(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド複合体であって：
（ａ）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の標的配列に相補的である標的特異的領域は少なくとも１５ヌクレオチド長である、第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の標的配列に相補的である標的特異的領域は少なくとも１５ヌクレオチド長である、第２のポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む１５〜３０ヌクレオチド長の第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の標的配列に相補的である標的特異的領域は少なくとも１５ヌクレオチド長である、第３のポリヌクレオチド
からなり、
ここでは、前記標的特異的領域の少なくとも２つは、異なる標的配列に相補的であり、
ここでは、前記第１のポリヌクレオチドの５’領域は前記第３のポリヌクレオチドの３’領域に相補的であり、前記第１のポリヌクレオチドの３’領域は前記第２のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、そして前記第２のポリヌクレオチドの３’領域は前記第３のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、
ここでは、前記３つの別々のポリヌクレオチドがそれらの相補的３’領域と５’領域を介してハイブリダイズして、（ｉ）第１、第２、および第３の１本鎖領域と、（ｉｉ）第１、第２、および第３の自己相補性領域とともにポリヌクレオチド複合体を形成し、
そしてここでは、前記ポリヌクレオチド複合体は、前記各標的配列を有する遺伝子の発現を低下させる活性を有する、ポリヌクレオチド複合体。
【請求項２】
前記自己相補性領域の１つ以上に５〜１０ヌクレオチド対が含まれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項３】
前記自己相補性領域の１つ以上に７〜８ヌクレオチド対が含まれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項４】
前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチドの前記標的特異的領域それぞれは、異なる標的配列に相補的である、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項５】
前記第１、第２、および第３の標的配列それぞれが、同じ遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項６】
前記第１、第２、および第３の標的配列のうちの少なくとも２つが、異なる遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項７】
ポリヌクレオチドそれぞれの５’領域および／または３’領域の全体あるいは一部が、そのポリヌクレオチドの標的配列にも相補的である、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項８】
前記自己相補性領域の１つ以上に３’突出が含まれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項９】
１つのポリヌクレオチド分子からなる自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子であって：前記１つのポリヌクレオチド分子は、
（ａ）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む３０ヌクレオチド長以下の第１のヌクレオチド配列であって、前記第１の標的配列に相補的である標的特異的領域が１５〜３０ヌクレオチド長である、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む３０ヌクレオチド長以下の第２のヌクレオチド配列であって、前記第２の標的配列に相補的である標的特異的領域が１５〜３０ヌクレオチド長である、第２のヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む３０ヌクレオチド長以下の第３のヌクレオチド配列であって、前記ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域が１５〜３０ヌクレオチド長である、第３のヌクレオチド配列
を含み、
ここでは、前記標的特異的領域の少なくとも２つは、異なる標的配列に相補的であり、
ここでは、前記第１のヌクレオチド配列の５’領域は前記第３のヌクレオチド配列の３’領域に相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列の３’領域は前記第２のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、そして前記第２のヌクレオチド配列の３’領域は前記第３のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、
ここでは、５’領域それぞれがそれらの相補的な３’領域にハイブリダイズして、（ｉ）第１、第２、および第３の１本鎖領域と、（ｉｉ）第１、第２、および第３の自己相補性領域とともに、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子を形成し、
そしてここでは、前記ポリヌクレオチド分子は、前記各標的配列を有する遺伝子の発現を低下させる活性を有する、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】
前記自己相補性領域の１つ以上に１０〜５４ヌクレオチドが含まれる、請求項９に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
前記自己相補性領域の１つ以上に３’突出が含まれる、請求項９に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】
前記自己相補性領域の１つ以上がステム−ループ構造を形成する、請求項９に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチドの前記標的特異的領域それぞれは、異なる標的配列に相補的である、請求項９に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
前記第１、第２、および第３の標的配列それぞれが、同じ遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、請求項９に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】
前記第１、第２、および第３の標的配列の少なくとも２つが、異なる遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、請求項９に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】
自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子をコードするベクターであって、前記自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、１つのポリヌクレオチド分子からなり、前記１つのポリヌクレオチド分子は、
（ａ）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む３０ヌクレオチド長以下の第１のヌクレオチド配列であって、前記第１の標的配列に相補的である標的特異的領域が１５〜３０ヌクレオチド長である、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む３０ヌクレオチド長以下の第２のヌクレオチド配列であって、前記第２の標的配列に相補的である標的特異的領域が１５〜３０ヌクレオチド長である、第２のヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む３０ヌクレオチド長以下の第３のヌクレオチド配列であって、前記ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的配列が１５〜３０ヌクレオチド長である、第３のヌクレオチド配列
を含み、
ここでは、前記標的特異的領域の少なくとも２つは、異なる標的配列に相補的であり、
ここでは、前記第１のヌクレオチド配列の５’領域は前記第３のヌクレオチド配列の３’領域に相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列の３’領域は前記第２のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、そして前記第２のヌクレオチド配列の３’領域は前記第３のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、
ここでは、５’領域それぞれがそれらの相補的な３’領域にハイブリダイズして、（ｉ）第１、第２、および第３の１本鎖領域と、（ｉｉ）第１、第２、および第３の自己相補性領域とともに、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子を形成し、
そしてここでは、前記ポリヌクレオチド分子は、前記各標的配列を有する遺伝子の発現を低下させる活性を有する、ベクター。
【請求項１７】
遺伝子の発現を低下させるための組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド複合体、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、または請求項１６に記載のベクターを含み、前記組成物が、細胞に導入されることを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、インビトロで導入されることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、インビボで導入されることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１、第２、および／または第３の標的特異的領域の２つ以上がそれぞれ、ＨＩＶ遺伝子のｍＲＮＡ転写物中の異なる標的領域に相補的である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド複合体、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、請求項１６に記載のベクター、あるいは、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物を含む組成物。
【請求項２１】
前記第１、第２、および／または第３の標的特異的領域の２つ以上がそれぞれ、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）遺伝子のｍＲＮＡ転写物中の１つの異なる標的領域に相補的である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド複合体、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、請求項１６に記載のベクター、あるいは、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年６月１日に出願された米国仮特許出願第６１／１８３，０１１号の米国特許法§１１９の下における利益を主張する。この仮特許出願はその全体が本明細書において参照として援用される。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願に関する配列表は、紙の印刷物の代わりにテキスト形式で提供され、そして本明細書に参照として組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、２７００３８＿４０５ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１０６  ＫＢであり、２０１０年６月１日に作成され、そしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子メールにて提出されている。
【０００３】
背景技術
本発明は、一般に、正確に構造化されたポリヌクレオチド分子と、多価ＲＮＡ干渉（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）および疾患の処置のためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
遺伝子のサイレンシングまたは遺伝子発現の阻害の表現形は、治療目的および診断目的に、ならびに遺伝子機能自体の研究に大いに有望である。この表現形の例としては、アンチセンス技術、および転写後の遺伝子のサイレンシング（ＰＴＧＳ）のｄｓＲＮＡ形態（これは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の形態で広まった）が挙げられる。
【０００５】
遺伝子のサイレンシングのためのアンチセンスストラテジーには、近年、多くの注目が集まっている。根底にある概念は簡単ではあるが、原則的に有効である：標的ＲＮＡとのアンチセンス核酸（ＮＡ）の塩基対が、標的化されたＲＮＡの不活化を生じる。アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡによる標的ＲＮＡの認識はハイブリダイゼーション反応と考えることができる。標的は配列相補性により結合されるので、これは、適切なアンチセンスＮＡの選択により、高い特異性を確保できるはずであることを暗に意味する。標的化されたＲＮＡの不活化は、アンチセンスＮＡ（修飾されたかＤＮＡもしくは未修飾のＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくは未修飾のＲＮＡのいずれか、あるいはそれらのハイブリッド）の性質と、阻害が起こる生物学的系の特性に応じて、様々な経路を介して起こり得る。
【０００６】
ＲＮＡｉに基づく遺伝子の抑制は、広く容認されている方法であり、ここでは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を（例えば、長いＲＮＡ２本鎖、１９〜２４ヌクレオチドの２本鎖として、または短いヘアピンｄｓＲＮＡ２本鎖（ｓｈＲＮＡ）（これは、酵素および／またはタンパク質の複雑な機構を含むことにより遺伝子の調節に関与している）として）形成する。長いＲＮＡ２本鎖とｓｈＲＮＡ２本鎖は、Ｄｉｃｅｒと記載されるエンドリボヌクレアーゼにより小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされる前駆体である。プロセシングされたｓｉＲＮＡまたは直接導入されたｓｉＲＮＡは、相補性遺伝子への道しるべとなるタンパク質複合体ＲＩＳＣに結合すると考えられ、これは、ＲＩＳＣ／ｓｉＲＮＡ複合体により切断される。
【０００７】
しかし、有効なアンチセンス技術およびＲＮＡｉ技術の開発には多くの問題が残る。例えば、ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、短い時間しか有効性を示さず、必要とされる用量では通常、毒性がある。同様に、アンチセンスＲＮＡの使用もまた、安定性の問題が原因で効果がないことが分かっている。また、ＲＮＡｉにおいて使用されるｓｉＲＮＡも、いずれかの鎖が、内因性の調節経路に関与している可能性がある複合体の切断を導くことが原因で、有意なオフターゲット抑制（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を生じることが分かっている。様々な方法がヌクレアーゼの感度を下げることによりアンチセンスの安定性を改善する試みにおいて使用されており、ｓｉＲＮＡの化学的修飾が利用されてきた。これらには、正常なホスホジエステル骨格の修飾（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートを使用する、２’−ＯＭｅ−ヌクレオチドを組み込む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用する、および３’−末端キャップ（例えば、３’−アミノプロピル修飾または３’−３’末端結合）を使用する）が含まれる。しかし、これらの方法には費用がかかり、さらなる工程が必要であり得る。加えて、自然界には存在しないヌクレオチドおよび修飾の使用により、インビボでアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ配列を発現する能力が排除され、これにより、その後にそれらを合成し、投与することが必要となる。さらに、ｓｉＲＮＡ２本鎖は、１つの遺伝子に対して主要な有効性を示し、第２の遺伝子に対してはオフターゲットを示す。この意図されない効果はネガティブであり、信頼できるＲＮＡｉ多価（ＲＮＡｉ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｅ）ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
結果として、依然、多価遺伝子阻害が可能な１分子複合体を含む、インビトロおよびインビボでの、特に、高等脊椎動物の細胞中での遺伝子機能の標的化された直接の阻害のための、有効かつ持続性のある方法および組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
本発明は、それぞれのヌクレオチドの標的部位の配列が互いに同じではない場合に、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現を同時に特異的に調節することにおいて有用である、正確に構造化されたオリゴヌクレオチドを含む、新規の組成物および方法を提供する。
【００１０】
特定の実施形態においては、本発明には、１つの標的遺伝子もしくは標的配列に対して複数の部位で配列相補性を有しているか、または複数の遺伝子に対して１つの部位で相補性を有している１つの領域を含む、単離された正確に構造化された三本鎖ポリヌクレオチド複合体が含まれる。
【００１１】
特定の実施形態においては、本発明には、それぞれが部分的に自己相補性領域を有している、１つの標的遺伝子もしくは標的配列に対して複数の部位で配列相補性を有しているか、または複数の遺伝子に対して１つの部位で相補性を有している１つの領域を含む、単離された正確に構造化されたポリヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドには、２つ以上の自己相補性領域が含まれる。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドに、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチド核酸が含まれる。
【００１２】
特定の実施形態は、以下を含む少なくとも３つの別々のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド複合体に関する：（ａ）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第１のポリヌクレオチド；（ｂ）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第２のポリヌクレオチド；ならびに（ｃ）ヌル領域（ｎｕｌｌ  ｒｅｇｉｏｎ）または第３の標的配列（ｔｈｉｒｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第３のポリヌクレオチド。ここでは、第１、第２、および第３のポリヌクレオチドの標的特異的領域はそれぞれ、異なる標的配列に相補的であり、第１のポリヌクレオチドの５’領域は第３のポリヌクレオチドの３’領域に相補的であり、第１のポリヌクレオチドの３’領域は第２のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、第２のポリヌクレオチドの３’領域は第３のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、上記３つの別々のポリヌクレオチドがそれらの相補的３’領域と５’領域を介してハイブリダイズして、第１、第２、および第３の１本鎖領域と、第１、第２、および第３の自己相補性領域とともにポリヌクレオチド複合体を形成する。
【００１３】
特定の実施形態においては、第１、第２、および／または第３のポリヌクレオチドには、約１５〜３０ヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、第１、第２、および／または第３のポリヌクレオチドには、約１７〜２５ヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上に、約５〜１０ヌクレオチド対が含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上に、約７〜８ヌクレオチド対が含まれる。
【００１４】
特定の実施形態においては、上記第１、第２、および第３の標的配列それぞれが、同じ遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する。特定の実施形態においては、上記第１、第２、および第３の標的配列のうちの少なくとも２つが、異なる遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する。
【００１５】
特定の実施形態において、それぞれのポリヌクレオチドの５’領域および／または３’領域の全体あるいは一部はまた、そのポリヌクレオチドの標的配列に対しても相補的である。特定の実施形態においては、１つ以上の自己相補性領域に３’突出が含まれる。
【００１６】
特定の実施形態は、以下を含む、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子に関する：（ａ）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第１のヌクレオチド配列、（ｂ）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第２のヌクレオチド配列；ならびに（ｃ）ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第３のヌクレオチド配列。ここでは、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列それぞれの標的特異的領域は、異なる標的配列に相補的であり、第１のヌクレオチド配列の５’領域は第３のヌクレオチド配列の３’領域に相補的であり、第１のヌクレオチド配列の３’領域は第２のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、第２のヌクレオチド配列の３’領域は第３のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、５’領域それぞれがそれらの相補的な３’領域にハイブリダイズして、第１、第２、および第３の１本鎖領域と、第１、第２、および第３の自己相補性領域とともに、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子を形成する。
【００１７】
特定の実施形態においては、第１、第２、または第３のポリヌクレオチド配列に約１５〜６０ヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、標的特異的領域に約１５〜３０ヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上に、約１０〜５４ヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上に３’突出が含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上がステム−ループ構造を形成する。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上に、２ヌクレオチドＡＧ／ＵＵの近位ボックス（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｂｏｘ）が含まれ、これは標的特異的領域の外側にある。特定の実施形態においては、自己相補性領域の１つ以上に、４ヌクレオチドの遠位ボックス（ｄｉｓｔａｌ  ｂｏｘ）が含まれ、これは標的特異的領域の外側にある。ここでは、遠位ボックスの３番目のヌクレオチドはＧではない。本明細書中に記載されるような、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子をコードするベクターもまた含まれる。
