(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体組織から再生細胞を回収する方法であって、容器中で上記体組織をタンパク分解酵素と一緒に水性媒体に入れ、上記容器はこの容器の内容物に互いに反対方向の加速力および減速力が加わるようなローター上の位置に固定し、上記容器に上記の回収が十分にできる所定時間の間、少なくとも２回のラウンドで遠心分離機の軸線の周りでの回転加速および減速を反復して加え、各ラウンドでは容器を遠心分離機の軸線上でローターを中心に１分間当たり少なくとも一回のスタート−ストップの反復サイクルを行って上記体組織とタンパク分解酵素を攪拌することを特徴とする方法。
【請求項２】
体組織が脂肪組織であり、タンパク分解酵素がコラーゲナーゼ（collagenase）および中性プロテアーゼの中の少なくとも一つである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
体組織が脂肪吸引物である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
容器を固定する上記のローター上の位置が下記の(i)または(ii)のいずれか一つの位置に対して上向きの鋭角を成す請求項１に記載の方法：
(i)遠心分離機の軸線が垂直方向を向く位置、または
(ii)上記容器に複数のラウンドで加速と減速を反復的に加える間にローターが固定される点で遠心分離機の軸線が通る水平位置。
【請求項５】
上記水性媒体に入れた体組織とタンパク分解酵素の容積が上記容器の完全充填容積より少なく、さらに、容器の一端がその容器の他端よりもローターに接近し且つ容器の他端が上記容器の一端より高くなるように、水平面と回転シャフトの垂直軸線との間の上向き傾斜位置で上記容器をローターに着脱自在に固定し、加速および減速のラウンドを１分間当たり上記容器が1回転以上する速度で回転して上記容器の内容物の混合を容易にする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
５０ｇ〜４０００ｇの範囲の遠心力を上記容器の内容物に加えるのに十分な回転力を加える請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のラウンドで加速と減速を反復的に加える間に上記容器を２６〜４２℃の間の制御温度に維持する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数の容器を使用し、この複数の容器を回転シャフトの周りに互いに所定角度だけ離して配置し、各容器の一端をローターに接近させ且つその他端を下側に配置して、ローター上で加速および減速の回転を反復する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体組織から再生細胞を分離させる方法であって、体組織を水性媒体中のタンパク分解酵素と一緒に容器に入れ、上記容器を遠心分離機の回転シャフトに対して一定位置に固定し、且つ、上記回転シャフトから上記容器を取り外さずに、あるいは、反復ラウンド中に上記容器の内容物が混濁させない状態で、複数のラウンドで上記回転シャフトの周りを回転させ、各ラウンドでは上記容器に１分間当たり少なくとも1回の加速および減速を行って複数のラウンドで上記容器の内容物に互いに逆向きの遠心力と重力とを加えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
容器をローター上に固定する上記の位置が、遠心分離機の軸線上でローターに容器を着脱自在に取り付けるカップリング装置によって提供され、このカップリング装置は下記の(i)または(ii)のいずれかの状態で上記容器を保持する請求項９に記載の方法：
(i)  回転シャフトに対して一定の角度位置、または
(ii)  容器に加わる回転力に応じて変化する回転シャフトに対して一定の角度位置。
【請求項１１】
体組織サンプルから再生細胞を単離するための組織自動処理装置であって、一つの回転シャフトと、体組織サンプルとタンパク分解酵素の各容器を上記回転シャフトに着脱自在に固定するための少なくとも一つのロック可能な機構と、上記回転シャフトに固定された各容器に回転力を加えるモータとを有し、このモータは、上記回転シャフトから上記容器を取り外さずに、あるいは、反復ラウンド中に上記容器の内容物が混濁させない状態で、１分間当たり少なくとも1回の加速および減速を各容器に生じさせる、スタート−ストップの反復ラウンドで回転シャフトをプログラム制御下に回転させ、
各容器は、体組織サンプルから再生細胞を分離ができるように上記容器の内容物の攪拌を促進するのに十分な時間と温度で、上記容器の内容物に互いに逆向きの複数のラウンドで遠力と重力とが加わるように、上記のロック可能な機構によって保持され、各容器の回転が制御されることを特徴とする組織自動処理装置。
【請求項１２】
上記回転シャフト上にローターをさらに有し、上記のロック可能な機構はこのローター上に配置され、各ロック可能な機構は隣接するロック可能な機構が互いに離れるように上記回転シャフトの周りに所定角度で配置され、各ロック可能な機構は(i)固定角度または(ii)ローターにロックした時に上記容器に加わる回転力に応じて変化する角度のいずれかの角度で各容器を着脱自在に保持し、これらの角度は鋭角で且つローターの他端よりローターにより接近して取り付けられた容器の一端が上方向に突き出る請求項１１に記載の組織自動処理装置。
【請求項１３】
体組織から再生細胞を回収するための装置であって、
体組織サンプルとタンパク分解酵素とを収容した少なくとも一つの容器を取付けでき且つ各容器の一端が他端よりもローターの軸線に接近し且つ下側に位置するように各容器をローターのシャフトに一定角度で保持する遠心分離機を有し、
この遠心分離機は、
組織サンプルから再生細胞を分離するのに十分な所定の時間の間、１分間当たり少なくとも1回の加速および減速度で上記容器の内容物を互いに逆向きの遠力と重力で攪拌するように、上記ローターに複数の反復ラウンドで加速および減速を加えるようにプログラミングされており、
さらに、前後の反復ラウンドを行う間に、上記回転シャフトから上記容器を取り外さずに、あるいは、反復ラウンド中に上記容器の内容物が混濁させない状態で、上記の所定の時間の間に上記容器に１分間当たり少なくとも1回の加速および減速のラウンドが行われるように遠心分離機がプログラムされている、
ことを特徴とする装置。
【請求項１４】
上記ローターに複数の反復ラウンドで加速および減速を加える間に、上記容器の内容物の温度、従って、上記ローターに保持された各容器の温度を２６℃〜４２℃の温度に維持するヒーターをさらに有する請求項１３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2010年12月16日出願の米国仮特許出願第61/424,012号および2011年11月3日出願の米国仮特許出願第61/555,305号に優先権を主張するものである。これら先出願の内容は本出願中で引用したものとする。
【０００２】
本発明は、細胞濃縮されたマトリックスおよび細胞、特に遠心力下に２回以上の加速および減速段階およびその組合せを実行して、組織サンプルから細胞を回収する回収方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
現在の再生医薬の戦略はアポプトーシス割合が増加した組織を交換する戦略に向かっている。換言すれば、交換される細胞より多くの細胞が死ぬため、器官内部では機能性細胞が正味では失われるということを意味する。従って、均衡した器官へ戻す治療アプローチは一つの局所位置から細胞（例えば幹細胞や先祖細胞）を再生サイトへ移動させることである。当研究所の研究から、幹細胞および再生細胞はあらゆる器官に存在するが、主として前弾性膜（interna）に付いた導管壁の早期先祖細胞と一緒に血管および血管周囲の空間中に位置していることが示された。これらの細胞の一部の母集団は器官の間質を交換でき、これらの細胞の他の部分は特定器官の各実質（parenchym）に分化することができる。各器官は家（ハウス）と比較でき、線維芽細胞および細胞外マトリックスでできた間質は家のレンガやモルタルの壁に対応し、家の配管は器官の血管に対応し、神経は壁内の電気配線を表す。家の内部で各器官は一定タイプの住人、例えば肝臓細胞、心臓細胞、骨細胞、軟骨または脂肪細胞（いわゆる器官の実質）を有する。
【０００４】
機能不全の器官で機能を戻すためには、両方すなわち実質細胞である器官の壁を形成するハウジングと住人に間質を与えることが重要である。
【０００５】
再生器官の機能を回収できる再生細胞を回収する簡単な方法は、血管を豊富に含み、脂肪組織の分離は生命にとって重要ではない皮下脂肪組織からそれを分離することである。大部分の人は、幸運にも、そうした組織を数グラム提供することができるようになっている。
【０００６】
脂肪吸引法（lipoaspiration）によって取り出した組織の自己グラフトは、小量（例えば鼻唇）および大量（殿部または胸）の容積を充填する整容手術で普通の手法である。「自己由来脂肪のグラフト」とよばれるこの手法の第一の利点は患者自分自身の組織を使うので、合成充填物より低コストであり、免疫不適合がないことである。現在ではいくつかの脂肪吸引法を用いて組織を回収し、グラフトに使っている。自己由来脂肪のグラフト後の臨床結果を決定するファクタは完全にはわかっていないが、グラフト鎖の持続性を改善することが重要な領域であることは広く認識されている。
【０００７】
