(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)、又はこれを発現する微生物の存在下に、O-ホスホセリン(O-phosphoserine, OPS)を硫化物と反応させてシステインを製造するステップを含む、システインの製造方法。
【請求項２】
前記OPSSが、配列番号９〜１２からなる群から選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記OPSが、精製されたOPS又はOPSを含む微生物の醗酵液である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記硫化物が、Na2S、H2S、NaSH,(NH4)2S及びS2O3からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記硫化物の添加量が、前記反応時に添加されるOPSモル濃度の０．１〜３倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応時に補助因子として０．００１〜２ｍＭのPLP(pyridoxal-5’-phosphate)又は０．００１〜１００ｍＭのDTT(dithiothreitol)を添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記システインを分離及び精製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)、又はこれを発現する微生物の存在下に、O-ホスホセリン(O-phosphoserine, OPS)を硫化物と反応させてシステインを製造するステップ、および
２）前記ステップ１）において製造された前記システインをシステイン誘導体に変換するステップを含む、システイン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase)を用いてシステイン又はその誘導体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
システインは、全ての生物体の硫黄代謝における重要なアミノ酸であり、毛髪のケラチンなど生体内タンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン及びその他の硫黄を含有した代謝産物の合成に用いられるだけでなく、コエンザイムA生合成の前駆物質として用いられる。また、システイン生合成は、セリン、グリシン、メチオニン等、他のアミノ酸の生合成と密接な関係があることが知られている。産業的には、システイン及びその誘導体は、製薬分野(気管支疾患の治療)、化粧品分野(ヘアーシャンプー及びパーマウェーブローションの成分)及び食品分野(抗酸化剤、風味増進剤及び混練補助剤)に用いられている。
【０００３】
これまでシステインは、主にヒトの髪の毛や、動物の羽毛などを原料として化学的な酸-加水分解工程により製造されてきた。しかし、髪の毛から抽出するシステインの生成収率は7〜8％と非常に低く、抽出過程中に用いる塩酸と硫酸の使用により環汚染廃棄物が過剰に生成される。また、原材料として毛髪を用いるため、消費者が嫌悪感を抱くこともある。このような問題により環境にやさしいシステインの製造工程の開発に対する要求が高まっており、これに応じて微生物を用いたシステインの製造方法が開発された。
【０００４】
微生物を用いたシステインの製造方法としては、1)まず、D、L-ATCに微生物を用いて生物学的に転換する方法が知られている。しかし、この方法は、前駆体であるD、L-ATCの溶解度が低く産業化が困難である。2)また、他の方法としては、大腸菌を用いた直接醗酵法でシステインを製造する方法が知られている。この方法は、微生物内にシステインが過剰蓄積された場合、細胞内毒性を示すことがあり、微生物を用いて高濃度のシステインを製造するのには限界がある。
【０００５】
微生物及び植物のシステイン生合成経路のうちの1つを詳察すると、O-アセチルセリン(O-acetyl-serine, OAS)は、システインの炭素骨格の中間前駆物質として作用する。OASは、硫黄供与体(sulfur donor)として硫化水素を用いてO-アセチルセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetyl-serine sulfhydrylase, OASS)によりシステインに転換される。したがって、OASを蓄積する微生物と様々な硫黄供与体からOASSを用いてシステインを製造することができる(特許文献１)。
【０００６】
