(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の細胞を含む試料中、またはヒト由来の細胞を含む試料から得られた核酸試料中で、PTPRMタンパク質またはPTPRM遺伝子のｍRNAの存在を検出することを含む、ヒトIL-17産生ヘルパーT細胞を検出する方法。
【請求項２】
前記ｍRNAに特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて前記ｍRNAを検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍRNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを用いて前記ｍRNAを検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記PTPRMタンパク質に特異的に結合する、核酸アプタマーまたは抗体を用いて前記PTPRMタンパク質を検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
PTPRM遺伝子のｍRNAに特異的にハイブリダイズする核酸プローブ；および
PTPRMタンパク質に特異的に結合する、核酸アプタマーまたは抗体；
から選択される少なくとも１つを含む、ヒトIL-17産生ヘルパーT細胞検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのIL-17産生ヘルパーT細胞（以下、「Th17細胞」ともいう）を検出するためのマーカーおよび試薬、並びにヒトTh17細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ（以下、「RA」という）は、関節炎を主な臨床症状とする全身性の炎症性自己免疫疾患である。RAは、関節の痛みのような自覚症状および腫脹の程度、骨X線による知見などに基づく視覚的な手法によりその病勢が判断されているが、定量的な指標が確立されていない。よって、治療効果を継続的にモニターする定量的方法も確立されていないのが現状である。【０００３】
RAの発症原因の詳細は未だ明らかとなっていないが、細菌感染などが引き金となり、免疫細胞群およびサイトカイン群の複雑なネットワークを介して、関節組織の炎症が起こると考えられている。
免疫反応の中心を担うのは、ヘルパーT細胞群である。未熟なヘルパーT細胞（ナイーブT細胞）は、抗原提示細胞から抗原を提示されるとヘルパーT細胞に分化するが、このときに特定のサイトカインが存在することにより、ナイーブT細胞は４種類の細胞種に分化誘導される。４種類の細胞種とは、インターフェロン（IFN）-γを産生するヘルパーT細胞（Th1細胞）、インターロイキン（IL）-4を産生するヘルパーT細胞（Th2細胞）、IL-17を産生するヘルパーT細胞（Th17細胞）および免疫抑制効果を有する制御性T細胞（Treg細胞）である。【０００４】
これらのヘルパーT細胞のうち、Th17細胞がRAの発症に関与し得ることが明らかになっている。【０００５】
例えば、特開２０００−１８６０４６号公報（特許文献１）には、RA患者の関節滑液では、変形関節炎の患者の関節滑液よりも、IL-17の量が有意に高いことや、RA患者由来の滑液組織中のT細胞にIL-17陽性細胞が存在することから、IL-17がRAの病態形成、特に関節・骨破壊に深く関与することが示されている。さらに、特許文献１では、IL-17をRAの診断マーカーとして用いることができると記載している。【０００６】
また、特開２００７−５０６１００号公報（特許文献２）には、RA患者からの末梢血血清中のサイトカインを分析したところ、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、IL-5およびIL-7のレベルがRA患者において有意に高い値であり、IL-2、CXCL8／IL-8、IL-12およびCCL2/MCP-1は高い値ではなかったことが記載されている。【０００７】
一方、Th17細胞については、Ivanovら（Cell, 2006, 126, p.1121-1133：非特許文献１）、Stumhoferら（Nature Immunology, 2006, vol.7, p.937-945：非特許文献２）、Wilsonら（Nature Immunology, 2007, vol.8, p.950-957：非特許文献３）などの研究により、以下のことが明らかになっている。
- RORγtとよばれる核内受容体がTh17細胞の分化に重要な役割を果たす。
- IL-6、IL-23およびTGF-βにより、未熟なヘルパーT細胞（ナイーブT細胞）からTh17細胞への分化が誘導される。
- IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-26、TNF、IFN-γ、CCL20を発現する。
- Th17細胞の表面には、IL-23受容体やIL-12受容体βが存在する。
【特許文献１】特開２０００−１８６０４６号公報
【特許文献２】特開２００７−５０６１００号公報
【非特許文献１】Ivanovら, "The Orphan Nuclear Receptor RORγt Directs the Differentiation Program of Proinflammatory IL-17+ T Helper Cells", Cell, 2006, 126, p.1121-1133
【非特許文献２】Stumhoferら, "Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system" Nature Immunology, 2006, vol.7, p.937-945
【非特許文献３】Wilsonら, "Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells" Nature Immunology, 2007, vol.8, p.950-957
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の非特許文献１〜３では、IL-17に特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着法（ELISA法）を用いてIL-17の量を測定している。
しかし、IL-17の量を測定するだけでなく、Th17細胞自体を検出する方法を確立することにより、自己免疫疾患、好ましくはRAとTh17細胞との関連をより深く理解することができると考えられる。【０００９】
本発明者らは、ヒトTh17細胞を特異的に検出することを可能にする分子マーカーを見出すことを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、健常な成人の末梢血からTh17細胞を分取し、得られたTh17細胞に特異的に発現する遺伝子を同定して、本発明を完成した。【００１６】
よって、本発明は、ヒト由来の細胞を含む試料中、またはヒト由来の細胞を含む試料から得られた核酸試料中で、PTPRMタンパク質またはPTPRM遺伝子のｍRNAの存在を検出することを含む、ヒトIL-17産生ヘルパーT細胞を検出する方法。
【００１７】
本発明は、PTPRM遺伝子のｍRNAに特異的にハイブリダイズする核酸プローブ；およびPTPRMタンパク質に特異的に結合する、核酸アプタマーまたは抗体；から選択される少なくとも１つを含む、ヒトIL-17産生ヘルパーT細胞検出用試薬。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーまたはタンパク質マーカーを少なくとも１つ検出することにより、ヒトTh17細胞を特異的に検出できる。また、Th17細胞が関与すると考えられている疾患、例えばRAなどの自己免疫疾患に該患者が罹患している可能性を検出できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Th1、Th2、TregおよびTh17の各細胞における、既知のTh17細胞特異的発現遺伝子（IL23R、IL17A、IL17F、IL22、IL26およびRORC）の発現量を示すグラフである。
【図２】MCAM測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図３】PTPRM測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図４】GPR34測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図５】CCR6測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図６】IL-17A測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図７】IFN-γ測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図８】IL-4測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図９】FOXP3測定用試料の解析から得られた蛍光強度を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーは、上記の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型および断片である。【００２１】
好ましくは、上記のポリヌクレオチドは、
ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5（LOC100134440）、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3およびUNC13Cからなる膜タンパク質をコードする遺伝子；
PCOLCE2、PNOC、TGFBIおよびIL1Aからなる分泌タンパク質をコードする遺伝子；ならびに
BHLHE22、PPARG、SIM1およびSNAI2からなる細胞内タンパク質をコードする遺伝子；
からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。【００２２】
本発明のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーは、ヒト末梢血由来の他のヘルパーT細胞（Th1、Th2およびTreg細胞）に比べて、Th17細胞において特異的に存在することが見出されたポリヌクレオチド、その変異型または断片である。
したがって、上記のポリヌクレオチドマーカーを少なくとも１つ検出することにより、Th17細胞をTh1、Th2およびTreg細胞と区別して特異的に検出すること、およびTh17細胞が関与すると考えられている疾患の生体における活動性指標の検討ができる。【００２３】
本明細書において、遺伝子とは、当該技術において一般的に用いられる用語と同等の意味を有し、mRNAに転写されてタンパク質に翻訳されることとなるゲノム上の一部分のことである。【００２４】