【００１８】
特定の実施形態においては、上記第１、第２、および第３の標的配列それぞれが、同じ遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する。特定の実施形態においては、上記第１、第２、および第３の標的配列のうちの少なくとも２つが、異なる遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する。
【００１９】
特定の実施形態においては、自己相補性領域に、２つのループ（ｂｉ−ｌｏｏｐ）、テトラループ（ｔｅｔｒａ−ｌｏｏｐ）、またはさらに大きなループからなるステム−ループ構造が含まれる。特定の実施形態においては、標的遺伝子配列に相補的な配列に、少なくとも１７ヌクレオチド、または１７〜３０ヌクレオチド（その間の全ての整数を含む）が含まれる。
【００２０】
特定の実施形態においては、自己相補性領域（または２本鎖領域）に、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、または１２〜５４または６０ヌクレオチド（その間の全ての整数を含む）が含まれる。
【００２１】
特定の実施形態においては、ステム−ループ構造のループ領域に、少なくとも１ヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、ループ領域に、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、または少なくとも８ヌクレオチドが含まれる。
【００２２】
さらなる実施形態においては、ステム−ループ構造のループ領域は、特異的なテトラループ配列ＮＧＮＮまたはＡＡＧＵまたはＵＵＵＵまたはＵＵＧＡまたはＧＵＵＡからなる。ここでは、これらの配列は、５’から３’の方向である。
【００２３】
さらなる実施形態においては、本発明には、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターが含まれる。様々な実施形態において、発現ベクターは構成的ベクターまたは誘導性ベクターである。
【００２４】
本発明にはさらに、生理学的に許容される担体と本発明のポリヌクレオチドを含む組成物が含まれる。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子を細胞に導入する工程を含む、遺伝子の発現を低下させるための方法を提供する。様々な実施形態において、細胞は、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌である。１つの実施形態においては、細胞は哺乳動物である。
【００２６】
いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチド複合体または分子は、細胞に直接導入されるが、他の実施形態においては、ポリヌクレオチド複合体または分子は、単離されたポリヌクレオチドを細胞に送達するために十分な手段により細胞外に導入される。
【００２７】
別の実施形態においては、本発明には、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子を細胞に導入する工程を含む、疾患を処置するための方法が含まれる。ここでは、標的化された遺伝子の過剰発現が上記疾患と関係している。１つの実施形態においては、上記疾患は癌である。
【００２８】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子を患者に導入する工程を含む、患者の感染を処置する方法を提供する。ここでは、上記単離されたポリヌクレオチドは、感染性物質の侵入、複製、組み込み、伝染、または維持を媒介する。
【００２９】
なお別の関連する実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子を細胞に導入する工程（ここでは、ポリヌクレオチド複合体または分子は遺伝子の発現を阻害する）、および上記細胞の特徴に対する上記ポリヌクレオチド複合体または分子の導入の効果を決定する工程を含み、それにより、標的化された遺伝子の機能を決定する、遺伝子の機能を同定するための方法を提供する。１つの実施形態においては、上記方法は、ハイスループットスクリーニングを使用して行われる。
【００３０】
さらなる実施形態においては、本発明は、以下の工程を含む、標的遺伝子の発現の調節のための２つ以上の自己相補性領域を含むポリヌクレオチド配列を設計する方法を提供する：（ａ）１７〜２５ヌクレオチド長であり、１つの標的遺伝子または複数の標的遺伝子に対して相補的である、第１の３つのガイド配列を選択する工程；（ｂ）自己相補性領域を含み、上記第１の配列に対して完全には相補的でない、４〜５４ヌクレオチド長の１つ以上のさらなる配列を選択する工程；ならびに、状況に応じて（ｃ）（ｂ）の中の配列モチーフを、工程（ａ）において選択した配列に対して相補的である、非相補的である、または工程（ａ）において選択した配列に対して非相補的である遺伝子配列を複製すると定義する工程。
【００３１】
別の実施形態においては、突然変異した遺伝子は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする遺伝子から発現された遺伝子である。別の実施形態においては、遺伝子はウイルスであり、これには、１つ以上の異なる遺伝子が含まれ得る。特異的な実施形態においては、上記遺伝子はＨＩＶ遺伝子（例えば、本明細書中に記載される、当該分野で公知であるものの中でも、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、またはｔａｔ）である。他の実施形態においては、上記遺伝子はＡｐｏＢである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
少なくとも３つの別々のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド複合体であって：
（ａ） 第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含
む第１のポリヌクレオチド；
（ｂ） 第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含
む第２のポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）ヌル領域または第３の標的配列（ｔｈｉｒｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第３のポリヌクレオチド
を含み、
ここでは、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチドの前記標的特異的領域それぞれが、異なる標的配列に相補的であり、
ここでは、前記第１のポリヌクレオチドの５’領域は前記第３のポリヌクレオチドの３’領域に相補的であり、前記第１のポリヌクレオチドの３’領域は前記第２のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、そして前記第２のポリヌクレオチドの３’領域は前記第３のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、
そしてここでは、前記３つの別々のポリヌクレオチドがそれらの相補的３’領域と５’領域を介してハイブリダイズして、第１、第２、および第３の１本鎖領域と、第１、第２、および第３の自己相補性領域とともにポリヌクレオチド複合体を形成する、ポリヌクレオチド複合体。
（項目２）
前記第１、第２、および／または第３のポリヌクレオチドに約１５〜３０ヌクレオチドが含まれる、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目３）
前記第１、第２、および／または第３のポリヌクレオチドに約１７〜２５ヌクレオチドが含まれる、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目４）
前記自己相補性領域の１つ以上に約５〜１０ヌクレオチド対が含まれる、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目５）
前記自己相補性領域の１つ以上に約７〜８ヌクレオチド対が含まれる、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目６）
前記第１、第２、および第３の標的配列それぞれが、同じ遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目７）
前記第１、第２、および第３の標的配列のうちの少なくとも２つが、異なる遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目８）
ポリヌクレオチドそれぞれの５’領域および／または３’領域の全体あるいは一部が、そのポリヌクレオチドの標的配列にも相補的である、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目９）
前記自己相補性領域の１つ以上に３’突出が含まれる、項目１に記載のポリヌクレオチド複合体。
（項目１０）
自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子であって：
（ａ）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第２のヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第３のヌクレオチド配列
を含み、
ここでは、前記第１、第２、および第３のヌクレオチド配列それぞれの標的特異的領域は、異なる標的配列に相補的であり、
ここでは、前記第１のヌクレオチド配列の５’領域は前記第３のヌクレオチド配列の３’領域に相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列の３’領域は前記第２のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、そして前記第２のヌクレオチド配列の３’領域は前記第３のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、
そしてここでは、５’領域それぞれがそれらの相補的な３’領域にハイブリダイズして、第１、第２、および第３の１本鎖領域と、第１、第２、および第３の自己相補性領域とともに、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子を形成する、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１１）
前記第１、第２、または第３のヌクレオチド配列に約１５〜６０ヌクレオチドが含まれる、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１２）
前記標的特異的領域それぞれに約１５〜３０ヌクレオチドが含まれる、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１３）
前記自己相補性領域の１つ以上に約１０〜５４ヌクレオチドが含まれる、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１４）
前記自己相補性領域の１つ以上に３’突出が含まれる、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１５）
前記自己相補性領域の１つ以上がステム−ループ構造を形成する、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１６）
前記自己相補性領域の１つ以上に、前記標的特異的領域の外側にある２ヌクレオチドＡＧ／ＵＵの近位ボックスが含まれる、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１７）
前記自己相補性領域の１つ以上に、前記標的特異的領域の外側にある４ヌクレオチドの遠位ボックスが含まれ、ここでは前記遠位ボックスの３番目のヌクレオチドはＧではない、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１８）
前記第１、第２、および第３の標的配列それぞれが、同じ遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目１９）
前記第１、第２、および第３の標的配列の少なくとも２つが、異なる遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの中に存在する、項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
（項目２０）
項目１０に記載の自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子をコードするベクター。
（項目２１）
遺伝子の発現を低下させる方法であって、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド複合体、項目１０〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子、または項目２０に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
（項目２２）
前記方法がインビトロで実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記方法がインビボで実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記第１、第２、および／または第３の標的特異的領域の２つ以上がそれぞれ、ＨＩＶ遺伝子のｍＲＮＡ転写物中の異なる標的領域に相補的である、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド複合体、項目１０〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子、項目２０に記載のベクター、あるいは、項目２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１、第２、および／または第３の標的特異的領域の２つ以上がそれぞれ、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）遺伝子のｍＲＮＡ転写物中の１つの異なる標的領域に相補的である、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド複合体、項目１０〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子、項目２０に記載のベクター、あるいは、項目２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図１〜図６は、本発明の例示的なポリヌクレオチド構造を説明する。
【図１】図１は、図１は、３つの別々のポリヌクレオチド分子のポリヌクレオチド複合体を示す。（Ａ）は、標的遺伝子上の１つの部位に相補的である配列を含む領域を示す（斜線）；（Ｂ）は、上記標的遺伝子上の第２の部位または異なる遺伝子上の１つの部位に対して相補的である配列を含む領域を示す（斜交線）；（Ｃ）は、上記標的遺伝子上の第３の部位または異なる遺伝子上の１つ部位に対して相補的である配列を含む領域を示す（黒で塗りつぶした）。数字１、２、および３は、遺伝子のサイレンシングを導くそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端を示す；（Ａ）は１の方向で載り、（Ｂ）は２の方向で載り、そして（Ｃ）は３の方向で載る。それらのそれぞれの自己相補性または２本鎖領域を形成するように互いにハイブリダイズするそれぞれの分子の３’領域および５’領域を、連結する線で示す。それぞれのポリヌクレオチドは、２つのヌクレオチド３’突出を含む。
【図２】図２は、コア分子にプロセシングされる前駆体である、３つの１本鎖領域と３つの自己相補性領域を有している、本発明の１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドを示す。標的特異的領域に影をつける。（Ｄ）は、４ヌクレオチドのテトラループで覆われた自己相補性ステム−ループ領域を示す（白で塗りつぶした）；（Ｄ）はまた、ステム−ループ構造内に１４／１６ヌクレオチドの切断部位を有しているステム−ループ領域を示す；ステムループヌクレオチドを除去するためには、切断をＲＮａｓｅ  ＩＩＩにより行うことができる（白色で示した）；（Ｅ）は遠位ボックスを示す。ここでは、Ｇの存在が、ステム−ループ領域の除去に必要なＲＮａｓｅ  ＩＩＩ切断を妨害するであろうと考えられるので、５’から３’方向で決定した場合の３番目のヌクレオチドはＧではない；（Ｆ）は、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ認識、およびＲＮａｓｅ  ＩＩＩの結合のインビボでの決定要因である（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ２０００）、２ヌクレオチドＡＧ／ＵＵの近位ボックスを示す；（Ｇ）はテトラループを示す。図２に示すポリヌクレオチド分子は、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩにより細胞内で「プレプロセシングされる」より長い転写物ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ＲＮＡ）である。生じるＲＮＡ構造は、図１に示す構造と同じである。
【図３】図３は、テトラループフォーマットを持つ自己形成性（ｓｅｌｆ−ｆｏｒｍｉｎｇ）１本鎖オリゴヌクレオチドを示す。（Ｈ）はテトラループを示す；（Ｉ）は、リーディング鎖が２ヌクレオチドの突出を組み込んだ場合の、トリループ結合性の２つのコア鎖を示す。この構造においては、テトラループは、図１に示した構造の中の突出の３’ヒドロキシル／５’リン酸であろうものを模倣するために使用され、図２に示す構造のものよりも直接的に機能する。実施例２に示すように、この短いテトラループフォーマットが、プレプロセシングを伴わずに、直接サイレンシングを導く。ＧＵＵＡループはこのループの中でヌクレオチドをねじり、水素を露出させると考えられている（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，第３１巻、Ｎｏ．３，図６、１０９４頁を参照のこと）。この構造は、ＰＡＺまたはＲＩＳＣと適合する。
【図４】図４は、２価の使用のための自己形成性１本鎖オリゴヌクレオチドを示す。（Ｊ）は、２つのコア鎖を連結しているより大きなループを示す；（Ｋ）は、複雑な構成を完成させる際に重要であるが、標的遺伝子に対しては「ヌル」である（すなわち、標的遺伝子に特異的ではない）鎖を示す。２つの標的特異的領域に影をつける。この構造は、ＲＮＡ転写物とともに作業する際の「二価の」使用のための組成物である。化学修飾が不可能であるので、この構造が、ローディング活性およびサイレンシング活性を非対称的に決定する。上記分子の最初の１９ヌクレオチドはＰＲＩＭＡＲＹ鎖であり、（Ｋ）は不活化されるＫＥＹ鎖を示し、そしてＳＥＣＯＮＤＡＲＹ鎖は、上記分子の最後の２１ヌクレオチドである。ＲＩＳＣへの搭載および機能についての最優先事項は、露出した５'／３'末端によるＳＥＣＯＮＤＡＲＹ鎖である。第２の優先事項は、細胞内でのＲＮａｓｅ  ＩＩＩでのプレプロセシング後に露出させられるＰＲＩＭＡＲＹ鎖である。無効とされた（ｎｕｌｌｉｆｉｅｄ）ＫＥＹ鎖の３’末端は、大きなループがプロセシングされず、また、ＲＩＳＣ自体への搭載とも適合しないので、機能性ではない。
【図５】図５は、修飾されたＲＮＡ塩基を有している本発明のポリヌクレオチド複合体を示す。（Ｌ）、（Ｍ）、および（Ｎ）は、末端１、２または３の順にアニーリングおよび／またはサイレンシングを優先するように修飾されたＲＮＡ（例えば、２’−ＯＨ  ＲＮＡの代わりに、２’−Ｏ−メチルＲＮＡまたは２’−フルオロＲＮＡ）の使用によりＴｍを徐々に増大させることができる領域（ハッシュ線（斜線）により明示する）を示す。
【図６】図６は、本発明のオリゴヌクレオチド複合体の２つの実施形態を示す。（Ｏ）は、この鎖のサイレンシング機能を不活化する平滑末端ＤＮＡ鎖を示し；そして（Ｐ）は、送達化学（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、リガンド、抗体、または他のペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）もしくは標的化分子の組み合わせに利用することができる末端を説明する。
【図７】図７は、標準的なｓｈＲＮＡ分子と比較した、本発明の多価ｓｉＲＮＡ分子によるＧＦＰ発現の抑制の結果を示す（実施例１を参照のこと）。図７Ａは、ｓｈＲＮＡ対照（１００％と設定した）と比較した、ＭＶクローンｌｏｎｇ  Ｉ（１０８％）およびＭＶクローンｌｏｎｇ  ＩＩ（１１９％）によるＧＦＰの抑制の増大を示す。図７Ｂは、ｓｈＲＮＡ対照（１００％と設定した）と比較した、合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  ＩによるＧＦＰ発現の抑制の増大を示す（１２７％）。これは、合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ複合体の鎖の一方がＤＮＡ鎖に置き換わっている場合には、わずかに少なくなる（ＭＦ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  Ｉ  ＤＮＡ（１１６％））。
【図８ＡＢ】図８は、ＧＦＰコード配列（配列番号８）についての例示的な標的化領域（下線）を示す。図８Ａは、実施例１の表１および表２のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子により標的化された領域を示す。図８Ｂおよび図８Ｃは、さらに別の例示的な標的化領域を示す。
【図８Ｃ】図８は、ＧＦＰコード配列（配列番号８）についての例示的な標的化領域（下線）を示す。図８Ａは、実施例１の表１および表２のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子により標的化された領域を示す。図８Ｂおよび図８Ｃは、さらに別の例示的な標的化領域を示す。
【図９】図９は、ＨＩＶ複製に対するＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子の阻害作用を示す。ここでは、ｇａｇとｔａｔの両方に対して標的化された２価のＭＶ−ｓｉＲＮＡは、ｇａｇだけに対して標的化されたｓｉＲＮＡよりも、ＨＩＶ複製に対して有意に大きな阻害作用を有する。１０日目に１９．７７％の阻害を示し、４０日目に３２．４３％の阻害を示したｇａｇだけに対して標的化されたｓｉＲＮＡと比較して、２価のＭＶ−ｓｉＲＮＡは、１０日目に５６．８９％の阻害を示し、４０日目には６０．０２％の阻害を示した。
【図１０Ａ】図１０は、本発明のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子により標的化され得る例示的なＨＩＶゲノムのヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。この配列は、図１０Ａから図１０Ｄに延びる。
【図１０Ｂ】図１０は、本発明のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子により標的化され得る例示的なＨＩＶゲノムのヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。この配列は、図１０Ａから図１０Ｄに延びる。
【図１０Ｃ】図１０は、本発明のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子により標的化され得る例示的なＨＩＶゲノムのヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。この配列は、図１０Ａから図１０Ｄに延びる。
【図１０Ｄ】図１０は、本発明のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子により標的化され得る例示的なＨＩＶゲノムのヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。この配列は、図１０Ａから図１０Ｄに延びる。
【図１１】図１１は、図１０のＨＩＶゲノム配列に由来するｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号４）。
【図１２】図１２は、さらに別のＨＩＶ配列を提供する。図１２Ａは、ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を示し（配列番号２）、図１２Ｂは、ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。これらはいずれも図１０のＨＩＶゲノム配列に由来する。