本発明者らは、これとは異なる新たなシステインの製造方法を模索する中で、特定の微生物においてはO-ホスホセリン(O-phosphO-serine, OPS)を用いてシステインを合成する酵素(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)が存在するという事実を見出した。OPSは、セリン(L-serine)の中間前駆物質であるため、OASより代謝経路が短い。したがって、 前駆体の製造にOPSを用いると、OASを用いた場合よりも有利であるといえる。特に、トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)由来のOPSSは、マイコバクテリアム・テュバーキュローシス(Mycobacterium tuberculosis)由来のOPSSとは異なりmec+及びcys0のように硫黄を伝達する補助酵素を必要とせず、また、アエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)のOPSSとは異なり37℃で最適活性を示すことを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国登録特許第６，５７９，７０５号
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２０１２−００４１１１５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551:133-138, 2003
【非特許文献２】Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc.,127:11602-11603, 2005
【非特許文献３】Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem.,281:25062-25075, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、高収率でシステインを製造する方法を開発するために鋭意努力した結果、様々な微生物からOPSを基質としてシステインを合成する活性を有する新規なOPSSを同定し、該新規なOPSSが既存のトリコモナス・バギナリスのOPSSよりもシステインの合成活性が増加していることを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、新規なO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)又はこれを発現する微生物の存在下に、O-ホスホセリン(OPS)を硫化物と反応させてシステイン又はこの誘導体を製造するステップを含む、システイン又はその誘導体の製造方法を提供することある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新規なO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)を用いてO-ホスホセリンを基質としてシステインを製造する方法を提供することによって、これを用いた簡便な方法で環境にやさしいシステインを高収率で容易に製造することができるという利点を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、3種のOPSSを用いて10分、30分及び60分後にシステイン転換率を測定した結果を示す。
【図２】図2は、Dal-OPSSのpH敏感性を確認するために、pH別のシステイン転換率を測定した結果を示す。
【図３】図3は、OPS醗酵液と硫化物を基質として3種のOPSSを用いて10分、30分及び60分後にシステイン転換率を測定した結果を示す。
【図４】図4は、Dal-OPSSの温度別システイン転換率を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔発明を実施のための形態〕
本発明の一態様として、配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)又はこれを発現する微生物の存在下に、O-ホスホセリン(OPS)を硫化物と反応させてシステイン又はこの誘導体を製造するステップを含む、システイン又はこの誘導体の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明における用語「O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase、以下OPSS)」とは、O-ホスホセリン(O-phosphoserine、以下OPS)にチオール基(SH基)を提供することにより、OPSをシステインに転換させる活性を有する酵素を意味する。
【００１５】
本発明において、前記OPSSは配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列であってもよく、これは、本発明者らにより新たに同定されたOPSSである。前記配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列はOPSSの活性を有し、その活性を維持する限り一定程度の修飾が可能である。本技術分野の当業者であれば、このような人為的変形により70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性が維持されるアミノ酸配列が、本発明において目的とする活性を保有する限り、本発明の前記アミノ酸配列に相当するものであることを容易に理解するであろう。
【００１６】