本明細書において、配列番号１４７〜１５１、１５７〜１６２および１６７〜１７４から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む遺伝子は、各配列番号で示される少なくとも１つの塩基配列またはその塩基配列に相補的な塩基配列を含むmRNAが転写される遺伝子である。すなわち、配列番号１４７〜１５１、１５７〜１６２および１６７〜１７４から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む遺伝子には、配列番号１４７〜１５１、１５７〜１６２および１６７〜１７４から選択される少なくとも１つの塩基配列に相補的な塩基配列を含む遺伝子が含まれる。【００２５】
本明細書において、膜タンパク質とは、細胞膜に存在し、細胞の膜画分に含まれるタンパク質を意味する。分泌タンパク質とは、細胞内で合成され、細胞質膜外へ分泌されるタンパク質を意味する。細胞内タンパク質とは、その局在が主に細胞内であるタンパク質を意味する。【００２６】
本明細書において、あるポリヌクレオチドがTh17細胞において「特異的に発現する」との表現は、Th17細胞以外の細胞でのそのポリヌクレオチドの発現に比べて、Th17細胞におけるそのポリヌクレオチドの発現が有意に高いことを意味する。
具体的には、Th17細胞におけるそのポリヌクレオチドの発現が、Th17細胞以外の細胞でのそのポリヌクレオチドの発現の約2倍以上であることを意味する。好ましくは、Th17細胞におけるそのポリヌクレオチドの発現が、Th17細胞以外のヘルパーT細胞（Th1細胞、Th2細胞、Th22細胞およびTreg細胞）でのそのポリヌクレオチドの発現の約2倍以上である。【００２７】
本発明のポリヌクレオチドマーカーの塩基配列は、すでに公知である。これらは、例えばUnigene（米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース）から知ることができる。本発明のポリヌクレオチドマーカーの塩基配列のUnigeneコードは、表９に示す。【００２８】
本明細書において、ポリヌクレオチドの「変異型」とは、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質の性質を変化させない変異が導入されたポリヌクレオチドを意味する。このような変異は、上記の遺伝子の塩基配列における１もしくは複数のヌクレオチドの欠失または置換、あるいは１もしくは複数のヌクレオチドの付加を含む。
本明細書において、ポリヌクレオチドの「断片」とは、上記の遺伝子の塩基配列の一部を連続して有し、後述するヒトTh17細胞検出用核酸プローブと特異的にハイブリダイズできる長さのポリヌクレオチドを意味する。【００２９】
本発明のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーとしてのポリヌクレオチドの変異型は、上記の各遺伝子の塩基配列と、通常は少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、特により好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、BLASTN、BLASTP、BLASTXまたはTBLASTN（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.govから利用可能）を標準設定で用いて算出される。【００３０】
上記のポリヌクレオチドマーカーは、DNAまたはRNAのいずれであってもよく、上記の遺伝子そのもの（DNA）、mRNA、cDNAまたはcRNAのいずれであってもよい。【００３１】
上記の遺伝子によりコードされるタンパク質を少なくとも１つ検出することによっても、ヒトTh17細胞を検出できる。よって、少なくとも１つの上記の遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型および断片であるヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーも本発明の一つである。【００３２】
好ましくは、上記のタンパク質は、
ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5（LOC100134440）、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3およびUNC13Cからなる膜タンパク質をコードする遺伝子；
PCOLCE2、PNOC、TGFBIおよびIL1Aからなる分泌タンパク質をコードする遺伝子；ならびに
BHLHE22、PPARG、SIM1およびSNAI2からなる細胞内タンパク質をコードする遺伝子；
からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子によりコードされるタンパク質である。【００３３】
より好ましくは、上記のタンパク質は、GPR34、MCAMおよびPTPRMからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子によりコードされる膜タンパク質である。【００３４】
このようなタンパク質マーカーのアミノ酸配列は、上記のUnigeneなどから得られたポリヌクレオチドマーカーの塩基配列に基づいて知ることができる。また、上記のようなNCBIにより提供されるデータベースから知ることもできる。本発明のヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーのアミノ酸配列についてのNCBIのコード番号は、表９に示す。【００３５】
上記のヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーは、少なくとも１つの上記の遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型および断片である。
本明細書において、タンパク質の「機能的に同等な変異型」とは、タンパク質の機能を変化させない変異が導入されたタンパク質を意味する。このような変異は、公知のタンパク質のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸の欠失または置換、あるいは１もしくは複数のアミノ酸の付加を含む。
本明細書において、タンパク質の「断片」とは、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質またはその機能的に同等な変異型のアミノ酸配列の一部を連続して有し、後述するヒトTh17細胞検出用の核酸アプタマー、抗体、リガンドまたは受容体と特異的に結合できるタンパク質を意味する。【００３６】
本発明のヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーとしてのタンパク質の機能的に同等な変異型は、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質の公知のアミノ酸配列と、通常は少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、特により好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。【００３７】
本発明のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズできる分子は、該マーカーを検出するために用いることができるので、ヒトTh17細胞検出用プローブとして有用である。該プローブは、上記のポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズできるDNA、RNAなどの核酸プローブ、ペプチドプローブのいずれであってもよい。ヒトTh17細胞検出用プローブとしては、ポリヌクレオチドマーカーを検出するための核酸プローブ、特にDNAプローブが好ましい。【００３８】
本明細書において、「特異的にハイブリダイズできる」とは、ストリンジェントな条件下で標的核酸分子（上記のポリヌクレオチドマーカー）にハイブリダイズできることを意味する。
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、ヒトTh17細胞検出用プローブが標的ポリヌクレオチドマーカーに、該標的ポリヌクレオチドマーカー以外のポリヌクレオチドよりも検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍を超える）でハイブリダイズできる条件である。
なお、ストリンジェントな条件は、通常、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱的融点（thermal melting point）よりも、約5℃低くなるように選択される。このTmは、（規定されたイオン強度、pHおよび核酸組成の下で）上記の標的配列に相補的なプローブの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。【００３９】
このような条件は、従来公知のポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション法、例えばPCR法、マイクロアレイ法、サザンブロット法などにおいてポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーションに用いられる条件であってよい。
具体的には、pH 7.0〜9.0で塩濃度が約1.5 M Naイオンより低い、より具体的には、約0.01〜1.0 M Naイオン濃度（または他の塩）であり、少なくとも約30℃の条件が挙げられる。例えば、マイクロアレイ法におけるストリンジェントな条件は、37℃で50%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDS中でのハイブリダイゼーション、および60〜65℃での0.1×SSC中での洗浄を含む。
また、ＰＣＲ法におけるストリンジェントな条件は、pH7〜9、0.01〜0.1 MのTris HCl、0.05〜0.15 M Kイオン濃度（または他の塩）、少なくとも約55℃の条件が挙げられる。【００４０】
上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブの配列は、当該技術常識および上記のポリヌクレオチドマーカーの配列に基づいて、上記のポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズできるように、当業者が適宜決定できる。
上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブは、例えば、一般に利用可能なプライマー設計ソフトウェア（例えばPrimer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgiから利用可能)やDNASIS Pro (日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社)）を用いて決定できる。【００４１】
