＥベクターは、イー・コリ中での組換えタンパク質の、厳重に調節された、高度なレベルの発現を提供するためのファージＴ５プロモーター（イー・コリＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および二重ｌａｃオペレーター抑圧モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳＩＩ）、６ＸＨｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、複製のＣｏｌＥ１起点、ならびにアンピシリン抵抗性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ末端のいずれかに６ｘＨｉｓタグを置くことを可能にする。上記プラスミドは、３つのすべてのリーディングフレームのためのマルチクローニングサイトを提供し、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質の発現を提供するｐＱＥ３２（配列番号３４５）、ｐＱＥ３０、およびｐＱＥ３１を含む。イー・コリ細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴ発現ベクターを含む（米国特許第４，９５２，４９６号を参照されたい；ＮＯＶＡＧＥＮ社、マディソン、ＷＩから入手可能；Ｎｏｖａｇｅｎ社により出版され、系を記載する文献もまた参照されたい）。上記プラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘起可能なイー・コリｌａｃオペレーター、およびｌａｃレプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ１１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびイー・コリｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ１２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いた精製において使用されるＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製の後での切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含有するｐＥＴ１５ｂならびにｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ社、マディソン、ＷＩ）を含む。
【０３８３】
２．発現
修飾プロテアーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を含む、当業者に知られている任意の方法により産生することができる。修飾プロテアーゼは、投与および処置に必要とされる所要の量および形態の修飾プロテアーゼを産生するのに適した任意の生物中で発現させることができる。発現宿主は、イー・コリ、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株および形質転換動物を含む哺乳動物細胞等の原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、それらのタンパク質産生レベルおよび発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。発現宿主の選定は、これらの因子ならびに調節および安全性の考慮、産生コストおよび必要性、ならびに精製のための方法等の他の因子に基づいてなすことができる。
【０３８４】
多くの発現ベクターが入手可能であり、当業者に知られており、修飾プロテアーゼの発現のために使用することができる。発現ベクターの選定は、宿主発現系の選定により影響を及ぼされるであろう。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターならびに所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナルを含むことができる。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを典型的に有する。いくつかの場合では、複製開始点は、ベクターのコピー数を増幅させるために使用することができる。
【０３８５】
修飾プロテアーゼはまた、タンパク質融合物として活用するまたは発現させることができる。例えば、プロテアーゼ融合物は、プロテアーゼに対して付加的な機能性を追加するために生成することができる。プロテアーゼ融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在化のため等のタグ、例えばｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、例えばＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／または膜会合を指示するための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
【０３８６】
一実施形態では、プロテアーゼは、活性形態で発現させることができる。他の実施形態では、プロテアーゼは、不活性なチモーゲン形態で発現させることができる。
【０３８７】
ａ．原核生物
原核生物、とりわけイー・コリは、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼ等の大量のタンパク質を産生するための系を提供する。イー・コリの形質転換は、当業者によく知られている単純で速い技術である。イー・コリのための発現ベクターは誘起可能なプロモーターを含有することができ、上記プロモーターは、高度なレベルのタンパク質発現を誘起するのにおよび宿主細胞に対していくらかの毒性を呈するタンパク質を発現するのに有用である。誘起可能なプロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７ＲＮＡプロモーターおよびＳＰ６ＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節性λＰＬプロモーターを含む。
【０３８８】
修飾プロテアーゼは、イー・コリの細胞質内環境中に発現させることができる。細胞質は還元環境であり、いくつかの分子については、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオスレオトールおよびβ−メルカプトエタノール等の還元剤ならびにグアニジン−ＨＣｌおよび尿素等の変性剤は、タンパク質を再可溶化するために使用することができる。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生につながり得る、細菌の細胞膜周辺腔における修飾プロテアーゼの発現である。典型的に、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列は、発現するようタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内部で、シグナルペプチダーゼにより除去される。周辺質標的リーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーを含む。いくつかの場合では、周辺質の発現は、培地中への発現したタンパク質の漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの速やかで単純な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、周辺質から浸透圧溶解により得ることができる。細胞質内発現に類似して、いくつかの場合では、タンパク質は、不溶性になり得、変性剤および還元剤は、可溶化およびリフォールディングを容易にするために使用することができる。誘起および成長の温度もまた、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼし得る、典型的に、２５℃および３７℃の間の温度が使用される。典型的に、細菌は、アグリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が、機能するためにグリコシル化を必要とする場合、グリコシル化は、宿主細胞からの精製の後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで追加することができる。
【０３８９】
ｂ．酵母
サッカロミセスセレビジエ、シゾサッカロミセスポンベ、ヤロウイアリポリティカ、クルイベロミセスラクチス、およびピキアパストリス等の酵母は、修飾プロテアーゼの産生に使用することができるよく知られている酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いてまたは相同組換えによる、安定した染色体の統合により形質転換することができる。典型的に、誘起可能なプロモーターは遺伝子発現を調節するために使用される。上記プロモーターの例は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１、ＡＯＸ１、または他のピキアプロモーターもしくは他の酵母プロモーター等のメタロチオネインプロモーターを含む。発現ベクターは、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３等の選択マーカーを含むことが多い。酵母中で発現したタンパク質は可溶性であることが多い。Ｂｉｐ等のシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解性を改善することができる。さらに、酵母中で発現したタンパク質は、サッカロミセスセレビジエからの酵母接合型アルファ−因子分泌シグナル等の分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラアデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼ等の酵母細胞表面タンパク質を有する融合物を使用して、分泌のために指示され得る。Ｋｅｘ−２プロテアーゼについて等のプロテアーゼ切断部位は、発現したポリペプチドが分泌経路を出る場合に、融合した配列をポリペプチドから除去するよう操作することができる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでのグリコシル化が可能である。
【０３９０】
ｃ．昆虫細胞
昆虫細胞は、特にバキュロウイルス発現を使用して、修飾プロテアーゼ等のポリペプチドを発現するのに有用である。昆虫細胞は、高度なレベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物の発現の調節の懸念を低下させる制限的な宿主範囲を有する。典型的な発現ベクターは、高度な発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター等のプロモーターを使用する。共通して使用されるバキュロウイルス系は、アウトグラファカリフォルニカヌクレアーポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）、およびボンビックスモリヌクレアーポリヘドロシスウイルス（ＢｍＮＰＶ）等のバキュロウイルスならびにスポドプテラフルギペルダから由来するＳｆ９、シューダレティアユニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）、およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）等の昆虫細胞株を含む。高度な発現のために、発現されることになる分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞中で厳密に処理され、発現したタンパク質を培地中に分泌するよう使用することができる。さらに、細胞株シューダレティアユニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系に類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
【０３９１】
昆虫細胞の代替発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。シュナイダー２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ）等の細胞株が発現に使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、高度なレベルの発現を、カドミウムまたは銅を用いた重金属誘起の存在下で誘起するために使用することができる。発現ベクターは、ネオマイシンおよびヒグロマイシン等の選択マーカーの使用により典型的に維持される。
【０３９２】
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系は、修飾プロテアーゼを発現するために使用することができる。発現構築物は、アデノウイルス等のウイルス感染によりまたはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン等の直接的ＤＮＡ移入によりならびに電気穿孔および微量注射等の物理的手段により哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびポリアデニル化要素を典型的に含む。上記ベクターは、高度なレベルの発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復配列）を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞型中で活性である。組織プロモーターおよび細胞型プロモーターならびにエンハンサー領域もまた発現に使用することができる。例示的なプロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ−１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御等の遺伝子からのプロモーター／エンハンサー領域を含むが、これらに限定されない。選択マーカーは、発現構築物を有する細胞を選択し、維持するために使用することができる。選択マーカー遺伝子の例は、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γ等の細胞表面シグナリング分子を有する融合物は、活性状態にあるタンパク質の、細胞表面上での発現を指示することができる。
【０３９３】
多くの細胞株は、哺乳動物発現に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリ、およびハムスターの細胞を含む。例示的な細胞株は、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他の骨髄腫細胞系、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、繊維芽細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｓ細胞、２Ｂ８細胞、ならびにＨＫＢ細胞を含むが、これらに限定されない。細胞株はまた、分泌されたタンパク質の細胞培養液からの精製を容易にする無血清培地に適合させて利用可能である。１つの上記例は無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である［Ｐｈａｍら、（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２−４２］。
【０３９４】
ｅ．植物
形質転換植物細胞および形質転換植物は、修飾プロテアーゼを発現することができる。発現構築物は、微粒子銃等の直接的ＤＮＡ移入およびプロトプラスト中へのＰＥＧ媒介性移入を使用してならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に典型的に移入される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写終結要素、ならびに翻訳制御要素を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、シロイヌナズナおよびタバコ等の双子葉植物宿主ならびにトウモロコシおよびイネ等の単子葉植物宿主の間で通常分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターを含む。ヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ等の選択マーカーは、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用されることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養中で維持するまたは完全な植物に再生成させることができる。形質転換植物細胞はまた、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを産生するよう操作された藻類を含むこともできる［例えばＭａｙｆｉｅｌｄら（２００３）ＰＮＡＳ  １００：４３８−４４２を参照されたい］。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主中で産生されたプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの選定に影響を及ぼし得る。
【０３９５】
３．精製技術
宿主細胞からのプロテアーゼポリペプチドの精製のための方法は、選定された宿主細胞および発現系に依存するであろう。分泌された分子については、タンパク質は、細胞を除去した後に培養液から一般に精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。形質転換植物および形質転換動物等の形質転換生物が発現に使用される場合、組織または器官は、溶解した細胞抽出物を作製するために出発物質として使用することができる。さらに、形質転換動物産生は、乳または卵中でのポリペプチドの産生を含むことができ、ポリペプチドは収集することができ、必要であれば、タンパク質を抽出し、さらに、当技術分野で標準的な方法を使用して精製することができる。
【０３９６】
プロテアーゼは、発現させ、精製して、不活性形態（チモーゲン形態）とすることができるまたは、代わりに、発現プロテアーゼは、プロ領域を除去するための自己触媒により活性形態に精製することができる。典型的に、自己活性化は、室温で、２４〜７２時間インキュベートすることによる等で精製プロセスの間に生じる。活性化の率および度合いは、タンパク質濃度および特異的な修飾プロテアーゼに依存的であり、例えば、より薄いサンプルでは、より長い時間室温でインキュベートすることが必要とされ得る。活性化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３キロダルトンシフト）および酵素活性（蛍光発生基質の切断）により監視することができる。典型的に、プロテアーゼは、精製前に、＞７５％の活性化を達成することが可能である。
【０３９７】
プロテアーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析、ならびにアニオン交換等のイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。アフィニティー精製技術もまた、調製の効率および純度を改善するために活用することができる。例えば、抗体、受容体、およびプロテアーゼに結合する他の分子をアフィニティー精製において使用することができる。発現構築物はまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物、またはＨｉｓ６等のアフィニティータグをタンパク質に対して追加するよう操作して、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、およびＮｉ−樹脂を用いてそれぞれアフィニティー精製することができる。純度は、ゲル電気泳動および染色ならびに分光光度計技術を含む、当技術分野で知られている任意の方法により評価することができる。
【０３９８】
４．融合プロテアーゼ
プロテアーゼおよび１つまたは複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた提供される。適した経路による投与のために製剤された上記融合タンパク質を含有する医薬組成物が提供される。融合タンパク質は、任意の順番で、スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼならびに抗体またはその断片、成長因子、受容体、リガンド、および他の同様の作用物質等の他のポリペプチドを連結させることにより、プロテアーゼの精製を容易にする、プロテアーゼの薬力学的特性を、標的細胞もしくは標的組織にプロテアーゼを向けることにより変更する、ならびに／またはプロテアーゼの発現もしくは分泌を増加させる目的で、形成される。プロテアーゼ融合タンパク質内で、プロテアーゼポリペプチドは、野生型プロテアーゼタンパク質またはスカフォールドプロテアーゼタンパク質のすべてまたはその触媒活性部分に対応し得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分は修飾プロテアーゼである。本明細書中で提供される融合タンパク質は、補体タンパク質のうちの任意の１つまたは複数についてのそれらの特異性および／または選択性のすべてを実質的に保持する。一般に、プロテアーゼ融合物ポリペプチドは、非融合プロテアーゼと比較して、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い基質特異性を含む、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の基質特異性および／または選択性を、非融合プロテアーゼと比較して保持する。
【０３９９】
プロテアーゼポリペプチドおよび他のポリペプチドの連結は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に達成することができる。一実施例では、連結は、ヘテロ二官能性剤を介する等の化学的連結またはチオール連結または他の同様の連結によるものとすることができる。他のポリペプチドに対するプロテアーゼの融合は、プロテアーゼポリペプチドのＮ−またはＣ末端に対するものとすることができる。本明細書中で提供されるプロテアーゼを有する融合タンパク質中に使用することができるポリペプチドの非限定的な例は、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）ポリペプチド、免疫グロブリンＧからのＦｃドメイン、または異種シグナル配列を含む。融合タンパク質は、イー・コリマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等の、細胞によるタンパク質の取り込みを援助する付加的な成分を含有することができる（国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／３２７１１を参照されたい）。
【０４００】
プロテアーゼ融合タンパク質は、標準的な組換え技術により産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、インフレームで、例えば、ライゲーションのための平滑端または付着端の末端、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適宜粘着端の補充、望ましくない加わりを回避するためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素によるライゲーションを利用することにより、共にライゲーションすることができる。他の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成することができる。代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを起こすアンカープライマーを使用して実行することができ、引き続いて、遺伝子断片をアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる［例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照されたい］。そのうえ、融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが市販で入手可能である（例えばＧＳＴポリペプチド）。プロテアーゼコード核酸は、融合部分がインフレームでプロテアーゼタンパク質に連結されるように、上記発現ベクター中にクローン化することができる。
【０４０１】
５．ヌクレオチド配列
スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコードする核酸分子が本明細書中で提供される。核酸分子は、任意のコードされたスカフォールドプロテアーゼの対立遺伝子変異体もしくはスプライス変異体またはその触媒活性部分を含む。一実施形態では、本明細書中で提供される核酸分子は、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９９％の配列同一性を有する、中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、完全長の任意の核酸にコードされたスカフォールドプロテアーゼまたはその触媒活性部分の少なくとも７０％に沿ってハイブリダイズする。他の実施形態では、核酸分子は、本明細書中で提供されるもの等のスカフォールドプロテアーゼまたはその触媒活性部分のいずれかの縮重コドン配列を有するものを含むことができる。スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコードする例示的な核酸分子またはその触媒活性部分は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４５１〜５２３、および５３４〜５４３のいずれかに記載されるヌクレオチドの配列を有する。
【０４０２】
核酸分子または哺乳動物細胞中での発現のために誘起可能なプロモーター等のプロモーターに操作可能に連結された核酸分子の触媒活性部分を含有する融合タンパク質もまた提供される。上記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーター；ＨＰＶ  Ｅ７腫瘍性タンパク質に応答性の、Ｅ２遺伝子プロモーター等のアデノウイルスプロモーター；ＰＶ  Ｅ２タンパク質に応答性の、ＰＢＶ  ｐ８９プロモーター等のＰＶプロモーター；およびＨＩＶもしくはＰＶまたは癌遺伝子により活性化される他のプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０４０３】
本明細書中で提供されるスカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼはまた、遺伝子移入ベクターで細胞に送達することもできる。移入ベクターはまた、プロテアーゼが投与される、関節リウマチまたは心血管疾患等の、疾患または障害の処置のための付加的な他の治療剤（複数可）をコードすることができる。プロテアーゼをコードする移入ベクターは、対象に核酸を投与することにより、全身的に使用することができる。例えば、移入ベクターは、アデノウイルスベクター等のウイルス性ベクターとすることができる。プロテアーゼをコードするベクターはまた、幹細胞中に組み入れることもでき、上記幹細胞は、治療のための部位の幹細胞に移植するまたは植え付けることによる等で対象に投与することができる。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、プロテアーゼを発現するよう操作することができ、上記ＭＳＣは、治療のために腫瘍部位に植え付けることができる。
【０４０４】
Ｇ．使用の方法：製剤／パッケージング／投与
