(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含むヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus、ＨＰＶ） Ｌ１タンパク質の精製方法：
（i）ＨＰＶのＬ１タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を培養した後、培養された宿主細胞を回収して破砕する段階；
（ii）上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加する段階；
（iii）上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物を過熱した後冷却する段階；
及び
（iv）上記の加熱及び冷却された宿主細胞の破砕物からクロマトグラフィーを行ってＨＰＶ Ｌ１タンパク質を精製する段階。
【請求項２】
上記のＨＰＶはＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３０、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ４１、ＨＰＶタイプ４２、ＨＰＶタイプ４３、ＨＰＶタイプ４４、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５４、ＨＰＶタイプ５５、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８、ＨＰＶタイプ６８及びＨＰＶタイプ７０からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項３】
上記の宿主細胞はバクテリア、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項４】
上記の酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）であることを特徴とする、請求項３に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項５】
上記の還元剤はβ−メルカプトエタノール（β−mercaptoethanol）、ＤＴＴ（dithiothreitol）、２-メルカプトエチルアミン塩酸塩（２-mercaptoethylamine-HCl ）、ＴＣＥＰ［tris（２-carboxyethyl）phophine］、システイン−ＨＣＩ（cystein−HCI）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項６】
上記の還元剤はβ−メルカプトエタノール（β−mercaptoethanol）またはＤＴＴ（dithiothreitol）であることを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項７】
上記のβ−メルカプトエタノール（β−mercaptoethanol）は宿主細胞の破砕物での最終濃度が０．１重量％以上になるよう添加することを特徴とする、請求項６に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項８】
上記のＤＴＴ（dithiothreitol）は宿主細胞の破砕物での最終濃度が２ｍＭ以上になるよう添加することを特徴とする、請求項６に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項９】
上記の段階（iii）での加熱は常温（ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）超過の温度で過熱することを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項１０】
上記の段階（iii）での常温超過の温度は２５℃超過の温度であることを特徴とする、請求項９に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項１１】
上記の段階（iii）での常温超過の温度は２５℃超過８０℃以下の温度であることを特徴とする、請求項１０に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項１２】
上記の段階（iii）での加熱は１０分−７２時間の間で行うことを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項１３】
上記の段階（iii）での冷却は０℃−１０℃の温度で冷却させることを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【請求項１４】
上記のクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー及び親和クロマトグラフィー（affinity chromatography）であることを特徴とする、請求項１に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は構造特性及び免疫特性が優秀なヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus、ＨＰＶ）のウイルス様粒子（Virus-Like Particles、ＶＬＰｓ）を高効率で精製できる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は子宮頸がんの発病原因のほぼ１００％を占める病因体である（参考文献１）。全世界的に毎年５００，０００名の女性が子宮頸がんと診断されて、２５０，０００名の女性が子宮頸がんで死亡すると知られている（参考文献２）。子宮頸がんを起こす高危険群ヒトパピローマウイルスのタイプ（type）には１６型、１８型、４５型、３１型、３３型、５２型、５８型、３５型、５９型などがあり、低危険群タイプには６型及び１１型などが知られている（参考文献３、４）。この中で、ヒトパピローマウイルスタイプ１６型と１８型が全体子宮頸がんの原因の７割を占めていて、子宮頸がんの予防に最も重要なタイプと認識されている（参考文献５）。子宮頸がんの発病の原因になるヒトパピローマウイルスのタイプは地域によりその種類が非常に異なる（参考文献５）。アフリカ、ヨーロッパ、北アメリカ及び中南米地域ではヒトパピローマウイルス１６型、１８型、３１型、４５型による感染が主な子宮頸がんの発病原因になる（参考文献５）。
【０００３】
ヒトパピローマウイルスのカプシドはメジャー抗原であるＬ１タンパク質とマイナー抗原であるＬ２タンパク質で構成されている（参考文献６）。この中でＬ１タンパク質はセルフアッセンブリー（self-assembly）されて、ウイルス様粒子（virus-like particles、ＶＬＰｓ）を構成する性質を持っていて、子宮頸がんの予防ワクチンの抗原及び診断用の抗原で使用されている（参考文献６、２７）。組み換えＬ１タンパク質は大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus casei）、Ｓｆ（Spodoptera frugiperda）細胞及び植物細胞などを発現細胞にして生産された（参考文献７−１２、２８）。現在、市販されている子宮頸がんの予防ワクチンにはGardasilTM（Merck）とCervarixTM（GlaxosmithKline、GSK）がある。GardasilTMはヒトパピローマウイルスのタイプ１６型、１８型、６型、１１型に対するＬ１ウイルス様粒子を抗原として含めており、CervarixTMはヒトパピローマウイルスタイプ１６型、１８型に対するＬ１ウイルス様粒子を抗原として含めている（参考文献１３）。GardasilTMはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を抗原発現細胞で使っていて、CervarixTMは昆虫細胞であるＳｆ（Spodoptera frugiperda）細胞を抗原発現細胞で使っている（参考文献１３、１４）。二つのワクチンは筋肉注射を通じて接種して、１回接種の際に１２０ドル、３回接種すると３６０ドルの費用が所要されて非常に高価である（参考文献１５）。現在の市販中である子宮頸がんの予防ワクチンの高い接種価は子宮頸がんが主に発生する地域である発展途上国までに広く用いられるのに多くの限界を有している（参考文献１６）。したがって、低費用高効率の子宮頸がんワクチンの開発は相変わらず重要な課題として残っている。
【０００４】
組み換えタンパク質を用いた医薬品の場合、ダウンストリームプロセシング（downstream processing）に掛かる費用は生産費用の全体の８割を占めるほどその比重が高い（参考文献１７）。子宮頸がんの予防ワクチンの抗原生産のためには、ダウンストリームプロセシング（downstream processing）で様々な段階の精製過程を通じてターゲット抗原の純度を順次に上げる方法が用いられてきた（参考文献１８）。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から生産されたウイルス様粒子の場合ターゲットタンパク質の純度を増加させるために超遠心分離法（ultra-centrifugation）を利用したスクロースクッション（sucrose cushion）またはサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）が主に使用されてきた。Hofmannなどはウイルス様粒子の精製のために超遠心分離法を利用したスクロースクッション、陰イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムの沈澱及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いた（参考文献１９）。Kimなどは超遠心分離法を利用したスクロースクッション、サイズ排除クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを順次的に使用してウイルス様粒子を精製した（参考文献７）。Parkなどは硫酸アンモニウムの沈澱、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーを順次的に用いる精製方法を使用した事がある（参考文献２０）。これらの方法を通じて高純度のウイルス様粒子を得ることはできるが、精製単位を増加させるのに限界を持っており、大量生産に適用するのに適していないという短所を有している。
【０００５】
サッカロマイセス・セレビシエから生産されたヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の大量精製のために次のような方法が使用された。Cookなどはクロスフロー精密ろ過（cross-flow microfiltration）、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを順次的に使用する方法を用いた（参考文献２１）。Kimなどは硫酸アンモニウム沈澱と沈澱された汚染物の除去過程を通じて不純物タンパク質を除去した後、ヘパリンクロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを通じてウイルス様粒子を精製する方法を試用した（参考文献２２）。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から生産されたヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質は全体細胞破砕液タンパク質の１％以下と知られており回収が容易ではない（参考文献２０）。組み換えタンパク質の製造方法を通じて生産されたヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子を高純度で精製するためには様々な段階の沈澱及びクロマトグラフィーを経なければならず、繰り返した透析（dialysis）過程も必要である。またヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子は簡単に壊れる性質を持っており、優秀な構造で組み立てられたウイルス様粒子を得ることは非常に重要なものと認識されている（参考文献３１）。研究者らは酵母（yeast）発現システムと同じ宿主細胞の破砕物内の不純物を効果的に除去するための工程開発に多くの努力をして来たが、ウイルス様粒子を高効率で精製するための技術はいまだに明確な進展をみせていない。
【０００６】
本明細書の全体にわたって複数の論文及び特許文献が参考にされ、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体で本明細書に参考として取り込まれ、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らはヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus、ＨＰＶ）のＬ１タンパク質を発現する宿主細胞から生産されたＨＰＶ Ｌ１タンパク質を高純度及び高効率で精製するめの新しい方法を開発しようと努力した。その結果、ＨＰＶのＬ１タンパク質を発現させた宿主際病の破砕物に還元剤を処理したり、または還元剤を処理した後、加熱及び冷却（heating and chilling）過程を経ることでクロマトグラフィーを通じて精製すると、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質の純度が驚くほど向上されるだけでなく、Ｌ１タンパク質から組み立てられるウイルス様粒子（Virus like particle、ＶＬＰ）の構造特性及び免疫特性が非常に優秀になるという事実を実験的に確認して本発明の完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を高純度及び高効率で精製する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の目的及び長所は下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によって、より明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様によれば、本発明は次の段階を含むヒトパピローマウイルス（Human  Papillomavirus、ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の精製方法を提供する：（ａ）ＨＰＶのＬ１タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を培養した後、培養された宿主細胞を回収して破砕する段階；（ｂ）上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加する段階；及び（ｃ）上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物からクロマトグラフィーを行ってＨＰＶ Ｌ１タンパク質を精製する段階。
【００１１】
本発明の他の一態様によれば、本発明は次の段階を含むヒトパピローマウイルス（Human  Papillomavirus、ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の精製方法を提供する：（i）ＨＰＶのＬ１タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を培養した後、培養された宿主細胞を回収して破砕する段階；（ii）上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加する段階；（iii）上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物を加熱した後冷却させる段階；及び（iv）上記の加熱及び冷却された宿主細胞の破砕物からクロマトグラフィーを行ってＨＰＶ Ｌ１タンパク質を精製する段階。
【００１２】