上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブは、当該技術において公知のポリヌクレオチドの合成方法により作製できる。【００４２】
上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブは、当該技術において通常用いられる標識物質により標識されていてもよい。標識された該プローブを用いることにより、ヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーの検出、すなわちヒトTh17細胞の検出を簡便に行うことができる。
上記の標識物質は、32Ｐなどの放射性同位体、フルオレセインなどの蛍光物質、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンなどの当該技術において通常用いられる標識物質であり得る。【００４３】
上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブは、1種のみを用いるか、または複数種を組み合わせて用いることにより、ヒトTh17細胞を特異的に検出できる。例えば、当該技術において公知の方法を用いて該プローブ1種以上を基板上に固定化することにより、ヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーを検出するためのDNAチップまたはマイクロアレイを作製できる。
上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブは、例えばPCR法などの核酸増幅法により上記のポリヌクレオチドマーカーを増幅するための2種以上のプライマーのセットであり得る。【００４４】
本発明のヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーに特異的に結合できる分子は、該マーカーを検出するために用いることができるので、ヒトTh17細胞を検出するために有用である。このような分子は、ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーに特異的に結合できるDNA、RNAなどの核酸アプタマー、抗体、リガンドまたは受容体などのいずれであってもよいが、好ましくは抗体である。
また、ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーが酵素である場合、該酵素に基質を作用させて発色、発光、蛍光などを生じさせることにより該マーカーを検出できる。【００４５】
上記のヒトTh17細胞検出用抗体は、例えば、次のような従来公知の手順により作製できる。上記のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーの塩基配列またはタンパク質マーカーのアミノ酸配列に基づいて、タンパク質マーカーのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA分子を適切な発現ベクターに導入する。得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養して、目的のタンパク質を得る。得られたタンパク質を精製して免疫原とし、免疫原と所望によりアジュバントとを用いて、適切な哺乳動物、例えばラット、マウスなどを免疫する。免疫された動物の脾臓細胞などから、目的の免疫原に対する抗体を産生する抗体産生細胞をスクリーニングにより選択する。得られた抗体産生細胞を、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得て、これをスクリーニングすることにより、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的結合性を有する抗体を産生する抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。得られた抗体産生ハイブリドーマを培養することにより、目的の抗体を得ることができる。【００４６】
上記のヒトTh17細胞を検出するために用いることができる核酸アプタマーは、例えば、次のような従来公知の手順により作製できる。ランダムな核酸の塩基配列を有する核酸ライブラリーを公知の手法により作成し、試験管内進化法（SELEX法）などにより標的のタンパク質（上記のタンパク質マーカー）に特異的に結合できるアプタマーを選択できる。【００４７】
上記のヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーに特異的に結合できる分子は、当該技術において通常用いられる標識物質により標識されていてもよい。標識されたヒトTh17細胞検出用抗体を用いることにより、ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーの検出、すなわちヒトTh17細胞の検出を簡便に行うことができる。
上記の標識物質は、32Ｐなどの放射性同位体、フルオレセインなどの蛍光物質、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンなどの当該技術において通常用いられる標識物質であり得る。【００４８】
ヒト由来の細胞を含む試料中で、少なくとも１つのヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーまたは少なくとも１つのヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出することによりヒトTh17細胞を検出する方法も、本発明の範囲に含まれる。
この方法においては、検出感度を向上させる観点から、複数のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーまたはヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出することが好ましい。【００４９】
本発明のヒトTh17細胞を検出する方法において、ヒト由来の細胞を含む試料としては、ヒトから採取した生体試料または人工的に培養したヒト細胞を含む試料が挙げられる。生体試料としては、血液、組織、関節液、脳脊髄液、胸水、腹水などが挙げられる。【００５０】
ヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーの存在を検出する方法のある実施形態について説明する。
まず、ヒト由来の細胞を含む試料から、フェノール抽出およびエタノール沈殿、市販のDNA抽出キットなどを用いる当該技術において公知の方法により核酸（DNAまたはRNA）を抽出する。
次いで、得られた核酸試料中の上記のポリヌクレオチドマーカーの存在を検出する。この検出においては、上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブを用いることが好ましい。特に、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法などの核酸増幅法により上記のポリヌクレオチドマーカーの存在を検出する場合、ヒトTh17細胞検出用核酸プローブとしては該ポリヌクレオチドマーカーを核酸増幅法により増幅するためのプライマーセットを用いることが好ましい。
また、ヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーの存在は、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）のようなハイブリダイゼーション法、DNAチップまたはマイクロアレイ法などの当該技術において公知の方法によっても検出できる。これらの方法を、上記のストリンジェントな条件下で行い、上記のヒトTh17細胞検出用核酸プローブがハイブリッドを形成したことを、上記の標識物質を検出することなどにより検出して、ポリヌクレオチドマーカーの存在を検出できる。【００５１】
次に、ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出する方法のある実施形態について説明する。
例えば、検出対象であるヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーが細胞内に存在するタンパク質である場合、当該技術において公知の方法を用いて、ヒト由来細胞を含む試料からタンパク質を抽出する。該試料からのタンパク質の抽出は、超音波による細胞の破砕、細胞可溶化液を用いる可溶化などの公知の方法により行うことができる。そして、該タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、得られたタンパク質抽出液中の上記のタンパク質マーカーを検出できる。具体的には、ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーは、ELISA法、ウェスタンブロッティング法などの当該技術において公知の方法により検出できる。検出において、上記のタンパク質マーカーに特異的に結合する分子は、上記の核酸アプタマー、抗体、リガンドまたは受容体、好ましくは上記のヒトTh17細胞検出用抗体を用いることが好ましい。【００５２】
例えば、検出対象であるヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーが分泌タンパク質である場合、該タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、上記細胞を含む試料中に分泌されたタンパク質マーカーを検出できる。
また、ヒト由来の細胞を含む試料から細胞（リンパ球）を採取し、抗CD3抗体、抗CD28抗体、コンカナバリンA、PHA（フィトヘマグルチニン）、PMA（ホルボールミリステートアセテート）、イオノマイシンなどを用いて採取した細胞を刺激した後、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、分泌されたタンパク質マーカーを検出できる。
具体的には、ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーは、ELISA法、ウェスタンブロッティング法などの当該技術において公知の方法により検出できる。検出において、上記のタンパク質マーカーに特異的に結合する分子は、上記の核酸アプタマー、抗体、リガンドまたは受容体、好ましくは上記のヒトTh17細胞検出用抗体を用いることが好ましい。【００５３】
例えば、検出対象であるヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーが細胞の表面に存在するタンパク質である場合、該タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、ヒト由来の細胞を含む試料中の細胞の表面に存在するタンパク質マーカーを検出できる。
