(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに直接的または間接的に連結した成長ホルモンまたは改変成長ホルモンを含む融合タンパク質であって、
前記成長ホルモン受容体ポリペプチドが、配列番号：１に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失または置換によって改変されている、融合タンパク質。
【請求項２】
前記改変が、配列番号：１に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列のアミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失を含むかまたはそれから成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸残基トリプトファン１０４が、１つまたは複数のアミノ酸残基に置換されている、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
トリプトファン１０４が、置換されている、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号２５に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸残基トリプトファン３４６での置換によって改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号２６に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列、配列番号２９に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列、または配列番号３２に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸残基トリプトファン３２１での置換によって改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ポリペプチドが成長ホルモン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する、核酸分子。
【請求項８】
添加剤または担体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含み、少なくともグリシン１４６で改変されている、改変成長ホルモンポリペプチドを含み、
前記改変成長ホルモンポリペプチドが、配列番号：１に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含み、トリプトファン１０４の欠失または置換によって改変されている成長ホルモン受容体ポリペプチドを含むポリペプチドに直接的または間接的に連結している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含む成長ホルモンポリペプチドを含み、
前記成長ホルモンポリペプチドが、配列番号：１に示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を除くアミノ酸配列を含み、トリプトファン１０４の欠失または置換によって改変されている成長ホルモン受容体ポリペプチドを含むポリペプチドに直接的または間接的に連結している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモンに結合しないまたは減少した結合を示す改変成長ホルモン受容体ポリペプチドを含む成長ホルモン融合タンパク質；前記タンパク質をコードする核酸分子および前記タンパク質を使用する治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン（ＧＨ）は、小児期における線形成長および成人における正常な体組成に重要なタンパク同化作用のサイトカインホルモンである１。ＧＨ置き換えのための現在の治療的投与計画には１日１回の皮下注射剤が必要であるが、これは不便で、しかも高価である。いくつかの手法が、ペグ化２および徐放性製剤３〜５を含めた、長時間作用型製剤を作るために取られた。ペグ化は、それが、受容体２に対するホルモンの親和性を低減するという不利益を有し、後の精製での化学修飾は、高価である。徐放性製剤は、立証された効率を有する４〜７が、かかるＧＨ製剤は、支配的な早期放出プロフィールによって特徴付けられ、超生理学的ＧＨレベルを引き起こし３、製造は、高価であり、注射は、痛い可能性がある４。製造コストを最小化し、良い薬物動態プロフィールを有し、投与が容易であり、患者に受け入れられる成長ホルモン製剤が必要とされている。
【０００３】
ＧＨは、細胞表面１型サイトカイン受容体（ＧＨＲ）を通して働く。他のサイトカイン受容体と同様に、ＧＨＲの細胞外ドメインは、タンパク分解性に切断され、結合タンパク質（ＧＨＢＰ）として循環する８。生理学的条件下で、ＧＨには、ＧＨＢＰが１：１モル比で、一部分において循環において結合しており、この複合体は、生物学的に不活性であり、クリアランスおよび分解から保護されていると思われる９、１０。ＧＨＢＰと架橋したＧＨの複合体は、遅延性のクリアランスを有するが、生物活性を有さない１１。１：１比でのＧＨとの別々に精製されたＧＨＢＰの同時投与は、ＧＨのタンパク同化作用を増大することができる１２。したがって、多くのホルモン系のように、循環における結合は、活性遊離ホルモンと平衡状態で非活性の循環貯蔵所を提供する１３。ＧＨは、部位１および部位２と称されるＧＨ上の２つの別々の部位を通して、２つの膜が結合した成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）と連続して結合する。部位１は、高親和性結合部位であり、部位２は、低親和性部位である。単一のＧＨ分子は、部位１を通して、１ＧＨＲに結合する。次いで第２のＧＨＲが、部位２を通して動員されて、ＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体を形成する。次いで複合体は、内部移行され、遺伝子発現における変化につながるシグナル伝達カスケードを活性化する。ＧＨＲの細胞外ドメインは、それぞれ約１００アミノ酸（ＳＤ−１００）の２つの連結したドメイン、細胞表面の最も近くにあるＣ末端ＳＤ−１００ドメイン（ｂ）および最も遠くにあるＮ末端ＳＤ−１００ドメイン（ａ）として存在する。三量体の複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの形成とともにホルモン結合時に起こるのは、これら２つのドメインにおける立体構造変化である。
【０００４】
我々の同時係属出願国際公開第０１／９６５６５号、国際公開第２００９／０１３４６１号および現在未公開のＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３０５６において、我々は、成長ホルモン受容体活性化のアンタゴニストおよびアゴニストとして挙動する、成長ホルモン融合タンパク質を開示する。成長ホルモン受容体の細胞外ドメインへの天然の成長ホルモンおよび改変成長ホルモンの融合は、超アゴニストおよびアンタゴニスト活性を有する改善された薬物動態および薬力学的性質を有する融合タンパク質を作る。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、成長ホルモン受容体の細胞外ドメインの改変、ならびに変化したＰＫおよびＰＤを有する融合タンパク質を作るための成長ホルモンおよび改変成長ホルモンへのこれらの改変ポリペプチドの融合、ならびに増強した成長ホルモン活性また成長ホルモン受容体活性化の抑制から利益を得るであろう疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００６】
本発明の態様に従って、成長ホルモン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに直接的または間接的に連結した成長ホルモンまたは改変成長ホルモンを含む融合タンパク質であって、前記受容体ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって改変されており、前記受容体ポリペプチドが、成長ホルモン結合活性を実質的に欠いているまたは低減した成長ホルモン結合活性を有する、融合タンパク質が提供される。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、成長ホルモン受容体；好ましくはヒト成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインを含むまたはそれから成る。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、前記細胞外結合ドメインの成長ホルモン結合ドメインにおいて改変されている。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記改変は、図１に示されたＷ１６９、Ｒ４３、Ｅ４４、Ｉ１０３、Ｗ１０４、１１０５、Ｐ１０６、Ｉ１６４およびＤ１６５から成る群から選択されるアミノ酸配列の１つまたは複数である。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態において、前記改変は、図１に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失を含むまたはそれから成る。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、前記アミノ酸残基トリプトファン１０４は、１つまたは複数のアミノ酸残基に対して置換されている。好ましくはトリプトファン１０４は、置換されている。
