(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤ２に結合することができるヒト化抗体またはその断片であって、ネズミ抗体ｍ３Ｆ８可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列のすべて、及びネズミ抗体ｍ３Ｆ８可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列のすべてを有し、
前記抗体は、
（ｉ）配列ＩＤ番号：４の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：５の可変軽鎖ドメイン
（ｉｉ）配列ＩＤ番号：６の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：７の可変軽鎖ドメイン
（ｉｉｉ）配列ＩＤ番号：８の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：５の可変軽鎖ドメイン
（ｉｖ）配列ＩＤ番号：８の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：７の可変軽鎖ドメイン
（ｖ）配列ＩＤ番号：９の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：１０の可変軽鎖ドメイン
（ｖｉ）配列ＩＤ番号：６の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：５の可変軽鎖ドメイン
（ｖｉｉ）配列ＩＤ番号：４の可変重鎖ドメインおよび配列ＩＤ番号：７の可変軽鎖ドメイン
のいずれか１つを有する、
ヒト化抗体またはその断片。
【請求項２】
請求項１記載のヒト化抗体において、前記抗体は末端マンノース、Ｎ−アセチルグルコース、またはグルコースでグリコシル化されているが、フコースではグリコシル化されていないものである、ヒト化抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヒト化抗体において、前記抗体は前記抗体の前記重鎖ドメイン配列において以下のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを有し、前記置換はＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、およびＧ５４Ｉから成るものである、ヒト化抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒト化抗体において、前記抗体は前記抗体の前記軽鎖におけるアミノ酸置換を有し、前記置換はＡ４３Ｓである、ヒト化抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のヒト化抗体において、前記抗体は、前記抗体をコードする核酸を有する組換えベクターによって生産されるものである、ヒト化抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載のヒト化抗体において、前記抗体はグリコシル化されているものである、ヒト化抗体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１つに記載のヒト化抗体において、前記抗体はグリコシル化されていないものである、ヒト化抗体。
【請求項８】
配列ＩＤ番号：４〜１０のいずれか１つに記載のコーディング配列を有する単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子を有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターを有する単離された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の単離された宿主細胞であって、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳類細胞から成る群から選択される宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の抗体またはその断片を生産する方法であって、抗体またはその断片の発現を可能とする条件下で培地において請求項１０記載の宿主細胞を培養する工程、および前記培地から前記抗体またはその断片を分離する工程を有する方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の抗体またはその断片を有する組成物。
【請求項１４】
請求項１３記載の組成物において、前記抗体は細胞傷害性剤にコンジュゲートされたものである、組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒト化抗体またはその断片、または請求項１３または１４記載の組成物を有し、さらに医薬上許容される担体または希釈剤を有する医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒト化３Ｆ８抗体に由来する第一の抗原結合部位と、第二の抗原結合部位とを有する二特異的抗体。
【請求項１７】
請求項１６記載の二特異的抗体において、前記第一の抗原結合部位は軽鎖および重鎖から成るものであり、前記第二の抗原結合部位はｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、またはＦｖから成るものである、二特異的抗体。
【請求項１８】
請求項１６記載の二特異的抗体において、前記第二の抗原結合部位は、Ｔリンパ球ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、神経幹細胞から成る群から選択される免疫学的細胞と会合するものである、二特異的抗体。
【請求項１９】
請求項１６記載の二特異的抗体において、前記第二の抗原結合部位はＣＤ３に対して特異的である、二特異的抗体。
【請求項２０】
請求項１９記載の二特異的抗体において、前記第二の抗原結合部位は配列ＩＤ番号：２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして軽鎖に結合するものである、二特異的抗体。
【請求項２１】
請求項１６記載の二特異的抗体において、前記第二の抗原結合部位はＤＯＴＡ（金属）に対して特異的であり、前記第二の抗原結合部位は配列ＩＤ番号：２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして軽鎖に結合するものである、二特異的抗体。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれか１つに記載の二特異的抗体において、前記抗体はグリコシル化されているものである、二特異的抗体。
【請求項２３】
請求項１６〜２１のいずれか１つに記載の二特異的抗体において、前記抗体はグリコシル化されていないものである、二特異的抗体。
【請求項２４】
請求項１６〜２３のいずれか１つに記載の二特異的抗体の前記第一および／または第二の抗原結合部位をコードする配列を有する単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４記載の核酸配列を有する発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５記載のベクターを有する単離された宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６記載の単離された宿主細胞であって、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳類細胞から成る群から選択される宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１６〜２３のいずれか１つに記載の二特異的抗体を有する医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒト化抗体またはその断片の抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体。
【請求項３０】
請求項２９記載のキメラ抗原受容体において、前記抗原結合ドメインはｓｃＦｖである、キメラ抗原受容体。
【請求項３１】
請求項２９記載のキメラ抗原受容体であって、免疫エフェクター細胞によって発現されるキメラ抗原受容体。
【請求項３２】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒト化抗体またはその断片からのｓｃＦｖを有する、モノクローナル抗体を係合させる二特異的Ｔ細胞。
【請求項３３】
対象における医学的疾患を治療または予防するための薬剤を製造するための、治療上有効量の請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒト化抗体またはその断片の使用であって、前記医学的疾患はＧＤ２発現によって特徴付けられるものである、使用。
【請求項３４】
請求項３３記載の使用において、前記医学的疾患は神経芽細胞腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、または癌腫である、使用。
【請求項３５】
請求項３４記載の使用において、前記医学的疾患は骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、紡錘細胞肉腫、脳腫瘍、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞白血病、および他のＧＤ２陽性腫瘍から成る群から選択されるものである、使用。
【請求項３６】
ＧＤ２発現に関連する疾患を治療または検出するための薬剤を製造するための、請求項２９〜３１のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）療法は、癌についての認められた治療様式であり、５種のＭｏＡｂが結直腸および乳癌、非小細胞肺癌、扁平細胞癌腫、および黒色腫を含めた、成人における固形腫瘍に対してＦＤＡの承認を受けている（Ｂｏｙｉａｄｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８，１１５１−８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １４，１７８−８３）。しかしながら、この様式は、小児科癌の治療のためには、不適切に開発されているままである。化学療法または放射線照射とは異なり、ＭｏＡｂ療法は、一般的には、少ない長期毒性を伴う、骨髄抑制性かつ遺伝毒性ではない。これらは、若い子供にとっては臨界的な考慮である。より重要なことには、ＭｏＡｂは、典型的には、高リスクの神経芽細胞腫（ＮＢ）で見出される、血液、骨髄、および骨における転移性癌に対して効果的である。剤のクラスとして、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体の薬物動態学および毒性は広範囲に研究されてきた。加えて、抗体は、免疫ベースであるか否かにかかわらず、細胞傷害性ペイロード、放射性同位体、トキシン、または酵素を運ぶことができ、それにより、標的化された療法に対する選択肢を増大させる。
【０００２】
神経芽細胞腫（ＮＢ）は子供時代の最も普通の頭蓋外固形腫瘍である。症例の〜５０％においては、治癒的戦略は骨髄（ＢＭ）における柔軟な組織の質量および転移の双方に取り組まなければならない。用量集中的化学療法は腫瘍の切除可能性を改善し、および外科的処置後照射は原発部位における再発の危険性を<１０％まで低下させる（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９，２８２１−８）。しかしながら、ＢＭ病は、組織学またはメタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）スキャンによって証明されるように、しばしば持続し、および致死的な結果を予知する（Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１，２４８６−９１；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４，１５５２−８）。加えて、誘導療法後におけるほとんど完全な緩和の達成にかかわらず、骨延髄再発は共通している。治療強化における試みは急性および長期の副作用双方に遭遇しており、双方は若い患者について重大な関心事である。有望な新しい剤の不足があり、今日、いずれかの標的／経路特異的小分子がＮＢを持つ患者において主な臨床的利益を示したならば少数であるが、多くの有望な先例は継続して蓄積されている。>１８月齢において診断されたステージ４の患者の中の毒性制限における<３０％の治癒率にて、改良の実質的な予知がある（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ９，２４７−５６）。
【０００３】
いくつかの因子は、ＮＢを、ＭｏＡｂ標的化免疫療法によく適したものとする。まず、ＭｏＡｂは、ヒト白血球の存在下においてＮＢの高度に効果的な抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する。第二に、ＭｏＡｂは、減衰加速因子ＣＤ５５（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１，１１２２−８）および相同制限因子ＣＤ５９（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，３０１３−８）を欠如する、ＮＢ細胞の補体媒介細胞傷害性（ＣＭＣ）を誘導する。ＮＢ細胞上への補体沈積は、コロニー刺激因子が与えられれば（Ｍａｃｋａｌｌ，ＣＬ，２０００，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８，１０−８）、用量集中的または骨髄破壊的化学療法＋幹細胞移植の後においてさえ利用可能な、好中球に対するｉＣ３Ｂ受容体の活性化を通じてＡＤＣＣを増強させる（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ，１９９２，Ｂｌｏｏｄ  ７９，１４８４−９０，Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９，４１６６−７３）。第三に、臨床的緩和を達成するための集中的化学療法（ＮＢについての看護の標準）の使用は、患者がネズミ、キメラ、またはヒト化ＭｏＡｂ（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ４８，４３０−４）をあまり拒絶しないようであるように、延長されたリンパ球減少症および免疫抑制（Ｍａｃｋａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ  ９６，７５４−７６２）を引き起こす。
【０００４】
ＧＤ２は、正常な組織においてはかなり制限された発現を持つ神経芽細胞腫および黒色腫を含めた、神経外胚葉性起源の腫瘍について豊富なジシアロガングリオシドである。少なくとも２つの抗体ファミリーが臨床的にテストされている。すなわち、３Ｆ８（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，２６４２−９）および１４．１８（Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９，２８５７−６１）。キメラｃｈ１４．１８は、ネズミＭｏＡｂ  １４．１８の可変領域、およびヒトＩｇＧ１−Ｋの定常領域（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｓ  １２５，１９１−２０２）から成る。それは、イン・ビボでのＮＢおよび黒色腫細胞のＡＤＣＣおよびＣＭＣを示している（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５１，１４４−９；Ｂａｒｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，３６２−７；Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７，５７０２−０５  ０）。相Ｉ研究における臨床的応答の促進に基づき、ｃｈ１４．１８は段階４のＮＢについての地固め療法として大きな相ＩＩ実験でテストされた（Ｇｅｒｍａｎ  ＮＢ９０およびＮＢ９７研究）。診断における>１２月の１６６人の患者では、イベントフリー生存（ＥＦＳ）は、維持化学療法に対する患者と比較した場合にｃｈ１４．１８を受ける患者において同様であるが、総じての生存（ＯＳ）は改善され、およびＢＭ再発の率はｃｈ１４．１８で治療された患者において低下した（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２，３５４９−５７）。２００１年において、子供の腫瘍学グループ（ＣＯＧ）はランダム化された相ＩＩＩ試験を開始して、自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）後の完全な緩和（ＣＲ）における患者でのＮＢ再発を予防するにおけるｃｈ１４．１８とＧＭＣＳＦおよびＩＬ−２の組合せの効力を実験し（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖＮＣＴ０００２６３１２）（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：８５−９１，２００９）、ここに、２年における進行フリー生存（ＰＦＳ）およびＯＳの有意な改良が見出された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：１３２４−１３３４，２０１０）。ＧＤ２に対して特異的なネズミＩｇＧ３  ＭｏＡｂである３Ｆ８は細胞の死滅を誘導し、イン・ビトロにてＮＢに対する有効なＡＤＣＣおよびＣＭＣを媒介する（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，上掲）。用量集中誘導＋攻撃的サルベージ計画にかかわらず化学療法抵抗性骨髄病を持つ患者の中で、８０％は、５日抗体＋ＧＭ−ＣＳＦ療法の１〜２サイクル後に通常ＢＭ緩和を達成した（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５，５２６ｓ）。化学療法抵抗性骨髄病に対するｍ３Ｆ８の活性を考えれば、ｍ３Ｆ８の使用は、促進の結果を伴ってそれらの最初の緩和においてｍ３Ｆ８の使用を患者に拡大した。子供におけるこれらの好都合な臨床的結果は、ｍ３Ｆ８が最高の再発危険性の最初の３〜５年にわたっての維持療法として与えられるならば、���良をすることができよう。しかしながら、ヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）が、化学療法が終了したときに免疫系が回復される場合の制限された因子である。ＨＡＭＡを低下させる１つの戦略は、３Ｆ８をキメラ化し、またはヒト化することである。
【０００５】
従って、ｍ３Ｆ８よりも優れた高い親和性でもってＧＤ２に結合することができ、かつ抗体依存性細胞の細胞傷害性を媒介することができ、それにより、病気の再発を低下させるための長期抗体療法を可能とすることができるキメラおよび／またはヒト化３Ｆ８抗体に対する要望が存在する。
【０００６】
キメラ３Ｆ８（ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１）およびヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４）の工学および単離をここに記載する。これらの抗体は、標準的な組換え方法を用いて作成され、無血清培地中でのＣＨＯ−ＤＣ４４細胞系による高い発現について選択された。（ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＭＡＧＥ１．５とも呼ばれる）ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎの特殊な糖型は、ＣＨＯ−Ｍａｇｅ１．５細胞系を用いて生産された。この特殊な糖型はフコースを有さず、末端マンノースおよびＮ−アセチルグルコースまたはグルコースのみを有する。Ｂｉａｃｏｒｅ系、キメラ３Ｆ８、およびヒト化３Ｆ８によって用いられた表面プラズモン共鳴を用いての測定は、ｍ３Ｆ８のそれと同様なＫＤを維持した。他の抗ＧＤ２抗体とは対照的に、ｍ３Ｆ８、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎは、イン・ビトロにてより遅い洗浄除去に移される、実質的により低いｋｏｆｆを有した。ｍ３Ｆ８と同様に、キメラおよびヒト化３Ｆ８はイン・ビトロにて細胞成長を阻害し、他の抗ＧＤ２抗体については典型的でない。同様な測定は、キメラおよびヒト化ＩｇＧ１抗体は、１４．Ｇ２ａと比較してより好都合なＫＤを有する。ｃｄ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎの血液単核細胞（ＰＢＭＣ）−ＡＤＣＣおよび好中球（ＰＭＮ）−ＡＤＣＣの双方はｍ３Ｆ８のそれよりも優れており（１０〜>１０００倍）、他方、ＣＭＣは劣っている。この優秀性は、ドナーにかかわらず、またはヒトＣＤ１６またはＣＤ３２でトランスフェクトされたＮＫ９２をキラーとして用いれば、ＡＤＣＣアッセイにおいて一貫して観察された。ＣＤ１６媒介ＡＤＣＣでは、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１と比較して１０〜４０倍良好であった。ＰＢＭＣ−ＡＤＣＣおよびＣＭＣ活性は、ｍ３Ｆ８と比較した場合にｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４で多いに低下した。他のガングリオシドとの交差反応性はｍ３Ｆ８のそれと同様であった。生体内分布において１３１Ｉ標識抗体を用いて、ｈｕ３Ｆ８形態は、ｍ３Ｆ８のそれに匹敵する正常な組織比率に対して腫瘍を有した。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１は、ｍ３Ｆ８と比較した場合に、ＮＢ異種移植に対する優れた抗腫瘍効果を示した。
【０００７】
また、応力方法を用いる計算分析と組み合わせたｍ３Ｆ８の実験的に誘導された結晶構造を用い、増強された安定性のプロフィールを有するように設計された新規なｈｕ３Ｆ８抗体であるｈｕ３Ｆ８Ｈ３Ｌ３も本明細書中に記載される。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２００４／０２５９７７１号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２００３／０１４７８８１号明細書
（特許文献３）  米国特許出願公開第２００４／０２２００８４号明細書
（特許文献４）  国際公開第２０１０／０１７５９８号
（特許文献５）  米国特許出願公開第２００５／０００２９３０号明細書
（特許文献６）  米国特許出願公開第２００５／０１０１７７０号明細書
（特許文献７）  国際公開第９２／１８６２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト化戦略は、ネズミ配列に特徴的なアミノ酸残基の、ヒト抗体の対応する部分で見出された残基での置き換えは、ヒトにおける得られた抗体のヒトでの免疫原性を低下させるであろうとの前提を共有する。しかしながら、種間の配列の置き換えは、通常、その抗原に結合する抗体の低下、および親和性の喪失をもたらす。ヒト化の技術は、従って、元来のネズミ配列の置き換えをバランスさせて、ヒト化分子に対する要望を伴う免疫原性を低下させて、十分な抗原結合を治療的に有用に保つことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ｍ３Ｆ８に由来する少なくとも１つのＣＤＲ配列を有する、作成されかつ単離されたキメラおよびヒト化３Ｆ８抗体、ならびに抗体組成物、該抗体の糖型、増強された安定性を持つ抗体、Ｆｃ受容体への増強された結合を持つ抗体、ＧＤ２に対する増強された親和性を持つ抗体、第二の区別される結合部位または二特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）を発現するように作成された二特異的抗体、または二特異的についてのモジュールのＩｇＧ構築における本発明の抗体のいずれかのＦｖ断片の使用、二特異的Ｔ細胞係合（ＢｉＴＥ）抗体、三特異的またはマルチ特異的抗体を提供する。これらの抗体およびコーディングまたは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、トランスジェニック動物、それに関連するトランスジェニック植物、および当該分野で知られているものと組み合わせた、本明細書中に記載されかつ実施可能とされた、その製造および使用方法は本発明の一部である。当該発明のｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１抗体は、ｍ３Ｆ８よりも低いが、無傷補体媒介細胞傷害性（ＣＭＣ）を持つ、（１４Ｇ．２ａ、ｃｈ１４．１８またはＭＥ３６１を含めた）ｍ３Ｆ８またはいずれかの他の公知の抗ＧＤ２抗体よりも有意により大きなＰＭＮ−ＡＤＣＣおよびＰＢＭＣ−ＡＤＣＣ活性を有する。この優秀性は、ドナーにかかわらず、またはヒトＣＤ１６またはＣＤ３２でトランスフェクトされたＮＫ９２をキラーとして用いれば、ＡＤＣＣアッセイで一貫して観察された。これは重要である。というのは、ＡＤＣＣは、一般に、患者においてＭｏＡｂの抗腫瘍効果についての証明されたメカニズムだからである。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１の糖型であるｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎ双方は、ｍ３Ｆ８と比較した場合に、神経芽細胞腫  ＮＢ）異種移植に対する優れた抗腫瘍効果を示した。抗体のＩｇＧ４形態は低下したエフェクター機能を示し、および抗ＧＤ２抗体療法の疼痛副作用をブロックするのに効果的である。重鎖において三重突然変異を持つＨｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ（またはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を示した。３Ｆ８：ＧＤ２相互作用の分析の結果、ＧＤ２に対して増大した親和性を付与すると熱力学的に計算されるｈｕＨ１Ｔ−ガンマ−１およびｈｕＨ３Ｉ−ガンマ−１重鎖を生産する重鎖において突然変異を持つ３Ｆ８抗体が設計される。
【００１０】
本発明は、本明細書中に記載されたように、少なくとも１つの単離され作成されたキメラｃｈ３Ｆ８、またはヒト化ｈｕ３Ｆ８抗体を提供する。本発明に従った抗体は、本発明の抗体に取り込むことができる、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域またはそのいずれかの部分と組み合わせた、ｍ３Ｆ８に由来する、重鎖または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそのリガンド結合部分を含むいずれかの蛋白質またはペプチド分子を含む。１つの実施形態において、当該発明は、本明細書中に記載された軽鎖および重鎖を含むｈｕ３Ｆ８抗体に向けられ、該鎖の各々は、ＧＤ２に対する特異性を有するｍ３Ｆ８に由来するヒト定常領域の少なくとも一部および可変領域の少なくとも一部を含み、該抗体は、少数の名称を挙げれば、高い親和性でもってＧＤ２に結合し、および所望の効果、例えば、イン・ビトロでの細胞成長の阻害、抗ＧＤ２抗体療法による疼痛副作用をブロックすることを媒介する。また、本発明は、重鎖定常、連結、多様性または可変領域、または軽鎖定常、連結または可変領域のような、抗体鎖の１もしくはそれ以上の部分のごとき、そのような抗体の断片または誘導体を含む。該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡのようないずれかのクラス、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ４のようないずれかのサブクラス、および当該分野で公知の他のサブクラスのものとすることができる。本発明で有用な抗体は、これに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一鎖抗体、ジスルフィド連結またはジスルフィド安定化Ｆｖ（ｓｄＦｖまたはｄｓＦｖ）を含めた、本発明の抗体の抗原結合抗体断片を含む。また、本発明は、ＶＬまたはＶＨドメインいずれかを含む単一ドメイン抗体も含む。さらに、該抗体は、ファージ提示のようないずれかの方法によって生産することができ、または細菌、昆虫、酵母（真菌）、哺乳動物、またはヒト化抗体のような所望の特徴を持つ抗体を生産する他のタイプの細胞または細胞系を含めた、いずれかの生物、卵、または細胞系において生産することができる。該抗体は、Ｆａｂ部分、および異なる種からのＦｃ領域を組み合わせることによって、または相補性決定領域を保持し、かつもう１つの種のそれに対するフレームワーク領域を修飾することによって形成することもできる。
【００１１】
該抗体は、ｍ３Ｆ８またはｈｕ３Ｆ８（そのような用語は本明細書中に定義されている）に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、重鎖または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）の少なくとも１つの特定の部分、および／または少なくとも１つの定常または可変フレームワーク領域、またはそのいずれかの部分を含むことができる。該抗体のアミノ酸配列は、さらに、本明細書中に記載されているように、または当該分野で知られているように、少なくとも１つの特定の置換、挿入または欠失を含んでもよい。
【００１２】
本発明の好ましい抗体はｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８ＩｇＧ１ｎ、Ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ、ｈｕ３Ｆ８Ｈ１Ｌ１Ｓ（増強されたｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１軽鎖界面）、ｈｕ３Ｆ８Ｈ３Ｌ３（増強されたｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１重鎖および軽鎖安定性）、ｈｕ３Ｆ８Ｈ３Ｌ３Ｓ（増強された界面および安定性）、ｈｕ３Ｆ８Ｈ１−Ｉ−ガンマ−１（増強されたｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１親和性）、ｈｕ３Ｆ８Ｈ３−Ｉ−ガンマ−１（増強されたｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１安定性および親和性）、ならびにその断片および領域を含む。
【００１３】
１つの実施態様において、本発明は、ＧＤ２に対する結合特異性を有するキメラモノクローナル抗体に関し、ここに、抗体ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１は重鎖ドメイン配列番号：１、および軽鎖可変ドメイン配列番号：２を含む。もう１つの実施形態において、抗体ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４は配列番号：３の重鎖可変ドメインおよび配列番号：２の軽鎖ドメインを含む。そのようなキメラ抗体はネズミ３Ｆ８抗体に由来し、ある実施形態においては、キメラ抗体は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３は配列番号：１の、各々、アミノ酸残基３１〜３５、５０〜６４、および９８〜１０８によって定義される。ある実施形態においては、キメラ抗体は、そのＣＤＲ１、２、および３が、配列番号：２の、各々、アミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６、および８９〜９５によって定義される軽鎖を含む。ある実施形態において、キメラ抗体は、そのフレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３、および４が、配列番号：１の、各々、アミノ酸残基１〜３０、３６〜４９、６５〜９７、および１０９〜１２０によって定義される重鎖を含む。ある実施形態において、キメラ抗体は、そのフレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３、および４は、配列番号：２の、各々、アミノ酸残基１〜２３、３５〜４９、５７〜８８、および９６〜１０８によって定義される軽鎖を含む。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、ＧＤ２に対する結合特異性を有するヒト化モノクローナル抗体に関し、ここに、抗体ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１は配列番号：４の重鎖可変ドメイン、および配列番号：５の軽鎖可変ドメインを含み、ここに、ｈｕ３Ｆ８Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１は重鎖可変ドメイン配列番号：６、および軽鎖可変ドメイン配列番号：７を含み、ここに、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４は重鎖可変ドメイン配列番号：８および軽鎖可変ドメイン配列番号：５または７を含む。そのようなヒト化抗体はネズミ３Ｆ８抗体のヒト化に由来する。ある実施形態において、ヒト化抗体は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３が配列番号：４、６、または８の、各々、アミノ酸残基３１〜３５、５０〜６４、および９８〜１０８によって定義される重鎖を含む。ある実施形態において、ヒト化抗体は、そのＣＤＲ１、２、および３が配列番号：５または７の、各々、アミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６、および８９〜９５によって定義される軽鎖を含む。
【００１５】
また、本発明は、増大されたエフェクター機能を持つ、修飾された炭水化物組成物を持つ抗ＧＤ２ヒト化抗体、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎにも関する。
【００１６】
また、本発明は、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１またはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎの重鎖において三重突然変異ＤＥＬ（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）を持つＨｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ抗体にも関する。Ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬは、配列番号：４、６、または８のＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅから成る重鎖における置換を含む。
【００１７】
また、本発明は、結晶構造の計算分析、および抗体の安定性を増強させるための復帰突然変異および正突然変異によるアミノ酸配列の調整に由来するｈｕ３Ｆ８Ｈ３Ｌ３にも関する。安定性が増強されたｈｕＨ３重鎖の配列は、配列番号：１０中のｈｕＬ３軽鎖を持つ、配列番号：９に開示されている。これらの突然変異は、単独の、または他の突然変異と組み合わせた重鎖配列に導入することもできる。重鎖は本明細書中に記載されている。
【００１８】
ＶＨ−ＶＬ界面における安定性を増強させるためのさらなる突然変異は、軽鎖における位置４３において加えられ、その結果、ｈｕＬ３Ｓが得られる。従って、ｈｕＬ３Ｓは、配列番号：１０のＡｌａ４３Ｓｅｒから成る置換を含む。位置４３におけるセリンへのこの変化がｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１の軽鎖に取り込まれた場合、その軽鎖をｈｕＬ１Ｓという。同様に、ｈｕＬ１Ｓは、配列番号：５または７のＡｌａ４３Ｓｅｒよりなる置換を含む。
【００１９】
計算モデリングは、さらに、位置５４におけるＧｌｙの、重鎖のＣＤＲ３におけるＩｌｅへの置換は、結合ポケットの形状を変化させ、およびＧＤ２リガンドとの接触を増加させることを示した。この突然変異Ｇｌｙ５４ＩｌｅのｈｕＨ１−ＩｇＧ１およびｈｕＨ３−ＩｇＧ１の配列のＣＤＲ領域へのこの突然変異Ｇｌｙ５４Ｉｌｅを加える結果、各々、ｈｕＨ１Ｉ−ガンマ１およびｈｕＨ３Ｉ−ガンマがもたらされた。従って、ｈｕＨＩ−ガンマ１は配列番号：４、６、または８においてＧｌｙ５４Ｉｌｅ置換を含む。ｈｕＨ３Ｉ−ガンマ１は配列番号：９におけるＧｌｙ５４Ｉｌｅ置換を含む。
【００２０】
本発明の好ましい抗体は、ヒトＧＤ２に結合し、所望の機能、すなわち、エフェクター機能、疼痛のブロック、または細胞成長の阻害を行うものである。競合阻害によるモノクローナル抗体の特異性および親和性を決定するための好ましい方法は、この参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）に見出すことができる。本発明の少なくとも１つの抗体は、ヒトＧＤ２に対して特異的な少なくとも１つの特定のエピトープ、そのサブユニット、断片、部分、またはいずれかの組合せに結合する。エピトープは少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、そのエピトープは好ましくは、少なくとも１〜５の糖残基、またはＧＤ２の少なくとも１つの部分のセラミドから成る。
【００２１】
１つの態様において、本発明は、ｍ３Ｆ８からの少なくとも１つの可変領域、およびそれをコードする核酸配列を含む、少なくとも１つの単離されたヒト化抗ＧＤ２抗体を提供する。
【００２２】
もう１つの態様において、本発明は、（ｉ）ｍ３Ｆ８に由来する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て、およびそれをコードする核酸配列；または（ｉｉ）ｍ３Ｆ８からの軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、およびそれらをコードする核酸配列いずれかを有する、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＧＤ２抗体を提供する。
【００２３】
もう１つの態様において、本発明は、ｍ３Ｆ８に由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを有する、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＧＤ２抗体、およびそれらをコードする核酸配列を提供する。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのｍ３Ｆ８  ＣＤＲを有する、少なくとも１つの単離されたキメラ、ヒト化またはＣＤＲグラフト化抗ＧＤ２抗体を提供し、ここに、該抗体は、少なくとも１〜５の糖残基を含む少なくとも１つのエピトープまたはヒトＧＤ２のエピトープのセラミドに特異的に結合する。
【００２５】
なおもう１つの態様において、本発明は、本発明の３Ｆ８  ＭｏＡｂのいずれかまたはその断片を含む抗体成分、または本発明の３Ｆ８抗体のいずれかまたはその断片を有する抗体融合蛋白質またはその断片を有する診断／検出または治療免疫コンジュゲートを提供し、ここに、該抗体成分は少なくとも１つの診断／検出剤または少なくとも１つの治療剤に結合する。
【００２６】
なおもう１つの態様において、本発明は、放射性核種、ホウ素、ガドリニウムまたはウラン原子、サイトカイン、幹細胞成長因子のような免疫モジュレーター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）のような造血系因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、−ベータまたは−ガンマのようなインターフェロン（ＩＦＮ）、および幹細胞成長因子、造血因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、抗体、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性治療剤、抗有糸分裂剤、アルキル化、抗代謝産物、血管形成−阻害、アポトーシス、アルカロイド、ＣＯＸ−２阻害および抗生物質剤のような細胞傷害性薬物、植物、微生物、および動物トキシンのような細胞傷害性トキシン、およびその合成変種、血管形成阻害剤、異なる抗体、およびその組合せから成る群から選択される治療剤を含む治療免疫コンジュゲートを提供する。
【００２７】
もう１つの態様において、本発明は、３Ｆ８抗体によって認識される抗原に向けられた親和性を有する１もしくはそれ以上の抗原結合部位、およびＧＤ２以外にエピトープまたはハプテンに向けられた親和性を有する１もしくはそれ以上のハプテン結合部位を有する多価、マルチ特異的抗体またはその断片も提供する。好ましくは、３Ｆ８抗体またはその断片はキメラ化され、またはヒト化される。また、好ましくは、該抗体またはその断片は十分にヒト型であり、またはキメラ化されている。１つの実施形態において、多価、マルチ特異的抗体またはその断片は診断／検出または治療剤を含む。
【００２８】
なおもう１つの態様において、本発明は、（ｉ）対象に、本発明の多価、マルチ特異的抗体またはその断片を投与し；（ｉｉ）対象の血流を除去するのに非結合蛋白質の量についての十分な時間の量を待ち；および（ｉｉｉ）該対象に、該抗体の結合部位に結合する、診断／検出剤、治療剤、またはその組合せを投与することを含む、診断／検出剤、治療剤、またはその組合せを標的に送達する方法を提供する。該診断／検出剤または該治療剤は、同位体、色素、クロマゲン、コントラスト剤、薬物、トキシン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、またはＤＮＡから成る群から選択される。第二の特異性は、記載された剤の群からのいずれかにコンジュゲートされたハプテンも含む。これらのハプテンは、これに限定されるものではないが、ビオチンおよびその誘導体、ＤＯＴＡおよびその誘導体、ＤＴＰＡおよびその誘導体、フルオレセインおよびその誘導体、ヒスタミンおよびその誘導体、デフェロキサミンおよびその誘導体を含む）。
【００２９】
本発明の方法のいずれにおいても、対象は、好ましくは、ヒトまたは家庭用ペットのような哺乳動物である。
【００３０】
本発明のもう１つの実施形態は：（Ａ）対象に、病気となった組織関連マーカーに特異的に結合する少なくとも１つのアーム、および標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有する二特異的抗体または抗体断片を投与し、ここに、該病気となった組織関連マーカーは３Ｆ８  ＭｏＡｂによって認識される抗原であり；（Ｂ）選択的に、該対象に除去組成物を投与し、該組成物が非局所化抗体または抗体断片を循環から除去するのを可能とし；次いで、（Ｃ）該対象に、該二特異的抗体または抗体断片の該少なくとも１つの他のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含む、または担持する担体部分、および１もしくはそれ以上のコンジュゲートされた治療または診断剤を含む第一の標的化可能コンジュゲートを投与することを含む、該対象において病気となった組織を治療し、または同定する方法である。好ましくは、標的化組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームは、ヒト、キメラまたはヒト化抗ＧＤ２抗体、またはヒト、キメラまたはヒト化抗ＧＤ２抗体の断片である。好ましい実施形態は、本明細書中で記載されたように、キメラ、ヒト化またはヒト抗体としてのそのような適用における３Ｆ８  ＭｏＡｂの使用である。
【００３１】
なおもう１つの態様において、本発明は：（Ａ）標的化された組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームおよび標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを含む有効量の二特異的抗体または抗体断片を投与し、ここに、標的化された組織に特異的に結合する該１つのアームは３Ｆ８抗体またはその断片であり；次いで（Ｂ）標的化可能なコンジュゲートを投与することを含む、哺乳動物において３Ｆ８  ＭｏＡｂによって認識される抗原を発現する腫瘍を検出し、または治療する方法を提供する。該標的化可能なコンジュゲートは（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｉｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２；（ｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２；（ｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ２；（ｘｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｘｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｘｉｉｉ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２；（ｘｉｖ）Ｔｓｃｇ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｘｖ）（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｄ−Ｇ―ｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｘｖｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｃｙｓ−ＮＨ２；（ｘｖｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２；（ｘｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；（ｘｉｘ）Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；フルオレセインおよびその誘導体；デスフェリオキサミン、およびその誘導体から成る群から選択することができる。
【００３２】
もう１つの態様において、本発明は：（Ａ）そのような手法を受けることとなっている対象に二特異的抗体Ｆ（ａｂ）２またはＦ（ａｂ’）２断片、または単一鎖Ｆｖ断片を注射し、ここに、該二特異的抗体または断片は、３Ｆ８  ＭｏＡｂによって認識される抗原に特異的に結合する第一の抗原結合部位を有し、およびハプテンに特異的に結合する第二の抗体結合部位を有し、次いで、抗体断片が標的部位において融合するのを可能とし；（Ｂ）二特異的断片が注射から約２４時間以内に循環からかなり除去されているのでなければ、選択的に、除去剤を用いて非標的化抗体断片を除去し、次いで、非標的化抗体または断片を分解のために素早く肝臓に除去する、ハプテン修飾デキストラン、またはデンドリマー、またはポリマーに注射し、（Ｃ）最初の注射から数時間以内に、スキャナーまたはプローブを用いて標的部位における融合した標識の上昇したレベルの核イメージングまたは近い範囲の検出によってハプテンの存在を検出し、次いで、該手法を行うことを含み、ここに、該検出はコントラスト剤または減剤の使用無くして行われることを特徴とする、標的化方法を提供する。好ましい実施形態において、ハプテンは診断／検出放射性同位体、ＭＲＩイメージ増強剤、蛍光標識、またはケミルミネセント標識で標識される。蛍光標識はローダミン、フルオレセイン、レノグラフィン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンを含むことができる。ケミルミネセント標識はルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびオキサレートエステルを含むことができる。ＭＲＩイメージ増強剤はガドリニウムおよび強磁性物質を含む。抗体ハプテン局所化のイメージングは、腫瘍ステージング、処置に対する腫瘍応答の測定、早い再発および腫瘍監督の検出にとって臨界的である、ＧＤ２を運ぶ無傷腫瘍細胞を検出する。抗体ハプテン局所化の手術中の検出は腫瘍の正確な位置を与え、および病気の肉眼で見えない部位を暴露して、癌に対する治癒的療法の一部としての完全な外科的摘出を可能とする。