【図１３】図１３は、マウスのアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）のコード配列を示す（配列番号１０）。これは、本明細書中で提供される特定のＭＶ−ｓｉＲＮＡを使用して標的化され得る。この配列は、図１３Ａから図１３Ｅに延びる。
【図１４Ａ】図１４は、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）のｍＲＮＡ配列を示す（配列番号１）。これは、本明細書中で提供される特定のＭＶ−ｓｉＲＮＡを使用して標的化され得る。この配列は、図１４Ａから図１４Ｅに延びる。
【図１４Ｂ】図１４は、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）のｍＲＮＡ配列を示す（配列番号１）。これは、本明細書中で提供される特定のＭＶ−ｓｉＲＮＡを使用して標的化され得る。この配列は、図１４Ａから図１４Ｅに延びる。
【図１４Ｃ】図１４は、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）のｍＲＮＡ配列を示す（配列番号１）。これは、本明細書中で提供される特定のＭＶ−ｓｉＲＮＡを使用して標的化され得る。この配列は、図１４Ａから図１４Ｅに延びる。
【図１４Ｄ】図１４は、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）のｍＲＮＡ配列を示す（配列番号１）。これは、本明細書中で提供される特定のＭＶ−ｓｉＲＮＡを使用して標的化され得る。この配列は、図１４Ａから図１４Ｅに延びる。
【図１４Ｅ】図１４は、ヒトのアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）のｍＲＮＡ配列を示す（配列番号１）。これは、本明細書中で提供される特定のＭＶ−ｓｉＲＮＡを使用して標的化され得る。この配列は、図１４Ａから図１４Ｅに延びる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本発明は、１つの遺伝子の発現を複数の標的部位で阻害するため、または複数の遺伝子の発現を１つ以上の標的部位で阻害するための組成物ならびに方法を提供する。上記部位は、真核生物において、インビボおよびインビトロで、等価なヌクレオチド配列の部位ではない。具体的に、本発明は、標的遺伝子を標的化し、その発現を抑制させることができる、１つ以上の標的遺伝子の複数の領域に対して相補的な配列を有している２つ、３つ、またはそれ以上の領域を含むポリヌクレオチド複合体およびポリヌクレオチド分子を提供する。様々な実施形態において、本発明の組成物および方法は、標的遺伝子またはその発現されたＲＮＡ中の複数の部位を標的化することにより、１つの標的遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。あるいは、これらは、２つ以上の異なる遺伝子またはそれらの発現されたＲＮＡの中の複数の部位を標的化することにより、２つ以上の異なる遺伝子を標的化するために使用され得る。
【００３４】
本発明は、従来のｓｉＲＮＡ分子を上回る有意な利点をもたらす。第１に、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子が１つの標的遺伝子内の２つ以上の領域を標的化する場合は、これらは、標的遺伝子内の１つの領域だけを標的化するＲＮＡｉ物質（ＲＮＡｉ  ａｇｅｎｔ）と比較して、標的遺伝子からの遺伝子発現のより大きな阻害を行うことができる。加えて、２つ以上の異なる標的遺伝子を標的化する本発明のポリヌクレオチド複合体または分子は、１つのポリヌクレオチド複合体または分子を使用して疾患あるいは障害と関係がある複数の標的遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子には、従来の２本鎖ＲＮＡｉ物質中に存在するさらに別の非標的化鎖は必要ない。このため、これらは、非標的化鎖により生じるオフターゲット効果を有さない。したがって、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子は、アンチセンスＲＮＡおよびＲＮＡ干渉分子を含む先行技術のポリヌクレオチド阻害剤を上回る驚くべき利点をもたらし、これには、１つ以上の標的遺伝子に対する効力の増大と有効性の増大が含まれる。
【００３５】
本発明はまた、標的遺伝子の１つ、２つ、または３つの異なるヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列に相補的であるガイド鎖のうちのわずか１つ、２つ、または３つを使用する切断にタンパク質複合体を導くポリヌクレオチド構造の認識に基づく。この多価機能は、多くの同じ内因性の機構を利用しつつ、ｄｓＲＮＡのものよりも顕著に広範囲かつ強力な、標的遺伝子または標的遺伝子の群の阻害を生じる。
【００３６】
本発明の特定の実施形態はまた、センス鎖を含まない複合体（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｆｒｅｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を生じる、３’突出および５’リン酸の提示による直接的なポリヌクレオチド構造の認識に基づく。センス鎖を含まない複合体は、ｄｓＲＮＡをベースとするｓｉＲＮＡの特異性よりも大きな特異性に寄与する
それらの有効性を考えると、本発明の組成物は、標的遺伝子または複数の標的遺伝子に相補的な単一のガイド鎖により予想される特異性について付随する保証がある細胞あるいは被検体に送達され得る。
【００３７】
多価ｓｉＲＮＡ
本発明には、１つ以上の標的遺伝子の複数の領域に相補的である２つ以上の標的化領域を含むポリヌクレオチド複合体および分子が含まれる。本発明のポリヌクレオチド複合体および分子は、これらが１つ以上の標的遺伝子の複数の領域に相補的な少なくとも２つの標的化領域を含むので、多価ｓｉＲＮＡ（ｍｖ−ｓｉＲＮＡ）と呼ぶことができる。したがって、本発明の組成物および方法は、１つの標的遺伝子中の２つ以上の領域を標的化するか、あるいは２つ以上の標的遺伝子中の１つ以上の領域を標的化するかのいずれかにより、１つ以上の標的遺伝子の発現を阻害あるいは低下させるために使用され得る。
【００３８】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体に、３つ以上の別々のオリゴヌクレオチド（それぞれが、５’末端と３’末端を有している）が、オリゴヌクレオチドが本明細書中に記載されるように互いにハイブリダイズして１つの複合体を形成する標的化領域を含む２つ以上のオリゴヌクレオチドとともに含まれる。それぞれの鎖は、本明細書中では「ガイド鎖」と呼ばれる。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド分子は、３つ以上のガイド鎖が、ポリヌクレオチドが自己相補性領域を通じて自らにハイブリダイズして本明細書中に記載される構造を形成する標的化領域を含む２つ以上のガイド鎖とともに含まれる、１つのポリヌクレオチドである。得られる構造は、その後、様々なガイド鎖を連結しているループ構造を除去するために、例えば、細胞内でプロセシングされ得る。異なるオリゴヌクレオチド中または１つのポリヌクレオチド中に存在し得るそれぞれのガイド鎖には、他のガイド鎖に相補的な領域が含まれる。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも３つのガイド鎖を含むポリヌクレオチド複合体および分子を提供する。上記少なくとも３つのガイド鎖のうちの少なくとも２つには、１つ以上の標的遺伝子内の異なる配列に相補的である領域が含まれる。様々な実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体に、２つ、３つまたはそれ以上の別々のポリヌクレオチドが含まれる。これらのそれぞれに、互いにハイブリダイズして１つの複合体を形成することができる１つ以上のガイド鎖が含まれる。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド分子には、１つのポリヌクレオチドの異なる領域内に３つ以上のガイド鎖を含む１つのポリヌクレオチドが含まれる。
【００４０】
本発明の特定の実施形態は、少なくとも３つのガイド鎖を有しているポリヌクレオチド複合体または分子に関する。上記少なくとも３つのガイド鎖のうちの２つ以上は、１つ以上の標的遺伝子に部分的あるいは完全に相補的であり、それぞれが、互いに相補的である約４〜約１２、約５〜約１０、または好ましくは約７〜約８ヌクレオチドをいずれかの末端上に有しており（すなわち、別のガイド鎖の１つの領域に相補的である）、これにより、ポリヌクレオチド複合体を構成することができる（例えば、図１を参照のこと）。例えば、ガイド鎖のそれぞれの末端には、ポリヌクレオチド複合体または分子のガイド鎖のうちの別のものの一方の末端にあるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドが含まれ得る。特定の実施形態には、４個、５個、６個、もしくはそれ以上の個々のポリヌクレオチド分子またはガイド鎖を含むポリヌクレオチド複合体が含まれ得る。
【００４１】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体に、以下を含む少なくとも３つの別々のポリヌクレオチドが含まれる：（１）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第１のポリヌクレオチド；（２）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第２のポリヌクレオチド；ならびに（３）ヌル領域または第3の標的配列（third  target  specific）に相補的である標的特異的領域のいずれか、５’領域、および３’領域を含む第３のポリヌクレオチド。ここでは、第１、第２、および第３のポリヌクレオチドの標的特異的領域それぞれが、異なる標的配列に相補的であり、第１のポリヌクレオチドの５’領域は第３のポリヌクレオチドの３’領域に相補的であり、第１のポリヌクレオチドの３’領域は第２のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、第２のポリヌクレオチドの３’領域は第３のポリヌクレオチドの５’領域に相補的であり、そして上記３つの別々のポリヌクレオチドがそれらの相補的３’領域と５’領域を介してハイブリダイズして、第１、第２、および第３の１本鎖領域と、第１、第２、および第３の自己相補性領域とともにポリヌクレオチド複合体を形成する。
【００４２】
上記のように、特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体には、それぞれが５’末端と３’末端を有している、少なくとも３つの別々のオリゴヌクレオチドが含まれる。図１に示されるように、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端にある１つの領域は、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端にある１つの領域にアニーリングし、第３のオリゴヌクレオチドの５’末端にある１つの領域は、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端にある１つの領域にアニーリングし、そして第２のオリゴヌクレオチドの５’末端にある１つの領域は第１のオリゴヌクレオチドの３’末端にある１つの領域にアニーリングする。さらに別のオリゴヌクレオチドが上記複合体の中に存在する場合は、これらは類似する様式で上記複合体の他のオリゴヌクレオチドにアニーリングする。互いにアニーリングするオリゴヌクレオチドの末端にある領域には、５’末端および／または３’末端のいずれかあるいは両方に、最終的なヌクレオチドが含まれ得る。ハイブリダイズする３’末端と５’末端の両方の領域にオリゴヌクレオチドの最終的なヌクレオチドが含まれる場合は、得られる２本鎖領域は平滑末端である。特定の実施形態においては、アニーリングする３’末端にある領域には、最終的なヌクレオチドおよび／または最後から２番目のヌクレオチドは含まれず、１つまたは２つのヌクレオチドの３’突出を有している２本鎖領域が生じる。
【００４３】
特定の実施形態においては、複数のガイド鎖が１つのポリヌクレオチド分子の中に存在し、３つの１本鎖領域と３つの自己相補性領域（または２本鎖領域）、および少なくとも２つの標的特異的領域とともに、１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドを形成するようにハイブリダイズする（例えば、図２を参照のこと）。関連する実施形態においては、１つの分子に少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個のガイド鎖が含まれ得、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの自己相補性領域（または２本鎖領域）と、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの標的特異的領域をそれぞれ持つ、１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドが形成する。特定の実施形態においては、この１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ループ領域と、状況に応じて、ある量の近位２本鎖領域を除去するために細胞によりプロセシングされ、活性なｍｖ−ｓｉＲＮＡ分子を生じ得る前駆体分子である（例えば、図２を参照のこと）。
【００４４】
したがって、特定の実施形態においては、本発明には、以下を含む自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子が含まれる：（１）第１の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第１のヌクレオチド配列、（２）第２の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第２のヌクレオチド配列；ならびに（３）ヌル領域または第３の標的配列に相補的である標的特異的領域、５’領域、および３’領域を含む第３のヌクレオチド配列。ここでは、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列それぞれの標的特異的領域は、異なる標的配列に相補的であり、第１のヌクレオチド配列の５’領域は第３のヌクレオチド配列の３’領域に相補的であり、第１のヌクレオチド配列の３’領域は第２のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、そして第２のヌクレオチド配列の３’領域は第３のヌクレオチド配列の５’領域に相補的であり、ここでは、５’領域それぞれがそれらの相補的な３’領域にハイブリダイズして、第１、第２、および第３の１本鎖領域と、第１、第２、および第３の自己相補性領域とともに、１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド複合体を形成する。
【００４５】
特定の実施形態においては、本発明の１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドがそれ自体にアニーリングする場合に形成される１本鎖ループの中に、１つ以上の切断可能なヌクレオチドが含まれ得る。一旦、１つの自己ハイブリダイズするポリヌクレオチドがそれ自体にアニーリングすると、切断可能なヌクレオチドが切断され得て、３つ以上の別々のオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体が生じ得る。本発明にしたがって使用され得る切断可能なヌクレオチドの例としては、光解離性ヌクレオチド（例えば、ｐｃＳｐａｃｅｒ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ））またはホスホルアミダイトヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で使用される場合は、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子には、３つの１本鎖領域（そのうちの少なくとも２つは２つ以上の標的配列に相補的であり、それぞれの標的配列は１つ以上の標的遺伝子の中に位置している）を含み、２本鎖領域（例えば、ステム−ループ構造）を形成することにより１本鎖領域の５’末端または３’末端を相互に連結する少なくとも２つまたは３つの自己相補性領域を含む、単離されたポリヌクレオチドが含まれる。このポリヌクレオチドはまた、本明細書中では、オリゴヌクレオチドとも呼ばれ得る。
【００４７】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子に、１つの標的遺伝子に相補的な配列の２つ以上の領域が含まれる。特定の実施形態においては、これらの領域は、同じ複数の標的遺伝子または同じ複数の遺伝子に相補的であるが、他の実施形態においては、これらは、２つ以上の異なる標的遺伝子または複数の遺伝子に相補的である。
【００４８】
したがって、本発明には、１つ以上の標的遺伝子または遺伝子に相補的な一連の配列を含む、１つ以上の自己相補性ポリヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態においては、これらの配列は、標的遺伝子配列に非相補的もしくは半相補的であり、自己相補性領域に非相補的である配列の複数の領域により隔てられている。複数の標的遺伝子または複数の遺伝子に相補的である複数の配列を含むポリヌクレオチドの他の実施形態においては、ポリヌクレオチドには、１つの標的遺伝子に相補的な配列の１つ以上の領域の５’末端、３’末端、または両方の末端にある自己相補性領域が含まれる。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドには、標的遺伝子に相補的であるそれぞれのガイド鎖の５’末端および３’末端に位置している自己相補性領域とともに、１つ以上の標的遺伝子に相補的な配列の２つ以上の領域が含まれる。特定の実施形態においては、これらの３’領域および５’領域の全体または一部は、それらの対応している３’領域または５’領域に相補的であることに加えて、標的配列にも相補的であり得る。
【００４９】
用語「相補的」は、標準的な塩基対合の規則にしたがって、互いに完全にまたは部分的に相補的であるヌクレオチド配列をいう。用語「部分的に相補的」は、完全には満たない相補性を有しているが、生理学的条件下でヌクレオチドのストレッチ内での結合またはハイブリダイゼーションをサポートするために十分な数の相補的ヌクレオチド対をなおも有する配列をいう。
【００５０】
特定の実施形態においては、標的遺伝子に相補的なガイド鎖の領域（すなわち、標的化領域）には、標的遺伝子と比較して１つ以上のヌクレオチドの不一致が含まれ得る。状況に応じて、標的遺伝子に対する一致しないヌクレオチド（単数または複数）の塩基対合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）が可能となるように、ガイド鎖の中の一致しないヌクレオチド（単数または複数）が、アンロックト（ｕｎｌｏｃｋｅｄ（ＵＮＡ））核酸またはホスホルアミダイト核酸（例えば、ｒＳｐａｃｅｒ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）で置換され得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合は、用語「自己相補性」または「自己相補性領域」は、Ａ−Ｔ（Ｕ）およびＧ−Ｃハイブリダイゼーション対を形成し、それにより２本鎖領域を形成するように同じ分子の別の領域に結合またはハイブリダイズする、本発明の１つのポリヌクレオチド分子の１つの領域を意味し得る。および／または、これは、本発明のポリヌクレオチド複合体（すなわち、ＲＮＡｉポリヌクレオチド複合体）を形成するように第２または第３のヌクレオチド分子の１つの領域に結合する、第１のヌクレオチド分子の１つの領域を意味し得る。ここでは、上記複合体は、２つ以上の標的部位に対してＲＮＡｉ干渉活性を発揮することができる。互いに結合して自己相補性領域を形成する２つの領域は連続している場合があり、また、他のヌクレオチドにより隔てられている場合もある。また、ＲＮＡｉポリヌクレオチド複合体の場合と同様に、２つの領域が別のヌクレオチド分子上に存在する場合がある。
【００５２】
特定の実施形態においては、「自己相補性領域」に、第２または第３の定義されたヌクレオチド配列の「５’領域」に結合またはハイブリダイズされる、第１の定義されたヌクレオチド配列の「３’領域」が含まれる。ここでは、上記第２または第３の定義された配列は同じ分子内にあり、自己ハイブリダイズするポリヌクレオチド分子を形成する。特定の実施形態においては、「自己相補性領域」に、ポリヌクレオチド複合体を形成するように別々のポリヌクレオチド分子の「５’領域」に結合またはハイブリダイズされる第１のポリヌクレオチド分子の「３’領域」が含まれる。これらの３’領域および５’領域は、典型的には、５’領域が標的特異的領域の５’末端上に存在し、３’領域が標的特異的領域の３’末端上に存在する、それらのそれぞれの標的特異的領域との関係において定義される。特定の実施形態においては、これらの３’領域および５’領域のうちの一方または両方は、自己相補性領域を形成するようにそれらの対応している３’領域または５’領域にハイブリダイズするだけではなく、完全にまたは部分的に相補的なそれらのそれぞれの標的配列もまた含むように設計され得、それにより標的特異的領域の一部を形成する。これらの実施形態においては、標的特異的領域に、１本鎖領域と自己相補性（すなわち、２本鎖）領域の両方が含まれる。
【００５３】
特定の実施形態においては、これらの「自己相補性領域」に、約５〜１２ヌクレオチド対、好ましくは５〜１０ヌクレオチド対、または７〜８ヌクレオチド対（それらの間の全ての整数を含む）が含まれる。同様に、特定の実施形態においては、それぞれの３’領域または５’領域に、約５〜１２ヌクレオチド、好ましくは５〜１０ヌクレオチド、または７〜８ヌクレオチド（それらの間の全ての整数を含む）が含まれる。
【００５４】
用語「非相補的」は、ヌクレオチドの特定のストレッチの中に、Ａ−Ｔ（Ｕ）またはＧ−Ｃハイブリダイゼーションを形成させるための１つの標的とのそのアラインメントの中にヌクレオチドが存在しないことを示す。用語「半相補的」は、ヌクレオチドの１つのストレッチの中に、Ａ−Ｔ（Ｕ）またはＧ−Ｃハイブリダイゼーションを形成させるために１つの標的とアラインメントする少なくとも１つのヌクレオチド対が存在するが、生理学的条件下でヌクレオチドのそのストレッチの中での結合をサポートするために十分な数の相補的ヌクレオチド対が存在しないことを示す。
【００５５】
用語「単離された」は、その物質の天然の状態において上記物質に通常付随する成分を少なくとも部分的に含まない１つの物質をいう。単離は、もともとの供給源または環境からの分離の程度を暗示する。本明細書中で使用される場合は、単離は、例えば、ＤＮＡに関連して、他のコード配列または非コード配列とは実質的に離れており、ＤＮＡ分子に、無関係なコードＤＮＡの大きな部分（例えば、大きな染色体断片または他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）が含まれ得るポリヌクレオチドをいう。もちろん、これは、最初に単離された、人の手によってそのセグメントに後で付加された遺伝子またはコード領域が排除されていないＤＮＡ分子をいう。
【００５６】
様々な実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子に、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチド核酸、あるいはこれらのタイプの分子の任意のまたは全ての組み合わせが含まれる。加えて、ポリヌクレオチドには、修飾された核酸、または核酸の誘導体もしくはアナログが含まれ得る。核酸修飾の一般的な例としては、ビオチン標識、蛍光標識、ポリヌクレオチドに第１級アミンを導入するアミノ変性剤、リン酸基、デオキシウリジン、ハロゲン化ヌクレオシド、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアナログ、キメラＲＮＡアナログ、ウォッブル基、ユニバーサル塩基、およびデオキシイノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「サブユニット」は、１つのヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）単位をいう。この用語は、サブユニット間結合が結合しているかまたは結合していないヌクレオチド単位を意味し得る。「電荷をもつサブユニット」と呼ばれる場合には、その電荷は通常、上記サブユニット間結合（例えば、リン酸結合もしくはホスホロチオエート結合、または陽イオン性結合）内に留まる。所定の合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡは、１種類以上の様々なタイプのサブユニット、および／あるいはサブユニット間結合を、主にその安定性、Ｔｍ、ＲＮａｓｅ感受性、または所望される場合には他の特性を変化させるために利用することができる。例えば、特定の実施形態では、１つ以上の２’−Ｏ−メチルＲＮＡサブユニットを持つＲＮＡサブユニットが利用され得る。