また、ヒト由来の細胞を含む試料から細胞の膜画分を採取し、上記のタンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、得られた膜画分中の該タンパク質マーカーを検出できる。具体的には、ELISA法、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリ（FCM）に基づく方法などの当該技術において公知の方法により検出できる。検出において、上記のタンパク質マーカーに特異的に結合する分子は、上記の核酸アプタマー、抗体、リガンドまたは受容体、好ましくは上記のヒトTh17細胞検出用抗体を用いることが好ましい。【００５４】
例えば、FCMによりヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーを検出する場合、次のような手順で検出を行うことができる。
まず、ヒト由来の細胞を含む試料を、適切な標識物質で標識された上記のヒトTh17細胞検出用抗体と接触させる。存在するのであればヒトTh17細胞は、この標識された抗体と細胞表面で結合する。よって、標識物質と結合した細胞を含む試料をフローサイトメータに通すことにより、ヒトTh17細胞を検出できる。また、所望により標識物質と結合したヒトTh17細胞を、セルソーターを用いて弁別・分取することもできる。
このようなFCMに基づく方法は、当業者に公知であり、反応の条件は当業者により適宜決定される。【００５５】
上記の本発明のヒトTh17細胞を検出する方法に用い得る、ヒトTh17細胞検出用試薬も本発明の一つである。
そのような試薬は、上記のヒトTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸プローブ、並びに上記のヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーに特異的に結合する核酸アプタマー、抗体、リガンドおよび受容体から選択される少なくとも１つを含む。
【実施例】
【００５６】
本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００５７】
実施例１：ヒト末梢血由来培養Th17細胞における高発現遺伝子の解析
１．ヒト末梢血からのTh1、Th2、TregおよびTh17細胞の単離
（１）ヒト末梢血からのTh1、Th2およびTh17細胞の単離
健常な成人の末梢血から得たバフィーコートをFicoll-paque plus溶液（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）に重層し、これを遠心分離することにより、単核球フラクションを得た。次いで、抗CD4抗体を結合させた磁気ビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いて、上記のフラクションからCD4陽性細胞を粗精製した。
このようにして得たCD4陽性細胞を、表１に示す蛍光標識抗体を用いて染色した後、セルソーター（FACS Aria：Becton Dickinson社）を用いて、Th1、Th2およびTh17の各細胞を分離した。また、分離のゲーティングは、表２に示すとおりに行った。【００５８】
【表１】
0005858785.tif 000002
【００５９】
【表２】
0005858785.tif 000003
【００６０】
なお、上記のソーティングの操作の詳細は、Acosta-Rodriguez EVらによる文献（Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.，Nat Immunol., 2007, vol. 8, p.639-646）を参照されたい。【００６１】
（２）ヒト末梢血からのTreg細胞の単離
上記の工程（１）と同様にして得たCD4陽性細胞を、表３に示す蛍光標識抗体を用いて染色した後、上記のセルソーターを用いて、CD4high CD25high CD127internal-negative細胞をTreg細胞として純化した。【００６２】
【表３】
0005858785.tif 000004
【００６３】
なお、上記のソーティングの操作の詳細は、Weihong Liuらによる文献（CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.，J Exp Med. 2006, vol. 203, p.1701-1711）を参照されたい。【００６４】
２．細胞の培養
（１）Th1、Th2およびTh17細胞の培養
上記の工程１．（１）で得られた成人末梢血由来のTh1、Th2およびTh17細胞をそれぞれ96ウェルプレートに1.5 x 105細胞／0.3 ml／ウェルの密度で播種した。培地は、Yssel培地（IMDM，1％ヒトAB型血清，0.25％ BSA，1.8 mg／l 2−アミノメタノール，40 mg／lトランスフェリン，5 mg／lインスリン，2 mg／lリノール酸，2 mg／lオレイン酸，2 mg／lパルミチン酸，1％ペニシリン／ストレプトマイシン）を用いた。
また、上記の細胞の活性化および増殖のために、各ウェルに抗CD2／3／28抗体でコーティングした磁気ビーズ（Miltenyi Biotec社）（以下、「抗体ビーズ」ともいう）を0.75 x 105個ずつ添加した。そして、Th1、Th2およびTh17細胞のそれぞれの分化培養に適したサイトカインおよび中和抗体を添加して、細胞を37℃、5％ CO2雰囲気のインキュベータ内で培養した。表４に用いたサイトカインおよび中和抗体を示す。【００６５】
【表４】
0005858785.tif 000005
【００６６】
上記のサイトカインの濃度は、IL-6を50 ng／mlとし、IL-6以外を10 ng／mlとした。また、上記の抗体の濃度は、抗IFN-γ抗体を10μg／mlとし、抗IL-4抗体を2.5μg／mlとした。
なお、サイトカインおよび中和抗体は、それぞれR&D systems社およびeBioscience社から入手した。
培養開始から3日後、上記のサイトカインおよび抗体を含んだ培地で細胞を3倍に希釈し、さらに7日間（合計10日間）培養した。
培養開始から10日後、得られたTh1、Th2およびTh17細胞をそれぞれ二等分し、これらの一方を、Yssel培地およびPBSを用いて洗浄した後、遠心分離により細胞を回収し、次のRNA抽出工程まで−80℃にて凍結保存した。これらをそれぞれ「活性化刺激なし」のTh1、Th2およびTh17細胞とした。そして、もう一方の各細胞には、上記の抗体ビーズを添加し、さらに３時間培養することにより再度活性化した後、遠心分離により細胞を回収し、同様に−80℃にて凍結保存した。これらをそれぞれ「活性化刺激あり」のTh1、Th2およびTh17細胞とした。【００６７】
（２）Treg細胞の培養
上記の工程１．（２）で得られたTreg細胞を、上記の工程２．（１）と同様にYssel培地で培養し、そして抗体ビーズを用いて活性化した。さらに、培地には、サイトカインとして、IL-2およびTGF-β１（R&D systems社）、ならびに中和抗体として、抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体（eBioscience社）および抗IL-6抗体（BD bioscience社）を添加した。
なお、これらのサイトカインおよび中和抗体は、それぞれ10 ng／mlおよび5μg／mlの濃度で用いた。
培養開始から3日後、培養開始時と同量のサイトカインおよび中和抗体を添加した。さらに3日間培養した後、細胞を二等分し、一方には活性化に用いた抗体ビーズを添加せず、もう一方には抗体ビーズを添加して、さらに３時間培養して、それぞれ「活性化刺激なし」および「活性刺激あり」のTreg細胞とした。その後、各細胞を遠心分離により回収し、次のRNA抽出工程まで−80℃にて凍結保存した。【００６８】
３．トータルRNAの抽出
上記の工程２．で得た各細胞からトータルRNAを抽出するために、それぞれRNeasy Plus MiniキットおよびRNeasy microキット（QIAGEN社）を用いた。なお、具体的な操作は、各キットの添付文書の記載に従って行った。【００６９】
４．マイクロアレイ発現解析
Two-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix社）を用いて、上記の工程３．で抽出した各細胞のトータルRNA（10〜100 ng）をcDNAに逆転写し、さらにビオチン化cRNAへの転写反応を行った。次いで、増幅したビオチン化cRNA（20μg）を断片化した。なお、具体的な操作は、キットに添付の説明書の記載に従って行った。
上記で得られた各細胞由来のビオチン化cRNA（15μg）を検体として、それぞれGeneChip Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array（Affymetrix社）に添加し、GeneChip Hybridization Oven 640（Affymetrix社）に移して、45℃、60 rpmの条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション終了後、上記のマイクロアレイを、GeneChip Fluidic Station 450（Affymetrix社）を用いて洗浄および蛍光標識を行い、該マイクロアレイを、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix社）を用いてスキャンし、蛍光強度データを取得した。【００７０】
５．ヒトTh17細胞に特異的に発現する遺伝子の選択
上記の工程４．で得られた蛍光強度のデータに基づいて、発現解析ソフトウェアGeneSpring Ver.10（Agilent Technologies社）を用いて、MAS5アルゴリズムにより該データを標準化した。そして、Th17細胞の各遺伝子の相対蛍光強度を、Th1、Th2およびTreg細胞のものと比較した。
Th17細胞における相対蛍光強度が、Th1、Th2およびTreg細胞のいずれよりも３倍以上高く、かつ有意に発現する遺伝子（相対蛍光強度のTh1、Th2、TregおよびTh17細胞の4群間のANOVA統計解析により、「p値＜0.05」を示した遺伝子）をTh17細胞に特異的に発現している遺伝子として同定した。
なお、上記の遺伝子の選択工程に用いた各検体の数を表５に示す。【００７１】
【表５】
0005858785.tif 000006
【００７２】
表６および表７に、それぞれ「活性化刺激なし」および「活性化刺激あり」のTh17細胞における特異的発現遺伝子を示す。【００７３】
【表６−１】
0005858785.tif 000007
【００７４】
【表６−２】
0005858785.tif 000008
【００７５】
【表６−３】
0005858785.tif 000009
【００７６】
【表６−４】
0005858785.tif 000010
【００７７】
【表６−５】
0005858785.tif 000011
【００７８】
【表６−６】
0005858785.tif 000012
