(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特にロバの乳から単離され、寄託番号ＤＳＭ２２０９８、ＤＳＭ２２０９９、ＤＳＭ２２１００、ＤＳＭ２２１０２、ＤＳＭ２２１０１、ＤＳＭ２３５５８、ＤＳＭ２３５５９、及びＤＳＭ２３５６０でＤＳＭＺに寄託された菌株から成る群から選択される、プロバイオティクス乳酸菌。
【請求項２】
少なくとも、
−請求項１に記載の生存可能なプロバイオティクス乳酸菌を食品製品に接種するステップと、
−前記プロバイオティクス乳酸菌が代謝するのに適した条件下に、前記接種した食品製品を置くステップと、
−個体数が、少なくとも１０６ＣＦＵ／ｍＬ（食品）に到達するまで、前記食品製品を発酵させるステップと、
を含む、食品組成物または飲料組成物の製造プロセス。
【請求項３】
少なくとも、
−請求項１に記載のプロバイオティクス乳酸菌を、個体数が少なくとも１０６ＣＦＵ／ｍＬに到達するまで発酵させるステップと、
−前記プロバイオティクス乳酸菌を保護するステップと、
−前記保護されたプロバイオティクス乳酸菌と食品製品とを混合させるステップと、
を含む、食品組成物または飲料組成物の製造プロセス。
【請求項４】
発酵が定常期に達した時に発酵を停止する、請求項２または３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記プロバイオティクス乳酸菌をそれらが代謝するのに適した条件下に配置した状態で２４時間以内に発酵を停止する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
リステリア、サルモネラ、カンピロバクターまたはクロストリジウムなどの食品の病原体に対して、このような食品病原体の成長の阻害によって発酵食品製品を保護するための、請求項１に記載のプロバイオティクス乳酸菌の使用。
【請求項７】
発酵の間に酪酸を製造するための、請求項１に記載のプロバイオティクス乳酸菌の使用であって、前記発酵が前記プロバイオティクス乳酸菌を利用する、使用。
【請求項８】
適した条件下で請求項１に記載のプロバイオティクス乳酸菌を発酵させるステップと、前記プロバイオティクス乳酸菌によって発酵されている間に製造された酪酸を収集するステップとを含む、酪酸を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクスとして知られている微生物及び食品産業（ヒトまたは動物の食物）におけるそれの使用方法の分野に関する。特に、本発明は、ロバの生乳から分離されたプロバイオティクスに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス微生物、または単にプロバイオティクスは、適切な用量で投与した場合、健康や栄養の面で利益を付与する可能性が高い微生物として定義することができる。それらは、所謂機能性食品のカテゴリに属する。
【０００３】
プロバイオティクスは、ダノンのＡｃｔｉｍｅｌ（登録商標）もしくはＡｃｔｉｖａ（登録商標）、ヤクルト本社のＹａｋｕｌｔ（登録商標）、またはネスレのＬＣ１（登録商標）のような市販されている商品などの乳製品でよく知られている。これらの細菌は、例えば、ビフィズス菌、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノサス、またはラクトバチルス・ジョンソニイのような、乳酸菌の異なる属及び種に属する。
【０００４】
一般的に、プロバイオティクスの正確なメカニズムは常に知られてはいないものの、プロバイオティクスが作用することにより、腸内細菌叢のバランスを保つことができるという効果を通じて、健康や栄養の利点を提供することが受け入れられている。
【０００５】
近年、ロバの乳への興味は、乳児栄養の粉ミルク、豆乳、またはその他の人工乳への有効な代替手段として用いることができるため、主にその組成のために、著しく高まってきている。実際、ロバの乳は、高分子不飽和脂肪酸、そのカルシウム／リン比、及びそのタンパク質含量という組成から、ヒトの母乳に非常に近いと考えられている。さらに、ロバの乳は、微生物の細胞壁の多糖類を加水分解することができるグリコシダーゼ、リゾチームが豊富である。幾つかの科学的証拠によって、リゾチームの栄養的、健康的重要性が証明されている。乳糖の高含有量は、カルシウムの腸管吸収にプラスの効果があり、それがおいしさを担っている。生後数ヶ月後でも、ロバの乳は、骨の石灰化を強化し、Ｉｇ−Ｅ介在の重篤な牛乳蛋白アレルギーの子供にとって、重要な栄養サポートを構成しており、従って、効率的な免疫系の形成に役割を果たす。高齢者の年代では、ロバの乳は、別の心臓血管病とコレステロール低下食生活において、プラスの効果を発揮することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規のプロバイオティクス乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的のために、本発明の実施形態は、特にロバの乳から分離し、ブタペスト条約の条件に基づいて、２００８年１２月８日に「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ社（ＤＳＭＺ社、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）で、寄託番号ＤＳＭ２２０９８、ＤＳＭ２２０９９、ＤＳＭ２２１００、ＤＳＭ２２１０２、及びＤＳＭ２２１０１として寄託された菌株、並びに、２０１０年４月２６日に寄託番号ＤＳＭ２３５５８、ＤＳＭ２３５５９、及びＤＳＭ２３５６０として寄託された菌株、並びに、前述の菌株から得られる変異株、並びに、ラクトバチルスプランタラムのクラスタに属する株（ＤＳＭ２２１０２、ＤＳＭ２２１０１、ＤＳＭ２３５５８、ＤＳＭ２３５５９、及びＤＳＭ２３５６０として寄託された菌株から成る群から選択された菌株と、少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性及び少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ＲＮＡ同一性を示す）から成る群から選択された、プロバイオティクス乳酸菌を提供する。そのようなクラスタは、以下、乳酸菌アシニ（ａｓｉｎｉ）と呼ばれる新しい種を画定する。
【０００８】