体の一つの位置から回収されて他の位置へ移される移動脂肪細胞は好気性代謝を続けているので、適切な血液供給をしないとこれらの細胞は壊死し、アポプトーシスし、24〜48時間以内に自己消化し死亡する。脂肪を体のある位置から脂肪吸引法し、他の位置へ移動させる従来の脂肪グラフトの一つの問題は移した細胞の大部分が生き残れず、壊死した細胞によってかなりの局所炎症が生じることである。脂肪グラフトの持続および再生の能力はグラフト鎖中のリポ充填（lipid-filled）脂肪細胞の含有量とは無関係で、幹細胞のような再生細胞の含有量および投与した細胞外マトリックスに関係する。収穫および再投与に起因する外傷とグラフトの虚血環境のために、成熟した脂肪細胞の後グラフトのロス量は多い。これとは対照的に幹細胞および再生細胞はこれらのファクターに強い耐性を示し、グラフトの長期生存力および再生ポテンシャルに大きく寄与する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、皮下組織またはビルドアップを必要とするその他の結合組織構造を容積充填（volume filling）するための改良された方法に関するものである。本発明方法は、脂質（リピド）の含有量を減らし、再生細胞の濃度を増加させた細胞濃縮マトリックスの移動を含む。結合組織は脂肪細胞と比較して代謝性が大幅に低いので、結合組織は虚血に対して長時間の許容性を有しているということは知られている。
【０００９】
従って、本発明の目的は、細胞−細胞濃縮マトリックスを長期間安定に容積充填するための方法と装置を提供することにある。本発明を用いると新しい位置へ移した時の組織の生存率が大きくなる。以下で記載するように、組織レジデント(居住性)幹細胞からの血管新生によって移植されたグラフトの生存力が強くなる。本発明方法の追加の改良点は、分離した再生細胞と一緒に加熱した遠心分離機中の反転ローターで加速と減速する、脂肪吸引物の酵素分解を含む本発明方法で回収した細胞濃縮マトリックス混合物を再び用いる点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞-濃縮されたマトリックスの新規な調整および回収方法と、マトリックスの回収で使用したのと同じ装置を用いて、皮下の位置から再生細胞を回収する改良された方法と、細胞-濃縮マトリックスと再生細胞とを組み合わせて血管新生率を高くし、移植した容積充填グラフト組織の生存率を高くする方法とを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、皮下脂肪組織中に存在するものから、早期間葉細胞(earlymesenchymal cells)に全ての範囲の先祖細胞をプラスしたものとして定義される再生細胞を有効に回収するためのコスト的に効率の良い方法を提供する。始めの脂肪吸引物(lipoaspirate)から前処理して脂質-充填細胞(脂質に満ちた細胞)の含有量を減らすことは高価な酵素、例えばコラゲナーゼや中性プロテアーゼを保存する効果的な方法である。本発明方法は、脂肪吸引物中の脂質-充填細胞の量を減らして細胞-濃縮されたマトリックスを回収する段階と、その後の、脂質含有量が減った細胞-濃縮されたマトリックスに酵素を加え、再構築可能な(reconfigurable)なローターを有する加熱した遠心分離機で温度を上げて加速と減速を繰り返すサイクルを行う酵素と機械的プロセスの段階の２ステップのアプローチを含む、再生細胞の調整を最適コストで回収する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例に記載の組織サンプルから細胞を解離、分離、回収する装置の透視図。
【図２】解離相の各時間およびエネルギーサイクルおよびその組合せのグラフ。
【図３Ａ】〜
【図３Ｅ】遠心分離機に適した各種容器の透視図。
【図４】実施例に記載の一つの容器組立体の透視図。
【図５】［図１］の装置の一実施例の横の横断面図。
【図６】［図１］の装置の実施例を使用した加工後または振盪培養器で加工後に得られる付着細胞数の棒グラフ。
【図７】［図１］の装置および［図３Ａ］、［図３Ｄ］または［図３Ｅ］の容器を使用して加工した後または振盪培養器を使用して加工した後に得られる付着細胞数の棒グラフ。
【図８】組織自動処理装置に挿入可能な着脱自在な回転装置の平面図。
【図９】組織自動処理装置に挿入可能な着脱自在な回転装置の側面図。
【図１０】遠心分離なし、遠心分離あり、またはそれを押出す処理をした脂肪組織から得られる付着細胞数/g組織のグラフ。
【図１１】押出しにエマルジョンノズルから押出し（押出しSS）またはルアー押出し、その後に遠心分離しないか、1200×gで遠心分離した、脂肪組織から得られる細胞数/g組織のグラフ。組織は注射器を使用して押出し装置を５×通して押出した。
【図１２】遠心分離を５分、10分または20分した後に脂肪組織から得られる付着細胞数/g組織のグラフ。
【図１３】遠心分離なし、400×gで30分または1200×gで30分間遠心分離した後に脂肪組織から得られる付着細胞数/g組織のグラフ。
【図１４】グラフト用組織調整で脂肪誘導再生細胞（ADRC）の濃度を増加させる方法の概略図。先ず最初に組織を加工して細胞濃縮されたマトリックス（ＣＥＭ）中のＡＤＲＣに濃縮する。このＣＥＭの半分を加工して単離ＡＤＲＣを作り、それをさらに残りのＣＥＭと組み合わせてグラフト中のＡＤＲＣ濃度を増加させる。
【図１５】酵素効率を増加させ、ＡＤＲＣを得るために脂肪組織または脂肪吸引物の加工で使用可能な方法を示す概念図。最初に組織を加工してＣＥＭ中のＡＤＲＣを濃縮し、それを組み合わせ、加工してＡＤＲＣを得る。  各図で類似要素には同じ記号を付けた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
処理済みの脂肪吸引物を得ることを目的とする現在公知の皮下脂肪の処理方法は単に遠心分離するだけである。以下で示すように、遠心分離による加工だけでは処理炉未組織の細胞収率が単に増加するだけである。しかし、遠心分離段階の前に大部分の脂肪組織を除去することで処理済み脂肪吸引物材料（細胞-濃縮されたマトリックスという）中の細胞含有量を増やすことができる。
【００１４】
以下で説明するように、皮下組織を加工して得られる細胞濃縮されたマトリックスは主としてコラーゲン、ラミニン、エラスチン、細胞外マトリックスおよび組織居住（tissue resident）細胞の他のプロテオグリカンから成るか、ステム細胞および先祖細胞、まとめると、組織に結合している「再生細胞(regenerative cells)」または「再生プラットホーム(regenerative platform)」を含む。一般に、細胞-濃縮されたマトリックスはその組織位置に結合された再生細胞を少なくとも90％を含む。
【００１５】
本発明の一つの実施例で、本発明は細胞-濃縮されたマトリックスを製造し、回収するための方法および装置を提供する。
【００１６】
本発明の一つの実施例で、本発明は細胞-濃縮されたマトリックスを調製し、再生細胞を回収する方法および装置を提供する。
【００１７】
本発明の一つの実施例で、本発明は分離した再生細胞を含む細胞の組成物または細胞-濃縮されたマトリックスと再生細胞の両方を含む細胞組成物を提供する。本発明で製造した細胞-濃縮されたマトリックスは脂質の含有量は減るが、再生細胞の濃度は増加する。結合組織は脂肪細胞と比べて代謝が低いので、結合組織は虚血に対してより長い許容正を有するということは知られている。本発明の細胞組成物はグラフトの血管新生を高め、グラフト鎖はより長時間生き残ることができる。細胞-濃縮されたマトリックスと再生細胞との組合せを含む細胞組成物はグラフトの血管新生を高め、時間生き残るグラフトを増やすのに特に有効である。
【００１８】
本発明の一つの実施例は細胞-濃縮されたマトリックスを組織から回収する方法に特徴がある。この方法は小孔（ostium）を通って水溶性流体中の脂肪組織ピースの懸濁物液を含む組織サンプルを押出し、押出された組織サンプルを遠心分離して細胞-濃縮されたマトリックスを脱凝集することを含む。小孔（ostium）の直径は1〜5mmにすることができる。押出された組織サンプルは最低で400×g、好ましくは1200×g（例えば400×g〜1200×g）で少なくとも5分間遠心分離される。この方法で細胞-濃縮されたマトリックスから細胞を回収することができる。
【００１９】
本発明の他の実施例の特徴は組織から細胞を回収する方法にある。本発明方法は、遠心分離機に適した容器中に収容した水性流体に懸濁させた組織ピースから成る組織サンプルを用意し、回転要素を介して加えられる遠心力を用いた少なくとも一回の加速段階および減速段階を上記組織サンプルに加え、上記回転要素はシャフトと、このシャフトから延びた一つまたは複数のアームから成り、(i)一つまたは複数のアームは、シャフトが回転した時に、一つまたは複数のアームがシャフトに対して上向き且つ外向きに回動するように上記シャフトに支持され、(ii)上記の一つまたは複数のアームは固定角度で吊り下げられ、アームに取付けた容器は、材料に加わる重力がそれに加わる遠心力とは逆方向となるように保持され、加える遠心力を約50ｇ〜約4000ｇにすることを含む。サンプルの温度は32〜42℃に維持できる。酵素（例えばコラゲナーゼまたは中性点プロテアーゼのようなプロテアーゼ）または以下に記載の他の酵素）を含めることもできる。
【００２０】
本発明の他の実施例の特徴は、組織サンプル（例えば脂肪吸引物、脂肪組織およびこれらの組合せ）からの再生プラットホームを回収する方法にある。この方法は収容した組織サンプルを組織自動処理装置に取り付けた第１容器に入れ、組織自動処理装置は少なくとも２つのキャビティを有する着脱自在な回転装置から成り、各キャビティはキャビティ内に組織収集容器を着脱自在に挿入するように構成され、組織サンプルは水溶性流体中に組織ピースの懸濁物を含み、組織サンプルを動化された組織処理装置を使用して少なくともや約５分間少なくとも約400×gで少なくとも1サイクル遠心分離して、組織サンプルから細胞-濃縮されたマトリックスを脱凝集する。この細胞-濃縮されたマトリックスは再生プラットホームを含む。この方法はさらに、組織自動処理装置に組織サンプルをセットする前にオリフィスを通して組織サンプルを押出すことを含むことができる。細胞-濃縮されたマトリックスは、オリフィスを通して組織サンプルを押出さずに行った対応する方法と比較して、再生プラットホームの濃度をより高くすることができる。この方法はさらに、クローズドシステム方法によって組織サンプル濃縮物を最初の組織収集容器から第２収集容器に移すことを含むことができる。いくつかの実施例では第２収集容器に少なくとも一つのプロテアーゼを加えられることができる。細胞-濃縮されたマトリックスには少なくとも２回の加速サイクルを加え、各加速サイクルの後に減速サイクルを行って、細胞-濃縮されたマトリックスを分解させることができる。いくらかの実施例では、細胞-濃縮されたマトリックスを濾過して、注射可能な再生プラットホームを得ることができる。