【００７９】
【表６−７】
0005858785.tif 000013
【００８０】
【表６−８】
0005858785.tif 000014
【００８１】
【表７−１】
0005858785.tif 000015
【００８２】
【表７−２】
0005858785.tif 000016
【００８３】
【表７−３】
0005858785.tif 000017
【００８４】
【表７−４】
0005858785.tif 000018
【００８５】
【表７−５】
0005858785.tif 000019
【００８６】
【表７−６】
0005858785.tif 000020
【００８７】
【表７−７】
0005858785.tif 000021
【００８８】
【表７−８】
0005858785.tif 000022
【００８９】
【表７−９】
0005858785.tif 000023
【００９０】
上記の遺伝子のうち、以下の表８に示すものは、Th17細胞に特異的に発現することが既に知られている遺伝子である。【００９１】
【表８】
0005858785.tif 000024
【００９２】
これらの既知遺伝子について、上記の工程２．で得たTh1、Th2、TregおよびTh17の各細胞における発現量を、上記のマイクロアレイを用いて解析したところ、Th17細胞は、これらの既知遺伝子をTh1、Th2およびTreg細胞よりも４〜９５０倍多く発現していた。この結果を図１に示す。この結果より、上記の各細胞がTh17細胞検出用マーカーの探索に適していることが示された。【００９３】
本発明者らは、上記で得られた遺伝子から表８に示す遺伝子を除いて、Th17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーを新たに同定した。表９にこれらの新規ポリヌクレオチドマーカーを示す。
なお、表中の「条件」とは、細胞の活性化刺激の有無を意味する。また、「条件」の欄が「共通」と記載される遺伝子は、該刺激をしたTh17細胞と該刺激をしなかったTh17細胞とに共通して特異的に発現している遺伝子であり、「刺激あり」および「刺激なし」と記載される遺伝子は、それぞれ該刺激をしたTh17細胞および該刺激をしなかったTh17細胞にのみ特異的発現が見られた遺伝子である。【００９４】
【表９−１】
0005858785.tif 000025
【００９５】
【表９−２】
0005858785.tif 000026
【００９６】
【表９−３】
0005858785.tif 000027
【００９７】
【表９−４】
0005858785.tif 000028
【００９８】
【表９−５】
0005858785.tif 000029
【００９９】
【表９−６】
0005858785.tif 000030
【０１００】
【表９−７】
0005858785.tif 000031
【０１０１】
【表９−８】
0005858785.tif 000032
【０１０２】
【表９−９】
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【０１０３】
【表９−１０】
0005858785.tif 000034
【０１０４】
表９に示す各ポリヌクレオチドマーカーを、PCR法などの当該技術において公知の方法を用いて検出することにより、また、これらのポリヌクレオチドマーカーによりコードされるタンパク質を、ELISA法やフローサイトメータを用いる方法などの当該技術において公知の方法を用いて検出することにより、ヒトTh17細胞を特異的に検出できると考えられる。【０１０５】
実施例２：ヒトTh17細胞検出用タンパク質マーカーの発現解析
１．測定用試料の調製
（１）MCAM測定用試料の調製
実施例１の「２．細胞の培養」において調製した「活性化刺激なし」のTh17細胞（５×106cells／ml）に、フィコエリスリン（PE）標識抗MCAM抗体（Biolegend社)を終濃度1.25μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させた。【０１０６】
反応後、0.5% BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、洗浄を行った。洗浄後のTh17細胞を、0.5μg／ml 7-アミノ-アクチノマイシンD（7-AAD）および0.5% BSAを含有するPBSに懸濁し、Th17細胞のMCAM測定用試料（５×106cells /ml）を調製した。【０１０７】
「活性化刺激なし」のTh17細胞に代えて、「活性化刺激なし」のTh1細胞、Th2細胞、およびTreg細胞を用い、同様の操作を行うことで、それぞれTh1細胞のMCAM測定用試料（５×106cells/ml）、Th2細胞のMCAM測定用試料（５×106cells/ml）およびTreg細胞のMCAM測定用試料（５×106cells/ml）を調製した。【０１０８】
PE標識MCAM抗体に代えてPE標識マウスIgG2aアイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１０９】
（２）PTPRM測定用試料の調製
実施例１の「２．細胞の培養」において調製した「活性化刺激なし」のTh17細胞（5×106cells/ml）に、抗PTPRM抗体（Abcam社）を終濃度が2.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させた。【０１１０】
反応後、0.5% BSAを含有するPBSを添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収した。回収したTh17細胞を、0.5% BSAを含有するPBSに懸濁した。この懸濁液に、PE標識抗マウスIgG抗体（Biolegend社）終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させた。【０１１１】
PE標識抗マウスIgG抗体と反応させた後、0.5% BSAを含有するPBSを添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、洗浄を行った。洗浄後のTh17細胞を、0.5μg／ml 7-アミノ-アクチノマイシンD（7-AAD）および0.5% BSAを含有するPBSに懸濁し、Th17細胞のPTPRM測定用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１１２】
「活性化刺激なし」のTh17細胞に代えて、「活性化刺激なし」のTh1細胞、Th2細胞、およびTreg細胞を用い、同様の操作を行うことで、それぞれTh1細胞のPTPRM測定用試料（5×106cells/ml）、Th2細胞のPTPRM測定用試料（5×106cells/ml）およびTreg細胞のPTPRM測定用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１１３】
抗PTPRM抗体に代えてマウスIgG2aアイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１１４】
（３）CCR6測定用試料の調製
上記の「（１）MCAM測定用試料の調製」における、PE標識抗MCAM抗体に代えて、終濃度1.0μg／mlのPE標識抗CCR6抗体（BDバイオサイエンス社)を用い、同様の操作を行うことで、Th17細胞のCCR6測定用試料（5×106cells/ml）、Th1細胞のCCR6測定用試料（5×106cells/ml）、Th2細胞のCCR6測定用試料（5×106cells/ml）およびTreg細胞のCCR6測定用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１１５】
上記のPE標識抗CCR6抗体に代えてPE標識マウスIgG1アイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１１６】
（４）FOXP3測定用試料の調製
実施例１の「２．細胞の培養」において調製した、「活性化刺激なし」のTh17細胞（５×106cells／ml）を、FOXP3 staining buffer set（eBioscience社）により固定および膜透過処理を行った後にPE標識抗FOXP3抗体（Biolegend社）を終濃度3.125μg／mlとなるように添加して４℃で２０分間反応させた。【０１１７】
反応後、0.5% BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、洗浄を行った。洗浄後のTh17細胞を、0.5% BSAを含有するPBSに懸濁し、Th17細胞のＦＯＸＰ３測定用試料（５×106cells /ml）を調製した。【０１１８】
「活性化刺激なし」のTh17細胞に代えて、「活性化刺激なし」のTh1細胞、Th2細胞、およびTreg細胞を用い、同様の操作を行うことで、それぞれTh1細胞のＦＯＸＰ３測定用試料（５×106cells/ml）、Th2細胞のＦＯＸＰ３測定用試料（５×106cells/ml）およびTreg細胞のＦＯＸＰ３測定用試料（５×106cells/ml）を調製した。【０１１９】
上記のPE標識FOXP3抗体に代えてPE標識マウスIgG1アイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（5×106cells/ml）を調製した。【０１２０】
（５）GRP34測定用試料の調製
実施例１の「２．細胞の培養」において調製した、「活性化刺激なし」のTh17細胞を５%FBS／RPMIで2.5×105cells/mlとなるように調製した。次に、ホルボールミリステートアセテートを終濃度50 ng/mlおよびイオノマイシンを終濃度1μMとなるように添加し、３７℃で４時間インキュベートすることで、Th17細胞を刺激した。次に、ブレフェルディンAを終濃度10μg/mlとなるように添加して、３７℃で２時間インキュベートした。【０１２１】
培養後、0.5% BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、2回洗浄を行った。洗浄したTh17細胞に、2%パラホルムアルデヒドを添加し、固定した。固定後、サポニン緩衝液（0.5%サポニン、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）、1 mMアジ化ナトリウム（PBS中））を添加し、Th17細胞の細胞膜の透過性を亢進させた。【０１２２】
サポニン緩衝液処理後の試料に、抗GPR34抗体（Lifespan Biosciences社)を終濃度25.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させた。反応後、サポニン緩衝液を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収した。回収したTh17細胞を、サポニン緩衝液に懸濁した。この懸濁液に、PE標識抗マウスIgG抗体（Biolegend社）を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させた。【０１２３】