変異体は、本発明の菌株の遺伝物質の変化を推定する、または他の分子との本発明の菌株の遺伝物質の組換えを推定する遺伝子工学的手法により得られる。通常、このような変異株を得るために、当業者は、紫外線照射や変異原性化学製品への暴露などの通常の変異誘発の手法を使用することができる。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、上記のような一つまたは複数の、本発明のプロバイオティクス乳酸菌の種または系統を含む組成物を提案する。前述の組成物は、ヒトまたは動物の食用である食品組成物または飲料組成物であり得る。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様では、食品組成物又は飲料組成物の製造プロセスを提供する。前述のプロセスは、少なくとも以下のステップを含み得る。
上記のような本発明の生きたプロバイオティクス乳酸菌を食品へ接種することと、
接種した食品を、前述のプロバイオティクス乳酸菌の代謝に有利な条件下に置くことと、
少なくとも、１０６ＣＦＵ／ｍｌの個体数になるまで、前述の食品を発酵させること。
【００１１】
別の実施形態において、食品組成物または飲料組成物を製造するプロセスは、少なくとも以下のステップを含む。
上記のようなプロバイオティクス乳酸菌を、１０６ＣＦＵ／ｍｌの個体数になるまで、発酵させることと、
例えば、エンベロープによって、前述のプロバイオティクス乳酸菌を保護することと、
食品組成物と前述の保護されたプロバイオティクス乳酸菌とを混合すること。
【００１２】
発酵は、発酵が定常期に到達すると停止し、好ましくは、前述のプロバイオティクス乳酸菌をそれらの代謝に有利な条件下へ配置した状態で約２４時間以内である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、病原性微生物による粘膜のコロニー形成に関連する病気を治療するための組成物の調製における、プロバイオティクス乳酸菌の使用を提案する。粘膜としては、腸粘膜、胃粘膜を含むが、これらに限定されない。例えば、病原性微生物は腸管病原性微生物であり得る。例えば、本発明に係る乳酸菌の菌株の阻害活性は、腸管病原性微生物に対するものであり得る（例えば、サルモネラ菌、コレラ菌、大腸菌）。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、リステリアやサルモネラ、カンピロバクターやクロストリジウムなどの食品の病原体に対して、このような食品病原体の成長を阻害することにより発酵食品を保護するためのプロバイオティクス乳酸菌の使用を提案する。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、このような細菌を利用して発酵させている間に酪酸を製造するために、上記で画定した本発明のプロバイオティクス乳酸菌の使用を提案する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明のプロバイオティクス乳酸菌を好適な条件下で発酵するステップ、および前述の細菌によって発酵する間に製造された酪酸を収集するステップを含む酪酸の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明のこれらの及び他の態様、特徴、並びに利点は、添付図面に関連してここで提供される開示を読めば当業者に明らかになるであろう。詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、単なる例としてのみ与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ロバの乳内において本発明のクローン及び対照菌株のインキュベーションを２４時間行っている間のｐＨの変化を示す図である。
【図２】ロバの生乳から分離した８個のクローンのＤＮＡ指紋法を示す図である。
【図３ａ】ＤＮＡ指紋法による分析後の、クローン３７の電気泳動を示す図である。
【図３ｂ】ＤＮＡ指紋法による分析後の、クローン３８の電気泳動を示す図である。
【図３ｃ】ＤＮＡ指紋法による分析後の、クローン４１の電気泳動を示す図である。
【図３ｄ】ＤＮＡ指紋法による分析後の、クローン４３の電気泳動を示す図である。
【図３ｅ】ＤＮＡ指紋法による分析後の、クローン４８の電気泳動を示す図である。
【図４】プローブとしてｄＵＴＰ‐ジゴキシゲニンで標識したＬ．プランタラムのＤＮＡを使用した、クローン３７、３８及び４８の間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図５】クローン３７、３８、及び４８の間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの結果を示す図であり、これらは、Ｌプランタラム、Ｌパラプランタラム、およびＬペントサス株型ＤＮＡ内において、クローン３７からの標識されたＤＮＡのプローブとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイズされた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
過去数十年の間に、ヒトの健康へのプロバイオティクスの役割は、製品の製造と消費の増加だけではなく、市場の要求に顕著な増加を引き起こすことによって、科学と産業レベルの両方での大きな関連性を得た。生存性の側面のためには、プロバイオティクス株は、胃酸の極端に低いｐＨ及び胆汁酸塩の界面活性効果を克服する能力持っていること、並びに、作用部位、即ち、腸管上皮へ生存可能な生理的状態で到達することが最も重要である。プロバイオティクス株は、結腸へコロニー形成することが可能であり、積極的に病原性細菌による感染症の結果に影響を与え、免疫系に刺激を与え、好ましくない代謝物の濃度を減少させる。更に、一部の菌株は、本発明の細菌を含めて、コレステロールとトリアシルグリセロール血漿中濃度の一定の削減を提供することができる。
【００２０】
胃腸（ＧＩ）管の通過時には、プロバイオティクス培養物はペプシンの存在と胃の低ｐＨ、十二指腸のプロテアーゼが豊富な条件、及び胆汁酸塩の抗菌活性に耐える必要がある。胃のｐＨは、食物摂取後に６．０以上にまで増加する可能性があるが、一般的には２．５〜３．５の範囲である。胃の通過の後、小腸は、ＧＩ管における２番目の主要な障壁である。小腸のｐＨ（すなわち、７．０〜８．５）は、細菌の生存に向けて、より有利であるが、胆汁酸塩の存在が悪影響を与える可能性がある。伝統的に、ＧＩ管通過を生き残るためにプロバイオティクス候補の能力は、例えばチャータリスらの論文、《上部胃腸管における潜在的にプロバイオティクス乳酸菌とビフィドバクテリウム属の種の通過トレランスを決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法の開発》Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８４：７５９−７６８（１９９８）で記載されている模擬ＧＩ管液でのインキュベーション中に、生存と生殖細胞の数に関する情報を提供する従来のプレーティング技術を用いて評価する。
【００２１】