【００１２】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記改変は、図１におけるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２５〜１３１の改変を含む。好ましくは、前記改変は、アミノ酸残基１２５〜１３１のすべてまたは一部の欠失である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、アゴニストである。好ましくは前記融合タンパク質は、図２に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、アンタゴニストである。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、成長ホルモンへの少なくとも１つの部位２改変を含む。
【００１６】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、成長ホルモンへの少なくとも１つの部位１改変を含む。
【００１７】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、部位２および部位１改変を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、図２に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基グリシン１２０で改変された成長ホルモンを含む。
【００１９】
好ましくは、改変は、アルギニン、アラニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはグルタミン酸とのグリシン１２０の置換である。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、前記改変は、アルギニンまたはリジンまたはアラニンに対するグリシン１２０の置換である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、前記改変は、アルギニンに対するグリシン１２０の置換である。
【００２２】
好ましくは、前記融合タンパク質は、アミノ酸配列改変、アスパラギン酸によるヒスチジン１８の改変、アスパラギンによるヒスチジン２１の改変、アルギニンによるグリシン１２０の改変、アスパラギンによるアルギニン１６７の改変、アラニンによるリジン１６８の改変、セリンによるアスパラギン酸１７１の改変、アルギニンによるリジン１７２の改変、セリンによるグルタミン酸１７４の改変およびトレオニンによるイソロイシン１７９の改変を含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、前記成長ホルモンまたは改変成長ホルモンは、ペプチドリンカー、好ましくは可動性ペプチドリンカーによって、前記受容体ポリペプチドに連結している。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５、６または７つのコピーを含む。
【００２６】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記ペプチドリンカーは、改変されて、少なくとも１つの糖部分の付加のための少なくとも１つのモチーフを含む。好ましくは、前記モチーフは、Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒを含む。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドリンカー分子は、モチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）［前記モチーフは、グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒを含む］の少なくとも１つのコピーを含む。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドリンカーは、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５［式中、Ｘａａ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｘａａ１  Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４  Ｘａａ５［式中、Ｘａａ３は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ４は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５［式中、Ｘａａ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｘａａ１  Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４  Ｘａａ５［式中、Ｘａａ３は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、および
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５［式中、Ｘａａ４は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］
から成る群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも１つのコピーを含む。
【００２９】
好ましくは、前記ペプチドリンカーは、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３  Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｇｌｙ１  Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４  Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ３は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｇｌｙ１  Ｇｌｙ２  Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ４は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３  Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｇｌｙ１  Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４  Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ３は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、および
Ｇｌｙ１  Ｇｌｙ２  Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５［式中、Ｘａａ４は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］
から成る群から選択されるモチーフの少なくとも１つのコピーを含む。
【００３０】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記ペプチドリンカーは：
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３  Ｓｅｒ４  Ｇｌｙ５［式中、Ｘａａ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｓｅｒ１  Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４  Ｇｌｙ５［式中、Ｘａａ３は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｓｅｒ１  Ｓｅｒ２  Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５［式中、Ｘａａ４は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３  Ｓｅｒ４  Ｇｌｙ５［式中、Ｘａａ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、
Ｓｅｒ１  Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４  Ｇｌｙ５［式中、Ｘａａ３は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］、および
Ｓｅｒ１  Ｓｅｒ２  Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５［式中、Ｘａａ４は、プロリンを除く任意のアミノ酸である］
から成る群から選択されるモチーフの少なくとも１つのコピーを含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドリンカー分子は、グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒを含むモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピーおよびモチーフ（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで、前記ペプチドリンカーは、５〜５０アミノ酸である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、前記ペプチドリンカーは、グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒを含むモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピーおよびモチーフ（Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ）のコピーを含み、ここで、前記ペプチドリンカーは、５〜５０アミノ酸である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、前記融合ポリペプチドリンカーは、例えばオリゴ糖またはスキャフォールド系（scaffolded system）における、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、グルコース、ラムノース、キシロース、または糖の組合せから成る群から選択される少なくとも１つの糖の付加によって改変されている。