【００２１】
本発明の全ての方法で、注射可能な再生プラットホームの一部を患者の注射部位に投与することができ、射出は注射部位またはその近傍区域を変更することができる。
【００２２】
本発明はさらに、再生プラットホームを含む細胞-濃縮されたマトリックスを脱凝集（disaggregating）する方法にも特徴がある。本発明方法は組織自動処理装置に適した第２組織収集容器に収容した細胞-濃縮されたマトリックスを用意し、この組織収集容器は少なくとも一種のプロテアーゼを含み、細胞-濃縮されたマトリックスを少なくとも２回加速し、各加速ラウンドの後に減速ラウンドを行い、少なくとも２回の加速、減速ラウンドを少なくとも10×ｇの速度で実行して細胞-濃縮されたマトリックスを脱凝集させる。本発明方法はさらに濾過工程または濾過と濃縮工程を含むことができ、分解された細胞-濃縮されたマトリックスは注射可能な再生プラットホームとして得られる。
【００２３】
本発明はさらに、少なくとも２つのキャビティを有する着脱自在な回転装置を特徴とする。各キャビティはそのキャビティ内に組織収集容器を着脱自在に挿入するように構成され、着脱自在な回転装置は細胞-濃縮されたマトリックスを組織サンプルから分離するために組織自動処理装置内で回転するように構成され、着脱自在な回転装置には高周波識別（RFID）タグを取り付けたことができ、それによって着脱自在な回転装置を組織自動処理装置で同定することができる。あるいは、着脱自在な回転装置のタイプを加速時に装置を加速するのに必要な電流量に基づいて識別することもできる。着脱自在な回転装置は加圧滅菌可能な材料を含むことができる。
【００２４】
本発明の別の態様では、本発明は、細胞-濃縮されたマトリックスを組織サンプルから分離するための組織自動処理装置に特徴がある。この組織自動処理装置は少なくとも２つのキャビティを有する着脱自在な回転装置を含み、各キャビティはキャビティ内に組織収集容器を着脱自在に挿入するように構成され、組織自動処理装置は温度運転制御装置を含むことができ、組織自動処理装置は少なくとも２回の加速の停止−開始インターバルを有するように構成でき、着脱自在な回転装置は組織自動処理装置が着脱自在な回転装置を識別するための少なくとも一つの所定スペックを有することができる。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明は遠心力下で急速な加速と減速の段階を少なくとも２回実行するために用いる改良型の遠心分離機が提供される。上記段階は一種または複数の酵素（例えばコラゲナーゼおよび中性のプロテアーゼ）の存在下で細胞外マトリックスの劣化および細胞の放出を高くする熱的に調整された環境（例えば35〜42℃）で実行できる。遠心分離は細胞外マトリックスから開放された細胞を回収するのに用いることができる。本発明方法および装置は血管を豊富に含むヒトまたは動物の任意組織を処理するのに利用できる。本発明の方法および装置は新生血管がリッチで患者からの回収が容易な脂肪組織（例えば皮下または腹腔内の脂肪組織）から細胞を回収するのに特に有効である。
【００２６】
本発明はさらに、細胞を組織から回収する方法を提供する。本発明方法は遠心分離機に適した容器に水溶性流体中の組織ピースの懸濁液を含む組織サンプルを用意し、その組織サンプルに遠心力を使用して複数の加速および減速段階を加える。組織サンプルはヒトの組織または動物の組織を含むことができ、血管を含むことができる。組織サンプルは例えば脂肪吸引物のような脂肪組織にすることができる。本発明方法では組織サンプルに複数の加速および減速段階を行うとともに容器内部を26℃〜42℃の温度に維持することができる。組織サンプルには一種または複数の酵素（例えばコラゲナーゼ、他のプロテアーゼまたはそれらの混合物）の存在下で加速および減速段階の複数回加えることができる。
【００２７】
本発明のいくつかの実施例では、各加速段階を５〜20秒間実行でき、各減速段階を３〜20秒間実行できる。組織サンプルに５分〜180分間（例えば20分〜60分）の加速および減速段階を複数回行うことができる。一つの実施例では、組織サンプルに少なくとも200×ｇの加速と1×ｇの減速の３サイクルを30分間行う。
【００２８】
本発明の他の観点から、本発明は細胞を組織から回収する方法に特徴がある。本発明方法は水溶性流体中の組織ピースの懸濁液を含む組織サンプルを用意し、その組織サンプルを遠心分離機に適した容器に収容し、そのサンプルに回転要素を介して加えられる遠心力を使用して複数回の加速、減速段階を実施する。回転要素はシャフトから延びたシャフトと一つまたは複数のアームを有し、(i)この一つまたは複数のアームはシャフトの回転時に、シャフトから各アームが上向き外側へスイングするか、(ii) アームが固定角度で支持されて、材料に加わる重力とは逆方向に遠心力が加わるように容器をアームに対して取付ける。各加速段階の遠心力は約50g〜約4000gの範囲で、５〜20秒間実行できる。各減速段階は３〜20秒間実行できる。組織サンプルには５〜180分（例えば２０〜６０分）の加速および減速段階を複数回行うことができる。一つの実施例では、組織サンプルは30分間で200×ｇの加速と１×ｇの減速を少なくとも３サイクル行う。
【００２９】
本発明はさらに、再生細胞を組織から回収する方法に特徴がある。本発明方法は水溶性流体中の組織ピースの懸濁液から成る組織サンプルを遠心分離機に適した容器に収容した組織サンプルを用意し、そのサンプルに遠心力を使用して複数回の加速および減速段階を加え、サンプルを400〜4000×ｇで遠心分離して細胞成分を分離する。細長い円柱形の中央部分を含む容器内にサンプルを収容し、400〜4000×ｇに遠心分離を加える。上記中央部分にはそれと一体的に形成された第１端部と、上記と一体的に形成された第２開放端部とが連結し、第１端部は開口端に向かって狭くなり、狭い開口端から突き出た収集部を有し、この収集部は液体を受けて保持することができ、収集部から第１端部を密封するための着脱自在なプラグを有する。
【００３０】
上記の本発明の全ての方法で、容器は多孔質インサートを含むことができる。この多孔質インサートは医用素材で作られ、孔径は0.5mm〜５mmである。多孔質インサートは組織サンプルに上記の複数回の加速および減速段階を加えた時に、組織サンプル中の細胞外マトリックスから細胞の解離を促進する。多孔質インサートの形は略逆円錐体、略円柱形にすることができ、また、容器を上下部分に分けることもできる。
【００３１】
上記の本発明の全ての方法で、容器が複数の粒子を含むこともできる。この粒子は直径が少なくとも100マイクロメートルであり、一種または複数の医用素材で構成され、組織サンプルに複数の加速および減速段階を加えた時に粒子は組織サンプル中の細胞外マトリックスからの細胞の解離を促進する。比重または形状の異なる複数の粒子を含むことができる。
【００３２】
上記の本発明の全ての方法で、容器はその内部ルーメン中に垂直に配置したシャフトを含むことができ、シャフトの長手方向に沿って配置した複数のアームを含み、各アームはシャフトからほぼ放射状に容器の内部ルーメン中に向かって延び、組織サンプルに複数回の加速および減速段階を加えた時に、アームは組織サンプル中の細胞外のマトリックスからの細胞の解離を促進する。アームの形状またはサイズは違うものにすることができる。容器は着脱自在な蓋を含むことができ、この蓋をシャフトに着脱自在に取り付けることができる。シャフトは容器に回転自在に取り付けることができ、また、シャフトを容器の内部ルーメン内で移動自在にすることもできる。
【００３３】
本発明の別の態様では、本発明は細長い円柱形の中央部分を含む容器または容器組立体に特徴がある。この中央部分は一体形成された第１端部と、中央部分と一体形成された第２開放端部と、細長い円柱形の一部から外側へ放射状に延びたポートとを有し、第１端部は狭い開口端に向かって狭くなり、狭い開口端から突き出た収集部を有し、この収集部は流体を受けて保持でき、収集部から第１端部を密封するための着脱自在なプラグを有するしている。流体は遠心力、圧力、酵素による解離または物理的移動によって着脱自在なプラグを介して上記端部から収集部に流れることができる。収集部は第１端部から分離可能である。収集部は水溶性流体を収容でき、第２開放端は勘合部を有することができる。
【００３４】
本発明はさらに、第１容器と、第２容器と、第２容器に第１容器を連結するのに適した連結装置とを含む容器組立体に特徴がある。第１容器は上記のものである。第２容器は細長い円柱形の中央部分と、この中央部分と一体形成された閉鎖端部と、中央部分と一体形成された開放端部とを含み、第２容器の開放端部は勘合部分を有することができ、上記連結装置は第１と第２の開放端を有する管状の中央部分と、連結装置全体に水平に延びた多孔質インサートとを有し、連結装置の各開放端は勘合部分を有することができ、上記多孔質インサートは40〜500μｍの孔径を有する。連結装置はさらに管状の中央部分から外側へ放射状に延びたポートを有し、連結装置の一つの勘合部分は第１容器の勘合部分に取り付けられ、連結装置の他の勘合部分は第２容器の勘合部分に取り付けられる。上記ポートは多孔質インサートを含むことができる。
【００３５】
第１容器および第２容器は予め組み立てることができ、第１容器および第２容器によって区画される内部空間は少なくとも部分的に真空下にされる。
【００３６】