【００５８】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの環状サブユニットは、リボースまたは別の五単糖をベースとする場合があり、また、特定の実施形態においては、代替えの基または修飾された基をベースとする場合もある。修飾されたオリゴヌクレオチド骨格の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、ホスホロジアミデート、チオホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに、通常の３’−５’結合を有しているボラノホスフェートおよびこれらの２’−５’結合アナログ、ならびに、ヌクレオシド単位の隣接している対が３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に連結されている逆の極性を有しているもの。ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（２’−ＯＭｅ）、２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチド（ＭＯＥ）、中でも特に、当該分野で公知の他のオリゴヌクレオチドもまた考えられる。
【００５９】
プリンまたはピリミジン塩基対合部分は、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。以下のような塩基もまた含まれる：ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメ１１５トキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジンもしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、クエオシン（ｑｕｅｓｏｓｉｎｅ）、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルチジン（４−ａｃｅｔｙｌｔｉｄｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン（５−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｈｎｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、スレオニン誘導体など（Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，前出）。この態様においては、「修飾された塩基」により、上記で説明されたように、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）以外のヌクレオチド塩基が意味される。そのような塩基は、アンチセンス分子中の任意の位置で使用され得る。オリゴマーの用途または化学的性質に応じて、ＴとＵが互いに交換可能であることは、当業者には明らかであろう。例えば、よりＲＮＡに似ている２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドのような他のアンチセンス化学特性が用いられる場合には、Ｔ塩基はＵと示され得る。
【００６０】
上記のように、本明細書中で提供される特定のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドには、１つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニットが含まれる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、それに対してピリミジン塩基またはプリン塩基が結合されるＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる、その骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形であるＤＮＡのアナログである。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基を含むＰＮＡは、ワトソン・クリック塩基対合規則に従う相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対の認識に関してはＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により形成され、これにより、それらをアンチセンスの用途に十分に適するようにする（以下の構造を参照のこと）。完全にＰＮＡから構成される骨格は電荷を持たず、通常を上回る熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ２本鎖を生じる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによっては認識されない。
【００６１】
ＰＮＡは、当該分野で公知の任意の技術を使用して合成により産生され得る。ＰＮＡは、ポリアミド骨格がＤＮＡの従来のリボースリン酸環に置き換わっているＤＮＡアナログである。天然の構造に対してラジカル構造が変化しているにもかかわらず、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのへリックス形態の中の配列特異的結合が可能である。ＰＮＡの特性としては、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、１塩基の不一致により生じる脱安定化効果、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度とは無関係なＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、ならびに、ホモプリンＤＮＡとの３重鎖の形成が挙げられる。Ｐａｎａｇｅｎｅ（商標）は、その商標であるＢｔｓ  ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）と、その商標であるオリゴマー化プロセスを開発した。Ｂｔｓ  ＰＮＡモノマーを使用するＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリング、およびキャッピングの反復サイクルから構成される。この技術についてのＰａｎａｇｅｎｅの特許としては、ＵＳ  ６９６９７６６、ＵＳ  ７２１１６６８、ＵＳ  ７０２２８５１、ＵＳ  ７１２５９９４、ＵＳ  ７１４５００６、およびＵＳ  ７１７９８９６が挙げられる。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。これらはそれぞれが、引用により本明細書中に組み入れられる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７の中に見ることができる。
【００６２】
「ロックト核酸」サブユニット（ＬＮＡ）もまた含まれる。ＬＮＡの構造は当該分野で公知である：例えば、Ｗｅｎｇｅｌ，ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４，３６０７、およびＡｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２，３０１）；Ｏｂｉｋａ，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８，８７３５；（１９９８）３９，５４０１、およびＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６，９２３０。
【００６３】
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドには、１つ以上のＬＮＡが組み込まれ得る。いくつかの場合には、上記化合物は、完全にＬＮＡから構成され得る。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成、およびオリゴヌクレオチドへのそれらの組み込みのための方法は当該分野で公知である：米国特許第７，５７２，５８２号；同第７，５６９，５７５号；同第７，０８４，１２５号；同第７，０６０，８０９号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第６，７９４，４９９号；および同第６，６７０，４６１号。典型的なサブユニット間結合には、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が含まれる。あるいは、リン酸を含まないリンカーが使用される場合がある。１つの実施形態には、ＬＮＡを含有している化合物が含まれ、ここでは、それぞれのＬＮＡサブユニットは、ＲＮＡまたはＤＮＡサブユニット（すなわち、デオキシリボースヌクレオチド）により隔てられている。さらなる例示的な化合物は、交互のＬＮＡとＲＮＡまたはＤＮＡサブユニットからなり得、ここでは、サブユニット間結合はホスホロチオエートである。
【００６４】
特定のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドには、電荷を持たないかまたは実質的には電荷を持たない結合により連結された、モルホリノをベースとするサブユニットを持つ塩基対合性部分が含まれ得る。用語「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」（ホスホルアミデートモルホリノオリゴマーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）は、モルホリノサブユニット構造からなるオリゴヌクレオチドアナログをいう。ここでは、（ｉ）複数の構造が、１〜３原子長、好ましくは２原子長、および好ましくは電荷を持たないかまたは陽イオン性の、隣接するサブユニットの５’環外炭素に対して１つのサブユニットのモルホリノ窒素を連結するリンを含む結合により互いに連結され、そして（ｉｉ）それぞれのモルホリノ環が、塩基特異的水素結合によるポリヌクレオチド中の１つの塩基への結合に有効なプリンまたはピリミジンまたは等価な塩基対合部分を持つ。
【００６５】
これらが結合または活性を妨害しない限りは、この結合のバリエーションを作製することができる。例えば、リンに結合させた酸素を硫黄（チオホスホロジアミデート）で置換することができる。５’酸素は、アミノまたは低級アルキルで置換されたアミノで置換され得る。リンに結合したぶら下がっている窒素は、置換されない場合、（状況に応じて置換された）低級アルキルで１置換される場合、または（状況に応じて置換された）低級アルキルで２置換される場合もある。プリンまたはピリミジン塩基対合部分は、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、またはイノシンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０７／１１４３５（陽イオン性結合）および同ＵＳ０８／０１２８０４（改良された合成）に詳細に記載されている。これらは全て、引用により本明細書中に組み入れられる。
【００６６】
本発明の１つの態様においては、ＭＶ−ｓｉＲＮＡに、変更された核酸塩基または非天然の核酸塩基につながれた少なくとも１つのリガンドが含まれる。ペイロード分子と標的化分子が含まれる。多数の化合物が、変更された塩基として機能し得る。変更された塩基の構造は、変更された塩基が、その標的（例えば、ｍＲＮＡ）に対するオリゴヌクレオチドの結合を実質的に妨げることがないはずである程度に重要である。特定の実施形態において、変更された塩基は、ジフルオロトリル、ニトロピロリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインドリル、ナフタレニル、アントラセニル、ピリジニル、キノリニル、ピレニル、または本明細書中に記載される非天然の核酸塩基のいずれか１つの２価のラジカルである。特定の実施形態においては、非天然の核酸塩基は、非天然の核酸塩基は、ジフルオロトリル、ニトロピロリル、またはニトロイミダゾリルである。特定の実施形態においては、非天然の核酸塩基はジフルオロトリルである。
【００６７】
多種多様なリガンドが当該分野で公知であり、本発明に利用できる。例えば、リガンドは、ステロイド、胆汁酸、脂質、葉酸、ピリドキサール、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、芳香族化合物、多環式化合物、クラウンエーテル、干渉物質、切断剤分子、タンパク質結合剤、または炭水化物であり得る。特定の実施形態において、リガンドは、ステロイドまたは芳香族化合物である。特定の場合には、リガンドはコレステリルである。
【００６８】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、細胞の標的化および取り込みを改善する目的のためにリガンドにつながれる。例えば、ＭＶ−ｓｉＲＮＡ物質が、抗体またはその抗原結合断片につながれ得る。さらなる例として、ＭＶ−ｓｉＲＮＡ物質は、特異的なリガンド結合分子（例えば、特定の細胞表面受容体に特異的に結合するか、またはより一般的には、細胞により取り込みを増大させるポリペプチドあるいはポリペプチド断片（例えば、アルギニンを多く含むペプチド）につながれ得る。
【００６９】
用語「アナログ」は、本明細書中で使用される場合は、本明細書中のポリヌクレオチドと同じ構造および／または機能（例えば、標的に対する結合）を保持している分子、化合物、または組成物をいう。アナログの例としては、ペプチド模倣物、ならびに、低分子および高分子の有機化合物または無機化合物が挙げられる。
【００７０】
用語「誘導体」または「変異体」は、本明細書中で使用される場合は、１つ以上の核酸の欠失、付加、置換、または側鎖の修飾により自然界に存在しているポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子配列）とは異なるポリヌクレオチドをいう。特定の実施形態において、変異体は、１つの標的遺伝子配列の１つの領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。したがって、例えば、特定の実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドには、１つの標的遺伝子配列の１つの変異体に相補的である１つの領域が含まれる。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチド複合体および分子には、１つの配列領域、または２つ以上の配列領域が含まれ、これらのそれぞれが、１つの標的遺伝子または複数のポリヌクレオチド配列（またはそれらの１つの変異体）の１つの領域に対して相補的であり、特定の実施形態においては完全に相補的である。特定の実施形態においては、標的遺伝子は哺乳動物の遺伝子、例えば、ヒトの遺伝子、または哺乳動物に感染する微生物（例えば、ウイルス）の遺伝子である。特定の実施形態において、標的遺伝子は、治療標的である。例えば、標的遺伝子は、その発現または過剰発現がヒトの疾患または障害と関係がある遺伝子であり得る。これは、突然変異体遺伝子である場合があり、または野生型遺伝子である場合もあり、また、正常な遺伝子である場合もある。様々な治療標的遺伝子が同定されており、これらのうちの任意のものが、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子により標的化され得る。治療標的遺伝子としては、腫瘍遺伝子、成長因子遺伝子、白血病のような疾患と関係がある転座、炎症性タンパク質遺伝子、転写因子遺伝子、成長因子受容体遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、インターロイキン、ナトリウムチャンネル遺伝子、カリウムチャンネル遺伝子（例えば、以下の遺伝子または以下のタンパク質をコードする遺伝子であるがこれらに限定されない：アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡｐｏＢ−１００）、ｂｃｌファミリーのメンバー（ｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘを含む）、ＭＬＬ−ＡＦ４、ハンチントン遺伝子、ＡＭＬ−ＭＴ６８融合遺伝子、ＩＫＫ−Ｂ、Ａｈａ１、ＰＣＳＫ９、Ｅｇ５、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、Ｎａｖ１．８、ＲｈｏＡ、ＨＩＦ−１α、Ｎｏｇｏ−Ｌ、Ｎｏｇｏ−Ｒ、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＳＮＣＡ、β−カテニン、ＣＣＲ５、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、インターロイキン−１、インターロイキン２、インターロイキン−１２、インターロイキン−６、インターロイキン−１７ａ（ＩＬ−１７ａ）、インターロイキン−１７ｆ（ＩＬ−１７ｆ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）遺伝子、乾癬遺伝子、および腫瘍壊死因子遺伝子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子には、２つ以上の遺伝子（例えば、特定の疾患もしくは障害と関係がある２つ以上の遺伝子）を標的化するガイド鎖あるいは標的特異的領域が含まれる。例えば、関節リウマチの処置については、これらには、インターロイキン−１遺伝子もしくはｍＲＮＡと腫瘍壊死因子もしくはｍＲＮＡに相補的なガイド鎖；インターロイキン−１遺伝子もしくはｍＲＮＡとインターロイキン−１２遺伝子もしくはｍＲＮＡに相補的なガイド鎖；または、インターロイキン−１遺伝子もしくはｍＲＮＡ、インターロイキン−１２遺伝子もしくはｍＲＮＡと、腫瘍壊死因子遺伝子もしくはｍＲＮＡに相補的なガイド鎖が含まれ得る。１つの実施形態においては、これらには、オステオポンチン遺伝子もしくはｍＲＮＡとＴＮＦ遺伝子もしくはｍＲＮＡに相補的なガイド鎖が含まれる。
【００７３】
治療標的遺伝子の他の例としては、ウイルスタンパク質（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質、ＨＴＬＶウイルスタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質、エボラウイルスタンパク質、ＪＣウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ヒトポリオーマウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、およびラウス肉腫ウイルスタンパク質）をコードする遺伝子およびｍＲＮＡが挙げられる。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子に、特定のウイルス（例えば、２つ以上のＨＩＶタンパク質遺伝子あるいは２つ以上のヘルペスウイルス遺伝子）により発現される、２つ以上の遺伝子あるいはｍＲＮＡに相補的なガイド鎖が含まれる。他の実施形態においては、これらに、２つ以上の単純ヘルペスウイルス遺伝子あるいはｍＲＮＡ（例えば、ＨＳＶ−２の発現、複製、あるいは活性を低下させるためには、ＨＳＶ−２のＵＬ２９遺伝子またはｍＲＮＡとＮｅｃｔｉｎ−１遺伝子またはｍＲＮＡ）に対して相補性を有しているガイド鎖が含まれる。１つの実施形態においては、２つ以上のＨＳＶ−２遺伝子もしくはｍＲＮＡを標的化する領域を有しているポリヌクレオチド複合体または分子が、局所送達のための処方物の中に存在する。
【００７４】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子に、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）遺伝子もしくはｍＲＮＡ（例えば、ヒトのＡｐｏＢ遺伝子もしくはｍＲＮＡ、またはマウスのＡｐｏＢ遺伝子もしくはｍＲＮＡ）を標的化する、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上のガイド鎖または標的特異的領域が含まれる。したがって、特定の実施形態においては、これらに、配列番号１に示されるヒトのＡｐｏＢ配列の１つの領域に相補的な領域を含む、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域が含まれる。他の実施形態においては、これらには、配列番号１０に示されるマウスのＡｐｏＢ配列の１つの領域に相補的な領域を含む、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域が含まれる。特定の実施形態においては、これらには、添付の実施例に示される特異的な配列を有している２つ以上のガイド配列が含まれる。
【００７５】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子に、ＨＩＶ遺伝子を標的化する、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上のガイド鎖または領域が含まれる。特定の実施形態においては、これらは、ＨＩＶ  ｇａｇ、ＨＩＶ  ｔａｔ、ＨＩＶ  ｅｎｖ、ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ＨＩＶ  ｖｉｆ、およびＨＩＶ  ｎｅｆタンパク質より選択される１つ以上のタンパク質をコードする、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上のＨＩＶ遺伝子またはｍＲＮＡを標的化する。したがって、特定の実施形態においては、これらに以下が含まれる：配列番号２に示されるＨＩＶ  ｇａｇ配列の１つの領域に相補的である、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域；配列番号３に示されるＨＩＶ  ｔａｔ配列の１つの領域に相補的である、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域；配列番号４に示されるＨＩＶ  ｅｎｖの１つの領域に相補的である、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域；配列番号５に示されるＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ配列の１つの領域に相補的である、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域；配列番号６に示されるＨＩＶ  ｖｉｆ配列の１つの領域に相補的である１つの領域を含む、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域；配列番号７に示されるＨＩＶ  ｎｅｆ配列の１つの領域に相補的である１つの領域を含む、１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の領域。特定の実施形態においては、これらには、添付の実施例に示される特異的なＨＩＶ配列を有している２つ以上のガイド配列が含まれる。
【００７６】
特定の実施形態においては、標的遺伝子（または遺伝子）に相補的な１つの配列領域の選択は、選択された標的配列の分析と、二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、ならびに相対的安定性および細胞特異性の決定に基づく。そのような配列は、ポリヌクレオチドの構造的完全性を低下させるかまたは宿主細胞中での標的遺伝子への特異的結合を妨げるであろう、二量体、ヘアピン、または他の二次構造を形成することについてのそれらの相対的な不能に基づいて選択され得る。
【００７７】
標的遺伝子またはｍＲＮＡの好ましい標的領域としては、ＡＵＧ翻訳開始コドン、または遺伝子もしくはｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的であるそのような配列にある、あるいはその付近にあるそのような領域を挙げることができる。これらの二次構造の分析および標的部位の選択の判断は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアおよび／またはＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェアのｖ．４（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）またはＯｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ２．０を使用して行うことができる。