ＭＴ−ＳＰ１（修飾）ポリペプチドを含む、本明細書中で産生されるプロテアーゼもしくは修飾プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ融合タンパク質、またはコード核酸分子を含有する医薬組成物は、任意の従来の様式で、選択された量のポリペプチドを、１つまたは複数の生理学的に許容し得る担体または賦形剤と混合することにより製剤することができる。担体または賦形剤の選択は、投与する医者の技術の範囲内にあり、多くのパラメータに依存し得る。これらは、例えば、投与のモード（すなわち、全身、経口、経鼻、経肺、局所、局部、または任意の他のモード）および処置される障害を含む。本明細書中で提供される医薬組成物は、単一投与量（直接）投与のためにまたは希釈もしくは他の修飾のために製剤することができる。製剤中の化合物の濃度は、意図した処置に有効な、投与の際の量のデリバリーに有効である。典型的に、組成物は、単一投与量の投与のために製剤される。組成物を製剤するために、化合物またはその混合物の重要分画は、処置された状態が軽減するまたは寛解するように、選択されたビヒクル中で、有効な濃度で、溶かす、懸濁させる、分散させる、またはその他の場合では混合させる。本明細書中で提供される化合物の投与に適した医薬担体または医薬ビヒクルは、投与の特定のモードに適していると当業者に知られている任意の同様の担体を含む。
【０４０５】
１．修飾プロテアーゼポリペプチドの投与
ポリペプチドは、組成物中のただ一つの薬学的に活性な成分として製剤することができるまたは他の活性成分と組み合わせることができる。ポリペプチドは、抗体等の標的作用物質への抱合による等で、デリバリーのために標的にすることができる。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容し得る担体として適し得る。これらは当業者に知られている方法に従って調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号中に記載されるように調製することができる。リポソームデリバリーはまた、徐放性製剤を含むこともでき、コラーゲンゲルおよびフィブロネクチンを用いて修飾されたリポソーム等の医薬マトリックスを含む［例えばＷｅｉｎｅｒら（１９８５）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．７４（９）：９２２−５を参照されたい］。
【０４０６】
活性化合物は、処置される対象に対する望ましくない副作用の非存在下で、薬学的に許容し得る担体中に、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療的に有効な濃度は、本明細書中で提供されるアッセイ等の知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ系で化合物を試験することにより経験的に決定することができる。
【０４０７】
本明細書中で提供されるポリペプチド（つまり活性化合物）は、体液または他の組織サンプル等の混合物を、本明細書中で提供される修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのいずれかを含む、本明細書中で提供されるプロテアーゼポリペプチドと接触させることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。例えば、化合物をｅｘ  ｖｉｖｏで投与する場合、対象からの体液または組織サンプルは、例えばバイパス機械中のチューブまたはフィルター等のチューブまたはフィルターでコーティングされているプロテアーゼポリペプチドと接触させることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、活性化合物は、任意の適切な経路により、例えば、経口的に、経鼻的に、経肺的に、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下に、または局部に、液体、半液体、または固体の形態で投与することができ、投与の各経路に適した様式で製剤される。
【０４０８】
修飾プロテアーゼならびに生理学的に許容し得る塩および溶媒化合物は、吸入投与（口もしくは鼻のいずれかを通して）、経口投与、経皮投与、経肺投与、非経口投与、または直腸投与による投与のために製剤することができる。吸入による投与については、修飾プロテアーゼは、加圧パックからのエアロゾル噴霧提示または適した噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、もしくは他の適した気体を使用した噴霧器の形態で送達することができる。加圧エアロゾルの場合では、投与量ユニットは、計量した量を送達するためにバルブを提供することにより決定することができる。例えば吸入器または注入器中に使用されるゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、治療化合物の粉末ミックスおよびラクトースまたはデンプン等の適した粉末ベースを含有して、製剤することができる。
【０４０９】
肺への経肺投与については、修飾プロテアーゼは、適した噴射剤を使用した噴霧器、ターボ噴霧器（ｔｕｒｂｏｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）、またはマイクロプロセッサー制御計量用量経口吸入器からのエアロゾル噴霧提示の形態で送達することができる。一般に、エアロゾルの粒径は、０．５〜５ミクロンの範囲にある等で、小さい。経肺投与のために製剤された医薬組成物の場合では、洗浄性界面活性剤は典型的に使用されない。経肺薬物デリバリーは、全身投与のうちで期待がもてる非侵入性の方法である。肺は、主として吸収のための高表面積、薄い肺胞上皮、広い血管分布、肝臓初回通過代謝の欠如、および比較的低い代謝活性により、薬物デリバリーのための魅力的な経路に相当する。
【０４１０】
経口投与については、医薬組成物は、結合剤（例えばあらかじめゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えばラクトース、結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（例えばバレイショデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容し得る賦形剤を用い、従来の手段により調製された、例えば錠剤、丸剤、液体懸濁剤、またはカプセル剤の形態を取ることができる。錠剤は、当技術分野でよく知られている方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば水剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態を取ることができるまたは液体調製物は、使用前に、水または他の適したビヒクルとの構成のための乾燥産物として提示することができる。上記液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加された食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば扁桃油、油性のエステル、エチルアルコール、または分留された植物油）；および保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸−メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸−プロピルまたはソルビン酸）等の薬学的に許容し得る添加剤を用いた従来の手段により調製することができる。調製物はまた、緩衝塩、矯味剤、着色料、および甘味料を適宜含有することができる。
【０４１１】
経口投与のための調製物は、活性化合物の放出制御のために製剤することができる。口内投与については、組成物は、従来の様式で製剤された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。
【０４１２】
修飾プロテアーゼポリペプチドは、デポー調製物として製剤することができる。上記長時間作用性製剤は、植え込み（例えば皮下にもしくは筋肉内に）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、治療化合物は、適したポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば許容し得る油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共にあるいはわずかに可溶性の誘導体として、例えばわずかに可溶性の塩として製剤することができる。
【０４１３】
修飾プロテアーゼは、注射による非経口投与（例えばボーラス注射または継続注入による）のために製剤することができる。注射のための製剤は、追加の保存剤を有する単位剤形（例えばアンプル中または複数用量容器中）で提示することができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中で、懸濁剤、水剤、または乳剤としての上記形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤等の調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有することができる。代わりに、活性成分は、使用前に、適したビヒクル、例えば発熱性物質なしの滅菌水との構成のための、粉末に凍結乾燥された形態とすることができる。
【０４１４】
医薬組成物は、ゲル、クリーム、およびローションの形態での、皮膚（経皮）および眼中等の粘膜に対する局部適用のためならびに眼に対する適用のため等の局所適用もしくは局部適用のためにまたは槽内適用もしくは脊髄内適用のために製剤することができる。上記水剤、特に眼の使用を意図した水剤は、０．０１％〜１０％等張溶液および約ｐＨ５〜７に適切な塩を用いて製剤することができる。化合物は、吸入による等の局部適用のためのエアロゾルとして製剤することができる（例えば、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号、および第４，３６４，９２３号を参照されたい、これらは、治療炎症性疾患、特に喘息の処置に有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾルを記載している）。
【０４１５】
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、および排泄率、投薬スケジュール、ならびに投与される量ならびに当業者に知られている他の因子に依存する。本明細書中でさらに記載されるように、投与量は、無修飾プロテアーゼおよび／または天然プロテアーゼと比較した、修飾プロテアーゼの特性および活性（例えば１つまたは複数の補体タンパク質の切断）の比較を使用して、経験的に決定することができる。
【０４１６】
組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができる、パッケージ、キット、またはディスペンサーデバイス中に提供することができる。いくつかの実施例では、組成物は、例えばバイパス機械中の、例えばチューブまたはフィルター上等のデバイス上で、コーティングすることができる。パッケージは、例えば、ブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔を含有する。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための使用説明書を添付することができる。活性剤を含有する組成物は、パッケージング材料、本明細書中で提供される作用物質、および作用物質が提供される障害を示す標識を含有する製造製品としてパッケージ化することができる。
【０４１７】
プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸分子および遺伝子治療に適したプロテアーゼポリペプチドをコードする発現ベクターの組成物もまた提供される。タンパク質を送達するのではなく、全身的にもしくは他の経路による等のｉｎ  ｖｉｖｏでまたはリンパ球を含む細胞の除去、核酸の細胞中への導入、および宿主もしくは適合性のあるレシピエント中への再導入による等のｅｘ  ｖｉｖｏで、核酸を投与することができる。
【０４１８】
２．修飾プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子治療）
プロテアーゼポリペプチドは、核酸分子の発現により細胞および組織に送達させることができる。プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができ、ｅｘ  ｖｉｖｏ技術および直接的ｉｎ  ｖｉｖｏ発現を含む。核酸は、当業者に知られている任意の方法により細胞および組織に送達することができる。単離核酸は、さらなる操作のためにベクター中に組み入れることができる。例示的な核酸は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０〜６９、４０４〜４１８、４１９〜４４７、５２４〜５３３、５５２〜６５９、または６６３〜７１０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有するスカフォールドプロテアーゼもしくは修飾プロテアーゼまたはその触媒活性部分をコードするあるいはそれをコードする核酸に、中から高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする任意の核酸である。スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコードする例示的な核酸分子またはその触媒活性部分は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４５１〜５２３、および５３４〜５４３のいずれかに記載されるヌクレオチドの配列を有する。
【０４１９】
コード核酸分子の発現によるプロテアーゼポリペプチドの投与のための方法は、組換えベクターの投与を含む。ベクターは、複製の起点の包含による等で、エピソームのままとなるよう設計することができるまたは細胞中の染色体中に統合するよう設計することができる。プロテアーゼポリペプチドはまた、ベクターを使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子発現治療に使用することができる。例えば、細胞は、ゲノムの場所にプロテアーゼポリペプチドコード核酸を、調節配列に効果的に連結してまたはゲノムの場所における調節配列に効果的に連結されて配置されるように統合することによる等で、プロテアーゼポリペプチドを発現するよう操作することができる。次いで、上記細胞は、処置を必要とする患者等の対象に局所的にまたは全身的に投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療のための例示的なベクターは、ウイルス性ベクターおよび例えばリポソームまたは人工染色体等の非ウイルス性ベクターを含む。
【０４２０】
例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および遺伝子治療のために設計された他のものを含むウイルス性ベクターを利用することができる。ベクターは、エピソームのままとすることができるまたは処置される対象の染色体中に統合することができる。プロテアーゼポリペプチドは、ウイルスにより発現させることができ、プロテアーゼポリペプチドは、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子治療に適したウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、および上述の他のものを含む。例えば、アデノウイルス発現技術は、当技術分野でよく知られており、アデノウイルスの産生および投与方法もまたよく知られている。アデノウイルス血清型は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ）から利用可能である。アデノウイルスはｅｘ  ｖｉｖｏで使用することができる、例えば、細胞は、処置を必要とする患者から単離され、プロテアーゼポリペプチド発現アデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適した培養期間の後、形質導入された細胞は、対象に局所的および／または全身的に投与される。代わりに、プロテアーゼポリペプチド発現アデノウイルス粒子は、単離されて、治療的有効量のデリバリーのために薬学的に許容し得る担体中に製剤され、対象の疾患または状態を予防する、処置する、または寛解させる。一実施形態では、処置されることになる疾患は補体活性化により引き起こされる。典型的に、アデノウイルス粒子は、対象体重１キログラム当たり１個の粒子から１０１４個の粒子の範囲、一般に、対象体重１キログラム当たり１０６個または１０８個の粒子から１０１２個の粒子の間の用量で送達される。
【０４２１】
核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクター中に導入することができる。ＡＣＥＳ等の人工染色体［Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｄｅｃ  ７；３２（２１）：ｅ１７２を参照されたい］は、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコードし、発現するよう操作することができる。手短に言えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）は、細胞中に大きなペイロードの遺伝子情報を自律複製非統合方式で導入するための手段を提供する。ＭＡＣの中で特有に、哺乳動物サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現系（ＡＣＥＳ）は、異なる種の細胞株において再現性よくｄｅ  ｎｏｖｏ生成し、宿主細胞の染色体から容易に精製することができる。次いで、精製哺乳動物ＡＣＥは、様々なレシピエント細胞株に再導入することができ、ＡＣＥは、長期間、選択圧の非存在下でＡＣＥ系を使用して安定して維持される。このアプローチを使用して、１つまたは２つの遺伝子標的を特異的に積むことがＬＭＴＫ（−）およびＣＨＯ細胞中で達成された。
【０４２２】
修飾プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸を導入する他の方法は、酵母中での２工程遺伝子交換技術であり、酵母人工染色体（ＹＡＣ）中でクローニングされた完全アデノウイルスゲノム［Ａｄ２；Ｋｅｔｎｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６１８０−６１９０］ならびにＹＡＣクローン中の特異的な領域を標的とするためのアデノウイルス配列、関心のある遺伝子のための発現カセット、ならびにポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含有するプラスミドを用いて始まる。ＹＡＣは、より大きな遺伝子の組み入れを可能にするので、特に関心がある。このアプローチは、記載される修飾プロテアーゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸を運ぶ、哺乳動物細胞または全動物に対する遺伝子移入のためのアデノウイルスベースのベクターの構築に使用することができる。
【０４２３】
核酸は、リポソーム等のビヒクルにカプセル化するまたは細菌細胞、特に弱毒化された細菌等の細胞中に導入するまたはウイルス性ベクター中に導入することができる。例えば、リポソームが利用される場合、エンドサイトーシスに関連する原形質膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型に対して向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいてインターナリゼーションを起こすタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的にし、細胞内半減期を増強させるタンパク質が、標的指向化のためにおよび／または取り込みを容易にするために使用することができる。
【０４２４】
いくつかの場面では、原形質膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンド等の、細胞を標的にする作用物質と共に核酸源を提供することが望ましい。本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、任意の適した方法により作製することができる。上記の核酸分子を含有する核酸ベクターがさらに提供される。上記の核酸分子を含有する核酸ベクターおよびこれらのベクターを含有する細胞がさらに提供される。
【０４２５】
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの方法については、プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸分子を、適したドナーまたは処置されることになる対象からの細胞中に導入する。治療の目的のために核酸を導入することができる細胞は、例えば、処置されることになる疾患または状態に適切な任意の所望の利用可能な細胞型を含み、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血球；それぞれ異なる幹細胞または前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、およびそれらの他の源から得られた幹細胞等の造血幹細胞または造血前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
【０４２６】
ｅｘ  ｖｉｖｏ処置については、処置されることになる対象と適合性のあるドナーからの細胞または処置されることになる対象からの細胞は、除去され、核酸がこれらの単離細胞中に導入され、修飾細胞が対象に投与される。処置は、例えば患者中に植え込まれる多孔質膜内にカプセル化されたもの等の直接的投与を含む（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい）。哺乳動物細胞中へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸の移入に適した技術は、リポソームならびにカチオン脂質（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ）、電気穿孔法、微量注射法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ならびにリン酸カルシウム沈降法の使用を含む。ＤＮＡデリバリーの方法は、プロテアーゼポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで発現させるために使用することができる。上記方法は、電気穿孔、超音波、およびリン酸カルシウムデリバリーの使用等の、局所的および全身的なデリバリーを含む、核酸のリポソームデリバリーおよび裸のＤＮＡのデリバリーを含む。他の技術は、微量注射、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、ミクロセル媒介性遺伝子移入、およびスフェロプラスト融合を含む。
【０４２７】
プロテアーゼポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現は、付加的な分子の発現に連結させることができる。例えば、プロテアーゼポリペプチドの発現は、操作されたウイルス中でのまたは細胞毒性ウイルス中で発現する等の細胞毒性産物の発現と連結することができる。上記ウイルスは、治療的効果のために、標的となる特定の細胞型を標的にすることができる。発現プロテアーゼポリペプチドは、ウイルスの細胞毒性を増強させるよう使用することができる。
【０４２８】
プロテアーゼポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現は、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーター等の特異的な調節配列に対して核酸分子コードプロテアーゼポリペプチドを効果的に連結することを含むことができる。プロテアーゼポリペプチドはまた、とりわけ標的細胞型および／または標的組織に感染するおよび／またはそれらの中で複製するベクターから発現させることができる。誘起可能なプロモーターは、プロテアーゼポリペプチド発現を選択的に調節するために使用することができる。
【０４２９】
核酸分子は、裸の核酸としてまたはベクター、人工染色体、リポソーム、および他のビヒクルで、全身投与、局所経路、局部経路、および投与の他の経路により対象に投与することができる。全身およびｉｎ  ｖｉｖｏの場合、核酸分子または核酸分子を含有するビヒクルは細胞を標的にすることができる。
【０４３０】
投与はまた、細胞または組織を典型的に標的にするベクターまたは細胞の投与による等の直接的なものとすることができる。例えば、腫瘍細胞および増殖細胞は、プロテアーゼポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現のための標的細胞となり得る。プロテアーゼポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現に使用される細胞はまた、患者にとって自己となる細胞も含む。上記細胞は、患者から除去され、プロテアーゼポリペプチドの発現のための核酸が導入され、次いで、注射または植え付けによる等で患者に投与することができる。
【０４３１】
Ｈ．治療上の使用
治療用プロテアーゼは、伝統的な治療的アプローチ以上の多くの潜在的な利点を有する。主な利点は、触媒的様式で疾患標的を不活性化する能力である（つまり一対多の化学量論）。さらなる差別化となる利点は、（１）不可逆的不活性化；（２）少ない投薬；（３）小さな分子サイズ；（４）翻訳後修飾を標的にする能力；（５）高度な標的濃度を中和する能力；および（６）活性部位から離れて標的にする能力が含まれる。治療用物質として、プロテアーゼはなお、以下の特徴を呈しなければならない：（１）分子標的（細胞外）に接近するおよび（２）疾患状態に決定的な標的について十分にストリンジェントな特異性を持つ。本明細書中で提供されるプロテアーゼポリペプチドは、疾患の処置に使用することができる。
【０４３２】
本明細書中で提供されるプロテアーゼポリペプチドおよび核酸分子は、補体経路の活性化が関係する任意の状態、特に、敗血症性ショック等の急性炎症性状態および関節リウマチ（ＲＡ）等の慢性炎症性状態を含む炎症性状態の処置に使用することができる。急性状態および炎症性状態は、例えば、免疫複合体媒介性の炎症により引き起こされる自己免疫疾患または組織傷害等の免疫媒介性疾患として顕在化され得る。補体媒介性炎症性状態はまた、炎症成分を有する神経変性疾患または心血管疾患として顕在化され得る。本セクションは、例示的な、プロテアーゼについての使用および投与方法を提供する。これらの記載される治療は、例示的なものであり、プロテアーゼの適用を限定しない。上記方法は、記載されたおよび以下に列挙される生理学的および医学的状態の処置の方法を含むが、これらに限定されない。上記方法は、セプシス、関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、エリテマトーデス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、呼吸窮迫症候群、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織傷害、多臓器不全、アルツハイマー病（ＡＤ）、心筋梗塞症（ＭＩ）、発作、心肺バイパス（ＣＰＢ）もしくは冠動脈バイパス術、血管形成術、または血液透析等の事象または処置により引き起こされる虚血再灌流傷害、あるいはギランバレー症候群の処置の方法を含むが、これらに限定されない。
【０４３３】