本発明者らはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＬ１タンパク質を発現するように製作された宿主細胞から生産されたＨＰＶ Ｌ１タンパク質を高純度及び高効率で精製するための新しい方法を開発しようと努力した結果、培養した上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を処理したり、または還元剤を処理した後加熱及び冷却（heating and chilling）過程を経ることでクロマトグラフィーを通じて精製すると、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質の純度が驚くほど向上されるだけでなく、Ｌ１タンパク質から組み立てられるウイルス様粒子（Virus like particle、ＶＬＰ）の構造特性及び免疫特性が優秀になるという事実を実験的に確認して本発明を完成した。
【００１３】
以下、各段階により本発明を詳細に説明する。
【００１４】
（ｉ）ＨＰＶのＬ１タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を培養した後、培養された宿主細胞を回収して破砕する段階
本発明の明細書で用語「ＨＰＶ Ｌ１タンパク質」はＨＰＶのＬ１遺伝子から発現されるものでＨＰＶのカプシド（capsid）を構成するメジャー（major）タンパク質を意味する。Ｌ１タンパク質はカプシドを構成する別のマイナー（minor）タンパク質であるＬ２タンパク質と共にまたはＬ１タンパク質単独で、適切な条件の下でウイルス様粒子（Virus-Like Particle、ＶＬＰ）でセルフアッセンブリー（self-assemble）される特性を有する。
【００１５】
パピローマウイルス（Papillomavirus）は最大８個の初期（early、E）及び２個の後期（late、L）遺伝子を有していて、そのサイズは５０〜６０nmであり、エンベロープがなく、正二十面体（icosahedral）のDNAゲノムウイルスである。遺伝子Eで「E」は初期（early）を意味して、遺伝子Lで「L」は後期（late）を意味する。E遺伝子はウイルス複製及び形質転換（transformation）の機能に関連された遺伝子である。Ｌ１及びＬ２遺伝子はウイルスカプシドタンパク質をエンコーディングする。Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、５５−６０ｋＤａの分子量を有する。Ｌ２タンパク質は５５−６０ｋＤａの予測分子量及び７５−１００ｋＤａのＰＡＧＥにより測定されるみかけの分子量を有するマイナー（minor）カプシドタンパク質である。
【００１６】
本発明の方法でＬ１タンパク質が由来されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタイプ（type）は特に限定されなく、望ましくは ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３０、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ４１、ＨＰＶタイプ４２、ＨＰＶタイプ４３、ＨＰＶタイプ４４、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５４、ＨＰＶタイプ５５、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８、ＨＰＶタイプ６８及びＨＰＶタイプ７０からなる群より選択されて、より望ましくは本発明のＬ１タンパク質はＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ４５及びＨＰＶタイプ５８からなる群より選択されるＨＰＶから由来されたものであり、最も望ましくはＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、またはＨＰＶタイプ５８から由来する。
【００１７】
本発明で、宿主細胞（host cell）に利用される細胞はバクテリア、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞である。
【００１８】
本発明の望ましい実施例によれば、上記の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・エスピ（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）、またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）である。
【００１９】
本発明でＨＰＶ Ｌ１タンパク質を発現する形質転換宿主細胞（transformed host cell）はＨＰＶ Ｌ１タンパク質を性向的に発現させる発現ベクトルに形質転換された宿主細胞を意味する。上記の発現ベクトルは当業界で公知された転写（transcription）または翻訳（translation）調節要素、他のマーカー遺伝子（marker gene）を含むことができる。本発明のＨＰＶ Ｌ１タンパク質を発現する形質転換宿主細胞は当業界に公知された方法を用いて容易に製造することができる。
【００２０】
（ii）上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加する段階
本発明の明細書での用語「還元剤（reducing agent）」は還元−酸化反応（reduction-oxidation  reaction）で電子を他の種（species）に供与する元素または化合物を意味して、望ましくはペプチドまたはタンパク質でのジスルフィド結合（disulfide bond）の還元または遊離スルフヒドリル基（free sulfhydryl group）の安定化のために用いられる化合物を意味する。
【００２１】
本発明で還元剤は例えばβ−メルカプトエタノール（β−mercaptoethanol）、ＤＴＴ（dithiothreitol）、２-メルカプトエチルアミン塩酸塩（２-mercaptoethylamine-HCl ）、ＴＣＥＰ［tris（２-carboxyethyl）phophine］、システイン−ＨＣＩ（cystein−HCI）からなる群より選択されて、より望ましくはβ−メルカプトエタノールまたはＤＴＴである。
【００２２】
本発明で細胞破砕物内での還元剤の最終濃度は０．１重量％以上、望ましくは０．１−２０重量％、より望ましくは０．１−１０重量％、よりさらに望ましくは１−８重量％、よりさらに望ましくは３−７重量％、最も望ましくは４−６重量％である。
【００２３】
本発明で還元剤を細胞の破砕物に添加した後、反応させる時間は特定の時間範囲で限定されなく、当業者が本発明の方法に適合する反応時間を選択して使用することができる。
【００２４】
（iii）上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物を加熱した後冷却させる段階
本発明で上記の細胞の破砕物に還元剤を添加した後、加熱及び冷却（heating  and  chilling）条件を経る。下記の具体的な一実施例で実験結果として立証されるように、還元剤を添加した細胞の破砕物を加熱及び冷却処理を行えば、形質転換宿主細胞の破砕物の中の不純物の除去効率が大きく増大されるだけでなく、L１タンパク質から組み立てられるVLPが望ましい構造及び免疫特性を有するようになる。
【００２５】
本発明で細胞の破砕物の加熱温度は常温（room  temperature）超過の温度を意味して、望ましくは２５℃超過の温度であり、より望ましくは２５℃超過８０℃以下の温度であり、よりさらに望ましくは３０−６５℃の温度であり、よりさらに望ましくは３５−６５℃であり、最も望ましくは３５−６０℃であって、最適な加熱条件は３５−５５℃の温度である。
【００２６】
本発明で細胞の破砕物の加熱時間は、加熱温度に応じて異なる場合があり、例えば１０分−７２時間の範囲で適合に選択できるが、これに限定されない。望ましくは３０分−72時間の範囲であり, より望ましくは３０分−４８時間の範囲であり、よりさらに望ましくは３０分−２４時間の範囲であって、最も望ましくは３０分−１２時間の範囲である。
本発明で上記の冷却の温度は細胞の破砕物の試料が凍らないほどの温度を意味して、このような冷却温度では０−１０℃の温度であり、望ましくは０℃超過８℃未満の温度であり、より望ましくは０℃超過７℃未満、よりさらに望ましくは０℃超過６℃未満、最も望ましくは０℃超過５℃未満の温度で冷却させる。冷却させる時間は本発明の方法に合うように適合した冷却時間を選択して使用することができる。
【００２７】
一方、実施例によっては、上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物を加熱及び冷却することなく、常温で維持させることもできる。
【００２８】
本発明の明細書で用語「常温」は加熱したり冷却していないそのままの温度として、１５℃以上２５℃以下の温度を示す。
【００２９】
（iv）上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物、または上記の加熱及び冷却された宿主細胞の破砕物からクロマトグラフィーを行ってＨＰＶ Ｌ１タンパク質を精製する段階
還元剤が添加された宿主細胞の破砕物に対してクロマトグラフィー精製方法を行ったり、または上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加して加熱及び冷却させた後クロマトグラフィー精製方法を行ってＨＰＶ Ｌ１タンパク質を精製する。
【００３０】
本発明で使用できるクロマトグラフィーは当業界で公知去れたもので合って、これに制限されるものではないが、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーのようなイオン交換クロマトグラフィー（ion exchange  chromatography）、サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion  chromatography）、疎水性結合クロマトグラフィー（hydrophobic  interaction  chromatography）、親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）が使用できる。本発明で分離及び精製しようとする物質がタンパク質であるのでタンパク質またはペプチドの分離に最も適合するイオン交換クロマトグラフィーが望ましい。下記の本発明の具体的な一実施例では陽イオン交換クロマトグラフィーの一種であるヘパリン樹脂クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてＨＰＶ Ｌ１タンパク質を成功的に分離及び精製した。
【００３１】
本発明の特徴及び利点を要約すれば次のようである：
ｉ）本発明はヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus、ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を高純度及び高効率に精製する方法を提供する。
ii）本発明の精製方法はＨＰＶのＬ１タンパク質が発現される形質転換宿主細胞の細胞の破砕物に還元剤を添加した後、または還元剤を添加して加熱及び冷却（heating and chilling）処理を追加的に行った後、クロマトグラフィーを通じてＬ１タンパク質を精製することに特徴がある。
iii）本発明の精製方法によれば、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製純度を大きく向上させることができる。
iv）本発明の精製方法によって、精製されたＨＰＶ Ｌ１タンパク質のＶＬＰは良質の構造を形成して免疫原性が非常に優れている。
【発明の効果】
【００３２】
本発明はヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus、ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を高純度及び高効率で精製する方法に関するものである。本発明の精製方法によれば、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質の精製純度を大きく向上させることだけでなく、精製されたＨＰＶ Ｌ１タンパク質のＶＬＰは本来のＨＰＶビリオンにより類似する構造を形成することによって免疫原性が非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子を精製するための先行文献の方法（以下「Ｔ−１」方法と記載する）と本発明の方法（以下「Ｔ−５」方法と記載する）の過程を示す。Ｔ−１方法に関する先行文献は以下のようである。（先行文献１） Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.（先行文献２） Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.（先行文献３）登録特許、 子宮頸がんワクチン、出願番号：10-2011-0137242（2011.12.19）、登録番号：1011780560000（2012.08.21）（先行文献４）登録特許、 子宮頸がんワクチン、出願番号（出願日）：10-2009-0099982（2009.10.30）、登録番号（登録日）：1011819070000（2012.09.05）  Ｔ−５方法のためにＨＰＶ Ｌ１タンパク質を発現させた宿主細胞であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を破砕した後、還元剤を添加した。還元剤を処理した後、加熱及び冷却（heating and chilling）過程を経るようにして不純物を除去した。上記の不純物を除去した後、細胞の破砕液に含まれたＬ１タンパク質はヘパリンクロマトグラフィー（heparin chromatography）を通じて１次精製した。１次精製されたＬ１タンパク質は２次ヘパリンクロマトグラフィーを追加的に行って高純度に精製した。  Ｔ−１方法のために上記のサッカロマイセス・セレビシエ破砕物の内のＬ１タンパク質は硫酸アンモニウムの沈澱（ammonium sulfate precipitation）を通じて回収された。回収された分画内の不純物は沈澱物の除去過程（removal of precipitated contaminants）を通じて除去された。これらの過程を経た破砕物の内のＬ１タンパク質はヘパリンクロマトグラフィーを通じて精製された。
【図２】図２はＴ−５方法による精製結果に関するものであり、Ｌ１タンパク質の発現宿主細胞の破砕物に対して透析を行って、還元剤を処理した後、加熱及び冷却過程を経て、１次ヘパリンクロマトグラフィーを行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。１次ヘパリンクロマトグラフィーを行った後に、高純度のＨＰＶ Ｌ１タンパク質が回収されたことを見せる。ＬＳはヘパリン樹脂にローディングされた破砕液（loading sample）を示して、ＦＴはヘパリン樹脂に結合されなくで流れ出た分画（flow-through）を示す。Ｗはヘパリン樹脂を洗浄する段階で流れ出た分画（wash）であり、Ｅは１Ｍ ＮａＣｌが含まれた緩衝液でＨＰＶ Ｌ１タンパク質を溶出させた分画（elution）を意味する。
【図３】図３はＴ−５方法による精製結果に関するものであり、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質発現宿主細胞の破砕物に対して透析を行わなく、細胞の破砕物に対して直接に還元剤を処理した後、加熱及び冷却過程を経て、１次ヘパリンクロマトグラフィーを行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。図２での結果と同じように、１次ヘパリンクロマトグラフィーを行った後に、同じく高純度のＨＰＶ Ｌ１タンパク質が回収された。ＬＳ、ＦＴ、Ｗ及びＥは図２で説明されたものと同じである。
【図４ａ】図４aはＴ−５方法による精製結果に関するものであり、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質の発現宿主細胞の破砕物に還元剤を処理した後、加熱及び冷却過程を経て、１次ヘパリンクロマトグラフィーを行って、２次ヘパリンクロマトグラフィーを行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。ＬＳとＦＴは図２で説明されたものと同じである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真の上部に表記された３から１８までの数字はＮａＣｌによる傾斜勾配（linear gradient）溶出の際に回収されたそれぞれの分画の数字を意味する。