PE標識抗マウスIgG抗体と反応させた後、サポニン緩衝液を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、2回洗浄を行った。洗浄後のTh17細胞を、0.5% BSAを含有するPBSに懸濁し、Th17細胞のGRP34測定用試料（2.5×105cells/ml）を調製した。【０１２４】
「活性化刺激なし」のTh17細胞に代えて、「活性化刺激なし」のTh1細胞、Th2細胞、およびTreg細胞を用い、同様の操作を行うことで、それぞれTh1細胞のGRP34測定用試料、Th2細胞のGRP34測定用試料およびTreg細胞のGRP34測定用試料を調製した。【０１２５】
上記の、抗GPR34抗体に代えてマウスIgG2aアイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（2.5×106cells/ml）を調製した。【０１２６】
（６）IL-17A測定用試料の調製
実施例１の「２．細胞の培養」において調製した「活性化刺激なし」のTh17細胞を５%FBS／RPMIで2.5×105cells/mlとなるように調製した。次に、ホルボールミリステートアセテートを終濃度50 ng/mlおよびイオノマイシンを終濃度1μMとなるように添加し、３７℃で４時間インキュベートすることで、Th17細胞を刺激した。次に、ブレフェルディンAを終濃度10μg/mlとなるように添加して、３７℃で２時間インキュベートした。【０１２７】
培養後、0.5% BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、洗浄を行った。洗浄したTh17細胞に、2%パラホルムアルデヒドを添加し、固定した。固定後、サポニン緩衝液（0.5%サポニン、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）、1 mMアジ化ナトリウム（PBS中））を添加し、Th17細胞の細胞膜の透過性を亢進させた。【０１２８】
サポニン緩衝液処理後の試料に、PerCP-Cy5.5標識抗IL-17A抗体（eBioscience社）を終濃度0.15μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させた。【０１２９】
反応後、サポニン緩衝液を添加し、遠心分離によりTh17細胞を回収することで、洗浄を行った。洗浄後のTh17細胞を、0.5% BSAを含有するPBSに懸濁し、Th17細胞のIL-17A測定用試料（2.5×105cells/ml）を調製した。
上記のPerCP-Cy5.5標識抗IL-17A抗体に代えてPerCP-Cy5.5標識マウスIgG1アイソタイプコントロール（eBioscience社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（2.5×106cells/ml）を調製した。【０１３０】
（７）IFN-γ測定用試料の調製
上記の「（６）IL-17A測定用試料の調製」における、PerCP-Cy5.5標識抗IL-17A抗体に代えて、終濃度1.0μg／mlのAlexa488標識抗IFN-γ抗体（Biolegend社）を用い、同様の操作を行うことで、Th17細胞のIFN-γ測定用試料（2.5×105cells/ml）、Th1細胞のIFN-γ測定用試料（2.5×105cells/ml）、Th2細胞のIFN-γ測定用試料（2.5×105cells/ml）およびTreg細胞のIFN-γ測定用試料（2.5×105cells/ml）を調製した。【０１３１】
上記のAlexa488標識抗IFN-γ抗体に代えてAlex488標識マウスIgG1アイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（2.5×106cells/ml）を調製した。【０１３２】
（８）IL-4測定用試料の調製
上記の「（６）IL-17A測定用試料の調製」における、PerCP-Cy5.5標識抗IL-17A抗体に代えて、終濃度0.2μg／mlのAPC標識抗IL-4抗体（eBioscience社）を用い、同様の操作を行うことで、Th17細胞のIL-4測定用試料（2.5×105cells/ml）、Th1細胞のIL-4測定用試料（2.5×105cells/ml）、Th2細胞のIL-4測定用試料（2.5×105cells/ml）およびTreg細胞のIL-4測定用試料（2.5×105cells/ml）を調製した。【０１３３】
上記のAPC標識抗IL-4抗体に代えてＡＰＣ標識ラットIgG1アイソタイプコントロール（Biolegend社)を終濃度1.0μg／mlとなるように添加し、４℃で２０分間反応させネガティブコントロール用試料（2.5×106cells/ml）を調製した。【０１３４】
２．フローサイトメータを用いた各測定用試料におけるタンパク質マーカーの発現解析
調製した各測定用試料を、FACSCanto II（BDバイオサイエンス社）およびFACS DIVAソフトウェア（BDバイオサイエンス社）を用いて解析した。解析により得られた蛍光強度のヒストグラム（粒度分布）を図２〜図９に示す。図２〜図９は、それぞれMCAM測定用試料、PTPRM測定用試料、GPR34測定用試料、CCR6測定用試料、IL-17A測定用試料、IFN-γ測定用試料、IL-4測定用試料、およびFOXP3測定用試料から得られたヒストグラムを示す。なお、図２〜図９のヒストグラムの縦軸は細胞数を示し、横軸は蛍光強度を示す。また、ヒストグラム右上の数値は、各測定用試料における、全細胞数に対するマーカー陽性細胞数の比率（％）を示す。ここで、陽性細胞と陰性細胞の判定は、ネガティブコントロールにおける最大の蛍光強度を基準として行った。すなわち、ネガティブコントロールにおける最大の蛍光強度よりも高い蛍光強度を示す細胞を陽性細胞と判定した。反対に、ネガティブコントロールにおける最大の蛍光強度以下の蛍光強度を示す細胞を陰性細胞と判定した。陽性細胞比率は、全細胞数に対する陽性細胞数の比として算出した。【０１３５】
CCR6およびIL-17Aは、Th17細胞の既知マーカーである。図５および図６から、Th17細胞において、CCR6およびIL-17Aのタンパク質の発現量が高いことがわかる。IFN-γは、Th1細胞の既知マーカーである。図７から、Th1細胞において、IFN-γのタンパク質の発現量が高いことがわかる。IL-4は、Th2細胞の既知マーカーである。図８から、Th2細胞において、IL-4のタンパク質の発現量が高いことがわかる。FOXP3は、Treg細胞の既知マーカーである。図９から、Treg細胞において、FOXP3のタンパク質の発現量が高いことがわかる。このことから、各測定用試料が、タンパク質マーカーの発現解析に適した試料であることがわかる。【０１３６】
図２〜図４から、Th17細胞において、MCAM、PTPRMおよびGPR34のタンパク質の発現量が高いことがわかる。また、MCAM測定用試料、PTPRM測定用試料およびGPR34測定用試料のTh17細胞の陽性細胞率は、CCR6測定用試料およびIL-17A測定用試料の陽性細胞率と同等以上であることがわかる。このことから、実施例１においてTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーとして同定された遺伝子であるMCAM、PTPRMおよびGPR34は、それらがコードするタンパク質もTh17細胞検出用タンパク質マーカーとして利用可能であることが明らかとなった。【０１３７】
実施例３：リアルタイムPCR法によるTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーの発現解析
１．cDNAの調製
（１）「活性化刺激なし」の細胞のcDNAの調製
実施例１の「３．トータルRNAの抽出」において抽出した、「活性化刺激なし」のTh17細胞のトータルRNA（0.1μg）を、poly dTプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）、ランダムプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）およびスーパースクリプトIII逆転写酵素（Invitrogen Corporation社）を用いて逆転写し、「活性化刺激なし」のTh17細胞のcDNAを得た。なお、逆転写は添付文書の記載に従って行った。【０１３８】
「活性化刺激なし」のTh17細胞のトータルRNA（0.1μg）に代えて、「活性化刺激なし」のTh1細胞のトータルRNA（0.1μg）、Th2細胞のトータルRNA（0.1μg）およびTreg細胞のトータルRNA（0.1μg）を用い、同様の操作を行うことで、それぞれ「活性化刺激なし」のTh1細胞のcDNA、「活性化刺激なし」のTh2細胞のcDNAおよび「活性化刺激なし」のTreg細胞のcDNAを得た。【０１３９】
cDNAの取得に用いた、「活性化刺激なし」の各細胞の検体数を表１０に示す。【０１４０】
【表１０】
0005858785.tif 000035
【０１４１】
（２）「活性化刺激あり」の細胞のcDNAの調製
実施例１の「２．細胞の培養」において調製した「活性化刺激なし」のTh17細胞を５%FBS／RPMIで2.5×105cells/mlに調製し、T cell activation/ expansion kit（Miltenyi Biotec社）を用いて３７℃で３時間インキュベートすることで、Th17細胞を刺激した。活性化刺激した「活性化刺激あり」のTh17細胞から、実施例１の「３．トータルRNAの抽出」と同様の操作により、Th17細胞のトータルRNAを抽出した。抽出した「活性化刺激あり」のTh17細胞のトータルRNA（0.1μg）を、poly dTプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）、ランダムプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）およびスーパースクリプトIII逆転写酵素（Invitrogen Corporation社）を用いて逆転写し、「活性化刺激あり」のTh17細胞のcDNAを得た。なお、逆転写は、添付文書の記載に従って行った。【０１４２】
「活性化刺激あり」のTh17細胞のトータルRNA（0.1μg）に代えて、「活性化刺激あり」のTh1細胞のトータルRNA（0.1μg）、Th2細胞のトータルRNA（0.1μg）、およびTreg細胞のトータルRNA（0.1μg）を用い、同様の操作を行うことで、それぞれ「活性化刺激あり」のTh1細胞のcDNA、「活性化刺激あり」のTh2細胞のcDNAおよび「活性化刺激あり」のTreg細胞のcDNAを得た。【０１４３】
cDNAの取得に用いた「活性化刺激あり」の各細胞の検体数を、表１１に示す。【０１４４】
【表１１】
0005858785.tif 000036
【０１４５】
２．プライマーセットの設計
以下のプライマーセットを、Primer3ソフトウェアを用いて設計した。
（１）Th17細胞の検出用プライマーセット