プロテアーゼを有する疾患および状態の処置は、皮下注射、経口投与、および経皮投与を含むが、こられに限定されない、本明細書中で記載される適した製剤を使用する投与の任意の適した経路により達成することができる。必要であれば、特定の投与量および継続期間ならびに処置プロトコールを経験的に決定するまたは推定することができる。例えば、組換えプロテアーゼポリペプチドおよび天然プロテアーゼポリペプチドの例示的な用量は、適切な投与量を決定するための出発点として使用することができる。野生型プロテアーゼまたはスカフォールドプロテアーゼと比較して、より特異性および／または選択性を有する修飾プロテアーゼは、投薬量または投薬回数の低下の点で有効となり得る。投薬レベルは、個人の体重、健康状態、年齢、利用される特異的な化合物の活性、性別、食餌、投与の時間、排泄の率、薬物の組合せ、疾患の重症度および経過、ならびに患者の疾患に対する素因および処置する医師の判断等の様々な因子に基づいて決定することができる。単一剤形を産生するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主および投与の特定のモードに依存して変わる。
【０４３４】
患者の状態の改善の際に、必要であれば、維持用量の化合物または組成物を投与することができ、および、投与量、剤形、もしくは投与の回数またはそれらの組合せを修正することができる。いくつかの場合では、対象は、疾患症状のあらゆる再発の際に、長期ベースでの断続的な処置を必要とし得る。
【０４３５】
１．免疫媒介性炎症性疾患
本明細書中で記載されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを含むが、これらに限定されず、炎症性疾患を処置するために使用することができる。プロテアーゼを用いて処置することができる炎症性疾患は急性および慢性炎症性疾患を含む。例示的な炎症性疾患は、中枢神経系疾患（ＣＮＳ）、自己免疫疾患、喘息における等の気道応答過剰状態、関節リウマチ、炎症性腸疾患、および免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織傷害を含む。
【０４３６】
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）のためのモデルとして働くことができる［Ｐｉｄｄｌｅｓｄｅｎら、（１９９４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：５４７７］。ＥＡＥは、ミエリンならびにミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）等のミエリン成分を用いた免疫化により、多くの遺伝子的に感受性の種において誘起することができる。例えば、ＭＯＧ誘起性ＥＡＥは、炎症、反応性の神経膠症、および大きな融合性の脱髄班の形成の病組織学的な三つ組の、慢性で再発性の臨床的疾患経過を含む、ヒトＭＳの本質的な特徴を繰り返す。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼはＥＡＥ動物モデルにおいて評価することができる。プロテアーゼは、毎日の腹腔内注射による等で投与され、症状の経過および進行は、コントロール動物と比較して監視される。疾患を増悪させ得る炎症補体成分のレベルもまた、溶血アッセイにおいて血清補体活性をアッセイすることによりならびに例えばＣ１、Ｃ３、およびＣ９等の補体成分の沈着についてアッセイすることにより測定することができる。
【０４３７】
補体活性化は、関節リウマチ（ＲＡ）等の疾患における炎症を調節する［Ｗａｎｇら、（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２：８９５５］。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含むプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、ＲＡを処置するために使用することができる。例えば、プロテアーゼは、局所的にまたは全身的に注射することができる。プロテアーゼは、毎日または毎週投薬することができる。ＰＥＧ化プロテアーゼは、免疫原性を低下させるために使用することができる。一実施例では、ＩＩ型コラーゲン誘起性関節炎（ＣＩＡ）は、炎症性滑膜炎、パンヌス形成、ならびに軟骨および骨のびらんにより特徴づけられるＲＡに組織学的に類似する自己免疫炎症関節疾患のモデルとしてマウスにおいて誘起することができる。ＣＩＡを誘起するために、完全フロイントアジュバントの存在下のウシＩＩ型コラーゲン（Ｂ−ＣＩＩ）は、尾の基部に皮内注射することができる。２１日後に、マウスは、同一のプロトコールを使用して再免疫化することができる。ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含むプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの効果を検査するために、Ｂ−ＣＩＩを用いた初期抗原投与後の３週目に、プロテアーゼまたはコントロールを、毎週２回、３週間、腹腔内に投与することができる。マウスは、初期免疫化の後の７週目に組織学的分析のために犠牲死させることができる。慢性疾患に対するプロテアーゼの治療的影響を評価するために、プロテアーゼは、１つまたは複数の肢における臨床的関節炎の発病の後で、合計１０日間、毎日投与することができる。初めに冒された関節における腫脹の度合いは、カリパスを使用して足の厚さを測定することにより監視することができる。両方のモデルにおいて、血清は、溶血アッセイならびに例えばＣ５ａおよびＣ５ｂ−９等の、活性化の補体マーカーの測定のためにマウスから取り出すことができる。他の実施例では、霊長類モデルがＲＡ処置に利用可能である。敏感で腫大した関節の応答は、プロテアーゼ処置を評価するために、プロテアーゼポリペプチドを用いて処置した対象およびコントロールにおいて監視することができる。
【０４３８】
プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含むが、これらに限定されず、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織傷害を処置するために使用することができる。ＩＣ媒介性傷害は、組織中のＩＣ沈着に対する局所的な炎症応答により引き起こされる。続いて起こる炎症応答は、浮腫、好中球増加、出血、および最終的には組織壊死により特徴づけられる。ＩＣ媒介性組織傷害は、ｉｎ  ｖｉｖｏアルサス（ＲＰＡ）反応において研究することができる。手短に言えば、ＲＰＡ反応において、過剰の抗体（例えばウサギＩｇＧ抗ニワトリ卵アルブミン等）が、例えばラットまたはモルモット等の動物の皮膚に注射され、これらの動物は、対応する抗原（つまりニワトリ卵アルブミン）が前もって静脈内に注入されている。［Ｓｚａｌａｉら、（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４６３］。ＲＰＡ反応の開始直前に、プロテアーゼまたはボーラスコントロールは、右大腿静脈を介した静脈内注射により対応する抗原と同時に投与することができる。代わりに、プロテアーゼは、ＲＰＡ反応の初期の時期の間に、抗原の注射直後の初めに、および抗体の皮膚注射の直前に投与することができる。補体依存的ＩＣ媒介性組織傷害の発生に対するプロテアーゼの効果は、それぞれ異なる時間に、ＲＰＡの開始の後で、血清溶血活性を決定するために血液を収集することによりおよび病変サイズの定量化のために皮膚の感染エリアを採取することにより評価することができる。
【０４３９】
ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む、本明細書中で記載されるプロテアーゼ等の治療用プロテアーゼは、セプシスおよび致命的ショックをもたらし得る重症のセプシスを処置するために使用することができる。補体媒介性致命的ショックのモデルは、治療剤としてのプロテアーゼの効果を試験するために使用することができる。上記の一実施例では、ラットに、微量のリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて抗原刺激し、その後に続いて、補体の膜阻害剤（抗Ｃｒｒｙ）に対するモノクローナル抗体を投与する［Ｍｉｚｕｎｏ  Ｍら、（２００２）Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５５］。プロテアーゼまたはコントロールは、ＬＰＳ抗原刺激の前、ＬＰＳ抗原刺激の後、または抗Ｃｒｒｙ投与の後等の、致命的ショックの開始の経過の間の任意の時間に投与することができ、致命的ショックからのラットの救出を評価することができる。
【０４４０】
２．神経変性疾患
補体活性化は、アルツハイマー病（ＡＤ）の進行を増悪させ、ＡＤ脳中の神経突起損失の一因となる。本明細書中で記載されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含むが、これらに限定されず、ＡＤを処置するために使用することができる。ＡＤの神経病理学的なおよび行動の特徴のいくつかを模倣するマウスモデルは、プロテアーゼの治療効果を評価するために使用することができる。形質転換マウスモデルの例は、疾患をもたらす突然変異を有するヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）またはプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質をマウス中に、強度のプロモーターの制御の下で導入することを含む。これらのマウスは、ベータ−アミロイド班およびジストロフィー性神経突起の増加を含むＡＤの特徴を発症する。ＡＰＰ突然変異タンパク質およびＰＳ１突然変異タンパク質についての二重形質転換マウスは、より多くの線維状ベータ−アミロイド班を発症し、班に関連する活性化されたグリアおよび補体因子を示す。プロテアーゼは、毎日の腹腔内注射または静脈内注射による等で投与することができ、症状の経過および進行は、コントロール動物と比較して監視される。
【０４４１】
３．心血管疾患
本明細書中で記載されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを含むが、これらに限定されず、心血管疾患を処置するために使用することができる。プロテアーゼは、発作、心筋梗塞、心肺バイパス、冠動脈バイパス術、血管形成術、または血液透析に起因する虚血再灌流傷害を含む心血管疾患の処置において使用することができる。プロテアーゼはまた、組織傷害の一因となり得る心肺バイパスに関連する炎症応答の処置において使用することもできる。一般に、プロテアーゼは、補体媒介性虚血再灌流傷害を誘起する処置または事象の前に、それと同時に、またはそれに続いて投与することができる。一実施例では、プロテアーゼは、例えば血管形成術の冠動脈バイパス術等の、補体媒介性で虚血傷害誘起性の事象による対象の処置の前に対象に投与することができる。
【０４４２】
虚血再灌流傷害の処置に対するプロテアーゼの効果は、傷害の動物モデルにおいて評価することができる。上記一モデルにおいて、心筋虚血は、前方の心膜が切開されたウサギにおいて、左前下行（ＬＡＰ）冠動脈のまわりをその起点から５〜８ｍｍのところで３−０絹縫合糸で縫い、血管が完全に閉塞されるように結紮糸を締めることにより誘起される［Ｂｕｅｒｋｅら、（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：５３７５］。例えば修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド等のプロテアーゼまたは生理食塩水等のコントロールビヒクルは、ボーラスとして用量を増加させて、冠動脈閉塞後の５５分間（つまり再灌流前の５分間）静脈内に与えることができる。５分間後（つまり合計６０分間の虚血後）、ＬＡＤ結紮糸はほどくことができ、虚血心筋は３時間再灌流することができる。再灌流期間の終わりに、ＬＡＤのまわりの結紮糸が締められる。虚血傷害に対するプロテアーゼの効果は、心筋壊死、血漿クレアチンキナーゼレベル、ならびに例えばミエロペルオキシダーゼ活性およびスーパーオキシドラジカル遊離等の好中球活性化のマーカーに対する効果を評価することにより分析することができる。
【０４４３】
６％のヒト血漿を含有するクレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いた単離マウス心臓の灌流の際に被る補体媒介性心筋傷害の他のモデルにおいて、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを用いた処置は、組織損傷を心臓に制限するために使用することができる。上記実施例では、心臓を灌流するために使用される緩衝液に、これらに限定されないが、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む修飾プロテアーゼ等の、いろいろな用量のプロテアーゼを補充することができる。灌流された心臓は、ヒトＣ３およびＣ５ｂ−９の沈着、冠動脈灌流圧、拡張末期圧、ならびに心拍数についてアッセイすることができる。
【０４４４】
例えばＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド等のプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、心肺バイパス（ＣＰＢ）または冠動脈バイパス術の前にまたはその後に、バイパスの結果として起こることが多く、組織傷害の一因となり得る炎症性免疫応答を阻害するために、治療用物質として使用することができる。体外バイパス回路における全血のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再循環は、血小板および白血球の変化ならびにＣＰＢにより誘起される補体活性化を刺激するために使用することができる［Ｒｉｎｄｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１５６４］。上記モデルにおいて、プロテアーゼもしくは修飾プロテアーゼまたはコントロール緩衝液は、いろいろな用量で、健常なドナーからの血液およびブタヘパリンを既に含有している移入パックに、体外回路への血液の追加の直前に追加することができる。血液サンプルを、再循環の後、５、１５、３０、４５、６０、７５、および９０分に取り出し、例えば、溶血アッセイならびに／またはＣ５ａ、Ｃ３ａ、および／もしくはｓＣ５ｂ−９を測定するための補体活性化アッセイ等の補体研究のためにアッセイすることができる。体外回路へのその追加前に取り出された血液の前処置サンプルは、コントロールとして使用することができる。血液サンプルのフローサイトメトリーは、例えばＣＤ１１ｂレベルおよびＰ−セレクチンレベル等の血液中に循環する集団の白血球（つまり好中球）上の接着分子のレベルを決定するために行うことができる。
【０４４５】
Ｉ．併用治療
野生型プロテアーゼならびに修飾プロテアーゼは、疾患ならびに状態を処置するために、お互いにならびに他の既存の薬物および治療剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書中で記載されるように、多くのプロテアーゼは、急性および慢性の炎症性状態および炎症性疾患を処置するために使用することができる。上記処置は、他の抗炎症薬および／または治療剤と共に行うことができる。併用治療に有用な抗炎症薬および抗炎症剤の例は、アスピリン等のサリチル酸塩を含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナブメトン、ピロキシカム、ジクロフェナク、またはインドメタシン等の伝統的なＮＳＡＩＤ、およびセレコキシブ［Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）］またはロテコキシン（Ｒｏｔｅｃｏｘｉｎ）［Ｖｉｏｘｘ（登録商標）］等のＣｏｘ−２選択的阻害剤を含む。併用治療に有用な他の化合物は、メトトレキサートおよびレフルノミド等の代謝拮抗物質、コルチコステロイドまたはコルチゾン、デキサメタゾン、もしくはプレドニゾン等の他のステロイド、アセトアミノフェン等の鎮痛薬、メサラミン等のアミノサリチル酸、ならびにアザチオプリン［Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）］、およびシクロスポリンＡ等の細胞毒性薬を含む。併用治療において使用することができる付加的な作用物質は、生物学的応答調節剤を含む。生物学的応答調節剤は、エタネルセプト［Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）］、インフリキシマブ［Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）］、またはアダリムマブ［Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）］等の、ＴＮＦ−アルファの阻害剤を含む炎症促進性サイトカイン阻害剤およびアナキンラ［Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）］等の、ＩＬ−１の阻害剤を含むことができる。生物学的応答調節剤はまた、ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカイン、抗ＣＤ２０抗体［Ｒｉｔｕｘｍａｂ（登録商標）］等のＢ細胞標的作用物質、Ｔ抗原を標的にする化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体拮抗薬、ＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、またはＮＦκＢに対する阻害剤等のキナーゼ阻害剤、およびＰＰＡＲ−γリガンドも含むことができる。
【０４４６】
野生型プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼはまた、心血管疾患を処置するために投与されるおよび／または例えば、補体媒介性虚血再灌流傷害に関連する炎症性状態の一因となる本明細書中で記載される手技等の、心血管疾患を処置するための手技の間に投与される作用物質と組み合わせて使用することができる。例えば、スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼ等の本明細書中で提供されるプロテアーゼは、抗凝固薬と組み合わせて投与することができる。例示的な抗凝固薬の例は、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩、およびアルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン等の直接トロンビン阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０４４７】
他の補体阻害剤等の付加的な作用物質は、本明細書中で記載されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼとの併用治療において抗炎症薬として使用することができる。上記他の補体阻害剤の例は、コブラ毒因子（ＣＶＦ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、ポリビニル硫酸、ポリリジン、もしくはスラミン等のポリアニオニック分子、Ｋ−７６ＣＯＯＨ、ロスマリン酸、もしくは中国の薬草マオウの抽出物等の自然分子、メシル酸ナファモスタット（ＦＵＴ−１７５）等の合成分子、Ｃ１ｓの合成抑制剤（Ｃ１ｓ−ＩＮＨ−２４８）またはＣ１ｓおよびｆＤに対する阻害剤（ＢＣＸ−１４７０）、コンプスタチン等のペプチド阻害剤、抗Ｃ５抗体（Ｎ１９−８）、ヒト化抗Ｃ５抗体（ｈ５Ｇ１．１）、抗Ｃ６抗体、もしくは抗Ｃ８抗体等の補体の抗体阻害剤、ならびに可溶性ＣＲ１（ｓＣＲ１）、可溶性ＤＡＦ（ｓＤＡＦ）、可溶性ＭＣＰ（ｓＭＣＦ）、もしくは可溶性ＣＤ５９（ｓＣＤ５９）等の膜補体調節因子の可溶性形態を含む［Ｍｏｒｇａｎら、（２００３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：１５９］。
【０４４８】
本明細書中で記載されるプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを含有する医薬組成物は、補体活性化により媒介される任意の１つまたは複数の炎症性疾患または炎症性状態を処置するために使用することができる。プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼおよび炎症性疾患または炎症性状態の処置のための他の処置剤または化合物の組合せもまた提供される。プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼおよび抗炎症剤は、共にまたは連続的にまたは断続的に投与するために別々の組成物としてパッケージ化することができる。代わりに、それらは、投与のための単一組成物としてまたは単一組成物としての投与のための２つの組成物として提供することができる。組合せは、キットとしてパッケージ化することができ、所望により付加的な試薬、使用のための使用説明書、バイアルおよび他の容器、シリンジ、ならびに修飾プロテアーゼの使用のための他のアイテムを有することができる。
【実施例】
【０４４９】
以下の実施例は、例示的な目的のみのためにのみ含まれ、本明細書中で提供される実施形態の範囲を限定するよう意図されない。
【０４５０】
［実施例１］
ＭＴ−ＳＰ１のクローニングおよび突然変異誘発
野生型ＭＴ−ＳＰ１を、ｐＱＥ３２細菌発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社、配列番号３４５）中に、６ヒスチジンタグに対してＣ末端に、ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を使用してクローン化した。構築物は、プロ領域、活性化配列、およびプロテアーゼドメインを含み、Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：１１０５４により公開された配列のＣ末端に５９８残基および配列番号２（つまり、配列番号２に記載されるアミノ酸の配列の５９８〜８５５残基に対応する）を含有する。突然変異体を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）により生成した。手短に言えば、ＰＣＲサンプル反応は、鋳型としての野生型ＭＴ−ＳＰ１および所望の突然変異を含有するよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（表２１を参照されたい）を含有して設定された。ＰＣＲ反応は、以下の通り５０μｌ合計反応容量中とした：５μｌ  １０×反応緩衝液、１μｌ  ＭＴ−ＳＰ１  ＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ／μｌ）、０．５μｌ  ５０μＭフォワードプライマー、０．５μｌ  ５０μＭリバースプライマー、１．０μｌ  ｄＮＴＰ、４１．０μｌ  Ｈ２Ｏ、および１．０μｌ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ（２．５ユニット／μｌ）。コントロール反応もまた、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの非存在下で行った。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：９５℃で３０秒間、その後９５℃で３０秒間、５５℃で６０秒間、および７２℃で８分間を１８サイクル、２４秒間。反応は、１０分間の７２℃での伸長工程とその後に続く４℃でのインキュベーションで終了させた。各反応産物を、ＤｐｎＩを用いて１〜２時間３７℃で消化した。１．０ｍｌの産物を、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する選択的寒天培地上で２．０μｌおよび２０．０μｌで平板培養した。
【０４５１】
【表２１】
0005860789.tif 000031
【０４５２】
ＣＢ番号付けにより命名されたクローン化プロテアーゼドメインＭＴ−ＳＰ１突然変異体のそれぞれの配列を、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５５２〜６０５、または６７２〜６８０のいずれかに記載する。
【０４５３】
［実施例２］
ＭＴ−ＳＰ１の発現および精製
野生型ＭＴ−ＳＰ１および修飾ＭＴ−ＳＰ１を、Ｎ末端６ヒスチジンタグ、プロドメイン、およびプロテアーゼドメインを含有するｐＱＥ３２細菌発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社、配列番号３４５）中に、上述の実施例１において論じられるようにクローン化し、結果としての構築物をＢＬ−２１イー・コリ細胞中に形質転換した。細胞を、１００ｍＬ培養物中で、０．６のＯＤまで成長させ、封入体中のプロテアーゼの発現を、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを追加することにより誘起させた。４〜６時間後、細菌を遠心分離によりペレットにし、ペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５００ｍＭ  ＫＣｌ、および１０％グリセリン（緩衝液Ａ）中に再懸濁させた。細胞を、超音波処理により溶解させ、６０００ｘｇで遠心分離によりペレットにした。ペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、６Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％２−メルカプトエタノール（緩衝液Ｂ）中に再懸濁させた。膜および細胞小器官を、１０，０００ｘｇで遠心分離によりペレットにし、上清を、ニッケルＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）に通過させた。カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、６Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１％２−メルカプトエタノール、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（緩衝液Ｄ）を用いて洗浄した。カラムを、Ｔｗｅｅｎ  ２０なしの緩衝液Ｄを用いて再度洗浄した。次いで、プロテアーゼを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、６Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％２−メルカプトエタノール、および２５０ｍＭイミダゾール（緩衝液Ｅ）を用いてカラムから溶離させた。次いで、プロテアーゼを〜１ｍＬの容量に濃縮し、次いで、１Ｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、３Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％２−メルカプトエタノール、および１０％グリセリン中で４℃で終夜透析した。最終的に、プロテアーゼを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０％グリセリン中で４℃で終夜透析した。最後の透析工程の間、プロテアーゼは、配列ＲＱＡＲ／ＶＶＧＧでの、プロドメインおよびプロテアーゼドメインの間の接合部での自己切断により自己活性化されるようになり、６ヒスチジンタグおよびプロドメインの除去がもたらされた。
【０４５４】
［実施例３］
振盪フラスコ中での修飾ＭＴ−ＳＰ１  ＣＢ１５５の発現および精製