【図４ｂ】図４ｂは上記の２次ヘパリンクロマトグラフィーのプロファイル（profile）を見せる。図４ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥのＦＴ（flow-through）でのタンパク質バンドが検出されていないが、図４ｂでのＦＴ（flow-through）で多量の不純物が流れ出ることが確認された。したがって、図４ｂの結果は２次ヘパリンクロマトグラフィーを通じて相当量の不純物が除去されたことを見せる。
【図５】図５のＴ−１方法のヘパリンクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。ヘパリンクロマトグラフィーの全サンプルの処理は図１に示したように進められた。ＬＳはloading sampleを意味する。ヘパリン樹脂に結合したタンパク質はＮａＣｌの傾斜勾配（linear gradient）増加による方法で溶出された。傾斜勾配の溶出は０．３２５ Ｍ ＮａＣｌから２ Ｍ ＮａＣｌまで進められた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の上段の数字は溶出分画の数字を意味する。分画１１−１４でＬ１タンパク質が高純度で溶出されることを見せる。
【図６ａ】図６ａは従来の方法（以下「Ｔ−１」方法と記載する）と本発明のＴ−５方法で精製されたＶＬＰの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて比較した結果である。「Ｔ−１  ＨＰＶ １６ ＶＬＰ」は従来に公知された方法[Kim et al. (2010) Protein Expr Purif 70: 68-74;  Kim et al. (2009) Arch Pharm Res 32: 1759-1766]を用いて精製された結果であって、「Ｔ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰ」は本発明の方法により精製された結果である。ＨＰＶ Ｌ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためにタンパク質の定量を実施した後、ウェル当たり５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、６２ｎｇのタンパク質をローディングした。独立的に２回反復実験したし、それぞれをパネルＡとＢで提示した。２回実験の結果すべてＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１タンパク質バンドの強度がＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのものよりもはるかに高かった。
【図６ｂ】図６ｂは図６ａの２回実験で確認されたＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１タンパク質バンドの強度をグラフで表示した結果である。結果は平均±標準偏差で表わしていて、ウェル当たり５００ｎｇがローディングされたＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１タンパク質バンドの強度を１００％として計算した。この結果はＴ−５方法で精製されたＶＬＰの純度がＴ−１方法で精製されたＶＬＰの純度よりはるかに優秀であることを示す。
【図７】図７はＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１タンパク質バンドの強度がＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１タンパク質バンドの強度と同一に表わすようにローディングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを進めた結果である。
【図８】図８はＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰの電子顕微鏡分析の結果を示す。Ｔ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰは２０−５０ｎｍのサイズであると確認されて、一方、Ｔ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰは４０−６５ｎｍのサイズであると確認された。これはＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬｐのサイズが本来のＨＰＶが有するサイズ（５０−６０ｎｍ）により近いことを意味する[２９、３０]。
【図９−１０】図９及び図１０は動的光散乱法（dynamic light scattering、ＤＬＳ）分析の結果である。動的光散乱分析はＶＬＰが溶液に存在する際のサイズを測定する。ＶＬＰの溶液内のサイズ分布はＤＬＳ−７００（図９）とＥＬＳ−Ｚ２（図１０）システムを使用して分析した。図９と図１０の結果から見られるように二つのＶＬＰ粒子サイズ別の分布は異なることと示された。この結果はＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰの物理的な特性がＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰと相違することを示す。
【図１１】図１１はＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する単クローン抗体の反応性を示す。抗-ＨＰＶ １６ Ｌ１単クローン抗体反応性の調査のため、既に公知された単クローン抗体であるＨ１６．Ｖ５とＨ１６．Ｅ７０を使用した。二つの抗体に対するＶＬＰの反応性の増加は免疫原性の増加と密接な連関があるものと知られている[２６、３２−３４]。Ｔ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＨ１６．Ｖ５とＨ１６．Ｅ７０抗体に対する反応性はＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬｐの二つの抗体に対する反応性よりはるかに高いことが確認された。
【図１２】図１２はＴ−１ ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの免疫原性を分析した結果である。免疫原性の比較のために各１ｎｇのＶＬＰは２００μｇのaluminium hydroxideと一緒にマウスに皮下で投与された。免疫は２週間隔で４回実施した。３次と４次免疫の１０日後、血清から抗-ＨＰＶ １６  Ｌ１ ＩｇＧ抗体価を測定した。抗-ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＩｇＧ抗体価の測定結果Ｔ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰがＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰより１０倍以上高い水準で抗-ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＩｇＧを誘導することを確認した。
【図１３】図１３は図１２で実施された免疫で４次免疫の後、採決された血清の抗-ＨＰＶ １６中和抗体の活性を測定した結果を示す。Ｔ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰで免疫されたマウス血清の中和活性は７８％である一方、Ｔ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰで免疫したマウス血清の中和活性は３３％で現れた。
【図１４】図１４は細胞破砕液に何も処理しない条件（non-treatment）、還元剤を処理した条件（β−ＭＥ）、還元剤の処理した後、加熱及び冷却過程を経た条件（β−ＭＥ＋heating and chilling）で精製したＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の純度を比較した結果である。上記のそれぞれの条件を経た試料を１次ヘパリンクロマトグラフィーを行って溶出させて、溶出された分画から同一な体積（5、2.5、1.2μＬ）のタンパク質を取って、ゲルにローディングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング（western blotting）を行った。図１４の結果から還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を経た条件（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating and chilling）のＨＰＶ Ｌ１タンパク質の純度が他の条件に比べてはるかに高いことが確認できた。
【図１５】図１５は細胞破砕液に何も処理しない条件（non-treatment）、還元剤を処理した条件（β−ＭＥ）、還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を経た条件（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating and chilling）で精製したＨＰＶ Ｌ１タンパク質の純度を比較した結果である。上記のそれぞれの条件を経た試料を１次ヘパリンクロマトグラフィーを行って溶出させて、溶出された分画から同一の量のタンパク質（1、0.5、0.25μｇ）を取ってゲルにローディングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング（western blotting）を行った。図１５の結果から還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を経た条件（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating and chilling）のＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の純度が他の条件と比べてはるかに高いことが確認できた。
【図１６】図１６は細胞破砕液に何も処理しない条件（non-treatment）、還元剤を処理しないで、加熱及び冷却過程だけと経た条件（heating and chilling）、還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を経た条件（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating and chilling）で精製したＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の純度を比較した結果である。上記のそれぞれの条件を経た試料を１次ヘパリンクロマトグラフィーで溶出された分画から同一な体積のタンパク質（5、2.5、1.2μＬ）を取って、ゲルにローディングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング（western blotting）を行った。図１６の結果から還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を経た条件（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating and chilling）のＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の回収率及び純度が他の条件と比べてはるかに高いことが確認できた。
【図１７】図１７はサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography SEC）による精製方法、硫酸アンモニウムの沈澱による精製方法（ammonium sulfate precipitation）、還元剤の処理後加熱・冷却する方法（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating ＆ chilling）による精製方法の過程を示す。サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムの沈澱方法の効果を還元剤の処理後、加熱・冷却する方法の効果と比べるためにＴ−５精製方法の中で還元剤の処理後、加熱・冷却する段階をサイズ排除クロマトグラフィーまたは硫酸アンモニウムの沈澱方法に置換した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び硫酸アンモニウムの沈澱による方法（Ｔ−１方法基盤の方法）は従来に公知された先行文献の方法に基盤する。１）サイズ排除クロマトグラフィー方法の先行文献（先行文献１）Park MA, Kim HJ, Kim H-J (2008) Optimum conditions for production and purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181.（先行文献２）登録特許、ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の生産及び精製方法、出願番号：10-2008-0026586（2008.03.21）、登録番号：1009591450000（2010.05.13）２）硫酸アンモニウムクロマトグラフィー方法の先行文献（先行文献１）Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.（先行文献２）Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.（先行文献３）登録特許、子宮頸がんワクチン、出願番号：102011-0137242（2011.12.19）、登録番号：1011780560000（2012.08.21）（先行文献４）登録特許、子宮頸がんワクチン、出願番号：102009-0099982（2009.10.20）、登録番号：1011819070000（2012.09.05）
【図１８】図１８は硫酸アンモニウム沈澱方法、還元剤のみに処理した方法（β−ＭＥ）、還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating & chilling）の間の差を示す。それぞれの精製の条件別１次クロマトグラフィーの溶出分画の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングで分析した。その結果β−ＭＥの処理後、加熱・冷却する方法から回収されたＬ１タンパク質の純度が最も優秀であることを確認した。
【図１９】図１９は硫酸アンモニウム沈澱（ammonium sulfate precipitation）による精製方法と還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating & chilling）の１次ヘパリンクロマトグラフィーの結果を示している。図１８の結果と同じく還元剤の処理後、加熱・冷却する方法の場合、１次ヘパリンクロマトグラフィーで溶出されたＬ１タンパク質が高い純度を表して、一方硫酸アンモニウム沈澱の後、１次ヘパリンクロマトグラフィーを行った場合、溶出されたＬ１タンパク質の分画に複数の不純物タンパク質を含めていることを確認することができた。ウェスタンブロッティングの分析結果、硫酸アンモニウム沈澱法で精製した場合、ヘパリンクロマトグラフィーでＬ１タンパク質が樹脂カラムに付着されなくＦＴ（flow−through）で流れ出た一方、還元剤の処理した後加熱・冷却過程を経た場合、ＦＴからＬ１タンパク質が流れ出ていないことが確認された。
【図２０】図２０はサイズ排除クロマトグラフィーを通じた精製方法（ＳＥＣ方法）でサイズ排除クロマトグラフィーの溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングで確認した結果である。分画３回から９回の間にＬ１タンパク質が高い純度で溶出されて、この区間の分画を集めて比較分析に使用した。