従って、このような胃液への耐性、胆汁酸塩への耐性、胆汁酸塩加水分解能、疎水性の評価、抗菌活性、抗生物質感受性など、様々な培養に基づく方法は、プロバイオティック微生物を特徴付けるために使用されることがある。これらの試験については、下記の実施例の節において十分に説明する。
【００２２】
本発明の実施形態において、プロバイオティクス細菌は、以下の条件のうち少なくとも一つを満たす。
本明細書に記載されたような胃液耐性評価後に、少なくとも７５％のＣＦＵ／ｍＬが保持されることと、
本明細書に記載されたような胃液及び胆汁酸塩耐性評価後に、少なくとも７５％のＣＦＵ／ｍＬが保持されることと、
本明細書の疎水性試験における、硫酸アンモニウム０．５Ｍ以下、好ましくは硫酸アンモニウム０．１Ｍ以下での、顕微鏡のガラス上に可視の微生物の凝集、
本明細書に記載されたように、ハローテストによって測定されたような、即ち、ハローが０．５ｃｍ未満、好ましくは０．２ｃｍ未満という、他の乳酸菌属に対する低い抗菌活性、および、
本明細書に記載されたように、ハローテストによって測定されたような、即ち、ハローが０．５ｃｍより大きい、好ましくは０．８ｃｍ大きいという、緑膿菌、セレウス菌、または大腸菌に対する阻害活性。
【００２３】
クローン３７、３８、４８、４３、４１、３２、３４及び５７は、本発明の特定の実施形態を表す。それらは、２００８年１２月８日（クローン３７、３８、４８、４３、４１）及び２０１０年４月２６日（クローン３２、３４、５７）に、以下の受託番号の下にブダペスト条約に準拠して「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ」（ＤＳＭＺ）に寄託された。
クローン  ３７            ＤＳＭ  ２２０９８
クローン  ３８            ＤＳＭ  ２２０９９
クローン  ４８            ＤＳＭ  ２２１００
クローン  ４３            ＤＳＭ  ２２１０２
クローン  ４１            ＤＳＭ  ２２１０１
クローン  ３２            ＤＳＭ  ２３５５８
クローン  ３４            ＤＳＭ  ２３５５９
クローン  ５７            ＤＳＭ  ２３５６０
【００２４】
クローン３７、３８及び３８は、ラクトバチルスプランタラムアシニ亜種に属し、クローン４３、３２、３４、５７及び４１は、乳酸菌アシニ種に属する。より具体的には、クローン３２は乳酸菌アシニＳＳＰブチリクス（ｂｕｔｙｒｉｃｕｓ）と呼ばれる亜種に属し、クローン３４は、乳酸菌アシニＳＳＰラクティスと呼ばれる亜種に属し、クローン５７は、乳酸菌アシニＳＳＰカウダツス（ｃａｕｄａｔｕｓ）と呼ばれる亜種に属している。
【００２５】
前述のプロバイオティクス細菌は、新鮮な培養または、栄養補助食品のような乾燥食品サプリメントとして提供されてもよい。後者の場合、例えば少なくとも１０８ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１０９ＣＦＵ／ｇのように高い品質の培養粉末を提供するために、バイオマスは凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。
【００２６】
本発明によると、プロバイオティクス細菌は、ヒトまたは動物が消費するための食品または飲料品を調製する際に使用されてもよい。食品と飲料は、新鮮な乳製品、発酵乳、ヨーグルトなどの発酵食品を含む。乳は通常、牛乳を指す。本発明上では、ロバの乳が好ましい場合があるが、ウマの乳、ヤギの乳、ラクダの乳、ヒツジの乳を含む他の乳も、乳製品を調製するために使用されることがある。
【００２７】
このような発酵乳製品の食品を調製するための方法は当業者の理解の及ぶ範囲内である。好ましくは、プロバイオティクス細菌は、提供または消費するまで、生存可能な形で維持される。乳は、未加工または水で再構成できる粉体で使用され得る。様々な成分を、発酵を改善するため、または消費者に付加的な健康上の利点を提供するために（例えばビタミンやミネラルの添加など）乳に添加してよい。
【００２８】
発酵の後、例えばレンネットを発酵乳に加えることによって、乳をカッテージチーズやクォークに変換することができる。そのような手順は、当業者に公知である。
【００２９】
別の実施形態において、プロバイオティクス細菌は、該組成物の発酵なしで、食品または飲料組成物の成分として使用される。言い換えると、前述のプロバイオティクス細菌は、食事や栄養補助食品である。この場合、プロバイオティクス細菌は生存可能な形態で提供されることが好ましい。
【００３０】
本発明に関するプロバイオティクス乳酸菌はまた、リステリア、またはサルモネラ、カンピロバクター、またはクロストリジウムなどの食品病原体から、そのような食品病原体の成長を阻害することによって、発酵食品のような食品を保護するために使用され得る。その場合、本明細書に開示されているような、所望のプロバイオティクス細菌を含む組成物は、食品や飲料製品に混合される。後者の製品は、所望のプロバイオティクス細菌を含む組成とは無関係に発酵されることがある。いずれの場合でも、発酵が約２４時間以上は持続しないことが好ましい。通常、プロバイオティクス菌株は、この期間内に発酵の定常期に達している。
【００３１】
本発明の実施形態において、発酵が定常期に達した所で発酵は停止され、前述のプロバイオティクス乳酸菌の代謝に有利な条件下に接種した食品を配置した状態で約２４時間以内が好ましい。
【００３２】
本発明はまた、病原性微生物による粘膜のコロニー形成に関連する疾患を治療するための組成物の調製におけるプロバイオティクス乳酸菌の使用に関する。粘膜は、腸の粘膜と胃の粘膜を含むがそれらに限定されない。例えば、病原性微生物は腸管病原性微生物であり得る。例えば、本発明に係る乳酸菌の菌株の阻害活性は腸管病原性微生物（例えば、サルモネラ菌、コレラ菌、大腸菌）に対抗し得る。これは、腸の細胞のような上皮細胞に付着するプロバイオティクス細菌の能力に関連しており、また、現在理解されているように、ある程度、腸からのそのような病原性細菌を除外する能力に関連している。同様に、これはプロバイオティクス細菌の疎水性と相関し得る。
【００３３】
本発明はまた、そのような細菌を利用した発酵過程での酪酸の製造のための本発明のプロバイオティクス乳酸菌の利用に関し、例えば、このような細菌を接種され、その後ユーザに摂取される食品の発酵、大腸での内部発酵、または適当な条件における適切な培地での発酵であって、前記微生物による発酵の過程で生成した酪酸を収集できるようにしている発酵、である。好ましい細菌は、ＤＳＭ２３５５８、ＤＳＭ２２０９８、ＤＳＭ２２１００、及びＤＳＭ２２０９９である。
【実施例】
【００３４】
培養に基づく手法（プロバイオティクスの試験、胆汁酸塩加水分解能力、疎水性の評価、抗菌活性、抗生物質感受性、有機酸の生産、インキュベーション中のｐＨの変化）