【００３３】
また、本発明で考えられるのは、３Ｆ８抗体によって認識される抗原に向けられた親和性を有する１もしくはそれ以上の抗原結合部位、および細胞上のエピトープまたはハプテン（リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、骨髄細胞、幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、白血病細胞、細胞傷害性リンパ球、およびＢリンパ球）に向けての親和性を有する１もしくはそれ以上のハプテン結合部位を含む多価、マルチ特異的抗体またはその断片である。これらの二特異的抗体または断片は、静脈内、髄腔内、および腫瘍内を含めた種々の経路を介して、ヒトを含めた哺乳動物に投与して、内因性細胞または外因的に注入された細胞を、抗原ＧＤ２を運ぶ部位または組織または細胞に標的化することができる。別法として、細胞は、ヒトを含めた哺乳動物への投与の前に、二特異的抗体断片を用いてエクス・ビボにてアーム化することができる。
【００３４】
また、本発明で考えられるのは、遺伝学的方法を用いてＧＤ２に特異的なキメラ表面受容体を作り出して、診断および治療的適用の双方のために、細胞（リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、骨髄細胞、幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、白血病細胞、細胞傷害性リンパ球、およびＢリンパ球）をＧＤ２を担持する組織、器官、または腫瘍に再度向ける、３Ｆ８またはその断片の配列の使用である。
【００３５】
本発明は、１つの態様において、少なくとも１つの特異的な配列、ドメイン、部分またはその変種を含む、前記した特異的抗ＧＤ２抗体をコードするポリヌクレオチドに相補的な、またはそれにハイブリダイズさせることを含む単離された核酸分子を提供する。より特別な態様において、本発明は、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を提供し、ここに、（ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１とも略される）Ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１軽鎖は配列番号：１１によってコードされ、およびＨｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１重鎖は配列番号：１２によってコードされ、ここに、Ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４軽鎖は配列番号：１３によってコードされ、およびＨｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４重鎖は配列番号：１４によってコードされ、ここに、Ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１軽鎖Ｌ２は配列番号：１５によってコードされ、およびＨｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１重鎖Ｈ２は配列番号：１６によってコードされる。ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖は、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖と相互交換可能であり、抗ＧＤ２抗体ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１およびｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１を形成する。さらなるヌクレオチド配列が本明細書中で提供され、ここに、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１軽鎖は配列番号：１７によってコードされ、およびｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１重鎖は配列番号：１８によってコードされ、ここに、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４軽鎖は配列番号：１９によってコードされ、およびｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４重鎖は配列番号：２０によってコードされ、およびここに、ｈｕ３Ｆ８Ｈ３Ｌ３−ＩｇＧ１軽鎖Ｌ３は配列番号：２１によってコードされ、および重鎖Ｈ３は配列番号：２２によってコードされる。
【００３６】
本発明は、さらに、該抗ＧＤ２抗体核酸分子、そのような核酸を含有する宿主細胞および／または組換えベクター、ならびにそのような抗体核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を製造し、および／または使用する方法も提供する。かくして、当該発明は、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＧＤ２抗体またはその断片をコードする単離された核酸を含み；単離された核酸ベクターは該単離された核酸を含み、および／または原核生物または真核生物宿主細胞は該単離された核酸を含む。宿主細胞は、選択的に、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＤＧ４４、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、またはリンパ腫細胞、またはそのいずれかの誘導体、不死化または形質転換細胞から選択される少なくとも１つであり得る。また、抗体が検出可能なまたは回収可能な量で発現されるように、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはイン・サイチュでの条件下で抗体をコードする核酸を翻訳することを含む、代謝経路の制御下で成長および生存選択を用いて蛋白質発現が増幅されるのを可能とするベクター、またはこれに限定されるものではないが、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクダーゼ）またはＧＳ（グルタミンシンターゼ）を含む酵素を用いる方法を含む。
【００３７】
また、本発明は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体が検出可能な、および／または回収可能な量で発現される条件下で、本明細書中に記載された宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞において少なくとも１つの前記した抗ＧＤ２抗体を発現するための少なくとも１つの方法を提供する。
【００３８】
本発明は、（ａ）単離された抗ＧＤ２抗体をコードする核酸、および／または本明細書中に記載された抗体で；および（ｂ）適当な担体または希釈剤を含む少なくとも１つの組成物も提供する。該担体または希釈剤は、選択的に、公知の担体または希釈剤に従って、医薬上許容できるものであってよい。該組成物は、選択的に、さらに、少なくとも１つのさらなる化合物、蛋白質、または組成物を含むことができる。これらの組成物のいくつかにおいて、キメラまたはヒト化抗体は、細胞傷害性薬物、トキシン、または放射性核種のような、細胞傷害性剤（すなわち、細胞の活力および／または機能を損なう剤）にコンジュゲートされている。
【００３９】
本発明は、さらに、当該分野で公知の、および／または本明細書中に記載されたように、細胞、組織、器官、動物、または患者において、および／または関連条件に先立って、それに引き続いて、またはその間に、少なくとも１つのＧＤ２関連疾患を変調しまたは治療するのに治療上有効量を投与するための、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体方法または組成物を提供する。かくして、本発明は、本発明の少なくとも１つの単離された抗ＧＤ２抗体またはその断片の有効量を含む組成物を、該細胞、組織、器官、または動物と接触させて、またはそれらを投与することを含む、細胞、組織、器官、または動物においてＧＤ２関連疾患を診断しまたは治療する方法を提供する。該方法は、選択的に、さらに、該細胞、組織、器官、または動物に対して本発明の抗ＧＤ２抗体の０．００１〜５０ｍｇ／キログラムの有効量を用いることを含んでもよい。該方法は、選択的に、さらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、キャビティ内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、髄腔内、オマヤ内、硝子体内、眼内、関節滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内、または経皮から選択される少なくとも１つの態様による接触または投与を含んでもよい。該方法は、選択的に、さらに、抗体の接触または投与に先立って、それと同時に、またはその後に、検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻薬、−ステロイド抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉ブロッカー、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、抗体または抗体由来コンジュゲート、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代替薬物、放射性医薬、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激剤、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入されたステロイド、エピネフリンまたはそのアナログ、細胞傷害性または他の抗ガン剤、メトトレキセートのような抗代謝産物剤、抗増殖剤、サイトカイン、インターロイキン、成長因子、サイトカインアンタゴニスト、および抗ＴＮＦα、白血球細胞、Ｔ細胞、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ細胞）、単球、ＮＫＴ細胞、作成されたＴ細胞またはＮＫ細胞または単球または顆粒球から選択される少なくとも１つの化合物または蛋白質または細胞の有効量を含む少なくとも１つの組成物を投与することを含む。
【００４０】
本発明は、さらに、当該分野で公知のようにおよび／または本明細書中で記載されたように、細胞、組織、器官、動物、および患者においておよび／または関連疾患に先立って、それに引き続いて、またはその間に、少なくとも１つのＧＤ２関連疾患を診断するための少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を提供する。
【００４１】
また、本発明は、本発明に従った、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体疾患の診断のための少なくとも１つの組成物、デバイスおよび／または該診断のための送達の方法も提供する。
【００４２】
また、少なくとも１つの単離されたヒト化抗ＧＤ２抗体または少なくとも１つの医薬上許容される担体または希釈剤を含む組成物が提供される。該組成物は、選択的に、さらに、検出可能な標識またはレポーター、細胞傷害性または他の抗ガン剤、メトトレキセートのような抗代謝産物剤、抗増殖剤、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻薬、非ステロイド抗炎症薬物（ＮＴＨＥ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉ブロッカー、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代替薬物、放射性医薬；抗鬱剤、抗精神病剤、刺激剤、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入されたステロイド、エピネフリンまたはアナログの少なくとも１つから選択された少なくとも１つの化合物または蛋白質の有効量を含んでもよい。
【００４３】
また、当該発明の少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＧＤ２抗体を含む医療機器が提供され、ここに、該機器は非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、キャビティ内、腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、オマヤ内、硝子体内、眼内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内、または経皮から選択された少なくとも１つの態様によって少なくとも１つの抗−ＧＤ２抗体を接触させ、または投与するのに適している。
【００４４】
さらなる態様において、当該開示は、第一の容器中の凍結乾燥された形態の当該開示の少なくとも１つのキメラまたはヒト化抗ＧＤ２抗体または断片、および水性希釈剤中の、滅菌水、滅菌緩衝化水、またはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル第二水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、マンニトール、スクロース、マンノース、他の糖、ｔｗｅｅｎ８０、またはその混合物から成る群から選択される少なくとも１つの保存剤の選択的な第二の容器を含むキットを提供する。１つの態様において、該キットでは、第一の容器中の抗ＧＤ２抗体または特定の部分または変種の濃度は、第二の容器の内容物で、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度まで復元される。もう１つの態様において、第二の容器は、さらに、等張剤を含む。もう１つの態様において、第二の容器は、さらに、生理学的に許容される緩衝液を含む。１つの態様において、該開示は、それを必要とする患者に、キット中で提供され、かつ投与に先立って復元される製剤を投与することを含む、少なくとも１つのＧＤ２で特徴付けられる疾患を治療する方法を提供する。
【００４５】
また、包装材料、および本発明の少なくとも１つの単離されたキメラまたはヒト化抗ＧＤ２抗体の溶液または凍結乾燥された形態を含む容器を含む、ヒト医薬または診断的使用のための製品も提供される。該製品は、選択的に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、キャビティ内、腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、オヤマ内、硝子体内、眼内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内、または経皮送達機器またはシステムの成分としての容器を有することを含むこともできる。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の記載において、組換えＤＮＡおよび免疫学で用いる多数の用語が広範に利用される。そのような用語が与えられる範囲を含めた、明細書および特許請求の範囲のより明瞭かつ一貫性のある理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００４７】
用語「抗体」は当該分野で認められた用語法であり、公知の抗原に結合する分子または分子の活性な断片を含める意図である。公知の抗原に結合する分子の活性な断片の例はＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を含む。これらの活性な断片は、多数の技術によって本発明の抗体から導くことができる。例えば、精製されたモノクローナル抗体は、ペプシンのような酵素で切断でき、およびＨＰＬＣゲル濾過に付すことができる。次いで、Ｆａｂ断片を含有する適切な画分を収集し、および膜濾過等によって濃縮することができる。抗体の活性な断片の単離のための一般的な技術のさらなる記載については、例えば、Ｋｈａｗ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３：１０１１−１０１９（１９８２）を参照されたし。用語「抗体」は二特異的およびキメラ抗体も含む。
【００４８】
本明細書中に記載された抗体とは、全長（すなわち、天然に生じる、または通常の免疫グロブリン遺伝子断片のレコンビナトーリアルプロセスによって形成された）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）または抗体断片のような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分をいう。
【００４９】
抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆ（ａｂ）．ｓｕｂ．２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等のような抗体の部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷抗体によって認識される同一の抗原と結合する。例えば、３Ｆ８モノクローナル抗体断片は、３Ｆ８によって認識されたエピトープに結合する。用語「抗体断片」は、特異的抗原に結合して、複合体を形成することによって、抗体のように作用するいずれの合成または遺伝子工学により作成された蛋白質も含む。例えば、抗体断片は、重鎖または軽鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」断片のような、可変領域から成る単離された断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え単一鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖ蛋白質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位を含む。
【００５０】
文言「モノクローナル抗体」は当該分野で認識された用語法である。モノクローナル抗体は、同一である一特異的抗体である。なぜならば、それらは、全てがユニークな親細胞クローンである免疫細胞の１つのタイプによって作成されるからである。
【００５１】
種々の方法が、モノクローナル抗体の生産のために当該分野で存在する。例えば、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたもののような組換えＤＮＡ方法によって作成されてもよい。この関係で、用語「モノクローナル抗体」とは、単一の真核生物、ファージ、または原核生物クローンに由来する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト、ヒト化、または他の源からのそのような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離し、および配列決定することができる。一旦単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクターに入れてよく、次いで、これは、そうでなければ免疫グロブリン蛋白質を生産しないＮＳ０細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、海藻細胞、卵、または骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質転換されて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡは、例えば、均一ヒト配列の代わりに所望の種のヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコーディング配列で置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，前掲）、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコーディング配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合により接合させることによって修飾することもできる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、当該発明の抗体の定常ドメインに代えて置換することができるか、または当該発明の抗体の１つの抗原組合せ部位の可変領域に代えて置換して、キメラ二価抗体を作り出すことができる。
【００５２】
用語「エピトープ」は当該分野で認識されている。一般に、抗体と相互作用する抗原または複数抗原の領域をいうのは当業者に理解される。ペプチドまたは蛋白質または糖抗原のエピトープは線状または立体配座とすることができるか、または抗原の連続的なまたは非連続的なアミノ酸および／または糖配列によって形成することができる。ＧＤ２分子は、多くの炭水化物のように、多くのエピトープを含有する。本発明の抗体によって認識されるエピトープまたは糖、および抗体、ＧＤ２抗原の化学的ミメティックスのペプチドおよび抗イディオタイプ抗体によって依然として認識されるこれらの糖の保存的置換は本発明の実施形態である。これらの糖またはミメティックスのペプチド／化学物質または抗イディオタイプ抗体は、免疫アフィニティーカラム上でＧＤ２をＭｏＡｂに、またはＧＤ２からＭｏＡｂを溶出させるための慣用的な方法を提供する。これらのエピトープのさらなる切形も可能である。
【００５３】
裸の抗体は、一般的には、治療剤にコンジュゲートされていない全抗体である。これは、抗体分子のＦｃ部分が、補体固定およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞の細胞傷害性）のようなエフェクター機能を提供し、これは細胞溶解をもたらし得る作用にメカニズムを設定するからである。裸の抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにキメラ、ヒト化またはヒト抗体のようなある種の組換え抗体の双方を含む。しかしながら、Ｆｃ部分は治療的機能に要求されず、むしろ、抗体は細胞周期の休止およびアポトーシスの誘導のような他のメカニズムを介してその治療的効果を発揮するのが可能である。この場合において、裸の抗体は、先に定義されたコンジュゲートされていない抗体断片も含む。
【００５４】
キメラ抗体は、１つの種、好ましくはげっ歯類に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた可変ドメインを含有する組換え蛋白質であり、他方、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のそれに由来する。動物適用では、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種のそれに由来してもよい。
【００５５】
ヒト化抗体は、１つの種からの抗体；例えば、げっ歯類抗体からのＣＤＲがげっ歯類抗体の重鎖および軽鎖可変鎖からヒト重鎖および軽鎖可変ドメインに移される組換え蛋白質である。
【００５６】
ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して、特異的なヒト抗体を生じさせるように「作成された」トランスジェニックマウスから得られた抗体である。この技術においては、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントは、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化された崩壊を含有する胚幹細胞系に由来するマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、およびマウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを生産することができる。トランスジェニックマウスからのヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載されている。十分にヒト型の抗体は、その全てが当該分野で知られている、遺伝子または染色体トランスフェクション方法、ならびにファージ提示技術によって構築することもできる。例えば、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、イン・ビトロでのヒト抗体およびその断片の生産については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）参照。この技術においては、抗体可変ドメイン遺伝子は、フィラメント状バクテリオファージの主たるまたは従たる外皮蛋白質遺伝子いずれかにインフレームにてクローン化させ、およびファージ粒子の表面に機能的抗体断片として提示される。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有する故に、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子が選択される。このようにして、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示は、種々の様式で行われることができ、それらのレビューについては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）参照。
【００５７】
ヒト抗体は、イン・ビトロ活性化Ｂ細胞によって生じさせることもできる。この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および第５，２２９，２７５号明細書参照。
【００５８】
治療剤は、抗体部位とは別々に、同時に、または順次に投与され、または抗体部位、すなわち、抗体または抗体断片、またはサブ断片にコンジュゲートされた分子または原子であり、および病気の治療で有用である。治療剤の例は抗体、抗体断片、薬物、トキシン、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫モジュレーター、キレーター、ホウ素化合物、光活性剤、または色素および放射性同位体を含む。
【００５９】
診断剤は、抗体部位、すなわち、抗体または抗体断片またはサブ断片にコンジュゲートされた、投与される分子または原子であり、および抗原を含有する細胞を突き止めることによって病気を診断し、または検出するのに有用である。有用な診断剤は、これに限定されるものではないが、放射性同位体、（ビオチン−ストレプトアビジン複合体を持つような）色素、コントラスト試薬、蛍光化合物、または分子、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）を含む。米国特許第６，３３１，１７５号明細書はＭＲＩ技術、およびＭＲＩ増強剤にコンジュゲートされた製剤を記載し、引用によりその全体を援用する。好ましくは、診断剤は放射性同位体、磁気共鳴イメージングで用いられる増強剤、および蛍光化合物から成る群から選択される。放射活性金属または常磁性イオンを持つ抗体成分を負荷するために、イオンを結合させるための多様なキレート化基が欠乏される長いテイルを有する試薬とそれを反応させる必要があろう。そのようなテイルはポリリシン、多糖、または例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、およびこの目的で有用であることが知られている同様な基のようなキレート化基を結合させることができるペンダント基を有する他の誘導体化されて、または誘導体化可能な鎖のようなポリマーであり得る。キレートは、標準的な化学を用いて抗体にカップリングさせる。該キレートは、通常、免疫反応性の最小の喪失および最小の凝集でもって分子への結合の形成を可能とする基によって抗体に連結されており、および／または内部架橋の他のより通常でない方法、およびキレートを抗体にコンジュゲートさせるための試薬は、この参照によりその全体が本明細書ら組み込まれる、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」と題された、１９８９年４月２５日に発行されたＨａｗｔｈｏｒｎｅに対する米国特許第４，８２４，６５９号明細書に開示されている。特に有用な金属−キレート組合せは、放射性イメージング用の診断同位体と共に用いられる、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシルアナログを含む。同一のキレートは、マンガン、鉄、およびガドリニウムのような非放射性活性金属と複合体化された場合、本発明の抗体と共に用いる場合に、ＭＲＩで有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環キレートは、種々の金属および放射性金属と、最も特別には、各々、ガリウム、イットリウム、および銅の放射性核種と共に使用されるものである。そのような金属−キレート複合体は、環のサイズを注目する金属に対して仕立てることによって、非常に安定とすることができる。ＲＡＩＴについての２２３Ｒａのような、安定に結合する各種のための注目する大環ポリエーテルのような他の環タイプのキレートは本発明によって含まれる。
【００６０】
免疫コンジュゲートは、抗体成分と治療または診断剤とのコンジュゲートである。診断剤は放射性活性または非放射性活性標識、（磁気共鳴イメージングについては、計算されたトモグラフィー、または超音波のような）コントラスト剤を含むことができ、および放射性活性レベルはガンマ−、ベータ−、アルファ−、オージェ電子−、または陽電子放出同位体であり得る。
【００６１】
免疫モジュレーターは、存在する場合、典型的には免疫細胞を増殖させるか、またはマクロファージ、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞のような免疫応答カスケードにおいて活性化されるように刺激する、本発明で定義された治療剤である。本明細書中に記載された免疫モジュレーターの例はサイトカインである。当業者が理解するように、ある種のインターロイキンおよびインターフェロンはＴ細胞または他の免疫細胞の増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００６２】
発現ベクターは、宿主細胞において発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子である。典型的には、遺伝子の発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーを含めた、ある種の調節エレメントの制御下に置かれる。そのような遺伝子は調節エレメントに「操作可能に連結している」といわれる。
【００６３】
組換え宿主は、クローニングベクターまたは発現ベクターいずれかを含有するいずれの原核生物または真核生物細胞であってもよい。この用語は、宿主細胞の染色体またはゲノム、または宿主細胞の細胞においてクローン化遺伝子（類）を得るように遺伝子工学により作成された、トランスジェニック動物も含む。
【００６４】
多特異的抗体は、異なる構造のものである少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同一抗原上の２つの異なるエピトープ、またはハプテンおよび抗原またはエピトープに対して同時に結合することができる抗体である。１つの特異性は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄−、血漿−、または肥満細胞抗原またはエピトープに対するものであろう。もう１つの特異性は、Ｂ細胞上の、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、またはＣＤ２２のような同一の細胞型上での異なる抗原に対することができよう。多特異的な多価抗体は、１を超える結合部位を有する構築体であって、および結合部位は異なる特異性のものである。例えば、１つの結合部位が１つの抗原と反応し、および他の結合部位がもう１つの抗原と反応する二特異的ダイアボディー。
【００６５】
二特異的抗体は、異なる構造のものである２つの標的に同時に結合することができる抗体である。二特異的抗体（ｂｓＡｂ）および二特異的抗体断片（ｂｓＦａｂ）は、例えば、ＧＤ２に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、および治療または診断剤を担持する標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有する。種々の二特異的融合蛋白質は、分子工学を用いて生産することができる。１つの形態において、二特異的融合蛋白質は二価であり、例えば、１つの抗原のための単一の結合部位を持つｓｃＦｖ、および第二の抗原のための単一の結合部位を持つＦａｂ断片から成る。もう１つの形態において、二特異的融合蛋白質は四価であり、例えば、１つの抗原のための２つの結合部位を持つＩｇＧ、および第二の抗原のための２つの同一のｓｃＦｖから成る。
【００６６】
二特異的ＭｏＡｂを生産するための最近の方法は、それらがより通常の免疫グロブリンイソタイプよりも強く架橋するように、さらなるシステイン残基を有する作成された組換えＭｏＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０（１０）：１２２１−１２２５、１９９７参照。もう１つのアプローチは、２もしくはそれ以上の異なる単一鎖抗体、または必要なデュアル特性を持つ抗体断片セグメントを連結させる組換え融合蛋白質を作成することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９−１６３，１９９７参照。種々の二特異的融合蛋白質は分子工学を用いて生産することができる。
【００６７】
２もしくはそれ以上の異なる単一鎖抗体または抗体断片を連結する二特異的融合蛋白質は同様な手法で生産される。組換え方法を用いて、種々の融合蛋白質を生産することができる。柔軟なリンカーはｓｃＦｖを、３Ｆ８抗体の重鎖の定常領域に連結させる。別法として、ｓｃＦｖはもう１つのヒト化抗体の軽鎖の定常領域に連結させることができる。重鎖ＦｄのｓｃＦｖへのインフレーム連結に必要な適切なリンカー配列はＰＣＲ反応を通じてＶＬおよびＶｋａｐｐａドメインに導入される。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含有するステージングベクターに連結される。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築体を切り出し、および３Ｆ８抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターに連結させる。得られたベクターを用いて、二特異的融合蛋白質の発現のために、哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞をトランスフェクトすることができる。
【００６８】
本発明の３Ｆ８抗体およびその断片を用いて、ダイアボディーとも呼ばれる機能的二特異的単一鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）を調製することもでき、組換え方法を用いて哺乳動物細胞において生産することができる。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７０２１−７０２５、１９９５参照。例えば、ｂｓｃＡｂは、２つの単一鎖Ｆｖ断片を、組換え方法を用いてグリシン−セリンリンカーを介して接合させることによって生産される。注目する２つの抗体のＶ軽鎖およびＶ重鎖ドメインは、当該分野で知られた標準的なＰＣＲ方法を用いて単離される。二特異的単一鎖抗体および二特異的融合蛋白質は本発明の範囲内に含まれる。
【００６９】
本明細書中に記載された二特異的ダイアボディーの最終の使用は、診断／検出または治療剤の引き続いての特異的送達用のＧＤ２陽性細胞を予め標的化するためである。これらのダイアボディーは標的化された抗原に選択的に結合し、増大した親和性および所望の位置におけるより長い滞留時間を可能とする。さらに、非抗原結合ダイアボディーは素早く身体から除去され、および正常な組織の暴露は最小化される。診断／検出および治療剤は、同位体、薬物、トキシン、サイトカイン、ホルモン、成長因子、コンジュゲート、放射性核種、および金属を含むことができる。例えば、ガドリニウム金属は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のために用いられる。放射性核種は診断および治療剤、特に、６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲のそれとしても入手可能である。
【００７０】
標的化可能な構築体は、多様な構造のものとすることができるが、免疫応答の惹起を回避するのみならず、ｂｓＡｂ標的化方法内で用いる場合に迅速なイン・ビボ除去のために選択される。疎水性剤は強力な免疫応答を惹起するにおいて最良であり、他方、親水性剤は迅速なイン・ビボ除去で好ましく；かくして、疎水性と親水性間のバランスが確立される必要がある。これは、部分的には、多くの生物部位の固有の疎水性を相殺するために親水性キレート化剤の使用に依拠することによって達成される。また、標的化可能な構築体のサブユニットを選択することができ、それは反対の溶液特性を有する。例えば、そのいくつかが疎水性であるアミノ酸、およびそのいくつかが親水性であるアミノ酸を含有するペプチド。ペプチドとは別に、炭水化物を使用することもできる。
【００７１】
２つ程度と少数のアミノ酸残基を有するペプチドを使用してもよく、キレート化剤のような他の部位にもカップリングされるならば、好ましくは２〜１０の残基を用いてよい。リンカーは、キレート中に金属イオンを含む、好ましくは、５０，０００ダルトン未満の、有利には約２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子量コンジュゲートとすべきである。
【００７２】
リンカー部位上の親水性キレート部位の存在は、迅速なイン・ビボ除去を確実とするのを助ける。親水性に加えて、キレーターは、それらの金属結合特性について選択され、および任意に変化させる。というのは、少なくとも、そのｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部であるか、または非キレート化学的ハプテンであるリンカーについて、金属−キレート複合体の認識はもはや論点ではないからである。
【００７３】
それに対して、蛍光分子のような検出可能な標識、または重金属または放射性核種のような細胞傷害性剤をコンジュゲートさせることができる、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、またはＮＯＴＡまたは適当なペプチドのようなキレーター。例えば、治療的に有用な免疫コンジュゲートは、光活性剤または色素を抗体融合蛋白質にコンジュゲートさせることによって得ることができる。フルオロクロームのような蛍光組成物、および可視光に対して感受性があるポルフィリンのような他の色原体または色素が、適当な光を病巣に向けることによって病巣を検出し、および処理するのに用いられてきた。療法において、これは光放射、光療法、または光力学療法といわれてきた（Ｊｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ  ２２：４３０（１９８６））。さらに、モノクローナル抗体は、光療法を達成するために光活性化色素とカップリングされてきた。Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３（１９８３）；ｉｄｅｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８７４４（１９８６）；ｉｄｅｍ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２５２９（１９９１）。しかしながら、これらのより早い研究は、特に、抗体断片またはサブ断片を使用した、内視鏡療法適用の使用を含まなかった。かくして、本発明では、光活性剤または色素を含む免疫コンジュゲートの治療的使用が考えられる。
【００７４】
同一のキレーターは、Ｍｎ、ＦｅおよびＧｄのような非放射性金属と複合体化させた場合、本発明のｂｓＡｂと共に用いると、ＭＲＩで用いることができる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミンテトラ酢酸）のような大環キレーターは、種々の金属および放射性金属と共に、最も好ましくは、各々、Ｇａ、Ｙ、およびＣｕの放射性核種と共に用いられるものである。
【００７５】
本明細書中で用いるように、用語「予防する」、「予防している」および「予防」とは、予防または治療剤の投与の結果としての、対象における障害の１またはそれ以上の兆候の再発または開始の予防をいう。
【００７６】
本明細書中で用いるように、用語「組み合わせた」とは、１を超える予防および／または治療剤の使用をいう。用語「組み合わせた」の使用は、予防および／または治療剤を障害を持つ対象に投与する順序を制限しない。最初の予防または治療剤は、障害を持つ対象への第二の予防または治療剤の投与に先立って（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、該投与と同時に、またはそれに引き続いて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）投与することができる。
【００７７】
「エフェクター機能」とは、本明細書中で用いるように、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から得られる生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、これに限定されるものではないが、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介貪食（ＡＤＣＰ）、および補体媒介細胞傷害性（ＣＭＣ）を含む。エフェクター機能は、抗原の結合後に作動するもの、および抗原結合から独立して作動するものの双方を含む。
【００７８】
「エフェクター細胞」は、本明細書中で用いるように、１またはそれ以上のＦｃ受容体を発現させ、および１またはそれ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞は、これに限定されるものではないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、大きな顆粒状リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球を含み、これに限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含めたいずれの生物からのものであってもよい。
【００７９】
「Ｆｃリガンド」は、本明細書中で用いるように、抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ−リガンド複合体を形成するいずれの生物からの分子、好ましくはポリペプチドも意味する。Ｆｃリガンドは、これに限定されるものではないが、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）、Ｆｃ−ガンマ−ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ−イプシロン−ＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、スタフィロコッカスプロテインＡ、ストレプトコッカスプロテインＧ、およびウイルスＦｃ．ガンマ．Ｒ．を含む。ＦｃリガンドはＦｃに結合する未発見の分子を含むことができる。
【００８０】
好ましい特別な実施形態においては、当該発明は変種Ｆｃ領域を含む分子を含み、ここに、該変種Ｆｃ領域は、該分子がＦｃγＲに対する改変された親和性を有するように、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、但し、該変種Ｆｃ領域は、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７−２７３）によって開示されたもののようなＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の結晶学的および構造的分析に基づいてＦｃγＲとの直接的接触をなす位置に置換を有しない。ＦｃγＲとの直接的接触を行うＦｃ領域内の位置の例はアミノ酸２３４〜２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７−２９９（Ｃ’／Ｅループ）、アミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである。いくつかの実施形態において、変種Ｆｃ領域を含む当該発明の分子は、構造的および結晶学的分析に基づいて、ＦｃγＲとの直接的接触をなす少なくとも１つの残基の修飾を含む。
【００８１】
本発明の１つの態様は、１またはそれ以上のアミノ酸修飾を持つ変種Ｆｃ領域を有する、活性化および／または阻害性受容体に対する改変された親和性を持つ３Ｆ８抗体を含み、ここに、該１またはそれ以上のアミノ酸修飾は、位置２３９におけるアスパラギン酸での、位置３３０におけるロイシンでの、および位置３３２におけるグルタミン酸での置換である（実施例１３参照）。
【００８２】
本発明は、本発明の抗体のＦｃ領域における１またはそれ以上のアミノ酸に対する付加、欠失、および／または置換を持つ変種Ｆｃ領域を含む分子を含んで、エフェクター機能を改変し、またはＦｃＲに対する抗体の親和性を増強させ、または減少させる。これらの突然変異は当業者に技量内のものである。従って、本発明は、１またはそれ以上のＦｃγＲｓに対するより大きな親和性でもって結合する変種Ｆｃ領域を含む分子を含む。そのような分子は、好ましくは、後記で議論されたエフェクター機能をより効果的に媒介する。他の実施形態において、当該発明は、１またはそれ以上のＦｃγＲｓに対するより弱い親和性でもって結合する変種Ｆｃ領域を含む分子を含む。エフェクター機能の低下または排除は、ある場合には、例えば、その作用メカニズムがブロッキングまたは拮抗作用を含むが、標的抗原を担う細胞の殺傷は含まない抗体の場合に望ましい。エフェクター機能の低下または排除は、エフェクター細胞においてＦｃγＲ活性化受容体をブロックしようとする場合、自己免疫疾患の場合において望ましいであろう（機能のこのタイプは宿主細胞に存在するであろう）。一般に、増大したエフェクター機能は、腫瘍および外来性細胞に向けられるであろう。
【００８３】