【図２１】図２１はサイズ排除クロマトグラフィー方法（ＳＥＣ）、硫酸アンモニウム沈澱による方法（ammonium sulfate precipitation）と還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法（Ｔ−５、β−ＭＥ＋heating & chilling）の１次クロマトグラフィーのＬ１タンパク質の溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングで分析した結果である。１次クロマトグラフィー（1st chromatography）のためのそれぞれの条件のサンプルは図１７に示したように用意された。サイズ排除クロマトグラフィー方法（SEC）のために細胞破砕液は硫酸アンモニウム沈澱を経てサイズ排除クロマトグラフィー（１次クロマトグラフィー）を行った。硫酸アンモニウム沈澱法による方法（ammonium sulfate precipitation）のために細胞破砕物は硫酸アンモニウム沈澱された後、沈殿物の除去過程を経てヘパリンクロマトグラフィーを経た。還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法のために細胞破砕物は還元剤の処理後、加熱冷却過程を経て、ヘパリンクロマトグラフィー（１次クロマトグラフィー）を経た。１次クロマトグラフィーの溶出分分画析のためにそれぞれの条件の分画を同一体積（0.35、0.17、0.08μL）にしてローディングした。分析結果、還元剤の処理後、加熱・冷却する方法のＬ１タンパク質の純度が最も優秀であることが分かった。
【図２２】図２２は図２１の１次クロマトグラフィーＬ１タンパク質の溶出分画を２次クロマトグラフィーで追加精製した結果である。２次クロマトグラフィーの後、Ｌ１タンパク質の溶出分画の間の差をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングで分析した結果である。分析のためにそれぞれの精製条件の溶出分画を同一の体積（2、1、0.5μＬ）でローディングした。分析結果、還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法がＬ１タンパク質の回収率の面で最も優秀であることが分かった。
【図２３】図２３は図２２で最終に精製されたＬ１タンパク質の単クローン抗体（H16.E70）反応性をenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）で分析した結果である。それぞれの精製条件から回収されたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰを同一な量でコーティングするためにサイズ排除クロマトグラフィーによる精製方法（SEC）、硫酸アンモニウム沈澱による精製方法（ammonium sulfate precipitation）、還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法（β−ＭＥ ＋ heating & chilling）から得られたＬ１タンパク質の量を確認した（図２３Ａ）。以後、ELISAを行ってH16.E70に対するそれぞれのＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの反応性を確認した（図２３Ｂ）。その結果、還元剤の処理後、加熱・冷却する条件によって精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ（Ｔ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ）のH16.E70に対する反応性が最も優秀であることが分かった。これは還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法を通じて得られたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの構造的な特性が最も優秀であることを示す（参考文献２６）。
【図２４】図２４はサイズ排除クロマトグラフィーによる精製方法（SEC）、硫酸アンモニウム沈澱による精製方法、還元剤の処理後、加熱・冷却する精製方法の免疫原性を分析した結果である。それぞれＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰをマウスに免疫する前、Ｌ１タンパク質の量は図２３Ａで確認したとおり同一に合わせた。１ngのＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰは２００μｇのaluminium hydroxideと混合された後、マウスに皮下で投与された。マウスの免疫は２週間隔で４回進められた。４回免疫した後マウスの血清の取った後、従来に公知されたシュードウイルス基盤の中和抗体活性測定法を通じて（参考文献２６）、それぞれのマウスグループの中和活性を測定した。その結果サイズ排除クロマトグラフィーによる精製を通じて得られたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰを免疫したマウスの中和活性は１６％、硫酸アンモニウム沈澱による精製を通じて得られたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰを免疫したマウスの中和活性は２８％、還元剤の処理後、加熱・冷却する精製を通じて得られたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰを免疫したマウスの中和活性は５０％になった。したがって、還元剤の処理後、加熱・冷却する精製法を通じて得られたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの中和抗体誘導能が最も優秀であることが分かった。
【図２５】図２５はＴ−５方法でＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質の精製の際に還元剤の処理後、加熱・冷却する過程において、加熱温度による効果を示す。それぞれの加熱温度の条件で細胞破砕物を１５分間加熱して冷却した後、遠心分離して沈殿物を除去した。パネルＡは加熱温度によるタンパクシルの濃度の測定結果を示す。パネルＢはそれぞれの加熱温度条件のサンプルを同一の体積でローディングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。パネルＣはそれぞれの加熱温度条件のサンプルを同一の体積でローディングしてウェスタンブロッティングでＬ１タンパク質を分析した結果である。パネルＤはそれぞれの加熱温度条件のサンプルをタンパク質定量した後、同一の量のタンパク質をローディングしてウェスタンブロッティングでＬ１タンパク質を分析した結果である。したがってパネルＤはＬ１タンパク質の純度を示す。これらの結果を通じてＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質を６０℃の加熱条件まで細胞破砕物に残されていることを確認したし、３５−５０℃で過熱する時にＬ１タンパク質の純度が高くなることを確認した。
【図２６】図２６はＴ−５方法でＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質の精製の際に、還元剤の処理後、加熱・冷却する過程において、加熱温度による効果を現す。それぞれのパネルに関する細部の内容は図２５と同じである。これらの結果を通じてＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質は６５℃の加熱条件まで細胞破砕物に残されていることを確認して、４５−５５℃で加熱する際にＬ１タンパク質の純度が高くなることを確認した。
【図２７】図２７はＴ−５方法を通じたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ精製において、還元剤の処理後、加熱、冷却する過程で冷却過程の効果を現す。パネルＡは４５℃と５０℃で加熱した後、冷却過程を経たサンプル（heating & chilling）と冷却過程を経ていないサンプル（heating）のタンパク質濃度の差を現す。パネルＢは４５℃で加熱した後、冷却過程を経たサンプルと冷却過程を経ていないサンプルのウェスタンブロッティング上のＬ１タンパク質の量分析結果を示す。パネルＣは５０℃で加熱した後冷却過程を経たサンプルと冷却過程を経ていないサンプルのウェスタンブロッティング上のＬ１タンパク質の量分析結果を示す。これらの結果は冷却過程を通じて不純物タンパク質が沈澱されることによって除去できることを示して、この過程でＬ１タンパク質の損失は起こらないことを示す。
【図２８】図２８はＴ−５方法と通じたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ精製において、還元剤の処理後加熱・冷却する過程で冷却過程の効果を示す。４５℃で加熱後、冷却過程を経たサンプル（ＨＣ）と冷却過程を経ていないサンプル（Ｈ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング上の差を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングの結果、冷却過程を経た後Ｌ１タンパク質は減少されないことが確認されたが、不純物タンパク質の減少は起こることが確認された。
【図２９】図２９は図２８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で示される不純物タンパク質protein １、protein ２、protein ３のバンド強度を数値で示した結果である。これらの結果は冷却過程を通じて不純物タンパク質の濃度が減少されることを示す。
【図３０】図３０はＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰとＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰを６０℃の加熱条件にしてＴ−５方法を通じて精製した結果である。パネルＡは１次クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。ＬＳはカラムにローディングしたサンプル、ＦＴはカラムに結合されなくて流れ出たサンプルを示す。Elutionは樹脂カラムに結合した後、溶出された分画と意味する。矢印はＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１の位置を示す。パネルＢは１次と２次クロマトグラフィーを経て最終精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。パネルＣは最終精製産物を透過電子顕微鏡で分析した結果である。電子顕微鏡での分析結果、精製されたＬ１タンパク質がウイルス様粒子を構成することが確認された。
【図３１】図３１はＴ−５方法でＨＰＶ １８ Ｌ１を１次クロマトグラフィーで精製した結果を現している。それぞれの分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分析された。ＬＳはローディングサンプル、ＦＴはflow−through、Ｗはカラムを洗浄した分画、Ｅはカラムに付着されたタンパク質を１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液に流されて溶出させた分画を意味する。ＨＰＶ １８ Ｌ１は還元剤の処理後、加熱・冷却過程を経た後、クロマトグラフィーを行う際に高い純度で精製できることを示す。
【図３２】図３２は図３１の１次クロマトグラフィーから溶出されたＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質の分画を２次陽イオン交換クロマトグラフィーを行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。ＬＳ、ＦＴ、Ｗは上記で説明したものと同じである。樹脂カラムに付着されたタンパク質は0.6、0.7、0.8、0.9、１Ｍ ＮａＣｌが含まれた緩衝液を流して順次的に溶出させた。ＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質は0.9Ｍと１Ｍ ＮａＣｌ分画で溶出されることが確認された。
【図３３】図３３はＴ−５方法で精製されたＨＰＶ １８  Ｌ１ ＶＬＰの動的光散乱分析結果を示す。Ｔ−５ ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰの動的光散乱はＥＬＳ−Ｚ２システムを用いて分析した。
【図３４】図３４はＨＰＶ ５８ Ｌ１をＴ−５精製方法で精製した結果を示す。パネルＡは１次クロマトグラフィーで溶出されたＬ１タンパク質の分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。パネルＢは２じクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。パネルＢの詳細な内容は図３２に記述したものと同じである。
【図３５】図３５はＴ−５精製方法で１次・２次クロマトグラフィーを経て最終的に回収されたＨＰＶ ５８ Ｌ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングの結果を示している。ＨＰＶ ５８ Ｌ１は還元剤の処理後、加熱、冷却過程を経る方法を通じて成功的に精製できることを示している。
【図３６】図３６はＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列（ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＮＧ２）を示す。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はＨＰＶ １６ Ｌ１ ＮＧ２が取り込まれた発現ベクターに形質転換された。形質転換された細胞はＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質の発現、精製のために用いられた。ＨＰＶ １６ Ｌ１核酸配列はGenBank KC792555.1で公知された。
【図３７】図３７はＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列（ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＮＧ３）を示す。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はＨＰＶ １８ Ｌ１ ＮＧ３が取り込まれた発現ベクターみに形質転換された。形質転換された細胞はＨＰＶ １８ Ｌ１タンパク質の発現、精製のために用いられた。ＨＰＶ １８ Ｌ１核酸配列はGenBank KC792556.1で公知された。
【図３８】図３８はＨＰＶ １６ Ｌ１ ＮＧ２はＨＰＶ １８ Ｌ１ ＮＧ３が暗号化するＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明さらに詳細に説明する。これらの実施例はただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【実施例】
【００３５】
実験方法
１．細胞培養
ＨＰＶ Ｌ１タンパク質を発現するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Y2805は従来に公知された方法により培養した（参考文献２５）。ＨＰＶ Ｌ１タンパク質発現細胞株はウラシル（uracil）がない合成完全培地（complete medium）である「SD-ura」に塗抹して、４日または５日間培養した。単一コロニーをSD-ura液体培地に接種して、２日間培養した。GAL10プロモーターからＨＰＶ １６  Ｌ１タンパク質を発現させるために、培養した形質転換細胞を１％酵母抽出物（Duchefa、Netherlands）、２％ペプトン（Duchefa）、７％グルコース（Duchefa）及び１％ガラクトース（Duchefa）を含むYPDG培地で培養した。培養完了後、培養した細胞を遠心分離して、培養液を除去して、PBS(phosphate-buffered saline)を用いて洗浄した。洗浄した細胞は再び遠心分離を行って回収して、タンパク質の精製まで−７０℃に保管した。
【００３６】
２．Ｔ−１方法を通じたＨＰＶ  ＶＬＰの精製