実施例１において、Th17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーとして同定された遺伝子であるADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、L1CAM、MCAM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5（LOC100134440）、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IL1A、BHLHE22、PPARG、SIM1およびSNAI2の各プライマーセットを設計した。【０１４６】
（２）Th17細胞の既知の遺伝子マーカーのプライマーセット
Th17細胞の既知の遺伝子マーカーであるCCR6、RORCおよびIL-17Aの各プライマーセットを設計した。【０１４７】
（３）Th1細胞の既知の遺伝子マーカーのプライマーセット
Th1細胞の既知の遺伝子マーカーであるTBX21およびIFN-γの各プライマーセットを設計した。【０１４８】
（４）Th2細胞の既知の遺伝子マーカーのプライマーセット
Th2細胞の既知の遺伝子マーカーであるGATA3およびIL-4の各プライマーセットを設計した。【０１４９】
（５）Treg細胞の既知の遺伝子マーカーのプライマーセット
Treg細胞の既知の遺伝子マーカーであるFOXP3のプライマーセットを設計した。【０１５０】
（６）内部標準遺伝子のプライマーセット
内部標準遺伝子であるGapdh、ACTB、B2MおよびUBCの各プライマーセットを設計した。【０１５１】
設計した各プライマーセットを、表１２に示す。【０１５２】
【表１２】
0005858785.tif 000037
【０１５３】
３．リアルタイムPCR法による遺伝子マーカーの発現解析
（１）「活性化刺激なし」の細胞のcDNAを鋳型としたリアルタイムPCR
上記の「１．cDNAの調製」で、５検体から取得した「活性化刺激なし」のTh17細胞のcDNAをそれぞれ鋳型として用いた。プライマーセットは、「２．プライマーセットの設計」において設計した、ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、L1CAM、MCAM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IL1A、BHLHE22、PPARG、SIM1、SNAI2、TBX21、GATA3、FOXP3、CCR6、RORC、GAPDH、ACTB、B2MおよびUBCのプライマーセットを用いた。鋳型とプライマーセットを、Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いて、7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems社）でリアルタイムPCRを行い、各遺伝子のCt値を測定した。なお、PCR条件は５０℃で２分、９５℃で１０分の反応の後、９５℃で１５秒と６０℃で１分を４５回繰り返し、９５℃で１５秒と６０℃で１分を２回繰り返した。また、Ct値は7300 Fast SDS software（Applied Biosystems社）を用いた自動計算により測定された。【０１５４】
「活性化刺激なし」のTh17細胞のcDNAに代えて、５検体から調製した「活性化刺激なし」のTh1細胞のcDNA、５検体から調製した「活性化刺激なし」のTh2細胞のcDNA、４検体から調製した「活性化刺激なし」のTreg細胞cDNAをそれぞれ鋳型として用いて、上記と同様にリアルタイムPCRを行い、各遺伝子のCt値を測定した。【０１５５】
（２）「活性化刺激あり」の細胞のcDNAを鋳型としたリアルタイムPCR
上記の「１．cDNAの調製」で、５検体から取得した「活性化刺激あり」のTh17細胞のcDNAを鋳型として用いた。プライマーセットは、「２．プライマーセットの設計」において設計した、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IFNG、IL4、IL17A、GAPDH、ACTB、B2MおよびUBCのプライマーセットを用いた。鋳型とプライマーセットを、Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いて、7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems社）でリアルタイムPCRを行い、各遺伝子のCt値を測定した。なお、PCR条件は５０℃で２分、９５℃で１０分の反応の後、９５℃で１５秒と６０℃で１分を４５回繰り返し、９５℃で１５秒と６０℃で１分を２回繰り返した。また、Ct値は7300 Fast SDS software（Applied Biosystems社）を用いた自動計算により測定された。【０１５６】
「活性化刺激あり」のTh17細胞のcDNAに代えて、５検体から調製した「活性化刺激あり」のTh1細胞のcDNA、５検体から調製した「活性化刺激あり」のTh2細胞のcDNA、および３検体から調製した「活性化刺激あり」のTreg細胞のcDNAをそれぞれ鋳型として用い、上記と同様にリアルタイムPCRを行い、各遺伝子のCt値を測定した。【０１５７】
（３）発現量の解析
リアルタイムPCRで得られたCt値に基づき、式（Ｉ）から各遺伝子マーカーの発現量を求めた。
（各遺伝子の発現量）＝100000×2-x  ・・・（Ｉ）
（但し、ｘ＝（各遺伝子Ct値）−（（Gapdh遺伝子Ct値＋ACTB遺伝子Ct値＋B2M遺伝子Ct値＋UBC遺伝子Ct値）／4））【０１５８】
なお、「活性化刺激なし」のTh17細胞の各遺伝子マーカーの発現量は、鋳型として用いた５つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。「活性化刺激あり」のTh17細胞の各遺伝子マーカーの発現量も、鋳型として用いた５つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。【０１５９】
同様に、「活性化刺激なし」または「活性化刺激あり」のTh1細胞およびTh2細胞の各遺伝子マーカーの発現量は、それぞれ鋳型として用いた５つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。また、「活性化刺激なし」のTreg細胞の各遺伝子マーカーの発現量は、それぞれ鋳型として用いた４つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。また、「活性化刺激あり」のTreg細胞の各遺伝子マーカーの発現量は、それぞれ鋳型として用いた３つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。【０１６０】
各遺伝子マーカーの発現量を表１３および表１４に示す。ここで、表１３は「活性化刺激なし」のTh1細胞、Th2細胞、Treg細胞およびTh17細胞における各遺伝子マーカーの発現量を示す。表１４は「活性化刺激あり」のTh1細胞、Th2細胞、Treg細胞およびTh17細胞における各遺伝子マーカーの発現量を示す。【０１６１】
「活性化刺激なし」の細胞における各遺伝子マーカーの発現量
【表１３】
0005858785.tif 000038
【０１６２】
「活性化刺激あり」の細胞における各遺伝子マーカーの発現量
【表１４】
0005858785.tif 000039
【０１６３】
Th17細胞の各遺伝子マーカーの発現量と、Th1細胞、Th2細胞およびTreg細胞の各遺伝子マーカーの発現量との比を、表１５および表１６に示す。ここで、表１５は、「活性化刺激なし」のTh17細胞における各遺伝子マーカーの発現量と、「活性化刺激なし」のTh1細胞、Th2細胞およびTreg細胞における各遺伝子マーカーの発現量との比を示す。表１６は、「活性化刺激あり」のTh17細胞における各遺伝子マーカーの発現量と、「活性化刺激あり」のTh1細胞、Th2細胞およびTreg細胞における各遺伝子マーカーの発現量との比を示す。なお、表１５および表１６における、Th17/Th1、Th17/Th2およびTh17/Tregに示される値は、以下の式により算出した。
Th17／Th1＝（Th17細胞における発現量）／（Th1細胞における発現量）
Th17／Th2＝（Th17細胞における発現量）／（Th2細胞における発現量）
Th17／Treg＝（Th17細胞における発現量）／（Treg細胞における発現量）【０１６４】
【表１５】
0005858785.tif 000040
【０１６５】
【表１６】
0005858785.tif 000041
【０１６６】
表１５から、ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、L1CAM、MCAM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IL1A、BHLHE22、PPARG、SIM1およびSNAI2の発現量は、「活性化刺激なし」のTh17細胞において、「活性化刺激なし」のTh1細胞、「活性化刺激なし」のTh2細胞および「活性化刺激なし」のTreg細胞よりも、２倍以上高いことがわかる。
また、表１６から、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOCおよびTGFBIの発現量は、「活性化刺激あり」のTh17細胞において、「活性化刺激あり」のTh1細胞、「活性化刺激あり」のTh2細胞および「活性化刺激あり」のTreg細胞よりも、２倍以上高いことがわかる。
したがって、これらの遺伝子は、Th17細胞の検出のためのポリヌクレオチドマーカーとして有用であることが示された。【０１６７】
実施例４：健常人および関節リウマチ患者のポリヌクレオチドマーカーの発現解析
１．健常人および関節リウマチ患者の末梢血からのCD4陽性細胞の単離
健常な成人（健常人）および関節リウマチ患者の末梢血を採血管NP-HE0557（ニプロ社）に採取し、抗CD4抗体を結合させた磁気ビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いて、末梢血CD4陽性細胞を単離した。なお、抗CD4抗体ビーズを用いたCD4陽性細胞の単離は、添付文書の記載に従って行った。【０１６８】
２．末梢血CD4陽性細胞のcDNAの調製
単離した末梢血CD4陽性細胞から、実施例１の「３．トータルRNAの抽出」と同様の操作により、トータルRNAを抽出した。抽出した、末梢血CD4陽性細胞のトータルRNA（0.1μg）を、poly dTプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）、ランダムプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）およびスーパースクリプトIII逆転写酵素（Invitrogen Corporation）を用いて逆転写し、末梢血CD4陽性細胞のcDNAを得た。なお、逆転写は、添付文書の記載に従って行った。【０１６９】
cDNAの取得に用いた、末梢血CD4陽性細胞の検体数を表１７に示す。【０１７０】