【００７８】
１つの実施形態においては、標的部位は、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）、または開始コドンに近い領域（およそ７５塩基以内）に優先的に位置することはない。なぜなら、調節領域に結合するタンパク質がポリヌクレオチドの結合を妨害する可能性があるからである。加えて、可能性のある標的部位は、ＮＣＢＩサーバー上でｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍで利用できるＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５のような適切なゲノムデータベースに対して、および排除された他のコード配列に対して有意な相同性を持つ、可能性のある標的配列に対して比較され得る。
【００７９】
別の実施形態においては、標的部位は、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する。加えて、ポリヌクレオチドの自己相補性領域は、標的の遺伝子の中に見られる特定の配列からなり得る。
【００８０】
標的遺伝子は、例えば、植物、動物（例えば、哺乳動物）、原生動物、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、細菌、または真菌を含む、任意の種の遺伝子であり得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドには、実施例１のＧＦＰ配列、実施例２のＨＩＶ配列、または実施例３のＡｐｏＢ配列が含まれ得るか、あるいは、本発明のポリヌクレオチドはこれらに相補的であり得る。
【００８１】
上記のように、標的遺伝子配列とそのポリヌクレオチドの相補的領域は、互いの完全な相補物であり得るか、またはこれらは、これらの鎖が生理学的条件下で互いにハイブリダイズする限りは、完全には満たない相補性であり得る。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチド複合体および分子には、１つ以上の標的遺伝子に対して相補的な少なくとも１つ、２つ、または３つの領域、ならびに、１つ以上の自己相補性領域および／または相互結合ループが含まれる。典型的には、標的遺伝子に相補的な領域は、１５〜１７〜２４ヌクレオチド長である（これらの範囲内の整数を含む）。この領域は、少なくとも１６ヌクレオチド長、少なくとも１７ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２４ヌクレオチド長、１５〜２４ヌクレオチド長、１６〜２４ヌクレオチド長、または１７〜２４ヌクレオチド長（端の値を含み、これらの範囲内の全ての整数を含む）であり得る。
【００８３】
自己相補性領域は、典型的には、２〜５４ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド長、少なくとも１６ヌクレオチド長、または、少なくとも２０ヌクレオチド長（これらの範囲のうちのいずれかの中の全ての整数値を含む）である。したがって、１つの実施形態においては、自己相補性領域には、約１〜２６ヌクレオチド対が含まれ得る。１本鎖領域は約３〜１５ヌクレオチドであり得る（その間の全ての整数を含む）。ヌル領域は、少なくとも設計による、いずれの標的遺伝子にも特異的ではない領域をいう。ヌル領域またはヌル鎖は、本発明の２価のポリヌクレオチド複合体または分子のデザインにおいてそうであるように、標的特異的領域の代わりに使用され得る（例えば、図ＩＶ（Ｋ）を参照のこと）。
【００８４】
特定の実施形態においては、自己相補性領域は２本鎖構造を形成するために十分に長い。特定の実施形態においては、３’領域と５’領域が、ステム−ループ構造を含む自己相補性領域（すなわち、２本鎖領域）になるようにハイブリダイズし得る。したがって、１つの実施形態においては、自己相補性領域の一次配列に、相補的ではないかまたは半相補的であるさらに別の配列により互いに隔てられている相補的な配列の２つのストレッチが含まれる。最適ではないが、特定の実施形態においては上記さらに別の配列は相補的であり得る。上記さらに別の配列はステム−ループ構造のループを形成し、したがって、２つの相補的なストレッチが互いに結合できるようにするために必要な折り畳みを促すために十分な長さでなければならない。特定の実施形態においては、上記ループ配列に、少なくとも３塩基、少なくとも４塩基、少なくとも５塩基、または少なくとも６塩基が含まれる。１つの実施形態においては、上記ループ配列に４塩基が含まれる。（自己相補性領域；すなわち、ステム領域内の）互いに相補的な配列の２つのストレッチは、生理学的条件下で互いに特異的にハイブリダイズために十分な長さである。特定の実施形態においては、ストレッチにはそれぞれ、４〜１２ヌクレオチドが含まれる。他の実施形態においては、ストレッチにはそれぞれ、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチド、あるいはこれらの範囲内の任意の整数値が含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域に、少なくとも４ヌクレオチドのループ配列により隔てられた少なくとも４つの相補的ヌクレオチドの２つのストレッチが含まれる。特定の実施形態においては、自己相補性領域全体またはその一部は、標的遺伝子または遺伝子に相補的なポリヌクレオチドの領域に相補的である場合があり、また、それらに相補的ではない場合もある。
【００８５】
特定の実施形態においては、自己相補性領域は、例えば、ステム−ループ構造を形成するための自己相補性領域の結合に適している熱力学的パラメーターを持つ。
【００８６】
１つの実施形態においては、自己相補性領域は、遊離エネルギーの分析を通じたＲＮＡの使用により熱力学的に計算され、その後、エネルギー組成が所望される構造（例えば、ステム−スープ構造）を形成するために適切であることを確実にするために、残っている「非自己相補性領域」またはループ領域内に含まれるエネルギーと比較される。一般的には、遺伝子標的化領域の様々なヌクレオチド配列が、そのような形成を確実にするためのステムループ構造の組成を決定する際に考慮される。遊離エネルギーの分析式は、この場合もやはり、ヌクレオチドのタイプまたは使用される環境のｐＨを考慮して変更することができる。多くの様々な二次構造予測プログラムが当該分野で利用可能であり、それぞれが本発明にしたがって使用され得る。ＲＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基についての熱力学的パラメーターもまた、標的配列選択アルゴリズムと組み合わせて広く利用することができ、これらのいくつかは当該分野で利用できる。
【００８７】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド複合体または分子に、（ｂ）１６〜５４ヌクレオチド長（その間の全ての整数値を含む）を含む自己相補性配列、または（ｃ）１つのループを形成することができる２〜１２ヌクレオチドが状況に応じて隣接している、１つの遺伝子分子の少なくとも一部に相補的であり、これに対して生理学的条件下でハイブリダイズすることができる、（ａ）１７〜２４ヌクレオチド長（その間の全ての整数値を含む）を含む３つのオリゴヌクレオチドが含まれるか、あるいはポリヌクレオチド複合体または分子は、これらからなる。１つの実施形態においては、自己相補性配列はそれぞれ、そのうちの１つが第２のガイド鎖の５’末端にあり、そのうちの１つが第２のガイド鎖の３’末端にある、ステムループ構造を形成することができる。
【００８８】
特定の実施形態においては、自己相補性領域は、それ自体の酵素的切断を動員するように、および／または遺伝子調節の触媒的プロセスに関与しているタンパク質の特定の領域に結合するように、１つの構造として機能する。加えて、ループは、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ）による自己相補性領域の切断を促進する特定の４−ヌクレオチド（例えば、テトラループＮＧＮＮ、ＡＡＧＵ、ＵＵＧＡ、またはＧＵＵＡ）構造のループであり得る。加えて、自己相補性領域は、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  １１／１３または１４／１６ヌクレオチドにより、２つのヌクレオチド３’末端を残す２本鎖領域に切断され得る。特定の実施形態においては、テトラループは配列ＧＮＲＡまたはＧＮＹＡを有する。ここでは、Ｎは任意のヌクレオチドまたはヌクレオシドを示し、Ｒは、プリンヌクレオチドまたはプリンヌクレオシドを示し、そしてＹは、ピリミジンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオシドを示す。
【００８９】
特定の実施形態においては、上記のように酵素により切断された自己相補性ポリヌクレオチドは、ＲＩＳＣ複合体のタンパク質領域上に載るであろう。特定の実施形態においては、５個以上のヌクレオチドの１つのループを含む自己相補性領域は、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ）による自己相補性領域の切断を妨げる可能性がある。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは標的遺伝子に結合し、その発現を低下させる。標的遺伝子は公知の遺伝子標的であり得、また代わりに、標的遺伝子が明らかになっていない場合、すなわち、無作為配列が使用され得る場合もある。特定の実施形態においては、標的遺伝子レベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下する。
【００９０】
本発明の１つの実施形態においては、標的遺伝子発現（すなわち、遺伝子発現）の阻害レベルは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、そして少なくとも９９％であるか、またはほぼ１００％であり、したがって、細胞または生物は、事実上、いわゆる遺伝子の「ノックアウト」と等しい表現形を有するであろう。しかし、いくつかの実施形態においては、部分的な阻害だけを得ることが好ましい場合があり、結果、この表現形は、いわゆる遺伝子の「ノックダウン」と等しい。遺伝子発現をノックダウンさせるこの方法は、治療的に、または研究のために（例えば、疾患状態のモデルを作製するために、遺伝子の機能を試験するために、物質が遺伝子に対してどのように作用するかを評価するために、薬物の発見のための標的を確認するために）使用することができる。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチド複合体および分子は、遺伝子（コード配列および非コード配列を含む）、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡを標的化して、それらの発現を低下させるまたは阻害するために使用することができる。特定の実施形態においては、それらのガイド鎖または標的化領域は、ｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡに結合する。
【００９２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドのアレイ（マイクロアレイを含む）を提供する。マイクロアレイは、化学反応および生化学的反応を行うためのマイクロメートルからミリメートル範囲の直径を通常持つ小型のデバイスであり、本発明の実施形態に特に適している。アレイは、そのような技術が、ポリヌクレオチド配列の蓄積および／またはスクリーニングに適しており、適合できる限りにおいては、半導体産業および／または生化学産業において公知であり、利用できる、原則として任意の全ての技術を使用して、小型電子部品技術ならびに／あるいは微細作製技術により構築することができる。
【００９３】
本発明のマイクロアレイは、多数のポリヌクレオチドのハイスループット分析に特に望ましい。マイクロアレイは、典型的には、本発明のポリヌクレオチドを含む別の領域またはスポットを用いて構築される。それぞれのスポットに、好ましくはアレイ表面上の場所をアドレスすることができる位置に、１つ以上のポリヌクレオチドが含まれる。本発明のアレイは、当該分野で利用することができる任意の方法により調製され得る。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発された光指向性の化学合成（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）プロセス（米国特許第５，４４５，９３４号および同第５，８５６，１７４号を参照のこと）が、固相光化学合成をフォトリソグラフィー製造技術と組み合わせることにより、チップ表面上で生体分子を合成するために使用され得る。Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌにより開発された化学析出アプローチは、チップ表面上での直接の析出のために予め合成されたｃＤＮＡプローブを使用する（例えば、米国特許第５，８７４，５５４号を参照のこと）。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド分子は、当該分野で広く利用できる技術を使用して化学合成され、３本鎖複合体としてアニーリングさせられる。関連する実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド複合体の３つ以上のガイド鎖が個別に化学合成され得、ポリヌクレオチド複合体を生じるようにアニーリングさせられ得る。
【００９５】
他の実施形態においては、これは、適している、広く知られている技術（例えば、ベクターまたはプラスミド構築物）を使用してインビトロまたはインビボで発現させられる。したがって、特定の実施形態においては、本発明に、ステムループまたはループのいずれかを形成するヌクレオチド配列により互いにつながれた本発明のポリヌクレオチドの配列を含む、インビトロおよびインビボ発現ベクターが含まれる。当業者に周知の方法が、ポリヌクレオチドをコードする配列、ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組み換えが挙げられる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００９６】
ベクターまたは核酸構築物システムには、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡまたはトランスポゾンを一緒に含む、１つのベクターまたはプラスミド、２つ以上のベクターまたはプラスミドが含まれ得る。ベクターの選択は、通常は、ベクターと、その中にベクターを導入しようとする宿主細胞との適合性に依存するであろう。この場合は、ベクターまたは核酸構築物は、好ましくは、哺乳動物細胞中で作動可能であるように機能するものである。ベクターにはまた、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子または薬剤耐性遺伝子）またはレポーター遺伝子（すなわち、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）も含まれ得、これは、適切な形質転換体またはトランスフェクタントの選択あるいは同定に使用され得る。例示的な送達システムとしては、ウイルスベクターシステム（すなわち、ウイルス媒介性形質導入）（当該分野で公知である中でも、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルス）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）を挙げることができる。
【００９７】
上記のように、特定の実施形態は、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を利用する。用語「レンチウイルス」は、分裂している細胞および分裂していない細胞の両方に感染することができる複雑なレトロウイルスの属をいう。レンチウイルスの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）、マエディビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、これらのレンチウイルスの任意の１つ以上に由来し得る（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１４７９−１４８９，１９９９；Ｃａｓｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：２９８８−２９９３，１９９９；Ｕｃｈｉｄａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：１１９３９−１１９４４，１９９８；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８２−６８６，１９９９；Ｓｕｔｔｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：５７８１−５７８８，１９９８；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１１２：４８４３−５２，２００８（これらはそれぞれがそれらの全体において引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。
【００９８】
特定の実施形態においては、レトロウイルスベクターには、レンチウイルスゲノム（例えば、ＨＩＶゲノムまたはＳＩＶゲノム）に由来する特定の最小配列が含まれる。レンチウイルスのゲノムは、典型的には、５’長末端反復（ＬＴＲ）領域、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（例えば、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ）、および３’ＬＴＲ領域にまとめられる。ウイルスのＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ（反復）、およびＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域には、エンハンサーエレメントとプロモーターエレメントが含まれ、Ｕ５領域には、ポリアデニル化シグナルが含まれ、Ｒ領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を隔てている。Ｒ領域の転写された配列は、ウイルスＲＮＡの５’末端と３’末端の両方に現われる（例えば、「ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｏ  Ｎａｒａｙａｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：１６１７−１６３９，１９８９；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ．，１９９０；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−７，１９９８；および米国特許第６，０１３，５１６号（これらのそれぞれが、それらの全体において引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。レンチウイルスベクターには、所望されるベクターの活性を調節するために、レンチウイルスゲノムのこれらのエレメントの任意の１つ以上を含めることができ、あるいは、これらに、例えば、レンチウイルスの複製の病理学的作用を小さくするため、もしくはレンチウイルスベクターを１回の感染に限定するために、これらのエレメントの１つ以上の中に欠失、挿入、置換、あるいは突然変異を含めることができる。
【００９９】
典型的には、最小レトロウイルスベクターには、特定の５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列、（標的細胞中で発現させようとする）１つ以上の目的の遺伝子、１つ以上のプロモーター、およびＲＮＡのパッケージングのためのシス作用性配列が含まれる。本明細書中に記載され、当該分野で公知であるように、他の調節配列を含めることができる。ウイルスベクターは、典型的には、パッケージング細胞株（例えば、真核生物細胞（例えば、２９３−ＨＥＫ））にトランスフェクトすることができるプラスミドにクローニングされ、典型的にはこれにはまた、細菌の中でのプラスミドの複製に有用な配列も含まれる。
【０１００】
特定の実施形態においては、ウイルスベクターに、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）の５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲ由来の配列が含まれる。ＬＴＲ配列は、任意の種に由来する任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列であり得る。例えば、これらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶ由来のＬＴＲ配列であり得る。好ましくは、ＬＴＲ配列はＨＩＶ  ＬＴＲ配列である。
【０１０１】
特定の実施形態においては、ウイルスベクターに、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲ配列およびＵ５配列、ならびにレンチウイルス由来の不活化された３’ＬＴＲまたは「自己不活型（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）」３’ＬＴＲが含まれる。「自己不活型３’ＬＴＲ」は、３’長末端反復（ＬＴＲ）であり、これには、ＬＴＲ配列が下流遺伝子の発現を促せないようにする、突然変異、置換、または欠失が含まれる。３’ＬＴＲ由来のＵ３領域のコピーは、組み込み型プロウイルスの中での両方のＬＴＲの作製のための鋳型となる。したがって、不活化型の欠失または突然変異を持つ３’ＬＴＲをプロウイルスの５’ＬＴＲとして組み込む場合には、５’ＬＴＲからの転写は不可能である。これは、ウイルスのエンハンサー／プロモーターと任意の内部エンハンサー／プロモーターとの間での競合を排除する。自己不活型３’ＬＴＲは、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０，１９９８；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８；およびＩｗａｋｕｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６１：１２０−１３２，１９９９（これらのそれぞれが、それらの全体において引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。自己不活型３’ＬＴＲは、当該分野で公知の任意の方法により作製され得る。特定の実施形態においては、３’ＬＴＲのＵ３エレメントに、そのエンハンサー配列（好ましくは、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐｌ、および／またはＮＦ−κＢ部位）の欠失が含まれる。自己不活型３’ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスには、不活化された５’ＬＴＲが含まれるであろう。
【０１０２】
発現ベクターには、典型的には、ポリヌクレオチドの発現を調節する調節配列が含まれる。発現ベクター中に存在する調節配列には、ベクターのそのような非翻訳領域（例えば、エンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）（これらは、転写および翻訳を行うために宿主細胞のタンパク質と相互作用する）が含まれる。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性に関して様々であり得る。利用されるベクター系および細胞に応じて、任意の数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。加えて、組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターも使用され得る。
【０１０３】
哺乳動物細胞中での発現のためには、哺乳動物遺伝子由来のプロモーターまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般的に好ましい。加えて、多数の、ウイルスをベースとする発現系が、一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合は、目的のポリペプチドをコードする配列が、後期プロモーターと３成分リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結され得る。ウイルスのゲノムの必須ではないＥ１領域またはＥ３領域への挿入が、感染した宿主細胞中でポリペプチドを発現させることができる生存可能なウイルスを得るために使用され得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。加えて、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）が、哺乳動物宿主細胞中での発現を増大させるために使用され得る。