ＣＢ１５５および関係する組換えヒトセリンプロテアーゼ突然変異体ならびに野生型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを、上述の実施例１および２中に記載されるように、クローン化し、封入体としてのイー・コリ中で発現させた。ＭＴ−ＳＰ１または突然変異体の産生を、可溶化およびリフォールディングのための、続く封入体ペレットの単離のために、３０本×１Ｌ振盪フラスコ分までプールすることにより、実験室規模に適合させた。手短に言えば、ＭＴ−ＳＰ１突然変異体ＣＢ１５５プラスミド構築物を、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞中に形質転換させ、単一の新鮮なコロニーを、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する２５ｍｌのルリアブロス（ＬＢ；Ｄｉｆｃｏ社製ＬＢブロスＬｅｎｎｏｘ、１リットル当たりのおおよその配合：１０．０ｇトリプトン、１０．０ｇ酵母抽出物、５．０ｇ塩化ナトリウム）中に取り、３７℃で終夜成長させた。１０ミリリットルの終夜培養物を、Ｕｌｔｒａ  Ｙｉｅｌｄフラスコ（２．５Ｌ）中で１ＬのＬＢ中に希釈し、約０．６〜約０．７のＯＤ６００まで３７℃で振盪させた（つまり、３７℃で約２時間振盪した）。１．０ＭのＩＰＴＧ（ジオキサンなし；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を、封入体中でのプロテアーゼの発現を誘起するために、１ｍＭの最終濃度で培養物に追加し、培養物をさらに４時間３７℃で振盪した。培養物を、Ｓｏｒｖａｌｌローター＃ＳＬＣ４０００中で６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離により採取した。
【０４５５】
１Ｌ培養物からの細胞ペレットを、５０ｍｌの洗浄緩衝液ＩＩ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸水素二カリウムｐＨ７．４）中に再懸濁させ、超音波処理のためにロゼット細胞へ移入した。細胞を、以下の通りの超音波処理により溶解させた：２０〜５０ｍｌ溶液で２分間、３０％デューティーサイクル、出力＝５〜６、氷上、３回繰り返す；１００＋ｍｌ溶液で２分間、６０％デューティーサイクル、出力＝８、氷上、６回繰り返す。超音波処理した溶解物を、７０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、約２．０グラムの封入体当たり、４０ｍｌ洗浄緩衝液Ｉ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸水素二カリウムｐＨ７．４、０．５％ＬＤＡＯ）中にスパチュラおよびボルテックスを使用して再懸濁させた。封入体を、９０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離し、合計３回洗浄緩衝液Ｉ中で洗浄した。遠心分離および洗浄工程を洗浄緩衝液ＩＩ中でさらに２回繰り返した。洗浄した封入体を、約２．０グラムの封入体当たり、２０ｍｌの変性緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ  ｐＨ８．０、２０ｍＭジチオトレイトール）中に、ペレットをばらばらにするためにスパチュラを使用して懸濁させ、ペレットが溶解するまたはほとんど溶解するまで、室温で３０分間揺り動した。あらゆる不溶性物質をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＬＡ６００ＴＣローター中での９０００ｒｐｍでの遠心分離とその後に続く２０ｍｌ緩衝液中での再懸濁により除去した。サンプルを、１００×容量のリフォールディング緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ還元型グルタチオン、０．０５Ｍ酸化型グルタチオン、１．５Ｍ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩）を含有するビーカー中にゆっくり滴下し、４℃で７２時間ゆっくり撹拌した。サンプルを、アルギニン−ＨＣＬの１Ｍ最終濃度まで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０／５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で希釈し、次いで、約７００ｍｌまで、クロスフローろ過を使用して濃縮した。次いで、サンプルを、ＶｉｖａＦｌｏｗ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、エッジウッド、ＮＹ）に移し、約３００ｍｌの最終容量までさらに濃縮した。サンプルを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０／５０  ｍＭ  ＮａＣｌ（８Ｌ）中で終夜透析した。サンプルのいくらかの沈殿物が生じた。沈殿物を除去するために、サンプルを９０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０４５６】
プロテアーゼの自己活性化がプロ領域の切断により生じ、成熟酵素を遊離するまで、サンプルを室温でインキュベートした。この自己活性化は、精製プロセス中に生じる。活性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより監視した（３キロダルトンシフト）。活性はまた、蛍光発生基質の切断により評価される酵素活性により監視した。酵素活性を測定するために、プロテアーゼを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するアッセイ緩衝液中で１：２０倍〜１：１００倍希釈した。５μｌの希釈プロテアーゼを１００μＭ  Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＭＣ基質のうちの５０μｌと混合し、蛍光発光を蛍光分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ）で、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍで４３５ｎｍに設定されたカットオフフィルターを使用して測定した。活性は、サンプルを室温でインキュベートするのが可能である長い間にわたって、約２４〜７２時間、活性が安定化するまで評価された。より薄いサンプルについては、より時間が必要とされる可能性がある。典型的に、プロテアーゼは、アニオン交換による精製の前で、＞７５％の活性化を達成することが可能である。
【０４５７】
活性が安定化したら、サンプルを、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．５（８Ｌ）中で終夜透析した。サンプルを、フィルターにかけ、ＳｏｕｒｃｅＱカラム上に装填した。ＳｏｕｒｃｅＱカラム上に装填した後、サンプルを、３カラム容量の緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．５）を用いて洗浄し、１０カラム容量を超える０〜２０％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．５／１Ｍ  ＮａＣｌ）の勾配を用いて溶離した。各分画の活性を測定し、活性分画を組み合わせ、ＰＢＳ中で終夜透析した。タンパク質サンプルを約５ｍｌまで濃縮し、ベンズアミジンを、ＣＢ１５５の自己溶解を阻害するために、最終濃度の２０ｍＭまで追加した。ＣＢ１５５の全収率は、典型的に、約１５〜２０ｍｇ  ＣＢ１５５／１Ｌ細胞培養物である。２２ｍｇ／リットル細胞培養物の収率は、振盪フラスコ規模でのＣＢ１５５の産生により達成された。封入体から天然タンパク質への全収率は典型的に１０％未満であった。３ｇ／Ｌまでの発酵における力価が振盪フラスコ中で達成された。
【０４５８】
精製タンパク質を、特異的活性、純度、およびエンドトキシンレベルについてアッセイした。各プレップ中の活性プロテアーゼの特異的活性または量は、いろいろな濃度の、機能的プロテアーゼの活性部位中に結合する阻害剤を用いたインキュベーションによる活性部位滴定とその後に続く基質タンパク質分解の測定のための蛍光発生基質への追加により決定した。活性酵素の量は、切片が活性プロテアーゼの濃度に対応する、阻害剤濃度に対する残存プロテアーゼ活性のプロットから算出した。手短に言えば、精製タンパク質を、エコチンＭ８４Ｒを用い、Ｈａｒｒｉｓらの方法（ＪＢＣ，１９８８，２７３：２７３５４〜７３）を使用して、４−メチルウンベリフェリルｐ−グアジノ安息香酸（ｐ−ｇｕａｎｄｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）（ＭＵＧＢ）でトリプシンのストックを滴定することにより滴定し、次いで、Ｍ８４Ｒエコチンのストックをトリプシンで滴定した。最終的に、精製プロテアーゼを、Ｍ８４Ｒエコチンストックで滴定した。それぞれの場合では、プロテアーゼは、３０分間、３０℃で、予想されるプロテアーゼ濃度の０．１倍および２倍の間の阻害剤の濃度でインキュベートした。非阻害プロテアーゼ活性の３０％および９０％の間の残存活性を、データのプロットのために使用した。酵素活性を、３０℃で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（トリプシン活性については、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を追加した）を含有するアッセイ緩衝液中の４０μＭ  Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＭＣの存在下で、Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ分光蛍光光度計（励起：３８０ｎｍ；発光：４５０ｎｍ；カットオフ：４３５ｎｍ）上で監視した。タンパク質調製物の純度は、クーマシーブルーを用いた染色が後に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥでのタンパク質産物の分離により評価した。成熟プロテアーゼは、２５ｋＤの単一バンドとして動く。各プレップ中のエンドトキシンのレベルは、カブトガニ血球抽出成分Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社）により、以下の修正を有するメーカーのプロトコールに従って決定した。プロテアーゼをＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）中に１００倍に希釈し、２本のチューブに分離した。１００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬのチャレンジを一方のチューブに追加し、ＬＲＷを他方に追加した。次いで、反応が、最終濃度の５ｍＭトシル−リシル−クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を含有するように、サンプルをストック溶液中に２倍に希釈した。各サンプルを、プロテアーゼ活性を不活性化するために２時間３７℃でインキュベートした。サンプルを５０倍にさらに希釈し、メーカーの使用説明書に従ってアッセイした。エンドトキシンチャレンジの回収率が、理論の５０〜１５０％であった場合、結果は妥当であると考えられた。最終精製ＣＢ１５５は、典型的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％純度、＞９０％特異的活性を有し、約５０〜５００ＥＵ／ｍｌのエンドトキシンを含有した。
【０４５９】
［実施例４］
ＭＴ−ＳＰ１および突然変異体の大規模発酵
実施例３に記載されるプロトコールに基づいたＭＴ−ＳＰ１突然変異体の大規模発酵を行った。突然変異体ＭＴ−ＳＰ１を用いて形質転換した選択されたイー・コリコロニーの２リットルの培養物を、ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社）中で終夜成長させた。終夜培養物を５０Ｌ発酵に接種し、ＯＤ６００の吸光度が対数期に達するまで、３７℃で振盪させながら約５時間成長させた。封入体中でのプロテアーゼの発現は、７００μＭの最終濃度までＩＰＴＧを追加して誘起し、発酵をさらに４時間流加モードで継続した。培養物を遠心分離により採取し、約７５０グラム〜１６８０グラムの湿重量の細胞ペレットを得た。細胞ペレットを再懸濁し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１０％グリセリン、１ｍＭベータ−メルカプトエタノール中で、１グラム細胞ペレット当たり１０ｍｌ緩衝液で超音波処理した。超音波処理条件は、パルスオン：４秒間、パルスオフ：６秒間、７００Ｗ、３０分間であった。超音波処理溶解物を、７０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、洗浄緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１０％グリセリン、１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中に、１ｇの封入体当たり１０ｍｌ緩衝液で、スパチュラおよびボルテックスを使用して再懸濁させた。封入体を遠心分離し、２回洗浄した。封入体収量は約１７６〜５０６グラムであった。
【０４６０】
［実施例５］
ピキアパストリス中でのＭＴ−ＳＰ１の産生
ＭＴ−ＳＰ１のマルチミリグラム量のプロテアーゼドメインの産生を、３．３Ｌ容積のバイオリアクターを装備したＢｉｏＦｌｏ３０００発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＮＪ）中での発酵により、ＳＭＤ１１６８／ｐＰＩＣ９Ｋ：ＭＴＳＰ１  Ｓａｃ  ＳＣＩクローンを使用して実行した［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２１６０−２１６８］。ＺＡ００１複合培地［１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、４０ｇ／Ｌグリセリン、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．２ｇ／Ｌ無水硫酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｈｅｐａｈｙｄｒａｔｅ）、２ｇ／Ｌ硫酸カリウム、２５ｇ／Ｌヘキサメタリン酸ナトリウム、４．３５ｍｌ／Ｌ  ＰＴＭ１］にＰ．パストリス形質転換体の１００ｍｌの終夜培養物を植えた。培養物に５０％グリセリンを流加段階で補充し、メタノールを０．０２５％に制御して１８〜２４時間誘起させた。
【０４６１】
培養液中に分泌された組換えＭＴ−ＳＰ１を精製するために、細胞および細胞片を５０００ｇで３０分間、遠心分離により除去した。結果としての上清を、デカントし、１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に合わせ、ＳａｒｔｏＢｒａｎ  ３００  ０．４５＋０．２μＭカプセル（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を通してフィルターにかけた。上清を、１Ｌまで、限外ろ過により、１０ｋＤａ限外ろ過カートリッジ（ＡＧ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＵＦＰ−１０−Ｃ−５Ａフィルターを有するＮＣ  ＳＲＴ  ＵＦシステム）を使用して濃縮し、緩衝液をクロスフローろ過により緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ８．０）に取り替えた。ろ過ユニットを１Ｌ緩衝液Ａを用いてすすぎ、緩衝液Ａを濃縮物と組み合わせた。
【０４６２】
濃縮したＭＴ−ＳＰ１含有溶液を、緩衝液Ａを用いて平衡化した１５０ｍｌベンズアミジンカラム上に８ｍｌ／分の流速で適用した。カラムを、３カラム容量の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ８．０）を用いて洗浄し、３カラム容量の緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０Ｍ  Ｌ−アルギニン、０．０５％ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ８．０）を用いて溶離した。ＭＴ−ＳＰ１活性を含有する分画を、プールし、ＪｕｍｂｏＳｅｐ濃縮器（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ社）および１０ｋＤａカットオフ膜を使用して１０ｍｌまで濃縮した。１０ｍｌまで濃縮したら、緩衝液を、緩衝液Ｄ（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）に取り替え、容量を５〜１０ｍｌに合わせた。不透過物を除去し、濃縮器を緩衝液Ｄを用いて洗浄し、緩衝液Ｄを濃縮物に追加した。合計のサンプル容量を１５ｍｌに合わせた。
【０４６３】
ベンズアミジンカラムからの部分精製ＭＴ−ＳＰ１を、１５ｍｌ緩衝液Ｄを用いてあらかじめ平衡化した５ｍｌＱ−セファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通過させた。通った流出物を収集し、タンパク質濃度をＯＤ２８０の測定により決定した（２．０１２ｍｇ／ＯＤ２８０の吸光係数を使用）。次いで、精製ＭＴ−ＳＰ１を、タンパク質１ｍｇ当たり０．１μｌのエンドグリコシダーゼＨ（ＰｒｏＺｙｍｅ社、５Ｕ／ｍｌ）の追加および緩やかな回旋での４℃での終夜のインキュベーションと、その後に続くアニオン交換精製工程（ＣＢ１５５  ＭＴ−ＳＰ１突然変異体には必要とされない）により脱グリコシルした。
【０４６４】
脱グリコシルしたプールの伝導率をＮａｎｏｐｕｒｅ  Ｈ２Ｏを用いて２．０〜３．０ｍＳ／ｃｍに合わせ、ｐＨを６．５に合わせた（約２００〜３００ｍｌ最終容量）。次いで、ＭＴ−ＳＰ１を、７ｍｌ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑアニオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用したＰｈａｒｍａｃｉａ社製Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム上に直接装填することによりアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。タンパク質を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５含有する緩衝液中で、１０カラム容量を超える０〜０．３３Ｍの勾配のＮａＣｌを用いて６ｍｌ／分の流速で溶離させた。タンパク質を含有する分画をプールし、ベンズアミジンを、ＯＤ２８０の測定および理論的な吸光係数２．０１２ｍｇ／ＯＤ２８０の使用により決定された最終濃度まで追加した。
【０４６５】
［実施例６］
血漿活性の評価
野生型プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの血漿中の活性を、ＭＴ−ＳＰ１自己活性化部位を含むペプチド基質Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＭＣの切断により決定した。１０μＭプロテアーゼストックの１マイクロリットルを、９μｌ  ＰＢＳＴまたは９μｌプールヒトクエン酸血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社；サラソタ、フロリダ）（１μＭ最終）中に希釈した。反応を５分間、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの終わりに、１μｌのインキュベートしたプロテアーゼ混合物を、２５０μｌアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に希釈した。１μｌのＡｃ−ＲＱＡＲ−ＡＭＣ基質（ＤＭＳＯ中６．２５ｍＭ）を、Ｎｕｎｃ社製黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに追加し、５０μｌの希釈し、インキュベートしたプロテアーゼ混合物をウェルに追加した。基質の切断は、Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ蛍光発光プレートリーダーを使用して、３８０ｎｍでの励起波長および４５０ｎｍでの発光波長を用いた反応速度測定を利用することにより監視した。プロテアーゼの分画活性は、ＰＢＳＴ中の活性で割った、血漿中のプロテアーゼの活性の比として算出した。
【０４６６】
野生型ＭＴ−ＳＰ１またはＭＴ−ＳＰ１突然変異体のパネルの血漿活性は、溶血アッセイにおけるプロテアーゼの評価と平行して決定した（以下の実施例７を参照されたい）。結果を以下の表２３に記載する。
【０４６７】
［実施例７］
赤血球の補体誘起性溶血の検出によりプロテアーゼ活性をスクリーニングし、滴定するための溶血アッセイ
補体系の機能的活性は、伝統的な溶血アッセイを使用して評価することができ、溶血アッセイは、サンプルが赤血球を溶解する能力を決定することにより、全補体経路の機能についてスクリーニングする。分析されることになるサンプルの階段希釈溶液は、抗体感作ヒツジ赤血球と共に規定温度でインキュベートする。溶解した赤血球の数を遊離ヘモグロビンの分光光度計吸光度により決定し、この吸光度は、補体タンパク質レベルに対する直線関係を５０％の溶解範囲において有する。結果は、５０％の溶解をもたらすのに必要とされるサンプルの希釈度の逆数として通常表現される。したがって、古典経路の成分の活性を評価すると、ＣＨ５０値を決定することができる。ＡＨ５０（５０％溶血が生じる力価）を決定するために代替経路の機能的活性を評価する試験は、モルモット、ウサギ、またはニワトリの赤血球を標的細胞として使用する。古典経路の活性化は、代替経路溶血アッセイに対するＥＧＴＡおよびＭｇの追加によりブロックされる。
【０４６８】
溶血アッセイは、補体活性化に対する所与のプロテアーゼの効果を決定するために修正することができる。プロテアーゼは、赤血球との共インキュベーションの前に血漿と共にインキュベートされる。プロテアーゼによる補体産物の切断は、補体活性の減少をもたらすであろう。プロテアーゼの階段希釈溶液と共に血漿をインキュベートすることにより、ＩＣ５０を決定することができ、ＩＣ５０は、補体活性の５０％阻害が達成されるプロテアーゼの濃度である。
【０４６９】
Ａ．古典溶血アッセイ
１．古典溶血アッセイ：２０％血漿を用いたプレインキュベーション
ａ．プロテアーゼでの処置の後での補体活性化を評価するために、抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを有するヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を、０〜１μＭの最終濃度まで希釈された野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、またはＣＢ４２の追加の前に２０％の最終濃度までＰＢＳＴ中に希釈した（４０μｌ  ＰＢＳＴ中１０μｌ血漿）。反応を３７℃で１時間インキュベートした。血漿溶液を、ＩｇＧを用いて活性化したヒツジ赤血球の溶液中に０．５％の最終濃度までさらに希釈した［２５０μｌヒツジ赤血球溶液中６．２５μｌ血漿溶液、Ｄｉａｍｅｄｉｘ社（マイアミ、ＦＬ）］。溶液を、室温で４５分間振盪させながらインキュベートした。細胞を２０００ｒｐｍで２分間遠心沈殿し、１００μｌの上清を除去し、透明な９６ウェルマイクロタイタープレート中に置いた。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、およびＣＢ４２による溶血のＩＣ５０（ｎＭ）はそれぞれ１３１ｎＭ、９４ｎＭ、および６７ｎＭであった。
【０４７０】
ＭＴ−ＳＰ１修飾プロテアーゼのパネルを溶血の阻害について試験した。抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを含有する希釈ヒト血漿を、２００ｎＭの野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１２、ＣＢ１３、ＣＢ３１、ＣＢ３２、ＣＢ４０、ＣＢ４１、ＣＢ４２、ＣＢ４３、ＣＢ４４、ＣＢ４５、ＣＢ６４、ＣＢ６６、ＣＢ６７、およびＣＢ１５５と共にインキュベートした。反応を３７℃で１時間インキュベートした。血漿溶液を、ＩｇＧを用いて活性化したヒツジ赤血球の溶液中で０．５％の最終濃度までさらに希釈し、溶血を、上記のようにアッセイした。ＣＨ５０値を決定した。溶血の分画は、追加のプロテアーゼを含有しないサンプル（ポジティブコントロール）と比較して、野生型プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼのＣＨ５０値を比較することにより決定し、ここで、ポジティブコントロールの溶血の分画は１．００に設定した。表２２は、生の、溶血の分画の値を表す。データは、試験したすべてのプロテアーゼが、ポジティブコントロールと比較して、溶血を少なくとも５０％阻害し、溶血が、ＣＢ４２の存在下で完全に阻害されたことを示す。
【０４７１】
【表２２−１】
0005860789.tif 000032
【表２２−２】
0005860789.tif 000033
【０４７２】
ｂ．他の実験では、プロテアーゼでの処置の後での古典の補体活性化を評価するために、プロテアーゼを、ＰＢＳＴ中に、５．０μＭの濃度まで、スクリーニングプロトコールのために初めに希釈し、５０μＭから０．３９０μＭまでのプロテアーゼの階段希釈溶液をＩＣ５０を決定するためのプロトコールに使用した。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、２μｌの希釈プロテアーゼ溶液、１０μｌのヒト血漿（抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを有する；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）および３８μｌのＰＢＳＴを組み合わせることにより、最終濃度の２０％血漿と共に０．２ｍｌチューブ中でプレインキュベートした。これによりプロテアーゼのさらなる希釈溶液がもたらされ、最終濃度を、スクリーニングプロトコールについては２００ｎＭプロテアーゼおよびＩＣ５０プロトコールについては２．０μＭ〜０．０１５６μＭプロテアーゼとした。非プロテアーゼコントロール（１０μｌ血漿および４０μｌ  ＰＢＳＴ）ならびにバックグラウンドコントロール（５０μｌ  ＰＢＳＴのみ）もまたアッセイに含まれた。反応を３７℃で１時間インキュベートした。感作ヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ社、マイアミ、ＦＬ）を、ポリプロピレン９６ウェルプレートにウェル当たり１２０μｌの容量で追加し、３μｌの血漿／プロテアーゼ溶液を、各ウェル中に混合し、最終血漿濃度を０．５％にした。溶液を室温で４５分間振盪させながらインキュベートした。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を、２０００ｒｐｍで、５分間、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上遠心分離機で遠心沈殿し、１００μｌの上清を除去し、透明な９６ウェルマイクロタイタープレート中に置いた。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。すべてのウェルからバックグラウンドコントロールを差し引き、非プロテアーゼコントロール（ポジティブコントロール）で実験的サンプルを割ることにより分画溶血を算出し、ここで、ポジティブコントロールの溶血の分画は１．００に設定した。プロテアーゼによる溶血のＩＣ５０（ｎＭ）は、分画溶血対プロテアーゼ濃度を４パラメータロジスティック曲線フィット（ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＣＡ）でプロットすることにより測定した。
【０４７３】
ＭＴ−ＳＰ１修飾プロテアーゼのパネルを、古典補体経路の１つまたは複数の成分の切断を通した溶血の阻害について試験した。抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを含有する希釈ヒト血漿を、野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ１２、ＣＢ１６、ＣＢ１７、ＣＢ２０、ＣＢ２１、ＣＢ４２、ＣＢ４３、ＣＢ４４、ＣＢ４５、ＣＢ６６、ＣＢ８０、ＣＢ８２、ＣＢ１５５、ＣＢ２１２、ＣＢ２１３、ＣＢ２１４、ＣＢ２１６、ＣＢ２１８、ＣＢ２１９、ＣＢ２３２、ＣＢ２３５、ＣＢ２３８、ＣＢ２４４、ＣＢ２４５、ＣＢ２５１、ＣＢ２５２、ＣＢ２５５、ＣＢ２５７、ＣＢ２６８、ＣＢ２７４、ＣＢ３３１、ＣＢ３３２、ＣＢ３４９、ＣＢ３５０、ＣＢ３５１、ＣＢ３５３、ＣＢ３５７、ＣＢ３６７、ＣＢ３７３、ＣＢ３７７、ＣＢ３８１、ＣＢ３８３、ＣＢ３８５、ＣＢ３８７、ＣＢ３８８、ＣＢ４０３、ＣＢ４０９、ＣＢ４１２、ＣＢ４１３、ＣＢ４２１、ＣＢ４２２、ＣＢ４２３、ＣＢ４５０、ＣＢ４５１、ＣＢ４５８、ＣＢ４６４、ＣＢ４８６、ＣＢ４８７、ＣＢ４８８、ＣＢ４８９、およびＣＢ４９０の２００ｎＭまたは２．０μＭから０．０１５６μＭまでのいずれかの階段希釈溶液と共にインキュベートした。反応を３７℃で１時間インキュベートした。プロテアーゼ／血漿溶液を、感作ヒツジ赤血球中でさらに希釈し、溶血を、上記のようにアッセイした。分画溶血およびＩＤ５０を決定した。表２３は、２００ｎＭでの分画溶血（古典２００ｎＭ溶血）および各プロテアーゼについてのＩＣ５０（２０％血漿プレインキュベーション）を表す。