Ｔ−１方法を通じたＨＰＶ ＶＬＰの精製は従来に公知された方法により細胞破砕液内のタンパク質を硫酸アンモニウムの沈澱を通じてpelletで回収した後、ヘパリンクロマトグラフィー（Heparin chromatography）を通じて精製した（参考文献２２、２３、２４）、ヘパリンクロマトグラフィーのためにHiTrapTM Herparin HP（GE Healthcare、USA）樹脂を使用した。硫酸アンモニウムと沈澱物の除去過程を経たサンプルを0.325 M NaClが含まれたPBSTで透析して、0.325 M NaClが含まれたPBSTで平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた。ヘパリン樹脂は樹脂の体積の５倍体積の緩衝液（0.325 M NaClを含むPBST）を流して洗浄して、樹脂と結合したタンパク質はNaClが0.325から２Mまで傾斜勾配で増加させるように溶出させた。溶出された分画の中、ＨＰＶ Ｌ１を含む分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を通じて選別して集めた。精製完了されたＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは0.33 M NaClが含まれたPBS＋0.01 Tween 80 （PBST）に対して透析した。
【００３７】
３．Ｔ−５方法を通じたＨＰＶ  ＶＬＰの精製（β−ｍｅ＋ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）
３−１．細胞の破砕、還元剤の処理、及び過熱・冷却
培養したＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の発現細胞は破砕緩衝液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）に混合させた。上記の細胞混合液を再び0.5 mmガラスビーズ（glass bead、Biospec Product、USA）と混合した後、ボルテックス（vortex）して細胞を破砕した。細胞残余物は12000xgで１５分間遠心分離して除去した。カラムクロマトグラフィーを行う前に細胞破砕物は異なる二つの方法を準備した。一つ目の方法は細胞破砕物に最終β−メルカプトエタノール（β−mercaptoethanol、β−ME、Sigma、USA）の濃度が４−６重量％になるようにβ−MEを添加した後、pHを7.0−7.3に調整する方法である。二つ目の方法は細胞破砕物を上記の破砕緩衝液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）に対して４−６時間透析した後に、最終β−ME濃度が４−６％になるようβ−MEを添加する方法である。続いて、β−MEが添加された細胞破砕物を２５−６５℃の恒温水槽に３０−５０分間置いた後に、氷に３０分−３時間または４℃に１６時間置いて冷却させた。冷却された細胞破砕物を12000xgで１５分間遠心分離して沈澱物を除去した。
【００３８】
３−２．１次クロマトグラフィー
還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を通じて用意した細胞破砕物をヘパリン樹脂（HiTrapTM Herparin HP、GE Healthcare、USA  または  POROS(R) 50 HE、Applied Biosystems、USA）または陽イオン交換樹脂（POROS(R) XS、Applied Biosystems、USA）に通過させた。ヘパリン樹脂または陽イオン交換樹脂は細胞破砕物の通過の前に４−６％のβ−MEが含まれた細胞破砕緩衝液（10 mM sodium phosphate dibasic、0.15−0.48 M NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）で平衡化させた。細胞破砕物をローディングした後にヘパリン・陽イオン交換樹脂を洗浄緩衝液（0.35−0.48 M NaClと5%β−MEが含まれたPBST）をカラム体積の５倍以上に流して洗浄した。ヘパリン樹脂と結合されたＨＰＶ  Ｌ１タンパク質は１ M NaCl、5%β−MEが含まれたPBSTを流して溶出させるか5%β−MEが含まれたPBSTに最終NaCl濃度が0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1Mが含まれるように用意した緩衝溶液を順次的に流して溶出させた。Ｌ１タンパク質を含む溶出液はAmicon Ultra（Millipore、USA）を使用して濃縮した後、1 M NaCl、0.2 M 硫酸アンモニウムが含まれたPBSTに20−２４時間の間透析を行った。
【００３９】
３−３．２次クロマトグラフィー
上記の１次クロマトグラフィーの後に、透析完了した溶液を0.3−0.42 M NaClが含まれたPBSTに対して追加で透析した後に、ヘパリン樹脂または陽イオン交換樹脂に通過させて２次クロマトグラフィーを行った。２次クロマトグラフィーのために使用されたヘパリン樹脂と陽イオン交換樹脂は１次クロマトグラフィーで用いられた樹脂と同一である。ヘパリン・陽イオン交換樹脂は試料をローディングする前に0.42 M NaClが含まれたPBSTで平衡化させた。試料をローディングして、樹脂にカラム体積の５倍以上の0.42 M NaClが含まれたPBSTを流して洗浄した。ヘパリン・陽イオン交換樹脂と結合したＨＰＶ  Ｌ１タンパク質はNaClの濃度が0.42から2.0 Mまで上昇するようにして溶出させたり、NaCl濃度が0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 Mが含まれるように用意した緩衝溶液を順次的に流して溶出させた。クロマトグラフィーの溶出パターンは280 nmの波長で測定して、Autochro-2000プログラム（Young Lin Instrument Co., South Korea）を使用して収集した。Ｌ１タンパク質が溶出された分画を回収した後、Amicon Ultra（Millipore、USA）を用いて濃縮して、0.33 M NaClが含まれたPBSTに透析した。
【００４０】
４．非処理精製方法（ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）
非処理精製のための細胞は上記で技術したものと同じ方法で破砕されて容易された。用意された細胞破砕液は緩衝液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）に４−６時間透析した。透析されたサンプルの沈殿物は12000xgで10分間遠心分離して除去した後、上記の緩衝液で平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた。その後ヘパリン樹脂を0.42 M NaClが含まれたPBSTを樹脂体積の５倍に流して洗浄した。洗浄した後ヘパリン樹脂に結合したタンパク質は1 M NaClが含まれたPBSTを流して溶出させた。
【００４１】
５．β−ｍｅ処理精製方法（β−ｍｅ  ｍｅｔｈｏｄ）
β−me処理精製方法は上記のＴ−５精製方法でheating & chilling過程を省略した精製方法である。β−me処理精製方法のためにＨＰＶ  Ｌ１発現細胞は上記で記述したように用意して、緩衝溶液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）で４−６時間の間透析した。透析された破砕液にβ−meを最終的に４−６％になるように添加した。ヘパリン樹脂は４−６％β−meが含まれた緩衝液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01％Tween 80 pH 7.2）で平衡化させた後、容易された細胞破砕液を通過させた。細胞破砕液を通過させたヘパリン樹脂を４−６％ β−meと0.42 M NaClを含むPBSTを樹脂体積の５倍に流して洗浄させた。ヘパリン樹脂に付着されたタンパク質は４−６％ β−meと１ M NaClを含むPBSTを流して溶出させた。
【００４２】
６．Ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ処理精製方法（ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）
Heating & chilling処理精製方法はＴ−５精製方法でβ−meを処理を省略した精製方法である。ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質精製のために細胞は破砕後、緩衝溶液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）で４−６時間透析した。透析された破砕液を３７−４５℃で３０分間処理して、氷に３０分−３時間置いて冷却させた。加熱・冷却過程を経た破砕液の沈殿物を12000xgで１０分間遠心分離して除去した後、緩衝液（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01％ Tween 80 pH 7.2）で平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた。この後、ヘパリン樹脂を0.42 M NaClが含まれたPBSTを樹脂体積の５倍に流して洗浄させた。洗浄の後、樹脂と結合したタンパク質は１ M NaClが含まれたPBSTを流して溶出させた。
【００４３】
７．サイズ排除クロマトグラフィーを利用した精製（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いた精製は従来に公知された方法（参考文献２０）を少し修正して行った。ＨＰＶ Ｌ１発現酵母を上記と同一に破砕して用意した後、４５％ 硫酸アンモニウムが飽和されるようにしてタンパク質を沈澱させた。沈澱されたタンパク質をＰＢＳＴで再分散（resuspension）させた後、緩衝液に（10 mM sodium phosphate dibasic、0.65 M NaCl、1.7 mM EDTA、0.01％ Tween 80 pH 7.2）４時間の間、透析させた。透析された分画はサイズ排除クロマトグラフィーを１次クロマトグラフィーにして精製が行われた。上記に用意されたサンプルは0.65 M NaClが含まれたPBSTに平衡化されたSuperose-6 resin（1.5ｘ32cm、GE Healthcare、USA）に通過させた（１次クロマトグラフィー）（参考文献３６）。サイズ排除クロマトグラフィーの溶出パターンは２８０ nmの波長で測定して、Autochro−2000プログラム（Young Lin Instrument Co., South Korea）を用いて収集した。
【００４４】
ＨＰＶ  Ｌ１を含む分画を集めた後、0.33 M NaClが含まれたPBSTに透析して、0.33 M NaClが含まれたPBSTで平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた（２次クロマトグラフィー）。その後、ヘパリン樹脂を0.42 Mが含まれたPBSTを樹脂体積の５倍に流して洗浄した。洗浄の後、ヘパリン樹脂に結合したタンパク質は0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、１M NaClが含まれたPBSTを順次的に流して溶出させた。
【００４５】
８． 硫酸アンモニウムの沈澱を利用した精製（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）
硫酸アンモニウム沈澱を用いた精製は上記のＴ−５精製方法でβ−me処理後、heating & chilling過程をammonium sulfate沈澱に置換した方法である。クロマトグラフィー段階の前、硫酸アンモニウム沈澱と沈殿物の除去過程は従来に公知された方法により行った（参考文献２２、２４）。細胞破砕物タンパク質を４５％硫酸アンモニウムで飽和させて沈澱させた後、沈澱不純物（removal of precipitated contaminants）を除去した過程を経た。クロマトグラフィーの前、上記に用意されたサンプルを緩衝液に（10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2）４時間の間透析させた。ヘパリン樹脂を上記緩衝液と同一な緩衝液に平衡化させた後、透析されたサンプルを通過させた（１次クロマトグラフィー）。
【００４６】
その後、0.42 M NaClが含まれたPBSTを樹脂体積の５倍に流して洗浄した後、１M NaClが含まれたPBSTを流して結合されたタンパク質を溶出させた。２次クロマトグラフィーのために溶出された分画を0.33 M NaClが含まれた緩衝液に透析させた。その後の過程はサイズ排除クロマトグラフィー方法の２次クロマトグラフィー方法と同一に進められた。
【００４７】
９．タンパク質の定量キット
タンパク質の濃度はウシ血清アルブミン（BSA; Pierce, USA）を標準物質にしてタンパク質定量キット（Bio-Rad Laboratories、USA）を使用して測定した。
【００４８】
１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはLaemmliの方法により行って（参考文献３５）、ウェスタンブロッティングは公知された方法を用いて行った（参考文献２６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に展開されたタンパク質は銀染色を実施して視覚化した。１次抗体としてウサギの抗−ＨＰＶ １６ Ｌ１血清と、２次抗体としてヤギＨＲＰ−コンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG、Bethyl、USA）を用いてＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出した（参考文献２６）。バンドの強度はNational Institute Health (NIH) open source software Image Jで測定して、公知された方法（参考文献２５）により算出した。
【００４９】
１１．電子顕微鏡分析
精製したＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質をカーボン・コーティングされたグリッドに吸着させた後、リンタングステン酸（phosphotungstic acid）または酢酸ウラニル（uranyl acetate）で染色した。透過電子顕微鏡写真は150,000Xの最終倍率でTEM200CX（JEOL、Japan）を用いて撮影した（参考文献２５）。
【００５０】
１２．ＨＰＶ  ＶＬＰのダイナミック光散乱分析
ＨＰＶ  ＶＬＰの動的光散乱（dynamic light scattering、DLS）分析は既に公知された方法により行った（参考文献２６）。精製したＨＰＶ  ＶＬＰは0.13 M NaClが含まれたPBSTを用いて0.13 mg/mlに希釈した後、ＤＬＳ−７００システム（Otsuka Electronics、Japan）またはＥＬＳ−Ｚ２ system（Otsuka Electronics、Japan）を用いて分析した。
【００５１】
１３．ＨＰＶ  ＶＬＰに対する単クローン抗体反応性の分析
ＨＰＶ  ＶＬＰに対する単クローン抗体の反応性は従来に公知された方法により行った（参考文献２６）。９６−ウェルELISA（enzyme−linked immunosorbent assay）プレートを精製したＨＰＶ  ＶＬＰで４００ngずつコーティングした。それぞれ異なる方法で精製されたＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰはコーティングの前、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を通じてそれぞれＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰのＬ１タンパク質の量が定量的に同一することを確認した後コーティングされた。ＶＬＰがコーティングされたプレートは３％ウシ血清アルブミンが含まれたＰＢＳ−Ｔ２０（0.05％ Tween 20を含むPBS）で常温で２時間の間ブロッキングした。抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１単クローン抗体であるＨ１６．Ｖ５とＨ１６．Ｅ７０を０．３％ウシ血清アルブミンが含まれたＰＢＳ−Ｔ２０を用いて0.25μg/ml、0.12μg/ml、0.06μg/ml、0.03μg/ml、0.015μg/mlになるように希釈させた後、コーティングされたＨＰＶ  ＶＬＰと３７℃で９０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＨＲＰ付着された抗-ハツカネズミＩｇＧ抗体（Bethyl、USA）を0.3％ウシ血清アルブミンが含まれた ＰＢＳ−Ｔ２０に１：５０００比率で希釈して３７℃で４０分間プレートに反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔ２０で５回洗浄の後、発色反応を行った。発色はo-phenylenediamine (Sigma, USA)を用いて行って、吸光度は４９２ nmで測定した。