本発明のＦｃ変種は、これに限定されるものではないが、エフェクター機能を改変する修飾を含めた、他のＦｃ修飾と組み合わせてもよい。当該発明は、当該発明のＦｃ変種を他のＦｃ修飾と組み合わせて、抗体またはＦｃ融合において相加的、相乗的、または新規な特性を供することを含む。好ましくは、当該発明のＦｃ変種は、それらが組み合わされる修飾の表現型を増強させる。例えば、当該発明のＦｃ変種が、野生型Ｆｃ領域を含む匹敵する分子よりも高い親和性でもってＦｃγＲＩＩＩＡに結合することが知られた突然変異体と組み合わせるならば、当該発明の突然変異体との該組合せの結果、ＦｃγＲＩＩＩＡ親和性におけるより大きな倍増強がもたらされる。いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ変種は、抗体、または１もしくはそれ以上の作成された糖型、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合により付着した炭水化物組成物を含むＦｃ融合に一体化され、ここに、該炭水化物組成物は、Ｆｃ領域を含む親分子のそれとは化学的に異なる。
【００８４】
当該発明は、好ましくは、抗体の機能性、例えば、結合活性ＧＤ２を改変することなく、修飾されたグリコシル化部位を持つ抗体を含む。本明細書中で用いるように、「グリコシル化部位」は、それにオリゴ糖（すなわち、一緒に連結した２またはそれ以上の単純な糖を含有する炭水化物）が特異的かつ共有結合的に付着した抗体におけるいずれの特異的アミノ酸配列も含む。オリゴ糖側鎖は、典型的には、Ｎ−またはＯ−連結いずれかを介して抗体の骨格に典型的には連結されている。Ｎ−結合グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部位の付着をいう。Ｏ−連結グリコシル化とは、オリゴ糖部位のヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、スレオニンへの付着をいう。フコースおよび末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含めたある種のオリゴ糖を欠如するＦｃ糖型、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧｌｎは特殊なＣＨＯ細胞において生産され、および増強されたＡＤＣＣエフェクター機能を増強させた。
【００８５】
いくつかの実施形態において、当該発明は、グリコシル化部位を付加または欠失することによって、本発明の抗体の炭水化物含有量を修飾する方法を含む。抗体の炭水化物含有量を修飾する方法は当該分野でよく知られており、および本発明内に含まれる。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１８，１４９号明細書；欧州特許第０３５９０９６号Ｂ１明細書；米国公開番号ＵＳ２００２／００２８４８６；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国特許第６，２１８，１４９号明細書；米国特許第６，４７２，５１１号明細書参照。他の実施形態において、当該発明は、抗体の１またはそれ以上の内因性炭水化物部位を欠失することによって、当該発明の抗体の炭水化物含有量を修飾する方法を含む。特別な実施形態において、当該発明は、位置２９７をアスパラギンからアラニンに修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失することを含む。
【００８６】
作成された糖型は、これに限定されるものではないが、エフェクター機能の増強または低下を含めた、種々の目的で有用であろう。作成された糖型は、当業者に知られたいずれかの方法によって、例えば、作成されたまたは変種の発現株によって、１またはそれ以上の酵素、例えば、ＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）での共発現によって、種々の生物におけるＦｃ領域を含む分子、または種々の生物からの細胞系を発現することによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を修飾することによって生成させることができる。作成された糖型を生成させるための方法は当該分野で知られており、これに限定されるものではないが、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号明細書；米国出願第１０／２７７，３７０号；米国出願第１０／１１３，９２９号；ＰＣＴ国際公開第００／６１７３９Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０２／３０９５４Ａ１号パンフレット；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）テクノロジー（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化エンジニアリングテクノロジー（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス国）に記載されたものを含む。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第０００６１７３９号パンフレット；ＥＡ０１２２９１２５；ＵＳ２００３０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９参照。
【００８７】
本明細書中で用いるように、ポリペプチドまたは蛋白質との関係での用語「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは蛋白質をいう。用語「誘導体」とは、本明細書中で用いられるように、すなわち、いずれかのタイプの分子のポリペプチドまたは蛋白質への共有結合付着によって修飾されているポリペプチドまたは蛋白質もいう。例えば、これに限定されるものではないが、抗体は、公知の保護／ブロック基蛋白質分解開裂、細胞リガンドまたは他の蛋白質への連結等により、例えば、グリコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、ホスホリル化、アミド化、誘導体化によって修飾されてもよい。誘導体ポリペプチドまたは蛋白質は、これに限定されるものではないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含めた、当業者に知られた技術を用いて化学的修飾によって生産されてもよい。さらに、誘導体ポリペプチドまたは蛋白質誘導体は、それが由来するポリペプチドまたは蛋白質としての同様なまたは同一の機能を保有する。
【００８８】
本明細書中で用いるように、用語「断片」とは、少なくとも５つの連続アミノ酸残基、少なくとも１０の連続アミノ酸残基、少なくとも１５の連続アミノ酸残基、少なくとも２０の連続アミノ酸残基、少なくとも２５の連続アミノ酸残基、少なくとも４０の連続アミノ酸残基、少なくとも５０の連続アミノ酸残基、少なくとも６０の連続アミノ酸残基、少なくとも７０の連続アミノ酸残基、少なくとも８０の連続アミノ酸残基、少なくとも９０の連続アミノ酸残基、少なくとも１００の連続アミノ酸残基、少なくとも１２５の連続アミノ酸残基、少なくとも１５０の連続アミノ酸残基、少なくとも１７５の連続アミノ酸残基、少なくとも２００の連続アミノ酸残基、またはもう１つのポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも連続した２５０アミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。特別な実施形態において、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保有する。
【００８９】
有効量：本明細書中で用いられるように、「有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な所与の化合物、コンジュゲートまたは組成物の量をいう。本発明の方法に従った所与の化合物、コンジュゲートまたは組成物の有効量はこの選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当該分野で知られた、および／または本明細書中に記載されたアッセイを用い、過度な実験の必要性無くして、当業者によってルーチンの事項として決定することができる。例えば、癌の転移を治療または予防するための有効量は、イン・ビボでの基底膜を横切っての、または内皮層を横切っての腫瘍細胞の移動および侵入を予防するのに必要な量であり得るであろう。該用語は「十分な量」と同義である。いずれかの特定の適用のための有効量は、治療すべき病気、障害または疾患、投与すべき特定の組成物、投与の経路、対象のサイズ、および／または病気または疾患の重症度のような因子に依存して変化し得る。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、本明細書中で提供されたガイドラインに従って、本発明の特定の化合物、コンジュゲートまたは組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００９０】
測定された量との関係で本明細書中で用いるように、用語「約」とは、測定を行い、測定の対象と同様なケアのレベル、および用いる測定機器の精度を行使する当業者によって予測されるであろう測定された量における通常の変動をいう。そうでないことが示されているのでなければ、「約」とは、提供された値の＋／−１０％の変動をいう。
【００９１】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変種、または誘導体とは、その天然の環境には無いポリペプチドを意図する。精製の特別なレベルは要求されない。例えば、単離されたポリペプチドはその生来のまたは天然の環境から除去することができる。宿主細胞で発現された組換えにより生産されたポリペプチドおよび蛋白質は、いずれかの適当な技術によって分離され、分画され、または部分的にまたは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的では単離されていると考えられる。
【００９２】
また、本発明のポリペプチドとして含まれるのは、これまでのポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、または変種、およびそのいずれかの組合せである。抗ＧＤ２抗体または抗体ポリペプチドをいう場合の用語「断片」、「変種」、「誘導体」、および「アナログ」は、対応する天然の抗体またはポリペプチド、すなわち、ＧＤ２上の１またはそれ以上のエピトープに結合する能力を保有するポリペプチドの抗原結合特性の少なくともいくらかを保持するいずれのポリペプチドも含む。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書中の他の個所で議論された特異的抗体断片に加えて、蛋白質分解断片、ならびに欠失断片を含む。本発明による有用な抗ＧＤ２抗体および抗体ポリペプチドの変種は、先に記載された断片、およびアミノ酸の置換、欠失、または挿入のため改変されたアミノ酸配列を持つポリペプチドも含む。変種は、天然で起こり得るか、または非天然で起こり得る。非天然で起こる変種は、当該分野で知られた突然変異誘発技術、または非天然アミノ酸を用いて生産することができる。変種ポリペプチドは保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含んでもよい。本発明に従って有用な抗ＧＤ２抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドで見出されないさらなる特徴を呈するように改変されたポリペプチドである。その例は融合蛋白質を含む。変種ポリペプチドは、本明細書中においては、「ポリペプチドアナログ」ともいわれる。本明細書中で用いるように、抗ＧＤ２抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、機能的側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１またはそれ以上の残基を有する主題のポリペプチドをいう。また、「誘導体」として含まれるのは、２０の標準アミノ酸の１またはそれ以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに代えて置換してもよく；５−ヒドロキシリシンはリシンに代えて置換してもよく；３−メチルヒスチジンはヒスチジンに代えて置換してよく；ホモセリンはセリンに代えて置換してよく；およびオルニチンはリシンに代えて置換してよい。
【００９３】
治療：本明細書中で用いられるように、用語「治療」、「治療する」、「治療された」、または「治療している」とは、特に、対象が多発性硬化症の進行のような望まれない生理学的変化または障害を予防し、または遅らせる（少なくする）ことにある予防および／または治療をいう。有益なまたは所望の臨床的結果は、これに限定されるものではないが、兆候の軽減、病気の程度の低下、病気の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、病気の進行の遅延または遅れ、病気状態の緩和または寛解、および（部分的または全体的を問わず）緩解を、検出可能であるかまたは検出できないかを問わず、含む。「治療」は、治療を受けるのでなければ、予測された生存と比較して延長される生存を意味することもできる。治療を必要とする者は、疾患または障害を既に持つ者、ならびに疾患または障害を有する傾向がある者、または疾患または障害が予防されるべき者を含む。「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または療法が望まれるいずれかの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ等のような、ヒトおよび他の霊長類、家畜動物、農場動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物を含む。
【００９４】
ヒト化抗体
１つの実施形態において、本発明によって提供される抗体は、好ましい実施形態においては、他の種に由来する同族抗ＧＤ２抗体のヒト化バージョンであるモノクローナル抗体である。ヒト化抗体は組換えＤＮＡ技術によって生産された抗体であり、そこでは、抗原結合で必要とされないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖（例えば、定常領域および可変ドメインのフレームワーク領域）のアミノ酸のいくつかまたは全てを用いて、同族の非ヒト抗体の軽鎖または重鎖からの対応するアミノ酸に代えて置換する。その例として、所与の抗原に対するネズミ抗体のヒト化バージョンは、その重鎖および軽鎖の双方の上に、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメインからのフレームワーク領域；および（３）ネズミ抗体からのＣＤＲを有する。必要であれば、ヒトフレームワーク領域における１またはそれ以上の残基を、ネズミ抗体における対応する位置での残基に変化させて、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を保持することができる。この変化は、時々、「復帰突然変異」と呼ばれる。同様に、正突然変異を行って、所望の理由、例えば、抗原に対する安定性または親和性のためにネズミ配列に戻してもよい。例えば、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１復帰突然変異が重鎖配列における１９位置、および軽鎖における１７位置において、結合のイン・ビトロ親和性を維持するために必要であった。ヒト化抗体は、一般に、キメラヒト抗体と比較して、ヒトにおいて免疫応答をあまり惹起しない。なぜならば、前者はかなり少数の非ヒト成分を含有するからである。
【００９５】
本発明のヒト化抗体を作成するための適当な方法は、例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ  ＥＰ０２３９４００；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ８６：１００２９（１９８９）；米国特許第６，１８０，３７０号明細書；およびＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８６：３８３３（１９８９）に記載されている。一般に、ヒト抗体へのネズミ（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は以下のように達成される。重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡをハイブリドーマから単離する。ＣＤＲを含めた可変ドメインのＤＮＡ配列は配列決定によって決定される。ＣＤＲをコードするＤＮＡは、所望のイソタイプ（例えば、ＣＨに代えてγ１およびＣＬに代えてＫ）のヒト定常領域遺伝子セグメントに付着された、ヒト抗体重鎖または軽鎖可変ドメインコーディング配列の対応する領域に挿入され、遺伝子合成される。ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子は哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはＮＳＯ細胞）において共発現されて、可溶性ヒト化抗体を生じる。抗体の大規模な生産を促進するためには、しばしば、プロデューサーラインにおいてＤＨＦＲ遺伝子またはＧＳ遺伝子を用いて高エクスプレッサーについて選択するのが望ましい。これらのプロデューサー細胞系はバイオリアクター、または中空繊維培養システム、またはＷＡＶＥ技術において培養して、可溶性抗体のバルク培養を生じさせ、または乳中で抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を生じさせる（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号明細書参照）。
【００９６】
前記したアプローチを用い、３Ｆ８抗体のヒト化およびキメラバージョンを生じさせた。軽鎖および重鎖のネズミ３Ｆ８可変領域をコードするｃＤＮＡを用いて、本明細書中の実施例において記載されたように、ネズミ３Ｆ８可変領域が（重鎖では）ヒトＩｇＧ１および（軽鎖では）ヒトカッパー定常領域に連結したネズミ−ヒトキメラの発現用のベクターを構築した。加えて、変種グリコシル化を持つｈｕ３Ｆ８の新規な形態が、Ｆｃ受容体への結合を増強させ、および抗原親和性を増強させるために作り出した。
【００９７】
ヒト化３Ｆ８抗体を生産するためには、ヒト・アクセプター・フレームワーク・ドメインを、ヒト生殖細胞系の配列に対する相同性マッチングによって選択した。これらの選択されたヒト・アクセプター・フレームワークを用い、軽鎖および重鎖可変ドメインを設計し、および、実施例にて後記するように、各々の多数の変種／バージョンを作り出し、および発現させた。
【００９８】
本発明のＭｏＡｂの重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を本出願において記載する。当該発明は、さらに、当該発明の抗体およびその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ストリンジェントな、またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。
【００９９】
該ポリヌクレオチドは、今や、当該分野で知られたいずれの方法によって得てもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られているので、抗体をコードするポリヌクレオチドを、簡単に述べれば、抗体をコードする配列の部分を含有するオリゴヌクレオチドを重ね、それらのオリゴヌクレオチドをアニールし、および連結させる合成、および次いでの、ＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む、（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４））に記載されたような）化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立ててもよい。
【０１００】
別法として、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適当な源からの核酸から生じさせてもよい。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手可能でないが、抗体分子の配列が知られていれば、免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成してもよく、または配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローン化して、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定することによって、適当な源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または当該発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞のような、抗体を発現するいずれかの組織または細胞から生じさせたｃＤＮＡライブラリー、またはそれらから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得てもよい。次いで、ＰＣＲによって生じさせた増幅された核酸を、当該分野でよく知られたいずれかの方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローン化してもよい。
【０１０１】
抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されるので、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ等（例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術参照）についての当該分野でよく知られた方法を用いて操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生じさせて、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作り出してもよい。
【０１０２】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはいずれかの他の形態のようなＲＮＡの形態、またはこれに限定されるものではないが、クローニングによって得られるか、または合成により生産されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、またはそのいずれかの組合せを含めた、ＤＮＡの形態とすることができる。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖、または一本鎖、またはそのいずれかの組合せとすることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つのストランドのいずれかの部分は、センスストランドとしても知られたコーディングストランドとすることができ、またはそれがアンチセンスストランドともいわれる非コーディングストランドとすることができる。
【０１０３】
本発明の単離された核酸分子は、選択的に、１またはそれ以上のイントロン、例えば、これに限定されるものではないが、少なくとも１つの重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３としての、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定の部分と共に、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子；抗ＧＤ２抗体についてのコーディング配列または可変領域を含む核酸分子；前記したものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝子暗号の縮重により、依然として、本明細書中に記載されたような、および／または当該分野で知られたように、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体をコードする核酸分子を含むことができる。
【０１０４】
本発明は、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。かくして、本実施形態のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離し、検出し、および／または定量するために用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて、寄託されたライブラリー中の部分的または全長クローンを同定し、単離し、または増幅することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された、またはそうでなければ、ヒトまたは哺乳動物核酸ライブラリーからのｃＤＮＡに相補的なゲノムまたはｃＤＮＡ配列である。
【０１０５】
核酸は、便宜には、本発明のポリヌクレオチドに加えて、配列を含むことができる。例えば、１またはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離において助けることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離において助けることができる。例えば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー配列は、本発明の蛋白質を精製するための便宜な手段を提供する。コーディング配列を除外した−−本発明の核酸は、選択的に、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプター、またはリンカーである。
【０１０６】
さらなる配列をそのようなクローニングおよび／または発現配列に加えて、クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離において助け、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を改良することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は当該分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前掲；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、前掲）。
【０１０７】
前記した単離されたまたは精製された核酸分子、またはその断片のいずれかを含むベクターが本発明によってさらに提供される。前記核酸分子、またはその断片のいずれかを適当なベクターにクローン化することができ、およびそれを用いて、いずれかの適当な宿主を形質転換し、またはトランスフェクトすることができる。ベクターの選択およびそれらを構築するための方法は当業者に通常は知られており、および一般的な技術文献（一般に、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ，」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５３，Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）参照）に記載されている。望ましくは、ベクターは、該ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡであるかを考慮し、適切であれば、該ベクターが導入されるべき宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に対して特異的な、転写および翻訳開始および停止コドンのような調節配列を含む。好ましくは、ベクターが、宿主の属に特異的な調節配列を含む。最も好ましくは、ベクターは宿主の種に対して特異的な調節配列を含む。
【０１０８】
複製系および挿入された核酸に加えて、構築体は、形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能とする、１またはそれ以上のマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子は、殺生物抵抗性、例えば、抗生物質、重金属等に対する抵抗性、原栄養性等を提供するための栄養要求性宿主における補充を含む。
【０１０９】
適当なベクターは、増殖および拡大のために、または発現または双方のために設計されたものを含む。例えば、クローニングベクターはｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｔｐｓａｌａ，スウェーデン国）、およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から成る群から選択される。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９のようなバクテリオファージベクターを用いることもできる。植物発現ベクターの例はｐＢＩ１１０、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。動物発現ベクターの例は、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。ＴＯＰＯクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）もまた製造業者の推薦に従って用いることもできる。
【０１１０】
発現ベクターは、前記したように、単離されまたは精製された核酸分子に操作可能に連結された天然または非天然プロモーターを含むことができる。プロモーター、例えば、強、弱、誘導性、組織特異的、および発生特異的の選択は当該分野における技量内のものである。同様に、前記したような、核酸分子またはその断片とプロモーターとの組合せもまた当該分野における技量内のものである。
【０１１１】
適当なウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、パルボウイルスベースのベクター、例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルスベースのベクター、および単純疱疹（ＨＳＶ）ベースのベクターのようなレンチウイルスベクターを含む。これらのウイルスベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載された標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０１１２】
レトロウイルスベクターはレトロウイルスから由来する。レトロウイルスは、広く種々の宿主細胞を感染させることができるＲＮＡウイルスである。感染に際して、レトロウイルスのゲノムはその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞ＤＮＡと共に複製され、それにより、レトロウイルスゲノムに組み込まれたウイルスＲＮＡおよびいずれかの核酸配列を常に生産する。それ自体、治療因子の長期発現は、レトロウイルスを用いる場合に達成可能である。遺伝子治療で用いるのが考えられるレトロウイルスは比較的非病原性であるが、病原性レトロウイルスが存在する。病原性レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ）を使用する場合、ウイルスゲノムが改変されて、宿主に対する毒性を排除することに注意を注がなければならない。レトロウイルスベクターは、加えて、操作して、ウイルス複製が不足するようにすることができる。それ自体、レトロウイルスベクターは、イン・ビボにて適当な遺伝子導入で特に有用であると考えられる。ＨＩＶベースのベクターのようなレンチウイルスベクターは遺伝子送達で用いられるレトロウイルスベクターの例である。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶベースのベクターは、それらのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞に組み込むことが知られており、従って、病気の執拗な形態を治療するにおいて用いることができる。
【０１１３】
選択的に、単離されまたは精製された核酸分子、またはその断片は、もう１つの核酸分子との連結に際して、融合蛋白質をコードすることができる。融合蛋白質の生成は当該分野における通常の技量内のものであり、制限酵素または組換えクローニング技術の使用を含むことができる（例えば、Ｇａｔｅｗａｙ．ＴＭ．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）参照）。また、米国特許第５，３１４，９９５号明細書参照。
【０１１４】
これまでを考慮すると、本発明は、選択的に、ベクターの形態であってよい、前記単離されまたは精製された核酸分子を含む組成物も提供する。組成物は本明細書中においてさらに記載されるように他の成分を含むことができる。
【０１１５】
また、前記を考慮すると、本発明は、選択的に、ベクターの形態であってもよい、前記した単離または精製された核酸分子を含む宿主細胞を提供する。本発明の細胞は、オリゴヌクレオチドまたはその断片は、共に、細胞によって効果的に転写され、および翻訳されるように、ベクターを発現させるのが最も好ましい。細胞の例は、これに限定されるものではないが、ヒト細胞、ヒト細胞系、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＢ−１、ＴＧ−２、ＤＨ５α、ＸＬ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＳＡ２８２１およびＹ１０９０）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｎ．ｃｒａｓｓａ、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｅａ４）、および本明細書中で以下に記載された他のものを含む。宿主細胞は、哺乳動物、特にヒトのような動物であり得る宿主中に存在させることができる。
【０１１６】
用語「ポリペプチド」は本明細書中においては、天然蛋白質、断片、またはポリペプチド配列のアナログをいうように上位概念的用語として用いられる。よって、天然蛋白質断片、およびアナログはポリペプチド属の種である。本発明によるポリペプチドは、配列番号：１、２、４、７、８に表された重鎖免疫グロブリン分子、および配列番号：２、５、６に表された軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子と共に重鎖免疫グロブリン分子、およびその逆、ならびにその断片およびアナログを含む組合せによって形成された抗体分子を含む。
【０１１７】
特定の実施形態において、ルーチン的な組換えＤＮＡ技術を用い、１またはそれ以上の本明細書中で同定されたＣＤＲをフレームワーク領域内に挿入することができる。フレームワーク領域は天然に生じるまたはコンセンサスフレームワーク領域、および好ましくはヒトフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧については、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）参照）であってよい。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生じるポリヌクレオチドは、特異的にＧＤ２に結合する抗体をコードする。１またはそれ以上のアミノ酸置換はフレームワーク領域内に作成してもよく、および好ましくは、アミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を改良する。加えて、そのような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に参画して、１またはそれ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠如する抗体分子を生じさせる、１またはそれ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作成することができる。ヌクレオチドに対する他の改変は本発明によって含まれ、かつ当該分野の技量内に含まれる。
【０１１８】
完全にヒト型の抗体は、ヒト患者の治療的処置で特に望ましい。ヒト型抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて前記したファージ提示方法を含めた、当該分野で知られた種々の方法によって作成することができる。この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４４４，８８７号明細書および第４，７１６，１１１号明細書；ならびにＰＣＴ国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／６０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６６４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットも参照されたし。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｏｅｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術もまたヒトモノクローナル抗体の調製でやはり入手可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｒｉｓｓ，（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５、（１９９１））。
【０１１９】
他の技術を用いて生産されるが、本発明の抗ＧＤ２抗体の可変領域を保持するヒト型抗体は本発明の一部である。ヒト型抗体は、機能的内因性マウス免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによってマウス胚幹細胞に導入することができる。別法として、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚幹細胞に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々に、または相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と同時に非機能的とすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は内因性抗体の生産を妨げる。修飾された胚幹細胞は拡大され、および胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを生産する。次いで、キメラマウスを育種して、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスを選択された抗原、例えば、当該発明のポリペプチドの全部または部分で通常の様式で免疫化する。抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術を用いて免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化の間に再編成され、引き続いて、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。かくして、そのような技術を用い、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を生じさせるのが可能である。ヒト型抗体を生じさせるためのこの技術の概観については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたし。ヒト型抗体およびヒト型モノクローナル抗体を生産するためのこの技術、およびそのような抗体を生産するためのプロトコルの詳細な議論については、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、例えば、ＰＣＴ国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；欧州特許第０  ５９８  ８７７号明細書；米国特許第５，４１３，９２３号明細書；第５，６２５，１２６号明細書；第５，６３３，４２５号明細書；第５，５６９，８２５号明細書；第５，６６１，０１６号明細書；第５，５４５，８０６号明細書；第５，８１４，３１８号明細書；第５，８８６，７９３号明細書；第５，９１６，７７１号明細書；および第５，９３９，５９８号明細書参照。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）のような会社は、前記したのと同様な技術を用いて選択された抗原に対して向けられたヒト型抗体を提供するのに従事できる。
【０１２０】
また、ヒトＭｏＡｂは、ヒト末梢血液白血球、脾臓細胞、または骨髄を移植したマウスを免疫化することによって作成できよう（例えば、ＸＴＬのＴｒｉｏｍａ技術）。選択されたエピトープを認識する完全にヒト型の抗体は、「ガイドされた選択」という技術を用いて生じさせることができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同一のエピトープを認識する完全にヒト型の抗体の選択をガイドする。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１２１】
本明細書中で用いるように、「抗ＧＤ２抗体」、「抗ＧＤ２抗体部分」、または「抗ＧＤ２抗体断片」および／または「抗ＧＤ２抗体変種」等は、本発明の抗体に取り込むことができる、非ネズミ起源の、好ましくはヒト起源の、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはそのいずれかの部分と組み合わせた、本明細書中に記載されたキメラまたはヒト化モノクローナル抗体のいずれかに由来する重鎖または軽鎖またはそのリガンド結合部分の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する、免疫グロブリン分子の少なくとも部分を含む分子を含有するいずれの蛋白質またはペプチドも含む。別法として、用語「抗ＧＤ２抗体」は、集合的に、または個々に、キメラ抗体ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ヒト化モノクローナル抗体ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧｌｎ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１Ｓ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３Ｓ、ｈｕＨ１−Ｉ−ガンマ−１、ｈｕＨ３−Ｉ−ガンマ−１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ抗体、ならびにその断片および領域をいうべきである。そのような抗体はイン・ビトロ、イン・サイチュ、および／またはイン・ビボにて、少なくとも１つの細胞機能を変調し、減少させ、拮抗し、軽減し、緩和し、ブロックし、阻害し、無くする、および／または干渉することができ、ここに、該細胞はＧＤ２を発現する。非限定的例として、本発明の適当な抗ＧＤ２抗体、特定の部分または変種はヒトＧＤ２のエピトープに高い親和性を持って結合することができる。
【０１２２】
用語「抗体」は、さらに、抗体ミメティックスを含めた、または各々が抗ＧＤ２抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含有する、単一鎖抗体およびその断片を含めた、抗体またはその特定の断片または部分の構造および／または機能を模倣する抗体の部分を含む、抗体、消化断片、その特定の部分および変種を含めることを意図する。機能的な断片は、哺乳動物ＧＤ２に結合する抗原結合断片を含む。例えば、これに限定されるものではないが、（例えば、パパイン消化による）Ｆａｂ、（例えば、ペプシン消化および部分的還元による）Ｆａｂ’、および（例えば、ペプシン消化による）Ｆ（ａｂ’）２、（例えば、プラスミン消化による）ｆａｃｂ、（例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による）ｐＦｃ’、（例えば、ペプシン消化、部分的還元および再凝集による）Ｆｄ、（例えば、分子生物学技術による）ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を含めた、ＧＤ２に結合することができる抗体断片またはその部分は本発明によって含まれる（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前掲）。
【０１２３】
抗体断片は、当該分野で知られているように、および／または本明細書中に記載されたように、酵素開裂、合成、または組換え技術によって生産することができる。抗体は、１またはそれ以上のコドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて種々の切形形態で生産することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子を設計して、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含ませることができる。抗体の種々の部分を、慣用的な技術によって化学的に一緒に連結することができるか、または遺伝子工学技術を用いて連続した蛋白質として調製することができる。
【０１２４】
本明細書中で用いるように、「キメラ」抗体または「ヒト化」抗体または「ＣＤＲグラフト化」は、本明細書中に記載された抗ＧＤ２  Ａｂ、または非ネズミ、好ましくはヒト抗体に由来する１またはそれ以上の蛋白質またはペプチドと組み合わせたそれから由来するいずれのＣＤＲのいずれの組合せも含む。当該発明によると、キメラまたはヒト化抗体は、ＣＤＲが本明細書中に記載された抗ＧＤ２  Ａｂの１またはそれ以上から由来するものを含み、および抗体の少なくとも一部または残りは、１またはそれ以上のヒト抗体に由来する。かくして、抗体のヒト部分は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であるフレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（または、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ）領域を含むことができる。ヒト抗体に由来する抗体の領域はヒト抗体に対して１００％同一性を有する必要が無い。好ましい実施形態において、できる限り多くのヒトアミノ酸残基が、免疫原性が無視できるように保持されるが、ヒト残基を必要に応じて修飾して、同時に抗体のヒト化を最大化しつつ、ＣＤＲによって形成される抗原結合部位を支持することができる。そのような変化または変動は、選択的にかつ好ましくは、非修飾抗体に対してヒトまたは他の種における免疫原性を保持し、または低下させてよい。ヒト化抗体は、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核生物または真核生物細胞によって生産することができることを指摘する。さらに、抗体が一本鎖抗体である場合、それは、天然ヒト抗体で見出されないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を連結させる、２〜約２０のグリシンまたは他のアミノ酸残基、好ましくは８〜１５のグリシンまたは他のアミノ酸残基のようなリンカーペプチドを含むことができる。そのようなリンカーペプチドはヒト起源のものであると考えられる。
【０１２５】