【００３４】
適した炭水化物部分は、単糖、オリゴ糖および多糖を含み、自然発生の糖タンパク質においてまたは生物システムにおいて存在する任意の炭水化物部分を含む。例えば、任意選択で保護されたグリコシルまたはグリコシド誘導体、例えば任意選択で保護されたグルコシル、グルコシド、ガラクトシルまたはガラクトシド誘導体。グリコシルおよびグリコシド基は、αおよびβ基の両方を含む。適した炭水化物部分は、グルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、シアル酸、およびマンノース、ならびに少なくとも１つのグルコース、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、シアル酸、および／またはマンノース残基を含むオリゴ糖または多糖を含む。
【００３５】
炭水化物部分における任意の官能基は、当技術分野で既知の保護基を使用して、任意選択で保護することができる（例えば、その開示が、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅら、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい）。炭水化物部分における任意の−ＯＨ基に関する適した保護基は、アセテート（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、シリル（例えばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＭＤＰＳｉ））、アセタール、ケタール、およびメトキシメチル（ＭＯＭ）を含む。任意の保護基は、ペプチドリンカーへの炭水化物部分の付着前または後に、除去することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、前記糖は、保護されていない。
【００３７】
特に好ましい炭水化物部分は、Ｇｌｃ（Ａｃ）４β−、Ｇｌｃ（Ｂｎ）４β−、Ｇａｌ（Ａｃ）４β−、Ｇａｌ（Ｂｎ）４β−、Ｇｌｃ（Ａｃ）４α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）３α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）４β−、β−Ｇｌｃ、β−Ｇａｌ、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ、Ｅｔ−α−Ｇｌｃ、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ、−Ｅｔ−Ｌａｃ、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）２、−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）３、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）２、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）３、−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）４、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）２、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）３、−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）４、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）３、−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）４、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）３、−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）４、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）５、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）６、−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）７、およびそれらの脱保護された同等物を含む。
【００３８】
好ましくは、自然発生の糖由来の炭水化物部分を構成している任意の糖類単位は、それぞれ、自然発生の鏡像異性型であることになり、これは、Ｄ−型（例えばＤ−グルコースまたはＤ−ガラクトース）、またはＬ−型（例えばＬ−ラムノースまたはＬ−フコース）とすることができる。任意のアノマー結合は、α−またはβ−結合とすることができる。
【００３９】
本発明のさらなる代替的な実施形態において、前記融合タンパク質は、ペプチド連結分子を含まず、成長ホルモンまたは改変成長ホルモンおよび受容体ポリペプチドの直接的な融合である。
【００４０】
本発明のさらなる態様に従って、図３に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００４１】
本発明のさらなる態様に従って、図４に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６における置換によって、改変されている。
【００４２】
本発明の別の態様に従って、図５に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３２１おける置換によって、改変されている。
【００４３】
本発明の別の態様に従って、図６に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００４４】
本発明の別の態様に従って、図７に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００４５】
本発明の別の態様に従って、図８に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３２１おける置換によって、改変されている。
【００４６】
本発明の別の態様に従って、図９に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００４７】
本発明の別の態様に従って、図１０に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００４８】
本発明の別の態様に従って、図１１に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３２１おける置換によって、改変されている。
【００４９】
本発明の別の態様に従って、図１２に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５０】
本発明の別の態様に従って、図１３に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５１】
本発明の別の態様に従って、図１４に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５２】
本発明の別の態様に従って、図１５に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５３】
本発明の別の態様に従って、図１６に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５４】
本発明の別の態様に従って、図１７に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５５】
本発明の別の態様に従って、図１８に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４９おける置換によって、改変されている。
【００５６】
本発明の別の態様に従って、図１９に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５７】
本発明の別の態様に従って、図２０に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５８】
本発明の別の態様に従って、図２１に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００５９】
本発明の別の態様に従って、図２２に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００６０】
本発明の別の態様に従って、図２３に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００６１】
本発明の別の態様に従って、図２４に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００６２】
本発明の別の態様に従って、図２５に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００６３】
本発明の別の態様に従って、図２６に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００６４】
本発明の別の態様に従って、図２７に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４６おける置換によって、改変されている。
【００６５】
本発明の別の態様に従って、図２８に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４９おける置換によって、改変されている。