【００５２】
１４．精製されたＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰのマウス免疫及び免疫原性の評価
ＨＰＶ  １６  Ｌ１の免疫原性の評価のために６週齢Balb/cマウスを用いた（Orientbio. South Korea）。ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質をマウスに免疫するために上記で公知されたタンパク質定量法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法によりＬ１タンパク質の純度及び濃度を確認した。マウスは皮下注射を通じて免疫されて、２週間隔で４回免疫された。１回免疫のため１ngのＬ１タンパク質と２００ug aluminium hydroxide（Sigma、USA）が皮下に投与された。１ngのタンパク質の量はＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの定量結果を基準にする。他の方法で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１タンパク質はＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１を標準品にして定量された。３次、４次免疫１０日後、マウス尻尾静脈を通じて血液を採取した。血清を回収するためにマウス血液を12000xgで１０分間遠心分離した後、上澄液を取って、抗体価の測定及び中和抗体の活性評価の前まで−７０℃に保管した。マウスの血液内の抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１ ＩｇＧ抗体価と抗−ＨＰＶ １６中和活性を公知された方法によりEnzyme-linked immnosorbent assay（ELISA）とpseudovirus-based neutralization assayを通じて測定した（参考文献２６）。
【００５３】
１５．統計分析
グループ間の差の統計学的な有意性はtwo tailed Student’s t-testを用いて決定した。P<0.05を有意な差と見なした。
【００５４】
実験結果
１．Ｔ−５精製：１次クロマトグラフィーによるＬ１タンパク質精製の結果
Ｔ−５精製過程は図１に示している。１次ヘパリンクロマトグラフィーのためのローディング試料は透析過程を経た場合と透析過程を経ていない場合に分けて用意した。透析過程を経た場合は細胞破砕後、細胞破砕緩衝液に透析を実施した後、還元剤（β−ＭＥ）を添加して、透析過程を経ていない場合は細胞破砕物に直接還元剤を添加した。その後、二つの試料は全て３７−４２℃に温度を上昇させて３０−５０分間放置した後、氷において０℃付近まで冷却させた。加熱・冷却過程で沈澱された不純物を除去した後ヘパリンクロマトグラフィーを実施した。図２と図３は透析過程を経た試料と透析過程を経ていない試料のヘパリンクロマトグラフィーの結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。二つの場合の試料、すべてＬ１タンパク質が高い純度で回収されたことが分かる。
【００５５】
２．Ｔ−５精製：２次クロマトグラフィーによるＬ１タンパク質精製の結果
１次ヘパリンクロマトグラフィーを通じて回収されたＬ１タンパク質溶出分画は２次ヘパリンクロマトグラフィー通じて追加精製した。図４ａは２次ヘパリンクロマトグラフィーを行って精製した結果を示している。ヘパリン樹脂と結合したＬ１タンパク質はＮａＣｌの傾斜勾配の増加により溶出された（図４ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの確認結果ヘパリン樹脂に結合されなく流れ出たＬ１タンパク質はＦＴ（flow-through）分画で観察されなかった。ヘパリン樹脂に結合したＬ１タンパク質はNaClの傾斜勾配（linear gradient）の増加により溶出されることが確認された（分画１１−１７）。図４ｂは２８０nmの波長でヘパリンクロマトグラフィーの際に溶出される物質を検出した結果である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果ではＦＴ（flow-through）で溶出されるタンパク質が観察されていないが、２８０nmで測定するときにＦＴ（flow-through）で相当な量の不純物が流れ出ることが確認された。したがって、２次ヘパリンクロマトグラフィーを通じてＬ１タンパク質の以外の不純物が除去されたことを確認した。
【００５６】
３．Ｔ−１とＴ−５方法により分離されたＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＶＬＰの純度分析
２次ヘパリンクロマトグラフィーから回収されたＬ１タンパク質（Ｔ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ）の純度を従来に公知された方法（参考文献２２、２４）で精製されたＬ１タンパク質（Ｔ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ）の純度と比較した。Ｔ−１精製方法は図１に示されていて、Ｔ−１精製方法のヘパリンクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果は図５に示されている。図５でＬＳはカラムにローディングしたサンプル（loading sample）を意味する。Ｔ−１方法のヘパリンクロマトグラフィーでＬ１タンパク質はNaCl濃度を0.325 Mから２ Mまで傾斜勾配で上昇するように溶出させて、L1タンパク質は分画１１から１５番の間に溶出された。図６ａはＴ−１とＴ−５方法で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの純度を比較した結果である。ＶＬＰの純度分析のために独立された２回の精製実験を実施してパネルＡとパネルＢの結果で提示した。Ｔ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１  ＶＬＰはタンパク質定量の後、ウェル当たり５００ng、２５０ng、１２５ng、６２ngをローディングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの展開の後、銀染色を通じて視覚化した。二つのＶＬＰで５５kDaのＬ１バンドが高い純度で観察された。しかし、Ｔ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１バンドの強度がＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１バンドの強度より強く現れた。図６ｂは図６ａの２回実験結果の値を平均±標準偏差で表した結果である。結果算出のために５００nｇがローディングされたＴ−５ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１バンドの強度を１００％にした。これらの結果によりＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの純度がＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの純度より高いことが確認できた。
【００５７】
後述するＨＰＶ Ｌ１タンパク質の電子顕微鏡分析、動的光散乱分析及び単クローン抗体反応性分析のために、Ｔ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰのＬ１の量をＴ−５ ＨＰＶ  １６ ＶＬＰのＬ１の量と同一に調整した。図７は二つのＶＬＰのＬ１の量を同一に調整した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【００５８】
４．Ｔ−１とＴ−５精製方法で分離されたＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＶＬＰの電子顕微鏡分析
図８はＴ−１ ＨＰＶ １６ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ  １６ ＶＬＰを電子顕微鏡で分析した結果である。Ｔ−５ ＨＰＶ  １６ Ｌ１ ＶＬＰのサイズは４０−６５nmと確認されたが、Ｔ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰのサイズは２０−５０nmと確認された。したがって、Ｔ−５方法で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの形態はＴ−１方法で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰと形態と区分される特徴を有していた。自然的に発生するＨＰＶビリオン（virion）のサイズは５０−６０nmであると知られている（参考文献２９、３０）。したがって、このような結果はＴ−５  ＨＰＶ  １６ ＶＬＰののサイズが本来ＨＰＶが有するサイズにより近いことを意味する。
【００５９】
５．Ｔ−１とＴ−５精製方法で分離されたＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＶＬＰのダイナミック光散乱分析
動的光散乱分析はＶＬＰが溶液内に存在する状態を調査する際に、ひろく使われている（参考文献３１）。図９は精製したＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰとＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰをＤＬＳ−７００システムを使用して分析した代表結果を見せている。図１０はそれぞれＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰをＥＬＳ−Ｚ２システムを用いて分析した代表結果を見せている。ＶＬＰのサイズは平均±標準偏差で示した。図９で、Ｔ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰは２９−４３８ｎｍの間に分布するが、 Ｔ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰは１７−２３３nmの間に分布することになった。したがって、二つのＶＬＰのサイズによる流体分布は相違するように示された。図１０ＡはそれぞれＶＬＰの動的光散乱のIntensity profileをみせる。図１０ＢはそれぞれＶＬＰの多分散指標（polydispersity index, P.I.）を示す。図１０Ａでも同じくＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰはＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰより広い範囲のサイズ分布を示すことと確認された。Ｔ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの多分散性（P.I.）はＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに比べてより低いことで確認された(図10B)。 結論的にＴ−５ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰはＴ−１ ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに比べて溶液内で均一な形態に存在することで確認された。
【００６０】
６．Ｔ−１とＴ−５方法で精製されたＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰに対する単クローン抗体反応性調査
ＨＰＶ １６ ＶＬＰに対する抗−ＨＰＶ １６ Ｌ１単クローン抗体の反応性はＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰの構造的な優秀性及び中和抗体の誘導能を評価するのに重要な目安として使用されている（参考文献２６、３２−３４）。このような評価のために最も一般的に使われている抗体であるH16.V5とH16.E70を使用して、Ｔ−１  ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰとＴ−５  ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰの反応性を比較した（参考文献２６）。二つの抗体に対する反応性の増加は 免疫原性の増加と密接な関連がある[26、36]。図１１に示すように二つの抗体の反応性は、Ｔ−５  ＨＰＶ  １６  ＶＬＰがＴ−１  ＨＰＶ  １６  ＶＬＰよりはるかに優れていることを確認した。
【００６１】
７．Ｔ−１とＴ−５方法で精製されたＨＰＶ１６Ｌ１  ＶＬＰの免疫原性の比較
Ｔ−１  ＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＶＬＰのＬ１タンパク質の純度はＴ−５  ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰより低いと確認された（図６ａ、図６ｂ）。二つのＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＶＬＰを同じ量で免疫するためにＴ−１  ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰの量をＴ−５  ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰの量に調整してＳＤＳ−ＰＡＧＥで Ｌ１タンパク質の量を確認した（図７）。１回の免疫のために1 ngのHPV16 L1 VLPをaluminium hydroxideとともに投与した。 1 ngのタンパク質の量はT-5 HPV16 L1 VLPのタンパク質定量値（Bradfordタンパク質定量値）を基準とした。 T-1とT-5精製方法で精製されたHPV16 L1 VLPをマウス皮下で2週間隔4回投与した。 3次免疫と4次免疫を実施した後、血清内の抗-HPV16 L1 IgG力価を測定した結果を図12に示している。 3次免疫後、T-5 HPV16 L1 VLP免疫グループは450の中間値を現わしたが、T-1 HPV16 L1 VLP免疫グループは0の中間値(media value)を示した。 4次免疫後T-5 HPV16 L1 VLP免疫グループは4050の中間値を現わしたが、T-1 HPV16 L1 VLP免疫グループは300の中間値を現わした。 したがって、T-5 HPV16 L1 VLPはT-1 HPV16 L1 VLPより10倍以上高い抗-HPV16 L1 IgG抗体客力価を誘導すると確認された。
4次免疫後、マウス血清の内の抗-HPV16中和抗体活性を測定した（図13）。 T-5 HPV16 L1 VLPの免疫グループは、78％の中和活性（median value）を示したのに対し、T-1 HPV16 L1 VLPの免疫グループは、33％の中和活性を示した。これらの二つのグループの間に中和活性は有意な差を示した。
【００６２】
８．還元剤の処理後、過熱・冷却処理の効果調査（非処理、β−ＭＥ処理、ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ、β−ＭＥ処理後ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ条件の比較）