本発明の具体的な一実施例では、配列番号1のアミノ酸配列を有するDac-OPSS及び配列番号2のアミノ酸配列を有するDal-OPSSを用いて精製されたOPS及びOPS醗酵液を基質としたシステイン合成活性を評価したところ、対照群であるTva-OPSSに比べて高いシステイン転換率を示すことを確認することにより、前記配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するOPSSが高収率でシステインを製造できることを確認した(図1、図3、表3及び表4)。
【００１７】
本発明における用語「相同性」とは、2個のポリペプチドの分子部分(moiety)間の配列類似性のパーセントを意味する。一方の部分からもう一方の部分までの配列類似性は、公知の当該技術により決定され得る。例えば、相同性は配列情報を整列させ、容易に入手できるコンピュータプログラムを用いて2個のポリペプチド分子間の配列情報を直接整列させて決定できる。また、相同性は、相同領域間の安定した二本鎖をなす条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズした後、一本鎖特異的ヌクレアーゼに分解することによって、分解された断片のサイズを決めることにより決定できる。
【００１８】
本発明における用語「配列類似性」とは、共通の進化的起源を共有するか、又は共有しないタンパク質の塩基配列やアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度を意味する。一実施態様において、2個のアミノ酸配列がアミノ酸配列の所定の長さに対してポリペプチドのマッチが少なくとも21％(好ましくは、少なくとも約50％、最も好ましくは、約75％、90％、95％、96％、97％又は99％)である時、「実質的に相同」又は「実質的に類似」する。実質的に相同である配列は、データバンクで用いられている標準ソフトウェアを用いたり、例えば、特定のシステムのために定義されたストリンジェントな条件の下で用いたハイブリダイゼーション実験により配列を比較することで確認することができる。定義される適切なハイブリダイゼーション条件は、該当技術の範囲内で行われる(例、Sambrook et al.,1989,infra参考)。
【００１９】
本発明における「システイン転換」とは、PSSの触媒作用により基質であるOPSから製造物であるシステインに転換される反応、即ち、OPSをシステインに転換してシステインを得る反応を意味する。また、用語「システイン転換率」は、OPSがシステインに転換された比率を意味する。最適な反応条件でOPS 1モルはシステイン1モルに転換されれば、例えば、OPS 100モルから転換反応を経てシステイン100モルが得られた場合、システイン転換率が100％となる。本発明のOPSSは、OPSをシステインに転換する過程を経るため、OASを用いる代謝経路より短いので前駆体の製造に有利なだけでなく、既存のOPSSとは異なり、硫黄を伝達する補助酵素(M. tuberculosisのmec+及びcys0)の非存在下においてもOPSS自体でシステインを製造できるという利点がある。
【００２０】
本発明のOPSSは、配列番号9〜12の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるものであってもよい。本発明の配列番号1又は2のアミノ酸配列を有するOPSSは、それぞれ配列番号9又は10の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるものであってもよく、より好ましくは異種タンパク質を大腸菌での発現を高めるためにコドン使用頻度が大腸菌に最適化された配列番号11又は12の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるものであってもよい。
【００２１】
本発明の前記OPSSを発現する微生物は、内在的に本発明のOPSSを発現する微生物又は本発明のOPSSをコードする塩基配列がベクターの形態、又は染色体内に挿入された形態で導入された微生物であってもよい。前記OPSSを発現する微生物は、さらにOPSSの活性が強化されてもよい。OPSS活性を強化する方法としては、OPSSをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターを前記微生物に導入する方法によりコピー数を増加させる方法、前記塩基配列のコドン使用頻度を前記微生物で主に用いられるコドン使用頻度により最適化する方法、前記OPSSを発現する微生物において前記OPSSをコードする遺伝子のプロモーターを強いプロモーターに置き換える方法、前記プロモーターに変異を導入する方法及び前記OPSSの活性が強化されるように前記新規な分離したOPSSをコードする遺伝子に変異を導入する方法などがある。
【００２２】
本発明における用語「ベクター」とは、宿主細胞を用いて塩基のクローニング及び/又は転移のための任意の媒介物を意味する。ベクターは、異なるDNA断片が結合し、結合した断片の複製をもたらすことができる複製単位(replicon)であっていもよい。「複製単位」とは、生体内でDNA複製の自己ユニットとして機能する、即ち、自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス)を意味する。
【００２３】