【表１７】
0005858785.tif 000042
【０１７１】
３．リアルタイムPCR法による遺伝子マーカーの発現解析
（１）末梢血CD4陽性細胞のcDNAを鋳型としたリアルタイムPCR
上記の「２．末梢血CD4陽性細胞のcDNAの調製」で調製した、９検体の健常人および９検体の関節リウマチ患者の末梢血CD4陽性細胞のcDNAを、それぞれ鋳型として用いた。プライマーセットは、「２．プライマーセットの設計」において設計した、ATP6V0A4、BVES、C5orf40、UPK1B、DRD2、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、BHLHE22、SIM1、CCR6、RORC 、GAPDH、ACTB、B2M、およびUBCのプライマーセットを用いた。鋳型とプライマーセットを、Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いて、7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems社）でリアルタイムPCRを行い、各遺伝子のCt値を測定した。なお、PCR条件は５０℃で２分、９５℃で１０分の反応の後、９５℃で１５秒と６０℃で１分を４５回繰り返し、９５℃で１５秒と６０℃で１分を２回繰り返した。また、Ct値は7300 Fast SDS software（Applied Biosystems社）を用いた自動計算により測定した。
（２）発現量の解析
上記の式（Ｉ）にしたがって、各遺伝子マーカーの発現量を求めた。なお、関節リウマチ患者の末梢血CD4陽性細胞の各遺伝子マーカーの発現量は、鋳型として用いた９つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。同様に、健常人の末梢血CD4陽性細胞の各遺伝子マーカーの発現量も、鋳型として用いた９つのcDNAから得られた対象の遺伝子マーカーの発現量の平均値を、その遺伝子マーカーの発現量とした。【０１７２】
健常人および関節リウマチ患者の末梢血CD4陽性細胞の各遺伝子マーカーの発現量と、健常人と関節リウマチ患者の末梢血CD4陽性細胞の各遺伝子マーカーの発現比を、表１８に示す。表１８中、「RA」は関節リウマチ患者を示し、「HC」は健常者を示す。なお、表１８における、RA群/HC群に示される値は、以下の式により算出した。
RA群／HC群＝（関節リウマチ患者の末梢血CD4陽性細胞における発現量）／（健常人の末梢血CD4陽性細胞における発現量）【０１７３】
【表１８】
0005858785.tif 000043
【０１７４】
表１８から、ATP6V0A4、BVES、C5orf40、UPK1B、DRD2、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、BHLHE22、およびSIM1の発現量は、RA群においてHC群よりも３倍以上高いことがわかる。このことから、これらの遺伝子は、関節リウマチ患者のスクリーニングのためのポリヌクレオチドマーカーとして有用であることが示された。【０１７５】
実施例５：ヒト末梢血由来培養のTh17細胞およびTh22細胞における各ポリヌクレオチドマーカーの発現量比の解析
１．ヒト末梢血からのTh17およびTh22細胞の単離
健常な成人の末梢血から得たバフィーコートをFicoll-paque plus溶液（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）に重層し、これを遠心分離することにより単核球フラクションを得た。抗CD4抗体を結合させた磁気ビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いて、上記のフラクションからCD4陽性細胞を粗精製した。
このようにして得たCD4陽性細胞を、表１９に示す蛍光標識抗体を用いて染色した後、セルソーター（FACS Aria：Becton Dickinson社）を用いて、Th17およびTh22の各細胞を分離した。なお、分離のゲーティングは、表２０に示すとおりに行った。【０１７６】
【表１９】
0005858785.tif 000044
【０１７７】
【表２０】
0005858785.tif 000045
【０１７８】
なお、上記のソーティングの操作の詳細については、Acosta-Rodriguez EV.らによる文献（Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells., Nat Immunol., vol.8, p.639-646 (2007)）およびTrifari S.らによる文献（非特許文献２）を参照されたい。【０１７９】
２．Th17およびTh22細胞の培養
上記の工程１．で単離された成人末梢血由来のTh17およびTh22細胞をそれぞれ96ウェルプレートに1.5 x 105細胞／0.3 ml／ウェルの密度で播種した。培地は、Yssel培地（IMDM、１％ヒトAB型血清、0.25％ BSA、1.8 mg/l ２-アミノメタノール、40 mg/lトランスフェリン、５mg/lインスリン、２mg/lリノール酸、２mg/lオレイン酸、２mg/lパルミチン酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を用いた。
また、上記の細胞の活性化および増殖のために、各ウェルに抗CD2／3／28抗体でコーティングした磁気ビーズ（Miltenyi Biotec社）（以下、「抗体ビーズ」ともいう）を0.75 x 105個ずつ添加した。そして、Th17およびTh22細胞のそれぞれの分化培養に適したサイトカインおよび中和抗体を添加して、細胞を37℃、５％ CO2のインキュベータ内で培養した。なお、用いたサイトカインおよび中和抗体を表２１に示す。【０１８０】
【表２１】
0005858785.tif 000046
【０１８１】
上記のサイトカインの濃度は、IL-6を50 ng/mlとし、IL-6以外を10 ng/mlとした。また、上記の抗体の濃度は、抗IFN-γ抗体を10μg/mlとし、抗IL-4抗体および抗TGF-β抗体を2.5μg/mlとした。【０１８２】
なお、サイトカインおよび中和抗体は、それぞれR&D systems社およびeBioscience社から入手した。【０１８３】
培養開始から３日後、上記のサイトカインおよび抗体を含んだ培地で細胞を３倍に希釈し、さらに７日間（合計10日間）培養した。【０１８４】
培養開始から10日後、得られたTh17およびTh22細胞をそれぞれ二等分し、一方の各細胞を、Yssel培地およびPBSで洗浄した後、細胞を遠心分離により回収し、次のRNA抽出工程まで−80℃にて凍結保存した。これらをそれぞれ「活性化刺激なし」のTh17およびTh22細胞とした。また、他方の各細胞に上記の抗体ビーズを添加し、さらに３時間培養することにより再度活性化した後、細胞を遠心分離により回収し、同様に−80℃にて凍結保存した。これらをそれぞれ「活性化刺激あり」のTh17およびTh22細胞とした。【０１８５】
３．トータルRNAの抽出
上記の工程２．で得た各細胞からトータルRNAを抽出するために、それぞれRNeasy PlusMiniキットおよびRNeasy microキット（QIAGEN社）を用いた。なお、具体的な操作は、各キットの添付文書の記載に従って行った。【０１８６】
４．マイクロアレイ発現解析
Two-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix社）を用いて、上記の工程３．で抽出した各細胞のトータルRNA（10〜100 ng）をcDNAに逆転写し、さらにビオチン化cRNAへの転写反応を行った。次いで、増幅したビオチン化cRNA（20μg）を断片化した。なお、具体的な操作は、キットに添付の説明書の記載に従って行った。【０１８７】
上記で得られた各細胞由来のビオチン化cRNA（15μg）を検体として、それぞれGeneChip Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array（Affymetrix社）に添加し、GeneChip Hybridization Oven 640（Affymetrix社）に移して、45℃、60 rpmの条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行った。【０１８８】
ハイブリダイゼーション終了後、上記のマイクロアレイをGeneChip Fluidic Station450（Affymetrix社）を用いて洗浄および蛍光標識を行い、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix社）を用いてスキャンし、蛍光強度データを取得した。【０１８９】
得られた蛍光強度のデータを、発現解析ソフトウェアGeneSpring GX Ver.11（Agilent Technologies社）を用いて、MAS5アルゴリズムにより標準化して、各細胞における遺伝子についての相対蛍光強度を得た。この相対蛍光強度は、細胞における遺伝子の発現量に相当する。【０１９０】
実施例１で得られたTh17細胞における各ポリヌクレオチドマーカーに対応する遺伝子の相対蛍光強度を、Th22細胞のものと比較した結果を表２２および表２３に示す。表２２は、「活性化刺激なし」のTh17およびTh22細胞における、各ポリヌクレオチドマーカーの発現量比を示す。表２３は、「活性化刺激あり」のTh17およびTh22細胞における、各ポリヌクレオチドマーカーの発現量比を示す。表中、「Th17／Th22」は、Th17細胞におけるポリヌクレオチドマーカーに対応する遺伝子の相対蛍光強度を、Th22細胞におけるポリヌクレオチドマーカーに対応する遺伝子の相対蛍光強度で除した値を示す。【０１９１】
【表２２】
0005858785.tif 000047
【０１９２】
【表２３】
0005858785.tif 000048
【０１９３】
表２２および表２３から明らかなように、実施例１で得られたTh17細胞における各ポリヌクレオチドマーカーは、Th17細胞においてTh22細胞よりも３倍以上発現していることがわかる。このことから、表２２および表２３に示される各ポリヌクレオチドマーカーは、Th17細胞の検出に有用であることが示された。【０１９４】
本出願は、２００９年７月２９日に出願された日本国特許出願特願２００９−１７６７５５号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
0005858785.tif 000049
【図２】
0005858785.tif 000050
【図３】
0005858785.tif 000051
【図４】
0005858785.tif 000052
【図５】
0005858785.tif 000053
【図６】
0005858785.tif 000054
【図７】
0005858785.tif 000055
【図８】
0005858785.tif 000056
【図９】
0005858785.tif 000057
【配列表】
0005858785000001.app