【０４７４】
２．古典溶血アッセイ：９０％血漿を用いたプレインキュベーション
修正した古典溶血アッセイは、より生理学的な条件下でのプロテアーゼの阻害活性を測定するために、血漿およびプロテアーゼの濃度を合わせることにより、さらに適合させることができる。プロテアーゼを、ＰＢＳＴ中に、５０μＭの濃度まで、スクリーニングプロトコールのために初めに希釈し、２００μＭから１．５６μＭまでのプロテアーゼの階段希釈溶液をＩＣ５０を決定するためのプロトコールに使用した。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、２μｌの希釈プロテアーゼ溶液、１８μｌのヒト血漿（抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを有する；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を組み合わせることにより、最終濃度の９０％血漿と共に０．２ｍｌチューブ中でプレインキュベートした。これによりプロテアーゼのさらなる希釈溶液がもたらされ、最終濃度を、スクリーニングプロトコールについては５．０μＭプロテアーゼおよびＩＣ５０プロトコールについては２０μＭ〜０．１５６μＭプロテアーゼとした。非プロテアーゼコントロール（１８μｌ血漿および２μｌ  ＰＢＳＴ）ならびにバックグラウンドコントロール（２０μｌ  ＰＢＳＴのみ）もまたアッセイに含まれた。反応を３７℃で１時間インキュベートした。反応混合物を、７０μｌ  ＰＢＳＴを追加して２０％血漿までさらに希釈した。感作ヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ社、マイアミ、ＦＬ）は、３．０ｍｌの一定分量をペレットにし、２．７ｍｌの緩衝液を除去し、残りの０．３ｍｌ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁させることにより、１０×に濃縮した。濃縮した感作赤血球を、ポリプロピレン９６ウェルプレートに１ウェル当たり１２μｌの容量で追加した。６μｌまたは６０μｌのプレインキュベートしたプロテアーゼ／血漿混合物を、１２０μｌの最終容量中それぞれ１％血漿または１０％血漿の最終濃度となるよう、赤血球に追加した（ＰＢＳＴは最終容量に追加）。溶液を室温で４５分間振盪させながらインキュベートした。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を、２０００ｒｐｍで、５分間遠心沈殿し、１００μｌの上清を除去し、透明な９６ウェルマイクロタイタープレート中に置いた。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。すべてのウェルからバックグラウンドコントロールを差し引き、次いで、非プロテアーゼコントロール（ポジティブコントロール）で実験的サンプルを割ることにより分画溶血を算出し、ここで、ポジティブコントロールの溶血の分画は１．００に設定した。プロテアーゼによる溶血のＩＣ５０（ｎＭ）は、分画溶血対プロテアーゼ濃度を４パラメータロジスティック曲線フィット（ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＣＡ）でプロットすることにより測定した。
【０４７５】
野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）ならびにＭＴ−ＳＰ１突然変異体ＣＢ２５２およびＣＢ３７７を、９０％血漿とのプレインキュベーションが後に続く溶血の阻害について試験した。プレインキュベートしたプロテアーゼ／血漿混合物（２０ｎＭ〜２０００ｎＭプロテアーゼの最終濃度で）を、１０％の最終血漿濃度で感作赤血球とインキュベートし、溶血を、上記のように評価した。溶血のＩＣ５０を、上記のように決定した。ＣＢ２００、ＣＢ２５２、およびＣＢ３７７のＩＣ５０は、それぞれ９６７ｎＭ、３７９ｎＭ、および２０５ｎＭであった。
【０４７６】
修飾ＭＴ−ＳＰ１  ＣＢ４５０もまた、９０％血漿とのプレインキュベーションが後に続くｉｎ  ｖｉｔｒｏ古典経路誘起性溶血について評価した。プレインキュベートしたプロテアーゼ／血漿混合物（２０ｎＭ〜２０００ｎＭプロテアーゼの最終濃度で）を、１％および１０％の最終血漿濃度で感作赤血球とインキュベートし、溶血を、上記のように評価した。結果は、ＣＢ４５０が、１％または１０％の血漿により誘起された溶血を容量依存的に減少させ、１％血漿による誘起の際に観察された溶血の阻害がわずかに高かったことを示す。例えば、１００ｎＭまたはそれよりも高いＣＢ４５０の存在下で、１％血漿中での誘起の際に観察された検出可能な溶血はなかったのに対して、１０％血漿中での誘起は、溶血の完全な阻害を達成するためにより高度な収量のプロテアーゼを必要とした。（つまり約７５０ｎＭまたはそれよりも高いＣＢ４５０プロテアーゼ）。
【０４７７】
Ｂ．代替溶血アッセイ
１．代替溶血アッセイ：２０％血漿を用いたプレインキュベーション
プロテアーゼでの処置の後での代替の補体活性化を評価するために、プロテアーゼは、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および８ｍＭ  ＥＧＴＡを有するゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ；Ｃｏｍｐｔｅｃｈ社）を含有するＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ緩衝液中に初めに希釈した。プロテアーゼを、スクリーニングプロトコールのために７．５μＭの濃度に希釈し、３０μＭから０．２３４４μＭまでのプロテアーゼの階段希釈溶液をＩＣ５０を決定するためのプロトコールに使用した。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを、５μｌの希釈プロテアーゼ溶液、１５μｌのヒト血漿（抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを有する；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、および５５μｌのＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ緩衝液を組み合わせることにより、最終濃度の２０％血漿と共に９６ウェルポリプロピレンプレートのウェル中でプレインキュベートした。これによりプロテアーゼのさらなる希釈溶液がもたらされ、最終濃度を、スクリーニングプロトコールについては５００ｎＭプロテアーゼおよびＩＣ５０プロトコールについては２．０μＭ〜０．０１５６μＭプロテアーゼとした。非プロテアーゼコントロール（１５μｌ血漿および６０μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ）ならびにバックグラウンドコントロール（７５μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡのみ）もまたアッセイに含まれた。反応を室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後で、５μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡを、インキュベートした混合物に追加し、その後に続いて２０μｌの洗浄ニワトリアルセバー（ニワトリからの全血およびアルセバー溶液の５０％ミックスで、抗凝固薬を含有する；Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、ＣＯ）を追加し、最終血漿濃度を１５％とした。追加の前に、ニワトリアルセバーを、以下の実施例１９に記載されるように感作し、細胞を、遠心分離し、冷ＰＢＳ中で３回洗浄し、１０ｍｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ中に再懸濁させ、使用まで氷上に保存した。プレートを３７℃で１時間振盪させた。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を、２０００ｒｐｍで、５分間遠心沈殿し、１００μｌの上清を除去し、透明な９６ウェルマイクロタイタープレート中に置いた。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。すべてのウェルからバックグラウンドコントロールを差し引き、非プロテアーゼコントロール（ポジティブコントロール）で実験的サンプルを割ることにより分画溶血を算出し、ここで、ポジティブコントロールの溶血の分画は１．００に設定した。プロテアーゼによる溶血のＩＣ５０（ｎＭ）は、分画溶血対プロテアーゼ濃度を４パラメータロジスティック曲線フィット（ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＣＡ）でプロットすることにより測定した。
【０４７８】
ＭＴ−ＳＰ１修飾プロテアーゼのパネルを、代替補体経路の１つまたは複数の成分の切断を通した溶血の阻害について試験した。抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを含有するヒト血漿を、野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ１２、ＣＢ１６、ＣＢ１７、ＣＢ２０、ＣＢ２１、ＣＢ４２、ＣＢ４３、ＣＢ４４、ＣＢ４５、ＣＢ６６、ＣＢ８０、ＣＢ８２、ＣＢ１５５、ＣＢ２１２、ＣＢ２１３、ＣＢ２１４、ＣＢ２１６、ＣＢ２１８、ＣＢ２１９、ＣＢ２３２、ＣＢ２３５、ＣＢ２３８、ＣＢ２４４、ＣＢ２４５、ＣＢ２５１、ＣＢ２５２、ＣＢ２５５、ＣＢ２５７、ＣＢ２６８、ＣＢ２７４、ＣＢ３３１、ＣＢ３３２、ＣＢ３４９、ＣＢ３５０、ＣＢ３５１、ＣＢ３５３、ＣＢ０３５７、ＣＢ３６７、ＣＢ３７３、ＣＢ３７７、ＣＢ３８１、ＣＢ３８３、ＣＢ３８５、ＣＢ３８７、ＣＢ３８８、ＣＢ４０３、ＣＢ４０９、ＣＢ４１２、ＣＢ４１３、ＣＢ４２１、ＣＢ４２２、ＣＢ４２３、ＣＢ４５０、ＣＢ４５１、ＣＢ４５８、ＣＢ４６４、ＣＢ４８６、ＣＢ４８７、ＣＢ４８８、ＣＢ４８９、およびＣＢ４９０の５００ｎＭまたは２．０μＭから０．０１５６μＭまでのいずれかの階段希釈溶液と共にインキュベートした。反応を室温で１時間インキュベートした。プロテアーゼ／血漿溶液を、ニワトリ赤血球中でさらに希釈し、溶血を、上記のようにアッセイした。分画溶血およびＩＤ５０を決定した。表２３は、５００ｎＭでの分画溶血（代替５００ｎＭ溶血）および各プロテアーゼについてのＩＣ５０（２０％血漿プレインキュベーション）を表す。
【０４７９】
【表２３−１】
0005860789.tif 000034
【０４８０】
【表２３−２】
0005860789.tif 000035
【０４８１】
【表２３−３】
0005860789.tif 000036
【０４８２】
２．代替溶血アッセイ：９０％血漿を用いたプレインキュベーション
修正した代替溶血アッセイは、さらに例えば活性が低いプロテアーゼ等のプロテアーゼの阻害活性を測定するために、血漿およびプロテアーゼの濃度を合わせることにより、適合させることができる。プロテアーゼを、ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ中に、５０μＭの濃度まで、スクリーニングプロトコールのために初めに希釈し、２００μＭから１．５６μＭまでのプロテアーゼの階段希釈溶液をＩＣ５０を決定するためのプロトコールに使用した。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを、２μｌの希釈プロテアーゼ溶液を１８μｌのヒト血漿（抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムを有する；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を組み合わせることにより最終濃度の９０％血漿と共に９６ウェルポリプロピレンプレートのウェル中でプレインキュベートした。これによりプロテアーゼのさらなる希釈溶液がもたらされ、最終濃度を、スクリーニングプロトコールについては５．０μＭプロテアーゼおよびＩＣ５０プロトコールについては２０μＭ〜０．１５６μＭプロテアーゼとした。非プロテアーゼコントロール（１８μｌ血漿および２μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ）ならびにバックグラウンドコントロール（２０μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡのみ）もまたアッセイに含まれた。反応を室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、８０μｌのＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡを、インキュベートした血漿／プロテアーゼミックス中に追加し、その後、２０μｌの洗浄ニワトリ細胞を追加し（上記）、最終血漿濃度を１５％とした。プレートを、３７℃で１時間振盪させた。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を、２０００ｒｐｍで、５分間遠心沈殿し、１００μｌの上清を除去し、透明な９６ウェルマイクロタイタープレート中に置いた。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。すべてのウェルからバックグラウンドコントロールを差し引き、非プロテアーゼコントロールで実験的サンプルを割ることにより分画溶血を算出し、ここで、ポジティブコントロールの溶血の分画は１．００に設定した。プロテアーゼによる溶血のＩＣ５０（ｎＭ）は、分画溶血対プロテアーゼ濃度を４パラメータロジスティック曲線フィット（ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＣＡ）でプロットすることにより測定した。
【０４８３】
修飾ＭＴ−ＳＰ１  ＣＢ４５０を、９０％血漿とのプレインキュベーションが後に続くｉｎ  ｖｉｔｒｏ代替経路誘起性溶血について評価した。プレインキュベートしたプロテアーゼ／血漿混合物（２０ｎＭ〜２０００ｎＭプロテアーゼの最終濃度で）は、ニワトリ細胞と１５％の最終血漿濃度でインキュベートし、溶血を、上記のように評価した。結果は、ＣＢ４５０が、１５％の血漿により誘起された溶血を容量依存的に減少させ、約５００ｎＭまたはより高いＣＢ４５０プロテアーゼで観察された赤血球の検出可能な溶血はなかったことを示す。
【０４８４】
［実施例８］
補体欠乏血清を使用した、赤血球の補体誘起性溶血の検出
ａ．野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、またはＣＢ４２プロテアーゼの存在下または非存在下において処置した精製補体因子による補体活性化を評価するために、精製補体因子Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５ならびにＣ２−、Ｃ３−、Ｃ４−、およびＣ５−補体欠乏培地をＱｕｉｄｅｌ社から購入した。精製補体タンパク質（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５）を、１００ｎＭの野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、またはＣＢ４２プロテアーゼと共に３７℃で３時間インキュベートした。反応中に使用された精製タンパク質の濃度は５μＭであった。１μｌの適切な補体欠乏血清と一緒に反応の１マイクロリットルを、１００μｌの感作ヒツジ赤血球に追加し、上述の実施例７に記載される溶血活性についてアッセイした。溶血のＣＨ５０値を決定した。サンプルの溶血の分画は、追加のプロテアーゼを含有しないサンプルを含有する、１．００に設定されたＣ２血清とサンプルのＣＨ５０値を比較することにより、決定した。表２４は、生の、溶血の分画の値を表す。野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、およびＣＢ４２プロテアーゼは、溶血の阻害により決定されるように、Ｃ２およびＣ３を不活性化するが、Ｃ４およびＣ５を不活性化しない。
【０４８５】
【表２４】
0005860789.tif 000037
【０４８６】
ｂ．他の実験では、補体タンパク質のパネルを、ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ２５２、およびＣＢ３７７の存在下または非存在下で処置し、プロテアーゼによる精製補体タンパク質の不活性化についての事象を評価した。精製補体タンパク質（すべてＱｕｉｄｅｌ社から；サンディエゴ、ＣＡ）を、それらの生理学的血清濃度（Ｃ１ｑ：１８０μｇ／ｍｌ；Ｃ２：２５μｇ／ｍｌ；Ｃ３：１０００μｇ／ｍｌ；Ｃ４：５００μｇ／ｍｌ；Ｃ５：７５μｇ／ｍｌ；Ｃ６：７０μｇ／ｍｌ；Ｃ８：８０μｇ／ｍｌ；Ｃ９：６０μｇ／ｍｌ）で、２５ｎＭ  ＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７プロテアーゼを有するＰＢＳＴ中でインキュベートした。反応の１μｌを、１００μｌの感作ヒツジ赤血球に、対応する補体因子が欠乏した１μｌの血清（すべての欠乏血清はＱｕｉｄｅｌ社から購入）の存在下で追加した。コントロールとして、非プロテアーゼコントロール、欠乏血清のみ、および正常血清のみが反応に含まれた。サンプルは、９６ウェルプレートのウェル中で１時間、室温で、振盪させながらインキュベートした。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を遠心分離により遠心沈殿し、８５μｌの上清を除去し、透明な９６ウェルマイクロタイタープレート中に移した。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。結果は、追加の対応する精製補体タンパク質の非存在下でのコントロール欠乏血清は、ＯＤ４１５での読み取りにより評価されるように溶血を示さなかったかあってもわずかであったのに対して、コントロール正常血清は、ＯＤ４１５により約０．４と評価されたように溶血を呈したことを示した。対応する精製補体タンパク質が、欠乏血清に追加されて戻された反応のそれぞれについて（非プロテアーゼコントロール）、ＯＤ４１５読み取りは正常血清で観察されたものと似ていた。補体タンパク質Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、またはＣ９のＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７とのプレインキュベーションは、正常血清または非プロテアーゼコントロールと比較して溶血の減少を示さなかった。対照的に、ＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７とのＣ２のプレインキュベーションは、欠乏血清コントロールに似たレベルまで低下したＯＤ４１５吸光度により評価されるように、溶血の阻害をもたらした。
【０４８７】
［実施例９］
ウェスタンブロッティングによるヒト血漿中での補体成分Ｃ２のタンパク質分解性切断の可視化
ａ．タンパク質分解性切断産物を可視化するために、ヒト血漿を、５％まで４０μｌ  ＰＢＳＴ中で希釈し、精製ＣＢ１５５、ＣＢ２００、またはＣＢ４２を０および５００ｎＭの間の最終濃度まで追加した。サンプルを１時間３７℃でインキュベートした。反応の２０マイクロリットルまたはコントロールとしての精製補体Ｃ２（ＣｏｍｐＴｅｃｈ社）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で、２００Ｖで、３５分間、Ｎｏｖｅｘ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して分離し、次いで、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  ＳＤ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌを使用して移した。膜を、ＴＢＳＴ（１％のＴｗｅｅｎ  ２０を有するＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水）中の５％粉乳で１時間ブロックし、その後に続いて洗浄し、５％粉乳／ＴＢＳＴ中のヤギ抗ヒトＣ２抗血清（Ｑｕｉｄｅｌ社）の１：３０００希釈溶液と共に終夜４℃でインキュベーションした。膜を、各洗浄１０分間ＴＢＳＴ中で３回再度洗浄し、５％粉乳／ＴＢＳＴ中の１：１０，０００ＨＲＰ抱合ウサギ抗ヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）と共に１時間室温でインキュベートした。フィルターは、各洗浄１０分間ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、血漿中のＣ２およびその切断産物は、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用い、メーカーの使用説明書に従って現像した。濃度測定は、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ画像システム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）で、ＡｌｐｈａＥａｓｅ  ＦＣ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８８００ソフトウェア、バージョン３．１．２（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を使用して行った。濃度測定は、切断産物に対する非切断産物の比を決定するために使用した。Ｃ２の切断についてのプロテアーゼのＩＣ５０は、以下の通り決定された：ＣＢ２００：１５．７ｎＭ；ＣＢ１５５：１８．４ｎＭ；およびＣＢ４２：１１．９ｎＭ。
【０４８８】
ｂ．他の実験では、野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）ならびに突然変異体ＭＴ−ＳＰ１  ＣＢ２５２およびＣＢ３７７によるＣ２およびＣ３の切断を比較した。９マイクロリットルのヒトクエン酸血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を１μｌのプロテアーゼと共にインキュベートし、プロテアーゼの最終濃度を０から２０００ｎＭまでの範囲とした。インキュベーションを１時間３７℃で行った。１マイクロリットルのプレインキュベートしたプロテアーゼ／血漿反応を、１０μｌ（Ｃ２の評価のため）または１０００μｌ（Ｃ３の評価のため）のＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳの同じ緩衝液およびサンプル還元試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）と組み合わせ、５分間煮沸した。並行して、１０μｌの煮沸サンプルを、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に装填し、２００Ｖで、３５分間、Ｎｏｖｅｘ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、タンパク質分離のために泳動し、その後に続いて、ＰＶＤＦ膜フィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  ＳＤ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌを使用して移した。膜を、ＴＢＳＴ（１％のＴｗｅｅｎ  ２０を有するＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水）中の５％粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、ＣＡ）で１時間ブロックした。次いで、膜を、５％粉乳／ＴＢＳＴ中１：２０００のヤギ抗ヒトＣ２（Ｑｕｉｄｅｌ社）またはヤギ抗ヒトＣ３を用いて終夜４℃でインキュベートした。膜を、３回ＴＢＳＴ中で１０分間洗浄し、次いで、５％粉乳／ＴＢＳＴ中１：２０００のＨＲＰ抱合抗ヤギ二次的抗体（Ｚｙｍｅｄ社；サンフランシスコ、ＣＡ）と共に１時間室温でインキュベートした。膜を、３回ＴＢＳＴ中で１０分間洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて現像した。濃度測定は、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ画像システム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ社；サンリアンドロ、ＣＡ）を用い、Ａｌｐｈａ  Ｅａｓｅ  ＦＣ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８８００ソフトウェア、バージョン３．１．２（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ社）を使用して行った。結果は、それぞれのＣＢ２００、ＣＢ２５２、およびＣＢ３７７が用量依存的様式でヒト血漿中のＣ２を切断したのに対して、試験したプロテアーゼのどれも、最高濃度のプロテアーゼ（２０００ｎＭ）ででさえ、非プロテアーゼコントロールと比較してヒト血漿中でＣ３を切断しなかったことを示す。Ｃ２の分解は、ウェスタンブロットにより、５００ｎＭのそれぞれの試験プロテアーゼで注目すべきものとなり、１０００ｎＭで観察された検出可能なＣ２はなかったかあってもわずかしかなく、２０００ｎＭの試験プロテアーゼでのＣ２の完全な分解が明らかとなった。
【０４８９】
［実施例１０］
代替溶血および古典溶血ならびにヒト血漿中での補体成分Ｃ３のタンパク質分解性切断との相互関係の評価
プロテアーゼのパネルは、２００ｎＭ（古典）または５００ｎＭ（代替）の最終濃度で、古典溶血または代替溶血に対するそれらの効果について、上記の実施例７Ａ．１およびＢ．１に記載されるヒト血漿を用いたプレインキュベーションの後で、それぞれスクリーニングした。試験されたプロテアーゼのパネルは、野生型（ＣＢ２００）、ＣＢ２３８、ＣＢ３３１、ＣＢ３４９、ＣＢ３５７、ＣＢ３６７、ＣＢ３７７、およびＣＢ３８７を含む。ＣＢ２００、ＣＢ３５７、ＣＢ３６７、およびＣＢ３８７はいろいろな度合いで古典および代替の溶血を阻害する。ＣＢ２３８およびＣＢ３７７は、代替溶血阻害をほとんど示さなかったが、古典溶血の実質的な阻害を示した。ＣＢ３３１およびＣＢ３４９は、古典溶血阻害をほとんど示さなかったが、代替溶血の阻害を呈した。結果は、ＣＢ３３１、ＣＢ３４９、およびＣＢ３８７が、古典経路と比較して、代替経路の切断について選択的であったことを示した。
【０４９０】
溶血結果は、プロテアーゼの存在下または非存在下でのＣ３の可視化により評価されたように、血漿中でのＣ３の切断に相互に関連した。代替溶血アッセイからのサンプルもまた、上述の実施例９に記載されるＣ３についてのウェスタンブロットにより検査した。代替溶血結果と一致して、結果は、ＣＢ３３１、ＣＢ３４９、およびＣＢ３８７が、Ｃ３産物の減少により評価されるように、非プロテアーゼ処置血漿サンプルと比較して、Ｃ３を切断することを示す。
【０４９１】
［実施例１１］
精製補体成分の切断および切断部位の同定