【００３５】
有機飼育から得られるロバの生乳は、順次滅菌生理溶液中（ＮａＣｌ  ０．８５％）に希釈し、特にラクトバシラス属の分離のために、ＭＲＳ（Ｍａｎ，ｄｅ  Ｒｏｇｏｓａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ）寒天プレートに接種した。プレートは、異なる温度で４８時間（Ａｎａｅｒｏｇｅｎ、オキソイド）嫌気的条件でインキュベートした。乳酸菌の分離株（約１５０）をランダムに最高希釈のＭＲＳ−寒天プレートから選んだ。分離株はＭＲＳ−ブロス培地で継代培養し、ＭＲＳ−寒天培地上に画線した。
【００３６】
プロバイオティクス性試験
【００３７】
１）胃液への耐性
【００３８】
増殖した後、各コロニーを遠心分離し、滅菌生理溶液中で洗浄し、同じ液で元の容積中に再懸濁した。胃液耐性の評価は、ＤｅＧｉｕｌｉｏらによって検定した。《凍結及び凍結乾燥後の乳酸菌の生存率を向上させるためのアルギン酸塩と低温保護糖の使用》Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：７３９−７４６（２００５）を、多少変更して。アリコートは、模擬胃液中（ペプシン３ｇ／Ｌ、ｐＨ２．５）でインキュベートし、１８０分までインキュベーションの異なる時間に取り出し、プレートした。陰性対照として、未処理の細胞を用いて接種した。胃液に対する耐性は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬで評価し、陰性対照と比較した。
【００３９】
２）胃液及び胆汁塩への耐性
【００４０】
胃液耐性のコロニーを、最大３時間、胆汁酸塩０．３％を含むＭＲＳから構成される模擬胆汁中でインキュベートし、それらをＤｅ  Ｇｉｕｌｉｏら（２００５）に従って、ＭＲＳ寒天培地に接種した。未処理のコロニーを陰性対照として用いた。胆汁塩への耐性は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬで評価し、陰性対照と比較した。
【００４１】
結果
【００４２】
ロバの生乳から分離された１５０の細菌コロニーの内、わずか８（暫定的に、クローン３２、クローン３４、クローン３７、クローン３８、クローン４１、クローン４３、クローン４８及びクローン５７と名づけた）のみが乳酸菌属に属すると同定され、胃液と胆汁酸塩に耐性を示し、未処理の対照乳酸菌を１００％として比較すると、７５％のＣＦＵ／ｍＬのコロニー形成を示した。それらの最適生育温度は、約３０〜３１℃であった。
【００４３】
１５０のコロニー中わずか８のみが、模擬胃液及び胆汁塩存在条件へ好適な耐性を示した。これらのコロニーは、次に、以下の活性について試験した：疎水性試験、胆汁酸塩加水分解活性についての培養のスクリーニング、抗菌活性、及び抗生物質感受性。
【００４４】
３）疎水性試験
【００４５】
潜在的に腸上皮に付着するコロニーの能力を、Ｓｔｒｕｓらの疎水性の間接的な方法を用いて評価した。《カンジダに対するプロバイオティクス特性を持つ膣乳酸菌のイン・ビトロでの活性》Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ，  １３（２） ：６９−７５  （２００５）及びＬｊｕｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．《ヒトの感染症から分離された黄色ブドウ球菌株をａｕｔｏａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇの高い表面疎水性は、塩の凝集試験についての研究。》Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ４７  ：  ５２２−５２６  （１９８５）。コロニーは、２４時間ＭＲＳブロス中で成長させた。微生物懸濁液は、等量の、前もって調製しておいた異なるモル濃度（２０ｍＭから４Ｍの範囲）の硫酸アンモニウムと混合した。微生物の集合体が顕微鏡のガラスに目に見えるようにできる最小の硫酸アンモニウム濃度は、塩の凝集試験に反比例する。等張液を対照として使用した。
【００４６】
結果
−０．１Ｍ硫酸アンモニウムでの微生物凝集が目視可能：クローン３２、３７、４３及び５７
−０．５Ｍ硫酸アンモニウムでの微生物凝集が目視可能：クローン３４、３８、４１及び４８
【００４７】
これらのデータから、クローン３２、３７、４３及び５７について、イン・ビトロにおける腸上皮へ接着能力がより強いという仮説を立て得る。
【００４８】
４）胆汁酸塩の加水分解活性のための培養のスクリーニング
【００４９】
胆汁酸塩の加水分解は、哺乳動物の胆汁酸塩の代謝に重要な代謝反応である。近年、人間や動物のコレステロール代謝に影響を及ぼす胆汁酸塩の加水分解の使用についての関心が増加している。胆汁酸塩の加水分解や細胞膜へのコレステロールの取り込みは、ヒトにおける血清コレステロール濃度を低下させる可能性を秘めている。小腸での結合胆汁酸塩の加水分解を介する遊離胆汁酸塩の放出は、糞便中のより多くの胆汁酸塩の排泄という結果になる。コレステロールが体内から除去される主要な手段は、加水分解胆汁酸塩の形で排泄することである。ほとんどの結合した胆汁酸塩は、腸肝循環を介して再循環されている。排泄される胆汁酸塩は、新たな胆汁酸で置き換える必要があり、これは、体内でコレステロールから形成されている。従って、胆汁酸塩がより多く排泄されると、より多くのコレステロールは、身体内のプールから利用される。さらに、遊離胆汁酸塩は、結合した胆汁酸塩が行うほどは、小腸からのコレステロールや他の脂質の吸収をサポートしていない。
【００５０】
コロニーの胆汁酸塩の加水分解活性を、Ｍｉｎｅｌｌｉらによって説明された方法によって定性的に評価した。≪機能性乳製品の生産のための新規プロバイオティクスラクトバチルスカゼイ株の評価≫Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．，１４：７２３−７２６（２００４）。簡単に言うと、株（５μＬ）の一晩培養した液体培養を、０．５％の結合胆汁酸塩混合物及び０．３７ｇ／ＬのＣａＣｌ２を含むＭＲＳ寒天培地上にスポットし、上述のようにインキュベートした。スポットの周りの沈殿胆汁酸（不透明なハロー）の存在は、胆汁酸塩を加水分解する菌株の能力を示す、正の結果をと見なされた。
【００５１】
結果
【００５２】
胆汁抽出物を加水分解する能力を定性的に評価した。すべての株は、胆汁抽出物を加水分解することができた。
【００５３】
５）抗菌活性
【００５４】
寒天プレートアッセイ上の阻害ハロー試験は微生物菌株の抗菌活性を調査するために採用された。サンプルは、以下の細菌について試験した。：