上記の結果から分かるように、一つ目のヘパリンクロマトグラフィーを通じて、高純度のL1タンパク質を得ることができる。還元剤の処理後、加熱・冷却過程がL1タンパク質の純度への影響を具体的に調査するために二つの種類の実験を行った。一つ目の実験では、何の処理もしていない条件（非処理精製方法、non-treatment）、還元剤のみを処理した条件（β-ME処理精製方法、β-ME treatment method）、および還元剤の処理後、加熱・冷却過程を経た条件（T-5の精製方法。β-ME+ heating＆chilling）の間で、ヘパリンクロマトグラフィー後のL1タンパク質の純度を比較した。二つ目の実験では、何の処理もしていない条件（非処理精製方法、non-treatment）、加熱・冷却処理のみした条件（heating＆chilling処理精製方法）、および還元剤の処理後、加熱・冷却過程を経た条件（T -5、β-ME+ heating＆chilling）の間で、ヘパリンクロマトグラフィーの後のL1タンパク質の純度を比較した。
【００６３】
表1および表2は、一つ目及び二つ目の実験で、ヘパリンクロマトグラフィーのためのそれぞれの条件のローディングサンプルのタンパク質の量と不純物タンパク質の除去率を示した結果である。表1に示すように、何の処理もしていない条件と還元剤のみを処理した条件は、ヘパリンクロマトグラフィーの前、24 - 25％のタンパク質が除去された一方、還元剤を処理した後、加熱・冷却を経た条件は、66％のタンパク質が削除された。表2からも同様に、何の処理もしていない条件と加熱・冷却のみを経た条件では、ヘパリンクロマトグラフィーの前、34 - 40％のタンパク質が除去された一方、還元剤の処理後、加熱・冷却を経た条件は、70％のタンパク質が除去されましたが確認された。
【００６４】
【表１】
0006014763.tif 000002
【００６５】
【表２】
0006014763.tif 000003
【００６６】
図14は、1次ヘパリンクロマトグラフィーの後、回収された分画を同じ体積（5μL、2.5μL、1.2μL）にローディングしてSDS-PAGEとウェスタンブロッティングに確認した結果である。何の処理もしていない場合は、L1タンパク質の回収された量は大きく落ちることが確認された。また、回収液の内に不純物タンパク質を多く含んでおり、純度も非常に低いことが確認された。還元剤β-MEのみを処理した条件では、回収されたL1タンパク質の量は増加したが回収液の内に不純物タンパク質を多く含んでおり、やはり純度が良くないことが確認された。
【００６７】
一方、還元剤β-ME処理の後、加熱/冷却過程を経た場合は、SDS-PAGEとウェスタンブローティングでL1タンパク質が主要なバンドで確認されて、L1タンパク質の純度だけでなく、回収率も優秀であることが確認された。
【００６８】
それぞれの条件で回収されたL1タンパク質の純度を比較するために、回収液の内のタンパク質を定量した後、同一な量（1μg、0.5μg、0.25μg）のタンパク質をローディングしてSDS-PAGEとウェスタンブロッティングで確認した（図15 ）。結果からわかるようにL1タンパク質の純度は、β-ME添加後、加熱/冷却過程を経た条件で最も高いことが確認された。
【００６９】
図16は、何の処理もしていない条件（non-treatment）、加熱冷却だけの条件（heating＆chilling）、還元剤の処理後、加熱、冷却した条件（T-5の精製方法。β-ME+ heating＆chilling）の1次ヘパリンクロマトグラフィーの溶出分画をSDS-PAGEで分析した結果である。 1次ヘパリンクロマトグラフィーの後、回収された分画を同じ体積（5μL、2.5μL、1.2μL）でローディングしてSDS-PAGEとウェスタンブロッティングで確認した結果、何の処理もしていない場合と、加熱及び冷却の過程だけ経た条件でL1タンパク質の回収された量は大きく落ちることが確認された。また、回収液内の不純物タンパク質を多く含んでおり、純度も非常に低いことが確認された。一方、還元剤β-ME処理の後、加熱/冷却過程を経た場合は、SDS-PAGEとウェスタンブロッティングでL1タンパク質が主要なバンドで確認されて、L1タンパク質の純度だけでなく、回収率も優れていることが確認された。
結論として、還元剤の処理だけした場合、または加熱と冷却だけの場合では、高い純度のL1タンパク質を得ることができなかった。L1タンパク質を高い純度に精製するためには、還元剤の処理後、加熱/冷却を経ることが不可欠であることを確認した。
【００７０】
９．還元剤の処理後、過熱・冷却処理の効果調査（硫酸アンモニウムの沈澱、β−ＭＥ処理、β−ＭＥ処理後ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ条件の比較）
硫酸アンモニウムの沈澱による精製過程は、図17に示されている。硫酸アンモニウムの沈澱による精製方法は、T-5の精製方法の中でβ-ME処理の後heating＆chilling過程をammonium sulfate沈殿に置換したもので、図1のT-1の精製方法と区別される。 β-ME処理（β-ME method）による方法は、上記実施例に示されているものと同じである。 1次クロマトグラフィーの後カラムに結合したタンパク質の溶出分画を同じ体積（10、5、2.5μL）にローディングしてSDS-PAGEとウェスタンブロッティングで分析した（図18、図19）。
【００７１】
β-ME処理の後、加熱、冷却を経た条件の場合、L1タンパク質が優れた純度を示した一方 硫酸アンモニウムの沈澱方法とβ-MEのみを処理した方法は、低いL1タンパク質の純度を示した（図18）。硫酸アンモニウムの沈澱方法とβ-ME処理の後、加熱、冷却した方法の1次クロマトグラフィーの結果を分析した結果、β-ME処理の後、加熱、冷却した条件の場合、ローディングのサンプル（LS）内のL1タンパク質の全てがカラムに合わされたが、硫酸アンモニウムの沈澱を使用した方法は、ローディングサンプル（LS）のL1タンパク質の一部がカラムに結合しなくて（FT flow-through）に流れ出ることが確認された（図19）。
【００７２】
１０．還元剤の処理後、過熱・冷却処理の効果の調査（サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムの沈澱、β−ＭＥ処理後ｈｅａｔｉｎｇ＆ｃｈｉｌｌｉｎｇ条件の比較）
サイズ排除クロマトグラフィーによる精製（SEC）の過程は、図17に示されている。サイズ排除クロマトグラフィーの方法は、従来のに公知された方法に基づいた（参考文献２０）。硫酸アンモニウムの沈澱による方法は、上記に記述した方法と同様である。サイズ排除クロマトグラフィーによる代表的な結果は、図20に示されている。サイズ排除クロマトグラフィー後、HPV16 L1タンパク質は、分画3 - 9で高い純度で溶出され、この分画を1次クロマトグラフィーによるL1タンパク質の純度の比較に使用した（図21）。サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、硫酸アンモニウムの沈澱方法、β-ME処理の後、加熱、冷却（β-ME+ heating＆chilling）する方法による１次クロマトグラフィー溶出分画内のL1タンパク質の純度を比較した（図21）。それぞれの方法の溶出分画を同一な体積（7 ml）に合わせた後、同一な体積のサンプル（0.35、0.17、0.08μL）をSDS-PAGEとウエスタンブロッティングで分析のためにローディングした。 1次クロマトグラフィーの溶出分画のうちβ-ME処理の後、加熱、冷却した条件のL1タンパク質の純度が最も高いことが確認された。
【００７３】
図22は、図21の1次クロマトグラフィー溶出分画を2次クロマトグラフィーを通じて精製した後、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングで分析した結果である。それぞれの条件の2次クロマトグラフィー溶出分画を同じ体積（2、1、0.5μL）にローディングした。 2次クロマトグラフィー溶出分画の分析結果β-ME処理の後、加熱、冷却した条件のL1タンパク質の回収率が最も高いことが確認された。
【００７４】
それぞれの条件で精製したHPV16 L1 VLPの抗原性の分析のためにHPV16中和単クローン抗体であるH16.E70との反応性をELISAで比較した（図23b）。同じ量のHPV16 L1 VLPをコーティングするために抗原コーティングの前、サイズ排除クロマトグラフィー基盤の精製方法（SEC）と硫酸アンモニウムの沈澱法で精製されたHPV16 L1 VLPの濃度をβ-ME処理の後、加熱、冷却過程を介して精製されたHPV16 L1 VLP（T-5 HPV16 L1 VLP）の濃度と同じように合わせた。濃度調整の後SDS-PAGEとウエスタンブロッティングで3種類のVLPの間にL1タンパク質の量の差がないことを確認した（図23a）。 H16.E70と反応性の分析結果β-ME処理の後、加熱、冷却した条件（T-5）で精製したHPV16 L1 VLPの反応性が最も優れていることが分かった（図23b）。
【００７５】
結論としてβ-ME処理の後、加熱、冷却過程を経る方法によって回収されたウイルス様粒子（VLP）は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムの沈澱方法などの従来に公知されて使用されていた方法で精製、回収したウイルス様粒子に比べて優れた純度を示したし、回収されVLPの抗原的特性も優れていることが分かった。
【００７６】
１１．サイズ排除クロマトグラフィー基盤方法（ＳＥＣ）、硫酸アンモニウム沈澱法、還元剤の処理後過熱・冷却する方法（Ｔ−５）で精製されたＨＰＶ１６Ｌ１  ＶＬＰの免疫原性の比較
図23で、最終に精製された3種類のHPV16 L1 VLPをマウス皮下に1 ngずつ免疫した。免疫の前、図23Aに示すように、それぞれのVLPの濃度は、同じように合わせていた。マウス免疫の際に1 ngのVLPは、200μgのaluminium hydroxideと混合して投与された。免疫は、2週間隔に4回行われた。 4回免疫したマウス血清中の中和活性を測定した結果、サイズ排除クロマトグラフィー基盤の方法（SEC）で精製したHPV16 L1 VLPで免疫されたグループの場合、16％の中和活性を示し、硫酸アンモニウムの沈澱法で精製したHPV16 L1 VLPで免疫されたグループの場合、28％の中和活性を示した。一方、還元剤処理後、加熱、冷却過程を経る方法（T-5）で精製されたHPV16 L1 VLPで免疫されたグループの場合、50％中和活性を示した。結論としては、T-5の方法で精製されたHPV16 L1 VLPは、公知された方法により精製されたHPV16 L1 VLPよりも優れた免疫原性を示した。
【００７７】
１２．還元剤の処理後、過熱温度による効果分析
図25と図26は、HPV16 L1 VLPとHPV18 L1 VLP精製において還元剤の処理の後、加熱温度による不純物タンパク質の除去効果を示す。細胞破砕物にβ-MEを処理した後、常温（starting）、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃の条件で15分間反応させた。以降、これらのサンプルを氷に1時間放置した後、12000xgで遠心分離して沈殿物を除去した。沈殿物が除去されたそれぞれのサンプルのタンパク質の濃度を測定した結果をパネルAに示した。それぞれのサンプルを同一体積でローディングしてSDS-PAGE上で分析した結果をパネルBに示した。それぞれのサンプルを同一体積でローディングした後、ウェスタンブロッティングでL1タンパク質の量を確認した結果をパネルCに示した。それぞれのサンプルのタンパク質の濃度を測定した後、同じ量のタンパク質をローディングしてウェスタンブロッティングでL1タンパク質の量を確認した結果をパネルDに示した。したがって、パネルDのウェスタンブロッティングの結果は、L1タンパク質の純度を示す。
【００７８】
加熱による不純物タンパク質の除去率は35℃以上で大きく増加したことが分かった（図25A、図25Bおよび図26A、図26B）。図25Cと図26Cに示すようにHPV16 L1タンパク質は、65℃と60℃の加熱条件でも細胞破砕液に残っていたし、HPV18 L1タンパク質は、60℃に加熱条件でも細胞破砕液に残っていることが確認された。それぞれの温度条件別にL1タンパク質の純度を分析した結果HPV16 L1タンパク質の純度は35-50℃の条件で優れていることを示したし（図25D）、HPV18 L1タンパク質純度は45-60℃の条件で最も優れていることが分かった（図26D）。したがって、35-60℃の条件で細胞破砕液を加熱の際に不純物タンパク質は除去されるが、L1タンパク質は、安定性を維持することが確認された。還元剤処理条件の下で、これらのL1タンパク質の熱安定性は、加熱により、不純物タンパク質からL1タンパク質の分離を容易にすることができる。
【００７９】
１３．還元剤の処理後、過熱・冷却過程で冷却による効果分析
図27は、還元剤の処理後、加熱のみにした条件（heating）、加熱後の冷却過程を経た条件（heating＆chilling）を比較した結果を示す。図27でパネルAは、加熱のみにした条件、加熱後の冷却過程を経た条件のタンパク質濃度を測定結果を示す。パネルBとCは、45℃と50℃の加熱条件で加熱のみにした条件（heating）、加熱後の冷却過程を経た条件（heating and chilling）のウェスタンブロッティングの結果を示す。ウェスタンブロッティング分析のために、それぞれの条件のサンプルは、同一サイズ（5、2.5、1.25μL）にローディングした。パネルAに示すように、加熱のみにした条件よりも加熱後の冷却過程を経た条件で全体のタンパク質の量が減少したことが確認された。一方、L1タンパク質は、減少を見せないことが確認された（図27B、図27C）。これらの結果は、冷却過程を通じてL1タンパク質の純度が増加することを示す。
【００８０】
図28は、還元剤の処理の後、加熱のみにした条件（H）、加熱後の冷却過程を経た条件（HC）をSDS-PAGEとウェスタンブロッティングで分析した結果を示す。正確な分析のために、それぞれのサンプルは、2.5μLと1.25μLにローディングした。還元剤処理の後、加熱のみにした条件では、protein1、protein2、protein3などの不純物タンパク質のバンド強度が強く現れたのに対し、加熱後の冷却過程を経た条件ではprotein1、protein2、protein3のタンパク質バンド強度が減少したになた（図28）。一方、L1タンパク質の量は、冷却過程で失われていないことが分かった（図28ウエスタンブロッティングの結果）。加熱のみにした条件（H only）と加熱後の冷却を経た条件（HC）の不純物タンパク質protein1、protein2、protein3のSDS-PAGE上のバンド強度は、図29に示されている。
【００８１】
１４．６０℃高温処理によるＨＰＶ１６Ｌ１  ＶＬＰ、ＨＰＶ１８Ｌ１  ＶＬ
Ｐの精製
HPV16 L1とHPV18 L1を発現する酵母細胞の破砕物に還元剤を加えた後、60℃に加熱し、冷却過程を経てVLP精製を試みた。図30のパネルAは、1次クロマトグラフィーのSDS-PAGE分析の結果である。 LSとFTはloadingサンプルとflow-throughを示す。 ElutionはL1タンパク質が溶出された分画を意味する。パネルBは、2次クロマトグラフィー後、最終産物のSDS-PAGEにより分析結果である。それぞれのL1タンパク質は、高純度に精製された。パネルCは、最終的な精製産物を透過電子顕微鏡で分析した結果である。 60℃で加熱した後L1タンパク質を精製した結果、ウイルス様粒子の形状を形成することが確認された。
【００８２】
１５．Ｔ−５方法を通じたＨＰＶ１８Ｌ１  ＶＬＰの精製
図31は、T-5の方法でHPV18 L1 VLPを精製の際、1次クロマトグラフィーのSDS-PAGEの結果を示す。 1次ヘパリンクロマトグラフィーの前に還元剤を細胞破砕物に加えた後、45℃に加熱し、氷で冷却した。図31は、1次ヘパリンクロマトグラフィーを通じて不純物タンパク質が効果的に除去されたことを示す。図32は、2次陽イオン交換クロマトグラフィーのSDS-PAGEの結果を示す。 2次クロマトグラフィーで不純物は0.6 Mと0.7 M NaClを含む分画に溶出され、L1タンパク質は、0.9 Mと1 M NaClを含む分画で溶出された。これにより、T-5の方法でHPV18 L1タンパク質を高純度に精製することができることを確認した。図33は、最終的な精製されたT-5 HPV18 L1 VLPの動的光散乱分析の結果を示す。
【００８３】
１６．Ｔ−５方法を通じたＨＰＶ５８Ｌ１  ＶＬＰの精製