抗体のヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにインフレームにて融合させた非ヒト標的モノクローナル抗体の６つのＣＤＲを含むコンビナトーリアルライブラリーを合成することによって行うことができる。全ての公知の重鎖および軽鎖のヒト生殖系遺伝子の遺伝子代表を含有するヒト・フレームワーク・ライブラリーを利用することができる。次いで、注目する抗原への結合につき、得られたコンビナトーリアルライブラリーをスクリーニングすることができる。このアプローチは、親抗体への結合活性を維持する関係で十分にヒト型フレームワークの最も好都合な組合せの選択を可能とすることができる。次いで、ヒト化抗体は、さらに、種々の技術によって最適化することができる。
【０１２６】
抗体ヒト化を用いて、マウスまたは他の非ヒト抗体を「十分にヒト型」抗体に発展させることができる。得られた抗体は、出発抗体と同様な結合親和性および特異性を維持しつつ、ヒト配列のみを含有し、マウスまたは非ヒト抗体配列は含有しない。
【０１２７】
全長抗体分子では、免疫グロブリン遺伝子は、ハイブリドーマ細胞系のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから得ることができる。抗体の重鎖および軽鎖を哺乳動物ベクター系にクローン化する。二本鎖配列分析でのアセンブリーは記載されている。抗体構築体は他のヒトまたは哺乳動物宿主細胞系において発現させることができる。次いで、注目する発現された抗体の一過性トランスフェクションアッセイおよびウエスタンブロット分析によって確証することができる。最高の生産性を持つ安定な細胞系は、迅速なアッセイ方法を用いて単離し、およびスクリーニングすることができる。
【０１２８】
本発明の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、選択的に、当該分野でよく知られているように、細胞系、混合細胞系、不滅化細胞または不滅化細胞のクローン集団によって生産することができる。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）。Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）参照。
【０１２９】
１つのアプローチにおいて、ハイブリドーマは、適当な不滅細胞系（例えば、これに限定されるものではないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、>２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ＳＡ３、Ｓｐ２  ＭＡＩ、Ｓｐ２  ＳＳ１、Ｓｐ２  ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ  １４４、ＡＣＴ  ＴＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ  １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａのような骨髄腫細胞系）等、またはヘテロ骨髄腫その融合産物、またはそれから由来するいずれかの細胞または融合細胞、または当該分野で知られたいずれかの他の適当な細胞系（例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ，ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．等参照）を、これに限定されるものではないが、単離されまたはクローン化された脾臓、末梢血液、リンパ、扁桃、または他の免疫またはＢ細胞含有細胞、または内因性または異種核酸いずれかとしての、組換えまたは内因性、ウイルス、細菌、海藻、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、めん羊、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または三本鎖のハイブリダイズされた、またはそのいずれかの組合せのような抗体生産細胞と重鎖または軽鎖定常または可変またはフレームワークまたはＣＤＲ配列を発現するいずれか他の細胞と融合させることによって生産される。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲，およびＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２参照。
【０１３０】
いずれかの他の適当な宿主細胞を、本発明の抗体、特定の断片またはその変種をコードする異種または内因性核酸で用いることもできる。融合された細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的培養条件または他の適当な公知の方法を用いて単離し、限界希釈法または細胞ソーティング、または他の公知の方法によってクローン化することができる。所望の特異性を持つ抗体を生産する細胞は、適当なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。
【０１３１】
本発明の抗体は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体をコードする核酸を用いて調製して、それらの乳中にそのような抗体を生産する、トランスジェニック動物、またはヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等のような哺乳動物を提供することもできる。そのような動物は公知の方法を用いて提供することができる。例えば、これに限定されるものではないが、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８２７，６９０号明細書；第５，８４９，９９２号明細書；第４，８７３，３１６号明細書；第５，８４９，９９２号明細書；第５，９９４，６１６号明細書、第５，５６５，３６２号明細書；第５，３０４，４８９号明細書参照。
【０１３２】
本発明の抗体は、加えて、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体をコードする核酸を用いて調製して、そのような抗体、特定の部分または変種を、植物の部分において、またはそれから培養した細胞において生産するトランスジェニック植物および培養された植物細胞（例えば、これに限定されるものではないが、タバコおよびトウモロコシ）を提供することができる。非限定的例として、組換え蛋白質を発現するトランスジェニックタバコの葉を首尾よく用いて、例えば、誘導性プロモーターを用い、大量の組換え蛋白質が提供されている。例えば、Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８（１９９９）およびそこに引用された文献参照。また、トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系で生産された、または天然源から生成されたものと同等な生物学的活性でもって、商業的生産レベルで哺乳動物蛋白質を発現するのに用いられてきた。例えば、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７（１９９９）およびそこに引用された文献参照。また、抗体は、タバコの種子およびトマトの塊茎を含めた、単一鎖抗体（ｓｖＦｖ’）のような抗体断片を含めた、トランスジェニック植物種子を大量に生産してきた。例えば、Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９（１９９８）およびそこに引用された文献参照。かくして、本発明の抗体は、公知の方法に従い、トランスジェニック植物を用いて生産することもできる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９−１０８（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９９）、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２−７（１９９５）；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４（１９９４）；およびそこに引用された文献参照。前記文献の各々は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
抗ＧＤ２抗体は、これに限定されるものではないが、プロテインＡ精製、プロテインＧ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含めたよく知られた方法によって組換え細胞培養から回収し、および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために使用することもできる。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）、例えば、ｃｈａｐｔｅｒｓ  １、４、６、８、９、および１０参照。
【０１３４】
本発明の抗体は、天然で精製された産物、化学的合成手法の産物、および例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含めた真核生物宿主から組換え技術によって生産された産物を含む。組換え生産手法において使用された宿主に依存して、本発明の抗体はグリコシル化することができ、またはグリコシル化しなくてもよく、グリコシル化されたのが好ましい。そのような方法は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前掲，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  １７．３７〜１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １０、１２、１３、１６、１８および２０、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２〜１４のような多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【０１３５】
精製された抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、免疫細胞学、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥＸＡ（商標）動態学的排除アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロットによって、またはＨＰＬＣ分析によって、ならびに本明細書中に開示された多数の他の機能的アッセイによって特徴付けることができる。
【０１３６】
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモーターエレメント、抗体コーディング配列、および転写の停止および転写体のポリアデニル化で必要なシグナルを含有する。さらなるエレメントはエンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、およびＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位によって近接挟まれた介入配列を含む。高度に有効な転写は、ＳＶ４０からの前期および後期プロモーター、レトロウイルスからのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲＳ）、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩおよび初期プロモーターで達成することができる。しかしながら、細胞エレメントを用いることのできる（例えば、ヒト・アクチン・プロモーター）。本発明を実施するのに用いられる適当な発現ベクターは、例えば、ｐＩＲＥＳｌｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、またはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ  ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＴ（ＡＴＣＣ  ６７１０９）のようなベクターを含む。用いることができる哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅＬａ２９３、Ｈ９、およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ  １、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０１３７】
別法として、遺伝子は、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細胞系で発現させることができる。ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ネオマイシン、またはヒグロマイシンのような選択マーカーでの共トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能とする。
【０１３８】
トランスフェクトされた遺伝子を増幅させて、大量のコードされた抗体を発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、注目する遺伝子の数百または数千さえのコピーを運ぶ細胞系を開発するのに有用である。もう１つの有用な選択マーカーは酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５（１９９２））である。これらのマーカーを用い、哺乳動物細胞を選択的培地で成長させ、最高の抵抗性を持つ細胞が選択される。これらの細胞系は、染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、しばしば、抗体の生産で用いられる。
【０１３９】
本発明によると、抗ＣＤ２抗体は、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１ｎ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１Ｓ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３Ｓ、ｈｕＨ１Ｉ−ガンマ−１、ｈｕＨ３Ｉ−ガンマ−１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ抗体、または可変領域またはＣＤＲがｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１ｎ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１Ｓ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３Ｓ、ｈｕＨ１Ｔ−ガンマ１、ｈｕＨ３Ｉ−ガンマ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ抗体のいずれかに由来し、かつ抗体のフレームワークおよび定常領域が１またはそれ以上のヒト抗体に由来する抗体のいずれか１つを含む。抗体から由来する可変領域またはＣＤＲは、好ましくは、抗体がＧＤ２に結合する能力を維持する限り、天然突然変異からの、またはヒト操作からの置換、挿入、および欠失を含めたいずれかのおよび全ての修飾が考えられるが、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１ｎ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ４、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１Ｓ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３Ｓ、ｈｕＨ１Ｉ−ガンマ１、ｈｕＨ３Ｉ−ガンマ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬのいずれかの可変領域またはＣＤＲに対して約９０％〜約１００％同一性を有する。ヒト抗体から由来するキメラ、ヒト化またはＣＤＲグラフト化抗体の領域は、ヒト抗体に対して１００％同一性を有する必要は無い。好ましい実施形態において、できる限り多くのヒトアミノ酸残基が、免疫原性が無視できるが、ヒト残基、特にフレームワーク領域の残基が必要に応じて、および本発明に従って後に本明細書中で教示されるように置換されるように保持される。本明細書中に開示されたそのような修飾は、抗体のヒト化を同時に最大化しつつ、ＣＤＲによって形成された抗原結合部位を支持する必要がある。
【０１４０】
本明細書中に記載された配列と実質的に同一であるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含む配列を含む。保存的アミノ酸置換とは、最初のアミノ酸の、該最初のアミノ酸のそれと同様な化学的および／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第二のアミノ酸による置き換えをいう。保存的置換は、以下のグループ内での１つのアミノ酸のもう１つのアミノ酸による置き換えを含む：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパルテート（Ｄ）およびグルタメート（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、およびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ、Ｓ、およびＴ。
【０１４１】
勿論、当業者が行うアミノ酸置換の数は、前記したものを含めた多くの因子に依存する。一般的にいえば、いずれかの所与の抗ＧＤ２抗体、断片または変種についてのアミノ酸置換、挿入、または欠失の数は、本明細書中で特定されるように、１〜３０のような、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１を超えず、またはその中のいずれかの範囲または値であろう。
【０１４２】
機能に必須の本発明の抗ＧＤ２抗体におけるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャンニング突然変異誘発のような当該分野で知られた方法によって同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前掲、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８、１５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手法は、分子中でのあらゆる残基において単一のアラニン突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異体分子を、これに限定されるものではないが、少なくともＧＤ２への結合のような生物学的活性についてテストする。抗体結合で臨界的である部位もまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造分析によって同定することもできる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１４３】
抗ＧＤ２抗体は、さらに、選択的に、本明細書中に記載された配列の少なくとも１つに由来するＣＤＲの連続アミノ酸の７０〜１００％のうちの少なくとも１つのポリペプチドを含むことができる。
【０１４４】
１つの実施形態において、免疫グロブリン鎖、またはその部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、表１〜４における少なくとも１つの配列のアミノ酸配列に対して約７０〜１００％同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中のいずれかの範囲もしくは値）を有する。
【０１４５】
例示的な重鎖および軽鎖可変領域の配列が本明細書中で提供される。本発明の抗体、またはその特定の変種は、本発明の抗体からのいずれかの数の連続アミノ酸残基を含むことができ、ここに、その数は抗ＧＤ２抗体における連続残基の数の１０〜１００％よりなる整数の群から選択される。選択的に、連続アミノ酸のこの配列は、長さは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０もしくはそれ以上のアミノ酸であるか、またはその中のいずれかの範囲もしくは値である。さらに、そのようなサブ配列の数は、少なくとも２、３、４、または５のような１〜２０よりなる群から選択されるいずれかの整数であり得る。
【０１４６】
本発明に従うと、配列番号：１１〜２２に記載された核酸配列および抗ＧＤ２抗体の可変領域（軽鎖および重鎖）の推定されたアミノ酸配列が配列番号：１〜１０に記載されている。重鎖および軽鎖可変領域の各々は、組み合わされて抗原結合部位を形成する３つのＣＤＲを含有する。３つのＣＤＲは、主としてＣＤＲを支持するように機能する４つのフレームワーク領域によって囲まれている。重鎖および軽鎖の可変領域の配列内のＣＤＲの配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  ｅｄ．，合衆国厚生省、合衆国政府印刷局，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．におけるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）に従ったコンピューター援助整列によって、または例えば、Ｌｅｖｉｔｔ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５によって記載されたＥＮＣＡＤプログラムを利用する可変領域の分子モデリングによって同定することができる。
【０１４７】
本発明のヒト化抗体、断片、および領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、公知の方法によって、ヒト胎児肝臓ライブラリーに由来することができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現し、および生産するものを含めたいずれかのヒト細胞に由来することができる。ヒトＣＨ領域は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、イプシロン、およびＧ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４のようなそのサブタイプを含めた、ヒトＨ鎖の公知のクラスまたはイソタイプのいずれかに由来することができる。Ｈ鎖イソタイプは抗体の種々のエフェクター機能を担っているので、ＣＨ領域の選択は、補体固定、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における活性のような望まれるエフェクター機能によってガイドされるであろう。好ましくは、ＣＨ領域はガンマ１（ＩｇＧ１）またはガンマ４（ＩｇＧ４）に由来する。
【０１４８】
ヒトＣＬ領域はヒトＬ鎖のイソタイプ、カッパまたはラムダいずれか、好ましくはカッパに由来することができる。
【０１４９】
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７−１９９３））によってヒト細胞から得られる。ヒトＣ領域遺伝子は、Ｌ鎖の２つのクラス、Ｈ鎖の５つのクラスおよびそのサブクラスを表す遺伝子を含有する公知のクローンから容易に入手できる。
【０１５０】
抗体の可変領域の配列は、キメラ抗体がヒトＧＤ２に結合する能力を維持する程度まで、挿入、置換、および欠失によって修飾することができる。当業者であれば、以下に記載される機能アッセイを行うことによってこの活性の維持を確認することができる。可変領域は、例えば、後に同定される可変領域に対して約５０％〜約１００％相同性を有することができる。好ましい実施形態において、抗体の可変領域は、後に同定される可変領域に対して約８０％〜約１００％相同性を有する。より好ましい実施形態において、可変領域は、後に同定される可変領域に対して約９０％〜約１００％相同性を有する。
【０１５１】
１つの特別な態様において、開示の好ましい抗ＧＤ２  Ｍａｂは本明細書中で同定された配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％アミノ酸配列相同性を有する可変軽鎖領域を含み、さらに、本明細書中で同定された配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％アミノ酸配列相同性を有する可変重鎖領域を含む。
【０１５２】
好ましくは、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片またはその特定の部分または変種はヒトＧＤ２に結合し、それにより、部分的にまたは実質的に１つのＧＤ２蛋白質または断片を中和し、それにより、ＧＤ２を介して媒介される活性を阻害する。本明細書中で用いられるように、用語「中和抗体」とは、アッセイに依存して、約２０〜１２０％だけ、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれ以上だけ、ＧＤ２依存性活性を阻害することができる抗体をいう。ＧＤ２依存性活性を阻害する抗ＧＤ２抗体の能力は、本明細書中に記載されているように、および／または当該分野で知られているように、好ましくは、少なくとも１つの適当なアッセイによって評価される。
【０１５３】
述べられたように、当該発明は、本明細書中に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一である配列における、アミノ酸を含む、抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖、およびＣＤＲにも関する。そのような抗ＧＤ２抗体は、本明細書中で特定されるように、天然突然変異またはヒト操作いずれかからの、１またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。好ましくは、そのような抗体または抗原または結合断片およびそのような鎖またはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性で持って、ヒトＧＤ２に結合することができる。当業者であれば認識するであろうように、本発明は、本発明の少なくとも１つの生物学的に活性な抗体を含む。生物学的に活性な抗体は、天然の（非合成）、内因性または関連するかつ公知の抗体のそれの少なくとも２０％、３０％、または４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、または７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、または９５％〜１００％の特異的活性を有する。酵素活性および基質特異性の指標をアッセイし、および定量する方法は当業者によく知られている。
【０１５４】
もう１つの態様において、本発明は、有機部位の共有結合による付着によって修飾された、本明細書中で記載されたようなヒト抗体および抗原結合断片に関する。そのような修飾は改良された薬物動態学的特性（例えば、増大したイン・ビボ血清中半減期）でもって抗体または抗原結合断片を生じさせることができる。有機部位は線状または分岐した親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基であり得る。特別な実施形態において、親水性ポリマー基は約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、またはポリビニルピロリドンであり得るが、脂肪酸または脂肪酸エステル基は約８〜約４０の炭素原子を含み得る。
【０１５５】
当該発明の修飾された抗体および抗原結合断片は、該抗体に直接的にまたは間接的に共有結合した１またはそれ以上の有機部位を含むことができる。当該発明の抗体または抗原結合断片に結合した各有機部位は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。本明細書中で用いるように、用語「脂肪酸」はモノ−カルボン酸およびジ−カルボン酸を含む。「親水性ポリマー基」は、該用語を本明細書中で用いるように、オクタンに水よりもより溶解する有機ポリマー、例えば、ポリリシンをいう。かくして、ポリリシンの共有結合付着によって修飾された抗体は本発明によって含まれる。本発明の抗体を修飾するのに適した親水性ポリマーは、線状または分岐状であり得るが、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧ等）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖等）、親水性アミノ酸のポリマー、（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパルテート等）、ポリアルカンオキサイド（例えば、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド等）、およびポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、別々の分子存在として、約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、転写体がダルトンで表してポリマーの平均分子量であるＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００を用いることができる。親水性ポリマー基は１〜約６のアルキル、脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適当な方法を使用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーは脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートにカップリングさせることができ、および脂肪酸または脂肪酸エステル上の（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化された）活性化されたカルボキシレートはポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。
【０１５６】
本発明の抗体を修飾するのに適当な脂肪酸および脂肪酸エステルは、飽和とすることができ、または不飽和の１もしくはそれ以上の単位を含有することができる。当該発明の抗体を修飾するのに適した脂肪酸は、例えば、ｎ−ドデカノエート、ｎ−テトラデカノエート、ｎ−オクタデカノエート、ｎ−エイコサノエート、ｎ−ドコサノエート、ｎ−トリアコンタノエート、ｎ−テトラコンタノエート、シス−．デルタ．９−オクタデカノエート、全てのシス−．デルタ．５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸等を含む。適当な脂肪酸エステルは、線状または分岐状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノ−エステルを含む。低級アルキル基は、１〜約１２、好ましくは１〜約６の炭素原子を含むことができる。
【０１５７】
修飾されたヒト抗体および抗原結合断片は、１またはそれ以上の修飾剤での反応によるような、適当な方法を用いて調製することができる。「修飾剤」とは、該用語が本明細書中で用いられるように、活性化基を含む適当な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）をいう。「活性化基」は、適当な条件下で、第二の化学基と反応し、それにより、修飾剤と第二の化学基との間の共有結合を形成することができる化学部位または機能的基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）のような親電子基を含む。チオールと反応することができる活性化基は、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）等を含む。アルデヒド機能性基はアミン−またはヒドラジド含有分子にカップリングさせることができ、およびアジド基は酸化リン基と反応させて、ホスホルアミデートまたはホスホルイミド連結を形成することができる。活性化基を分子に導入するための適当な方法は当該分野で知られている（例えば、Ｈｅｒｎａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）参照）。活性化基は直接的に有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に結合させることができ、またはリンカー部位、例えば、二価Ｃ１−Ｃ１２基を介して結合させることができ、ここに、１またはそれ以上の炭素原子は酸素、窒素、または硫黄のようなヘテロ原子によって置き換えることができる。適当なリンカー部位は、少数の名称を挙げれば、例えば、テトラエチレングリコール、−−（ＣＨ２）３−−、−−ＮＨ−−。リンカー部位を含む修飾剤は、例えば、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレート間にアミド結合を形成することによって生じさせることができる。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理によって生成物から除去して、記載されたようにもう１つのカルボキシレートにカップリングさせることができる第一級アミンを露出させることができまたは無水マレイン酸と反応させることができ、および得られた生成物は環化させて脂肪酸の活性化されたマレイミド誘導体を生じさせることができる。（例えば、この参照によりこの教示全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９２  １６２２１号パンフレット参照）。
【０１５８】
当該発明の修飾された抗体は、ヒト抗体または抗原結合断片を修飾剤と反応させることによって生じさせることができる。例えば、有機部位を、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することによって、非部位特異的な様式で抗体に結合させることができる。修飾されたヒト抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば、鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって調製することもできる。次いで、還元された抗体または抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、当該発明の修飾された抗体を生じさせることができる。本発明の抗体の特異的部位に結合する有機部位を含む修飾されたヒト抗体および抗原結合断片は、逆蛋白質分解（Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：１４７−１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：４１１−４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９−６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６−４６３（１９９７））、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載された方法のような適当な方法を用いて調製することができる。
【０１５９】
当該発明の抗体は、以下に示すように、広い範囲の親和性（ＫＤ）でもってヒトＧＤ２と結合することができる。
【０１６０】
抗原に対する抗体の親和性または結合活性はいずれかの適当な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；および本明細書中で記載された方法参照）。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定するならば変化し得る。かくして、親和性および他の抗原結合パラメーターの測定は、好ましくは、抗体−抗原の標準化された溶液、および本明細書中で記載された緩衝液のような標準化された緩衝液でなされる。
【０１６１】
本発明の方法および組成物で有用な抗ＧＤ２抗体は、ＧＤ２への結合、好ましくは低い傷害性を有することによって特徴付けられる。特に、可変領域、定常領域、およびフレームワークのような個々の成分が個々に、および／または集合的に、選択的に、かつ好ましくは低い免疫原性を保有する、本発明の抗体、特定の断片、または変種は、本発明で有用である。本発明で用いることができる抗体は選択的に、兆候の測定可能な緩和ならびに低いおよび／または許容される傷害性でもって延長された期間の間患者を治療するそれらの能力によって特徴付けられる。低いまたは許容される免疫原性および／または親和性ならびに他の適当な特性は、達成される治療的結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、本明細書中においては、治療された患者の約７５％未満、また好ましくは約５０％未満において、有意なＨＡＨＡ、ＨＡＣＡまたはＨＡＭＡ応答を生起させる、および／または治療された患者において低い力価を生起させるとして定義される（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１２５−１１２７（１９９４））。
【０１６２】
少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルのヒト化された抗体である二特異的、ヘテロ特異的、へテロコンジュゲートまたは同様な抗体を用いることもできる。本場合においては、結合特異性の１つは少なくとも１つのＧＤ２蛋白質に対するものであり、他の１つはいずれかの他の抗原に対するものである。二特異的抗体を作成するための方法は当該分野で知られている。伝統的には、二特異的抗体の組換え生産は、免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の共発現に基づくものであり、ここに、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダム仕分けのため、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は、そのうちただ１つが正しい二特異的構造を有する、１０の異なる抗体分子の可能な混合物を生じる。通常はアフィニティークロマトグラフィーの工程によってなされる正しい分子の生成はむしろ面倒であり、および生成物の収率は低い。同様な手法が、例えば、この参照により各々この全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、米国特許第６，２１０，６６８号明細書、第６，１９３，９６７号明細書、第６，１３２，９９２号明細書、第６，１０６，８３３号明細書、第６，０６０，２８５号明細書、第６，０３７，４５３号明細書、第６，０１０，９０２号明細書、第５，９８９，５３０号明細書、第５，９５９，０８４号明細書、第５，９５９，０８３号明細書、第５，９３２，４４８号明細書、第５，８３３，９８５号明細書、第５，８２１，３３３号明細書、第５，８０７，７０６号明細書、第５，６４３，７５９号明細書、第５，６０１，８１９号明細書、第５，５８２，９９６号明細書、第５，４９６，５４９号明細書、第４，６７６，９８０号明細書、国際公開第９１／００３６０号パンフレット、国際公開第９２／００３７３号パンフレット、ＥＰ０３０８９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）；Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．１０，３０１−３１６；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．１０，３１７−３２７に開示されている。
【０１６３】
ある実施形態においては、ＧＤ２に結合する抗体はコンジュゲートしていない形態で用いることができる。他の実施形態において、ＧＤ２に結合する抗体は、例えば、検出可能な標識、薬物、プロドラッグ、または同位体にコンジュゲートさせることができる。
【０１６４】
腫瘍細胞の転移の可能性の尺度として、または組織におけるイン・サイチュ癌腫（例えば、ＤＣＩＳまたはＬＣＩＳ）を同定する方法として、細胞または組織においてＧＤ２発現を検出する方法のような、以下により詳細に記載される当該発明のある方法において、抗ＧＤ２抗体を１またはそれ以上の検出可能な標識にコンジュゲートさせる。そのような使用では、抗体は、色原体、酵素、放射性同位体、同位体、蛍光、毒性、ケミルミネセント、核磁気共鳴コントラスト剤、または他の標識の共有結合または非共有結合付着によって検出可能に標識することができる。
【０１６５】
適当な色原体標識の例はジアミノベンジジンおよび４−ヒドロキシアゾ−ベンゼン−２−カルボン酸を含む。
【０１６６】
適当な酵素標識の例はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含む。
【０１６７】
適当な放射性標識の例は３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５１、１３１１、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ等を含む。１１１Ｉｎは好ましい同位体であり、ここに、それが肝臓による１２５Ｉまたは１３１Ｉ標識ＧＤ２結合抗体の脱ハロゲン化の問題を回避するので、イン・ビボイメージングが用いられる。加えて、この放射性ヌクレオチドはイメージングに対してより好都合なガンマ発光エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．７０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：２８１−２８７（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ＤＰＴＡと共にモノクローナル抗体にカップリングした１１１Ｉｎは非腫瘍性組織、特に肝臓においてほとんど摂取を示さず、従って、腫瘍の局所化の特異性を増強させる（Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。
【０１６８】
適当な非放射性同位体標識の例は１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅを含む。
【０１６９】
適当な蛍光標識の例は１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識、およびフルオレスカミン標識を含む。
【０１７０】
適当なトキシン標識の例はジフテリアトキシン、リシン、およびコレラトキシンを含む。
【０１７１】
ケミルミネセント標識の例はルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を含む。
【０１７２】
核磁気共鳴コントラスト剤の例はＧｄ、Ｍｎ、および鉄のような重金属核を含む。
【０１７３】
前記した標識を抗ＧＤ２抗体に結合させるための典型的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣＭｍ．Ａｃｔａ  ７０：１−３１（１９７６）、およびＳｃｈｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．ＣＭｍ、Ａｃｔａ  ８１：１−４０（１９７７）によって提供される。後者で述べたカップリング技術はグルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸塩方法、ジマレイミド方法、ｍ−マレイミドベンジル−ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル方法であり、その全ての方法はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
外科的処置に続いての残存腫瘍細胞の切除、または転移の予防のような当該発明のある種の治療的アプローチで用いるためには、抗ＧＤ２抗体を１またはそれ以上の薬物、プロドラッグまたは同位体にコンジュゲートすることができる。好ましいそのようなコンジュゲートは、１またはそれ以上の細胞傷害性剤にコンジュゲートされた、ＧＤ２に結合する、１またはそれ以上のリガンド、例えば、１またはそれ以上の抗体またはその断片、誘導体または変種を含み；そのようなコンジュゲートは、当該発明によって提供される腫瘍転移の治療および予防の方法で有用である。当該発明のあるそのような実施形態によると、抗ＧＤ２抗体は細胞傷害性剤にコンジュゲートされる。抗ＧＤ２抗体−細胞傷害性剤コンジュゲートの生成において有用な細胞傷害性、例えば、化学治療剤は当該分野でよく知られており、これに限定されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、微小管ポイズン、およびバンレイシ科アセトゲニンを含む。当該発明のこの態様に従って用いるのに適した他の化学治療剤はよく知られており、当業者は精通しているであろう。
【０１７５】
１またはそれ以上の抗ＧＤ２抗体、およびカリケアミシン、マイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号明細書）、トリコセン、およびＣＣ１０６５のような１またはそれ以上の小分子トキシンもまた本明細書中において考えられる。当該発明の１つの実施形態において、抗ＧＤ２抗体は１またはそれ以上のマイタンシン分子（例えば、抗ＧＤ２抗体当たり約１〜約１０のマイタンシン分子）にコンジュゲートされる。マイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換することができ、これはＭａｙ−ＳＨ３に還元することができ、および修飾された抗ＧＤ２抗体と反応させて（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））、マイタンシノイド−抗ＧＤ２抗体コンジュゲートを生じさせることができる。
【０１７６】
別法として、抗ＧＤ２抗体は１またはそれ以上のカリケアミシン分子にコンジュゲートさせることができる。抗生物質のカリケアミシンファミリーは、ピコモル下濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせることができる。カリケアミシンの構造的アナログを用いることができる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）およびＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。
【０１７７】
１またはそれ以上の抗ＧＤ２抗体とのコンジュゲートを生じさせるのに用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合性活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリフトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、１９９３年１０月２８日に英語で公開された国際公開第９３／２１２３２号パンフレット参照。マイタンシノイドもまた１またはそれ以上の抗ＧＤ２抗体にコンジュゲートすることもできる。
【０１７８】
本発明では、さらに、核酸分解活性を持つ化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼのようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）とコンジュゲートさせた抗ＧＤ２抗体が考えられる。