−非病原性株：乳酸菌ＤＳＭ２００７９、ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ９５９５、ラクトバチルス・ブルガリＤＳＭ２００８１、ラクトバチルス・サケイ  ＤＳＭ２０４９４、ラクトバチルス・ラムノサスＤＳＭ２０７１１
−病原性のグラム陽性菌：枯草菌ＧＮ１０１、ＤＳＭ４３１３及びＤＳＭ４３８４、並びに腸球菌ＡＴＣＣ２９２１２
−病原性のグラム陰性菌：大腸菌（ＤＳＭ８５７９）及び緑膿菌（ＤＳＭ５００７１）。
【００５５】
全ての株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ社（ＤＳＭＺ社  ドイツ）から購入した。各株は、その特定の増殖培地中に３７℃で１８時間インキュベートした。：乳酸菌は、Ｍａｎ  ｄｅ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）ブロス（オキソイド）中で培養し、大腸菌、フェカリス菌、緑膿菌及びセレウス菌は、栄養塩ブロス（オキソイド）中で培養した。微生物懸濁液（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を、均一にその特定の固体培地プレート上に広げた。各培養物の５０μＬを、接種プレート上にそれぞれ配置した。室温無菌条件下で３０分放置後、プレートは、株菌によって３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。プレートに見られるクリアゾーンの直径を正確に測定し、これは、ｃｍで表される抗菌活性である。滅菌脱イオン水を陰性対照として使用し、標準的な抗菌剤、クロラムフェニコールは、Ｄａｌｌ’Ａｇｎｏｌらのように陽性として使用した。≪いくつかのオトギリソウ属の抗菌活性≫Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ１０：５１  １−５  １６．（２００３）。
【００５６】
結果
【００５７】
ａ）他の乳酸菌に対する抗菌活性
クローンは、乳酸菌サケイ２０４９４に対する抗菌活性を示さなかった（非常に低い程度でのクローン５７を除く）。
−クローン３７、３８及び４８は、ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ９５９５、Ｌ．ブルガリカスＡＴＣＣ１１８４２、Ｌ．ファーメンタムＤＳＭ２００５２、及びＬ．ラムノサスＤＳＭ２０７１１に対して低い阻害活性を示した。
−クローン４１は、Ｌ．ファーメンタムＤＳＭ２００５２、Ｌ．ラムノサスＤＳＭ２０７１１、Ｌ．アシドフィルスＤＳＭ２００７９に対して低い阻害活性を示した。
−クローン４３は、Ｌ．ファーメンタムＤＳＭ２００５２及びＬ．アシドフィルスＤＳＭ２００７９に対して低い阻害活性を示した。
【００５８】
この結果は、通常と見なすことができ、それはバクテリオシンのような抗菌性物質のすべての乳酸菌による生産のためであり、これは、病原性細菌に対してだけでなくまた、他の乳酸菌に対する「領土防衛のメカニズム」としてふるまうことができる。
【００５９】
ｂ）病原細菌に対する抗菌活性
【００６０】
結果は以下の表に示す。
【表１】
0005875975.tif 000002
凡例：
ＮＤ    検出されず
ＯＸ    低い阻害活性（ハロ：５ｍｍ未満）
Ｘ      中間の阻害活性（ハロ：６〜８ｍｍ）
ＸＸ    離散的阻害活性（ハロ：８〜１０ｍｍ）
ＸＸＸ  強い阻害活性（ハロ：１０ｍｍより大きい）
【００６１】
Ｐｓ緑膿菌に対してクローン３７が強い抗菌活性を示すのを観察することは興味深い。クローン３７、３８及び４８は、毒素原性株の大腸菌ＤＳＭ８５７９に対して特定の抗菌活性を示した。
【００６２】
６）抗生物質感受性
【００６３】
コロニーの異なる抗生物質への感受性は、３０ｍｇ〜４０ｍｇの以下の抗生物質を用いて評価した。
−細胞壁合成の阻害剤としてアンピシリン、及びアモキシシリン；
−タンパク質合成の阻害剤として硫酸ゲンタマイシン、リンコマイシン、ストレプトマイシン硫酸塩、テトラサイクリン、クロラムフェニコール及びスピラマイシン；
−核酸合成の阻害剤としてリファミキシン（ｒｉｆａｍｉｘｉｎ）。
【００６４】
抗生物質の粉体の各々は、慎重に秤量し、溶解し、適切な希釈剤で希釈し、ＭＲＳ培地に添加する前に、滅菌濾過を行った。プレートは、ＬＡＢ株を接種し、上述のようにインキュベートした。抗生物質に対する感受性や抵抗性は阻害ハロー試験によって評価した。
【００６５】
結果
【００６６】
クローンは、テストで使用される抗生物質に対して種々の度合いの感受性を示した。下記の表に示されているように、クローン３２は全ての抗生物質に対して敏感であり、一方、その他のクローンは、ストレプトマイシン及びリンコマイシンに対してある程度の耐性を示した。
【表２】
0005875975.tif 000003
【００６７】
７）有機酸の生産
【００６８】
発酵後の有機酸の生産は、紫外線検出器（Ｂｅｃｋｍａｎ社、ＣＡ、米国）を搭載したゴールドシステム装置を用いて、濾過上澄み液の高速液体クロマトグラフィー（Ｖｕｌｅｖｉｃ，Ｒａｓｔａｌｌ＆Ｇｉｂｓｏｎ，２００４；Ｎａｚｚａｒｏら  ２００９）によって測定した。サンプルはプレパックＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７カラム（３００  ７．８ｍｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）上にロードし、０．００５ｍＭの硫酸で溶出した。合計実行時間４０分、流速０．６ｍｌ／分、注入体積２０μＬ、及び検出波長２１０ｎｍ。
【００６９】
結果
【００７０】
ロバ乳中で培養した、本発明の菌株及びいくつかの参照の菌株によって発酵中に生成される酪酸、クエン酸の量を、以下の表に示す。データは、絶対面積に関して表現している。
【表３】
0005875975.tif 000004
【表４】
0005875975.tif 000005
【００７１】
酪酸の生産は、外部から本発明の細菌が接種されている食物を発酵させて作ることができ、そのような食物は、消化器系で酪酸を増加させるために、ユーザによって摂取されている。
【００７２】
酪酸は、大腸での細菌による発酵からも生成される短鎖脂肪酸であり、大腸の上皮細胞のエネルギー需要の６０％から７０％を満たしている。さらに、酪酸は大腸、空腸、回腸の上皮の再生を刺激し、大腸内の微生物の増殖を阻害する。上皮による酪酸の代謝が悪い場合は大腸の潰瘍性炎症を引き起こす可能性がある。
【００７３】
表は、本発明の菌株が、参照の菌株よりも高い酪酸の量を生産することができることを示している。従って、本発明の菌株は、腸の壁を刺激し、免疫システムを強化することができる。
【００７４】
クエン酸は食品や飲料中の天然防腐剤として使用される。表は、本発明の菌株が、参照の菌株よりも高いクエン酸の量を生産することができることを示している。従って、それらによって本発明の菌株を含む組成物の貯蔵特性を向上させることができる。