【００６６】
本発明の別の態様に従って、図２９に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４９おける置換によって、改変されている。
【００６７】
本発明の別の態様に従って、図３０に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４９おける置換によって、改変されている。
【００６８】
本発明の別の態様に従って、図３１に示されたアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸残基トリプトファン３４９おける置換によって、改変されている。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、トリプトファンは、アラニンに対して置換されている。
【００７０】
本発明の態様に従って、本発明による融合ポリペプチドをコードする核酸分子、または前記核酸分子にハイブリダイズしかつ成長ホルモン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補核酸分子が互いに一定量、水素結合される場合に起こる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を囲んでいる環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、および使用する核酸分子の組成および長さに従って、変動することができる。ストリンジェンシーの特定の程度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１）；およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）において考察されている。Ｔｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％が、その相補鎖にハイブリダイズされる温度である。以下のものは、ハイブリダイゼーション条件の典型的なセットであり、限定的ではない。
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
２回洗浄：それぞれ、２×ＳＳＣ、室温（ＲＴ）で１５分間
２回洗浄：それぞれ、０．５×ＳＳＣ、６５℃で２０分間
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：５×〜６×ＳＳＣ、６５℃〜７０℃で１６〜２０時間
２回洗浄：それぞれ、２×ＳＳＣ、ＲＴで５〜２０分間
２回洗浄：それぞれ、１×ＳＳＣ、５５℃〜７０℃で３０分間
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：それぞれ、２×〜３×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で２０〜３０分間。
【００７２】
本発明のさらなる態様に従って、本発明による核酸分子を含むベクターが提供される。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、前記ベクターは、本発明による核酸分子を発現するように適応された発現ベクターである。
【００７４】
本発明による核酸（複数可）を含むベクターは、特に、ベクターが、安定なトランスフェクションのために、ゲノム中への組換えのために細胞中に核酸を導入するために使用される場合、プロモーターまたは他の制御配列を含むことを必要としない。好ましくは、ベクターにおける核酸は、宿主細胞における転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントに作動可能に連結している。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能発現ベクターとすることができる。「プロモーター」によって、転写開始部位から上流にあり、転写のために必要なすべての調節領域を含有するヌクレオチド配列を意味する。適したプロモーターは、真核または原核細胞における発現のための、構成的、組織特異的、誘導性、発生的または他のプロモーターを含む。「作動可能に連結している」は、プロモーターから開始される転写に関して適切に位置し方向付けられ、同じ核酸分子の一部として結合していることを意味する。プロモーターに作動可能に連結しているＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。
【００７５】
好ましい実施形態において、プロモーターは、構成的、誘導性または、調節可能なプロモーターである。
【００７６】
本発明のさらなる態様に従って、本発明による核酸分子またはベクターをトランスフェクトされたまたはそれで形質転換された細胞が提供される。
【００７７】
好ましくは、前記細胞は、真核細胞である。あるいは、前記細胞は、原核細胞である。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態において、前記細胞は、真菌細胞（例えばピキア種、サッカロミセス種、ニューロスポラ種）、昆虫細胞（例えばスポドプテラ種）、哺乳類細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞から成る群から選択される。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、前記細胞は、安定にトランスフェクトされる。本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記細胞は、一過性にトランスフェクトされる。
【００８０】
本発明のさらなる態様に従って、添加剤または担体を含む、本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、さらなる治療薬と組み合わされる。
【００８２】
投与する場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される製剤において投与する。かかる製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、および任意選択で他の治療薬例えば化学療法剤を、常法に従って含有することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、注射を含めた、任意の従来法の経路によって投与することができる。投与および適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（眼）、真皮（例えば皮膚または粘膜中へのクリーム脂質可溶性挿入物）、経皮、または鼻腔内とすることができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、有効量で投与する。「有効量」は、単独で、またはさらなる用量もしくは相乗的薬物と共に、所望の応答をもたらす医薬品／組成物の量である。これは、疾患の進行を一時的に遅くすることのみを伴うことができるが、より好ましくは、それは、疾患の進行を永久に停止することを伴う。これは、通例の方法によってモニターすることができるかまたは診断法に従ってモニターすることができる。
【００８５】
対象に投与する医薬品組成物の用量は、種々のパラメーターに従って、特に、使用する投与の様式および対象の状況（すなわち年齢、性別）に従って選択することができる。投与する場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される量および薬学的に許容される組成物において適用する。医薬において使用する場合、塩は、薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩を、好都合に使用して、その薬学的に許容される塩を調製することができ、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的におよび薬学的に許容される塩は、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものを含むが、これらに限定されない。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などの、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として、調製することができる。
【００８６】
医薬組成物は、所望の場合、薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書では、ヒト中への投与に適した１つまたは複数の適合性の固体または液体増量剤、賦形剤またはカプセル化物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分がそれと組み合わされて、適用を促進する、天然または合成、有機または無機成分を意味する。医薬組成物の構成成分は、所望の薬学的効率を実質的に損なう相互作用がないように、本発明の分子と、および互いに、混合されることもできる。
【００８７】
医薬組成物は、塩中に酢酸、塩中にクエン酸、塩中にホウ酸、および塩中にリン酸を含む、適した緩衝剤を含有することができる。
【００８８】
医薬組成物は、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの、適した防腐剤も含有することができる。
【００８９】
医薬組成物は、単位剤形で好都合に提供することができ、薬学の分野でよく知られている任意の方法によって、調製することができる。すべての方法は、活性薬剤を、１つまたは複数の副成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を液体担体、微粉化した固体担体、または両方と均一におよび本質的に結合させ、次いで必要な場合、生成物を付形することによって、調製される。
【００９０】
経口投与に適した組成物は、それぞれ所定の量の活性化合物を含有する、カプセル剤、錠剤、トローチ剤などの、別々の単位として提供することができる。他の組成物は、シロップ剤、エリキシル剤またはエマルションなどの、水性液体または非水性液体における懸濁剤を含む。