【０１７９】
当該発明の治療方法で用いられる放射性コンジュゲーテッド抗ＧＤ２抗体の生産のために、種々の放射性同位体も入手可能である。その例は２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５１、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、およびＬｕの放射性同位体を含む。
【０１８０】
抗ＧＤ２抗体および細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−Ｉ−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミレート）ＨＣｌのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性なエステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ｈｉｓ−アジド化合物、（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリレン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて作成することができる。例えば、リシンイミュノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。１４炭素−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗ＧＤ２抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレット参照。リンカーは、細胞において細胞傷害性薬物の放出を促進する「開裂可能なリンカー」であってよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））を用いることができる。
【０１８１】
別法として、抗ＧＤ２抗体リガンドおよび細胞傷害性剤を含む融合蛋白質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作成することができる。
【０１８２】
また、本発明は、天然に生じない組成物、混合物または形態で提供される、本明細書中に記載された、および／または当該分野で知られた、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６またはそれ以上のその抗ＧＤ２抗体を含む少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物も提供する。そのような組成物は、本明細書中に記載された抗体のＣＤＲ領域、またはその特定の断片、ドメインまたは変種の連続アミノ酸の７０〜１００％から成る群から選択される抗ＧＤ２抗体アミノ酸配列の、少なくとも１つまたは２つの全長Ｃ−および／またはＮ末端欠失変種、ドメイン、断片、または特定の変種を含む天然に生じない組成物を含む。好ましい抗ＧＤ２抗体組成物は、本明細書中に記載された抗ＧＤ２抗体配列の少なくとも１つのＣＤＲまたはＬＢＲ含有部分として、少なくとも１つまたは２つの全長の断片、ドメインまたは変種を含む。さらなる好ましい組成物は、本明細書中に記載された抗ＧＤ２  ＡｂのＣＤＲ領域の７０〜１００％の少なくとも１つの４０〜９９％を含む。そのような組成物のパーセンテージは、当該分野で知られているように、または本明細書中で記載されるように、液体または乾燥溶液、混合物、懸濁液、エマルジョン、またはコロイドとしての重量、容量、濃度、モル濃度、または質量モル濃度による。
【０１８３】
本発明の抗ＧＤ２抗体組成物は、さらに、選択的に、さらに、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、これに限定されるものではないが、ＴＮＦ抗体または断片、可溶性ＴＮＦ受容体または断片、その融合蛋白質、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、ヒドロキシクロロキノン硫酸、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、麻薬、非ステロイド抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉ブロッカー、抗微生物剤（例えば、アミノグルコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、もう１つの抗微生物剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、糖尿病関連剤、ミネラル、栄養素、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、抗下痢剤、鎮咳剤、抗嘔吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固剤、エリスロポエチン（例えば、エペオチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポジェン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、リューキン）、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、サイクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン代替薬物、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳剤、シクロプレジック、アルキル化剤、抗代謝産物剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬、抗鬱剤、抗躁剤、抗精神病剤、抗不安剤、低張剤、交感神経作動薬、刺激剤、ドネペジル、タクリン、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入されたステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたはアナログ、ドマーゼ（ｄｏｍａｓｅ）アルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニスト、および細胞療法から選択される少なくとも１つを含む、変調、治療、または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物、または患者に対する少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含むいずれかの適切かつ有効な量の組成物または医薬組成物の少なくとも１つを含むことができる。そのようなサイトカインの非限定的例は、限定されるものではないが、ＩＬ−１〜ＩＬ−３４のいずれかを含む。適当な投薬量は当該分野でよく知られている。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）参照。
【０１８４】
そのような抗ガン剤または抗感染剤は、本発明の少なくとも１つの抗体と会合した、結合した、共製剤化された、または共投与されるトキシン分子も含むことができる。トキシンは、選択的に、病原性細胞または組織を選択的に殺傷するように作用することができる。病原性細胞は癌または他の細胞であり得る。そのようなトキシンは、これに限定されるものではないが、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、ヘビトキシン、または細菌トキシンの少なくとも１つから選択される、トキシンの少なくとも１つの機能的細胞傷害性ドメインを含む精製されたまたは組換えトキシンまたはトキシン断片であり得る。該用語トキシンは、いずれかの死滅の結果となり得る、トキシンショックを含めた、ヒトおよび他の哺乳動物においていずれかの病原性疾患を引き起こし得るいずれかの天然に生じる、突然変異体または組換え細菌またはウイルスによって生産されたエンドトキシンおよびエキソトキシンの双方も含む。そのようなトキシンは、これに限定されるものではないが、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）、熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌サイトトキシン、アエロモナスエンテロトキシン、トキシンショック症候群トキシン−１（ＴＳＳＴ−１）、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、またはＣ（ＳＥＣ）、ストレプトコッカスエンテロトキシン等を含むことができる。そのような細菌は、これに限定されるものではないが、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸内出血Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、血清型０１５７：Ｈ７の株）、スタフィロコッカス種（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、赤痢菌種（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｏｂｒｉａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）、Ｐｌｅｉｓｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｖｉｂｒｉｏｓ種（例えば、Ｖｉｂｒｉｏｓ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏｓ  ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの種の株を含む。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｐｐ１−１３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ２３９−２５４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１−１３４（１９９１）；Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５−７１１（１９９０）参照。
【０１８５】
本発明の抗ＧＤ２抗体化合物、組成物または組合せは、さらに、これに限定されるものではないが、希釈剤、バインダー、安定化剤、緩衝液、塩類、親油性溶媒、保存剤、補助剤等のようないずれかの適当な補助物質の少なくとも１つを含むことができる。医薬上許容される補助物質が好ましい。そのような滅菌溶液の非限定的例、またはそのような滅菌溶液を調製する方法の非限定的例は、限定されるものではないが、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）１９９０のように、当該分野でよく知られている。当該分野でよく知られているように、または本明細書中に記載されたように、抗ＧＤ２抗体、断片または変種組成物の投与の態様、溶解度、および／または安定性に適した医薬上許容される担体をルーチン的に選択することができる。
【０１８６】
本発明の組成物で有用な医薬賦形剤および添加剤は、これに限定されるものではないが、単独で、または１〜９９．９９重量または容量％と組み合わせた、単独で、または組み合わせて存在させることができる、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖を含めた糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖等；および多糖または糖ポリマー）を含む。例示的な蛋白質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン等のような血清アルブミンを含む。緩衝能力においてやはり機能することができる代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等を含む。１つの好ましいアミノ酸はグリシンである。
【０１８７】
本発明で用いるのに適した炭水化物賦形剤は、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等のような単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セルビオース等のような二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉等のような多糖；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトール等のようなアルジトールを含む。本発明で用いられる好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、およびラフィノースである。
【０１８８】
抗ＧＤ２抗体組成物は緩衝液またはｐＨ調整剤も含むことができ；典型的には、緩衝液は有機酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝液はクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、またはフタル酸の塩のような有機酸塩；Ｔｒｉｓ、トロメタミン塩酸塩、またはリン酸緩衝液を含む。本発明の組成物で用いる好ましい緩衝液はクエン酸塩のような有機酸塩である。
【０１８９】
加えて、本発明の抗ＧＤ２抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、フレーバー剤、抗微生物剤、抗甘味剤、抗酸化剤、静電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」および「ＴＷＥＥＮ８０」のようなポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含むことができる。
【０１９０】
本発明による抗ＧＤ２抗体、部分または変種組成物で用いるのに適したこれらおよびさらなる公知の医薬賦形剤および／または添加剤は、例えば、この参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  &  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，１９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｌｉａｍ，（１９９５），において、および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」，５２．ｓｕｐ．ｎｄ．ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）にリストされているように、当該分野で公知である。好ましい担体または賦形剤物質は炭水化物（例えば、糖類およびアルジトール）および緩衝液（例えば、クエン酸塩）またはポリマー剤である。
【０１９１】
前記したように、本発明は、医薬上許容される製剤中に少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む、生理食塩水または選択された塩を含む好ましくはリン酸緩衝液である安定な製剤、ならびに保存剤を含有する保存された溶液および製剤、ならびに医薬または動物使用に適した多用途保存製剤を提供する。保存された製剤は少なくとも１つの公知の保存剤、または選択的に、水性希釈剤中の、少なくとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル第二水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはその混合物から成る群から選択される保存剤を含有する。いずれの適当な濃度または混合物も、０．００１〜５％、またはこれに限定されるものではないが、０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、またはいずれかの範囲またはその中の値のような、いずれかの範囲またはその中の値のように当該分野で知られているように用いることができる。非限定的例は、保存剤無し、０．１〜２％のｍ−クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１〜３％ベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％チメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％フェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）等を含む。
【０１９２】
前記したように、本発明は、包装材料、および選択的に、水性希釈剤中の、所定の緩衝液および／または保存剤を含む少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の溶液を含む少なくとも１つのバイアルを含む製品を提供し、ここに、該包装材料は、そのような溶液が１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間、またはそれ以上の期間にわたって保持できることを示す標識を含む。本発明は、さらに、包装材料、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む第一のバイアル、および所定の緩衝液または保存剤の水性希釈剤を含む第二のバイアルを含む製品を含み、ここに、該包装材料は患者に、水性希釈剤中の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を復元させて、２４時間またはそれ以上の期間にわたって保持することができる溶液を形成するように指示する標識を含む。
【０１９３】
本発明に従って用いる少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、哺乳動物細胞またはトランスジェニック製剤を含めた組換え手段によって生成させることができ、または本明細書中に記載されたように、または当該分野で知られているように、他の生物学的源から精製することができる。
【０１９４】
本発明の製品における少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の範囲は、より低いおよびより高い濃度は操作可能であって、意図した送達ビークルに依存し、例えば、溶液製剤は経皮パッチ、肺、経粘膜、または浸透圧またはミクロポンプ方法とは異なるであろうが、湿潤／乾燥システムにおいては、復元に際して、約１．０マイクログラム／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を生じる量を含む。
【０１９５】
好ましくは、水性希釈剤は、選択的に、さらに、医薬上許容される保存剤を含む。好ましい保存剤はフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはその混合物から成る群から選択されるものを含む。製剤で用いる保存剤の濃度は、抗微生物効果を生じさせるのに十分な濃度である。そのような濃度は選択された保存剤に依存し、かつ当業者によって容易に決定される。
【０１９６】
他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、保存増強剤を選択的にかつ好ましくは希釈剤に加えることができる。グリセリンのような等張剤は、既知の濃度で通常用いられる。生理学的に許容される緩衝液を好ましくは加えて、改良されたｐＨ制御を提供する。製剤は約ｐＨ４〜約ｐＨ１０のような広い範囲のｐＨ、および好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲、および約６．０〜約８．０の最も好ましい範囲をカバーすることができる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８と約７．８間のｐＨを有する。好ましい緩衝液はリン酸緩衝液、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【０１９７】
Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、プルロニックＦ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような医薬上許容される可溶化剤、またはポリソルベート２０または８０またはポロキサマー１８４または１８８のような非イオン界面活性剤、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））ポリル、他のブロックコポリマー、およびＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのようなキレーターのような他の添加剤を、選択的に、製剤または組成物に加えて、凝集を低下させることができる。これらの添加剤は、ポンプまたはプラスチック容器を用いて、製剤を投与すれば特に有用である。医薬上許容される界面活性剤の存在は蛋白質が凝集する傾向を緩和する。
【０１９８】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、および水性希釈剤中の、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはその混合物から成る群から選択される保存剤を混合することを含む方法によって調製することができる。水性希釈剤中での少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体および保存剤の混合は、慣用的な溶解および混合手法を用いて行われる。適当な製剤を調製するために、例えば、緩衝化溶液中の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の測定された量を、緩衝化溶液中の所望の保存剤と、所望の濃度における蛋白質および保存剤を提供する十分な量にて合わせる。この方法のバリエーションは当業者によって認識されるであろう。例えば、成分が加えられる順序、さらなる添加剤が用いられるか否か、製剤が調製される温度およびｐＨは、全て、濃度および用いる投与の手段に対して最適化することができる因子である。
【０１９９】
特許請求された製剤は、清澄な溶液として、または水性希釈剤中に水、保存剤および／または賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液および／または生理食塩水および選択された塩を含有する第二のバイアルで復元される少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体において凍結乾燥されたバイアルを含むデュアルバイアルとして患者に供することができる。単一溶液バイアルまたは復元を必要とするデュアルバイアルいずれかは複数回数再使用することができ、患者処置の単一または複数サイクルに十分なものとすることができ、かくして、現在入手可能なものよりもより便宜な処置計画を供することができる。
【０２００】
本特許請求される製品は、直後〜２４時間またはそれ以上までの期間にわたっての投与で有用である。従って、現在特許請求される製品は、有意な利点を患者に供する。本発明の処方は、選択的に、約２℃〜約４０℃の温度にて安全に保存することができ、および延長された時間の間、蛋白質の生物学的活性を保持することができ、かくして、溶液を６、１２、１８、２４、４８、７２、または９６時間またはそれ以上の期間にわたって保持でき、および／または用いることができることを示す包装標識を可能とする。保存された希釈剤を用いるならば、そのような標識は１〜１２カ月まで、半年、１年と半年、および／または２年までの使用を含むことができる。
【０２０１】
当該発明における少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の溶液は、水性希釈剤中の少なくとも１つの抗体を混合することを含む方法によって調製することができる。混合は慣用的な溶解および混合手法を用いて行われる。適当な希釈剤を調製するには、例えば、水または緩衝液中の少なくとも１つの抗体の測定された量は十分な量で合わせて、所望の濃度の蛋白質および、選択的に、保存剤または緩衝液を提供する。この方法のバリエーションは、当業者によって認識されるであろう。例えば、成分が加えられる順番、さらなる添加剤が用いられるか否か、製剤が調製される温度およびｐＨは、全て、濃度および用いる投与の手段について最適化することができる因子である。
【０２０２】
特許請求される製品は、清澄な溶液として、または水性希釈剤を含有する第二のバイアルで復元される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして患者に提供することができる。単一の溶液のバイアル、または復元を必要とするデュアルバイアルいずれかを、多数回再使用することができ、および患者の処置の単一または複数サイクルの間十分なものとすることができ、かくして、現在入手可能なよりもより便宜な処置計画法を提供する。
【０２０３】
特許請求された製品は、薬局、クリニック、または他のそのような機関および施設に、清澄な溶液、または水性希釈剤を含有する第二のバイアルで復元される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体のバイアルを含むデュアルバイアルを供することによって、間接的に患者に提供することができる。この場合、清澄な溶液はサイズが１リットルまで、またはそれよりも大きいまでとすることができ、少なくとも１つの抗体溶液のより小さな部分が、より小さなバイアルへの移動のために１回または複数回回収することができ、および薬局またはクリニックによってそれらの顧客および／または患者に提供することができる大きな貯蔵器を提供する。
【０２０４】
これらの単一バイアルシステムを含む認められたデバイスは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  （Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、スイス国；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｍｄ，Ｏｒｅｇ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｍｅｄｉ−ＪｅｃｔＣｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）によって作成され、または開発されたように、ＢＤ  Ｐｅｎｓ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）のような溶液の送達のためのペン−インジェクターデバイスを含む。デュアルバイアルシステムを含む認められたデバイスは、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）のような復元溶液の送達のためのカートリッジ中で凍結乾燥された薬物を復元するためのペン−インジェクターシステムを含む。
【０２０５】
現在特許請求されている製品は包装材料を含む。包装材料は、取締当局によって要求される情報に加えて、製品が用いられる条件を提供する。本発明の包装材料は、患者に対し、水性希釈剤中で少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を復元して、溶液を形成し、および２つのバイアルの湿潤／乾燥製品について２〜２４時間またはそれ以上の期間にわたって該溶液を用いるよう指令することを提供する。単一のバイアルの溶液製品では、標識は、そのような溶液が２〜２４時間またはそれ以上の期間にわたって用いることができることを示す。現在特許請求される製品は、ヒトの医薬製品の使用で有用である。
【０２０６】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体および選択された緩衝液、好ましくは、生理食塩水または選択された塩を含有するリン酸緩衝液を混合することを含む方法によって調製することができる。水性希釈剤中での少なくとも１つの抗体および緩衝液の混合は、慣用的な溶解および混合手法を用いて行われる。適当な製剤を調製するには、例えば、水または緩衝液中の測定された量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度の蛋白質および緩衝液を供するのに十分な量にて、水中の所望の緩衝化剤と合わせられる。この方法のバリエーションは、当業者によって認識されるであろう。例えば、成分が加えられる順序、さらなる添加剤が用いられるか否か、製剤が調製される温度およびｐＨは、全て、濃度および用いる投与の手段について最適化することができる全ての因子である。
【０２０７】
特許請求される安定なまたは保存された製剤は、清澄な溶液として、または水性希釈剤中に保存剤または緩衝液および賦形剤を含有する第二のバイアルで復元される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含むデュアルバイアルとして患者に提供することができる。単一の溶液のバイアル、または復元を必要とするデュアルバイアルのいずれも、複数回再使用でき、患者の処置の単一または複数サイクルで十分であり得るが、かくして、現在入手可能なよりも便宜な処置計画法を提供する。
【０２０８】
本明細書中に記載された安定なまたは提示された製剤または溶液いずれか中の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、当該分野でよく知られているように、ＳＣまたはＩＭ注射；経皮、肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、または当業者によって認識される他の手段を含めた、種々の送達方法を介して本発明に従って患者に投与することができる。
【０２０９】
本発明の１つの実施形態において、開示の抗ＧＤ２抗体を含む医薬組成物は、生物、特に、動物、好ましくは哺乳動物へのヒト化抗体の投与を容易とする。特別な哺乳動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、およびブタ動物、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。ヒトは特に好ましい。
【０２１０】
ＧＤ２に対する高親和性の中和キメラまたはヒト抗体は、ＧＤ２が発現される、例えば、ＧＤ２が>５０％の黒色腫（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７３，４２−４９）、骨肉腫の８８％（Ｈｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７，５３７７−５３８８）、および脂肪肉腫、線維肉腫、悪性線維状組織球腫、平滑筋肉腫、および紡錘細胞肉腫（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  ７０，６３３−６３８）、ならびに脳腫瘍（Ｌｏｎｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８２，４５−５４）において発現される病気で用いるのが望ましいであろう。抗ＧＤ２抗体は黒色腫（Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３，１９−２４；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．５，１４３０−１４４０；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５５，７６１−７７４）、肉腫（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，前掲；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｈｅ  ｆｉｆｔｈ  Ａｓｉａ  ａｎｄ  Ｏｃｅａｎｉａ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，ｐ．１０４）、小細胞肺癌（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３，１４５−１４９）、脳腫瘍（Ａｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２２，４１９−４２６）を持つ患者において、ｉｖ注射によって、ならびにオマヤ貯蔵器を用いる区画療法（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５，５４６５−５４７０）によってテストされた。ＧＤ２は網膜芽細胞腫（Ｃｈａｎｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２８，３６９−３７３）およびＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞白血病細胞（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０，１９７２−１９７６）に対する腫瘍標的でもある。１つの好ましい態様において、開示の抗ＧＤ２抗体を用いて、神経芽細胞腫を治療することができる。抗ＧＤ２抗体またはその誘導体を、単一の剤として、または他の治療剤と組み合わせて用いることができる。加えて、これらのＭａｂは化学増感剤として用いることができ、それにより、それらの使用は細胞傷害性剤の治療効力を増加させることができる。これらの抗体は放射性増感剤として用いることができ、それにより、それらの使用は放射線照射の効力を改良することができる。それらは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、および／またはＩＦＮアルファのような他の腫瘍−免疫調節剤と組み合わせて用いることもできる。加えて、抗ＧＤ２抗体は、抗ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ−２、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＣＤ５２、ＣＤ２０、ＲＳＶ蛋白質、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体等のような他のモノクローナル抗体；ならびにリツキサン、ヘルセプチン、ミロタルグ、カンパス、ゼバリン、ベキサール、エルビタックス、アバスチン、およびベクチビックスを含めた商業的に承認された抗体���組み合わせて用いることができる。
【０２１１】
かくして、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を用い、当該分野で知られたように、または本明細書中で記載されたように、細胞、組織、器官、動物、または患者において、少なくとも１つのＧＤ２関連病を変調し、または治療するための方法も提供する。
【０２１２】
本発明は、これに限定されるものではないが：多発性骨髄腫、白血病、急性白血病、急性リンパ芽細胞白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、毛状細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポシ肉腫、結直腸、癌腫、腎臓細胞癌腫、膵臓癌腫、前立腺癌腫、鼻咽頭癌腫、悪性組織球症、腫瘍随伴症候群／悪性の高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性病、癌関連骨再吸収、癌関連骨疼痛；癌転移の抑制；癌悪液質の緩和；および糸球体間質増殖性糸球体腎炎等のうちの少なくとも１つを含めた、細胞、組織、器官、動物、または患者において少なくとも１つの悪性病を変調または治療する方法を含む。そのような方法は、選択的に、そのようなＧＤ２抗体の前、同時または後の投与によって、放射線療法、抗脈管形成剤、化学治療剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等と組み合わせて用いることができる。
【０２１３】
本発明は、これに限定されるものではないが、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身開始若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、骨関節炎、炎症性腸病、潰瘍形成性結腸炎、全身紅斑性狼瘡、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身血管炎／ヴェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管再開通手法、アレルギー性／アトピー性病、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏間質性肺炎、移植、器官移植拒絶、移植片対宿主病、全身炎症応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、火傷、電離放射線暴露、急性膵臓炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール誘導肝炎、慢性炎症性病状、サルコイドーシス、クローン病状、鎌状細胞貧血症、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性病、過敏反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血病、血小板減少症、いずれかの器官または組織の移植片拒絶、腎臓移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、皮膚同種移植片拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植片拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺インプラント拒絶、副甲状腺移植拒絶、いずれかの器官または組織の異種移植片拒絶、同種移植片拒絶、抗受容体過敏反応、グラーベ病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介細胞傷害性、ＩＩＩ型過敏反応、全身紅斑性狼瘡、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、モノクローナル、免疫グロブリン異常症、および皮膚変化症候群）、多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、モノクローナル免疫グロブリン異常症、皮膚変化症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性白斑、脈管炎、ＭＩ後心臓切開症候群、ＩＶ型過敏、接触皮膚炎、過敏肺炎、同種移植片拒絶、細胞内生物による肉芽腫、薬物感受性、代謝／突発性、ウイルソン病、ヘモクロマトーシス、アルファ−１−抗トリプシン欠乏症、糖尿病性網膜障害、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性繊維症、新生慢性肺病、慢性閉塞性肺病（ＣＯＰＤ）、家族性ヘマトファゴシティクリンパ組織球増多症、皮膚科学的疾患、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸玉体腎炎、急性腎臓不全、血液透析、尿毒症、毒性、妊娠高血圧腎症、ｏｋｔ３療法、抗ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、これに限定されるものではないが、衰弱、貧血、悪液質等を含む）、慢性サリシレート中毒、睡眠時無呼吸、肥満、心不全、静脈洞炎、炎症性腸病等の少なくとも１つを含めた、細胞、組織、器官、動物または患者において、少なくとも１つのＧＤ２媒介免疫関連病を変調し、または治療するための方法も提供する。例えば、この参照により各々その全体が本明細書に組み込まれる、ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ−１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９）、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）参照。
【０２１４】
本発明は、これに限定されるものではないが、細菌、ウイルスおよび真菌感染、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ等）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症候群／血栓溶解血小板減少性紫斑病、マラリヤ、デング出血性熱、リーシュマニア症、らい病、毒ショック症候群、ストレプトトコッカス筋炎、ガス壊疽、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、カリニ肺炎、骨盤炎症病、睾丸炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザａ、エプスタイン−バールウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌髄膜炎等を含めた、急性または慢性細菌感染、急性および慢性寄生虫、または感染性プロセスの少なくとも１つをまとめた、細胞、器官、動物、または患者において少なくとも１つの感染症変調または治療する方法も提供する。
【０２１５】
そのような方法のいずれも、選択的に、有効量の、少なくとも１つの組成物、または少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む医薬組成物を、変調、治療、または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物、または患者に投与することを含むことができる。
【０２１６】
本発明のいずれの方法も、有効量の、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む組成物または医薬組成物を、変調、治療、または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物、または患者に投与することを含むことができる。そのような方法は、選択的に、さらに、そのような免疫病または悪性病を治療するための共投与または組合せ療法を含むことができ、ここに、該少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、その特定の部分または変種、の投与は、さらに、同時前、および／または後に少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、これに限定されるものではないが、ＴＮＦ抗体または断片、可溶性ＴＮＦ受容体または断片、その融合蛋白質、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト）、ＩＬ−１８抗体または断片、小分子ＩＬ−１８アンタゴニストまたはＩＬ−１８受容体結合部分、（ＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１ベータを含めた）ＩＬ−１抗体または断片、可溶性ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキセート、アウラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、チオリンゴ酸菌ナトリウム、ヒドロキシクロロキン硫酸、レフルノマイド、スルファサラジン、放射線療法、抗脈管剤、化学療法剤、サリドマイド筋肉弛緩剤、麻薬、非ステロイド抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋肉ブロッカー、高微生物（例えば、アミノグルコシド、抗真菌、抗寄生虫、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、もう１つの抗微生物剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、糖尿病関連剤、ミネラル、栄養素、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、エリスロピエイチン（例えば、エポエチンアルファ）、フルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポゲン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン）、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、サイクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン代替薬物、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝産物剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬、抗鬱剤、抗躁薬、抗精神病剤、不安解消剤、低張剤、交感神経ミメティック、刺激剤、ドネペジル、タクリン、喘息投薬、ベータアゴニスト、吸入されたステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたはアナログ、ドマーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも１つを投与することを含む。適当な投与量は当該分野でよく知られている。例えば、この参照により各々その全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．���２０００）参照。
【０２１７】
（さらに、本発明の少なくとも１つの抗体、その特定の部分および変種を含む）本発明の組成物、組合せ療法、共投与、デバイス、および／または方法に適したＴＮＦアンタゴニストは、これに限定されるものではないが、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、およびＴＮＦに特異的に結合する受容体分子；サリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ペントキシフィリンおよびロシプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体アンタゴニストおよびＡ２ｂアデノシン受容体増強剤のような、ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出または標的細胞に対するその作用を妨げ、および／または阻害する化合物；マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤のような、ＴＮＦ受容体シグナリングを妨げ、および／または阻害する化合物；メタロプロテイナーゼ阻害剤のような、膜ＴＮＦ開裂をブロックしおよび／または阻害する化合物；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル）のような、ＴＮＦ活性をブロックし、および／または阻害する化合物；およびＭＡＰキナーゼ阻害剤のような、ＴＮＦ生産および／または合成をブロックし、および／または阻害する化合物を含む。
【０２１８】