【００７５】
８）インキュベーション中のｐＨ変化
【００７６】
ロバの乳中の微生物の増殖を試験した。ロバの乳はＥｕｒｏｌａｃｔｉｓ  Ｆａｒｍ社から、噴霧乾燥形態で得た。乳は、滅菌脱イオン水に再懸濁した（率  １００グラム＋水６００ｍｌ）。そのような懸濁４２ｍＬに、０．８４０ｍＬの分離した微生物培養（２％接種、λ６００ｎｍでの初期吸光度＝１）を接種した。サンプルは３０℃でインキュベートした。
【００７７】
ロバの乳は、ラクトバチルスプランタラム、ラクトバチルスパラプランタラム及びラクトペントサス型菌株により、同じ条件下で接種し、一方、温度３７℃がラクトバチルス・ブルガリとラクトバチルス・ラムノサスのために利用された。
【００７８】
菌株のロバ乳中の成長能力及び発酵能力は、微生物細胞の計数（インキュベーション開始から３、６及び２４時間後の、ＭＲＳ培地上の嫌気培養によって測定する）コロニー形成単位（ＣＦＵ）ｍＬ及び結果として得られるｐＨを測定することのそれぞれによって評価した。
【００７９】
結果
【００８０】
初期ｐＨ値は、７．１４であった。
【００８１】
図１は、ロバの乳中における本発明のクローン及び参照菌株のインキュベーションの、２４時間のｐＨの減少を示す。参照Ａは、本発明の異なる菌株の群を示す。参照Ｂ〜Ｆは、Ｌ．ブルガリカス、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．パラプランタルム、Ｌ．ペントサス、及びＬ．プランタラムにそれぞれ対応する。
【００８２】
図１は、本発明のクローンと比較して、参照菌株がより酸性−発酵能力が高いことを示している。商品の嗜好性に、低いｐＨは悪影響を及ぼす。従って、本発明のクローンは、そのようなクローンを含む組成物の嗜好性を維持することができる。
【００８３】
表現型と遺伝子型のアプローチ（糖の代謝、ＤＮＡ指紋、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、１６Ｓ  ＲＮＡ配列比較）
【００８４】
９）糖の代謝
【００８５】
分離物は、炭水化物発酵のＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）識別システムを使用して、種レベルまで同定した。ラクトバチルス属及び関連する生物の同定を目的としたＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ培地は、ＡＰＩ  ５０  ＣＨストリップ上の研究される４９の炭水化物の発酵を可能にする既製品の培地である。試験する微生物の懸濁液を培地中で作り、ストリップの各チューブに接種する。インキュベーション中、炭水化物は発酵し、ｐＨを低下させる酸となり、インディケータの色の変化によって検出される。結果は、生化学的プロファイルを形成しており、その識別またはタイピングに使用される。推定されるプロバイオティクス菌株をＡＰＩ  ５０  ＣＨＬストリップ中で接種し、色変化の評価を、３７℃でのインキュベーションの２４時間と４８時間後に行った。
【００８６】
各ストリップは、以下の表に示されるように構成された。結果は、ＡＰＩビオメリューソフトウェアを使用して分析した。
【表５】
0005875975.tif 000006
発酵試験の結果（ＡＰＩ）
クローン３２  同定不十分
クローン３４  同定不十分
クローン３７  ラクトバチルスプランタラム９９．５％という優れた同定
クローン３８  疑わしい同定
クローン４１  予備的な疑わしい同定
クローン４３  予備的な疑わしい同定
クローン４８  ラクトバチルスプランタラム９９．５％という優れた同定
クローン５７  同定不十分
【００８７】
遺伝学的アプローチ
【００８８】
以下の方法論を、分子同定に適用した：ＤＮＡ指紋、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション及び１６Ｓ  ＲＮＡ配列。
【００８９】
１０）ＤＮＡ指紋法
【００９０】
Ｒｏｎｉｍｕｓら（１９９７）による、ランダム増幅多型ＤＮＡ−ＰＣＲ（ＲＡＰＤ−ＰＣＲ）アッセイを、指紋パターンを生成するために使用した。ＤＮＡの増幅は、ゲノムＤＮＡを５０〜２００ｎｇ、１ＸＰＣＲ緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼキットの構成要素として提供される）、ＭｇＣｌ２を３ｍＭ、ｄＮＴＰｓを２５０μＭ、ＯＰＲ−２プライマー（５’−ＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’，配列  配列番号１）を０．５μＭ、または、ＯＰＲ−１３プライマー（５’−ＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧ−３’，配列  配列番号２）、及びＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を２．５単位含む、５０μＬのＰＣＲ反応混合物中で行った。増幅プロファイルは、９２℃で２分間の初期変性、９４℃で１５秒を３５サイクル、３６℃で１５秒間アニーリング（事前に温度勾配増幅で最適化）、及び７２℃で２分間伸長から構成した。７分の最終伸長を７２℃で実施した。ＰＣＲ産物の１０〜２０μＬを、２１００エキスパートソフトウェア（アジレント）を搭載した２１００バイオアナライザを使用して、ＤＮＡ７５００マイクロチップ（アジレント）上で電気泳動した。
【００９１】
結果
【００９２】
ＡＰＩテストに続いて遺伝子型の研究を行った。ＤＮＡ指紋法分析（図２）は、クローン３７、３８及び４８が、同じ種に属しているようであることを示す。図３ａ〜図３ｅにおいて、クローン３７、３８、４１、４３及び４８に関連した電気泳動図が提供されている。
【００９３】
１１）１６Ｓ  ＲＮＡ配列の比較
【００９４】