【０１０４】
特定の実施形態は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの１つ以上を利用することができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの適切な選択は、例えば、Ｐａｕｌｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，第２８巻、１２８３−１２９８頁、２０００（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に見ることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにはまた、その下流のＲＮＡコード配列を転写するための、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを指向し得る、任意の合成の、あるいは操作されたＤＮＡ断片が含まれる。さらに、ウイルスベクターの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩ）プロモーター（単数または複数）は誘導性であり得る。任意の適切な誘導性Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、本発明の方法とともに使用され得る。例示的なＰｏｌ  ＩＩプロモーターまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターとしては、Ｏｈｋａｗａ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，第１１巻、５７７−５８５頁，２０００；およびＭｅｉｓｓｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２９巻、１６７２−１６８２頁、２００１（これらはそれぞれ、それらの全体において引用により本明細書中に組み入れられる）の中で提供されているテトラサイクリン反応性プロモーターが挙げられる。
【０１０５】
使用され得る構成的プロモーターの限定ではない例としては、ユビキチンのプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１３，１９８９を参照のこと）、β−アクチンプロモーター（例えば、Ｇｕｎｎｉｎｇら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：４８３１−４８３５，１９８７を参照のこと）およびｐｇｋプロモーター（例えば、Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ  ６０：６５−７４，１９８７を参照のこと）；Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍら、Ｇｅｎｅ  ３２：４０９−４１７，１９８４；およびＤｏｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：２６３５−２６３７，１９８２）が挙げられる（これらはそれぞれ、引用により本明細書中に組み入れられる）。組織特異的プロモーターの限定ではない例としては、ｌｃｋプロモーター（例えば、Ｇａｒｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３０５８−３０６４，１９８８；およびＴａｋａｄｅｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２１７３−２１８０，１９８９を参照のこと）、ミオゲニンプロモーター（Ｙｅｅら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７：１２７７−１２８９．１９９３）、およびｔｈｙ１（例えば、Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、Ｇｅｎｅ  １１３：２０７−２１４，１９９２を参照のこと）が挙げられる。
【０１０６】
プロモーターのさらなる例としては、ユビキチン−Ｃプロモーター、ヒトμ重鎖プロモーターまたはＩｇ重鎖プロモーター（例えば、ＭＨ−ｂ１２）、およびヒトκ軽鎖プロモーターまたはＩｇ軽鎖プロモーター（例えば、ＥＥＫ−ｂ１２）（これらはＢリンパ球の中で機能的である）が挙げられる。ＭＨ−ｂ１２プロモーターには、マトリックス結合領域が隣接しているｉＥμエンハンサーが先行しているヒトμ重鎖プロモーターが含まれ、ＥＥＫ−ｂ１２プロモーターには、イントロンエンハンサー（ｉＥκ）、マトリックス結合領域、および３’エンハンサー（３’Ｅκ）が先行しているκ軽鎖プロモーターが含まれる（例えば、引用により本明細書中に組み入れられる、Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ．１１３：１４２２−１４３１，２００９を参照のこと）。したがって、特定の実施形態は、これらのプロモーターまたはエンハンサーエレメントの１つ以上を利用し得る。
【０１０７】
特定の実施形態においては、本発明は、ポリヌクレオチドの条件的発現を提供する。様々な条件的発現系が公知であり、細胞および動物の両方での使用のために当該分野で利用することができ、本発明は、ポリヌクレオチドの発現または活性を調節するための任意のそのような条件的発現系の使用を意図する。本発明の１つの実施形態においては、例えば、誘導性発現はＲＥＶ−ＴＥＴシステムを使用して達成される。このシステムの成分と、遺伝子の発現を制御するためにこのシステムを使用する方法は文献に十分にまとめられており、テトラサイクリン制御型トランス活性化因子（ｔＴＡ）または逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現するベクターが市販されている（例えば、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、およびｐｔＴＡ−２／３／４ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。このようなシステムは、例えば、米国特許第５６５０２９８号、同第６２７１３４８号、同第５９２２９２７号、および関連する特許に記載されている（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。
【０１０８】
特定の実施形態においては、本明細書中で提供されるウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス）は、選択された細胞のタイプを主に標的化するための、１つ以上の選択されたウイルス糖タンパク質またはエンベロープタンパク質を持つ「偽型」である。偽型化は、一般的には、細胞表面のウイルス粒子上への１つ以上の異種ウイルス糖タンパク質の取り込みをいい、多くの場合は、これにより、その正常な標的細胞とは異なる選択された細胞にウイルス粒子が感染することが可能となる。「異種」エレメントは、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来する。典型的には、ウイルスベクターの糖タンパク質をコードする領域は、例えば、その自身の糖タンパク質の発現を妨げるための欠失により、遺伝的に変更されている。例にすぎないが、ＨＩＶ由来のレンチウイルスベクターに由来するエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１および／またはｇｐ１２０は、典型的には、異種ウイルス糖タンパク質での偽型化の前に欠失させられる。
【０１０９】
ウイルスベクターの作製には、当該分野で公知の任意の適切な遺伝子操作技術を使用して達成され得る。これには、例えば、以下に記載されているような、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、ＰＣＲ増幅、およびＤＮＡ配列決定の標準的な技術が含まれるが、これらに限定されない：Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））、Ｃｏｆｆｉｎら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９７））、および「ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））。
【０１１０】
当該分野で公知である任意の様々な方法が、そのゲノムにウイルスベクターのＲＮＡコピーが含まれる適切なレトロウイルス粒子を産生するために使用され得る。１つの方法として、ウイルスベクターは、所望される標的細胞特異性を持つウイルス粒子にウイルスベクターをベースとするウイルスゲノムＲＮＡをパッケージングするパッケージング細胞株に導入され得る。パッケージング細胞株は、典型的には、ウイルスのゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングするため、および標的細胞に感染させるために必要なウイルスタンパク質をトランスで提供し、これには、構造ｇａｇタンパク質、酵素ｐｏｌタンパク質、およびエンベロープ糖タンパク質が含まれる。
【０１１１】
特定の実施形態において、パッケージング細胞株は、必要なまたは所望されるウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ）を確実に安定的に発現し得る（例えば、引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第６，２１８，１８１号を参照のこと）。特定の実施形態においては、パッケージング細胞株は、必要なまたは所望されるウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、糖タンパク質）（本明細書中に記載される麻疹ウイルス糖タンパク質配列を含む）を確実にコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトされ得る。１つの例示的な実施形態においては、パッケージング細胞株はｇａｇ配列とｐｏｌ配列を安定的に発現し、この細胞株はその後、ウイルスベクターをコードするプラスミドおよび糖タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。所望されるプラスミドの導入後、ウイルス粒子が収集され、例えば、ウイルス粒子の濃縮されたストックを得るための超遠心分離により処理される。例示的なパッケージング細胞株としては、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３０）細胞株が挙げられる。
【０１１２】
１つの特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、ｐＳＵＰＥＲベクター骨格と、発現させようとするポリヌクレオチドに対応しているさらに別の配列を含むベクターシステムを使用して発現させられる。ｐＳＵＰＥＲベクターシステムは、ｓｈＲＮＡ試薬を発現させることにおいて、および遺伝子発現をダウンレギュレートさせることにおいて有用であることが示されている（２００２年８月２２日にオンラインで公開された、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０（２００２）、およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）。ｐＳＵＰＥＲベクターは、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから市販されている。
【０１１３】
遺伝子発現の調節方法
本発明のポリヌクレオチドは、一般的に、１つ以上の標的遺伝子の発現を阻害するまたは低下させるそれらの能力に全てが関係している、様々な目的のために使用され得る。したがって、本発明は、上記１つ以上の標的遺伝子を含む細胞に、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子を導入する工程を含む、１つ以上の標的遺伝子の発現を低下させる方法を提供する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチド複合体または分子には、１つ以上の標的遺伝子をまとめて標的化する１つ以上のガイド鎖が含まれる。１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ガイド鎖または標的化領域のいずれか１つ、２つ、または３つにより標的化される標的遺伝子、またはそのホモログ、変異体、もしくはオルトログを含む細胞に導入される。
【０１１４】
加えて、本発明のポリヌクレオチドは、発現を間接的に低下させるために使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子は、第２の遺伝子（すなわち、標的遺伝子）の発現を駆動するトランスアクチベーターの発現を低下させ、それにより第２の遺伝子の発現を低下させるために使用され得る。同様に、ポリヌクレオチドは、発現を間接的に増大させるために使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子は、第２の遺伝子の発現を阻害する転写リプレッサーの発現を低下させ、それにより第２の遺伝子の発現を増大させるために使用され得る。
【０１１５】
様々な実施形態において、標的遺伝子は、その中にポリヌクレオチドを導入しようとする細胞に由来する遺伝子、内因性遺伝子、外因性遺伝子、トランスジーン、またはそのトランスフェクション後に細胞中に存在する病原体の遺伝子である。特定の標的遺伝子および細胞に送達されるポリヌクレオチドの量に応じて、本発明の方法は、標的遺伝子の発現の部分的なまたは完全な阻害を生じ得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物（例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌に由来し得るか、あるいは任意の生物の中に含まれ得る。本明細書中で使用される場合は、「標的遺伝子」には、遺伝子、ｍＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏＲＮＡが含まれる。
【０１１６】
標的遺伝子の発現の阻害は、標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルがないこともしくは観察できるほどの低下、標的遺伝子により発現される遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ０）のレベルがないこともしくは観察できるほどの低下、および／または、上記遺伝子の発現と関係がある表現形の観察あるいは検出を含むが、これらに限定されない手段により、本発明の分野の当業者に公知の技術を使用して、確認することができる。
【０１１７】
本発明のポリヌクレオチド複合体または分子の導入により生じる効果を決定するために試験され得る細胞の特徴の例としては、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期の特徴、細胞の分化、および形態学が挙げられる。
【０１１８】
本発明のポリヌクレオチド複合体または分子は細胞に直接（すなわち、細胞内に）導入される場合があり、また、生物（例えば、哺乳動物）の体腔または間質空間内に細胞外に導入される、生物の循環に導入される、経口により導入される、上記ポリヌクレオチドを含む溶液中に生物を浸すことにより、または上記細胞にポリヌクレオチドを送達するために十分ないくつかの他の手段により導入される場合もある。
【０１１９】
加えて、ポリヌクレオチドを発現するように操作されたベクターが細胞に導入される場合があり、この場合、上記ベクターがポリヌクレオチドを発現することにより、細胞内にそれが導入される。発現ベクターを細胞内に移動させる方法は当該分野で広く知られており、当該分野で利用することができる。これには例えば、トランスフェクション、リポフェクション、スクレープローディング、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、遺伝子銃、およびレトロトランスポジションが含まれる。一般的に、細胞内にベクターを導入する適切な方法は、ベクターのタイプおよび細胞のタイプ、ならびに当該技術分野で広く利用することができる教示に基づいて当業者により容易に決定される。感染性物質は、当該分野で容易に利用することができる様々な手段（例えば、鼻腔内吸入を含む）により導入され得る。
【０１２０】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子発現を阻害する方法は、他のノックダウンおよびノックアウト方法（例えば、遺伝子標的化、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、２本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）と組み合わせることにより、標的遺伝子の発現をさらに低下させる場合がある。
【０１２１】
様々な実施形態において、本発明の標的細胞は、初代細胞、細胞株、不死化細胞、または形質転換された細胞である。標的細胞は体細胞である場合も、また生殖細胞である場合もある。標的細胞は、非分裂細胞（例えば、ニューロン）である場合があり、また、適切な細胞培養条件においてインビトロで増殖できる場合もある。標的細胞は正常細胞である場合があり、また、疾患細胞（既知の遺伝子突然変異を含有するものを含む）である場合もある。本発明の真核生物の標的細胞としては、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、げっ歯類細胞、および霊長類細胞が挙げられる。１つの実施形態においては、本発明の標的細胞は幹細胞であり、これには例えば、胚性幹細胞（例えば、マウス胚性幹細胞）が含まれる。
【０１２２】
本発明のポリヌクレオチド複合体、分子、および方法は、例えば、炎症性疾患、心臓血管疾患、神経系疾患、腫瘍、脱髄疾患、消化系疾患、内分泌系疾患、生殖系疾患、血液リンパ疾患、免疫学的疾患、精神障害、骨格筋疾患、神経学的障害、神経筋疾患、代謝疾患、性感染症、皮膚および結合組織の疾患、泌尿器疾患、ならびに感染症を含むがこれらに限定されない広範な様々な疾患または障害のいずれかを処置するために使用され得る。
【０１２３】
特定の実施形態においては、これらの方法は、動物に対して、特定の実施形態においては、哺乳動物に対して、特定の実施形態においては、ヒトに対して実施される。
【０１２４】
従って、１つの実施形態においては、本発明には、遺伝子の脱調節、過剰発現、または突然変異と関係がある疾患の処置または予防のために本発明のポリヌクレオチド複合体あるいは分子を使用する方法が含まれる。例えば、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子は、癌性細胞または腫瘍に導入され得、それにより、癌原性／腫瘍形成性の表現型の維持に必要な、あるいはそれに関連する遺伝子の発現が阻害される場合がある。疾患または他の病状を予防するために、例えば、疾患／病状の開始または維持に必要な標的遺伝子が選択され得る。処置には、疾患と関係があるいずれかの症状または病状と関係がある臨床的適応症の緩解が含まれ得る。
【０１２５】
加えて、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子の突然変異と関係がある疾患または障害を処置するために使用される。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、突然変異した遺伝子または対立遺伝子の発現を調節するために使用される。そのような実施形態においては、突然変異した遺伝子は、突然変異した遺伝子の領域に相補的な領域を含むであろうポリヌクレオチド複合体または分子の標的である。この領域には突然変異が含まれる場合があるが、必須ではなく、上記遺伝子の別の領域もまた標的化される場合には、それにより突然変異体遺伝子または遺伝子の発現の低下を生じる場合がある。特定の実施形態においては、この領域には突然変異が含まれ、関連する実施形態においては、ポリヌクレオチド複合体または分子は、突然変異体遺伝子または遺伝子の発現を特異的に阻害するが、野生型遺伝子または遺伝子は阻害しない。このようなポリヌクレオチドは、例えば、対立遺伝子が突然変異しているものとしていないものがある状況において特に有用である。しかし、他の実施形態においては、この配列は必ずしも突然変異を含むわけではなく、従って、野生型配列のみを含む場合がある。このようなポリヌクレオチドは、例えば、全ての対立遺伝子が突然変異している状況において特に有用である。種々の疾患および障害が遺伝子の突然変異と関係があるか、または遺伝子の突然変異により生じることが当該分野で知られており、本発明には、任意のこのような疾患または障害のポリヌクレオチドでの処置が含まれる。
【０１２６】
特定の実施形態においては、病原体の遺伝子が阻害のために標的化される。例えば、遺伝子は宿主の免疫抑制を直接引き起こす可能性があり、また、病原体の複製、病原体の伝染、もしくは感染の維持に不可欠である可能性もある。加えて、標的遺伝子は、その宿主への病原体の進入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製もしくは組込み、宿主内における感染の確立もしくは拡大、または次世代の病原体のアセンブリを担う病原性遺伝子あるいは宿主遺伝子である場合もある。予防の方法（即ち感染の予防または感染リスクの低減）、ならびに感染に関係がある症状の頻度または重症度の低減が、本発明に含まれる。例えば、病原体による感染のリスクがある細胞または既に感染した細胞（特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染）が、本発明のポリヌクレオチドの導入による処置のために標的化される場合がある（標的化配列については、実施例１および実施例２を参照のこと）。したがって、１つの実施形態においては、１つ以上のＨＩＶタンパク質を標的化する本発明のポリヌクレオチド複合体または分子が、ＨＩＶ感染または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を処置あるいは阻害するために使用される。
【０１２７】
他の特定の実施形態においては、本発明は、いずれかのタイプの癌の処置に、またはそのような処置法の開発に使用される。本明細書中に記載される方法を使用して処置できる腫瘍の例としては、神経芽細胞腫、骨髄腫、前立腺癌、小細胞性肺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞性肺癌、脳腫瘍、乳癌、白血病、リンパ腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
１つの実施形態においては、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）を標的化する本発明のポリヌクレオチド複合体または分子が、アテローム性動脈硬化症または心臓疾患を処置、軽減、または阻害するために使用される。ＡｐｏＢは、コレステロールの組織への運搬を担っている低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の主要なアポリポタンパク質である。ＬＤＬ粒子上のＡｐｏＢは、ＬＤＬ受容体のリガンドとして作用し、高レベルのＡｐｏＢは、血管疾患（アテローム性動脈硬化症）を引き起こし、心臓疾患に至るプラークを生じる可能性がある。
【０１２９】
ポリヌクレオチド複合体、分子、および発現ベクター（ウイルスベクターおよびウイルスを含む）は、インビトロまたはエキソビボで細胞に導入され、続いてその後、動物に入れられて治療が行われる場合があり、また、ポリヌクレオチド複合体、分子、および発現ベクターが、インビボでの投与により患者に直接導入される場合もある。したがって、本発明は、特定の実施形態において、遺伝子療法の方法を提供する。本発明の組成物は、多数の方法のうちのいずれかで患者に投与することができ、これには、非経口、静脈内、全身、局所、局部、経口、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、吸入、または任意のそのような送達方法が含まれる。１つの実施形態においては、組成物は、非経口投与、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与される。特定の実施形態において、リポソーム組成物が静脈内注入により投与されるか、または瞬時注射により腹腔内投与される。
【０１３０】