本発明のいずれの方法も、有効量の、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む組成物または医薬組成物を、変調、治療、または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物、または患者に投与することを含む、ＧＤ２媒介障害、またはＣＤ２発現によって特徴付けられる障害を治療する方法を含むことができる。そのような方法は、選択的に、さらに、そのような免疫病を治療するための共投与または組合せ療法を含むことができ、ここに、該少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、その特定の部分または変種を投与することは、さらに、前記した少なくとも１つの剤と同時の前および／または後にさらに投与することを含む。
【０２１９】
典型的には、病理学的疾患の治療は、組成物に含有された特異的活性に依存して、平均して、用量当たりの患者のキログラム当たりの少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の少なくとも約０．０１〜５００ミリグラム、好ましくは単一または多数投与当たりの少なくとも約０．１〜１００ミリグラム抗体／患者のキログラムの合計範囲の少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物の有効量または用量を投与することによって行われる。別法として、有効な血清中濃度は単一または多数投与当たり０．１〜５０００ｕｇ／ｍｌの血清中濃度を含むことができる。適当な用量は医療実践者に知られており、勿論、特定の病気状態、投与すべき組成物の特異的な活性、およびいくつかの例において治療を受けている特定の患者に依存して、所望の治療量を達成し、反復された投与、すなわち、特定のモニターされたまたは計量された用量の反復された個々の投与を提供する必要があり得、ここに、個々の投与は所望の日用量または効果が達成されるまで反復される。
【０２２０】
好ましい用量は、選択的に、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９．１、２、３、４、５、６、７、８、９．１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５，８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および／または１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはいずれかの範囲、値またはその一部を含んで、０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１．６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、７５、８０、８５，９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、および／または５０００．ｍｕ．ｇ／ｍｌの単一または複数投与当たりの血清濃度、またはそのいずれかの範囲値または部分の血清中濃度を達成することができる。
【０２２１】
別法として、投与される用量は、特定の剤の薬力学的特徴、および投与の態様および経路；受容者の年齢、健康および体重；兆候の性質および程度、同時処置の種類、処置の頻度、および望まれる効果のような既知の因子に依存して変化し得る。通常、有効成分の用量は体重キログラム当たり約０．１〜１００ミリグラムとすることができる。通常、投与当たり、または徐放形態において、キログラム当たり０．１〜５０、好ましくは０．１〜１０ミリグラムが、所望の結果を得るのに有効である。
【０２２２】
非限定的例として、ヒトまたは動物の治療は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日の少なくとも１つにて、または別法として、または加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２週のうちの少なくとも１つにて、または別法として、または加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０年のうちの少なくとも１つにて、またはそのいずれかの組合せにて、単一の注入または反復された用量を用い、日当たり、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇのような、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの本発明の少なくとも１つの抗体の１回、または期間的用量として供することができる。
【０２２３】
内部投与に適した剤形（組成物）は、一般に、単位または容器当たり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラムの有効成分を含有する。これらの医薬組成物において、有効成分は、通常、組成物の合計重量に基づいて約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在させることになろう。
【０２２４】
非経口投与では、抗体は、医薬上許容される非経口ビークルと共に、会合させて、または別々に提供される、溶液、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビークルの例は水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および１〜１０％ヒト血清アルブミンである。不揮発性油のようなリポソームおよび非水性ビークルを用いることもできる。ビークルまたは凍結乾燥された粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、緩衝液および保存剤）を維持する添加剤を含有することができる。該製剤は公知のまたは適当な技術によって滅菌される。
【０２２５】
適当な医薬担体は、この分野における標準的な文献テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最も最近の版に記載されている。
【０２２６】
非経口投与のための製剤は、共通の賦形剤として、滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレン等を含有することができる。注射用の水性または油性懸濁液は、公知の方法に従って、適当な乳化剤または加湿剤および懸濁化剤を用いることによって調製することができる。注射用の剤は、溶媒中の、水性溶液または滅菌注射溶液または懸濁液のような非毒性の非経口投与可能な希釈剤であり得る。使用できるビークルまたは溶媒として、水、リンゲル液、等張生理食塩水等が供用され；通常の溶媒または懸濁化溶媒として、滅菌不揮発性油を用いることができる。これらの目的にため、天然または合成または半合成脂肪油または脂肪酸；天然または合成または半合成モノ−またはジ−またはトリ−グリセリドを含む任意の種類の不揮発性油および脂肪酸を用いることができる。非経口投与は当該分野で知られており、これに限定されるものではないが、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８５１，１９８号明細書に記載された注射、ガス加圧無針注射デバイス、および米国特許第５，８３９，４４６号明細書に記載されたレーザー・パーフォレーター・デバイスの慣用的な手段を含む。
【０２２７】
当該発明は、さらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、キャビティ内、腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、オマヤ内、眼内、硝子体内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内、または経皮手段による少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物は、特に液状溶液または懸濁液の形態にて、非経口（皮下、筋肉内または静脈内）またはいずれかの他の投与で用いるために；特にこれに限定されるものではないが、クリームおよび坐薬のような半固体形態での、膣または直腸投与で用いるために；これに限定されるものではないが、錠剤またはカプセルの形態のような、頬、または舌下投与のために；またはこれに限定されるものではないが、粉末、点鼻剤、またはエアロゾルまたはある種の剤の形態にて鼻内用に；またはこれに限定されるものではないが、ジメチルスルホキシドのような化学物質を含む、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液、またはパッチ送達系のような経皮用に調製して、皮膚構造を修飾し、または経皮パッチにおける薬物濃度を増加させることができ（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＪｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ「Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９−９０，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）、または蛋白質およびペプチドを含有する製剤の皮膚への適用（国際公開第９８／５３８４７号パンフレット）、またはエレクトロポレーションのような一過的な輸送経路を作り出すための電場の印加を可能とする酸化剤と一緒に調製し、またはイオントフォレシスのような皮膚を通じての荷電した薬物の移動性、またはソノフォレシスのような超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号明細書および第４，７６７，４０２号明細書）を増加させることができる（前記刊行物および特許はこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２８】
肺適用では、好ましくは、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物を、肺または洞の低部気道に到達させるために有効な粒子サイズにて送達される。当該発明によると、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、吸入による治療剤の投与のための当該分野で知られた種々の吸入または鼻デバイスのいずれかによって送達することができる。エアロゾル化された製剤を患者の洞腔または肺胞に沈積させることができるこれらのデバイスは、計量用量吸入器、ネビュライザー、乾燥粉末ジェネレーター、スプレイヤー等を含む。抗体の肺または鼻投与を指令するのに適当な他のデバイスもまた当該分野で知られている。全てのそのようなデバイスは、エアロゾルで抗体を分注するための投与に適した製剤の使用であり得る。そのようなエアロゾルは溶液（水性および非水性双方）または固体粒子のいずれかから成ることができる。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）計量用量吸入器のような計量用量吸入器は、典型的には、プロペラントガスを用い、かつ吸気の間に作動を必要とする（例えば、国際公開第９４／１６９７０号パンフレット、国際公開第９８／３５８８８号パンフレット参照）。少数の名称を挙げれば、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）のような乾燥粉末吸入器、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって市販されるデバイスは、混合された粉末の呼吸−作動を用いる（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６６８，２１８号明細書  Ａｓｔｒａ、ＥＰ２３７５０７  Ａｓｔｒａ、国際公開第９７／２５０８６号パンフレット  Ｇｌａｘｏ、国際公開第９４／０８５５２号パンフレット  Ｄｕｒａ、米国特許第５，４５８，１３５号明細書  Ｉｎｈａｌｅ、国際公開第９４／０６４９８号パンフレット  Ｆｉｓｏｎｓ）。Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネビュライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、およびＡｃｏｒｎ  ＩＩ（登録商標）ネビュライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５，４０４，８７１号明細書  Ａｒａｄｉｇｍ、国際公開第９７／２２３７６号パンフレット）のようなネビュライザー（前記文献をこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、溶液からエアロゾルを生じさせ、他方、計量用量吸入器、乾燥粉末吸入器等は小さな粒子のエアロゾルを生じさせる。商業的に入手可能な吸入デバイスのこれらの特異的例は、本発明の実施に適した特定のデバイスの代表であることが意図され、および本発明の範囲をこれに限定する意図のものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を含む組成物は乾燥粉末吸入器またはスプレイヤーによって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入デバイスのいくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入デバイスによる送達は、便宜には、信頼性があり、再現性があり、および正確である。吸入デバイスは、良好な呼吸性のために、選択的に、小さな乾燥粒子、例えば、約１０ｕｍ未満、好ましくは約１〜５ｕｍを送達することができる。
【０２２９】
ＧＤ２抗体組成物蛋白質を含めたスプレーは、加圧下で、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の懸濁液または溶液をノズルに通すことによって生じさせることができる。ノズルのサイズおよび立体配置、適用される圧力、および液体供給速度は、所望の出力および粒子サイズを達成するように選択することができる。例えば、毛細管またはノズル供給と連結させた電場によって、電子スプレーを生じさせることができる。有利には、スプレイヤーによって送達された少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物蛋白質の粒子は、約１０ｕｍ未満、好ましくは約１ｕｍ〜約５ｕｍの範囲、最も好ましくは約２ｕｍ〜約３ｕｍを有する。
【０２３０】
スプレイヤーで用いるのに適した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物蛋白質の製剤は、典型的には、溶液のｍｌ当たりの、またはｍｇ／ｇｍの、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物蛋白質の約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの濃度の、またはその中のいずれかの範囲または値の、例えば、これに限定されるものではないが、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｍｌまたはｍｇ／ｇｍの、水性溶液中の抗体組成物蛋白質を含む。該製剤は、賦形剤、緩衝液、等張剤、保存剤、界面活性剤、および好ましくは亜鉛のような剤を含むことができる。該製剤は、緩衝液、還元剤、バルク蛋白質、または炭水化物のような抗体組成物蛋白質の安定化のための賦形剤または剤も含むことができる。抗体組成物蛋白質を製剤化するのに有用なバルク蛋白質はアルブミン、プロタミン等を含むことができる。抗体組成物蛋白質を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物はスクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等を含む。抗体組成物蛋白質製剤は、エアロゾルを形成するにおける溶液の霧化によって引き起こされる抗体組成物蛋白質の表面誘導凝集を低下させ、または妨げることができる界面活性剤も含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、およびポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような、種々の慣用的な界面活性剤を使用することができる。量は、一般に、製剤の０．００１と１４重量％間の範囲であろう。本発明の目的で特別に好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０等である。ＧＤ２抗体または特定の部分または変種のような蛋白質の製剤用の当該分野で公知のさらなる剤を製剤に含めることもできる。
【０２３１】
抗体組成物蛋白質は、ジェットネビュライザーまたは超音波ネビュライザーのようなネビュライザーによって投与することができる。典型的には、ジェットネビュライザーにおいては、圧縮された空気源を用いて、オリフィスを通じての高速空気ジェットを引き起こす。ガスがノズルを越えて膨張するにつれ、低圧領域が作り出され、これは液体貯蔵器に連結された毛細管を通じて抗体組成物蛋白質を吸う。毛細管からの液体流は不安定なフィラメントおよび液滴に剪断される。というのは、それはチューブから出て、エアロゾルを作り出すからである。一定範囲の立体配置、流速、およびバッフルタイプを使用して、所望の性能特徴を所与のジェットネビュライザーから達成することができる。超音波ネビュライザーにおいて、高周波数電気エネルギーを用いて、典型的には圧電変換器を使用して振動、機械的エネルギーを作り出す。このエネルギーは、直接的に、またはカップリング流体を通じて抗体組成物蛋白質の処方に伝達され、抗体組成物蛋白質を含むエアロゾルを作り出す。有利には、ネビュライザーによって送達された抗体組成物蛋白質の粒子は約１０ｕｍ未満、好ましくは約１ｕｍ〜約５ｕｍの範囲の、最も好ましくは約２ｕｍ〜約３ｕｍの粒子サイズを有する。
【０２３２】
ジェットまたは超音波いずれかのネビュライザーと共に用いるのに適した少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の製剤は、典型的には、溶液のｍｌ当たり少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体蛋白質の約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの濃度を含む。該製剤は賦形剤、緩衝液、等張剤、保存剤、界面活性剤、および好ましくは亜鉛のような剤を含むことができる。該製剤は、緩衝液、還元剤、バルク蛋白質、または炭水化物のような、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物蛋白質の安定化のための賦形剤または剤を含むこともできる。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物蛋白質を製剤化するのに有用なバルク蛋白質はアルブミン、プロタミン等を含む。少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を製剤化するにおいて有用な典型的な炭水化物はスクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等を含む。該少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体処方は、エアロゾルを形成するにおいて溶液の霧化によって引き起こされた少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の表面誘導凝集を低下させ、または妨げることができる界面活性剤を含むこともできる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステルのような、種々の慣用的な界面活性剤を使用することができる。量は、一般的には、製剤の０．００１と４重量％間の範囲となろう。本発明の目的で特別に好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０等である。抗体蛋白質のような蛋白質の製剤化のための当該分野で公知のさらなる剤は、製剤に含めることもできる。
【０２３３】
計量式吸入器（ＭＤＩ）において、プロペラント、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体、およびいずれかの賦形剤または他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターに含有される。計量弁の作動は、好ましくは、約１０ｕｍ未満、好ましくは約１ｕｍ〜約５ｕｍ、最も好ましくは約２ｕｍ〜約３ｕｍのサイズ範囲の粒子を含有するエアロゾルとしてダイ混合物を放出する。所望のエアロゾル粒子サイズは、ジェットミリング、スプレー乾燥、臨界点凝縮等を含めた、当業者に知られた種々の方法によって生じさせた抗体組成物蛋白質の製剤を使用することによって得ることができる。好ましい計量式吸入器は、３ＭまたはＧｌａｘｏによって製造され、かつヒドロフルオロカーボンプロペラントを使用するものを含む。
【０２３４】
計量式吸入デバイスと共に用いられる少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体の製剤は、一般に、例えば、界面活性剤の助けを借りてプロペラントに懸濁させた、非水性媒体中の懸濁液として、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する微粉砕粉末を含む。該プロペラントは、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタン、ＨＦＡ−１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ヒドロフルオロアルカン−２２７）等を含めた、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンのような、本目的で使用されるいずれの便宜な材料とすることもできる。好ましくは、該プロペラントはヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤はプロペラント中の懸濁液としての少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を安定化させるように選択して、化学的分解等に対して活性な剤を保護することができる。適当な界面活性剤はソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイン酸等を含む。いくつかの場合において、エタノールのような溶媒を用いる溶液エアロゾルが好ましい。蛋白質の製剤用の当該分野で公知のさらなる剤を製剤に含めることもできる。
【０２３５】
当業者であれば、本発明の方法が、本明細書中に記載されていないデバイスを介する少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体組成物の肺投与によって達成できることを認識するであろう。
【０２３６】
経口投与用の製剤は、腸壁の浸透性を人工的に増大させるための補助剤（例えば、レゾルシノール、およびポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのようなノニオン性界面活性剤）の共投与、ならびに酵素分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）およびトラシロール）の共投与に依拠する。経口投与用の固体タイプの剤形の活性な構成化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、澱粉、寒天、アルジネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアガム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成または半合成ポリマー、およびグリセリドを含めた少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は他のタイプの添加剤、例えば、不活性な希釈剤、ステアリン酸マグネシウムのような活滑剤、パラベン、ソルビン酸、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロールのような保存剤、システインのような抗酸化剤、崩壊剤、バインダー、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、フレーバー剤、香料剤等を含有することもできる。
【０２３７】
錠剤および丸剤は、腸被覆製剤にさらに加工することができる。経口投与用の液体製剤は、医療使用で許容される、エマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁液、および溶液製剤を含む。これらの製剤は、該分野で通常に使用される不活性な希釈剤、例えば、水を含有することができる。リポソームもまた、インスリンおよびヘパリンのための薬物送達系としても記載されてきた（米国特許第４，２３９，７５４号明細書）。より最近では、混合アミノ酸の人工ポリマーのマイクロスフィア（プロテイノイド）が、医薬を送達するのに用いられてきた（米国特許第４，９２５，６７３号明細書）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号明細書および米国特許第５，５，８７１，７５３号明細書に記載された担体化合物が、当該分野で知られているように、生物学的に活性な剤を経口送達するのに用いられている。
【０２３８】
粘膜表面を通じての吸収では、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体を投与する組成物および方法は、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性マクロ分子、生物活性ペプチド、および水性連続相を含むエマルジョンを含み、それはエマルジョン粒子の粘膜接着を達成することによって粘膜表面を通じての吸収を促進する（米国特許第５，５１４，６７０号明細書）。本発明のエマルジョンの適用に適した粘膜表面は、角膜、結膜、頬、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、および直腸投与経路を含むことができる。膣または直腸投与のための製剤、例えば、坐薬は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオバター等を含有することができる。鼻内投与用の製剤は固体とすることができ、賦形剤として、例えば、ラクトースを含有し、または点鼻剤の水性または油性溶液とすることができる。頬投与では、賦形剤は糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糊化澱粉等を含む（米国特許第５，８４９，６９５号明細書）。
【０２３９】
経皮投与では、少なくとも１つの抗ＧＤ２抗体は、リポソームまたはポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、またはマイクロスフィア（そうでないことが述べられているのでなければ集合的にマイクロ粒子という）のような送達デバイスにカプセル化される。ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリアンヒドライド、およびポリホスファゼンのような合成ポリマー、およびコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、および他の蛋白質、アルジネートおよび他の多糖、およびその組合せのような天然ポリマーで作成されたマイクロ粒子を含めた多数の適当なデバイスが知られている（米国特許第５，８１４，５９９号明細書）。
【０２４０】
本発明の化合物を、延長された期間にわたって、例えば、１週間〜１年またはそれ以上の期間の間、単一の投与から対象に送達するのが時々望ましくあり得る。種々のゆっくりとした放出、デポ剤、またはインプラント投与形態を利用することができる。例えば、剤形は、体液中での低い程度の溶解性を有する化合物の医薬上許容される非毒性塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ−またはジ−スルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような多塩基性酸との酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等のような多価金属カチオンとの、または例えばＮ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成された有機カチオンとの塩；または（ｃ）（ａ）、および（ｂ）の組合せ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有することができる。加えて、本発明の化合物または、好ましくは、丁度記載されたもののような比較的不溶性の塩は、ゲル、例えば、注射に適した、例えば、ゴマ油とのアルミニウムモノステアレートゲルに製剤化することができる。特に好ましい塩は亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩等である。注射用のもう１つのタイプの遅延放出デポ剤製剤は、例えば、米国特許第３，７７３，９１９号明細書に記載されたポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのような、ゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマーにカプセル化のために分散させた化合物または塩を含有するであろう。化合物、または好ましくは、前記したもののような比較的不溶性の塩もまた、特に、動物で用いるために、コレステロールマトリックスシリコン剤ペレットに処方することもできる。さらなる遅延放出、デポ剤、またはインプラント製剤、例えば、ガスまたは液体リポソームが文献で知られている（米国特許第５，７７０，２２２号明細書および「維持および制御放出薬物送達系」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）。
【０２４１】
本出願を通じて引用された（刊行物文献、発行された特許、公開された特許出願、および共−係属特許出願を含めた）全ての引用された文献の内容は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
当該発明の他の特徴は、本発明の説明のために与えられ、かつそれを限定することが意図されていない例示的な実施形態の以下の記載の進行において明らかとなろう。
【０２４３】
以下の材料および方法は以下の実施例で用いた。
【０２４４】
材料および方法
細胞培養およびヒト組織
ヒト神経芽細胞腫細胞系ＬＡＮ−１はＲｏｂｅｒｔ  Ｓｅｅｇｅｒ博士（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓの小児病院，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）によって提供され、およびＮＢ１６９１はＰｅｔｅｒ  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ博士（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ小児研究病院，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）によって提供された。ＮＫ−９２ＭＩはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから得た。全ての細胞系を３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーターにて、Ｆ１０［１０％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｓｏｕｔｈ  Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地］中で成長させた。正常な組織ならびにＭｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）で得られた異なる組織学的タイプの固形腫瘍試料を液体窒素中でスナップ凍結させた。書面による同意の通知は、ＭＳＫＣＣの治験審査委員会のガイドラインに従って患者および／またはそれらの後見人から得た。
【０２４５】
モノクローナル抗体
ネズミ３Ｆ８は、カッパ軽鎖を持つマウスＩｇＧ３抗体であった（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，２６４２−９）。神経芽細胞腫と反応性であるモノクローナル抗体３Ｆ８（マウスＩｇＧ３、カッパ）、５Ｆ１１（マウスＩｇＭ、カッパ）、および８Ｈ９（マウスＩｇＧ１、カッパ）は従前に記載されている（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，前掲；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４５，８６７−７７；Ｍｏｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，４０４８−５４）。それらは腹水液として生じ、アフィニティークロマトグラフィー：３Ｆ８についてはプロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、８Ｈ９ではプロテインＧ、および５Ｆ１１についてはＣｌｑ−セファロース（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって精製した。これらの抗体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによると>９０％純粋であった。Ｆ（ａｂ’）２断片は、従前に報告されているようにペプシン消化によって調製した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１，１１２２−２８）。抗ＧＤ２ハイブリドーマＭＥ３６１およびＴＩＢ１１４（Ｎ．Ｓ．７）、ＩｇＧ３対照抗体を分泌するハイブリドーマはＡＴＣＣから得た。１４．Ｇ２ａはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから購入した。キメラ１４．１８は、Ｌｅｘｉｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＳｔｅｐｈｅｎ  Ｇｉｌｌｉｅｓ博士によって親切にも提供された。ＭＡＢ１０２７（抗−Ｂ７−Ｈ３  ＭｏＡｂ）はＲ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入した。ＧＤ２に対して特異的なマウスＩｇＧ３抗体Ｓ２２０−５１はＮｏｒｔｈｓｔａｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，ＭＡから購入した。
【０２４６】
ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、およびｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４抗体プロデューサー系の構築
ｍ３Ｆ８のヒトホモログに基づき、ｍ３Ｆ８の重鎖および軽鎖双方のＣＤＲ配列をヒトＩｇＧ１フレームワークに合体させ、および最適化した。２つの重鎖および２つの軽鎖遺伝子から、ｈｕ３Ｆ８の４つのバージョンを設計した。これらのｈｕ３Ｆ８遺伝子を合成し、およびＣＨＯ細胞のために最適化した（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｈｅｌｌ，ＷＡまたはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＹ）。ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｅｕｒｅｋａ，ＣＡ）を用い、ｈｕ３Ｆ８のこれらの重鎖および軽鎖をＤＣ４４細胞にトランスフェクトし、およびＧ４１８（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で選択した。Ｍａｇｅｌ．５  ＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｉｋａ，ＣＡ）にトランスフェクトした場合、特殊なＩｇＧ糖型が生じる。同様にマウスＶＨおよびＶＬ配列をヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４フレームワークに合体させて、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１およびｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４組換え抗体を作成した。
【０２４７】
ｈｕ３Ｆ８およびｃｈ３Ｆ８の精製
ｈｕ３Ｆ８およびｃｈ３Ｆ８プロデューサー系はＯｐｔｉｃｈｏ無血清培地（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）において培養し、および成熟上清を収穫した。プロテインＡアフィニティーカラムを、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２、で予め平衡化させた。結合したＨｕ３Ｆ８を、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．９で溶出させ、および２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．２中でアルカリ化した（１：１０  ｖ／ｖ比率）。それをＳａｒｔｏｂｉｎｄ−Ｑ膜を通過させ、および２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２中に５〜１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。安定性の実験は、ｔｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ）の０．７ｍｇ／ｍｌの存在下または不存在下で、２５ｍＭクエン酸ナトリウム  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．２対ＰＢＳ  ｐＨ７．４中のｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１に対して行った。
【０２４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
各２ｕｇの蛋白質を、４〜１５％Ｔｒｉｓ−グリシン  Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２の予備染色標準を蛋白質の分子量マーカーとして用いた。電気泳動の後、ＰＩＥＲＣＥ’ｓ  ＧｌｅＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてゲルを染色した。ゲルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてスキャンし、およびバンドの強度をＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で定量した。
【０２４９】
ＥＬＩＳＡによるｈｕ３Ｆ８およびｃｈ３Ｆ８の定量
マイクロタイタープレートをウェル当たり２０ｎｇにてＧＤ２で被覆した。ＰＢＳ（希釈剤）中の０．５％ＢＳＡのウェル当たり１５０ｕｌを、雰囲気温度にて、少なくとも３０分間で各プレートに加えて、過剰な結合部位をブロックし、ＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１（ストック濃度１ｍｇ／ｍｌ）の精製されたバッチを用いて、０．５ｕｇ／ｍｌで出発して標準曲線を作成し、続いて、２倍希釈した。１００ｕｌの標準および試料（やはり２倍希釈）を各ウェルに加え、および３７℃にて２．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで５回洗浄した後、希釈剤中に１：３５００で希釈したヤギ抗ヒト−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の１００ｕｌを各ウェルに加え、および４℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ発色反応を基質過酸化水素と共に色原体ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）で、暗所にて、室温で３０分間発色させた。反応物を５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、およびＯＤを４９０においてＥＬＩＳＡプレートリーダーＭＲＸ（Ｄｙｎｅｘ）で読み取った。標準曲線に基づき、ｈｕ３Ｆ８上清の定量を蛋白質のｕｇ／ｍｌまたはｕｇ／ｍｇで計算した。
【０２５０】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ  ｏｆ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）に対するイン・ビトロ結合動態学
ＣＭ５センサーチップ（研究グレード）および関連試薬はＢｉａｃｏｒｅ  ＵＳＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。ガングリオシドＧＭ１はＡＬＥＸＩＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （ＡＸＸＯＲＡ  ＬＬＣ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのものであり、およびＧＤ２はＡｄｖａｎｃｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌ（Ｌｏｎｇ  Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）からのものであった。ＧＭ１を９０％エタノール、１０％メタノール（ｖ／ｖ）に溶解させ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、およびＧＤ２はエタノールに溶解させた（０．５ｍｇ／ｍｌ）。ガングリオシドは、疎水性相互作用を介して、ＣＭ５センサーチップに直接的に固定化した。参照表面をＧＭ１で固定化した。ＧＭ１は１００％エタノールで１：１希釈し、次いで、ＨＢＳ−Ｅ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，および３ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１／５希釈した。希釈されたＧＭ１（５０  μｇ／ｍｌ）を１５μｌ／分の流速にて２０分間にわたって注射した（３００μｌ）。広範な洗浄を、安定なベースラインが得られるまで、１０ｍＭ  ＮａＯＨ（典型的には、５μｌ／分の流速にて２０μｌの５回の洗浄）に続いて行った。活性な表面をＧＤ２およびＧＭ１で１：１比率にて固定化した。ＧＤ２およびＧＭ１は１００％エタノールで１：１希釈し、および１：１比率で混合した。ＧＤ２およびＧＭ１の混合物をＨＢＳ−Ｅ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，および３ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１／５希釈した。ＧＤ２およびＧＭ１の希釈された混合物（５０μｇ／ｍｌ）を２０分間にわたって１５μｌ／分の流速で注射した（３００μｌ）。広範な洗浄を、安定なベースラインが得られるまで、１０ｍＭ  ＮａＯＨ（典型的には、５μｌ／分の流速にて２０μｌの５回の洗浄）を続けた。
【０２５１】
精製された抗ＧＤ２  ＭｏＡｂを、分析に先立って、濃度を変化させて（５０〜１６００ｎＭ）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＨＢＳ−Ｅ緩衝液に希釈した。試料（６０μｌ）を２分間にわたって３０μｌ／分の流速でセンサー表面に注射した。会合相の完了に続いて、解離を、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＨＢＳ−Ｅ緩衝液中で同一流速にて３００秒間モニターした。各サイクルの最後に、５０μｌの２０ｍＭ  ＮａＯＨを用いて５０μｌ／分の流速で１分間にわたって、および１００μｇの４Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて５０μｌ／分の流速にて２分間にわたって表面を再生させた。固定化されたＧＤ２上の試料の注射に続いて得られたバイオセンサー曲線を、動態学分析に先立って固定化されたＧＭ１上に注射された試料で得られた対照曲線で減算した。データは、二価分析物モデル、および速度定数について設定するデフォルトパラメーターによって、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００評価ソフトウェアを用いて分析し、および速度定数に対する見掛けの会合（ｋｏｎ，ｋａｌ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ，ｋｄ１）および平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ１／ｋａｌ）を計算した。
【０２５２】
ｈｕ３Ｆ８およびｃｈ３Ｆ８を、さらに、ラット抗３Ｆ８抗特発性抗体で特徴付けた（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎ  ５４，４９９−５０５）。これらのラットＩｇＧ１抗体をＦａｂ断片に消化し、およびＦａｂ調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８のそれらの反応性はＥＬＩＳＡによって、およびＢＩＡＣＯＲＥによってアッセイした。
【０２５３】
他のガングリオシドとの交差反応性についてのＥＬＩＳＡ
ＧＤ２、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ならびにＧＤ３、ＧＭ３、ＣＭ１、ＧＤ１ａを９０％エタノール中でウェル当たり２０ｎｇでコーティングした。風乾に続いて、ウェルを室温にてウェル当たり１５０ｕｌでＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで１時間ブロックし、その後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。抗体を１ｕｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００ｕｌ）にて三連で０．５％ＢＳＡに加えた。バックグラウンド減算のために、（１）抗原無しおよび（２）試料無しでのウェルを用いた。３７℃における２時間のインキュベーションおよびＰＢＳ５回での洗浄に続いて、マウス抗体（例えば、３Ｆ８）についてのＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１：１０００に希釈）またはヒト化抗体についてのＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１：１０００）を用いた。４℃での１時間のさらなるインキュベーションおよびさらなる洗浄に続いて、４９０においてＥＬＩＳＡプレ−トリーダー（ＭＲＸ（Ｄｙｎｅｘ）を用いてＯＤを読み取り、および交差反応性をＧＤ２に対する％最大結合として表した。
【０２５４】
抗体のビオチニル化