スカフォールドプロテアーゼまたは野生型プロテアーゼと比較して増加した標的タンパク質についての修飾プロテアーゼの特異性を決定するために、精製補体因子Ｃ２、ｉＣ３、およびｉＣ４をＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。５μｇの各タンパク質を５μＭの最終濃度にＰＢＳＴ中で希釈した。ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、または第Ｉ因子を１００ｎＭの最終濃度に追加し、反応を３７℃で５時間インキュベートした。Ｎ−連結グリコシル化は、タンパク質を変性させ、メーカーのプロトコールに従ってＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社、イプスウィッチ、ＭＡ）を用いて処置することにより除去した。標的タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）上で分離し、その後に続いて、ＰＶＤＦ膜に移した。結果としての膜は、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色剤（ＴｅｋＮｏｖａ社、ホリスター、ＣＡ）を用いて染色し、タンパク質バンドが見えるようになるまで５０％メタノールを用いてすすぎ、風乾した。タンパク質分解性断片は、ＵＣ  Ｄａｖｉｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙによるＥｄｍａｎのプロトコールに従って配列決定し、切断配列を決定した。以下の表２５は、ヒトＣ２、Ｃ３、およびＣ４のプロテアーゼ切断配列を表す。切断が生じた場合に、切断産物の配列決定から同定されたＣ２、Ｃ３、およびＣ４上のそれぞれの切断部位を、自然プロテアーゼ第Ｉ因子、カテプシンＫ、ＭＴ−ＳＰ１、および修飾ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ１５５）について示す。それぞれの配列番号は、配列の隣の括弧中に示す。
【０４９２】
【表２５】
0005860789.tif 000038
【０４９３】
［実施例１２］
補体不活性化とＣ２切断の相互関係：Ｃ３コンバターゼの形成および溶血の評価
Ｃ３コンバターゼは、Ｃ４およびＣ２とのＣ１複合体の相互作用により形成される。Ｃ１複合体中でのＣ１ｒプロテアーゼの活性化が、Ｃ１ｓを切断し、活性Ｃ１ｓプロテアーゼが得られる。Ｃ４は、Ｃ１ｓに対して敏感な基質であり、それによって、Ｃ４ａおよびＣ４ｂへのＣ４の切断がもたらされる。活性Ｃ４ｂの生成は、Ｃ１ｓについての第２の基質であるＣ２のための結合部位を提供する。Ｃ２の切断は、断片Ｃ２ａおよびＣ２ｂの形成をもたらす。Ｃ１ｓによる切断に際して、Ｃ４ｂおよびＣ２ｂの断片は会合するようになり、それらは、古典経路のＣ３コンバターゼを共に形成する。Ｃ２中に存在するＳＬＧＲ切断部位は、Ｃ２ａおよびＣ２ｂが得られるＣ２切断のための自然活性化部位であるのに対して、Ｃ２中のＶＦＡＫ切断配列は、分子のＣ２ａ部分中のＣ２のプロテアーゼドメイン内に存在する。野生型ＭＴ−ＳＰ１または修飾ＭＴ−ＳＰ１による、Ｃ２中の切断配列の切断が、Ｃ２の活性化およびＣ３コンバターゼの形成に影響を及ぼすかどうか評価するために、切断を評価し、切断の機能的事象を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成細胞表面溶血モデルにおいて決定した。
【０４９４】
Ａ．Ｃ２切断
Ｃ２ａおよびＣ２ｂの切断産物の存在は、野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７による精製Ｃ２の切断の後に評価した。プロテアーゼとの精製Ｃ２のインキュベーションの際の切断産物を評価するために、５μｇの精製Ｃ２（Ｑｕｉｄｅｌ社）を、単独でまたは最終濃度の１００ｎＭのＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７プロテアーゼと共に１時間３７℃でインキュベートした。全反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）上で分離し、その後に続いて、ＰＶＤＦ膜に移した。結果としての膜を、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色剤（ＴｅｋＮｏｖａ社、ホリスター、ＣＡ）を用いて染色し、タンパク質バンドが見えるようになるまで５０％メタノールを用いてすすぎ、風乾した。結果は、１００ｎＭのＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７の存在下で、Ｃ２が、ほぼ完全に分解され、Ｃ２ａおよびＣ２ｂにそれぞれ対応する約７０ｋＤおよび２３ｋＤの切断産物が得られることを示す。さらに、ＣＢ２００の存在下で、約３５ｋＤの第３の切断産物が観察された。
【０４９５】
Ｂ．細胞表面溶血モデル
補体活性化の中間段階の細胞を単離し、プロテアーゼで処置した血漿またはタンパク質に細胞を暴露することにより、とりわけＣ２タンパク質に対するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの活性を、アッセイした。手短に言えば、活性化赤血球を、Ｎａｇａｋｉらの方法を使用してＣ１／Ｃ４ｂ複合体段階で停止させた［１９７４、Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＡＣ１４  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  ｏｒ  Ｇｕｉｎｅａ−Ｐｉｇ  Ｓｅｒｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：３０７−３１７］。購入した活性化赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐ社）を、２０００ｒｐｍでそれらの細胞をペレットにすることにより、３回洗浄し、その後に続いて、ＧＧＶＢ−ＴＴＨＡ（５０％ＧＶＢ０（Ｄｉａｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐ．）＋５％グルコース＋５ｍＭ  Ｃａ−ＴＴＨＡ［１００ｍＭ  ＴＴＨＡと等量の１００ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ社）］中に再懸濁させ、最終洗浄後、５×１０８細胞／ｍＬで再懸濁させ、氷上で保存した。細胞を、２．５倍容量の１０％正常ヒト血清（ＮＨＳ；ＧＧＶＢ−ＴＴＨＡ中で作製し、１５分間３０℃でインキュベートし、Ｍｇ２＋のキレート化を確実にした）と混合し、５分間３０℃でインキュベートした。混合物を、２回、ＧＧＶＢ−ＴＴＨＡで洗浄し、２回、ＧＧＶＢ−Ｃａ（５０％ＧＶＢ０＋５％グルコース＋０．３ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄し、２回、ＧＧＶＢ＋＋（５０％ＧＶＢ０＋５％グルコース＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄した。最終洗浄後、細胞が過剰に沈むのを回避するために３０分ごとに混ぜながら、細胞混合物を２時間３７℃でインキュベートした。インキュベートした細胞混合物を、ＧＧＶＢ＋＋中で１回洗浄し、１．５×１０８細胞／ｍＬで再懸濁させた。懸濁液を１週間まで４℃で保存した。
【０４９６】
補体活性化の間、Ｃ１／Ｃ４ｂ複合体は、Ｃ３コンバターゼならびに膜侵襲複合体（ＭＡＣ）および細胞溶解の形成をもたらす、残りの補体カスケードの結果として生じる活性化を生成するＣ２を切断するために必要とされる。プロテアーゼによるＣ２切断の事象を評価するために、プロテアーゼのストック溶液を２μＭにＧＧＶＢ＋＋中で希釈し、このストックを、不透明な９６ウェルアッセイプレート（Ｎｕｎｃ社）の１１ウェルにわたって、０．２ｎＭ〜２０００ｎＭの最終プロテアーゼ濃度に向けて１：２に段階的に希釈することにより、ＣＢ２００、ＣＢ２５２、ＣＢ３７７のいずれかの２×プロテアーゼ溶液を段階的に希釈した。ＧＧＶＢ＋＋緩衝液のみは、バックグラウンドコントロールとして１２番目のウェルに追加した。Ｃ３欠乏血清（Ｓｉｇｍａ社）の４０％溶液をＧＧＶＢ＋＋での希釈により作製した。５マイクロリットルの段階的に希釈した２×プロテアーゼ（上から）を、５μＬ希釈Ｃ３欠乏血清と混合し、１時間３７℃でインキュベートした。反応をＧＧＶＢ＋＋で５０μＬに希釈し、５０μＬ  ＥＡＣ１４ｂ細胞（１．５×１０８細胞／ｍＬ）を追加した。混合物を６分間３０℃でインキュベートし、Ｃ２複合体をあらかじめ形成させた。ＧＧＶＢ−ＥＤＴＡ（５０％ＧＶＢ０＋５％グルコース＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１：１００に希釈した１５０μＬ  Ｃ２欠乏血清を各ウェルに追加した。サンプルを、緩やかに振盪させながら１時間３７℃でインキュベートした。プレートを２０００ｒｐｍで回転させ、細胞をペレットにし、１００μｌの上清を透明な９６ウェルアッセイプレート中に移した。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより監視した。
【０４９７】
結果は、濃度が増加するプロテアーゼ（ＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７）とあらかじめインキュベートしたＣ３欠乏血清が、Ｃ２欠乏血清に追加した場合に、あらかじめ形成されたＣ１／Ｃ４ｂを含有する赤血球の溶血を低下させたことを示す。試験したプロテアーゼのそれぞれの影響は、用量依存的で、０．２ｎＭ〜１０ｎＭのプロテアーゼの範囲の濃度で明らかな阻害はほとんどないかあってもわずかであり、増加性のプロテアーゼ濃度で連続して阻害が生じ、８００ｎＭまたはそれ以上のプロテアーゼ濃度で観察された溶血はほとんどないかあってもわずかであった。これらの結果は、プロテアーゼ存在下でＣ２を含有する血清のプレインキュベーションは、補体活性化および細胞溶解に必要な、Ｃ１／Ｃ４ｂによるＣ２の切断を模倣しないことを示唆する。
【０４９８】
［実施例１３］
対のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび溶血アッセイによる阻害切断部位の決定
補体成分のプロテアーゼ切断を補体活性化の阻害と相互に関連させるために、精製補体因子をＱｕｉｄｅｌ社およびＣｏｍｐＴｅｃｈ社から購入した。５μｇの各タンパク質を５μＭの最終濃度にＰＢＳＴ中で希釈した。スカフォールドプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを、０および５００ｎＭの間の最終濃度に希釈した。サンプルを、３７℃で１時間インキュベートした。０．５〜１μｇの処置補体成分を除去し、ＰＢＳＴを用いて全容量１０μｌに希釈した。この反応を、２５０μｌ  ＩｇＧ活性化ヒツジ赤血球およびアッセイされることになる対応する補体因子が欠乏した５μｌ培地と混合した。溶液を、４５分間室温でインキュベートした。細胞を２分間５０００ｒｐｍで遠心沈殿し、２００μｌの上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４１５ｎｍの吸光度を、溶解した赤血球からのヘモグロビンの遊離を決定するために測定した。
【０４９９】
残存する４〜４．５μｇの反応サンプルを、メーカーのＰＮＧａｓｅＦについてのプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）に従って脱グリコシルした。サンプルは、４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後に続いて、クーマシーブリリアントブルー染色剤を用いて染色した。Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｉｍａｇｅｒの濃度測定機能を使用して、各バンドのエリアを決定し、アッセイを通じて切断された完全長補体成分の百分率およびすべての主要な分解産物の出現について算出するために使用した。
【０５００】
［実施例１４］
Ｃ２欠乏血清中で溶血により評価される、補体不活性化とＣ２切断の相互関係
補体媒介性溶血のＣ２切断の機能的事象は、実施例１３における上記の対のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび溶血アッセイにおいて評価した。精製補体因子による補体活性化を評価するために、精製Ｃ２およびＣ２欠乏培地をＱｕｉｄｅｌ社から購入した。０．５〜１μｇの精製Ｃ２を、１０〜５００ｎＭ  ＣＢ１５５プロテアーゼと共に、合計１０μｌ  ＰＢＳＴ中で３７℃で１時間インキュベートした。全反応を、アッセイされているＣ２補体因子が欠乏した５μｌの血漿と共に、２５０μｌのＩｇＧ活性化ヒツジ赤血球に追加した。その溶液を４５分間室温に放置した。細胞を２分間５０００ｒｐｍで遠心沈殿し、２００μｌの上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４１５ｎｍでの吸光度を、溶解した赤血球からのヘモグロビンの遊離を決定するために測定した。
【０５０１】
タンパク質分解性切断産物を可視化するために、反応の２０マイクロリットルまたはコントロールとしての精製補体Ｃ２（ＣｏｍｐＴｅｃｈ社）を、４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。全タンパク質を、メーカーのプロトコールに従ってクーマシーブルーを用いたゲルの染色により可視化した。Ｃ２の切断は、ゲル濃度測定を使用して比較した。Ｃ２の切断は、用量依存的様式で生じ、Ｃ２のほぼ完全な切断は、５００ｎＭのプロテアーゼで生じた。さらに、溶血パーセントは、プロテアーゼの濃度を増加させると共に減少した。Ｃ２切断産物のゲル濃度測定に基づいたＣＢ１５５のＩＣ５０は、２．２ｎＭであった。プロテアーゼ処置Ｃ２を補充したＣ２欠乏血清中での溶血についてのＣＢ１５５のＩＣ５０は、１７ｎＭであった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、精製Ｃ２の完全な分解が、溶血における機能的減少に必要とされる。
【０５０２】
［実施例１５］
ＥＬＩＳＡによるＣ５ｂ−９（膜侵襲複合体）の検出および補体活性化に対するＭＴ−ＳＰ１または突然変異体の効果
Ａ．Ｃ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡ
Ｃ５ｂ−９についてのＥＬＩＳＡを、メーカーのプロトコール（Ｑｕｉｄｅｌ社）に従って行った。手短に言えば、捕捉抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、ＩＬ）で室温で３０分間再水和した。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、上から８０μｌ  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで希釈した２０μｌのプロテアーゼ処置補体刺激血清溶液を、マイクロタイタープレートのウェルに追加した。プレートを１時間室温でインキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ中で洗浄した。１００μｌの検出抗体ＨＲＰ抱合体溶液を追加し、プレートを１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ中で洗浄した。最終的に、１００μｌの基質溶液を追加し、プレートを室温で約１５分間インキュベートして進めた。進む反応を停止するために、１００μｌの停止溶液を各ウェルに追加し、４５０／６５０ｎｍの吸光度をメーカーのプロトコールに従って測定した。
【０５０３】
Ｂ．補体活性化に対する野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ１５５、またはＣＢ４２の効果
補体活性化を検出するために、抗凝固薬（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、サウスフィールド、ＭＩ）としてクエン酸ナトリウムを有するヒト血漿を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中に、２０％（４０μｌ  ＰＢＳＴ中１０μｌ血清）の最終濃度まで希釈し、これに、野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、またはＣＢ４２を、０〜５μＭの最終濃度まで追加した。溶液を、１５分間３７℃でインキュベートした。古典経路の活性化および代替経路の活性化を、リポ多糖の追加により開始させた（それぞれ１ｍｇ／ｍｌの最終濃度のＩｇＧまたはＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ社）。反応を３０分間３７℃でインキュベートした。反応は、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度までペファブロック（Ｒｏｃｈｅ社）をおよび５０ｍＭの最終濃度までＥＤＴＡを追加することにより止めた。２０μｌの最終溶液を続くＥＬＩＳＡに使用した。ＥＬＩＳＡは、上記のＡ部に記載されるように行った。
【０５０４】
プロテアーゼのそれぞれについてのＣ５ｂ−９生成のＩＣ５０を決定した。古典経路の活性化の後での野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、およびＣＢ４２についてのＩＣ５０は、それぞれ１０３ｎｍ、４７ｎｍ、および２３ｎｍと決定された。代替経路の活性化の後での野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ１５５、およびＣＢ４２についてのＩＣ５０は、それぞれ１９５ｎｍ、８４ｎｍ、および４１ｎｍと決定された。
【０５０５】
［実施例１６］
Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｒｅｅｎにおける、補体活性化に対する野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７の影響
古典、ＭＢＬ、または代替補体経路に対するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼまたは突然変異体ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの影響を評価するために、最終濃度が１μＭのプロテアーゼとなるように、９μｌのヒトクエン酸血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を、１μｌのＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７プロテアーゼと共に３７℃で１時間インキュベートした。Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ，Ｌｅｃｔｉｎ，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓを使用して、メーカーのプロトコール（ＷｉｅｓＬａｂ社；スウェーデン）に従って、それぞれの反応を補体活性化について評価した。このアッセイにおいて、メーカーにより提供されるマイクロタイターストリップのウェルは、古典、代替、またはＭＢＬ（レクチン）経路の特異的な活性化剤でコーティングされている。反応は、各経路についての血漿の濃度となるよう、メーカーにより提供される適切な緩衝液中に希釈し、反応を、メーカーにより規定されるように、インキュベートした。古典経路については、血漿サンプルは、希釈剤ＣＰ中で希釈し、分析前に最大６０分間室温に放置した。レクチン経路については、血漿サンプルは、希釈剤ＬＰ中で希釈し、分析前に、１５分間よりも長いが６０分間より短い時間、室温でインキュベートした。代替経路については、血漿サンプルは、希釈剤ＡＰ中でインキュベートし、分析の前に最大６０分間室温に放置した。マイクロタイタープレートに、サンプルを１００μｌ／ウェルで二つ組で追加した。プレートを、３７℃で６０〜７０分間インキュベートした。血清インキュベーションの後、マイクロタイタープレートのウェルを、３００μｌ洗浄溶液で３回洗浄した。最終洗浄後、過剰な洗浄緩衝液を、吸収性のティッシュペーパーにプレートを軽く打ちつけることにより除去した。補体活性化は、Ｃ５ｂ−９の検出により各サンプルにおいて評価した。Ｃ５ｂ−９に対するアルカリホスファターゼ標識抗体を含有する１００μｌの抱合体を各ウェルに追加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。反応を進めるために、１００μｌ基質溶液を各ウェルに追加し、プレートを３０分間室温でインキュベートした。反応は、５ｍＭ  ＥＤＴＡを１００μｌ／ウェルで追加することにより停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで読み取った。生成されたｓＣ５ｂ−９の分画は、サンプルのＯＤ４０５値を非プロテアーゼコントロールサンプルと比較することにより決定した。
【０５０６】
結果は、古典およびＭＢＬ経路により誘起された補体活性化の際に生成された分画Ｃ５ｂ−９は、試験プロテアーゼ（ＣＢ２００、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７）のそれぞれの存在下でほぼ完全に阻害されたことを示す。対照的に、Ｃ５ｂ−９生成の阻害は、補体活性化が代替経路により誘起された場合に、試験プロテアーゼのいずれによっても観察されなかったか観察されたとしてもわずかであった。古典経路およびＭＢＬ経路はＣ２を必要とするが、代替経路は必要としないので、これらの結果は、古典経路およびＭＢＬ経路の阻害がＣ２の切断によるものであることを示唆する。この結果は、試験プロテアーゼ（ＣＢ２００、ＣＢ２５２、およびＣＢ３７７）のそれぞれがＣ２と共にプレインキュベートされた場合に溶血を阻害する観察と一致している（上記の実施例８．ｂを参照されたい）。
【０５０７】
［実施例１７］
ＳＬＧＲまたはＧＬＡＲ対ＲＱＡＲ基質の選好的な切断についてのスクリーニング
基質ライブラリーにより決定された、所望の特異性プロファイルにマッチする修飾プロテアーゼを、所望の切断配列に対応する個々のペプチド基質を使用して、特異性の大きさの変化を決定するためにアッセイした。１つの天然標的基質を設計した：Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＭＣ、これは、ＭＴ−ＳＰ１自己活性化部位を含む；２つの所望の基質切断配列を設計した：Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＭＣ（Ｃ２切断部位）およびＡｃ−ＧＬＡＲ−ＡＭＣ（Ｃ３切断部位）。
【０５０８】
基質は、１ｍＭおよび２μＭの間の一連の１２段階の濃度に、５０μｌ全容量のＭＴ−ＳＰ１活性緩衝液中に、Ｃｏｓｔａｒ社製９６ウェル黒色ハーフエリアアッセイプレートのウェル中で希釈した。溶液を、５分間３０℃まで暖め、５０μｌのプロテアーゼ溶液（野生型ＭＴ−ＳＰ１、ＣＢ４２、またはＣＢ１５５）を、アッセイのウェルに追加した。蛍光発光は、蛍光分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ）で、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍで４３５ｎｍに設定されたカットオフフィルターを使用して測定した。蛍光発光における増加率は、３０分間にわたり、３０秒間隔での読み取りで測定した。反応速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍ、およびｋｃａｔ／Ｋｍ（特異性定数）は、基質濃度の逆数対基質切断の速度の逆数をグラフで表し、ラインウィーバー−バーク式［１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；式中、Ｖｍａｘ＝［Ｅ］＊ｋｃａｔ］にフィットさせることにより算出することができる。プロテアーゼ野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ４２、およびＣＢ１５５は、ＡｃＲＱＡＲ−ＡＭＣ基質を、それぞれ１．９×１０６、１．８×１０６、および９．１×１０４Ｍ−１ｓ−１で切る。プロテアーゼ野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ４２、およびＣＢ１５５は、Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＭＣ基質を、それぞれ２．０×１０４、５．９×１０４、３．７×１０３Ｍ−１ｓ−１で切る。プロテアーゼ野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ４２、およびＣＢ１５５は、Ａｃ−ＧＬＡＲ−ＡＭＣ基質を、それぞれ６．４×１０４、６．３×１０４および３．５×１０３Ｍ−１ｓ−１で切る。
【０５０９】
［実施例１８］
個々の基質対完全長タンパク質の切断についてのスクリーニング
基質切断配列対完全長補体タンパク質に対する野生型プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの特異性を、基質が、特定のタンパク質によりどれくらい切られるかを測定するための特異性定数（ｋｃａｔ／ｋｍ）を比較することにより決定した。ペプチド基質切断配列を設計し、Ｃ２切断配列を含有させた：Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＭＣ。切断の特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、実施例１７で上記のように、プロテアーゼ［野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ４２、またはＣＢ１５５］と共に基質切断配列をインキュベートすることにより決定し、蛍光発光における増加率を決定した。
【０５１０】
ゲル中反応速度は、標的補体タンパク質Ｃ２の特異性定数を決定するために使用した。Ｃ２標的タンパク質の切断の反応速度は、時間的経過にわたる、少量のプロテアーゼの存在下での標的の消耗によりアッセイし、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このアッセイのために、５ｍＭ  Ｃ２を、１０ｎＭプロテアーゼ［野生型ＭＴ−ＳＰ１（ＣＢ２００）、ＣＢ４２、またはＣＢ１５５］と共に、ＭＴＳＰ活性緩衝液中で５時間３７℃でインキュベートした。一定分量を、０、１０、２０、４０、６０、１００、２００、および３００分に除去し、直ちに希釈し、還元剤中で煮沸した。サンプルをＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）で処置し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。完全長タンパク質バンドの密度は、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｇｅｌ  Ｉｍａｇｅｒを使用して決定した。特異性定数ｋｃａｔ／Ｋｍは、式：密度＝ｅｘｐ（−１＊時間＊［酵素］＊ｋｃａｔ／Ｋｍ）を用いて積分密度値（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）対時間をプロットすることにより生成された曲線の非線形フィッティングにより決定した。
【０５１１】
結果は、基質ペプチド配列対完全長タンパク質のプロテアーゼによるの切断の特異性定数が類似するパターンを伴ったことを示す。ＣＢ２００野生型ＭＴ−ＳＰ１は、基質ペプチド配列対Ｃ２完全長タンパク質の切断についてほぼ同一の特異性定数を示したのに対して、ＣＢ４２およびＣＢ１５５は、それらの特異性定数においてわずかな変動を示した。ＣＢ２００、ＣＢ４２、およびＣＢ１５５によるＡｃ−ＳＬＧＲ−ＡＭＣ基質配列の切断の特異性定数は、それぞれ２．０×１０４、５．９×１０４、および３．７×１０３Ｍ−１ｓ−１であった。ＣＢ２００、ＣＢ４２、およびＣＢ１５５によるＣ２タンパク質の切断の特異性定数は、それぞれ１．９５×１０４、３．６０×１０４、および７．２０×１０４Ｍ−１ｓ−１であった。
【０５１２】
［実施例１９］
カニクイザル溶血プロトコール
プロテアーゼ処置後のカニクイザル補体系の機能的活性はまた、修正した溶血アッセイを使用して評価することができる。
【０５１３】
Ａ．ニワトリ赤血球の感作