【００９１】
非経口投与に適した組成物は、レシピエントの血液と好ましくは等張である無菌水性または非水性製剤を好都合に含む。この製剤は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の方法に従って、製剤化することができる。無菌の注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中溶液として、無毒の非経口的に許容される賦形剤または溶媒における無菌の注射用溶液または懸濁液とすることもできる。用いることができる許容される溶媒としては、水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、および等張食塩水が挙げられる。さらに、無刺激性の固定油が、溶媒または懸濁媒として従来用いられている。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含めた、任意の無刺激性の固定油（bland fixed oil）を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射薬の製剤において使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出すことができる。
【００９２】
本発明のさらなる態様に従って、成長ホルモン欠乏症に罹っているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１種のポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【００９３】
本発明の好ましい方法において、前記成長ホルモン欠乏症は、小児成長ホルモン欠乏症である。
【００９４】
本発明の好ましい方法において、前記成長ホルモン欠乏症は、成人成長ホルモン欠乏症である。
【００９５】
成長ホルモン欠乏症の治療は、例えば、ターナー症候群、プラダーウィリー症候群、子宮内胎児発育遅延、特発性低身長、腎不全、例えば化学療法治療中およびＡＩＤＳの治療における異化状態の治療を含む。
【００９６】
本発明のさらなる態様に従って、成長ホルモン過剰に罹っているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１種のポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【００９７】
本発明の好ましい方法において、前記成長ホルモン過剰は、巨人症をもたらす。
【００９８】
本発明の好ましい方法において、前記成長ホルモン過剰は、先端巨大症をもたらす。
【００９９】
本発明のさらなる態様に従って、がんに罹っているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１種のポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【０１００】
本明細書では、「がん」という用語は、自律的増殖、すなわち、急速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状況または状態のための能力を有する細胞を表す。この用語は、病理組織学的型または侵襲性の段階に関係なく、がん性増殖または発がんプロセス、転移性組織または悪性に形質転換された細胞、組織、または器官のすべての型を含むものとする。「がん」という用語は、例えば、肺、胸、甲状腺、リンパ、胃腸、および尿生殖路に影響するものなどの様々な器官系の悪性腫瘍ならびに大部分の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。「癌腫」という用語は、当技術分野において認識されており、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、およびメラノーマを含めた、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を表す。典型的な癌腫は、頚部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものを含む。「癌腫」という用語は、例えば、癌性のおよび肉腫組織から成る悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織由来のまたはそこで腫瘍細胞が認識できる腺構造を形成する癌腫を表す。「肉腫」という用語は、当技術分野において認識されており、間葉派生物の悪性腫瘍を表す。
【０１０１】
本発明の好ましい方法において、前記がんは、前立腺がんである。
【０１０２】
本発明の好ましい方法において、前記ポリペプチドは、静脈内に投与される。
【０１０３】
本発明の代替的な好ましい方法において、前記ポリペプチドは、皮下に投与される。
【０１０４】
本発明のさらなる好ましい方法において、前記ポリペプチドは、毎日または２日間間隔で投与される。好ましくは、前記ポリペプチドは、毎週、２週間に１回または毎月間隔で投与される。
【０１０５】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」および「含有する」という言葉およびその言葉の変形物、例えば「含むこと（comprising）」および「含む（comprises）」は、「を含むが限定されない」を意味し、他の部分、追加物、構成成分、整数またはステップを排除することは意図されていない（および排除しない）。
【０１０６】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈が要求しない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されるところで、明細書は、文脈が要求しない限り、複数および単数を企図しているものと理解されるべきである。
【０１０７】
本発明の特定の態様、実施形態または例とともに記載された特色、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、それとともに不適合でない限り、本明細書で記載した任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。
【０１０８】
本発明の実施形態を、ここで、例のみによっておよび以下の図を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】ヒト成長ホルモン受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】トリプトファン１０４からアラニンへの置換を有するヒト成長ホルモン受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２】ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図３】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図４】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図５】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｖ３のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図６】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図７】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図８】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｖ３のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図９】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１０】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１１】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｖ３のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１２】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１３】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１４】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１５】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１６】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１７】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１８】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図１９】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２０】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｇ１−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２１】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｇ１−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２２】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｇ１−