ビオチン（Ｌｏｎｇ  Ａｒｍ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＮＨＳ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を５０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。ビオチニル化試薬は試薬の１／１０重量比率で抗体に加えた。場合により攪拌しつつ、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチニル化抗体を室温で４時間、または４℃で一晩ＰＢＳ中で透析した。ビオチニル化抗体の免疫反応性を天然抗体と比較し、およびＥＣ５０が相互の２０％内にあることを確実とした。
【０２５５】
免疫染色による組織交差反応性
−２０℃で３０分間、２５０ｕｌのアセトンで固定されたクライオスタットを用い、５〜７ミクロンの厚い凍結セクションを切断した。ＰＢＳでスライドを洗浄した後、スライドを、新たに調製した０．１％過酸化水素に室温で１５分間暴露した。洗浄の後、ブロッキングアビジン溶液（ＶＥＣＴＯＲ  アビジン−ビオチンブロッキングキット）を加えて、および室温で２０分間インキュベートした。洗浄の後、ブロッキングビオチン溶液（ＶＥＣＴＯＲ  アビジン−ビオチンブロッキングキット）の滴を加え、室温で２０分間インキュベートした。さらなる洗浄の後、>１００ｕｌのブロッキング血清（ＰＢＳ中に新たに希釈した１０％ウマ血清）を加え、および室温で１時間インキュベートした。この工程はより長くすることができる。注意：血清を再使用してはならない。ブロッキング血清を各スライドから吸引した後、１００ｕｌの１ｕｇ／ｍｌビオチニル化ＭＯＰＣ２１（陰性対照）または１％ウマ血清に希釈されたビオチニルカ抗体を加え、および室温で１時間インキュベートした。洗浄の後、ＰＢＳ中の１：１００希釈における１００ｕｌのアビジン−ビオチン複合体［ＡＢＣ］（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット、ＶＥＣＴＯＲ）を加え、および室温で３０分間インキュベートした。洗浄の後、２００ｕｌの色素（ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット、ベクター）を各セクションに加え、および（染色の所望の強度が標準における発色に基づいて達成されるまで）２時間の間色を発色させた。セクションを流れる水道水で５分間洗浄し、およびＭｙｅｒのストックヘマトキシリンで逆染色し、およびさらなる洗浄を流れる水道水中で５分間行った。スライドを、順次、７５％、次いで９５％、次いで１００％エチルアルコール中で脱水した。最終の脱水工程はキシレンまたはキシレン代替物中で行った。新鮮なサイトシール（Ｃｙｔｏｓｅａｌ）の一滴を加え、次いで、セクションをカバーガラスでシールした。
【０２５６】
直接的な細胞傷害性
抗体を、腫瘍細胞成長に対するそれらの直接的効果、およびヒト血清またはヒトエフェクター細胞の不存在下における生存についてテストした。腫瘍標的を２ｍＭ  ＥＤＴＡまたはトリプシン−ＥＤＴＡで解離させ、洗浄し、Ｆ１０における９６ウェルの平坦な底のプレートにウェル当たり１．２×１０３〜３．５×１０４で平板培養した。３７℃および５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーター中での２４時間のインキュベーションの後、Ｆ１０における増大させる濃度の抗体を各ウェルに加える。対照ウェルはＦ１０単独を受けた。５％ＣＯ２中の３７℃での７２時間のインキュベーションの後、ＷＳＴ−８試薬を各ウェルに加え、およびＣＯ２インキュベーター中の暗所にて３７℃で２〜６時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダーＭＲＸ（Ｄｙｎｅｘ）を用いてＯＤを４５０ｎｍおよび６９０ｎｍで読み取った。トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）またはベックマン・コールター・カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いる直接的細胞カウンティングを用いＷＳＣ−８アッセイを検証した。
【０２５７】
５１クロム放出による抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
標的細胞をＣａ２＋Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡで脱着させ、およびＲＰＭＩ１６４０（Ｆ１０）中の１０％子ウシ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄した。１００μＣｉの５１Ｃｒを１０６の標的細胞と共に２５０μｌの最終容量にてインキュベートし、および１５分間隔でペレットの温和な再懸濁と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、および２５０ｕｌのＦ１０に再懸濁させ、および３７℃にて３０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞をカウントし、および活力をトリパンブルー（シグマ）で設定し、９６ウェルのＵ底プレートに素早く平板培養した。正常なボランティアからの末梢血液をヘパリン化チューブに集めた。血液を３％デキストラン／ＰＢＳと混合し、および室温にて２０分間保って、赤血球を沈積させた。次いで、白血球をフィコール処理し、および、各々、ＰＢＭＣ−ＡＤＣＣおよびＰＭＮ−ＡＤＣＣのために末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）および顆粒球（ＰＭＮ）に分離した。細胞をＦ１０中で洗浄し、カウントし、および活力を決定した。ＰＢＭＣ−ＡＤＣＣを１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および２ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ中のＰＭＮ−ＡＤＣＣの存在下で行った。ＡＤＣＣの最終容量は２５０ｕｌ／ウェルであった。抗体をＦ１０中で３倍または５倍希釈において１ｕｇ／ｍｌから希釈した。プレートを、室温にて、スナップスピンのために、５００ｒｐｍで遠心し、次いで、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で４時間インキュベートした。ＡＤＣＣ上清中の放出された５１Ｃｒをガンマカウンティングのために収集した。合計放出を、１０％ＳＤＳで決定し、およびバックグラウンドの自然発生放出をエフェクター無しでＦ１０のみで決定した。５０：１のＥ：Ｔ比率を一般的に用いた。同様に、ヒトＣＤ１６またはヒトＣＤ３２  Ｆｃ受容体で安定にトランスフェクトされたＮＫ９２−ＭＩ細胞を用いてＡＤＣＣアッセイを行った。ＰＢＭＣまたはＰＭＮとは異なり、アッセイにおいてサイトカインは必要でなかった。Ｅ：Ｔ比率は一般に２０：１に維持した。
【０２５８】
％特異的溶解＝（実験−バックグラウンド）／（合計−バックグラウンド）×１００％
抗体のヨウ素化
１２４Ｉおよび１３１Ｉを用いるヨウ素化はヨードゲン方法を用いて行った（Ｄｉｖｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．８，３０４−１０）。ガラスバイアルを５０μｇのヨードゲンでコーティングし、および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１００μｇのＩｇＧを１ｍＣｉの１２４Ｉ（または１３１Ｉ）と一緒に加えた。ヨウ素１２４はＭＳＫＣＣにおけるサイクロトロンによって部位に生じた。０．０５Ｍ  ＮａＯＨ中の１０ｍＣｉの１２４Ｉ（０．０２〜０．０５ｍＬ）を１ｍｇのＭｏＡｂ（〜０．５ｍＬ）、０．０６３ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、および０．４ｍＬの０．２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４と反応バイアル中で混合した。反応を氷上で１５分間進行させ、その後、溶液を除去し、およびＰ６サイズ排除カラムおよびＰＢＳ中の１％ＢＳＡの溶離剤でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２５９】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
Ｌｉｎｄｍｏの方法を用いて、免疫反応性を見積もった（Ｌｉｎｄｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７２，７７−８９）。放射性方式ＭｏＡｂを、５０μｌが約１５，０００〜２０，０００ｃｐｍ（ほぼ１〜１．５ｕＣｉ／３ｍｌ）が含有するまで１％ＢＳＡで希釈した。５０μｌを、６２５、３７５、２５０、２２０、１９０万の腫瘍細胞を含有する５００μｌの０．５％ＢＳＡに加え、および雰囲気温度にて１時間混合した。１５００ｒｐｍにおける５分間の遠心の後、上清を除去し、および１ｍｌの氷冷０．５％ＢＳＡで洗浄した。１５００ｒｐｍにおける５分間のもう１つの遠心に続いて細胞ペレットをガンマカウンターでカウントした。細胞またはヨウ素化抗体の不存在下におけるバックグラウンドカウントを差し引き、および免疫反応性をＬｉｎｄｍｏ方法によって見積もった（Ｌｉｎｄｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，前掲）。
【０２６０】
異種移植したマウスにおけるＭｏＡｂの生体内分布
ｓｃ  ＬＡＮ１神経芽細胞腫を異種移植した無胸腺ヌードマウスを用いて、薬物動態学／生体内分布および抗腫瘍特性を調べた。腫瘍をキャリパーで測定した。ｓｃ腫瘍が〜２００ｍｇに到達すると実験を開始した。マウス当たり〜１００ｕＣｉの放射性ヨウ素化抗体を静脈内注射し、および動物を通常４８時間において犠牲にし、およびそれらの器官を摘出し、およびガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でカウントした。これらの器官は皮膚、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、胃、小腸、大腸、膀胱、大腿骨、筋肉、腫瘍、心臓、肺、脊椎骨、および脳を含んだ。器官に蓄積されたｕＣｉおよび器官の重量に基づき、マウスの％注射用量（ＩＤ）／ｇｍを計算した。％ＩＤ／ｇｍの正常な組織に対する腫瘍の比率も計算した。
【０２６１】
糖分析
抗体の単糖およびオリゴ糖分析は、Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃｏｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡによって行った。単糖分析はＨＰＡＥＣによってアッセイした。Ｎ−グリカンプロファイリングはＭＡＬＤＩ−ＭＳによって行った。
【実施例１】
【０２６２】
キメラ−ＩｇＧ１および４つのヒト化ＩｇＧ１のアミノ酸配列
ｍ３Ｆ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲを、各々、ヒトフレームワークＩＧＧ  ＨＶ３−３３およびＩＧＫＶ３−１５に対するそれらの相同性に基づいて、ヒトＩｇＧ１フレームワークに移植した。２つの重鎖および２つの軽鎖設計から、ＨＵ３Ｆ８の４つのバージョンを遺伝子合成し、ＤＧ４４細胞に発現させた。キメラ重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、各々、配列番号：１および２に示し、ヒト化重鎖配列ｈｕＨ１−ガンマ１は配列番号：４に示し、ｈｕＨ２−ガンマ１は配列番号：６に示し、および、ヒト化軽鎖配列ｈｕＬ１−カッパは配列番号：５に示しおよびｈｕＬ２−カッパは配列番号：７に示す。
【０２６３】
全ＩｇＧとして発現される場合、４つのｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１はｈｕ３Ｆ８−ｈｕＬ１−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ２−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１、およびｈｕ３Ｆ８−Ｈ２Ｌ１−ＩｇＧ１と命名した。さらなる構築体を作成し、ｍ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１の重鎖配列を、ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターを用いてＤＧ４４細胞にトランスフェクトされたヒトＩｇＧ４フレームワーク（キメラ重鎖ガンマ４、配列番号：４およびヒト化３Ｆ８重鎖ガンマ４、配列番号：８）で置き換えた。実験のもう１つの組において、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１配列を、特殊なグリコシル化シグネチャー（材料および方法参照）について選択された特殊なＭＡＧＥ１．５  ＣＨＯ細胞系にトランスフェクトした。キメラおよびヒト化３Ｆ８双方を、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２６４】
ＳＤＳゲル上で、キメラおよびヒト化抗体は適当なサイズの重鎖および軽鎖を持つＩｇＧとして移動し；およびＨＰＬＣによると、それらは全て<１０％凝集形成を伴って全ＩｇＧとして溶出した（データは図示せず）。ＥＬＩＳＡによると、それらは全て同様な結合活性でもってＧＤ２に結合した。ＦＡＣＳ分析によると（ＬＡＮ−１、データは図示せず）、抗体は、それを超えるとより高い抗体濃度における細胞死滅のため平均蛍光強度（ＭＦＩ）が降下する、最適な抗体濃度（〜０．１〜１ｕｇ／１００万細胞）を示した。Ｍ１４黒色腫では、細胞の死滅は１００万細胞当たり１ｕｇを超える過剰な抗体で起こらなかった（データは図示せず）。ＩｇＧ４は経口性第二の抗体とヒトＩｇＧ１との優先的な反応性のため、より低いＭＦＩを有する傾向があった。他のｈｕ３Ｆ８構築体と比較して、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１は凍結および解凍の後最も安定であり、ＦＡＣＳによると、およびＥＬＩＳＡによると腫瘍細胞へのその欠乏を保持した（データは図示せず）。糖分析によると、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎは、フコースおよびＮ−アセチル−グルコサミンのほとんど等しいモル比率を含有したｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４とは対照的には、ほとんどマンノースおよびいくらかＮ−アセチル−グルコサミンを有した（表１）。
【実施例２】
【０２６５】
ＳＰＲによる結合活性測定（ＢＩＡＣＯＲＥ）
ＧＤ２をＣＭ５チップ上にコーティングした状態で、抗体結合の動態学（ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫＤ）を、低いＧＤ２密度にてＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ−１００を用いる表面プラズモン共鳴によって比較した（表２）。ｋｏｆｆおよびＫＤは高いＧＤ２密度にて全ての抗体について比例して改良された（データは図示せず）。異なる抗体密度における代表的な抗体のセンサーグラムを、ＢＩＡＣＯＲＥ  ＣＭ５チップに関して、双方の低いＧＤ２密度にて（データは図示せず）および高いＧＤ２密度にて（データは図示せず）比較した。
【０２６６】
【表１】
0006029581.tif 000002
【０２６７】
抗体をＧＤ２陽性腫瘍細胞と反応させた場合、抗体の遅いｋｏｆｆはより遅い洗脱に移った。ここに、ＬＡＮ−１細胞（データは図示せず）またはＭ１４細胞（データは図示せず）をモノクローナル抗体と反応させ、および洗浄緩衝液で複数回洗浄した。各洗浄では、細胞表面の残存する抗体を、二次ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体を用いて検出した。ＭＦＩをベースラインのパーセントとして表した（すなわち、最初の洗浄後）。ＬＡＮ−１細胞では、３Ｆ８および抗−Ｂ７−Ｈ３  ８Ｈ９抗体は、１４．Ｇ２ａ（〜３０％保持、データは図示せず）と比較して遅い洗脱（１０回の洗浄後〜８０％保持）を有した。同様に、Ｍ１４腫瘍細胞については、５回目の洗浄まで、腫瘍細胞への抗体の保持の実質的な差があった。３Ｆ８、３Ｆ８−（Ｆａｂ’）２、およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１（全て遅いｋｏｆｆを持つ）は>８０％保持を有したが、他の抗ＧＤ２抗体１４．Ｇ２ａ（ｍＩｇＧ２ａ）、ＭＥ３６１（ｍＩｇＧ２ａ）、およびＳ２２０−５１（ｍＩｇＧ３）（全て、ＢＩＡＣＯＲＥによる速いｋｏｆｆを持つ）は、<３０％まで漏洩した。Ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、およびｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ４は、やはり、ラット抗３Ｆ８抗イディオタイプ抗体（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５４，４９９−５０５）およびＥＬＩＳＡにおいて、およびＳＰＲにより（方法参照）、高い結合活性を持つそれらのＦａｂ断片に特異的に反応した。
【実施例３】
【０２６８】
他の抗原との交差反応性
交差反応性実験において、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１はｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１およびｍ３Ｆ８と同様なプロフィールを有した（表３）。固相ＧＤ２上のＯＤに対するＥＬＩＳＡによるパーセントＯＤとして表したＧＤ１ｂとの交差反応性の低いレベルがあった。ウエスタンブロット、またはＳＰＲいずれかによる（データは図示せず）ヒトＮ−ＣＡＭ（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０，８６１−８６６）とのｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、または１４．Ｇ２ａの交差反応性は無かった。
【０２６９】
【表２】
0006029581.tif 000003
【実施例４】
【０２７０】
直接的な細胞傷害性
これらの抗体をイン・ビトロにて神経芽細胞腫細胞に加えると、それらは直接的な細胞の死滅を誘導し、およびイン・ビトロ細胞成長を遅延させた。３日培養系においてＷＳＴ−８によってアッセイすると、ｍ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８は、それらのＥＣ５０を比較すると（表４参照）、〜１０倍より弱かった１４．Ｇ２ａとは対照的に、同様な能力を有した。
【０２７１】
【表３】
0006029581.tif 000004
【実施例５】
【０２７２】
抗体依存性細胞は細胞傷害性を媒介した
４つのｈｕ３Ｆ８  ＩｇＧ１抗体（Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２）を、エフェクターとしてボランティアＰＢＭＣ（データは図示せず）およびボランティアＰＭＮ（データは図示せず）を用いてＡＤＣＣアッセイにおいて比較した。Ｈ１Ｌ２以外で、全ての３つのｈｕ３Ｆ８は匹敵するＰＢＭＣ−ＡＤＣＣを有した。しかしながら、最も重要なことには、それらは、全て、>１０−１００のファクターだけｍ３Ｆ８よりも優れていた。
【０２７３】
【表４】
0006029581.tif 000005
【０２７４】
（ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１と略される）ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１はイン・ビトロにて最も安定であって、さらなる特徴付けのために選択した。ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎ、１４．Ｇ２ａ、およびｍ３Ｆ８を、エフェクターとしてＰＢＭＣ（データは図示せず）またはＰＭＮ（データは図示せず）を用いてＬＡＮ−１に対してＡＤＣＣアッセイにおいて比較した。これらの抗体のＡＤＣＣ能力は比率（３Ｆ８についてのＥＣ５０）／（ＭｏＡｂについてのＥＣ５０）（表５）として計算した。ｍ３Ｆ８に対して、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１はＰＢＭＣ−ＨＤＣＣにおいて２１７倍より強くおよびＰＭＮ−ＡＤＣＣにおいては１９倍強かった。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎについては、それは、各々、３９０１倍および５倍であった。加えて、キメラおよびヒト化３Ｆ８双方に関して達成された最大細胞傷害性は、それがＰＢＭＣ−ＡＤＣＣまたはＰＭＮ−ＡＤＣＣであるかにかかわらず、ｍ３Ｆ８または１４．Ｇ２ａのそれよりも実質的にかつ一貫してより高かった。
【０２７５】
（阻害性ＦｃＲの不存在下で）単離における個々のＦｃＲについてＡＤＣＣでのＭｏＡｂの能力を調べるために、我々はＮＫ９２細胞を用いてＡＤＣＣをテストした。ＮＫ９２細胞はそれらの細胞表面にヒトＦｃＲを運ばない。ヒトＣＤ１６およびＣＤ３２でトランスフェクトすると、それらは有効なＡＤＣＣを媒介できた。これらのエフェクター細胞を神経芽細胞腫ＬＡＮ−１標的に対してテストすると、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１よりも有効であり、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１は、今度は、ＣＤ１６−ＡＤＣＣにおいてｍ３Ｆ８よりもより有効であった（１２倍）（データは図示せず）。対照的に、ＦｃＲとしてのＣＤ３２に関しては、能力は、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎのそれと比較してｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１についてほとんど１０倍より高かった（データは図示せず）。同様な傾向が、黒色腫Ｍ１４を標的として用いた場合に観察された。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１またはｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１よりも〜１０倍より有効であり、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１またはｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１は、今度は、ＣＤ１６−ＡＤＣＣにおいてｍ３Ｆ８または１４．Ｇ２ａよりも〜２０倍より有効であった（データは図示せず）。対照的に、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎ、およびｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１は、ＣＤ３２がＦｃＲである場合には同様であり、全てがＣＤ３２−ＡＤＣＣにおいてｍ３Ｆ８よりも>１０倍より有効であった（表６）。ＩｇＧ４サブクラスの抗体は<３％のＣＭＣ活性、最小のＣＤ１６−ＡＤＣＣ活性を有したが、しかしながらｍ３Ｆ８よりも良好なＣ３２−ＡＤＣＣであった。
【実施例６】
【０２７６】
補体は細胞傷害性を媒介した
ヒト補体媒介溶解（ＣＭＣ）において、異なるｈｕ３Ｆ８  ＩｇＧ１形態（Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、およびＨ２Ｌ２）は有効性において匹敵した（表６）。ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８は４０〜６０％であり、他方、１４Ｇ．２ａおよびｃｈ１４．１８は、ｍ３Ｆ８と同程度にＣＭＣにおいて有効な４〜１２％であった（表６）。
【０２７７】
【表５】
0006029581.tif 000006
【実施例７】
【０２７８】
ヒト神経芽細胞腫異種移植片の標的化
ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎ、およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４は、４０〜４５％程度の匹敵する免疫反応性を持つ１３１Ｉで放射性標識した（表７）。４８時間内におけるそれらの生体内分布を、ｓｃ  ＬＡＮ−１神経芽細胞腫異種移植片を担うマウスにおける１３１Ｉ−ｍ３Ｆ８のそれと比較した。％ＩＤ／ｇｍによって測定された場合の腫瘍摂取はｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１（２９．６％）とｍ３Ｆ８（２８．６％）間で匹敵し、双方は、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎおよびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４のそれのほとんど２倍であった（データは図示せず）。通常の組織に対する腫瘍の比率は、ＮＢ  ＬＡＮ−１異種移植片に対してこれらの４つの抗体の間で匹敵した。比較において、黒色腫Ｍ１４に関しては、全ての３つのｈｕ３Ｆ８抗体の％ＩＤ／ｇｍおよび正常な組織に対する腫瘍の比率の双方はｍ３Ｆ８のそれと同様であった（データは図示せず）。
【０２７９】
【表６】
0006029581.tif 000007
【実施例８】
【０２８０】
神経芽細胞腫異種移植片の処置
樹立されたヒト神経芽細胞腫ＬＡＮ−１（０．５〜１ｃｍ直径）で異種移植したマウスを、ｉｖ  ｍ３Ｆ８またはｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１で毎週２回、４週間の間処理した。腫瘍の応答およびマウスの生存をモニターした。腫瘍成長における遅延は、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１−ＩｇＧ１抗体用量（２００ｕｇ>１００ｕｇ>２０ｕｇ、データは図示せず）に依存した。１００〜２００ｕｇを受けているマウスの生存は、ＰＢＳ対照またはｍ３Ｆ８を受けているマウスよりも有意に長かった（ｐ＝０．００３）（データは図示せず）。
【０２８１】
【表７】
0006029581.tif 000008
【０２８２】
考察
抗ＧＤ２抗体はＧＤ２陽性神経芽細胞腫についての証明された療法である（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：１３２４−１３３４，２０１０）。ネズミ抗体１４．１８およびその誘導体（１４．Ｇ２ａおよびｃｈ１４．１８）は、抗ＧＤ２療法の将来の改良のための基準を提供した。我々は、１４．Ｇ２ａまたはｃｈ１４．１８と比較して、ＧＤ２結合の間におけるその１０倍より遅いｋｏｆｆのため、臨床開発のためにネズミＩｇＧ３抗体ｍ３Ｆ８を選択した。骨髄における化学抵抗性転移神経芽細胞腫を持つ患者の中では、ｍ３Ｆ８＋ＧＭＣＳＦは８０％完全な寛解を誘導した（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９，４１８９−９４）。しかしながら、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、その抗原に結合するその能力を中和することによって、抗体の直接的効果をブロックすることによって、および循環からの抗体の除去を加速することによって、ネズミ抗体の効果を減少させることができる。ネズミからヒトＩｇＧフレームワークへ変化させる遺伝子工学はＨＡＭＡ応答を低下させるはずである。ｃｈ１４．１８およびｈｕ１４．１８（双方は、１４．Ｇ２ａのＶＨおよびＶＬに由来する）は、患者において最小免疫原性を有する。従って、我々は、潜在的次世代の抗ＧＤ２抗体としての３Ｆ８のキメラおよびヒト化形態をテストした。
【０２８３】
成功したキメラ化およびヒト化の１つの基準は、遺伝子工学の間における親和性の保存である。これは、ヒト化プロセスにおけるＣＤＲ移植で特に不確かである。ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８におけるゆっくりとしたｋｏｆｆの保存は心強いものであった。しかしながら、より重要なことには、イン・ビトロでのエフェクターの機能、ならびにイン・ビボでの腫瘍標的化＋イン・ビボでの治療特性の保存および増強は臨界的なものであり得た。ｃｈ３Ｆ８−ＩｇＧ１およびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１の双方は、ｍ３Ｆ８よりも>２００倍より有効なＰＢＭＣ−ＡＤＣＣを示したが、ＰＭＮ−ＡＤＣＣは>２０倍であった。加えて、特殊な糖型ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎは>３５００倍より有効なＰＢＭＣ−ＡＤＣＣ、およびｍ３Ｆ８のそれよりも５倍より有効なＰＭＮ−ＡＤＣＣを有した。かなり対照的に、ＣＭＣでは、ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８は、ｍ３Ｆ８よりも低い補体活性化能力を有した。
【０２８４】
ＡＤＣＣにおけるこの大きな改良は、患者におけるモノクローナル抗体の抗腫瘍効果におけるその役割についての最も望ましい所与の最近の証拠である。リツキシマブで治療されたリンパ腫患者の中では、高親和性ＦｃＲ２ＡおよびＦｃＲ３Ａの双方は、良好な応答および生存の利点を有することが示された（Ｗｅｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｖｙ，２００３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１，３９４０−７）。高親和性受容体ＦｃＲ３Ａはイン・ビトロにてＡＤＣＣの<１０改良に移動したが（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０，６２４８−５５）、総じての応答および進行までの時間は２００％だけ改良された（Ｗｅｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｖｙ，２００３，前掲）。転移性乳癌をヘルセプチンで治療した場合、高親和性ＦｃＲ３Ａを持つ患者は良好な総じての応答（８３％対３５％、ｐ＝０．０３）、およびより長い無進行生存（ｐ＝０．００５）（Ｍｕｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６，１７８９−９６）を有した。セツキシマブで治療された転移性結直腸癌では、低親和性ＦｃＲ２ａおよびＦｃＲ３Ａを持つ患者は、突然変異したＫＲＡＳを持つ患者と匹敵する危険比率を有した（Ｂｉｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７，１１２２−９）。ネズミ３Ｆ８では、骨髄細胞でのｍ３Ｆ８についての高親和性ＦｃＲ３Ａ受容体を持つ患者は、良好な生存を有することが示された（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，２８８５−９０）。
【０２８５】
結合親和性およびエフェクター機能は治療的適用で臨界的であるが、交差反応性は予測できない毒性の問題を引き起こしかねない。我々は、３Ｆ８についてのこれらのキメラおよびヒト化形態が精製されたガングリオシドでのＥＬＩＳＡアッセイ、ならびに正常なヒト組織のパネルでの免疫組織化学双方によるとネズミ３Ｆ８として匹敵する交差反応性パターンを有したことを示した（データは図示せず）。ｍ３Ｆ８と同様に、３Ｆ８のキメラおよびヒト化形態の双方は、ＧＤ２と比較した場合にＧＤ１ｂに対して低いレベルの反応性を示した。ＧＤ１ｂは、特別には、レチノイドによって分化した場合、神経芽細胞腫瘍内でかなり圧倒的なガングリオシドであることが示されている（Ｈｅｔｔｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９１，３８９−９７；Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｒａｉｎ  １２５，２４９１−５０６）。これは、シスレチノイン酸は高リスクの神経芽細胞腫に対する免疫療法を受けている患者にルーチン的に与えられるので、これは妥当であろう。しかしながら、抗ＧＤ１ｂ抗体もまた感覚失調性神経障害に関連付けられてきた（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，前掲）。それにもかかわらず、５００を超える患者における永久的ではないまたは後期の感覚神経障害を伴う（ＧＤ１ｂに対する同様な交差反応性を持つ）ｍ３Ｆ８の安全性プロフィールは心強かった。
【０２８６】
補体媒介細胞傷害性（ＣＭＣ）は、ＣＤ５５（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２８，３８７）およびＣＤ５９（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，前掲）のそれらの低い発現のため、ヒト神経芽細胞腫に対して異常に効果的である（Ｓａａｒｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２６，２９１）。全ての抗ＧＤ２抗体は有効な補体媒介細胞傷害性を媒介し、およびｍ３Ｆ８は特に有効であるように見える。しかしながら、リツキシマブの実験は、ＡＤＣＣをダウンレギュレーションするにおいて補体活性化の負の役割を示唆した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１４，５３２２−３０）。臨界的実験では、補体成分Ｃ１ｑＡのより高い活性は、リツキシマブ療法に対するより低い好都合な応答と関連付けられた（Ｒａｃｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４，６６９７−７０３）。抗ＧＤ２抗体では、補体活性化は疼痛副作用の原因であると考えられ（Ｎａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １０：２００−２０９，２０１０）、よって、Ｆｃ−ＣＨ２ドメインの突然変異したバージョン（ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ）は現在臨床試験中である。これらの考慮に鑑みれば、ＣＭＣのオーバードライブは恐らくは望ましくない。ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８の双方はわずかにより低い有効なＣＭＣを有したのは心強い。
【実施例９】
【０２８７】
急性疼痛副作用をブロックする抗体の使用
低いｋｏｆｆを持つが、ＡＤＣＣまたはＣＭＣ活性が枯渇した抗体は、血管周囲の空間を囲う神経繊維上のＧＤ２をブロックするために用いることができようと仮定した。３Ｆ８（ＨＭ３Ｆ８）の熱処理は、そのＣＤ２結合に影響することなくそのＡＤＣＣおよびＣＭＣ活性を枯渇させる（Ｋｕｓｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９，１１６８−１１７４）。ラットを熱処理した３Ｆ８で予備的に注射すると、天然３Ｆ８の５〜１０モラー過剰の引き続いての注射に対するそれらの疼痛応答は実質的に低下した。より重要なことには、抗腫瘍効果は危うくなかった。相Ｉ臨床試験（ＩＲＢ−０５０１５、ＮＣＴ００４５０３０７）では、抵抗性神経芽細胞腫（ＮＢ）を持つ３０の患者は、外来患者設定における３Ｆ８＋顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子１〜２のサイクルを受けた。３Ｆ８用量は用量制限性毒性（ＤＬＴ）の不存在下で、２０ｍｇ／ｍ２／ｄで開始し、および２０ｍｇ／ｍ２／ｄだけ増加した。プレ投薬は鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、および２ｍｇ／ｍ２  ＨＭ３Ｆ８の５分の注入を含むものであった。オピオイドの使用を、２０ｍｇ／ｍ２／ｄにおける３Ｆ８で処置したが、ＨＭ３Ｆ８で処置しなかった一次的な対照群と比較した。用量の上昇は、薬物供給限界のため１６０ｍｇ／ｍ２／ｄで停止させ；この用量レベルを通じてさえ、鎮痛剤の要件は歴史的な対照と同様であり、およびＤＬＴは無かった。８０ｍｇ／ｍ２／ｄを通じての３Ｆ８用量レベルにおける鎮痛剤の要件は、対照と比較して有意に少なかった。抗ＮＢ活性は全ての用量で起こった。この３Ｆ８の多数倍用量の上昇は実行可能であって、ＨＭ３Ｆ８は抗ＮＢ活性を平滑とすることなく毒性を修飾することができたことを示唆した。
【０２８８】
ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４の疼痛ブロッキング潜在能力
ＨＭ３Ｆ８の臨床結果に基づき、我々は、血管周囲の疼痛繊維が、ＣＭＣまたはＡＤＣＣ機能を欠如する抗体の小用量によって優先的にブロックすることができると仮定する。ｍ３Ｆ８の加熱はそのＣＭＣおよびＡＤＣＣ機能を（結合を保持しつつ）破壊するが、熱修飾されたｈｕ３Ｆ８はほとんど十分なＣＭＣおよびＡＤＣＣ機能を保有する。Ｌａｎ１、ＮＭＢ７、ＳＫＮＬＰ、ＢＥ（１）Ｎ、およびＳＨＥＰ１のような異なるＮＢ細胞系においてＣＭＣおよびＡＤＣＣを活性化するｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４の無能力（表８、データは図示せず）は、この抗体サブクラスを、ＨＭ３Ｆ８についての活力のある代替法とする。抗体構造および免疫原性に対する未知の効果を伴う加熱とは異なり、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４は作成された蛋白質である。ＣＭＣおよびＡＤＣＣ機能の不存在の他に、ＩｇＧ４のサブクラスはユニークな生化学的特性を有する。慢性抗原刺激によって典型的に誘導され、それらは他の抗体のイソタイプによる免疫複合体形成に干渉することが知られており、それにより、免疫反応を弱らせる（Ｌｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１３２，１７４−９）。最も重要なことには、それは、それ自体を一価に還元する天然の能力を有し、それにより、血液中での数時間の期間の後にｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１と競合するその能力を喪失する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７，１５５４−７）。そのような一価は、重鎖および付着した軽鎖（半分子）をもう１つのＩｇＧ４分子からの重−軽鎖対と交換することによってＦａｂアームを交換するその既知の特性から由来し、その結果、問題とする特異的抗原に向けての一価がもたらされる（例えば、ＧＤ２）。
【０２８９】
【表８】
0006029581.tif 000009
【０２９０】
ラット異痛症モデル
該ラットモデルを用いて、疼痛副作用をブロックするｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４の能力をテストした（ＭＳＫプロトコル  ＃０９−０５−０１０）。ｍ３Ｆ８（ラット補体の有効なアクチベーター、Ｂｅｒｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４９，２５９−６６）およびｈｕ３Ｆ８の双方を用いて異痛症を誘導した。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４（０．１、０．２５、または０．５ｍｇ／ｋｇ）を、ｉｖ  ｍ３Ｆ８（５ｍｇ／ｋｇ）、またはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１（５ｍｇ／ｋｇ）、またはｃｈ１４．１８（５ｍｇ／ｋｇ）に３０分間先立って静注として投与した。他の群は熱修飾ｍ３Ｆ８（ＨＭ３Ｆ８）またはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４の代わりに対照抗体を受けた。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント方法を用いて、ＭｏＡｂ注射に先立って、およびその後に、ベースラインにおける疼痛を見積もった（Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６１，３８９−９７；Ｂｅｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８，２９０４−１４）。
【０２９１】
生体内分布に対するｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４の効果および１３１Ｉ−ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１の効力
神経芽細胞腫（ＬＡＮ−１）の腫瘍を、低い血清ＩｇＧを持つ雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２−ｇｃｎｕｌｌ免疫欠乏マウス（群当たりｎ＝１０）の群において皮下移植した。マウスに、実験に２４時間先立って、１ｇｍ／ｋｇのヒトＩｇＧを注射した。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４（０．１、０．２５、または０．５ｍｇ／ｋｇ）または対照ｈｕＩｇＧ４（０．１、０．２５、または０．５ｍｇ／ｋｇ）、またはＨＭ３Ｆ８（０．５ｍｇ／ｋｇ）、または生理食塩水を、１３１Ｉ標識各ＭｏＡｂで標識されたｍ３Ｆ８、またはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、またはｃｈ１４．１８（５ｍｇ／ｋｇ）分量に３０分間先立って、静注として投与した。血液を１、３、６、１２、２４、３６、４８、および９６時間において尾から収集した。生体内分布実験において、組織カウントのため、２つの時点（１３１Ｉ−ＭｏＡｂ注射から２４時間および４８時間後に）マウスを犠牲にした。主な器官を摘出し、および既知の容量の注射でガンマカウンターにてカウントし、およびデータはパーセンテージＩＤ／ｇｍ組織として表した。薬物動態学分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアプログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用い、血清濃度−時間のデータの非区画分析によって行った。実験の別の組において、異種移植マウスを、同様に、しかしながら、１３１Ｉ分量標識無くして処理し、およびそれらのｓｃ腫瘍応答を２カ月間にわたって測定した。
【０２９２】
ラットにおいて異痛症をブロックするｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４の能力を、熱処理したｍ３Ｆ８のそれと比較することができる。（天然ｍ３Ｆ８、またはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１またはｃｈ１４．１８による挑戦を、全て５ｍｇ／ｋｇにおけるように維持しつつ）用いたブロッキング抗体の用量応答曲線に基づき、ラットで異痛症をブロックするにおける相対的な能力を引き出すことができる。我々は、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４が、異痛症をブロックするにおける熱処理３Ｆ８と比較した場合に同等、またはより有効であると予測する。これらの実験は、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４を臨床試験に移すための前臨床根拠を提供するであろう。
【実施例１０】
【０２９３】
増強された安定性についてのｈｕ３Ｆ８フレームワーク配列の最適化
ネズミ抗体をヒト化するプロセスにおいて、構造的に重要な位置にあるフレームワーク残基は、しばしば、ネズミ配列に復帰突然変異させて、抗体安定性および抗原結合の双方を保存する（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ，２００８，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｉｎ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１８１）。
【０２９４】
材料および方法
ｍ３Ｆ８可変ドメインの構造モデル
ｍ３Ｆ８可変ドメインの相同性モデルを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  （Ａｃｃｅｒｌｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）においてＭＯＤＥＬＥＲ（Ｅｓｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １５，５．６．１−５．６．３０）を用いて作り出した。マラリヤ抗原ＡＭＡ１抗体Ｆａｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｃｏｄｅ  ２Ｑ８Ａ）の結晶構造を、可変軽鎖のための鋳型として選択した（８４％同一性）。抗体１３Ｇ５  Ｆａｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｃｏｄｅ  ２ＧＪＺ）の結晶構造を、可変重鎖のための鋳型として選択した。
【０２９５】
ｍ３Ｆ８  Ｆａｂ断片の結晶構造
標準的なＦａｂ調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用い、ｍ３Ｆ８のＦａｂ断片をパパイン消化によって生じさせた。精製されたｍ３Ｆ８を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５中で１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、および０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、２５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ３３５０を含有するＨａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ試薬Ｄ９（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）を含有する貯蔵器に対して１６℃での蒸気拡散によって吊り下げた滴中で結晶化させた。該液滴は、１μｌの蛋白質溶液および１μｌの貯蔵器溶液を混合することによって液滴を形成した。結晶は、２５％グリセロール、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、２５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ３３５０を含有する低温保護剤によって保護した。データはＡｒｇｏｎｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｂｅａｍｌｉｎｅ  ２４ＩＤＣにおいて収集した。結晶は空間群Ｃ２に属し、および１．７Å分解能まで回折する。
【０２９６】
Ｆａｂ構造は、サーチモデル（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３，２９４７３−８４）としてのフェイザー（Ｐｈａｓｅｒ）（ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ）（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０，６５８−６７４）およびＰＤＢエントリ−２ＡＪＵを用いる分子置き換えによって解決した。最良の分子置き換えモデルは、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３，２４０−２５５）を用いて改良し、マニュアルフィッティングはＯで行い（Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５０（１９９４）７６０−７６３）、Ａｒｐ−Ｗａｒｐを含む溶媒を加えた（Ｌａｍｚｉｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４９，１２９−１４７）。最終のモデルはｍ３Ｆ８  Ｆａｂの２つのポリペプチド鎖、および５８５溶媒分子を含有した。