ニワトリ赤血球は、ニワトリアルセバーから単離した（ニワトリからの全血およびアルセバー溶液の５０％ミックスで、抗凝固薬を含有する；Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、ＣＯ）。細胞は、細胞ペレットが見えなくなるまで、ピペットで静かに上下させることにより再懸濁させ、５０μｌの細胞を１ｍｌ  ＧＶＢ＋＋緩衝液に希釈した。細胞の容量は、各実験の必要に応じて計り、５０μｌ細胞の希釈溶液が１枚のプレートについて十分なように最終の１ｍｌ懸濁液のうち１ウェル当たり１０μｌを各ウェルに追加することを仮定した。細胞は、細胞を卓上遠心分離機で２５００ｒｐｍで１分間４℃でペレットにすることにより洗浄し、上清を捨て、細胞を、ピペットで静かに上下させることにより１ｍｌ  ＧＶＢ＋＋中に再懸濁させた。洗浄工程は、もう２回または上清が最後の回転で完全に透明となるまで繰り返された。１μｌの抗ニワトリ赤血球抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）を細胞を感作するために追加した。抗体−細胞懸濁液を混合した後、溶液を、最低１５分間、氷上でインキュベートし、次いで、２分間４℃で卓上遠心分離機で２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、感作細胞を１ｍＬ  ＧＶＢ＋＋中で再懸濁させ、さらに上清が透明となるまで、２０００ｒｐｍでの１分間の遠心分離により２回洗浄した。最終洗浄後、細胞ペレットを、最終容量の１ｍｌ  ＧＶＢ＋＋中に再懸濁させ、細胞をＧＶＢ＋＋中に１０：５０に希釈した（つまり、全容量６ｍｌについて、１ｍｌの再懸濁感作細胞、５ｍＬ  ＧＶＢ＋＋）。抗体を用いたニワトリ細胞の感作は、実験の日に新たに行った。感作細胞を終夜保管することはなかった。
【０５１４】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的（ＰＤ）実験からの溶血アッセイ
溶血反応は、感作赤血球の存在下でのプロテアーゼ処置動物またはビヒクルコントロール（非プロテアーゼ）処置動物から得られた各血漿サンプルについて、１％、２．５％、および１０％の血漿の最終濃度に設定した。追加の濃縮感作赤血球を含有しない吸光度コントロールもまた各サンプルと並行して設定した。すべての反応を、ポイントディボット（ｐｏｉｎｔ  ｄｉｖｏｔ）を有する不透明プレート中に設定した。１％血漿サンプルについては、溶血サンプル（二つ組）は、１０μｌ感作赤血球、８９μｌ  ＧＶＢ＋＋、およびプロテアーゼまたは非プロテアーゼ処置動物からの１μｌ血漿を用いて設定し；対応する吸光度コントロールは、９９μｌ  ＧＶＢ＋＋、およびプロテアーゼ処置動物からの１μｌの血漿を用いて設定した。２．５％血漿サンプルについては、溶血サンプル（二つ組）は、１０μｌ感作赤血球、８７μｌ  ＧＶＢ＋＋、およびプロテアーゼまたは非プロテアーゼ処置動物からの２．５μｌ血漿を用いて設定し；対応する吸光度コントロールは、９７μｌ  ＧＶＢ＋＋、およびプロテアーゼ処置動物からの２．５μｌの血漿を用いて設定した。１０％血漿サンプルについては、溶血サンプル（二つ組）は、１０μｌ感作赤血球、８０μｌ  ＧＶＢ＋＋、およびプロテアーゼまたは非プロテアーゼ処置動物からの１０μｌ血漿を用いて設定し；対応する吸光度コントロールは、９０μｌ  ＧＶＢ＋＋、およびプロテアーゼ処置動物からの１０μｌの血漿を用いて設定した。プレートを、３０分間３７℃で振盪させながらインキュベートした。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を、２０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、８０μｌの上清を除去し、透明な９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中に置いた。サンプルがゼラチン状であることがあるので、これは注意して行った。ゼラチン状のサンプルには留意した。上清が移されたプレートは、泡を除去するために５分間２５００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離は、泡が残らないまで繰り返したまたは、代わりに、残りの泡を１８Ｇ針を用いてはじいた。溶解した赤血球からのヘモグロビンの遊離は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ６８０で４１５ｎｍで吸光度を読み取ることにより測光法で監視した。吸光度が１より大きかった場合、サンプルは、ＧＶＢ＋＋中で１：３に希釈し、再度読み取った（つまり２０μｌサンプルを４０μｌ  ＧＶＢ＋＋中に）。分画溶血は、対応する溶血ウェルから吸光度コントロールサンプルからの吸光度を差し引き、次いで、非プロテアーゼビヒクルコントロールサンプルで実験的サンプルを割ることにより算出した。ＥＤ５０値は、プロテアーゼ濃度の関数としてＯＤ４１５ｎｍ値をグラフで表すことにより決定した。
【０５１５】
Ｃ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定溶血アッセイ
カニクイザル血漿を使用したプロテアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定については、１０％の最終反応容量のプロテアーゼを、購入したカニクイザル血漿と共にインキュベートし（つまり、ポリプロピレン９６ウェルプレート中で、２μｌのプロテアーゼ溶液を１８μｌカニクイザル血漿に追加した）、プロテアーゼの最終プロテアーゼ濃度を、ＩＣ５０滴定プロトコールのために２０μＭから０．１５６μＭまでの範囲とし、血漿濃度を９０％とした。非プロテアーゼ（１８μｌ血漿および２μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ）コントロールおよびバックグラウンド（２０μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡのみ）コントロールもまたアッセイに含まれた。反応を室温で１時間インキュベートした。９０％血漿とのプロテアーゼのプレインキュベーション後、溶血を、上記のＢ部に記載されるように行った。吸光度コントロールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶血滴定に含まなかった。
【０５１６】
［実施例２０］
マウス溶血プロトコール
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的（ＰＤ）実験からの溶血アッセイ
プロテアーゼ処置後のマウス補体系の機能的活性は、修正した溶血アッセイを使用して評価することができる。マウス溶血プロトコール中で使用される赤血球もまた、上記の実施例１９、Ａ部に記載されるように感作したニワトリ赤血球とした。溶血反応は、感作赤血球の存在下でのプロテアーゼ処置動物またはビヒクルコントロール（非プロテアーゼ）処置動物から得られた各血漿サンプルについて、４０％の血漿の最終濃度に設定した。追加の濃縮感作赤血球を含有しない吸光度コントロールもまた、以下に論じられるように吸光度コントロール値が分析の間に溶血値から２回差し引かれるように、半分の血漿濃度（２０％血漿）に各サンプルと並行して設定した。溶血サンプルは、６０μｌの濃縮感作赤血球およびプロテアーゼ処置動物または非プロテアーゼ処置動物からの４０μｌの血漿を各ウェルに追加することにより、ディボットを有する不透明なプレート中に二つ組で（血漿が十分な場合）設定した。対応する吸光度コントロールは、８０μｌ  ＧＶＢ＋＋およびプロテアーゼ処置動物または非プロテアーゼ処置動物からの２０μｌマウス血漿を各ウェルに追加することにより設定した。プレートを、１時間３７℃で振盪させながらインキュベートした。壊れていない細胞をペレットにするために、細胞を、２０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、５０μｌの上清を除去し、透明な９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中に置いた。サンプルがゼラチン状であることがあるので、これは注意して行った。ゼラチン状のサンプルには留意した。上清が移されたプレートは、泡を除去するために５分間２５００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離を、泡が残らないまで繰り返したまたは、代わりに、残りの泡を１８Ｇ針を用いてはじいた。溶解された赤血球からのヘモグロビンの遊離は、４１５ｎｍで読み取ることにより監視した。吸光度が１より大きかった場合、サンプルは、ＧＶＢ＋＋中で１：３に希釈し、再度読み取った（つまり２０μｌサンプルを４０μｌ  ＧＶＢ＋＋中に）。分画溶血は、対応する溶血ウェルから吸光度コントロールサンプルからの２×吸光度を差し引き、次いで、非プロテアーゼビヒクルコントロールで実験的サンプルを割ることにより算出した。ＥＤ５０値は、プロテアーゼ濃度の関数としてＯＤ４１５ｎｍ値をグラフで表すことにより決定した。
【０５１７】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定溶血アッセイ
マウス血漿を使用したプロテアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ滴定については、１０％の最終反応容量のプロテアーゼを、購入したマウス血漿または社内コントロール血漿と共にインキュベートし（つまり、ポリプロピレン９６ウェルプレート中で、２μｌのプロテアーゼ溶液を１８μｌマウス血漿に追加した）、プロテアーゼの最終プロテアーゼ濃度を、ＩＣ５０滴定プロトコールのために２０μＭから０．１５６μＭまでの範囲とし、血漿濃度を９０％とした。非プロテアーゼ（１８μｌ血漿および２μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡ）コントロールおよびバックグラウンド（２０μｌ  ＧＶＢ／Ｍｇ／ＥＧＴＡのみ）コントロールもまたアッセイに含まれた。反応を室温で１時間インキュベートした。９０％血漿とのプロテアーゼのプレインキュベーション後、溶血を、上記のＡ部に記載されるように行った。吸光度コントロールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶血滴定に含まなかった。
【０５１８】
［実施例２１］
古典Ｃ３ｂ沈着ＥＬＩＳＡ
Ｃ３ｂ沈着を検出し、定量するために、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社）を、１００μｌ／ウェルの０．５％のオバルブミンで、３７℃で２時間または４℃で終夜コーティングした。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製ＳｋａｎＷａｓｈｅｒ  ３００  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｂを使用して２５０μｌ  ＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中で１：１０００を希釈した１００μｌ／ウェルのウサギ抗ニワトリ卵アルブミン抗体（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）でコーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄する前に、室温で１時間または４℃で終夜インキュベートした。プレートを、２００μｌブロッキング緩衝液（３０％ＢＳＡ溶液；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）でブロックし、プレートを１時間室温で振盪させた。ＰＢＳＴでの３回の洗浄後、ＧＶＢ＋＋（１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、４．９ｍＭベロナールナトリウム、０．１％ゼラチン、０．１５ｍＭ  ＣａＣ１２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するベロナール（バルビタール）緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４；Ｃｏｍｐｔｅｃｈ社）中で所望の百分率（つまり１％、１０％）に希釈した１００μｌの血漿サンプルを、各ウェルに追加し、プレートを３０分間室温で振盪させた。ウェルを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ブロッキング緩衝液中で１：４０００に希釈したヤギ抗ヒトＣ３ｂ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を、１００μｌの容量でウェルに追加し、プレートを、１時間室温で振盪させた。ＰＢＳＴで洗浄した後、ブロッキング緩衝液中で１：８０００に希釈した１００μｌ  ＨＲＰウサギ抗ヤギ抱合抗体（Ｚｙｍｅｄ社）をウェルに追加し、室温で振盪させながら１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄し、ＥＬＩＳＡを、メーカーの使用説明書に従って、１００μｌ  ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ社）の追加により進めた。反応を、１００μｌ  ２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の追加により停止し、４０５ｎｍの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で読み取った。
【０５１９】
［実施例２２］
プロテアーゼのマウス薬力学的（ＰＤ）分析
Ａ．ＣＢ４５０の薬力学
マウス（各用量についてｎ＝６）に、いろいろな範囲の投与量のＣＢ４５０を静脈内ボーラス注射した（０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および１５ｍｇ／ｋｇ）。血漿を、心臓穿刺により注射後５分に処置マウスから収集した。異なる処置群からの血漿サンプルの補体活性は、実施例２０に記載される溶血アッセイによりまたは実施例２１に記載されるＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡにより決定されるＣ３ｂ沈着により試験した。
【０５２０】
溶血実験の結果は、４１５ｎｍの吸光度レベルにより評価されたように、ＣＢ４５０処置マウスからのマウス血漿により誘起された、赤血球の用量依存的な溶血の減少があったことを示した。プロテアーゼなしで処置したマウスからの血漿サンプルは、約０．２３の４１５ｎｍの吸光度により評価されるように、このアッセイにおいて溶血を誘起し、吸光度は、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ４５０処置群において約０．１に減少し、５、２０、または１５ｍｇ／ｋｇのＣＢ４５０で処置したマウスからのサンプルにおいて測定された検出可能な吸光度シグナルはほとんどないかあってもわずかであった。
【０５２１】
Ｃ３ｂ  ＥＬＩＳＡは、処置群のそれぞれからの１％または１０％の血漿を使用して行った。非プロテアーゼ処置サンプルからの分画溶血を、１．０に設定し、すべての実験的サンプルの分画溶血はそれに応じて決定した。したがって、プロテアーゼなしで処置されたマウスからの１％および１０％血漿サンプルの両方については、Ｃ３ｂ沈着の分画を測定し、１とした。１０％の血漿サンプルに対するＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡの結果は、ＣＢ４５０の用量を増加させながら処置したマウスからの血漿が、非プロテアーゼ処置サンプルと比較して、２．５、５、または１０ｍｇ／ｋｇのＣＢ４５０の用量で、Ｃ３ｂレベルにおける測定可能な差異を示さず、しかしながら、１５ｍｇ／ｋｇで処置したマウスは、約０．４０と測定されたＣ３ｂ沈着の分画の減少を呈したことを示した。１％の血漿サンプルについてのＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡの結果は、ＣＢ４５０で処置したマウスからの血漿が、非プロテアーゼ処置血漿サンプルと比較して、分画Ｃ３ｂ沈着における用量依存的な減少を有したことを示し、これは、溶血実験で観察された結果と一致した。２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ４５０で処置したマウスからの血漿サンプルは、約０．４０と測定された、Ｃ３ｂ沈着の減少を呈し、一方、５、２０、または１５ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ４５０で処置したマウスからの血漿は、検出可能なＣ３ｂをほとんど示さなかったか示したとしてもわずかであった。
【０５２２】
Ｂ．ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ突然変異体のパネルの薬力学
マウスに、ＣＢ２００（野生型）、ＣＢ２３８、ＣＢ２４５、ＣＢ２５２、ＣＢ２５５、ＣＢ２５７、ＣＢ２６８、ＣＢ３５１、ＣＢ３７７、ＣＢ４０９、ＣＢ４２２、ＣＢ４５０、ＣＢ４６４、およびＣＢ４７３を含む、増加性の濃度のＭＴ−ＳＰ１突然変異体のパネルを静脈内ボーラス注射した。血漿を、心臓穿刺により注射後５分に処置マウスから収集した。異なる処置群からの血漿サンプルの補体活性は、実施例１９に記載される溶血アッセイによりまたは実施例２０に記載されるＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡ（１％および１０％血漿中でアッセイ）により決定されるＣ３ｂ沈着により試験した。結果は、ＥＤ５０値を決定するためのプロテアーゼ濃度の関数としてグラフで表した。結果の概説を以下の表２６に表す。表はまた、プロテアーゼの最大耐量（ＭＴＤ）およびＭＴＤとＥＤ５０の比として算出された治療指数（ＴＩ）を記載する。結果は、試験プロテアーゼのいくつかのｉｎ  ｖｉｖｏ効力の差異を示す。
【０５２３】
【表２６】
0005860789.tif 000039
【０５２４】
［実施例２３］
プロテアーゼのラット薬力学的（ＰＤ）分析
Ａ．ＣＢ２５２およびＣＢ３７７
ラットに、ＣＢ２５２（２３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内ボーラス注射し、その後に続いて、３．３ｍｇ／ｋｇ／時間で１時間注入またはＣＢ３７７（１８ｍｇ／ｋｇ）のボーラス注入し、その後に続いて、１．８ｍｇ／ｋｇ／時間で１時間注入した。ビヒクルコントロールで処置したラットもまた研究に含まれた。血漿を、注射後のそれぞれ異なる時点で収集し（ここでｔ＝０は注射前；つまり０、５、１５、３０、６０、または１２０分）、実施例９（１．５μｌの血漿のみを使用した以外）に記載されるウェスタンブロットによりＣ２切断についてアッセイすることにより補体活性についておよび１％または１０％ラット血漿を使用する実施例１９に記載されるカニクイザル溶血プロトコールを使用して溶血について分析した。
【０５２５】
結果は、ＣＢ２５２およびＣＢ３７７処置ラットからの血漿中でＣ２切断が増加したことを示した。ＣＢ２５２は、ウェスタンブロットにより評価されたように血漿サンプル中に検出可能なＣ２がほとんど存在しなかったように、注射後のたった５分後でさえ、Ｃ２のより多くの切断を示し、注射後６０分または１２０分に検出可能なＣ２は存在しなかった。ＣＢ３７７もまた、早期時点で、ビヒクルコントロールと比較してＣ２レベルの減少を示し、しかしながら、６０分および１２０分では、Ｃ２のレベルは、ビヒクルコントロールサンプルからのレベルに似ていた。
【０５２６】
処置ラットからの１０％血漿により誘起された溶血の結果は、ＣＢ３７７からの血漿が、ビヒクルコントロールと比較して、溶血の阻害に対する効果を有していなかったことを示し、一方、ＣＢ２５２からの血漿が、溶血の著しい阻害を示したことを示した。注射後５、１５、３０、および６０分で収集したＣＢ２５２で処置したラットからの血漿サンプルは検出可能な溶血を示さなかったか示したとしてもわずかであった。溶血は、より後期の時点（つまり９０および１２０分）で、ＣＢ２５２処置マウスからの血漿により、ビヒクルコントロールに似たレベルに増加した。溶血が、処置ラットのそれぞれからの１％血漿により誘起された場合、ＣＢ２５２およびＣＢ３７７の効果は、より明白であった。ビヒクルコントロールラットからの１％血漿により誘起された分画溶血（ｔ＝０時点のビヒクルコントロールサンプルで１．０に設定）は、試験時点の中で変化せず、常に約１．０であった。ＣＢ２５２で処置したラットからの血漿は、収集された時点のいずれにおいても検出可能な溶血を誘起しなかった。ＣＢ３７７で処置したラットからの血漿もまた、ビヒクルコントロール処置動物からの血漿と比較して、ＣＢ２５２処置ラットからの血漿よりも少ない程度であったが、すべての時点で溶血の低下を示した。溶血は、ＣＢ３７７の注射後の１５分に収集した血漿中で最も高い程度まで低下し、報告された分画の溶血は、血漿コントロール処置マウスと比較して約０．２で、注射後のより長期にわたる時点で着実に増加し、注射後１２０分で約０．６に増加した。
【０５２７】
Ｂ．ＣＢ２００、ＣＢ１５５、およびＣＢ４２の比較
ラットに、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２５ｍｇ／ｋｇでＣＢ２００（野生型）、ＣＢ１５５、およびＣＢ４２を静脈内ボーラス注射した。血漿を、注射後のそれぞれ異なる時点で（ｔ＝０は注射前である）、注射後の約１３８０分まで収集し、１％血漿を使用する実施例１９に記載されるカニクイザル溶血プロトコールを使用して、溶血についてアッセイすることにより補体活性について分析した。結果は、２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでＣＢ２００またはＣＢ４２で処置したラットからの血漿が、プロテアーゼの注射前のｔ＝０で観察されたレベルに似た溶血のレベルを呈したことを示した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢ２００またはＣＢ４２で処置したラットからの血漿は、早期時点で赤血球の溶血の低下を誘起し、プロテアーゼの注射後の約６０分までの時点で観察された溶血はほとんどないかあってもわずかであった。溶血は、ＣＢ２００またはＣＢ４２の注射後の１３８０分までに収集した血漿サンプルから、プロテアーゼの注射前のｔ＝０での溶血に似たレベルに増加した。しかしながら、ＣＢ１５５処置ラットからの血漿は、試験したすべての容量で溶血の減少を示した。２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇでのラットの処置は、プロテアーゼの注射前のｔ＝０と比較して、収集した血漿により誘起された、わずかではあるが、再現性のよい溶血の減少を早期時点で示した。ラットが投与量２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＣＢ１５５を受けた後、約３０分で収集した血漿サンプルは、ＯＤ４１５での溶血がｔ＝０（非プロテアーゼ）血漿サンプルの約０．４５と比較して、それぞれ約０．３または約０．２５と観察された。２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＣＢ１５５の注射前の後の２４０分またはそれよりも後で収集した血漿は、ｔ＝０処置動物から観察されたレベルに似たレベルまで溶血を誘起した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢ１５５で処置したラットからの血漿は、早期時点で赤血球の溶血の低下を誘起し、プロテアーゼの注射後の約２４０分までの時点で観察された溶血はほとんどないかそれに近かった。溶血は、ＣＢ１５５の注射後の１３８０分までに収集された血漿サンプルから、プロテアーゼの注射前のｔ＝０での溶血に似たレベルに増加した。これらの結果は、ＣＢ１５５は、この実験中で評価されるＣＢ２００およびＣＢ４２よりも補体不活性化に対する高いｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的効力を有することを示す。
【０５２８】
［実施例２４］
プロテアーゼのカニクイザル薬力学的（ＰＤ）分析
Ａ．ＣＢ２５２カニクイザルｅｘ  ｖｉｖｏ補体阻害
２匹の未処置オスおよび２匹の未処置雌カニクイザル（処置の開始時、約２．２〜４．４ｋｇ、２〜４歳）を単一処置群にあてた。各動物に、特有の識別番号を永久に入れ墨し、投薬の前の１４日間の順化期間にあてた。研究動物に、５ｍｇ／ｋｇの容量で、１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌ用量のＣＢ２５２を静脈内投与した。ｅｘ  ｖｉｖｏ薬力学的分析のための血液サンプルを、予定した時点（注射前、つまりｔ＝０；注射後の５分、３０分、６０分）で収集した。血液を、拘束した意識のある動物の末梢静脈から静脈穿刺により収集した。血液サンプルを、ベースライン値として使用するための予備の動物から収集した。約１ｍｌの血液をリチウムヘパリンで処置したチューブに移し、氷上に置き、次いで、収集から３０分以内に４℃で１５分間、２０００ｇで遠心分離した。得た血漿を、２つのほぼ等しい一定分量に分け、次いで、ドライアイスで凍結させたクリオバイアルに移した。サンプルを、解凍および分析の前に、約−６０℃またはそれ以下で保存した。血漿サンプルは、ウェスタンブロット、１％および１０％の血漿濃度でのＥＬＩＳＡによるＣ３ｂ沈着により、ならびに１％、２．５％、および１０％血漿での感作ニワトリ赤血球の溶血を通してＣ２切断についてアッセイすることにより補体活性化に対する効果について試験した。
【０５２９】
１．Ｃ２切断
血漿サンプル中のＣ２切断は、以下の修正を有する実施例９で記載されるウェスタンブロットにより評価した：ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液およびサンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で５分間煮沸した１μｌ血漿を分析において使用した；ヤギ抗ヒトＣ２は、５％粉乳／ＴＢＳＴ中で１：２０００に希釈した；およびＨＲＰ抱合抗ヤギ二次は、５％粉乳／ＴＢＳＴ中に１：４０００に希釈した。結果は、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２のボーラスＩＶ注射で投薬したカニクイザルからのｅｘ  ｖｉｖｏ血漿が、３ｍｇ／ｋｇのみでのＣ２の部分的な切断を実証したことを示した。１ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿では、識別可能なＣ２切断がなかった。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルから収集した血漿では、血漿サンプルが入手可能であった３匹のすべての動物について、著しいＣ２切断が観察された。Ｃ２ウェスタンブロットの濃度測定により決定されるＣ２の分解の平均的な程度は、５分で６０％の分解、３０分で５０％の分解、６０分で４０％の分解であった。３ｍｇ／ｋｇのＣＢ２５２で処置したすべての動物からの血漿中でのＣ２切断により評価される補体の阻害百分率を以下の表２７で概説する。
【０５３０】
【表２７】
0005860789.tif 000040
【０５３１】
２．Ｃ３ｂ沈着
血漿サンプル中でのＣ３ｂ沈着は、実施例２１に記載されるＥＬＩＳＡにより評価した。Ｃ３ｂ沈着アッセイにおいて、いずれの動物についても、アッセイしたいずれの時点でも、投与した１ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２を投与したサルからの血漿サンプル中で、補体の著しい阻害は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇ用量のＣＢ２５２で、１０％血漿で、Ｃ３ｂ沈着は、平均して、５分の時点で約５０％、３０分の時点で３０％、および６０分で１５％阻害された。ＣＢ２５２による阻害のレベルは、１％血漿中で測定した場合、より大きいことがと観察された。３ｍｇ／ｋｇ用量のＣＢ２５２については、１％血漿で、Ｃ３ｂ沈着は、平均して、５分で約７０％、３０分で５５％、および６０分で５０％阻害された。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したすべての動物からの血漿中でのＣ３ｂ沈着により評価される補体の阻害百分率を以下の表２８で概説する。