本発明のさらに他の特徴は、内部ルーメンを区画する細長い円柱形の中央部分と、この中央部分と一体形成された第１端部と、中央部分と一体形成された第２開放端部と、シャフトの長さに沿って配置されたシャフトから内部ルーメンに向かってほぼ半径方向配置された複数のアームとを含む容器にある。複数のアームの形状または寸法は互いに変えることができる。容器はさらに、第２開放端部に取り付けた着脱自在な蓋を含むことができ、シャフトは着脱自在な蓋に取り付けることができる。シャフトは容器に回転可能に取り付けでき、シャフトは容器の内部ルーメン内で移動可能にすることができる。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、本発明は上記の任意の容器または容器組立体を含むキットに特徴がある。キットはさらに一種または複数の細胞分離試薬を含む。
【００３８】
本発明の別の態様では、本発明は、処理された脂肪吸引物から細胞濃縮されたマトリックスを回収して患者に戻すために、細胞の含有量を増加させる方法に特徴がある。本発明方法は直径が1〜５mmのオリフィスを通して脂肪吸引物を押し出し、押し出された脂肪吸引物を少なくとも5分間、最少で400×ｇのgの力で遠心分離段階で処理する。この遠心分離段階では最高で2000×ｇの遠心力をかけることができる。遠心分離段階では約1200×ｇの遠心力を加えることができる。組織サンプルは脂肪吸引物、脂肪組織およびこれらの組合せを含むことができる。遠心分離は固定角度の水平ローターを使用して実行できる。
【００３９】
別の態様で本発明は、タンパク分解酵素の存在下で遠心分離機で組織を加速、減速し、組織の容器を逆にすることから成る脂肪組織から再生細胞の容易に回収する方法に特徴がある。遠心分離機の内部は制御される温度にすることができる。毎分一回または複数回の加速と減速のサイクル数を組織に加えることができる。タンパク分解酵素はコラゲナーゼ、中性プロテアーゼまたはこれらの両方にすることができる。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとを組合せ、温度および攪拌を増加させ、逆にしたローターで遠心分離機で加速と減速を加えることで脂肪組織からの再生細胞を容易に回収できる。
【００４０】
本発明はさらに、濃縮したマトリックスを用意し、この細胞-濃縮されたマトリックスをタンパク分解酵素の存在下で容器を逆さにして遠心分離機で組織を加速、減速して、脂肪組織から再生細胞を経済的に回収する方法に特徴がある。遠心分離機の内部は制御される温度にすることができ、毎分一回または複数回の加速と減速のサイクル数を細胞-濃縮されたマトリックスに加えられることができる。コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼを組合せ、温度および攪拌を増加させ、ローターを逆さにして遠心分離機で加速と減速をして細胞-濃縮されたマトリックスから再生細胞を容易に回収する。
【００４１】
本発明はさらに、患者に注射する組成物として上記の細胞-濃縮されたマトリックスと、上記で製造された再生細胞の調整物とを含む組成物に特徴がある。
【００４２】
本発明の別の態様で、本発明は少なくとも２つのキャビティを有する着脱自在な回転装置に特徴がある。各キャビティはそのキャビティ内に組織収集容器を着脱自在に挿入するように構成され、着脱自在な回転装置は細胞濃縮されたマトリックスを組織サンプルから分離するために組織自動処理装置内手回転するように構成されている。着脱自在な回転装置は高周波識別（RFID）タグが付けられ、それによって取り付けた着脱自在な回転装置を組織自動処理装置が識別できるようになっている。着脱自在な回転装置は加圧滅菌に耐える材料を含むことができる。
【００４３】
本発明はさらに、細胞濃縮されたマトリックスを組織サンプルから脱凝集するための組織自動処理装置に特徴がある。この組織自動処理装置は少なくとも２つのキャビティを有する着脱自在な回転装置を有し、各キャビティはそのキャビティ内に組織収集容器を着脱自在に挿入するように構成され、組織自動処理装置は温度制御装置を有する。
【００４４】
着脱自在な回転装置は、組織自動処理装置が着脱自在な回転装置を識別できるようにする少なくとも一つの所定スペックを有する。
【００４５】
本発明の別の態様では、本発明は脂肪組織から細胞を回収する方法に特徴がある。この方法では脂肪吸引物をオリフィスを通して押出し加工し、押出し加工された脂肪吸引物を遠心分離して細胞濃縮したマトリックスを製造する。細胞濃縮されたマトリックスを遠心力を加えて複数回の加速および減速段階にかけて再生細胞を回収する。この方法はさらに、組織サンプルを複数回の加速および減速段階にかけるとともに、容器内部を26℃〜42℃の温度に維持することを含むことができる。組織サンプルには一種または複数の酵素（例えばコラゲナーゼ、他のプロテアーゼまたはこれらの混合物）の存在下で複数回の加速および減速段階を加えることができる。
【００４６】
本発明の別の態様では、本発明は組織から細胞を回収する方法に特徴がある。本発明方法では、水溶性流体中の組織ピースの懸濁液から成る組織サンプルを遠心分離機に適した容器に収容した組織サンプルを用意し、組織サンプルに回転要素によって遠心力を加え、少なくとも一回の加速および減速段階にかける。回転要素はシャフトと、シャフトから延びた一つまたは複数のアームを有し、シャフトが回転した時に一つまたは複数のアームは（i)一つまたは複数のアームをシャフトの上方かつおよび外側へ旋回するようにシャフトに支持するか、(ii) 材料に加わる重力が遠心力とは逆になるような位置に容器が保たれるように一つまたは複数のアームを固定角で支持し、加える遠心力を約50g〜約4000gの範囲にし、サンプルの温度を32℃〜約42℃の間に維持する。組織サンプルは一種または複数のプロテアーゼをさらに含むことができる。
【００４７】
特に断わらない限り、本明細書で使用する技術用語はこの発明が属する技術の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似の方法および材料を本発明で使用し、テストすることができるが、以下の実施例では典型的な方法および材料を記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許、出願、遺伝子バンク（Genbank、登録商標）のアクセス番号および他の基準の全ては本明細書で引用したものとする。コンフリクトの場合には、定義を含めて本出願が対照となる。材料、方法および例は単なる実施例で、本発明を制限するものではない。
【００４８】
本発明の他の特色および利点は以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００４９】
一般に、本発明はヒトの組織および動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、羊、ブタ等の動物の組織から細胞を回収するための方法と装置に関するものである。本明細書に記載の方法および装置は細胞、例えば真空アシスト、ベーパーアシスト脂肪吸引（すなわち脂肪吸引物）超音波アシスト脂肪吸引およびこれらの組合せで得られる脂肪組織の回収に特に有用である。本発明に記載の方法および装置は幹細胞、先祖細胞、造血細胞または完全分化細胞を脂肪組織から脱凝集するのに使用できる。
【００５０】
本発明方法および装置は、細胞組成物調物を患者に投与する（自己由来投与）のに使用できる。例えば、本発明の方法および装置は患者から再生細胞（再生プラットホームとよぶ）を回収し、それを投与用に調整し、患者に投与（例えば、注射または外科手術）する。いくつかの実施例では、例えば細胞を注射針のような供給装置（例えば注射器）に入れ、患者の皮下または静脈内または筋肉内または腹腔内に入れる。例えば、再生細胞を全身または局所供給のために血管中、真皮（皮下）中、組織（例えば心筋または骨格筋）中、組織空間（例えば心膜または腹膜）中またはその他の部位に注入できる。再生プラットホームの注射で注射部位の近傍区域が増加し、修復され、炎症、痛みおよびその両方を減らすことができる。いくつかの実施例では投与前に細胞を一種または複数の添加剤を添加できる。例えば、細胞を他の細胞、生物活性体、生物非活性化合物、脱ミネラル骨、マトリックスまたはその他の吸収性スキャホルド（懸垂足場）、一種または複数の成長因子、デリバリー、効果、耐薬性または細胞集団の機能を高めることができるその他の添加物と混合することができる。
【００５１】
本発明の方法および装置を使用して、成長研究、遺伝子発現研究、分化の研究またはその他の研究を目的とする細胞組成物を調製することができる。さらに、本発明の方法および装置は再生細胞集団（例えば幹細胞）の回収し、例えば細胞貯蔵（バンキング）、例えば細胞を適当な媒体で凍結保存することができる。その他の参照に関してはアメリカ特許出願公開第20100285588-A1を参照のこと。
【００５２】
本発明の一つの実施例では、本発明方法を用いて遠心力下で２回以上の複数回の加速および減速段階を行って細胞外マトリックスから細胞、例えば再生細胞、例えば幹細胞または先祖細胞の解離を促進する。遠心力下での一回の加速および減速段階を遠心分離の一ラウンド（round）という。いくつかの実施例では細胞の回収率を高くするために以下の少なくとも一つを用いることができる：機械的解離、機械的攪拌、温度を室温以上で42℃以下（例えば約37℃〜約40℃に維持、組織を分解させる酵素を使用、組織を物理的に解離（例えば密度、比重および可溶性）に基づいて異なる成分に分離。いくつかの実施例では、組織は遠心力下で組織を２回の加速および減速段階にかける前に、機械的に（例えば押出しによって）解離させる。いくつかの実施例では、組織の機械的解離後に、最初の加速および減速段階で遠心力下に組織を一般の３つの層（すなわち水層、再生プラットホームを含む細胞-濃縮されたマトリックス層および脂質層）に分ける。遠心力下に第２の加速および減速段階にかけて細胞-濃縮されたマトリックスを取り出すことができる。いくつかの実施例では、細胞-濃縮されたマトリックスを第２の加速および減速段階にかける前に一種または複数の酵素（例えばプロテアーゼ）を細胞-濃縮されたマトリックスに加える。少量の酵素で組織を処理することができるのでこの方法はサンプル容積を減らすことができる。いくつかの実施例では、細胞-濃縮されたマトリックスの一部を遠心力下の第２の加速および減速段階にかけて細胞ペレットから再生細胞を分離する。その後、細胞-濃縮されたマトリックスの一部から脱凝集した細胞を遠心分離をしなかった細胞-濃縮されたマトリックスと合せることができる。