【０２９７】
ｍ３Ｆ８結晶構造のコンピューターによる解析
ヒト鋳型ＩｇＨＶ３−３３−ＨＣおよびＩＧＫＶ３−１５−ＬＣに基づき、ｍ３Ｆ８上のフレームワークに導入されるであろう各ヒト化突然変異を、コンピューター化学方法を用いて解析した。ｍ３Ｆ８の結晶構造は、ＣＨＡＲＭｍ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）力場（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｊ．Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ  ３０，１５４５−１６１５）を用いてシミュレートし、および各点突然変異の効果を、突然変異した構造の折り畳み自由エネルギーと野生型蛋白質との間の鎖から計算した。一般化されたＢｏｒｎ近似式を用いて、溶媒の効果を説明し、および全ての静電項をクーロン相互作用および溶媒和エネルギーに対する極性寄与の合計として計算した。ファン・デル・ワールス、静電、エントロピーおよび非極性項の重み付けした和を各点の突然変異につき計算した。全ての計算は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。
【０２９８】
結果
ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１重鎖配列では、ヒトＩｇＧ重鎖配列ＩｇＨＶ３−３３−ＨＣを鋳型として用い、および位置５、９、１６、１９、２０、２４、２８、２９、３０、４０、４８、４９、６７、７１、７６、７８、８１、８６、および９２において復帰突然変異を行った。ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１軽鎖では、ヒトＩｇＧ軽鎖配列ＩＧＫＶ３−１５−ＬＣを鋳型として用い、位置１、７、９、１５、１９、２１、２２、４３、４５、５８、６０、６７、７０、７３、７８、８０、および８７で復帰突然変異を行った。復帰突然変異はｍ３Ｆ８の相同性モデルに基づいて推測し、および突然変異がＣＤＲループの折り畳みに影響するか、または骨格安定性（ＧｌｙおよびＰｒｏを含む突然変異）に影響するかを決定することを含んだ。
【０２９９】
相同性モデルの正確性を実証し、およびヒト化戦略をさらに高めるために、ｍ３Ｆ８の結晶構造を１．７Åにおいて解析した（データは図示せず）。ｍ３Ｆ８可変領域の相同性モデルに、解析された結晶構造を重ねた（データは図示せず）。ＣＤＲの外側のフレームワーク領域の大部分についての相同性モデルは実験的に誘導された結晶構造に密接にマッチした。しかしながら、注目すべき差がＣＤＲ領域に、特に、ループＨ３、Ｈ２、およびＬ３に観察された。相同性モデルは、Ｆｖ構造の安定性に対して非常に重要であるＶＨ−ＶＬ界面における相互作用のいずれかを正確に予測できなかった。ＶＨ−ＶＬ界面において水素結合するアミノ酸の６つの対、およびπ相互作用に参画するアミノ酸の２つの対がある（表１０）。ｍ３Ｆ８の結晶構造を解析した後、コンピューター解析を適用して、ＩｇＨＶ３−３３−ＨＣおよびＩＧＫＶ３−１５−ＬＣ鋳型に基づいた各ヒト化突然変異のエネルギー的効果を決定した。折り畳み自由エネルギーの差を各突然変異について計算した。この解析に基づき、ヒト化突然変異のうち５つは、ｍ３Ｆ８の総じての折り畳みに対して脱安定性であることが判明した（表９）。これらは、重鎖の位置１１および２１、および軽鎖の位置１、１０、１２、４０、および９７を含んだ。また、各々、位置４０および９７において軽鎖におけるＰｒｏおよびＧｌｙに関連するヒト化突然変異は骨格柔軟性に有意に影響することも決定された。２つのＧｌｙ／Ｐｒｏ突然変異に加えてこれらの５つの脱安定化突然変異は復帰突然変異についての候補と考えられ、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３の配列に含まれる（配列番号：９および１０）。ｍ３Ｆ８結晶構造のコンピューター解析は、抗体の安定性に対して中性の影響を有するであろう５つのヒト化突然変異も同定した（データは図示せず）。これらの突然変異は軽鎖の位置２４および５６、および重鎖の位置２０、５８、および９２である。これらの突然変異は、相同性モデルに基づくが、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３についての設計に含まれる、ｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１の配列に含まれなかった（配列番号：４および５）。
【０３００】
ｍ３Ｆ８の結晶構造のＶＨ−ＶＬ界面の解析を行って、ｈｕ３Ｆ８における水素結合およびπ相互作用の各々を保存した（表１０）。界面の相互作用に関与する１５のアミノ酸のうち、１４はｈｕ３Ｆ８−Ｈ１Ｌ１およびｈｕ３Ｆ８−Ｈ３Ｌ３に保存された。１つの失われた相互作用は軽鎖におけるＳｅｒ４３を含む。この突然変異はｈｕ３Ｆ８−Ｌ１およびｈｕ３Ｆ８−Ｌ３の設計に加えて、Ｈｕ３Ｆ８−Ｌ１ＳおよびＨｕ３Ｆ８−Ｌ３Ｓを生じさせた。
【０３０１】
これらの安定性増強フレームワークは、安定なヒト化フレームワークを設計するための相同性モデリングの使用を含む、当該分野の現在の水準では可能性を有しなかったであろう。力場方法を用いてコンピューター解析と組み合わせたｍ３Ｆ８の実験的に導かれた結晶構造の使用は、増強された安定性プロフィールを持つ新規な抗体を設計するために必要であった。
【０３０２】
【表９】
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【０３０３】
【表１０】
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【実施例１１】
【０３０４】
３Ｆ８：ＧＤ２相互作用のコンピューター解析に基づくより高い親和性３Ｆ８抗体
ｍ３Ｆ８の結晶構造をコンピューター実験のための鋳型として用いて、抗原認識の分子の詳細を決定した。ＧＤ２抗原は、セラミド脂質テイルに連結された五糖頭部から成る。実験的に導かれた３Ｆ８：ＧＤ２共複合体の不存在下では、コンピュータードッキングはＧＤ２五糖頭部のみで試みられ、ここに、セラミド部位はメチル基によって置き換えた。ＧＤ２五糖分子は、コンピュータードッキングにおける場の状態を考えるとドッキング実験のための主な挑戦を表した。最初に、大きな柔軟性リガンドのドッキングは、正確に予測するのは困難である。ＧＤ２頭部は３０を超える回転可能な結合を有する。そのような高度な柔軟性を持つリガンドについて正確であると報告された、確立されたドッキングプロトコルは無い。第二に、ＧＤ２頭部は炭水化物分子であり、力場方法を炭水化物分子に適用した場合に、ドッキング実験の精度に関する少数の報告しか無い。第三に、ＧＤ２頭部は炭水化物の特殊なクラスである。というのは、それはそのシアル酸部位で見出された２つの荷電基を含有するからである。そのような大きくて、柔軟であって荷電された炭水化物の結合立体配座を正確に予測することが示された、確立されたドッキング方法は無い。
【０３０５】
（荷電シアル酸残基を含有しないが）オリゴ糖の結合立体配座を予測するのに信頼性があると報告された１つのドッキングアルゴリズムはＧＬＩＤＥである（Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｆ  Ｍｏｄｅｌ  ４９，２７４９−６０）。該報告は、ＧＬＩＤＥが、実験的に導かれた共結晶構造と比較して、抗体に対するオリゴ糖の結合立体配座を予測するにおいてＡｕｔｏＤｏｃｋ、ＧＯＬＤ、およびＦｌｅｘＸよりも優れたことを示した。テストされた抗原のいずれもより大きな四糖ではなかったことに注意すべきである。文献中のもう１つの有望なドッキングアルゴリズムはＣＤＯＣＫＥＲ（Ｗｕ  ａｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ  ２４，１５４９）、８またはそれ以上の回転可能な結合のドッキング立体配座を正確に予測するにおいてＤＯＣＫ，ＦｌｅｘＸ、およびＧＯＬＤよりも優れていることが示されたＣＨＡＲＭｍベースのドッキングアルゴリズムであった（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４７，４５−５５）。オリゴ糖は実験において分析せず、およびテストされたリガンドはＧＤ２頭部よりもかなり小さくかつ低い柔軟性のものであった（>３０回転可能結合）。
【０３０６】
ＧＬＩＤＥとＣＤＯＣＫＥＲ間のヘッドトゥーヘッド比較を、蛋白質データバンクからの３つの入手可能なテストケース（ＰＤＢコード２ＨＲＬ：ＧＴ１ｂとの複合体であるＳｉｇｌｅｃ−７；ＰＤＢコード３ＢＷＲ：ＧＭ１との複合体であるシミアンウイルスＶＰ１；およびＰＤＢコード３ＨＭＹ：ＧＴ２との複合体である破傷風トキシンＨＣＲ／Ｔ）を用いてＧＤ２と同様なドッキングリガンド（オリゴ糖を含有するシアル酸）にて行った。３つのテストケースのうち全ての２つにおいて、ＣＤＯＣＫＥＲは、各オリゴ糖の正しい結合態様を正確に予測できた（２オングストロームの根平均二乗偏差内）。
【０３０７】
ＧＬＩＤＥは２つを３つのテストケースに不正確にドッキングさせ（>２オングストローム根平均二乗偏差）、および第三のテストケースにおいてはドッキングされた姿勢を見出すことができなかった（表１１参照）。この分析によって、ＣＤＯＣＫＥＲは、荷電オリゴ糖をドッキングさせるにおいてＧＬＩＤＥよりも優れていた。
【０３０８】
ＧＬＩＤＥはケースの各１つにおいて失敗した（表１１参照）。次いで、ＣＤＯＣＫＥＲを用いて、ＧＤ２五糖の頭部をｍ３Ｆ８の結晶構造の抗原結合ポケットにドッキングさせた。次いで、頂部をドッキングさせた構造は、ＣＨＡＲＭｍ力場を用いてエネルギーを最小とした。該分析は、ＧＤ２の頭部と直接的に相互作用する１４のアミノ酸を示した（表１２）。次いで、これらの位置の各々、イン・シリコにて、可能なアミノ酸の全てに突然変異させ、およびＣＨＡＲＭｍベースの相互作用エネルギーを計算した。最高の相互作用突然変異体を表１３にリストする。このアプローチに基づいて、１つの突然変異（重鎖Ｇｌｙ５４Ｉｌｅ）は相互作用エネルギーを有意に増加させると予測された。コンピューターモデリングは、重鎖のＣＤＲ３における位置５４のＧｌｙのＩｌｅへの置換が、結合ポケットの形を変化させ、およびＧＤ２リガンドとの接触を増加させたであろう。この分析を用いて、重鎖突然変異Ｇｌｙ５４ＩｌｅをｈｕＨ１−ガンマ１およびｈｕＨ３−ガンマ１の配列のＣＤＲ領域に加えて、各々、ｈｕＨ１Ｔ−ガンマ１およびｈｕＨ３Ｉ−ガンマを作り出した。
【０３０９】
ドッキング方法
ＧＬＩＤＥドッキングは、Ｓｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｓｕｉｔｅ２００９（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて行った。ＯＰＬＳ力場を用いて、蛋白質およびリガンドをパラメーター化した。頂部リガンドの姿勢は２．０Åの根平均二乗偏差内でクラスター化し、およびＧｌｉｄｅＳｃｏｒｅによってスコア取りした。
【０３１０】
ＣＤＯＣＫＥＲドッキングおよび相互作用エネルギー測定は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ３．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。ＣＨＡＲＭｍ力場を用いて、蛋白質およびリガンドをパラメーター化した。頂部リガンド姿勢は、２．０オングストロ−ム根平均二乗偏差内でクラスター化し、およびＣＤＯＣＫＥＲ相互作用エネルギーによってスコア取りした。
【０３１１】
【表１１】
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【実施例１２】
【０３１２】
抗原およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する親和性を増強させることによるエフェクター機能の改良
抗ＧＤ２  ＭｏＡｂは化学抵抗性転移性神経芽細胞腫（ＮＢ）に対する証明された療法であり、ｃｈ１４．１８は次世代のＭｏＡｂについての基準を提供する。抗ＧＤ２  ＭｏＡｂマウス３Ｆ８（ｍ３Ｆ８）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の組合せは、原発性難治性ＮＢを持つ患者の８０％において完全な骨髄寛解を一貫して誘導した。第一の完全な／非常に良好な部分的緩解（ＣＲ／ＶＧＰＲ）で処置された患者の中では、この組合せは１３−シス−表１２をプラスする。ＣＤＯＣＫＥＲおよびＣＨＡＲＭｍエネルギー最小化レチノイン酸に基づいてＧＤ２と直接的に相互作用する３Ｆ８アミノ酸残基は、ＰＦＳを５１％±７％まで、およびＯＳを８０％±５％まで、過去５年間で改良した。治療効果の分析は、ＮＢおよび他の固形腫瘍のＭｏＡｂ療法における遺伝子多形に基づくＦｃＲ親和性の重要性を反復して示した。抗原に対する、および犠牲にする特異性無しのＦｃＲに対する親和性の改良は、イン・ビトロおよびイン・ビボでのＭｏＡｂ効力を改良するはずである。
【０３１３】
【表１２】
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【０３１４】
【表１３】
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【０３１５】
方法：
ｈｕＩｇＧ１サブクラスのキメラ３Ｆ８（ｃｈ３Ｆ８）およびヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８）は遺伝子工学によって構築し、ＣＨＯ細胞において発現させ、およびプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。フコースおよびＮ−アセチルグルコサミンを欠如するｈｕ３Ｆ８のＦｃ糖型（ｈｕ３Ｆ８ｎまたはｈｕ３Ｆ８−ＭＡＧＥ１．５）を特殊なＭＡＧＥ１．５  ＣＨＯ細胞において生じさせた。ＧＤ２に対する、およびＦｃＲに対するこれらのＭｏＡｂ形態の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ−１００を用いて比較した。エフェクター機能を、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体媒介細胞傷害性（ＣＭＣ）アッセイを用いてテストし、およびそれらの能力はＭｏＡｂのＥＣ５０に由来した。これらの戦略を、臨床的潜在能力を持つ他の腫瘍抗原系（Ｂ７−Ｈ３、ＨＥＲ−２、ＣＳＰＧ４、ＬＩ  ＣＡＭ）に対するＭｏＡｂに適用した。
【０３１６】
結果：
ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８はｍ３Ｆ８のそれと同様なＫｄを維持し、１４Ｇ．２ａまたｃｈ１４．１８と比較した場合、全ては１０倍遅いｋｏｆｆを共有し、その結果、より好都合なＫＤおよびより長い滞留時間をもたらした。ｍ３Ｆ８、ｃｈ３Ｆ８またはｈｕ３Ｆ８はイン・ビトロにてＮＢ細胞系の増殖を阻害し、他方，他の抗ＧＤ２抗体は有効でなかった。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）−ＡＤＣＣ、顆粒球（ＰＭＮ）−ＡＤＣＣまたはＣＭＣにおいて、ｃｈ３Ｆ８およびｈｕ３Ｆ８はｃｈ１４．１８よりも１０倍を超えてより強かった。ｈｕ３Ｆ８ｎによるＰＢＭＣ−ＡＤＣＣはｈｕ３Ｆ８よりも１０倍効果的であり、およびｍ３Ｆ８よりも>１００倍より優れていた。他方、生体内分布実験における１３１Ｉ−ｈｕ３Ｆ８は、１３１Ｉ−ｍ３Ｆ８のそれと匹敵する腫瘍〜通常の組織の比率を示し、ｈｕ３Ｆ８はＮＢ異種移植片に対して優れた抗腫瘍効果を示した。同様な結論が他の腫瘍抗原系に特異的なキメラおよびヒト化抗体で導くことができたが、腫瘍エピトープ／抗原の性質は腫瘍殺傷の有効性を決定するにおいて臨界的であった。
【０３１７】
結論：
抗原またはＦｃＲについてのｋｏｆｆ（またはＫＤ）はエフェクターの機能を個々に改良し、一緒にそれらの効果は、抗ＧＤ２  ＭｏＡｂ  ３Ｆ８について増殖性に見えた。双方の親和性の改良に向けられた将来の戦略は、さらに、これまでに観察されたＭｏＡｂの臨床的有効性を拡大するはずである。
【実施例１３】
【０３１８】
ＦｃＲ結合を改良するためのさらなるＦｃの修飾：
重鎖における三重突然変異ＤＥＬ（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）を持つｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬ（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０３，４００５−１０）は、ＦｃＲ３ＡおよびＦｃＲ２Ａに対する、のみならずＦｃＲ２Ｂに対する親和性の実質的な増加を伴って作成された（表１４中のＢＩＡＣＯＲＥデータ参照）。しかしながら、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧｎに対する活性化対阻害性シグナルについてのＡ／Ｉ比率は、臨床的な利点（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ，２３６：２６５−２７５，２０１０）を有することが仮定されている、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬに対する３０と比較して、ＣＤ１６−１５８Ｖに対して１９６である。
【０３１９】
【表１４】
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【０３２０】
神経芽細胞腫ＬＡＮ−１に関するＣＤ１６媒介ＡＤＣＣ
ＮＫ９２−ＣＤ１６エフェクター細胞を、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて異なる抗体濃度での５：１のエフェクター：標識比率でＬＡＮ１神経芽細胞腫の腫瘍標的に加えた。
【０３２１】
ＦｃＲに対する親和性の増加は、ＣＤ１６またはＣＤ３２によって媒介されるＡＤＣＣ能力の増加に移った。ＣＤ１６によって媒介されるＡＤＣＣでは（データは図示せず）、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬおよびｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎは同等であった。
【０３２２】
神経芽細胞腫ＬＡＮ−１の補体媒介溶解
ヒト補体を、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、増大させる抗体濃度にて、１：１００の最終の血清補体希釈で神経芽細胞腫ＬＡＮ−１腫瘍標的に加えた。補体媒介溶解（ＣＭＣ、データは図示せず）において、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１−ＤＥＬはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１またはｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎよりも悪くはなかった。ＩｇＧ重鎖における三重突然変異をｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１ｎと組み合わせると、ＡＤＣＣにおいてさらなる改良はなかった。
【実施例１４】
【０３２３】
イン・ビボでのＴ細胞およびエフェクターの装備
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞−媒介免疫において立役者であるＷＢＣである。それらはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるそれらの細胞表面での特殊な受容体の存在によってＢ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような他のリンパ球タイプから区別することができる、また、それらは、ＣＤ３と呼ばれるユニークな表面マーカーを運ぶ。Ｔは、Ｔ細胞の成熟を担う主たる器官である胸腺を表す。Ｔ細胞の数個のサブセットが存在し、各々が区別される機能を備えている。Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、抗体を分泌するためのＢ細胞の成熟、および細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含めた、免疫学的プロセスにおいて他のＷＢＣを援助する。それらはＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれるようになった。なぜならば、それらはＣＤ４蛋白質を運ぶからである。活性化された場合、ヘルパーＴ細胞は、迅速に分裂し、およびサイトカインを分泌して、免疫応答を調節し、または援助する。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して、免疫応答を変調する数個のサブタイプ（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、またはＴＦＨ）に分化することができる。いくつかの腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、癌の成長を抑制するにおいて十分である。規則的な活性化シグナルは抗原提示細胞（ＡＰＣ）から来るが、それらの表面ＣＤ３が抗体によって架橋された場合に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は活性化されたようになることができる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植または移植片拒絶の原因でもある。それらはＣＤ８＋Ｔ細胞と呼ばれる。なぜならば、それらは表面ＣＤ８糖蛋白質を発現するからである。それらは、多くのヒト腫瘍では存在しないか、または少ない、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に関連する抗原を認識することによって標的を係合させる。記憶Ｔ細胞は、ウイルスまたは腫瘍細胞が殺傷された後、長時間執拗に存在する抗原特異的Ｔ細胞である。それらは、腫瘍抗原で攻撃された場合に素早く多数に拡大でき、かくして、免疫系に癌に対する「記憶」を与える。ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、二次免疫系と先天性免疫系とを橋渡しするＴ細胞の特殊な種類である。ＭＨＣ上のペプチド抗原を認識する慣用的なＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞はＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示された糖脂質抗原を認識する。一旦活性化されると、これらの細胞はＴｈおよびＴｃ細胞双方と同様な機能（例えば、サイトカインの生産および細胞溶解性／細胞殺傷性分子の放出）を行うことができる。それらは腫瘍細胞を認識し、排除することが知られている。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、それらの表面にＴＣＲを運ぶＴ細胞の小さなサブセットを表す。Ｔ細胞の大部分は、α−およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの糖蛋白質鎖から成るＴＣＲを有する。しかしながら、γδＴ細胞においては、ＴＣＲは１つのγ−鎖および１つのδ−鎖から成る。それらは合計Ｔ細胞の５％のみを表すが、腸粘膜で最も豊富であり（上皮内リンパ球、ＩＥＬと命名される）。γδＴ細胞を活性化する抗原は知られておらす；しかしながら、γδＴ細胞がＭＨＣ制限されておらず、恐らくは、ＭＨＣ上のペプチドよりはむしろ全蛋白質を認識する。
【０３２４】
リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる１９８６年の養子免疫療法試験は、患者における偶発的腫瘍応答を報告した。ドナーリンパ球注入は、同種異系幹細胞移植に続いての慢性骨髄性白血病を持つ患者において、または移植後ＥＢＶ関連リンパ球増殖性の病気（ＰＴＬＤ）を持つ患者においてより多くの成功さえ示してきた。固形腫瘍においては、ＣＴＬは、高用量化学療法によって作り出されたリンパ球減少相の間に悪性黒色腫を治療するにおいて成功した。二特異的抗体は、２つのハイブリドーマを融合させて、２つの結合部位を持つハイブリッド免疫グロブリンを作り出すことによって作成される。該抗体は腫瘍をＴ細胞に拘束するのみならず；それらはＴ細胞上のＣＤ３を架橋し、および活性化カスケードを開始させる。このように、ＴＣＲベースの細胞傷害性は、ＭＨＣ制限を迂回する所望の腫瘍標的に再度向けられる。ポリクローナル的に活性化されたＴ細胞（ＡＴＣ）の抗ＣＤ３×抗ＴＡＡ（ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥ抗体）での装備は、ＭｏＡｂの標的化特異性（例えば、ＴＡＡがＧＤ２であるｈｕ３Ｆ８）をＴ細胞の非ＭＨＣ制限ペルフォリン／グランザイム媒介細胞傷害性と組み合わせる。ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥは、患者への注入前に、エクス・ビボでの拡大された活性化Ｔ細胞を装備させることができる。この戦略はあらゆるＡＴＣを特異的ＣＴＬに変換する（Ｔｈａｋｕｒ  ａｎｄ  Ｌｕｍ，２０１０，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２，３４０−３４９；Ｇｒａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，５６９−５７６）。
【０３２５】
腫瘍は多数のメカニズム：（例えば、ＮＢにおける）ＭＨＣの低い発現、または発現無し、Ｔ細胞シグナルのズレ、ＭＨＣ上への腫瘍ペプチドの減少した提示、共刺激分子の不存在、およびＣＴＬおよび液性応答を阻害する調節Ｔ細胞の誘導によってＴ細胞から逃れる。ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥを備えたＡＴＣによって行われる殺傷は非ＭＨＣ制限的であるので、この戦略は、これらの腫瘍逃避メカニズムを克服するはずである。腫瘍はＴｈ２型に対するＴ細胞免疫応答をシフトさせるＴＧＦ−βを分泌し、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＦＮ−γ分泌をダウンレギュレートし、他方、ＩＬ−１０およびＩＬ−６をアップレギュレートし、全ては免疫抑制に至る。ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥによって再度向けられたＴ細胞は調節サイトカインのこれらの負の効果を迂回することができる。というのは、装備されたＡＴＣはＩＬ−２独立的に腫瘍標的を溶解するからである。それらの腫瘍に向けられたＢｓＡｂまたはＢｉＴＥ装備Ｔ細胞で処置された患者は、増大したレベルのＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γを有し、これはＴ細胞をＴｈ１応答に向けてシフトさせるはずである。加えて、細胞傷害性Ｔ細胞は、それらのＦａｓを通じて、腫瘍細胞上のＦａｓ受容体（ＣＤ９５）を係合させるリガンド（ＦａｓＬ）を殺傷する。あいにく、腫瘍細胞上のＦａｓＬもまたＴ細胞のアポトーシスを誘導することもできる。ＣＤ３カスケードを通じてのＴＣＲ刺激はＣＤ９５媒介自殺からＣＤ８＋細胞を保護する。装備されたＡＴＣは、ＴＣＲのＢｓＡｂまたはＢｉＴＥでの架橋を通じてＣＤ９５−誘導細胞死滅に抵抗する。系列的に殺傷する、すなわち、１つのＴ細胞が連続した腫瘍標的を殺傷し、プロセスの間に増殖し、およびリンパ管および柔軟組織に移動するＴ細胞の能力は、それらが骨髄空間から外へ転移して、腫瘍塊を形成しつつ、ＮＢ細胞を捕獲するチャンスを増大させた。ＢｓＡｂまたはＢｉＴＥ標的化ヒト癌を用いる最近の研究は有望性を示した。
【０３２６】
特に、同種異系造血系細胞移植片を受けた患者の分析から、増加する証拠があり、リンパ腫およびある種の形態の白血病を抑制し、または根絶するＴ細胞の潜在能力を裏付ける（Ｏ’ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２，１６２−１７２）。しかしながら、子供における固形腫瘍の制御でのＴ細胞に対する役割を裏付ける確実なデータは無い。これは、これらの腫瘍の切断は遺伝されたクラスＩまたはＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子（例えば、神経芽細胞腫）（Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，４６３４−４６４４；Ｗｏｌｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４，４００−４０６）またはクラスＩ対立遺伝子のみを、かつ低いレベルで発現する（例えば、横紋筋芽細胞腫（Ｐｒａｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  ５３，２２６−２３１）事実と合致する。さらに、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１のような臨界的な共刺激性分子の発現は、しばしば、低いかまたは検出できない。その結果、Ｔ細胞応答を惹起するこれらの腫瘍の能力は貧弱であって、ＨＬＡ対立遺伝子によって提示される腫瘍抗原を結合させることによってＴ細胞受容体を通じて腫瘍を係合させるエフェクターＴ細胞の潜在能力は制限されている。さらに、神経芽細胞腫、横紋筋芽細胞腫、ユーイング肉腫、および線維形成性の小さな細胞腫瘍について現在利用できる最も効果的な療法は、重度のＴリンパ球減少症を誘導する用量にて免疫抑制アルキル化剤、特にシクロホスファミドを使用する。二機能性抗体は、Ｔ細胞の標的化係合、およびそれらの抗原特異的ＨＬＡ制限ＴＣＲよりはむしろＨＬＡ非制限ＣＤ３媒介活性化を通じてのそれらのエフェクター機能の開発を可能とする。ＣＤ３、およびＣＤ−１９、ＨＥＲ−２  ＮＥＵ、またはＣＥＡのような腫瘍抗原に対して特異的なある種の二機能的モノクローナル抗体の実験は、細胞傷害性Ｔ細胞を、他の標的化抗原を発現する腫瘍細胞に連結させるこれらの抗体の能力を示した（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，９７４−９７７；Ｔｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ（ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒｕｃｔｓ）１１４，８４０；Ｋｉｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，３０８５−３０９１；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｎｏｔｈｅｒ  ３２，３４１−３５２）。一旦双方の抗体受容体が係合したならば細胞傷害性Ｔ細胞の応答は腫瘍細胞に対して開始される。Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞受容体と腫瘍細胞間の細胞傷害性シナプスの形成、ならびに腫瘍細胞アポトーシスのぺルフォリンおよびグランザイム媒介誘導を含む（Ｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３，７６３−７７１；Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３，１１２９−１１４３）。ＣＤ３の係合もまたＴ細胞を活性化させ、抗腫瘍効果を増強させるエフェクターサイトカインの増殖および生成を誘導する（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，前掲；Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａ���．，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３０，７９８−８０７）。顕著には、活性化されたＴ細胞は、Ｔ細胞活性化の間に生じたＴＮＦおよびＦａｓリガンドの細胞傷害性効果からそれらを保護する抗アポトーシス蛋白質ｃ−ＦＬＩＰをアップレギュレートする（Ｄｒｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００，６９０−６９７）。その結果、Ｔ細胞応答は大きくなる。結果として、ピコグラムレベルの二機能性抗体は、前臨床動物モデルにおいて、特に、Ｂ細胞リンパ腫およびＡＬＬ（Ｔｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，前掲；Ｋｉｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，前掲）の処置において二特異的なＣＤ３／ＣＤ１９の最初の臨床試験の結果において示されるように、イン・ビトロにて（Ｌｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，前掲；Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６，１５５１−１５６３）およびイン・ビボにて、有意な抗腫瘍効果を発揮することができる。誘導されたＴ細胞応答はナイーブなＴ細胞を動員させることもでき、および腫瘍部位における腫瘍特異的Ｔ細胞の生成を刺激すると仮定されてきた（Ｋｏｅｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９，１７３０−１７４０）。二特異的抗体を用いて、Ｔリンパ球とは別に他のエフェクター細胞を再度標的化することもできる。これらのエフェクター細胞は、ＧＤ２を発現する細胞、組織または器官に対する、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、神経幹細胞、および他の幹細胞を含む。組織が腫瘍である場合、これらのエフェクター細胞は、蛋白質（例えば、サイトカイン、抗体、酵素、またはトキシン）、診断用の、または療法用の放射性同位体を殺傷し、または沈積させるように開発させることができる。組織が正常な器官である場合、エフェクター細胞は、同様に、診断用、または療法用の蛋白質または同位体を送達するように開発することができる。
【０３２７】
二特異的ＭｏＡｂは、１つのドメインが抗３Ｆ８可変ドメインを有し、他のドメインが腫瘍細胞傷害性のためのＴ細胞を再度標的化するための抗ＯＫＴ３、または多工程予備標的化のためのＤＯＴＡ金属、Ｃ８．２．５、またはアゴニストとしての抗４１ＢＢ−ｓｃＦｖを備えた、またはＣＤ１３７を備えたＡＤＣＣのための、アゴニストとしての４１ＢＢＬを備えたＡＤＣ用の４１ＢＢＬから成る群から選択される、デュアル可変ドメインから成ることができる。ＣＨ２ドメインにおけるＮ２９７Ａ突然変異の結果、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）がもたらされ、これはＦｃＲまたはＣ１ｑ結合に至らない。ｈｕＯＫＴ３−ｓｃＦｖがジスルフィド安定化された（ｈｕ３Ｆ８−ＬＣ）−（ｈｕＯＫＴ３−ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列は配列番号：２３に示される。（Ｏｒｃｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３，２２１に基づいた）、ｃ８．２．５−ｓｃＦｖがジスルフィド安定化されたｈｕ３Ｆ８−ＬＣ）−（Ｃ８．２．５−ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列は配列番号：２４に示される。
【０３２８】
二特異的抗体（抗ＧＤ２および抗ＤＯＴＡ）は多工程予備標的化の第一の工程で用いることができ、続いて、除去剤としてのＤＯＴＡ（金属）−デキストランを用いて血液除去を行い、第三の工程はＤＯＴＡ（金属）−放射性金属、ＤＯＴＡ（金属）−ナノ粒子、ＤＯＴＡ（金属）−リポソーム、ＤＯＴＡ（金属）−薬物、ＤＯＴＡ（金属）−ＤＮＡ，ＤＯＴＡ（金属）−ＲＮＡおよびＤＯＴＡ（金属）−トキシンのようなＤＯＴＡ（金属）−コンジュゲーテッド治療剤を導入する。
【０３２９】
Ｃ８．２．５は、ＤＯＴＡ−金属複合体の各タイプに対して異なる親和性を有するので、除去剤およびＤＯＴＡリガンドに対する予め標的化されたＣ８．２．５の親和性は正確に制御することができる。
【０３３０】
３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８およびその変種のアミノ酸配列を用いて、他の抗ＧＤ２抗体について既に示されたように（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８，６１９−６２６）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を構築することができる。再標的化免疫エフェクター細胞のＣＡＲ戦略は、ＭＨＣ−ペプチド−ＴＣＲ相互作用から独立しており、および細胞を、非常に種々の細胞表面抗原に対して反応させる（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｈｅｒ，２０１０，Ａｃｈｉｖｕｍ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  ｔｈｅｒａｐｉａｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ５８，１６５−１７８）。数種の方法がＣＡＲの設計で用いられてきており、それらのうちほとんどは、抗原認識のための単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態であるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを使用する。最初のＴ細胞活性化受容体は、研究者がＣＤ３ζ鎖の役割を解明するのを可能とする実験に由来するものであった（Ｉｒｖｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６４，８９１−９０１；Ｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８，８８９−８９７）。引き続いての実験において、注目するｓｃＦｖをＣＤ３ζ鎖（Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０，７２０−７２４）またはＦｃεＲＩγ（Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７，８３６−８４３）に融合させ、および双方はＴ細胞活性化で十分なことが判明した。これがＣＡＲ構築のための計画を準備する間に、共刺激分子の取り込みが、第一世代のＣＡＲが、ただ２〜３回の細胞分裂までＴ細胞増殖を誘導でき、続いて、迅速に細胞の死滅が起こることが判明した後に、起こった（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １，１２３−１２７）。標的腫瘍細胞上にＣＤ８０を発現させることによって、研究者らはＣＡＲ発現細胞が再度を刺激することができ、Ｔ細胞の数のさらなる増加につながることを示すことができた。ＣＤ３ζ鎖と共にＣＤ２８共刺激性分子を取り込んだ最初のＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖を単独で発現させたものよりもかなりの改良を示した（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，前掲；Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  １００，３１５５−３１６３；Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０，７０−７５）；これはＴ細胞の数の絶対的な増加ならびにＩＬ−２の生産の増加を含むものであった。それ以来、他の数グループは、ＣＤ３ζ単独と、またはＣＤ３ζおよびＣＤ２８双方と組み合わせて、他の共刺激分子を用い始めた。これらのさらなるシグナリング分子は４−１ＢＢ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８，７１２−７２５；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，５４２６−５４３２；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８，６７６−６８４；Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，１０４−１１３）、ＤＡＰ１０（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，前掲）、ＯＸ４０（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，前掲；Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，前掲；Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０，４９０１−４９０９；Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅｒ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０，５９４−６０４；Ｐｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２，９３３−９４１）およびＩＣＯＳ（Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，前掲）を含み、およびＴ細胞ならびにＮＫ細胞との関係で適用されてきた（Ｄａｌｄｒｕｐ−Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｒｏｐｅａｎ  ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １５，４−１３；Ｉｍａｉ  ａｎｄ  Ｃａｍｐａｎａ，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  Ａｇ  １８，６２−７１；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７５−３８４；Ｋｒｕｓｃｈｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＡＮＳ  ＵＳＡ  １０５，１７４８１−１７４８６；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１，３４４９−３４５５）。第一世代のＣＡＲは、この時点まで診療所でテストされてきた唯一のものであり、イン・ビトロおよびイン・ビボの双方の比較は、第二および第三世代のＣＡＲに関する明らかな優位性を示した（Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，前掲；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，前掲；Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １５，６９９−７０８；Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，５７８０−５７８６；Ｋｏｗｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，１０９９５−１１００４；Ｌｏｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０，１８１９−１９２８；Ｍｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１，３７１−３７９；Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８，３８９０−３８９７）。
【０３３１】
現在、ほとんどの研究者らは大量のヒト末梢Ｔ細胞を用いているが、他の研究者らは、最近、ＥＢＶ−特異的Ｔ細胞（Ｒｏｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９，２００９−２０１６）、リンパ系先祖細胞（Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １２，１０３９−１０４７；Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２６，４５３−６１）、および未分画骨髄細胞（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９，１５７−１６８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ４，１６８−１７２）を使用し始めた。細胞溶解性であって培養が容易なキラー白血細胞系（ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩ、ＫＨＹＧ−１）もまた前臨床および臨床試験のためのエフェクター細胞を発現するＣＡＲの連続的な供給を供することができる。ＮＫ９２ＭＩは非ホジキンリンパ腫に由来するヒトＮＫ細胞系であってヒトＩＬ−２ｃＤＮＡで形質導入され；従前の研究はマウスモデルにおけるその強い細胞傷害性能力を示した（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８，２８１−２９０；Ｋｏｒｂｅｌｉｋ  ａｎｄ  Ｓｕｎ，２００１，Ｉｎｔｅｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９３，２６９−２７４）。加えて、ＮＫ９２細胞もまた臨床設定において用いられており、および腎臓細胞癌腫および黒色腫を持つ患者において多数の相Ｉ研究後に安全であることが証明された（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １０，６２５−６３２）。イン・ビトロでの維持のそれらの容易性および比較的短い倍加時間のため、これらの細胞は、種々の標的化アプローチをテストするための種々の細胞傷害性アッセイのための理想的なエフェクターである。元来のＩＬ−２−依存性ＮＫ９２細胞系を用いる研究はマウスおよびヒト双方において最小の傷害性を示したが、ＩＬ−２−形質導入ＮＫ９２ＭＩ細胞はより大きな白血病誘発性潜在能力を有し得る。研究者らがＮＫ９２細胞を用いてＳＣＩＤマウスにおける白血病誘発を試み、かつそれを回避する１つの方法は、接種前にエフェクターに３０００ｃＧｙを照射することによるものである。相Ｉ臨床試験において、これは、ＮＫ９２ＭＩ細胞を、免疫無防備状態患者の内部で制御できずに増殖するのを妨げるにおいて十分である。代替安全性メカニズムは、自殺遺伝子の使用を含むことである。１つの共通の例は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の使用である。これは、アシクロビルまたはガンシクロビルの投与によって遺伝子を発現する細胞を殺傷することによって働く（Ｈｅｌｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５０７９−５０８２）。
【配列表】
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