全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲｉｂｏＰｕｒｅ−細菌キット（Ａｍｂｉｏｎ）で抽出した。ＲＮＡは、ＲＮＡ−保存溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）に溶解し、ＵＶ−定量はバイオ光度計（登録商標）（エッペンドルフ）で行い、−８０℃で保存した。最終容積２０μＬの反応混合物中で、ゲノムＤＮＡの混入を除去するように、ＲＮＡアリコート（６μｇ）をＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ社ＤＮＡ−ｆｒｅｅＴＭキット）で消化した。ＤＮＡｓｅ消化後、ＲＮＡサンプルの濃度と純度は、製造元の指示に従って、２１００エキスパートソフトウェア（登録商標）（アジレント）を装備した２１００バイオアナライザ（登録商標）を使用してＲＮＡ−６０００−ナノ（登録商標）マイクロチップアッセイにより評価した。試験された全てのサンプルについてＲＮＡ完全性数値（ＲＩＮ）は、７超（０〜１０の範囲に対して）であった。それらを２０μＬの反応混合物中で逆転写した。１０μＬの全容量中、バイオアナライザで評価された３μｇの全ＲＮＡ、２ｐｍｏｌの１５１７Ｒフォワードプライマー（前記参照）、２ｍＭのｄＮＴＰｓを含む混合物は、７０℃で２分間インキュベートし、４０℃まで急冷却した。混合物へ、２倍の適した緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０ｍＭのジチオスレイトール、ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２０ユニット、及びＭｏＭｕＬＶ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ＠ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２００ユニット含むものを１０μＬ添加した。該反応混合物（最終容積２０μＬ）を５５℃で６０分間インキュベートし、７０℃で１５分間インキュベートし、反応及びＲＮＡ分解を停止させた。１６ＳｃＤＮＡの増幅を、１倍の適した緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２００ｐＭのｄＮＴＰＳ、３００ｎＭの大腸菌１６Ｓ  ＲＮＡ配列のアクセッション上に設計された細菌性１６Ｓ一般プライマー（８フォワード及び１５１７−リバース）を含む５０μＬの反応混合液中で、ｉＣｙｃｌｅｒ−ｉＱ５（登録商標）によって行った。増幅のプロファイルは、９４℃で３分間の初期変性、９４℃で３０秒の２５サイクル、５７℃３０秒間のアニーリング、７２度で１分間の伸長、及び７２度で７分間の最終伸長から構成した。１倍のＴＡＥ緩衝液中で５Ｖ／ｃｍで４時間、５μＬのＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲル（アガロース−１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で電気泳動を行った。臭化エチジウム（０．１μｇ／ｍＬ）は、ゲルと泳動バッファの両方に含まれており、ＰＣＲ生成物は、ＵＶ可視化によって検出され、Ｐｏｌａｐａｎ５５フィルム（ポラロイド（登録商標））上に記録した。各増幅混合物１００〜１５０μＬを空気乾燥させ、配列決定のためＭＷＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ−Ｇｅｒｍａｎｙ社）に送付した。配列決定は、プライマー８Ｆ、１５１７  Ｒ及び内部プライマー３６８  Ｆを用いて行い、第一の配列データを基に設計された。シーケンスコンティグは、「．ｓｃｆ」シーケンスファイルを利用したＤＮＡ−Ｂａｓｅｒ  ｖｅｒ２．０ソフトウェアによって行った。生成された「．ｆａｓｔａ」シーケンス（約１４００塩基長）は、ＮＢＣｌ−ＢＬＡＳＴ及び「リボソームデータベースプロジェクト」−ＲＤＰ��ータバンクで整列させた。
【００９５】
結果
【００９６】
リボソーマルＲＮＡを抽出し、レトロ転写した。得られたｃＤＮＡを増幅させ、上記のように配列を決定した。約１４００塩基のシーケンスコンティグを得て、データバンクにおいて比較した。以下は、リボソームデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）における配列比較をまとめたものである。９９．９％超の１６Ｓ  ＲＮＡ同一性を示す（菌株型）Ｌ．プランタラム、パラプランタラム及びペントサス種の非常に緊密なクラスタに私達のクローンが含まれるという構図が明らかになった。以下の結果は、これらの種と比較した本発明のクローンの１６Ｓ  ＲＮＡの同一性の割合である。
クローン４１
細菌（２０）ドメイン  （一致配列）
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（２０）門、「桿菌」（２０）綱、「ラクトバチルス」（２０）目、ラクトバシラセエ（２０）科、ラクトバチルス（２０）属
０．９９４  １４００  Ｌ．パラプランタラム（Ｔ）、ＤＳＭ１０６６７Ｔ；Ａ５３０６２９７
０．９７９  １４０５  Ｌ．プランタラム（Ｔ）、ＪＣＭ１１４９；Ｄ７９２１０
０．９８４  １４１０  Ｌ．ペントサス（Ｔ）、ＪＣＭ１５５８、Ｄ７９２１１
クローン４３
細菌（２０）ドメイン  （一致配列）
「ファーミキューテス」（２０）門、「桿菌」（２０）綱、「ラクトバチルス」（２０）目、ラクトバシラセエ（２０）科、ラクトバチルス（２０）属
１４００  Ｌ．パラプランタラム（Ｔ）；ＤＳＭ  １０６６７Ｔ；ＡＪ３０６２９７
０．９８５  １４０５  Ｌ．プランタラム（Ｔ）；ＪＣＭ  １１４９；Ｄ７９２１０
０．９９０  １４１０  Ｌ．ペントサス（Ｔ）；  ＪＣＭ  １５５８；Ｄ７９２１
クローン４８
細菌（２０）ドメイン  （一致配列）
「ファーミキューテス」（２０）門、「桿菌」（２０）綱、「ラクトバチルス」（２０）目、ラクトバシラセエ（２０）科、ラクトバチルス（２０）属
１．０００  Ｌ．プランタラム（Ｔ）；ＪＣＭ  １  １４９；Ｄ７９２  １０
クローン５７
細菌（０／２０／５１６４）ドメイン  （選択／一致／総  ＲＤＰ配列）
「ファーミキューテス」（０／２０／１１７８）門、「桿菌」（０／２０／６９７）綱、「ラクトバチルス」（０／２０／２８９）目、ラクトバシラセエ（０／２０／１１４）科、ラクトバチルス（０／２０／１０４）属
０．９８７  １４００  Ｌ．パラプランタラム（Ｔ）；ＤＳＭ  １０６６７Ｔ；Ａ５３０６２９７
０．９９０  １４０５  Ｌ．プランタラム（Ｔ）；ＪＣＭ  １１４９；Ｄ７９２１０
０．９９４  １４１０  Ｌ．ペントサス（Ｔ）；ＪＣＭ  １５５８；  Ｄ７９２１１
【００９７】
１２）ＤＮＡ−ＤＮＡ  ハイブリダイゼーション
【００９８】