【００５３】
上記の逆位置にセットするか、震盪バケット形状の改良遠心分離機ローターを使用することは下記の方法で特に有用である。逆位置形状では遠心力でサンプルの内容物を容器の外側の高い部分へ駆動し、静止時にはサンプルの内容物は容器の内側の下側部分へ戻る。従って、加速と減速の繰り返すサイクルによって逆転ローターがサンプルの攪拌手段となり、引力および加速力のない静止時にはサンプルの内容物が遠心分離機のセンターおよびシャフトの方へ移動し、次の加速でその内容物は遠心力で外へ移動する。ここで記載されていて、逆にした改良ローターに容器をセットし、上記のタンパク分解酵素溶液と組み合わせることで、加速と減速を繰り返すサイクルで組織の酵素の解離を容易になる。しかし、改良ローターを代表的な揺動バケット・ローター形状にした場合にはサンプル中の内容物は容器の底に集まり、攪拌作用は減る。
【００５４】
再生細胞の回収を大きく改良し、本発明方法の現場での作業時間を短くするためには、遠心分離機チャンバ内部で加速と減速の繰り返すサイクル時に外気温度を35〜42℃（例えば40℃）まで上げ、組織サンプルに対して他の方法に対して酵素の解離スピードを増や数倍に上げる。本発明方法および装置は、室温で遠心力下での複数回の加速および減速段階を利用しないで回収する方法と比較して、細胞の収率を増やすことができる。本発明の方法および装置を使用して回収される細胞の収率の増加は、一定速度で遠心分離しただけでは放出が不十分で、細胞外マトリックスから成育可能な幹細胞の数を増やせないことを記載した下記文献からは驚くべきことである。
【非特許文献１】Kurita et al., Plast.Reconst.Surg.121：1033-1041（2008）
【００５５】
［図１］は一つの実施例の遠心分離機１の斜視図で、隔壁２（例えば金属隔壁）によって区画された内側チャンバー４を有する。この内側チャンバー４の寸法は一般に20〜40cmで、製造する細胞に応じて変化する。内側チャンバー４の内部にはモーター８によって回転駆動されるシャフト６がある。モーター８は一般に内側チャンバー４の下側に位置している。モーター８はコントローラ１０によってオン／オフでき、また、以下で説明するように、内側チャンバー４内の温度を調整する役目をする。モーター８はシャフト６を介してロータ１２を回転させる。ロータ１２の数は２つ（図示の場合）またはそれ以上のロータアーム１４を有する。各ローターアーム１４は容器１６を受け、確実に把持できる。一つの実施例では、ローターアーム１４はシャフト６を介してモーター８の回転で加わる遠心力によってスイング運動し、シャフト６の１分あたりの回転数に応じて加わるその遠心力ｇ（例えば２０〜３０ｇ）に応じて垂直姿勢から完全９０°位置まで姿勢を変える。例えば［図５］に示した他の実施例では、ローターアーム１４は固定角度θ（例えば１°〜９０°以下の角度）にセットされる。アングルθは例えば１２°に固定できる。この実施例では容器１６は逆さを向いてローターアーム１４に取付けられ、着脱自在な蓋を有する容器１６の最上部がシャフト６の中心近傍に来る。
【００５６】
いくらかの実施例では、内側の容器の温度は例えば２６〜４２℃、３０〜４２℃、３５〜４２℃、３５〜４０℃、３７〜４０℃または約３７℃に調整できる。この温度は公知の任意の方法、例えば閉ループの熱フィードバック調節法によって調整できる。本発明の一つの実施例では電気抵抗ワイヤ（図１には図示せず）を内側の容器４に埋込むか、巻き付け、例えばケーブルを介して電気的に内側の容器４を加熱することができる。この種のワイヤは加熱パッドの一部にするか、可撓性ポリマー中に埋め込むことができる。一定温度を保つために内側の容器４の温度を検出するための温度プローブ１８用いことができ、この温度プローブ１８はコントローラ１０に接続して、内側の容器４内の温度を調整することができる。一種以上の酵素を使用する場合には３５〜４２℃の温度を維持するのが特に有効である。この範囲より下側の温度では分解プロセスが遅くなり、４２℃以上の温度では細胞を傷つける。
【００５７】
コントローラ１０をプログラミングして、例えば加速と減速の段階を制御し、モーター８の回転開始と停止を制御して、温度を調整する。コントローラ１０は電源（例えば、プラグまたはケーブル）に連結する。
【００５８】
コントローラ１０は容器１６を加速して、５０×ｇ〜４，０００×ｇのｇの力を加え、この時間を短時間維持し、次いで、短い時間内で容器１６を１６〜１×ｇに減速するようにプログラムされることができる。この加速／減速段階の繰返しサイクルは５〜１８０分（例えば５〜１２０分、１０〜１００分、２０〜６０分、２５〜５０分、３０〜４５分、約３０分または約４５分）の時間行うことができる。例えば、各加速段階は５〜２０秒実行し、各減速段階を３〜２０秒実行できる。一つの実施例では２００×ｇへの加速を少なくとも３サイクルと、１分当たり１×ｇへの減速を３０分間実行することができる。
【００５９】
［図２］は、［図１］に示す容器８中に収容した組織サンプル中の細胞外マトリックスからの細胞の解離を高めるために使用できる各種時間サイクルの例を示す。［図２］に示した異なるパターン、例えば中断、オン、オフ、長時間維持する加速を組み合わせることができる。
【００６０】
［図３Ａ］〜［図３Ｅ］は各種容器を示し、各容器は［図１］［図６］に示した容器１６の典型的な具体例である。［図３Ａ］〜［図３Ｅ］の容器は遠心分離機（例えば［図１］または［図６］に示す遠心分離機）ように構成される。これらの容器は、その容器を遠心力、例えば［図１］の遠心分離機１によって加えられる遠心力で複数回加速され、減速させた時に組織の細胞外マトリックスからの細胞の解離を助けるためのインサートを有している。［図３Ａ］〜［図３Ｅ］の各図では、容器３００は細長い円柱形の中央部分３０２と、中央部分と一体化された閉鎖端部３０４と、内部ルーメン３０８を区画する中央部分と一体化された開放端部３０６とを含む。閉鎖端部３０４はほぼ平らであるか、丸いか、半球状、円すい状、その他の適当な形にすることができる。いくつかの具体例では、容器３００は約１０〜１２ｃｍの長さを有することができる。いくつの具体例では容器３００は約５０〜６０ｍｌの容積を有する。
【００６１】
開放端部３０６は着脱自在なキャップ３１２を受ける勘合部分３１０（例えばネジ部）を含む。着脱自在なキャップ３１２はそれを勘合部分３１０上に取り付けた時に容器３００の内部ルーメン３０８を密封する。いくつかのプロジェクトの実施例では、キャップ３１２は螺合、摩擦フィット、例えばパチンとはまるキャップ、真空シール、磁力または容器を開放自在に密封できるその他任意の機構によって開放端部に取り付けることができる。
【００６２】
［図３Ａ］では容器３００は略逆円錐体のインサート３２０を含む。円錐体のインサート３２０中空の逆コーンとして内部ルーメン３０８内に形成される。略逆円錐体のインサート３２０は円錐体の側壁３２２は密封端部３０４に近い頂部３２４から開放端部３０８の基部に近い基部３２６まで細長い円柱形の中央部分３０２とほぼ同軸に延びている。
【００６３】
略逆円錐体のインサート３２０は医用素材から成り、多孔質である。医用素材の例はポリアミド（例えばナイロン）、ポリカプロラクトンのようなポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニール化合物、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）のようなポリケトン、ポリテトラフルオロエチレン、ＰＴＦＥ、テフロン（登録商標）、サーマノックス(thermanox)、ニトロセルロース、ポリ（オルトエステル）、ポリウレタン、ステンレススチール、チタンまたはチタニア（二酸化チタン）であるが、これらに限定ささない。インサートの孔の寸法は０．５ｍｍ〜５ｍｍ（例えば０．７〜１．５ｍｍ、０．７〜１．２ｍｍ、０．９〜１．１ｍｍ、０．９〜１．５ｍｍ、０．９ｍｍ〜２．０ｍｍ、２〜４ｍｍ、３ｍｍ〜５ｍｍ）である。いくつかの実施例では略逆円錐体の側壁３２２はスクリーン、格子、メッシュ、ネット、穿孔シート、その他の生物適合材料の多孔基材にすることができる。いくつかの実施例では略逆円錐体のインサートは１ｍｍの孔を有するメッシュである。
【００６４】
円錐体のインサート２３０のベース３２２は開放端３０８で細長い円柱形部分３０２の直径と同じ直径を有する。円錐体インサート３２０はベースが開放端３０６のリムと接触する開放端３０８から内部容積３０２中に挿入される。その後にキャップ３１２を開放端３０６に取外し自在に付ける。それによって円錐体のインサート３２０はほぼ内部ルーメン３０８内に心出しされる。いくつかの実施例では、ベース３２６はフランジを使って開放端３０８に取付ける。ベース３２６をキャップ３１２の底面に直接に固着することもできる。ベース３２６を端部３０４に直接固着することもできる。
【００６５】
使用時には略逆円錐体のインサート３２０を容器３００中に挿入する。略逆円錐体のインサート３２０中に水溶性流体の組織ピースの懸濁液を含む組織サンプルを充填すると、流体および孔より小さい組織成分は円錐体のインサート３２０を通過し、円柱形の側壁３０４および閉成端３０６によって捕らえられる。
【００６６】
いくつかの実施例では、１種または複数のプロテアーゼ（例えばタイプＩおよび／またはタイプＩＩのコラゲナーゼのようなコラゲナーゼ、サーモリシンのような中性プロテアーゼ、トリプシンまたはこれらの混合物）を容器３００に加えて、組織サンプルの細胞外マトリックスからの細胞の解離を促進させる。例えばタイプＩコラゲナーゼ、タイプＩＩコラゲナーゼおよびデイスパーゼを使って細胞外マトリックスからの細胞の解離を促進する。
【００６７】