本発明において、前記OPSSを発現する微生物は、前記OPSSを含むベクターを形質転換させる方法により得られた微生物であってもよく、前記形質転換の方法は塩基を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、当分野において公知の適切な標準技術を選択して行うことができる。その例として、エレクトロポレーション(electroporation)、リン酸カルシウム共沈殿法(calcium phosphate co-precipitation)、レトロウイルス感染(retroviral infection)、マイクロインジェクション法(microinjection)、DEAE-デキストラン(DEAE-dextran)、カチオン性リポソーム(cationic liposome)法などがあるが、これに制限されない。
【００２４】
前記OPSSを発現する微生物は、原核細胞又は真核細胞のいずれも可能であり、好ましくは、エンテロバクター科微生物又はコリネ型微生物など、より好ましくは、エシェリキア属微生物、セラチア属微生物などであってもよく、最も好ましくは大腸菌であっていもよい。
【００２５】
本発明により、前記新規な分離したOPSSを発現する微生物を培養し、その培養液からOPSSを分離させることができる。当業界において公知の方法はいずれも用いることができ、本発明の具体的な実施例では、pET発現システムマニュアル(NovagenInc.社)を用いて微生物を培養し、Ni-NTAカラムで分離する方法を用いた。
【００２６】
本発明において、新規なOPSSの基質として用いられるOPSは、市販の精製されたOPSだけでなく、醗酵により製造されたOPS醗酵液を用いることができる。前記精製されたOPSは、例えば、Sigma-Aldrich社の製品番号P0878又はWako社の 製品番号CAS407-41-0 で購入することができる。また、前記OPS醗酵液は、OPS製造能を有する微生物、例えば、寄託番号KCCM11103P(CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC;特許文献２参照)で受託された微生物を培養することにより製造できる。
【００２７】
本発明における用語「硫化物(sulfide)」とは、硫黄と、それより陽性である元素との化合物を総称したものを意味し、本発明の目的上、システイン又はその誘導体の製造時に用いられる化合物である。前記硫化物は、当該技術分野において通常用いられる固形だけでなく、pH、圧力、溶解度の差により液体又は気体の形態で提供され、スルフィド(sulfide, S2-)、チオサルフェート(thiosulfate, S2O32-)などの形態でチオールグループ(SH基)に転換され得る硫化物であれば全て利用できる。好ましくは、Na2S、H2S、NaSH、 (NH4)2S及びS2O3を用いることができる。本発明の具体的な一実施例では、Na2Sを硫黄ソースとして用いた。本発明の反応は、1つのOPS反応基に1つのチオール基を提供して1つのシステイン又はシステイン誘導体を製造する反応であり、前記反応時に硫化物の添加量はこれに制限されないが、反応時に添加されるOPSモル濃度の0.1〜3倍が好ましく、1〜2倍がより好ましい。
【００２８】
本発明のOPSSが最適な酵素転換を可能にする方法は、当該分野において公知の様々な方法が適用され得る。その方法の例としては、これに制限されないが、OPSS酵素の特性を把握する方法、好ましくは、OPSS酵素の最適活性温度、pH、基質に対する阻害有無及び濃度、そしてOPSS酵素自体の熱安定性の把握などがあり、酵素転換反応の最適条件を把握する方法、特に、酵素転換反応時に用いられる最適なOPSS酵素濃度及び用いられる基質の最適の濃度バランス、OPS基質以外に酵素転換反応時に用いられる硫化物に対する選好度、転換反応時に用いられるバッファーの選好度と、これにより発生するイオン影響性、そして補助酵素の存在の有無及び最適濃度の把握などがある。
【００２９】
本発明の具体的な一実施例では、Dal-OPSSを用いてpH及び温度別システイン転換率を確認した結果、pHの場合、7.0〜7.4で最適な活性を示し(図2)、温度の場合、37℃で最適な活性を示したことを確認した(図4)。
【００３０】
本発明において、システイン転換反応時にさらに補助因子(cofactor)としてPLP(pyridoxal-5’-phosphate) 、DTT(dithiothreitol) 、又はPLP及びDTTを同時に添加することができる。前記補助因子は、システイン転換反応において、その効率を増大させることができ、本発明の具体的な一実施例では、0.2 mMのPLP、25 mMのDTT、又は2つの補助因子を同時に添加する場合、システイン転換率が増加したことを確認した(表5)。前記PLPは、これに制限されないが、好ましくは0.001〜2 mMを添加することができ、より好ましくは0.01〜1 mMを添加することができる。また、前記DTTは、これに制限されないが、好ましくは、0.001〜100 mMを添加することができ、より好ましくは、0.01〜50 mMを添加することができる。
【００３１】