定量的ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション及びＤＮＡの相同性割合の計算のために、細菌性細胞培養（各菌株について約２５０ｍｇの乾燥ペレット）から、ゲノム−ＤＮＡ−バッファセット及びゲノム−チップ−１００／Ｇカラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＳＰＡ社、ミラノ、イタリア）を使用して、製造元の指示に従って、それを若干変更して、ＤＮＡを抽出、精製した。ＤＮＡをＴＥバッファに溶かし（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ８、１ｍｍ  ＥＤＴＡ）、また、バイオ光度計（エッペンドルフ、ドイツ）を使用してＵＶ吸収による測定として、５０μｇ／ｍＬの最終濃度（ＷＳ）に連続希釈した。ＷＳ  ＤＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、ミラノ、イタリア）を使用して蛍光測定によって確認し、ＤＮＡサイズは、分子量マーカーとしてのＤＮＡ（ＤＮＡサイズ約３２ｋＤ）を使用して、０．８％ＤＮＡ−グレードアガロース（ＢＩＯ−ＲＡＤ）電気泳動によって推定した。ＷＳ溶液は、５ｎｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡを含む０．１×ＳＳＣで２ｎｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。ＤＮＡを１００℃で１０分間変性させ、水−氷槽内で素早く液浸した。各菌株について５０〜１００ｎｇのＤＮＡを、弱いバキュームに接続されているドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、米国カリフォルニア州）を使用して正に荷電したナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ）上に４連でブロットした。標準曲線２０から２００  ｎｇのＤＮＡ／相同ＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）のスポットは、ドットに含まれていた。ＤＮＡは、３分間のＵＶ露光及び１２０℃での減圧下での１時間のバッキングにより、ナイロンに架橋した。膜は分析まで、−２０℃で凍結した。
【００９９】
１μｇのプローブＤＮＡを、２０μＬの反応混合物中で、製造元の指示に従ってランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ）を使用して、ジゴキシゲニン−ｓＵＴＰに一晩標識した。膜を事前にＤＩＧ  Ｅａｓｙ−Ｈｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ社）中で４０℃で３時間ハイブリダイズし、そして２０ｐｇ／ｍＬのＤｉｇ標識されたプローブ（上述のように熱変性させた）を含有するＤＩＧ  Ｅａｓｙ−Ｈｙｂ溶液中、チューブ−回転ハイブリダイゼーションインキュベータ（ＧＦＬ）を用いて、４０℃で一晩ハイブリダイズした。ストリンジェント洗浄は、以下のように行った：０．１ＳＤＳを含む２倍のＳＳＣ溶液中で室温で５分間を２回、０．１倍ＳＤＳを含む０．１倍のＳＳＣ溶液中で６８℃で１５分間を２回。免疫検出は、抗ジゴキシゲニン−ＡＰ抗体（アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光基質、並びにＤＩＧ洗浄およびブロックバッファセットキットを用いて行い、すべての試薬及び相対的な手順についてはＲｏｃｈｅ社から得た。化学発光はＱｕａｎｔｉｔｙ−ｏｎｅソフトウェアを搭載したＶｅｒｓａＤＯＣ４０００装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して、時間露光直線性の条件で定量した。ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性の割合はＪａｈｎｋｅ（１９９４）に従って、相同ＤＮＡスポットから取得した化学発光値のメディア（調整後のボリューム輝度×ｍｍ２）を１００％として置くこと及び、相同ＤＮＡ標準曲線の線形応答を考慮にいれることによって算出した。複製サンプルのメディアの標準偏差は、メディアの値の５％を超えなかった。
【０１００】
結果
【０１０１】
代謝のデータは、プローブとしてｄＵＴＰ−ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎによって標識されたＬ．プランタラムＤＮＡを利用することにより、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって確認された。分類学的ＤＮＡ−ＤＮＡは、異なる種については、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が７０％以下に制限されることが知られているが、図４が示す通り、クローン３７、３８、及び４８は、それぞれ８６、９９、９９％のＬ．プランタラム（図４上にＬ．Ｐｌ）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を示した。
【０１０２】
三つの可能性から区別し、これまでの知見を確認すると、クローン３７、３８及び４８は、Ｌ．プランタラム（図５上のＰＬ）、Ｌ．パラプランタラム（図５のＰＰＬ）及びＬ．ペントサス（図５のＰＥ）菌株型のＤＮＡ内で、クローン３７から標識されたＤＮＡのプローブ（図５）にＤＮＡ−ＤＮＡハイブリタイズされていた。Ｎ−Ｃｔｒは陰性対照である。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態の前述の説明は、網羅的であることまたは開示された実施形態に本発明を限定することを意図したものではない。本発明の範囲内での種々の変更が当業者には明らかであり、また本発明の実施から取得してもよい。
【０１０４】
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験結果及び１６Ｓ  ＲＮＡの分析に基づき、菌株３７、３８及び４８は、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ペントサス及びＬ．パラプランタラムも存在するが、それらとは異なる固有のクラスタに属する。菌株３７、３８と４８はＬ．プランタラムの亜種を表すと考えられ、これは、Ｌ．プランタラムアシニと名づけられる。同様の理由で、菌株４１及び４３は、明らかに新しい種、乳酸菌アシニに属する。確かに、菌株４１と４３は、主にペントサス、タラム及びパラプランタラムという、他の乳酸菌と４０〜５０％の類似性を示す。
【０１０５】
菌株３７，３８及び４８、並びに菌株４１及び４３は、ラクトバチルス属に属する微生物であり、Ｌプランタラム、Ｌパラプランタラム及びＬペントサスの厳密なクラスタで９９．２パーセントより高い１６Ｓ  ＲＮＡ相同性を有し、またそのような相同性に比例する指紋と相対的なタンパク質プロファイルを有する。
【図１】
0005875975.tif 000007
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４】
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【図５】
0005875975.tif 000015
【配列表】
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