キャップ３１２を取り付けると、内部ルーメン３０８は密封され、略円錐体のインサート３２０は定位置に固定される。加速および減速段階の複数によって流体および組織は略円錐体のインサート３２０の孔を通って押出される。例えば、略円錐体のインサート３２０内に組織サンプルを充填した容器３００を［図１］の遠心分離機１のローターアーム１４に取付ける。［図１］および［図２］で説明するように、容器３００を加速、減速する。加速と減速のサイクルを繰り返すことで、組織サンプルはインサートの孔を通って種々の方向に押し出される。このプロセスで組織は機械的に分離され、細胞外マトリックスからの細胞の開放が促進される。
【００６８】
［図３Ｂ］では容器３００が略円柱形のインサート３４０を含む。略円柱形のインサート３４０はシリンダとして内部ルーメン３０８内に形成される。円柱形のインサート３４０は細長い円柱形の中央部分３０２とほぼ同軸で、側壁３４４は閉成端部分３０４から開放端部３０６まで延びている。略円柱形のインサート３４０は医用素材から成り、多孔性である。適した医用素材および孔の寸法の例は上記のものである。
【００６９】
使用時には、略円柱形のインサート３４０を容器３００中に挿入する。略円柱形のインサート３４０には水溶性流体の組織ピースの懸濁液を含む組織サンプルが充填される。流体および孔より小さい組織成分は円柱形のインサート３４０を通過し、細長い円柱形の中央部分３０２および閉成端３０４によって捕らえられる。上記のように、一種または複数の酵素を容器に加えることができる。キャップ３１２を取り付けると、内部容積３０８は密封され、略円柱形のインサート３４０の一が固定される。［図１］および［図２］で説明するように、容器３００を加速、減速する。加速と減速のサイクルを繰り返すことで、組織サンプルはインサートの孔を通って種々の方向に押し出される。このプロセスで組織は機械的に分離され、細胞外マトリックスからの細胞の開放が促進される。
【００７０】
［図３Ｅ］では、容器３００は容器を上下２つの部分に分けるインサート３４５を含む。このインサートは医用素材から成り、多孔性である。適した医用素材および孔の寸法の例は上記と同じである。このインサートは例えばゴムリングを使用して位置を固定できる。使用時には水溶性流体の組織ピースの懸濁液を含む組織サンプル容器の上または下の部分に充填する。加速および減速段階を複数回行うと細胞外マトリックスから細胞の解離が促進される。組織サンプルに一種または複数の酵素を加えることもできる。
【００７１】
［図３Ｃ］を参照すると、容器３００は内部ルーメン３０８内に複数の粒子３５０を含む。この粒子ペレットの直径は少なくとも１００マイクロメートルであり、一種または複数の医用素材から成るか、一種または複数の医用素材で被覆されている。医用素材の例としてはポリアミド（例えばナイロン）、ポリカプロラクトンのようなポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニール化合物、ポリカーボネート、ＰＥＥＫのようなポリケトン、ＰＴＦＥ、サーマノックス（thermanox）、ニトロセルロース、ボリ（オルトエステル）、ポリウレタン、ステンレススチール、チタン、チタニア（二酸化チタン）およびガラスを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では粒子３５０は複数は異なる比重、形状または表面特性の粒子を含むことができる。一つの実施例ではこの粒子３５０は複数の鉄の被覆を有する平滑ポリスチレンビーズおよび粒子を含むことができる。
【００７２】
使用するときは、水溶性流体中の組織ピースの懸濁液および粒子３５０を含む組織サンプルが容器３００中に充填され、キャップ３１２が付けられる。いくつかの実施例では、キャップで密封する前に一種または複数の酵素を容器に加える。次いで、容器を［図１］の遠心分離機１に取付け、複数の加速および減速段階を加える。それによって粒子３５０が攪拌され、細胞外マトリックスからの細胞の放出が促進される。
【００７３】
［図３Ｄ］は、容器の内部ルーメン３０８中にシャフト３７０を垂直に配置したインサートを収容した容器３００の他の実施例を示している。シャフト３７０は複数のアーム３７２を有し、各アーム３７２はシャフト３７０の長手方向に沿って配置され、シャフト３７０からほぼ放射状にルーメン３０８中を延びている。［図３Ｄ］に示すように、アーム３７２は互いに異なる形状および／または寸法にすることができる。
【００７４】
いくつかの実施例では、シャフト３７０は着脱自在な蓋３１２に取り付けることができる。シャフト３７０は容器または着脱自在な容器蓋３１２に回転自在に取り付けることができる。例えば、シャフト３７０をキャップ３１２に回転自在に取り付け且つそれを貫通させて、シャフト３７０を把持できるようにして、容器の外側から回転して組織サンプルを攪拌できるようにする。いくつかの実施例では、シャフト３７０をキャップ３１２に回転自在に取り付け且つ偏心ウエイトを取り付けて、重力または遠心力で回転できるようする。いくつかの実施例では、シャフト３７０をキャップ３１に回転自在に取り付け、一つまたは複数のアーム３７２にマグネットを含ませ、容器の外部から磁気的に連結して、シャフト３７０を外部磁界とカップリングさせる。容器に対して磁界を回転させることによって内部ルーメン３０８内でシャフト３７０を回転しては組織サンプルを攪拌することができる。いくつかの実施例では、シャフト３７０をルーメン３０８内で垂直方向に移動できるようにして、アーム３７２が組織サンプル中を上下に通過できるようにする。いくつかの実施例ではアームアールはブレード形をしている。
【００７５】
一つの実施例では、水溶性流体中の組織ピースの懸濁液を含む組織サンプルが容器３００中に充填され、シャフト３７０が取り付けられたキャップ３１２で開放端を密封する。それによってシャフト３７０の長手方向に沿って配置されたアーム３７２が内部ルーメン３０８中および組織サンプル中に挿入される。一種または複数の酵素を組織サンプル中に加えることができる。次いで、容器３００に上記と同様に複数回の加速および減速段階を加えることができる。複数回の加速および減速段階を加えると、シャフト３７０およびそれに取り付けたアーム３７２は組織サンプル中の細胞外マトリックスからの細胞の解離を促進させることができる。
【００７６】
［図４］は第１容器３００と、第２容器４０４と、連結装置４０６との容器組立体４００の例を示す。［図４］に示す実施例では、組立体４００は［図３Ａ］の容器３００と容器４０４とを含む。いくつかの実施例では、容器３００は［図３Ｂ］〜［図３Ｅ］に示した容器のいずれかにすることができる。容器４０４は細長い円柱形の中央部４０８を有し、第１端部４１０は中央部４０８と一体形成され、第２の開放端部４１２は中央部４０８と一体形成されて、内部ルーメン４１４を区画している。
【００７７】
いくつかの実施例では、ポート４３２は細長い円柱形の一部４０８から放射状に外へ延びて、内部ルーメン４１４から外側まで延びる流体通路を提供できる。この種のポートも多孔質インサート４３４を含むことができる。いくつかの実施例では、多孔質インサートは約０．２ミクロンの孔を有し、それによって、空気は通過できるが、汚染物質が内部ルーメン４１４に入るのを防ぐことができる。
【００７８】
第1端部４１０は狭い開口部４１６に向かって狭くなり、狭い口部４１６の所で第1端部４１０から突き出た収集部４１８を含む。収集部４１８は流体を受け、保存することができ、収集部４１８から第１端部４１０を密封するための着脱自在なプラグ４２０を含む。この着脱自在なプラグ４２０は遠心力、圧力、酵素による解離または物理的除去時に端部４１０から収集部４１８への流体の流れを許す。いくつかの実施例では、着脱自在なプラグは収集部にアクセスするために駆動可能な弁である。いくつかの実施例では、収集部を第1端部から分離できる。
【００７９】
いくつかの実施例では、収集部４１８は着脱自在なプラグ４２０を介して内部ルーメン４１４から分離された水溶性流体を含む。例えば、収集部４１８には生理食塩水、緩衝液、細胞培地、一種または複数の生物活性化合物、一種または複数の生物非活性化合物、脱ミネラル（demineralized）骨、マトリックスまたは他の吸収正（resorbable）スキャフィルド（足場）、一種または複数の成長因子またはデリバリー、有効性、耐薬品性または細胞集団の機能を高めることができるその他の添加物含むことができる。
【００８０】
第２端部は勘合部（例えばネジ部）を含み、それによってキャップを取り付けた時に容器をほぼ密封するようにすることができる。
【００８１】
容器４０４は、連結装置４０６を用いて容器３００に着脱自在に連結でき、第１および第２の開放端４２４を有する管状中央部分４２２と連結装置４０６を通って水平に延びた多孔質インサート４２６とを含む。各開放端４２４は勘合部（例えばネジ部）を含む。多孔質インサートは４０〜５００マイクロメートルの孔寸法を有し、連結装置４０６を通って水平に延び、多孔質インサート４２６が内部容積４１４から内部容積３０８を分離する。  
【００８２】
いくつかの実施例では、少なくとも2つの多孔質インサートを互い上下に配置することができる。例えば、相対的に孔の寸法が大きい多孔質インサートを容器３００の近くに配置し、相対的に寸法の小さい多孔質インサートを容器４０４の近くに配置することができる。そうすることで容器３００から容器４０４へ流れる流体および粒子は次第により小さくなる孔を通って多孔質インサート４２６を通過するようになる。
【００８３】
連結装置４０６はポート４２８をさらに含むことができる。このポート４２８は管状中央部分４２２から放射状に外側へ延びて、連結装置の内部からの流体通路を提供している。このポート４２８には０．２〜５００マイクロメートルの孔寸法を有する多孔質インサート４３０が配置できる。いくつかの実施例の多孔質インサート４３０は約０．２ミクロンの孔を有することができる。これによって空気が連結装置４０６の内部へ入ることができるが、容器３００、４０４または組織サンプルを汚染するバクテリアおよび粒状物は濾過される。
【００８４】