本発明の方法は、前記反応ステップを通じて製造されたシステイン又はその誘導体を分離及び精製するステップをさらに含むことができる。前記ステップでは、当該分野において公知の適切な方法を用いて反応液から目的とするシステインを分離及び精製して収集することができる。
【００３２】
当業者であれば、公知の化学的合成方法によって、本発明の方法により製造されたシステインからシステイン誘導体を容易に合成することができる。システインは、アセチル化剤(acetylation agent)と反応し、NAC(N-アセチルシステイン)で容易に合成されてもよく、塩基性の条件では、ハロ酢酸(haloacetic acid)と反応させることにより、SCMC(S-カルボキシメチルシステイン)で合成されてもよい。前記システイン誘導体は、主に、製薬原料として、鎮咳剤、せき緩和剤、気管支炎、気管支喘息及び咽喉炎などの治療剤として用いられる。
〔発明の実施のための形態〕
以下、本発明を実施例により、より詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例1:O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(OPSS)酵素の同定
トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)由来のOPSSは、OPSS以外に2種類の補助酵素を必要とするマイコバクテリアム・テュバーキュローシス(Mycobacterium tuberculosis)由来のOPSSとは異なり、補助酵素の非存在下においても活性を示し、60℃で最適の活性を示すアエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)のOPSSとは異なり、37℃で最適活性を示すことが報告されている。前記事実を基づき、本発明者らはトリコモナス・バギナリスのOPSSアミノ酸配列を基盤として、これとタンパク質配列類似性が高い微生物由来の新規なOPSSを確保した。前記新規なOPSSは、それぞれ配列番号1及び2のアミノ酸配列を有し、Dac-OPSS及びDal-OPSSと命名した。また、前記配列番号1及び2のアミノ酸配列を有する新規なOPSSは、それぞれ配列番号9及び10の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３４】
前記2つのOPSSは、大腸菌由来ではないため、大腸菌での発現が容易でないことがある。大腸菌における発現を容易にするために、前記の新規分離したOPSSのコドン使用頻度の最適化を行い、これには、コドン使用頻度の最適化道具であるJcatを用いた(www.jcat.de)。これにより前記ポリヌクレオチドに対する配列番号9及び10のコドン使用頻度が最適化された配列番号11及び12を得た。前記配列番号11及び12の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、ジェノテック(Genotech Corp.社)に前記塩基配列を提供して合成し、Topo TA クローニングによるベクター形態での供給を受けた。それぞれの菌株からOPSS酵素を得るために、酵素発現に通常用いられるpET28a(Novagen社)ベクターシステムを製作した。
【００３５】
総3種のOPSS酵素発現ベクター名と、ベクターを製作するために用いたそれぞれの鋳型及びプライマーは、下記表1に示した通りである。鋳型とプライマーを組合わせてPCR技法によりそれぞれのOPSS遺伝子を増幅して得た遺伝子断片とベクターpET28aをNdeIとHindIII制限酵素で処理(37℃、3時間反応)した。その後、通常のライゲーション技法を用いてpET28aベクターにそれぞれの遺伝子断片を挿入した。それぞれの酵素発現ベクター製作有無及び遺伝子配列は、シーケンシング技法でいずれも確認した。前記製作された酵素発現ベクターをDE3遺伝子型を有する大腸菌に導入して総3種のOPSS酵素を獲得できる菌株を製作した。
【００３６】
【表１】
0005860550.tif 000002
【００３７】
酵素を発現するための方法は、pET システムマニュアル(Novagen)を参照した。平板LB培地からそれぞれの菌株の単一コロニーを選別して5mlのLB液体培地に接種し、37℃、200 rpmの条件で16時間培養した。これをさらに新たな25 mlのLB液体培地(250 ml容量のフラスコ)に250 mlを再接種し、OD600が0.5〜0.6になるように(2〜3時間)同一の培養条件で培養し、その直後に1 mMのIPTGを培地に添加して18℃、120 rpmの条件で18時間培養して酵素の発現を誘導した。酵素の精製のための方法は、His-tagを用いてNi-NTA カラムで分離した。精製方法はHis Spin Trap(GE healthcare社)を用いた。
【００３８】
実施例2:OPSS酵素のシステイン合成活性の評価
OPSを基質としたシステインの合成が成されるかを把握するために確保した総3種のOPSS酵素のシステインの合成活性を測定した。システインの合成活性の評価(cysM enzyme assay)の条件及び方法は、文献報告(非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３)に記載された方法を引用した。酵素活性を測定するための条件は、下記表2の通りである。