図34Aは、HPV58 L1 VLPを、T-5の方法で精製の際に1次クロマトグラフィーを通じて分離されたHPV58 L1分画をSDS-PAGEで分析した結果を示す。 1次クロマトグラフィーでHPV58 L1タンパク質は主要バンドで確認された。図34Bは、HPV58 L1 VLPを2次クロマトグラフィーを通じて分離した結果をSDS-PAGEで分析した結果である。 HPV58 L1タンパク質は、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M NaClを含む分画の全般に溶出された。図35は、T-5の方法で最終的な精製されたHPV58 L1 VLPをSDS-PAGEとウェスタンブロッティングトで分析した結果を示す。 T-5の方法でHPV58 L1 VLPは、高純度に精製したことが確認された。
【００８４】
以上の本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者においてこのような具体的な技術はただ望ましい実施例に過ぎなく、これに本発明の範囲が制限されるものではないことは明確である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されるのであるだろう。
【００８５】
参考文献
1.Woodman CB, Collins SI, Young LS (2007) The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues. Nat Rev Cancer 7: 11-22.
2.National Cancer Institute (2007) Women's Health Report, Fiscal Years 2005-2006. NCI Women's Health Report FY2005-2006.
3.Burk RD, Chen ZG, Van Doorslaer K (2009) Human Papillomaviruses: Genetic Basis of Carcinogenicity. Public Health Genomics 12: 281-290.
4.de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H (2004) Classification of papillomaviruses. Virology 324: 17-27.
5.Clifford G, Franceschi S, Diaz M, Munoz N, Villa LL (2006) Chapter 3: HPV type-distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine 24 Suppl 3: S3/26-34.
6.Conway MJ, Meyers C (2009) Replication and assembly of human papillomaviruses. J Dent Res 88: 307-317.
7.Kim SN, Jeong HS, Park SN, Kim H-J (2007) Purification and immunogenicity study of human papillomavirus type 16 L1 protein in Saccharomyces cerevisiae. J Virol Methods 139: 24-30.
8.Li M, Cripe TP, Estes PA, Lyon MK, Rose RC, et al. (1997) Expression of the human papillomavirus type 11 L1 capsid protein in Escherichia coli: characterization of protein domains involved in DNA binding and capsid assembly. J Virol 71: 2988-2995.
9.Hanumantha Rao N, Baji Babu P, Rajendra L, Sriraman R, Pang YY, et al. (2011) Expression of codon optimized major capsid protein (L1) of human papillomavirus type 16 and 18 in Pichia pastoris; purification and characterization of the virus-like particles. Vaccine 29: 7326-7334.
10.Aires KA, Cianciarullo AM, Carneiro SM, Villa LL, Boccardo E, et al. (2006) Production of human papillomavirus type 16 L1 virus-like particles by recombinant Lactobacillus casei cells. Appl Environ Microbiol 72: 745-752.
11.Baek JO, Seo JW, Kim IH, Kim CH (2011) Production and purification of human papillomavirus type 33 L1 virus-like particles from Spodoptera frugiperda 9 cells using two-step column chromatography. Protein Expr Purif 75: 211-217.
12.Maclean J, Koekemoer M, Olivier AJ, Stewart D, Hitzeroth, II, et al. (2007) Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. J Gen Virol 88: 1460-1469.
13.Garland SM, Smith JS (2010) Human papillomavirus vaccines: current status and future prospects. Drugs 70: 1079-1098.
14.Madrid-Marina V, Torres-Poveda K, Lopez-Toledo G, Garcia-Carranca A (2009) Advantages and disadvantages of current prophylactic vaccines against HPV. Arch Med Res 40: 471-477.
15.National Cancer Institute Human Papillomavirus (HPV) Vaccines,
http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/prevention/HPV-vaccine.
16.Mukhopadhyay P, Paul B (2009) Introducing HPV Vaccine in Developing Countries - Addressing the Challenge. Indian J Community Med 34: 370-371.
17.Walsh G (2010) Biopharmaceutical benchmarks 2010. Nat Biotechnol 28: 917-924.
18.Vicente T, Roldao A, Peixoto C, Carrondo MJ, Alves PM (2011) Large-scale production and purification of VLP-based vaccines. J Invertebr Pathol 107 Suppl: S42-48.
19.Hofmann KJ, Cook JC, Joyce JG, Brown DR, Schultz LD, et al. (1995) Sequence determination of human papillomavirus type 6a and assembly of virus-like particles in Saccharomyces cerevisiae. Virology 209: 506-518.
20.Park MA, Kim HJ, Kim H-J (2008) Optimum conditions for production and purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181.
21.Cook JC (2003) Process for purifying human papillomavirus virus-like particles. Merck & Co., Inc.
22.Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.
23.Kim HJ, Lee SJ, Kim H-J (2010) Optimizing the secondary structure of human papillomavirus type 16 L1 mRNA enhances L1 protein expression in Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol 150: 31-36.
24.Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.
25.Kim HJ, Kwag HL, Jin Y, Kim H-J (2011) The composition of the carbon source and the time of cell harvest are critical determinants of the final yield of human papillomavirus type 16 L1 protein produced in Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 80: 52-60.
26.Kim HJ, Lim SJ, Kwag HL, Kim H-J (2012) The choice of resin-bound ligand affects the structure and immunogenicity of column-purified human papillomavirus type 16 virus-like particles. PLoS One 7: e35893.
27.Jin Y, Kim HJ, Yim GW, Tae Kim Y, Chang DY, et al. (2012) A single serum dilution enzyme-linked immunosorbent assay for determining anti-human papillomavirus (HPV) antibody titres in humans immunised with prophylactic HPV vaccines. J Pharm Biomed Anal 66: 352-355.
28.Han JE, Wui SR, Park SA, Lee NG, Kim KS, et al. (2012) Comparison of the immune responses to the CIA06-adjuvanted human papillomavirus L1 VLP vaccine with those against the licensed HPV vaccine Cervarix in mice. Vaccine 30: 4127-4134.
29.Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, Galloway DA (1994) Three-dimensional structure of vaccinia virus-produced human papillomavirus type 1 capsids. J Virol 68: 4503-4505.
30.Baker TS, Newcomb WW, Olson NH, Cowsert LM, Olson C, et al. (1991) Structures of bovine and human papillomaviruses. Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction. Biophys J 60: 1445-1456.
31.Shi L, Sanyal G, Ni A, Luo Z, Doshna S, et al. (2005) Stabilization of human papillomavirus virus-like particles by non-ionic surfactants. J Pharm Sci 94: 1538-1551.
32.Ryding J, Dahlberg L, Wallen-Ohman M, Dillner J (2007) Deletion of a major neutralizing epitope of human papillomavirus type 16 virus-like particles. J Gen Virol 88: 792-802.
33.Culp TD, Spatz CM, Reed CA, Christensen ND (2007) Binding and neutralization efficiencies of monoclonal antibodies, Fab fragments, and scFv specific for L1 epitopes on the capsid of infectious HPV particles. Virology 361: 435-446.
34.White WI, Wilson SD, Palmer-Hill FJ, Woods RM, Ghim SJ, et al. (1999) Characterization of a major neutralizing epitope on human papillomavirus type 16 L1. J Virol 73: 4882-4889.
35.Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. 
36. Chang DY, Kim HJ, Kim H-J (2012)  Effects  of  downstream  processing on  structural  integrity  and immunogenicity in the Manufacture
of papillomavirus type 16 L1 virus-like particles, 
Biotechnol Bioprocess Eng 17: 755-763.
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明はヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus、ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を高純度及び高効率で精製する方法に関するものである。本発明の精製方法によれば、ＨＰＶＬ１タンパク質の精製純度を大きく向上させるだけではなく、精製されたＨＰＶＬ１タンパク質のＶＬＰは本来ＨＰＶビリオンにより類似する構造を形成することによって免疫原性が非常に優れている。
【図１】
0006014763.tif 000004
【図２】
0006014763.tif 000005
【図３】
0006014763.tif 000006
【図４】
0006014763.tif 000007
【図５】
0006014763.tif 000008
【図６】
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【図７】
0006014763.tif 000010
【図８】
0006014763.tif 000011
【図９】
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【図１０】
0006014763.tif 000013
【図１１】
0006014763.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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