連結装置の一つの勘合部分は容器３００の勘合部分に取り付けることができ、連結装置の他の勘合部分は容器４０４の勘合部分に取り付けることができる。容器３００および４０４の開放端部にネジ部を有する具体例では、連結装置４０６が各端にネジ部を有し、容器３００および４０４をそれらのネジ部によって連結装置４０６に螺合させることができる。いくつかの実施例では、第1容器および第２容器によっていて区画される内部空間が少なくとも部分的に真空下となるように容器３００および４０４予め組み立てられる。
【００８５】
使用中には容器３００を連結装置４０６から外して組織サンプル、緩衝液（例えばlactated Ringer's）およびオプションの酵素を入れる。キャップ（例えばキャップ３１２）を付けて容器３００を着脱自在に密封する。容器３００中に収容した組織サンプルに遠心分離機１による処理を加える。容器３００内のサンプルに上記のような複数回の加速および減速段階を加えた後、キャップ３１２を外し、容器３００および容器４０４に連結装置４０６を取り付ける。容器組立体を逆にし、ポート４３２に負圧を加えることによって容器３００中の液体成分を容器４０４中へ移動させる。例えば、小さなチューブをポート４３２に取付け、注射器（例えば、Ｌｕｅｒ連接で）を使用して吸引力を加えて容器４０４中に負圧を生じさせて、容器３００中の流体および細胞を多孔質インサート４２６を通って容器４０４の内部ルーメン４１４中へ移動させる。
【００８６】
容器４０４中へ移動させた後、容器３００を連結装置から外し、さらに連結装置を容器４０４から外す。キャップを勘合部分４２０に着脱自在に取付けて容器４０４をほぼ密封する。４００〜４０００×ｇで容器を遠心分離することによって他の細胞の成分から細胞外マトリックスから分離された細胞を回収する。いくつかの実施例では、この細胞は容器４０４の収集部４１８に集める。
【００８７】
いくつかの実施例では遠心分離機１を使用して４００〜４，０００×ｇの遠心分離を第２のプログラムとして実行する。第２のプログラムは例えばコントローラ１０にプログラムできる。容器４０４を固定角のローター・アーム１４に投入し、キャップはローターの地希有新方向に向け、収集部４１８は即向きに配置する。容器４０４に約５〜１０分間、約４００〜４，０００×ｇの力（例えば４００〜１，０００×ｇ）を加えて遠心分離する。このｇの力の遠心分離で収集部４１８に細胞を分離、収集できる。
【００８８】
いくつかの実施例では、磁気ビーズまたは抗体またはその抗原結合断片を含む一つまたは複数の細胞分離試薬を本発明の方法および装置と一緒に使うことができる。例えば、特定の細胞タイプに結合親和性を有する抗体は使って収集部中に集めた細胞からそのタイプの細胞を回収する。いくつかの実施例ではそうした細胞を容器３００中に入れる。いくつかの実施例ではそうした細胞を容器４０４中に入れる。
【００８９】
いくつかの実施例では、遠心力下で組織サンプルに一回の加速および減速段階を加えて細胞濃縮されたマトリックスを調製し、それに一回または複数回の加速および減速段階を加える。例えば、組織収集容器中に収容した組織サンプルを遠心分離して再生プラットホームを含む細胞濃縮されたマトリックスを製造することができる。再生プラットホームとは濃縮物中の幹細胞、先祖細胞および／または造血細胞等の再生（regenerative）細胞を意味する。そうした細胞の製造方法の例は下記文献に記載されている。
【特許文献１】米国特許公開第２０１０／０１２４５６３Ａ１号明細書
【００９０】
組織サンプルは組織サンプル全体にわたって再生プラットホームを有することができるが、遠心分離によって組織サンプルは再生プラットホームの濃度が濃縮された細胞リッチなマトリックスを形成する。例えば、組織収集容器中で組織サンプルを遠心分離すると一般に３つの層（例えば、水の層、再生プラットホームを含む細胞濃縮されたマトリックスの層、脂質層）が形成される。一般に細胞濃縮されたマトリックスは脂質層と水の層との間に位置する。水の層を抜き出した後に細胞濃縮されたマトリックスは組織収集容器スから（例えばクローズドシステムを使用して）容易に抜き出し、細胞濃縮されたマトリックをさらに利用することができる。
【００９１】
組織サンプルを遠心分離するために組織自動処理装置を用いることができる。組織自動処理装置は例えば着脱自在な回転装置を有しこの回転装置を組織自動処理装置内で回転させて遠心力を発生させることができる。組織自動処理装置はユニット内に温度を制御するための温度制御装置を含むことができる。
【００９２】
［図８］は組織自動処理装置（図示せず）に挿入した着脱自在な回転装置５００の平面図である。組織収集容器５０２は着脱自在な回転装置５００に着脱自在に挿入でき、ロッキング機構５０４（例えばスナップロック機構）によって固定される。ここでは組織収集容器５０２はキャビティ５０６中に収容される。一つの具体例では、組織収集容器５０２はキャビティ５０６中にスナップフィットするようにカスタマイズされ、スナップロック機構５０４によって固定される。組織収集容器５０２は組織収集容器５０２の開口部５１２が中心から遠い位置にくるように配置される。細胞濃縮されたマトリックスは開口部５１２の近くに形成され、細胞濃縮されたマトリックスは細胞濃縮されたマトリックスを汚染せずに上記開口部を通って組織収集容器５０２から容易に抽出できる。
【００９３】
着脱自在な回転装置５００は少なくとも２つのキャビティ（ここでは５０６、５０８）を有することができ、約８つのキャビティを有することができる。各キャビティ５０６、５０８は水平を向いており、キャビティ５０６、５０８中に組織収集容器５０２を挿入するための着脱自在機構を有している。この着脱自在機構はスナップフィット機構、ベルクロ（Velcro）、その組合せ等を使用できるが、これらに限定されない。他の非制限的具体例では、着脱自在な回転装置５００がオートクレーブ材料を有する、または含むことができ、それによって着脱自在な回転装置５００を加圧滅菌構成にすることができる。
【００９４】
［図９］は組織自動処理装置（図示せず）に挿入される着脱自在な回転装置５００の側面図である。組織収集容器５０２はキャビティ５０６内にあり、ロック機構５０４によって固定されている。［図８］［図９］は例示のためのものであり、着脱自在な回転装置は実際の寸法ではなく、形も変形してあり、比率も誇張してある。
【００９５】
また、組織自動処理装置は各着脱自在な回転装置を少なくとも一つの所定スペックによって同定するための識別機構を有することができる。その一つの実施例では着脱自在な回転装置にはＲＦＩＤタグが付けられている。このＲＦＩＤタグは、着脱自在な回転装置を組織自動処理装置にセットした時に組織自動処理装置によって同定される。他の具体例では組織自動処理装置内の着脱自在な回転装置のスペックを測定し、加速に必要なパワー、重量、風抵抗およびこれらの組合せを記録するが、これに限定されるものではない。測定したスペックは組織自動処理装置のソフトウェア・プログラムおよび／またはソフトウェア・パッケージの一部として保存されて、組織自動処理装置がそのスペックデータによって着脱自在な回転装置を識別することができるようにする。
【００９６】
組織サンプルは組織自動処理装置に適した第１組織収集容器に収容される。この組織サンプルは水溶性流体中の組織ピースの懸濁液を含んでいる。一つの非限定的実施例では、組織サンプルは第１組織収集容器中に押し出してから組織サンプルにセットする。組織サンプルは直径が各々独立して約１ｍｍ〜約４ｍｍ、あるいは直径が各々独立して１．５ｍｍ〜３ｍｍのオリフィスを介して１回〜２０回あるいは２回〜１０回押し出すことができる。一連の加速を行う前に組織サンプルを押し出すことで、組織サンプルの押出しを行わずに全く同じ方法を行った場合と比較して、再生プラットホームをより高い濃度を有する細胞濃縮されたマトリックスを製造することができる。ここで、「直径が各々独立して」とは任意の下側閾値を任意の上側閾値と一緒に使用して、適切なレンジにすることができるということを意味する。
【００９７】
組織サンプルには遠心分離力を加えて各々が独立して約２００×ｇ〜約２０００×ｇのｇ力または組織自動処理装置を使用して少なくとも４００×ｇを加えることができる。遠心分離は各々独立して約３分〜約６０分または少なくとも約５分間の時間行うことができる。遠心分離後に細胞濃縮されたマトリックスが形成される。
【００９８】
細胞濃縮されたマトリックスは第１組織収集容器から第２収集容器へクローズドシステム法で移すことができる。この種のクローズドシステム方法には第１収集容器と第２収集容器との間のコネクタ機構）スパイクポート、ニードルまたはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。クローズドシステム法で移動することで組織サンプルおよび／または組織収集容器が外部の病原体で汚染されるのを防止でき、再生プラットホームを含む細胞濃縮されたマトリックスを防ぎ、バクテリア、ウィルス等（これらに限定されない）が組織収集容器または細胞濃縮マトリックス中に入るのを防ぐことができる。クローズドシステムを用いることで、組織サンプルを上記のように患者に戻す前に、細胞濃縮されたマトリックスに追加の段階をする必要性を無くすことができる。ここで、「第１組織サンプル容器」「第２組織サンプル容器」の数字は容器の使用順番を示す。各容器は同じタイプまたは異なるタイプの容器、例えば小びんまたは沈澱管にすることができる。
【００９９】
第２組織収集容器には上記のように少なくとも一回の加速および減速段階を加えることができる。各ラウンドでの加速および減速は少なくとも約１０×ｇの速度が得られるまで続けることができる、あるいは、加速および減速の速度は各々独立して約１０×ｇ〜約４００×ｇ、他の実施例では各々独立して約２０×ｇ〜４０×ｇが生じるようにする。しかし、これらの速度に限定されるものではない。一つの非限定例では、加速および減速の１分当たりのラウンド数は約１ラウンド／１分〜約１ラウンド／５分、または、少なくとも約３ラウンド／１分にする。他の非限定実施例では、所定数の加速および減速のラウンド後または少なくとも２回のラウンドの加速と減速後に細胞濃縮されたマトリックスが解離される。