本発明の組成物は、患者への送達に適している薬学的組成物として製剤化することができる。本発明の薬学的組成物には、多くの場合、１つ以上の緩衝液（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸塩緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート形成剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、処方物をレシピエントの血液と等張、低張または弱低張にする溶質、懸濁剤、増粘剤、および／または保存料が含まれる。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化される場合がある。
【０１３１】
患者に投与される自己保護オリゴヌクレオチドの量は、様々な要因（例えば、疾患、および（ベクターが投与される場合には）使用されるベクターから発現されるオリゴヌクレオチドのレベルを含む）に基づいて、医師が容易に決定することができる。用量当たりの投与量は、典型的には、最少の治療用量を上回るが毒性用量を超えない量となるように選択される。用量当たりの量の選択は、多数の要因（例えば、患者の病歴、他の治療薬の使用、および疾患の性質）に応じて様々である。加えて、投与量は、処置に対する患者の応答、およびいずれかの処置に伴う副作用の有無または重篤度に応じて、処置期間を通して調整される場合がある。
【０１３２】
遺伝子機能を決定する方法
本発明にはさらに、これまでには機能が明らかになっていない標的遺伝子の活性を抑制するための本発明のポリヌクレオチド複合体または分子の使用を含む、生物における遺伝子機能を同定する方法が含まれる。従来の遺伝子スクリーニングによる時間と手間がかかる突然変異体の単離に代わり、機能ゲノム学は、標的遺伝子活性の量を減少させ、および／またはその時期を変えるために本発明を利用することにより、特性決定されていない遺伝子の機能を決定することを想定している。本発明は、医薬品の潜在的標的の決定、発育に関連する正常な事象および病理学的事象の解明、生後の発育／老化に関与しているシグナル伝達経路の決定などにおいて使用され得る。ゲノム遺伝子および発現された遺伝子の供給源（例えば、酵母、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムの全配列を含む）からヌクレオチド配列情報を取得する、次第に速まっている速度を本発明と組み合わせることにより、生物（例えば、線虫）における遺伝子の機能を決定することができる。特定のコドンを使用することについての様々な生物の優先性、関連する遺伝子産物の配列データベースの検索、遺伝形質の連鎖マップとヌクレオチド配列が由来する物理的マップとの相関関係、および人工知能法を、このような配列決定プロジェクトで取得されたヌクレオチド配列から推定のオープンリーディングフレームを定義するために使用することができる。
【０１３３】
１つの実施形態においては、例えば、遺伝子の機能または生物学的活性を決定するために、本発明のポリヌクレオチドが使用され、発現配列タグ（ＥＳＴ）から利用することができる部分配列に基づいて遺伝子発現が阻害される。成長、発育、代謝、疾患耐性、または他の生物学的プロセスにおける機能的な変化は、ＥＳＴの遺伝子産物の正常な役割の指標となる。
【０１３４】
標的遺伝子を含有するインタクトな細胞／生物にポリヌクレオチドを容易に導入できることにより、本発明をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に使用することができる。例えば、発現された異なる遺伝子を阻害することができるポリヌクレオチドを含む溶液は、順序付けされたアレイとしてマイクロタイタープレート上に配置された個々のウェルに入れることができ、それぞれのウェルの中の無傷細胞／生物を、標的遺伝子活性の阻害に起因する性質または発育の何らかの変化または修飾についてアッセイすることができる。標的遺伝子の機能は、遺伝子活性が阻害された場合に細胞／生物に対してそれが及ぼす作用からアッセイすることができる。１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ケモコゲノミクススクリーニングに、すなわち、本発明のポリヌクレオチドを使用した遺伝子発現の低下によりモデル化された疾患を退行させる化合物の能力について化合物を試験するために使用される。
【０１３５】
ＲＦＬＰまたはＱＴＬ解析により、生物の特性が多形に遺伝子的に関連していると決定された場合は、本発明は、その遺伝的多形が特性に直接関与しているかどうかに関する知見を得るために使用することができる。例えば、遺伝的多形を定義している断片、またはそのような遺伝的多形の周辺の配列を増幅してＲＮＡを得、ポリヌクレオチドを生物に導入して、特性の変化が阻害と関係しているかどうかを決定することができる。
【０１３６】
本発明はまた、必須遺伝子の阻害を可能にすることにおいても有用である。そのような遺伝子は、特定の発育段階または細胞コンパートメントにおいてのみ細胞または生物の生存能力に必要とされ得る。標的遺伝子の活性を、これが生存能力に必須でない場合または場所において阻害することにより、条件的突然変異体の機能的等価物が産生される場合がある。本発明は、標的のゲノムに永久突然変異を導入することなく、生物の特定の発育時期および位置でのポリヌクレオチドの付加を可能にする。同様に、本発明は、所望される場合にのみポリヌクレオチドを発現する誘導性ベクターまたは条件的ベクターの使用を想定する。
【０１３７】
本発明はまた、遺伝子産物が創薬または新薬開発のための標的であるかどうかを確認する方法に関する。分解のために遺伝子に対応する遺伝子を標的化するポリヌクレオチドが、細胞または生物内に導入される。細胞または生物は、遺伝子の分解が起こる条件下で維持され、これにより、遺伝子発現の低下が生じる。この遺伝子発現の低下が細胞または生物に影響を及ぼすかどうかが決定される。遺伝子発現の低下が影響を及ぼす場合は、その遺伝子産物が創薬または新薬開発の標的となる。
【０１３８】
ポリヌクレオチド複合体および分子の設計および生産方法
本発明のポリヌクレオチド複合体および分子は、ポリヌクレオチドの利点を付与する１つ以上の２本鎖領域を含む二次構造（ステムループ構造またはループ構造が隣接していることもある）を採用するように配置された、新規であり、固有の機能的配列のセットを含む。したがって、特定の実施形態においては、本発明に、本発明のポリヌクレオチド複合体および分子を設計する方法が含まれる。そのような方法には、典型的に、ポリヌクレオチド複合体および分子の様々な配列成分の適切な選択が含まれる。用語「プライマリー鎖（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒａｎｄ）」、「セカンダリー鎖（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒａｎｄ）」、および「キー鎖（ｋｅｙ  ｓｔｒａｎｄ）」は、本発明のポリヌクレオチド複合体または分子内に存在する様々なガイド鎖をいう。
【０１３９】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド複合体の基本設計は、以下の通りである：
モチーフの設計：
（プライマリー鎖）（ＵＵ）（セカンダリー鎖）（ＵＵ）（キー鎖）（ＵＵ）
従って、関連する実施形態においては、ポリヌクレオチドは、以下のように設計される：
ＩＩ．（セカンダリー鎖）（ＵＵ）（ＵＵ）（キー鎖）（ＵＵ）（プライマリー鎖）
ＩＩＩ．（セカンダリー鎖）（ＵＵ）（ループまたはステムループ）（キー鎖）（ＵＵ）（ループまたはステムループ）（プライマリー鎖）（ＵＵ）
パラメーターの設定
自己相補性についてのシードサイズ（ｓｅｅｄ  ｓｉｚｅ）は、およそ３８％〜４３％に設定する。１９のヌクレオチド標的については、１つの範囲または７ヌクレオチドもしくは８ヌクレオチドが、ＳＥＥＤ＿ＳＩＺＥとして好ましい。
【０１４０】
それぞれの遺伝子について、ＰＲＩＭＡＲＹ標的遺伝子とＳＥＣＯＮＤＡＲＹ標的遺伝子を定義する。
【０１４１】
プライマリー鎖の定義
１つ以上の標的遺伝子配列を用いて開始する。それぞれの遺伝子について、Ｇ／Ｃ含有量、特異性、およびポリＡまたはポリＧフリーの基準を満たすＰＲＩＭＡＲＹ標的配列の１７〜２４ヌクレオチドモチーフのリストをつくる。それぞれについて、ＳＥＣＯＮＤＡＲＹ鎖およびＫＥＹ鎖もまた見つける。
【０１４２】
セカンダリー鎖とキー鎖の発見
ｄ．それぞれの遺伝子上のそれぞれの標的配列について、塩基１からＳＥＥＤ＿ＳＩＺＥまでが、ＳＥＣＯＮＤＡＲＹ遺伝子に対してそれぞれの配列の逆鎖とクラスターアラインする（ｃｌｕｓｔａｌ  ａｌｉｇｎ）。
【０１４３】
完全なアラインメントを持つ配列を記録する。ＳＥＣＯＮＤＡＲＹ遺伝子上の標的配列は、アラインメントの開始点、マイナス鎖のモチーフの長さ、アラインメントの開始点に対してプラス鎖のＳＥＥＤ＿ＳＩＺＥ、プラス鎖のＳＥＥＤ＿ＳＩＺＥである。ＳＥＣＯＮＤＡＲＹ鎖は逆相補鎖である。
【０１４４】
それぞれのＫＥＹ鎖を見つけるために、ＳＥＥＤ＿Ａを、ＰＲＩＭＡＲＹ鎖の１位の塩基からＳＥＥＤ＿ＳＩＺＥまでと定義し、ＳＥＥＤ＿Ｂを、マイナス鎖のＳＥＥＤ＿ＳＩＺＥのモチーフの長さからＳＥＣＯＮＤＡＲＹ鎖のモチーフの長さまでの塩基と定義する。ＭＩＤ＿ＳＥＣＴＩＯＮを、モチーフ配列の長さ、マイナス鎖のＳＥＥＤ＿Ａの長さ、プラス鎖のＳＥＥＤ＿Ｂの長さの繰り返しの符号「|」と設定する。重要なアラインメント配列を、ＳＥＥＤ＿Ａ、ＭＩＤ＿ＳＥＣＴＩＯＮ、ＳＥＥＤ＿Ｂと設定する。キーセグメントの標的遺伝子にクラスターアラインさせる。塩基のアラインメントに対するキー標的遺伝子上のアラインメントのヒットにある塩基としてのＫＥＹ標的配列と、モチーフの長さを記録する。ＫＥＹ鎖は逆相補鎖である。
【０１４５】
随意のポリヌクレオチドの構築
ｇ．標的の等しい長さ領域に支配的な融点を有する（４〜２４個の）ヌクレオチドを持つステムＡおよびステムＢの候補を構築する。ステム鎖は、互いにＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ相補性を有する。長さと組成は、ステムループ構造のプレプロセシングのために選択されるエンドヌクレアーゼに依存する。
【０１４６】
ｈ．標的の等しい長さ領域に支配的な融点を有する（４〜２４個の）ヌクレオチドを持つステムＣおよびステムＤの候補を構築する。ステム鎖は、互いにＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ相補性を有するが、ステムＡおよびステムＢに対する相補性は有さない。長さと組成は、ステムループ構造のプレプロセシングのために選択されるエンドヌクレアーゼに依存する。
【０１４７】
ｉ．ループＡおよびループＢの中に（４〜１２個の）Ａ−Ｔを多く含むヌクレオチドを持つループ候補を構築する。長さと組成は、ステム−ループ構造のプレプロセシングのために選択されるエンドヌクレアーゼに依存する。記載するテトラループは、（図Ａ）に示すように、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩまたはＰａｃ１  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩエンドリボヌクレアーゼによりプロセシングされたより長いステムについて示唆される。より大きなループが、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩまたはＰａｃ１プロセシングを妨げることについて示唆され、これは、（図Ｃ、図Ｄ）に示すように、より短いステム上に配置される。
【０１４８】
ｊ．各モチーフ候補について連続する配列を構築する。
【０１４９】
ｋ．所望されるパラメーターを持つソフトウェアを使用して候補配列を折り畳む。
【０１５０】
ｌ．出力から、所望されるステム／ループ構造を持ついずれか一方の末端または両方の末端に１本鎖標的領域が隣接している構造を特定する。
【０１５１】
１つの実施形態においては、標的遺伝子の発現の調節のための１つ以上の自己相補性領域を含むポリヌクレオチド配列（即ち、ポリヌクレオチド）を設計する方法には、（ａ）１７〜３０ヌクレオチド長の、標的遺伝子に相補的である第１の配列を選択する工程；および（ｂ）自己相補性領域を含み、第１の配列に非相補的である、１２〜５４ヌクレオチド長のさらに別の配列を選択する工程が含まれる。
【０１５２】
これらの方法には、特定の実施形態においては、例えば、それらの配列がステムループ構造を採用できるかどうかを決定するために、工程（ｂ）で選択された配列により採用される二次構造を決定または予測する工程が含まれる。
【０１５３】
同様に、これらの方法には、（例えば、インビボまたはインビトロの試験システムにおいて）設計したポリヌクレオチド配列を標的遺伝子の発現を阻害するその能力について試験することを含む確認工程が含めることができる。
【０１５４】
本発明はさらに、本明細書中に記載される相補性の特徴に基づいてポリヌクレオチドの配列を選択するためのコンピュータープログラムの使用を意図する。したがって、本発明は、ポリヌクレオチド配列を選択するために使用しようとするコンピューターソフトウェアプログラム、および上記ソフトウェアプログラムを格納しているコンピューターで読み取り可能な媒体、ならびに本発明のプログラムの１つを格納しているコンピューターを提供する。
【０１５５】
特定の実施形態においては、ユーザーは、標的遺伝子の配列、位置、または名称に関する情報をコンピューターに提供する。コンピューターは、この入力を本発明のプログラムにおいて入力して、標的化する標的遺伝子の１つ以上の適切な領域を同定し、本発明のポリヌクレオチドにおいて使用するための相補性配列を出力または提供する。次に、上記コンピュータープログラムは、この配列情報を使用して、ポリヌクレオチドの１つ以上の自己相補性領域の配列を選択する。典型的には、プログラムは、標的遺伝子、または上記標的遺伝子に相補的な上記ポリヌクレオチドの領域を含む、ゲノム配列とは相補的でない配列を選択するであろう。さらに、このプログラムは、互いに相補的ではない自己相補性領域の配列を選択するであろう。所望される場合は、このプログラムはまた、ギャップ領域の配列も提供する。適切な配列を選択すると、コンピュータープログラムは、ユーザーにこの情報を出力または提供する。
【０１５６】
本発明のプログラムはさらに、標的遺伝子を含む生物のゲノム配列に関する入力、例えば公的なデータベースまたは私的なデータベース、ならびに特定の配列の二次構造および／またはハイブリダイゼーション特性を予測するさらに別のプログラムを、ポリヌクレオチドが正確な二次構造を採用し、非標的遺伝子にはハイブリダイズしないことを確実にするために、使用する。
【０１５７】
本発明は、本明細書中に記載されるように、ポリヌクレオチドが１つ以上の遺伝子の標的遺伝子の発現を低下させることにおいて極めて有効であるという驚くべき発見に部分的に基づいている。ポリヌクレオチドは、高い効力、および複数の標的遺伝子に対する有効性の増大を含む、これまでに記載されたアンチセンスＲＮＡを上回る有意な利点をもたらす。さらに、本発明のポリヌクレオチドの使用により、ｄｓＲＮＡ分子に伴うオフターゲット抑制が実質的に排除され、多価ＲＮＡｉがもたらされるので、本発明のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡに使用される従来のｄｓＲＮＡ分子を上回るさらなる利点ももたらす。
【０１５８】
本発明の組成物および方法が、様々な異なる標的遺伝子を標的化するために使用され得ることが理解される。用語「標的遺伝子」は、遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡを意味し得る。したがって、本明細書中で提供される標的配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のいずれかとして示され得る。当業者は、本発明の組成物に、本明細書中に提供されるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のいずれかに相補的である領域が含まれ得ることを理解するであろう。したがって、ＤＮＡ標的配列またはＲＮＡ標的配列のいずれかが提供される場合は、それぞれ、対応しているＲＮＡ標的配列またはＤＮＡ標的配列もまた標的化され得ることが理解される。
【０１５９】
本発明の実施では、当該技術分野の範囲に含まれる細胞生物学、分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡの様々な従来技術が利用されるであろう。そのような技術は、文献の中で十分に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；およびＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ，Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）を参照のこと。
【０１６０】
本明細書中で言及した特許、特許出願、および非特許参考文献は全て、あたかもそれぞれが引用により個々に本明細書中に組み入れられるかのように、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１６１】
上記の様々な実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書中でにおいて言及した、および／または出願データシートに列挙した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が引用により本明細書に組み入れられる。上記実施形態の態様は、なおさらなる実施形態を提供するために、様々な特許、出願、および刊行物の概念を利用することが必要である場合には、改変することができる。
【０１６２】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明を参照して複数の実施形態について行うことができる。一般的には、以下の特許請求の範囲の中で使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲の中で開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきものではなく、むしろ、そのような特許請求の範囲が得る等価物の完全な範囲とともに、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【実施例】
【０１６３】
実施例１
Ｔｒｉｖｏｉｄ抗ＧＦＰ
多価ｓｉＲＮＡを、１つの遺伝子である緑色蛍光タンパク質タンパク質（ＧＦＰ）に対して設計した。ＧＦＰに対する多価の合成ＲＮＡ  ＭＶ−ｓｉＲＮＡ複合体を、１つのｓｈＲＮＡクローンのものに対して抑制活性を比較するために試験した。また、合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ複合体の鎖の一方を不活化させる効果を試験するために、一方の鎖を以下に示すようにＤＮＡ（Ｔ１−１９＿Ｃ＿ｄｎａ）で置き換えた。この置き換えにより、抑制において約３０％の相対的低下が生じた。さらに、本明細書中に記載するＭＶ−ｓｉＲＮＡ自己相補性クローンの「ｓｈｏｒｔ」形態および「ｌｏｎｇ」形態をＧＦＰ発現の抑制について試験し、公開されているｓｈＲＮＡクローンのＧＦＰ発現の抑制に対して比較した。
【０１６４】
合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡ置換鎖のオリゴマー配列を、表１において以下に示す。ＧＦＰコード配列の標的化される領域を図８Ａの中で説明する。
表１：合成ＭＶ−ｓｉＲＮＡ用のオリゴ：
【０１６５】
【表１】
0005875976.tif 000002
合成の多価ｓｉＲＮＡ（ＭＶ−ｓｉＲＮＡ）を調製するために、上記個々のオリゴのチューブそれぞれを、５０μＭ（５０ｐｍｏｌｅ／μＬ）の最終濃度が得られるように、ＲＮａｓｅを含まない水の中に再懸濁した。その後、個々のオリゴを以下のように組み合わせ：（ａ）ＴＩ−１９／７＿Ａ、ＴＩ−１９／７＿Ｂ、およびＴＩ−１９／７＿Ｃ（ＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  Ｉ）、または（ｂ）ＴＩ−１９／７＿Ａ、ＴＩ−１９／７＿Ｂ、およびＴＩ−１９／７＿Ｃ＿ｄｎａ（ＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  Ｉ  ＤＮＡ）、以下のようにアニーリングさせた。３０μＬの上記再懸濁したオリゴのそれぞれ１つを、１０μＬの１０×アニーリング緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）と混合し、ボルテックスし、９４℃で５分間加熱し、３０分かけて７０℃まで段階的に冷却した。アニーリングしたＭＶ−ｓｉＲＮＡの最終濃度は約１５μＭであった。
【０１６６】
多価ｓｉＲＮＡクローンとｓｈＲＮＡ対照を調製するために、以下の表２の配列を、ｐＳＵＰＥＲマニュアルにしたがってｐＳＵＰＥＲベクターにクローニングした。命名したそれぞれのクローン（例えば、ＴＩ、Ｔ１＿ｌｏｎｇ、ＴＩＩ）についての最初の配列は、ＲＮＡ転写物（表１の合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡの配列に匹敵する）として細胞中で発現された自己相補性の多価ｓｉＲＮＡの配列を示し、「＿ａｓ」と呼ばれる配列は、その分子のコード配列の一部である。
表２：ＭＶ−ｓｉＲＮＡを発現するクローン用のオリゴ：
【０１６７】
【表２−１】
0005875976.tif 000003
【０１６８】
【表２−２】
0005875976.tif 000004
ＧＦＰの発現に対する効果を試験するために、アニーリングさせたＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子（ウェルあたり７．５ｎＭの最終濃度）と、ＭＶ−ｓｉＲＮＡクローンまたはｓｈＲＮＡ対照を含むｐＳＵＰＥＲベクターを、ＧＦＰを構成的に発現する２９３細胞にリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ蛍光を、トランスフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーにより測定した。
【０１６９】
１つの実験の結果を以下の表３に示し、図７Ａにまとめる。図７Ａでは、ＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ｌｏｎｇ  ＩクローンおよびＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ｌｏｎｇ  ＩＩクローンは、ｓｈＲＮＡ対照（図の中では「ｓｉＲＮＡ」と呼ぶ）と比較したＧＦＰ活性の抑制の有意な増大を示す。
表３：
【０１７０】
【表３】
0005875976.tif 000005
図７Ｂは、合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  Ｉ複合体がｓｈＲＮＡクローン（その図の中では「ｓｉＲＮＡ」と呼ぶ）と比較してＧＦＰ活性の抑制の増大を示した実験の結果を示す。しかし、ＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  Ｉ複合体についての抑制活性は合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ  Ｉ  ＤＮＡ複合体について示されたように、一方の鎖をＤＮＡで置き換えた場合にはわずかに低下した。
【０１７１】
ＧＦＰに特異的な例示的な合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡもまた、以下の表４のように設計することができる。ここでは、Ｔ１．Ａ−Ｃの３つのオリゴを上記のようにアニーリングさせることができる。同様に、Ｔ２．Ａ−Ｃの３つのオリゴも上記のようにアニーリングさせることができる。
表４：例示的な合成のｓｉＲＮＡセットＴ１およびＴ２
【０１７２】
【表４】
0005875976.tif 000006
ＧＦＰに特異的なＭＶ−ｓｉＲＮＡクローンもまた、以下の表５のように設計することができる。上記で説明したように、これらの配列は、ｐＳｕｐｅｒベクターまたは任意の他のベクターシステムにクローニングすることができる。
表５：例示的なＭＶ−ｓｉＲＮＡクローン
【０１７３】
【表５−１】
0005875976.tif 000007
【０１７４】
【表５−２】
0005875976.tif 000008
実施例２
Ｔｒｉｖｏｉｄ抗HIV
多価ｓｉＲＮＡは、無関係な部位にある多数の遺伝子に対して設計することができる。本実施例では、クローニングしたＭＶ−ｓｉＲＮＡをＨＩＶに対して試験した。これらの結果は、ＨＩＶのＧａｇ遺伝子およびＴａｔ（ｈｖ＿ｓＢ）遺伝子に対する２価のＭＶ−ｓｉＲＮＡ分子が、Ｇａｇだけに特異的なｓｉＲＮＡ（ｈｖ＿ｓ）よりも、ＨＩＶ複製を阻害することにおいて有意に効果が高かったことを示す。
【０１７５】
表６に示すオリゴを、製造業者のガイドラインにしたがってｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ＋ｇｆｐベクターにクローニングした。ｈｖ＿ｓはＧａｇだけを標的化し、ｈｖ＿ｓＢはＧａｇとＴａｔの両方を標的化する。