【０５３２】
【表２８】
0005860789.tif 000041
【０５３３】
３．溶血
溶血を、実施例１９に記載される感作ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）溶血アッセイにおいて評価した。結果は、１ｍｇ／ｋｇ用量のＣＢ２５２で処置したサルからの血漿が、いずれの動物についても、アッセイいずれの時点でも、感作ニワトリＲＢＣの溶血に対する観察可能な効果を呈しなかったことを示した。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿サンプルは、アッセイしたそれぞれ異なる時点で、溶血の著しい阻害を示し、阻害は、１％、２．５％、および１０％の血漿で観察された。１０％血漿では、３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿は、平均して、５分で溶血の８０％の阻害、３０分で４５％の阻害、および６０分で２５％の阻害を示した。２．５％血漿では、３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿は、平均して、５分で溶血の９２％の阻害、３０分で８０％の阻害、および６０分で６５％の阻害を示した。１％血漿では、３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿は、平均して、５分で溶血の９９％の阻害、３０分で９８％の阻害、および６０分で９０％の阻害を示した。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したすべての動物からの血漿による、ニワトリＲＢＣの溶血により評価される、補体の阻害百分率を以下の表２９で概説する。
【０５３４】
【表２９】
0005860789.tif 000042
【０５３５】
要約すると、１ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２の単一ボーラス静脈内注射で処置したサルからのカニクイザル血漿は、Ｃ２分解、Ｃ３ｂ沈着ＥＬＩＳＡ、または感作ニワトリ赤血球の溶血により測定されたように、補体の著しい阻害を示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２の単一ボーラス静脈内注射で処置したサルからのカニクイザル血漿は、５分および３０分の時点でのすべてのｅｘ  ｖｉｖｏ補体アッセイで、著しい阻害を示した。最もストリンジェントでないアッセイレベル、Ｃ３ｂ沈着ＥＬＩＳＡでの１％血漿および溶血での１％血漿で、著しい阻害は６０分の時点まで続く。
【０５３６】
Ｂ．カニクイザルにおける他のＭＴ−ＳＰ１突然変異体と比較したＣＢ２５２の薬力学的効力
サルに、ＣＢ２５２またはＣＢ３７７を、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇプロテアーゼで静脈内ボーラス注射した。血漿を、注射後のそれぞれ異なる時点で収集し（ここでｔ＝０は注射前；つまり０、５、３０、および６０分）、実施例９に記載されるウェスタンブロットによりＣ２切断についてはアッセイすることにより補体活性についておよび１％、２．５％、または１０％サル血漿を使用する実施例１９に記載されるカニクイザル溶血プロトコールを使用して溶血について分析した。
【０５３７】
結果は、１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼでの処置の後ではなく、３ｍｇ／ｋｇプロテアーゼでの処置の後での、ＣＢ２５２およびＣＢ３７７処置サルからの血漿中でのＣ２の切断の増加を示した。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２およびＣＢ３７７プロテアーゼで処置したサルから収集した血漿は、Ｃ２の時間依存的切断を示し、最も大きなＣ２切断が、サルから収集した血漿において、プロテアーゼ処置後の５分で生じ、より後の時点で切断の減少が生じた。結果はまた、ＣＢ３７７処置サルと比較して、Ｃ２のより多くの切断が、試験したすべての時点で、ＣＢ２５２処置サルから収集した血漿中で生じたことを示した。
【０５３８】
１ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２またはＣＢ３７７プロテアーゼで処置したサルからの２．５％血漿または１０％血漿により誘起された溶血においての差異が、プロテアーゼで処置しなかったサルからの血漿により誘起された溶血（つまりｔ＝０）と比較して、いずれの収集時点でも観察されなかったので、溶血実験の結果はＣ２切断結果と相互に関連した。結果はまた、３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２またはＣＢ３７７で処置したサルからの２．５％または１０％の血漿を使用して観察された溶血が類似したことも示した。両アッセイの条件下で、３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ３７７で処置したサルからの血漿は、ｔ＝０の血漿と比較して、赤血球の溶血においてわずかな減少のみを示した。ｔ＝０での溶血の分画を１．０と設定すると、ＣＢ３７７処置サルからの血漿から観察された分画溶血は、試験したすべての時点で約０．７であった。ＣＢ２５２は、この実験においてＣＢ３７７よりも著しく強力であった。注射後の５分に収集した、３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿は、赤血球の検出可能な溶血を誘起せず、観察された分画溶血は０または０付近であった。３ｍｇ／ｋｇ  ＣＢ２５２で処置したサルからの血漿から誘起した分画溶血が、ＣＢ２５２処置サルからの、それぞれ３０分および６０分に収集した血漿において、約０．４および約０．７に増加したので、溶血に対するＣＢ２５２の効果は、時間依存的であった。
【０５３９】
他の実験では、プロテアーゼＣＢ２３８、ＣＢ２５２、およびＣＢ３７７の薬力学的効力を、カニクイザルへの投与の際に比較した。サルに、ＣＢ２３８、ＣＢ２５２、またはＣＢ３７７を、各プロテアーゼについての最大耐量（ＭＴＤ）（つまりそれぞれ２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ）で静脈内ボーラス注射した。血漿を、注射後のそれぞれ異なる時点で収集し（ここでｔ＝０は注射前；つまり０、５、３０、および６０分）、２．５％または１０％サル血漿を使用する実施例１９に記載されるカニクイザル溶血プロトコールを使用して、ニワトリ赤血球の溶血を支持する能力についてアッセイすることにより、補体活性について分析した。溶血の阻害％を、ｔ＝０サルから収集した２．５％または１０％血漿により誘起された溶血と比較して決定した。結果を、以下の表３０に概説する。
【０５４０】
【表３０】
0005860789.tif 000043
【０５４１】
［実施例２５］
ウサギ心臓におけるｅｘ  ｖｉｖｏでのプロテアーゼの補体媒介性心血管効果の検査
補体媒介性傷害に対するプロテアーゼの効果を、ウサギ心臓中での心臓の損害を検査するためにランゲンドルフアッセイを使用してｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。単離した心臓についての研究は、化合物の血行動態効果、心電図上の効果、および電気生理学的な効果についての同時の観察を考慮に入れる。ウサギＩκγチャネルのアミノ酸配列がヒトＩκγチャネル配列と９９％の相同性を共有するので、ニュージーランドホワイトウサギをこの研究において使用した［Ｗｙｍｏｒｅら（１９９７）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．、８０：２６１−２６８］。ウサギは、心血管の研究に広範に使用されてきており、ウサギ心臓活動電位（ヒト心臓活動電位に類似する）は、Ｉκγにより強く駆動されると思われるので、ヒト心臓に対する電位効果のモデルに適切な種である［Ｗｅｉｒｉｃｈら（１９９８）Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、９３：１２５−１３２、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９２）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．、２６２：８０９−８１７］。また、ヒト血漿およびウサギ心臓組織の間の相互作用は、以前に特徴づけられており、主に補体媒介性であることが示された［Ｋｉｌｇｏｒｅら（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２８５：９８７−９４］。例えば、ヒト血漿およびウサギ心臓の外来性表面の接触は、補体を活性化し、次いで、補体は、最終的に不全収縮をもたらす心筋層に対する損害を媒介する。したがって、このモデルは、１つまたは複数の補体成分を標的にするプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼ等の補体阻害剤の効力を決定するのに適切である。
【０５４２】
Ａ．実験の設計および方法
ウサギは、スタンニングとその後に続く噴門切除を介して安楽死させた。心臓を、速やかに除去し、ランゲンドルフ装置上にマウントし、修正し、酸素化したクレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いて灌流した［３７℃；クレブス−ヘンゼライト緩衝液：１１８．１ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．１７ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．１８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１１．１ｍＭ  ｄ−グルコース、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２４．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、および２．０ｍＭピルビン酸塩；２．５ｇのウシ血清アルブミン／灌流培地の１０００ｍｌの追加で修正；加圧酸素／二酸化炭素（９５％／５％）を介して酸素化］。心室ドレーンおよび液で満たしたラテックスバルーンを、左心室中に、心耳に巾着縫合して取り付けた。肺動脈ドレーンを取り付けた。心臓は、右心房上に配置したペーシング電極を介して鼓動した。心臓は、心臓が、許容し得る血行動態パラメータ（例えば、ｄＰ／ｄＴ＞１０００ｍｍＨｇ／秒）を平衡期間を通じて呈した場合、研究に許容し得ると考えられた。
【０５４３】
プロテアーゼ試験化合物（１μＭの最終濃度で）を、インキュベーション培地と共に３７℃で１時間インキュベートした（灌流緩衝液中で５０％に希釈したヒト血漿を含有する；つまり１２ｍｌのヒト血清を１２ｍｌの灌流培地中に希釈した）。インキュベーションの後で、試験化合物混合物は、実験的灌流培地に追加し、最終血清濃度が３００ｍｌの全容量中で約４〜６％となるよう再循環させた。１０〜１５分間灌流培地と前もって平衡化し、その後に続いて、１０分間、ベースライン測定値の収集を行った単離ウサギ心臓を、約１時間インキュベートした試験化合物混合物を含有する灌流培地に暴露し、以下に記載するように測定値を続けて収集した。実験は、不可逆的な心室細動が生じた場合、終了させた。心室細動は、心臓が、開始の９０秒以内に自発的に復帰しなかった場合、不可逆的であると考えた。試験化合物に対する暴露の後に、心臓を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．中で固定し、ドライアイス上で凍結させ、次いで、免疫組織化学評価のために−８０℃に設定したフリーザーに保存した。
【０５４４】
１．血行動態測定値
約５ｍｍＨｇのＬＶ拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）を達成するために、左心室（ＬＶ）中のラテックスバルーンを水を用いてふくらませた。ＬＥＰＤ、ＬＶ拡張期血圧（ＬＶＤＰ）、およびＬＶ収縮期血圧（ＬＶＳＰ）を測定するために、バルーンを圧変換器へのチューブ類とつないだ。冠灌流は、大動脈カニューレの側枝ポートにつないだ圧変換器を用いて測定した。血行動態測定値を、Ｎｏｔｏｃｏｒｄ  ＨＥＭ（カラマズー、ＭＩ）ｖ３．５データ収集システムを用いて続けて監視した。デジタルマーカーを、試験化合物暴露期間を示すために使用した。ＬＶＤＰは、ＬＶＥＤＰおよびＬＶＳＰの間の差異として定義した。ＬＶ圧における最大の増加率（＋ｄＰ／ｄｔ）およびＬＶ圧における最小の減少率（−ｄＰ／ｄｔ）の両方を、ＬＶＥＤＰからＬＶＳＰおよびＬＶＳＰからＬＶＥＤＰのそれぞれの時間の一次導関数として測定した。冠灌流圧（ＣＰＰ）もまた測定した。
【０５４５】
平衡期間の最終分（０分間）からの、試験化合物暴露期間の時間内の各１５分の期間（つまり１５分間、３０分間、４５分間、６０分間）の最後の１分間の血行動態測定値を調べ、試験化合物の効果を決定するために使用した。異所性拍動の干渉により中断されない連続した５つの心臓周期から取った平均値を、血行動態パラメータの分析に使用した。個々の心臓からの値を、個々の濃度での各変数についての平均を決定するためにプールした。ベースラインおよび各濃度の間の各変数の平均的なパーセント変化もまた決定した。血行動態パラメータに対する各試験化合物の効果を、正当な場合に群比較のためのポストホックテストが後に続く反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計的有意差について検査した。値がｐ＜０．０５であれば統計的に有意と考えられた。データは、平均値±ＳＥＭまたは適切であればベースラインからのパーセント変化として提示した。
【０５４６】
２．クレアチンキナーゼ濃度分析
約２．０ｍｌの灌流培地を、各１５分の試験期間の終わりの直前に肺動脈ドレーンから収集した。実験の早期終了（例えば心室細動で）の前に、サンプルを分析に利用した。サンプルをドライアイス上で凍結させ、次いで、分析のために−８０℃に設定したフリーザー中に保存した。
【０５４７】
Ｂ．実験結果
１マイクロモルのＣＢ２００、ＣＢ１５５、またはＣＢ４２を、５０％に希釈したヒト血漿と共に、灌流培地中で、１時間３７℃でプレインキュベートした。次いで、プロテアーゼ試験化合物混合物を、６％血漿の最終濃度に希釈し、単離ウサギ心臓に灌流させて、補体活性化を誘起し、補体活性化に対するプロテアーゼの効果を、血行動態測定値に基づいて決定した。熱不活性化血漿での心臓の灌流をネガティブコントロールとして使用した。ＬＶ圧（＋ｄＰ／ｄｔ）における最大の増加率を、試験化合物プロテアーゼを用いた灌流の後、ベースライン（０分）ならびに１５分、３０分、４５分、および６０分に決定した。結果は、血漿のみが、心筋層に対する損害を示すＬＶ圧における増加率の低下を誘起したことを示す。＋ｄＰ／ｄｔ値は、ベースライン値から約５分の１に減少し、試験したすべての時点の間で類似していた。対照的に、最初に熱不活性化した血漿は、ベースラインで観察された＋ｄＰ／ｄｔ値と比較して、＋ｄＰ／ｄｔ値の変化を示さず、補体が活性化されていないことを示した。プロテアーゼ試験化合物を用いたウサギ心臓の灌流は補体媒介性傷害から心臓を保護した。ＣＢ４２およびＣＢ１５５の両方は、ベースラインレベルに似た＋ｄＰ／ｄｔ値により示されるように、すべての測定時点で心臓機能を完全に保護した。しかしながら、ＣＢ２００（野生型）は、このモデルにおいて心臓機能を部分的に保護したのみであった。ＣＢ２００での灌流の後の１５分で、観察された心臓機能は、ベースラインレベルに似た＋ｄＰ／ｄｔ値を有するほぼ完全な保護を示した。３０分までに、ＣＢ２００は、心臓機能の保護をほとんどかそれに近く示さず、３分の１を超えて減少した＋ｄＰ／ｄｔの値が観察され、血漿のみでのウサギ心臓の処置により観察されたレベルに接近した。ＣＢ２００の存在下で灌流したウサギにおけるＬＶ圧レベルの増加率は、４５および６０分で低いままであり、これらの時点での心臓への損害を示した。
【０５４８】
［実施例２６］
振盪フラスコ中での修飾ＭＴ−ＳＰ１  ＣＢ２３８の発現および精製
ＣＢ２３８および関係する組換えＭＴ−ＳＰ１突然変異体または野生型ＭＴ−ＳＰ１を、実施例１および２に記載されるようにクローン化し、封入体としてのイー・コリ中で発現させた。ＭＴ−ＳＰ１または突然変異体の産生を、可溶化およびリフォールディングのための、封入体ペレットの続く単離のために約４４本×１Ｌ振盪フラスコ分までプールすることにより、ＭＴ−ＳＰ１突然変異体ＣＢ２３８の産生を最適化することにより、実験室規模に適合させた。手短に言えば、１μｌのプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡミニプレップ精製からの）を５０μｌのＢＬ−２１細胞と混合した。細胞を、プラスミドＤＮＡと共に氷上で３０分間インキュベートし、次いで、４５秒間４２℃で熱ショックを与えた。次いで、細胞を、回復のために２分間氷上でインキュベートした。５００μｌのＬＢ（ＬＢ；Ｄｉｆｃｏ社ＬＢブロスＬｅｎｎｏｘ、１リットル当たりのおおよその配合：１０．０ｇトリプトン、１０．０ｇ酵母抽出物、５．０ｇ塩化ナトリウム）を細胞に追加し、培養物を、１時間振盪させながら３７℃でインキュベートした。次いで、５０μｌの細胞を、選択のために、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する寒天プレート上で平板培養した。プレートを、３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【０５４９】
５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する２５ｍｌのＬＢに単一コロニーを植え、完全にコンフルエントとなるまで成長させた。０．５ｍｌの種培養を、１０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する８００ｍｌの２ＸＹＴに追加し、終夜（〜１２−１６時間；約４４個のフラスコ）成長させた。細胞を、Ｓｏｒｖａｌｌローター＃ＳＬＣ４０００で６０００ｘｇで遠心分離により採取した。細胞ペレットをプールし、重さを量った。３５．２Ｌのイー・コリ培養物から、３２０ｇの湿性細胞ペレットを得た。５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ＫＰＯ４）ｐＨ７．４および３００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する６００ｍｌの緩衝液を、細胞ペレットに追加した。細胞を完全に再懸濁させた後、バッチを２つに分離し、各パートを氷上のガラス管中で超音波処理した。超音波処理器を、６０％デューティーサイクル、出力レベル８、４分間に設定した。超音波処理手順は各サンプルにつき２回繰り返した。結果としての超音波処理サンプルを、４℃で２０分間、１６，９００ｘｇで遠心分離した。上清を流し出して、５０ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．５％ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）容量／容量を含有する〜３００ｍｌの新鮮な緩衝液と交換した。封入体は、スパチュラを使用して再懸濁させ、溶液を、均質となるまで撹拌した。撹拌したサンプルを再度遠心分離し、上清をデカントした。ＬＤＡＯ洗浄を合計３回行い、その後に続いて、５０ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有し、ＬＤＡＯを含有しない緩衝液で３ラウンド洗浄した。
【０５５０】
７０ｇの精製湿性封入体に、７００ｍｌの変性緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中６ＭグアニジンＨＣｌおよび２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）］を追加し、タンパク質を可溶化した。次いで、サンプルを２２℃で３０分間２０，４００ｘｇで遠心分離し、上清を収集した。次いで、タンパク質溶液を、３５Ｌのリフォールディング溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５Ｍアルギニン、５ｍＭ還元型グルタチオン、０．０５ｍＭ酸化型グルタチオン）中に、勢いよく撹拌させながら、ゆっくり滴下した。タンパク質溶液を７２時間４℃に放置した。
【０５５１】
結果としてのタンパク質溶液を中空ろ過により〜１−２Ｌに濃縮し、次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１６Ｌ緩衝液中に終夜４℃で透析した。緩衝液を、翌朝、新鮮な緩衝液に取り替え、サンプルをさらに８時間透析した。次いで、プロテアーゼサンプルを透析チューブ類から除去し、プロテアーゼの自己活性化がプロ領域の切断により生じ、成熟した酵素を遊離するまで、室温でインキュベートした。活性は、上記実施例３に記載されるように、蛍光発生ＲＱＡＲ−ＡＭＣ基質およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して監視した。次いで、完全な活性化の際に、サンプルを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５を含有する緩衝液中に終夜４℃で透析させた。
【０５５２】
次いで、タンパク質溶液をＳｏｕｒｃｅ  １５Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に装填し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５から０．１５ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５までの緩衝液勾配を使用して溶離した。すべてのクロマトグラフィー工程の前に、各カラムを、０．５Ｎ  ＮａＯＨで逆に洗浄し、次いで、水ですすいだ。活性分画をプールした。５０ｍＭ  ＰＯ４  ｐＨ７．０中に２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する等容量の緩衝液を追加し、結果としての溶液を、５０ｍＭ  ＰＯ４  ｐＨ７．０、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する緩衝液であらかじめ平衡化したフェニルセファロースＨＰカラムに装填した。活性タンパク質を、５０ｍＭ  ＰＯ４  ｐＨ７．０、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４から５０ｍＭ  ＰＯ４  ｐＨ７．０への緩衝液勾配を用いて溶離した。活性分画をプールし、緩衝液を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５に取り替えた。次いで、サンプルを、第１のクロマトグラフィー工程におけるように、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ上に再装填し、精製した。次いで、活性分画をプールし、撹拌セルを使用して、緩衝液をＰＢＳに取り替え、〜１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。サンプルはタンパク質濃度、Ａ２８０を測定するために除去した。次いで、ベンズアミジンを、０．２ｕＭシリンジフィルターに通すタンパク質試料のろ過の前に、２０ｍＭの最終濃度まで、残りのサンプルに追加した。タンパク質溶液を液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。最終収量は、〜８００ｍｇの純粋タンパク質（〜２０ｍｇのプロテアーゼ／１Ｌの培養物）であった。精製タンパク質を、上述の実施例３中で記載されるように、特異的活性、純度、およびエンドトキシンレベルについてアッセイした。
【０５５３】
類似する戦略を、他のＭＴ−ＳＰ１突然変異体または野生型ＭＴ−ＳＰ１について利用した。プロトコールは、特定の突然変異体に依存して変更した。フェニルセファロースで十分に精製されない突然変異体について、ベンズアミジンセファロースをその代わりとして使用した。例えば、ＭＴ−ＳＰ１突然変異体ＣＢ４５０をベンズアミジンカラムで精製した。
【０５５４】
［実施例２７］
ＭＴ−ＳＰ１突然変異体のパネルによる溶血および血漿活性の評価
プロテアーゼのパネルを、古典溶血または代替溶血を支持するそれらの能力について、２０％血漿とのプレインキュベーションの後で、上述の実施例７、Ａ部．１．ｂおよび実施例７、Ｂ部．１に記載されるように試験した。さらに、プロテアーゼを、実施例６に記載されるように、血漿活性について試験した。表３１は、２００ｎＭでの分画古典溶血、５００ｎＭでの分画代替溶血、ならびに古典および代替溶血に対する各プロテアーゼについてのＩＣ５０を表す。
【０５５５】
さらに、アルファ−２マクログロブリン（ａ２Ｍ）により結合を解除されたプロテアーゼパーセントもまた決定した。アルファ−２マクログロブリンによるプロテアーゼの不活性化は、プロテアーゼが小さな蛍光基質をなお取り扱うことはできるが、大きなタンパク質基質に接近することができない複合体中にプロテアーゼを閉じ込める。アルファ−２マクログロブリンのこの特性は、血漿中でのプロテアーゼ活性の評価を複雑にする。血漿中で遊離し、複合体を形成していないプロテアーゼの実際の活性を決定するために、２工程の測定が必要とされる。第１に、蛍光基質に対するサンプルの活性を測定する。第２に、高分子阻害剤を、すべての遊離プロテアーゼに結合するよう追加し（ＡＴＩＩＩまたはＭ８４Ｒエコチン）、アルファ−２マクログロブリン中に閉じ込められた（したがって阻害から保護された）プロテアーゼ活性を測定する。アルファ−２マクログロブリン活性により結合を解除されたパーセントは、エコチンの追加により阻害された血漿残存活性の百分率である。手短に言えば、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブ中で、１μＬ  １０×プロテアーゼを９μＬのクエン酸塩中のヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）と混合した。非阻害コントロールもまた、調製し、９μＬ  ＰＢＳＴと混合した１μｌ  １０×プロテアーゼを含有させた。混合物を３７℃で５分間インキュベートした。サンプルをＰＢＳＴ中で２５０倍希釈し、氷上で保存した。各サンプルについての２つの５０μＬ一定分量を、２μＬ  ＰＢＳＴまたは２μＬ  ５２０ｎＭ  Ｍ８４Ｒエコチンを含有する不透明なアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ社  ＃３６９４）に移した。プレートを、室温で１０分間インキュベートした。５マイクロリットル０．４ｍＭ  Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＭＣ基質を追加し、蛍光発光を、３０℃で３０分間、２０秒ごとに読み取るよう設定した（Ｅｘ：３８０ｎｍ、ＥＭ：４５０ｎｍ、カットオフ：４３５ｎｍ）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５分光蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて長い間にわたって測定した。アルファ−２マクログロブリンにより結合を解除されたパーセントを、以下の式を用いて算出した：（１−（［（血漿中のプロテアーゼ／ＰＢＳＴ中のプロテアーゼ）−（血漿中のプロテアーゼ＋エコチン／ＰＢＳＴ中のプロテアーゼ）］／（血漿中のプロテアーゼ／ＰＢＳＴ中のプロテアーゼ）））＊１００。試験したプロテアーゼのパネルについて、アルファ−２マクログロブリンにより結合を解除された％の結果を、以下の表３１に記載する。
【０５５６】
【表３１−１】
0005860789.tif 000044
【表３１−２】
0005860789.tif 000045
【０５５７】
［実施例２８］
付加的な突然変異体
本明細書中で記載されるように、付加的な突然変異体が調製される。上記突然変異体は、以下の表３２に記載される突然変異体を含むが、これらに限定されない。
【０５５８】
【表３２】
0005860789.tif 000046
【図１】
0005860789.tif 000047
【配列表】
0005860789000001.app