【０１００】
いくつかの実施例では、一種または複数のプロテアーゼ（例えばタイプＩおよび／またはタイプＩＩのコラゲナーゼのような一種または複数のコラゲナーゼ、サーモリシンのような中性プロテアーゼ、トリプシンまたはこれらの組合せ）を第２組織容器に加えることができる。プロテアーゼの少なくとも一つは組み換え法で製造できる。例えば、一種または複数のコラゲナーゼを各々独立に１ｍｌ当たり約０．５Wunschコラゲナーゼ単位〜約４．０のWunschコラゲナーゼ単位の量、または各々独立に１ｍｌ当たり約１．０Wunschコラゲナーゼ単位〜約３．０のWunschコラゲナーゼ単位の量で第２組織収集容器に加えることができる。プロテアーゼの存在下での減速に続く加速の間欠ラウンドで細胞濃縮されたマトリックスの再生プラットホームが脱凝集できる。
【０１０１】
加速および減速段階の後、細胞濃縮されたマトリックスを濾過し、洗浄して再生プラットホームを得ることができる。この再生プラットホームは移植または注射によって患者に戻すことができる。例えば、細胞濃縮されたマトリックスを濾過して注射可能な再生プラットホームを得ることが可能である。この場合、再生プラットホームを患者に注射する前に追加の段階を実行する必要はほとんどない。
以下、本発明の実施例を説明するが、下記実施例は単なる説明のためのもので、本発明が下記実施例に限定されるもいのではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
卵巣摘出手術後に捨てられた組織からイヌの新しい大網脂肪組織を得た。組織を滅菌メスで細かく切り刻み、５０ｍＬ沈澱管に等分した（約２ｇ／管）。細菌性コラゲナーゼＩおよびＩＩとディスパーゼとを一緒にしたブレンドを含む滅菌した乳酸化リンゲル（Ringer）を加え、次いで振盪培養器（６０ｒｍｐ）中または固定ローター中ランダムに割り当て、加熱組織処理装置で培養する（ＴＰＡ、１×ｇから２００×ｇから１×ｇの毎分３サイクル）。温度は３７〜４０℃に維持した。培養／処理は３０分間実施した。
【０１０３】
処理後、解離した組織スラリーを１００μｍフィルタに通し、ＴＰＡ中で濾過物から４００×ｇで１０分間遠心分離して細胞画分を回収した、細胞画分を２５ｃｍ2の組織培養フラスコに種付けし、抗体および抗カビ剤を含むＤＭＥＭ／２０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）中で３７℃で２日間培養した。２日間培養した後、血球計算板を使用して付着細胞を数えた。［図６］はＴＰＡを使用し、振盪培養器を使用して処理した後に得られた付着細胞数の棒グラフである。ＴＰＡで処理した組織の結果は解離を振盪培養器で実行した時より２．６倍の高い。
【０１０４】
実施例２
選択脂肪吸引を行った患者から患者インフォームドコンセント後にヒトの新しい脂肪吸引物を得た。その組織をステンレススチールのストレーナを使用して水抜きし、孔寸法が１ｍｍのナイロンメッシュから成るインサートを付けた（［図３Ａ］、［図３Ｄ］、［図３Ｅ］）または付けない滅菌した５０ｍｌ沈澱管に等分した（約１０ｇ／管）。細菌性コラゲナーゼＩおよびＩＩとディスパーゼとを一緒にしたブレンドを含む滅菌した乳酸化リンゲル（Ringer）を加え、振盪培養器（６０ｒｐｍ）での培養か、揺動バケット・ローター中での加熱ＴＰＡ（１×ｇから２００×ｇから１×ｇの毎分３サイクル）にランダムに割り当てた。温度は３７〜４０℃に維持し、培養／処理は３０分間実施した。
【０１０５】
処理後、解離された組織スラリーを１００μmフィルタに通し、濾液から細胞画分を回収し、ＴＰＡ中で１０分間、４００×ｇで遠心分離した。細胞画分を２５ｃｍ2の組織培養フラスコに種付けし、抗体および抗カビ剤を含むＤＭＥＭ／２０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）中で２日間培養した。２日間培養した後、血球計算板を使用して付着細胞を数えた。［図7］はＴＰＡを使用して処理し、３つの異なるインサート後または振盪培養器を使用して処理した後に得られた付着細胞数の棒グラフである。ＴＰＡ処理し、インサート（例えば図３Ａ）を使用して得られる細胞収率の結果は培養器中で処理した細胞収率と類似していることを示す。
【０１０６】
実施例３
選択的脂肪吸引をしたヒトの患者から脂肪吸引物のサンプルを得た。脂肪吸引物を２０ｃｃ体積を有する複数の組織収集容器へ移し、各組織収集容器の脂肪吸引物をミクロ乳化（emulsifying）ニードルを通して５回押出した。次いで、各組織収集容器から押出した脂肪吸引物を別々の組織収集容器へ移した。組織収集容器を組織自動処理装置内の着脱自在な回転装置のキャビティにセットした。着脱自在な回転装置では組織収集容器を横向姿勢を維持し、組織自動処理装置で組織収集容器に加速および遠心力を加えた。遠心力は４００×ｇ、約７００×ｇ、約１２００×ｇで３０分間か、約２０００×ｇの速度で３０分間加えられた。各遠心力の速度に対して２つの組織収集容器の内容物を使用した。
【０１０７】
遠心分離後、各組織サンプル収集容器内で組織サンプルの残りから再生プラットホームを含む細胞濃縮されたマトリックスを分離した。オイル層の容積、脂肪吸引物画分および水溶性画分を除去し、各サンプルを測定した。脂肪吸引物の層を別の５０ｃｃ円錐沈澱管に入れる。
【０１０８】
対照試料として約５ｇの未処理すなわち押出しせず、遠心分離もしていない脂肪吸引物を２つの組織収集容器に移した。容器を秤量して移した脂肪吸引物の重量を記録した。コラゲナーゼ酵素およびディスパーゼ酵素を含むリンゲル乳酸塩を各組織収集容器中の５ｍＬの量の未処理の脂肪吸引物に加えた。次いで、組織収集容器を３７℃の振盪培養器にセットして未処理の脂肪吸引物を約３０分間、約６０ｒｐｍで脱凝集した。次いで、脱凝集された組織サンプルを１００μｍの滅菌フィルタに通し、濾過した組織を約６００×ｇの速度で約１０分間遠心分離して再生細胞を回収した。回収した細胞は２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を有する最少必須栄養素培地（ＭＥＭ）で２４時間培養した。付着細胞は血球計算板によって数えた。
【０１０９】
［図１０］に示すように、遠心分離前に組織サンプルを押出すことで組織１グラム当たりの細胞数が大きくなる。［図１１］は１２００×ｇの遠心分離で、組織を遠心分離前に押出すか否かにかかわらず、細胞濃縮されたマトリックス中の細胞濃度が増加するという点で相加効果を有することを示している。
【０１１０】
［図１２］は組織サンプルに加える遠心分離の時間を長くすると細胞濃縮されたマトリックスのグラム当たりの細胞数が高くなることを示している。［図１３］は４００×ｇの速度の加速または全く遠心分離を加えない場合と比較して、１２００×ｇの加速で細胞濃縮されたマトリックス当たりの細胞濃度が高くなることを示している。
【０１１１】
実施例４
ヒトの深浅な脂肪吸引物を２つのアリコットに分け、アリコット１（「対照方法」）は脂肪移植片を調製するために美容手術で一般に使用される条件と同様に脂肪吸引物を処理した。脂肪吸引物を２００×ｇで２分間遠心分離した。アリコット２（「細胞濃縮されたマトリックス」（ＣＥＭ）方法）は最初に２つの注射器の間のルアーカップリングを通して押出し加工し、押出された脂肪吸引物を１２００×ｇで３０分間遠心分離して処理した。遠心分離後、両方の方法とも上部オイル層、中央組織層および下側水層に分かれた。各アリコットの中央組織層画分を回収した。各方法で回収した組織層画分の一部を１ｃｃの注射器に入れ、メスの免疫不全ＮＵ／ＮＵマウスのうなじ部に皮下投与した（ｎ＝３マウス／調整物）。
【０１１２】
各方法からの組織層画分の追加の一部をさらにコラゲナーゼＩおよびＩＩおよびディスパーゼのブレンド物で３７℃で処理し、１００μｍフィルタで濾過し、６００×ｇで遠心分離して再生細胞を得た。深浅な細胞調整物中の成育可能な再生細胞の数と、２４時間培養でのプラスチック付着細胞の数とを求めた。移植から１ヵ月後にマウスを犠牲にしてグラフト鎖を評価した。
【０１１３】
ＣＥＭ方法による加工で新鮮な調整物と比較してプラスチック付着細胞の濃度が２．２倍高くなり、対照方法と比較して成育可能な細胞の濃度は５．５倍高くなる（［表１］参照）。この細胞濃縮結果は１ヵ月のグラフト鎖の生存力が高いことで表され、血管新生と、ＣＥＭ方法を用いて得られた細胞調整物を注射したマウスにオイルポケットが無いことで証明された。
【０１１４】
【表１】
0006014045.tif 000002
【０１１５】
他の具体例
以上、本発明を説明したが、上記の説明は本発明を限定するためのものではなく、本発明は特許請求の範囲でのみ定義される。上記以外の観点、利点および変更は本発明の範囲内である。
【図１】
0006014045.tif 000003
【図２】
0006014045.tif 000004
【図３Ａ】
0006014045.tif 000005
【図３Ｂ】
0006014045.tif 000006
【図３Ｃ】
0006014045.tif 000007
【図３Ｄ】
0006014045.tif 000008
【図３Ｅ】
0006014045.tif 000009
【図４】
0006014045.tif 000010
【図５】
0006014045.tif 000011
【図６】
0006014045.tif 000012
【図７】
0006014045.tif 000013
【図８】
0006014045.tif 000014
【図９】
0006014045.tif 000015
【図１０】
0006014045.tif 000016
【図１１】
0006014045.tif 000017
【図１２】
0006014045.tif 000018
【図１３】
0006014045.tif 000019
【図１４】
0006014045.tif 000020
【図１５】
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