【００３９】
【表２】
0005860550.tif 000003
【００４０】
酵素を除いた反応液を37℃で5分間培養させた後、精製されたOPSS 50μｇを添加して37℃で反応させ、時間別に酵素反応液100 mlを取り、33.2％のTCA 100 mlと混合して反応を中止させた。酵素反応液内のシステインの濃度はGaitondeの方法でOD560の波長で吸光度を測定して定量した。図1及び下記表3は、3種のOPSSのシステイン合成活性を示し、反応時間別システイン転換率を比較してOPSSのシステイン合成力価を評価した。
【００４１】
【表３】
0005860550.tif 000004
【００４２】
前記結果から、Tva-OPSSの場合、OPSを基質としてシステインを合成する活性を有することが検証され、新規なOPSSであるDac-OPSS及びDal-OPSSのシステイン合成活性を初めて確認した。また、Tva-OPSSに比べ、Dac-OPSS及びDal-OPSSを用いた場合にシステイン転換率が増加し、特に、Dal-OPSSの場合には、顕著にその活性が高いことが確認された。
【００４３】
実施例3:OPSS酵素のpH敏感性
システイン合成過程においてpHがどのような影響を及ぼすかを調べるために、Dal-OPSSのpH別システイン転換率を確認した。100 mMのバッファー条件で50μｇ/mlを用いて37℃で、30分間反応させた。リン酸カリウムバッファー のpH 6.4/7.0/7.4/8.0, Tris-HCl バッファー pH 7.0/7.4/8.0/8.5/8.8, 炭酸ナトリウムバッファー pH 8.0/8.5/9.0/10.0 HEPES バッファー pH 7.4, クエン酸ナトリウムバッファー pH 4.0/5.0/6.0を用いた。生成されたシステインはGaitondeの方法で定量した。図2に示された通り、pH 7.0〜7.4で最も高い活性を示し、最も高い活性を示した条件はTris-HCl(pH 7.0)であり、クエン酸ナトリウム, 炭酸ナトリウムバッファーでは活性がほとんど見られなかった。また、バッファー別に最適pHは異なった。
【００４４】
実施例４:OPS醗酵液を基質としてOPSS酵素を用いたシステイン転換反応
大腸菌W3110菌株にserBが欠損し、変異型serA*が導入されてOPS製造能を有するKCCM11103P(CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC;特許文献２)をMMYE固体培地に塗抹した後、30℃のインキュベーターで一晩培養した。MMYE固体培地で一晩培養した菌株を25 mlの力価培地に1ループずつ接種した後、これを30℃、200 rpmのインキュベーターで48時間培養した。前記方法で製造されたOPS醗酵液を基質としてTva-OPSS、Dac-OPSS及びDal-OPSSのシステイン転換率を確認した。5.4 mMのOPS醗酵液、10 mMのNa2S、0.2 mMのPLP条件で各OPSS濃度を50μｇ/mlの条件で37℃でシステイン転換反応を行った。生成されたシステインはGaitondeの方法で定量した。図3及び表4は37℃で3種のOPSSの時間別システイン転換率を示し、前記転換反応条件で3種のOPSSのうち、Dal-OPSSを用いた時に最も高い転換率を示したことが確認された。
【００４５】
【表４】
0005860550.tif 000005
【００４６】
一方、温度がシステインの合成過程でどのような影響を及ぼすかを調べるために、Dal-OPSSの温度別システイン転換率を確認した。前記条件で温度条件のみをそれぞれ30℃、37℃、50℃、65℃及び80℃に変えてシステイン転換率を測定した。その結果、図4に示された通り、Dal-OPSSを各温度別に30分間反応した時、37℃で活性が最も高いことが確認された。
【００４７】
実施例５:OPSSの補助因子(cofactor)要求性
システイン転換反応において助酵素要求性を確認するために、Dal-OPSSを用いてPLP(pyridoxal-5’-phosphate) 及びDTT(dithiothreitol)の有無によるシステイン転換率を確認した。5.4 mMのOPS醗酵液、10 mMのNa2Sを基質として25 mMのDTT及び/又は0.2 mMのPLPの条件において、37℃で30分間反応させ、生成されたシステインはGaitondeの方法で定量した。その結果を下記表5に示した。
【００４８】
【表５】
0005860550.tif 000006
【００４９】
表5に示された通り、PLP及びDTTが添加されていない対照群に比べ、PLP及びDTTが添加された実験群におけるシステイン転換率が約2.4倍増加した。また、PLP又はDTTがそれぞれ単独で添加された実験群においてもシステイン転換率が増加したことが確認された。即ち、システイン転換時にPLP及びDTTが反応に肯定的に作用したことが確認された。
【図１】
0005860550.tif 000007
【図２】
0005860550.tif 000008
【図３】
0005860550.tif 000009
【図４】
0005860550.tif 000010
【配列表】
0005860550000001.app