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２３】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｇ１−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２４】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｇ３−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２５】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｇ３−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２６】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｇ３−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２７】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｇ３−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２８】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｇ４−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図２９】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ８−Ｇ４−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図３０】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｇ４−Ｖ１のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図３１】成長ホルモン融合タンパク質１Ｂ９−Ｇ４−Ｖ２のアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列は、太字で示され、任意選択である。
【図３２】１Ｂ７ｖ２＿野生型（レーン１）および１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４変異体（レーン２）の分離を示すｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットを示す図である。イメージは、１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４におけるＧＨＲ部分における変異、Ｗ１０４Ａの包含が、１Ｂ７ｖ２分子間の二量体であると考えられているものの形成を防ぐことを示す。この二量体の形成は、主にＧＨのＧＨＲとの分子間結合の結果であると考えられる。
【図３３】１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａ；トランスフェクション１（レーン１）、１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａ；トランスフェクション２（レーン２）および１Ｂ７ｖ２＿野生型（レーン３）の分離を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットを示す図である。両方の分子は、約７５ｋＤａで検出される。
【図３４】２９３Ｈｉ細胞において行ったデュアルルシフェラーゼバイオアッセイからの修正されたルシフェラーゼデータを示すグラフである。これらのデータは、非変異体１Ｂ７Ｖ２＿Ｈｉｓｔと比較して、１Ｂ７Ｖ２＿Ｈｉｓｔ＿Ｗ１０４変異体に関する増加した生物活性を示す。これは、変異体の包含が、１Ｂ７Ｖ２分子の生物活性を実際に増加させることができることを示す。
【図３５】プレート１：ｒｈＧＨ検量線、プレート２：安定なＧＨｗｔトランスフェクトされた細胞からの培地、プレート３：安定な１Ｂ７ｖ２＿ｗｔトランスフェクトされた細胞からの培地、プレート４：安定な１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａトランスフェクトされた細胞からの培地、プレート５：対照培地試料を示すグラフである。
【図３６】組換えヒト成長ホルモンおよび１Ｂ７ｖ２＿ｗｔと比較した、１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａ変異体によるＮｂ２細胞の増殖の刺激を例示する図である。
【実施例】
【０１１０】
材料および方法
特に明記しない限り、すべての材料は、Ｓｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から購入した。組換えＧＨは、Ｐｆｉｚｅｒから購入し、結合アッセイにおいて使用した組換えＥ．ｃｏｌｉ由来ヒトＧＨ結合タンパク質は、ＤＳＬ（ＤＳＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）からの寄贈品であり、ヨウ化ＧＨは、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ  Ｐａｒｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）からの寄贈品であった。精製および特徴付けに使用したＧＨおよびＧＨＲ  ｍＡｂは、社内の材料であった。
【０１１１】
トリプトファン−１０４（Ｗ１０４）からアラニン（Ａ１０４）への置換を含有する１Ｂ７ｖ２／ｖ３分子の構築、発現および試験
段階１：１Ｂ７ｖ２／ｖ３＿Ｈｉｓｔ分子の構築
１．制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＡｇｅｌを使用して、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ０−Ｈｉｓｔを消化する。この分子は、Ｃ末端でヒスチジンタグを含有し、したがって、この領域において終止コドンを有さない（配列に関して図１．２を参照されたい）
２．ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ２およびｖ３分子（これらの分子は、Ｈｉｓｔタグの前に終止コドンを含有し、したがって、Ｈｉｓｔタグづけされていない、図１．４を参照されたい）を採取する。この分子におけるＥｃｏＲＶ／Ａｇｅｌ配列をｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ０−Ｈｉｓｔ（図１．２）由来の配列と置き換えることは、Ｈｉｓｔ−タグへの読み過ごしを可能にすることになる。
図２．１：ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ０−Ｈｉｓｔ
ＥｃｏＲＶおよびＡｇｅｌ部位は、赤色で示す。Ｈｉｓｔタグは、イタリック体で示し、下線を引いている。リンカーは、太字で示す。シグナル配列は、下線を引いている。
0006029601.tif 000002
図２．２：ＥｃｏＲＶ／Ａｇｅｌ断片
0006029601.tif 000003
図２．３：ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ２
ＥｃｏＲＶおよびＡｇｅｌ部位は、赤色で示す。リンカーは、太字で示す。Ｈｉｓｔタグは、下線を引いており、イタリック体で示す。終止コドンは、大きいフォントで示す。
0006029601.tif 000004
図２．４：ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ２＿Ｈｉｓｔ
0006029601.tif 000005
注：同じ反応を、１Ｂ７ｖ３＿Ｈｉｓｔ分子の構築に関して行う
【０１１２】
段階２：Ｗ１０４Ａ  ＧＨＲ変異の構築
鋳型としてｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ２＿Ｈｉｓｔを使用する。Ｗ１０４変異の構築後、変異を、ＡｖｒＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ酵素を使用して、他の構築物（１Ｂ７ｖ２およびＧＨＢＰ＿Ｈｉｓｔ）に単純に移すことができる。
【０１１３】
方法１：ＰＣＲに基づく方法
ハイライトしたＤＮＡ（以下の配列を参照されたい）は、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＷ１０４変異の両方を含むＤＮＡプライマーを使用して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増殖されることになる。方法は、どちらもＷ１０４変異を含む、２つのＰＣＲ断片を作製する。重複ＰＣＲ（すなわち両方のＤＮＡ断片が、重複配列により、互いにアニールすることになる）を使用して、我々は、隣接するＡｖｒＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する全長ＤＮＡ挿入断片を作製することになる。次いでこれを両方の酵素で消化し、適切なベクター中にライゲートすることができる。
【０１１４】
ＰＣＲ反応およびプライマー設計：
１Ｂ７分子のＧＨＲ部分を示す配列：Ｗ１０４Ａ変異は、下線を引いている。ＡｖｒＩＩおよびＥｃｏＲＶ部位は、オレンジ色で示す。
0006029601.tif 000006
【０１１５】
ＰＣＲ反応１：
プライマー１＝ＧＨＲ−ＡｖｒＩＩ：順方向プライマー：ＧＨＲの５’末端に結合し、内在性の制限部位ＡｖｒＩＩ（Ｃ＞ＣＴＡＧＧ）を含む。ＡｖｒＩＩ部位は、下線を引いて示し、ＧＨＲ配列は、イタリック体で示す（５’＞３’）。Ｔｍ＝６０Ｃ。２８ｍｅｒ
0006029601.tif 000007
プライマー２＝ＧＨＲ＿Ｗ１０４ｒｅｖ：逆方向プライマーは、Ｗ１０４変異（Ｗ＞Ａ、ＴＧＧ＞ＧＣＡ）を含有する。ＰＣＲ反応２への重複配列も含有する。
オーバーハングに関するＴｍ＝３０Ｃ、３’末端に関するＴｍ＝５８Ｃ。３８ｍｅｒ
0006029601.tif 000008