表６：抗ＨＩＶ  ＭＶ−ｓｉＲＮＡクローン
【０１７６】
【表６】
0005875976.tif 000009
ＭＶ−ｓｉＲＮＡクローンをコードするベクター構築物を細胞にトランスフェクトし、１．０のＭＯＩでのＨＩＶ−Ｉ（ｐＮＬ４．３株）での感染の１０日目および４０日目に分析を行った。図９は、感染後１０日で、ＧａｇおよびＴａｔの両方に対して標的化されたＭＶ−ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ複製の阻害が、Ｇａｇに対してのみ標的化されたｓｉＲＮＡ分子による阻害よりも約３倍大きかったことを示す。
【０１７７】
ＨＩＶの１つ、２つ、または３つの異なる遺伝子を標的化するように、多価ｓｉＲＮＡを設計することができる。例示的なＨＩＶゲノムの配列を図１０に提供する。ｅｎｖ遺伝子の配列を図１１に、ｇａｇ遺伝子の配列を図１２Ａに、そしてｔａｔ遺伝子の配列を図１２Ｂに提供する。ＨＩＶの様々な遺伝子または領域は一般的に定義することができ、以下のようなヌクレオチド配列のそれらの範囲により標的化させることができる：５’ＬＴＲ：１−１８１；ＧＡＧ：３３６−１８３８；ＰＯＬ：１６３１−４６４２；ＶＩＦ：４５８７／４６６２−５１６５；ＶＰＲ：５１０５−５３９５（５１５７位、５２６６位、および５２９７位に突然変異を含む）；ＴＡＴ：５３７６−７９６６；ＲＥＶ：５５１５−８１９５；ＶＰＵ：５６０７−５８５２；ＥＮＶ：５７６７−８３３７；ＮＥＦ：８３３９−８９５９；ならびに、３’ＬＴＲ：８６２８−９２６３。これらの標的遺伝子に基づき、ＨＩＶについての例示的なＭＶ−ＲＮＡオリゴ配列を、以下の表７に提供する。
表７：例示的な３価のＭＶ−ｓｉＲＮＡ配列
【０１７８】
【表７−１】
0005875976.tif 000010
【０１７９】
【表７−２】
0005875976.tif 000011
【０１８０】
【表７−３】
0005875976.tif 000012
【０１８１】
【表７−４】
0005875976.tif 000013
上記表７の配列からＨＩＶに対して標的化させられたＭＶ−ｓｉＲＮＡ複合体を作製するためには、以下のように個々のオリゴを組み合わせ、アニーリングさせることができる。１）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿１６４９／１６４８／１６４８；配列１および２と３をアニーリングさせる。２）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６２５９／４０６２／５２９１；配列４および５と６をアニーリングさせる。３）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿７３８７／７３８７／７３８７；配列７および８と９をアニーリングさせる。４）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿１６／１６３０／７０１１；配列１０および１１と１２をアニーリングさせる。５）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４０／８５８５／７３２５；配列１３および１４と１５をアニーリングさせる。６）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５９１／６９８８／１７８５；配列１６および１７と１８をアニーリングさせる。７）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６８５／８４８１／９０４６；配列１９および２０と２１をアニーリングさせる。８）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿１２８４／６５７３／６３１１；配列２１および２２と２３をアニーリングさせる。９）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿１７８５／５９１／６９８８；配列２４および２５と２６をアニーリングさせる。１０）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿３５３４／５４３２／２９５２；配列２７および２８と２９をアニーリングさせる。１１）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８７２／５７７９／７３８４；配列３０および３１と３２をアニーリングさせる。１２）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５２１２／７５８／４７３６；配列３３および３４と３５をアニーリングさせる。１３）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５３６５／７５４４／４１９１；配列３６および３７と３８をアニーリングさせる。１４）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５７８４／８９４２／８１５８；配列３９および４０と４１をアニーリングさせる。１５）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５８６２／４３１０／４９９；配列４２および４３と４４をアニーリングさせる。１６）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６３６２／８５５９／６３７１；配列４５および４６と４７をアニーリングさせる。１７）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６９７３／１３５／１５８；配列４８および４９と５０をアニーリングさせる。１８）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿７３３７／８４８１／８１９０；配列５１および５２と５３をアニーリングさせる。１９）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿９０４４／５３１／７１１８；配列５４および５５と５６をアニーリングさせる。２０）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿９０８１／９２８／７５５７；配列５７および５８と５９をアニーリングさせる。２１）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿９０９７／１６３０／７０１１；配列６０および６１と６２をアニーリングさせる。２２）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿９１２１／８５８５／７３２５；配列６３および６４と６５をアニーリングさせる。
【０１８２】
実施例３
Ｔｒｉｖｏｉｄ抗ＡｐｏＢ
１つの遺伝子上の２〜３の位置を標的化することにより大きな遺伝子を抑制するように、多価ｓｉＲＮＡを設計することができる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡはまた、アニーリングの際のＴｍを上昇させるために、別のＲＮＡケミストリーを利用することもできる。本実施例では、以下の表８に示すように、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）遺伝子を標的化するように一連のＭＶ−ｓｉＲＮＡを設計し、随意の２’−ＯメチルＲＮＡサブユニットの存在を括弧内に示す。
表８：ＡｐｏＢに対する３価のＭＶ−ｓｉＲＮＡ
【０１８３】
【表８−１】
0005875976.tif 000014
【０１８４】
【表８−２】
0005875976.tif 000015
上記表８の配列から合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ  ３価の複合体を作製するためには、以下のように個々のオリゴを組み合わせ、アニーリングさせることができる。１）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２６８／９９５０／１７０３；配列１および２、その後、３とアニーリングさせる。２）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４４８／２２８８／６６０９；配列４および５、その後、６とアニーリングさせる。３）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４６９／４５８／１２２６３；配列７および８、その後、９とアニーリングさせる。４）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５２０／４１８２／１２５４８；配列１０および１１、その後、１２とアニーリングさせる。５）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２７９／９１６１／９９８６；配列１３および１４、その後、１５とアニーリングさせる。６）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２７８／９１６１／９９８６；配列１６および１７、その後、１８とアニーリングさせる。
【０１８５】
強力なプライマリー鎖とセカンダリー鎖を用いて設計する多価ｓｉＲＮＡはまた、完全な標的相補性のためのウォッブル塩基またはユニバーサル塩基、あるいは、いずれかの標的をサイレンシングさせることにより鎖を不活化させるための平滑末端化されたＤＮＡを利用することもできる。ＡｐｏＢに特異的な例示的なオリゴを以下の表９に示す。ここでは、（＊）は、状況に応じたウォッブル塩基またはユニバーサル塩基を示す。
表９：ＡｐｏＢに対する例示的な２価のＭＶ−ｓｉＲＮＡ
【０１８６】
【表９−１】
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【０１８７】
【表９−２】
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上記表９の配列から合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ２価複合体を作製するためには、以下のように個々のオリゴを組み合わせ、アニーリングさせることができる。７ａ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２２３／８８３／１０１１６）；配列１９、２０、および２１をアニーリングさせる。７ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２２３／８８３／１０１１６＊）；配列１９、２０、および２２をアニーリングさせる。７ｃ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２２３／８８３／ヌル）；配列１９、２０、および２３をアニーリングさせる。８ａ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８３／１１５９６／２４５４）；配列２４、２５、および２６をアニーリングさせる。８ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８３／１１５９６／２４５４＊）；配列２４、２５、および２６をアニーリングさせる。８ｃ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８３／１１５９６／ヌル）；配列２４、２５、および２６をアニーリングさせる。
【０１８８】
１つの遺伝子上の２〜３の位置を標的化することにより大きな遺伝子を抑制するように、多価ｓｉＲＮＡを設計することもできる。上記のように、本発明のＭＶ−ｓｉＲＮＡの特定の実施形態は、アニーリングの間のＴｍを上昇させるために、別のＲＮＡケミストリーを利用することもできる。以下の表１０においては、随意の２’−ＯメチルＲＮＡ  ２’−フルオロ塩基を括弧内に示す。中でも、別の塩基の例である５−メチルもまた、所望される場合には、ＭＶ−ｓｉＲＮＡ構造のＴｍを上昇させることができる。
表１０：ＡｐｏＢに対する例示的な３価のＭＶ−ｓｉＲＮＡ
【０１８９】
【表１０−１】
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【０１９０】
【表１０−２】
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上記表１０の配列から合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ２価複合体を作製するためには、以下のように個々のオリゴを組み合わせ、アニーリングさせることができる。１）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２６８／９９５０／１７０３；配列１および２、その後、３とアニーリングさせる。２）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４４８／２２８８／６６０９；配列４および５、その後、６とアニーリングさせる。３）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４６９／４５８／１２２６３；配列７および８、その後、９とアニーリングさせる。４）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿５２０／４１８２／１２５４８；配列１０および１１、その後、１２とアニーリングさせる。５）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２７９／９１６１／９９８６；配列１３および１４、その後、１５とアニーリングさせる。６）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２７８／９１６１／９９８６；配列１６および１７、その後、１８とアニーリングさせる。７）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６４２７／８１４４／１２８３１；配列１９および２０、その後、２１とアニーリングさせる。７ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６４２７／８１４４／１２８３１；鎖２２をアニーリングさせ、次いで、水酸化アンモニウムでリン酸結合を切断する。７ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿６４２７／８１４４／１２８３１；鎖２２をアニーリングさせ、次いで、３００〜３５０ｎｍのスペクトル範囲のＵＶ線でＰＣ  Ｓｐａｃｅｒを切断する。
【０１９１】
特定の実施形態においては、完全な標的相補性のために、強力なプライマリー鎖とセカンダリー鎖を用いて設計される多価ｓｉＲＮＡは、ウォッブル塩基、スペーサー塩基、または非塩基性塩基（ａｂａｓｉｃ  ｂａｓｅ）タイプを利用することができるか（例を以下の表１１に（＊）により示す）、あるいは、いずれかの標的をサイレンシングすることにより鎖を不活化させるために、平滑末端化ＤＮＡを利用することができる。いくつかの実施形態においては、ＵＮＡ、リンカーホスホルアミダイト、ｒＳｐａｃｅｒ、５−ニトロインドールが、適合しないヌクレオチドの代わりに有効な非塩基性塩基となり得る。所望される場合は、非塩基性塩基の使用により弱くなったＴｍが生じ得る、および／または非塩基性部位を取り囲む環境が、各２’−フルオロ塩基ごとに約２℃、Ｔｍを上昇させるように、２’−フルオロ塩基を利用することができる。
表１１：ＡｐｏＢに対して標的化された例示的なＭＶ−ｓｉＲＮＡ
【０１９２】
【表１１−１】
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【０１９３】
【表１１−２】
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上記表１１の配列から合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ２価複合体を作製するためには、以下のように個々のオリゴを組み合わせ、アニーリングさせることができる。７ａ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２２３／８８３／１０１１６）；配列２３、２４、および２５をアニーリングさせる。７ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２２３／８８３／１０１１６＊）；配列２３、２４、および２６をアニーリングさせる。７ｃ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿２２３／８８３／ヌル）；配列２３、２４、および２７をアニーリングさせる。８ａ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８３／１１５９６／２４５４）；配列２８、２９、および３０をアニーリングさせる。８ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８３／１１５９６／２４５４＊）；配列２８、２９、および３１をアニーリングさせる。８ｃ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４８３／１１５９６／ヌル）；配列２８、２９、および３２をアニーリングさせる。９）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿９２４４／１９５８／８００５）；配列３３、３４、および３５をアニーリングさせる。９ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿９２４４／１９５８／８００５）；配列３３、３４、および３６をアニーリングさせる。１０）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿１０４３９／９２４４／２２８４）；配列３７、３８、および３９をアニーリングさせる。１０ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿１０４３９／９２４４／２２８４）；配列３７、３８、および４０をアニーリングさせる。１１）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４５２／１１５８８／９２４４）；配列４１、４２、および４３をアニーリングさせる。１１ｂ）ＭＶ−ｓｉＲＮＡ＿４５２／１１５８８／９２４４）；配列４１、４２、および４４をアニーリングさせる。
【０１９４】
以下の表１２において例示するように、多価ｓｉＲＮＡは、ヒトＡｐｏＢに対して標的化することができる。２価のＭＶ−ｓｉＲＮＡは、それぞれの鎖の構造および標的相補性に対して様々な寛容性で機能し得る。
表１２：ヒトＡｐｏＢに対して標的化された例示的な多価ｓｉＲＮＡ
【０１９５】
【表１２−１】
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【０１９６】
【表１２−２】
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【０１９７】
【表１２−３】
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【０１９８】
【表１２−４】
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【０１９９】
【表１２−５】
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上記表１２の配列から合成のＭＶ−ｓｉＲＮＡ２価複合体を作製するためには、以下のように個々のオリゴを組み合わせ、アニーリングさせることができる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列１、２、および３をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列４、５、および６をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列７、８、および９をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列１０、１１、および１２をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列１３、１４、および１５をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列１６、１７、および１８をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列１９、２０、および２１をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列２２、２３、および２４をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列２５、２６、および２７をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列２８、２９、および３０をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列３１、３２、および３３をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列３４、３５、および３６をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列３７、３８、および３９をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列４０、４１、および４２をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列４３、４４、および４５をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列４６、４７、および４８をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列４９、５０、および５１をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列５２、５３、および５４をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列５５、５６、および５７をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列５８、５９、および６０をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列６１、６２、および６３をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列６４、６５、および６６をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列６７、６８、および６９をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列７０、７１、および７２をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列７３、７４、および７５をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列７６、７７、および７８をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列７９、８０、および８１をアニーリングさせる。ＭＶ−ｓｉＲＮＡ；配列８２、８３、および８４をアニーリングさせる。
【０２００】
本明細書中に記載され、当該分野で公知であるように、ＡｐｏＢに対するＭＶ−ｓｉＲＮＡを、その標的タンパク質の発現と関係がある広範な様々な疾患または症状を処置あるいは管理するために使用することができる。
【０２０１】
参考文献：
【０２０２】
【化１】
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【０２０３】
【化２】
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【０２０４】
【化３】
0005875976.tif 000029
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ＡＢ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
0005875976.tif 000040
【図１０Ｂ】
0005875976.tif 000041
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【配列表】
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