0006029601.tif 000009
【０１１６】
ＰＣＲ反応２：
プライマー３＝ＧＨＲ＿ＥｃｏＲＶｒｅｖ。逆方向プライマーは、ＧＨＲの３’末端に結合し、内在性の制限部位ＥｃｏＲＶを含む。ＥｃｏＲＶ部位は、角括弧で示す。ＧＨＲ配列は、イタリック体で示す。Ｔｍ＝６２Ｃ
３４ｍｅｒ
0006029601.tif 000010
プライマー４：＝ＧＨＲ＿Ｗ１０４ｆｏｒ：順方向プライマーは、Ｗ１０４変異（Ｗ＞Ａ、ＴＧＧ＞ＧＣＡ）を含有する。
Ｔｍ＝６０Ｃ。オーバーハングに関するＴｍ＝２６Ｃ。３４ｍｅｒ
0006029601.tif 000011
0006029601.tif 000012
【０１１７】
段階３：ＰＣＲ断片の生成
ＰＣＲ反応１
伸長酵素系（expand enzyme system）を使用。Ｑｉａｇｅｎゲル単離キットを使用した、１％アガロース／ＴＡＥゲル上での、ゲル単離ＰＣＲ断片。
【０１１８】
【表１】
0006029601.tif 000013
【０１１９】
注意：鋳型を、反応混合物に最後に加える。水およびｄＮＴＰを、鋳型による汚染を防ぐために、最初に加える。相互汚染を避けるために、ＭＭＩが調製されるまで、ＭＭ２材料を取り出さない。準備ができるまで、ＭＭＩを氷の上に置く。
【０１２０】
【表２】
0006029601.tif 000014
【０１２１】
正の対照。ＰＣＲ条件下で産物を作製することが知られている試料、ＧＨ鋳型（ＧＨ１−２３およびＧＨ  Ｈｉｎｄｒｅｖプライマーを有するＧＨｓｔｏｐ鋳型）。負の対照は、上記の反応であるが、鋳型はない。２５ｕｌのＭＭＩを、２５ｕｌのＭＩＩと混合し、鉱物油で覆う。
【０１２２】
ＰＣＲ反応：
９５Ｃで２分間、［９５Ｃで３０秒、５４Ｃで３０秒、７２Ｃで３０秒］２５サイクル、
７２Ｃで１０分間
【０１２３】
上記のＰＣＲ反応を、ＰＣＲ２に関して繰り返す（適切なプライマーと置き換える）
【０１２４】
ＰＣＲ反応３
重複ＰＣＲ反応。反応１および２からのＰＣＲ断片を、アニールし、制限酵素部位ＡｖｒＩＩおよびＥｃｏＲＩを含む適切な順方向および逆方向プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅する。
【０１２５】
【表３】
0006029601.tif 000015
【０１２６】
注意：鋳型を、反応混合物に最後に加える。水およびｄＮＴＰを、鋳型による汚染を防ぐために、最初に加える。相互汚染を避けるために、ＭＭＩが調製されるまで、ＭＭ２材料を取り出さない。
【０１２７】
【表４】
0006029601.tif 000016
【０１２８】
【表５】
0006029601.tif 000017
0006029601.tif 000018
【０１２９】
段階４：ＰＣＲ反応３のクローニング
ＰＣＲ反応３の消化
Ｑｉａｇｅｎゲル単離キットを使用した、１％アガロース／ＴＡＥゲル上での、ゲル単離ＰＣＲ断片。制限消化反応は、以下のように設定する。
【０１３０】
【表６】
0006029601.tif 000019
【０１３１】
３７Ｃで２４時間。消化された断片を単離し、ＴＡＥ／アガロースによって消化物を分析する。流れているアガロースゲルを標準と対照して濃度を推定する、または２６０ｎｍでＮａｎｏｄｒｏｐを使用する。
【０１３２】
段階５：付着／平滑末端のライゲーション
１０〜１５ｕｌの総体積において、１：３（モル）のプラスミド対挿入断片の最初の割合を設定する
使用するための断片の量を、以下のように計算する（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼデータシートから得た）
【０１３３】
【数１】
0006029601.tif 000020
【０１３４】
【表７】
0006029601.tif 000021
【０１３５】
段階６：ライゲーション産物の形質転換：
５ｕｌの上記ライゲーション産物を採取し、ＸＬ１−青色化学コンピテント細胞に加えた。氷の上で３０分間放置し、次いで４２Ｃで熱ショックする。さらに３０分間、氷の上に放置する。ライゲーション混合物を、１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する新たに調製された寒天板上にプレートアウトする。３７Ｃでｏ／ｎ放置する。
【０１３６】
クローンの分析：
＋ｖｅクローンからプラスミドを調製し、Ｎｈｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩ（全長クローンを作製する）を使用して、制限消化によって確実性を確認する。これらのライゲーション産物は、以下の構築物を作製する。
【０１３７】
段階７：ＰＣＲスクリーニングおよび配列決定によって、クローンを検証する：
Ａ−Ｔａｑポリメラーゼを使用したＰＣＲによる、ライゲーションクローンをスクリーニングする
単離された単一のコロニーを採取し、寒天グリッドプレート中に画線し、次いで残部を鋳型として５ｕｌ  ＳＤＷに加える。
【０１３８】
【表８】
0006029601.tif 000022
【０１３９】
【表９】
0006029601.tif 000023
【０１４０】
ＰＣＲ反応：
９５Ｃで２分間、［９５Ｃで３０秒間、５２Ｃで３０秒間、７２Ｃで３０秒間］３５サイクル、７２Ｃで１０分間
【０１４１】
段階８：クローンの配列決定（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで完成した）：
少なくとも２つのクローンを、配列決定のために提出する。各プラスミドを１００ｎｇ／ｕｌで少なくとも１０ｕｌ（合計１ｕｇ）、１ｐｍｏｌ／ｕｌの関連するプライマーと一緒に送付する（少なくとも１０ｕｌ送付する）
【０１４２】
１Ｂ７ｖ２および１Ｂ７ｖ２  Ｗ１０４Ａの一過性の細胞発現
１．トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、フラスコからＣＨＯ細胞を除去し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンに再懸濁した。
２．ウェルあたり１ｍｌを使用して、２４ウェル−プレートのウェル中に２×１０Ｅ５  ＣＨＯ細胞個で播種する。忘れずにトランスフェクトされていない対照のための場所を残す。付着のためにｏ／ｎ放置する。
３．翌日、３：２の割合でＦｕｇｅｎｅ−６（またはＭｉｒｕｓ）を使用してＤＮＡにトランスフェクトする、すなわち４マイクログラムのＤＮＡを、容量１００ｕｌの無血清培地中の６ｕｌのＦｕｇｅｎｅ−６に加える。簡潔に述べると、Ｆｕｇｅｎｅ−６をＲｍＴに温め、ボルテックスすることによって予混する。６ｕｌを１００ｕｌ無血清培地中にピペットで移す。フリックすることによって穏やかに混合し、ＤＮＡを加え、穏やかにフリックすることによって再び混合する。ＲｍＴで１５分間放置する。個々のウェル中にトランスフェクション混合物をピペットで移し、内容物をよく回旋して、確実に均一に分布させる。Ｆｕｇｅｎｅ−６を使用しているチューブのプラスチック側と接触させない。
４．２４時間細胞を放置し、必要に応じて、培地を無血清培地に変える。培地を回収する前に、細胞を処置後４８〜７２時間放置する。
５．産物の力価は、約３〜５日後、通常は安定する。
６．ＮａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方を使用して、発現を試験する。
【０１４３】
安定な細胞発現
哺乳類の発現系を、改変ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＳｅｃＴａｇ−Ｖ５／ＦＲＴ−Ｈｉｓｔを使用して、樹立した。このベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  Ｆｌｐ−Ｉｎシステムにおいて使用して、標的遺伝子の組込みを宿主細胞系統中に向け、高発現のために、宿主ゲノム内の特異的な部位中への安定なクローンの急速な生成を可能にする。
【０１４４】
Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞系の培養；基礎的な細胞培養技法を使用して、製造業者の指示に従った。
【０１４５】
安定な細胞系を、Ｆｕｇｅｎｅ−６をトランスフェクション試薬として使用して、６ウェルプレートにおいて生成した。ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、発現ベクターおよびｐＯＧ４４、ｆｌｐリコンビナーゼ、細胞染色体の「ホットスポット」中へのＬＲ−融合遺伝子の組換えを引き起こす酵素を発現するプラスミドをコトランスフェクトした。ハイグロマイシンＢを使用して、正の組換えを有する細胞を選択した。
【０１４６】
ＧＨ−ｅｘＧＨＲ融合物の精製
それぞれヒト下垂体および肝臓由来のヒトＧＨおよびＧＨ受容体を、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ヒトＧＨ分泌シグナル配列下で、ベクター、ｐＳｅｃＴａｇ−Ｖ５／ＦＲＴ／Ｈｉｓｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中にクローニングした。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーの４つの反復を使用して、ヒトＧＨの天然のＣ末端をヒトＧＨＲの天然のＮ末端に連結した。安定なクローンを、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）において作製し、タンパク質を含まない培地に適合させ、懸濁培養において増殖した。ＬＲ−融合物発現を、社内のＥＬＩＳＡによって確認した。親和性精製を、ＧＨ  ｍＡｂカラムを使用して行った。
【０１４７】
転写バイオアッセイ
これらを、ヒトＧＨＲを安定に発現するヒト２９３細胞において、上記のように行った１６。ＥＬＩＳＡ。社内のＧＨおよび融合ＥＬＩＳＡを、サンドウィッチＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて樹立した。アッセイにおいて、標準（ＧＨまたは融合）、対照および未知のものを、ヒトＧＨ抗体（ｍＡｂ  １０Ａ７）に対するマウス抗体で前もって被覆したウェルにおいて、ヒトＧＨ（ｍＡｂ  ７Ｆ８）に対するビオチン標識したマウス抗体でインキュベートする。アッセイに関する検出限界は、２．５ｐｇであり、アッセイ内およびアッセイ間ＣＶは、＜１０％である。ＩＧＦ−Ｉ  ＥＬＩＳＡは、ＤＳＬ（ＤＳＬ−１０−２９００  ＡＣＴＩＶＥマウス／ラットＩＧＦ−Ｉキット；ＤＳＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から購入した。
【０１４８】
Ｎｂ２増殖アッセイ
細胞系Ｎｂ２がラクトゲンの存在下で増殖する能力およびＣｅｌｌｔｉｔｒｅ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した内在性の脱水素酵素活性のアッセイ
非放射性増殖アッセイ試薬（Ｃａｔ＃Ｇ３５８Ｃ、Ｌｏｔ＃２４４６４４０３、１つの溶液試薬を使用する準備ができている：２０ｕｌを培地に直接加える）
１．Ｎｂ２細胞を採取し、約２０ｍｌのアッセイ培地で２回洗浄する。ｍｌあたり５．５×１０Ｅ５細胞個でアッセイ培地に再懸濁する。
２．細胞をＴ７５フラスコにおいてｏ／ｎ増殖して、３７Ｃ、５％ＣＯ２で細胞からラクトゲンを枯渇させる。
３．アッセイに関して：細胞を計数し、密度をアッセイ培地中で５０ｕｌ中約２×１０Ｅ４細胞個（ｍｌあたり４×１０Ｅ５細胞個）に調節する。９６ウェルプレート上に蒔く（１００×５０×（２×１０Ｅ４）＝２×１０Ｅ６細胞個を必要とする）。
４．以下の表において示す一連のＰＲＬ標準を調製する。試料および対照希釈物を、示す通りに調製する。割り当てたウェルに、それぞれ５０ｕｌを加える。
５．細胞を標準および試験試料の存在下で、３７Ｃ／５％ＣＯ２で約３日間増殖する。
６．アッセイするために：２０ｕｌのＣｅｌｌＴｉｔｒｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ）を加え、３７Ｃで２〜６時間放置する。
７．マイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルのＡ４９０ｎｍ示度を記録する。
【０１４９】
薬物動態学的試験
Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）からの７週齢の正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、薬物動態学的試験のために使用した。Ｓｃまたはｉｖ投与（陰茎静脈）および採血（眼窩静脈叢）を、イソフルラン麻酔下で行った。ラット（ｎ＝４〜６／群）に、０．１ｍｇ／ｋｇ  ｒｈＧＨまたは融合物をｉｖまたはｓｃで注射した。血液試料を、後眼窩神経叢（retro-orbital plexus）から採取した。血清を回収し、アッセイまで−７０℃で保管した。薬物動態パラメーターを、非線形最小二乗回帰分析を使用して、ホルモン濃度対時間の値を区画モデルに適合させることによって、推定した。クリアランス値を、動物重量に標準化した。動物重量あたりのクリアランス率および終末半減期（terminal half life）（ｔ１／２）を、ｉｖボーラスモデルフィットから得られた係数および指数を使用して、計算した。
【０１５０】
霊長類薬物動態学的試験
試験物質を、１１．９ｍＭナトリウムおよびリン酸カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する溶液中で製剤化した。溶液のｐＨを、７．４に調節した。
【０１５１】
血液試料を、血清における適切な試験材料の濃度を決定するために、試験を通してすべての動物から得た。これらの試料を、試験を通して、いくつかの時点で採取した。
【０１５２】
臨床エンドポイントおよび測定値
ＩＢ７ｖ２およびＩＢ７ｖ３の血清濃度を、確証されたＥＬＩＳＡ法を使用して、決定した。それぞれのタンパク質に関する薬物動態プロフィールを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ（ｖ４．０．１）ソフトウェアを使用して、血清中の各タンパク質の濃度を時間に対してプロットすることによって、決定した。
【０１５３】
増殖試験
増殖試験は、下垂体切除されたラットを使用し、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）からのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて行った。ラットは、飼育者によって、４週齢においてイソフルラン麻酔下で下垂体切除され、手術を成功させるために体重基準で選択されてから１週間後に配達された。動物を、個々におりに入れ、実験段階に入る前にさらに１週間休息させた。添加剤、ｒｈＧＨおよび融合物の注射溶液は、２ｍｌ／ｋｇを決して超えなかった。ラットを、毎日秤量し、投与プロトコールに応じて、１０日間、試験物質の注射をほどこした。
【０１５４】
成長ホルモン融合物の特徴付け
融合タンパク質の立体構造を、１６の立体構造的に感受性のｈＧＨ受容体ｍＡｂのパネルを使用して調べた。変性、天然ゲルおよびウエスタンブロット法を使用して、ＬＲ−融合物を分析し、ウエスタンブロット法をＧＨに対して非立体構造的に感受性のもので行った。溶液中のＬＲ−融合タンパク質の形を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  Ｇ２００分析カラムおよび超遠心分析法を使用して、ゲルろ過によって規定した。超遠心分析法（ＡＵＣ）を、沈降速度（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｄｒ  Ａｎｄｙ  Ｂａｒｒｙ、Ａｓｔｂｕｒｙ、Ｌｅｅｄｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ）によって行った。
【０１５５】
統計
２つの群を、それらの分散が正規分布している場合、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔで、または正規分布していない場合、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ’ｓ  ｔｅｓｔで比較した。分布を、Ｆ検定で試験した。Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して、３つ以上の群の平均値を比較し、有意水準が、ｐ＜０．０５であった場合、個々の比較をＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔで行った。すべての統計検定は、５％有意水準で両側であり、インピュテーションは、欠側値に関して行わなかった。
【０１５６】
実施例１
ＧＨｗｔは、予期されたように、ｒｈＧＨに匹敵する活性を示す。１Ｂ７ｖ２＿ｗｔは、当量濃度でｒｈＧＨより低い活性を示す（通常１０〜２０倍少ない）。しかしながら、変異体１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａ変異体は、試験したすべての濃度で増加した活性を示す。これは、１Ｂ７ｖ２分子の二量化を防ぐＷ１０４Ａ変異の存在が、単量体の１Ｂ７ｖ２のバイオアベイラビリティを増加させることによってその活性を増加させることを暗示し得る。図３４および３５を参照されたい。
【０１５７】
実施例２
Ｎｂ２細胞系は、１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａ変異体の存在下で、１Ｂ７ｖ２＿ｗｔと比較した場合、増殖のより大きいレベルを示す。図３６を参照されたい。１Ｂ７ｖ２＿Ｗ１０４Ａに関する成長曲線は、ｒｈＧＨのより近くにシフトする。これは、１Ｂ７ｖ２分子の二量化を防ぐＷ１０４Ａ変異の存在が、単量体の１Ｂ７ｖ２のバイオアベイラビリティを増加させることによってその活性を増加させることを暗示し得る。
【０１５８】
参考文献
0006029601.tif 000024
0006029601.tif 000025
0006029601.tif 000026
【図１Ａ】
0006029601.tif 000027
【図１Ｂ】
0006029601.tif 000028
【図２】
0006029601.tif 000029
【図３】
0006029601.tif 000030
【図４】
0006029601.tif 000031
【図５】
0006029601.tif 000032
【図６】
0006029601.tif 000033
【図７】
0006029601.tif 000034
【図８】
0006029601.tif 000035
【図９】
0006029601.tif 000036
【図１０】
0006029601.tif 000037
【図１１】
0006029601.tif 000038
【図１２】
0006029601.tif 000039
【図１３】
0006029601.tif 000040
【図１４】
0006029601.tif 000041
【図１５】
0006029601.tif 000042
【図１６】
0006029601.tif 000043
【図１７】
0006029601.tif 000044
【図１８】
0006029601.tif 000045
【図１９】
0006029601.tif 000046
【図２０】
0006029601.tif 000047
【図２１】
0006029601.tif 000048
【図２２】
0006029601.tif 000049
【図２３】
0006029601.tif 000050
【図２４】
0006029601.tif 000051
【図２５】
0006029601.tif 000052
【図２６】
0006029601.tif 000053
【図２７】
0006029601.tif 000054
【図２８】
0006029601.tif 000055
【図２９】
0006029601.tif 000056
【図３０】
0006029601.tif 000057
【図３１】
0006029601.tif 000058
【図３２】
0006029601.tif 000059
【図３３】
0006029601.tif 000060
【図３４】
0006029601.tif 000061
【図３５】
0006029601.tif 000062
【図３６】
0006029601.tif 000063
【配列表】
0006029601000001.app